博 士 （ 獣 医 学 ） 長野 秀樹

学位論文題名Demonstrationofacommonantig
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probe（鶏伝染性気管支炎ウイルス共通抗原の検出およびDNAプ 口 一 ブ を 用 い たウ イ ルス 株 の型 別 ）学 位 論 文 内 容の 要旨

鶏伝染性気管支炎ウイルス（IBV）はコロナウイルス科に属し、粒子は直径80−120nmで、エンペロープを有して多形性を示し、表面には涙滴状の突起（スパイク）を持っている。核酸は一本鎖の感染性十鎖RNAである。構造蛋白はスパイク（S）ならびにマトリックス（M） 糖蛋白およびヌク レオカプシッド（N）蛋白の3種がある。
本ウイルスは鶏に呼吸器病、腎炎、腎症、さらに産卵率低下を引き起こす。また、本病の血清学的診断には中和試験が最もよく用いられてきた。この試験は血清型特異的試験方法であり、また本ウイルスには多くの血清型が存在するため、その的確な診断には多くの抗血清あるいはウイルス株が必要できわめて煩雑である。近年、抗原抗体反応の検出方法として固相酵素抗体法（ELISA）が広く種々の感染症の抗体あるいは抗原の検出に用いられるようになった。本研
究では、ELISAを用い、IBV感染症の簡易で確実な診断法を確立することを目的として検討を行った。
中和試験で交差性の低い種々の株に対する抗血清を用いて、IBV
B42株のトリトンX−100による可溶化抗原に対するELISAを行った
ところ、これらの抗血清も強く反応した。この結果はE
LISAにより、中和試験では検出できない他の株に対する抗体をも検出し得ることを示すものと思われる。従来のELISAでは血清の多段階希釈法を用いていたために多くの検体数を処理することは困難であったが、今回著者が開発したELISAでは一定希釈の血清を用いているため操作がより簡便で、1度に扱える検体数も格段に増え、鶏群のモニタリングにはより適していると思われる。
一方、より迅速な診断のため、感染鶏からのウイルス抗原の検出のためにモノクローナル抗体を用いたELISAについて検討した。IBV B42株に対する5っのモノクローナル抗体について、交差反応性の少ない9株およぴB42株と同じ血清型に属する2株との反応性を，ELISAで調べたところ、N蛋白を認識するクローン1Fがすべての株に対 して強く反応した。そこで本モノクローナル抗体と抗B42鶏IgGを用 いて抗原検出のためのELISAを確立した。その結果、B42株あるいは血清学的に異なるA5968株を接種した発育鶏卵の尿膜腔液ばかりでなく、上記の2種のウイルスをそれぞれ接種した鶏の気管乳剤からも、ウイルスをより高感度に検出することができた。
以上のように、単一の株の抗原あるいは抗体を用いたELISAにより、血清型とは関係なく、抗体や抗原を検出するこ、とができ、IBVの血清学的診断が大きく簡易化改善された。
一方、IBV診断では分離ウイルスの血清型を決定する必要がある。
これまで血清型別は交差中和試験で行われてきたが、明瞭な血清型別が困難な株があり、結果が明瞭でないことが、しばしばあった。
そこで、cDNAプロープを用いたドット・ブロット・ハイプリダイゼ
イ ショ ン によ る 血清 型 の同 定につい て検討した 。
B42株と同じ血清型に属するM41株のS蛋自をコード゛している遺伝子のcDNAを作製し、制限酵素を用いてS蛋白の1っの領域（Sl）をカバーするcDNA断片を作製した。本cDNA断片をジゴキシゲニン‐dUTPで標識し、S1プローブとして試験に供した。可検ウイルスのRN
Aはプロ ーブに用いたM41株ならびにそれと同じ血清型に属する4株および互いに交差性の少ない14株から得た。S1プロープは68℃では、M41株以外とはまったく反応せず、同一血清型に属する株でも変異の度合いが高いことが示された。また56℃ではM41株を含むそれと同じ血清型に属する5株とのみ反応し、中和試験による血清型と一致した。すなわち、SS株および7073株と中程度の交差性を示すTochigi株に対しても本プローブは反応せず、ハイブリダイゼイシ
ヨンによって明瞭に型別できる可能性が示唆された。また、プロー
ブさえ用意できれば、本手技は中和試験と比べて容易であり、さらに早く結果が得られることが明らかとなった。
以上の実験成績により、ELISAによるIBVの抗体および抗原の検出がより簡素化され、IBの血清診断がより容易になった。また血清型別についてもSl遺伝子のcDNAプローブを用いたハイブリダイゼイシ
ヨンによって、明瞭にできることが示唆された。このように本研究によってIBVの同定から血清型別までの診断が容易かつ確実に行うことが可能となった。

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 清 水 悠 紀 臣
副 査 教 授 橋 本 信夫
副 査 教 授 板 倉 智敏
副 査 教 授 小 沼
操

学 位 論 文 題 名

Demonstration ofacommon antigen in chickens
1nfeCtedWithinfeCtiouSbr、 OnChitiSViruSand
differentiationoftheViruSStrainSWithaDNAprobe（ 鶏 伝 染 性 気 管 支 炎 ウ イ ルス 共通 抗原 の検 出お よび
DNAプ 口 ― ブ を 用 い た ウ イ ル ス 株 の 型 別 ）鶏 伝 染 性 気 管 支 炎 (I B)ウ イ ル ス に は 多 く の血 清型 が ある ため 、そ の診 断に は多 種
類 の 抗 血 清 と ウ イ ル ス 株 を 必 要 と し 、 き わ め て 煩 雑 で あ っ た 。 本 論 文 は 酵素 抗体 法（ ELISA） を 用 い 、 IBの 簡 易 確 実 な 診 断 法 の 確 立 に つ い て 検 討 し て 得 ら れ た 新 知見 につ いて 述 べた もの であ る。
ウ イ ル ス を 卜 リ 卜 ン Xー 100で 可 溶 化 し た 抗 原 と 種 々 の ウ イ ル ス 株 に 対 する 抗血 清と の 間 で ELISAを 行 っ た と こ ろ 、 中 和 試 験 で は 抗 体 が 検 出 さ れ な ぃ 抗 血 清 か ら も 抗体 が 検 出 さ れ た 。 中 和 試 験 と は 異 な り 、 ELISAで は 一 定 希 釈 の 血 清 で 抗 体 測 定 が 可能 なの で、 手 技が 大巾 に簡 易化 され た。
血清 型の 異 なる ウイ ルス を検 出す るた め、 ウイ ルス のN蛋 白を 認識 する モノクロ―ナル 抗体 のな か から 全て のウ イル ス株 に対 して 強く反応する 抗体を選別した。このモ丿クロ ー ナ ル 抗 体 と 抗 鶏 IgGを 用 い て 抗 原 検 出 の た め の ELISAを 確 立 し た 。 こ の 方 法に よっ て血 清 型の 異な る全 ての ウイ ルス の検 出が可能とな り、実験感染鶏の気管乳剤から もウ イル ス を高 感度 に検 出す るこ とが でき た。
一 方 、 IBの 診 断 では 分離 ウイ ルス の血 清型 を決 定す る 必要 があ り、 これ まで 中和 試
験 が用 いら れ てき たが 、結 果が しば しば 明確 でなく手技も 煩雑であった。この欠点を改善 す る た め 、 ウ イ ル ス の S蛋 白 の cDNAプ ロ ー ブ を 用 い た ド ッ 卜 ・ ブ ロ ツ 卜 ハ イ ブ リダ イ ゼ イ シ ョ ン を 用 い た と こ ろ 、 血 清 型 別 ば か り で な く 株 の 分 別 も 可 能 とな った 。
以 上 、 本 論 文 に は ELISAに よ る IBの 抗 体 お よ ぴ 抗 原 の 検 出 が よ り 簡 易 化 さ れ たこと が示されているばかりでなく、cDNAプローブを用いたハイブリダイゼイションによって血清型別もより簡易化されたことが明示されている。このように本研究によって鶏のウイルス病のなかで最重要疾病のーっであるIBの診断が容易かつ確実となった。 よって著者は博士（獣医学）‐の学位を授与される資格があるものと認めた。

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