博 士 （ 医 学）

モ ハメ ド カメ ルハ ッ サン

学位論文題名●An association between clusterin over− express10nand
taxol‑resistance in ovarian cancer（卵巣癌におけるクラスタリン過剰発現とタキソール耐性との関連）

学位論文内容の要旨(Background)
Clusterin (CLU) /Apolipoprotein J (Apoj) is a heterodimeric glycoprotein
ubiquitously expressed in all human tissues. CLU has been implicated in several
physiologic processes as well as sensitivity to chemotherapy in many cancers. We,
therefore, studied the effect of taxol (TX) ontheexpre
ssionandlocalizati
on ofCLUin
TX‑sensitive and resistant ovarian cancer cell lines. Although some studies reported
CLU upregulation as an apoptotic response, the precise relationship between CLU gene
expression and programmed cell death has not been elucidated. In this study weinvestigated the . relationship between " CLU expression and chemoresponse/chemoresistance in the ovarian model.
(Material and methods)
We treated the ovarian cancer cells (KF) and their taxol‑resistant counterpart (KF‑TX) with TX in a dose and time course and checked the expression by westem blotting.
Confocal microscopy study and sub‑cellular fractionation were performed to detect t
heintracellular trafficking and distribution of CLU inside the cells in response to TX
treatment Also, siRNA targeted the secreted isoform of CLU was transfected into
resistant cells and apoptotic outcome was estimated using FACS analysis and viability
assay. Stable clones expressing CLU was established from OVK18 cells. Finally,
immunohistochemical study was performed on sets of primary and recurrent clinicalovarian cancer tissues to map out the relationship between CLU and chemoresponse.
(Results)
CLU expression was higher in KF‑TX than in KF. In KF, full length CLU (60 KDa)
was up‑regulated in response to TX treatment in a time and dose dependent manner,
while no rapid increase of this CLU expression in KF‑TX. Cleaved secretory CLU(sCLU; 40KDa) was upregulated as an early event in both cells and rapidly decreased
with high doses of TX in KF cells. That decrease started with higher dose in KF‑TXcells. The same expression pattern was observed in the culture media from sameexperiment when sCLU was checked in. Confocal microscopy and sub‑cellular
fractionation studiesreve
aledcytos
olicaccumulati
on ofCLUin the resistant cells morethan that in sensitive after TX treatment. CLU mRNA was selectively amenable tospecific degradation by small interference siRNA which designated to target CLU.
Transfection of KF‑TX cells with CLU‑siRNA caused taxolto in
ducemuchgreateramount of apoptosis in these cells, than those cells transfected by control siRNA as
confirmed by DNA ladder, FACS analysis and viability assay. Moreover, exogenous fullー 337―1ength CLU renders OVK18 cells chemoresistant proving that fulllengthCLUisessential for the ovarian cancer cells toresistTX. Clonogenic assayunder TX
confirmed the importance of CLU for cells to develop chemoresistance.
Immunohistochemicalresultsofovariancancertissuesindicatedaccumulation ofCLU
in the persistant recurrent tumors comparedwith theirprimary ones while theresponsiverecurrenttumorsshowedless CLU expression.Thatexpressionwaslower
when comparedwiththeirprimaryones.
(Conclusion)
This work demonstrates that alterationsinCLUbiogenesisare induced duringchemorsistance development,apparentlyasa result of changes in expression andproteolyticprocessing.Thesealterationsleadtoaccumulationoftheprotein.Moreprecisely,specificoverexpressionoff
ulllengthCLUinduceschemore
sistantph
enotypewhen accumulated inside the ovarian cancer cells. Thus, CLU appears to be an
importantproteinthat mediatestheregulationofchemotherapy‑inducedapoptosis.
Taken together, our resultssuggestthat fulllengthCLUupregulation positively
correlateswith the developmentofchemoresistance.FulllengthCLUoverexpression
along with chemotherapy could be a potential new predictive marker forchemoresistance in ovarian cancer.MoleculartherapytargetingCLUmayrestorethe
sensitivity to some chemotherapeutic agents asa newapproach for ovarian cancertherapy.

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 櫻 木 範 明
諭
副 査 教 授 福 田
副 査 教 授 秋 田 弘 俊

学 位 論 文 題 名●An association between clusterin over― express10nand●taXOl− reSiStanCeinOVarlanCanCer（ 卵 巣癌 における クラスタ リン過剰 発現とタキ ソール耐 性との関 連）

ク ラス タ リ ン(CLU)は 幾 っ かの生 理的機能 を有すると ともに多 くの癌に おいて 化 学 療法 に 対す る 耐 性に 関 与して いることが 示されて いる。CLUの 発現と局在 が卵巣癌 治療のkey drugで あるタキ ソールに 対する感受 性や耐性 に及ばす 影
響 を 明 らか に する こ と を目 的 に本研 究を行った 。CLUにはア ポトーシ ス抑制作用のあるsecre
toryCLUとアポトーシス促進作用のあるintr
acellularC
LUのisoformが あ る 。タ キ ソー ル 耐 性卵 巣 癌 細胞 KF‑TXに お ける CLU発現 はその 親細胞で ある KFよりも高 かった。 secre
toryCLU
はタキソール1処理によりKF，KF−TXともに初 期に発現 が増加し たが、KFで は高濃度 のタキソー ル処理に より急速 に減少した 。 共 焦点 顕 微鏡 と 細 胞分 画 を用い ての検討で 、KFーTXでは KFと異なり CLUが細 胞 内 に局 在 する こ と が認 め られた 。KF―TXにCLU siRNAを導 入しタキ ソールで 処理する と、control siRNAを導 入した細 胞に比べて顕著なアポトーシスを誘導できた。一方、secre
toryCLUのprecursorであるfulllengthCLUを卵巣癌細胞
OVK18に導 入 す ると OVK18は タ キソール 耐性とな り、full length CLUがタキ ソー ル耐性獲 得に必要 であるこ とが示さ れた。卵巣 癌臨床検 体を用い ての免疫 組織 化学的検 討により 、治療に 反応せず 残存する腫 瘍あるい は寛解後 早期に再 燃し た 腫 瘍と 治 療に 反 応 し寛 解 後長期 間を経てか ら再発し た腫瘍で はCLUの局在に 違 い が認 め られ た 。 すな わ ち、前 者では原発 病巣、再 発病巣に CLU局在が強く 認 め られ 、 後者 で は CLU発 現 が低いこ とが観察さ れた。こ れらの結 果は卵巣癌 の タ キソ ー ル耐 性 獲 得過 程 におい て、CLU遺伝子 発現やタ ンパク転 写後修飾の変化が起こることを示している。とくにfull length CLUの蓄積は卵巣癌のタキソール耐性を誘導し、アポトーシスを阻害する。full lengthCLUの過剰発現は卵巣 癌 の タキ ソ ール 耐 性 を予 測 する指 標となりう ると考え られ、CLUを ターゲッ
ト とした分 子標的治 療は卵巣 癌のタキ ソール耐性 を解除す る新しい 治療法と なる可能性があると考えられる。
公開発表終了後、副査の福田教授から，1）cisplatinなど他の薬剤に対する 耐性とCLU過剰発現と の関連、2）chemosensitiv
ityの予測因子として将来的な臨床応用を考えた時、血清での測定は可能か、また可能であれば治療前と 治療後、chemosensitive
例とchemoresistant
例でのpreliminar
yな結果は
持 っ てい る かに つ いて 質 問 があ った．副査 の秋田教授 からは，1）CLUのbiomarkerとしての意義、2）他の癌腫におけるCLUの発現について質問があった．主査の櫻木教授から，1）内因性抗がん剤耐性で知られる卵巣明細胞腺
癌 におけるCLUの発現、 2）CLUをターゲ ットとした 分子標的治 療の臨床応用の可能性について質問があった．これらの質問に対して，申請者は自身のこれ ま で の 研 究 成 績 や 文 献 的 情報 を もと に 概ね 妥 当な 回 答を な しえ た ．
本 論文は卵巣癌のタキソール耐性におけるCLUの関与とそのメカニズムを明 らかにしたものであり、今後CLUを標的とした卵巣癌治療法開発の可能性を示したことで高く評価される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。