Press Release2023 年 9 ⽉ 13 ⽇
京都⼤学アイセムス（⾼等研究院 物質−細胞統合システム拠点）

細胞外カルシウムが不要細胞除去に重要！
細胞膜貫通領域どうしを近づけるのりの働きの発⾒・⽣体内からの不要細胞を除去する際に⽬印となるホスファチジルセリン（PS）を細胞表⾯に提⽰するスクランブラーゼ※1 の活性化機構を明らかに
・細胞外カルシウム※3 がスクランブラーゼの膜貫通領域のポケットに⼊り込み、膜貫通領域どうしを近づけることで活性化していることが明らかに・カルシウムイオンに、細胞内への流⼊に伴うシグナルとしての役割、細胞外での細胞どうしを接着する以外の働きがあることが明らかに京都⼤学アイセムス（⾼等研究院 物質−細胞統合システム拠点）の鈴⽊淳教授、チョウ・パンパン特定研究員、圓岡真宏特定助教、蚊⾕光⽒（⼤学院⽣）、童友⽒（⼤学院⽣）、ダ
ニエル・パックウッド講師等の研究グループは、アイセムス連携 PI の⽥中求特任教授、鈴⽊量特定助教、徳島⼤学の⼩迫英尊教授と協⼒し、⽣体内において不要な細胞を除去する分⼦メカニズムを明らかにしました。この成果は、9 ⽉ 11 ⽇に英国科学雑誌ネイチャー・コミュニケーション誌に発表されました。
⼈の⽣体内では毎⽇ 10 億−100 億個の細胞が細胞死を起こします。細胞死を起こした細胞が⽣体内に残ると細胞内容物が漏れ出て炎症を引き起こすため、速やかにマクロファージ等の貪⾷※2 細胞に除去される必要があります。死細胞は、貪⾷細胞に⾒つけてもらうために、スクランブラーゼというタンパク質を⽤いて細胞膜を構成する脂質の⼀つホスファチジルセリン（PS）を“死んだ⽬印”として細胞表⾯に提⽰します。しかし、スクランブラーゼが死細胞で活性化する仕組みについては、完全には理解されていませんでした。
今回、研究グループは、スクランブラーゼの活性化には細胞外カルシウムが重要なことを発⾒しました。通常カルシウムは、細胞外から細胞内に流⼊することで様々なタンパク質を活性化することが知られています。しかし、スクランブラーゼの活性化には、細胞外から細胞内まで⾄らず、その途中の膜貫通領域へのカルシウムの流⼊が重要であることが分かりました。この際、カルシウムが“のり”として作⽤することで、２つの膜貫通領域を近づけることでスクランブラーゼが活性化することが⽰されました。
今回対象としたスクランブラーゼは脳の神経細胞に強く発現しており、不要な細胞の除去により脳の健康維持に関与していると考えられています。今後、⾒出された不要細胞除去システムの理解に基づき、それを⼈⼯的に操作することで、脳内における不要細胞を除去し脳内健康を維持する新しい技術の開発が期待されます。

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1. 背景⼈の⽣体においては、毎⽇ 10~100億個程度の不要細胞が細胞死を起こし、同時にそれを補うために細胞増殖が起こることで、臓器の恒常性が動的に維持されています。このバランスが崩れた状況が病気の状態であるともいえます。細胞死を起こした細胞は、細胞膜を構成する脂質⼆重膜の内側に局在するリン脂質のホスファチジルセリン（PS）を”死んだ⽬印”として細胞表⾯に提⽰し、貪⾷細胞は PS に対する受容体によって PS を認識し、死細胞を貪⾷しています（図 1）。PS が”死んだ⽬印”として機能することは 1980 年代より⽰唆され、PS を細胞表⾯に露出させるタンパク質、スクランブラーゼの存在が仮定されていましたが、その分⼦的実体は⻑らく分かっていませんでした。鈴⽊教授らのグループは、これまで世界に先駆けて TMEM16 ファミリー、Xkr ファミリーといった PS を露出するスクランブラーゼのファミリーを同定し、その機能解析を進めてきました（2010 Nature,2013 J Biol Chem, 2013 Science,
2014 J Biol Chem）。また、スクランブラーゼの細胞膜への局在に必要なサブユニット、活性化に必要なドメイン、活性化因⼦も同定しています（2016
PNAS, 2017 PNAS, 2021 Mol Cell）。
⼀⽅でスクランブラーゼがどのように活性化するのかという謎は残されていました。今回、細胞外カルシウムがスクランブラーゼの活性化に必須であること が 分 か り ま し た （ 2023 NatCommun）（図 2）。

2. 研究内容と成果
研究グループは、神経細胞に強く発現している Xkr4 に注⽬して研究を進める中で、細胞外カルシウムが無い場合、Xkr4 が活性化できないことを発⾒しました。カルシウムは、細胞内に流⼊し様々なタンパク質を活性化させることが知られています。そこで、⼈⼯的に細胞内にカルシウムを流⼊させるカルシウムイオノフォアを⽤いたところ、Xkr4 の活性は変化せず、細胞外のカルシウムが Xkr4 活性化に重要なことが分かりました。次に、Xkr4 においてカルシウムが結合するサイトを探索したところ、驚くことに、細胞外領域ではなく、細胞膜貫通領域にカルシウム結合サイトの候補部位があることが⽰唆されました。つまり、細胞膜に埋まっている箇所に候補がみつかったということです。実際に、1 つ⽬の膜貫通領域（TM1）に存在する 123 番⽬のアスパラギン酸,と 127 番⽬のアスパラギン酸、3 つ⽬の膜貫通領域（TM3）に存在する 310 番⽬のグルタミン酸に変異を導⼊する（他のアミノ酸に変える）と Xkr4 が活性化できないことが分かりました。
カルシウムイオンは正電荷を持つことから、これら３つの負電荷をもつアミノ酸と相互作⽤する

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ことで、TM1 と TM3 を接着させる“のり”として機能することが⽰唆されました。ではこれをどのように証明すれば良いのでしょうか？
これを⽰すために研究グループは１つのアイデアを思いつき実験を⾏いました。具体的には、123 番⽬のアスパラギン酸と 127 番⽬のアスパラギン酸の中央に位置する 125 番⽬のグリシンをシステインに変換し、同様に 310番⽬のグルタミン酸もシステインに変換しました。この変異体（G125C/E310C）はそれ⾃⾝では活性化しませんが、酸化剤で処理すると２つのシステインがジスルフィルド結合※4を形成し活性化することが分かりました。また、310 番⽬のグルタミン酸を、正電荷をもつリジンに変換すると、123 番⽬のアスパラギン酸と 127 番⽬のアスパラギン酸と塩橋※５を形成し活性化することが⽰されました（図 3）。以上の結果は、TM1 と TM3 を近づけることでXkr4 が活性化することを⽰しています。最後に分⼦動⼒学シミュレーションを⾏い、カルシウム結合サイトにカルシウムが結合すると、TM1と TM3 が近づくことに伴い、タンパク質の構造変化が誘導されることを⾒い出しました（図 4）。
これまで細胞外カルシウムは、細胞外空間で接着分⼦に結合することや、細胞内に流⼊することで様々なタンパク質を活性化することは良く知られていましたが、タンパク質の膜貫通領域に⼊り込み“のり”として機能することは予想外の発⾒であり、研究分野に対して⼤きなインパクトがあると考えられます。

3. 今後の展開
今後、同様の分⼦機構で活性化する様々なタンパク質の存在が明らかになることが予想される点において、本研究は⼤きな意義をもっています。また、スクランブラーゼ Xkr4 は神経細胞において不要な細胞だけなく、⽣きた細胞の不要な領域を部分的に除去する際にも機能すると考えられています。今後、神経変性疾患や精神疾患がどのように発症するのか、そのメカニズムを理解するうえにおいても、本研究は重要な知⾒をもたらすと考えられます。

4. ⽤語解説
※1※2※3

スクランブラーゼ：細胞膜のリン脂質を双⽅向に輸送することで、“死んだ⽬印”となるホスファチジルセリン（PS）を細胞表⾯に露出する。
貪⾷：マクロファージなどの貪⾷細胞は、死んだ細胞を速やかに貪⾷することで炎症を防ぐと考えられている。
カルシウム：細胞外空間において接着分⼦に結合することで機能を制御し、細胞内に流⼊す

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※5

ることで様々なタンパク質を活性化することが知られている。
ジスルフィド結合：２つのシステイン残基が共有結合することで形成される結合。
塩橋：タンパク質のなかで正電荷をもつアミノ酸（アルギニンやリジン）と負電荷をもつアミノ酸（アスパラギン酸，グルタミン酸）の側鎖間に働く弱いイオン性相互作⽤。

5. 研究プロジェクトについて鈴⽊ 淳
1. JST-CREST (1199566)
2. AMED-FORCE (19191470),
3. AMED-PRIME (15665392),
4. Grants-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Dynamic regulation of brain
function by Scrap & Build system” (KAKENHI 16H06456),
5. Joint Usage and Joint Research Programs of the Institute of Advanced Medical Sciencesof Tokushima University,
6. Takeda Science Foundation
7. WPI-iCeMS
圓岡真宏
1. MEXT Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (KAKENHI 20K06486)

6. 論⽂タイトル・著者“Extracellular calcium functions as a molecular glue for transmembrane helices to activate
the scramblase Xkr4”（細胞外カルシウムはスクランブラーゼXkr4を活性化するための膜貫通領域の分⼦接着剤として機能する）
著者：Panpan Zhang, Masahiro Maruoka, Ryo Suzuki, Hikaru Katani, Yu Dou, Daniel M.
Packwood, Hidetaka Kosako, Motomu Tanaka, and Jun Suzuki
Nature Communications｜DOI: 10.1038/s41467-023-40934-2

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