博士（医学）下田直彦
学位論文題名腎虚 血再 灌流 障害 における好中球 より分泌さ れるcathepsinGの役割
学位論文内容の要旨
緒言 ： 臓器 移随 において臓器の虚血は不回避であり、しばしば重大 な移植臓器障害をもたらすふ ま た阻 血時 間の延長は移植臓器機能発現を遅延させるだけでな く、急性拒絶反応や細織の線維化、act:{iopathyといった慢性臓器障害を発生させる。虚血臓器への血液の再灌流により組織 中 にサ イト カイ ン、 ケモ カイ ンが 産生 され、接着因子、MHC分 子が高度に発現するが、これ ら の因 子は 虚血再潅流を受けた臓器へ好中球を遊走させ、組織 障害を惹起する。動物実
験モデンレでは再灌流前に好中 球をdeplete
することや虚血再灌流後の臓器へ好中球の遊走を阻害 す る こと によ り障 害を 軽減 する こと が 可能 であ った 。補 体活 性化 物質 やCXC、CCケモ カイ ン は 炎 症 馴 蟄 、 好 中 球 を 遊 走 さ せ、 それ に加 え、 CX
CR1とCXC
R2に 対す るり ガン ドは 好中球を牽囀えし、プロテアーゼ 、サイトカイン、ケモカインやほかの走化因子を含む孵弛を放出させ、組織炎症を増幅、持続 させる。 adhepsin
Gは好中球が放出するセリンプロテアーゼであり 、 アズ ッレ 顆粒蛋白の約加％を占め、その働きには細胞外基質 やサイトカインの前駆体を 分 解 する こと 、好 中球 上の イン テグ リ ンク ラス タを 調節 する こと 、Tリ ンノ 嚇ほ かの 自血球 を 炎症 部位 ヘ遊走させることが挙げられる。ところで、虚血再 灌流障害を生じるメカニズム を 解明 し、 その障害を軽減する方法を確立することは臓器移随 などの臨床の場において重要 な こと であ る。虚血再潅凋箪害を惹起する好中球の主たる産生 物質を同定することは、この障害を回避0尹るためのストラテジーを描く上で有効なターゲットとなりうる可育旨陸がある。今回、私は腎の虚cf．再潅 流障害の免疫反応や病理＊B織形成における好中球、また放出され る cathepsinGの 役 割 に つ い て cathepsinG欠 損 マ ウ ス を 使 用 し て 検 討 し た 。
方法： 129t
Sv野生型マウス（嗣出M汐マウス）およぴ嚠塒泣lG欠損マウス（雄陸、81也週）に腎 虚血 再潅 流障害を与えた。麻酔下に両側の腎血管 をクランプし、32℃の温虚血を60分与えた 後に クラ ンプを外し、血液を再灌流させた。再灌 流後舛時間ごとに血清クレアチニン値を測 定 丶 生 存 率 を 検 討 し た 再 灌 流舛 時 間、 30日 後の 聞蔵 を摘 出し mT
ぬ 嚠irトeo幽母 ・ml丶
お よ び Ml巛 m缸 恤 xm染 色 を 施 行 し 、 腎 組 織 の 形 態 、 線 維 化 を評 価し 也ま た、 再潅 流斟 時
間後の腎切片にお いて爪胤日ー法を用いアポトーシス細胞を検出し両群を 比較した。再漕流9及 び舛 時間 後に腎臓の凍結切片を作成し、一次抗体 として顆粒球の表面抗原に対するラット
抗 マウ ス（ 翻肛 y弼抗 体RB韻℃ 5を 用 い免 疫細 織染 色を 施行 し、 虚血再灌流後の好中球の浸潤 にっ い て比 較し た。 虚血 再灌 流9及 び斟 時間 後の 腎細 織内 のQaくL1蛋白 、O（ CL2蛋白 とn蜘k驛卿翻織叫瞰 ：）ほ白の産生をHBA法にて 測定した。

結果： 64％のw
nd‑typeマウスが60分の虚血再灌流後4日以内に死亡し、その一方でcathepsinG
欠 損 マ ウ ス では 全例 が 生存 した 。血 清ク レア チニ ン値 は両 群と も同 様に 掬多 し 2
時 間後 にpe
akに達 し 、96時間 後ま でに は正 常レ qレま で戻った。腎 組織内への好中球浸潤は両群とも再 灌 流 9時 間 後で は高 度で あっ たが 、24時間 後に は c
athe
psG欠損 マウ スで は弸 1幽ype
マウスに 比し て 有意 に減 少し た。 虚血 再灌 流舛 時間 後、硼出ypeマウスでは高度な尿細管壊死と尿細 管細 胞 のア ポト ーシ スを 生じ 、30日後 にi瑚鯔匕、尿 細管の減少を広範囲に認めた。一方 、 虚 血 再 灌流 舛時 間 後の 例均 血G欠損 マウ スで は 尿細 管壊 死は 軽く 、尿 細管 細胞 のア ポ
ト ー シ ス は 有 意 に 減 少 、 繊 維 化 の 形 成 は 認 め な か っ た 。 腎 組 織 の Qぬ i、 O【 Q2と M恥 蛋
白蛋 白産 生 は再 灌流 9時 間後 では 両群 い ずれ も高く、有意 な差は認めなかったが、再灌流舛時 間 後 の Qぬ J、 O。 〔 ユ 2と MPO蛋 白 産 生 は 倒 t印 血 G欠 損 マ ウ ス で は w
丑 ypeマ ウス に比 して有意に低下していた。
考 察 ： cathepsinGは 好 中 球 の 一 次 顆 粒 で 、 細 胞 外 基 質 を 分 解 し、 ケモ カ イン やMat
rixMetaolxoteinase (MMP)の前駆体を 分解することでそれらを活性化するセリンプロテアーゼである。活幽匕された好中球はreactiveoxygenspecies(ROS)
を産生し、蛋白質鋤釋織きや他の白血球 の 走 化 因子を 含有 した 立 を細 織中 ｜こ放 出す るこ とに より 障害 を引 き起 こす ふcathepsinG
欠損マウスでは虚血，再灌流の好中球浸潤が持続しない。これは組織中の好中球のケモ カイ ン(CXCL1、CXCI2)の産生が24時間後 には低下していることが関係している。cathepsm
Gは接着因子の発現、活陞牝も調節 すると報告されている。cathepsinG
欠損マウスではこれらが 抑制 され て いる可能陸があり、好中球の 浸潤の持続と関係しているかもしれない。好中球活 陸を 示す MPO
放 出は再灌流24時間後ではwild‑typeマウスに比してcathepsinG
欠損マウスで低 下し てい る 。MPOは 過酸 化水 素を さら に 活陸を有する次亜塩素酸や次亜臭素酸などの生成を すす める こ とで細織障害を引き起こす。 cathepsinG
欠損マウスでは 虚血再灌流後のMPO
放出 が減 少す る ため 組織 内の ROSの生 成が 減 少し てい る可 能性 があ る。 生成されたROS、次亜塩素酸 は障害された組織にアポトーシスを誘導する重要な因子であり、cathepsinG欠損マウス
では虚 血再灌流後の尿細管上皮のアポトーシスが減少している。腎の虚血，再潅凋章害に韜いて 尿細 管上 皮 細胞のアポトーシスの誘導が 組織の線維化を導く重要な因子であると報告されており 、この研究でもadhepsin
G欠損マウスではwD̲d‑typeマウスと比較して虚血，再潅流障害後30日の腎臓の線維化は有意1こ減少した。
結語：

cathe
psin
Gは腎臓の虚血再灌流後に好中球が惹起する障害を持続させ、その結果として組織 の線維化を引き起こす重要な因子であり、虚血 再潅流後の組織障害を軽減する効果的なス ト ラ テ ジ ー を 描 く 上 で cathepsinGは 有 効 な タ ー ゲ ッ ト と な る 可 能 陸 が 示 唆さ れた 。

学位 論文審査の要旨
主査 教授 野々村克也
副査 教授 笠 原正典
副査 教授 藤 堂 省

学 位論文題 名腎虚血再灌流障害における好 中 球 よ り 分 泌 さ れ る cathepsinGの役 割こ の論文は 、catheps
inG欠損マウスとそのwildーtypeマウスを用いることで腎虚血再灌流
障 害 に お け る 好中 球 のセ リ ン プロ テ アー ゼ で ある cathepsinGの 役 割 を検 討 して い る 。
camepsinG欠 損マ ウスの虚 血再灌流 後の腎組 織では急 性尿細管壊 死とその 後Blき起こ される 組織の線 維化が軽減 しており 、理由と して再灌 流後早期 に起こる 好中球の浸潤、集積が持 続 し な い こ とが 原 因と し て いる 。 その メ カ ニズ ム とし て 好 中球 の ケ モカ イ ンで あ る
KC／ CXCL1とMIP‐ 2/CXC12の産 生 が持 続 し ない こ とが 挙 げ られ 、 好 中球 浸潤が持 続しない ことはmyelopero虹 dase活性、尿細 管上皮のアポトーシス誘導を低下させると報告している。
質 疑応答で は副査の笠 原正典教 授から、 他の好中球のセリンプロテアーゼよりcathepsin
Gを阻 害 する こと の有効性 、ケモカ インに対 するcathepsinGによる 制御につ いて質問 あった 。これら の質問に対 し申請者 は、cathepsinGの阻 害の研究 は未だに 未解明のことが多い
分 野であり 他のプロテ アーゼ阻 害と直接 比較検討 すること はできな いが、ca
thepsinG
は好中 球の放出 するアズー ル顆粒の 20％を占め ることを 考えると 、他のプ ロテアーゼを阻害す
る のと同等 以上の効果 が期待で きること 、またcathepsinGは 様々なケ モカインをcleave
する ことで活 性化するこ とが既に 報告され ており、 一例とし てりンパ 球やマクロファージのケ モ カイ ン で ある CCR1に 対す る り ガン ド を制御 しているこ とを挙げ 解答した 。次いで 、副 査の藤堂 省教授から、虚血再灌流障害に対する治療ではelastaseの阻害よりP一sel
ecti
11
glyc
opro
teinligand−1（PSGし1）を阻害することの方が有効であるとの知見から、虚血再灌流障 害治療の より効果的 なタイミ ングにつ いて、ま た腎移植 後慢性期 の線維化は解決すべき
問 題であり 、虚血再灌流障害後の組織線維化にはアポトーシスの以外の系も関係しており、そ の考え得 る他のメカ ニズムに ついて質 問があっ た。これ らの質問 に対し申請者は、虚血再 灌流障害 を好中球の 一機能を 阻害する だけでは 治療とし ては不十 分であり、それにはより 早いstageの治 療、例えば E，Pselectin等の接着因子の阻害をcathepsinGの阻害に併用す

る ことで 効果 をあ げる こと が可 能であると予想されること、また線維化形成に対するアポト ーシス 以外 の系 につ いて は、 浸潤したマクロファージやりンパ球の機能により線維化を起 こすこ とを 例に 、cathepsinGはこれらの細胞を活性化、遊走させるケモカイン、サイトカ インを 制御 して おり 、cathepsinG欠損によりこの系も抑えられることで線維化形成を抑制 してい る可 能性 があ るこ とを 挙げ、腎移植における臨床の検体を用いて臓器の繊維化と特 殊顆粒 の働 きの 関係 につ いて も検討する考えがあると発言した。次いで、主査の野々村克 也教授 から 、cathepsinGの阻 害剤の製造について、虚血再灌流障害以外の急性炎症後の線 維化形 成と その 予防 につ いて 、腎移植後に炎症を契機に誘発される急性拒絶反応と好中球、またcathepsinGの関係について質問があった。これらの質問に対し申請者は、cathepsin
G阻 害剤 は既 に実 験レ ベル で使 用可能 なも のが 開発 済み であ り、今後その阻害剤を用いた
実 験を計 画し てい るこ と、 急性 炎症後の線維化形成にも好中球やそれに引き続き浸潤する
マ クロフ ァー ジな どが 深く 関与 していることが報告されており、cathepsinGの阻害はマク
ロ ファー ジに 対す るケ モカ イン 、サイトカインを制御することで線維化形成を抑制できる
可 能 性 が あ る こ と 、 ま た 炎 症 の拒 絶反 応誘 発に はMHC分子 の発 現な どが 関係 して おり 、ま だcathepsinGとMHC分子 発現 に関 する 報告 はな いが 、cathepsnGが 血管 内皮 を傷 害し 、サ イトカ イン 産生 ・接 着因 子発 現を介し、抗原提示し、拒絶反応を誘発させる可能性があると解答した。
この論 文は 、camepsinGが腎 虚血再 灌流 後の 組織 障害 を持 続させ、組織の線維化形成の重 要な因 子で ある こと を明 確化 したことで高く評価され、今後caぬepsinG阻害剤を使用した 実験 を発 展さ せる こと で、 虚血再 灌流 障害 に対 する 有効 な治 療の 確立 が期 待さ れる 。
審査員 一同 は、 これ らの 成果 を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有す るも のと 判定 した 。