博 士 （ 医 学） 野 矢 洋 一
学 位 論 文 題 名デイーゼル排気粒子に含まれる心・血管作用原因物質の探索と単離、定量に関する研究
学位論文内容の要旨［背景と目的］ディーゼル 排気はディーゼルエンジンか ら排出されるガス状物質と 粒子状物質の混合物である。
これらは数 千種類もの有機化合物を含ん でいると言われ、都市部に おける環境汚染の主要因であると考えられている。ディーゼル排気粒子(
dieselexhaustpart
icles： DEP）による生物作用に関する多くの研究 がなされており、肺がん、ア レルギー性鼻炎、気管支疾 患、内分泌腺機能障害などの健康影響が 報告されている。しかし、こ れらの研究は、活性本体の特定も、DEPの十分な精製もないまま行わ れていたため、定量的評価を 困難にしていた。これらの 生物影響を定量的に評価し、DEPに よる 健康 被害 や環 境 に対 する 負荷 を検 討 する ため には 、 DEP中 の生 物 活性 物質を分離、同定し、それらの含有量を明らかにすることが不可欠である。
これまでの研究において、関らはヘキサン、ベンゼン、ジクロロメタン、メタノールを用いた連続的溶媒抽出とカラムクロマトグラフイーの繰り返しによる多段階分析法を開発し、ホルモン様作用を指標として多 くの化合物の同定に成功している。本分析法によって同定されたニトロフェノール類には強い血管拡張作用を有することが見出された。これらのニトロフェノール類のいくっかはエストロゲンおよび抗アンドロゲン作用を有していることも見出されている。同様にして、抗エスト口ゲン作用を 有す るヒドロキシ フタル酸類も見出されている 。これらの研究はDEP構成成 分の単離・同定がDEPの 健康に及ぼす影 響を検討する上でいかに有 効かつ有意義であるかを示し たものであった。
しかし、こ の多段階分析法は、各溶媒抽 出層に同一化合物が混入し ているなど単離に至る工程は複雑なもの であり、分析法としての効率、精度あるいは定量性に大きな問題を抱えており、ディー
ゼル排気に よる生体影響を定量的に評価することは依然として困難なままであった。このため、従来法に代わる、より簡 便かっ信頼性の高い新たな分析法の開発が必要であると 考えた。
従来法に よるこれまでの研究から、DEP成分は大きく1）中性画分 、2）弱酸性画分、そして3）強酸性画分 から成っていることが推察で きる。この考えに基づき新 規系統分析法として酸塩基抽出 法を 基軸とした分 析法の開発に着手することと した。本研究は、DEPの簡便 かつ定量的分析法を開発し、 従来法によって単離されていたDEP中のニトロフェノール類の定量を行うとともに、従来不可能であ ったガス成分中のニトロフェ ノール類の定量も行うことにする。さらにDEP中の生物活性 物質 の探 索も 行 い、 本分 析法 の有用性を確立 し、ディーゼル排気による生 物影響研究の進展に寄与することを目的とする。
［材料と方法 ］
1． DEPとガ ス成分
デ ィ ー ゼ ル 排 気 の 粒 子 状 物 質 (DEP)及 ぴ ガ ス 成 分 は 独 立 行 政 法人 国立 環境 研 究所 （茨 城県っくば市）に 採取を依頼した。
2．機器
使 用 し た ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 質 量 分析 計 (GC― MS)は、 島 津製 作所 製GCMS― QP2010であ り、Zebron ZB― 5msキャピラリカラム(0.25mmX 30m)を用いた。カラム温 度は80―250℃で分析を行つた。
‑ 15―

高速液体クロマト グラフイ(HPLC)ば、LC−10A（島津製作所）、使用したカラムはI
nertsil OD
S‑3（ 分 取 250X 20mm、 分 析 250X 4.6mm， GL Science)及 び Lobar Si 60 (250mmX10mm， MERCK)である。検出波長は254nmで行った。
1H―N
MRは、JEOLJNM―ECA500(500MHz)（日本電子）を使用した。
液体クロマトグラ フ質量分析計(LCーMS)は、 LCMS―2010A（島津製作所） でカラムはSh
im―pack
FC―ODS(150mmX 2mm、島津製作所）を使用した。
3．方法
DEPを 1ー ブ タ ノ ー ル (n― BuOH） に 溶 解 し 、 標 準 物 質 と し て 4― ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル―2，3，5，6−d4(pNP―d4)を添加して1晩攪拌した。得られたnーBuO
H溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウム(NaHC03)水溶 液、 10％ 水 酸化 ナト リウ ムく NaOH)水 溶 液で 順次 抽出 した 。NaHC03抽出液及びNaOH抽 出 液 は 塩 酸 で 中 和 後 、 そ れ ぞ れジ クロ ロメ タン で 抽出 して 、H20画 分、 NaHC03画分 、NaOH画 分 を 得 た 。 得 ら れ た 各 画 分 は 分 析 目 的 に 応 じ た ク ロ マ ト グ ラ フ ィ に 付 し た 。
［結果］
塩 基 抽 出 法 を 基 軸 とし た新 規系 統分 析 法を 開発 した 。 本分 析法 を用 いて DEP及ぴ ガ ス成 分の分析を行 い、以下の結果を得た。
1． DEPのニトロフェノール類をGC― MS測定に付した結果、DEP中 のニトロフェノール類が従来考えられ ていたものより有意に高濃 度であった。
2．従来 不可能であったガス成分中の ニトロフェノール類の定量にも成功し、予想以上に多量のニトロフ ェノーノレ類が含まれてし ヽることを明らかにした。
3．カ ルボ ン酸 層に 焦 点を 当て 新規 生物 活性物質の探索を行った。 その結果、8種類の新規化合物を 同定 し 、その内の4―メチルフタ ル酸と3―ヒドロキシー4―ニ トロ安息香酸に血管拡張作用があ ることを明らかにした。
［考察］
今 回 新 た に 開 発 し た 系 統 分析 法は 化合 物の 酸 性度 の差 を利 用し て DEP含 有 化合 物を 荒分 けし、各種のクロマトグラフイーによって分離、同定、定量を行うものである。本法によって、簡便なDEP分析が可能 となり、さらにガス成分にも応用することが可能であることが示された。その高い定量値から本法の分析法としての有用性が確認できた。
ニト ロフ ェノ ール 類は、強い生物活性を持つ 上、揮発性も比較的高いので DEPのみならずガス成分中の含有量 も求め、それらの総量によ る健康被害を評価しなければならなぃと考えられる。本
分析法によって 、DEP及びガス成分中のニトロフェノール類を精度よく分離し、同定・定量することができた。その 測定に際しては、ニトロフ ェノール類をメチルエステル誘導体に導きGC―MS測定に付すことにより 、直接測定に比しておよそ 100倍の高感度測定を可能と した。その結果、DEPに含まれるニトロフェノール類は従来法の結果から考えられていたものよりはるかに高濃度であることが明らかとなった。ガス成分中のニトロフェノール分析にも初めて成功し、これについても予想以上のニトロフェノール類が含まれていることが分かった。これらの結果は、ディーゼル排気中のニトロフェノー ル類の生体影響の評価に有用な知見を与えることができたものと思われる。
DEPに は 依然 とし て未 知の 生 物活 性物 質が 含ま れ てい る。 NaHC03画分を 焦点とし、新規の生物 活 性 物 質 の 探 索 を 行 っ た 結 果 、 8種 の 新 規 化 合 物 の 同 定 に 成 功 し 、 そ の う ち の 2種 に 血管 拡 張 作 用 を 見 出 し 、 定 量 し た 。 こ れ ら の 生 物 活性 は ニト ロフ ェノ ール 類 に比 して 弱い もの の 含 量 は 比 較 的 多 く 、 そ の 生 体 影 響 は 無 視 す るこ と がで きな ぃで あろ う と考 えら れる 。
［結論］
DEPの主成分は燃料の酸化物 であり、さらにその主体を なすものはフェノール類とカルポン酸類と 考 えら れて いる 。 以上 の結 果よ り、 こ れらの化合物 を効率よくNaOH画分とNaHC03画分に分画し、精度よく同定・定量できることを明らかにし、本分析法の有用性を確立することができた。さらに
今 回 得ら れた 分析 結 果は 今後 のデ ィー ゼ ル排気の生体 影響研究にとっていずれも重 要なものであった。
ディーゼル排気による生物 影響の研究は今後ますます重 要となると考えられ、本研 究はそれらに対して十分な寄与をもたらすものであることカミ期待できる。
ー 16−学位論文審査の要旨
主 査 教 授 関興 一
副 査 教 授 玉長 良
副 査 教 授 三 木 聡 一輪

学 位 論 文 題 名デイーゼル排気粒子に含まれる心・血管作用原因物質の探索と単離、定量に関する研究
ディーゼル排気は数千種類もの有機化合物を含んでいると言われ、都市部における環境汚染の主要 因であ ると考えられている。ディーゼル排気粒子(
dieselexhaustparticles：
DEP）による生物作用に関しては多くの研究がなされており、肺がん、アレルギー性鼻炎、気管支疾患、内分泌腺機能障害などの健康影響が報告されている。しかし、これらの研究は、活性 本体の 特定も、DEPの十分な精製もないまま行われていたため、定量的評価を困難にしていた。これまでの研究において、関らはヘキサン、ベンゼン、ジク口口メタン、メタノールを用いた連続的溶媒抽出とカラムクロマトグラフイーの繰り返しによる多段階分析法を開発し、いくつかの化合物の同定に成功している。しかし、この多段階分析法は、各溶媒抽出層への同一化合物混入を避けることができないため、単離に至る工程は複雑なものであり、分析法としての効率、精度あるいは定量性に大きな問題を抱えていた。このため、申請者は従来法に代わる、より簡便かつ信頼性の高い新たな分析法の開発が必要であると考えた。
従来 法 に よる こ れ まで の 研 究か ら 、 D
EP
成分 は大きく 1） 中性化合 物、2）弱酸 性化合物、そし て3）酸性化合物から成る混合物と見なせるものと推察した。この考えに基づき酸塩基抽出法を基軸とした新規系統分析法の開発に着手することとした。すなわち、溶媒の塩基性 の差（ 水、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム）を利用して、DEPを中性化合物、弱酸性化合物（フェノール類）、酸性化合物（カルボン酸類）に大きく分画し、各分画をクロマトグラフイーに付すとしゝうものである。DEP及びガス成分について本分析法を適用した 結果、 1）DEP中のニ トロフ ェノール類が従来考えられていたものより有意に高濃度であ ったこ と、2）従来不可能であったガス成分中のニト口フウノール類の定量にも成功し、予想以上に多量のニト口フェノール類が含まれていることを明らかにしたこと、
さらに3）カ ルポン酸 層からは 、8種類の新 規化合 物を同定 し、その 内の2種の化合物に血管 拡 張 作用 が あ るこ と を 明ら か に し たこ と 等 の成 果 を 得た 。以 上のよ うに、本 研
究 は 、 DEPに 含 ま れ る 生 物 活 性 物 質 を 精 度 よ く 分 離 、 同 定 で き る 系 統 分 析 法を開 発 し、 種 々 の生 物 活 性物 質 の分 析 に 成功 す るこ と に より 、 本分 析 法の有用性 を 確 認す る こ とが で き た。 さ ら に 今回 得 ら れた 分 析 結果 は今 後のデ ィーゼル 排
気 の 生 体 影 響 研 究 お よ び 評 価 に と っ て いず れ も有 益 なも の であ っ た。
学 位 論 文 公 開 審 査 は 、 平 成 21年 2
月 3日 午 前10時 10分 よ り医 学 部 臨床 大 講 堂に て― 17一

行われ た。主 査から紹 介があっ た後、 申請者はスライドを用いながら約15分に渡うて学位論文内容の発表を行った。その後、副査の玉木教授からディーゼル排気粒子の粒径やその吸収経路等についての質問があった。次いで副査の三輪教授からニト口フェノール類の血管作用とそのアッセイ法について、及び新規分析法と測定法に関して酸塩基抽出法の原理と意義、誘導体化測定の長所と短所等の質問があった。会場の出席者から測定データの再現性についての質問があった後、最後に主査から新規に単離した化合物の概要について、及び従来法と比較した新規分析法の長所についての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は自らの研究データや知見、過去の研究報告を引用し、将来的な構想も交えながら適切に回答した。質疑応答の時間は約15分間であった。
この論 文は、 数千もの化合物からなると言われるDE
Pの効率的新規系統分析法の開発を行うと共に、生理活性物質の単離を行い、その有用性を示したという点で高く評価され、今後の 環境汚 染原因物 質の探索 とその 評価に有益な手法を提供するものと期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

ー 18−