博 士（獣医学）高田健介
学位論文 題名
h/Iolecular rvIec
hanisms of Aut01nlnlunity
in工 QI／ JiCnliCe，AMOdelforSj6g
ren SSyndrome（シェーグレン症候群モデルマウスIQI/Jicにおける自己免疫の分子機構）

学位論文内容の要旨
ヒト のシェ ーグレ ン症候 群(SS)は、 涙腺´ ・唾液 腺への りンパ球浸潤により、ドライアイおよび口腔乾 燥 を星 する代 表的な 慢性自 己免疫疾 患であ る。SSの 病態に は、複 数の遺 伝要因 および 環境要 因が関与 す ると 考えら れてい るが、 その因子 の多く は未だ 明らか にされ ていな い。本 研究で は、ssの 自己免疫病 態の分 子機構の 一端を 明らか にする 目的で 、新規 動物モ デルであるIQ
I/Jic
マウスの解析を行った6SSで は 、 涙 腺 ・ 唾液 腺 に 始 まっ た 炎 症 が全 身 諸 臓 器へ 波 及 す る症 例 が 多 く、 こ の 病 像は 古 く から autoinimuneexocr
inopath/'、あるいは autoimmuneepithelitis として知られている。その機序と し て、 標的臓 器に共 通に発 現する自 己抗原 の関与 が示唆 されて いるが 、詳細 は明ら かにされ ていな
い 。 そこ で 、 ま ず、 4週 齢 か ら 52週 齢 ま での IQI/Jicマ ウス の全身 臓器を 病理組 織学的 ならび に免疫組 織 化学 的に検 索した 結果、 28週齢以 上の老 齢マウス では、 これま で報告 されて いる涙 腺炎・ 唾液腺炎 に 加え 、 肺 、 眸臓 、 腎 臓 にも CD4十 T細 胞 およ び B細 胞 か ら 成る り ン パ 球浸 潤 巣 が認め られた 。また、 8週齢に おける 初期の病 変は唾 液腺に 限局し て発症 し、そ の後、 加齢に 伴って他 の臓器に現れることが 明らか となった 。
これ らの結 果を受 け、次 に、IQI/Jicマ ウスに おける 多発性 自己免 疫病変 に関連 した自己抗原の同定を試 みた。 IQJJJicマウス の血清 中抗体 と各臓 器抽出 物との 反応を ウエスタ ンブロ ット法で検索したと
こ ろ 、唾 液 腺 抽 出物 中 の 16〜 18 kDaの ポり ベ プ チ ドと の 特異的 な反応 が認め られた 。この ポりペプ
チ ド を、 イ オ ン 交換 、 ゲ ル 濾過 、 お よ び逆 相 HPLCに よ って 精 製 し 、N末 端ア ミ ノ 酸配列 解析を 行っ
た結 果、マ ウス組織 カリク レイン (KJk)‑lおよ び‑13であ ること が明ら かとな った。 IQI/Jic
マウスの血清 中 自己 抗 体 は 、こ れ ら IOkに対 して 交差性 に反応し 、さら に、脾 細胞は Klk‑13に特 異的な 増殖反応を 示 した 。 ま た 、RrpPCR法 に よる 検索か ら、KIk‐ 13の発現 は唾液 腺で最 も豊富 である ととも に、他の標 的臓器 にも共通 に発現 してい ること が明ら かとな り、IQI′Jic
マウスにおける唾液腺から他臓器への 炎 症 波 及 に 、 K止 ・ 13に 対 す る 自 己 免 疫 反 応 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
自 己 抗 原 に対 す る 細 胞性 免 疫 反応 を検討す る過程 で、T細 胞特異 的マイ トージ ェンに 対する 脾細胞増 殖 反応 が 、 IQWicマ ウ ス では 、 対 照 B釦 B′ cマ ウ スに 比 較して 有意に 低い、 という 興味深 い知見を得た 。この 異常は、 発症前 の4週齢 から、 全身症 状を伴 う48週齢 までの マウス で同程 度に認められた。
T細 胞 増 殖異 常 の 原 因を 検 索 す るため 、培養 上清中 に産生 された 各種サ イトカ インの 濃度を測 定した
結果 、Iし・ 2の産生 が顕著 に低下し ており、また、これがIL．2遺伝子発現の低下に起因することが、定量 的 PCRに よ る 検 討か ら 明 ら かと なっ た。IL‐ 2は由ぬ ′Dにお いて自 己抗原 に対する 免疫寛 容の維 持に 重 要な 役割を 果たし ている ことが知 られて おり、 これら の結果 から、 T細胞活 性化に 伴うIL・ 2の産生低 下が、 IQI／J・icマウスにおける自己寛容の破綻を引き起こし、自己免疫疾患の発症に直接的に関与して いる可 能性が考 えられ た。 ．
近年 、CD4＋（ m25＋制御 性T細胞 （Tkpの 機能維 持におけ るIL 2の重要性が明らかとなり、IL．2を介した 自己寛 容の機序 のひと っとし て注目 されて いる。 そこで 、′kgによる自己寛容機構とIQI／Jicマウスの 自己免 疫病態との関連を明らかにする目的で、′kgの発生を特異的に阻害する手法として知られる、― 1269 ‑生後 3日目の 胸腺摘 出(D3'BC)を IQI/Jicマウ スに施し 、16週 齢におけ る唾液 腺炎お よび涙 腺炎へ の影
響を 組織学 的に検 討した 。その 結果、 D3Txにより 涙腺炎 の顕著 な悪化 が認められたのに対し、唾液腺炎は 胸腺摘 出群お よび無 処置群 で同程 度であっ た。こ のこと から、 若齢IQI/Jcマウス ではregの 機能は 正 常 に 維 持 さ れ、 初 期病 変 の 形成 に は直 接 関 与し て いな い こ とが 示 唆 され た 。
本研 究 の 結 果を ま と め ると 、 IQ恥cマウ ス で は 、T細胞 の活性 化に伴 うIL．2産 生不全 がTregとは異な る自己 寛容機 構を破 綻させ 、カリ クレイン ‐13を 含む自己 抗原に 対する 持続的 なT細胞 の活性 化を引 き起こ すと考 えられ る。また、カリクレイン．13に対する自己免疫反応は、唾液腺から他の標的臓器ー の炎症 波及に 関与し 、全身 病態の 形成に重 要な役 割を果 たすと 考えら れる。これらの知見はSSを含め た自己 免疫疾 患の病 因解明 に寄与 すると期 待され る。

ー 1270 ‑学位論文審査の要旨
主 査

教 授

稲 葉睦

副 査

教 授

斉 藤 昌 之副 査

教 授

梅 村 孝 司副 査

教 授

安 居 院 高 志

学位論文題名Molecular h/Iechanis
mso
fA
ut
oi
mmunityinI
QI/J
icm
ice，
AR/IodelforSj
ogren SSyndrome（シ ェー グレ ン症 候群 モデル マウ スIQI/Jicに おけ る自己 免疫 の分子機構）

ヒトのシェーグレン症候群(SS)は、涙腺・唾液腺へのりンパ球浸潤によルドライアイと口腔乾燥を呈する代表的な慢性自己免疫疾患である。SSの病態には、複数の遺伝性素因と環境要因が関与すると考えられているが、その因子の多くは未だ明らかにされていない。本研究では、SSの自己免疫病態の分子機構 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 に 、 新 規 動 物 モ デ ル で あ る ioI/Jicマ ウ ス の 解 析 を 行 っ た 。
SSでは、涙腺・唾液腺に始まった炎症が全身諸臓器へ波 及する症例が多く、この病像は古くから"autoimmuneQ【．ocrinopathy として知られている。その機序として、標的臓器に共通して発現する自己抗原の関与が示唆されているが、詳細は不明である。そこで、まず第1章では、4週齢から52週齢までのioI/Jic
マウスの全身臓器を病理組織学的、ならびに免疫組織化学的に検索した。その結果、28週齢以上の老齢マウスでは、これまで報告されている涙腺炎・唾液腺炎に加え、肺、膵臓、腎臓にもCD4+T細胞、およびB細胞からなるりンパ球浸潤巣を認めた。また、8週齢における初期の病変は唾液腺に限 局 し て 発 症 し 、 そ の 後 、 加 齢 に 伴 っ て 他 の 臓 器 に 現 れ る こ とを 明 ら か に し た 。
この知見に基づき、第2章ではiol/J
ic
マウスにおける多発性自己免疫病変に関連した自己抗原の同定を試みた。I
QI/J
icマウスの血清中抗体と各臓器抽出物との反応をウェスタンプロット法で検索したところ、唾液腺抽出物に含まれる18k
Da、ならびに16kDaのポリベプチドとの特異的な反応が認められた。これらのポリベプチドを、イオン交換、ゲル濾過、および逆相クロマトグラフイーによって精製し、N末端アミノ酸配列解析を行った結果、各々マウス組織カリクレイン(Klk)―1と‑13であることが明らかになった。ioI/J
ic
マウスの血清中自己抗体は、これらのKlkに対して交差性に反応し、さらに、脾細胞はK
lkー13に特異的な増殖反応を示した。また、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による検索から、Klk―13の発現は唾液腺で最も豊富であるとともに他の標的臓器にも共通に発現していることが明らかとなり、
iouj
ic
マウスにおける唾液腺から他臓器への炎症波及に、K
lk−13に対する自己免疫反応が関与している可能性が示された。
第3、4章では 、iol/J
ic
マウスにおける自 己免疫病態とT細胞機能の関 連について、T細胞が産生するイン夕一ロイキンC[L)―2などのサイトカイン、ならびにIL‑2を介した自己寛容の機序のひとっとされるCD
4+CD25+制御性T細胞(
TreS:)に焦点を充てた検討を行った。まず、T細胞特異的マイトージェンに対する脾細胞 の増殖反応がIQ
I/Jic
マウスでは対照B
AL
B/cマウスに比較して有意に低いという知見を得た。この異常は、発症前の4週齢から、全身症状を伴う48週齢までのマウスで同程度に認められた。
細胞培養上清中に産生されたIL‑2、IL‑4、イン夕一フェロン―アの濃度を測定した結果、IL―2の産生が顕著に低下していること、さらに定量的ポリメラーゼ連鎖反応により、これがI
L‑
2遺伝子発現の低下に― 1271―

起 因す るこ と を明 らか にし た。 一 方、 Tegの発 生を 特異 的に 阻 害す る手 法で ある 生後3日目での 胸腺摘
出 をIQI/Jicマ ウス に施 し 、16週齢 にお け る唾 液腺 炎お よび涙腺炎 への影響を組織学的に検討し たところ 、胸 腺摘 出 によ り涙 腺炎 の顕 著な悪化 が認められたのに対し、唾 液腺炎は胸腺摘出群と無処置 群とで同程度であ った。即ち、若齢IQIかicマ ウスでは1、re。の機能は正 常に維持され、初期病変の形成には直接 関与 しな い こと が示 され た。 こ れら の結 果か ら、 IQIかicマウス では、T細胞の活性化に伴う II′2産生不全が′rreヨの機能によるものとは異なる自己寛容機構を破綻させ、Iくlkー13を含む自己抗原に対する持続的なT細 胞の活性化を引き起こすこと が考えられた。
本 研 究は 、SSモ デル マウ スで あ るIQIかicマ ウス の自 己免 疫 病態 とそ の進 行に 関 わる 因子 を解 明、さ らに 発症 機 構解 明へ の基 盤と なる知見 を提供し、広く自己免疫疾 患の分子機構解明に貢献する ものであ る。 した が って 、審 査員 一同 は、上記 博士論文提出者高田健介の 博士論文が北海道大学大学院 獣医学研究科規程 第6条の規定による本研究科 博士論文審査等に合格と認 めた。

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