博 士 （ 医 学 ） 下 出 和 美

学位論文題名Bone MarrowStromalCellsActasFeederCellsfor
Tendon Fibrobl
asts through Soluble Fac
tors（腱線維芽細胞に対する骨髄間葉系細胞のfeeder作用）学 位論文 内容の要旨
骨髄間葉系細胞（以下BMSC)はその多分化能を利用して、種カの組織再生の細胞源として注目されているとともに、ある種の細胞に対しfeeder作用を持っていることが近年明らかになってきた。また腱・靱
帯損傷は比較的頻度の多い外傷で多くは自然治癒する。腱・靭帯損傷の治癒過程は出血期、炎症期、増殖期、成熟期の4期に分類されており、このうち炎症期において線維芽細胞、血小板、白血球、BMSCを含むさまざまな細胞の侵入が起こることが分かっており、なかでもBMSCはその治癒に幹細胞として重要な働きをしていると言われているが、その詳細なメカニズムは依然不明のままである。BMS
Cの損傷腱・靱帯治癒における役割としてはニっの可能性が考えられ、一っはBMSC自体が損傷部位で線維芽細胞に分化する事であり、二つ目は線維芽細胞に働きかけその生理機能を高める事である。BMSC
はこれまで細胞接着による心筋細胞や肝細胞の治癒促進、また分泌する液性因子により神経幹細胞の分化促進がこれまで報告されている。 し かし なが ら、 腱線 維 芽細胞とBMSCの細胞間相互作用について は、未だ明らかではない。
本研究では、BM
SCの液性因子の線維芽細胞の生理機能に対する影響に着目し、BMSCが液性因子を介して腱線維芽細胞に対してfee
der作用を有することを仮説とした。この仮説を証明すべく、ラット由来の線維芽細胞をB
MSCと細胞間接触のない多孔膜を介した共培養を行った。本研究の目的は細胞増殖、細胞外マトリックス産生能、細胞遊走能、細胞接着能に関してBM
SCの液性因子の影響を明らかにし、その上でその特異的な液性因子を同定することである。これらを明らかにすることにより、ティッシュエンジニアリングの手 法 を用 いた 腱・ 靱帯 再 生お よび 同損 傷 の細 胞治 療に 有益 な 情報 を提 供し 得ると考える。
BMS
Cと共培養することにより、腱由来線維芽細胞は細胞増殖能、細胞遊走能、細胞接着能が高まった。
また細胞外マトリックス産生能には変化がなかった。次に共培養の培養上澄による腱由来線維芽細胞の培養を行ったところ、同様に細胞増殖能が高まることが分かった。以上よりBM
SCは何らかの液性因子を介して、これらの作用をもたらしていることが明らかとなった。さらにこれらの腱由来線維芽細胞の挙動に変化を及ばした液性因子を同定すべく二次元電気泳動を用いた共培養の培養上清の蛋白解析を行った。二次
元電気泳動による蛋白分離と質量解析によって数種類の蛋白が同定された。このうち腱線維芽細胞の挙動に変化を与える可能性のあるものはプラスミノーゲンのみであった。またプラスミノーゲンはBMSCと共培養することにより、そのタンパク量は減少していた。次にプラスミノーゲンの腱線維芽細胞の挙動に対する影響を確認するため、プラスミノーゲンを培養液に加えた細胞増殖試験を行った。その結果プラスミノーゲンは用量依存性に腱線維芽細胞に対して増殖抑制効果があることが明らかとなった。以上よりB
MSCは

何らか の機 序によ り培養 液中の プラ スミノ ーゲン量を減少させることにより腱線維芽細胞に対してfeeder
作 用をも たらし てい る可能 性が示 唆され た。
こ れまで BMSC
はさ まざ まな細 胞に対 して増 殖や分 化に影響を与えることが報告されているが、腱由来線維 芽細胞 に関し ては 報告が 無かっ た。そ の様式 に関 しては細胞接着によるものと液性因子を介するニっの様 式がこ れまで 言わ れてい るが、 腱由来 線維芽 細胞 に関しては液性因子を介することが分かった。また本研 究で同 定され たプ ラスミ ノーゲ ン自体 は活性 のな い蛋白として知られているがその分解産物であるアンギ オスタ チンと kringl
e―5はある 種の細 胞に 関して アポトーシスを誘導することが明らかとなっている。
ま た腱・ 靭帯由 来の 線維芽 細胞は プラス ミノー ゲン 活性化酵素を発現していることが報告されており。これ らの分 子が影 響し ている 可能性 が考え られた 。以 上の結果より腱・靱帯の治癒過程の幹細胞としての役
割 は既存 の線維 芽細 胞に対 してこ れらの 液性因 子を 介しての制御に関わる可能性が示唆された。またティシ ュエン ジニア リン グの手 法を用 いて組 織再生 を行 う場合、事前に効率的に細胞数を増やす際に現在様々な 増殖因 子の添 加が 一般的 である が、臨 床応用 を考 えた場合、増殖因子の使用は非常に高額であることや発 癌性な どの安 全性 の確認 が必要 である などま だ問 題も多い。自家細胞で共培養の手技を用いてこの変わり にする ことが 出来 るのは これら の欠点 をおぎ なえ る可能性があり、選択肢のーっとして考えうると思われ た。

学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 清 水宏
副 査 教 授 安 田則副 査 教 授 三 浪 和 男
明

学位論文題名Bone MarrowS
tromalCellsA
ctasFeederCellsfor
Tendon Fibroblasts throu
gh Soluble Fac
tors（腱線維芽細胞に対する骨髄間葉系細胞のfeeder
作用）

学位論文は骨髄問葉系細胞（以下BMSC)による腱線維芽細胞に対するfeeder作用に関するものである，BMS
Cはその多分化能を利用して，種カの組織再生の細胞源として注目されているとともに，ある種の細胞に対しfeeder作用を持っていることが近年明らかになってきた．また腱・靱帯損傷は比較的頻度の多い外傷で多くは自然治癒する．腱・靱帯損傷の治癒過程は出血期，炎症期，増殖期，成熟期の4期に分類されており，このうち炎症期において線維芽細胞，血小板，自血球，BMS
Cを含むさまざまな細胞の侵入が起こることが分かっており，なかでもBM
SCはその治癒に幹細胞として重要な働きをしていると言われているが，その詳細なメカニズムは依然不明のままである． BMS
Cの損傷腱・靱帯治癒における役割としてはニっの可能性が考えられ，一っはB
MS
C自体が損傷部位で線維芽細胞に分化する事であり，ニつ目は線維芽細胞に働きかけその生理機能を高める事である． B
MS
Cはこれまで細胞接着による心筋細胞や肝細胞の治癒促進，また分泌する液性因子により神経幹細胞の分化促進がこれまで報告されている．しかしながら，腱線維芽細胞とBM
SCの細胞間相互作用については，未だ明らかではない．
BMSCと共培養することにより，腱由来線維芽細胞は細胞増殖能，細胞遊走能，細胞接着能が高まった．また細胞外マトリックス産生能には変化がなかった．次に共培養の培養上澄による腱由来線維芽細胞の培養を行ったところ，同様に細胞増殖能が高まることが分かった．
以上よりB
MSCは何らかの液性因子を介して，これらの作用をもたらしていることが明らかとなった．さらにこれらの腱由来線維芽細胞の挙動に変化を及ばした液性因子を同定すべ
く二次元電気泳動を用いた共培養の培養上清の蛋白解析を行った．二次元電気泳動によるー45
7ー蛋白分離と質量解析によって数種類の蛋白が同定された．このうち腱線維芽細胞の挙動に変化を与える可能性のあるものはプラスミノーゲンのみであった．またプラスミノーゲンはBMS
Cと共培養することにより，そのタンパク量は減少していた．次にプラスミノーゲンの腱線維芽細胞の挙動に対する影響を確認するため，プラスミノーゲンを培養液に加えた細胞増殖試験を行った．その結果プラスミノーゲンは用量依存性に腱線維芽細胞に対して増殖抑制効果があることが明らかとなった．以上よりBM
S
Cは何らかの機序により培養液中のプ ラスミ ノーゲン 量を減少させることにより腱線維芽細胞に対してfeeder
作用をもたらしている可能性が示唆された，
学位論文公開発表では、副査の安田和則教授から腱線維芽細胞に対するBMS
Cの作用因子でプラスミノーゲン以外のものの存在の可能性、またプラスミノーゲンを抑制した場合の腱線維芽細胞の挙動についての質問があり，申請者は他の蛋白の存在の可能性および今後の研究の方向性を述べた．・次いで主査の清水宏教授より接着因子の変化についての質問があり，申請者はその必要性に関して述べた．最後に副査の三浪明男教授より腱線維芽細胞以外でのBMSCの作用、および接着性があがる事に対するメカニズムについて質問があり，申請者は過去の報告を引用して他の細胞での挙動の変化を述べ，メカニズムに関しては増殖性が上がることとの関連性を述べた．
この論文は，ティッシュエンジニアリングの手法を用いる上で細胞の挙動を知ることは大変重要であり，腱線維芽細胞を用いた再生医療への応用にっながる重要な研究である点で高く評価され，今後さらなる研究が期待される．
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請者 が博士（ 医学） の学位を 受ける のに充分 な資格を 有する ものと判定した．

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