福岡県保健環境研究所年報第43号，82－86，2016

原著
ＢＯＤ植種希釈水の微生物活性の安定化方法
土田 大輔・森山 紗好・志水 信弘
BOD試験に用いる植種希釈水について、微生物活性を安定化する方法を検討した。植種希釈水の活性度は、工場排水試験方法（JIS K 0102）に示されているグルコース・グルタミン酸混合標準液（GG標準液）のBOD（220±10 mgO/L）によって評価した。秋期に採取した河川水を植種源に用いた場合、BODは目標範囲内となり、馴化期間18日までは微生物活性を維持できた。GG標準液を用いて河川水植種希釈水の馴化を行ったが、活性の向上効果は認められなかった。植種菌製剤を用いた場合、開封直後のものを使用したときに目標範囲内となった。土壌抽出液については、冬期に採取した真砂土および腐葉土を検討したが目標範囲を満たせなかった。本検討結果から、定期的にGG標準液のBOD測定を行い、植種希釈水の微生物活性を把握することの必要性が示された。
［キーワード：BOD、植種源、グルコース・グルタミン酸混合標準液、河川水、植種菌製剤、土壌抽出液］
１

はじめに水由来の植種希釈水にGG標準液を添加して、GG標準液の公共用水域や事業場排水の汚濁指標の一つである生物

BOD測定に適した微生物を繁殖させること（馴化）で、JIS化学的酸素要求量（BOD）の測定値については、有機物の規定を満たす植種希釈水が得られたと報告している。ただ種類や濃度、微生物の種類、阻害物質の有無など多くの因し、植種源の選び方については、微生物活性の違いに加え1)子が影響を及ぼす。工場排水試験方法（JIS K 0102） では、て入手のしやすさ等も考慮する必要があるため、様々な植試験操作を確認する方法としてグルコース・グルタミン酸種源に応じて活性を安定化する方法が求められる。

混合標準液（以下、GG標準液）のBODを測定する方法がそこで本稿では、植種源の異なる様々な植種希釈水を対推奨されており、BOD 220±10 mgO/Lからの偏差が著しい

象に馴化等の操作を加えることで、GG標準液のBODがJIS場合には、希釈水の水質や植種液の活性度等に疑問があるの示す濃度範囲（220±10 mgO/L）を満たすことができるとされている。

かを検討した。

BODの植種源として、JISでは下水の上澄み液、河川水、土壌抽出液等が示されているが、植種源の活性がBOD測定２に及ぼす影響は大きい。環境省が実施した環境測定分析統

２・１

実験方法
試薬および水一精度管理の調査結果2)によれば、試料のBODは植種源に標準液等の調製には超純水を、それ以外は工業用精製水より異なり、市販の植種菌製剤を用いた場合の値は、他の（高杉製薬株式会社製）を用いた。BOD希釈水（以下、希植種源（河川水、下水等）に比べ低いということが報告さ釈水）に加える、緩衝液pH7.2（A液）、硫酸マグネシウム

3)れている。同様に日暮ら は、植種菌製剤を用いた植種希溶液（B液）、塩化カルシウム溶液（C液）、および塩化鉄

釈水では、GG標準液のBODがJIS規定範囲に入らなかった（Ⅲ）溶液（D液）の調製には、和光純薬工業株式会社製4)ことを報告している。また、安達ら によると河川水の微または関東化学株式会社製の特級試薬を用いた。GG標準

生物活性にも季節変動があり、7月から12月にかけて採取

液は、和光純薬工業株式会社製試薬特級のD（+）-グルコした河川水を植種希釈水に用いて比較したところ、12月にースおよびL-グルタミン酸を103℃で1時間乾燥し、各150採水した河川水では、GG標準液のBODがJIS規定範囲外とmgを超純水に溶かして1 Lとした。植種菌製剤（以下、菌なったことを報告している。

製剤と略す）には、BI-CHEM™ BOD Seed（Novozymes

上記のように植種源ごとの微生物活性のばらつきが大Biologicals, Inc.製、Lot No. D14062702、製造日2014年6月27

きいことから、JIS規定を満たす植種希釈水の調製方法に日）を使用した。有機体炭素（TOC）測定用の標準物質に3)関する検討も行われている。前述の日暮ら は、工場放流

は、和光純薬工業株式会社製 水質試験用 フタル酸水素カリウム標準液（1 mg/mL水溶液）を用いた。

福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）

-82-

２・２

希釈水1Lに対しGG標準液を5mL添加した（以下、GG添加

測定装置

BOD測定の際は、ワイエスアイ・ナノテック株式会社製割合0.5%volと称す）。また、対照としてGG標準液を添加

溶存酸素（DO）メーターモデル57およびBOD電極5750をしない系も調製した（以下、非馴化系と称す）。

用いてDOを測定した。TOCの測定には株式会社島津製作(2) 馴化期間の延長
植種希釈水の調製後の馴化期間を0日から最大38日間と所製TOC-Lを用いた。

し、微生物活性への影響を検討した。温度は室温（20～２・３

測定方法25℃）とし、馴化期間中のGG標準液の追加補充は行わな

BOD および TOC は、JIS K 0102 1)の 21.生物化学的酸素消費量（BOD）および 22.有機体炭素（TOC）にしたがっかった。
(3) 馴化温度およびGG添加濃度の検討て測定した。BOD の測定では、GG 標準液を 400 mL メス

冬期に採取した河川水については、微生物活性が低下す

フラスコおよび 8 mL ホールピペットを用いて各植種希釈ることが指摘されている4)。そのため、GG馴化時の水温を水で 50 倍希釈し、BOD 測定用ふらん瓶 3 本に分取した。

20℃、GG標準液の添加量を植種希釈水1 Lに対し0 mL、5またブランクとして植種希釈水をふらん瓶 2 本に分取しmLおよび10 mLとした系（GG添加割合0%vol、0.5%volおた。

よび1.0%volと称す）と、GG馴化時の水温を35℃、GG添

植種希釈水の微生物活性は、GG 標準液の BOD 測定結果により評価し、JIS に示された濃度範囲である 220±10加割合0.5%volおよび1.0%volとした系を比較した。
２・５・２mgO/L を目標範囲とした。

菌製剤

菌製剤を用いた植種希釈水は、次のように調製した。菌製剤1カプセルの内容物を希釈水500 mLに分散させ、60分

２・４

ＧＧ標準液の保存可能期間間曝気撹拌した。この植種液を、希釈水1 Lに対して10 mL

GG標準液を構成するグルコースやグルタミン酸は、生添加して植種希釈水とした。さらに、以下の点について検物分解されやすいため、予備検討としてGG標準液の保存討した。

可能期間を確認した。調製後0、2、22、29、36、44、およ(1) GG標準液を用いた馴化
植種希釈水にGG標準液を添加し、GG馴化による効果をび57日間保存したGG標準液について、BODを比較した。
調製からBOD測定までの間は、ガラス製メスフラスコに入検証した。GG添加割合は0.5%volとした。

れて4℃で冷蔵保存した。BOD測定時の植種希釈水には、(2) 馴化期間の延長

GG馴化（2・5・1で後述）した河川水植種希釈水（GG添

植種希釈水の調製後の馴化期間を0日から最大38日間と加割合0.5%vol、馴化期間3日間、採水時期11月）を用いた。

し、微生物活性への影響を検討した。温度は室温（20～25℃）とし、馴化期間中のGG標準液の追加補充は行わな

２・５かった。

各植種源を用いた植種希釈水の調製方法

植種源には、河川水、菌製剤、および土壌抽出液を用い(3) 容器開封後の保存期間開封直後の菌製剤および開封後5か月間冷蔵保存した菌た。以下、2・5・1～2・5・3において、それぞれの植種源を用いたときの手順について述べる。

製剤から、それぞれ植種希釈水を調製し、微生物活性を比２・５・１

較検討した。

河川水

福岡県保健環境研究所（以下、当研究所と略す）近傍の

２・５・３

土壌抽出液

御笠川水系大佐野川で採取した河川水（採取時期：10月、土壌抽出液を植種液として用いた植種希釈水は、次のよ1月および2月）を、A液～D液を加えたBOD希釈水（以下、うに調製した。土壌（植物の生育している土壌）200 gを希釈水と略す）1 Lに対して50 mL添加し、これを植種希釈

超純水2 L中に加え、スターラーで10分間撹拌、30分静置水とした。植種希釈水の調製後、原則として3～4日間は室後の上澄み液（以下、土壌抽出液）を、希釈水1 Lに対し温または20℃で曝気培養を行い、植種菌を増殖させた。さ20 mL加え、これを植種希釈水とした。さらに、以下の点

らに、植種希釈水の微生物活性を安定させるため、以下のについて検討した。

点について検討した。

(1)土壌種類
土壌の種類による活性の違いを比較するため、花壇また(1) GG標準液を用いた馴化2)

既往研究 を参考に、植種希釈水の調製時にGG標準液をは芝生下から採取した真砂土、および林内で採取した腐葉添加し、グルコースやグルタミン酸の分解に適した微生物土の2種類を検討した。本研究で使用した土壌は、いずれの繁殖を促した。以下では、この操作をGG馴化、得られも当研究所敷地内で採取した。

た植種希釈水をGG馴化系と称する。GG馴化系では、植種-83-

殖に必要な炭素源が不足し、微生物が減少したためと考え(2) GG標準液を用いた馴化
植種希釈水にGG標準液を添加し、GG馴化による効果をられた。
次に、2016 年 1、2 月に採取した河川水を植種源に用い、検証した。GG添加割合は0.5%volとした。

馴化温度を 20℃、GG 添加割合を 0、0.5、1.0%vol に設定(3) 恒温保管
冬期に採取した土壌（腐葉土）を1週間30℃で恒温保管して検討を行った。その結果、非馴化系の BOD 184 mgO/Lし、活性を向上することを試みた。採取した土壌をプラスに対し、GG 馴化系の BOD は 194 または 198 mgO/L と 10チック製容器に入れ、30℃に設定した恒温器内で1週間保mgO/L 程高いものの、GG 馴化系および非馴化系ともに目管した。保管の間は適宜水分を補充して湿潤状態を保ち、標範囲外であった。そこで、馴化温度を 35℃、GG 添加割

1週間保管後に植種希釈水の調製に用いた。

合を 0.5 および 1.0%vol に設定したところ、0.5%vol の GG
馴化系では BOD が 210 mgO/L と目標範囲内となった。し３

かし、馴化温度を 35℃まで上げた場合には、DO の飽和濃結果および考察

３・１度が低くなる。そのため、DO 測定前に 20℃の恒温水槽内ＧＧ標準液の保存可能期間

表1に、0～57日間冷蔵保存したGG標準液のBOD測定結で曝気して DO 濃度を 20℃の飽和量近くにする必要があ果を示す。保存期間0日～36日までのBODは、211～215

り、測定時の操作が煩雑になるという弊害が生じた。

mgO/Lであり、目標範囲を満たした。しかし、保存期間44

３・２・２

菌製剤

日と57日のBODは、それぞれ209および208 mgO/Lと目標表3に、菌製剤を植種源に用いた場合のGG標準液のBOD範囲外となった。このことから、GG標準液は調製から1測定結果を示す。開封直後の菌製剤を使用した場合、GGか月程度の冷蔵保存が可能と判断された。なお、以降の実馴化系および非馴化系ともに、目標範囲内であったのは馴

験で用いたGG標準液は、全て調製後1日以内のものを使用化期間が4日間のときだけであった。馴化期間が11日以上した。になると、いずれの系においてもBODは低下し、目標範囲外となった。このように、菌製剤の植種希釈水に関しても、

３・２各植種源を用いた植種希釈水の評価

３・２・１

GG馴化によって微生物活性を維持できる期間の延長効果は認められなかった。また、河川水の植種希釈水に比べる

河川水表 2 に、河川水を植種源に用いた場合の GG 標準液のと、菌製剤の植種希釈水は、活性を維持できる期間が短い

BOD 測定結果を示す。2015 年 10 月に採取した河川水を植ことが明らかになった。日暮ら3)は、工場放流水由来の植種源に用いた場合、馴化期間 0～18 日間までは GG 馴化の種希釈水をGG馴化した場合、活性は2～3日間維持できる有無によらず、BOD は目標範囲内（220±10 mgO/L）であと報告しており、活性を維持できる馴化期間は植種源によった。馴化期間 38 日間では、GG 馴化系および非馴化系り異なると考えられる。
次に、容器開封後の経過期間による影響を確認するため、のいずれも目標範囲外となった。GG 馴化による効果について考察すると、馴化期間 18 日目までの BOD は、GG 馴化系と非馴化系とで大差はなく、いずれも目標範囲内であったことから、河川水の微生物活性が十分であれば、GG馴化は必要ないと考えられた。ただし、馴化期間 38 日では、非馴化系の BOD 173 mgO/L に対し、GG 馴化系の BODが 203 mgO/L であり、非馴化系では微生物活性が低下した。
これは、期間が長くなったことで非馴化系では微生物の増表1 冷蔵保存したGG標準液のBOD測定結果
GG標準液
保存期間[日]022229364457

BOD
平均値* ± 標準偏差[mgO/L]215212216
215
215
209
208±±±±±±±7787778*太 字 は目標範囲内であったことを示す。

表2 河川水の植種希釈水によるBOD測定結果
活性度向上方法
河川水のGG添加
馴化温度
採水時期 馴化期間割合[日][℃][%vol]
2015年
00.0
室温
10月0.04
室温
0.50.011
室温
0.50.018
室温0.50.038
室温0.5
2016年
30.0201月
2016年
0.5202月
1.040.5351.0*太 字 は目標範囲内であったことを示す。

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BOD
平均値* ± 標準偏差[mgO/L]

223
227
211223214
215222173
203±±±±±±±±±161262159113

184± 30

194198210
188±±±±80612開封直後の菌製剤と、開封後5か月間冷蔵保存した菌製剤mgO/L）を満たすことができるかを検討した。検討した植を比較した。その結果、開封直後の菌製剤を使用した系で種源のうち、秋期（10月）に採取した河川水についてはは215 mgO/Lと目標範囲内であったのに対し、開封後5か月GG馴化の有無によらず目標範囲を満たすことができたが、の菌製剤を使用した系ではBODが201 mgO/Lと目標範囲冬期（1、2月）の河川水は活性が低かった。土壌抽出液にを満たさなかった。菌製剤の使用期限は2年間と記されてついては、冬期に採取した真砂土および腐葉土を検討した

いるが、開封後は早めに使用しなければならないことが示が、目標範囲を満たすことはできなかった。これらの結果唆された。

から、環境中で採取した植種源を用いる場合には、定期的

３・２・３にGG標準液のBODを測定し、微生物活性の季節変動を把土壌抽出液

表4に、土壌抽出液を植種源に用いた場合のGG標準液の握する必要があることが示された。また、菌製剤についてBOD測定結果を示す。1月に採取した真砂土を用いた場合、は、GG馴化の有無によらずBODが目標範囲内であった。

非馴化系では148 mgO/L、GG馴化系では185 mgO/Lであり、ただし、容器開封後は早めに使用しなければならないこと

GG馴化によりBODは上昇したものの目標範囲には入らなが示唆されたことから、定期的なGG標準液のBOD測定はかった。

必要と考えられた。

1、2月に採取した腐葉土を用いた場合も同様の結果であ

今後の課題として、冬期に菌製剤以外の植種源を確保す

り、非馴化系のBODが190および195 mgO/Lであったのにる方法を確立することが挙げられる。具体的な検討事項と対し、GG馴化系では209 mgO/Lと、GG馴化により活性のしては、秋期に採取した河川水や土壌を用いて調製した植向上は認められたものの目標範囲には入らなかった。ただ種液に、継続的にGG標準液を添加し、微生物活性の安定し、真砂土に比べ、腐葉土を用いた系のBODが高かったこした植種液を培養維持する方法等が考えられる。とから、腐葉土の方が微生物活性は高いと考えられた。
また、土壌についても河川水と同様に冬期に微生物活性が低下している可能性が考えられたため、3月に採取した

文献
1) 日 本 工 業 標 準 調 査 会 ： 工 場 排 水 試 験 方 法 JIS K

腐葉土を用いて、30℃で1週間恒温保管した後に植種液と0102:2013，p.45，日本規格協会，2013.

した。結果は、恒温保管した系のBODは195 mgO/L、恒温

2) 環境省 水・大気環境局 総務課 環境管理技術室：平保管していない系のBODは200 mgO/Lであり、活性を向上

成23年度環境測定分析統一精度管理調査結果（本編），させることはできなかった。

p.55，2012.
3) 日暮久敬ら：分析化学，63，331-337，2014.

４4) 安達収吾ら：生物化学的酸素要求量測定用植種液に河まとめ
BODの測定に影響を及ぼす因子の一つである植種源の川水を用いた場合の有用性について，http://www.pref.ni

微生物活性に着目し、馴化等により微生物活性を安定化さ

igata.lg.jp/HTML_Article/38/120/08,0.pdf（2016年6月24日

せ る こ と で 、 GG 標 準 液 の BOD が 目 標 範 囲 （ 220 ± 10アクセス）

表3 菌製剤の植種希釈水によるBOD測定結果

菌製剤の状態
開封直後

開封後5か月
開封直後

活性度向上方法
GG添加
馴化期間
割合
[日]
[%vol]
0.0
40.50.0
110.50.0
180.50.0380.5
30.5

表4 土壌抽出液の植種希釈水によるBOD測定結果

BOD
平均値* ± 標準偏差[mgO/L]215
210198192205
197
207
208
201
215±±±±±±±±±±2106751312726*太 字 は目標範囲内であったことを示す。

-85-

活性度向上方法
GG添加
恒温割合
保管
[%vol]
0.0なし
0.5

BOD

土壌の種類

土壌の採取時期

真砂土

2016年
1月

腐葉土

1月

0.0なし

195 ± 92月

0.00.5なし

3月

0.5なし
30℃×1w

190
209
200
195

平均値 ± 標準偏差[mgO/L]148 ± 15185 ± 12±±±±81164

（英文要旨）Stabilization of the Microbial Activity of Seed Solutions in a Biochemical Oxygen DemandTest
Daisuke TSUCHIDA, Sayo MORIYAMA and Nobuhiro SHIMIZU
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, JapanThe microbial activity of seed solutions is a critical factor in the measurement of biochemical oxygen demand (BOD). The
present study examined methods to stabilize the microbial activity of solutions seeded with river water, a commercial seed
preparation, and soil suspensions. The degree of microbial activity was evaluated by BOD measurements of a glucose-glutamic
acid standard solution (GG standard), which should have a value of 220±10 mg/L as described in Testing Methods for Industrial
Wastewater (JIS K 0102). The BOD of the GG standard seeded with river water collected in autumn was within the range specified
by JIS K 0102, and the seed solution maintained its activity for 18 days. Acclimatization was carried out by adding a small volumeof GG standard to the seed solution, but this did not enhance the microbial activity. The BOD of the GG standard seeded with acommercial seed preparation was within the JIS K 0102 range when the commercial preparation was used immediately after thebottle was first opened, which suggests that the storage time affected the microbial activity. Soil suspensions of weathered granite
and leaf mold, each taken in winter, were prepared as seed solutions. The measured BOD values for the GG standard seeded withthese soil suspensions were outside the JIS K 0102 range. These results indicate that periodic BOD measurement of the GG
standard is necessary to check the microbial activity of the seed solutions.
[Key words; BOD, seed source, glucose-glutamic acid solution, river water, soil suspension, commercial seed preparation]-86-