博士 （環 境科 学） 堤正純

学 位論 文 題名
Community structure and activity of aerobic methane
oxidizing bacteria in forest soils and freshwater lakes（森林 土壌およ び淡水湖 沼におけ る好気性メタン酸化細菌の群集構造と活性）

学位論文内容の要旨
好 気 性メ タン酸化細菌 (MOB)
は、メタンを酸素で酸 化し、炭素源およびエネルギー源として利用できる細菌であり、メタンと酸素の両方を利用できる様々な環境に生息している。その性質により、MOBは地球の炭素循環において重要な役割を果たしていると考えられている。その役割のーっは、重要な温室効果ガスであるメタンの消費である。大気中のメタン濃度は、大気への放出と消費のバランスにより決まる。メタンは、湿地や湖沼の底泥などの嫌気的な環境においてメタン生成菌により生成される。この生成されたメタンの大半は、大気へ放出される前に 好気的な環境においてMOBにより消費される。大気へ放出されたメタンは、成層圏において化学反応により分解されるが、森林や草原のような十分に好 気 的な 土壌 に生 息す るMOBに よ って も消費される。また、MOBを起点とした食物網も存在する。例えば湿原や湖沼 においては、メタンを構成する炭素からMOBによって合成された有機物が、従属栄養生物の炭素源として重要な位置を占めるという例が報告されている。これらのことから、MOBの活性とその決定要因を知ることは、メタン動態、ひいては地球上の炭素循環の包括的な 理解のために重要である。MO
Bの存在量はその場のメタン酸化活性に反映され、その生理学的特性は系統により異なる。したがって、環境中におけるMOBの存 在量 と群 集構 成(MOB群 集 構造 ）や その 決定 要因 を知 るこ とは、メタン酸化活性の決定要因を知るために重 要である。また、MOB群集を構成する系統から、その環境に対する応答についての知見も得ることができると期待される。これまで、様々な環境におけるMOB群集構造が調べられてきたが、これらの多くは、綱レベルか属レベルでの解析が主であった。しかし、細菌の多くは、種以下のレベルでもその生理学的特性は異なる。
したがって、本論文では、環境 中のMOB群集構造を種レベル以下の解像度で解析することにより、各種環境要因への応答 について調査した。調査地は、そこに生息するMOBがメタン動態や地球上の炭素循環へ大きな影響を与えている、森林土壌および淡水湖沼である。
MOB群 集構 造は 、16S rRNA遺伝子や、主要なメタン酸 化酵素である粒子性メタン一酸化酵 素 の の サ ブユ ニッ トを コー ドす るpm04
遺 伝 子を 対象 とし た手 法に より 解析 した 。
第2章では、大気メタンの吸収源である森林土壌において調査を行った。森林生態系は、林床 に植生が繁茂しており、その分布や密度は空間的に非常に不均一である。本章では、
北海 道の森林林床で幅広く繁茂しているササに注目した。林床にクマイザサが繁茂した針広混 交林およぴミズナラ林、チシマザサが繁茂したダケカンバ林およぴチシマザサを除去した ダケカンバ林の4つの調査地 を選択した。これらの調査地において、土壌の大気メタン吸 収速度および土壌中のMOB群 集構成を解析した。メタン吸収速度はクローズドチャン
バ ー 法 に よ り 、 MOB群 集 構 成 は pm04遺 伝 子を 対 象に した P
CR，DGGE法 （PCR．変 性剤濃度 勾配ゲル電気泳動法）により解析した。その結果、ササ除去区において、ササが繁茂して いる調査地より2倍程度高い大気メタン吸収活性が見られた。また、MOB群集構成は、林床 植生が共通している混交林とミズナラ林では同様であったが、他の調査地間では異なって いた。ここで検出されたp皿 甜遺伝子はいずれも、陸上土壌における大気メタン消費を主 に担っていると考えられている属レベルの系統（USCa） に属していた。メタン吸収一 1163−

活性お よびMOB群集構 成の調査 地間の違 いと、 土壌の温 度、含水率、pHおよぴ灼熱減量の間で 関連性は見られなかった。以上の結果から、ササにより土壌中のMOB活性が抑制されてい る可能性が示唆された。また、MOB群集構成は、林冠植生ではなくササの種類の影
響を強 く受けて 決定づ けられて いること が示唆 された。
第3章では 、部分循環湖である淡水ダム湖において調査を行った。一般に部分循環湖の深層は年間を通じて嫌気的であり、全層が淡水の場合には深層の湖水中にはメタンが蓄積され ている。 この深層 部のメ タンの大 部分は、大気へ放出される前に好気的な湖水中のMOBに よ り消費さ れる。本 章では 、様々な 季節に おいて、 各水深 における M
OBの優 占度
お よび 群 集 構 成を 解 析 した 。 MO
Bの 優 占度 は 、 定量 PCR
法 に よ り決定し たpm04遺伝 子と 全 バ ク テ リ ア の 16SrRNA遺 伝 子 の コ ピ ー 数 の 比 率 と し て 求 め た 。 MOBの 16SrRNA
遺 伝子 を 対象とし たPCR．DGG
E法によ りM
OB群集構成 の鉛直プ ロファ イルを調 べ、代 表
的な 深度にお いてp皿D
4遺伝子対象のクローニング法を用いてその構成をより詳細に解析した 。その結 果、MO
Bは、酸素とメタンが同時に多く供給されている好気ー嫌気境界層付近で最も優占していた。この水深付近では、メタンの炭素安定同位体比船よびメタン濃度から、活発なメタン酸化が起きていると推測された。また、好気層におけるメタン極大層に おい て も MO
B優 占 度の ピ ー クが 見 られた。 DGGE法およ びクロ ーニング 法により 得られた 配列の大 半は脇め ゆぬcたlr
属で あった が、その 構成は 深度により異なっていた。
DGGE
バン ドパター ンは、 温度や酸 素濃度 の変動に伴って垂直的に変化していた。以上の結果 から、湖 水中のMOBの活性および存在量は、酸素とメタンの両方により決定づけられてい ることが 示唆された。また、MOB群集構成は、温度や酸素濃度によって決定づけられていることが示された。
第4章では、 水面から底泥表面まで好気的な淡水湖沼の底泥において調査を行った。この湖の 水深の異 なる2地点において、底泥の好気的な表層から嫌気的な深層にかけて、潜在的な 好気的メ タン酸化 活性、 pm04遺伝子 のコピー 数および MOB
群 集構成を解析した。
メタン酸化活性は、十分に好気的な条件下でのメタン消費速度とした。p皿D4
遺伝子コピー数 は 、 定 量 PCR
法 に よ り決 定 し た 。群 集 構 成は 、 MOBの 16SrRN
A遺 伝 子を 対 象 と したP
CR‐DGGE法により解析した。その結果、いずれの地点においても潜在的なメタン酸化活性は深くなるにっれて減少していた。一方で、p閲D4
遺伝子コピー数は、好気的な表層よりも嫌気 的な深層 の方が多かった。M
OB群集は脇吐皿 ぬcぬr属により構成されており、地点間およぴ深度間で優占する系統に違いは見られなかったが、一部の系統の相対量に違いが見ら れた。こ れらの結果から、嫌気的な底泥深層に存在するMOBの遺伝子は、その場でメタン を酸化し ているM
OB群集ではなく、過去に好気的な表層において増殖し嫌気的な深層に 埋 没 したMOB群集に 由来す ると考え られた。 一つの 属により 構成さ れたMO
B群集構成の違いは、地点間や過去の環境要因の違いによってもたらされていることが推測された。
本 論文で 、環境中のMOB群集の活性や構造は、様々な環境要因により決定づけられている ことが 示された 。そして、MO
Bの自然環境中における生理生態学的特性は、種以下のレベ ルで異 なること が示唆された。本論文は、MO
B群集構造を調べる際に綱や属よりも低いレ ベルで 解析する ことの重要性を示している。本論文で示されたMO
B
群集と環境要因との関 連性は 、他の調 査地でのMOB群集を調査する上で有用な情報となるだろう。今後、森林
土 壌や淡 水湖沼だ けではな く様々 な生態系 のMO
B群集構造 をより で細かな系統で調べる
こ とで、 M
OB群集 の環境への応答についての新たな知見を得ることができるだろう。このこ と は 、 地 球 上 の 炭 素 循 環 に つ い て の 理 解を 深 め るこ と に 繋が る と 期待 さ れ る。

― 1164―

学位論文審査の要旨
主 査 教授 福 井学
副 査 教
授 森 川章副 査 准 教 授
原 正 裕
笠
副 査 助
教
島 康 弥小久

学位 論文 題名
Community structure and activity of aerobic methane
oxidizing bacteria in forest soils and freshwater lakes（森 林土壌および淡水湖沼における好気性メタン酸化細菌の群集構造と活性）

好気 J陸メ タン 酸化 細菌 (MOB)は、 メタンを 酸素で酸化し、炭素源およびェネルギー源として 利用 でき る細 菌で あ り、 メタ ンと 酸素の両 方を利用できる様々な環境に生息している。その 性質 によ り、MOBは地球の炭素循環において 重要な役割を果たしていると考えられている。
その役割の ーっは、重要な温室効果ガスであるメタンの消費である 。大気中のメタン濃度は、大気への放 出と消費のバランスにより決ま，る。メタンは、湿地や 湖沼の底泥などの嫌気的な環 境に おい てメ タン 生 成菌 によ り生 成される 。この生成されたメタンの大半は、大気へ放出さ れる 前に 好気 的な 環 境に おい てMOBに より消費される。これらのことか ら、MOBの活性とその 決定 要因 を知 るこ と は、 メタ ン動 態、ひい ては地球上の炭素循環の包括的な理解のために重 要で ある 。MO
Bの存在量はその場のヌタン酸 化活性に反映され、その生理学的特性は系統によ り異 なる 。し たが っ て、 環境 中に おけ るMOBの 存 在量 と群 集構 成(
MOB群集構造）やその決定 要因 を知 ること は、メタン酸化活性の決定要因を知るために重要である 。また、MOB群集を構成する系 統から、その環境に対する応答につしゝての知見も得ることができると期待される。
こ れま で、 様々な 環境におけるMOB群集構造が 調べられてきたが、これらの多くは、綱レベルか 属レ ベル での 解析 が 主で あっ た。 しかし、 細菌の多くは、種以下のレベルでもその生理学的 特性 は異 なる。 したがって、本論文では、環境中のMOB群集構造を種レベル以下の解像度で解 析す るこ とによ り、各種環境要因への応答について調査した。調査地は 、そこに生息するM
OBがヌ タン 動態 や地 球 上の 炭素 循環 ヘ大きな 影響を与えている、森林土壌および淡水湖沼である。MOB群集構造は、16S rR
NA
遺伝子 や、主要なメタン酸化酵素である粒子l'ftメタン一酸化酵 素 の aサ プ ュ ニ ッ ト を コ ー ド す る pmoA遺 伝 子 を 対 象 と し た 手 法 に よ り 解 析 し た 。
第2章 では 、大 気ヌ タン の吸 収源 であ る森 林土 壌 にお いて 調査 を行った。本章では、北海道の森林林 床で幅広く繁茂してしゝるササに注目した。ササ除去区におしゝて、ササが繁茂してい る調 査地 より 2倍程 度高 い大 気ヌ タン 吸収活性が見られた。また、MOB群集構成は、林床植―1165一生が共 通してい る混交 林とミズ ナラ林 では同様であったが、他の調査地間では異なっていた。
以上の 結果から 、ササ により土 壌中の MOB活性 が抑制 されてい る可能性 が示唆された。また、
MOB群 集構成は 、林冠 植生では なくサ サの種類 の影響 を強く受 けて決定 づけられていることが示唆さ れた。
第3章では、 部分循 環湖であ る淡水 ダム湖に おしゝ て調査を 行った。 一般に部分循環湖の深層 は年 間を通じ て嫌気 的であり 、全層 が淡水の 場合には 深層の 湖水中に はヌタ ンが蓄積 されている 。本章で は、様 々な季節 におい て、各水 深にお けるMO
Bの優占度 および群集構成を解析した。 その結果 、MOBは、酸素 とヌタ ンが同時 に多く 供給され ている好 気一嫌気境界層付近で最も優 占してし ゝた。 この水深 付近で は、メタンの炭素安定同位体比およびヌタン濃度から、活 発な メタン酸 化が起 きている と推測 された。 D
GG
E法およ びク口ー ニング 法により 得られた配列の 大半は脆 thyloぬピ′刮禹であったが、構成バターンは、温度や酸素濃度の変動に伴って垂直的 に変化し てしゝた。以上の結果から、湖水中のMOBの活性およぴ存在量は、酸素とヌタンの両方 により決 定づけ られてい ること が示唆さ れた。 また、MOB群集構 成は、温度や酸素濃度によっ て決定づ けられ ているこ とが示 された。
第4章では、 水面か ら底泥表 面まで 好気的な 淡水湖 沼の底泥 において 調査を行ったところ、嫌 気的 な底泥深 層に存 在するMO
Bの遺 伝子は、 その場で メタン を酸化し ている M
OB
群集 ではなく、過 去に好気 的な表 層におい て増殖 し嫌気的 な深層 に埋没し たM
OB群 集に由来すると考えられた。 一つの属 により 構成され たMO
B群集構成 の違い は、地点 聞や過去 の環境要因の違いによっても たらされ ている ことが推 測され た。
本論文 で、環 境中のMOB群集の 活性や 構造は、 様々な 環境要因 により 決定づけられていることが示 された。 そして 、MOBの 自然環 境中にお ける生 理生態学 的特性は 、種以下のレベルで異なるこ とが示唆 された 。本論文 は、MOB群集構 造を調 べる際に 綱や属よ りも低いレベルで解析するこ との重要 性を示 している 。本論 文で示さ れたMO
B群集と 環境要因 との関連性は、他の調査地で のMOB群 集を調 査する上 で有用 な情報と なるだ ろう。今 後、森林 土壌や淡水湖沼だけでは なく 様々な生 態系の M
OB
群集 構造を よりで細 かな系統 で調べ ることで 、MOB群集の環 境への応 答に ついての 新たな 知見を得 ること ができる だろう。 このこ とは、地 球上の 炭素循環 についての 理解を深 めるこ とに繋が ると期 待される 。
審 査委 員一同は ，これ らの成果 を高く 評価し， また研 究者とし て誠実か つ熱心 であり， 大学 院博 士課程に おける 研鑽や修 得単位 などもあ わせ，申 請者が 博士（環 境科学 ）の学位 を受けるの に充分な 資格を 有するも のと判 定した。

― 1166ー