エンドキャッピングを備えたシリル試薬によるC18固定相の開発：
2μm粒子への応用
クロマニック テクノロジーズ○長江 徳和，山本 孝治，門田 千明
Norikazu Nagae, Kouji Yamamoto and Chiaki Kadota
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp
日本薬学会第130年会

1

【緒言】
カークランドによりHPLCが発明されて以来40年近く経過するが，この間充填剤は日々改良が進められてきた。
 表面多孔性（ペリキュラー）充填剤から全多孔性に，さらに近年再び粒子径を3μm以下にした表面多孔性へと，シリカ系充填基材も変化している。
 またシリカ系逆相充填剤はシラノール基の影響を防ぐため，様々なエンドキャッピング技法が開発されてきた。
 演者らは従来のエンドキャッピング方法の概念を変え，エンドキャッピング試薬をあらかじめオクタデシルシリル化試薬に結合させたシリル化試薬を開発した。
 アミトリプチリンのピーク形状を比較することにより，この試薬で調製した充填剤の残存シラノール基の評価を行った。
日本薬学会第130年会

2新規C18試薬A（HMODTS) 特許出願中
ヘキサメチルオクタデシルテトラシラン

Step 2

Step 1toluene＋ H2O＋80℃，4h

MeO

SiOMe
OMe

HOSi

OMe
OMe

HOMeClMeMe MeMe MeSi

O

Si

O

Si

Cl

toluene30℃，2h

Si

OMe
OMe

MeCl

日本薬学会第130年会

MeMe
SiO

MeMe
SiO

MeSi

O

Si

OMe
OMe

3

推定されるシリカ表面での結合状態（Sunniest C18 HMODTS）

Final TMS

HO
Si
O
Si

Si

O

Si

Si
Si
OO

Si
OOSi

Si O

Si

O OOOOOOOSi

SiOOSiOSiOOOSiOSiOOO

Si

Si O

O

Si

OOSi

O
Si
Si
HOO

OSi
OSi
OOSi

O O

Si

OSi

O OH
OSi
OOSi
Si
Si
O OO O OOOSi O
O Si O
SiOO

日本薬学会第130年会

O
SiOOO

429Si CP-MAS NMR
Si

OOSi

シリカゲル
O

Si

O

Q3

OH
Si

OH

O

Si
Si

Si

Si

O

Si

OO

Si

O

Si

Si

OH

Q2

Q4
R
Si

Monofunctional C18

O

R

M1

OH
Si

Difunctional C18

Si R

O

Si

O

Si R

Si
Si

R

O

Trifunctional C18

Si

O+ TMS

T1
日本薬学会第130年会

Si
Si

O

Si ROHRD2

D1OHROHSiSiORT2SiSiOSiOROT35

Sunniest C18 HMODTS充填剤の物性用いたシリカゲル: 12nm, 340 m2/g, 5 μm
C18試薬結合後の炭素含有量：16.1%
最終エンドキャッピング後の炭素含有量：16.3%

日本薬学会第130年会

6アミトリプチリンのピーク比較Ⅰ
メタノール CH3OH, pH7.5, 40 ºC
Sunniest C18 （HMODTS)
1４

３

N(4)=11,000
TF(4)=1.06

2Sunniest RP-AQUA
1４３
2

N(4)=10,500
TF(4)=1.07

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = PropranololCH3ONHCH3OH1４

A社C1832

1N(4)=8,950
TF(4)=1.76
４

B社C18３2N(4)=10,000TF(4)=1.50

3 = Nortriptyline
NHCH34 = Amitriptyline
CH3NCH30246810Retention time/min

121416

日本薬学会第130年会

7アミトリプチリンのピーク比較Ⅱ
メタノール CH3OH, pH6.0, 22 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
1４

N(4)=9,000TF(4)=1.08

３2４Sunniest RP-AQUA
1N(4)=8,000TF(4)=1.10

３2

1

A社C18４N(4)=3,900
TF(4)=2.92

321Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μmMobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 22 ºCSample: 1 = Uracil
CHONHCH
2 = Propranolol

B社C18 ３N(4)=5,800
TF(4)=2.86

４233OH3 = Nortriptyline
NHCH3

4 = Amitriptyline
CH3NCH302468

101214Retention time/min

日本薬学会第130年会

8アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-A
アセトニトリル CH3CN, pH7.0, 40 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
４1３N(4)=14,000
TF(4)=1.162Sunniest RP-AQUA
1４３21

A社C18321N(4)=13,800
TF(4)=1.24４33OH

3 = Nortriptyline

N(4)=4,000
TF(4)=4.33

B社C18
３2Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
CH
2 = Propranolol
ONH
CH

４NH
CH3

N(4)=4,300
TF(4)=5.24

4 = Amitriptyline
CH3N
CH302

4681012141618

202224

Retention time/min

日本薬学会第130年会

9アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-B
ColumnTFN

ColumnTF

NSunniest C18(HMODTS)

1.16 14,000

Japanese company C1 C182.148,700

Sunniest RP-AQUA

1.24 13,800

P11.099,500

D15.19

M12.01 11,200

D2

2.19 14,200

Japanese company D1 C18

1.30 12,000

AT

3.255,300

Japanese company D2 C18

2.928,000

S11.748,300

Japanese company D3 C18

2.706,100

W11.97 10,600

Japanese company E1 C18

0.99 11,400

WS2

1.59 10,100

Japanese company F1 C18

3.44

W3

1.33 10,000

Japanese company G1 C18

1.71 10,000

3,300

6,700

Japanese company A1 C18 3.078,500

Japanese company G2 C182.15 11,500

Japanese company A2 C18 2.529,200

Japanese company H1 C1811.12,100

Japanese company B1 C18 2.2350

Japanese company I1 C183.777,400

A13.285,900

Japanese company B2 C18 2.01 10,900
Japanese company B3 C18 7,75

Column size: 150 X 4.6 mm
Particle size: 5 μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphatebuffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

CH3N
CH33,600

日本薬学会第130年会

10耐久性の評価

耐酸性加速試験

耐久性試験条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/1.0% TFA,pH1=10/90
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 80 ºC

保持時間測定条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Ethylbenzene
日本薬学会第130年会

11耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C18はpH10，50℃の条件で700時間の耐久性耐久性試験条件
Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC
理論段数測定条件
Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

日本薬学会第130年会12耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C8はpH9.2，40℃の条件で600時間の耐久性耐久性試験条件
Column: Sunniest C8, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC
理論段数測定条件
Column: Sunniest C8, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

日本薬学会第130年会

13リン酸緩衝液によるpH選択性
23
1pH2.36543pH7142653,540pH102516101520Retention time/minColumn: Sunniest C18 HMODTS, 5 μm,4.6 x 150 mm
Mobile phase:A1) 20mM Phosphoric acid pH2.3A2) 20mM Phosphate buffer pH7A3) 20mM Phosphate buffer pH10B) Acetonitrile
Time (min)030%B (%)
226
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: 1= Thiamine HCl Vitamin B1
2 = Nicotinamide
3 = Nicotinic acid
4 = Pyridoxine HCl Vitamin B6
5 = Folic acid
25630
= Riboflavin Vitamin B2

日本薬学会第130年会

14移動相の異なる条件でのアミトリプチリンのピーク比較A41N(4) =11,000
TF(4) =1.03 Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:A) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5 = 80/20
B) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0 = 80/20
C) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 = 60/40
4N(4) =9,000 D) CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8 = 40/60
TF(4) =1.06 Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC for A, C and D, 22 ºC for B
Sample: 1 = Uracil,
2 = Propranolol,
4 N(4) =12,500
3 = Nortriptyline,
4 = Amitriptyline,
TF(4) =1.04
5 = Toluene

32B312C1235D01223446N(4) =12,100
TF(4) =1.09

810Retention time (min)1251416

日本薬学会第130年会

182015

他社との比較
N=12,200
TF=1.30
1

N=12,100
TF=1.21

N=12,000
TF=1.28

Sunniest C18 HMODTS
Sunniest RP-AQUA
N=5,100
TF=2.4

Sunniest C8

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase: CH3CN/10mM
Ammonium acetate
pH6.8=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

N=8,500
TF=2.6

E社 C18N=5,500
TF=2.1F社 C18

N=8,100
TF=2.0

G社 C18CH3N
CH3

H社 C1802468101214

Retention time/min

日本薬学会第130年会

16カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）
Column size: 2.0x150 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: Corona CAD

F社 C18

B社 C18Sunniest C18 HMODTS

Retention time/min

日本薬学会第130年会

17

MSを用いたブリードの比較

Company B C18

Sunniest C18 HMODTS

Column size: 150 x 2.0 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization: Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

日本薬学会第130年会

182μm粒子
精密分級による狭い粒度分布
コールターカンウンター方式による粒度分布
D10:1.67 μm
D50: 2.09 μm
D90: 2.65 μm
D90/D10=1.59

D10:1.78 μm
D50: 2.04 μm
D90: 2.44 μm
D90/D10=1.37(μm)

日本薬学会第130年会

2 μmシリカゲ
ルでは驚異的な値
19カラム圧（MPa）

有機溶媒と水移動相を用いたカラム圧

有機溶媒濃（%）
Column: Sunniest C18, 2μm （Prototype) 50 x 2.0 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O, CH3CN/H2O
Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 40 ºC
日本薬学会第130年会

20

2 μm充填剤も同様な表面処理
A メタノール/20mMリン酸緩衝液 pH7.5 =(80:20)
12N(4) =8,068
TF(4) =1.13

3

4

4

N(4) =7,670
TF(4) =1.50
Ｆ社 C18B アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH7.0 =(60:40)
12

理論段数の比較N(4) =7,529
TF(4) =1.19

34
4N(4) =3,068
TF(4) =4.26
Ｆ社 C18
1.00

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.00

2.0テーリングファクターの比較

Retention time (min)Column: Sunniest C18 HMODTS, 2 μm 2.0 x 50 mm, Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 = Amitriptyline,
日本薬学会第130年会

21ハイスループット化
解熱鎮痛剤の分離 Analgesics
Sunniest C18 5 μm, 150 x 4.6 mm i.d.
1
Mobile phase:2

N(4)=80,000 plate/m
3

4

CH3CN/0.1% Formic acid = 20/80
Flow rate: 1.0 mL/min for 150 x 4.6 mm i.d.,
0.6 mL/min for 50 x 2.0 mm i.d.
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@230 nm
1

NHCH3O

AcetaminophenHO

CH3

ハイスループット化

2N(4)=162,000 plate/m

3

Sunniest C18 2 μm, 50 x 2.0 mm i.d.
01234567NO891012ON

CH3OOH

Antipyrine

Aspirin

OCH34H2N
H3CO

O

Ethenzamide

Retention time (min)日本薬学会第130年会

22

【まとめ】Sunniest C18, RP-AUQA
エンドキャッピング試薬として用いられるヘキサメチル
トリシロキサンをODSに結合させた新規C18試薬（HMODTS)を開発した
 HMODTSの官能基はシリカ表面の様々な位置のシラノール基と結合可能
 残存シラノール基を非常に少なくすることが可能，その結果耐久性が向上 - pH10使用可能
 移動相中の有機溶媒や緩衝液などの制限を受けることなく，塩基性化合物のテーリグを少なくできる 2μm粒子を用いることにより高速分析が達成された
日本薬学会第130年会23