【化学技術部】

LC-MS/MS を用いた食品素材の非蛍光性糖化最終産物
CML 生成抑制作用評価
瀬戸山
１．

央、橋本知子、廣川

はじめに隆彦（化学技術部

バイオ技術グループ）

素分解処理し、分解の様子を SDS-PAGE により確認し最近年、生体を構成するタンパク質や脂質の糖化が皮膚老化、動脈硬化など様々な疾患の一因となることが明ら適な PronaseE の濃度について検討を行った。SDS-PAGEには 12.5%均一ゲルを用い、泳動後のゲルはクマシーブリかにされつつある 1)。この糖化を抑制するための 1 つの方法として機能性食品の摂取がある。広く行われている機リアントブルー（CBB）染色にてタンパク質を検出した。
タンパク質分子量マーカーは EzStandard（AE-1440、ATTO

能性食品の抗糖化性評価法には in vitro で蛍光性の糖化最終産物（AGEs：Advanced Glycation End Products）の生成社製）を用いた。
SDS-PAGE の結果、PronaseE の濃度依存的に糖化牛血抑制作用を評価する方法がある。一方、AGEs は様々な化合物の総称であり非蛍光性の化合物も存在する 2)。

清アルブミン（分子量 66.4kDa）が分解され、低分子領域のバンドが濃くなる様子が観察された（図１）。この結果

本研究は、非蛍光性糖化最終産物の１つである CML（カルボキシメチルリジン）に着目した。CML はグルコースから、終濃度 1 mg / ml の PronaseE で 37℃、24 時間処理することで糖化牛血清アルブミンを十分に分解できることリジンの反応産物の 1 つとして構造決定された化合物であり、糖とタンパク質が反応して生成するアマドリ化とが分かった。

合物がさらに酸化分解を受けて生成することが知られている 3)。生体中に形成される AGEs の中で比較的多く存在し、皮膚に蓄積し皮膚老化に関与することが明らかにされている 4)。
一般に機能性食品の CML 生成抑制作用評価は ELISA法を用いて行われている 5)。ELISA 法は抗原抗体反応を利用した方法であり、高感度にタンパク質中の CML を分析することが出来る。一方、分析には作業工程が多く時間がかかることや、用いる抗体が高価であるなどのデメリットがある。本研究では ELISA 法に代わる方法として、
図１ SDS-PAGE 後のゲル画像

微量成分を高感度に分析することが可能である
LC-MS/MS を用いた CML 分析方法について検討を行い、（３）LC-MS/MS による CML の解析分析方法の確立および食品素材の CML 生成抑制作用評価方法の構築を目的として行った。

糖化タンパク質の酵素分解により遊離した CML を測定するため、LC-MS/MS を用いた CML 分析条件の検討を行った。表１に示す条件で標準 CML 溶液を分析した。その結果、標準 CML の濃度が 0.007～0.7ppm の濃度範囲で良２． 実験及び結果（１）糖化タンパク質の調製好な直線性を有する検量線を得ることができ（図２）、
LC-MS/MS を用いた CML 分析条件を確立することができ

牛血清アルブミンおよびグルコースをそれぞれ終濃度た。

8 mg / ml および 0.2 M となるように PBS （pH7.0）に溶
解し、60℃、40 時間反応させることでウシ血清アルブミ

表１ CML 分析時の LC-MS/MS 条件

ンを糖化させ、糖化タンパク質溶液（糖化牛血清アルブミン溶液）を調製した。

（２）糖化タンパク質の酵素分解
CML は糖化タンパク質のリジン残基が糖化修飾されることで生成するが、糖化タンパク質を直接 LC-MS/MS で分析することはできない。そのため、プロテアーゼにより遊離アミノ酸に分解する必要がある。調製した糖化タ
ンパク質溶液に PronaseE（プロテアーゼ）を反応液中終濃度 0.1 ～1.0 mg / ml となるように加え 37℃、24 時間酵

39KISTEC研究報告（2018） 2018.10

【化学技術部】

分について表１に示す条件で LC-MS/MS による CML の分析を行った。試料溶液のかわりに 70%メタノール溶液を加え同様の操作を行ったものをコントロールとし、コントロールの CML 生成量（A）および試料を添加した際の CML 生成量（B）より以下の式で CML 生成抑制率(%)
を算出した。
CML 生成抑制率(%) ＝ ｛（A－B）/ A ｝×100
結果を図４に示す。いくつかの食品素材について 50%

図２近い CML 生成抑制率を示し、これらの食品素材に CML生成抑制作用があることが明らかとなった。

LC-MS/MS 分析による CML 標準溶液の検量線確立した分析条件を用いて、実際に調製した糖化タンパク質溶液を酵素分解したものについて CML が検出、定量できるかを試みた。
牛血清アルブミンおよびグルコースをそれぞれ終濃度
8 mg / ml および 0.2 M となるように PBS（pH7.0）に溶解し、60℃、40 時間反応させることでウシ血清アルブミンを糖化させ、糖化タンパク質溶液（糖化牛血清アルブミン溶液）を調製した後、PronaseE を反応液中終濃度 0.02 ～1.0 mg / ml となるように加え 37℃、24 時間酵素分解処理し、限外濾過により得た分子量 10K 未満の画分について
表 1 に示す条件で CML の分析を行った。その結果、PronaseE の濃度依存的に CML 濃度が高まる傾向が確認でき、PronaseE 終濃度 1.0 mg / ml で十分酵素分解できるこ

図４ 食品素材の CML 生成抑制作用

３．とがわかった（図３）。

考察及び今後の展開

LC-MS/MS を用いた CML 分析方法について検討を行い、ウシ血清アルブミンおよびグルコースを用いて調製した糖化タンパク質について、酵素分解することで CML を遊離させ、遊離した CML の LC-MS/MS 分析方法を確立することができた。また確立した方法を用いて、数種類の食品素材を対象とした CML 生成抑制作用評価を行った結果、いくつかの食品素材に CML 生成抑制作用があることが明らかとなった。
一方、今回の分析では各食品素材について 1 回の測定図３しか行っていないため、今後測定回数や試料数を増やし本研究で確立した評価方法の精度についての検討が必要

PronaseE 濃度と CML 生成量の関係である。また、従来法である ELISA 法との相関についても今後の検討課題である。

（４）LC-MS/MS を用いた食品素材の CML 生成抑
制作用測定
牛血清アルブミンを用いた糖化タンパク質調製、酵素【参考文献】

分解、LC-MS/MS による CML 分析までの一連の方法を用いて食品素材の CML 生成抑制作用評価を行った。

1. Palimeri, S. Palioura, E. Diamanti-Kandarakis, E., Diabetes
Metab Syndr Obes, 8, 415-426 (2015).

食品素材として市販されている野菜、果物およびハーブを細断し、10 倍容の 70%メタノールで抽出後、遠心分

2. Thorpe, SR. Baynes, JW., Amino Acids, 25, 275-281 (2003).
3. Ahmed, MU. Thorpe, SR. Baynes, JW., J Biol Chem, 261

離を行い上清を回収、0.45µm フィルターでろ過したものを試料溶液とした。

(11), 4889-94 (1986).
4. Masamitsu, I. Masayuki, Y. Keitaro, N. Yoshikazu, Y.,

試料溶液、ウシ血清アルブミン（終濃度 8 mg / ml）およびグルコース（終濃度 0.2 M）を PBS（pH7.0）に溶解

ANTI-AGING MEDICINE, 8 (3), 23-29 (2011).
5. Wakako, K. Tomohiro, A. Seikoh, H. Ryoji, N., J. Biochem,

し、60℃、40 時間糖化反応を行った。その後、PronaseEを反応溶液中 1.0 mg / ml となるように加えて 37℃、24 時

136, 831-837 (2004).

間酵素分解し、限外濾過により得た分子量 10K 未満の画

【外部発表】口頭発表

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