博士（獣医学）池田卓也
学位論文題名ラ ッ ト 肝 細 胞 膜 特 異 抗 体 に よ る 肝 障 害 に 関 す る 実験 的研 究

学 位 論 文 内 容の 要 旨
ウイ ルス肝炎を含めた種々の肝 障害において，その発生および進展に免疫反応の関与が 指摘されている．特に，肝細胞膜上に存在する臓器特異抗原と ，これに対する抗体を介した免疫反応が，肝細胞障害の発生と 進展に深く関わる事が示唆されている，しかし，多くの精力的 な研究にもかかわらず，肝障害の発現に対する肝特異抗原の果たす役割については不明な点が多い。
本論文では，肝障害の発生 に対する免疫学的機序の関与を採るために，ラッ卜の肝細胞膜 抗原に対する単クローン抗体を用いての実験的研究を行い，以下の成績を得た．

．

ラッ ト 肝細 胞膜 に存 在す る 分子 量105，000の糖 蛋白質抗原（RLSA）を認識する，ハイブリ．ドーマ・R
M―1株由来のIgM型モノクローナル抗体（MoAb）を用い，RLSAの種および臓器特異性ならびに個体発生過程にお ける発現を免疫組織化学的に検討した．その結果，ラッ卜では 本抗原は肝細胞膜にのみ認められ，他の臓器，組織には検出さ れなかった．この抗原は肝細胞表面を構成する類洞，細胞間お よび毛細胆管側面の膜に均等に存在し，細胞質内には検出され なかった．また，分離肝細胞の超微形態学的観察により，RLSAは微絨毛を合む細胞膜表面に存在することカi確認された，RLS
Aはマウス，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウシ，ニワトリ，サルおよび．ヒトの肝組織には存在しなかった．以上の所見から，MoAbにより認識される抗原は，ラット肝細胞膜にのみ存在する，臓器および種特異的な抗原であるとみなされた．
ラット の発生 および 成熟過程 におけ るRLSAの発現を検討した結果，この抗原は妊娠18日齢以前の胎子肝には検出されず，
妊 娠19日 齢から の幼若 肝細胞の 接合部 の膜に 発現していた・
こ の抗原 量は生 後急速 に増加し ，生後 25日で は肝細胞膜全周に 認めら れるよ うにな り，以後 検索し た22週 齢まで変化なく観察された．RLSAは，成熟ラッ卜において｜ま，肝小薬の門脈周囲，中間帯，中心静脈周囲に存在する肝細胞膜の全周に均等に観察され，肝小葉内における抗原の局在は認められなかった・
RLSAを認識するMoAb・を用い，ラットの初代培養肝細胞に急性壊死性変化を誘導した．すなわち，補体源としてのラット新鮮血清の存在下゛で肝細胞培養液にMoAbを添加した結果，MoAbの 濃度に 依存して肝細胞逸脱酵素lactate dehydrogenaseが急激に上昇した，この細胞障害は，補体非存在下では発生しなかったことから，抗原抗体反応により活性化された補体によって誘導されたものと考えられた・
形態学的には，MoAb添加後速やかに細胞表面に多数のブレブが形成され，細胞内小器官の変性が細胞表面から細胞中心部へと進行していた，ブレブ内には細胞内小器官はほとんど認められず，これは種々の薬剤性肝障害で形成されるブレブの形態とは異なっていた，本障害は補体の腹への直接的侵襲によるものであり，間接的に膜障害が惹起される薬剤性障害とは成因的に異なるようであった．一方，肝細胞膜の形態的変化に先行して細胞膜直下に変性した細胞骨格とみなされる線維様構造が認められた，したがって，補体による膜侵襲の過程では，細胞内に流入した Ca2゛ により 細胞骨 格系に破 錠が生 じ，こ れが細胞膜断裂を伴った変化の一因をなすものと考えられた・
MoAbを ラット の尾静脈に投与することにより，肝臓に一過性の劇 症 型 肝 炎が 誘 発 さ れた ． す なわ ちMoAb投与直 後から， 肝小葉中間 帯およ び門脈域に，充出血を伴った肝細胞の融解壊死巣が多数 形成さ れた．この壊死巣には炎症性細胞浸潤は認められなかっ たが， MoAbと 補体第 3成分C3の沈着 を認め た，血清中のMoAbは 投 与直 後 か ら 急速 に 低 下し ，投与 後30分 以降では 検出さ れ な か った ． 血 清 中補 体 価 はMoAb投与 直後か ら急速に 低下し ， 投 与 後10分 で 最 低値 に 達 した が，以 後漸次 上昇し投 与
後4時 間に は 正 常 値の 50%ま で 回 復し た，一 方，コ ブラ毒フ ァクターによって補体系を枯渇させたラットにおいては，MoAb
投与による肝障害の発生は認められなかった・
M oAb投与後 1時間から，12時間まで，壊死巣は次第に拡大したが，こ の時期 の肝細胞の壊死は凝固壊死であり，壊死巣にはC3の 沈 着 は なか っ た ． また 血 清 中か らはMoAbが消 失し，補 体価は回復 傾向を 示した ．以上 から， MoAb投 与1時間 以降に生じる肝細胞 の凝固 壊死は，融解壊死による局所的な微小循環障害の結果生じるものと考えられた．
一方， 血清中 の肝細胞逸脱酵素aspartete aminotransferase（AST），alanine aminotr
ansferase（ALT）はMo
Ab投与後急速に 上 昇 し ， 投 与 12時間 後 に は 最高 値 に 達 した ． し か しAST，
ALT｜ま MoAb投 与3日後には正常値に復した．病理組織学的には
MoAb投 与 後 12時 間 以 降 では 肝 細 胞の 壊死性 変化は 終息に向 かい，肉芽 組織に よる置換を経．て瘢痕化した．なおMoA
b投与後3週 目 で は ， 肝臓 組 織 像 は正 常 で あ った ． 以 上 の成 績 か ら ，MoAbによるラットの肝細胞の壊死は，抗・原抗体反応により誘発されたキm体の活性化により引き起こされるものと考えられた．
以 上，RLSAを認 識するMoAbと肝 細胞膜との抗原抗体反応に基づく，補体依存性細ー胞融解（complement−dependentcyt
o−toxicity:CDC）により，急性の壊死性肝細胞障害が惹起されることを示した．これまでに多くの肝細胞膜特異抗原を認識する抗体 が報告 されて いるが， これら の抗体による肝細胞障害性は示されていない．本研究において確立した肝細胞障害の実験系は，肝細胞膜特異抗原と液性免疫因子との関与によって生じると推洞されている肝障害，例えば劇症型肝炎の発症機序の解明 に 極 め て 有 用 な モ デ ル に な る も のと 考 え られ る ．

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 板 倉 智 敏
誠副 査 教 授 杉 村昭
副 査 教 授 佐 藤 文 之
副 査 教 授 斉 藤 昌

学他論 文腦 名ラ ッ卜 ハ1‐荊 川J包 ‖炎 ！I＃う せわ ヒ1本に よる n￣1｜ ；江讐 fに｜矧する災験的りfシヒ

本 研 究 で は 、 ラ ッ ト の JJr翁 IJJ'dl JL:!に 存 在 す る 分 子 畳 】 05、 000の 枇 蛋 白 質 LLb,(（ 11ヽ1」 SA）を認 ｜池 する1gM聾｜ J．モノ ク口 ―ナル L'Pb:（ MoAb）を 用い 、ULIi,iliL'Ph:
反応 によ って亅 J；i： 1雌害 の起こ るこ とをIリJらか にし た。
1く 1． ， S八 は ラ ット の 亅 亅 ・ l‐ gflllJ包 J亅 炎 に の み 認め ら れ 、 こ の lr:IIIJi'dt彊 、 亅 亅 l:議 以 外 の 荊 川 包・ 荊 ． t織 、 他 の 励 物 ： 、 1￠ び に ヒ ト の あ ら ゆ る 8111)J に は 認 め ら れ な い 'rsH『 ｜ ′ 、 Jな ゎ ． c肌 （ であっ た、この 抗原 は、胎 齢19口 から Hj現し 始め、 生後 25日以 降では JJr荊1‖ J包JJ葵 仝

J問 に及ん で存 7FしたlI
ラ ッ ト の 初 f℃

野 ヨ 缶 亅 亅 ： I． 荊 lIJ胞 の J 捲 養 液 に、 MO八 bと 、 和 n1イ

泓〔 として ラッ ト新角 f．Irllね｜ jを添カ ‖し たキ｜ li冫に 、J亅 I‐荊 川J包に坡タピ．1型：変化が±｜ニじた．，しかし、この′将j聖み藍にh6
仆源 を添 加しな い場 合には 、JJ1‐ 荊‖ 胞蛾死 は誘 導され なか った． ・Mo八 bを ラ ッ ト の JEi伽 脈 内 に 投 与 し た 茄 − 泉 、 J亅 ・ l‐ 臓 に 多 発 性 域 死 巣 が 一 過 ・ ピ l三にA悉発さ れた 。づ． なわ ち、域 死巣 はMO八b投与後 血ち に起こ り、 1211暑｜ flJまで
j広 人し、 J災後 修j鎚に ｜句 かった l、MO八bj殳与 後JilI】川の 壊死 欒には 、Mn八 hとね6体成分 じご Iの沈着 を総 めたが 、llJふ ｜‖ J後の 坡死巣 には C＾の沈 着は なかっ た（ 、｜ fl【 f肖 ｜ 1｜ の Mo八 bは 、 投 与 後 10分 で 最 低 1｜ 虹 に 述 し 、 以 後 漸 次 上 昇 し 、 投 与 後イ ‖ 、 0川 で 正 ↑ ； 0101の 50％ ま で 匝 lj鉅 し た 。 一 方 、 コ ブ ラ i缶 フ ァ ク ク ー に よ っ て キ m仆系を'fiii沁させたラットにおいて1よ、M（）八b投与によるJJi:
lf,ii
i胞壊7/Lは誘発されti ij‑) t‑"ま t‑.

I(ILiilJilia)nl:!
f:IIIJJ'rliE)ll;Zn筆索； lsixir
Lnt.
cこlmi
11（）Lrans「crascと ；lIミ1．ーilln
C：lml11（） trエlns「CrdsCは、 M（ ）八bj
楚！j後；急：述に亅ニ牙｜し、12‖暑｜fllJ
後には´汝1
1．5
101（ に 述 し た， し か し 、投与 3
1：1後に t．よ 両r≠索は 正↑ ；f『lIに 復した，

J1亅． ． ． の よ うに 、 c｜ 1葡桁 は 、 Iく 1． 」 SAを ；恐j池づ →るM（） Abと川￣ 荊川色 J亅 炎との I)Llj;
i
jJ
t1ホ反L
己こにゴふづき、わn
1水．f火行．Y｜：の川．′fiIill
Wikfiri:、すなわち域死の´心こることを実証した、 この 成 果 は 、 川‐ 5； X〓 野の 発 7｜ 1！機 Jfの frl乍 1リ Jに人きくft献 づ ． る ‥よ っ て'秤型モn―． ．ff‖は 、iL川 ・1；t也氏が 、t噂．． 1： （献1欠く t）の ：ピ 他を受 けるに ←｜． 分な資々符をイ］．
す るもの と憇 めた． ，‑ 351‑