博士（理学）櫻井琢磨

学位論文題名
ヒト型1Jコンビナントマクロファージコロニー激因 子 (rhN/I‑CSF)の 生 体 防 御 系 に 及 ぼ す 作 用 に 関 す る 研 究

学 位 論 文 内 容の 要 旨

M‑CSFは単球・マクロファージ系の細胞に作用してその分化増殖や機能亢進に関与していることが知られている。一方、マクロファージは抗原非特異的な生体防御反応のみならず、抗原特異的免疫反応においても重要な役割を果たす細胞であることが知られている。本研究ではM‑CSFによるマクロファージの増殖と機能亢進そして、生体防御反応への影響について検討しその結果についてまとめたものである。骨子は以下の6章からなる。
第1章：rhM−CSF投与によって誘導される腹腔内マクロファージの検討：マウスの腹腔内にthM‑CSFを投与すると、腹腔内のマク口ファージが増加する。この作用は直接の増殖作用の他にM−CSFの走化性因子としての作用も関連している。また、M−CSF投与によって誘導されたマクロファージはin vitroにおいて二次刺激(LPS添加）に対する反応性（サイトカイン産生能、一酸化炭素産生能、殺腫瘍活性）が亢進しており、いわゆるプライミング状態にあることが考えられた。
第 2章： rhM−CSF投与 によ る血中TNF誘導の増強(in vivoにおけるプライミング効
果 に つい て）： BCGやIFN‑yを 投与 した マウ スに LPSを 投与 する と、 血中 のTNFの濃度が一過性に上昇する事が知られている。同様の実験モデ´レで、rhM―CSFを前投与した
マウ スに おい ても、 LPS投与 による血中TNF濃度の一過性の上昇が見られた。また、
thM‑CSFの複数回の投与やIFN‑Yとの併用によってこのプライミング効果はさらに増強された。
第 3章 ：rhM− CSFに よ る 混 合 リ ン パ 球 増 殖 反 応 (MLR)の抑 制： rhM− CSFをMLRに添 加す ると 濃度依存的にMLRが抑制された。しかし、マクロファージの存在しない培養 系（ 樹状 細胞 とT細 胞に よる MLR） では rhM−CSFの添加培養による抑制作用は見られなかった。さらに、rhMーCSF投与で誘導された腹腔マクロファージの培養上清中には
樹 状細 胞と T細胞 によ るMLRを抑 制す る活 性が 見ら れた 。こ のこ とか らthM‑CSFによる MLRの 抑制 はマクロファージによる抑制因子の産生を介した反応である可能性が考えられた。この抑制因子についてIL−10，TGFーpである可能性を仮定して検討したが、否定的な結果であった。また、この抑制因子はLBRM33 TG6細胞の増殖を抑制した。
(11‑10，TGF‑13にはみられない活性。）
第 4章 ： マウ ス の免 疫反 応におけ るthM‑CSF投与の 効果：正常 マウスに thM‑CSFを5連投すると脾臓細胞の増加が観察された。さらにその時、IL‑4，IL‑10といった血中サイトカインの濃度の上昇もみられた。このことから、正常マウスの平常時の免疫反応がthM‑CSFの投与によってなんらかの修飾を受けている可能性が考えられた。そこで、実際に抗原 特異的な 免疫反応 モデル実験 における rhM―CSF投与の 影響につ いて検討した。 そ の 結果 、 塩化 ピ クリルに 対する接 触過敏反応 (DTH反応）は （Thl型の免 疫反応である と考えら れている ）rhM−CSFの投与 によって抑制された。一方、DNPに対する抗体産 生はIgEの産生（Th2型の免疫反応において優勢であると考えられている）がthM‑CSF投与によ って増強 される事 がわかった 。これらの結果からrhM−CSFの投与によってマウスの免疫反応がTh2型の免疫反応が優勢になる傾向に修飾されている可能性が示唆された。
第5章： thM‑CSF投与によ るNK細胞の 活性化：rhM− CSFを投与す ると、血 中や脾臓におけるNKl.1+細胞の数が増加した。一方、Yac−1細胞の肺におけるクリアランスはthM‑CSFの投与 によって亢進した。そこで脾臓中のNK l.1+細胞を精製し、その機能をinvit
roで調べると、rhM―CSFを投与したマウスから集めたN
Kl.
1+細胞はYac―1細胞傷
害活性 、IL‑2に対す る増殖反 応性、IFN‑y産生 能のすべてについて機能亢進がみられた。こ の事は、 thM‑CSF投与によって誘導されたYac‑l細胞のクリアランスの亢進が単にNK l.1+細胞 の増加によって誘導されたのではなく、NKl.1+細胞自体の活性化も関与している事を示唆していると考えられた。
第 6章：rhMーCSF投 与によるB16メラノーマ細胞の転移抑制効果：尾静脈からの移植に よって肺 と肝臓に 転移結節を形成するB16細胞を用い、thM‑CSF投与による転移抑制
効 果につい て検討し た。その結果、B16細胞を移植する前にthM‑CSFを投与した場合には 肺及ぴ肝 臓の転移 は抑制されたが、B16細胞を移植した翌日からthM‑CSFを投与した
場 合には肝 臓の転移 のみが抑制 された。 抗NKl．1抗体を投与してNKl.1+細胞を一時的 に 消 去す る 実験 を 行 なっ た結果 、肺にお けるrhM−CSFに よる転移 抑制効果 は「5章」で示したNKl.1+細胞の活性化が関与している可能性が示唆されたが、肝臓においてはそれ以外のメカニズムの存在が示唆された。
以上の事 からthM‑CSFの投 与は生体内のマクロファージの増殖や機能修飾に影響を与えるだけではなく、マクロファージを介した間接的な作用などにより、抗原特異的な免疫反応 のバランスを変化させ、さらにはNK細胞の活性化も誘導するなど、成体防御反応に対して幅広い影響を与える事が示唆された。

学 位 論 文 審査 の 要 旨
主査
副査
副査
副査

教授 東 市郎教 授 菊 池九二 三
教授 谷 口和彌
講師 劉 永春

学位論文題名丶゛
ヒ ト 型 リ コ ン ビ ナ ン ト マ ク ロ フ ァ ー ン コロ ニ ー 刺 激因子（thrvi・CSF）の生体防御系に及ぼす作用に関する研究
M−CSFに関する研究はこれまで造血作用とマクロファージの機能亢進に関連した研究が主であり、生体防御系（特に免疫系）に及ぼす作用について、詳細な検討を行なった例がこれまでなかった。
本論文は高純度のヒト型リコンビナントM−CSF(rhM‑CSF)を用いて、これまで検討されなかったマウスの生体防御系に及ぼす作用について様々な角度から検討を 行 な っ た 結 果 を ま と め た も の で 第 1章 〜 第 6章 で 構 成 さ れ て い る 。
第1章：rhM―CSF投与によって誘導される腹腔内マクロファージの検討：マウスの腹腔内にrhM−CSFを投与すると、腹腔内のマクロファージが増加し、誘導された腹腔マクロファージはin vitroにおいて二次刺激(LPS添加）に対する反応性(IL―6，TNF産生、一酸化炭素産生能、殺腫瘍活性）が亢進していること（プライミング状態）が示された。
第2章：rhM―CSF投与による血中TNF誘導の増強(in vivoにおけるプライミング効果について）：BCGやIFN‑yを前投与したマウスにLPSを投与すると、血中のTNFの濃度が一過性に上昇することが知られている。同様の実験モデルで、rhM−CSFを前投与したマウスにおいても、LPS投与による血中TNF濃度の一過性の上昇が見られた。また、rhM−CSFの複数回の投与やIFN‑yとの併用によってこのプライミング効果はさらに増強された。
第3章 ：rhM― CSFによ る混合 リン バ球 増殖 反応(MLR)の抑 制： rhM−CSFをMLR系に 添加すると濃度依存的にMLRが抑制された。しかし、マクロファージの存在しない培養系（樹状細胞とT細胞によるMLR）ではrhM―CSFの添加による抑制作用は見られなかった。さらに、thM‑CSFの投与で誘導された腹腔マクロファージの培養上清中には樹状細胞とT細胞によるMLRを抑制する活性が見られた 。以 上のことからthM‑CSFによるMLRの抑制はマクロファージによる抑制因子の 産生を介し た作用で ある可能 性が示唆 された。
第 4章 ： マ ウ ス の 免 疫 反 応 に お け る rhM― CSF投 与 の 効 果 ： 正 常 マ ウ ス にrhM−CSFを投与すると脾臓細胞数の増加と、IL―4，ILー10の血中濃度の上昇がみられ た。 こ れは、 マウスの 平常時の 免疫反応 がrhMーCSFの投与 によって なんらか の修 飾を 受 けてい る可能性 示すもの である。 そこで、実 際に抗原 特異的な 免疫反応
モデ ´レ実験に おけるrhM― CSF投与の影響について検討した。その結果、塩化ピクリ ルに 対 す る接 触 過 敏反 応 (DTH反応 ） は rhM− CSFの投 与 に よっ て 抑制さ れた。
一 方、 DNPに 対す る 抗 体産 生 はIgEの 産 生が rhM−CSFの 投 与に よ って 増強さ れる
こ とが わ かった 。これら の結果か らrhMーCSFの投 与によって マウスの 免疫反応 性が修 飾されるこ とを示唆 している 。
第 5章 ： rhM− CSF投 与 によ る NK細 胞 の活 性 化 ：rhM− CSFを 投 与 する と 、血 中や脾 臓における NK'1.1゛細胞の 数が増加し、Yac−1細胞の肺におけるクリアランスが亢 進した。そ こで脾臓 中のNKl.1十細胞を精製し、その機能をinvitroで調べると 、 rhM― CSFを 投 与 し たマ ウ スか ら 精 製し た NK l.1十 細 胞は Yac‑l細 胞 傷害 活性、 IL一2に対する 増殖反応 性、IFNーY産 生能のす べてにつ いて機能亢進がみられた 。こ の ことは 、rhM―CSFの投 与によっ てNKl.1十細胞 の増加と活 性化を誘 導す
るこ とを示唆し ている。
第6章 ： rhM−CSF投 与 によ る B16メ ラ ノ ーマ 細 胞の 転 移 抑制 効 果： 尾静脈 からの 移植 に よ って 肺 と 肝臓 に 転移 結 節 を形 成するB16細胞 を用い、 rhM−CSF投与によ る 転 移 抑 制 効 果 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 B16細 胞 を 移 植 す る 前 にrhMーCSFを 投 与し た 場 合に は 肺及 び 肝 臓の転移 は抑制され たが、B16細 胞を移植し た翌 日 か らrhM− CSFを投 与 した 場 合 には 肝 臓の 転 移 のみ が 抑制 さ れた。抗 NKl，1抗 体を投与し てNKl.1゛細胞 を一時的 に消去す る実験を 行なった結果、肺におけ るrhM− CSFによ る 転 移抑 制 効果 は 「 5章 」で 示 した NK l.1+細 胞の 活性化が 関
与 して い る可能 性が示唆 されたが 、肝臓に おいてはそ れ以外の メカニズ ムの存在が示 唆された。
以上 の ことから rhM−CSFの投与 は生体内 のマクロ ファージの 増殖や機 能修飾に影 響を 与 えるだ けではな く、抗原 特異的な 免疫反応の バランス を変化さ せ、さらに はNK細 胞の 活 性 化も 誘 導す る な ど、 生 体防 御 反 応に 対 し て幅 広 い影響 を与える こと が 示唆さ れた。こ れらのデ ータは実 際の臨床現 場で患者 に投与さ れている
M‑CSF製 剤 の使 用 経 験を 考 察し た り 、M‑CSFの生 体 にお け る 意義 を 考える 上で重要な 知見を含ん でいるも のと考え られる。
よっ て申請者は 、北海道 大学博士（理学）の学位を授与される資格あるものと認めた 。