Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria
Copyright © 2021, Japan Society for Lactic Acid Bacteria

解説

次世代シーケンサーデータの解析手法 第 16 回
なぜ次から次へと新規手法が開発されるのか？
門田 幸二 1, 2, 3*、清水 謙多郎 1, 2, 3
1

東京大学 大学院情報学環・学際情報学府
2
東京大学 大学院農学生命科学研究科
3
東京大学 微生物科学イノベーション連携研究機構
我々はよく、「同じ目的のプログラムが多く存在し、どれを使えばいいのかよくわからない。
」という感想を聞く。考えられる理由としては、多様な評価基準が挙げられる。例えば、同程度以下の性能であっても、従来法よりも高速であれば存在意義が認められる。また、同一群内の反復数が多い（または少ない）といった特定の条件下で効果的な発現変動解析手法もおそらく存在する。しかしながら、本当の意味で存在意義が疑われる手法も現実には存在する。おそらくこれは、比較対象が代表的な手法に偏っているためである。本稿では、なぜ疑わしい手法が存在しうるのかについて、RNA-seq 発現変動解析分野を例として筆者らの経験を交えて解説する。
Key words：RNA-seq, research integrity, normalization, symmetry/asymmetry

はじめににして、それぞれの手法開発論文中では、その長所を示せるようなデータで比較される。これは、仮に利害関係のな世の中には無数の論文が存在する。そのため、今回の対い別の研究グループによる手法比較論文であったとして象分野に限ったとしても、全てを網羅するのは事実上不可も、例えば手法 C の論文で用いられた枠組みに近い条件能である。実際、新規手法に関する論文投稿時に、全てので比較を行えば、C のほうが優れているといった結論にな既存手法を含めた性能評価が要求されることはない（要求りがちだということを意味する。

されたことはないし、査読者の立場でも要求したことはな

次に、手法 C と似た特徴をもつ、さらに後発の新規手い）。ただし、edgeR 1）や DESeq2 2）のようなこの分野で

法 C’ について考えてみる。我々の感覚では、新規手法 C’

よく用いられている代表的な R パッケージは、手法比較の開発グループは、彼らの責任において類似した特徴をも論文 3）などでもベンチマークとして含められるのが通例でつ論文がないかを丁寧に探さねばならない。そして競合すある。それゆえ、例えば後発の新規手法 A の投稿論文は、る既存手法 C を見つけ出し、C’ が代表的な既存手法だけ

上記 2 つの手法（+α）と同程度以上の優れた何かがあるこ

でなく C よりも優れていることを示さねばならない（さもとが認められれば受理される。これは別の新規手法 B やなくば C’ の存在価値はない）。万が一 C の存在に気づかC についても成立するため、結果として代表的な手法よりず C’ の論文が投稿されたとしても、査読者によって C のも優れていると結論付けられた 3 つの新規手法 A と B と存在が適切に指摘されれば、現行の査読システムがうまくC が存在しうる。もし同じ解析条件なら、直接的な比較を機能したといえよう。リバイス時に C が適切に引用され、通じて ABC 間の優劣を決めることができる。しかし往々C にはない C’ の存在意義が示されれば、投稿先の基準に従って可否が判断されるであろう。今回は、Vieth らによ＊る単一細胞 RNA-seq（scRNA-seq）のデータ解析パイプ

To whom correspondence should be addressed.
Phone ： +81-3-5841-2395
Fax ： +81-3-5841-1136
E-mail ： koji.kadota@gmail.com

4）
ラインの性能比較論文 に対して重大な疑義をもち、事実を列挙して痛烈に批判した我々の批評論文 5）の内容を中心に解説する。大まかな関係性としては、Vieth 論文が C’123

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ずしもその全てが①のシナリオを想定しているわけではなに、そして我々が以前開発した RNA-seq データ正規化法
6）

いということである。例えば、RNA-seq 用として開発しDEGES が C に相当する。

た我々の DEGES 正規化法は、①のようなシナリオを想定
ステレオタイプなイメージの形成しているとは一言も書いていない 6）。また、⑥仮に①のシナリオを想定していたとしても、そのことが DEG が多数

今回のタイトルで示した問題へのユーザ側の対処法としを占めるデータに対応できないことに直結するわけではなては、様々な手法の特徴を把握し、自身のデータの性質・い。しかしながら、④・⑤・⑥に触れることなく①のみをデザイン・解析目的に合致した手法を利用するのが理想で示すような論文が続出すれば、②のイメージを定着させるある。一方で現実は、インストールのしやすさ、マニュアことができてしまうのである。

ルの豊富さや丁寧さ、そして不明な点や疑問点を問い合わ
Vieth 論文の概要せた際に誠実に回答してくれるかなどが重要である。ストレスのない実行時間や、インストール不要のウェブツールとしての提供などもまた、利用しやすさや R に馴染みのscRNA-seq 解析分野では、ウェットとドライ両面で次々ないユーザへの門戸を広げるという意味で重要といえる。と新しい方法が開発されている。Vieth らは、前者として実際、以前我々が edgeR 開発者にメールで問い合わせたライブラリ調製プロトコル、後者としてリードのマッピン

7）グから発現変動解析（データ正規化含む）までを調査対象際には丁寧な回答をいただいた。また DESeq2 は、前回も紹介した Galaxy 8）上で（インストール不要で）利用可能としている 4）。特に後者は複数のステップからなるため、である。これら 2 つのパッケージは、（DESeq2 の前身で前者と合わせた計 2,979 通りの可能な組合せ（パイプライある DESeq 9）を含め）RNA-seq の普及初期から存在し、ン）を、計 999 通りのシミュレーション条件を用いて性能今日でも継続的なアップデートがなされている。論文引用評価している。主なシミュレーション条件は、2 群間比回数も 1 万回超（2021 年 7 月 26 日に PubMed で調べた結較（A 群 vs. B 群）
、遺伝子数は 10,000 個、DEG の割合に果）であり、「勝者が全てを得る（Winners take all）」の典相当する Effect size が 5%・20%・60% の 3 通り、そして型例といえよう。

DEG の発現変動パターン（DE-patterns）が下記の 3 通り

遺伝子（転写物）の働き具合は、個体・組織・状態・細である。

胞ごとに異なる。転写物の全貌（トランスクリプトーム）
・対 称（DEG の 50% が A 群で高発現；DEG の 50% が Bを網羅的に調べる実験技術は、「臓器を塊（bulk）として群で高発現）

平 均 的 な 情 報 を 調 べ る bulk RNA-seq」か ら「 細 胞 ご と・非 対称（DEG の 75% が A 群で高発現；DEG の 25% が（single cell）の情報を調べる scRNA-seq」に移行していB 群で高発現）る。edgeR や DESeq2 は元々 bulk 用に開発されたもので・完 全 非 対 称（DEG の 100% が A 群 で 高 発 現；DEG のあるため、これらが bulk 用の代表的な手法という位置づけになる。したがって、edgeR や DESeq2 の特徴が bulk0% が B 群で高発現）用の発現変動解析手法に対するステレオタイプなイメー
ジということになる。内部的に用いられている正規化法

例えば Effect size が 20% で DEG が非対称なら、10,00010）を、そして×0.2＝2,000 個の DEG のうち A 群で高発現のものが 2,000

DESeq2 は MR 法 9）を利用しているが、これらは①大部分×0.75＝1,500 個、そして B 群で高発現のものが 2,000×0.25の遺伝子は発現変動遺伝子（DEG）ではない（つまり non-＝500 個となる。また、Effect size が 60% で完全非対称DEG である）というシナリオを想定している 11-12）。必然なら、10,000×0.6＝6,000 個の DEG の全てが A 群で高発的に、② bulk 用の正規化法はこのような古い発想に基づ現となる。他にも 3 通りのサンプルサイズ（96 vs. 96, 384

いているというのがステレオタイプなイメージということvs. 384, and 50 vs. 200 細胞）や発現変動の度合いなどがあについても同様である。edgeR は TMM 法になる。

るものの、性能に直結する主な事柄としては DEG の発現「古い発想」というのは、実際には全遺伝子の半分以上変動パターンが挙げられている。具体的には、DEG が対が DEG だと記された論文が存在することを根拠としてい称の場合にはライブラリ調製が、そして非対称の場合にはる。例えば③ Zeisel らは、scRNA-seq の異なる細胞型間正規化が発現変動解析結果に大きなインパクトを与えるとの比較で～ 60% の DEG を同定している 13）。また、④酵母結論づけている。特に⑦正規化の影響が最も大きく、非対の 2 群間比較用 bulk RNA-seq データ 14）でも同様の結果称の度合いが高くなるほど「scRNA-seq 用の正規化法で。ここで注意してもらいたいのは、実ある scran 17）や SCnorm 18）」が「代表的な bulk RNA-seq際によく用いられているのは edgeR と DESeq2 であるこ用の正規化法（や他の scRNA-seq 用の正規化法であるとは間違いないものの、⑤他にも数多くの（bulk）RNA-Linnorm 19））」よりもよい性能を示すと述べている。

が得られている15-16）

seq 用の発現変動解析手法（正規化法含む）が存在し、必124

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批評論文の概要

批評論文中では、我々は特にこの点を痛烈に批判している。
研究者としての誠実な姿勢

2 つの重要な事柄が挙げられる。1 つ目は、Vieth 論文
ではまず①～③が述べられ、bulk RNA-seq 用の正規化法 と し て 代 表 的 な TMM お よ び MR の み と 比 較 し た 結

本稿で強調しておかねばならないのは、Vieth らの⑦の果として、⑦が書かれているという点である（正確には主張自体は決して捏造でも法に触れるものでもないという

Positive Count というものも比較しているようだが、詳細ことである。理由は、「正規化が結果に与えるインパクトが全く説明されていないうえに特筆すべき性能でもないが大きいことや、bulk 用の “代表的な” 正規化法より優れためここでは無視する）。2 つ目は、Vieth らが⑦と同趣ているというのは、彼らの解析によって得られた事実関係旨の内容を Fig. 3b の考察として述べる際に「（bulk RNA-を正確に述べている」からである。我々が批判しているのseq 用の正規化法を比較した）Evans らの結果と同様に」は、あくまでも⑩読者に誤解を与えぬよう誠実な姿勢で論と記載している点である（原文：In line with Evans et al.

文を執筆すべきだという研究者としての倫理観についてで(2018), …）。Evans 論文は、我々の DEGES 正規化法を含ある。本稿や我々の批評論文を知ることなく Vieth 論文をむ様々な bulk RNA-seq 用の正規化法を、対称・非対称読めば、おそらくほとんどの読者は「scRNA-seq は bulkを含む様々なシミュレーションシナリオで比較したものでRNA-seq の頃に比べて得られる DEG の割合（Effect size）ある 20）。つまり、⑧ Vieth らは非対称なシナリオの bulkも非常に多く、データの性質自体も大きく異なる。得られ解析結果が既に存在することを認識している。

る DEG の割合が少ないと仮定して設計された bulk RNA-

Evans 論文は bulk 用のシミュレーション解析であるた

seq 用の正規化法の性能は、scRNA-seq 用に比べて特にめ、サンプルサイズ（2 vs. 2 and 5 vs. 5）が Vieth 論文に非対称なシナリオの場合に劣っている。よって scRNA-比べて圧倒的に少ないという違いは確かに存在する。しseq 用として開発された scran や SCnorm を使おう。」とかし、Vieth 論文の結論に直結する事柄は、サンプルサイいった思考回路になるであろう。しかし事実は、④・⑤・ズが多いか少ないかではなく、DEG の発現変動パターン⑥・⑨なのである。

が対称か非対称かである。Vieth 論文では、おそらく①のもし非対称なシナリオを争点化したいのであれば、bulk

シナリオが Effect size＝5% や 20% に相当し、③を反映し用の “代表的な” 正規化法だけでなく、そのシナリオで “ベたシナリオが Effect size＝60% なのだろう。Vieth らは、ストな” 正規化法（つまり DEGES）も正直に含めて比較す

Introduction の 3 段落目で③を実例として挙げつつ、「非べきであろう。我々は、これが⑩の具体的な行動指針であ対称の問題は、概念的には scRNA-seq と bulk RNA-seqると考えている。もし Vieth らが④・⑤・⑥・⑨を正しくを区別する特徴の 1 つであり、これまで取り組まれてこ認識し、正直に bulk 用の DEGES も含めて比較していたなかった（原文：This issue of asymmetry is conceptuallyならば、彼らの論文の Introduction（特にモチベーション

one of the characteristics that distinguishes single cell部分の説明）や⑦の結論は異なるものになっていたであろfrom bulk RNA-seq and has not been addressed so far.）」う。一部の研究者は、なぜその研究を行う必要があるかとと述べている。この問題を Vieth 論文のモチベーションという論文のモチベーションに大きな疑問符がつけられる論して掲げていることを踏まえれば、⑦を主要な結論とする文や、結論が異なりうるほどの事案を含む論文は撤回すべロジックに特段の違和感は感じないだろう。

きだと思うかもしれない。また別の研究者は、今回我々がしかし実際には、③と同様の Effect size を示す④ bulk

指摘したような事柄は、ただの業界の慣習であり黙認すべデータが存在するだけでなく、⑧の文章が Vieth 論文のきだと考えているかもしれない。でなければ、論文を出しDiscussion 中に存在するのである。Evans 論文は、対称・づらくなってしまうからである。どうあるべきか？につい非対称だけでなく、Effect size が 5-95% まで 5% 刻みで調ては、それぞれの価値観に従って実践すればよいだろう。

べている。つまり Evans 論文は、Effect size の観点でいえ今回のタイトルで示した疑問に対する、おそらく全員がば完全に Vieth 論文のシナリオを含むのである。したがっ納得できる理由付けは、本稿の要旨でも述べた多様な評価て、この時点で Vieth らがモチベーションとして掲げた事基準である。例えば計算時間がかかってもよいから精度を柄に大きな疑問符がつく（つまり「has not been addressed重視したい局面もあれば、たとえ同一研究者であったとso far」という主張は間違い）。さらに、⑨ Vieth 論文で用しても、状況次第ではその逆を望む場面も十分にありういられた Effect sizes（＝5, 20, and 60%）の範囲を Evans 論る。しかし本文中の冒頭でも述べたように、⑪自分の専門文の結果で眺めると、我々の DEGES が代表的な bulk 用の分野の全ての論文およびその内容を完全に把握していると正規化法（TMM と MR）よりも明らかに優れていることが言い切れる研究者はおそらく皆無である。それでも我々がわかる（例えば Evans 論文の Figure 7 や 8）。Vieth らは、Vieth 論文に対する批評を書くことを決心した大きな理由

Evans 論文の存在を認識している（つまり⑧）にもかかわは、⑧だと判断したためである。もし彼らが Evans 論文らず、⑨の事実に触れることなく⑦を述べているのである。

を引用していなければ、我々は⑪を考慮して批評論文を書125

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くことはなかった。我々は私信で Vieth らとやりとりをしく非対称のシナリオで）Effect size＝70 ～ 80% を採用してていないため真意は不明であるが、おそらく彼らは Evans

いれば、たとえ批評論文を書いていたとしてもそのロジッ論文の詳細（つまり⑨）までは把握しきれていなかったもクに苦労したであろう。理由は、Evans 論文の Figure 7のと思われる。しかしもし仮にそうであったとしても、⑫の非対称シナリオによれば、Effect size＝70 ～ 80% で最論文の第一義的な責任の所在は著者らにある。研究者は⑩も性能が高いのは DEGES でも TMM でも MR でもなくを常に意識すべきであろう。

Total Count だからである。これは、第 15 回でも紹介した CPM 補正と実質的に同じ基本的な正規化法に相当する査読者の果たすべき役割ものである。ただし、Total Count は対称のシナリオでは一貫して劣っている点にも注意せねばならない（Evans論文の査読に対する考え方はヒトそれぞれだと思われる論文の Figure 7 の下半分）。このように、Evans 論文のが、たとえ C’ のような存在意義の疑わしい論文であった

Figure 7 を眺めるだけでも、シナリオ次第で精度の高いとしても、ミスや疑念を建設的に指摘する使命感をもって方法が変わりうることがわかる。

査読が行われるのが理想である。例えば、我々の批評論

我々の DEGES 正規化法は、2010 年に出版された TMM

文の核心部分である「④・⑤・⑥・⑨」は、本来査読の時正規化法にヒントを得たものである。TMM のアルゴリ

点で適切に指摘がなされるのが理想である。また、⑬否定

ズムは、DEG の発現パターンが対称の場合にはうまくい文とすべきところが肯定文になっているようなミスがもくが、非対称の場合には理論上うまくいかない（ことに気しあれば、それに気づき適切に指摘するのが査読者の役づいた）。それゆえ、対称のシナリオでの理論性能は同じ割であろう。しかしながら、Vieth 論文中には⑬のミスがだが、非対称の場合でもうまくいくように設計したのがIntroduction の第 3 段落中に存在する 5）。この種のミスは、DEGES のアルゴリズムである。しかしながら、DEGESある程度経験を積んだ研究者であれば、自己修正した上で開発当時（2010-2011 年）は今回の主要なトピックである読み進めることができる。しかし、学術論文の記載内容を非対称なシナリオが DEG の発現パターンとして存在しう読み解く能力がまだそれほど高くないものにとっては、理ることが想定されていなかった頃である。そのため、査解を妨げる大きな混乱のもととなる。世界中の学術論文の読者から「本当に非対称となるような事例が存在するの内容を学習し知識の体系化を行うような取り組みを行う上か？」と指摘され、「そのようなシナリオの場合でも理論でも、情報源側のミスをできる限り取り除くことが非常に上うまくいくのが提案手法だ。」と反論したことを今でも重要である。

よく覚えている。

⑫の大前提のもとでではあるが、今回 Vieth 論文の査読者全員が⑬のミスに気付かなかった点も非常に残念であDEGES 論文の Table 1 では、Effect size（論文中ではP DEG と表記）が 5%・10%・20%・30% の 4 通り、そしてる。もし我々の批評論文の核心部分である「④・⑤・⑥・

DEG の発現変動パターンが対称（P A＝50%）から完全非対⑨」の一部でも査読者が適切に指摘し、Vieth らがそれに称（P A＝100%）までの 6 通りのシナリオ（計 4×6＝24 通

誠実に対応できていれば、今回のような痛烈な批判を受けり）で、（a）DEGES（論文中では edgeR/TbT と表記）とずに済んだかもしれない。

（b）TMM（論文中では edgeR/default と表記）の性能評価を行っている。DEGES はどのシナリオでも安定した性おわりに能を示す一方で、TMM は対称（表の左側）から完全非対称（表の右側）になるにつれて徐々に性能が低下している

今回の内容は手法開発者側の視点で書いたが、大半の読ことがわかる。そしてその低下の度合いは、Effect size が者はエンドユーザ側である。また、一般には一読者として大きいほど顕著であることもわかる。つまり我々は、2012かかわる論文数のほうが、著者や査読者としてかかわる論年にはこのような知見を bulk のシミュレーションデータ文数よりも圧倒的に多いだろう。しかしながら、今回紹介ですでに得ていたということである。それゆえ、Vieth らしたような事例はどの分野においても多かれ少なかれ存在のシミュレーション条件で性能評価を行えば、Effect sizeする。そのため、著者側に期待する高い倫理観や査読者側＝60% で非対称なシナリオの場合に「⑦正規化は結果に与に期待する高い使命感だけではなく、（この原稿を含めて）えるインパクトが最も大きい」となるのはごく当たり前の読者として論文を批判的に読み解く姿勢も重要である。例こととして受け止められるのである。逆に、対称なシナリえば、⑨は「Evans らによる性能比較結果で “DEGES がオの場合には正規化法の違いによる性能差が理論上出にく抜群の性能を示すギリギリの範囲” を Vieth らがたまたいため、必然的に正規化法以外のものが議論の対象になるま採用していたおかげで、運よく非常にスッキリとしたのも当たり前である。また、もし Effect size が 10% 程度

ロジックで批評論文を書くことができただけではないの

以下で評価が行われれば、「対称・非対称であろうと正規か？」と勘ぐってほしい。

化法の違いは性能にほとんど影響しない」という知見が得られるであろう。論文の結論の文章だけに着目している

これは実際そうである。もし Vieth らが（対称はともか
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Vol. 32, No. 3と、矛盾する知見が得られうる。読者は、結論が導きださDEGES を比較対象に加えるべきだという点までであり、れた解析条件にも注意を払わねばならない。

Vieth らが推奨する scran や SCnorm よりも優れているとEvans 論 文 の 結 果 に 着 目 す る と、Effect size が 60%までは主張していない点に注意してほしい。Lieberman

程 度 以 下 で あ れ ば DEG の 発 現 変 動 パ タ ー ン に よ ら ずらが間接的に述べているように 24）、あくまでも scRNA-DEGES が最もよい性能を発揮すると解釈してよい。30%

seq 用の正規化法が bulk 用のものよりも優れていると主以下の範囲に限定すれば、さらにそれを DEGES 論文が補張できなくなっただけにすぎない（DEGES is competitive

強する形となる。ただし、2019 年に出版された書籍 21）でwith scRNA-seq normalization methods）というのが正しも言及しているが、我々は 50% 以上の DEG を含むようない現状認識であろう。データの正規化は、マイクロアレイデータをそもそも想定していない。それゆえ、今でも「70の時代から今日まで継続的に議論されている。実際、我々～ 95% という異常に高い Effect size のシナリオまで含めの大学院生向けの講義においても、時間の関係上省略するて考えると DEGES はそれほどでもない（原文：DESeqと必ず不満が出るほどである。次回は、コロナ渦で激変しand TMM generally perform well）」と も 読 み 取 れ る

た我々のバイオインフォマティクス教育の取り組み全般にEvans 論文の内容には同意しかねる部分も存在する。しかついて紹介する予定である。

しながら実際には、③や④という Effect size の大きなも謝のだけでなく、非対称なリアルデータも存在する 22-23）。このことを踏まえれば、現在我々が非常識だと思っているシ

辞
本連載の一部は、JSPS 科研費 18K11521 の助成を受けナリオに合致したリアルデータも既に存在するのかもしれたものです。

ない。
利益相反（COI）

Vieth 論文は、scRNA-seq が主流になった現在においても依然としてデータの正規化が重要であることを示し

門田幸二、清水謙多郎：本論文発表の内容に関連して開た点で意義はある。また、我々の批評論文はあくまでも示すべき COI 状態はない。		
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Methods for analyzing next-generation sequencing data
XVI. Why are new methods being developed
one after the other?
Koji Kadota1, 2, 3, Kentaro Shimizu1, 2, 3Interfaculty Initiative in Information Studies, The University of Tokyo.
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo.
3
Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology,
The University of Tokyo.
12		Abstract

We often hear people say, “There are so many programs out there with the same purpose, I don’tknow which one to use.” One possible reason is that there are various evaluation criteria. For example,
even if the performance of a method is less than or equal to that of a conventional method, it is still
considered valuable if it is much faster than the conventional one. There are many differential expression
methods that are more powerful under certain conditions, such as a large (or small) number of replicatesin the same group. In reality, however, there are some methods whose value is questionable. This isprobably due to the fact that the comparison has been biased toward representative methods. In thispaper, we explain why such methods can exist, using our experience in the field of RNA-seq differential
expression analysis as an example. Supplementary materials are available online at: http://www.iu.a.utokyo.ac.jp/kadota/r_seq2.html#about_book_JSLAB.

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