Jpn J Clin Ecol（Vol.23 No.1 2014）34「第22回日本臨床環境医学会学術集会特集」
総説

奨励賞発表論文

Neuropathy target esterase（神経障害標的エステラーゼ）
遺伝子導入マウスの作製
加賀谷大久保徹１）
朋 一３）

割坂田部

貴之２）
貢２）

三木浦村浩美２）
穣２）

大塚正人２）

１）東海大学大学院医学研究科
２）東海大学医学部基礎医学系
３）東海大学伊勢原研究推進部生命科学統合支援センター

Construction of transgenic mice harboring humanPNPLA６ gene encoding neuropathy target esterase
Toru Kagaya１) Takayuki Warita２) Hiromi Miura２) Masato Ohtsuka２)
Tomoichi Ohkubo３) Kou Sakabe２) Minoru Kimura２)
1) Graduate School of Medicine, Tokai University
2) Division of Basic Medical Sciences and Molecular Medicine, School of Medicine, Tokai University3) Education and Research Support Center, Tokai University

要約

我々はこれまでにシックハウス症候群の発症に関する遺伝子素因を検討してきたが、現在その候補として PNPLA6（Patatin-like phospholipase domain containing 6）遺伝子に注目している。この遺伝子産物は神経障害標的エステラーゼ（Neuropathy Target Esterase:NTE）である。シックハウス症候群の原因物質と言われる有機リンの毒性はコリンエステラーゼ（ChE）の阻害作用による急性中毒の他に遅発性神経毒性（OPIDN；Organophosphorus-induced Delayed Neurotoxicity）があり、これが NTE の阻害によるものであるといわれている。したがって、シックハウス症候群と OPIDN との関連性は興味深い。
これまで我々はシックハウス症候群の患者群では NTE 活性が高い傾向にあることに加え、線虫や鶏卵などの実験動物を使用した NTE 酵素活性量と有機リン曝露による生物学的影響について報告してきた。
今回はヒト PNPLA6 遺伝子導入マウス作製に成功したので、その結果を報告する。
（臨床環境 23：34－40，2014）《キーワード》シックハウス症候群、有機リン、Neuropathy Target Esterase、PNPLA6 gene、遺伝子導入マウス
受付：平成26年９月19日 採用：平成26年９月22日
別刷請求宛先：木村 穣〒259-1193 伊勢原市下糟屋143 東海大学医学部基礎医学系分子生命科学
Received: September 19, 2014 Accepted: September 22, 2014
Reprint Requests to Minoru Kimura, Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 143 Shimokasuya, Isehara, Kanagawa 2591193, Japan

臨床環境医学（第23巻第１号）

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Abstract
Sick House Syndrome (SHS) or Sick Building Syndrome (SBS) is a set of several clinically recognizable symptoms without a clear cause thought to be brought on by exposure to volatile agents, such as formaldehyde andorganophosphates(OPs). Neuropathy target esterase (NTE) is a membrane bound serine esterase, and its reaction
with OPs can lead to OP-induced delayed neuropathy (OPIDN) and nerve axon degeneration. Our previous study
showed that the enzymatic activity of NTE was significantly higher (P <0.0005) in the patients compared withcontrols and the population with an AA genotype of single nucleotide polymorphism rs480208 within the PNPLA6gene, in intron 21 of the PNPLA6 gene reduced the activity of NTE. In this study, we generated transgenic micethat highly expressed the PNPLA6 gene, leading to a high activity of NTE. Using these mouse lines we expected
to determine whether a high activity towards NTE corresponds to the high sensitivity for organophosphate exposure or not, and examine the mouse model for SHS or OPIDN.
( Jpn J Clin Ecol 23 : 34－40, 2014)《Key words》	sick building syndrome, organophosphate, neuropathy target esterase, PNPLA６ gene,transgenic mouseⅠ．はじめに

シックハウス症候群は気密性の高い家で、建設の際に使用した揮発性の化学物質のホルムアルデヒド、トルエン、キシレンや有機リンが室内に存在することや農薬散布により、そこに住む人が１ヶ月間などの長期間の曝露を経て、倦怠感・め
図１

まい・頭痛・湿疹・のどの痛み・呼吸不全などの種々の有機リン慢性的な症状が現れる疾患である。しかし、同一環境でも個人によって症状がでないこともあるたすることができた３）。ヒト PNPLA6 遺伝子は染色め、遺伝要因があると想定される。

体19p13.2に存在する６）。一般的に、有機リンの毒

我々は有機リン代謝に関与する神経障害エステ性としてはコリンエステラーゼ（ChE）の阻害作

ラ ー ゼ（Neuropathy Target Estrase；NTE）１） と、用が有名であるが、そのほかに遅れて症状が出る

そのタンパクをコードする遺伝子の PNPLA6 に

遅 発 性 神 経 毒（Organophosphate-induced delayed

絞って研究を行い、これまでにシックハウス症候neuropathy：OPIDN）があり、これが NTE の阻害群患者では NTE 酵素活性が高いことを発表してによるものであるといわれ、シックハウス症候群

きた。また鶏卵を使用した実験では、農薬に含２, ３）のモデルとしても考えられている１, ７, ８）。

まれる有機リン DDVP（ジクロルボス）４）の投与にNTE 欠損マウス（PNPLA6 ノックアウトマウ

より、アセチルコリンエステラーゼと同様の即時ス）のホモ型では、胎児期８日頃に死亡し、NTE性の NTE 阻害効果が現れた事を報告した 。

活性の低いヘテロ（+/−）型マウスでは出生はす５）

現在、新築の家屋では建材などに防虫等の目的るが、正常なマウスと比較して多動性であることで使用されるホルムアルデヒドとクロルピリフォが報告されている６, ９）。また野生型マウスに NTEス（図１）に規制値があるが、未だ農薬・殺虫剤の阻害物質である ethyl octylphos phonofluoridateに DDVP 等の有機リンは多用されている。

（EOPF）を少量投与した場合もまた多動性症状が遺伝子多型マーカーを用いた遺伝子相関解析に顕著に認められる６）。以上のことから、遺伝子破より、我々の研究グループはシックハウス症候群

壊または阻害剤投与による NTE 活性の低下が、の疾患感受性遺伝子として神経障害標的エステ神経毒性効果に影響を与えていることが明らかにラーゼ（NTE）をコードする PNPLA6（Patatin-likeされた。

phospholipase domain containing 6）遺伝子を同定

また最近の NTE に関する知見では、NTE は膜Jpn J Clin Ecol（Vol.23 No.1 2014）36

結合型の lysophospholipase であり10）、NTE 活性の中心であるセリン残基が有機リンと結合するとき11）、さらに化学構造の変化が引き起こされ（アルキル基の除去）、これが遅発性神経毒を発現させるという報告がある１）。
我々はいままでに PNPLA6 遺伝子産物である
NTE がシックハウス症候群の患者群で活性が高い傾向にあること ３）、そして線虫や鶏卵などを用いた動物実験から NTE 活性が有機リン曝露により生物学的影響を受けることについて報告してきた５）。また有機リンの培養細胞に対する影響について、この遺伝子の一部を導入した培養細胞の

図２

ROSA26部位を利用したトランスジェ
ニックマウスでの安定的遺伝子発現

NTE 活性の上昇を報告した（第22回日本臨床環境医学会学術集会）。

lox2272）で組換えを起こさせるという方法であ本研究では、NTE を通した有機リンの生物学る。

的影響を更に理解するために、動物個体での影響

現在では CRE 酵素の供給は DNA からではなを調べることを目的として、ヒト PNPLA6 遺伝子

く、mRNA 注入（導入ベクター DNA との同時注を導入したマウスを作製したので報告する。

入）による発現によっている12）。これまでにすでこのようなマウスを利用してシックハウス症候群や OPIDN の発症機構を解明していくことが最に多くの実績例があったが、今回の PNPLA6 遺伝子にも応用することとした。
話がやや複雑になるが、通常導入ベクターのベ終目標である。

Ⅱ．ヒト PNPLA6 遺伝子導入マウスの作製

クター部分（大腸菌で大量に DNA を得るためのプラスミド DNA）も遺伝子導入マウスでは発現抑一般に遺伝子導入マウスを作製する場合は、マ制に関わることが多く、その部分を ROSA26に遺ウス受精卵の融合前の精子に由来する核（前核と伝子導入と同時に、除去するための FLPe-FRT シいう）に DNA を注入するが、注入した DNA はマステムを導入ベクターに組み込んでいたが、162ウス染色体の一カ所にランダムに挿入される（図個の受精卵に injection を行い、出生仔を20匹得２）。つまり我々が挿入位置を決定することがでた。しかし、その中に PNPLA6 遺伝子を持つ個体きない。その結果、導入した遺伝子の発現がまちは得られなかった。

まちで、せっかく導入した遺伝子が染色体の不活

その理由として、PNPLA6 遺伝子の発現には全領域に挿入された結果、発現しない例も多々観察

身で強力に発現する CAG プロモーターを用いてされた。そこで、我々のグループは導入遺伝子がいるため、このタンパク質が過剰に発現するとか指定された位置に導入され、遺伝子発現が必ず約えって生存には不利な可能性が考えられた。

束される系を開発した 。このシステムでは導入

そこで上述の FLPe-FRT 配列を除いた BFH ベ12）

DNA がマウスの第６染色体上にある ROSA26といクターを構築し（図３）、上述の発現抑制領域を残う染色体活性化領域の遺伝子に挿入されるようにしたまま、ROSA26部位に PNPLA6 遺伝子を導入

予 め ROSA26遺 伝 子 に 細 工 が 加 え ら れ て い る。

し、一旦発現抑制をかけた遺伝子導入個体を得

Cre-loxP というもともとバクテリアが持っていたて、その後に FLPe-FRT システムで過剰発現を検組換えの系をマウスでも働かせ、CRE という組換討する系を考え、実施することにした。

え 酵 素 が ROSA26上 の loxP 配 列（loxJT15とその結果、384個の受精卵に BFH DNA を導入lox2272）と導入ベクター上の loxP（loxJTZ17とし、38匹が出産、そのうち hNTE1〜 hNTE8まで

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Ⅲ．PNPLA6 遺伝子導入マウスにおける遺伝子発現

導入遺伝子は PNPLA6 遺伝子の下流に一つのmRNA から複数種のタンパク質を発現させるための IRES（Internal Ribosome Entry Site）配列を配置し、その下流にレポーター遺伝子、GFP（GreenFluorescent Protein）を配備した。GFP はもともとクラゲのタンパク質で自身が蛍光を発するため、上流の目的遺伝子発現の簡便な指標として広く用いられている（図４）
FLPe と交配後のマウスについて GFP の発現をチェックしたところ、図５示すような結果が得られた。写真は胎生18日目のマウスを示しているが、同様の手法は DNA 解析に用いる際の耳片においても観察することができる。すなわち耳で蛍図３

ヒト PNPLA6 遺伝子導入ベクター

光を観察出来るマウスは PNPLA6 の発現が行われていると推測出来る。の計８個体（雌雄それぞれ４個体）が遺伝子導入

これらマウスの NTE 活性測定のため、胎仔期個体として得られた（BFH マウス）
。ベクター由から３週齢の段階で PNPLA6 遺伝子導入マウスと来の発現抑制領域を排除させるためにヘテロ型

Wild-type マウスから脳を採材し、脳内の NTE 酵BFH マウス（BFH +/−）とヘテロ型 FLPe マウ素活性について検討した（図６）。

ス（FLPe +/−）を交配し、BFH +/− FLPe +/−その結果、対照である Wild-type マウスの NTEマウスの取得を目指した。FLPe 組換え酵素も活性と比較して、PNPLA6 遺伝子発現マウスの脳CAG プロモーターによって発現するマウスを用

では NTE 活性が6.5倍程度高くなっていることがいているため、受精卵の時期に FLPe によって組認められた（図６）。

換えを起こすことが期待される。このマウスではNTE 活性の測定は常法にしたがっているが、BFH マウスがもつ FRT で挟まれた neo- 発現抑制

paraoxon 耐性で mipafox 感受性の活性を NTE 活性領域が切断排除されるので、Rosa26領域に存在すとしている３, ６）。

る CAG プロモータ活性により PNPLA6が発現し、さらに IRES 配列が存在することによってこの転写産物に翻訳システムが再会合するので、緑色蛍Ⅳ．考察

本論文では NTE をコードする PNPAL6 遺伝子光タンパク質（GFP）が全身で高発現することが期待される。
現在までの結果では、94個体中10匹；10.6% が目的の個体と言える。ただし、PCR による DNA解析結果は、FLPe によって予想通り発現抑制部分が抜けている細胞と抜けきっていない細胞が同一個体のなかで混在するモザイク個体であることが判明した。子孫への伝達率の低さはそれを物語っているかもしれない。また一部の遺伝導入個体に成長の遅れが観察された。

図４

ヒト PNPLA6 遺伝子導入マウスの作製

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高発現のさしたる悪影響は観察されていない（未発表）。現在は主に脳での影響に注意しているが、個体での解析においては各臓器での発現比較も含めた総合的な判断が必要と思われる。
Winrow らはノックアウトマウスを作成し、胎生期９日目ぐらいで胎児は死亡するとしている６）。これはその後に胎盤の血管形成の影響と判明したが９）、それでもこの PNPLA6 遺伝子が生物種を超えて保存され、植物やバクテリアに至るまでその活性中心付近の構造が類似していることを
図５考えると、単にセリン残基を活性中心とするエス

遺伝子導入マウスでの蛍光発現（胎生期18日目）

テラーゼの活性以外に何らかの生命に共通の必須機能を持つタンパク質の可能性が考えられる。
ちなみに他の生物種ではショウジョウバエではPNPLA6 相 同 遺 伝 子 欠 損 は グ リ ア の 神 経 へ のhyperwrapping、進行性神経変性を招き、フォスファチジルコリンが上昇、また、zebrafish では運動ニューロンの異常が観察される14）が、線虫ではRNAi では異常なし、酵母では PC 合成の調節に関与するものの正常、とあまり遺伝子欠損が影響を受けない生物種もある。
マウスで Cre-loxP 系を用いて脳でのみ遺伝子を欠損させた例が2004年に報告されているが、海馬、プルキニエ細胞等の神経細胞消失と空胞変性

図６

遺伝子導入マウス（mosaic）脳でのNTE 酵素活性量（３週齢）が観察されている。行動異常も報告されている15）。
一方、運動ニューロンの疾患で PNPLA6 遺伝子に変異を持つ家系が知られていることから、この導入マウスを用い、高発現マウスを作成出来たこ

タンパク質が神経系に取って重要なことは間違いとを報告した。PNPLA6 ベクターの GFP マーカー

なさそうである16, 17）。

発現と共に、確かに NTE 酵素活性の高いマウス

器官や組織によっても NTE タンパク質の機能が得られたことから、我々の遺伝子導入マウス作の貢献度は異なると考えられるが、今回の我々が製システムは有効に動いていると考えられる 。

作製した遺伝子挿入マウスのような産生過剰例はマウスにおいて高発現させた場合には、調べるショウジョウバエでしか報告されていない。ショ

限りすべてがモザイク個体であり、成長の遅い個ウジョウバエの場合、細胞内膜構造異常・空胞変体も現れた。高発現の影響が個体に取っては不利性・細胞死が生じ、フォスファチジルコリンが減な状況となることが考えられ、その原因として臓少する。

12）

器別の発現量の差も追究して行かなくてはならな細胞レベルの研究や 18～21）や今後の曝露実験の結果が待たれるが、ショウジョウバエのケースと同い。
このことは PNPLA6 の過剰発現が個体維持にとって不利かもしれないと推測させるが、腎臓由来の293細胞と我々のベクター を使用する限り、
13）

様、マウスでも NTE は器官・細胞内で適量発現されることが重要と考えられる。
Winrow らはヘテロノックアウトマウスと正常臨床環境医学（第23巻第１号）

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マウスに有機リンを投与した結果から、マウスの

７）Francis BM, Metcalf RL, et al. Toxicity of organopjos-PNPLA6 遺伝子の発現低下つまり NTE 発現の低phorus esters to laying hens after oral and dermal

下が多動性などの神経症状を引き起こすと結論していたが６）、これに対しては主に毒性学の研究者から有機リン投与の場合、発現低下が問題ではな

administration. Environ. Sct Health B20: 73-95, 1985
８）Johnson MK. The Anomalous Behaviour of Dimethyl
Phosphates in the Biochemical Test for Delayed
Neurotoxicity. Arch Toxical 41: 107-110, 1978

く、NTE の活性中心での有機リンとの共有結合

９）Moser M, Li Y, et al. Placental Failure and Impaired

後、有機リンのアルキル基が欠落するいわゆるVasculogenesis Result in Embryonic Lethality for

Aged Esterase の産物が OPIDN 様の症状を引き起Neuropathy Target Esterase-Deficient Mice. Mollecular

こしている可能性が高いとの指摘がある 。我々はNTE と有機リンの複合化合物が種々の神経症状を引き起こす可能性があると考えており、OPIDN

and cellular biology, 1667-1679, 2004
10）Quistad GB, et al. Evidence that mouse brain neuropathy
target esterase is a lysophospholipase. Proc Natl Acad
Sci 100: 7983-7987, 2003について言えば、後者の可能性が高いのではない

11）Atkins J, Glynn P. Membrane associated of and criticalかと考える。この問題を明らかにするには分子的residues in the catalytic domain of human neuropathyにはまず、その複合化合物や Aged Esterase を確実に定量する系が必要であり、今後 NTE 高発現細胞における質量分析をするとともに、今回作製に成功したマウスに DDVP などの有機リンを投与し、OPIDN やシックハウス症候群様の症状を惹起させるモデル系を提供出来ればよいと考える。
文献
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