博士（医学）相馬孝光
学 位 論 文 題 名

新規Ca2+依存性K+チャネルのクローニングとそ の機能解析
学位論文内容の要旨
I． 背 景Ca2+依存性K+チャネルは電位非依存性で、細胞内Ca2+濃度上昇により活性化されるK+チャネルであり、機能的には単一チャネルの大中小のコンダクタンスの違いからBK，IK，SKに分類される。SKチャネルは人間の体内に幅広く分布しており、活動電位或いは受容体の活性化により細胞を刺激し、膜電位及び神経の興奮，分泌細胞からのホルモン放出，聴覚器官のコントロール，平滑筋緊張の制御等の興奮細胞及び非興奮細胞両方の機能の制御に関して重要な役割を果たしている。S
Kチャネルが開口すると膜の過分極が生じ、電位依存性カルシウムチャネルを介したCa2+流入が減少し、平滑筋の弛緩が生ずる。動脈においては、SK3は内皮細胞の細胞膜に高度に発現していると報告されているが、血管平滑筋に発現しているとの報告は殆ど無い。一方、心臓におけるSKチャネルの分子多様性及び機能的役割は殆ど分かっていない。
II． 目 的本研究では、心臓に発現したSKチャネルを同定し、その作用機構を解明するために、ラットの心臓のcDNAライブラリーをスクリーニングし、得られたチャネルの発現の分布及び機能的な特性について検討した。
III. 方 法
32pで標識したプローブを用いてラットの心臓のcDNAライブラリーをスクリーニングし、 SK3とその変異であるSK3‑bチャネルを得た。ラットの様々な組織におけるこれらのチャネルの発現の分布及び比率を検証するために、RT‑PCRを施行した。3匹のラットから 心臓，脳，肝臓，肺，小腸のIータルRNAを単離し、SuperScriptTM First‑StrandSynthesis for RT‑PCRKit(Invitrogen)およびランダムヘキサマーを用いて、卜ータルRNAを cDNAへ 逆 転 写 し た 。 得 ら れた cDNAを 鋳 型 と し て 、 SK3また は SK3‑bに特 異的なプライマーを用いてPCRを行い、最終的には塩基配列の確認を行った。次に、機能的な 特 性 を 解 析 す る た め に 、 SK3又 は SK3‑bの cDNAを pIRES2‑EGFPベ ク タ ー (BDBiosc
iences Clontech，CA)
へ組み込み、PolyFectTransfec
tionReagent(Qiagen)を用
いてHEK293細胞にトランスフェクションを行い、ホールセル及びインサイドアウ卜パッ
チクランプ法を用いて細胞膜を介して流れる電流を計測した。これによルチャネルのブロッカー、Ca2+、各種プロテインキナーゼに対する感受性を確認した。SK3チャネルおよびS
K3‑bチャネ′レが、cDNAを卜ランスフェクションした細胞および´い臓をはじめとするラットの組織において、蛋白質レベルで実際に発現しているかどうか、また、組織の場合にはどの細胞に発現しているかを確認するために、それぞれのチャネル特異的抗体を作製してウエスタンブロット解析および免疫組織化学も施行した。
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IV 結 果
ラットの心臓のcDNAライプラリーをスクリーニングした結果、SK3及びその変異体であ る SK3‑bの クロー ンを 得た 。RT‑PCRを用 いて ラッ トの 様々 な組 織に おける SK3チャ
ネ ル お よ び SK3‑bチ ャ ネ ル の mRNAの 分 布 を 解 析 し た と こ ろ 、 SK3の mRNAは ラ ッ トの 心臓 ，脳 ，肝 臓， 肺， 小腸 など の組 織に 存在し たが 、SK3‑bのmRNAは心臓にのみ存在 した 。ま た、 SK3お よび SK3‑bチャネルの機能的特性を解析するために、これらのチ
ヤ ネル を安 定的 に発 現し たHEK293細胞 にパ ッチク ラン プ法を行ったところ、SK3及びSK3‑bを介した電流はいずれもアパミン感受性であり、感受性の程度にも差は認められなかった。また、両チャネル共にカリブドトキシンに対しては抵抗性であった。アデニル酸シクラーゼ活性化薬であるフオルスコリン、プロテインキナーゼC活性化薬であるPDBu、グァニル酸シクラーゼ活性化薬であるニトロプルシドのいずれに対しても抵抗性であった。
SK3‑bのCa2＋感 受性 はSK3より も低 値を 示し た。 SK3ま たはSK3‑bチャネルを安定的に発現しているHEK293細胞、ラッ卜脳および心臓の蛋白質抽出液を用いて、ウエスタンブ
ロ ツ卜 を行 った とこ ろ、 予想される大きさである85kDaにバンドが確認できた。抗SK3
抗 体 に よ る 免 疫 組 織 化 学 を 行 っ た と こ ろ 、 心 筋 細 胞が び 慢 性 に 強く 染色 され た。
v． 考 察脱分極性電気刺激は活動電位を誘発して、L型Ca2+チャネルを活性化する結果ヾ心筋細胞 内へ のCa2+流 入を 惹起 する。 誘発 された細胞内Ca2+濃度上昇は、SK3やSK3‑bなどのSKチャネル群を活性化し、活動電位後の膜の再分極へ移行していく。アパミンなどのSKチャネルブロッカーが人間及ぴマウスの心筋細胞の活動電位終末部分を延長させる事実は、SKチ ャ ネ ル が 活 動 電 位 後 の 膜 の 再 分 極 に 寄 与 し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。
本 研 究 で は 、 RT‑PCRを 用 い た mRNAの 組織 分布の 解析 から 、SK3チ ャネ ルは検 討した全ての組織（心臓，脳，肝臓，肺，小腸）に存在しているが、ー方、SK3‑bチャネルは心臓においてのみ発現していることを示唆するとともに、その発現比率がSK3チャネルの約1/10であることを明らかにした。また、パッチクランプクランプ手技を用いた電気生理学 的解 析から、SK3‑bの細胞内Ca2＋濃度に対する感受性は、SK3の感受性と比較して、より低いことも明らかとした。これらの結果から、生理的な条件下における心臓の活動電位後の再分極に関しては、SK3‑bと比較して、SK3はより大きな役割を果たしていると考え られ る。 しか しな がら 、病的 な状 況下ではSK3‑bとSK3の存在比率に変化が起こり、心筋細胞の再分極に影響を及ぽす可能性も考えられる。
SK3遺 伝子はヒ卜染色体lq21領域に存在する。この領域は、ある種の家族性精神分裂病，小脳性運動失調症を伴う家族性片麻痺性偏頭痛，神経性食思不振症などの疾患に対する主要な感受性領域である。SK3チャネルのN端には高度な多形性を呈するグルタミンの繰り返し配列があり精神分裂病と関係があると考えられているが、この考えは議論のあると ころ でも ある 。SK3のN端の一 部を 欠損 した 変異 体で ある SK3‑△や、SK3のスプライシング変異体であるSK3‑1Bなどの変異チャネルが、ニューロンの異常興奮や精神分裂病の 病因 に寄 与し てい る可 能性が 示唆 されている。興味深いことに、SK3のN端領域の19
個 のグ ルタ ミン 繰り 返し 配列は SK3‑bにおいては18個のセリンおよぴ1個のアルギニンに 置換 され てお り、 機能 的な解 析に よると、SK3‑bはSK3と比較してCa2+感受性が低いことが示唆されている。SK3‑bはこの低Ca2＋感受性を利用することにより、正常な心機能及び代謝のみならず心筋細胞の異常興奮においても、SK3ではカバーできなぃ高Ca2+濃度
領 域で 、重要な役割を果たしているのかもしれなぃ。さらに、機能的なSKチャネルは4量体として構成されると考えられるが、SK3‑bを含むヘテロ4量体が構成されると、心筋細胞の正常及び病的な機能の双方に影響を及ばすのかもしれない。今後、正常及び病的状態での心機能におけるSK3およびSK3‑bの機能と役割分担を解明することが期待される。

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 筒 井 裕 之
副 査 教 授 三 輪 聡 一
副 査 教 授 吉 岡 充 弘

学 位 論 文 題 名新 規 Ca2+依 存 性 K+チ ャ ネル の ク ロ ーニ ン グ とその機能 解析
C
a2+依存性K+チャネルは電位非依存性で、細胞内Caz+濃度上昇により活性化されるK+チヤネルであり、機能的には単一チャネルの大中小のコンダクタンスの違いからB
K，IK，SKに分類される。S
Kチャネルは人間の体内に幅広く分布しており、活動電位或いは受容体の活性化により細胞を刺激し、膜電位及ぴ神経の興奮，分泌細胞からのホルモン放出，聴覚器官のコントロール，平滑筋緊張の制御等の興奮細胞及ぴ非興奮細胞両方の機能の制御に関して重要な役割を果たしている。SK
チャネルが開口すると膜の過分極が生じ、電位依存性カルシウムチヤネルを介したCa2+流入が減少し、平滑筋の弛緩が生ずる。動脈においては、
SI(3は内皮細胞の細胞膜に高度に発現していると報告されているが、血管平滑筋に発現しているとの報告は殆ど無い。一方、心臓におけるS
Kチャネルの分子多様性及ぴ機能的役割は殆ど分かっていナょい。
本研究では、心臓に発現したSKチャネルを同定し、その作用機構を解明するために、ラットの心臓のcDNAライブラリーをスクリーニングし、得られたチャネルの発現の分布及ぴ機能的な特性にっいて検討した。
スクリーニングの結果、SK3及ぴその変異体であるSK3‑bのクローンを得た。RTーPCRを用いてラットの様々ナょ組織におけるSK
3およぴSK
3−bm
RN
Aの分布を解析したところ、SK3m
RNA．はラットのJい臓，脳，肝臓，肺，小腸などの組織に存在したが、SK3−bm
RN
Aは心臓にの み存在し、その発現比率はSK3チヤネルの約1/10であった。また、SK3およびSK3−bの機能的特性を解析するために、これらのチャネルを安定的に発現したHE
K
293
細胞にバッチクランプクランプ手技を用いた電気生理学的解析を行ったところ、SK3及びSK3−bを介した電流はいずれもアパミン感受性・カリブドトキシン抵抗性であり、感受性の程度にも差は認められなかった。アデニル酸シクラーゼ活性化薬であるフオルスコリン、プロテイン― 346―

キナー ゼC
活 性化薬で あるPD
Bu、 グアニル酸シクラーゼ活性化薬であるニトロプルシドのいずれに対しても抵抗性であった。SK
3−bのCa2+感受性はS
K3よりも低かった。これらの結果から、生理的な条件下における心臓の活動電位後の再分極に関しては、S
K3―bと比較して、
SK3はより大きな役割を果たしていると考えられる。しかしながら、病的な状況下ではS
K3−bとSK3の存在比率に変化が起こり、心筋細胞の再分極に影響を及ぼす可能性も考えられる。
SK3
遺 伝子はヒ ト染色 体lq21領域に 存在する。この領域は、精神分裂病などの疾患に対する主 要な感受性領域である。SK3のN端には高度な多形性を呈するグルタミンの繰り返し配列が あり精神分裂病と関係があるとも考えられているが、SK3のN端の一部を欠損した変異体であるS
K3―△や、SK3のスプライシング変異体であるS
K3−1Bなどの変異チャネルが、ニュー ロンの異常興奮や精神分裂病の病因に寄与している可能性も示唆されている。興味深いこ とに、SK3のN端領域 の19個のグ ルタミ ン繰り返 し配列 はSK
3−bにおいては18個のセリン およぴ1個のア ルギニ ンに置換 されており、機能解析によると、SK3‑bはS
K3と比較してCaz+感受性が低いことが示唆されている。SK3一bはこの低C
a2+感受性を利用することにより、正常な´C、機能のみならず心筋細胞の異常興奮においても、SK
3ではカバーできない高Caz+濃度領 域で、重要な役割を果たしているのかもしれない。さらに、機能的なSK
チャネルは4量体として構成されるが、SK3―bを含むへテロ4量体が構成されると、心筋細胞の正常及ぴ 病的な機能の双方に影響を及ぽすのかもしれない。今後、正常及ぴ病的状態での心機 能 に お け る SK3お よ ぴ SK3― bの 機 能 と 役 割 分 担 を 解 明 す る こ と が 期 待 さ れ る 。
口頭発表に際し、筒井教授から新規分子の役割および存在意義について質問がなされた。
次いで 吉岡教授から新規分子の存在の普遍性、ホモおよぴヘテロ四量体における機能変化にっい て質問がなされた。最後に三輪教授からボリグルタミンの疾患に対する寄与、新規分子と EDHF反応の関係にっいて質問がなされた。いずれの質問に対しても、申請者は研究結果に基づ いて、ある いは文献的 知識により 、概ね適切 な回答を行 った。
この論文は、新規Ca2+依存性K
十チャネルの存在とその機能を明らかにしたものとして意義のあるものと評価され、審査員→同は、これらの成果を高く、評価し、大学院課程における研鑚や 取得単位なども併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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