博 士 （ 医 学 ） 白 鳥 聡 一
学 位論文題 名Identif
icationofZA
PSasapositi
veregulatorof
RIG‑I‑mediated antiviral response（パターン 認識受容体RIG−Iを介した抗ウイルス応答を増強する、

新 規調 節因子 ZAPSの同定）

学位論文内容の要旨[Background and purpose】

Pathogen invasionis sensed by pattem recognit
ion r
eceptors(PRRs) of the innate immu
ne system vi
a it
srec
og
ni
tio
n of pathog
en‑associat
ed molecular pattems(PAMPs). ViralRNAs can serve as a P
AMP, and the retinoic acid‑
induc
ib
le ge
ne I(RIG‑I)is akeyPRR for t
he detecti
on of positiv
e‑ and negative‑
stran
ded RNAv
irus
es in the cytoplasmof cells.
RNA carrying 5'‑tri
phosphate modif
icati
on (3pRNA)is shownt
o be an essential determina
nt forviralR
NA recognit
ionby RIG‑I, which resul
ts in t
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rferon(IFN)‑regulatory factor (IRF) 3 an
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mediatedpathways are important for the activation of innat
e imm
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ses to vir
al infection.
Poly(ADP‑ribose) polymerases (PARPs) are known to regulate notonly cell su
rviv
al and celldeath,butalsootherdiv
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that some PARPs, including PARP‑1 and PARP‑13 (also termed ZAP; zinc‑finger CCCH‑typeantiviralproteinl),interactwithv
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ntermsof its possible involvement in pattern recognition receptor‑mediated signaling.
[Methods and Results)

To investigatet
he roleof the PARPs innucleic acid‑i
nduce
d innate

immune responses, we exogenously expressed PARP‑1, PARP‑2, PARP‑7, PARP‑9, PARP‑12 andPARP‑13, all of which were reporte
d to be involved in microbial infec
tion, inflammati
on andimmunity. We performed quantita
tive RT‑PCR (qRT‑PCR) analysis, and found that PAR
P‑13/ZAP
uniq
uely showe
damarked enhancing effe
ct on the expre
ssion of I
FN‑p mRNA upon transfectionwith 3pRNA in HEK
293T human embr
yonic kidn
ey cells. Next, we examin
ed whether there is any
diff
erenc
e bet
ween the t
wo isoform
s of PARP‑
13/ZA
P: qR
T‑PCR anal
ysis also reve
aled that theshorter isoform (we herea
fter call thisisoform ZAPS (zinc‑finger CCCH‑type antivir
alproteinl,shortform)) rat
her than the ful
l‑form ZAP, w
as selective
ly induced by IF
N‑oc or3pRNAandhada
stronge
reffectonIFN‑pmRN
Ainductionb
ystimulationw
ith3p
RNA.
By conducting qRT‑PCR experiments, we found that exogenous expression of ZAPS inHEK2
93T cells remar
kably enha
nced the induction of typeII
FN genes w
ith 3
pRNA stim
ulation.
Cons
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ent with this result,luc
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activation of the IFNB prom
oter in a manne
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sion. In
addition, we cond
ucted RNA inter
feren
ce‑ba
sed knockd
own e
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ments with small int
erfer
ingー 330ーRNA (siRNA) targeting ZAPS mRNA (siZAPS). qRT‑PCR analyses showed that the induction ofIFN‑p mRNA was severely abrogated in siZAPS‑treated CD14+ monocytes as well as similarly
treated other cell lines (HEK293T cells and A549 human lung epithelial adenocarcinoma cells).
The production of IFN‑p protein was also verified by enzyme‑linked immunosorbent assay(ELISA). We also found that ZAPS overexpression in HEK293T cells strongly enhanced the3pRNA‑induced activation of NF‑KB‑driven luciferase reporter gene. Consistently, qRT‑PCR
analyses showed that the induction of genes encoding other cytokines, such as tumor necrosis
factor (TNF), interleukin 6 (IL‑6) and CXCL10, in response t0 3pRNA stimulation, was diminishedin A549 cells, in which ZAPS mRNA was knocked down. These data indicated that ZAPS stronglypotentiates the activation of not only type I IFN but also NF‑KB in the RIG‑I‑mediated pathway.
Next, we investigated how ZAPS

functions as a potentiator of RIG‑I pathway. ‑The IFN‑pmRNA expression induced by the exogenous expression of ZAPS in HEK293T cells wasabolished by RNAi‑mediated downregulation of not only several molecules situateddownstream of RIG‑I but also RIG‑I itself. Therefore, we speculated that ZAPS plays apossible role as a novel regulator in the proximal process of RIG‑I‑mediated signaling.
Confocal analysis and immunoprecipitation assay revealed that ZAPS is in association with RIG‑I
after 3pRNA stimulation. Moreover, native page and immunoprecipitation assay showed that theformation of RIG‑I oligomers induced by Newcastle disease virus (NDV) infection or stimulation
with 3pRNA was suppressed in siZAPS‑treated HEK293T cells. These findings suggest that ZAPS
associates with RIG‑I to promote the RIG‑I oligomerization.
To evaluate the function of ZAPS in RIG‑I‑mediated antiviral responses, we infected A549 cellswith influenza virus, which are known to activate RIG‑I‑mediated signaling. Knockdown of ZAPS
expression by siRNA impaired influenza virus‑induced mRNA expression of type I IFN, IL‑6, TNF
and CXCL10 and the production of IFN‑p protein, which were assessed by qRT‑PCR and ELISA,respectively. By qRT‑PCR analyses, we also detected higher expression of a viral nucleoprotein
gene in siZAPS‑treated A549 cells than control siRNA‑treated A549 cells following influenza virus
infection. Moreover, qRT‑PCR analysis showed that exogenous expression of ZAPS in HEK293T
cells resulted in much more induction of IFN‑p mRNA after influenza virus infection, andconsistent with this result, a notable suppression of viral replication was observed byplaque‑fonning assay. A similar observation was also obtained for NDV infection. These suggestthat ZAPS exerts its antiviral activity through the RIG‑I‑mediated pathways.
{:Discussion)

In this study, we demonstrated that PARP‑13 is a regulator of RIG‑I‑mediatedantiviral signaling in human cells. We also found that ZAPS, the shorter isoform of PARP‑13, isselectively upregulated by stimulation with 3pRNA, possibly through type I IFN signaling. It has
been speculated that ZAPS acts as a positive feedback regulator for RIG‑I‑mediated type I IFN
pathway. In this regard, it is the next issue to clarify how each isoform is differently regulated.
Activation of RIG‑I after ligand binding is thought to be a multistep process that includes theactivation of its ATPase activity, conformational changes and oligomerization. The present data
have demonstrated that ZAPS interacts with RIG‑I after 3pRNA stimulation, and oligomerizationof RIG‑I, possibly by stabilizing the RNA‑RIG‑I complex, although the underlying mechanism
needs to be investigated further. The results also indicated that ZAPS expression alone slightly
enhances the expression of IFN‑p mRNA and the activation of the IFNB promoter independently of
any ligands. Consistent with these data, we detected the ZAPS‑RIG‑I interaction before stimulation,albeit very weakly. This disconnection of ligand dependence may suggest that this interaction issufficient to promote small amounts of signaling but that the overall signaling program is mostefficiently triggered by the binding of ligand to RIG‑I in addition to its activation by ZAPS.
The result showing that ZAPS is critically involved in antiviral innate immune responses to331

influenza virus and NDV raises the possibility that ZAPS have an important role against otherviruses which activate RIG‑I signaling. It is also needed to investigate the role of ZAPS in other
PRR‑activated innate signaling. Previous reports show that ZAP has a role in the decay of mRNAs,
which are derived from certain viral subsets. Together with this observation, our present data
indicate that ZAPS might exert a "dual‑mode" defense activity against viral infection. How these
activities are regulated remains to be clarified.
[Conclusion】

This study indicates that ZAPS has a key role as a positive regulator ofRJG‑I signaling during innate antiviral immune responses, suggesting that ZAPS may be an
important target for therapeutic intervention in the control of viral diseases.

― 332 ‑

学位論文審査の要旨
主査 准教授 松本美佐子
副査 教 授 畠 山鎮次
副査 教 授 佐 邊壽孝
副査 教 授 志 田壽利
副査 教 授 今 村雅寛

学位論文題名Identification ofZAPS asa
positiveregulatorof
RIG― Iー mediated antiviral response（パターン認識受容体RIG―Iを介した抗ウイルス応答を増強する、新規調節因子ZAPSの同定）

本 研 究 は 、 細 胞 質 内 ウ イ ル ス RNA認 識 受 容 体 RIG‑Iに よ る 抗 ウ イ ル ス 応 答 を 調 節 す る 分 子 を 新 た に
探 索 し 、 RIG‑Iシ グ ナ ル を 増 強 す る 分 子 と し て 、 poly(ADP‑ribose) polymerase (PARP)ー 13 shorter
isoform (ZAPS)を 同 定 し た 。 ZAPSは typeIinterferon (IFN)に よ り 発 現 誘 導 さ ； れ ´ 、 ウ イ ル tス RNA存在 下 で RIG‑Iと 相 互 作 用 し 、 RIG‑Iの オ リ ゴ マ ー 化 を 増 強 す る こ と で typeIIFN、 炎 症 t生 サ イ ト カ イン 産 生 を 増 加 さ せ る こ と が 示 さ れ た 。 更 に 、 イ ン フ ル エ ン ザ 感 染 に お い て ZAPSを ノ ッ ク ダ ウ ン す る と 、typeIIFN産 生 が 低 下 し ウ イ ル ス 複 製 が 増 加 す る こ と 、 逆 に ZAPSの 過 剰 発 現 で は Newcastle diseasevirus感 染 で の IFNp産 生 が 上 昇 し 、 ウ イ ル ス タ イ タ ー が 低 下 す る こ と か ら 、 RIpIを 介 し た t卯 eII剛
産 生 に よ る 抗 ウ イ ル ス 応 答 に ZAPSが 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と が 明 ら か と な っ 也
審 査 会 に お いて 、 申 請 者 の発 表 後 、 副 査の 畠 山 割 受 から 、 申 請 者 の 実験の 進め 方につ いて、 また全長 の ZAPと ZAPSの 種 々 の 組 織 で の 発 現 量 の 違 い 、 RIGIIと ZAPSの 結 合 に お け る Znの 関 与 な ど に っ いて 質 問 が あ り 、 申 請 者 は 自 ら 行 っ た 実 験 内 容 ・ 手 技 に つ い て 詳 し く 説 明 し 、 ZAPSと ZAPの 発 現 誘 導 の違 い に つ い て も ス ラ イ ド で 示 し な が ら 答 え た 。 今 回 同 定 し た shortformの ZAPsは 、 全 長 の ZAP遺 伝
子 か ら alternativesplicingに よ り 生 成 さ れ る と 考 え ら れ て お り 、 siRNAに よ る ノ ッ ク ダ ウ ン で は ZAP，ZAPSの 両 者 が ノ ッ ク ダ ウ ン さ れ る こ と 、 強 制 発 現 系 に お い て ZAPと ZAPSの 機 能 の 違 い が 見 ら れ る こと を 説 明 し た 。 副 査 の 佐 邊 教 授 か ら 、 ZAPSの N末 に 存 荏 ナ る Znフ イ ン ガ ー に 関 連 し た 実 験 上 の 注 意
点 、 お よ び 学 位 論 文 に お け る 序 章 の 書 き 方 に つ い て コ メ ン ト が あ っ た 。 ま た 、 NFKBが 活 陸 化 さ れ た
細 胞 に お い て ZAPSに よ る RIや Iシ グ ー ナ ソ レ 増 強 が ど の よ う な 効 果 を も た ら す か 質 問 が あ り 、 申 請 者 は 、想 定 さ れ る こ と を 現 時 点 で の 実 験 ・ デ ． ー タ か ら 説 明 し 、今 後 取 り 采 岳 む 重要 な 課 題 で あ る と の認 識 を 示 し‑ 333 ‑た。副査の志田 教陵からは、RIG‑Iのアダプター分子MAVSからのIRF・7活性化にっいて質問があり、適切に答えた。また、ウイルスによる宿主免疫系、特にIFN産生系の撹舌し齣洲各について討論がなされた二。副査の今村教陵G旨導教員）から、臨床において申請者の研究をどう発展させるか、また炎症疾患との関連につ いて質問があり、申請者は、 ZAPSがRIGーIを介したtypeIIFNとNF・1くBの両方のシグナルに関与することから、炎症を増強させる可制生などにっいて述べ、今後、炎症疾患とウイルス感染との関連を 基礎的およひ1臨床的に明らかにすることが重要であるとの見解を示しt‑
最後に主査の松本准教授から、RIG一I
il‑Itf匕に関与する蛋白群のなかでのZAPSの位置についての質問、およびZA
P，ZAPSによるウイ ルスR¥iA分解系とIFN産生誘導系への振り分けがどのように行われているかという質問がなされた。申請者は、RI
G‑I
はZAPSによルオリゴマー化された後、ATPa
se活｜生が起こること、RIG・Iのユビキチン化はZAPSの下流であることを示した。R¥IA
分解系とIF¥1誘導系への分岐については、まだ不明であることをスライドで示して返答した。
申請者はすべての質問に対してその土旨を理解し、自らの研究内容と文jf{kca'j考察を交えて適切に回答した。
この論文は、自然免疫による抗ウイルス防御において重要な役割を果たすRIG‑
Iの活にヒイヒにZAP
Sという新労移チ子が関与することを明らかにした点で高く評価され、今後のウイル′スRN
A認i
馴幾購の解明およぴ抗ウイルス剤の開発に寄与ナることが期待される。
審査員一同は、これらの成果を評価し、大学院過程に韜ける研鑽や取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

― 334 ‑