Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法プロトコール

Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法
プロトコール

作成 ︓ 2021 年 8 月 4 日
改訂 ︓ 2024 年 1 月 10 日

Public Interest Incorporated FoundationCiRA Foundation

Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法プロトコール

目次
1. iPS 細胞凍結ストックの解凍 .................................................................... 3
2. 培地交換 .......................................................................................... 5
3. iPS 細胞の継代（6 ウェルプレートから 6 ウェルプレートへ） ............................... 6
4. iPS 細胞の凍結（6 ウェルプレート）.......................................................... 9

参考資料 ............................................................................................... 111)

StemFit AK03N 培地の調製 ............................................................ 112)

0.5×TrypLE Select 溶液の調製 ...................................................... 113)

培養スケールに応じた試薬量、細胞播種数等 ........................................... 12

Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法プロトコール

iPS 細胞凍結ストックの解凍

【準備】
細胞 ：

iPS細胞の凍結バイアル



試薬 ：

iMatrix-511 （Laminin-511 E8）（ニッピ、892012）
10 mM Y-27632 （富士フィルム和光純薬、036-24023）
PBS （ナカライテスク、14249-24）
StemFit (AK03N)培地 （味の素）
トリパンブルー溶液 （シグマアルドリッチ、T8154）

器材 ：6ウェルプレート
15/50 mL コニカルチューブ
プラスチックピペット

【手順】
1.

培地、試薬の準備1)

作業開始30分前にStemFit培地を室温に置いておく。

2)

50 mLチューブに2 mLのStemFit培地を分注する。2 µLのY-27632溶液を添加し、よく混ぜる（最終濃度10 µM）。→” StemFit+Y培地”

2.

6ウェルプレートのコーティング

1)

50 mLチューブにPBSを必要量準備する（1.5 mL×ウェル数）。

2)iMatrix-511溶液を必要量（9.2 µL×ウェル数）準備し、1)のPBSに添加する。良く混合し、6ウェルプレート各ウェルに1.5 mLずつ添加する。

3)

すぐに6ウェルプレートを揺らして全体に行き渡らせた後、37°C、5% CO2インキュベーターで1時間以上静置する。

4)

インキュベーターからコーティング中の6ウェルプレートを取り出す。

5)

各ウェルにStemFit培地を0.75 mLずつ添加し、全体に良くなじませた後、除去する。

6)

コーティングしたウェルに StemFit+Y 培地を 1.5 mL ずつ加える。空いたウェルには PBS を 2 mLずつ添加する。

7)

全ての 6 ウェルプレートをインキュベーターに入れる。

3.

凍結細胞の融解

1)

恒温槽を37°C に温めておく。

2)

50 mLチューブにStemFit培地を5 mL分注する。

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3)

液体窒素保存容器からiPS細胞の凍結バイアルを取り出し、恒温槽で氷の塊が少し残る程度まで解凍する（約1分間）。

4)

StemFit培地を分注した50 mLチューブに、ステップ3）で融解した細胞懸濁液を添加する。遠心し（160 × g、23°C、5 min）、上清を取り除く。

5)

0.3 mLのStemFit+Y培地を加え、ピペッティング（6回）により細胞を懸濁する。

6)

細胞懸濁液10 µLにトリパンブルー溶液10 µLを加えて混合し、セルカウントを行う。
コーティングした 6 ウェルプレート１ウェル に 65,000 個の生細胞を播種する。すぐにプレートを揺らし、細胞を均一に広げる。顕微鏡で細胞を確認する。

7)

37°C、5% CO2インキュベーターで培養する。

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培地交換※培地から Y-27632を除くため、細胞融解後や細胞継代後の翌日には必ず培地交換を行う。

【準備】
細胞 ：

細胞を播種した6ウェルプレート



試薬 ：

StemFit (AK03N)培地 （味の素）

器材 ：プラスチックピペット

【手順】
1)

作業の30分前にStemFit培地を室温に戻しておく。

2)

顕微鏡で細胞の状態を確認し（細胞生着、iPS細胞様コロニーの有無）、必要に応じて写真を撮る。

3)

培地を除去し、StemFit培地を1ウェルあたり3 mL、静かに添加する（ウェルの壁を伝わらせるように）。

4)

37°C、5% CO2インキュベーターで培養する。

※培地交換の目安︔
6日目に継代する場合：Day1（細胞播種後1日目）、 Day4、Day5
7日目に継代する場合︓Day1、Day4、Day6

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iPS 細胞の継代（6 ウェルプレートから 6 ウェルプレートへ）

【準備】
細胞 ：

iPS細胞を播種した6ウェルプレート※※コロニーが大きくなり始めており、かつ大きくなりすぎていない状態を見計らって継代を行う。財団では、
通常、培養 6、7 日目に継代を行っている。
細胞状態の目安（Scale bar; 200 µm）

試薬 ：iMatrix-511 (Laminin-511 E8) （ニッピ、892012）
10 mM Y-27632 （富士フィルム和光純薬、036-24023）
PBS（ナカライテスク、14249-24）
0.5×TrypLE Select溶液
StemFit (AK03N)培地 （味の素）
トリパンブルー溶液 （シグマアルドリッチ、T8154）

器材 ：6ウェルプレート
15/50 mL コニカルチューブ
プラスチックピペット
セルスクレーパー【手順】
1.

培地、試薬の準備1)

作業開始30分前にStemFit培地を室温に置いておく。Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法プロトコール

2)

50 mLチューブに2 mLのStemFit培地を分注する。2 µLのY-27632溶液を添加し、よく混ぜる（最終濃度10 µM）。→「StemFit+Y培地」

2.

6ウェルプレートのコーティング

1)

50 mLチューブにPBSを必要量（1.5 mL×ウェル数）準備する。

2)

iMatrix-511溶液を必要量（9.2 µL×ウェル数）準備し、PBSに添加する。 良く混合し、各ウェルに1.5 mLずつ添加する。

3)

すぐにプレートを揺らして全体に行き渡らせた後、37°C、5% CO2インキュベーターで1時間以上静置する。

4)

インキュベーターからコーティング中のプレートを取り出す。

5)

各ウェルにStemFit培地を0.75 mLずつ添加し、全体に行き渡らせた後、除去する。

6)

コーティングしたウェルにStemFit+Y培地を1.5 mLずつ加える。 空きウェルにはPBSを2 mLずつ添加する。

7)

プレートをインキュベーターに入れる。

3.

継代

1)

顕微鏡で細胞の状態を確認し（細胞生着の様子、iPS細胞様コロニーの有無）、必要に応じて写真を撮る。

2)

培地を除去し、PBSを1 mL加える。プレートを揺らしながら細胞全体を洗浄したのち、PBSを除去する。

3)

0.5×TrypLE Select溶液 を1 mL加え、プレートを揺らし、全体に行き渡らせる。

4)

37°C、5% CO2インキュベーターで最長10分間反応させる。

5)

インキュベーターからプレートを取り出し、顕微鏡下で観察する（細胞間接着が緩んで個々の細胞が認識できるかどうかを確認する）。

6)

0.5×TrypLE Select溶液を除去する。2 mLのPBSを静かに加え、プレートを揺らしながら細胞全体を洗浄した後、PBSを除去する。

7)

新しいStemFitを1 mL加えた後、セルスクレーパーで細胞を剥がす（注1）。

Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法プロトコール（複数のクローンまたは株をまとめて継代する場合、先に全ての細胞をスクレーパーで剥がしてから次に進む）

8)

ピペッティング（10 回程度）で細胞をばらばらにし、新しいコニカルチューブに回収する.。

9)

細胞懸濁液10 µLにトリパンブルー溶液10 µLを加えて混合し、セルカウントを行う。
コーティングした 6 ウェルプレート１ウェルに 13,000 個の生細胞を播種する。
全量播種の場合は、細胞懸濁液に 1/1000 量の Y-27632 を添加する。

10)

すぐにプレートを揺らし、細胞を均一に広げる。

11)

顕微鏡で各ウェルの細胞を確認する。 37°C、5% CO2インキュベーターで培養する。

12)

継代翌日、培地交換を行う（「2. 培地交換」を参照）。

注1: 当財団内の検証では、StemFit培地の代わりにPBSを添加し、ピペッティングで細胞を剥離して回収する方法でも、細胞生存率・増殖率、未分化マーカー（OCT3/4）の発現量において差がない結果を得ている。

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iPS 細胞の凍結（6 ウェルプレート）

【準備】
細胞 ：

iPS細胞を播種した6ウェルプレート細胞状態の目安（Scale bar; 200 µm）

＜試薬＞
試薬 ：

StemFit AK03N （味の素）
STEM-CELLBANKER （日本全薬工業、CB045/047）
PBS （ナカライテスク、14249-24）
0.5×TrypLE Select溶液



器材 ：

クライオチューブ （1.0 mL）
プラスチックピペット
セルスクレーパー
バイセル （日本フリーザー、BICELL）

【手順】
1)

顕微鏡で細胞の状態を確認し（細胞生着の様子、iPS細胞様コロニーの有無など）、必要に応じて写真を撮影する。

2)

培地を除去し、PBSを1 mL加える。揺らしながら細胞全体を洗浄した後、PBSを除去する。

3)

0.5×TrypLE Select溶液を1 mL加え、細胞全体を覆うように6ウェルプレートを揺らす。

4)

37°C、5% CO2インキュベーターで最長10分間反応させる。

5)

インキュベーターから6ウェルプレートを取り出し、顕微鏡下で観察する（細胞間接着が緩んで個々Feeder-Free 法によるヒト iPS 細胞の培養方法プロトコールの細胞が認識できるかどうかを確認する）。

6)

0.5×TrypLE Select溶液を除去した後、PBSを2 mL静かに加え、プレートを揺らしながら細胞全体を洗浄する。添加したPBSを除去する。

7)

新しいStemFit を1 mL加えた後、セルスクレーパーで細胞を剥がす（注1）。
（複数のクローンまたは株をまとめて継代する場合、先に全ての細胞をスクレーパーで剥がしてから次に進む）

8)

ピペッティング（10 回程度）で細胞をばらばらにし、新しいチューブに回収する。

9)

細胞懸濁液を50 mLチューブに移す。（全てのウェルの懸濁液を1本のチューブにまとめる）

10)

細胞懸濁液をピペッティング（6回）で混合し、液量をピペットのメモリで測る。

11)

細胞懸濁液10 µLにトリパンブルー溶液10 µLを加えて混合し、セルカウントを行う。

12)

凍結する本数を確認し、必要な生細胞数を確認する（ストック本数×2.4×105 cells）。

13)

適切な容量の新しいチューブを準備し、細胞懸濁液の入ったチューブからストックに必要な生細胞数に相当する細胞懸濁液を分取する。

14)

遠心を行う。（160×g、23℃、5分間）遠心中に新しいクライオチューブを必要本数準備する。

15)

遠心終了後、上清を除去する。

16)

ペレットをやさしくタッピングで崩し、STEM-CELLBANKERを1.2×106 cells/mLの濃度になるように加え、泡が生じないよう気をつけながらピペッティング（8回）で懸濁する。

17)

細胞懸濁液をクライオチューブに200 µLずつ分注する。 分注後、予め冷却したバイセルにクライオチューブを入れて-80℃で凍結する。

18)

数日中に液体窒素タンクに移して保存する。

注1: 当財団内の検証では、StemFit培地の代わりにPBSを添加し、ピペッティングで細胞を剥離して回収する方法
でも、細胞生存率・増殖率、未分化マーカー（OCT3/4）の発現量において差がない結果を得ている。

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参考資料
StemFit (AK03N)培地の調製
【準備】
試薬 ：

StemFit AK03N A液 400 mL （4°C 保存）
StemFit AK03N B液 100 mL （-30°C 保存）
StemFit AK03N C液

2 mL （-30°C 保存）（B液とC液を4℃または室温で溶解する（8時間以上～o/n））
器材 ：ディスポーザブルピペット

【手順】
1)

B液をピペッティングで混合し、100 mLをA液のボトルへ添加する。

2)

C液2 mLをA液のボトルへ添加する。

3)

A液の蓋をしっかりと閉めてよく混合する。

4)

50 mL チューブまたはボトルに混合液を分注する。

5)

4℃もしくは-80℃で保管する。

0.5×TrypLE Select 溶液（0.5 mM EDTA/PBS 最終濃度0.75 mM）の調製
【準備】
試薬 ：

Cell Therapy Systems TrypLE Select CTS （Thermo Fisher
Scientific、A12859）
0.5 mmol/L-EDTA/PBS溶液（ナカライテスク、13567-84）

器材 ：ディスポーザブルピペット
250 mLストレージボトル

【手順】
1)

TrypLE Select 90 mLを250 mLストレージボトルに分注する。

2)

0.5 mM EDTA/PBS溶液90 mLを、1)のストレージボトルに添加し、ピペッティング（5回程度）で混合する。

3)

ボトルの蓋を閉めて良く混ぜる。

※使用期限は室温保管で6か月とする（試薬の期限が6か月未満の場合はその期限に合わせる）。

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培養スケールに応じた試薬量、細胞播種数等
表1. コーティングで使用するラミニン量（iMatrix-511MG; 0.5mg/mL）及び培地量
ラミニン量
Scale

培養面積

（iMatrix-PBS 量511）

プレートまたはディッシュへのStemFit+Y 培地 添加量

6 ウェルプレート※

9.2 cm2

9.2 µL

1.5 mL

1.5 mL90 mm ディッシュ

257 µL

9.3 mL

9 mL

57 cm※1 ウェルあたり

表2. 細胞継代時の試薬量0.5× TrypLE

PBS 添加量

StemFit 添加量

Select 量（TrypLE 処理後）（細胞剥離時）6 ウェルプレート※

1 mL

2 mL

1 mL

90 mm ディッシュ

3 mL

10 mL

5 mL

Scale

※1 ウェルあたり

表3. 細胞継代時の細胞播種数
Scale

細胞播種数

6 ウェルプレート※

1.3×104 cells

90 mm ディッシュ

8×104 cells※1 ウェルあたり

作成：

公益財団法人 京都大学iPS細胞研究財団
細胞調製施設 FiT

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参考文献：
1.

A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent
stem cells
M. Nakagawa et al., Scientific Reports, 4:3594 (2014) DOI: 10.1038/srep03594

2.

An Efficient Non-viral Method to Generate Integration-Free Human iPS Cells from Cord
Blood and Peripheral Blood Cells
K. Okita et al., Stem Cells, 31(3):458-66 (2013) DOI: 10.1002/stem.1293