博士（地球環境科学）

井尻貴之

学位 論 文題 名
Molecular cloning of mouse novel testis―specific genes
and analysis of their function using the knockout mice
（マウスの新規精巣特異的遺伝子の単離とノックアウ トマウスを 用いた機能解析）

学位論文内容の要旨
精子形成は、精原細胞の分裂増殖と精母細胞への分化、精母細胞における減数分裂、減数分裂によって形成された精子細胞の精子への変態の3段階に大きく分けられる。これらの一連の分化過程の正確な進行は、生殖細胞における特異的な遺伝子群の発現や支持細胞との細胞間相互作用により厳密に制御されている。近年、ヒトを含む哺乳類の減数分裂や精子形成を制御する遺伝子が単離され機能の解析がなされているが、その遺伝的制御機構にういては未だに不明な点が多い。
また、遺伝子操作技術の進歩によルトランスジェニックマウスやノックアウトマウスの作製が可能となったために、数多くの不妊モデルマウスが作製され、既に200ラインを越えている(MatzukandL
amb，2002)。これらのモデル動物のinvivoの解析系は、哺乳類の精子形成機構を理解する上で非常に有カなものとなっている。本研究では、哺乳類の減数分裂や精子形成を制御する遺伝子を網羅的に単離し、これらの遺伝子の発現パターンを明らかにした。さらに、単離した精巣特異的遺伝子のノックアウトマウスを作製して生殖器官における表現型を解析したところ、inv
ivoでの機能に関して興味深い知見が得られた。
第1章で は、精巣特異的な新規遺伝子の単離を試みた。特に、減数分裂期に着目し、エルトリエーション法によって分画されたパキ テン期精母細胞由来のcDN
Aライプラルーを用いて遺伝子のスクリーニングを行った。このcDNAライブラリーから120クロー ンを単離して、各クローンの3．端と5．端の塩基配列を決定し、データベースを用いてホモロジー検索を行った。その結果、35クローンが機能が未知な遺伝子であり 、このうち14クローンは体細胞由来のESTと相同性をもたなかった。そこでノーザン解析を行ったところ、これら14クローンのうち7クローンが精巣特異的に発現していた。以上により、バ キテン期精母細胞特異的cD
NAライブラリーを用いた遺伝子スクリーニングは、新規で精巣特異的な遺伝子を得るために非常に効率の良い方法であることが示された。さらに、ms
ぬハイブリダ イゼーションにより、新規精巣特異的な7クローンの精巣内での発現部位を調ぺた結果、精母 細胞に強く発現するものが2つ得られた。これら2クロー
ンの うち 、公 共の デ ータ ベー スか らcDN
Aの 全長 配列 が入 手で きた MA
00
11クローンを觚〃と一 91 ‑命名し、その機能解析を試みた。
第2章では、マウスP
acI
亅遺伝子の構造とタンパクの局在を明らかにした。データベースから入 手 し た Rlc． Hの cDNA配 列 と ゲ ノ ム DNA配 列 の 比 較 から 、 Rdj遺 伝 子は ゲ ノ ム 上約 30kbの 間に 27個の エ ク ソン を も ち、 CDN
Aの 全 長は 3493
bDでコード するタ ンパクは 983
アミ ノ酸から構成されていることがわかった。さらに、Pac11
夕ンパクのアミノ酸配列は、夕ンバク同士の相互作用に関わるAm】adi】lOほRM）リピートを含んでいることが判明した。また、データベース検索によりR℃11のラットホモログが得られ、マウスーラット間で82％のアミノ酸の一致がみられ た。次に 、PacnのC末端領 域に対するポリクローナル抗体を作製し、免疫染色を行った
ところ 、Pacn
夕ンパクは精巣内で精母細胞の核とともに前期精子細胞の核にも局在することが示され た。これらの結果から、PaCn
夕ンパクは減数分裂期だけでなく減数分裂後にも存在し、他のタンパクと共同で精子形成に関与していると推測された。
第3章では、 Rにn遺伝 子のノッ クアウトマウスを作製し、精巣や雄性生殖器官における表現型を詳細に解析した。本研究では、ゲノムデータベースの情報を基にPCRによって得たゲノムDNAを用いることによって、効率の良い遺伝子夕ーゲテイングを試みた。その結果、短期間でノックアウト マウスを得ることに成功した。興味深いことに、B6/129系統の遺伝的背景をもつノックアウトマウスでは、野生型マウスにおいてもホモ接合型マウスにおいても精巣の大きさにぱらつきがみられたが、これは異なるマウス系統間の遺伝的相互作用に起因すると考えられた。そのため、交 配により B6系統だ けの遺伝 的背景と129系統だけの遺伝的背景をもつノックアウトマウス系統を作出した。これら遺伝的背景を均一化したマウスにおいては、両系統ともに野生型マウスとホモ接合型マウスの間で精巣の大きさにほとんど差がなかった。次に、精子形成の異常を調べるために精巣の病理組織の観察を行ったところ、B6系統と129系統のいずれの遺伝的背景においてもノックアウトマウスの精子形成は正常であった。そこで、雄のノックアウトマウスの妊性を確認するため野生型のB6系統の雌マウスとの交配実験を行った結果、両系統ともにホモ接合型マウスは妊性を示し産仔数も野生型マウスと比べて差がみられなかった。さらに、精巣上体内の成熟精子の塗沫標本を作製し、精子の形態を調べたところ、両系統ともに野生型マウスの精子よりもホモ接合型マウスの精子において中片部の形態異常が多くみられた。また、精巣上体内の精子数も ホモ接合 型マウ スの方が 少なかった。以上の結果から、Rdi遺伝子は、生殖能カにはほとんど影響を及ぽさないが、精巣上体における精子数と精子の形態形成に関与する可能性が示唆された。
第2章、第3章の 結果から 、PaC
11夕ンバクは後期精子細胞以降の細胞には存在しないが、ノックアウトマウスの主な表現型は精巣上体における精子数の減少と精子鞭毛の形態異常であることがわかった。本研究で得られたRにZi遺伝子のノックアウトマウスでは、不完全夕ンパクが作られていたため観察された表現型は顕著ではなかったが、半数体特異的な遺伝子の転写制御因子であるA（冫「のノックアウトマウスと類似した表現型を示した。aぱ遺伝子のノックアウトマウス
も精子形成は正常で妊性をもっが、精巣上体内の精子数の減少と精子鞭毛の異常を示す巛o喞aeC‑ 92―畆，2004)。しかし、」匁CT夕ンパクは精巣内で前期精子細胞の核だけでなく後期精子細胞の細胞質にも局在しているのに対し、Pacllの場合にはタンパクの局在部位と表現型の観察される時期が一致しない点で異なる。そのため、PacIi遺伝子は前期精子細胞の核において半数体特異的な遺伝子の転写制御に関わっており、そのターゲットとなる遺伝子が鞭毛を構成するタンパクを作っている可能性が考えられた。精子の鞭毛の形成は減数分裂直後の前期精子細胞の細胞質で開始される（RuSSeueC畆，1990）という報告もあり、前述の仮説の可能性を支持している。今後は、
免疫 沈降や 弧′Oh皿） nd法でPacnのAR
Mリピートと相互作用するタンパクを確認することで、Pac11の精子形成・精子成熟過程での役割を解明する必要がある。

‑ 93−

学位論文審査の要 旨
主査
副査
副査
副査

教授 松田洋一
教授 木村正人
助 教授 瀧 谷重 治助 教授 北 田一 博

学位論文題名Mo
lec
ularcloni
ngofmou
senov
elte
st
is−speci
ficgenesandanalys
isofthe
ir f
unc
tionu
singt
hekno
ckou
tmice（ マウ スの 新規精巣 特異的遺 伝子の単 離とノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 用 い た 機能 解 析 ）減数分裂や配偶子形成の遺伝的制御機構に関する研究は、これまで主に出芽酵母を対象として行われてきた。しかし、最近ではマウスからも減数分裂や配偶子形成に関わる遺伝子が数多くの単離され、それらの機能が少しずっ明らかにされてきている。しかし、哺乳類にはまだ未知な遺伝子も数多く存在すると考えられ、その同定と機能の解析が求められている。本研究では、マウスより新規の精巣特異的遺伝子を単離し、その機能の解明を試みた。
マウス精巣から新規の精巣特異的遺伝子を効率よく単離する目的で、C57BL/6J(B6)マウ スの精巣 からェル トルエー ション法を 用いてパキテン期精母細胞を分画し、cD
NAライ ブラリー を作製し た。ラン ダムにcDNAク口 ーンを120個単離し、各クローンの3 端と5 端の部分塩基配列を決定した。塩基配列に基づいてゲノムデータベースを用いて相同 性検索を 行い、体細胞由来のESTと相同性をもたない未知の14ク口ーンを検出した。
ノ ーザン解 析の結果、14クローン中7クローンが精巣特異的に発現する新規遺伝子であった。精巣組織を用いたinsit
uハイブルダイゼーション解析の結果、精母細胞に強く発現 する遺伝 子クロー ンが2つ同 定された。 これら2クローンのうち、公共のデータベース からcDNAの全 長配列の 情報が入 手できたク ローンをPaclヱと命名し、その機能解析を試みた。
ま ずマ ウ スPaclユ 遺 伝 子の 構 造を 明 ら かに し た。 cDNA配列とゲノ ムDNA配列の 比較 から、Paclユ 遺伝子は 約30kbの大き さで27個のエクソンをもち、cDNAの全長は3493bpで 983アミノ酸 をコードしていることがわかった。さらに、夕ンパク同士の相互作用に 関わるArmadillo (ARlvDル ピートを 含んでいる可能性が示唆され、ラットホモログー 94一との間で82％のアミノ酸が一致した。次に、C末端領域に対するポリクローナル抗体を作製し、免疫染色によってPacll夕ンバクの局在を調べた。その結果、Pacllは精母細胞と前期精子細胞の核に存在し、核内において他のタンパクと相互作用することによって、精 子 形 成 に 関わ る 遺 伝 子 の 発 現を 制 御 し て い る 可 能性 が示 唆され た。
最後に、Paclユ遺伝子の機能を調べる目的で、遺伝子夕ーゲティング法を用いてノックアウトマウスを作製し、精巣や雄性生殖器官における表現型を詳細に解析した。ノックアウ トマ ウス は、 129/Sv由来 のES細胞 のキ メラ マウ ス雄 とB6雌との交配によって得られた個体に由来するため、遺伝的なパックグラウンドの影響を排除する目的で、交配によづ てB6系統 の遺 伝的背 景と 129系統 の遺 伝的 背景を もつ 系統を作出し、Pacll遺伝子の機能解析に用いた。両系統とも野生型マウスとホモ接合型マウス(Pacll+マウス）の間で精巣の大きさに差は見られず、ノックアウトマウスの妊性は両系統ともに正常であった。また、精子形成の異常を調べるために精巣の組織標本を観察した結果、両系統ともにホモ接合型マウスの精子形成は正常であった。しかし、成熟精子の形態を調べた結果、両系統ともに野生型マウスの精子よりもホモ接合型マウスの精子において鞭毛の形態異常が有意に多くみられた。さらに、精巣上体内の精子数もホモ接合型マウスの方が有意に少なかった。以上の結果から、Pacll遺伝子は、生殖能カにはほとんど影響を及ぼさないが、精巣上体における精子数と精子の形態形成に関与する可能性が示唆された。また、ノックアウトマウスでは、野生型よりもサイズの小さいmRNAが発現することがノーザン解析によって判明し、さらにウェスタン解析によって不完全夕ンパクが産生されていることが示された。そのため、産生された不完全夕ンパクが他のタンバクと相互作用することによってほぽ正常に近い状態で精子形成が進み、顕著な表現型が表れなかった可能性が考えられる。そのため、Paclユ遺伝子は前期精子細胞の核において半数体特異的な遺伝子の転写制御に関わっており、そのターゲットとなる遺伝子が鞭毛を構成するタンパクを作っている可能性が考えられた。精子の鞭毛の形成は減数分裂直後の前期精子細胞の細胞質で開始 さ れ る と い う 報 告 も あ り 、 前 述 の 仮 説 の 可 能 性 を 支 持し て い る 。
今 後 は 、 免 疫 沈 降 法 や two hybrid法 を用い てPacllのARMルピ ート と相 互作 用するタンパクを確認することで、Pacll遺伝子の精子形成・精子成熟過程での役割を解明することが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、また申請者が研究者として誠実かつ熱心であり、大学院博士課程における研鑽や修得単位などもあわせ、博士（地球環境科学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

ー 95ー