トピックス
X 線自由電子レーザーで捉えたバクテリオロドプシン
構造変化の三次元動画
南後恵理子
理化学研究所放射光科学総合研究センター

久保稔

理化学研究所放射光科学総合研究センター

岩田〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111

想

京都大学大学院医学研究科

要 旨〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111〒6068501 京都市左京区吉田近衛町

タンパク質はその機能を発現する際に三次構造を変えるとされ，“動いている”状態の詳細に興味が持たれてきた。
しかし，タンパク質の動きを原子レベルまで解明できる汎用的な手法はなく，タンパク質動的構造解析の新たな手法の確立が期待されていた。今世紀に入って実用化された X 線自由電子レーザー（XFEL）は，非常に強力な X 線
パルスによって放射線損傷が顕在化するより短い時間（＜10 fsec）で回折現象が完結するため，化学変化など物質の極めて速い動きを原子分解能で捉えることが可能な技術である。我々は，XFEL を用いたタンパク質結晶構造解析の技術開発に取り組み，タンパク質が機能を発現して動いている段階の構造を捉えるための時間分割実験を行った。光照射によってプロトン移動を起こす膜タンパク質であるバクテリオロドプシンを用いて測定を行ったとこ
ろ，ナノ秒からミリ秒にかけて13点の時間で測定に成功し，プロトン移動における一連の構造変化を動画のように捉えることができた。

その詳細が明らかとなる。今までに，タンパク質の“動く”

1. はじめに状態を捉えるために，白色 X 線を用いたラウエ法や極低タンパク質の三次構造はその機能と密接に関与すること

温で中間体を捕捉するクライオトラップ法が検討されてきから，機構解明や医薬などの設計などを目的として，多くた。しかし，前者は技術的な困難さがあり，後者は極低温のタンパク質について三次構造解析が行われている。 X

下でも反応が進行する可能性がある。このように，“動的”

線結晶構造解析は，原子分解能での構造情報が得られるたな構造を原子分解能で決定することは， X 線結晶学におめ，重要なタンパク質構造解析方法として用いられてき

いて長い間試行錯誤されてきた課題であった。これが実現た。今までに 10万件以上ものタンパク質構造が X 線結晶化されると構造生物学のパラダイムの転換とも言うべき進構造解析によって解明され， protein data bank に登録さ歩と言えよう。

れている。その一方で，従来の X 線結晶構造解析では基

さて，今世紀に入り新たな放射光源である X 線自由電

本的にタンパク質が働く前か後の“止まった形”を測定しており，“動いている”途中を観測することは非常に困難であった。
一般的に，タンパク質が“働く”際には，三次構造の変化が起こるとされ，機能する前もしくは後の構造とは異なると考えられている。例えば，細胞膜に存在する物質の運搬を担う輸送タンパク質は，イオンなどを細胞外から取り込み，細胞内へと運ぶ際，図のように構造変化を起こす（交互アクセスモデル）と推測されている（ Fig. 1 ）。現在
は，“静止”状態の三次構造を基に薬剤など設計を試みた
り，どのような機構でその機能を発現するのか推測を行ったりしているが，生体内で重要な役割をしているタンパク質の機能する瞬間を原子レベルで捉えることが可能となると，タンパク質と特異的に作用する分子の結合する様子やFig. 1(Color online）Alternative access model for transporters inmembrane.

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(C) 2017 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

トピックス ■ X 線自由電子レーザーで捉えたバクテリオロドプシン構造変化の三次元動画

子レーザー（XFEL）が実用化され，最初に米国の LCLS

結晶からの回折像を記録する。最初の SFX 実験は2009年(Linac Coherent Light Source）で2009年より供用開始とLCLS で行われ2)，2013年には，光で励起されるタンパクなり，続いて日本の SACLA (SPring8 Angstrom Com-質（光化学系 II ）を用いたポンププローブ型の時間分割

pact free electron LAser）においては2012年より供用開始

SFX 実験が報告された3) 。この実験では，空間分解能 5.9となった。 XFEL の非常に強力なフェムト秒の X 線レーÅ といった低い分解能での構造決定であったが，その後ザーパルスにより，試料が崩壊して放射線損傷が顕在化す

2014 年から 2016 年にかけて，同様の方法を用いて， pho-

る前に回折像を取得すること1)が可能となった。また，そtoactive yellow protein （ 分 解 能 1.6 Å )4) や ミ オ グ ロ ビ ンの極めて短い X 線パルスにより，素早く起きる構造変化（分解 能 1.8 Å )5) の時間分割 SFX 実験が LCLS で行なわを捉えることができることから，タンパク質が動いている

れ，詳細な構造変化を捉えることに成功している。

姿を原子レベルで捉える手段としても期待されている。
XFEL を 用 い た タ ン パ ク 質 結 晶 構 造 解 析 方 法 と し ては，シリアルフェムト秒結晶構造解析（ SFX ）が挙げら

SACLA においては，理化学研究所を代表機関とする X

線自由電子レーザー重点戦略研究課題「創薬ターゲット蛋
白質の迅速構造解析法の開発」（代表岩田想）が採択される（ Fig. 2 ）。これは，微結晶を XFEL の照射領域に連れ， 2012 年より SFX 法の技術及び装置開発を行ってき続的に送って測定する方法で， XFEL によって試料が損た。我々は測定装置の開発6)や高粘度媒体を用いた結晶送傷を受けるために新しい試料を次々に供給して，多数の微液 方 法 の 技 術 開 発7) な ど に よ り SFX の 基 盤 を 構 築 し ，2014 年からは光によってプロトン移動を行う膜タンパク質であるバクテリオロドプシン（ bR ）をモデルとして，汎用的な時間分割 SFX 実験装置及び技術開発に取り組んできた。昨年度には， bR が光で励起された後ナノ秒からミリ秒にかけて，構造を変化させながらプロトン移動を行う様 子を 動画 のよう に捉 える実 験に成 功す るに至 った（Fig. 3)8)。
bR は，高度好塩菌の膜に存在する光駆動型プロトンポンプであり，光により細胞質のプロトンを細胞外へと能動的に輸送する。それによりプロトン濃度差が生じ，高度好塩菌 は生 体エ ネルギ ー分 子であ るアデ ノシ ン三リ ン酸（ ATP ）の合成を行っている。 bR は様々な研究グループ
Fig. 2(Color online）Outline of serial femtosecond crystallography.

Fig. 3によって長年研究が行われてきたタンパク質で， 15 年程前にはクライオトラップ法による光中間体構造解析が盛ん(Color online）Time-resolved SFX data collection from bR crystals at thirteen time-points from nanoseconds tomilliseconds following photo-activation.

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 219

に行われた9)。しかし，放射線損傷を受けやすいこと，極吐出する。試料を節約するには流速を下げたいところだ

低温では真の中間体構造を捉えるのが難しかったことなど

が，流速を下げると表面張力の影響で直線状のジェットをから，反応機構などの議論の終結に至っていなかった。我維持できずに液滴状になってしまう。一方で，集光した々は，今回の実験によりプロトン移動の際に起こる一連の

XFEL ビーム（SACLA では約1.5 mm×1.5 mm）を試料ス

構造変化を原子分解能で捉えることができ，bR がどのよ

トリームに照射して，微結晶と XFEL が“ヒット”する

うにしてプロトンを同一方向に移動させるのか，その巧妙ためには，ある程度結晶密度を高くする必要がある。我々な仕組みの解明に重要な貢献をもたらした。また，本成果は，概ね 107 から 108 個/ mL の結晶密度で実験を行っておのようなナノ秒からミリ秒という長いタイムスケールで，り，この場合は20から30程度の“ヒット”率である。

水分子の移動や広い範囲に渡ったタンパク質構造の変化を

この結晶密度はタンパク質の量としては 1 mL 当たり数10明らかにした例は今までになく，世界に先駆けて捉えたmg に相当し，SFX 実験では 1 つのデータセットを得るの“タンパク質三次元動画”となった。

に 30 分 か ら 1 時 間程 度 試 料 を 流 し続 け て 測 定 す るた めに，この輸送方法では必要とされる試料量が非常に多い。

2. シリアルフェムト秒結晶構造解析とは
2.1

概要

そこで我々は， bR の時間分割 SFX 実験において，試
料消費量の低減のために lipidic cubic phase ( LCP ）を用いた結晶輸送方法を用いることにした。 LCP は，モノオ

従来のタンパク質 X 線結晶構造解析では， 1 つの結晶

レインなどの脂質膜中で結晶化する方法であり，非常に高を固定して，少しずつ回転させながら X 線を照射するこ

粘度な溶液の中で比較的小さい結晶が生成される傾向があとによって回折像を得るという振動写真法が主に用いられる11)。高粘度溶液を用いる利点は，低流速（0.25 ml/min）てきた。また， X 線による放射線損傷を防ぐために結晶でも連続した試料ストリームを得ることができることで，を急速凍結し，極低温下で測定するのが一般的である。一

結果的に必要試料量を少なくすることができる。液体ジェ

方， SFX では， XFEL の非常に強力な X 線レーザーパル

ットインジェクターを用いた場合と比べると概ね千分の一スで結晶が照射後に崩壊することから，多数の微結晶（1程度まで試料消費量を減らすことができる。 LCP 試料の～30 mm 程度の大きさ）を結晶化溶液などの溶液と混合し結晶輸送装置としては， 2014 年に Weierstall らによってた状態で結晶輸送装置（インジェクター）より流して，異LCP インジェクターが開発されており，これは細いシリなる配向の多数の微結晶からの回折像を収集する10) 。こ

ンダーの先端に 50 100 mm の細いキャピラリーを，後方の方法の利点は，1試料の放射線損傷が顕在化する前のにプランジャーを取り付けて， HPLC の水圧によって高構造情報が得られる， 2凍結せずに室温下で測定を行う

粘度の試料を押し出す仕組みとなっている12) 。我々も，ため，生体内の条件に近い常温構造が得られる， 3極短

このタイプと同様の装置を用いて， bR の時間分割 SFX

X 線パルス（SACLAでは10フェムト秒より短い X 線パル実験を行った。

ス）を用いるため，シンクロトロンのバンチ幅よりも短い
フェムト秒～ピコ秒といった高い時間分解能が得られる，

2.3

試料調製方法4強力な X 線レーザーのため微結晶（10 mm 前後）で実LCP による結晶化方法は，液状のモノオレインとタン験を行うことが可能，などが挙げられる。時間分割実験のパク質溶液を混合して LCP を作成し，それをガラス板の観点からは， SFX では微結晶を使うために，反応を開始

上に分注した後に結晶化溶液を滴下し，ガラス板を被せてする際，結晶内の分子を一斉に反応させることが容易であ結晶を作成するのが一般的である。 SFX では， LCP 法でるなどの利点がある。また，光で励起する場合は，大きな作成した結晶を単離して使用するのではなく，脂質も輸送結晶に比べて光が透過しやすく，十分に励起しやすい。一媒体として利用するため，この方式で結晶化すると測定試

般的に結晶内のタンパク質を100励起させることは容易

料の回収とインジェクターへの導入が困難である。 SFX

ではなく，励起状態と基底状態の複数構造が観測されるこに適した LCP 結晶化方法としては， Liu らが報告したシとが多いことから，比較的励起させやすい小さな結晶で時リンジを使った方法が知られている13) 。これは，結晶化間分割実験が行うことができるのは非常に有利である。

溶液 の入 った シリン ジに ，脂質 とタン パク 質から 成る
LCP を細い筒状で挿入して結晶化を行う方法で， 100 ml

2.2

結晶輸送方法のシリンジ一本当たり， 5 ml 程度の LCP 結晶しか得られ

SACLA では，最大60 Hz で繰り返される XFEL パルス

ないため多くのシリンジを用意する必要がある。また，試を試料に照射する。そのため， SFX では XFEL 照射領域

料回収の際，溶液を含みやすく粘度が低下するため，溶解に連続的に結晶を送ることで，高速で繰り返される X 線

したモノオレインの添加も必要であるなど，試料を調製しパルスに試料が当たるようにしている。 SFX 実験用に最にくい点があった。そこで我々は， 30 ml ほどの筒状の初に開発された液体ジェットインジェクターは，緩衝液にLCP を作成し，崩れにくいように細い金属ワイヤーを挿懸濁させた結晶を高流速（流速 10 ～ 300 ml / min 程度）で入してから，結晶化溶液の入ったチューブに筒状の LCP

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トピックス ■ X 線自由電子レーザーで捉えたバクテリオロドプシン構造変化の三次元動画を浸漬する方法を開発した。この方法では，多くの器具を光を行なった。溶液中における bR の光反応サイクルは，必要とせず， LCP 結晶の回収も容易であったことから，

K → L → M → N → O 中間体を経てターンオーバーすること

多くのデータセットを測定する時間分割実験に適していた。

が知られている（Fig. 4）。それらの中間体は，可視波長域

さて， SFX 実験における成功の鍵は，如何に試料を一にレチナール由来の特徴的な吸収を示すため，時間分解可定流速で安定して流せるか，にある。決まったタイミング

視分光は中間体の同定に有用である。ただし，微結晶の時で励起のための可視光レーザーと XFEL が試料ストリー

分割分光はこれまでに例がないため，測定には自作の顕微

ムに照射されるため，試料の流れが途中で止まったり，一装置を用いた。

定流速でなかったりすると損傷や複数回光照射を受けてい得られた時間分解スペクトルを Fig. 5 に示す。図には各る結晶からの回折像が得られる恐れがある。 LCP 法で作

遅延時間のスペクトルから光反応前（暗状態）のスペクト成した bR 結晶をそのままインジェクターから流すと，非ルを引いた差スペクトルを示してある。したがって，負の常に柔らかいため真っ直ぐに流れず，ノズル付近で玉状に

信号は暗状態の bR （ lmax 570 nm ）由来である。 Global

なるという問題があった。粘度を上げるために，溶かしたˆtting 解析の結果，時間分解スペクトルは次のように解釈

モノオレインを少量加えてからインジェクターより流したできることがわかった。まず装置の時間分解能（ ms ）よが，今度は部分的に粘度のムラがあるためか，真っ直ぐにりも速く， L 中間体（ lmax 550 nm ）が生成する。 2.5 ms

流れつつも流速は不安定であった。そこで，モノオレインのスペクトルの負の信号のピークが 570 nm よりも長波長だけでなく様々な添加剤を検討し，一定流速になるように側にあるのは，L 中間体の吸収のためである。次に試行錯誤した。しかし，流れが良くなったとしても一方では結晶の質が低下するなどの問題が起こり，真っ直ぐに一定流速に流す，ということは意外に難しかった。最終的には少量のパラフィンオイルを LCP 結晶に添加すると安定して真っ直ぐに流れ，結晶の質にも影響を与えないことを見出すことができた。

3. バクテリオロドプシン結晶の光反応
サイクル
bR は，発色団としてレチナール分子を含んでおり，その構造は，細胞膜を 7 本のヘリックスによって貫通する形を成している（Fig. 4）。レチナールはリシン残基とシッ
フ塩基を形成し，レチナール部分が光を吸収すると，トランス体からシス体へと異性化し，プロトン移動を開始する（Fig. 4）。
時間分解 SFX を行う前に，結晶パッキングのダイナミ
クスへの影響を調べるため，bR 微結晶の時間分解可視分

Fig. 4

Fig. 5(Color online）Time-resolved diŠerence absorption spectra
recorded from slurries of bR microcrystals.  represents
stray light originating from the pump beam at 532 nm.

(Color online）Bacteriorhodopsin. (A) Structure. (B) Photo-isomerization of the retinal. (C) Photocycle.

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 22115(±7)ms の時定数で M 中間体（lmax 410 nm）が生成す（すなわち結晶の表面と裏面）から照射できるように設計る。410 nm の正の信号の増大は，M 中間体に由来する。

し，結晶中で起こるわずかな構造変化を捉えやすくする工

このとき同時に L 中間体が消失するため，負の信号の中夫も行った。

心は短波長側にシフトしている。最後に 8(±3)ms の時定

ところが，二方向励起を導入したために，ヘリウムチャ

数で M 中間体が消失し，系は光反応前の bR に戻る。以ンバーを設置することが非常に困難となった。従来，空気上をまとめると，LCP 微結晶中の bR は，（K)→L→M 中

散乱によるバックグラウンドノイズを低下させるためにヘ間体を経てターンオーバーすることがわかった（装置の時リウムチャンバーを使用してきたが，時間分割 SFX 実験

間分解能の制限のため，我々は K 中間体の観測はしていでは，インジェクター付近にはレーザーの焦点径を絞るたない）。

めの対物レンズやそれにつながる光ファイバーなどの光学結晶中で N, O 中間体が観測されなかった原因は，おそ素子が並び，これらを覆うようなチャンバーを置くと，今らく結晶コンタクトによりへリックスの構造変化が制限を

度はレーザー調整やインジェクターの試料交換が難しくな受け，それらの中間体が不安定化したためであろう（中間ることが考えられた。そこで，チャンバーは設置せず，バ体の分解速度が生成速度を上回ると観測できない）。実際

ックグラウンドノイズ低下のために試料付近までヘリウムに結晶構造を見てみると，光サイクルの後半で大きく構造

パスを設置して対応した。インジェクターや各光学素子な変化が起こるとされる E 及び F ヘリックスを繋ぐループ

どはすべて XYZ ステージで調整できるようになっており，が，隣接する分子の C 末端と接していた。bR ではこのよ

75 mm 径の細さで流れる試料と， 1.5 mm 径の XFEL, 40

うに結晶相と溶液相とで遅いダイナミクスに相異が見られmm （半値全幅として）径の可視光レーザーが空間的に高たが，レチナールから Asp85 へのプロトン移動は L → M

精度で重なり合うことを可能にした（Fig. 6)14)。

遷移で起こることがわかっている（ M 中間体の吸収極大が 410 nm にまで大きく短波長シフトしているのは，レチ

4.2

時間分割 SFX 実験

ナールの脱プロトン化に起因する）。そこで我々はこのプ

我々は， 2014 年 4 月から結晶化，結晶分光，装置開発

ロトン移動機構の解明を目指し，時間分解 SFX においてといった準備を進め，2015年 1 月に最初の実験を SACLA

K, L, M 中間体の構造解析を試みた。

で行った。bR の構造変化は，光照射後の構造と暗状態の構造との差フーリエ電子密度マップで高感度に捉えること

4. 時間分割 SFX 実験について
4.1

測定装置開発ができる。そこで光照射後の回折測定と暗状態での回折測定を交互に行なうことで（可視光レーザー 15 Hz, XFEL
30 Hz），両測定条件をできるだけ同一にした（Fig. 7）。つ

SACLA で は ， SFX 実 験 の た め の 測 定 装 置 と し てまり，光照射を行ってから設定した遅延時間後に XFELDAPHNIS (diverse application platform for hard Xrayの 照 射 を 行 い （ light ）， 次 に 光 照 射 な し で XFEL 照 射

SACLA）を用いている6)。この実験プラッ（ dark ）を行い，指数付け可能な回折像が 15000 枚得られトフォームは，インジェクター取り付け部分を含むヘリウるまで同じ遅延時間での測定を続けた。可視光レーザーのムチャンバー，試料やインジェクターノズルの位置確認の照射範囲は，試料ストリームの幅とほぼ同じ大きさに絞っためのカメラ，検出器などから構成されており，各種インてあるが，結晶を含む媒体（脂質）がまるで光ファイバー

diŠraction in

ジェクターを取り付けることができるなど汎用的な設計となっている。しかし，時間分割 SFX 実験を行うにあたっては，光励起を行うための可視光レーザーを導入する必要があり，新たに測定装置を準備する必要があった。
まず，使用する可視光レーザーについては， 532 nm の
ナノ秒パルスレーザーを用いることとした。これは，結晶分光から bR の構造変化を少なくともナノ秒～ミリ秒まで追うことが予想されており，このような長いタイムスケー
ルで様々な時点で測定するには，ナノ秒レーザーの方が調整や取り扱いが容易であったためである。この研究を始めた 2014 年頃は， LCLS 及び SACLA に設置されている可視光レーザーはフェムト秒レーザーでありこちらを使うほうが一般的であったが，一般的にタンパク質の構造変化が起こる時間スケールはマイクロ秒以降であるため，汎用性も考慮してナノ秒レーザーの導入を決めた。また，bR 結晶の励起効率を上げるために，可視光レーザーは二方向

222 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5

Fig. 6(Color online）Set-up for the time-resolved SFX experiment.

トピックス ■ X 線自由電子レーザーで捉えたバクテリオロドプシン構造変化の三次元動画のように光を試料ストリームの軸に沿って（上流方向に）16ナノ秒から 1.7ミリ秒の時間スケールにおける13タイム

散乱する傾向がある。そこで，交互に測定された暗状態のポイント（16 ns, 40 ns, 110 ns, 290 ns, 760 ns, 2 ms, 5.25構造に励起光の散乱の影響がないかを，完全な暗状態の構

ms, 13.8 ms, 36.2 ms, 95.2 ms, 250 ms, 657 ms, 1.725 ms）で造と比較することで確認した。その結果，流速を通常のの測定を成功するに至った。この 13 種の中間体データにSFX 実験の10倍にあたる2.5 mL/min にまで上げて測定す

ついて，差フーリエ電子密度マップを基にモデル構築を行る必要があることがわかった。

った。これらの構造はすべて基底状態の構造と中間体構造

さて， SFX 実験では，膨大な枚数の回折像からデータの混ざった状態であり，中間体の平均占有率はおよそ 20

セットを構築している。SACLA で30 Hz のデータ測定をから 30程度であった。 Phenix を用いて構造精密化を行行うと，データレートは毎秒120 MB にも及び，その中にい，最終的に2.1 Å の空間分解能でそれぞれの構造を決定

は，結晶からの回折を含むヒット画像と結晶に XFEL がすることができた。

当たらなかった外れ画像が混ざっているため，ヒット画像だけを選別して処理する必要がある。また，各回折像は別々の結晶に由来するため，数枚の回折像を見て分解能など

5. bR の構造変化とプロトン移動の機構

結晶の質を判断することは困難であり，データセット全体

bR における最初のプロトン移動は，レチナール上のシにおける分布を考慮する必要がある。これらの情報をビー

ッフ塩基から 4 Å ほど離れた細胞外側にある Asp85 に移

ムタイム中に迅速に得るために，SACLA では2014年後期

動することによって始まる。不思議なことに，シッフ塩基より SACLA 向けに修正された Cheetah によるデータ処のプロトンは，光照射前は細胞外の方向を向いているが，

理パイプラインを使用している15) 。パイプラインは，オ

光異性化によってシス型に変化した時には，移動する方向

ンライン系とオフライン系の二段階からなり，前者では検とは逆の細胞内側へと方向を変える。これは一見不利な状出器で取得された画像がほぼリアルタイムで解析され，ヒ況にも思えるため，どのようにして最初のプロトン移動がット率や飽和した回折点の数，空間分解能の見積もりが表行われているのか，また，何故いつも同じ方向に移動する示される。後者のオフライン系ではヒット画像だけを選別のか長い間興味が持たれてきた。

して HDF5 形式のファイルに書き出し，CrystFEL によっ光が照射される前の基底状態の bR 構造を見てみると，て指数付けと積分を行っている。我々が行った時間分割実レチナール上のシッフ塩基と Asp85 の間，すなわちプロ

験では，励起レーザー照射の有無をフォトダイオードの出トンが移動する領域に複数の水分子が存在して，強力な水力によって分類する機能を新たに導入し，光照射と暗状態

素結合を形成している（Fig. 8）。これらの配置が，シッフを交互に測定すると同時にこれらのデータの分類を可能と塩基（ pKa 13.3 ）と Asp85 （ pKa 2.2 ）の酸解離定数の大した。

きな差を生じ，基底状態ではプロトン移動が起きにくい仕このように様々な準備や検討を経て最初の実験を行った組みを形成している。

我々であったが，その時に調製された結晶は反射が出ない

時間分割 SFX 実験で得られた構造を時間経過ごとに見トラブルに見舞われ，実験続行が困難かと思われた。しかていこう。光励起から最も早い遅延時間である 16 ナノ秒

し，数ヶ月前に作成して保管しておいた結晶で良好な反射後の構造変化を見てみると，この時間での構造変化は，レを示し，なんとか実験装置の検証を達成した。その後，時チナール付近にのみ観察された。また，光によりシス体へ

間分割 SFX 実験に適した試料調製，結晶導入方法の技術と異性化したレチナールが，平面構造ではなく捻じれた構

開発に取り組み， 2015 年 7 月にはナノ秒からミリ秒にかけての 4 つのタイムポイントでのデータ取得に成功し，最終的には三回目の実験である 2016 年 2 月に，光照射後Fig. 7(Color online）Data collection sequence of the timeresolved SFX experiment.

Fig. 8(Color online）Hydrogen-bond networks around the SchiŠbase in the ground state structure of bR.

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 223

造をしていることがわかり，シッフ塩基と水素結合していにより，シッフ塩基上のプロトンは逆方向を向くものの，た水分子が消失していることも明らかとなった。次に，

この水分子が現れ，Asp85へのプロトン受け渡しを媒介し290ナノ秒後の変化を見ると，今度はレチナールが共役二てその移動を達成するという bR の巧妙な仕組みが突き止

重結合のとるべき平面構造になっていた。更に， 20 位のめられた。また，最初のプロトン移動が完結するまでにメチル基が細胞質側にシフトすることにより，その近傍には，光照射から 10 マイクロ秒程度の比較的長い時間がか

存 在 す る Trp182 が 細 胞 質 側 へ と 押 し 上 げ ら れ て い た

かっていたが，この間にヘリックスの大きな動きを伴う変（Fig. 9）。

化が起こっていることが明らかとなった。

光照射から760ナノ秒程度経過すると，今度はレチナー

さて，シッフ塩基から Asp85 へのプロトン移動が終わル付近の Trp182 だけでなく， Leu93 の側鎖が細胞質側へると，今度は一過性の水分子が消えるだけでなく，Asp85と向きを変えていた。興味深いことに，Leu93の側鎖が動と Thr89の水素結合もやがて消失していく（～250マイクいて生じた空間には，水分子と考えられる電子密度が現れロ秒以降）。それまでは，シッフ塩基と Asp85の間は水分ることがわかった（ Fig. 10 ）。この水分子は，シッフ塩基子も含めた強力な水素結合ネットワークを形成していたが，及び Thr89 と水素結合しており，シッフ塩基上のプロト

250マイクロ秒後はシッフ塩基と Asp85は断絶された状態

ンが Asp85 へと移動するのに重要な役割をしていると考になり，プロトンの逆流が起こりにくくなる（Fig. 11）。こえられた。また，この水分子は光照射後 40 ナノ秒から 10の観察結果から，bR が細胞質側から細胞外へと同じ方向

マイクロ秒の間に観測されその後消失していた。ちょうどにプロトンを輸送する機構はこの一連の構造変化に起因す

この時間スケールは，bR 結晶を用いた可視吸収分光測定

ると考えられる。

により L 中間体から M 中間体へと移り変わる過程と一致

今回我々が行った時間分割 SFX 実験により，ナノ秒かしていた。 L から M 中間体へと遷移する時にプロトン移

らミリ秒にかけたまさに“動画”のような bR の構造変化動が行われることが知られていることから，この水分子はを追跡することができた。光照射から 16 ナノ秒後は，中プロトン移動の時だけ現れることが今回初めて明らかとな心に存在するレチナールの光異性化やその近傍の小さな構った。今まで，レチナールが光異性化する際，シッフ塩基

造変化であったのが，時間経過につれて構造変化が外側へ上のプロトンは細胞質側へと向きを変えるため，移動すると広がっていく様子が観測された。bR におけるプロトンべき方向とは逆向きに動くことが謎であった。今回の結果

移動のきっかけは，レチナールのトランスからシス体への光異性化であるが，これ自体はナノ秒以前の非常に早い時
間スケール（フェムト秒からピコ秒）で起こっている。一方，プロトン移動は 10 マイクロ秒程度かけて，ヘリック
スなど大きな構造変化を伴いながら起こっている。これは，bR がプロトンを逆流させることなく，毎回同じ方向へと移動させるために必須な構造変化と思われる。このように，
bR がプロトンを移動するために構造を様々に変化させている様子を目の当たりにすると，タンパク質が起こす反応の仕組みの巧妙さに感嘆させられる。

Fig. 9(Color online）Early structural changes in the photo-cycle.

Fig. 10(Color online）Pathway for proton transfer from the
SchiŠ-base to Asp85.

224 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5

Fig. 11(Color online）Superimposition of the structural model for
Dt＝36.2 ms and the ground state structure.

トピックス ■ X 線自由電子レーザーで捉えたバクテリオロドプシン構造変化の三次元動画

6. 終わりに
我々が開発した時間分割 SFX 実験装置は現在 SACLA
で供用装置として使用されており，光で反応する様々なタ
ンパク質の動的構造解析に利用されている。最近の成果としては，光合成に関与する光化学系 II の時間分割実験結果が報告された16) 。今後，光で反応を開始する様々なタ
イプのタンパク質反応機構の解明が成されると期待される。
一方，光ではなく基質やリガンドなどの低分子と反応するタンパク質（酵素や受容体等）においても，時間分割
SFX 実験が展開されている。 2016年末に，結晶溶液とリガンドの二つの溶液を混合して直ちに XFEL による測定が可能な mixing jet インジェクターを用いた実験が LCLSで行われた17) 。この結果では秒以降の遅い反応を観測していたが，今後は数 10 ミリ秒といった混合直後のタンパ
ク質変化を追跡できるようになると思われる。このように

3)

様々な進展を遂げている XFEL を用いたタンパク質構造
解析は，将来的に，タンパク質の動きを詳細に捉える重要なツールとなっていくであろう。
ただし，時間分割実験を行なうに当たっては，実際に結晶中で起こっていることを分光法でモニターし，機能研究と結び付けながら進めることが重要である。今回の bR の時間分割 SFX 研究では，実際に測定する結晶での時間分
解可視分光を行い，どのような時間スケールにどの中間体4)が生成するかを予め知っていたことが，実験の成功を導いた。また，中間体構造は基底状態との混合状態で観測されることが多いため，構造変化は差フーリエ電子密度マップ
での解釈が主となるが，時にそれは非常に弱く曖昧なマッ
プとなることもある。主観的な解釈を避け，観測された構造を正確に意味づけするためにも，他の手法による解析と5)の組み合わせが今後ますます重要になるであろう。
謝辞
本研究は 2012 年度より文部科学省 X 線自由電子レー
ザー重点戦略研究課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造

6)

解析法の開発」（研究代表者岩田想）等の支援を受けて，理化学研究所，高輝度光科学研究センター，東京大学，京都大学，大阪大学，兵庫県立大学，高エネルギー加速研究

7)

機構の共同で実施された成果の一部である。特に，装置開発では，登野健介博士，城地保昌博士，亀島敬博士（以上，高輝度光科学研究センター），大和田成起博士，初井
宇記博士，矢橋牧名博士，エンジニアリングチーム（以上，理化学研究所）の皆様をはじめとする関係各位に深く感謝申し上げる。

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放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 225

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14)

著者紹介
南後恵理子

岩田

理化学研究所放射光科学総合研究センター
研究員
E-mail: nango＠spring8.or.jp
専門構造生物学，生物有機化学［略歴］
2004 年 3 月東京工業大学大学院理工学研
究 科博 士課 程満 期退 学。 博士 （ 理学 ）。
2004 年 4 月東京工業大学助手（ 2007 年 4月より助教），2013年より現職。

理化学研究所放射光科学総合研究センター
グループディレクター
京都大学大学院医学研究科 教授
E-mail: s.iwata ＠ mfour.med.kyoto-u.ac.
jp
専門膜タンパク質の構造生物学，X 線結晶学［略歴］
1991 年東京大学大学院農学系研究科博士課程修了，博士（農学）。インペリアルカ
レッジロンドン生命科学科（イギリス）教授，ダイヤモンド放射光実験施設（イギリス）ダイヤモンドフェローなどを経て，2007 年 3 月より京都大学大学院医学研究科教授。 2012 年 6 月より理化学研究所放射光科学総合研究センターグループディレ
クター兼任。

久保稔

理化学研究所放射光科学総合研究センター
専任研究員
E-mail: minoru.kubo＠riken.jp
専門時間分解振動分光，生体分子のダイ
ナミクスを見るための手法開発［略歴］
2003 年 北 海 道 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 修了，博士（理学）。岡崎統合バイオサイエ
ンスセンター IMS フェロー，JSPS 海外特別研究員（ノースイースタン大学），兵庫
県立大学特任准教授などを経て，2014年 4月より現職。

226 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5

想

トピックス ■ X 線自由電子レーザーで捉えたバクテリオロドプシン構造変化の三次元動画

A three-dimensional movie of structural changes
in bacteriorhodopsin captured by X-ray free electron lasers
Eriko NANGO
Minoru KUBO
So IWATA
Abstract

RIKEN SPring8 Center, Hyogo 6795148, JapanRIKEN SPring8 Center, Hyogo 6795148, Japan
Graduate School of Medicine, Kyoto University, Kyoto 6068501, JapanThe recent advent of time-resolved serial femtosecond crystallography at Xray free-electron
lasers enables to measure ultra-fast reactions in proteins. We observed conformational changes inbacteriorhodopsin known as a light-driven proton pump at thirteen time-points from nanoseconds
to milliseconds following photo-activation at 2.1 Å resolution using time-resolved serial femtosecond crystallography at SACLA. The resulting cascade of structural changes throughout the protein provided unprecedented insight into how structural changes in bacteriorhodopsin conspire toachieve unidirectional proton transport.

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 227