博士（医学 ）後藤真゛希
学位 論文題名
栄養障害型表皮水疱症のW型コラーゲン遺伝子(COL 7Aヱ）変異検索
学位論文内容の要旨
背 景： 表皮 水 疱症 は、 軽微 な外 的機 械刺 激に より 、皮 膚に 容易 に水 疱 やぴ らん 、潰 瘍を形成する
疾 患の 総称である。本症は、水疱形成部位により単 純型、接合部型、栄養障害型の大きく3つに分類されて いる。単純型は表皮内に水疱を形成し、接合部型では表皮真皮接合部に位置するlaminalucidaに水疱 を形成し、栄養障害型では真皮最上部のlamina densa
直 下に水疱を形成する。さらに、近年の
皮 膚分 子生 物 学の 進歩 によ り、 単純型はケラチン5，ケラチン14，プレクチ：/遺伝子の異常により発 症、 接合 部 型は ラミ ニン 5， a6
ロ 4イン テグ リン ，XVII型 コラ ―ゲ ン の遺 伝子 の異 常、栄養障害型はVII型コラ―ゲニ／遺伝子の異 常により発症することが明らかになった。VI
I型コラーゲン遺伝子がコ― ドしているV
I｜型コラーゲンは、表皮と真皮の境界部に あたる基底膜を構築させる構造蛋白である。 そのため、栄養障害型では、VI
I型コラーゲニ′遺伝子の異常により、VII型コラ―ゲンから成る
anchor ing fibri Isの形成不全を伴い、生後まもなくから真皮内に水疱を生じる。栄養障害型は、遺伝 形 式 に よ り 優 性 型 、 劣 性 型 に 分 類 さ れ て お り、 劣性 型は さら に比 較的 臨床 症状 が 軽症 であ る
non‑HallopeauーSiemens（nHS）型と臨床症状が重篤化するH
aI10peau
一Sie肥nsくHS）型に分類されている。
現 在、 本症 の有 効な 治療 法は 見っ かっ てお らず、 新し い治 療法の開発が期待されている。
目的 ：本研究の目的は、栄養障害型表皮水疱症患者のVII型コラ―ゲニ′遺伝子（a葱例カの変異検索を行い、日本人及葱挧′変異の詳細を明らかにすることである。
方法 ：2000年か ら200
6年 に北 海道大学癇皖に紹介または受診された全く血縁 関係の無い日本人の栄 養 障 害 型 表 皮 水 疱 症 28家 系 に つ い て 、 臨 床 症 状 や 家 族 歴 に つ い て 詳 し く 聴 取 し た 。
次に 、患者の皮膚生検を行い、電子顕微鏡学的所見を検討するため、ブロック作製、超薄切片作製、電子染 色を行い、透過型電子顕微鏡にて観察した。また、各種 基底膜抗原発現の有無をスクリ―二ングする ため、患者皮膚の凍結ブロックを作製し、基底膜抗原に 対する抗体を用い、免疫染色を施行した。
a葱挧′変異検索を行うため、エクソンーイントロン境界部を含めたエクソンと及葱例′のプロモータ
一 部位 をPCRによ り増 幅し た。 増幅 した PCR
産 物を BigDyeTer
minatorSyst帥ひ抑｜iedB
iosystems，FOsterCity， （ 瑚 を 用 い 、 自 動 核 酸 シ ― ク エ ン ス 装 置 に て 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。
結果 ：栄 養 障害 型患 者の 電子 顕微 鏡学 的所 見は 、真 皮最 上部のlaminadensa直下に水疱形成を確認し た。 さら に 、免疫組織化学的に基底膜蛋白の発現を解析したところ 、優性型ではVII型コラーゲンの 発現 が認 め られ たが 、nHS型 では VI
I型 コラ ―ゲ ンの 減弱 、HS型で は全くVII型コラーゲンの発現を 認め なか っ た。また、VII型コラーゲン 以外の基底膜蛋白の発現の減弱および欠損は認められなかった。
次 に、 C 7A1の変 異検 索を 行っ たと ころ 、 5
6 allele
中 、45 al leleに餓7A1の変異を同定し、栄養障害型と診断された患者の80%に変異を同定した。栄養障害型 の内訳は、優性型が6例（21％）、nHS型が14例（5（恥、HS型が8例（29％ ）であった。今回同定したロ兜7A
1の変異は、優性型では6変異中、4変異 （67％） が新 規変 異で あっ た。 新規 変 異は G
1776
Vく 5327G>D、G2003
E (6008G>lD、G2064E，8069de｜17insGAであった。劣性型では28変異中、19変異（68％ ）が新規変異であった。新規変異の内
訳は、G
1595R
く4783G>A)，G
1667E(5000G>A)，G
1815R(5443G>A)，R
1957Q
く5870G>A)，G
2304R(6910G>)
D，
G2623S (7867G>A)， G2633
S (7096G>D，G2677
S (8029G>A)，C2876F (8627G>T)，R137X (409C>T)
，
Q
641X(
1921C>D，R1683X
く5047C>T)，R2261X(6781C>
D，・02827X
く8479C冫T），434insGCAT，1474de
18，5604
十2G冫C，81（）9十2T冫A，8358十1pTであった。今回の及葱刀′変異検索において、片方のaIleIeのみにしか変異を同定出来なかった3家系といずれのalIeleにも変異 を同定出来なかった1家系があった。
結 論： 近年 、 栄盞 緯害 型の 遺伝 子型 と表 現型の関連について多数の報告があるが、劣性型の患者のほ とん どは 臨 床症 状が 重篤 化し てい る。 特にHS型では、餓瀏／の両aIleleに早期終止コドン変異を有 する ため 、 完全 なVIl型 コラ ーゲ ン欠 損 をき たす 。そ のた めVII型 コ ラ― ゲン から 形成 される
anchoringf
ibrHsの 形成 不全 に至 り、 臨床 症状が重症化する。さらに、 nHs型は、免疫組織化学的所見に より 基底 膜 にVlI型 コラ ーゲ ンの 沈着 を認めるため、臨床症状が重 症化しない。nHS型は、早期終止コドン変異同士の細み合わせを 除く、早期終止コドン、アミノ酸置換変異、スプライスサイト変
異 の 組 み 合 わ せ を 両 aIIeleに 有 す る こ と に よ り 、 VIl型 コ ラ ー ゲ ン の 減 弱 と な る 。
本研究において、日本人に多く認 められる変異として報告されている変異の出現頻度は、28家系中、5818delCの変異は7家系（25ゆ、6573
十1G〉Cは3家系（11％）、 E
2857X
は2家系（7ゆで同定された。さらに 、0282
7Xは 2家 系（ 7ゆで 認め られ 、日 本人のa
葱例′変異に多く認 められる変異の1つであることが示唆された。さらに、34種類の 政葱例′の病的変異は、新規変異が23種類同定されたことから、日本人の比む弭′の変異は、家族特異性の変異であることが示唆される。
今回a葱挧′変異検索において、片方のaI
leIeのみにしか変異 を同定出来なかった3家系（11％）と変異を同定出来なかった1家系（4％）があった。しかしながら、過去の報告でも、49家系中片方のalIeleにしか変異を同定出来なかった家系 が13家系（27ゆがある。このことから、病気を引き起こす変異は、儷例′以外の音陞に存在する可肓離カ沫唆される。
日本人の栄養障害型表皮水疱症患 者の〔班挧′変異検索を行った結果、海外の変異報告とおおむね同様の結果であったが、日本人特有の変異も同定し得た。

− 347 ‑学位論文審査の要旨
主 査 教 授 清 水宏
副 査 教 授 守 内也
副 査 教 授 有 賀 哲 正

学 位 論 文 題 名

栄養障害型表皮水疱症のV
J
I型コラーゲン遺伝子(COL7Aヱ）変異検索
表 皮水 疱 症は ，軽 微な 外的 機械 刺激 によ り，皮膚に容易に水疱やびらん，潰瘍を 形成する疾患の 総称である．本症は，水疱形成部位により単純型，接合部型，栄養障害型の大きく3っに分類さ れている．近年の皮膚科学領域における分子生物学の進 歩により，栄養障害型はMI型コラーゲン遺伝子の異常により発症することが明らかになった． v
n型コラーゲン遺伝子がコードしているVII型コラーゲンは表皮と真皮 の境界部にあたる基底膜を構築させる構造蛋白である，栄養障害型 は，遺伝形式により優陸型，劣陸型に分類されており，劣陸型はさらに比較的臨床症状が軽症で あるnonHallopeau‑Siemens(nHS)型と臨床症状が重篤化するHa
llopeau
一SiemensくHS)型に分類されている．
本研 究 の目 的は ，栄 養障 害型 表皮 水疱 症患 者の VI
I型 コラ ーゲ ン遺伝子(COL
鯛 のの変異検索を行い，日本人CO
L7A1変異の詳細を明らかにすることである．
初め に ，栄 養障 害型 表皮 水疱 症28家系 にっいて，患者の皮膚生検を行い，電子 顕微鏡学的検索 と各種基底膜抗原に対する抗体を用い，免疫染色を施行した．次に，PCR法により，CO
L7A1変異検索を行った．
栄養 障 害型 患者 の電 孑顕 微鏡 学的 所見 は，真皮最上部のlamina densa
直下に水 疱形成を確認し た．さらに，免疫組織化学的に基底膜蛋白の発現を解析したところ，優性型ではVII型コラーゲン の発現が認められたが，nHS型ではVII型コラーゲンの減弱，HS型では全くVI
I型コラーゲンの発 現を認めなかった．次にCOL7A1の変異検索を行ったところ，56allele
中45alleleにCO
L7A
1の変 異を同定し，栄養障害型と診断された患者の80YOに変異を同定した，栄養障害型の内訳は，優性型が6例く21％），nHS型が14例（50％），HS型が8例（290／o）であった．今回同定したCOL7A
1の変 異ぼ 優 陸型 では 6変 異中 ，4変 異(67T0)が新規変異であった．劣陸型では28変異 中，19変異
く68016)が新規変異であった．本研究において，日本人に多く認められる変異として報告されている変異の出現頻度は，28家系中，5818delCは7家系(25Yo)，6573+1G>
Cは3家系（110／0），E2857X
は2家系(7%)で同定され，過去の報告と概ね同様であった．さらに，Q2827Xは2家系（7啣で認められ，
日 本 人 の COL7A1変 異 に 多 く 認 め ら れ る 変 異 の 1っ で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ．
副査 の 有賀 正教授からは，栄養障害型表皮水疱症の 診断確定に至る過程の質問，またVII型コラ ーゲン遺伝子に変異を同定出来なかった症例に関して，次にどのような実験計画で確定するのかという質問，副査の 守内哲也教授からは，本症の発症頻度，およぴ保因者における表現型についての質問，また主 査の清水宏教授から，V
II型コラーゲン遺伝子変異検索の今後の臨床への展望の質問があったが ，申請者は大概適切な回答をした，
この論文は，栄養障害 型表皮水疱症の診断を確定する手法，また本症で同定された変異と臨床症状との関連を明らかにし，今後，新しい治療法が開発されると，患者ごとに適切な治療法を選択できる可能陸が期待 される．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ申請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た．