古細菌に特異的な tRNA 修飾ヌクレオシドの生合成機構解明
沼田倫征（産業技術総合研究所 バイオメディカル研究部門）
研究の目的
原核生物には、イソロイシンコドン（AUU, AUC, AUA）に対応する二種類の tRNA（tRNAIle1 と tRNAIle2）が存在する。この内、AUA コドンを解読する tRNAIle2 のアンチコドン配列（CAU）は、メチオニンコドン（AUG）を解読する tRNAMet のアンチコドン配列と同じであり、AUG コドンと配列相補的な関係にある。このため、未修飾の tRNAIle2は、メチオニンコドンを誤って解読する。この誤翻訳を防止し、tRNAIle2 のアンチコドンと AUA コドンが正しく塩基対合できるよう、アンチコドン 1 文字目のシチジン（C34）は転写後修飾される。古細菌では、C34 がアグマチンで修飾され 2-アグマチニルシチジン（agm2C）として存在する 1)（図 1a）。agm2C は酵素 TiaS によって ATP 依存的に形成される 1)。しかしながら、TiaS には一次構造上、既知の ATP 結合モチーフが存在せず、修飾反応を触媒する仕組みは不明であった。本研究では、agm2C 形成機構の解明を目的に、TiaS の構造機能解析を行った 2,3)。

方法
大腸菌 C41(DE3)株を宿主として、古細菌 Archaeoglobus fulgidus 由来 TiaS の組換えタ
ンパク質を調製した。また、T7 RNA ポリメラーゼを用いた in vitro 転写によって A.
fulgidus 由来 tRNAIle2 を合成した。得られたサンプルを用いて、TiaS, tRNAIle2, ATP からなる 3 者複合体の結晶および TiaS, tRNAIle2, AMPcPP（非加水分解性 ATP アナログ）, アグマチンからなる 4 者複合体の結晶を調製した。Photon Factory の BL17A にて回折実験を行い、まず、セレノメチオニン標識タンパク質を用いた単波長異常分散法によってTiaS-tRNAIle2-ATP 複合体（3 者複合体）の結晶構造を 2.9Å 分解能で決定した。次に、
TiaS-tRNAIle2-AMPcPP-アグマチン複合体（4 者複合体）の結晶構造を分解能 3.1Å で決定した。

図 1：2-アグマチニルシチジン(agm2C)の化学構造と生合成反応スキーム

結果
3 者複合体の結晶構造から、TiaS は TCK ドメイン、FL ドメイン、OB ドメイン、ZRドメインから構成されており、ATP は TCK ドメインに結合していることが明らかとなった（図 2）。また、生化学的な実験から、TiaS は ATP を AMP とピロリン酸に加水分解し、生じたピロリン酸の ATPリン酸に由来するリン酸基を使って C34 の 2 位カルボニル基をリン酸化し活性化することが明らかとなった 4)（図 1b）。ATP の三リン酸周辺には、保存された三つのアスパラギン酸残基が存在し、これらを Ala に置換した変異体
では、ATP の加水分解活性および agm2C 合成活性がともに消失していた。以上の結果
より、TCK ドメインは TiaS の触媒ドメインであり、C34 のリン酸化に関わることが明らかとなった。
本研究では、3 者複合体構造に加え、TiaS、tRNAIle2、AMPcPP およびアグマチンからなる 4 者複合体の結晶構造も決定した。興味深いことに、3 者複合体と 4 者複合体の構造では、C34 の結合位置がアグマチンの有無で異なっていた（図 3）。3 者複合体の構造
では、C34 は FL ドメインに形成されたポケットに配置され、ATP のリン酸から距離にして 10Å 程度離れた場所に結合していた。一方、4 者複合体の構造では、FL ドメインに形成されたポケットにアグマチンが結合し、C34 は AMPcPP のリン酸近傍に配置されていた。したがって、リン酸基のすぐ近くに C34 が配置された 4 者複合体の構造は、まさに C34 をリン酸化する直前の状態と考えることができる。これに対して、ATPリン酸から C34 が隔離されている 3 者複合体の構造は、C34 のリン酸化が起こりえないnon-productive な状態といえる。

図 2：TiaS-tRNAIle2-ATP 複合体（3 者複合体）の結晶構造

図 3：3 者複合体(a)と 4 者複合体 (b)における活性部位の構造の比較

結論(i) 3 者複合体と 4 者複合体構造の比較、(ii) アグマチンと tRNAIle2 の推定される細胞内濃度、そして、(iii) TiaS のアグマチンや tRNAIle2 に対する親和性を考慮すると、TiaS
は tRNAIle2 と相互作用する前に既にアグマチンと結合しており、tRNAIle2 が結合すると同時に C34 は ATPリン酸の近傍に配置され、4 者複合体にみられる“リン酸化前状態”の構造をとると考えられる。一方、アグマチンの供給が追いつかない場合に限り、TiaS
は C34 を FL ドメインに形成されたポケットに一時的に捕らえ、C34 を ATP から隔離することでリン酸化中間体の形成を抑制していると思われる。TiaS はアグマチンが存在しない場合でも ATP を加水分解することから、常に C34 をリン酸化しうる能力を持つ 4)。
したがって、アグマチンが不足する条件下で、3 者複合体構造にみられる“C34 捕捉状態”を形成することは、リン酸化中間体の蓄積を防止するという観点から重要な意味を持つ。
また、この場合、アグマチンの供給に伴ってアンチコドン領域の構造が変化し、C34 がATP のリン酸近傍に配置されると考えられる。いずれの場合においても、アグマチンが結合することによって C34 が活性部位に配置され、リン酸化に適した構造を形成する。C34 はリン酸化された後、アグマチンの近傍に移動してくることが予想され、その場において、アグマチンがリン酸化 C34 を求核攻撃して agm2C が形成すると考えられる。

文献
1) Ikeuchi, Y. et al. (2010) Agmatine-conjugated cytidine in a tRNA anticodon is essential for
AUA decoding in archaea. Nat. Chem. Biol. 6: 277-282.
2) Osawa, T., Inanaga, H., Kimura, S., Terasaka, N., Suzuki, T., and Numata, T. (2011)
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of an archaeal tRNA-modification
enzyme, TiaS, complexed with tRNAIle2 and ATP. Acta Crystallogr. Sect. F 67: 1414-1416.
3) Osawa, T., Kimura, S., Terasaka, N., Inanaga, H., Suzuki, T., and Numata, T. (2011)
Structural basis of tRNA agmatinylation essential for AUA codon decoding. Nat. Struct.
Mol. Biol. 18: 1275-1280.
4) Terasaka, N., Kimura, S., Osawa, T., Numata, T., and Suzuki, T. (2011) Biogenesis of
2-agmatinylcytidine catalyzed by the dual protein and RNA kinase TiaS. Nat. Struct. Mol.
Biol. 18: 1268-1274.