博士（獣医学）池田幸司
学位論文題名
Porc
inesomaticcell nucl
eartransfer●
uslngf011iCularOOCyteSderiVedf・ romprepubertalgilt（性成熟前の豚の卵胞から採取した卵子を用いた体細胞核移植）

学位論文内容の要旨
豚 の体細 胞核移植 は、人へ の臓器 移植用豚 の作出 法として 注目さ れているが、豚核移植 胚の発生 率は極 めて低い 。通常 、豚の核 移植に は食肉用 に処理さ れた性成熟前の豚の卵 胞から採 取した 卵子が細 胞質体 として使 用され ている。 性成熟前 の家畜の卵子は性成熟 した家畜 の卵子 に比ぺて 発生能 が低く、 性成熟 前の豚由 来卵子の 使用が核移植胚の発生 率の低い 原因の ひとっと 考えら れる。し かし、 豚の体細 胞核移植 技術の実用化には性成 熟前の豚 由来卵 子の利用 が必須 である。 そこで 、本研究 では豚の 体細胞核移植技術の開 発を目指 して、 性成熟前 の豚の 卵胞内卵 子の核 と細胞質 の成熟能 および発生能について 検討した 。
第一章 では、 初めに性 成熟前の 豚の卵 胞から採 取した 未成熟卵 子の核成熟に要する時間を検 討した。 その結 果、ほと んどの 卵子は32時 間の成 熟培養で 第二減数分裂中期（ni期）に 到達した 。次い で、32
丶‑48時間 培養した卵子を活性化処理すると、単為活性化胚の 胚盤 胞 へ の発 生 率 は42時 間培 養 し た卵子 が最も高 かった 。さらに 、成熟培 養33時間
目 （MIi期到 達直後） および 44時間目に 除核し た卵子と 血清飢 餓培養し た豚胎 子線維芽細 胞を 融 合さ せた。作 出した 核移植胚 は、そ れぞれ成 熟培養 39‑‑40時間 目（成 熟完了前後） および50〜51時間目 に活性 化処理し て発生能 を比較 した。そ の結果、rvni期到達
直 後に 除 核 して 成 熟 完了 時 に 活性 化 させ た核移植 胚の方が 胚盤胞 への発生 率が高 かった 。以 上 の結 果から、 性成熟 前の豚の 卵胞内 卵子は体 外で完 全に成熟 するため にMI
I期
到 達後 も 約 10時 間 の成 熟 培 養が 必 要 であり 、核移植 の細胞 質体とし て使用す る場合 はMI
I期 到 達時 に除核し て成熟 完了時に 活性化 処理する と核移 植胚の発 生率の高 いこと が示され た。
第 二章では 、性成 熟前の豚 と経産豚 の卵胞 から採取 した未 成熟卵子の核成熟能、単為発 生能およ び核移植 胚の発 生能につ いて比 較した。 その結 果、両者 の卵子の減数分裂にお ける核成 熟動態、 p34
cdc2
キ ナーゼ 活性および単為活性化刺激に対する反応に差異は認め られなか った。し かし、 性成熟前 の豚の 卵子に由 来する 単為活性 化胚と血清飢餓培養
一 1292―

した卵丘細胞を融合させて作出した 核移植胚の胚盤胞への発生率は、経産豚の卵子に由来す るも のに 比 ぺて 低か った 。ま た、 性成 熟前 の豚 の卵胞内卵子は経産豚の卵子に比べて卵 細胞 質の 直 径が 小さ く、 卵子 の成 熟培 養中 に卵 細胞質の直径は大きくなった。したがっ て、 性成 熟 前の 豚の 卵胞 から 採取 した 卵子 は多 くが発育途上にあり、核成熟能は経産豚 の卵 子と 同 等で あっ ても 細胞 質が 未成 熟な ため 、核移植の細胞質体として用いた場
合に 核移 植胚 の 発生 率が 低く なる こと が示 唆さ れた 。
第 三章 では 、性 成 熟前 の豚 の卵 胞か ら採 取し た卵 子の 細胞 質の 発育 と成 熟 を促 すた
め 、cdc2キ ナー ゼの 特異 的な 阻害 剤で ある but
yrolacto
neI (BL―I）存在下での卵子の発 育培 養を 試み た。 初め に、 卵子 を様 々な 濃 度の B
L− Iを 含む 培養液中で28 ‑72時間培養 し た結 果、 100 VM BL―I存 在下 で28時間 培養 する とほ とん どの 卵子 は卵 核 胞期 に停止 して いた が、 48
時 間以 上培 養す ると約 半数の卵子が減数分裂を再開した。また、BL―I処 理 卵子 を20時間 成熟 培養 する と、 無処 理卵 子 と同 様に M
II期に 到達 した 。 さら に、BLー I処理 (28時間 ） 後20時間 成熟 培養 した 卵子 と無 処理 の卵 子を 除核 し、 そ れぞ れ血清 飢餓 培養 した 卵丘 細胞 と融 合さ せ核移 植胚を作出した。BL‑
I処理卵子に由来する核移植 胚の 胚盤 胞へ の発 生率 は、 無処 理卵子 由来の核移植胚と同等であった。これらの結果
か ら、 性成 熟前 の豚 の卵 子の 減数 分裂は B
L―I
処理により可逆的に抑 制でき、BL−I
処理
卵 子 は発 生能 を損 な うこ とな く核 移植 の細 胞質 体と して 利用 でき るこ とが 分 かっ た。
本 研究 の結 果、 性 成熟前の豚の卵 胞から採取した卵子は核成熟後約10時間で細胞質も成熟 して 発生 能を 獲 得するため、こ の時点で核移植に使用すると核移植胚の発生率が改善さ れる こと が分 か った。また、性 成熟前の豚由来卵子を用いて作出した体細胞核移植胚は 経産 豚卵 子に 由 来する核移植胚 に比ベ発生能が低く、その原因は性成熟前の豚の卵子が発育途上で未熟な細胞質にあることが分かった。さらに、BL―I．を用いた発育途上にある卵胞内卵子の体外発育培養法開発 の可能性が示唆された。

‑ 1293―

学位論 文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

高橋芳幸
小沼 操
伊藤茂男
片桐成二

学 位論 文題 名
Porcine somatic cell nuclear transfer●
uslngf011iCularOOCyteSderiVedf・ romprepubertalgilt（ 性 成 熟 前 の 豚 の 卵 胞 か ら 採 取 し た 卵 子 を 用 い た 体 細胞 核 移 植 ）豚の 体細 胞核移植技術の実用化には食肉用に処理された性成熟前の豚の卵 胞か ら採 取した未成熟卵子の利用が必須である。申請者は、性成熟前の豚 の卵子 を用 いた核 移植 技術の 開発 を目指 して研究を行った。
はじ めに 、性 成熟前の豚から採取した未成熟卵子の体外培養における核成 熟に 要す る時 間を調ぺるとともに、成熟培養時間の異なる卵子を用いて作出した核移植胚の発生能を検討した。その結果、性成熟前の豚の卵子は、核 成熟 の約 10時 間後 に発 生能 が最 も高 くな り、核 移植 の細 胞質 体と して使 用す る場 合も この時期に活性化処理を施すと核移植胚の発生率が高くなる こと を見 いだ した。ついで、性成熟前の豚と経産豚の未成熟卵子の成熟能 、単 為発 生能 および核移植胚の発生能について比較した。その結果、両者 の卵 子の 核成 熟動態 、p34cdc2キ ナー ゼ活 性および単為活性化刺激に対す る反 応に 差異 は認められぬかった。しかし、性成熟前の豚の卵子に由来
す る単 為発 生胚 と核移植胚の発生率は経産豚の卵子に由来するものに比べて 低く 、そ の原 因が性成熟前の豚の卵子の未成熟な卵細胞質にあることを
明 らか にし た。 そこで、性成熟前の豚の卵細胞質の発育・成熟を促す方法
を 開発 する ため 、p34cdc2キナーゼの特異的な阻害剤であるbutyrolactoneI(BL‑I)存在 下 で の 卵 子 の 発 育 培 養を 試み た。そ の結 果、 性成 熟前 の豚の 卵子 の減 数分 裂は BL‑I処理 で可 逆的 に抑 制でき 、処 理卵 子を 核移 植の細 胞質 体と して 利用しても核移植胚の発生に悪影響のないことを示した。
以 上の ように、申請者は性成熟前の豚の卵胞内卵子の核および細胞質の成熟 と発 生能の特徴を明らかにして核移植胚の発生率を向上させるとともに、 減数 分裂を一時抑制して卵子の成熟を促す培養法の可能を示し、豚の核移 植技 術の実用化に必要な貴重な知見を提供した。よって、審査員一同は 申 請 者 が 博 士 （ 獣 医 学 ） の 学 位 を 受 け る 資 格 を 有 す ると 認 め た 。