博士（理学）福井康浩
学位論文題名
大動 脈平滑 筋ミオシ ン重鎖 リン酸化酵素に関する研究
学位論文内容の要旨
平 滑筋 ミ オ シン は ATPを 加 水 分解 す るこ と で 収縮 カを 発生するタ ンパク質 であり、200kDaの 重 鎖 2つ 、20kDaの 制 御 軽鎖 2つ 、 17kDaの 必須 軽 鎖 2っか ら 成 る6量体 で ある 。
ミ オシ ン の ATPase活 性は 、制御 軽鎖(LC20)が特 異的なり ン酸化酵 素であるミ オシン軽 鎖
リ ン酸 化 酵 素（ MLCK） でり ン 酸 化さ れ るこ と で 活性 化 され る 。 MLCKは細 胞 外の 刺 激に
応 じて カ ル シウ ム をセ カ ン ドメ ッ セン ジ ャ ーと す る 情報 伝 達系 で 活 性化 さ れ、 LC20のSer19をりン 酸化する ことで収 縮系をonの 状態にす る。このよ うな収縮 制御を担 うLC20のりン酸 化のほか に、ミオ シン重鎖 のりン酸 化が非筋型 ミオシンIIや平滑筋ミオシンについて報告 されてい る。下等 真核生物であるDictyosteliumにおいては、重鎖のりン酸化はミオシン会 合体を脱 会合させ る作用が 知られて おり、細胞 内でミオシンの分布を調節していると考え られてい る。哺乳 動物の非 筋型ミオ シンIIや平滑筋ミオシンについては、カゼイン
キナー ゼII(CKII)，プロ テインキナーゼC(PKC)，カルシウムーカルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMキナーゼII）が重鎖リン酸化酵素として機能しうることがinvivo
およびinvitroの 実験結果 から示唆 されてい る。しか し、それらの酵素による哺乳類のミオシン重 鎖リン酸 化の役割 は明らか にされて おらず、ま た平滑筋では内在性重鎖リン酸化酵素の研 究は皆無 である。
我 々は 、 こ れま で なされ た研究の ように既 存のりン 酸化酵素に よる平滑 筋ミオシ ン重鎖の りン酸化 を検討し たのでは 、重鎖リ ン酸化に関 する全体像が把握できないとの考えから、 まず大動 脈平滑筋 抽出液に 含まれる ミオシン重 鎖をりン酸化する酵素活性の検索から 始め た 。 大動 脈 平滑 筋 に含まれ るタンパ ク質を0.6MKC1を 含む緩衝液 で抽出後 、抽出液をDEAE‑Toyopearl650S陰 イオン交 換カラム で分離し て、溶出 画分に含ま れる重鎖リン酸 化活 性 を 測定 し た。 そ の 結果 、 カル シ ウ ムキ レ ー ト剤であ るEGTA存在下 で2種類、 さら にカ ル シ ウム ー カル モ ジ ュリ ン 存在 下 で 2種 類の 活 性が検出 された。 これらの うち、EGTA存 在下 で 検 出さ れ た2種類 の活性（ MKI，MKII）につ いてさら に精製を進 めた後、 それ らの 性 質 を調 べ た。 MKIに ついては さらに2段 階のカラ ムクロマト グラフイ ーを用い て約 130倍 に 精 製し た 。MKIの 未 変性 条 件下 の 分 子量 は 約 40kDaであ り 、 MKIに は ミオ シン
重 鎖リ ン 酸 化活 性 に加 え て LC20リン 酸 化活 性 も みら れ た。MKIによる ミオシン 重鎖上のりン酸 化部位は C末端領域 に存在し 、リン酸 化されるSer付近のアミノ酸配列は平滑筋ミオシンに 特異的で あった。 また、LC20は MKIによりSerl， Ser2がりン酸化 されるこ とが明らかとな った。平 滑筋ミオ シンの以 上のよう な残基をり ン酸化するりン酸化酵素の報告は今回が初 めてであ る。一方 、MKIIはさら に3段階の カラムクロ マトグラ フイーを 用いることで高度 に精製さ れた。MKIIは MKIと異なり 、平滑筋 ミオシンの 重鎖のみ をりン酸 化した。

MKIIの 未 変 性 条 件 下 の 分 子 量 は 約 160kDaであ り、 43kDaと26kDaのサ ブユ ニッ トをほ ぼ1:1の 割 合 で 含む こと が示さ れた 。ま た、 MKIIは酸 性タ ンパ ク質 をよ ぃ基 質と し、数 Pg/mlの 濃度の ヘパ リン で阻 害さ れた 。こ れら の性 質か ら、 MKIIは既存 のSer/Thr型プロテ
イ ンキ ナー ゼの CKIIであ ると 考え られた が、 抗体 染色 の結 果か らMKIIはCKIIであることが 確認 され た。 MKII/CKIIに よる ミオシ ン重鎖上のりン酸化残基はMKIによるりン酸化残基 の19残基 下流 に位 置す るこ とが わかっ た。リン酸化されるSerは、CKIIのりン酸化部位の共通配歹IJ、によく当てはまり、平滑筋ミオシンと非筋型ミオシンIについて保存されている領域に存在した。
次 に 、 MKIま た は MKII/CKIIで り ン酸 化 し た ミ オ シ ン の ア ク チ ン 活 性 化 ミ オ シ ン
MgATPase活 性、自己会合能力、10S‑6S形態変化を調べた。平滑筋ミオシンは、in vitroにおいて溶媒条件を変えるこ、とで、会合体、10S単量体、6S単量体を形成する。会合体はミオ シン 分子 が自 己会 合し て繊 維状 の形態 をと った もの で筋 収縮 には この形態が必要である 。 10S単 量 体と 6S単 量体は 沈降 係数 から 名付 けら れた が、 それ ぞれ MgATPase活性が 不活 性ま たは 活性 な状 態で 安定 化し たミオ シン単量体である。MKIまたはMKIIどちらの酵素
で りン 酸化 した 場合 も、 アク チン 活性化 ミオ シン MgATPase活性 に変 化はなく、これらのり ン酸 化は 収縮 系に 直接 関係 しな いと思 われた。また、MKII/CKIIによってりン酸化した
ミ オ シ ン は 、 自 己 会 合 能 力 、 10S‑6S形 態 変化 とも りン 酸化 しな いミ オシ ンと 変わら な
か っ た 。 こ れ に対 して 、MKIによ るり ン酸 化は アク チン 活性 化ミ オシ ンMgATPase活性 は変 えず に、 ミオ シン の10S形態 形成 を阻 害し、自己会合を促進することが見い出された。
こ の結 果か ら、 MKIに よる りン 酸化 は、 弛緩状態におけるミオシン会合体の安定化に寄与し てい ると 考えられた。以上のように、今研究では大動脈平滑筋に含まれるミオシン重鎖リ ン酸 化酵 素の精製を進めたことで、これまで報告のあったCKII以外の酵素が平滑筋に含ま れる こと が新たに示された。また、CKIIによる重鎖リン酸化の意義が明らかにされていな いの に対 し、 MKIに よる りン 酸化 は平 滑筋ミオシン会合体を安定化する作用があることが 見い 出さ れた。平滑筋ミオシンの性質が重鎖リン酸化に関連して変化することを報告した のは 今回 が初めてであり、ミオシン重鎖リン酸化の生理的な役割を検討する上で重要な結果であると思われる。

学 位論文審査の要旨
主副副査
査
査

教教教授 盛授 杉授 谷田本口フ ミ
和 則和 彌

学 位 論 文 題 名大動脈平 滑筋ミ オシン重 鎖リン酸 化酵素に関する研究
ミ オシ ンは 、大 動脈 平滑筋において張カを維持するために作用する主なるタンパク質分子である。ミオシンは、その分子内にATPase活性部位を持ち、ATP加水分解で得られるエネ ルギ ―を 消費 して 、張カを発生する。大動脈平滑筋ミオシン分子は重鎖と二種の軽鎖そ れぞ れニ ケづ っが 会合 した 6畳体 であ り、 二つ の頭部と細長い一本の尾部を持っている。二つの重鎖のN末端部分は、ミオシン分子のそれぞれ異なる頭部を形成し、頭部付け根の部分から、ほぼ、10016ヘリックスとなった重鎖が互いにコイルドコイルとなって一本 の尾 部を 形成 して いる。二種類の軽鎖は各頭部において、尾部の付け根付近に結合し、制御軽鎖(LC20）のSer19は、カルシウムイオン濃度に依存して燐酸化され、平滑筋張力発生を制御している。
一方、大動脈ミオシン重鎖においても、ミオシン尾部先端に位置するC末端付近で燐酸化の起こることが認められている。しかし、その燐酸化の役割は全く解明されておらず、
また 、燐 酸化 酵素 の分 離精製や、キャラクタリゼーションも、これまでほとんど、なされて いな かっ た。 申請 者は、ブタ大動脈平滑筋を用いて、内在性のミオシン重鎖キナー
ゼの 検索 、ミ オシ ン重 鎖キナーゼの精製とキャラクタリゼーション、ミオシン重鎖上の燐酸 化部 位の 同定 、お よび重鎖燐酸化に伴うミオシン分子の物性の変化、を追求した。
申 請者 は、 先ず 、内 在性ミオシン重鎖キナ―ゼを組織的に追跡するために、大動脈平滑筋抽出液をDEAE―Toyopearlカラムで展開し、各画分の重鎖キすーゼ活性を測定した。
その結果、カルシウムイオンで活性化される二種類と、EGTA存在下で活性を示す二種類、合計 四種 のミ オシ ン重 鎖キナーゼの存在を認めた。申請論文では、EGTA存在下で活性を持 つ 二 種 類 、 即 ち、 DEAEカ ラム から 0．15およ ぴ0．21KC1で 溶出 され た画 分、 myosin
kinaseI（JIKI）およびII（IIKII）について詳しく調べた。1IKI
は、さらに、二段階のカラムク 口マ トグ ラフ アに より、約130倍精製され、分子量は、4万と推定された。基質特異性は低く、プロタミンやカゼインの他に、ミオシンLC20のSerlおよびSer2も燐酸化した。
〔ア−8 2PJ ATPを基質とし、IIKIで燐酸化したミオシン重鎖をトリプシンで消化し、燐酸化ペプチドを単離した。ペプチドのアミノ酸配列分析から、燐酸化部位付近はRGNETSFVPの配列 を持 ち、 6番目 のSerが燐酸化されていることを明らかにした。この配列と、既に報‑ 167―

告さ れている ミオシン 重鎖のア ミノ酸配 列を比較 すると、ペ プチドC末端のProは、平滑筋ミ オシン204ー kDa重鎖アイ ソフォーム尾部先端の近くにある、ヘリックスを崩すProの位置 に相当し ていた。 一方IIKIIは、ほぼ均一に精製され、カゼインキナーゼIIであると同定 された。その燐酸化部位は204―kDa
重鎖アイソフォームの尾部先端のヘリックスの崩れた 部分に存 在するこ とが明ら かになっ た。
IIKIIによ る大動脈 ミオシン 燐酸化は、ミオシン分子のATPase活性や溶解度に有意の変化を 与えず、その燐酸化の意義は不明のまま残された。しかし、IIKIで燐酸化すると、大動脈 ミオシン 分子の溶 解度が減 少し、ミ オシンフ アラメント が安定化されることが示された 。また、それに伴い、ミオシンATPase活性が高くなることも見いだした。これらは、哺乳 類由来の ミオシン 標品、で 初めて観 測された 変化である 。
以上 の研究結 果は、大 動脈のみ ならず、 哺乳類平 滑筋一般のミオシン重鎖燐酸化の生理的 意義の解 明に大き く貢献す るものと 評価され る。よって 審査員一同は、申請者が博士 （ 理 学 ） の 学 位 を 受 け る に 充分 な資 格 を有 する も のと 判断 し た。

‑ 168ー