博士（医学）畠山博充
学 位論文 題名Prot
ein clusters associate
dw
it
h ca
rci
noge
nesis，
histological differentiationand
nodalmetaStaSlSlneSOphagealCanCer（ 食 道 がん の が ん 化、 組 織 学 的分 化 度 お よび
り ン パ 節転 移 に 関 する タ ン パ ク質 群 の 同 定）
学 位 論 文 内 容 の要 旨

【背景】食道扁平上皮がんは内視鏡の普及による診断技術の発達および放射線化学療法や再建を含めた外科技術の進化にも関わらず、消化管がんの中で最も予後が悪い。そのためより臨床に即した腫瘍マーカーや革新的な治療のターゲットが求められている。それには食道がんのがん化や浸潤、転移のメカニズムにおける分子生物学的背景のより一層の解明が必要である。本研究では従来に無い多数の食道がんの臨床検体から扁平上皮がん組織、正常扁平上皮組織のみを用いて、 プロテオーム解析技術によりそのタンパク質の変動を網羅的・定量的に調べた。こうして得られた多量のデータをバイオインフオマティクスアプ
ローチによって解析し、食道がんのがん化や分化度、リンパ節転移に関連したタンパク質群を解明した。
【症 例と方法】他がんを含む術前治療を受けておらず、術後5年間の経過追跡が可能であった 72症例の初 回手術 摘出標本 を対象とした。72症例すべてのがん組織および対となる57症例の正常重層扁平上皮組織をレーザーマイクロダイセクション法により採取し、タンパク質を抽出した。新たに分子量方向に拡大し、40cmX20cmと大型化したゲルを用いて、
螢光二次元電気泳動法によるタンパク質分離を行った。すべての標本から得られたタンパク質 を混ぜた ものを内 部標準 としてCy3
螢光色素で標識し、それぞれのサンプルをCy5の螢光 色素で標識した。内部標準はゲル一枚あたルタンパク質として5ugを、それぞれのサンプルはゲル一枚当たりlrrrrri2の組織切片を使用した。全てのサンプルにっき電気泳動は2回行っている。泳動後、それぞれの螢光色素に合わせた波長でゲルの画像を取り込んだ。
組織型や分化度およびりンパ節転移等の臨床情報に関連して統計学上有意に発現および翻訳後修飾が変化する二次元電気泳動のゲル上のスポット群を層別化した。質量分析を用いて、絞り込まれたスポットのタンパク質の同定を行った。各群に代表的なタンパク質につい て は 、 そ の 発 現 を ウ エ ス タ ンブ ロ ッ ティ ン グ法 に よっ て 確認 し た。
【結 果】2枚のゲル 上でと もに発現 解析が可能な1672スポット中98％でその発現比が2倍
以 内に 含 ま れ 、そ の 相 関係 数 も 0． 9406と 高く こ の 実験 系の再 現性が確 認され た。
80％のサンプルで発現の確認された1730スポットによる教師なし階層的クラスター分類―371―

では正 常組織 、がん組織の2群に完全に分類され、またがんは分化度に応じた分類がされた。分 化度と 組織型に 応じて 有意に(p<0.01)2倍以上変化するスポットが498スポット認めた。 自己組 織化写像法により先の498スポットを2群（A，B）に分類した。A群は正常に比べがん組織に強く発現を示すスポットが選ばれ、その数は221スポットであった。B群は正常に 比べが ん組織で発現が低下するスポット群であり、277スポットが含まれた。A、Bそれぞ れをさ らに自己 組織化 写像法を 用い分類した。A群からはC、D群にB群からはE、F群に分類された。C群には高分化と正常で発現差があるものの、分化度が低下するに従い正常との 差が少 なくなる72スポットが分類された。D群には分化度問で差が少なく、わずかに低分化になるに従い増加する149スポットが分類された。E群にはがん組織で分化度に関わらず低下する167スポットが、F群には正常と高分化ではあまり変わらないものの低分化になる に従い 減少する 110ス ポットが 分類された。これらの498スポットは全て質量分析により計217種類のタンパク質を同定した。
リンパ節転移数は食道がんの予後に最も関与する因子である。今回の72症例においてもりンパ節転移数と5年生存率との関連を認め、特に転移数が5個以上で有意(p<0.01）であった。リンパ節転移の無い17例と転移数5個以上の15例との比較で有意差（p＜0．01）のある41スポットを同定した。転移数の異なる他検体を加え、41スポットによる白己組織化写像法による解析を行い、転移数に応じた段階的な変化を認めた。転移に関連した41スポットから、33種類のタンパク質を同定した。またウエスタンブロッティング法による発現変化が二次元電気泳動上のものと同様であることを確認した。またりンパ節転移数にっれて増加す るタン パク質として同定されたHe
atshockprotein60についてもウエスタンブロッ ティ ング 法 にて 転 移数 に 応じ た段 階的な発現の 変化を確認し た。
A群、B群に含まれるタンパク質をその機能によって分類した。両群とももっとも多いのは細胞骨格に関わるタンパク質であったが、それ以降では各群で機能的な分類での差異の大きいタンパク質の数は大きく異なっていた。
【考察】タンパク質回収にレーザーマイクロダイセクション法を用いることで組織ごとの構成するタンパク質の特徴をより鮮明にすることが出来た。またプロテオーム解析の改良によって網羅性を高め、より多種のタンパク質を定量的に解析することを可能にした。得られた膨大なデータはバイオインフオマティクスアプローチにより系統的に分類した。最新の質 量分析 技術により正常食道粘膜、分化度の異なる癌組織それぞれに特徴的な217種
類以上のタンパク質を明らかにし、更には食道癌の予後に最もかかわるりンパ節転移に関連する33種類のタンパク質を同定することができた。この同定したタンパク質群にはこれまでも癌化や増殖に関連すると報告されてきた分子の他、CYFRAやSCC抗原等の実際に臨床応用されているタンパク質も含まれていた。従来報告の無かった新たな分子も多数同定され、これまでに報告のない遺伝子配列からの想定上のタンパク質の関連も明らかになった。
今後の臨床応用に当たって、これらのタンパク質は腫瘍マーカーとして期待されるだけではない。タンパク質の相互作用の解明が進み、各分子の機能が明確化されていくことで新たな分 子標的 治療のターゲットとなる可能性を持っている。豊富な臨床情報をもつ129ものサンプルによるプロテオーム解析技術から得られたこの研究結果は、がん化や転移機構の解明への礎となるだけでなく、診断・治療におけるブレイクスルーとなることが期待される。
‑372―

学位論文 審査の要旨
主 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 福 田
諭
副 査 教 授 近 藤哲

学位論文題名Proteincl
uste
rsass
ociat
edw
it
hc
arci
nogen
esis，
histological differentiation andnodal metastaslSlneSOphagealCanCer（食道がんのがん化、組織学的分化度およびりンパ節転移に関するタンパク質群の同定）

食道 扁平上皮 癌は消 化管癌の 中で最 も予後が 悪いた め、臨床 に即した 腫瘍マーカーや革新的な 治療のタ ーゲッ トが求め られて いる。そ れには食 道癌の 癌化や浸 潤、転 移のメカニズムにお ける分子 生物学 的背景の よる一 層の解明 が必要と なる。 本研究で は従来 にない多数の食道癌 の臨床検 体から 、プロテ オーム 解析技術 によりそ のタン パク質の 変動を 網羅的・定量的に調 べられて いる。 得られた 多量の データは バイオイ ンフオ マティク スアプ ローチによって解 析 され 、 食 道癌 の 癌 化や 分 化 度、 リ ンパ 節転移 に関連し たタン パク質群 が同定 された。
食道 癌 72症 例 の 初回 手 術 摘出 標 本 を対 象と され、す べての 癌組織お よび対と なる57
症例の正 常重層扁 平上皮 組織がレ ーザー マイクロ ダイセク ション 法により 採取さ れ、そこに含まれ る タン パ ク 質が 抽 出 され た 。 新た に 分子 量方向 に拡大し た大型 化したゲ ル(40cmX20cm)を用 いて、螢 光二次 元電気泳 動法に よるタン パク質分 離を行 った。す べての 標本から得られた タ ンパ ク 質 を混ぜた ものを 内部標準 として C
y3
蛍光 色素で標 識し、 それぞれ のサン プルをCy5の 螢 光 色素 で標識 した。 泳動後、 それぞ れの螢光 色素に合 わせた 波長でゲ ルの画 像を取り込 んだ。組 織型や 分化度お よびり ンパ節転 移等の臨 床情報 に関連し て統計 学上有意に発現
およ び翻訳後 修飾が 変化する 二次元 電気泳動 のゲル上 のスポ ット群を 屈別化 した。その後、
質量 分析を用 いて、 絞り込ま れたス ポットの タンパク 質の同 定を行っ た。各 群に代表的なタン パク 質 に つい て は 、そ の 発現 を ウエス タンブロ ッティング 法によっ て確認し た。
全ス ポ ッ トに よる階層 的クラ スター分 類では 正常組織 と癌組 織の2群に完全 に分類 され、また 癌は分化 度に応 じた分類 がなさ れた。そ こにおい て、分 化度と組 織型に 応じて有意に変化 す る 498ス ポ ッ ト を 認 め ら れ た 。 自 己 組 織 化 写 像 法 に よ り 先 の 498ス ポ ッ ト を 4群（C，D，E，F）に分類した。C群には高分化と正常で発現差があるものの、分化度が低下するに− 373−

従い正常との差が少なくなる72スポットが分類された。D群には分化度間で差が少なく、わずかに低分化になるに従い増加する149スポットが分類された。E群には癌組織で分化度に関わらず低下する167スポットが、F群には正常と高分化ではあまり変わらないものの低分化になるに従い減少する110スポットが分類された。これらの全498スポットから質量分析により計217種類のタンパク質を同定した。
リンパ節転移数は食道癌の予後に最も関与する因子である。今回の72症例においてもりン
パ節転移数と5年生存率との有意な関連を認めた。リンパ節転移のない17例と転移数5個以上の15例との比較で有意差(p<0.01）のある41スポットを同定した。転移数の異なる他検体を加え、41スポットによる自己組織化写像法による解析を行い、転移数に応じた段階的な変化が確認された。そして転移に関連した41スポットから、33種類のタンパク質を同定された。またウエスタンブロッティング法による発現変化が二次元電気泳動の結果と同様であることが確認された。
以上の結果より、癌化や分化に関わるタンパク質群を明らかになり、さらには食道癌の予後に最も影響するりンパ節転移と相関関係を有するタンパク質群が同定された。また、従来報告のない遺伝子配列から想定されるタンパク質との関連も明らかになった。多くの臨床情報を有する129サンプルによるプロテオーム解析技術から得られたこの研究結果は、癌化や転移機構の解明への礎となるだけでなく、診断・治療におけるブレイクスルーとなることが期待される。
以上の発表後、副査の近藤教授からトランスクリプトームと比較したプロテオーム解析の利点と欠点、マイクロダイセクションの実際の手技、今後の臨床応用への発展について質問があった。続いて副査の福田教授から本研究結果の頭頚部癌分野への応用にっいて質問があった。また、主査の畠山教授からはタンパク抽出における標本作製の工夫点、2次元電気泳動法の問題点、iTRAQ法、ICAT法との比較についての質問があった。申請者は、これらの質問に対し、自己の研究結果と文献的知識に基づき、タンパク質サンプル回収におけるマイクロダイセクションの実際と染色法の工夫、プロテオーム解析の特にタンパク質分離技術における各方法の再現性と定量性、頭頸部分野では食道癌と臨床的類似性のある下咽頭癌への応用の可能性、放射線化学療法への臨床応用の可能性を回答した。
この論文は、従来になぃ大規模なプロテオーム解析により、食道癌の分化や癌化、さらにはりンパ節転移、予後に関連するタンパク質群を明らかにし、腫瘍マーカーや分子標的治療等の臨床応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ 申 請者 が博 士（ 医学 ）の 学位 を受 ける のに 十分 な資 格を有 する もの と判 定し た。

‑ 374−