博 士（ 生 命 科 学 ）林泰弘

学位論文題名2型糖尿病早期診断・治療を目指した候補遺伝子群の探索と 多機能性 ナノ粒子 を用いたinvivo機能解析
学位論文内容の要旨
世 界 的 な 2型 糖尿 病の 患者 数は 過去 30年 間で 約3億 4700万人 に達 し、 増加 の一 途を辿っているため、2型糖尿病の発症予防診断・画期的な治療法の開発が強く望まれている。特にゲノム・遺伝子発現情報を利用した研究開発は、病気の発症 予測や原因因子を理論的に推測可能なため、2型糖尿病の診断・治療法開発に革新的な進展をもたらすことが期待されている。しかしながら、（1）膨大な情報の中 から 2型糖 尿病 の疾 患に 決定 的に関わる遺伝子を効率よく発見する方法、(2)
候 補遺 伝子 の機 能を in vivoで 効率よく評価する方法、の2点が不十分であるために診断・治療へ向けた創薬開発が遅れているのが現状である。そこで（1）を解決するために、独自のアイディアに基づぃて膨大な情報の中から疾患に重要な役割を担っていると思われる診断・治療候補分子の選定を試みた。そして(2)を解決する為に、申請者の所属する研究室で開発されている核酸デリパリーシステム：多機能性エンベロープ型ナノ構造体(Multifunctional Envelope‑type N
anoDevice；MEND)に 着目 し、 糖尿 病関 連組 織の1つである肝臓への核酸デリパリーシステムの 構築を試みた。上記に記載した2つの問題点を解決することによって、独自で開 発された人工キャリアを用いたin vivo標的候補遺伝予のスクリーニングを行
い 、 2型 糖 尿 病 の新 規 診 断 ・ 治 療 標 的 分 子 の発 見を 行う こと を目 的と した 。
初め に2型 糖尿 病早 期診 断可 能な遺伝子探索を試みた。将来の2型糖尿病発症予測を確実に行うためには、糖尿病関連組織（肝臓、脂肪組織、骨格筋）の遺伝子発現変動を調べるのが理想である。しかしながら、糖尿病を発症していない健常人に対してそのような非侵襲的な方法は非現実的である。そこで、サンプルングが容易な血液に着目して、自血球の網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、
2型 糖 尿 病 発症 前の OLETFラッ 卜自 血球 では 、合 計300遺伝 子が 1.5倍以 上発 現変 動しており、そのうち4遺伝子がインスリンシグナル伝達関連経路に含まれてい た。 さら に、 糖尿 病関 連組 織間の相関について解析したところ、合計57遺伝子 が血液と肝臓、脂肪組織、骨格筋間で共通発現変動しており、その一部は2型
糖 尿病 の病 態関 連遺 伝子 が検 出され た。 一方 、糖 尿病 発症 後のOLETFラッ卜にお ける 解析 も行 った とこ ろ、 発症後の自血球、肝臓間でも合計29遺伝子が共通発現変動していた。従って、自血球と糖尿病関連組織との共通発現変動遺伝子群
は、2型糖尿病早期診断に有望である可能性が示唆された。
次に 新規 2型糖 尿病 治療 標的 遺伝子群の探索を試みた。2型糖尿病モデルマウス（KKAyマウス）、健常マウス(C57BL/6Jマウス）を用いて肝臓の網羅的遺伝子発現 解析 を実 施し た。 発症 前（ 4週齢 ）、 発症 後（ 11週 齢） のKKAyマウスの遺伝
子 発現 プ口 ファ イル をを 比較 して、2倍以上発現亢進レている583遺伝子を抽出した。これらの遺伝子群の中には週齢差によって発現変動した遺伝子群が含まれて い る と 考 え 、C57BL/6Jマウ スで 2倍 以上 発現 亢進し た193遺 伝子 、発 現低 下し た793遺伝 子と の比 較を 行っ た。 その 結果 、583遺伝 子中 442遺伝子が病態関連遺伝子、129遺伝子が週齢によって変動する遺伝子であった。Gene Ontology解析 により442遺伝子の多くが脂質代謝に関わることが明らかとなり、これらを治― 375―

療標 的候 補遺 伝子 群とし た。 これ らの候補遺伝子の機能解析をin vivoで行うため、 pDNA，siRNAと いっ た核 酸を 肝臓に送達可能な核酸デリバリーシステムの構築を行うことにした。
細胞膜透過能カを有するoctaa
rginine(R8）ベプチドは、その機能以外に肝臓に集積す ると いう 特徴 を有す るこ とが 明ら かと なっ てい る。 そこ で、R8ベプチドを
基 盤 と し た尾 静 脈投 与型 キャ リア の構築 に取 り組 んだ 。初 めに 2種類 の凝 縮化
pDNAコ ア （ 負 電 荷 凝 縮 化 コ ア 、 正 電 荷 凝 縮 化 コ ア ） を内 封 し た R8修 飾 MEND
（ R8‑MEND） をマ ウス に尾 静脈 投与 した とこ ろ、 肝臓 での 遺伝 子発現 活性 は非常に 低い 値で あっ た。そ こで 、肝 臓で の遺 伝子 発現 活性 を上 昇させるためにinvivoにおいて様々な最適化を実施した。その結果、負電荷凝縮化コアの使用、総脂 質 量 を 減少 さ せる こと 、pH応答 性膜融 合促 進ベ プチ ド（ GALA)を修 飾す ること 、 の 3点 が 重要 な要 因で ある こと が明 らか とな った が、 特に 負電荷 凝縮 体とGALA修飾の組．み合わせが最も遺伝子発現活性を上昇させる要因であり、肝臓での 遺 伝 子 発 現 活 性 は 3350倍 上 昇 し た 。 最 適 化 さ れ た R8‑GALA‑MENDは 肝 臓 での遺 伝子発現活性が他組織（肺、脾臓）と比べて有意に高いことから、肝臓指向性 の 高 い キャ リ ア で あ る こ と が 明 ら か と な った 。さ らに この R8‑GALA‑MENDはpDNA以 外 にも siRNAも 搭 載 可 能 で あ り 、肝 臓 の内 在性 遺伝 子SR‑Bl(scavengerreceptor classB，memberl）の有意な発現抑制にも成功した。一方、R8‑GALA‑MENDにHGF(Hepatocyte Growth Factor，肝細胞増殖因子）をコードしたpDNAを内封して 、 急 性 肝 炎 の 抑 制 効 果 を 試 み た 。 そ の 結 果 、 HGF pDNA内 封 R8‑GALA‑MENDを投与した群では、有意な肝障害の軽減、及び市販の肝臓導入試薬であるinviyo
j etPEI‑Galと比べて有意な生存率の延長も確認された。この結果は、構築された
R8‑GALAー MENDが 急性 肝炎 を始 めと する 様々 な病 態を 改善 する ための 予防 ・治療ツールとして利用できる可能性があることを示している。
最 後に 肝臓 への siRNAデリ バル ーシ ステ ムを 用いた 標的 候補 遺伝子のin viYo
機 能 解 析 を 行 っ た 。 DNA microarray解 析 の 結 果 、 脂 質 代 謝 に 関 わ っ て た
monoa
cylgl
ycer
ol O‑acyltransfe
rase1（ ogatl）遺伝子に着目した。Re
al‑timeP
CRによ って 肝臓 にお ける遺 伝子 発現 量を 確認 した 結果 、KKAyマ ウスにおいては病態の 進行 によ り徐 々に発 現の 上昇 が認められ、糖尿病発症後の段階Iで35倍発現亢進 して いた 。さ らに他 の糖 尿病 モデル動物db/dbマウスや、高脂肪食負荷マウス肝 臓に おい ても 有意な 発現 上昇 が観 察さ れた 。そ こで 、Mogatl siRNAをMENDに内 封し 、10週齢 のKKAyマウ スに 投与 する こと でinvivo機能 解析を実施した。
その 結果 、投 与1日 後に おい て血 糖値の有意な低下が確認された。そして、グルコー ス負 荷試 験、 ピルビ ン酸 負荷 試験 の結 果か ら、 Mogatl siRNA投与群において全 身性のグルコース代謝能カの改善、肝臓における糖産生量の減少が観察された。 一方 、顕 微鏡 観察の 結果 、Mogatl siRNA投 与群 では 肝臓 の血管周辺部位では異 所性 脂肪 の量 が減少 して いる こと が示 唆さ れた 。以 上の 結果より、Mogatlは新規2型糖尿病治療標的分子である可能性が示唆された。
本 研究 はDNA microarrayに よる 診断・候補遺伝子の探索研究と、in vivo核酸
デリ パリ ーシ ステ ム研究 を組 み合 わせ た融 合研 究で あり 、そ の結果、Mogatl遺伝子が2型糖尿病の新たな標的分子である可能性を示した。

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学位 論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授

原教授

武准 教 授秋特任 准 教授

梶島 秀吉
田 宏司
田 英万
本 和昭

学位 論 文 題 名

2型糖尿 病早期診 断・治 療を目指 した候 補遺伝子 群の探 索 と 多 機 能 性 ナ ノ 粒 子 を 用 い たin vivo
機能解析
博 士 学位論 文審 査等 の結 果に つい て（ 報告 ）近 年、2型 糖尿病 の発 症予 防診断・早期治療に関する研究は盛んに行われて いる。 しか し、 その多 くは 既知の2型糖尿病関連分子、もしくはその周辺 に位置 する 分子 に焦点 を当 てた研究である。2型糖尿病を引き起こすと考えられる新規標的分子を探索し、その機能を検証するという研究は未開拓 の分野 で、 今後 の発展 が待 たれている状況にある。林泰弘氏は、DNAマイク口アレイによる網羅的な診断・治療候補遺伝子探索研究と、肝臓への核酸デリバリーシステム開発研究を同時に行い、これらの研究を融合させる ことで in vivoにお いて 2型 糖尿 病の 新規標 的分 子の 発見 を行うことを目的としていた。
2型糖尿病の早期診断・治療標的遺伝子探索研究において、林泰弘氏は2型糖 尿病発 症前 のOLE
TFラッ トを用いて、自血球（血液）と糖尿病関連組織（肝臓、脂肪組織、骨格筋）の共通発現変動遺伝子群に着目し、合計57遺伝 子が2型 糖尿病 早期 診断 に有望である可能性を示した。これら遺伝子群は血糖値、インスリン量に異常がない週齢においても変動していることから、血清パラメーターよりも早期に、高感度で病態の進行を検出できる可能 性が示 唆さ れて いた。 早期 治療候補遺伝子探索においては2型糖尿病
発症 前後の KK
Ayマウ スを用 いて 、疾 患の 進行に より 変動 する 遺伝子群に着目して、脂質代謝関連遺伝子群が候補遺伝子群になることを示していた。
これら 候補 遺伝子 の抽 出方法 は非 常に独 自性 が高いものであった。
次に、これら候補遺伝子の機能をin vivoで実証する目的で、肝臓での核酸（ pDNA、 siRNA） デリ パリ ーシステムの開発研究を行っていた。林泰弘
氏が所属していた北海道大学大学院薬学研究院・薬剤分子設計学研究室で構築 された 多機 能性 エンベ 口ー プ型 ナノ 構造体 （MEND） に着 目して研究― 377―

匹 敵する核 酸導ま困難であった。
ク タアルギ ニンプ チ ド を MENDに 高めるこ とに臓 に送達さ せる
は 、急性肝 炎の防 、治療に 有効
見 し た 新規 分 子
尿 病 モ デル で あし て い るこ と をを 用 い て肝 臓 での 減 少 、肝 臓 内ー ス 能 、耐 ピ ル
治 療 標 的分 子 で型 糖 尿 病と 関 連病 の 治 療法 開 発
デ リ バリ ー シスの 方 法論 を 示し
分 子 の発 見 にも有 用 であ る 。よ与 さ れる 資 格あ