博 士 （ 獣 医 学 ） エ ド ウ イ ン ク ラ デ イ ン アタ ノ ヾ イ
学位論文題名Preparation and cryopreservation of cytoplasts
for the production of bovine somatic cell
nuclear transfer embryos（ 牛 体細胞 核移 植に おけ る細胞 質体 の調 製と 低温保 存）

学位論文内容の要旨
牛の体細胞核移植胚は、体外成熟により得られた第二減数分裂中期(MII期）の卵子を除核し、細胞質体として使用する。しかし、MIi期卵子の除核率は低く、また核移植胚産生は体外成熟に供する卵子の供給によりその産生数およぴ産生時期が制約を受ける。そこで本研究では、牛卵子の効率的な除核・調製法と低温保存による利用性向上について検討した。
第1章では、まず卵子に付着した卵丘細胞を除去するためのボルテックス処理が除核成功率に及ぼす影響を検討した。その結果、長時間ボルテックス処理した卵子では、ピペヅテイングにより卵丘細胞を除去した卵子に比べて卵細胞核が第一極体の近傍に存在する割合と除核成功率が低いことが分かった。また、第一極体直下に卵細胞核の存在する卵子を選んでボルテックス処理すると、60％の卵子で第一極体が移動していた。これらの結果から、牛卵子のボルテックス処理時間を延長すると第一極体の位置が変化して除核成功率の低下することが明らかになった。
次いで、除核に伴い除去される細胞質量を卵細胞質の10および20％として除核率と核移植胚の発生率を比較したところ、20％の卵細胞質を除去しても胚盤胞への発生率を低下させることなく、除核率も向上することが分かった。以上の結果より、MIi期の卵子は低張液中で卵細胞質を膨張させて第一極体の移動を制限し、短時間ボルテックス処理することにより卵丘細胞を除去し、第一極体とそれに隣接する20％の卵細胞質を除去することにより高い除核率の得られることが分かった。
第2章では、除核率およびその後の核移植胚の発生率向上が期待できる第二減数分裂終期での除核に必要なMIi期卵子の活性化処理法を検討した。MIi期卵子をカルシウムイオノフオアA23187とシクロヘキシミド、あるいはエタノールとシクロヘキシミドの組み合わせで活性化処理した後、牛卵丘細胞（核体）と融合して体細胞核移植胚を作出し、融合後の核の形態変化と発生率について無処理のrvni期卵子を用いて作 出 した 体 細 胞核 移 植胚 と 比 較し た 。無 処 理 のMII期 卵子 お よ びェ タノ ールとシ クロヘキ シミドで 処理した 卵子を用 いて作出した核移植胚の約 50％ は 、 融 合 後 3時 間 目 ま で に 1つの 前 核 を形 成 し た。 ま た、 エ タノ ー ル とシ ク ロ ヘキ シ ミド で 処 理し た 卵子 を用い て作出し た核移植 胚は 、 無処 理 の MII期 卵 子を 用 い て作 出 した 核 移 植胚 と 同等 の 融 合率 と胚 盤 胞 へ の 発 生 率 を 示 し た 。 一 方 、 カ ルシ ウ ム イオ ノ フオ ア A23187と シクロヘ キシミド で処理し た卵子を 用いて作 出した核移植胚は、融合
後 3時 間 まで に 前核 形 成 がみ ら れ ず、 そ の後 の 培 養に よ り胚 盤 胞 は得ら れなかっ た。これ らの結果 より、第 二減数分 裂終期に除核するための卵 子の活性 化には、 エタノー ルとシク ロヘキシ ミドを組み合わせた処理が 適切であ ることが 示された 。
第 3章 で は、 ま ず細 胞 質 体の 低 温 保存 法 とし て 微 小滴 ガ ラス 化 法 によるlvni期 卵子の低 温保存法を検討した。35％エチレングリコール、5％
ポ リ ビ ニ ル ピ ロ リ ド ン お よ び 0.4Mト レ ハ口 ー ス を合 む ガラ ス 化 溶液の 微 小 滴 中で ガ ラス 化 保 存し た MII期卵 子 は高 い 生 存率 （ 約90％ ）を示し、 ガラス化 保存して いない無 処理卵子 と同等の 除核率が得られた。
また、 ガラス化 保存した 卵子ある いは無処 理の卵子 と牛卵丘細胞を用いて作出 した核移 植胚の胚 盤胞への 発生率に も差異は なかった。次いで、
ガ ラ ス 化 保存 し たMII期 卵 子を 細 胞 質体 と し、 牛 （ 同種 間 ）あ る い は水牛（ 属間）の 皮膚を培 養して得 られた線 維芽細胞 を核体として体細胞核移植 胚を作出 し、発生 能を比較 した。そ の結果、 同種間および属間体細胞核 移植胚の 融合率と 胚盤胞へ の発生率 に差異は みられなかったが、得られ た胚盤胞 の細胞数 は属間体 細胞核移 植胚の方 が少なかった。以上の 結果 よ り 、体 細 胞核 移 植 の細 胞 質 体に 用い る〜ni期卵 子は、微 小滴法によ ルガラス 化保存す ることで 、ガラス 化保存し ていない無処理卵子と同等 の発生能 を保持し たまま低 温保存で きること が分かった。また、
ガ ラ ス 化 保存 し た牛 の MIi期卵 子 を 細胞 質 体と し て 利用 す るこ と に より 、 属 間 で の 体 細 胞 核 移 植 胚 の 作 出が 可 能 であ る こ とが 示 され た 。

学位論文審査の要旨
主査

教授

高橋芳幸

副査教授岩 永 敏 彦 （医 学研究 科）

副査

教授

梅村孝司

副査

助教 授

片桐成二

学位論文題名Preparation and cryopreservation of cytoplasts
for the production of bovine somatic cell
nuclear transfer embryos（牛体細胞核移植における細胞質体の調製と低温保存）

申請 者は 、牛 の体細胞核移植胚の作出効率を向上させるため、細胞質体 と し て使 用す る牛体 外成 熟（ 第二 減数 分裂 中期 、Mn期） 卵子 の効 率
的 な除 核・ 調製 法と 低温保 存に つい て検 討し た。
まず 、卵 子に 付着した卵丘細胞を除去するためのボルテックス処理時
間 が長 くな ると 、除核（卵子染色質の存在部位）の指標となる第ー極体の 位置 が変 わり 除核成功率を低下させることを明らかにした。また、除核 に 伴 い 卵細 胞質の 20％ を除 去す ると 高い 除核 率が 得ら れ、 核移 植後の発生能も低下しなしヽことを示した。次に、高い除核率の期待できる第二 減 数 分 裂 終 期 (TII期 ） で の 除 核 に 必要 なMII期卵 子の 活性 化法 を検討 した 。そ の結 果、あらかじめエタノールとシクロヘキシミドを組み合わ せて 活性 化し た卵子を用いて作出した核移植胚は、無処理の卵子と融合 させ た後 に活 性化 した通 常の 核移 植胚 と同 等の発生能を有し、TII期で の除 核の 可能 性を 示唆し た。 最後 に、 MII期卵子のガラス化低温保存法 につ いて 検討 し、エチレングリコール、ポリビニルピロリドンおよびト レハ ロー スを 含むガラス化溶液を用いて微小滴ガヲス化を行えぱ、高い 卵 子 生 存 率 (90％ ） が 得 ら れ 、 除 核 およ び核 移植 後の 発生 能に も悪影 響の ない こと を示した。また、ガラス化保存した牛卵子と水牛の皮膚由 来線 維芽 細胞 を用いて作出した属間体細胞核移植胚は、牛卵子と皮膚由 来線 維芽 細胞 を用いて作出した同種内体細胞核移植胚と同等の胚盤胞への発生能を有することを明らかにした。
以上 のように申請者は、牛体細胞核移植胚生産に細胞質体として使用す る卵 子の除核・調製法およぴガラス化低温保存法を開発し、牛体細胞核移植胚の作出効率を向上させた。また、ガラス化保存した牛卵子を利用して牛と水牛の属間体細胞核移植胚の作出が可能であることを示した。よって、審査員一同は申請者が博士（獣医学）の学位を受ける資格を有すると認めた。