博 士 （ 獣 医 学 ） 堀江 正 人
学 位 論 文 題 名Molecularanalysisofthethymusleukemiaantigengenepromoter（マウスの胸腺白血病抗原遺伝子のプ口モーター領域の分子生物学的解析）
学位論文内容の要旨
マ ウ ス の 胸 腺 白 血 病(TL)抗 原は ， 移 植 抗 原で あ る H− 2
抗 原 や ， リ ンパ 球 分 化 抗 原で あ る
Qa抗 原 等の よ う に マ ウス ク ラ ス I分子 の 一 員 であり ，第17染 色体 上の主 要組織 適合遺 伝子座 に
位 置 し て いる 。 TL抗 原の 分 子 量 は 約45キ 口 ダルト ンで あり， 12キ口ダ ルト ンのロ 2− ミクロ グ
口 ブ リ ン と非 共 有 結 合 で結 ば れ て い る 。TL抗 原 はH― 2抗 原 と異 な り， 移植抗 原とし ての機 能はなく，H− 2抗 原 ほ ど多 様 で も な ぃ。 TL抗 原 の機 能 は 現 在 のと こ ろ 不 明 であ る が ， Tリン パ
球 上に発 現され ている こと や，H―2抗原と 構造 上類似 してい ること ナょ どから，細胞間の相互作用 に関与 してい ること が予 想され る。
TL抗 原 の 発 現 調 節 機 構 に は 次 の 3っ の 特 徴 が あ る 。 1) TL抗 原 は あ る 種 (C58， BALB/c等 ） の マ ウ ス の 胸 腺 細 胞 に発 現 さ れ て いる 。 2) TLハ プ ロ タイ プ bの マ ウス は TL抗 原を 発 現しない。3)TLハ プロ タ イ プ bのマ ウ ス に 由 来 する あ る 種 の 自血 病 細 胞 は T
L抗 原 を 発 現す る 。
最 初 の 2点は い く っ かの 細胞分 化抗 原に共 通した 特徴で あり， 第3点は癌 化に 伴う遺 伝子発 現調
節 の 異 常 によ る も の と推 察され ている 。この 異常発 現の 機序を 解明す るため には ，TL抗原 遺伝
子 の発現 がT細胞の 成熟過 程にお いて どのよ うに調 節され てい るかを 明らか にする ことが 必須 であ り，こ の研究 の課題 とな ってい る。
T18d遺 伝 子 は BALB/cマ ウ ス の TL抗 原 を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 一 員 で あ り ， BALB/cマウ ス の 胸 腺細 胞 お よ び T
細 胞 由 来 の 自血 病 細 胞に発 現さ れてい る。TL
抗 原遺 伝子の 発現調 節には そ の プ ロモ ー タ ー 領域 が重要 な役割 を担っ ている との 報告に 基づき ，T18d
遺 伝子の プロモ ー
夕 ― 領 域 の詳 細 な 解 析を 行った 。まず ，T18d
遺 伝子の 転写開 始部 位をプ ライマ ―伸長 法によ り
決 定 し た 。T18d遺伝 子 には複 数の転 写開 始部位 が存在 し，最 上流 の転写 開始部 位は翻 訳開始 部位 の 158
塩 基 上 流 に 位置し てお り，そ のグア ニン残 基を ポジシ ョン十 1と した。 次に， T18d遺伝一 205 ‑子のプ口モータ一流域（ポジション―457から十146まで）を制限酵素を用い部分的に削除し，それ らのDNA領域をクロラ ムフェニコールアセチル卜ラ ンスフェラーゼ（CAT)遺伝 子に接続
す るこ とに よ り作 製し たプ ラスミドDNAをTL抗原陽 性および陰性細胞に導入した 。DNAの導 入により形質転換され た細胞のCAT活性を測定する ことにより，削除されたDNA領域のT18 遺伝子の転写に対する影響を推定した。この方法によりT18 遺伝子の転写調節に関わると推測される DNA領域が数多く同定された 。それらの中にはシスに転写を抑制するものと促進する 機能 を持 っ もの があ った 。ポジション‑105と‑33の間に位置するDNA領域はTL抗原陽性細胞と陰性細胞で異なる作用を示し，TL抗原の表現形の決定に重要な働きをすることが示唆され た。 また ， これ らの 転写 調節DNA領域に結合する DNA結合蛋白質がゲル移動度 シフト法に より 同定 さ れた 。3っの DNA結 合 蛋白 質（ ファ ク ターm，I，V）が組織特異的 転写調節DNA領域に 特異的に結合することが明らかとなり，また，そのうちトランスに働く2っ（ファク タ‑IVおよびV)はTL抗 原陽性細胞に特異的に発現さ れていることから，TL抗原 遺伝子の組織特異的転写に重要な役割を演じているものと推察された。
上記の CAT遺伝子を用いたT18d遺伝 子プ口モーターの転写活性の 測定により，2っの隣接するDNA領域（ポジシ、ヨン―4から十29，および十29から十54)がT18 遺伝子のプ口モーターを形成す ることが明らかとなった。そ のうちポジション一4と十29間に位置するDNA領域は
イ ンタ ーフ ェ 口ン レス ポン スDNAシ ーク エ ンス (IRS)を含んでおり，このDNA領 域に結合する蛋白 質（ファクターVI)が，ゲル 移動度シフト法により同定された。DNaseIフッ卜プリン ト法 によ り ，フ ァク タ‑ VIがIRSに結合すること が示された。IRSはHー2抗原 やQa抗原等の主要組織適合遺伝子複合体クラスI遺伝子のプロモ一夕一領域中にも保存されており，H―2抗原遺伝子ではエンハンサーとしてインターフェ口ンによるH―2抗原遺伝子の転写促進に重要な役割 を果たしている。T18d遺伝子転写におけるIRSの機能を調べるため，その5′領域と3′ 領 域の DNA配列 に人 工的 に変異を導入し，その転 写およびファク夕‑uとの結 合に及ばす影響を 調べた。その結果，T18d遺伝 子のIRSはファクターVIとの親和性およびT18d遺伝子のプ口モ 一夕一活性に必須であること が明らかとなった。特に3′ 領域のDNA配列が重要であることが示唆された。ゲル移動度シフト法において電気泳動時間を延長することにより，ファクターVIが4っの構成要素より成ることが明らかとなった。そのうちのファクタ‑VIbは30℃でATPあ るい はdATPを 加 える こと によ りIRSか ら特 異 的に解離した。また，この反 応は4℃では起こ らないことから，酸素反応の 関与が示唆された。このよ うにTATAボックスを欠く
TL抗原遺伝子ではIRSが プロモ一夕ーとして重要であ ることが明らかとなった。 H一2抗原

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遺伝子のIRSがエンハン サーとして作用するのに対 し，TL抗原遺伝子のIR
Sはプ口モー夕―として働いており，こ のような機能的相違は，両IRSの塩基配列の違い，IRSの 周囲のDNA配列の違い，転写開始 部位に対するIRSの相対的位 置の違い等によるものと推測 される。
上述の組織特異的転 写調節DNA領域の機能の解析をinvivoおよびinvitroのフットプリント法により行った。ま ず，DNaseIフットプリン卜法 によルファクターmおよびIの結合するDNA配列 が決 定さ れた 。次に ，このDNA配列がTL抗原陽性 の細胞中で実際に核内蛋白質 と結合しているかどうかを調べるため，プライマー利用遺伝子増幅法を用いたi
nvivoフットプリント法を行った。その 結果，このDNA配列はTL抗原 陽性細胞でのみ蛋白質と結合 していることが判明し，細胞内におけるTL抗原遺伝子の組織特異的転写調節に極めて重要であることが示唆された。
TL抗原遺伝子のプロ モーター中に数多くの転写促進あるいは抑制に働くDNA配列が近接して存在していることは ，正常細胞においてはTL抗原 遺伝子の総合的な転写調節が，特異的DNA結合蛋白質の特定部 位への結合によってなされ ていることを暗示している。 それらのDNA結合蛋白質の合成は細胞分化の過程において調節されており，白血病細胞ではその合成に異常を来していることが予想される。

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学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 小沼 操教授 清水悠紀臣教 授 佐 藤文昭
助教授 林 正信

マウス の胸腺自血病(TL)抗原は，マ ウスタラスI分子の一員であり，第17染色体上の主要組織適合遺伝子座に位置している。本抗原の機能は現在のところ不明であるが，Tリンパ球上に発現されていることや，Hー2抗原と構造上類似していることなどから，細胞間の相互作用に関与してい ることが示唆されている。TL抗原はBALB/cマウスの胸腺細胞に発現されているがTLハプロ タイプbのマウスでは発現さ れていない。しかしTLハプ口タイプbのマウスに由来するある種の自血病細胞では発現されている。これは癌化に伴う遺伝子発現調節の異常によるも207

のと推察されている。
申請者はTL抗原遺伝子の発現がT細胞の成熟過程においてどのように調節されているかを検討 し ， 本 論 文に ま とめ た。 本論 文は 英 文80頁か らな り ，参 考論 文2編を 付し てい る 。
T18d遺 伝 子 は BALB/cマ ウ ス の TL抗原 をコ ー ドす る遺 伝子 の一 員 であ り， BALB7cマウスの胸腺細胞お よびT細胞由来の白血病細胞に発現されている。そこで申請者は，まず，T
18 遺伝子のプ口モー夕―領域の詳細な解析を行った。その結果T18d遺伝子には複数の転写開始部位が存在し，最上流の転写開始部位は翻訳開始部位の158塩基上流に位置しており，そのグアニン残基をポジション十1とした。T18d遺伝子のプロモーター領域（ポジション―457から十146まで）を制限 酵素を用い部分的に削除し，それらのDNA領域をク口ラムフェニコールアセ
チル ト ラン スフ ェラ ー ゼ(CAT)遺 伝 子に 接続 する こ とに より 作製 した プラスミ ドDNAをTL抗 原 陽 性 お よ び 陰 性 細 胞 に 導 入 し， その CAT活性 を 測定 し， 削除 され た DNA領 域 のT18d遺伝子の転写に対する影響を推定した。この方法によりT18d遺伝子の転写調節に関わると推測されるDNA領 域が数多く同定され，それらの中にはシスに転写を抑制するものと促進す
る機 能 を持 っも のが あ った。また，これらの転写調 節DNA領域に結合するDNA結 合蛋白質がゲ ル 移動 度シ フト 法 によ り同 定さ れた 。 3っの DNA結合 蛋白 質 （フ ァク夕一 m，I，V)が組織特異的転写 調節DNA領域に特異的に結合することが明らかとなり，また，そのうちトランスに働く2つ （ファク夕‑IVおよびV)はTL抗原陽性細胞に特異的に発現されいることから ， TL抗 原 遺 伝 子 の 組 織 特 異 的 転 写に 重要 な 役割 を演 じて いる も のと 推察 され た 。
次に，CAT遺伝 子を用いたT18d遺伝子プ口モ ーターの転写活性の測定により，2っの隣接するDNA領域（ポ ジション‑4から十29，および 十29から十54)がT18d遺伝子のプ口モーターを形成することが 明らかにした。そのうちポ ジション‑4と十29間に位置す るDNA領域はインタ ― フェ 口ン レス ポ ンス DNAシ ー クエ ンス (IRS)を含んでおり，このDNA領域 に結合する蛋白質（ファク タ―vI冫が，ゲル移動度シフト法により同定された。DNaseIフットプリント法により，ファ ク夕‑ VIがIRSに結合するこ とが示された。T18d遺伝子転写におけるIRSの機能を調べるた め，その5′領域と3′領域 のDNA配列に人工的に変異を 導入し，その転写およびファクターVIとの結合に及ぼす影響を調べた。その結果，T18d遺伝子のIRSはファクターVIとの親和性およびT18d遺伝子のプロモーター活性に必須であることが明らかとなった。
特に3′領域のDNA配列が重要であることが示唆された。
最後に，組織特 異的転写調節DNA領域の機能の解析をinv
ivoおよびin vit
roのフットプリ
ント 法 によ り行 った 。 まず，DNaseIフットプリント 法によルファクターmおよび Iの結合

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す る DNA配 列 が 決 定 さ れ た 。 次 に ， こ の DNA配 列 が TL抗 原 陽 性 の 細 胞 中 で 実 際 に 核 内 蛋
白 質と 結合し ている かどう かを 調べる ため， プライ マ―利 用遺 伝子増 幅法を 用いた invivoフット プ リ ン ト 法 を 行 っ た 。 そ の 結 果 ， こ の DNA配 列 は TL
抗 原 陽 性 細 胞 での み 蛋 白 質 と結 合 して い る こ と が 判明 し ， 細胞内 におけ るTL
抗 原遺伝 子の組 織特 異的転 写調節 に極め て重要 であ るこ とが 示唆さ れた。
以 上 の 成績 の よ う に申 請者は ，TL
抗 原遺伝 子のプ 口モ 一夕ー 中に数 多くの 転写 促進あ るいは抑制に働くDNA配 列 が 接近 し て 存 在 して い る こ と を 明ら か に し た 。こ の 事 実 は ，正 常 細 胞 にお い て は TL抗 原 遺 伝 子 の 総 合 的 な 転 写 調 節 が ， 特 異 的 DN
A結 合 蛋 白 質の 特 定 部 位 への 結 合に よ っ て な さ れて い る こ と を暗 示 し て い る。 そ れ ら の D
NA結 合 蛋 白質 の 合 成 は 細胞 分 化 の 過
程 にお いて調 節され ており ，自 血病細 胞では その結 合に異 常を 来して いることが予想される。この研究は，TL抗 原 遺 伝子 の発現 調節 の機序 に関し て重要 な知 見を提 供する もので ある。 よっ て審 査員 一同は 堀江正 人氏が 博士 （獣医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと認めた。

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