博士（医学）太田英伸

学位論文題名Effec
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（ ラ ッ ト 視交 叉上核 におけ る時 計遺伝 子
ガセ灯、 Per2発現に対する母ラ・ット保育行動の影響）

学位論 文内容の要旨［序論・目的］．
未熟児は、多くの施設にお いて24時間連続照明下で保育されている。しかし、保育器内の光環境やその他の保育環境 が児の発達に適切かどうか、ほとんど検討されていない。
そこで、ラット新生仔の生物時 計に対する光環境および母ラヅト保育行動の影響を調ペ、
新 生 児 期 に お け る 生 物 時 計 の 外 部 環 境へ の 同 調 機 能 を 検討 し た 。
睡眠覚醒、ホルモン分泌ナょど、様々な生体機能に見られる約24時間のりズム（サーカディアン・リズム）は間脳視床 下部の視交叉上核（suprachiasmaticnuclei：SCN)に存在する生物時計に支配されている 。近年ショウジョウバェの時計遺伝子Period(Per)の相同遺伝子Perl、Per2が哺乳類でク ローニングされた。これら時計遺伝子をノヅクアウトとしたマウスでは、行動のサーカデ ィアン・リズムが消失することから、Perl、Per2が哺乳類のサ ーカ ディ アン ・リズム形成に重要な役割を果たしていると考えられている。
ラヅトの生物時計は24時間 より長い内因性周期をもち、成熟ラヅトでは明暗サイクルが最も強力顔同調因子であり、 生物時計の周期を24時間に調節している。一方、新生仔ラットの生物時計は生後5日前後まで母ラットの保育行動に影 響されることが、松果体のりズムや離乳後の行動リズムから 、間接的に示されている（母仔同調）。今回、この母仔同調に生物時計が直接関与してい るか否かを、生物時計が局在するSCNにおける時計遺伝子
Perl、Per2の発現リズムを指標 として検討した。また、時計遺伝子発現リズムと行動リズ
ム の 関 係を 、 離 乳 後 の 仔ラ ット行 動リ ズムを 指標 として 評価 した。
【方 法］
実 験にはWistar系ラヅトを用いた。6−18時が明期(Lightperiod；L）、18−6時が暗期（ Darkperiod；D）の明暗（LD）条件下にて飼育された母ラヅトより出生した新生仔に、
生 後O日 より 以下 の3つ の保 育環境 を与えた。また、生物時計に対するLDサイクルの影響を調 べる目的で、出生直後に両側の眼球摘出を行った群と行わなかった群を作成した：1）

眼 球摘 出を 行わ ず明 暗サ イ クル がLDの母 ラッ ト(LD母 ラ ヅト ）に て保 育(LD対 照群 ） 、2）眼 球摘出を行 いL
D母ラットにて保育(LD保 育群）、3）眼球摘出を行い 明暗サイクルを逆 転さ せた（6ー18時が暗期、18―6時が明期 ）D
L母ラットにて保育(DL保 育群）。胎生20日、生後7日、14日、21日にそれそれ4時間毎に断頭を行い、1時点にっき6つの脳(n:ニ6）を摘出した。
SCNに お け る raと Perl/Per2 mRN
A発 現量 はわ situ hybri
dization法 にて 検出 、 画
像 解析 (MCID法） にて定量化し、時計遺伝子発現リズムを測定した。試料 の準備にあたって は、 凍結 脳を クリ オス タッ トに て厚さ20Um、冠状断切片にてスライス した。リズム有無 の判 定にはone−w
ay A
NOVA (p<0.
05)を用いた。また、リズム・ピーク 時刻の算出およぴ群間のりズム位相差の検 出にはコサイナー法を用いた。
離乳後（生後21日）よ り仔ラットの行動リズムを行動計（感熱式アクトグラム）で測定した。離乳後3週間の行動開始・終了を視覚的に測定し、リズム位相と周期を算出した。
群問のりズム位相差の検出 はt検定（p＜0．05）を用い た。
［ 結果・考察］対 照 群 に お け る SCNの rat Perl/P
er2発現 リズ ムは 胎生 20日 、生 後7日 、14日、 2
1日 では同一位相を示し、対象群の生物時計はLDサイクルに 同調したと考えられた。それに対 し 、LD保育 群、 DL保 育群 の時 計遺 伝子リズムは生後1〜3週に かけて位相後退し、LDサイ クルへの同調は認めなかった。
生後 7日 目において、LD保育群と母ラットの保育行動リズム が逆転しているD
L保育群で はrat Perl/´Pe・r2リズム位相が約2時間異なり、母ラットの保育行動がラヅト新生仔生物 時 計に 対し て影 響す るこ とが 明ら かに なっ た。 しか し、 生 後2週目ではLD保育群とDL
保 育群の間に朋t
P卵J/′Pe・r2リズム位相差に変化を認めず、母ラットの保育行動リズムの影 響 は生 後1週の期間に強く発揮されていたと考えられた。一方 、生後3週目において朋t
胎レm
彪 リズ ム位 相に LD
保 育群 、 D
L保 育群 の両 群に 差を 認め たこ とから、母ラヅトの保育 行動が再ぴ仔ラヅトの生物時計に作用したことが推定さ れた。また、離乳後の行動リズ
ム 位相は、朋とP・舵リズムの 位相と対応していた。
［結諭］
明暗サイクルがナょい条件下では、母ラヅトの保育行動リズムは、仔ラットの視交叉上核（生物時計）に おける時計遺伝子発現リズムの位相を変化させる。その影響はPer
2遺伝子の発現を介して 離乳後の行動リズムに現れると考えられた。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 福 島 菊 郎
副 査 教 授 本 間 研 一
副 査 教 授 渡 邊 雅 彦

学位論文題名EffeCtSOfnurSingmother
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SupraChiaSma
tiCnuCleiVaryWithde
Ve10pmentalStage．
（ラ ッ ト 視 交 叉上 核にお ける時 計遺伝 子
Pe灯 、 ． Per2発 現 に 対 する 母 ラ ッ ト 保 育 行 動 の 影 響）

未熟児は、多くの施設において24時間連続照明下で保育されている。しかし、保
育器内の人工環境が児の発達に適切かどうか、ほとんど検討されていない。そこで：申請者はラットを動物モデルとして、新生仔生物時計に対する光環境および母ラット保育行動の影響を評価することを目的に、新生児生物時計の外部環境への同調機能を検討した。睡眠覚醒など、様々な生体機能に見られる約24時間のりズム（サーカディアンリズム）は視交叉上核．(suprachiasmaticnuclei:SCN)に存在する生物時計に支配されている。近年ショウジョウバェの時計遺伝子Period(Perの相同遺伝子凡n、尸めつが哺乳類でクローニングされ、これら時計遺伝子が哺乳類のサーカディアンリズム形成に重要な役割を果たすと考えられている。成熟ラットでは明暗サイクルが最も強カな同調因子であり、生物時計の周期を24時間に調節している。一方、新生仔ラットの生物時計は生後5日前後まで母ラットの保育行動に影響される（母仔同調）。今回申請者は、
ラット母仔同調に生物時計が直接関与しているか否かを、生物時計が局在するSCNにおいてjぬ灯、織口の発現リズムを指標として検討した。また時計遺伝子発現リズムと行 動リ ズム の関 係を 、離 乳後 の幼 若ラ ット 行動 リズ ムを指標として評価した。
ウィスター系ラットの生後O日より以下の3っの保育環境を与えた：1）眼球摘出を行わず明暗サイクルがLDの母ラット（LD母ラット）にて保育（LD対照群）、2）眼球摘出を行いLD母ラットにて保育（LD保育群）、3）眼球摘出を行い明暗サイクルを逆転させた（6―18時が暗期、18―6時が明期）DL母ラットにて保育（DL保育群）。むd如hybridization法の解析の結果、対照群におけるSCNのガむ〃rんだ発現リズムは胎生20日、生後7日、14日、21日では同一位相を示し、対象群の生物時計はLDサイクルに同調したと考えられた。それに対し、LD保育群、DL保育群の時計遺伝子リズムは生後1〜3週にかけて位相後退し、LDサイクルヘの同調は認めなかった。また、生後7日目において、LD保育群とDL保育群ではガ む〃rんだりズム位相が約2時間異なり、母ラットの保育行動がラット新生仔生物時計に影響することが明らかになった。しかし、生後2週目ではLD保育群とDL保育群の聞に、ガ紆〃織だりズム位相差に変化を認めず、母ラットの保育行動リズムの影響は生後1週の期間に強く発揮されていたと考えら
一 476一れた。また、生後3週日においてガ む〃ごずをだりズム位相にLD保育 群、DL保育群の両群に 差を 認めたことから、母ラットの保育行動 が再び仔ラットの生物時計に作用したことが 推定 され た。 一方 、行 動 リズ ムの解析結果より、rぬだりズムと離乳時の行動リズム位相に強い相関を認めた。
公開 発表前の個別面接において、副査の渡 邊教授 本間教授、及び主査の福島教授に背 景・ 目的・方法に重点おき、審査対象とな る学位論文の説明を行った。副査の渡邊
教授 から 、出生前に遺伝子によってプログラム された個体が、出生後の外部環境にどのよう に適 応す るの か生 物時 計 を指 標と して 研究 した 点が 興味 深いとのコメントを頂いた。 副査 の本間教授から、ラットを動物モデル とした本研究の結果から臨床医学にどのよう な貢 献をすることが可能か質問があり、こ れに対し申請者は光感受性が既に存在するヒ ト未 熟児 では 明暗 サイ ク ルを 重要 な環 境要 因と して 考慮 することの必要性を述べた。 主査 の福島教授から、授乳・身体接触等と いった母ラット保育行動の中で、どの行動が新生仔生物時計に影響したカゝ質問が あり、これに対し申請者は本研究のプロトコー
ルで は個 別の 保育 行動 が与 え る新 生仔 生物 時計 ーの 影響 を評 価することは困難で今後の検討課題であると解答をした。
公開 発表において、副査の渡邊教授からは 、開眼前の新生仔生物時計に対する光の影響 の有 無、母ラット保育行動リズムの影響カ の強さ、新生仔生物時計と母ラット保育行動 リズ ムがずれることから生じる発達への影 響について質問があった。これに対し申請者 は、 開眼前から新生仔生物時計は光同調機 能を持ちうること、母ラット行動リズムが新 生仔 生物時計のりズム位相を逆転させるほ ど強い影響カを持たないこと、母仔聞のりズ ムの ずれが生後の体重増加率の減少を起こ す可能性を述べた。また、副査の本間教授 か ら は 生 後 2〜 3週 目 に か け て 2
つ の時 計遺 伝子 ＃釘 〃rカ だ発 現リ ズム が異 なる 反応を 示し た原因ついて質問があった。これに対 し申請者は時計遺伝子ノックアウト動物の実 験か ら＃ む〃 ′ん ぽが 環 境因 子に対し異なる反応を示す可能性、及び Hりr〃r
ぬ口のkヽ ずれか が内因性リズムの変化をより反映している可能性を示唆した。主査の福島教
授か らは 、コサイナー法を用いた検定方法の精 度、及び、ヒト未熟児生物時計を検討す
る動 物モ デルとしてラット新生仔を使用する妥 当性について質問があった。これに対し申請 者は 、コサイナー法がカイ2乗法（p〈O．05）に基づぃた検定法であり 2時間の位相差を 検出 しうること、ヒトの光感受性の開始が 未熟児で既に起こることからラットは解析に 妥当 な動物モデルであることを述べた。申 請者はいずれの質問に関しても自身の解析結果と文献的考察をもとに概ね妥当な解 答をなしえた。
本論 文は、時計遺伝子を用い、生後の保育 環境が新生仔ラッ卜の生物時計に影響するこ とを 初めて示したことが高く評価され、今 後、保育器内におけるヒト未熟児の発育環境の改善に貢献することが期待される。
審査 員ー同は、これらの成果を高く評価し 、大学院課程における研鑽や取得単位等も 併 せ 申 請 者 が博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る資 格を 有す るも のと 判定 した。

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