博 士（ 水産 科 学） ヤス イ ンヨ ーンシゲ キ
学位論 文題 名Studies on restoration of t
he loachrnus ang
uillicaud
atusfrom cryopreserved spermandblastomeresb
yandrogenesis and germ‑line chimera（ドジョウにおける精子、割球の凍結保存と雄陸発生、生殖系列キメラを介した個体復活に関する研究）

学位 論文内容の要旨
Genebanking is of importance for both farmed and wild species as a means to preserve
endangered populations and reconstitute unique genotypes. In fish, a large number of species orstrains are now being endangered, and farmed stocks are derived from few genotypes from wildpopulations. Thus, germplasm preservation may represent a useful tool to increase genetic
diversity in broodstock.
Liquid nitrogen cryopreservation is effective for long‑term genebanking, but is only
applicable for sperm preservation in most species. Cryopreserved sperm is useful for breeding
programmes and maintenance of genetic diversity, but the reconstitution of already extinct fishusing cryopreserved sperm is very difficul,
t atpresent becausesper
m giv
es ri
se toinvi
ablehaplo
idprogeny after induced androgenesis. Moreover, maternally inherited genotypes and cytoplasmic
mitochondrial DNA are not preserved by sperm cryopreservation and thus never restored byandrogenesis.
Blastomeres may be also applicable for genebanking because fish genotypes may bereconstituted by a germ‑Jine chimera. Target genotypes may be reconstituted by this method
because the host should produce donor gametes in the germ‑line chimeras. So, cryopreservation ofblastomeres followed by production of germ‑hne chimeras is con
sider
ed ausefu
l rep
osito
ry strategy.
Cryopreservation of blastomeres was achieved for a number of teleosts, but the successful
production of germ‑line chimeras from cryopreserved samples has not been achieved yet.
The loach (Nhsgurnus angrn71icaudatus) isa freslrwa
ter f
ish w
idelydist
ribut
ed inJapan,and the species includes unusual genotypes such as gynogeneticaUy reproducing diploid clones andsome polyploids in nature (Arai, 2001, 2003). These fish are interestingforaquacultur
e aswellasacademic research, what emphasizes genebanking.
Previously, many technologies i
nclud
ing i
nduce
d androgenesisand productionof germ‑linechimeras were developed in loach. These procedures may facilit
ate t
he restora
tionof fi
sh ge
notypes― 1085ーAndrogenesis using cryopreserved diploid sperm: The aim of this stucly was to evaluate thefeasibility of cryopreserved diploid sperm as a repository genebank for the loach, along with arestoration strateg
y uti
lizin
g ind
uced‑
androgenes
is. F
irstl
y, weevaluatedthree typ
es ofmedi
a for
egg inactivation: Hank's saline solution + 0.5% bovine serum albumin (BSA), Ringer's solution +0.5% BSA, and masu salmon seminal plasma. Haploid and diploid sperm were taken from diploid
and t
etrap
loidloaches, respec
tively, and then cry
opre
serve
dus
ingo
urpr
ev
iousprotocol(seeabove).
Freshandcryopreser
ved haploi
d ordiplo
id sp
erm w
ere t
hen‑u
sed t
o fer
tiliz
e int
act or UVi
rrad
ia
ted
eggs from wild diploid females. The irradiation media evaluated here successfu
lly mainta
inedtheegg quality over 2 hours, but Hank's saline showed improved storage ability and was used for:irradiation. Using fresh haploid sperm, the fertilizationratewas 6
3.51+ 10.
68%,decre
asingto28.80+ 20.06%whenirrad
iatedeggswereemployed.Thes
e pro
genie
s wer
e diploid(2:rD and haploid(ln),resp
ectiv
ely,as co
nfume
d byflowcy
tome
try.Fo
rfre
shd
ip
loi
dsp
erm
,thefer
ti
li
za
tio
nra
tewa
s
53.20
土 2.71% fornorm
al eg
gs and34.
92+27.1
2%forin
acti
vat
ede
ggs
, w
ithrespect
iveploidystatusof 3n and 2n. Whencryo
preservedhaplo
id sperm w
as us
ed tofertilizenorm
al eg
gs, a fertilization‑ 1086

rate of 41.83士 17.88% was recorded, with diploid progeny. The same sperm source resulted in afertilization of 28.35士 15.01% and haploid progeny when inactivated eggs were utdized.
Cryopreserved diploid sperm resulted in triploid progeny and fertilization rate of 21.33 + 7.14%
when normal eggs were used. Using the same sperm source, the fertilization rate of UV‑irradiatedeggs was only 11.68士 6.74% and diploid progeny was obtained. In this putative androgenetic
progeny from cryopreserved sperm, all‑male inheritance was confirmed by determination of larvalmorphology and microsatellite genotyping, demonstrating successful reconstitution of the loach
from cryopreserved diploid sperm (see Yasui et al, 2010)‑.
Cryopreservation of blastomeres and production of gerrrrline chimera: An efficient procedure forcryopreservation ofloach blastomeres followed by restoration through germ‑line chimera formation
was established in this study. Blastomeres of the loach were cryopreserved in 250 VL straws inEagle's nainimum essential medium (MEIVD with various concentrations of dimethyl‑sulfoxide(DMSO; 0, 5, 10, 15and20%),andthe b
est c
oncen
tration was com
binedwithglyc
erol(1, 2 and4%)
and external cryoprotectants (1 0r 2% sucrose; 2, 5 0r 10% fetal bovine serum; 1 and 2% bovine
serum albumin). Post‑thaw viability of the blastomeres was used to optimize cryopreservation
conditions. The best post‑thaw results indicated that cryopreservation of blastomeres wasoptimized using 10% DMSO as the cryoprotectant, giving rise to a viability of 65.1 + 0.6%. This
result is lower (P<O.OOOl) when compared to fresh blastomeres (96.8 + 0.8%). Later, donor
blastomeres were injected with zebrafish GFP‑nosl 3'UTR mRNA and biotin dextran prior tocryopreservation in the optimal freeze medium. Host embryos were injected with zebr sh
DSRed‑nosl 3'UTR mRNA and reared to the blastula stage. Donor blastomeres were then thawed
at 25aC for 10 s and transplanted to the host embryos either immediately or after incubation for
16h at 200C. Donor and host primordial germ cells (PGCs) migration were visualized withfluorescent imaging during the early stages of embryogenesis, and also by histology in 4‑day oldembryos. 'Iyansplantation of blastomeres immediately after thawing gave lower hatching rates
卜 3%) and generated a low percentage of germ‑line chimeras（〜 1.1%). In contrast, incubation ofcryopreserved sample for 16h followed by transplantation of the GFP‑positive blastomeres
improved the hatching rate t0 90%, and successfully produced presumable germ‑line chimeras at arate of 16.5%. The improved survival rates and germ‑hne chimerism may be an effective method forgenebanking and subsequent reconstitution of endangered fish genotypes (see Yasui et al:,accepted).
Conclusion: Protocols for cryopreservation of loach spe
rm and bla
stomeres w
ere establishedin t
hisstudy. In addition, the loach was reconstituted by induced androgenesis from cyopreserved dipl
oid
sperm and by a germ‑hne chimera. Both reconstitution procedures showed improved survivalrates.
It was also demonstrated that the new procedure of incubation of post‑thaw blastomeres improved
survival ancl production of germ‑line chimeras. Sex ratios and gamete maturation of the― 1087 ‑reconstituted fish are important characteristics to be studied in later experiments. Despite thepotential application for other fsh species, severalintrinsicchara
cteri
sticsmustbe e
xamin
ed su
ch
asthepossi
bilit
y ofinduc
ed sp
awnin
g, g
en
et
icma
ct
iv
at
iono
fthee
gg
, th
eab
il
ityt
odec
ho
ri
on
ati
on,
re8
i8tan
ce tomicr
omani
pulat
ion and ot
her traits.

ー 1088 ‑学位論文審査の要旨
主査

教授

荒井克俊

副査

教授

都木靖彰

副査 教授 山羽悦郎（北方生物圏フイールド科学センター）

学位 論文題名Studies on restoration of the loach MisguT7ZuSa7zguillicauCを あ 岱
f・ romCryopreSerVedSpermandblaStomereSby
androgeneSlSandgerm― 1ineChimera（ド ジョウにお ける精子、 割球の凍結 保存と雄 l生 発 生 、 生 殖 系 列 キ メ ラ を 介 し た 個 体 復 活 に 関 す る 研 究 ）

魚 類 にお い て、 多く の野生種 の絶減が 危惧され 、人工種 苗生産によ る集団の遺伝 的 多 様性 低 下も 懸念され る。遺伝 資源保存 は多様性 を維持する ためのー つの手段と なる。液 体窒素を 用いた精 子の長期凍結保存は多くの魚種で開発され、育種 計 画 と種 苗 生産 に応用さ れてきた 。しかし 、人為雄 性発生によ る精子か らの 個 体 復 活 は 技 術 的 に 染 包 体 倍 加 が 難し く 、 ミト コ ンド リ ア DNAを 含 む母 系
遺伝 子 型 は保 存 ・復 活できな い。胚の 割球が保 存できれ ば、生殖系 列キメラ の作出 を 介 して 、 遺伝 資源を復 活しうる 可能性が あるが、 割球凍結保 存にっい ては研 究 例 が乏 し く、 凍結した 材料から 生殖系列 キメラを 作出した成 功例も限 られて い る 。本 研 究で は、ドジ ョウを材 料に精子 、割球凍 結保存の好 適条件を 明
らか に す ると と もに 、凍結保 存精子を 用いた雄 性発生と 凍結保存割 球を用い た生殖 系 列 キメ ラ 作成 による個 体復活の 諸条件を 明らかに し、以下の 評価すべ き成果を得 た。
（1）ド ジ ョウ の 精 子凍 結 保 存の 好 適な 方 法 とし ては、 ドジョウ 用あるい はコ
イ科魚類 用の希釈 液、細胞 膜透過型（ 内部）耐凍剤として10あるいは15％メタノール、細 胞膜非透過型（外部）耐凍剤として0．5％グリシンあるいは1％牛血清アルブ ミ ン (BSA)を用 い て 凍結 保 存液 を 調 整す る こ と、解凍条 件を25℃10秒 間とす るこ と 、媒 精 液 とし て 50mMNaClを用 い る こと 、 ー33.3士 2． 09℃/分の 冷 却
速度 と す るこ と が推 奨され た。この 条件で液 体窒素を用 いて凍結 保存した ところ、 新鮮精子 に対して47％の受精率が実現でき（精子量687.65精子／卵/ml)た。
また 、本条件 により他の ドジョウ 類（カラ ドジョウ、フクドジョウ等）の精子凍結保 存が可能 であった。
（ 2） 雄性 発 生 のた め の卵 の保存液と して、◎ Hank s＋0.5％BSA、 ◎リンゲ ル液 +0.5％BSA、 ◎ サク ラ マス精漿 を検討した ところ、 いずれも 2時間以上 卵質を保 持 した が 、◎ が 最 良で あった。そ こで、＠ 液に卵を 入れ、紫 外線照射 を行い
卵 核 の 遺 伝 的不 活 性 化を 試 みた 。 そ して 、 無処 理 卵 、UV照 射卵 に 、半 数 体 ある い は二 倍 体の 生 鮮 、凍 結保存精子 を媒精し 、生じる 胚の発生 成績を調 べた。
実 験 に用 い た卵 と 半 数体 精子は野生 型二倍よ り、二倍 体精子は ネオ四倍 体雄より 得 た。 前 者は 函 館 近郊 より採集し 、後者は 野生型二 倍体雌の 卵に自然 四倍体（原 産地不明 、市場標本 ）の二倍 性精子を 受精後、第二極体放出阻止により作成し た もの で ある 。 フ ロー サイトメト リーとマ イクロサ テライト マーカー 型分析に よ り、 生 鮮・ 凍 結 保存 半 数体 精 子 と無 処 理卵 の 受 精からは 二倍体子 孫が、UV照 射 卵の 受 精 から は 雄 性発 生 半数 体 が 、生 鮮 ・凍 結 保存二倍 体精子と 無処理
卵 の 受 精 か らは 三 倍 体子 孫 が、 UV照射 卵 の受 精 か らは 雄 性 発生 二 倍体 が 生 じ
た こ とが 判 明し た 。 すな わち、凍結 保存二倍 体精子を 用いた人 為雄性発 生により 、 生存 性 を有 す る 二倍 体ドジョウ の個体復 活が実現 できるこ とが示さ れた。
（3） 生殖系列 キメラを介 した復活 に向けて 、ドジョ ウの胚細 胞（割球 ）の凍結保存 のための 好適条件を 検討した 。その結 果、glycerol、BSA、 牛胎児血 清等の細胞 膜非透過 型耐凍剤を 一切使わ ず、10％DMSOを細胞膜透過型の耐凍剤として、
割 球 を 250ロ Qス ト ロ ー 中 の MEM培 地 に 入れ 液 体窒 素 で 凍結 す る条 件 が 生存 率65.1％ （生 鮮 割 球生 存 率96.8％） の良好な成 績を与え た。ドナ ーの胚に ゼブラ
フ イ ッ シ ュ のGFP‑nosl3 UTRmRNAと biotindextranを 顕微 注 射 し、 そ の後 、凍 結 保存 し た。 ホ ス トの 胚にはDSRed−nosl3 UTRmRNAを顕微注 射し、螢 光の違い によルホ スト由来、 ドナー由 来の始原 生殖細胞（PGCs）を区別可能とした。
25℃ 10秒凍 結 割 球を 解 凍し 、 そ の直 後 あ るい は 20℃ で 16時 間 培養 後 、ホ ス ト
胚 に 移植 し た。 螢 光 実体 顕微鏡観察 と組織学 的観察か ら、移植 したPGCsはホ ス
ト の 生殖 隆 起領 域 に 移動 、到達する ことが判 明し、そ の観察の 結果、解 凍直後の移 植（孵化 率〜3％；生殖系列キメラ作成率〜1．1％）に比べて、培養後の移植によ り、より 高い90％の孵 化率と16． 5％の生殖 系列キメ ラ作成率 が得られることが 判明した 。すなわち 、凍結割 球から得 たPG
Csの解凍・培養後の移植により、ド ジ ョ ウ 個 体 の 遺 伝 子 型 の 復活 が可 能ぬ こ とが 示き れた 。
申請 者 に よる 以上の 研究成果は 、魚類を はじめと する水産 動物の遺 伝資源の保存 と復活に 寄与する 、基礎生 物学およぴ水産育種学上重要な成果と評価でき、
審 査 員一 同 は 、申請 者が博士（ 水産科学 ）の学位 を授与さ れる資格 のあるも のと判 定した。