博 士（ 獣医 学） 山 口聡一郎
学 位 論 文 題 名

ウシ耳下腺腺房細胞における起 電性 Na+−HC03一共輸送体(NBCel―B）の細胞内機能調節機構及び生理的役割に関する研究
学位論文内容の要旨
Na+と 重 炭 酸 イ オ ン (HC03‑)を 1： 2
あ る いは 1： 3の比 率で 共輸 送す る起 電性 NB
C(NBCe)は 細胞 内pHの調 節だ けで なく上皮細胞にお．けるHC
03
一 輸送に重要顔役割を担 って いる。例えぱ弾臓導管細胞な どのI{C03＿分泌上皮細胞に おいて、NBCeのーつで ある NBCelーBが 血管 側膜 側の H
C03の細胞内への蓄積機構とし て働いている。高濃度 のHC03ーを 含む 唾液 を大 量に 分泌 する ウシ 耳下 腺の 腺房 細胞においてもNBCel‑Bは 機 能 発現 し 、ホ ール セル パッ チク ラン プ法 でNaとHC0rの 共輸 送電 流 （NBCel‐B電流 ）という形で輸送活性を測定することができる．。本研 究ではウシ耳下腺腺房細胞 を実 験材料として用い、NB
Cel＿Bの新たな細胞内機能調節因子として細胞内Mg2．によ る抑制作用を明らかにし、その作用機序を探る実験を行うと共に、｜王C
03
輸送機構 への 関 与の ーつ の形 とし てNBCelmが細胞膜電位形成に関与す る可能性を示した。
細胞 内 M屮 は形 質膜 上の 様々 なイ オ ン輸 送タ ンパ ゥ質 に対し て機能的影響を及ぽす 。作 用 機序 とし ては 膜タ ンパ ク質へ直接結合するだけでぬく 、陰性荷電を持った脂質 であるホスファチ・ジルイノシトールに電荷を介して結 合し、膜タンパク質との相 互作 用を阻害することも知られて いる。しかし、細胞内Mず゛ のN
BCe機能に対する影 響は 調ぺられたことがぬVゝ。そこで、ホールセルパッチクラ ンプ法をウシ耳下腺腺房 細胞に適用して、細胞内Mg2 濃度の変化によるNBC
ellB電流への影響を闘ぺた。
遊離 Mず゛濃度を様々に定めたピ ペット内液を用いることにより、細胞内Mず゛濃度を調 節し た 。NBCelIB電 流砿 細胞 内M屮濃度が10ー5Mでは増加して いったが、10ーエ5Mで は増 加しなかった。細胞内Mg2十濃度を高めていくと、NBCel一B電流倣膜電位非依存性 に抑嗣きれた。阻竃定数（約1卿岨）は生理的細胞内M
g2゛濃度（O．5から1‐OmM）の 範囲 で あっ た。 その 抑嗣 効果 は二価陦イオレキレータの種類 に依存世ずに認められた 。作用機序は不明であるが、RC03−を含まないピペット 内液あるいはpHを低下さ世た ピペット内液（pH7．O）を用いるととによりNBCe1‐B電流のMず゛感受性は低下した 。NBC覘． B電流 は細 胞外 のMg2
゛ によっては影響を受けなかった。Mずと同様に多価 陽イ オ ン化 合物 のネ オマ イシ ンと スペ ルミ ンに よっ ても NBCe
いB電流は抑制された 。続 いて強制発現系での実験を行 った。1
琵K293細胞あるいは NIH
3T
3細胞に一過性に 発 現 さ 甘 た NBCe1． B電 流 § 細 胞 内の Mg0
及 びネ オマ イシ ンに より 抑 制さ れた 。
Mg2゛の 抑制作用の作用部位を探るため、自己の輸送活性に抑制 的に働くと考えられ― 752 ‑

てい るNBC
el‐B
特異的細胞内N端領域を取り、除いたNBCel（ANt NBCel)を作製し、Mg2
゛及ぴネオマイシンのr効果を調ぺた。強帝旺発現さ甘たA
Nt‑NBCel
電流でもMgz
゛及ぴネ オマ イシンによる抑翻効果は認めら れたが、野生型N
BCel‑B
電流 に比べて低い感受性 であ った 。以 上の 結果 から NB
Cel‑
Bの 新た な機 能調 節因 子とし て細胞内Mgz+による 機能 調節の可能性が示されただけで なく、NBCel−B特異的細胞内N端領域が細胞内Mgz
゛ に対 す る感 受任 の決 定に 重要 であ るこ とも 示唆 され た。生 理的には細胞内Mgz
゛濃度はCa2゛濃度のようには大きく変動しないと考えられているが、特異的N端領域が関与する細胞内Mgz'に対する感受性の変化に よって：NBCel゛Bの輸送活性弦調節されているかもしれなkゝ。また・ヽ多価陽イオン化合物もM
g2十と同様に抑制作用を示した結果強、Mg2+の陽性荷電が重要であること と共に、ホスフ・アチジルイノシトール とNBCel‑Bとの 相互 作用 の可 能性も 示唆している。しかし、Mg2゛の作用機序を解明するに博さらなる実験が必要である。
続 いて 、ウシ耳下腺腺房細胞の生理機 能への役割としてN
BCel‑Bが 細胞膜電位に影
響を 及ぽ すかどうか調ぺた。ウシ耳下腺 腺房細胞で実際に測定されたようにNB
Cel‑Bが Na゛ とHC03‑ 1： 2の比 率で 輸送 して いる 場合 に 砿、 平衡 電位 は生 理的 Na+及 ぴHC03濃度 では 約‑80 mVとbゝ う深 い値と 顔る。よって、N
BCel‑Bがウ シ耳下腺腺房細胞において細胞膜電位に影響を及ぽすだけの活性 を持つ場合に独、K*チャ．ネルと共に細胞膜電位を過分極させ、管腔価膜での陰イオ ンチャネルを介したHC
Ol一の細胞内から 細胞 外へ の輸 送の ため の電 気的 ポテンシャルを与えている可能 性がある。細胞膜電位測定方法として、約150 mMのKvを倉むピペ ット内液を用いたセルアタ．ッチ法
で測 定さ れる シン グル K+
チ ャネ ルの 逆転電位を測定し、その値の変 化から細胞膜電位変 化を 推測 した 。細 胞膜 電位 はHC03
存 在 下で 細胞 外液 から Narを 除去すると脱分極し た。 Na+除 去に よる 脱分 極倣 N
BCel‑Bの阻害薬であるDIDSによっ て抑制された。
Na+存在 下で 細 胞外 液に HC03ーを 添加 する と細 胞膜 電位 は過 分極し 、その過分極はD
IコDSで抑制された。このNa゛及びHC03ー依存性の膜電位変化が、pHなどの細胞内環境の変 化に より K+
コ シダ クダ ンス が増 減したことに起因する可能性を 調ぺるため、ウシ耳 下腺 腺房 細胞 のK゛ チャ ネル の阻害 薬であるB
a2+（1 mM)存在下 で同じ実験を行った。Ba2
゛存在下で はH
C03‑存在下でのNa゛除去による脱分極とNa+存在下でのH
C03−添加による過分極はいずれちBa2
゛非存．往下よりbより大きぬ変化を示したことから、
B
a2
十感受性K*
チャネルはNa゛及びHC03一依存性の細胞膜電位変化に関与していぬb
ゝこと が 示 され た。 これ ら の結 果か らウ シ耳 下腺 腺房 細胞 では ぐチ ャネ ルだ けで な くNBCelー Bも 静 止 膜 電 位 の 形 成 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
以 上、 本研 究で 弦細 胞内 Mgz'によ る抑 制 作用 とい うNBCel‑Bの新 たな機能調節機構を 提唱 すると共に、ウシ耳下艨腺房細 胞でのNBC
el‑Bの生理的役割 として静止膜電位形成への関与を示唆した。これらの成果はNB
Cel‑B研究における新たな展開を弓Iき
起こ す重 要ぬ プレ イク スル ーに なる と共に、KC03分泌機構の理解を いっそう深めるものであると恩われる。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 葉原芳昭
副 査 教 授 木村和弘
副査 准教授 太田利男
副査 准教授 石川 透

学 位 論 文 題 名

ウシ耳下腺腺房細胞における起 電 性 Na+− HC03ー共 輸送 体(NBCel― B)の細胞内機能調節機構及び生理的役割に関する研究
Na゛と 重 炭酸 イオン (HC03を1：2あるい は1：3の 比率で共 輸送する 起菅陸 NBC (NBCe)は細胞内pHの調節だけでは愈く上皮細胞におけるHC
0一輸送にも重要ぬ役割を担ってぃゝる。
高濃度の H
COrを含む 唾液を大量に分泌するウシ耳下腺の腺房細胞に韜いてもN
B
Cel−B
は機能発現し 、ホー ルセルパッチクラ冫プ法でNa十とHCOrの共輸送電流（NBCe1一B電流）という形で輸送活性を測定することができる。本研究ではウシ耳下腺腺房細胞を用い、NBQ
1−Bの新たな細胞内機能調節因子としての細胞内Mず゛による抑制作用を明らかにし、その作用機序を探ると共に、NBQ
1＿Bが細胞膜電位形成に関与する可能性について検討したものである。
細胞内Mg2゛は形質膜上の様々なイオン輸送蛋白質に対して機能的影響を及ぽす。しかし、細胞内Mず゛のN
B
Ce
機能に関する報告はな。ゝ。申請者は、ホールセルバッチクランプ法を適用して、細胞内M ヂ濃度の変化によるNBCe1．B
電流への影響を調べた。細胞内Mgッ濃度が
1ヂM
ではNBC
e1
一B
電流は増加したが、lO・215Mでは増加しなかった。細胞内Mず゛濃度を高めていく と、NB
Cel B
電流は膜電位非依存性に抑制された。阻害定数（約1n1M）は生理的細胞内Mg2十濃度（o．5から1．0mM）の範囲内であった。その抑制効果は二価陽イオンキレー
タの種類に依存せずに認められた。RC03＿を含ま綏いあるいはpHを低下させたピペット内液（pH710冫を用い ることに よりNBCe1‐B電流の M2＋感受性は低下した。NBCel一B
電流は細胞外のMず゛によっては影響を受けなかった。Mず゛と同様に多価陽イオン化合物のネオマイシンと ス ベ ルミ ン に よっ て も NBの 11B
電 流 は抑制さ れた。 H巒幽 3細胞 あるい はM
H3T3細胞に一過性 に発現 させた強 制発現 系におい てもNB
Ce1−B
電流は細胞内のMヂ及びネオマイシンにより抑制された。続いてMgッの抑制作用の作用部位を探るため、輸送活性に抑驪的に働くと考え られて いるNB
Ce1ーB特異的細 胞内N端領域を取り除bゝたN
BCe1（△NtINBCel）を作製し、Mず゛及びネオマイシンの効果を調ぺた。△Nt一NBCc1
電流でちM戸及ばネオマイシンによる抑制効果は認められたが、野生型NBCelーB電流に比ぺて感受性は低かった。以上の結‑ 754ー

果からN
BCel‑Bの新たな機能調節因子として細胞内Mg2+による機能調節 の可能性が示されただけでなく、NBくニel‑B特異的細胞内N端領域が細胞内MPに対する感 受性の決定に重要であることも示唆された。また、多価陽イオン化合物もMf゛と同様に抑制作用を示した結果
は、Mず゛の陽性荷電が重要であることと共に、ホスファチジルイノシトールとN
B
Cc1．Bとの相互作用の可能性も示唆していると申請者は考えている。
次に、ウシ耳下腺腺房細胞の生理機能的役割としてNBCel‐Bが細胞膜電位に影響を及ばすかどうかについての検討が行われた。細胞 膜電位はH
co蒋在下で細胞外 液からNa十を除去
すると脱分極した。Na十除去による脱分極ばN
Bの1一Bの阻害薬であるI）IDSによって抑制された。Na゛存在下で細胞外液にHC0rを添加すると細胞膜電位は過分極し、その過分極はDIDSで抑制された。このNa十及びRcof依存性の 膜電位変化が、pHぬどの細胞内環境の変化によりでコンダクタンスが増減したことに起因する可能性を調ぺるため、ウシ耳下腺腺房細胞のK十チャネルの阻害薬であるBa2＋（1mM）存在下で同様の実験を行った。Ba2＋存在下ではHCOr
存在下でのNa゛除去｜3よる脱分極とN
a十存在下でのHC031
添加による過分極はいずれもBa・2＋非存在下よりもより大きな変化を示したこ とから、B
ヂ感受性でチャネ ル憾Nr及びHc03
一依存性の細胞膜電位変化に関与していないことが示された。これらの結果からウシ耳下腺腺房細胞ではでチャネルだけでなくNBCel，Bも静止膜電位の形成に関与していると申請者は推測している。
本研究は、細胞内Mヂによる抑制作用とbゝうNBCel堪の新たな機能調 節機構を提唱すると共に、ウシ耳下腺腺房細胞でのNBCe1‐Bの生理的役割として静止膜電位形成への関与を示唆したものである。これらの成果はN
Bの1‐B研究における新たな展開を弓Iき起こす重要なブレイクスルーになると共に、Hcof分泌機構 の理解をいっそう深めるものであると恩われ、基礎獣医学領域において重要な知見を提供するものである。
よって、審査員一同は、上記博士論文提出者山口聡一郎氏の博士論文は、北海道大学大学
院獣医学研究科規程第6条の規程による研究科の行う博士論文の審査等 に合格と認めた。

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