博 士 （ 医 学 ） 浅 野

毅

学 位 論 文 題 名

関節 リウマチ におけ る内在性制御因子としてのcv
9インテグ1
Jンの役割
学 位論文 内容の要旨【背景と目的】関 節リ ウマ チ(RA)に おい て好 中球 やT細 胞の 役割は解明が進んでいるが、常在滑膜細胞の重要性も指摘されている。滑膜細胞は種々の細 胞外マトリックスを産生するが、その中 で も オ ス テ オ ポ ン チ ン (OPN)や テ ネ イ シ ンC(TN‑C)の 発現 上 昇や 炎症 との 関与 が報
告 さ れ て い る 。OPNとTN‑
Cの 共通 の受 容体 とし てa9イン テグ リ ンが ある 。我 々は マウ
スコ ラー ゲン 抗体 誘導 性関 節炎 (CAIA)が a9
イ ン テグ リン の中 和抗 体で 抑制されることを証明した。しかしヒトRAにおけるa9インテグリン の発現は部分的な報告があるのみで、その 機能 は不 明で ある。本研究の 目的は、ヒトRA滑膜組織および細胞におけるa9インテグ リ ン の 発 現 と 、 そ の 関 節破 壊 に お け る 機 能 を 解 析 する こ と で あ る 。
【対象と方法】
滑 膜切 除術 また は関 節置 換術 を受 ける 予定 の R
Aお よび 変形 性関 節症 (OA)
患者にイン
フオ ーム ドコ ンセ ント を行 い、 同意 が得 られ た 3
1名 のRA患者 、25名の OA患者から手術中に切除された滑膜組織を採取し解析に用いた。本研究は北海道．大学大学院医学研究科・医学部の医の倫理委員会に承認されている。
免 疫 組 織 化 学で 滑膜 組織 中の a9イン テグ リン 、OPN、 TN‑Cの 発現 を解 析し た。 a9インテグリン染色はポリクローナル抗体を作成した。 a9インテグリンの細胞内アミノ酸配列を合 成し たペ プチ ドをC57B
L/6マウスに4回免疫して得られた血清を不活化して染色に用いた 。滑 膜組 織中 の遺伝子発現は 、組織を凍結破砕しRNAを抽 出した後、real‑time P
CR法にて定量解析した。
滑膜組織からコラゲナーゼで滑膜細胞を単離し、細胞レベルの解析および培養を行った。
フローサイトメトリーにて滑膜線維芽細胞、マクロ ファージの分画を特定し、それぞれの細胞 群に おけ るa9インテグリンの 発現を解析した。発現強度は解析ソフト(Flow0）で計算し た平 均螢 光強 度を 比較 した 。ま た、 CD
14抗 体‐ 磁気 ビー ズを 用い た分離システム（MACS） で滑 膜線 維芽 細胞 とマ クロ ファ ージ を 分離 し、 TN． C
お よび OP
Nの発現を上清中 の タ ン パ ク レ ベ ル （ ELISA） 、 遺 伝 子 レ ベ ル （ real― timePCR） で 解 析 し た 。
Q9特 異 的 に 反 応 す る よ う 0PNお よ ぴ TNIC分 子 内 の RGD配 列 を RAA配 列 に 置 換 し た
変異 タン パク （OPN爪AAおよ びTNIC瓜 ．AA）を 作成し、これを用いて滑膜線維芽細胞の細胞接着試験、細胞増殖試験を行った。抗Q9インテ グリン抗体による阻害の影響も検討した。細胞接着試験は接着細胞をクリスタルバイオレ ットで染色し、光学顕微鏡像およぴ吸光度にて細胞接着を評価した。細胞増殖試験はCeuCounting
瓩t‐8による、吸光 度にて細胞数を評価した。
滑膜線維芽細胞および滑膜マクロファージに対し 、TN．C
爪AA刺激によるサイ トカイン産生試験を行った。各試験の際には抗Q9インテグリン抗体またはコントロール抗体を加え、− 226―

a9
イ ンテグリ ン阻害 による影 響も検討した。遺伝子レベルの発現はreal‑timePCR法、上清中のタンパクレベルの発現をELISAにより解析した。
統 計学的解 析は統 計ソフト G
raphPadP
rismを使用し、2群間比較はunpaired2‑tail̲edSt
udent 8ttest、多群間比較はl‑wayA
NOVAにより有意差検定を行った。Pく0.
05を統計学的有意とした。
【結果】
免 疫組 織 染 色及 び real‑time P
CRで 、滑 膜 組 織に a9イン テグリ ン、OPN、TNCの発現を 認めた。 RA滑膜組 織ではこ れらの 発現が遺 伝子レ ベル、タンパクレベルともにOA滑膜組織よりも亢進していた。
フ ローサイ トメト リー解析 では滑 膜線維芽 細胞、 滑膜マクロファージの両群にa9インテ グリンの 発現を 認めた。 RAでは滑 膜線維芽 細胞お よび滑膜マクロファージともにa9インテグリンの発現がOAの滑膜細胞に対して亢進していた。
MA
CSに よっ て 滑 膜細 胞 は 、CD14陽性 の 滑 膜マ ク ロ ファ ー ジ とCD14
陰 性 の 滑膜 線維芽 細 胞 に分 離 さ れた 。 CD14
陽 性および 陰性細胞 の培養 にて、TN‑Cは主にCD
14陰 性細胞（ 滑膜線維 芽細胞 ）から、 OPNは 主にCD14陽性 細胞（ 滑膜マク ロファ ージ）か ら産生されていた。
細 胞接 着 試 験、 細 胞 増殖試 験では 、OPN/RAAまたはTN‑ C/RAAの濃 度依存性 に滑膜 線維 芽細胞の接着性および増殖性が亢進した。また、これら接着性および増殖性の亢進は、滑 膜 線 維芽 細 胞 を抗 a9インテ グリン 抗体で処 理する ことによ って、 有意に低 下した。
TN‑C/RAAを用いた滑膜線維芽細胞の刺激試験では、M
MP‑
1，・3，‐13，IL‑6の産生が遺伝子 レベル、 タンパ クレベル とも刺激によルコントロール(BSA)群に比し有意に亢進した。
抗a9インテグ リン抗 体による 阻害で、T
N‑C/RAA
刺激によるM
MP‑1，3，13，IL‑6の産生亢
進 が 有 意に 抑 制 され た 。 また 、 抗 a9イ ン テ グリ ン 抗体 による阻 害でBSA群にお いてもMMP‑
1，3，IL‑6の産生が抑制された。刺激試験の条件下で、滑膜線維芽細胞からはT
N‑Cおよ び OPNが 産 生 さ れ て お り 、 TN‑Cの 産生 は 炎 症性 サ イ トカ イ ン (TNF‑aま た は I
L‑1B)
添加時に、サイトカインの濃度依存性に亢進した。
TN‑ C/
RAAを用 いた滑膜 マクロ ファージ の刺激 試験では 、TNFーQおよびIL‑1Bの産生がコ ントロー ル群に 比し亢進 した。抗a9インテグリン抗体による阻害で、TN‑C/RAA
刺激によるTN
F‑aおよびIL‑16の産生亢進は有意に抑制された。
【考察】
ヒ トRA及 びOA滑 膜組 織 の 解析 か ら 、 我々 は a9イ ン テ グリ ン と その り ガ ンド であ るOPN、TN‑CがR
A患者の関 節微小 環境の重 要な要素 である ことを発 見した 。これら 分子のRAに おけ る 発 現レ ベ ル はOAと 比べ有意 に増加し ていた 。a9インテ グリン を介した シグ
ナ ルは滑膜線維芽細胞に細胞増殖を促し、これはRAの病理学的特徴である滑膜の過形成の一部を説明することが出来る。滑膜線維芽細胞はa9インテグリンを介した刺激で、MMP‑1，3．13のような蛋白分解酵素や、炎症性サイトカインIL‑6を分泌する。これらは軟骨の主成分 であるコラーゲンやプロテオグリンカンの分解を促進し、関節破壊に寄与することが明ら かになっている。また、滑膜マクロファージはa9インテグリンを介した刺激で、炎症性サ イトカイ ンTNF‑cニL、n‑iBを分泌 する。TNF‑aおよ びIl‑l
BのRAの病態における重要性は 、これらサイトカインがヒトRAの治療における分子標的となっていることからも明らかである。
滑 膜線維芽 細胞は TN‑Cを産生 しており 、これは 炎症性 サイトカインの存在下で更に亢進 した。こ れらの 結果は、 滑膜線 維芽細胞 や滑膜マ クロファージが自ら産生したTN‑C及ぴO
PN
は、 滑膜線 維芽細胞 やマク ロファー ジ自身が 発現す るa9インテ グリン に作用するという自己分泌・傍分泌反応の存在を示唆するものである。
【結論】
ヒ トR
A滑膜 組織、滑 膜細胞（ 滑膜線 維芽細胞 韜よぴ 滑膜マクロファージ）ではa9
イン
ー 227ーテグリンの発現が亢進していた。a9イン テグリンを介した刺激により、滑膜線維芽細胞の増殖性やMMP‑
1，3，13や炎症性サイトカ インの産生亢進が認められた。これら細胞増殖性や 炎 症 性 メ デ ィ エ ー タ ー の 産 生 亢 進 は 抗 a9イ ン テ グ リ ン 抗 体 に よ り 抑 制 さ れ た 。
a9Blイ ン テ グ リ ン は ヒ ト RAに お け る 治 療 標 的 に な り 得 る こ と が 示 唆 さ れ た 。

− 228−

学位論文審査の 要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 上 出 利 光
副 査 教 授 今 村 雅 寛
副 査 教 授 瀬 谷
副 査 教 授 三 浪 明 司男

学 位 論 文 題 名

関 節リウマチにおける内在 性制御因子としてのcv9
インテグ1フンの役割

申請 者は 、ヒ ト関 節リ ウマ チ(RA)お よび 変 形性関節症患者(OA)から手術時に得られた滑膜組織及びそこから単離された滑膜細胞を用い、炎 症性滑膜におけるa9インテグリンの発現および滑膜細胞におけるa9インテグリンの役割について詳細に解析し、その研究結果を報告した。
RA患 者 由来 の滑 膜組 織は OA患者 由来 の滑 膜組 織と 比べ 、a9イン テグ リン とそ のり ガ ンド
で あ る オ ステ オポ ンチ ン(OPN)や テネ イシ ンC(TN‑C)の発 現が 亢進 して いた 。滑 膜を 構 成する細胞群における発現解析では、滑膜線維芽細胞と 滑膜マクロファージにおいてa9インテグリンの発現が認められ、RA由来の滑膜細胞ではOA由来の滑膜細胞に比べその発現は亢進していた。
また、ば9インテグリン のりガンドの産生源を解析したところ、OPNは主に滑膜マクロファージから、TN‑Cは主に滑膜線維芽細胞から産生されていることが明らかになった。次に、滑膜線維芽細胞およびマクロファージにおけるa9インテグリン の機能解析を行った。細胞接着試験では、
滑膜 線維 芽細 胞は a9
イ ンテ グリ ンの りガ ンド で ある T
N‑Cおよ びOPNと 濃度 依存的ぬ接着を示し、この接着性は抗a9インテグリン抗体による処理 で、有意に低下した。細胞増殖試験では、
滑膜線維芽細胞はT
N‑Cの濃度依存的に増殖性を示し 、これは抗a9インテグリン抗体により抑制された。サイトカイン産生試験では、滑膜線維芽細 胞ではT
N‑
C刺激により、MMP‑1、‐3、‑1
3およびI
L‑6の産生が亢進した。この産生亢進は抗a9イ ンテグリン抗体により有意に抑制された。
この 抗a9イン テグ リン 抗体 によ るMMP群お よぴ IL−6の産生抑制は、TN‑
C刺激群のみならず対照群でも認められた。この現象は滑膜線維芽細胞自 身が内在性に産生するa9インテグリンのり
ガン ドが 関与 する と考 え、滑膜線維芽細胞からのTN‑CおよびOPNの産生を解析した。滑膜線維芽細 胞は T
N‑Cおよ ぴOPNを産 生し てお り、 TNー Cの産 生は T
NF‑a
韜 よび IL‑1ロの存在で促進さ― 229―

れ た。 一方 、滑膜マクロファージに対するサイトカイン産生試験で は、TN‑C刺激によりTNF‑0
およぴIL‑1ロの産生 が亢進し、この産生亢進は抗a9インテグリン抗体による 阻害で有意に抑制された。
主査 の小 池教 授か らは 、1） 抗線 維芽 細胞 抗体 の特 徴・ 抗原 につ い て、 2
） CD147M
ac‑lによ る展 開に つい て、 3）ロ 9イ ンテ グリ ン が局 所で 発現 が亢 進し てい るか 、4） OPNとTN‑Cは相 加的 又は 相乗 的に 作用 する か、 5）a9インテグリンはIL‑6のpathw
ayに関与するか、副査の三浪教授からは、6）a9インテグリンの阻害が局 所のみの病態のブロックになるのか、7）IL‑
6を 直接 阻害 する場合との治療効果の違い、8）ヒトとマウスのa9インテグリンおよびりガンドの 役割 の違 いについて、9）抗a9インテ グリン抗体による治療に際し考えられる利点・欠点につ いて 、副 査の 今村 教授 から は10）サ イトカイン産生に対するa9インテグリン阻害が部分的で ある 点が 実際 の治 療効 果に 影響 する か、11）抗a9インテグリンを全身投与した場合の副作
用 の可 能性 、1
2）TNF‑0の産生源（マク ロファージと線維芽細胞）について、副査の瀬谷教授
か らは 1
3） 他の サイ トカ イン 阻害 と比 較した際のa9インテグリン阻害のメリットについて、
14）自 己分 泌に 強く 影響 を与 えて いる 内 因性 のり ガン ドの 特定 にっ いて 、15）抗 a9イ ンテグリン抗体による接 着阻害が完全ではないことの考察にっいて、副査の上出 教授からは16）抗a9イン テグ リン 抗体 の実 際の 治療 に応 用した場合の考えられる位置づけ、17）局所でのa9インテグリンが発現増 加しているメカニズムにっいて質問を受けた。申請者はいずれの質問に対して も、 自己 の実 験デー タや 過去 の報 告を 引用 しな がら 概ね 適切 な回 答を なし得 た。
この論文は、こ れまでヒト特にRAおける関連が殆ど分かっていなかった めインテグリンという分子について、 発現およぴ滑膜線維芽細胞とマクロファージにおける機能を明らかにした。
ヒトRA滑膜において 発現が亢進しているa9インテグリンとそのりガンドは、 リガンドを産生した滑膜細胞自身にa9インテグリンを介して作用し、炎症維持・関節破壊を促 進するという自己分泌・傍分泌サイク ルが存在することが明らかになり、a9インテグリンがヒ トRA治療における分子標的のーっにな り得る事が示唆された。
審査員一同は、こ れらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取 得単位なども併せ申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け るの に 充 分 な 資 格 を 有す るも のと 判定 した 。

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