9特 集

変化する肺癌治療

Topics 1
分子異常診断法新時代
萩原弘一

要旨：非小細胞肺癌において EGFR 遺伝子変異検査は必須となった．
EGFR 遺伝子変異同様，癌の発生，進展に重要な変異遺伝子としてALK，ROS1，RET 融合遺伝子が報告され，DNA，RNA 検査用検体取扱い手法が臨床医の必須の知識となってきている．遺伝子変異には生殖細胞系列変異，体細胞変異があり，両者を厳密に区別して理解し，検索する必要がある．多数の遺伝子変異の同時検索施行には，高速シークエンサーの利用が現実的な選択肢である．今後高速シークエンサーを利用した遺伝子変異システムが開発されていくであろう．
キーワード：EGFR 遺伝子変異検査，ALK 融合遺伝子，生殖細胞系列変異，体細胞変異，高速シークエンサー
EGFR mutation test, ALK fusion gene,
Germ line mutation, Somatic mutation,
High-speed sequencer

連絡先：萩原 弘一〒350‑0495 埼玉県入間郡毛呂山町毛呂本郷 38
埼玉医科大学呼吸器内科（E-mail: hagiwark@saitama-med.ac.jp）

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日呼吸誌

はじめに

3（1），2014

なければ，長期間安定して存在する．古墳から出土した人骨から DNA を抽出して調べた研究は数多い．小説『ジュラシック・パーク』では，琥珀に閉じ込められた遺伝子工学技術が広く世界に広がったのは 1970 年代

恐竜の血を吸った蚊から 6,500 万年前の恐竜の DNA をのことであった．西欧の呼吸器病学はいち早くその恩恵抽出するが，類似の試みは実際に行われている．このよを受けた．α1 アンチトリプシン欠損症，嚢胞性線維症

うに DNA は安定なため，臨床検体から DNA を抽出すの遺伝子が明らかにされ，病態生理の理解，診断法の開るのは難しくない．しかし，注意しなければならないの発，治療戦略の構築に大きな寄与をするとともに，肺気は，ホルマリン固定は DNA を「引きちぎる」ことであ腫，気管支拡張症，慢性気道感染症を来す類縁疾患を理る．ホルマリンがタンパクを架橋させ固定するため，長解するための基礎となった．
さらにはKartagener症候群，鎖 DNA は物理的な牽引力を受けて細断されるようだ．

Hermansky-Pudlak 症候群など，より患者数の少ない病そのため，ホルマリン固定された組織中の DNA はずた態の原因も解明された．一方，日本の呼吸器病学においずたになっている．遺伝子変異検査を想定する検体は，て，遺伝子工学はあくまで研究分野の技術であり，臨床凍結保存や DNA 保存液中での保存が勧められる．

で利用されることは少なかった．わずかに感染症分野で病原体の同定に用いられた程度であった．
この状況を一変させたのが，肺癌における上皮成長因

DNA とは対照的に，RNA はきわめて不安定である．
手術材料から RNA を抽出するため，手術室に液体窒素を持ち込み，摘出後の組織をすぐに細切して液体窒素に子受容体（epidermal growth factor receptor：EGFR）投げ入れて保存した経験のある人もいるだろう．RNA遺伝子変異の発見だった．EGFR 遺伝子変異のある患者は反応性が高く，時に酵素としても働くほど化学的に活に EGFR 阻害剤を使用すると，劇的な臨床効果が得ら性が高い．タンパク質酵素が出現する前，初期の生命はれることが明らかになり，EGFR 遺伝子変異検査は肺癌タンパク質の代わりに RNA を酵素として使用したと考診療に必須の検査となった．それとともに，遺伝子工学えられている．その名残がタンパク合成を触媒するリボの用語，知識，技術が呼吸器病学に流れ込み，呼吸器病

ソームや tRNA など，細胞代謝の基幹経路に残されて学を学ぶものにとって必須の事項となった．

いる．
他の物質と反応するとRNA自身も分解されやすい．

EGFR 遺伝子変異は，遺伝子検査にとっても全く新し

RNA 検査を行うためには，検体をできるだけ早く，い挑戦となった．α1 アンチトリプシン欠損症，嚢胞性RNA 保存液中に入れることが必要である．今後，臨床線維症は，人体を構成するすべての細胞が異常をもって検体でさまざまな RNA を測定する必要が生じるだろう．

いるため，末梢血を採取して白血球 DNA を調べれば遺それが可能かどうかは臨床医の手技にかかっている．現伝子診断可能である．感染症病原体は，感染部位に大量在提案されている手法を図 2 に示す．の病原体が存在することがほとんどであり，検出は一般に容易である．一方，EGFR のように癌細胞のみに存在する体細胞変異の同定はきわめて難しい．検体採取法，検出手法，臨床で必要な感度，特異度に関して，日本で生殖細胞系列変異（germ line mutation）（図 3）と体細胞変異（somatic mutaiton）

はおおむねコンセンサスが確立されたが，世界標準は確立されておらず，模索が続いている．

遺伝子変異には，①生殖細胞系列変異と②体細胞変異がある．混乱しやすいのでまとめておこう．

DNA と RNA（図 1）①生殖細胞系列変異：体を形成するすべての正常細胞がもつ変異である．子孫に伝えられる（遺伝する）変異でもある．

遺伝子検査の対象は 2 種類ある．DNA と RNA である．
DNA と RNA は全く異なる化学的性質を示すので，遺伝子検査を行うにはそれぞれの性質を熟知しておかねばならない．
DNA は安定な物質である．DNA 分解酵素が存在し②体細胞変異：癌細胞など，異常をきたした細胞のみが有する変異である．子孫には伝えられない．
生殖細胞系列変異は倫理上の重要性が高い．ヒトゲノ
ム・遺伝子解析研究に関する倫理指針など，遺伝子検索上の指針の多くは生殖細胞系列変異を対象としている．

特集

変化する肺癌治療

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図 1 DNA と RNA．DNA と RNA の 違 い は， 酸 素 原 子 1つの違いにすぎない．しかし，この酸素原子の有する孤立電子対は反応性が高く，他の物質からの求核反応（nucleophilic reaction）の標的となり，さまざまな物質と反応する．
その結果，RNA は酵素としてもはたらいたり（ribozyme），分解されたりする．

生殖細胞系列変異は，個人の「体質」を規定し，子孫へ遺伝子変異検査に関して述べる．

伝えられるものだからである．一方，体細胞変異は個人

1．EGFR 遺伝子変異検査

情報としての重要性ははるかに少ない．癌などの病的細EGFR 遺伝子変異は肺癌細胞に生じた体細胞変異であ胞に限定した性質を規定するものであり，子孫には伝える．DNA を検索する．癌細胞を採取した際に混入するられないものだからである．
いくつか例を挙げよう．ダウン症候群の有無を妊婦の正常細胞は EGFR 変異をもたず，正常の EGFR 遺伝子を保有している．EGFR 遺伝子変異検査は，正常細胞に血液から検索する検査は，妊婦の血液中に流出している由来する正常 EGFR 遺伝子の存在のもとで，それとは胎児 DNA を利用し，胎児の生殖細胞系列 DNA を観察

わずかに塩基配列が異なる変異 EGFR 遺伝子を検出すしている．肺癌における EGFR 変異，EML4-ALK 融合る必要があるため，高感度法が使用される．日本で施行

遺伝子検査は，体細胞変異検査である．

されているすべての検査法は，検体中の癌細胞が 1％，正常細胞が 99％の状態でも検出可能である1）〜3）．

遺伝子変異検査DNA を検索する理由は以下のとおりである．① DNAは安定であり，RNA よりはるかに扱いやすいこと．②
EGFR 遺伝子は正常細胞には 2 コピー，癌細胞では時に上記の知識を基礎として，現在行われている遺伝子変増幅しているため 2 コピー以上存在することが保証され異検査に関して述べてみたい．ここでは特に体細胞変異ているので，検体中の癌細胞の数に比例した形で定量的に限定し，代表的な EGFR 遺伝子変異検査と ALK 融合な検査結果が得られること．RNA を使用した場合，正12Topics 1

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図 2 遺伝子変異検査用臨床サンプルの採取法．DNA と RNA の同時検索が可能な手法である．RNA は分解しやすく，採取時の不適切な手技により容易に分解する．良好な RNA を採取可能なサンプルを保存することは，臨床医の重要な責任になるだろう．

常細胞が癌細胞よりEGFR遺伝子を多く発現していると，ソン配列が隣接した構造が残る．この構造は RT-PCR癌細胞由来の異常 EGFR が覆い隠されてしまう．DNAで容易に検出できるため，RNAレベルの検査が行われる．

検査のメリットの一つは，遺伝子発現とは無関係に変異正常の細胞由来の RNA にはこの共通構造が存在しない検索ができることである．

ため，バックグラウンドのない検査が可能である．

2．ALK 融合遺伝子検査
ALK 融合遺伝子は肺癌細胞に生じた体細胞変異であRNA 検査の問題は，RNA がきわめて不安定なことである．臨床検体を適切に処理しないと，検体採取現場でる． 現 在，reverse transcriptase-polymerase chain re-RNA は分解してしまう．さらに，癌細胞が EML4-ALKaction（RT-PCR），免疫組織染色（IHC），蛍光をどの程度発現しているかがわからないため，検出されhybridization（FISH） で 検 査 さ れ て い る． 本 稿 で はなかった場合，① EML4-ALK が存在しない，② RNA

RT-PCR を扱う．IHC，FISH に関しては Topics 2 を参が分解していた，③EML4-ALKの発現量がきわめて低い，照されたい．のいずれだったのか判然としない．そのため，適切なコ

ALK 融合遺伝子では，融合部位が染色体上 DNA 上ントロールをおいて検査する必要があるが，コントローの広い領域に分散しているため，DNA で検査すると非ルをおく標準的な手順は確立されていない．検査法開発

常に広範な染色体領域を検索する必要が生じ，事実上検者の創意工夫にまかされている．

査が不可能になる．RNA では，融合部位の DNA はイントロンとして除去されてしまうため，融合遺伝子を構成する 2 つの遺伝子（たとえば EML4 と ALK）のエク特集

変化する肺癌治療

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図 3 生殖細胞系列変異と体細胞変異．癌細胞のみに存在する変異は体細胞変異（somaticmutation）であり，正常細胞に存在する変異は生殖細胞系列変異（germ line mutation）である．非小細胞肺癌でみられる EGFR 遺伝子変異は体細胞変異の例であり，嚢胞性線維症でみられる CFTR 遺伝子異常は生殖細胞系列変異の例である．

新たな遺伝子変異検査②すべての患者から検体採取可能なこと．
③ 1 週間以内に結果返却可能なこと．
④全細胞の 1％の癌細胞しか含まない検体からも検索

癌細胞に体細胞変異が存在した場合，利用可能な保険適応分子標的薬が存在する遺伝子は，現時点で EGFR変異遺伝子，ALK 融合遺伝子のみである．しかし，BRAF 変異遺伝子，ROS1 融合遺伝子，RET 融合遺伝
子には，それぞれ分子標的薬が存在し，近い将来使用で可能なこと．
⑤感度，特異度が 0.95 以上で施行可能なこと．実際には 0.99 以上が求められるだろう．
⑥現実的な検査代金で施行可能なこと．実際には数万円程度であろう．

きる可能性がある．BRAF 変異遺伝子は DNA 検査，①〜⑥すべてを満足する検査を開発するために現在利ROS1 融合遺伝子，RET 融合遺伝子は RNA 検査である．

用可能な選択肢は，高速シークエンサーを使用する手法

これからも，適切な分子標的薬のある変異遺伝子の数はであると思われる．

さらに増えるだろう．これは，上記の遺伝子を含んだ複数の遺伝子変異を同時検査する検査法を確立する必要があることを示している．

高速シークエンサー（図 4）

さらに，実臨床で使用可能な検査は，以下の条件を満たす必要がある．
①実現可能な検体採取方法が確立されていること．

高速シークエンサーは，次世代シークエンサーと呼ばれる．高速シークエンサー登場前，核酸塩基配列決定は，

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図 4 高速シークエンサーによる変異解析の手順．（1），（2）変異領域（mutation hotspot）を PCR で増幅，（3）高速シークエンサーで塩基配列を決定，（4）正常配列と比較し，変異配列の割合を計算，（5）結果報告．

蛍光シークエンサーを用いて Sanger 法で行われていた．

21 など）を PCR で増幅する．RNA の場合は，RT-PCR

反 応 は サ ン プ ル ご と に 液 相 で 行 わ れ， 一 度 に 1 つ のにより増幅する．

DNA 鎖の塩基配列しか決定できず，決定可能な塩基対数は 600〜800 塩基対であった．固相反応と液相反応を②複数の標的配列の増幅産物をすべて合わせ，高速シークエンサーにかける．

共用することで，数十塩基対の配列を一度に数千万配列

臨床検体中，1％の癌細胞しか含まない検体を検索し決定する手法が開発された．当初は 30 塩基対程度の短たと考えよう．この癌細胞は EGFR exon 19 変異をもっい配列しか決定できなかったが，徐々に決定できる塩基ているとする．その場合，正常 EGFR exon 19 配列が対の長さが伸び，現在では 200〜300 塩基対を数千万配100,000 配列，
変異 EGFR exon 19 配列が 500 配列（通常，列一度に決定できるようになっている．このデータ量は癌細胞の 2 つの EGFR 遺伝子のうち片方のみが変異を数百 GB（ギガバイト）にもなり，以前の非力なコンピュー有するため）という形でデータが出てくる．

タではとても処理できる量ではなかった．しかし，近年高速シークエンサーも塩基配列決定時に誤りをおかし，の CPU（中央演算装置）の進歩により，デスクトップ正常配列を変異配列と読み間違うことがある．このようパソコンでも処理可能な範囲に入ってきた．高速シークなエラーをどのように補正するか，また，RNA 検査のエンサーは，コンピュータ科学の進歩が可能にした技術

場合は，どのように RNA の品質を保証するためのコンという側面が大きい．

トロールをおくか，などの点が実用化上の問題だが，こ高速シークエンサーを用いた検査の理屈は難しくない．

近い将来，高速シークエンサーれらも解決されつつある．

①臨床検体より目的とする標的配列（EGFR exon 19，が遺伝子変異検査の主役になることは間違いない．

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遺伝子変異検査における日本の果たすべき役割

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ろう．基礎医学の進歩を臨床医学に速やかに還元するために，遺伝子変異検査も進歩しなければならない．そのためには，検体採取法を臨床現場で施行可能なものにしながら，結果の返却時間や必要な感度など，臨床に必要EGFR 遺伝子変異頻度が日本で高かったこと，EGFRな検査仕様を考慮してシステムを設計していく必要があ

遺伝子変異が早期に保険収載されたこと，臨床検査が国る．高速シークエンサーを用いたシステムは，それらを内少数の検査センターで集約的に行われる医療システムすべて満たす可能性があり，今後積極的に開発を進めてであることなどが幸いし，日本では進行非小細胞肺癌患いく必要があると考えられる．

者全員が EGFR 遺伝子変異検査を受けるシステムができ上がった．これは世界の最先端の成果である．また，引用文献

日本の遺伝子変異検査は，世界で最も厳しい基準で施行

1）Goto K, et al. An evaluation study of EGFR muta-

されているといってよい．EGFR 遺伝子変異システムでtion tests utilized for non-small-cell lung cancer in

達成したこの成果を損なうことなく，さらに発展させ，

the diagnostic setting. Ann Oncol 2012; 23: 2914‑9.

患者に迅速に基礎研究結果を還元できるシステムを推進

2）Hagiwara K, et al. Importance of the cytologicalすることが，日本の責務であると考える．

samples for the epidermal growth factor receptor
gene mutation test for non-small cell lung cancer.

おわりにCancer Sci 2013; 104: 291‑7.
3）Kobayashi K, et al Epidermal growth factor receptor（EGFR）mutation and personalized therapy in肺癌細胞はさまざまな遺伝子変異をもっている．そのなかに，治療薬と密接に結びついた変異が存在する．検advanced nonsmall cell lung cancer（NSCLC）. Target Oncol 2013; 8: 27‑33.

索しなければならない遺伝子の数はこれからも増すであAbstract
Next-generation test system for genetic mutation in lung cancer
Koichi Hagiwara
Department of Respiratory Medicine, Saitama Medical University
The identification of an epithelial growth factor receptor（EGFR）mutation as a cancer driver gene in nonsmall celllung cancers, and the development of high-sensitivity mutation test systems have dramatically changed the procedures totreat nonsmall cell lung cancers. Currently, almost all patients with advanced nonsmall cell lung cancer are tested for thepresence of EGFR mutation in Japan, and if positive, treating patients with regimens containing EGFR-tyrosine kinase
inhibtors（EGFR-TKIs）are considered mandatory. The EGFR mutation test should detect mutant EGFR genes fromclinical specimens in which cancer cell content is only 1％. Recently, anaplastic lymphoma kinase fusion genes, rearranged
during transfection（RET）fusion genes, and c-ros1 proto-oncogene（ROS1）fusion genes have been reported: all of thesegenes have drugs that suppress activities and thus can be used for treatment. Genetic tests that are capable of investigating all these mutant genes are required. Moreover, the test system should be equipped with the practical sample isolation
procedures, should report the result within a week, should detect mutation from a clinical specimen in which cancer cell
content is only 1％, and should be inexpensive and allow all patients with nonsmall cell lung cancer to be tested. The mostpractical approach constructing such a system is to employ a high-speed sequencer. Systems using them are now being
constructed and will soon be introduced to clinical practice.