分離選択の大幅な改善：高温/長鎖アルキル基の知られざる能力㈱ クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和

日本薬学会129年会1高耐熱性SUNARMOR C18の開発• 近年，2µm以下の微小粒子径充填剤を充填した超高速HPLCカラムが市販されはじめている• 微粒子化は高性能化の有効な手段ではあるが，装置側のリスクが大きく，また，汎用HPLCではその能力を十分に引き出すことはできない• 高温下で使用することができれば拡散係数を大きくでき，高分解能を得ることができるが，一般的なシリカ系逆相固定相は50ºC以上での長期使用は不可能である• クロマニックテクノロジーズは，シリカ系逆相固定相の耐熱性向上を目的として，エチレン基をC18シリル化試薬に結合した新規試薬を開発し，60°Cで十分に使用可能なC18カラムであるSunArmor C18を開発した
日本薬学会129年会2

酸性/アルカリ性下でのシリカゲルの分解RH3C

OCH3CH3Si

Rin AcidRSi

H3C求電子反応

CH3CH3Si

R

R
Si

O

O

O

O

Si

Si

Si

Si

O

OOO

O

O

O

R
Si

H3C+

H

CH3CH3Si

H
H

OO

Si

O

O

官能基の切断

OO

Si
O

OO

O

in Alkaline
基材の切断
H3C

CH3CH3Si
O

O

求核反応

RSi

OH

O

Si
O

R

H3C-SiOO

CH3CH3 R
Si
H

Si

O

O

O

Si
O

O

O

H3C

R

O

R

O
Si

Si
O

CH3CH3Si

O

日本薬学会129年会

O

O

R

H

Si

O

O
Si

O

H

O

O3耐熱性シラン化合物
GC用固定相に用いられている
CH3CH3O

CH3O

O

SinR1Si
CH3OnSiO

R2mPoly[dimethylsiloxane]

Poly[alkylsiloxane]/[dimethylsiloxane](OV-1, SE30…)(phenyl:OV-5, OV-17, cyano/phenyl:V-225, OV-1701…)
CH3O

CH3CH3SiSi

CH3CH3R1OnSi

O

R2m

R=

C3H6CN

Silarylene (silphenylene) type
アルキル・アルキレン基の導入で耐熱性・化学的安定性が向上する?!
日本薬学会129年会

4新規開発C18試薬 特許出願中(SunArmor C18)
シリカゲルに結合

X
X

SiX

H2C

Si O

OSi

2X X

X

H2C

Si
O
X X
Si

2H2C

X X

シリカの物性値

Si X
X

2SiX

HOX
X

TMS化

H2COH

O
H2HO2SiOHOHSiC
H2 O OH2OOSiSiOOOCC2 Si
Si2O
2 Si
SiSiOOH2H2OOOOOCCOOOSiOSiSi2 Si2OSiOO O
O O OOSiOSiSiOOOSiSiOSiOOSi
Si OOOSiOO OSiOOOOO SiOOOOSiOO

比表面積：340m2/g，細孔容積：1.0mL/g，細孔径：12nm
日本薬学会129年会

580ºC-pH 2.0における理論段数と保持時間の変化
120

相対理論段数（ ）相 対 保 持 時 間 （ ）/ %100
80
60Conditions
SunArmor C18, 5μm 150 mm x 4.6 mm i.d..

40

Mobile phase: ACN/ 0.1% trifluoroacetic acid pH2.0=40:60
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 80 oC

2000100200300
通液時間 / hour

日本薬学会129年会400500600680ºC-pH 8.0における理論段数と保持時間の変化
120

相対理論段数（ ）相 対 保 持 時 間 （ ）/ %10080
60Conditions
SunArmor C18, 5μm 150 mm x 4.6 mm i.d..

40Mobile phase:
ACN/ 20 mM Ammonium acetate + TEA pH8.0=40:60

20

Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 80 oC00100200300
通液時間 / hour

日本薬学会129年会4005007カラム温度を上げるとどうなるか？
★溶質の拡散係数が上がる★吸脱着速度が速くなる★移動相の粘度が下がる三環系抗うつ剤のような比較的分子量の大きく拡散係数の低い試料はNHNCH3ノルトリプチリン

CH3CH3アミトリプチリン

理論段数が上昇，更に対称性も向上
高粘度有機溶媒も10MPa以下の低圧で使用可能になる

溶出順序が逆転することもあり，分離が改善
日本薬学会129年会8

各温度における線流速と理論段高との関係
102倍

H/dp

86420204060

80100udp/Dm,25F.D.Antia and C. Horvath, J. Chromatogr., 436, 1-15 (1988).

日本薬学会129年会9温度と粘度および拡散係数との関係
η = α exp(β/T)η25TDm = Dm,25・ η298
η:粘度，T:絶対温度， D：拡散係数
日本薬学会129年会10温度と分析時間の関係
カラム圧，段数を一定となる条件
1.0tR/ tR,250.80.60.40.250

100200150Temperature (°C)

F.D.Antia and C. Horvath, J. Chromatogr., 436, 1-15 (1988).

日本薬学会129年会

11カラム温度による理論段数と対称性の変化
260

2

アミトリプチリン/メタノール

240

相対理論段数 (%)

200

1

対称性

1.5220トルエン/メタノール
アミトリプチリン/1,4-ジオキサン

1800.5160トルエン/1,4-ジオキサン

1400

アミトリプチリン/メタノール

120
-0.5
100

アミトリプチリン/1,4ジオキサン

80-11520253035 40 45
温度（℃）

5055

60

65

カラム： SunArmor C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：メタノール/2０mM リン酸緩衝液pH7.5 (80:20)
1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液ｐH7.5 (65:35)
流速：1.0 mL/min

日本薬学会129年会

12

60 ºCと20 ºCでのクロマトグラム
メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(80:20)

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(65:35)

552

160 ºC

N=10300
As=1.214

N=8700As=1.192

143
135230244520 ºC

1

N=5700As=1.51

68101214Retention time / min

2401233

N=4700As=1.62456
78Retention time / min

カラム: C18, 5μm, 4.6 x150 mm.
カラム温度: 60 ºC, 20 ºC 検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロプラノロール, 3=トルエン, 4=ノルトリプチリン, 5=アミトリプチリン日本薬学会129年会13高粘性溶媒による選択性の変化
82% メタノール

68% 1,4-ジオキサン

η=0.6, 3.7 MPa
δ=12.9, δd=6.2 7

7

η=1.54, 6.5 MPa
δ=9.8, δd=7.85
Peak 52342465610

Peak78Retention time / min

10

1. ウラシル
2. カフェイン
3. フェノール
4. ブチルベンゼン
5. o-ターフェニル
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ
7. トリフェニレン

1042324668

10

Retention time / min

カラム: C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.
日本薬学会129年会14高粘性溶媒の使用－選択性のコントロールⅠ
77523164

82% メタノール
η=0.63.7 MPa
δ=12.9
δd= 6.2

2
1 3547674% アセトニトリル
η=0.372.3 MPa
δ=11.8
δd= 6.5752
1 3466,7523
102446870% エタノール
η=1.2
6.1 MPa
δ=11.2
δd= 6.8523
1758% 2-プロパノール
η=2.3
18.0 MPa3
δ=10.22δd= 7.21002

日本薬学会129年会4654 646867% 1,4-ジオキサン
η=1.54
6.5 MPa
δ= 9.8δd=7.849% THF
η=0.555.5 MPa
δ= 9.1δd=7.61015

選択性のコントロールⅡ
263

メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(81:19)

5142631エタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(66:34)

5421631,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(63:37)

5401234567Retention time / min

カラム: C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン
日本薬学会129年会16

温度，pHの効果
2pH10.0,pHを上げる

40 ºC

635140246

N=8500As=1.25
N=6800As=1.40825 N=5500
402428Retention time / min

pH＜温度

N=8300As=1.3063

N=10800
As=1.155

1

As=1.696

ピーク形状への効果

pH7.0,60 ºC63

移動相: メタノール/20mMリン酸緩衝液. (80:20)
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン

12

温度を上げるpH7.0,40 ºC
110カラム: C18, 5μm, 4.6 x 150mm

N=8500As=1.3041012

日本薬学会129年会

02468

101217長鎖アルキル基固定相
炭素数２８のオクタコシル基C28★Sunrise C28: 炭素含有量18%異性体の分離★Sunniest RP-AQUA: 炭素含有量16%
水リッチな移動相で安定 しかも
残存シラノール基の影響ほとんどない（シリカ基材： 340m2/g，12nm）
日本薬学会129年会18ビタミンEの分離比較
C18では不可能な構造異性体の分離達成
Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: 97/3=CH3OH/H2O
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

1Sunrise C28
234Detection: UV at 295nm
Sample: 1=δ-tocopherol
HO05

1015

20

25

30

35

O
retention time / minConventional C18

12=γ-tocopherol
HO

2, 3O

4

3=β-tocopherol
HOO

4=α-tocopherol
05

1015

20

2530

HO

retention time / min

日本薬学会129年会

O19

α, β−カロテンの分離比較
22
11Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:80/20=CH3CN/CHCl3
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ºC

ConventionalC18Detection: UV at 450nm
Sample: 1=α-carotene

Sunrise C28

2=β-carotene
05101520253035Retention time / min

日本薬学会129年会20核酸塩基の分離
40 ºC 125340℃でのチミンの保持時間の変化（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

25 ºC

15234024681012Retention time/min

14

チ ミン の 相 対 保 持 時 間 (%)

4100
90
80
7060
50
4030
20
1001Column: Sunniest RP-AQUA, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: 10mM Phosphatebuffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25ºC
Sample: 1 = Cytosine 2 = Uracil
3 = Thymidine 4 = Uridine
5 = Thymine

2345

ポンプ停止毎の保持時間測定回数

緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，Sunniest RP-AQUAはほとんど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，97%以上の再現性を示しました。
日本薬学会129年会21水溶性ビタミンの分離例
4123Column: Sunniest RP-AQUA, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: 40mM Phosphate buffer
pH6.8Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nmSample: 1 = Nicotinic acid，2 = Pyridoxal，
3 = Pyridoxine，4 = Nicotinamide

01234567891011121314Retention time/min

日本薬学会129年会

22ヌクレオチドの分離
32
15N=19,800
4012345678910111213

Column: Sunniest RP-AQUA, 3μm
4.6x150 mm
Mobile phase: 20mM Phosphatebuffer pH6.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 5’-GDP, 2 = 5’-GMP,
3 = 5’-ATP, 4 = 5’-ADP, 5 = 5’-AMP

14Retention time/min

日本薬学会129年会

23まとめ• カラム温度を60°Cに設定するだけで，理論段数が上がり，対称性が向上する• さらに，高粘度有機溶媒をカラム圧力を気にすることなく使用でき，選択性を大きく変化させることが可能となる• C28オクタコシル基は異性体の分離や水の多い条件で分離を可能とする

日本薬学会129年会24