博士（医学）松井裕

学位論文題名BlockadeofTcell costimulatoty signals using adenovirus
vectors prevents both the induction and the progressionof experimental autoimmune myocarditis（ T細 胞 活 性 化 補 助 シ グナ ルの 遮断 によ る
実験 的自 己免疫 性心 筋炎 の治 療効 果の 検討）

学位論文内容の要旨
I． 背 景ヒト心筋炎は若年者の突然死の主要死因のーつであり、しばしばコクサッキーウイルスによる感染がその原因と考えられる。ウイルス性心筋炎の病態は完全にはわかっていないが、心臓の抗原特に心筋ミオシンに対する自己免疫機序がその進展に関与していると考えられている。ルイスラットを心筋ミオシンで感作すると多核巨細胞の出現と極めて重症な心病変を特徴とする実験的自己免疫性心筋炎(EAM)を発症することが報告されている。EAMの急性期の心病変はヒト巨細胞性心筋炎及びヒトウイルス性心筋炎に類似し、又、その慢性期には拡張型心筋症に類似した心病変をきたすことから、ヒト巨細胞性心筋炎、ヒ卜ウイルス性心筋炎、拡張型心筋症の疾患モデルと考えられる。EAMは抗原感作ラットのT細胞を正常同系ラットに移入することにより疾患転嫁が可能であることよりT細胞依存性の自己免疫性疾患であることが報告されている。
一方、T細胞活性化にはT細胞レセプターを介した主要シグナルと補助シグナルが必要であり、主要シグナル単独ではT細胞は活性化せずアナジーに陥ることが知られている。
複数の補助シグナルが存在する中で、T細胞上のCD28、CD40Lと抗原提示細胞上のB7、CD40を介 した シグ ナル が重 要とさ れて いる 。キ メラ 蛋白 であ るCTLA4IgはCD28と B7によ る補 助シ グナ ルを 阻害することが報告されており、同様にCD40IgはCD40LとCD40による補助シグナルを阻害すると考えられるが、EAMにおけるこれら経路の遮断による治療効果の報告はない。効果的にこの経路を遮断する目的で我々はC
TLA4Ig、CD40Igを組み込んだアデノウイルスベクターAdexCTLA4Ig、Adex
CD40Igを作成した。以前我々はAdexCTLA4Igのマウス静脈内投与により高濃度のCTLA4Igが長期間産生されることを報告している。
II． 目 的AdexCTLA4Ig、AdexCD40Igを用いて、免疫時同時投与あるいは発症後投与におけるEAMの治療効果とその有効性の機序を検討すること。
III. 方 法
1） AdexCTLA4Ig及ぴ AdexCD40Igを ルイ スラ ヅトに静脈内投与した際のCTLA4Ig及びCD40Igの血 中濃 度をELISA法で測定した。2）心筋ミオシンとCFAを混和したものをルー 418―

イス ラッ トに皮 下注 してEAMを作成した。3）EAMの心臓における各共刺激分子の発現を RT‑PCR法 、 免 疫 染 色 法 に よ り 確 認 し た 。 4） 治 療 実 験 で は 、 免 疫 と 同 時 にAdexCTLA4Ig(CTO群）、AdexCD40Ig(CDO群）、または対照としてAdexLacZ(EAM群）を静脈内投与した。免疫21日後（炎症極期）に犠牲死させ肉眼的検討、心体重比測定、組織学的検討を行い重症度の評価を行った。又、有効性の機序を調ぺる目的で、各群における5）
RPA法及ぴELISA法による心組織中サイトカイン測定、6）ELISA法による血中抗ミオシ
ンIgG1、IgG2a抗体価測定、7）サイミジン取り込みによる抗原特異的リンバ球増殖能測定、8） E
LISA法による抗原特異的リンバ球サイトカイン産生能測定を行った。9）更に、発症後の治療効果の検討として、Adex
CTLA4Ig(CT14群）、AdexCD40Ig(CD14群）、またはAdexCTLA4Igと AdexCD40Igの併用(CT14+CD14群）の免疫14目後投与による治療効果の検討も行った。
IV. 結 果1） AdexCTLA4Ig及ぴAdexCD40Igをラットに静脈内投与二した際のCTLA4Ig及ぴCD40Igの血中濃度はいずれも100ルg/ml以上の高濃度を示し投与後21日後においても維持されていた。2） EAM群の心臓では肉眼的には心臓の腫大と心臓表面の変色、組織学的には多数の炎症性細胞浸潤を伴う広範な心筋壊死像が観察された・。3） RT‑
PC
R法により心臓におけ るB7‑1、 B7‑2、CD28、 CD40、CD40Lの mRNAレベ ルで の発 現は 、正常 対照 群と比較するとEAM群においヽて有意に亢進していた。また免疫染色法によるB7‑1、B7‑2、CD40のEAM群の心臓における発現は、多数の浸潤した炎症細胞とその周囲の少数の心筋細胞にも認められた。4） AdexCTLA41g、AdexCD40
Ig治療群では、免疫と同時に投与すると、肉眼的検討、心体重比測定、組織学的検討いずれにおいてもほば完全に心筋炎の発症を抑制した。5）心組織中サイトカイン産生の検討では、正常対照群と比較してEA
M群ではIL‑
1p、IL‑6、TNF‑a、IFN‑ア、IL‑10などの各種サイトカインの増加が認められ、CTO、CDO群ではその増加が抑制されていた。6）血中抗ミオシンIgG
1、I
gG2a
抗体価測定では正常対 照群 と比 較し てEAM群ではIgG2a/IgGl比の増加が認められ、CTO、CDO群ではその増加が抑制されていた。7）抗原特異的リンバ球増殖能測定では、正常対照群と比較してEAM群で抗原量依存的に増殖能の増加が認められ、CTO、CDO群ではその増加が抑制されていた。またその際のConAに対する反応性は各群で同程度に保持されていた。8、抗原特異的リンバ球サイトカイン産生能測定ではIFN‑
ア、TNF‑
口の産生は正常対照群と比較してEAM群 で抗原 量依 存的に産生の増加が認められ、CTO、CDO群ではその増加が抑制されて おり これ らサ イトカインのEAMの発症における重要性が示唆された。91又、免疫14日後投与（発症後）における治療効果の検討では、EAM群と比較して各群とも完全ではな
い が有 意に 治療 効果 が認 めら れ、 特にCD14群 より もCT14群 及び CT14+CD14群において 有 効 で あ っ た が 、 CT14群 と CT14+CD14群 間 で 差 は 認 め ら れ な か っ た 。
V． 考 察本 研究に より 、AdexCTLA4Ig、 AdexCD40IgによるEAMの治療効果が示された。その治療効果は免疫と同時に投与するとほぼ完全に発症を抑制した。EAM群と比較してCTO、CDO群では心臓における炎症細胞浸潤とひき続く各種サイトカインの産生、血中抗ミオシ ン抗体 産生 がほぽ完全に抑制されおり、又、EAM群と比較してCTO、CDO群では抗原特異的リンバ球増殖能の増加が抑制されているー方で、ConAに対する反応性は各群で同程度に保持されていたことより、その有効性の機序は抗原特異的なT細胞のアナジーであ ること が示 唆された。更にEAMにおいて炎症が始まるとされる12日目以降の投与でも 、特に AdexCTLA4Ig又は AdexCTLA4Igと AdexCD40Ig併用投与により有意な治療効果が 認 め ら れ 、 心 筋 炎 の 治 療 に 対 す る 本 法 の 臨 床 的 有 用 性 が 示 唆 さ れ た。

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 小 野 江 和 則
副 査 教 授 北畠顕副 査 教 授 上出 利 光

学位論文題名BlockadeofTcellcostimu
latotysl
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S
VeCtorSpreVentSboththeinduCtionandtheprogreSSion
OfeXperlmentalautoimmunemyOCarditiS（ T細 胞 活 性 化 補 助 シ グ ナ ル の 遮 断 に よ る
実 験 的 自己 免 疫性 心 筋 炎の 治 療効果 の検討）

心筋炎は 若年者の 突然死の 主要死因 のーつで あり、有 効な治療法 が確立さ れていな い疾 患であ る。ルイ スラット を心筋ミ オシンで 感作する と、多核巨 細胞の出 現と極め て重症 な心病 変を特徴 とする実 験的自己 免疫性心 筋炎(EAM）を 発症するこ とが報告 されている 。 EAMは巨 細 胞 性心 筋 炎、 ウ イ ルス 性 心筋 炎 、 拡張 型 心筋 症 の 疾患 モ デ ルと 考 えら
れ 、 又 、 T細 胞 依 存 性 の 自 己 免 疫 疾 患 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。
一方 、抗原特異 的な1細胞 活性化に は11細胞レ セプター を介した主要シグナルと補助シグナ ルが必要で あり、主 要シグナ ル単独で はT細胞は 活性化せ ずアナジーに陥ることが知られ ている。複数の補助シグナルが存在する中で、B7/
CD28、CD4（）／CD
40Lのシグナルが重 要と さ れ てい る 。 キメ ラ 蛋白 で あ るCmA41gはB7と CD28によ る補 助シグナル を阻害す
る こと が 報 告さ れ て おり 、 同様 に CD401gはCD40とCD40Lによ る補助シ グナルを阻 害すると 考えら れるが、 B丶Mにおけ るこれら 経路の遮 断による 治療効果の 報告はな い。アデ ノウ イル ス ベ クタ ー AdexCmA41g、 AdexCD401gは 効 果的 に こ れら の経 路を遮断 することが可 能と考 えられる 。本研究 は、B｀Mの 発症機序 の解明と 、新たな治 療法の開 発を目的 とし て、AdexCrIA41g、 ALdexCD401gを用いた 1細胞活性 化補助シ グナルの 遮断によ る郡心Hの治 療効果とそ の有効性 の機序の 検討を行 っている 。
AdexCTLA41gまたはAdexCD401gを ラットに 静脈内投 与した際 のCTIーA41g、CD401gの 血中 濃度 は い ずれ も 100ルヴ ml以 上 の高濃 度を示し 、投与21日 後において も維持さ れていた 。B丶M群 では肉眼 的には心 臓の腫大 と心臓表 面の変色 、組織学的 には多数 の炎症性 細胞浸 潤 を伴 う 広 範な 心 筋壊 死 像が観 察された 。AdexCTLA4Igまたは AdexCD40Igを免疫と同時に投 与する治療 群（それ それCTO群、CDO群）では、肉眼的検討、心体重比測定、組織学的検討 いずれにお いてもほ ぼ完全に 心筋炎の 発症を抑 制した。 心組織中サ イトカイ ン
産生 の 検討 で は 、正 常 対照 群 と 比較 し て EAM群 で はILrlp、IL‑6、TNF‑a、 IFN‑ア、ILr10などの各 種サイトカ インの増 加が認め られ、CTO丶 CDO群ではそ の増加が 抑制されて いた 。 血 中 抗 ミ オ シ ン IgG1、 IgG2a抗 体 価 測 定 で は 正 常 対 照 群 と 比 較 し て EAM群 で はIgG2a/J[gG1比の増加 が認められ 、CTO、CDO群で はその増 加が抑制されていた。抗原特異的リンノ ヾ球増殖能 測定では 、正常対 照群と比 較してEAM群 で抗原量依存的に増殖能の増加が 認 めら れ 、 CTO、 CDO群で は そ の増 加 が 抑制 さ れて い た。 またその 際のConAに対する反応性 は各群で同 程度に保 持されて いた。免 疫後14日目 投与にお ける治療効 果の検討で は (CT14群 、CD14群 XEAM群 と比 較 し て各 群 とも 完 全 では な い が有 意 に治 療 効 果が 認め ら れ た 。 特 に CD14群 よ り も CT14群 及 ぴ AdexCTLA4Igと AdexCD40Igの 併 用 投 与 群(CT14+CD14群 ）に お い て有 効 であった 。CT14群とCT14+CD14群 間で統計 的有意差 は認められなか った。
こ れら の 実 験結 果 か ら、 AdexCTLA4Igま たはAdexCD40Igは免 疫と同時 に投与す るとほぼ完全に EAMの発症を抑 制し、又 、その有 効性の機 序は抗原 特異的な11細胞のアナジーであ る こ と が 示 唆 さ れ た こ と 、 更 に 、 発 症 後 の 投 与 で も 、 特 に AdexCTLA4Ig又 はAdexCTLA4Igと AdexCD40Igの 併 用投与によ り有意な 治療効果 が認めら れ、心筋 炎の治療に対 する 本法 の臨 床 的有 用性 が示 唆 され たこ とを 考察 し てい る。
学 位論 文 の 公開 発 表 に際 し て副査の 上出教授 からEAMの発 症機序に 関してと、 他の薬剤に よ る治 療 実 験と の 比較 に ついて 、副査の 北畠教授 からはAdexCTLA4Igと AdexCD40Igの治療効 果の相違と 、臨床応 用する際 の問題点 について 、主査の 小野江教授 からは発 症後投与に おけるAdexCTI．A4Igと AdexCD40Igの治療効 果の相違の機序と、マウスにおけるEAMモ デ ルに つ い ての 質 問が あ ったが、 申請者は 実験結果 に基づい て、また文 献的知識を駆使し て誠実かつ 、概ね適 切に回答 し得た。
本 研究 は 、 AdexCTLA4Igま たは AdexCD40Igが心筋炎 の新たな 治療法の ーっと成 りうる
可能性を 持つことを 明らかと し、臨床 応用ヘ向 けての展 開に重要 な寄与をし うるもの と評価され る。
審査員一 同は、申請 者の豊富 な学識に 併せて、 この研究 が心筋炎 治療の進展 に与える成果を評 価し、申請 者が博士 （医学） を受ける に十分な 資格を有 するものと 判定した 。