博士（理学）中島謙一
学 位 論 文 題 名

出芽酵母カルモジュリンのCa2十結合と高次構造変化に関する研究
学位論文内容の要旨
カ ルモ ジュ リン （ C aM)
は 真核 生物 に存 在す る C
a2゛結 合蛋白質であり、外部か らの 刺激に応じた細胞内Ca2゛濃度の上昇に伴ってCa2゛を結合し、さまざまな標的 酵素 の活性を調節している 。そのアミノ酸配列は多くの生物種間で90％以上の高い 相同 性を 示す が、 出 芽酵 母の CaMは脊椎動物と比べて60％の相同性しかないュ特に最もC末端側のCa2゛結合部位に当たる領域に相違が多く見られ、そこにはCa2ーが結 合し ない。また、他の領域 にも違いが見られ、脊椎動物由来の標的酵素を活性化す る能 カが 劣っ てい る 。本 研究 の第一部では、出芽酵母 CaMの標的酵素に対する低い 活性 化能 カが いか な る理 由に よるかを調べた。第二部 では出芽酵母のCaMの構造と 機能 の特 異性 を調 べ 、第 三部 では 出芽 酵母 のCaMのCa2゛ 結合と構造変化について詳しく検 討したュ
第 一 部 ： CaMは 球 状 の Nド メ イ ン 、 Cド ヌ イ ン が 中 央 の り ン カ ーで っな がった亜鈴型の立体構造をとってぃゝる 。各々のドヌインに2っずつの、1分子あたりでは計4個 のCa2 を結合すると、多種多様な標的酵素と結合し、活性を調 節する。出芽酵母 のCaMは、 脊椎 動物 Ca
Mに 対す る相 同性 が低 いゝ ので 、脊 椎動物 由来の標的酵
素を 活性 化す る能カが低い。この理由を調べれば、活性化のヌカニズ ムを知ることがで きる 。そ こで、あるCa2
゛結合部位も しくはりンカーよりも、N末 端側に出芽酵
母 、 C末 端 側に 鶏の Ca
Mに 相当 する 配列 を持 っキ ヌラ 分 子を 7
種 、遺 伝子 工学 的に作製 した 。そ れらについて、標的酵素を活性化する能カを調ぺたとこ ろ、鶏の配列が多 くな れば 、より高い活性化能を獲得した。活性化能の低いキヌラ 分子と高い分子と を比 較す ることで、標的酵素を活性化するために必要な領域が決 定できた，ホス ホ ジ エ ス テ ラ ー ゼ は CaMが 結 合 レ さ えす れば 高い 活 性を 示し たが 、CaMが 結合するためにはそのCドヌインの寄与が大きいことカミ分かった。 カルシニューリンにCaMが 結合 し、 活性 化さ れる ため には 、最 も C
末 端側 の第 4C
a2一結合 部位（サイトIV） にCaz‐が 結合 する こと と、 Nドヌイ ンが鶏型のCa2゛結合特性を 示すことが必要 で あ っ た 。ま た基 質と して タン バク 質を 認識 する た めに は、 A
la88− Ala128の領域 も必 要で あ った 。骨 格筋 、及 び平滑 筋ミオシン軽鎖ルン酸化酵素にCaMが結合する ため には 、 サイ トIVにCa2 が結 合レ 、 さら にAla
88ーAlal98の 領域が鶏由来の配列である必要があった。また活 性化には骨格筋のものに対してはCドメインが、平滑 筋の もの に 対し ては N
ド メイ ンが 大きく関与していることが示さ れた。以上の結果 から 、CaMは分 子内 の異 なる 領域 を用いて、それぞれの酵素をす ることが示され、CaMが多種多様な標的に対し、異なった認識機構を持ってい ることが示された。
第 二 部 ： CaMの 中 央 リ ン カ 一 部 分 は 柔 軟 な 構 造 で あ り 、 2つ の ド ヌ イ ン はCa2+を結 合す る 上で 独立 レて 機能 する こと が知 られ てい る。 しかし 、分子Imol当― 188―

た り3molしかC
a2゛を 結合 しな い出 芽酵 母Ca
Mは、協同的にすべてのCa2゛を結合する こと から 、 ドヌイン間相互作用の存在が示されている 。その性質について調べる
た め 、 N末 端 及 び C末 端 半 分 の 断 片 を 用 い て 、単 独で 存 在す る各 々の ドメ イン のCa
2゛結合特性を調ベ、全長の配列 を持つ分子と比較レた。ドメインが独立して機能し てい る一 般 のCaM
分 子全 長の Ca
2゛ 結合 曲線 は、 それ ぞれ のド メイ ンだけを持った 断片 の結 合 曲線 の和 と、 完全 に一 致す る。出芽酵母Ca
M分子全長のCa2・r結合曲線 は、 ニつ の 断片の曲線の和と重ならず、各々のドヌイ ンが独立していないことが示 さ れ た 。 ま た 、出 芽酵 母 C
aMのサ イ卜 IV
付 近の アミ ノ 酸配 列は 、一 般の もの とは 特に 異な っ てい る。 その 領域 の機 能を 検討するために、C末端17残基を欠損した
変 異体 につ い てCa2
゛ 結合 能を 調べ たと ころ、Ca2゛に対する親和性はCa
M分子よりも 高い こと が 分か った 。こ の17残基 中に Nドヌインと相 互作用する部位が含まれる
た め、 すべ て の部 位へ のCa2
゛ 結合 能が 影響されたと考 えられる。しかし、Hisl07
由 来の 1H― NMRシ グナ ルに つい て、 Ca2゛ 濃度 依存 性を 調べ ると 、こ の変異体でも出 芽酵 母CaMと同 様に 二相 性の 変化 を示 し た。 Ca2゛が 1っし か結 合しないCドヌイン に存 在す る 残基由来のシグナルが、二相性の変化を示 すのは、NドヌインヘCa2＋が 結合 する と C
ド メイ ンの 構造 が変 化す る ため であ ると 考え られ 、C末端17残基以
外 にも 両ド ヌイ ンの相互作用に関係している領域があることが示唆された，第 三 部 ： 出 芽 酵 母 CaMの Nま た は Cド ヌ イ ン が 他 の ド ヌ イ ン の Ca2゛ 結 合 に及ぽす 影響を調べるため、一方のドヌインにしかCa2
゛が結合しない変異体を作製し、Ca2゛結 合能 を測 定し た。 出芽 酵母 Ca
M分 子全長と比較すると、N末端側半分の断片はCa2゛に低い親和性を示したが、 NドメインにしかCa2゛が結合しない変異体は、同程 度の 親和 性 を示 した 。Cドヌ イン にし か C
a2゛が 結合 しな い変 異体 は、出芽酵母
CaMのCa2
゛ 結 合曲 線と 、Nドメ イン にし か C
a2゛が 結合 レな い変 異体 の曲線との差
よ りも 、Ca2゛に低い親和性 を示した。Ca2
゛非結合状態 （アポ状態）で、これらの変 異体 は出 芽 酵母 C
aMと類 似の 構造 をし て いる こと を考 慮す ると 、アポ状態でNドメ イン はCド ヌインから影響 を受け、Ca2゛の親和性が高 い状態になっていると考えら れる 。ま ず 、N
ドヌインに Ca2゛が結合すると、Ca2゛型のNドメインの影響を受けて Cド メ イ ン は 高 親 和 性 に 変 化 し 、 最 後 の Ca2゛ を 結 合 す る こ と が 示 さ れ た 。
次 に C末 端 側 か ら 、 1、 2、 3、 6、 9残 基 欠損 して い る変 異体 を作 製し 、測 定し た。 順に 1、2、 3残 基と 欠損 させ ると 、初めの2つのCa2゛がより協同的に結合する よう にな り 、さらに欠損させてもそれ以上変わらなか った。Ca2
゛はまずN末端に2つ 結合 する こと を考 慮す ると 、ア ポ状 態でC末端の3残 基がNドメインのCa2゛結合に影響 を与えることが示された。また、C末端の2残基はCa2゛結合状態においても、分 子 全 体 の 構 造 形成 に関 与 して おり 、そ の2残基 の欠 損 によ り、 出芽 酵母 由来 のCaM依存 性夕 ンパ ク質 リン 酸化 酵素 を活 性化する能カが 低下した。標的酵素活性化
因 子と して 機 能するためにも、C末端の2残基を含むドヌ イン間の相互作用が必要であるこ とが分かった。
出 芽 酵 母 CaMを 用 い て 、 高 等 生 物 由 来 の 標 的 酵 素 の 活 性 化 機構 を調 べる こと は非 常に 有 効な 方法 であ る。 さらに出芽酵母C
aM自体の構造や性質の理解を深め
れ ば、 多く の 情報 が得 られ ると 考え られ る。 本研 究に より 、出芽酵母CaMにCa2÷
が 結合 する と き、 一般 のCaMと は全く異なった構造 変化を起こしていることが示され た。 生物進化の過程で、出芽酵母と他の生物が分 化したときから今までに、多くの もの はEFハンドの対を形成することで、また出芽 酵母の場合は相互に影響しあったドメ インを持つことで細胞内Ca2゛濃度変化に敏感に反応できる仕組みになったので は な い か と 考 え ら れ る 。 ま た 分 子Imol
当 た り、 4molのCa2
゛ を結 合で き るCaMを 持 つ 生物 種が 非 常に 多い のに 対し 、3molし か結 合で きな いCaMを持 つ生 物は 非常 に少 ない 。 この こと は、 前者 におけるCaMの柔軟 な分子認識機構が生物の進化に深く結 びっいている可能性を示した。
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学位論文審査の要旨
主 査

教 授

矢 澤 道 生

副査
副査
副査

教授
教授
教授

谷 口 和彌
田村 守
引 地 邦男

学 位 論 文 題 名

出 芽 酵母カ ルモジュ リンの Ca2十結合と高次 構造変化に関する研究
カルモ ジュリン(CaM)
は、真核細胞のCa2+受容タンパク質であり細胞外からの刺激に応じた細胞内Ca2+濃度の上昇にともなってCa2+を結合して、様々な標的酵素を活性化する。
細胞の 刺激に 対する応答はその結果として起きる現象である。C
aMの標的酵素活性化の分子機構 の概要 は、CaMにCa2+が結合することで分子内の疎水性アミノ酸残基が分子表面に露出し、この疎水性領域が標的酵素分子を認識して結合し活性化にっながるというものである。出芽酵母(SacchalOD
ユycescerevisiae)のCaM(yCaM）は、高等生物CaMに比ベアミノ酸配列の相同性は低く、分子内に4っあるEF―handとよばれるCa2十結合サイトのうち最もC末端のものは機能しない。このために高等生物由来の標的酵素を活性化する能カがきわめて低い。本研究では、yCaMの性質を詳細に調べることで標的酵素活性化の分子機構を解明することを目的の行われた。
本論文 は、3部からなり、第1部では、CaMの酵素活性化の分子機構を明らかにする目的
でyCaMと、 ニワト リCaM（cCaM）のキ メラタンパク質を7種類構築し、その性質を解析した結果 にっい て述べている。yCaMの機能ドメインをC末端から順にcCaMのものに交換し、それぞれについて種々の標的酵素活性化能を調べたところ、キメラタンパク質中のcCaMの機能ドメインが多いほど標的酵素活性化能が上昇すること、活性化に必要な機能ドメインは標的酵素ごとに異なることが明らかになった。また、標的酵素の認識に必要な領域と活性化に必 要な領 域が異なることも示され、CaMは異なる標的酵素に対して多様な認識機構をもち、酵素の活性化は2段階で生じることを明らかにした。
第2部では、yCaMのN末端，およびC末端側1／2に相当する分子を構築し、それぞれの機能を解析 するこ とでyCaM
分子 のNドメインとCドメインの間の相互作用（ドメイン間相互作用）に っいて 検討した 結果が述 べられ ている。Ca2十結合およびNMRの測定結果からyCaMには、C末端17残基を介したもの、およびそれ以外の領域を介したものの計2種類のドメイン間相互作用が存在することを明らかにした。
第3部では 、yCaMのドメイン間相互作用の機能的な意義を検討した結果が述べられている。EF‐han
d型Ca2十結合ル ープの 12番目に位置するGlu残基をGh残基に置換することでCa2十 結合能 を欠如させる手法を用い、yCaMのNドメインにのみCa2十を結合できる変異タンパク 質と、 Cドメ インにの みCa2十を結合できる変異体を構築し、その機能をyCaMと比較した。その結果、yCaMの両ドメインは互いに相互作用しあって、それぞれのCa2十結合を190強め合っていることが明らかになった。また、C末端から順に1残基ずつ欠如させた変異タンパ ク質を 構築し、C末端領域の機能を検討した。その結果、C末端3残基を介したドメイン間相互作用により、NドメインのCa2+結合の協同性が強められることが明らかになった。
同様 に、C末端の 2残基 はyCaMの内 在性標的酵素活性化構造の形成に必須であることを明らかにした。
以上の結果から、著者は、ドメイン間相互作用のない高等動物由来のC
aMは、分子表面のアミノ酸残基をフルに活用して、30種類に及ぶ酵素を認識し活性化する多様性を備えているの に対し て、yCaMは、 Ca2十 を3モ ルしか結合できないけれども、複雑なドメイン間相互作用によって、数少ない内在性の標的酵素の活性化をになっているという見解を明らかにした。以上の結果は、タンパク質工学的手法と、タンパク質化学的手法を駆使して得られたものであり、著者は、北海道大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認める。

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