博 士（ 水産 科学）当瀬 秀和
学 位 論文 題名
Physiological St
udies on the Carbonate Fo
rmationof Otoliths in Teleosts（ 硬骨 魚類耳石の炭酸形成に関する生理学的研究）

学位論文内容 の要旨

耳石 は内 耳膜 迷路 に存 在す る炭 酸カル シウ ムの 生鉱物で、平衡・聴覚器官として 機能 する 。耳 石の りン グは 1日1本 形成 され 、耳石微量元素組成は生理・環境条件に影響を受ける。この日周輪と微量元素組成より水温、塩分濃度、孵化および変態など：魚類の生活履歴情報解析が行われるがこれらは経験則内に過ぎず、耳石形成機構解明が望まれている。耳石形成機構に関する知見は耳石を 用 いた 履歴 解析 の一般 化に 貢献す る可 能性が ある ためで ある 。
耳石 は非 細胞 性組 織で ある 故、 その形 成に は耳 石を内包する内耳小嚢とそれに含まれる内リンパ液が関与すると考えられている。
本研 究で は、 耳石 形成 機構 解明 の一助 とし て、 耳石の炭酸形成とそれに関わる炭酸代謝を、耳石、内耳小嚢および内リンパ液に着目し生理学的に調べた。
L
耳石含有内耳小嚢における加vitro炭酸代謝
14C． 45Caを用 いた耳石含有内耳小嚢器官培養法およびダブルラベルした放射性同 位元 素の 分離法を確立し、加vitroにおける内耳の炭酸代謝と耳石炭酸形成を調べた。
耳石 含有 内耳 小嚢 を培 養しH14C03．取 込か ら算出した耳石への炭酸取込量は1.8 nmol mg‑12h・1であったが、内耳小嚢から分離した耳石のみを培養した場合、約40%に減 少し た。また、この取込は代謝阻害剤であるシアン化イオンによって阻害された。一方、14C̲グルコースおよび14C̲クエン酸由来の炭素は耳石には殆ど取り込まれなかった。
以上 より 、耳 石炭 酸形 成への 内耳 小嚢 にお ける重炭酸の能動輸送の関与が示唆さ れた 。ま た、 本培 養系で は内 耳に おけ る代 謝C02の検 定は 不可 能と 考えられた。
II．内 耳小 嚢に おけ る重炭 酸輸 送
前 項に 於い て示 唆し た内耳 小嚢 にお ける 重炭 酸の能動輸送について、その機― 1448−構 を H14C03・ お よ び 45CaCl2を 用 い た 培 養 系 で 薬 理 学 的 に 調 べ た 。
ま ず 、様 々 な HC03・濃度 の培養液 で耳石含有 内耳小嚢 を培蕃し た結果、 炭酸の 内 リン パ 液 と耳 石 への 取 込 は10 mMまで は 培養液HC03・ 濃度に依 存して増加 し たが 、 25 mM以 上 では ブ ラト ー に 達し た 。こ の と き半 最 大取 込 時 濃度 bと最大取込量Vm
ヨーはそれぞれ内リンパ液で26.
3mM、36.
1nm
olyl"2h‥、耳石で0.6mM、1.6nmolmg‑
1 2h‑1であった。カルシウム取込にはH
C03・濃度の影響は なかった。 培養液Cl'濃 度を変化 させた結 果、炭酸 の内リン パ液および耳石へ の取込はCl'濃 度に従っ て減少し た。また 、内リン パ液およ び耳石への炭酸取込は、炭酸脱水酵素阻害剤、Cl'/
HC03．交換系阻害剤、Cl‑チャンネル阻害剤、
HC03． ‑ArPase阻 害 剤 お よ び Na十 /K゛ ‑ArPase阻 害 剤 に よ っ て 減 少し た 6以上より、内耳小嚢細胞において、重炭酸イオンはHC
03． ‑ArP
ase、Cl'/HC03。
交 換系を介し て内リン パ液へと 輸送されることがわかった。また、小嚢細胞内に お け る 重 炭 酸 恒 常 性 へ の 炭 酸 脱 水 酵 素 の 関 与 が 考 えら れた 。
III．耳石の炭 酸の由来
I項で 行 っ た加 vitro培 養 系に お い て解 明 不可 能 で あっ た 耳 石の 炭 酸源 を 加vivo実験系にお いて調べ た。
H14C03・ を含 む環 境水にお いて24時間 飼育した、 または14C̲グ ルコース を投
与後 24時 間 飼 育し た キン ギ ョ 耳石 の 無 機炭 素の放 射活性か ら上記14C化 合物
由来炭素の 耳石への 取込量を 測定した 。
その結果、 環境水お よびグル コース由来の炭酸取込量は、それぞれ19.51nmo
lmg‑1 d‑1および3.94nmol mg‑l d‑lであった。則ち、耳石の炭酸の約80%が環境
水 由 来 で 約 20u/oは 代 謝 C02由 来 で あ る こ と が わ か っ た 。
IV.耳石炭酸形成の日周性
前項 の 珈vivo実 験系を用 いて、前 項で調べ た各炭酸源 からの無 機炭素取 込の日周変動を調べた。
18時‐翌6時 を暗条件 とし、前項と同様の方法でキンギョを6，1
2，18，24時および 翌 6時か ら6時間飼 育した。 飼育後、 血清および 耳石を採 取し、そ れらの無機およ び有機炭 素放射活 性から耳石への炭酸取込量を測定した。また、血清
総C02濃度も測定した。
各 炭 酸源か らの耳石 への炭酸 取込量お よび代謝活 性の指標 として測 定した血清の無機／有機放射活性比は暗期に減少し、明期に上昇する日周性を示した。
血清総C02濃度は逆位相の日周性を示した。
以上 か ら 、耳 石 の 炭酸 形 成は 日 周 性を 示すが、 血中C02濃度 より代謝 活性に依存することがわかった。
V．内耳における炭酸脱水酵素と耳石の炭酸形成― 1449−

II項に 於いて、 内耳小嚢 細胞にその 存在が示 唆された 炭酸脱水酵素についてその 性状を調 べた。
V‑i.炭酸脱 水酵素タ ンパク質 の性状と 局在
内 耳小 嚢 タ ンパ ク 質を SDS‑PAGEで 分 離後 、 抗炭 酸 脱 水酵 素 抗体 を 用 いたウエ スタ ン ブロ ットを行 った結果、 分子量約 28および60 kDaの 炭酸脱水 酵素様タンパ ク質の存 在がわか った。分子量60 k
Daの炭酸脱水酵素様タンパク質は、内リン パ液およ び耳石有 機基質にも存在した。同抗体を用いた免疫組織化学により、 本タンパ ク質は内 耳小嚢の感覚斑を除（体軸側と体表側に局在する事が明らか となった 。また、 耳石研磨切片に於いても本タンパク質の局在が認められた。 さらに、 赤血球お よび鰓に比ベ低いものの、内耳小嚢および内リンパ液でも炭 酸脱水酵 素活性が 確認され た。
V‑ii.内耳小嚢炭酸脱水酵素cDNAのクローニング
内耳 小嚢にお いて存在が 確認され た炭酸脱 水酵素様 タンパク 質2種の関 係を明らかにするために、酵素活性ドメイン゛であり且つ高保存性部位をプ口ーブとし て炭 酸 脱水 酵 素 遺伝 子 ．を 内耳 小嚢cDNAライ ブラリー からスク リーニン グした。 60 kDaタンパク 質遺伝子はスクリ一二ング出来なかったが、分子量28.
61
お よぴ 28.34 kDaの 炭 酸脱 水 酵素 を コ ード す る cDNAを ク ロ ーニン グした。 両者の 相同性は 790/0であり、双 方とも炭 酸脱水酵 素IIファミ リーに分 類される
こ とが わ かっ た 。 これ ら がコ ード するタン パク質に はシグナ ル配列が 存在せず 、 こ れ ら は 非 分泌 性 タ ンパ ク 質 であ る こと が わ かっ た 。ま た 、 両mRNAの発現量は器官によって異なることがわかった。
以 上 5項 目 の結 果 、本 研 究 では 耳 石炭 酸 形成機 構の一部 を解明し た：耳石の炭 酸 源 は、 環 境水 よ り 体内 に 取り 込 ま れる炭 酸と代謝 C02であり、 耳石形成に 利用され る割合は 約8:2である 。各炭酸源 由来の重 炭酸は重炭酸の能動輸送
I： より小嚢細胞を介して内リンパ液へ輸送され、耳石に取り込まれる。小嚢細胞 では炭酸 脱水酵素 に触媒さ れるC02‑HC03．平衡で重炭酸恒常性は保たれる。
ま た 、 約60kDaの 炭 酸 脱水 酵 素 様タ ン パク 質は内リ ンパ液側 に放出さ れて有機 基 質 とし て 耳石 に 取 り込 ま れ、 内 リ ンパ 液 お よび 耳 石表 面 に 於い ても、C02‐HC03・平衡により炭酸源を確保する、自己触媒 の機能を持つことが考えられた。
し かし、60kDaの タンパク 質に関し ては不明な 点が多（ 、今後さらなる研究が 必要であ る。また 、本研究 で明らかに した2種の 炭酸脱水酵素遺伝子が相同遺 伝子であ るか否か を調べる 必要がある。また、炭酸脱水酵素以外の輸送体についても遺伝子解析その存在を確かめる必要がある。

― 1450ー学位論文審査の要 旨
主 査 教 授 都木靖彰
副 査 教 授 原 彰彦
副査 助教授 清水幹博

学位論文題名PhysiologicalStudiesontheCarbonateFormationofOtolithsinTeleosts（硬骨魚類 耳石の炭 酸形成に 関する生理学的研究）

硬骨 魚類の耳 石は内耳 に存在する 炭酸カル シウムを 主成分と レた硬組 織であり 、その日 周輪およ び微量元素 特性を用 いて魚類 の生活履 歴情報解 析の手段と して生態 学や生物資源科学の分野において広く用いられている。しかし、耳石 そのもの の形成機 構に関して は不明な 点が多く 、これら 履歴情報 解析は経験 的に行わ れている にすぎない 。特に耳 石の炭酸 形成に関 する研究 は少ない。 耳石は無 細胞性組 織であるた め、その 形成には 耳石を内 包する内 リンパ液お よび内リ ンパ液を 満たす内耳 小嚢組織 が重要な 役割を果 たすと考 えられてい る。
本研 究は、耳 石、内リンパ液および内耳小嚢に注目レて、．耳石の炭酸形成機構 を生理学 的、免疫 組織化学的 および分 子生物学 的手法に より調べ たものであ る。得ら れた研究 結果の概要 は次の通 りである 。
1．耳 石含有内 耳小嚢の 器官培養系 の確立に より、内リンパ液への重炭酸輸
送お よび耳石 の炭酸形 成を生理学 的に調べ ることに 成功した 。培養液のHC03ー 濃 度 を 変 え る こ と に よ り 、 耳 石 へ の 炭 酸 沈 着 様 式 はMichaelis‑Mentenの式 に従うこ と、すな わち重炭酸 は担体輸 送により耳石へ と輸送さ れること を示した。 また、同 培養系を 用いた薬 理学的実験によ り、耳石 への重炭酸イオンの輸送には、CI一イオン勾配によって駆動さ れ るCI7HC03父 換系 、 能 動輸 送 系で あ る HC03=AI'Pase、 C02―HC03一緩衝 系を触媒 する炭酸 脱水酵素等 が関与し ているこ とを明ら かにレた。
2．放 射性化合 物H
14C03―を含む環境水における飼育、または14C―グルコ―スを 腹腔内に 投与する ことにより 、これら を由来と する炭素 の耳石への取 り 込み 量 を調 べ た 。そ の結果、HC03‑由 来の炭酸 とグルコ ―ス由来 の炭 酸 は約 4： 1の 割 合で 耳 石に 取 り 込ま れ る こと を 明らか にした。 すなわ ち、 耳石 の炭 酸の 約80%は環 境水 に由 来し 、20u/oは 代謝 由来のC02に起 因す るこ とを 示し た。 また 、一日の各時間帯において飼育実験を行い、 いず れの 起源 由来 の炭 酸沈 着にも日周変動が認められ、夜間沈着量は昼 間の それ に比 べて 半分 以下 に減少することを示した。さらに、血清総 C02濃 度 は 耳 石 の 炭 酸 沈着 と 逆 位 相 の 日 周 変 動 を示 すこ とを明 らかにし た。 すな わち 、耳 石の 炭酸 沈着 の日 周変 動が 、血液 C02濃度よりもむし ろ代 謝活 性を 反映 して いる こと を解 明し た。
3．生 理学的実験により、内耳小嚢にその存在を明らかにした炭酸脱水酵素(CA)の 特 性 を 調 べ た。 抗CA抗体 を用 いた Western blottingにより 、小嚢 に は 28 kDaま た は 60 kDaの CA様 タ ン パ ク 質 が 、耳 石 の 不 溶 性 有 機
基 質 に は 60 kDaの CA様 タン パク 質が 認め られ た。 また 、同 抗体を 用いて免 疫組 織化 学を 行っ た結 果、 小嚢の扁平上皮細胞、移行上皮細胞および 耳 石 の 不 溶 性 有 機基 質に CA夕 ンパ ク質 の局 在が 認め られ た。ま た、内 耳 小 嚢 の 抽 出 夕 ンパ クお よび 内リ ンパ 液の タン パク 質に CA活性 が認めら れた 。
4． 内 耳 小 嚢 cDNAラ イ ブラ り を 用 い て 、 全 長 1.7 kbと 2.4 kbの CA cDNAを ク口 ーニ ング した 。こ れら のオープンリーディングフレームは共に780 bpで 、 分 子 量 28.6 kDaと 28.3 kDaの 2種 類 のCAアイ ソザイ ムII
を コ ー ド す る mRNAが 存 在 す る こ と が 確 認 し た。 また 、こ れら 2種の遺伝 子を 識別 する プラ イマ ーを 作成 して RT‑P CRを 行い 、い くつかの組
織に おい てこ れら 遺伝 子の 発現 を調べた結果、肝臓および皮膚組織におい てこ れら mRNAの発 現が 異な るこ とを 示し た。
以上 の結 果は、魚類耳石の炭酸形成機構とそれに関わる炭酸代謝機構を明らかに し、 さらに耳石の炭酸形成に関連する炭酸脱水酵素の分子生物学的特性を明 らか にしたものである。本研究の成果は、耳石の形成機構の解明に新知見を もた らしたものであり、耳石による履歴情報解析の研究分野に応用・貢献しうるものである。よって審査員一同は申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した。