博 士（生命科学）孫凡

学位論文題名Monitoring the caspase cascade in smgle apopt
oticcellsus
ing multi‑color fluorescent protei
nsubstrate（多色螢光蛋白質を用いた生細胞内アポトーシス過程におけるカスパーゼカスケードの解析）

学 位論文内容の要旨

ア ポトーシ スは生体組織が一定の秩序を保ちながら形成、成長していく上で重要なイベントである。細胞内アポトーシス過程において重要な役割を果たしているのが、カスパーゼファミリーの活性化である。カスパーゼはアポトーシス初期に関わるイニシェーターカスパーゼと、アポトーシスの実行そのものに関わるエフェクターカスパーゼの2つのタイプに大別され、アポトーシスの過程はこの両者によって厳密に制御されている。殆どのアポトーシスはこのカスパーゼの活性化に依存して誘導されるものであり、カスパーゼに対する阻害剤で処理することでアポトーシスの進行が阻害される。アポトーシスは個体の発生段階における正常な器官形成に必須な細胞内反応であり、また、癌やアルツハイマー病たどの疾病にも関係があることから治療のターゲットとして注目されている。これまで
カスパーゼの活性化に関する研究は加vitroからinvivoまで幅広く行われて韜り、現在では 2色 螢光蛋 白質を融 合した 基質を螢 光共鳴 エネルギ ー移動 (FRET)法で観察 するこ とで、生細胞内におけるカスパーゼの活性をりアルタイムで追跡することが可能になった。
し かし、FRET
法は基質を構成するドナー螢光蛋白質とアクセプター螢光蛋白質の間の角度、距離、螢光蛋白質の励起・発光波長の重なりという3っの満たすべき条件が厳密であるため、2種類以上のカスパーゼの活性を同時に解明するための基質を構築するのは容易ではをい。
そこで、本研究では、近年細胞内での分子間相互作用解析に用いられている螢光相互相 関 分 光法(FCCS)を 利用する ことで、 3種 類の異な る発光 波長をも つ螢光蛋 白質を 利用して新たな基質を構築し、細胞内におけるカスパーゼ￣9からカスパーゼ−3への活性化カスケードを測定することを目的として解析を行った。
第二章においては、カスパーゼ−3およびカスパーゼ‐9の活性を同時に測定することを目的とした新たな基質EC
FP‑DEV
D‑mCherry‑LE
HD−Venus(
Cyan‑Red‑Yellow融合螢光蛋白質： CRY)を構築し、加vitroでの検証を行った。この基質は活性化カスパーゼ‐3あるいはカ スパーゼ ―9に よって 切断され 、その 切断はFCCS
測定からそれぞれ、ECFP‑mC
herry間の相互相関の減少、あるいはmC
herry‑Venus間の相互相関の減少として検出されることがー77−

期 待され る。実際 、CRYを 発現し たH
eL
a細胞 のライセートのF
CCS測定を行ったところ、EC
FP‑mC
herry間の相互 相関、 mCherry‑Venus
間 の相互相関、共にネガティブコントロー
ル に比べ て高い振 幅の相互 相関が 観察され た。また、CRY発現He
La細胞ライセートに対し、リコンビナントカスパーゼ‐3、カスパーゼ‐9を加えたところ、EC
FP‑mC
herry間の相互相関、mC
herry‑
Venus間の相互相関のいずれの相互相関の振幅も時間とともに減少した。
このことから、新規に構築した基質CRYはカスパーゼ‐3およびカスパーゼ＿9の活性評価に利用可能であることが確認された。
次 に、こ の新規基 質CR
Yが細胞内 におけ るカスパーゼ活性化の評価に適応可能かど
う か の 検証 を 行 った。 CRYを発 現した HeLa細胞をア ポトー シス誘導 直後、 30分、60分
後 に そ れぞ れ 溶 解し FCCS
測 定 を 行っ た と ころ、 アポト ーシス誘 導60分後 において はEC
FP‑mC
herry間の相互 相関、 mCherry‑Venus
間 の相互相関、共に有意な減少が観察された 。しか し、誘導 30分後に おいては E
CFP‑mC
herry間の相 互相関 に有意な 減少はみられず、mCherry‑Venus間の相互相関にのみ有意な減少が観察された。この結果はカスパーゼ￣ 9が カ ス パ ー ゼ − 3に よ り 先 に 活 性 化 さ れ た こ と を 示 唆 し て い る 。
第三章においては、単一生細胞内でのカスパーゼ−3およびカスパーゼ＿9活性化の経時変化をFCCSにより追跡した。また、カスパーゼ―3およびカスパーゼ―9基質認識の特異性を確認するため、阻害剤を用いた実験を行った。カスパーゼ‐3阻害剤存在下ではアポトー
シス誘導後のHeLa細胞ライセートにおいて、カスパーゼ−3の活性化が阻害されたものの、カスパーゼ−9の活性化には影響がなかった。一方、カスパーゼ−9阻害剤存在下ではカスパーゼ‐9の阻害だけでなく、カスパーゼ‐3も弱く阻害されていることがわかった。この結果からカスパーゼ＿9の阻害によルカスケードが一部遮断され、下流のカスパーゼ‐3の活性化が抑えられたと考えられる。
さ らに、 アポトー シス誘導後の単一生細胞内において経時的FCCS測定を行ったところ 、ECFP‑mCherry
間の 相互相 関、mCherry‑Venus問の相互相関、共に時間経過に従った減少が観察された。そして、この減少がアポトーシス特有な形態変化より前に観察されたことは特筆すべき点である。この結果はアポトーシス誘導開始から細胞死に至るまで一連の追跡が単一細胞において可能であること示した。さらに、mCherry‑Venus間の相互相関の 減少が ECFP‑mC
herry間の相互相関の減少より、15分早く始まることもわかった。この結 果から も、カス パーゼ‐9がカスパーゼー3より先に活性化されたことが支持された。
本 研究に おいて構 築された 3色 螢光蛋白 質基質 をF
CCSを用いて追跡することで、生細胞内のカスパーゼ‐3とカスパーゼ‐9の活性をモニターできることを示した。さらに、アポトーシス誘導後の細胞においてカスパーゼ‐9がカスパーゼ＿3より先に活性化されたことを明 らかに した。ま た、FCCSを用いたこの方法は形態変化より早くアポトーシスを検出できるため、これまで知られているアポトーシス検出法に比べ、より初期のアポトーシス過程の評価法として活用可能である。

ー 78―

学位 論文審査 の要旨
主査
副査
副査

教授 金城政孝
教授 出村 誠准 教 授 相 沢智康

学位論文題名
I
VIon
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bstrate（ 多 色 螢光 蛋白 質を 用い た生 細胞 内ア ポトー シス 過程 にお ける
カスパーゼカスケードの解析）

アポトーシスは生体組織が一定の秩序を保ちながら形成、成長していく上で重要なイベントである。細胞内アポトーシス過程において重要な役割を果たしているのが、カスパーゼ蛋白質ファミリーの活性化である。カスパーゼはアポトーシス初期に関わるイニシェーターカ
スパーゼ と、アポトーシスの実行そのものに関わるエフェクターカスパーゼの2つのタイプに大別され、アポトーシスの過程はこの両者によって厳密に制御されている。殆どのアポトーシスはこのカスパーゼの活性化に依存して誘導されるものであり、カスパーゼに対する阻害剤で処理することでアポトーシスの進行が阻害される。アポトーシスは個体の発生段階における正常な器官形成に必須な細胞内反応であり、また、癌やアルツハイマー病などの疾病にも関係があることから治療のターゲットとして注目されている。これまでカスパーゼの活性 化に 関す る研 究 はぁ v
itro
か ら血 wv
oま で幅 広く行われており、現在では 2色螢光蛋白質 を融 合し た基 質 を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法で観察することで、生細胞内におけるカス パーゼの活性をりアルタイムで追跡することが可能になった。しかし、FRET法は基質を構成するドナー螢光蛋白質とアクセプター螢光蛋白質の間の角度、距離、螢光蛋白質の励起・ 発光波長の重なりという3つ の満たすべき条件が厳密であるため、2種類以上のカス パ ー ゼ の 活 性 を 同 時 に 解 明 す る た め の 基 質 を 構築 す る のは 容易 では ない。
そこで、本研究では、近年細胞内での分子間相互作用解析に用いられている螢光相互相関分光法(FCCS)を利用することで、3． 種類の異なる発光波長をもつ螢光蛋白質を利用して新たな基質を構築し、細胞内におけるカスパーゼ・9からカスパーゼ・3への活性化カスケードを測定 することを目的とした。
第二章においては、カスパーゼ‐3およびカスパーゼ‐9の活性を同時に測定することを目的 と し た 新 た な 基 質 ECFP‑DEVD‑mCherry‑LEHD‑Venus (Cyan‑Red‑Yellow融合 螢光 蛋白質：CRY)を構築し、あガぬりでの検証を行った。この基質は活性化カスパーゼ．3
あるいは カス パー ゼ‐ 9によ って 切断 され 、そ の切 断 はF
CC
S測定からそれぞれ、ECFP‑mCherry間の相互 相関の減少、あるいはmCherry‑Venus間の相互相関の減少として検出されることが 期 待 さ れ る 。 実 際、 CRYを発 現 した H
eLa細胞 のラ イセ ート のFCCS
測 定を 行っ たと ころ 、ECFP‑mCherry間の 相互 相関 、mCherry‑Venus問の相互相関、共にネガティブコント
ロ ール に比 べて 高 い振 幅の 相互 相関 が観 察さ れた。また、CR
Y発現H
eLa細胞ライセートに対し、 リコンビナントカスパーゼ．3、カスパーゼー9を加えたところ、ECFP‑mCherry間
一 79―

の 相互相関、mCherry‑Venus
問の相互相関のいず れの相互相関の振幅も時間とともに減少した。このことか ら、新規に構築した基質CRYはカスパーゼ‐3およびカスパーゼ．9の活性評価に利用可能で あることが確認された。
次に、この新規基 質CRYが細胞内におけるカス パーゼ活性化の評価に適応可能かどうかの 検 証 を 行 っ た 。 CRYを 発 現し た H
eLa細胞 をア ポト ーシ ス誘 導直 後、 30分 、60分後 にそ れ ぞ れ 溶 解 し FCCS測 定 を 行 っ た と こ ろ 、 ア ポ ト ー シ ス 誘 導 60分 後 に お い て はECF
P‑mCherry
聞 の相 互相 関、 mCherry‑Venus問の 相互 相関 、共に有意な減少が観察された 。し かし 、誘 導30分後 おい てはEC
FP‑mCherry間の相互相関に有意な減少はみられず、mCherry‑Venus問の相互相関にのみ有意な減少 が観察された。この結果はカスパーゼ．9がカスパーゼ‐3により先に活性化されたことを 示唆している。
第三章において は、単一生細胞内でのカスパーゼ．3およぴカスパーゼ・9活性化の経時変化をFCCSにより追 跡した。また、カスパーゼ￣3およびカスパーゼ．9
基質認識の特異性を確認するため、阻 害剤を用いた実験を行った。カスパーゼ―3阻害剤存在下ではアポトーシ
ス 誘導後のHeLa細胞 ライセートにおいて、カスパーゼ．3の活性化が阻害されたものの、カスパーゼ．9の活性化には影響がなかった。一方、カスパーゼ．9阻害剤存在下ではカスパーゼ‐9の阻害だけでなく、カスパーゼ．3も弱く阻害されていることがわかった。この結果からカスパーゼ‐ 9の阻害によルカスケードが一部遮断され、下流のカスパーゼ‐3の活性化が抑えられたと考 えられる。
さらに、アポト ーシス誘導後の単一生細胞内において経時的FCCS測定を行ったところ、ECF
P‑mCherry
間 の相 互相 関、 mCherry‑Venus間の 相互 相関 、共に時間経過に従った減少が観察された。そ して、この減少がアポトーシス特有な形態変化より前に観察されたことは
特 筆す べき 点で ある 。さ らに 、mCherr． y‑Venus間の 相互 相関の減少はE
CFP‑mCherry間の相互相関の減少 より、15分早く始まることもわかった。この結果は、カスパーゼ‐9がカスパーゼ．3より先に活性化されたことを支持するだけでなく、単一細胞を観察することに
よ り 、 両 者 の 活 性 化の 時 間 差 を も 評 価 可能 であ ること を示 唆し てい る。
本研 究に 韜い て構 築さ れた 3色蛍 光蛋 白質 基質 をFCCSを 用いて追跡することで、生細胞内のカスパーゼ ‐3とカスパーゼ・9の活性をモニターできることを示した。さらに、アポトーシス誘導後の 細胞においてカスパーゼ．9がカスパーゼ 3より先に活性化されたことを明らかにし、その 時間差についても評価可能であることを示した。また、FCCSを用いたこの方法は形態変化 より早くアポトーシスを検出できるため、これまで知られているアポトーシ ス 検 出 法 に 比 べ 、 よ り 初 期 の ア ポ ト ー シ ス 過 程 の 評 価法 とし て活 用可 能で ある 。
これを要するに ，著者は，カスパーゼ9なら びにカスパーゼ3についてその評価法の新知見を得たものであ り，アポトーシス研究に対して新規解析法として貢献するところ大なるものがある。よって 著者は，北海道大学博士（生命科学）の学位を授与される資格あるものと認める。

ー 80ー