博 士 （ 獣 医 学 ） バ ウテ イ ス タ ホ セ ア ル セ オ ナ ウ イ

学位論文題名Vitrific
ation‑ of mouseoocytesandembryos using
ethylene glycol as thesole cryoprot
ective agent（エチレングリコールを単独の凍害防止剤として用いたマウス卵子および初期胚のガラス化保存）
学 位 論 文 内 容の 要 旨卵子および初期胚の低温保存は、動物繁殖の分野では実用性を持っている。ガラス化はあらゆる動物種の卵子および初期胚の低温保存法として、簡易的、実用的かつ経済的な方法である。数種の凍害防止剤を用いた卵子および初期胚のガラス化保存に関する研究が報告されているが、一種類の凍害防止剤のみを含む溶液によるガラス化保存に関する研究は報告されていない。本研究では、エチレング
リコ―ルを単独の凍害防止剤として用いたマウス卵子および初期胚のガラス化保存法の有用性を証明するために、以下の実験を行った。
研究1では、エチレングリコールが単独の凍害防止剤としてマウス8細胞期胚のガラス化に使用できるかどうかを検討するとともに、胚のガラス化前のエチレングリコールヘの暴露時の温度が融解後の8細胞期胚の生存性に与える影響について調ぺた。実験1においては、ガラス化に必要なエチレングリコールの最低濃度は7Mであることが示された。実験2では、8細胞期胚は2Mのエチレングリコー
ル を加 えた10％子牛血清を含むりン酸緩衝液(PBS)に、2、5あるいは10分間暴露した後、さらに7Mのエチレングリコールを加えたPBSに2あるいは5分間暴露した。その後、胚はガラス化せずに1Mのショ糖溶液に5分間暴露し、胚内のエチレングリコールを希釈除去した。エチレングリコ―ルに暴露した胚は無処理の対照群と同様の胚盤胞への発育率を示した。実験3および4では、8細胞期胚を18

〜 22℃ あ る い は 24〜 30℃ で、 2お よ び 7Mの エ チレ ン グリ コ ー ルに 実 験Zと同 じよ う に各 種 の 時間 暴 露し た 後 、ガ ラス化 した。高 室温下（ 24〜30℃）で エチレン グ リコ ― ル ヘ暴 露 する と 胚 盤胞 への発 育率は低 かった。 一方、18〜 22℃で7Mの エ チレン グリコー ルに2分間 暴露した胚 の発育率 は、無処 理の対照 群と同等 の高 い 値 で あ っ た 。 し か し 、 5分 間 暴 露 し た 胚 は 有 意 に 低 い 発 育 率 を 示 し た(p<0.0001）。 こ れら の 実 験結 果 か ら、 マ ウス 8細 胞 期 胚は 、 18〜22℃で 最初に 2Mの エ チ レン グ リコ ー ル に2〜10分間 の 暴 露し た 後 、7Mのエ チ レングリ コー
ル 中 での2分 間の平衡 を行うこ とにより、 ガラス化 保存でき ることが 示された 。
さら に、24℃以 上でのエ チレング リコール ヘの暴露が 、胚の発育に有害であることが 明らかに なった。
研究 2で は 、マ ウ ス 1細 胞期 胚 を7Mの エチ レ ン グリコ ―ル中で効 果的にガ ラス化で きるかど うか、ま た、ガラ ス化・融解 胚の体外 での発育 を培養液 交換によって 改 善で き るか ど う かについ て検討し た。実験 1では、工チ レングリ コールへ の暴露 時間とガ ラス化が 胚の発育 に与える影 響につい て、培養 液交換を 行わずに検討 し た。 1細 胞 期胚 は 7Mのエチレ ングリコ ールを加 えた修正リ ン酸緩衝 液(PB1）
中 に 1、 2あ るい は 5分 間 、18〜 20℃ で暴 露 し 、そ の 後ガ ラ ス 化を 行 っ た場 合 と行わ なかった 場合につ いて比較 検討した。 その結果 、エチレ ングリコ ール暴露だ
けで は胚の発 育に影響はないが、ガラス化により胚の発育に有害な影響が現れた。
実 験 2に おい て は、 培 養 24時 間 目に 培 養液 交 換 を行 い、実験1と 同様の暴 露時間
での エチレン グリコールヘの暴露とガラス化が胚の発育に与える影響を検討した。
1ある いは2分間 エチレン グリコ― ルヘ暴露し た胚は高 い胚盤胞 への発育率を示した 。 しか し 、5分間 暴 露したガ ラス化胚 の発育率 は著しく低 下した(p幻 ．05）。
実 験 3で は、 7Mの エ チ レン グ リ コー ル に2分間 暴 露し た胚の生存 性と細胞 数について 無処理胚 と比較検 討した。 培養24時間目 に培養液 交換を行 った場合、ガラス化 ・ 融解 胚 は無 処 理 胚と差異 のない高 い胚盤胞 への発育率 を示した 。研究2の 実
験 か ら 、マ ウ ス1細胞 期 胚 は7Mのエ チ レ ング リ コ ール を 含む PB1中 に1ある い は2分 間 暴 露す る こと に よルガラ ス化保存 が可能で あり、本実 験条件下 では、培 養24時間目に培養液を交換することによってガラス化胚の発育率の改善されることが示された。
研究3では、7Mのエチレングリコールを含むPB1への―段階あるいは二段階暴露によるガラス化法が、マウス卵子の低温保存に適用できるかどうか検討した。
また、融解卵子に対する1Mのショ糖溶液中でのエチレングリコールの希釈時間（5あるいは10分間）の影響およびガラス化溶液へのショ糖の添加効果についても検討した。まず、実験1ではガラス化を行わずに7Mのエチレングリコ―ルを含むPB1への暴露が卵子の発育能に及ぼす影響について検討した。すなわち卵子は、―段階で7Mのエチレングリコールを含むPB1に2分間、あるいは2および7Mのエチレングリコ―ルを含むPB1にそれぞれ2分間ずつ二段階で暴露した。その結果、どちらの暴露方法を用いても、7Mのエチレングリコールヘの暴露は、卵子の発育に対して有害であることが示された。実験2においては、ガラス化卵子の発育に対するエチレングリコ―ルヘの暴露方法およびガラス化・融解後のエチレングリコールの希釈時間の影響について検討した。実験1と同様に一段階あるいは二段階にエチレングリコールに暴露した後、卵子を液体窒素中でガラス化した。融解後、エチレングリコールの希釈を5あるいは10分間行い、全ての卵子を体外授精して胚盤胞への発育率を調べた。その結果、希釈時間が5分間の場合、二段階でエチレングリコールに暴露した方が一段階の暴露よりも卵子の胚盤胞への発育率は高かった（p幻.01）。希釈時間を10分間に延長した場合、一段階および二段階暴露の間に有意な差は認められなかった。次に、0.5Mのショ糖添加および無添加の7Mのエチレングリコ―ルを含むPB1を用いて卵子を一段階暴露した後ガラス化し、融解卵子は10分間エチレングリコール希釈した。ショ糖のガラス化保存液への添加はガラス化卵子の発育能を大きく改善しなかった。研究3では、マウス卵子は7Mのエチレングリコ―ルによってガラス化保存が可能であり、一段階でのエチレングリコール暴露後の卵子の生存性は、希釈時間を10分間に延長することによって改善されることが示された。しかし、7Mのエチレングリコ―ルに 0.5Mの シ ョ 糖 を 添 加 し て も 、 卵 子 の 発 育 能 は 改 善 さ れ な か っ た 。

以上の結果から、エチレングリコールが単独の凍害防止剤としてマウス8細胞期胚、1細胞期胚および未受精卵子のガラス化保存に有用であることが明らかになった。また、エチレングリコ―ルによるマウス卵子および初期胚を効果的にガラス化するためには、以下の点が重要であることが分かった。1）ガラス化保存するためのりン酸緩衝液中のエチレングリコ―ルの最低濃度は7Mである。2）
7Mエチレングリコール暴露時の温度は重要であり、卵子や初期胚は18〜22℃で暴露することにより高い生存性が得られる。3）ガラス化・融解した1細胞期胚の生存性は、培養24時間目に培養液を交換することによって改善される。4)ガラス化卵子の生存性は、1Mショ糖溶液に10分間暴露してエチレングリコールを希釈することによって改善される。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

金 川 弘司斉 藤 昌之渡 邊 智正高 橋 芳幸

学位論文題名Vitrificationofmou
seoocytesa
ndembryosus
ing
ethyleneglycolast
hesolecryo
protectiveagent（エチレングリコールを単独の凍害防止剤として用いたマウス卵子および初期胚のガラス化保存）
卵子 や初 期胚 の低 温保 存技 術の 簡易 化に は、 単独の凍害防止剤を用いたガラス化 溶液 の開 発と ガラ ス化 した 卵子 およ び初 期胚 の生存性に関与する因子の解明が必要である。
申請 者は 、エ チレ ング リコ ール を単 独の 凍害 防止剤として用いたマウスの卵子
お よび 初期 胚の ガラ ス化 保存 法に つい て検 討し た。ガラス化に必要なエチレング
リ コ ― ル の 最 低 濃 度 は 7Mで あ る こ と を 確 認 し た 後 、 マ ウ ス 8細 胞 期 胚 の エ チ レ ン
グ リ コ ー ル へ の 暴 露 時 の 温 度 が 胚 の 生 存 性 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 。 18〜 22℃で 2Mの エ チ レ ン グ リ コ ー ル に 2〜 10分 間 、 さ ら に 7Mの エ チ レ ン グ リ コ ー ル に 2分間 暴 露 し て ガ ラ ス 化 す る と 90％ 以 上 の 胚 が 胚 盤 胞 ヘ 発 育 す る が 、 24℃ 以 上 で 同様 の処 理を した 場合 、胚 の発 育率 が低 下す るこ とを明らかにした。次に、マウス
1細 胞 期 胚 の ガ ラ ス 化 に お け る 1段 階 暴 露 法 に つ い て 検 討 し た 。 7Mの エ チ レ ン グ
リ コ ー ル に 1あ る い は 2分 間 暴 露 し た 後 ガ ラ ス 化 す る と 胚 盤 胞 へ の 発 育 率 は 高 く 、発 生 培 地 を 途 中 で 交 換 す る と 約 90％ の 発 育 率 の 得 ら れ る こ と を 示 し た 。 さ ら に 、7Mの エ チ レ ン グ リ コ ー ル を 用 い た マ ウ ス 卵 子 の ガ ラ ス 化 保 存 に お け る 段 階 的 暴 露と 融 解 後 の エ チ レ ン グ リ コ ー ル 希 釈 方 法 を 検 討 し た 。 1段 階 暴 露 し た 卵 子 は 、 5分 間 の 希 釈 で は 低 い 生 存 率 で あ っ た が 、 希 釈 時 間 を 10分 間 に す る と 2段 階 暴 露 の卵 子 と 同 等 の 高 い 生 存 率 が 得 ら れ た 。 ま た 、 ガ ラ ス 化 溶 液 ヘ シ ョ 糖 を 添 加 し た が、ガラス化卵子の体外受精後の発育能は向上しなかった。
以上 のよ うに 申請 者は 、マ ウス 卵子 およ び初 期胚のガラス化保存においてエチレ ング リコ ―ル が単 独の 凍害 防止 剤と して 有効 であることを示した。さらに、エチ レン グリ コー ルを 用い たガ ラス 化保 存に おけ る卵子および胚の生存性を左右す

る要 因を明らか にし、高 い生存率を得ることに成功した。よって、審査員一同は、申 請者 が 博士 （獣医 学）の学位を 受ける資格を 有するものと認 めた。