博士 （水 産科 学 ）田元勇

学 位論 文題名スルメイカ肝臓に含まれるプロテアーゼ群の酵素化学的性 質 と 魚 肉消化 ベプ チド の生産 に関 する 研究
学位論文内容の要旨
スル メイカ は、日本 沿岸の いずれの 地域で も漁獲さ れ、日本 人にと って最も親しみの深い水産物の ー っで あ る 。特 に 、 北 海道 で の漁獲 量は国内 最大で 、年間7．5万トン に達し、 全体の 34％を占め て いる 。 ス ルメ イ カ は 可食 部 分 であ る 外 套膜 及 び 、ヒ レ 、足の みが利 用され、 重量の 14%
くらい を 占め る 肝 臓は 、 ほ と んど 廃 棄 物と し て 処理 さ れ 、こ の 量 は北 海 道 で年 間 1− 2万 ト ンに達する。 この廃 棄物に付 加価値 を見出し 、その高 度利用 を推進す ること はイカ水 産業にとって重要であり、 さらに 環境に負 荷をか けないゼ ロエミッ ション 産業に変 える可 能性も出 てくる。このような状
況を 背景と して、イ カ肝臓 の有効利 用を目指 す様々 な研究が 行われ ている。 高度不飽和脂肪酸を含む脂 質の利 用、集魚 作用の ある魚用 飼料とし ての活 用、また 伝統的 なイカ塩 辛の製造への活用などが行 われて いる。し かし、 内臓部位 の総排出 量に比 べれば、 このよ うな利用 はごく少量である。本
研究 ではイ カ肝臓に 含まれ ているプ ロテアー ゼを用 いて、他 の水産 タンパク 質残渣や、未低利用資源に 含まれ るタンパ ク質に 作用させ 、そのま までは 利用でき ないタ ンパク質 を有用ペプチドに変換さ せ、 食 品添 加物 と して 利用 す るた めの 基 礎を 作ることを目的とし た。
第一 章では 、スルメ イカ肝 臓のプロ テアー ゼを水産 廃棄物に 付着し ている筋肉タンパク質に作用させ ること を想定し 、コイ 筋原繊維 (Mf)を基質 としたモデル実験を行った。その結果、E―64、PMSF及びo‑Phenantheroi
neで 阻害 さ れるメ タロ、 システイ ン、セ リンの三 種プロテ アーゼ がイカ肝 臓の主 要酵素 であると 結論さ れた。こ の三種の 阻害剤 の添加で 完全に 阻害され ることから、この阻害剤の 組み合 わせから 一種を 除くこと で、それ によっ て阻害さ れるは ずの一種 のみのプロテアーゼ活性 の 特性 を 検 討す る 事 が でき た 。筋原 繊維中の ミオシ ンHCの分解 から見 ると、中 性、低 温において は メタ ロ プ ロテ ア ー ゼ の活 性 が最も 高く、セ リンプ ロテアー ゼの活 性が最も 低いこ とが分か った。 また、 分解の特 徴とし て、メタ ロプロテ アーゼ はミオシ ンを数 ケ所のみ で選択的に切断する特徴を 有する のに対し て、シ ステイン プロテア ーゼは ミオシン を小断 片化させ る傾向が高く、アクチ‑94
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ン も分解 するのが 特徴であ った。 セリンプ ロテア ーゼは、 概して活性が低く、粗酵素による分解への 寄与は 小さいと 判断され た。さ らに、三 種のプ ロテアー ゼの中で、システインプロテアーゼが最も 高温(50℃）ま で活性を 維持し 、最も安 定であ った。ま た、Mfの 加熱変性 は三種 類のプロテアーゼ 活性に 異なる影 響を与え た。す なわち、 システ イン、セ リンプロテアーゼでは活性上昇を、メタロ プ ロ テア ー ゼ では 活性低 下を引き 起こし た。さら に、三 種のプロ テアーゼ 活性の p
H依存性は 異な り 、 シス テ イ ン、 メ タ ロ 、セ リ ン プロ テ ア ーゼはそ れぞれ 、pH5、pH6―7、pH8―9に最大 活性を 示 し た。 そ し て、 Mfの p
H3の 酸処 理 は 加熱 と 同じよう に、シ ステイン プロテ アーゼに よる分 解促 進と、 メタロプ ロテアー ゼによ る活性低 下を引 き起こし た。一 方、pH10のアル カリ処理は、メタ ロプロ テアーゼ の活性低 下は起 きたが、 システ インプロ テアーゼの活性を上昇は起こらなかったの で、変 性手段に より影響 も異な ることが 示され た。これ らの結果から、筋肉タンパク質の分解には 、熱安 定性に優 れたシス テイン プロテア ーゼが 作用しや すい弱酸性、高温の条件を選ぴ、筋肉タン パ ク 質も 前 も って 加熱あ るいは酸 処理を 行い変性 させて おくこと が有用で あると 考えられ た。
第 二章で はタンパ ク質を 強く小断 片化する システ インプロ テアーゼに注目した。まず、酵素選択的 な合成 基質を用 いること で、シ ステインプロテアーゼはカテプシンLであると同定した。しかし、
特 異的合 成基質で あるZ−Phe―A
rg−M
CAを 用いて諸 性質を調 べたところ、Mfを用いた場合と異なる点 が 見 出 さ れ た 。 ま ず 、 Mfの ミ オ シン 消 化 から 得 た 最適 pHはpH5であ っ た のに 対 し て 、pH7に最 適 pHを 示 し た。 活 性 の 測定 方 法 が変 わ る と最 適 pH
も 変 わ るこ と が 示唆 され たので、 Mfからの酸 可 溶 性 ペプ チ ド の生 成 量 を活 性 の 指 標と し て 最適 pHを再 検 討 した 。 そ の結 果 、 pH5に 最 適pHを 示した ので、合 成基質が 必ずし も酵素の 特性を 検討する ために最適であるとは限らないことを示し ている 。また、 異なる活 性測定 方法によ り活性 の温度依 存性も変化することを見出した。最も単純 な基質 であるZ―Phe―Arg−MCAを 用いた 場合の活 性化エネ ルギーは最も小さく8．6kcal/molと計算 さ れ た。 こ れ に対 して、 最も構造 が複雑 な未加熱 M
fを用い た場合の 活性化 エネルギ ーは、41.
8kcal/molであり、4倍 以 上 の値 を 示 した 。 さ らに、 前もっ てMfを加熱 変性さ せると、 活性化 エネ
ル ギーは 28.
6kcal/molに低下 した。
次 に、こ のカテプ シンLを精製 すること を試み た。最初 に、イ カ肝臓に 含まれて いる大 量の脂質を アセト ン処理に より除去 した。 このアセ トン処 理によっ ては三種プロテアーゼの活性に影響がな
か ったの で、アセトン処理肝臓粉末が出発材料として使用できると判断した。次のステップとして、
40−60Y
O飽和硫 安で酵素 を集め 、この画 分で沈 殿しない 不純タ ンパク質を除いた。次に、各種クロマ トグラ フイーに よる精製 操作に 入ったが 、これ までカテ プシン Lの精 製に用い られて いる陽イオ−949―

ン交 換樹 脂に は本 酵素 は結 合 せず 、逆 に陰 イオ ン交 換体 TOPEAEL DEAE−650Mに 結合した。この結果は 本酵 素が これ まで 報告 されているものと逆の電荷を有しているこ とを示している。このクロマ
トグ ラフ イー で、 セリ ンプ ロテアーゼの全てと二種のメタロプロテア ーゼのうちの一種のメタロプ
ロテ アー ゼを 非吸 着画 分に 除 くこ とが でき た。 もう 一種のメタロプロテアーゼとカテプシンLは完
全に 分離 され なか った が、 活 性の 重な らな い部 分を 回収した。最終的に、TOYOPEARL HW―55Fのゲ
ルろ 過に 供し 、メ タロ プロ テ アー ゼを 除き 、カ テプ シンLを精製する ことができた。精製したカテプ シ ン Lは 、 Z― Phe− Arg一 MCAの み を 分 解 し 、 最 適 pHも pH 7.0で あ り 、 最 適 温 度 は 55℃ に 示
し 、 粗 酵 素 で 得 ら れ た 結 果 と 同 じ で あっ た。 SDS− P
AGEから カテ プシ ンLの 分子 量は 24 kDaで あると推察した。この分子量は今まで報告さ れている哺乳類、魚類のカテプシンLの分子量に類似し、この点では違いは認められなかった。
第 三章 では 基質 とし て水 産系廃棄物のモデルとしてコイ肉を用い、 ペプチドを生産する最適条件を探 索し た。 酸可 溶性 ペプ チドの生産および収率計算のためにトリプ トファンに由来する紫外吸収を用 いた 。ま ず、 イカ 肝臓 に存在する三種のプロテアーゼがどのよう に酸可溶性ペプチド生産に関
わ っ て い るの かを 検討 した 。そ の結 果 、pH7で は、 シス テイ ンプ ロ テア ーゼ に加 えセ リン プロ テアー ゼも 作用 して いた が、 pH5で はシ ステ イン プロ テアーゼのみが作 用すること、また、最大の生成が 認め られ るこ とを 見出 した。また、いずれの条件でもメタロプロ テアーゼの関与はほとんどなかっ た。 そし て、 消化 温度 は 50℃ まで 上昇 させ るこ とが でき 、活 性の 促進 を図 れると判断した。
し か し な が ら 、 カ テ プ シ ン Lと 筋 肉 タ ン パ ク 質 の 見 掛 け の 親 和 カ が小 さく (Kmとし て5mg/ml)、
ペプ チド 生産 時に はな るべ く高濃 度の 筋肉 タン パク 質を 用いる方がよいことが示された。
現 実的 なペ プチ ド生 成の 際 はTCA
な どの 酸を 用い る事はできなぃ。 そこで、沸騰水中での加熱で反応 を停 止さ せる 方法 が使 用できるか検討した。両方法によるペプチ ドの収量およぴ分子量分布もほとんど同じで、平均分子量は3，000付近 であった。さらに現実的なイカ肝臓の利用形態を想定し、魚肉にイカ肝臓のアセトン粉末を直接添加 する方法を試みた。その結果、2．5一5％の粉末を添加し、50℃ で 数 時 間 反 応 さ せ る と 、 lgの 洗 浄 魚 肉 （ 想 定 し た タ ン パ ク 質 量 は 100mg)か ら 54― 67 mgのペ プチ ドが 得ら れた ので 、 十分 にタ ンパ ク質 から ペプ チド を生 産す るこ とが できると考えられた。 なお 、イ カ肝 臓に はカ ド ミウ ムの 混入 の問 題が あるが、5％以下 のアセトン粉末の添加であれば問題ないと計算された。そして、このよ うに調製したアセトン粉末は非常に熱安定に優れ、また、脂 質 酸 化 の 影 響も 除 か れ て いる ので 、長 期間 の貯 蔵や 流通 にも耐 えら れる と判 断し た。
以 上の 結果 より 廃棄 物で あるイカ肝臓のプロテアーゼを利用し、そ のままでは利用価値の少ない−950−

残渣 のタンパ ク質から効率的にペプチドを調製する基礎が確立したと結論した。

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学位論文審査の要旨
主査 教授 今野久仁彦
副 査 教 授 川 合祐史
副 査 教 授 佐 伯宏樹
副 査 助 教 袁 春紅

学 位 論 文 題 名スルメイカ肝臓に含まれるプロテアーゼ群の酵素化学的性 質 と 魚肉 消化 ベプ チドの 生産 に関 する研 究
スルメイカは、 日本人にとって最も親しみの深い水産物のーっであり、北海道での漁業に占める価値は高い。スルメイ カは可食部分である外套膜及び、ヒレ、足のみが利用され、重量のかなりを占める肝臓 を主 体と する 内臓 は、 廃棄物 として処理され、この量は北海道で年間1ー2万トンに達 する。ゼロエミッションの考 え方から、廃棄物に付加価値を見出し、その高度利用を推進することはイカ水産業にとって重要である 。これまで、高度不飽和脂肪酸を含む脂質の利用、集魚作用のある魚用飼料としての活用、また伝統的 なイカ塩辛の製造への活用などが行われている。しかし、内臓部位の総排出量に比べれぱ、このような 利用はごく少量である。本研究ではイカ肝臓に含まれているプロテアーゼを用いて、他の水産タンパク 質残渣や、未低利用資源に含まれるタンパク質に作用させ、そのままでは利用できないタンパク質を有 用ペプチドに変換させ、食品添加物として利用しようとするゼロエミッションの考え方に基づぃた水産 資源の利用の基礎を作ることを目的とした。
まず、スルメイ カ肝臓のプロテアーゼを水産廃棄物に付着している筋肉タンパク質に作用させること
を 想 定 し 、 コ イ 筋 原 繊 維 (Mf） を 基 質 と した モデ ル実 験を 行っ た。 その 結 果、 E− 64、 PMSF及びcr
Ph
enantheroi
neで阻害されるメタロ、システイン、セリンの三種プロテアーゼがイカ肝臓の主要酵素であると結論され た。この三種の阻害剤の組み合わせから一種を除くと、阻害されない一種のプロテアーゼが活性を発現 するので、その特性を検討する事ができる。筋原繊維中 のミオシンHCの分解から見ると、メタロプロ テアーゼの活性が最も高いことが分かった。また、分解の特徴として、メタロプロテ
アーゼはミオシン を数ケ所のみで選択的に切断する特徴を有するのに対して、システインプロテアーゼ− 952―

はミオシンを小断片化させる傾向が高く、アクチンも分解するのが特徴であった。セリンプロテアーゼ
は、概して活性が低く、粗酵素による分解への寄与は小さいと判断された。さらに、三種のプロテアー
ゼの中で、システインプロテアーゼが最も高温(50℃）まで活性を維持し、最も安定であった。また、Mfの加熱変性は三種類のプロテアーゼ活性に異なる影響を与えた。すなわち、システイン、セリンプロテアーゼでは活性上昇を、メタロプロテアーゼでは活性低下を引き起こした。さらに、システイン、メタロ、セリ ンプロ テアーゼ はそれ ぞれ、pH5、pH6−7、pH8ー9に 最大活性 を示した。そして、MfのpH3の酸処理は加熱と同じように、システインプロテアーゼによる分解促進と、メタロプロテアーゼによる活性低下を引き起こした。条件を選べば、変性している筋肉タンパク質のほうが逆に分解されやすいことが示された。
変性タ ンパク質 を強く小断片化したシステインプロテアーゼは酵素選択的な合成基質を用いた解析から、カ テプシ ンLと 同定し た。しか し、合成 基質を用いて諸性質とMfを用いた場合では異なる点が見出され た。ま ず、Mfのミ オシン 消化から 得た最 適pHはpH5であっ たのに対して、合成基質ではpH7に最適pHを示した 。酸可溶 性ペプ チドの生 成量を 活性の指 標とし て最適pHを求めたところMfからの生成でも pH5に 至適pHを示 した。 また、活 性の温 度依存性も変化することを見出した。複雑な構造を持つ未加 熱Mfを用 いた場合 の活性 化エネル ギーは合成基質を用いた場合の4.5倍の値を示した。この結果は合 成基質 が必ずしも酵素の特性を検討するために最適であるとは限らないことを示している。
このカ テプシン Lは、イカ肝臓のアセトン処理、40―60%飽和硫安分画、およぴ、クロマトグラフイーを組み合わせて精製した。本酵素は陽イオン交換樹脂には結合せず、陰イオン交換体に結合したので異なる電 荷を有 することが示された。S
DS−PAGEからカテプシンLの分子量は24kDaであると推察したが、 こ の 分子 量 は 今ま で 報 告 され て い る哺 乳 類 、魚 類 のカ テプシ ンLの 分子量に 類似し ていた。
この肝臓のプロテアーゼを用いて魚肉からペプチドを生産する最適条件を探索した。その結果、pH5でカテプシンLが作用する条件が最適であると判断した。そして、優れた熱安定性から消化温度は50℃まで上昇させることで高い収量を得ることができると判断した。現実的なペプチド生成を想定し、沸騰水中での加熱で反応を停止させる方法が使用できるか検討した。ペプチドの収量および分子量分布には差が無いことが分かった。さらに現実的なイカ肝臓の利用形態を想定し、魚肉にイカ肝臓のアセトン粉末を直接添加する方法を試みた。ぞの結果、2．5−5％の粉末の使用で高収量でペプチドが得られることから現実的な方法として使用できることを確認した。そして、このように調製したアセトン粉末は非常に熱安定に優れ、また、脂質酸化の影響も除かれているので、長期間の貯蔵や流通にも耐えられると判断した―953―

これらの研究成果は、北海道、函館に重要な資源であるイカの総合利用を提案し、新たな可能性を示している。よって、審査員一同は申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格があると判定した。

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