博 士（ 地 球環 境科 学） 木村真三
学位 論文題名Studies on DNA damage caused by metal‑binding
melanin having superoxide dismutase like activity（スーパーオキシドデイスムターゼ様活性を有する
金 属 結 合メ ラニ ンに よる D
NA損傷 に関す る研 究）

学 位論文゛内容の 要旨

メラニンは菌類から哺乳類までの広い範囲に存在する黒色、赤褐色あるいは黄色の色素であり、その構造は5，6−ヒド口キシインドールが無秩序に高分子構造をとっているものである。このうち、ヒトの皮膚や毛髪中に存在するユーメラニンは、スーバーオキシドディスム
夕一ゼ （SOD）様活 性を有す ることが古くから知られており、その生理学的役割は、紫外線等に対する生体防御を担っていると考えられている。このユーメラニンの合成経路は銅依存性酵素であるチ口シナーゼによるドーバの酸化により引き起こされる。悪性黒色腫はこのチ口シナーゼの活性異常が原因で起こると考えられており、その細胞内では通常と比べ高い濃度で銅の存在が確認されている。
一方、脳内の黒質緻密層に多く存在しているニュー口メラニンは、その合成経路がューメラニンと異なり、黒質細胞で産生されたド―パミンが自動酸化することにより非酵素的に生成され る。この ニューロ メラニン の生理学的 役割は明 確にされ ておらず 、SOD様活性 を有しているのか否かについても明らかにされていない。このように、脳内のニュー口メラニンに関しては不明な点が多く残っている。近年、このニュー口メラニンに重金属が結合していることが報告され、パーキンソン病患者の黒質細胞での鉄の異常蓄積との関連性が議論されている。これら合成経路の異なるメラニンに於いて、結合する重金属の種類によって様々な障害の起こりうる可能性が考えられた。しかし、メラニンに結合している重金属種の差によるスー パーオキ シドアニ オン（02―）除去作用及びDNA損傷能の違いに関する研究はこれまで行われていない。
そこで、本研究では金属と結合していないニューロメラニン（ドーバミンメラニン）及び、銅、亜鉛、鉄等の重金属と結合したニューロメラニン（金属結合メラニン）を合成し、それら金属結 合メラニ ンによる ドーバミ ン存在下で のDNA損傷能 を調べる と共に、 これまで メラニンの生理学的役割とされてきたスーバーオキシドディスムターゼ様活性との関連性を併せて検討した．
金 属 と 結 合 し て い な い ド ー パ ミ ン メ ラニ ン の 合成 は 、5mMド ー バミ ン 溶液 （50mM
Tris pH7.4）を72時 間撹拌す ることに より得ら れた。また 、金属結合メラニンの合成は、10 mMド ー バ ミン 溶 液中 に 10 mM塩 化鉄 （ III）、 10 mM硫 酸 銅（ II)及 び10 mM塩化 亜 鉛（II）の各溶液を添加し、同様に24時間撹拌することにより得られた。未反応の重金属は濾過後、塩酸で洗浄することにより取り除いた。調製した金属と結合していないドーパミンメ

ラニン及び金属結合メラニンは赤外吸収スベクトル法により同定した。金属と結合していな
いドー パミ ンメ ラニ ン及 び金 属結合メラニンの溶液化は、5M水酸化ナトリウム溶液により溶解し た後 、そ れぞ れの メラ ニン 溶液 を2Mリン 酸溶 液で pH 7.8に調 製し た。 金属 結合 メ
ラニン中に存在する結合金属量は原子吸光分析装置により測定した。また、金属結合メラニン溶液にキレート剤を添加することによルメラニン濃度一定の状態で金属量だけを変化させた。金属結合メラニン及び金属と結合していないドーパミンメラニンによるDNA損傷能は、結合メラニンあるいは等濃度のドーパミンメラニンと共に37℃で1時間反応させ、アガ口ース電気 泳動 法に より 検討 した 。SOD様活 性は Beauchampら （1971）の 方法 に基 づき 、キ サ
ンチンーキサンチンオキシダーゼ系により発生した02−が、二ト口ブルーテ卜．ラゾリウムを還元する ことに よルフ ォルマ ザンに なるこ とを利 用して 測定した。
その 結果 、金 属と 結合 して いな いド ーバ ミン メラ ニン 及び金属結合メラニンが、SOD様活性を有することが明らかとなった。この結果より、反応速度論的解析解析を行った結果、SODと 金属 結合 メラ ニン の02ーの消 去能 を比 較し た場 合、 金属 結合 メラ ニン 中で 一番 SOD
様 活 性 の 高 か っ た Cu− メ ラ ニ ン は SODに 比 べ て 約 1/10000程 度 の 活 性 を 有 し て い た 。
金属 結合 メラ ニン 中に 結合 する 金属 種あ るい は、 金属 量の変化に対するSOD様活性の変化は、Cu−メラニン及びFe−メラ ンは金属と結合していないドーバミンメラニンの02−の消去能 に比 べ高 いこ とが 示さ れた。この活性はCu‑メラニン及びFe‑メラニンの中に存在する結合重金属量に比例して増加することが明らかになった。なお、Zn−メラニンの02―の消去能は Zn含 有量 に関 係な く一 定であったことより、Znーメラニンの02―の消去能は金属と結合し てい ないド ーパ ミンメ ラニ ンその もの に依存 して いると 考えられた。
一方 、ド ーパ ミン 存在 下で の金 属結 合メ ラニ ンに よる DNA損傷能は、Cu―メラニン及びFe― メ ラ ニ ン に 於 い て 確 認 さ れた 。し かし 、Zn‑メ ラニ ン及び ドー パミ ンメ ラニ ンで はDNA損 傷が 認め られ なか った 。更に Fe― メラ ニン では 、ド ーバミン存在下に比ベ過酸化水素存在 下の 方が より 強い DNA損傷能 を示 した 。特 に、 Cu― メラ ニン では 10 uMと低 濃度 のドーバ ミン から DNA損傷 を起 こし、 また Fe− メラ ニン では 、1000 uMと高 濃度 にド ーバ ミンを添 加し たと きの みDNA損 傷が確 認さ れた 。更 にFe−メ ラニンでは、ドーバミン存在下より過 酸化 水素 存在 下の 方が より 強い DNA損 傷能 を示 した 。こ れら のDNA損傷 はカ タラ ーゼ、ア ジ化 ナト リウ ム、 マン ニトールにより抑制されたことから、過酸化水素由来の．OH
もしく は． OHに 類似 した ラジ カル種あるいは一重項酸素が関与していることが明らかになった 。 ま た 、 SODに よ り DNA損 傷が 抑制 され なか った こと から 02− によ る， 直接 的な DNA損傷はないことが示された。
以上の結果からCuーメラニン及びFe一メラニンは、それぞれの重金属が結合することにより金属と結合していないドーバミンメラニンと比べ02―の消去能が上昇するにも関わらず、ドーバ ミン 存在 下で 02― 以外 のラ ジカ ルを 放出 して より 強いDNA損傷を示すことが明らかになった。近年、悪性黒色腫細胞中の銅の蓄積及びバーキンソン病の黒質細胞での鉄の異常蓄積等が報告されているが、これらの報告と本研究の結果を合わせて考えると、生合成されたニュ ーロ メラ ニン がこ れら 銅ま たは 鉄と 結合 する こと により、この細胞内でDNA損傷を引き起こすことが予想され、この疾病の病因となりうる可能性が示唆された。またユーメラニンに於いては、蓄積した銅がユーメラニンと結合することから、悪性黒色腫の病因のひとっとなり得るのではないかと考えられた。
本研究の成果は、バーキンソン病あるいは悪性黒色腫の発現機序の解明に貢献するものと期待される。

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学 位 論 文 審査 の 要 旨
主査
副査
副査
副査

正剛教授

東教授

岩熊敏

夫教授

田村守（電子科学研究所）

助教 授

新 岡正

学位論文題名
Studies on DNA damage caused by metal‑bindingヽ．
melanin havlngSuperOXldediSmutaSelikeaCtiVity（スーパーオキシドデイスムターゼ様活性を有する
金 属結 合 メ ラニン による DNA損傷 に関す る研究 ）生体内にはメラニンとして、主としてニューロメラニン、ユーメラニン及びフェオメラニンが存在する。ユーメラニンとフェオメラニンは、人では皮膚や毛髪中に存在し、スーバーオキシドアニオン除去作用（スーバーオキシドディスムターゼ（SOD）様活性）を有していることが知られており、紫外線等に対する生体防御を担っていると考えられている。一方、ニ
ユー口メラニンは、脳内の黒質緻密層に多く存在しているが、その生理学的役割は明確にされていなしゝ。近年、このニューロメラニンに重金属が結合していることが報告され、パーキンソン病患者の黒質細胞での鉄の異常蓄積との関連性が議論されている。これらのメラニンが、結合する重金属の種類によって様々な生体影響を有する可能性が考えられるが、メラニン に結 合し てい ，る重 金属 種の 差に よる SOD様活性及び、DNA損傷能に関する研究はこれまで行われていない。本研究は、二ユーロメラニン（ドーバミンメラニン）及び、Cu，Fe，Znの重金属と結合したニューロメラニン（金属結合メラニン）を合成し、これまでユーメラニン とフ ェオ メラ ニンの 生理 学的 役割 とさ れて きた SOD様 活性 がニ ュー ロメラニンにも存在するのか否か、また、結合する各重金属種によって活性がどのように変化するのかを調べると とも に、 それ ら金属 結合 メラ ニン によ るド ーパ ミン 存在 下で のDNA損傷能を検討したものである。
本論 文は 、導入部とそれに続く3章から構成されている。導入部ではメラニンの一般的特徴 を概 説し ている。第1章では合成したドーバミンメラニン及び金属結合メラニンの化学的特性について赤外線吸収スベクトル分光法及び紫外線吸収スベクトル分光法を用いて検討している。金属と結合したドーパミンメラニンについては、金属結合部位を明らかにし、また、金 属種 の異 なる 場合の 結合 状態 の違 いに ついて、Fe‑メラニン中のFeイオンのみが3価で結合してい ることを はじめて 明らかにし ている。
第2章 では、反 応速度論 的解析結果 を述べて いる。す なわち、 これまで 報告がな かった
NBTによ る反応速 度論的解 析法に取り 組み、こ れを初め て確立す ることに より、従 来問題となって いた酵素 反応を阻 害する系においても簡便な方法で第2次反応速度定数を求めることが可能となることを示している。この方法を用いてド―パミンメラニン及び金属結合メラ
ニン のSOD様活性 を検討し た結果、ド ーバミン メラニン 及び金属 結合メラ ニンのS〇 D様活性に関し て、Cu―メ ラニン及 びFe‑メラニンではドーパミンメラニンの02一消去能に比べ、より高くなることを明らかにしている。また、この活性はCu‑メラニン及びFさーヌラニン中に存在す る金属量 に依存し て直線的に 増加する ことを示 している。なお、Zn−メラニンの02一消去能 はZn含有量 に関係な く一定であ ったこと より、Zn−メラニンの02一消去能はメラニンそ のものに 依存して いることを 明らかに している 。
第3章 では、Cu， Fe，Znの重金 属と結合し た金属結 合メラニ ンによる ドーパミ ン存在下での DNA損 傷能 に つい て 述 べて い る。 す な わち 、 ドー パ ミ ン存 在下でCu− メラニン 及びFe−メ ラニンに よってDNA損 傷が生じ、 一方、Zn− メラニン 及びドー バミンメ ラニンで はDNA損傷 が認めら れないこ とを明らか にしてい る。特に 、Cu−メラ ニンでは ドーパミ ン濃度 が 10ロ Mと い う低 濃 度 の場 合 でも DNA損 傷を 起 こし 、 ま たFe‑メ ラ ニン で は、 10 00UMと高濃度 のドーパ ミンを添 加した場合にDNA損傷が生ずることを明らかにしてしゝる。更にFe−メ ラニンで は、ドー パミン存在 下ではDNA損 傷を起こ さない条 件である 低濃度の Fe含有量 における 過酸化水 素存在下で DNA損傷能が 引き起こ されるこ とを明ら かにして いる。
これ らのDNA損傷 はカタラ ーゼ、アジ 化ナトリ ウム、マ ンニトー ルにより 抑制され たことから、過 酸化水素 あるいは 一重項酸素 由来の． OHもしくは ．OHに類似したラジカル種の関与が 示 唆 され る こと を 述 べて いる 。また、 SODによりDNA損 傷が抑制 されなか ったこと から 02― に よ る 直 接 的 DNA損 傷 は な い と 推 察 さ れ る こ と を 述 べ て い る 。
これを要するに、Cu―メラニン及びFe−メラニンは、それぞれの重金属が結合することによルドーパミンメラニン単体と比ベ高い02一消去能を獲得するにも関わらず、ドーバミン存
在 下 で よ り 強 い DNA損 傷 を 引 き 起 こ す こ と を 明 ら か に し て い る 。 、これらの 研究成果 は、パー キンソン病 発症機序 の解明の 一助となるものと期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、また申請者が研究者として誠実かつ熱心であり、大学院課程に於ける研鑽や取得単位なども併せ、博士（地球環境科学）の学位を受けるのに十分 な資格を 有するも のと判定し た。