抗体の部位特異的標識用触媒
京都大学

大学院工学研究科 合成・生物化学専攻
講師 田村 朋則
令和３年６月２９日

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抗体薬物複合体(ADC)+抗体 (Antibody)=薬物 (Drug)

抗体薬物複合体(Antibody-Drug conjugate: ADC)

がん細胞

抗原に結合

内在化

抗体の分解
＋
薬物のリリース

細胞死

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従来技術とその問題点①
CysやLysへのランダム化学修飾

修飾試薬

・薬剤の修飾部位や個数の制御が困難
・抗体の安定性・有効性が損なわれる可能性
・ロット間の不均質性 (認可の障害)
3従来技術とその問題点②

Ex.

AHA

HPG

・天然の抗体を利用できない・低い作製効率、高い開発コスト
天然抗体の部位特異的な修飾方の開発が必要
4従来技術とその問題点③
CCAP法: Fc結合性ペプチドの親和性を利用した部位特異的修飾
薬剤Fc結合性ペプチド
pH 5.5−8.0

抗体
Bioconjugate Chem. 2019, 30, 698-702

Advantage
高い部位特異性（DAR=~2）
Drawback
修飾後に比較的大きなFc結合性ペプチドが残る

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従来技術とその問題点④
AJICAP法: CCAP法をベースに切断可能なジスルフィド結合を導入

1. TCEP
2. DHAA

薬剤のマレイミド誘導体
Angew. Chem. Int. Ed.. 2019, 58, 5592-5597

Advantage
高い部位特異性、traceless (ペプチドが残らない)
Drawback
Fc結合性ペプチドの除去に還元処理が必要（還元処理によって抗体中のジスルフィドも開裂してしまう）

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従来技術とその問題点のまとめ
従来技術

問題点

CysやLysへのランダム化学修飾

修飾部位や個数の制御が困難

遺伝子工学による導入

天然抗体を利用できない、開発コスト高い

CCAP

Fc結合性ペプチドが残ってしまう

AJICAP

Fc結合性ペプチドは除去できるが還元処理が必要

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新技術:抗体の部位特異的標識用触媒+

新技術

抗体

Fc-修飾抗体= アジド基、蛍光色素、薬剤 etc.

従来技術の問題点

新技術

ランダム修飾：修飾部位や個数の制御が困難

特定のLys残基に対して特異的に修飾可能

遺伝子工学：天然抗体を利用できない

あらゆる天然抗体に適用可能

CCAP： Fc結合性ペプチドが残ってしまう

余分な部分は残らない

AJICAP：ペプチド除去に還元処理が必要

還元不要
8新技術:抗体の部位特異的標識用触媒ペプチド

抗体認識ペプチド
連結触媒+抗体

リンカー

機能性分子を導入した
アシルドナー

Fc-修飾抗体= アジド基、蛍光色素、薬剤 etc.

・Fc領域特異的な抗体修飾が可能
・ 様々なプローブ分子（Click反応基、蛍光色素、薬剤）を導入可能
・クリック反応基（アジド/アルキンなど）を修飾することで、薬剤や蛍光色素など多様な機能性分子を抗体に修飾できる（クリック反応を介さずダイレクトに薬剤修飾することも可能）
・反応に使用するペプチド連結触媒は簡便に除去できるので余計な部分が残らない
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ペプチドとPyOxの連結
IgBPの異なる部位から触媒を連結した
Cat1–4を作製

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連結部位による標識率[Herceptin] = 1 µM
[Acyl doner] = 10 µM[Oxime catalysts] = 1 µM
[Inhibitor] = 10 µM
37 ℃, 3hin 50 mM HEPES buffer (pH7.4)

In gel Fluorescence

Heavy chain

Light chain
フルオレセイン標識用プローブ

・Heavy Chain特異的な抗体修飾
・Fc領域の認識に基づいた標識

IgBP–(as competitor)–+
Cat1・Cat4を用いた場合の標識率は156% (重鎖1本あたり78%)–
Cat2+–
Cat3+–+
Cat4

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リンカーによる標識率
ペプチド

リンカー長Long

リンカー

Short12修飾部位解析
フルオレセイン修飾Herceptinをトリプシン/Lys-Cによってペプチド断片化し、HPLCで解析した。
<Condition>[FL-Herceptin] = 533 µg[Trypsin/Lys-C mix] = 20 µg
50 mM NH4HCO3 buffer with ProteaseMAX
37 ℃, 16hUVHerceptin:(Heavy chain)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRYADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG(Disulfide bridge: 22-96; 147-203; 264-324; 370-428, Dimer: 229; 232)
(Light chain)
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPSRFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
(Disulfide bridge: 23-88; 134-194; H223-L214, Dimer)

蛍光フルオレセイン修飾ペプチドに由来する蛍光ピークが2本検出された(右図ピーク5と6)。
MALDI-TOF MS解析から、ピーク5, ピーク6はHerceptin重鎖の赤字で示した配列由来と同定された。
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修飾部位解析MALDI-TOF MSMS解析から、Lys249およびLys251がフルオレセインラベルされていることが判明した。
前ページのHPLC解析のピーク比から、これら２つのLysが主要なラベル化部位であると言える。
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修飾部位解析
Lys249Lys251

青:その他のLys

Herceptinに存在する88個のLys(モノマーあたり44個）のうち、抗体認識物質の結合サイトに存在するLys249, Lys251が選択的に標識された。
(Lys249 : Lys251 = 1 : 2)15

新技術:抗体の部位特異的標識用触媒ペプチド

抗体認識ペプチド
連結触媒+抗体

リンカー

機能性分子を導入した
アシルドナー

Fc-修飾抗体= アジド基、蛍光色素、薬剤 etc.

新技術の特徴

メリット

反応工程

１～２

標識率156%修飾部位の特異性

K249/K251

ペプチド切断処理

ペプチド切断処理が不要
16新技術の特徴・従来技術との比較
ADCを得るまでの修飾反応条件
反応
工程数
本技術

AJICAP

CCAP

ペプチド除去方法

部位特異性

修飾効率

1~2ゲル濾過K249/K251

156%(抗体1分子あたり1.56個修飾)

4

還元処理後、抗体内ジスルフィドの再結合処理

K246/K248(本技術と同部位)

190%(抗体1分子あたり1.9個修飾）

K248

120%
(抗体1分子あたり1.2個修飾）

1~2除去不可17

新技術の特徴・従来技術との比較
試薬類
誘導体化の
薬剤連結用官能基
簡便性

試薬

安定性

本技術

ペプチド連結触媒、
NASAアシルドナー◎◎

あらゆる官能基

AJICAP

ジスルフィド結合を含む
ペプチド連結NHS活性エステル

△△

チオール基

CCAP

ペプチド連結NHS活性エステル△△

あらゆる官能基18想定される用途• 本技術は、従来の抗体ランダム修飾技術と比較して修飾数・修飾部位のコントロールが厳密であり、抗体薬物複合体(ADC)製造に適していると考えられる。
• 抗体以外にもあらゆるタンパク質について本技術は適用可能であるため、タンパク質製剤やタンパク質/抗体工学への応用も期待される。
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実用化に向けた課題• 現在、Herceptinなどの抗体医薬にアジド基や蛍光色素、薬剤を導入可能なところまで開発済み。しかし、修飾済み抗体の抗原やFcRnに対する結合活性評価は未実施である。
• 今後、本技術で作製したADCについてHer2結合活性や癌細胞に対する毒性評価などの実験データを取得し、抗体医薬に適用していく場合の条件設定を行っていく。
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企業への期待• 抗体の結合活性評価やin vivo評価についての技術、ノウハウを持つ、企業との共同研究を希望。
• また、ADCを開発中の企業、抗体医薬分野への展開、抗体の部位特異的な機能性分子導入を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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問い合わせ先
国立大学法人京都大学内
株式会社TLO京都
京大事業部門 技術移転チーム
TEL 075 - 753 - 9150
FAX 075 - 753 - 9169
e-mail event@tlo-kyoto.co.jp
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