博士 （医学）佐々木拓郎
学位論文題名IVIagnetic Nanoparticles for Improving Cell Invasion in●Tissue Engineerlng（細胞浸潤性の向上を目指した細胞接着性磁性体ビーズの開発）

学位論文内容の要旨
導入： T
i88ueengineeringは一般的にvitroで増殖させた細胞を足場となる担体(
scaffold)に播穏し細胞外マトリックス形成を促すというステップを踏む。この際播稀された細胞がscaff
old深屑にまで到達しにくいため深鴈・中心部では細胞が粗になりやすく、その結果十分な細胞増殖までに時間を要しマトリックス産生効率が低下するという問題が生じる。
そこで8caffold
深周部への低い細胞浸潤能を改藩させる効率的な細胞播輒法のI娟発が繰題となっている。
近年ナノテクノロジーの進歩により開発きれた磁性体ビーズが様々な分野に応用されている。今回我々は磁性体ビーズのTissueengineering ‑の応用として、キトサンでコートした磁性体ビーズを開発し、これを付蔚させた細胞に磁カを与えることによりscaffo
lrl深
周部への低い細胞浸潤能の改醇を試みた。
本研究の目的はこのシステムによる細胞浸潤能の変化を検討すること、磁性体ビーズ付蔚に よ る 細 胞 の 反 応 お よ び 細 胞 浸 潤 に 関 わ る 因 子 を 検 討 す る こ と であ る 。
実験方法および結果：キトサンでコートした直径約200nmの磁性体ビーズを開発しヒト線維芽細胞ヘ導入した。細胞増殖性による磁性体ビーズの毒性評価、mvasi
on assayによる細胞浸潤能の評価、real‑time PCRによるMMPおよぴ細胞接着分子発現を評価した。
統計学的評価には分散分析(ANOVA)を用いた。
細胞への導入により電顕像において細胞表面に多数の磁性体ビーズが付着していることが確認された。また磁性体ビーズ付着細胞をキチナーゼ／キトサナーゼで48nや間処理する こと によ りほ とんど の磁 性体 ビーズ が除 去さ れて いるこ とが 確認された。
細胞増殖性は吸光度で12、24、48時間後の細胞数を測定しi！F価した。細胞対磁性体ビーズが1： l05のhighdenslty
醫roup、1：104のmiddl
eden
8itygroup、1： 103のlowd
en
8itygroupの3群 でcontrol群と 比較 した 。highden8itygroupでは24、48時1粥後においてcontrol群に対して有意な低下がみられた。middleおよびlowdeI18ityがoupではcontrol群に対して有意差は認められなかった。
Invasiona88ayと mRNA発 現測 定 に は 以 下 の 5つ の experimentalgroupを 設定 した 。
磁性体ビーズを付符させ巌も強い磁カを与えたgroup（MN8．MF100％）、50％の磁カを与えたgroup（MN8．MF50％）、25％の磁カを与えたgでoup（MNs・MF25％）、磁性体ビーズを付着させただけで磁カを与えないgroup（MN8）、そして磁性体ビーズも磁カもないcon
trolgroup（C）。
23―invasion assayは 8pmの ポ ア を I型 コ ラ ー ゲ ン で塞 い だ イン サ ー ト内 に 、 蛍光 標 識 した
細 胞を 播 穏 し、 下 方 から 磁 カ を 与え て イ ンサ ー ト 底面側 に浸潤 した細胞 を6、12、24時間
後 に プ レ ー ト リ ー ダ ー で bottom readingし た (Fig.1）。 MNs‑MFl00％ groupで測定した
す べ て の 時 間 に お い て 細 胞 浸 潤 能 の 有 意 な 上 昇を 認 め た(control比： 124％ 、 133％ 、138％ ） （Fig．2） 。
mRNAは MMP‑1、 8、 13お よ び 細 胞 接 着 分 子 と し て integrin a5、 fibronectinの 24時 間
後 の 発 現 を 測 定 し た 。磁 性 体 ビー ズ を 付着 さ せ たgroupで MMP‑1、 13、 integrin a5の 発
現 が上 昇 し 、か つ 磁 カと 正 の 相 関を 示 し た。
ま た MMPの 細 胞 浸 潤 能 へ の 関 与 を み る た め に MMP inhibitor(GM6001)を 加 え てmvasion assayを 再 検 し た 。 MNs‑MFl00％ groupに み ら れ た 細 胞 浸 潤 性 の 有 意 な 上 昇は消 失し た 。
考察
キ ト サ ン で コ ー ト し た 磁 性 体 ビ ー ズ を 細 胞 に 導入 し 磁 カを 与 え る こと に よ り細 胞 浸 潤
能 は 上 昇 し た 。 こ の 傾 向 は 最 も 強 い 磁 カ を 与 え た groupに み ら れ 、 高 い 細 胞 浸 潤能 の獲 得の た め には 十 分 な磁 カ が 必 要で あ る こと が 示 唆さ れ た 。
MMP‑1、 8、 18の mRNAの 発 現 上 昇 お よ び MMP inhibitorの 添 加 に よ り 細 胞 浸 潤 性 の 上
昇 が消 失 し た結 果 か ら本 シス テムの細 胞浸潤 性の上昇 には磁カ と共に 磁性体ビ ーズ付 着細胞 か ら の MMPの 発 現 ・ 分 泌 増 加 が 大 き く 関 与 し て い る と 考 え ら れ た 。
キ トサ ン は 自然 界 に 存在 す る bi
ocom
pati
bili
ty、 biodegradability、ant
imicrobialなどの 性 質 を 有 す る 物 質 で 毒 性 が 低 い た め 様 々 な 分野 に 利 用さ れ て い る。 今 回 細胞 に 付 着し た磁 性 体 ビー ズ の ほと ん ど を キチ ナ ー ゼ／ キ ト サナ ー ゼ 処理 に よ り除 去 で きたこ とも臨 床 へ の 応 用 を 考 慮 し た 場 合 、 新 た な 細 胞 播 種法 の 有 用な 候 補 と なり 得 る 可能 性 を 示
し てい る 。
本 研究 で 開 発さ れ た シス テ ム を tissu
e engineering＾ 応 用す る こ と によ り 、 sca
ffold深層 部へ の 低 い細 胞 浸 潤能 を改 善させ、 より効 率的な細 胞播種法 を実現 させるこ とが期 待され る。

Fig.1
りC屬L・ロE山Eu・ C・ EbljOk・ E−1ユむ輔
吶世a・一
〓：uu

6b12hTlmeIn cul
tureFig.2‑24‑24h学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 安 田 和 則
副 査 教 授 藤 堂
省
副 査 教 授 三 浪 明 男

学位論文題名
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ingCellInv
asi
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TissueEngineering（ 細胞浸 潤性の向上 を目指し た細胞接 着性磁性 体ビーズ の開発）

Tis
sueengineer
ingにおいて細胞播種時に細胞がsca
ffold深層にまで到達しないため深層・中心部で細胞が粗になり、その結果十分な細胞増殖までに時間を要しマトリックス産生効率が低下するという問題が生じる。そこでscaffo
ld
深層部への低い細胞浸潤能を改善させる効率的な播種法の開発が課題となっている。本研究ではキトサンでコートした磁性体ビーズを付着させた細胞に磁カを与えることにより低い細胞浸潤能の改善を試みた。本
研究の目的はこのシステムによる細胞浸潤能の変化を検討すること、磁性体ビーズ付着によ る細胞の 反応およ び細胞浸潤に関わる因子を検討することである。直径約200nmの磁性体ビーズをヒト線維芽細胞ヘ導入し、細胞増殖性による磁性体ピーズの毒性評価と、
1nvasion assayに よる細胞 浸潤能の 評価と、 real‑timePCRによるMMPおよび細胞接着分子発現の評価を行った。電顕像により細胞表面への多数の磁性体ビーズの付着が、さらにキチナーゼ／キトサナーゼ処理によりほとんどの磁性体ピーズの除去が確認された。細胞増殖性は吸光度で12、24、48時間後の生細胞数を測定し評価した。細胞対磁性体ビー
ズ が1: 105のhigh density gr
oupで24、48時間後においてcontrol群に対して有意な低下がみられた、1:104のmiddledensitygroup、1:103のlowd
ensitygroupではcontrol
群 に対して 有意差は 認められ なかった 。Invasion assay
は底面膜の8pmのポアをI型コラーゲンでコートし塞いだインサート内に螢光標識した細胞を播種し、下方から磁カを与え て6、12、24時 間後に膜 底面側に浸潤した細胞をプレー卜リーダーでbottomread
ingした。磁性体ビーズを付着させ最も強い磁カを与えたグループですべての時間における細胞 浸潤能の 有意な上 昇を認め た。mRNAは磁 性体ビー ズを付着させたグループにおいてMMP‑1、13、integrina5の発現が上昇し、かつその発現上昇は磁カと正の相関を示した。
ま たMMP inhibitorを加え た1
nvas
ion assayの再検では最も強い磁カを与えたグループにみられた細胞浸潤能の有意な上昇は消失した。本研究の結果により高い細胞浸潤能の獲得のためには磁性体ビーズの細胞への付着と同時に十分な磁カの存在が必要であることが示唆された。また本システムの細胞浸潤能の上昇には磁カと共に磁性体ビーズ付着細胞から のMMPの発現 ・分泌増 加が大きく関与していると考えられた。審査にあたり副査藤堂
教 授よりtissueengineeringにおいて問題となる02供給に関連して具体的に考えている
scaffoldの形態（長さ、厚さ）について質問があり、現在はインサートの厚さ1Hm未満の底面膜を浸潤した細胞に有意差が出たという段階であり，応用にあたってはさらなる基礎研― 25 ‑

究が必要であると回答した。副査三浪教授より磁性体ピーズの除去後の細胞増殖性への影響について質問があり、ビーズ除去後も細胞増殖に影響がみられなかったため問題はないと考えられると回答した。また、主査安田教授より磁場を与えることによるMMPsの発現上昇の理由について質問があり、印象としてではあるが、磁性体ビーズ付着という物理的な現象の他にI型コラーゲンで塞いだポアを塞いだインサート底面膜に圧着させられることによるにカ学的な要因も影響していると思われると回答した。
こ の論 文は 新しい細胞播種法における細胞浸潤能を評価し、それに関わる因子の検討まで行った独創的な研究であり、この新しい細胞播種システムによりscaf
fold深層部への低い細胞浸潤能を改善させ、より効率的な細胞播種法を実現させることが期待される。
審査員一同はこれらの成果を評価し、大学院過程における研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受ける資格を有すると判定した。

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