2014/10/29

回折実験でタンパク質結晶を取り扱う問題点

抗凍結剤を使用したループマウント法の特徴•簡単、実績（最も一般的に使用されている）のある手法•多くの試料に対して適応されている。

ポリマーコーティングと湿度調節を組み合わせたタンパク質結晶マウント法
JASRI/SPring‐8タンパク質結晶解析推進室
測定技術開発チーム

しかし,いくつかの試料では抗凍結条件の溶液に浸すことで環境が変わり、結晶が損傷することがある。

 回折実験を行うために、脆く、環境変化に弱いタンパク質結晶をどのように保持するか？
 放射光施設の高輝度X線による放射線損傷をいかに低減して高精度なデータを収集するか？

馬場清喜• 結晶と浸透性の抗凍結剤の間には、相性の問題がある。
>>安定条件を見つけるために多くの結晶で確認が必要。
• 室温で結晶の状態を確認する回折実験との互換性が低い。

 X‐ray scattering noise の原因となる結晶周辺の溶媒をどのように削減するか？

outline• HAG法– 背景– 実験方法
– 整備状況と運用– 実験例– 今後の計画

低温測定には抗凍結剤が必要
室温測定

湿度制御

低温測定

抗凍結剤

ループマウント××○

必要

キャピラリー○

保持○（キャピラリーは外す）

必要（低温）

湿度調整

○

○

○

必要

• BL38B1の高度化

キャピラリー
トップマウント××○

必要– 目的– 高度化の概要

接着剤によるマウント

××

○

必要

低温・室温測定の特徴• 室温HAG法

Humid Air and Glue-coating (HAG)法
実験方法の概略

これまでに開発されたマウント方法
室温測定では湿度の保持or制御が必要

× 放射線損傷が甚大
ー 質を保つ手段が必要（封入、湿度調節など）○ 結晶の質を確認できる○ 抗凍結剤の影響を受けない
× 位置の固定が困難• 低温○ 放射線損傷を低減
ー 低温吹きつけ装置が必要
× 凍結条件の検討が必要
× 凍結することで活性部位の構造が変化する報告もある○ 位置が固定されている○ 液体窒素中で安定に保存が可能• 水溶性ポリマーをループに張る• 結晶を張り付ける>> コーティングされる• 湿度を調整、結晶の質を確認• データ収集（室温or凍結）
References:
Baba et al. Acta Cryst D69, 1839‐1849 (2013). Open Access
Patent application number : 2012‐137346(JP)

HAG法で使用する水溶性ポリマーのコーティング剤• Polyvinyl alcohol (PVA):
Pol. Deg. 3,500 ‐ 4,500
with 81‐90% hydrolyzed

Mw = 41 x pol.deg.

 生体試料に対して無毒
様々な生体試料に利用されている••

A cryopreservation reagent for embryos.
The mounting media of microscopic subjects.
Microbes in PVA glue.

 濃縮されたPVA溶液は凍結時に ice ring は現れない•

PVA soln. exposed to 92% RH (relative humidity)or below is suited to cryo‐exp.
@92.0%RH12014/10/29

HAG法の使用方法 (1/4)

HAG法の使用方法 (4/4)(4) 瞬間凍結 :(1) 少量のPVA溶液をループに張る。

湿度調整ノズルを退避＆クライオノズルを戻し、瞬間凍結操作。

PVA 溶液実験結果1：抗凍結剤なしでの凍結
枯草菌由来RsbQ 結晶は、環境変化で損傷を受けやすい•PVAは結晶に浸透し難く、結晶を損ないにくい•凍結時にice ringが現れず、結晶を損傷しない従来法（抗凍結剤を添加、ループマウント）
Glycerol, Ethylene glycol, PEG400, MPD,
Trehalose and Paratone‐N…

HAG法
Resolution：1.4 Å
Mosaicity：0.3

Glue type: 13% PVA3500
Humidity: 69.1% RH

HAG法の使用方法 (2/4)

実験結果2：溶媒由来の散乱を抑制短波長でのS‐SAD法の成功例

BL38B1の整備状況と運用

高精度データ測定を実証(2)PVAを張ったループで結晶を取り出す。
コーティングされた結晶＞PVAと結晶周囲の溶媒がなじむ。
＞結晶を自然にコーティングする。

• 2014A期より共用利用を開始– ビームラインへ常設（顕微分光装置とは排他利用）
HUM‐1(リガク社製)（大流量タイプ）

制御用GUI

ビームラインBL38B1へ設置した様子• 7月22日に第1回 HAG法研修会を開催– 20グループが参加（試料持ち込み7グループ）

HAG法の使用方法 (3/4)

Lysozyme (hen egg white)・Space group
P43212・Unit cell parameters (Å) a = b = 78.876, c =36.927
・Crystal size
150 x150x 100 m3
・Wavelength
0.85 Å
・Oscillation range
720 deg.
・Oscillation angle
0.5 deg.
・Exposure time
2.0 sec (Al 100m)・Camera distance
150 mm・Measurement time 108 min
・Intensity integration HKL2000& Data scaling(DENZO + SCALEPACK)・Heavy Atom Search SHELX C/D/E& Density modification
・Model Building
ARP/wARP

実験結果3：湿度に対する結晶間の格子変化の高い再現性

実験例(3) 湿度調整ノズルを設置したゴニオメータ上に結晶を設置。
室温で最適な湿度条件を検討する。

1. 抗凍結剤なしでの凍結

3つのリゾチーム結晶の間で湿度への応答性を確認

ゴニオメータa axis (Å)

2. 溶媒由来の散乱を抑制#13. 湿度に対する結晶間の格子変化の高い再現性#24. 結晶の質の改善
湿度調整ノズル

湿度調整後の結晶c axis (Å)

mosaicity (º)
Catastrophe @68 %RH#3••

結晶の湿度応答による格子変化は高い再現性が見られた。
格子定数は湿度に対して高い相関が見られた。

2

2014/10/29

実験結果4：結晶の質の改善
Blastochloris viridis RC結晶をHAG法でマウントし、室温で結晶の質の変化を観察• 装置関連– 長時間（3‐5日）連続稼働タイプのHUM‐1を導入– 低温対応の湿度調整装置を開発– 実験ハッチ内での低温対応ハンドリングBOXを整備予定• 普及のための展開– 2014B期 11月19日 第2回目 HAG法研修会を開催予定– BL26B2へHAG法実施のためのシステムを2015年度に導入予定

Glue: 8% PVA4500 :Glycerol = 1 : 1
Humidity: 84.7% RH

ビームラインBL38B1

今後の計画

偏向電磁石光源とシンプルな光学系を組み合わせた安定性の高いビーム• 回折能の高い結晶からの高精度データ測定・迅速データ測定- ルーチンデータ測定- 遠隔実験の運用- 位相決定（SAD法等）のための高精度データ測定• 様々な手法を活用した構造研究- 顕微分光- HAG 法オンライン紫外可視顕微分光装置

Bv RC（産総研 小田原先生）

BL38B1のビーム性能

HAG法での実験の特徴
 マウント時の乾燥を防ぐ
 PVAは結晶に浸透し難く、損傷を与えにくい 湿度調整実験
 結晶周辺のPVAが濃縮される
 溶媒由来の散乱が減少する
 結晶を固定できる
 結晶の質が改善する場合がある

標準分光器

疑似トロイダルミラー

BL38B1の高度化

1.0E+11━ w87 x h142 um2━ w87 x h114 um2

 凍結操作 抗凍結剤を削減しても凍結時に氷晶を形成しない━ w87 x h81 um2

 室温・凍結両方のデータを収集可能• 低温○ 放射線損傷を低減
ー 低温吹きつけ装置が必要○ 凍結条件の検討は不要 << 凍結条件の検討が必要
× 凍結することで活性部位の構造が変化する報告もある○ 位置が固定されている○ 液体窒素中で安定に保存が可能8.0E+107.0E+10
6.0E+105.0E+10
4.0E+103.0E+102.0E+101.0E+100.7━ w87 x h53 um2

試料サイズに応じたビームサイズの選択が可能••

特徴の異なる2本のビームラインを運用
幅広いターゲットからデータ測定に対応

BL41XU

1.1

1.3

1.5

1.7

1.9

利用可能波長と強度

課題

共用ビームラインBL38B1/BL41XU
共用ビームライン
幅広いユーザー層 (国内外のアカデミックユーザー・産業界など)

0.9

波長(Å)

試料位置でのビーム形状• 室温
× 放射線損傷が甚大
ー 調湿ガスを吹きつけて質を保つ○ 結晶の質を確認できる○ 抗凍結剤の影響を受けない○ 位置を固定できる << 位置の固定が困難

9.0E+100.0E+00

 回折データ測定

HAG法使用時の低温・室温測定の特徴

回折計

BL38B1の光学系
強度(photons/sec/100mA)

 マウント操作• 解析対象の拡大– 結晶サイズが50 μm以下の微小な結晶、膜タンパク質や巨大分子など回折能の低い結晶への対応• HAG法により可能となった室温測定への対応– 放射線損傷を低減、高精度な測定- アンジュレータ光源からの高輝度ビーム- 微小結晶など低品質結晶からの回折データ測定
BL38B1- ベンディングマグネットを光源とした安定性の高いビーム- 回折能の良い試料からの迅速かつ高精度な回折データ測定

高難度試料への対応やさらなる迅速化をめざし、ビームラインの高度化やHAG法などの新規手法の開発を実施

高度化の目的測定対象拡大を目指したビームの高強度化
高精度化・迅速化を目指した新しい回折計の導入

3

2014/10/29

測定対象拡大を目指したビームの高強度化• 非対称反射を用いた分光器の開発
第一・二両方の結晶を非対称に配置する

強度が2~3倍強くなると予想される

謝辞 （敬称略）(公財)高輝度光科学研究センター
タンパク質結晶解析推進室
水野 伸宏
奥村 英夫
長谷川 和也
熊坂 崇

光源光学部門山崎 裕史
大橋 治彦(独)理化学研究所
放射光科学総合研究センター
ビームライン基盤研究部
吾郷 日出夫
上野 剛
村上 博則
山本 雅貴

独立行政法人産業技術総合研究所
小田原 孝行

制御・情報部門古川 行人
大端 通

日本酢ビ・ポバール株式会社
技術開発部
河西 将利

利用研究促進部門
福居 知樹
早賀 紀久男

松岡 敏文
木村 佳弘

株式会社 リガク
熱事業部
田中 宣弘

高精度化・迅速化を目指した
新しい回折計の導入• 回折計定盤を更新– 安定性向上のために回折計と検出器架台を分離– 試料周辺部空間を拡大 → 顕微分光・HAG法がより簡便に– ピンホールシステムによるビームサイズ可変機構の導入• 低偏芯・高速回転ゴニオメーターの導入• 高感度検出器の導入と検出機の最短距離を短縮– MX225HE (Rayonix, USA)

更新予定の回折計まとめ• SPring‐8共用ビームライン– 幅広いターゲットをカバーするため、特徴の異なる2本のビームラインを運用• BL41XU– 世界最高強度のビームを提供– 高速検出器と組み合わせ高精度・迅速測定を実現• BL38B1– 回折能の高い結晶から簡便に高精度・迅速データ測定が可能– 様々な手法を活用した構造研究が可能

4