博士（医学）齋藤善也
学位論文題名Osteopontin Small工 nterf・ eringRNAProtectSMiCefromFulminantHepatitiS（オステオポンチンsiRNAによる劇症肝炎の治療）学 位論文内容の要旨【 背景 と目 的】 細胞 外マ トリ ック スの 一種 であるオステオポンチン(OPN)は、非コラーゲン性分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、乳汁、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファー ジ、 活性 化T細 胞や NKT細 胞、 ある 種の 腫瘍 組織 など に広 く発 現が 認め られている。
OP
Nは 分子 内に 複数の機能ドメインが存在し ている。すなわち、av[33、aspiインテグ
リ ン を 代 表 と す る RGD認 識 イ ン テ グ リ ン と 結合 する GR
GDS配列 、a4pi、 a9piイン テグ
リンと結 合するS；VVYG
LR配列、シン デカンファミリー分子の側鎖と結合するへパリン結合 ドメ イン が存 在 し、 また 、OPNは CD44と結 合することも報告されている 。このように
OPNは多種の受容体やタンパク質と結 合することで、細胞接着、細胞遊走、細胞増殖、腫瘍細胞の 浸潤や転移、免疫系ではThl型サイトカインとして生体防御反応を制御するなど、多彩な機 能を持っことが報告されている。
OPNは 炎 症 性 疾 患 の ー つ 、 で あ る 肝 炎 の 病 態 に 深 く 関 与 し て い る 。 当研 究室 ではconcanavalinA(ConA)肝 炎 モ デ ル マ ウ ス を 用 い て OPNと NKT細 胞 の 関 係 を 明 ら か にし て お り 、 NKT細 胞 か ら 分 泌 さ れ た OPNが NKT細 胞 の 活 性 化 と 好 中 球 の 遊走 、活 性化を惹起す ることで肝炎を重症化させ、抗OPN中和抗体の投与により肝炎が抑制できることを報告し てきた。また、抗OPN中和抗 体は関節リウマチに対する治療効果も見いだすことができ、抗体医薬としての臨床応用が期待され、現在、臨床試験が進められている。このよう に 、 OPNは 炎 症 性 疾 患 に 対 す る 疾 患 治 療 の 標 的 分 子 と し て 注 目 さ れ て い る 。
しかし抗体医薬を臨床に応用する場合、その作製には多くの費用、期間がかかるため、実際の治療においては膨大な医療費負担を余儀なくされる。また、アナフィラキシー等の抗体
投 与時 反応 や、 連 用投与による薬効力価の低下を生じる可能性もある。現 に、抗CD28ア
ゴニステ ィック抗体の臨床応用では、第I相臨床試験にて重大な被害が出ている。さらに、
抗体医薬 では局所特異的に作用させることが未だ困難であり、DrugD
elive
rySystemの開発も遅れ ているのが現状である。
そこで 本研究では、抗体以外の方法によるOPNの機能抑制法として、分子特異的ノックダウン法 のーっであるRNA干渉(RNAi)法に着目した。
smallinterferingRNA (siRNA)に よ る RNAiは 、 21〜 23塩 基 の 2本 鎖 RNAを 細 胞 内に 導入 する こと に より、その配列特異的にmRNAを分解し、目的遺伝子の発 現を抑制する方法であ る。siRNAはアンチセンス核 酸やりボザイムと比較し、配列特異性、有効性が共にはるかに優れており、化学合成が可能であるため安価に短期間で作製できる。また、その作用部位 は細胞内であり、血中では容易に分解されるため、抗siRNA抗体は産生されにくいと考え られ、連用治療が容易に行えると予想できる。さらにsiRNA発現ベクターの使用により長期的発現抑制、薬剤誘導による発現抑制の制御も可能であり、また、ウイルスベクター等に組み込むことによって、将来的には臓器・部位特異的な発現抑制も可能になると考えられる 。このようにsiRNAを用いた 核酸医薬は、抗体医薬と比べて優れた点が多く存在している 。
―228―

本研 究で は、 RN
缸 法、 すな わ ち8迅N
Aを用いた核酸医薬による疾患治療法 の開発を目的 と し て 、 OPNに 対 す る 8iRNA（ OPN8皿 NA） を 用 い た OPN発 現 抑制 効果 と、 0PNsiR
NAに よ る 劇 症 肝 炎 の 治 療 効 果 、な ら び に そ の メ カ ニ ズ ム に つ い て 検 討 し た 。
【 方 法 と 結 果 】 本 研 究 で は 最 初 に 、マ ウス O
PN遺伝 子配 列か ら 配列 特異 的な s皿 NAを複 数 個 作 製 し 、 血 廐 朋 に お い て 外 来 性 0PNの 発 現 抑 制 を mRNAレベ ル、 タン パク 質レ
ベ ルで 確認 した 。内 在性 OP
Nの 発現 抑制についても同様にその効果を確認し 、作製した
siRN
Aの 内、 最も 発現 抑制 効果 の高 いOPNs凪 NA
配 列を 以後 の 実験に用いた。また、OPN
s皿N
Aによる発現抑制効果の持続期間を検討 したところ、約7日間の抑制効果がみられた。
0P
NsiR
NAの核酸医 薬としての可能性を評価するため、以下の実験を行った 。まず、投与 し た s凪 NAの 体 内 動 態 を 確 認 す るた め、 螢光 標識 した s皿NAを0時 間、 8時 間、 24時間の3回、マウスに尾静脈から投与し、最終 投与から24時間後に肝臓組織切片を作製、共焦 点顕 微鏡にてsiRNAの導入を確認した。s皿NAは肝実質細胞及び内皮細胞の 細胞質内、核近傍に存在す ることを確認した。
次に 、炎症性疾患 に対する治療効果を検討するため、ConA
肝炎モデルマウ スを用いた
血 ガ 閉 ア ッ セ イ を 行 っ た 。 OPNs皿 N
Aを 、ConA投 与の 2
4時 間前 、16時間 前、 同時 間の3回、尾静脈からマウスに前投与し、さらに C
onAを投与して肝炎を誘発させ、炎症反応とOPN発現 に対 する 抑制 効果 にっ いて 検討した。炎症の指標として血清脚｜値 を測定したと こ ろ 、 OPNsiRNA投 与 群 に お い て その 有意 な低 下が 見ら れた 。ま た、 この OP
Ns皿NA投与群では、肝 臓内の0PNタンパク質発現も 同様に抑制されていた。更に、肝臓組織切片の HE
染 色に より 、病 理学 的に も 、OPNsiRN
A投 与群 にお いて 肝炎の増悪化が 抑制されてい る こ とを 確認 した 。こ れら のこ とか ら、 OP
Ns迅NAは0PNタン パク 質の 発現 を抑 制す
る こ と に より 、肝 炎の発 症・ 増悪化 を抑 制する こと が示唆 され た。
0PNsiRNAが 肝 炎 を 抑 制 す る メ カ ニズ ムに つい て解 明す るた め、 肝臓 組織 にお ける
OPN、 IFN・ Yの 発 現 量 を mRNAレ ベ ルに て確 認し た。 その 結果 、 OPN発現 量と IF
Nー Yの発現量が相関し ていることが明らかとなった。
【考 察】 本研 究の 結果 より 、OPN si
RN
Aを尾静脈から投与し肝臓内に導入することで、肝臓 内の OPN発 現量 を下 げ、 ConA
誘 導劇症肝炎の発症を抑制し、治療できることが明らかとなった。
1ConA肝 炎モ デル マウ スに 韜い て、 NKT細 胞が 発現 する OPNが肝 炎 の増 悪化 に大 きく
寄与 して いる こと が、 OP
N欠 損マ ウス 、NKT細胞 欠損 マウ ス、 抗0PN中和 抗体 を用 いた研究により報告されている。OP
N8iR
NAは肝実質細胞、内皮細胞への導入は確認できたが、N
KT細胞 へ の取 り込 みは 確認 でき てい ない 。こ れは 、NKT細胞を示すNK
l．1
マーカー分子の 発現 が、 ConAによ るNKT細胞 の活 性化 に付 随し て低 下して しまい、s迅NAが導入された 活性 化NKT細胞 を検 出す るこ とが 困難 なた めで ある 。今後 、s迅NAが導入された細胞の同定をはじめとする、肝炎抑制メカニズムのより詳細な解明が必要であると考える。
これまでに、OPNの機能抑制が関節リウマチ、多発性硬化症等といった炎症性疾患の発症抑制にっながることが報告されている。投与法ならびに導入法の検討を必要とするが、0PNsiRNAは こ れ ら の 疾 患 に 対 し て も 治 療 効 果 が 期 待 で き る と 考 え ら れ る 。
【結 論】 本研 究に より 、OPN siR
NAに疾患治療効果 があることが明らかにたった。これに よ り 、 OPN siRNAが 核 酸 医 薬 と 成 り 得 る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

ー 229―

学 位論文審 査の要旨
主 査 教 授 小 野 江 和 則
副 査 教 授 笠原 正 典
副 査 教 授 上出 利 光

学位論文題名OsteopontinSmall工nterferingRNAProtectsh/IicefromFulminantHepatitis（オステオポンチンsiRNAによる劇症肝炎の治療）
オステオポンチン(OPN)は、分子内に複数の細胞結合部位を有し、それぞれに特異的な受容体、タンパク質と結合することにより細胞の生存・増殖、免疫細胞の活性化などに関与している。OPNの発現増強は炎症性疾患を悪化させ、OPN欠損やOPNに対する中和抗体投与により炎症性疾患の緩和が 報告されている。特に肝炎においては、NK
T細胞の産生するOPNが、NKT細胞、好中球、T細胞といった免疫細胞を活性化し、肝実質細胞に対する細胞障害を惹起し、肝炎を悪化さ せていることが報告されている。 そこで申請者は、OPNを抑 制 す る siRNA (OPN siRNA)を 用 い た 肝 炎 抑 制 効 果 に つ い て 検 討 し た 。
申請者は、OPN siRNAを4種 作製し、最初にその発現抑制効果について検討した。外因性 及ぴ 内在 性OPN発現細 胞にて卿Nの発現抑制効果を 検討し、最も効果の高いO
PN siRN
Aを 以後 の実 験に 用いた。OPN siRN
Aは分裂を繰り返す培養細胞において5日間程度のOPN発現抑制効果を持つことを確 認した。
次にsiRN
Aの肝臓導入について検討した。蛍光標識した siR
NAをハイドロダイナミクス法にてマウス尾静脈から静注し、肝臓切片を共焦点顕微鏡にて確認したところ、肝実質細胞や血管内皮細胞の細胞質に siRNAの導入が確認された。
そこで、OPN si
RN
AをコンカナバリンA投与肝炎モデルマウスに発症前投与し、肝炎抑制 効果 につ いて 検討した。siRN
A単独投与では血清ALT値の増加は見られず、siRN
Aそのも のの 肝毒 性な 無いことをまず確認した。肝炎モデ ルにコントロールsiRNAを投 与した群では高い血清ALT値を示したが、OP
N siRNA投与群では、その増加が有意差をもって抑制された。 この時の肝臓内でのOPN
タンパク質もまた、OP
Nsi
R
NA投与群に韜いてその発現が抑制されていた。肝臓組 織切片を用いた病理組織学的検討により壊死範囲を確認したところ、.
OP
Nsj
RN
A
投与群では肝壊死の著明な減少を確認した。これらのことから、O
PNsi
RN
Aは肝臓内のOPN発現を抑 制することにより、肝炎増悪化を抑制することを明らかにし た。 肝臓 内に おけるOP
N発現と肝炎増悪に関与するインターフェロンッの発現 に相関性があることから、OP
N si
RNAの肝炎抑制効果の1っのメカニズムとして、Thl型サイトカインの産生抑制の可能性があ る。
申請者の発表に対し、副査 笠松教授より、OPN siR
NAに よる肝炎治療において、NKT細胞へのsiRNA導入、発現抑制の確認について質問があり、 申請者は、コンカナバリンA刺‑ 230ー

激によりNKT細胞特有のマーカーが消失する特性があり、当時、技術的にNKT細胞を追跡・分離することが不可能だったことを説明した。次に、肝炎の発症初期での治療的si
RNA投与に対する効果の見解について質問があり、申請者は、他の免疫細胞への活性化刺激が考えられることから、本発表のような抑制効果i瑚誰しいと回答した。最後に、関節炎モデルでの疾患抑制を目的としたsiR
NA投与の検討についての質問に対し、申請者斌、他の標的分子に対するsi
RNAを用いた関節炎実験の結果から、導入及び発現抑制には効果が見られるものの、疾患抑制という点では効果が低く、これは導入された細胞の種類が大きく関係していると回答した。
次いで主査小野江から、siR
NAの遺伝子発現抑制メカニズムについて質問があり、自身の実 験デー タに基づ き詳細 に回答し た。siRN
Aの水圧による細胞導入の機序説明に対しても適切に回答した。また、作製したOP
NsiRN
Aのヒト・マウス種族間の相補性と効果についての質問に対しても、配列特異性の点から、異種間においては同様の抑制効果は得られないと推察する旨の回答をした。
最後に副査上出教授より、培養細胞導入後のsiRN
Aによる長期遺伝子発現抑制の機序につい て質問 があり、申請者は、過去の文献的考察をもとに概ね妥当な回答を成しえた。
本学位論文は、siRN
Aを用いて肝炎モデル動物における肝炎抑制効果を示したことが評価で き、今 後siRNAを用いた肝炎治療への応用が期待される。更に近年、si
RN
Aによる核酸医薬の臨床試験が始まっている状況を踏まえると、本学位論文は核酸医薬の基礎研究として重要であると判断する。
審査員一同はこれらの成果を高く評価し、また、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定する。

ー 231―