博士（獣医学） 市橋
学位論文題名Development of cytotoxicTlymphocyte‑inducing●peptide vacclne（細胞 傷害性T細胞 誘導型ペプチドワ クチンの開発）

学位論文内容の要旨
獲 得 免 疫 応 答 は 抗 体 が 産 生 さ れ る 液 性 免 疫 と 細胞 傷 害 性T細 胞(cytotoxicTlymphocyte， CTL)が 誘 導 さ れ る 細 胞 性 免 疫 か ら 構成 さ れ る。 現在 主に 使用され てい る不 活化 ワク チン や成 分ワ クチ ンでは 抗体 のみ が誘 導さ れる 一方 、生ワ
ク チ ン は 抗 体 と CTLの 両 方 を 誘 導 す る こ と が 可 能 で あ る 。 現状 で 、 あ る 種 の感 染症 に対 して 生ワ クチ ンに よる 防御 効果が より 強い と言 われ るの は、 液性免疫 と 細 胞 性 免 疫 を 活 性 化 し 病 原 体 に 対 し て 極 め て有 効 な 免疫 応答 を誘 導できるからである。しかし、副反J´ふの問題や適切な弱毒株を作製することが困難で
あ る 等 の 理 由 で 、 生 ワ ク チ ン を 使 用 で き る 感 染 症 は 少 数 に限 ら れ て い る 。
こ れ ま で に CTLの 誘 導 を 目 的 と し た 様 々 な ワ ク チ ン 開 発 が行 わ れ て き た 。
そ の 中 で MHC classI分 子 に提 示さ れる 8〜10アミ ノ酸 から 成る エピ トー プペプ
チ ド で 免 疫 し CTLを 誘 導 す る ペ プ チ ド ワ ク チ ン は 安 全 で 実 用的 な ワ ク チ ン であ ると 考え られ る。 しか しペ プチ ド自 体の免 疫原 性は 弱い ため 、ペ プチ ドワク
チ ン で 強 カ な CTL活 性 を 誘 導 す る た め に は 、 抗 原 提 示 細 胞 を活 性 化 す る た めの アジ ュバ ント と共 に、 ペプ チド を抗 原提示 細胞 ヘ効 率良 く輸 送す るた めのキヤリアーが必要となる。
本研 究は 、実 用的 なペ プチ ドワ クチ ンの開 発を 目指 し、 イン フル エン ザに対す る CTLエ ピ ト ー プ ワ ク チ ン の 評 価 お よ び 細 胞 性 免 疫 誘 導 に効 果 的 な 新 た なペプチドキャリアーの開発を目的に実施した。
第 一 章 で は A型 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 内 部 蛋 白 質 由 来 の CTLエ ピ ト ー プの 同定 およ び、 同定 され たペ プチ ドで の免疫 によ る防 御効 果の 検討 を行 った。
現行 の中 和抗 体誘 導を 目的 とし たイ ンフル エン ザワ クチ ンは 、表 面蛋 白質であ るへ マグ ルチ ニン の亜 型に 防御 効果 が依存 する ため 、亜 型問 での 交差 防御効
果 は低 い。 また 、同 じ亜 型間 でも 流行 するウ イル ス株 の抗 原性 を予 測し てワク
チ ンを 毎年 作り 直す 必要 があ る。 そこ で本研 究は 、ウ イル ス内 部蛋 白質 を認識
で き 、 ウ イ ル ス 亜 型 に 対 す る 依存 性 が 低 い CTLを 誘 導 可 能 なワ ク チ ン を 開 発す るた め、 ペプ チド ワク チン の技 術を 用いた 。さ らに ヒト にす ぐに 応用 可能とす る た め 、 主 要 な ヒ ト MHCク ラ ス I分 子 で あ る HLA‑A*2402分 子 を 発 現 す る― 526―

HLA‑A24 transgenicmice(A24Tg)をワクチン効果の解析に用いた。まず抗原ペプチドを結合予測プログラムによりHLA−A*2402分子に結合する可能性が高いぺプチド配列を絞り込んだ。次にそのペプチドをりポソームの表面に結合してA24Tgを免疫し、in vivo CTL活性の測定により高いCTL誘導効果を示すぺプチドを選定した。最終的にこれらのペプチドでA24Tgを免疫し、インフルエンザウイルスを感染させて感染防御効果を検討した。その結果、亜型間で共通に保存されているペプチド3種類を経鼻投与した場合は、異なる2種類のウイルス亜型を感染させても無症候または軽度の体重減少のみで全マウスが生存し、さらに肺におけるウイルス増殖も有意に抑制されていた。しかし、皮下投与した場合は途中まで非免疫群と同様の体重減少を示し、生存率は50〜80％であった。次にワクチン投与経路による防御効果の差を病理組織学的に調べた
ところ、ワクチン経鼻投与群では細気管支周囲にT細胞の集積が認められたが、皮下投与群では認められなかった。以上の結果により、インフルエンザウ
イルス 由来 の内 部構 造蛋白 質から同定されたCTLエピトープを用いたCTL誘導型ペプチドワクチンは、気道内で感染細胞を排除しウイルスの増殖を阻止す
るこ と に よ って ウ イ ル ス抵 抗 性 を 誘導 す る と 考え ら れた 。
第二章では新たなペプチドキャリアーの探索を行った。リポソームは4種類の異なる脂質から構成され、二分子膜が何重にも重なった多重膜構造を形成している。この多重膜リポソームを作製するには時間がかかることや生産コストが高いこと等が実用上の問題点である。そこでりポソームに代わる安価で容易に調製可能なキャリアー物質を探索するため、様々な候補物質をペプチドに結合してB6マウスを免疫し、生体内でのエピトープ特異的細胞傷害活性を測定することで、有効なキャリアーを選別した。その結果、フオスファチジルセリン(phosphatidylserine，PS)が最も強いCTL誘導効果を持っことが判明した。さらに、PSの免疫増強機序を解析するため、各種免疫細胞によるPSの取込み能および抗原提示能を調べた。その結果、PSは通常型樹状細胞(conventionaldendriticcells，cDCs)に優先的に取り込まれることで抗原を効率良くcDCs＾輸送し、エピトープ特異的なCTLの誘導効果を増強させていることが明らかになった。
以上、本研究では、第一章で予測プログラムによりCTLエピトープを予測し、invivoで免疫原性ペプチドを選別する技術により、感染防御効果があるペプチドを同定、さらに感染防御試験を実施してペプチドワクチンの効果を評価する系を確立した。また、第二章では実用的な新たなペプチドキャリアーを開発し、その作用機序を明らかにした。これらの研究成果は、インフルエンザウ
イルスに限らず種々の細胞内寄生体に対するCTL誘導型ワクチンの開発、実用化において極めて有益な技術を提供するものである。

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学 位 論 文 審 査 の 要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
准教授

杉本大橋
高田梶野千尋和彦
礼人喜一

学 位 論 文 題 名Development of cytotoxicTlymphocyte― inducing
●pept
ideva
cclne（細胞傷害性T細胞誘導型ペプチドワクチンの開発）
獲 得 免 疫 応 答 は 抗 体 が 産 生 さ れ る 液 性 免 疫 と 細 胞 傷 害 性 T細 胞 （ cytotoxicTlymp
hocyte， CTL)が誘 導さ れる 細胞 性免 疫か ら構成される。現在主に使用されてい る不活 化ワ ク チン や成 分ワクチンでは抗体のみが誘導される 一方、生ワクチンは抗体とCTLの両方 を誘導する事が可能である。現状で、生ワクチンによる 防御効果がより強いと言われるの は、液性免疫と細胞性免疫を活性化し病原体に対して極 めて有効な免疫応答を誘導できる からである。しかし、副反応の問題や適切な弱毒株を作 製する事が困難である等の理
由で 、生ワクチンを使用できる感染症は少数に限られている 。
これ ま でに C
TLの誘 導を 目的 とし た 様々 なワクチン開 発が行われてきた。その中でMHC
classI分 子に 提示 され るエ ピト ープ ペプ チド で免 疫し CT
Lを 誘導 する ペプチドワク チンは実 用的なワクチンであると考えられる。しかしペプチド自 体の免疫原性は弱いため、ペプ チド ワ クチ ンで 強カなC
TL活性を誘導するためには、抗原提示細胞を活性化するた めのアジ ュバントと共に、ペプチドを抗原提示細胞へ効率良く輸 送するためのキャリアーが必要と なる。
本研 究 は、 実用 的なペプチドワクチンの開発を目指し 、インフルエンザに対するCTLエ
ピ トー プ ヮク チン の評 価お よび 細胞 性免 疫誘 導に効果的な新たなペプチドキャリア ーの開発 を目的に実施した。
第 一章ではA
型インフルエンザ ウイルス内部蛋白質由来のCTLエピトープの同定および、同定 されたぺプチドでの免疫による防御効果の検討を行った 。現行の中和抗体誘導を目的とし たインフルエンザワクチンは、表面蛋白質であるヘマグ ルチニンの亜型に防御効果が依存 するため、亜型間での交差防御効果は低い。また、同じ 亜型間でも流行するウイルス株の 抗原性を予測してワクチンを毎年作り直す必要がある。 そこで本研究は、ウイルス内部 蛋白 質 を認 識で き、ウイルス亜型に対する依存性が低 いC
TLを誘導可能なワクチン を開発す るため、ペプチドワクチンの技術を用いた。さらにヒトヘの応用を考え、HLA―A゛2402
分子 を発現するHLA―A24遺伝子導入マウス(A24Tg)をワクチン効果の解析に用いた。まず抗原ペ プチドを結合予測プログラムによりHL
A―A
゛2402
分子に 結合する可能性が高いペプチド配 列を絞り込んだ。次にそのペプチドでA24Tgを免疫し、jnレゴv
DCTL
活性の測定により一 528ー高いCT
L誘導効 果を示 すペプチ ドを選 定した。 そして、 ペプチド免疫によるインフルエン
ザウイ ルスに対 する感 染防御効 果を検 討した。 その結果 、亜型 間で共通 に保存 されているペプ チド3種類を 経鼻投与 した場合 は、異 なる亜型 のウイルスを感染させても無症候または軽 度の体重 減少の みで全マウスが生存し、さらに肺におけるウイルス増殖も有意に抑制され ていた。 しかし 、皮下投与した場合は途中まで非免疫群と同様の体重減少を示し、生存率 は50〜8096で あった。次にワクチン投与経路による防御効果の差を病理組織学的に調べた ところ、 ワクチ ン経鼻投 与群で は細気管 支周囲にT細胞の集積が認められたが、皮下投与 群では認 められ なかった 。以上 の結果に より、内部構造蛋白質から同定されたC
TLエピト ープを用 いたCT
L誘導型 ペプチ ドワクチ ンは、気 道内で感染細胞を排除しウイルスの 増 殖 を 阻 止 する 事 によ っ てウ イ ルス 抵 抗性 を 誘導 す ると 考 えら れ た 。
第二章 では新た なペプ チドキャリアーの探索を行った。リポソームは複数の異なる脂質から構 成され、 二分子 膜が何重にも重なった多重膜構造を形成している。この多重膜リポ
ソーム を作製す るには 時間がか かる事 や生産コ ストが高 い事な どが実用 上の問 題点である。そ こでりポ ソーム に代わる安価で容易に調製可能なキャリアー物質を探索するため、様々な 候補物質 をペプ チドに結 合して C57BL/6マウ スを免疫し、生体内でのエピ卜ープ特異的細 胞傷害活 性を測 定する事で、有効なキャリアーを選別した。その結果、フオスファ
チジル セリン(PS)が最も強 いCTL
誘 導効果 を持つ事 が判明した。さらに、PSの免疫増強機序を解 析するた め、各 種免疫細胞によるPSの取込み能および抗原提示能を調べた。その結果、PSは 通常型樹 状細胞 へ優先的に取り込まれる事で抗原を効率良く抗原提示細胞へ輸送
し 、 エ ピ ト ー プ 特 異 的 な CTLの 誘 導 効 果 を 増 強 さ せ て い る 事 が 明 ら か に な っ た 。
以上、 本研究で は、第 一章で予測プログラムによりCTLエピトープを予測し、1n vivoで免疫 原性ペプ チドを 選別する技術により、感染防御効果があるペプチドを同定、さらに感染防 御試験を 実施し てペプチドワクチンの効果を評価する系を確立した。また、第二章
では実 用的な新 たなペ プチドキャリアーを開発し、その作用機序を明らかにした。これらの研究 成果は、 インフ ルエンザ ウイル スに限ら ず種々の細胞内寄生体に対するCTL
誘導型
ワ ク チ ン の 開 発 、 実 用 化 に お い て 極 めて 有 益 な技 術 を 提供 す るも の で ある 。
よって 、審査委 員一同 は、上記博士論文提出者市橋徹君の博士論文は、北海道大学大学
院 獣医 学 研 究科 規 程第 6条の 規定に よる本研 究科の 行う博士 論文の審 査等に 合格と認 めた。

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