博士（理学）堀学位論文題名

麻希

Controlofthegrowthlimitationinprotozoan
Tetrahy7nena（ 原 生 動 物 テ ト ラ ヒ メ ナ の 増殖 制 御 機構 の 研 究）

学 位 論 文 内 容 の要 旨

本 研究は 、原生動 物テト ラヒメナ（Te・tra
由y皿enatぬerm〇p由iヱa´の増殖調節機 構、特 に富栄 養環境下 での増 殖停止機 構の解 明と増殖 停止に応 じた細 胞内の変 化を 調べた 。十分 に増殖可 能な条 件下にあ る細胞 集団が、 物理的な 制限に よるもの では なく、 自発的 に増殖を 停止し ている現 象は広 く種を超 えて見ら れる。 しかしこ の現 象の解 明は、 飢餓によ る増殖 停止のし くみの 研究が盛 んに行わ れてい るのに比 べて 、あま り進ん でいない 。テト ラヒメナ におい ても、分 泌性の増 殖を活 性化する 因子や、DNA及 びRNA合 成を 活 性 化す る ポ リベ ブ チ ドな ど の細胞 増殖の 促進に関 する
研 究 は 盛 ん に 行 わ れ て い る が 、増 殖 停 止に 関 す る研 究 は 殆ど 行 わ れて い な い。
私は増 殖曲線の 定常期に 到達し たテトラ ヒメナ を用いて 、容易 で且つ高 率に同調分 裂を誘 導する方 法を見い 出した。さらに、定常期のテトラヒメナは、飢餓、酸欠、有 害な老 廃物の 蓄積など の培養 環境の変 化によ って増殖 が停止す るので はなく、 自ら が 培 養液 中 に 細胞 周 期 を G
1期 で 停止 さ せ る因 子 を 放出 して積 極的に増 殖を停止し ている ことを明 かにした 。
増殖曲 線の定常 期に達し たテト ラヒメナ を、新 鮮な培養 液に移 して培養 すると、2時 間 後 に 約80％ の細 胞 が い っせ い に 分裂 す る こと が 分 かっ た 。 この 同 調 分裂 は
株 に非特 異的に 誘導され るが、 増殖曲線 の他の 時期の細 胞では誘 導され なかった 。
さ らにこ の同調 分裂は、 定常期 の細胞を 栄養分 を含まな いバッフ ァーに 移して培 養
し て も 、 2時 間 後 に 約 40％ 誘 導 さ れ 、 3時 間 後 に は 細 胞 密 度 も 2倍 に 上 昇し た 。
以 上の結 果は、 定常期の 細胞は 飢餓によ り分裂 を抑制さ れている のでは なく、外 液に 存在す る細胞増 殖を阻害 する因子によって細胞周期の進行が特定の時期で停止し、そ の阻害 因子除 去による 細胞周 期停止の 解除が 、同調分 裂誘導の 原因で あること を示 してい る。そ こで、定 常期の 細胞周期 がどの 時期で停 止してい るのか を調べる ため に、定 常期の 細胞を新 しい培 養液に懸 濁して から同調 分裂が誘 導され るまでの 大核 と小 核 の D
NA量 の変 化 を 顕 微分 光 測 光法 で 測 定し た と ころ 、 同 調分 裂 が 誘導 され るまで の問に 倍増し、 分裂終 了後にほ ほ半減 すること が分かっ た。こ の結果は 、定 常 期 細 胞 の 細 胞 周 期 が G1期 で 停 止 し て い る こ と を 示 し て い る 。
さ らに 、 定 常期 細 胞 の G
1期 停 止の 原 因 つい て 検 討を 行っ た。そ の結果、 定常期細胞のG
1期 停 止の 原 因 は 、老 廃 物 であ る ア ンモ ニ ア の蓄 積、培 養液のpHの 上昇、酸 欠 、 細胞 密 度 の上 昇 で は なく 、 テ トラ ヒ メ ナが そ の 細胞周期 をGl期で 停止させる 因 子 を外 液 に 放出 し て い るた め で ある こ と が明 か に なった。 この因 子は、5、0OOダ ル ト ン 以 下 の 分 子 量 で 、 100℃ 、 10分 の 熱 処 理 で も 活 性 が 失 わ れ な か った。
― 124−次に、このGl期停止因子が、細胞周期各期の細胞にどのような影響を与えるのか、またどのようにして細胞周期をGl期で停止させるのかを調べた。上記のように、定常期のテトラヒメナは細胞周期をGl期で停止している。そのため、新しい培養液に懸濁後は、殆どの細胞の細胞周期が同調して進行するはずである。そこで、定常期細胞を一定時間新しい培養液で培養して細胞周期を進行させ、その後再びGl期停止因子を含む定常期の培養上清に懸濁して、 Gl期停止因子が細胞周期のどの時期の進行を停止させるかを調べた。その結果、定常期培養上清に存在するGl期停止因子は、 Gl期の細胞のs期への移行を阻止するが、分裂期やG2期の細胞の細胞周期の進行には無影響であることが明かになった。
また、テトラヒメナは接合準備期（initiation期）においても、接合に必要な因子を外液に放出し、細胞周期をGl期で停止していることが知られている。そこ
で、定常期と接合準備期のGl期停止は、同じ因子によって誘発されているのかどうかを調べるために、initiat
ionが行われた細胞外液に定常朗の細胞を懸濁した
ところ、懸濁後2時間目に同調分裂が誘導され、 Gl期停止は解除された。この結果は、定常期で誘発されるGl期停止と接合準備期に引き起こされるGl期停止が、そ れぞ れ 別 の 因 子 に よ って行 われ ている 可能 性を示 唆し ている 。
以上のように、テトラヒメナは富栄養環境下で積極的に細胞周期をGl期で停止させる因子を放出して増殖の制御を行っているが、この因子によって、細胞内ではどのような変化が生じているのかを調べるために、この因子によって活性化される遺伝子の単離を試みた。テトラヒメナのRNA合成量は、増殖が進行するにっれて減少することが知られている。従って、定常期に転写量が増大する遺伝子の中に、Gl期停止因子の影響を受けて遺伝子発現を活性化した遺伝子が含まれていると考えられる。そこで、定常期で転写量が増大する遺伝子（cD NA）のひとっを単離して解析を行ったところ、対数増殖期の細胞にGl期停止因子を与えると、その遺伝子の発現が促進されることが確認された。全長約1.2kbpのこの遺伝子の塩基配列を解析 したところ、予測されたアミノ酸配列の約70％が、よく保存された12個の酸性アミノ酸の繰り返しで占められた特徴的な構造をしていた。またこの繰り返し配列について、既存のタンバク質のデータベースと類似性検索を行ったところ、繰
り返し配列の一部がマウスの神経細胞の軸索で多量に発現している微小管結合タンバク質（MAPIB）の微小管結合モチーフに非常に類似していることが分かった。そこで、この遺伝子が発現するタンバク質の挙動を調べるために、繰り返し配列に相当する合成ベブチドを作成して抗原とし、モノク口一ナル抗体を作成した。この抗体を用いて間接螢光抗体法で細胞を観察すると、抗原は繊毛の長軸に沿って点在していること、さらに基底小体にも存在していることが分かった。そこで、繊毛内での抗原の局在性を免疫ブロット法で調べたところ、抗原は軸糸分画及び繊毛を界面活性剤で抽出した軸糸以外の分画の両方に存在していることが分かった。これらのことから、この遺伝子産物は、繊毛の微小管と関連して存在し、多量体を形成してアクソネームと繊毛膜を連結する機能を持っタンバク質である可能性が示唆された。
さ らに、このcDNAをブローブとして用いたサザンハイブリダイゼ―ションによ り 、 こ の 遺伝 子 は 別 種 の テ ト ラ ヒ メ ナ （ T. pyrif ormis）や ソウ リム シ(Paramecヱ umcaudatum)に は存 在しないことが分かったが、間接螢光抗体法
では同じ抗原決定基を持っタンバク質がそれらの繊毛に存在することが明かになり、一次構造は異なるが、同じ機能を持つタンバク質の普遍的な存在が示唆された。

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学 位 論 文 審 査の 要 旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授

片 桐干 明鈴 木範 男
山 下正 兼助教授
教授

藤 島政 博（山口大学大学院理学研究科）

学 位 論 文 題 名Controlofthegr
owthl
imit
ati
oninprotozoanTetrahy7nena（原 生動物テトラヒメナの増殖制御機構の研究）

細胞の 増殖 機構 の研 究は 、こ の現 象が 単に生物の遺伝的継承をもたらす基本的な手段で あるが ゆえ に重 要で ある のみ なら ず、 細胞のがん化や分化機構の解明のためにも必須の 情報を 提供 する 。し かし この テー マの 研究を押し進めるためには、どのような生物
種あ るいは タイ プの 細胞 を用 いる ので あれ 、増殖を任意に制御できる実験系の開発が前提 と な り 、 近 年 真 核 細 胞 に 普 遍 的 な 細 胞 周 期 調 節 因 子 と し て の MPF (M‑phase pro‑moting factorに 関 す る 分 子 的 解 明 が 活 発 に 展 開 さ れ つ っ あ る の も 、 M期 を 誘 導 す るため の優れ た実 験系 が背 景に あっ ての こと である。同様の意味で、細胞周期を一般に細胞 の 「 生 活 期 」 と さ れ る G1期 に 保 つ 機 構 が あ る と す れ ば 、 そ の 維 持 機 構 の 解 明 は 極 め て重 要な 意 義 を も っ が、 その ため の適 当な 実験 系はこ れま で存 在し なか った 。堀 麻希 提出 の 学 位 論 文 は 、 原 生 動 物 テ ト ラ ヒ メ ナ （ 7観 raわ 冫 ′ mena曲 em舛 mIぬ ） を 用 い て 増 殖 の定常 期にあ る細 胞に 高率 で同 調分 裂を 誘導 することに成功し、その成功の原因の追求から 、 そ れ が 細 胞 周 期 を G1期 に 停 止 さ せ る し く み に 基 づ い て い る こ と を 明 ら か に す る こ とを通 じて、 細胞 増殖 制御 機構 解明 のた めの 新しい実験系としてこれを提起したものである。
申 請者の 第一 の貢 献は 、増 殖曲 線の 定常 期にあるテトラヒメナを新鮮な培養液に移すと 80％ と い う 高 い 同 調 率 で 分 裂 を 開 始 す る こ と を 見 出 し た 点 に あ る 。 こ の 簡 単 な 分 裂誘 導 法 は 、 こ れ ま で テ 卜 ラ ヒ メ ナ ， ゾ ウ リ ム シ な ど で 知 ら れ て い る 熱 処 理 （ heat― shok）や 飢餓に よる 方法 とは 同調 率の 高さ にお いて格段の差があるのみならず、栄養を含まないバッファー液に移しても誘導されること、および細胞周期のGl期にある細胞に特異的にもたらされるという意味で、従来知られている見かけ上類似した分裂誘導法とは本質的に異なる新しさをもつものと位置づけられる。申請者の第二の貢献は、上記条件下でのGl期停止が細胞から分泌される耐熱性の低分子物質(G
1停止因子）によりもたらされることを証明した点にあり、さらに付随する実験から申請者の扱っているG
1期停止が従来報告されている接合準備期における同停止とは異なる機構に基づくものであることを示しているのは興味深い。さて、ここで見出された増殖停止がもし積極的なG1期維持機構に基づくものであるとすれば、増殖の定常期に限って転写が増強される遺伝子が存在する可能性がある。この観点から申請者は意欲的に上記停止因子の存在下で発現が増大する遺伝子(
cDNA)のひとつを単離し、その塩基配列の解析およびそれに基づいて作成した抗体を用いた解析から、それが繊毛の微小管関連蛋白質であることを明らかにしている。
この研究で見出された同調分裂を誘導する方法は、その手続き上の簡単さおよび同調率の高さにおいて、増殖制御機構のみならずその他の多様な現象の研究にテトラヒメナを実験モデルとして用いている多くの研究者にとって極めて利用価値の大きいものとして、高く評価される。増殖制御機構の観点では、増殖の単なる抑制ではなくGl期に積極的にとどめる機構を提唱する申請者の研究は、その機構が可能性として含む適応的な意義の大きさから注目に値するものである。その意味で、申請者が見出したGl停止因子の分子的実体、およびそれにより発現誘導される遺伝子のさらなる同定と機能の解明が期待されるが、本研究はその方向に向けて今後展開される研究の基礎を提供するものとして広く 利用される であろう。 申請者に対 する最終試 験は、平成9年1月28日に多数の大学院担当教官の出席のもとに論文の口頭発表と質疑応答の形で行われ、満足すべき結果であった。したがって審査員一同は、申請者が博士（理学）の学位を受けるに十分の資格があるものと認める。