博士（獣医学）ユフロシナデラベニアアタノヾイ
学位論文題名Vitrification ofMouse Preantral Follicles UsingaMixtureof
EthyleneGlycol and Ra伍nose（ エ チ レ ン グリ コ ー ルと ラ フ ィノ ー ス を添 加 し た
ガ ラ ス 化 溶 液 に よ る マ ウ ス 前 胞 状 卵 胞 の 低 温 保存 ）学位論文内容の要旨
卵胞培 養技術が 開発され れぱ、 卵巣内に 多数存 在する前 胞状卵 胞に由来 する卵子を用いて多 数の優 良家畜や 希少動物の産子を作出できる。さらに、前胞状卵胞の低温保存法を開発 して卵 胞培養技 術と組み合わせれぱ、前胞状卵胞を有効に活用できるようになる。低温 保存法 の中でも ガラス化保存は簡便で、しかも高い生存率が期待される。しかし、現在 、卵胞 培養が可 能な動物はマウスだけである。そこで本研究では、マウスの前胞状 卵 胞 の低 温 保 存法 を 開 発 する た め 、6Mエ チレ ング リコー ルと0.
3M
ラフ イ丿一 ス
を添加し たガラ ス化溶液 を用い て検討を 行った 。
まずは じめに 、ガラス 化保存に おいて 重要な前 処理と ガラス化 溶液へ の暴露時 間について マウスの 体内成 熟卵子（ 排卵卵 子）を用 いて検 討した。 卵子は前 処理と して2M
エ チレ ン グ リコ ー ル に0、 2ある い は 5分 間 暴 露 、も し く は0.15と 0.3Mラ フ ィノ ー スに それ そ れ 2、 5あ るい は 10分 間 ず つ暴 露 し た 。前 処 理を 加えた卵 子は、 ガラス化 溶液に0.
5、1、2あるいは 5分間 暴露し た後、液 体窒素 中で冷却 ・保存し た。融 解後、それそれ の処理を 施した 卵子の生 存性を 体外受精 後の胚 盤胞への 発生能を もって 比較した。そ の結果、 エチレ ングリコ ールを用いて前処理を行った場合には、ガラス化溶液への暴露 時間を短 縮する ことによ り生存率の向上することが明らかになった。また、ラフィ ノー ス を 用い て 5分間 ず つ前 処理を 行うと、 ガラス 化溶液へ の暴露時 間が0.
5〜2分の範囲 で安定し た高い 生存率の 得られることも判明した。さらに、前処理およぴガラス化溶液 ヘ暴露し た卵子 の体積変 化から、エチレングリコールもしくはラフイ丿ースを用いて適 当な時間 だけ前 処理を加 えるとエチレングリコールの浸透や脱水により、卵細胞質内の エチレン グリコ ールと溶 質の濃度がガラス化に適した状態になり、生存性が向上するこ とが示唆 された 。
‑ 1269−次に、排卵卵子を用いた実験で得られた成績に基づき、前胞状卵胞の前処理およびガラス化溶液への暴露条件を検討した。前胞状卵胞はマウスの卵巣から機械的あるいは酵素処理により採取し、2Mエチレングリコールに2あるいは5分間暴露、もしくは0.15および0.3Mラフイ丿ースに2あるいは5分間ずつ暴露した。前処理後、ガラス化溶液に0.5、1あるいは2分間暴露し、液体窒素中で冷却・保存した。融解後の生存性は、前処理時間およびガラス化溶液への暴露時間に拘わらず、機械的に採取した卵胞の方が酵素処理で採取した卵胞より高かった。また、機械的に採取した卵胞を2Mエチレングリコールで5分間前処理した後、ガラス化溶液にO．5あるいは1分間暴露して冷却した場
合、最も高い生存率（約80％）が得られた。0.3Mラフィノースによる前処理では2分間ずつの暴露の後、ガラス化溶液に1分間暴露した場合、最も高い生存率（約70％）が得られた。そこで、機械的に採取した卵胞をエチレングリコールあるいはラフイ丿ースの最適な条件で前処理を加えてガラス化保存し、融解後に10日間培養して卵胞の発育能と卵胞内卵子の体外成熟能も比較検討した。その結果、エチレングリコールで前処理した卵胞はラフイ丿ースで前処理した卵胞に比べて、発育率（約70％vs.40％）も卵子成熟率（約50％vs.30％）も高かった。融解後の卵胞の形態からラフィノースによる前処理は顆粒層細胞と卵子に過度の脱水を招き、顆粒層細胞同士および卵子と顆粒層細胞の結合が傷害を受けるため、卵胞生存率も卵子成熟率も低下するものと推察された。
最後に、卵巣から機械的に採取し、最適と判断された処理条件（2Mエチレングリコールに5分間暴露したのちガラス化溶液に1分間暴露）でガラス化保存した前胞状卵胞に由来する卵子の発生能を調べた。融解卵胞を10日間培養した後、得られた卵子に体外成熟と体外受精を施し、無処理の前胞状卵胞（ガラス化保存せずに10日間培養）および体内発育卵胞に由来する卵子の発生能と比較した。その結果、ガラス化保存した前胞状卵胞に由来する卵子の胚盤胞への発生率（約30％）は無処理の前胞状卵胞と同等であった。しかし、体内発育卵胞由来の卵子の発生率（約50％）に比べて低い値であり、卵胞培養法を改善する必要のあることが示唆された。また、ガラス化保存した前胞状卵胞に由来する卵子を体外成熟・体外受精させて得られた胚盤胞をレシビェントマウスに移植した結果、産子が得られた。
本研究により、エチレングリコールとラフィノースを添加したガラス化溶液を用いたマウス前胞状卵胞の低温保存法が開発され、ガラス化したマウス前胞状卵胞に由来する産子を世界で初めて得ることに成功した。

− 1270―学位論 文審査の要旨
主査

教授

高橋芳幸

副査
副査

教授
教授

岩永敏彦
渡邉智正（農学研究科）

副査

助教授

片桐成二

学位論文題名VitrificationofMousePreantralFolliclesUsingaMixtureofEthylene Glycoland Raffinose（ エチ レン グリ コー ルと ラフイ ノー スを 添加 した
ガラ ス化 溶液 によ るマ ウス 前胞状 卵胞 の低 温保 存）

前胞状卵胞の培養法と低温保存法が開発されれば、多数の卵胞内卵子を優良家畜や希少動物の産子の作出に有効利用できるようになる。そこで、申請者は体外培養が可能なマウス前胞状卵胞の低温保存法、とくにガラス化保存法を開発するため、毒性の低いエチレングリコール（6M）とガラス転移温度を上昇させるラフイ丿ース（0.
3 M)を添加した溶液を用いて検討を行った。
はじめに、ガラス化溶液の特性を明らかにするため、マウス排卵卵子を用いて前処理とガラス化溶液への暴露時間が生存性に及ぼす影響について検討した。卵子はエチレングリコール（2M）あるいはラフイ丿ース(0.15Mと0.3M）で前処理を加えた後、ガラス化溶液に暴露して液体窒素中で冷却保存した。その結果、前処理により卵子生存率は向上するが、ガラス化溶液への最適暴露時間は前処理法に応じて変化することを明らかにした。
次に、マウス前胞状卵胞について、排卵卵子と同様の前処理とガラス化溶液への暴露時間および前胞状卵胞の採取方法が生存性や発育能に及ほす影響について検討した。その結果、機械的に採取した卵胞は酵素処理で採取した卵胞よりも生存率の高いことと、エチレングリコールで前処理した卵胞の方がラフィノースで前処理した卵胞よりも生存率、発育率および卵胞内卵子の成熟率が高いことを明らかにした。さらに、機械的に採取してガラス化保存した前胞状卵胞に由来する卵子の受精能と発生能を調べた。その結果、ガラス化保存卵胞由来卵子はガラス化保存しなかった無処理の前胞状卵胞由来卵子― 1271―

と同等の受精能を 有し、正常産子ヘ発生することを実証した。
以 上の よう に、 申請 者は マウ ス前 胞 状卵 胞の ガラス化保存法を開発し、ガラス化保存した前胞状卵胞に 由来する産子の作出に世界で初めて成功した。よって、審査員一同は、
申 請 者 が 博 士（ 獣 医 学 ） の 学 位 を受 け る 資 格 を 有 する と 認 め た 。