博士（医学）市山廣樹
Inhibition of Joint Inflammation andDestruction Induced by anti‑type n Collagen
Antibody‑induced Art
hritis in Mi
ce due to De
letion ofMacrophage Migration Inhibitory Factor (X/IIF)
マ クロ フ ァー ジ 遊走阻止 因子欠損モ デルマウス における抗II型コ ラーゲン抗体誘導関節炎の炎症と破壊の抑制機序

学 位論文内容の要旨【はじめに】
関 節 リウマチ （以下 RA)
をは じめと する関節 炎では、 TNF‑aを はじめと する種 々の炎症性液性因子の関与が明らかとなっている。そのため、近年、関節炎に対し、これら炎症性液性因子を標的とする治療の開発がすすめられている。マクロファージ遊走阻止因子（以下MIF)
は、遅延型アレルギー反応に関与する液性因子として発見され、主にマクロファージの 機 能 を活 性 化 する 免 疫 機能 を 有する と考えら れてき た。その 後、1989
年 にヒトMIFcD
N
A、がクローニングされて以来、・免疫応答のみならず、炎症をはじめとする種々の病態に関与することが明らかになってきた。（グルココルチコイドの抗炎症作用を抑制し炎症を惹 起するこ と、Tリンパ 球の活性 化に必須な因子である）。我々は本M
I
FがRA患者の関節液 中 にMIFが 高濃度 に存在す ること ，さらに R
A滑膜細 胞には正 常滑膜細 胞に比 べてMI
Fに よるMM
P転写′ 発現の促 進作用 が高いこ とを報告 してき た。しかし，RA発症におけるMIFの意義 はいまだ不明であった。本研究の目的はカクテル誘発関節炎モデルを用いて関節 炎 発 症 に お け る MIFの 意 義 を in vivoに お い て 検 討 す る こ と で あ る 。
【材料および方法】
実験動 物とし ては6週齢のBalb/cw
ildtype
雄マウスおよび同M[Fknock‑outマウスを使用した 。これ ら動物を 無処置の wndtype
群 、抗MIF抗体を 腹腔内投 与した 抗体投与 群、
knoc
k．out
群の3群に分け、以下の関節炎誘発操作を行った。関節炎誘発操作は抗I型コラーゲン 抗体カクテルを2mg
尾静脈注射した後、4日後にりポポリサッカライド（以下LPS）を50
嵋腹 空内投 与し行な ぃ、カ クテル投与後14日で関節炎の判定を行った。なお、抗体投与群 はカク テル投与 の2日 前より 2
日毎 に抗MIFポリク ローナル抗体200斗gを腹腔内投与した 。関節炎の判定には四肢の4足関節をHE染色によるhi8topath010glica亅scoreを用い評価 した。H
i8topathologica18core
は、滑膜が正常なものを0点、滑膜の軽度肥厚を認― 46ーめるも のを1点、滑 膜の高 度な肥厚 を認める ものを 2点、パンヌス形成を認めるものを3点とし、四肢で合計12点として評価した。また、MI
F発現の検討を目的として、免疫染包
ならび にRT‑PCRを行 った。
【結果】
肉眼的 観察ではカクテル投与後、14日において、少なくとも1関節以上に腫脹が認められた マ ウ ス は 、 wdd type群 9匹 中 8匹 、 抗 体 投 与 群 9匹 中 5匹 、knock‑ou
t群 9匹中 4匹であった。H
istopathologicalscoreに関してはwildt
ype群では平均7.
9点であったのに対し、抗体投与群3.
1点、knock‑out群2.2点と、wil[dtype群は抗体投与群およびknock‑out群に比 し、有意 に高いscoreであ った。wddtype群の関節炎を発症した足関節の組織像では滑膜 は肥厚し、滑膜細胞が増殖し、パンヌス形成による骨破壊も認められた。MIFに対する免 疫染色では滑膜に増殖した滑膜細胞にMIF発現を認めた。肝P（mによる検討では、
w
ndtype群 で 関節 炎 発 症の 足 関 節滑 膜 で は正 常 足 関節 滑膜 に比しMIFmRN
A発現 が亢進していた。
【考察】
本研究では受動的コラーゲン関節炎モデルであるカクテル誘発関節炎モデルにおける滑膜細 胞に タ ン パク レ ベ ル およ びmRNAレベ ルでMIF発現が 亢進す ることを 明らかに した。
MIFは 種々のス卜レスにより分泌されたグルココルチコイドにより産生が亢進し、この産生亢進 したMI
Fが炎症 のイニ シエータ ーとし てT
NF‑ロなど の炎症性サイトカインを誘導するこ とが知 られてい る。し たがって 、RAなど の関節炎 においてもM
IFは炎症イニシエーター として発現している可能性が考えられた。また、抗体投与によるMIFの中和あるいはknoc
k‑out mouseによ るM
IFの 欠損はカクテル誘発による関節炎ならび関節破壊を抑止した。 我々は 過去にMI
FはAP‑1を 介してMMPの転 写魘現を 亢進さ せること を報告 した。
したが って、MIFのプロテアーゼ産生亢進作用を阻止することで関節炎を抑止した可能性が考え られた 。臨床と の関連 では、前 述のよ うにMI
Fは炎症性疾患においてTN
F．Qより上流に 位置する炎症イニシエーターと考えられている。したがって、MIFを標的とした治療戦略は抗TNF‐ぱ抗体より効果的な治療効果を得ることが期待でき，今後、その治療法の確立が 期待される。カクテル誘発関節炎モデルを用いて関節炎発症におけるMIFの意義を
i11vivoにおいて検討した。その結果、カクテル誘発関節炎モデルにおける滑膜細胞ではタンパク レベル およびmRNAレベルで M
IF発現 が亢進 していた 。また 、抗体投 与によ るM
IFの中和 あるい はknock￣out
mou8eによるMIFの欠損はカクテル誘発による関節炎ならび関節破壊を抑止した。

ー 47ー

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 岩 永 敏 彦
副 査 教 授 三 浪 明 男
副 査 教 授 安 田 和 則

Inhibitiono
fJointInfla
mmationand
Destruction Inducedby anti‑type n CollagenAntibody‑inducedArthritisinM
icedu
etoDe
letionofrvIacrophage MigrationInhibitoryFactor(MIF)
マクロファージ遊走阻止因子欠損モデルマウスにおける抗H型コラーゲン抗体誘導関節炎の炎症と破壊の抑制機序

マク口ファージ遊走阻止因子（以下MIF)
は、遅延型アレルギー反応に関与する液性因子として発見されたが、その後の研究で免疫応答のみならず、炎症をはじめとする種々の病態に関 与するこ とが明 らかにな ってき た。申請者のグループは関節リウマチ(RA)患者の関節液 中にMIFが高濃 度に存在 するこ と，さらにRA滑膜細胞には正常滑膜細胞に比ぺてM
IFによ るMMP
転 写/発現の促進作用が高いことを報告してきた。しかし，RA発症におけるMIFの意義はいまだ不明であった。申請者の研究の目的はカクテル誘発関節炎モデルを用いて
関 節 炎 発 症 に お け る MIFの 意 義 を in vivoに お い て 検 討 す る こ と で あ っ た 。
実験 動物とし ては6週齢のBalb/cw
ildt
ype
雄マウスおよび同M
IFknockーoutマウスを使用した。これら動物を無処置のw
ildtype群、抗MIF抗体を腹腔内投与した抗体投与群、knock−out群 の3群に分け、以下の関節炎誘発操作を行った。関節炎誘発操作は抗II型コラーゲン抗体カクテルを2mg尾静脈注射した後、4日後にりポポリサッカライド（以下LPS)を50
鱈 腹空内投 与し、 カクテル 投与後 14日で関節炎の判定を行った。なお、抗体投与群はカ クテル投 与の2日前よ り2日 毎に抗 MIFポリク口ーナル抗体200鱈を腹腔内投与した。
関節 炎の判定 には四肢の4足関節をHE染色によるhist
opathologicalscoreを用い評価した。H
istopathologicalscore
は、滑膜が正常なものを0点、滑膜の軽度肥厚を認めるものを1点、滑 膜の高 度肥厚を 認めるも のを2点、パ ンヌス 形成を認 めるものを3点とし、四肢で 合計12点と して評価した。足関節滑膜におけるMIF発現は免疫組織染色ならびに半定量RT―PCRで検 討した。またmRNAレベルでのmatrixmetalloproteinase(MMP)―13およびmacrophage inflammatory protein (MIP)‑2の 発 現 を半 定 量 R
Tー PCRで 評 価 した 。
‑ 48―

結果：肉 眼的観察ではカクテル投与後、14日において、少なくとも1関節以上に腫脹が認 め ら れ たマウス は、wild type群9匹中8匹、抗 体投与群 9匹 中5匹 、knock―out
群9匹中4匹 であった 。Histopatholog
icalscoreに関してはwildt
ype
群では平均7．9点であったのに対し、抗体投与群3.
1点、knoc
k―out群2．2点と、wifdtype
群は抗体投与群およびknock―out群に比し、有意に高いscoreであった。wildtype群の関節炎を発症した足関節の組織像では滑膜は肥厚し、滑膜細胞が増殖し、パンヌス形成による骨破壊も認められた。
MIFに対 する免疫 染色では滑膜に増殖した滑膜細胞にMIF発現を認めた。RT―PCRによる検討 では、 w
ild type群で関節炎発症の足関節滑膜では正常足関節滑膜に比しMIFm
RNA発現が 亢進し ていた。 w
ildtype群では足関節滑膜にMIF、MMP―13およびMIP−2の発現亢進を認めたが、他の群ではこれらの発現が著しく抑制されていた。
本研究は受動的コラーゲン関節炎モデルであるカクテル誘発関節炎モデルにおける滑膜細 胞にタ ンパクレ ベルお よびmRNAレベ ルでMIF発現が亢進することを明らかにした。M
IFは種々のストレスにより分泌されたグルココルチコイドにより産生が亢進し、この産生亢進 したMI
Fが炎症 のイこ シェータ ーとし てTNF‑aなどの炎症性サイトカインを誘導すること が知ら れている 。したがって、RAなどの関節炎においてもMIFは炎症イニシエーターとして発現している可能性が考えられた。また、抗体投与によるMI
Fの中和あるいはknock―outmouseによるMIFの欠損はカクテル誘発による関節炎ならび関節破壊を抑止した。申請らは過 去にMI
FはAP‑1を 介してMMPの転写 /発 現を亢進 させる ことを報 告した。したがって、MIFのプロテアーゼ産生亢進作用を阻止することで関節炎を抑止した可能性が考えられた。
臨 床との 関連では 、前述 のように M
IFは 炎症性疾患においてTN
F‑aより上流に位置する炎症 イニシ エーター と考え られてい る。し たがって、MIFを標的とした治療戦略は抗TNF‑Q抗体より効果的な治療効果を得ることが期待でき，今後、その治療法の確立が期待される。
口頭発表の後、副査の三浪教授より本モデルを選んだ理由や妥当性などについて、安田教授より本結果の臨床応用への戦略と問題点などについて、また主査の岩永教授より滑膜に 存在す る種々の 細胞内におけるMIFの局在および抗TN
Fa抗体投与との比較などについて質問があったが、申請者は自己の研究結果と文献的考察に基づいて概ね妥当な回答を行った。
本研究は 、MIFがR
Aモデルにおける炎症の発生と関節破壊の機序において重要な役割を
果 たすこ とを示し 、またMIFがRAの治療における標的となりうる可能性を示した。審査員
一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。

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