ｍ～2nd Choice・C18で分離困難な場合の選択肢～

クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

分離を変えるには・・
疎水性相互作用

相互作用の異なるカラムに交換する

アルキル基
親水性相互作用
イオン交換相互作用
陰イオン
交換基

π-π相互作用
フェニル基

N+

陽イオン
交換基
OO

-水素結合
ジオール基
OHSO

アミド基
OH

CH3

カラム充填剤基材

CH3NO

分離を変えるには・・2
疎水基 (主効果)
吸着性基(二次効果相互作用)

既存の分離剤
主効果(疎水基)

二次効果相互作用
制御型分離剤
主効果
(疎水基)

二次効果
(吸着等)

第二主効果を持つ
二足型分離剤
主効果
(疎水基)

制御された
二次効果

第二の主効果本日の内容• C28カラムの紹介
100%水系移動相で使用で来る理由
親水性化合物の分離への適用• PFPカラムの紹介
PFPカラムの分離の特長
PFPカラムでHILIC？イオン交換？

• Amideカラムの紹介
Amideカラムの分離の特長
C28カラムとの比較

オクタコシル(C28)• 疎水性相互作用が主な相互作用• 水系の移動相での安定性が高い• 立体選択性が高い• 極性基導入型ODSより、耐久性が高い

CH3H3CC18とC28の標準試料の分離
23Column: Sunniest C18, 5mm 150 x 4.6 mm
Sunniest RP-AQUA, 5m m 150 x 4.6 mm
Sunniest C18, 5mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene, (N=15,700)
5 = o-Terphenyl, (N=15,000)
6 = Amylbenzene, (N=15,300)
7 = Triphenylene, (N=14,500)

Sunniest C18

15764051015Retention time/min

20253035

ODSとの比較1

1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: 97/3=CH3OH/H2O
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC2, 34C18Detection: UV at 295nm
05101520
retention time / min

2530

Sample: 1=δ-Tocopherol
HOOSunrise
C28 %C:18%

2=γ-Tocopherol

1C28HOO

3=β-Tocopherol2HO43O

4=α-Tocopherol
HO05101520retention time / min

253035O

固定相容量は同じODSとの比較21 212Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:80/20=CH3CN/CHCl3
Flow rate: 1.0 mL/min

Conventional
C18 %C:18%

Temperature: 30 ºC
Detection: UV at 450nm
Sample: 1=a-Carotene

Sunrise C28 %C:18%

2=b-Carotene
051015202530

35Retention time / min

固定相容量は2倍

酸性、塩基性条件下の耐久性
Relative plate number of thtmine
(%)

100

100

Relative retention (%)

9090

80

80707060

60505040

Sunniest RP-AQUA30Other brand aqua type C1840

Sunniest RP-AQUA30

Other brand aqua type C182020020406080

Time (h)Test conditions
Mobile phase: 0.5% TFA
Temperature: 60 ºC

1001201400100200300

400

Time (h)Test conditions
Mobile phase:
20 mM phosphate buffer (pH 8.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

SunShell RP-Aqua の40 oCでの保持
核酸塩基の分離

25 ºC2（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

53

Relative retention of thymine(%)

40 ºC

140℃でのチミンの保持時間の変化
4215340

123Retention time/min

4Column: SunShell RP-Aqua, 2.6 μm 75 x 4.6 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25 ºC
Sample: 1 = Cytosine, 2 = Uracil, 3 = Thymidine,
4 = Uridine, 5 = Thymine

1009080706050403020
10012345Measurement number every stop flow
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。
毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，SunShell RP-Aquaほとん
ど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，94%以上の再現性を示しました。

細孔からの移動相の抜け出し
内径0.5mmのガラス管10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006気圧である。内径が1mmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。

毛細管現象水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合
毛管現象の式:h=2g cosq /(rrg)g : 表面張力
r: 液体の密度（比重）

qgr

hr

hq

液体が管に濡れる場合

液体が管に濡れない場合

q < 90°q > 90°疎水性と撥水性
撥水性

水をはじく性質
θ水『液体と物質の表面との接触角が90度より大きくその角度が大きいほど撥水性が強い』

疎水性

水と混ざりにくい性質

物質を水とn-オクタノールに溶解して水と混ぜ合わせ、平衡に達したときの双方での濃度の比、分配係数によって表される。分配係数はしばしば常用対数を用いてLogPと表される。

物質

撥水と疎水違う？同じ？

FFF
Trifluoromethane

Octadecane

OctaneOctacosane

接触角(θ)

120°

126°

140°

108°

分配係数(LogP)

0.64

9.18

5.18

14.09

水の溶解度 (㎎/L)

4090

0.006

0.66

8.84×10-10

分析化学 Vol.59 No. 3 , P193-205(2010)

疎水性(logP)が高いから撥水性(接触角)が高いわけではない

疎水性の高さ ≠ 撥水性の強さ

水溶性ビタミンの分離
SunShell RP-AQUA
1Column:
N(4)=30,800 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:N(3)=31,800
40mM Phosphate buffer pH6.843Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
2Sample: 1 = Nicotinic acid,
2 = Pyridoxal,
3 = Pyridoxine,
4 = Nicotinamide

アミノ酸の分離Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM

010Retention time/min2030

アミノ酸のLC/MSm/z

100%11880

AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIle,LeuLysMetPheProSerThr
TrpTyrVal
02010Retention time/min

90
175
133
134
122
147
148
76156
132
147150166
116106120205
182
118

6040MW =117
Structure of Valine

20050 65 78 88 102 114 130 140 155 166 181 203 216 231 247m/z

Mass spectrum of Valine

Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIMペンタフルオロフェニル（PFP)FFFFFH3C• 疎水性相互作用• 水素結合性• 双極子相互作用• π-π相互作用• 静電的相互作用• 極性化合物の保持が可能• 立体選択性に優れている• ハロゲン化合物の分離に有効標準試料の分離

1524312,3176

SunShell RP-Aqua

754Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine,
3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

SunShell PFP

6Hydrogen Hydrophobicity
Stericbonding (Amylbenzene/ selectivity

72SunShell C18 4246810Butylbenzene)(Triphenylene/o-Terphenyl)

RP-Aqua

0.52

1.52

1.30

PFP

1.00

1.31

2.38

C18

0.39

1.60

1.46

630(Caffeine/Phenol)

51214

16

Retention time/min

1820

2224

クレゾール異性体の分離
1,2SunShell C18

3123
SunShell PFP

Column:SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell PFP, 2.7 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºCSample: 1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

C18カラムではp-クレゾールとm-クレゾールは分離不可能ですが、PFP は分離可能です。

C18とPFPによる塩基性化合物の保持比較
2,3,4SunShell C18

Column: SunShell C18, PFP, 2.6μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/10mM Phosphate buffer pH7.0 = 80/２0
Flow rate: 1.8 mL/min
Temperature: 25 ºC

1Sample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 =Amitriptyline

1SunShell PFP
234

AmideRO• 親水性相互作用• 水素結合性HN• 極性化合物の保持に優れる• ＭＳとの相性が良い• 電荷的に中性であり、低濃度の緩衝液で分離可能

Amide vs C28
21435SunShell Amide

Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
SunShell RPAqua 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
Mobile phase: acetonitrile :Amide : 20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2RPaqua : 20 mM phosphate buffer(pH7.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

5243SunShell RPAQUA
011234核酸塩基の分離
21435

SunShell Amide

Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Acentice Express OH5 2.6 mm : 100 x 4.6 mmAcentice Express HILIC 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm,
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

243

15

他社HILICカラム(ポリオール)
24
135

他社HILICカラム(シリカ)
00.5

11.5

22.5

33.5

合成甘味料の分離
Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :25 mM phosphate buffer (pH2.5) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 室温
Detection: UV@215 nm,

21301. Aspartame

0.5

12. Saccharin,

1.523. Acesulfame K,

2.5

メラミンの分離

2Column:
SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :5 mM phosphate Buffer (pH6.9) =75:25
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 40 ℃
Detection: UV@220 nm,

100.5
1. Cyanuric acid,

11.5
2. Melamine,22.5

高分子分離用コアシェルカラム
作成した粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子を用いて以下のカラムを作成した
P/N

SunShell HFC18-30
C46471
4.6 x 150 mmPorediameter

Surface Carbon
arealoading

C18
EndSurfacecapping
coverage

30 nm

40 m2/g

1.3%

1.2mmol/m2

Yes

Amplus C8-30
4.6 x 150 mm

C36471

30 nm

40 m2/g

1.2%

2.5mmol/m2

Yes

Amplus C4-30
4.6 x 150 mm

C26471

30 nm

40 m2/g

0.9%3mmol/m2

Yes

Particle diameter is 2.6 mm for all.

HFC18とは
Hexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

Sunniest
Bonding
Technology
Hexamethydichlorotrisiloxane+Trimethylchlorosilane (TMS)X
X
SiSiXX
X
X（X: Cl, OCH3, OC2H5)

HFC18試薬の概略図

SiSiOOOSiOSi

Si O OOSiSiOOOOOSiO OSiOOSiSiOSiOSi OSi
Si O OSiSi OO OOOOSiHO OOSiSiSiSiOOSiOOOSiSiOOOOO
Si O

O OO

シリカ表面への結合状態の概略図

タンパクの分離(Amplus C4-30)
Column:Amplus C4-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 25 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Cytochrome C
2. Bovine Serum Albumin
3. Myoglobin
4. Carbonic Anhydrase
5. Phosphorylase B

タンパクの分離(SunShell HFC18-30)
Column:Amplus C18-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 20 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:
1. Angiotensin I
2. Ribonuclease A
3. Lysozyme
4. Transferrin
5. Bovine Serum Albumin

リパーゼの分離(Amplus C8-30)
Column:Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% Formic acid in waterB) 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 10 min%B 15% 60%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 60 oC
Detection: MS,
Injection volume: 10 μL,Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Lipase Impurity
2. Lipaseまとめ• C28カラムは、水系移動相のみでも保持時間が安定しており、極性化合物の分離に有用である。
• PFPカラムは、優れた立体選択性を示す。
• Amideカラムは、高極性化合物の分離に有用である• 30 nm細孔のコアシェルカラムはタンパク分離に有用である。