博 士 （ 医 学 ） 高 橋徹

学位論文題名Donor pretreatment with DHMEQ
improvesisl
ettra
nspl
antation（新規NF‑rcB阻害剤，DHMEQのドナー投与による膵島移植成 績改善効果の検討）

学 位論文内容の要旨【背景と目的】膵島移植は膵臓より膵島のみ分離し経皮的に細胞を肝臓内に移植する治療法
で、臓器移植と異なり低侵襲であり繰り返し移植が 可能であるため、今日1型糖尿病における治療手段として注目されている。ただし、1人の1型糖尿病患者の血糖を正常化するためには2人以上のドナーが必要とされており、また治療成績も膵移植より劣っており、様々な改良が求められている。問題点の1つに、移植前に半数以上の膵島組織が失われていることが挙げられる。これは、膵島分離から移植までの間に機能が保存された膵島が移植できていなしゝことによる。膵島は膵組織の保存から消化、膵島分離の過程までに虚血などの様々なストレスに晒されアポトーシスに至ると考えられ、膵島組織の損失の大部分の原因と考えられている。膵島のアポトーシスに関与する機序はいまだ完全に解明されていないが、細胞内シグ ナルの核内転写因子のーつNF‑K
Bが分離後の膵島内p細胞のアポトーシスに関与していると考えられている。NF‑K
Bは膵島内においても培養中に活性化され、膵島内からサイトカインを産生し、アポトーシスを促進すると考え られている。またNF‑K
Bは、アポトーシス関連遺伝子の調節因子でもある。
新 規NF‑KB阻害 剤 、dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ)は、Amycolatop
sis spより 分離 され たepox
yqui
nomi
cin
C誘導体で、NF‑K
Bの活性化を核への移行レベルで抑制
しそ の他の蛋白のりン酸化などに関与し ないため、NF‑KBの阻害に特 異的である。DHMEQはこれまで、様々な細胞でNF‑KBの阻害作用とサイトカイン産生抑制作用を示してきたため、炎症性疾患に対する治療薬として有望である。
今 回 我 々 は 、 膵 島 分 離 後 に 膵 島 内 NF‑KBが 活 性 す る か、 NF‑KB阻害 剤の DH
MEQをドナーに投与することで分離後膵島内NF‑K
Bを抑制し、サイトカインの産生、あるいはアポトーシス関連遺伝子の活性化を抑制し、膵島のアポトーシスを抑制できるか、さらに同種同系統移植モデルを用いて膵島移植成績が改善するかを検討した。
【材 料と 方法】C57BL/6Jマウスを用しゝた。レシピエント は移植7日前にSTZを腹腔内投与 し た 糖 尿 病 マ ウ ス を 用 い た 。 DHMEQは DMSOに 溶 解 し た 後 、 CMCに 懸 濁 し た 。
1）膵島分離治 療 群 に DHMEQを 12mg/kgの 投 与 量 で 、 対 照 群 に は DMSOと CMCの 懸 濁 し た ものを分離2時間前に腹腔内投与した後、コラゲナーゼを用いて膵を消化し、比重遠心法にて膵島を分離した。
2） Invitro試験
膵島 分離 後30分で 謄島 内の NFーK
B活性をE
LISA法にて 測定した。分離後の機能を確認するため、分離後膵島を低濃度、高濃度のグルコース内で培養しインシュ1
jン産生量を測定した（グルコース刺激試験）。3〜6
時間培養後の膵島からRNAを抽出しサイトカ― 42 ‑

イン、アポトー シス関連遺伝子をR
eal‑timePC
R法にて測定した。分離後膵島を24〜48
時 間培 養後 、膵 島内 Ca
spase3/7
活 性 を測定し、膵島をTUNEL染色し膵島内アポトーシスを評価した。
3） Invivo試験
膵 島 移 植 は 同 種 同 系 統 の marginal modelを 用 いた 。分 離後 膵島 を一 晩培 養後 、marginalの 160個 の膵 島を S
TZ糖尿 病 マウ スに 経門 脈投 与に て移 植した。対照群は
n=16，治療群は n=12とした。評価項目は血糖測定によるグラフト生着率、グルコース負荷後の耐糖能、グラフト内インシュ1」ン含量、摘出後グラフトの組織学的評価とした。
【結果】1）膵島内NF‑KB
活性分離後膵島内NF‑KBが早期に活性化されるの を確認したのと同時に、治療群で有意にNFーKBの活性が抑制されているのを確認した。
2）グルコース刺激試験
膵島分離後時間 経過とともに高濃度グルコースに対する反応が両群とも低下していたが両群間で有意差はなかった。
3）膵島内サイトカイン発現
膵 島分 離後 6時間 での M
CP‑1発 現は 、 治療 群で やや 低い もの の有 意ではなかった。
IL‑1[3の発現は治療群で有意に発現が抑制されていた。
4）膵島内アポトーシス関連遺伝子発現
ア ポト ーシ ス遺伝子Baxは分離6時間後に治療群で有 意に発現が抑制された。抗アポトーシス遺伝子B
cl‑2は両群間で差を認めなかった。
5）アポトーシス評価(TUNE
L，Caspase3/7activity)
分離48時間後の 膵島内のアポトーシスを全細胞数で除してapop
toticindexとして比較したところ、治療群で有意差に低かった。また分離2
4，48時間後のcaspase3/7活性は、有意に治療群で低下していた。
6）膵島移植後グラフト生着率
血 糖200mg/dl以下をグラフト生着とし60日間観察し たところ、対照群で31％であるの に 対 し 、 治 療 群 で は 83.3％ で あ り 有 意 に グ ラ フ ト 生 着 を 改 善 し た 。
7）グルコース耐糖能
移 植1カ 月後の耐糖能を 比較したところ、AUCにおい て明らかに治療群で改善した。
勘グラフト内インシュ1」ン含量
移植60日後に摘 出したグラフト内インシュリンは、治療群で有意に多く保持されていた。
9）グラフト組織学的評価
グラフト内の膵 島壊死領域は有意に治療群で小さく、TU
NE
L染色でも膵島内のアポトーシスは対照群で観察されるのに対し、治療群ではほとんど認められず、インシュリン染色にもよく染まっていた。
【考察】1
人のドナーによる膵島移植が成り立つには相当量の膵島が必要であるが、移植前にアポトーシスによ り半数以上が失われているのが現状である。分離後培養 中にNF‑KBが活性化し膵島機能不全、膵島炎に関与していると考えられているが、分離直後にN
F‑1くニBが活 性し てい るか は知 られ てい ない 。今 回 我々は、ドナーにDHMEQを投与することで、膵島分離直後のNF‑KニBの活性化を抑制した。さら に、Bax遺伝子の活性を抑制することで、
Casp
ase3経路を抑制 し膵島内アポトーシスを抑制することができ、膵島移植成績の改善に寄与したと考えられる。
膵島移植において も、NF‑KBを抑制する治療法が成績改善の治療戦略と考えられており、各種の方法でNF‑KBを抑制する試みがなされているが、それらは遺伝子操作を必要とする、あるいは大量投与にて初めて抑制効果を示すものである。またその作用は非特異的で副作用も報告されている中 、DHM
EQ
は核内への移行のみ を選択的に阻害するためN
F‑1く二B特異的であり、これまでの動物実験レベルで副作用は認められていない。また低分子量であるため
drug deliveryに優れており、現在臨床応用に向 けて開発中である。膵島移植において、― 43 ‑

NF‑KBを抑 制する 効果的な治療法を同定することは、ロ細胞の損失を抑制するばかりでな
く 、 1型 糖 尿 病 患 者 の 血 糖 正 常 化 に 必 要 な 膵 島 数 を 減 ら す た め に も 重 要 であ る 。
【結論】 DHM
EQ
は 分離に伴 うアポト ーシス から膵島 を保護 するため 膵島移植にとって有望な 薬 剤で あ り 、ド ナ ーに 投 与 する こ とで 膵 島 移植 成 績 の改 善 に寄 与 する 。

− 44 ‑

学位論文審査の要旨
主 査

教 授

小 池 隆 夫

副 査

教 授

野 々 村 克 也

副 査

教 授

藤 堂

省

学位論文題名Donor pretreatment with DHMEQ●1mprOVeSiSlettranSplantation（新規NF−だB阻害剤，DHMEQのドナー投与による膵島移植成績改善効果の検討）
膵島移植は低侵襲で繰り返し移植が可能であるが、治療成績は膵移植より劣り、様々な改良が求められている。膵島は膵島分離の過程で虚血等のストレスによルアポトーシスに至るが 、 核 内 転 写 因 子 の NF‑KBが 関 与 し て い る と 考 え られ て い る。 新 規 N
F‑KB阻害剤、
dehydroxy
methylep
oxyquinomicinくDHMEQ)は、NFーKBの活性 化を核内 への移行 レベルで 抑制し 特異的で あるこ とから、 本研究で は、DHMEQをドナ ーマウ スに投与 することで膵 島内NF‑K
Bとアポ トーシ スを抑制できるか、抑制機序、さらに同種同系統膵島移植モデルを用いて膵島移植成績の改善効果を検討した。
膵 島分 離 2時 間前 に DH
MEQ 12mg/kg（対 照 群 には Vehicle)
を C57BL/6Jマ ウス ヘ腹腔内 投与し 、膵島内 N
F‑KB
活 性を測定した所、分離早期の膵島内での活性化を確認したのと同 時に、 治療群で 有意に N
F‑KBの活性が抑制されていた。膵島機能評価のグルコース刺激試験では両群問で有意差はをかった。膵島内サイトカイン発現を確認した所、IL‑ipの発現が 治療群で有意に抑制されていた。膵島内アポト ーシス関連遺伝子Baxは分離6時間後に治療群で有意に発現が抑制された。抗アポトーシス遺伝子Bcl‑2は両群間で差を認めなかった 。アポ トーシス 評価と してTU
NEL染色し ところ、 治療群で 有意差 に抑制さ れていた。
分 離 24， 48時 間 後 の caspase3/7活 性 は 、 有 意 に 治 療 群 で 低 下 し て い た 。
膵 島移植では、グラフト生着率は対照群で31％であるのに対し、治療群では83.3％と有意 にグラ フト生着 を改善 した。グルコース耐糖能は、AUCにおいて明らかに治療群で改善し た。移植60日後グラフト内インシュリン含量は治療群で有意に多く保持されていた。グ
ラフト摘出後の組織学的評価では、グラフト内の膵島壊死領域は有意に治療群で小さく、アポ トーシ スも対照 群では T
UN
EL染色 で観察 されるの に対し、 治療群 でほとん ど認めず、インシュリン染色にもよく染まっていた。
以 上よ り 、 ド ナー に DH
MEQを投 与 す るこ と で 、膵 島 分 離直 後 の NF‑KBの活 性化を 抑制 し、Bax遺伝子 の活性 の抑制とCaspase3経路の抑制により膵島内アポトーシスを抑制することができ、膵島移植成績の改善に寄与したと考えられる。
膵 島移植 に茄いて N
F‑KBを 抑制する効果的な治療法を同定することは、ロ細胞を保持するばかりでなく、1型糖尿病患者の血糖正常化に必要な膵島数を減らすためにも重要である。
公開発表後、まず副査の野々村教授より1） humanにドナー投与を適応する場合の投与方
法 につい て、2）複数の ドナー が必要な 現状で 、このDH
MEQによりどの程度臨床成績の改善が見込まれるかについて質問があった。申請者は1）膵管内注入という方法でアポトーシー 45ース を抑 制し て humanで すで に開始している、2） 膵管内注入により膵島収量も2倍に増加し臨床 膵島移植のcriteriaをonedonorでクリアできている、と回答した。続いて主査の小池教授 より1）膵島収量を上げる方 法としてcollagenaseを用いた方法以外にあるか、2）overnightc
ultureは必要かについて質問があったが、1）自己消化する前に処理する必要があり、膵外分泌組織からの分離方法としてcollagenaseが迅速で妥当であること、2）culture
により 分離直後の様々ナょmediatorを除去でき、apoptosisあるいはprimarynonfun
ctionの膵島 を多く除去して移植できる利点があると述べるなどいずれの質問にも妥当な回答をなしえた。最後に藤堂教授より1）今後改善するためには何が必要であるか，2）膵島移植と自然免疫反応との関係は、についての質問があったが、1）膵島のviabilityを改善すること、
2） マク ロフ ァー ジか らの cytobne産 生に よる 膵島 炎を 抑制 する ため に D
HMEQは 有望であると 回答し、藤堂教授より自然免疫反応においてHM（迅1の産生を抑えることが重要であ るこ と、 そ の産 生と alloの免 疫反 応の 両者 に対 しNF．kBが関 与し て おり D
HME
Qは抑制できるとのコメントがなされた。いずれの質問に対しても、申請者は概ね妥当に回答した。
本研 究に よ り、 新規 N
F． K
B抑 制剤 DHMEQが膵 島分 離に 伴う アポ トー シス をド ナーに投与す ることで分離前より抑制し、膵島移植成績の改善に貢献 したことが証明された。
本論文は、ドナーの虚血状態、摘出後の臓器保護の程度によって移植成績に影響することを示唆する点で高く評価され、今後の臨床応用として期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ）の 学位 を 受け るの に十 分な 資格 を有 する もの と判 定し た。

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