博 士 （獣 医 学）

シ ュ ジャ ア リソ ン オブ サ イ ヤド マ ズハ ル フセ イ ンシ ャ

学 位論 文 題名Immunologi
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smosis(Babesia equiピ 凸プ ラ ズム 蛋 白質の 免疫学的解 析とDNA診 断の開発）

学 位 論 文 内 容の 要 旨BabesねequjならびにB．ca6a所はAp．め0″1p．鰍a門に属する赤血球内寄生性の原虫であり、ウマに貧血・発熱を主徴とする疾病を引き起こす。B．equfとB．ca6釧jはともにダ ニに より 媒介さ れ、 熱帯 ・亜 熱帯 のほ とんどの地域で流行が見られる。ペクターと なる 多種 のダニ が世 界中 に広 く分 布す るために、馬ピロプラズマ症は大きな問
題 と な って い る 。 従 来 か ら用 いら れて いる 血液 塗抹標 本検 索法 なら ぴに 補体 結合（CF）反応ではB．eq酊とB．ca6amの感染の識別は困難であり、また血液塗抹標本検索にお いて は低 寄生寧 の慢 性感 染馬 の診 断が 困難である。そこで、より確実な血清学的診 断法 を開 発するため、B．eq小ならぴにB．ca6amピロプラズムの主要表而蛋白質の生 化学 的お よぴ免 疫化 学的 解析 を行 うと とも に、 遺伝 子増 幅法 （PCR）を用いたDNA診断についても検討し、以下の結果を得た。
1．二次元電気泳動によってB． equiピロプラズムの主要な蛋白質の分子量は18、28、30、 41、 43、 54、 66.5お よ ぴ 96キ ロ ダ ル ト ン く kDa)で あ るこ と が 示 さ れ た 。
2．B． equiピロプラズムの15、18、28、30、41およぴ96kD
aの6種の主要抗原がWesternblounigにより実験感染馬の血清と反応した。
3． Triton X‑114相分離法により、B．eq
uiピロプラズムの分子量18、28およぴ30k
Daの蛋白質は膜結合型であることが示された。
4．B． equiのp28
およぴp30のN
末端のアミノ酸配列はTheileriaserg
entiのp32と相同性が高く、これら2種の類縁性が示唆された。
5．B． equiのp28ならぴにp30の合成ペプチドに対する抗血清は、ウマの2種のバベシア(B.equiおよぴB．cabam）の鑑別診断に有効であった。

6． B． equiピロプ ラズムに 対して作 出された 3つの単クローン抗体(MoAbs)はB．equiの p18と同一エ ピトープ を認識す ることが 競合酵素 抗体法（競 合ELISA)により 示された。
7． MoAbsを用いた two‑site ELISAの結果が陰性であったことから、B．equiのp18には反復するエピトープが存在しなぃことが示された。
8． 且equiのp18に対 するMoAbsは、B．caballi
ならぴにウマ赤血球膜蛋白質とは交差反応 が認 め ら れな か った こと から、二 種の原虫 の混合感 染による馬 ピロプラ ズマ症の鑑別診断に有用であることが明らかになった。
9． B.equiのp37の塩基 配列に特 異的なプ ライマー を用いたPC
Rによって、アメリカ、
南 アフリカ 、ロシア およぴ中国のB． equiのgenomic DN
Aのサンプルから約935bpのフラグメントが増幅された。
10.同 じ プ ラ イ マ ー を 用 い た PCRに よっ て Zsergentiの Chitose株 な らぴ に Ikeda株
genomic DNAか ら、1，353 bpの フラグメ ントが増 幅され、B．equiとZsergentiのこれらの株との間に遺伝子構造の類似が示唆された。
11．本P
CR法では他種のバベシア（B．bovis,B．bigeminaおよびB．ovata)あるいはタイリア（r pa
rva rannulat
aおよぴ工bu ffeli)原虫DNAからの増幅が認められなかった。
ま た、B． cabalhDNAか らの増幅 も認めら れず、B．eq小に対するプライマーの特異性の高さが示された。
12． 本PCR法 で は鋳 型 とし て 精 製さ れ たB．eq酊 DNAの 10pgか ら増幅が 認められた 。
13． PCRと血清学 的検査を組み合わせることにより、0．001％の寄生率のウマの血液から もB．eq所 DNAを 増 幅す ることが 可能とな り、より 正確な馬 ピロプラズ マ症の診断が可能となった。
以 上の 結 果 、B． equiの p28ならぴに p30の合成ペ プチドに 対する抗 血清を用 いた丶Western blottingおよぴMoAbsを用 いたELISAによ る免疫学 的方法に 加えて、 PCRを用いたDNA診断法 が、B．equi単 独感染あ るいはB． calnmとの混合感染による馬ピロプラ
ズ マ 症 感 染 馬 か ら B． eq函 を 検 出 す る 方 法 と し て 有 用 で あ る こ と が 示 さ れ た 。

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学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 小 沼 操
教授 神 谷正男
教授 前 出吉光
助 教授 杉本 千尋
学 位 論 文 題 名

Immunological analysis of Babesia eqひ i piroplasm
proteins and development of polymerase chain
reaction based assay for the diagnosis of equine
piroplas mosis(Babesia equiピ 口 プ ラ ズ ム 蛋 白 質 の 免 疫 学 的 解 析 と DNA診 断 の 開 発 ）Babesia equiならぴにB．cabamは、ウマに貧血・発熱を主徴とする疾病を引き起こす 赤 血 球 内 寄 生 性 の 原 虫 であ る 。 本 研 究 で は 、血 清学 的診 断法 を開 発す るた め、B．equjならびにB．ca6加jピロプラズムの主要表面蛋白質の生化学的および免疫化学的解 析 を 行 う と と も に 、 遺 伝子 増 幅 法 （ PCR） を用 いた DNA診 断に つい て検 討し た。
B．eqUjピ ロプ ラズ ムの蛋 白質 は二 次元電気泳動によって分子量は18〜96キ口ダル
トン （kDa） 、に 分布 し、そ のう ち15〜96kDaの6種の主要抗原がWestemblonmgにより
実 験 感 染 馬 の 血清 と反 応し た。 この うち 分子 量18、28およ ぴ30kDaの 蛋白 質は 膜結合 型 で あ り 、 p28なら びに p30の 合成 ベプ チド に対 する 抗血 清は 、ウマ の2種の バベ
シア原虫の鑑別診断に有効であった。
次 に 、 B． eqmピ ロプ ラズ ムp18に 対する 3つ の単 クロ ーン 抗体 （MOAbs） を作 出した。 本MOAbsは、 B．equjに 特異 的で ある こと から ウマピ ロプ ラズ マ症の鑑別診断に有用であることが明らかとなった。
最 後に B． eq小 のp37の塩 基配 列に 特異的なプライマーを用いたPCR法を開発した。
本法 によ り、 アメ リカ 、南 アフ リカ 、ロシア、および中国のB．equjのgenomicDNAのサン プル から 約935bpのフラ グメ ント が増幅されたが、B．ca6釧jDNAの増幅は認められな かっ た。 PCRと血 清学的 検査 を組 み合 わせ るこ とに より 、B． eqUj診断の特異性を向 上さ せることができ、0．ool％の赤血球寄生率のウマも陽性として摘発することが可能となった。

本研究 はB． equiの免 疫学的な らぴにDNA診 断法の確立 について 述べたものであり、ウ マピロプ ラズマ症 の診断・ 防疫に貴重な知見を提供するものである。よって
審 査 員 一 同 は シ ュ ジ ャ ア リ ソ ン オ ブサ イヤ ド マズ ハ ルフ セ イン シャ
氏 が 博 士 （ 獣 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 する も の と認 め た。