博士 （ 地球 環境 科 学） 神崎 郁 代

学位論文題名
Studies onaserlneproteaSeZymogen
Oftheprophen010XidaSe
aCtiVatingSyStem
oftheSilkWOrm， B〇 絖 み ガ 絖 〇 ガ（家蚕幼虫のフェノール酸化酵素前駆体活性化系を構成する
新 規 な セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ 前 駆 体 に 関 す る研 究 ）学位論文内容の要旨
カピや細菌の感染に対する昆虫の自然免疫作用として、血球細胞による貪食や被嚢形成、メラニン合成、抗菌ベプチドの産生などが知られている。メラニン合成は、昆虫の体内に侵入したカピ、バクテリア、寄生虫などの周囲が黒色色素（メラニン）で覆われる現象として観 察されている。このメラニン合成を触媒するkey enzymeがフェノール酸化酵素(PO)で 、 昆 虫 で は POは 不 活 性 な 前 駆 体 (proPO)と して 存在 し、 カピ や細 菌の 感染で引き 金がひかれるプロテアーゼカスケード(proPO活性化系またはproPOカスケード）の働きにより活性化される。自然免疫においてカピや細菌を異物として認識するのに重要な役割を担っている分子は、バターン認識夕ンパクと呼ばれている。バターン認識夕ンパ
クは感 染微生物に共通に存在する特有の分子構造を認識すると考えられている。昆虫のproP
Oカスケードの全体像はまだ明 らかにされていないが、出発点にパターン認識夕ンパクが 位置している。そのため、proP
Oカスケードがメラニン合成以外の他の自然免疫作用の発動においても異物認識機構の役割を担っている可能性が指摘されている。家蚕幼虫ではp―1，3ーグルカン認識夕ンバクとべプチドグリカン認識夕ンパクが、それぞれカピと細菌の細胞壁成分であるロ―1，3ーグルカンとべプチドグリカンに特異的に結合する。
その結合によってカスケードの引き金がひかれ、まだ明らかにされていない数段階のプロテ アー ゼ反 応 を経 て、proPO活性化酵素前駆体(proPPAE)が活性化され、さらにproPOが活性化されると、血液中に存在するチロシンやドーバなどのフェノール性物質を酸化し、生じた キノン類が重合してメラニンとなる。また、proPOの活性化には関わらないプロテアー ゼ前駆体proBA
EEaseも活性化されるが、生体内での基質 や機能は不明である。
しかし 、活性型のプロテアーゼB
AEE
aseは、ショウジョウパェの抗菌ベプチドの産生に関わるプ口シュペッツルを限定加水分解して活性型のシュペッツルとすることが確認されており 、proBA
EE
aseが家蚕で抗菌ペプチドの産生に関わってい る可能性が高いと考えられている。昆虫の自然免疫における異物認識の仕組みや自然免疫作用の相互関連を知るために pro
POカスケードの全貌を解 明することは重要である。本研究では、家蚕幼虫血液 から proPOカス ケ冖 ドを 構成 する 新規 の 因子 (factor S)を 単離 し、 cDNAクローニン グ を 行 い 、 こ の 因 子 の カ ス ケー ド 中 で の 役 割 に つ い て 検討 し た 。
家蚕 幼虫血液からproPO
カスケー ドが動き出していない状態の血漿画分（以下、プラズマと 略称）を得た。このプラズマを陽イオン交換(SP)、He
parinの連結カラムに吸着さ せ、 それ ぞ れの カラムから得られた溶出液 （それぞれSP、Heparin
画分 と呼ぶ）とproB
AEEase、 カル シウムを混合すると、工リ シターの存在下でのみB
AE
Eas
e活性が現― 1506―

れ る。 そこ で、 BA
EEase活 性の 出現 に必 要な SP
画 分の 因子 (factor S)の 精 製を試みた。120 mlのプラズマ を硫安分画後、3回のク口マ トグラフイー操作により約60ptgの精 製標 品が 得ら れた 。精 製factorS標品 は非 還元 条件下のSDS−PAG
Eで42 kD
a付近に2本のパンドを与えたので、さらに逆相HPLCカラム で展開したところ、2つのピ ークに分かれた。それぞれの ピークを分取して還元条件下のSDS―PAGEで分析した結果、一方の ピ ー ク か ら は 29 kDaと24 kDaに2本 、も う一 方の ピー クか らは 51 kDaに 1本の バンドが確認された。こ れらの断片のアミノ酸配列分析の結果、24 k
Daと51 k
Daの断片のN
末 端か らの 配 列は 同じ であ った 。cDNA塩 基配 列より推定されたfactor
Sの一次構造から判断すると、2つのピークは同じタンバクに 由来し、一方は51kDaのタンバクが切 断さ れて 24 kDaと 29 kDaの断片 が生じ、2つの断片がジスル フィド結合で連結しているものと同定された。
次に、fact
or
Sのプラズマ中での役割について検 討した。抗factorS
抗体を作 り、プラズマに加えてインキュベーション後、遠心し、その上清を抗体処理後のプラズマとした。
それにカルシウムとロ −1，3−グルカンを加えて活性化反応を行い、PO活性とB
AEEase活性を測定した結果、両者の活性は現れなかった。そこで、抗体処理後のプラズマに精製
fac
torS
標 品を 加 えて 活性化反応を行ったところ、PO活性とBAE
E;
ase活性が再び現れた。また、ロ−1，3−グルカンの代わりにぺプチドグリカンを用いて同じ実験を行った場
合 に も 、 同 様 の 結 果 が 得ら れた 。こ れら の事 実は 、factorSがproPOと proBA
EEaseの両方の活性化に必要な因子であること、かつ、ロー1，3―グルカンとぺプチドグリカンのいずれによってカス ケードが動き出す場合にも必要な因子であることを示している。
一方 、cDN
Aク ロー ニングの結果 より推定された一次構造から、factor
Sはシグナルベプチドが切断されて 細胞外に分泌される391アミ ノ酸残基のセリンプロテアーゼ前駆体と推測され、活性化 の際に限定加水分解を受ける部位に特徴的な配列も存在 した。
そこで、factorSの活性型(factor S*と呼ぷ）の 精製を行った。60 m1のプラ ズマからロ−1，3―グルカンによる活性化反応を経て4回のクロマトグラフイー操作により、約2嵋の精製標品が得られた。精製factor
S＊標品は非還元条件下のSDS−PAGEで、38kDaの1本 のバ ンド を 与え た。また、精製標品のアミノ酸配列分析 の結果は、cDNA塩基配列から推定されたfactorSの一次構造と一致し、こ の精製標品が確かにfactorSが切断されたものであると同定された。
精製f．aCt
orS＊標品に、組み換え体のロoBAEEaseまたはproPR
゜正産生のた めの培養上清を加えてインキ ュベーションし一定時間ごとにサンプリングして、BAEEaseまたはPI）AEの活性を測定したところ、factor
S＊を加えた場合にのみ、培養上清からそれぞれ の活 性が 検出 され た。 同時 に抗 proBAEEase抗体 また は抗 proPPAE抗体 を 用いたウ
エスタンプ口ット分析を行った結果、時間が経過するにっれて、proBAEEaseとproPR゜正の バン ドが 少な くな り、活性型の ＆6正EaseとPPAEのパンドが 現れた。これらの結果
から、factor
S＊はpro＆岨EaseとproPI） AEを直接、活性化していることが示された。
prOBAEEaseは proPOの 活 性 化 に は 関 わ っ て い な い の で 、 faCtorS＊ が proPOとpro
BAEEaseの2つ の活 性化 系の 分岐 点に 位置 する ことが示唆された。今後、fact
orSの活性化の機構やfactorS＊活性の制御の仕組み、 さらにはpro
POカスケードの 全貌を明らかにすることが、 pro
POカスケードと他の自然 免疫作用がどのような有機的なっながりをもって働いているかについての理解を深めるために必要と考えられる。

― 1507 ‑学位論文審査の要旨
主査教授

戸 田正 憲副査

教授

木 村正 人

副査

教授

川 畑俊 一郎（ 九州大学理 学部）

副査

名誉教 授

芦 田正 明 （北 海 道大 学）

学位論文題名IStudies onaserlneprote
aSeZymog
enOfthe．prophen
01
0XidaSea
CtiVatingSyStem
OftheSilkWOrm， B〇 絖 0ガ 絖 〇 カ（家蚕幼虫のフェノール酸化酵素前駆体活性化系を構成する
新 規 な セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ 前 駆 体 に 関 す る 研究 ）近年、昆虫の生体防御機構（自然免疫）につしゝての研究が進展し、カビや細菌の侵入により合 成誘導 される抗 菌・抗カ ピベプチドをコードする遺伝子の転写制御因子や、カビや細菌 の侵入 により生 じたシグ ナルを受容する受容体に関して、昆虫で得られた知見が脊椎動 物の自 然免疫に ついての 研究にも大きく貢献している。カビや細菌などの異物（非自己）に対する生体防御機構の発動には、異物を非自己として認識した後、認言哉したシグナ ルは増 幅されて 防御反応 を実行する細胞へ伝えられなければならない。昆虫の自然免疫 におけ る、この 認識、増 幅に関して、まだ解明されるべき点が多く残されている 。 フ ェ ノ ー ル 酸 化 酵 素 前 駆 体 (prophenoloxidase， proPO)活 性 化 系 （ proPOカスケード ）は、 ごく微量 のカビや バクテリアの細胞壁成分で活性化される一種のプロテアー ゼ カ スケ ー ド であ る 。 pr oPOカ ス ケ ード の 研 究か ら 、 ベプ チ ド グリ カ ン やBー
1、 3― グ ル カ ン （ pathogenに 共 通 し て 存 在 す る 化 学 構 造 、 い わ ゆ る pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）と特異的に結合するべプチドグリカン認識夕ン ノ 弋 ク （ PGRP） や 口 ー 1、 3― グ ル カ ン 認 識 夕 ン パ ク （ ロGRP）が 発 見 され た 。
その 後 、 P
GRPに相 同 な 分子 が 脊 椎動 物 に も 発見 さ れ 、脊 椎動物に おける 自然免疫 に
お い て も PGRPは 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 proPOカ ス ケードは昆 虫にお いて、カ ピやバク テリアを非自己として認識し、その認識シグナルを増幅す る機 構 とし て 働い て いる可能性 が指摘され注 目を集めてい る。
こ の よう な 状 況を 踏 ま え、 申請 者は、本 学位論文 におい て、p ro
P〇カス ケードの生理 機 能 を解 明 す るた め に は、 p roPOカ スケ ー ド を分 子レ ベルでよ り深く 理解すること が 必 要と 考 え 、家 蚕 pr oPO
カ ス ケ ー ドの 未 知 の構 成要 素を単離 精製し 、その性質を 調 べ た。 さ ら に、 そ の 構成 要 素 のpr oP
Oカ ス ケー ド活 性化にお ける機 能を明らかに し た 。ま ず 、 家蚕 血 液 の血漿 部分を p roP〇カ スケー ドの引き 金を引 かず粗分 画する 方 法 を用 い 、 家蚕 pro
P〇 カ スケ ー ド が 再構 成 で きる ことを示 した。 さらに、 これま で に 同定 さ れ た家 蚕 proPOカス ケ ー ド の構 成 要 素が 、 ど の粗 分 画 々分 に 含 まれ

て い る か を 検 討 し 、 Sfractionと 命 名 さ れ た 粗 分 画 々 分 に 未 同 定 の 構 成 要 素が 、 少 な く と も ー つ 存 在 す る こ と を 突 き 止 め た 。 Sfractionに 含 ま れ る 未 同定 の 構 成 要 素 を factorSと 命 名 し 、 そ の 半 定 量 的 検 出 法 を 考 案 し た 。 factorSを 精 製 し 、 cDNAク 口 ー ニ ン グ を 行 な っ た 。 推 定 一 次 構 造 か ら factor
Sはク リッ プド メインをN？末端側に 、触媒ドメインをC？末端側 に持っトリプシン様基質特異性を示すことが期待さ れるセリンプ口テアーゼ前駆体であることが示された。また、fact
orSの活性型、factor
S*を精製し、fa
ct
orSの活性 化 機 構 を 明 ら か に し た 。 factorS*の 基 質 は 、 フ ェ ノ ー ル 酸 化 酵 素 前 駆 体 活性 化 酵 素 の 前 駆 体 と 、 inレ ´ 〇 レ 〇 に お け る 基 質 が 明 ら か に な っ て い な い BAEE
aseと 命 名 さ れ て い る セ リ ン プ 口 テ ア ー ゼ の 前 駆 体 、 pr oBAEEaseで あ り 、factorS*は そ れ ら を 活 性 化 す る こ と が 示 さ れ た 。 家 蚕 pr o'P〇 カ ス ケ ー ド
は 、 そ の 経 路 の 途 中 で 、 一 っ は pr oPO活 性 化 経 路 ヘ 、 他 方 は proBAEEase
活 性 化 経 路 と 分 枝 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 factorSは こ の 分 岐 点 に 位 置する構成要素であることが示 された。ショウジョウパエでは、受容体丁〇´´にりガンド（シュベッツレ）が結合し て抗菌・抗カピベプチドの合成誘導シグナルが細胞に伝達されること、シュベッツレは プロテアーゼカスケードの作用でプロシュベッツレから生じることが示されている。シ ョウジョウパエでは限定加水分解によルプロシュベッツレ
か ら シ ュ ベ ッ ツ レ を 生 成 す る 酵 素 が ま だ 同 定 さ れ て い な い が 、 BAEEaseは プ 口 シユベッツレに作用してシュベ ッツレを生成することが示されている。また、無脊椎動物の セリ ンプ 口テ アー ゼカ スケ ード を構 成するセリンプ口テアー ゼ前駆体にはクリップドメインを持っものが多く知 られているが、クリップドメインの生理機能についてはほと ん ど 何 も 明 ら か に さ れ て い な い 。 factorSは 活 性 化 さ れ る 際 に ク リ ッ プ ド メインが遊離されるめずらしい プロテアーゼ前駆体である。遊離されるクリップドメインにつ いて の研 究か ら、 その 生理 機能 が明らかにされることが期待されている。
以上のように、申請者は、 これまで昆虫の自然免疫において、異物認識、認識シグナルの増幅に働いているのでは ないかと関心を持たれているにも関わらず、その詳細が解明 さ れ て い ない p roP
Oカ スケ ード の新 規な 構成 要素 を同 定し 、そ の 役割 を明 らか にした。この成果は、昆虫の自然免疫における異物認識、認識シグナ，ルの増幅、いくつかの自然免疫反応の相互関連を 究明する上で重要な研究成果である。審査委員一同は、本研究を高く評価し、また申請 者は、研究者として誠実かつ熱心であり、博士（地球環境科 学 ） の 学位 を 受 け る の に 十分 な 資 格 を 有 す るも の と 判 定し た。

ー 1509―