抗核抗体検査の自動化と国際ガイドラインの動向
メタデータ

言語: Japanese
出版者:
公開日: 2019-03-31
キーワード (Ja):
キーワード (En): antinuclear antibodies, indirect
immunofluorescence assay, automation, internationalguideline, anti-DFS70 antibody
作成者: 今西, 麻樹子, 林, 伸英, IMANISHI, Akiko,
HAYASHI, Nobuhide
メールアドレス:所属:

URL

https://doi.org/10.20608/00001035

神戸常盤大学紀要

神戸常盤大学紀要

Vol.12, pp.01−08, 2019

第12号

2019

総説

抗核抗体検査の自動化と国際ガイドラインの動向
今西麻樹子1）

林伸英1）

The automation and international guideline of the examination
for antinuclear antibodies
Akiko IMANISHI1）and Nobuhide HAYASHI1）
要旨
抗核抗体検査は、自己免疫疾患の診断や病態の把握において重要である。HEp-2 細胞を基質とした間接蛍光抗体法は国際的に標準法と認められており、現在広く使用されているが、蛍光顕微鏡による鏡検が必要なため自動化が困難とされてきた。抗核抗体支援型自動判定システムが欧州を中心に開発されてはいるが、自動判定の確度は完全ではなく、最終的には判定者の確認が必要であるため、現時点では判定者を支援するシステムである。
ANA 染色型に関する国際的コンセンサス（ICAP）が公開されており、今後この新しい分類基準が採用されていくものと思われる。この中で Speckled 型判定において、Dense ﬁne speckled 型を個別に判定することが示されたが、本邦では日常検査の中でこの分類はあまり浸透していない。しかし、Dense ﬁne speckled 型の判定は抗 DFS70 抗体の存在を検出することにつながり、疾患特異的抗核抗体が共存しない抗 DFS70 抗体（単独）陽性症例ではかなりの確率で膠原病を否定できることがわかってきた。したがって、抗 DFS70 抗体を検出することは、これまで抗核抗体陽性という所見だけで必要以上に膠原病を疑われ、患者に不用意な警告を与えることを回避できる点で意義が高い。
キーワード：抗核抗体、間接蛍光抗体法、自動化、国際ガイドライン、抗DFS70抗体

Abstract
Antinuclear antibody (ANA) testing is indispensable for diagnosing and estimating clinicaloutocomes of autoimmune disease.
The indirect fluorescent antibody method using HEp-2 cells as a substrate has been accepted
and is widely used internationally as the gold standard for ANA screening. However, it has been
considered difficult to automate because it requires a visual interpretation using a fluorescence
1）保健科学部医療検査学科−1−神戸常盤大学紀要第12号

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microscope. Although the automatic judgment system for ANA testing has been developed mainlyin Europe, is not accurate, and the examiner should

confirm all decisions, currently rendering

this tool as a system supporting laboratory staff. The international consensus on ANA patterns( ICA P) has been published a nd this new classification sta ndard will likely be adopted in thefuture. The speckled pattern judgement section, is required to judge the dense fine speckled
pattern individually, but in Japan, this classification is not generally used in routine examinations.
However, the determination of the dense fine speckled pattern leads to the detection of thepresence of the anti-DFS70 antibody, and it was found that the collagen disease can be denied
with considerable probability in the positive case of the anti-DFS70 antibody (alone) not coexistingwith the disease specific antinuclear antibody. Therefore identifying the anti-DFS70 antibody isimportant in diagnosis collagen disease,which is flasely suspected just by the ANA positive result,to avoid unnecessary distress for the patient.
Key words: antinuclear antibodies、indirect immunofluorescence assay、automation、internationalguideline、anti-DFS70 antibody

１． コンピュータ支援型自動判定システム

はじめに

IF 法による抗核抗体検査は抗核抗体のスクリー

抗核抗体とは、真核細胞の核内にある抗原（対応ニング検査として、現在広く使用されている。この抗原は多種類）に対する抗体で、その検出は膠原

方法は高感度で染色型から対応抗原が推定可能で病や自己免疫性肝炎などの自己免疫疾患の診断やあり、抗細胞質抗体や抗核小体抗体も検出できる病態の把握において重要である 1）。抗核抗体検査は利点がある反面、健常人での陽性率が高い点、蛍スクリーニングとしての検査と個々の疾患特異的光顕微鏡の性能や減光フィルターの使用の有無と抗核抗体検査に大別される。前者は国際的に標準いったハード面に起因する施設間差の大きい点が法と認められているヒト喉頭癌由来培養細胞であ問題となっている 5, 6）。さらに、暗室を必要とする点、る HEp-2 細胞を基質（核材）とした間接蛍光抗体

客観性に乏しい目視判定である点、鏡検に労力と熟法（indirect immunoﬂuorescence assay; IF 法）に練を必要するという欠点もある 7）。

よる抗核抗体検査が現在広く使用されているが、蛍これらの問題を解決するために ELISA 法をはじ

光顕微鏡の鏡検による操作が必要で、自動化が困難めとする限定した核抗原を使用した検査が開発さとされてきた 2）。後者はイムノアッセイ法が主流でれてきたが、これらの代替検査は使用抗原の種類や自動化が進んでいる 3）。

量によって疾患特異的自己抗体への反応性に差が本稿では自動化の点でさまざまな問題点を抱えてある 8）。2013 年に欧州、米国の主要機関から抗核いる IF 法による抗核抗体検査の自動化について 4）、抗体を含めた自己抗体検査の国際ガイドライン（推日常検査としての有用性および問題点について解奨される 25 事項）が提示された 9）。この中で IF 法説する。さらに自己抗体検査の国際ガイドラインのは抗核抗体のスクリーニングの標準法として位置動向および最近注目されている抗 DFS70 抗体につづけられ、代替検査はスクリーニング検査と呼ぶべいても紹介する。

きではないと記されている。しかしながら、本邦で−2−神戸常盤大学紀要第12号

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は IF 法を院内検査として実施している検査室は多発現させた HEp-2000 Ⓡ（Immuno Concepts, USA）

くなく、それは煩雑な操作とコストパフォーマンスが 作 ら れ た。 他 に も HEp-20-10（Euroimmun AG,の低さ等が理由として挙げられる。このような背景ドイツ）は HEp-2 細胞と比較して染色型に大差はから、IF 法による抗核抗体検査の重要性が高まる

ないものの、分裂期細胞が多いことが特徴であるとともに、用手法中心の本検査法の自動化への要求（HEp-2 細胞と比較して約 10 倍の分裂期細胞）。こはさらに強くなり、欧州を中心に自動機器が開発され は、 後 述 す る EUROPattern（Euroimmun AG,れた 10）。

ドイツ）に使用されている試薬で、自動で画像を撮影する時、一視野に分裂期細胞を複数個入らなけれ

A．IF 法による抗核抗体検査の原理と使用核材ばならないという必要性から作られた。

IF 法による抗核抗体検査の原理を図１に示す。
B．自動判定システムの種類と性能

1957 年に Friou らが抗核抗体検査に IF 法を応用して後、核材は臓器切片より変更され、現在ではより欧州で新たに開発されたコンピュータ支援型自高感度なヒト喉頭癌由来培養細胞である HEp-2 細動判定システムは、IF 法で得られる標本画像を自胞が使用されている。また、近年改良された細胞が動撮影し、撮影された画像から抗体価および染色型現れている 4）。例えば、抗 SS-A/Ro 抗体は対応抗を自動で判定するシステムである（染色型自動判定原が核内外に存在し、HEp-2 細胞を核材とした IFのできない機種もある）。

法では見落とすことがあるため、この欠点を補う

2014 年 Bizzaro らは 126 例を対象に用手法を対ためにヒト 60kD SS-A/Ro 抗原を形質移入して強照として EUROPattern、AKLIDES（Medipan , ドイ ツ ）、NOVA View（Inova Diagnostics, USA）、Zenit G-Sight（A. Menarini Diagnostics, イタリア）、HELIOS Ⓡ（Aesku Diagnostics, ド イ ツ ）、ImageNavigator（Immuno Concepts, USA） の 6 機 種 を比較検討した 11）。陰陽性一致率は機種間による差異なく（93 〜 96%）、全体で 95% と高率であった。
染色型の判定は HELIOS Ⓡと Image Navigator が自動ではない（モニター画面で判定者が確認する；ただし、HELIOS Ⓡは最近自動判定機能が搭載された）ため、染色型自動判定機能を有する 4 機種の比較となるが、染色型判定の一致率は EUROPattern で79％、AKLIDES、NOVA Vie、Zenit G-Sight で 52〜 63% と染色型判定（特に混合型）についてはあまり信頼性がない。現時点ではこれらの機種は判定

図 1 間接蛍光抗体法の原理
1. 一次反応：スライドガラス上に固定、乾燥させたHEp-2 細胞に希釈した被検血清（通常は 40 倍希釈から希釈系列を作成）を反応させる。
2. 二次反応：洗浄後、FITC 標識抗ヒト IgG 抗体を反応させる。
3. 鏡検：洗浄後、封入した標本を蛍光顕微鏡で観察し、陽性 ( 核内に蛍光を認める ) であれば、染色型と最終希釈抗体価を報告する。

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支援型システムであり、自動判定の確度は完全ではなく、最終的には判定者がすべてを確認する必要がある。
こ の 6 機 種 の う ち、EUROPattern（ 図 2A） とHELIOS Ⓡ（図 2C）が本邦に導入されており、抗核 抗 体 陽 性 例 92 例 に お け る 感 度、 健 常 者 34 例

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2019に お け る 特 異 度 は、 そ れ ぞ れ EUROPattern で96.7%、85.3%、HELIOS Ⓡ で は 97.8%、94.1% と 良好であったA。EUROPattern はオプションの全自11）

動 EIA 分析装置 Sprinter XL（図 2B）を使用すれば、染色操作を自動化できる（スライドの封入とEUROPattern への搭載は用手で）12）。HELIOS Ⓡは検体を搭載すれば、標本作製から封入液分注、画像取込までの過程を自動で行える 13）。林らが行った検討（膠原病 282 例）では、EUROPattern の自動判定の確度は陰陽性一致率 98.9%、抗体価一致率（± 1 管差含む）97.4%、染色型の判定一致率 55.3%であった 14）。陰陽性判定と抗体価判定には満足できるものの、染色型については大半を修正する必要があるため、判定の確度の向上が望まれる。しB

かし、判定者による確認後の EUROPattern 最終検
査結果の抗体価は対照法（用手法）との陰陽性一致率は 93.3%、対照法との抗体価一致率（± 1 管差含む）94.0% および染色型判定の一致率（主な染色型で 89.3 〜 100%）が高いことがわかった 14）。また、
各種膠原病患者および健常人における陽性率も対照法とほぼ同等であった。一方、
HELIOS Ⓡの検討（対象 161 例）では、陰陽性一致率 91.9%、抗体価一致率（± 1 管差含む）98.8% であった。
これらのシステムは判定者による確認と補正がC必要ではあるものの、撮影した画像で判定を確認するため判定者が実際に顕微鏡をみる必要はなく、暗室が不要で、画像の保存が可能であることから、抗核抗体検査の自動化法として日常検査に適用でき、判定者の労務軽減や検査の省力化の面での有用性は高く、今後多くの検査室で使用されていくものと考えられる。また、このような自動化システムの導入は本邦における抗核抗体検査の標準化を進め
るうえでの一助になると思われる。

図 2 コンピュータ支援型自動判定システム
EUROPattern（A）、EUROPattern オプションの全自動 EIA 分析装置 Sprinter XL（B）： 共に Euroimmun AG
より画像掲載許諾を得ている。
HELIOS Ⓡ（C）： 医学生物学研究所（日本での販売元）
より画像掲載許諾を得ている。

−4−

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２．IWAA における国際的な ANA 染色型分類の動第12号

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類に習熟するには、判定能力のレベルアップを図る

向必要がある 16）。しかし、ICAP で抗核抗体に包括さ2016 年、第 13 回 IWAA（International Workshopれた抗細胞質抗体（Cytoplasmic）や分裂関連装置

on Autoantibodies and Autoimmunity） が 京 都 でに対する抗体（Mitotic）は、本邦の薬事上の分類開催され、前回までの ANA 染色型に関する国際では抗核抗体に含まれない。今後の動向を注視する的コンセンサス（ICAP）の内容が支持された必要がある。

。

15）

この染色型判定は ICAP のホームページ（https://

また、注目すべき染色型判定として、Speckled

www.anapatterns.org/nuclear_patterns.php） に 公型判定がある。ICAP の分類において、Speckled 型

開されており、今後、日本語翻訳も追加される予定

を coarse（きめの粗い）speckled と ﬁne（きめの細である。染色型別（AC-1 〜 AC-28）の写真が複数かい）speckled および後述の Dense ﬁne speckled

閲覧できるようになっており、染色型判定の際の助型（DFS 型）を個別に判定することが示されたが、けとなる。今後、わが国においても、この新しい分

本邦では日常検査の中でこの分類はあまり浸透し類基準が採用されていくものと思われるが、この分ていない 17）。

図 3 国際自己抗体と自己免疫に関するワークショップ（IWAA）における国際的な ANA
染色型分類ツリー（ICAP ツリー）http://www.anapatterns.org より引用
オレンジ色カラムはルーチン検査レベルとして報告が必須とされ、緑色のカラムは専門家レベル（専門家のみが報告すべきレベル）として区別している。

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３．抗 DFS70 抗体検出の重要性
抗 DFS70 抗体は、米国人の間質性膀胱炎患者血清中に含まれる新規の抗核抗体として初めて発見された。HEp-2 細胞を基質とした IF 法において、間期の細胞は核質が密に（dense）、細かく（ﬁne）、斑紋状（speckled）に染色され、同様に分裂期染色体も染色されること、そして SDS-PAGE 上、対応抗原が 70kDa のタンパク質であったことから、抗DFS70 抗体と命名された 18）。抗 DFS70 抗体は多くの膠原病での陽性率が低く、免疫遺伝学的に調べられた HLA クラスⅡハプロタイプは、膠原病関連自己抗体のものと抗 DFS70 抗体のものとは異なり、膠原病の関連性が否定されることを示唆している 19）。したがって、疾患特異的抗核抗体が共存しない症例では抗 DFS70 抗体（単独）陽性の場合はかなりの確率で膠原病を否定できる。このことは、抗 DFS70 抗体の検出がこれまで抗核抗体陽性という所見だけで必要以上に膠原病を疑われ、患者

図 4 IF 法による抗 DFS70 抗体の染色型（EUROPattern)
A：典型的な抗 DFS70 抗体の染色像
間期核はモザイク状の染色（青矢印）、分裂核はクロマチン領域が染色される（黄色矢印）。
B：他の抗核抗体との共存による抗 DFS70 抗体の染色像
間期核（青矢印）は粗い顆粒や細かい顆粒が認められ Speckled 型の特徴を認めるが、分裂核（黄色矢印）はクロマチン領域が染色されると同時に核質にも染色が認められることから、Homogeneous & speckled型と判定されることが多い。に不用意な警告を与え、不必要な検査を強いられることを回避できる点で意義が高い。しかし、抗DFS70 抗体の検出は IF 法の染色型で分類するのが一般的であるものの、DFS 型は典型的な染色型を除いて、他の抗核抗体との共存により判定が難解な場合が多く（図 4）、検査室からの抗核抗体の染色型の報告として、「抗 DFS70 抗体」と判定せず、４．最 後 に「Homogeneous & speckled」として曖昧なまま報

抗核抗体検査の自動化および染色型判定の国際告されることが多い 19）。

的コンセンサスについて述べた。本邦への国際的コ

近年、DFS 型の確認検査として、ELISA 法、インセンサスの導入は明確になっておらず、注視してムノブロット法、DFS70 抗原をノックアウトした動向を見守りたい。IF 法のコンピュータ支援型自HEp-2 細胞による IF 法および DFS70 抗原吸収後動判定システムは、検査室の労務軽減やコストの削の IF 法などの抗 DFS-70 抗体の検出法が開発され減に貢献し，多くの検査室で使用されてきている。ている 20）, 21）。前者 2 法は抗 DFS70 抗体の確認法で検査室はこのような検査技術の進歩や改変を適宜あるのに対し、後者 2 法は抗 DFS70 抗体の有無と取り入れて運用し、品質の高い検査を迅速に提供で同時に、本来の抗核抗体の検査の特徴である染色型きるように努めなければならない。

や抗体価が検査できる点において有用である。今後、日常検査として使用できる抗 DFS70 抗体検出法が淘汰されていくものと考えられる。

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