博 士 （ 獣 医 学 ） 加納 里 佳
学 位 論 文 題 名

弱 毒 お よ び 強 毒 マ レ ッ ク 病 ウ イ ル ス感 染 鶏 に おけ る
免疫 応答に関 する研究
ー・
学 位 論 文 内 容 の要 旨マ レッ ク病 (MD)の病 態に は宿 主免 疫応 答が関 与していることが示唆されている。
特に M
Dウ イル ス（ MDV)の増 殖抑 制お よぴ MDの発 症防御に斌細胞性免疫応答が有効であるとされているが、MDワクチンの作用機序との関連にっいては完全に猿解明されていを い 。 そ こ で 本研 究で は、 鶏に MD
VI強 毒株 （RBIB） また はMDV
1の 弱毒 ワク チン 株(CVI988)、あるいは両者を実験感染し、誘導される免 疫応答の解析を行った。まず第1章ではマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析により、宿主免疫応答の全体像を捉．えると共に重要段役割を担っていると考えられる候補遺伝子のスクリーニングを行った。続く第2章ではサイト カインおよびサイトカイン関連因子に注目した解析を、第3章では異なるT細胞受容体(TCR)を発現する細胞集団に着 目して解析を行った。各章で得られた知見を以下にまとめる。
1）MD
V1
強毒株攻撃鶏で は、感染初期にあたる7日目 には多くの宿主＾病原体相互作用闘連遺伝子の発現が上昇していたが、潜伏感染後期の21日日になるとMD
V遺伝子盪の増加にも開わらず、免疫応答が抑制されていることが示唆された。一方、ワクチン株接種対照鶏で誼、劇的な遺伝子発現最の変化は認められなかったが、ワクチン接種後強毒株攻撃鶏では21日日に多くの宿主−病原体相互作用関連遺伝千の発現上昇が認められ、潜伏感染期においても免疫応答が誘導されることで、MDVの再活性化を抑制していることが示唆された。
2）強毒株攻幣後、各実験群におけるサイトカイン遺伝子およぴその関連造伝子の経時的ナょ発現検索をりアルタイムP
CR法によって行ったところ、MDV
1
強毒株攻撃群では感染初期に細胞性免疫応答に関連する遺伝予発現の上昇が認められたが、潜伏感染が完全に成立すると考，えられる感染10
一14日目に壮発現は減少していた。また同群では21日目にMDV遺伝子蠡の増加が確認 され、MDVの再活性化が示唆 されたが、これに対する各種サイトカイン遺伝子の発現誘導は観察されなたかった。これらの結果は第1章で観察された免疫応答の全体像と一致した。一方、ワクチン接種鶏では、強毒株攻撃の有無に関わらず様々な遺伝子発現が変動を示し、免疫応答の誘導が示唆された。特にワクチン接種後
攻撃 鶏で 弦、 攻撃後 10日目においてインターフェロン(IFN)イの一過性発現増加が認められた。各群鶏のマイトージェン刺激下での脾臓細胞に韜けるI
FN‑y産生竃をEnzymelinkedImmuneSorbentAssay（ELISA)法により測定したところ、強毒株攻撃群では発現が殆ど謠められなかったのに対し、ワクチン接種後攻 撃群では、活発なIFN1産生が検出された。また同群ではI
FN‑y受容体2やI
F
Nregulator
yfactorー3の発現上昇も綛められ、‑ 721‑

MD
V
遺伝子量も終始検出限界以下か検出されても非常に低V、値であったため、ワクチン接種によるMD防御に韜いて、潜伏感染期のIFN‑y発覗重要な役割を担らている可能性が示唆された。
3）第1章の結果から、T
く濱1細胞がワクチン接種によるMD発症防御機構に関与している可能性が示唆されたため、その詳細について検討した。その結果、ワクチン接種後攻撃群において、強毒株の潜伏感染後期にCD8a鎖を強発現しているT
CRl+細胞（ CD80冖ghTCR1゛細胞）が特異的に誘導されている可龍性が示唆された。またこの細胞集団におけるMDV潜 伏感染率 拙低く 、TCR2+細 胞の産 生したIF
N‑yによる何らかの作用を受けている ことが 示峻され た。そ の機能の 詳細にっ いては 明らかにされなかったが、CD8pi
ヰ
TCRl+細 胞 が M
Dワ ク チン接 種による MD発症防 御の一端 を担っ ている可 能性が 強く示唆された。
MDワクチン 接種によ るM
D発症防御には様々な因子が関与し、その機構は非常に複雑である。本研究において、潜伏感染後期に韜けるM
DV再活性化の抑制に閲して、IFN‑tおよぴC
D80卩曲．′rC
RI4細胞が璽要た役割を担っている可能性が示唆された。これはM
D
ワクチン作用機序に関する新しい知見であり、NI
Dワクチン作用機序の免疫学的観点からの解明、韜よび安全かつ効果的な新しいMDワクチンの作製に貢献し得る研究結果であると考える。

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学 位論文審査の要旨
主査

教授

大 橋和彦

副査

教授

堀 内基広

副査

准教 授

今内覚

副査 名誉教授 小沼 操
学 位 論 文 題 名

弱毒および強毒マレック病ウイル ス感染鶏における免 疫 応答 に関 する 研究
マレッ ク病(MD)は 、非病 原性あ るいは 弱毒マレック病ウイルス(MDV)を用いた生ワクチンにより制御さ れてい る。MDの 発症防 御には細 胞性免 疫応答 が有効 である とされているが、MDワクチンの作用 機序と の関連に ついて は解明 されて いない 。本研 究では 、MDV強毒 株や弱 毒ワク チン株に感染した鶏で誘導される免疫応答の解析を行った。まずマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析により、重要ナょ役割を担うと考えられる候補遺伝子の探索を行った。そしてその中でサイトカイン およぴ サイトカ イン関 連因子 や異な るT細胞 受容体 (TCR)を発現する細胞集団に着目して解析を行った。
MDV強 毒 株攻 撃 鶏 で は、感 染初期 （7日目 ）に多く の宿主 ―病原 体相互 作用関 連遺伝 子の発現が上 昇して いたが、 潜伏感 染後期 (21日目） には、 MDVの再 活性化にも関わらず、免疫応答が抑制さ れてい た。―方、ワクチン株接種鶏では、劇的ぬ遺伝子発現量の変化は認められず、ワクチン接 種後強 毒株攻撃 鶏では 、潜伏 感染期 に船い ても多 くの宿 主q芳原 体相互 作用関連 遺伝子の発現が上昇し、MDV再活性化が抑制されていることが示された。
次にり アルタ イムPCR法 により 、MDV強毒 株攻撃 後のサ イトカ インおよぴその関連遺伝子の経時的 な 発 現 検索 を 行 った 。強毒 株攻撃 鶏では 、感染 初期に細 胞性免 疫応答 に関連 する遺 伝子の発現 が上昇 していた が、潜 伏感染 期の10‑14日目に は減少し 、MDVの 再活性 化(21日目 ）に対する各種サイトカイン遺伝子の発現誘導は観察されナょかった。しかしワクチン接種鶏では、強毒株攻撃の 有無に 関わらず 様々を 遺伝子 発現が 変動を 示し、 免疫応 答の誘導が示唆された。特にワクチン 接種後 攻撃鶏では、lO日目でインターフェロン(IFN)―Yの一週性発現増加がみられた。さらにマ イトー ジェン刺 激下の 脾臓細 胞に韜 けるI
FN‑y産生量を測定したところ、強毒株攻撃鶏では発現しなかったのに対し、ワクチン接種後攻撃鶏では、活発ナょIFN‑y産生およぴIF
N−Yreceptcぼ2やIFNregulaめ づfalc紛う の発現 上昇が 認められた。以上より、潜伏感染期に豁けるlFNッ発現が、ワ クチン による防御に重要な役割を担っている可能性が示唆された。さらにTCR1細胞（や型TCゼT細胞 ）の役 割を検 討した 結果、 ワクチン接種後攻撃鶏において、強毒株の潜伏感染後期にCD8a鎖 を強 発 現 す るTCRl細 胞 （ cI） 8一 f岬CR1細 胞）が特 異的に 誘導き れる可 龍性が 示された。 ま た こ の細 胞 集 団で 弦MDV感染 率が低 く、1℃ R2細胞（ 叩型TCRマ細胞） が産生 したIFNッによる 作用を 受けていることが示され、TCRl細胞もワクチンによるMD発症防御の一端を担っている可能性が強く示唆された。
以上 よ り 、 ワク チ ン に よる MD発 症防 御 機 構 のひ とっ として 、IFN叫お よびTCRl細 胞が潜 伏感― 723 ‑

染 後 期に ねけ るMDV
再 活性 化の 抑 制に 重要 な役 割を 担っている可能性が 示唆された。
MD
ワタチンによる防御機構の詳細は不明であるが、本研究により、IF
N‑
YおよぴT
C
R
1細胞によるM
DV再活性化の抑制という知見が得られ、M
Dワクチン作用機序の免疫学的観点からの解明やより効果的な新規MDワクチンの作製に貢献し得ると考える。よって、審査委員一同は、加納里佳君の博士論文は、北海道大学大学院獣医学研究科規程第6条の規定による本研究科の行う博士論文の審査等に合格と認めた。

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