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日呼吸誌2（6），2013●ファイザーフェローシップ報告

精巣上皮特異的分泌蛋白である EP2c は腫瘍抗原を抗原提示させ，腫瘍免疫を成立させる
住友

はじめに賢哉

phage inﬂammatory protein IIIα（mMIP3α）.
2．MHC Class I presentation

Epididymis-specific secretory proteins, epididymis

Wild-type C57BL/6 of tibia were puriﬁed from boneprotein 2 type C（EP2c）はアンドロゲン依存性蛋白でmarrow dendritic cells, and incubated with EP2c fusion

精子に結合し，精子形成に関係している．ヒト EP2c 遺

protein and/or inhibitors. From TCR, transgenic pmel-1

伝子は chromosome 8（8p23）に位置し抗菌ペプチドでmouse splenocytes were concurrently puriﬁed and co-あるβ-defensin 遺伝子とクラスターを形成している．

culture with dendritic cells and splenocytes, and theDefensin は 貪 食 細 胞 と 肥 満 細 胞 に 遊 走 作 用 を 持 ち，IFN-γ was measured by ELISA.

CCL20（MIP3α）の受容体である CCR6 によって，未3．Procedure of receptor binding assay

分化樹状細胞の活性化は促される．それゆえ，EP2c はB6/129: mouse macrophage, RAW264.7: virus trans-chemokine receptors を介して未熟な樹状細胞を活性化

formed BALB/c mouse macrophage, HEK293/mCCR6:させると仮定し実験を行った．

human adenovirus E1 transformed embryonal kidney,

研究目的

THP-1: human acute monocytic leukemia, CCRF-CEM:
human T acute lymphoblastic leukemia, MOLT-4: hu-

粘膜免疫におけるキャリアとして EP2c を利用できる

man T acute lymphoblastic leukemia, A20: mouse B cell

かどうか検討した．すなわち，抗菌作用を持つβ-defen-lymphoma, and C57BL/6: mice bone marrow dendritic

sin 様のペプチドである EP2c が未知の受容体を介してcell lines were purchased from ATCC（American Type

免疫細胞を活性化させ，さらに EP2c と融合した抗原がCulture Collection）. Harvest cells 0.5×106/tube. Incu-

MHC Class I & II を通じて粘膜免疫における抗原提示細bate 50 μl of 50 μg/ml of fusion protein or control pro-胞への標的とする可能性を検証する．

tein on ice. Incubate 10％ goat serum/PBS/0.1％ azide

Materials and Methods
1．MHC Class II presentation

on ice. Add 1:300 Anti c-myc Ab on ice. Add 1:50 Antimouse FITC-IgG Ab on ice. Analyze by FACS.
4．Chemokine fusion vaccination elicits antitumor re-Wild-type BALB/c splenocytes were incubated withsponses in BALB/c mice

0.01‑1 μg/ml murine or human EP2c peptide fused with

Eight or 10 mice per group were electroporate immu-VL315（VL from MOPC315 plasmacytoma cells, Igλnized three times over a two-week interval with mEP-chain）O/N. Splenocytes were washed, irradiated, and2cOFApCMVE or PBS. Four days before the last im-

mixed with BALB/c CD4＋ T cell clone 7A10B2, whichmunization, the mice were challenged subcutaneously

recognizes processed epitope λ91‑101. IFN-γ secretion

with A20（TIB-208; BALB/cAnN B cell lymphoma）

was measured after 24 h of incubation. Control spleno-cells.

cytes were incubated with VL315 fused with VH fragment（sFv315）, with（mDF1β）, or with murine macro連絡先：住友 賢哉〒783‑8509 高知県南国市明見字中野 526‑1
JA 高知病院内科（E-mail: kenyasum@gmail.com）

Tumor growth was subsequently assessed, and micewith tumors greater than 400 mm2 were euthanized.

結果

1．EP2c は細胞表面にある受容体に結合し，腫瘍抗原を MHC Class II へ提示する
Epididymis-specific secretory proteins, epididymis

EP2c は腫瘍抗原を抗原提示させ，腫瘍免疫を成立させる

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Fig. 1 Schema of constructs to study MHC Class IIpresentation. Human or mouse EP2c was linked inframe with VL315, a plasmacytoma MOPC315 immunoglobulin-delivered variable light（VL）-chain fragment, which contained CD4＋ T cell epitope λ91‑101.
Control construct is single chain antibody（scFv）,
which is contained in frame fusions of both VH andVL fragments of Ig from MOPC315.

protein 2（EP2）はアンドロゲン依存性蛋白ファミリーで精子と結合し精子の成熟に関係していると考えられている．ヒト EP2 遺伝子は染色体 8 番（8p23）に位置し抗菌ペプチドであるβ-defensin 遺伝子と一群を形成している．EP2 遺伝子は副睾丸に強く発現し，spliced formである EP2c はβ-defensin 様の特徴と関連があると考えられている．しかし EP2c の免疫細胞での役割は不明で
あ る． 最 近 我 々 は，β-defensin が chemokine receptor
である CCR61）を介して免疫細胞の誘導を行い，未熟なFig. 2 Both human and murine EP2c can deliver antigens to MHC Class II processing pathway. Murinesplenocytes from BALB/c mice were incubated with
1‑0.01 μ g/ml murine or human EP2c fused withVL315（mEP2 and hEP2, respectively）overnight.
The splenocytes were then washed and irradiatedand mixed with CD4＋ T cells, which recognized thatprocessed epitope λ91‑101. IFN-γ secretion was measured after 48 h of incubation. Control splenocytes
were incubated with VL315 fused with VH fragment（sFv315）, with mDF1β, or with mMIP3α.

樹状細胞が TLR-42）を介して成熟することを見いだした．
さらに免疫原性のない自己の腫瘍抗原がβ-defensin や（Fig.
II 経路へ運び CD4＋ T 細胞を刺激することを示した

chemokine との融合蛋白により免疫原性が回復するこ2）．それゆえ，これらの結果から EP2c は細胞表面の受とを示し1），マウス同系腫瘍モデルに対する予防的治療

容体に結合することができ，抗原提示細胞に抗原を発現的効果を示した ．chemokine の融合蛋白は，chemo-し抗原提示を促進すると考えられた．

1）3）

kine receptorを介して抗原を効率的に細胞内へ取り込み，MHC Class I & II を通じて抗原提示を行い，CD4＋ CD8＋

2．EP2c は腫瘍抗原の MHC Class I processing を促進する（cross-presentation）．これらの方法は chemoattrac-

殺傷性 CD8＋ T 細胞反応の誘導は，腫瘍や慢性炎症疾tant の種類に依存して免疫反応の調整を可能とする．た患の治療の鍵である．CD8＋ T 細胞反応は抗原を処理しとえば成熟樹状細胞を chemoattract する恒常性 chemo-

MHC Class I に提示する．外因性の抗原は MHC Class I

kine である SLC，SDF1 ではなく，未熟樹状細胞を標処理経路にはほとんど到達しない，これを cross-pre-T 細胞を反応させる

1）4）5）的とするβ-defensin 2 や炎症性 chemokine の融合組換え

sentation と呼んでいる．我々の最近の結果にもかかわ体は中等度の humoral responses を引き起こすが，強いらず，抗原が融合体としてβ-defensin やβ-defensin に類予防的治療的抗腫瘍効果を発揮する．対照的に，いわゆ似する EP2c を輸送するとしたならば，cross-presenta-る Th2 chemokine は細胞傷害性 T cell 反応を誘導する

tion 経路が効率的に利用されるだろう．Cross-presenta-

ことはできないが，抗体の産生には優れている1）．そのtion を研究するため gp100 と融合した EP2c を作製した

ため EP2c ペプチドは，粘膜の抗原提示細胞に抗原を提（Fig. 3）．gp100 は melanoma/melanocyte 分 化 自 己 抗示する能力があると仮定した．すなわちβ-defensin に類原である．我々は共同研究者である National Cancer In-

似する EP2c は chemokine receptor を介して抗原提示

stitute の Dr. Nicolaus Restiﬀo から，Vα1Vβ13 T cell re-細胞に結合し MHC Class I & II を通じて抗原処理を効

ceptor を発現している transgenic mice pmel-1 を提供し率的に行うことができると考えた．加えて腫瘍抗原であていただいた．この T cell receptor は mouse and hu-る VL315 や plasmacytoma MOPC315 由 来 variable

man gp100 epitope を MHC Class I: H-2Db 特異的に拘束light（VL）-chain fragment（Fig. 1）と融合した EP2c（ヒする．我々の予備実験の結果から，EP2gp100 で処理しト，マウスともに）は，特異的に VL315 を MHC Class

た抗原提示細胞は pmel-1 mice 由来の CD8＋ T 細胞を刺854

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激することがわかっており，これは，EP2 は gp100 を2（6），2013

3．EP2c 融合蛋白の結合する受容体の検索

MHC Class I 処理経路に輸送することを示している（Fig.

MHC Class I & II 処理経路における EP2c 融合蛋白に4）．一方 gp100 だけでは CD8＋ T 細胞を刺激するのによる抗原輸送の経路を検討した．取り込みと抗原提示を失敗した．さらに反応は非常に効率的でごく少量の蛋白特異的に阻害する阻害剤［pertussis toxin（PTX），su-が必要なだけであった．それゆえこれらより，EP2 はcrose，lactocystin］ を 使 用 し，ELISA を 用 い て IFN-γ

抗原提示細胞の未知の受容体に特異的に結合し抗原をを測定することにより抗原提示能を検討した．EP2c はMHC Class I & II 処理経路に輸送することが示された．

chemokine receptor に結合すると考え，受容体は G 蛋

EP2 は粘膜で産生される．それゆえ EP2 は粘膜の抗原白質共役型かどうか検討した（Fig. 5）．その結果 PTX提示細胞を標的とし，ワクチンキャリアとして使用できや sucrose で抗原提示が阻害されることが示され，そのることが示唆された．

受容体はG蛋白質共役型であることが示唆された．また，当初から EP2c はβ-defensin と同様，chemokine receptor である CCR6 に結合することにより抗原提示を行うことが示唆されていた．そのため FACS を用いて結合能を検討したが，結合は確認できなかった．そのほか
CCR4 に結合する受容体である TARC も検討したが同じく結合は確認されなかった．さらに未知の受容体があFig. 3 Schema of constructs to study MHC Class I
presentation. Human or mouse EP2c was linked inframe with gp100, a melanoma specific antigen that
contained H-2Db-restricted mouse gp100 epitope. Control protein consisted of unlinked gp100 alone.

ると考え，いくつかの細胞において結合の有無を検討したが確認できなかった（Fig. 6〜8）．
4．

での EP2c の DNA ワクチンとしての働き

マ ウ ス の モ デ ル を 用 い，EP2c 融 合 蛋 白 も し く はDNA を皮下もしくは筋肉注射で投与し全身性 T cell 反Fig. 4 Human and murine EP2c/gp100 peptide can both deliver antigens to MHC Class I processing pathway. Murine immature DCs from C57BL/6 mice were incubated with 1‑0.01 μg/
ml murine or human EP2c fused with gp100（mEP2gp100 and hEP2gp100, respectively）overnight, and then DCs were washed and irradiated and mixed with CD8＋ T cells from pmel-1
mice, which recognized processed H-2Db-restricted epitope. IFN-γ secretion was measured after 48 h of incubation. Control DCs were incubated with unlinked gp100 alone or DCs pulsedwith irrelevant peptide（MOPC315 peptide）.

EP2c は腫瘍抗原を抗原提示させ，腫瘍免疫を成立させる

Fig. 5MHC Class I presentation by EP2c is mediated by G-coupled receptor endocytosis.

Fig. 6Receptor-binding assay. Human T cells do not bind murine and human EP2c.

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Fig. 7 Receptor-binding assay. CCRF-CEM（human peripheral leukemia acute lymphoblastic）cells bind
hTARC, but do not bind murine and human EP2c.

Fig. 8 Receptor-binding assay. Mouse MIP3α and murine EP2c show little difference compared to singlechain Fv315. Single chain is negative control.

EP2c は腫瘍抗原を抗原提示させ，腫瘍免疫を成立させる

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abFig. 9 （a）Vaccination with EP2-cmOFA suppresses tumor growth.（b）DNA vaccination with
EP2-cmOFA improves survival.

応の有無を調べた．同時に腫瘍を皮下投与し，予防的抗target immature, but not mature, dendritic cells in-

腫瘍免疫能を検討した．

duce antitumor immunity when genetically fused

腫瘍径や生存曲線を検討した．その結果，治療群は有意に生存曲線，腫瘍径の改善を認め，抗腫瘍効果を期待できる結果となった（Fig. 9）．

結語

我々の究極の目標は，理想的なワクチンキャリアの作製と粘膜免疫の誘導にある．EP2c の生物学や免疫学，すなわち EP2c の抗菌ペプチド作用，粘膜免疫細胞の活性化に注目することとなる．EP2c を介した MHC ClassI & II 抗原提示のメカニズムの解明は，臨床応用に重要な意味を持つであろう．腫瘍や性行為感染症（HPV，HBV，HCV，HIV），呼吸器感染症，腸管感染症の治療的予防的ワクチンの開発にも重要である．
引用文献
1）Biragyn A, et al. Mediators of innate immunity thatwith nonimmunogenic tumor antigens. J Immunol
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2）Biragyn A, et al. Toll-like receptor 4-dependent activation of dendritic cells by beta-defensin 2. Science 2002; 298: 1025‑9.
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4）Schiavo R, et al. Chemokine receptor targeting eﬃciently directs antigens to MHC class I pathwaysand elicits antigen-speciﬁc CD8+ T-cell responses.
Blood 2006; 107: 4597‑605.
5）Biragyn A, et al. Chemokine receptor-mediated delivery directs self-tumor antigen eﬃciently into theclass II processing pathway in vitro and induces
protective immunity in vivo. Blood 2004; 104: 1961‑9.