博士（獣医学）齋藤愛

学位論文題名Polymorphism of diazepam metabolisminrats（ ラ ッ ト の ジ ア ゼ パ ム 代謝 に お け る多 型 ）学位論文内容の要旨
CytochromeP
450(CYP)
における遺伝的多型は薬効・薬物動態、薬物代謝に関する系統差、個体差を弓Iき起こす原因となっている。ジアゼバムはCYPにより代謝を受けるが、雄性ラッ ト で は 、 CYP2D1、 CYP3A2、 CY
P2C1
1が 、 それ そ れ p位水 酸 化 、3位 水 酸化 、 N位脱メチル化の代謝に関与していることが報告されている。一方で、ラットにおけるジアゼバ
ムの薬効には系統差が存在することも報告されている。そこで、本研究では、Wistar(W)、Sprague‑Dawley (SD)、 Brown‑Norway (BN)、 Dark‑Agouti (DA)の 4系 統 のラ ッ トに お ける ジ アゼ バ ム代 謝 の系 統 差につ いて検討す ることを目 的とした。
第一 章 で は、 Wラ ッ トに お け るジ ア ゼ バム p位 水酸 化 に は高 活性個 体（ ExtensiveMetabolizers： EM)と 低 活 性個 体 (Poor Metabolizers：PM)が存在す ること を見出した。 W
ラ ット肝ミ クロソー ムを用 いてジアゼバム代謝活性を測定したところ、Wラットの約83％ （15/ 18匹）はジアゼバムp．位水酸化に殆ど活性を示さず(PMW)、一方で約17％の個 体がPMWのおよ そ200倍高い活 性を示すことが明らかとなった(EMW)。

Kineti．cs

解 析 の 結 果 、 ジ ア ゼ バ ム p． 位 水 酸 化 の Km値 は PMWで は 23.3彫 Mで あ っ た が 、 EMW
では6.3皿 Mと 小 さ か った 。 ジ アゼ バムp・位水 酸化に ついて、 Vmaxおよぴ Kmから、 EM
Wでは高 最大活性・高基質親和性をもつ酵素が存在することが示唆された。これまでの報
告に より、 ジアゼバムのp位水酸化はCY
P2D1によると考えられてきた。しかし、Westernblottingの 結 果 で は EMWと PMWの 肝 ミ ク ロ ソ ー ム に 発 現 す る CYP2D1量 に 差 は 見 ら
れな かった 。
第 二章で は、4系統のラ ットに おけるジ アゼバム代謝の系統差について検討した。第1章 で 示 したWラッ トのジア ゼバム p―位 水酸化の 代謝多 型に加え 、SDおよ ぴB
Nラヅト はp‐ 位 水酸 化 の 高活 性 (EM)系 統 であ り、 D
Aは低活 性(PM)系統で あるこ とが分か った。
また、DAラッ トは高い 3位水 酸化活 性とN脱メチル 化活性 を有する 系統で あること も明ら かにな った。ジ アゼパム p￣ 位水酸化 におけ るK
inetics解析 の結果、ラットEM系統とPM系 統 間 の Km値 の 差 は 、 第 1章 で Wラ ッ ト の EMお よ び PM個 体 間 に 見 ら れ た 結 果と 同様で あった。 また、ラ ヅトの 田抗体を用いてジアゼバム代謝の阻害実験を行った結果 、CYP2D2抗体 によってジアゼバムp．位水酸化が阻害されることが分かった。しかし、―1253−

各ラ ット 系統 に発 現す るCYP2
D2量や 、CYP2D
2に よっ て代 謝さ れる デブ リソキン4位水酸化活性の結果からは、ジアゼバムp．位水酸化の系統差はCY
P2D2にも起因しないことが分かった。一方で、CY
P2D2抗体によってp．位水酸化が阻害されたことから、この代謝がC
YP2D
2抗 体と 交差 する他のCY
P2Dサブフんミリーによって行 われることが推測された。
第三章では、ジアゼバムp゜位水酸化を行うC
YP分子種にっいて同定を試みた。ラット抗C
YP2D2抗体でp．位水酸化が阻害されることから、この抗体を用いて免疫沈降を行った。
得ら れ た蛋 白画 分を 低濃度B
IS
ポリアクリ ルアミドゲルのS
DS‑PAGEで展開したところ、
p‐位 水酸 化活 性が 高いラット(SD、BN、EM W)にのみ発現する特異的な蛋白質(CYP2DX)が確 認 され た。 そこ で、CYP2DXを単離し、N末端のアミノ酸にっいてシークエンスした
ところ、そのアミ丿酸配列はCYP2D3と一致することが分かった。以上のことから、ジアゼバ ム p． 位水 酸化 はCYP2
D3によ っ て代 謝さ れ、CY
P2D3の多型がジア ゼバムp．位水酸化 に お け る phenotypeの 多 型 の 原 因 と な っ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
前章より、ジ アゼバムp．位水酸化はCY
P2D3によって代謝されることが推測された。そこ で、 第4章 では 、SD、BNおよ ぴEMWラッ トに おけ る、 ジア ゼバ ムp．位水酸化 の酵素
科学的特徴にっ いて検討した。基質（ジアゼバム）濃度の範囲をより広く0.
4〜 400
LtMに設定して代謝活性を測定したところ、p．位水酸化反応のみにおいて基質阻害が起こることが分かった。
以上の結果により、本研究では、ラット系統間および個体問におけるジアゼバム代謝の多型にっいて明らかにした。特にジアゼバムp．位水酸化に関しては酵素科学的特徴を明らかにし、その代謝をCY
P2D3が行っている可能性を新たに示した。

― 1254−

学位論文 審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授

藤田正一

教授

伊藤茂男

助教授

佐々木宣哉

助教授

石塚真由美

学位論文題名Polymorphism ofdiazepammetabolismin rats
（ ラ ッ ト の ジ ア ゼ パ ム 代 謝に お け る多 型 ）CytochromeP450
くCYP)
における遺伝的多型は薬効・薬物動態、薬物代謝に関する系統差、個体差を引き起こす原因となっている。ジアゼパムはCYPにより代謝を受けるが、雄性ラッ ト では 、 く :YP2D1、 CY
P3A2、 CYP2C11が、 それぞ れp位 水酸化 、3位 水酸化 、N位脱メチル化の代謝に関与していることが報告されている。一方で、ラッ卜におけるジアゼパ
ム の 薬効 持 続 時間 はDa
rk‑Agouti(DA)ラッ トで顕著 に短く、 その薬 理効果に ラッ卜 問で系統差が存在することも報告されている。そこで、齋藤愛氏は、その原因がジアゼパム
代 謝 の 差 に よ る とい う 作 業 仮説 を 立 て、 Wistar（W） 、 S
prague． Dawley（ SD）、Brown．N0rway（BN） 、DAの4系統のラッ卜におけるジアゼパム代謝の系統差にっいて検討した。
本 研 究 か ら 、 Wラ ッ 卜 にお け る ジア ゼ パ ムp位 水 酸化 に は 高活 性 個 体(ExtensiveMetabolizers： EM)と 低活 性 個 体 (Poor Metabolizer8：PM)が存 在する ことを見 出した 。ま た 、 SDお よ ぴBNラ ッ卜 は p‐位 水 酸 化 の高 活 性 (EM)系統 で あ り、 DAは低 活性(PM)系 統で あ る こと が 分 かっ た 。 D
Aラ ッ 卜 は高い 3位水 酸化活 性とN脱メチル 化活性を有する系統であることも明らかになった。
また、 ラット CYP抗体 を用いて ジアゼ パム代謝 の阻害実験を行った結果、CYP2D2抗体によってジアゼパムp．位水酸化が阻害されることが分かった。しかし、各ラッ卜系統に発現 する CYP2D2量や 、CYP2D2によって 代謝さ れるデブ リソキン 4位 水酸化活 性の結 果から、ジ アゼパム p． 位水酸化 の系統 差はCYP2D2に起 因しないことが分かった。そこで、C
YP2D2抗体を 用いて 免疫沈降 を行っ たところ 、得ら れた蛋白 のアミノ 酸配列はC
YP2D3と一致することが分かった。
以上の結果により、齋藤愛氏は、ラット系統問およぴ個体間におけるジアゼパムの薬理―1255―

効果の系統差が代謝の多型によることを明らかにした。さらに、ジアゼパムp 位水酸化に関す る酵素化 学的特徴を明らかにし、その代謝をCYP2D3が行っている可能性を新たに示した。よって審査委員一同は、上記学位論文提出者齋藤愛氏の論文が、北海道大学大学院獣医学研究科規程第6条の規程による本研究科の行う博士論文の審査等に合格と認めた。

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