(57)【要約】【課題】

アポトーシス誘導性の細胞増殖阻害物質を含有する植物を発見し、このものから得られる細胞増殖阻害物質を有効成分とするアポトーシス誘導性細胞増殖阻害剤を提供する。
【解決手段】

マメ科アズキの種子を熱水に浸漬し、この熱水をポリスチレンゲルと混合した後、このポリスチレンゲルに吸着した成分をエタノールで溶出させる。その際、エタノールの溶出工程は、３５〜４５重量％濃度のエタノール水溶液でポリスチレンゲルを洗浄する工程と、その後で５５〜８０重量％濃度のエタノール水溶液で溶出した成分を抽出する工程から構成する。抽出された成分を有効成分として含有するアポトーシス誘導性細胞増殖抑制剤とする。

(2)特開２００１−１５１６８７12【特許請求の範囲】

る。

【請求項１】

マメ科アズキの種子から水およびエタノ【０００７】また、アポトーシス誘導性の癌細胞増殖抑ールを溶媒として抽出された成分を有効成分として含有制の効果は、細胞を既存の制癌剤や放射線などで壊死さするアポトーシス誘導性癌細胞増殖抑制剤。

せる場合とは異なり、患部周囲の正常細胞にダメージを【請求項２】

与えることなく、細胞の制御作用の異常を抑制できるの

マメ科アズキの種子を熱水に浸漬し、この熱水をポリスチレンゲルと混合した後、このポリスチで、副作用を防止できる効果がある。

レンゲルに吸着した成分をエタノールで溶出させること【０００８】アポトーシス誘導性の癌細胞増殖阻害の開により、液状成分を抽出することからなるアポトーシス

示に関する刊行物としては、平成１１年特許第２９６７
１９０号公報に、ソバ種子由来の蛋白質分解酵素阻害剤

誘導性癌細胞増殖抑制物質の抽出方法。
【請求項３】

エタノールの溶出工程が、３５〜４５重10であるＢＷＩ−３が、白血病に代表される血液癌由来の量％濃度のエタノール水溶液でポリスチレンゲルを洗浄株化細胞に対してアポトーシスを誘導することが記載さする工程と、その後に５５〜８０重量％濃度のエタノーれている。

ル水溶液で溶出した成分を抽出する工程からなる請求項【０００９】

２に記載のアポトーシス誘導性癌細胞増殖抑制物質の抽【発明が解決しようとする課題】しかし、これまでに発出方法。

見された植物由来のアポトーシス誘導性の癌細胞増殖阻【発明の詳細な説明】

害物質は、上記したソバ種子由来のＢＷＩ−３のように【０００１】

極めて限られた植物種から得られるものであり、確実に【発明の属する技術分野】この発明は、アポトーシス誘作用するアポトーシス誘導性物質をより多くの生物から導に基づいて細胞の増殖を抑制する作用のあるアポトー発見し、これを癌細胞増殖阻害剤として適用することがシス誘導性癌細胞増殖抑制剤およびアポトーシス誘導性20課題であった。

癌細胞増殖抑制物質の抽出方法に関する。

【００１０】また、ヒトなどに対して処方される植物由【０００２】

来のアポトーシス誘導性癌細胞増殖阻害物質を含む薬剤【従来の技術】アポトーシスは、生物個体発生におけるは、その効能が処方部位や個人差によって変わる可能性組織や臓器の形成、生体の恒常性の維持と防御に重要ながあるため、より多くの植物種等から抽出された多種類働きをしているだけでなく、多くの病気の発生に深い関の有効成分を開発するべきものである。

係があることが解明されつつある。

【００１１】そこで、この発明の課題は、上記した問題【０００３】また、アポトーシスは、プログラム細胞死点を解決して、新たにアポトーシス誘導性の癌細胞増殖とも呼ばれるように、これを細胞形態学的に見ると、先阻害物質を含有する植物を発見し、このものから得られる癌細胞増殖阻害物質を有効成分とするアポトーシス誘ず核の凝縮が起こり、次いで細胞縮小、空洞化と細胞表面の平滑化、細胞間間隙の拡大、周囲からの細胞の遊30導性癌細胞増殖阻害剤を提供することである。

離、細胞の断片化（アポトーシス小体）、マクロファー【００１２】

ジなどによる貧食が起こる。なお、生化学的には、アポ【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた

トーシス誘導が起こると、先ずＤＮＡ分解酵素が活性化

め、この発明においては、マメ科アズキの種子から水おされて、ヌクレオソームごとにＤＮＡが断片化される。

よびエタノールを溶媒として抽出された成分を有効成分【０００４】そのため、アポトーシスによって細胞死がとして含有するアポトーシス誘導性癌細胞増殖抑制剤と起こった事実は、断片化されたＤＮＡが電気泳動によっしたのである。てＤＮＡラダー（はしご状態）として観察できるように【００１３】上記した抽出成分を有効成分とするアポトなることで確認できる。

ーシス誘導性癌細胞増殖抑制剤は、後述の実験結果から【０００５】なお、アポトーシスによる細胞の制御作用も明らかなように、これを癌細胞や悪性腫瘍細胞のようの異常は、癌形成のひとつの原因であると考えられてお40な異常に活発に増殖する病態細胞に接触させることにより、本来は死滅すべき細胞が、アポトーシスを起こすこってＤＮＡの断片化を起こし、癌細胞の増殖を阻害してとなく生き残ることにより、その細胞が様々な刺激を受細胞核の凝縮および細胞の縮小を起こし、すなわちアポけて染色体上に変異を重ね、最終的には癌細胞になるとトーシス誘導性の癌細胞増殖抑制作用がある。

いわれている。

【００１４】なお、アポトーシス誘導性は、細胞分裂の【０００６】このように癌細胞は、アポトーシスの耐性速度が異常に速い特異的な病変細胞に対して顕著な細胞機構を獲得して初めて増殖を可能としている。このこと増殖抑制を示す性質であるが、正常細胞においては、細から、種々の遺伝子変異を伴う細胞の癌化の過程は、ア胞分裂の速度が病変細胞に比べて著しく遅いので、アポポトーシスに対する耐性獲得の過程とも関係しており、トーシス誘導性癌細胞増殖抑制剤の影響による弊害は殆どないと考えられる。

逆にいえば、特定の細胞に対して積極的にアポトーシスを誘導することができれば、その細胞の癌化を防止でき

50【００１５】また、前記した課題を解決するためのアポ(3)特開２００１−１５１６８７34

トーシス誘導性癌細胞増殖抑制剤の有効成分を確実に製【００２２】合成吸着剤の具体例としては、ポリスチレ造するために、マメ科アズキの種子を熱水に浸漬し、こンゲルからなる三菱化学社製のＤＡＩＡＩＯＮの熱水を冷却後、ポリスチレンゲルと混合した後、このリーズ、特にＨＰ−２０などが適当である。この合成吸ポリスチレンゲルに吸着した成分をエタノールで溶出さ着剤は、マクロポアーを有する不溶性の三次元架橋構造せることにより、液状成分を抽出することからなるアポポリマーからなるものであって、イオン交換基のようなトーシス誘導性癌細胞増殖抑制物質の抽出方法を採用し官能基は有していないが、ファンデルワールス力によたのである。

り、種々の有機物を吸着する。そして、吸着した有機物【００１６】この抽出方法では、マメ科アズキの種子のは、種々の有機溶媒または酸、アルカリによって溶離することができる。

熱水抽出物がポリスチレンゲルに効率よく吸着され、これをエタノール水溶液で溶出した成分として回収するこ

ＨＰシ

10

【００２３】因みに、三菱化学社製の合成吸着剤であるとにより、アポトーシス誘導性のある癌細胞増殖抑制物

ＤＡＩＡＩＯＮ質を効率よく採取することができる。

面積５１１（ｍ２ ／ｇ）、水銀圧入法による細孔容積【００１７】また、上記の抽出方法において、エタノー

１．１８（ｍｌ／ｇ）、窒素吸着法による細孔容積１．

ルの溶出工程が、３５〜４５重量％濃度（好ましくは４３０（ｍｌ／ｇ）、溶媒膨潤比は、メタノールで１．３０重量％濃度）のエタノール水溶液でポリスチレンゲル

１、水で１．００、セファロスポリン−Ｃ吸着量は、３を洗浄する工程と、その後に５５〜８０重量％濃度（好８ｇ／ｌという物性のものである。

ましくは６０重量％濃度）のエタノール水溶液で溶出し【００２４】そして、この発明では、ポリスチレンゲルた成分を抽出する工程からなるようにすれば、アポトーに吸着した成分をエタノールで溶出させるが、その際、シス誘導性癌細胞増殖抑制剤の有効成分をより確実に製

約４０重量％濃度のエタノール水溶液でポリスチレンゲ造できる。

20

ＨＰ−２０は、水分５６．５％、比表

ルを洗浄する工程と、その後で約６０重量％濃度のエタ【００１８】そして、約４０重量％濃度のエタノール水ノール水溶液で溶出した成分を抽出する工程からなる工溶液でポリスチレンゲルを洗浄する工程において、ポリ程を採用することが好ましい。

スチレン吸着成分のうち、アポトーシス誘導性癌細胞増【００２５】このようにアポトーシス誘導性癌細胞増殖殖抑制物質が含まれている確率が低い濃度のエタノール抑制物質は、マメ科アズキの種子を熱水に浸漬し、この水溶液を除去し、その後、多くのアポトーシス誘導性癌熱水（いわゆる煮汁）を遠心分離して上清を得て、この細胞増殖抑制物質が含まれていると考えられる成分を約上清に含有されている機質成分をポリスチレンゲルに吸６０重量％濃度のエタノール水溶液で溶出させることに着させ、これを充填したカラムに所定濃度のエタノールより可及的に高濃度のものを効率よく回収できる。

を導入して溶出した成分（フラクション）を濃縮して得られる。なお、このような基本的な製造工程には、適宜【００１９】【発明の実施の形態】この発明に用いるアズキ（小豆）の種子は、マメ科のアズキ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ30に溶媒を加える希釈や濾過、または滅菌処理を加えることができる。

ａｎｇｕｌａｒｉｓ）の子実であって、通常、食品として入【００２６】このようにして得られたアズキの煮汁中の手できる生または乾燥して保存性を高めたものである。

所定成分を有効成分として含有するアポトーシス誘導性

因みに、アズキの種子は、ダイズに比べてタンパク質お癌細胞増殖抑制剤は、必要に応じて賦形剤、甘味料やビよび脂肪が少なく、可溶無窒素物に富んでいる。その組タミン類その他の副次的材料を添加し、例えば、カプセ成（重量％）は、水分１２．７、粗タンパク質２２．０

ルや錠剤、シロップ状に調製し、主として経口的に摂取

１、粗脂肪０．４０、無窒素物５５．３９、粗繊維６．

される形態が好ましい。

４４、灰分３．０６というのが平均的なものである。

【００２７】特に、この発明のアポトーシス誘導性癌細【００２０】このようなアズキの種子から所期した成分

胞増殖抑制剤は、飲料に添加してもよく、例えばスポーを抽出するには、水およびエタノールを溶媒として抽出

40

ツドリンクやお茶のように日常的に摂取したり、その他する。すなわち、水およびエタノールを溶媒として抽出の多くの食品に添加し、健康食品または特定保健用食品する際には、好ましくは熱水抽出物をポリスチレンゲルとして提供することもできる。また、この発明では、食に接触させ、ポリスチレンゲルに吸着した成分をエチル品製造工程で副生する小豆煮汁を無駄にすることなく、アルコールで溶出させる。

有効利用を計ることができる。

【００２１】好ましい抽出工程としては、まず、マメ科【００２８】

アズキの種子を例えば８０〜１００℃程度の熱水（加熱【実施例および比較例】〔実施例１〕アズキ（種子）のされた水蒸気であってもよい。）に浸漬し、この熱水を煮汁（１００℃の熱水中で２時間加熱したアズキ）１ｋ

三次元架橋構造の多孔質ポリマーからなる合成吸着剤とｇ（約１リットル）を遠心分離機で９０００回転、１０分、４℃の条件で遠心分離し、上澄みの液体を分取し混合し、抽出対象物を含む有機物を合成吸着剤に吸着させる。

50た。

(4)

特開２００１−１５１６８７56【００２９】この液体をポリスチレンゲルからなる合成（４）

実施例の５０％エタノール溶液

１ｍｇ／ｍｌ

吸着剤（三菱化学社製：ＤＡＩＡＩＯＮ（５）

実施例の５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ

３００ｍｌと混合し、１２時間、４℃で攪拌混合した（６）

実施例の５０％エタノール溶液

３ｍｇ／ｍｌ後、傾斜法によって上澄みを廃棄した。有機物が付着し図１の結果からも明らかなように、エタノールを添加した合成吸着剤は、水５００ｍｌで３回洗浄し、これをカてヒト胃癌細胞を培養したもの（１）〜（３）では、電ラムに充填し、先ず４０％濃度のエタノールを１．５リ

気泳動によってＤＮＡバンドが分散せず、ＤＮＡが断片ットル通過させ、このエタノールを廃棄した後、次に６化されておらず、すなわち、アポトーシス誘導による癌０％濃度のエタノールを１．０リットル導入し、カラム細胞の増殖抑制が起こっていないことがわかる。

ＨＰ−２０）【００３６】これに対して、実施例の小豆煮汁エタノーを通過した液を小豆煮汁エタノール抽出物（実施例）として採取した。なお、その後のカラムは８５％濃度エタ10ル抽出物を添加してヒト胃癌細胞を培養したもの（４）ノール０．５リットルで洗浄した。

〜（６）では、電気泳動によってＤＮＡバンドが分散【００３０】得られた小豆煮汁エタノール抽出物の実施し、ＤＮＡが断片化され、アポトーシス誘導による癌細例のアポトーシス誘導性および癌細胞の増殖抑制性を調胞の増殖抑制が起こっていることがわかる。

べるために以下の実験を行なった。

【００３７】＜実験２＞ヒト胃癌細胞を１０容量％牛胎【００３１】＜実験１＞ヒト胃癌細胞を１０容量％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ培地で培養した。５×１０５ 個／ｍ児血清含有ＲＰＭＩ培地で培養した。５×１０５ 個／ｍｌの密度になるようにヒト胃癌細胞を調整した８つの培ｌの密度になるようにヒト胃癌細胞を調整した６つの培養液のうち、３つの培養液に対して実施例の小豆煮汁エ養液のうち、３つに対して、実施例の小豆煮汁エタノー

タノール抽出物の５０％エタノール溶液を最終濃度が２ル抽出物の５０％エタノール溶液を最終濃度が１ｍｇ／ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、また他の３つの培養液ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌまたは３ｍｇ／ｍｌとなるように添20に対しても大豆サポニン（和光純薬社製）の５０％エタ加し、３７℃、９５〜５％ＣＯ２ の条件下で３日間培養ノール溶液を最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。また、対照群として他の３つの試料液に対し、５して、３７℃、９５〜５％ＣＯ２ の条件下で１〜３日間０％エタノール溶液を２０μｌ、４０μｌまたは６０μ培養した。また、対照群として前記培養液のうち、残りｌ添加し、同培養液を前記と同じ条件で培養した。の２つに対して５０％エタノール溶液を２０μｌ添加し【００３２】そして、各培養液を遠心分離し、上澄みをた同培地を前記と同じ条件で２〜３日培養した。

除去した後に残った細胞を１回ＰＢＳ（−）で洗浄し、【００３８】その後、各培養液を遠心分離し、上澄みをその細胞ペレットに細胞融解用バッファーを加えて細胞除去した後に残った細胞を１回ＰＢＳ（−）で洗浄し、を融解し、ＲＮａｓｅ溶液を加え、５０℃で２．５時間

その細胞ペレットに細胞融解用バッファーを加えて細胞を融解し、ＲＮａｓｅ溶液を加え、５０℃で２．５時間反応させた後、ＤＮＡ断片を抽出した。
【００３３】そして、ＤＮＡ抽出液とゲルローディング

30反応させた後、ＤＮＡ断片を抽出した。

液を混合して２％アガロースゲル板のウェルに添加し、【００３９】そして、ＤＮＡ抽出液とゲルローディング１００Ｖで電気泳動を行なった。ゲルを水に浸してＵＶ液を混合して２％アガロースゲル板のウェルに添加し、トランスイルミネーターでエチジウムブロマイド蛍光を１００Ｖで電気泳動を行なった。ゲルを水に浸してＵＶ発するＤＮＡを検出した写真を図１に示した。

トランスイルミネーターでエチジウムブロマイド蛍光を【００３４】図中、番号（１）〜（６）の試験に用いた発するＤＮＡを検出した写真を図２に示した。

培養液抽出物と各培地に対する添加物を一括して示す【００４０】図中、番号（１）〜（８）の試験に用いたと、以下の通りである。

培養液に対する添加物と培養期間を一括して示すと、以下の通りである。なお、図中、Ｍは、ＤＮＡ分子量マー【００３５】（１）

５０％エタノール

２０μｌ

（２）

５０％エタノール

４０μｌ

（３）

５０％エタノール

６０μｌ

カーを示している。
40【００４１】（１）

５０％エタノール

２０μｌ＜２日培養＞（２）５０％エタノール

２０μｌ＜３日培養＞（３）実施例の５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ＜１日培養＞（４）

実施例の５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ＜２日培養＞（５）

実施例の５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ＜３日培養＞（６）

大豆サポニンの５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ＜１日培養＞（７）

大豆サポニンの５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ＜２日培養＞（８）

大豆サポニンの５０％エタノール溶液

２ｍｇ／ｍｌ＜３日培養＞図２の結果からも明らかなように、エタノールを添加し50てヒト胃癌細胞を培養したもの（１）、（２）では、電(5)特開２００１−１５１６８７78

気泳動によってＤＮＡバンドが分散せず、すなわち、Ｄた。

ＮＡが断片化されておらず、アポトーシス誘導による癌【００４７】この結果、図Ｂの胃癌細胞は、明らかに縮細胞の増殖抑制が全く起こっていないことがわかる。ま小し、空洞化しており、細胞形態的にもアポトーシスがた、大豆サポニンを添加してヒト胃癌細胞を培養したも誘導されていることが観察された。の（６）〜（８）では、培養期間が長いほどわずかに電【００４８】

気泳動によってＤＮＡバンドは分散したが、ＤＮＡの断【発明の効果】この発明は、以上説明したように、マメ片化は不充分であり、アポトーシス誘導による癌細胞の科アズキの種子から所定溶媒で抽出された成分を有効成増殖抑制がほとんど起こっていない。

分とするアポトーシス誘導性癌細胞増殖抑制剤としたので、アポトーシス誘導性のある新規な癌細胞増殖阻害物【００４２】これに対して、実施例の小豆煮汁エタノー
ル抽出物を添加してヒト胃癌細胞を培養したもの（３）10

質を抽出し、新規なアポトーシス誘導性癌細胞増殖阻害〜（５）では、電気泳動によってＤＮＡバンドが分散剤を提供できるという利点がある。

し、ＤＮＡの断片化は培養期間が長いほど進行してお【００４９】また、この発明は、所定の工程を必須工程り、アポトーシス誘導による癌細胞の増殖抑制が起こっとするアポトーシス誘導性癌細胞増殖抑制物質の抽出方ていることがわかる。

法としたので、熱水抽出物がポリスチレンゲルに効率よ【００４３】＜実験３＞ヒト胃癌細胞を１０容量％牛胎く吸着され、吸着された物質のみをエタノール水溶液で児血清含有ＲＰＭＩ培地で培養した。５×１０５ 個／ｍ溶出させて、アポトーシス誘導性癌細胞増殖抑制物質をｌの密度になるようにヒト胃癌細胞を調整した４つの培効率よく採集することができる。

養液のうち、３つに対して、実施例の小豆煮汁エタノー【００５０】また、上記の抽出方法において、エタノー

ル抽出物の５０％エタノール溶液を最終濃度が１ｍｇ／ルの溶出が、所定濃度のエタノール水溶液で洗浄し、さｍｌ、２ｍｇ／ｍｌまたは３ｍｇ／ｍｌとなるように添

20

らに所定濃度のエタノール水溶液で抽出する工程からな加し、他の１つの培養液（ブランク）に対しては５０％るようにすれば、より確実にかつ効率よくアポトーシス

エタノール溶液を２０μｌ添加し、全ての培養液を３７誘導性癌細胞増殖抑制物質を抽出することができる。

℃、９５〜５％ＣＯ２ の条件下で３日間培養した。

【図面の簡単な説明】【００４４】そして、ブランクのヒト胃癌細胞の増殖量【図１】実施例または比較例を作用させたヒト胃癌細胞を１００％として、各培養液の最終濃度（培養３日後）培養液から得られたＤＮＡ抽出液のアガロースゲル電気での胃癌細胞数を計測して増殖率を求め、得られた増殖泳動図曲線を図３に示した。

【図２】実施例または比較例を作用させたヒト胃癌細胞【００４５】図３の結果からも明らかなように、培養液培養液から得られたＤＮＡ抽出液のアガロースゲル電気泳動図に対して実施例の小豆煮汁エタノール抽出物の添加量が多いほどヒト胃癌細胞の増殖率は低くなっており、この

30【図３】実施例の小豆煮汁エタノール抽出物量とヒト胃発明のアズキ抽出成分に胃癌細胞増殖抑制効果のあるこ癌細胞増殖率との関係を示す図表とがわかる。

【図４】（Ａ）５０％エタノールを作用させたヒト胃癌【００４６】また、上記実験中に顕微鏡で観察したブラ細胞の形態を示す顕微鏡写真

ンクの培養液中のヒト胃癌細胞を図Ａに示し、小豆煮汁（Ｂ）実施例の小豆煮汁エタノール抽出物を作用させたエタノール抽出物の５０％エタノール溶液２ｍｇ／ｍｌ

ヒト胃癌細胞の形態を示す顕微鏡写真（最終濃度）の培養液中のヒト胃癌細胞を図Ｂに示し

(6)

【図１】

【図４】

特開２００１−１５１６８７

【図３】

(7)

特開２００１−１５１６８７【図２】

フロントページの続き(72)発明者

古市幸生

三重県亀山市本町２丁目８番２号

Ｆターム(参考） 4C088 AB59 AC04 BA09 BA10 BA37CA02 CA05 CA06 CA08 CA11CA17 NA14 ZB26 ZC41 ZC54