博士（獣医学）亀山健一郎
学 位論 文 題名
Studies on the Pa
thogenesis and Rapid Diagnosis ofBovine Viral Diarrhea（牛 ウイ ルス 性下 痢症 の病 理発 生お よび迅速診断に関する研究）

学 位論文内容の要旨

牛ウイルス性下痢ウイルス(bovineviral diarrhea v
irus;BVDV)はフラピウイルス科ペスチウイルス族に属する。このウイルスのゲノムは約12.
3kbの十極性を持つ1本鎖RNAからなり、5 およぴ3 非翻訳領域の間にーつの大きな翻訳領域を持つ。この翻訳領域より生成されたポリプロテインはウイルスもしくは
細 胞 の 蛋 白 分 解 酵 素 に よ り 11ま た は 12の ウ イル ス 蛋 白 に 切 断 さ れ る 。
BVDVは全世界に浸潤しており、このウイルスにより弓1き起こされる牛ウイルス性下痢症(bovine viraldiarrhea;BVD)
は発熱、水様下痢 、呼吸器症状、粘膜の糜爛テょどを主徴とする。妊娠牛がBVDVに感染すると経胎盤感染が容易に起こる。胎齢約80〜100日の胎児がncpBVDVに感染すると免疫寛容となり、持続感染仔牛として生まれる。このような持続感染牛は一見健康であるが、周囲にウイルスを排泄し続けるため牛群内の感染源と詮る。さらに、持続感染牛
波致死的な粘膜病を発症することが多い。
BVDのコ ントロールには感染源となる持続感染牛の早期発見と淘汰が最も重要である。現在、BVDの診断にはウイルス分離、RT‑PCRおよぴ市販のELISAキットなどガ用いられている。本研究では、 BVDのコントロールと分子基盤の解 明を 目的 として、BVD迅速診断法の開発、BVDVの新規遺伝子組換えメカニ
ズ ムの 解明 およ び生 体内 にお ける BVDV蛋白のプロセヅシングの解析を行った。
1．イムノクロマトグラフイ法を用いてBVDV抗原を迅速に検出するキットの開発・本 章で は、 BVDVのNS3蛋白 に対するモノクローン抗体を用いてBVDを迅速に診断するイムノクロマトキットを開発した。このキットはぬvitroにおいて様々な遺伝子型のBVDVのNS2:．3蛋白を検出し、また、in vivoにおいてもBV
DVに持続感染した牛の自血球抽出液からウイルス抗原を検出した。ウイルス分離と比較したこのキットの感度と特異度はそれぞれ100%
およぴ97.2%であった。さらに、BVDVを急性感染さ世た牛からもウイルス抗原を検出した。本キットは1mlの血液 から 比較 的簡 単極 手順でBVDV抗原を検出することから、BVDの迅速診断に有用であると考えられる。

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2．牛ウイルス性下痢ウイルスのNpro遺伝子領域における遺伝子組換えとウイルスの抗原性と病原性の変化の関連
cpBVDV KS86‑1cp株 は、 ncpBVDV KS86‑1ncp株に持続感染した牛にcpBVDV
Nose株が重感染し、牛が粘膜病を発症した際に分離された株である。cpBVDV
799cpおよぴ839cp株はこのcpBVDV KS86ーlcp株の重感染により粘膜病を発症した牛から分離された。本章で倣これらのウイルスの遺伝子構造を解析し、cpBVDV 799株お よび 839株 が、 牛に 持続 感染していたncpBVDVと重感染した
KS86‑1cp株の闘での遺伝子組換えにより生じたキメラウイルスであることを明らかにした。また、799cpおよび839cp株を生んだ遺伝子組換えはそれそれ異なる部位で起こっていたにも関わらず、両ウイルスは共にKS86‑1cp株の持つJiv遺伝子と牛に持続感染株していたncpウイルスの膜糖蛋自遺伝子を受け継いでいた。さらに、中和試験により、799cpおよぴ839cp株の抗原性はそれそれの持続感染ウイルスと類似していることが分かった。これらの結果は5 非翻訳
領 域に Jiv遺伝 子を持 つ外 来性 cpBVDVは 牛に持続感染しているncpBVDVと様々な部分で遺伝子組換えを起こし、抗原性と病原性を変化させる能カを持つことを示している。
3． 生 体 内 に お け る 牛 ウ イ ル ス 性 下 痢 ウ イ ル ス NS2ー 3蛋 白 の 開 裂
cpBVDVjjs感染した培養細胞中において、その非構造蛋白2‑3（NS2ー3）は開裂し、ncpBVD
Vjjs感染した培養細胞中で敬そのNS2‑31,ま開裂しないことが知られている。しかし、生体内におけるNS2‑3蛋白の開裂は未だ調べられていナょい。
本章では粘膜病発症の分子基盤を明らかにするため、BVDVに持続感染している牛の体内におけるNS2‑3蛋白の開裂を調ぺた。実験に用いた持続感染牛から分離した】3VDVの生物型は全てncpであり、これらのウイルスを感染させた培養細胞から誼約120kDaのNS2‑3蛋白が検出された。一方、これらの持続感染牛の 自血 球か らは NS2ー3蛋白の開裂により生ずる約80 kDaのNS3蛋白が検出され、健康牛から分離した自血球にBVDVを感染させた場合にも同じ現象が確認された。さらに、NS3蛋白は持続感染牛のりンパ系組織、甲状腺、肺およぴ腎臓などの多くの組織からも検出された。以上の結果から、f門vitroで倣N
S2‑3が開裂しないncpBVDVであっても、牛の体内においてはNS2ー3が開裂することが分かった。このNS
2‑3蛋白の開裂は粘膜病の発生と直接的な関連は詮いものの、発育不良、下痢、呼吸器症状詮どのBVDの一般症状の発症に関与しているものと考えられる。

― 1108 ‑学位論 文審査の要旨
主副副副査
査
査
査

教授 喜 田教授 澤助 教 授洋助 教 授 田 島 誉迫 田 義宏文士博

学位論文題名
Studies onthe PathogenesisandRapidDiagnos
isof
BovineViralDiarrhea（ 牛ウ イルス性下 痢症の病 理発生お よび迅速 診断に関 する研究 ）牛 ウイルス 性下痢症 （bovineviraldiarrhea;BVD)は、BVDウイ ルス(BVDV)の感染によ って、発 熱、水様 下痢、呼吸器症状、粘膜の糜爛などを主徴とする届出伝染病である。
BVDVに 持 続感 染 し た牛 は 周 囲に ウ イル ス を 排泄 し続 けるため 他の牛の 感染源と なる。
さ ら に 持続 感 染牛 は 致 死的 な 粘膜 病 を 発症 す るた め、BVDVの 蔓延によ る経済的 損失は大 き い 。本 研 究は 、 BVDのコ ン トロ ー ル と病 理 発生 の 分 子基 盤 の 解明 を 目的 と して、BVD迅 速 診 断 法 を 開 発 し て 、 感 染 牛 の 摘 発 に 適 用 す る と と も に、 牛 生体 内 に おけ る
BVDVの 遺 伝 子 組 換 え お よ び 蛋 白 の プ ロ セ ッ シ ン グ を 解 析 し た も の で あ る 。
初 め に BVDVの NS3蛋 白 に 対す る モノ ク ロ ーン 抗 体 を用 い てBVDを 迅 速に 診 断す る イ
ム ノクロマ トグラフ イーキット を開発し た。本キ ットは高 い感度と 特異度を 持ち、少量の サ ン プル か ら従 来 法より 迅速に診 断が行える ことから 、BVDの迅速 診断に有 用であると 考えられ る。次に 、粘膜病を 発症した 牛から分 離された ウイルス の遺伝子 構造を解析
し 、5 非翻 訳領域に Jiv遺伝子を持つ細胞病原性（cp)BVDVが持続感染牛に感染すると、持 続 感 染し て いる 非 細 胞病 原 性（ ncp)BVDVと 遺 伝子 組 換 えを 起 こ し、 抗 原性 の異 なる 新 た なcpBVDVが生 ま れ 、粘 膜 病を 発 症 する こ とを明 らかにし た。最後 に、粘膜 病発症 の 分 子基 盤 を明 ら か にす る ため 、 BVDVに 持続 感染 している 牛の体内 における NS2―3
蛋 白 の 開裂 を 調べ た 。 持続 感 染牛 か ら 分離 し たBVDVの 生 物 型は 全 てncpで あ った が、
こ れ ら の持 続 感染 牛 の白血 球からは NS2−3蛋白の開 裂により 生ずる約 80kDaのNS3蛋白が 検 出 され た 。さ ら に、持 続感染牛 の臓器内で も高い割 合でNS2‑3蛋白 が開裂す ることが 明らかと なった。 以上の結果 から、invitroで はNS2‑3が開裂 しないncpBVDVであっても 、 牛 の生 体 内に 韜 いては 、NS2‑3が開裂 することが 分かった 。従って NS2―3蛋白の 開裂 は粘膜病 の発生と 直接的な関 連はない ものの、 発育不良、下痢、呼吸器症状などのBVDの 一般症状 の発症に 関与してい るものと 考えられ る。
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本研究成果はBVDの発症メカニズムの解明と対策に有用である。よって、審査委員一
同は、上記博士論文提出者亀山健一郎氏の博士論文は、北海道大学大学院獣医学研究科
規 程 第 6条 の 規 定 に よ る 本 研 究 科 の 行 う 博 士 論 文 の 審査 等 に 合 格 と 認 め た 。

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