博 士（ 水産科学 ）清水 茂雅

学位論文題名培養併用螢光彪sitrtt
ハイブリダイゼーション法を用いた
食中 毒細菌の高精度定量検出に関する研究
学位論文内容の要旨
食 品の微 生物検査 は，安全 な製品 を製造・ 販売す る上で欠かせない過程である。現在，この検査は 培養法が 主流で あるが， これは 多大な労 カを要 する過程である。また最終結果を得るまでに長い時 間を要す るため ，食品が 摂食さ れた後に 結果が 判明することも少なくない。したがって，消費者
へ の食品危 害リス クを低減 するた めには， 迅速か つ高精度な食品微生物検査法が必須である。そこで本研究では，公定法に採用されている培養法と特異検出に優れたF
luorescencei
nsituhybridiz
ation(FISH)法 を組 み 合 わせ た 培 養 併用 FISH (FISHFC)法 を用 い た 食中 毒 細 菌 の迅 速 定 量検 出 法 の確立を試みた。
第1章で は，損 傷したC． perfringensを高感度検出するための培地，回復剤および培養条件を検討 した。加 熱処理 (54゜C）し たC．perfringensの 検出菌数 を種々 の培地を 用いて調ぺた結果，TSC培 地で検出 菌数が 多く，加 熱損傷 菌を含め た検出 のできる培地であることが確認できた。次に加熱損 傷C． perfringensのさ らなる回復を目的に，回復効果のある物質を探索したところ，他の細菌と同 様 に ピル ピ ン 酸ナ ト リ ウム (Pyr)の 添加によ って最 も回復効 果が認め られ， その最適 添加濃 度は 0.3％ で あった 。さらに 回復に適 した培 養条件が ，発育 至適温度 の43‑46aCより低い 370Cおよび
pH7‑8であることも明らかとなった。
第2章で は，第 1節で C．

per
fr ingensでのFISHFC法の最適反応条件の検討，第2節では汚染食品

モ デルにおけるFI
SHFC法によるc．perfringensの定量検査法を確立した。まず，C．perfringens
でのFISHFC最 適反 応 条 件を 検 討 し た結 果 ，固定 は100％ エタノ ールに一 時的に 曝し(Omin)， ハイブリダ イゼーシ ョンは 46°C，30分間が 適当であ った。 供試菌58菌株に対するC・ perfringens
検出プ口ー ブC
LP‑180の特異性 を評価 したところ，C，perfringensのみに陽性シグナルが検出され，CL
P―180
プ 口ーブが 極めて 特異性の 高いプ 口ーブで あるこ とが明らかとなった。0.
3％Pyr‑TSC培地を用いて一 1047ー加熱損傷C． perfringensを培養し，最適なマイクロコ口二ー形成時間を調ベ，7時間培養が適当と判断レた 。2
種 類の食品 へ加熱 損傷C． perfr
ingensを人 為的に接種し，FISHF
C法と従来法（培養法）
および 損傷回復 培養法で の生菌 数測定値 を比較 したとこ ろ，これらの問には有意差が認められなかった こ と から ，本章 で開発し たFI
SHFC法が 培養法 と同等以 上の検出 精度で 生菌数を 測定で きる方法であ ることが 証明され た。
第 3章で は ， 第 1節 で Salmonella
検 出 の ため の FI
SHFC反応 条 件 の検 討 ， 第2節 で 汚染 食 品 モデルを 用 い て検 出精度 評価を行 った。 まず，Salm
onella検出プ口 ーブと して23SrR
NA
塩 基配列を 標的とし たS
AL
343を新た に設計 し，その 反応条 件と性能 を評価した。その結果，SalmonellaのFI
SHF
C法の 最 適 条件 は 検 出 陽性 率 お よび 螢 光 染色され たコロ ニーと背 景との S/N比か ら固定30分間，ハイプ リ ダ イゼ ー シ ョ ン46° C， 30分間 が 最適と判 断した 。また， 供試菌 34菌株に対 するSA
L343プ
口 ー ブ は ， Salmonellaの み に 反 応す る プ 口ー ブ で あっ た 。 次 に加 熱 や 凍結 ス ト レス を 受 けた
Salmonellaを 検 出 す る た め の FI
SHFC
法 に 適 した 培 地 を 検討 し ， M
LCB培地 が 回 復効 率 に 優れ ，FIS
HF
C法に適 している ことが 明らかと なった 。また， S
almonellaのマイクロコ口二ー形成時間は，7時間 培養が最適であった。河川水および食品7種にS
almonella
3株(S.Enteritidis，STyphimurium，＆ Infantis)の混 合菌液 を接種し ，FISH
FC法の 検出精度 を調べたところ，一般的にSalmonella
検出に用 い る 平板 法 と の 間に 有 意 な差 は な く， 同 等 の検 出 結 果が 得 られ ること が明らか となっ た。
第 4章で は ， 食 品の 汚 染 指標 菌 と して 最も一 般的に 検査され るEcoliのFISH
FC法 による 定量検出法 を 確 立し た 。 ま ずE coli検 出プ 口 ー ブと し て 16S r
RNA塩 基配 列内か らEC0636
プロ ーブを新規に 設 計 し， その反 応条件と 特異性 を評価し た。そ の結果， 固定30分 間，ハイ ブリダイ ゼーシ ョン46° C， 60分 間が 最 適 なFISHFC反 応条 件 で あり ， 供 試34菌 株 に対 す る 検出 特 異 性評 価 か ら，
EC0636プ口ー ブがE．coliを特 異的に検 出でき るプ口ー プであ ることが 明らか となった。しかし，
EC0636プ口ー ブは，Ecoliと極 めて近縁 である 赤痢菌(Shigella属）も検出するプローブであった。
次に FIS
HFC法 に用 い る 培地 を 検 討し た と ころ ， SEL培 地 に胆 汁 酸 塩を0.
056％添加 して選 択性を持たせ て培養す るのが良 いこと を見出し ，コ口 二ー形成 時間は ，7時 間が適切 であった。牛挽肉に
Ecoliを 接 種し， FIS
HF
C法の検 出精度を 調べた ところ， 公定法に 準拠し た平板法 と同等 の結果の得られ る方法で あること が証明 された。
第 5章で は ， Salmonella
およびEcoliの 検 出 を同 時 に 行 うた め ，前 章までの F
ISHF
C法を各 々最適化し ，Multiplex‑FISH
FC法の 確立を試みた。まず，両菌の同時検出を可能とするために，E．coli用に 設 計 した 0.0
56％ 胆汁酸塩 加SEL培地にお けるSa
hnonellaの コ口二 ー形成能 につい て調べた 。
‑104
8―

そ の結 果 ， S
almonellaに お いて も7時 間以上の 培養で FISHF
C法での 検出可能 なコロ ニーサイ ズとなっ たことか ら，SalmonellaおよびEcoliでの Multiplex‑FIS
HF
C法にお ける培 養時間は 7時間 とした 。ま た ， この Mul
tipl
ex‑FISHFC
法 の 反 応条 件 は 第3章 および 第4章 の結果か ら，固 定30分問，
ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 46° C， 60分 間 が 最 適 と 判 断 し た 。 最 後 に SalmoneHaと EcoliのMultiplex― FISHFC法 で の 検 出 精 度 を 確 か め る た め に 食 品 サ ン プ ル に 両 菌 を 接 種 し ，Mult
iplex‑FISHFC
法 と培養 法での生 菌数測定 値の比 較を行っ た。そ の結果， SAL343および EC0636
プ口ー ブによ るFISHF
Cでの計 数値は ，Salmonella
また はE．coli検出用 培地での生菌数と同等の検出結果 が得ら れた。
実際の 食品微 生物検査 で行わ れている 培養法のみに依存した方法では，確かな最終結果を得るには，様 々な確 定試験を 必要とす るため ，少なく とも2‑3日間の 時間を 要する。しかし，本研究で開発 した FIS
HFC法に よ れ ばぃ ず れの菌 種におい ても9時間以 内で検出 可能と なった。 したが って，本研 究で確立 したFISH
FC法 は，培 養法に準 じた生 菌のみを モ二夕リ ングで きる迅速 定量技 術を提供し， 自主衛 生管理の 場におい て食品 の微生物汚染リスクを高精度に把握することで食品の安全性を確保 するこ とが可能 となる。

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学位論文 審査の要旨
主査 教 授 川合 祐史
副査 教 授 澤辺 智雄
副査 准教授 山崎浩司

学 位 論 文 題 名培養併用螢光励Sitztハイブリダイゼーション法を用いた
食中毒細菌の高精度定量検出に関する研究
食 品の 微生 物検 査は 、 安全な製品を製造、販売する上で不可欠であり、消費者 への食品危害リスク を低 減す るた めに 、 より迅速かつ高精度な手法が要求されている。そこで本 研究では、公定法に 採用 され てい る培 養 法と 特異 検出 に優 れた 螢光 in situ
ハイブリダイゼーシ ョン(FISH)法を組 み 合 わ せ た培 養併 用FISH (FISHFC)法 を用 いて 食中 毒細 菌の 損傷 菌を も高 精度 に検 出可 能 な
迅速 定量 検出法 の確 立を 試み ている 。得 られ た成果 は以 下の よう に要約される。
1．ウェルシ ュ菌の高精度定量検出法の確立
ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)の特異検出プローブとし て16S rRN
A塩基配列を標的とした CLP― 180を設 計し 、 FIS
HF
C条件を最適化するとともに、損傷回復検出培地と して0．3％ピルビン 酸ナ トリ ウム 添加 TSC培 地を 開発 し、 加熱 損傷 C．p
eサf門gP門sを7時間培養 でマイクロコロニーの検出が可能であった（全工程9時間以内）。また、このときの 回復培養条件は、発育至適温度の43‐46℃より低い37℃およびpH7‐8であることも明らかにした。
2種 類の 食品 へ加 熱損 傷C．p
Pサf門ぴ門sを人為的に接種し、FISHFC法と従来法 （培養法）および損 傷回 復培 養法 での 生 菌数測定値を比較したところ、これらの間には有意差が 認められなかったこ とか ら、 本研 究で 開 発し たFIS
HFC法が 培養 法と 同等 以上 の検 出精 度で 生菌 数を測定できることを実証した。
2．サルモネ ラ属細菌の高精度定量検出
サルモネラ（駈加？0門P〃ロ）属細菌 の特異検出プローブとして23SrRN
A塩基配列を標的とした
SAL343を 設 計し 、FlS
HFC条件 を最 適化 し、 勵加 〇門 Pぬの 損傷 菌回 復検 出用 培地 とし てMLCB培
地を 用い て7時 間培 養に より 螢光 検出 が可 能と なっ た。河川水およぴ食品7種に勵fm〇〃ビぬ3株
1050−

(S. Enteri
tidis，STyphimurium，SInfantis)の混合菌液を接種し、FISHFC法の検出精度を調べたとこ ろ、 一般 的に Salmon
ella検出に用いる平板法との間に有意な差はなく、培養法と 同等の検出精度で検出可能 であることを明らかにした。
3.
大腸菌の高 精度定量検出法の確立
食品の汚染 指標菌として最も一般的に検査される大腸菌(Escherichiacoli)の検出プローブとして 16S rRNA塩 基 配列 内か らEC0636プロ ーブ を新 規に 設計 し、 FI
SHFC条件 を最 適化 し、 0.056％
胆 汁酸 塩添 加SEL培地 で選 択性 を持 たせ て7時 間培 養す るこ とに より 、マ イク ロコ ロニーの螢光
検 出が 可能 とな った 。EC063
6プローブは、E．coliと極 めて近縁である赤痢菌(Shigella属）も検出 する プロ ーブ であ った が 、有害菌の誤検出は実用上容認できると判断した。牛挽 肉にE coliを接 種し 、FISH
FC法の 検出 精 度を 調べ たと ころ 、公 定法 に準 拠し た平 板法 と同 等の 検出精度が得られることを 実証した。
4.
サルモネラ と大腸菌の同時高精度定量検出法の確立
E coli用 に 設 計 し た 0.056％ 胆 汁 酸 塩 添 加 SEL培 地 に お い て Salmonellaと EcoliのMultiplex‑FISHF
C法 を最 適化 し、 FISHFCに よる Sa
lmonellaと Ecoliの同 時検 出法 を構 築し た。
食品試料に而 菌を接種し、Multiplex‑FISH
FC
法と培養法でのSalmonellaとE．ピ〇ぬの生菌数測定値の 比較 を行 った とこ ろ， SAL
343およ ぴEC0636プロ ーブ によ るFISH
FCでの 計数 値は 、Salmonella
ま た は E， coli検 出 用 培 地 で の 生 菌 数 と 同 等 の 検 出 精 度 が 得 ら れ る こ と を 確 認 し た 。
実際 の食 品微 生物 検査 で 行われている培養法のみに依存した方法では、確かな最 終結果を得るに は、 各種 確定 試験 を必 要 とす るた め、 少な くと も2‑3日問の時間を要する。しか し、本研究のFISHFC法 に よ れ ばぃ ずれ の菌 種に おい ても 9時間 以内 で、 培養 法に 準じ た生 菌の みの モニ タリン グ（ 迅速 定量 ）が 可能 と なる。本研究の成果は、自主衛生管理の場において食品 の微生物汚染
リ スク を迅 速か つ高 精度 に 把握することを可能とする技術を提供し、水産食品も含 めた食品安全性 向上 技術 の発 展に 大き く 寄与するものとして高く評価できる。よって審査員一同 は申請者が博士（水産科学 ）の学位を授与される資格のあるものと判定した。

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