博士（医学）安部崇重
学 位 論 文 題 名

ヒト尿路上皮癌組織を用いたSCIDマウス移植モデルの樹立と癌研究への有用性．学位論文内容の要旨
緒言
癌基礎研究において適切な動物実験モデルの樹立は必須と考えられる．ヌードマウスを代表とする免疫不全マウスヘヒト培養癌細胞株を移植することが多いが，長期にわたり培養，継代をくり返された培養癌細胞株は，癌の多様性を失った少数クローンであり，種々の治療反応性が実際に臨床癌で期待されるものと異なる危険性がある，これに対し患者癌組織を dis
hを介さず直接ヌードマウスに移植しXenograftm
odelを樹立する方法も多種の癌で試みられ，尿路上皮癌についてその樹立は15‑40％と報告されている．本手法で樹立された早期継代モデルは，癌細胞株由来モデルに比ベ，本来の癌細胞の性質の保持が期待される．また，T‐ cell，B―cell系ともに障害されたS
everecombinedimmunodeficientm
ice（SCIDマウス）を利用する方法も報告され，尿路上皮癌においてはMcCueらにより17例中10例(59翻と 高率にS
C
ID
マウス皮下で尿路上皮腫瘍を再現出来たと報告されている．しかし彼らの報告では継代が可能だったのは3系のみで，その維持，継代に伴う性質の変化，早期継代モデルの基礎実験利用への容易性は不明なままである．
本研究では様々な背景をもつ患者尿路上皮癌組織をSCI
D
マウス皮下に移植し，尿路上皮癌Xenogr
aftmo
delを作成，樹立の可否に影響を与える背景因子，継代に伴う組織像及び性 質の 変 化を 評 価し ，最 終 的に癌基 礎研究への有 用性を検討し た．
材料及ぴ方法(Xenograftmodelの樹立方法）
遺伝子解析研究を含む医学研究への使用に関し同意が得られた尿路上皮癌手術検体を，切除後すぐに4‐ 5mm片の腫瘍塊に調整し6週〜10週齢の雌S
CID
マウス右背部皮下に移植，移 植後 6ケ月 間観察 した，腫 瘍を形 成した症 例では， 腫瘍体 積が1000mm
3̲1500mm3に達した時点で麻酔下に犠牲死させ，腫瘍の一部を次のマウスヘ継代し，一部はホルマリン固定後 組織学的 に評価した．残りは凍結保存した．以後もX
enograftは同様の方法で継代維持した．Ki
67
ラベリングインデックス(LI)及ぴp53遺伝子を各継代で再評価した．患者癌検体からの初代移植で樹立されたモデルをP1と定義し，以後は継代を重ねるごとにP。（n＝継代数1と表現した．
（組織学的検討）
摘出組織はホルマリン固定後，バラフイン包埋し，HE染色を行い組織学的観察を行った．
さら にサイト ケラチン，Ki
67，CD20，ヒトHLA‑AJ3Cの発現に関し免疫組織学的に検討した． なおKi
67 11は対物 400
倍 数視野で少なくとも1000個の細胞をカウントし，陽性細胞数 ／ 全 細 胞数 を 百 分率 で 示 した ． ま た Epstein‑Barr virus (EBV) encoded RNAs(EBERs)の発現の有無は，バラフイン切片を使用しI
nsituhibridization法(ISH）により検討した，‑ 468ー(RNA抽 出及び酵母p53機能アッセイ ）50‑100 mgの 凍 結 組 織 を 粉 砕 後 1mlの TriReagent (SIGMA‑ALDRICH， St. Louis，USA)に 溶 解 し ， RNAを 抽 出 し た ． 続 い て p53遺 伝 子 は 酵 母 p53機 能 ア ッ セ イ で 評 価 し た ．
(Xenograftを用いた放射線治療シミ ュレーション）
4系 の Xenograft modelを 用 い て SGy単 回 照 射 治 療 シ ミ ュ レ ー シ ョ ン を 行 っ た ． 4‑5 mm
径 の 腫 瘍 塊 を マ ウ ス 右 背 部 皮 下 に 移 植 し 腫 瘍 体 積 が 250― 350mm3（ 8・ 9mm径 ） に 達し た時
点 で， コン ト ロー ル群 ，照 射群 に 無作 為に 振り 分 けた （一 群5‑8匹 ）． コントロール群と治 療
群 に つ い て ， 治 療 開 始 体 積 か ら 3倍 に な る 時 間 の 差 を も っ て Absolute growth delay(AGD)
を 算 出 し た ． ま た ， 今 回 用 いた 4系 は腫 瘍 倍加 時間 が異 なる た め， 各モ デル 間 での 放射 線反応 性 の 比 較 に は AGDを 各 Xenograftの 腫 瘍 倍 加 時 間 で 除 す る こ と で Specific growihdelay(SGD)を算出した．
（統計 学的処理）
Xenograft model樹 立 の 可 否 と 背 景 因 子 と の 関 連 は X2検 定 を 用 い て 検 討 し た ， また グループ間で のIくi67 11の差はStudent st―testを使用し検討した ．
結果（初代移 植の結果）
尿 路 上皮 癌30検体 （ 膀胱 腫瘍 24検 体， 上 部尿 路腫 瘍6検体 ）を 移植 し ，18検体 (60c70)がマ
ウ ス 皮 下 で 腫 瘍 を 形 成 し た ． 組 織 学 的 に 15例 の 形 成 腫 瘍は 患 者腫 瘍の 特徴 を よく 保存 し，
免 疫 組 織 学 的 検 討 の 結 果 こ れ ら 15例 は サ イ ト ケ ラ チ ン ， HLA− ABCを 発 現 し ヒ ト 由 来 の 上
皮 系癌 細胞 で ある こと が確 認さ れ た． 一方 ，3例の 形成 腫瘍 の 組織 像は 移植癌組織と異なり ，小 中 型 の 円 形 の 細 胞 の 増 殖 像 を 呈 し た ． 免 疫 組 織 学 的 に 腫 瘍 は HLA‑ABC． B‑cellマー カーで あ る CD20を 強 発 現 し た が ， サ イ ト ケ ラ チ ン は 陰 性 で あ っ た ． さ ら に ISHに よ り 腫瘍 細胞は EBERsを 発 現 し て い た ． ま た ， EBERs発 現 リ ン パ 球 は 由 来 患 者 膀 胱 癌 の 問 質 に 浸 潤 し てい る こ と も 確 認 さ れ ， こ れ ら 3例 は 腫 瘍 問 質 に 浸 潤 し た EBV感 染 Bリ ン バ 球 由 来 の り ン バ増 殖 病 態と 診断 した ． マウ ス皮 下で の腫 瘍 の形 成の 可否 に関 し ては ，浸 潤癌 ， もし くは 低分化 癌 で よ ル マ ウ ス 皮 下 で 腫 瘍 を 形 成 す る 率 が 高 か っ た が統 計 学的 有意 差は 認 めな かっ た．
また，p53変異を有する腫瘍のlくi67 11（平均値土標準偏差，52.2+12.1e70)は野生型のそれ(26.4土20． 7％ ）の お よそ 2倍 で有 意に 増殖 能カ が 高い 結果 であ った が (＝0.0004)， 移 植さ れた 患者腫 瘍 の p53変 異 の 有 無 お よ び Iく i67 11と マ ウ ス 皮 下 腫 瘍形 成 の可 否に は関 連 を認 めな かった．
（継代に よるXenograft modelの維持 ）
現 在 15検 体 中 11検 体 が P2を 超 え て 継 代 維 持 さ れ て い る ． 継 代 に 伴 い 細 胞 は や や 大 型 化
し ， よ り異 型度 の高 い 集団 が優 位と なる 傾 向を みと めた が， 細 胞形 態， 組織 構 築バ ター ンは非 常 に よ く 保 持 さ れ ， p53遺 伝 子は ，す べ ての 検体 は継 代を 重 ねて もオ リジ ナ ルの 患者 腫瘍の p53遺 伝 子 を 保 持 し た ， lくi67uに関 して はXenograflでは オ リジ ナル の患 者 腫瘍 にく らべ
若 干 増 加す る傾 向が あ った が， 各世 代間 で の変 動は 非常 に小 さ く各 モデ ルで 安 定し てい た．
（放射線 単回照射による治療シミュレ ーション）
樹 立 し た Xenogtaftの う ち ， 4系 を 用 い て 腫 瘍 増 殖 遅 延 反 応 を エ ン ド ポ イ ン ト に SGy単回 照 射 を 施 行 し た ． 使 用 し た 4検 体 は す べ て 移 行 上 皮 癌 よ り 樹 立 さ れ た モ デ ル で ある がその 反 応 は 大 き く 異 な り ， AGDは 20.3+2.4目 （ 平 均 値 土 標 準 誤 差 ） か ら 76.4+7.4日 に 分 布
し た ． 4系 の SGDは 0.8+・ 0.3か ら 4.5 +1.3に 分 布 し ， こ の 結 果 は Xenograftの 増 殖 速 度及びKi67 11とは関連がなかった．
結論
尿 路 上 皮 腫 瘍 30検 体 を dishを 介 す る こ と な く SCIDマ ウ ス 背 部 に 直 接 移 植 す る こ と で15検 体 (50め で Xenotransplantが 可 能 で あ っ た ． こ れ ら モ デ ル の 大 半 が 継 代 可 能 で ． また 患 者 腫 瘍 の 性 質 を 十 分 残 し た 状 況 で 治 療 実 験 が 可 能 であ っ た． 本モ デル は 癌基 礎研 究に
有 用 で ， 近 年 注 目 さ れ る オ ー ダ ー メ イ ド 医 療 研 究 の 基 礎と な るも ので 今後 の さら なる 解析に繋がる ものである，―469ー

学位 論文審査の要旨
主査 教授 野々村克也
副査 教授 守内 哲也
副査 教授 高田 賢藏

学 位 論文 題 名
ヒ ト 尿路 上 皮 癌組 織 を 用い たS
CIDマ ウ ス移 植 モ デル の 樹 立と 癌 研 究への有 用性
現在、ヒト癌基礎研究おいて頻用される動物モデルは、ヒト培養癌細胞株をヌードマウ
スを代表とする免疫不全マウスに移植するXenograftである。このモデルは樹立が容易である利点を有するが、培養癌細胞株は長期にわたる継代培養に伴い由来癌腫の性質を大幅に失っている危険性があり、このXenograftでの反応が臨床癌での反応を反映していない可能性が危惧される。本研究では、SCIDマウスヘ直接ヒト尿路上皮癌検体を移植する方法でXenograftを樹立し、由来腫瘍の性質を十分残した状態で治療実験を行い得るか 評価 した 。結果 、初 代移植時30例中15例(50％）でXenograftを樹立出来たこと、肉眼的に固形腫瘍のみからなる系と、嚢胞を形成し内腔に腫瘍細胞が裏打ちする系の2種類の増殖様式を呈したこと、また30例中3例では膀胱癌問質に浸潤したEBウイルス感染リンパ球カs腫瘍化する現象が生じXenograftの樹立を妨げる現象があったこと、樹立モデルの大半が安定して継代維持出来たこと、継代によってもp53変異、Ki67ラベリ
ングインデックスは由来腫瘍を反映し組織構築バターンの保持も良好であったこと、4系の早期継代モデルを用いたSGy単回照射放射線感受性試験では放射線感受性と腫瘍の増殖速度には関連がなくp53変異をもつ系が最も放射線耐性を示したこと、最終的に本モデルの治療実験への利便性を報告している。
質疑応答では副査の高田賢藏教授から、放射線感受性試験が行われたXenograftでの反応と由来患者の治療成績との相関は認められるか、またオーダーメイド医療を考えた場
合Xenograftを用いた治療試験に要する時間が問題とならないか質問があった。これらの質問に対し申請者は、放射線感受性試験を施行した4系のうち由来患者が放射線治療を受けている1系では観察期間も短く相関は現時点では不明であること、またXenograftを利用した治療試験は時間を要するが、尿路上皮癌が表在性癌から浸潤癌へと進行するのに要する時間、また浸潤癌が遠隔転移を生じるのに要する時間も数年であることが多く、時間は大きな問題ではないと考えられると回答した。
次 い で 副査 の 守 内 哲 也 教 授 か ら膀 胱癌に おけ るp53変 異の 意味 につい て今 回のXenograftでの知見も併せて質問があった。申請者は、p53変異は膀胱癌の予後不良因子とする報告と関連無しとする報告があり結諭が出ていないこと、またXenograftの増殖速度からはp53変異が膀胱癌のgrowth advantageになるとは言い切れないと回答した。さらに今回の樹立Xenograftを用いた放射線感受性試験がすべてのモデルで行われていない点に関し質問があり、申請者はその理由として嚢胞形成を伴う系では外表からの腫瘍計測が難しく、超音波による腫瘍体積のみの測定など別の測定方法で嚢胞形成性モデルの実験利用を考慮していると回答した。また、出席者からはp53変異癌細胞を伴う
Xenograftでは継代に伴いp53変異癌細胞が優位となっていくか質問があり、質問者の指 摘 ど う り の 現 象 が p53酵 母 機 能 ア ッ セ イ の 結 果 み ら れ た と 回 答 し た 。
次いで主査の野々村克也教授よりEBウイルスと膀胱癌の発生の関連に関し質問があった。申請者は、発表内容では触れなかったが追加実験にて約6割の症例で膀胱癌問質にEBウイルス陽性リンパ球の浸潤を認め、かつ一部の症例でEBウイルスの溶解感染を膀胱癌問質で生じていること、またこのEBウイルス陽性リンバ球の浸潤は表在性癌に比較し浸潤癌で高率に認めることから癌の進行に関与する可能性を考えていると回答した。最後に野々村克也教授より、実際の臨床応用への距離を埋めるべく、さらに多くの症例でXenograftでの反応と実際の患者の治療反応性を比較することが必要とのコメントで終了となった。
この論文は、将来の新たな医療の可能性を示しているものとして高く評価され、今後の発展によるオーダーメイド治療への寄与が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判断した。