博 士 （ 医 学 ） 小 笹 真 理 子
学 位 論 文 題 名

膵癌細胞において低酸素・低グルコース下で発現亢進する遺伝子‑ BCL6を中´いに―

学位論文内容の要旨【目的と背景】
生体内における腫瘍微小環境は 低酸素であると同時に低栄養下にあり，低酸素・低栄養状態が血管新生の誘導などを介し て腫瘍の増殖・進展に深く関与すると考えられる．低酸素に対する適応応答に重要な制御因子は転写因子hypoxia‑inducibl
efactor(HIF‑1)であり，低酸素下でHIF‑1は血管新生，解糖系，糖輸送などに関与する 様々な遺伝子の発現を亢進させている．
キ一 J
膵癌は化学療法，放射線療法に 抵抗性であり，いまだ満足できる治療成績が得られていない極めて予後不良な悪性腫瘍の ーつである．低酸素環境下にある癌細胞は化学療法，放射線療法抵抗性であり，HIF‑1dの 発現が高い腫瘍ほど悪性度が高く，予後不良であることが数多く報告されている．膵癌組 織は、血管造影などの検査上腫瘍血管が少ないことが知られており、厳しい低酸素・低栄 養状態状態下にあると考えられる．事実多くの膵癌細胞がHIF‑1aを恒常的に過剰発現して いることが報告されている．したがって、膵癌において低酸素・低栄養環境下で誘導さ れる遺伝子を探索することによって，生体内における低酸素・低栄養適応応答や低酸素・ 低栄養によって誘導される治療抵抗性において重要な働きをしている遺伝子を同定できる可能性があると考えた．
【材 料と方法】
膵癌 細 胞株 M
iaPa
Ca‑2を 用い て， DNAマ イク 口アレイ法で低酸素・低栄養条件下で発現が 亢進する遺伝子を探索した．得られた遺伝子の中で，B
CL6(
B‑celllymphoma6）遺伝子に 着目し，リアルタイムPCR法 およびウエスタンプロッテイングにより，低酸素・低グル コー ス 環境 下に おけ るBCL6の 発現 を調 べた ．次 にsiRN
A導 入に より BC
L6発現を抑制
し， 細胞増殖に対する影響をトリパンブルー染色による細胞数計測及びM
TSアッセイにより 検討 し た， また ，BCL
6に 対す るsiRN
Aを 導入した膵癌細胞をGemc
itabineで処理し，抗 癌剤 感 受性 に対 する影響をM
TS
アッセイ にて検討した．さらにB
CL
6発現における転写因 子 HIF‑1の 関 与 を 調 べ る 目 的 で 、 HIF‑1に 対す る siRNAを 導入 後の BC
L6発現 量 の変化 を り ア ル タ イ ム PCR法 及 び ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ に よ り 検 討 し た ．
【結果】
1． DNAマイク口アレイ法により，低酸素・ 低栄養条件下で発現亢進する遺伝子として
BCL6を 含 め 十 数個 同 定し た． 2
. BC
L6の遺 伝子 発 現量 をア ルタ イム P
CR法に よ り検 討
し，低酸素，低グ ルコース条件下で発現亢進することを確認した． 3.
ウエスタンブ口ッテ イン グに より BC
L6蛋白 が低 酸素 条 件下 で発 現亢 進す るこ とを 確認 した．4. B
CL
6に― 263―

対す る si
RNAの導 入 に より BCL
6の発 現は抑 制され， BCL6の発現 抑制によ って正 常酸素分圧 下およ び低酸素 下にお けるMi
aP
aC
a‑2細胞の 増殖が 抑制され た．5. B
CL
6に対す るsiR
NAの導 入によりBCL
6発現を抑制した結果，正常酸素分圧下および低酸素下において，Mia
PaCa‑2細 胞の Gemcitabineに 対 す る 感受 性 の 上昇 を 認 めた ． 6. HIF‑laに対 す るsiRNA導 入に よ っ て低 酸 素 下で の HI
F‑1aの 発 現 は 抑制 さ れ たが ， BC
L6の m
RNA発現 と蛋白発現 に影響を 認めな かった．
【考察】
今回の研究では低グルコース環境を低栄養環境として，低酸素及び低栄養環境下で発現が 亢進す る十数個 の遺伝 子を同定 した． 同定され た遺伝 子の中で ，B
CL6遺伝 子のmR
NA発現が低酸素・低栄養環境下で亢進することが多くの細胞株で確認された．さらに蛋白レ
ベ ルでも 発現亢進 するこ とが確認 された ．B
CL6は胚中 心B細胞に特 異的に 発現し， B
細胞の分 化やB細胞性悪性リンパ腫の発症に関与していることが報告されている．本研究ではBCL6がB細胞 性腫瘍ば かりでな く固形 腫瘍にお いても 発現しており，さらに低酸素・低栄養環境下ではその発現が亢進してくることを明らかにした．こうした低酸素・低栄養環境下で発現亢進してくる遺伝子産物は腫瘍の生体内生存，増殖にとって重要で必須な働きをし ていると 考えら れ，実際 B
CL6遺伝子のノックダウンによって膵癌細胞株の増殖が抑制され，さらに抗癌剤誘導アポトーシスに感受性となることが示された．このことから
BC
L6は膵癌細胞の生存，とりわけ抗癌剤などのストレス誘導アポトーシスに対する耐性機構に関与している可能性が示唆された．しかしそのヌカニズムに関しては，明確な結論を得 るに は い たっ て い ない ， si
RNAを 用いたBC
L6の ノック ダウンに よって p21やp27の蛋白発現亢進が認められ、細胞周期停止が関与している可能性が示唆されたが，今後の詳細な検討が必要と思われる．
ま た 低 酸素 環 境 にて BCL
6の 発現 が亢進 している ことか ら，HI
F‑1による B
CL6の転写活性化 の可能性 につい て検討し たが，低酸素環境下でHI
F‑1の発現亢進をsiRNAにて抑制
し ても ， BCL6 m
RNA発現 は 抑 制さ れなか った，こ の結果 から，低 酸素に よるBC
L6発現
亢進はH
IF‑1非依存性の機序による可能性が示唆された．
すでに膵癌細胞において，低酸素・低栄養環境下でアドレノメジュリン，VE
GF，GL
UT‑1，
GLU
T‑
3，hexok
inase2の発現が低酸素環境下よりも亢進していることを報告しており、これらの遺伝子発現亢進により，腫瘍細胞が低酸素・低栄養環境下でも低酸素環境下と同様に血管新生や嫌気性代謝の活性化を介して腫瘍環境に対して適応しているという仮説を提起している．本研究は，低酸素・低栄養環境下においてこうした既知の適応応答機構に加え て BCL6を 介 す る 新 し い 適 応 応 答 機 構 が 存 在 す る こ と を は じ め て 示 し た ．
【結語】
1． 膵癌 細 胞 株に お け る低 酸 素・ 低栄養 誘導遺伝 子とし てB
CL6が同定 され， BCL6は膵癌にお ける低酸素・低栄養環境に対する適応応答を担っていると考えられた． 2.
低酸素・ 低 栄 養に よ る B
CL6発現 亢 進 はHIF‑1
非 依 存 性で あ る こと が示唆さ れた． 3. BC
L6は膵癌において増殖・抗癌剤耐性に関与しており，新たな治療の標的となりうる可能性が示唆された．

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学位論文審査の要旨
主査教
授浅香正博
副査教
授畠山鎮次
副査准教授田中淳司

学 位 論 文 題 名

膵癌細胞において低酸素・低グルコース下で発現亢進する遺伝子― BCL6を 中 心 に 一

生体内における腫瘍微小環境は低酸素であると同時に低栄養下にあると考えられている．
低酸素適応応答に最も重要な制御因子は転写因子hypoxia‑induciblefactor(HIF‑I)
であり，低酸素下で血管新生，解糖系，糖輸送などに関与する様々な遺伝子の発現を亢進させている．
低酸素環境下にある癌細胞は 化学療法，放射線療法抵抗性であり，HI
F．1の発現が高い腫瘍ほど悪性度が高く，予後不良であることが数多く報告されている．膵癌は血流の不足から厳 しい低酸素・低 栄養状態下にあると考えられ，事実多くの膵癌細胞がHIF‑1aを恒常的に過剰発現している．このため膵癌において低酸素・低栄養環境下で誘導される遺伝子を探索することで，生体内における低酸素・低栄養適応応答や誘導される治療抵抗性において重要な遺伝子を同定できる可能性があると考えた．
本研究では膵癌細胞株MiaPa
Ca‑2を用い，低グルコース 環境を低栄養環境として検討を行った．網羅的探索の結果，十数個の低酸素・低グルコース誘導遺伝子が新たに同定された．
その中でBCL6 (B‑celllymphoma6）遺伝子に着目し，低酸 素・低グルコース環境下における BCL6の mRNAお よ び 蛋 白 レ ベ ルで の発 現亢 進を 確認 した ．膵 癌細 胞で BCL6を抑 制した結果，正常酸素分圧下およ び低酸素下において細胞増殖が抑制され，Gemcitabineに対する抗癌剤感受性の増加を認 めた， BCL6の発現量はHIF‑1aの抑制による影響を認めなかった．
BCL6は胚 中心 B
細 胞に 特異 的 に発 現し ，B細胞 の分 化や B細胞 性悪 性リ ンパ 腫の 発症
へ の関与が報告さ れているが，本研究ではBCL6が固形腫瘍においても発現 し，低酸素・低 栄養環境下では その発現が亢進していることを明らかにした．またBC
L6が膵癌細胞の増殖，抗癌剤などのストレス誘導アポトーシスに対する耐性機構に関与していることを示し，新 たな治療標的と なりうる可能性を示唆した．さらに低酸素・低栄養環境 によるB
CL6発
現 亢進 はHIF‑1非依 存性 と考 え られ，低酸素・低栄養環境下においてBCL6を介する新たな適応応答機構が存在することを初めて示した．
公開発表では，学位論文内 容の発表の後，副査畠山鎮次教授より，膵癌におけるHIF‑1の 発 現 機 序 ， BCL6が 関 与 す る 悪性 リン パ腫 の発 症機 序お よび BC
L6の制 御機 構に ついての質問があった．
申請 者は これ に対 し， 膵癌 においてはVHLに関する報告はなく，血流の 不足により癌の 中で も特 に低 酸素 ・低 栄養 環境にさらされ ることによりH
IF‑1が発現し ていると考えられると回答した．悪性リン パ種の発症機序については，染色体転座によるプロモーター― 265ー

置 換に より B
CL6の脱 制御 が起 こる ため と考 えら れて いる と 述べ た．低酸素におけるBCL6の 制御 機構としては，プロモ一夕ー領域に転 写因子A
P‑1の結合部位が報告されていることからその関与の可能性，また転写制御だけではなくunfoldedproteinresponseの 関与 の可 能性 につ いて も言 及し た． 畠山教授からはBCL6とCullin3の関係について研究を進めてほしいとのコメントがあった．
次い で副 査田 中淳 司准 教授 から BC
L6に着 目し た理 由お よ び膵 癌組織におけるBCL6の発現，染色体異常についての質問があった．また実験結果で正常酸素と低酸素下で同様の結果が得られたことの解釈についての質問があった．
申請者はこれに対し，BCL6が血液疾患では重要な遺伝子のーつとして知られているが，固 形癌 にお ける働きが未知であることから着目し たと回答した．また，膵癌組織ではBCL6の発現，3q27の遺伝子増 幅が報告されているが ，染色体転座の有無は不明であると回答した．正常酸素，低酸 素下で同様の結果が得られたことについては，BCL6が膵癌細胞において正常酸素でも発現し，低酸素下では発現量が増加することでその働きが増強するためと考えられると回答した．
主査 浅香 正博教授からは他の固形癌におけるBCL6発現についての質問があった．またBC
L6の抑制方法，マウスを 用いた動物実験および臨床応用についての質問があった．
申請 者は これに対し，食道癌細胞株でも同様に B
CL6発現亢進を認めたこと，組織では膵癌に加え乳癌，悪性黒色 腫，膀胱移行上皮癌の報告があることを述べた．B
C
L6の抑制方法については良好な結果 が得られたためsiRNAを用い たと回答した，動物実験については今後行う予定であり，ノックアウトマウスでは脾臓の胚中心形成が障害されること，トランスジェニックマウスでは悪性リンバ腫を発症したが，固形癌の発症に関する報告はさ れて いな いと回答した．またBC
L6を特異的ペプ チドおよびアセチル化により抑制する報告がなされており，海外では悪性リンバ腫を対象とした新たな治療法としての開発が進んでいることについても言及した．
本研 究は ，膵 癌に おい て低 酸素 ・低 栄養環境下でHI
F‑1非依存的にBCL6を介する適応応答が存在することをはじめて示し，治療抵抗性で予後不良な膵癌において新たな治療
標 的 と な り う る 可 能 性 を 示 唆し た も の で あ り ， 今 後 の 発展 が期待 され る．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請者 が博士（医学）の学位を受けるのに充 分な資格を有するものと判定した．

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