2021年10月26日

増殖抑制と薬剤抵抗性改善作用をもつ

大腸がん治療薬岐阜薬科大学
生命薬学大講座 生化学研究室
五十里 彰
1

がんの統計データ
日本におけるがんデータ
がんによる死亡者数：37.4万人（2018年）
大腸がんが女性で最多（男女計で第2位）
がんの医療費抗がん剤市場： 4.5兆円（2018年）← 全体の14.4％： 1.2兆円 → 2025年には1.5兆円(予測)平成30年 厚生労働省 人口動態調査
国立がんセンターがん対策情報センター
富士経済

世界におけるがんデータ
がんの罹患数：1810万人（2018年）
大腸がんの患者数 ： 180万人（2018年）
がんによる死亡者数： 960万人（2018年）
がんの医療費： 60兆円
World Cancer Report 2020

2大腸がんの薬物療法の変遷
1950
5-FU
(1957-)

2000
5-FU+ロイコボリン(1980-)

IFL療法

イリノテカン(1994-)

FOLFIRI療法

オキサリプラチン(2002-)
ベバシズマブ (2004-)
セツキシマブ (2004-)

分子標的薬療法

パニツムマブ (2006-)
ラムシルマブ (2015-)
ペムブロリズマブ(2018-)

臓器別治療

免疫CP療法ゲノム医療3

がん治療の問題点
1. 既存の抗がん剤に対して低感受性のがん（難治がん）が存在する。

分子標的薬の治療対象となる大腸がん患者は約40％
2. 抗がん剤抵抗性（耐性）を改善する治療薬がない
P-糖タンパク質阻害剤：ゾスキダル
3. がんの再発を予防する薬がない
既存抗がん剤の感受性を回復・亢進させる薬剤が治療奏功率を向上させ、医療費の高騰を防ぐ。
4

治療抵抗性の獲得機序

5

がん微小環境の形成による治療抵抗性の獲得
酸素

栄養素
抗がん剤

低酸素度の亢進
低栄養度の亢進

抗がん剤濃度の低下

微小環境内部のがん細胞は✓ ストレス環境により薬剤抵抗性が高い✓ 親水性薬剤の透過性が低い✓ 高分子量の薬剤の透過性が低い

不完全な毛細血管

がん微小環境新たな標的分子と薬剤の開発 6

クローディン（CLDN）の特徴
タイトジャンクションの構成因子

タイトジャンクション
上皮細胞• CLDN1～27• オクルディン

タイトジャンクションの役割

上皮系

間様系

• 細胞増殖の制御• 分化の制御• 細胞間透過性の制御

細胞間接着構造の消失による上皮間葉転換 (EMT)が、増殖・浸潤・転移能の獲得に重要である。
Zhang X et al., Cytoskeleton (2017)

CLDNの発現は低下するのか？
7

がん組織におけるCLDNサブタイプの異常発現
多くの固形がん組織でCLDNsが高発現する
CLDNs

組織

CLDNs

組織

CLDN1

大腸、胃、前立腺、肝臓、膵臓

CLDN7

胃、大腸、舌、卵巣
甲状腺、乳房、肝臓

CLDN2

大腸、肝臓、食道

CLDN9

胃

CLDN3

胃、肺、腎臓、精巣、卵巣

CLDN10

肝臓、肺

CLDN12

大腸

腎臓、精巣、卵巣、肺、胃、膵臓、甲状腺

CLDN16

卵巣、乳房

CLDN18

肺、膵臓

CLDN4
CLDN5

肺、膵臓

CLDN6胃Tabaries S et al., Oncogene (2017)
Ding L et al., Canc. Manag. Res. (2013)

正常組織に未発現・低発現のCLDNサブタイプが高発現することにより、がん細胞のタイトジャンクションの機能を8変化させる。

肺がん治療の新たな分子標的：CLDN2Lung Cancer cDNA Array（OriGene 社）

扁平上皮がん

大細胞がん

小細胞がん

ステージ
III
III
IV
IIIIII
IV
III
III
I
III

21
812411104121112

リアルタイムPCR解析
Relativelevelofclaudin-2mRNA
CLDN2
ofmRNA量
level
Relative
CLDN2

男性
女性
正常
がん種
腺がん

患者数
5931
122015**1050織組肺常正んんんんがががが胞胞
腺皮細細上大小平扁Ikari A et al., Biochim. Biophys. Acta (2012)9本技術に関する知的財産
肺腺がん細胞におけるCLDN２の発現を低下させ、抗がん剤抵抗性を改善する新しいタイプの抗がん剤を開発した。

発明の名称：抗がん剤抵抗性改善作用を有する
クローディン-２結合性低分子化合物の開発
出願番号：特願2020-18075

出願人：岐阜市
発明者：五十里 彰、松永 俊之
10がん組織におけるCLDNサブタイプの異常発現
多くの固形がん組織でCLDNsが高発現する
CLDNs

組織

CLDNs

組織

CLDN1

大腸、胃、前立腺、肝臓、膵臓

CLDN7

胃、大腸、舌、卵巣
甲状腺、乳房、肝臓

CLDN2

大腸、肝臓、食道

CLDN9

胃

CLDN3

胃、肺、腎臓、精巣、卵巣

CLDN10

肝臓、肺

CLDN12

大腸

腎臓、精巣、卵巣、肺、胃、膵臓、甲状腺

CLDN16

卵巣、乳房

CLDN18

肺、膵臓

CLDN4
CLDN5肺、膵臓CLDN6

胃Tabaries S et al., Oncogene (2017)
Ding L et al., Canc. Manag. Res. (2013)

各がん組織でCLDNサブタイプの発現パターンが異なる。
11大腸がん治療の新たな分子標的：CLDN14
Lung Cancer cDNA Array（OriGene 社）
人数

健常者

3

大腸がん患者

95

CLDN15

CLDN14

CLDN12RKO

HCT116

HCT15

CLDN14

CLDN100

Lovo

10

Caco-2

ヒト大腸がん由来培養細胞
DLD-1

ウエスタンブロット解析

15

CLDN1mRNA比（がん／正常）

リアルタイムPCR解析

b-Actin12

CLDNの細胞局在
蛍光免疫染色解析

10 mm

CLDN14は裏打ちタンパク質のZO-1とともに細胞の隣接部位に分布していた。CLDN14発現のノックダウンにより、CLDN1の細胞分布は変化しなかった。
13CLDN14の病態生理機能 ①細胞増殖に対する CLDN14ノックダウン (KD) の効果si-Negative
si-CLDN1420**
10**Cell cycle (%)

300**

40**

30NS

CLDN14KDは増殖能 down

2010048

SG2/M72 (h)si-Negative
si-CLDN14150p-ERK

p-Akt

ERKAktタンパク質量 (%)

si-Negative

si-CLDN14

si-Negative
si-CLDN14**

G0/G124

si-Negative50

si-CLDN14

細胞数 (x103)

4010050

CLDN14KDは増殖シグナル down**

0p-ERK

p-Akt
14CLDN14の病態生理機能 ②細胞移動に対する CLDN14 KDの効果

CLDN14KDは移動能 downmRNA量 (%)

150

MMP-2

MMP-9TIMP

NSNS100**50

CLDN14KDは移動促進因子 down015CLDN14の病態生理機能 ③
スフェロイドの低酸素ストレスに対する CLDN14 KDの効果

CLDN14KDは低酸素度 down

スフェロイドの抗がん剤抵抗性に対する CLDN14 KDの効果
si-CLDN14si-Negative

**

140

##

12010080

si-Negative

si-CLDN14120
細胞生存率 (%)

ドキソルビシン
蓄積率 (%)

160

10080

**

6040

##

CLDN14KDは蓄積 up
感受性 up200－＋＋ ドキソルビシン－＋＋ ドキソルビシン－－＋ si-CLDN14－－＋ si-CLDN1416

CLDN14の病態生理機能 ④
ストレスシグナルに対する CLDN14 KDの効果

Nrf2b-Actin

Relative mRNA levels (%)

B
Nrf2 protein level (%)

A150100**
500150HO-1100

NQO-1GCLM

*

*

**

CLDN14KDはストレス down500

高発現幹細胞

CD133Nanog
Oct4

Relative mRNA levels (%)

幹細胞の生存に対する CLDN14 KDの効果
150

10050CD133Nanog

**

**

Oct4*

CLDN14KDは幹細胞 down017CLDN14発現低下薬に期待される効果① 増殖細胞に対して、増殖・移動能の阻害－
CLDN14発現低下薬－耐性化細胞② 微小環境細胞に対して、抗がん剤耐性の改善
がん再発の予防
幹細胞

しかし、CLDN14発現低下薬は国内外で未開発である。 18

CLDN14結合性低中分子化合物の探索
ドッキングシミュレーション

細胞毒性解析
細胞生存率 (%)

1401201008060402001 10#11 10#41 10#5

1 10#6

1 10#7

1 10#8

1 10#91 10#10200150

100

#10

#9#8#7#6#5#40

#350

#2

CLDN14タンパク質量 (%)(e-Drug3D、約1,700個)

1 10#3ウエスタンブロット解析

CLDN14ドッキングモデル

化合物の順位付け

1 10
#2

#1019

#6の濃度依存的効果
リアルタイムPCR解析

510

CLDN14

CLDN1

b-Actin

150
NS100NS

NS

NS

**
50**

00

1

5

#6 (mM)

10150

CLDN14
CLDN1NSNS

100500#61

CLDN14CLDN1CLDN mRNA量 (%)

0

CLDNタンパク質量 (%)#6 (mM)

Vehicleウエスタンブロット解析#6は、濃度依存的にCLDN14のタンパク質量を低下させたが、CLDN1は影響を受けなかった。また、mRNA量も変化しなかった。
20

リソソーム阻害剤の効果
ウエスタンブロット解析

蛍光免疫染色解析#6Veh Veh CQ
CLDN14

CLDN14タンパク質量 (%)

b-Actin15010050##**

0Veh Veh CQ#6CQ：リソソーム阻害剤#6はリソソームにおけるCLDN14の分解を促進した。

10 mm21

CLDN14と#6の結合
水晶振動子マイクロバランス (QCM) 解析

NAPiCOS
日本電波工業#6#6#6は
CLDN14に結合
30

 Frequency (Hz)

BSA

BSA

BSA

CLDN14

CLDN14

CLDN14#6 or BSA

20
#610BSA

0-10

センサーチップ

020

406080Time (s)

CH1

CH222

#6の抗がん効果 ①細胞増殖に対する#6の抑制効果
Vehicle
#6**

**

**

Cell cycle (%)

2010Vehicle

ERK40**

Akt#6は増殖能 down**302010G0/G1SG2/MVehicle#6150p-Akt

NS072 (h)タンパク質量 (%)

48

#624

#60p-ERKVehicle#65030Vehicle

細胞数 (x103)

40NS100#6は増殖シグナル down*

500p-ERK

p-Akt

23

#6の抗がん効果 ②細胞移動に対する#6の抑制効果
624 (h)#6Vehicle

24時間の移動能 (%)

0403020**#6は移動能 down

10Relative mRNA levels

01.5

1.00.5

MMP-2**

MMP-9TIMP

NSNS#6は移動促進因子 down024

細胞間透過性に対する#6の効果
イオン透過性

低分子透過性

電気抵抗低分子化合物

イオン

傍細胞経路

0タイトジャンクション

400300**200
1000Veh#6C1.5**1.00.50Veh#6低分子透過姓：
ドキソルビシン (mM/h)

B
低分子透過姓：
ルシファーイエロー (mM/h)

電気抵抗値 (W·cm2)

A108

**

64

#6は電解質透過性 up
低分子透過性 up

20Veh

#625

抗がん剤感受性に対する#6の効果 ①
低酸素ストレス（3D）#6はストレス down

抗がん剤感受性（3D）
250

Mock
#6

##
##

200
NS150

*

**

100
5000Mock
#6120

510

ドキソルビシン (mM)

20

細胞生存率 (%)

ドキソルビシン
蓄積率 (%)

300

NS100

#

**
##80

**
##

6040

#6は蓄積量 up
感受性 up2000510

ドキソルビシン (mM)2026

抗がん剤感受性に対する#6の効果 ②
抗がん剤感受性（3D）
HCT116細胞生存率 (%)

120Veh#6NS##10080** ## **##6040120

細胞生存率 (%)

A200100110** #5010080** ##60402000NS NSVeh#6200300

オキサリプラチン (mM)

ドキソルビシン (mM)

B LovoNS##10080** ## **
##

6040

100

600010

ドキソルビシン (mM)

20##40201**80200Veh#6120

細胞生存率 (%)

細胞生存率 (%)

120Veh#6#6は感受性 up

050

**

##

** ##

100300

オキサリプラチン (mM)27

#6の効果とメリット#6
バリアの破壊✓ 大腸がん細胞の増殖を抑制✓ 大腸がん細胞の移動を抑制✓ 抗がん剤感受性を亢進✓ 幹細胞数を減少

抗がん剤#6は大腸がん細胞の増殖抑制と薬剤抵抗性改善作用をもつ新しいタイプの抗がん剤である。
✓ 化学合成が可能である✓ 製造コストが安い✓ 高い品質が保証される✓ 免疫原性が低い✓ 細胞間を通過しやすい 28

本技術に関する知的財産

発明の名称：抗癌剤

出願番号：特願2021-043591
出願人：岐阜市

発明者：五十里 彰、松永 俊之

29

#6の利用拡大
CLDN14の高発現が原因となる疾患の治療薬としての利用
他臓器がんへの利用

肝臓がん治療薬

肝臓がん組織にCLDN14が高発現する。
Li CP et al., Carcinogenesis 37, 557-566 (2016)

Ca2+ホメオスタシスとCLDN14の関係

Ca2+再吸収の機能改善

副甲状腺機能低下症患者では、腎尿細管のCLDN14発現が増加し、Ca2+再吸収が抑制される。
Sato T et al., PNAS 114, E3344-E3353 (2017)遺伝性難聴とCLDN14の変異の関係

遺伝性難聴の病態解明

CLDN14をコードする遺伝子の変異は常染色体劣性難聴DFNB29の原因となる。
Wilcox ER et al., Cell 104, 165-172 (2001)30

お問い合わせ先岐阜薬科大学

生化学研究室教授・五十里彰

TEL: 058-230-8124

E-mail: ikari@gifu-pu.ac.jp
岐阜薬科大学

知的財産評価委員会事務局

TEL: 058-230-8100
FAX: 058-230-8105
E-mail: syomuk@gifu-pu.ac.jp
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