博 士（ 獣医学 ）マ ブル クアテ イア アブ ドゥ ルダイ ムア ブドゥカティロ

学位論文題名Anovelregulatoryroleofreti
noidinlipidmet
aboli
sminmammali
ancells（哺乳動物細胞の脂質代謝におよぼすレチノイドの新たな作用）

学位論文内容の要旨
ビタ ミン A (VA)は 視 覚、 免疫 機能 、繁 殖、 胚発 生、 さら には 細胞 の増 殖や 分 化など多岐に渡る生理現象やその過程に重 要な役割を果たす。
本研 究で は先 ず反 芻 類に おける主要な血中VAであるレチノールお よぴその輸送体であ るレ チノ ール 結合 タ ンパ ク質R
BP4の動態を明らかにするため、様 々な生理的、病態生 理学 的条 件に ある 牛 の血 漿、初乳および乳中レチノール濃度とRBP4濃度を測定した。 非妊 娠、 非泌 乳期 の 牛血 漿RBP4濃 度は 大凡 45 yg/mlであ り、 牛に 60
時 間、 餌 を与え なか った 場合 でも そ のレ ベルは維持されたが、LPS投与実験では投与後4時間で有意な減少が見られた。非妊娠、非泌乳期 の牛血漿レチノール濃度は約30Lxg/dlであり、非 給 餌 60時 間 後 に は 対 照 群 の 3分 の 1に 、 LPS投 与 後 8時 間 で は 対 照 群 の 2分 の 1に減少 した 。出 産3− 6日 前 の血 漿R
BP4濃度およぴレチノール濃度は非妊 娠、非泌乳期のそれ らとほぼ同程度であった。しかし、出 産直後に両者は有意な減少を示し、その2週間後 に元 の水 準に 復帰 し た。 興味深いことに、RBP4は初乳中に検出さ れ、その濃度は16.4土 5.6 yg/mlで あ っ た 。 し か し 、 出 産 後 7日 あ る い は15日目 の乳 中か らは ほ とんど 検出 され なか った 。 初乳 中のレチノール濃度は血漿の約10倍であ り、乳中の濃度は血 漿と ほば 同程 度に ま で減 少した。これらの結果は牛において血中 VAとRBP4の濃度が、生理的あるいは病態生理学的条件下 で独立して調節されていることを示しており、また RB
P4がレ チノ ール 同 様に 母体から子牛に初乳を介して輸送、移動 することを示した。
レチ ノー ルは 細胞 に 取り 込まれるとレチノイン酸(RA)に代謝され 、強い生物活性を持っようになる。その生物活性のーっ として脂肪細胞分化の抑制が知られるが、逆にRAが 脂肪 分化 を促 進す る との 報告もある。そこで本研究ではRAの脂肪 蓄積に及ぼす作用を む汀 troの 培養 系で 再評 価した。牛筋 問脂肪細胞とマウス3T3―Ll細胞に正常なグルコ ース 濃度 (NG， 5． 5mM)で 培養し、RAを添加すると脂肪蓄積が抑制 された。一方、高グ ルコース濃度(HG，217.5mM)ではRAは何れの細胞においても脂肪蓄 積を促進した。
グル コー スに 代え 酢酸 (lOmM)を脂肪合成基質として添加してもRAの作 用の反転は見られな かっ た。 RAの 脂肪 蓄 積へ の作 用は 脂肪 酸合 成酵 素(FAS)
遺伝子発 現と並行して起
こり 、ア セチ ルCoAカル ポキ シラ ーゼ 遺伝 子発 現と は 解離した。また FAS mRNAの転写を促 進することが知られる転写因子SREBP―1遺伝子発現もFASの発現と パラレルに変化したが、SREBP−2遺伝子発現は異なる変 化を示した。活性化型SREB
Pーlac
DNAの3T3−L1細 胞 へ の 強 制 発 現 は FAS遺 伝 子の 発現 増強 を伴 いNGにお ける RAの 脂肪 蓄積 抑制 作 用を解 除し た。 一方 、SREBP− 1siRNAの 添加 はFAS遺伝 子の 発現 を阻 害し 、HGにお け る‑ 173 ‑RAの 脂肪蓄 積促進作 用を阻 害した。 っまり、 R
Aの脂肪 蓄積に及 ぼす作 用はグル コース
濃 度によ って促進 あるいは 抑制と 反転し、 それは 転写因子 SREBP一laの発現を変化させてFAS遺伝子の転写量を調節することに因ると考えられた。
RAに よる グ ル コ ース 濃 度 依存 性 の S
REBP― laの発 現 調 節機 構 を 明 らか に す るた
め、先ず最初に酸化ストレス剤H202の作用を検討した。N
GにおいてH202(211M)
で3T3ーLl
細 胞を刺 激すると 高分子量 膜結合型SREBP−laの分解促進（核内活性化型SREBP―laの増加 ）とも にFAS
遺 伝子の発 現亢進 と脂肪蓄 積の増 加が見ら れた。しかし、酸化ストレス剤 H202に よ るSREBPー la活性 化とRAによ るその 転写抑制 は独立 して起こ ったの で、HGで 生 じ る 酸 化 ス ト レ ス は RAに よ る 転 写 亢 進 に は 寄 与 し な ぃ と 考 え ら れ た 。
次 に、核 内受容体 のSREBP一laの発現 調節へ の関与を 調べた 。NGにおい て3T3一Ll
細胞をR
Aで 刺 激す る と retino
ic acid rece
ptor (RAR)aと R
ARy遺伝 子 の 発現 増 加とSREBP―la， retinoid X receptor (RXR)（X， peroxisomeproliferator−activatedrece
ptor (PPAR)y，PPAR
I3/6，韜よ ぴliver
Xrec
eptor (LXR)
a遺伝子 の発現抑 制が観察 された 。一方、 H
Gにおい てR
AはSREBPーla，RXRp，PPA
RI
3/8，およ びL
XRI
3遺伝子の発 現を亢 進させた が、RARa
遺 伝子の発 現を減 少させた 。興味深 いこと に、同様 の変化は脂肪分化誘導後6日目のみならず1日目でも観察された。
通常、3T3― Ll
細 胞 を 脂肪細胞 に分化 させるた めには、 コンフ ルエント になっ た
後 、分化 剤［insulin，isobutylmethylxanthinおよびdex
amethasone(Dex：合成グルココ ルチコ イド）］ で2日 間処理 する。各 成分に ついて検 証したところ、NGにおいては分化 剤 で 刺激 し な かっ た 細 胞に おいても R
Aによる SREBP―la
発 現抑制 が観察さ れた。 HGに おいて R
A単独では SREBP−la発現亢進 は見ら れず、Dexを作 用させた 細胞にお いてのみ 、 そ の亢 進 作 用が 見 ら れ た。 っ ま り、 グ ル ココ ル チコイ ド(GC)がHGに おける R
Aの応答性を与えることが示された。
次 に HGにおけるG
Cお よ びRA依 存性 SRE
BP− 1a発 現 誘導 に 対 す る核 内 受 容体 の 関与について調べた。細胞をR
A、9−CI
S―RA(RXR刺激剤）、troglitazone(PPARy刺激剤）
あ るいは T
0901
317 (LXR
刺 激剤）で処理するとG
C依存性にSREBP−1a発現が亢進したが、TTNPB(RAR刺激剤） とGW
0742 (PPARp/6刺激剤 ）では見 られなかった。HX531(RXR阻害剤 ） や T0070907 (PPAR‑阻 害 剤 ）処 置 、 およ ぴ LX
R[3あ るい は PP
ARyに対 す る siRNAの 細 胞 内へ の 導 入は GCお よびRA
依 存性SREB
P一la
発現 誘導を 阻害した が、LXRa
あ るいはPPA
Rp/6に 対するsi
RNAの細 胞内への 導入は それらに 影響を 与えなか った。さ らに、
LXRp siRNAの 導 入 は PPARyお よ び RXRI3遺 伝 子 の RAと Dexに よる 発 現 亢進 を 抑 制した のに対 し、PPARy si
RN
Aの導入 はR
XR[3遺伝子の 発現亢進 を阻害したが、LXRI
3遺伝子の 発 現 に は 影 響 し な か っ た 。 これ ら の 結果 は LX
Rp， PPARy
お よ び RX
Rが HG
における
GC
お よびRA依 存性SR
EBP―la発現 誘導に中 心的な 役割を果 たすこ とを意味 し、LXRI3がPP
A
Rlr遺伝子の発現を調節しうることを示唆した。
以 上のよ うにRAは細 胞外液 のグルコ ース濃 度に依存 して細 胞の脂質 代謝を抑 制ある いは亢 進きせる ことが新 たに見 いだされ た。こ のR
Aの相反 する作 用の鍵と なる分 子はSREBP―laであり、その遺伝子のR
Aによる発現変動は脂肪分化の初期段階から見られ、
HG、 GCお よ ぴ RA依 存 性 に 核 内 受 容 体 LXRI3， PPARyお よ び RX
Rが 誘 導さ れ る こと で
SREB
P−la
遺 伝子発現 が亢進 すること が明ら かとなっ た。LXRpは細胞内グルコースセン
サ ーとし て知られ るので、 この核 内受容体 がRA作用 の細胞外 グルコ ース濃度 依存性 に関わると考えられる。

― 174ー

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教 授

木村 和 弘教 授

石塚 真由 美准 教授

佐 藤 耕 太准 教授

寺 尾晶

学位論 文題名
Anovelregulatoryroleofretinoid
inlipidmetabolisminmammaliancells（哺乳 動物細胞の 脂質代謝 におよぼ すレチノ イドの新 たな作用 ）ビタミン Aは視覚、 免疫機能、 繁殖、胚 発生、さ らには細 胞の増殖 や分化な ど多岐に渡る生理 現象やそ の過程に重 要な役割 を果たす 。本研究ではまず反芻類における主要な血中ビ タ ミン Aで あ る レチ ノ ール お よ ぴそ の 輸 送体 で ある レチノー ル結合タ ンパク質 RBP4の動態に っいて調 ベ、牛にお いてレチ ノールと RBP4の濃度が、生理的あるいは病態生理学的条件下 で独立し て調節され ているこ とを示し 、さらにRBP4がレチノール同様に母体から子 牛 に 初 乳 を 介 し て 輸 送、 移動 する こと を 初め て明 らか にし た 。
レチノー ルは細胞 に取り込ま れるとレ チノイン 酸(RA)に代謝され、強い生物活性を持っようになる。その生物活性のーっとして脂肪細胞分化の抑制が知られる。しかしながら、
牛筋間脂 肪細胞と マウス3T3―Ll細 胞を用い た本研究 において RAの脂肪蓄 積に及ぼ す作用は正常グ ルコース 存在下では 抑制であ るのに対 し、高グルコース存在下では促進と反転することを 初めて明 らかにした 。また、 グルコー ス濃度に依存したRAの脂肪蓄積に及ばす作
用は転写因子sterolregulatoryelement−bindingprotein(SREBP)ーlaの発現を抑制あるいは亢進 させて脂 肪酸合成酵 素遺伝子 の転写量 を調節することに因ることが強く示唆された。
RAによるグ ルコニス 濃度依存性 のSREBP一laの発 現調節機 構を明ら かにする ため、最初に高グ ルコース 濃度で生じ る酸化ス トレスの 作用について検討したが、酸化ストレスは高グルコ ース濃度 条件下での RAによる転 写亢進に は寄与しないと考えられた。次に、核内受容体の SREBP―laの発現 調節への関与を調べた。各種アゴニスト、アンタゴニストを用いた解析結 果により 、RAによるSREB
P―la
遺伝子の発現変動にはグルコース濃度のみならず、グ ル コ コ ル チ コ イ ド が 必 要 で あ り 、 そ れ ら 3っ の 因 子 に 依 存 し て 核 内 受 容 体 liverX
receptor (LXR)p，peroxisomeproliferator―activatedreceptorYおよ てドretinoi
dXreceptorが誘導さ れること でSREBP―la遺伝子 発現が亢 進することが明らかとなった。LXR

は細 胞内グル コースセ ンサーと して知ら れるので、 この核内受容体がRA作用の細胞外グルコー ス濃度依 存性に関 わると考 えられた 。
。
以上 のように 、本研究 は、ビタミンAの作用やその輸送に関わるRBP4．の動態にっいて新た な一面を 明らかに したもの であり、 哺乳動物の 生理学に貢献が大である。よって、審査委 員一同は 、上記博 士論文提 出者、MabroukAttiaAbdEldai
mAbdElkader氏の博士論
文は 、北海道 大学大学 院獣医学 研究科規 程第6条の規 定による 本研究科 の行う博 士論文の審査 等に合格 と認めた 。