博士（獣医学）辻学位論文題名尚利

ベ ネ ズ エ ラ 糞 線 虫の 自 由 生 活期 幼 虫 か ら寄 生 期 幼 虫 へ の 発 育 に 関す る 研 究学 位 論 文 内容 の 要 旨

Rattus
属のげっ歯類を自然宿主とするべネズェラ糞線虫は，ヒト及び家 畜を宿主とする糞線虫のモデル寄生虫として用いられている．本虫の宿主への感染は，自由生活期である感染幼虫の経皮的侵入によって成立する．経皮感染の前後で幼虫を取り巻く環境は，土壌中の外的環境
か ら 宿 主体内 の内的 環境に 変化 する． しかし ，自由 生活期 の幼 虫は相 当 な ストレ ス状態 に曝さ れて いるに も関わ らず， なんら 損傷 も受けずに2つ の 環 境 に 巧 みに 適 応 し て 発育 し ， 感染後 は寄生 期の 幼虫とし て体内を移行し，最終的に小腸に寄生する．著者は，ベネズェラ
葵 線 虫 の経皮 感染時 におけ る自 由生活 期幼虫 から寄 生期幼 虫へ の発育 過 程 に焦点 をあて ．その 発育 機構を 明らか にする ことを 目的 に実験を計画レた，は じめに，現在のラットを用いたぺネズェラ糞線虫の実験室内維持
では ，2〜3週で次の宿主に継代する必要があり繁雑であるため，スナ
ネズ ミを用いたべネズェラ糞線虫の長期継代法について検討した．次に， 自由生活期幼虫及び，感染ラットから寄生期幼虫及び成虫を回収し， 発育期の差異による虫体構成蛋白質に´っいて検討した．また，
一
自 由 生 活期幼 虫から 寄生期 幼虫 への発 育にお ける生 化学的 機構 を明らか にする一環として，感染幼虫を移行幼虫に発育させるin vi troの 培 養 系確立 を試み た．さ らに ，この 培養系 を用い て，発 育に 関与す る 蛋 白 質 及 び そ れ を 規定 す る 遺 伝 子の 発 現 に つ いて 解 析 し た ．
第 I章で は ， ス ナ ネ ズミ に お け る べネ ズ エ ラ糞線 虫の長 期感 染に

つ い て調 ぺ｜ス ナネズ ミを用 いて の長期 継代法 につい て検討 した ，そ の 結果 ，感染 スナネ ズミで は， 成虫の 長期持 続寄生 が成立 し， その 寄 生 期 間は 感 染 後 450
日 以 上 に 及 ん だ． また ，寄生 期間中 ，糞 便
内 の 虫卵 数は減 少する するこ とな く安定 した値 を維持 し，そ の値 は投 与 感染 幼虫数 に依存 するこ とが 確認さ れた， これら のこと から ，ラ ッ トの 代替宿 主とし てスナ ネズ ミを用 いるこ とによ り効翠 のよ い
継 代 及び 自由生 活期幼 虫を大 量か つ短期 間に準 備する ことが 可能 となった．
第II章では，発育期の差異における生化学的性状を明らかにする一環として，二次元電気泳動を用いて自由生活期幼虫，肺寄生期幼虫及び成虫の構成蛋白質にっいて検討した．その結果，自由生活期幼虫は13個の特異的スポットを有し，肺寄生期幼虫及び成虫と明らかに区別され た．こ れに対 して肺 寄生期 幼虫 及び成虫はわずか6スポットを除いてほぼ同一なパ夕―ンであった．これらのことから，虫体を構成する蛋白質は自由生活期の虫体と寄生期の虫体では大きく異なることが分かった．
第m章．で は，自 由生活 期か ら寄生期への発育における生化学的機構を解明するために，宿主を用いず，に自由生活期の幼虫を寄生期にま で発育 させる jnレj troの培 養系確立を試みた，温度25℃において虫 卵から 発育し た自由 生活期 幼虫 t
ま，培養温度を37℃に変化させる
こ と によ って， その形 態は宿 主か ら回収 した移 行幼虫 の形態 にま で変 化 する ことが 確認さ れた． また ，形態 変化の 認めら れた幼 虫と 感
染 ラ ット から回 収した 移行幼 虫の 構成蛋 白質及 び抗原 性につ いて ，二 次 元電 気泳動 及び感 染ラッ ト血 清を用 いたウ エスタ ンプ口 ット 法に よ って 検討し たとこ ろ．両 者の スポッ トパタ ーン及 び主要 抗原 はほ ぼ 同一 であっ た．こ れらの こと から， 自由生 活期幼 虫を温 度37℃の 環 境下 で培養 するこ とによ って ，虫体 は寄生 期幼虫 へと発 育す る
こ と が 確 綛 さ れ ， 1ぬ レ i troの 培 養 系 を 確 立 し 得 た ．
第 IV章 では， 感染時 の虫体 発育 に関与 する蛋 白質を 明らか にす るため，第】II章で確立したjロレi troの培養系を用いて自由生活期幼虫を S35メ チオ ニ ン で 代 謝標 識 し ， 二 次 元電 気泳 動によ って蛋 白質 を分離した後，オートラジオグラフイーを実施した．その結果，自由生活期の幼虫が寄生期へと形態変化する間に分子量70k
ilodalron（kDa）の蛋白質の産生増大及び2つの複合体よりなる16〜22kDaの蛋白質の産 生が確認された，これらの蛋白質は，熱ショック蛋白質（HSP）70に対するモノクローナル抗体を用いたウエ．スタンプ口ット法及ぴパルスチェイス法を用いた解析から，HSP70及び低分子畳領域HSPの関連蛋白質であることが示された，これらのことから感染時の 虫 体 発 育 に は HSPが 深 く 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た ・
第V章では，感染時の虫体発育機構を遺伝子レペルで解明するた
め．産生の増大が確認されたHSP70関連蛋白質を規定する遺伝子の性状につL、て検討した．温度37℃で培養した自由生活期幼虫のmRNAより，ラムダZAPriベクターを用いてcDN．Aライブラリーを作製した
その結果．これまでに報告されている喃乳動物のHSP70遺伝子との間で70％以上の相同性を示す全長1705basepair（bp）のクローン（pSH70−1）を 得た． pSH70ー1の塩 基配列 から推 定される3通りのアミノ酸配列の内の1っは，すでに報告されている各種生物の恒常型HSP70との間に85％以上の高い相同性を示した．サザンブ口ット法
による解析からpS
H70‐1は．ゲノ厶上に単一コピ―で存在することが分かった．また，/‐一ザンブロット法による解析から，pSH70−1の反応する3．2kbのmRNAの発現畳は，虫体が発育する間に増加することが示された．これらのことから，ベネズエラ糞線虫のHSP70関迎遺伝子は，感染時の虫体発育に深く関与する遺伝子であることが示唆された．
以上5章の成績から，スナネズミをぺネズェラ糞線虫の宿主とし用いることによって効率のよい継代法が確立され．また，自由生活期と寄生期の幼虫における構成蛋白質の変化は，発育環境によるものと推察された．さらに，自由生活期の幼虫を寄生期の虫体に発育させるjnレjfr〇の培養系の確立によって，感染時の虫体発育にHSPが重要 な役割 りを果 たして いるこ とが示 唆され た．なかでもHSP
70につ いては遺伝子レベルでも発現が認められ，環境への適応及び形態 変化の誘導が遺伝子によって規定され，複雑な生活環を営

む上で予めプ口グラムされていることを示唆した．

学 位 論文 審 査 の 要旨
主査 教授
副査 教授
副査 教授
副査 助教授神谷 正 男小沼 操
渡邉 智 正奥 祐三郎

学 位 論 文 題 名ベ ネ ズ ェ ラ 糞 線 虫 の 自由 生 活 期 幼虫 か ら
寄 生 期 幼 虫 へ の 発 育 に 関 する 研 究
土壌 伝 播性 の糞線虫には，外界の自由生活期と宿主寄生期の2っの発育期が存在する．
宿 主へ の 感染 は皮 膚よ り侵 入す る第 3期幼 虫（ L3） によ って 成立 し，その後は体内を移行 し寄 生 部位 である小腸内で第4期幼虫 から成虫にまで発育する，本研究は，この一連の発 育過 程 にお いて L3が どの よう にし て異 なった環境に適応し発育するのか，感染時の虫体発 育過程に焦点をあて，ヒト及び家畜に寄生する糞線虫類 のモデル寄生虫であるべネズ
エラ 糞線虫を用いてその発育機構にっいて検討したものであ る．
ベ ネズェラ糞線虫の実験室における継代は，通常ラットを 用いて行れている．しかし，継 代方 法 が繁 雑で ．自 由生 活期 L
3を 多数 入手する方法は確立されていなぃ，申請者は代替宿 主を用いた継代方法の改良を試み，スナネズミにおける 成虫の長期寄生現象を利用した 長期 継 代法 を確 立し た． そこ で， 一度 に多数の自由生活期L3を準備できるようになったこ とから，各発育期における虫体構成蛋白質を調べた．そ の結果，自由生活期と寄生期の虫 体では大きく異なることを明らかにし，この差異は虫体 を取り巻く環境に依存するものと 推察した．
自由 生 活期 L
3の 好適 発育 温度 は25℃で ある．申請者は自由生活期L3の培養温度に注目
し ，in灯 troの培養系確立を試みた．こ れによって，培養を宿主の体温である370Cで実施
す るこ と によ って ，寄 生期 L3の 形態 的特 徴を有した虫体に変化し，加えて，構成蛋白質及び 抗原性の面からも充分に目的を果たした培養系の確立に 成功した，また，発育が温度変 化に よ って 認められたことから熟ショック蛋白質（HSP）の産生が形態変化に関与するも のと 想 定さ れた ．そ こで ，培 養温 度37℃で自由生活期L3が産生する蛋白質及び遺伝子の発 現にっいてさらに検討を行った．
自由 生 活期 L
3の 形態 が寄 生期 へと 変化 する過程で，分子量70kDaの恒常型H
SP70の産生増大 及び分子量16〜22kDa付近の 低分子量領域蛋白質のあらたな産生が確認された．また，
自 由生 活 期L3よりH
SP70関連遺伝子を単 離することによって，本遺伝子が形態変化にともなっ て発現する遺伝子のひとっと考えられ，感染時の虫体発 育にス卜レス蛋白質のひとつであ るH
SP70が重要な役割を果た していることが示唆された・
以上 ， 感染 時の虫体発育を再現したin灯troの培養系によって，感染時における虫体の生化 学的機構の一端が明らかにされた．これらの成果は，一 連の発育過程における環境ヘ

の 適応及 び形態変 化の誘 導が遺伝子によって規定され，複雑な生活環を営む上で予めプロ
グ ラムさ れている ことを ，糞線虫属の線虫で初めて明らかにしたもので宿主ー寄生虫相互関 係を理 解する上 で重要 な知見であった．また，モデル寄生虫としてのべネズェラ糞線虫の 有用性 をさらに 高めた ものであり，糞線虫属線虫の生物学的機能解析の進展に寄与すると ころが 大きぃ． 審査員 一同は， 辻尚利氏 が博士 （獣医学 ）の学 位を受け るのに充分な資 格を有 するもの と認め る，