嫌気的CO2固定化のための金属酵素群を発現させた大腸菌細胞触媒の開発
藤城 貴史
埼玉大学大学院 理工学研究科
研究成果
嫌気的 CO2 代謝系を担う金属酵素と、その補因子である鉄硫黄クラスター生合成酵素群をコードする遺伝子を大腸菌細胞内に種々の組み合わせで導入した大腸菌形
質転換体を作製し、好気的培養においては、作製した形質転換体は、野生株とで同程度に生育可能であり、一般的により生育が落ちる嫌気培養条件でも使えることを確認した。引き続き、嫌気培養の系でも、それらの生育と、CO2 の代謝が可能であるかどうかを検討していく。
研究の目的
CO2 は、温室効果ガス削減、また低炭素社会に向けた炭素資源再利用の観点から、大気中 CO2 を固定化し炭素資源として再利用する触媒系が注目されている。その中でも、大腸菌などのモデル生物を宿主とし、種々の遺伝子を導入することで代謝系を改変、細胞触媒とする「合成生物学」の手法を用いた細胞触媒の構築が盛んである。細胞触媒系は、温和な環境かつ高効率で働く酵素を利用する上で、(1) 細胞内環境により、in vitro 系で不安定な酵素分子も安定に利用できる、 (2) 補因子などを細胞の別の代謝系から供給できる、などの利点があり、注目を集める研究対象である。
本研究では、嫌気性微生物の CO2 代謝系を担う金属酵素群、CO デヒドロゲナーゼ、アセチル CoA シンターゼ、ヒドロゲナーゼを大腸菌細胞内で同時に高発現させ、水素の還元力を利用して、CO2 から CO、さらにアセチル CoA へと変換する細胞触媒系による人工嫌気 CO2 固定化細胞触媒系の確立を目指している。まず初めの段階として、CO2 と CO の変換を行う CO デヒドロゲナーゼと、水素とプロトン／電子の変換を行うヒドロゲナーゼの検討を行った。また、嫌気系 CO2 固定系の酵素は鉄硫黄（Fe-S)クラスター酵素であり、通常の大腸菌では活性体の調整が困難であるが、我々はこれまで Fe-S クラスター生合成遺伝子オペロン isc を高発現させ、Fe-S クラスター豊富な大腸菌を作り出すことに成功している。しかし、Fe-S クラスター遺伝
子は他にも数種が存在し、生合成した Fe-S クラスターを渡す際の相性も問題となっている。そこで、CO デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼと共発現させるのに最適なFe-S クラスター生合成系酵素群遺伝子の探索／検討も行なった。
方法
CO デヒドロゲナーゼは、細菌型と古細菌型の２種類に大別されることが知られている 1)。そこで、CO デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として、細菌型 Desulfovibrio
vulgaris 由来の cooS 遺伝子と、古細菌型 Methanosarcina barkeri 由来の遺伝子 cooSαε遺伝子を、それぞれ大腸菌発現用ベクターにクローニングした pACYC-cooS、pCDF-cooSαε を作製した。ヒドロゲナーゼ遺伝子としては 2)、大腸菌に元々存在する[NiFe]-ヒドロゲナーゼをコードする hyaABCDEF operon の触媒部位遺伝子 hyaAB と、大 腸 菌 が 持 た な い 別 種 の [FeFe]- ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子 で あ る 、 Clostridiumpasteurianum 由来 hydA をそれぞれクローニングし、pRSF-hyaAB、pET21d-hydA ベクターを作製した。また HydA の成熟化遺伝子 hydE、 hydF、 hydG もそれぞれ
pACYC-hydE-hydF、 pRSF-hydG ベクターとしてクローン化した。作製したプラスミドを大腸菌に導入し、CooS+HyaAB 系、CooSαε+HyaAB、CooSαε+HydAEFG 系を作製した。また、CooSαε と HydAB は、それぞれの酵素の立体構造上、融合タンパク質とすることで効率よく電子伝達、触媒が進行する可能性が考えられたため、融合タンパク質 CooSαε-fusion-HyaAB を発現する系を有する大腸菌も作製した。
一方、Fe-S クラスター遺伝子としては、これまで報告された isc operon を含む
pRK-isc に加え 3)、コピー数や耐性遺伝子が異なる pBBR5-isc ベクターを作製し、その Fe-S クラスター供給について検討した。また isc 以外の Fe-S クラスター生合成系遺伝子である大腸菌由来の suf operon、枯草菌由来の suf-like operon の pRK ベクター、pBBR5 ベクターへのクローニングも試みた。
結果作製したプラスミドをそれぞれ個別に大腸菌 C41(DE3)に導入し、IPTG による発現誘導を行ったのち、その細胞抽出液を SDS-PAGE で確認した結果、全ての場合において目的タンパク質の発現が見られた。ただし、その発現量は異なり、D. vulgaris
CooS と、HydA、 HydE、 HydF、 HydG は発現量が多く、一方、M. barkeri CooSαε、HyaAB、融合タンパク質 CooSαε-fusion-HyaAB は発現量が低いことがわかった。一方、Fe-S クラスター生合成系遺伝子のスクリーニングでは、従来用いられてきた isc
operon を持つ pRK-isc ベクターを用いた場合に比べ、pBBR5-isc ベクターの方が、より Fe-S クラスターを大腸菌内で合成していることが、大腸菌の Fe-S クラスター由来の呈色（褐色変化）により示された。また suf を持つ pRK、pBBR5 ベクター、pRK-suf-likeベクターを用いた場合、大腸菌の色は、pBBR5-isc より薄いことが示された。一方、
pBBR5-suf-like ベクター構築が成功しておらず、現在も条件検討中である。ただし、
suf-like オペロンを構成する各遺伝子を個別にクローニングでき、またそのタンパク質発現や、その遺伝子産物であるタンパク質の生化学的解析が可能であることを確認している 4 )。よって、今後はオペロンを構成する各遺伝子を個別に PCR で増幅し、in vitro でアッセンブルすることでクローニング行ったのち、その大腸菌内での Fe-Sクラスター生合成能を pBBR5-isc ベクターの場合と比較し、用いる Fe-S クラスター生合成系の検討を進める予定である。次に、それらのプラスミドを、Fe-S クラスタ

ー遺伝子を含むベクターpBBR5-isc で形質転換した C41(DE3)に段階的に導入して、CooS+HyaAB 系、CooSαε+HyaAB 系、CooSαε+HydAEFG 系、CooSαε-fusion-HyaAB系を作製し、1mM IPTG 存在下、37 ℃、LB 培地で好気的培養を行なった。その結果、どの系の大腸菌も、遺伝子を持つプラスミドを導入していない pBBR5-isc 導入
C41(DE3)大腸菌と同程度に生育可能であることを確認した。
結論
CO デヒドロゲナーゼとして、cooS、cooSαε 遺伝子、ヒドロゲナーゼとして hya 系、hyd 系遺伝子、また HyaAB と CooS 両者の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を導入した大腸菌の作製に成功した。また、同時に用いる Fe-S クラスター生合成系
は pBBR5-isc が現在のところ最適であることがわかった。今後は、これら形質転換した大腸菌の M9 最小培地+グルコースの系で嫌気培養条件、例えば、炭酸源や二酸化炭素、水素やギ酸などの添加物の検討を行い、どの条件で水素-二酸化炭素の変換が起こるか、またその際の生育や代謝物解析などを検討していく予定である。また、
Fe-S クラスター生合成遺伝子の検討では、suf-like オペロンを Gibson assembly などの方法で構築し、クローニングする予定である。また、生成する代謝中間体 CO を無害化しつつ、acetyl-CoA へと変換する acetyl-CoA synthase の遺伝子導入も検討し、COdehydrogenase/acetyl-CoA synthase を利用する嫌気性微生物と同様のエネルギー獲得系を大腸菌内で構築する予定である。
文献1 ） Adam, P. S., Borrel, G., Gribaldo, S., (2018) Evolutionary history of carbon monoxide
dehydrogenase/acetyl-CoA synthase, one of the oldest enzymatic complexes. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 115: E1166-E1173.
2 ） Vignais, P. M., Billoud, B, (2007) Occurrence, classification, and biological function ofhydrogenases: an overview. Chem. Rev. 107: 4206-4272.
3)

M. Nakamura, Y. Takahashi, (1999) Hyperproduction of recombinant ferredoxins in Escherichia
coli by coexpression of the ORF1-ORF2-iscS-iscU-iscA-hscB-hscA-fdx-ORF3 gene cluster. J.
Biochem., 126: 10-18.

4)

R. Nakamura, M. Hikita, S. Ogawa, Y. Takahashi, T. Fujishiro. (2019) Snapshots of

PLP-substrate and PLP-product external aldimines as intermediates in two types ofcysteine desulfurase enzymes. FEBS J., accepted.