シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第3回

我々がたどった道： ホスホリラーゼから始めて
福 井 俊 郎! （ふくい! としお）! !
1953 年に私は大阪大学理学部化学科を卒業した。Watson̺Crick が DNA の二重らせんモデルを発表した年である。敗戦から 8 年、わが国の社会は大学を含めてまだひどい混乱期にあった。私はデンプンを看板とする研究室で育ったが、デンプンはグルコースから成る枝分かれをもつ複雑な巨大分子で、食品として重要であっても生物学的な機能をもたない。私の興味は徐々にデンプンに働く酵素の方に移って行った。

1．一次構造 1,2ラーゼの構造比較を可能にしただけでなく、分子α̺グルカン ホスホリラーゼは、グリコーゲン量が 10 万を越す巨大な蛋白質の全一次構造を、化やデンプンのようなα̺グルカンを加リン酸分解学的手法によって決定した希少な例としても評価して、α̺グルコース 1̺リン酸を生成する酵素された。

である。哺乳動物の筋肉では、活性なリン酸化型と動物と植物のホスホリラーゼの一次構造を比較

不活性な脱リン酸化型の 2 種で存在するが、植物すると、全体としてかなり高い類似性が認められ組織にはリン酸化されない活性型だけが存在する。

たが、筋肉酵素のアミノ末端に近いリン酸化部位

筋肉ホスホリラーゼは典型的な調節酵素として、の構造はジャガイモ酵素では全く異なっていて、1950 年頃から活発に研究されていた。

両酵素の調節性の差違を裏付けることが出来た。

我々のホスホリラーゼ研究は、動物酵素と植物また、ジャガイモ酵素のポリペプチド鎖の中央部酵素の酵素学的な特性を比較することによって、分に、78 残基から成る特徴的な挿入配列が見つか酵素の調節性に関する理解を深めようとして始まった。同じ頃に、ウサギ筋肉ホスホリラーゼの 6Åった。1960 年後半のことであったが、それだけで分解能での立体構造が、カナダのアルバータ大学は酵素の本質的なところまで到達できそうになかグループによって決定された。その結果に今回のった。米国ワシントン大学で、ウサギ筋肉酵素の全一次構造比較を当てはめると、ジャガイモ酵素の一次構造決定が進められているという情報に刺激

巨大な挿入配列は、ウサギ筋肉酵素の活性部位クされて、1976 年頃から我々はジャガイモ塊茎酵素

レバスの入口付近にあって、基質グルカンを優先の一次構造の研究を始めた。蛋白質の構造研究に的に結合する“グリコーゲン貯蔵部位”を被うようまったく経験がなかったので、当初は大阪大学理に見えた。

学部松原グループの全面的な協力を得た。当時は筋肉酵素では、枝分れが多いグリコーゲン分子蛋白質一次構造決定の自動化はまだ進んでいなくは、一つの枝が“グリコーゲン貯蔵部位”に優先的て、蛋白質の部分加水分解物から単離したペプチに結合して、他の枝がそこから離れた触媒部位でドを、試験管内で Edman 分解して、生じた PTH-ア反応を受けるものと考えられていた。それに対し

ミノ酸を 1 個ずつ TLC で同定する手法が一般的でて、ジャガイモ酵素では、 “グリコーゲン貯蔵部あった。

位”が巨大な挿入部分によって被われているため、ほとんど無謀であったと思うが、中野らによるグルカン分子はここに結合しなくて、直接に触媒10 年近くの努力が実って、ジャガイモ塊茎ホスホ部位で反応を受けると考えられる。直鎖のグルカリラーゼの全一次構造（916 残基）の決定が完成しン分子は、筋肉酵素でこのようなまたがった結合た。この結果は、調節性の異なる 2 種のホスホリが出来ないために良い基質になれない。それに対17

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して、植物酵素ではグルカン分子が直接に活性部接的に関与するが、ホスホリラーゼは例外的な存位に入り、触媒反応を受けるようである。

在であった。ある教科書では「酵素学上の興味ある謎」として取り上げられていて、この謎を解くため2．分子生物学的手法 3,4の研究が広く行われていた。

1980 年頃から、分子生物学的な手法を蛋白質科

下村らはピリドキサール 5¶̺リン酸の種々の学に取り入れることが、一般的になって来た。高等誘導体を合成して、ウサギ筋肉ホスホリラーゼか植物の組織には、少なくとも 2 種のホスホリラーら調製したアポ酵素との結合性を調べていたが、ゼ・アイソザイムが存在している。我々は、これまピドキサール 5¶̺二リン酸̺5¶̺ピリドキサール

で研究してきた L 型アイソザイムと、もう一つのが、2 つの Lys 残基にまたがって結合することを見H 型アイソザイムをコードする 2 種の cDNA をジ出した。一つの残基はもともとピリドキサール

ャガイモ塊茎から単離して、それぞれのヌクレオ5¶̺リン酸が結合していた残基で、もう一つの残チド配列を決定した。L 型アイソザイムには、アミ基は Lys574 と同定できた。この Lys 残基は、ジャロプラストへのシングナル・ペプトチドと考えらガイモ酵素にも保存されていた。

れる、アミノ末端の伸長配列（50 残基）があった

多くのアミノ酸代謝関連酵素では、ピリドキサが、それを除いた成熟蛋白質部分 916 残基の配列

ール 5¶̺リン酸のアルデヒド基に基質アミノ酸は、先の化学的構造決定の結果と完全に一致した。

が結合して触媒反応が起こる。それに対して、ホスジャガイモ塊茎の 2 つのアイソザイムの一次構ホリラーゼでは、結合ピリドキサール 5¶̺リン酸造はよく類似していたが、先に L 型アイソザイムのアルデヒド基ではなくて、5¶̺リン酸基が必須に見つけたポリペプチドの中央部分の挿入配列は、である。我々は、ピリドキサール 5¶̺リン酸とαH 型アイソザイムには見当たらず、H 型アイソザ

̺グルコース 1̺リン酸とがピロリン酸結合で縮イムの構造は、むしろウサギ筋肉酵素の構造に類合した化合物である、ピリドキサール 5¶̺二リン似していた。H 型アイソザイムのグルカン分子に酸̺α̺グルコースを合成して、アポ酵素に再構対する高親和性は、筋肉酵素と同じような“グリコ成させた。この再構成酵素にグリコーゲンを加えーゲン貯蔵部位”の存在に起因するものと推定さると、触媒反応が起こって、合成化合物のグルコーれた。

ス残基がグリコーゲンに転移することを見出した。

そのことを確かめるために、L 型アイソザイム

この発見は、補酵素ピリドキサール 5¶̺リン酸の“グリコーゲン貯蔵部位”に相当する領域を、Hのリン酸基と基質α̺グルコース 1̺リン酸のリ型アイソザイムあるいはウサギ筋肉酵素の相当すン酸基が、直接的に相互作用することによって、触る領域で置換したキメラ酵素を作製して、それら媒反応が起こるという仮説に対する直接的な証拠のグルカン分子に対する親和性を比較した。作製となった。X 線結晶解析から決められたホスホリしたキメラ酵素では、すべてのグルカン分子に対ラーゼの立体構造では、結合ピリドキサール 5¶̺する親和性が予想通りに大きく上昇していた。こリン酸のリン酸基と基質のリン酸基との距離は 7のようにして、この挿入部分が L 型アイソザイム〜8Åであったが、これは酵素の不活性状態での結のグルカン親和性を支配していることを確かめる果であって、活性状態ではもっと近づいて相互作ことができた。

用が起こるのだろう。

3．補酵素の役割 5~74．親和標識 8~10

すべてのα̺グルカン ホスホリラーゼには、起! ピリドキサール 5¶̺リン酸は蛋白質のリシン源によらず、ビリドキサール 5¶̺リン酸を共有結残基の一般的な修飾剤としても用いられてきた。

合している。この化合物は、アミノ酸代謝に関連す

多賀谷は、ピリドキサール 5¶̺リン酸のリン酸基る酵素の間では広く存在していて、触媒作用に直にピロリン酸結合で基質を結合させることによっ18

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第3回て、基質結合部位に特異的な新しい親和標識剤をたが、“Gly-リッチ領域”に含まれる Lys 残基の反つくることを考案した。それを試すために、UDP̺

応性は、標識剤のリン酸基の数にあまり関係なかグルコースを基質とする筋肉グリコーゲン合成酵った。反応する Lys 残基がフレキシブルな“Gly-リ素を用いた。合成した新しい標識剤である UDP̺ッチ領域”に含まれていると、位置がかなり自由にピリドキサール（図 1）は、筋肉酵素の基質結合部変わるからであろう。親和標識によって同定され位に特異的に結合して、そこにある Lys574 を修飾た Lys 残基は、次に別のアミノ酸に置換されて、することが明らかになった。

その役割が検討された。

5．親和標識と変異導入の組合せ 11~13
大腸菌グリコーゲン合成酵素は ADP̺グルコースを基質とする。大腸菌酵素を ADP̺二リン酸ピリドキサールと反応させたところ、Lys̺Thr̺Gly̺
Gly 中にある Lys15 が標識された。大腸菌酵素と筋肉酵素（UDP̺グルコースを基質とする）との間には一次構造類似性がない。それにも関わらず、筋肉酵素で標識された Lys574 は、Lys̺Val̺Gly̺Glyという類似した Gly リッチな配列の中にあった。
! 大腸菌酵素の Lys15 を Arg に置換すると、基質に対する ADP̺グルコースに対する Km はあまり変わらなかったが、Gln または Glu に置換するとKm は 30〜40 倍大きくなった。ｋcat はいずれもかなり下がったが、置換した残基の電荷とは関係なかった。これらの結果は Lys15 が基質とのイオン結合に関係していて、触媒反応には必須でないことを示している。さらに、Lys15 周辺の Gly 残基を 1個ずつ Ala に置換すると、いずれでもｋcat が大きく下がった。これらの Gly 残基は活性部位領域の

図 1．UDP̺グルコース（a）、UDP̺ピリドキサール（b）、構造変化を助けるのだろう。

UTP̺ピリドキサール（c）、ピリドキサール 二リン酸̺グ

さらに、Lys15 を Gln に置換した大腸菌変異酵素

ルコース（d）の化学構造を ADP̺二リン酸ピリドキサールと反応させると、新しくLys277 が標識されることが分った。
このLys残基を Gln に置換すると、ADP̺グルコースに対! この成功に刺激されて、ウリジンの代わりにアする Km は余り変わらないのに、ほとんど完全に失デノシンまたはグアノシンをもち、さらにリン酸活した。このように、親和標識と変異導入を組み合基の数が異なる修飾剤を合成した。これらの新しわせることによって、酵素反応についての有用ない親和標識剤は、アデニル酸キナーゼ、ATP 合成知見が得られた。

酵素、ホスホリラーゼ キナーゼ、アミノ酸̺tRNA合成酵素、ras 遺伝子産物 p21 などを含む、多くの

6．
“比較親和標識法”14~16

蛋白質に適用されて、それぞれの基質結合部位に我々が考案した親和標識剤では、親和基の種類存在するリシン残基を同定することが出来た。そと反応基との距離を任意に変えることが出来る。の多くは“Gly-リッチ領域”に含まれるものであっ

UDP̺グルコース ピロホスホリラーゼは、UDP̺

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グルコースを加ピロリン酸分解する酵素である。
ジャガイモ塊茎酵素に UDP̺ピリドキサールまたは UTP̺ピリドキサール（図 1）を作用させると、急速な失活が起こった。完全な失活は酵素モル当たり約 1 モルの試薬の結合に対応していたが、5 個の異なるリシン残基が標識された。このように多数の Lys 残基が同時に標識されるという結果は、
UDP̺グルコース ピロホスホリラーゼと共に、アミノ酸 tRNA 合成酵素のような基質が多くのリン
図 2．ジャガイモ塊茎 UDP̺グルコースピロホスホリラー酸基をもつ酵素の場合に見られた。
ピリドキサール 二リン酸グルコース
（図 1）
は、

ゼに結合する基質周辺にある 5 個のリシン残基の可能な配先の 2 つの標識剤と比べると、反応性ピリドキシ置。
“比較親和標識法”に基づいて作成した仮説的なモデル

ル基がピロリン酸基を挟んで逆の位置にある。この標識剤も先と同じ 5 個の Lys 残基を標識したが、大阪大学蛋白質研究所楠木グループとの共同研究それぞれの Lys 残基が標識される度合いは、先の 2で得られた、本酵素の立体構造ともよく一致した。

つの標識剤の場合と明らかに異なっていた。標識蛋白質がもつ分子認識能の高さを裏付けるもので剤の構造の違いから来るこれらの差違は、それぞあろう。

れの Lys 残基のε̺アミノ基と標識剤の反応基と今から 50 年ほど前に、蛋白質に全く素人であっの距離を反映するものと想定して、活性部位におた我々が始めたホスホリラーゼに関する研究が、けるこれら 5 個の Lys 残基の位置を推定した（図その後どのような道をたどったか、私が停年退官2）。

した 1995 年までをまとめてみた。長年にわたる多さらに、これら 5 個の Lys 残基をそれぞれ別個くの共同研究者及びこれを発表する機会を与えらに Gln に置換した酵素を作成し、それぞれの性質れた日本蛋白質科学会に感謝する。大阪大学時代を調べたが、それらの結果はこの仮想的なモデの同級生であり、蛋白工学会の発足に際して中心ルによって、ほぼ矛盾なしに説明できた。! また、的な役割を果たした次田! 皓君にこの小文を捧げ!

たい。

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! ! ! ! ! ! 中野憲一・下村正二! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 良き先輩（濱口、池中）・同輩（松原）・後輩（高木）!
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! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 研究室メンバー（1992 年頃）!
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Scientific, Tokyo), pp. 73-86.

文献
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福井俊郎先生ご略歴：! ! !

1931 年! 兵庫県に生まれる。
1953 年! 大阪大学理学部化学科卒業
1958 年! 大阪大学大学院理学研究科博士課程! ! ! ! ! 修了、理学博士
1958 年! 大阪大学助手
1958 年! 米国バデュー大学博士研究員
1964 年! 米国パデュー大学訪問助教授
1966 年! 大阪大学助教授
1970 年! 大阪大学教授
1995 年! 大阪大学名誉教授

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