博 士 （ 医 学 ） 陳

欽 忠

学位論文題名．Signifi
canceofCO
X‑2Ex
pressioninHum
anRenalC
ellC
arcmomaCellLines（ヒト腎臓細胞癌株細胞におけるCOX‑2発現の意義）

学位論文内容の要旨
シクロオキシゲナーゼ(cOx)
は、アラキドン酸からプロスタグランディンが合成される過程を制御する酵素で、炎症反応に関与することが知られている。cOxには2っのIsoformが知られており、そのうちCOX‑1は、多くの組織で発現しており消化管組織の粘膜保護作用や腎血流を維持するといった生体の恒常性に強く関わる酵素とされている。一方、COX―2は、正常組織ではほとんど発現していないにも関わらず、細胞の増殖、成長因子、サイトカイン、発癌物質の投与など種々のストレスにより誘導される酵素である。さらにcOxー2は、疼痛や発熱に際し、過剰のプロスタグランディン合成を引き起こすとされる。さらに、Cox―2は、．近年の研究から、癌腫の発生・増殖・進展・転移において重要な役割を果たしていることも明らかになってきた。しかし、COX−2の発現と腎臓細胞癌(RCC)との関係については明らかではない。本研究ではヒト腎細胞癌株におけるCOX‑2の発現を解析するとともに、ヒト腎細胞癌の増殖・アポトーシス・造腫痔陸・血管新生における役割を検討した。
本研究では、細胞株としてヒト腎癌細胞株(
OS―R
C―2，SMKTーR4，ACHN)、正常尿細管上皮細胞(
RPTEC)、またC
O
X−2発現コントロール細胞株として、ヒト膵臓癌細胞株(
BxPC一III)を用いた。
［方法と結果］
l．ヒト腎細胞癌細胞株におけるcOx
一2の発現：COX―2の発現はR
T‑PCRとWesternblotにより検討した。その結果、RT一PCRからcOx一2mRNAは0SーRC−2で強く増幅していたが、他の腎細胞癌細胞株（SMKT刑，ACHN）およびと正常尿細上皮細胞RPTECでは、増幅を認めなかった。一方W
esternb10t
解析においても、cox12蛋白質の発現増強はmRNAと同様、0S―RC一2のみで認めた。
2．ヒト腎細胞癌細胞株の増殖に対するCOX一2阻害剤の効果：C0ト2の選択的阻害剤N
s398を用い、ヒト腎細胞癌細胞株の増殖へのNS
398の効果をM
TTassayを用い解析した。細
胞増殖曲線よりNS
398は全ての腎細胞癌細胞株で濃度依存性に増殖抑制を引き起こしたが、CO
X−2発現の有無とは関係がみられなかった。一方、正常尿細管上皮細胞では、腎細胞癌細胞株より低濃度で増殖が抑制された。腎細胞癌細胞株におけるCO
X−2阻害剤による細胞増殖抑制に関わる因子を検討するため、NS398投与によルリン酸化が抑制されるAktの発現を検討した。しかし、Akt，リン酸化Aktの発現には細胞間で差を認めなかった。
3．Invitroでの腎細胞癌 細胞株の増殖におけるCOX―2発現の影響：腎癌細胞癌細胞株に対するCO
X−2発現の細胞増殖に対する直接的な効果を検討するため、COX
一2センス遺伝子とアンチセンス遺伝子を作成し、これらを組み込んだプラスミドベクターを用い、― 591ー腎細胞癌細胞株(OS−RC−2，SMKT−R4)に遺伝子導入した。その結果、cOxー2アンチセンスの 遺伝子導 入によ りinvitroの 細胞増 殖は、 COXー2発現細胞株OS一RC―2で有意に抑制され たが、非 発現株 SMKT−R4で はほと んど抑 制され なかった 。一方 、COX−2
センスの遺伝子 導入によ り、SMKT−R4では 有意に 増殖が 促進されたのに対し、OS−RC−2における効果は わ ず かで あ っ た 。こ れ ら の点から 、腎細 胞癌細 胞株の 増殖に COX―2の発 現が強 く関わ っている ことが 示され た。
4．、 COX−2発 現細胞 腎細胞癌株におけるcOx―2センス、アンチセンスを定常的に発現するトラ ンスフェ クタン トの作 成：COX一 2発現細 胞腎細 胞癌株 におけ るCOXー2の役割を明確にす る た めに 、 COX― 2セ ンス 、ア ンチセ ンスを 定常的 に発現 するトラ ンスフ ェクタ ントを 作成 した。 作成し たCOX‑2セン ス・ト ランス フェク タント 、cOx―2ア ンチセ ンス・ トラ ン ス フェ ク タ ン トに お い て 、COX− 2セ ン ス 、ア ン チセン スの発 現はReal‑timePCRと Westernblotを 用 い て 確認し た。さ らにCOX― 2の酵素 活性を 確認す るため に、PGE2の 産 生 をこ れ ら ト ラン ス フ ェクタン トにお いて解 析した 。その 結果、 COX―2の発 現とPGE2の 産 生 は相 関 し て おり 、こ れらト ランス フェク タント ではcOx− 2センス 、アン チセ ン ス が、 機 能 的 にも 安 定 している ことが 確認さ れ以下 の実験 に用い ること とした 。
5．OS− RC→2細 胞およ ぴcOx−2セ ンス・ トラン スフェ クタント 、COX― 2アンチセンス・トラン ス フ ェク タ ン ト にお け る アポトー シスの 検討： アンチ センス トラン スフェ クタン ト
で は 、 親細 胞 株 と セン ス ト ランスフ ェクタ ントと 比べ、 酪酸塩 による アポト ーシス の増 加 が 認め ら れ た 。こ の 点 からCOX― 2アンチ センス によル アポトー シスが 誘導さ れる
こ と、逆に いえば COX−2は OS−RC−2の アポト ーシス回避に関与していると考えられた。
6．OS− RCー2細 胞およ びcOx一2セ ンス・ トラン スフェ クタント 、cOxー 2アンチセンス・トラン ス フ ェク タ ン ト にお け る ヌードマ ウスで の造腫 瘍性・ 血管新 生・生 存期間 の解析 ：こ れ ら 細胞 を ヌ ー ドマ ウ ス 皮 下に 移 植 し 、腫 瘍 の Invivoに おける 増殖動 態を解析 した 。その結 果、OS―RC一2ア ンチセ ンス・ トランスフェクタントの増殖は、親株．cOx−2セ ン ス ・ト ラ ン ス フェ ク タ ントに比 べ有意 に抑制 された 。また 、生存 期間自 体もア ン
チ セ ン ス・ ト ラ ン スフ ェ ク タントを 移植さ れたヌ ードマ ウスは 、他の 細胞を 移植さ れた も の とく ら べ 有 意に 長 か った。ヌ ードマ ウスで の腫瘍 形成に は、細 胞自体 の増殖 以
外 に 血 管新 生 も 関 与し て い る可能性 がある ため、 これら ヌード マウス 移植腫 瘍を摘 出し 、 microvesseldensityを 測 定す る こ と で血 管 新 生を 解析した 。その 結果、 アンチセ ンス ・ ト ラン スフェ クタントは 、有意に 血管新生 が抑制さ れていた 。
［ ま とめ ］本研 究から 、いく っかの 腎細胞 癌では COX‑2の発現 が亢進 してい ること 、そし てCOX―2発現腎細 胞癌細 胞株で は、COX− 2の発現 亢進が これら 細胞の 増殖・アポトーシス回避
機 構 ・血 管 新 生 に大 き く 関 わっ てい ること が明ら かにさ れた。し かし、 COX一2選 択的阻 害剤 で は 、 こ れ ら を 抑 制 す るに は 不 十 分で あ り 、 COX‑2ア ン チセ ン ス の 遺伝 子 導 入 によ りcOxー2の発現自 体を抑 制する ことが 必要で あるこ とが示 された 。これら の点からCOX一2の発現 は腎 細 胞 癌の 癌 腫形 成において 重要な役 割を果た している と考えら れた。
今後 、 こ の COX― 2アン チ セ ンス 遺伝子 を用い ることで 、cOx一 2発現亢 進を有 する腎細 胞癌に 対する 新しい 治療法 が開発 されるこ とが期 待され る。

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学位論文審査の要旨
主 査 教授 加藤紘之副 査 教授 守内哲也
副査 教授 野々村克也

学位論文題名Significance of COX‑2 Expressi
oninHumanRenalCellCar
cinomaCellLines（ ヒ ト 腎 臓 細 胞 癌 株 細 胞 に お け る COX‑2発 現 の 意 義 ）COX‑2は種々 の癌において発現亢進を認め、癌化過程において重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。しかし 、腎細胞癌におけるCOX‑2の発現亢進の有無や癌化過程における意義はまだ明らかではな い。本研究ではヒト腎細胞癌細胞株におけるC
OX‑2発現を解 析、ヒト腎細胞癌の増殖・アポトーシス・造腫瘍性・血管新生における役割について検討を加えている。3種類のヒト腎癌細胞株を用い、mRNA．蛋白質レベルから
CO
X‑2の発 現を 検討 、COX‑2発 現腎 癌細 胞株 にCOX‑2のセ ン ス遺 伝子、アンチセンス遺伝子を導入した細胞を用い、アポトーシス誘導の有無、ヌードマウスでの造腫瘍性、形成腫瘍における血管新生にっき検討している 。これらの検討から腎細胞癌の一部ではCOX‑2の発現が亢進していること、COX‑2の発現亢進がこれら細胞の増殖・アポトーシス回避機構・血管新生に大きく関わっており、COX‑2は腎癌治療における重要な分子標的となる可能性が示された。質疑応答では、副査の守 内哲也教授からこれまで腎癌細胞株でC
OX‑2に関する研究が行われなかった理由、CO
X‑2阻害剤を用いた薬剤感受性研究が行われなかった理由、C
OX‑2アンチセンスを用いた遺伝子治療の臨床応用の可能性について質問がなされた。これらの質問に対し、申請者は過去 の研究において腎の正常組織においてC
OX‑2の発現亢進があると報告されていたので、COX‑2の発現と腎癌の癌化の関係には注目が集まっていなかった事を指摘し、本研究が腎癌細胞株での初めての論文になった理由を説明した。また、臨床的に使用されているCO
X‑2阻害剤として、セレコキシプやメ口キシカムを用いた薬剤感受性試験も行ったが、NS398と同様、それらの感受性とCOX‑2発現との関連性はなかったという実験結果を述べ、本論 文では代表的薬剤としてNS
398のデータを示したと解答した。アンチセンスを用いた遺伝子治療の臨床応用の可能性については、臨床応用までにはかなり長い期間を要するが、将来にわたる研究が必要であると解答した。ついで、主査の加藤紘之教授よりCOX‑2発現腎癌細胞株と非発現細胞株における遺伝子発現の差について質問がなされた。これに対し、申請者は現在までの研究でこれら細胞株間で特一 593

徴的な遺伝子異常の報告はみられていないが、今後検討が必要であると解答した。さらに
COX‑2の発現亢進と予後の相関についての質問がなされた。これに対し、申請者は本論文では検討していないが、CO
X‑2の発現が腎癌のGr
ade，Stage、転移の有無と相関していたとの報告もあり、今後多くの臨床検体を用いた検討が必要であるが、COX‑2の発現亢進は腎癌の予後因子になる可能性があると解答した。これに付随して、その研究アプ口ーチに関する質問がなされたが、申請者はCO
X‑2抗体を用いた免疫組織学的検討の有用性を述べ、今後この方法により研究を進めていく予定であると解答した。最後に副査の野々村克也教授から、CO
X‑2発現と腎癌の臨床像との関係に関する質問がなされた。これに対し申請者
は、予後不良のR
apidgrowingt
ypeの腎癌では、熱発を伴うように炎症性サイトカインの分泌が増加しており、炎症反応に関わるC
OX‑2の発現がこれに関わっている可能性を指摘、実際本論文で用いたC
O
X‑2発現腎癌細胞株では、増殖が早かったと解答した。さら良性腎病変でのCO
X‑2の発現亢進、および腎癌との相違点に関する質問がなされた。これに対し、申請者は、CO
X‑2には、生理的な機能があり、逆流性腎症のような良性の腎病変ではCO
X‑2の発現亢進により腎血流が保持され、正常腎細胞が保護されていると解答した。一方、腎癌では血管新生促進やアポ卜ーシス回避といった機能が腎癌の悪性化にっながっているのではないかと解答した。最後、主査の加藤教授から、きちんと順序良く実験を積み重ねた非常に優れた論文であり、今後臨床的にも非常に役に立っばかりでなく将来性も大きな研究であると評価された。また外国からの留学生として言葉の苦労があったにもかかわらず、よく ま とま っ た 学位 論 文発 表 で あっ た と のコ メ ント を も って終了 となった。
この論文は、腎細胞癌におけるCOX‑2発現の意義を明らかにしたものとして高く評価さ
れ 、 今 後 COX‑2を 分 子 標 的 と し た 新 規 治 療 方 法 が 樹 立 さ れる こ と が期 待 さ れる 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑚や取得単位なども併せ、申 請者が 博士（医 学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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