博 士 （獣 医 学） 河 津信 一郎
学 位 論 文 題 名Studies on classif
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i/bu′ノをn／OrfP
凡とo臣SgroupparaSiteS（ ZsP曙 P凡 Cむ ， Fろ 妨 を 臣 お よ び F〇 rfP凡 と Q2沁 群 原 虫 の分類に関する研究）

学位論文内容の要旨
1
905年に我が国のウシから検出された小型ピ口プラズマtま，1978
年になってピ口プラズマ目タイレリア科のTheileria sergentiと同定され た。Fserg
entiに起因する小型ピ口プラズマ病
は我が国の畜産振興上重要な疾病であり，類似のタイレリア種が日本，オーストラリア，韓国，英国，および北米など温帯から熱帯にかけての世界各地に分布している。現在これらのタイレリア種の学名として はF sergenti，Forientalisおよびアbuffeliが日本，ヨー口ッパおよびオーストラリアの研究グループによってそれぞれ別個に用いられているが，個々の原虫間での詳細な比較検討はおこなわれていない。一方，我が国のウシ寄生性夕イレリア種にっいて現在用いられている学名ア sergentiは1926年に記載された羊のタイレリア種に対して既に使用されており，これを再びウシのタイレリア種の学名として用いることは異物同名（ホモニム）となって命名規約上適当でないとの指摘がなされている。このような混乱した状況を解決し我が国のウシ
寄 生 性 タイ レリア 種を 分類 上ど のよ うに 位置 づけ るべ きか を検 討し た。
まず，各研究グ ループがそれぞれアsergertti，ForientalisおよびT．buげe
臣と称している原虫株を入手し，それらの赤内型原虫（ピ口プラズム）の構成蛋白質を二次元電気泳動で比較した。この結果，大部分の主要蛋白質のスポットは3種の原虫に共通していたが33／34kilo・dalton（kDa）の塩基性主要蛋白質や他のいくっかのマイナーなスポットには差異が認められた。T．se′Igemfの塩基性主要蛋白質が33kDaであったのに対して，F6醴ガセ臣およびF0nーenぬ肛sでは34kDaの位置にこの蛋白質のスポットが検出された。これらの蛋白質分子の間には分子量の差だけではなく等電点の差も認められ，FsergenCfが，ピロプラズムの主要蛋白質の生化学的性状からF6 ．′/．e肛およびForfPnぬ臣sと区別されうることが明らかとなった。

ウェスタンブ 口ットによる解析では，これ ら33/34kD
a蛋白質が各原虫の主要抗原(34kDa)は互いの感染牛 血清と強く反応したが，F sergenti感染牛血清とは弱い反応を示した。また
丁． sergentiの 主要抗原(33kDa)とFbuffeliおよびァ，orienLalis
感染牛血清との間には著明な交叉反応は 認められなかった。各原虫の 可溶化抗原を用いた酵素抗体法(ELISA)においてもウェスタン ブロットと同様の交叉反応が，抗原―感染牛血清間に認められた。Biotin―avidinプ口テイ ンブロット法により，これら33734
kDa主要抗原はともに原虫細胞の表面に分布していることが明らかとなった。
次に遺伝子レ ベルでも比較する目的で，F sergentiおよびFbuffeliの ピ口プラズムより調 製し たmRNAを 鋳型 と して ，そ れぞ れの cDNAラ イプ ラリ ーをAgtllを用いて作製した。
各 ライ ブラ リー から F sergentiの表 在性 主 要抗 原(33kDa； p33)およ びFbuffeliの同抗原(34kDa；p34)を発現するクローンをイムノ スクリーニングにより選択 した。これらの発現蛋白質をウェ スタンブロットで解析した結 果，組換え体p33およびp34はFs
ergenti，T．
buffeliおよびForientalis感染牛血清と同等 に反応した。塩基配列解析の結果，p33およびp34を発現するcDNAク口ーンには全長849base pair (bp)の蛋白質コード 領域がともに存在している。これらの塩基配列より翻訳された両アミノ酸配列(283アミノ酸）の相同性は82％で，それらの推定分子量は約32. 2kDaであった。両配列のN末端側にはN→グリコシル化が可能なアスパラギン残基 がともに認められ，それはp33では2力所，またp34では3力所であった。そのうち最もN末端寄 りの1力所のみが両者に共通していた。これらのことから，p33およびp34は糖鎖の付加によって分子量が異なり，またその糖鎖部分に感染牛血清によって認識される種特異的 な エ ピ ト ― プ を 包 含 す る類 似 の 蛋 白 質 で あ る 可 能 性 が 観 察 さ れ た 。
p33およびp34をコードする遺伝子の塩基配列には84％と高い相同性が認められたが，両者にはいくっかの異なる制限酵素認識部位が存在していた。p33734
遺伝子の両端部配列よルデザイ
ンしたプライマーを用いて，polymer
ase chainreaction(PCR)
でFsergentf，Fわ ．′ノを臣およびForfeれぬ 臣sのゲノムDNAから同遺伝 子の増幅を試みたところ，単一の遺伝子断片が増幅された。こ の遺伝子断片の長さはcDNAの塩基配列より予想されたそれに一致していた。
次に，Fse′．genとfおよびF6 ．ガを肛の ゲノムDNAよりPCRで増幅した p33／34遺伝子をcDN
A塩基配列上で両者に共通しナょい制限酵素認識部位で切断したところ，両増幅遺伝子はそれ ぞれ に特 徴的な切断パターンを示し， 容易に識別された。また， Forfenぬ臣sのゲノムDNAより増幅した同遺伝子の制限酵素切断パタ―ンはT．6 ′/．e臣のp34遺伝子のそれと，使用した酵素のす べてにおいて一致していた。 これらのことから，PCRで各 原虫のゲノムDNA461

からp 33/34遺伝子を増幅し，それらを制限酵素で切断することにより，それぞれp33およびp34を主要抗原とするT． sergentiおよび丁．bu′ノセ比／F0んen
ぬ肛sを容易に識別可能な手法が確立された。
以上の成績から，丁．se曙enEf，Fbり托肛およびT．0んenぬ肛sは，ピロプラズム期の原虫構成蛋白質，特にこれらの原虫細胞の表面に分布ずる主要抗原（p33／34）の差異と，このp33／34によって規定される血清学的性状の差異によってFsergenとfとァ，bMげe
肛／丁，0んe戒o臣sの2群に分類されう ることが確かめられた。さらに，p33／34遺伝子を各原虫ゲノムからPCRで増幅し，その制限酵素切断パターンを比較することによってF
se曙PmfとF6 ．′ノを肛／ア，0厄en施nsを容易に識別可能な手法も確立された。
したがって，現在，我か国のウシ寄生性夕イレリア種，いわゆる小型ピ口プラズマ原虫の学名と．して用いられているF
se′雷e
凡とfは命名学上不適当であることから，種名の検討を早急におこなう必要があると結論された。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 小沼 操教授 清水悠紀臣
教授 神谷正 男
助教授 杉本千尋

我が国のウシ小型ピ口プラズマ病はピ口プラズマ目夕イレリア科のTh
eileriaser
gentiに起因する疾病である。類似のタイレリア種は温帯から熱帯にかけての世界各国に分布しているが，これら個々の原虫間での詳細な比較検討は行われていない。また丁， serg
ent
iの学名はヒツジのタイレリア種に対して既に使用されており，ウシのタイレリア種の学名として用いることは異物同名（ホモニム）となる。申請者はこのような混乱した状況を解決し，我が国のウシ寄生性タイレリア種を分類学上どのように位置づけるべきかを検討した。本論文は英文72頁からなり参考論文13編を付している。
まずアsergentL， アorientalisおよびFbuげeぬの赤内型原虫（ピ口プラズム）の構成蛋白質を比較した。主要蛋白質はFse′曾emfで33kDa，Fら ．′ノを臣およびF0んe
凡ぬぬs
では34462

kDaで あ っ た 。 丁 ， bu弛 ぬ お よ び ア 〇 nentn臣sの 主 要 抗 原（ 34kDa） は 互 い に強 い 交 差 反 応を 示 し た が ， 丁， sピ rぎPmfの 主 要抗 原 （ 33kDa） と は著 明 な 交 差 反応 は 認めら れなか った 。
次に丁 ，se曙e′比fと丁，bり弛比主要抗原遺伝子をクローニングし，その塩基配列を解析した。
両 遺 伝 子には 全長84
9塩基 の蛋白 質コ ード領 域が存 在して いた。 塩基 配列よ り翻訳 された 両ア ミノ 酸 配 列（283アミ ノ酸） の相同 性は 82％で， これら の推 定分子 量は約 32．2kDaで あった 。両 遺伝 子の 塩基配 列には 84％と 高い相 同性が 認めら れた が，両 者には いくっ かの異 なる制限酵素認識部 位 が 存 在 し てい た 。 両 遺 伝子 の 両 端 部 配列 よ り 設 計 した プ ラ イ マ ー を用い て，Po
lymer
asechainreaction（PCR）でT．se′舊ピ nn，ア． 6 ．′ノ をnおよび r0んen缸 臣sのゲノ 厶DN
Aから
同 遺 伝 子 の 増 幅を 試 み た と ころ ， 単 一 の 遺伝 子 断 片が増 幅さ れた。 これら PCRで 増幅し た遺 伝
子 を 制 限 酵 素 で切 断 し た とこ ろ，丁 ．bツ形臣 とrorf
en地f
ぬ は全く 同じ 切断パ ターン を示し たが T． se曙PnCfのそ れ は 異 な って い た 。 以 上 の成 績 か ら ， Fse曙 emf， ア 6q′′e臣は 主要抗 原の 分 子 量，そ の血清 学的性 状なら びに 遺伝子 の制限 酵素切 断パ 夕―ン によル ヶ，se曙e凡nとT．
6圻 B肛 ／ F0nピ n紐臣 sの 2者 に分 類 さ れ う るこ と を 示 し た 。こ の 研 究 は ウシ寄 生性夕 イレリ ア
種 の 比 較 を と おし ， 我 が 国 のT． se曙emfの 命 名の 再 考 に 重 要な 知 見 を 提供 するも のであ る。
よ って 審査員 一同は ，河津 信一 郎氏が 博士（ 獣医学 ）の学 位を 受ける のに十 分な資格を有するもの と認 めた。

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