博士（獣医学）池田富夫
学位論文題名Basic studies for the construction ofaretroviral
vector system to transfer vectorgeneSlntothe
CentralnerVOuSSySten1（ 中 枢 神 経 親 和 性 レ 卜 口 ウ イ ル ス ベ ク 夕 ― 系構 築 の基 礎 的 研究 ）、

学位論文内容の要旨

レ ト ロウ イルス が細胞に 感染する と、その 遺伝子は 宿主細胞の 染色体に 組み込ま れる。 レ トロ ウイ ルスベク ター系は 、この性 質を利用 して遺伝子 導入に広 く用いら れている 。 しか しな がら現在 用いられ ているべ クター系 は、標的細 胞の性状 により、 必ずレも 十 分な 遺伝 子導入効 率が得ら れない。 これまで に、中枢神 経系細胞 に遺伝子 を導入す る ため の 新 しい べ ク ター 系 を構 築 す る目 的 で、 フ レ ンド マ ウス 白 血病ウイ ルス(FriendMLVl)から、ラ ッ卜の中 枢神経系な らびにグ リア系の 細胞でよく増殖するFr
C6
ウイ ル スな らび にその遺 伝子クロ ーンA8が分 離された 。A8ウイルス は、ラッ トの中枢神経系な らびにグ リア系細胞 でよく増 殖し、こ の増殖に はウイル ス遺伝子のenv及び末端反 復 配列 を含 む領域が 関与する 。env遺伝子 にコード されるenv夕ン パク質は 、ウイルス 感 受性 細胞 への吸着 ならびに 細胞内侵 入に関与 することに よルウイ ルスの宿 主域を規定し ている。 env夕ンパク質 は、ベク ター遺伝 子の導入 効率に最 も影響を及ぼすことか ら 、そ の生 物性状を 明らかに する必要 がある。 本研究はA8ウ イルスの enレタンパ
ク質 が 中枢 神経 系細胞へ のウイル ス感染性 を高め、 外来遺伝子 の導入効 率の上昇 に貢献するこ とを明ら かにした。
FrC6な らび に A8ウ イ ル スの eny夕ン パ ク質 を検出す るために 、まず単ク 口ーン抗 体(MAb)を 作成 し た。 Friend MLV持続 感 染細 胞 株 FBaな ら びに FrC6ウ イ ルス持 続感染細胞株 FrC6を 認識する 30ク口一ン が得られ た。次に A8ウイルス と非神経親 和性のFriend
MLヽ野生株 57ウイルス を用いて、 抗体の生物活性を解析レた。得られた30クローン中、2ク口ーン (MAb25，85‑1)に中和 活性が認め られた。 MAb85‑1は、A8ならびに57ウイルスに 対 して 中和 活性を示 したが、 A8ウイルス に対する 活性は57ウイ ルスの約 25倍高い値で あ った 。 ま たMAb25は 、A8ウイ ル ス のみを中 和した。 免疫沈降法 により、 4つのIgG抗 体 がenv夕 ン パク 質 を 認識 す るこ と が明ら かとなっ た。これら の2クロー ン(MAb85・1，111‑3)は、 表在型糖 夕ンパク質 であるgp70を 、また残 り2クローン(MAb73‑1，97‑1)は 、膜 貫通型夕 ンパク質 であるp15Eを 認識レて いた。gp70を 認識するMAb111‑3‑ 203 ‑はA8ウイ ルス特 異的 であ り、 他の 3抗 体は両 方の ウイ ルス を認 識し てい た。 gp70に対する MAb 85‑1， 111‑3は 、尿素により変性したタンパク質には結合レなかった。一方、p15Eに対 する抗 体は 、い ずれ も尿 素処 理夕 ンパ ク質 にも結合レた。以上の結果から、
中枢 神経 系にお いて よく 増殖 する A8ウ イル スの gp70は、非神経親和性である57ウイルスの gp70と抗原 性が 異な るこ とが 明ら かと なっ た。 A8ウイルスと57ウイルスを区別しうるMAb 85‑1，111‑3は、env夕ンパク質の高次構造が形成する抗原決定基を認識し、両ウ イ ル ス の p15Eを 認 識 す る 抗 体 は 高 次 構 造 非 依 存 性 で あ る こ と が 判 明 し た 。
A8ウイルスのenv夕ンパク質(A8‑ enめの生物性状を明らかにするために、レト口ウイルスベクター系を用いて A
8‑ en vを持つ偽ウイルスを作成した。レトロウイルスベクター系で は、 ウイル スに より 運ば れる べク ター 遺伝 子を 、ウイルス粒子の形成を行うパッケ ー ジン グ 細 胞 に 導 入 す る こ とに より 、偽ウ イル スが 得ら れる 。そ こで 偽ウ イル ス
CREを 産生 する モ口 ニー マウ ス白 血病 ウイル ス(Moloney MLV)由来のパッケージング細胞rpCREに 、A8‑envを発 現す るべ クタ ー遺伝 子を 導入 し、 偽ウ イル スCRE‑A8を得 た。
偽ウイルスを感染させてベクター遺伝子(neor)を導入レ、薬剤(G418)耐性を獲得した細胞の コ口 ニ一数 を偽 ウイ ルス の感 染価 とし た。 偽ウ イルスCRE‑A8は、ラットグリア系細胞 株C6ならび にF10に 対して、繊維芽細胞株NIH 3rI3とほぽ同程度の高い感染価を示レた 。一 方A8‑envを 持た ない 偽ウ イル スCREは、 NIH 3T3細胞に比べ、ラッ卜グリア系細胞 株に 対して 明ら かに 低い 感染 価を 示し た。 MAb 85‑1は、ラットグリア系細胞株に対する偽ウイルスCRE‑A8の感染陸を中和したが、A8‑ enレを持たない偽ウイルスCREは、中和しなかった。この結果は、A8‑en¥r/j1CRE̲
A8ウイルス粒子に取り込まれていることを示 す。 さらに MAb 85‑1と補 体の 存在 下で 、著 レく 感染価が低下したことから、偽ウイル スCRE‑A8粒 子の ほと んど は、 A8‑enレを 持つ こと が示された。同様に、抗Moloney
MWfn清と 補 体 に よ っ て も 感 染 価が 著レ く低下 した こと から 、CRE‑A8ウイ ルス 粒子 のほと んど がA8ウ イル スな らび にMoloney MLV由来 のenv夕ンパク質を発現していることが明 らか となっ た。 以上 の結果から、A8‑enレは偽ウイルスCRE‑A8粒子に取り込まれ、ラットグリア系細胞に対するCRE‑A8ウイルスの感染効率を高めていることが判明レた。
以 上の 成績は 、A8ウイ ルスのenv夕ンパ．ク質を導入したレト口ウイルスベクター系
を構 築す ること によ り、 効率 よく 中枢 神経 系細 胞に 遺伝子導入することが可能であることを示す。

学 位論 文 審 査 の要 旨
主査 教授 小沼 操
副査 教授 喜田 宏
副査 教授 渡邊智正
副査 教授 林 正信（酪農学園大学）

学 位 論 文 題 名Basic studぬ Sfor the construction ofaretroviral
vector system to transfer vector geneslntothe
CentralnerVOuSSySte］ n（ 中 枢 神 経 親 和 性 レ ト 口 ウ イ ル ス ベ ク 夕 一 系 構 築 の 基 礎 的 研 究）

レトロウイルスが細胞に感染すると、その遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれる。レトロウイルスベクター系は、この性質を利用して遺伝子導入に広く用いられている。これまでに、中枢神経系細胞に遺伝子を導入するための新しいべク夕一系を構築する目的で、フレンドマウス自血病ウイルスから、ラットのグリア系の細胞でよく増殖するウイルスFrC6ならびにその遺伝子クローンA8.
が分離された。ウイルスのenv夕ンパク質は、細胞への吸着ならびに細胞内侵入に関与することが知られている。本研究ではA8ウイルスのenv夕ンバク質(A8‑ env)の性状を明らかにし、ウイルスの中枢神経系 細胞 への 感染 性なら びに、外来遺伝子の導入にどのような影響をおよぼすか検討を行った。
まず FrC6なら びにA8ウイルスのenv夕ンバク質に対する単クローン抗体(MAb)を作出し、得られた抗体を用いて、中枢神経系に親和性を示すウイルスと非親和性ウイルスのenv夕ンパク質の性状を検討した。その結果中枢神経系においてよく増殖するA8ウイルスのA8‑envは．、非神経親和性ウイルスのenv
夕ンパク質と抗原性が異なることが明らかとなった。抗原性の相異を区別しうるMAbは、env
タンパク質の高次構造が形成する抗原決定基を認識していた。
次にA
8‑envの生物性状を明らかにするために、レト口ウイルスベクター系を用いてA8‑envを持つ偽ウイルスを作成した。レトロウイルスベクター系では、ウイルスにより運ばれるべクター遺伝子を、ウイルス粒子の形成がおこるバッケージング細胞に導入することにより、偽ウイルスが得られる。偽ウイルスは、ラットグリア系細胞株に対して、繊維芽細胞株NIH3T3とほぽ同程度の高い感染価を示したが、A8‑envを持たない偽ウイルスは、ラットグリア系細胞株で低い感染価を示したにすぎなかった。A8‑envは偽ウイルス粒子に取り込まれ、ラットグリア系細胞に対する感染効率を高めていることが判明した。
本研究により、中枢神経親和性のA8ウイルスのenvタンパク質を導入したレトロウイルスベクター
ー 205一

系を構築することにより、効率よく中枢神経系細胞に遺伝子を導入することが可能となった。この研究はこれまで困難であった神経系細胞への遺伝子導入に重要な知見を提供するものである。よって審査員一同は、池田富夫氏が博士（獣医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと認めた。

‑ 206一 ―