博士 （生 命 科学 ）太田龍馬
IVIolecular Biological Analysis of IVIechanisms Involved in
the Signal Transduction and in the Translational
Activation of mRNAs in Amphibian Oocyte IVIaturation（両生類卵成熟過程でのシグナル伝達系およびmRNAの 翻 訳 に 関 す る 分 子 生 物 学 的 研 究 ）学位論文内容の要旨
ヒトを含む多くの脊椎動物では、減数分裂の第一前期で停止した卵母細胞（未成熟卵）が、ホルモン刺激により減数分裂を再開することで受精可能な卵（成熟卵）ができる。この過程は卵成熟と呼ぱれ、卵母細胞中で卵成熟促進因子(MPF)が形成されることで引き起こされる。
MPF
は サイ クリ ンBと Cdc2から なる 複合 体で ある 。未 成熟 卵 中で 、サイクリンBは翻訳抑制されたmRNAとして存在し ており、ホルモン刺激によルタンパク質が翻訳される。新規に合成されたサイクリンBタンパク質は、未成熟卵中ですでにタンパク質として存在するCdc2と結 合し 、MPFが 形成 さ れる 。しかし、ホ ルモン受容からMPFの形成に 至るシグ
ナ ル 伝 達 系 お よ ぴ サ イ ク リ ン B翻 訳 制 御 に つ い て は 、 未 だ に 不 明 の 点 が 多 い 。
アフリカツメガエルは一年中未成熟卵を採取することが出来るため、卵成熟研究に一般的に用いられている。しかし、その未成熟卵は、ほとんどの脊椎動物が持たない不活性型のMPF(pre‑MPF)を持ち、これが活性化することで卵成熟が引き起こされる。っまり、ツメガエルは脊椎動物では例外的な卵成熟誘起機構を採用しており、脊椎動物の卵成熟におけるシグナル伝達系の一般的な機構の解析には適さなぃ。そこで第一章では、pre‑M
PFを持たないアカガエル卵母細胞を用いて解析を行った。
著者 はツ メガエル卵成熟に関わるとされる、ホ スファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)、プロテインキナーゼB(PKB)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3p(GSK3p）が、アカガエル卵成熟で機能しているかを調べた。PI
3Kの阻害剤は卵成熟を阻害し、かつ、その効果は卵成熟過程の初期に限ら れることが明らかとなった。一方、PK
B阻害剤は卵成熟に影響 せず 、恒 常的 に活 性を 持っ PK
Bあ るいはGS
K3
Bの強制発現も卵成熟への影響 は全く見られなかった。以上の結果か ら、PI3
KはサイクリンBの翻 訳の上流に位置するが、PKB
韜
よ び GSK3pは pre‑MPFを 持 っ ツ メ ガ エ ル の 卵 成 熟 の み に 関 わ る と 考 え ら れ る 。
ツメ ガエ ルを 用い た研 究か ら、 サイ クリンBlmRNAの翻訳制御は、ポリA鎖 伸長を伴う細胞質ポリアデニル化を介して行われ、それには複数のタンパク質が関わることがわかっている。゛その中で中心的な役割を果たすのは細胞質ポリアデニル化因子結合タンパク質(CPEB)であり、そのりン酸化が引き金となって翻訳が起こるとされている。しかし、卵成
熟過 程では サイクリ ンB
lmRlxlrA
以外 にも複数のmRNAが細胞質ポリアデニル化により翻訳 制 御さ れてお り、それ らm
RNAの翻 訳時期は それぞ れに異な る。し たがって 、各mRNAの翻訳開始のタイミングを決定する機構が存在するはずであるが、その詳細は全く不明である 。過去 の研究に おいて 、サイク リンBl mRN
Aに特異 的に結 合するタンパク質として
Pumiliol(Puml)が同定され、これによるサイクリンB
lmRNAの翻訳制御が示唆された。また、 ツメガ エル卵母細胞中にはP
umlと同じタンパクファミリーに属するPumili02(Pum2)も存 在して いること が判っ ている。 しかし、PumlとPum2の機能に関する研究は未だ十分にはなされておらず、実際、これらの機能の違いは不明である。そこで第二章では、ツメガ エ ル卵 母細胞 を材料に 、mRNAの時 期特異的 な翻訳 開始を制 御する タンパク 質としてPumlと Pum2に着 目し、こ れらの 機能を明 らかに すること を目的と して研 究を行っ た。
その 結果、 両タンパク質とも、1）未成熟卵中で、CPEBを含めた細胞質ポリアデニル化に関 与する タンパク質群と複合体を形成する、2）卵成熟過程でりン酸化された後、CPEBと解 離する 、3）抗体注射により機能を阻害すると、卵成熟過程でサイクリンBlの合成が早まり、卵成熟が促進することがわかった。また、卵成熟過程を通じてPumlとサイクリン
Bl mRNAの 結 合 は 維持 さ れ るが 、 CP
EBはmR
NAから解離 するとい う結果 も得られ た。これら のこと から、l)Pumilioは標 的m
RNAの翻 訳開始に 必要な CPE
Bのりン酸化を抑えている。2)
Pumilio
がりン酸化されると、CPEB
のりン酸化が可能になる。3）リン酸化されたCPE
Bは mR
NAから 解離する ことで標 的mR
NAの翻 訳が可 能となる と考えら れる。 さらに、 リン酸 化 とCPEB
か ら の 解 離の タ イ ミン グ は P
um2の方 が 早 く起 こ り、 標的mR
NAも 両者で 異なる ことも 明らかに なった 。以上の ことから、PumlとPum2は、細胞質ポリアデニル化を介 し てそ れ ぞ れに 特 異 的 なmRNAの 翻 訳 開始 の タ イミ ン グ を決 めて おり、Pu
m2の 標的mRNAは Pum1の 標 的 で あ る サ イ ク リ ン BlmRNAの 上 流 に 存 在 す る と 考 え ら れ る 。
ツメ ガ エ ル卵 母 細 胞 では 、 Mosが 新規合成 され、 p42
MA
Pキナー ゼが活性 化される 、Mos‐MAPキナーゼ 経路に より卵成 熟が誘起 される ことがわ かって いる。また他のMAP
キナーゼファミリータンパク質である、c‐JunNltenninm
キナーゼ、p38Yキナーゼも卵成熟への関 与が示 唆されている。したがって、ツメガエル卵成熟の様々な過程において、MAP
キナー ゼタン パク質ファミリーは必要とされると考えられる。しかし、上記以外のMAP
キナー ゼ フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 に つ い ては 十 分に 解 析が な され て いな い 。
第三章ではM
APキナーゼ様のタンパク質のーっであるNem
0−likeキナーゼ（NLK）に着目し、そのツメガエル卵成熟過程への関与を調べた。その結果、1）NLK
は卵成熟過程を通して一定の発現が見られるが、未成熟卵中では活性を持たず、卵成熟過程の初期に活性化する、2）N
LKの活性化 にはMosタンパ ク質が必 要であ るが、MAPキナ ーゼの活 性化は必 要
で は なぃ 、 3）NLKの 強制 発 現 によ ルサ イクリン BlmRN
Aのポリ A鎖 伸長およ び翻訳を 促進 し 、卵 成熟を 促進する 、4）NLK
は 直接Puml、Pum2、CPE
Bをり ン酸化す ることが 明らかとなった。これらのことから、ツメガエル卵成熟過程ではMos―MAP
キナーゼ経路とは別― 1450―

に、Mos‑NLK経路が存在し、NL
KはPuml、Pum2、CPE
Bのりン酸化を介して、サイクリン Bl mRNAを 含 む mRNAの 翻 訳 を 制 御 に 関 わ る と 考 え ら れ る 。

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学 位 論 文 審 査 の 要旨
主査

教授

山下正兼

副査
副査

教授
高橋孝行
准 教授 勝 義直

副査

准 教授

木村敦

:N/IolecularBiologicalAnalysi
sofMechanismsInvolvedinthe Signal Transdu
cti
on and in the Tr
anslation
alActivation of mRNAs in Amphibian Oocyte IVIaturation（ 両生 類卵成 熟過 程で のシ グナ ル伝 達系 およ び
mRNAの 翻 訳 に 関 す る 分 子 生 物 学 的 研 究 ）多くの脊椎動物では、減数分裂の第一前期で停止した卵母細胞が、ホルモン刺激により減数分裂を再開することで受精可能な卵が作られる。この過程は卵成熟と呼ばれ、卵母細胞内で卵成熟促進因子(MPF)が形成されることで誘起される。MPFはサイクリンBとCdc2からなる複合体で、未成熟卵にはサイクリンBは翻訳抑制されたmRNAとして存在し、ホルモン刺激によルタンパク質が翻訳される。合成されたサイクリンBタンパク質は未成熟卵にすでに存在するCdc2タンパク質と結合してMPFを形成する。しかし、ホルモン受容からMPF形成に至るシグナル伝達系およびサイクリンB翻訳制御については、未だに不明の点が多い。
アフリカツメガエルは卵成熟研究に一般的に用いられているが、その未成熟卵は、ほとん
どの脊椎動物が持たない不活性型MPF(pre−MPF)を持ち、その活性化により卵成熟が誘起される。著者は第了章において、preーM
PFのないアカガエル卵母細胞を用い、ツメガエル卵成熟に関わるとされるホスファチジルイノシトール3キナーゼ(PI3K)、プロテインキナーゼB(PKB)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3p(GSK3p)がアカガエル卵成熟で機能しているかを調べた。PI3Kの阻害剤は卵成熟を阻害し、その効果は卵成熟過程の初期に限られた。一方、PKB阻害剤や恒常的に活性を持つPKBあるいはGSK3pの強制発現は卵成熟に影響を与えなかった。以上の結果から、PI3KはサイクリンB翻訳の上流に位置するが、PKBおよびGSK3pはpre―MPFを持っツメガエルの卵成熟のみに関わると考えられる。
サイクリンBlmRN
Aの翻訳制御は細胞質ポリアデニル化を介して行われ、それには細胞質ポリアデニル化因子結合タンパク質(CPEB)が主要な役割を果たす。しかし、卵成熟過程ではサイクリンBl以外にも複数のmRNAが細胞質ポリアデニル化により翻訳制御されており、またそれらの翻訳時期は異なる。したがって、各mRNAの翻訳開始のタイミングを決める機構が存在するはずであるが、その詳細は全く不明である。過去の研究でPumiliol(Puml)がサイクリンBl mRNAの翻訳を制御することが示唆された。また、ツメガエル卵母細胞にはPumlに類似のPumili02 (Pum2)も存在することが知られている。しかし、PumlとPum2の機能の違いは不明である。そこで第二章では、ツメガエル卵母細胞を材料に、mRNAの時期特異的‑ 1452−

な翻訳開始を制御するタンパク質としてPumlとPum2に着目し、これらの機能を明らかにする研究を行った。
その結果、Puml、Pum2ともに以下のことが判った。1）未成熟卵中でCPEBを含めた細胞質ポリアデニル化に関与するタンパク質群と複合体を形成している。2）卵成熟過程でりン酸化された後、CPEBと解離する。3）抗体注射により機能を阻害すると、卵成熟過程でサイクリンBlの合成が早まり、卵成熟が促進する。以上のことから、Pumilio
゛がりン酸化されるとCPEBがりン酸化され、リン酸化CPEBがmRNAから解離することで標的mRNAの翻訳が可能となると考えられる。さらに、リン酸化とCPEBの解離のタイミングはPumlよりのPum2の方が早く起こり、標的mRNAも両者で異なることから、PumlとPum2は細胞質ポリアデニ
ル 化 を 介 し て そ れ ぞ れ に 特 異 的 な mRNAの 翻 訳 を 制 御 し て い る と 考 え ら れ る 。
ツメガエル卵成熟はMosーMAPキナーゼ経路によりが誘起される。また他のMAPキナーゼの関与も示唆されているが、十分に解析されていない。第三章ではM
APキナーゼ様タンパク質であるNemo―likeキナーゼ(NLK)のツメガエル卵成熟過程への関与を調べた。その結果、以下のことが明らかになった。1）NL
Kは卵成熟過程の初期に活性化する。2）それにはMosが必要だが、MAPキナーゼは必要ではなぃ。3）NLKの強制発現はサイクリンBlmRNAのポリA鎖伸長と翻訳を促進し、卵成熟を促進する。4） NLKはPuml、Pum2、CPEBをりン酸化する。
これらの結果は、ツメガエル卵成熟過程ではM
os―MAPキナーゼ経路とは別にMos―NLK経路が存在し、NLKはPuml、Pum2、CPEBのりン酸化を介してサイクリンB1を含むmRNAの翻訳を制御することを示唆する。
以上を要するに、著者はアカガエルとアフリカツメガエルを用い、両生類卵成熟における情報伝達機構と卵母細胞に蓄積されたmRNAの翻訳開始機構を分子生物学的解析により明らかにした。これらの成果は生命科学分野における基本原理の理解に貢献するところ大なるものがある。
よって著者は、北海道大学博士（生命科学）の学位を授与される資格あるものと認める。

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