福岡県保健環境研究所年報第43号，114－117，2016

短報
2015年2月の市販カキから検出されたノロウイルスGII.17の分子疫学解析
吉冨秀亮・芦塚由紀・野田衛*
2015年2月の市販カキからノロウイルスGII.17の検出を行い、ポリメラーゼ遺伝子およびカプシドVP1遺伝子を解析し、2013年および2015年の食中毒由来GII.17と比較した。遺伝子増幅およびシークエンス解析は独自に設計したGII.17特異的プライマーにより行った。その結果、カキから検出された
GII.17のアミノ酸配列は2015年の食中毒由来GII.17と99%一致した。一方、2013年の食中毒由来GII.17と比較すると、カプシドVP1遺伝子のP2ドメインにアミノ酸変異が認められた。このことから、カキ中のGII.17は2014/15シーズンの市中で検出されたGII.17と関連があり、2015年のGII.17の流行拡大は2013年以降のカプシドVP1領域の変異が一因であることが示唆された。
［キーワード：カキ、ノロウイルスGII.17、分子疫学解析］
１(Roche)を用い、cDNAの合成はHigh Capacity cDNA Reverse

はじめにノロウイルスGII.17は2014年12月から2015年5月の期間Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific)を用いた。

1)2)

糞便検体は2013年および2015年の食中毒事例の5検体をに日本国内において流行した。2015年2月に川崎市において検出されたGII.17 (Kawasaki308株）の解析により、

材 料 と し た 。 糞 便 の RNA抽 出 は QIAamp Viral RNA mini

2014/15シーズンのGII.17は新たな変異株であったことがKit(QIAGEN) 、 cDNA 合 成 は SuperScript III Reverse

松島ら3)によって報告された。しかし、食中毒の一因とさTranscriptase (Thermo Fisher Scientific)を用いた。

れるカキ中のGII.17の浸淫状況はこれまで報告されていない。さらに、カキ中には複数の遺伝子型のノロウイルス

２・２

遺伝子増幅が混在する可能性があるため、クローニング法による解析

GII.17のポリメラーゼ領域およびカプシドVP1領域を特が汎用されるが4)、この方法はダイレクトシークエンス法

異的に増幅するプライマーは、G2SKFプライマーを除き、と比較して煩雑である。そこで、本研究ではGII.17のカキ独自に設計した（表1）。これらのプライマーを用いてへの浸淫状況の把握を目的として、GII.17特異的増幅プラ

Nested PCR法により各遺伝子領域を増幅した。1stPCR反応

イマーの設計および分子疫学解析を行ったので報告する。

はPrimeScript II High Fidelity One Step RT-PCR Kit

２98℃ 10秒、60℃ 15秒、68℃ 2分(40サイクル)→68℃ 7(Takara Bio)を用い、45℃ 15分,94℃ 2分(1サイクル)→
方法

２・１分 (1 サ イ ク ル ) の 反 応 条 件 で 行 っ た 。 2ndPCR 反 応 は材料

カキは2015年2月に県内で購入した市販カキ6ロット（生PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio)を用い、98℃

食用4ロット、加熱用2ロット、全て県外産）を検査材料と10秒、60℃ 15秒、68℃ 2分(40サイクル)→68℃ 7分(1サした。カキ1個あたり中腸腺を1g～2.5g採取し、9倍量のイクル)の反応条件で行った。

PBS(-)を加え、粉砕処理した後、α-アミラーゼ（Wako）を10mL当たり25mg添加し、よく混和した後、37℃で1時間

２・３

分子疫学解析静置した。フィルター付き滅菌バッグを用いて濾過し、濾PCR増幅産物は精製後、BigDye Terminator v3.1 Cycle

過液10mLを10,000rpm、20分間、4℃で遠心分離し、上清をSequencing Kit (Applied Biosystems)によりダイレクト35,000rpm、2時間、4℃で超遠心分離した。上清を取り除シークエンスを行い、3500xlジェネティックアナライザ

き、沈渣を0.5% Zwittergent (Merk) 400µL で再浮遊させ(Applied Biosystems)を用いて塩基配列を決定した。決定た。RNA抽出およびDNase処理はHigh Pure Viral RNA Kit

した塩基配列はGenBank/EMBL/DDBJ データベ－スに登録し、アクセッション番号を取得した（LC101778-LC101788）。

福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）* 国立医薬品食品衛生研究所（〒158-8501 東京都世田谷区上用賀 1-18-1）

また、比較する参照配列は松島らの報告 3) を参考に、
GenBank/EMBL/DDBJ データベ－スから入手した。系統解析

-114-

表1

GII.17 特異的増幅プライマーおよびシークエンスプライマ－

Polarity*

Sequence (5'-3')MethodPolymerase region
GII.17 POL-386F
GII.17 POL-276F
GII.17 Cap517R
GII.17 Pol343F
GII.17 Pol397R
GII.17 Pol563R+++-CACCACGTCCGGAAGAATGA
AGTTTACACCGCAGCACTCACGGCTGTTAGGCTGGTTACTATGGCCTTAAACCCACTCGG
TCACTAATCACCAACGGCCCCACAGGTCTYTGTGCGTGTG

1st PCR
2nd PCR
1st , 2nd PCR
Sequencing
Sequencing
Sequencing

Capsid VP1region
G2SKF
GII.17 Cap1889R
GII.17 Cap1543R
GII.17 Cap13F
GII.17 Cap517R
GII.17 Cap612R
GII.17 Cap1433F
GII.17 Pol589F++++

CNTGGGAGGGCGATCGCAA
ACCAATGGATCCCCTTGCTG
AGTGTCCATTAGCCGGAACAGACGCCGCTCCATCTAATGACGGCTGTTAGGCTGGTTACTAGGCCTAGTCAAAACCCTGCCCGATACGGGACGTACACTG
CCTCCCTACATGGACCCTCA

1st , 2nd PCR
1st PCR
2nd PCR
Sequencing
Sequencing
Sequencing
Sequencing
Sequencing

Primers

Ampliconsize (bp)

Nucleotide
position **Authors

1671
1561

3941-3960
4051-4070
5611-5592
4668-4687
4722-4703
4888-4869

This study
This study
This study
This study
This study
This study5049-5067
6982-6963
6630-6611
5106-5125
5611-5592
5705-5686
6526-6545
4914-4933

Kojima et al. (2002) 5)This study
This study
This study
This study
This study
This study
This study1934
1582*+; Forward primer,-; Reverse primer** 塩基配列番号は Kawasaki308 株 (Accession No: LC037415)に準拠した同一のクラスターに分類された。このことから、カキ中のはMEGA5ソフトウェアを用いて最尤法により行った。

GII.17は市中の流行と関連があることが示唆された。また、
３

カキに含まれるノロウイルスの解析により、そのシーズン結果
本研究において設計した GII.17 特異的プライマーによの流行遺伝子型の推測が可能であり、食中毒の発生予防のり、カキは 6 ロット中 5 ロット、糞便検体は 5 検体全てに基礎資料となることが示された。一方、IASR集計1)によるついて、ポリメラーゼ領域 759bp (253aa)およびカプシドGII.17の検出割合は2014年12月が0.6%（3/476）、2015年1

VP1 領域 1488bp (496aa)を決定することができた。

月が2.2%(11/495)であり、同時期の主流行株であるGII.4

ポリメラーゼ領域 253aa について、カキ中の GII.17 とおよびGII.3と比較して検出割合は小さい。このことから、2013 年および 2015 年の糞便由来 GII.17 を比較した結果、GII.17は不顕性感染率が他の遺伝子型と比較して高い可それぞれ 99% (252aa/253aa)および 100%一致し、同じクラ能性がある。GII.17による感染症または食中毒事例との関スターに分類された（図 1）。

連については今後の検討課題である。

カプシド VP1 領域 496aa について、カキ中の GII.17 と2015年2月のカキ中のGII.17と2013年の糞便由来GII.17

2015 年 の 糞 便 由 来 GII.17 を 比 較 し た 結 果 、 99%の比較を行った結果、ポリメラーゼ領域のアミノ酸配列は(494aa/496aa) 一致し、同じクラスターに分類された。一99%一致し、同じクラスターに分類された（図1）。このこ方、2013 年の糞便由来 GII.17 と比較した結果、アミノ酸とから、2013年以降のGII.17の増幅性は変化がないことが配列は 95% (471aa/496aa)一致し、異なるクラスターに分示唆された。一方、カプシドVP1領域のアミノ酸配列は5%類された（図 2）。25 個のアミノ酸変異のうち 23 個は P2程度変異しており異なるクラスターに分類された（図2）。

ドメイン内に位置し、さらにそのうち 10 個はエピトープ変異はP2ドメインに集中し、さらにエピトープ推定領域内推定領域内に位置していた（図 3）。に変異が認められた（図3）。このことから、2015年にGII.17が流行拡大は、2013年以降にカプシドVP1領域P2ドメイン４の変異によって抗原性が変化し、ホストの免疫を回避でき考察
本研究では、GII.17に対する特異的なプライマーを設計るようになったことが一因であることが示唆された。

することによって、クローニング法を用いず、ダイレクトノロウイルスの解析は従来、N/S領域約350塩基を解析しシークエンス法によりカキ中のGII.17を解析することがてきた。GII.17のN/S領域について2013年と2015年の検出できた。このことから、複数種類のノロウイルスが混在す株を比較すると、塩基配列の変異は認められるが、全て同ることが想定されるカキのような検体において、特定の遺義置換であった。このことから、GII.17のアミノ酸変異を伝子型のみを解析する場合は、特異的プライマーの設計が捉えるためには、本研究で解析したように、カプシドVP1有用であることが示された。

全領域を解析する必要がある。今後も、食中毒発生予防を2015年2月のカキから検出されたGII.17と2015年の糞便目的とし、市販カキを活用したノロウイルスの調査を継続

由来GII.17についてアミノ酸配列を比較した結果、ポリメして実施することにより、ポリメラーゼ領域およびカプシラーゼ領域およびカプシドVP1領域ともに相同性が高く、ドVP1領域の変異を早期に捉える必要がある。

-115-

図 1 ポリメラーゼ領域 (253aa)の系統解析結果★：カキから検出されたノロウイルス GII.17, ■：2015 年の糞便から検出されたノロウイルス GII.17●：2013 年の糞便から検出されたノロウイルス GII.17

図 2 カプシド VP1 領域 (496aa)の系統解析結果★：カキから検出されたノロウイルス GII.17, ■：2015 年の糞便から検出されたノロウイルス GII.17●：2013 年の糞便から検出されたノロウイルス GII.17-116-Name of Strain
FE21_2013
FE44_2014
FE47_2014
FE58_2014
FE20_2015
Oyster1-2015
Oyster2-2015
Oyster3-2015
Oyster4-2015
Oyster6-2015

図3

P・・・・・・・・・P・・・・・・・・・

217–225 (I)S V E S K・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・T・・・・・・・・・K・・・・・・・・・T・・・・・・・・・A・・・・・・・・・

291–298 (II)E T D HQ I N QQ I N QQ I N QQ I N QQ I N QQ I N QQ I N QQ I N QQ I N Q

Amino acid number (major epitopes)
359–363 (III)371–379 (IV)R D S P Q F V F R S N D N D・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ L ・ I S ・ ・ ・D・・・・・・・・・F・・・・・・・・・

Q・・・・・・・・・IVVVVVVVVVN・・・・・・・・・390–396 (V)D D G D・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・・ ・ D ・GGGGGGGGG

H・・・・・・・・・

GII.17 のカプシド VP1 領域 P2 ドメイン内のエピトープ推定領域におけるアミノ酸変異*アミノ酸配列番号は Kawasaki323 株 (Accession No: AB983218)に準拠した５まとめされた。

・GII.17特異的増幅プライマーの設計により、カキ中のGII.17のポリメラーゼ全領域およびカプシドVP1全領域を文献増幅が可能であり、ダイレクトシークエンス法により塩基

1)

病原微生物検出情報,

国立感染症研究所

http://www.nih.go.jp/niid/ja/iasr.html

配列を解析することができた。
・アミノ酸配列比較の結果、カキ中のGII.17は2015年糞便

2)楠原ら, IASR., Vol.36, 91-92, 2015由来GII.17と99%一致し、市中で検出されたGII.17と関連

3)

Matsushima Y et al, Euro Surveill., 20, 2015があることが示唆された。

4)

藤井ら, 広島市衛研年報., 34, 37-43, 2015

・2013年および2015年に検出されたGII.17のアミノ酸配列

5)Kojima S, Kageyama T, Fukushi S, et al. J Virolを比較した結果、カプシドVP1のP2ドメイン内のアミノ酸

Methods. 100(1-2), 107-114, 2002

が変異していたことが明らかになり、2015年の流行は抗原性が変化したことが原因の一つであると考えられた。
謝辞
本研究は、平成27年度厚生労働科学研究費補助金(食品の安全確保推進研究事業) 「食品中の病原ウイルスの検出法に関する研究」班（研究代表者：野田衛）において実施（英文要旨）

Detection and Genetic Analysis of Norovirus GII.17 in Oysters
Hideaki YOSHITOMI, Yuki ASHIZUKA and Mamoru NODA*Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan* National Institute of Health Sciences,Kami-yoga, Setagaya-ku, Tokyo 158-8501, JapanThe norovirus polymerase gene and capsid gene were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction

with

GII.17 specific primers designed for detection and phylogenetic analysis of the norovirus genome. Purified concentrates wereprepared from the stomachs and digestive diverticula of oysters collected in February 2015. In phylogenetic analysis, the aminoacid sequences of GII.17 in oysters showed high degrees of identity with the GII.17 that was detected in gastroenteritis outbreaks
in January and April 2015 . By contrast, the P2 domain in the capsid VP1 region of GII.17 from the oysters showed amino acidsubstitution differences when it was compared to GII.17 from a 2013 gastroenteritis outbreak. These results suggest that the GII.17
strain found in the oysters could have caused

the 2015 gastroenteritis outbreaks, and that mutations in the capsid VP1 region ofthis strain compared to the 2013 strain are a defining characteristic.
[Key words ; Oysters , norovirus GII.17, Phylogenic analysis]-117-