枯草菌における標的遺伝子の高発現翻訳系の開発
河村富士夫（立教大学 理学部）
研究の目的
有用物質の高生産系を開発することは発酵産業において極めて重要な課題である。その解決策の一つには、タンパク質の合成装置であるリボソームを改変し、有用物質のみを長時間にわたり高生産可能な翻訳系の構築が挙げられる。
この翻訳系を構築するには、細胞内におけるリボソーム量の制御機構や翻訳制御機構を把握した上で標的遺伝子の高発現系を構築する必要がある。しかしながら、このような知見は殆ど得られていない。
この機構には、リボソームの主な構成成分であるrRNAが深く関与していると考えられることから、本研究では、枯草菌の各rRNAオペロンの転写活性、緊縮応答に重要な役割を果たす３種のppGpp合成酵素をコードするrelA, yjbM, ywaC遺伝子の欠失変異が与えるrRNAオペロン転写活性への影響、ならびにリボソーム形成量への効果を定量的に測定した1)。

方法
本研究では、Bacillus subtilis 168 株を親株（野生株）として使用し、7 つの rRNA オペロン(rrnO, -A, -J, -I, -D, -B, -E)のプロモーターの下流にプロモーターとターミネーターを欠く cat 遺伝子を導入した変異株を構築した（図１）。これらの変異株への relA
欠失は RIK900(trpC2 relA::erm)の DNA を用いてエリスロマイシン形質転換体を選択することにより行った。同様に、RIK908(trpC2 ywaC::spc)と RIK1000(trpC2 ∆yjbM)に catpt1 を形質転換で導入し、さらに relA::erm を導入して二重変異株を構築した。

rrn オ ペ ロ ン の 下 流 に catpt1 を も つ 三 重 欠 失 変 異 株 は RIK1002(trpC2 ∆yjbM

図１．rrn オペロンのプロモーター領域の塩基配列

ywaC::spc)から同様にして構築した。
リボソームの形成量はショ糖密度勾配超遠心法により解析した。37℃LB液体培地でOD600 = 0.2 まで振とう培養で増殖させた細胞を遠心で集め、フレンチプレス(Aminco)で細胞を破壊した後、低速遠心により細胞残渣を除きその上澄を粗抽出液とした2)。培養液のOD600 値が 3.09 に相当する粗抽出液を 10%-40%のショ糖密度勾配超遠心（Hitachi P40ST ローター, 65,000 x g, 17.5 時間, 4℃）でリボソームを分離した。

結果
relA欠失変異をサプレスする２種類の変異の単離と同定。relAの欠失変異株はLB培
地で培養した時に親株に比べて増殖速度がかなり低下していたが、新たな(p)ppGpp合成酵素をコードするyjbM やywaCの遺伝子の変異を導入するとその増殖速度が回復した１)。relA欠失変異株からしばしば増殖速度の回復した２種類のサプレッサー変異株が出現する。我々は 35 のサプレッサー変異株を単離し、遺伝解析ならびに塩基配列の決定を行った結果、16 株がyjbM遺伝子、残りの 19 株がywaC遺伝子の突然変異であることが判明した。点変異、付加や欠失変異など様々な突然変異が観察されたが、付加変異はyjbMにのみ、また欠失変異はywaCにのみ見られた。これらのサプレッサー変異はrelA変異株の増殖速度を完全に回復させることはなかった。このことは、relA変異株の完全な増殖回復がrelA yjbM ywaCの三重変異株でのみ認められた以前の報告と一致する３)。
さらに、relA欠失変異株から得られたサプレッサーはすべてyjbMかywaCのいずれかの突然変異であったことは、枯草菌にはRelA, YjbM, YwaC以外には(p)ppGpp合成酵素が存在しないということを強く示唆する。SrivatsanらもrelAのサプレッサー変異の同定に関する実験では同じような結果を報告している４)。
70S リボソーム形成への relA 変異とそのサプレッサー変異の効果。relA 変異株における増殖阻害は rrn オペロンの転写が低下しているために起きている可能性を探るため、

relA 変異株と yjbM か ywaC、もしくは yjbM と ywaC の両方の変異を導入した relA
変異株における 70S リボソームの形成能を 10%-40%のショ糖密度勾配超遠心法で調べ親株と比較した（図２）。relA 変異株の 70S リボソームの量は親株に比べて明らかに少なくなっていた。relA 変異株で見られる 30S, 50S, 70S 粒子のプロファイルから判断す
ると、リボソームの形成過程ではなく rRNA オペロンの転写活性が低下することにより、リボソーム量の低下が引き起こされているものと考えられる。relA 変異株の 70S
リボソームの量は、yjbM もしくは ywaC との二重変異株では部分的に回復しているが、yjbM と ywaC の両方をもつ三重変異株ではほぼ完全に回復していた（図２）。このことは、relA 変異株に yjbM と ywaC の変異が入ると rRNA オペロンの転写活性が回復し、その結果増殖速度も回復したことを示唆するものと思われる。

relA 変異株において転写活性を失った各 rrnP1 プロモーターからの転写がサプレッサー変異により回復する。各 rrn オペロンのプロモーターの下流に catpt1 を導入した
株を用いて、まず relA 変異における各 rrn オペロンの転写活性を調べた。すべての rrnオペロンのプロモーターは GTP で転写が開始されていた。また relA 変異株では調べたすべての rrn オペロンの P1 プロモーターからの転写が阻害され、さらに rrn-A, -D, -E, -J
オペロンの P2 プロモーターからの転写もかなり阻害されていた（図３）。一方、その他の rrn オペロンの P2 プロモーターおよび rrnE の P3 からの転写活性はほとんど影響を受けていなかった。yjbM もしくは ywaC の変異が導入された relA 変異株では各rrn オペロンの P1 プロモーターからの転写活性が部分的に回復しており、さらに yjbMと ywaC の両方をもつ三重変異株ではすべての rrn オペロンのプロモーターからの転写活性は親株と同じくらいに回復していた（図３）。

結論
relA 変異株における 7 つの rrn オペロン(rrnO, -A, -J, -I, -E, D, -B)の転写活性を、プロモーターとターミネーターを欠く cat 遺伝子を rrn プロモーターの下流に導入して調べた。その結果、各 rrn オペロンのすべてのプロモーターからの転写は GTP で開始されており、P1 プロモーターからの転写が劇的に低下していた。
この転写阻害は relA yjbM

ywaC の三重変異株でほぼ完全に回復していた。これらの結果と以前の報告を考慮に入れて考えると、relA 変異株では ppGpp の合成酵素である YjbM や YwaC が機能し GTP濃度が低下し、rrn オペロンからの転写の低下を引き起こすものと考えられる。

図３．各変異体における rrn オペロンの転写活性文献1) Natori, Y., Tagami, K., Murakami K., Yoshida S., Tanigawa, O., Moh, Y., Masuda, K., Wada,T., Suzuki, S., Nanamiya, H., Tozawa, Y., and Kawamura, F. Transcription activity ofindividual rrn operons in Bacillus subtilis mutants deficient in (p)ppGpp synthetase genes,relA, yjbM, and ywaC. J. Bacteriol., 191: 4555-4561 (2009).
2) Natori, Y., Nanamiya, H., Akanuma, G., Kosono, S., Kudo, T., Ochi, K., and Kawamura, F. A
fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis. Mol.
Microbiol. 63: 294-307 (2007).
3) Nanamiya, H., Kasai, K., Nozawa, A., Yun, C. S., Narisawa, T., Murakami, K., Natori, Y.,
Kawamura, F., and Tozawa, Y. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp
synthetase genes in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67: 291-304 (2008).
4) Srivatsan, A., Han, Y., Peng, J., Tehranchi, A. K., Gibbs, R., Wang, J. D., and Chen, R.
High-precision, whole-genome sequencing of laboratory strains facilitates genetic studies.
PLoS Genet. 4: e1000139 (2008).