博 士 （ 医 学 ） 董培 新

学位論文題名
p53dominant―negativemutantR273Hpromotesinvasion
andmigrationof human endometnal cancerHHUA cells(p53遺 伝 子 ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ イ ブ 変 異 に よ る
子宮体癌細胞HHUAの浸潤，運動能の促進に関する研究）

学位 論文内容の要旨【背景と目的】
子宮体癌は欧米では婦人科癌の中で最も頻度の高い悪性腫瘍であるが、近年，日本においても，子宮体癌の頻度が増加してきている．子宮体癌の筋層浸潤および子宮体部外進展が患者さんの予後と強く関連している。子宮体癌の治療成績向上のためには、子宮体癌細胞の浸潤 お よ び 運 動 機 構 を 解 明 し 、 そ れ に 基 づ く 適 切 に 個 体 治 療 方 針 が 不 可 欠で ある 。
p53
夕ンパク質は転写因であり、癌抑制遺伝子として働き、p21、BAXなど多くの遺伝子群の発現に関与し、損傷を受けたDNAの修復、細胞周期の制御、細胞アポトーシスの誘導の機能を持っている。近年、野生型p53遺伝子は癌細胞浸潤に関連する遺伝子M
aspin，PAI−1
およびK
AI1の機能を制御することが示唆された。一方、p53遺伝子の変異が人の癌の半分位で見ら れ、 野生 型p53
遺 伝子 の 転写 機能 を阻 害す るドミナントネガテイブ作用(domin
antnegative)、また癌浸潤や抗癌剤耐性など非野生型p53依存性機能亢進(
gain―of―function)を保有するのが報告された。
子 宮 体 癌 の 26％ に p53変 異 が 認 め ら れ 、 p53 (dominant negative)変 異を 持つ 子宮体癌患者さんは癌進展しやく、予後が有意に悪いことが判明した。しかし、p53dominantnegative
変異は子宮体癌進展に与える影響がまだ十分に解明されていない現状である。従って、p53遺伝子変異がdominantnegative作用およびgain―of―function
作用によって、子宮体癌細胞浸潤能/運動能を促進できる仮説を立てた。そこで、以下の2点を目的とする。（1）野生 型 p53を 有 す る 子 宮 体 癌 細 胞 株 HHUAに DNE作用 を持 つ変 異を 導入 し、 p53dominantnegative変異が子宮体癌悪性化を誘導する分子メカニズムの解明を目指している。（2）野生型p53を欠失している卵巣 癌細胞株や骨肉種細胞株にp53DNE変異を導入し、p53変異のgainーof−function
作用による癌細胞の浸潤および運動能を加速するかどうかを明らかにする。
【材料と方法】
材料は、野生型p53を有す る子宮体癌細胞株としてHHUA、野生型p53を欠失している卵巣 癌 細 胞 株 SKー Ovー 3や 骨 肉 種 細 胞 株 Saos− 2を 用 い 以 下 の 検 討 を 行 っ た 。
1． p53dominantne
gativ
e変異R
273Hの導入による子宮体癌細胞株HHUAの増殖能、運動能、浸潤能変化の検討
＠p53
遺伝子変異の発現ベクターの構築：p53dominantnegative変異(R273H)とrecessive
変 異 (R213Q)の 強 制 発 現 ベ ク タ ー pcDNAー R273Hお よ び pcDNA− R213Qを 作 製 し た 。
＠細胞株の作製：子宮体癌細胞H
H
UAにpc
D
NA―R273H、pc
D
NA―R213Q、またemptypcDNA3．1
ベ ク タ ー を 導 入 し 、 HHUA− 273H、 213Qお よ び Mockの 細 胞 株 を 作 製 し た 。
◎ 導 入 さ れ た p53遺 伝 子 変 異 発 現 の 確 認 ： Yeast functional assayに よ り調 べた 。
＠ 野 生 型 p53標 的 遺 伝 子 遺 伝 子 、 p21、 Bax並び にMDM2の promoterの転 写 機能 解析 ：― 307ー

Luciferaseassayにより解析する。
◎細胞増殖能の測定：MTT asa
yにより検討した。
◎ 細 胞 運 動 能 /浸 潤 能 の 測 定： CP― 31398は 変 異型 p53の 機 能を 回 復 で きる small moleculecompoundで あ る 。 273H細 胞 株 、 213Q細 胞 株 お よ び E細 胞 株 に 種 々 の 濃 度 CP― 31398を 添
加 し ， 細 胞 運 動 能 お よ び浸 潤 能 を cell migration assayと cell invasion assayに よ り 検討した。
◎ 野 生 型 p53標的 遺伝子 Maspin，PAI− 1および KAI1のmRNA発 現の解 析：Realt ime RT―PCRにより確認する。
2． p53変異 R273Hが、 p53を 欠 失 して い る 癌 細胞 の 浸 潤 能お よび 運動能変 化にど のよう に関与しているのを明らかにする。
＠ 細胞株 の作製 ：卵巣 癌細胞 株SK−OV− 3や骨肉 種細胞 株Saos− 2にpcDNA−R273
Hおよびemp typcDNA 3.1ベ ク ター を 導 入 し、 SK― Ov― 3― 273Hと SKー OV− 3− mock、 また Saos― 2− 273HとSaos―2―mock細胞株を作製した。
◎ 細 胞 運 動 能 /浸 潤 能 の 測 定 ： 細 胞 運 動 能 お よ び 浸 潤 能 を cell migration assayと cellinvas
ion assayにより検i寸した。
◎ 野 生 型 p53標的 遺 伝 子 Maspin， PAI― 1お よ びKAI1の mRNA発 現の 解析： Real−time RT― PCR
により検討する。
【結果】
1． p53 dominant negative変 異R273Hの発現 による 子宮体 癌細胞 株HHUAの増 殖能、 運動能 、浸潤能を促進された。
＠ Yeast functional assayに よ り 、 273H細 胞 株 並 び に 213Q細 胞 株 で 、 変 異 p53の 発 現を確認し、E細胞株では、変異p53の発現を認めなかった。
◎ 273H細 胞 は 、 213Q並 び に E細 胞 株 に 比 べ て 、 p21、 Bax並 び に MDM2遺 伝 子 promoterの 転写 活 性 が 有 意 に 低 下 し 、 p53変 異 の dominant negative作 用 が 認 め ら れ た 。
◎ 273H細 胞 で は 、213Q並び に E細 胞 株 に比 べ て 、 増殖 能 が 有意 に亢進 してい た。こ れらは 全てCP―31398処理により抑制された。
＠ 273H細 胞 では、 213Q並び にE細胞 株に比べ て、浸 潤能お よび運 動能が 有意に 亢進し ていた 。
これらは全てCPー31398処理により抑制された。
◎ 273H細 胞 で は 、213Q並び に E細 胞 株 によ り 、 Maspin， PAI−1お よびKAI1のmRNA発現 が有意に低下していた。
互 p53変 異 R273Hの 発 現 が、 p53を 欠 失し て い る 癌細 胞 の 浸 潤能 お よ び 運動 能 に 関 与し て いないことを明らかにした。
ぐD SK―OVー3―273HとSK―OV−3−mock、またSaosー2ー273
HとSaos−2―mock細胞株の間に運動能と浸潤能の変化が認めなかった。
＠SK−OV―3ー273HとSK―OV−3―mock、またSaos―2―273HとSaos―2−mock細胞株の間にM
aspin，PAI―1およびKAIlのmRNA発現の変化が認めなかった。
【考察】
野 生 型 p53を 有 す る 子 宮 体 癌 細 胞 HHUAに 、 p53遺伝 子 変 異 R273Hが 強 いdominant negative
作 用 を 示 し 、 野 生 型 p53標 的 遺 伝 子 p21、 Bax並 び に MDM2の promoterの 転 写 機 能 解 析 を有 意 に 抑 制し て い た 。更 に 、 HHUA細胞 の浸潤 能およ び運動 能が有意 に促進 するこ とが認 められ た 。 こ の変 化 に と 関連 し て 、 273H細 胞では 、Maspin，PAI−1およ びKAI1のmRNA発現が 有意に 低 下 し てい た 。 こ れら の 変 化 は変 異 型 p03の 機能 を 回 復 でき る CP― 31398の処 理 に より抑制 された 。また 、R273Hの 発現が p53−null癌細 胞SK―Ov−3やSaos― 2の浸潤 能および運動能を促 進 す る こと が で き ず、 こ の 変 異が dominant negative作 用に よる子 宮体癌 HHUA細胞の 浸潤および運動能を加速していると考えられる。
【結論】
p53遺 伝 子 dominant negative変 異 R273Hが 野 生 型 p53遺 伝 子 の 転 写 機 能 を 阻 害 し 、 癌 浸潤 抑 制 遺 伝 子 Maspin， PAIー 1， KAI一 1の mRNA発現 を 低 下 させ 、 子 宮 体癌 細 胞 HHUAの 浸 潤能および運動能を促進する可能性が高いと考えられた。

― 308 ‑

学位論文審査の要旨
主副副副査
査
査
査

教
教
教
教

授 福 田
諭
授 守 内也授 秋 田 哲 俊授
弘 明
櫻 木 範

学位論文題名p53 dominant― negadVemutantR273HpromoteSinVaSion
andn五 gra伍 OnofhunlanendometrialCanCerHHUACenS（ p53遺 伝 子 ド ミ ナ ン ト ネ ガ テ イ ブ 変 異 に よ る
子宮体癌細胞HHUAの浸潤，運動能の促進に関する研究）

p53はヒ ト癌にお いて最も 高頻度に 変異が見 られる遺伝 子である 。変異p53タン パ ク の 機 能 的 類 型 は 、 1） 野 生 型 p53遺 伝 子 の 転 写 機 能 の 喪 失 （ lossoffunction）、 2） 野 生 型p53遺 伝子 の 転 写機 能 を阻 害 す るド ミ ナン トネガ ティ
ブ 作 用 （ dominantnegativeeffect） 、3）癌 浸 潤 や抗 癌 剤耐 性 な どの 機 能亢進作用（ gain一ofーfunctioneffect）に 分けられ る。体癌の26％にp53
変異が認
めら れ 、p53ドミ ナントネ ガティブ （DNE）変異 を持つ子宮 体癌は進 展しやく 、有意 に 予 後不 良 で ある こ とが 明 ら かと なっている 。子宮体 癌に認め られるp53
変異 の 機能的 類型と癌 細胞の浸 潤能、運 動能との関 連を明ら かにする ことを目的に 以 下 の検 討 を 行っ た 。（ 1） 野 生型 p53を有する体 癌細胞株 HHUAにDNE作用を持 つ 変 異（ R273H） と 持た な い recesslve変 異（R213Q）を 導入し、p53DNE変異が 体 癌の高 悪性化を 誘導する 分子メカ ニズムを解 明する。 （2）野生 型p53を欠失 し て いる 卵 巣 癌細 胞 株や 骨 肉 種細 胞株にp53DNE変異 を導入し 、p53変異のgainーof―function作用 により癌細胞の浸潤およぴ運動能が促進されるかどうかを 検 討 す る 。 そ の 結 果 次 の こ と が 明 ら か と な っ た 。 1） p53DNE変 異R273Hの発現によ り体癌細 胞株HHUAの増 殖能、運 動能、浸 潤能が促進される。2）p53DNE
変異 R273Hの発現は p53を欠失し ている癌 細胞の浸 潤能および 運動能に は関与しない。す なわちR273Hは 、gain−of−functi
on作用ではなく、野生型p53遺伝子の転写 機 能を阻 害し、癌 浸潤抑制 遺伝子Maspin， PAI―1，KA11のmRNA発現 を抑制
し、 体 癌 細胞 の 浸 潤能 お よぴ 運 動 能を 促 進す る 可 能性 が 高い と 考え られた。
R213Qには浸潤 能、運動 能促進作 用は認め られなか った。

発表終了後，副査の守内教授から，1）野生型p53を有する体癌細胞株HHUAに導入したp53 DNE変異がgainーofーfunction作用によって浸潤能、運動能を促進する可能性、2）recessive p53変異を有する体癌患者の予後は、野生型p53を持つ体癌患者と同様に良好であるので、recessive p53変異が野生型p53と同様に体癌細胞株HHUAの浸潤能および運動能を抑制できるかにっいて質問があった．副査の秋田教授からは，1）p53 nullの卵巣癌細胞SK−Ov―3および骨肉腫細胞Saos−2にp53DNE変異を導入した場合の増殖能の変化、2）HHUA―
73H，213Qおよぴmock細胞に対するadriamycin添加による細胞アポトーシスの変化について質問があった．副査の櫻木教授から，1）p53 DNE変異導入による抗がん剤耐性関連遺伝子発現の変化、2）p53を欠失した子宮体癌細胞を用いてp53DNE変異のgain−of―functionについて検討する必要性にっいて質問があった，主査の福田教授から、1）p53 DNE変異の他部位の癌での報告にっいて、2）p53 DNE変異の結果に基づく適切な個体治療方針の方向性、将来展望について質問があった。これらの質問に対して，申請者は自身のこれまでの研 究 成 績や文 献的 情報を もとに 概ね妥 当な回 答を なしえ た．
本論文は高悪性度の子宮体癌において高頻度に認められるp53変異について、その機能的類型と悪性形質との関連の一端を明らかにしたものであり、今後p53変異を標的とした治療法開発にあたっては、変異の有無のみではなく、その機能に応 じた 個別的検討が必要であることを示したことで高く評価される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。