博士（医学）市原真

学 位 論 文 題 名癌精巣抗原SSX1を介する細胞増殖制御機構の解析
学位論文内容の要旨
I．緒言
滑膜 肉腫は 若年成 人の四 肢、関節 近傍に 好発す る悪性 軟部腫 瘍で、 腫瘍細 胞には特徴的な染色体相互転座t(X;18)(p11.2;q11.2)が認められ、それによルキメラ遺伝子｜SyT‑SS，，xが形成される。｜SYT‑SSX
遺 伝 子 は 18番 染 色 体上 の synovial sarcoma translocation (Sy印 遺 伝 子 とX染 色体 上 の synovial
sarcomaXbreakpoint (SSX)遺伝 子 が 融 合す る こ と によ って 形成さ れてお り、ssx遺 伝子の ホモロ グの 中 では SSX1と SSX2が 主 に キメ ラ 遺 伝 子の 形 成 に 関与 す る 。 近年 、 SYT‑｜ SSX1遺伝子が 検出さ れる 滑 膜肉 腫 と SYT‑SSX2遺 伝 子が検 出され る滑膜 肉腫で は予後 に差異 がある ことが見 い出さ れ、こ れら の 組 織 抽 出 液 中 で は Cyclin Dlや CyclinAの 発 現 量 に 差 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。
SSX1は188ア ミ ノ 酸か ら 詮 る 分子 量 約 27 kDaの蛋 白 で、 正常組 織では主 として 精巣に 発現が 認められ 、胸腺 に弱い発 現を示 す。ま た、ー 部の悪 性腫瘍 にも発 現が認 められる ため癌精巣抗原のーっに属 す る。SSX1の N末端に は転写 抑制因 子と相 同性のあ るKrtippel‑associated boxlike domain (KRABlike domain)が 存 在 し、 C末端 の 33アミ ノ 酸 か らな る SSX repressor domain (SSXRD)は転 写抑制 能を 有 する こ と が 、人 工 的 な 転写 活 性 系 にお い て 示 され て い る 。SSXは 既 知 のDNA結合配 列を持 たな
いた め、何 らかの蛋 白と結 合する ことで その機 能を果 たすと 予測さ れていた が、最近、一過性発現系に お い て SSX1がヒ ス ト ン H2Aバリ ア ン ト と結 合 す る こと が 報 告 され て い る 。ま た 、 SSXはRING1、BMI1な ど の Polycomb遺 伝 子 産物 と 共 局 在す る こ と が報 告 さ れ てい る 。 し かし な が ら 、SSXの 明 らか な 機能はい まだ不 明であ り、そ のため SYT‑SSXによ る癌化 誘導のメ カニズ ムにも 不明な 点が多 い。
本研 究では 、SSX1分子 が、コ アヒス トンの みなら ずヒス トン修飾 酵素の いずれかと相互作用すること で 転 写 抑制 機 能 の 役割 を 果 た すと 仮 定 し 、SYT、 SYT‑SSX1、 SSX1と ヒ ス トン H3K9特 異 的 メチ ル化 酵 素 SUV39H1の 結 合 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 SSX1の み が SUV39H1と 共 沈 す る こ と が 判明 した 。 さら に 、 内 在的 に SSX1を 発現し ている ヒト線維 肉腫細 胞株に おいて 、SSX1過剰 発現系 でCyclin
D1蛋 白 発 現 量が 低 下 し た。 以 上より 、SSX1は ヒスト ン修飾 分子と結 合し、 細胞周 期関連 分子の 発現量を調節することが示唆された。
H．結果！：龜癨塗隆法によるSSX1とSUV39
H1との鐘金鰹盤
293T細 胞 に SSX1と ヒ ス ト ン H3K9特 異 的 メ チ ル 化 酵 素 で あ る SUV39H1を 一 過性 に 共 発 現さ せ 、免 疫 沈降 を 行 い 解析 し た 。 さらに 、SYTおよ び滑膜 肉腫原 因キメ ラ遺伝 子産物 SYrILSSX1につ いても同 様 に SUV39H1と の 結 合 の 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 SUV39H1を 沈 降 さ せ た 場 合 に SSX1の共 沈が 確 認 さ れ た 。 一 方 、 SYTや SYT‑SSX1は い ず れ も SUV39H1と の 共 沈 は 認 め な か っ た 。
2．ssxi墨麺麭墜おけるヒストZH3Q
K9メチl
rDfl:
堕盤萱
SSX1は SUV39H1と 相 互 作 用 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た た め 、 SUV39H1の メ チ ル 化 ター ゲ ッ
ト で あ る ヒス ト ン H3の 9番 リ ジ ン 残基 (H3K9)の メチ ル 化 お よび ア セ チ ル化 状 態 に つい て 、 HeLa細胞 に SSX1を一 過 性 に 発現 さ せ て 、H3K9のメ チ ル 化 、ア セ チ ル 化状 態 の 違 いを 特異 的に認 識する 抗体を 使用し てウェス タンブ ロット 法にて 解析を 行った 。その 結果、 SSX1の発現 細胞と対照群との間にはメチル化・アセチル化いずれにおいても明確な差は認められなかった。
― 536 ‑

墨CyclinD1
蛋白登墨量堕盤肝SUV39H1はヒストンH3K9のメチル化の 他に、分化初期の細胞においてCycl:inDlの発現に関わる可能性が示唆されている。また、滑膜肉腫細胞においてSY
T‑
S
SX1を発現している細胞はS
YT‑
SS
X2を発現している細胞に比してCyclinDlの発現量が亢進していることが報告されている。これらより、
SSX1の発現 がCycl
inD1の蛋白発現量に影響を与えるかどうかを検討するため、HeLa細胞、HT1080細胞、SY01細胞においてS
SX1を一過性に過剰発現させて抗Cycl:inD1抗体にてCycl
inDl蛋白発現量を解析 した。その結果、HT1080細胞ではCyclin D1蛋白発現量の低下が認められたが、HeLa細胞、SY01細胞においてはCyclinDl蛋白発現量に明らかな変化は認められなかった。次に、HT1080細胞におい てS
SX1に対するsiRNA を導入し内在的S
SX1をノックダウンしてC
yclinD1蛋白発現量を検討したところ、CyclinD1発現量には明らかな差は認めなかった。
4．細堕周塑圃麹墮Q C
yclinD
1蛋自登璽量Q鰹擾さ ら に 詳 細な 検討 を行 うた め、 我々 はSSX1を 安定 的に 発 現す るHT1080細胞 株を 樹立 した(HrIX̲10)。Serumstarvation法によって調整したGO期同期細胞抽出液とnocodazole法によって調整したG1
後 期同期細胞抽出液を用いてCy
clin D1の蛋白発現量を解析した。また、HT1080細胞にSS
X1に対す るsiRNAを導入した細胞にお いても同様の解析を行った。その結果、GO期同期検体ではSS
X1
定常 発現系、S
SX
1ノックダウン系いずれにおいてもCy
clinD1蛋白発現量に明らか詮変動は観察され なかったが、Gl後期同期細胞においてはS
S
X1定常発現時に対照に比べC
yclinD1の蛋白発現量に低下が認められた。また，SS
X1ノックダウンを行ったG
l後期同期細胞においては逆にCyclinD1蛋白の発現量が微増した。
5． デ ュ ア 生 坐 2Z壬 乏 ニ 塗 ア ッ セ イ 法 に よ る SSX】 ： QCyclin D1藍 塁 垂 壁 鐘 堕 鰹 抵SS
X1がCyclinDlの転写を制御する可能性を検討するために、HT1080一過性発現系にてデュアルルシフェラ ーゼアッセイ法を用いてS
S
X1のCyclinDl
遺伝子プロモーターに対する転写活性能を解析した。その結果、SSX
1
強制発現系では対照に比ベルシフェラーゼ活性が約3倍程度上昇することが観察された。SS
X1
ノックダウン系においては有意差は認められなかった。またS
Y
T‑SSX
1
およびSY
Tについても 同様の解析を施行したところ、S
Y
T‑SS
X1
では対照に比ベルシフェラーゼ活性が約4倍程
度 上 昇 し た 。 ま た 、 SYTで は ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 の 上 昇 は 認 め ら れ た か っ た 。
≦〓RT‑PC
R法によ歪CyclinDlm
RNA
Q発墨鰹抵SS
X1
過剰 発現時のC
yclin Dl
蛋白発現 量と転写活性能に逆相関関係が認められたため、mR
N
A発現量をHT108
0細胞一過性発現系において半定量的R
T‑
PC
R法を用いて解析した。その結果、対照に比べssxiやSYTを一過性に発現させた群 には顕著な差は認められなかった。一方，S
YT‑S
SX
1を一過 性 発 現 さ せ た 群 で は 対 照 に 比 べ て 軽 度 の Cyclin Dl./GAPDH比 の 低 下 が 認 め ら れ た 。
7． ssxi室堂登現丞莖屈！ニ墨壇殖堕纏盤盤
SS
X1の一過性発現および定常発現によりCyclinD1の蛋白量に変化が認められたことから、我々はHTX‑10細胞 (HT1080細胞SSX1定常発 現株）を用いて細胞増殖性について検討した。10％牛胎 児血清存在下の培養条件にて解析を行ったが、対照細胞と比して増殖能の有意な変化は認めなかった。
m．結語
本研 究により、一過性発現系における免疫沈降にて、SS
X1はSUV
39H1と共沈することが示された。さらに、HT1080細胞の一過性発現系および定常発現株において、SSX1の発現はC
ycl
inD1蛋白の発現量を低下させることが示された。SS
X1は細胞周期依存的にC
yclinD1蛋白の発現量を調節する可能性が示唆され、SSX1の導入により、CyclinD1の転写活性は軽度増加することが明らかとなったが、CyclinD1のmRNA量は一定で低下が認められなかった。癌精 巣抗原SSXの機能を解析する ことは、 キメラ蛋白sYr−S
SXの癌化能の解明にも繋がる可能性があり、SSXやSYT‐SSX1を介する細胞増殖制御機構を検討することは、滑膜肉腫の治療法開発にも有用であると考えられる。現在、8SXlがcyc1血D1の蛋白発現量を低下させる機構は不明であるが、今後Cycl血D1の蛋白分解機構を検討することで、8sx1の機能を詳細に解析できると期待される。
― 537ー

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 笠 原 正 典
副 査 教 授 瀬 谷司
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 田 中 一 馬

学 位 論 文 題 名癌精巣抗原SSX1を介する細胞増殖制御機構の解析
滑膜肉腫は若年成人の四肢，関節近傍に好発する悪性軟部腫瘍で，腫瘍細胞には特徴的な染色体相互転座t(X;18)(p11.
2;q11.
2)が認められ，それによルキメラ遺伝子SYT‑SSXが形成される．SYT‑^S's．X
遺伝子は18番染色体上の8yn0晒alsarcomatranslocation（syめ遺伝子とX
染 色 体 上の 卿 0vi
a1
8arcomaX
breakpoint（SS駒遺 伝子が融 合するこ とによ って形成されており，s｜S区遺伝子のホモログの中ではSsx1とSSX2が主にキメラ遺伝子の形成に関与する ．近年 ，SW笛Sxl遺伝子 が検出さ れる滑膜 肉腫とSYT・SSX2遺伝子が検出される滑膜肉腫 では予 後に差異 があるこ とが見 い出され ，これらの組織抽出液中ではCyclinD1やCycunAの発現量に差があることが報告されている．
SSX1は 188
ア ミ ノ酸か らなる分 子量約 27k
Daの蛋 白で， 正常組織 では主と して精 巣に発現が認められ，胸腺に弱い発現を示す．また，一部の悪性腫瘍にも発現が認められるため
癌 精 巣 抗 原 の ー っ に 属 す る ． SSX1の N末 端 に は 転 写 抑 制 因 子 と 相 同 性 の あ る闘q）peI‐aB80ciatedb
oxlikedomain（瓩強Blikedoma
血）が存在し，C末端の33アミノ酸からな るSSXrepres恥r
domain（SSXRD）は転写抑制能を有することが｜人工的な転写活性系にお いて示 されてい る．SSXは既知 のDNA結 合配列を持たないため，何らかの蛋白と結合することでその機能を果たすと予測されていたが，最近，一過性発現系においてSSX1がヒ スト ン H2
Aバ リ アン ト と 結合 す る こ とが 報 告 され て い る． ま た ，SSXはRIN
G1，BMnなどのPoりcomb遺伝子産物と共局在することが報告されている，しかしながら，蹤遜の明らかな機能はいまだ不明であり，そのためsYT‐SS
Xによる癌化誘導のメカニズムにも不明な点が多い，
本研究では，SSX1分子が，コアヒストンのみならずヒストン修飾酵素のいずれかと相互作用す ること で転写抑 制機能の 役割を 果たすと 仮定し，sYr，sYT‐SS
X1，SS
X
1とヒストン B3K9特 異 的 メ チ ル 化 酵 素 SUV39H1の 結 合 解 析 を 行 っ た ． そ の 結 果 ， SSX
1の み が8UV
39
H1と 共沈す ることが 判明し た，さら に，内 在的にSS
X1を 発現し ているヒト線維肉腫細胞 株にお いて，SS
X1
過 剰発現 系でCychnD
1蛋白発 現量が低 下した ．以上より，SS
X1はヒストン修飾分子と結合し，細胞周期関連分子の発現量を調節することが示唆された．
―538−

口頭発表に当たり，副査の田中教授より，SY
T‑
S
S
X1
遺伝子一過性発現時のCyclinD
1発現量の変化の有無，．SYT,．s:
rr‑ss
x
1
遺伝子の癌化に及ばす影響，SY
T‑SS
X
1の構造とSSX1の構造の相違点，ヒストンメチル化が蛋白制御に及ばす影響，SYT‑SSX1の局在等に関する質問があっ た．また 副査の 瀬谷教授 よりSSX1がpol
ycom
bcomplexを形成する可能性について，
SSX工 が 癌 化に 関わ ってい るとした らそのメ カニズ ムは何か ，SUV39とS
YT‑SSX1など の集 合 体が 癌 化 に及ば す影響 等に関す る質問が あった ．さらに 副査の 畠山鎮次 教授よ り
phenotypeに変化 の生じた細胞がH
T
1080細胞だけであったかどうかの確認，HT1080細胞とA375M細胞の共通点，細胞周期調整にnocodazoleを用いた理由，CyclinDl発現の変化を他のRb蛋白リン酸化などの解析を用いて確認したかどうか等の質問があった．最後に主査の笠原 教授より S
SX1と結合する淡白としてSUV
39を用いた理由等についての質問，指摘があっ た． ． これ ら の質 問 に 対し て 申請 者 はお お むね 適切な回 答を行った ．
この 論文は 従来まで 機能が不 明であ ったSS
X1が ヒストン 修飾酵素 であるS
UV
39H1と結合 すること を明ら かにし，またS
SX1がCycl
inDlの蛋白発現を制御することを明らかにした 点で優れ ている と判断さ れ，今 後のSS
X1遺伝子産物の生理機能を明らかにする上で貴重な示唆を与えたものと考えられた，
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請者 が 博 士（ 医 学 ）の 学 位 を受 け る のに 充 分 な 資格 を 有 する も のと判 定した ．

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