博 士 （ 医 学 ） 李栗

学位論文題名DRD2/DARPP―32 Expression Correlates w
ith
Lym
phNodeINtIeta
stasisandTumorProgressionln
P
atien
tsw
ithEs
op
hag
ea
lS
quamousCellC
arcinoma（食道扁平上皮癌症例におけるDRD2/DARP
P―32遺伝子の発現はり ン パ 節 転 移 及 び 腫 瘍 の 進 行 度 と相 関す る）

学位論文内容の要旨【緒言】
食道癌は、予後が極めて不良な疾患である。外科的技術と術中管理の進歩により、生存率が改善された
ものの、全症例の5年生存率は、50%未満にとどまっている。
近年、腫瘍細胞の遊走性はドーパミン、ノルエピネフリン等の神経伝達物質によって誘導されることが報告された。神経伝達物質が直接遺伝子発現を制御し、遊走能を増大させることによって、腫瘍細胞の転移能が誘導される。
ドーパミンは、消化器における主要な神経伝達物質である。ドーパミンレセプター(DR)を活性化させることによって 、遺伝子発現を制御している。DRには5種類のサブタイプ(DRDl‑DRD5)があり、すべてのサブタイプは 七回膜貫通型タンパクであり、三量体GIP結合タンパク質に属する。ドーパミンがDRを介した、複数の 経路でDAR
PP‑32のりン酸化を制御することが知られている。たとえば、DRD1が活性化されることによって、cAMP濃度が増大する。すると、プロテインキナーゼA（PKA）が活´陸化され、チロシン34
がりン 酸化されたD
AR
PP132がプロテインホスファターゼ1
任 P‐1）を強く抑制する。DR
D2の活性化は、二通りの機序でりン酸化されたD´6心P
一32を減少させる：一っは、アデニリルシクラーゼを抑制し、cAMP濃度 を減少させるところで、H強 の漕陸を減少し、DAR
PP132のりン酸化を減少させる；他は、細胞内（ニa2十を増加させて、カルシニュリンを活性化し、D甜卿‐32のチロシン34を脱リン酸化させる。
血Vitr0における研究では、腫瘍細胞の増殖がドーパミンによって直接抑制されことが示された。近年、血漿ドーパミン濃度が、健常のボランティアと比較して、肺恩陸腫瘍では有意に高値であることが判明された。また、DRの発現は多くの他の悪´陸瞳瘍で、例えば胃癌、大腸癌、乳がん、悪性黒色腫や下垂体腫瘍 など で見 られ てい る。 本研 究 では122
例の食 道扁平上皮癌（ESCC）に於けるDRD1，DRD2の発現とDARPP132の発現の相関、また、これらと症例の予後および臨床病理学的因子との相関を、免疫組織化学的手法を用いて検討した。
【対象と方法】
198
9年から199
9年までに北海道大学病院第2外科およぴその関連病院において外科的に切除された、遠隔転陟のない、術前未治療のESCC
症例122例を対象とした。ホルマリン固定パラフイン包埋組織より4ロm厚の薄切切片を 作製し、これ用いて免壊孫B織染色を行った。
‑ 531−

薄 切切 片、 キシ レン を 用い て脱 パラ フイ ン 化し 、エ タノ ー ルを 段階希釈した溶液を通し て水和させた。
抗 原 賦活 のた め120℃ で12min処理 し、 内因 性 ′ル レオ キシ ダ ーゼ に対しては、0.3%過酸化 水素で30分間処理 し た 。 PBSで 希 釈 し た rabbit抗 ‑DRDl (1:500希 釈， Calbiocheq324390） と 抗‐ 班u）2（ 1： 450希釈 ，曲 emi∞ nInternationdkIc． Temecula， （ A， AB1558） ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 一 次 抗 体 と し て 用 い 、4℃ に て 一 晩 反 応 さ せ た 。 洗 浄 後 、 二 次 抗 体 を 反 応 さ せ 、 n狃 と DABH202を 用 い て 発 色 さ せ た。 核染 色と し てへ マト キシ リン を 用い た。 同一 切片 に 存在 する 神経 節 細胞 を陽性対照とした。染色 強度の判定は、陽性 対照を参考にして、陽は＋ ）と陰´f生（うに分類した 。症例は、DRD1とDRD2の発現 を基にして、以下の4っの群に分類された：DRD1
脚2（＋/十）、DRD
1／DR
D2（小）、DRD1／DR
D2（・・／＋）とDR
D1ゆ耐）2（一/一）。

同様 に、他の群分けとして、DRD1凪ARPP‐32（＋／＋）、DRD1
凪ARP
Pう2（小）、DRD
1凪AR
即一32（―／＋）、
DRDl/DARPP−32（ナ）とD
RD
2／DARP
P．32（十/十）、DR
D2皿）

A
RP
P．32（十/l）、DRD2皿） ARP
Pー32（‐／十）とDRD加）Am）P・32（．／．）と 分類された。以上の分類に従って、臨床病理学的因子との相関を統計学的に解析
分 類 さ れ た 。以 上の 分類 に従 って 、臨 床病 理学 的因 子と の相 関を統 計学 的に 解析 した 。
統 計 用 ソ フ ト ウ エ ア Statview5． 0を 用 い 、 DRの 発 現 と 組 織 病 理学 的因 子 との 相関 をぞ 検 定も しく は聡 herの直 接法 瑚 噺． した 累積 生 存率 は、 Kapl孤．Meier法によ って求め、統計学的有意性は log．rank法で検 定 した 。単 変量 ・多 変 量あ 晰は （k比例 ハザ ード モ デル を用 いた 。P値が O● 05未 満を 有 意差有りと定義した。
【結果】
染 色 は 、 他 の 報 告 と 同 様 に 腫 瘍 細 胞の 細胞 膜 と細 胞質 に認 め られ た。 122例の うち 、DRD1の陽 性症 例
は 63例 ； DRD2の 陽 陸 例 は 60例 で あ っ た 。 DRD1の 発 現 と 分 化 度 と の 問 に 有 意 な 相 関 を 認 め た 。 DRD2の 発 現 と 病 理 病 期 、 N因 子 と 間 に 有 意な 相関 を認 めた 。 DRD1とDRD2と の発 現 に正 相関 が認 め られ たが 、
DRD1およぴDRD2の発現とn气心

P‐32との発現に｜瓣目関が認めなかった。

DRD
1ゆA触）P‐32の組合せで群分けした場合、（十′＋）／（・/十）群と（小）／（壬）群では、p・N、pIT、および腫 瘍径に著しい差が見られた 。同様に、DIm1ゆRD2の組み 合わせで（十/十）／（・/十）群と（小）/（チ）群では、p・N、p・T、病理病期と腫窃径に差が見られ也
同 様 に DRD飢 ） ARPP‐ 32（ 小 ） 群 は 病 理 病 期 、 pN、 pT、 腫 瘍 径 に 有 意 な 相 関 を 認 め た 。 同 様 に 、DRD1圧）AR
PP‐32（→．／＋）および（十／‐）群は病理病期、pT丶pN、腫瘍径に有意な相関を認めた。DR
D1／DR
D2（ り ） お よび は） 群 は病 理病 期、 pNに有 意な 相関 を認 め た。 DRD2ゆAm，P‐32（＋ /I）群 は他 の3つの 群と 比 較し て、 有意 に予 後 不良 であ った 。多 変 量解 析で の検 討 では 、DRD加 ）ARPP‐ 32は 独 立予後因子ではなか った。DRD1ゆARPP‐32の（ →・／＋）と（小）グループ は他の2つのグループと比べ て、有意的に予後良好であった。
【考 察】
神 経伝 達物 質が 接着 能 、遊 走能 、白 血球 の 帰巣 能を 制御 す ることが知られている。近年 では、神経伝達物 質 はDR、p2‑adrenoceptors或いは ニューロキニン―1レセプタ ーの活J陸化を通して、腫瘍 細胞の遊走能を増 大 さ せ る こ と が 報 告 さ れ た 。 DARPP− 32は 、ド ーパ ミ ン情 報伝 達に 関 する 重要 な役 割を 演 じて いる 。
DARPP‑32は 、 DRの 活 ｜ 陸 化 を 介 し て 、 MAPKと CREBの り ン 酸 化 を 制 御 し て い る 。 DARPP‑32ノ ッ ク アウ ト マ ウ ス に お い て は 、 MAPKと CREBの り ン 酸 化 レ ベ ル が 亢 進 し て お り 、 DRsを 介 し た 、 MAPK、 CREB
リ ン 酸 化 が 誘 導 さ れ な い 。 DRDVDRD2の 発 現 と 予 後 に は 相 関 が な か っ た こ と か ら 、 ESCC患 者 に て DRD1
ま た は DRD2の 過 剰 発 現 の み で は 予 後 を 予 測 で き な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 DRD1、 DRD2と DARPP‑32の発 現 の 相 関 関 係 か ら 見 る と 、 DRD1と DRD2の 発 現 機 序 が 類 似 し て い る 一 方 で 、 DRと DARPP‑32の 発 現機 序 は全 く異 なっ てい る と考 えら れる 。
神 経 系 で は 、 DRD2/DARPP‑32/PP‑1経 路 に よ っ て 、 DRD2が 活 性 化 さ れ た 場 合 、 CREB発 現 が 低 下 し 、増 殖 が低 下す る。 この こ とか ら、 当初 、DRD2/DARPP‑32（−／ ＋）群は予後不良であると仮 説を立てた。しか し 、 本 研 究 で は 逆 に 、 DRD2/DARPP‑32（＋ ／． ）群 が 他の 群と 比較 し て、 有意 に予 後不 良 であ った 。
‑ 532―DR
D2/DA
RPP‑32/
PP‑1
経路がES
CC
では正常に機能していない可飽陸が示唆された。また、同じ病期における症例間で全てのDR
D2/DARP
P‑32組み合わせを比較検討したが、有意な差が認められたかった。全てDR
Dl/DAR
PP‑32群の解 析から 、ESC
Cにおけ る予後 への影響 はD
RD1
では なく、DARI）P‑32に依存することが判明した。同様に、DR
Dl/DRD2の組合せにおいても、DRD2に依存して有意差が認められている。
DRDl/DARPP‑32ま たは DRDl/DRD
2で は 、DRD1の 相 加 作用 は 認 めな か っ た 。DRDl/DRD
2の 染 色が原
発部 分よりむ しろ浸 潤部分に 強かっ たことか らD
RDl/D
RD2が腫瘍の 浸潤に 相関する可能性がある。
DRD2/DAR
PP‑32（ヰ） 群が他の群と比べて、病理病期、pNに有意な相関を認めたことからE
SC
Cでは、
DRD2¥/DARPP‑32の 発 現 が り ン パ 節 転 移 と 腫 瘍 進 行 度 の 指 漂 に な る か も し れ な い 。
DRsの生物学的機能が癌において、未だ不明な点が多く、更なる研究が必要である。結論として、本研
究は、DR
D2/DARPP‑
32の発現がりンパ節輯陟と腫瘍進行度と関係しており、DRD2/DARPP‑32発現がESCC患者にて予後予測因子になる司1詣陸が示唆された。

― 533 ‑

学 位論文審 査の要旨
主 査 教 授 今 村 雅 寛
副 査 教 授 秋 田 弘 俊
哲副 査 教 授 近 藤

学位論文題名DRD2/DARPP― 32 Expression Correlates withLymph Node Metastasis and Tumor Progresslonln
PatientSWithESOphagealSquamouSCellCarCinoma（食道扁平上皮癌症例におけるDRD2/DARPP―32遺伝子の発現はりンパ節転移及ぴ腫瘍の進行度と相関する）

ドーパミン、ノルエピネフリン等の神経伝達物質は腫瘍細胞の遊走性を誘導する。ドーパミン は、 消化器 にお ける 主要 な神 経伝 達物 質であり、ドーパミンレセプター(DR)を活性化させ るこ とによ って 、遺 伝子 発現 を制 御し ている。DRファミリーにはDRD1からDRD5まで、5つ の サ ブ タ イ プの 存在 が知 られ てい る。 本研 究で は122例の 食道 扁平 上皮 癌(ESCC)に 於ける DRD1，DRD2の発現とDARPP−32の発現の相関、またこれらと症例の予後およぴ臨床病理学的因子との相関を、免疫組織化学的手法を用いて検討した。
北 海道 大学病 院第2外科およびその関連病院において外科的に切除された、遠隔転移のない、 術前 未治療 のESCC症例122例を対象とした。パラフィン包埋切片を、キシレンを用いて脱パラフアン化し、エタノールを段階希釈した溶液を通して溶解させた後、抗原賦活し、内因性 ベル オキシ ダー ゼを ブロ ック した 。抗 ‑DRD1または抗‑DRD2ウナギポリクローナル抗体
を一次抗体として用いた後、二次抗体処理し、それぞれDABとDAB H02を用いて発色させた。
核染色にはへマトキシリンを用いた。同一切片に存在する神経節細胞を陽性対照とした。染
色強度の判定は、陽性対照を参考にして、陽性（十）と陰性（→に分類した。症例は、遺伝子の発現 を基 にして 、4つの群に分類された。分類に従って、臨床病理学的因子との相関を統計学的 に解 析した 。統 計用 ソフ トウ エア Statview5．0を用い解析を行った。P値が0．05未満を有意差有りと定義した。
染 色は 、腫瘍 細胞の細胞膜と細胞質に認められ、122例のうち、DRD1の陽性症例は63例、DRD2の陽 性例は 60例 であ った 。DRD1の 発現 と分化度との間に有意な相関を認め、DRD2の発現と 病理 病期ゝ N因子と間に有意な相関を認めた。DRD1とDRD2との発現に正相関が認められたが、DRDlまたはDRD2の発現とDARPP一32との発現には相関を認めたかった。DRD2／I） ARP
P−32（十/→群とそうでない群を分けて検討した場合、病理病期、pN、pT、腫瘍径と有意な相関を認めた。また、DRD2/DARPP−32（十／―）群はそうでない群と比較して、有意に予後不良であった。

DARPP−32
は、ドーパミン情報伝達に関する重要栓役割を演じており、DRの活性化を介して、MAPKと CREBの り ン 酸 化を 制御 して いる 。ESCC患 者にお いて DRD1また はDRD2の 発現 と予 後に は相 関が なかっ たこ とか ら、 DRD1また はDRD2の 過剰発現のみでは予後を予測できないこと が示 唆さ れた。 DRD1、DRD2とDARPP―32の発現の相関関係から見ると、DRD1とDRD2の発現機 序が 類似 してい る一 方で、DRとDARPP―32の発現機序は全く異なっていると考えられる。
MAPKとCREBの活性化を抑制すると考えられるDRD2/DARPP―32 (+1−）群が他の群と比較して有意に予後不良であることから、DRD2/DARPP−32/PP−1経路がESCCでは正常に機能していぬい可能性が示唆された。DRD2/DARPP−32の発現がりンパ節転移および腫瘍進行度と相関してお り、 その 発現が ESCC患者 にて 予後 予測 因子 にな る可能性が示唆された。本研究が、今後ESCCに お け る DR/DARPP― 32遺 伝 子 の 研 究 に お い て 大 い に 役 立 っ こ と が 期 待 さ れる 。
口頭発表において、副査秋田弘俊教授より、食道癌におけるDRD2遺伝子の陽性細胞発現率、腫瘍の陽性判定基準、DARPP一32のりン酸化特異抗体による検討の有無、今後の研究の展望について質問があった。続いて副査近藤哲教授より、過去におけるDARPP−32と癌の予後に関連する報告、他の研究で使用している抗体や手法との差異、本研究で予想と反対の結果が得られた理由について質問があった。最後に主査今村雅寛教授より、神経で働く分子が癌で発現し た理 由、 食道癌 にお いてDARPP−32の発現していない腫瘍では元来DRD2が機能していない可能性のあることについて質問があったが、いずれの質問に対しても、申請者は主旨をよく
理 解 し 自ら の 研 究デー タと文 献的考 察を混 じえて 適切に回 答した 。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 する と 判 定 し た 。