ブチロシンの特異生合成酵素遺伝子の機能解析と応用研究
工藤史貴（東京工業大学大学院 理工学研究科）
研究の目的
アミカシンやアルベカシンは、カナマイシンやジベカシンの 2-デオキシストレプタミン（DOS）部位に、ブチロシンに特徴的な４–アミノ–２–ヒドロキシ酪酸（AHBA）側鎖を有する半合成抗生剤であり、耐性菌に対して有効である。本研究では、ブチロシン
生合成中に特徴的に存在すると予想されたアミノ酸側鎖生合成システムを利用して、生合成工学的にこれら化合物を生産できるかどうか検討することにした。また、このような特異的な生合成システムは酵素化学的に興味深く、新たなタイプの反応を触媒する酵
素機能を解明できるだけではなく、カナマイシンをはじめとする各種アミノグリコシド抗生物質生産菌に本生合成遺伝子群を導入することで、発酵技術によりアミカシンなど耐性菌に有効な抗生物質を生産できると期待された。

方法
我々はこれまでに、ブチロシンとネオマイシン生合成遺伝子の比較の結果、共通構造であるリボスタマイシンの生合成に関与する生合成遺伝子を推定し、その大部分の機能を酵素化学的に明らかにしてきた。一方、ブチロシン生合成遺伝子クラスターに特異的に存在するbtrF, G, H, I, J, K, N, O, UがAHBA の生合成と転移反応に関与すると予想された。このうちの5つの酵素遺伝子btrI, J, K, O, UがAHBA生合成に関与することは、英国の研究グループにより2005年に報告にされた[1]。したがって、残された4つの遺伝子 btrF, G, H, N がAHBAの転移反応に関与すると推定された。本研究では、これら遺伝子を全て大腸菌で発現させて予想される酵素反応を検討すると同時に、遺伝子破壊により生合成に関与することを確かめることにした。

結果
まず、BtrF, G, H, N を大腸菌にて大量発現させ、可溶性タンパク質として得ることに成功した。また、AHBA転移反応の基質も供給するためにbtrF, G, H, I, J, K, O, U 遺伝子を一つのプラスミドに組み込むなど、様々な発現系を構築した。しかNH3+CO2-ATP

BtrI

ADP

AHBAのアシル基転移酵素活性、つづO2O

くBtrGによるγ-L-glutamylシクロト-O C
2NH3+

S

ランスフェラーゼ活性が英国のグループにより報告されてしまった[2, 3]。
一方、BtrNに関しては、その遺伝子破壊株を作製した結果、抗生物質非BtrO

BtrK

FMNH2O+H N
3S

S

BtrI

BtrI

H2O

O

-O C
2O

N
H

O

-O C
2

BtrJ

SH

しながら、BtrHによるγ-L-glutamyl

NH3+

NH3+

-O C
2FMN

NH3+

OH
N
H

NAD+

BtrU

ADP

BtrH

O

ribostamycin

NADH + H+NH2O

HO OH

ATPS

NH2H2N H2N
OO
HOO

CO2-BtrJ

BtrI

BtrI

HO
HO-O C2HOHOOH

HNOH

OO
N
H

CO2NH3+BtrG

O

H2N H2N
OO
HOO

OH

HNOH

HO OH

butirosin B

NH2O

生産性を示したことから、ブチロシンのH2N
HOHO
HO
H

生合成に関与することが明らかとなっシ-scyllo-イノサミン脱水素酵素反応に

S+Me

O

COO-H

N

N

関わるのかが興味が持たれたため、大腸菌で発現させた組換え酵素を用いて酵O

N

HO OH

HO OH

N
N
H 2N
HO
HO

OH

HO
[4Fe-4S]2+

ミ ノ 酸 配 列 か ら ラ ジ カ ル SAM
質と考えられたが、どのように生合成にNN関わると推定された。BtrNは、そのア（S-adenosyl-L-methionine） タンパクNH2NH2N+H N
3OH

HOた[4]。さらに生合成中間体による相補実験 の 結 果 、 DOS 生 合 成 中 の 2- デ オ キ

H2NHOHOOH

eH+[4Fe-4S]+NH2Me+H N
3NN

SCOO-ON

H 2NHOHON

HOO

HO OH

BtrN reaction mechanism

素反応解析を進めた。嫌気条件下で細胞破砕、BtrNを精製し、二価の鉄イオンと硫化ナトリウム存在下でBtrNの鉄硫黄クラスターを再構成、さらに亜ジチオン酸ナトリウ
ムで還元することにより、活性を有すると考えられる還元型の鉄硫黄クラスターを有するタンパク質を調製することができた。次に、基質として考えられる2-デオキシ-scylloイノサミン（DOIA）とSAMを混合し、生成すると考えられるアミノジデオキシ-scylloイノソース（アミノ-DOI）をオキシム誘導体へと変換して酵素反応を追跡した。その結果、嫌気条件下でSAMを添加した場合のみ本酵素活性が検出された。また本酵素反応では、1等量のDOIAに対して1等量のSAMを消費し、等量のアミノ-DOI、5’-デオキシアデノシン、メチオニンが生成した。さらに3位重水素化DOIAを別途酵素的に調製し、BtrN酵素反応に付した結果、重水素化された5’-デオキシアデノシンの生成を確認することができた。すなわち、本酵素反応ではまず、ラジカルSAM酵素であるBtrNがSAMを還元的に開裂して5’-デオキシアデノシルラジカルを発生させ、次に、5’-デオキシアデノシルラジカルがDOIAの３位水素を引き抜きDOIAラジカル中間体を形成、最後に１電子と１プロトンを放出する酵素反応機構が推定された。さらにEPRによりBtrN反応を追跡した結果、DOIAラジカル中間体を分光学的に検出することに成功した[4, 5]。

結論
ブチロシン生合成に特異的に存在する生合成酵素機能を解析した結果、酵素化学的に興味深いラジカル SAM 脱水素酵素を機能解明することができた。本酵素に関しては、
さらに EPR を用いた反応解析からラジカル機構で進行することを証明することができた。ラジカル SAM 酵素は、酸素に対して極めて不安定で取扱いが困難とされており、これまで数例の機能解析に留まっていた。今回のラジカル SAM 脱水素酵素 BtrN の機能解明は、今後のラジカル SAM 酵素の機能解析において重要な知見を与えたと考えている。一方、AHBA 生合成酵素と転移酵素に関しては、英国のグループに先を越されて報告されてしまったが、本研究計画が妥当であったことを示している。これで、ブチロシン生合成遺伝子のうち機能解明されていない酵素は、先述の BtrF と、BtrN が機能解明される前に DOIA 脱水素酵素として推定されていた BtrE である。これら酵素は、未解明生合成段階であるブチロシン B から A への異性化反応に関与すると推定される。
この反応もアミノグリコシドの修飾酵素反応として重要である。今後はブチロシン生合成系だけではなく、他のアミノグリコシド抗生物質生合成に見られる特異的な修飾酵素の機能解析を通じて、耐性菌にも効果の高い新たな機能を有するアミノグリコシドの創製へと展開していく。

文献[1] Y. Li, N. M. Llewellyn, R. Giri, F. Huang and J. B. Spencer, Chem. Biol. 2005, 12, 665-675.
[2] N. M. Llewellyn, Y. Li and J. B. Spencer, Chem. Biol. 2007, 14, 379-386.
[3] N. M. Llewellyn and J. B. Spencer, Chem. Commun. 2008, 3786-3788.
[4] K. Yokoyama, M. Numakura, F. Kudo, D. Ohmori and T. Eguchi, J. Am. Chem. Soc. 2007,129, 15147-15155.
[5] K. Yokoyama, D. Ohmori, F. Kudo and T. Eguchi, Biochemistry 2008, 47, 8950-8960.