博士（環境科学）田村健一
学 位 論 文題 名

牧草における越冬性向上のための種間比較アプローチを用いた分子育種学的研究(Studies on molecular breeding usingcompara
tiveapproach
es amongspe
ciesfor the purpose of an improvement of winter hardine
ss inforagegrasses)

学位論文内容の要旨
北海道の ような寒地の草地では寒地型イネ科牧草が栽培されているが、その栽培適応の第一の制限要因は越冬陸 であり、この遺伝改良は主要な育種目標である。本研究では、寒地型イネ科牧草の越冬陛に関する基礎 的知見を蓄積するために、越冬陸に関わる遺伝子としてCBF（C一repeat bin
dingfactor)とフルクタン 代謝酵素遺伝子に着目して分子遺伝学・分子生物学的解析を行った。また越冬性改良のための種（属） 間雑種を利用した分子育種研究と、その解析ツールとしてDNAマーカーの開発や種間比較トランスクリプ トーム解析を行った。本研究の遂行にあたり、研究資源の乏しい寒地型イネ科牧草の研究を効率的に進 めるため、研究蓄積の豊富なイネやコムギなど近縁作物におけるグノム情報を有効活用し、また寒地型イネ科牧草間を含めた種問比較を主な研究手法として用いた。
低温に 応答し低温馴化に関与する様々な遺伝子発現を誘導する転写因子をコードし、ムギ類などで越冬性QTL(Quantitative trait loci)の候補遺伝子と考えられてい るCBFのホモログ(LpCBF)をペレニア
ルライグ ラスから10個単離した。ゆ ぽは低温により急激に転写誘 導されたが、その後の低温下での発現様式は、遺伝子により異なった。LpCBFIbの過剰発現シロイヌナズナ形質転換体は著しい矮化を示した
一方、Lp〔髄rぬ形質転換体は生殖生長への移行に遅延が認められたが、耐凍陸は向上した。マッピング
できた5つの遺伝子のうちゅ〔Z炉め、Ep〔齟rr、Ep〔駅Hめおよぴゅ〔Zびffkの4っは5番連鎖群に2．2cMの範囲にクラスターを形成して座乗していた。ペレニアルライグラスの〔ヨ戸と他種の越冬陸（m」との関係についてシンテニーに基づき考察した。
フルク タンは寒地型イネ科牧草が蓄積する主要な貯蔵炭水化物であり、耐凍性などの環境ストレス耐性との関 連が示唆されている。本研究では特異的に高重合度のフルクタンを蓄積するチモシーからフルクタン代 謝酵素遺伝子を単離し、そ の機能・発現解析を行った。 履阿Zはコムギ由来酵素遺伝子m｜との比較等により、直鎖B（2，6）結合型フルクタンを合成する新規酵素遺伝子であることを明らかにした。
履朋2も直鎖B（2，6）結合型6―SFTを生成する酵素をコードするが、PpFT1とは異なる活性構成を示した。
また」ゆ伊：匝加は高重合度のB（2，6）結合型フルクタンに対し高い基質特異陸を示すフルクタン分解酵素（6ーFEH）をコードすることを明らかにした。露lF
Wと露捫2はスクロースにより発現誘導されたのに対し、ゆ伊 脚j｜捌U取り処理後の基部組織において発現誘導が認められた。これらの発現変動には酵素活性の変化 も同調したことから、フルクタン代謝酵素の活性がシンク／ソースバランスにより転写レベル― 371 ‑で市｜J御されることが示唆された。低温に対してはPpFT1とpplr12がスクロース濃度の上昇とともに徐カに発現誘導された のに対し、Pp6‑FE
H1ま一過的に発現量が増加し、その後急激に減少した。また、越冬前後の自然条件下 においてもフルクタン含量や糖細成の変動に、代謝酵素遺伝子の転写レベルの制御が大きく関与 することを明らかにした。履 FT1過剰発現Br曲聊出脚出sね曲癶m形質転換体は生育抑 制を示したが、低温馴 化条件下において単少糖の増加および高重合度のフルクタンの蓄積が認められ、野生型 や mj形 質 転 換 体 と Eヒ 較 し て 糸 ロ 胞 レ ベ ′ レ で の 耐 凍 陸 向 上 が 認 め ら れ た 。
越冬陸に優れる メドウフェスクと放牧適隆や飼料品質に優れるペレニアルライグラスの種（属）間雑種を利用した分子 育種研究を行った。まずライグラス類とフェスク類の雑種であるフェストロリウムやイントログレッシ ョン個体の遺伝解析のために、イネゲノム情報を利用し多型頻度の高いイントロン領域をターゲットとしたI）mマーカーを開発した。イントロン多型の種特異陸は高く、フェストロリウムの解析に有用である ことを明らかにした。またイネとライグラス・フェスクのシンテニーを利用することでゲノム中の任意の染色体・遺伝子座にI）NAマーカーの設計が可能であることを明らかにした。さらにプライマーの3 側配列の種間保存性を利用することで、近縁種の豊富な配列晴報を利用した、寒地型イネ科牧草に広く利用 可能なプライマー設計法を開発した。次にベレニアルライグラスにメドウフェスクの優れた越冬陸を導 入するために、両種の三倍体雑種の戻し交雑により、メドウフェスクの一部染色体がペレニアルライグ ラスヘ移入されたイントログ レッション集団の作出を行った。3つの戻し交雑後代二倍体集団について、各染色体に座乗する74のI竍岨マーカーによるジェノタイピングを行った結果、51〜77％の個体でメドウフェスク由来染色体のイントログレッションが確認された。二倍体戻し交雑後代個体の耐凍性は、幅広 い変異を示し、戻し交雑親であるペレニアルライグラスより高い耐凍性を示す個体が認められたが、メ ドウフェスクより優れる耐凍陸を示す個体はみられなかった。優れた耐凍陸を示した
いくっかの個体で はメドウフェスク由来のイントログレッションが認められた。さらに、メドウフェス
クとペレニアルラ イグラスの越冬陸の差異に寄与している遺伝子を同定するために、次世代シーケンサーを用いて低温馴 化条件下における両種聞のトランスクリプトーム比較を行った。低温馴化させた冠部組織由来EsTにっいて、配列の類似陸に基づくクラスタリングを行い、対応する両種由来のクラスターの構成リード数を比 較することで、両種間で発現量の異なる遺伝子を同定した。また同条件のcDNAについて種間サブトラク ションを行い種間差次的遺伝子の同定を試みた。候補遺伝子について両種に由来する各20個体の発現解 析を行った結果、低温馴化時 に種間の発現量に2倍以上の差がある遺伝子として、メドウフェスク高発 現遺伝子7種およびペレニア ルライグラス高発現遺伝子2種を同定した。メドウフェ
スク高発現遺伝子 はべレニアルライグラスとの比較でメドウフェスクにおいて低温馴化時に著しく発現量が増加する傾向 が認められた。また低温馴化時のFl繼における種間差次的発現遺伝子は両種の中間的な発現量を示す傾向がみられた。さらにイントログレッション集団におけるメド．ウフェスク高発現遺伝子の発現量を評価した結果、一部の遺伝子についてはcfs因子が、両種間の発現量差に関与することが示された。
以上の研究の結 果、ゲノム情報の豊富なモデル植物や近繍腫との比較アプローチの手法により、これまで研究蓄積が少 なかった寒地型イネ科牧草における越冬性や低温馴化に関わる遺伝子レベルでのメカニズムを明らかにすることができた。今後、本研究で機能を明らかにした遺伝子や有用なDNAマーカーを用いた分子育種の 手法により、寒地型イネ科牧 草における越冬性の飛躍的 な遺伝改良が期待される。

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学位 論文審査の要旨
主査
副査

教授

山田敏彦

教授

荒木准 教授山崎健一

助教

星野洋一 郎准 教授

荒 川 圭 太 （ 大 学 院 農 学研 究 院 ）

准 教授

金澤肇

章 （ 大 学 院 農学 研 究 院）

学 位 論 文題 名

牧 草 に お け る 越 冬 性 向 上 の ため の 種 間 比較 ア プ ロ ーチ を用 いた分 子育種学 的研究(Studies on molecular breeding usingcompara
tiveapproach
es amongspecies
for the purpose of an improvement of winter hardine
ss inforagegrasses)

北 海 道 の よ う な 寒 地の 草 地で は 寒 地型 イ ネ科 牧 草 が栽 培 され て い るが 、 そ の栽 培 適 応 の 第 ー の 制 限要 因 は 越冬 性 で あり 、 この 遺 伝 改良 は 主要 な 育 種目 標 である 。 本 研究 で は 、 寒地 型 イ ネ科 牧 草 における 越冬性 の基礎的 知見を 蓄積する ために、
CBF (C‑repeatbindingfactor)と フルク タン代謝 酵素遺伝 子に関 する分子 遺伝学 ・分子生 物 学 的 研 究 を行 っ た 。ま た 、 越 冬性 改 良 のた め の 種（ 属 ） 間雑 種 を 利用 し た 分子 育種 研 究 と 、 そ の 解 析 ツ ー ル と し て DNAマ ー カ ー の 開 発 や 比 較 ト ラ ン ス ク リ プ ト ー ム解 析 を 行 っ た 。本 研 究 の遂 行 に あ たり 、 研 究資 源 の 乏し い 寒 地型 イ ネ 科牧 草 の 研究 を
効 率 的 に 進 め るた め 、 研究 蓄 積 が 豊富 な イ ネや コ ム ギな ど 近 縁作 物 の 情報 を 有 効活 用
し、ま た、寒地型 イネ科牧草 間を含めた 種間比較を 主な手法と して用いた 。
低 温 に 応 答 し 下 流 の 低 温 馴 化 に 関 与 す る 様 々 な 遺 伝 子 発 現 を 誘 導す る 転 写因 子 をコード し、ムギ 類などで 越冬性 Q
TL(Quantitativ
etraitloci)の候 補遺伝 子と考えられて
い る CBFの ホ モ 口 グ (Lp CBF)を ぺ レ ニ ア ル ラ イ グ ラ ス か ら 10種 単 離 し た 。 Lp CBFは 低 温 に よ り 急激 に 転 写誘 導 さ れ たが 、 そ の後 の 低 温下 で の 発現 様 式 は、 遺 伝 子に より異なった。Lp CB
Flbの 過剰 発 現 シ口 イ ヌ ナズ ナ 形 質転 換 体 は著 し い 矮化 を 示 し た一方、 LpCBFIVa形 質転 換 体 は生 殖 生 長移 行が遅 延したが 、耐凍性 の向上 が認めら れた。
5つ の 遺 伝 子 の う ち マ ッ ピ ン グ で き た 4っ は 5番 連 鎖 群 に 2.2cMの 範 囲 に ク ラ ス ターを 形 成し て 座乗 し、 近 縁種 と の間 に シン テニ ー 関係が認め られた。
フ ル ク タ ンは 寒 地 型イ ネ 科 牧 草が 蓄 積 する 主 要 な貯 蔵 炭 水化 物 で 、耐 凍 性 など の 環境ス ト レ ス耐 性 と の 関連 が 示 唆さ れ て いる 。 本 研究 で は 特異 的 に 高重合 度（100以上）
フ ル ク タ ン を 蓄積 す る チモ シ ー か らフ ル ク タン 代 謝 酵素 遺 伝 子を 単 離 し、 そ の 機能 ・発 現 解 析 を 行 った 。 Pp
FT1お よび PpF
T2は 直鎖 B(2， 6） 結合 型 フ ルク タ ン を 合成 す る 新規酵 素 遺 伝子 で あ る こと を 明 らか に し た。 ま た 、Pp6‑FEH′は 高 重 合度のB(2，6）結合― 373―

型 フル クタ ンに 対し 高い 基質 特異 性を 示す フルク タン 分解 酵素 (6‑FEH)をコードすることを明らかにした。これらの遺伝子の発現解析により、チモシーにおけるフルクタ ン代 謝酵 素の 活性 がシ ンク ／ソ ースバランスの変化や低温により転写レベルで制御されることを明らかにした。また、越冬前後の自然条件下においてもフルクタン含量 や糖 組成 の変 動に 代謝 酵素 遺伝 子の転写レベルの制御が大きく関与していることを明らかにした。PpFT1過剰発現Brachypod
iumdistac緲D
門形質転換体は生育抑制を示したが、低温馴化条件下において単少糖の増加と高重合度フルクタンの蓄積が認められ 、野 生株 やり 釘形 質転 換体 と比 較して細胞レベルでの耐凍性向上が認められた。
越冬 性に 優れ るメ ドウ フェ スク と放牧適性や飼料品質に優れるぺレニアルライグラスの種（属）間雑種を利用した分子育種研究を行った。まずライグラスとフウスクの 雑種 であ るフ ェス トロ リウ ムや イントログレッション個体の遺伝解析に有用な種（ 属） 間識別DNAマーカーを、イネゲノム情報を利用して作出した。これを利用し、両種の三倍体雑種の戻し交雑後代の解析を行い、ヌドウフェスク由来ゲノムのイントログレッションを確認した。イント口グレッション集団の耐凍性は、幅広い変異を示し、戻し交雑親であるぺレニアルライグラスより高い耐凍性を示す個体が見出された。
また、メドウフェスクとべレニアルライグラスの越冬性の差異に寄与する遺伝子を同定するために、次世代シーケンシングを利用し低温馴化条件下における両種間のトラン スク リプトーム比較を行った。網羅的EST解析およびサプトラクション法により、
低 温馴 化時に種間の発現量に2倍以上の差がある遺伝子として、メドウフェスク高発
現 遺伝 子7種お よびぺ レニ アル ライ グラス高発現遺伝子2種を同定した。メドウフェス ク高 発現 遺伝 子は メド ウフ ウス クにおいてぺレこアルライグラスと比較して低温馴 化時 に著 しく 発現 量が 増加 する 傾向が認められた。またF1雑種における種間差時的発現遺伝子は両種の中間的は発現量を示す傾向を示した。さらにイント口グレッシヨン集団におけるメドウフェスク高発現遺伝子の発現量を評価した結果、一部の遺伝
子 に つ い て は cお 因 子 が 、 両 種 間 の 発 現 量 差 に 関 与 す る こ と が 示 さ れ た 。
以上の研究の結果、ゲノム情報の豊富なモデル植物や近縁種との比較アプローチの手法により、これまで研究蓄積が少なかった寒地型イネ科牧草における越冬性や低温馴 化に 関わ る遺 伝子 レベ ルで のメ カニズムに関して数多くの研究知見を明らかにする こと がで きた 。今 後、 本研 究で 機能を明らかにした遺伝子および開発した有用なDNAマ ーカ ーを 用いた 分子 育種 の手 法に より 、寒 地型 イネ 科牧 草における越冬性の飛躍的な遺伝改良が期待される。
よ って ，申 請者 は博 士（ 環境 科学 ）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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