博士 （ 医 学 ） 森一 茂学 位論文 題名
Novel models of cancer− related anemia
1n mlce moculated with IL― 6一 producing tumor cells(IL− 6産 生 腫 瘍 株 移 植 マ ウ ス を 用 い た 新 規 癌 性 貧 血 モ デ ル に 関 す る 研 究 ）学位論文内容の要旨【背 景と 目的 】新 規に 癌と 診断 され た未 治療 の 癌患 者に おけ る貧 血の 頻度は約30％であり、ヘモグ口ビンレベルの低下は癌患者の一般状 態不良と相関すると報告されている。
この よう な癌 性貧 血は失血・溶血あるいは栄養 欠乏などで単純に説明できないと考えられ、 炎症 性サ イト カインを介した赤血球生成障 害の可能性が示唆されている。一方、炎症性 サイ トカ イン であ るIL―6は 、乳 癌、 大腸 癌、肺癌の患者血清中に検出され、癌患者に おい てへ モグ ロピン値と負の相関を示すこ とが報告されている。また免疫療法としてIL‑6を 癌患 者に 投与 した 臨床 試験 にお いて 貧 血の 発症 が報 告さ れて いる。そこで本研究 では 、ILー6が 癌性貧血の発症に関与している可能性を検討するため、 IL一6産生株
であ るヒ ト肺 癌株 LC― 06
一 JCK及 びマ ウス 結腸 癌株colon26 clone5を皮下に移植した動物モデルを作成し、貧血の発症とIL―6との関連性を解析した。
【材 料と 方法 】く 癌細 胞＞ 副甲 状腺 ホル モン 関 連夕 ンパ ク(PTHrP)
を 産生 す るヒト肺癌株LC−06一JCK及びヒ ト膵癌株PAN−07―JCKは実験動物中央研究所より入手した。IL
―6を 高 産 生 す る マ ウ ス 結 腸癌 株colon 26 clo
ne5は癌 悪液 質誘 導株 であ るcolo
n26から
中 外 製 薬 株 式 会 社 に て 大内 らに より 樹立 され た。 く動 物モ デル ＞雄 性 ヌー ドラ ット
F344/Nは ク レ ア よ り 購 入し た。 雄性 ヌー ドマ ウス BA
LB/c nu/nu及び 雄 性CDF
1マ ウスは日本チャールズリパーより購入した。LC―06―JCK株及びPA
N―07
ーJC
K
株は癌組織片をヌー ドマ ウス 皮下 に移 植す るこ とで 継代 維持 し た。 Colon26 clone
5株 は、 10%牛胎児血清 を含 むRPM
I1640
培 地に て、5％炭 酸ガス37℃の細胞培養恒温器中で継代培養した。
0． 05%
トリプシン0．02% ED
TAを用いて培養細胞を 回収し、単細胞浮遊液を調製し106個の細 胞を C
DF1マウ ス皮 下に 移植 した 。く 血清 中 サイ トカイン、アルブミン及びヘモグ
ロピ ンの 測定 ＞血 清中 サイ トカ イン 及び アル ブ ミン は市 販の E
LISA
キ ット を 用いて定量し た。 ヒト I
L― 6E
LISA： R&D Sy
stem
社 、マ ウ スIL一6EL
IS
A：Pierce社、マウスエリス 口 ポ ェ チ ン (EPO) ELI
SA：R&D Syst
em社 、マ ウス アル ブミ ンELI
SA： シパ ヤギ 社。
ヘモ グ口 ピン はシ スメ ック ス社 の動 物用 多項 目 自動 血球計数装置KX一21NVを用いて測定した。くラット抗マウスIL一6受容体モノクローナル抗体投与＞ I
L―6産生腫瘍担癌マ
ウスでの貧血発症におけるIL―6の役割を検討するため、ラット抗 マウスI
L―6受容体モノク ロー ナル 抗体 MR16一1を用いた。 マウスI
Lー6受容体はマウス I
L−6だけでなくヒトI
L―6とも 結合することから、MR16−1は、マウスI
Lー6だけでなく ヒトI
L―6の生物活性も阻害することができる。MR16―1抗体は20 mg/kgの用量でLC―06―J
CK
皮下移植マウス
モデ ルに おい て腹 腔内 投与 した。くヒト化抗ヒトPT
Hr
Pモノク口ーナル抗体投与＞ヒト
化抗 ヒト P
THrP
モ ノ ク口 ーナ ル抗 体は 1mg/kgの 用量 でLC
一06―JCK及びPA
Nー07ーJCK担癌ラットモデルにおいて静脈内投与した。
‑ 24―

【結果】これまでヒト肺癌株L
C―06―JCK及びヒト膵癌株PAN−07−JCKはPTHrPを産生し、ヌー ドラ ット 皮下 移植 モデ ルに て共 に体 重減 少を特徴とする癌悪液質を発症することが報告されているが、ヘモグ口ピン低下及び赤血球数の減少はL
Cー06―J
CK
移植ヌードラットでのみ観察された。また、ヒト型化抗ヒトPT
HrP
モノク口ーナル抗体は、L
Cー06−JCK
担癌 ラッ bの 癌悪 液質を改善すること が報告されているが、貧血の改善効果は認められなかった。これらのことから、癌性貧血は癌悪液質とは 異なる機序により発症することが示唆された。また、L
Cー06−JC
K担癌ヌードラットでは血清中に高濃度のILー6が検出されることが報告されており、従ってLC―06
ーJC
K担癌ヌードラットでのみ認められた貧血は 、PTHrPでは なくIL―6に起因する可能性が推測された。次に 癌性貧血にIL―6が関与している可能性を検証するため、IL―6，の作用を阻害するラット抗マウスI
L―6受容体抗体 M
R16−1を用 いて検討を行った。 M
R16―1はマウスIL−6受容体特異的モノク口ーナ
ル抗 体で あり 、ラ ットI
L―6受容体に は交差性を示さぬいため、マウス皮下移植モデルでの検討を行った。P
AN―07―JCK
担癌ヌードマウスと異なり、LC―06‑JCK
担癌ヌードマウスに おい て、 移植 後51日、 65
日 、72日で 非担 癌マウスと比較して有意にへモグ口ビンは減少し、血清中ヒトILー6の上昇が認められた。また・、非担癌マウスと比較して有意に血 清ア ルブ ミン が低 下し マウ スEPOが上 昇し た。 さら にIL―6産 生株 であるcolon
26clone5細 胞 を 皮下 移植 した マウ スに おい ても 、移 植後 28
日 及び 35日 に て非 担癌 マウスと 比較 して 有意 にへモグ口ビンが減少し、血清中マウスIL―6濃度が上昇した。そこで、LC―06−J
CK
皮下移植ヌ ードマウスにおいてラット抗マウスIL一6受容体モノク口ーナル 抗体 M
R16ー1を投与した結果、ヘ モグロピン及び血清アルブミンの減少を有意に抑制し た。 一方 、血 清中 ヒト ILー 6及び マウ スEP
O濃度はM
R1
6‑1投与で有意な変化は認め
ら れ な か っ た 。血 清中 マウ スIL−6はMR16―1投与 によ らず 検出 限界 以 下で あっ た。
【 考察 】こ れま で癌 患者 に おい て血清I
L−6レベルの亢進 とへモグロピン低下との間に相 関性 が報 告さ れて おり 、 本論 文でもL
Cー0
6ーJ
CKとcolon
26 clone
5担癌マウスモデルに お い て 、 血 清 IL− 6レ ベ ル の 上 昇 と へ モ グ 口 ピ ン の 低 下 が 認 め ら れ た 。 こ こ でLC―06
ーJC
Kで貧血と共に認められた血清 アルブミン減少は、ILー6による炎症性急性期反応であると考 えられ、臨床的に血清アルプミン減少は癌患者の予後因子とされているが、単 に栄 養不 良を 意味 する の では なく、血清アルブミン減少を誘導するIL―6が予後に影響 して いる 可能 性が 考え ら れた 。また、癌悪液質マウスモデルでも血清中IL―6が高値を示し、IL一6中和抗体投与により悪液質 発症を抑制することが報告されている。今回、LC―06―JCK担癌マウスモデル において、ラット抗マウスIL−6受容体抗体を投与すること で貧 血発 症を 抑制 した こ とか ら、I
L―6が癌性貧血の原 因となっている可能性が示され た。 現在までにIL―6による 貧血発症機序は未だ解明されていないが、ILー6は鉄利用を 制御 する ホル モン であ る hepcidinの肝 細胞 での 産生 を誘 導することが報告されていた 。本 論文 の癌 性貧 血モ デ ルで は血 清中 E
POレベ ルは 亢 進していたことから、IL―6によ る貧 血発 症機 序と して 、 E
PO産生 抑制 では なく hepcidi
n産 生亢 進に よる 鉄利 用抑 制に起因する赤 血球生成障害が推測された。
【 結諭 】本 論文 で示 した 新規 貧 血マウスモデルは、癌性貧血におけるIL−6の関与を示唆するとともに 、癌患者における貧血の新たな治療法の探索に有用であると考えられる。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 岩 永 敏 彦
副 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 西 村 孝 司

学位論文題名Novelmodelso
fcancer−relatedanem
ia1n mlcelnoculated with IL― 6− producing tumor cells(
ILー6産生腫瘍株移植マウスを用いた新規癌性貧血モデルに関する研究）
本研究では、IL―6が癌性貧血の発症に関与している可能性を検討するため、IL−6産生株であるヒ ト肺癌株L
C―06−JCK
及ぴマウス結腸癌株colon26clone5を皮下に移植した動物モデルを作成し、貧血の発症とILー6との関連性を解析した。その結果、LC―06−JCKとcolon26clone5
担 癌マウスモデルにおいて、血清IL−6レベルの上昇とへモグロビンの低下が認められた。ここでLC―06―JC
K
で貧血と共に認められた血清アルブミン減少は、IL―6による炎症性急性期反応であると考えられ、臨床的に血清アルブミン減少は癌患者の予後因子とされているが 、単に栄養不良を意味するのではなく、血清アルブミン減少を誘導するIL―6が予後に影響している可能性が示唆された。今回、L
Cー06―JCK
担癌マウスモデルにおいて、ラット抗マウスIL―6受容体抗体を投与することで貧血発症を抑制したことから、エL―6が癌性貧血の原因となっていることが確認された。従って、本研究で構築した新規貧血マウスモデル
は、癌性 貧血におけるIL―6の関与を示唆するとともに、今後、本マウスモデルを用いて更なる実験を遂行する事により、癌患者における貧血の新たな治療法の探索に有用であることが示された。
学位論 文発表後、主査の岩永敏彦教授から、本癌性貧血モデルにおけるILー6に関係する標的分子、あるいはILー6に加えてLIFなど他のサイトカインレベルについて質問があった。
この点に 対して、他の文献を例にI
L―6依存的に肝細胞でのhepcidin遺伝子レベルの増強が認められることから癌性貧血の新たなターゲットである可能性が高いことを考慮し、現在質量分析シ ステムを用いたhepcidinの測定系を確立した所であることを回答した。またI
L―6を介した hepcidinの発現増強による癌生貧血の関与を確認する為に、本癌生貧血モデルにおける血清鉄レベルの測定の必要性があることも回答に加えた。さらに、これまでに報告された腫瘍モデルにおいて、他のサイトカインにっいても、上昇の可能性があることを言及し、今後本研究で確立された癌生貧血モデルを用いて詳細に検討する予定である旨を回答した。
次に副 査の秋田弘俊教授から、実際に癌性貧血モデルにおいてhepcidinをターゲットにした治療実験は行われているか否かについての質問があった。この点に対して、今後本モデルにおけるエL−6シグナル依存的なhepcidinの制御機構を明らかにするとともに、hepcidinを ター ゲッ トにした治療実験 を行う予定であると回答した。また本癌性モデルにおい て
IL−6受容体に対する抗体を用いる事で、血清アルブミンレベルの低下が回復するか否かにっいての 質問があった。これに対して、IL―6のみならず癌悪液質の中の他の因子によってもアルブ ミンの低下がおこる可能性はあるものの、IL―6受容体抗体を投与する事で、実際に 血清 アル ブミ ンレ ベル の低 下が 有意 に回復 する こと を確 認し たと回答した。
また、副査である西村孝司教授から、担癌生体内で未熟赤血球の異常な髄外造血の可能性‑ 26−についての質問があった。これに対して、癌患者生体内においても血清IL―6レベルの上昇が認められることを述べ、IL―6依存的な赤血球の異常産生の可能性も否定できなぃ事を述べた。さらに、癌患者における貧血治療に関する最近の知見と抗エL→6受容体抗体の臨床応用に関する今後の展望についての質問に対して、実際にキャッスルマン病や関節リューマチ等自己免疫疾患に対しての抗IL―6受容体抗体が臨床応用され、それらの疾患の軽減効果・カ§示されていることを例に挙げ、今後、癌疾患患者に対しても抗IL一6受容体を用いることによる貧血や過剰な炎症疾患の改善効果や、患者のQOLの向上に向けた応用の可能性があるとの見解を述べた。
最後に、聴講者か ら、抗IL―6受容体抗体の結合によって他のサイトカインがgp130分子を介した刺激をも阻 害する可能性もあるか否かの質問があった。これに対して、確かに抗IL−6受容体抗体投与によってgp130分子を使用する他のサイトカインシグナル伝達を阻害する可能性も否定できないとの回答を行った。
この論文は、新規 癌性貧血モデルが確立されたことだけでなく、癌性貧血モデルを用いIL―6シグナルカスケード依存的な癌性貧血発症の作用機序を示した点で高く評価され、今後 、 癌 患 者 の 貧 血 改 善を 目指 し た新 規治 療法 の開 発に 寄与 する こと が期 待さ れる 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、これまでの研究活動における研鑽なども併せ申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 した 。

‑ 27−