博士（獣医学）折野宏一
学位論文題名ウシの鉄結合夕ンパク質フェリチンに関する生化学的研究
学位論 文内容の要旨
フウリチ ン(Ft)は24量体で分子量約48万の鉄貯蔵夕ンバク質である。Ftは細胞内夕ンパク質であるが、血中にも微量に存在する。血清Ft量は体内貯蔵鉄量の指標であり、また炎症および腫瘍性疾患で上昇する。胎子血清Ftレベルも妊娠の進行とともに上昇するが、ヒト以外の動物における胎子Ftについての情報は全くない。従来より、ヒト血清または血漿にFt結合夕ンバク質が存在し、Ft免疫学的測定に影響を与えることが示唆されていた。本研究ではウシの構造と病態生理学的意義を明らかにする目的で、まず、ウシ組織Ftの分子性状を明らかにした。次にウシおよびウマFtのための免疫学的測定法を確立し、これに対する血清および血漿の阻害効果を調べた。そして、この測定法を用いて健常牛および各種疾病牛の血清Ft濃度を測定した。さらにウシ
胎子血清Ftの分子性状を明らかにし、胎子血液循環系における生理学的役割 について検討した。これらの成績は以下の如く要約される。
1）Sodiumdodecylsu
lfa
te‑ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS‑PAGE)に おいて測定されるウマ、ヒトおよびラットFtのH(eart)型鎖の分子量はL(iver)型鎖より大きいことが一般に報告されているが（H： 21 kDa，L： 19 kDa)、ウシでは逆で あった（H：18 kDa，L：21kDa）。ウシと他の哺乳類の間のFtサブユニットの分子量の違いが何に起因するかを明らかにするために、ウシ脾臓スgtllcDNAライブラリーか ら分離したウシFtサブユニットcDNAクローンの塩基配列を決定し、演繹されたウシFtサブユニットのアミノ酸配列と既報の他の哺乳類Ftサブ ユニットのアミノ酸配列を比較した。HおよびL鎖はそれぞれ180および174アミノ酸残基で構成され、アミノ酸配列から算出されたH鎖の分子量は 20，920、L鎖は19．856であった。HおよびL鎖間のアミ ノ酸配列の相同性は54%であった。ウシH鎖とヒト、ラットおよびマ ウスFtH鎖の間の相同性はそれぞれ91％、92%およぴ9390と高かった 。ウシL鎖は ウマ、ヒトおよびウサギL鎖と同じアミノ酸残基数であり、ウシとウマ、ヒトおよびウサギL鎖の配列比較ではそれぞれ24個（相 同性，8690）、28個（8490）および23個(87%）のアミノ酸置換が見られたが、アミノ酸あるいはべプチドの挿入または欠失は認められなかった。ウシFtサブユニットはコンカナノヾリンA(ConA）と 反 応 し な か っ た 。 バ キ ュ ロ ウ イ ル ス一 昆 虫細 胞（ ＄ odopぬ rafrugip erda)発現系で発現させたHおよびL鎖をSDS‑PAGEにより解析し た結 果 、発 現Hお よび L鎖は それ ぞれウ シ脾臓FtのHお よびL鎖と全く同 じ移動度を示した 。以上の結果から、SDS‑PAGEにおいてウシL鎖が他の哺乳類 L鎖に比べ非 常に遅く泳動され るのは、ウシL鎖へのアミノ酸あるいはべプチドの挿入および欠失または糖鎖付加によるのでは なく、これらのL鎖へのSDSの結合量の違いに起因すると推察された。
2）ウマFt免疫測定に及ぼす血清の影響を、システムAおよびシステムBの2種の サンドイッチELISAシステムを用いて調べた。システムA
では、一次抗体としてアフイニティ精製ウマ脾臓Ft抗体を、二次抗体としてアルカリホスファターゼ標識精製抗体を用い、システムBでは全抗血清および酵素標識全抗血清をそれぞれ用いた。ウマ血清に添加した精製ウマ脾臓Ftの回収率iま、いずれのシステムでも非常に低かった（システムA： 50‑71％；システムB：42‑79%）。血清を75℃で15分間加 熱処理することに よルシステムAでの回収率は改善された(90〜9690）が、システムBにおける回収率は加熱処理によっても十分には改善されなかった(75〜8390）。これらの結果から、ウマ血清にはFt
免疫測 定法を阻害する熱 に不安定な物質の存在することが示唆された。ELISAシステムAにより測定したウマ血漿のFt測定値は血清のそれより も10‑‑‑ 50%低いFt値を示したが 、両者を加熱処理（ 75℃ ，15min)することによ り、これらのFt測定値は上昇し、ほぼ同じ値を示した。ウマ血清に添加したウマフィブリノーゲンは、Ft測定値を著しく低下させた。また、フイブリノーゲンはウマ脾臓Ftの免疫測定を阻害し、このFtと結合することが見出された。以上の結果から、フイブリノーゲンはFtの免疫測定を阻害する血漿特異的Ft結合物質であることが結論づけられた。
3）ウシ血清Ft測定のための高感度ABC(avidin‑bitotincomplex）法
ELISAを 開 発し た。 こ の測 定系 に おけ るウ シ 脾臓 Ftの 測定 限界 はO.lng/mlであった。硫酸アンモニウム（硫安）を含むELISA緩衝液で希釈した血清（最終濃度：0.46M)のFt測定値は硫安を含まない同緩衝液で希釈した血清のそれより有意に高い値を示したが、血漿Ft測定値は硫安の影響を受けなかった。硫安存在下および非存在下のいずれにおいても血漿は血清より有意に低いFt値を示した。血清に添加した
ウシ脾臓Ftの回収率は39〜5790と低かったが、硫安を添加することによりほぼLOO％に改善された。しかし、血漿における回収率は硫安存在下でも73〜87%と低かった。これらの結果から、ウシ血清および血漿にはFt免疫測定を阻害するFt結合物質が存在することが示唆された。
血清Ftレベルは2才以上の健常な非妊娠牛の血清Ft値（平均値土SD=ニ46土28 ng/ml,n=69)に上ヒベて、自血病（149土130ng/ml，n=14)、炎症性疾患(553
土530ng/ml，n二＝ニ7）および小型ピロプラズマ病（415
土337ng/ml，n=13)においては非常に高い値を示した。したがって、
ウシ血清Ftは炎症および腫瘍マーカーになり得ること、および小型ピロプラズマ発症牛の血清Ft値が高値を示すのは網内系の活発な異常赤血球の貧食に起因することが考えられた。
6） 市 販 ウ シ 胎 子 血 清 13ロ ッ ト に お け る Ftレ ベ ル は 800〜6，OOOng/mlの範囲であった。免疫沈降反応により測定した血清Ft鉄濃度は0.16〜0.96メg/mlの範囲であった。Ft鉄含量はFt濃度にかかわらず約20%と高値を示し、Ft鉄は血清鉄の8.8〜28.5cYoを占めた。Ft鉄含量と血清Ft濃度の間には高い正の相関性が認められた(r‑0.9398，pく0.001）。胎子血清FtのConAへの結合はほとんど見られなかった。血清Ftの Lおよび H鎖の分子量は脾臓Ftのそれらと同じであり、L鎖が優勢であった。血清Tf濃度は1.8〜2.2mg/mlとほぼ一定であったが、Tf飽和度は54．8〜91.7％と大きく変動した。血清Ft濃度とTf飽和度の間には高い相関性（尸0.8864，pく0.001）が認められた。以上の結果
から、ウシ胎子は高い鉄貯蔵レベルを有すること、および血清Ftは胎子血液循環系の鉄輸送に寄与することが示唆された。

学位論文審査の要旨
主査
副査

教授
教授

斉藤昌之
藤永 徹

副査 助教授 木村和弘
副査 教授 首藤文栄（岩手大学農学部）｀

学位 論 文題 名ウ シの 鉄 結合 夕ン パク 質 フェリチンに関する生化学的 研究
フ ェリ チ ン(Ft)は 、20 kDa前後 の2種類の ポりベプチ ド（L鎖と H鎖）24個か らなる鉄貯 蔵夕ンパ ク質である 。Ft(ま細胞 内夕ンパ ク質であるが、血中にも微量存在しており体内 貯蔵鉄量 の指標とさ れている 。ヒトで はFtの分子 構造や診 断学的意 義などについて多く の研究が なされてい るが、家 畜を含め て他の動 物種での Ftに関する 知見は極めて少ない 。本論文 では、ウシFtIrこついて、分子性状を明らかにするとともに免疫学的測定法を確 立し、各 種疾患での 血中濃度 変化や胎 子血清中 のFtに関す る検討を 行った。その要旨は以下の通りである。
1、 ウシFtのL， H鎖は、電気 泳動での 挙動が他 の哺乳動物Ftと異なることが知られていた 。 この 原 因 を調 べ る目的で 、ウシ脾臓 cDNAライブラ リーから Ft cDNAをクロー ニング
し ヌクレオ チド配列を 決定した 。その結 果、HとL鎖 はそれぞ れ180と174アミ ノ酸からなり、両者に540/0の相同性があることが明らかとなった。また、他の動物種との比較では、アミノ酸数で0−2個しか違わず、H鎖で91一93％，L鎖で84‑87％の相同性があった。バキュロ
ウ イルス一 昆虫細胞発 現系から 得られた HおよびL鎖 は電気泳 動の上で はウシのそれと全く 同じであ った。以上 のように 、ウシFtの 構造を明 らかにす ることに よって、電気泳動
上 の 特 異 な 挙 動 は 分 析 に 伴 う 人 為 的 な 変 化に 起 因す る こと が 示さ れた 。
2、 ウシFtl,こ対 する抗体を用いて高感度ELISAを開発したが、血清中にはFtに結合して測 定を妨害 する物質が 存在する ため、そ のままで は利用で きなかっ た。測定条件を検討し た結果、 硫酸アンモ ニウムを 添加する ことによ って血清 濃度を正 確に測定できることが 明らかに なった。こ れを利用 して、合 計103頭の成牛の血清Ft濃度を測定した。健常牛の Ft濃度は約 46ng/mlであったが 、自血病 や炎症性疾患、小型ピロプラズマ病では高値とな っていた ので、炎症 や腫瘍の マーカー となりう る可能性 が示唆さ れた。またく市販ウ
シ胎子血清には、800‑6，OO
Ong/mlとぃう高濃度のFtが含まれるおり、ウシ胎子血清が高い
鉄 貯蔵レベ ルを有する ことが示 唆された 。なお、 ウマFnこつ いても同 様の測定法を開発
し 、 フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン が 妨 害 物 質 と し て 作用 す るこ と を明 ら かに した 。
以 上のよう に、本論文 は、従来 ほとんど 研究され ていなか ったウシ のFnこついて、分子 構造を明 らかにする とともに 診断学的 有用性を 検討して おり、獣 医学への貢献が大であ る。よっ て審査員一 同は折野 宏一氏が 博士（獣 医学）の 学位を受 ける資格が十分あると認めた。235‑