博 士 （ 獣 医 学 ）安 達 啓 一
学位 論文題 名Characterization of the Plasma Membrane Targetingand the Endoplasmic Reticulum― assoclatedDegradation
OfBOVineAnionEXChanger1（牛アニオン交換輸送体1の細胞膜輸送と小 胞 体 関 連 分 解 分 子 機構 の 性 状解 析）

学位論文 内容の要 旨

小胞 体(ER)で 合成 きれ た膜 内在性タンパク質は、多くの分泌タンパク質 と同様、ERにおける品 質管 理機 構の 作用 で選 別を 受けながら細胞内の目的部位に輸送される。 構造に異常のある
ポり ペプ チド は、 細胞 質で ユビ キチ ン ープ ロテ アソ ーム システムにより分解される(ER関連分解、 ERAD)。哺 乳動 物細 胞に おけ るERADの 分子 機構 は、 従来、主に嚢胞性線 維症の原因タンパ
ク質 であ るcyst
ic fibro
sis transmembrane conduct
ance regulator (CFTR)と、そのAF
508変異体 (AF508−CFTR)を 中心に進められてきた。本研究は、CFTRとは仕組みが異 なることが示唆される アニ オン 交換 輸送 体AEl (band3）のERA
Dにっいてその性状を明らかにす るこ、とを目的とした。
E
RADは、 ERに おけ る認 識、 ERから細胞質への逆行輸送、ならびにユビキ チンープロテアソーム 系に よる ポり ペプ チド の分 解か ら なる 一連 のプ ロセ スである。第1章で は、ERA
D関連分子によ る認 識に 関わ るAE1の分 子内 領域 を特 定す る一 助と して 、C末 端細 胞質 内領 域に 焦点を充てた 検討 を行 った 。ヒ トAE1のC末端 11アミ ノ酸 残基 欠損 変異 体は 、細 胞膜 輸送 異常 を来し、家族 性尿 細管 性ア シド ーシ スの 原因 と なる こと が知 られ る。まず、このC
末 端細胞質内ドメイン(Phe891ー…―Val903―COO‑)の11、18、28各 アミノ酸残基を欠失させた牛AE1変異体（それぞれACtll、 ACtl8、 ACt28)の HEK293細 胞 に お け る 細胞 内分 布を 調べ たと ころ 、ACtllと ACtl8は野生 型(WT)と 同程 度に 細胞 膜に 分布 し たの に対 し、 ACt28は ERに 滞 留し た。 ACt28がLyS90
3以降の 配列 を欠 く変 異体 であ るこ とか ら 、種 間で 配列 が保 たれ 、ま た炭 酸脱 水酵 素II結合部位(L905DADD)を含む近傍領域Glu901ー… ‑As
p909のアミノ酸置換変具体を作製してER滞留の有無とターンオーバーを解析した。その結果、Glu901、Leu902、Leu905、ならびにAs
p906のAla置換変異体 が 細 胞 膜 に 移 行 せ ず ERに 留 ま っ た 。 こ れ ら E
R滞 留変 異体 のタ ーン オー バー はWTの それ と著し くは異ならなかったが、いずれもプロテアソ ーム阻害剤lac taC
YS tin
存 在下での延長が認めら れた 。こ の領 域の 配列 が数 カ所 異 なる マウ スAE1の 各アミノ酸置換変異 体でも同様の結果
が 得 ら れ た 。 こ れ らの 結果 から 、AE1のER滞留 、あ るい はER以降 の細 胞内 輸送 に関 わ る認 識にC
末端細胞質内ド メインのE
L(K/Q) (L/C)LD(A/G)DD配列の構造が関与することが明らかになった。
第 2章 で は 、 従 来 の 研 究 か ら 示 唆 さ れ る 、 AE
1の E
RADがユ ビキ チン 非依 存性 であ る こと 、
また プロ テア ソー ム阻 害時 に細 胞質 内 凝集 体ア グリ ソー ム(aggresome)
を形 成しなぃことにっ
いて 遺伝 性球 状赤 血球 症の 原因 とな る 牛AE1の ナン セン ス変 異体 R66
4X A
E1を用 いた 検討を行った 。AF50
8− C
FTRのER滞留 が見 られ るHEK293細胞 のプ ロテアソーム系をlactacys tinで阻害すると、AF508−CFT
Rは微小管依存性に中心小体周囲で大きなアグリソームを形成するが、R664X
AE1の局在は変化せず ERに留まり、アグリソームには全く分布が認められなか った。ところが、両者 を同 時に 発現 させ てプ ロテ アソームを阻害すると、R664X AE
1はA
F508ーC
FTRとともに中心― 52ー

小 体周囲 で中間径 フィラ メントに囲われたアグリソームに局在した。この細胞では、R664XAE1がA
F508−CFTRと特異 的に結合 していることが免疫沈降法で明らかになった。これらの結果は、AE1のERADの 一連の 過程がAF
508ー． CFT
Rのそれと 異なり ER膜上で生じること、両者の相互作用により△F508―CFTRの ER仙関 連 分 子群 の 作 用が A
E1のERか ら細胞 質への移 行を生じ ること が明 らかに なった。
以 上 のよ う に 、本 研 究 は、 牛 AE
1の ER
ADと 細胞膜 輸送に関 する細 胞質内ド メインの 特定領
域 の 関 与 とそ の ER
ADがER
膜 上にお いて生じ ること とを明ら かにした 。これ らの知見 は哺乳 動物細胞のE
Rに お ける膜 内在性タ ンパク 質の品質 管理機 構におけ る未知 分子機構 の存在を 示唆
す るもの である。

― 53―

学 位 論 文 審 査 の 要旨
主査
副査
副査
副査

教授 稲葉 睦教授 稲波 修教 授 木 村和弘
准 教 授 佐 藤 耕太

学位論文題名Characterizat
ion of thePlasmalN/IembraneTar
getingand the Endopla
smic Reticu
lumーassoclat
edD
egr．adat
ionOfBOVineAni
onEXChanger1（牛 ア ニオ ン 交 換輸 送 体 1の細 胞 膜 輸送 と小 胞 体 関 連 分 解 分 子機 構 の性 状 解析 ）哺乳動物細胞における小胞体関連分解(ERAD)の分子機構研究は、主に嚢胞性線維症の原因夕ンパク質であるcys
ticfibrosistransmem
brane conduc
tance regulator (CFTR)と、そのAF508変異体 (AF508‑CFTR)を対象に進められてきた。本研究は、CFTRとは仕組みが異なることが示唆される牛アニオン交換輸送体AEl (band3）のERADについてその性状を明らかにすることを目的としたものである。
第1章で6ま、ERAD関連分子による認識に関わるAE1の分子内領域を特定する一助として、C末端細胞質内領域に焦点を充てた検討を行った。まず、この領域の11、18、28各アミノ酸残基を欠 失させた 牛AE1変異体（それぞれACtll、ACt18、ACt28)のHEK293細胞における細胞内分布を 調べ、ACtllとACt18が野生型(WT)と同程度に細胞膜に分布したのに対し、ACt28はERに滞留することを示した。次いでACt28が欠く、種間で配列が保たれ、また炭酸脱水酵素II結合部位 (L905DADD)を含む近 傍領域E901‑D909の アミノ酸 置換変異 体を作製してER滞留の有無とタ ーンオー バーを解 析し、E901、 L902、L905、ならびにD906のアラニン置換変異体が細胞膜に移行せずERに留まることを見出した。これらER滞留変異体のターンオーバーはいずれもプロテアソーム阻害剤lactacystin存在下での延長が認められた。この領域の配列が数カ所異なるマウスAE1の各アミノ酸置換変異体でも同様の結果が得られた。これらの結果は、AE1の ER滞 留 、 あ る い は ER以 降 の 細 胞 内 輸 送 に 関 わ る 認 識 に C末 端 細 胞 質 内 ド メ イン のEL(K/Q)(L/C)LD(A/G)
DD配列の関与を明らかにしたものである。
第2章で は、遺伝 性球状赤 血球症の 原因とな る牛AE1のナン センス変 異体R66
4X AE1を用いて 、従来の 研究から示唆される、AE1のERADがユビキチン非依存性であること、またプロテアソーム阻害時に細胞質内凝集体アグリソーム(aggresome)を形成しないことについて検討した 。AF508‑CFTRのER滞留 が見られ るHEK293細胞の プロテア ソーム系をlact
acystinで阻害すると、AF508‑CFT
Rは微小管依存性に中心小体周囲で大きなアグリソームを形成するが、R664X AE1の局在 は変化せずERに留まルアグリソームには全く分布しなかった。ところが、両 者 を 同 時 に 発 現 さ せ てプ ロ テア ソ ー ムを 阻 害す る と 、R664X AE1の 分 布 が変 化 し 、ー 54―

AF508―CFTRとともにアグリソームに局在した。さらに、免疫沈降法により、この細胞ではR664X AE1が AF508‑CFTRと 特異 的に結合していることを示した。これらの結果は、AE1のERADの 一連 の過程 がAF508‑CFTRのそれと異なりER膜上で生じることと、両者の相互作用に よ り AF508・CFTRの ERAD関連 分子 群の 作用 がAE1のERから 細胞 質へ の移 行を 生じ ることを明らかにしたものである。
以上のように、本研究｜ま、牛AE1のERADと細胞膜輸送に細胞質内領域の特定構造が関与 する こと 、なら びに その ERADがCFTRとは異なりER膜上において生じることを示したものであり、広くERにおける膜内在性タンパク質の品質管理分子機構の解明に貢献するものである。したがって、審査員一同は、上記博士論文提出者安達啓一の博士論文が北海道大学大学院獣医 学 研 究 科 規 程 第 6条 の 規 定 に よ る 本 研 究 科 博 士 論 文 審 査 等 に 合 格 と 認 め た 。