博士（地球環境科学）森 勝伸
学位論文題名(:Study on improvement of resolutions
in capillary electrophoresis using novel additives（ 新規 添 加 剤を 用いるキャ ピラリー 電気泳動 法におけ る分離能 改善の研 究）

学位論文内容の要旨
キ ャ ピ ラ リー 電 気 泳動 (CE)は 、内径 100ym
以 下のキャ ピラリ ー管内に 電解質 溶液を満 たし、そ の両 端 に 高 電圧 を 印 加し 、 電 気泳 動 す る分 析 法 であ り 、高 理論段 を有し、 高い分 離能を示
す こ と が で き る 分 離 分 析 法 とし て 注 目さ れ て いる 。 し か し、 CEの実 際 試 料へ の 適 応の た めに は、 しゝく っかの問 題点が ある。例 えば、 生体試料 を対象と する場 合、通常 の溶融 シリカ性キ ャピ ラ リ ー の内 壁 表 面が 負 に 帯電 し て いる た め 、塩 基 性夕 ンパク 質との強 い静電 吸着が発生 し、 分 離 を 困難 に し たり 、 高 塩濃 度 の 試料 を 対 象と す る場 合、電 流値の急 激な上 昇に伴うジ ュー ル 熱 の 発生 が 見 られ 、 夕 ンバ ク や 高塩 濃 度 試料 の 分析 にはあ まり向い ていな い。さらに 、工 業 廃 棄 物や 環 境 ホル モ ン とい っ た 有機 汚 染 物質 は 、多 くの構 造異性体 や位置 異性体が含 まれ る た め 、そ れ ら に対 応 し て高 い 分 離能 を 有 する 泳 動シ ステム の開発が 急務と されている。 それゆえ 、本研究 は、こ ．れらの 問題を 解決するため、主に新規添加剤を導入することで、新た な泳動系 の開発を 行い、 その分離 に対す る最適化 を計っ た。
本 論文 は 、 7章 か ら 構成 さ れ てい る 。 第1章 は、キ ャピラリ ー電気 泳動(CE)が有 する特 徴、現 在 ま で に 至 る歴 史 そ して 分 析 分野 に お ける 位 置 付け を 示 した 。 さ ら に、 CEが抱 え る 未解
決 な 問 題と 幅 広 い分 析 試 料に 対 す る分 離 改善の 必要性を 背景に、 本研究 が行って きた研 究の目 的 と その 概 要につ しゝて述 べてい る。第2章は 、CEの分離 原理、 そして解 析方法に ついて 、本 法 で 用い た 泳 動系 を 中 心に 簡 潔 にま と め た。 第 3章は 、 両 性 イオ ン界 面活性剤 を用い たキヤ ピ ラ リ一 内 壁 表面 上 へ のタ ン パ ク質 の 吸着抑 制効果に ついて検 討し、 その応用 につい ても述 べ て いる 。 第 4章 は 、 両性 イ オ ン界 面 活 性剤 が 持 つ無 機 陰 イ オン に対 する分配 作用の 検討と 、 そ の応 用 と して 唾 液 と海 水 に 含ま れ る無機 陰イオン の分離定 量につ いて示し ている 。第5章 は 、負 電 荷 を有 す る シク 口 デ キス ト リ ンを 用 い 、中 性 化 学 種で ある アルキル フェノ ール
類 お よ びビ ス フ ェノ ー ル 類の 分 離 挙動 に つ いて 調 べ た。 第 6章 は、 本研 究におい て合成 した
陽 イ オ ン性 ジ ア ザク ラ ウ ンエ ー テ ルが 持 つ選択 性を、位 置異性体 陰イオ ンの分離 分析を 通して 考 察 し て い る。 第 7章は 、 総 括で あ り 、本 論 文 の主 な 結 果と 知 見 を まと め た 。以 下 、 第3章から6章 ま で の概 要 を 述べ る 。
第 3章で は 、 キャ ピ ラ リー 内 表 面上 へ の タン バ ク 質の 吸 着 を 抑制 す るため の修飾剤 の検討 を行 っ た。 陰 イ オン 性 、 陽イ オ ン 性、 非 イオ ン性そ して両性 イオン の界面活 性剤と、 ポリピ ニル ア ルコ ー ル のよ う な 親水 性 ポ リマ ー をそ れぞれ 泳動溶液 に添加 し、糖夕 ンバク質 のアピ ジン と その 関 連 物質 を 含 む六 種 類 のタ ン パク 質の分 離挙動に ついて 調べた。 結果とし て、両 性イ オ ン界 面 活 性剤 の 利 用は 、 pH5〜 9の比 較的 広領域に おいて、 ピーク 理論段や 泳動時 間の再現 性 にお い て 最も 優 れ てい る こ とが わ かっ た。ま た、この 泳動系 を用い、 さらに電 解質溶 液‑ 134―

にアビジン‐色素(HABA)の複合体を添加し、アビジンに対するHABAとビオチンとの交換反応を利用した、ビオチンのオンライン高感度分析を行った。その結果、カラム内での交換反応によるピオチンのピークが試料濃度に依存しながら増大することがわかり、ピタミン剤中のビオチンの定量を簡便に行うことができた。
第4章では、無機陰イオンに対する両性イオンミセルと分配作用に注目し、唾液中及び海水中の無機陰イオンの成分分析を行った。基礎実験として、両性イオンミセルの濃度に対する無機陰イオンの移動度の変化を調べたところ、水和度が小さく、極性の大きいチオシアン酸イオンが最も大きな移動度の変化を与えた。このミセルはタンパクの吸着抑制効果もあることから、除夕ンパク質前処理なしの唾液試料を用い、亜硝酸、硝酸そしてチオシアン酸イオンのべースライン分離が達成された。また、これらの定量結果から、喫煙者のチオシアン酸イオンの濃度は、非喫煙者のそれの2倍〜 10倍近く検出されることもわかった。さらに高塩濃度を含む海水の分析では、通常の電気泳動において、キャピラリーの電流値の上昇に伴うべースラインの大きな乱れが観察されるが、両性イオンミセルの添加は、電流値の急激な上昇 を抑 え、 海水中 の臭 素と 硝酸イ オン の分 離定 量を簡 便に 行う こと ができ た。
第5章では、主に光学異性体分離に利用されるスルホン化p￣シク口デキストリン(SCD)
を長鎖の異なるアルキルフェノール類とビスフェノール類の分離能改善のために用いられた。イオン性修飾剤が添加されていない場合、フェノール類は電気的中性であるため、EOFと同じ速度で泳動され、分離はほとんど達成されなかった。一方、SCDの添加は、包接された中性分子が負電荷を有することになり、EOFよりも遅れて検出される。また、その結合作用は、試料の疎水度、分子サイズあるいは官能基の位置によっても異なるため、フェノール同士の分離能改善だけでなく、/二ルフェノールの構造異性体分離も、大幅に改善することができた。
第6章では、12‑crown‑4と18‑crown‑6の類似体からなる2種類の陽イオン性ジアザクラウン
ェーテルの新規CE添加剤としての可能性を調べた。その第1段階として、位置異性体をもつ2価の芳香族陰イオンの分離能改善について検討した。ジアザクラウンの添加は、3種のフタル酸類、2種のナフタレンジカルボン酸類そして3種のナフタレンジカルポン酸類、計8種の異性体の完全分離を2mM以下の低濃度で達成することができた。また、これら陰イオンの分離挙動あるいは移動度に対する影響は，いずれも環サイズの小，さいジアザクラウンが優れていることがわかった。この実験で示された陰イオンの移動度は，主にクラウン分子内の陽イオンとのイオン対生成の差によって制御されているものと考えられる。さらに，イオン対生成定数の算出から，スルホン酸基を有する陰イオンの方が、カルボキシル基を有する陰イオンよりも強い結合性があることがわかった。これにより、陽イオン性ジアザクラウンが 位置 異性 体分 離に 対す る優 れた 選択 的添加 剤と して 利用 でき るも のと 考えられる。
以上、本研究では、CEでは比較的困難とされていたいくっかの試料を対象とし、分離能を改善するための新規添加剤を導入した泳動システムを開発し、それらの分離分析に適応した。その結果、簡便な泳動系でありながら、それぞれ分離能を改善することができ、一部は実試料への応用分析も可能とした。

‑ 135一

学 位 論 文 審 査 の 要旨
主査
副査
副査
副査

教授 田中俊逸教授 長谷 部 清教授 中村 博
教授 坂入信夫

学位論文題名S
Study on improvement of resolutions
in capillaryelectr
ophoresisusingnove
ladditives（新 規 添加 剤 を用い るキャピ ラリー電 気泳動法 における分 離能改善 の研究）

キ ャピラ リー電気 泳動(CE)は 、内径100ym以下のキャピラリー管内に電解質溶液を満たし、そ の両端に 高電圧 を印加し 、電気 泳動する 分析法 であり、 高理論段 ・高分離能を示す分離分析 法として 注目さ れている 。しか し、実試 料分析 への適応 のために は、解決しなければならな いいくっ かの問 題点があ る。例 えば、生 体試料 を対象と する場合 、溶融シリカ製キャピラ
リ ーの内壁 表面が 負に帯電しているため、塩基性夕ンバク質との強い静電吸着が発生したり、工 業廃棄物 や環境 ホルモン といっ た有機汚 染物質 には、多 くの構造 ・位置異性体が含まれる
た め 、 通常 の CE
法 で は 、分 離 分 析が 困難なこ とが多 い。それ ゆえ、本 研究で は、これ らの問 題を解決 するた め、主に 新規添 加剤を導 入する ことで、 新たな泳 動系の開発を行い、それら の分離に 関する 最適化を 計った 。
本 論 文 は、 7章 から 構成され ている。 第1章は、CEが 有する 特徴、現 在まで に至る発 展の歴 史と CEの分 析 分 野にお ける位置 付けを 示した。 さらに、 CEが抱え る未解決 な問題 と、幅広い分 析試料 に対する 分離改 善の必要 性に関す る背景 を示すとともに、本研究が目指す目的と 研究 概 要 につ い て 述べ て い る 。第 2章 は、 CEの 分離原理 、そし て解析方 法につ いて、本法で用 いた泳 動系を中 心に簡 潔にまと められて いる。
第3章では 、キャピ ラリー 内壁表面 上へのタ ンバク 質の吸着 を抑制 するため の修飾剤の検討を行 った。 種々のイ オン性 界面活性 剤と親水 性ポリ マーをそれぞれ泳動溶液に添加し、電荷の異 なる6種類の タンバク 質の分 離挙動に ついて 調べた。 結果と して、両 性イオン界面活性剤(2wittergent‑3‑14)の利用が、ピークの高い理論段数を保持するとともに、泳動時間の再現性が 広いpH
範 囲におい ても保 たれるこ とが分 かった。 さらに、この泳動系にアピジン‐色素(HABA)の 複 合体 を 添加し、 アビジン に対す るH
ABAとピ オチンと の交換反 応を利 用した、ビオチ ンのオ ンライン 高感度 分析法を 開発した 。その 結果、カラム内での交換反応によるビオチン のピー クが試料 濃度に 依存しな がら増大 するこ とが分かり、多くのマトリックスを含むビタ ミン剤 中のビオ チンの 定量を簡 便に行う ことが できた。

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第4章で は、両 性イオン ミセル(2wittergent‑3‑14)への無機陰イオンの分配作用に注目し、
唾 液及び海 水中の 無機陰イ オンの分 離定量 を行った 。両性イオンミセルの濃度に対する無機陰 イオンの 移動度 の変化を 調べたと ころ、 水和度が 小さく、極性の大きいチオシアン酸イオン が最も大 きな移 動度の変 化を与え た。こ のミセル はタンバク質の吸着抑制効果もあること
か ら、ヒト 唾液試 料中に含 まれる亜 硝酸、 硝酸そし てチオシアン酸イオンの分離定量を除夕ン パク前処 理なし で行うこ とができ た。こ れらの定 量結果から、喫煙者のチオシアン酸イオン の濃度は 、非喫 煙者の2倍〜10倍 高く検 出される ことも 分かった 。さら に高塩濃 度を含む
試 料 で は、 通 常 のCEにおいて 見られ る急激な 電流値 の上昇に 伴うべ ースライ ンの乱れ が、両 性イオン ミセル の添加に よって抑 えられ 、海水中 の臭素と硝酸イオンの分離定量を希釈なし で直接分 析する ことがで きた。
第 5章 では 、 スルホン 化シク 口デキス トリン (SCD)を長 鎖の異 なるアル キルフ ェノール 類とビス フェノー ル類の 分離能改 善のた めに用い た。SCDがない 場合、フ ェノー ル類は電気的中 性で あ る ため 、EOFと 同じ速 度で泳動 され、 分離は困 難であ ったが、 SCDの添 加によ り、中性分 子を負に 帯電さ せ、EOFよりも 遅れて検 出する とともに 、各アル キルフ ェノールのシ
ク口デ キストリ ンとの 包接作用 の差に 基づいて 分離が達成された。この泳動系での結合作用は、試 料の疎水 度、分 子サイズ あるい は官能基 の位置によって異なるため、フェノール類の分離能 改善とと もに、 /二ルフウノールの構造異性体分離も、大幅に改善することができた。
第 6章 では 、 12‑crown‑4と18‑crown‑6の類似 体からな る2種類の陽 イオン 性ジアザ クラウ
ン エー テ ル の新 規 CE
添 加 剤 とし て の 可能 性 を調 べた。位 置異性 体を持つ 2価の 芳香族 陰イ
オ ンの 分 離 能改 善に ついて 検討した 結果、ジ アザク ラウンの 添加は 、3種 のフタル 酸類、 2種 のナ フ タ レン ジカ ルボン 酸類、そ して3種のナ フタレン ジカル ボン酸類 の計8種類の 位置異性体 陰イオン を、2mM以下の 低濃度 で完全分 離する ことがで きた。ま た、こ れら陰イオンの分離 挙動ある いは移 動度に対 する影 響は，い ずれも 環サイズの小さいジアザクラウンが優れてい ることが 分かっ た。この 実験で 示された 陰イオ ンの移動度は，主にジアザクラウン分子内の 陽イオン とのイ オン対生 成の差 によって 制御さ れているものと考えられる。イオン対生成定 数の算出 から， スルホン 酸基を 有する陰 イオン の方が、カルボキシル基を有する陰イオンよ りも強い 結合性 があるこ とが示 された。 また、 分子動力 学計算か ら、第 4級アンモニ
ウムイ オンのN+ーN+間の距 離より も、位置 異性体の 官能基のO・―0．間の距離が2A長いときに最も 大きい相 互作用 を示すこ とが分 った。陽 イオン 性ジアザクラウンエーテルによって得ら れた 分 離 能は 2個の第4級ア ンモニウ ムイオ ンを持つ 直鎖型の ものよ りも優れ 、特に 分離の困難 だったフ タル酸 類の完全 分離を 可能とし た。こ れにより、陽イオン性ジアザクラウンが 位 置 異 性 体 分 離 に 対 す る 優 れ た 選 択 的添 加 剤 とし て 利 用で き る も のと 考 え られ る 。
以 上 、本 研 究 では、 C
Eでは比 較的困難 とされ ていたい くっか の試料を 対象とし 、分離 能を改善す るため の新規添 加剤を導 入した 泳動シス テムを開発し、それらの分離分析に応用した。その 結果、 簡便な泳 動系であ りなが ら、それ ぞれの分離能を大幅に改善するとともに、一部は実 試料へ の応用分 析をも可 能とし た。
審査員一 同は、 これらの 成果を 高く評価 し、また 研究者として誠実かつ熱心であり、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（地球環境科学）の学位を受けるのに充分な資 格を有 するもの と判定し た。

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