博 士 （医 学 ）石 津桂

学 位 論 文 題 名

先天性下垂体疾患の分子遺伝学的解析
学位論文内容の要旨［背 景］
下 垂 体 異 常に よ る 先 天性 下 垂 体 形成 不 全 ， 成長 ホ ル モ ン単 独 欠 損 症は 早 期診断 ，治療によ り 良 好 な 予 後 が 期 待 で き る ． 特 に 先 天性 下 垂 体 形成 不 全 の 重症 例 で は ，成 長 ホ ル モン(GH；growthhormone)，甲 状腺刺 激ホルモ ン(TSH； thyroidーstimulatinghormone)，ゴ ナド
トロ ピン(LH； luteinizinghormone， FSH；follicle― stimulatinghormone)，副腎 皮質刺激
ホ ルモ ン (ACTH； adrenocorticotropic hormone)，プ ロラク チン(PRL；prolactin)， それぞれ の産 生 細 胞 全て の 発 生・ 分化が 障害さ れ，出 生時か ら低血 糖，循 環不全を おこす ため， 迅
速な 診断，治 療が必 要であ る．
こ れ ら の ホル モ ン 産 生細 胞 は 前 駆細 胞 か ら 発生 し ， 種 々の 特 異 的 な転 写 調節因 子の働きに より 上 記 細 胞に 分 化 ・増 殖する ．その ため下 垂体形 成に関 わる転 写遺伝子 の異常 は，関 連
す るホ ル モ ン の分 泌 異 常 をひ き お こ す， 現 在 ま でに ヒ ト 複 合型 下 垂 体 前葉 ホルモ ン欠損 症(combinedpituitaryhormonedeficiency；CPHD)の原因遺伝子として，PROP1，POUI
Fl/PIT1，HESXl,LHX3,LHX4などが 同定され ている ．
HESX1は ，ラ ト ケ 嚢 発生 初 期 に 発現 し ， 下 垂体 前 葉の発 達，視神 経の発 生を制 御する 転写
抑 制因 子 で あ る， ノ ッ ク アウ 卜 マ ウ スの 報 告 で は， 眼 胞 を 含む 中 枢 神 経系 の欠損 と下垂 体
低 形成 を 呈 し ，多 く は 致 死的 で あ っ た． HESX1はPROP1に よる 遺 伝 子 発現 の 増強を 抑制す るが ，Hesxlノ ック ア ウ ト マウ ス で は Propl発 現 の量 や タ イ ミン グ の 異 常が 報 告され ている ．
ヒト のfIESXl遺伝 子の異 常は， septoーopticdysplasiaの兄弟 例で初めて同定され，現在まで
9家 系 13例 で 変 異 報 告 が あ り ， GH単 独 欠 損 か ら ， GH欠 損 を 含 む CPHDま で 多 彩 で あ る ．
LHX4は下 垂 体 発 生初 期 に 発 現す る 転 写 因子 で あ る ．ノ ッ ク ア ウト マ ウ スの報 告では ラト
ケ 嚢の 発 生 と 全て の 下 垂体 前葉ホ ルモン 産生細 胞の分 化・増 殖が障 害され， 重症な 下垂体 の低形 成を呈す る．ヒ トのL彪 ｜：鑓 伝子異 常の報 告は1家 系4症例 のみで，GH，TSH，ACTH欠損に加え ，卜ルコ 鞍低形 成や小 脳形成 異常が 特徴的 とされ る，
先 天 性 の 下垂 体 前 葉 ホル モ ン 単 独欠 損 症 に は， GH，ACTH，ゴナ ドトロピ ン，TSHそれぞ れの 単 独 欠 損 症 が あ る が ， そ の 中 で 遺 伝 性 GH単 独 欠 損 症 （ isolatedgrowthhormonedeficiency；IGHD）は 常 染 色 体劣 性 遺 伝 のIGHDI型 と常 染 色 体 優性 遺 伝 の II型 に 分類 さ れる ． II型 の 多 く は ， 馴 イ 遺 伝 子 の 第 3イ ン 卜 ロ ン の ス プ ラ イ シ ン グ 変 異 で 発 症 す る ，［ 目的 と 方 法 ］当 科 で 経 験し た CPHD患 者 に おい て その成 因を探 るため 恕S．r′ ，m孵遺 伝子を 解 析 し ， 同 定 し た 変 異 を む ぬ む Dの 機 能 解 析で 評 価 し た， ま た IGHDII型 の 1家 系 を 経 験し ，甜 イ 遺伝 子 の異 常 ，優 性 阻害 効果の メカニズム について検 討した．
［対象］
(A)GHDを 含 む CPHD症 例11例
こ の う ち， 生 後 早 期よ り 重 篤 な症 状 を 呈 した 3例 の 経 過 を報 告す る，症 例1：現 在6歳男 児．
在 胎 40週 ， 正 常経 膣 分 娩 で仮 死 な く出 生，生後 10時間 で呼吸障 害と著 明な低 血糖を 認めた ．
小 陰 茎 を呈 し ， 精 巣は 触 知 で きな か っ た ．TSHの 上 昇 しな い 甲 状 腺機 能 低 下 症を 認 め， MRIで は 下 垂体 低 形 成 ，異 所 性 後 葉と 左 側 視 神経 低 形 成 を認 め た ， アル ギ ニ ン ，イ ン スリ ン負荷 に て GHの 分 泌 は 低 下 ， GnRH負 荷 に て LH， FSHの 分 泌 不 全 を 認 め た ． 症 例 2： 現 在5歳女児 ． 在 胎37週 ，骨 盤 位 の ため 帝 王 切 開術 で 出 生 ，生 後 30分で 呼 吸 障 害と 著 明 な 低血 糖を 認め た ． TSHの 上 昇 し ない 甲 状 腺 機能 低 下 症 を認 め ， MRIでは 下 垂 体 はほ ぼ 無 形 成， 異 所性後
葉 と キ アリ 奇 形 を 認め た ． GH分泌 刺 激 試 験で は 完 全 に無 反 応 ， GnRH負荷 に て LH， FSHと も無 反 応 だ っ た ． 症 例 3：現 在 17歳男 児 ． 在 胎40週 ， 正常 経 膣 分 娩に て 仮 死 なく 出 生 ， 生後12時間 で チ ア ノー ゼ ， 低 血糖 を 認 め た． 3歳ま で 無 治 療で 経 過した が，低 血糖， 身長増 加速― 250―

度 の低下，小陰茎を認め精査，GH分泌刺激試験，GnRH刺激試験で，GH，LH，FSH全て無反応で，MRIにて下垂体低ー無形成，異所性後葉を認めた．
（B）IGHD
症例1家系（3例）
現 在10歳女児．3
歳健診にて低身長を指摘，5歳時に当科に紹介され精査を行なった，この時の身長は86cm（−4．0SD）で，前額部突出，鞍鼻を認めた．患児の母の成人身長は133cmで，小児期にGHDと診断されているが未治療である．血清IGFー1，IGFB
Pー3はいずれも低値で，GH分泌刺激試験ではいずれも低反応であった．M
RIで下 垂体 前葉 の低 形成 を 認め た．
［結果］1） H
ES
X
1遺伝子，LH
X4遺伝子の変異解析
症例1で，I'LcS
X1
遺伝子の新規変異(306/307insAG)をへテロで確認した，この変異は直後に終止コドンを形成していた． 症例2で，LH
X鑓伝子の新規変異(P389T)，症例3でLHX
4
伝子の新規変異(VlOIA)をヘテロで確認した．症例1−3以外の症例ではF‑I
E
SX
1遺伝子，LHX
4
遺伝子いずれの変異も同定できなかった．
2）変異H
ESX
1の機能解析
Proplの導入で上昇した，PIT
1遺伝子のプロモーター活性は，野生型のHE
S
X1の発現により有意に抑制されたが，変異HE
S
X
1ではこの抑制効果は減弱した．P
itxlの導入で上昇した，
己げ〆遺伝子のプロモーター活性は，野生型のH
E
S
X1の発現により有意に抑制されたが，変異H
ESX
1ではこの抑制効果は減弱した．Pitxl下でのPOM
Cc
Dプロモーター活性も，野生型のH
ESX1を発現することにより抑制され，変異H
ES
X
1ではこの抑制効果が軽度減弱していた．
GF
P融合蛋白による細胞内局在の検討で，野生型及びR1
12G変異のHE
S
X
1では，核内に存在したが，306/
307insA
Gの変異体では核内移行を認めなかった．
3）変異L
HX
4の機能解析
野生型のLH
X4の発現によりF
S
H
汐遺伝子のプロモーター活性は上昇したが，VlOIA
変異では 有 意 に 減 少 し た ， P389T変 異 で は 野 生 型 に 対 し て ， 変 化 を 認 め な か っ た ．
4） G
H‑1
遺伝子の変異解析
GI1イ 遺 伝 子 の 第 3エ ク ソ ン に E56Xの 変 異 を へ テ ロ で そ れ ぞ れ 同 定 し た ．
5） RT− PCR法 に よ る 変 異 GH‑1遺 伝 子 (E56X)か ら 産 生 さ れ る GH mRNAの 検 討
野 生 型と同サイズである476塩基のmR
NAの他431塩基，356
塩基 のm
RNAが産生された，［考察］1） HESXI
遺伝子異常
プロモーターアッセイの結果では，HESX1の変異がProplやPitxlなどのさまざまな転写因子と相互に関連し，GH，PRL，TS
H産生のみならず，LH，ACTHの産生にも影響を与えうることが示唆された，さら に306/307insAGの変異H
ES
X1は核への存在が認められず，DNA結合能の喪失が考えられた．
。）LH
X
4遺伝子異常む汀むりの解析では，野生型で見られた活性増強効果がV
lOIAの変異では消失していた．
101番目のバリンはL工Mドメインに存在し前後の アミノ酸配列は同じL
IM
ドメ インを持っLH
X3と共通で，種を 超えよく保存されている．このバリンは重要な機能を有することが予想され，本変異はCPHD発症の成因と推定された，P389Tの変異は，C末端側のLIM特異的ドメインに存在する， むぬtroの解析では野生型と 変化していなかったが，正常100アリー
ルにはなく，病因としての意義があると考えられる．
3）嚠イ遺伝子異常IGHDI
I型の多くは第3イン卜ロンの変異だが，この場合第3エクソンをスキップした短い変異GHが産生され，正常GHの分泌を阻害することが示されている．そのメカニズムとして，分子量の小さい異常 GH蛋白が分泌顆粒内で正常GHとダイマ―を形成し，正常GHが下垂体細胞から分泌されないことによるものとされている．今回のRT―PC
R法による解析で，E56Xの変 異GH‑1遺 伝子 から3種類の mRNAが産生された．356
塩基 対のものは第3イン卜ロンの 変異 によ って 生じ る第3エクソ ンを欠失したmRNAと同一であった．したがって，このmIW
Aから産生された異常 GH様蛋白が，正常アリールからのGHの分泌を阻害するものと考えられる，このmRNAの産生 はラッ卜下垂体由来細胞にても認められ，実際のGH産生細胞で起きていることが推定される．
［結論］
1）重 症CPH
Dでは出生直後より重篤な症状を呈するため，早期診断，治療が必要である．
2） CPH
D
患者より，HES
X
1遺伝子の新規変異1例とLH
X
4遺伝子の新規変異2例を同定した，わぬ む り の 解 析 か ら ， こ れ ら の 変 異 は CPHDの 原 因 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ．
ー 251―

3） IGHD
1
家系で，GH‑1遺伝子の新規変異を同定した． jカ vi
むりの解析から，この変異GHにより優性阻害を起こすことが示唆された．

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学位論文 審査の要旨
主 査 教授 有賀 正
副 査 教授 清水 宏
副査 教授 佐々木秀直

学 位 論 文 題 名

先 天性下 垂体疾患 の分子遺伝学的解析
先天性下垂体形成不全は，従来骨盤位分娩・仮死等が原因であったが，近年遺伝子異常による発症が報告されている．前葉ホルモン産生細胞は特異的な転写調節因子の働きにより発生・分化するため，転写遺伝子の異常は関連するホルモンの分泌異常をひきおこす．
重症例で は全て の前葉ホ ルモン を欠損し，出生時から呼吸不全・低血糖を呈し迅速な診断・治療を要する． HESXl,LHY
4は共に，下垂体ホルモン複合欠損症(combinedpituitaryhor
monedeficiency；CPHD)の原因遺伝子で，下垂体発生初期から重要な役割を果たすが未だ十分な解析は行われていない．今回先天性下垂体形成不全の成因解明のため，liESX1LHX4に注目しその分子遺伝学的成因，臨床症状の特徴にっき検討を行った．またGH単独欠損症(isolatedgrowthhormonedeficiency；IGHD)のうち常染色体優性遺伝形式を示すI
GHDu型の1家系にっき成因の検討を行った．
まずCPHDに関して，当院受診の11例を対象とした．MR
Iにて多くが下垂体低形成・異所性後葉・ 柄形成不全を呈した．このうち生後早期より重篤な症状を呈した3例で遺伝子異常を同定した，
症例1はHESX
1異常の症 例で現 在6歳 の男児で ある． 出生時よ り呼吸不全と重症な低血糖，そしてゴナド卜ロピン分泌不全を示唆する小陰茎・精巣の形成不全を示した，内分泌検査では甲状腺ホルモン，コルチゾールの低値，GHはGHRHによる刺激にて分泌を認めたが視床下部を介する負荷試験では分泌を認めなかった，MRIで下垂体低形成，異所性後葉と左側視神経低形成を認めた．本例で新奇変異(
306/307insAG)をへテロで同定，直後に終止コドンを形 成して いた，PROP
1はPIT1の 転写活性を促進するが，HES
X1はこの作用の抑制因子である ．プロモーターアッセイの結果では今回同定した変異H
ES
X1はその機能抑制を喪失してい た．またGFP融合蛋白による細胞内局在の検討で，306/307i
nsA
Gの変異体では核内移行を 認めなかった．以上より本変異によりDNA結合能を喪失したものと考えられた．
症例2，3はLHX4異常の 症例で ，症例2は現在5歳の女児である．出生時より呼吸障害と著明な低血糖を認めた．下垂体前葉ホルモンの分泌はほとんど認められず，MR
Iで下垂体はほぼ無形 成で異所性後葉とキアリ奇形を認めた．症例3は現在17歳の男児である．出生後にチアノ ーゼ，低血糖を認めた．症例2
より軽症だが全ての下垂体前葉ホルモンの分泌不全を認め ，MRIにて下垂体低形成，異所性後葉を認めた．症例2で新奇変異(P389T)を，症― 253ー

例3で新奇変異(VlOIA)をそれぞれヘテロで確認した．LH
X4の結合部位が存在するパけタ遺伝子プロモーターを用いた解析では，野生型で活性を増強させたが，VlOIA
ではその増強効
果が消失した．10
1番目のバリンはLI
Mドメインに位置し，そのアミノ酸配列はよく保存されている．LIM
ドメインは特異的に働くco―activatorの存在により，蛋白同士の相互作用としての機能を有すると考えられているが，VlO
I
Aではその作用障害により活性を低下させた ものと考 えられ た．重症型のP
389T
ではプロモーター活性に対する効果は野生型と変化を 認めなか った． 変異の位置するC末のアミノ酸配列はLH
X3，LH
X4のみに認められ他の蛋白との相同性がない．その正確な役割は不明だが，正常100アリールにこのアミノ酸置換は認められず，病因としての意義があると考えられた．
今 回CPH
Dに加 え，HESX
1異常では視神経病変を，LHY
4異常ではトルコ鞍形成不全を認めた ．これら は逆に H
ES
X1
異常 ，LHX4
異常 を疑わせ る特徴 的所見で あることを示唆した．
続いてIG
H
DI
I型の症例である．現在10歳女児で，3歳健診にて低身長を指摘された．内分 泌学的に はGHの単独欠損で，MRIで下垂体前葉の低形成を認めたが柄・後葉は正所性であ っ た ．母 ， 妹 もGHDであ り IG
HDn型 と診 断 さ れた ． 本 症例 で GH‑1
遺 伝子の 新奇変異(E56X)をヘテロで同定した．I
GHDII型の多くはスプライシングの異常だが，初めて終止コドンへの変異を報告した．E56Xから産生されるGHmR
N
Aの検討をRT―PCR法にて行ったところ 野生型と 同サイ ズである 476
塩 基のmRNAの他，431
塩基，そしてスプライシングの異常に よ っ て生 じ る 356塩 基の mRN
Aが 産 生 された． この356塩基の mRN
Aにより ，第3エクソン をスキッ プした 短い変異 GHが産生 され，小胞体内で正常GHの分泌を阻害することが示されていることからE
56Xにおける優性阻害が説明され，釧イ遺伝子の終止コドンヘの変異がIGH
DH型を発症しうることを明らかにした，
公開発表に際し，副査の佐々木秀直教授から鰯ゞr′

M孵異常症の先行研究について，発症例の両親の変異の有無，発症例が遺伝子多型でなぃと考える根拠，脳の発生異常と遺伝子異常の関連について質問があった．次いで副査の清水宏教授からCPH
D
発症に関わる他の遺伝子異常の可能性，遺伝子の大きさは小さいが重要な機能を所持しているのかどうか，妊 娠中にCPHDを予見で きる可能 性卜重 症CPHDに対する出生時からの具体的な診断・治療法に関する質問があった．また主査の有賀正教授から舶孵異常の重症度と機能解析の結果が乖離している点，ならびに異なる方法で機能解析ができないかに関して，IGHDの症例で遺伝子検索をするに至った経緯に関する質問があったが，いずれの質問に対しても申請者は妥当な回答をした．
本研究は新生児期より症状を示す重症CP
H
Dでは下垂体発生に関わる転写遺伝子の異常が要因である可能性を示した点で高く評価され。今後の症例の蓄積からさらなる病態の把握，新たな治療ーの手がかりが得られることも期待される．
審査員一同はこれらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者が 博 士 （医 学 ） の学 位 を 受け る の に 充分 な 資 格を 有 す るものと 判定し た．

― 254―