日本薬学会年会新技術セミナー

逆相固定相どうなっているの？
これを知れば見方・使い方が変わる
逆相固定相のアルキル基の状態および試料との相互作用ついての考察

クロマニックテクノロジーズ
長江徳和
E-maiｌ: nagae@chromanik.co.jp
1

RPLCの保持機構• アルキル基が集積する充填剤表面に吸着する疎溶媒和相互作用（solvophobic interaction）:
Horvath• 結合層内部への分配が起こる分配理論:
Dill，Dorsey• アルキル結合層表面には移動相中の有機溶媒成分が溶媒和し，それがもう一つの固定相として機能すると考える分配モデル:
Kazakevich , Guiochon2

ラマンスペクトルによる溶媒和量の測定
Adsorption Mechanism in RPLC. Effect of the Nature of the Organic Modifier
Fabrice Gritti, and Georges Guiochon, Anal. Chem., 2005, 77 (13), 4257-4272

3

Molecular Dynamics Simulations of Alkylsilane Stationary-Phase Orderand Disorder. 1. Effects of Surface Coverage and Bonding Chemistry
Katrice A. Lippa, Lane C. Sander, and Raymond D. Mountain
Anal. Chem., 2005, 77 (24), 7852-7861

4

Molecular Dynamics Simulations of Alkylsilane Stationary-Phase Orderand Disorder. 1. Effects of Surface Coverage and Bonding Chemistry
Katrice A. Lippa, Lane C. Sander, and Raymond D. Mountain
Anal. Chem., 2005, 77 (24), 7852-7861

5アセトニトリル・水移動相を用いたｔ０（亜硝酸ナトリウム）とアセトニトリル（ベイカントピーク）のクロマトグラム
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tAcetonitrile/water=(20:80) 0 (Sodium nitrite)
Systemvolume0.291 min

カラム：C18 4.6x150mm
流速：0.5 mL/min

温度：40℃

Acetonitrile/water=(10:90)
Acetonitrile/water=(5:95)
Acetonitrile/water=(2:98)

ts (Vacant peak of acetonitrile)

Acetonitrile/water=(1:99)

アセトニトリルは保持しており，固定相中に分配する。この分配量を溶媒和量とする
6アセトニトリル・水移動相を用いた場合の保持時間，保持および固定相へのアセトニトリルの分配量
k = (ts-t0) / (t0-system volume)

k=S/M

S=kxM

カラム：ODS 4.6x150mm，カラム中の充填剤は約1.5gであり，この充填剤の約0.3g(0.35mL)がC18固定相に相当する
60.80.101mL

アセトニトリルの保持時間

50.740.5

亜硝酸ナトリウムの溶出時間

30.40.059mL

20.033mL

1

アセトニトリルの保持（ｋ）

0.20.017mL 固定相へのアセトニトリルの分配量
0.011mL

00%0.3

保持（ｋ）

時間（分）

0.6

5%

10%

15%

移動相中のアセトニトリル濃度(%)

0.1
020%
7

C1, C18およびC28固定相 へのアセトニトリルの分配量（溶媒和量）
0.16

カラム内固定相中の有機溶媒量(mL)

TMS (C1)
カラム: TMS (C1, %C: 5%)

C18

0.12

C18 (%C: 16%)C28

C28 (%C: 16%)
4.6x150mm

0.08

アルキル鎖長が長くなっても溶媒和量は大差ない

0.04

00510152025

有機溶媒濃度(%)
8

C1, C18およびC28固定相の状態
移動相：CH3CN/H2O
C28

C18: Acetonitrile

C1 (TMS)

疎水性表面上に溶媒和するため，アルキル鎖長が異なっていてもアセトニトリルの溶媒和量はほとんど同じである。
またラマンスペクトルを用いてアセトニトリルの溶媒和量を測定した報告もある
が，同様にC1, C8, C18固定相への溶媒和量は同じであると結論づけている。
9C18固定相への分配量（溶媒和量）
カラム：C18，（一部C28)

0.2
テトラヒドロフラン THF(C28)

4.6x150mm

カラム内固定相中の溶媒量(mL)

テトラヒドロフラン THF

１）4.6x150mmカラムにC18充
填剤は約1.5g入っている

アセトニトリル

0.15

エタノール

２）C18の炭素含有量16%
C28の炭素含有量16%

メタノール

0.1

カラム内のオクタデシル基の容量は約0.35mLと計算される

0.05

有機溶媒濃度20%でメタノールは約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している。

0051015

有機溶媒濃度(%)

2010

有機溶媒中でのオクタデカンの状態
メタノールにオクタデカン（C18H38)は混ざらない（溶けない）

テトラヒドロフラン（THF)にオクタデカン（C18H38)は混ざる（溶ける）

メタノールとの接触面積が最低になるようなコンフォメーションをとると考えられる

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11C18表面上での溶媒和の概略図
メタノール

アセトニトリル

テトラヒドロフラン

このイメージは、現在表示 できません。

オクタデシル基は寝込み，表面に少量のメタノールが溶媒和している

オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している

オクタデシル基は立ち上がっており，全体にテトラヒドロフランは溶媒和している12

アセトニトリル・水移動相を用いた場合の保持時間，保持および固定相へのアセトニトリルの分配量
k = (ts-t0) / (t0-system volume)

k=S/M

S=kxM

カラム：ODS 4.6x150mm，カラム中の充填剤は約1.5gであり，この充填剤の約0.3g(0.35mL)がC18固定相に相当する
60.80.101mL

アセトニトリルの保持時間

50.7

40.5亜硝酸ナトリウムの溶出時間

30.40.059mL

20.033mL

1

アセトニトリルの保持（ｋ）

0.20.017mL 固定相へのアセトニトリルの分配量
0.011mL

00%

0.3

保持（ｋ）

時間（分）

0.65%

10%

15%

移動相中のアセトニトリル濃度(%)

0.1
020%
13

有機溶媒によるt0の変化
705452
1 3446カラム: C18, 5mm, 4.6 x 150 mm

50% THF

カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.

6 774% アセトニトリル
5682% メタノール

アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるよ
うに有機溶媒と水との混合比を決定

71 321232

移動相：

4 68(mL)10

1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール，4. ブチルベンゼン, 5. o-ターフェニル，
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ，7. トリフェニレン

ウラシルｔ０の溶出量
１）溶媒和した有機溶媒とアルキル基の両方が固定相として働く。
２）溶媒和量の多い場合にｔ０は小さくなる
021.64mL
1.80mL1.89mL

３）THFはメタンノールに比べ，0.25mL
46（=1.89-1.64）多くアルキル基に溶媒和していることになる

14

C18固定相への分配量（溶媒和量）
0.55
0.5
カラム内固定相中の溶媒量(mL)

カラム：C18，（一部C28)

テトラヒドロフラン THF(C28)
テトラヒドロフラン THF

0.45

4.6x150mm
THF(C28)

アセトニトリル

0.4

エタノール

0.35

THF(C18)１）4.6x150mmカラムにC18充
填剤は約1.5g入っている
２）C18の炭素含有量16%
C２8の炭素含有量16%

メタノール

0.3
THF(C8)

カラム内のアルキル基の容量は約0.35mLと計算される

0.25

有機溶媒濃度20%でメタノールは約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している。

0.2
0.15
0.1
0.05
00204060

有機溶媒濃度(%)

80

100

82%メタノールの溶媒和量を0.06mLと仮定すると，ウラシルの溶出量から74%アセトニトリ
ルと50%THFの溶媒和量はそ
れぞれ0.15mLと0.31mLとなる
15

ｔo(ウラシル）の溶出時間の比較
カラム: C18, 5mm, 4.6 x 150 mmカラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm. 試料: 1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール
アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるように有機溶媒と水との混合比を決定

有機溶媒の疎水性(Log P)
82%メタノール-0.77

70%エタノール-0.31

58% 2-プロパノール

074%アセトニトリル-0.34

67%ジオキサン-0.42

50% THF

0.46
12Retention time/min

酢酸エチル: 0.73
クロロホルム: 1.97
16

メタノールとテトラヒドロフラン（THF)の差
メタノール

2 3
1Sunniest C28 ％C:16%

2Sunniest C18 ％C:16%

121436754345675075Sunniest C8 ％C:10%

610THF

1520
Retention time/min30

536471 2Sunniest C18 %C:16%

5341672Sunniest C8 %C：10%

534035Sunniest C28 ％C:16%

71 225Column: Sunniest C28, C18, C8, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
THF/H2O=50/50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

561015Retention time/min

Peak 52025

Peak717

C28,C18,C8固定相の状態
C28 %C 16%

C18 %C 16%

C8 %C 10%CH3OH/H2O=75/25

C28C18C8THF/H2O=50/50：メタノール：THF

18炭素含有量の同じC28とC18はメタ
ノール・水移動相条件では保持は同じ
1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=(97:3)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

2, 34C18Detection: UV@295nm
05101520
retention time / min

2530

Sample: 1=δ-Tocopherol
HOOSunrise C28 %C:18%

2=γ-Tocopherol

1C28HOO

3=β-Tocopherol

2HO43O

4=α-Tocopherol
HO05101520
retention time / min

253035O

固定相容量は同じ19炭素含有量の同じC28とC18でもアセトニトリル・ク
ロロホルム移動相条件では保持は変わる
C181 2

12Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:
CH3CN/CHCl3=(80:20)
Flow rate: 1.0 mL/min

Conventional
C18 %C:18%

C28Temperature: 30 ºC
Detection: UV @450nm
Sample: 1=a-Carotene

Sunrise C28 %C:18%

2=b-Carotene
05101520253035Retention time / min

固定相容量は2倍20メタノール・水移動相におけるアミルベンゼンとフェノールの保持◆標準試料の分離例
2 3
1Sunniest C28 %C:16%

2Sunniest C18 %C:16%

43151534561021Sunniest C18 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.38

7516Sunniest C8 %C:10%

2530

135Column: Sunniest C18, C28, C8, 5mm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

0232Sunniest C8 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.4171520Retention time/min

3Sunniest C28 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.40

76420◆ピリジンとフェノールの分離

3246Retention time/min

8Column: Sunniest C18, C28, C8, 5mm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Pyridine
3 = Phenol

C8はC18とC28に比べ，アミルベンゼンの保持は半分であるが，フェノールの保持はほぼ同じである。

21

試料とC18固定相の相互作用場
メタノール・水移動相：メタノール

C18

C8

アミルベンゼンはオクタデカンに可溶

OH

フェノールはオクタデカンに難溶

22

層の厚い固定相（C30)と層の薄い固定相（C18)の比較
ノンポーラスシリカにポリメリックC30とモノメリックC18を結合
NP-C30, %C：0.23%

炭素含有量は約1/4で層の厚みも約1/4
NP-C18, %C：0.06%

23

NP-C30とNP-C18の比較
タンパク質の分離4.6x30mm

NP-C18A) 0.1%TFA,
B) CH3CN
グラジエント溶離

Sample: 1 = Ribonuclease,
2 = Insulin,
3 = Cytochrom C,
4 = Lysozyme,
5 = Myoglobin,
6 = Carbonic anhydrase

NP-C30

タンパク質

タンパク質

Retention time/min

タンパク質は固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す

24

NP-C30とNP-C18の比較
多環芳香族炭化水素の分離
4.6x30mm

NP-C18

NP-C30A) H2O
B) CH3OH%B: 20%-100%, 5 min

No. 11

グラジエント溶離

No. 1

Retention time/min

Retention time/min

多環芳香族水素は極性が低いため，アルキル基全体と相互作用し，NP-C30は固定相が厚く，NP-C18に比べ溶質の固定相内への出入りに時間がかかるため，ピークがブロードになると考えられる

25

NP-C30とNP-C18の比較
ナギのメタノール抽出成分の分離
4.6x30mm

NP-C18NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 0%-30%, 5 min
グラジエント溶離Retention time/min

Retention time/min

ナギの極性成分も固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す
26

水素結合性の比較 キサンチン類の分離
Sunrise C18

メタノール・水(30:70)

32142

Sunrise C18-SAC

1=TheobromineOα(3/4)=0.50
34α(3/4)=1.42

1421132

アセトニトリル・水(30:70)

α(3/4)=0.16

42,3α(3/4)=0.46
THF・水(30:70)

142102346810Retention time/minα(3/4)=0.066

4α(3/4)=0.081

1214

H3C

N
NNO

CH3H3CONN

N

4=Phenol

CH3NN

HN

N

CH3

3=Caffeine
O3O

CH3HNO

2=Theophylline

OH

N

CH3Column:
Sunrise C18, End-capped （%C:15)
Sunrise C18-SAC, Not end-capped(%C:14%)5mm, 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=30/70
CH3CN/H2O=30/70
THF/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

カフェインは水素結合性が高く，シラノール基の存在により保持が大きくなるが，THFを用いるとシラノール基の影響が少なくなる

27

水素結合性の比較 固定相の状態
THF・水

メタノール・水カフェイン

O
H3COCH3NNNN
CH3O
H3COCH3カフェイン

NN

N

N
CH3OHOHOHOH

THF・水移動相を用いた場合には，極性の高いTHFが固定相内に存在することにより，溶質に対するシラノール基の影響を弱ませる。
28

メタノールとテトラヒドロフラン（THF)の差
メタノール

2 3
1Sunniest C28 ％C:16%

2Sunniest C18 ％C:16%

121436754345675075Sunniest C8 ％C:10%

610THF

1520Retention time/min

30536471 2

Sunniest C18 %C:16%

5341672Sunniest C8 %C：10%

534035Sunniest C28 ％C:16%

71 2

25

Column: Sunniest C28, C18, C8, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
THF/H2O=50/50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

5610
15
Retention time/min

Peak 52025

Peak729

高粘性溶媒の使用－選択性のコントロールⅠ
77523
164752
1 34024468723
171060246558% 2-プロパノール
1=2.338.0 MPa
2=10.2d= 7.254570% エタノール=1.26.1 MPa=11.2d= 6.866,723121 382% メタノール=0.6
3.7 MPa=12.9d= 6.254 646874% アセトニトリル=0.37
2.3 MPa=11.8
d= 6.567% 1,4-ジオキサン=1.54
6.5 MPa= 9.8
d=7.849% THF=0.55
5.5 MPa= 9.1
d=7.61030まとめ• C18アルキル基は，メタノール・水移動相では固まっており，表面にのみメタノールは溶媒和していると考えられる• THF・水移動相ではTHF濃度の上昇に伴い，固定相内部にTHFは溶媒和し，アルキル基は立ち上がり始めると考えられる• 固定相に溶媒和した有機溶媒は固定相として働き，メタノールとTHF では分離は大きくことなる• 試料の極性により固定相としてのアルキル基の相互作用場が異なると考えられる
31