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放射光第巻第号()

特集放射光利用の広がり

放射光微小血管造影法による再生血管の可視化
田中越郎1，笠原啓史1，八反尚一郎1，篠崎芳郎1，福山直人1
岩田美郎1，平 広之1，谷岡健吉2，望月 亮3，河合敏昭4
兵藤一行5，梅谷啓二6，盛 英三7
1 東海大学医学部生理科学外科放射線科再生医学センター，2NHK 放送技術研究所，
3NHK エンジニアリングサービス，4浜松ホトニクス，5高エネルギー加速器研究機構，
6高輝度光科学研究センター，7国立循環器病センター研究所心臓生理部

Visualization of Angiogenic Vessels by Synchrotron Radiation Microangiography
Etsuro TANAKA1, Hirofumi KASAHARA1, Naoichiro HATTAN1, Yoshiro SHINOZAKI1, Naoto FUKUYAMA1,Yoshiro IWATA1, Hiroyuki TAIRA1, Kenkichi TANIOKA2, Ryo MOCHIZUKI3, Toshiaki KAWAI4,Kazuyuki HYODO5, Keiji UMETANI6 and Hidezo MORI7
1Departments of Physiology, Surgery, and Radiology, Tokai University School of Medicine;
2NHK Science & Technical Research Laboratories;
3NHK Engineering Services Inc.; 4Hamamatsu Photonics K.K.;
5National Laboratory for High Energy Physics; 6Japan Synchrotron Radiation Research Institute;
7Department of Cardiac Physiology, National Cardiovascular Center Research Institute
Abstract
The usefulness of synchrotron radiation microangiography for evaluating angiogenic vessels in regenerative therapy isillustrated. In a rabbit model of microvascular myocardial ischemia, angiogenic vessels in the heart were well visualized.
In a rabbit model of hindlimb ischemia, vessel-regenerative therapy with ˆbroblast growth factor 4-gene incorporated togelatin hydrogel well ameliorated muscle necrosis. Synchrotron radiation microangiography conˆrmed signiˆcant blood‰ow increase to adenosine administration in these treated rabbits (vascular responsiveness), but not in the control. Thus,
synchrotron radiation microangiography is shown to be useful for the depiction, quantiˆcation and evaluation of angiogenic vessels in reproductive therapy.

.

はじめに血管再生医療は次世代医療として注目を集めている。たとえば虚血性疾患では虚血組織に対して血管再生を促進させることが治療の基本となる1)。我々は再生血管が有効に機能するには血管の成熟度が重要であり，再生血管の制御能の有無が その成熟度 を示す指標 になると主 張している2)。しかしながら，この鍵を握っている再生血管はその直径が細く，既存の血管造影法ではその詳細な観察と制御能の評価は不可能である。そこで我々は， X 線源に放射光を利用した新しい微小血管造影法を開発し311)，モデル動物において再生血管の観察を試みた。
.

Figure 1. Schematic drawing of synchrotron radiation microangiographic system.

放射光を用いた血管造影システム
血管造影システムは大きく 2 つの部分から成り立って血管造影装置の画質は 3 種類の分解能（空間分解能，いる。すなわち X 線源と撮像系である。よりよい画像を時間分解能，コントラスト分解能）で表示され，これらが得るためには両者の改良が必要である。本システムでは，総合的に画像の解像度を左右する。これら 3 者はお互い

X 線 源に は 既 存の X 線 管球 の 代 わり に 単色 放 射光1113)に密接に関連しあっている。血管造影法においては解像度を，撮像系にはイメージ増強管型テレビシステムの代わりの向上に伴う感度の低下は避けなければならない。例えに蛍光板とハイビジョンテレビカメラ11,1418)，を組み合わば，心臓のように動きの激しい臓器では，1 フレームあたせて用いた（ Fig. 1 ）。なお得られた画像にはデジタル処りの時間分解能を高めなければならず，露光時間が制限さ理を加えることもできる9)。

れるためにフレームあたりの光子数が減少し画質は低下す

8565 大阪府吹田市藤白台 5
7
1国立循環器病センター研究所心臓生理部 〒565
6833
5012（2530） FAX: 06
68355416 E-mail: hidemori＠ri.ncvc.go.jp
TEL: 06――(C) 2003 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

放射光第巻第号

()る。また，脳のように厚い骨で囲まれた臓器では，骨組織による X 線の減衰および造影剤のコントラストの低下が避けられず，その結果やはり画質が低下する。既存のイメージ増強管型テレビシステムではその構造上 170 mm 以上の空間分解能は期待できない。さらにこの既存のシステ
ムで冠動脈や脳動脈の造影を行うと，上述した動きや骨との重なり等のために小血管内の微量の造影剤を検出することが困難となり，200 mm 以下の血管の観察には困難が多い。再生医療に代表される次世代医療の目的を満たすためには，微小血管内に含まれる微量の造影剤を背景となる生体組織から識別できる必要があり，そのためには上述のすべての要件を満たす X 線源と，高解像度を持つ撮像装置とが必要である。

Figure 2. Synchrotron radiation microangiograms of the rabbit
heart with microvascular myocardial ischemia. (A) Normal rabbit.
(B) Ischemic rabbit. Arrows, the diagonal branch of the left coronary artery; arrowheads, small branches of the left coronary artery.

本システムの X 線源には高エネルギー加速器研究機構（ AR NE5 と PF14C )12) およ び SPring-8 （ BL20B2 )11) から得られる放射光を利用した。放射光はエネルギーレベル作製した。虚血作製 17 日後に右総頚動脈よりカテーテルを造影剤（ヨード）の K 吸収端の直上（ 33.3 keV ）に単（注造影剤等を注入する細いチューブ）を大動脈弁直上色化して用いた。この場合，ヨードと周囲組織との X 線の左冠動脈入口部付近に留置し，水溶性ヨード系造影剤を吸収の差が極大になるので，造影剤のコントラストを最大投与しつつ撮影を行った（Fig. 2 ）。対照正常家兎の左冠とすることができる。また放射光は指向性が鋭く平行光に動脈造影像（ Fig. 2A ）では直径 680 mm の対角枝に相当近いので，被写体と検出器の距離を離しても半影はできにすると思われる枝（矢印）を分岐した後，長さ約 9 mm のくく，血管造影にとっては理想的な X 線源である。撮像

間に矢頭で示した直径約300 mm の 3 本の枝を分岐してい系では，蛍光板には X 線シンチレータ付ファイバオプテることが観察できた。この 9 mm の区間においては明瞭にィクプレート（FOS ，Gd2O2STb，浜松ホトニクス）を可視化できた直径 100 mm 以下の血管はなかった。これに用いた。この蛍光板から発する蛍光像をハイビジョンカメ

対し心筋内微小血管虚血を作成した家兎（Fig. 2B）では，ラを用いて横 2.5 ～ 3 cm ，縦 1.5 ～ 2.0 cm の視野を毎秒 30

直径520 mm の対角枝に相当すると思われる枝（矢印）をコマで撮影した。

分岐した後，長さ約 7 mm の間に矢頭で示した多数の直径本 シ ス テ ム の 空 間 分 解 能 を MTF チ ャ ー ト （ MICK

100 mm 以下の血管を直接分岐していることが観察でき

Type14: 2.020.0 lp/mm）を用いて測定すると最小間隔でた。これらの血管は虚血により生じた再生血管と思われ，ある 20 ラインペアを識別でき，少なくとも 25 mm をしの放射光を用いた微小血管造影法はこれらの細い再生血管のぐ空間分解能を示した。コントラスト分解能を血管ファン観察に有用であった。

トム（Type76700, Nuclear Associates 社）を用いて測定

この心筋内微小血管虚血を有する家兎は正常対照に比較すると，厚さ 75 mm のアクリル板を置いた状態で最低濃して，明かな心機能の低下（体重減少，心収縮力の低下，度 （ ヨ ー ド 濃 度 2.5 mg / ml ） の 造 影 剤 を 含 ん だ 最 小 径

心筋酸素代謝の低下，心筋微小梗塞巣の存在等）を認める（0.5 mm）の血管を識別することができた。また，本シス

ものの，マイクロスフェアー法により測定したグラム心筋

テムの時間分解能は33ミリ秒（30コマ/秒）であるが，奇当りのベースラインすなわち安静時における平均血流は数番目（あるいは偶数番目）の走査線だけから構成される

2.22 ± 0.42 ml / min / g と対照群（ 2.48 ± 0.62 ml / min / g ）画像であればその半分の時間（ 1 / 60 秒）で得られる。さに比べ有意な減少を認めなかった。また組織学的検索でらに高速メカニカルシャッターを併用すれば露光時間を 1は，直径30 mm 以上の細動脈の心筋内密度は1.55±0.53本ミリ秒程度まで減らすことができ，心臓の動きに伴う画像/ mm2 （ n ＝ 14 ）と対照群（ 1.17 ± 0.40 本/ mm2, n ＝ 7 ）よのブレを防止するだけでなく X 線被曝量の減少にも貢献りもかえって増加傾向を示した（ただし統計学的には有意する。

差はない）。以上の結果は，再生医療における再生血管の評価は安静時での観察だけでは不十分であり，成熟性のよ.

心臓の虚血モデルにおける再生血管の可視化うな機能面も含めた観察が必要であることを示している。

心臓の虚血モデル動物において，放射光微小血管造影法による再生血管の可視化を試みた。家兎（体重約3.5 kg）

.

下肢の虚血モデルにおける再生血管の可視化の冠動脈（注心臓の筋肉に血液を供給している血管のこ遺伝子治療を代表とする血管再生療法では，臨床所見のと）内に直径15 mm のプラスチック製マイクロスフェアを改善度と既存の血管造影法で撮影した再生血管像の発達程2.8×105 個/kg 注入し，慢性の心筋内微小血管虚血障害を度との間に相違が認められることが少なくない。我々は安――

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静時に加え血管拡張時等の微小血管造影像を合わせて評価することで再生血管の成熟度が検出でき，これが虚血性組織変化の改善度をよく反映すると考えている。そこで血管再生療法における血管の反応性の差の可視化を放射光微小血管造影法により試みた。
家兎を用い，左大腿動脈を結紮除去することにより下肢虚血モデルを作製した。この下肢虚血家兎に対し血管再生を誘導する遺伝子治療を行った。遺伝子として線維芽細胞成長因子 4 遺伝子（ FGF4 )19) を用い，対照には生理作用を有しないマーカー遺伝子である lacZ を用いた。なお遺伝子治療においては，遺伝子を単独投与するよりも，遺伝子をベクター（注投与したい遺伝子を細胞の中まで運搬するの運び屋のこと。ウイルス性のものと非ウイルス性のものとがある）と共に投与する方がその遺伝子導入効率がFigure 3. Synchrotron radiation microangiograms of the hindlimb
ischemia taken under baseline conditions and after repeated adenosine administration in lacZ-GHG-treated rabbit and FGF4-GHGtreated rabbit. Arrows indicate the same point in the vessels. Arrowheads, reference copper wires with a diameter of 130 mm.

向上することがわかっている。そこで今回はベクターとして非ウイルス性のゼラチンハイドロゲル（GHG)20)も用いた。この GHG が遺伝子発現期間を延長しかつ発現領域を以上，再生血管の成熟度の評価には放射光微小血管造影拡大することは既に確認済みである。下肢虚血作製 10 日法が有用であった。血管再生医療における臨床効果の差

後 に ， FGF4 単 独 （ 500 mg ）， FGF4 GHG （ 500 mg と 4は，血管の成熟度の差すなわち血管反応性の差として現れmg ）あるいは LacZ GHG （ 500 mg と 4 mg ）を左大腿部ており，その血管反応性の差は放射光微小血管造影法で可の筋肉内に投与した。この 3 群に対し下肢虚血作製 38 日視化することにより評価可能であった。

後に，各群の治療効果を血管造影を含む種々の方法で評価した。放射光微小血管造影は上記と同じシステムを用い，

.

ベースラインの状態と血管拡張剤としてアデノシンを投与した状態とにおいて行った。

おわりに次世代の治療としての再生医療では，より早期のそしてより正確な診断だけでなく，その治療効果の評価に対してまず肉眼的所見であるが， LacZ GHG 群では下肢先端も細かい再生血管の可視化が求められている。今回示したの壊死脱落が見られ，FGF4GHG 群では，ほとんど異常単色放射光を用いた微小血管造影法は再生医療の進歩とと所見は見られなかった。FGF4 単独群ではちょうどその中もに次世代の種々の疾患の診断と治療に役立つことが期待間的所見であった。すなわち臨床症状における治療効果は，される。

FGF4GHG 群＞FGF4 単独群＞LacZ GHG 群の順であった。また，筋肉壊死の程度や筋肉重量も同様な結果を示し謝辞た。これらのことは，同じ遺伝子治療でも非ウイルス性ベ実験に協力して頂いた京都大学田畑泰彦先生，国立がんクターを使用することにより，より有効な再生医療が行わセンター坂本裕美先生，NHK 山口孝一久保田節江上れたことを示している。

典文大川裕司斉藤信雄宮川和典松原智樹の各先

虚血下肢の放射光微小血管造影においては，治療群では生，浜松ホトニクス鈴木克彦先生，東海大学放射線科およアデノシンに対する良好な血管拡張反応を可視化できたび共利研の皆様に深謝いたします。本研究は文部科学省（ Fig. 3 ）。しかし非治療群（ LacZ GHG 群）では逆にア科 研 費（ 12670064,デノシン投与により虚血部の再生血管像は減少した。これ

14657460, 14657461），循環器病研究委託費（13C1），厚は治療群では血管拡張刺激に反応しうる血管が再生されて

生労働科学研究費補助金（ H14 ナノ001 ，ゲノム005 ）13470154,13470381,13877114,

おり，一方非治療群での再生血管は同刺激に対してむしろ医薬品機構，NEDO，私立大学学術フロンティア推進事業局所血流を減少させることを示すものである。造影結果をの補助により行われた。

造影スコアとして数値化すると，FGF4 GHG 群は他の 2群に比べ有意に大であった（ 0.51 ± 0.15， 0.43 ± 0.15 ，

参考文献0.34 ± 0.10 ，p ＜ 0.05 ANOVA ）。アデノシンによる各群1)の変化率も 28 ± 8， 5 ± 10 ， 0 ± 10 と FGF4 GHG 群でのみ有意に大（p ＜ 0.05 ANOVA ）であった。すなわち
非ウイルス性ベクターと FGF4 との併用でより成熟した血管の再生が行われたことを放射光微小血管造影法によって確認できることを示している。

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5)

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第巻第号

()盛英三，山川明彦，篠崎芳郎，ミンハズウッディンモハメ
ド，田中越郎，中澤博江，田中豊，後藤研一郎，飛田浩輔，石過孝文，三富利夫，岩田美郎，松山正也，青木直人，阿部純久，半田俊之介，兵藤一行，安藤正海，谷岡健
吉，久保田節放射光 8, 398 (1995).
H. Mori, K. Hyodo, E. Tanaka, M.M. Uddin, A. Yamakawa,Y. Shinozaki, H. Nakazawa, Y. Tanaka, T. Sekka, Y. Iwata,
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10)

11)
12)

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14)

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17)

18)

19)

20)

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T. Sekka, S. A.Volchikhina, A. Tanaka, M. Hasegawa, Y.
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