博士（獣医学）佐倉康文
学位論文題名
遺伝子組換え型ヒト・インターロイキン‑2のマウスにおける抗腫瘍作用の形態学的研究― 特 に 大 型顆 粒 細 胞 を中 心 に して―
学位 論 文 内 容の 要 旨

インターロイキンー2（ILー2）はT細胞から産生される分子量約15，O00の蛋白質で、リンホカインの一種である。近年、遺伝子工学技術の発 達 に よ り 、 ヒ ト ILー 2の complementaryDNAが単 離 され 、遺 伝 子
組み換え型ヒトILー2（rIL―2）の大量生産が実現した。このrIL−2は人の悪性腫瘍の治療に試みちれ、現在までに腎窟、黒色腫および血管内皮腫に対し臨床的な治療効果が認められている。しかし、その作用機序は解明されていない。
本研究ではrIL−2の抗腫瘍作用の機序を解明するために、正常マウス、腫煽移植マウス、および腫蕩移植ヌードマウスにおけるrIL−2の作用を形態学的に検，索した。この中で、特にrILー2
投与によってマウス の 組織 に出 現 する 大型 顆粒 細胞 に 注目 して 研究 を 行っ た。
｜第I章では、マウスの移植腫蕩であるColon26結腸癌（腫湯）に対する、rIL‑・2の抗腫瘍作用を組織学的に検索した。実験はColon26腫協をIl班のBAIJB/cマウスに皮下移植し、腫瘍移植7口後からマウスにf．IL‑‑2を、1口1回、2―10日間にわたり、筋肉内投与して行った。
また、遺伝子組換え型ヒト・インクーフェロン，−ばA/D（rIFN‑ぱA/D）を、単独あるいはrIL−2と併用投与し、それらの抗腫瘍作用も検索しI 、た。臘顔移植マウスは薬剤の投与開始2、，6、10および14日後に剖検し、腫蕩を組織学的に検索した。

rIL―2または rIFN‑ばA/Dを単独投与したマウスの腫煽の発育は、投 与6日後以 降（薬剤投与14日後まで 観察）に抑制され 、rIL−2とrIFN‑ぱA/Dを併用投 与したマウスの腫瘍の発育は停止した。組織学的には、投与日数に比例して、各薬剤投与群の腫蕩組織の壊死が拡大し、同時に直径15−30〃mの大型顆粒細胞の浸潤が多く認められた。
両者の程度は併用投与群においてより顕著であった。大型顆粒細胞の出現状況は、腫瘍重量の減少と良く相関し、この細胞の抗腫蕩作用への 関与が示唆された 。大型顆粒細胞は、好酸性で過ヨウ素酸シッフ（ PAS）陽性の円 形顆粒を細胞質内に 多数有し、免疫組 織化学的には、T細胞の分化抗原であるThy―1陽性、Lyt−1およびLytー2陰性、B細胞の分化 抗原であるIgG陰性を示した。この細胞は超微形態学的には、高電子密度の円形顆粒と発達したゴルジ装蓮ならびに粗面小胞体を持っていた。これらの，表面抗原の性状および超微構造の特徴は、ILー2を含む培養液で継代されている大顆粒リンパ球様細胞と酷似していた。この大型顆粒細胞は、胸腺細胞以後の分化段階のT細胞に存在するLytー1およびLytー2陰性を示したので、naturalkiller（NK）
細 胞由来のlymphokine activated killer（LAK)丶細胞と考えられた。
第II章では、大型穎粒細胞の由来を検討するために、ヌードマウスにマウスの血管内皮腫由来の培養細胞株D14を移植し、rIL−2の抗腫煽作用を組織学的に検索した。実験はD14細胞を雌のBALB/c由来ヌーJ
ド マウスに皮下移植 し、rIL−2を1日1回、腫瘍移植28日後から35日間にわたり、腫瘍周辺部皮下に投与して行った。マウスは薬剤の投与開始35日後に削検し、腫煬、脾臓および骨髄を組織学的に検索した。
rILー2を投与したマウスの腫瘍の発育は、薬剤の投与開始12日後から抑制され、剖検時の腫瘍重量は対照群の約1/4であった。組織学的には、rIL―2を投与レたマウスの腫瘍組織内に、Thy−1陽性の大型顆粒細胞と核崩壊を示す腫瘍細胞が増数していた。大型顆粒細胞の表面
抗原性状、組織学的特徴および超微形態学的特徴は、第1章で示した大 型顆粒細胞のそれ と一致していた。大型顆粒細胞には、NK細胞マーカーのーつ．であるasialo GM1陽性を示唆する所見も認められた。
rIL―2を投与した腫蕩移植マウスの脾臓には、大小不同のThy―1陽性
細 胞 の 顕著 叔増加 がみら れ，少 数の 大型顆 粒細胞 も認め られた 。
以上のように、腫瘍の増殖がrIL一2の皮下投与により抑制され、腫瘍 組 織 には 第I章でみ られた と同一 の大 型穎粒 細胞、 すなわ ちLAK様細胞の浸潤が認められた。特に、大型顆粒細胞が腫瘍細胞の崩壊に重要な役割を演じている所見が注目された。この細胞反応はヌードマウスで生じたこ′とから、大型穎粒細胞はNK細胞に由来する細胞と考えられた。
第 I章 お よ び 第 u章 で 、 大 型 顆 粒 細 胞 が NK細 胞 由 来 の LAK細 胞である可能性が強く示唆されたことから、第m章では、抗原感作を行っていない正常マウスにrIL−2を投与し、大型顆粒細胞の出現の有無について検討した。実験は雌のBALB/cマウスの腹部皮下に、rIL−2を1日1回、10日間連続投与して行った。また、同様のマウスの背部皮下にrIL一2を6日間徐放投与した。
rILー2を皮下投与したマウスの脾臓および投与部皮下組織には、少数ではあるが大型顆粒細胞が認められた。一方、rIL−2を皮下に徐放投与したマウスの牌臓、骨髄および投与部皮下組織には、多数の大型顆粒細胞が認められた。投与部皮下組織にはりンパ様細胞の浸潤も認められた。これらの大型顆粒細胞は、第I章およびH章の実験でみられた大型顆粒細胞と同一の形態的特徴を示した。
以上のように、抗原感作を行っていない無処置マウスにrILー2を投与しても、脾臓、骨髄および投与部皮下組織に大型顆粒細胞の出現することが確認された。また、この出現には、体内におけるrIL―2濃度の維持が重要であることが示唆された。
第IV章では、大型顆粒細胞の細胞傷害活性について、2種の腫瘍細胞を用いて検討した。実験はrIL−2の徐放投与7日後にマウスを屠殺し、脾臓細胞を採取して行った。最初に、採取レた脾臓細胞の表面抗原性状をフローサイトメト．リーにより解析した。この結果、rILー2を徐放投与したマウスからの脾臓細胞には、Thyー1陽性の大型細胞が増数していたが、Lytー1、Lyt−2およびIgG夫々の陽性細胞には変動は超かった。一方、同一の脾臓細胞中にはLyt―1、Lyt−2およびIgG夫々の陰性大型細胞が増数し、それらの比率は、Thy−1陽性の大型細胞の比率とほぱ同一であった。したがって、Thyー1陽性の大型細胞は、Lyt−1、Lyt−2およびIgG陰性とみなされた。この脾臓細胞からThyー1陽性の大型細胞を分離した結果、その多くが大型顆粒細胞の形態を示していた。次に、rILー2を徐放投与したマウスの脾臓細胞の細胞傷害活性を、sICrで標識したYAC−1細胞ならびにMethーA細胞を標的細胞に用いて検索した。rILー2を徐放投与したマウスの脾臓細胞は両標的細胞に対し強い傷害活性を示レた。また、分離したThy―1陽性の大型細胞は、Meth−A細胞に対し、分離前の脾臓細胞より強い細胞傷害活性を示した。
以上の研究から、rIL−2を腫瘍移植マウスに投与した結果、NK細胞 由来 のLAK細胞 と考え られる 大型顆粒細胞が腫瘍組織内に誘導され、この細胞が抗腫瘍作用に大きく関与していることが示された。また、rIL−2を無処置の正常マウスに投与した場合においても、大型顆粒細胞は出現し、この細胞は非特異的な強い細胞傷害活性を持っていることが示された。

学 位 論 文 審 査の 要旨

主査 教授
副査 教授
副査 教授
副査 教授

板倉智敏
杉村 誠
佐藤文昭
小沼 操

学位論文題名遺 伝 子 組 換 え 型 ヒ ト ・ イ ン タ ー 口 イ キ ン ‑2のマ ウ ス に お け る 抗 腫 瘍 作 用 の 形 態 学 的研 究― 特 に 大 型 顆粒 細 胞を 中心 にし て一遺 伝 子 工学 技 術 の発 達 によ り 大 量に 生 産さ れ る よう に なっ た ヒ トの インク ー
口 イ キン ー 2 (rIIーー 2）に は 、 抗 腫瘍 性 のある ことが 指摘さ れてい る，， 1・｜1,iij者 tま、マ ウ ス の 実 験 的 腫 瘍 に 対 す る rIL― 2の 抗 腫 瘍 作 用 を 形 態 学 的 に 訓 べ 、 本 論 文をまとめた。
ゴ泣初に、rl
L一2のむヒJJ岨瘍．ヒl三を、マウスの移縦iJ亅亜瘍であるCく）1川126春；SJ亅坊j齲にっいて 検索した） 抗 腫 瘍 性 は rII,― 2の 投 与 日 数 と 共 に 現 れ 、 形 態 学 的 に は J亅 亜

D3ritn織 の 壊 死 で 示 さ れ た 。 壊 死 組 織 に は 、 好 酸 性 の 大 型 顆 粒 を 有 す る 直 径 15ー
30#mの 荊 II胞 浸 irI!が 特 に 注 目 さ れ た 。 こ の 細 胞 は 、 免 疫 組 織 化 学 的 並 び に 超 微形 態 学 『 r、 Jに 解 析 し た 結 果 、 natural killer(NK） 荊 ‖ 胞 山 来 の lymphc)kinc acti‑vat
cd killer（1，AK)
荊Il胞と考えら．れた。
次 に 、 マ ウ ス の I(IL管 内 皮 ‖ 亜 由 来 の 培 養 細 胞 株 Dl4を ヌ ー ド マ ウ ス に 移 楢 し 、こ れ に 対 す る rIL− 2の 抗 ‖ 亜 瘍 性 を 検 索 し た 。 そ の 結 果 、 抗 臚 瘍 性 が み ら れ 、:f.LI織 学的には ヵ百liLJLの大型 顆粒;f:lllJJ
包が腫瘍細胞の崩壊に重要な役！川をfi！じている像 が 所 見 さ れ た r こ の よ う に 大 型 願 粒 翁 ‖ 胞 反 応 が ヌ ー ド マ ウ スに お い て も生 じたことから、この%‖胞はNK細胞由来と考えられた。
さ ら に 、 抗 原 感 作 を 行 っ て い な い 無 処 避 マ ウ ス に rll」 ― 2を 投 与 し た 結 果 、J亅illkYt,、骨髄、rI
I，ー2投与部皮下組繊に大型顆粒荊Il胞が出現した。また、rllーー2を 徐 放 投 与 し た マ ウ ス か ら 牌 臓 細 胞 を 採 取 し 、 こ れ よ り 大 型 顆 粒 !f:III胞 が 分 離 で′きた。この分iv
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胞は、5ICrで標識したマウスリンパJJi
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以上のように、「11i肖者はrll，−2の抗臓瘍効果について、NK
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細 胞 と 考 え ら れ る 大 型 顆 粒 細 胞 の出 現を 指摘 し、 この 細胞 の非特 興的 な強 い細胞 傷 害 性 を 明 ら か に し た 。 こ の 成 果 は 、 rIL− 2の 作 用 機 序 の 解 明 に 大 き く 貢 献す る （ ） よ っ て 擶 査 員 一 I司 は 、 佐 倉 康 文 氏 が f噂 士 （ 獣 医 学 ） の 学 位 を 受 け る に十分な資格を有するものと認めた。