博士（獣医学）朴鍾任

学 位論 文 題名
Developmental potential of mouseparthenogenetic embryonic stem cells（ マウ ス 単為 発生 胚 幹細 胞の発生能）

学位論文内容の要旨
雌性 ゲノムし か持たな い単為発 生胚は、雌 性および 雄性の両ゲノムを有する受精卵 とは異な る遺伝子 発現パタ ーンを示す 。この単 為発生胚と受精卵を凝集して作成 したキメ ラ胚では 、単為発 生胚由来の 細胞が特 定の組織から選択的に除去される 。同じ単 為発生の 細胞であ る単為発生 胚幹(ES)細胞を受精卵と凝集させて作成したキメラ胚でも、同じような現象が見られるとぃわれてきた。しかし、最近、単為 発生胚の 細胞と単 為発生胚 由来のES細胞 のキメラ 胚内での分化能に差異のあるこ とが示唆 された。 また、単 為発生胚の 細胞と単 為発生胚由来のES細胞を異所移植 した場合 に形成さ れる腫瘍 （奇形腫） 内での分 化能にも違いのあるニとも示
唆さ れている が、一致 した見解 には至って いない。 ES細胞を用いてキメラ胚あるいは キメラ組 織を作成 した場合 、他の細胞 との識別 が可能なマーカーを持つES
細胞は 、キメラ 組織の中 での分布 を容易に追 跡できる 。そこで、本研究では、はじめに大腸菌由来ロ‑gal
acto
sida
seを発現させる遺伝子をマーカーとして持つ単為発生胚 由来ES細胞 株を樹立 し、その ES細胞株の分 化能について受精卵由来のES細胞と比 較検討し た。
第1章 では、単 為発生胚由 来ES細胞株 であるTMA‑48Pにロ‑gala
ctos
idas
eを発現さ せ るた め LacZ遺伝 子 を 導入した。 その結果 、五つの LacZ遺伝子発 現細胞株 が得 ら れた 。 Rバ ンド お よ びQバンド 法を用い ての五つ のLacZ遺伝子 発現細胞 株の核型 分析を行 った結果、 いずれも 第8染色体 がトリソ ミーであ った。さ らに、単為 発 生 胚 由 来 ES細 胞 株 (TMA‑48Pと LacZ遺 伝 子 発 現 ES細 胞 株 の ひ と つ で ある

T48P24)と 受精 卵 由 来ES細 胞株 (NR2)の 体 外で の 胚 様体 の 形成 能 と腎臓皮 膜下で の 奇 形腫 の 形成 能 に つい て 比較 検討 した。そ の結果、 TMA‑48PおよびT48P24
か ら形成さ れた胚様 体の成長と胚葉体内胚葉層の発達は、受精卵由来細胞株に比較 して低下 すること が分かった。また、単為発生胚由来ES細胞株から発生した奇形 腫は、受 精卵由来 ES細胞株から形成された奇形腫に比べて、骨組織や筋繊維など 中胚葉由 来の組織 への分化が 制限され る傾向が 示された。さらに、TMA‑48PとT48P24の 胚様体お よび奇形腫 の形成能 には差異 のなかっ たことか ら、LacZ発現ES細 胞株 (T48P24）に お け る第 8染 色 体の ト リ ソミ ー は、 培 養 下での 単為発生の 性質に影 響のない ことが示さ れた。
第2章 では、単為 発生胚由 来ES細胞の 培養下で の分化能 を検討す るため、単 為発 生胚由来 ES細胞と受精 卵由来ES細 胞を凝集 させてキ メラ胚様体を作出し、キメ
ラ 胚様体に おける単為 発生胚由 来ES細胞の 分布と寄 与率を調べた。キメラ胚様体の 形 態学 的 お よび 組 織 学的 検 索に より、単 為発生由 来ES細胞株 (TMA‑48P）は受精 卵 由来 ES細胞 株 (NR2） と比 較 して、特 に内胚葉 形成期お よびその 後の発育ス
テ ー ジに お い て極 め て 低い 分 化の バターン をとるこ とが示さ れた。また 、LacZ
発 現 単 為 発 生 胚由 来 ES細 胞 株の T48P24と 受 精 卵由 来 ES細 胞 株で あ る TMA‑24によ って作製 されたキメ ラ胚様体 において は、T48P24は内胚葉系に特異的に分布し単 為発生胚 由来ES細胞は 胚外胚葉 での寄与 率が低下 していた。単為発生胚由来ES細 胞がキメ ラ胚様体か ら選択的 に除去さ れた本実 験の所見は、単為発生胚と正常胚 を凝集し て作製した キメラ胚 から単為 発生胚由 来細胞が選択的に除去される所
見 に類似す る。したが って、単 為発生由 来ES細胞は 単為発生細胞特有の性質を維持 している ことが示唆 された。
第 3章では、 単為発生 胚由来ES細 胞および 受精卵由 来ES細胞を細 胞浮遊液 （未分 化の状態 ）にして 皮下に注 入あるい は、両者 のES細胞から発生した胚葉体（分化 した状態 ）を腎臓 皮膜下に 移植して 奇形腫形 成能を比較検討した。組織学的検索 の結果、 皮下に未 分化な状 態で注入 された場 合と胚様体に分化した状態で腎臓
皮 膜下に移 植された 場合では 、単為発 生ES細胞の 奇形腫形成能は異なっていた。
す なわち、 未分化な 状態のES細 胞から形 成された 奇形腫では、単為発生胚由来でも 受精 卵由 来の奇形種と同じように内胚葉、中胚葉および外胚葉に由来する様々な 組織 で構 成されていた。いっぼう、単為発生胚由来ES細胞から発生した胚様体の 移植 によ って形成された奇形腫は、主に神経系組織や角化上皮などの外胚葉由来 の組 織と 腺上皮や繊毛上皮など内胚葉由来の組織により構成され、中胚葉由来の 組織 はほ とんど認められなかった。このことから、胚様体ヘ分化した状態の単為発生胚由来ES細胞は中胚葉由来の組織への分化能の低いことが明らかとなった。
以上 、本 研究 で作 出した マー カー 遺伝 子(LacZ）発現単為発生胚由来ES細胞(T48P24)の分 化能は、元の単為発生胚由来ES細胞の分化能と比べて差異はなく、単為 発生 の有 カな研究材料となることが分かった。また、このT48P24は、胚様体を形 成す る過 程で内胚葉へ特異的に分化するとともに、形成された胚様体内での数が 減少 し、 単為発生細胞の特徴を維持していることが示唆された。さらに、単為発 生胚 由来 ES細胞を異所移植した場合に形成される腫瘍（奇形腫）内での分化能は 、移 植時 点での分化程度の違いによって異なることが分かった。このことから、 従来 報告 されていた奇形腫における単為発生胚の細胞と単為発生胚由来ES細胞の 分化 能の 相違は、細胞を異所移植する時点での両者の分化程度の差異に起因する もの と思 考さ れた 。

学 位 論 文 審 査 の要 旨
主査

教授

金川弘司

副査

教授

高木信夫（地球環境科学研究科）

副査

教授

渡邊智正

副査

助教授

高橋芳幸

学位論文題名Developmental potential of mouseparthenogenetic embryonic stem cells（マウス単為発生胚幹細胞の発生能）
単 為発生の 研究、と くに単為 発生胚細胞 のキメラ 個体内で の分化能を明らかにす るために は、マ一 力一遺伝 子を有する 細胞は有 カな研究 材料とな る。また、研究 材 料 と し て は 、 胚 細 胞 よ り も 胚 幹 細 胞 (ES細 胞 ） の 方 が 実 用 性 は 高 い 。
そ こで、申 請者は既 存の単為 発生ES細胞株 の細胞に 遺伝子を 導入し、ローガラク 卜シダ― ゼを遺伝子マ―カーとして持つ単為発生ES細胞株を樹立するとともに、そ の 分 化能 を 調べ た。 新たに樹 立した単 為発生ES細 胞株の細胞 は第8染色 体のト
リ ソミーで あったが 、その体 外培養にお ける分化 能は遺伝 子導入前 の元のES細胞と 差異の無 いことを 示した。 ついで、樹 立した遺 伝子導入 単為発生 ES細胞と受精
卵 由来ES細胞 を凝集させてキメラ胚様体を作出し、両者の分化能の違いを調べた。
そ の 結 果、 単 為発 生 ES細 胞 は 受精 卵 由来 ES細胞 に比ぺ て内胚葉形 成期以降 の発育 において 極めて低 い分化パ タ―ンを示 すことを 明らかに した。さ らに、樹立単為 発 生 ES細 胞の 皮 下 移植 お よ び単 為 発生 ES細胞 から発 生した胚様 体の腎臓 皮膜下 移植を行 い、単為 発生ES細胞 の奇形腫形 成能を検 討した。 その結果、未分化状態 の 単 為発 生 ES細 胞 の皮 下 移 植に よ って 形 成 された 奇形腫では 、受精卵 由来ES細 胞によっ て形成さ れた奇形 腫と同じよ うに内胚 葉、中胚 葉および 外胚葉に由来
す る種々の 組織が観 察された 。いっぽう 、分化の 進んだ状 態にある 単為発生ES
細胞 の胚様体 から発生 した奇形 腫は、主に 外胚葉お よび内胚 葉由来組 織により構成
さ れ 、 中 胚 葉 由 来組 織 への 分化 能 の低 いこ と を明 らか に した 。
以 上のよう に、申請 者は単為 発生特有の 発生・分 化能を有 するマーカ―遺伝子
導 入単為発 生ES細胞株 を樹立し 、単為発生 胚の代わ りに単為 発生の研究に活用でき ることを 示した。 さらに、 奇形腫にお ける単為 発生ES細胞 の分化能は、奇形腫
形 成開始時 点でのES細 胞の分化 程度の違い によって 異なるこ とを明らかにした。
よ って、審 査員―同 は申請者 が博士（獣 医学）の 学位を受 げる資格 を有するものと 認めた。 ―978ー