高輝度放射光によるタンパク質結晶構造解析の現状と問題点
河本正秀
酒井久伸
井田 孝
上野 剛
山本雅貴

要旨

財団法人高輝度光科学研究センター〒6795198 兵庫県佐用郡三日月町光都 111

財団法人高輝度光科学研究センター〒6795198 兵庫県佐用郡三日月町光都 111

北里大学理学部生物科学科〒2288555 神奈川県相模原市北里 1151

独立法人理化学研究所播磨研究所〒6795148 兵庫県佐用郡三日月町光都 111

独立法人理化学研究所播磨研究所〒6795198 兵庫県佐用郡三日月町光都 111

財団法人高輝度光科学研究センター〒6795148 兵庫県佐用郡三日月町光都 111タンパク質結晶構造解析は放射光施設の高輝度かつ波長可変な X 線の利用により，飛躍的な進歩を遂げた。

SPring-8 をはじめとする第 3 世代放射光施設においては，挿入光源より発する超高輝度光を活用した，微小結晶の構造解析や迅速回折データ収集に向けたビームラインの研究開発が進められ，大きな成果を上げている。その一方，光源の高輝度化に伴い試料結晶の放射線による損傷が再び問題となり，実験手法の改善等解決に向けたさまざまな試みが行なわれている。

1. はじめにを含んだ結晶の位相決定に，多波長異常分散法（ Multi-wavelength Anomalous DiŠraction method, MAD 法）が21 世紀に入り人間の設計図であるヒトゲノムの全 DNA開発され，構造決定の簡便化をもたらした4)。

配列解読完了をうけたポストゲノム研究の一環として，広SPring-85)は，兵庫県西部の相生市から北約20 km に位範囲にわたるタンパク質の立体構造情報の蓄積をめざす構

置する播磨科学公園都市に設置された第三世代放射光施設

造ゲノムプロジェクトが世界各国で進められている1)。日で，その蓄積リングは周長1436 m と世界最大を誇ってい本でも平成 14 年度から「タンパク 3000 プロジェクト」がる。その蓄積リングから放射光を導くビームラインは合計スタートし2)，5 年間に3000 種以上のタンパク質について62本の利用が可能であり，現在，全体の3/4以上にあたる

その立体構造と働きを解明しようとしている。生命機能を48 本のビームラインが供用中もしくは建設中である。そ司る分子機械であるタンパク質は， 20 種類のアミノ酸がのうち 11 本のビームラインにおいてタンパク質結晶構造直線状に並んだ高分子鎖であり，遺伝情報によって直接作解析 の実験が 可能で，タ ンパク質結晶 構造解析は 今やられる唯一かつ最終の産物である。その巧妙に折り畳まれSPring-8 の主要な研究テーマの一つとなっている6)。

た安定な立体構造はその分子機械としての機能と深い関係

本稿では，世界最大規模の第 3 世代放射光施設としてを持つ。近年の構造生物学や構造ゲノム科学研究に代表さ建設された SPring-8 のタンパク質結晶構造解析用ビームれるように，そのタンパク質の立体構造に多くの関心が寄ラインとくに BL41XU の現状を紹介するとともに，高輝せられるようになってきた。

度放射光の利用にともない深刻化した放射線損傷の問題に

現在，タンパク質の立体構造決定には， X 線結晶構造ついて記述する。

解析法が広く用いられている。この手法は，タンパク質単体だけではなくタンパク質複合体核酸など広範囲にわたる生体高分子について原子レベルでの立体構造を明らかに

2. SPring-8 の タ ン パ ク 質 結 晶 構 造 解 析 用
ビームライン

することができる。実験室の X 線発生装置にくらべ数桁X 線輝度が 高く波長可変の 放射光（ Synchrotron Radia-

タンパク質結晶構造解析において放射光ビームラインにtion）がタンパク質 X 線結晶構造解析にも利用されるよう期待されているのは，従来解析が困難だった対象サンプルになり，飛躍的な進歩をもたらしている3)。放射光の高輝への解析可能範囲の拡大と構造決定の簡便化迅速化であ度性は，今まで回折強度不足で解析不可能であった 100る。 SPring-8 でも，上記の二つの目標にむけてビームラmm 以下の微小サイズ結晶での構造決定を可能にした。まインの建設高度化が進められている。現在， SPring-8

た，放射光の波長可変性により，金属などの異常散乱原子にはタンパク質結晶構造解析に利用できる放射光ビームラ

330 ● 放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6(C) 2004 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Researchトピックス ■ 高輝度放射光によるタンパク質結晶構造解析の現状と問題点

イ ン が 合 計 11 本 あ る （ http: / / www.spring8.or.jp /結晶格子が長く回折能が弱い超分子複合体結晶からも高精JAPANESE/facility/bl/index.html を参照）。

度のデータ収集が可能である。

解 析可 能範 囲の 拡大 は， 構造 生物 学 ビー ムラ イン

3.2（BL44XU )8)を中心に進めている。従来構造解析が出来なビームライン光学系
Fig. 1 に BL41XU の光学機器構成を示す。アンジュレー

かった厚さ 10 mm 以下の微小結晶や分子量 1 千万を越え

タからの X 線は，光源から 35.9 m にある Si ( 111 )を分光るウィルスなど1,000 Å 程度の格子長をもつ超分子複合体素子とする 2 結晶分光器によって単色化される。この 2結晶の回折実験がこれらのビームラインによって可能とな結晶分光器では，結晶が回転傾斜配置されており，第一結（ BL41XU )7) や生体超分子複合体構造解析ビームラインった。これには，第三世代放射光の最大の特徴である高輝晶はピンポスト加工した Si 結晶を直接水冷して用いるこ度放射光を発生する挿入光源装置アンジュレータが大きなとでアンジュレータ光の高い熱負荷に対応する設計11) になっている。蓄積電流100 mA での各エネルギーのロッキ役割を担っている。
一方，構造決定の簡便化迅速化にむけて，理研構造生物学ビームライン（ BL45XU )9) や偏向電磁石ビームラインを中心に，多波長異常分散法（MAD 法）による回折ングカーブを Fig. 2 に示すが，高熱負荷にも充分対応していることが分かる。

2 結晶分光器によって分光された X 線は，光源から 44

強度データ収集の迅速化簡便化に向けた努力が進められm にある水平集光用ミラーと， 45 m にある垂直集光用ミている。さらに，サンプルチェンジャーの開発やビームララーの 2 枚によって集光される。水平集光用ミラーは 70

イン制御の自動化により，ビームライン回折強度測定の完

cm 長の溶融石英，垂直集光用ミラーは33 cm 長の単結晶全自動化高効率化が切り拓かれようとしている。

シリコンを母材とし，各々反射角 3.5 mrad で用いられている。また，各ミラーは 3 種類（ロジウムプラチナ

3. BL41XU（構造生物学Ⅰ）

高エネルギー用スーパーミラー）の反射材を使用しており，利用する X 線のエネルギーに応じて切り替えること

3.1

BL41XU の特長ができる。

BL41XU （構造生物学）は， SPring-8 に 3 本あるタ

これらの光学機器により分光集光された X 線は実験

ンパク質結晶構造解析用共同利用ビームラインのうちの 1ハッチに入射し，回折実験に供される。利用可能なエネル本である。このビームラインの最大の特徴は，光源として（アンジュレータ 1 次光利用），ギー範囲は，6.5～17.5 keVSPring-8 標準真空封止型アンジュレータ10) を採用してい19.0～37.5 keV（アンジュレータ 3 次光利用）で，その Xることである。このアンジュレータから発生する高輝度

線強度は 12 keV 付近で最大 2 × 1013 photons / sec. 以上に高平行性の X 線を用いることで，数十 mm の微小結晶や達する（ Fig. 3 ）。これは SPring-8 の偏向電磁石を用いた

Fig. 1

Schematic view of beamline BL41XU at SPring-8.

放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6 ● 331タン パ ク結 晶 構造 解 析用 ビ ー ムラ イ ンよ り 2 桁 以 上高はミラーによる集光を行わないが，アンジュレータビームい。また試料位置（光源から約 52 m ）でのビームサイズの高指向性を生かして垂直方向のビームサイズは 300 mm（Fig. 4）。
は水平垂直方向とも半値幅で150 mm 以下である以下になることが見込まれる。この結果，集光ミラー系のBL41XU では 2004 年夏に集光光学系の改良を計画して更新にともない試料に照射されるビーム強度を大きく変えいる。水平垂直集光用の 2 枚のミラーは 1997 年の共用ることなくサンプル位置でのビームの高平行度を達成する。

開始以来そのまま使い続けており，それぞれのミラーの反射率が初期の 7 割程度，ミラー集光系全体のスループッ実験ステーション

3.3

トは初期の 50 程度にまで低下している。そこで，水平BL41XU の実験ハッチ内を Fig. 5 に示す。実験ステージ

集光用ミラーを新規にロジウムコートされた70 cm 長単結には， SPring-8 の理研構造ゲノムビームライン12) や創薬晶シリコンのものに置き換えて，1 枚のミラーによる水平産業ビームライン13)で用いられているものを SPring-8 標集光光学系とする。これにより，トータルでの X 線強度準として採用している。この実験ステージは試料前位置にが現状の約 2 倍向上すると見込まれる。また，垂直方向2 組の X 線用 4 象限スリットが用意されており，上流側

Fig. 3Fig. 2Total photon ‰ux at the experimental hutch of BL41XU.

Variation of rocking curve of Si(111) double crystal
monochromator at BL41XU. Energy range is from 6.5 to24.8 keV and ring current is 100 mA.

Fig. 4332 ● 放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6

Beam proˆle at the sample position of BL41XU.

トピックス ■ 高輝度放射光によるタンパク質結晶構造解析の現状と問題点

Fig. 5Equipments in the experimental hutch of BL41XU.

をビームサイズ整形スリット，下流側を寄生散乱防止スリットとして用いている。 BL41XU では多くの場合，このスリットで 100 mm × 100 mm に整形した X 線ビームを実験に用いている。現状では最小で50 mm×50 mm までしか対応していないが，将来的には集光用ミラーの最適化などにより25 mm ×25 mm 以下の微細ビームをサポートする予定である。この微細な X 線ビームによって，微小結晶からの回折写真測定で S/N 比の大幅な向上が期待できる。

X 線検出器には，イメージングプレート検出器にリガク社製 RAXIS V14)が，X 線 CCD 検出器に mar research社製 marCCD165を用意している。また2004年 9 月からは

X 線 CCD 検出器として ADSC 社製 Quantum315が利用可能になる。この Quantum315 と R AXIS V の 2 台は，現在市販されているそれぞれのタイプの検出器としては最高クラスの検出面積（Quantum315: 315 mm×315 mm, RAXIS5: 400 mm×400 mm）と，高速読み取り系（Quantum3151.2秒，RAXIS V50秒）を持っている。

Fig. 6

High resolution diŠraction experiment at BL41XU. (a)DiŠraction image of CCD-detector. (b) 0.85 Å resolution
electron density map calculated with the high resolution
diŠraction data15).

300 Å 程度の格子定数の結晶や 2 Å 程度の分解能での測定といった一般的な実験はほとんど Quantum315でカバー可能となる。また，より大きな格子定数を持つ超巨大分子ンでの放射線損傷は克服されたように見られていた。しか複合体の結晶や，原子レベルでの構造決定に必要な 1 Å

しながら， 1990 年代後半から世界的に第 3 世代放射光施

分解能を超える超高分解能測定（ Fig. 615) ）には，より大設が運転され，アンジュレータを光源とする BL41XU のきな検出面積と高いダイナミックレンジを備えた R

ような超高輝度ビームラインによるタンパク質結晶構造解AXIS V を用いることであらゆるユーザーニーズを満たす

析が開始されると，再び放射線損傷18) が大きな問題としことが可能である。てクローズアップされている。
第 3 世代放射光施設のアンジュレータビームラインの4. 高輝度放射光による放射線損傷

ような高輝度放射光によるサンプル結晶の放射線損傷の原
因は，光吸収による温度上昇と放射線との相互作用によるタンパク質結晶構造解析での放射線損傷とは化学的損傷に大別できる。ただし，前者の放射光吸収によ1990 年頃からタンパク質結晶構造解析への第 2 世代放るサンプルの温度上昇については， 1014 Photons / mm2 /4.1

射光施設の利用が一般化するにつれて，放射光の大強度

sec. のような高輝度放射光下においてさえ，小さな結晶サX 線による放射線損傷16) が深刻な問題として取り上げらンプル（ 100 mm 以下）を実験に用いて 100 K の窒素ガスれた。そこで，放射光による回折データ収集時の放射線損吹き付け低温装置のガスフローと露光時間に充分注意して傷対策として，100 K という極低温での窒素ガス吹き付けおけば， 10 K 程度の温度上昇に抑えることが可能であ

冷却による回折実験法17) が開発され，放射光ビームライる19) 。このように，実験条件に十分な注意を払うことに

放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6 ● 333

より温度上昇による放射線損傷は克服できる。

derson Limit に達するまでの露光時間を，波長，ビームサ

しかしながら，放射線とサンプルの相互作用による化学イズ，フラックス，アミノ酸残基数，重原子数，格子長，的損傷は放射光をプローブとして構造解析を進める限り，結晶のサイズを入力することで計算するプログラム原理的に避けることが出来ない。放射線による化学的損傷

Raddose23)が開発されている。SPring-8 のタンパク質結晶は 2 つのステップによるものと考えられている。まず，

構 造 解 析 ビ ー ム ラ イ ン に お い て ， 最 も 高 い 輝 度 （ 1014

一段階目では，放射線とサンプル原子との直接相互作用にPhotons / mm2 /秒以上）を誇る BL41XU では，一般的なより，光電効果やコンプトン効果などによってエネルギーサンプル結晶を仮定した場合，Henderson Limit に達するの吸収がおこる。この結果，入射した放射線が直接サンプまでの照射時間は高々 200 ～ 300 秒である。また，偏向電ル内の化学結合を切断して，サンプル分子自身に損傷を負磁石ビームラインの場合では，30000秒程度と見積もれる。

わせる。二段階目の損傷として，一段階目の相互作用で生そこで， SPring-8 の偏向電磁石を光源とする理研構造じた光電子やフリーラジカルによる損傷が考えられる。まゲノムビームライン（BL26B1）において，放射線損傷にた，サンプル結晶中の溶液が放射線と相互作用した場合による影響を調べるために Sweet Tasting Protein (Thauma-も，フリーラジカルが発生する。タンパク質結晶の場合，こtin) を用いた実験を行った。データ収集は一枚あたりの露のようなフリーラジカルは結晶中に広がり，さらなる化学光時間を 4 秒とし，180枚のデータ収集と一時間連続での変化によって分子自身の構造変化20) や結晶格子を作る分X 線照射を組み合わせて 1 セットとした。このセットを 9子間の相互作用を破壊して，結晶格子自身をも変化させる。

回繰り返し，合計39600秒の X 線を照射しながら系統的にタンパク質結晶からの回折データにおいては，放射線損データセットを集め，それぞれについて解析結果を比較し傷によって，回折強度の減少，結晶のモザイク性温度因た。回折強度データ処理は，格子体積の変化を正確に見積

子格子体積の増加による回折分解能の劣化などが引き起もるためにカメラ長固定の条件で全データセットを処理しこされる。また，放射線損傷によるタンパク質分子内の化た。Fig. 7 に 1.65 Å 分解能での回折強度の統計精度をあら

学変化や結晶格子の変化は，結晶の同型性を失わせ，回折わす Rmerge と回折強度のシグナルノイズ比を示す I / s のデータに系統誤差をもたらす。この放射線損傷を逆手にと変化および格子定数の変化を示したが，統計精度の悪化，って，損傷前のデータと損傷後のデータを使い位相を決定

回折強度の減少や格子体積の増大が観測されている。まする方法21) （ RIP: Radiation Damage-Induced Phasing ）た，タンパク質内部でアミノ酸の構造変化を調べるために，も近年考案されているとはいえ，結果として MAD 法や1 セット目と 9 セット目のデータを用いて精密化した構造SAD 法での位相決定の障害となるのが現実である。

について，各アミノ酸残基の温度因子の変化を調べた。そのアミノ酸毎の平均温度因子変化を見ると，システインや4.2

放射線損傷の実際

酸性 側鎖アミ ノ酸に大き な温度因子変 化が観測さ れたタンパク質結晶の回折実験においては，放射線損傷によ（Fig. 8）。Asp147のカルボキシル基は温度因子が 3 倍程度る影響を最低限に抑える為の単位面積当たりの最大放射線上昇しており，ジスルフィド結合には切断された電子密度量は Henderson Limit22) （ 2 × 107 Gy ）として報告されても観測されている（Fig. 9）。

おり，高輝度放射光による実験ではこの限界を越えないよ

この様に，高輝度放射光による回折実験ではもはや放射うなデータ収集を心がける必要がある。現在では， Hen-線損傷を避けて通ることができない。そこで，少しでも放Fig. 7

Radiation damage measurement of Sweet Tasting Protein (Thaumatin) crystal at BL26B1. Nine datasets of 180
oscillation images at 4-second exposure were collected. The sample was continuously exposed for 60 minutes after
each dataset measurement. (a) Change in statistic values according to the radiation dose. (b) Change in unit cellparameters.

334 ● 放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6

トピックス ■ 高輝度放射光によるタンパク質結晶構造解析の現状と問題点

Fig. 8

Increasing ratio of averaged temperature factor of amino acids in the Sweet Tasting Protein (Thaumatin) crystal.
The comparison between structure reˆnements based on the initial and ˆnial datasets.

Fig. 9

Electron density map around Cys134 and Asp147 calculated with 1st and 9th datasets. Green: 2fo-fc map at 1.0slevel. blue: fo-fc map at ＋3s level. Red: fo-fc map at －3s level.

放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6 ● 335

射線損傷を低減するために，2 次的に生成するフリーラジ

タの掲載許可を感謝いたします。理研構造ゲノムビームラ

カルを捕捉しタンパク質内の損傷を抑える方法として，結インの調整および運転は理研の二澤宏司氏，スプリングエ

晶凍結時に加えるクライオプロテクタント（凍結防止剤）

イトサービスの福本祐史氏，村上博則氏，藤尾美紀氏の協にラジカルスカベンジャーであるアスコルビン酸を用いた力により進められています。ここに述べた多くの方々をは実験が報告されている。高濃度アスコルビン酸の添加によじめ SPring-8 のスタッフおよびビームラインユーザーのり，タンパク質分子中のジスルフィド結合の切断を抑える皆様に深く感謝いたします。

ことが出来たが，添加により結晶母液の pH が大きく変化

ここに 述べた BL41XU の光 学系の改 造は文部科 学省してしまうため，すべての結晶に用いることは出来ない。

「タンパク3000プロジェクト個別解析プログラム」から，その他にも多くのラジカルスカベンジャーが放射線損傷低理研構造ゲノムビームライン開発の一部は文部科学省「タ減剤の候補として考えられるが，今後の研究に期待する状

ンパク 3000 プロジェクト網羅的解析プログラム」から，況である。

支援を受けて実施したものである。

また，放射線損傷深刻化の原因として，アンジュレータ

参考文献など放射光高輝度化技術の進展に比べて，検出器高速化など実験ステーションでの測定技術の進歩が追いついていない状況であり，さらなる技術開発が必要である。

1)
2)
3)

5. おわりに
4)

SPring-8 のタンパク質結晶構造解析用ビームラインでは，アンジュレータビームラインを中心として，第三世代放射光の高輝度 X 線を生かした微小結晶や超格子結晶にも解析対象の拡大が進んでいる。また，全てのビームラインにおいて MAD 法による回折強度測定が一般化され，構造決定の簡便化迅速化が進んでいる。
タンパク質結晶構造解析における，これら放射光ビームラインの高度化は，今まで不可能であった難解サンプルの解析可能性の助けになるとともに，多くのビームライン利用者の負担を軽減するものであり，タンパク質結晶構造解析の一層の拡大と発展が期待される。しかしながら，高輝度放射光の性能を最大限活用するには，原理的に避けられない放射線損傷を如何にコントロールしながら実験を進めていくかが大変重要である。
謝辞
本稿に記述した BL41XU の改造，調整および運転は，JASRI の清水伸隆氏，長谷川和也氏，理研の二澤宏司氏
をはじめ多くの SPring-8 スタッフの協力により支えられています。特に BL41XU のピンポスト結晶や集光ミラー系の更 新につ いては ， JASRI の山 崎裕史 氏，清 水康宏氏，後藤俊治氏をはじめ JASRI ビームライン技術部門の皆様に協力頂きました。また， BL41XU での超高分解能回折実験は，京都大学薬学部の清水哲也氏，中津亨氏，加藤博章氏との共同研究により進めているものであり，デー

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5)
6)
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8)
9)
10)
11)
12)
13)
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トピックス ■ 高輝度放射光によるタンパク質結晶構造解析の現状と問題点● 著者紹介 ●河本正秀

上野財団法人 高輝度光科学研究センター
利用研究促進部門 構造生物グループ
E-mail: kawamoto＠spring8.or.jp
専門タンパク X 線結晶構造解析［略歴］
1996 年大阪大学大学院理学部博士課程（後期）生化学専攻修了， 1996 年理化学研究所基礎科学特別研究員， 1998 年財団法人高輝度光科学研究センター研究員，現在に至る。

独立行政法人 理化学研究所播磨研究所
石川 X 線干渉光学研究室
E
mail: ueno＠spring8.or.jp
専門X 線結晶構造解析［略歴］
1994 年東京大学大学院理学系研究科物株 リガ
理学専攻修士課程終了， 1994 年
ク入社， 2001 年理化学研究所播磨研究所へ出向，現在に至る。

剛山本雅貴
酒井久伸
財団法人 高輝度光科学研究センター
利用研究促進部門 構造生物グループ
E-mail: saki＠spring8.or.jp
専門計算機科学［略歴］
2000 年京都大学大学院理学研究科博士
前記過程修了， 2000 年財団法人高輝度光科学研究センター研究員，現在に至る。

井田孝

所属，北里大学理学部生物科学科
E-mail: idakoh＠sci.kitasato-u.ac.jp
専門構造生物学［略歴］
2001 年理化学研究所ジュニアリサーチアソシエイト， 2004 年横浜市立大学総合理学研究科博士課程修了， 2004 年北里大学理学部生物科学科助手，現在に至る。

独立行政法人 理化学研究所播磨研究所研究技術開発室(兼 )財 団 法 人 高 輝 度 光 科 学 研 究 セ ン
ター 利用研究促進部門 構造生物グループ
E-mail: yamamoto＠postman.riken.go.jp
専門タンパク X 線結晶構造解析［略歴］
1991 年大阪大学大学院理学部博士課程（後期）修了， 1991 年理化学研究所研究財 高輝度光科学研究セン員 ， 1997 年 財 高輝
ター副主管研究員兼務， 2002 年
度光科学研究センター利用研究促進部門
構造生物グループリーダ， 2003 年理化学研究所播磨研究所石川 X 線干渉光学研究室副主任研究員， 2004 年 10 月より理化学研究所播磨研究所研究技術開発室室長，現在に至る。

High-brillant synchroton radiation
for the protein crystallography at SPring-8
Masahide KAWAMOTO
Hisanobu SAKAI
Koh IDAGo UENO
Masaki YAMAMOTOJASRI/SPring-8 Kouto, Mikaduki, Sayo, Hyogo 6795198, JAPANJASRI/SPring-8 Kouto, Mikaduki, Sayo, Hyogo 6795198, JAPANKitasato University Kitasato, Sagamihara, Kanagawa 2288555, JAPANRIKEN/SPring-8 Kouto, Mikaduki, Sayo, Hyogo 6795148, JAPANRIKEN/SPring-8 Kouto, Mikaduki, Sayo, Hyogo 6795148, JAPANJASRI/SPring-8 Kouto, Mikaduki, Sayo, Hyogo 6795198, JAPANAbstract Protein crystallography has dramatically progressed utilizing the high-brilliant and variablewavelength X-ray source of synchrotron radiation facilities. At the third-generation synchrotron facilities suchas SPring-8, protein crystallography beamlines with the insertion devices have been developed and improvedto achieve the data collection for smaller sample crystals and more rapid data acquisition, taking advantage ofthe bright light source. On the other hand, the radiation damage on sample crystals because of the brilliant incident beam has become un-ignorable, and various eŠorts to improve the experimental procedures have been
dedicated.

放射光 Nov. 2004 Vol.17 No.6 ● 337