博士（ 獣医学）柴 田治樹
学 位 論文 題 名
不 コ 目 動 物の レプ チン ：特異的測定法の開発と栄養評価への応用
学位論文内容の要旨
脂肪 組織 はエ ネル ギーの 主要 な貯 蔵部 位であると同時に、様々な生理活性ポ
リ ベ プ チ ド を合 成 分 泌 し て お り 、そ の 代 表 例 が レ プチ ン で ある 。
レ プ チ ン は 16kDaの ポ りペ プチ ドで 、ob/obマ ウス の肥 満原 因遺 伝子 産物 とし て同 定さ れた 。そ の血中 濃度 は、 短期 的には絶食により低下し摂食後数時間で 上昇 する とい う日 内変動 を示 し、 長期 的には脂肪組織量と良く相関し肥満する と血 中濃 度が 高く なるこ とが 、ヒ トや マウスで知られている。従って、レプ
チ ン の 合 成 分 泌 動 態 は 体脂 肪量の 変化 をそ のま ま反 映し てい るこ とと なる 。
獣 医学 領域 にお いて も、家 畜の 飼養 栄養 との関連で、ウシやブタのレプチンの構 造や その 発現 、血 中濃度 の測 定な どが なされており、基本的にはヒトや齧歯類 と同 様の 成績 が報 告され てい る。 これ ら各種の動物のレプチン測定に汎用されているのが市販のmulti‑species RIAkitである。しかし、本キットではヒトレプチンに対する抗体を用いているため、 全て の動 物種 のレプチンに対して満足すべき交差反応性を有するとは言えず、 しか も標 準品 もヒトレプチンなので、これ に対 する 相対 値で しか レプ チン 濃度 を求 めることができないという問題を抱え てい る。 これ らを 解決 する には 、対 象と する各動物種に特異的な測定系を用い る必 要で ある 。本 研究 では 、ネ コ目 の動 物を対象として、伴侶動物であるネコのレプチンの構造、組み替え蛋白質の性質、免疫学的測定法の開発を行い、先行 して いる イヌ での 知見 と比 較す ると とも に、更に野生動物への応用の可能性を検討した。
ま ず 、 ネ コ の 白 色 脂 肪 組 織 か ら 抽 出 し た RNAか ら 、 501bpの open reading
frame、 21ア ミノ 酸のN末シ グナ ルペ プチ ド、 146ア ミノ 酸の mature peptideから な る ネ コ レ プ チ ン cDNAを ク ロ ー ニ ン グ し た 。 分 泌 型 ネ コレ プチ ンの 146ア
ミノ酸配列は他の動物のレプチンと81．5％から91．8％の相同性を持っていた。
RT． PCR法 で ネ コ レ プ チ ン m心 岨の 発現 を調 べた ところ 、脂 肪組 織で は確 認された が 、 心臓、 肺、肝臓 、腎臓、骨 格筋、膵 臓、脳で は確認さ れなかっ た。このよ う に 、ネコ レプチン は他の動物 のレプチ ンと高い 相同性を 持ってお り、主に脂肪組 織に発現 している ことが明 らかとな った。
次 に 、ネ コ レ プチ ン およ び イ ヌレ プ チン の cDNAを 大腸 菌 に組 み 込 み、組み換えレプ チンを作 製した。 その組み 換えレプ チンは他種 のレプチン同様、16kDa
で ラ ッ ト の レ プ チ ン 受 容体 (OB‑Rb)を 発現 し た細 胞 の STr U'3や MAPK(Erk)のりン 酸 化 を誘導 した。組 み換えネコ レプチン をウサギ に免疫し て作製し た抗ネコレ プ チ ン抗体 はウェス タンプ口ッ ト法での 分析では ネコとヒ 卜のレプ チンに良く 反 応 し、齧 歯類のレ プチンヘの 反応性は 弱かった 。また、 組み換え イヌレプチ ン を 免疫し て作製し た抗イヌレ プチン抗 体はウエ スタンブ 口ット法 や非変性条 件 下 での 抗 原固 相 化 EIA法 で の 分析 でイヌ レプチン に良く反 応したが 、ヒトと 齧 歯 類のレ プチンヘ の反応性は 著しく弱 かった。 これらの ことより 、ネコ目、 特 に イヌ の レプ チ ン は他 の 動 物種 と アミ ノ 酸 配列 で は相 同 性 が高 いものの、免疫 抗原性が 大きく異 なること が示され た。
そ の 組み 換えイ ヌレプチ ン及び組み 換えネコ レプチン とそれぞ れに対す る特異抗 体 を 用い て ELISA法 を開 発 し 、有 用 性を検討 した。こ の方法を 用いるこ とによ り 、 ヒトレ プチンに 対する相対 値ではな く、絶対 値でレプ チン濃度 を測定する こ と が出 来 るよ う に なっ た 。 また 、 これ ら に よっ て 従来 用 い られ てきた
multi‑speciesRIAk
itに比ベ、特に低濃度領域において遙かに正確に血中レプチン濃 度 を 測定 す るこ と が でき た 。 本ELISAによル イヌやネ コの血中 レプチン 濃度を 求 め ること により、 体型が大き く異なる これら伴 侶動物の 体脂肪評 価、肥満の定量 的評価に 応用でき ることが 示された 。
最 後 に、 こ の 特異 的 ELISAの 系が 野 生動 物へも応 用可能か 、ネコ目 の一種であるアライグマとクマを対象に、multi‑speciesRIAkitと抗イヌレプチン抗体を用 い た 特 異 的 ELISAで の結 果 を 比較 検 討 した 。 その 結 果 秋か ら 冬に か け て高く、 春 以 降低く なるとい う血中レプ チンの季 節変動が 観察され た。さら に、血中 レ プ チ ン 濃 度 と BMIの 間 に 正 の 相 関 が あ っ た 。 BMIは多 く の動 物 で 大ま かな肥 満 の マーカ ーとなる ことから、 秋にレプ チン濃度 が高くな ることは 、越冬に向 け て 脂肪を 蓄えるこ とを反映し ていると 推察され た。この ようにイ ヌレプチン ELISAは 、 ネ コ目 の 種の 中 で 少な く ともイヌ 科、アラ イグマ科 、クマ科 の動物 の レ プチン 測定に有 用であり、 これらの 動物の栄 養状態を 知る上で の良い指標とな ることが 判明した 。
以 上 の よ う に 、 イ ヌ と ネ コ の レ プ チ ン 及 び そ の 特 異 抗 体 を用 い て 作成 し た
ELISA法 の開 発 に より 、 従来 不 可 能で あ ったこれ らの動物 の血中レ プチン濃 度

を 正確 に測 定す ること が出 来る よう になった。また、その測定法は、ネコ目の種 の中 で少 なく ともイ ヌ科 、ア ライ グマ科、クマ科の動物のレプチン測定に有用 であ り、 これ らの動 物の 栄養 状態 を知る上での良い指標となることが判明した。今後、multi‑species RIA kitを使用して野生動物のレプチン濃度を測定してい た従 来の 報告 、とり わけ ネコ 目の 成績については、再検討が必要となろう。

学位論文審査の要旨
主査

教授

斉藤昌之

副査

助教授

鈴木正嗣

副査助教授

木村和弘

副査

教授

橋本晃 （光 塩学 園女子 短期 大学 ）学゛位論文題名
ネコ目動物のレプチン：特異的測定法の開発と栄養評価への応用
脂肪組織はエネルギーの貯蔵部位であると同時に、様々な生理活性ポリペプチドを合成分泌しており、その代表例がレプチンである。実験動物やヒ卜のレプチンについては膨大な知見があるが、獣医学領域では対象動物の多様性と特異性のため満足すべき測定系が確立されていないなど、未解決の問題が山積している。本研究では、伴侶動物であるネコのレプチンについて基礎および臨床獣医学的検討を行い、イヌでの知見と比較するとともに、更に野生動物への展開を試みた。
まず、ネコのレプチンc NAをクローニングし、他の動物種と高い相同性や脂肪組織でのmRNA発現などを確認した。次に、ネコ組み替えレプチンを大腸菌で作成し、これがレプチン受容体を介して細胞応答を惹起することを見出した。更にこれに対するウサギ抗体を作成し反応性を調ぺたところ、ネコとヒトレプチンには良く反応するが齧歯類レプチンには反応性が弱いことが明らかになった。イヌ組み替えレプチンに対する抗体についても同様に検討したところ、齧歯類、ヒトいずれのレプチンに対しても反応性が著しく弱いことが判明した。これらの結果から、ネコ目、特にイヌのレプチンは他の動物種と構造上の相同性が高いものの免疫原性が大きく異なることが明らかとなった。そこで、これらの組み替えレプチンとそれぞれに対する抗体を利用して、ネコおよびイヌに特異的なELISA法を開発した。この方法を用いることにより、対象動物のレプチン絶対値の測定が可能となり、更に従来用いられてきた非特異的R亅A法に較べて、特に低濃度領域において正確に血中レプチン濃度を測定することが可能となった。実際、本ELISA法により求めたイヌやネコの血中レプチン濃度は体脂肪量と良く相関しており、体型が大きく異なるこれら伴侶動物の体脂肪・肥満の評価に応用できることが示された。最後に、野生動物であるアライグマとクマの血中レプチン濃度を本ELISA法で測定したところ、体脂肪が増える秋冬に高値となり春には低値となる明瞭な季節変動の存在が明らかとなった。
以上のように、イヌとネコのレプチンに特異的なELISA法の開発により、従来不可能であったこれら伴侶動物および他のネコ目の野生動物の血中レプチン濃度を正確に測定することが可能となり、これら動物の体脂肪量や栄養状態の指標としての有用性が示された。よって審査員一同は上記学位論文提出者柴田治樹氏が博士（獣医学）の学位を授与されるに十分な資格を有するものと認めた。