，博士（獣医学）前田秋彦
学位論文題名
核酸を用いたマウス肝炎ウイルス(MHV）の増殖阻害に関する研究
一特にりボザイムについて一

学 位 論 文 内 容の 要旨

近年、様々な型の核酸を用いたウイルス遺伝子の発現制御の研究が盛んに行なわれており、ウイルス感染に対する遺伝子治療への応用の期待も高まっている。アン
チセンス核酸は、ウイルスの特定タンパク質をコードするmRNAに相補的な塩基配列を有する核酸であり、それを用いた当該タンパク質の発現制御の様々な検討がなされてきた。最近では、切断活性を有するりボザイムの塩基配列をアンチセンス核酸に組み込み、より効果的なウイルスの増殖阻害を得る試みもなされている。本研究においては、実験用マウスに重篤な肝炎や腸炎、呼吸系の疾患などを引き起こすマウス肝炎ウイルス(MHV)に対してりボザイムを含めた各種のアンチセンス核酸が抗ウイルス効果を持っか否かについて検討すると共に、近年、注目されているDNAワクチネーションについても検討した。さらにMHVにおいてはウイルスの持続感染機構に不明な点が多いので、そのことについても検討し、以下に示す成績を得た。
1． MHVの RNA依 存 RNAポ リ メ ラ ー ゼ (poり 遺 伝 子 mRNAに 対 す る ハ ン マ ― ヘ ツ
ド型リボザイムを発現するベクターを構築し、このりボザイムの肋灯troでの切断 活性に つい て検 討した 。切断部位はpol遺伝子mRNAの十238番目に存在するシトシン塩基の直後である。リボザイムの切断活性は反応温度、Mg2+濃度およびりボザイムと標的であるpol遺伝子mRNAの濃度比に依存して進行し、本研究で作製した りボザ イム が所 vitroで 期待 された 切断 活性 を有す るこ とが示された。さらに、リボザイムのアンチセンス配列の長さが酵素活性に及ぼす影響を検討したところ、アンチセンス配列の長さの短い方がりボザイムの切断は効率的におこることが示された。
・2．アンチセンス配列の長さの異なるニ種類のりポザイムを細胞内で発現するベクターを構築し、MHVに高感受性のマウスのアステロサイト―マに由来するDBT細胞に導入した。各リボザイムを高発現する形質転換細胞について、急性感染期におけるウイルスの増殖に対するりボザイムの効果を検討したところ、どちらのりボザイ

ムを発現する細胞においても効果的にMHVの増殖が阻害された。細胞内でりボザイ
ムによる切断産物は検出できなかったが、リボザイム配列を含まないアンチセンスR
NAを発現する細胞よりも増殖抑制の程度は大きく、細胞内でもりボザイムとして作用していることが示唆された。
3．M
HVに持続感染した細胞をク口一ン化することによって、持続感染した細胞の特徴を解析した。クロ―ン化した全ての細胞は、ウイルスの重感染に対して抵抗性を示し、細胞に何らかの変異が起こっていることが示唆された。また、持続感染状態にある細胞は細胞内のウイルスの存在とウイルス粒子の産生性が様々であることが 示さ れ 、そ の ことが持 続感染状態の成 立に重要であ ると考えられ た。
4．リボザイ ム配列を含 むアンチセ ンスRN
A
発現細胞において、MH
V持続感染におけるウイルス遺伝子の転写およびウイルス粒子の産生は顕著に抑制されており、アンチセンスRNAが持続感染状態のウイルス増殖の抑制にも効果的であることが示された。
5． MH
Vの 転写 や 複製 の プ口 モ ―タ ー であ る MH
Vの り― ダ −RN
Aに対する ホスホロ チオエ―ト 型アンチセ ンスオリゴ ヌクレオチドは0． 001から0.
1pMの濃度範囲で、塩基配列および濃度に依存してMHVの増殖を阻害し、通常の非修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも100〜1000倍低い濃度で効果を有することを示し た。また、 0.5 Lt
M以上の 濃度では塩 基配列に非 特異的にMHVの増殖を 阻害した。
6．ラウス肉腫ウイルスのーlongterminalrepeat(LTR)をプロモータ―として、
MHVのヌクレオキャプシドタンパク質を発現するプラスミドベクタ―pR
SV―mR
N
A7を 、C57BL/6マウスに筋肉内投与した場合に、このマウスではMHVの接種後、非投与のマウスで観察された囲管性細胞浸潤と神経細胞の壊死性変化を伴う急性脳炎の組織像は観察されなかった。
本研究の結果は、様々なアンチセンス核酸が急性および持続感染期におけるMHVの増殖を効果的に抑制することを示した。さらに、DNA
ワクチネ―ションの有効性も示唆した。しかし、これらの核酸が示す抗ウイルス効果の機序については今だ不明な点も多く、さらに詳細な検討が必要であると考えられた。また、より効果的なウイルス増殖阻害効果を得るために、いかにしてこれらの発現ベクタ―を目的の臓器に導入し高発現させるかというドラック・デリバリ―・システムの開発や、体内での 代謝、各組 織への分布 などの検討 が今後の課 題となるものと考えられた。

学位論文審査の要旨
主査 教授 渡辺智正
副査 教授 喜田 宏
副査 教授 小沼 操
副査 酪農学園大学教授 林 正信
学位論文 題名核 酸を 用い たマ ウス 肝炎 ウイ ルス （ IVIHV）の増殖 阻害 に関 する 研究
ー 特に り ボザ イ ム について ―近 年、 様 々な型 の核酸を 用いてウ イルス遺 伝子の発 現制御に 関する研究 が盛んに 行
な わ れ てお り、 ウイルス 感染に対 する遺伝 子治療へ の応用の 期待も高ま っている 。本研 究 に お い て は 、 ウ イ ル ス の 特 定 タ ン バ ク 質 の mRNAに相 補 的な ア ン チセ ン ス核 酸や 切 断 活 性 を 有 す る り ボ ザ イ ム 、 さ ら に MHVに 対 す る DNAワ ク チ ネ ー シ ョ ン によ っ て 、 実 験 用 マ ウ スに 重 篤 な肝 炎 、腸 炎 、 呼吸 器 系 の疾 患 など を 引 き起 こ すMHVの 増 殖 を抑 制 でき る か 否か に つい て 検 討し た 。
MHVの RNA依 存 RNAポ リ メ ラ ー ゼ (pol) mRNAを 切 断 す る ハ ン マ ー ヘ ッ ド 型 リ
ボ ザ イ ムの 発現 ベクター を構築し 、invitroでの切 断活性に ついて検 討した。リ ボザ
イ ム の 切 断 活 性 は 反 応 温 度 、 Mg2゛ 濃 度 お よ び 標 的と な るpol遺 伝 子mRNAの 濃 度に
依 存 し て変 化し た。さら に、長さ の短いり ボザイム の方が長 いものより も切断効 率が良 い こ とが 示 され た 。
次 に 、 リ ボ ザ イ ムの 細 胞 内発 現 ベ クタ ー を構 築 し 、MHV高 感受 性 の マウ ス アス トロ サ イ ト ー マ に 由 来 する DBT細 胞に 導 入し た 。 リボ ザ イ ムを 高 発現 す る 形質 転 換細胞 に つ いて 、 急性 お よ び漫 性 感染 期 に おけ る り ボザ イ ムの 影 響 を検 討 したとこ ろ、MHVの 増 殖が 効 果的 に 阻 害さ れ た。
ま た 、 MHVの 転 写 や 複 製 の プ ロ モ ー タ ー で あ る MHVの り ー ダ 一 RNAに 対 す る ホス ホ ロ チ オ エ ー ト 型 ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ド は0.001〜0.1pMの濃 度 範囲
で 、 塩 基配 列 およ び 濃 度に 依 存し て MHVの増 殖 を 阻害 し た。
ラ ウ ス 肉 腫 ウ イ ルス の 末 端反 復 配 列を プ ロモ ー タ ーと し て、 MHVの ヌク レ オキ ャ
プ シ ド タ ン バ ク 質 を 発現 す る プラ ス ミド ベ ク ター を 、 C57BL/6マ ウ スに 筋 肉 内投 与し た 。 MHV接 種 後 、 非 投与 の マ ウス で 観察 さ れ た囲 管 性 細胞 浸 潤と 神 経 細胞 の 壊死性 変 化 を伴 う急 性脳炎の 組織像は 、投与マ ウスでは 観察され なかった。 この結果 は、プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー の投 与 に よっ て MHV感 染 に 対す る 抵 抗性 が 投与 マ ウ スに 付 与され た た めで あ ると 考 え られ た 。
本 研 究 は 、 リ ボ ザイ ム を 含め た 様 々な ア ンチ セ ン ス核 酸 やDNAワ ク チネ ー ショ ンの た め の プ ラ ス ミ ド DNAが 、 MHVに 対 し て 抗 ウ イ ル ス 効 果 を 有 す る こ と を 示 し た
も の で あり 、そ の予防治 療におけ る興味深 い知見を 提供する ものである 。よって 、審査 員 一 同は 前田 秋彦氏が 博士（獣 医学）の 学位を受 けるのに 十分な資格 を有する ものと 認 め た。 853ー