博士 （獣 医学 ）ワ ギソ ベイ アブ ドエ ルラ ヘム アブド アラ ハダ ルウ イッ シュ

学位論文題名
Biological defense systemaga
instx
enobiotics●●1nmeat‑producin
g anlmalS（ 外来 性の 化学 物質 に対 する 食肉用動物の生体防御システム）学 位 論 文 内 容 の 要旨

有蹄 類を はじ めとする 食肉用動物は、植物由来の化学物質の他、飼料添加物、 動物用医薬 品 、環 境汚 染物 質など、 多くの外来化学物質に曝露される。しかしながら、これ らの種では 、 生体 に取 り込 まれた外 来化学物質に対する生体防御機構については知られてい ない。外来 性 化学 物質 を代 謝す る異 物代 謝酵 素に 関し て、哺乳 類では、第I相反応において シトクロムP450 (P450、CYP）、第II相 反応ではグルクロン酸転移酵素(UGT)などの抱合酵素が化学物質に 対 する 生体 防御 の主要な 機構として働いている。一方でこれらの酵素群は外来化 学物質を代 謝 的に 毒性 化す るこ とが あり 、特 にP450の 分子種の ひとつ、CYP
IA
はがん原物質 の90％以
上 の 活性 化に 関与 して いる こと が報 告さ れて いる。ま た、第I相、第II相反応には 大きな種差 が 存在 する こと も報告さ れている。そこで本研究では、食肉用動物において、シ トクロム
P450を中 心に 様々 な外 来化 学物 質を 代謝 する 生体 防御 の機 構 を明 らか にすること を目的とし た。
第1章で はウ シの 各臓 器（ 肝 臓、 乳腺 、肺 、脾臓、腎臓、心臓、筋肉、舌）に 外来化学物 質 代謝 のた めに どの よう な異 物代 謝酵 素が 発現 して いる の かを mRNAレベルで明 らかにした。C
YPIA
1様 分子 種は肝臓 を中心に殆どの臓器に発現しており、これまでP450発現 の報告がな かった舌においてもCYPlAの 比較的高い発現が認められた。C
YP
IA2、CYP
2C9、CYP2E1、CYP3A
4に 関 して は肝 臓で の発現が 検出されたが、他の哺乳類同様、それ以外の臓器では発 現レベルが 低 いか ある いは 検出限界 以下であった。興味深いことにCYP286様分子種は肝臓と 、特に肺で 高 い発 現レ ベル を示した 。グルクロン酸転移酵素の分子種のひとつUGTIA1および グルタチオ ン 転移 酵素 (GST) Alにつ いては、殆どの臓器で発現しており、これまでに報告さ れている
ラ ット やマウ スの 抱合酵 素と は異な る発 現分布 を示 すこと が分かった。
第2章で は食 肉用 動物 とし て ウシ に加 えて ウマ 及び シカ のCYPI
Aを 中心にその 酵素学的特 徴 を同 定し た。 ウシ、シ カ、ウマ、および対照動物としてのラットから肝臓ミク ロソームを 調 製し 実験 に用 いた 。CYP
IA1依存 のエ トキ シレゾル フインO脱エチル化活性(EROD)、およぴ QYP
IA2依存 のメ トキシレ ゾルフイン(MROD)について、代謝活性を測定したところ 、ウシやウ マ では 顕著 に高 いER
OD活 性を示した。特にウマ肝臓のERODは高いVmaxを示すこと から、ラッ ト 、シ カ、 ウシ に比 べて 有意 に高 い酵 素効 率Vmax/Km値を示した。またいずれの 動物種に
お い ても E
RODおよ びMRO
Dは C
YPIA依存 の代 謝活 性であることが、抗体および阻害剤 添加後のー177―

代謝活性測定実験により明らかとなった。また、Lineweaver−Burkプロットにより、ウマではCYPIAがEROD反応に主要に寄与しているが、1種類の酵素ではなく、基質親和性の高い酵素と 低 い 酵 素 の 2種 類 の 酵 素 が こ の 反 応 に 関 わ っ て い る 可 能 性 も 示 さ れ た 。
第3章ではこれらの動物種における変異原物質の代謝的活性化および解毒の機能について明らかにした。遺伝子毒性を持っべンゾ[a]ピレンはC
YPIA1によって代謝的に活性化される。そこで、ベンゾ[a]ピレンを基質として、ウシ、シカ、ウマおよぴラットの肝臓酵素画分を用いて復帰突然変異原性試験(Ames試験）を実施した。CYPI
A依存の代謝活性の高いウマ
では、Ames試験においても、他の動物種に比べてベンゾ［a]ピレンの高い代謝的活性化能を示した。しかし、Ames試験の系に補酵素（グルクロン酸およびグルタチオン）を加えるとこれらの変異原性は減少し、補酵素添加による変異原性の抑制の程度もウマで最も顕著であることが分かった。従ってウマでは、高いCYPIA依存活性によって外来化学物質を代謝的に活性化 する が、 第II相抱 合酵 素に よる 解毒 機構 も顕著 に高 いこ とが 明ら かとなった。
第4章ではウマなどでCYPIA依存の活性が高い原因を明らかにすることを目的として実験を行った。まずウマやウシ、シカおよびその対象動物としてラットの肝臓から化学物質の抽出を行い、肝臓に含まれるCYPIAを誘導する化学物質の分析を行った。CYPIAを誘導する多環芳香族類はいずれの食肉用動物の肝臓においても検出されたが、その濃度は極めて低く、またCYPIAの発現や活性との相関は認められなかった。そこで、草食性動物に蓄積が高いカロテノイド類について分析を行ったところ、各動物のCYPI
A発現およぴその代謝活性とBカロテン蓄積量が高い相関を示すことが分かった。次に各動物の肝臓から抽出したカロテノイドをラットの肝がん由来の肝細胞H4IIE細胞に曝露したところ、ウマ肝臓から抽出したカロテノイド類がmRNAレベルで最も高いCYPIA1誘導能を示した。ウマ肝臓から抽出したカロテノイド分画に曝露した細胞ではCYPIA依存の活性も高く、たんぱく質発現量も上昇した。各種動物の肝臓中のカロテノイド濃度とin vitroで曝露したH4IIE細胞のCYPIA発現量が相関を示すことから、これらの有蹄類、特にウマ肝臓で示されたCYPI
Aの高い発現や高活性はカロ
テノ イド による 誘導 が原因 のー っであ るこ とが初 めて 明らか とな った。
第5章ではエジプトで重要な食肉用動物であるラクダに関して、CYPIA1をクローニングし、その臓器の発現分布を明らかにした。興味深いことに、ラクダではウシ同様、肝臓や肺以外に舌においても顕著に高いCYPIA1発現を示した。
以上の結果から、1）様々な変異原物質やがん原物質の代謝的活性化を行うCY
IAは、ラットに比べてウマやウシで顕著にその発現や代謝活性が高い、2）これらの動物種では変異原物質の解毒の代謝経路となっている第II相反応によって、変異原物質の高い代謝的活性化能による遺伝毒性はキャンセルされている、3）CYPI
Aの発現およびその代謝活性が高いのはカロテノイド、特にロカロテンの蓄積が原因のーっであることが示唆される、4）エジプトの重要な食肉動物のーっであるラクダでも、他の有蹄類と同じく、肝臓や肺以外に、舌においても高いCYPIA発現が認められる、ことが明らかとなった。従って、本研究によって、有蹄類である食肉用動物ではP450の臓器分布の発現様式がラットなどの実験動物とは異なること、また食肉用動物の中でもウマは高いCYPIA発現および代謝活性を示し、その原因のーっが カロ テノイ ドの 高濃度 の蓄 積であ るこ とが初 めて 明らか にさ れた。

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学 位 論 文 審 査の 要 旨
主査
副査
副査
副査

教 授 石 塚真由 美
教 授 木村和 弘
教 授 坪田敏 男
准 教授 乙黒兼 一

学位論文題名
Biolo
gical defens
e systemaga
instxeno
biot
ics
● ●1
nmeat一produ
CinganlmalS（ 外来 性の 化学 物質に 対す る食肉用動物の生体防御システム）

有蹄類をはじめとする食肉用動物は多くの外来化学物質に曝露される。しかしながら、これらの種では、化学物質に対する生体防御機構にっいては知られていない。外来性
化学物質を代謝する異物代謝酵素は、第I相反応においてシトクロムP450(P450、CYP)、第II相反応ではグルクロン酸転移酵素(UGT)などの抱合酵素が化学物質に対する生体防御の主要な機構として働いている。一方でこれらの酵素群は外来化学物質を代謝的に毒性化することがあり、特にP450分子種CYPIAはがん原物質の90％以上の活性化に関与していることが報告されている。そこで本研究では、食肉用動物において、シトクロムP
450を中心に様 々な 外来 化学 物質 を代 謝す る生 体防 御の 機構を 明ら かに する こと を目 的と した 。
第1章ではウシの各臓器（肝臓、乳腺、肺、脾臓、腎臓、心臓、筋肉、舌）に外来化学物質代謝のためにどのような異物代謝酵素が発現しているのかをmRNAレベルで明らかにした。C
YPIA
1様分子種は肝臓を中心に殆どの臓器に発現しており、これまでP450発現の報告がなかった舌においてもCYPIAの比較的高い発現が認められた。U
GTIA1
およぴグルタチオン転移酵素(GST) Alにっいては、殆どの臓器で発現しており、これまでに報告されてい るラ ッ ト や マ ウ ス の 抱合 酵素 とは異 なる 発現 分布 を示す こと が分 かった 。
第2章では食肉用動物としてウシに加えてウマ及びシカのCYPIAを中心にその酵素学的特徴を同定した。ウシ、シカ、ウマ、船よび対照動物としてのラットから肝臓ミクロソームを調製し実験に用いた。CYPIA
1依存のエトキシレゾルフインO脱エチル化活性(EROD)にっいて、代謝活性を測定したところ、特にウマ肝臓では高いVmaxを示し、ラット、シカ、ウシに比べて有意に高い酵素効率Vmax/Km値を示した。またいずれの動物種においてもERODはCYPIA依存の代謝活性であることが明らかとなった。また、Linewe
aver‑Burk
プロツトにより、ウマではCYPIAがEROD反応に主要に寄与しているが、基質親和性の高い酵素と―179ー

低い 酵 素 の2種 類 の酵 素 がこ の反応に 関わっ ている可 能性も示 された 。
第 3章で は こ れら の 動 物 種に お け る変 異 原 物質 の 代 謝的 活 性 化船 よ び 解毒 の 機能 について 明らか にした。 遺伝子毒 性を持 っベンゾ［a］ピレン（B［a］P）はCYPIA1によって代謝的に 活 性化 さ れ る。 そ こ で、 B[a]Pを 基 質と し て 、ウ シ 、 シカ 、 ウ マお よ び ラッ ト の肝 臓酵
素 画 分を 用 い て復 帰 突 然変 異 原 性 試験 (Ames試 験） を 実施し た。CYPI
A依存の 代謝活 性の高い ウ マで は 、 他の 動 物 種に 比 べ て B［ a]Pの 高 い 代謝 的 活性化能 を示し た。しか し、Ames試
験 の 系に グ ル クロ ン 酸 およ び グ ル タチ オ ン を加 え る とこれ らの変 異原性は 減少し、 これらの 添加 によ る変異原性 の抑制の程 度もウマで 最も顕著で あることが 分かった。
第4章 で は有 蹄 類 のCYPIA
依 存 の 活性 が 高 い原 因 を 明らか にする ことを目 的とし て、ウマや ウ シ 、シ カ お よび そ の 対象 動 物 と して ラ ッ トの 肝 臓か ら化学物 質の抽 出を行い 、肝臓に含 ま れ るCYPI
Aを 誘 導す る 化 学 物質 の 分 析を 行 っ た。 しか し、CYPIAを誘導 する多 環芳香族類 の 蓄 積濃 度 は 極め て 低 く、 ま た CY
PIAの発 現 や 活性 と の 相関 は 認 めら れ な かっ た 。そこ で 、 草 食 性 動 物 に 蓄 積 が高 い カ ロテ ノ イ ド類 に っ いて 分 析 を行 っ た とこ ろ 、 各 動物 のC
YPIA
発 現 お よび そ の 代謝 活 性 と ロカ ロ テ ン蓄 積 量 が高 い 相 関を 示 す こと が 分 かっ た 。次に各 動 物 の肝 臓 か ら抽 出 し たカ ロ テ ノ イド を ラ ット の 肝 がん 由 来 の肝 細 胞 H
4IIE
細 胞 に曝露し た と ころ 、 ウ マ肝 臓 か ら抽 出 し た カロ テ ノ イド 類 が最 も高いCYP
IA
1誘導能を 示した 。
各 種 動 物 の 肝 臓 中 の カ ロ テノ イ ド 濃度 と む v
i troで 曝 露し た H4
IIE細 胞の CYP
IA発 現量 が
相関 を 示 すこ と か ら、 有 蹄 類CYPIAの 高 い 発現 や 高 活性 は カ ロテ ノ イ ドに よ る 誘導 が 原因のー っ で ある こ と が初 め て 明ら か と な った 。
第 5章で は エ ジプ ト で 重要 な 食 肉用 動 物 で ある ラ ク ダに 関 し て、 CYP
IA1をク ロー ニン
グ し 、そ の 臓 器の 発 現 分布 を 明 らか に し た。 興 味 深 いこと に、ラク ダでは ウシ同様 、肝臓や 肺 以外 に 舌 にお い て も顕 著 に 高い CYP
IA1発 現を 示 し た。
以 上 の 結果 か ら 、有 蹄 類 で ある 食 肉 用動 物 で はP450の 臓 器 分布 の発 現様式が ラッ卜など の 実 験 動物 と は 異な る こ と、 ま た 食肉 用 動 物 の中 で も ウマ は 高 いCYPI
A発 現 およ び 代 謝
活 性 を 示し 、 そ の原 因 の ーっ が カ ロ テノ イ ド の高 濃 度 の蓄 積 で ある ことを 初めて 明らかにし た 。 よ っ て 、 審 査 員 一 同 は 、 上 記 学 位 論 文 提 出 者 Wageh Sobhy Ab
delrahemAbda
llah
Darw
ish氏の 博 士 論文 は 、 北 海道 大 学 大学 院 獣 医学 研 究 科規 程 第 6条 によ る本研究 科の行う
博 士 論 文の 審 査 等に 合 格 と認 め た 。

― 180ー