研究報告 №５（２０１５）

非ラベル化アミノ酸分析カラムを用いたLC/MSによる遊離アミノ酸分析の検討
バイオ系チーム

要

清野珠美，廣岡青央

旨

本チームで従来行っていた，ガスクロマトグラフィーを用いたプレラベル化法による遊離アミノ酸分析は，アミノ酸のラベル化という前処理があるものの，1試料の分析時間が10分以内という迅速分析が可能であった。しかし，天然アミノ酸の1つで，清酒の苦味に寄与するアミノ酸であるアルギニンが検出できないという欠点があった。そこで今回，液体クロマトグラフィー質量分析装置 (LC/MS)と非ラベル化アミノ酸分析カラムを用いて，多重反応検出 (Multiplereactionmonitoring:MRM)モード による，アルギニンを含んだ20種類の遊離アミノ酸分析の検討を行った。条件検討の結果，化学的な前処理を行わなくても，1
試料15分で，20種類のアミノ酸を分離・検出することができ，ほとんどのアミノ酸が125mMの濃度幅で良好な検量線を作成できた。またこの条件を用いた，実試料（麹汁培地，清酒）のアミノ酸分析でも，再現性の高い結果が得られた。本法で得られる多成分データは，食品，特に清酒の品質管理に大きく貢献できると考えられる。

１．はじめに操作が必要であり，試料マトリックスによってはラベ食品におけるアミノ酸は，三大栄養素の1つであるタ

ル化効率が下がる可能性があること，といった難点がンパク質の構成成分であるとともに，ヒトが口にしたあった。

とき，個々に甘味，酸味，苦味を感じたり，他成分と近年普及している質量分析装置 (Massspectrometer:の相乗効果でうま味を感じるといった，味に寄与するMS)は，物質を イオン化し，その質量電荷比 (m/z)を成分でもある。ゆえに，食品に含まれるアミノ酸の量選択的に検出・追跡することができる装置である。こやその組成は，食品産業分野において重要な分析項目

れをGCやHPLCの検出器として利用することで，クロの1つとなっている。

マトグラフィーによるピークの分離が完全でなくとも，アミノ酸分析には，現在ガ スクロマトグ ラフ ィー

特定のm/zを追跡し，複数の成分を同時に，且つ高感度(GC)や高速液体クロマトグ ラフ ィー (HPLC)が用いに検出することが可能となった。

られている。本チームでは従来，アミノ酸分析キット

さらに近年，インタクト株式会社から，液体クロマ

EZ:faast(Phenomenex)
によるプレラベル化法を用いたトグラフィー質量分析装置 (LC/MS)専用の非ラベル1)GC分析 を採用してきた。しかし，この方法では，1
試化アミノ酸分析カラムが開発された (図１左)。このカ料10分以内で再現性の高い分析が可能であるが，天然アミノ酸の1つであるアルギニンが検出できないという欠点がある。アルギニンは，清酒の苦味に大きく寄与することが報告されており2)，清酒製造の技術貢献を目的としている本チームにとっては，アルギニンも分析可能な，アミノ酸迅速分析方法を確立する必要があった。一方で，HPLCを用いた方法では，ポストラ
ベル化法によるイオン交換クロマトグラフィー3)やプレラベル化法による逆相クロマトグラフィー4)がある
図１ 左：非ラベル化アミノ酸分析カラム（IntradaAmino Acid，Imtakt），
右：液体クロマトグラフィー質量分析装置（AQUI
TY TQD，Waters）

が，前者は検出させる複数のアミノ酸を，クロマトグラム上で完全に分離しなければならないため，分析時間の短縮が困難であること，後者は分析前にラベル化－96－京都市産業技術研究所
ラムは，ギ酸アセトニトリル溶液とギ酸アンモニウム

表１ LC/MS分析条件溶液という，2つの移動相を用いたグラジエント溶出に㻹㻿 ᮲ ௳ 㻌

よって，天然アミノ酸20種類を分離することができる

䜲䜸䞁໬ 㻌カラムである。

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本チームでは今年度，GCでは分析できなかったアル㻸㻯 ᮲ ௳ 㻌

ギニンを含む，天然アミノ酸20種類をより迅速に分析することを目的とし，上記の非ラベル化アミノ酸分析㻌㻵㼚㼠㼞㼍㼐㼍㻌 㻭㼙㼕㼚㼛㻌 㻭㼏㼕㼐㻌 㻔㻡㻜㼤㻟㻌 㼙㼙㻘㻌 㻟㻌䃛㼙㻘㻌㻵㼙㼠㼍㼗㼠㻕㻌䜹䝷䝮㻌

カラムと本研究所で所有しているLC/MS (図１右)を䜹䝷䝮用いて，遊離アミノ酸分析条件を検討してきた。これ

ὶ㏿㻌㻜㻚㻡㻌㼙㻸㻛㼙㼕㼚㻌⛣ ື ┦ 㻭㻌㻜㻚㻝㻑䜼㓟 㻙㻤㻜㻑䜰䝉䝖䝙䝖䝸䝹㻌⛣ ື ┦ 㻮㻌㻝㻜㻜㻌㼙㼙㼛㼘㻛㻸㻌 䜼㓟 䜰䞁䝰䝙䜴䝮㻌⁐ ฟ 䜾䝷䝆䜶䞁䝖㻌㻜㻙㻞 ศ 㻌㻮㻌㻡㻌㻌㻞㻙㻤 ศ 㻌㻮㻌㻡㻙㻝㻜㻜㻑㻌㻌㻤㻙㻝㻝 ศ 㻌㻮㻌㻝㻜㻜㻑㻌の 検 出 モ ード で あ る 多 重 反 応 検 出(Multiplereaction㻌㻝㻝㻙㻝㻡 ศ 㻌 㻮㻌㻡㻑㻌monitoring:MRM)
モードによる分析条件を確立したのὀධ㔞㻌㻡㻌 䃛㻸㻌までに，LC/MSに よ る選択 イオン 検出 (Selectedionmonitoring:SIM)モードを用いて，実際の試料による良好な分析結果が得られ，酒研会報にて報告している5)。
SI
Mモード とは，特定のm/zを持つ物質を追跡し，選択的に検出するモード である。
本ノートでは，さらに検討を進め，LC/MSのもう1つᗘ㻌㻟㻡䉝㻌で，その結果を報告する。MRMモード とは，SIMモード で選択した物質にエネルギーを当てて，物質を開裂させることで生成したプロダクト イオンのm/zを追跡するモード であり，SIMモード よりも選択性が高く，３．結果と考察高感度な検出が可能である。

3.
1 標準アミノ酸の検量線とその直線性各アミノ酸のm/zとそのプロダクト イオンのm/zの組

２．実験方法み合わせ (MRMト ラ ン ジ シ ョ ン)の 決 定 に は，

2.
1 標準アミノ酸の分析

Masslynx
ソフトウェア(Waters)のI
ntelliStart
機能を用い天然アミノ酸20種類のうち，トリプトファン，アスた。その際のMS検出はエレ クトロスプレ ーイオン化

パラギン，グルタミンについては，蒸留水を用いて10(ESI)，Positiveモード で行った。得られた各アミノ酸のmmol/L混合溶液を作成した。それ以外のアミノ酸につMRMトランジションを表２に示す。これを用いて，アいては，0.
1N HClを用いて10mmol/L混合溶液を作成

ミノ酸混合標準溶液を分析し，原点を通る検量線を作した。ただしシスチンのみ，濃度を5mmol/Lにした。

成した。図２はアミノ酸混合標準溶液10mmol/
Lのマス

両液は80°Cで保存した。使用時は 両液を 混合し，クロマトグラムである。分析開始後9分までに，20種類

0.
1%ギ酸を用いて希釈して1，5，10，25，50，100，のアミノ酸が検出されている。

500，1000mmol/
Lのアミノ酸混合標準溶液を作成して検量線については，20種類すべてのアミノ酸におい分析に供した (この時シスチンは各濃度値の半分となて，5001000mmol/Lの間で検量線が飽和する傾向が見る)。LC/MSの分析条件を表１に示す。

られた。表２に示すように，一部を除き，ほとんどのアミノ酸は，125mmol/Lの濃度幅において直線性の寄与率r2が0.
99以上となった。プロリン，シ スチン，ヒ2.
2 実試料を用いたLC/MSによる遊離アミノ酸分析
実試料として，麹汁培地および清酒サンプルを用いスチジンは，110mmol/Lにおいてr2が0.
99以上となった。

た。試料は0.
1%ギ酸を用いて200倍に希釈し，0.
45mm

リジンは110mmol/L，アルギニンは125mmol/
Lにおいフィルターによるろ過後，分析に用いた。LC/MS分析てr2が0.
98となった。よって，これらの濃度範囲で20条件は表１の通りである。試料濃度は，各アミノ酸の種類のアミノ酸の良好な検量線が得られることが示さ

ピーク面積と原点を通る標準溶液1，5，10mmol/Lの検れた。

量線を基に算出した。

－97－

研究報告 №５（２０１５）䜰䝹䜼䝙䞁䝸䝆䞁䝠䝇䝏䝆䞁䝅䝇䝏䞁䜰䝇䝟䝷䜼䞁䝉䝸䞁䜾䝸䝅䞁䜾䝹䝍䝭䞁䜰䝷䝙䞁䝇䝺䜸䝙䞁䜾䝹䝍䝭䞁㓟䝞䝸䞁䝥䝻䝸䞁䜰䝇䝟䝷䜼䞁㓟䝻䜲䝅䞁䠈䜲䝋䝻䜲䝅䞁䝏䝻䝅䞁䝯䝏䜸䝙䞁䝖䝸䝥䝖䝣䜯䞁䝣䜵䝙䝹䜰䝷䝙䞁

図２ アミノ酸混合標準溶液のマスクロマトグラム (Cystine：5μmol/
L，その他：10μmol/
L)

原因としては次のようなことが考えられる。化学的な

3.
2 実試料の遊離アミノ酸分析
表３に麹汁培地および清酒サンプルの各遊離アミノ

前処理なしの試料にはアミノ酸以外にも様々な成分が酸濃度とCV値を示す。試料を200倍に希釈しても，麹含まれている。SI
Mモード のような一段階のm/z
選択で汁培地のシスチンを除き，すべてのアミノ酸を検出し，は，試料分析時に，アミノ酸と同じm/z値を持つ成分を濃度を算出することができた。また3回分析によるCV同時に検出し，ピークを過大検出している可能性があ値も，一部10%を超えているが，ほとんどのアミノ酸る。一方，MRMモード で濃度値が大きくなる原因に関で10%未満となり，おおむね再現性の高い結果が得らしては，現在のところ不明である。しかし，MRMはれた。

m/z値を二段階で選択するため，SIMよりも選択性は増している。ゆえに今回の結果も，原理的にMRMによる

表４では，同サンプルをSIM，MRMの両モード で分濃度値の方がより妥当な値であると考えられる。

析した時の濃度値を比較した。MRMモード でのアミノ酸の濃度値は，ほとんどがSI
Mモード の場合から±数麹汁培地のシ スチン に ついは，SI
Mモード で1.
75%の差で収まっていたが，麹汁培地のグルタミン，アppmと検出されたが，実際のクロマトグラムを見ると，スパラギン，リジン，アルギニンでは±10%超，清酒ノイズをピークとして検出していた。クロマトグラム

サンプルのアスパラギン 酸およびアスパラギンではにおけるベースラインのノイズの大きいSI
Mモード で±10%超，アルギニンでは±20%超の違いが見られた。

は，希釈後試料の濃度が低かったため，そのノイズにSI
Mモード よりもMRMモード で濃度値が低くなる

目的ピークが埋もれてしまい，正しいピーク検出を行－98－

京都市産業技術研究所
表２ 各アミノ酸のMRMトランジションと検量線の直線性

表３ 麹汁培地と清酒サンプルのアミノ酸分析結果㯜Ồᇵᆅ㻌Ύ 㓇 䝃䞁䝥䝹㻌㻌⃰ ᗘ 㻖㻌㻔㼜㼜㼙㻕㻌㻯㼂㻌㻔㻑㻕㻌⃰ ᗘ 㻖㻌㻔㼜㼜㼙㻕㻌㻯㼂㻌㻔㻑㻕㻌┤ ⥺ ᛶ 䛾㻌ᐤ ୚ ⋡ 㻌 㻔㼞 㻞 㻕 㻌䝣䜵䝙䝹䜰䝷䝙䞁㻌㻢㻞㻝㻌㻞㻚㻟㻌㻞㻟㻞㻌㻞㻚㻡㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻠㻌䝖䝸䝥䝖䝣䜯䞁㻌㻝㻥㻚㻢㻌㻞㻚㻞㻌㻥㻚㻜㻣㻌㻡㻚㻟㻌㻞㻜㻠㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻝㻠㻡㻚㻥㻝㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻤㻌䝯䝏䜸䝙䞁㻌㻟㻚㻡㻤㻌㻝㻟㻌㻠㻚㻜㻤㻌㻠㻚㻡㻌䝯䝏䜸䝙䞁㻌㻝㻠㻥㻚㻥㻝㻌㻪㻌㻝㻜㻟㻚㻥㻜㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻝㻤㻌䝏䝻䝅䞁㻌㻥㻞㻚㻢㻌㻝㻚㻢㻌㻡㻡㻚㻣㻌㻞㻚㻠㻌䝏䝻䝅䞁㻌㻝㻤㻝㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻝㻟㻡㻚㻥㻢㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻠㻞㻌䝻䜲䝅䞁㻌㻝㻠㻢㻌㻜㻚㻟㻡㻌㻤㻠㻚㻤㻌㻜㻚㻡㻣㻌䝻䜲䝅䞁㻌㻝㻟㻝㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻤㻡㻚㻥㻟㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻡㻤㻌䜲䝋䝻䜲䝅䞁㻌㻡㻞㻚㻡㻌㻜㻚㻟㻡㻌㻟㻟㻚㻠㻌㻜㻚㻣㻡㻌䜲䝋䝻䜲䝅䞁㻌㻝㻟㻝㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻤㻡㻚㻥㻟㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻞㻌䜰䝇䝟䝷䜼䞁㓟 㻌㻤㻞㻚㻡㻌㻜㻚㻢㻥㻌㻠㻟㻚㻞㻌㻝㻚㻝㻌䜰䝇䝟䝷䜼䞁㓟 㻌㻝㻟㻟㻚㻤㻤㻌㻪㻌㻤㻣㻚㻤㻥㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻠㻟㻌䝥䝻䝸䞁㻌㻟㻤㻚㻜㻌㻝㻚㻥㻌㻝㻟㻠㻌㻜㻚㻣㻠㻌䝥䝻䝸䞁㻌㻝㻝㻡㻚㻥㻠㻌㻪㻌㻢㻥㻚㻥㻝㻌㻝㻙㻝㻜㻌㻜㻚㻥㻥㻡㻥㻌䝞䝸䞁㻌㻣㻢㻚㻣㻌㻜㻚㻢㻟㻌㻡㻥㻚㻝㻌㻝㻚㻟㻌䝞䝸䞁㻌㻝㻝㻣㻚㻥㻝㻌㻪㻌㻣㻝㻚㻥㻠㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻢㻌䜾䝹䝍䝭䞁㓟 㻌㻝㻣㻟㻌㻝㻚㻟㻌㻝㻥㻥㻌㻟㻚㻞㻌䜾䝹䝍䝭䞁㓟 㻌㻝㻠㻣㻚㻥㻠㻌㻪㻌㻤㻟㻚㻥㻞㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻝㻌䝇䝺䜸䝙䞁㻌㻡㻣㻚㻞㻌㻝㻚㻢㻌㻟㻞㻚㻡㻌㻞㻚㻢㻌䝇䝺䜸䝙䞁㻌㻝㻝㻥㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻣㻟㻚㻥㻟㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻠㻌䜰䝷䝙䞁㻌㻤㻤㻚㻡㻌㻞㻚㻥㻌㻞㻜㻥㻌㻜㻚㻡㻠㻌䜰䝷䝙䞁㻌㻤㻥㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻠㻟㻚㻥㻝㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻤㻌䜾䝹䝍䝭䞁㻌㻝㻣㻚㻥㻌㻜㻚㻤㻡㻌㻥㻥㻚㻟㻌㻞㻚㻜㻌䜾䝹䝍䝭䞁㻌㻝㻠㻢㻚㻥㻠㻌㻪㻌㻤㻟㻚㻥㻞㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻞㻥㻌䜾䝸䝅䞁㻌㻡㻜㻚㻥㻌㻠㻚㻤㻌㻝㻟㻞㻌㻢㻚㻝㻌䜾䝸䝅䞁㻌㻣㻡㻚㻤㻝㻌㻪㻌㻞㻥㻚㻥㻝㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻣㻣㻌䜰䝇䝟䝷䜼䞁㻌㻞㻝㻚㻡㻌㻝㻝㻌㻡㻟㻚㻠㻌㻝㻝㻌䜰䝇䝟䝷䜼䞁㻌㻝㻟㻞㻚㻤㻤㻌㻪㻌㻣㻟㻚㻥㻜㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻤㻝㻌䝉䝸䞁㻌㻤㻥㻚㻣㻌㻟㻚㻥㻌㻡㻤㻚㻠㻌㻠㻚㻠㻌㻖㻖㻌㻙㻌㻝㻠㻚㻜㻌㻤㻚㻝㻌᳨㔞⥺㻌㻌㻹㻾㻹㻌䝖䝷䞁䝆䝅䝵䞁㻌㻔㼙㻛㼦㻕㻌⃰ᗘᖜ㻌㻔䃛㼙㼛㼘㻛㻸㻕 㻌䝣䜵䝙䝹䜰䝷䝙䞁㻌㻝㻢㻡㻚㻥㻝㻌㻪㻌㻝㻝㻥㻚㻥㻟㻌䝖䝸䝥䝖䝣䜯䞁㻌䝉䝸䞁㻌㻝㻜㻡㻚㻤㻤㻌㻪㻌㻡㻥㻚㻥㻡㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻥㻝㻌䝅䝇䝏䞁㻌㼚㻚㻌㼐㻚䝅䝇䝏䞁㻌㻞㻠㻜㻚㻥㻡㻌㻪㻌㻣㻟㻚㻤㻤㻌㻜㻚㻡㻙㻡㻌㻜㻚㻥㻥㻞㻝㻌䝠䝇䝏䝆䞁㻌㻞㻠㻚㻞㻌㻟㻚㻝㻌㻟㻜㻚㻥㻌㻟㻚㻢㻌䝠䝇䝏䝆䞁㻌㻝㻡㻡㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻝㻜㻥㻚㻥㻝㻌㻝㻙㻝㻜㻌㻜㻚㻥㻥㻟㻢㻌䝸䝆䞁㻌㻡㻞㻚㻡㻌㻜㻚㻠㻟㻌㻠㻠㻚㻜㻌㻜㻚㻢㻣㻌䝸䝆䞁㻌㻝㻠㻢㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻤㻟㻚㻥㻠㻌㻝㻙㻝㻜㻌㻜㻚㻥㻤㻞㻠㻌䜰䝹䜼䝙䞁㻌㻝㻝㻤㻌㻞㻚㻟㻌㻣㻠㻚㻡㻌㻝㻤㻌䜰䝹䜼䝙䞁㻌㻝㻣㻠㻚㻥㻤㻌㻪㻌㻢㻥㻚㻥㻤㻌㻝㻙㻞㻡㻌㻖㻜㻚㻥㻤㻝㻥㻌⃰ ᗘ 䛿 㻟 ᅇ ศ ᯒ 䛾ᖹ ᆒ ್ 䛷♧ 䛩䚹㻌㻖㻖㼚㻚㻌㼐㻚㻦㻌㻺㼛㼠㻌㼐㼑㼠㼑㼏㼠㼑㼐㻚㻌㻔䝢䞊䜽ᮍ ᳨ ฟ 㻕㻌

えなかったことが原因だと考えられる。同試料を，ク４．まとめロマトグラムのノイズが小さくなるMRMモード で分今回検討した分析条件により，試料の前処理なし析したところ，200倍希釈した麹汁培地ではシスチンのに， 1
試料全15分で20種類のアミノ酸を分析することピークは現れなかった。これらの結果から，この希釈が可能となった。実際の食品試料を含め，分析値の再倍率では麹汁培地中のシスチンは正しく検出されない

現性も比較的良好であった。特に清酒の苦味に寄与すことが示された。一方で，清酒サンプル中のシスチンるアルギニンは，GCでは分析できなかったが，LC/MSはSI
M，MRMモード ともに検出された。食品中のアミを用いた今回の分析条件により分析可能である。そのノ酸 濃 度に は 大 小が あ るた め，各ア ミ ノ酸 濃 度がため，本分析方法で得られる多成分データは，食品，LC/MSの検出範囲に収まるように，試料の希釈倍率を特に清酒の品質管理に大きく貢献できると考えられる。

考慮した方が，より正確な分析値を得られると考えら

今後，この分析条件を活用し，様々な試料のデータをれる。

蓄積していく予定である。

－99－

研究報告 №５（２０１５）
表４ SI
Rモード とMRMモード の比較㻖㯜Ồᇵᆅ㻌㻌Ύ 㓇 䝃䞁䝥䝹㻌㻹㻾㻹㻌㻌㻿㻵㻹㻌㻹㻾㻹㻌㻢㻢㻡㻌㻢㻞㻝㻌㻌㻞㻟㻥㻌㻞㻟㻞㻌䝖䝸䝥䝖䝣䜯䞁㻌㻝㻤㻚㻞㻌㻝㻥㻚㻢㻌㻌㻥㻚㻟㻤㻌㻥㻚㻜㻣㻌䝯䝏䜸䝙䞁㻌㻟㻚㻡㻡㻌㻟㻚㻡㻤㻌㻌㻟㻚㻤㻜㻌㻠㻚㻜㻤㻌䝏䝻䝅䞁㻌㻥㻞㻚㻡㻌㻥㻞㻚㻢㻌㻌㻡㻠㻚㻟㻌㻡㻡㻚㻣㻌䝻䜲䝅䞁㻌㻝㻠㻢㻌㻝㻠㻢㻌㻌㻤㻡㻚㻜㻌㻤㻠㻚㻤㻌䜲䝋䝻䜲䝅䞁㻌㻡㻝㻚㻢㻌㻡㻞㻚㻡㻌㻌㻟㻟㻚㻜㻌㻟㻟㻚㻠㻌䜰䝇䝟䝷䜼䞁㓟 㻌㻣㻥㻚㻠㻌㻤㻞㻚㻡㻌㻌㻟㻤㻚㻡㻌㻠㻟㻚㻞㻌䝥䝻䝸䞁㻌㻟㻣㻚㻣㻌㻟㻤㻚㻜㻌㻌㻝㻟㻠㻌㻝㻟㻠㻌䝞䝸䞁㻌㻣㻠㻚㻥㻌㻣㻢㻚㻣㻌㻌㻡㻤㻚㻟㻌㻡㻥㻚㻝㻌䜾䝹䝍䝭䞁㓟 㻌㻝㻢㻥㻌㻝㻣㻟㻌㻌㻝㻥㻤㻌㻝㻥㻥㻌䝇䝺䜸䝙䞁㻌㻡㻡㻚㻝㻌㻡㻣㻚㻞㻌㻌㻟㻝㻚㻡㻌㻟㻞㻚㻡㻌䜰䝷䝙䞁㻌㻤㻤㻚㻢㻌㻤㻤㻚㻡㻌㻌㻞㻝㻝㻌㻞㻜㻥㻌䜾䝹䝍䝭䞁㻌㻞㻜㻚㻡㻌㻝㻣㻚㻥㻌㻌㻝㻜㻝㻌㻥㻥㻚㻟㻌䜾䝸䝅䞁㻌㻡㻟㻚㻢㻌㻡㻜㻚㻥㻌㻌㻝㻟㻠㻌㻝㻟㻞㻌䜰䝇䝟䝷䜼䞁㻌㻞㻠㻚㻥㻌㻞㻝㻚㻡㻌㻌㻢㻝㻚㻝㻌㻡㻟㻚㻠㻌䝉䝸䞁㻌㻤㻤㻚㻥㻌㻤㻥㻚㻣㻌㻌㻡㻤㻚㻡㻌㻡㻤㻚㻠㻌䝅䝇䝏䞁㻌㻝㻚㻣㻡㻌㼚㻚㻌㼐㻚 㻖㻖㻌㻌㻝㻠㻚㻥㻌㻝㻠㻚㻜㻌䝠䝇䝏䝆䞁㻌㻞㻠㻚㻜㻌㻞㻠㻚㻞㻌㻌㻟㻜㻚㻤㻌㻟㻜㻚㻥㻌䝸䝆䞁㻌㻠㻢㻚㻞㻌㻡㻞㻚㻡㻌㻌㻠㻞㻚㻝㻌㻠㻠㻚㻜㻌䜰䝹䜼䝙䞁㻌㻝㻟㻢㻌㻝㻝㻤㻌㻌㻥㻣㻚㻡㻌㻣㻠㻚㻡㻌⃰ ᗘ 㻖㻌㻔㼜㼜㼙㻕㻌㻿㻵㻹㻌䝣䜵䝙䝹䜰䝷䝙䞁㻌⃰ ᗘ 䛿 㻟 ᅇ ศ ᯒ 䛾ᖹ ᆒ ್ 䛷♧ 䛩䚹㻌㻖㻖㼚㻚㻌㼐㻚㻦㻌㻺㼛㼠㻌㼐㼑㼠㼑㼏㼠㼑㼐㻚㻌㻔䝢䞊䜽ᮍ ᳨ ฟ 㻕㻌文献1)特開2000310626.
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