博士 （ 地 球 環境科 学）朝 野維起
学 位 論 文 題 名Studies on prophenoloxidasein the cuticleof the silkworm, B07nbyx0九ori.
（家蚕幼虫外皮に存在するフェノール酸化酵素前駆体についての研究）

学 位 論 文 内 容 の 要旨

昆 虫 の 外 骨 格 （ ク チ ク ル ） は 、 夕 ン バ ク 質 、 糖 、 脂 質 か ら 成 る 非 細 胞 性 の マト 1」 クス であ る。 クチクルを構成するタ ンバク質の多くはクチクルを裏打ちする表皮細胞により 合成されるが、なかには脂肪体や血球など で合成されるものもある。非表皮細胞由来のタンパク質 は血液中に放出された後、表皮細胞層を通 過しクチクルに達すると考えられている。しかしながら 、血液からクチクルヘのタンパク質の移行 に関する報告は少なく、また、移行の仕組みについては 何も分かっていない。
一 方 、 哺 乳 動 物 に 於 い て イ ム ノ グ 口 ブ リ ン A、 ト ラ ン ス フ ェ リ ン な ど 、 上 皮 及 び 内 皮 細 胞 層 を 通 過するタンパク質の輸 送の仕組みについては、詳しく調べられている。脊椎動 物の上皮細胞層にはタイ 卜 ・ ジ ャ ン ク シ ョ ン (TJ） が 存 在 し て 、 細 胞 間 隙 に 於 け る 物 質 の 行 き 来 を 制 限 し て い る 。 哺 乳 類に関しては、細胞内 をタンバク質が直接通過する輸送機構（トランスサイト ーシス）が、上皮及び内皮細胞層をタンバ ク質が通過する際に重要であることが示されている。受 容体を介したェンドサイ卜一シスにより細 胞内に取り込まれたタンバク質は、目的部位に運ばれた 後にエクソサイトーシス で 放 出 さ れ る 。 昆 虫 を 始 め と す る 無 脊 椎 動 物 の 上 皮 に は セ プ テ イ ト ・ ジ ャ ン ク シ ョ ン (SJ)が 存
在 し て お り 、 TJと 同 様 の 機 能 を 有 し て い る が 局 在 す る 部 位 や 構 造 な ど が 異 な る 。 こ の よ う な 昆 虫 上皮において上皮細胞 層を隔てたタンバク質輸送がどのように行われているの かは興味深い問題である 。 本 研 究 の 実 験 対 象 で あ る 家 蚕 フ ウ ノ ー ル 酸 化 酵 素 前 駆 体 (proPO)は 、 フ ェ ノ ー ル 酸 化 酵 素 (PO)の前駆体であり昆虫 の生体防御で重要な働きをしているタンバク質である。 これまでにノーザン解析 な ど に よ り 、 ク チ ク ル の proPOは 血 球 細 胞 で 合 成 さ れ た 後 に ク チ ク ル ヘ 移 行 し た も の で あ る こ とが 示 唆 さ れ て い る 。 こ の proPOを 用 い て 、 こ れ ま で に 直 接 的 な 証 明 の な か っ た タ ン バ ク 質 の 移 行 を明確に示す ことが本研究の目的である 。
家 蚕 proPOは ヘ テ 口 ダ イ マ ー で あ り 、 両 サ ブ ュ ニ ッ ト と も 鋏 角 類 ヘ モ シ ア ニ ン に 相 同 な 銅 夕 ン
バ ク 質 で あ る 。 当 研 究 室 で 用 い て い る 系 統 の 家 蚕 の proPOに は Native‑PAGE上 で 移 動 度 の 異 な る ニ
つのアイソフオームが存在する。移動度の大きい順にF‑type(faster migrating)、Sーtype (slower migrating)と 名 付 け ら れ て い る 。 ま た 、 同 系 統 に は 、 F‑type， S typeを 両 方 持 つ 個 体 (FS‑Iarva)と F‑type片 方の み を 持 つ 個 体 (F‑Iarva)の 2夕 イ プ の 個 体 が 存 在 し て い る 。 F‑Iarvaの 血 体 腔 に S‑typeの proPOを
注 入 し て 、 そ れ が 血 液 か ら ク チ ク ル に 移 行 す る の であ れば ェー S‑typeを注 入さ れた 個 体の クチ クル には 移 行 し た S‑type proPOが 検 出 さ れ る は ず で あ る 。ま ず、 血液 から と れた F‑type， S‑type proPOの 混合 物 を Mono‑Qカ ラ ム で 展 開 す る こ と に よ り 、 そ れ ぞ れ の ア イ ソ フ オ ー ム を 分 離 し た 。 比 活 性 や 基質 特 異 性 に は 、 ほ と ん ど 差 が 見 ら れ な か っ た が 、 両 ア イ ソ フ ォ ー ム 間 で 5つ の ア ミ ノ 酸 置 換 が 存 在一 1423 ‑していた。S‑typeのproP
O
はF‑
Iarv
aの血体腔に注入され、2日後にそのクチクル抽出物をNative‑PAGEで調べたところS‑typeのproPOが検出された。この結果は血液中のS‑typeがクチクルに移行したことを示す直接的な証拠といえる。次に、組織化学的手法 を用い、pro
POがクチクルを裏打ちする表皮細 胞層のどの部分を通過しているのかを調べた。抗proPO抗体で5齢幼虫の切片を染色したところ表皮細胞内でシグナルが検出された。また、insituhybridiz
ationでpro
POのmRNAが検出されなかった ことにより、表皮細胞中のproPOは表皮細胞で合成されたものではなく、おそらく 、pro
POが移行の際、直接細胞内を通過している途中のものだと考えられる。また、大腸菌で発現したショウジョウバ工pro
POを抗原にし て作成した抗体では、ショウジョウバエ幼虫のクチクルにシグナルが観察された。ショウジョウパェに於いてもproPOが血液からクチクルに移行している可能性が考えられる。
1960年代にその存在が示唆されて以来、クチクルに 存在するpro
POが精製できたという報告はなかったが、本研究では、proPOをクチクルから精製することができた。精製標品のプ口テアーゼ
消化 物を M
ALDI・ TOF質 量分 析計 でマ ッピ ング する と、 ク チク ルpro
POには cD
NAから 予想される分子量よりも16 Da重いぺプ チド断片が観察された。ポスト・ソース・ディケイ法で、その断片をさらに解析した結果、ヌチオニン(Met)残基がメチオニン・スルフォキシド（Met（0））に酸化されてい るこ とが 分か った 。二 つの サブュニットの内、片方は5〜6個のMetが酸化され、もう片方では1個だけが酸化しているこ とが分かった。M
et(0)以外の修飾は見っかっていない。鋏角類ヘモシアニンの結晶構造解析のデ一夕を用いてproPOの立体構造のモデルを導き出したが、モデルの表面に露 出し て存 在す るMetと 、 クチクルproP
OにてMet(0)として同定されたMetとがおおむね一致していた。特定のMetが酸化さ れているわけではなく、表面に露出しているものが押し並べて酸化を受けているようである。proP
Oがクチクルに移行する際に、どこかで酸化的環境を経ることが示唆される。現在、昆虫のクチクルに存在するタンバク質の 中でMet(0)を含むタンバク質はpro
PO以外に知られておらず、クチクル内のタンバク質に見られる M
et酸化の生理的意義は不明である。興味深いことにMet(0)を含むクチクルproP
Oは幼虫体腔内に注入されてもクチクルには移行しない。これは 、Met(0)を含 むpro
POと 含まないproPOを選別する機構の存在と、選別の際にMet残基が何らかの働きをしている可能性のニっを示唆する。Met残基の疎水性がタンバク質同士の相互作用に機能していることや、酸化による親水性の増加により結合が弱まることなどが報告されているが、もし、 proPOに 対す る受 容体 が 存在するならば、proPO上のMet残基が受容体との相互作用に働いているかも知れない。
本研究は、昆虫の表皮細胞層を隔てたタンバク質移行を明確に示した。また移行前後に於けるpro
POの構造の違いも明らか にすることが出来た。昆虫におけるトランスサイ卜ーシスの仕組みは全く未開拓の分野だが、もしかするとTJをもつ哺乳類゛とは異なる独自の機構を発達させてきたかもしれない。本研究は、昆虫以外にもSJを持った多くの無脊椎動物のトランスサイトーシス研究に於ける優れたモデルになり得る。ところで、無脊椎動物の代表的なモデル生物であるショウジョウパエやC.elegansが属する節足動物や線虫類は、共にクチクルを持ち、脱皮を重ねて成長するが、このような特徴を持った生物は「脱皮動物」という大きなグループを形成している。脊椎動物を含む後口動物に対比される前口動物に於ける主要なグループのーつである。しかし、ゲノムシークエンシングの完了しているこれらの動物種においてもクチクル形成・表皮の生理の研究は、まだ未開拓の分野である。節足動物や線虫類は種数においても、また生息環境や生活史についても、他の動物群には見られない際立った多様性を有しているが、このような繁栄をもたらした原因として、身体と環境の接点であるクチクルを如何様にも変えられることの持つ意味は大きい。今後、ショウジョウ
1424―

パエ、C．elegans
双方でこの分野の研究が進み、そして両者間でのク口ストークが進んでいくことが期待される。本研究を含め「脱皮動物」が独自に発展させてきた上皮の性質についての理解が深まることを期待する。

― 1425―

学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 芦 田 正明
副 査 教 授 木 村 正人
副査 助教授 早川洋一

学位論文題名
Studieson prophenoloxidasein the cuticle of the silkworm， B077lbyx77lori・（家蚕幼虫外皮に存在するフェノール酸化酵素前駆体についての研究）

昆虫においてフェノール酸化酵素前駆体(prophenoloxidase，proPO)は限定加水分解により活性化され、フェノール酸化酵素(phenoloxidase，PO)になる。proPOを限定加
水分 解す るproPO活性 化酵素 （proPO activating einzyme，PPAE）は不活性なproー
PPAEとし て存 在する 。proPOを活 性化する仕組み全体はproPOカスケ―ドと呼ばれ、ごく微量の徹やバクテリアの細胞壁成分で引き金が引かれることが分かっている。proPOとproPOを活性化する仕組みは昆虫の血液とクチクラに存在することが証明されている。
POはチロシンやドーパなどのフェノ―ル性化合物を酸素の存在下で酸化してメラニンを合成する。メラニンの合成途中に生成されるキノンは反応性に富み、細胞毒性が指摘されている。さらに、キノンは傷口や侵入した徹やバクテリアの周囲に形成される不溶性高分子を共有結合で結び、傷口を塞ぎ、徽やバクテリアを体内で物理的に閉じ込めるのに役立っていると考えられている。このようにproPO及びproPOカスケードは、クチクラと血液において、昆虫が自身の体を守る生体防御機構に重要な役割を果たしている。血液のproPOは約30年前に家蚕から精製され、その性質が調べられている。しかし、クチクラのproPOにつ いて は、 その存 在の 可能 性が 1960年 代半 ばに 指摘さ れたにもかかわらず、それ以後、誰ひとり単離、精製に成功せず現在に至っている。申請者の研究室でクチクラタンパクの新しい抽出法が数年前に考案され、家蚕クチクラからproPOを活性化せずに抽出することが可能になった。
本論文では、この新しい抽出法を用いてクチクラからproPOを抽出し、研究した。研究結果は3章に分けて報告されている。第1章では、クチクラからproPOを精製し，PPAEで活性化してえられたPOの酵素としての性質を調べた。クチクラのproPOと、血液のproPOのそれぞれを活性化して得られたPOの間には、酵素としての性質の差はほとんど認められなかった。さらに、血液のproPOは、表皮細胞層を横切ってクチクラに運ばれることが証明された。逆相液体クロマ卜グラフィ―において、血液のproPOとクチクラのproPOは異なる溶出パターンを与えることが観察された。この事実から、クチクラのproPOは血液のproPOが修飾されたものである可能性が指摘された。第2章では、血液のproPOがどのような修飾を受けるとクチクラのproPOになるのかが調べられている。proPOは2種のポりベプチドから構成されるへテロダイマ―である。クチクラのproPOの1本のボリベプチドは5ないし6つのメチオニン残基がメチオニンサルホキシドヘ酸化されており、他のボリベプチドではメチオニン残基1つがメチオニンサルホキシドヘ酸化されていることが示されている。酸化されていたすべてのメチオニン残基が特定され、それらが分子の表面に位置している可能性が示された。クチクラから精製きれたproPOを家蚕幼虫の血体腔ヘ注入しても、そのproPOのクチクラへの移行は認められなかった。しかし、血液から精製されたproPOを血体腔ヘ注入すると、そのproPOのクチクラへの移行が確認された。これらの結果から、血液のproPOがクチクラヘ移行するか否かは、proPOのいくつかのメチオニン残基の酸化状態により決定されていることが明らかにされた。第3章では、血液のproPOが上皮細胞層を通過してクチクラヘ移行する際、proPOが上皮細胞内部を横切るのか否かが、免疫組織化学的方法で調ぺられた。proPOは上皮細胞の液泡に取り込まれろことが確認された。液泡への取込みや、液泡からクチクラヘproPOが分泌される仕組みの解明は、今後の研究に待たなければならないが、、これまでに記載されたことがない新しい仕組みが存在している可能性が指摘された。1章と2章の内容は、それぞれ単独の論文として、国際的に権威ある雑誌に投稿され、現在印刷中である。また、3章の内容は投稿準備中である。
脊椎動物において、上皮細胞あるいは内皮細胞を横切ってタンパクが移行する現象（卜ランスサイトーシス）はよく知られていおり、生理学上重要であることもよく分かっている。ほ乳動物ではイムノグロブリンAやトランスフェリンのトランスサイ卜―シスの仕組みがよく研究されている。昆虫などの無脊椎動物においても、卜ランスサイト―シスの重要性は脊椎動物におけると同様であると推測されていた。しかし、無脊椎動物の卜ランスサイトーシスの仕組みは、これまで全く手付かずの研究分野であった。本論文に報告されているproPOの血液からクチクラへの移行の証明が、昆虫における卜ランスサイト―シスの明確な証明の初めての例である。
本研究で報告されている、proPOの血液からクチクラヘの移行に関する研究は、昆虫におけるトランスサイ卜一シスの仕組みを解明するための突破ロになると期待される。
よって、著者は博士（地球環境科学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

― 1427―