研究報告 2018 (KISTEC Annual Research Report,2018)【研究開発部】
有望シーズ展開事業「腸内細菌叢」プロジェクト
解析ツール開発グループ◆総括･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････
プロジェクトリーダー兼グループリーダー

大野

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博司

◆業績･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

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腸内環境制御グループ◆総括･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････
腸内環境制御グループグル―プリーダー109

福田真嗣◆腸内環境制御基盤技術の開発に向けた難培養性腸内細菌の培養法確立および生体に与える影響の評価･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

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中藤 学
◆業績･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････

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【研究開発部】 腸内細菌叢（解析ツール開発）

腸内細菌叢プロジェクト
解析ツール開発グループ
プロジェクトリーダー兼グループリーダー 大野博司

【基本構想】
我が国において糖尿病患者は増加の一途をたどり、高齢者における主要な疾患である。糖尿病に肥満・高脂血症・高血圧が合併するメタボリックシンドロームはその心血管合併症により日本人の健康寿命を短縮する最大の原因として、大きな社会的・経済的問題である。最近腸内細菌と肥満、2 型糖尿病といった生活習慣病との関連が動物やヒトで報告され、これが肥満や 2 型糖尿病の誘因の１つとなっているのではないかと考えられている。従って摂取する栄養素やエネルギー状態によって変化する腸内細菌叢を捉えることができれば、肥満や 2 型糖尿病などの生活習慣病の発症予測や治療に役立つと考えられる。本研究では、摂取する栄養素やエネルギー状態の把握とメタゲノム解析による腸内細菌の菌種や機能といった包括的な解析に加え、遺伝的背景を加味し、そのデータを横断的に解析することにより、食習慣、腸内細菌叢、生活習慣病発症の相互関係を明らかにすることを目的とする。具体的には、東京大学付属病院の検診受診者で 20 歳から 75歳までの男女から肥満者 100 名、耐糖能異常者 100 名、肥満も耐糖能異常もない者 計 100 名の合計 300 名のボランティ
アを募集した。解析項目は、(1) 簡易型自記式食事歴法質問票(BDHQ)を用いた食事調査と活動量計を用いた身体活動量の測定、(2)腹部エコーを含む臨床データ(3)血中アディポカインの測定、(4)腸内細菌叢の 16S・メタゲノム解析、(5)血中・糞便中のメタボローム解析、(6)単核球を用いたトランスクリプトーム解析、(7)全ゲノムシークエンスによる遺伝子多型解析、であり、これらのデータをもとに、統合データベースの作成と解析ツールの開発を行う。これにより、どのような腸内細菌叢が生活習慣病発症に重要な役割をしているかが明らかになることが期待され、それを元にさらに新規バイオマーカーなどの開発や予防薬、個別化医療といった新しい予防法やリスク診断の実現を目指す。

１．研究背景我が国において糖尿病患者は増加の一途をたどり、罹患の１つとなっているのではないかと考えられている。従って摂取する栄養素やエネルギー状態によって変化する腸者数は約 950 万人を数えるに到っている。糖尿病は高齢者における主要な疾患であり、糖尿病に肥満・高脂血症・高内細菌叢を捉えることができれば、肥満や 2 型糖尿病といった生活習慣病の発症予測や治療に役立つと考えられる。

血圧が合併するメタボリックシンドロームは動脈硬化を促進し、心筋梗塞・脳卒中のリスク増大を介して日本人の2 型糖尿病と腸内細菌に関しては、2012 年に中国から 2型糖尿病に関わる約 60,000 種類の最近遺伝子マーカーが健康寿命を短縮する最大の原因となっており(図 1)、大きな社会的・経済的問題である。

発 見され 、特に 2 型糖尿病 患者で Clostridium 属やBacteroides 属の細菌が優位であること、また 2 型糖尿病患者では，腸上皮バリア機能の保持に重要な役割を果たす酪酸の生合成に関わる細菌叢が減少しており，逆に酸化ストレスに対し保護的に働くカタラーゼなどの還元酵素と逆相関することが明らかとなっている 1。2013 年にはのコ
ホートにおいて 70 歳時の正常耐糖能者、耐糖能異常者、2 型糖尿病の比較解析から Clostridium 属、Ruminoccocus
属 、 Faecalibacterium 属 が 正 常 耐 糖 能 者 で 優 位 に 、Lactobacillus gasseri が 2 型糖尿病患者で優位であることが見出され，さらに酪酸を産生する腸内細菌の数が健康な女性に比べ減少していることが報告された 2。また境界型糖尿病が正常耐糖能に近いグループと 2 型糖尿病に近いグループに分類できることが明らかとなった。さらにヨ

最近腸内細菌と肥満、2 型糖尿病といった生活習慣病とーロッパ人と中国人のコホートで糖尿病の同定につながるメタゲノムマーカーが異なることが示唆された。このよの関連が動物やヒトで報告され、高脂肪食などエネルギー過剰な状態では、通常より効率的にエネルギー源を獲得でうに腸内細菌叢には民族差が認められ、同じアジア人でも健常者において中国と日本で異なる腸内細菌叢を有してきる腸内細菌が増加し、増加した腸内細菌により慢性的な炎症などが惹起され、このことが肥満や 2 型糖尿病の誘因いることが報告されている 3。腸内細菌は食事によっても大きな影響を受けることから、食事を加味した腸内細菌と103

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【研究開発部】 腸内細菌叢（解析ツール開発）

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【研究開発部】 腸内細菌叢（腸内環境制御）

腸内細菌叢プロジェクト
腸内環境制御グループグループリーダー

福田真嗣【基本構想】
本プロジェクトは、近年増加傾向にある様々な疾患と関連が示唆されている腸内細菌叢を含む腸内環境を適切に制御することにより、腸内環境のバランスの悪化が起因となる疾患の予防や治療につながる腸内環境制御システムの基盤構築を目的とする。
ヒトの腸管内にはおよそ 1,000 種類、100 兆個にも及ぶとされる腸内細菌が生息している。正常なバランスを保っている腸内細菌叢は外部から侵入する外来細菌の定着を防いだり、宿主免疫系を活性化したりする。しかし、腸内細菌叢のバランスの乱れは大腸炎や大腸がんといった腸管関連疾患のみならず代謝疾患、自己免疫性疾患などの発症にも関連することが報告されている。遺伝子解析技術の進歩により、腸管内に生息する細菌叢の構成、種類などが明らかになってきたが、生息する個々の腸内細菌が果たす役割もしくはその培養方法に関しては研究途上となっている。また、腸内細菌叢由来の代謝物質が宿主の健康維持や疾患に深く関与していることが示されてきたが、それらがどのような腸内細菌により産生されているかは不明な点が多い。
腸内細菌叢を含む、腸内環境を適切に制御するためには個々の腸内細菌の特性を理解し、腸内細菌叢由来の代謝物質や菌体自身が宿主へ与える影響を知ることが重要となる。腸内細菌が主に生息する大腸は嫌気性環境であり、腸内細菌叢を構成する細菌のほとんどは偏性嫌気性細菌に区分されている。これまで、専用の培養容器と脱酸素・炭酸ガス発生剤を組み合わせた簡易的な嫌気環境下やグローブボックスなどの嫌気培養装置を使用した腸内細菌の単離培養も進んでいる。また、腸内細菌の単離培養に使用することができる培地もいくつか市販されている。しかしながら、標的腸内細菌の培養が困難なケースが報告されるなど、腸内細菌の培養技術については改善が必要とされる部分も数多く残されている。ゆえに難培養性腸内細菌の培養技術の開発が最優先課題となる。そこで、本プロジェクトの鍵となる腸内環境制御システムの構築を行うために（１）難培養性腸内細菌の新規培養方法の確立する（2）難培養性腸内細菌単独定着マウスを作製し、それらが宿主に与える影響を解析する。これらの研究を遂行することで、腸内環境制御を行うための創薬やサプリメント、機能性食品の開発につながり、健康維持、疾患予防および新規治療方法開発に貢献できると考えている。

１．研究目的菌叢の解析データと過去の論文報告などを照らし合わせプロジェクト初年度となる平成 29 年度は以下の各項目

ることで重要度が高い腸内細菌を選定してきた。本リストに含まれる入手可能な腸内細菌基準株は理研 BRC より購を重点項目として定めた。

入し、今後の研究に向け嫌気チャンバー内にて安定的かつ(1) 腸内細菌基準株の安定的培養技術の確立容易に培養する方法を模索してきた。

腸内細菌叢を構成している個々の腸内細菌を得るためには主に二つの方法がある。一つ目は、実際に腸内細菌叢が含まれているヒトやマウスの便試料を培地プレート上に播種し、コロニーを形成させ、単離する方法である。二つ目は微生物バンクに登録されている腸内細菌基準株を入手し、培養する方法がある。腸内細菌基準株はいくつかのバイオリソースセンターから入手することができるが、日本国内において腸内細菌を含む微生物基準株は理化学研究所バイオリソースセンター（以下理研 BRC とする）内の微生物材料開発室に保管、登録されている(図 1, URL:
図１理研 BRC 微生物材料開発室のホームページ

http://jcm.brc.riken.jp/ja/)。
これらの登録されている微生物株は基準を満たす研究設備を備えた上で、必要な手続きを行うことで購入するこ

微生物株の提供のみならず、寄託・譲渡も依頼することができる(URL: http://jcm.brc.riken.jp/ja/ )。とが可能である。本プロジェクトを遂行するにあたり、先行研究において蓄積してきたヒトおよびマウスの腸内細109

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する）と連携して本プロジェクトを遂行することにした。
CIEA は実験動物の維持、供給、個体復元を担い、実験動物に関するあらゆるノウハウを有する国内屈指の研究機関である。本プロジェクトの必要となる腸内細菌単独定着マウス作成に必要な無菌マウスの繁殖及び維持方法が確立されているため、共同研究を実施することにした。

2．

図２ 腸内細菌基準株の検索結果の一例、個々の基準株の基本的情報を得ることができる

研究成果

平成 29 年度は以下に挙げる具体的な研究成果を得る(2) 新規ヒト由来腸内細菌の単離、培養技術の確立ことができた。実験方法、結果の詳細は研究員報告書に記載するため要点を示す。

ヒトやマウスの腸内細菌叢において主要な割合を占める腸内細菌に関しては基準株として単離されているもの(1) 腸内細菌基準株の安定的培養方法の確立が多い。その一方で、腸内細菌叢の中で割合が低く、数が少ない腸内細菌の単離、培養は難しく培養の工夫や新規培独自に作成した腸内細菌株のリストを元に、理研 BRC から入手可能な腸内細菌基準株 40 種類（グラム陽性菌 25 種養法の開発が必要となってくる。腸内細菌の多くは偏性嫌気性細菌に分類され、培養中に酸素が混入してしまうと死類、グラム陰性菌 15 種類）を入手した。本年度はそのう
ち 34 種類の腸内細菌基準株の培養を嫌気チャンバー内で滅することもある。このような腸内細菌を失わないためには単離、培養する際に、培養環境中の酸素を可能な限り除試みた。はじめに嫌気性菌の一般的な培養に広く用いられている GAM ブイヨンを用いて寒天培地、液体培地を作成し、去することが必要となる。また、我々の体内には食物に由来する多くの栄養素や未消化物が存在しており腸内細菌腸内細菌基準株の培養を実施した。検討を行った 34 種類の腸内細菌基準株のうち、18 種類のグラム陽性菌、9 種類はそれらを栄養源として増殖している。そのため細菌の増殖に必要な栄養等を添加した新たな培地を作製することのグラム陰性菌の安定的な培養に成功した。一方で、いくつかの腸内細菌基準株は GAM ブイヨン培地で増やすことも重要となる。
腸内細菌の培養ノウハウを得るために腸内細菌叢解析ができなかった。そこでより栄養素が豊富に含まれている
YCFA 培地をベースにさらにいくつかの栄養素を加えた改の研究拠点である慶應義塾大学先端生命科学研究所と協力し、嫌気性培地作成方法の確立および嫌気性チャンバー

良型 YCFA 培地を作製し、これらの培養を試みた。その結果、さらに 3 種の腸内細菌基準株の培養に成功し、平成 29のセットアップを実施した。はじめに、理研 BRC より入手した腸内細菌基準株の中でも厳密な嫌気環境下でしか年度は合計 30 種類の腸内細菌基準株の安定的培養方法を確立できた（表１）。

生育できない腸内細菌を用いて、実際に嫌気環境が構築できているか否かを検討する。嫌気環境下での培養条件が整一方で、4 種類の腸内細菌基準株に関しては GAM 培地、改良型 YCFA 培地のどちらでも培養することができなかっったところで、実際に健常人の便試料からの腸内細菌の単離を試みた。

た。これらの腸内細菌基準株に関しては、引き続き組成の異なる培地を用いて安定的な培養方法の確立を目指して(3) 腸内細菌単独定着マウスの構築に向けた共同研究契約いく。また、本年度内に培養検討ができなかった 6 種類の腸内細菌基株に関しても、同様に培養の確立を試みる。の締結および共同実験の開始
先の項目でも記したように慶應義塾大学先端生命科学研究所では数多くの腸内細菌叢の解析やその代謝物の網羅的解析を実施している研究機関である。また、慶應義塾

グラム陽性菌
グラム陰性菌基準株入手数

培養成功数

培養検討中

2515201055

大学の湘南藤沢キャンパスでは実験動物を用いた機能性食品の評価を行っている。これらの研究ノウハウは本プロ

表１ H29 年度の腸内細菌基準株の培養状況

ジェクトを円滑に進めていくための強力なツールと考え、共同研究契約を締結し、互いの研究ノウハウを融合させる(2) 新規ヒト由来腸内細菌の単離、培養技術の確立ことで新規腸内細菌の分離培養技術の構築を試みることにした。
単離、培養方法が確立した腸内細菌が生体に与える影響を評価するためには、腸内細菌単独定着マウスを構築し、代謝物の網羅的解析や腸管上皮細胞、免疫細胞の組成や数を検討する必要がある。本プロジェクトの拠点である川崎ップを行った。次に、脱酸素ユニットを用いて炭酸ガスを添加しながら嫌気性培地を作成し（図 3）、嫌気チャンバー内において厳密な嫌気環境下でしか生育できない腸内細菌基準株の培養を行った。その結果、培養 24 時間以降に腸内細菌基準株の増殖が目視でも確認され、嫌気環境が正常に構築されていることを確認することができた。

生命科学・環境センター（LiSE）には実験動物の維持、繁殖、実験を実施するための施設が備わっていない。そこで隣接する公益財団法人 実験動物中央研究所（以下 CIEA とKISTEC研究報告（2018） 2018.10

嫌気培養に向けた準備のため、嫌気チャンバーおよび嫌気性培地の作成のための脱酸素ユニット装置のセットア

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