博 士 （ 生 命 科 学 ） 森 口留 美子
学 位 論 文 題 名

革 新 的 ワ ク チ ン の 創 製 を 目 指 した
デリバリーシステ ムの機能解析と癌免疫療法への展開
学 位論文内容の要旨【背景】
近 年、 AI
DSから 癌に 至る 様々な病気に対抗できる治療法 として、DNAワクチンが注目されている。しかしながら、現状では期待した効果が得られず臨床応用されるまでには至っていない。この最大の障壁となっているのが、樹状細胞への効率的な遺伝子導入システムの開発である。
当研究室では、夕ンパク質や核酸等の細胞内送達を目的として、独自のキャ1」アーである 多 機 能 性 工 ン ベ 口 ー プ型 ナノ 構造 体(MEND)の開 発を 進 めて いる 。MENDは 様々 な機能性素子を組み込むことにより体内動態・細胞内動態の制御が可能である。特に、膜透過性ベ プチ ドで ある オク タア ルギ ニ ン(R8)を 修飾 した R
8‑ME
NDは 、培 養細 胞に おいて高い遺伝子発現活性を示すことが明らかにされ ており、DNAワクチン開発のためのデリバリーシ ステ ムと して 有用 であ ることが期待される。本研究で は、R8‑ME
NDを基盤とした革新的ワクチンの創製を目指し、段階的にデリパリーシステムの機能解析を行った。また、これと平行して免疫効果の評価系を確立し、免疫誘導能の評価を行うことにより、それぞれ の デ リ パ リ ー シ ス テ ムが ワク チン とし て機 能し うる も ので ある か検 証を 行っ た。
【 結果及び考察】！ ：R
8堡飽竺耋2ームによる抗 原夕ンノ！2質c送達
これまでに当研究室において、抗原を封入したルポソーム膜の表面をR8で修飾することに よ り、 効率 的に M
HC classI(MHC‑I)抗原 提示 を誘 導で きる こと が示 され てい る。 そこ で 本研究では、R8による抗原提示誘導メカニズムの解明に 焦点を当て、オクタリジン(K8)を対照に抗原提示能及び細胞内動態の比較解析を行っ た。ovalbumin(OVA)を封入した りポソームをマウス骨髄由来樹状細胞にバルスし抗原提示量を評価した結果、驚くべきこ と に、 R8修 飾リ ポソ ーム のみ で投与量依存的なMHC‑I
抗原 提示が認められ、K8修飾リポ ソームでは見られなかった。そこでさらに詳細な検討を行ったところ、両リポソームの取 り込み量及びェンドソーム脱出能は同程度であった。ま た、プ口テアソームによるOVAの 分解量についても評価を行ったが、顕著な違いは認められなかった。さらに、樹状細胞の 成 熟化 も同 程度 であ った 。興 味深いことに、空のR8リポソームをOV
A封入リポソームと 同 時に添加することにより、R8リポソームだけでなくK8リ ポソームによる抗原提示も増 加した。一方、空のK8リポソームでは顕著な影響は認められなかった。これらの結果か
ら、R8に よる MHC‑I
抗 原提 示の 誘導はその正電荷によるもの ではなく、抗原の分解以降の 過 程 で R8特 有 の 抗 原 提 示 促 進 作 用 が 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

― 1377―

2.デリ パ リ ー2丞 孟 ム 仝c TL
Rリ ガ ンド の 組 墨込 墨 による 恕胞壁免 疫透蔓能 Q
壇 強圭疸
壁尅空塗 性Q
証価
続いてこの1」ポソームのワクチン効果をあガ VOで評価した。抗原に対する特異的かっ強カな 細胞障 害性T細胞(CTL)を誘導 すること を目的 として、Tou‑likereceptor(.TI』R)リガ ンドの 共封入を 試みた 。その結果、TLR3の1jガンドである合成二本鎖RNA(PolyI:C)の共 封入に よって、 R8リポソ ームのCTL誘導 能が著し く増強さ れた。 次に、Poly I:C
封入量 の最適 化を行い 抗癌効 果につい て評価を 行った 。R
8リポソームを免疫したマウスにOV
A発現癌 細胞を移 植し予 防的な抗癌効果を評価した結果、R8リポソームを投与した群におい ては、細胞性免疫誘導アジュパントとして知られるフ口イト完全アジュパントを上回る癌 の増殖抑制効果が認められた。さらに、先に癌を移植したマウスに免疫を行った場合に も 癌の 増 殖 が抑 制 さ れ、治療 的なワク チンと しても有 効であ ることが 示唆さ れた。
3.賞 状 趨 胞 仝 QsiRNA： Q速 達 丞 び SOCS1ノ ッ ク ダ ウ ン に よ 塗 龜 疫 増 塗 効 墨
次に 、siRN
Aの送達に ついて 検討を行 った。 ベクターは、si
RNAの送達のために培養細胞 系 で最 適 化 され た di‑lamellar‑MEND (D‑MEND)を 用 いた 。 さ らに 、 supp
ressor ofcytokine signalingl(SOCSl)を 標的 と し て免 疫 効果の評 価を行っ た。SOCS
1はサイ トカインシグナル伝達における負のフイードパック分子として機能していることから、免疫の誘 導に合 わせてSOCS1を一過的にノックダウンすることにより、ワクチンの効果を増強可能 である と期待さ れる。 GAPDHを標 的とし た評価で は、D‑MENDを 用いるこ とにより、RNAi用 の 導入 試 薬 として 広く用い られて いるLi
pofectamin
e 2000を 上回る R
NAi効果が得 ら れ た 。 続 い て SOCS1に 対 す る siRNAを 導 入 しIFN‑
Yに よ りSOCS
1の 発 現を 誘 導 した結 果、87.5％ のS
OC
S1発現抑制 及び、TNF‑a, IL‑6の産生増加が観察された。さらに、
SOCS
1をノッ クダウン した樹状細胞を免疫したマウスでは、有意に強い癌の増殖抑制効果が認 められ た。
4： 樹 迭 趨 胞 仝 Q違 伝 子 遂 達 童 目 指 し た 新 規 iリ パ リ ニ 2丞 孟 ム 囲 登 Ol‑塾
最後に、遺伝子送達における細胞内動態の定量的解析と、主に核移行に焦点を当てた新規デルパリーシステムの開発を試みた。まず、遺伝子の投与量と発現量の関係が非線形性を示すことに着目し、その要因を解明するために細胞内動態の解析を行った。その結果、非線形性は細胞への取り込み・エンドソーム脱出・核移行過程を含む細胞内動態ではなく、それ以降の転写・翻訳過程を含む核内動態に起因するものであることを見出した。さらに、
核膜孔を 介さな い膜融合 による 核移行戦 略に基 づいた新規MEN
Dを用いることにより、核移行 だ けで なく 核 内動 態 の効 率 も改 善 されることを明 らかにした。
これらの結果は、非ウイルスベクターの開発において、細胞内動態の制御と同時に核内動態を制御することの重要性を示唆する結果である。今後は核移行の改善と核内動態制御の両 面 か ら、 さら なる遺 伝子発現 効率の 上昇を目 指した べクター 開発が期 待され る。
【まとめ】
1． R8による M
HC‑I
抗原提示の誘導はその正電荷によるものではなく、また、そのメカニズ ム に細 胞 質へ の抗 原 送達 過 程は 関与しな いことを明ら かにした。
2． R8を用い たタンバク質のデリパリーシステムにTLRルガンドを組み込むことにより、
わ VI VOでのCTL誘導能を増強することに成功し、さらに、このシステムが癌に対するワクチンとして有用であることを明らかにした。
3． D‑MENDを用い て樹状細 胞のSO
CS
1をノッ クダウ ンするこ とによ り、樹状細胞のワクチン効果を増大させることに成功した。
4．非ウイルスベクターの開発において、細胞内動態の制御と同時に核内動態を制御することの重要性を見出した。
― 1378ーこれらの結果より、これまで培養細胞において様々な解析結果に基づき最適化が行われてき たデリバ リーシ ステム(MEND)が樹状細 胞へも 適用可能 であり、 さらに それらは 癌免疫療法におけるワクチンとして機能しうることが示された。

一 1379―

学位論文審査の要旨
主査

教授

原島秀吉

副査教授

松田副査准教授

副査教授

正紙谷浩之
小暮健太朗（京都薬科大学）

学 位 論 文 題 名

革新的ワクチンの創製を目指した
デリバリーシステムの機能解析と癌免疫療法への展開
近年、AIDSから癌に至る様々な疾患に対抗できる治療法としてDNAワクチンが注目されているが、樹状細胞への効率的な遺伝子導入システムの開発が障壁となり臨床応用には至っていない。本研究では、独自の遺伝子送達システ
ムで ある オクタ アルギ ニン修 飾多 機能性 エンベ ロープ 型ナノ 構造体（R8‑MEND）を基盤とした革新的ワクチンの創製を目指し、デリバリーシステ
ムの機能解析と免疫誘導能の評価を行った。
まず、オクタアルギニン（R8）を修飾したりポソームの抗原タンパク質の送達について、マウス骨髄由来樹状細胞を用いて検討した。その結果、R8リポソームでは効率的にMHC class1（MHC‑I）提示が誘導されたのに対し、比較対象として用いたオクタリジン（K8）リポソームでは提示が認められなかった。
興味深いことに、両リポソームの取り込み・エンドソーム脱出・プロテアソー
ムによる抗原の分解過程に差異は認められなかったが、抗原を含まないR8リポソームを同時に添加した場合K8リポソームの抗原提示が促進された。よって、
R8リポソームによるMHC‐I抗原提示誘導はR8に特有の作用であり、また、そのメカニズムに細胞質への抗原送達過程は関与しをいことを見出した。これらの結果は、R8修飾キャリアーのワクチンとしての利点を明らかにした初めてのものである。
こ の R8リ ポソ ー ム の ワ ク チ ンとし ての 効果を ねdVOで評 価した 結果 、Toll‑likerec
epto
r3のりガンドである合成二本鎖RNA（PolyI：C）を抗原と共封入することにより、CTL誘導能を著しく増強し、フロイト完全アジュバントを上回る抗癌効果を誘導することに成功した。よって、このR
8修飾キャリアーが癌ワクチンとして有用であることが証明された。
さらにDNAワクチンの前段階として、樹状細胞への核酸医薬（siRNA)送達に ついて 検討 した。 siRNA送達 のために培養細胞系で最適化されたR8修飾
di‑lamellar‑MENDにより、市販試薬で最強のLipofec
tamine 2000を上回る‑ 1380←

RNAi効果を得 ることに成 功した。ま た、サイトカインシグナル伝達における負の フ イ ー ド バ ッ ク 分 子 とし て 機能 し てい る S
OCS1に 対 する si
RNAを用 い ることで、 インターフェロン￣Y刺激時のシグナル伝達の増強、及びサイトカイン産生の増 加に成功し た。さらに 、SOC
S1をノ ックダウン した樹状細 胞を免疫し たマウス では、有意 に強い癌の 増殖抑制効 果が認められた。樹状細胞において、
非 ウイ ル スキ ャ リア ー を用 い て強カな R
NAi効果を誘導 し、さらに ワクチン効果 を 増 強 す る こ と に 成 功 し た 報 告 は 本 研 究 が 初め てで あ る。
さ ら にDNAワク チ ン開 発 に重 要 な遺 伝 子送 達 時の 細 胞 内動 態の 定量的解析を行い 、新規キャ リアー開発 を試みた。 培養細胞において、遺伝子の投与量と発現量 の関係が非 線形性を示 すことに着 目し解析を行った結果、非線形性は細胞への 取り込み・ エンドソー ム脱出・核 移行過程を含む細胞内動態ではなく、それ以 降の転写・ 翻訳過程を 含む核内動 態に起因するものであることが示唆された。 このことか ら、樹状細 胞へ効率的 に遺伝子導入可能なキャリアーを開発するた めには、細 胞内動態制 御と核内動 態制御の両面からの効率改善が重要であるこ とが示唆さ れた。そこ で、樹状細 胞への遺伝子送達効率の改善を目的とし て、 核 膜孔 を 介さ な い膜 融 合による 核移行戦略 に基づぃた 新規M
EN
Dについて解析 したところ 、核移行だ けでなく核 内動態の効率も改善されたことを明らかにし た。
以上、 本研究は、 R
8‑MEN
Dが樹状細 胞へも適用 可能であり 、それらは 癌免疫療法に おけるワク チンとして も有用であ ることを示す優れた研究成果である。
よって 著者は、北 海道大学博 士（生命科 学）の学位を授与される資格がある
ものと 認める。

― 1381―