糸状菌 Aspergillus aculeatus におけるセルラーゼ遺伝子発現制御機構の解析
谷修治（大阪府立大学大学院 生命環境科学研究科）
研究の目的
Aspergillus aculeatus は糖化力に優れた多種のセルラーゼ・ヘミセルラーゼを分泌する特長を有している1-3) 。この特長をセルロース系バイオマスの酵素糖化に活用するために、A. aculeatus におけるセルラーゼ遺伝子発現制御機構を分子レベルで解明し、得られた知見を基盤としてセルラーゼの大量発現系を構築することを目指している。これまでに糸状菌におけるセルラーゼ・ヘミセルラーゼ遺伝子の転写活性化因子として、Aspergillus 属では唯一XlnRが同定されており、Trichoderma 属ではXlnRのホモログ因子Xyr1が、セルラーゼ・ヘミセルラーゼ遺伝子の発現誘導を統御していることが報告されている4)。一方我々は、XlnRに非依存的な新規セルラーゼ遺伝子発現制御経路がA. aculeatus に存在することを見出し（XlnR-independent pathway）、この経路によりセロビオヒドロラーゼI遺伝子（ cbhI ）とカルボキシメチルセルラーゼ２遺伝子（cmc2）が制御されていることを見出した。本課題では、cbhI遺伝子の発現様式を指標として、XlnR-independent pathwayに関わる生理的誘導物質とプロモーター上のシスエレメントを同定した。

方法
A. aculeatus の培養は最少培地を用いて全て 30˚C で行った。RNA は、グルコースを単一炭素源とした最少培地にて 24 時間培養後、集菌、洗浄し、更に最少培地に種々の炭素源を添加した培地にて、3 時間培養した菌体より調製した。cbhI 遺伝子転写産物はリアルタイム PCR 法により定量した。cbhI プロモーターの機能解析は、種々の改変 cbhIプロモーターを GUS 遺伝子に融合したレポータープラスミドを A. aculeatus sC 座位にシングルコピーで導入した株を用いて行った。GUS 活性は pNP-glucuronide を用いて測定した。

結果
１）A. aculeatus cbhI 遺伝子の生理的誘導物質の同定
糸状菌セルラーゼ遺伝子の発現は、セルロースの加水分解産物やその糖転移反応生成物である二糖により誘導されると想定されている。そこで、グルコースがβ-結合した二糖に着目し、ソフォロース（β-1,2）、ラミナリビオース（β-1,3）、セロビオース（β-1,4）、ゲンチオビオース（β-1,6）の cbhI 遺伝子発現誘導能をリアルタイム PCR 法を用いて解析した。各二糖の直接的な影響を解析するために、グルコシダーゼ阻害剤であるノジリマイシンを培地に添加し、cbhI 発現を誘導した。その結果、セロビオースによる遺伝子発現誘導能が最も大きく、ラミナリビオースがその約 30%の誘導能を有していた

以外は、顕著な遺伝子発現誘導は観察されなかった。また、ラクトースも cbhI 遺伝子発現を誘導しなかったころから、β-1,4 結合した二糖であるだけでなく、C4 の水酸基の立体配置が生理的誘導物質として機能するために重要であることが示唆された。
一方で、A. aculeatus が分泌するβ-グルコシダーゼは活性が強く、ノジリマイシンを添加していない条件ではセロビオースが即座に加水分解され、誘導剤として機能しない。
そこで、cbhI 遺伝子発現を誘導するのに十分なセロビオース濃度をノジリマイシン存在下で検討した結果、30 nM 以上のセロビオースが存在すれば cbhI 発現は誘導されることが示された。β-グルコシダーゼのセロビオースに対する Km 値は数百µM 以上であることから、低濃度のセロビオースが継続的に供給されればセルラーゼの発現は誘導されるものと推測された。
２）cbhI 遺伝子発現誘導に必須なシスエレメントの同定

cbhI遺伝子のプロモーター領域を順次欠損したプロモーターと部位特異的変異を導入した改変プロモーターの機能をGUSをレポーターとして解析し、cbhI遺伝子の発現誘導に必須なシスエレメントを同定した。GUS活性は、改変プロモーターを有すレポータープラスミドをA. aculeatus のATPスルフリラーゼ遺伝子座に1コピー導入した株を用いて測定した。まず、翻訳開始点の上流-657 のプロモーター領域をGUSに融合させた場合、cbhI遺伝子の誘導基質であるアビセルに応答したGUS生産が観察され、非誘導炭素源であるアラビノースを用いた場合の45倍の発現が観察された。この発現は、-469までの欠失では影響を受けなかったが、順次-192まで欠失した結果、遺伝子発現量が減少するとともに、発現様式が構成的になり誘導能は消失した。そこで、遺伝子発現誘導能に影響のみられた-469 ~ -192の領域に着目して共通配列を検索した結果、共通配列を含む領域が3ヵ所見出された。これらの領域に単独、二つずつ、全ての組み合わせで部位特異的変異を導入してその遺伝子発現誘導能を解析した結果、全てに変異を導入した場合にのみ誘導能が完全に消失することが明らかとなった。cbhIプロモータ
ー上に見いだされた共通配列と、 cbhI 遺伝子と同様の発現様式を示す A. aculeatuscmc2 遺伝子プロモーター配列を比較することにより、共通配列CCGN2CCN7Gが見出された。この配列は、遠藤ら５）によって報告されたA. nidulans エンドグルカナーゼA
遺伝子の発現誘導に必須なシスエレメントCeRE (CCGN2CN2TN4GGA)と類似しており、同様のファクターにより認識されると推測された。
今回の一連のプロモーターの機能解析により、既知の CeRE 配列とは 3 塩基異なる配列でも発現誘導に関わることが明らかとなった。今後、得られた知見を基に
XlnR-independent pathway に関わる制御因子を単離するためのスクリーニング系を構築する。

結論
Aspergillus aculeatus cbhI遺伝子の発現は、XlnR-independent signaling pathway（新規なセルラーゼ遺伝子発現誘導経路）により制御されている。この発現誘導経路は、セルロースの加水分解により生成されるセロビオースにより誘導されることが明らかになった。一方で、本菌は強力なβ-グルコシダーゼ活性を有していることから、当初申請者は、生成されたセロビオースは即座に加水分解され誘導物質として機能しないと予想していたが、30 nM以上のセロビオースが存在すればcbhI 遺伝子発現誘導が観察されたことから、低濃度のセロビオースが継続的に供給されれば、cbhI 遺伝子発現は誘導されると推測された。セロビオースからのシグナルはプロモーター上の共通配列
CCGN2CCN7Gに伝達され、遺伝子発現誘導に至ることが明らかになった。

文献1) Montenecourt, B. S., Trichoderma reesei cellulases. Trends Biotechnol. 1,156-161 (1983)
2) Béguin, P., Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol. 44,219-248 (1990)
3) Murao, S., Kanamoto, J., and Arai, M., Isolation and identification of acellulolytic enzyme producing microorganism. J. Ferment. Technol., 57, 151-156(1979)
4) Stricher, A. R., Grosstessner-Hain, K., Würleitner, E., and Mach, R. L., Xyr1(xylanase regulator 1) regulates both the hydrolytic enzyme system andD-xylose metabolism in Hypocrea jecorina. Eukaryotic Cell, 5, 2128-2137 (2006)
5) Endo, Y., Yokoyama, M., Morimoto, M., Shirai, K., Chikamatsu, G., Kato, N.,
Tsukagoshi, N., Kato, M., and Kobayashi, T. Novel promoter sequence requiredfor inductive expression of the Aspergillus nidulans endoglucanase gene eglA.

Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 312-320 (2008)