博士（獣医学）咼

在弘

学位 論文 題名Polymorphisms and AntiviralActivity ofthe Mx and PKR in the Chicken（ニワトりにおけるM
xとPKRの多様性と抗ウイルス活性）学 位論文内容の要旨

動物・ 宿主細胞 には特 異的な遺伝子発現により、感染ウィルスの増殖を抑制する機構がある
こ と が 知 られ て い る 。Mxと PKRはイ ン 夕 一 フェ ロ ン (IFN)刺激に よって 発現し 、RNAウイ ルス に 対 する抵 抗性作 用を示 す。また 、様々 な種か らMxとPKR遺伝子 がク口一 ニング され、 その coding領域 が解析 されている。とくにヒトとマウスでは解析が進み、抗ウィルス作用を持つ
抵 抗性Mx遺伝子と PKR'遺伝 子の存 在が報 告されて いる。 ヒトと マウス の場合、人為突然変異
Mxを用い てウイル ス感染 実験を 行った 結果、 一つの アミノ 酸置換 によってウイルス増殖抑制能 が変化 したこ とが報 告され ている 。この ように Mx遺伝子 には、 ウイルス増殖抑制にかかわる 領 域 が 存在 す る と 考え ら れ る。 PKRはわず かでは あるが ほとんど の細胞 に存在 し、IFNによ り 発 現 がさ ら に 増 強さ れ る 。ヒ トとマウ スのPKRを解析 した結果 、N末端 側には dsRNA結合 蛋白の 特徴で あるdsRNA結合ド ヌイン (DRBD)が2箇所 、C末端 側には 多くのセリン／スレオニ ンキナ ーゼを 含んで いるこ とが知 られて いる。 多くのウイルスがPKRを不活化する断片をコー ドする と共に 、多数 の感染 実験結 果から 、細胞 レベルの感染防御に対してPKRは重要な役割を 果たす ことが 予測さ れてい る。し かし、 ウイル スとPKRの相互作用に関してはまだそのメカ
ニ ズムは はっき りとは 解明さ れてい ない。
自然界 でウイル スの主 な中間宿主と知られているニワトりの場合、ドイツの研究グループから 白色レ グホン 種を用 いてす でにMx遺 伝子の ク口一 二ング と塩基 配列が報告されているものの 、抗ウ イルス 活性の ない感 受性夕 イプで あった 。また、二ワトリPKRに関してはまだその構造 や詳し い機能 解析が なされ ていな い。本 研究は 、ニワトりにおいてMxおよびP」繦遺伝子の多 型と発 現、ウ イルス 増殖抑 制能の 解析を 目的と して行っ た。
第 一章 では、 白色レ グホン 種を含 む多数 の品種に おける ニワト リM遺伝 子の検 索を行 い、多 様 性 の有無 とRNAウィ ルス感 染に対 する増 殖抑制 活性を調 べた。 すなわ ち、合 計で15品 種の ニワトりを用いて11日令の胎子から繊維芽細胞を初代培養し、IFN誘導剤のpoly（I）パC）で刺 激 し た 後totalRNAを 抽 出レ た 。 次 にRACE法と RT‑PCRに より 全 長 Mx cDNAを ク口一 二ン
グ しcoding領 域の塩 基配列を決定し、文献の感受性夕イプの白色レグホン種と比較した。その結 果 、 品種に よって 10から18箇 所の塩 基置換 が検出 され、 そのうち 6から12箇所に おいてア―64ーミノ酸置換を 伴うことが認められ、品種に よる多様性がきわめて高い ことが明らかになった。
さらに、シー クエンス結果から文献の感受 性夕イプの白色レグホン種 と遺伝的距離がかなり遠い と 推 定 さ れ た い く っ か の 品 種 の Mx遺 伝 子 を 、 機 能 欠 損 に よ り Mxを 発 現 し な い マ ウ ス
BALB/3T3 (3T3)細胞に導 入発現させた。それらの導 入培養細胞を用いて組換えGFP遺伝子を持つ 水泡 性ロ 内炎ウイルス (VSV)による感染実験を行い 、感染細胞数を螢光顕微鏡 下で計測レたと ころ 、シ ャモ を 含む 5品種 の Mx遺 伝子 はコ ン ト口 一ル より 明らかに抗ウィル ス作用が高かっ た。 一方 ナゴ ヤ 種を 含む 2品 種の Mx遺 伝子 は 抗ウ イル ス作 用がコント口一ル と同様低かった。また、イ ンフルェンザウィルス(H5Nl）を用いた感染実験の結果、 VSVと同様な抗ウイルス活性の多様性 を示した。したがって、二ワ トりにおいてウィルス感染 に対する抵抗性夕イプのMx遺伝 子が 存在 す るこ とが 初め て見 出された。これ らの結果から、ニワトりの Mx遺伝子は品種間において 多様性があり、その中で機能的な抵抗性夕イプが存在することが明らかにされた。
さ らに 、抵 抗性 夕 イプ 品種 のMx夕ン パクのアミノ酸 配列を他の感受性夕イプと 比較検討した
ところ、抵抗 性夕イプあるいは感受性夕イ プにのみ共通して存在する 特異的なアミノ酸置換が見 出さ れた 。すなわち、 631番のアミノ酸がAsnであ る場合は抵抗性、Serである 場合は感受性を示すことが 確認された。
第二 章で は、二ワトリ PKR遺伝子の全長cDNAをク口 一二ングし、その塩基配列 を決定した。
さ らに 、VSV感 染に 対す る増 殖 抑制 活性を調べた。 7品種のニワトリ胎子から繊 維芽細胞を初代培養し、IFN誘導剤のpoly（I）パC）で刺激した後、total RNAを抽出した。他種刷は遺伝子を比 較検 討し 、ホ モ 口ジ ーの 高い 領域 の 塩基 配列 を基 に作 製 した プラ イマ ー を用 いて RACEとRT‑PCRを行 い、 二 ワト りの 全長 PKR cDNAを クロ ーニ ング し た。 その 塩基 配 列を 比較 した結果 、 二 ワ ト リ PKRは 550アミ ノ酸 か ら趣 るタ ンパ ク質 で あり 、他 のRNA結 合夕 ンパ ク 質及 びキ ナー ゼ群 の特 徴 であ るニ つの DRBDと多くのキナー ゼドメインが保存されてい ることが確認さ れた 。ま た、品種にお いて多型を示し、186番、234番、そして507番のアミノ 酸においてーつの塩基置換 によってアミノ酸置換を伴う ことが判明した。さらに、 VSV感染に対し感受性PKRを 持つ マウ スBALB／3T3（3T3）細胞を用いてニワト リPKR遺伝子を導入発現させ 、第一章と同じ方法でVSV感 染実験を行った結果、KS13（R507Q）以外の全てがコン ト口一ルより明らかに抗ウ イル ス作 用が 高 かっ た。 KS‐ 3の 場合、全部で6つ のクローンのうちぅっは抵 抗性を、また他 の3っ は 感受性を示し 、ウイルス感染に対し不安定 な抗ウイルス活性を持つこ とが確認された。
本 研 究 か ら ニ ワ ト り のMxとPKRに は多 型も し くは 変異 が存 在 し、 抗ウ イル ス活 性 につ いて も多 様性 が存在するこ とが分かった。ヒト及びマ ウスのA血遺伝子の多型及び 変異と抗ウイル ス活 性の 研究結果と今 回の結果を総合すると、A血 遺伝子はその種内において 系統もしくは品種間で多様 な多型と変異を持っており、 それが抗ウイルス活性の多 様性を決定している因子のーっとなっ ていることが推察された。ま た、自然界において主な中 間宿主であるニワトりには他のホ乳類 が持っている機能的なPKRが 保存されており、C‐末端の ーつのアミノ酸置換によって多様な抗 ウイルス活性を示すことが示 唆された。
ー65−

学位論文審査の要旨
主査 教授 安居院高志副 査 教授 喜田 宏
副 査 教授 小沼 操
副 査 教授 高島郁夫
学位論文題名PolymorphismsandAntiv
iralActiv
ityofthe Mx and PKR in the Chicken（ ニ ワ ト り に お け る Mxと PKRの 多 様 性 と 抗 ウ イ ル ス 活 性 ）Mxとdouble‑str
andea RN
A‑depend
edp
roteinkinase(PKR)はインターーフェロンによって発 現される ウイ´レ ス抵抗性夕ンパク質である。両夕ンバク質についてはこれまで ヒト、マ ウス及ぴ 一部の家畜 について はその一 次構造が 明らかに され、そ の構造と 抗ウイル ス活性と の関連が明 らかにさ れている が、鳥類 、得に家 畜として 重要なニ ワトりに おいては 十分な研究 がなされ ていない 。本研究 では、種 々のニワ トリ品
種 の Mx及 ぴ PKRの 一 次構 造 と抗 ウ イ ルス 活 性の 解 析 を行 い 、 両者 の 関連 に っ いて検討した。
ま ず 15品 種の ニ ワ トリ 胎 仔 線維 芽 細胞 か ら Mx遺 伝子 を ク ロー ニング し一次構 造を決定す ると共に 、これら の遺伝子を発現ベクターに組込み、マウスBA
LB/3
T3 (3T3)細胞 に 導 入し 、 組換 え 緑 色螢 光 色素 遺 伝 子を 持 つ水 疱 性 口内 炎 ウィルス （VSV)に対す る 抗 ウイ ル ス活 性 を 測定 し た。 そ の 結果 、 二ワ ト リ Mxに は品 種によル アミノ酸配 列 に 多様 性 が見 ら れ るこ と 、そ の中で得 に631番のア ミノ酸の 多様性が 抗ウイルス活性 に深く関 与してい ることを明 らかにし た。
ニ ワ トり に おけ る PKRにつ い ては これま で全く報 告がなく 、ウイル ス感染抵 抗性にお け る 寄与 は おろ か 、 その 存 在す ら明らか になって いない。 Mxの場合と 同様に7品種 の ニ ワト リ 胎仔 線 維 芽細 胞 から PKR遺伝子を クローニ ングし一 次構造を 決定す
ると 共 に 、3T3細 胞と 組 換 えVSVを 用い 抗 ウ イル ス 活性 を 測 定し た。そ の結果、 全ての 品 種 から PKR遺伝 子 を クロ ー ニング すること ができ、 更にその 一次構造 と抗ウイル ス活 性の測定 結果から507番 アミノ酸 がArgの場合 強い抗ウ イルス活 性を示し 、Glnの 場 合 そ の 抗 ウ イ ル ス 活 性 が 減 弱 す る こ と を 明 ら か に し た 。
以 上 の よ う に 申 請 者は 、 ニワ ト り にお い てMxと PKRに は ア ミノ 酸 配列 の 多 様性が存 在し 、そのア ミノ酸の種 類によっ て抗ウイ ルス活性 に違いが 見られる ことを明らか にし た。これ らの結果は ニワトり のウイル ス感染抵 抗性の機 構の解明 に寄与す−66−

るぱかりでなく、ウイルス感染に強い品種の育成という実用面にも多大な貢献をしたと評価できる。よって、審査員一同は、申請者が博士（獣医学）の学位をうける資格を有すると認めた。