博士（獣医学）

ゴウタムシュリーハリ

学位 論文題名Studies on the mechanism of Ca2十 signaling in rat andpig olfactory receptor neurons： Effect￠ 厂 あ り た Tzsity￠ 厂sti7nulatioTz aTzd劾ぴolve7ne7zt￠厂コ・｀−tyク￠くを戸十Cカ口刀銘￠ム（ ラ ッ ト お よ び ブ 夕 嗅 神 経 細 胞 の カ ル シ ウ ム シ グ ナ ル伝 達 機 構 に
関 す る 研 究： 刺 激 強 度 依 存 症 の 反 応 と T型 カ ル シ ウ ム チ ャ ネ ルの 関与 ）学位論文内容の要旨
1）嗅 神経 細胞 (ORNs)の 線毛 ／嗅 小胞に 存在 する G夕 ンパ ク質 共役型受容体がにおい物質と反応すると、cA
MP依存性に細胞内カルシウムイオン濃度が一過性に上昇する。第1章では、刺激の強さに依存する一過性カルシウム反応の特性について、カルシウム指示薬のFluo−4を負荷した単離ORNsを用いて共焦点顕微螢光画像解析法で検討した。比較的小さなカルシウム反応は、嗅小胞に限局して起こるのに対して、大きなカルシウム反応は細胞体にまで伝播した。また、嗅小胞に限局していた反応は、におい物質への暴露時間を延長すると細胞体に伝播するようになった。さらに、におい物質の濃度に依存して、低濃度では嗅小胞に限局していたカルシウム反応が、高濃度になるにっれて細胞体にまで伝播するようになった。f orskolin/IBMX
刺激の場合でも同様の現象が認められた。
MDL12330
Aでアデニレートサイクラーゼを部分的に抑制すると、細胞体まで伝播が認められた反応が嗅小胞に限局する反応に変化した。NifedipineでL型カルシウムチャネルを抑制すると、細胞体でのカルシウム反応の振幅は減少したが、嗅小胞での反応は影響されなかった。以上から、嗅小胞に限局したカルシウム反応は弱い刺激の場合に認められ、それはORNsの反応を全体として抑制するか、あるいは微弱な興奮生反応として自発性ノイズを覆い隠すことに役立っている
カゝもしれなしゝ (Gautametal.，Neurosci. Res.，2006，55: 410ー420)。
2）

これまで、におい物質で惹起される嗅小胞から細胞体へのカルシウム反応の伝播は、L型カルシウムチャネルによって媒介されていると考えられてきた。
第 2章では、共焦点顕微螢光画像解析法と免疫染色法によって、L型に加えてT型のカルシウムチャネルの存在を同定し、カルシウム反応の伝播への関与を明 らかにした。T型カルシウムチャネルの特異的抑制物質であるmibef radil(10―15ロM）とNi2+(100ルM
冫は、におい物質あるいはfor
skolin/IBM
Xによる細 胞体および樹状突起におけるカルシウム反応を強く抑制あるいは消失させた 。これに対して、嗅小胞におけるカルシウム反応の抑制の程度は、前者の― 56―40―50%であった。30mMK十による反応はmibef radilによって部分的に抑制されたが、この抑制の程度には嗅小胞と細胞体とで差が認められなかった。また、K十濃度をわずか2.5 mM上昇させただけでもカルシウム反応が惹起された。この反応はmibefradilあるいはNi2+で完全に抑制された。細胞外Na+をNMDGで置換してもカルシウム反応は影響を受けなかった。免疫染色により、T型チャネルのサプユニットであるCaヤ3.
1、CaV3.
2およびCaワ3．3の存在が細胞体、樹状突起そして嗅小胞で確認された。以上の知見から、ORNsのT型カルシウムチャネルは、カルシウム反応の伝播のみならず電気生理学的反応を修飾し、におい物質に対する感受性を上昇させている可能性が浮かび上がった(Gautam et al.，Neuroscience，2007，144：70
2―713)。
3）第 3章 では 、T型 カル シウ ムチャネルの関与についてブタの新鮮分離ORNsで検 討 し た 。mibefradil (10ル め あ る い は Ni2+ (100ル め の 存 在 下 で は 、
forskolin/IBMXによる細胞体でのカルシウム反応は、比較的強い刺激の場合には強く◇60％）抑制され、中等度の刺激の場合には完全に消失した。これに対して、嗅小胞での反応はいずれの刺激強度においても部分的に（く60%)抑制されただけであった。30mMK十による反応もまた細胞体、嗅小胞いずれにおいても部分的に（〜60％）抑制されただけであった。また、ラットOR
Nsで認められたのと同様、2.
5 mMの細胞外K十濃度上昇によってカルシウム反応が認められ、これはmibef radilあるいはNi2+で完全に抑制されたが、TTXあるいはNMDGによるNa+の置換では影響を受けなかった。これらのことは、ブタのORNsにT型カルシウムチャネルが存在することを示唆し、におい刺激に続くカルシウム反応の嗅小胞から細胞体への伝播に関与していることを推測させる(Gautam et al.，Neurosci.Res．，2007，57：129―139)。
以上を総合して、においの受容と認識機構について以下の結論を得た。（1）
各々のOR
Nsは様々な強度（濃度）のにおい物質に対して異なった反応性を示し、におい物質の認識にっながる情報の符号化は、高次中枢より前のORNsレベルで既になされている。（2）OR
Nsの嗅小胞、樹状突起および細胞体すべての部位に存在するT型カルシウムチャネルを介して流入するカルシウムイオンが、におい物質の情報の処理と感受性の修飾に寄与している。（3）カルシウム反応が嗅小胞に限局する微弱なにおい刺激の際には、カルシウム依存性K十チャネルを活性化して過分極反応を惹起することにより、ORNsでの電気的な自発性ノイズを抑制しているかもしれない。これらの特性は、におい物質を検出して、混在する他のにおい物質からそのにおい物質を差別化して上位中枢で認識するという
ORNsの 基 本 的 な 能 カ の 達 成 に 深 く 関 わ っ て い る と 思 わ れ る 。

− 57―

学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 葉原 芳昭
副 査 教 授 伊藤 茂男
副 査 助教 授 太田 利男
副査 助教授 岩永ひろみ

学 位 論 文 題 名Studies on the mechanism of Ca2十signal
ing in rat andpigol
fact
oryr
ec
ep
torneurons：上ffect
￠厂int
e7zsi
ty
￠厂
sti
7nu
lati
onand
励ぴ〇あ￠所￠耐ザT‑typeくゲ十ch
anTzels（ラッ トおよびブ 夕嗅神経細 胞のカルシ ウムシグナル伝達機構に関す る研究：刺 激強度依存症の反応とT型カルシウムチャネルの関与）

博 士 （ 獣 医学 ） 学 位 の申 請 者 、 シュ リ ー ・ ハリ ． ゴ ウ タム 氏 の 博 士論 文 は 3章 か ら構 成 さ れている 。
第 1章 は、刺 激の強さ と細胞 内カル シウム 反応の 特性に ついて 単離嗅 神経細胞 を用い て共焦 点蛍
光顕微 画像解 析法で検 討した ものである。比較的弱いカルシウム反応は、嗅小胞に限局して起こるのに対し て、大 きなカル シウム 反応は細胞体にまで伝播した。また、喚小胞に限局していた反応は、におい物 質への 暴鱈時闇 が延長 されると、細胞体にまで伝播する反応に変化した。さらに、低濃度のにおい物 質刺激 では嗅小 胞に限 局していたカルシウム反応が、高濃度になるにっれて細胞体にまで伝播すると いう濃 度依存性 の変化 を認め た。forskolin/IBMX刺激 でも同 様の現象 が認められた。アデニ
レート サイク ラーゼ活 性を部 分的に抑制すると、細胞体にまで伝播していた反応が、嗅小胞に限局する反応 に変化 した。L型カルシ ウムチ ャネル を抑制 すると、細胞体でのカルシウム反応の大きさは減少した が、嗅 小胞での 反応は 影響されなかった。以上のことから、におい刺激が弱い場合には、カルシウム 反応は 嗅小胞に 限局し 、嗅神経細胞の情報伝達は抑制されているか、あるいはごく弱い興奮性反応を 示すと 考えられ る。こ れによって、自発性ノイズが覆い隠され、におい物質に対する感受性と識別能 が増大 している のでは なぃか 、とい う新し い仮説 を提唱 した。
第 2章 は 、 共 焦点 蛍 光 頭 徽画 像 解 析 法と 免 疫 組 織化 学 法 に よっ て 、 L型 に 加え て T型 の カ ル シウム チ ャ ネ ルの 存 在 を ラッ ト で明 らかに し、カ ルシウ ム反応の 伝播へ の関与 を検討 したも のである。 T型 カ ル シ ウム チ ャ ネ ルの 特 異 的 抑制 に よ っ て、 に おい物 質ある いはforskolin/IBMXによ る細胞 体 お よ ぴ樹 状 突 起 にお け るカ ルシウ ム反応 が強く 抑制され た。こ れに対 して、 嗅小胞 におけるカ ル シ ウ ム反 応 の 抑 制は 、 前 者 の40− 50%であ っ た 。30rnMFによる 反応は 、T型カ ルシウ ムチ
ヤネ ル 抑 制 薬に よ っ て 部分 的 に抑 制され たが、 この抑 制は嗅小 胞と細 胞体と で差が なかっ た。一一 58―

方、 7.5 mMK十に 対す る 反応 は、 T型 カル シウ ムチ ャ ネル 抑制 薬で 完全 に 抑制 され た。 免疫 組織化学により、T型チャネルの サプタイプであるCa、311、 Ca，3．2およぴCa，3．3の サブユニットの存在が 、 細 胞 体 、 樹 状 突起 そし て 嗅小 胞で 確認 され た 。以 上の 知見 から 、 嗅神 経細 胞に 存 在す るT型
カル シウ ムチ ャ ネル は、 カル シウ ム 反応 の伝 播の み なら ず、 電気 生理 学 的反 応を 修飾 する と考えた。
第 3章 は、 T型 カル シウ ムチ ャネ ル の関 与に っい て 、ブ タの 嘆神 経細 胞 で検 討し たも ので ある。
T型カ ル シウ ムチ ャネ ル 抑制 薬は 、forskolin/IBMXに よる 細胞 体 でのカルシウム反応にたい して、比較的強い刺激の場合に は部分的に抑制し、中等度の刺激の場合には完全に抑制した。これに対して、嗅小 胞で の反 応 は、 いず れの 刺激 強 度に おいても部分的に抑制 されただけであった。30 mMFに対する反応も細胞体、嗅小胞 いずれにおいても部分的に抑 制されただけであった。ま た、ラット嗅神経細胞同 様、 7.5 mMむに 対し てカ ルシ ウ ム反 応が 認め ら れ、 これ 熾T型カルシウムチャネル抑制 薬で完全に 抑制 され た 。これらのことから 、プタの嗅神経細胞にもT型 カルシウムチャネルが存在す ることが示 唆さ れ、 に おい 刺激 によ るカ ル シウ ム反応の嗅小胞から細 胞体への伝播に関与している と考えた。
以上の知見を総合して 、ゴウタム氏は、においの受 容と認識機構にっいて以下の結論を得た。（1）
各々の嗅神経細胞は、様 貴な強度（濃度）のにおい物 質に対して異たった反応性 を示し、におい物質の認識にっながる情報の符号化は、高次中枢よりも前の、嗅神経細胞レベルで既に詮されてV、る。（2）
嗅神 経細 胞の 嗅 小胞、樹状突起およ ぴ細胞体すぺての部位に存在 するT型カルシウムチャネル を介して流 入す るカ ル シウムイオンが、に おい物質の情報の処理と感受 性の修飾に寄与している。 （3）弱
いに おい 刺激 の 場合、カルシウム反 応は嗅小胞に限局し、カルシ ウム依存性K十チャネルを活 性化して過分極反応を惹起する ことにより、嗅神経細胞での 電気的な自発性ノイズを抑 制している可能性が浮か ぴ上 がっ た。 本知 見は 、嗅 覚の 生理 学 領域 に新 しいアイデアを提供するものであり、Neuroscience Researchに 2報 、 Neuroscienceに 1報 、 公 表 あ る い は 印 刷 中 で あ る 。
よ っ て 、 審 査 委 員 一 同 は 、 上 記 博 士 論 文 提 出者 シュ リ ー・ ハリ ．ゴ ウタ ム 氏の 博士 論文 は、
牝 海 道 大 学 大 学 院 獣 医 学 研 究 科 規 定 第 6条 の 規 定 に よ る 本 研 究 科 の 行 う博 士 論文 の審 査等 に合格と認めた。

― 59―