博 士 （水産 科学）福 井洋平
学 位論 文題 名Ecology of abalone pathogenlCレ 了 ろ ダ Z〇 カ ロ ダ ぴ と ツ Zin
aquaCultureenVlronmentS（ アワ ビ養 殖環 境に おけ るWみ ァめ カ口 朋り fの生 態に 関する研究）

学位論文内容の要旨
ア ワ ピ は 世 界 規 模 で流 通さ れて いる 水産 物の ーつ であ る。 世界 のア ワピ生 産量 は1968年にピークに達した後、1994年までは減少し続け、日本の生産量もほぽ同様の傾向にある。
最 近5年 間で は中 国及 び韓 国で アワ ピ養殖 技術 が向 上し 世界 生産 量の 急速 な回 復が見られる のに 対し、 日本 の生 産量 は横 ばい 状態 であ る。 日本のアワピ生産量の低下の主たる原因は乱獲及び微生物感染症である。
北海 道の熊 石ア ワビ 養殖 場は 年間 約200万個 体の 種苗 生産 が可 能で あり 、北 海道のアワ
ピ 資 源 の 安 定 供 給 に 大き な役 割を 担っ てき た。 しか し、 1990年代 以降 、夏の 高水 温期 に
Wbrio harveyiの感染を原因とする養殖エゾアワピ(llaliotis discus hannai)の大量死が発生
し 北 海 道 の ア ワ ピ 生 産事 業の 大き な障 害に なっ てい る。 この 感染 症で 死亡し た個 体は 心臓 ・腎 臓が位 置す る鰓 の基 部周 辺に 浮腫 を伴 い、 外観所見では腹部の膨満が観察されることから「腹部膨満症」として知られている。
レharveyiの感 染に よる海洋動物の大量死は、世界19ケ国、35魚種で報告されているが、エ ゾア ワピヘ の感 染例 の報 告は いま まで にな い。 アワピの種苗生産事業をより安定的に行う ため には、 本菌 のア ワピ ヘの 感染 動態 を明 らか にし、防除対策を構築する必要がある。
そ こで 、本研 究で はエ ゾアワビ養殖環境でのレharveyiの生態を解明することを目的とし、本 菌の 迅速で 正確 な特 異検 出法 の構 築、 この 方法 を用いたアワピ養殖環境における本菌の分 布と 変動、 それ に影 響を 及ぽ す環 境要 因の 解明 を行った。さらに環境やヒトに対し無害なハーブの本菌に対する抗菌効果を調ぺた。
は じ め に 、 レ harveyiを迅 速か つ正 確に 検出す る2種類 の方 法を 開発 した。 第2章の 第1
節 では コロニ ーPCR法 を構 築し た。 レharveyiの標 準株の16S rRNA遺伝子配列を再解析し、デ ー タ ベ ー ス 上 の 塩 基配 列 が 誤 読 領 域 を 含 むこ とを 見い だし た。 その 領域 にVHARRプ ラ
イ マ ー が 会 合す るよ う塩 基配 列を 調整 し、 アこ ーリ ング 温度600C、 サイ クル 数を 20回 とした PCR反応 を行う こと によ り、 レharveyiの特異検出が可能となることを明らかにした。
こ の PCR条 件 は 細 菌 集 落 を 鋳 型 DNAと し て も 特異 性が 維持 され たこ とか ら、 レharveyiのコロ ニー PCR法を構 築す るこ とが でき た。 本法 を用 いる こと によ り、 環境試料の培養から始 め て レ harveyiを 3日以 内 に 検 出 及 び 定 量 する こと が可 能に なっ た。 第2節 では 培養 をすることなくW harveyiの定量が可能なrealーtime PCR法を構築した。レharveyiの16S r
RNAに 見 ら れ る 特 異 領 域 をRTVHAプ ロ ー プ が 会 合す るよ うに 設計し 、ア ニー リン グと 伸長 温度 を 68° Cと す る 条 件 で レ harveyiの 特 異 検 出が 可能 にな った 。レ ジン を用 いた 鋳型 DNAの 抽 出 法 と 併 用 す る こと で 、 わ ず か 1mLの 海水 から 6.Ox101 CFU/mLのWharveyiを 検出 するこ とに 成功 ，し た。 本法 によ り5時 間以 内に海水中のW harveyiを定量できる。両検出法と も こ れ ま で W harveyiと 区 別 が 困 難 で あ っ た 近 縁 菌 種 を 見 極 め る こ と が で き た 。
次 にア ワピ 養殖 場周 辺環 境に おけ るW harveyiの 分布 と変 動を 明ら かにした。2003年〜
2007年 の 間 、毎 年7月〜 9月に 、熊 石ア ワピ 養殖 場の 海水 および アワ ピ個 体を 採取 し、 本研究 で開 発し た特 異検 出法 を用 いて W harveyi生菌 数を 定量 した 。第 3章の第1節では養殖場 に お け る W harveyiの 分布 と変動 を調 べた 。ア ワピ の大 量死 が発 生す る2週 間前 では 養殖場 周辺 の沿 岸海 水で レharveyiの検 出率 は58%、そ の菌 数は 103̲104 CFU/Lと高かった。
この 結果 はW harveyiの 初期 感染 源が 養殖 場周 辺の 沿岸 域で ある こと を示唆する。そして大量 死の 1週 間前で は飼 育用 水お よび 飼育 水槽水の全ての試料から形harveyiが検出され、それらの菌数は飼育用水で102 CFU/Iハ飼育水槽水で102̲105 CFI班ーであった。大量死が発生し た水 槽で は104̲106 CFU/Lに 菌数 が増 加した。さらにreal‑time PCR法により大量死が発生 した 水槽 から は1.8x102 CFU/mLの菌 数が定量された。大量死発生前のアワピのエラからは 9.Ox101 CFU/abaloneの レharveyiが 検出された。大量死発生中にはエラに加え内臓でもレ harveyiの菌数 が増 加し 内臓 で104 CFU/abalone以上となった。これらの結果からアワピ大 量死 の発 生頻 度を 高め るW轟 ロ′ Wガ 菌数の閾値は、水槽水で104CnソL、エラ及び内臓でそれぞれ104‐105CFUおよび105‐106CHJ/abaloneであると推察した。従ってレ轟ロwグfの菌数をこれら以下に保つことが大量死を防ぐ手段になると考えられた。
第 2節 では レね′ vグ fの初 期感 染源 と考 えられた沿岸域を対象とし、過去5年間の8−9月に得られたレヵロ′関yfの菌数及びアワピ死亡数と相関が認められる環境要因を調ぺた。その

結果 W harveyiの 平均菌 数と強い相関が認められた環境要因は、平均水温(rs= 0.80)、アワピ累積死亡数(rs=0.90)及びChla平均濃度(rs=‑0．8）であった。Wh
arveyiの平均菌数と平均水
温 あ る い は こ れ と ア ワピ 累積 死亡 数の 重相 関係 数は それぞ れR=0.955及 びR=0.931であ った。 この 相関 解析 で導 き出された回帰式に基づくとn°Cの水温上昇によルレharveyi菌数は2.5n倍 に 、 ア ワ ピ 死 亡数 は21 倍 に増 加す るこ とが 明らか にな った 。IPCCの A2シ ナリ オに従 うと 100年後 のこの 養殖 場周 辺海 域の 水温 は最 大で 2゜C上昇 する と予 測され 、得られた回 帰式 から 100年後の 年間 アワ ピ死 亡数 は2，200万に達すると予測された。レharveyiは多様 な海 洋動 物へ の感 染性 が報 告さ れて いる ことか ら、将来、地球温暖化による水温上昇傾向 が続 けば 、レ harveyiの感染リスクはアワピに留まらず、海洋動物の生物多様性に大きな負の影響を及ばす可能性がある。
第 4章 では 、W harveyiの 感染 によ るア ワピ 大量死 の抑制対策としてスバイスのWharveyiに 対 す る 抗 菌 効 果 を 調べ た。 供試 した 25種 のス パイ スの中 で高 い抗 菌活 性を 示し たも のは、 ク口 ーブ 、ガ ーリ ック 及び マジ ョラ ムで あった 。また、ガーリックとマジョラムの抽出 液 は 海 水 中 で の 作 用が 安定 であ ルレ harveyiに 対す る最 小発 育阻 止濃 度(MIC)は 0.125%
で あ っ た 。 こ の 濃 度 で 103̲104 CFU/mLの レ harveyiに作用 させ ると 12時 間以 内に 検出 限界 以 下 と な っ た 。 マ ジョ ラム 抽出 液に 比ベ ガー リッ ク抽出 液の アワ ピに 対す る急 性毒 性(LDso)は0.033%と高くアワピヘの使用は困難であった。そこで0.125％（w／v）のマジョラム
乾燥 粉末 をガ ーゼ で包 みアワピ飼育水槽に垂下した後、レharveyi菌液に暴露したアワピを供試 して 飼育 試験 を行 った とこ ろ、 エラ に付 着する 形harveyiの菌数は6時間後までに1/10に 減 少 し た 。 こ れ ら の結 果は マジ ョラ ムが アワ ピ飼 育水及 びア ワピ のエ ラに 付着 した レ
harveyi菌数を減少させるのに効果的であることを示す。
以 上、 本研 究で 得ら れた アワ ピ養 殖環 境に おける W harveyiの 生態 に関 する知 見からレharveyiの感 染に よるア ワピ 大量 死を 防ぐ ため の実 践的 な方 策と して 、＠ リモー トセンシ
ング デー タを 活用 した アワ ピ養 殖場 周辺 水域 の水温 上昇パターンの監視とこのデータに基づ く 大 量 死 発 生 の 予 測 を 行 い な が ら 、 ◎ ス パ イ ス を 活 用 し た ア ワ ピ 飼 育 環 境 下 のレharveyi菌 数 の 制 御 及 び ◎ 熊 石 の 地 域 性 を 生 か し た 海洋深 層水 によ るア ワピ 飼育 水の 水温制御、を組み合わせて実施することを提案する。

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 澤 辺 智 雄
副 査 教 授 吉 水守
副 査 教 授 荒 井 克 俊

学位論文 題名
Ecology of abalonepathogenlCレ 7ろ ダ Z〇 カ ロ ダ ぴ ￠ ツ Zin
aquaCultureenVlronmentS（ア ワ ビ 養殖 環 境 にお け る Wみダ め カ ロ〆 ぴ ￠ ガの 生 態 に関 す る 研究 ）Vbrioharveyi
は多種多様な海洋動物に病原性を持っ細菌である。北海道の基幹エゾアワビ養殖場では本菌の感染によるアワビ大量死が発生し，種苗生産事業の障害となっている。アワビ養殖場における本菌の分布や変動及ぴアワビへの感染動態は未解明の課題である。本論文はアワビのレharveyi感染症の防除対策の構築に向けた基礎的知見を得ることを目的として，養殖環境における本菌の生態を明らかにした。特に評価される成果は以下のとおりである。

1．レharv
eyiを正 確かつ迅 速に検出 する2種類の 方法を 構築した 。1っ はコロ ニーP
CR法であり，レharv
eyiの細 菌集落を 鋳型DNAとし， アニーリ ング温度を60
゜C，サイクル数を20回としたP
CR条
件 とするこ とでレ harveyiの特 異検出 が可能で あるこ とを示し ，環境 試料の培養から始めてレharv
eyiを3日で検 出するこ とが可 能になっ た。も う1っはりアルタイムP
CR法であり，これは細菌の培養を行うことなくレharveyiの定量が可能である。アニーリングと伸長温度を68°Cとする条件 がレharveyiの特異 検出に適 してお り，キー レックスレジンを用いた鋳型DNAの抽出法と併用
す る こ と で 海 水 中 の レ harveyiを 5時 間 以 内 に 定 量 で き る こ と を 示 し た 。
2．開発した上記の特異検出法を用いて，熊石のアワビ養殖場におけるレharveyiの分布と変動を明らか にした。 2003年から 2007年の間，毎年7‑9月に，養殖場の海水及ぴアワビを採取し，レharveyiの生菌数を定量した。アワビの大量死が発生する2週間前の養殖場周辺の沿岸海水では，レharv
eyiの検出率及ぴ菌数はそれぞれ58％及びl03
̲
104CF
U/Lと高く，レharveyiの初期感染源が沿岸域であることを示した。大量死が発生した水槽ではその菌数はl04
̲106CF
U/Lに増加した。大量死発生前のア―957
一ワビのエラからは90 C
FU/アワビ個体のレharv
eyiが検出された。大量死発生中には内臓のレharv
eyi
菌数はl04 C
FU/アワビ個体まで増加した。アワビ大量死の発生頻度が高くなるレharv
eyi
菌数は，水槽水でl04C
FU/L，エラ及び内臓でそれぞれ104ー105及びl05
̲106C
FUノアワビ個体であると推定した。
3．レharv
eyi平均菌数及ぴアワビの累積死亡数 と強い相関を示すアワビ養殖場沿岸海水の環境要因を解析した。レharv
eyiの平均菌数と強い相関が認められた要因は，平均水温（ザ0．80）及びアワビの累積死亡数(野0.90)であった。さらに，平均水温とレharv
eyiの平均菌数あるいはこの水温とアワ

ビ 累積 死亡 数の 重相 関係数はそれぞれR‑0.
955及びR=0.931であった。 この相関解析で導き出された回帰式に基づくとnoCの水温上昇によルレharv
eyi菌数は2.
5 倍に，アワビ死亡数は21 倍に増加
す るこ とが 明ら かに なっ た。 IPCCの A
2シ ナリ オでは100年後のその養 殖場周辺海域の水温は最大で2°C上昇すると予測されたことから，この 値を回帰式に当てはめたところ100年後の年間アワビ死亡数は2，200万に達すると予測された。レharveyi
は多様な海洋動物への感染性が報告されていることから，将来，地球温暖化による水温上昇傾向が続けば，海洋動物の生物多様性に大きな負の影響を及ばす可能性が推察された。
4．レharv
eyi感染症の抑止対策としてスパイスのレharv
eyiに対する抗菌効果を調べた。ガーリックとマジョラムは高い抗菌活性を示した。また，これら抽出液のレharveyiに対する最小発育阻止濃度は0.1
25％であった 。0.
1
25％(w/v)のマジョラムをガーゼで包みアワビ飼育水槽に沈めた後，レharv
eyi
菌液に暴露したアワビを供試したところ，エ ラに付着するレhar v
eyiの菌数は6時間後までに1/10に減少させる効果を示した。
5．本研究で得られ た知見からレharveyi
感染に よるアワビ大量死を防ぐための実践的な方策として，◎リモートセンシングデータを活用した養殖 場周辺水域の水温上昇パターンに基づく大量死発生の予測を行いながら，◎熊石の地域性を生かし た海洋深層水によるアワビ飼育水の水温制御，を組み合わせて実施することを提案した。

以上の成果は，5年間にわたるモニタリング研究によルアワビ養殖環境におけるレharveyiの生態を明らかにしたのみならず，自然水域の海水温がレharve
yiの菌数とアワビの死亡数に影響することをはじめて示したものである。また，研究結果に基づき現場で実行可能な防除対策を提案した。これらの知見はアワビ以外の海洋動 物に対するレharve
yi感染症のりスク評価と防除にも応用が期待される。よって
審 査員 一同 は申請 者が 博士 （水 産科 学） の学 位を授与される資格のあるものと判定した。

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