博 士 （ 獣 医 学 ） 中 満智 史
学 位論文 題名Studies on cellular factors affeCtingtheformationof
abnormaliS
Oformofprionprotein（異 常型プ リオ ン蛋白質の生成に影響する細胞因子に関する研究）

学位論文内容の要旨
プリオン感染細胞は、プリオン増殖や異常型プリオン蛋白質(PrPSc冫生成の 細胞生 物学 的機 構の 解析に 用い られ てきた 。プ リオ ン感 染細胞を用いた研 究は、 PrP生合 成機 構や プリ オン増殖の細胞生物学的機構を明らかにするた めの、 多く の知 見を 提供し てき た。 しかし 、細 胞内 にお けるプリオン増殖 の詳細 な機 構は 依然 として 不明 な点 が多い 。本 研究 では 、プリオンの増殖機構のさらたる理解・を目的として、プリオン持続感染マウス神経芽細胞腫N
eur02a(N2a)を 用い 、プリ オン 増殖 に関連 する 宿主 因子 および細胞内環境の同定を試みた。
第1章で は、プ リオ ン持 続感 染N2a細 胞内に おけ る蛋 白質 分解酵素抵抗性PrP (PrP‑res)の 量的 変動 の解 析を行 った 。プ リオ ン持続 感染N2a細胞内のPrP‑res量 は、継 代後 48
時 間で 最初の量の50％程度にまで減少し、継代後72時 間から 96
時 間で 元の 量にま で回 復し た。正 常型 プリ オン 蛋白質(PrPc)の量も変動していたが、Pr
P
C量の変動はPr
Pーres
量の変動には影響しをかった。
プ リ オ ン 持 続 感 染N2a細胞 をプ リオ ン非感 受性 細胞 と共培 養し た場 合、 非感受性細胞を入れないものと比較して、PrP‑res量は細胞密度依存的に最大2倍 程度に まで 増加 した 。これ らのことから、細胞密度はP
rP‑res量の変動に影 響する こと が示 唆さ れた。 この細胞密度依存的P
rP‑res量増加には、液性因 子より も細 胞同 士の 接触が 関連 して いた。 細胞 のコ レス テロールの量およ び局在 はPrP
‑res生 成に 影響 することが知られているが、これらも細胞密度 依存的 に変 化し てい た。以 上の 結果 から、 細胞 密度 によ って変化する細胞 内 の 微 小 環 境 が、 PrP‑res生 成に 影響を 与え てい ること が示 唆さ れた 。
第2章で は、PrPs。 生成 にお ける、エンドソーム小胞の酸性化およびエンド ソーム 系の 小胞 リサ イクリ ング 経路 の関与 にっ いて 調べ るために、エンド ソ ー ム の 酸 性 化 に 寄 与 す る こ と が知 ら れ て い る Clc‑5の 遺 伝 子発 現 をsiRNAに よ り 抑 制 した 。Clc‑5を標 的と した siRN
Aを 導入し たと ころ 、プ リ
オ ン 感 染 N2a‑5細 胞の PrP‑r
es量は 、陰 性対 照si
RNAを導入 した もの に比 べて 、40％程 度にま で減 少し た。 この条 件下 では PrPCの減少は見られなかった 。予 想に 反し、 Cl
c‑5の 発現 抑制 によ り、N2a細胞のエンドソーム又はライ ソソ ーム と考え られ る小 胞の 酸性化 は亢 進し た。バフイロマイシンAl処理により小胞の酸性化亢進は抑制されたが、Clc‑5の発現抑制によるPrP‑res量の減少は抑制されなかった。従って、Clc‑5の発現抑制によるPrP‑res量の減 少 の 主 要 因 は 小 胞 の 酸性 化 の 亢 進 で は な いこと が示 唆さ れた 。一方 、Clc‑5の発 現を 抑制 したN
2aー5細胞では、陰性対照と比べてトランスフェリン の細 胞内 輸送が 遅く なっていた。さらに、Clc‑5の発現抑制は、細胞内コレ ステ ロー ルの分 布お よぴ りサ イクリ ング エン ドソームのマーカーであるrabllの局 在を 変化 させた 。こ れら の結 果は、 Clc‑5の発現抑制により、エンドソームーリサイクリング経路が障害されたことを示唆している。エンドソ ーム ／ラ イソソ ーム 小胞の酸性化亢進がPrP‑res量の減少の主要因ではなかったことを考えると、Clc‑5の発現抑制によるPr
Pーres量減少の原因は、エン ド ソ ー ム ‐リ サ イ ク リ ング 経 路 の 障 害で あ る と考え られ た。
本論 文で はPrPs。生 成に、(i)細胞密度およぴ細胞同士の接触によって調節 され る細 胞内環 境、 およ ぴ(ii)エン ドソ ーム ‐リサイクリング経路、が関 与し てい ること を明 らか とし た。こ れら の発 見は細胞内のプリオン増殖機 構の ごく 一部を 明ら かに した に過ぎ ない が、 本論文で得られた結果はプリ オ ン の 増 殖 機 構 を よ り詳 細 に 解 き 明 か し ていく 上で 有用 であ ると考 える。

学位論 文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教 授

堀教 授

稲教 授

大准 教授寺内基広
波 修
橋和彦
尾 晶

学位 論文題名Studies on cellular factors affeCtingtheformationof
abnormaliSOformofprionprotein（ 異 常 型 プ リ オ ン 蛋 白 質 の 生 成 に 影 響 す る 細 胞 因 子 に 関 する 研 究 ）プ リオン感染細胞は、プリオンの増殖機構や異常型プリオン蛋白質(PrPsc）の生成機構を 紐解くた めの、多 くの知見 を提供し てきた。し かし、細 胞内におけるプリオン増殖の詳 細な機構 は依然と して不明 な点が多 い。本研究 では、プ リオンの増殖機構のさらなる理 解を目的 として、 プリオン 持続感染 マウス神経 芽細胞腫 Neur02a(N2a)を用いて、プリオ ン の 増 殖 に 関 連 す る 宿 主 因 子 お よぴ 細胞 内 環境 の同 定 を試 みた 。
第1章 では、プ リオン持 続感染N2a細 胞における蛋白分解酵素抵抗性PrP(PrP―res)の量的変 動につい て解析し た。プリ オン持続 感染N2a細胞のPrP―res量は一定ではなく、継代後48時 間で最初 の量の50％ 程度に減 少し、継 代後72時間 から96時間で 元の量まで回復した 。 プリ オ ン 持続感染 N2a細胞とプリ オン非感 受性細胞 との共培 養の結果 から、細 胞密度お よび細胞 間の直接接触がPrP―res量の変動の一要因であることが示唆された。細胞のコレ ステロー ル量と局 在は、PrP‑resの 生成に影響することが知られているが、これらが細胞 密度依存 的に変化 すること を見出し た。従っ て、細胞密 度依存的 に変化する細胞内の微 小環境が 、PrP・resの生 成に影響 すること が示唆さ れた。
第2章で は 、PrPs。 の生成に おけるエン ドソーム の酸性化 の関与に っいて検 討するた
め に 、 エ ン ド ソ ー ムの 酸 性化 に 関 与す る Clc‑5の 遺伝 子 発 現を siRNAに よ り抑 制 し 、PrP‑res生 成へ の影響 を調べた 。Clc‑5の発現抑 制により 、プリオ ン持続感 染N2a細胞のPrP‑res量は 、陰性対 照の40％程 度にまで 減少した 。予想に 反し、Clc‑5の発現抑制により、 エンドソ ーム又は ライソソ ームと考 えられる 小胞の酸陸 化は亢進 したが、このことはPrP‑res量 の減少の 主要因で はなかっ た。一方、Clc‑5の発現を抑制したN2a細胞では、陰性 対照と比 べてトラ ンスフェ リンの細 胞内輸送 が遅く、細 胞内コレ ステロールの分布
お よ ぴり サ イ クリング エンドソー ムのマー カーであ るrabllの局在 が変化し ていた。 これら の変化は 、エンド ソーム‐ リサイク リング経 路の障害を 示唆する ことから、エンドソ ー ム ー リ サ イ ク リ ン グ 経 路 は PrPs。 の 生 成 に 関 与 す る と 考 え ら れ た 。

本研究では、PrPs。の生成に、（i）細胞密度および細胞同士の接触によって調節される細胞 内微 少環境、および(ii)エンドソームーリサイクリング経路、が関与していることを明 らか にした。本論文で得られた結果は、プリオンの増殖機構をより詳細に解き明かして いく 上で有用であり、研究成果は博士の学位を授与するに相応しいと考えられる。
よっ て、 審査 委員一 同は 、上 記博 士論文 提出 者中 満智 史氏の 博士 論文 は、北 海
道大 学大 学院 獣医 学研 究科 規定 第， 6条の規定による本研究科の行う博士論文の審査等に合格と認めた。