博 士 （ 医 学 ） 中 島 淳 太
学位論文題 名Anti− tumor activity of ESXl on cancer cells●harboring oncogenlCあ 卜 粥 CZSmutation（腫 瘍原性K‑ras変異を有する癌細胞に対するESX1の抗腫瘍効果）

学位論文内容の要旨【背景と日的】ESXl (exuae
mbryonic，sperm
atoge
nesis，homeobox
l homolog)
はヒトX染色体Xq
22.
1上のE
SX1
遺伝子によルコードされる全長65 kDaのpai
I司一likeホメオドメイン蛋白である。細胞内においてESXlはプロリンに富む反復領域をもつ20kDaのC端断片とホメオドメ インを含む45kI）aのN端断片に分解される。 その 後、 N端 断片 は核 内 に移 行し尽鰡遺伝子の 第一イントロン内のP3配列（ 1AArGTTATTA；REK；Repres
sorEernentof彫．′甜）に特異的に結合し転写リプレッサーとして機能する。K・Ra
sはR
asファミリー蛋白のーっで、機能獲得型K‐R
asは細胞癌化に必須の異常増殖シグナルを生成する。この遺伝子異常は細胞癌化だけではなく癌形質の維持にも必須であると推察されK‐ぬsは癌治療における分子標的療法の有カな標的のー っと考えられてきたこれまでの研究で培養腫瘍細胞に異所性発現させたESXlは尽鰡リプレッサー機 能を介して腫瘍尿陸K．．R
as蛋白発現を抑制し、器珊遺伝子変異をもつ腫瘍細胞の増殖を抑制でき ることが報告されている。 本研究ではESX1のの抗腫瘍効果を肌yめにおいて検討することを目的とした。
【材料と方法】
プラスミド： pc
DNA3nいESXlはび：DNA3/ESX
Rl・△C上のE鍬｝U‐ムCd）NA
終端直後にユニバーサ′レ
タ ーミネータを挿入し作成し た。ET16b・TAT/N―ESX1は大 腸菌発現ベクターpET‐16bにmV−1L
虹蛋 白の膜移行罐瀏紐TD：pro晒 n恤峪membmnedomain）とその下流にM巨5瓰c
DへMを挿入し作成した。
安定発現株：H（T矧ヒト大腸癌細胞株H〔汀116細胞にテトラサイクリン依存的に任意の遺伝子を発現さ せ る 転 写 因 子 m、 A（ 刪 erse倣 mcydine缸 脚 ぬ valor） を 安 定 発 現 さ せ た 細 胞 株 ） に
pC卿 匝 Hヨ SD贓 SX1（ M驪 瓰 c蹴 4を pCrE． ‐ BSDベ クタ ー に挿 入） を導 入 し選 択培 地で 培養 しN‐E§Xl安定 発現 株 を樹 立し た。ウェスタン ブロット法：細胞溶解液の 上精をサンプルとしてSDS−PA．（週にて分離後、免疫ブロットを行っ也コロニー形成抑制法：蛋白発現プラスミドとピュー
ロマイシン耐性遺伝子ベクターを細胞内に導入し、ピューロマイシンを含む培地で培養した。ルシフ
ェ ラーゼアッセイ：蛋白発現 ベクターとともにレポーターベクター、pRIm
くをりン酸カルシウム法
で ヒト骨肉腫細胞株U2て峪内 に導入し24時間後デュアルルシフェラーゼァッセイにて解忻した。リjンビ ナン ト 蛋白 精製 ：BL21q）E3）大 腸 齢に TATnq・ ESX1発現ベクター を導入、04mMP11Gにて蛋白発現を誘導しNi−NI、Aビーズで蛋白を精製した。Xロlogra
轟態say：6週齢のBA
LB
df
6｀Jdnu／nu（ヌー ドマウス）の背側にHCT‐tetまたはN‐ESX1
安定発現株1xlず個を皮下接種し腫瘍径を観察した。
0．17州TA：r／N‐ESXlまたは △TAlm−BX1を含む培地で48時間培養したHCT116細胞をヌードマウ― 15 ‑

ス の両 背 側 に 1カ所 に っ き 1Xl06個皮 ― F接 種 し月 黜 着 の 有 無を 観 察 し た。 免疫染 色法 ：トラ ンスフ
ェ ク シ ョ ン 後 24時 間 に 細 胞 を 固 定 、 免 疫 染 色 を 行 い 観 察 は 共 焦 ー 制 頭 微 鏡 で 行 っ た 。

【結果 】
こ れ ま で の 研究 で 使 用 し てい た ESXRl‑ACの3 末端 にユニ バーサ ルター ミネ ータを 挿入し ESXRl‑△CのC端 末 尾 の pcDNA3
由 来 の 35
アミノ酸を4
ア ミ ノ 酸 に 減 らし た N― ESXlを 作三成 した。 HCT116に一 過性導入 し た N‐ E
SX1は 細胞 核内 に発現 し、ウ ェスタ ンブロ ット でKーR
as蛋白の 発現抑 制が確 認され た。 またpGL3珊Dm0缸 ベ クタ ー に 3X
REKi己 歹IJを 挿 入し た レ ポ ー タ ーの ル シフ ェラー ゼ活陸 の抑制 を認め 、コロ ニ ー 形 成 抑制 試 験 で 器 恥変 異 を 持 つ 大 腸癌 細 胞 株 駲 ゾ480、 H
CT1
16の 増殖抑 制を認 めた。 以上 よりN・ ESX1は ESX
R1― △ Cと同 等の 生物学 的活陸 を有す ると結 諭づ けられ た。次 にテト ラサ イクリ ン誘導 陸Iこ N― E
SX1を 発 現す る HCT
l16細 胞 株を 樹 立し よう と試み たが、 樹立し た細胞 株は いずれ も薬剤 非依存的 に NIE
SX1を 発 現し た た め 、 これ を N‐ ES
X1構 成 的発 現 株 と し 研究 を進め た。ヌ ード マウス の背側 の左 側にHCT―tet（ 親株） 、右側 にN‐ESX
1安定発現株を接種し腫瘍の増殖を比較したところ、HC
T―tetは安定 発 現 株 と 比べ て 明 らかに 腫瘍 増大率 が大き かった 。安定 発現 株はN―ES
X1の 発現 量も弱 くK・R
aSの発現 抑 制 も 軽 度で あ っ た が 加vn´ 〇 の 結果 よ りN‐E
SXによる K馳s
蛋 白の発 現抑制 は軽度 でも十 分に 腫瘍
原 陸 を 抑 え ると 考 え ら れ た。 次 に NES
X1の 癌 治 療応 用 を 考 え 、大 腸 菌 発 現 系を 用 い て mV・1W｀T
蛋白の 膜 移 行 領 曦（ PID） の下 流 に N― E
SXlを 融合 さ せ た TA
： r爪 ― E
SX1
蛋 白を作 成、精 製した 。TAFP
TDはそ の 下 流 に 任意 の 蛋 白 を 融合 さ せ る こ と により 蛋白を 細胞内 に直接 移入 するこ とが知 られて いる 。また 、 コ ン ト ロ ー ル と し て TA1甲 TD領 域 を 持 た な い △ W汀 ／ MSX1を 作 成 し た 。 免 疫 染 色 法 に て△ TAT／MSX1は H（ 汀 116
細 胞 内 に は 検出 さ れな かった が、n灯膩 ―ES
X1
は 細胞内 に入る こと が確認 された 。 MTT
ア ッ セ イ に お いて も TA1、 ′ N― ESXl
は 増殖抑 制を示 したこ とよ りTAT膩―ES
X1は沈vむmにおいて H（ 汀 116細 胞 内 に 入り 増 殖 抑 制 を 来す こ と が 示 され た 。 さ ら にTAT烈 ・ E
SX1で 鵠時 間 培 養 さ れたH〔汀 116は △W｀T／N―E
SX1
で培 養さ れた細 胞、お よびコ ントロ ール と比較 してヌードマウスヘの生着率が 有意に 抑制 された 。
【考察】
こ れ まで ア ン チ セ ンス オ リ ゴ ヌ クレ オ チ ド や フ ラネ シ ル ト ラ ンスフ ェラー ゼ阻害 剤な どのRa
sを標 的と し た抗 腫 瘍 剤 を 用い た 治 療 戦 略が 精 力 的 に 研 究さ れ て き た が、K‑ras
遺伝 子の 転写調 節を分 子標的
療 法 の標 的 と し た 研究 は 知 ら れ てい な い 。今回 の研究 ではESX1のN端断片 をK‑
rasリプ レッサ ーとし てと ら えK‑ras
変 異 をも つ腫 瘍に対 する沈 v
iv
oにお ける抗 腫瘍効 果を 検証し た。分 子標的 療法を 考え る上
で、N― ESX1を 細 胞内 に効 率よく 導入す る手法 が望ま れる が、ウ イルス ベクタ ーを 用いた 方法な どでは
遅 発 陸に 自 血 病 を 誘発 す る な ど 重篤 な 副 作 用 が 問題 と な る 。 H
IV‑1のTAT蛋 白の 膜 移 行制菰 TAT‑PTD)に N―ESX1を融 合 さ せ た T
AT/N・ESX1はinvivoの 実験に おい てK‑ras変異を もつ 癌細胞 の増殖 を抑制 する こ とを 見 出 し た。 本研究 から 、K‑rasリプレ ッサー とし てのES
X1を用い た新規 分子標 的癌治 療の 開発
へ の 道が 開 か れ た と考 え る 。

‑ 16−

学位論 文審査の要旨
主 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 小 池 隆 夫

学位論文題名Anti―tumor act
ivity ofE
SXloncancercells●
harboring oncogenlCi卜 ガ 鯲 mutation（腫瘍 原性‑
ras変異を有 する癌細胞 に対するES
X1の 抗腫瘍効果）論 文 の 内 容 は ヒ ト X染 色 体 Xq22.1上 の ESX1遺 伝 子 に よ ル コ ー ド さ れ る ESX1(extraembryonic，spermatogenesis，homeoboxlhomolog)のN端断片がK‑ras遺伝子の第一イン
トロン内のP3配列（TAATGTTATTA;REK;R
epressorEl
ementofK‑ras）に特異的に結合し、転写 リプレッサーとして機能することを介して腫瘍原性K‑
ras
変異をもつ腫瘍細胞の増殖を面 v
itroにおいて抑制すること を背景に、この抗腫瘍効果を加v
ivoにおいて検討すること を目 的 とし たも ので あっ た。 これ まで 研究 に用 いら れて 来た ESX
1． △Cを改変した
N‑ESXlがESX
1‐△Cとほぽ同等の 抗腫瘍効果を血vitroにおい て示すことを確認した後、以後 の実験に用いていた。N‑ESXl
構成的安定発現細胞株を用 いた実験において、N‑ESXlの ヌ ー ド マ ウ ス 生 体 内 に お け る 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し 、 HIV‑1の TAT蛋 白 の 膜 透 過領 域
TAT‑PTDとN‑ESXlの融 合蛋 白を 用い て 細胞 内に N‑ESXlを 導入 し、 血ガ ぬり における抗腫瘍効果および、ヌードマウス生体内における抗腫瘍効果を明らかにした。この論文における 研究 は 、K‑ras遺伝 子を 分子 標的 と して N‑ESXlのK‑
rasリプレッサー機能を利用し、
K‑rasの転写抑制を介した腫瘍原 生K‑ras
変異を有する癌細胞 に対する抗腫瘍効果を利用し た新 規治療 戦略 の開発 の可 能性を 初め て示唆 する もので あっ た。
申 請者はこれらの内容をスライドにまとめ約15分の発表を行った。発表においては論文には掲載されていなかったデータも含め提示し、論文の内容を補足していた。発表の後、副査の 浅香教授より、このN．ES
X1が臨床応用された場合、膵癌を含む固形癌における複数の遺 伝子異常に対してKt設s
リプ レッサー機能だけで果たして単剤で治療効果が得られるのか 、またE
SX
1のりプレッサー機能は他の遺伝子にも影響し ており、この抗腫瘍効果については他の遺伝子の影響もあるのではないか、との質問があった。これに対し申請者は、
これ までの研究および本研究から腫瘍原性ぱ7賀s変異に生存を強く依存している腫瘍に対して E
SX1は特異的に抗腫瘍効果を発揮すると推察され、他の 遺伝子の転写を抑制することや 腫瘍自体が他の遺伝子異常を有する場合においてもこれらを考慮せず単剤で治療効果が得られることが予想されると回答した。っづいて副査、小池教授より全身投与する場合、癌種に特異的な薬剤投与の治療戦略（Drugdeliverysystem）はあるのかとの問いがあり、申請者 は血管造影などを利用した動脈注射などによる至近距離からの投与を検討していると回答 した。さらに主査、秋田教授よりEG珊遺伝子異常や口む・2白eU
遺伝子増幅などによっ てRas上流 から の異 常増殖亢進シグナルが 存在し、ぬ館遺伝子が野生型である場合に― 17―

N‑ESXlは効 果がある のか、 またK‑
Ra
s蛋白質 発現の抑 制の程度 が軽度にもかかわらず著明な抗腫瘍効果を示していたのはなぜかと言う質問に対し、申請者は先の柳原らの論文の実験で、 野生型 K‑ras
遺伝 子をも つ腫瘍に 対して はE
SX
1．△Cによ るK‑Ras
発現抑制は他のRasフ ァミリ ーによる 代償作 用により 抗腫瘍効 果を示 さなかっ たことを引用し、野生型
K‑ras遺伝 子 を 持つ 場 合 、 N‑ESXlよ ってK‑
Ras蛋白質 発現を抑 制して も他のRasファ ミリーによって代償され下流にシグナルは伝わる可能性があることや、Ras
より上流からの増殖シグ ナルは 必ずしも R
as‑MAP
K経路を 介するものだけではなく他のシグナル経路を経由する場 合もあ るため、 R
as
よ り上流か らの増殖 シグナ ルに対し てはN‑
ESXlは効果がないかあっ ても部 分的なものであることが予想されると回答した。また、K‑R
as蛋白の発現抑制が軽 度であ っても、今回の実験に用いた腫瘍細胞は腫瘍原性K‑R
as
蛋白質に生存を強く依存し ており (K‑Rasaddiction)、極少量そのK‑Rasの発現を阻害するだけで、addictionの 状 態 を 解 除 さ せ 、 腫 瘍 増 殖 を 抑 制 し うる 可 能性 が ある と 回答 し た。
この論文は、腫瘍原性K‑rロs変異をもつ腫瘍に対する新規治療戦略開発への可能性を示した点で高く評価され、今後の研究の発展が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申請 者 が 博士 （ 医 学） の 学 位 を受 け る のに 充 分 な資 格 を 有する ものと 判定した 。

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