博士（医学）牧野吉倫
学位論文題名Elmol inhibits ubiquitylation of Dock180．
(ElmolによるDock180のユビキチン化の抑制）

学位論文内容の要旨
緒言
細 胞 内シ グ ナ ル 伝達 ア ダ プ ター 蛋 白 で ある Crkの SH3ドメ イ ン 結 合分 子 と し て同 定 さ れ たDock180 Q)Qwnstream of QRK Q‑kDa)は 、 様々 な シ グ ナル 経 路 の 下流 に 於 い て、 Raclを 活性 化 す る こと に よ り 細胞 運 動 や 貪食 作 用 に関与 してい る。また Elmol(E.ngulfment andCellMotj］ityl）は 線虫の Ced＾12の 哺乳動物 におけ る相同 遺伝子 産物と して同 定され 、Dock180と直 接結合 し相互 作用す ること によっ て細胞 運動や貪 食作用 を制御 するこ とが明 らかにされている 。今回 我々は Elm01とDOck180と の相互 作用に ついて 検討し た。
方 法と結 果HEK293T細 胞 に Dock180と Elmolを 共 発 現 さ せ る と 、 Dock180単 独 発 現 時 よ り も Dock180の 発 現 量が 上 昇 す る事 を 見 出 した 。 そ こ で、 ElmolがDock180のタ ンパク 質量を 制御し ている
可 能 性 を 考え 、 (35S〕 ー メチ オ ニ ン を用 い て Dock180及 びElmolを 過剰 発 現 さ せた 293T細 胞
内 の タ ンパ ク 質 を 標識 し 、 Dock180の半 減 期 に ついて 検討し た。結 果、Dock180単 独に比 して
Elm01と の 共 発 現 で 、 Dock180の 半 減 期 の 延 長 を 認 め た 。 ま た RpPCR法 に よ り Dock180のmRNA量 を 検 討 し た と こ ろ 、 Elm01存 在 下 、 非 存 在 下 で Dock180の mRNA量 は ほ ば 同 量 で あっ た 。 これ ら の 結 果か ら、 D0ck180の発 現量は タンパ ク質レ ベルで 何らかの 制御を 受ける 事とE1m01が Dock180の タ ン パ ク 質 の 安 定 化 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
はじ め に 我 々は Dock180のタンパ ク質量 の制御 機構と してユ ビキチ ン・プ ロテア ソーム系 が関 与 す る可 能 性 を 考え 、 Dock180が 細胞 内 で ユ ビキチ ン化さ れるか 否かを 検討した 。HEK293T
細胞 にDock180と HA‐tagを 付加した ubiquitin（HA．ubめを 共発現 させた細胞抽出液を用意し、抗 Dock180抗 体で の 免 疫 沈降 を 行 っ た後 に 抗 HA・ tag抗体 を用いた ウエス タンブ ロット 法により Dock180の ユビ キ チ ン 化を 検 出 し た。 Dock180は RA．ubiと 共 発 現さ せ た時 にのみ ユビキ チン化 が検出 され、 このユ ビキチ ン化は プロテ オソーム 阻害薬 である MG￣132によって亢進した。
ま た MG‐ 132と げ c10heimideを 用 いて 内 因 性 のDock180の 半 減 期 を調 べ た と ころ 、 MG．132
処 理 に よっ て 半 減 期の 延長 が認め られた 。これ らの結 果より Dock180は細胞 内でユ ビキチ ン化され プロテ オソー ムによ って分 解さる ことが 明らかと なった 。
次 に Dock180の ユ ビ キ チ ン 化 に 対 す る Elm01の 作 用 を 検 討 す る 目 的で DOck180、 HA．ubiに 加 え て Elm01を 共 発 現 さ せ た HEK293T゛ 細 胞抽 出 液 を 用い て Dock180の ユ ビキ チ ン 化 を調べ た 。 結 果 、 E1molは Dock180の ユビ キ チ ン 化を 抑 制 す る事 が 判 明 した 。 更 に E1m01の 変 異体 を 用 い た 解 析 に お い て Dock180との 結 合 能 を有 す る Elmolの 欠 失 変異 体 で は Dock180のユビキ チン化 は抑制 され、 結合能 を有し ない変 異体では抑制効果が認められなかった。これらの事
か ら 、 Ehnolは D0ck180と 結 合 す る事 に よ っ てDock180の ユ ビ キ チン 化 を 抑 制す る こ と が示され た。
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更に細胞内でのDock180のユビキチン化の役割を調べる為に、Dock180とHA‑ubiを発現させたH
EK293
T細胞の細胞抽出液を膜成分と細胞質成分に分画し、Dock180のユビキチン化の程度を比較した所、膜分画に於いてより強いユビキチン化を認めた。またE
lmolはこの膜分画でのDock180のユビキチン化を抑制した。またH
EK293T細胞を用いた免疫染色法によって、
Dock180とubiqutinの細胞周縁部での共局在が観察され、Dock180のユビキチン化が細胞膜近傍で起こる事が示唆された。
続いて、Dock
180は細胞外からの刺激によりCrk等の上流因子によって膜近傍に誘導される事が知られているので、EGF刺激、fibronectin依存的な刺激、Crkの共発現下における膜分画中のDock180のユビキチン化の程度を検討した。結果、何れもDock180のユビキチン化は亢進した。
考察
Dock180が細胞内、特に細胞膜近傍でユビキチン化されることが明らかになったが、Dock180のユビキチン化が細胞膜近傍で起こっている事や細胞外からの刺激によって亢進する事から、
Dock180は細胞外からの刺激を契機にCrk等の上流因子によって膜近傍に誘導されRacを活性化すると共にユビキチン化されていると推察される。またDock180に対するユビキチン化酵素は同定されておらず、今後の詳細な解析の為にはこのユビキチン化酵素の同定が必要である。
Elmolは結合依存的にDock
180のユビキチン化を抑制する事が示されたが、詳細な抑制機構につい ては明らかにされていない。ユビキチン化酵素のDock
180への接近を阻害する可能性やDock180のユビキチン化部位を被覆している可能性等が考えられた。今後は、Dock180の膜近傍への局在がユビキチン化に必要とされる理由や、Dock180の膜への局在化及ぴDock180のユビキチン化がRacの活性に与える影響について、Dock180のユビキチン化酵素の同定も含めて検討する予定である。
結語1） Dock180が細胞膜近傍でユビキチン化されプロテアソームによる制御を受ける事が示された。
2） El
molはDock180のユビキチン化を抑制し、Dock180
タンパク質の安定性の上昇に関与した。
3） Dock180のユビキチン化は増殖因子や細胞外マトリックス等、上流からの様々な刺激によって亢進した。

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学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 笠 原 正 典
副 査 教 授 田 中 一 馬
副 査 教 授 畠 山 鎮 次

学位論文題名Elmol inhibi
tsub
iquitylat
ionof Dock180．
(ElmolによるDock180のユビキチン化の抑制）
Dock180は、様々なシグナル経路の下流に於いて、Raclを活性化することにより細胞運動や貪食 作用に関与している。またEl
molはDock180と直接結合し相互作用することによって細胞運 動や貪食作用を制御することが明らかにされている。今回我々はElmolとDock180との 相 互 作 用 に つ い て 検 討 し た 。 HEK293T細 胞 に Dock180と Elmolを共 発 現さ せる と、Dock180単独 発現 時よ りも Do
ck180の発現量が上昇する事を見出し た。そこで、ElmolがDock180のタンパク質量を制御している可能性を考え、〔35S〕−メチオニンを用いてDock180
及 びElmolを過剰発現させた293T細胞内のタンパク質を標識し、Dock180の半減期について検討 した。結果、Dock180
単独に 比してElmolとの共発現で、 Doc
k180の半減期の延長を認 め た 。 ま た RT PCR法 に よ り Dock180の mRN
A量 を検 討し たと ころ 、Elmol存 在下 、非存 在下 でDock180のmRNA量はほば同量であった。これらの結果から 、Dock180の発現量はタンパ ク質レベルで何らかの制御を受ける事とE
lmolがDock180のタンパク質の安定化に関与していることが示唆された。我々はDock
180のタンパク質量の制御機構としてユビキチン・プロテアソーム系が関与する可能性を考え、Dock180が細胞内でユビキチン化されるか否かを検討し た。HEK
293T
細胞にDock180とHA￣tagを付加したubiquitin（HA‐ubi）を共発現させた細胞抽出液を用意し、抗Doc
k180抗体での免疫沈降を行った後に抗HA．tag抗体を用いたウエスタ ンブロット法によりDock180のユビキチン化を検出した。Dock180はHA‐ubiと共発現させた時にのみユビキチン化が検出され、このユビキチン化はプロテオソーム阻害薬である
MG．132によって亢進した。またMG‐132とcyc10hei
mideを用い て内因性のDock180の半減期を調 べたところ、MG．132処理に よって半減期の延長が認められた。これらの結果より
Dock180は細胞内でユビキチン化されプロテオソームによって分解さることが明らかとなった。次 にD
ock180のユビキチン化に 対するE
lm01の作用を検討する目的でDock
180、HA．ubiに 加え てElm01を 共発 現さ せた HE
K293T
細胞抽出液を用いてDock180のユビキチン化を調べた。 結果、Elm01はDock180のユビキチン化を抑制する事が判 明した。更にElm01の変異体を用 いた解析においてDOck180と の結合能を有するE1m01の欠 失変異体ではDOck180のユビキチン化は抑制され、結合能を有しなぃ変異体では抑制効果が認められなかった。これらの事から 、Elm01はDock180と結合する事によってDock180のユビキチン化を抑制することが示され た。更に細胞内でのDock180のユビキチン化の役割を調べる為に、Dock180とHA￣ubi―6811を発現させたHE
K293
T細胞の細胞抽出液を膜成分と細胞 質成分に分画し、Dock180のユビキチン化の程度を比較した所 、膜分画に於いてより強いユビキチン化を認めた。またElmolはこ の膜 分画 での Dock180のユビキチン化を抑制した。 またHEK293T細胞を用いた免 疫染色法によって、Dock180とubiqutinの細胞周縁部での共局 在が観察され、Dock180のユビキチン化が細胞膜近傍で起こる事が示唆された。続いて、Dock180は細胞外からの刺激によりCrk等の上流因子によって膜近傍に誘導される事が知られているので、EGF刺激、fibronectin
依存的な刺激、Crkの共発現下における膜分画中のDock180のユビキチン化の程度を検討した。
結果、何れもDock180のユビキチン化は亢進した。以上から刺激依存的に細胞膜近傍に誘導されたDock180がユビキチン化される事、このユビキチ ン化はDock180/Raclのシグナル経路を抑制的に制御している 事、更には、Elmolはそのユ ビキチン化を抑制する事を介してDock180/Raclのシグナル経路を正に制御している事が考えられる。
以上の学位論文の発表内容に対し、田中―馬教授からDock180のユビキチン化の生物学的意
味について、更にはA531mutantがDoc
k180のユビキチン化を抑制するにも関わらず、細胞運動はなぜ亢進させ得なぃの かっいての質問があった。次いで畠山鎮次教授からDo
ck180のE
3ligaseが同定されているか、また同定されていないとしたら具体的に実験を行った候補について、またDo
ck180のユビキチン化は何番目のりジンを介しているのか、ユビキチン化が分解制御ではなくendocytosisに関わっている可能性、あるいはGGAcomplexとの相互作用の可能性、またElmolのノックアウトマウスが存在するか、またその表現形についての質問があった。また、笠原正典教授からEl
molのDock180に対する制御ではなくE
lmol自身の制御機構について何が分かっているのかについての質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は過去の実験データや参考文献を引用し、田中教授の質問に対しては、Doc
k180は半減期が比較的長いタンパク質でユビキチン化によって細胞内全体のDock
180の量が大きく変化するとは考えにくいため、Dock
180のユビキチン化は局所的なDock
180のユビキチン化に関与している可能性が考えられると解答した。また、畠山教授の質問に対しては、Dock180のE3ligaseは判明しておらず、Cblに関しては具体的に実験を行ったがDock
180をユビキチン化する事は出来なかった事、その他にはNEDD4等が候補となりうる事、またDock180はMG
一132
処理で安定性が増加する事から、K48のユビキチン化を介したプロテアソーム系の分解は受けていると考えられるが、その他のりジン残基については検討していないので不明であるが、エンドサイトーシス等の現象も含め関与している可能性は十分に考えられる事、またElmolのノックアウトマウスは作成されておらず、細胞レベルでのE
lmolのノックダウンでは明らかな表現形は観察されない旨を解答とした。笠原教授の質 問に対しては、神経系に発現しているRhoGがElmolのN末領域に結 合 し て Elmolを 制 御す るこ と、 それ を介 し てRaclを 活性 化し てい る旨 を解 答し た。
こ の 論 文 は 、 Elmolの Dock180に 対 す る 新 し い 機能 を発 見し た点 で高 く評 価さ れ、
Dock
180/
Raclのシグナル経路やそれを介した細胞運動や貪食作用の更なる解明が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ、申 請者が 博士 （医 学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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