博 士 （ 獣 医 学 ） 後 藤 明子
学位論文題名Influence． of the mutations of envelope protein amino acids on
the biological characteristics of tick‑borne encephalitis vlrus（ ダ ニ 媒 介 性 脳 炎 ウ イ ル スの エン ベロ ープ 蛋白の アミ ノ酸 変異 がウ イ ル ス の 生 物 性 状 に 与 える 影 響 ）学位論文内容の要旨
ダ二媒介性脳炎(TBE)ウイルスはフラピウイルス科に属し、人に致死率の高い重篤な脳炎を起こす人獣共通感染症の原因となる。 TBEウイルスはエンベロープ上に2種類の糖蛋白(prM丶E)を有し、これらの糖蛋白ががウイルスの標的細胞への感染に大きな役割を果たすと考えられている。そのためエンベロープ上の蛋白（特にE蛋白）の様々な変異がウイルスの生物活性や病原性に影響を与えたという報告は数多い。本研究ではTBEウイルスのprM、E蛋白の変異が 病 原 性を含 めた 生物性 状に 与える 影響 につい て解 析を加 えた 。
まず第1章では、培養細胞に適応したTBEウイルス変異株のマウスにおける病原性解析を行った。TBEウイルスの10shima5‑10株をBHK‑21 ‑細胞で継代した所、BHK‑21細胞で増殖が早い変異株(Oshima0‑1株）が得られた。Oshima5‑10株とOshima 0‑1株のマウスでの体内動態および両株の遺伝子RNA塩基配列と生物性状を比較し、病原性との関連を調ぺた。その結果、マウス脳内接種による神経毒カは両株間で有意な差は見られ毅かったが、皮下接種による神経侵入性毒カの比較ではOshima 01‑1株はOshima 5‑10株より弱かった。血清中の中和抗体価は両株接種マウス問で有意な差は見られなかったが、Oshimaa‑l株感染マウスの血液中及び脾臓の平均ウイルスカ価はピーク時そOshima5‑10株感染マウスよりも減少していた。また、Oshima5‑10株感染マウスとは異なり、
Oshima01‑1株感染マウスの脳内ウイルスカ価は検出感度以下であった。ウイルス蛋白の推定アミノ酸配列の比較では、E蛋白と非構造蛋白のーつであるNS5蛋白に1ケ所ずつアミノ酸の相違が見られた。また、Oshima 5‑10株ではグリコサミノグリカン(GAG)によるBHK‑21細胞への感染阻害はほとんど見られナょかったが、Oshima 0‑1株では強い感染阻害が見られた。以上より、OshimaClー1株 は E蛋 白 の ア ミ ノ 酸 変 異 に よ り GAGに 対 す る 高 い 親 和 性 を 持 っ た めに 、細 胞 外 の GAGに 捕捉 さ れ てウ イ ルス の 伝 播が 起 こり に く くな る 可能 性 が 考えられた 。その結 果、中和 抗体価が上 昇する前 の血液中 のウイル ス量が少 なくな
る た め 、 脳 内 へ の ウイ ル スの 侵 入が 起 こら な い事 が示 唆 され た 。
第 2章 で は TBEウ イ ル ス の エ ン ペ ロ ー プ 蛋 白の 糖 鎖付 加 の 変異 が ウイ ル ス粒 子 分 泌 に 与 え る 影 響 に つ い て 研 究 を 行 っ た 。 TBEウ イ ル ス の prM蛋 白 とE蛋 白 に は 、 そ れそ れ 1箇 所ず つ N型 糖 鎖結 合 配列 が 存 在し て い る。 ま た、 E蛋
白 に結 合 して い る N型 糖鎖 の数や位 置はフラピ ウイルス 科のウイ ルスの種 類によ って 異 なる 事 が 知ら れ ている。 TBEウイルスの 粒子の分 泌と糖蛋 白の糖鎖 の関 連 を 明 ら か にす る た め、 哺 乳類 細 胞 でTBEウ イル ス の prM‑E蛋 白を 発 現 する プラ ス ミド を 用 いた ウ イルス様 粒子(VLPs)分泌発 現系を使 用してTBEウ イルス の E蛋 白の 糖 鎖 がVLPsの 発 現量 や 性 状に 与 える 影 響 を調 ぺ た 。そ の 結果 、prM蛋白 糖 鎖欠 損 型 では 培 養 上清 中 のE蛋白 は 野 生型 と比較 して減少 が見られた 。一 方 、E蛋白 糖 鎖 欠損 型 とprM‑E蛋 白糖 鎖 欠 損型 では培養 上清中の E蛋白は 野生 型 やprM蛋 白 糖鎖 欠 損 型と 比 較し て さ らに 減 少して いた。E蛋 白糖鎖増加 型で は 細胞 内 お よぴ 培 養上清中 のE蛋白が野 生型と比 較して全 体的に増 加して いる 事 が示 さ れ た。 一 方 、E蛋 白 糖 鎖移 動 型 のE蛋 白の 合成量は 野生型と 比較して 細胞内で は増加していたものの、培養上清中では大幅な減少が見られた。
以 上 よ り 、 正 常な VLPsの 分泌 に は E蛋 白の 糖 鎖の 付 加 位置 が 重 要で あ る可 能性 が示 唆 され た 。 また 、 E蛋 白の 糖 鎖 が増 加 す ると E蛋白 の合成分 泌が促進 される事 が示され た。
本 研 究 にお い て、 TBEウイル スのエン ベ口ープ蛋 白のアミ ノ酸の様 々な変異がウイ ルスの粒 子形成や 感染などに 影響を及 ぼし、ウ イルスの 弱毒化お よぴ生
物性状 変化の原 因となっ ている事が 明らかに なった。 また、い ずれのア ミノ酸
変異も E蛋白の抗 原性自体 を大きく変 化させる事は顔かったため、．今回見出され たE蛋白 上 のア ミ ノ 酸変 異は培養 細胞で効率 良く増殖 する弱毒 ウイルス 株を作出す る際に有 用な遺伝 子マ‐カー になると 考えられ る。従っ て、これ らの成績 は TBEの 新 世 代ワ ク チ ンの 開 発や 新 し い診 断 法の 開 発 に有 効 に活 用 で きるものと 考えられ る。

学 位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

高島郁夫
梅村孝司
堀内基広
苅和宏明

学位 論 文 題 名Influence of the mutations of envelope protein amino acids on
the biological characteristics of tick‑borne encephalitis vlrus（ダ ニ 媒 介 性 脳 炎 ウ イ ル ス のエ ンベ ロープ 蛋白 のア ミノ 酸変異 がウイ ル ス の 生 物 性 状 に 与 え る 影響 ）ダ二媒介性脳炎(TBE)ウイルスはフラピウイルス科に属し、人に致死率の高い重篤な脳炎を起こす人獣共通感染症の原因となる。TBEウイルスはエンベ
口ープ上に2種類の糖蛋白(prM、E)を有し、これらの糖蛋白がウイルスの標的細胞への感染に大き顔役割を果たすと考えられている。本研究ではTBEウイルスのprM、E蛋白の変異が病原性を合めた生物性状に与える影響について解析を加えた。
TBEウ イルス のOshima 5‑10株 をBHK‑21細 胞で 継代 した所 、BHK‑21細胞で増殖が早い変異株(Oshima Cl‑l株）が得られた。マウス皮下接種による神経侵襲性毒カの比較ではOshima Cl‑l株はOshima5‑10株より弱かった。OshimaCl‑l株感染マウスの血液中及び脾臓の平均ウイルスカ価はOshima5ー10株感染マウスよりも減少していた。また、ウイルス蛋白の推定アミノ酸配列の比較では、E蛋白と非構造蛋白のーつであるNS5蛋白に1ケ所ずつアミノ酸の相違が見られた。また、OshimaCl‐1株ではグリコサミノグリカン(GAG)によるBHK‑21細胞への強い感染阻害が見られた。これらの成績より、OshimaCl‑l株はE蛋白のアミノ酸変異によりGAGに対する高い親和性を持っために、細胞外のGAG様物質に捕捉されてウイルスの伝播が起こりにくくなり、神経侵襲性毒カが弱くなった可能性が考えられた。 ′TBEウイルスの粒子の分泌と糖蛋白の糖鎖の関連を明らかにするため、哺乳類細胞でTBEウイルスのprM‑E蛋白を発現するプラスミドを用いたウイルス様粒子(VLPs)分泌系を使用してTBEウイルスのE蛋白の糖鎖がVLPsの発現量や性状に与える影響を調べた。その結果、E蛋白糖鎖欠損型とprM‑E蛋白糖鎖欠損型では培養上清中のE蛋白は野生型と比較して減少していた。この成績より、正常なVLPsの分泌にはE蛋白の糖鎖の付加が重要である可能性が示唆された。

本研究において、TBEウイルスのエンベロープ蛋白のアミノ酸の様々な変異がウイルスの神経侵襲性毒カの低下および生物性状変化の原因となっている事が明らかになった。よって、審査員一同は上記学位論文提出者後藤明子氏が博士（獣医学）の学位を授与されるのに十分な資格を有するものと認めた。