酵素とポリリン酸を用いた安価な核酸合成技術

東京工業大学 地球生命研究所
教授 松浦 友亮
2024年5月21日

1

ヌクレオチド三リン酸
A

G

CNTP

U

• トリヌクレオチド三リン酸は、酵素を⽤いた物質⽣産に必須なエネルギー物質• ATPは、それ⾃体が薬• mRNAの原料

2

ヌクレオチド三リン酸生産の課題• ヌクレオチド三リン酸の合成法– 化学合成– 酵素合成– 微⽣物合成• 酵素合成は、環境負荷の少ない反応であること、⽣成物の精製が容易であるなどの利点がある。
• ⼀⽅で、原料のコストが嵩む問題がある。
グリーン

⽣産コスト ⽣成物精製の簡便さ

化学合成
酵素合成

+++

低い
⾼い場合もある++++++

微⽣物合成+

低い+3

ヌクレオチド三リン酸は高価
A

G

CNTP

U

A

G

CNMPU

• ヌクレオチド⼀リン酸は、三リン酸より安価（1/4〜1/10の市場価格）• NMPからNTPを安価に合成する⽅法は、市場価値がある4ポリリン酸キナーゼ２（PPK2）Class I (4YEG)
NDP + polyP(n)⇆ NTP + polyp(n-1)

Class II (3CZP)Class I

NMP + polyp(n)⇆ NDP + polyp(n-1)

Class IIClass III (6ANG)
NMP/ NDP + polyp(n)⇆ NDP /NTP + polyp(n-1)

Class III
Neville et al. Int J Mol Sci 2022, 23 (2).

Motomura et al. Appl Environ Microbio 2014

Class III PPK2 は、安価なポリリン酸を供与基質として、４種のNTPを合成できる可能性がある

5Class
III
PPK2
ATPの再生反応に使用されているProteinsynthesis

ATP,
GTP

AMP,
GDP

Shimizu et al., Nat Biotechnol, 2001

ATPCP
ADPAMP

ATPCKMK

ADP
ATP

NDK

GTPGDP

クレアチンリン酸¥5000/gFedorchuk, T. P. et al., J Am Chem Soc 2020, 142, 1038-1048.
Lubberink, M. et al, ACS Catalysis 2020, 10, 10005-10009.

GTPAMP PPK2+ GDPpolyP
Wang et al., ACS Synth Biol, 2020

ポリリン酸
¥10/g
既報では、特定種のClassIII PPK2が使⽤されているが、より⾼活性の酵素が存在する可能性がある6

Class III PPK2CHU(A0A6N4SMB)
pI: 6.78
MAN(A0A2T5C445)
pI: 8.79
ARE(A0A1M6FUJ9)
pI: 9.17
LEE(A0A1M5Z1E8)
pI: 6.43

PED(A0A519X5M4)
pI: 5.97
CHU: Cytophaga hutchinsonii
MAN: Mangrovibacterium marinum
ARE: Arenitalea lutea
LEE: Leeuwenhoekiella palythoae
PED: Pedobacter sp.

バイオインフォマティクスを駆使して、活性が⾼い可能性ある４種の酵素を選定
7

大腸菌を用いたClassIII PPK2の生産
MANPEDM

M- +ARE

LEE- +M

M- +240
180
140

240
180140240180140240
180140

100

100

100

100

7272727260606060

454545353535252525

202020151015151010- +• ⼤腸菌で⾼い発現量を⽰すため、酵素の製造コストも抑えることができる

453525

M: Protein maker(multicolor)20(-) : non induction(+) : induction

1510WAKO Supersep Ace 1020%20mA cc, 1.5hr
EzAqua gel stain, 90min

8100AMP

80

ヌクレオチド三リン酸合成活性
UDP

ADP

60NH2NNO
HO P O
OH

NO
OH OH

polyP60
UDP

N

ATPpolyP
Class III
PPK2100OOOHO P O P O P OOH OH OH

UMP

O

100000N

HPLC
analysis 050000

AMP

ARE

ADP
ATP

LEE
GMP

MAN

01CDP

234567Retention Time / min

89PED

GDP

ADP

CMP

4020
GMP

0CDP

N

20

N

-50000

60

UMP

N

OH OH

AMP

80

NH240 150000
Abs 260 nm / a.u.

AMP

9: AnP mix

GDP• ARE
MANは、４種のなかで最も⾼いLEE
NTP合成活性を⽰した。
MANPED• 単⼀酵素で全てのNDP, NMPを7080%の効率でNTPに変換可能

CMP

9MANは既報のCHUより高活性

MAN v2Full-length CHU v2
CHU
polyP 60

Identity: 51%

MAN(alpha-fold)

DP GMP GDP CMP CDP UMP UDP

120100806040200

MAN v2
MAN polyP
60
Relative Peak Area / %Relative Peak Area / %CHU(PDB:6ANG)AMP ADP GMP GDP CMP CDP UMP UDP

NTP
NMP
NDP
NPn

120 NTP
100 NMP80 NDP
NPn
6040200AMP ADP GMP GDP CMP CDP UMP UDP• MANは、既報のCHUより⾼活性• NTP⽣産に他のPPKを使⽤している企業もある

特願2023-182220

10MANはポリリン酸核酸誘導体を生成可能
MAN_Temperature 230721

NH2Relative
Peak Area%
Relative
Peak/ Area/%

Effect of temperature
120100NATPAMP
ATP ADPAMP APn

MAN_Temperature 230721

120801006080

ADP
APn

4060

HOO
P OOHOP OOH

NOnOH OHN
NOgawa et al., ChemBioChem, 2019
Mordhorst et al. ChemBioChem, 2019
Frank et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2020

2040200
02030374555
Incubation
Temperature
2030374555 / ºC
Incubation
Temperature/ ºC
MAN_Metal230722

Relative
Peak Area/ %Area / %Relative
Peak

Effect of metal ion

120100ATPAMP
ADP
ATP
APn

MAN_Temperature 230721

8012060100AMP
ADP
APn

80406020400200Mn

Mg
Ca
Co
Metal Ions

2030374555
Incubation Temperature / ºC

Ni

温度条件や⾦属イオンを調整することで、MANは世界最⻑のポリリン酸核酸を⽣成できた11

MANはワンポットでNTP４種を同時生成

12MANはNMPとpolyPからmRNAを生成

Nat. Biotechnol., 37(11), 1287-1293(2019).

• MANは、安価なNMP、polyPから⾼付加価値のmRNAを⽣成可能• 国内でのNTP⽣産技術基盤となる可能性がある

13

新技術の特徴・従来技術との比較
1.
2.
従来法（化学合成） 3.
4.
5.

微⽣物からRNA精製
ヌクレアーゼデNMPに分解
NMPをそれぞれ精製
化学合成によりNTPに変換
NTPの精製• 酵素合成は、化学合成より環境負荷が低い• 酵素合成は、微⽣物合成より精製プロセスを簡素化できる• 本技術により、安価なNMP、NDP、及びポリリン酸から、⼀つの酵素（MAN）でNTPを製造できる。単⼀プロセスでの製造が可能
14

今後の方向性・実用化に向けた課題• MANは、ピリミジン塩基(C, U) よりもプリン塩基（A, G)を好むため、４種に対して同程度のkcat/Kmを有する酵素の創出が課題• 反応後のpolyPの除去⽅法を検討する必要あり。(PPXを検討したい）• MANは、⾼価な⼈⼯塩基（主にウリジン誘導体）の⽣成に有⽤である可能性が⾼く、その可能性を早急に明らかにすべき

15

企業への期待• 現在のNTP製造法に対する優位性の⽴証• MANを⽤いたNTPの製造プロセスの構築（共同研究も可能）• ⼈⼯塩基合成ビジネスを展開する・あるいはその予定がある企業との共同研究

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称︓ヌクレオシド三リン酸の製造⽅法• 出願番号 ︓特願2023-182220• 出願⼈︓東京⼯業⼤学• 発明者︓松浦 友亮、リアム マイケル ロンゴ、渡邉 貴嘉、松本 ⿓征

17産学連携の経歴• 2012年-2013年– JST A-stepフィージビリティスタディステージ 探索タイプ事業に採択（カネカ株式会社と共同研究）• 2015年-2017年– 第⼀三共と共同研究実施（TaNeDSプロジェクト）• 2020年-現在– GeneFrontierと共同研究実施
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お問い合わせ先
東京⼯業⼤学 研究推進部 産学連携課
TEL︓03-5734-3817
Mail︓sangaku@sangaku.titech.ac.jp
URL︓https://www.ori.titech.ac.jp/

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質問事項
•『原料のポリリン酸は化学合成品か、あるいは⽣物由来か。』– 現在使っているのは、化学合成品。⽣物由来も使⽤可能– ポリリン酸は⾷品添加物として⼤量に使われているため、市場で⼊⼿が容易で、安全性や価格⾯でメリットが⾼い•『不純物の種類、⽐率について⽣産物に起因するものと⽣産物に起因しないもの、それぞれの情報』– 反応後に通常の核酸精製⽅法で、精製すれば、不純物は取り除ける。
– NTPの合成を⽬指す場合、不純物はNMP, NDPで総核酸に対して不純物が20-30%ほど（未精製の場合）。
– ⽣産物に由来しない不純物としては供与基質のpolyPがあるが、PPXで分解すれば⽐較的簡便な精製⽅法で取り除けると考えられる。
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