博 士 （ 医 学 ） 井 戸 坂弘 之
学位論文題名Fibrin :N/Iatrix ProvidesaSuitable ScaEf 01dforBone
MarrOWStromalCe11STranSplantedintOInjuredSpinal
COrd： ANOVelMaterialforCNSTiSSueEnglneerlng（フィブ，リンは脊髄損傷部位への骨髄問質細胞移植における適切な足場となる〜中枢神経組織工学の新たな材料として〜）
学 位論文内 容の要旨

［背景と目的］
脊髄損傷による障害には未だ確立された有効な治療法が無く、多くの患者及びその家族が後遺症、介護などに苦しんでいる。近年の基礎研究により細胞移植治療が脊髄損傷患者の機能回復に対し有効に働く事実が示唆されている。しかしながら、移植技術の安全性や有効性に関してはいまだに確立された方法がない。特に脊髄組織は脆弱かつ繊細な構造でありながら、非常に狭い環境にある為、いかに効率的に移植細胞を生着させ、しかも投与による侵襲を抑えるかという大きな問題がある。今回われわれは、いずれも自己骨髄及び自己血より採取可能な骨髄問質細胞(
BoneMarrow Stromal Cells：BMSC)とフィブリンに着目し、これらを用いてフィブリン基質が有効な
scaffold（足場）となり得るかどうかにつ いての研究を行った。
［ 材料と方法］
く 移植細胞＞
BMS
Cはgreenfluorescentp
rotein(GFP)を発現させた生後4ー8週のトランスジェニックマウス
よ り採取し、3代継代培養した ものを使用。
く フィブリンの作成＞
市販されているボルヒール＠を用い、移植に適したフィブリン作成のためA液(
2，．5、10mg/ml
フ ィ ブリ ノー ゲン ）と B液 (20U/mlの トロ ンビ ンと2mMのCaCl2を同体積で混合）を用意した。
重 合に要する時間は濃度に依存する。
く フィブリン基質内でのBMSCの培養冫
A液（ フィ ブリ ノーゲン10mg/ml) 100Hlと、B液にBMSC（lxl04)を 含んだ混合B液100111を重合 させフィブリンを形成し2週 間培養。フィブリン基質の3次元構造を走査電子顕微鏡、BMSCの存 在を螢光顕微鏡で確認した。
く ラット脊髄hem
isection
モデ ルの作成と移植＞
成体S
prague―Dawleyラット(200ー250g)を用いて1．5％イソフルレンと笑気：酸素(70:30)の吸入 麻酔を行なった。手術顕微鏡下で第8胸椎椎弓切除し28G針で硬膜切開後、右背側脊髄に小切開 を加えエチレン・テトラフロロエチレン共重合体(ETFE)製の留置針を使い2．5mmの長さの右半切 モデルを作成した(Fig.
1）。それらを以下の3群を分類。
A群（n=ニ5）：リン酸緩衝食塩液(PBS)を摘出腔ヘ注入（対照群）。
B群（n:ニ5）：BMSC (3xl05)を含む15 ulの懸濁液を摘出腔ヘ注入。
C群（n:ニ9）：2..
5mg/mlのフ ィブリノーゲンを含んだ7．5UlのA液と、BMSC(3xl05)を含むB液
7． 5ロ 1を 混 合 し 柔 ら か な グ ル 状 と た っ た フ ィ ブ リ ン 15ハ 1を 摘 出 腔 へ 移 植 。
―6 ‑すべての群で移植後はサイクロスポリンA l
Omg/Kgを連日皮下に投与。B
asso−BeattieーBresnahan(BBB)ス コ ア を 用 い て 、 移 植 後 1， 7， 14， 21， 28日 目 に 右 下 肢 の 運 動 機 能 を 評 価 した 。
く組織学的解析＞移植4週後にホルマリンで潅流固定し移植 部を摘出し4mmの連続軸状断切片を作成。GFP、GF
AP(GlialFibrillaryAci
dicProtein)、MAP2(Microtubule
一AssociatedProtein2）による免疫組織染色を行い移植細胞の生着、移動、分化の状態を評価した。
［結果］
くフィブリン基質内で培養されたB
MSC＞
走査電子顕微鏡で見るとフィブリン基質 は薄い繊維からなり、2〜5umの小孔を持つ均一な網目構造を形成する(Fig.2）。培養を始めて 2週間後に螢光顕微鏡で観察 した結果、多くのGFP陽性細胞が観察された。これによりBM
SCはフ ィブリン内で少なくとも2週間生存可能であると考えられた。
くフアブリンによる足場はBM
S
C移植後の機能回復を改善させる冫Fig.
3が 示す よう に、 2、 3及び 4週日 のBBB
下 肢運 動機 能 評価(
21点満点 ）において、C群はA群およぴB群よりも有意な神経症状の改善が見られた（P〈O．05）。
く フ ィ ブ リ ン に よ る 足 場 は 移 植 さ れ た BMSCの 生 着 と 組 織 内 移 動 を 強 化 す る ＞
移植後4週目 にA
群でH―E染色を行い後索 、側索そして背側灰自質が完全に破壊されていることが確かめられた。
B群では少数 のGFP陽性細胞のみが障害部 境界領域の灰白質に分布するに過ぎなかった。そして、その細胞の大多数が円形または楕円形であった(
Fig.4A，B）。蛍光二重免疫染色法により移植細胞 の表 現型 を見 ると 、GFP陽性 細胞はastroc
yteの特異的マーカーであるGF
AP陰性であった(Fig.4C―E）。しかし、、灰白質に存在するGF
P陽性細胞のおよそ30％が成熟したneuronの特異的マーカーであるM
AP2を発現していた。
C群 ではB群に比 べ、多数のGFP陽性細胞が傷 害された脊髄灰白質内に確認できた。それらは障害部境界領域から広く分布し、中心管周囲や反対側の灰白質まで及んでいた(Figs.5&6)。それらの幾っかは形態的にneuronに類似してい た(Fig.
5）。螢光二重免疫染色法を行うとGFP陽性細胞はGFAPで陰性を示し、約30％がMAP2で陽性となった(Fig.6C―H）。
BMS
Cとフィブリンの複合体は損傷部の大きさを変えず、免疫染色の結果からも重大な反応性変化は生じていない。
［結論］
損傷した組織に移植細胞を投与する際、その足場となる材料に求められるものは、毒性が無く、不活性で、柔軟性に富みしかも吸収性であるなどである。足場により局所に集中的に投与された移植細胞は組織内に生着し遊走、増殖し、軸索の成長を助長し、さまざまな細胞外基質分子と神経組織栄養因子の放出を可能とする。その候補としてアルギニン、マトリゲル、コラーゲン、ポリグリコール酸(PGA)、ゼルフオーム、pHEM
Aヒドロゲルなどがあり、諸家がその有効性について報告している。しかし、異種間の材料であるゼラチンやコラーゲンなどは炎症や免疫反応を惹起する可能性がある。一方、フィブリンは自家より採取されるフィブリノーゲンとトロンビンより作られ安全性が高い。またフィブリノーゲンの濃度を変え重合に要する時間をコントロールする事により、移植腔の体積や形態、性状に応じてより柔軟に対応することが可能となる。これらの理想的ぬ特徴を利用して、すでに骨、軟骨、心臓、皮膚や腎臓などで、フィブリンは細胞移植の足場としての有用性が報告されている。
今 回の 研究では、in vitroでBMSC細胞がフィブリン内で少 なくとも2週間生存できるこ とが確認された。またラットの脊髄hemisectionモデルにおいて、BMSC移植の足場としてフィブリンを用いることによりBMSC単独移植よりも有意に神経症状の回復が見られた。免疫組織学的にも多くの移植細胞の生着、移植周囲組織のみならず中心管や反対側の灰白質に及ぶ遊走、一部の細胞はneuron＾の分化を示唆する所見が得られた。
これらのことから、外科的に脊髄損傷の移植治療を行うにあたり、移植細胞をより効率的かつ安全に局所投与する足場としてフィブリンは有効と考えられる。
―・ワ−学位論文 審査の要旨
主 査 教 授 三 浪 明 男
副 査 教 授 渡 辺 雅 彦
副 査 教 授 岩 崎 喜 信

学位論文題名Fibrin rvIatrix ProvidesaSuitable Sca［ f01dforBone
MarrOWStromalCe11STranSplantedintO工 njuredSpinal
COrd： ANOVelMaterialforCNSTiSSueEnglneerlng（フィブリンは脊髄損傷部位への骨髄問質細胞移植における適切な足場となる〜中枢神経組織工学の新たな材料として〜）

近年の基礎研究により細胞移植治療が脊髄損傷の機能回復に対し有効に働く事
実が 示唆 され てい る。 しか し 、移 植技 術の 安全 性や 有効 性に関してはいまだに確立され た 方 法 が な い 。 特 に 脊 髄組 織は 脆弱 かつ 繊細 な構 造 であ りな がら 、非 常に 狭い 環
境に ある 為、 いか に効 率的 に 移植 細胞 を生 着さ せ、 しか も投与による侵襲を抑えるかとい う大 きな 問題 があ る。 本 研究 では 、い ずれ も自 己骨 髄及び自己血より採取可能な
骨髄 問質 細胞 (Bone Marrow Stromal Cells: BMSC)とフィ ブリンに着目し、これらを用いてフィブリンが有効なscaffold（足場）となり得るかどうかについての検討を行った。
市 販さ れて いる フィ ブリ ン 製剤であるボルヒールoを用 い、移植に適したフィブリン
作 成 の た め A液 (2.5、 10mg/mlフ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン ） と B液(20U/mlの トロ ンビ ンと 2mMのCaC
I2を同体 積で混合）を用意した。先ずA液（フィブリノーゲン10mg/ml)100パ｜と、B液 に BMSC（ 1xl04)を 含 ん だ 混 合 B液 100ロ 1を 重 合 さ せ フ ィ ブ リ ン を 形 成 し 2週 間培 養 。 フ ィ ブ リ ン 基 質 の 3次 元 構 造 を 走 査 電 子 顕 微 鏡 、BMS
Cの 存在 を螢 光顕 微鏡 で確 認 し た 。 次 に 成 体 Sprague一 Dawleyラ ッ ト を 用 い て 第8胸椎 椎弓 切除 し2.5mmの 長さの 右半切モデルを作成した。それらを以下の3群を分類した。A群（n＝5）：リン酸緩衝食 塩液 (PBS)を摘 出腔 へ注 入（ 対照 群） 。B群 (n:ニ5） ：BMSC (3x105)
を 含む 15ロIの懸 濁液 を摘 出腔 ヘ注 入。 C群(n=9)： 2.5mg/mlの フィ ブリノーゲンを含んだ7.
5〃｜のA液 と、 BMSC(3x10s)を含 む B液 7.
5〃 1を 混合 し柔 らか な ゲル 状と なっ ′こ フィ ブリン15ロ1を 摘出 腔へ 移植 。Basso− Beattie―Bresnahan(BBB)
スコアを用いて、移植後 1
7， 14， 21， 28日 目 に 右 下 肢の 運動 機能 を評 価し た。 移植 4週後 にホ ルマ リン で潅 流固 定 し 移 植 部 を 摘 出 し 4mmの 連 続 軸 状 断 切 片 を 作 成 。 GFP、 GFAP、 MAP2に よ る 免

疫 組 織 染 色 を行 い 移 植細胞 の生 着、移 動、 分化の 状態 を評価 した 。
BMSCとフィブリンを2週間培養した結果、走査電子顕微鏡で見るとフィブリン基質は薄い繊維からなり、2〜5ロmの小孔を持つ均一な網目構造を形成していた。螢光
顕微鏡で観察した結果、多くのGFP陽性細胞が観察された。これによりBMSCはフイブリン内で少なくとも2週間生存可能であると考えられた。またBMSCをラットに移植し たモ デル では、2、3及び4週目のBBB下肢運動機能評価(21点満点）において、C群はA群およびB群よりも有意な神経症状の改善が見られた（P〈0，05）。B群では少数 のGFP陽性 細胞 のみ が障 害部 境界 領域 の灰白質に分布するに過ぎなかった。そして、その細胞の大多数が円形または楕円形であった。螢光二重免疫染色法により移 植細 胞の 表現 型を 見ると 、GFP陽 性細 胞は astrocyteの特 異的 マ― カーである
GFAP陰 性で あっ た。 しかし 、灰 白質 に存 在するGFP陽性細胞のおよそ30％が成熟し たneuronの特 異的 マーカ ―で ある MAP2を発 現し てい た。 C群で はB群に比べ、多 数の GFP陽 性細 胞が 傷害 され た脊 髄灰 白質内に確認できた。それらは障害部境界領域から広く分布し、中心管周囲や反対側の灰白質まで及んでいた。それらの幾っ かは 形態 的に neuronに類 似し てい た。 螢光二重免疫染色法を行うとGFP陽性細胞はGFAPで陰性を示し、約30％がMAP2で陽性となった。
損傷した組織に移植細胞を投与する際、その足場となる材料に求められるものは、毒性が無く、不活性で、柔軟性に富みしかも吸収性であるなどである。足場により局所に集中的に投与された移植細胞は組織内に生着し遊走、増殖し、軸索の成長を助長し、さまざまな神経組織栄養因子などの放出を可能とすると考えられる。今回の研究では、in v
itroでBMSC細胞がフアブリン内で少なくとも2週間生存できることが確認された。またラットの脊髄hemi
sectionモデルにおいて、BMS
C移植の足場としてフィブリンを用いることによりBMSC単独移植よりも有意に神経症状の回復が見られた。免疫 組織 学的 にも多くの移植細胞の生着、移植周囲組織のみならず中心管や反対側の 灰白 質に 及ぶ遊走、―部の細胞はneuronへの分化を示唆する所見が得られた。
これらのことから、外科的に脊髄損傷の移植治療を行うにあたり、移植細胞をより効率 的 か つ 安 全 に 局 所 投 与 す る 足 場 と し て フ ィ ブ リ ン は 有 効 と 考 えら れ る 。
公 開発 表に おい て、 主査の 三浪 教授 から BMSCのneuron分化 への 特異 性、フィブリンの具体的な作用、臨床応用する場合の時間的な問題点の質問があった。続いて副査の渡辺教授から、フアブリンの品質的安定性、BMSCのフィブリン内での増殖能、iPS細胞に対する意見の質問があった。最後に副査の岩崎教授から共著者としての意 見、 臨床 応用する場合の問題点や改善点などが提示された。約30分にわたり非常に活発な質疑応答が行われ、何れの質問に対しても申請者は自らの研究に基づく経験や過去の論文の内容を引用し適切な回答をした。
この論文は脊髄損傷に対する骨髄問質細胞移植治療を有効に行う際の足場として、フィブリンの有効性と安全性を初めて証明した点で優れており、臨床応用の際に重要な 実 験 的 根拠 と な り 得 るも の で、 大変 意義の ある研 究であ る。

審査員一同はこれらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判断した。