博 士 （ 生 命 科学 ）北川 宗 典

学位論文題名
Stucly on intercellular movement of molecules throughplasmodesmata atacellular level using protonemata ofPhyscomitre仏pa加S（ヒメツリガネゴケ原糸体を用いた細胞レベルでの原形質連絡を介する分子の細胞間移動についての研究）

学位論文内容の要旨
細胞間コミ ュニケーションは 多細胞生物におけ る成長、発生、環境応答において必須であると考えられ ている。植物と動 物は多細胞性を独 立に進化させ、その中で効率的な細胞間コミュニケーシ ョンを実現するため、独自のメカニズムをそれぞれ発達させてきた。植物では、
隣り 合 う細 胞同 士 は細 胞壁 を 貫通 する原形質連絡(plasmodesmata，PD)と呼ばれ る卜ンネ
ル状 の 構造 体によって直 接的に連結されて いる。このPDは水 、イオン、代謝産物 、タンパ
ク質や核酸な どの様々な低分子 および高分子の細 胞間輸送に機能しており、ニれは植物の成長、発生、環 境応答の中で厳密 に制御されている 。
PDを 介 す る 分 子の 細 胞間 移動 は 、細 胞壁 に おけ るPDの 密度 やPDそ のも のの 開 口度 によっ て 制御 され て いる こと が 知ら れて い る。 特に PDの開口 度は、PDの中を拡散 によって移動できる分 子の上限のサイズ によって定義されるサイズ排除限界(sizeexclusionlimit．
SEL)と 呼ば れる 指 標に よっ て 評価 され る 。PDの密 度 やSELの動 的な 変 化に よっ て、PDを介す る 分子 の細胞間移動 は植物の発生の中 で時空間的に制御 されていることが知 られている。このよう なP
Dを介する分子 の細胞問移動の動 的な制御は、植物の発生過程において「シンプラスティ ックフィールド」 と呼ぱれる細胞も しくは細胞群の確立に繋がることが知られている。この シンプラスティッ クフイールドに含 まれる細胞（群）は、周囲の細胞群との細胞問コミュニ ケーションが制限 され、周囲から隔 離された状態に維持される。この隔離された細胞（群） は周囲の細胞群と は独立した発生過 程を経る。このように、PDを介する分子の細胞間移動の 制御は植物の発生 過程において細胞 レベルもしくは組織レベルで重要な役割を果たしている と考えられている 。
これまで、 PDを介する分子の 細胞間移動の制御 は、螢光色素や蛍光タンパク質の細胞間移動の観察を通 して評価されてき た。なぜならば、 これらのトレーサーは単純拡散によってPD経由 で 細胞 問を 移 動し 、そ の 移動 度は PDを介 する 分 子の細 胞間移動の制御要因 であるPDの密 度 やSELに依 存す る から であ る。しか しながら、このよ うなトレーサーの細 胞間移動を、三次元的 に構築された組織や器官において細胞レベルで解析することは技術的に難しい。
なぜならば、 まずトレーサーを 組織や器官の内部 にある任意の単一細胞のみに導入することが困難であり 、またたとえ単一 細胞にうまく卜レ ーサーを導入できたとしても、それらの三次元的な細胞 間移動を正確に追跡することもまた困難だからである。このような問題点から、個々 の 細胞 の状態などに 応じてPDを介する 分子の移動がいっ どのように制御され るのかといった知見は あまり得られてい ない。
従って、本 研究において私は モデルコケ植物で あるヒメツリガネゴケの原糸体と呼ばれる組織を用いて 、PDを介する分子 の細胞間移動を細 胞レベルで解析するための新しい実験系を提案した。原 糸体は個々の細胞 が一列に並んだ糸 状組織である。糸状組織では一次元的で単純な細胞間コ ミュニケーション を観察でき、また 個々の細胞が露出しているため任意の単一細胞のみにト レーサーを導入す ることが容易であ る。さらに、コケの原糸体では、PDの微細構造 が 電子 顕微鏡によっ て観察されており 、その構造は種子 植物のPDと類似する ことが示一 1030―

されている 。これらのことか ら、原糸体はPDを介 する分子の細胞間 移動を細胞レベルで解析するうえ で有用な材料であ ると考えられる。加えて、原糸体は頂端細胞の連続的な細胞分裂によって 伸長を続け、頂端 の若い細胞は原糸体の基部に向かって順次分化していく。そのため、原糸 体では細胞の分化 状態の変化も細胞レベルで観察することができ、個々の細胞の状 態 に 応 じ た PDを 介 す る 分 子 の 細 胞 間 移 動 の 制御 に つい ても 調 べる こと が でき る。
さらに私 は、原糸体におい てP
Dを介する分子の 細胞間移動を細胞 レベルで研究するために 、光 変換 型 螢光 タンパク質De
ndra2を構成的 に発現するヒメツリ ガネゴケの形質転 換体を作出した 。Dendra2は元々緑色の螢光 を持つ螢光タンパ ク質であるが、紫外光の照射によっ てそ の螢 光 の色 を緑色から赤色に変 換させることがで きる。このDendra2を構成的 に発現する形質 転換体の原糸体に おいて、私は任意の単一細胞に紫外光を照射し、その細胞に存在 する De
ndra2の み を赤 色に 光 変換 し、 こ の赤 色に 変 換さ れた Dendra2がそ の隣 の 原糸体細胞へ移 動していく様子を タイムラプスイメージングによって捉えることに成功した。私は さら にDendra2の細胞間移 動を定量的に評価 するために、紫外光 を照射した細胞と その周囲の細胞 の螢光強度の経時 変化をそれぞれ定量 し、Dend
ra2の細胞間移動のカイネティク
ス を得 た。 私 はこ のようなDendra2の細胞間移 動に関する定量的な 解析手法を用い、 まず初めに原糸 体においてPDを介 する分子の細胞問移動の方向性にっいて調査した。その結果、
よ り分 化が 進 んだ 原糸体の基部におい てD
endra2は光変換された細 胞から基部方向と いうよりはむし ろ頂端方向へ移動 しやすいことを見出した。また、この頂端方向ヘ向かう分子の細胞問移動 は原糸体の成長を 停止させることで見られなくなることがわかった。これらの結果は、原糸 体ではその成長に 応じて分子を頂端方向ヘ方向性を持って輸送する仕組みが存在することを 示唆している。
次に私は 、原糸体の細胞の 位置に応じてPDを介 する分子の細胞問 移動が制御されているのかどうか 、されているのな らばどのように制御されているのかという問題を調査した。私は 、Dendra2の細 胞 間移 動が 単 純拡 散に よって起こって いると仮定し、Dendra2の細 胞間移 動に 関す る 数学 的モデルを確立し、 これを実際の観察 から得られたDendra2の細胞 間移動のカイネ ティクスとフイッ トさせることによっ て、Dendra2の細胞問移動の速度定数を算出した。こ の速度定数を原糸 体の細胞の位置に応 じて算出し比較した結果、Dendra2の細胞間移動の速度定数が原糸体の頂端から基部に向かって上昇していることがわかった。さら、に私 は、 この Dendra2の細胞間 移動の速度定数が 原糸体の基部に向か って上昇すること の原因 を調 べる た めに 、電子顕微鏡を用い てD
endra2の移動経路である と考えられるPDの 密度と構造を観 察し、原糸体の頂 端と基部でそれらを比較した。その結果、PDの密度は原糸体の頂端と基部 の間で大きく違わ ないのに対し、PDの孔のサイズが頂端より基部で有意に大きいことを見出 した。これらの結 果は、原糸体では細 胞の位置に応じて PDの孔のサイズを変化させること によりPDを介する 分子の細胞問移動を 制御する仕組みが 存在することを示唆している。
本研究で は以上の研究結果 から、原糸体では分 子のサイズや細胞 の位置に応じてPDを介する分子の 細胞間移動を制御 する仕組みが存在し、それが原糸体のような糸状組織における細 胞の 成長 や 分化 にお い て重 要な 役 割を果た している可能性を示 唆することができ た。

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学 位論文審査の要旨
主査准 教授藤田知道
副査教
授山本興朗
副査教
授山口淳 太二学 位 論 文題 名
Study on intercellular movement of molecules throughplasmodesmata atacellular level using protonemata ofPhyscomitre仏pa紬S（ヒメツリガネゴケ原糸体を用いた細胞レベルでの原形質連絡を介する分子の細胞間移動についての研究）
博士学 位論文審査等の結果について（報告）

細 胞間 コミ ュ ニケーションは多細 胞生物における成 長、発生、環境応 答において必須であ ると考え
ら れ て い る 。植 物で は 隣り 合う 細 胞同 士の コ ミュ ニケ ー ショ ンは 、 細胞 壁を 貫 通す る原 形 質連 絡(plasmodesmata， PD)と 呼 ば れ る 構造 体に よ って 直接 的 にな され て いる 。こ の P
Dは 水、 イ オン 、代 謝 産物 、夕 ン バク質や核酸などの 様々な分子の細胞 問輸送に機能して おり、厳密に制御さ れていな
け れ ばな らな い 。
こ れま で、 PDを介 する 分 子の 細胞 間 移動 の拡 散 制御 は、 螢光色素や 螢光タンバク質の細 胞間移動の 観 察を 通し て 評価されてきた。し かしながら、この ようなトレーサー の細胞問移動を、三 次元的に構 築 され た組 織 や器官において細胞 レベルで解析する ことは技術的に難 しい。トレーサーを 組織や器官 の 内部 の任 意 の単一細胞のみに導 入することは困難 であり、またたと え単一細胞にトレー サーをう
ま く 導入 でき た としても、それらの 三次元的な細胞間 移動を正確に追跡 することは容易では ない。この よ うな 問題 点 から 、個 々 の細 胞の 状 態な どに 応 じて 分子 の拡散移動 がP
Dを介していっど のように制 御 され るの か とい った 知 見は ほと ん ど得 られ て いな い。
本 論文 では 、 モデ ルコ ケ 植物 ヒメ ツ リガ ネゴ ケ の原 糸体 に着目し、 PDを介する分子の拡 散による細 胞 間移 動を 細 胞レベルで解析する ための新しい実験 系を提案している 。原糸体は個々の細 胞が一列に 並 んだ 糸状 組 織であり、このよう な糸状組織では一 次元的で単純な細 胞間コミュニケーシ ョンを観察 で き、 また 個 々の細胞が露出して いるため任意の単 一細胞のみに卜レ ーサーを導入するこ とが容易
で あ る。 さら に 原糸体は頂端側の細 胞群が増殖活性が 高く、基部に向か って順次分化してい く。そのた め 、原 糸体 で は細胞の分化状態の 変化も細胞レベル で観察でき、個々 の細胞の分化状態に 応じたPDを 介 する 分子 の 細胞 間移 動 の違 いに つ いて も調 べ るこ とが で きる 。
さ ら に 本 論 文 で は 、 PDを 介 す る 分 子 の 拡 散 移 動 を 研 究す るた め に、 光変 換 型螢 光タ ン バク 質Dendra
2を 構成 的 に発 現す る ヒメ ツリ ガ ネゴ ケ形 質 転換 体を 作 出し 利用 し てい る。 Dendra2は元 々緑 色 の螢 光を 持 つ螢光タンパク質で あるが、紫外光の 照射によりその螢 光色を緑色から赤色 に変換させ る こと がで き る。 この Dendra2形質 転換体の原糸体 において、任意の 単一細胞に紫外光を 照射し、Dendra2を 赤色 に 変換 し、 こ の赤 色に 変 換さ れた Den
dra2が隣 接す る 細胞 へ移 動 して いく 様 子を ラ
イ ブ セル イメ ー ジングによって捉え ることに成功した 。このような実験 系を用いることによ り、原糸体 に おい てDendr
a2は 、光 変換 さ れた 細胞から頂端方 向へ移動しやすい ことを見出した。ま たこの頂端 方 向へ 向か う D
endra
2の 細胞 問 移動 は原糸体の成長 を停止させること で見られなくなるこ とを明らか に した 。こ れ らの結果は、原糸体 ではその成長に応 じて分子を頂端方 向へ方向性を持って 輸送する
仕 組 みが 存在 す るこ とを 示 唆し てい た 。
次 に、 原糸 体 の細胞の位置に応じ て分子の細胞間移 動が制御されてい るのかどうか、また されてい― 1032−

るな らぱど のよう に制 御され ている のかと いう問 題に 挑み、 D
endra2の細胞 間移動を定量解析できる
数理 モデル を考案 し、 それを 用いて D
endra2の拡散 速度定 数が原 糸体 の頂端 から基部に向かって上昇して いるこ とを見 出し た。さ らにこ の原因 を調べ るた め、電 子顕微 鏡を用 いて PDの密度 と構造 を原糸体 の異な る位置 の細 胞間で 比較し たとこ ろ、PDの密度 は原糸 体の頂 端と 基部の 間でほ ぽ一定 であった のに対 し、PDの孔の サイズ が頂端 より 基部で 有意に 大きい ことを 見出 した。 これら の結果 は、
原 糸 体で は 細 胞 の 位置 に 応 じ て P
Dの 孔 の サ イズ を 変 化 さ せ るこ と に よ り P
Dを 介 す る 分子 の細 胞間移 動を制 御する 仕組 みが存 在する ことを 示唆し てい た。
以上 の結果 等に より、 著者は 、原糸 体で は分子 のサイ ズや細 胞の位 置に 応じて P
Dを介す る分 子の細胞 間移動 を制御 する 仕組み が存在 し、そ れが原 糸体 のような糸状組織における細胞の成長や分化におい て重要 な役割 を果 たして いると いう新 しい成 長と 物質輸送のモデルの提唱に成功している。このよう に細胞 間コミ ュニ ケーシ ョンと 細胞の 運命制 御が 被子植物のみならずコケ植物でも共通に重要な役割 を果た してい る可 能性を 見出し 、今後 それら を制 御するメカニズムを陸上植物においていち早く
明ら かにで きる可 能性 を拓き 、また 陸上植 物にお ける このような制御メカニズムの共通性や多様性を
明 ら かに で き る 手 懸り を 与 え る 研 究と し て 、本 論文は 重要な 貢献を 果た したも のと評 価でき る。
よ っ て 著 者 は 、 北 海 道 大 学 博 士 （ 生 命 科 学 ） の 学位 を 授 与 さ れる 資 格 あ る もの と 認 め る 。

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