博 士 （ 獣 医 学 ） 塩 崎 拓 也

学位論文題名インフルエンザAウイルスの複製に関わるアポトーシス誘導分子Siva―1の機能解析
学位論文内容の要旨
H5Nl亜型高病原性鳥インフノレェンザウイノレスA/HongKong/483/97(HK483)
株お よぴ A/Hong Kong/486/97 (HK486)株の哺乳動物に対する病原性の相違に関与 する PB2タンパク質に注目し、抗体アレイ法によりPB2タンパク質と会合する宿主細胞分子をスクリーニングした。その結果、16種類の宿主細胞分子がPB2タンパク質と会合する候補分子として同定された。
これらの分子の会合を、免疫共沈降法で解析した結果、Siva‑lタンパク質がPB2タンパク質と会合することが示された。また、Siva‑lタンパク質はHK483、HK486およびA/PuertoRico/8/34(PR8；HIN1）株に由来するPB2タンノ弋ク質と会合す るが 、特にHK486株に由来するPB2タンパク質に親和性が高いことが明らかになった。次に、Siva‑lタンパク質とPB2タンパク質の細胞内局在を、螢光抗体染色法により解析した。その結果、インフルエンザAウイルスの感染した細胞ではSiva‑lタンパク質とPB2タンパク質は核に局在し、ほとんど同一の細胞内分布を示すことが明らかになった。これらの結果からSiva‑lタンパク質に注目し、インフルエンザAウイルスの感染した細胞での機能と役割を明らかにするために、さらに解析を進めた。
Siva‑lタンパク質は、CD27タンパク質と会合しアポトーシスの誘導に関わるシグナル伝達分子として見出され、その後の解析により様々なアポトーシス誘導に関わることが報告されている。これらのことから、Siva‑lタンパク質がイン フル エン ザAウイ ルスの 感染 によ る細胞死船よびアポトーシスの誘導に関与している可能性が考えられた。そこで、Flp−insystemを用いて、Siva‑lタンパ ク質 を恒常的に発現するA549細胞由来の細胞株を樹立し、インフルエン
ザAウ イルスPR8株の感染による細胞死誘導を解析した。位相差顕微鏡で観察した結果、Sivaー1タンパク質を恒常的に発現させた細胞株ではコントロールの細胞に比べてPR8株の感染により細胞死が著しく誘導された。このことはトリパ ン ブ ル ー 染 色 法 で 死 細 胞 の 割 合 を 算 出 し た 結 果 か ら も 確 認 され た 。
Siva‑lを恒常的に発現させた細胞株では、インフルエンザAウイルスの感染により、細胞収縮を起こした細胞が多数認められ、アポトーシスが誘導されていると考えられた。そこでアポトーシスの誘導過程で特徴的に認められるゲノムDNAの断片化を解析した。その結果、Siva‑l
タンパク質を恒常的に発現させた細胞 株ではコントロールの細胞に比べて、ゲノムDNAの断片化によるラダー状のバ ンドが強く検出された。この結果からインフルエンザAウイルスの感染した細胞においてS
iva‑lタンパク質の発現により誘導される細胞死は、アポトーシスによるものであることが示された。さらにSivaー1
タンパク質を恒常的に発現さ せた細胞株 に、H5Nl亜型高 病原性鳥イ ンフルエン ザウイルス H
K483株を感染させ、Siv
a‑lタンパク質のアポトーシス誘導能を検討した。その結果、
Siv
a‑lタンパ ク質がH5Nl
亜型高 病原性鳥インフルエンザウイルスの感染による ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 に も 重 要で あ るこ とが 明 らか にな っ た。
インフ ルエンザAウイル スの感染に よるアポト ーシス誘導 に対する内 在性のSiv
a‑lタンパク質の機能を明らかにするために、Siva‑l遺伝子に対して3種の標的配 列のshRNAを発現するレトロウイルスベクターを構築した。これらのレトロウ イルスベクターを用いて、インフルエンザAウイルス感染によるアポトーシス 誘導に対す るS
iv
a‑l遺伝子発 現抑制の影響をトリパンブルー染色法により解析した。その結果、Siv
a‑l遺伝子の発現を抑制したA
549細胞では、インフルエ ンザAウイルス感染による細胞死の誘導が抑制された。この細胞死誘導の抑制 効果と各shRNAによるS
iv
a‑l遺伝子の発現抑制効果の問には、相関関係が認め られ、このことはゲノムDNAの断片化の解析によっても確認された。これらの 結果から、インフルエンザAウイルス感染により誘導されるアポトーシスは、 内在性のSiva‑l
遺 伝子の発現 により制御されていることが示された。
アポト ーシスは、インフルエンザAウイルスの複製にも関与することから、
Siv
a―1
タンパク質のウイルス複製への関与を調べるため、Siv
a‑lタンパク質の発現を 抑制したA
549細胞にPR8株を感染させ、ウイルスの増殖を経時的に解析した。 その結果、インフルエンザAウイルスの複製は、Siv
a‑lタンパク質の発現抑制 によって阻害された。Siva‑lタンパク質がPB2タンパク質に会合するため、ウ イルスのRNA
ポリメラーゼの機能阻害により複製を阻害する可能性が考えられた。そこで、ウイルスのNP(nuclearprotein)の量をりアルタイムRT−PCR法で測 定し、Siva―1タンパク質のインフルエンザAウイルスのRNA合成への関与を調 べた。その 結果、イン フルエンザ A
ウイルスのRN
A
合成は、Siva‑lタン
パ ク 質 の 発 現 抑 制に よ りほ とん ど 影響 を 受け な いこ と が示 され た 。
これまでに、カスパーゼ依存的なアポトーシス誘導に極めて重要な役割を果たして いるカスパ ーゼ3の活性化は 、インフルエンザAウイルスの効率的を複製にも重要であることが報告されている。このことから、Siva―1
タンパク質がカスパ ーゼの活性 化を制御し インフルエ ンザAウイルス感 染により誘 導されるアポトーシスおよぴウイルス複製に関与する可能性が考えられた。そこでカスパー ゼ阻害剤で あるZ―VAD―FMKを用いて、インフルエンザAウイルスの増殖と細胞死の誘導について、それぞれプラークアッセイおよびトリパンブルー染色法で解析した。その結果、コントロールの細胞およびSiva‑lタンパク質の発現を 抑制したA549
細 胞ともにイ ンフルエン ザA
ウイ ルス感染に よるアポトーシス 誘導は、Z‑VA
D‑
FM
K処理によ り抑制され た。一方、 ウイルスの 複製は
一 827−

Siv
a‑lタンパク質の発現を抑制したA549
細胞ではコントロールの細胞と比べて阻 害さ れて いたが 、Z‑VAD‑FMKの処理により、而細胞でほとんど差が認められなくなった。
これらの結果から、Siva‑lタンパク質はカスパーゼの活性化によルインフル
エンザA
ウイルス感染後の宿主細胞のアポトーシス誘導に働くとともに、ウイル ス 複 製に と っ て も 重 要 な役 割 を 果 た して いるこ とが 示唆さ れた 。

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学 位論文審査の要旨
主 査 教授 宮崎忠 昭
副 査 教授 高田礼 人
副査 准教授 木村享史
副 査 講師 岩井 淳

学 位 論 文 題 名イン フ ル エン ザ Aウ イル ス の 複製 に関 わる
アポトーシス誘導分子S
iva―1の機能解析
Sivaー 1は 抗 体 アレ イ 法を 用い たス クリ ーニ ング によ ルイ ンフ ルエ ンザ Aウイ ルス のRNAポ リ メ ラ ー ゼ サブ ユ ニッ トで ある P
B2と会 合す る 宿主 因子 とし て見 出さ れた アポ トーシス誘導分子である。
免 疫共 沈降 法お よび 蛍光抗 体染色法により、S
iv
a‑lがヒト培養細胞内でPB2と会合し、インフルエンザAウイルス感染後、S
iv
a‑lとPB2は核に共局在することが明らかとなった。
Siva‑lを 恒常 的に 発現 させ たA549細胞 では ウイ ルス感染 後の細胞死の誘導が亢進される
こと 、ま た、 DN
A断 片化 の解 析に より この 細胞 死は アポ トー シ スに よる もの であることが示された。
shRNAを用いて Sivaー｜遺伝子の発現を抑制したA549細胞では、インフ ルエンザAウイル
ス感 染に よる 細胞 死の 誘導 が抑 制 され 、ま た培 養上清中 に回収されるウイルスのカ価も有意 に抑 制さ れた 。し かし なが ら 、ウ イル スの R
NA合成 は、 Siv
a‑l遺伝 子の 発現抑制に
よ り 阻 害 さ れ な い こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ こで カス パー ゼ阻 害剤 であ るZ‑VAD‑FMKを用 いて 解析 した とこ ろ、 コン ト ロー ルの 細胞 とSi
va‑l遺伝子の発現を抑制したA
549
細胞の 培養 上清 中に 回収 され るウ イ ルス カ価 の差 はZ‑VAD‑F
MK処 理に より 、ほ とんど認められなくなった。
上 述の よう に、 本研 究でイ ンフルエンザウイルスのPB2に会合する分子として同定されたSiva‑lがカ スパ ーゼ の活 性化 制 御に よル ウイ ルス感染 による宿主細胞のアポトーシス
誘導 に働 くと とも に、 ウイ ルス 複 製に 重要 な役 割を果た していることを明らかにした。
これ らの 研究 成果 は、 イン フル エ ンザ A
ウ イル スの 複製 制御 お よび 哺乳 動物 における病原性に関わる新たな分子の知見を提供するも のである。
審 査委 員一 同は 、上 記博 士論 文 提出 者塩 崎拓 也氏が、 博士（獣医学）の学位を授与されるに十分な資格を有するものと認めた。

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