博 士 （ 獣 医 学 ） ア ブ レ ス ジ ー ン ベナ フロ ー ア
学 位 論 文 題 名Functional and Genetic Analysis ofIVI
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op
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tr
icO
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ideProductioninh/Iice（マ ウスにお けるマク ロファー ジの一 酸 化 窒素 生 産能 に 関す る機能的 およぴ遺 伝的解析 ）

学位論文内容の 要旨

本 研 究 では 、 マウ ス を 用い て サイ 卜 カ イン 刺 激 後および S.typhimurium感染時の NO
産 生に 関 す るNramplと覡 向 遺 伝子 の 役割 に つ いて 解 析を 行 っ た。 ま た サイ ト カイ ン
刺 激後 比 較 的高 い NO産 生を示す と考えら れるいく っかのマウ ス系統の マク口フ ァージを 用 い て NO産 生 に か か わ る 他 の 遺 伝 的 要 因 に つ い て も 解 析 し た 。
第 一 部 で は 、 Nr ampl抵 抗 性系 統 (Nramplr)で ある C3H/Heマウ ス をNrampl感 受 性系 統(Nrampl ）で あ る C57BL/6マ ウ スに 8世 代 バ ック クロスさ せ、遺伝的 バックグ ラ
ウンド がC57BL/6である Nramplrコンジ工 二ックマ ウスを作製 した。さ らに、Nramplrコ
ンジ工 二ックマ ウスとC57BL/6を 遺伝的バ ックグラウ ンドに持 つTNF‑a‑'‑マウスと交配
さ せ 、 Nramplと Tnfaに つ い て 4つ の 組 み 合 わ せ を 持 つ マ ウ ス を 作 製 し た 。
IFN‑yとLPSで 刺激 し た マウ ス 腹 腔マ ク ロフ ァ ー ジの iNOSに よる NO産生 は Nramplに 比 べ Nramplrマ ク ロ フ ァ ー ジ の方 が きわ め て 高い と いう 結 果 が得 ら れ た。 ま た、
Nramplの遺伝 子発現は サイトカ インの刺 激に関らず 両夕イプ のマク口 ファージで差が見られ ず、恒常 的に検出された。したがってNrampl は機能欠損遺伝子と考えられた。
TNF‑a・′・ マク口フ ァージに おいてIFN‑y、 LPS、TNF‑aそれぞれ独立に、もしくは組み合 わ せ て 刺 激 し た 場 合 の NO産 生 は、 NramplrとNrampls両 方の TNF‑aの 正 常 マク 口 フ
アージ に比べて 著しく低 かった。
S.typhimurium6203株の感 染時、Nramplrと Nramplsマク口フ ァージの CFUsに大きな差は 無かった 。加えて TNF‑a゛マク口 ファージを 用いたと ころ、特 にそのNrampl マ
ク 口フ ァ ← ジで は S.typhimuriumが より増殖 すること が観測さ れた。さら にNramplsマ−1212−

ク口ファージは感染後24時間でNrampl′に比べ高いNO産生が見られたが、このことはNramplrマク口ファージでは細菌感染に対してすばやく反応ができるため長時間NO産生が必要のないことが示唆された。これらの結果から正常マク口ファージではTNF‑QがS.typhimurium感染時のNO産生を補助していることが示された。また、短時間（1時間以内）感染実験のデータからNrampl遺伝子はS.typhimurium感染防御の初期に働くことが示された。RT‑PCRの結果においても、Styphimur ium感染時Nramplrマク口フアージではiNOS遺伝子の誘導がすみやかに起こったが、その発現は持続しなかった。
逆にNramplsマク口ファージではiNOS mRNAの発現は遅く、長い時間保持されていた。
さらにTNF‑a mRNAは、正常マク口ファージからは検出されたけれども、TNF‑a‑／‑マク口ファージからは全く検出されなかった。
以上 の結 果より 、Nr amplとTNF‑aはNO産生に重大な役割を持ち、サイ卜カインの組み合わせによってNO産生が増強された。全ての組み合わせのマク口ファージが初期のS.typhimuriumの増殖を抑制することから、Nrampl遺伝子やTnfa遺伝子に加えて他 の 因子 も細菌 の増 殖抑 制に 関与し てい ると 推測 された 。こ れら の結果 から 、S typhim urium感 染の制御に対してNOが唯一の因子ではないことが示唆された。
第二 部で はIFN― YとLPSでの刺激後のNO産生を計12系統のNramplrマウスで測定し た。 この 12系統 においてNO産生レベルは様々で一定ではなかった。すなわち、
NZBfN、DBA/2N、AKR/N、A/Jは低いNO産生を、NJL、129/J、MOG、SJL/J、CBAJN、NOD/Shiは 中 間 の 、 C3 H/He、 SPRは 最 も 高 い NO産 生 を 示 し た 。
そこで高いNO産生を示すC3FiUHeマウスと低いNO産生を示すA/J、AKR/N、DBA/2Nと の間 でFlを作製 した 。さ らに それぞ れの Flの NO産生に基づいて3種のバックク口 ス 群 を 作 製 し た 。 削 JとC3FUHe、 およ びAKR/NとC3 H/Heの Flは 高いNO産生 を示 し、 それ ぞれA/JとAKR/Nとに パック ク口 スさ せた。DBA/2NとC3 H/HeのFlは低いNO産生を示し、C3I‑UHeにバックク口スさせた。バックク口ス群のNO産生は個体間できわめてばらつきが観察された。
これらのバックク口ス群の実験から、マク口ファージにおけるNO産生の制御は複数の遺伝子によることが示唆され、さらにNO産生に関する遺伝的因子についての解析を行っ た。 高いNO産生を示す10個体と低いNO産生を示す10個体をそれぞれのバックク口ス群から選び、マイク口サテライ卜マーカーによる遺伝子夕イピングに供した。
‑ 1213−

遺伝子夕イピングの結果、18番染色体のCd14、19番染色体のJak2とM
ifp
s9、11番染色体の1112b、Il4、Csfgm、Nos2がNO産生を制御する候補遺伝子のーつである可能性が推測された。
一方 、iNOSプ口モー ター領域の シークエン ス解析で、MOG系統のー960番のGがAに、NJL系 統の ― 846番の CがTに、 SPR系統の ‑839番のGの 欠失といっ た塩基置換が それぞれ確 認された。 これらの置 換はMOGで はN
F‑KB結合領域に、SPR
ではy‑IR
E結合領域に近接した部分で起こっており、NO産生の差との係わりが示唆された。M
OGとSP
Rにおけ るiNOSプ口モータ ー領域の塩 基置換とNO
産 生との関係 については 今後の解析が待たれる。
以上の結果からN
O産生と細菌感染に対しての機能にはいくっもの因子が関っていることが示唆された。

学位論文審査の 要旨
主査

教授

喜田宏

副査

教授

小沼

操

副査 教授 桑原幹典
副査 教授 渡辺智正（農学研究科）

学位論文題名Functional and Genetic Analysis ofIN/Iacrop
hageN
itricOxideProductioninlVIice（ マ ウ ス に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ の一 酸化 窒素 生産 能に 関す る機 能的お よび 遺伝 的解 析）

マウスを用いてサイトカイン刺激後およびェSalmonellaryphimurium(S.typhimurium)
感 染 時 の 一 酸 化 窒素 (NO)産生 に関 する Ni‑amplと TNF‑a遺 伝子 の役 割につ いて 解析 した。またNO産生に係わる他の遺伝的要因についても検討した。
Nrampl感 受性 系統 (Nrampl ）で ある C57BL/6に、Nr amplr遺伝子を導入しコンジェ
ニ ック マウ スを 作製 した 。それ らを C57BLl'6‑TNF‑a‑/‑マウスと交配させ、Nr amplとTNF‑aに っ い て4つの 組み 合わ せを 得た 。サ イト カイ ン刺 激後 、マ クロフ ァー ジの NO
産 生 は Nramplrの 方 がNr ampl に 比ベ 高か った 。＆ typhimurium感 染時 Nr ampl′ はinducible NOsynthase（iNOS）遺伝子の誘導がすみやかに起こったが、Mロ卿´ はその発現 が遅 く、 逆に長い時間保持されていた。Mロ舛´遺伝子は感染防御の初期に働くことが示された。一方、TNF‐Q一/Iマク口ファ｀−ジにおいてNO産生は著しく低く、感染実験でもSルアカ加釘′f甜聊がより多く増殖することが観測された。以上の結果より、
M口 ′ 叩 ´ と TNF− Qは NO産 生 に 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と が 示 唆 さ れ た 。
12系統の肌ロ′ゆ´′マウスにおいて高いNO産生を示す系統と低い系統との間でパック ク口 ス群 を作 製し た。 ノぶシ クク 口ス 群において著しいN0産生のばらっきが観察され た 。 こ れ ら の こと から 、マ ク口 ファ ージ にお ける NO産 生は 複数 の遺伝 子に よる こと が 示 さ れ 、 さ ら に 高 い N0産 生 を 示 す 個 体と 低 い NO産 生 を 示 す 個 体 を バ ッ クク 口ス 群か ら選 び、 遺伝 子夕 イピン グに 供し た。遺伝子夕イピングの結果、いくっかのNO産 生を 制御 する 遺伝 子が 候補と して 推測 された。iNOSプ口モ一夕ーー領域のシークエン ス解 析で も、 塩基 置換 や欠失 とい った 変異が確認され、これらの変異はNF‐KB結合
領 域 あ る い は Y− IRE領 域 に 近 接 し て お り 、NO産 生 の 差 と の 係 わ り が 示 唆 さ れた 。
本研 究は 感染 防御 に係 わるNO産生 に関 して册ロ卿´と1NFーu遺伝子が重要な役割を果 たし、さらには他の遺伝的因子の存在を予測し，た貴重な知見を提供するものである。よって審査員一同はアブレス・ジーーン・ペナフ口一ア氏が博士（獣医学）の学位を授与されるのに十分な資格を有するものと認めた。