博 士 （ 獣 医 学） 田 崎 隆 史

学位論文 題名
イヌ Cytochrome P450 2D15の分子
生 物学的手 法を用い た機能解析
学位論文内容の要旨

本 研究では、 肝臓での薬物代謝において重要なCYP2D分子種に着目し、実験動物として 重要である にもかかわらず、情報の少ないイヌCY
P2D分子種の機能解析を目的とした 。ま ず、 イヌ CY
P2D分子 種cDNAを 単離 し、 塩基 配 列、 アミノ酸配列を完全に決定し た。 他動 物種 のCYP2D分 子種 と比 較し たと ころ 60％以 上の相同性があり、また保存 配列 も確 認さ れた 。 した がっ て、 単離 した c
DNAはCYP2D分子種であると同定され、CYP2D15と命名された。また、ウシや霊長類（ヒト、サル）のCYP
2D分子種とは約75％の相同性、齧歯類（モルモット、ラッ卜、マウス）とは70％以下の相同性で、動物種 間 で ば ら っ き があ り 、薬 物代 謝活 性に も違 いが ある こと が予 想さ れた。
そ こで 、イ ヌCYP2D15 c
DNAからバキュロ ウイルス発現系を用いて発現蛋白を作成した 。発現蛋白 は、イヌCYP
2D15に特異的な ぺプチド抗体を用いたW
estern blot
解析によ って、イヌ 肝ミクロソーム中のC
YP
2D15と同一であることが示唆された。また、スペクトル解析による定量で、薬物代謝 を測定するために十分な量のP450が発現され
てい ることがわ かった。次にC
YP
2D
分子種の 典型的な基質である、ブ二卜口口ールとイ ミ プラ ミン を用 いて 、発 現 C
YP2D15の薬 物代 謝活 性を 測 定し た。 CYP2DJ5発現 蛋
白は 高いブニト 口口ール4位水酸化およびイ ミプラミン2位水酸化活性を 持ち、CYP
2D分 子 種と して ラッ 卜や ヒト の C
YP2D分 子種 と同 じ性 質を 示 した が、 イヌ C
YP2D15はイミ プラミンN脱メチル化活性もよく触媒す る点で、ユニークな基質特異性を有していた 。キ ニン によ る代 謝 阻害 実験 によ り、 イヌ 肝ミ クロ ソーム中で、 イヌCYP
2D15がブ ニト 口口 一ル およ び イミ プラミンの水 酸化活性の主酵素であることが示唆された 。 また 、イ ミプ ラミ ンN脱 メチ ル化 活性 も部 分的 に肝 ミ ク口 ソー ム中 でCYP2D15が関与していることが考えられた。
ヒ ト、ラット のC
YP
2D
分子種は、肝ミク□ ソーム中の含有量が少ないことが知られ
てい るが 、Sakamoto
ら は 、イ ヌCYP
2D15は 含有 量が 多 い分 子種であると報告した。
そ こ で、 作成 した CY
P2D1
5発 現蛋 白を 用い て、 イヌ 肝ミ ク 口ソ ーム 中の C
YP2D15の含有量を検討したが、非常に少ないこと が推察された。
次に、CYP2D】5発現蛋白を用いてイヌ 、ラット、ヒトの間で種差が存在することが知られているプ口プラノ口一ル(PL)代謝 、デブリソキン代謝を調べた。これまで報告されているように、イヌ肝ミクロソーム では、PL4位水酸化(4‑OH)、5位水酸化(5‑OH)ー936―に関し て、ヒト肝ミク口ソームとは逆の立体選択性を示した。また、ラット肝ミク口ソーム におい て主要な 代謝物 である7位水酸化体は全くみられなかった。このような
イヌ肝 ミクロ ソームの ユニー クなPLの部位および立体選択性は、C｀Y
P2D15発現蛋白でも同 様にみ られた。 また、 CYP
2D15に特異的なぺプチド抗体によって、イヌ肝ミクロソー ムの4―、5―OH活性は強く阻害された。したがって、イヌ肝ミク口ソームによる ブ口 ブラ ノロー ル4‑.5‑OHの部 位および 立体選 択性には 、イヌ C
YP
2D15が大 きく
関 わっ て い るこ と が 示 され た 。 また、 C
YP
2D15発 現蛋白は 高いPL
N脱イソ プ口ピル化（DIP)活性を持 っが、 C
YP
2Dl5
特異 的なべブチド抗体によって、イヌ肝ミクロソームでの PLDIP活性は 阻害さ れなかっ た。し たがって 、イヌ肝 ミク口ソームによるPLDIPは ，他の 分子種に よって 触媒され ている と考えら れた。
デブ リソキン はヒトCYP2D6の遺伝的 多形性 を示す代 表的な 基質であるが、イヌ肝ミ ク□ ソー ムでは 低基質濃 度でデ ブリソキ ン4位 水酸化 活性は検 出され なかった 。
CYP2D15発現蛋白 でもデ ブリソキ ン4位 水酸化 活性は、 顕著に 低かった。高基質濃度におい ても、 CYP
2D15発 現蛋白は イヌ肝ミク口ソームに比べてそれほど高い活性を示さなか った。 したがっ て、イ ヌ肝ミク口ソームの低デブリソキン4位水酸化活性は、
イ ヌCYP2D15の デブ リ ソ キン 4位 水酸化 活性が 顕著に低 いためで あるこ とが示さ れた。
最後 に、生体 内物質と してテ ストステ 口ンの 代謝をラ ットCY
P2DI、CYP
2D2、ヒトCY
P2D6、 イヌCYP2D15で測 定した。 その結果 、それ ぞれの分 子種は 異なる代 謝部位特 異性 を示 した。 ヒトCY
P2D6はテス 卜ステ口 ンの6p位 水酸化お よび17位 酸化、イヌC
YP2D15は 17
位 酸 化 のみ で 顕 著な 活性を示 した。 一方イヌ C
YP2D15
同 様、高い ブ
ニト口 口ール4位水酸化活性を持つラット（ニYP
2D2は全ての部位でほとんど活性がみられな かった 。しかし 、ブニ ト口口ール4位水酸化活性を持たないラットC
Y
P2D1は、7a位水 酸化にお いて顕著 な活性 を示した 。
以 上の こ と から 、 イ ヌ C
YP2D15の 発現蛋白 を用い ることに よって 、イヌCY
P2
D15の基本的 な性質 が本研究 で明ら かになった。本研究の知見は、CYP2D
分子種に関する動物種差 を考え る上で有 効な指 標を与え るであ ろう。

― 937―

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

藤田中里
渡邊升田正一幸和
智正
真木彦

学位 論文 題名
イ ヌ Cytochrome P450 2D15の 分 子
生物学的手法を用いた機能解析

ヒ ト薬物代 謝酵素 P
450の一分子 種、cytochrome P4
50 2D (CYP2D)は多く の医薬 品の代謝に関与している。医薬品を創製するためには、動物からヒトヘの外挿を考慮しなければならないが、実験動物とし て重要な イヌの C
YP
2Dに関 する情 報は少な い。そこ で、田 崎君はイ ヌCY
P2D分子種の 機能解析を目的 と し た。 ま ず 、イヌCY
P2D
分子 種cDNAを単 離し、塩 基配列、 アミノ 酸配列を 完全に 決定した 。他のCYP
2D分子 種との 相同性は 、動物 種間でば らっきが あり、 薬物代謝活性にも違いがあることが予想された。
次 にイヌCY
P2D15 cDN
Aからパ キュロウ イルス発 現系を 用いて発 現蛋白 を作成し 、この発現蛋白を使 って様々 な薬物 代謝活性 を調べた 。CY
P2D15発現蛋 白は高い ブニト口 口ール 4位水 酸化およびイミプ ラ ミ ン2位 水 酸化 活 性 を持 ち 、 C
YP2D
分 子 種 と して ラ ッ トや ヒ ト のCYP
2D
分子 種と同 じ性質を 示
し たが、イ ヌC
YP2
D15はイミプ ラミン N
脱メ チル化活 性もよ く触媒す る点で 、ユニー クな基質特異性を有していた。
次 に、CYP2D15発現蛋 白を用い てイヌ 、ラット 、ヒト の間で種差が存在することが知られているプロ プラノ口 ール(PL)代謝、デブリソキン代謝を調べた。これまで報告されているようI
こ、イヌ肝ミクロ ソームで は、PL4位水酸 化(4‑OH)、5位水酸化（5−OH)に関して、ヒト肝ミク口ソームとは逆の立体選 択性を示 した。 また、ラ ット肝ミ クロソ ームにお いて主 要な代謝物である7位水酸化体は全くみられ な か った 。 こ のような イヌ肝 ミク口ソ ームの ユニーク なP
Lの部 位および 立体選択 性は、 C
YP
2D15発 現 蛋 白で も 同 様にみら れた。 CYP
2D15に特 異的な べプチド 抗体に よって、 イヌ肝 ミクロソ ームの4―、5―OH
活性 は強く 阻害され た。したがって、イヌ肝ミクロソームによるPL4‑、5‑OHの部位および立 体 選 択性 に は 、イヌCY
P2D15が大 きく関わ ってい ることが 示され た。デブ リソキ ンはヒト C
YP2D6の 遺伝的多 形性を 示す代表 的な基質 である が、イヌ 肝ミク 口ソームでは低基質濃度でデプリソキン4― 938―

位水 酸化 活性 は検 出さ れな かっ た。CYP
2D15発現蛋白でもデブリソ キン4位水酸化活性は、顕著 に低かっ た。し たがって、イヌ肝ミクロソームでデブリソキン4位水酸化活性が低いのは、この反応 におけるC
YP
2D15の触媒活 性が顕著に低いためであることが示された。
以 上のよ うに、田崎君は、バキュ口ウイルス発現系によるイヌCYP
2D15の発現蛋白を用いるこ とによっ て、 イヌ CY
P2D15の 基本 的な 性質を本研究で明らかにした。本 研究の知見は、今後C￣YP
2D分子種に関する動物種差を考える上で有用となると考えられる。よって、審査員一同は田崎君が博士（獣医学）の学位を受けるのに十分な資格を有するもの と判断した。

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