日本薬学会 第127回年会 新技術・新製品セミナー
2007年3月28日 15:30 ~ 15:50 富山市総合体育館

極性化合物のために特別に設計された固相抽出剤，親水性化合物の分離に最適なヒリックカラム，高温・耐アルカリ性に優れたジルコニアカラム。
充填剤の特性を最大限に引き出す上手な使い方を！

株式会社 クロマニック テクノロジーズ
TEL: 06-6581-0885 FAX: 06-6581-0890
E-mail: info@chromanik.co.jp URL: www.chromanik.co.jp※本資料中の固相抽出剤は試作開発品です。詳細については，㈱クロマニックテクノロジーズにお問い合わせください。

主要なHPLC分離モードの使用比率

HPLC分析におけるイオン交換サイズ排除[ Second Choice ]分配モード (約70%)

分離ができない！ さぁ困った！
さぁ~て，次の手は？
2007/03/28

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分配モードの内，約70%が逆相分配モード

C18/C8カラムがFirst Choice!!
1

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First Choice (極性化合物の場合)

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 C18, 5 µm, 150 x 4.6 mm，mm，一官能型，エンドキャップ一官能型，エンドキャップ

分析条件の変更

 各メーカーの技術資料から類似化合物の条件検索する組成組成
 H2O/CH3OH溶解度試験：析出点よりOH溶解度試験：析出点より 5%溶解5%溶解する
ば，有機溶媒 20% ⇒ 80% 20 min
 グラジエント可能ならグラジエント可能ならば，有機溶媒 イオン性化合物の場合は 25 mMリン酸緩衝液を添加
mMリン酸緩衝液を添加

分離が不十分 移動相

分離機構の変更

 酸： pH4.5 (KH2PO4)，塩基： pH 6.8 (KH2PO4/Na2PO4=1/1)

保持力

組成，温度

選択性

溶媒種，pH，温度，固定相

分解能

流速，pH，温度，カラム長，粒子径

イオンペア

順相分配

イオン交換

サイズ排除

HILIC

その他

溶媒抽出

 試料前処理法の検討

 移動相で溶解，あるいは移動相で希釈
 0.45 µmのメンブランフィルタでろ過後，5のメンブランフィルタでろ過後，5 ∼ 10 µL注入
2007/03/28

2分離の改善，定量精度の向上

 カラム

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その他

固相抽出

RP，IEx，RP/IEx，HILIC

分画
3

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41

もっと過激な条件が使えるとしたら…
 強酸性/…
強酸性/強塩基性移動相が使用できたら強塩基性移動相が使用できたら…
 酸性物質の解離 (イオン化)
イオン化) が抑制される

Second Choice c

 塩基性物質の解離 (イオン化)
イオン化) が抑制される

して取り扱い可能になる取り扱い可能になる 非イオン性物質と非イオン性物質として
 高温で使用できたら…
高温で使用できたら…

逆相モードのままで選択性を大幅改善

 拡散係数が大きくなり，拡散係数が大きくなり，理論段数が向上する
理論段数が向上する

ZirChrom® HPLC Column

短縮される 分離平衡が早くなり，分析時間も分離平衡が早くなり，分析時間も短縮されるも使用でき，選択性改善の幅
 高粘性溶媒
高粘性溶媒も使用でき，選択性改善の幅が拡大する
高耐酸/カラム
高耐酸/耐塩基性，高耐熱性 ジルコニア基材逆相HPLC
ジルコニア基材逆相HPLCカラム

ZirChrom® HPLC Column
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5

ジルコニア系HPLC固定相 ZirChrom®

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6

ジルコニアの表面化学と不活性化

 ジルコニアの主な長所
 化学的安定性が高い (pH 1 ~ 14) 熱的安定性が高い (~ 200 ºC)
 機械的安定性が高く，膨潤/機械的安定性が高く，膨潤/収縮しないa) Brönsted acid site(cation exchange) 高化学的安定性の利点
高化学的安定性の利点

Lewis acidは，表面に多量に存在し，『配位子交換作用』を生み出します。

 高イオン性物質を単純なイオン抑制法で分離可能
 イオンペア剤が不要なためシンプルな条件設定が可能

ZirChrom® の不活性化技術

 高熱的安定性の利点
高熱的安定性の利点
 分離平衡が速やかになり，シャープなピークが得られる
 保持容量が小さくなり，ハイスループット分離が可能
日本薬学会 第127回年会
127回年会 新技術・新製品セミナーc) Lewis acid site
(ligand exchange)

Brönsted acidとBrönsted baseは，『イオン交換作用』を生み出します。

 測定対象に最も適した条件で分離可能

2007/03/28b) Brönsted base site(anion exchange)

7・ポリマーコートによるポリマーコートによるBrönsted acid/baseの不活性化
・Lewis Base (EDTPA(EDTPA)) によるLewis
によるLewis Acidの不活性化
Acidの不活性化
2007/03/28

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82高pH条件 (pH12) 下での長期安定性

抗ヒスタミン剤の高温・高速分離
1=Doxylamine, 2=Methapyrilene, 3=Chlorpheniramine, 4=Triprolidine, 5=Meclizinea) 21 ºCb) 140 ºC

1212-fold
Faster!

Rs=2.1Rs=2.1Rs=2.1Rs=2.1

ZirChrom®-PBD

Temperature: 140 ºC
Flow rate: 4.20 mL/min.
Pressure drop: 194 bar
Resolution (2,3): 2.1
Analysis time: 0.85 min

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9RT –9%LC CONDITIONS
ZirChrom®-PBD, 150 x 4.6 mm, Mobile phase: 28/72 ACN/20 mM Potassium phosphate, pH 12.0
Flow rate: 1.0 mL/min, Injection volume: 5 µL, Temperature: 30 ºC, Detection: UV @ 254 nm
ANALYTES: β-Blockers
1 – Labetalol, 2 – Atenolol, 3 – Acebutolol, 4 – Metoprolol, 5 – Oxeprenolol, 6 – Lidocaine,
7 – Quinidine, 8 – Alprenolol, 9 - Propranolol

試料：塩基性薬物

10Propranolol
m/z 268

ZirChrom®-MS

保持指数 k日本薬学会 第127回年会
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2007/03/28

HPLC-MSによる塩基性医薬品の測定

ZirChrom®-MS と市販C18との保持比較

Hydroxypropranolol
m/z 284

Leading C18 silica

LC Conditions: Column, ZirChrom®-MS, 5 x 2.1 mm i.d. (3 µm). Mobile phases channel C=10mM ammonium acetate at
pH 5, channel D=10mM ammonium acetate at pH 5:acetonitrile (10:90, v/v) , Linear gradient 5% D to 100% D in 6 min,hold 100% 6-7.4 min, 100 to 5% D 7.4-8.1min, hold 5% D 8.1-13.0 min. Flow rate, 0.2mL/min, Waters/Micromass ZQ
single quadrupole interfaced with the LC using an electrospray ionization (ESI) interface. Positive ion mode (XIC) fromfull scan acquisitions from m/z 120-700. Temperature, 35 ºC. Solute concentrations = 10 µg/mL, 2µL injections.

溶質番号2007/03/28b) After (15,000 column volumes)
37,393 mL = 623 Hour

ZirChrom®-PBDMobile Phase, a) 20.5/79.5 ACN/50mM Tetramethylammonium hydroxide, pH 12.2;b) 26.5/73.5 ACN/50mM Tetramethylammonium hydroxide, pH 12.2;
Injection volume, a) 0.2 µL, b) 0.5 µL; detection, UV @ 254 nm
2007/03/28a) Before (Initial Injection)

Temperature: 21 ºC
Flow rate: 1.35 mL/min.
Pressure drop: 195 bar
Resolution (2,3): 2.1
Analysis time: 12.5 min

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112007/03/28

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123親水性化合物だけを保持できたら…
 逆相モードと溶出順序が逆転できたら…
逆相モードと溶出順序が逆転できたら…
 C18には保持し難い親水性化合物の分離が可能になる
C18には保持し難い親水性化合物の分離が可能になる

Second Choice d

性能劣化が防げるが防げる 疎水性化合物の疎水性化合物の残存による残存による性能劣化
 それも，単純な分配モードで分離ができたら…
それも，単純な分配モードで分離ができたら…
 水－有機溶媒系で親水性化合物の分離が可能になる

C18で保持の小さい成分の分離の改善
C18で保持の小さい成分の分離の改善

 イオン抑制法のような強酸/イオン抑制法のような強酸/強塩基を使用しないでよい塩基を使用しないでよい

ZIC®-HILIC HPLC Column

 イオンペア剤を用いないのでLCイオンペア剤を用いないのでLC--MSと結合し易くなる
MSと結合し易くなる イオン交換のような煩雑な緩衝液調整から開放される
親水性化合物分析用親水性相互作用クロマトグラフィーカラム

ZIC®-HILIC HPLC Column
2007/03/28

13

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Silica-HILICにおける保持機構

親水性固定相における順相分配

H2O

O

親水性官能基の周りには水分子が水分子

O

O

Si

SiO

SiO

O
SiO

OH
Si

Si

H2O
O

O
O

Si
O層に取り込まれます。この水和相への水素結合取込まれ易さ (分配) の差を利用して エタノール分子

O

親水性化合物を分離します。

OOO

SiO

Si

H2O

OOO-OOOSiOOOO
SiO
O

H2O
OHSi

親水性相互作用クロマトグラフィー
親水性相互作用クロマトグラフィー:: HILIC

O
Si

O

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

O

Si

OO

15

Si

O H2O
Si

2007/03/28

SiO

Si

O
HOO

H2O
O

OH
OH

Si
O

-H2O

ElectrostaticInteraction

Gradient
1.4mL/min

OH

O

H2O

ODS silica
(RP)

H2O
Si

O H2O

O
Si
O H O
2OO

O

HO

2Analyte

OH H2O O

O
O
Si

O

O

Morphine
3-β-D-Glucuronide

Hydrophilic
Partitioning

-H2O

Si

2Analyte

SiSi

OO

OO

Si

極性化合物の水和O

OO

OH

SiOO

H2O

Si

H2O O H2O

Si
SiOHO

1Silica gel(HILIC)
Gradient
2.0mL/min

OSiHOH

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Mobile PhaseH2OOOO

水に溶け易い化合物ほど，この水和2007/03/28

OHOOOO

H

多数集まり，水素結合によって，繋がり合って水層 (水和層) を形成します。

14

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1

MorphineAnalyte-※日本ウォーターズ㈱資料を基に作成
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極性基 (親水基) を持つ固定相Analyte

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HILICシリカとの保持比較- ペプチド分離

33SO
2CH2CH
3H2O

3

H2O

H2O

2CH

H2O

17N
CHCH
2SO3SOCH
3N C
H2 C
H2 C
CH
H23H2OCH

H2O

H2O

2CH33> Cl2CHCOO− > NO3−, Br− > Cl− > CH3COO− > F− > SO42−

Cation: Ba2+ > Ca2+ > Mg2+ > Li+ > Cs+, Na+, K+, Rb+ > NH4+ > (CH3)4N+H2O

ElectrostaticInteraction

2Br3CCOO− > Cl3CCOO− > SCN−, guanidinium > I−, ClO4−

H2O

CH

Anion:

H2O

CH
2CHN
3CH

カオトロピックイオン (Chaotropic ions)
ions)

AnalyteCH

ヒドロキシメタクリレートゲル

CH

アミノ型メタクリレートゲル

2CH

シリカゲル

H2O

N CH2 CH2 CH2H2O2OH

H2O

CH33SOHONH2H2OCH3OAnalyte
H2O

CH2

ElectrostaticInteraction

OH

HO

HydrophilicPartitioning
H2O
H2O

AnalyteOO

Chaotropic理論に基づき設計された
Chaotropic
強い水和層を形成できる
スルホベタイン型Zwitter ion官能基

SO3CH3OHジオール型シリカゲル

OO

N CH2 CH2 CH2

SO 3SiOH

C H2OX

アミノ型シリカゲルOO

C H2SiOH

Si

H2
N C
C H3O

O

NH2SiX

O

CH2X

X
O

ZIC®-HILICの官能基構造
HILICの官能基構造

CH3

中性型
中性型 (無電荷型)
無電荷型)

C H2

荷電型

ZIC®-HILIC/pHILICの保持機構

H2O

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2007/03/28

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移動相の有機溶媒濃度と保持指数6b) Silica HILIC

イオン交換相互作用に基づいて保持される。
イオン強度を高くしないと良好なピークとならない。

カラム:
ZIC®-HILIC, 100 x 4.6 mm, 10 µm
溶離液:50/50= ACN/50 mM AcONH4, pH 6.7
流速: 0.5 mL/min
検出: UV @ 214 nm

2007/03/28

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19Retention factor k

10 µm, 20 nm

10 µm, 20 nm

acetonitrile5a) ZIC®-HILICHILICにおける溶媒強度

NH24NH2N

3NH

NNONHN

THF < acetone < ACN< IPA < ethanol < water

21methanol

0507090110

Concentration of organic solvent / %2007/03/28

Column; ZIC®-HILIC 150 x 4.6 mm
Mobile phase: 10 mM formic acid
Legend;(circles) cytosine(triangles) adenine

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205

前処理は本当に必要か？
分析工程と所要時間

Second Choice e

分析工程とエラーの発生
キャリブレーション [9%]データ処理 [27%]データ解析 [6%]サンプリング [6%]装置 [8%]

前処理 [30%]

やっぱり前処理?!
やっぱり前処理?! 極性化合物の回収率向上

ZIC®-HILIC HPLC Column

測定 [6%]

前処理 [61%]

分析に関わる時間の半分以上は前処理に費やされています!!
前処理に費やされています!!

分離 [7%]

コンタミ [4%]カラム [11%]

オペレータ [19%]試料導入 [6%]前処理関係 ≫ 測定者 ≧ 分離関係※『環境測定2000年，年，p.45
p.45から引用，一部加筆から引用，一部加筆※『環境測定 絵とき基本用語』
絵とき基本用語』，YAN環境測定技術委員会編，オーム社，
YAN環境測定技術委員会編，オーム社，2000

2007/03/28

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21

固相抽出 (SPE) 法を利用すると…

22

 固相抽出剤の変更
 疎水基の種類，基材の変更

安全性，低コスト 複合モードの利用

 溶媒低減可能，自動化が容易，溶媒低減可能，自動化が容易，

 逆相 ＋ イオン交換

フィールドサンプリングが可能
 液-液抽出は水溶性溶媒が液抽出は水溶性溶媒が使用不可
使用不可

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逆相モードでクリ－ンアップできない…

 高回収率，高精度，迅速，簡便， 【液-液抽出】 溶媒制限が少なく適用範囲が広い

2007/03/28(イオン性官能基を持つ化合物)
イオン性官能基を持つ化合物)

 HILICモードの利用
HILICモードの利用 親水性相互作用【固相抽出】(逆相モードで保持されない化合物)
逆相モードで保持されない化合物)

 イオン交換モードの利用 選択性を変化させることが容易
選択性を変化させることが容易

 明確なイオン性を示す化合物が可能
 異なるモードの組合わせ
異なるモードの組合わせが

 その他
 配位子交換，錯形成，アフィニティ等のモードを検討

2007/03/28

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23

2007/03/28

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246

固相抽出におけるHILICモード…

ZIC®-HILIC SPE における保持機構

 HILICモードは，逆相モードと異なる選択性
HILICモードは，逆相モードと異なる選択性

非イオン性極性化合物
H
Pa yd
rt rop
it h
io il
ni ic
ng
32

H2

H
C3

非常に安定した強い水和層を形成します ZIC®-HILIC SPEのSPEの親水性相互作用は，マトリックスの親水性相互作用は，マトリックスの影響を受け難いため，極性化合物の前処理に最適です
影響を受け難いため，極性化合物の前処理に最適です
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2007/03/28

25

H2OCH 2NmAU @UV-230nm

3H

2007/03/28

アセトニトリルで血漿沈殿
遠心分離
上澄1 mLを負荷

HOO

1(A)

アセトニトリルで洗浄
水 (400 µL) で溶出(B)0(C)-10246810Retention time / min1214(A) Acetonitrile precipitated blank plasma(B) ZIC®-HILIC extracted acetonitrile
precipitated spiked plasma(C) ZIC®-HILIC extracted acetonitrile
precipitated blank plasma
2007/03/282Analytecostati
Electrction
InteraH2O

H2N C
C H3H2OC H2C H2

H2O

Analytecostati
Electrction
Intera

SO 3

H2O

H2O

陰イオン性極性化合物

陽イオン性極性化合物

H2O

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26

 First Trial Conditionでの結果を見て，分離を改善する
Conditionでの結果を見て，分離を改善する

抽出手順

SN

2CH

 First Choice は，C18カラム
は，C18カラムHNOC H323

Second Choice 分離の改善

Amoxicillin

OCH

H2O

血漿中の抗生物質Amoxicillinの測定
OC

H

3NH
C

3SO

H2O

CH
2CH
H2O
N
32CHCH “AntiAnti-Chaotropic“
Chaotropic“ なスルホベタイン型官能基は，

H2O

H2O
H2O

CH

2づく官能基官能基がが導入されています Chaotropic理論に基Chaotropic理論に基づく導入されています

SC

H

2H2O

CN
CH

H2O

ZIC®-HILIC SPEの両性イオン型官能基

H2OSO

3SO
2H
2 C

H
2 C
3H2O

CH

3SO

H2O

AnalyteCH

H2ONAnalyte

H2O

H2O

3CH
3N C
H2 C
H2 C
CH
H232

H2O

H2O

2 ZIC®-HILICの高水和性両性イオン型官能基
HILICの高水和性両性イオン型官能基

H2O

CH

合物の前処理に有用です 水を溶離液に用いますので，RP水を溶離液に用いますので，RP--HPLCを用いる場合に，HPLCを用いる場合に，良好な分離と感度を得られますの溶出液の精製や液性調整にも利用可能です 逆相型SPE逆相型SPEの溶出液の精製や液性調整にも利用可能です

H2O

CH

特性を示しますので，極性化 逆相モードとは反対の捕捉逆相モードとは反対の捕捉特性を示しますので，極性化

逆相カラムで分離
移動相：0.1 M PBS/ACN

固相抽出カートリッジ
コンディショニング

高安定性固定相の使用

 測定対象に最も合った条件で分離を改善
 塩基性薬物の分離改善には Second Choice d－ ZirChrom® column

HILICモードの使用
HILICモードの使用 C18に保持され難い高極性化合物の分離を改善
C18に保持され難い高極性化合物の分離を改善
 極性化合物の分離改善には Second Choice e

100 mg ZIC®-HILIC SPE－ ZIC®-HILIC column

HILIC固相抽出剤の使用
HILIC固相抽出剤の使用

 逆相で捕捉性の低い極性化合物を高度に捕捉

水 2mL
アセトニトリル 2 mL

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 Second Choice c 極性化合物の回収率向上には27

2007/03/28－ ZIC®-HILIC SPE

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