博士（獣医学）

横 山和 正学 位論 文 題 名Correlation between drug resistance and amlno acidsubstitutionsinDNA gyrase of Mycobactenum leprae（ ら い 菌 の DNA gyra
seにお ける アミノ 酸置 換と 薬剤 耐性の 関係 ）学位論文内容の要旨
ハンセン病はM
ycobacterium leprae
によって引き起こされる慢性感染症であり、 ヒト 、サ ル、 アル マジ ロ間 を伝 播し うる 人獣 共通 感染症である。ハンセ゛ン 病 の 治 療 に はダ プ ソ ン、 リフ ァン ピン、 クロ ファ ジミ ンか らな る多 剤併 用療法 が用 い ら れ 、 フ ル オ ロ キノ ロン は病 変が単 一の とき に使 用さ れる 。し かし なが ら 、 近 年 で は 多 剤 併 用 療 法 の主 要 薬 で あ る ダ プソ ン並 びに りフ ァン ピン の2剤 に 耐 性 を 持 つ 多 剤 耐 性 菌が 出現 し問 題とな って いる 。多 剤耐 性ハ ンセ ン病 の治 療に 対し てはフルオロキノロンが用いられることからフルオロキノロンの重要度は高まっている。一方で、フルオロキノロン耐性M. Ie
praeが現れ始めていることも事実である。フルオロキノロン耐性M. Iepraeにおいてはフルオロ キノ ロン の標的 蛋白 質で ある D
NAジャ イレースのキノロン耐性決定領域と呼ばれる部位にアミノ酸置換が確認されている。DNAジャイレースはタイプII
トポイソメラーゼに分類され、菌内においてDNAの負のスーパーコイルフオーム形成の役割を担っている。本研究ではM. Ie
praeにおけるフルオロキノロンの 唯 一 の 標 的 で あ る 、 DNAジ ャ イ レ ース に着目 して A並 びに B
サ ブユ ニッ トに おけ るア ミノ酸置換とフルオロキノロン耐性の影響を明らかにしたものである。加えて、M. Iepraeにフルオロキノロン耐性を付与する新たなアミノ酸置換を予測したものであり、得られたデータはハンセン病迅速試験法構築の為の重要な基礎データとして貢献しうるものである。

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1． Aサ ブ ユ ニ ッ ト 上 の ア ミ ノ 酸 置 換 の 耐 性 獲 得 へ の 関 与
フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 耐 性 M. I
epraeに お け る DNAジ ャ イ レ ース Aサ ブ ユ ニ ツ
トの アミノ 酸置換は89番目と91番目の位置にのみ報告されている。一方で、
M. Ie
praeと同じく抗酸菌に分類されるMycobacterium tube
rculosisのフルオ
ロキ ノロン 耐性株に見られるアミノ酸置換はキノロン耐性決定領域内に広く分布しており、94番目(M.Iepraeでは95番目）の位置に最も高頻度に見られるが、フルオロキノロン耐性M. I
epraeにおいてこの位置のアミノ酸置換に関する報告はない。本研究では、当該位置にアミノ酸置換を導入した後、フルオロキノロン耐性への影響を評価検討した。実験は大腸菌を用いたりコンビナントの系より発現精製した組換え蛋白質を用いて、フルオロキノロン存在下でのスーパーコイルフオーム形成阻害試験とDNA切断試験を実施した。その結果、95番目 のアミ ノ酸がアスパラギン酸からグリシンまたはアスパラギンヘ置換された場合DNAジャイレースが、高度なフルオロキノロン耐性を獲得することを見出 した。 この結果より95番目にアミノ酸置換を持つフルオロキノロン耐性
M. Iepraeが将来的に出現する可能性が示唆された。
2． Bサ ブ ユ ニ ツ 卜 上 の ア ミ ノ 酸 置 換 の 耐 性 獲 得 へ の 関 与
M. Iepraeの DNAジ ャ イ レ ース Bサ ブ ユ ニ ッ ト に お け る フル オ ロ キ ノ ロ ン
耐性に関わるアミノ酸置換の報告はない。しかしながら、他の細菌のDN
A
ジャイ レー ス の X線 結 晶 構 造 解 析 によ り、 DNAジャ イレ ースBサ ブユニ ット のキノロ ン耐性 決定領域がフルオロキノロンとの重要な相互作用部位であることが明 らかと なっている。また、フルオロキノロン耐性M. tuberculosisのB
サブユ ニット 上に耐性と関わるアミノ酸置換が複数確認されている。本研究では、M.lepraeにおけるBサブユニット上のアミノ酸置換のフルオロキノロン耐性への関与を明らかとする為に結核菌で報告のあるアミノ酸置換(461，499並びに501番目）に対応する、464，502，504番目の位置にアミノ酸置換を有する− 555−

組換 えM. IepraeD
NAジャ イレ ース を作出 し、 それ らのフ ルオ ロキ ノロ ンに対 す る 感 受 性を 変 異 体 DNAジ ャ イ レ ー ス A
サ ブ ユ ニ ッ ト 評 価 時 と同様 の試験にて評価した。その結果これらのアミノ酸置換が生じた場合にM.Iepraeがフルオロキノロン耐性を獲得することを明らかとした。また、502番目の位置にアミノ酸置換が生じた場合、M. I
epraeは高度なフルオロキノロン耐性を獲得することも明らかとした。
以 上 の 研 究 か ら M. Iepraeは DNAジ ャ イ レ ー ス A並 び に Bサ ブ ユ ニ ッ ト
上に 特定 のアミノ酸置換が生じた場合フルオロキノロン耐性を獲得することが明らかとなり、将来的にこれらのアミノ酸置換を伴うフルオロキノロン耐性菌出現の可能性が示唆された。本研究によって得られた基礎的知見は遺伝子変
異検 出に よるハンセン病迅速感受性試験法構築の基礎データとして活用されるこ とに 加え フルオ ロキ ノロ ン耐 性M. leprae
出現時のより効果的な薬剤選択に貢献しうることが期待される。

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学位論文審 査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
准教授

鈴高東
迫

木 定彦
田 礼人
秀明
田 義博

学 位 論 文 題名

Correlation between drug reslStanCeandamlnoaCidSubStitutionSinDNAgyraSeofA0卩 〇 ろ aC自 田 1unコ ム 響 W沼 e
（ら い菌のDN
Agyraseにおけるアミノ酸置換と薬剤耐性の関係）
らい菌によって引き起こされるハンセン病は、全世界で毎年約25万人の新規登録患者を記録している慢性皮膚感染症である。ハンセン病の治療はこれまで、第一次選択薬であ るダプソ ン、リフ ァンピン、クロファジミンの3剤併用療法により実施されてきたが 、これら 3剤の うちの 2剤以 上に耐性 を示す 多剤耐性らい菌が出現し、ハンセン病対策の大きな障害となっている。フルオロキノロンの一種であるオフロキサシンは、多剤耐性ハンセン病に対する有効な治療薬として注目を集めているが、近年になって、この薬剤に耐性を示すらい菌が報告されるようになり、耐性獲得機構の解明が急務となっている。本論文では、オフロキサシン耐性ハンセン病迅速鑑別法開発および同治療用フルオロキノロン剤選択のための基礎的知見を得るために、らい菌におけるフル オロキノ ロンの唯 一の標 的である DNAジ ャイレース（それぞれ2個のA、Bサブユニッ トからな る4量 体）に焦点を当て、それぞれのサブュニットにおけるアミノ酸置換の フルオロ キノロン 耐性獲得への影響を明らかにした。その成果は以下の2点に要約される。
第一に、横山和正氏は、らい菌の近縁菌種である結核菌のフルオロキノロン耐性臨床分離株では高頻度に見られるが、らい菌ではこれまでに報告のなぃ、DN
AジャイレースA
サブ ュニッ ト上の95番 目のアミノ酸置換に着目して研究を進めた。同氏は、大腸菌を宿主 として発 現させた 当該位置にアミノ酸置換を導入した組換えDNA
ジャイレースを対象として、各種フルオロキノロンに対する感受性をむぬtroで評価・検討した。その結果同氏は、らい菌においても結核菌と同様に95番目のアミノ酸がアスパラギン酸からグリシンまたはアスパラギンヘ置換した場合には高度なフルオロキノロン耐性を− 557−獲得することを見出した。更に同氏は、シタフロキサシンは上記何れのアミノ酸置換を有するDNAジャイレースに対しても低濃度でその活性を抑制する事を見出し、DNA
ジャイレースAサブュニット上に上記アミノ酸置換を有し、オフロキサシン耐性となっているらい菌により引き起こされている ハンセン病の治療に同薬剤が使用可能であることを明らかとした。
第二に、横山和正氏は、結核菌の D
NAジャイレースのX線結晶構造解析により明らかにな って いる DNA
ジ ャイ レースBサブユニット上 のフルオロキノロンとの相互作用部位に着目して研究を進めた。フルオロキノロンとの相互作用部位に存在するフルオロキノロン耐性臨床分離結核菌には見られるが、らい菌では見られないアミノ酸置換をB
サブユニツ卜に導入したらい菌DNAジャイレースを作出し、フルオロキノロン耐性への関与について検討した。その結果、464、500、502番目の位置にそれぞれアスパラギン酸からアスパラギン、アスパラギンからアスパラギン酸、グルタミン酸からバリンヘのアミノ酸置換を有する組換えDNAジャイレースがオフロキサシン耐 性となることを明らかとした。更に同氏は、他のフルオロキノロンのDN
Aジャイレース阻害活性を評価する
事により、シタフロキサシンが上記何れのアミノ酸置換を有するD
N
Aジャイレースに対しても低濃度で抑制活性を有する事を見出し、D
N
A．ジャイレースBサブュニット上に上記アミノ酸置換を有することによル オフロキサシン耐性となっているらい菌により引き起こされているハンセン病の治療 に同薬剤が使用可能であることを明らかとした。
以上の様に横山和正氏の本論文は、組換えDN
Aジャイレースを作出し、これを用いる事により、らい菌のキノ口ン耐性獲得機構を分子レベルで明らかにしたものであり、オフロキサシン耐性ハンセン病迅速鑑 別法開発および同治療用キノロン剤選択のための基礎データを取得できたという点で重要な研究である。よって、審査員一同は、上記学位論文提出者横山和正氏の博士論文が、北海道大学大学院獣医学研究科規程第6条の規定による本研究科の行う博士論文の 審査等に合格と認めた。

一 558−