SPring-8 BL45XUで BioSAXS 現状

引間孝明
理化学研究所 放射光科学総合研究センター
ビームライン基盤研究部 生命系放射光システム開発ユニット

SPring-8 主な小角散乱ビームライン¾ BL45XU 理研・構 生物学I (SAXS, WAXS)
バイオ 物質科学,理研内利用(60-80%) 一般利用(20%)
創薬等PF事業（上限20%）¾ BL40B2 構 生物学II (SAXS, WAXS)
バイオ 物質科学,一般利用¾ BL40XU 高フラックス（SAXS, μBeam SAXS）
バイオ 物質科学,一般利用¾ BL03XU フロンティアソフトマター開発産学連合 (SAXS,WAXS, USAXS)
物質科学,連合体専用利用※一般利用：
年度2回の課題募集
創薬等PF事業： 通年で課題募集（SPring-8 稼働BLs56本, 計画・建設中BLs1本）

理研構 生物学I(BL45XU)

SAXS-station
エネルギー
エネルギー分解能
ミラー
ミラー集光比フラックス@試料位置
ビームサイズ@検出器面

6.7 – 14.0 keV (波長 0.9 Å – 1.85 Å)'E/E < 10-4
Rh-coated K-Bミラー
2.48 : 1
5 x 1012 photons/sec @12.4 keV (1.0 Å)
350 Pm (h) x 150 Pm (v) 非整形

SAXS実験ステーション
検出器

Φ4㎜
ビームストップ(BS)

Upper stream

真空パイプ

下流真空パイプ
ピンホール

TC3 Slits(Scatterless slits)

溶液セル¾ 下流真空パイプを45cm～3.5mに変更可能¾ １スリット ＋ １ピンホール光学系¾ ３ヶ所でX線強度を常時測定
PinPhoto
内蔵BS

Pinhole
MIC
寄生散乱

検出器

X線ビーム
試料から散乱散乱プロファイル
（ビームサイズ350x150μm2）

TC3 Slits ビーム位置モニタ(RIGI)

0試料

下流真空パイプ
50(450~3500)

真空パイプ
5100mm (TC3)or 9600mm (TC2)

カメラ距離と測定可能ｑレンジ
1.0Å (12.4keV)
検出器

PILATUS3X
2M

1.5Å (8.3keV)

カメラ距
離(mm)

dmin (Å)

dmax (Å)

qmin (Å-1)

qmax(Å-1)

dmin (Å)

dmax (Å)

qmin (Å-1)

qmax (Å-1)

450

2.9

112

0.056

2.182

4.1

235.8

0.027

1.519

2000

14.4

761

0.008

0.436

19.5

1165

0.005

0.324

3500

27.6

1475

0.004

0.227

34.5

2066

0.003

0.182

※500mm単位で調整可、ビームストップφ4mm
q = 4S sinT / O = 2S / d¾測定試料

カメラ距離450mm

粒計サイズからカメラ長を選択

カメラ距離3500mm

BL45XUで利用可能な検出器¾ PILATUS3X 2M 2014年12月インストール⇒溶液散乱, 時間分割測定, 高分解能測定◎高 読み出し (max. 500 Hz),
大面積（253.7x288.8mm2）
フォトンカウンティング¾ 6” X-ray Image Intensifier (+ ORCA FLASH4.0)⇒繊維回折, 時間分割測定◎ギャップ ない画像
高 読み出し (max. 33 Hz)¾ Flat Panel Sensor⇒SAXS・WAXS同時測定

PILATUS3X 2Mを用いたBSA散乱曲線測定
4F4S.pdb (crysol)
500mm, BSA3.1mg/ml, 0.5sec x 202000mm, BSA3.1mg/ml, 0.5sec x 203500mm, BSA3.1mg/ml, 0.5sec x 20

4103Intensity (a.u.)

10210110010-1104567 8 920.0134567 8 920.134567 8 912-1

q (Å )

カメラ長変更により 0.0045 < q < 1.5 で広ｑ範囲で溶液散乱測定が可能

溶液散乱測定用セルと測定ステージ

CCDカメラガード
Pinhole4mm

試料観察用同軸カメラ
気泡、コンタミ 混入を監視

溶液セル
3mm

2mm

ピンホール付ミラー

25Pｌ溶液セル
光路長 3mm（波長１Å用）
20Pm石英窓
放射線ダメージ低減 ため垂直方向に移動しながら測定

マイクロ
イオンチェンバー
MIC

溶液セルフォルダー
(制御温度：4～80℃）

入射X線溶液散乱測定
ビームラインセットアップ（・波長選定、波長変更）
・カメラ距離選定、カメラ距離変更
・検出器選定、検出器変更
・スリット調整・ビームストッパ、試料位置調整※青字

BLスタッフサンプル調製

流れ

標準サンプル測定（カメラ長検定）
周期長既知 物質・ベヘン酸銀 (58.4Å)（ビーム位置決定）（水 散乱強度測定）（分子量検定用）
分子量既知 タンパク質・lysozyme (14kDa)
・BSA (66kDa)
・glucose isomerase (173kDa)
etc….

・溶液条件設定・タンパク質濃度調製

サンプル測定・ダメージ確認・濃度依存性測定
データ処理
・二次元→一次元

データ解析

ビームタイム 一回当たり24時間

ビームライン セットアップを決める要素
・測定される散乱パターン“散乱ベクトル（qあるい S）”ｖｓ”散乱強度（I(q))”
であらわされる。
・大きな構
情報 qが小さい領域に、小さな構情報 qが大きい領域に観測される。

q = 4πsinθ/λ1） X線 波長 (BL45XUで 基本 １Å）S = 2sinθ/λ2） カメラ距離3） 検出器 受光面積 （現在 PILATUS3X 2Mで一択）
組み合わせにより、自分 サンプルに適したqレンジを選択する。
low q: ギニエプロット（～0.7 < q Rg <1.3）が引ける範囲
high q: モデリングに q Rg～ 8(dammin）, >10以上(gasbor)

自分 サンプルに適した測定条件になるようカメラ距離を選択。
¾初期スクリーニング時 ギニエ解析で単分散性 判断がし易いようにlow q重視¾モデリング用 精密測定で 、必要なhigh qを重視

サンプルについて¾0.5mg/ml～15mg/ml程度

濃度領域で測定を行う。

¾測定に必要な容量 25～50μｌ程度である。
¾データ解析 際に分子間相互作用 効果を考慮する必要がある。
⇒異なる蛋白質濃度を数点（4,5点程度）選んで測定を行う。

トータルとして数ｍｇ¾バッファー

サンプルが必要サンプルに適したpH、塩濃度等を適宜選択する。
（高濃度溶液でバッファー電子密度が上がる で注意）

¾濃度 正確に測っておくこと。
¾単分散であること！
⇒ゲルろ過、DLS、超遠心分析などで確認したら確実。
¾最終的な濃度に調製したときにaggregation

平均電子密度water

0.334 e-/Å3protein

0.42 e-/Å3RNA

0.46 e-/Å3DNA

0.55 e-/Å3ない状態であることが必須。

¾ダメージを避けるためにDTTや2-メルカプトエタノールをバッファーに加える場合もある。

放射線ダメージ低減対策

3.7 mg/ml BSA at 20℃, 1 sec. 露光 x 15 フレーム

露光開始2-3秒後にダメージが 見受けられるセル静止状態で中心にみ連続照射

ダメージ 影響られない見受け

露光中に溶液セルを動かし露光点をずらす(0.1mm/sec)

セル 移動により放射線ダメージを低減させられる
ただし、ダメージ 大小 試料に大きく依存露光時間・枚数

標準的な推奨値① セルを移動させながら、1秒露光 x 20フレーム 連続測定
ダメージが避けられなけれ ・・・② セルを移動させながら、（1秒露光+1秒無露光で10フレーム
間欠測定
それでもダメージが避けられなけれ ・・・③ アッテネーターで入射強度を5%に落とし、セルを移動させながら、10秒露光x20フレーム 連続測定
それでもダメージが避けられなけれ ・・・④ 入射強度をさらに落とし、セルを静止で長時間露光ｘ複数フレーム測定。あるい 、バッファー条件 再検討

測定用GUI（DataCollector3）
自動表示
ファイル名

露光時間 撮影枚数

ALBULA

Click !

試料濃度ログ
書出し

一次元化

ファイル名、試料濃度と（露光時間、撮影枚数）を設定して測定¾ ALBULAで 画像表示、 Header log file 出力、一次元平均化（&除算）測定データ一次元化

readcommand

DataCollector

DataProcess

散乱データ 一次元化、バッファー 引き算、Gunier解析によるRg まで 自動評価が可能
利用事例１
Conformational Changes of Molecule by Light-induced Reaction
LOV1
LOV2
kinasekinaseOkajima et al 2013 J. Mol . Biol.

Stopped Flowセルを用いた二液混合
時分割測定

070140210280

Assembly reaction of ferritin
池口先生 (創価大学)提供
ユニソク製ストップトフローシステム¾ 混合比: 1:1, 6:1, 9:1¾ インジェクション容量: 50 ~ 500 PL¾ 時間分解能: 最大250 Hz (PILATUS3X 2M使用時)

利用事例2
Initial Folding Intermediates of β-Lactoglobulin with Non-Native α-Helix
Rg (Å)[θ]222(deg cm2 dmol-1)

35.1-3100

23.5-9000< 300 μs

21.2-9000

18.1-6500

28 ms

Schematic representation of the early folding events of βGL- Native state- I1 state- I0 state- Kinetic intermediate statein the presence of TFE

Pair distribution function of the native andkinetic intermediate state of βLGThe time-dependent changes of Rg2 in thepresence and absence of TFE

The time-dependent changes ofPorod volume in the presence andabsence of TFE

Konuma et al in press J. Mol . Biol.

First and Slow Time-Resolved Study by SAXS

PiPi

ATP

Ser431
Thr432(pS/pT)

Pi

Ser431
Pi Thr432

15 ATP/Day/KaiC(S/pT)

Ser431
Thr432(pS/T)KaiAC complex

KaiBC complex

Ser431
Thr432(S/T)

Ferritin assembly reaction(5 msec resolution)

Circadian molecular beating of KaiC
Maruyama et al 2011 EMBO J.

Sato et al 2016 Biochemistry

SEC-SAXS

導入セル観察画像(X線と同軸観察)

キャピラリー
フローセル

Superdex200
10/300GL

X線
インジェクション
バルブ

Rg

I0

OD280

In-vacuum キャピラリーフローセル(Φ2mm)型
溶液散乱測定システム

オンタイムデータ処理システム(DataProcess)オートサンプラー（SEC-SAX）

導入

キャピラリー
フローセル

Superdex200
10/300GL

X線
インジェクションバルブ

FPLC用オートサンプラー
導入(2016年2月)

In-vacuum キャピラリーフローセル(Φ2mm)型
溶液散乱測定システム

2016B期より試験供用開始予定

BL45XUで利用可能なオフライン装置• 小型冷却遠心器 2台• インキュベーター(４℃ｘ２台、任意温度ｘ１台)• 吸光度計（Nanodrop2000)• ACTAシステム（SPring-8共通機器、要カラム持ち込み）• ブロックインキュベーター 3台• 微量透析システム• リキッドハンドラー（SBSプレートへ 分注･希釈）BL45XU 利用方法について• 理研所属（客員含む）

方通年利用申請が可能• JASRI共用枠で 利用申請も可能（前後期2回）• 創薬等プラットフォーム事業で通年で課題申請を受付中