博 士（医学）梁学位論 文題名
新規ユビキチン結合夕ンパク質シンテニンの生化学的解析
学位論文内容の要旨【背景と 目的】 ユビキ チン化 は真核 細胞においてタンパク質にユビキチン(Ub： ubiquitin)が付加する翻訳後修飾であり、タンパク質の寿命の決定や細胞内輸送など多様な生命活動に重要な役割を果 た し て いる ， ユ ビ キチ ン は 、 活性 化 酵 素 皿1）、 結 合 酵 素(E2)およ びりガ ーゼ(E3)か ら構成されるユビキチンシステムによって標的タンパク質に共有結合される．一方、ユビキチンに結合するタンパク質（ユビキチン結合タンパク質）がこれまで同定されている．ユビキチン結合タンパク質はユビキチン化されたタンパク質上のユビキチンに非共有結合で相互作用し、ユビキチン化タンパク質の機能、安定性、または局在の決定などに重要な役割を果たしている．その中、モノユビキ
チン化されることにより、ユビキチン化タンパク質がエンドサイトーシスされる報告があるが、モノユビキチンタンパク質のメカニズムに関しては不明な点が多い．本研究ではプロテアソームヘのターゲットシグナル以外のユビキチンの役割、特にモノユビキチン化の機清ヒヒを明らかにするため、モノユビキチン結合タンパク質の同定を試みた．

【材料 と方法 】酵母株L40を使用して酵母twohybri
d法スクリーニングを行った．酵母two hybrid
法 のbaitは ユ ビ キ チン 変 異 体 Ub (K48RJG76A)であ り 、 ラ イブ ラ リ ーは マウス T細胞リ ン／瀧cDNAラ イ ブ ラ リ ー で あ る ． 哺 乳 類 細 胞 内 結 合 を 検 討 す る た め 、 HEK293T細 胞 株 にFLAG‑synteninと HA．Ubを導 入し、 免疫沈 降し、 ウエス タンブ ロット解析を行った．タンパク質の安定 陸を検 討する ため、 HEK293T細胞 にFLAG．synteninを導入 し、cyclohexInideで処理後、各 時 間 に お け る タ ン パ ク 質 抽 出 液 を 調 整 し ウ エ スタ ン 解析 を 行っ た ．
【 結 果 】Ub (K48R/G76A)に 結 合 す るタ ン パ ク 質を 8x10s個の マ ウ ス T細 胞リ ン ／ く 腫cDNAライ ブラリ ーからスクリーニングした結果、9個の陽性クローンが得られた，このうちニっはマウスのシンテニンと同一であった．哺乳類細胞内でシンテニンとユビキチンの結合を検計尹るために、
HEK293T細 胞 に FLAG． synte血 1と HA・ Ubを 導 入 し 、 抗 FLAG抗 体 で 免 疫 沈 降 し 、 抗 HA抗 体でウエスタン解析を行った．この結果、シンテニンがユビキチンと共有結合およて腓共有結合で哺乳 類細胞 内では結 合して いるこ とが示 唆された．これらの結合はユビキチンの48番目のりシン依存 性かど うかを検 討した 結果、 ユビキ チンの48番目のりシン以外の部位でも行われていることが示 唆され た．シンテニンとユビキチンの非共有結合はユビキチンのC末端のグリシン依存性かどう― 237一か を 検 討 す る た め ユ ビ キ チン 変 異 体 Ub（ △ GG)(75と 76番 目の Glyを 欠 損さ せ た も の） 作 製した．免疫沈降実験により検討した結果、シンテニンのユビキチンとの非共有結合はユビキチンのC末端部 分のグ リシン 依存性 であっ た，シ ンテニン のユビ キチン 結合部 位を同定するため、PDZ欠損シンテニンとN末欠損シンテニンの変異体を作製した．免疫沈降実験により検討した結果、シンテニ ンがユ ビキチ ンと非 共有結 合で相互 作用す るドメインはシンテニンのN末部分であることが示唆 された ，次に 、ポリ ユビキ チン鎖を 特異的 に認識する抗体FK2を利用して、哺乳類細胞内でシンテニンとユビキチンとの結合を解析した結果、細胞内でシンテニンは内在性もしくは外来陸いずれのユビキチンによってもポリユビキチン化を受けていることが示唆された．シンテニンの安定陸を調べた結果、cyclo
hexim
ide処理24時間後でもシンテニンは安定して存荏していることがわ
かっ た ．シン テニンの ポリユ ビキチン 化は分 解シグナ ルではな いこと が示唆さ れた．
【考察】ユビキチン結合タンパク質はユビキチンと非共有結合で相互作用することによってユビキチン化タンパク質の機能や寿命を決定し、さまざまな細胞プロセスに関与している．シンテニンは細胞内でモノユビキチン化タンパク質として機能することが示唆された，しかし、これまでに、ユビ キチ ン 結 合 タン パク 質のユ ビキチン 結合ド メイン がいず れのUBDも ユビキ チンの 44番目の イ
ソロイシンを中心とする疎7k'It/くッチのロシート面に結合するものであった．これに対して、シンテニン が結合 するユビキチンのC末端は新規の結合部位である．一般にタンパク質のユビキチン化
修飾も ユビキ チンの C末端を 介する ことか ら、シ ンテニン は、ユ ビキチ ンのC末 端以外 で相互作用して いる他 のユビ キチン 結合タ ンパク質にユビキチンを介して結合している可能陸が考えられる．シ ンテニ ンは構 造上の 特徴は ニつの PDZドメイ ンで膜 タンパ ク質のC末部分と 細胞質側で相互作用しエンドサイ卜ーシスなどの細胞膜輸送、細胞骨格と膜の編成、癌転移、シナプス伝達、そして軸索伸長などさまざまな細胞活動に関与することが報告されている．シンテニンはモノユビキチンと結合することによってこれらの現象を調節している可能陸が考えられた．リサイクリングとりソゾ ームへ の輸送 は膜タ ンパク 質による時空間的なシグナル伝達を制御する重要な過程と考えられる ．ユビ キチン とPDZタン パク質 はりソ ゾーム とりサ イクリングヘの輸送に関与している．
膜タン パク質 のユビキチン化はりソゾームへのシグナルであり、PDZタンパク質と膜タンパク質の相互作用は膜タンパク質をりサイクリングするシグナルであると考えられている． PDZタンパク質としてのシンテニンも膜タンパク質シンテニンのりサイクリング制御することがわかっている．本研究により、シンテニンはユビキチンとの相互作用を介して、これらニつの細胞内輸送を直接調整する可能性が示唆された．シンテニンがユビキチンと相互作用して、膜タンパク質亠シンテニンー
ユビキチン―ユビキチン結合タンパク質のネットワークを形成して、膜タンパク質の細胞内輸送を制御するかもしれない．このようにシンテニンは膜タンパク質とユビキチン化タンパク質を連結させるという新しい役割を行っているかもしれない，シンテニンは乳癌、胃癌およびメラノーマの癌組織中に高発現し、これらの癌細胞の転移能を高めることが報告されている，シンテニンはメラノーマで 、FAKの自 己リン 酸化を 高めて 癌転移 を調節 するこ とが知 られてい るが、 FAKとシンテニンは直 接な相 互作用 はない ．シン テニン はユビキ チンと の相互 作用を介してFAKの自己リン酸化を調節している可能性があるかもしれない．また、シンテニンは異なる種類の癌細胞においては異なるシグナル経路に関与している可能性がある．本研究においてシンテニンのポリユビキチン化は分解シグナル ではないことが示唆された．シンテニンのポリユビキチン化の具体的な生物学的意義を解析するこ とは、今後の重要な課題であ る．

【結論】シンテニン は、ユビキチンと非共有結合および共有結合で結合していることが判明した．
この シン テ ニン とユ ビキ チ ンの 相互作用は シンテニンのN末部分とユビ キチンのC末端のグリシンに依存している， シンテニンが有するさまざまな機能がユビキチンとの相互作用により調整されている可能陸が示唆 された，

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 笠 原 正 典
副 査 教 授 渡 辺 雅 彦

学 位 論 文 題 名

新規ユビキチン結合夕ンパク質シンテニンの生化学的解析
ユビキチン化は、真核細胞においてタンパク質にユビキチン(Ub： ubiquitin)を付加する翻訳後修飾であり、タンパク質の寿命の決定や細胞内輸送などの多様な生命活動に重要な役割を果たしている．ユビキチンは、活性化酵素(El）、結合酵素(E2)
およぴりガーゼ(E3)
か ら構成さ れるユ ビキチンシステムによって標的タンパク質に共有結合される．近年、多くのユビキチンに結合するタンパク質（ユビキチン結合タンパク質）が同定されている，ユビキチン結合タンパク質はユビキチン化されたタンパク質上のユビキチンに非共有結合で相互作用し、ユビキチン化タンパク質の機能、安定性、または局在の決定などに重要な役割を果たしている．例えば、モノユビキチン化されることにより、ユビキチン化タンパク質がエンドサイトーシスされる報告があるが、モノユビキチン結合タンパク質の関与には不明な点が多い，本研究ではプロテアソームへのターゲットシグナル以外のユビキチンの役割、特にモノユビキチン化の機能を明らかにするため、モノユビキチン結合タンパク質の同定を試みた，
ユ ビキチン 変異体 Ub (K48R/G76A)
をベイトとし、酵母twohybrid
スクリーニングを行った，スクリーニングの結果、9個の陽性クローンが得られ、このうちニっはマウスのシンテニンと同一であった．哺乳類細胞内でシンテニンとユビキチンの結合を検討するために、HE
K293T
細胞にFL
A
G
タグ―シンテニンとHA
タグーユビキチンの発現ベクターを導入し、抗FLAG抗体で免 疫沈降 し、抗HA抗体でウエスタン解析を行ったところ、シンテニンがユビキチンと共有結合および非共有結合で哺乳類細胞内では結合していることが示唆された，
シンテニンとユビキチンの非共有結合はユビキチンのC末端のグリシン依存性かどうかを検 討するた めユビ キチン変 異体Ub (AGG) (75と76番目のGlyを欠損させたもの）を検討した結果、シンテニンとユビキチンの非共有結合には、ユビキチンのC末端部分のグリシ― 240−

ンが重要であることが判明した，シンテニンのユビキチン結合部位を同定するため、シンテニンの変異体を作製したところ、ユビキチンと非共有結合で相互作用する領域は、シン
テニ ンのN末部分で あるこ とが示唆 された，また、シンテニンの安定性を調べた結果、
cycloheximide処理24時間後でもシンテニンは安定して存在していることがわかり、シンテ ニン の ポリユ ビキチン化 は分解シグ ナルではな いことが示 唆された，
口頭発表において、渡辺雅彦教授より，酵母ツーハイブリッドスクリーニングで同定された他のクローンについて、シンテニンに注目した理由、シンテニンの組織発現特異性、非共有結合によるユビキチンとの結合についての質問があった．これらの質問に対し、他にUCHーL3が同定されたが、シンテニンが膜タンパク質の動態制御に関連することからシンテニンに注目したこと、さらにPDZタンパク質が豊富な神経組織等にも存在していること、そしてユビキチンとの非共有結合に関する分子論的解説を述べた。ついで，笠原正典教授
より，これまでに報告されているユビキチン結合タンパク質、およびユビキチンのC末端がシンテニンとの結合に関与することの新規性についての質問があった，これらの質問に対し、これまでに報告されているユビキチン結合ドメイン（モチーフ）を説明し、今回の結合様式はこれまでにない分子間結合に依ることを述べた。さらに，畠山鎮次教授より、シンテニンのユビキチン結合領域におけるドメインの検索、およびエンドサイトーシスにシンテニンのユビキチン化もしくはユビキチン化認識が重要であることを証明する実験に関する質問があった，これらの質問に対し、ユビキチンと非共有結合する領域には既知のドメイン構造はないこと、さらにシンデカンなどの膜タンパク質の動態を細胞生物学的に解析することの重要性を述べた。
この論文は、北海道医学雑誌で高く評価され、今後、エンドサイトーシスを含む細胞内膜輸送の分野において、膜タンパク質のユビキチン化の重要性を認識させることが期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院過程における研鑽や取得単位なども併せ 申請者が 博士（ 医学）の 学位を受 けるの に十分な 資格を 有するものと判定した。

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