公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

ドパミン神経前駆細胞分化プロトコル
ver.1.0（2023.5.8）

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

ドパミン神 経 前 駆 細 胞 分 化 誘 導 （ 0 日 目 ）1.

24-well plate を iMatrix-511（1.9 µL/well）でコーティングする。

2.

iMatrix-511 コーティングしたプレートに 1mL の 8GMK+LAY 培地添加し、1.0 × 106 cells/wellの播種生細胞数で iPS 細胞を播種する。

3.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

培 地 交 換 （ 1,2 日 目 ）1.

必要量の 8GMK+LAFP 培地を調製する。

2.

1 mL/well の 8GMK+LAFP 培地で毎日培地交換する。

3.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

培 地 交 換 （ 3~6 日 目 ）1.

必要量の 8GMK+LAFPC 培地を調製する。

2.

1.5 mL/well の 8GMK+LAFPC 培地で毎日培地交換する。

3.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

培 地 交 換 （ 7~11 日 目 ）1.

必要量の 8GMK+LC 培地を調製する。

2.

2 mL/well の 8GMK+LC 培地で毎日培地交換する。

3.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

中 脳 腹 側 細 胞 回 収 （ 12 日 目 ） と再 播 種 および解 析
1.

必要量の NB/B27+GABA+Y 培地を調製する。

2.

Well の培地上清を除去し、1mL の PBS(-)を添加する。

3.

PBS(-)を除去し、再度 1mL の PBS(-)を添加する。

4.

PBS(-)を除去し、1mL の 0.5× TrypLE Select を添加する。

5.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）内で 10-15 分間静置する。

6.

マイクロピペット(P1000)を用いてピペッティングし、シングルセルにする。

7.

細胞懸濁液をチューブ（15 mL）に全量回収する。

8.

2mL の NB/B27+GABA+Y 培地で希釈する。

9.

190 × g , 4℃で 3 分間遠心する。

10. 上清を除去し、1mL の NB/B27+GABA+Y 培地で懸濁する。
11. 細胞懸濁液の中央部分から 10 µL をチューブ（1.5 mL）に分取し、10 µL のトリパンブルー溶液で染色した後、セルカウントを行う。
12. 2.0 × 104 cells/150 µL/well となるように 96-well plate へ再播種する。
13. CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。
14. 残りの懸濁液について 200 × g 室温で 5 分間遠心する。
15. 上清を除去し、1 mL の 4%PFA を添加し、室温で遮光して 15 分間静置する。
16. 400 × g 室温で 3 分間遠心する。
17. 上清を除去し、1 mL の FCM Buffer を添加する。
18. 測定まで遮光して 4℃で保存する。

公益財団法人京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

19. FCM で CORIN 陽性細胞を測定する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

培 地 交 換 （ 15 日 目 以 降 ）1.

15 日目以降 2 日おきに半量ずつ培地交換を行う。

2.

必要量の NB/B27+GABA 培地を調製する。

3.

スフェアを吸わないよう注意して上清を 65 µL 除去する。

4.

75 µL の NB/B27+GABA 培地を添加する。

5.

CO2 インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

ドパミン神 経 細 胞 の回 収 （ 26 日 目 ） と評 価
1.

チューブ（1.5 mL）にスフェアを回収する。

2.

1mL の PBS(-)を添加する。

3.

PBS(-)を除去し、再度 1mL の PBS(-)を添加する。

4.

PBS(-)を除去し、1mL の 0.5× TrypLE Select を添加する。

5.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）内で 10-15 分間静置する。

6.

マイクロピペット(P1000)を用いてピペッティングし、シングルセルにする。

7.

細胞懸濁液をチューブ（1.5 mL）に全量回収する。

8.

190 × g , 4℃で 3 分間遠心する。

9.

上清を除去し、1mL の FACS buffer で懸濁する。

10. 細胞懸濁液の中央部分から 10 µL をチューブ（1.5 mL）に分取し、10 µL のトリパンブルー溶液で染色した後、セルカウントを行う。
11. 200 × g 室温で 5 分間遠心する。
12. 上清を除去し、1 mL の 4% PFA を添加し、室温で遮光して 15 分間静置する。
13. 400 × g 室温で 3 分間遠心する。
14. 上清を除去し、1 mL の FACS Buffer を添加する。
15. 測定まで遮光して 4℃で保存する。
16. FACS で FOXA2 と Tuj 1 の両陽性細胞を測定する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

試 薬 と調 整 方 法
試薬については SDS（安全性データシート）を入手し、試薬の取扱い方法を理解し使用する。
試薬一覧表
試薬名

メーカー

型番

GMEM (1×), liquid + L-Glutamine-TPB

Life Technologies

11710

KSR

Life Technologies

10828

SIGMA

S8636

Life Technologies

11140

Wako

198-15781

Life Technologies

21103-049

Life Technologies

12587-010

Life Technologies

A12860-01

Wako

039-24591

REPROCELL

04-0074

A-83-01Wako

039-24111

線維芽細胞成長因子 8、ヒト、組換え体、動物由Wako

067-06231

パルモルファミン

Wako

166-23991

CHIR99021

Wako

034-23103

グリア細胞株由来神経栄養因子、ヒト、組換え

Wako

070-06261

Wako

028-16451

アスコルビン酸注射液 500mg「トーワ」

東和薬品-アクトシン注射用 300mg

第一三共

-DMSO

SIGMA

D2438

ピルビン酸ナトリウム溶液,100 mM,MEM Non-Essential Amino Acids Solution(100×)StemSure®10mmol/l 2-メルカプトエタノール溶液
NEUROBASAL® Medium (1×), liquid - LGlutamine
B-27 Supplement (50×) without vitamin
A
Cell Therapy Systems GlutaMAX™- I CTS(TM) (100×) 200 mM
CultureSure® 10mmol／l Y-27632 溶液、動物由来物フリー
LDN-193189

来物フリー

体、動物由来物フリー
脳由来神経栄養因子，ヒト，組換え体，動物由来物フリー

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

Water

SIGMA

W3500

Monoclonal Anti-CORIN, clone 5B6

SIGMA

WH0010699M1

Invitrogen

A11001

FOXA2 antibody (goat)

R&D

AF2400Alexa 647 anti-goat IgG

ThermoA21447

BD560381

antibody produced in mouse, purified
immunoglobulin
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG

Alexa Fluor 488 mouse anti-β-Tubulin,
Class ⅢLDN-193189
1. LDN-193189 粉末を DMSO で 1mM となるように調製する。

A-83-01
2. 1.A-83-01 粉末を DMSO で 5mM となるように調製する。

FGF8
1. 線維芽細胞成長因子 8、ヒト、組換え体、動物由来物フリー粉末を Water で 100 µg/mL となるように調製する。

パルモルファミン
1. パルモルファミン粉末を DMSO で 10mM となるように調製する。

CHIR99021
1. CHIR99021 粉末を DMSO で 3mM となるように調製する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

GDNF
1. グリア細胞株由来神経栄養因子、ヒト、組換え体、動物由来物フリー粉末を Water で 10 µg/mL となるように調製する。

BDNF
1. 脳由来神経栄養因子，ヒト，組換え体，動物由来物フリー粉末を Water で 100 µg/mL となるように調製する。

アスコルビン酸
1. アスコルビン酸注射液 500mg「トーワ」粉末を Water で 200mM となるように調製する。

dbcAMP
1. アクトシン注射用 300mg 粉末を Water で 400mM となるように調製する。

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

8GMK 培 地

約 562mL

GMEM

500 mLKSR

45 mL

ピルビン酸ナトリウム溶液

5.5 mLMEM Non-Essential Amino Acids Solution

5.5 mL

2-メルカプトエタノール溶液

5.5 mLNB/B27 培 地

約 515mLNEUROBASAL® Medium

500 mL

B-27 Supplement (50×) without vitamin A

10 mL

GlutaMax

5.1 mL

8GMK+LAY 培 地

約 1mL

8GMK 培地

1 mL

LDN-193189

0.1 µL

A-83-01

0.1 µL

Y-27632

1 µL

8GMK+LAFP 培 地

約 1mL

8GMK 培地

1 mL

LDN-193189

0.1 µL

A-83-01

0.1 µL公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

FGF8

1 µL

パルモルファミン

0.2 µL

8GMK+LAFPC 培 地

約 １ mL

8GMK 培地

1 mL

LDN-193189

0.1 µL

A-83-01

0.1 µL

FGF8

1 µL

パルモルファミン

0.2 µLCHIR99021

1 µL

8GMK+LC 培 地

約 １ mL

8GMK 培地

1 mL

LDN-193189

0.1 µLCHIR99021

1 µL

NB/B27+GABAY 培 地

約 １ mL

nb/b27 培地

1 mLGDNF

1 µL

BDNF

0.2 µL

アスコルビン酸

1 µL

dbcAMP

1 µL

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

Y-27632

1 µL

NB/B27+GABAY 培 地

約 １ mLNB/B27 培地

1 mL

GDNF

1 µL

BDNF

0.2 µL

アスコルビン酸

1 µL

dbcAMP

1 µL

公益財団法人

京都大学 iPS 細胞研究財団
606-8397
京都市左京区聖護院川原町 53 番地

参考文献
本プロトコルは、京都大学 iPS 細胞研究所 土井大輔先生のご指導に従い、下記論文を参照して作成しました。詳細については、下記をご確認下さい。
１）Doi D, Magotani H, Kikuchi T, Ikeda M, Hiramatsu S, Yoshida K, Amano N,Nomura M, Umekage M, Morizane A, Takahashi J.
Pre-clinical study of induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitor
cells for Parkinson’s disease.
Nat Commun. 2020 Jul 6;11(1):3369. https://doi.org/10.1038/s41467-02017165-w

２）Doi D, Kikuchi T, Morizane A, Takahashi J.
Clinically compatible differentiation protocol for human pluripotent stem cellderived dopaminergic progenitor cells.
Protoc. Exch. 2020 July 06. https://doi.org/10.21203/rs.3.pex-954/v1