博士（医学）真栄田裕行

学位論文題名Ubiquitin― conJugatingenzymeUBE2Q2SuppreSSeSCe1
1pr01ifer
ati
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Wn―regulatedinreCu
rrent
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CkCanCer（ユビキチン結合酵素UB
E2
Q2の細胞増殖抑制能および再発 頭 頚部 癌 にお け る発 現低 下 に関 する研究）

学位論文内容の要旨【 背景と目的】頭頸部癌はヒトに発生する癌の部位別割合において6番目に発生数の多い癌であり、その発生部位の解剖学的特殊性から早期発見が難しい場合があることや、外科的切除または化学療法、放射線療法などの治療に対しても制限を余儀なくされるために、他領域の発生部位の癌に比しても予後が悪く、世界的にも重要な健康課題のーっとされている。また頭頸部癌は唾液腺や甲状腺など一部の臓器を除いてそのほとんどが扁平上皮癌であり、主に鼻・副鼻腔、口腔、咽頭およぴ喉頭に発生する。その発生の主な要因として喫煙や飲酒などの生活習慣を起因とした発癌性物質への曝露や、パピローマウイルスなどの感染の関与が考えられている。しかし診断や治療に有用な臨床的指標や分子標的治療の対象はいまだ明らかとはなっていない。この頭頸部癌発生のメカニズムを明らかにすることは頭頸部癌に対する治療成績を向上し、治療後の生存率を改善させることに寄与することが期待される。一方
悪性新生物を遺伝子で解析した場合、正常の細胞では発現がほとんど見られない遺伝子が過剰 に発現 する場合 がある 。最近、 UBE2Q2と命名 された遺 伝子が 頭頚部扁 平上皮 癌、特に下咽頭癌において高頻度に発現していることが報告された。われわれの研究においても、先に 述べた ように下 咽頭癌 のみなら ず他の頭 頸部領 域の悪性 腫瘍組 織におい てもUB
E2Q2
遺伝 子が過 剰に発現 してい ることが 明らかと なった 。この事 実はUBE2Q2
遺 伝子の 発現が頭頚 部悪性 腫瘍と何 らかの 関わりを 持つ可能 性を示 唆してい ると考 えられた 。またUBE
2Q2はユビキチン化に関与する酵素のーっとして考えられている。ユビキチン化はタンパク質の翻訳後修飾に関わる重要な機能を担っており、タンパク質分解を通してタンパク質の品質をコントロールし、保証しているとされている。このユビキチン化はユビキチン活性化酵素(E1)、 ユ ビキ チ ン連 結酵素(E2)、ユビキ チンリガ ーゼ(E3)の3種類 の酵素 によって 触媒 さ れ 、 UBE2Q2は こ の うち ユ ビ キチ ン 連 結 酵素 (E2)の ー っと し て 報告 さ れ てい る 。
UBE2
Q2は 37
5ア ミ ノ酸 残 基 から 成 り 立ち 、 RW
D、コ イルド コイル、 ユビキ チン結合 部の
三 種類の 機能的ド メイン から構成される。このU
B
E2
Q2の不活化は細胞分裂の停止を引き起こし、それが細胞増殖に影響を与えるとされている。この機能は癌細胞の増殖に対し抑制的 に働く 可能性を 有して いると考えられる。そこでわれわれはUB
E2Q2遺伝子の発現上昇と 頭頸部 悪性腫瘍 との関 わりを分 子生化 学的手法 を用いて 明らか にしよう と試みた。
【 材料と 方法】頭 頚部扁 平上皮癌細胞株であるHEp2を始め複数の細胞株および頭頸部扁平上 皮癌組 織を用い て、UBE2Q2タンパク質の発現をウエスタン解析法およぴ免疫螢光染色法 により 検討した 。また U
BE2Q2の野生型とドミナントネガティブ型の発現ベクターを作製し、パルスチェイスアッセイおよび免疫螢光染色法により比較検討した。抗腫瘍薬である
Cispl
atinおよびDocetaxel
に対する耐性細胞株および再発頭頸部扁平上皮癌組織における― 19―

UBE2Q2タン パク質 の発現を ウエスタ ン解析 法および免疫螢光染色法により比較検討した。
また 、部位の 異なる 複数の扁 平上皮癌 組織におけるUBE2Q2の発現を統計学的に検討した。
さら に、UBE2Q2を 過剰発現 した安 定細胞株を用いて細胞の増殖能を検討した。また、その 細 胞株 を用い て細胞周 期の各 段階にお けるUB
E2Q2の 発現を ウエスタ ン解析法 および フロー サイトメ ーター で検討し た。さ らに、癌 遺伝子と して活 性化型SrcとUBE2Q2と共発現さ せた場合 におけ るフオー カスアッ セイおよぴ足場依存性細胞増殖能を比較検討した。
【 結 果】 ヒト悪 性腫瘍 由来細胞 株である H
Ep2、Ishikawa、HT108
0およぴ U
251細胞株にお い て UBE2Q2が 高 発 現 し て い た 。ま た 免 疫螢 光 染 色に お い て 、UBE2
Q2は 核内 に 局 在す る こと が明ら かとなっ た。頭 頸部悪性 腫瘍組 織におけ るU
BE2
Q2の発 現の比較 では咽 頭お よ ぴ喉 頭癌に おける発 現が上 昇してい た。頭 頸部扁平 上皮癌 組織の抗 UBE2Q2抗体に よる組 織 染 色に 韜 い ては 、 核 にお け る U
BE2Q
2の 高 発 現が 顕 著 であった 。また UBE2Q
2の野生型とドミナントネガティブ型での間に細胞内発現部位の差異は見られなかった。抗腫瘍薬 耐 性細 胞株お よぴ再発 頭頚部 扁平上皮 癌組織 における UBE2Q2の発現 は明らか に低下 していた。比較したパラメーターのうち、年齢、性別、腫瘍分化度、臨床的進展度別の比較におい てはUB
E2Q2発 現の差は 認められ なかっ た。しかし、原発部位別の比較においでは中、下 咽 頭お よび喉 頭におけ るUB
E2Q2の核 染色性 が高かっ た。ま た抗腫瘍 薬未治療 の切除 組織 例 にお いて核 の高い染 色性が 認められ た。UBE2Q2を 過剰発 現した細 胞は細胞 増殖が 抑制 さ れ た 。 UBE2Q2と 活 性 化型 Src
を 共 発 現さ せ た 細胞 に お い て、 UBE
2Q2の発 現 し た細胞 に お い て は 細 胞 集 塊 の 形 成 や 足 場 依 存 性 の colony増 殖 が 抑 制 さ れ た 。
【考 察】 癌関 連遺伝子の発癌におけるメカニズムとして、oncogeneの活性化またはtumorsu
pp
ressor geneの不活化が重要であることが知られている。今回われわれの研究において示 さ れた 頭頸部 扁平上皮 癌細胞 株や頭頸 部扁平 上皮癌組 織でUBE2Q2の 発現上昇 という 結果 は 、通 常 で あれ ば UB
E2Q2が onc
ogeneと し て の性 質 を 有し て いるも のと考 えること が可能 である。 しかし ながら、 Cis
platinやDocetaxelなどの抗腫瘍薬に対し耐性を獲得した
頭 頸 部扁 平上皮 癌細胞株 や再発 頭頸部扁 平上皮 癌組織に おいて U
BE2Q2の発現の 減少が 認められた。またU
BE2Q2を過剰発現した頭頸部扁平上皮癌細胞株では細胞増殖が抑制され、さら にU
BE2Q2を過 剰発現さ せた線 維芽細胞株においては、細胞集塊の形成や足場依存性の細 胞増殖の 抑制が 確認され た。こ の事実からはU
B
E2Q2が癌抑制遺伝子的な働きをしていることが推察された。ー方、ユビキチン‐プロテアソームシステムは生体内のタンパク質分 解 系に 関 与 する 重 要 なシ ス テ ムで あ る こと が 知 られ て い る 。今回の 研究対象 である
UBE
2Q2はユ ビ キ チン 連 結 酵素 (E2)の 一 種で あ る と 報告 さ れ てい る。タン パク質 分解に関与 するUB
E2Q2が 癌抑制遺 伝子的 な働きをすることから考えると、ある種の癌遺伝子産物の 分解制御 に関与 する可能 性がある 。癌化した細胞においては．UB
E2Q2遺伝子が変異す
るこ と で酵素と して不 活化され 、その正 常機能 が破綻し ている 可能性も 考えら れる。
【 結 論】 本 研 究で 癌 細 胞び 増 殖 制御 に UB
E2Q2が 関 与 す る可 能 性が示 された。 UBE
2Q
2遺伝子およびその遺伝子産物の研究は、癌化制御に関与するタンパク質を解明するための端緒となり得ると考えられ、きらには頭頚部扁平上皮癌発生の臨床学的指標およぴ新規抗癌剤開発における一助として寄与する可能性が示唆された。

― 20―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 佐 邊 壽 孝
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 福 田諭学位論文題名Ubiquitin― con］ ugatingenzymeUBE2Q2
S
upp
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11pr01
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SdOWn−regulatedin
reCurrentheadandneC
kCanCer（ユビキチン結合酵素U
BE2Q2の細胞増殖抑制能および再 発頭 頚 部癌 に おけ る発 現 低下 に関する研究）

正常の細胞では発現が低い遺伝子が悪性新生物において過剰に発現する場合がある。最近、UB
E2Q2と命名された遺伝 子も頭頸部扁平上皮癌、特に下咽頭癌において高頻度に高い発現をすること が明らかとなった。そこでUB
E2Q2遺伝子の発現が頭頸部 悪性腫瘍と何らかの関わりを持 つ可能性を示唆していると考えられた。本論文において は、特にUBE2Q2遺伝子の発現上昇と頭頸部悪性腫瘍との関係が病理組織学的手法及び分子生化学的手法を用いて解析された。
まず頭頚部扁平上皮癌 細胞株であるHE
p2を始め複数の細胞株および頭頸部扁平上皮癌組織を用いて、UB
E2Q2夕ン バク質の発現をウエスタン解析法および免疫螢光染色法により検討 し た 。 そ の 結 果 、 HEp2、 Ishikawa、 HT1080お よ び U251細 胞 株 に お い て UBE2Q2が高発現していた。また免 疫螢光染色において、UBE2
Q2は核内に局在することが明らかとなった。頭頚 部悪性腫瘍組織におけるUBE2Q2の発現の比較では咽頭癌 及び喉頭癌における発現が上昇 していた。そして頭頸部扁平上皮癌組織においては、核 におけるUBE2Q2の高発現が顕著 であった。次いでUBE2Q2の野生型とドミナントネガテイ プ型の発現ベクターを作製し、バルスチェイスアッセイおよび免疫螢光染色法により比較検討したが、両者の間に細胞内発現部位の差異 は見られなかった。またCis
platinおよびDocetaxel
に対する耐性細胞株およ び再発頭頸部扁平上皮癌組織におけるUBE2
Q2
夕ンパク質 の発現を検討した。
その結果、 抗腫瘍薬耐性細胞株および再発頭頚部扁平上皮癌組織に おけるUBE2Q2の発現は明らかに低下していた。また原発部位別の比較においては中咽頭癌、下咽頭癌および喉頭癌におけるUB
E2Q2の核内 染色性が高しゝことが判明し、各種治療後の比較においては抗腫瘍 薬 未 治 療 の 切 除 組 織 例 にお いて U
BE2Q2の 高い 核内 染色 性が 認め られ た 。さ らに 、−2 11

U
BE2Q2を 過剰 発現した安定細胞株を用いて、細胞増殖能及び 細胞周期の各段階におけるU
BE2Q2の 発現 を検 討し た。 その 結果 、UBE2Q2を過 剰 発現 した 細胞 は細胞増殖が抑制されて いた 。さ らに 癌遺 伝子 とし て活 性化 型SrcとUB
E2Q2と共 発現させた場合におけるフオーカスアッセイおよび足場依存性細胞増殖能を比較検討した結果、共発現させた細胞において フ オ ー カ ス形 成能 や足場 依存 性コロ ニー 形成能 が抑 制され た。
今 回 の 研 究 に お い て 示 さ れ た 頭 頸部 扁平 上皮 癌細 胞株 や 頭頸 部扁 平上 皮癌 組織 でU
BE2Q2の 発現 上昇 とい う結 果は 、通 常で あれ ばUBE2Q2が 癌遺 伝子 としての性質を有しているものと考えることが可能である。しかしながら、Cisplatin やDoc
etaxelなどの抗腫瘍薬に対し耐性を獲得した頭頸部扁平上皮癌細胞株や再発頭頸部扁平上皮癌組織においてU
BE2Q2の 発現 の減 少が 認め られ た。 また UBE2Q2を 過 剰発 現し た頭 頚部扁平上皮癌細胞株で は細 胞増 殖が抑制され、さらにUBE2Q2を過剰発現させた 線維芽細胞株においては、細胞 集塊 の形 成や足場依存性の細胞増殖の抑制が確認された 。これらのことからU
BE2Q2が癌抑制遺伝子的な働きをしていることが推察された。夕ンパク質分解に関与するUBE2Q2が癌抑制遺伝子的な働きをすることから考えると、ある種の癌遺伝子産物の分解制御に関与する 可能 性が ある。また、癌化した細胞においてはUBE2Q2遺 伝子が変異することで不活化され、その正常機能が破綻している可能性も考えられた。UBE2Q2遺伝子およびその遺伝子産物の研究は、癌化制御に関与するタンバク質を解明するための端緒となり得ると考えられ、さらには頭頸部扁平上皮癌発生の臨床学的指標および新規抗癌剤開発における一助として寄与する可能性が示唆された。
口 頭 発 表 後 、 副 査 の 佐 邊 教 授 か らは UB
E2Q2の 癌抑 制遺 伝 子と して の特 質、 およ びU
BE2Q2の関与する微小管の特異性の有無について、副査の福田教授からは再発頭頸部癌におけ るUBE2Q2発現 低下 の機 序、 UB
E2Q2の 臓器 特異 的 発現 の理 由、 および今後の治療や検査 への 応用 の可能性についての質問があった。次いで、主 査の秋田教授からはU
BE2Q2の癌抑制遺伝子としての特質、UB
E2Q2の微小管重合に及ぽす影響とユピキチン結合酵素とし て の 機 能 と の 関 係 、 お よ び UBE2Q2の 細胞 内局 在に つい て 、副 査の 畠山 教授 から はU
BE2Q2の発現が頭頸部癌で上昇していることの妥当性、ユピキチンープ口テアソーム系に
お け る E2と し て の UBE2Q2の 酵 素 学 的意 味合 い、 SUMOなど ユ ピキ チン 以外 のタ ンバ ク
質分 解系 の関 与の可能性、およびUB
E2Q2結合夕ンパク質の同 定に関する実験内容などについての質問があった。いずれの質問に対しても申請者は自身の研究結果や文献的知識に基づき適切に回答した。
こ の論 文は 下咽頭癌で高発現するとされるUB
E2Q2の頭頚部 癌における臓器特異的発現性を 検討 し、 またその発現が細胞増殖や発癌の抑制に関与し 、さらにUBE2Q2の発現と抗癌剤耐性組織との関係を検討した点で高く評価され、今後の頭頸部癌治療への応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受け るの に十 分な 資格 を 有す るも のと 判定 した 。

一 22―