博 士 （ 医学 ） 首藤 聡 子

学位論文題名Protein Related to DAN and Cerberus
IsaBoneMorphogen
etic Protein AntagonistTh
atPar
ticip
ateSinOVa
rlanP
ara
Cri
neReg
ulation(Protein relatedto DANand cer
berusのBMP
アンタゴニスト作用と卵巣におけるパラクライン作用に関する解析）

学位論文内容の要旨【研究の背景】Bonem
orphogeneti
cprotein(BMP)は生物の形態形成において重要な役割をになっているのみならず、卵胞形成を制御する複雑な内分泌ネットワークの一環を形成している。
BMPア ン タ ゴニ ス ト はBMPの作 用 に 拮抗 するこ とにより 胎生期の 発達と 組織分化 を制御 してい ることが 知られて いる。 しかしな がら哺 乳類の卵巣におけるBMPの機能についてはいまだ不明な点が多い。P
roteinrelatedtoDANandcerberu8くPRDc）はgenetrapp
血gによルマウ ス ES細 胞で 発 見 さ れた 呵 8t
血 eknot構 造を も つ 分泌 タ ン パク で あ る 。PRDCは BMP
アンタゴニストとアミノ酸配列の相同性を示すが、その生物学的・生理的活性については十分に解析 され て い な い。 【 目 的】 今 回 われ わ れ は、 リ コ ンビ ナ ン トPRDCを作 成し、PRDCがB
MPタ ンパ ク の 活 性に 与 え る影 響 を 解明 した 。また PRDCmRNAの組織 分布およ び局在、 さらには 卵 巣 に お け る PRDCの 生 理 機 能 に 関 する 検 討 を行 っ た 。【 方 法 】1． ヒ ト PRDCcDNAを293T細胞 で発現さ せ、リ コンビナ ントPR
DCを 作成し、 ウエス タンブロ ットを用いた解析を行 った 。 PIm
Cの 機 能解 析 の コン ト ロ ールとし て、そ のparalogであるBM
Pアンタ ゴニス トg門ml血のりコンビナントタンパクも同時に作成した。2．リコンビナントタンパクを用いて、
Lu
cifer
a8e
レ ポーター アッセ イにおい てB
MPタンパク および他 のTG
F‐B
フ ァミリ ータンパ
ク によ り 惹 起される シグナリ ングに 対するPRDCの作用を 検討．し た。3．リコ ンビナ ント
PRDCとBMPタンパ クとの 相互作用 を証明 するため、c0．precipitationを行った。4．マウス組 織 に お け る PIめ Cの mRNA発 現 パ タ ー ン を RTPCRに て 確 認 し た 。 5． PRDCの 卵 巣 で の局 在 と ゴ ナ ド ト ロ ピ ン に よ る 調 節 を 解 明 す る た め 、 PMSG（ pregnantmareserumgonadotropin） およびhCGを投 与された マウス 卵巣を用 いてNorthern
b10t
お よぴrealtimequantit8tivePCRを行っ た。血面 ぬb雨ridizationを用 いて、PRDC
転 写産物の卵巣での局在を 検討 し た 。6． 卵巣にお けるPR
DCの 生理学的 作用を 解明する ため、 25日齢のラ ット顆 粒膜細 胞を用い 、BMP4によって惹起されるproge
8ter
0
珊産生能に対する影響を検討した。【結果 】 1． ヒ ト 293T細 胞 に よ り 産 生 さ れた り コ ンビ ナ ン トPRDCを 抗 PRD
C抗 体 を用 い た ウエ ス タ ン ブ ロッ ト に て 解析 し た 。Reducedc
onditionにおいてPRDCは23、 19、 18およびー53−

16kDaのバ ンド と して検出された。Pept
ide N‑
glyc
osidaseFによる糖鎖切断により、23kDaの バン ドは 消失 した ため 、PRDC
は 糖鎖 修飾 を うけ てい るも のと 考え られた。抗PRDC
抗体がnon‑reduc
ed condit
ionにお いて P
RDCを認 識し ない ため 、C‑termin
usにFI」AGepitopeを 付 加 し た り コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク （ PRDC‐ CT） と 抗 FLAGM2antibodyを 用 い 、
non‐reducedconditionでのウエスタンブロットを 行ったところ、40kDa付近にバンドを検出し た。 この こと よりPR
DCは二量 体を形成しているものと思われた。2．Luc泣rase
レポー ター ア ッ セ イ に お い て 、 gremhnと 同 様 に り コ ン ビ ナ ン ト PRDCは BMP2お よ び BMP4に よ り惹起されるシグナリン グに対し有意な抑制効果を示した。PRDCはgremliIlとは異なり、BMP6およびBMP7に対しても 有意なシグナルの抑制を示した。しかしながら、（mF．9，acti晒n，TGF‐ ロ に 対 す る 抑 制 効 果 は 認 め ら れ な か っ た 。 PRDCは BMP2お よ ぴ B
MP4の惹 起す るシ
グ ナル を容 量依 存性に抑制する ことが確認された。3．c0．p
recipitationを用い、PRDCとBMP2お よ び BMP4が 相 互 に 結 合 し う る こ と を 証 明 し た 。 PImC‐ CTを BMP2お よ ぴ BMP4とco．血cubate
し、抗 FLAG抗体ビーズを用いてimmunoprec
ipitationを行った。ビーズからの溶出液を抗BMP2
ル抗 体を用いたウエスタンブロットで解析したところ、バンドが確認された 。 熱 変 性 を 加 え た PRDC． CTで 同 様 の 実験 を行 った が 、溶 出液 中に B
MP2ある いは BM
P4を 確認 でき なか った。．4．マウス組織を用いたI胡pPC
RでPRDCの転写産物はさまざまな 組織に発現しており、なかでも卵巣、脳、脾臓で発現レベルが高かった。5．Realtimequantitative
PCRお よ び Northemblotを 用 い 、 マ ウ ス 卵巣 にお ける PRD
C産 生が ゴナ ドト ロピ ン投 与によ り調 節さ れる こと を確 認し た。 PRDC転写 レ ベル はPMS
G投 与に より 増加することが確 認さ れた 。マ ウス 卵巣を用いた血 8むHハイブリダイゼーションでは、PRDC転写産物は顆粒 膜細胞に発現しているこ とが示された。6．ラット顆 粒膜細胞においてFSH添加（ 30mIU／ml冫に よ り 、 proge8terone産 生 量 が 増 加 し た。 BMP4（1nM）を 添加 する と、 FSHで 増加 した
proge8terone産 生 が 抑 制 さ れ た が 、 PRDCは こ の BMP4の 作 用 に 拮 抗 し 、 培 養 液 中 のpro
ge8t
erone濃 度を有意に上昇 させた。リコンビナントgremhnもBMP4によるprog
e8terone産生抑制に拮抗した。 【結論】1．われわれはりコ ンビナントPRDCを初めて作成し、その解析を行った。ウエスタ ンブロットにて、PRDCは複数のバンドとして認識され、糖鎖修飾のみならず、prote0り8isの影響を受けているものと考えられた。NDn一reducedconditionの結果から 、 PRDCは 二量 体を 形成 し てい ると 推測 され た。 2． PRD
Cは Lucifera8
eレ ポー ター アッ
セ イに おい てBMP2、 4、6およ び7の 惹起 する シグナルを有意に抑制した。しかしながら 、GDF 9，acti唖 ，TGFーロ に対 する 抑制 効果 は認 めら れな かっ た。 3．PRDCはBMP2
およ ぴBMP4に 直接 結合 する こと でBMPタン パク に対 する 拮抗 作用 を示 すこ とが 推測された。4．
PRDCは マ ウ スに おい て広 い 組織 分布 を示 した 。5．マ ウ ス卵 巣で はPRD
Cは 顆粒 膜細 胞に局在し、ゴナドトロピ ンで発現量の調節を受けることが示された。6．PRDCは顆粒膜細胞にお いて B
MP4によ るprog
e8terone
産 生抑 制作 用 に拮 抗し た。 【結 語】 PRDC
は広範な組織 分布を示す強カなBMPアンタゴニストであると考えら れた。卵巣においては顆粒膜細胞に発現し、ゴナドトロピンに より発現調節をうけ、さらに莢膜細胞由来のBMPの作用に拮抗し、顆粒 膜細 胞で のprog
esterone
産生 を回復されることなどから、PRDCは卵胞発育、あるいは 黄体化の促進など、卵巣パラクライン調節機構になんらかの役割を果たしているものと考えられた。
−54−

学位 論文審査の要旨

主 査 教 授 櫻 木 範 明
副 査 教 授 水 上 尚 典
副 査 教 授 畠 山 鎮 次

学位論文題名Protein Related to DAN and Cerberus
IsaBone Morphogenetic Protein Antagonist
ThatPartic
ipatesinOva
rianParacri
neRegulation(Protein related to DAN and cerberusの BMPア ン タ ゴ ニ ス ト 作 用 と卵 巣 に お け る パ ラ ク ラ イ ン 作 用 に 関 す る 解 析 ）TGFーロスーパーファミリーに属するB
onemo
rphogeneticp
rotein(BMP)
は生物の形態形成において重要な役割を担っているのみならず、卵胞形成を制御する複雑な内分泌ネットワークの一環を担っていると考えられている。B
MPアンタゴニストはBMPの作用に拮抗することにより胎生期の発達と組織分化を制御していることが知られていたが、哺乳類の卵巣機能調節に果たす役割についてはいまだ不明な点が多い。Proteinrelated toDANandcerb
erus(PRDC)はcystineknot構造をもつ分泌タンパクでありBMPアンタゴニストとアミノ酸配列の相同性を示す。本研究において申請者はまずヒト293T細胞を用いてりコンビナントhum
an P
RDCを作成し、リコンビナントhumanPRDCがりコンビナントhum
an B
MPの活性に与える影響について検討した。また、マウスにおけるPRDCmRN
Aの組織分布および局在について、ならぴに卵巣におけるPRDCの役割についてマウス卵巣とラット培養顆粒膜細胞を用いて検討した。その結果、リコンビ
ナントPRDCは糖鎖修飾．proteolys
isを受け、二量体を形成していると推測された。
PRDCはLuciferaseレポ ーターアッセイにおいてBMP2、4、6およぴ7によるSmadが介在する転写活性を有意に抑制し、co−imm
unopr
ecip
itat
ionよりBMP2．BMP4に直接会合することが示された。RT―PCRでマウスPRDCi
ま脳・卵巣で高い発現を認めた。マ
ウス卵巣PR
DCはゴナドトロピンで発現調節をうけ、マウスPRDCcDNA probeを用いた
insit
u hybridizati
onにより顆粒膜細胞に局在することが示された。P
RDCはラット
顆粒膜細胞に描けるBMP4のproges
tero
ne産生抑制作用に拮抗した。これらのことか
らPRDC
は強カなBMPアンタゴニストであり、卵胞発育、黄体化の促進など、卵巣パラ
ク ラ イ ン 調節機 構に なん らかの 役割 を果 たし ている もの と考 えら れた。

発 表終 了後 畠山 教授 よ り、 P
RDCの翻 訳後 修飾 に関 し、 糖鎖 修飾 はN― linkedのもの
のみ であ った のか 、dibas
ic prote
olyt
ic processing point細胞内のどのレベルで生じるのか、Luciferaseーassay reporterにプロモーターは存在するのか、PRDC． gremlinが血 中に 分泌 され endocri
ne factorと して 働く 可能性などについての質問があった。
水上 教授 から 、BMPの卵 巣で の作 用に つい て、 さらに莢膜細胞か らはB
MP
7． BM
P4など
同様 の作 用を 示す 物質 が 共存 して いる こと の意 義に関して質問があった。最後に櫻木教 授 よ り 、 Bl*fPとPRDC
な どBMPアン タゴ ニス トと 卵胞 発育 の停 止と の 関連 につ いて
polycystic ova
ry syndrome(PCO)の病 態解 明の 観点から質問があった。これらの質問に 対 し て 申 請 者 は自 ら の 研 究 内 容と文 献を 引用 し概 ね妥 当な 回答 を行 った 。
本 論 文 は 卵 巣 をは じめ とし た諸 々の 生体 組織 にお ける BM
Pと B
MPア ンタ ゴニ ストとの 相互 作用 につ いて の 研究 を展 開す るた めの 基礎と栓るものと評価され、今後この知見 が、 排卵 障害 ・黄 体機 能不 全の病 態解 明に 応用されることが期待される。
審 査員 一同 は、 これ ら の成 果を 高く 評価 し、 申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した 。

― 56ー