博 士 （ 医 学） 中 川隆 公
学位論 文題名Autoinhibitory Regulation of p73 by lNp73 to Modulate
Cell Survival and Death Throughap73‑Specific Target
Element Within the L¥Np73 Promoter(deltaNp73の発現誘導を介したP73の自己抑制調節機構の同定
および同 機構によ る細胞死 制御の解析）

学位論文内容の要旨
p53に 対す る初め ての相同 遺伝子 産物とし て分離 同定され たp73
は 、p53と同様に p53標的遺伝子群の転写誘導を介して、癌細胞の細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導作用を示すことから、p53と並ぷ癌抑制遺伝子の候補として注目されている。しかしながら、各種
悪性腫瘍 におけ るp53の 機能喪 失を伴う 変異が50％を越えるのに対し、p73で検出される変異は極めて稀である。さらに、p53のノックアウ卜マウスでは自然発がんが認められるのに対して、p73のノックアウトマウスでは自然発がんは観察されず、むしろ発生過程における異常すなわち水頭症などの神経系異常や、上気道の慢性炎症といった免疫異常を示す。
これらの 観察結 果は、p73がp53とは異 なる生理学的機能を持つ可能性を示唆している。
興味深い ことに 、最近p53依存性の神経細胞死を阻害し、神経細胞の発生・分化を調節する機能を 持つp73の転写 活性調 節ドメイ ンを欠 いた変異 体(delta
Np 73)の存在が明らかになった 。転写 活性調節 ドメイ ンを有す るp73（以下、TAp73)およびdeltaN
p73は同一の遺伝子由来の産物であるが、del．ぬハル殆の開始エクソンはp刀のイン卜ロン3上に存在していることから、両者の発現は異なるプ口モーターによって制御されていると考えられている。しかしながら、出此aAり紹の発現調節機構の詳細は不明であった。本研究では、シスプラチン処理による神経芽細胞腫のアポトーシス誘導過程において、1、Ap73の蓄積に伴うdelta
Np73の発現誘導を見出し、その発現調節機構を明らかにするとともに、delta
Np73とT． Ap73、 およ び p53と の 物 理的 な ら びに 機 能 的相 互 作 用に つい て解析 を行った 。
神経芽細胞腫より樹立されたSH．S
Y5Y細胞株に対して、シスプラチン処理によるアポトーシス誘 導刺激 を加える と、TAp73alphaの 蓄積に伴って抗p73alpha抗体で特異的に検出される約62kDaの蛋白質の発現誘導が観察された。delta
トゆ73に対する特異抗体を用いたウェスタ ン法に よって、 この62kDaの蛋白 質はdeltaN
p73alphaであることが明らかにな−58―

った。また、アデノウィルスベクターを利用した′IヽA
p73およびp53の強制発現実験から、
delta
Np73alphaの発現誘導はp53によっては検出されず、′rA・p73によって転写レベルで調節されていることが示唆された。次に、′IヽAp73によるdeltaN
p73の転写調節機構を詳細に解析す る目的 で、p紹のイン トロン 3上に存在する出此2´ゆ刀のプ口モーター領域を含む約2．9kbのDNA
断 片をクロ ーニン グするとともに、この領域に対する系統的な欠失変異体を作成 し、ル シフェラーゼレポーターアッセイを試みた。その結果、ぬん劃ゆ殆のプロモーター領域の‐76から．57（ぬ´ぬAり殆のエクソン1の開始点を十1とする）の位置に存在するp53結合配 列に類似 した配 列に依存 した1強p73によるレポーター活性の顕著な上昇が観察された。さらにゲルシフトアッセイによって、B細73がこの配列に特異的に結合するが、同一の実験条件下ではp53は結合しないことが認められた。この実験結果は、′I帥73が特異的に deltaNrp73を発 現 誘 導 する と いう分子 機構の 一端を物 語ってい ると考 えられる 。
一方、．細胞粗抽出液に対する免疫沈降実験からdeltaNp73は′I、Ap73およびp53と細胞内で物理的に結合していることが示唆された。また、p53の標的遺伝子である働み舵、ぬ、およびぬ此＆Aり刀のプ口モーターに対するレポーターアッセイから、p53および′I冷p73の転写活性化能はdeltaNrp73によって、著しく阻害されることが示された。従って、deltaNp73によるp53とTAp73の転写 活性化 能の阻害 は、両 者の直接 結合によ る複合体形成によるものであると考えられる。
さらに、′11Ap73に依存した神経芽細胞腫のアポトーシスに対するdelta
Np73の効果を検討した。 神経芽 細胞腫由 来の細 胞株SK．N．B
EにTAp73alphaを強制発現することによって誘導され るアポ トーシスは、deltaN
p73alphaを同時に強制発現させることによって抑制された 。 ま た、 シ ス プラ チ ン 処理 に よるp53とp73の蓄積 を介した S
H．SY
5Y細胞 のアポトーシスは、delta
Np73を強制発現させることにより阻害された。従って、これらの実験結果
はdeltaNp73が′I強p73の転写活性化能のみならず、神経由来の細胞に対するアポトーシス誘導能を顕著に阻害する機能を持つことを示唆している。
本 研 究より得 られた 実験結果 から、 p73
はイ ント口 ン3上 に存在す るp73結合配列 を介して、転写活性調節ドメインを欠いた変異体であるdelta
Np73を発現誘導することにより、自らの転 写活性 化能ならびにアポトーシス誘導能を阻害する機能をもつことが判明した。
最近、乳 癌や卵 巣癌など でp73の発現レ ベルが、正常組織に比べて癌組織で亢進していることが相 次いで 報告され たが、 これらの 観察結果 はp73の高発現 に伴うdeltaN
p73の発現誘導がこ れらの 癌の発生、進展に密接に関与している可能性を示唆している。本研究で明らかにな ったp73による delta
Np73を 介した自 己抑制 調節機構 は、細胞の生存と死ならびに癌化を制御する重要な分子機構のーつであると考えられる。

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学位論文審査の要旨

主査教授守内哲也
副査教授浅香正博
副査教授藤堂 省
学 位論 文 題 名Autoinhibitory Regulation of‑p73 by ANp73 to IVIodulate
Cell Survival and Death Throughap73‑Specific Target
Element Within the△ Np73 Promoter(deltaNp73の発現誘導を介したp73の自己抑制調節機構の同定
および同機構によ．る細胞死制御の解析）

p53に 対す る初 めて の相 同遺 伝子 産 物として1997年に分離同定されたp73は、p53と同様に p53標的遺伝子群の転写誘導 を介して、癌細胞の細胞増殖抑制およびアポトーシス誘導 作用 を 示す 。ま た、 各種 がん 細胞 で多くのLOHが認められるlp36に位置する。これらのこ とから、p53と並ぶ癌抑制遺 伝子の候補として注Hされている。しかしながら、各種悪性腫 瘍におけるp53.の機能喪失を伴う変異が50％を越えるの に対し、p73で検出される変異は 極めて稀であり、がん組織での発現は正常組織より高い。さらに、p53のノックアウト
マウ スでは自然発がんが認められるのに対して、p73のノックアウトマウスでは自然発がんは 観察 さ れず、むしろ発生異常を示す 。これらの観察結果は、p73がp53とは異なる生理学的 機能を持つ可能性を示唆している。神経芽細胞腫より樹 立されたS
H‑SY5Y細胞株に対して、シスプラチン処理によるアポ卜ーシス誘導刺激を朋1えると、TAp73aの蓄積に伴って抗 p73a抗 体で特異的に検出される約62kDaの蛋白質の発現誘導が観 察された。A
Np73に対す る特 異 抗体 を用 いた ウェ スタ ン法 によって、この62kDaの蛋白質はANp73aであろことが 明ら か になった‥また、アデノウィ ルスベクターを利川したT
Ap73およびp53の憶制発現実験から、AN
p73aの発現誘導はp53によっては検f1．iされず、′IヽA
p73によって転′写レベルで 調節されていることが示唆された。次に、4｜ゆ刀のブロモーター領域を含む約2．9kbのDNA断片をクローニングするとともに、この領域に対する系統的な欠失変異体を作成し、ルシフェラーゼレポーターアッセイを試みた。その結果、4Aり殆のプロモーター領域の．76から．57の位置に存在するp53結合配列に類似した配ダI
Jに依存したT．Ap73によるレポータ‑ 60−

ー 活 性の 顕 著 な 上昇 が 観 察 され た ‥ さ らに ゲ ル シ フト ア ッ セ イに よっ て、TAp73が この配 列に 特 異 的 に 結 合 す る が 、 同 一 の実 験 条 什 下で は p53は 結合 し な ぃ こと が 認 め られ た ニ の 実
験 結 果は 、 ′ Iヽ Ap73が特異 的に△ Np73を発現 誘導す るとい う分子 機構の ・端を 物語っ ていると 考 え ら れ る 。 p53の 標 的 遺 伝 子 で あ る 朋 DA怨 励 鼠 お よ び 別 ゆ 刀 の プ ロ モ ー タ ー に 対する レポー ターアッ セイか ら、p53および′ r Ap73の 転´学 t刪生化能は△Np73によって、著し
く 阻 害さ れ る こ とが 示 さ れ た″ 神 経 芽 細胞 腫 由 来 の細 胞 株 SK． N． BEにTAp73aを 強ft川発 現する ことに よって誘 導され るアポ トーシ スは、 △Np73aをI｜可時に 強制発 現させ ることによって 抑 制 さ れ た 。 ま た 、 シ ス プ ラ チ ン 処 理 に よ る p53と p73の 蓄 積 を 介 し た SH‐ SY5Y細 胞の ア ポト ー シ ス は、△Np73を強制 発現さ せるこ とにより m害され た、 従って 、これ らの実 験

結果 は△Np73が 吼ゆ73． の転写 活性化 能のみ ならず 、神経 I．臼来の細胞に対するアポトーシス
誘導 能を顕 著に阻害 する機 能を持 つこと を示唆 してい る，
審査 に当た ってま ず浅香 教授より 1）癌組 織での p73抗体 を用いた 免疫染 色、2） ′IヽAp73と△ Np73の 発現 調 節 な どの 質 問 が あっ た 。 1）癌組 織中で p73の増加 が免疫 染色で 増力‖ している こ とが 確 認 で きる が 、 そ の場 合 も p73には 変 異 が 見ら れ な ぃ こと 、2）△ Nrp73の発 現調節が p73の り ン 酸 化 な ど 、 蛋 白 の 修飾 が 関 与 して い る と 予想 さ れ 、 それ に つ い て実 験 Ipであっ た こと 等 の 回 答が あ っ た 。藤 堂 教 授 より 臨 床 検 体で の △ Np73の 発現 と 予 後 との 関 連 性 に
つ い て な ど の 質 問 が さ れ 、 neurobla8tomaで は △ Np73の 発 現量 と 予 後 が相 関 し 、 △Np73の発現 が高い ものは予 後が悪 いとい う論文が最近発表されたことを紹介し、回答が行オ・）れた。
守 内 教 授 か ら は p73knockout． mou8eの phenotypeに つ い て 確 認が 行 わ れ 、さ ら に 、 ANp73の プ ロモ ー タ ー 解析 の 詳 細 につ い て の 質問 が あ り 、自 ら の 実 験結 果 と 他 の遺 伝 子 に おけ る
プ ロ モ ー タ ー と enhancerと の 関 係 な ど と の 違 い に つ い て 間 答 が 行 わ れ た 。
こ の 論 文 は p53と p73と の 生 体 内 で の 機 能 の 違 い を △ Np73の 誘導 を 通 し て説 明 さ れ ること を 示し た 世 界 で始 め て の 報告 で あ り 高く 評 価 さ れ、 今 後 、 未知 の 部 分 が多 い 発 生 や発 癌に お け る p73の 役 割 が 分 析 さ れ て い く 際 に 重 要 な 理 論 的 根 拠 に な る こ と が 期 待 さ れ ろ 。
審 査 員 一 同は 、 こ れ らの 成 果 を 高く 評 価 し 、大 学 院 過 雛に お け る 研鑽 や 取 得 単位 な ど も併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学位 を 受 け るの に 充 分 な資 格 を イ 1 する も の と 判定 し た 。

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