博 士 （ 獣医 学 ）ムレン ガ・アル ノヾート学位論文題名A STUDY TOWARDS DEVELOPh/IENTOFATICK VACC
INE（ダニワクチン開発に関する研究）
学位論文内容の要旨
動 物寄生性 の各種病 原体のべ クターとな るマダニ を免疫学 的な方法 で防除しよ うとする 試み、す なわち抗 ダニワクチ ン開発は 、薬剤使 用に代わ るべクター
コ ント口ー ル法として有望であると、されている。本研究はダニの侵襲に対する
ワ クチン開 発を目的 としてフ タトゲチマ ダ二(llaemaphysalislongicornis)・
ウ サギモデ ルを使用 し、候補 となる分子 の探索と 精製、遺 伝子解析 を行った。
ダ ニ の 吸血 時 に宿 主 体 内に 分 泌さ れ る 分子 に 関 する報 告は今ま でほとん どな
さ れていな かった。 そこで、 本研究にお いてはフ タトゲチ マダニの 分泌性分子を 2種 類 同 定 し 、 そ の 性 状 を 明 ら か に し た 。 ま ず 、 分 子 量 84 kDaの 分 子(p84)を精 製 しア ミ ノ 酸配列の 一部を解 析した結 果、本分子 はトリプ シン様分子 であり、 ダ二吸血 で感作し たウサギに 即時型過 敏反応を 誘導する 活性を持つこ とが明ら かとなっ た。一方 、ダ二感作 ウサギの 血清抗体 に強く認 識される分子 量 29kDaの 分子 (p29)は セ ヌ ント 物 質の 形 成 に関 与す る細胞外マ 卜リック ス様 分子であ ることが 遺伝子ク 口ーニング の結果明 らかにさ れた。セ メント物質は ダ二唾液 腺から分 泌される 複数の蛋白 質から成 り、ダニ の吸血部 位への固着に 重 要 な役 割 を果 た すこ とが知ら れている 。大腸菌で 発現させ た組換え p29を用 いてウサ ギを免疫 しダニを 吸血させた ところ、 飽血時の 成ダ二重 量の減少や幼 ダニおよ び若ダニ の死亡（ 死亡率はそ れぞれ40％ および56％ ）が観察され、ダ ニ に対 する ワ クチ ン効 果があることが明ら かとなった。
｀ワ クチン開 発の観点 から考え ると、ダニ に存在す る分子は 、ダ二吸 血時に宿主 体内に分 泌される 暴露型と 分泌されな い非暴露 型に分類 される。 非暴露型抗原 による免 疫は一般 に暴露型 抗原よりも ワクチン 効果が強 く発揮さ れると考えら れている 。すなわ ち、ダニ と宿主間で 進化して きた宿主 寄生体関 係から、生体 反応と暴 露型抗原 との間で は免疫学的 バランス が成立し ており、 暴露型抗原に よる防御 免疫誘導 能は十分 でないと考 えられてきた。しかし、今回組換えp29を 用 い た免 疫 実験 か ら、 暴露型抗 原である p29によって強 い抗ダ二 免疫が誘 導さ れること が明らか にできた 。本研究で 得られた 成績およ び他の研 究にて示され ている成 績から、 1種類の抗 原を用いた ワクチンによるダ二排除は完全ではない と考えら れる。こ れに加え 、未成熟お よび成熟 ダニは宿 主免疫反 応に対してそ れぞれ異 なる感受 性を示す ことから、 数種の抗 原をカク テルとし て用いたワク チンがよ り有効で あると考 えられたた め、さら に標的分 子の探索 を進めた。

ダニワクチンの標的抗原として蛋白質分解酵素の有用性が多くの研究者によって指摘されてきたにも関わらず、その解析はあまり行われてこなかった。本研究において、分子生物学的手法を用いてH.10ngjcormsのセリンプ□テアーゼおよびシステインプ□テアーゼ遺伝子をク口ーニングしその構造解析を行った。
すなわち、各蛋白質分解酵素の活性中心部に保存されているアミノ酸配列を基にプライマーを設計し、polymerasechain reaction (PCR)により遺伝子の一部を増幅、クローニングした。さらに得られたPCR産物の塩基配列を決定後、各遺伝子に特異的なプライマーを設計し5 および3 rapidamplificationof
cDNA ends(RACE)法を 用い て全 長cDNAをク ロー ニング し、 遺伝 子全 長の塩基配列を決定した。ク口ーニングした2種のセリンプ口テアーゼ遺伝子（
HLSG‑1および‑2)は、それぞれ分子量37.7および31.2kDaのポリベプチド鎖をコードしていた。また、2種のシステインプ口テアーゼ遺伝子(HLCG‑Iおよび‑2)はそれぞれ33.7および37.OkDaのポりペプチド鎖をコードしていた。
HLSG‑1および．2を大腸菌で発現させ、家兎免疫血清を作製し、免疫ブ口ット法によルダニ乳剤と反応させたところ、予想される分子量の位置にバンドが検出された。このことから、ク口ーニングした遺伝子産物がダニで発現されていることが確認された。また、前者は唾液腺、後者は中腸で発現されていることが示唆された。しかし、HLSG‑lあるいは・2免疫によるワクチン効果は認められなかった。
本研究はダニに対するワクチン開発に重要かつ基礎的な情報を提供するものである。ウサギにおける組換えp29を用いたワクチン試験により、唾液腺抗原による免疫がダ二排除に有効であることが示された。今後そのワクチン効果を増強するため、免疫方法や他の抗原分子の添加など検討する必要があろう。また、蛋白質分解酵素クローニングに関する研究は、ダニワクチンとして効果が期待できる抗原を分子生物学的アプ口ーチにより得ることが可能であることを示している。今後、得られた蛋白質分解酵素がダニ体内のどの部位で発現しており、いかなる生物学的活性を担っているのか明らかにする必要がある。

学位論文審査の要旨
主査 教授 小沼 操
副査 教授 神谷正男
副査 教授 高島郁夫
副査 助教授 杉本千尋

学位論文題名A STUDY TOWARDS DEVELOPIN/IENT
OFATICK VACCINE（ ダ ニ ワ クチ ン 開発 に関 する 研究 ）動物 寄生 性の 各種 病原 体のベクターとなるマダニを免 疫学的な方法で防除しようと する 試み 、す なわ ち抗 ダニワクチン開発は、薬剤に代 わるベクターコント口ール法として有望視されている。本研究はフ夕卜ゲチマダ二(llaemaphysalislongicornis)― ウサ ギの 系を 使用 し、 候補 とな る蛋 白質 の探 索と 精製 、 遺伝 子解 析を 行っ た。
まずフタトゲチマダニの分泌性蛋白質を2種類同定し、その性状を明ら かにした。
一 っ は 分 子 量 84kDaの 分 子 (p84)で あ り 、 精 製 し ア ミ ノ 配 列の 一部 を解 析し た結果 、p84はト リプ シン 様蛋 白質 であ り、 ダ二 吸血 で感 作したウサギに即 時型過敏反応 を誘 導し た。 もう ーっ は、 ダ 二感 作ウ サギ の血 清抗 体に 強く 認識 され る分 子量29kDaの 分 子 (p29)で あ る 。 p29は遺 伝子 クロ ーニ ング の結 果か ら、 セメ ン卜 物質の 形成 に関 与す る細 胞外 マト リックス様蛋白質であることが明らかにな った。セヌン ト物 質は ダニ 唾液 腺か ら分 泌される複数の蛋白質から成り、ダニの吸 血部位への固 着に 重要 な役 割を 果た すこ と が知 られ てい る。 大腸 菌で発現させた組換えp29を用 いて ウサ ギを 免疫 しダ ニを 吸血させたところ、飽血時の成ダ二重量の 減少や幼ダ二 及び 若ダ ニの 死亡 （死 亡率 はそれぞれ40％および56％）が観察され、 ダニに対する ワク チン 効果 があ るこ とが 明 らか とな った 。
ダ ニワ クチ ンの 標的 抗原 としてこれまで蛋白質分解酵素 の有用性が示唆されている 。 そこ で次 にダ ニの セリ ンプ口テアーゼおよびシステイ ンプ口テアーゼ遺伝子をク 口 ーニ ング し、 その 構造 解析 を行 った 。ク 口ー ニン グした2種類のセリンプロテ
ア ー ゼ 遺 伝 子 (HLSG‐ 1お よ び ‑2)は 、 そ れ ぞ れ 分 子 量 37.7およ び31.2
kDaのポ リペ プチド鎖をコードしていた。 また、2種のシステインプ口 テアーゼ遺伝子(HLSG．1
お よ び‑2)
は それ ぞれ 33.7およ び3
7.
OkDaのポリベプチド鎖 をコードしていた。H
LSG・ 1およ び‑2を大 腸菌 で発 現さ せ 、ウ サギ 免疫 血清 を作製 し、免疫ブロット法によル ダ ニ乳 剤と 反応 させ たと ころ、予想される分子量の位置 にバンドが検出された。
こ のことから、ク口ーニングした遺伝子がダニで発現され ていることが確認された。
し か し 、 H LSG‑Iあ る い は ‐ 2免 疫 に よ る ワ ク チ ン 効 果 は 認 め ら れ な か っ た 。

本研究はダニに対するワクチン開発に重要かつ基礎的な情報を提供するものである。よって審査員一同は、MulengaAlbert氏が博士（獣医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと認めた。