博士（医学）水町貴諭
学位論文題名Increased mitochondrial DNA induces acquired
docetaxelresi
stanceinhea
dandneckcanc
er cells（頭頚部癌細胞においてミトコンドリアDNAの増加は
ドセ タキセル 耐性を引 き起こす ）学位論文内容 の要旨【背景と目的】
新しいタキソイド系抗悪性腫瘍剤であるドセタキセルは本邦において2004
年4月より頭頸部癌への適応が認められて以来、化学放射線併用療法や化学療法に広く用いられるようになり、頭頸部癌治療のK
eyDrugとなりうる薬剤である。北海道大学病院耳鼻咽喉科では2001
年8月 よルドセタキセル併用化学放射線療法の第H相臨床試験を開始し、初期治療効果が94％と の成績を残したが、CRに至らなぃ例や再発例も存在し、ドセタキセル耐性は臨床上重要な問題である。しかしながら現在のところ頭頚部癌におけるドセタキセル耐性の機序解明やドセタキセル耐性株樹立の報告はなぃ。
ミトコンドリアDNAはミトコンドリア内に存在する16569塩基からなる環状のDNAで、ミトコンドリアDNAの変異やコピー数の増減は発癌や抗癌剤耐性に関与することが報告されている。
本研究ではヒト頭頚部扁平上皮癌細胞株を用いドセタキセルに対する耐性株を樹立し、ミ卜コ ン ド リア DNA量 を 比 較す る こ とに よ ル ド セタ キ セ ル耐 性 の 機序 解 明 を試 み た。
【材料と方法】
1）ドセタキセル耐性頭頚部扁平上皮癌細胞株の樹立
ヒト喉頭扁平上皮癌細胞株であるHEp2にドセタキセルを10nMから160nMまで段階的に濃度を上げて処理することにより耐性を獲得させた。得られた耐性細胞株DRHEp2はドセタキセル160nMを含む培地で継代維持した。ドセタキセルに対する生存率の測定にはクリスタルバイオレット法を用いた。
2） 親 株 と ド セ タ キ セ ル 耐 性 株 に お け る ミ ト コ ン ド リ ア DNA量 の 比 較
親株とドセタキセル耐性株におけるミトコンドリアDN
A量を用いて比較した。親株およびドセタキセル耐性株から1細胞を採取、DNAを抽出してlong―distancenestedPC
R法を用いてミトコンドリアDNAを増幅し、増幅産物を電気泳動にて比較した。また、サザンブロツト法も行いミトコンドリアDNA量を比較した。
3）親株とドセタキセル耐性株におけるドセタキセル投与の有無による活性酸素産生量の比較
親 株とドセタキセル耐性株において活性酸素の産生量をdihydroethidiumを用いてフローサイトメトリーで測定した。また、ドセタキセルを加えたときの活性酸素産生量の変化も検討した。
― 329―【 結果】1）ドセ タキセ ル耐性頭 頸部扁平 上皮癌 細胞株の 樹立
ド セタキセ ル耐性 ヒト喉頭 扁平上皮癌細胞株DRH
Ep
2は親株であるH
Ep
2と比較して約75倍 の耐陸を 有した 。
2） 親 株 と ド セ タ キ セ ル 耐 性 株 に お け る ミ ト コ ン ド リ ア DNA量 の 比 較long―distancenestedP
CR法およびサザンブロット法においてドセタキセル耐性株は親株よりもミトコンドリアDNA量が増加していた。耐性株にミトコンドリアDN
A量を減少させる臭化エチジウムで処理したところ、ミトコンドリアDN
A量は減少し、ドセタキセルに対する感受性も未処理の耐性株に比べ亢進していた。さらにドセタキセル耐性株は親株に比べ酸素消費量は亢進していた。ミトコンドリアの呼吸鎖を選択的に阻害する薬剤が耐性を解除できるか検討したところ、Fo―ATPaseの選択的阻害薬であるオリゴマイシンAのみが耐性を解除できた。R
NAi法を用いて耐性株においてFo−ATPaseのd―subunitの発現を抑えたところ、ドセタキセルに対する感受性は亢進した。
3）親株とドセタキセル耐性株におけるドセタキセル投与の有無による活性酸素産生量の比較
ドセタキセル未処理下では、親株に比べて耐性株では活性酸素の産生量は減少していた。
親株をドセタキセルで処理すると活性酸素の産生は濃度依存的に亢進したが、耐性株ではわずかの増加のみであった。また、親株を抗酸化剤であるpyrrolidinedithiocarbamateで処理すると、ドセタキセルによる細胞死は抑制された。さらに、耐性株をドセタキセルおよびオリゴマイシンAで処理したものはドセタキセルのみで処理したものに比べて活性酸素の産生は明らかに亢進した。
【考察】
本研究において、ドセタキセル耐性株は親株に比ベミトコンドリアDNAの量が増加していることが明らかになった。ミトコンドリアDN
Aの増加がドセタキセル耐性にどのような役割を持っ かを調べ るため に、ミト コンドリ アの呼 吸鎖の選 択的阻 害薬を用 いたと ころ、
FoーA
TPaseの選択的阻害薬であるオリゴマイシンAのみが耐性を解除できた。R
NAi法を用いて耐性株においてFo−AT
Paseのd―subunitの発現を抑えたところ、ドセタキセルに対する感受性は亢進した。このことからFo―AT
Paseの増加がドセタキセル耐性獲得に関与していることが示唆された。また、耐性株をドセタキセルおよびオリゴマイシンAで処理したものはドセタキ セルのみ で処理 したもの に比べ活 性酸素 の産生は 亢進した。オリゴマイシンAがFo―ATPaseを阻害することによルプロトンの移動がブロックされ、ミトコンドリアの膜電位が上昇することにより、自由電子が増加し、活性酸素の産生が亢進するものと思われる。
以上よ り、耐性 株では ミトコン ドリアD
NA量が増加し、ミトコンドリア呼吸鎖複合体VのFo部分が活性化されることにより活性酸素の発生が抑制されドセタキセル耐性を獲得することが考えられた。

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学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 白 土 博 樹
副 査 教 授 福 田諭学位論文題名Increased mitochondrial DNA induces acquired
docetaxel resista
nce inheadandneckcancercells（頭頚部癌細胞におぃてミトコンドリアDNAの増加は
ド セ タキセル 耐性を引 き起こす ）新しいタキソイド系抗悪性腫瘍剤であるドセタキセルは各臓器の悪性腫瘍の治療に広く用いられている。しかし、ドセタキセル耐rt症例も存在し、ドセタキセル耐性は臨床上重要な問題である。また、現在のところ頭頚部癌におけるドセタキセル耐性の機序解明やドセタキセル耐性株樹立の報告はなぃ。
ミ トコンド リアDNA（以下 mtDNA)はミト コンドリ ア内に 存在する環状のDNAで、mtDNAの 変 異 や 数 の 増 減 は 発 癌 や 抗 癌 剤 耐 性 に 関 与 す る こ と が 報告 さ れて い る 。
本研究ではヒト頭頸部扁平上皮癌細胞株を用いドセタキセルに対する耐性株を樹立し、mtDNA量 を 比 較 す る こ と に よ ル ド セ タ キ セ ル 耐 性 の 機 序 解 明 を 試 み た 。
本研究において、ドセタキセル耐性株は親株に比ベmtDNAの量が増加していることが明らかになった。mtD
NAの増加がドセタキセル耐性にどのような役割を持っかを調べるために、ミトコンドリアの呼吸鎖の選択的阻害薬を用いたところ、Fo一A
TPaseの選択的阻害薬である
オ リゴマイ シンAのみが耐性を解除できた。RNAi法を用いて耐性株においてFo―ATPaseのd一subunitの発現を抑えたところ、ドセタキセルに対する感受性は回復した。このことから
Fo−ATPaseの増加がドセタキセル耐性獲得に関与していることが示唆された。また、耐性株を ドセタキ セルおよびオリゴマイシンAで処理したものはドセタキセルのみで処理したものに比べ活性酸素の産生は亢進した。オリゴマイシンAがFo一AT
Paseを阻害することによルプロ卜ンの移動がブロックされ、ミトコンドリアの膜電位が上昇することにより、自由電子が増加し、活性酸素の産生が亢進するものと思われる。
以上より、耐性株ではmt
DNA量が増加、Fo−ATPaseが活性化され、活性酸素の発生が抑制されドセタキセル耐性を獲得することが考えられた。
審査にあたり、副査の白土教授より申請者がmt
DN
Aの減少はシスプラチン耐性になるとの報告があると述べたが、それとの関係はいかがかということ、ドセタキセル耐性を解除できたオリゴマイシンAの毒性を少なくするアイデアはあるかということ、およびドセタキセル耐性株はmt
D
NAが増加し活性酸素が減少するのではと発表したが、mt
D
NAの減少がシスプラチン耐性になるとの報告との関係はどうか、との質問があった。これらの質問に対し、申請者はドセタキセル耐性株ではシスプラチンに対する感受性は親株に比べ亢進しており、ドセタキセルとシスプラチンとの間には相反する耐性メカニズムがあるのではと考えられ、実際臨床で用いられているドセタキセル、シスプラチンおよぴ5―FUを組み合わせたT
PF
療法は理にかなっていると考えられること、オリゴマイシンのように完全にFo―AT
Paseをブロック― 331ー

するのではなく、本発表で示したFo―ATPaseの一部分を抑制することで毒性を軽減できる可能性があること、mt
D
NA減少によルシスプラチン耐性になるという機序は本発表で示した活性酸 素に よる もの とは 別の 耐性 メカ ニズム が働いているのでは、と回答した。
副査の福田教授よルドセタキセル耐性株において5―FU、放射線への影響はどうかということ、mtDNA量の変化は変異、減少、増加の3パターンに分かれるが、各癌で異なることの理由、および抗酸化剤の臨床への応用はどうか、との質問があった。これらの質問に対して申請者はドセタキセル耐性株は5ーF
Uに対する感受性は親株と差がみられなかったが、他の報告では大腸癌細胞においてオリゴマ イシンA処理やFo―ATPaseのdーsubunitをRN
Ai法にて5−FU耐性になるとの報告があること、頭頚部癌や肺癌ではmtDNA量は増加していること、
また喫煙者において唾液からのmt
DNA量は非喫煙者に比べ増加しているとの報告があることから、扁平上皮癌においてはmt
DNAが上昇すると考えられる、また抗酸化剤の臨床応用については本発表で用いたPD
TCは毒性が 強いが、ビタミンCやEにも抗酸化作用があり、補助治療として期待できるのでは、と回答した。
主査の秋田教授よルドセタキセル耐性株における他の抗癌剤に対する感受性について、ドセタキセル耐性株においてmt
DNAが増加するメカニズムについて、および薬剤耐性に関する分子マーカーへの応用について質問があった。これらの質問に対し、申請者はドセタキセル耐性株では親株に比ベシスプラチンに対する感受性は亢進、5―FUに対しては親株と同様の感受性をもつこと、ドセタキセル耐性株においてmtDNAが増加するメカニズムはまだ明らかでないこと、分子標的治療剤との関係は明らかではなく今後の研究課題となる、と回答した。
この論文は、ドセタキセル耐性に対するmtDNA、Fo−ATPase
および活性酸素の関与を明らかにした点で高く評価され、今後の抗癌剤耐性メカニズムのさらなる解明に向けて期待されるものである。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （医 学） の学 位を 受け るの に充 分な 資格 を有 す るも のと 判定 した 。

332―