博士（医学）前田昌紀
学位論文題名インターロイキン−21
処理樹状細胞によって刺激されたNKT細 胞のイン ターフェロン―ソ産生増強効果
学位論文内容の要旨【背景と目的】
NKT細胞は， NK細胞およ びT細胞の機能を併せ持ち，自然免疫および獲得免疫の制御に深 く関与し ている． NKT細胞は，抗原提示細胞上のCDldに結合したa−ガラクトシルセラミド（a一GaICer)などの脂質抗原により活´陸化され，TヘルパーI型(Thl）で あ る IFN‑7およ び Th2サイ ト カ インで あるIL―4な どを迅速 かつ多量 に産生する．樹状細胞(
dendritic cells，DC)は強カな抗原提示細胞であり，T細胞のみならずNKT細胞も強く活性化し，種々のサイトカイン産生を誘導する．従って，DC刺激によるNKT細胞からのサイトカイン産生制御は，今後I型アレルギー反応の制御を含めた種々の臨床応用に資すると考えられる．
近年同定されたILー21は，CD4+T細胞から産生されるサイトカインであり，多彩な機能を有することがこれまでに報告されている，しかしながら，DCとNKT細胞の相互反応におけるIL−21の作用については不明である．そこで今回，DCによるNKT細胞 か ら のサ イ トカ イ ン 産生 誘 導 に対 す るIL− 21の 作 用に つ いて 検 討し た・【材料と方法】
以前BALB/cマウ ス脾細胞 から成長 因子依存 性の未成 熟DC（以下iDC：immatureDC)細胞株で あるBC1細胞 を樹立し た．本研究では未刺激のBC1細胞をiDC，ILー21で72ま たは 96時間 刺激され たBC1細胞をIL― 21/DCとしてそ れぞわ用 いた，こ れらの細胞膜分子はフローサイトメトリーで解析した．さらにNKT細胞を刺激する実験系においては，IL−21
刺激と同時にDCに対してa−GalCerまたは溶媒によるバルスを行 っ た ．こ れ らの DCによ っ て in vitroま た は in vivoで NKT細胞 を 刺激 し，サイトカイン産生と細胞内サイトカインを定量した．一部の実験では，培養系に抗CD86単ク口ーン抗体(mAb)を加え，サイトカイン産生に対する効果を解析した．また，100ng／マウスのI
L―21を腹腔内に投与48時間後に，2彫g／マウスのaーG
alCerを腹腔内投与し，3，6，12，24時間後に採血し，血清中サイトカインを定量した，DC刺激後のIL−12産生の定量も行った．各サイトカインの定量はELISA法で行った．
統計 解 析 はStudent sPtestを 用 い， 有 意差 5％ 未 満 を統 計 学的 有 意 とした ．
【結果】
a−GalCerまたは 溶媒をパ ルスしたiD
CまたはIL−21/DCと，NKT細胞が含まれる
ナイ口ン 非付着性 脾細胞と の共培養後の上清中（invitro）のIFN−7とIL―4の濃度および ，これら DCを直接脾 臓に投与後の血清中（inviv0）のIFN―アとILー4の濃度を比較した．

invitro，in v
ivoいずれの実験系においても，a−GalCerをパルス した DCによ って 有意 なIFN‑ア とIL−4の産生を認めたが，溶媒をバルスしたDC
で は，IFN‑アとIL―4はほとんど検出されなかった．細胞内染色でNKT細胞のIFN‑ア産生を確認したが，それ以外にもIFN‑ア産生細胞が観察された．従って，NKT細胞の活性化によって他の脾細胞からのIFN‑ア産生も誘導されていると考えられた・
注目すべき点として，a―GalCerをパルスしたIL―21/DCは同様に処理したiDCに比ベ ，有意にNKT細胞からのIFN‑アの産生増加を示した．しかし，ILー4の産生に対してはiDCとIL−21/DC
問で差は認められなかった．
次に，DCが産生するIL−12が，a―GalCerバルスIL―21/DCによって刺激された
NKT細胞 の IFN‑ア産 生増 強に 関与 して いる か検 討し た．各 DCを 抗CD40 mAbで 刺激 後の IL−12 p40産生 量と ，NKT細胞とDCをin vitroで共培養する実験系における ILー12 p40産生量を解析した．その結果，IL―21/DCのIL―12産生量はiDCと比ベ 有意に減少しており，IL−21/DCによるNKT細胞のIFN‑ア産生増強に，IL―12は関与していないと考えられた．
C
Dld，CD40，C
D86分子の発現量は，ILー21/DCではiDCに比ベ有意に増加していた．
aーGalCerパルスDCとナイ口ン非付着性脾細胞を共培養する実験系に，抗CD86 mAbを加える実験系では，ILー21/DC刺激によるIFN‑ア産生は抗C
D86mAbによって抑制されたが，iDCによる産生では抑制効果は認めなかった．また，I
L−4産生に対しては，各 DCい ず れ の 培 養 系 に お い て も ，抗 CD86 mAb添加 の影響 は見 られ なか った ．
IL―21を前投与したマウスにa−GalCerを投与し，血清中のサイトカイン産生を経時 的に 分析し た． 血清 IFN‑ア濃 度は ，a― GalCer投 与3時間 後より上昇し，12時間後にピークを示したが，IL−21
前投与マウスでは，3および6時間後で非投与群より有意に増加していた．血清I
Lー4濃度はIL―21前投与群と非投与群で差を認めなかった．
【考察】
IL一21およびNKT細胞は，抗腫瘍効果やI型アレルギー反応を制御する作用を持つことが報告されているが，DCのNKT細胞活性化能に対するILー21の作用はこれまでに報告されていない．本研究では，IL―21で刺激したDCが未刺激のiDCと比較して，a− GalCer刺激後のNKT細胞のIFN‑ア産生を特異的に増強させることを示した．また ，その機序として，T細胞受容体とCD28などの共刺激分子からNKT細胞に入るシグナルの増強が関与していると考えられた．
マウスにa−GaICerを投与すると，NKT細胞は速やかに多量のIFN 7を産生する．
NKT細 胞 か ら 産 生 さ れ た IFN‑ア は 次 に NK細 胞 の IFN‑ア 産 生 を 誘 導 す る が ， a―GaICer投与8時間後までの血中IFNーアiま，NKT細胞のみから産生される，従って，IL―21前投与 マウ スを 用い たin vivoの実 験結 果か ら， NKT細胞から産生されるIFN‑アが，IL―21前投与とa−GaICer刺激によって先ず増加し，その後更なるIFN−ア産生増強効果をもたらすと考えられた．
NKT細 胞か ら産 生さ れる IFN‑アは ，NK細 胞や CD8+T細 胞に よる腫瘍細胞排除の誘導や，I型アレルギー反応を抑制する作用をもつ．またILー21は，NK細胞やCD8+T細胞を介する抗腫瘍効果や，B細胞を介するI型アレルギー反応を制御する作用を持
つ．本研究の結果は，IL−21による抗腫瘍効果のヌカニズム解明に寄与すると同時に，
I型 ア レ ル ギ ー 制 御 に 対 す る 治 療 戦 略 を 提 供 す る と 考 え ら れ た ．
本 研 究 で は ，ILー21がDCに 作用 し， この DCで 刺激 され たNKT細胞 によ るIFN‑‑ 386―

7産生を選択的に増強させることを明らかにした， NKT細胞はサイトカイン産生を介してアレルギー，自己免疫疾患の制御に関与している．このため，DCーN
KT細胞相互反応によって産生されるThl/T
h2サイトカインバランス制御メカニズムの解明は，新しい調節機構を用いたI型アレルギー疾患を含む免疫疾患に対する治療法開発などの臨床応用の発展にっながると考えられる．

学 位論文審査の要旨
主 査 教授 福田 諭
副査 教授 小野江和則
副 査 教授 上出利 光

学 位 論 文 題 名インター ロイキ ン‑ 21
処 理樹状細胞によって刺激されたNKT細 胞 の イ ン タ ーフ ェ ロ ンー ソ 産 生増 強 効 果NKT
糸田月包は，NK糸田胞およびT糸田胞の機能を併せ持ち，自然免疫および溌幹影も疫の 啼ギに深く関与 し て い る ． NKT細 胞 は ， 抗 原 提 示 細 胞 上 の CDldに結 合 した 冊ガ ラク トシ ル セラ ミド m‑Ga】C帥
な ど の 脂 質 抗 原 に よ り 活 陸 化 さ れ ， T′ ソ レ パー I型 （Th1） であ るm叫お よび 1112サ イト カイ ン
で あるIL一4などを迅速かっ多量に産生する．樹状細胞（dlmdrilic∞lls，DC）は強カな抗原提示細胞であ り ，T細 胞 のみ なら ずNKT細 胞も 強く 活 幽匕し，種々 のサイトカイン産生を誘導 する．従って，DC朿 L瞰1こよ るNKT細 胞か らの サ イト カイ ン産 生制 御 は， 今後 I型 アレ ルギ ー反 応 の制 御を 含めた
種 々 の臨 床応 用に 資す る と考 えら れて い る． 近年 同定 され た H′21は，CD4十T細胞 から産生される
サ イ トカ イン であ り， 多 彩な 機能 を有 す ることがこれま でに報告されている，しか しながら，DCとNKT細胞の相互反応におけるu′21の作用にっいては不明である．
申 請 者 は ， DCの M汀 細 胞 に 対 す る 制 御 能 に 対 し ， m・ 21が ど の よ う に 作 用 す る か 解 析 し た ．
a．．（涵】Cerまたは溶媒をノヤレスした血mぬlreDC（iDC）またはILえ1／DCと，NKT
糸田月包が含まれるナ
イ ロ ン 非 付 着 陸 脾 細 胞 と の 共 培 養 後 の 上 清 中 価 viロ o） のIFT叫と Iし 4の 濃度 およ び

こ れら DCを 直接睥臓に投与後の血清中（ 血vivo）のIFNッとIL′4の 濃度を上ヒ較した，血v
itm，血uvo
いずれの実 験 系 に お い て も ， 飴 GmCerを ノ ヤ レ ス し た DCに よっ て 有意 なIFN一 yとIL4の 産生 を 認め たが ，溶 媒 を パ ル ス し た DCで は ， m叫 と IL4は ほ と ん ど 検 出 さ れ な か っ た ， 注 目 す べ き 点 と し て ，併 Gaに erを ノ ヤ レ ス し た u′ 21ゆ Cは 同 様 に 処 理 し た DCに 比 べ ， 有 意 にNKT細 胞か ら のIFN‐Yの産 生 増 加 を 示 し た ． しか し， ILイ の産 生 に対 して はiDCと ILえ 1価 C間 で差 は認 めら れ なか った ．
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IL‑21を前 投与した マウス にa‑GalCerを 投与し ，血清 中のサ イトカ イン産生を経時的に分析した，
血 清 IFN‑y濃 度 は ，a‑GalCer投与 3時間 後 よ り 上昇 し ， 12時 間 後 に ピー ク を 示 したが， IL‑21前投与 マ ウ スで は ， 3お よ び 6時 間後 で 非 投 与群 よ り 有 意に 増 加 し てい た ． 血 清ILr4濃度 はIL‑21前 投
与 群 と非毅 肖群で 差を認め なかっ た．マ ウスに oc‑GalCerを投 与する と，NKT細 胞は遠 やかに 多量のIFN‑yを 産 生 す る ． NKT細 胞 か ら 産 生 さ れ た IFN‑Yは 次 に NK細 胞 の IFN‑Y産 生 を 誘 導 す る が ，a‑GalCer投 与 8時 間 後 ま での 血中 IFN‐Yは ，NKT糸田 貝包の みから 産生さ れる． 従って， Iし21前 投
与 マ ウ ス を 用 い た 血 viVoの 実 験 結 果 か ら ， NKT細 胞 か ら 産 生 さ れる IFN‐ Yが ， H′ 21前 投 与 と叶 Gむ Cer刺激に よって 先ず増 加し， その後 更なる IFN‐Y産生 増強効 果をも たらす と考えら れた． これ ら の 実験 結 果 よ り， 凡 ‐ 21で 刺 激 さ れた DCは Mく T細胞 のIFN‐Y産 生を選 択的に 増強す ること が判 明 し た． n′21圧 ℃は CDld， CIX0，CD86分 子の発 現量が iDCに比ベ 有意に 増加し ていた ．僻GmCer
ノ ヤレス DCとナイ ロン夢 斷寸着陸 脾糸田 胞を共 培養す る実験 系に， 抗CD86mAbを加える実験系では，
ILえ1／ DC朿Ij激 によるIF―Y産生 は抗Cニ D86mAbによっ て挧啼 ｜Jされ たが， DCによる 産生で は抑制
効 果 は 認 め なか っ た ． また ， IL4産 生 に対 し て は ，各 DCいず れ の 培 養系 に お い ても ， 抗 CD86mAb
添 ル ロ の 影 響 は 見 ら れ な か っ た ． こ の た め， m． 21脱 によ る M汀 細 胞 の m4． Y産 生 増 強は ， DC上の CDldや CD86に 対 ： 密 ナ る ， NKT細 胞 上 の T細 胞 受 容 体 や CD28な ど の 共 弟 膨 扮 子 か ら の シ グ
ナ ル増強 が関与し ている と考え られた ．
口答 発表後 ，副査 の上出 教授か ら，DC亜 集団間 でのL． 21の作用 の差異 にっいて ，H′21産生誘 導の 棚 芋 につ い て ， DCの CD40発 現 量 瑚ロ に 対 す るi刊面 につ いて， 副査の 小野江蔘 授から ，凡121受
容 体の細 胞内シグ ナ′W云 達につ いて，凡‐21の1h1誘導の要因にっいて，主査の福田教授から，IFNIy
産 生細胞 の評価に っいて ，本研 究の臨 床応用 への展 望について質問がなされた．申請者は自身の研究
結 果 あ る い は 文 献 的 知 識 に基 づ いて ， 誠 実か つ ，概 ね 適切 に 回答 し 得た ，こ の論 文 は ， m・ 21の DCに対 す る 新 たな 作 用 を 明ら かに し，DCと NKT細胞の 細胞間 作用の 解明やMく Tを用い た新し い治療 への応用 が期待 される ．
審 査員一 同は， これら の成果を 高く評 価し， 大学院 課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者
が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受け る のに 充 分 な資 格 を有 す るも の と判 定 した ．

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