博士（水産科学）阪尾寿々学位論文題名サクラマス四倍体の誘起ならびに発生特性に関する研究
学位論文内容の要旨
近年、漁獲量の減 少や人口増加に対する水産資源の供給不足に対し、効率 的な生物生産を目指した育種技術 の開発が求められている。染色体の数と組み合わせを人為的に統御する染色体操作技術を基盤とする倍数体も、育種上非常に有効な方法であると考えられている。
すなわち、染色体操作技術を用いることにより、配偶子形成を行わせない「不妊個体の誘導」、全雌や全雄の養殖集団を作出する「性統御」、成長等の経済形質において「優良な系統や品種の 作 出 」 と そ れ らを 遺 伝 的 に 固 定 す る 「 ク 口 一ン 化 」等 が可 能とな る。
染色体操作のうち 、第ー卵割阻止法では完全同型接合型の雌性発生ニ倍体 と四倍体が誘起できる。雌性発生 二倍体を用いた次世代でのクローン系統の作出はすでに実験魚や有用種で報告されているのに対し、四倍体は親魚まで成育した例が極めて少ない。しかし、もし四倍体親魚が作出できれば 、ニ倍体との通常交配による不妊三倍体のほか、異種間での交雑から複ニ倍体、すなわち新種をも合成できる可能性がある。このように、有用な形質を備えた個体を受精後の染色体の倍 加処理なしで得られることから、二倍性配偶子を産出する四倍体親魚の作出は育種の幅を飛躍的に拡大するツールになると期待されている。しかし、前述のように四倍体の生残率は極め て低いため実用化には程遠く、四倍体の死亡要因の解明 やニ倍性配偶子獲得のための新たな手法の開発は急務である。
本研究ではニサク ラマスO
ncorhynchusmasouを材料として用い、第ー卵割阻止胚および誘起された四倍体の死 亡要因の解明と、生殖系列キメラを介して四倍性始原生殖細胞(PGCs)
由 来 の 二 倍 性 配 偶 子 を 誘 導 す る 方 法 の 確 立 を 目 的 と し 研究 を 行 っ た 。

第 1章 第 ー 卵 割 阻 止 に よ り 誘 起 し た 四 倍 体 お よ び 雌 性 発 生 二 倍 体 の 発 生 能 カ の 比 較
雌 雄1対 1
交 配 によ る受 精卵から、 四倍体(4N)と雌性発生ニ倍体(G2N)の両群を同―処

理条件(
700kg/cm2，7分間）で誘起し、第ー卵割阻止の最適時期の検討と両群の発生能カの比較 を 行 った 。 受精 後100Cで培養 した時 、受精後 の最適 な処理開 始時間は G2N
群 の方が30分遅れ ていたが 、細胞学的に最適な処理時期は、両群共に第ー卵割前中期の後半であった。また、最適時期は受精後のごく短い限られた時間であり、それから前後に30分/100Cずれた処理群では、生残率と胚体形成率の低下が認められた。この30分/1
00Cの差は、一定の培養条件下 におけ る家系問 の発生速度の差の範囲内であることから、受精卵に最適時期で効率よく処理を施すことは非常に困難であり、また四倍体誘起の成否を大きく左右する要因である与考えられた。
両群共 に、最適 時期での 処理群 は他の処 理群と 比較して 孵化直 前まで高 い生残率を維持した。しかし、G2N群では正常な孵化稚魚が実験期間終了（受精後50日）以降も生残したのに対し、 4N群では 孵化期直前に急激に死亡し生残個蝌ま得られなかった。孵化直前の四倍体胚の殆どは、小眼、小頭、体軸の湾曲等の重度の奇形胚であり、正常な外部形態を示す個体でも血管系の発達が著しく悪かった。このことから、四倍体の死亡要因は、第ー卵割阻止処理の副作 用より むしろ、 四倍体への倍数性の上昇に起因する遺伝学的あるいは生理学的要因にあると考えられた。

第2章第ー 卵翻阻止 胚の発 生の特性
雌雄 1対1交配に よる受 精卵を4等分し、コン卜ロール(Cont)群、第ー卵割阻止群として最適 時期より 早い処理 群、最 適時間で の処理 群、最適 時期よ り遅い処 理群の計 4群 を作出し、 処理後の発生を比較した。最適時期より早い処理群では後期での染色体の分離異常、遅い処 理群では 処理直後 の染色 体の．塊 状化や 断片化が 顕著に見られた。これらの処理群では、 異常細胞 数を示す 胚や胞 胚期に核 の存否 や細胞の サイズが不均一となる異常胚が高頻度で 出現した。―方、最適時期での処理群では、処理後の異常は見られず、胞胚期では正常胚の 出現頻度が高かった。このことから、最適時期以外での処理は第ー卵割阻止胚の死亡要因を 弓1
き 起こすこ とが示 された。
最適 時間での 処理群 では、外 部形態 上、2細胞期が 長期に亘り観察され、Cont群より1細胞 周期遅れて卵割が進行した。また、細胞学的には、処理後、Cont群と同様に第ー卵割を終了 して2細胞期に 達した が、この 後、Cont
群 では中心 体が2つに複製され、第二卵割終了―1497―

後4細 胞期に達 したのに対し、処理群では中心体が複製されず、中心体が1つしか存在しな
いまま娘 核の膨潤 、核膜の形成、染色体の形成、核膜の消失、娘核の形成の一連の細胞分裂過程が観察された。この時、細胞質分裂は伴わず、分裂終了後も2細胞期のままであった。
このことから、処理群では第ー卵割終了後に、細胞数が変化しない「隠された」第二卵割が存在することが示唆された。また、この第二卵割で、染色体は複製されるが中心体が複製されないた め に染 色 体 の分 離 と細 胞 質 分裂 が 阻害さ れ、四倍 体化する と考えら れた。
10°C培 養下で のサクラ マスニ倍 体の正 常胚発生過程について受精から孵化までの発生段階を規定し、四倍体の発生を検討した。四倍体について、ニ倍体とほぼ同時に胞胚期に到達したことから、四倍体では非同調分裂に入るまでの分裂回数が減少し、胚盤を構成する割球数も減少すると考えられた。胞胚期から100％エピボリ―期の第ー卵割阻止胚の―部に、エピポリ―運動の停止胚や胚軸構造が異常な奇形胚が観察され、これらの胚ではYSLと卵黄細胞表面の微小管繊維が正常に機能していないものと考えられた。さらに、低率ながら受精後2ケ月まで生残した四倍体稚魚では91.
8％で水腫が認められた。また、組織学的には、鰓弁や腹大動脈 の血管壁 、腸管の粘膜層の発達が不十分であり、浸透圧調節に関わる器官あるいは細胞に生理学的な変化が生じた可能性が考えられた。
第 3章 四 倍 性 始 原 生 殖 細 胞 の 特 性 と 生 殖 系 列 キ メ ラ を 介 し た 二 倍 性 配 偶 子 の 誘 導
第 ー卵割 阻止によ り誘起 した四倍体胚におけるPGCsの存否を調べた。組織学的観察、
Whole mount加situ hybri
dization
法 による生殖細胞に特異的なvasm
RNAの検出、生殖隆起細 胞の生 体観察の結果、四倍体においても運動能を有するPG
Csの存在が確認され、生殖系列キメラ作出への応用が可能であると考えられた。また、奇形胚においても、数は減少するがP
G
Csが確認された。
四倍性PGCsを移 植 し た 二倍 体 宿 主の う ち 3個 体 の 雌お よ び11個 体の雄 が成熟し た。
雌3個体の うち1個体で、ニ倍体雄と交配した子孫の中に三倍体と四倍体の出現が確認された。ま た、雄 11個体中2個体の精子から二倍体が検出された。このうち1個体から通常の精子より 大型の 頭部を持つ精子が観察され、これが二倍体に相当する可能性が考えられた。
以上、第ー卵割阻止処理により誘起した四倍体の致死性として様々な死亡要因が明らかとなった。また、この致死性の四倍体には機能的なPGCsが存在することが明らかとなり、生殖系列キメラを介した借腹生産技術によルニ倍性配偶子の誘導が可能であると考えられた。しかしな がら、現 時点では移植した四倍性PG
Cs由来の子孫か否かは不明であり、今後、移植した四 倍性PG
Csが宿 主生殖腺内で配偶子に分化・増殖したかどうか、詳細に解析する必要がある。

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 荒 井 克 俊
副 査 教 授 阿 部 周 一副 査 教 授 山 羽 悦 郎

学 位 論 文 題 名サクラマス四倍体の誘起ならびに発生特性に関する研究
染色体 操作 によ り誘 起さ れる四倍体は、不妊三倍体や複二倍体を誘起するための二倍性 配偶子 を得 る上 で重 要な 役割を持っ。しかしながら、魚類においては処理後の胚が低生 残率で ある ため 限ら れた 種においてしか誘起されていない。誘起条件やその後の生物学 的特 性を 明ら かに する こと は、四 倍体 を様 々な 魚種 で作 り出 して いく 上で 重要 である 。また 、二 倍性 配偶 子を 得るための方法を開発することも求められる。本論文では、
サ クラマ スを 材料 とし て用 い、第一卵割阻止胚および誘起された四倍体の死亡要因の解
明 と、生 殖系 列キ メラ を介 して四倍性始原生殖細胞(PGCs)由来の二倍性配偶子を誘導する 方法の 確立 を目的 とし て研究 を行 ない、 以下 の評価 すぺ き成果 を得 た。
1）雌雄 1対 1交配 によ る受 精卵 から 、四 倍体 と雌 性発生二倍体の両群を同一処理条件で誘起 し、 第ー 卵割 阻止の最適時期の検討と両群の発生能カの比較を行った。第ー卵割阻止 の最 適な 処理 開始時間は、両群共に第一卵割前中期の後半であり、それぞれ四倍体、 雌性 発生 二倍 体が誘起された。しかしながら、前者が孵化前後に高死亡率を示したの に対 し、 後者 は実験期間終了（受精後50日）以降も生残した。このことから、四倍体 の死 亡要 因は 、第一卵割阻止処理の副作用よりむしろ、四倍体への倍数性の上昇に 起 因 する 遺 伝 学 的 あ るい は 生 理 学 的要 因 に あ る と考 え ら れ た 。
2）第一卵割阻止の最適時期より早い処理群、遅い処理群を作出し、処理後の発生を比較した 。最 適時 期よ り早い処理群では後期での染色体の分離異常、遅い処理群では処理直後 の染 色体 の塊 状化や断片化が顕著に見られ、初期卵割期での異常細胞数や胞胚期での 核や 割球 サイ ズの不揃いたど異常胚が高頻度で出現した。このことから、限られた最適時期で第一卵割阻止を引き起こす必要性が示された。

3）最 適 時 間で の 処理 群の処 理後の細 胞学的な 観察の結 果、処理 群では第ー 卵割終了 後に 、細 胞 数 が変 化 しないr隠 された」 第二卵割 が存在し 、染色体 は複製され るが中心
体 が複製さ れないた めに染色 体の分離 と細胞質 分裂が阻害 され、四 倍体化すると考えら れた。そ の後の四 倍体の発 生を二倍 体対照群 と比較した 結果、エ ピポリー運動の停止 胚や 胚 軸 構造 が 異常な奇 形胚が観 察され。 さらに、 低率なが ら受精後2ケ 月まで生残 した 四 倍 体稚 魚 では91.鼎で 水腫が認 められ、 組織学的 には、鰓 弁や腹大動 脈の血管 壁、腸管 の粘膜層 の発達が 不十分で あり、浸 透圧調節に 関わる器 官あるいは細胞に生 理学的な 変化が見 られた。 これらの 形態形成 や器官形成 の異常が 死亡の原因であると 予想され た。
こ れ まで の 結 果よ り 、本 種 に おい て第ー卵 割阻止に よる四倍体 の誘起は 可能であ るが 、その個体としての致死性が明らかとなった。そのため、二倍世ニ配偶子を得るために 、 四 倍 体 始 原 生 殖 細 胞 ほ 鋤 に よ る 借 腹 生 産の 検討 を 行な った 。
4）第ー 卵割阻止 により誘起 した四倍 体胚にお けるPGCsの存 否を、組 織学的観察、Wholemountむsituhybridization法に よ る生 殖 細 胞に 特 異的 な vas mRNAの 検出、 生殖隆
起 細 胞の 生 体 観察 に よ り調 べ た。 そ の 結果 、四倍体に おいても 運動能を 有するPGCsの存在が 確認され、 生殖系列キ メラ作出へ の応用が可 能であると 考えられた。
5） 四倍 性 PGCsを 分離し二 倍体孵化 稚魚ヘ移植 して生殖 系列キメ ラを誘起 した。成 熟した 雌 3個 体の う ち 1個 体で 、 二倍 体 雄 と交 配 した子孫 の中に三 倍体と四 倍体の出 現が
確 認 され た 。 また、 雄11個体中 2個体で二倍 性の精子 が検出さ れた。し かしぬが ら、現 時 点で は 移 植し た 四倍 性 PGCs由 来の 子 孫か 否かは不 明であり 、今後、 移植した 四倍 性 PGCsが宿 主 生 殖腺 内 で配 偶 子 に分 化 ・増 殖したか どうか、 詳細に解 析する必 要が あ ると 考 え られ た 。
申請 者による 以上の成 果は、魚 類におけ る二倍性配 偶子誘起 を目指す染色体工学の研究に 大きく寄 与するも のであり 、さらに は今後の魚 類の発生 工学技術の発展に資するものと して、審 査員一同 は本論文 が博士（ 水産科学） の学位を 授与される資格のあるものと判 定した。