Paracoccus sp. 43P 株の L-glucose 代謝機構の解析
中村顕（筑波大学大学院 生命環境科学研究科）
研究の目的
地球上のほぼすべての生物は、D-glucose (D-glc)を炭素源及びエネルギー源として利用し、生活している。また、D-glc の代謝経路に関しても、解糖系やペントースリン酸経路などその詳細が明らかになっている。ところが D-glc の鏡像体の L-glc に関しては、自然界での存在は確認されていない上、L-glc を資化する生物も知られていない。むしろ Rudney が 1)、1940 年に哺乳類・酵母・いくつかのバクテリアは L-glc を資化しないと報告して以来、生物は L-glc を資化しないものと捉えられている。このため、タンパク質合成に L-アミノ酸のみが利用されるように、地球上の生物は糖質の資化、特にグルコースの資化に関して、"ホモキラリティー"を有していると捉える事ができる。
我々はこの"糖質資化のホモキラリティー"の問題にチャレンジするために、自然界から L-glc 資化能を有する微生物のスクリーニングを行い、Paracoccus sp. 43P 株を得た。
同株の L-glc 代謝経路について検討したところ、初発反応が L-glc dehydrogenase (L-GDH)
による NAD+依存的な酸化反応であることを明らかにした。本研究では、L-GDH 以降のL-glc 代謝に関わる酵素・遺伝子の同定を行い、同株の L-glc 代謝機構の全貌を明らかにすることを目指した。

方法
L-GDH 遺伝子 (lgdA) 周辺領域の解析

既にクローン化した lgdA の周辺領域を解析するため、43P 株のゲノム DNA を鋳型として、primer walking 法により PCR 増幅を行い、塩基配列解析を行った。
各遺伝子の大腸菌を宿主とした異種発現及び酵素精製
上記で同定した L-GDH、L-GnDH 及びその周辺遺伝子の ORF を pET21a または pET28aにクローン化し、大腸菌 BL21(DE3) 株を宿主として、C 末端または N 末端に His-tagを付加する形で発現させた。さらに常法に従って His-tag に対する affinity を用いて各酵素の精製を行った。
各酵素の酵素活性の同定
各精製酵素を用いて、予想される酵素活性の検出を行った。基質には市販の糖・アルドン酸類またはそれらを化学反応及び酵素反応により変換した化合物を用い、反応条件及び活性検出には各酵素に適した方法で行った。
酵素反応生成物の同定
一部の酵素反応生成物に関しては、TLC を用いた精製後、HPLC 解析、GC/MS 解析、あるいは 1H-NMR による水素原子の帰属解析を行うことによって、同定を行った。

結果
1)

L-GDH 遺伝子周辺領域の解析

クローン化した 43P 株の L-GDH 遺伝子(lgdA)は、ゲノム配列が公開されている同属のP. denitrificans PD1222 株の Pden_1680 遺伝子とアミノ酸配列レベルで 84%の相同性を示
すが、Pden_1680 遺伝子周辺にはイノシトール代謝に関連すると推定される ORF がクラスターを形成していた。43P 株の lgdA 周辺領域の塩基配列を解析したところ、PD1222株の該当する ORF とアミノ酸配列レベルでそれぞれ 76-93%の相同性を示す ORF が見出され、これら 2 株でこの領域の遺伝子構造が類似していることが明らかになった（Fig.
1）。
そこで、精製した組換え L-GDH を用いて基質特異性について検討したところ、イノシトール類に対する酸化活性が検出された。特に scyllo-inositol に対する活性(190 U/mgprotein)は、L-glc に対する活性(31 U/mg protein)よりも約 6 倍強く、本酵素が生理的にはscyllo-inositol dehydrogenase として機能することが推定された。L-GDH の L-glc を基質とした反応産物を GC/MS により同定した結果、本酵素は L-glc の 1 位を酸化して L-glucono-1,5-lactone を生じることが示された。なお、L-glucono-1, 5-lactone は水溶液中で容易に加水分解され、L-gluconate へと変換される。
2)

L-GnDH 遺伝子のクローン化と周辺領域の解析

次に、L-GDH 反応により生じる L-gluconate を基質として、43P 株の細胞抽出液を用いて酵素活性を検討したところ、NAD+依存的な dehydrogenase 活性が検出されたので、同活性を指標に L-GnDH を精製した。精製酵素の N 末端アミノ酸配列は PD1222 株のPden_4931 遺伝子のものと一致したので、L-GnDH は 43P 株の Pden_4931 遺伝子に相当する遺伝子にコードされているものと推定した。そこで、決定した N 末端アミノ酸配列及び Pden_4931 遺伝子の内部配列を元に primer を設計し、PCR を用いて同遺伝子及び周辺領域をクローン化し、配列解析を行った。その結果、L-GnDH 遺伝子の周辺に 9つの ORF からなるクラスターと、その上流に転写調節因子をコードすると推定される

Fig. 1. Gene organization of the region around lgdA gene in the genome of strain 43P.
The ORFs are shown with boxes, and the amino acid sequence identity of each ORF with thecorresponding gene from strain PD1222 is indicated. Annotations for PD1222 genes were cited fromthe KEGG database.

ORF を見出し、これらの ORF は PD1222 株の該当遺伝子(Pden_4923-Pden_4932)とアミノ酸配列レベルでそれぞれ 71-91%の相同性を示した。これらの遺伝子産物はアルドースの 1 位が酸化されて生じるアルドン酸代謝に関連することが推定されたので、これらの遺伝子が L-gluconate 以降の代謝に関連するものと推定し、lgnR 及び lgnA-I と命名した（Fig. 2）。これらの遺伝子のうち lgnE-I が代謝関連酵素をコードすると推定されたので、以降の解析を行った。
3)

L-gluconate 以降の代謝経路の解析

以上を踏まえて、LgnE-I が L-gluconate 以降の代謝に関与するのかどうかを明らかにするため、大腸菌を宿主として各酵素を生産・精製し、各酵素活性について以下のように検討を加えた。
LgnH (L-GnDH)
LgnH は、予想通り精製 L-GnDH と同様の活性を示した。
本酵素は L-gluconate 以外に、L-gluconate の C4 epimer の L-galactonate にも活性を示したが、C2 epimer および C5 epimerの L-mannonate、D-idonate に対しては活性を示さなかった。本酵素の L-gluconate を基質とした反応産物は、HPLC 分析により 5-keto-L-gluconate と同定されたので、LgnH はL-gluconate の 5 位の炭素を酸化する酵素であることが判明した。

LgnI (D-idonate dehydrogenase/5-keto-L-gluconate reductase)
LgnI は、D-idonate に対して NADP+依存的な dehydrogenase 活性を示し、また LgnH 反応産物である 5-keto-L-gluconate に対して reductase 活性を示した。反応平衡は reductase側に大きく偏っており、生理的には reductase として機能するものと考えられる。そのため L-glc 代謝経路では、LgnH/LgnI による酸化/還元反応を通じて、L-gluconate からD-idonate へと D/L 変換を行うものと結論した。

Fig. 2. Gene organization of the lgn cluster of strain 43P.
The ORFs of the lgn cluster are shown with boxes, and the amino acid sequence identity of each
ORF with the corresponding gene from strain PD1222 is indicated. Annotations for PD1222 genes werecited from the KEGG database.

LgnE (D-idonate dehydratase)
LgnE は一般的な dehydratase と同様、Fe2+と DTT の存在下で D-idonate を還元性の化合物へと変換する活性を有していることを TLC により示した。また、反応生成物は HPLC及び NMR 解析により 2-keto-3-deoxy-D-galactonate (KDGal)と同定されたので、LgnE はD-idonate の 2, 3 位の炭素原子から水分子を引き抜く D-idonate dehydratase であることが明らかになった。
LgnF (KDGal kinase)と LgnG (phospho-KDGal aldolase)
LgnF 及び LgnG の PD1222 株のオルソログ(それぞれ Pden_4929 及び Pden_4930 遺伝子産物) は、それぞれ KDGal kinase、6-phospho-KDGal (PKDGal) aldolase とアノテートされていたので、該当する活性について検討した。LgnF は ATP 存在下で KDGal を他の化合物へと変換する活性を有していることが TLC により示された。さらにこの反応系に LgnG を添加して反応させた後、その反応液を基質に市販の lactate dehydrogenase、3-phospho-glyceraldehyde (G3P) dehydrogenase をそれぞれ反応させると、顕著な活性が検出されたことから、
LgnG 反応により pyruvate と G3P が生じたことが示された。従って、LgnF が KDGal の 6 位をリン酸化し、LgnG が PKDGal を pyruvate と G3P に解裂させることが明らかになった。

結論
上記の解析により明らかになった、Paracoccus sp. 43P 株の L-glc 代謝経路のモデルをFig. 3 に示す。一般に、アルドース糖の C1 位を酸化してアルドン酸へと変換し、さらに dehydratase、aldolase 反応により TCA 回路基質である C3 unit へと代謝する経路は、
Entner-Doudoroff (ED)経路と総称される。本代謝経路は、基質のリン酸化が起こるタイミングから、semi-phosphorylative (semi-P) ED 経路に分類されるが、従来知られている

Fig. 3. Model of L-glucose metabolic pathway in strain 43P.
The compounds and the enzymes in this pathway are shown, and the atoms and bonds altered byeach enzyme reaction are indicated by red color.

semi-P ED 経路は超好熱性古細菌の D-glc 代謝でのみ認められる 2) 。これと比較すると、本代謝経路はアルドン酸の C5 位の酸化/還元を通じて D/L 変換を行う点が特徴的である。
また、本代謝経路の L-gluconate 以降のステップは、大腸菌 L-galactonate 代謝経路 3)と起こる反応は同一であるが、大腸菌の代謝酵素との間の相同性はほとんど認められない。
従って本代謝経路は、L-glc を出発基質とする点に加えて、非常にユニークなものであると考えられる。

文献
1. Rudney, H. (1940) The utilization of L-glucose by mammalian tissues and bacteria. Science92: 112-113
2. Ahmed, H., Ettema, T. J. G., Tjaden, B., Geerling, A. C. M., van der Oost, J., and Siebers, B.
(2005) The semi-phosphorylative Entner-Doudoroff pathway in hyperthermophilic archaea:a re-evaluation. Biochem. J. 390: 529-540
3. Cooper, R. A. (1979) The pathway for L-galactonate catabolism in Escherichia coli K-12.
FEBS Lett. 103: 216-220