麹菌 Aspergillus oryzae 由来耐塩性グルタミナーゼの醤油醸造への応用
吉宗一晃（産業技術総合研究所）
研究の目的
グルタミナーゼは醤油の主要な旨味成分であるグルタミン酸を生成することから、醤油醸造において最も重要な酵素の一つである１）。しかし麹菌Aspergillus oryzae由来の既知グルタミナーゼは醤油の様な高濃度食塩存在下でその活性が著しく低下する ２） 。醤
油醸造中に高濃度食塩存在下でも活性が低下しない耐塩性グルタミナーゼを添加すると醤油中のグルタミン酸濃度が高まる報告も有ることから３）、耐塩性グルタミナーゼは醤油の高品質化等に有用であると考えられる。これまで我々は麹菌A. oryzae RIB40 株のゲノムから新規グルタミナーゼAoGlsを見出し、AoGlsが既知の麹菌由来グルタミナーゼより高い耐塩性を有することを明らかにしている４)。本研究では耐塩性グルタミナーゼAoGlsを含む麹菌A. oryzae由来グルタミナーゼの醤油醸造への応用を目的としてそれら酵素の発現条件の検討を行った。

方法
A. oryzae RIB40 株は独立行政法人酒類総合研究所より分与頂いた。培養は全て 30℃で行い、培地としてふすま培地（ふすまの等重量の 0.17M リン酸カリウム緩衝液 (pH7.2)を加えたもの）、麦芽エキス培地（1% malt extract, 0.1% 酵母エキス）もしくは、LB 培
地（1%ペプトン、0.5%酵母エキス、1%食塩）を塩酸もしくは水酸化ナトリウムで目的の pH に調整して用いた。
ふすま培地から菌体外酵素の抽出は等重量の 10mM トリス(pH9.0)を加え、4℃で一晩攪拌後、ガーゼでろ過後、遠心分離後の上清を酵素液とした。麦芽エキス及び LB 寒天培地から菌体内酵素の抽出は寒天培地上にセロハンを載せ培養し菌体を回収した。この菌体を液体窒素で凍結させ、等重量の海砂及び 10mM トリス(pH9.0)を入れ良くすり潰した。遠心後の上清を菌体内酵素とした。
グルタミナーゼ活性は 100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、30mM L-グルタミンを含む反応液に酵素溶液を加え、30℃、10 分反応後、3 分間煮沸により反応を停止し、反応液中のL-グルタミン酸濃度をグルタミン酸脱水素酵素(GlDH)を用いて定量した5）。1 分間に 1 μmolのL-グルタミン酸を生成するのに必要な酵素量を 1Uとした。比活性はタンパ
ク質 1 mg あた りの 単 位数 で表 し た。 タン パ ク質 濃度 の 定量 はBCA protein assaykit(PIERCE社)を用いて行った。
A. oryzae RIB40 株由来酵素の AoGls の検出にはウエスタンブロット法を用いた。抗原は精製したヒスチジンタグ結合型 AoGls を用い、ウサギから AoGls 抗体を得た（北海道システムサイエンス社）。A. oryzae 由来酵素を SDS-PAGE で分離後、電気的に転写した PVDF 膜に AoGls 抗体を一次抗体、イミュンスターGAR(Bio-Rad 社)を二次抗体としてイミュンスターHRP ケミルミネセントキット(Bio-Rad 社)を用いて Hyperfilm ECL (GEヘルスケアバイオサイエンス社)に感光させ、AoGls の存在を確認した。

結果
１） 菌体外グルタミナーゼ
A. oryzae RIB40 株を培養したふすま培地を 10mM トリス(pH9.0)で抽出した液からは5mU/mg の活性が検出された。この菌体外グルタミナーゼは不安定で、安定 pH（9.0）
においても 4℃で 24 時間放置すると残存活性は 76%となった。この酵素を Q-セファロース及びブチルトヨパールで部分精製すると安定化し 4℃ではほとんど失活しなくなった。このことから A. oryzae RIB40 株の菌体外グルタミナーゼはその菌体外プロテアーゼ等により容易に分解されることが予想される。一方、麦芽エキス及び、LB 液体培地の A. oryzae RIB40 株培養液からはグルタミナーゼ活性は検出されなかった。グルタミナーゼ活性は上記培地の pH を 5,7 及び 9 にしても活性は検出されず、50mM L-グルタミンを上記培地に添加しても検出されなかった。液体培地ではグルタミナーゼがプロテアーゼにより分解されやすく、その活性が検出されないことも考えられた。
２） 菌体内グルタミナーゼ
菌体内グルタミナーゼの比活性は菌体外グルタミナーゼの場合と比較してやや高かった。麦芽エキス寒天培地（比活性 1mU/mg以下）よりもLB寒天培地で高い活性が見られ、LB寒天培地ではpH5(11mU/mg)及び 7(10mU/mg)よりもpH9(16mU/mg)で高い比活性が得られた。この菌体内酵素 30 μgに対してウエスタンブロット法によりAoGlsの有無を調べたところ、AoGlsは検出されなかった。今回のウエスタンブロット法で はEscherichia coliに発現させた 10ngの組換えAoGlsが検出できたことから、LB寒天培地で培養したA. oryzae RIB40 株の菌体内酵素 30 μg中にAoGlsは 10 ng以下で有ることが示された。AoGlsの比活性を増尾らの報告と同じ 730U/mgと考えた場合6)、LB寒天培地で培養したA. oryzae RIB40 株菌体内で主なグルタミナーゼ活性を有するタンパク質はAoGlsではないことが示唆された。AoGlsは耐塩性グルタミナーゼであることからAoGlsの発現条件の検討が必要である。また組換えAoGlsに対する抗体がA. oryzae RIB40 株のAoGlsと反応しないことも考えられるため、今後さらなる検討が必要である。

結論
A. oryzae RIB40 株の菌体内及び菌体外グルタミナーゼの誘導条件検討、特に耐塩性グルタミナーゼ AoGls の誘導条件検討を行った。ふすま培地で培養した時に菌体外グルタミナーゼ活性が得られたが、今回試みた液体培地で培養した際にはグルタミナーゼ活性を得ることが出来なかった。LB 寒天培地（pH9.0）で培養した A. oryzae RIB40 株の菌
体内グルタミナーゼ活性は 16mU/mg であったが、ウエスタンブロッティング法で AoGlsの存在を確認できなかった。今後、AoGls の誘導培養条件をさらに検討する必要が有る。

文献
1) R. Nandakumar, K. Yoshimune, M. Wakayama, M. Moriguchi, J. Mol. Catal. B: Enzym., 23,

87-100 (2003)
2) T. Yano, M. Ito, K. Tomita, H. Kumagai, T. Tochikura, J. Ferment. Technol., 66, 137-143(1988)
3) M. Wakayama, T. Yamagata, A. Kamemura, N. Bootim, S. Yano, T. Tachiki, K. Yoshimune,M. Moriguchi, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 32, 383-390 (2005)
4) N. Masuo, K. Yoshimune, K. Ito, K. Matsushima, Y. Koyama, M. Moriguchi, J. Biosci.
Bioeng., 100, 576-578 (2005)
5) K. Yoshimune, R. Yamashita, N. Masuo, M. Wakayama, M. Moriguchi, Extremophiles, 8,441-446 (2004)
6) N. Masuo, K. Ito, K. Yoshimune, M. Hoshino, K. Matsushima, Y. Koyama, M. Moriguchi,Protein Expr. Purif., 38, 272- 278 (2004)