博士 （獣 医学）迫康仁

学位論 文題 名T
heiler切s￠響刀ガ遺伝子クローニングおよびTheileria
属原虫ゲノム構造比較解析
学位論文内容の要旨
小型ピ口ブラズマ症は、Tん 酬erぬsergenH原虫の赤血球 内寄生に伴う貧血および発熱 を主徴とする 疾病である。本原虫の単独感 染での病原性は低いが、飼育環境の変化、輸送、妊娠、ウイルス・細菌 ・住血原虫（バベシア）を含 む他の病原体の混合感染等によるストレス負荷により、急激な原虫増殖 が誘発され発症に至ると考え られている。重篤な貧血を 示した場合、死亡することも 希ではない。 その経済的損失が大きいこと から本原虫症は日本での家 畜衛生において重要な位置を 占めている。 レかし、本症の防御法は確立 されておらず、また宿主体 内での動態、貧血発症の機序 等不明な点が 多い。そこで、本研究はrserge冖灯感染症のコントロ― ル法開発を目的とし、原虫特 異的な化学療 法剤の開発および効果的な免 疫賦与法の開発に必要であ る原虫の各種遺伝子のクロ― ニングと構造解析を行い、さらに原虫株間の多型性解析を行った。
ま ず 、Fse曙 en灯に 特異的な効果を発揮する化学 療法剤の開発を目的とし、 システインブロテ
ア― ゼの遺伝子クロ―二ングを行 いその塩基配列を決定した 。その結果、システインプロ テアーゼ
cDNAク ロ ーン は402個 のア ミノ 酸を コ ード して おり 、 その 予測 分子 サイズは46．4kDaであった。
また 、システインプロテアーゼが ビロプラズムステージでも 発現していることを明らかに した。さらに、池田（｜）型および千歳（C）型原虫聞でシステインブロテア―ゼ遺伝子内の制限酵素認識配列や遺伝子のフランキング領域に多型性が存在することを明らかにした。
次 に Fsergen灯感染 症に対するワクチン開発を目 的とし抗原蛋白質遺伝子の クロ―ニングを行った 。現在までに主要ピロブラズ ム表面蛋白質（MPSP）のワクチン抗原としての有用性が示されているが 、その効果が十分ではないこ とから他の抗原の探索が必 要とされている。ピロブラズ ム表面蛋
白 質の 1つ であ る 分子サ イズ23kDaの抗原蛋白質（p23）はワクチン抗原候補と考 えられている。その 遺伝 子 解析 の結 果、1型およびC型間での多型性が すでに確認されている。p23を免疫賦与抗原とし て使 用 する には 、MPSP遺伝 子で 示さ れて いるよう な表面抗原型の異なる原虫 の混合感染があるのか を明らかにする必要がある。 そこで、今回p23のアレル特 異的polymera
sechainreaction（PCR）
法 を 開 発 し 、 実 験 継 代 株お よび 日 本国 内分 離株 を用 い て分 子疫 学解 析 を加 えた 。そ の結 果 、rse′ ．ge冂灯はC型および1型原虫の混合集団として感染牛内に存在していることが明らかとなった。また、 世界に広く分布しているF6U冖舌〃（B型）のp23遺伝子を クロ―ニングしその塩基配列を決定した 。そ の 結果 、B型p23は アミ ノ酸 レベ ルで C型 p23と93．5％の 相同 性を 示 し、 N型 糖鎖 付加 部位やC一末端部位のVaIineに富んだ領域は保存されていた。
Fsa′g帥灯感染症に対するワ クチン開発の標的ステージ として、貧血という病態に主 に関与するス テージであるピロブラズムで 発現される抗原蛋白質の解 析が行われてきた。しかしな がら、多くの 原虫抗原蛋白質はステ―ジ特 異的に発現していることが 知られており、この虫体構成 蛋白質のス テー ジ 間の 発現 変化が 寄生虫の宿主免疫応答回避 機構の1つと考えられている 。そこで、ピ口ブ
ラズ ムと感染ステージであるスボ ロゾイトの両ステージで発 現している抗原蛋白質の遺伝 子クローニ ング を 行っ た。 その 結 果、 両ス テ― ジで 発 現し てい る分 子サ イ ズ60kDaの新 規抗原蛋白質Ag60を同 定した。Ag60は免疫電子顕徴 鏡法を用いた観察より、ア ピカルコンブレックス門原虫 に特徴的な構 造物であるロブトリ―に存在 する蛋白質であることを明 らかにした。また、1型およ びC型原虫― 1133―

間 でAg60の 遺 伝的 ・抗 原的 多 型性 が示 され た。 これらステージ共通抗原を用 いることにより、ステージ毎 での抗原変換による原虫の 宿主免疫応答回避機構を克服 できるワクチンの開発の可 能性が示された 。
本研 究で行った一連の遺伝子解 析から、F serger7ti原虫内 の多型性が示された。原虫の遺伝的多 型性 の生 じ る要 因の 1っは有性生殖を介した染 色体の組換えである。そこで 、これを解析するための重要 な基礎情報となる原虫のゲ ノム構造の解析を行った。さ らに、二種のTheileria属原虫間のゲノム構 造の比較解析を行い、種の 分化の過程でゲノム構造に変 化が生じ、それが病原性に 影響するかにつ いて考察を行った。
パ ルス フ ィ― ルド ゲル 電 気泳 動法 を用 いた 解 析よ り、 F sergentiはFparvaと同様に4本の染色体を有 していることが明らかとな り、Theileria属原虫聞の染 色体数やそのサイズの差は少ないことが示さ れた。さらに、現在までに クローニングされている遺伝 子の位置している染色体を 調ベ、
MPSP遺 伝子 は 第1染 色 体上 に、 p23、シ ステ イン ブ 口テ アー ゼ、 Heat shock protein（Hsp）70遺伝 子は 第2染色 体上 に 、small subunit ribosomal RNA（SSUrRNA)遺 伝 子は 第1およ び第 3あ るい
は4染色 体上に存在していることを明 らかにした。
次 に、 ニ 種の Th eileria属原虫間（FparvaとFsergentDのゲノム構造の 比較をhouse keeping
遺伝子を マーカーとして用いた染色 体核型解析により行った。そ の結果、本研究で使用した ほとん
どの遺伝 子の位置する染色体は同一 であった。つまり、両種間で シンテ二―の保存が観察さ れた。
しかしながら、システインブ口テア―ゼ遺伝子下流域の染色体構造に違いが観察された。すなわち．、F sergentiにおいてシステインブ口 テアーゼ遺伝子はHsp遺伝子 （第2染色体）と連鎖してい たが、F parvaで は 連 鎖 し て い な かっ た。 こ のよ うな 染色 体構 造 の違 いは 、Fparvaの 第2お よ び第 3染
色体がシ ステインプロテアーゼ遺伝 子下流域で交差することによ り生じたためと解釈するこ とができ た。 この 仮 説は 、F parvaに おい てシ ス テイ ンブ ロテ ア ―ゼ 遺伝 子はSSUrRNA遺伝子（第3染色体）と連 鎖しているのに対し、F sergentiでは連鎖していないという結果によっても支持される。この 染色 体交 差 の際 、ス ポロゾイトの宿主細胞に対 する親和性を決定するp67遺 伝子が欠損してしまった可能 性が推察され、染色体構造 の変化がTheileria属原虫の 種分化において極めて重要な意味をもつと考 えられた。
今後 、本研究でクロ―ニングさ れた遺伝子の情報に基づいて より有効なF sergenti感染 症コン
トロ―ル 法開発への道が開けると思 われる。また、ゲノム構造お よび各遺伝子の位置する染 色体が明らかと なったことより、それら遺 伝子をマ一カーとして用い、 有性生殖を介した遺伝子多 型性の生じる機 構を明らかに出来ると考え られる。

ー 1134 ‑学位論文審査の要旨
主 査

教 授

小 沼

操

副 査

教 授

斉 藤 昌 之副 査

教 授

渡 邉 智 正

副 査

助 教 授

杉 本 千 尋学 位 論 文 題 名

Theilerzaserge7zガ遺伝子クローニングおよびTheileria属原虫ゲノム構造比較解析
Thei
leri
a sergent
i感染症の防御法はいまだ確立されておらず、宿主体内での動態、貧血発 症の 機序についても不明な点が多い。本研究はF sergent
i感染症の防御法の開発を目的と し 、 原 虫 の 各 種 遺 伝 子 の ク 口 ー ニ ン グ と 原 虫 株 間 の 多 型性 解 析 を 行 っ た 。
まず 、f serg
entiに対する化学療 法剤の開発を目的とし、システインプロテアーゼの遺伝 子ク 口 ーニ ング を行 いそ の塩 基配 列を 決定 した 。シ ステ インプロテアーゼcDNA
ク口ーン は 402個 の ア ミ ノ 酸 を コ ー ド し て お り 、 予 測 分 子 サ イ ズ は 46.4kDaで あ っ た 。
次 にf sergentiとァbuffeliの 抗原蛋白遺伝子のク口ーニングを行い、ピ口プラズム表面
蛋 白質 の 23kDa
抗 原(p23） 遺伝 子の 多 型性 を明 らか にし た。 また 、ピ 口プ ラズ ムと スポ口 ゾ イ 卜 の 両 ス テ ー ジ で 発 現 し て い る 60kDaの 新 規 抗 原 Ag60を 見出 した 。Ag60は 免疫電 子顕 微 鏡観 察よ り口 プト リー に存 在す る蛋 白質 であ り、 Ag60は両ステージで発現することよルワクチンに利用できる可能性が示された。
今 回の遺伝子解析からァぷergent
i原虫内での遺伝子多型性が示され、原虫の遺伝子多型性 の生 じ る要 因の 1っ は有 性生 殖を 介した染色体の組換えが考えられる。そこで、原虫のゲ ノム 構 造の 解析 を行 った 。そ の結果、F serg
enti
は4本の染色体を有しており、既知遺伝 子の 染 色体 マッ ピン グを 行っ たと ころ 、p32遺伝 子は 第1染色 体 上に 、p23、 シス テイ
ンプ口テアーゼ、heatshockprotein70遺伝子は第2染色体上に、smallsubunitribosomalRNA
遺 伝 子 は 第 1お よ び 第 3あ る い は 4染 色 体 上 に 存 在 し て い る こ と を 明 ら か に し た 。
次に 、二種のTh
ei
leri
a属原虫聞(T. parvaとFsergenti)のゲノム構造の比較を行った。
そ の結 果、本研究で使用したほとん どの遺伝子の染色体上の位置は両原虫間で同一であった が、 システインプロテアーゼ遺伝 子下流域の染色体構造に違いが観察された。このような 染色 体構 造の 違い は、 染色 体が 交差 する こと により 生じたためと考えられる。
本 研究 によルクローニングされた遺伝子を用いてのワクチン 開発の可能性、また既知遺伝子 の染 色体上の位置が明らかとなり有性生殖の際の遺伝子多 型性の生じる機構の解析が可能となった。この研究はTh
ei
leri
a原虫感染症の制圧に重要な知見を提供する。よって審査員 一同 は、 迫康 仁氏 が博 士（ 獣 医学 ）の 学位 を受 ける のに 十分な資格を有するものと認めた。
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