博 士 （ 獣 医 学 ） 小 松 智彦
Cani
neR
eticulocyteExosomes:P
arallelandSelectiv
eExtrusion of Na,K‑ATPase and Stomatin during
Reticulocyte h/Iaturation in Dogs
with HK and LK Red Cell Phenotypes（犬網状赤血球エクソゾーム：H
K型ならぴにL
K型犬の網状赤血球成熟過程に お け る Na， K― ATPaseと stomatinの 選 択 的 同 時 排 出 機 構 ）学位論文内容の要旨

網状 赤 血球 の成 熟は 、赤 芽球 系細 胞分 化・ 成熟 の最 終段 階で あ り、 成熟 赤血球が必 要とする 膜の 特 性を 獲得 する ために、 トランスフェリンレセプター(TfR）をはじめとする過剰 ／不要な 細胞 膜 成分 を排 除す る過程で ある。この過程には、タンパク質分解、ならびにエクソ ゾーム(exosome)と 呼ば れる 微小 小胞の放出が関わるとされる。犬 網状赤血球にはNa．K−ATPaseが存在 する が 、こ れは 成熟 赤血 球に 至る 過程 で消 失し 、結果と して、犬赤血球は一般に高Na+、低K＋ のLK型赤 血球 とな る。 一方で、柴犬や珍道犬には遺伝的 にN
a，K―ATPaseを保持した HK型赤血球 をもつ個体が存在する。本研究の目的は、犬網状赤血球 成熟過程におけるNa K―ATPase消失 に お け る エ ク ソ ゾ ー ム の 役 割 と 、 そ の HK/LK赤 血 球 表 現 型 と の 関 連 の 解 明 で あ る 。
第 1章 で は 、 犬 網状 赤血 球の 成熟 過程 で放 出さ れ る小 胞の 性状 を解 析し た。 LK型 犬か ら得た 網状 赤 血球 を孵 置し 、24、72時間後に上清を分別遠心すると微小小胞が得られた。こ の小胞は 直径 20〜60 nmで、 Hsc70、TfR
な ど 、既 報エ クソ ゾームの指標となるタンパク質を主 要成分と して 含 むこ とか ら、 エクソゾ ームと判断した。膜タンパク質の解析から、犬の網状赤 血球膜に含 まれるが赤血球膜には存在しないNa K―A
TPase彊サブユニット、Hsc
70、TfR、GLU
T1、ならぴ に脂 質 ラフ トタ ンパ ク質 のひ とつ S tomatinは、 いずれもこのエクソゾームに存在し た。一方 で 、 赤 血 球 膜 の 主 要 タ ン パ ク 質 、 バ ン ド 3、 ス ペ ク ト リ ン は 検 出 さ れ なか った 。ま た、Na，K一AT
Pase、Hsc70、TfR
はTritonX―100可溶性画分に、一方、GLUT1は不溶性画分に、GLUT
1と 相互 作 用す るs toma tin
は両 画分に含まれていた。さらに、このエクソゾームをショ 糖密度勾配 遠心で分画したところ、小胞は比重1． 06 g/ml〜1．14g/ml（画分4〜12）の範囲に 広く分
布 し 、 HsC70、 TfR、 stomati
nは 画分 5〜 8、特 にラ フト マー カー のGM1と同 じ画 分7と 8に 多く含ま れていた。一方、Na，K−ATPaseは、より比重の小さい画分4〜6に主に認められた。 これらの 結果 か ら、 網状 赤血 球エクソ ゾームの組成は均一ではなく、タンパク質構成の異なる ポピュ
レ ーシ ョ ンか ら成 るこ とが明ら かになるとともに、Na，K―ATP
aseと一部のstomatin、Hsc70が同一 ポピュレーションに存在することが示唆された。
そ こ で 第 2章 で は、 0v
erhy
drat
edst
omat
ocyt
osis（0HSt） 患者 にお ける 欠損 を発 端に 見出
さ れ様 々 なト ラン スポ ータ ーと の相 互作 用が 提唱 され てい るstoma
tinに焦 点をあて、 遺伝子型 々セ 励 オの H
K型 、讎 刀をと他 /m由来のLK型各犬の網状赤血球と成熟赤血球におけるstomatinの含 量を検討した。HK型（々卮励闘の赤血球膜に韜けるstomatin含量がヒト赤血球と同程度である の に 比 ベ 、 LK型（ 此 /mは その 2％ 以下 で0HSt
患 者 と同 様の 低値 を示 した 。ま た、 遺伝 子型
讎 カ 々 の LK型 赤 血球 の stoma
tin含量 はHK型の 10％ 程度 で、 鮒乃 カ型 、な らび に 此／ m型 と明確 な 差 異 を 示 し た 。 上 述 の よ う に LK型 （ 此 /m
網 状 赤血 球に はstomatinが 存在 し、 これ に対する H
K型の赤血球、網状赤血球のstomatin
含量はそれぞれ8倍、12．5倍であった。N
a．K―ATPase― 60 ‑と GLU
T1に も類 似 し た量 的 関 係が 認 め られ た 一 方で 、 TfR含量はH
K型 、 LK型 の 網状赤血 球で同 程 度 であ っ た 。こ れ らの 成績から 、HK型と L
K型は、 いずれも 網状赤血 球の成 熟にとも なった stomatinとNa，K―ATPaseの減少 を同様に 生じる こと、成 熟赤血球 のHK/LK表現型が 両型の
網 状赤血球 における 発現量 の差違に 基づく ことが明 らかに なった。
N 以上の ように 、本研究 は、複数 のポピ ュレーシ ョンを 含む犬網 状赤血 球工クソ ゾームがNa｜KーAT
Paseやstomatinをはじ めとす る膜タンパク質の同時、かっ選択的な除去に寄与すること 、ならび にstomatinの膜含量 がHK/LK遺伝子型 の指標 とぬることを明らかにした。加えて、
こ れ ら の知 見 は 、HK/LK赤血 球表現 型を生じ る本質的 要因が T
fRを発 現する よりも前 の前駆 細胞 の段階に あること を示唆 するもの である 。

‑ 61―

学位論文 審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授 稲葉 睦教 授 木 村和弘
准教授 山盛 徹
准 教 授 佐 藤 耕太

CanineReticuloc
yteE
xo
so
me
s:Paralle
landSelec
tive
Extrusion of Na,K‑ATPase and Stomatin during
Reticulocyte IVIaturation inDogs
with HK and LK Red Cell Phenotypes（ 犬 網 状 赤 血 球 エ ク ソ ゾー ム： HK型 ならび にLK型犬 の網 状赤 血球 成熟 過程に お け る Na， K一 ATPaseと stomatinの 選 択 的 同 時 排 出 機 構 ）網状赤血球の成熟段階では、成熟赤血球が必要とする膜の特性を獲得するために、トランスフェリンレセプター(TfR)をはじめとする不要な細胞膜成分の排除が生じるが、これにはタンパク質分解、ならびにェクソゾーム(exosome)と呼ばれる微小小胞の放出が関わるとされる。犬では網状赤血球のNa，K‑
ATPaseがこの過程で消失し、成熟赤血球は一般に高Na→、低K゛のLK型赤血球となる。一方で、柴犬等には遺伝的にNa，K‑ATPaseを保持したHK型赤血球をもっ個体が存在する。本研究は、犬網状赤血球成熟過程におけるNa，K‑ATPase
消失におけるエクソゾ―
ム の 役 割 と 、 そ の HK/LK赤 血 球 表 現 型 と の 関 連 の 解 明 を 目 指 し た も の で あ る 。
第1章では、まず犬網状赤血球の成熟過程で放出される直径20〜60nmの小胞がHsc70、TfRなど、既報エクソゾームの指標となるタンパク質を主要成分として合むことに基づきこれをエクソゾームと同定した。網状赤血球膜に含まれるが赤血球膜には存在しないNa，K‑ATPasea
サブユニット、Hsc70、TfR、GLUT1、ならびに脂質ラフトタンパク質のひとっstomatinがいずれもこのエクソゾームに含まれるのに対し、赤血球膜の主要夕ンパク質、バンド3、スペクトリンは存在しなかった。ショ糖密度勾配遠心により分画したェクソゾームでは、主にラフトマー
カーのGM1と同じ画分に、次いで比重の小さな画分にHsc70、TfR、stomatinが多く含まれていたのに対し、Na，K‑
ATPaseは比重の小さい画分に主に分布していた。したがって、網状赤血球エクソゾームの組成は均一ではなく、夕ンパク質構成の異なるポピュレーションから成ることが明らかになるとともに、Na，K‑ATPaseと一部のstomatin、Hsc70が同一ポピュレーションに含まれることが示唆された。
そこで第2章では、overhydr
ate
dstom
ato
cytosis(OHSt)
患者における欠損を発端に見出され様々なトランスポーターとの相互作用が提唱されているstomatinに焦点をあてた。HK型(hk仂問の赤血球膜におけるstomatin含量がヒト赤血球と同程度であるのに比ベ、LK型（炊仰は その 2％以 下でOHSt患者と同様の低値を示した。また、遺伝子型カ彫按のLK型赤血球のstomatin含量はHK型の10％程度で、カ彫カ々型、ならびに｜り瓜型と明確な差異を示した。ま― 62−

た、HK型 の 赤血 球 、 網状 赤 血 球のstomatin
含 量はLK型(1k/lk)
網状 赤血球 の10倍程度 であり 、Na， K‑ATPaseと GLUT1に も こ れ に 類 似 し た 量 的 関 係 が 認め ら れ たが 、 HK型、 LK型の 網 状 赤血 球 のTfR含量 は 同 程度 で あ った 。 こ れら の 成 績 は、 HK型と LK型は stomatinと Na， K‑ATPaseの 減 少を 網 状 赤血 球 の 成熟 過 程で同 様に生 じること を明ら かにし、 また成 熟赤血球 のH
K/
LK表
現 型 が両 型 の 赤芽 球 系 前駆 細 胞 にお け る 発現 量 の 差 違に 基づく ことを示 唆する ものであ る。
以 上 のよ う に 、本 研 究 は、 複 数 のポ ピ ュ レ ーシ ョ ンを 含む犬網 状赤血 球エクソ ゾーム がNa，K・AT
Paseやstomatinをはじ めとする 膜夕ン パク質の 同時、か つ選択的な除去に寄与すること 、 さら に stomat
inの 膜含 量 がHK/L
K遺伝子 型の指 標となる ことを明 らかに したもの であり 、犬 を はじ め と する 哺 乳 動物 種 ごとに 特有な H
K/LK
赤血 球表現 型発現の 機序、 および関 連する 溶血性 疾患の易 罹患性 の解明に 資する ものであ る。したがって、審査員一同は、上記博士論文提出
者 小 松智 彦 の 博士 論 文 が北 海 道大学 大学院 獣医学研 究科規 程第6条の規定 による 本研究科 博士
論文 審査等に 合格と 認めた。

― 63−