福岡県保健環境研究所年報第42号，93－94，2015

短報
A549細胞を用いた流入水中アデノウイルスの分離
吉冨秀亮・濱﨑光宏・中村麻子・世良暢之
終末処理場への流入水中アデノウイルスの分離におけるA549細胞の有用性を検討した。検体は2014年4月から2015年3月までの期間において、毎月1回、2箇所の終末処理場で採取された流入水合計24検体を用いた。流入水濃縮液をA549細胞に接種しアデノウイルスの分離・同定を行った。その結果、アデノウイルスは10月を除く調査月で分離され、合計53株のアデノウイルスが分離された。今回の検討の結果、A549細胞のウイルス分離率は35.9%と算出され、A549細胞はエンテロウイルス流行期においても流入水中のアデノウイルスを感度良く検出することが可能であることが示唆された。
［キーワード：アデノウイルス、A549細胞、流入水］
１

はじめにル」に準拠した。すなわち、流入水 1L を良く混和し、4℃

A549 細胞（ATCC 登録番号CCL185）はヒト肺胞上皮細胞

で 3000rpm、30 分間遠心し、上清に塩化マグネシウムを添株で、1972年にGiardらによって樹立された細胞である1）。

加、PH3.5 に調整後、陰電荷フィルターにウイルスを吸着

A549細胞はコクサッキーウイルスB群（CB）およびアデノさせ、10mL の 3%ビーフエキストラクト存在下で誘出し、ウイルス（HAdV）共通の受容体（Coxsackie and adenovirus

これをウイルス濃縮液とした。

receptor: CAR)を発現しており、CARを介してHAdVの感染
2）

A549 細胞は 5%ウシ胎児血清（Invtrogen,USA）存在下が成立することが知られている 。国立感染症研究所の示Dulbecco’s MEM（Sigma-Aldrich）培地で培養した。963）

すHAdV検査・診断マニュアル において、A549 細胞はHEp-2

ウェルプレートに A549 細胞を 0.1mL 播種後、濃縮液 10μ細胞、CaCo-2細胞、FL 細胞及びHeLa 細胞と比較して特にL を 8 ウェルずつ接種し、37℃で培養した。接種から 10

HAdVに対する感受性が高いとされており、臨床検体からの日後盲継代しさらに 10 日間観察し、細胞変性効果が見らHAdVに汎用される細胞である。

れたウェルの培養上清を分取した。さらに、既報 9）10）をまた、流入水中のウイルス分離は、平成25年度から感染参考に表 1 に示すプライマー及びプローブを用い、HAdV症流行予測調査事業のポリオウイルス感染源調査としては TaqMan Universal PCR Master Mix（Life technologies）

4）行われている 。しかしながら、ポリオウイルスを含めたにより、EV は QuantiTect Probe RT-PCR Kit（QIAGEN）にエンテロウイルス（EV）が対象であるため、流入水からのより、Stratagene MX3005P リアルタイム PCR システム

HAdVの分離については、海外での環境水サーベイランスで（Agilent Technologies）を用いて、培養上清から HAdVは報告されているが5）6）、国内での報告は少ない7）。さら及び EV の検出を行った。ウイルス分離率は、接種数 192に、A549細胞は臨床検体に対する有用性は示されているがウェル（8 ウェル×12 ヶ月×2 箇所の終末処理場）に対す

8）

る HAdV 及び EV の分離株数を分離率として算出した。

、流入水検体を用いた検討はほとんど報告がない。
そこで本研究では、環境中のHAdVの消長を把握すること

表 1 HAdV 及び EV 検出プライマー・プローブセットを目的とし、A549細胞による流入水からのHAdV分離を行った。
２VirusHAdV

Primer or probe
AQ2
AQ1
AP

Sequence (5'→3')
GCCCCAGTGGTCTTACATGCACATC
GCCACGGTGGGGTTTCTAAACTT
FAM-TGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-TAMRA

EV

PCR-1
PCR-2
PanEV Probe

GCGATTGTCACCATWAGCAGYCAGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC
FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-BHQ1

３

結果及び考察方法
検体は 2014 年 4 月から 2015 年 3 月までの期間において毎月 1 回、2 箇所の終末処理場で採取された流入水合計 24
検体を用いた。流入水中のウイルス濃縮は国立感染症研究所が示す「ポリオウイルス感染症の実験室診断マニュア

A549 細胞を用いて流入水から分離された HAdV は 53 株、福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）

EV は 16 株であった。各月毎の分離状況を図 1 に示した。

-93-

行うことができることが示唆された。しかし、同一条件における他の細胞の HAdV 分離結果との比較、また、今回分離された HAdV の詳細な遺伝子解析については未実施であるため、今後も継続して検討を行う予定である。
４

まとめ
A549 細胞によって流入水検体から EV 存在下においても、HAdV を効率的に分離できた。A549 細胞は流入水中の HAdVの消長を調査するために有用であることが示唆された。
図 1 分離株数の月別推移
文献
A549 細胞によるウイルス分離率は 35.9%であった。また、

1) D. J. Giard et a1.: J Natl Cancer Inst., 51,

HAdV が分離された 53 件のうち、4 件（7.5%）からは HAdVに加えて EV が検出された。

1417-1423, 1973.
2) D McDonald et al.: Gene Therapy, 6, 1512–1519, 1999

FL 細胞及び RD-A 細胞を用いた福岡県におけるポリオウ
イルス感染源調査では、全国的な傾向

3) 咽頭結膜熱・流行性角結膜炎検査，診断マニュアル(第11）と同様に、20142 版), 国立感染症研究所, 平成24年5月

年 5 月から 11 月は流入水中から多くの CB が分離された

4) 平成26年度感染症流行予測調査実施要領（資料未記載）。A549 細胞が有する CAR は CB と HAdV の共

5) Fong TT. et al.: Appl Environ Microbiol., 76,

通の受容体であるが、A549 細胞を用いてポリオウイルス感染源調査と同じ流入水検体からウイルス分離を行った

715-723, 2010
6) He JW1, Jiang S.: Appl Environ Microbiol., 71,

結果、HAdV は 10 月を除く全ての月で分離され、EV よりもHAdV が多く分離された（図 1）。このことから、A549 細胞

2250-2255, 2005
7) Haramoto E. et al.: Appl Environ Microbiol. 71,

は CB 存在下であっても、HAdV を分離できることが示唆された。

2403-2411, 2005
8) Enomoto M. et al.: Jpn.J.Infect.Dis., 63, 338-341,

流入水分離株について遺伝子解析または中和試験を行2010

う際、１つの分離株に２種類以上のウイルスが分離されて

9) Heim et al.: J Med Virol 2003;70, 228-239

いる場合は解析が困難になることがある。FL 細胞及び

10) Oberste MS. et al.: J Clin Virol., 49, 73-4, 2010

RD-A 細胞を用いたポリオウイルス感染源調査において、

11) 伊藤ら, IASR, 35, 275-276, 2014

HAdV 分離株から EV が検出された割合はそれぞれ 20.0%、10.8%であった（資料未記載）。このことから、A549 細胞による分離株を解析する場合、他の細胞より比較的容易に（英文要旨）

Adenovirus isolation from sewage using an A549 cell line
Hideaki YOSHITOMI, Mitsuhiro HAMASAKI, Asako NAKAMURA and Nobuyuki SERAFukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan
Although the A549 cell line, a human lung carcinoma cell line, has been used successfully to isolate viruses from clinicalspecimens, few studies of virus isolation from sewage have been reported. A total of 24 sewage samples, collected between April
2014 and March 2015, were inoculated in A549. In total, 53 adenoviruses and 16 enteroviruses were isolated using the A549 cellline, yielding an isolation ratio of 35.9%. In four of the adenovirus positive samples, enteroviruses also were detected. Thus, weshow that the A549 cell line is suitable for isolating adenoviruses from sewage, with a high sensitivity to epidemic enteroviruses.
[Key words; Adenovirus, A549 cell line, sewage]-94-