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静岡水技研研報 (46)：11-16，2014
Bull. Shizuoka Pref. Res. Inst. Fish.(46)：11-16，2014

養鰻池から分離した Edwardsiella tarda 溶菌性ファージの宿主範囲
飯田益生 *・松山創*

ウナギ養殖に大きな被害を与えるパラコロ病の予防及び治療へのバクテリオファージ ( 以下ファージ ) 利用の可能性を探るため，原因菌である Edwardsiella tarda を特異的に溶菌するファージの分離を試み，調査した延べ 20 の養鰻池中 6 池から 9 株のファージを得た。分離したファージを用いて類別されたウナギ病魚由来の E.
tarda 23 菌株のファージ型は多様であり，血清型や病原性との関連は認められなかった。一方，本研究で分離されたファージ株には，宿主範囲の広いものが含まれており，ファージ型の多様な菌株に比較的少数のファージで対応できる可能性が示された。また，分離ファージにはマダイ及びヒラメの病魚由来の E. tarda に対して溶菌性を示すファージ株が含まれ，両種のエドワジエラ症防除への応用も期待できた。
キーワード：ウナギ，パラコロ病，Edwardsiella tarda，バクテリオファージ，宿主範囲
ウナギ Anguilla japonica のパラコロ病は，腸内細菌科の型が比較的均一であり，少ないファージ株で防除できる可Edwardsiella tarda を原因菌とする感染症である。露地養殖能性が示されている。また，ヒラメ養殖環境中の E. tarda も，が中心であった時代には夏季を中心とした高水温期の病気

大部分が単一のファージ型に属することが明らかにされてであったが，ハウス養鰻が普及し，常時高水温での飼育がいる 8)。一方で，ウナギ養殖環境中の E. tarda のファージ型行われるようになって以降は周年発生するようになり ，は多様であることが知られており 9)，ファージによるウナウイルス性血管内皮壊死症と並んで，ウナギ養殖に大きなギのパラコロ病防除のためには，これら多様な菌株に対応被害を与える病気の一つとなっている。

できるファージ株の確保が求められる。利用するファージ1)

本疾病に対しては，オキソリン酸製剤，フロルフェニコール製剤等の化学療法剤の経口投与による治療が一般的であ株は，宿主範囲が広いほど汎用性が高く，実用性に優れると考えられる。

る。しかし，近年，消費者の食の安全に対する関心が高まこれまでウナギ病魚由来の E. tarda に溶菌性を示すファーり，無投薬で飼育された養殖魚が好まれる傾向にあること

ジの分離事例はあるが，そのうち雨宮ら 10) と Hsu et al. 11)から，養殖業者は化学療法剤を使用しない本疾病の対策をは供試菌株数が少ないため分離ファージの宿主範囲が明求めている。化学療法剤を使用しない細菌病対策の一つと確でなく，山本・前川 9) は宿主範囲の狭いファージ株を確して，バクテリオファージ ( 以下ファージ ) を利用した方認しているのみで，宿主範囲の広いファージ株が確認さ法が注目されており ，いくつかの細菌病ではファージのれた事例はない。そこで本研究では，養鰻池の池水中か投与による治療ら分離した E. tarda 溶菌性ファージについて，ウナギ由来

2)

3 ～ 5)や飼育水へのファージ添加による防除

6)の E. tarda 菌株に対する宿主範囲を調べ，パラコロ病の予の有効性が示されている。
細菌病をファージで防除するためには，原因菌のファー防・治療への利用の可能性を検討した。ファージの分離にジ型に適合したファージ株を用いる必要がある。アユの細あたっては，宿主菌に用いるウナギ由来 E. tarda 菌株を既菌性出血性腹水症の原因菌 Pseudomonas plecoglossicida や報 9 ～ 11) の 1 ～ 2 株から 5 株に増やし，より多様なファーウシエビのビブリオ病の原因菌 Vibrio harveyi6) はファージジ株の分離を試みた。併せて，マダイ Pagrus major やヒラ7)

平成 23 年 3 月 1 日受理
静岡県水産技術研究所浜名湖分場業績 151 号* 静岡県水産技術研究所浜名湖分場

―12―飯田益生・松山

メ Paralichtys olivaceus などウナギ以外の魚種に由来する E.

創

表１ 本研究で用いた E. tarda 菌株

tarda 菌株に対する養鰻池由来のファージの溶菌性を調査し，得られたファージの宿主範囲が複数魚種の E. tarda 感染症に対応可能なものか否かを検討した。
報告に先立ち，養魚場における調査に協力いただいた浜
名湖養魚漁業協同組合の組合員の皆様，E. tarda 菌株を提供いただいた静岡うなぎ漁業協同組合の見崎禎久氏，熊本県水産研究センターの中根基行博士，静岡県水産技術研究所
富士養鱒場の鈴木基生氏に感謝の意を表する。

材料及び方法
使用菌株
本研究には，表 1 に示したウナギ病魚由来 23 株，マダイ病魚由来 5 株，ヒラメ病魚由来 2 株の合計 30 株の E.
tarda を用いた。なお，ウナギ由来菌株のうち，SH0901 ～SH0902，SH0903 ～ SH0905，SH0906 ～ SH0908，SH0909～ SH0910 はそれぞれ同じ日に同一の養鰻池の複数の病魚から分離されたものである。これらの菌株は，農林水産省
農林技術会議事務局・農林水産省水産庁養殖研究所 12) にE. tarda であることを確認した。
従って性状試験を実施して，併せて，日本水産資源保護協会配付の抗 E. tarda(FPC-22 株 )家兎血清に対する凝集性を調べ，SH0805 株以外の 29 株がラークを選んで採取した。保存したファージは，標示菌株同一の血清型であることを確認した ( 表１)。

を用いた二重寒天法によるプラーク検出と SM 緩衝液へのなお本報では，松岡・中井 に従い，ファージの集殖に8)保存を２回繰り返して純化し，ファージ株として保存した。

用いた菌株を宿主菌，プラークの観察に用いた菌株を標示

ファージの宿主範囲菌と標記した。

分離されたファージの各菌株に対する溶菌性をスポッ養鰻池からのファージの分離トテスト法 13) により確認した。すなわち，菌液 (108CFU/2008 年 11 月～ 2009 年 3 月に，静岡県浜松市内 8 か所のmL)80 μ L と規定の 1/3 濃度に調整したトリプトソーヤ寒養魚場の延べ 20 の養鰻池の池水を各 100mL 採取し，ファー天培地 (TSA)3mL との混合液を重層した TSA 平板上に，ジの分離に供した。1,000 × g，5℃で 5 分間遠心分離後標示菌株に対するプラーク形成数が 105PFU/mL となるよに上清を 0.45 μ m メンブレンフィルターでろ過した池水うに調整したファージ液を 10 μ L 滴下し，25℃で 24 時間

80mL を，規定の 2 倍濃度のトリプトソーヤブイヨン 80mL培養してプラーク形成の有無を確認した。と混合し，ウナギ由来の 5 株の E. tarda( 表１) を宿主菌としまた，宿主範囲の広い 2 株のファージを選び，菌株によて加え，25℃で 24 時間培養した。培養後，2,000 × g，室るファージのプラーク形成能の違いを検討した。すなわち，

温で 10 分間遠心分離し，その上清を 0.45 μ m メンブレン

ファージの宿主菌 5 株に対するプラーク形成能 (PFU/mL)

フィルターでろ過したものをファージ液とした。得られたを二重寒天法 (25℃，24 時間培養 ) により求め，SH0603 株ファージ液を用い，上記 5 株を標示菌とした二重寒天法に対するプラーク形成能を 1 としたときのプラーク形成能13)により E. tarda 溶菌性ファージの形成するプラークの検出の比をプレート効率 (efficiency of plating) として計算し 7),10)，を行った。得られたプラークを採取し，1mL の SM 緩衝液

各菌株に対するファージの感染効率の指標とした。

(50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，8mmol/L MgSO4，0.01% ゼラチン ) 中で 30 分間ファージを拡散させた後，20 μ L のクロロホルムを加えて 5℃で保存した。同一の養鰻池から検出されたプラークのうち，プラーク径が明確に異なるものは別のファージによるものとして扱い，それぞれ１つのプ

―13―Edwardsiella tarda 溶菌性ファージの宿主範囲

結果り，特定のファージ型が多くみられることはなかった。また，同じ日に同一の養鰻池の病魚から分離された菌株で養鰻池からのファージの分離あってもファージ型が異なる場合があった (SH0901 株と調査を行った 8 か所中 5 か所の養魚場，延べ 20 池中 6SH0902 株；SH0903 株，SH0905 株 と SH0904 株；SH0906

池の養鰻池から合計 9 株の E. tarda 溶菌性ファージが分離

株と SH0907 株と SH0908 株 )。一方，マダイ由来菌株は 5された ( 表 2)。ファージが分離された 5 か所の養魚場のうち、株のうち同一施設の病魚から分離された 3 株は，分離年が2 か所からは複数のファージが分離され，このうち N 養魚異なるにも関わらず全て同じファージ型であった。同一施場から分離された PSH0802 ～ PSH0804 株と J 養魚場から設の病魚から分離されたヒラメ由来の 2 菌株も同じファー分離された PSH0808，PSH0809 株は同一の池から分離されジ型であった。なお，供試した 30 菌株の血清型が 1 株をたものである。

除いて均一であるにも関わらず，ファージ型は多様であり，ファージ感受性と血清型の間に関連は見出せなかった。

ファージの宿主範囲分離したファージは，ウナギ由来の全菌株に溶菌性を示分離したファージの E. tarda 菌株に対する溶菌性を図 1

す PSH0802 株や 16 菌株に溶菌性を示す PSH0803 株など宿及び図 2 に示した。マダイ及びヒラメ由来菌株を含む試験主範囲の広い株が認められた一方で，1 菌株のみに溶菌性に用いた全ての菌株が，いずれかのファージ株に感受性を示す宿主範囲の狭い株 (PSH0809 株 ) も確認された。また，を示した。ウナギ由来の 23 菌株は 13 のファージ型に類別

ファージの宿主範囲は，PSH0807 株と PSH0808 株を除きされたが，各ファージ型に含まれる菌株数は 1 ～ 3 株であ全て異なっており，多様であった ( 図 1)。なお，PSH0807株と PSH0808 株は分離された池は異なるが同一の養魚場か

表２ 本研究で分離された E. tarda 溶菌性ファージら得られたファージ株であった。ファージ収集以後に分離された菌株 (SH0903 株以降の菌株 ) についても，いずれかのファージ株が溶菌性を示し，ファージ非感受性株は確認されなかった。
また，マダイ及びヒラメ由来菌株については，3 株のファージが全菌株に溶菌性を示すなど，今回分離されたファージはウナギ以外の魚種由来の菌株に対しても広く溶菌性を示した ( 図 2)。PSH0802 株は，ウナギ由来株を含む今回供試した全ての菌株に対して溶菌性を示した。
宿主範囲の広い PSH0802 株と PSH0803 株の菌株ごとのプラーク形成能を表３に示した。いずれのファージ株も菌株によりプラーク形成能は異なり，SH0603 株，SH0701 株，

図１ ウナギ病魚由来 E. tarda 菌株に対する分離したファージ株の溶菌性

図２ 分離したファージ株のマダイ及びヒラメ病魚由来
E. tarda 菌株に対する溶菌性飯田益生・松山―14―

表３ PSH0802 株と PSH0803 株の E. tarda 菌株に対するプラーク形成能

創で得られた菌株間にファージ感受性の違いが認められることは，個々の養鰻池のパラコロ病防除も限定的な宿主範囲を持つファージでは困難であることを示している。
一方で，本研究では，比較的宿主範囲の広いファージ株が得られ，ウナギ養殖環境中の多様な E. tarda 菌株に少数のファージ株で対応できる可能性が示された。特に，PSH0802 株が今回用いたすべての菌株に溶菌性を示したことは，少なくとも菌株収集を行った 3 年 7 か月，静岡県内という範囲内での E. tarda の変異に，PSH0802 株が対応できたことを示している。すなわち，PSH0802 株はパラコロ

SH0704 株に対するプラーク形成能と比較して，SH0802 株病の予防や治療に必要な宿主範囲を満たしており，汎用性と SH0805 株に対するプラーク形成能は低かった。の高い有用なファージ株とみなすことができる。
しかし，PSH0802 株や PSH0803 株などの宿主範囲の広考察いファージに，菌株によって最大で 2 桁の感染効率の違いが見られたことは，対象とする菌株により制御効果の違い

本研究では，延べ 20 の養鰻池から 9 株のファージの分が生じることを示す。つまり，パラコロ病の防除にこれらが 240 か所の養鰻池とのファージ株を用いる際には，対象菌株ごとに使用する河川から 12 株のファージ，山本・前川 が延べ 48 の養鰻ファージの量の調整を要する可能性がある点に留意する必池から８株のファージを分離したのと比較すると高い分離要がある。また，予防など対象菌株が特定できない状況で率である。Hsu et al.と山本・前川 が宿主菌としてウナ用いる場合には，異なった感染特性を持つファージ株を組ギ病魚由来株を 1 〜 2 株しか用いなかったのに対し，本研み合わせて用いることで，パラコロ病の防除効果をより高

究では 5 株の病魚由来株を宿主菌として用いたことで多様めることができるかもしれない。本研究でファージの分離なファージが検出され，その結果分離率を高めた可能性がを試みた養鰻池は延べ 20 池のみであり，調査を進めるこある。また，多くの養魚場でファージが検出されたことは，とで，有用なファージ株をさらに集積できる可能性がある。

E. tarda 溶菌性ファージが広く分布していることを示唆し本研究で分離したファージの多くは，ウナギ由来株のみている。ハウス式の養鰻池では E. tarda が周年分布しておならずマダイ及びヒラメの病魚由来株に対しても溶菌性をり示した。マダイ由来の E. tarda は，運動性や遺伝的な特性離に成功した。これは，Hsu et al.

11)

9)

11)

9)

，宿主の分布がファージの広範な分布を支えている

14,15)がウナギ及びヒラメ由来の E. tarda と異なることが知られと考えられる。
山本・前川 は，養鰻池の池水及び底泥中の E.tarda のているが 17)，ウナギ由来菌株とマダイ由来菌株の双方に溶ファージ型が多様であることを明らかにしているが，本研菌性を示すファージが高い頻度で得られたことは，これら究ではウナギ病魚由来の 23 菌株に対して 13 のファージ型の性状の違いがファージ感受性に関与していないことを示が認められ，ウナギに感染した E. tarda についてもファーす。マダイとヒラメのエドワジエラ症に対しては承認されジ型が多様であることが確認された。また，供試菌株の血た化学療法剤がないことから，何らかの対策技術の開発が清型が比較的均一であるにも関わらずファージ型に多様性求められている。今回得られたファージは，両種への応用が認められる傾向も既報 と同じであり，アユの細菌性出が期待できるものであり，ウナギを含めた３魚種共通のエ血性腹水症の原因菌 P. plecoglossicida が血清型，ファージドワジエラ症防除技術が確立できれば，単一魚種を対象と型ともに均一であること と比べると大きな相違点である。

した場合と比較して市場を広く設定できることから，商品供試菌株のうち，SH0603，SH0701，SH0704 株は同一実験開発に繋がり易くなることが期待できる。

9)

9)

7)

系での感染試験では病原性が異なっていた

16)にも関わらず，4 株の共通したファージに感受性を示すことから，E.
tarda のファージ感受性が病原性とは直接関連していないことが示唆される。これらの結果は，山本・前川 9) が指摘したように，ウナギ養魚場の E. tarda の生物型が多様であることを示しており，E. tarda 溶菌性ファージを用いたパラコロ病の予防や治療には，この多様な E.tarda 菌株への対応が求められることを意味する。また，同日に同一養鰻池―15―

Edwardsiella tarda 溶菌性ファージの宿主範囲

文

献

環境アセスメントのための微生物実験法 ( 石田祐三郎・杉田治男編 )，恒星社厚生閣，東京，114 ～ 117．

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飯田益生・松山創

Host ranges of Edwardsiella tarda bacteriophages isolated
from eel farms
Masuo Iida and Hajime Matsuyama
Abstract We tried to isolate bacteriophages specific to Edwardsiella tarda, a causative agent of paracolo disease (edwardsiellosis)
in cultured eels, to examine the potential for phage control of the disease. A total of nine bacteriophages were isolated from
6 of the 20 examined water samples from eel farms. The susceptibilities of the tested E. tarda strains from diseased eels tothe isolated phages showed large variation and were independent of serotype or pathogenicity. Two of the phages isolated
in this study had a relatively broad host range and were able to lyse 16 to 23 of the tested 23 strains, suggesting that it may
be possible to use these phages to control the disease caused by various strains of E. tarda. Phages infecting E. tarda strainsfrom diseased red sea bream and Japanese flounder were found among the isolates, providing a basis for future explorationof the potential of phages in the treatment of edwardsiellosis.
Keywords: Anguilla japonica, paracolo disease (edwardsiellosis), Edwardsiella tarda, bacteriophage, host range