博 士（獣 医学 ）カ ン ポ エ マ ヨ オ フ ム ザ ンデ ュ

学位論 文題名ROLE OF LYCOPENE ANDグ − CAROTENE INOXIDATIVE AND NITROSATIVE STRESS DUE TO
CATECHOL ESTROGENS AND PEROXYNITRITE(catechol estrogensお よ び peroxynltriteカ ミ ひ き 起 こ す
酸 化 ス ト レス に 対 す るり コピ ンお よび グカ ロチ ンの 作用 ）学位論文内容の要旨
活性酸素種および活 性窒素種は慢性炎症、癌、血管およぴ神経性疾患など、さまざまな 疾病 をひ き起 こす こと が報 告さ れて いる 。Superoxide
は4位水酸化estradiolなどのcatecholestrogenの代謝過程においても生成され、また、superoxideおよぴnitricoxideから生成されるperoxynitriteはestrogenとの共存に よって発癌を亢進させる可能性が指摘されている。しかしな がら、estrogenがひき起こす癌を亢進させるnitricoxideの作用は不明な点が多い。そこ で、本研究ではcatechol est
rogenによるDNA傷害や変異原性にperoxynitriteがどのように関与するのか、その過程を明らかにすることを目的として本研究を行った。
また、近年、活性酸 素種や活性窒素種に対する防御能を有するとして、機能性食品が注目を集めている。そこ で、機能性成分であるカロテノイド、リコピンやpカロチンについ て、 その抗 発癌 作用 や変 異原 作用 の機 構を明らかにすることを目的とした。
第1章では、前立腺癌由来LNCaP細胞を用いた研究を行った。d
ihydrorhodamine(DHR)
はHz
0,やperoxyn
itriteによって螢光を 発する。catecholestrogenにLNCa
P細胞を曝露すると螢光レ ベルが上昇するが、nitricoxide
単独ではDHRの螢光強度に変化は見られなかった。しか し、catechol estrog
enとnitri
c oxideの共存下では、DHR螢光は相加的な上昇を示した 。また、DHR螢光はperoxynit
riteのスカベンジャーであるuricacidによって顕 著な 阻害 を受 けた 。一方、SOD (superoxide dismutase)やcata
lase存在下ではDHR螢
光の弱い抑 制が見られ、catechol estrogenとnitri
c oxide曝露によって発生するメインの活性分子 がper
oxynitriteであること がわかった。また、LNCaP
細 胞をnitric oxideのド ナー であ るNOC5と 4位水酸化estradiolに曝蕗することによって、有意にDNAダメージが増加する ことがコメットアッセイによって明らかとなった。
第2章 で は、 4位 水酸 化estradiolとnitri
c oxideを共曝露することで、単 独暴露よ― 173―

りもDN
A傷害が 促進され ること 、リコピ ンやpカロチンが、4位水酸化estradiolとnitricoxideが ひき起こ したDNAダメー ジや変異 原性を 抑制する ことを plasmidDNAを用いたinv
itro
実験系やV79細胞（チャイニーズハムスタ一線維芽細胞）を用いたコメットアッセイによって明らかにした。
第3章では、V
79細胞を用いたヒボキサンチンフオスフォリボシルトランスフェラーゼ(HRPT）試験から、リコピンやロカロチンがperoxynitriteによる変異原性を抑制することを示した。またnitricoxide
ドナーであるSIN―1を曝蕗したV
79細胞において、これらのカロテノイドは、チロシン残基のニトロ化によるnitrotyros
ineの生成を抑制することも抗体を用いた免疫染色からわかった。
以上の結果から、本研究では、invitro、細胞invivoの両試験系において、catecholestrogenとnitricoxideによってperoxynitriteが生成され、DNAを傷害することを明らか にした。また、活性窒素種によるDNA
傷害や蛋白のニトロ化を、機能性成分カロテノイ
ド で あ る り コ ピ ン や 口カ ロ チン が 抑制 す るこ とを 明 らか に した 。

ー 174−

学位論文 審査の要旨
主 。査 教 授 藤田 正一
副 査 教授 桑原 幹典
副 査 助教 授 稲波 修
副査 助教授 石塚真由美

学 位論文題 名
ROLE OF LYCOPENE ANDグ ― CAROTENE INOXIDATIVE AND NITROSATIVE STRESS DUE TO
CATECHOL ESTROGENS AND PEROXYNITRITE(catechol estrogensお よ び peroxynitriteカ ミ ひ き 起 こ す
酸 化 ス ト レ ス に 対 する りコピ ンお よび 〆カ ロチ ンの 作用 ）活性酸素種および活性窒素種は慢性炎症、癌、血管および神経性疾患など、さまざまな疾 病を ひき 起こ すこ とが 報告 され てい る 。Superox
ideは4位水酸 化estradiolなどのcatec
hol estrogenの 代謝過程においても生成され、また、su
peroxideおよびnitricoxideから生成されるper
oxyni
trit
eはestrogenとの共存によって発癌を亢進させる可能性が指摘されている。しかしながら、estrogenがひき起こす癌を亢進させるnitricoxideの作用は不明な点が多い。そこで、カンポウエイ・マヨブ・ムザンデュ氏は、catecholestrogenによ るDNA
損 傷や変異原性にperoxynitriteがどのように関与するのか、その過程を明らかにすることを目的として本研究を行った。
また、近年、活性酸素種や活性窒素種に対する防御能を有するとして、機能性食品が注目を集めている。そこで、機能性成分であるカロテノイド、リコピンやロカロチンについて 、そ の抗 発癌作 用や 変異 原作 用の 機構 を明 らか にす るこ とを目的とした。
第1章では、前立腺癌由来LNCaP細胞を用いた研究を行った。dihydrorhodamine(DHR)
はHzozやperoxynitriteによって螢光を発する 。catechol estrogenにLNCaP細胞を曝露すると蛍光レベルが 上昇するが、nitri
c oxide単独ではDHRの螢光強度に変化は見られなかっ た。 しか し、catechol estrogenとnitri
c oxideの共存下では、DHR螢光は相加的な上昇を示した。また 、DHR螢光はperoxynitriteのスカベンジャーであるuricacidによって顕 著な 阻害 を受 けた 。一 方、 SOD (superoxide dismutase)やcatalase存在下ではDHR螢
光の弱い抑制が見 られ、catecho
l estrogenとnitri
c oxide曝露によって発生するメイン― 175―

の活性分子がperoxy
nitriteであることが強く示唆された。また、LNCaP細胞をnitricoxideのドナ ーであ るN
OC5と4位水酸 化estradiolに曝露す ること によって 、有意にDNA損傷が増加することがコメットアッセイによって明らかにした。
第2章では 、4位 水酸化 estradiolとnitric oxideを共曝 露するこ とで、単独暴露よりもDNA損傷 が促進さ れること、リコピンや日カロチンが、4位水酸化estradiolとnitricoxideがひき起 こしたDNA
損傷 を抑制す ること を、plasmid DN
Aを用い たinvitro
実験系
やV79細胞（ チャイニ ーズハムスター線維芽細胞）を用いたコメッ卜アッセイによって明らかにした。また、V79細胞を用いたヒポキサンチンフオスフォリポシルトランスフェラー
ゼ (HRPT)試 験 か ら 、 4位 水 酸 化 estradiolが 変異 原 性 を増 加 さ せる こ と を示 し た 。
第3章 では、plas
midD
NAを用 いたin v
itro
実 験系やV79
細胞 のコメットアッセイによ って、リ コピン やロカロ チンが nitricoxide
ドナーS
I
N‑1の産生するperoxynitriteによ るDNA
損 傷を抑 制するこ とを示 した。ま たS
IN‑1を曝露し たV
79細胞において、これらの カロテノ イドは、チロシン残基のニ卜ロ化によるnitrotyrosineの生成を抑制することも 抗体を用 いた免 疫染色か ら明ら かにした ；以上の 結果から、カンポウェイ・マヨブ・ムザンデュ氏は、inv
itro、細胞invivoの両試 験系に おいて、 catechol estrog
enとnitricox
ideによってperox
ynitriteが生成され、DNAを損傷することを明らかにした。また、活性窒素種によるDNA損傷や蛋白質のニトロ化を、機能性成分カロテノイドであるりコピンや口カロチンが抑制することを明らかにした。よって、審査委員ー同は、上記学位論文提出者カンポウェイ・マヨブ・ムザンデ
ユ氏の 博士論 文は、北海道大学大学院獣医学研究科規程第6条の規程による本研究科の行う博士論文の審査等に合格と認めた。

― 176一