福岡県保健環境研究所年報第47号，62－66，2020

原著
河川水を対象とした環境DNA分析による魚類相調査の可能性
平川周作・中島淳
魚類相調査を目的としたメタバーコーディング法による環境 DNA 分析について、福岡県内の大佐野川における採捕調査で確認された魚種をどの程度検出できるか調査した。2014 年から 2020 年までの期間に実施した計 7 回の採捕調査では、調査回によって確認される魚種が異なっていたが、採捕調査で確認された全ての魚種を瀬と淵の混合試料による一度の環境 DNA 分析で検出することができた。また、採捕して確認されていないオオクチバスが環境 DNA 分析で検出されたため、調査地点上流を調査した結果、目視調査によりその生息が確認された。このように、環境 DNA 分析は調査地点およびその上流に生息する魚類を検出する能力が高く、魚類相調査に有効な手法と考えられる。
［キーワード：環境 DNA、メタバーコーディング］
１

はじめに調査計画を検討する必要がある。我々はこれまでに、環境近年、環境中に放出された生物由来のDNA (環境DNA)

DNA メタバーコーディング法を用いて河川における魚類を分析する技術が発展し、環境水から DNA を抽出し、そ相調査に関する検討をおこなった6)。その結果、同一の調のDNA を解析することで調査地点に生息する魚類の情報

査地点でも瀬と淵で環境 DNA 分析によって検出されるを獲得できるようになってきた1)。水域の環境 DNA 分析

魚種が完全に一致することはなく、どちらか一方で採水しにおける試料採取は水を汲むだけで良いという利点があた場合、検出可能な魚種を取りこぼす可能性が示唆された。

る一方で、採水地点の特徴に応じた時期、場所、採水量とそのため、河川を対象とした環境 DNA 分析では、各調査いった採水方法、採水後の保存方法や DNA の抽出方法な地点について瀬と淵の試料を混合するなど複数箇所で採どにおいて、研究者により様々な方法が採用されている2,水することにより、検出される魚種の取りこぼしの低減に3)。国内では、環境つながると考えられた。

DNA 分析手法の普及と標準化を目的

として、一般社団法人環境 DNA 学会により“環境 DNA調査・実験マニュアル”が発行され、標準的な方法と注意点が示されている4)。しかし、調査地点の環境や状況は一様ではないため、実際に環境 DNA 分析による魚類調査をおこなうにあたっては、同マニュアルや研究事例を参考にしつつ、目的に応じた調査計画と検討が求められる。
魚類を対象とした環境 DNA メタバーコーディング法
は、多種の魚類から放出され調査地点に存在する環境DNA をまとめて同時並列的に分析する手法であり、近年、魚類相の把握のための適用とその有効性が検証されはじめている3, 5)。環境 DNA 分析による魚類相の把握には、調査地点の水中に存在する多様な魚種から放出された環境 DNA を効果的に捕集できるように採水することが重要である。環境 DNA の抽出濃度や検出率を上昇させるた
めには、採水量や調査地点を増やすなどの方法があるが3)、調査や分析にかけることができる労力は限られていることから、コストパフォーマンスが最大になるよう、最適な
図 1 調査地点の概要

福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）- 62 -

本研究では、環境 DNA 分析による魚類相調査の可能性

および AMPure XP (Beckman Coulter) を用いて DNA をを探るため、事前検討した採水方法を用いて環境 DNA メ抽出・精製した。

タバーコーディングをおこない、同調査地点でこれまでに次に、12S rRNA の一部を標的領域とした MiFish U実施された採捕調査から確認された魚種をどの程度検出(forward: 5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAできるか調査した。

TCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’, reverse:5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNN

２

NNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’) および試料と方法

２・１

MiFish E (forward: 5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTC

採捕調査

福岡県内の御笠川水系大佐野川川久保橋付近

TTCCGATCTNNNNNNGTTGGTAAATCTCGTGCCAGC-3’,(N33.5111、E130.4995) において、2014 年 6 月 14 日、

reverse: 5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA2015 年 6 月 11 日、2016 年 6 月 11 日、2017 年 6 月

TCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG-3’)

17 日、2018 年 6 月 9 日、2018 年 9 月 7 日、2020 年を混合したプライマーセットを用いて、精製した DNA に1 月 21 日の計 7 回、投網 (直径約 5 m、目合約 10 mm)

ついて環境 DNA メタバーコーディング法による網羅的およびタモ網 (口径 40 cm、目合 2 mm) を用いて採捕調な魚類検出をおこなった 10)。PCR 酵素は TAKARA Ex Taq

査を実施し、採捕した種および目視で確認した種を記録し(タカラバイオ株式会社) を用い、1st PCR は 4 連で実施た。調査地点の概要は図 18)に示す。種の同定は、中坊 7)

おし、それらを混合したものを 2nd PCR に適用してサンプを基本とした。また、環境 DNA 分析でのみ

ル識別 index とアダプター配列を結合させ、ライブラリ検出された魚種に関する追加調査のため、調査地点の約ーを作製した。シーケンシング解析は、Miseq System

1.2 km 上流に位置するため池 (大池) と、同じく約 3.3(Illumina) を用いて 2×300 bp の条件で実施した。解析しkm 上流に位置するダム (大佐野ダム) において 2020 年

た DNA 配列データは、DDBJ Sequence Read Archive デー

10 月 19 日に双眼鏡を用いて目視調査を実施した。

タベースに登録した(Accession No. DRA010905)。

よび細谷

２・２

環境 DNA メタバーコーディング取得した DNA 配列について、MiFish pipeline (MiFish

環境 DNA メタバーコーディングのための採水は、2020

DB Ver. 30) (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/mifish) を用い

年 1 月 21 日の採捕調査と同時に実施した。試料は、瀬て魚種の同定をおこなった 11)。今回解析に用いた MiFishと淵をそれぞれ複数回採水し、約 500 mL ずつを混合して領域による環境 DNA メタバーコーディングでは、配列の1 L としたものを用いた。採水地点は図 1 に示す。なお、相同性が高いことから分類が困難な種が存在し、属までのDNA の分解を抑制するため、採水時に 10 w/v% ベンザ分類になるものや近縁の他種が代表種として出力されてルコニウム塩化物液 (日本製薬株式会社) を 1 mL 添加しまう場合がある。そこで、MiFish pipeline から出力されした。試料は、採水当日中にガラス繊維円形ろ紙 GF/F

た代表配列について、National Center for Biotechnology(Whatman) を用いてろ過し、DNA 抽出までろ紙を -20 ℃

Information の BLAST 検索機能を用いて国際塩基配列デら 9)の方法を参考にして、ろ紙にータベースに登録されている DNA 配列との相同性を確

細胞溶解液を加え、溶解液を回収した後、15% ポリビニ

認し、また、調査地点の生息情報をもとに和名の表記を含ルポリピロリドン溶液を最終濃度 2.5% になるように添めて表 1 のように整理した。

で冷凍保存した。Miya

加し、MPure Bacterial DNA Extraction Kit (MP Biomedicals)
表 1

BLAST および生息情報に基づく MiFish Pipeline 出力結果の読み替え

MiFish pipeline 出力結果

読み替え結果

学名

和名

学名

和名

Cyprinus carpio

コイ→

Cyprinus carpio

コイ

Cyprinus megalophthalmus

コイと同じ属名の種→

Cyprinus carpio

コイ

Pseudorasbora parva

モツゴ→

Cyprinus carpio

コイ

Carassius gibelio

フナ→

Carassius auratus

キンギョ

Oryzias latipes

メダカ→

Oryzias latipes

ミナミメダカCarassius sp.

アカブナと同じ属名の種→

Carassius langsdorfii

ギンブナ

Rhinogobius sp.

アヤヨシノボリと同じ属名の種→

Rhinogobius sp. OR

トウヨシノボリ- 63 -

表 2 採捕調査 (目視含む) で確認、および環境 DNA メタバーコーディングで検出された魚種の一覧
採捕調査

環境 DNA

2014 年6月

2015 年6月

2016 年
6月

ギンブナ

〇〇〇

ゲンゴロウブナ〇〇〇オイカワ〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇〇種名2017 年6月

コイ

カワムツ
カマツカ

〇

イトモロコ
ムギツク

〇

2020 年
1月

〇〇〇

〇
△

△

2020 年
1月〇〇〇

トウヨシノボリ

３2018 年
9月〇

ドンコ
ミナミメダカ2018 年
6月

〇
△〇〇

〇
〇

キンギョ

〇

オオクチバス
採捕調査 (○：採捕確認、△：目視確認)、環境DNA (○：検出)〇結果及び考察2014 年 6 月から2020 年 1 月の期間に実施した計 7回の採捕調査の結果、表 2 の左側に示す合計 11 種の魚類が確認された。調査回によって確認された魚種は異なっていたが、オイカワ Zacco platypus は全ての調査回で確認され、次いでカワムツ Nipponocypris temminckii、カマツカ
Pseudogobio esocinus、ムギツク Pungtungia herzi は 7 回のうち 6 回、イトモロコ Squalidus gracilis gracilis は 7回のうち 5 回の調査で高頻度に確認された。一方、コイ
Cyprinus carpio やドンコ Odontobutis obscura は 7 回の図 2 大佐野ダムで確認されたオオクチバス

うち、それぞれ異なる 1 回の調査でのみ確認された。採捕調査は主に小型の投網を用いて実施したことから、大型のコイや基質内に隠れる性質の強いドンコは捕獲されにくかったと考えられる。このほか、調査期間中に採集はできなかったが、ミナミメダカ Oryzias latipes が複数回、目視により確認された。
2020 年 1 月に実施した環境 DNA メタバーコーディングの結果を表 2 右側に示す。シーケンシング解析から取得した DNA 配列データについて MiFish pipeline を用いて魚種の同定をおこない、BLAST 検索および生息情報

図 3 大佐野ダムで確認されたブルーギルをもとに整理した結果、採捕調査で確認された全ての魚種(11 種) が検出された。これまでに、環境 DNA メタバーコーディングでは底生魚の確認率が低い傾向にあることが報告されているが5, 6)、本研究ではカマツカやドンコ、トウヨシノボリ Rhinogobius sp. OR などの底生魚を含め、採捕調査で確認された魚種全てを検出することができた。
本研究において実施した瀬および淵で複数回採水し混合する方法は、一度の環境 DNA メタバーコーディングにおいて検出魚種の取りこぼしの低減に寄与したと考えられ- 64 -

図 4 大佐野ダムで確認されたニシキゴイ

本研究では環境 DNA 分析の試料採取において瀬およびる。
また、環境 DNA メタバーコーディングにおいて、採捕淵で複数回採水し混合する方法を採用しており、検出魚種調査では確認されていない外来種のキンギョ Carassiusの取りこぼしの低減に寄与したものと考えられる。さらに、

auratus とオオクチバス Micropterus salmoides も検出さ調査地点において採捕確認されていないオオクチバスがれた。これらの魚種は 7 回の採捕調査で一度も確認され

環境 DNA 分析で検出され、上流を調査した結果、その生ていないが、その上流に生息していた場合は DNA のみ流息が確認された。このように、環境 DNA 分析は、外来種下して検出された可能性があることから、調査地点上流のの侵入を検知する手段としても活用できる可能性があり、ため池およびダムについて追加調査をおこなった。ため池

速やかな環境保全対策を講じる手立てとなり得ることがでは、目視調査で魚影を確認することはできなかった。一示された。

方 、 ダ ム で は 、 オ オ ク チ バ ス 、 ブ ル ー ギ ル Lepomis
macrochirus、コイ (ニシキゴイ)、オイカワが確認された。

謝辞

このうち、撮影したオオクチバス、ブルーギル、コイ (ニシキゴイ) の写真を図 2－4 に示す。また、ダムの流入部

本研究は、JSPS 科研費 JP19K04682 の助成を受けたものです。

では、採捕によりトウヨシノボリとタカハヤ
Rhynchocypris oxycephala の生息が確認された。調査から、

文献

環境 DNA でのみ検出されたオオクチバスは、調査地点の1)

宮正樹：環境 DNA メタバーコーディング－魚類群集

上流に生息していることが確認されたが、キンギョについ研究の革新的手法 バケツ一杯の水で棲んでいる魚がては、その生息を確認することができなかった。要因としわかる技術，化学と生物，57，242-250，2019．て、放流により一時的に生息した個体を検出した可能性や

2)

キンギョを飼育している家庭からの生活排水の混入の可能性、キンギョと在来フナ類は交雑することから12) 形態域の研究事例を中心にして～，66，583-599，2016．
3)と DNA 情報が一致していなかった可能性が考えられる。
また、オオクチバスと同様に上流に生息していたブルーギ

高原輝彦ら：環境 DNA 分析の手法開発の現状～淡水
山中裕樹ら：環境 DNA 分析の野外調査への展開，日
本生態学会誌，66，601-611，2016．

4)

環境DNA 調 査 ・ 実 験 マ ニ ュ ア ル

Ver.2.2

ルとタカハヤは、下流にある本研究の環境 DNA 調査では(https://ednasociety.org/wp/wp-content/uploads/2020/09/e

検出されなかった。個体から放出された DNA は環境中でDNA_manual_ver2_2_1.pdf)，2020.10.9.

分解が進むため、環境 DNA が生物分布を反映する距離は5)

赤松良久ら：河川水辺の国勢調査による魚類相調査と数百 m 程度と見積もられているが4)、河川において約 10

環境 DNA メタバーコーディング解析の比較検討，土km 上流の地点に生息する生物の環境 DNA を検出した

木学会論文集 B1 (水工学)，74，I_415-I_420，2018．

事例も報告されている13)。また、魚種によって水試料の採6)

取位置で DNA 濃度と検出率が異なることも示されていた河川における魚類調査手法の検討と水質による影る2)。このように、河川によって環境が異なること、また、対象種やその存在量にも影響されることから、どの程度下

平川周作ら：環境 DNA メタバーコーディングを用い響の解析，環境化学，30，125-132，2020．

7)

流まで DNA が残存し、環境 DNA 分析で検出されるか

中坊徹次：日本産魚類検索 全種の同定 第三版，2013（東海大学出版会，秦野）については、今後さらなる検証が必要である。

8)

４9)

細谷和海：増補改訂 日本の淡水魚，2019（山と渓谷社，東京）

まとめ

M. Miya et al.: J. Vis. Exp., e54741, 2016.

メタバーコーディング法を用いた環境 DNA 分析につ

10) M. Miya et al.: Royal Soc. Open Sci., 2, 150088, 2015.

いて、福岡県内の御笠川水系大佐野川を対象に採捕調査で11) Y. Sato et al.: Mol. Biol. Evol., 35, 1553-1555, 2018.

確認された魚種をどの程度検出できるか調査した。201412) 冨澤輝樹ら：ミトコンドリア DNA および核 DNA の年から 2020 年までに実施した 7 回の採捕調査では、調解析による魚取沼テツギョの起源，魚類学雑誌，62，査回によって確認される魚種が異なっていたが、7 回の採51-57，2015．

捕調査で確認された魚種全てを一度の環境 DNA 分析で13) K. Deiner and F. Altermatt: PloS one, 9, e88786, 2014.

検出することができた。このように、メタバーコーディング法を用いた環境 DNA 分析は、調査地点に生息する魚種を把握する有効な手法になり得る可能性が示された。また、- 65 -（英文要旨）

Possibility of fish fauna survey by environmental DNA analysis of river water
Shusaku HIRAKAWA and Jun NAKAJIMA
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan
We investigated the extent to which environmental DNA analysis using the metabarcoding method can detect fish species
identified in the fishing survey in the Osano River in Fukuoka Prefecture. In seven fishing surveys conducted between 2014 and2020, the identified fish species differed from survey to survey, but all the fish species identified in seven fishing surveys weredetected by a single environmental DNA analysis. In addition, a largemouth bass (Micropterus salmoides) was detected inenvironmental DNA, which fishing survey had not identified. As a result of an upstream survey, the presence of largemouth bass
was confirmed by visual inspection. Thus, environmental DNA analysis is considered an effective method for ichthyofaunalsurveys because of its ability to detect fishes living at, or upstream from, a study site.
[Key words ; environmental DNA, metabarcoding]- 66 -