ナノパルスレーザによる骨組織適合型インプラントの創製
東北大学大学院 工学研究科
准教授 水谷正義（平成 23 年度一般研究開発助成 AF-2011212）
キーワード：インプラント，チタン，レーザ照射，表面改質，生体適合性

１．緒 言

細胞が選択的に接着し，増殖しやすいことを報告している．

近年，欠損した歯に対する治療法の一つとしてデンタル

Lawrence ら 6）は Ti の酸化皮膜の存在によって濡れ性の向インプラントが注目を集めている．同インプラントの骨埋上した表面が仮足の伸展を促し，細胞の増殖に有利である入部である人工歯根は本体に切られたねじによって初期ことを報告している．また，酸化皮膜に存在する OH 基の固定力を得るが，その後歯槽骨と堅密に接着することによ

量が多いほど，播種した細胞は増殖しやすくなることが報って完全に固定される．そのためデンタルインプラントを告されている 7）．表面の濡れ性の向上や，OH 基量の増加

用いた治療では機能性，審美性について良好な回復が期待

は骨芽細胞の骨生成活性も向上させる 8）．酸化皮膜に加えできる．また，近年の本治療法では 10 年後のインプラン

数百 nm から数m オーダの凹凸が存在する場合も，骨芽ト生存率が 90%以上であることが報告されており 1），治療細胞の骨生成活性が向上する 9）．一般的に骨生成活性が向成績も優れている．そのため，デンタルインプラントの利上した骨芽細胞は増殖性が低下するが 10），表面の OH 基用は今後増加していくことが予想される．

を紫外線照射や水蒸気処理などで意図的に増加させた場

デンタルインプラントでは主に純 Ti および Ti 合金が用いられる．それは，疲労強度が高く人体に対する毒性が低合には，細胞の増殖性を維持しつつ骨生成活性を向上させることができる 11）．
以上のことから，骨芽細胞の増殖性と骨生成活性を向上

く，しかも耐食性に優れるためである．特筆すべき点は，オッセオインテグレーションと呼ばれる，骨に対し軟組織させる表面には微細な凹凸と酸化皮膜が不可欠である．そを介在せず接着する現象を起こすことである．このため，れらを純 Ti 表面に形成する手法として，本研究ではレーTi 系金属はデンタルインプラントに限らず，骨埋入型のザ照射に着目した．純 Ti にレーザ照射することで表面がインプラントに広く用いられる．Ti 系金属の中でも純 Ti

熱加工され，微細凹凸と酸化皮膜の両方が同時に形成されは縦弾性係数が Ti 合金より低く，人骨により近いため広ると考えられる．同表面は細胞の増殖性や骨生成活性を向く用いられている．

上させる可能性がある．

Ti 製インプラントを骨に埋入すると，まず体液中に過本報告ではマウス由来の骨芽細胞様細胞を用いて培養飽和に含まれているリン酸カルシウム類が析出する．同時試験を行った．まず，レーザ照射した純 Ti 表面におけるに骨芽細胞が空間を感知することで活性化し，骨の成分を細胞の接着状態を観察し，検討を加えた．また，MTT Assay骨とインプラントの双方の表面上で生産する．最終的に新により増殖性を，ALP（アルカリホスタファーゼ）活性の生骨が骨－インプラント間を完全に埋め，堅密な接着状態

測定により骨生成活性を評価した．

が得られる．一方でこの接着状態が得られるまでには数ヶ月間必要であるとされている．未接着である期間が長いと，２．実験方法

埋入部の骨吸収を招き，インプラントが脱離してしまう場

2・1合がある．そのため，骨との接着を早めるための表面改質供試材としては，JIS2 種の純 Ti を用いた．同材を試験片の準備15.0mm，厚さ 4mm の円盤状に機械加工し，その一方の手法が開発されている．
表面改質手法として代表的なものにハイドロキシアパ

端面を耐水研磨紙（#320～#1200）および SiO2 懸濁液を用タイトの被覆 2）や陽極酸化 3），サンドブラスト・酸エッチいて鏡面状に仕上げた（Polished シリーズ）．図 1 に装置4）などがあげられる．これらの表面改質のの外観を示す．本研究ではレーザダイオードを励起源とすング複合処理

狙いは主に二つある．一点目は体液中においてリン酸カルるナノ秒パルス Nd:YVO4 レーザを用いた．表 1 に試験片シウムを自然に析出させる性質を有すること，二点目は骨に対するレーザ照射条件を，図 2 にレーザ走査パスを示す．

芽細胞に対して無害で，かつ骨生成活性を向上させる性質

この条件でレーザ照射された試験片を Laser シリーズとすを有することである．本報告では改質した表面における骨る． 同シリーズの SEM による観察および XRD，XPS に芽細胞の挙動に着目する．

よる分析を行った．XPS 分析を行う試験片は表面への炭化Khang ら5）は異なるオーダの微細凹凸がある表面を数物の付着を防ぐため，超純水で繰り返し超音波洗浄を行っ種類作製し，その表面における細胞の接着性を評価していたうえで，超純水中に保管した．また，洗浄した Laser シる．その結果，表面に対し水平方向に数百 nm オーダ，垂リーズの試験片全体を表 2 に示す組成を有する 1.5SBF に直方向に数十 nm オーダの凹凸を有する表面において骨芽2 日間浸漬し，Laser-SBF シリーズを作製した．

－ 158 －

表12・2

レーザ照射条件

本実験では，ラットの間葉系幹細胞から分化させた骨芽レーザダイオード励起
Nd:YVO レーザ使用レーザ細胞様細胞を用いた．骨芽細胞の接着性および増殖性，骨4表2イオン生成活性を向上させる表面は自然骨との早期の接着が期

2.0mm
5.0W
50mm
10mm/s532nm

焦点ずらし量
ビーム強度
走査線の間隔
走査速度
波長
集光レンズの焦点距離
周波数
パルス幅

細胞培養試験

待できる．試験片は HCl-Tris 緩衝生理食塩水に浸漬した状態で高圧蒸気滅菌（121℃，15 分間）したものを用いた．
細胞は試験片一つ当たり 1×104cells 播種し，温度 37℃，CO2 濃度 5 %に維持されたインキュベータ内に 72 時間静置することで培養した．

150mm
40kHz
13.4ns培養後 SEM による細胞の観察，MTT Assay および ALP活性の測定を行った．なお，MTT Assay および ALP 活性の測定におけるサンプル数は n=5 とし，上記シリーズに1.5SBF のイオン組成

Well シリーズも加えて実験を行った．

イオン濃度/mmol・L-1

MTT Assay では相対的な細胞数を測定することができ

213.00
7.50
2.25
3.75
221.70
6.30
1.50
0.75

る．本実験では 4 種類の異なる数の細胞を播種したウェル

Na+K+
Mg2+
Ca2+
ClHCO3HPO42SO42励起用LDを 2 組用意し，一方を MTT Assay で，もう一方を血球計算盤で細胞数を測定することで検量線を引いた．これを用いて MTT Assay の結果を細胞数で表すようにした．
また，
ALP 活性は骨芽細胞の骨生成量と強い相関があることが知られている 15）．本研究ではその結果を細胞数で割ることにより，細胞数あたりの骨生成活性を評価した．

３．実験結果及び考察

レーザ共振器・発振器

3・1集光レンズ

レーザ照射した純 Ti の表面性状

図 3 に Laser シリーズの表面の SEM 画像を示す．同図より，Laser シリーズでは，50m おきにレーザ走査の方向に沿った数十m オーダの凹凸が形成されていることがわかる．これはレーザ照射によって基材が蒸発したためであステージ

る．同図の（d），（e）より，加工痕内側では，数m オー
ダの凹凸と 100 nm を下回るオーダの凹凸が混在した表面

/2偏光板+ビームスプリッター(ビーム強度調節)

図1になっていることがわかる．この部位における数m オー

Nd:YVO4 レーザシステム

ダの複雑な形状をした凹凸は基材の蒸発によって形成さxれたと考えられる．また，（f），（g）に示された部分では
数m オーダの凹凸に加え数十 nm および数 nm の凹凸が自己相似的に形成した表面となっている．図 3（b），（c）

加工痕の間があかないよう決定yの部分ではm 以上のオーダについて平滑であるが，数十nm オーダでは凹凸が認められる．図 3（b），（f）に示さ図2れた部分ではレーザ走査線の中心から外れているため，基走査パス材の蒸発は起きていないと考えられる．その一方，十m以上のオーダでみると平坦ではないため，基材の溶融が起各 シ リ ー ズ の 試 験 片 は 緩 衝 剤 に HCl と Tris

きているか，あるいは加工痕中心部で溶融した基材が付着（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）を用いた生理食塩水したものと考えられる．図 3（f）の部位は（d）の部位と中に保管した．これは細胞の増殖性や骨生成活性に悪影響比較して高さがあるため，溶融した基材が付着することでを及ぼす不純物の付着を防ぐためである．HCl-Tris 緩衝生図にみられる凹凸が形成した可能性が高い．このように．

理食塩水は 8.4g の NaCl と 25ml の 1 M HCl を加えた 1 リ

レーザ照射した純 Ti は数 nm から数十m オーダの凹凸がットルの水溶液に，Tris を少しずつ溶かしいれ pH7.6 に調混在した非常に複雑な凹凸を有する表面となった．前述し整することで作製した．緩衝溶液とすることで溶液を酸性たように表面凹凸のオーダによって細胞に及ぼす影響がに傾きにくくし，Laser-SBF シリーズ表面のハイドロキシ異なるが，このような表面では細胞の増殖性と骨生成活性アパタイトの溶出を防ぐ狙いがある．

がともに向上する可能性がある．

－ 159 －

図 4 に XRD 分析の結果を示す．同図より，Laser シリー
ズ表面には，ルチルおよびアナターゼ型結晶を有する TiO2が形成していることがわかる．これらの結晶構造を有する
TiO2 は OH 基と合わせ，細胞の骨生成活性向上に有効であることが知られている 12）．
次に OH 基の数は XPS によって評価を行った．図 5 に1XPS による表面の分析結果を示す．OH 基のピークは O1s軌道のピークを分離することで得られるが，通常このピークには不純物である炭化物の炭素－酸素結合のピークが2含まれている．本研究では下記の式によって OH 基の量を3算出した．

(OH)  (OH)MEAS  (C O) O  (O C  O) O(1) C (C O) (OH)MEAS(C O)O  (CH)
(CO)
(OCO)






 O (2)m(a)全体像

 C (O C  O)
 (OH)MEAS (3)(O C  O)O   (C H)  (C O)  (O C  O)  O 

本研究では OH 基のピークから不純物のピークを割合1m的に差し引くことによって本来の OH 基の量を算出した．

(b)拡大図1（×10k）100nm(c)拡大図1（×100k）

原理的には不純物のピークを O1s 軌道のピークから分離することも可能であるが，ピークの強度が相対的に小さく，分離数も多くなるため，正確に行うのは困難である．
図 6 に式（1）～（3）を用いて求めた OH 基の量を示す．
本研究で用いた方法を用いて算出した OH 基量は，不純物1mのピークが大きいほど結果は不確かになる．図 5 より両シ(d)拡大図2（×10k）

リーズの C1s 軌道のピークは O1s 軌道のピークの 10 分の100nm(e)拡大図2（×100k）

1 程度であるため，図 6 を解釈するうえでは最大 10%程度の不確かさを考慮すればよい．図 6 における二つのデータはそれ以上の差があるため，Laser シリーズ表面ではPolished シリーズより多くの OH 基が存在していることがいえる．

100nm

1m以上のことより，純 Ti 表面にレーザ照射することで複(f)拡大図3（×10k）

雑な微細凹凸と，表面に OH 基を有するルチルおよびアナ

図3

ターゼ構造の酸化皮膜が形成することが明らかとなった．

(g)拡大図3（×100k）

Laser シリーズの表面観察結果

この表面は，骨芽細胞の増殖性および骨生成活性を共に向な接着面積でも大きな接着強度が得られている可能性が上させる可能性がある．
3・2ある．Mangano ら 13）はこのような形状の骨芽細胞は高い

レーザ照射した純 Ti の表面の細胞適合性

図 7 に細胞の SEM による観察結果を示す．同図（a）よ骨生成活性を有していることを報告している．

り，Polished シリーズ表面の細胞は非常に薄く伸展しておLaser-SBF シリーズ表面では，図 7（f）に示すような加り，繊維芽細胞様になっていることがわかる．また，図 7

工痕間の凸部に密着した細胞が多いことが特徴である．図（b），（c）より Laser シリーズの表面では細胞がより立体7（g）に示した凸部以外の位置にも細胞が接着しているこ的になっていることがわかる．図中のいずれの細胞も加工ともあった．この場合，Laser シリーズ表面のものと同様，痕の底に接着せず，加工痕をまたぐようにその両岸に接着加工痕の両岸に接着していた．また，細胞を上から見た際する形となっている．図 7（e）のような山部に存在するの大きさは他のシリーズ表面上のものと比較して最も小細胞においても同様に細胞中央部は基材表面から離れてさい傾向が認められた．その一方で，図 7（f），（g）に示いる．なお，図中の位置に限らず，Laser シリーズ表面にされた細胞のように立体的な構造をとっているものが多おいて加工痕の底部に密着した細胞は確認されなかった．

かった．もう一点，Laser-SBF シリーズ上の細胞に特徴的以上のことより Laser シリーズ表面に接着した細胞は小さなことはその表面に例外なく凹凸が形成されていること－ 160 －Intensity / a.u.

(301)

020

図440602 scale

80140012001000
8006004002000100OO2-OH545540535530525
Binding energy/eV(a) Laserシリーズ：O 1s120

Laser シリーズ表面の XRD 分析結果である．図 7（h）にその様子を示す．Laser シリーズ表面の細胞は同 7（d），（e）に示すもののように表面に凹凸の80604020あるものが多数を占めていたが，同図（b）のように凹凸0の少ないものもあった．骨芽細胞や軟骨細胞などの間葉系

295

細胞の機能性が高い状態にある場合，細胞はより立体的な2500

ーズ＞Polished シリーズの順に，表面で培養した骨芽細胞

2000

ALP 活性の測定値を示す．両図のデータは検定力検定ソ
フト G*Power による検定力の事後検定によって 90％以上

Intensity / a.u.

る 14）．以上のことから，Laser-SBF シリーズ＞Laser シリ

図 8 に MTT Assay による細胞数の測定結果を，図 9 にO
O2-OH5000545

シリーズ表面で最もよく細胞が増殖し，次いで Laser シリ

Intensity / a.u.

200150100500めである 8）．逆に骨芽細胞が高い増殖性を獲得した場合，機能性を失うことになる．これは図 8，図 9 の Polished シ
リーズおよび Well シリーズにおいて顕著に表れている．
Laser シリーズ表面では Polished シリーズ表面と同程度皮膜が，骨芽細胞の骨生成活性を向上させつつ増殖を促したためと考えられる．Laser-SBF シリーズ表面（ハイドロキシアパタイト層）は骨芽細胞の骨生成活性は向上させる
ものの細胞増殖性を低下させた．ハイドロキシアパタイトは OH 基を有しているので，Laser シリーズにおける細胞全体の元素数に対するOH基の割合/%といえる．これは表面の凹凸，および OH 基を有する酸化295290285280
Binding energy/eV(d) Polishedシリーズ：C 1s

図5細胞が増殖するが，骨生成活性は Polished シリーズのそれせることなく，骨生成活性を向上させる表面を有している

XPS 分析結果

121086420の高い増殖性には凹凸が深く関与しているものと考えら

Laser

れる．

図6－ 161 －520

CC-O
C-H
O-C=O250

芽細胞が高い機能性を示す場合，細胞の増殖性が落ちるたを上回る．つまり Laser シリーズは細胞の増殖性を低下さ

535
530
525
Binding energy/eV300た．このことより，Laser シリーズ表面は Polished シリーは細胞一つ当たりの骨生成活性が最も高かった．これは骨540(c) Polishedシリーズ：O 1sーズおよび Polished シリーズ表面で細胞増殖率が高かっが播種した数よりも減少している．その一方で，同表面で2751000

分散分析の結果は信頼できるものといえる．図 8 より Wellい表面であるといえる．Laser-SBF シリーズ表面では細胞285
280
Binding energy/eV1500の高い検定力を有していることがわかっている．そのためズと同程度に細胞に対して無毒であり，細胞が増殖しやす

290(b) Laserシリーズ：C 1s構造をとり，表面には凹凸が形成されることが知られていの骨生成活性が高いことが予想される．

520

CC-O
C-H
O-C=O

100

Intensity / a.u.

(200)

(211)

(004)

(101)
(110)

回折強度

Ti
TiO2 (ルチル)TiO2 (アナターゼ)

Polish表面の OH 基量275

MTT Assay によって測定した細胞数 / ×104count5m(a) Polishedシリーズ

1(b) LaserシリーズⅠ2.5
n=5
mean±S.D.

21.5
10.50210m2m(c) LaserシリーズⅡ

図8(d) 拡大図1

1細胞あたりのp-ニトロフェニル
リン酸処理速度 / ×10-13mol・h-12m(f) Laser-SBFシリーズⅠ5m(g) Laser-SBFシリーズⅡLaser-SBF
Polishedシリーズ

Well

MTT Assay による細胞数促成結果＊Laser シリーズ―Polished シリーズを除く全組み合わせにおいて有意水準 5%で有意差あり

3(e) 拡大図2

Laser2m8n=5mean±S.D.

76543210

Laser(h) 拡大図3Laser-SBF
Polishedシリーズ

図9

図 7 骨芽細胞の SEM 観察結果

Well

ALP 活性測定結果＊全組み合わせにおいて有意水準 5%で有意差あり

４．結 言
本報告ではレーザ照射した試験片上における細胞の挙動や増殖性，骨生成活性を調べるため，骨芽細胞様細胞を参考文献
1) 塩山司，伊藤創造，武部純，石橋寛二，横田光正，石川義人，飯島伸，鈴木哲也，八重柏隆，佐藤雅仁，朝用いた細胞試験を行った．Laser シリーズや Laser-SBF シ岡昌弘，高橋直子，口腔インプラント室における臨床

リーズ上では細胞の形状が立体的に変化し，細胞表面に凹統計観察，岩手医科大学歯学雑誌，Vol.34，No.3，Page

凸が形成された．これは細胞の機能性が発現しやすい状態にあることを示す証拠の一つである．実際に，Laser シリーズでは Polished シリーズと比較して細胞数あたりの97-109 （2009）．
2）T Hayakawa，K Takahashi，M Yoshinari，H Okada，HYamamoto，M Sato，K Nemoto，Trabecular bone response

ALP 活性は 4 倍程度と大きく向上し，Laser-SBF ではさらtoにその 1.5 倍程度であった．増殖性は Laser シリーズとprovidedapatitecoatingwithathin

appliedusing

molecular precursor method ， Int J Oral Maxillofac

らに劣る結果となった．以上の結果はレーザ照射した表面れる可能性を示唆するものである．

implants

carbonate-containing

Polished シリーズが同程度で，Laser-SBF シリーズはそれでは細胞の増殖性を損なうことなく機能性を向上させら

titaniumImplants，Vol.21，No.6，Page 851-858 （2006）．
3）B Setzer，M Bächle，M C Metzger，R J Kohal，The
gene-expression and phenotypic response of hFOB 1.19
osteoblasts to surface-modified titanium and zirconia，

謝 辞
本研究は公益財団法人天田財団（天田金属加工機械技術振興財団）平成 23 年度一般研究開発助成 AF-2011212

Biomaterials，Vol.30，No.6，Page 979-990 （2009）．
4）G Zhao，Z Schwartz，M Wieland，F Rupp，J Geis-Gerstorfer，による助成を受けて実施した．ここに謝意を表する．

D L Cochran，B D Boyan，High surface energy enhancescell response to titanium substrate microstructure ， J
Biomed Mater Res A，Vol.74，No.1，Page49-58 （2005）．

－ 162 －5）D Khang，J Lu，C Yao，K M Haberstroh，T J Webster，

11）T Miyauchi，M Yamada，A Yamamoto，F Iwasa，T Suzawa，

The role of nanometer and sub-micron surface features on

R Kamijo，K Baba，T Ogawa，The enhanced characteristics

vascular and bone cell adhesion on titanium，Biomaterials，of osteoblast adhesion to photofunctionalized nanoscale

Vol.29，No.8，Page 970-983 （2008）．

TiO2 layers on biomaterials surfaces，Biomaterials，Vol.31，No.14，Page 3827-3839 （2010）．

6）J Lawrence，L Hao，H R Chew，On the correlation between
characteristics

12）H T Chen，C H Hsiao，H Y Long，K C Chen，J L He，

modification and osteoblast cell bioactivity on a titanium

C J Chung，C H Tang，Micro-arc oxidation of β-titanium

alloy ， Surf Coat Technol ， Vol.200 ， No.18-19 ， Page

alloy:

Nd:YAG

laser-inducedwettability

Structuralcharacterizationandosteoblastcompatibility，Surf Coat Technol，Vol.204，No.6-7，Page5581-5589 （2006）．

1126-1131 （2009）．

7）L Xie，X Liao，G Yin，Z Huang，D Yan，Y Yao，W Liu，X Chen，J Gu，Preparation，characterization，in vitro13）C Mangano，F Mangano，A De Rosa，V Desiderio，Rbioactivity，and osteoblast adhesion of multi-level porous

D'Aquino，F De Francesco，V Tirino，G Papaccio，Atitania layer on titanium by two-step anodization treatment，

Piattelli，The osteoblastic differentiation of dental pulp

J Biomed Mater，Vol.98，No.2，Page 312-320 （2011）．

stem cells and bone formation on different titanium surface

8）L Bren，L English，J Fogarty，R Policoro，A Zsidi，J Vance，

textures，Biomaterials，Vol.31，No.13，Page 3543-3551

JDrelich ， N

Istephanous ， K

Hydrophilic/electron-acceptor

surface

Rohly ，

propertiesof（2010）．
14）S Nuernberger，C Albrecht，V Vecsei，S Marlovits，H Redl，

metallic biomaterials and their effect on osteoblast cell

N Cyran ， The influence of scaffold architecture onactivity，J Adhes Sci Technol，Vol.18，No.15/16，Pagechondrocyte distribution and behavior in matrix-associated1711-1722 （2004）．

chondrocyte transplantation grafts，Biomaterials，Vol.32，No.4，Page 1032-1040（2011）．

9）Z Schwartz，R O Navarrete，B D Boyan，M Wieland，DL Cochran，Mechanisms regulating increased production of15）T M Li，H C Huang，C M Su，T Y Ho，C M Wu，W C

osteoprotegerin by osteoblasts cultured on microstructured

Chen，Y C Fong，C H Tang，Cistanche deserticola extract

titanium surfaces，Biomaterials，Vol.30，No.20，Page

increases bone formation in osteoblasts，J Pharm Pharmacol，3390-3396 （2009）．

Vol.64，No.6，897-907 （2012）．

10）R A Gittens，T McLachlan，R Olivares-Navarrete，Y Cai，
S Berner，R Tannenbaum，Z Schwartz，K H Sandhage，
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effectsof

combined

micron-/submicron-scale surface roughness and nanoscalefeatures on cell proliferation and differentiation ，Biomaterials，Vol.32，No.13，Page 3395-3403 （2011）．

－ 163 －