更なる高分離を提供！
高安定性/高選択性C18による分離の改善！
測定対象に適したシンプルな分析メソッドが提供可能な耐熱・耐アルカリ性C18，
極性物質選択性C18について紹介いたします2007/8/29 16:30-16:55

A-5会場

於：アパホテル&リゾート 東京ベイ幕張 ホール㈱クロマニックテクノロジーズ

ChromaNik Technologies Inc. TEL: 06-6581-0885 http://chromanik.co.jp

高安定性C18
高安定性C18
POST-X2 C18

POST-X2 C18の開発
R1
R1

オルガノシリケートグラフト型
高耐熱性C18
カラム
高耐熱性C18カラム

O
CH2
CH2SiO

Si

R2
R2SiO

Si OO

Si O

Si O

Si

CH2OOOSi

CH22SiOOSiOO

高選択性C18
高選択性C18OOO

SiOO

R2R2OSi

CH2SiOSiCH2OSiO

R1R1OnCHOSiSiOSiR2R2Si OOSiOO

R1R1OCH2OOOHOSunrise C18
Sunrise C18-SAC

SiSiOOSiOOIsolated Silanol
HSilanol Activity Controlled C18 HPLC Column

HOO

SiSiO

Vicinal Silanol

シラノール基を化学した活性調節型
逆相カラム

HH
OOSi

• 近年，2µm以下の微小粒子径充填剤を充填した超高速HPLCカラムが市販されはじめている• 微粒子化は高性能化の有効な手段ではあるが，装置側のリスクが大きく，また，汎用HPLCではその能力を十分に引き出すことはできない• 高温下で使用することができれば拡散係数を大きくでき，高分解能を得ることができるが，一般的なシリカ系逆相固定相は50ºC以上での長期使用は不可能である• クロマニックテクノロジーズは，シリカ系逆相固定相の耐熱性向上を目的として，有機シリケートグラフトによる基材シリカゲルの改質を行い，60°Cで十分に使用可能なC18カラムを開発した

23Geminal Silanol

50ºC-pH 10における理論段数の変化
120100100）/ %1208060Conditions
POST-X2 C18，5μm

40Mobile phase: ACN/ 50 mM acetic acid pH3.0=40:60

相対理論段数（相対理論段数（ ）相 対 保 持 時 間 （ ）/ %80ºC-pH 3.0における理論段数と保持時間の変化

150 mm x 4.6 mm i.d..
oFlow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 80 C

★POST-X2 C18はpH3からpH8までの範囲で60°Cでも十分な安定性を発揮する
6080Conditions
POST-X2 C18，5μm

40Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 50 oC

2020150 mm x 4.6 mm i.d..

Mobile phase: ACN/ 50 mM TEA + HCl pH10.0=40:60

000100200300
通液時間 / hour

4000500

100200300

400500通液時間 / hour4

カラム温度による理論段数と対称性の変化

カラム温度を上げるとどうなるか？

ノルトリプチリン

N

2600

1.5

CH3CH3

アミトリプチリン

理論段数が上昇，更に対称性も向上

1400

ノルトリプチリン/メタノール
トルエン/メタノール
アミトリプチリン/1,4-ジオキサン

0.5

ノルトリプチリン/1,4-ジオキサン

300
200100

高粘度有機溶媒も10MPa以下の低圧で使用可能になる

対称性

500
相対理論段 数 (%)

CH3700

アミトリプチリン/メタノール

三環系抗うつ剤のような比較的分子量の大きく拡散係数の低い試料は
NH50

トルエン/1,4-ジオキサン-0.5

アミトリプチリン/メタノール
アミトリプチリン/1,4ジオキサン

0-11520253035 40 45温度（℃）

50556065

カラム：POST-X2 C18, 5μm 4.6x150 mm

溶出順序が逆転することもあり，分離が改善
6

移動相：メタノール/2０mM リン酸緩衝液pH7.5 (80:20)
1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液ｐH7.5 (65:35)
流速：1.0 mL/min71カラム温度による理論段数と対称性の変化
260

60 ºCと20 ºCでのクロマトグラム

2

メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(80:20)

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(65:35)

55

アミトリプチリン/メタノール

240
1.5

相対理論段 数 (%)

200

1トルエン/メタノール

対称性

220

2130アミトリプチリン/メタノール

1-0.510052

アミトリプチリン/1,4ジオキサン

803-11520253035 40 45
温度（℃）

5055

6065

0カラム：POST-X2 C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：メタノール/2０mM リン酸緩衝液pH7.5 (80:20)

28

η=0.6, 3.7 MPa
δ=12.9, δd=6.2 77523Peak 54468

10446541010024642
136pH7.061234524 6468

67% 1,4-ジオキサン
η=1.54
6.5 MPa
δ= 9.8δd=7.849% THF
η=0.55
5.5 MPa
δ= 9.1δd=7.6
1011ノルトリプチリン，アミトリプチリンの保持増加
521,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(63:37)

540642346141774% アセトニトリル
η=0.37
2.3 MPa
δ=11.8
δd= 6.5

プロピルパラベン保持減少
42 3エタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(66:34)

523
10106pHの上昇に伴い，1384

2,56pH3.0

メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(81:19)

57pHによる保持の変化

6345678
Retention time / min5

58% 2-プロパノール
1η=2.3
38.0 MPa2
δ=10.2
δd= 7.2

4

選択性のコントロールⅡ
13570% エタノール
η=1.2
6.1 MPa
δ=11.2
δd= 6.86523121 382% メタノール
η=0.63.7 MPa
δ=12.9δd= 6.2

Retention time / min

カラム: POST-X2 C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.

2642
1 356823752316,72

1

7

η=1.54, 6.5 MPa
δ=9.8, δd=7.8

3120

Retention time / min

68% 1,4-ジオキサン

56

1. ウラシル
2. カフェイン
3. フェノール
4. ブチルベンゼン
6. o-ターフェニル
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ
7. トリフェニレン

1N=4700
As=1.62

高粘性溶媒の使用－選択性のコントロールⅠ

7Peak7624068101214Retention time / min

高粘性溶媒による選択性の変化
82% メタノール

1N=5700
As=1.5144520 ºC

カラム: POST-X2 C18, 5μm, 4.6 x150 mm.
カラム温度: 60 ºC, 20 ºC 検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロプラノロール, 3=トルエン, 4=ノルトリプチリン, 5=アミトリプチリン 9

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液ｐH7.5 (65:35)
流速：1.0 mL/min

2

43トルエン/1,4-ジオキサン

140210.51601200N=8700As=1.19

4

アミトリプチリン/1,4-ジオキサン

180

60 ºC

N=10300
As=1.21567Retention time / min

カラム: POST-X2 C18, 5mm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン
1236pH10.0 1

540123456789Retention time / min10

カラム: POST-X2 C18, 5μm, 4.6 x 150mm
移動相: メタノール/20mMリン酸緩衝液. (80:20)
カラム温度: 40 ºC
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン
132

高安定性C18 POST-X2 C18のまとめ

温度，pHの効果
2pH10.0,pHを上げる

40 ºC

635140246

N=8500As=1.25N=6800
As=1.40825 N=5500

242

N=8300As=1.308

ピーク形状への効果

pH＜温度
63

N=10800
As=1.1551As=1.696N=8500
As=1.30

41012• カラム温度を60°Cに設定するだけで，理論段数が上がり，対称性が向上する• さらに，高粘度有機溶媒をカラム圧力を気にすることなく使用でき，選択性を大きく変化させることが可能となる• つまり一本のカラムで性能向上させ，しかも選択性を大きく変え，最適な分離条件を簡単に導き出せる

pH7.0,

60 ºC

634012

温度を上げるpH7.0,
40 ºC
110

カラム: POST-X2 C18, 5mm, 4.6 x 150mm
移動相: メタノール/20mMリン酸緩衝液. (80:20)
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン

02468101214

Retention time / min15

シラノール基の活性調節

Sunriseシリーズカラム2• 逆相型固定相中の残存シラノール基は，吸着やピークテーリン
グ等の原因であるとされている• 残存シラノール基に基づく主な相互作用は，吸着， イオン交換，水素結合である

3A

１3１0B

23１• これらの二次効果相互作用を積極的に利用することで，極性化合物に対して特異的な保持を示す新規な逆相固定相の創出を目指す

C2246810

ピリジンピークの比較
カラム：A)Sunrise C18B)三官能性C18＋〔エンドキャップなし〕
C)Sunrise C18-SAC
カラムサイズ：4.6 x 150 mm
移動相：メタノール/水 (30:70)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=ピリジン，3=フェノール1214161820

保持時間(min)

AはCカラムと同様な処理後，TMS化により，シラノール基の活性を最小限にした固定相• シラノール基活性調節技術を用いて，シラノール基の状態を制御した上でシラノール基を活用したC18-SACと，シラノール基の制御とさらなるエンドキャッピング処理によりシラノール基の影響を最大限に削減したC18を開発した

Bはシラノール基の活性調節をしていない固定相
Cはシラノール基の活性を最大限にし，なおかつ塩基性化合物のシラノール
17
基へのイオン的吸着を減らし，テーリングをなくした固定相

16

シリカによるヒリックモードの塩基性化合物の分離

Silica-HILICにおける保持機構
H 2O

O
OO

O

SiO

Si

SiOH

O

SiOOO

Si

Silica gel(HILIC)

12

Gradient
2.0mL/min

O

H 2O

O

Mobile Phase

H 2OO

SiO

SiOOHOO-Morphine
3-β-D-GlucuronideHOO

Si
O

Si

OO

O
O
Si

OO
O
O
Si

O
O

OH

Si

O

O
O

Si
O

O

塩基性化合物は有機溶媒と緩衝液の移動相でテーリングすることなく溶出する

O

Si
O18OOH

OO

Si

Si

O
HOAnalyte

H 2O
OHO

O H 2OOO H2O Si
Si
O
Si
O
OH
O H O
H 2O2OSiOHydrophilic
Partitioning

-

H 2O
Si

OH H2O O

O

Waters技術資料よりAnalyte

Si

Si

O

O

H 2O

OOO

Si

Si

O

Si

H 2O

Si
O

OOO

H 2O O H 2O

Si
O

Si

OH

H 2OOOO

SiOOO

H 2O

OH
OH

SiO-

H 2O

ElectrostaticInteraction

ODS silica(RP)Gradient
1.4mL/min

21
MorphineAnalyte-※日本ウォーターズ㈱資料を基に作成
193

逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は？

Sunrise C18-SACのシラノール基疎水場（C18)の近くのシラノール基はシロキサンになっている

シリカを用いるヒリックモードでは塩基性化合物良好
シラノール基が安定に水和している状態では塩基性化合物はテーリングしない

高吸着性
シラノール

塩基性化合物のテーリング抑制

シロキサン結合に変換
HHO

もし不完全な水和状態のシラノール基が存在すれば疎水場（C18)から離れたシラノール基は水和した状態になっている

イオン交換的吸着により塩基性化合物はテーリングする

OOOO

Si

Si

Si

Si

Si

Si

H
O
Si

Si

21

プロカインアミドとN-アセチルプロカインアミドの分離

3

Sunrise C182O
SiHO

中性化合物の保持は変化しない

20

キサンチン類の分離
Sunrise C18HO

極性化合物や塩基性化合物の保持増加

疎水場の近くに存在するシラノール基は，疎水場の影響により水和が妨害され，不完全な水和状態である

H

H

O

H

SiO

241=プロカインアミド

112=N-アセチルプロカインアミド
CH3O

CH3O
N
O

CH3CH3N
CH3O

2H2N

2Sunrise C18-SAC

4

31=テオブロミン
O

1HN
O

N

2=テオフィリン

N

H3C

N
H

O

N

CH3012345678910

3=カフェイン
O

O

CH3N

H
N

H3C

N
H

O

NH

1OH

CH3N

N
N

CH3

Sunrise C18-SAC

4=フェノールO

N
H

CH30.0Time (min)カラムサイズ：4.6 x 150 mm
移動相：メタノール/20mMリン酸二水素カリウム (pH4.5)＝(30:70)
流 速：1.0 mL/min
温 度：40 ºC

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5
3.0
保持時間(min)

3.5

4.0

4.55.0

カラムサイズ：4.6 x 150 mm
移動相：メタノール/アセトニトリル/20mMリン酸二水素カリウム（pH4.5)=(20:10:70)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=プロカインアミド，2=n-アセチルプロカインアミド
231122

移動相pHによる保持時間の制御

三環系抗うつ剤の分離

イオン交換相互作用の保持機構が働く成分は移動相pHにより保持を大きく変化させることが可能
4

1=ウラシル2=プロプラノロール

3=ノルトリプチリン 4=アミトリプチリン 5=トルエン
CH3

HNO

N
H

CH3OONHNH

CH3N

5CH34

1CH323

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20)

155Sunrise C18-SAC

5101520

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH4.5 (50:50)

5アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH6.0 (80:20)

425カラム：Sunrise C18-SAC 5μm, 4.6 x 150 mm
ｴﾝﾄﾞｷｬｯﾌﾟC18, 4.6 x 150 mm
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=プルプラノロール，
3=ノルトリプチリン，4=アミトリプチリン，
5=トルエン1

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20)

0アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH3.0 (50:50)

CH3

Sunrise C18

331OH

42123253035

保持時間(min)404550556065

2405101520

432253035

保持時間(min)404550556065254移動相の塩濃度による保持時間の制御
移動相の塩濃度を高くすることにより，シラノール基とイオン交換する塩基性化合物は保持を減少させることが可能
53B21C

1340mMリン酸二水素カリウム

4231D45pH 2.7

カラム：Sunrise C18-SAC 5μm, 4.6 x 150 mm
移動相：アセトニトリル/リン酸二水素カリウム (50:50)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=プロプラノロール，3=ノルトリプチリン，
4=アミトリプチリン，5=トルエン

460mMリン酸二水素カリウム

530min4E1

塩濃度グラジエント

32

1 2

pH 3.5

1 2pH 4.1

5min

15min

A液100%0%0%

B液0%100%100%4534

流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC試料：1=ウラシル，2=プロプラノロール，3=ノルトリプチリン，4=アミトリプチリン，5=トルエン

26

100 mM
150 mM

423423234pH 6.830530352740

緩衝液濃度と保持指数との関係
1.4

14,0001.2

12,000

1.0

10,000

0.8

8,000

0.6

6,000

0.4

4,000

0.2

2,000

0.0

0
0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.05

3468101

他社高純度ODS

Nortriptyline

Amitriptyline

N (ami)

N=12,0004

12 14 16 18
保持時間(min)

Propranololzz
V1log k = − B log[ A] + B log[ A] + log r +log K ABzAzA
Vm z A202224

A：溶離剤イオン，B
溶離剤イオン，B：測定イオン，：測定イオン， k：Bの保持指数，Kの保持指数，K：選択係数，Vr, Vm：カラム内の樹脂体積と移動相体積
ZA, ZB：各イオンの電荷：各イオンの電荷，2628

金属配位性化合物の分離
15 N=11,500

152025保持時間(min)

N=13,500

22410Toluene

5105 N=11,5004log [buffer concentration]

25 mM
10 mM

N=11,500

1 2

N=12,000

31

カラム：Sunrise C18-SAC 5μm, 4.6 x 150 mm
移動相：アセトニトリル/ 酢酸アンモニウム緩衝液 pH 4.15(70:30)
N=12,500
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC5
試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，
4
N=13,000
4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

51 2log k153

N=12,500

412

N=13,000

3pH 5.9

酢酸アンモニウム緩衝液を用いた塩
基性化合物の分離：塩濃度の影響
200 mM

カラム：Sunrise C18-SAC 5μm, 4.6 x 150 mm
移動相：
アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム緩衝液 (70:30)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，
4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

53pH 5.0

50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
保持時間(min)412カラム：Sunrise C18-SAC 5μm, 4.6 x 150 mm
移動相：A)アセトニトリル/20mMリン酸二水素カリウム (50:50)
B)アセトニトリル/80mMリン酸二水素カリウム (50:50)

80mMリン酸二水素カリウム

553E

42

12

A，B，C，D

20mMリン酸二水素カリウム

2N [amitriptyline]

1A

酢酸アンモニウム緩衝液を用いた塩
基性化合物の分離：pHの影響

29

Sunrise C18の物性値
比表面積

細孔径

細孔容量

炭素含有量

エンドキャプ

340m2/g

12nm

1.0mL/g

15%ありSunrise C18-SAC 340m2/g

12nm

1.0mL/g

14%

なし

Sunrise C18-SAC

2

カラム：他社高純度ODS 5μm, 4.6x150 mm

Sunrise C18

Sunrise C18-SAC 5μm, 4.6x150 mm

A: 20mM リン酸

2

移動相：A)アセトニトリル/20mM リン酸 (10:90)
B)アセトニトリル/50mM ギ酸 (10:90)
C)アセトニトリル/50mM 酢酸 (10:90)2

流速：1.0 mL/min

12B: 50mM ギ酸

1Sunrise C18-SACはシリカ表面に残っているシラノール基を有効に活用し，極性化合物の選択性を大きく変える固定相であり，Sunrise C18は一般的なC18と同様にシラノール基の分離への影響を減らした固定相である

温度：40 ºC
試料：1=8-キノリノール，2=カフェイン

22

C: 50mM 酢酸

Sunrise C18はSunrise C18-SACと同様のシラノール基活性調節後に，エンドキャッピング処理を施しているため，通常のエンドキャッピングタイプC18に比べ，塩基性化合物に対する残存シラノール基の影響をさらに減らすことができる

110246810 12保持時間(min)14160246810 12 14 16保持時間(min)18202230315

Sunrise C18の三環系抗うつ剤の分離

Sunrise C18の分離例（ピリジン，8-キノリノール）
１3225カラム：Sunrise C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：メタノール/25mMリン酸緩衝液pH7.52(80:20)

１

流速：1.0 mL/min

1

温度：40 ºC43

試料：1=ウラシルCH3O

2=プロプラノロール

NHCH3OH

3=トルエン
4=ノルトリプチリン

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
保持時間(min)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

カラム：Sunrise C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：メタノール/水 (30:70)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル, 2=ピリジン
3=フェノール

カラム：Sunrise C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：アセトニトリル/20mMリン酸 (10:90)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=8-キノリノール
2=カフェイン保持時間(min)

NHCH35=アミトリプチリン

CH3NCH30246810121416

保持時間(min)32

Sunrise C18の分離例（有機酸，核酸塩基）
1 2

Sunriseカラムのまとめ

2331• Sunrise C18-SACはシラノール基の状態を調節し，シラノール基活性を分離に最大限活かした固定相である• Sunrise C18-SACは中性化合物の保持は変えず，極性化合物のみの保持を増大させることができ，移動相のｐHや塩濃度によりイオン交換相互作用の働く塩基性化合物は保持時間を自由に変化させることができる• Sunrise C18は15%の炭素含有量でシラノール基の活性を抑制しており，多くの化合物に適用できる固定相である

40 1 2 3 4 5 6 7 8 9
保持時間(min)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112
保持時間(min)
カラム：Sunrise C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：アセトニトリル/0.1％ リン酸 (2:98)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ギ酸
2=酢酸
3=プロピオン酸

カラム：Sunrise C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：20mMリン酸緩衝液pH4.5
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=シトシン, 2=ウラシル, 3=シチジン, 4=チミン*水100%移動相条件での保持時間は，ある程度減少しますが，送液停止してから数時間経過した後は一定になり，その後は再現性が得られます。

34

シリカ系逆相型HPLCカラムの変遷
5th generation
4th generation
3rd generation
2nd generation
1st generation
CoatingType

33

BondedType＜クロマニックの提案＞
性能アップ
高温分離

Hybrid XBridge
GeminiType

溶媒拡張性

HiHi-Endcapped
Inertsil
TypeL-Column

高選択性

YMCYMC-Gel Pro

HiHi-Carbon
Type

YMCYMC-Gel
CosmosilCapcellpak *シラノール基を活かす

SunriseC18C18-SAC

Silanol Activity
Controlled Technology

36

Post-X2 C18

高安定性

POSTPOST-X2µBondPak
LiChrosorb
HyperSil
SpheriSorb
Pericurar Parmaphase

Type35シラノール基のコントロール

POST-X2 C18
Sunrise C18-SAC

疎水性分離
シラノール基をつぶす

Sunrise C18
1st Choice column
376