博士（理学）津田哲郎
学 位論文 題名Studies on rvIucin Type Glycopeptides（ ム チ ン 型 糖 ベ プ チ ド の 生 物 有 機 化 学 的研 究）

学 位 論 文 内容 の 要 旨

ムチン型糖タンパク質の糖鎖は生体内で、細胞接着、細胞間情報の伝達、分化、免疫反応、免疫担当細胞の血管内交通、傷の治癒など、多くの生命現象に関わるりガンド分子であることが最近の研究により明らかになってきた。しかし、糖鎖リガンドとそのレセプター間の結合は非常に特異的である反面、その結合カは極めて弱いことが知られている。生体内ではこの弱い相互作用を増幅させるためにりガンド分子を局所的に高密度で存在させ、より強い結合を誘導しているということが知られている（糖鎖クラスター効果）。ー方、ム
チン型糖タンパク質の糖鎖構造は多様性に富んでおり、また糖残基が欠損していない天然型の試料を生体内よりを得る事は非常に困難であるため、リガンドの糖鎖構造とその機能に関する研究を行うには限界があった。このような研究をより系統的に行うため、本研究
では、規則的な間隔で均一の糖鎖リガンドを持つ糖ベプチドを効率的に化学合成する手法を確立することを第ーの目的とした。次に、この糖ペプチドとその糖鎖リガンドを認識するモノクローナル抗体との結合性をベプチド鎖に対する糖鎖リガンドの密集性（糖鎖クラスター度）に対して評価した。また、この糖ペプチドの基質としての有効性をシアル酸転移酵素に対して調べた。
ムチン型糖タンパク質にはアミノ酸の繰り返し構造を持っタンデムリピート域がある。
この領域はセリン(Ser)またはトレオニン(Thr)などのムチン型糖鎖が結合するア ミノ酸に富んでおり、この領域には糖鎖がクラスター状に高密度で存在する事が知られている。
このような構造のモデルとして、まず、糖鎖リガンドであるTn‑抗原を等間隔に持つ規則性糖ベプチドの合成を行った。すなわちTn‑抗原［N‑アセチルガラクトサミン(GalNAc)
ートレオニン（Tk）］をアラニルアラニン(Ala‑Ala)のスペーサーを介して等間隔に配した規貝I
亅性ペプチドを合成した。まず、Ala‑
Thr‑
Alaの三残基からなるトりペプチドを液相中で合成した。続いてアノマー位にフッ素原子を持ち、水酸基をベンジルエーテル基で保護した
GaINAc誘導体を前述したトりベプチド誘導体とカップリングした。カップリングは鈴木法を用いて行い、目的とするaグリコシドを高選択的・高収率で得た。続いてGalN
Ac誘導体のアジド基をルーアセチル基に変換した後、保護基として用いているベンジルエーテル、ベンジルエステル、ベンジ ルカルボキシカルボニル基を水素化により同時に脱保護 しA
la‑Thr
ーAlaのThrにGalNAcが導入された糖ペプチドを得た。次に、この糖ペプチドを完全に遊離の（糖鎖水酸基、ベプチドのアミノ末端、カルボキシル末端等が保護されていない）状態で DPP
A法を用い て重合 することにより、Tn抗原をアミノ酸三残基に一回持つ規則性糖ベプチドを得た。このポリマーはゲルろ過で精製した後、GPC法を用いて分子量を測定した（繰り返し単位5〜15、アミノ酸残基15〜45)。
同様に極地の魚類の血液中に存在する不凍化糖タンパク質をDP
PA法を用いて合成した。
この糖タンパク質はAla‑
Thr‑Alaを繰り返し単位として持つ規則性糖ペプチドでその全てのThr残基にGaipi
ー3 GalNAcの二糖残基からなる糖鎖が結合している糖タンパク質である。合成は上述のTn‑
抗原を等間隔に持つ規則性糖ベプチドに沿って行ったが、特に二糖グリコシドの合成を工夫した。すなわち、このニ糖グリコシドの合成はグリコシルフローライドが存在する系でグリコシルイミデートを選択的に活性化することにより効率的に行うことができた。この二糖グリコシド（グリコシルフローライド）はさらに連続的にベプチドとのカップリング反応に用いることができるため、この反応を利用した糖ペプチドの合成手法はより長い糖鎖を有する糖ペプチドを合成する上で大変有効な手法であるといえる。

HO OHROAC´仁：二二冫H2N濃 ヨ 嵜 怯 。 ・．

OH

n= 5‑15R:H orG al Derivative

次いでTn―抗原を等間隔に持つ規則性糖ペプチドと抗Tn抗原モノクローナル抗体との結合を表面 プラズモン共鳴法(SPR法）を用いて測定した。この際、Tn‑抗原をーっしか持たない短い糖ベプチド（モノマー）とこのモノマーを重合して得たポリマー(
Tn‑抗原10〜15残基、30〜45アミノ酸残基）との2種類の糖ペプチドを同じT
n‑抗原濃度下でその結合カの違いを比較した。クラスター化された抗原はそうでない抗原に対して10倍程度強い結合カを持つ。これは、両者の解離速度定数はほぼ同じであるにも関わらず、その結合速度定数はポリマーの方が10倍程度大きいことによることが確認された。この結果は、ひとたびりガンドーレセプター間に結合が起きるとクラスター化された糖ペプチドではレセプター分子に対する糖鎖リガンドの実効濃度が急激に上昇することから誘導されると考えられる。
また、糖 鎖にシ アル酸を 転移さ せるヒト N‑アセチ ルガラク トサミン6
シアル酸転移酵
素Iの 基質とし て分子量の異なる2種類のTn‑抗原を含む糖ベプチドを用いた。分子量の大きなポリ マー(Tn‑
抗原10〜15残基、30〜 45アミノ酸残基）はシアル酸転移酵素の有効な基質であったが、その一方Tn‑抗原をーっしか持たなぃ短い糖ペプチド（モノマー）は全く基質となり得なかった。この実験結果も糖鎖リガンドを高密度で局在化させることにより糖鎖クラスター効果が誘導される例であるといえる。

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学 位 論 文 審 査 の 要旨
主査

教授

西村紳一郎

副査
副査
副査

教授

山岸皓彦

教授

副査

助教授

西則雄
坂入信夫
吉田孝教授学位 論文 題名
Studies on N/Iucin Type Glycopeptides（ ムチ ン型 糖ベプ チド の生 物有 機化学的研究）

ムチン型糖タンパク質の糖鎖は生体内で、細胞接着、細胞間情報の伝達、分化、免疫反応、免疫担当細胞の血管内交通、傷の治癒など、多くの生命現象に関わるりガンド分子であることが最近の研究により明らかになってきた。しかし、ムチン型糖タンパク質の糖鎖構造は多様性に富んでおり、また糖残基が欠損していない天然型の試料を生体内より得る事は非常に困難であるため、リガン ド の 糖 鎖 構 造 と そ の 機 能 に 関 す る 研 究 を 行 う に は 限 界 が あ っ た。
この背景にあって、申請者は糖鎖構造とその生体内での役割にっいてより詳細な研究を行うために、規則的な間隔で均一の糖鎖リガンドを持っ糖ペプチドを効率的に化学合成する手法を確立した：さらに糖鎖クラスター効果にっいても局所的な糖鎖密度が高まると抗体に認識されやすくなる、糖転移酵素の基質になり得る等の知見を得た。
ムチン型糖タンパク質にはアミノ酸の繰り返し構造を持っ領域がありここには糖鎖がクラスター状に高密度で存在する事が知られている。この構造のモデル分子として、申請者はTn‑抗原を等間隔に持つ規則性糖ペプチドの合成を行った。ここで糖ペプチドの合成を行う際には保護基としてベンジルエーテル、ベンジルエステル、ベンジルカルボキシカルポニル基を用いることにより水素添加により同時に脱保護が行えた。また、この糖ペプチドを完全に遊離の（糖鎖水酸基、ペプチドのアミノ末端、カルボキシル末端等が保護されていない）状態でDPPA丶法を用いて重合することにより目的とする分子を合成することができた。申請者の開発したこの一連の反応を利用することにより従来非常に困難とされている糖ペプチド、その中でも特に規則性糖ペプチドの合成がより簡便に行えるようになったと言えよう。

さ らに、申 請者はこ のー連の 反応を利 用し極地 魚の血液中 に存在す る不凍化
糖タ ンパク 質の合成 も行った 。ここで 、二糖グ リコシドの 合成に関 しては、 グリコ シルフ ローライ ドが存在 する系で グリコシ ルイミデー トを選択 的に活性 化する ことに より行っ た。この 二糖グリ コシド（ グリコシル フローラ イド）は さらに 連続的 にペプチ ドとのカ ップリン グ反応に 用いること ができる ため、よ り長い糖鎖 を有する 糖ペプチドを合成する上で大変有効な手法であるといえよう。
次 に 、合 成 し たポ リ 糖ペ プ チ ドに糖 鎖クラス ター効果が 見られる ことを2種類の 実験か ら実証し た。第一 の例とし てこの糖 ペプチドと その糖鎖 リガンド を認識 するモ ノクロー ナル抗体 との結合 性をその クラスター 度に対し て表面プ ラズモ ン 共 鳴法 (SPR法 ）を 用 い て評 価 し た。 こ の結 果 、 クラ ス ター化さ れた糖ペプ チドは クラスタ ー化され ていなぃ それと比 較して10倍程 度強い相 互作用が誘導され ることが わかった 。また、 糖鎖にシ アル酸を 転移させるヒトM一アセチルガ ラ ク トサ ミ ン 6シア ル 酸 転移 酵素 Iの基質と して分子量 の異なる Tn‑抗原を含む 糖ペプ チドを用 いた。結 果は分子 量の大き なポリマー はシアル 酸転移酵 素の有効な 基質とな ったが、 Tn‑抗原をー っしか持 だない短い糖ペプチド（モノマー） は全く 基質とな り得なか った。こ の実験結 果も糖鎖リ ガンドを 高密度で 局在化 さ せ るこ と に より 糖 鎖ク ラ ス ター 効 果が 誘 導 され る 例で ある といえる 。
学 位論文の 公開発表 に際して 、西教授 より生体 内でのクラ スター効 果の実例
およ びその 重要性に ついて、 吉田助教 授よ．り 重合縮合剤 として用 いたDPPAの反応 機 構 、山 岸 教 授よ り SPR法 の 理論的 背景にっ いて、坂入 教授より 二糖グリコシ ド生成 における の反応条 件等にっ いての質 問がなされ た。申請 者は自ら の経験 や過去 の論文内 容を引用 し、豊富 な知識に 基づいてこ れらの質 問に明快 に回答した 。
以上のよ うに申請 者は、規則性糖ペプチドを簡便に合成する方法を開発し、この方 法によ って合成 した糖ペ プチドの クラスタ ー効果にっ いていく っかの知 見を示 した。 審査員一 同はこれ らの成果 を高く評 価し、大学 院課程に おける研 鑚や学 識も併 せ申請者 が博士（ 理学）の 学位を受 けるに充分 な資格を 有するも のと認定し た。