博士（理学）糸山光紀
学 位 論 文 題 名Adsorption lVIechanism of Pr.oteinto
Functionalized Porous Chitosan Beads（ 高機 能化 キトサ ン多孔性ビーズへの蛋白質の吸着機構）

学位論文内容の要旨
キ トサンは天然に広く存在するキチンを脱アセチル化する事によって生成される、塩基 性のムコ多糖である。その化学構造はセルロースに類似しており、グルコサミンが ロ 1― 4結 合 で っ な が っ た 構 造 を 持 つ 。 キ チ ン や キ ト サ ン は 自 然 界 で セ ル ロ ー ス に次ぐ 生産量を示すが、現在までほとんど利用されていないのが現状である。しかしながら 、近年キチンやキトサンに種窟の機能が見いだされ、様員な分野での応用が進められ てい る。
こ の キ チ ン 及 び キ ト サ ン の 生 医 学分 野で の展 開を 考え る上 で、 キ トサ ンの 低毒 性、生体 親和性、親水性、脱アセチル化度を調節することによる生体内消化性等の利点が考え られる。又、キトサンは分子内に反応性の高いアミノ基を有していることから、化学 修飾が容易であり、様々な高機能化の可能性がある。そのうえ、キトサンは有機酸の 希薄水溶液に容易に溶解するため、再生が容易でフィルム、紙、繊維、ビーズ等に成 形する こと も可能 であ り、広 範な 分野で の応 用が進 められている。
本 研 究 で は 、 キ ト サ ン を 多 孔 質 のビ ーズ に成 形し 、様 走な 化学 修 飾を 施す こと によって 、高機能化を試みた。キトサン成型物の中で、多孔質ビーズはその巨大な表面積及び ハンドリングの容易さの点で、繊維等に比較して、タンパク質の吸着担体として有利 であると考えられる。そこで、このキトサン多孔質ピーズを化学修飾によって高機能 化し、糖鎖を認識するタンパク質との相互作用を検討した。近年、糖鎖の生体内での 役割が注目されてきており、この糖鎖とタンパク質の認識が、生体内での種々の機能 発現に大きく影響することが知られてきた。化学修飾キトサンを糖鎖のアナ口グと考 え、糖鎖を認識するタンパク質との相互作用を検討することは、糖鎖機能の解明のた めに、非常に有効な手段であると考えられる。本研究では、糖鎖認識タンパク質とし て、リ ゾチ ーム とラ クト フ ェリ ンを 選び 、これ らの タン パク 質の糖鎖認識機構の解明を目的とした。
キ トサン多 孔買ピー ズは、細 孔調節剤 の様な添加 物を添加することなく、低分子量キ トサンを 酢酸水溶 液に溶解 し、この 溶液を塩基 性の凝固液に細いノズルを通して噴靄 するとい う簡単な 方法で調 製する事 ができ、こ の際にキトサンの濃度、若しくは凝固 液の濃度 を調節す ることに よって、 ビーズの嵩 密度が制御可能であった。この嵩密度はビ．一ズの細孔径に大きく影響与え、嵩密度が大きくなると細孔径が滅少するが、コントロールする事が可能であった。
キ トサン多 孔買ビ― ズの化学 修飾は反 応の際に有 機溶媒でピーズを平衡化した後に試薬を加え、攪拌することで容易に行えた。
キトサンのアミノ基への化学修飾では、アセチル化はエタノール中無水酢酸で反応を行 い、加え る無水酢 酸の量を 変えるこ とでキトサ ンのアミノ基のアセチル化度をコン
ト ロールす る事がで きた。ま た、アミ ノ基を利用 した化学修飾としてはこの他にエタノ―ル中、無水コハク酸によるスクシニル化、及びジメチルホルムアミド中、ヘキサノチレンジイソシアネートによる架橋も容易であった。
キトサン水酸基の化学俸飾はキトサンのアミ丿基のアセチル化、及び架橋を行った
後 に 可 能 であ っ た。 ピ ー ズを NaOHで マ― セ ル 化後 に 、イ ソ プ ロピ ル アル コ ー ル中
で モノクロ ル酢酸を 反応させ ることで 、水酸基の カルボキシメチル化が可能であり、ジメチルホルムアミド中、ジメチルホルムアミド―三酸化イオウ複合体を反応させる

こ と で ス ルホ ン 化を 行 っ た。 カ ルポ キ シ メチ ル 化度 は マ ーセ ル 化 の際 の NaOHの濃度 で、スル ホン化で はジメチ ルホルム アミド一三 酸化イオウ複合体の量でそれぞれ置換度の制御が可能であった。
カ ル ポ キ シ ル 基を 導入 し たキ

トサンピーズヘの卵白リゾチームの吸着挙動及びスルホ ン 化 キ ト サン ピー ズヘ の 牛ラクトフェリンの吸着挙動を調ぺ、糖鎖認識の知見を得ると共に 、両担体 のそれぞ れのタンバ ク質のア フアニティークロマトグラフィ一用担体としての可能性の検討を行った。
カルポキシル基を導入したピーズではカルポキシル基の導入量が増加するにっれて、リゾチー ムの吸着 量は増加 したが、そ の導入位 置がアミノ基か水酸基かで異なるりゾチーム吸着挙動を見せた。また、リゾチームとビーズとの吸着は、塩濃度にはほとんど影響を 受けず、 pH変化に影 響を受け、カルポキ シメチル化セルロースとは異なる性質を示 した。このカルボキシル化されたキトサンビ―ズヘのりゾチームの吸着は、尿素、し ょ糖、N一 アセチル グルコサ ミンによって阻害されることから、この吸着には水素結 合の関与が示唆された。この担体を用いて、卵白からのルゾチームのアフィニティー ク口マ卜 グラフィ による精 製が可能 であった 。
ー方スル ホン化キ トサンピ ーズヘのラクトフェリンの吸着は0―スルホンの場合、
そ の 導 入 畳 が 増 加 す る に っ れ て 吸 着 量 が 増 加 し た が 、 約 100皿 eq/ml程 度 で 最大となり 、それ以上導入量が増加すると逆に吸着量は減少した。また、この吸着はビ―ズの物 理的性状によっても影響を受け、見掛け密度が大きくなるにっれてその吸着量は 減 少 した 。スルホ ン基の導 入位置にっ いてはO― スルホン のみより も、N．

Oースルホン が共存する方が吸着畳は増大した。ヘパリン認識タンバクであるラクトフェ
リンはや はり、Nー、及びOースルホンの両者を認識していることが示唆された。 この 担 体 を 用 い て の 脱 脂 乳 か ら の ラ ク ト フ ェ リ ン の 精 製 は 、 溶 出 に 1M― NaClを 用いること で可能であった事から、 うクトフェリンのスルホン化ピーズヘの吸着はイオン的相互 作用が主 であるこ とが考え られた。
この様に化学修飾によって機能化されたキトサンピ―ズの応用として、カルポキシル基を有 するキト サンビー ズのカル ポキシル 基を活性 エステル化 することによって、タンパク 買の固定 化担体と しての応 用を試み た。この カルポキシ ル基を利用してジアミンージ カルポン 酸の段階 的反応で スペーサ ー長の異 なる担体を 調製し、それぞれにりガンド 及び酵素 を固定化 し、アフ ィニティ ークロマ トグラフィ ー及び酵素固定化用の担体と しての性 質を検討 した。
ス ペ ーサ ー 長 によ っ てり ガ ン ド及 び 酵素の 発現率が 上昇した が、耐熱 性、及び pH変化に対 する耐性は減少する傾向を示した。また、 アフィニティーク口マトグラフィーを行っ た燭合の 非特異的 相互作用 も、スペ ―サ―長 が長くなる につれて増加する傾向が見ら れた。

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学位論文審査の要旨
主査′教授

戸倉清一

副，査 教授副査 助教授

西 則雄
吉田 孝

副査

林 寿郎（京都大学）

助教授

学 位 論 文 題 名Adsorption h/Iechanism of Protein toFunctionalized Porous Chitosan Beads（高機能化キトサン多孔性ビーズへの蛋白質の吸着機構）

キトサンは天然に広く豊富に存在するキチンを脱アセチル化することによって生成される、塩基性のムコ多糖である。その化学構造はセルロースに類似しており、グルコサミンがplー4結合でっながった構造を持つ。キトサンは低毒性、生体親和性、親水性、脱アセチjレ化度を調節することによる体内消化性等の利点が報告され、生医学分野での活用が考えられている。キトサンは分子内に反応生の高いアミノ基を有していることから、化学修飾が容易であり、様々な高機能化の可能性がある。そのうえ、キトサンは有機酸の希薄溶液に容易に溶解するため、再生が容易でフイルム、紙、 繊維 、ビ ーズ 等 に成 形す るこ とも 可能 であ り、 広範 な分 野で の研 究が 進 めら れている申請者は、キトサン多孔質ビーズが繊維等に比較してその巨大な表面積のため、タンパク質の吸着担体として有利であると考えた。さらに、このキトサン多孔質ピーズを化学修飾によって高機能化し、糖鎖を認識するタンバク質との相互作用を検討している。これは近年糖鎖の生体内での役割が注目されてきており、この糖鎖とタンバク質との認識が、生体内での種々の機能発現に大きく影響することが知られてきた。化学修飾キトサンを糖鎖構造の類似物と考え、糖鎖を認識するタンバク質との相互作用を検討することは、糖鎖機能の解明のために、非常に有効な手段であると考えたためである。本研究では、糖鎖認識タンバク質として、リゾチームと牛ラクトフウリン(LF)を選び、
こ れら の蛋白 質の 糖鎖認 識機 構の解 明を 目的と して 研究を 行な ってい る
まず、細孔調製剤のような添加物を使用することなく、低分子量キトサンを酢酸水溶液に溶解し、この溶液を塩基性の凝固液に細いノズルを通して噴霧するとぃう簡単な調製方法を見い出した。この際にキトサンの濃度、もしくは凝固液の濃度を調節することによって、ビーズの嵩密度が制御可能なことを見いだし、様々な表面積をもったキトサンビーズの調製を行なった。さらに有機溶媒で―140−・

キトサン多孔質ビーズを平衡化した後に試薬を加え、攪拌することで容易に化学修飾できることを見いだしている。
キトサンのアミノ基への化学修飾は、エタノール中無水酢酸によるアセチル化、エタノール中、無水コハク酸によるスクシニル化、お￣よびジメチルホルムアミド(DMF)中、ヘキサメチレンジイソシアネートによる 架橋法が有効であることを見い出した。ピーズをNaO
Hでマーセル化後にイソプロピルアルコール中でモ丿クロル酢酸を反応させることで水酸基のカ´レボキシメチル(CM)化、およびDMF中DMF‑三酸化イオウ複合体を反応させる ことでスルホン化されることを見いだした。CM化
度はマーセル化の 際のNaO
Hの濃度で、スルホン化ではDMF，三酸化イオウ複合体の量でそれぞれ置換度の制御が可能であることを示している。
CM基を導入したキトサンピーズへの卵白リゾチームの吸着挙動及びスルホン化キトサンビーズヘのL
Fの吸着挙動を調ペ、糖鎖認識の知見を得ると共に、両担体のそれぞれのタンバク質のアフイニテイークロマトグラフイー用担体としての可，能性の検討を行なっている。C
M基を導入したビーズではC
M基の導入量が増加するにつれて、リゾチームの吸着量は増加したが、その導入位置がアミノ基か水酸基かで異なる1Jゾチーム吸着挙動のあることを見いだしている。C
M化されたキトサンビーズ
ヘのりゾチームの吸着は、尿素、しょ糖、N・アセチルグルコサミンによって阻害され、この吸着には水素結合の関与が示唆された。この担体を用いて、卵白から直接リゾチームをアフイニテイークロマトグラフイーで精製できることを見いだした。
ス少ホン化キトサンピーズヘのL
Fの吸着は、O‑スルホンの場合、その導入量が増加するにっれて吸着量が増化した が、約100yeq/ml程度で最大となり、それ以上導入量が増加すると逆に吸着量は減少した。また、この吸着は、ピーズの物理的形状によっても影響を受け、見かけ密度が大きくなるにっれてその吸着量は減少した。スルホン基の導入位置についてはO‑スルホンのみよりも、N.
Oスルホンの共存するほうが吸着量は増大した。ヘバリン認識タンバクであるLF
でも、N‑,及びO・スルホンの両者を認識していることが示唆された。この担体を用いての脱脂乳からのLFの精製は、溶出にlM‑NaClを用いることで可能であったことから、LFのスルホン化ビーズヘの吸着はイオン的相互作用が主であることを示唆した。
また化学修飾によって機能化されたキトサンピーズも、CM基を活性エステル化することによって、タンバク質の固定化担体としての応用を試もみている。
このように化学修飾により全く新しい機能性を引き出せることを示した本研究は高く評価される。
参考論文はぃずれも本論文と関連性があり、審査員一同は申請者が博士（理学）の学位を得る充分な資格があると認めた。