博 士 （ 医 学 ） 増 渕

悟学 位論 文 題名
Clock genes outside the suprachiasmatic nucleus involvedin manifestation of locomotor activity rhy
thm in rats
（ラット行動リズムの発現に関与する視交叉上核外時計関連遺伝子）

学位論文内容の要旨【 背 景・ 目 的 】 視交 叉 上 核 (SCN)は 哺 乳類 に 於 い て明 暗 サ イク ルに同 調する 概日リ ズムを 駆動 し て い る 。 一 方 、 ラ ッ ト に Methamphetamine (MAP)を 飲 水 中 に混 ぜ て 慢 性投 与 す る と、行動 リズム が明暗 サイク ルから 脱同調し 、24時 間より長 い周期 でフリ ーラン する現象が知られて い る が 、 こ の MAPによ っ て 発 現す る 行 動 リズ ム は SCNに依 存 し な い。 こ の こ とか ら 、 SCN以外にも概日リズムを駆動する振動体の存在が示唆されていた。
近年、Per，Per2，B＾鶴エ，ヱ，a〇cをなどの時計関連遺伝子が同定された。現在、これら時計関連遺 伝子と それら の遺伝 子産物 からなる 遺伝子 転写の ネガテ イブフ イード バックループによって 生 物時 計 は駆動 されて いると 考えら れてい る。こ れらの 時計関連 遺伝子 はSCNだ けではな く、 SCN外の 脳 内部位 及び末 梢臓器に おいて も周期 的に発 現して いる。 その生 理的意 義は不明 であ る が、 株 化 細 胞で あ る Rat−1flbroblastやH35hepatomaceuを 高 濃 度血 清 で 処 理す ると 時計 関 連遺 伝 子 （ Perヱ ， R吻 の 発 現 に少な くとも2〜3サイ クル続く 概日リ ズムが 生じる ことが知 ら れて お り、SCN外の細 胞におい ても自 律的な サーカ ディア ン振動 が生じ る可能 性が示さ れて い る 。 そ こ で MAP投与 で 発 現 する SCN非 依 存性 行 動 リ ズム が 、 MAPの作 用 部 位 であ る ド ー
パミ ン神経 の投射 部位に おいて 、時計関 連遺伝 子の概 日振動 が誘導 された 結果生じた可能性を検討する目的で以下の実験を行った。

【 方 法 】 実 験 動 物に は 、 Wistar系雌 ラ ッ ト (2〜 3ケ 月 齢 、MAP投 与 群 nニ 49、 対 照 群n 58)
を 用 い た 。6時 から 18時ま で が 明 期の 24時 間明 暗 サ イク ルで飼 育した 動物を 個別ケ ージに 移し 、 Animexm（島 津 製 作 所） で 自 発 行動 リ ズ ム を持 続 的 に 測定 し た 。 行動 リ ズ ム の解 析 はChronobioloigy Kit (StanfordSo爪 vareSystems） で行っ た。測 定開始 約1週間 後にMAP（ 塩酸 メタン フェタ ミン、 大日本 製薬） を飲水 中にO．01％の濃度で溶解し持続的投与を開始した。
MAP投与後 、通常暗 期にあ る行動 リズム の活動 期が明 暗サイ クルか ら脱同調し、フ1」ーランし‑ 371―

た後完全に明期に移動したところで、4時間おきに1日6点で断頭サンプリング（脳、松果体、血漿）を行った。その際、活動期の開始が午前4時前後になるように断頭日を定めた。対照群にも同様のスケジュールで断頭サンプリングを行った。松果体及び血漿中に含まれるメラトニン量をラジオイムノアッセイにて測定した。また脳内の時計関連遺伝子mRNA
量を加situhybridizationにて測定し、MicrocomputerImagingDevice(MCID)を用いて定量解析した。

【結果】SC
NのPerl発現リズム、松果体及び血漿中のメラトニンリズムは、行動リズムが明暗サイクルから脱同調しフリーランしているにもかかわらず、明暗サイクルに同調していた。
これらのりズムは位相、振幅、振動レベルに於いて対照群と差は認められなかった。一方、線条体、側頭葉ではPerl，Per2，BMA
L1の発現リズムは明暗サイクル、SC
NのP
erl
発現リズム、メラトニンリズムから脱同調したが、行動リズムとは一定の位相関係を維持していた。側坐核、cingulatecortexにおいては、MA
P投与後も時計関連遺伝子の発現リズムに大きな変化はみられなかった。

【考察】MA
P慢性投与で行動リズムが明暗サイクルから脱同調したとき、SCNPerl
発現リズム、血漿中及び松果体メラトニンリズムが明暗サイクルに同調していたことより、行動リズムと視交叉上核リズムの間で内的脱同調が生じたと考えられる。行動発現と関連がある線条体、側頭葉のP
erl，R．r2，BMA
L
1発現リズムもSCN及びメラトニンリズムから脱同調し、行動リズムと一定の位相関係を保っていたことから、これらの脳部位がMAPによって発現する行動リズムの駆動に関与している可能性がある。
ヒ卜では時間隔離環境下や非24時間睡眠覚醒症候群において行動リズムとメラトニンリズムの乖離が知られており、これによルヒト体内時計は2振動体からなると考えられている。今回、MAP
慢性投与ラットで行動リズムとメラ卜二ンリズム及び視交叉上核のP｜erl
発現リズムに内的脱同調を認め、実験動物で初めて生物時計の2振動体仮説を支持する結果を得た。また、視交叉上核以外の振動体局在として線条体を示唆した。

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 福 島 菊 郎
副 査 教 授 本 間 研 一
副 査 教 授 渡 辺 雅 彦

学位論文題名Clock genes outside the suprachiasmatic nucleuslnVOlVed
inmanifeStationof10COmotoraCtiVityrhythmlnratS（ラット行動リズムの発現に関与する視交叉上核外時計関連遺伝子）

覚醒剤であるMethamphetamine(MAP)慢性投与ラットにおいては、その行動リズ
ムが24時間周期の明暗サイクルから脱同調することが知られている。この動物の行動リズムを周期解析すると約30時間の長い周期成分だけでなくMAPを投与していないラッ卜でみられる約24時間の周期成分が検出されるため、MAP慢性投与ラッ卜には生物時計の中枢として確立されている視交叉上核(SCN)と、SCN以外の慨日振動機構が存在する事が想定されていた。
本研究はMAP慢性投与ラッ卜におけるりズム形成の脳内機構を知るために、行動リズムが明暗サイクルから脱同調した時点で、生物時計の出力系としてのメラトニンリズムおよびSCN内外の時計関連遺伝子Per7，Per2, BMAL1，Clockの発現リズムを検討した。
実験動物には、Wistar系雌ラッ卜を用いた。明暗サイクルで飼育した動物を個別ケージに移し、Animex川で自発行動リズムを持続的に測定した。行動リズムの解析はChronobiologyKitで行った。測定開始約1週間後にMAPを飲水中にO．01％の濃度で溶解し持続的投与を開始した。MAP投与後、通常暗期にある行動リズムの活動期が明暗サイクルから脱同調したところで、4時間おきに1日6点で断頭サンプリングを行った。
松果体及び血漿中に含まれるメラトニン量をラジオイムノアッセイにて測定した。また脳内の時計関連遺伝子mRNA量を加餅fuhybridizationにて測定し、Microcomputer
ImagingDeviCe（MCID）を用いて定量解析した。
メラ 卜ニンリズム及びSCNのPer7およびPer2発現リズムは、行動リズムが明暗サイクルから脱同調しているにもかかわらず、明暗サイクルに同調していた。―方、線条体、頭頂葉ではPer7，Pe′2，M AL7の発現リズムは明暗サイクル、SCNリズム、メラトニンリズムから脱同調したが、行動リズムとは一定の位相関係を維持していた。側坐核、帯状回皮質においては、MAP投与後も時計関連遺伝子の発現リズムに大きな変化はみられなかった。
これらの結果から、行動リズムとSCNリズムの間で内的脱同調が生じたこと、全ての生体リズム機能がSCNから脱同調したのではなくSCNは松果体のりズムを行動リズムの脱同調後も支配していること、線条体、頭頂葉がMAPによって発現する行動リズムに関与している可能性があることが示された。
公開発表では、副査の渡邉教授からこのりズムを神経化学的に考えた場合その中枢となる部位、作用メカニズム、関与する神経伝達物質について、また、運動に関与する小脳との関連について質問があった。次いで副査の本間教授からMAPを投与した動物は分裂病のモデルとして知られているが精神病では内的脱同調が起こりやすいのか、またヒトにおいて覚醒度と内的脱同調の関連について知られていることはあるかとの質問があった。また主査の福島教授より遺伝子発現と行動リズムとの因果関係について質問があった。これらの質問に対して、申請者は自身のこれまでの研究成績や文献的考察をもとにおおむね妥当な回答をなし得た。
審査員一同は、本諭文が哺乳類の生物時計が階層的に支配されていることを時計関連遺伝子の発現リズムから示した点、また、MAP慢性投与ラッ卜がヒトの概日システムのモデル動物であることを示し今後睡眠覚醒リズム障害の原因を探る上での有カな疾患モデルとして期待される点で、本諭文を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。