博 士 （ 獣 医学 ） 宇 野泰 広
学位論 文題名工dentif
icationand characterizat
ion of CY
P2C76 incyno
molgus monkeys（ カ ニ ク イ ザ ル に お け る CYP2C76の 同 定 と 解 析 ）学位論 文内容の要旨

サルは進化的にヒトに近い動物種のーっであり、その薬物代謝パターンが一般に極めてヒトに近いため、新薬開発における薬物代謝や安全性の試験において重要なモデル動物として使用されている。しかし、稀にではあるがヒ卜と異なる代謝パターンを示すこと が明ら かとなっ てきた。これは、チトクロームP450(CYP)を始めとする薬物代謝酵素におけるサルとヒトとの違いが一因であると考えられるが、ヒトやラットに比べてサルでは薬物代謝酵素遺伝子が十分に同定・解析されておらず、種差の原因を詳細に理解することが困難であった。そこで本研究では、サルの薬物代謝を分子レベルでより深く理解するための第一歩として、カニクイザル肝臓でEST (expressedsequencetags)を網羅 的に取 得して、 薬物代謝酵素のcDNAを同定し解析することにより、以下の結果が得られた。
1．カ ニクイ ザル肝臓から1，06
4
種類の異なるESTを取得し、多くの薬物代謝酵素をコード す る c
DN
Aを同定す ること に成功し た。CY
Pについ ては計21種類の異 なる分子種を コードす るcD
NAを同 定するこ とができた。さらに、得られたESTを解析することによルヒトには存在しないサルESTの同定を試みたところ、薬物代謝酵素では、 新 規 の C
YP2CであるC
YP2C
76の E
STを 候補 と し て 同定 す る ことが できた。
2．得ら れたCY
P cD
NAの 塩基配列 を解析 したとこ ろ、得られたクローンのほとんどがヒ トC
YPを コード する遺伝 子の塩 基配列と cDN
Aレベル で930/0
以 上の相 同性を示し た の に対 し 、 C
YP2C76の みが い ず れの ヒ トCY
Pとも比較 的低い （約80%)
相同性しか示さなかったので、CYP
2C76がヒトには存在しない分子種である可能性が考え られた。 よって 、本研究 ではCY
P2C76について更なる解析を行うことにした。
3． 同定する ことが できた4種類の カニク イザルCY
P
2C
分子種について遺伝子発現を調べたと ころ、 これらの C
YP
2Cの 中ではCY
P2C76が最 も高く肝 臓で発 現しており、CYP
2C76が カニク イザルの 肝臓で は最もメ ジャー なC
YP
2Cで あるこ とが示唆された。 また 、 C
YP
2C76がタンパク質として 肝臓で発現し、ヒトC
YP
2Cの モデル基質を用いた代謝実験によりCY
P2C76が代謝機能を有する分子種で あることが分かった。
C
YP2C
76がヒトには存在しなぃ分 子種であるかどうか調べるためにRT‑PCR
およぴウェスタン・ブロッティングを行ったところ、m
RN
Aおよびタンノヾク質レベノレでC
YP2C76様 のCYP
2Cをヒ トで は検 出 する こと がで きな かった 。また、サルC
YP
2Cのゲノム構造を調べたところ、ヒトと同様にCY
P2Cはゲノム上でクラスターを形成しており、CYP
2C76がこのクラスターの末端に存在し、この領域がヒトのゲノム上
では遺伝子の存在しない領域(intergenicregion)に相当することから、ヒトにはCYP
2C76に相当す る遺伝子が存在しなぃことが示された。
以 上のことから、CYP2C76が薬物代謝におけるサルとヒトの種差の一因である可能性 が考えられたので、ピタバスタチンをモデル薬物としてC
YP
2C76の代謝への関与を 調べた。その結果、ヒトには見られないサルの代謝物の生成やヒトではCY
P
3A4に よ る代 謝反 応に サル ではCY
P2C76が関与していることから、CY
P2C76がピタバス タチンの代謝におけるサルとヒトの種差の一因となっていることが明らかになった。
これまでの結果から、CY
P2C76の機能をもたなぃサルは、よルヒトに近い代謝パターンを示す可能性が考えられた。カニクイザルCYP2C76において網羅的に遺伝子多型を探索することにより計46種類の多型を見出したが、その中に1塩基の欠損を伴う多型があった。この変異がゲノム上に存在すると、フレームシフトにより未熟な終始コドンが生じるため、翻訳されても機能的なCYPタンパク質が生じないことが明らかになった。これまでに、この多型をへテロで有する個体を雄雌数頭ずつ見出すことに成功したが、今後、ホモ個体を見出す、或いはへテロ個体から生み出すことができれば、薬物代謝におけるより良い モデル動物になるものと期待される。

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学位論 文審査の要旨
主 査

教 授

副 査

名 誉 教 授 鎌 滝 哲 也

副査 教授
副査 准教授

藤 田 正 一

伊 藤茂男
石塚真由美

学位論文題名Identif
ication andcharacteri
zationofCYP
2C76incyn
omolgus monkeys（カニ クイザ ルにお けるCYP2C76の 同定と 解析）
サルはその薬物代謝パターンが一般に極めてヒトに近いため、新薬開発における薬物代謝や安全性の試験において重要なモデル動物として使用されている。しかし、稀にではあるが、同じ医薬品について、ヒ トとサルでは異なる代謝パターンを示すことが明らかとなってきた。これは、医薬品開発におけるヒトヘの安全性確保にきわめて重要な問題である。チトク
ロームP450 (CYP)
を始め とする薬物代謝酵素におけるサルとヒトとの違いが一因であると考えられるが、サルでは薬物代謝酵素遺伝子が十分に同定・解析されておらず、種差の原因の詳細は明らかではなかった。そこで宇野氏は、カニクイザル肝臓でEST(expressedsequencetags)を網 羅的 に取 得 して 、薬 物代 謝酵 素の cDNAを解 析し、計21種類の異なるCYP
分子
種 をコ ード する c
DNAを同 定し た。 この ほと んど が ヒト C
YPの塩 基配 列と cDNAレ ベルで93％以上の相同性を示したのに対し、今回新規に見っ けたC
YP2C76はいずれのヒト CYPとも比較的低い（約80％） 相同性しか示さなかった。遺伝子発現を調べたところ、CY
P2C76はカニクイザルの肝臓で は最もメジャーなCYP2Cであることが示唆された。また、CY
P2C76が 代謝 機能 を有 する 酵素 タン パク 質と して 肝臓 で 発現 していることも明らかにした。
RT‑PC
Rおよびウェスタン・ブロッティングを行ったと ころ、mRN
Aおよびタンパク質レベル でCYP
2C76様 のCYP2Cを ヒト では 検出 する こと が でき なか った 。ま た、 サル CY
P2C
遺伝子のゲノム構造を調べ たところ、ヒトと同様にC
YP2C遺伝子はゲノム上でクラスターを形成しており、CY
P2C76遺伝子がこのクラスターの末 端に存在していることが分かった。
この領域はヒトのゲノム上では遺伝子の存在しない領域(intergenicregion)に相当する。明ら か に 、 CYP2C76に 相 当 す る 遺 伝 子 は ヒ ト で は 存 在 し な い こ と が 示 さ れ た 。
以上のことから、CY
P2C76が薬物代謝におけるサル とヒトの種差の要因である可能性が考えられたので、ピタバ スタチンをモデル薬物としてCY
P2C76の代謝への関与を調べた。
そ の結果、ヒトには見られないサル独自の代謝物の生 成や、ヒトではCYP3A4が行う代謝反応をサ′レではCY
P2C76が行ってしヽることが明らかになった。これらから、CYP2C76がピタバスタチンの代謝におけるサルとヒトの種差の要因となっていることが明らかになった。
以上、宇野氏はこれまで原因が明らかにされていなかったヒトとサルの薬物代謝の種差の要因 が、ヒトには存在しない、サル独特のCY
P分子種、CY
P2C76の存在によるものであることを明らかにした。
医薬品開発における薬物代謝や安全性研究に汎用されるサルにおいて、ヒトと対応しない薬物代謝酵素が存在するという知見は既存の認識を変える重要な発見であり、より安全な医一1
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薬品開発に資するものである。また、この遺伝子の同定は、ヒトにより近い薬物代謝酵素組成を持ったモデル動物作出にも道を開くものである。
よって審査員一同は、上記学位論文提出者宇野康弘氏が、博士（獣医学）の学位を授与されるに十分な資格を有するものと認めた。

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