公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

研究用 iPS 細胞の樹立プロトコル
ver.1.3

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

末 梢 単 核 球 細 胞 （ PBMC） の 前 培 養

1.

凍結末梢血単核球バイアルを恒温槽にて溶解する。

2.

全量を 5 mL StemSpan-AOF にて懸濁し、遠心（440 x g、5 min）。

3.

上清を除去し、1mL 顆粒球系細胞培地にて懸濁してセルカウント。

4.

3x106cells/mL 前後となるよう顆粒球系細胞培地にて調整。

5.

24well plate に 1mL/well ずつ播種し、37℃、5%CO2 にて５日間培養。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

遺伝子導入

1.

顆粒球系細胞培地 10mL と遺伝子導入試薬を調製しておく。

2.

9mL 顆粒球系細胞培地に iMatrix-511 を 57.6μL 加え、6well plate に 1.5mL/well ずつ素早く加えて 37℃で静置。

3.

前培養を行った単核球細胞を回収し、セルカウント。

4.

遠心（440 x g、5 min）して上清を除去し、調製しておいた遺伝子導入試薬 100μL と混合。

5.

細胞混合液をキュベットに移し、4D-Nucleofector 装置にて遺伝子導入（プログラム：EO-117）。

6.

キュベットに 0.4mL 顆粒球系細胞培地を加え、スポイトで穏やかに混ぜる。

7.

ステップ 2 で用意した 6well plate に播種し、37℃、5%CO2 にて培養開始。

8.

遺伝子導入後１週間はおよそ２日に１回 1.5mL StemFit を各 well に添加。

9.

遺伝子導入後８日目以降はおよそ２日に１回、iPS 細胞のコロニーが 1mm 程度になるまで 1.5mL StemFit にて培地交換。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

iPS 細 胞 コ ロ ニ ー の ピ ッ ク ア ッ プ

1.

StemFit に Y-27632 が 10μM、iMatrix-511 が 0.5μg/cm2 となるよう調整し、12well
plate に 0.6mL/well ずつ 素早く加えて 37℃で静置。

2.

実体顕微鏡でコロニーを見ながらピペットマンにてピックアップ。

3.

1.5 mL チューブに入れ、ピペッティングにてコロニーを適当な大きさに破砕。

4.

ステップ 1 で用意した 12well plate ｘ1well に全量を播種。

5.

コロニーごとにステップ 3~5 までの操作を繰り返し、37℃、5%CO2 にて培養開始。

6.

翌日、StemFit

7.

以降、80%コンフルエントに達するまで１日おきに StemFit にて培地交換。

0.6mL /well に置換。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

iPS 細 胞 の 継 代 （ 12well plate か ら 100mm dish へ ）1.

StemFit に Y-27632 が 10μM、iMatrix-511 が 0.5μg/cm2 となるよう調整し、10mL を100mm dish に素早く加えて 37℃で静置。

2.

80%コンフルエントに達した細胞の培地を除去し、0.5 mL PBS(-) にて洗浄。

3.

0.3 mL 0.5x TrypLE Select を加え、37℃で 10 分間静置。

4.

上清を除去し、0.5 mL PBS(-) を加えてピペッティングにより細胞を回収。

5.

セルカウント後、ステップ 1 で用意した 100mm dish に 1ｘ105cells を播種し 37℃、５%CO2 にて培養。

6.

翌日、StemFit

10mL に置換。

7.

以降、80%コンフルエントに達するまで１日おきに StemFit にて培地交換。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

iPS 細 胞 の 凍 結

1.

80%コンフルエントに達した細胞の培地を除去し、5 mL PBS(-) にて洗浄。

2.

3 mL 0.5x TrypLE Select を加え、37℃で 10 分間静置。

3.

上清を除去し、3 mL PBS(-) を加えてピペッティングにより細胞をバラバラにして回収。

4.

セルカウントし、必要量を分取して遠心（ 160 x g、5 min）。

5.

上清を除去し、STEM-CELLBANKER に 5ｘ105 cells/300μL/vial となるように懸濁。

6.

マイクロチューブへ分注し、凍結保存。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

試薬調整◆顆粒球系細胞培地：要時調整
StemSpan-AOF に下記サイトカインを添加。
SCF （最終濃度 50ng /mL）
TPO （最終濃度 10 ng/mL）
Flt3L （最終濃度 20 ng/mL）
IL-6 （最終濃度 50 ng/mL）
IL-3 （最終濃度 20 ng/mL）
G-CSF （最終濃度 10 ng/mL）◆◆

pCXLE プラスミド溶液：要時調整
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F（1mg/mL）

1.38μL

pCXLE-hSK（1mg/mL）

1.38μL

pCXLE-hUL（1mg/mL）

1.38μLpCXWB-EBNA1（1mg/mL）

0.86μL

遺伝子導入試薬（ 105μL/ 1donor ）：要時調整
P3 Primary Cell Solution

82μL

Supplement118μL

pCXLE プラスミド溶液

5μL

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地◆0.5x TrypLE Select
0.5mM EDTA/PBS と TrypLE Select を等量で混合。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

原材料一覧

StemSpan-AOF（STEMCELL Techno、ST-100-0130）
Recombinant human SCF（富士フイルム和光純薬、197-15511）
Recombinant human TPO （富士フイルム和光純薬、207-17581）
Recombinant human Flt3L（富士フイルム和光純薬、061-05391）
Recombinant human IL-6（富士フイルム和光純薬、098-06041）
Recombinant human IL-3（富士フイルム和光純薬、090-05761）
Recombinant human G-CSF（富士フイルム和光純薬、072-06101）
StemFit AK02N（味の素ヘルシーサプライ株式会社）
CultureSure Y-27632（富士フイルム和光純薬、034-24024）
iMatrix-511（株式会社ニッピ、892012）
PBS (-)（ナカライテスク、14249-24）
TrypLE Select（Thermo Fisher Scientific、12563011)
0.5mM EDTA/PBS（ナカライテスク、13567-84）
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit（Lonza、V4XP-3012）
STEM-CELLBANKER（タカラバイオ、CB061）
エピソーマルプラスミドセット（pCXLE セット）