博 士 （ 獣 医 学） 永 野 昌 志
学位論文題名
Studies on thecytoplasmi
ヽ Cytopla
Smlc morphol
ogy，
maturational and developmental abilityof bovine oocyt
es derived from s
ma1
1an
tralf01
1iC
leS（ 牛胞 状 卵 胞由 来 卵子 の 卵 細胞 質の形態 と成熟能 および発 生能 に 関す る 研 究）

学 位 論 文 内 容 の要 旨

体 外 受精 や 核移植技 術を用い た牛胚の 体外生産 には、食肉 用に処理 された牛 の卵巣に 存 在す る 未成熟 胞状卵胞 内の卵子 が活用さ れている。 これらの 卵子は体 外培養によ っ て成 熟 させて いるが、 体外受精 あるいは 核移植後の 発生能は 低く、実 体顕微
鏡下 で 観察 さ れる形 態学的な 特徴によ って発生 能も異なる 。しかし 、実体顕 微鏡下で観 察 され る 卵細胞 質の形態 と卵子の 成熟・発 生能、卵細 胞質の微 細構造お よび機能の 関 連を 詳 細に解 析した報 告はない 。そこで 本研究では 、牛卵巣 に存在す る直径2〜 8 mmの 未 成 熟 胞 状 卵 胞 よ り卵 子 を採 取 し 、数 層 以上 の 卵 丘細 胞 に 覆わ れ た未成 熟 卵 子 を 卵 細 胞 質 の 直 径 (115 ym以 上 、 115 pm未 満 ） 、 色 調 （ 褐 色 、 淡 色 、黒色）お よび卵細 胞質内の黒 色領域（ 黒色顆粒、黒色辺縁）の有無によって分類し、以下の実 験を行っ た。
ま ず 、一 般 的に 体 外 成熟 用 に選 抜 ・ 供試 さ れて い る 直径 が 115 ym以 上の 褐色で黒色 領 域の 認 められ ない卵子 と、これ よりも卵 巣からの回 収数は多 いが通常 は使用され な い褐 色 で卵細 胞質に黒 色顆粒を 有する卵 子の核成熟 、受精お よび胚盤 胞への発生を比 較すると ともに、成 熟培養前 後の卵細胞質の超微形態学的な検討を行った。
その 結 果、 両 者の核 成熟能と 卵割後の 発生能に 差異はなか った。し かし、黒 色領域の認 め られ な い卵子 では成熟 培養後も 表層顆粒 は集塊を形 成したま まであり 、多精子侵 入 率が 高 く、卵 割率が低 かった。 一方、黒 色穎粒を有 する卵子 では表層 顆粒が卵 細 胞 膜 付 近 に 分 散 し て お り 、 卵 細 胞 質 成 熟 の 進 ん で いる こ と が示 唆 され た 。

そこで、胞状卵胞から回収される卵子について形態と発生能の関係をより詳細に検討するため、卵細胞質の直径が115pLm以上の卵子については6種類（卵細胞質が褐色で黒色領域なし、黒色顆粒あり、黒色辺縁あり；卵細胞質が淡色で黒色領域なし、黒色顆粒あり；卵細胞質が黒色）に分け、卵細胞質の直径が115ym未満の卵子と合わせて7種類に分類して、成熟培養前の卵子形態と核成熟能、発生能、アデノシン三リン酸(ATP)含有量および卵細胞質の微細構造との関係を精査した。
その結果、褐色の卵細胞質を有する卵子のうち黒色領域が認められる卵子はATP含有量が多く核成熟能も発生能も高いが、黒色領域の認められない卵子はATP含有量が少なく核成熟能は高いものの発生能は低いことが明らかになった。一方、淡色の卵細胞質を有する卵子はATP含有量は少なく核成熟能も発生能も低いが、卵細胞質内に黒色顆粒が認められる場合は」゜汀P含有量が多く、一部は高い発生能を有していることがわかった。また、卵細胞質の色調が黒色の卵子は」゜汀P含有量が多いものの核成熟能および発生能は低く、産生した」虹、Pを利用する機能が破綻していることが示唆された。さらに、超微形態学的な検査の結果、実体顕微鏡下で卵細胞質の色調が褐色を呈する卵子は細胞小器官が卵細胞質全体に均質に分布して異常所見が観察されなかったが、淡色を呈する卵子は卵細胞質に細胞小器官密度の低い領域が存在し、変性過程にあることが示唆された。また、色調が黒色の卵細胞質全域や褐色と淡色の卵細胞質内の黒色領域には多数の脂肪滴が認められた。脂肪滴周囲にはミトコンドリアが集蔟しており、脂肪滴貯留が多いほど卵子のATP含有量も多いことが明らかになった。直径が115メm未満の小型の卵子では、成熟培養後も表層穎粒の分散が全く見られないなど、未発達の構造が認められ、核成熟能も発生能も著しく低かった。
以上の結果から、卵細胞質が褐色で黒色領域を有する卵子は卵細胞質の構造も機能もほぽ正常に発育した卵子であり、体外成熟培養によって高い発生能を獲得できる卵子であることがわかった。また、淡色の卵子は卵細胞質の構造と機能に異常がみられ始めた変性過程の卵子であり、色調が黒色の卵子はすでに機能異常を呈する変性卵子と考えられた。さらに、小型の卵子は発育過程の卵子であることが確認され、実体顕微鏡下の色調および卵細胞質内の黒色領域の有無によって発生能の高い卵子の選抜が可能となった。

学位 論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教 授

高橋 芳 幸教 授

梅村 孝 司

教 授

昆

泰寛

助 教授

片 桐 成 二学゛位論 文題名
Studies on the、cytoplasmlCmorphology，
maturationalanddeVe10pmentalability
OfbOVineOOCyteSderiVedfromSmallantralfolliど1eS（ 牛 胞状 卵 胞由 来 卵 子の 卵 細胞 質の形態 と成熟能 および発 生 能に 関 する 研 究 ）学位論 文提出者 は、食肉 用に処理された牛の卵巣に存在する胞状小卵胞（直径 2〜 8mm)か ら採 取 した 数 層 以上 の 卵 丘細 胞 に覆 わ れ た未 成 熟卵 子 （卵細胞質直 径115ルm以上 ）を卵細 胞質の色調（褐色、淡色、黒色）と黒色領域（黒色顆粒 、黒色辺 縁）の有 無によって分類し、それぞれの核成熟能、発生能、微細 構 造 お よ び ア デ ノ シ ン 三 リ ン 酸 (ATP)含 有 量 と の 関 係 を 精 査 し た 。
そ の 結 果、1）褐 色の卵子 のうち黒 色領域を有 する卵子 はATP含有量 が多く
核 成熟 能 も 発生 能 も高 い が 、黒 色 領 域の認 められな い卵子は ATP含有量が 少な く、 核 成熟能 は高いも のの発生 能は低いこ と、2）淡 色の卵子 はATP含有量が 少な く 、 核成 熟 能も 発 生 能も 低 い が、黒 色顆粒が 認められ るものは ATP含有 量が 多 く、そ の一部は 高い発生 能を有して いること 、3）黒色 の卵子は ATP
含 有 量 が 多 い も の の 核 成 熟 能 も 発 生 能 も 低い こ とを 明 らか に した 。
また、 卵細胞質 の超微形 態学的検 索により 、1）成熟 培養前の褐色の卵子は細 胞小 器 官が均 質に分布 して異常 所見は見ら れないが 、黒色領 域の認め られな いも の は成熟 培養後で も表層顆 粒の集塊が 認められ 、多精子 侵入防御 能の低いこ と、2）淡 色の卵子 は細胞小 器官密度 の低い領 域が存在し、変性過程にあるこ と、3）黒 色の卵子 の全域、 褐色およ び淡色の 卵子の黒色領域には多数の 脂肪 滴 が存在 し、脂肪 滴の周囲 にはミトコ ンドリア が集蔟し ているこ とを示した 。
さらに、直径が115ルm未満の卵子は、 成 熟培養 後でも表層 顆粒の分 散が見られないなど未発達な構造が認められ、 核 成熟能 も発生能も 著しく低 いことを明らか にした。

本研究により胞状小卵胞由来牛卵子の卵細胞質の形態と成熟および発生能の関係の一端が明らかとなった。よって、審査員一同は上記学位論文提出者
永野昌志氏が博士（獣医学）の学位を授与されるに十分な資格を有するものと認めた。