2023.4.25
公益財団法人京都大学 iPS 細胞研究財団

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京都市左京区聖護院川原町 53 番地

心筋分化プロトコ－ルver.1.1

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iPS 細 胞 の培 養
1.

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60-mm dish（Corning）を iMatrix-511（8 µL/dish）でコーティングする（37℃、1 時間～一晩）。
iMatrix-511 コーティングした 60-mm dish に 2×105 cells/dish で iPS 細胞を播種する。

2.

翌日、培地交換を行う（StmFit AK02）。
以降、細胞が増えてきて培地の色がオレンジ色～黄色に変わる場合は毎日培地交換を行う。

3.

播種後 5~7 日目に、90～100％コンフルエントの状態になったら、分化誘導に進む。

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心筋分化誘導（0 日目）

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1.

IMDM 3 mL 入りチューブ（15 mL）1 本、トリパンブルー溶液 10 µL 入りチューブ（1.5 mL）2 本を準備する。
注：IMDM は StemPro34 でも良い。

2.

dish の培地を除去し、2.0 mL の PBS(-)を添加する。

3.

PBS(-)を除去し、1 mL の 0.5× TrypLE Select を添加する。

4.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO₂）内で 10 分間静置する。

5.

マイクロピペット(P1000)を用いて 1～5 回ピペッティングし、シングルセルにし、1.で IMDM を入れておいたチューブ（15 mL）に全量を移す。

6.

細胞懸濁液の中央部分から 10 µL をチューブ（1.5 mL）に分取し、10 µL のトリパンブルー溶液で染色した後、セルカウントを行う。

7.

15mL チューブを 160×g 室温で 3 分間遠心し、ペレットを吸わないよう注意して上清を除去する。

8.

しっかりとタッピングし、細胞ペレットを崩す。

9.

セルカウント結果より平均生細胞数を算出し、2.0 × 10⁶ cells/1.5 mL となるように Aggregation
medium で懸濁する（ピペッティングは 3 回までとする）。

10. Ultra low attachment 6 well plate（Corning）に 1.5 mL 播種する。
11. 低酸素インキュベーター（37℃、5％CO2、5％O2）で培養する。

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培地交換（１日目）

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1.

必要量の 2 × Differentiation Medium 1 を作製する。

2.

分化誘導開始時刻±1 時間であることを確認する（分化誘導開始から 23～25 時間後）。

3.

1.5 mL/well の 2 × Differentiation Medium 1 を添加する（培地は除去しない）。

4.

plate を揺らして、均一にまぜる。

5.

低酸素インキュベーター（37℃、5％CO2、5％ O2）で培養する。

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培地交換（３日目）

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1.

必要量の Differentiation Medium 2 を作製する。

2.

分化誘導開始時刻±1 時間であることを確認する。

3.

plate を傾け、スフェアを吸わないよう注意して上清を除去する。

4.

2～3 mL /well の IMDM を加え、plate を軽く揺らす。
培地の色が赤色の場合は 2 mL、オレンジ色～黄色の場合は 3 mL 添加する。
注：IMDM は StemPro34 でも良い。

5.

plate を傾け、スフェアを吸わないよう注意して上清を除去する。

6.

2～3 mL /well の Differentiation Medium 2 を添加する。
培地の色が赤色の場合は 2 mL、オレンジ色～黄色の場合は 3 mL 添加する。

7.

低酸素インキュベーター（37℃、5％CO2、5％O2）で培養する。

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培地交換（７日目）

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1.

必要量の Differentiation Medium 3 を作製する。

2.

plate を傾け、スフェアを吸わないよう注意して上清を除去する。

3.

2～3 mL /well の Differentiation Medium 3 を添加する。
培地の色が赤色の場合は 2 mL、オレンジ色～黄色の場合は 3 mL 添加する。

4.

低酸素インキュベーター（37℃、5％CO2、5％O2）で培養する。

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培地交換（９日目以降）

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1.

7 日目以降 2～3 日に 1 度、培地交換を行う。

2.

必要量の Differentiation Medium 3 を作製する。

3.

plate を傾け、スフェアを吸わないよう注意して上清を除去する。

4.

2～3 mL /well の Differentiation Medium 3 を添加する。
培地の色が赤色の場合は 2 mL、オレンジ色～黄色の場合は 3 mL 添加する。

5.

12 日目までは低酸素インキュベーター（37℃、5％CO2、5％O2）、13 日以降は CO2 インキュベーター（37℃、5％CO2）で培養する。

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心 筋 細 胞 の回 収 （ １ ５ 日 目 ） と評 価606-8397
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1.

plate を傾け、スフェアを吸わないよう注意して上清を除去する。

2.

2 mL/well のコラゲナーゼⅠを添加する。

3.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）で 2 時間以上（～over night）静置する。

4.

plate を傾け、スフェアを吸わないよう注意して上清を除去し、1 mL/well の Accumax を添加する。

5.

CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）内で 10 分間静置する。

6.

マイクロピペット(P1000)を用いてピペッティングし、シングルセルにする。

7.

顕微鏡で細胞の状態を確認し、シングルセルになっていないものがあれば、さらに CO₂インキュベーター（37℃、5％CO2）内で最大 15~30 分間静置し、6.を繰り返す。

8.

細胞懸濁液をチューブ（1.5 mL）に全量回収する。

9.

細胞懸濁液の中央部分から 10 µL をチューブ（1.5 mL）に分取し、10 µL のトリパンブルー溶液で染色した後、セルカウントを行う。

10. 180 × g 室温で 5 分間遠心する。
11. 上清を除去し、1 mL の Fixation Buffer を添加し、室温で遮光して 10 分間静置する。
12. 400 × g 室温で 2 分間遠心する。
13. 上清を除去し、1mL の Perm/Wash Buffer(1×)を添加し、室温で遮光して 10 分間静置する。
14. 400 × g 室温で 2 分間遠心する。
15. 上清を除去し、1 mL の FCM Buffer を添加する。
16. 測定まで遮光して 4℃で保存する（1 週間以内に測定すること）。
17. FCM で Troponin-T 陽性細胞を測定する。

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試 薬 と調 整 方 法

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試薬については SDS（安全性データシート）を入手し、試薬の取扱い方法を理解し使用する。

試薬一覧表
試薬名メーカー

型番

Accumax

Sigma-Aldrich

ICT-AM105-100

Stem Pro34

Thermo Fisher

10640-019

MTG (1-Thyoglycerol)

Sigma-Aldrich

M6145-25mL

Glutamax

Thermo Fisher

35050061

L Ascorbic acid

Sigma-Aldrich

A4544-25G

Activin A recombinant humanR&D systems

338-ACBMP-4 recombinant humanR&D systems

314-BP

rhFGF recombinant humanR&D systems

233-FB

VEGF recombinant humanR&D systems

293-VE

Matrigel

Thermo Fisher

356230Transferrin

Roche

10652202001

SB431542

Sigma-Aldrich

S4317-5MG

Stemolecule Wnt
Inhibitor

04_0035

Dorsomorphin

Sigma-Aldrich

P5499-5MGDMSO

Sigma-Aldrich

D2438

IMDM

invitrogen

12440-053

Water, 細胞培養用
30w/v% Albumin Solution, from Bovine
Serum(BSA), Fatty Acid Free（30％BSA）

Sigma-Aldrich

W3500

FujiFilm Wako

017-22231

FBS

Thermo Fisher

10091148

コラゲナーゼタイプⅠ

FujiFilm Wako

035-17604

ナカライ

002492-94

Thermo Fisher

MS-295-PBD

550826

IWP-3

D-PBS(+)調製用 Ca,Mg 溶液
Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1 (Clone13-11)
APC Goat Anti-Mouse IgG

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コラゲナーゼⅠ
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1. collagenaseⅠ粉末 0.5 g をチューブ（50 mL）に移し、PBS(-) 20 mL を加え、collagenase
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Ⅰ粉末を溶解する。
2. フィルターボトルに 1.の溶液と PBS(-) 180 mL、FBS 50 mL、D-PBS(+)調製用 Ca, Mg 溶液 2 mL を加え、フィルターろ過する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、-20℃保管で 6 ヶ月とする。

L-Ascorbic Acid (5 mg/mL)
1. L-Ascorbic Acid 25 g を Water 100 mL に溶かし、溶かした溶液 1 mL と Water 49 mL を混合して 5 mg/mL となるように調製する。
2. フィルターろ過し、必要に応じて適当なチューブに分注する。
※使用期限は 4℃保管で当日使い切り、-80℃保管で 6 ヶ月とする。

Matrigel
1. Matrigel 5 mL と IMDM 5 mL を混合する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、-20℃保管で 6 ヶ月とする。

0.1％ BSA-PBS
1. 30％BSA 100 µL と PBS(-) 200 µL を混合する（10％BSA-PBS）。
2. 10％BSA-PBS 100 µL と PBS(-) 9900 µL を混合し、100 倍希釈する。
※使用期限は調製当日の使い切りとする。

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BMP4606-8397

1. 30％BSA 100 µL と DW 200 µL を混合する（10％BSA-DW）。
2. DW 5 mL、1N HCL 20 µL、10％BSA-DW 50 µL を混合し、フィルターろ過する。
3. BMP4 粉末 10 µg を 2.で調製した溶液 1 mL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－80℃保管で 3 ヶ月とする。

Activin A
1. Activin A 5 µg を 0.1％BSA-PBS 500 µL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－80℃保管で 3 ヶ月とする。

FGF
1. FGF 25 µg を 0.1％BSA-PBS 2.5 mL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－80℃保管で 3 ヶ月とする。

SB431542
1. SB431542 5 mg を DMSO 1.3 mL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－80℃保管で 6 ヶ月とする。

Dorsomorphin
1. Dorsomorphin 5 mg を DMSO 6.26 mL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－80℃保管で 6 ヶ月とする。

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IWP-3
1. IWP-3 2 mg を DMSO 413 µL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－20℃保管で 6 ヶ月とする。

VEGF
1. VEGF 50 µg を 0.1%BSA-PBS 5 mL に溶解する。
※使用期限は 4℃保管で 2 週間、－80℃保管で 3 ヶ月とする。

Anti-Troponin T, Mouse-Mono
1. Anti-Troponin T, Mouse-Mono 100 µg に 200 µL の PBS(-)を添加する。
2. ボルテックスで良く混合する。
※使用期限は 4℃保管で 1 ヶ月、－20℃保管で 6 ヶ月とする。

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下記試薬は使用時に調製し、使用は当日に限る。
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MTG(working)

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Stem Pro34

1 mL

MTG(1-Thyoglycerol)

13 µL

Aggregation medium
Stem Pro34

1 mL

Glutamax

10 µL

Ascorbic Acid

10 µL

Matrigel

10 µL

Transferrin

5 µL

MTG (working)

3 µL

Y-27632

1 µL

BMP4

0.2 µL

2×Differentiation Medium 1
Stem Pro34

1 mL

Glutamax

10 µL

Ascorbic Acid

10 µL

Transferrin

5 µL

MTG (working)

3 µL

BMP4

1.8 µL2023.4.25
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Activin A

1.2 µL

FGF

1 µL

Differentiation Medium 2
Stem Pro34

1 mL

Glutamax

10 µL

Ascorbic Acid

10 µL

Transferrin

5 µL

MTG (working)

3 µL.

VEGF

1 µL

SB431542

0.54 µL

Dorsomorphin

0.3 µLIWP-3

0.1 µL

Differentiation Medium 3
Stem Pro34

1 mL

Glutamax

10 µL

Ascorbic Acid

10 µL

Transferrin

5 µL

MTG (working)

3 µL

VEGF

0.5 µL

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参考文献

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本プロトコルは、京都大学 iPS 細胞研究所 吉田善紀先生のご指導に従い、下記論文を参照して作成しました。詳細については、下記をご確認下さい。
Funakoshi S, Miki K, Takaki T, Okubo C, Hatani T, Chonabayashi K, Nishikawa M, Takei I,Oishi A, Narita M, Hoshijima M, Kimura T, Yamanaka S, Yoshida Y.
Enhanced engraftment, proliferation and therapeutic potential in heart using optimized
human iPSC-derived cardiomyocytes. Sci Rep 6, 19111 (2016).
https://doi.org/10.1038/srep19111