Interview

iPS細胞由来ナチュラルキラー細胞の大量製造法開発におけるコールター原理の有用性

倉知 建始 様株式会社ヘリオス 神戸研究所研究部 工業化研究グループ

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Interview

iPS細胞由来ナチュラルキラー細胞の大量製造法開発におけるコールター原理の有用性
再生・細胞医療や遺伝子治療は、既存の医薬品では治療が難しい、あるいは治療法が確立されていない疾患に対して新たなモダリティとなる可能性があります。これらの新規モダリティが臨床応用され医療の現場で実用化されるためには、原料となる組織幹細胞、ES 細胞、iPS 細胞などの大量生産と安定供給を実現するための品質管理が求められます。
新規モダリティ用の培養細胞の品質管理には、細胞濃度（細胞数）、細胞体積、生存率、培地成分濃度など多くの管理項目があり、安定した細胞の大量生産には、これらの計測の簡便性と正確性が求められます。
コールター法（電気的検知帯法）を原理とした粒度分布測定装置は、ライフサイエンスから工業分野の幅広い領域で使用されている精度の高い粒子計測装置です。測定できる検体は、無機材料から細胞・微生物までの実績があり、粒子（細胞・微生物）数、サイズ（分布）、体積、濃度などの項目を短時間、かつ高精度で計測できるため、再生医療分野においては材料開発、研究開発、品質管理で使用されています。
本日は、再生医療やがん免疫療法用医薬品の研究開発に取り組まれておられる株式会社ヘリオスの倉知様に、iPS 細胞由来ナチュラルキラー細胞（以下、NK 細胞とする）の大量製造の開発、ベックマン・コールターのコールターカウンター（Multisizer 4e）の有用性や、今後の展望について伺いました。
2024年x月

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Introduction

株式会社ヘリオスの研究内容
株式会社社ヘリリオスの研研究内容されています。しかしながら、既存の CAR-T 療法は、血液がんに対して劇的な治療効果を示しますが、固形がんに対しては、株式会社ヘリオスは、「『生きる』を増やす。爆発的に。」とい現在のところ十分な治療効果は認められていません。一方で、うミッションを基に、一人でも多くの患者さんに一刻も早く新しがん疾患は日本人の死因1位となっており、がん疾患が原因でい治療法を届けるために、人体組織のあらゆる疾患領域の再死亡したヒトの約90％が固形がんによるものといわれています。

生医療に対して技術開発を行い、主に iPS 細胞由来細胞治療

そこで我々は、iPS 細胞由来 NK 細胞を用いた固形がん治療製品という形で iPS 細胞技術を具現化することを目指していを目標に、NK 細胞の抗腫瘍作用強化に働くと考えられる6つます。具体的には、iPS 細胞由来細胞治療の将来の基盤技術の遺伝子（IL-15、CCR2B、CCL19、NKG2D、DAP10、CD16）となりうる新規技術・ノウハウをいち早く確立し、実用化を加速を導入したヒト iPS 細胞株を樹立し、その細胞株から分化誘導させるため、国内外の研究機関や企業との提携のみならず、自を行うことで、遺伝子導入 NK 細胞（eNK® 細胞）を作製しました

社研究開発にも積極的に取り組んでいます（Figure 1）。この（Figure 4）。作製した eNK® 細胞は、意図した通り、① IL-15方針の下、遺伝子編集技術を用いたヒト白血球抗原（HLA：の発現に起因する生存・増殖機能の向上、② CCR2B の発現

Human Leukocyte Antigen）型に関わりなく免疫拒絶のに起因するがん細胞への遊走能力の亢進、③ CCL19 の発現リスクの少ない次世代 iPS 細胞であるユニバーサルドナーセルに起因する免疫細胞のリクルート機能、④ NKG2D/DAP10（Universal Donor Cell）の作製（Figure 2）
や、iPS 細胞の発現に起因するサイトカイン産生・細胞傷害活性の増強、⑤技術と遺伝子編集技術を組み合わせた次世代がん免疫細胞

CD16の発現に起因する顕著な抗体依存性細胞傷害活性を示の作製などの研究活動を進めています（Figure 3）。

しています。以上のことから、iPS 細胞より得られた eNK® 細胞
は、固形がんに対して、従来よりも高い抗腫瘍効果を示すこと固形が固形がん治療を目指した遺伝子導入
がん治療療を目指指した遺伝子導導入iPS細胞由来
来NK細胞細胞の作製と評価胞の作作製と評価価弊社にはさまざまなパイプラインがありますが、私が主に担当しているのは、NK 細胞を用いた、がん免疫の領域です。免が期待されます。

3次元自次元自動灌流培養法による自動灌灌流培養法
法によるeNK® 細細胞の大量製造の開発
胞のの大量製造造の開発

疫細胞にはさまざまな細胞がありますが、その中でサイトカイeNK® 細胞の製造では、遺伝子導入 iPS 細胞スフェロイド作製

ン放出症候群などの副作用が T 細胞よりも少ないとされるから最終的な eNK® 細胞になるまでの全工程を、3次元自動灌NK 細胞に着目して研究開発、治験製品製造準備等を進めて流培養装置を用いて実施しています。

3 次元自動灌流培養法による eNK® 細胞の大量製造には、います。
がん免疫細胞療法は、CAR-T 療法を代表に、近年特に注目いくつかの重要なメリットがあります。

Figure 1 株式会社ヘリオスの事業戦略
Figure 3 株式会社ヘリオスがん免疫療法戦略

Figure 2 株式会社ヘリオスUniversal Donor Cell概要
Figure 4 eNK® 細胞の特徴

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まず、3次元自動灌流培養装置では培地交換が連続的に閉

さらに、3次元自動灌流培養装置では、培養槽内を攪拌して鎖系内で自動的に行われるため、手動の培地交換による作業均一な状態にして、pH、溶存酸素濃度などの工程内管理値を者間のばらつきやヒューマンエラーを回避できることです。特リアルタイムでモニタリングしながら、連続的に培地交換を実に iPS 細胞スフェロイドの形成過程では、いかに効率よく培地施します。その結果として、グルコース、アミノ酸等の基質を一交換を行うかが重要となります。培地交換のために培養装置定濃度以上に維持しながら、乳酸、アンモニア等の老廃物を一を止めると、細胞およびスフェロイドは培養槽内底部に沈降し定濃度以下に抑え、pH、溶存酸素等の培養環境も最適な状態て凝集し、スフェア径にばらつきが生じ、次工程で分化誘導するで制御できるため、それぞれの工程で細胞が増殖、分化する環

造血前駆細胞（HPC）の質に悪影響を及ぼす場合があります。

境を最適な条件で保つことができ、2D 培養では達成すること

この手動での交換は、個人差も多く発生し、大きな課題となっができなかった、高密度での大量培養を可能にしていますていました。一方で、3次元自動灌流培養装置では自動化され（Figure 5）。

た培地交換ができるため、培養装置停止による細胞・スフェロイ

実際に我々が開発した方法で eNK® 細胞を作製するには、ドの沈降を起こすことがなく、作業者間のばらつきも発生せず、遺伝子導入 iPS 細胞を浮遊細胞用の3次元培養容器に播種し、安定したスフェロイド作成が可能となっています。また、培地交3次元自動灌流培養装置で iPS 細胞スフェロイドを形成させる換が自動化された閉鎖システムのため、ヒューマンエラーによるところから始まります。得られた iPS 細胞スフェロイドを基に、コンタミネーションのリスクも低くできる点も大きなメリットです。

各種成長因子およびサイトカイン存在下で自動灌流培養装置にFigure 5 3次元自動灌流培養法によるeNK® 細胞の大量製造概要

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iPS細胞由来ナチュラルキラー細胞の大量製造法開発におけるコールター原理の有用性

よる分化誘導を実施し、eNK® 細胞を作製します。自動灌流培養装置により得られた eNK® 細胞は、高い純度を示し、グランザ
イム B およびパーフォリン等の細胞傷害活性に関わる因子も高コールターカウンターの有用性
コールタ
ターカ
カウンターーの有用性①コールターカウンターとはく発現しており、in vitro での細胞傷害活性試験で高い細胞

コールターカウンターは、電気的検知帯法として知られる傷害活性を示すだけでなく、モデル動物を用いた試験においコールター原理を用いて、1回の測定で粒子・細胞の個数、体ても高い抗腫瘍作用を示しております（Figure 6、7）。

積、粒度分布を高精度に測定します。粒子・細胞を実測するため、以上の通り、我々は3次元自動灌流培養装置を用いた高効

色、形状、組成、屈折率などの影響を一切受けず、さまざまな率に大量培養可能な eNK® 細胞製造プロセスを開発しました

粒子・細胞の個数、体積、粒度分布の測定が可能です。コール

が、その中でも基盤となる iPS 細胞スフェロイドの品質は、重ターカウンターは、電解質溶液に懸濁された粒子・細胞が小口要な管理項目となります。我々はこの重要な管理項目をさま径のアパチャーを通り抜ける際に生ずる電気抵抗の変化を検出ざまな方法で評価しましたが、最終的にベックマン・コールターし、粒子・細胞の数と容積をリアルタイムに算出します。電解質社のコールターカウンターである Multisizer 4e を採用しま溶液に懸濁された粒子・細胞は絶縁体として機能するので、した。

小口径の円筒状アパチャーを通過すると、アパチャーの両側に位置した2本の電極間の電気経路のインピーダンスが瞬時にFigure 6 eNK® 細胞の抗腫瘍効果（胃がん腹膜播種モデル）

Figure 7 eNK® 細胞の抗腫瘍効果（中皮腫皮下移植モデル ）4

Interview

変化し、電気パルスを生成します（Figure 8）。粒子・細胞にカウンターの調査を実施しました。その中で、iPS 細胞スフェロ

よって生じる電気パルスの数は細胞計数を示し、電気パルスのイドのサイズに対応し、我々の要望を満たした機器が、アパ高さは粒子・細胞の体積に依存します。

チャーのサイズバリエーションが多く広範囲をカバーできる

Multisizer 4e でした。
Multisizer 4e を用いる利点の一つに、短時間で測定可能② eNK® 細胞の大量製造におけるコールターカウンターの有用性である点が挙げられます。実際に iPS 細胞スフェロイド培養液

Multisizer 4e を導入するまでは、iPS 細胞スフェロイドのをサンプリング後、Buffer に希釈するだけでサンプル調製は品質は、主に顕微鏡を用いて評価しておりました。主な測定項終了し、その後、装置にセットしてすぐに、iPS 細胞スフェロイド

目は iPS 細胞スフェロイドの粒子径とスフェロイド密度となりま濃度およびスフェロイド径の測定が完了します。eNK® 細胞のすが、顕微鏡を使ってそれらの項目を計測するうえで、測定に製造において、iPS 細胞スフェロイドは、大きすぎるとスフェロ時間を要する点、測定者の主観的な判断による測定者間差がイド内に栄養や酸素が十分に浸透せずネクローシスを起こす可発生する点、測定する細胞数が数百程度であるため、統計的に能性があり、小さすぎるとスフェロイドが形態を維持できず、次信頼性が低い点、などの問題が発生しておりました。我々はこ工程の分化誘導が不安定になるため、iPS 細胞スフェロイドのれらの問題を解決すべく、コールター原理に着目し、コールター。
粒度を一定の範囲に制御することが重要です（Figure 9）

Figure 8

Multisizer 4eを用いたiPS細胞スフェロイドの解析

使用アパチャーサイズ：1000μm

使用アパチャーサイズ：1000μm

Figure 9 Multisizer 4eを用いたiPS細胞スフェロイドの解析

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iPS細胞由来ナチュラルキラー細胞の大量製造法開発におけるコールター原理の有用性

iPS 細胞スフェロイドの粒度がばらつくと、HPC の質が悪くなり、最終的に高品質の eNK® 細胞を作製することができません。
また、次工程の HPC 分化誘導工程では、スフェロイドの密度も重今後の展望
今後の展展望当社は、これまで3 次元自動灌流培養法により遺伝子導入要です。そのため、スフェロイドの粒度が測定できるだけでなく、iPS 細胞から細胞傷害活性を有する eNK® 細胞を効率的に、スフェロイド密度も同時計測できる Multisizer 4e は、当社のかつ、大量に製造する方法を確立しました。当社の eNK® 細胞

eNK® 細胞製造プロセスには欠かせない装置となっています。

は凍結保存が可能であり、解凍後も良好な細胞傷害活性を示

そして、今後当社が、医薬品として eNK® 細胞の製造を進めすことから、自家細胞を用いる既存の方法と比べて安価なていくにあたって、Multisizer 4e が FDA 21 CFR Part 11

off-the-shelf 免疫細胞療法の手段として今後も開発を進めに 準 拠 し て い る こ と も、利 点 の 一 つ に 挙 げ ら れ ま す。

を導ていきたいと思います。現在、キメラ抗原受容体（CAR）

Multisizer 4e のソフトウエアで、「FDA 21 CFR Part 11」の入した新たな細胞株（CAR-eNK®）
も研究開発を進めていま

オプション機能を選択すると自動的に、電子署名の構成と管理、す。新規細胞株においても3次元自動灌流培養法での製造をユーザ権限の管理、ID・パスワードの管理、履歴の管理など、こ考 えて おり、そ の 中 でも iPS 細 胞 スフェロイドの 評 価 は、の規制に準拠するために必要なレベルのセキュリティが構成さMultisizer 4e を使用していく予定です。

れます。当社は、eNK® 細胞を研究するだけでなく、医薬品として製造販売まで進め、多くの患者さんに新しい治療法と希望を届けることを目指して研究開発を進めていますので、FDA 21

CFR Part 11に準拠できる点も安心して使用できる点でした。

最後にベックマン
最後にベベック
クマン・コールターについて一言
コーールターにつついて一言
ベックマン・コールターの Multisizer 4e は、3次元自動灌流培養装置で iPS 細胞スフェロイドを形成させるなかで、iPS 細胞スフェロイドの粒子径、および濃度を短時間に計測できるという点で、我々にとっては必要不可欠なすばらしい装置です。

Multisizer 4e が今後も iPS 細胞を用いた再生・細胞医療分野で普及していくことを願っております。

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倉知 建始 様株式会社ヘリオス 神戸研究所研究部
工業化研究グループ

使用機器

Multisizer 4eMultisizer 4eは、コールター法（電気的検知帯法）を用いて、0.2〜1,600μmの範囲で測定ができる高精度で多機能な細胞径の分布・計測装置です。細胞を実測するため、色、形状、組成、屈折率などの影響を一切受けず、様々な粒子・細胞の個数、体積、面積粒度分布の測定が可能です。
□ コールター法は、細胞・微生物の体積を正確に測定することができる細胞分布測定法□ 個数、体積、面積の細胞径分布を測定□ 監査セキュリティ対応可能なCFR 21 Part 11 準拠のソフトウエア

精密粒度分布測定装置 Multisizer 4e の詳細はこちらからhttps://www.beckman.jp/cell-counters-and-analyzers/multisizer-4e

ベックマン・コールター ライフサイエンスベックマン・コールター株式会社〒135-0063 東京都江東区有明 3-5-7 TOC 有明ウエストタワー
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ベックマン・コールター ライフサイエンスは Danaher の一員です。

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