博 士 （地 球環 境 科学 ）佐 藤 孝治
学位論文題名
Studiesonpurificati
on and characterizatio
nof nucleop
lasmin‑relat
ed protei
ns from fi
sh eggsand echi
noderm ovarleS（魚類卵及び棘皮動物卵巣に含まれるヌクレオプラスミン関連夕ンパク質の精製と性質に関する研究）

学位 論文 内容の要旨

真核生物においてクロマチンは、ヌクレオソームと呼ばれるヒストン8量体（ヒストンH2A, H2B，H3，H4のそれそれ2分子）の周りにDNAが約200 bp巻き付いた構造からなっている。クロマチンの凝縮、脱凝縮の構造変化は遺伝子の発現や複製に関与していることが報告されており、脱凝縮の最初のステヅプにおいてヌクレオプラスミンと呼ぱれる分子シャペロンが関与していることが明らかとなってきている。また、アフリカツメガェル成
熟未受精卵の抽出液からヌクレオプラスミンを免疫除去したものでは、脱凝縮活性が低下することからこのタンバク質は卵抽出液中において脱凝縮に深く関与している因子であることが示された。
アフリカツメガェルの成熟未受精卵から単離されたヌクレオプラスミンは、熱に安定な5量体で存在している。このタンバク質の一次構造は2つの異なったcDNAから決定され、200アミノ酸残基数から成ることが報告された。また、このタンバク質はC末端にGluが局在した配列を有し、ヌクレオソーム構造の再構築を促進する活性と精子核脱凝縮活性を有することも報告されている。アフリカッメガェル由来のヌクレオプラスミンは両生類のみぬらず、ヒト、軟体動物（イガイ）、魚類（サケ）の精子核をそれそれ脱凝縮することが報告されており、ヌクレオプラスミンと同様に精子核脱凝縮活性を有するタンパク質が広く生物種に分布していることが示唆されている。そこで本研究では、これまで報告がなかった魚類（コイCyprinus carpio)成熟未受精卵からヌクレオプラスミン様夕ンパク質を単離・精製し、既に単離されているアフリカツメガェルのヌクレオプラスミンと比較検討する ことを 第一 の目 的と した。 また 棘皮動物（エゾバフンウニStrongylocentrotusintermedius)卵巣中にアフリカツメガェル・ヌクレオプラスミンに対する抗血清で反応するヌクレオプラスミン関連夕ンバク質を見出し、そのタンパク質の構造と機能を明らかにすることを第二の目的とした。

コイ ・ ヌク レ オ プラ ス ミン 様 夕 ンバ ク 質 の精製 は、コイ 成熟未受 精卵(50g）の 可溶化
画 分 を55%の 飽和 硫安 で分画し た後、イ オン交換と グルろ過 のカラム クロマト グラフイ ーに よ り SDS‑PAGEで 単 一 バ ン ド と な る ま で 行 っ た 。 こ の 精製 に よ り約 2mgのヌ ク レ オプ
ラス ミン様夕 ンノヾク質が単離された。このタンバク質はアフリカツメガェル・ヌクレオプ
ラ ス ミン に 対す る 抗 血清 に より 認 識 され 、 オリ ゴマーで 存在して いること がHPLCを用いたゲ ルろ過カ ラムクロマトグラフイーで示された。また部分アミノ酸配列を調べたところ、
ア フ リカ ツ メガ エ ル ・ヌ ク レオ プ ラ スミ ン 同様 、C末端に Gluがっなが った酸性 領域を有し、 リン酸化 修飾を受け ているこ とがアル カリフオ スファタ ーゼ処理 により確認された。
さら にサケ精 子核を脱凝縮する活性を有していーることが明らかとなった。以上の結果から単離 されたヌ クレオプラ スミン様 夕ンバク 質はコイ の成熟未 受精卵中 において受精や遺伝
子 の 発 現 な ど の 生 命 現 象 に 重要 な 役割 を 果た し てい るも の と考 え られ る 。
一方 、棘皮動 物（エゾバ フンウ二 ）卵巣の 抽出液を 調製し、 アフリカ ツメガエル・ヌク
レオ プラスミ ンに対する 抗血清を 用いてウ ェスタン ブロット を行った 。その結果、分子量33 kDaのバ ン ドが 検 出 され 、 ウ二 卵 巣 中に ヌ クレオプ ラスミン 関連夕ン バク質が 存在するこ とが明ら かとなった 。そこで このタン バク質の 精製を試 み、55％の 飽和硫安で分画した 後 、 疎 水 性 カ ラ ムと ゲ ル ろ過 の カラ ム ク ロマ ト グラ フ イ ーに よ り SDS‑PAGEで 単 一 バン ド とな る まで 精 製 した 。 この 精 製 法に よ り25gの ウ ニ卵 巣 か ら1.2 mgのタ ンパク 質が精製 された。 33 kDa夕ンパク質 は糖鎖修 飾を受け ていない ことがglycopeptidase
消化により示唆された。また部分アミノ酸配列を調べたところ、neuronalcelladhesionmoleculeとして見 出された fasciclinIのフんミリ ーのタン バク質と 高い相同 性を示し た。決定されたアミノ 酸配列中 には、細胞 と相互作 用すると 推定され る配列（ Val‑Asp‑LeuとLeu‑Arg‑Glu)
が 検 出さ れ たた め 、 ヒト 線 維芽 肉 腫 細胞 (HT1080）を 用 い て細 胞 接着 実 験 を行っ た。その 結 果33 kDa夕ン バ ク 質は 細 胞接 着 活 性を 有 し、濃度 依存的に 細胞の接 着を促進 すること が 明ら か とな っ た 。ま た 、EDTAと へ パ リン を用い た細胞接 着の阻害 活性を調 べたとこ
ろ 、 EDTAで は 阻 害を 受 け ずへ パ リン で 細 胞接 着が阻 害される ことが明 らかとな った。この結 果から、 このタンパ ク質の細 胞接着活 性にはへ バリンが 重要な役 割を果たしていること が 示唆 さ れた 。 また推定 される細 胞接着ドメ インを合 むGly17‑Leu39のべプ チドを合 成
しそ の細胞接 着活性を調 べたとこ ろ強い接 着活性を 示し、そ の活性は へバリンで阻害される こ とが 明 らか と な った 。 さら に こ のぺ プ チド により33 kDa夕 ンバク質 の細胞接 着活性が 阻 害さ れ たこ と からGly17‑Leu39の領 域が活性 に重要な役 割を果た している ことが示 唆さ れ た。 以 上の 結 果 から 本 研究 に よ り単 離 され た33 kDaのウ二 ・ヌクレ オプラス ミン関連夕 ンバク質 は細胞接着 を介して 卵巣内に おいて重 要な役割 を果たし ている可能性が示唆された。

学 位論文審 査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 西 則 雄
教授 坂入信 夫
教授 荒木義 雄
助 教 授 野 水基 義

学位論文題名Studies on purif
icat
ionandchara
cterizati
onof nucle
oplasmin‑rel
atedpr
otei
nsfro
mf
isheg
gs
andechinoderm ovarleS（ 魚 類卵 及 び 棘皮 動 物卵 巣 に 含ま れ る ヌク レ オプ ラ ス ミン 関連夕 ンパク質の 精 製と 性 質 に関 す る研 究 ）真核生物 において クロマ チンは、 ヌクレ オソーム と呼ばれるヒストン8量体の周りにDNAが 約200bp巻 き付 い た構 造から なってい る。クロ マチン の凝縮、 脱凝縮 の構造変化 は遺伝 子の発現 や複製 に関与していることが報告されており、脱凝縮の最初のステップ におい てヌクレ オプラ スミンと 呼ばれ る分子シ ャペロン が関与 している ことが 明らか となっ てきてい る。ま た、アフリカツメガエル成熟未受精卵の抽出液からヌクレオプ
ラ スミン を免疫除 去した ものでは、脱凝縮活性が低下することからこのタンパク質は卵
抽 出 液 中 に お い て 脱 凝 縮 に 深 く 関 与 し て い る 因 子で あ る こと が 示さ れ た 。
アフリカ ツメガエ ルの成 熟未受精卵から単離されたヌクレオプラスミンは、熱に安定な 5量 体 で存 在 し てい る 。 この タ ン パク 質 の 一次 構 造は 200
アミ ノ酸残基 数から 成る
こ と が 報 告さ れ た 。ま た 、 この タ ン パク 質 は C
末 端 にGluが局在 した配列 を有し 、ヌク レオソ ーム構造 の再構 築を促進 する活 性と精子 核脱凝縮 活性を 有するこ とも報 告され ている 。アフリ カツメ ガエル由来のヌクレオプラスミンは両生類のみならず、ヒト、軟 体動物 （イガイ ）、魚 類（サケ）の精子核をそれぞれ脱凝縮することが報告されており 、ヌク レオプラ スミン と同様に精子核脱凝縮活性を有するタンパク質が広く生物種に分 布して いること が示唆 されている。そこで本研究では、これまで報告がなかった魚類（ コイ） 成熟未受 精卵か らヌクレオプラスミン様タンパク質を単離・精製し、既に単離さ れてい るアフリ カツメ ガエルの ヌクレ オプラス ミンと比 較検討 すること を第一 の目的 とした 。また棘 皮動物 （エゾバフンウニ）卵巣中にアフリカツメガエル・ヌクレオプ
ラ スミン に対する 抗血清 で反応するヌクレオプラスミン関連タンパク質を見出し、そのタ ン パク 質 の構 造 と機 能を明ら かにすることを 第二の目的と した。
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コイ・ヌクレオプラスミン様タンパク質の精製は、コイ成熟未受精卵の可溶化画分を55％の飽和硫安で分画した後、イオン交換とゲルろ過のカラムクロマトグラフイーによりSDS‑PAGEで単一バンドとなるまで行った。このタンパク質はアフリカツメガエ
ル・ヌクレオプラスミンに対する抗血清により認識され、オリゴマーで存在していることがHPLCを用いたゲルろ過カラムクロマトグラフイーで示された。また部分アミノ酸配列を調べたところ、アフリカツメガエル・ヌクレオプラスミン同様、C末端にGlu
がっながった酸性領域を有し、リン酸化修飾を受けていることが確認された。さらにサケ精子核を脱凝縮する活性を有していることが明らかとなった。以上の結果から単離されたヌクレオプラスミン様タンパク質はコイの成熟未受精卵中において受精や遺伝子の 発現 な ど の生命 現象 に重 要な役 割を 果た して いるも のと 考え られ る。
一方、棘皮動物（エゾバフンウニ）卵巣の抽出液を調製し、アフリカツメガエル・ヌクレオプラスミンに対する抗血清を用いてウェスタンブロットを行った。その結果、分子量33 kDaのバンドが検出され、ウニ卵巣中にヌクレオプラスミン関連タンパク質が存在することが明らかとなった。そこでこのタンパク質の精製を試み、55％の飽和硫安で 分 画 した 後 、 疎 水 性 カ ラ ム と ゲ ルろ 過の カラ ムク ロマ トグ ラフ イーに より
SDS‑PAGEで単一バンドとなるまで精製した。33 kD
aタンパク質は糖鎖修飾を受けていをいことが示唆された。また部分アミノ酸配列を調べたところ、neuro
nalcelladhes
ionmoleculeとして見出されたfa
sc
ic
linIのファミリーのタンパク質と高い相同性を示した。決定されたアミノ酸配列中には、細胞と相互作用すると推定される配列(Val‑Asp‑LeuとLeu‑Arg‑Glu)が検出されたため、ヒト線維芽肉腫細胞(HT1080)を用いて細胞接着実験を行った。その結果33 kDaタンパク質は細胞接着活性を有し、濃度依存的に細胞の接着を促進することが明らかとなった。また、EDTAとへパリンを用いた細胞接着の阻害活性を調べたところ、EDTAでは阻害を受けずヘパリンで細胞接着が阻害されることが明らかとなった。この結果から、このタンパク質の細胞接着活性にはヘパリンが重要な役割を果たしていることが示唆された。また推定される細胞接着ドメインを含むGly17‑Leu39のベプチドを合成しその細胞接着活性を調べたところ強い接着活性を示し、その活性はへパリンで阻害されることが明らかとなった。さらにこの ベ プ チ ド に よ り 33 kDaタ ン パ ク 質 の 細 胞 接 着 活 性 が 阻害 さ れ た こ と か らGly17‑Leu39の領域が活性に重要な役割を果たしていることが示唆された。以上の結果から本研究により単離された33kDaのウニ・ヌクレオプラスミン関連タンパク質は細胞接着を介して卵巣内において重要な役割を果たしている重要で興味深い可能性が示唆された。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、また研究者として誠実かつ熱心であり、大学院過程における研鑽や単位取得なども併せ申請者が博士（地球環境科学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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