博 士 （ 医 学） 牧 山九 重
学 位 論 文 題 名

ヒト乳癌組織および非癌部組織におけるHOX遺 伝 子 の mPNA発 現
学位論文内容の要旨［ 緒言］
癌 におけ る組織 構築の 乱れや転 移・浸 潤は， 細胞の もつ空 間的位 置情報 の異常 によって 引き 起され る現象と 捉える ことが できる ，胚発 生過程 におい て形態 形成プロ グラム を位置 情報に 変換す る遺伝子 にホメ オボッ クス遺 伝子が 知られ ている ．ホメ オボック ス遺伝 子は転 写因子 をコー ドしてお り，そ の下位 にある 標的遺 伝子の 発現を 制御し ながら形 態形成 を進め ていく ． ホ メ オ ボ ッ ク ス 遺 伝 子 の ひ と っ の フ ァ ミ リ ー に 属 す る HOX遺 伝 子 は A， B， C， Dの 4っ のクラ スターを 形成し ，合計 39個同定 されて いる， 各クラ スター にはパ ラログ 番号の若 い
HOX遺 伝 子 か ら 順 番 に ゲ ノ ム の 3 側 か ら 5 側 に 向 け て 9か ら 11個 並 ん でい る ． 胚 発生の 形 態 形成 過 程 に おい て は，個 々のHOX遺 伝子は 空間的 ・時間的 に規則 正しい 発現パ ターンを 示す，最 近，HOX遺 伝子は ，成体 におい ても組 織・臓 器に特徴 的な発 現パターンを示すことがわかっ てきた ，一方， 腎癌， 大腸癌 ，悪性 黒色腫 ，肺癌 ，子宮 癌，乳 癌，膀胱癌などのHOX遺伝子の 発 現 は， そ れ ら の由 来 する正 常組織と は異な ること が報告 されて おり， HOX遺伝子 の発現
異 常と癌 化とを関 連付け て考え ること が可能 になっ てきた ．しか しながら ，これ ら癌組 織にお け る HOX遺 伝 子 の 発現 解 析 報 告は ， 特 定 のHOX遺伝 子のみ を対象 にして いたり ，ある いは定 性 的 な発 現 解 析 法に よ るもの が多く， 39個の HOX遺伝子 すべて の発現 レベルを 定量的 に解析 し た もの は き わ めて 少 なぃ， 本研究で は，リ アルタ イムPCRを 基盤と した定 量性に 優れた
発 現 解 析法 を 用 い て， ヒ ト乳癌 組織と非 癌部組 織に韜 ける39個 のHOX遺 伝子すべ ての発 現を調 べ た ，さ ら に ， 乳癌 組 織にお けるHOX遺 伝子の 発現パ ターンと 臨床病 理学的 因子と の関連性 につい て検討し た。
［症例および細胞株］
北大 医 学 部 附属 病院 腫瘍外 科およ びその 関連施 設(12施設 ）にお いてイ ンフオ ームド コン
セ ン トの 得 ら れ た浸 潤 性 乳 癌患 者 か ら 手術 切除 され， 浸潤性乳 管癌と 診断さ れた癌 組織18例と非癌部組織6例を対象とした，ヒト乳癌細胞株はZR−75−1，HCC721，HCC
1500，MDA‑
MB―231，
MDA
一MB−435Sを使用した，［方法 ］
手 術 切 除組 織 お よ び培 養 細 胞 から 全 RNAを 抽出 し ， 逆 転写 反 応 を行 いcDNAを得 た，cDNAを鋳型 に各HOX遺 伝子に 特異的 なプラ イマー を用い て定量的 リアル タイム RT―PCRを行った．
各HOX遺伝 子の発 現量は 内部標 準とし て用い たロー アクチン 遺伝子 の発現 量で各 HOX遺伝子の発 現 量 を 補 正 し た 相 対 比 の 百 分 率 で 表 し た ． p53遺 伝 子 の 変 異 の 有 無 は ， Yeast p53368―

functionalassayにて判定した，プロゲステロン受容体ならびにエストロゲン受容体の有無にっいては通常の乳癌の手術切除組織のE
I
A検査にて行った，統計学的有意差はS
tat.View
を 用 い て ノ ン パ ラ メ ト リ ッ ク 解 析 で あ る Mann― Whitneyの U検 定 に て 評 価 し た ．

［結果］
非癌部組織では，HOX
A4，B9を除くパラログ2から9に属する全てのHOX遺伝子が発現し，パラログ 10から13に属するHOX
遺伝子 は，Cl0およびC13を除き，発現していないか，あるいは極めて低い発現しか認めなかった．
浸潤性乳管癌組織と非癌部組織のHO
X
遺伝子の発現を比較すると，HOXAl，A2，A3，A5，A9，Cll，D3，D4，D8，D9およびDl0の発現量に両者の問で有意な差を認めた．非部癌組織に
比ベ乳癌 組織において，HOX Cllの発現は高かったのに対し，他のA
およぴDクラスターのHO
X
遺伝子の発現は低かった．
H
O
X遺伝子の発現と臨床病理学的因子との関連性について調べてみたところ，以下のことが明らかとなった．
1） 充 実 腺 管 癌 は ， 乳 頭 腺 管 癌 ・ 硬 癌 に 比 べ HOXA1の 発 現 が 有 意 に 低 か っ た ．
2）手術切除時にりンパ節転移のあった症例のHOX
B7の発現は，リンパ節転移のない症例に比べ有意に低かった．
3）プロゲステロン受容体陽性例く 4例）は陰性例(14例）に比べ，HOX
D12およびD13の発現が有意に高かった，エストロゲン受容体陽性例（7例）と陰性例(11例）問で個カのHOX遺伝子の発現を比較したが，発 現量に有意差を示すH
OX遺伝子は見出せなかった．
4）p53遺伝子に変異のある浸潤性乳管癌（7例）のH
OX
C5の発現は，変異のない浸潤性乳管癌(11例）と比べ有意に低かった．また，非癌部組織のHO
XC5の発現レベルは野生型
p53をもつ癌組織と同程度であった．さらに，ヒト乳癌細胞株を用いてHO
X
C5の発現とp53遺伝子の変異の有無を検討したところ，p53遺伝子に変異のある乳癌細胞株（2株〕のH
O
X
C5の発現は野生型p53をもつ乳癌細胞株（3株）に比べ低かった．
5）その他の臨床病理学的因子として，エストロゲン受容体の有無，腫瘍径，乳管内進展の有無，閉経の有無あるいは腫瘍マーカー(
CEAおよぴCA
15―3）の発現とH
OX遺伝子の発現パターンの関連性について検討したが，いずれも関連性を示唆する特定のH
O
X
遺伝子は認められなかった．
［考察］
本研究の結果から，乳癌の発生および悪性化に関与するであろういくっかのH
O
X
遺伝子が明らかとなった，個々のH
OX遺伝子が乳癌の発生あるいは癌化に伴う性状変化にどのように関わっているかを現時点で言及することは困難ではあるが，他家の報告を考え合わせるといくっかの興味深い推察ができる．Hの(A5の発現は非癌部組織で高く，癌組織で低いことが認められた．HO
X
A5は癌抑制遺伝子p53の発現を促す事が知られており，今回検討した乳癌組織においてもH
O
X
A5の発現低下に伴うp53の発現低下が発癌に関与している可能性が考えられる．ー方，p53遺伝子に変異のある癌組織のH
O
XC5の発現は，変異のない癌組織に比べ有意に低いという現象を見出した，HO
X
遺伝子の発現調節機構にっいては不明の点が多く，p53蛋白がその機構のー役を担うとすれば非常に興味深い，野生型p53蛋白がH
OX
C5の転写に必要なのか，あるいは変異型p53蛋白がH
OX
C5の転写に対して抑制的に働くのか，大きく2っの可能性が考えられる，いずれにしても，HOX
遺伝子の発現ネットワークに韜けるp53の役割につ い て は ， HOXA5お よ び HOXC5を 含 め 今 後 明 ら か に し て い き た い 課 題 で あ る ．

ー 369ー

学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 守 内 哲 也
副 査 教 授 長 嶋 和 朗

学位論文題名
ヒト乳 癌組織および非癌部組織におけるHOX遺 伝 子 の mPNA発 現

癌 に お ける 組 織 構築 の 乱 れや 転 移 ・浸 潤 は ， 細胞 の も つ空 間 的 位置 情 報 の異常によっ て引き起 される 現象と捉 えるこ とができ る，胚 発生過程において形態形成プ口
グラム を位置情 報に変 換する遺 伝子に ホメオボ ックス 遺伝子が知られている．ホメオボック ス遺伝子 は転写 因子をコ ードし ており， その下 位にある標的遺伝子の発現を制御しながら形態形成を進めていく．ホフくオポックス遺伝子のひとつのファミリーに属するHOX遺 伝子 は A，B， C，Dの4つ のクラス ターを 形成し， 合計39個 同定され ている．
各クラ スターに はパラ 口グ番号 の若い H
OX
遺伝 子から 順番にゲ ノムの3 側 から5 側に 向け て 9から 11個並 ん で いる ． 胚 発生 の 形 態 形成 過 程 にお い て は， 個 々 のHO
X遺伝子は空間的・時間的に規則正しい発現パターンを示す，最近， HOX
遺 伝子は， 成体にお いても 組織・臓 器に特徴的な発現/ヾ夕ーンを示すことがわ かってき た．一 方，腎癌 ，大腸 癌，悪性 黒色腫 ，肺癌，子宮癌，乳癌，膀胱癌などの H
OX
遺伝 子の発 現は，そ れらの 由来する 正常組 織とは異 なること が報告 されており， HOX遺伝 子の発 現異常と癌化とを関連付けて考えることが可能になってきた．しか しな が ら ，こ れ ら 癌組 織 に おけ る HO
X遺 伝 子 の発 現 解 析報 告 は ，特 定 の H
OX遺伝子のみ を対象に してい たり，あ るいは 定性的な 発現解 析法によるものが多く，39個のHOX遺 伝 子す べ て の発 現 レ ベル を 定 量的 に 解 析 した ものは きわめて 少ない ．本研究では， リアルタ イムPC
Rを基盤とした定量性に優れた発現解析法を用いて，ヒト乳癌組織 と非 癌 部 組織 に お ける 39個の HOX
遺 伝 子 す ぺて の 発現を調 べた． さらに， 乳癌組
織 に お け る HOX遺 伝 子 の 発 現パ タ ー ン と臨 床 病 理学 的 因 子と の 関 連性 に つ いて 検討した。
乳癌組 織では非 癌部組 織と比べ ，HOXA
1，3，5，9，D3，4，5，9，10で発 現が低く，
HOXC11で 発 現 が 高 か っ た ． ま た ， p53変 異 を 持 つ 乳 癌 で はHOXC
5の 発 現が 低 く ，細 胞株 を 用 いた 実 験 でも 同 様 の結 果 を 得た ． 浸 潤 性乳 管 癌 症例 内 で の検 討 では ，充 実 腺 管 癌 は ， 乳 頭 腺 管 癌 ・ 硬 癌 に 比 べ HOXA1の 発 現 が 有 意 に 低 く ， 手 術 切 除時 に り ン パ 節 転 移 の あ っ た 症 例 の HOXB7の 発 現 は ， リ ン バ 節 転 移 の な い 症 例 に比 ベ有 意 に低 か っ た． ま た， プ 口ゲステ 口ン受容 体陽性例 は陰性例に 比ベ，
HOXD12お よ び D13の 発 現 が 有 意 に高 か っ た， そ の 他の 臨 床 病理 学 的 因子 と し て，エス 卜□ ゲン 受容体 の有 無，腫瘍径，乳管内進展の有無，閉経の有無あるいは腫瘍 マー カー の発現 とHOX遺 伝子 の発 現バ ターン の関 連性についても検討したが ， い ず れ も 関 連 性 を 示 唆 す る 特 定 の HOX遺 伝 子 は 認 め ら れ な か っ た ，
本研究の結果から，乳癌の発生および悪性化に関与するであろういくっかのHOX遺伝子が明らかとなった．HOX遺伝子の発現調節機構については不明の点が多く，個々のHOX遺伝子が乳癌の発生あるいは癌化に伴う性状変化にどのように関わっているかを現時点で言及することは困難ではあるが，今回検討した乳癌組織において，
HOXA5の発現低下に伴うp53の発現低下が発癌に関与している可能性が考えられる．
一方 ，p53遺伝 子に 変異 のある癌組織のHOXC5の発現は，変異のない癌組織に比ベ有意に低いという現象を見出した．
質 疑応 答に おいて は長 嶋教授から、正常Adult乳腺でのHOXの発現ではductとacinusのどちらによるものか，正常乳腺における個体差は年齢や性周期と関係があるのかについて，M astropathy
や癌の組織での検討について，HOXC11とp53との関係について，HOXC11と形態発生についての質問があった。次いで守内教授から，p53と HOXB5に ついて ，症 例中の特異的に発現値の高いものについての臨床的な差について，臨床的応用について，PAX遺伝子などの検討について，小池教授から，HOX遺 伝子 と各 種癌 の発 現・分化度の違いでの発現の差について，HOX遺伝子とp53以外の癌遺伝子との関連についての質問があった．いずれの質問に対しても，申請者は概ね適切に回答した，
本研究の結果から，HOX遺伝子の発現ネットワークにおけるp53の役割について
は ， HOXA5お よ び HOXC5を 含 め ， 今 後 明 ら か に し て い き た い 課 題 で ある ．
審査委員一同は、これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した．