（0140）原位置浄化による油分解微生物量の変化と最大分解能力の検討○打木弘一 1・西島正範 1・田村正嗣 1・原 学 1・宋 德君 2・伊藤恵輔 1
1
基礎地盤コンサルタンツ㈱・2㈱アイ・エス・ソリューション
１．はじめにバイオレメディエーションによる浄化は、浄化の進行に伴う対象物質の土壌及び地下水のモニタリングだけでなく、分解微生物のモニタリングを継続的に行うことにより、微生物量及び地下環境の変化に応じた適切な現場対応が浄化の進行に大きく影響する。
一般的に分解微生物のモニタリングは、総菌数調査及び遺伝子解析等で行うが、総菌数調査では分解微生物の分離はできず、遺伝子解析では特定の分解微生物を定量することはできても、分解微生物群集として定量することは労力が大きく現実的でない。微生物のキノンプロファイル法によるキノン分析は、分解微生物群集のキノン種がわかれば、推定される分解微生物の有無を把握することができ、キノン量を定量することにより遺伝子解析の定量から比べると精度は低いものの、手軽に分解微生物の量の変化も把握することができる。
今回、バイオスティミュレーションによる油含有土壌・地下水の浄化サイトにおいて、浄化の進行に伴う原位置油分解微生物のモニタリングを行った。微生物のモニタリングは、浄化の進行に伴い土壌のキノンプロファイル法によるキノン分析を行い、キノン量を定量した。キノン種ごとのキノン量を油分解微生物量と読み替え、浄化の進行に伴う変化について検討したので、その結果を報告する。
２．浄化サイトの状況
浄化サイトは、海岸低地の旧海浜沿いの標高約 2.0 ｍの平坦地で、西方向海側へ約 500 ｍは埋立地になっていて、東方向山側へ約 250 ｍには河川がある。地質は、深度-5.00 ｍまでは一部にシルトの薄層を挟む砂地盤の沖積層で、地表部は厚さ約 0.5～1.0 ｍの礫混じり砂質土で造成されている。地下水位は、GL.-2.5 ～-3.5 ｍ付近にある。
浄化対象範囲は、Ⅰ工区が約 500 ㎡、隣接するⅡ工区が約 250 ㎡であり、それぞれ油分の漏えい箇所及び時期が異なる。Ⅰ工区は、2012 年 10 月頃に地上タンクからつながる地中埋設配管の老朽化により灯油が地盤への流出がわかった。Ⅱ工区の灯油の流出は、Ⅰ工区の調査で新たに見つかったもので、別の地下タンクからつながる地中埋設配管の老朽化により、灯油が地盤に流出していたことがわかり、流出時期は不明である。灯油の流出量は、最大 1,900 L と推定されている。
浄化対象深度は、Ⅰ工区は地下水位付近から下の深度 2.5 ～3.2ｍにあり、Ⅱ工区は地下水位を中間に深度 2.0 ～3.5 ｍであり、Ⅱ工区はⅠ工区に比べ浄化対象厚さが厚い。土壌油分（TPH）は、最大 49,860 mg/kg で、地下水の油分(TPH)は、1,232 mg/L であった。
また地下水の下流側にあたる敷地境界には、拡散防止のための遮水矢板が施工され、地下水の流れが東向きから北向きに変わった。
３．浄化方法
浄化工法はバイオスティミュレ
図-1 自動浄化システムーション工法で、図-1 に示すようStudy of oil cracking ability and change of oil degrading microorganism amount in situ remediation site
Koichi Utsugi1, Masatsugu Tamura1, Masanori Nishijima1, Hara Manabu1, Hisashi Hoshiyama1, Keisuke Itou1(1 KISO-JIBAN Consultants, 2 In Situ Solutions)
連絡先：〒135-0016 東京都江東区東陽 3-22-6 基礎地盤コンサルタンツ(株) 環境技術センター
TEL 03-5632-6827 FAX 03-5632-6816 Email utsugi.koichi@kiso.co.jp

表-1 油分解微生物の属種と保有キノン量に揚水した地下水の油膜を除去し、油分ナノ分解
保有キノン種
分解対象
微生物属と種微生物栄養剤の溶液を添加したナノバブル水を地Acinetobacter
Q-8
中に注入し、原位置の油分解微生物を活性化させPseudomonas
Q-9
ユビキノン
油分を分解・浄化する方法で実施した。
yeast
Q-10
Rhodococcus sp.
Q-10(H2)
浄化効果を確認するためにⅠ工区には、管理孔芳香族またはMycobacteriumsp.
MK-7
1 及び管理孔 2 を設置し、Ⅱ工区には管理孔 3 及脂肪族炭化水素
ArthrobacterMK-8(H2)
び管理孔 4 を設置したほか、最大油分濃度が確認
Sphingomonas spp メナキノン MK-8(H4)された観測井戸 7 もモニタリング孔とした。
Bacillus sp.
MK-9
NocardiaMK-9(H2)
不飽和帯は、地表部から、油分ナノ分解微生物栄養剤の溶液を添加したナノバブル水を地表部注入孔及びトレンチから自然浸透させた。浄化期間は、10 ヶ月間で、土壌油分（TPH）は、最大 120 mg/kg で、地下水の油分(TPH)は、1.3 mg/L まで低下した。
４．油分解微生物のキノン種とキノン量の深度分布
油分解微生物のキノン種を表-1 に示す。一
表-2 浄化開始前の油分及び油分解微生物群のキノン量
総キノン量 油分解菌キノン量
TPH分析結果
般的にユビキノンは好気性微生物で、メナキ
GL.-(ｍ）
油臭油膜(umol/kg)(umol/kg)(mg/kg)
ノンは嫌気性微生物である。
1.0ND
000.0690.035
管
油分解微生物は、ユビキノンで 4 種、メナ
2.0
ND000.0760.027
理2.79050
310.1390.071
キノンで 5 種が確認されている。6）孔
3.5ND
000.0440.019
1
浄化開始前の深度方向の油分濃度及びキノ
5.0
ND000.0050.003
ン量は、表-2 及び図-2 に示すように特定の深1.0ND000.0420.015
管度で土壌油分（TPH）及び油分解キノン量が2.0ND
000.0080.004
理2.57370
310.275
0.145
増加しており、この深度付近には地下水位が孔
3.5ND
000.0060.0032あり、油分（TPH）濃度も高い傾向にある。
5.0ND
000.0190.008
油分解微生物のキノン量の増加する深度の1.0
50
000.0530.03
管
キノン種は、図-3 に示すように油分解微生物
2.0ND
000.3650.224
理
2.5102104
10.7910.621のキノン種 Q-n9、Q-n10、MK-n7、MK-n8(H2)、 孔
3.55290410.0410.023
3MK-n8(H4)、MK-n9 及び MK-n9(H2)が存在す5.0ND
000.0040.002
ることがわかった。地下水面付近の油汚染土
1.0ND
000.0410.018
管2.0ND
000.0120.007
壌では、好気性菌の保有する Q-n9、Q-n10 及理
3.018090
410.210.148
び MK-n7、MK-n8、MK-n9、MK-9H2 等の油孔
4.0ND000.0270.005
4
分解菌保有キノン種が優占種であった。
5.0ND
000.0160.001※ N.D.とは定量下限値未満を表す

0.10

0.20

0.00
00.30

0.10

0.20

0.00
00.30

0.20

0.40

0.60

0.00
00.80

-1-1-2-2-2-2-3-3-5-5キノン総量キノン総量

油分解菌キノン量

油分解菌キノン量管理孔１-5

管理孔20.100.200.30-3-4キノン総量-5キノン総量
油分解菌キノン量

油分解菌キノン量-6-6-6-6-3-4-4-4深度（GL-ｍ）-1深度（GL-ｍ）-1深度（GL-ｍ）

深度（GL-ｍ）

0.00
0

キノン量（umol/kg）

キノン量（umol/kg）

キノン量（umol/kg）

キノン量（umol/kg）

管理孔3

図-2 深度方向の油分解微生物群のキノン量の変化

管理孔4キノン量(umol/kg)

キノン量(umol/kg)
0.00

0.02

0.04

0.06

キノン量(umol/kg)

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40

キノン量(umol/kg)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

キノン種

Q-n7
Q-n8
Q-n9
Q-n10
Q-n10(H2)
MK-n6
Mk-n7
MK-n7(H2)othersMK-n7(H4)MK-n8
MK-n8(H2)other1other2MK-n8(H4)MK-n9
MK-n8(H6)MK-n9(H2)NEW
MK-n9(H4)MK-n10MK-n9(H6)MK-n10(H2)MK-n9(H8)MK-n10(H4)MK-n11othersMK-n10(H6)MK-n10(H8)MK-n12

MK-管理孔1管理孔 1
GL.-2.7ｍ
GL-2.7m

管理孔 2
MK-管理孔2GL.-2.5ｍ
GL-2.5m

管理孔 3MK-管理孔3GL.-2.5ｍ
GL-2.5m

管理孔 4MK-管理孔4GL.-3.0ｍ
GL-3.0m□：油分解微生物のキノン種
図-3 浄化開始前の各管理孔の地下水位付近の深度のキノンプロファイルの測定結果

土壌油分TPH（mg/kg)

５．油分解微生物群のキノン量の変化
浄化開始は、6 月初旬から開始し、土壌油分のモニタリングは、11 月までは 2 ヶ月に 1 回の頻度で、11 月以降は 1 ヶ月に 1 回の頻度で実施し、地下水の油分のモニタリングは、1 ヶ月に 1 回の頻度で実施した。
土壌油分（TPH）及び油分解微生物のモニタリングは、管理孔等を中心に約 0.5ｍ程度の離れた四方でボーリングまたはハンドオーガーで土壌試料を採取した。採取深度は、浄化開始前の管理孔設置時に深度方向調査で最も土壌油分濃度の高い深度付近で、油臭が強い土壌試料を採取した。
油分解微生物群のキノン種ごと
30,000のキノン量は、表-3 及び図-5 に2013年4月30日
示すように、浄化開始後の土壌油
2013年7月9日
分濃度の増減の繰り返しは、管理2013年9月12日
孔周辺の土壌油分の不均質を示す
2013年11月8日
2013年12月10日
ものと思われるが、浄化期間の経20,000
2014年1月15日
過に伴い土壌油分濃度は低下し、2014年1月31日
浄化開始前には最大 49,680 mg/kg
2014年2月13日
線形 (2013年4月30日)
あった土壌油分（TPH）が浄化開
線形 (2013年7月9日)
始 後 約 8 ヶ 月 後 に は 最 大 120
10,000線形 (2013年9月12日)
mg/kg まで低下した。
線形 (2013年11月8日)
線形 (2013年12月10日)
油分解微生物群のキノン量は、
線形 (2014年1月15日)
浄化開始後、しだいに増加しピー
線形 (2014年1月31日)
クに達すると土壌油分の低下とと線形 (2014年2月13日)
0もに減少する傾向にある。
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
油分解菌キノン量（μmol/kg)
また油分解微生物のキノン種別にキノン量の変化を比較すると浄図-4 土壌油分と油分解微生物量との関係

化開始後にユビキノン Q-8 の増加が顕著に認められ、主にユビキノン Q-8 を保有する Acinetobacter 属の増殖が土壌油分の低下に貢献したものと考えられる。
ユビキノン Q-8 のキノン量は、管理孔 3 では概ね 3 ヶ月後、管理孔 4 では概ね 2 ヶ月後、観測井戸 7 では概ね 1 ヶ月後に増加のピークが来ており、管理孔 4 及び観測井戸 7 は油分解微生物のキノン量の増加に伴い、土壌油分は顕著に低下した。
土壌油分と油分解微生物量との関係は、図-4 に示すように全体的には土壌油分 TPH が大きいと油分解微生物のキノン量も多い傾向にあり、油分濃度が高い土壌に油分解微生物が多く生息していることがわかる。浄化が進行している期間では、線形近似線は同じような傾きを持っていることから、土壌油分濃度に応じて油分解微生物の生息量が制限されていることが予想され、その生息量は油分解微生物のキノン量に置き換えると最大2.0 μmol/kg 程度と考えられる。
これらのことから最大キノン量になるように油分解微生物を増殖させるための現場管理が効率的で効果的な浄化につながるものと考えられる。

表-3 土壌油分と油分解微生物のキノン種ごとのキノン量の変化
地点

油分解微生物のキノン種

Q-8
Q-9
Q-10
Q-10（H2)
MK-7
管理孔1MK-8（H2)
GL.-2.7m
MK-8(H4)
MK-9MK-9(H2)

油分解微生物の種類

Acinetobacter
Pseudomonas
yeast
Rhodococcus sp.
Mycobacterium sp.
Arthrobacter
Sphingomonas spp
Bacillus sp.
Nocardia計
油分（TPH）mg/kg
Acinetobacter
Q-8
Pseudomonas
Q-9
yeast
Q-10
Rhodococcus sp.
Q-10（H2)
Mycobacterium sp.
MK-7
管理孔2
ArthrobacterMK-8（H2)
GL.-2.5m
Sphingomonas spp
MK-8(H4)
Bacillus sp.
MK-9
NocardiaMK-9(H2)
計
油分（TPH）mg/kg
Acinetobacter
Q-8
Pseudomonas
Q-9
yeast
Q-10
Rhodococcus sp.
Q-10（H2)
Mycobacterium sp.
MK-7
管理孔3
ArthrobacterMK-8（H2)
GL.-2.5m
Sphingomonas spp
MK-8(H4)
Bacillus sp.
MK-9
NocardiaMK-9(H2)
計
油分（TPH）mg/kg
Acinetobacter
Q-8
Pseudomonas
Q-9
yeast
Q-10
Rhodococcus sp.
Q-10（H2)
Mycobacterium sp.
MK-7
管理孔4
ArthrobacterMK-8（H2)
GL.-3.0m
Sphingomonas spp
MK-8(H4)
Bacillus sp.
MK-9
NocardiaMK-9(H2)
計
油分（TPH）mg/kg
Acinetobacter
Q-8
Pseudomonas
Q-9
yeast
Q-10
Rhodococcus sp.
Q-10（H2)
Mycobacterium sp.
観測井戸 MK-77
ArthrobacterMK-8（H2)
G.-2.7m MK-8(H4)Sphingomonas spp
Bacillus sp.
MK-9
NocardiaMK-9(H2)
計
油分（TPH）mg/kg

キノン種ごとのキノン量(umol/kg)
浄化開始
浄化開始
浄化開始
浄化開始
注入孔の浸透トレンチ等
浄化開始
約1ヶ月後
約3ヶ月後
約5ヶ月後
約6ヶ月後
増加後の追加後
約8ヶ月後
2013年4月24日 2013年7月9日 2013年9月12日 2013年11月8日 2013年12月10日 2014年1月11日 2014年1月31日 2014年2月13日
0.00050.24940.1316
0.09640.05180.01230.12400.05570.00660.02170.01580.00950.00540.00790.01220.00730.03150.1601
0.09750.04120.03250.02710.10050.03910.00000.00060.00050.00070.00040.00110.00030.00280.01090.03020.02050.01510.01710.00820.01850.00500.00600.00560.00570.00700.00740.00220.00590.00250.00590.01890.00570.00220.00170.02680.00400.00120.00770.01460.00900.0080
0.00750.00480.00830.00260.00150.00140.00000.00170.00410.00090.01150.00260.0706
0.50240.28630.18180.12800.09130.28530.11889,050
14,5002,750
11,360
1,800
1,570
1,000
10
0.00170.13670.19370.30630.17530.15030.49820.10550.01390.01000.01950.01930.04010.02840.13500.01830.07320.08030.08630.12060.0401
0.06230.09260.02580.00030.00110.00110.00230.00080.00150.00100.00060.02080.02330.02530.02560.01930.03510.02460.01780.01810.02050.01000.01190.00840.02920.01410.00660.00110.00770.00570.00350.00200.00350.01600.00080.01510.01180.01060.01340.00710.01840.01680.00760.00120.00040.01320.00880.01090.06600.07260.00020.14540.29190.36540.51170.30400.39460.87090.1831
7,370
14,3309,060
21,480
3,000
2,640
230
10
0.01080.36971.28031.39030.9959
0.61870.89090.44120.04140.03830.05810.07580.06220.07580.14940.05030.10650.11550.06970.10240.07980.07870.07910.05980.00030.00210.00290.00720.00640.00120.00410.00070.04030.02160.04530.03650.0271
0.02240.02270.01780.04580.00640.02800.03320.01740.01120.01500.00660.02380.01220.04010.02980.02920.01520.03350.00080.04890.04180.05600.03630.02990.0397
0.03610.00760.30300.04780.32650.16180.15420.07180.12320.00020.62080.65541.90691.87331.40200.93471.35400.585010,21015,4009,230
17,1506,730
12,7901,090
1200.0022
1.19561.36740.21610.17380.08890.05200.02220.06590.08750.01580.01030.00480.00360.07030.08680.10260.02830.01230.00650.00370.00000.00470.01330.00200.00030.00030.00010.01920.0436
0.03680.01950.01400.01290.00920.00670.02410.03390.00940.00430.00240.00190.00410.0276
0.03860.00310.00130.00070.00060.00960.04280.04270.01210.01300.01000.00660.01420.00030.13620.01380.01200.01030.00690.1485
1.49151.85910.32000.24120.13680.084618,09011,9509,410
10,6402,800
13,570810
90.62090.61490.44230.37840.35180.30630.58780.02910.04060.03060.02300.02160.01460.04030.06040.08490.07290.08090.0427
0.03630.07690.00030.00260.00060.00000.00000.00030.00070.01890.01450.01280.01540.00190.00700.01240.02350.01220.00800.02850.01240.02000.00720.00750.00460.00120.00460.00190.00900.00160.01460.02500.01020.04120.00840.01300.00990.08140.03070.01380.05250.02500.03130.02080.85660.83000.59250.62440.46570.43780.7577
49,68025,63027,66017,3502,400
11,4701,790
9
汚染後の自然状態

キノン量(umol/kg)

2.50

Q-9

40,0001.50

30,0001.00

20,0000.50

10,0000.00
2013年4月6日

0MK-9(H2)
油分（TPH）mg/kg

50,000

Q-8

2013年7月5日

2013年10月3日

2014年1月1日

管理孔2 GL.-2.5m

Q-10
Q-10（H2)
MK-7
MK-8（H2)
MK-8(H4)
MK-9

Q-9

2.00

40,0001.50

30,0001.00

20,0000.50

10,0000.00
2013年4月6日

0MK-9(H2)
油分（TPH）mg/kg

50,000Q-82.50

2013年7月5日

2013年10月3日

油分：TPH（mg/kg)

キノン量(umol/kg)

Q-82.00

2.50

2014年1月1日

管理孔3 GL.-2.5m

Q-10
Q-10（H2)
MK-7
MK-8（H2)
MK-8(H4)
MK-9

Q-9

2.00

40,0001.50

30,0001.00

20,0000.50

10,0000.00
2013年4月6日

0MK-9(H2)
油分（TPH）mg/kg

50,000Q-8

2.50

2013年7月5日

2013年10月3日

油分：TPH（mg/kg)

キノン量(umol/kg)

50,000管理孔1 GL.-2.7m

油分：TPH（mg/kg)

６．まとめ
土壌・地下水の油分浄化サイトで、油分解微生物群のキノン種とキノン量の変化から、同サイトでの油分解微生物群の最大分解能力がキノン量で評価できる可能性があることがわかった。
バイオレメディエーショ
ンによる土壌地下水浄化は、分解微生物の活性化を簡易な方法でモニタリングしていくことが重要である。
分解微生物のキノン分析によるモニタリングは、微生物群集の変化がわかり、キノン量を微生物量に置き換えることにより、分解能力を推定できる有効な手法と考えられ、多くの浄化サイトで事例を収集し、バイオレメディエーションでの有効な微生物管理手法に活かしたい。

Q-10
Q-10（H2)
MK-7
MK-8（H2)
MK-8(H4)
MK-9

2014年1月1日

キノン量(umol/kg)

油分：TPH（mg/kg)

キノン量(umol/kg)

油分：TPH（mg/kg)

管理孔4 GL.-3.0m[参考資料]
Q-9
2.00
40,000Q-101) Katayama A, Fujie K
Q-10（H2)
30,0001.50(2000): Characterization
MK-7of soil microbiota with
1.00
20,000MK-8（H2)
MK-8(H4)quinoneprofile.
In:
0.50
10,000MK-9Bollag JM, Stotzky G
MK-9(H2)
0.00
0(eds) Soil Biochemistry.
2013年4月6日
2013年7月5日
2013年10月3日
2014年1月1日
油分（TPH）mg/kg
Vol. 10. Marcel Dekker,
2.50
50,000Q-8
観測井戸7 GL.-2.7m
New York, pp303-347.
Q-9
2.00
40,000Q-102) 片山新太(2000)：土壌中
Q-10（H2)
30,0001.50の農薬分解に関与する
MK-7
1.00
20,000MK-8（H2)
微生物群の構造と挙動,
MK-8(H4)
日 本 農 薬 学 会 誌 , 25,
0.50
10,000MK-9pp300-309
MK-9(H2)
0.000
2013年4月6日
2013年7月5日
2013年10月3日
2014年1月1日
油分（TPH）mg/kg
3) Song, D., and Katayama,A .(2005): Monitoring
図-5 キノン種ごとのキノン量の変化
microbial community in asubsurface soil contaminated with hydrocarbons by quinone profile. Chemosphere, 59(3), pp. 305-314
4) Song, D., and Katayama, A. (2010): Approach for Estimating Microbial Growth and the Biodegradation ofHydrocarbon Contaminants in Subsoil Based on Field Measurements: 1. Model Development and Verification,Environ. Sci. Technol. 44, pp767–773
5) Song, D., Kitamura, M. and Katayama, A. (2010): Approach for Estimating Microbial Growth and the Biodegradationof Hydrocarbon Contaminants in Subsoil Based on Field Measurements: 2. Application in a Field Lysimeter Experiment,Environ. Sci. Technol. 44, pp6795–6801
6) 宋德君・田村和嗣・打木弘一・原 学・西島正範 (2012): 栄養塩注入に伴う油汚染サイトの微生物分解容量の変化, 第 18 回地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会 講演集,pp529～532