博 士 （ 医 学 ） 松 尾綾

学 位 論 文 題 名

脊椎動物における自然免疫系の分子進化と多様性に関する研究
学位論文内容の要旨（背景と目的）
生物は病原微生物に対抗 するために生体防御機構を備えている。この生体防御機構は、獲得免疫と自然免疫の2っに大別され、全ての生物には 自然免疫が備わっているが、獲得免疫は魚類以上の高等動物のみ持っている機構である。近年、自然免疫はToll‑likereceptor(TLR)の発見から、獲得免疫と密接に相互作用していることが明らかとなり、生体防御機構としての自然免疫の重要な 役割が注目されている。生物の進化の過程で初めて獲得免疫を備えた動物は脊椎動物の魚 類であると考えられるが、これまでの研究から魚類における獲得免疫は高等な哺乳類に比 べ非常に未熟である。よって、魚類は未熟な獲得免疫を補うように強カな自然免疫機構を 発達させたと考えられる。魚類の中でも硬骨魚類・フグのゲノムプロジェクトが早くに完 了し、そのドラフト配列が公開され、当研究室においてフグにも ヒト のTLR1〜10に相当する遺伝子が存在することがデータ ベース解析により予想された 。 し かし 、ヒ トの TLRフ ァミ リー と比 較し て、 TLR4が存 在 した いこ と、 可溶 型TLR5が 存在 する こと、そしてヒトには存在しないTL
R21及びTLR22が存在するという相違点が明 らか にな った。これらT
LR21とTLR
22
のりガンドやその機能 は不明である。そこで本研
究 では 、何 故ヒトにはT
LR
21とTLR
22が存在しないのかという 疑問も含め、昆虫からヒトに至るまでの生物が持つ自 然免疫機構の系統進化を考察する目的でTL
R21とTI
ぷ22の機能解析を行った。
（方法と結果）第一 に、 フグ T
LR21 (fgTLR21)の 解析を行った。fg
TLR21をクローニングし、ヒトCD4と のキ メラ 体を 作製 した 。ヒ ト培 養細 胞であるHEK293細胞に発現させ、TLR21を介した細胞内シグナル伝達活性を ルシフェラーゼアッセイにて解析したところ、fgTL
R21
はNF‑KBを活性化し、IFN‑[3promoterも若干活性化した。これを指標としてりガンド探索を行ったと
ころ、ヒトの細胞またはサ カナの細胞においてfgT
LR21は大腸菌を認識し、さらにグラム陰 性菌 由来 ペプチドグリカン(PGN)を認識して主にNF‑KBを活 性化することが明らかとなった。また、Yeast two‑hybr
id法と免疫沈降法の結果から、fgTLR21はアダプター分子としてfgMyD88とfgTICAM‑lと相互作用することが明らかとなった 。さらに、免疫染色の結果から、fgTL
R21は細胞表面に局在しており、刺激が入ると細胞内へ移行してアダプター分子と会合することも明らかにした。
第二 に、 fgTLR22の機 能 解析 を行 った。fgTLR22をクローニングしてCD4とのキメラ体をHE
K293細胞へ発現させる と、fgTLR22を介してIFN‑[3promoterのみを活性化した。リガンド探索を行った結果、ヒ トの細胞またはサカナの細胞においてfgTL
R22はウイルス由来
dsRNAを認識して、type−IIFNを活性化することで抗ウイルス活性を示した。また、免疫沈降 と免 疫染 色の結果から、fgT
LR22はアダプター分子としてTI
CA
M‑1依存的にtype‑
I IF
N− 295ー

を 活性化 している ことが 明らかと なった 。これま での研究 から、dsR
NAを認識するTL
Rとし て、TLR3が 報告さ れている 。そこで 、次は fgT
LR3のクロ ーニングをして同様の実験を行 ったと ころ、fg
TLR
22と同 じdsRNA認識機能 を持って いることが明らかとなった。しかし 、免疫 染色の結 果から 、fgT
LR
22は細胞表面、fg
T
L
R3は細胞質内に局在しており、異なった場所でdsRNAを探索していることが明らかとなった。
第三に、fgTL
R22が抗ウイルス活性を持っことが明らかになったので、fg
T
L
R22が哺乳類において機能し得るかを検討するためにfg
TI
風22トランスジェニックマウス(fgTLR22tg)
を作 製 し 、 生体 内 に おけ る fg
TL
R22の機能 解析を行 った。 Wild type (WT)とfg
TL
R22tgにpoly(I:C)を腹腔内投与し、血清中の様々なサイトカイン産生量をELISAにて測定したとこ
ろ 、WTに比ベfgTLR22tgの方が多く産生されていた。また、poly(I:C)
刺激した骨髄樹状細胞(BMDC)や胎児 繊維芽 細胞(MEF細胞 ）にお いてもfg
TIーR22tgの 方がWTに 比べてtype‑I
IFN産 生が 多 か った 。 次 に、 増殖過程 におい てdsR
NAが できる ポリオウ イルス の受容体(PVR)
を発現させたhu
PVRトランスジェニックマウス(huPVRtg)とfgTLR22tgを交配させて、huPVR丿fg
TLI也2tgを作製した。このマウスを用いてポリオウイルス感染実験を行った。その結果、huPWく／fg
TLR22tg
はコントロールのマウスに比べて、ポリオウイルス感染に対してのみ 抵抗性 を示した 。また 、BMDCやMEF細胞に ポリオウ イルス を感染させると、f酊｀LR22を介してぢpe‐II
FNをより活性化し、哺乳類の生体内に韜いても唾打L
弛2は機能し得ることが明らかとなった。
（考察）
本研究結 果から、 TLI也1は細 胞表面でグラム陰性菌由来PGNを認識して主にNF‐KBを活性化し、TL
I也2は細胞表面でウイルス由来ds心乢Aを認識してtype・IIFNを活性化することが 明らか となった 。ヒト では、グ ラム陰性菌由来PGNを認識する受容体として細胞質内に存 在する NOD1が報告されている。サカナのゲノム上にもNOD1‐likeprotemは存在するが、そ の機能 等はまだ不明である。また、ヒトでは、ds心岨を認識する受容体として、エンドソ ームに 局在しているTI
風3以外にR亅GーI／MDA5が細胞質内でds心岨を認識することが明ら かとな っている。さらに、腸管上皮細胞に発現しているT
LR3はエンドソームではなく、細 胞表面 に局在し て機能 している ことも 報告され ている。 このことから、ヒトではT
LR3が 細胞質 内と細胞 表面に 分担して ds恥nを認識していることが考えられ、ヒトにおいて細胞 表面に 局在して いるTL
R3は 進化の過 程でTL
R22の代わ りを担 っている ことが 示唆される 。 サ カ ナに は MD
A5は 存在 するが 心G＿I
は 存在せず 、サカ ナにおけ るM
DA5の機 能はまだ 不明で ある。これらのことから、サカナではヒトよりも獲得免疫が未熟なため、豊富なT工風を持つことで様々な病原体を認識することができ、サカナからヒトヘと進化する過程で 獲得免 疫が発達していくと共に自然免疫もそれに対応する形で進化していったと考えられ る。ま た、TLI
也2をマウスに入れることで特定のウイルス感染に抵抗性が示されたこと
か ら、魚 類の免疫系が哺乳類で劣っている免疫系をカバーできたことになり、ヒトの感染症に対する治療戦略に使えるかもしれなぃ。
（結論）
昆虫からヒトに至る生物は生体防御として自丶然免疫機構を備えており、ヒトへの進化の過 程でど のように発達させていったかを解明することは必要不可欠である。本研究から、
哺 乳類と 魚類にお いて異 なったTLR機構が存在することが浮き彫りとなり、免疫系の進化は 環境微 生物の進化と密接な関係を持っていることが考えられた。そして、これが感染の
種 間 ト ロ ピ ズ ム を 規 定 す る 一 因 で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ ると い う 結論 に 至 った 。

‑ 296 ‑

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 岩 永 敏 彦
副 査 教 授 小 池 隆 夫
副 査 教 授 有 川 二 郎
副 査 教司授西村孝
副 査 教利、 志 田 壽授

学 位 論 文 題 名

脊椎動物における自然免疫系の分子進化と多様性に関する研究
近年 、自 然免 疫 はToll‑like receptor (TLR)の発 見か ら 、獲 得免疫と 密接に相互作用してい るこ とが 明ら か とな り、 生体 防御 機 構と して の自 然免 疫 の重 要ぬ役割 が注目されている。
下 等 な 脊 椎 動 物 で は 、 未 熟 な獲 得免 疫 を補 うべ く強 カ な自 然免 疫機 構を 発 達さ せた と考 えら れ る 。 申 請 者 の 研 究 室 に 船 い て 行 わ れ た デ ー タ ベ ー ス 解 析 に よ り 、 サ カ ナ にも ヒト のTLR1〜 10に 相 当 す る 遺 伝 子 が 存 在 す る こ と が 予 想 さ れ た 。 同 時 に 、 フ グ に は ヒト には 存
在 しな いフ グTLR21 (fg lCLR21） 韜よ びフ グ TLR22 (fgrI'LR22)が存在 することが明らかにな っ た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 こ れ ら 未 知 の TLR21と TLR22の 機 能 解 析 を 行 っ た 。
ま ず 、 fgTLR21の 機 能 解 析 を 行 っ た 。 fgTLR21は 大 腸 菌 を 認 識 し 、 さ ら に グ ラ ム 陰 性菌 由 来 PGNを 認 識 し て 主 に NF‑KBを 活 性 化 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、 fgTLR21
は 、 ア ダ プ タ ー 分 子 と し て fg． MyD88と 印 ICAM‐ 1と 相 互 作 用 す る こ と が 示 さ れた 。さ らに 、 fgTLR21は 細 胞 表 面 に 局 在 し て お り 、 刺 激 が 入 る と細 胞内 ヘ移 行し て アダ プタ ー分 子と会合するこ とも明らかにした。
っ ぎ に 、 龜 汀 LR22の 機 能 解 析 を 行 っ た 。 坩 rLR22は ウ イ ル ス 由 来 dsRNAを 認 識 し て 、TIQW． 1依 存 的 に type‐ IIFNを 活 性 化 す る こ と で 抗 ウ イ ル ス 活 性 を 示 し た 。 TLR3と の違 い を 調 べ る と 、 TLR22は 細 胞 表 面 、 fgTLR3は 細 胞 質 内 に 局 在 し て お り 、 異 な っ た 場所で機能して いることが明らかとなった。
最 後 に 、 坩 TI」 R22が 哺 乳類 にお いて 機能 し 得る かを 検討 する た めに 、fgTI」 R22トラ ンスジェニック マウス（fg．TLR22tg）の機 能解析を行った。Poly（I：C）に対する反応を調べたとこ ろ 、 WTに 比 べ fgTLR22tgの 方 が type‐ IIFN産 生 が 多 か っ た 。 次 に 、 ポ リ オ ウ イ ル スを 用 い て 感 染 実 験 を 行 っ た 結果 、fぎTLR22tgは コン ト ロー ルの マウ スに 比 べて 、ポ リオ ウ
イルス感染に 対してのみ抵抗性を示した。
以 上 の 研 究 結 果 か ら 、 サ カ ナ で は ヒ ト よ り も 獲 得 免 疫 が 未 熟 な た め 、 豊 富 な TLRを 持っ こ と で 様 々 な 病 原 体 を 認 識す るこ と がで き、 サカ ナ から ヒト へと 進化 す る過 程で 獲得 免疫 が発 達し てい く と共 に自 然免 疫も そ れに 対応 する 形で 進 化し ていった と思われる。また、
哺 乳 類 と 魚 類 に お い て 異 な っ た TLR機 構 が 存 在 す る こ と が 浮 き 彫 り と な り 、 免 疫 系 の 進― 297 ‑化 は 環 境 微 生 物 の 進 化 と密 接 な 関 係 を 持 っ て い る こと が 考 え ら れ た。
非 公 開 の 審 査 会 は 、 平 成 21年 2月 9日 午 後 4時 00分 より 医学 研究 科組 織細 胞学 分野
図 書室 にお いて 、発 表 約30分、 質疑 応答 が約 30分問行われた。主な質問は以 下の通りである。＠ ウイルスに対する反応性の違いの理由：ヒト由来ではなくマウス由来のウイルスに対して はもっと強い効果が現れるのでは？条件設定を変えたり（ウイルスの摂取量たど）、評価法を変えることで（生死以外の評価）、より明瞭な効果が期待できないか。◎TLR
22よるウイル ス由来dsR
NA認識において、 インフルエンザウイルスを感染させた場合とポリオ ウイ ルス を感 染さ せた場合とで異なっていた。 どちらのウイルスも増殖過程でdsRNAを作るはず だが、なぜウイルスの種によって反応性が違うのか？ ds
R
NAの長さの違いによっ て TLR22と TLR3の 認識 の違 いが なぜ 起こ るの か？ TL
R9にお いて CPGに 見ら れる メチル化・非メ チル化のわずかな違いをどうやって区別できるのか？◎魚類から哺乳動物への進化にっれ、自然免疫は縮小され、かわりに獲得免疫が充実することの背景にあるものは？
TL
Rのりガンド認識においては、自然免 疫はほどほどでよく、あとは獲得免疫にまかせれば よい と考 えら れな ぃか？＠ポリオウイルス感染 においてT
LR22を介したウイ ルス抑制遺伝子が腎 臓で増加するのはなぜか？◎今後の発展性にっいて：TL
R
のりガンドを利用して 免 疫 系 を 活 性 化 さ せ る こと で 養 殖 魚 の 感 染 防 御 な ど に 応 用 で き な い か 。
いずれの 質問に対しても、申請者は自身の研究成果を元に、過去の文献およぴ未発表所見を加えて 、おおむね適切に回答した。この論文は、硬骨魚特有のTLRの存在意義を明らかにし、ひ いては哺乳類における白然免疫の理解を推し進めた点で高く評価され、免疫学の発展に貢献するものとして期待される。
審査員一 同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ申 請者 が博 士（ 医 学） の学 位を 受け るの に充分な資格を有するものと判 定した。

‑ 298 ‑