博 士（ 地球 環境 科学）

リ ムシ ヱーピ ン

学位論文題名S
tudiesonthesynthetasesandtranspor
tsystemsof
nonribosomalp
epti
des，arthrofa
ctinandp
yoverdine，inPseudoy
noyzassp．MIS38（シュードモナス属細菌MIS38における非リボソームベプチド，
ア ル ス ロ フ ァ ク チ ン と ピ オ ヴ ェ ル デ イン ．
合 成酵素 および 輸送シ ステム に関す る研究）

学 位論文内容の要旨
近年、微生物がさまざまな生理活性や界面活性を有するべプチドを生産することが知られている。これらのぺプチドには通常のタンパク質には存在しないD‑型アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸やさまざまな修飾アミノ酸を構成分子とするものが多く見られる。さらにはりポベプチドなどの複合ペプチドや環状ペプチドなどその構造の多様性は極めて広い。これらは微生物固有のりボソームを介しない、いわゆる非リボソームペプチド合成酵素により合成される。
非リポソームベプチド合成酵素は基質アミノ酸を合成酵素に固定するチオレーションドヌイン(T)、アミノアシル化反応により基質アミノ酸を活性化するアデニレーションドメイン(A)、および2つのアミノ酸基質あるいはぺプチドとアミノ酸を連結する縮合ドメイン(C)から基本的に構成される。またこれら以外にアミノ酸の異性化を触媒するエピメラーゼドメイン(E)やべプチド産物を合成酵素から切り出す機能をもつチオエステラーゼドヌイン(TE)などが含まれる。すなわち、一つの構成アミノ酸ごとに一組のC/A/T（これを基本モジュールと呼ぶ）が配置されたマルチモジュール酵素である。非リボソームベプチド合成酵素は生命進化の視点から興味深いが、このモジュールを入れ替えることによって新しいべプチドを設計できることが1995年に報告されて以来、次世代の生理活性ペプチド合成法としても注目されている。
本研究で対象とするシュードモナス属細菌MIS38は高活性型リポベプチド型バイオサーファクタントであるアルス口ファクチンを合成することが知られている。アルス口ファクチンはユニークな双頭C/E‑ドメインを有する非リポソー― 173−ムベプチド合成酵素(ArfABC)によって合成されることが既に報告されている。
そこでMIS38における非リポソーム型ベプチド合成酵素およびその産物ベプチドの輸送システムについてより深く検討する目的で以下の研究を進めた。
MIS38は鉄 欠乏 培地で 培養 する と黄緑 色の 螢光 物質 （ピオヴェルディン；PVD38)を 生産 した ので 、その物質を精製し構造解析を行った。その結果、
PVD38は分子量1064でありAla，Glu，Gly(OHOrn)，Ser Thrを2：1：1：（1）：1：1の割合で含む新規化合物であることが判明した。続いてピオヴェルディン合 成酵素 (Pvd38‑chr)をコードする遺伝子ゆvd38‑chr)を取得した。ArfABCとは対照的にPvd38‑chrは従来型のC．，E‑ドメインを有する酵素であった。
pvd38‑cむ の うち E‐ ドメ イン 遺伝子 を破 壊し た変異 株を 作成 した ところ
PVD38の生産性は完全に失われていたが、アルス口ファクチンを正常に生産した。またAdABCを破壊した変異株でもピオヴェルディンは正常に生産された。
これらの結果はMIS38においてアルス口ファクチン合成酵素およびピオヴェルディン合成酵素はいずれも活性を有しており、かっお互いが独立して機能していることを示唆する。
次に産物ベプチドの膜輸送システムについて比較した。まず、ピオヴェルデ
イ ン の 膜 輸 送 に 関 与す る こ と が 予 想 さ れ る ABCトラ ンス ポ一 夕ー 遺伝子
ゆm粥召ろみがpレd38ア印の直下流に存在したのでこれを破壊した。破壊株のPVD38生 産 性 は野 生株に 比べ て9％程 度ま で低 下して いた 。そ こで 同様にar翻日ビの直下流に存在するABCトランスポーター遺伝子およびべりプラズムタンバク質遺伝子を同時に破壊した。その結果、驚いたことにアルス口ファクチン生産性は培養6時間後において野生株の50％程度まで低下したが18時間後においてはほぼ100％の生産性を示した。この結果はピオヴェルディンとは異なルアルス口ファクチンは複数の輸送系によって細胞外へ運搬されていることを示唆する。アルス口ファクチンがその界面活性によって自ら膜透過を行っているのかについてはまだ不明であるが、本研究により非リボソーム型ベプチドの生産システムに関する理解が格段に深まった。

学 位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教 授 森川正章
教 授 福井 学
准教授 山崎健一
助 教 鷲尾健司

学位論文題名
Studiesonthesynth
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ansportsyst
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nonri
bosomalpept
ides，arthr
ofa
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dp
yov
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ine，
i
nPseud07non
assp．IVIIS38（シュードモナス属細菌MIS
38における非リボソームベプチド，
ア ルスロファクチンとピオヴェルデイン，合成酵素および輸送システムに関する研究）

近年、微生物がさまざまな生理活性や界面活性を有するべプチドを生産する ことが知られている。これらのぺプチドには通常のタンパク質には存在しな
いD‑型アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸やさまざまな修飾アミノ酸を構成分 子とするものが多く見られる。さらにはりポペプチドなどの複合ベプチドや環 状ベプチドなどその構造の多様性は極めて広い。これらはりポソームを介しない、微生物固有のいわゆる非リボソームベプチド合成酵素により合成される。
非 リボソームペプチド合成酵素は基質アミノ酸を合成酵素に固定するチオレー
シ ョンドメイ ン(T)、ア ミノアシル化反応により基質アミノ酸を活性化するアデ ニレーショ ンドメイン (A)、およ び2つ のアミノ酸 基質あるい はべプチドとア ミノ酸を連 結する縮合 ドヌイン（ C)から基本的 に構成され る。またこれら
以 外 にア ミ ノ酸 の 異性化 を触媒する エピメラー ゼドメイン (E)やぺ プチド産物 を合成酵素 から切り出 す機能をも っチオエス テラーゼド メイン(TE)などが含 まれる。す なわち、一 つの構成アミノ酸ごとに一組のC/A/T（これを基本モジ ュールと呼ぷ）が配置されたマルチモジュール酵素である。非リボソームベプ チド合成酵素は生命進化の視点から興味深いが、このモジュールを入れ替える ことによって新しいべプチドを設計できることが1995年に報告されて以来、
環 境負荷が小さい次世代の生理活性ベプチド合成法としても注目されている。
本 研究 で 対象 と するシュ ードモナス 属細菌MI
S38は静岡県の 油田より単 離さ れ、高活性型リポベプチド型バイオサーファクタントであるアルス口ファクチンを合成する。アルス口ファクチンはユニークな双頭C/E‑ドメインを有する‑ 175―

非リボソー ムベプチド 合成酵素(ArfABC)によ って合成さ れることが既に報告され て いる 。 そこ で M
IS38にお ける非リポ ソーム型ペ プチド合成 酵素およびその産物ペプチドの輸送システムについてより深く検討する目的で以下の研究を進めた。 MI
S38は鉄欠 乏培地で培 養すると黄緑色の螢光物質（ピオヴェルデイン；PVD38)を生産 したので、 その物質を 精製し構造 解析を行っ た。その結果、PVD38は 分子量1064であり Ala，Glu，Gly(OHOrn)，Ser Thrを2：1：1：(1）：1：1の割合で含む新規化合物であることが判明した。続いてピオヴェルデイン 合 成酵 素 （Pvd38‑chr)
を コ ー ドす る 遺伝 子 （pvd38‑chr)を取得した 。
Arf:
ABCとは 対 照的 に P
vd38‑chrは 従来 型 の C‑， E‑ド メインを 有する酵素 であった。pvd
38ーchr、のうちE‑ドメイン遺伝子を破壊した変異株を作成したところPVD38の生 産 性 は完 全に失わ れていたが 、アルス口 ファクチン を正常に生産した。ま たArfABCを破壊した 変異株でも ピオヴェル ディンは正 常に生産された。これ らの結果は MI
S38におい てアルス口ファクチン合成酵素およびピオヴェルディン合成酵素はいずれも活性を有しており、かっお互いが独立して機能していることを示唆する。
次 に産物ペプチドの膜輸送システムについて比較した。まず、ピオヴェルデ
イ ン の 膜 輸 送 に 関 与 す る こ と が 予 想 さ れ る ABCト ラ ン ス ポ ー タ ー 遺 伝 子
ゆv
d38‑abc)
がpレd38 pepの直 下流に存在したのでこれを破壊した。破壊株のP
VD38生 産 性 は 野 生 株 に 比 べ て 9％ 程 度 ま で 低 下し て いた 。 そこ で 同様 にarL4B
Cの直下流 に存在する ABC
トラ ンスポータ ー遺伝子お よびべり．プラズ
ムタンパク質遺伝子を同時に破壊した。その結果、驚いたことにアルス口ファク チ ン 生 産 性 は 培養 6時間 後 にお い て 野生 株 の50％程 度 まで 低 下し た が18時間後にお いてはほぼ 100％の生 産性を回復した。この結果はピオヴェルディ
ンとは異なルアルス口ファクチンは複数の輸送系によって細胞外へ運搬されていることを示唆する。そこで阻害剤を用いた実験を行ったところアルス口ファクチンがその界面活性によって自ら膜透過を行っている可能性は実験的に否定され 、 複数 の A
BCトラ ンス ポーターが アルス口フ ァクチンの 膜輸送に関 与していることが強く示唆された。
本 研究 に より 油 田細 菌MIS
38が 有する非リ ボソーム型 ペプチドの 生産システムの多様性に関する理解が格段に深まった。本研究成果は従来の化学触媒法にくらべて環境負荷の小さな微生物発酵法による環状リポベプチド生産の基盤構築に寄与するものであった。
審査員一同は、これらの成果を評価するとともに、申請者の研究者としての誠実かつ熱心な研究態度および大学院博士課程における研鑚や単位の修得状況なども合わせて考慮し、申請者が博士（地球環境科学）の学位を授与される資格を有するものと判定した。