博 士 （獣 医 学 ） ジ ョ セフ

ム イ ル リカ マ ウ

学位論文題名IVIolecular ep
idemiolog
yof Theilena orienta
ji
sin
fec
t
ioni
n
Australian cattle and development of a molecul
ar method
fo
rd
if
fe
rent
i
at
io
nofT.orient
alisgenotypes（オ ース トラ リア の牛 にお ける Theileria orientalis感染症の分子疫学解析
な ら び に同原 虫の 遺伝 子型 別法 の開 発）

学位 論文内容の要旨
Bovinethei
lerio
sis causedby T. ori
ental
is isprevalentthroughout Japan,Koreaand parts of Russia and China. The distribution of benign Theileria related to T.
orientalis often referred to as T. buffeli appears to be worldwide, but is lessfrequently associated with clinical disease although some fatal cases have beenreported to occur in America. Based on the major piroplasm surface protein (MPSP)
gene, thereare eightgenet
ic types (genotypes)curr
entlycomprisin
g theT. orientaliscomplex. These types include typel (Chitose), type2 (Ikeda), type3 (Buffeli) andtype‑4‑8 yet to be classified with taxonomically. Mixed infection with different
types of T. orientalis in cattle are common in Japan, Korea, and China. Herein, I
report the molecular epidemiology of T. orientalis in Australian cattle anddevelopment of molecular diagnostic method for differentiation of T. orientalis
genotypes.
In recent years,thei
lerio
sis b
een s
uspec
ted of bei
ng responsibleforanum
berofoutbreaks of disease in cattle near the coast of New South Wales, Australia.
Therefore, in thefirst par
t ofmy study,I identifi
ed and characteriz
edthespeciesofTheileria in cattle on six farms in New South Wales where disease outbreaks hadoccurred, and compared this with Theileria from three disease‑free farms in
Queensland that is endemic for Theileria. Special reference was made to sub‑ty
pingof T. orientalis by type‑specific PCR and sequencing of the small subunit (SSU)rRNA gene, and sequence analysis of the gene encoding the major piroplasm surface
protein (MPSP). Nucleotide sequencing of SSU rRNA and MPSP genes revealed thepresence of four Theileria MPSP and SSU rRNA genotypes: Buffeli, Ikeda, Chitoseand MPSP type 4, or SSU rRNA type C. The majority.of animals showed mixed
infections w
hilea fewshow
ed si
ngleinfection.
Notingthatthecurre
nt detecti
on andiden
ti
fi
cat
io
nme
tho
dsf
ortheT.orientalisgenotypes have got limitations as mentioned above, I developed a novel easy tousesensitive and specific diagnostic method for population structure analysis of T.
― 163―

orientalis types specifically Ikeda, Chitose and Buffeli the most frequently
encountered genotypes. By applying ITSl and ITS2 spacers in fragment genotyping,
I utilized primers flanking the two ribosomal RNA internal transcribed spacers(ITSl and ITS2). Due to varying degrees of sequence polymorphism in the ITS
regions found w
ithinandbetwe
en species,Ie
xploi
ted t
he in
serti
ons and ordele
tionsin these regions whi
ch resulted indiffe
rentfragm
ent sizes.On t
he ba
sis of fragment
size polymorphism, it was able to discriminate the thr
ee commonl
y found ty
pes of T.
orientalis. ITSl was capable of discriminating all three types (Ikeda‑251 bp,Chitose‑274 bp and Buffeli‑269 bp) in one single reaction by fragment genotyping.
However, using ITS2, Ikeda (133 bp) a more pathogenic type was distinguishable
from Buffeli/Chitose (139 bp). In addition, parasite load was quantified inexperimental animals using ITSl. When compared with previous PCR detection
method, ITS‑based genotyping was found to be more sensitive methods with highspecificity in population analysis and can be deployed in molecular epidemiology
studie
s.
In c
onclu
sion,thisstud
y pro
videsa new ins
ightintomolecularepidemiologyof
T. orientalis especially in the Oceanian regions, and a new tool of sensitive
diagnosis and pa
rasit
e populati
on analysi
s.

164 ‑

学位 論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
教授

杉 本千 尋片倉 賢
大 橋和 彦鈴 木定 彦

学 位 論 文題 名

IVIolecular epidemiology of Theカ a門 白 D門 を 口 丘 刎 括 infectionin
AuS
trali
an
Catt
leanddeVel
opmentof
amoleCularm
ethodfordi任e
rent
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onof
アD門を口た引括genotype
S（オーストラリアの牛における7協餬を門白甜尭勿ぬ艢感染症の分子疫学解析ならびに同原虫の遺伝子型別法の開発）

T
hei
leri
a orientalisは いわゆる 牛の小 型ピ口プラズマ病の原因となる赤血球内寄生 性原虫 である。本種の中にIkeda，Chitose，Buffeliなど、Smallsubuni
tribosomal R
NA遺 伝子 (SSUrDNA)あ るい は ピ ロプ ラズ ム主要表 面蛋白 質(Maj orPirO
Plasmsu
rfaceprotein；MPSP）遺伝子により型別可能ないくっかの遺伝型が存在することが報告されている。貧血と黄疸を主徴とする本原虫感染症は日本、韓国、中国の一部で発生報告があり、多くの場合、複数の遺伝型の原虫が混合感染してbゝる。類縁原虫は世界的にも報告されているが、多くは非病原性と考えられており家畜衛生の上では重要視はされてこなかった。
オーストラリアではTor
iento
ハぷ感染による重度の臨床症例の報告は従来はなかったが、近年、本原虫によると考えられる重度の貧血例、死亡例がN
ewSouthWales
州で報 告され た。そこ で、こ れらの臨 床症例 の血液DNAを入手 し、MPSPならびに
SSUrDN
Aによる原 虫遺伝子検出ならびに遺伝子型別により問題となった感染症の分子疫学的研究を行った。その結果、これらの検体からIkeda，Chitose，Buffeli型の原虫 が検出 され、これらの混合感染であることが明らかとなった。特にI
keda型
は、日本、韓国など本原虫感染症が問題となっている地域で検出されていたが、それ以外の地域で検出された初めての例であった。
次に、混合感染例での原虫集団の簡易・迅速な遺伝子型別を目的として、InternalT
ranscribedSpacer領域（ITS1及びITS2）を標的とするP
olyme
raseChainReaction(PCR)にフラグメント解析を組み合わせた手法を検討した。すなわち、IT
S
1内、IT
S2内配列に基づき、それぞれ特異的なプライマーを設計し、螢光標識された増幅産物のサイズをキャピラリー電気泳動で測定する方法である。PCR
産物のサイズはIT
S―1ではIkeda型‑251bp，Chitose型‑ 274bp，Buffeli
型＝269bp、IT
S−2ではIkeda型＝133bp，Buffeli型，Chitose型＝139bpとなる。その結果、フラグメントサイズによる遺伝子型別が可能で、かっピークサイズを測定することにより、各型の原虫の相対量の解析が可能であった。この方法を用いてI
keda，C
hitose型原虫を実験感染さ― 165―

せ た 牛 の 血 液 DNAを 試 料 と し て 原 虫 集 団 を 解 析 し た 結 果 、 牛 体 内 で の 両 型 の 動 態 を解 析 す るこ と が 可 能で あ っ た 。ま た 野 外 試料 の 解 析 でも 原 虫 型 別が 可 能 で あっ た。
本 研究 は 、 こ れま で 発 生 報告 の な か った オ ー ス トラ リ ア で 牛小 型 ピ ロ プラ ズ マ病の 発 生 を 初 め て 確 認 し た も の で あ り 、 ま た ITS領 域 を 標 的 に し た PCRノ フ ラ グ メ ン ト解 析 に よ ル ァ ． orientalisの 高 感 度 検 出 と 簡 易 か つ 迅 速 な 遺 伝 子 型 別 法 を 開 発 し た
点 で 、 本 原 虫 感 染 症 の 分 子 疫 学 的 研 究 の 進 展 に 寄 与 する も の と 考え る 。 よ って 、審 査 委 員 一 同 は 、 上 記 博 士 論 文 提 出 者 Joseph Muiruri KAMAU君 の 博 士 論 文 は 、 北海 道 大 学 大 学 院 獣 医 学 研 究 科 規 程 第 6条 の 規 定 に よ る 本 研 究 科 の 行 う 博 士 論 文の 審 査 等に 合 格 と 認め た 。

― 166―