博 士 （ 医 学 ） 橋 本陶 子
学 位 論 文 題 名

関節リウ マチ患者の末梢血単核球におけるRasGuanine nucleotiderele
asingprotein4(RasGRP4)
発現 異常に 関する検討
学位 論文内容の要旨【背景と目的】
関節リウマチの罹患関節局所では，マクロファージ讎め），線維芽細胞 破骨細胞，T細胞，B細胞，形 質細胞 ，樹状細 胞(DC)，肥満細胞などの免疫担当細胞が滑膜へ集簇し，それらの活性化と相互作用により関節炎の病態が形成される。L
eeらは関節炎マウスモデルにおいて， 肥満細胞の存在が炎症性関節炎の発症に必須であることを明らかとした。R
Aの滑膜炎
では ，主に単 球由来 のMめ が滑膜 増殖に関 与するサ イトカ インを主 に産生 する。一 方，RasGRP(Ras−guanylrele
asingprotein)
は，低分子G夕ンバクのRasを活性化するグアニンヌ クレオチ H変 換因子(GEF)であり，ファミ1」ー分子としてRas
GRPl―4がある。ヒトのRasGRP4は肥満細胞と末梢血単核球分画(PBMC)に発現することが知られており，肥満細胞の分化 に重要な分子であることが明らかとなっているが，PB
MCにおける同分子発現の意義は不明 である。 PBMCのうち T，B細胞にはRasG
RP4の発現は認められず，単球細胞での発現が示唆 される。 本研究 は，単球 系細胞におけるR
as
G
RP4の発現を明らかにし，RA患者末梢血にお けるRasG
RP4の発現 を検討 する。RA
病 態形成 とR
asGRP4の発現異常との関係を明らかにすることを目的とした。
【対象と方法】
健常 人より採 取した PBMCからCD
14陽 性細胞， T
細 胞，また 非単球・ 非T・非B細胞を採 取した 。C
D14陽性 細胞を用 い，MーCSFの添加によりM￠を，GM―CSFとIL一4の添加によりDCをそ れぞれ分 化誘導 した。こ れらの 細胞より Total R
NAを 抽出した のちcD
NAを 作製し，
R
T−PC
R法，Real−timeP
CR法により遺伝子発現量を評価した。ウサギ由来抗ヒトRasG
RP4
ポリ ク口ーナ ル抗体 を作製し CD
14陽性 細胞，T細胞 R
asG
RP4を強制発現させたH
EK293細胞 M￠ DCを用い て免疫染 色を行 い RasG
RP4夕ンバ クの発現を評価した。次に，健常人 38
名 ， RA
患 者 41
名 ， 他 の自 己 免 疫 疾患 患 者 36名 (SLE 10例 ， 多発 性 筋 炎/皮 膚筋 炎
(PM/DM)8
例 ，全身性 強皮症(SSc)8例，シェ ■グレ ン症候群 (SS) 10例 ）を対象 として末梢血 を採取し ，各群 のPBMCにお けるRasGRP4
遺伝子発現量をR
eal―timePC
R法にて定量的に評 価した。 さらに ，健常人 12名，治 療中RA
患者 18名，未 治療RA
患 者5名 ，他の自 己免疫疾 患患者名 (SLE 10名 ，PM/DM8名｜ S
Sc 10名，SS8名）のPB
M
Cより作製したcDNAを用いてサブク口ーニングを行しゝ RasGRP4の塩基配列を決定した。パリアント頻度解析にはx2テス トを用い た。健 常人群と RA患者群 の遺伝子 発現量 をStudentのT検定で比較した。遺伝子発現量と臨床像との相関はPearsonの積率相関係数（r）により検討した。RasGRP4
スプライ スバリアントの有無と遺伝子発現量，またスプライスパリアントの有無と臨床像との関連についてMann―WhitneyのU検定を行った。
【結果】
PBMC，CD14+細胞 非単球 ・非T．非B細胞，M￠，D
CではRasG
RP4
転写産物が認められたの− 264一に対し．T細胞で は認められなかった。RasGRP4はCD14陽性細胞において最も高い発現が認められた。免疫組織染色では，CD14+細胞およびRasGRP4を強制発現させたHE
K293細胞，M￠， DCにおいて RasGRP4
夕ンバクの発現を認 めた。R
A患者群の41%におい てR
asGR
P4の発現は異常高値を示し，健常人群に比較してその頻度は有意に高かったが(p=0.027)，遺伝子発現量と臨床像には相関を認めなかった。 10種類のRasGR
P4新規スプライスパリアントを同定した。本研究において最も高い頻度で認められたRasG
RP4の異常アイソフオームはエクソン9の276塩基全てを欠損するパリアント 5であり、次に高い頻度で認められたものはバリアン卜6であ った。エクソン9におけるス プライスバリアン卜は，健常人に比してRA患者において高頻度に認められ（pくO． 0001） 特にパリアント6は疾患群においてのみ認められた。対象をパリアント6の有無によって2群に分け，両群におけるRasG
RP4の遺伝子発現量を比較検討したところ，バリアント6を有する群において有意に遺伝子発現量が高かった。
【考察】
肥満細胞の前駆細胞は末梢血中を循環し局所組織で肥満細胞へと分化する能カをもっがP
BMCsにお いて 肥満 細胞 の前駆細胞の占める 割合は極めて低い。そのため，本研究ではPBMCsにおけるRasGRP4の発現は他の細胞集団によるものであるとの仮説をたて，単球がおもにRasG
RP4を発現していることを明らかにした。さらに，肥満細胞や単球系細胞は関節炎におけるイニシエータまたはエフェクターとして広く認識されていることから，RA患者におけ るRasG
RP4発現 に注 目した。本研究によ り，RA患者のPBM
Csにおいて R
asGR
P4は高発現でありR
as
GRP4のスプライス異常が高頻度に認められることが明らかとなった。R
asG
R
P4のエクソン9には GEFとしての機能性ドメインが含まれるため，同部位に異常のあるアイソフオームタンバクが生体内のCD14陽性細胞で 発現していた場合，RasGRP4の機能不全をきたす可能性がある。Real−timePC
R法で用いたプライマーはエクソン7―8の接合部位に設計されているため，スプライスバリアント6を含むパリアントの大部分はこのプライマーによって認識される。RasGR
P4の遺伝子発現量はそのタンバク発現の亢進を示すものではないが，非機能性アイソフオームによる質的異常を量的に補完しようとする代償機構を観察しているものと推察された。一方，肥満細胞に おいてR
asGRP4はIL―13産生に抑制的に働く
I
L−13レセプターa2の発現を亢進することが報告されている。IL―13レセプターa2は単球での発現も認められており，I
L―13の刺激により単球は炎症性サイトカインを産生することが知られている。ここで得られた知見より，肥満細胞や単球系細胞におけるRasG
RP4の発現異常がRAの病態に関与する可能性が考えられ 同分子のスプライス異常を制御することがR
Aのあらたな治療法となる可能性があるといえる。
【結諭】
1． ヒ ト 単 球 に お い て ， Ras GRP4が 発 現 し て い る こ と を 新 た に 示 し た 。
2． R
A患者において，末梢血におけるRasG
RP4の遺伝子発現が亢進している事を示した。
3． RasGRP4の 新 規 ス プ ラ イ ス パ リ ア ン ト を 10種 類 新 た に 同 定 し た 。
4． R
A患者においてRasGR
P
4のスプライスパリアントが高頻度に認められることを示し，パルア ント 6を有 する 患者 においては同分子の 転写が亢進していることを明らかにした。

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学位論文 審査の要旨
主 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 笠 原 正 典
副 査 教 授 畠 山 鎮 次

学 位 論 文 題 名

関節 リウマチ 患者の末梢血単核球におけるRas Guaninenucleotidereleasingp
rotein4(RasGRP4)
発現異 常に関 する検討
RasGRP4と は 、 肥 満 細 胞と 末梢 血単 核球 分 画(PBMC)に発 現す る低 分子 G夕ン バク R
asの グアニンヌクレオチド変換因子(GEF)として2002年にはじめて同定されたシグナ ル分子
であり、肥 満細胞自血病患者および気管支喘息患者では、同分子のスプライス異常が報告されている 。一方、関節リウマチ（瓰りの病態において滑膜増殖や関節破壊に関与するサイト カイ ンは 単球 系細 胞 や肥 満細胞で主に産生され、それらの前駆細胞は全身を循 環する
PBMCに 含 ま れ る 。 本 研 究 は 、 関 節 リ ウ マ チ 患 者 の PBMCお よ び 滑 膜 に お け る RasGRP4の 発現にっき検討している。その結果、末梢血におけ るR
asGR
P4の発現は単球によ るものであること が明らかとぬり、同分子のスプライスパリアントが10種類新たに同定された。
ま た 、 PBMCに お け る RasGR
P4遺伝 子の 発現 は 健常 人に 比較 して R
A患 者に おい て高 いこと 、 RA患 者 で は ス プ ラ イ スパ リア ント が高 頻度 に認 めら れる こと 、RA滑 膜で R
asGR
P4はCD68
陽性 細胞および肥満細胞に発現し、炎症滑膜に分布していることなどが示された。
公開発表 に際し、副査の畠山鎮次教授から、1．アレルギー疾患患者群におけるRasGR
P4の遺伝子発 現についての検討有無、2． スプライスパリアント由来のアイソフオームがタンパク構造変 化や機能異常を有する可能性、3．スプライスパリアントがドミナントネガテイプである可 能性の有無、4．スプライス パリアントの塩基配列に関するスプライシングの理論 的 妥 当 性 の 検 証 な ど 、 数 点 の 質 問 が あ っ た 。 申 請 者 は 、 既 報 O Biol Chem.
277:25756―74，2002.)を引用し、喘息 患者におけるRasGR
P4のスプライスパリアントが確認 され てい るが 本研 究 では アレルギー疾患患者は未解析である旨を説明した。さ らに、
RasG
RP4のスプライスパリアントを呈し た群において同分子の遺伝子発現が亢進しており、
ま たRA患者 にお いて 高 頻度 に認 めら れた スプ ライ スパ ルアントはG
EFとしての機 能性ドメインを一 部欠損するという本研究の実験結果を引用し、スプライスパリアント由来のアイソフオー ムタンバクに機能異常が存在する可能性を示唆したうえで、今後はパリアントタンバクの 機能解析を行う所存を表明した。
次いで副査の笠原正典教授から、1． RAの滑膜組織 における他の免疫担当細胞のGEFにつ いて の異 常有 無、 2．滑 膜でのIL‑13レセプターa2の発現有無について、3．RT―PC
Rのゲルアッセ イにおけるスプライスパリアントの可視性についての質問があった。申請者は、RAの滑膜組 織において、他の免疫担当細胞についての解析は本研究では未施行であるが、IL‑13レセプターa2の発現 については現在免疫組織染色における評価を実施中であ ると回― 266―

答した。また、RI、−PC
Rにおいて観察されるサイズの小さなパンドがスプライスパリアントである可能性が高いが、頻度 の高いスプライスパリアントを特異的に認識するプロープを作成し定量評価する実験計画 を説明した。
最後に主査の小池隆夫教授から、1． RasG
RP4の異常発現を制御することカミRAの治療戦
略に 寄 与す る可 能性について、2． RasG
RP4におけるIL‑13レセプターa2．およびその下流にある炎症性サイトカインの 発現制御とI
L‑17の関与につ いての質問があった。申請者
は、既報(Science. 5587: 1689ー92，2002)
や本研究の実験結果を引用し、RasGRP4の異常発現の制御することでRA病態における滑膜炎を抑制出来る可能性があると回答した。また、
RasGRP4は IL‑13産生 に抑 制的 に働 くIL‑13レ セプ ター ぱ2の発 現 を亢 進するという既報（J Biol C
hem. 283:1610−21，2008)を引用し、本研究の実験結果から、RasGR
P4の異常アイソフオームが、単球における I
L‑13に対する感受性に影響を与える可能性はあるがIL‑17の関与については明らかでない と言明した。
こ の 論 文 は、 PBM
Cに おけ るRas
GRP4の 発現 細 胞を はじ めて 明ら かに した 点、 また 同分子について新規のスプライス パリアントを同定し、RA患者における遺伝子発現量の亢進とパリアント発現頻度の上昇に ついてその関連性を示した点において高く評価され，今後のRAの病態解明に寄与する研究 として期待される。
審査員一同は、これらの成果 を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請者 が博 士（ 医学 ）の 学位 を受 ける のに 充分 な資 格を 有 する ものと判定した。

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