統計数理（2004）
第 52 巻 第 2 号 353–365
c 2004 統計数理研究所


特集「環境科学と統計科学の融合に向けて」［原著論文］

2 標本 t 検定に基づく Ames 変異原性試験結果の陽性・陰性の判定
高梨 啓和

†

（受付 2004 年 4 月 1 日；改訂 2004 年 6 月 23 日）

要旨

代表的な変異原性試験である Ames 変異原性試験に着目し，水道水中に含まれている変異原性物質を対象としてサルモネラ菌 TA100 株を用いて試験した結果の統計的解析を行った．すなわち，Ames 変異原性試験結果が正規分布に従うと見なせることを確認した上で，2 標本間の差の検出力が強い 2 標本 t 検定を用い，2 人の実験者が行った合計 100 回の Ames 変異原性試験で得られた合計 10702 点の測定データに対して著者等が提案した方法を適用し，検出限界を求めた．その結果，世界的に広く利用されている経験則である 2 倍則と本研究で求めた検出限界とは一致せず，本研究で求めた検出限界の方が低かった．サンプルの試験結果とブランク
試験の結果との比（MR 値という）を用いて検出限界値を表した場合，2 倍則では MR 値が 2 以上の時に陽性と判断しているが，本研究では有意水準 95％で MR 値が 1.7 以上で陽性と判断できた．また，ブランク試験に用いるプレートの枚数（標本数）を 2 枚増やすことにより，検出限界を MR 値で 1.4 にすることができ，Ames 変異原性試験を簡易に高感度化できることを明らかにした．
キーワード： 2 標本 t 検定，変異原性試験，Ames 試験，TA100 株，環境サンプル．
1.

はじめに

先進国各国で年間 1 万トン以上使用されている化学物質の種類は 7∼10 万種類と言われている．これらの化学物質は，使用にあたって 1 種類ずつ安全性管理が求められる．我が国においては，化学物質審査規制法，労働安全衛生法などで，化学物質が生産・使用される前（上市前）に変異原性などの毒性を有するか否かが評価され，毒性を有する物質の使用を規制することによって主な管理が行われている．また，環境基準，水道水質基準などにより，上市後の管理がなされる．以上の上市前後の管理において，法的に，あるいは自主管理を行う際に変異原性試
験が用いられている．
変異原性とは，遺伝子に傷を付ける性質を指し，変異原性を有する化学物質は発がんや奇形の発生などを引き起こす可能性がある．このため，変異原性を有する化学物質は発がん試験などのより詳細な試験が求められる．すなわち，より多くの費用，時間などを必要とする発がん試験の前に簡易な変異原性試験を行い，発がん試験を行うべき化学物質をスクリーニングしている．このように，化学物質の安全管理において変異原性を測定することは重要である．したがって，多くの化学物質を含んでいる水道水サンプルなどの環境サンプルにおいても変異原性†

鹿児島大学 工学部：〒890–0065 鹿児島市郡元 1–21–40; takanashi@be.kagoshima-u.ac.jp

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を評価することは重要と考えられ，Takanashi et al.（2002）の報告の他多くの研究例が報告されている．
変異原性試験には多くの方法が用いられているが，最も代表的な試験が 1971 年に米国カリフォルニア州立大学の B. N. Ames 博士が開発した Ames 変異原性試験である．Ames 変異原性試験はサルモネラ菌を用いる方法が一般的であり，予め遺伝子操作したサルモネラ菌を用いて，そのサルモネラ菌が遺伝子操作前の状態に戻る（復帰突然変異を起こす）頻度に基づいてサンプルの変異原性を定性的・定量的に評価する方法である．
Ames 変異原性試験は，同様の他の試験と比較して再現性がよく結果の誤差範囲が小さいとされているが，10−8 ∼10−6 程度の確率で起こる突然変異を評価するためにある一定の誤差範囲をもち，変異原性が弱い検体を試験するときなどには誤差範囲が問題になる．このため，統計的な解析手法を用いて結果が陽性と見なせるか否かを検定する方法を提案し，検出限界を求めた検討が Hamada et al.（1994）など数多く報告されている．それらの多くは，提案された方法
で求めた検出限界と 2 倍則とを比較している．2 倍則とは，サンプルを試験した際の結果と同時に行ったブランク試験の結果の比（MR 値という）が 2 倍以上であった場合に陽性と判断する方法であり，日本を含めた世界各国で最も広く用いられている．従来の統計的解析方法は，2倍則の妥当性を検討する際には有効であったが，通常業務として定期的に変異原性試験を行い，その試験結果の陽性・陰性を判断するためには煩雑すぎるといった欠点を有している．このため，毎試験ごとに検定するのではなく，MR 値で判断できる方法などの簡易な判断方法が開発されることが望まれる．そこで Takanashi and Urano（1998）は，MR 値で判断できる簡易な判断方法を提案して報告した．
本研究では，大学で 1 年間以上訓練された実験者 A，B がそれぞれ 70 回及び 30 回行った合計 100 回の Ames 変異原性試験で得られた合計 10702 点の測定データに対して著者等が提案した方法を適用し，検出限界を求めた．
2.

Ames 変異原性試験の原理

Ames 変異原性試験には，予め人工的に突然変異させておいたサルモネラ菌を用いる．この
サルモネラ菌は，細胞分裂に必要なアミノ酸であるヒスチジンの合成酵素遺伝子が突然変異しており，自力ではヒスチジンを合成できない．このため，ヒスチジンを含まない培地上では成長できず，細菌の集合体であるコロニーを形成することができない．このサルモネラ菌と変異
原性物質とを接触させた後にヒスチジンを含まない寒天培地（プレートという）で培養することにより，復帰突然変異を起こしてヒスチジン合成能力を取り戻した菌のみが増殖してコロニー（復帰コロニーという）を形成する．変異原性物質と接触させる菌体数を一定に保つことにより，復帰コロニー数で復帰突然変異を起こした確率を評価できるため，復帰コロニー数を計数することにより，サンプルの変異原性強度を定量的に評価することができる．また，ヒスチジンの合成酵素遺伝子に与える変異の型が異なる菌株が開発されており，検出したい変異の型に合わせて菌株を選ぶことができるので，被検物質の変異の型を明らかにすることができる．変異の型として，DNA の塩基対の種類が入れ替わる塩基対置換型，DNA に余分な塩基対が挿入されたり欠損したりするフレームシフト型，DNA に架橋する架橋型が知られており，それぞれの型の変異を検出する菌株が開発されている．また，被検物質がサルモネラ菌の細胞膜を通過し易いように細胞外膜を欠損（rfa 変異）させたこと，DNA 修復遺伝子を欠損（∆uvrB ）させたこと，薬剤耐性因子をもつプラスミド pKM101（R-factor）を導入して被検物質の急性毒性でサ
ルモネラ菌が死滅するのを最小限にしたことにより，変異原性の検出感度を著しく改善し，検出可能物質の範囲を広げた．TA92，TA100，TA1535 株は塩基対置換型の変異原性物質の検索

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355に，TA94，TA98，TA1537，TA1538 株はフレームシフト型の変異原性物質の検索に用いられる．これらのうち，TA92 株と TA94 株は，架橋型の変異原性物質も同時に検出することができる．通常の場合，R-factor が導入された TA98 株と TA100 株を用いて試験を行い，比較的まれな変異である DNA 架橋型の変異を検出する必要がある場合には TA92 株と TA94 株を用いて追加試験されることが松原（1992）などにより推奨されている．用いる菌株により，ブランク
試験値（陰性対照値という）の値が 10∼160 復帰コロニー plate−1（以下，rev. · plate−1 と表記）と大きく異なるため，検出限界値が異なると考えられる．
そこで本研究では，環境サンプルの中でも水道水サンプルを対象としているので，水道水などの塩素処理された水試料の変異原性試験に広く利用されている TA100 株を用いることとした．
3.

Ames 変異原性試験

Ames 変異原性試験は，Fig. 1 に示す労働省のガイドブック（労働省化学物質調査課（1991））を基にしたプレインキュベーション法で行った．菌株は，国立公衆衛生院から提供を受けた
TA100 株を用いた．これを，Difco Laboratories 社のニュートリエントブロスを用いて 37◦ C で
9±1 時間前培養し，菌懸濁液を得た．菌懸濁液 100 µl に，リン酸緩衝液 500 µl とジメチルスル
ホキシド（DMSO）を溶媒とした検体液 100µl とを加えて 37◦ C で 20 分間プレインキュベーショ
ン（予備培養）した後に，ソフトアガー 2 ml を加えてよく混合し，Difco Laboratories 社の Bacto
Agar を用いて予め作成しておいたプレート上に添加した．その際，用量作用関係を確認するため，検液の用量が 2 分の 1 及び 4 分の 1 になるように 50 µl · plate−1 ，25 µl · plate−1 の検液と 50 µl · plate−1 ，75 µl · plate−1 の DMSO を添加した試験も同時に行った．添加後，37◦ C で
48 時間培養して復帰コロニーを形成させた．
すべての試験において，プレート上に植菌した菌体数，菌体の活性，プレートの含水率，ヒスチジンおよびビオチンの濃度を一定に保った．同一の用量段階でそれぞれ 2 枚のプレートを用いたが，DMSO のみを用いた陰性対照試験は 4 枚のプレートを用いて行った．また，陽性対照物質である 4 ニトロキノリン 1 オキシド（4NQO）の DMSO 溶液を用いた陽性対照試験を毎回行い，菌体の活性を確認した．

Fig. 1. Procedure for the Ames Salmonella mutagenicity assay.

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4.

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解析方法

解析に用いた方法を Fig. 2 に示す．合計 l 回行った Ames 変異原性試験の結果について，まず，
i 回目の Ames 変異原性試験における陰性対照値を，陰性対照試験に用いた 2 または 4 プレートの復帰コロニー数の平均値 x̄Si (i = 1, 2, 3, . . . , l) として算出した．次に，i 回目の Ames 変異原性試験において合計 m 回行った陰性対照試験以外の試験（検体試験）に用いた 2 プレートの復帰コ
ロニー数の平均値 x̄Di,j (i = 1, 2, 3, . . . , l; j = 1, 2, 3, . . . , m) を求めた．また，x̄Si と x̄Di,j との組
み合わせ（データセット）について，それぞれ MR 値 M Ri,j (i = 1, 2, 3, . . . , l; j = 1, 2, 3, . . . , m)
を式（4.1）より求めた．なお，M Ri,j が 0.95 以下の場合は陽性とは考えられないし，2.05 より大きい場合には明らかに陽性と考えられるので，M Ri,j が 0.95 より大きく 2.05 未満のデータ
セットについて解析した．
(4.1)

M Ri,j =x̄Di,j,x̄Sii = 1, 2, 3, . . . , l ;j = 1, 2, 3, . . . , mx̄Si と x̄Di,j との有意差を，式（4.2）に示した 2 標本 t 検定を用いて，有意水準 0.05 で検定した．
なお，Ames 変異原性試験で得られる値は離散変数であるが，値が大きいために連続変数としFig. 2. Procedure for estimating detection limit.

2 標本 t 検定に基づく Ames 変異原性試験結果の陽性・陰性の判定

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Table 1. MR levels defined for estimating detection limit.

て扱っても大きな問題は生じないと考え，2 標本 t 検定を行った．
(4.2) ti,j =x̄Di,j − x̄Si
s2Si (nS − 1) + s2Di,j (nD − 1)
nS + nD − 2

1,

i = 1, 2, 3, . . . , l ;j = 1, 2, 3, . . . , m

1
+
nS
nD

ここで，t は統計量，s2Si は陰性対照 2 または 4 プレートの復帰コロニー数の標本分散，s2Di,jは検体試験に用いた 2 プレートの復帰コロニー数の標本分散，nS は陰性対照試験における繰
り返し数（プレート数），nD は検体試験における繰り返し数（プレート数）であり，自由度は
nS + nD − 2 である．2 標本 t 検定を行う際は，検定される母集団の分散が等しくなければならないが，本研究では検定に用いるユニット数（x̄Si と x̄Di,j を求めた合計プレート数）が 4 または 6 と非常に少ないので，たとえ xSi と xDi,j の分散に多少の差があっても有意な差とは考えにくい．したがって，2 標本間の等分散性は保たれていると考えることができる．また，x̄Di,j
が常に x̄Si 以上なので両側確率で検定する必要がなく，片側確率で検定することとした．検定
により，x̄Si と x̄Di,j の間に有意水準 0.05 で有意差が認められた場合に，陽性と判断した．
検定した全てのデータセットを，MR i,j の大きさにより，Table 1 のように設定した 0.1 間隔のＭＲレベルに分類した．ＭＲレベルごとに，陽性と判断されたデータセット数 N p と判断されなかったデータセット数 N n とを求め，全データセット数 N p + N n に対する陽性と判断されたデータセット数の割合（陽性率）Rp を 式（4.3）により求める．Rp が 0.95 以上になる MR 値
を検出限界とした．
Rp =

(4.3)

5.

Np
Np + Nn

結果及び考察5.1 データの信頼性と分布型解析に用いた Ames 変異原性試験結果は，大学で 1 年間以上訓練された実験者 A，B が 5 年間に行った試験結果である．実験者 A は 70 回，B は 30 回 Ames 変異原性試験を行い，それぞれ 7526 枚のプレートを用いた試験結果，3176 枚のプレートを用いた試験結果を得た．得られた試験結果は，すべて解析に用いた．実験者 A が同一の検体について 45 枚のプレートを用いて行った試験結果の分散と，同様にして Hamada et al.（1994）が 50 枚のプレートを用いて行った試験結果の分散とを比較して Table 2 に示す．両者の分散に大きな差はなく，他の研究機関

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Table 2. Reproducibility of the Ames assay results by the student A and a reference.

Fig. 3. Examples of dose-response line.

Table 3. Fitness of the Ames assay results for the normal distribution.

と同等の再現性が得られる試験が行われていることが確認された．
実験者 A は合計 37 回 (l = 37)，実験者 B は合計 23 回 (l = 23) の Ames 変異原性試験を行い，得られた結果をすべて解析に用いた．すべての試験を通して，陰性対照値は 121 から 152
rev. · plate−1 ，比活性は 9,200 から 11,000 net rev. · (ug-4NQO)−1 の範囲であり，菌体の活性は安定していた．得られた用量作用直線は，Fig. 3 に例を示すようにすべて直線性が良く，回帰直線の勾配から変異原性を算出するのに問題はなかった．以上のことから，本研究で用いた試験結果は十分な信頼性を有すると考えられる．
次に，同一の検体を Ames 変異原性試験により試験した結果の分布型を検討するために，45

2 標本 t 検定に基づく Ames 変異原性試験結果の陽性・陰性の判定

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枚または 47 枚のプレートを用いて実験者 A が三種類の検体の試験を行い，3 つの母集団を得た．得られた母集団の復帰コロニー数の平均値は，それぞれ 127，347，591 rev. · plate−1 であった．それぞれの母集団の分布型を正規分布と見なせるか否かを，χ2 検定を用いて有意水準
0.05 で検定して検討した．その結果，Table 3 に示すようにすべての母集団において χ2 < χ2αであり，正規分布と見なせないことが否定された．このため，母集団が正規分布に従うことを仮定した 2 標本 t 検定による解析が可能であることが明らかになった．
Ames 変異原性試験で同一の検体を試験した結果の分布型は，二項分布に従うという Margolin
et al.（1981）の報告や Weinstein and Lewinson（1978），Stead et al.（1981）などのようにポアソ
ン分布に従うという報告，ポアソン分布に従わないという Snee and Irr（1984），Bogen（1994），
Chu et al.（1981），Bernstein et al.（1982），Barry et al.（1981）の報告などがあり，結論に至っていない．Ames 変異原性試験は，プレート上に植菌された約 108 個の菌体のうちの 5×100 から 5 × 102 個程度の菌体のみを突然変異させる試験であり，このように確率が非常に低い事象の典型的な分布型であるポアソン分布を Ames 変異原性試験結果の分布型として仮定するのは妥当である．しかし，ポアソン分布は母集団の平均値が大きくなると正規分布とほぼ同型になるので，本研究の TA100 株を用いた結果のように，通常の陰性対照値が 100 rev. · plate−1 以上の場合は，より解析が容易な正規分布として取り扱うことができると考えられる．
5.2 陰性対照試験に 2 枚のプレートを用いた場合の検出限界
陰性対照試験に 2 枚のプレートを用いた場合の検出限界を実験者 A の試験結果を用いて検討した．陰性対照試験は 4 枚のプレートを用いて行ったが，4 枚の結果から 2 枚分の結果のみを無作為に抽出して解析に用いた．実験者 A の試験結果のうち，MR i,j が 0.95 から 2.05 の範
囲内のデータセットは 3733 セットであり，そのすべてを解析に用いた．
N p，N n および両者の合計数 N p + N n を求め，MR レベルごとに Table 4 及び Fig. 4 に示す．各 MR レベルで 209 から 447 個のデータセットがあり，十分に正確な Rp を求められると考えられる．MR レベルが同じでも陽性と判断されたデータセットと判断されなかったデータ
セットがあった．MR レベルが 1.4 以下では，MR レベルが大きくなるにつれて N n が減少しN p が増加したが，MR レベルが 1.5 以上では N p + N n が大きく減少したために N p も減少した．そこで，MR レベルごとに Rp を算出し，Fig. 5 に示す．MR レベルが 1.6 では 94.9％のTable 4. Number of data set toward the MR level (experimenter: A, negative control
set: duplicate plates).

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Fig. 4. Behavior of the number of data set toward the MR level (experimenter: A,
negative control test: duplicate plates).

Fig. 5. Determination of detection limit by positive ratio (experimenter: A, negative
control test: duplicate plates).

データセットが陽性と判断され，MR レベルが 1.7 以上では 95％以上のデータセットが陽性と判断された．このため，陰性対照試験に 2 枚のプレートを用い，TA100 株を用いて行った実験
者 A の試験結果に対しては，検出限界を MR 値で 1.7 と判断できた．
前述のように，Ames 変異原性試験の検出限界を MR 値で 2 とする 2 倍則が広く用いられているが，TA100 株を用いた試験結果に対して 2 倍則を適用すると，陽性の結果を陰性と判断する確率が高いとの Hamada et al.（1994）および Snee and Irr（1984）の報告がある．本研究でも，

2 標本 t 検定に基づく Ames 変異原性試験結果の陽性・陰性の判定

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陰性対照試験に 2 枚のプレートを用いた場合の検出限界について，同様の結論が得られた．ただし TA98 株等の陰性対照値の小さい菌株を用いた試験結果に対しては，検出限界は 1.7 より大きくなると考えられる．
5.3 陰性対照試験に用いるプレート数を 4 枚にすることの効果
陰性対照試験に 4 枚のプレートを用いた場合の検出限界を実験者 A の試験結果を用いて同様に検討した．実験者 A の試験結果のうち，M Ri,j が 0.95 から 2.05 の範囲内のデータセット
は 3763 セットであり，そのすべてを解析に用いた．
N p，N n および N p + N n を求め，MR レベルごとに Table 5 および Fig. 6 に示す．各 MR
レベルで 238 から 425 個のデータセットがあり，十分に正確な Rp を求められると考えられる．
陰性対照試験に 2 枚のプレートを用いた場合と同様に，MR レベルが大きくなるにつれて N nが減少し，N p が増加したが，2 枚のプレートを用いた場合と比較して明らかに急激に N n が減少し，N p が増加した．MR レベルごとに Rp を算出して Fig. 7 に示したところ，MR レベル
が 1.3 では 93％のデータセットが陽性と判断され，1.4 以上では 95％以上のデータセットが陽性と判断された．このため，陰性対照試験に 4 枚のプレートを用い，TA100 株を用いて行った実験者 A の試験結果に対しては，検出限界を MR 値で 1.4 と判断できた．陰性対照試験に 2 枚のプレートを用いた場合と比較して検出限界が 0.82 倍になったことから，陰性対照試験に用いるプレート数を 2 枚から 4 枚に増やすことは Ames 変異原性試験を高感度化するのに有効であり，非常に簡易で優れた方法であることが明らかになった．検出限界が低くなったのは，母集団の平均値と分散を算出するためのユニット数（プレートの枚数）が増えたために，差の検出力が強くなったためと考えられる．検出限界が MR 値で 1.4 であれば十分に低く，陰性対照試験に用いるプレート数をさらに増やす必要はないと判断した．ただし，TA98 株等の陰性対照値の小さい菌株を用いる試験で，検出限界を TA100 株のそれと同程度に低くするためには，陰性対照試験に用いるプレート数をさらに増やす必要があると考えられる．
5.4 検出限界の個人差実験者 B の試験結果を用いて，陰性対照試験に 4 枚のプレートを用いた場合の検出限界を同様にして求めた．実験者 B の試験結果のうち，M Ri,j が 0.95 から 2.05 の範囲内のデータセッ
Table 5. Number of data set toward the MR level (experimenter: A, negative control
set: quadruple plates).

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Fig. 6. Behavior of the number of data set toward
the MR level (experimenter: A, negative
control test: quadruple plates).

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Fig. 7. Determination of detection limit
by positive ratio (experimenter: A,
negative control test: quadruple
plates).

Table 6. Number of data set toward the MR level (experimenter: B, negative control
set: quadruple plates).

トは 1588 セットであり，そのすべてを解析に用いた．
N p，N n および N p + N n を求め，MR レベルごとに Table 6 および Fig. 8 に示す．各 MR
レベルで 120 から 171 個のデータセットがあり，十分に正確な Rp を求められると考えられる．
MR レベルごとに Rp を算出して Fig. 9 に示したところ，MR レベルが 1.4 以上では 95％以上のデータセットが陽性と判断され，実験者 A の試験結果の場合と同じ検出限界が得られた．これは，実験者 A と B の熟練度に差がないことを示していると考えられる．両者の間で検出限界の個人差が無視できたことから，Table 2 に示した分散と同程度の分散となる試験結果が得られる実験者の検出限界には個人差がほとんどなく，本研究で例を示した検出限界と同程度になると考えられる．ただし，正確な検出限界は実験者ごとに求める必要がある．また，実験者の熟練度が同じであっても，陰性対照値が 121 から 152 rev. · plate−1 の範囲から大きく逸脱し2 標本 t 検定に基づく Ames 変異原性試験結果の陽性・陰性の判定

Fig. 8. Behavior of the number of data set toward the MR level (experimenter: B,
negative control test: quadruple plates).

363

Fig. 9. Determination of detection limit bypositive ratio (experimenter: B, negative control test: quadruple plates).

ている場合には，検出限界も異なると考えられる．
6.

まとめ

本研究では，大学で 1 年間以上訓練された実験者 A，B がそれぞれ 70 回及び 30 回の Ames
変異原性試験を行い，それぞれ 7526 枚及び 3176 枚のプレートを用いて得た試験結果に対して著者等が提案した方法を適用し，検出限界を求めた．その結果，陰性対照試験に 2 枚のプレー
トを用い，TA100 株を用いて行った試験結果に対しては，検出限界を MR 値で 1.7 と判断できた．一方，陰性対照試験に 4 枚のプレートを用い，TA100 株を用いて行った実験者 A の試験結果に対しては，検出限界を MR 値で 1.4 と判断できた．陰性対照試験に 2 枚のプレートを用いた場合と比較して検出限界が 0.82 倍になったことから，陰性対照試験に用いるプレート数を2 枚から 4 枚に増やすことは Ames 変異原性試験を高感度化するのに有効であり，非常に簡易で優れた方法であることが明らかになった．正確な検出限界は実験者ごとに求める必要がある
が，Table 2 に示した分散と同程度の分散となる試験結果が得られる実験者の検出限界は本研究で例を示した検出限界と同程度になると考えられる．
記号
M R : MR 値n
: プレートの枚数
N n : 陽性と判断されなかったデータセット数
N p : 陽性と判断されたデータセット数
Rp : 陽性率s: 母標準偏差t: 統計量x̄: プレートあたりの復帰コロニー数の平均値

単位—[plate][data set]
[data set]—[rev. · plate−1 ]—[rev. · plate−1 ]364

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添字
D
:
i
:
j
:
S
:

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検体試験
i 番目の Ames 変異原性試験
j 組目の検体試験
陰性対照試験
参 考 文 献Barry, H. M., Kaplan, N. and Zeiger, E.（1981）. Statistical analysis of the Ames Salmonella/microsome（6）, 3779–3787.
test, Proceeding of National Academic Science USA, 78
Bernstein, L., Kaldor, J. and Pike, M.（1982）. An empirical approach to the statistical analysis ofmutagenesis data from the Salmonella test, Mutation Research, 97, 267–281.
Bogen, K. T.（1994）. Applicability of alternative model of revertant variance to Ames-test data for
121 mutagenic carcinogens, Mutation Research, 322（4）, 265–273.
Chu, K. C., Patel, K. M., Lin, A. H., Tarone, R. E., Linhart, M. S. and Dunkel, V. C.（1981）. Evaluating
statistical analyses and reproducibility of microbial mutagenicity assays, Mutation Research,
85, 119–132.
Hamada, C., Wada, T. and Sakamoto, Y.（1994）. Statistical characterization of negative control datain the Ames Salmonella/microsome test, Environmental Health Perspectives Supplements,
102, 115–119.
Margolin, B. H., Kaplan, N. and Zeiger, E.（1981）. Statistical analysis of the Ames Salmonella/
microsome test, Proceeding of National Academic Science USA, 78（6）, 3779–3783.
松原 聰（1992）. 『がんの生物学』，裳華房，東京．
労働省化学物質調査課（1991）. 『安衛法における変異原性試験』，中央労働災害防止協会，東京．
Snee, R. D. and Irr, J. D.（1984）. A procedure for the statistical evaluation of Ames Salmonella assay
results comparison of results among 4 laboratories, Mutation Research, 128, 115–125.
Stead, A. G., Hasselblad, V., Creason, J. P. and Claxton, L.（1981）. Modeling the Ames test, Mutation
Research, 85, 13–27.
Takanashi, H. and Urano, K.（1998）. Statistical procedures for estimating the detection limit anddetermination limit of the Ames Salmonella mutagenicity assay, The Science of the Total
Environment, 221, 31–42.
Takanashi, H., Mayumi, M., Kato, M., Hirata, M. and Hano, T.（2002）. Removal of mutagen precursor
from wastewater by activated sludge and oxidation treatment, Water Science and Technology,（11–12）, 389–394.
46
Weinstein, D. and Lewinson, T. M.（1978）. A statistical treatment of the Ames mutagenicity assay,
Mutation Research, 51, 433–434.

Proceedings of the Institute of Statistical Mathematics Vol. 52, No. 2, 353–365 (2004)

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A Procedure for Statistical Evaluation of Ames Salmonella
Mutagenicity Assay Results Based on Two Sample t-test
Hirokazu Takanashi
Department of Bioengineering, Kagoshima University

The detection limit for the Ames Salmonella mutagenicity assay, which is very widelyused all over the world to evaluate the genetoxicity of environmental samples, was determined in the present study. Salmonella typhimurium TA100 strain was used and exogenous activation S9 was not used in the study, because these test conditions are sensitive todetection of mutagen in chlorinated water samples. To determine the detection limit, 100
accumulated results from the assay conducted by two experimenters A and B were taken
as examples. The total number of base-agar plates used in the assay was up to 10,702.
The distribution function was considered to be a normal distribution by the chi-squared
test, so that the two sample t-test was employed to determine it. The mean and varianceof the negative control test conducted by using 45 base-agar plates (45 recurrences) were
127 rev. plate−1 and 117 rev. plate−1 , respectively. The detection limit was determined at
1.7 as the MR value (the number of revertant colonies in the sample test divided by thosein the negative control test) at a level of significance of 0.05 when duplicate plates wereused in the negative control test. However, it decreased to 1.4 as MR level when quadruple
plates were used in the negative control test. Therefore, it was found that the sensitivityof the Ames Salmonella mutagenicity assay was improved very easily by increasing thenumber of plates in the negative control test from two to four. The application of theconventional two-fold rule to the data obtained with the strain TA100 was considered too
conservative. It was proved by comparing the data of the two students that the detection
limit determined in the present study was acceptable to well trained students. However,
the accurate detection limit should be determined for each experimenter.

Key words: Two sample t-test, mutagenicity, Ames Salmonella assay, TA100 strain, environmental
sample.