生体分子の軟 X 線自然円二色性
中川和道
田中真人

神戸大学発達科学部〒6578501 神戸市灘区鶴甲 311

産業技術総合研究所：計測フロンティア研究部門〒305
8568 茨城県つくば市梅園 1
1
1

安居院あかねつくば中央第二日本原子力研究開発機構量子ビーム応用研究部門放射光科学研究ユニット〒679
5148 兵庫県佐用郡佐用町光都 1
11

要

旨

生体分子の自然円二色性はこれまで主に可視紫外領域で観測されてきたが，軟 X 線領域では自然円二色性の信号強度は X 線吸収端近傍構造の信号強度の約0.1と小さく，技術的困難が大きいため測定はなされて来なかった。今回
我々は，軟 X 線領域の偏光制御技術を利用し，世界で初めて生体分子の軟 X 線領域における自然円二色性の観測に成功した。軟 X 線 NCD は軽元素を元素選択して観測できるため，特にタンパク質， DNA といった生体高分子の構造情報を，原子近傍の構造に特化して得ることができ，従来の可視紫外領域の NCD よりも詳細な構造情報を得られる有利さがある。そのためその構造解明は新規の医薬品開発等に大きな知見を与え，各種疾病の予防や治療に大きな貢献をもたらすものと期待されている。今回の成果は創薬や生命起源の研究に有益なヒントを与えるものである。

1. はじめにかという基礎研究や，主に生体分子を対象とする構造解析のツール開発をめざす応用研究などが盛んに展開されてい光の基本的性質のひとつに，垂直水平直線偏光や左右った4) 。精力的な研究は多くの成果をもたらした。例え（楕）円偏光という偏光性をあげることができる。これら

ば，生化学を学ばれた人なら存じておられるであろう「タの偏光に対する物質の応答は，物質の構造解析や光学定数

ンパク質の NCD スペクトルを測定して波長 194 nm 付近の詳細な決定など様々な面において研究され，また利用さに負の CD が観測されたならばタンパク質の構造はランダれている。とくに生物を形づくる生体分子の多くは光学異ム コ イ ル 構 造 に ， 194 nm 付 近 に 正 の CD な ら ば b 構 造性体をとりうるカイラリティーをもち，左右円偏光に対すに，190 nm 付近に正の CD と205 nm 付近に負の CD が観る光学応答が異なる。左右円偏光に対する屈折率の違いは測されたならば aへリックス構造に同定できる。」という旋光性（または円複屈折），光吸収係数の違いは円二色性

今日 でも広く 利用されて いる規則が実 験的に確立 され（ Circular Dichroism: CD ）と呼ばれ，古くから盛んに研た5) 。 こ れ ら の 実 験 事 実 は 後 に Woody6), Tinoco7),

究されてきた。本誌の読者には，強磁性体において光磁気

Vournakis8), Urry9)らによって理論的な裏づけが与えられ効果がもたらす磁気円二色性（Magnetic Circular Dichro-

た。

ism: MCD）に関する研究についてご存知の方も多いと思

現在， NCD 測定はタンパク質を中心と生体分子の構造

う。MCD ではその CD の起源に磁気が関与しているのに研究など多くの分野で非常に広く利用されている。特に生対し，生体分子の CD は光学異性体のカイラリティーその体高分子機能は，分子のカイラリティーが完全に偏極した

ものにより生じている。特に外場を何も与えない自然のま

ホモカイラリティー状態になっていることとの関連が深まの状態がもたらす円二色性という意味を強調し MCD とい。カギとカギ穴に例えられるように生体の高度な生化学

区別して自然円二色性（Natural Circular Dichroism: NCD）

反応を間違うことなく遂行するのはタンパク質である。こと呼ぶ。

の機能が働くためにはタンパク質の構造が安定でなければカイラリティーをもつ分子や結晶が旋光性や NCD を呈ならない。タンパク質の構成要素であるアミノ酸には，4することはよく知られている。歴史的には，まずこれらの個の互いに異なる元素または基と結合している炭素原子，

光学的な性質が発見され， Biot1), Pasteur2), Cotton3) らをすなわち不斉炭素，があるため，カイラリティーをもつ。

はじめとする多くの研究者により二世紀近い年月をかけてそれらの基のつき方により L アミノ酸（L 体）と D アミ

旋光性や NCD の起源を明らかにするための研究が積み重ノ酸（D 体）という 2 種類の光学異性体がある。生体内でねられ，それが構造的なカイラリティーに起因することがタンパク質を構成している 20 種類のアミノ酸は生体アミ解明された。そしてさらに NCD が生じるメカニズムは何ノ酸と呼ばれ，グリシンを除く 19 種類がカイラリティー

放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6 ● 363(C) 2005 The Japanese Society for Synchrotron Radiation ResearchFig. 1

Far-UV NCD spectra of L-, D- and DL-alanine ˆlms12) measured with a conventional CD spectrophotometer (JASCO
J720WI).

を有し，L 体，D 体の光学異性体が存在する。ところが，Fig. 2

Absorption coe‹cient of a bio-molecule, phenylalanine. 5
30 eV: Our experimental result. 1001000 eV: Calculated
result of available optical constants of atoms by Henke(1993)44).

生体中のタンパク質に含まれているアミノ酸は L 体のみであり，このことがタンパク質の構造を安定にしている。
もし D アミノ酸が混在していると，タンパク質の構造に（ USA ）の Sutherland らのグループ13) は，偏向電磁石か

極めて不安定となるカイラル欠陥とも呼ぶべき欠陥が生じら発生する放射光が軌道面内に直線偏光していることを利るため，生体の高度な生化学反応が進行せず，最終的には用し，その直線偏光真空紫外光を光弾性変調子（ Photo-

生物の生命活動そのものが成り立たなくなる。

elastic modulator; PEM ）に通して右円偏光と左円偏光を

このように，生体アミノ酸がホモカイラリティーを有す

切り替え， 140 nm という短波長までの NCD スペクトル

ることは，生命にとって不可欠である。ホモカイラリテの測定を実現した。広島大学の Gekko らのグループ14,15)

ィー成立の起源を探ることは，生命の起源を探る上での要も HiSOR において同様の手法で 140 nm の短波長までの石であると言われる所以である。筆者のうち中川10,11)はこ

溶液試料の NCD スペクトルの測定を実現した。 Bonn 大の観点から生命の起源に興味をもって研究を展開している。

学（ドイツ）の Hormes らのグループ16) も気体試料を用Fig. 1 に，市販されている円二色分散計（ JASCO ， J 

いて 160 nm までの NCD スペクトルの測定に成功した。

720WH ）で測定されたアラニン（ Ala  C3H7NO2 ）薄膜

この方法は光源として放射光を利用していることを除けばの遠紫外領域での NCD スペクトル12)を示す。L 体と D 体

市 販 の NCD 測 定 法 と ほ ぼ 同 じ も の で あ る 。 現 在 こ のとで絶対値は等しいが符号が互いに反対のスペクトルとな

PEM と 放 射 光 の 組 み 合 わ せ を 用 い た 真 空 紫 外 域 で のり， DL 体ではスペクトルは平坦で構造を示さない。このNCD 測定ビームラインが世界各地に建設され1719)，主に

実験結果は一般的な可視紫外域の NCD スペクトルの特徴

たんぱく質の二次構造解析などに利用されている2022) 。

であり，我々はこの特徴が軟 X 線領域の NCD スペクトル

ただしこれらの装置では，透過型の PEM を用いているたにも成り立つという大前提のもとに研究をすすめた。

NCD スペクトルの測定は，これまで主に赤外から紫外め，原理的には光学素子の吸収の始まる波長 105 nm （実際には波長140 nm 程度）が短波長限界となる。

領域で，研究室に設置できる装置を用いて行われてきた。

また硬 X 線領域では最近ダイヤモンドの位相子を利用

とこ ろ が 前 述 のた ん ぱ く 質の 例 で a へリ ッ ク ス の CDすることによって左右円偏光を変調させて CD スペクトル

ピークが190 nm に観測されたように，アミノ酸の光学遷を 測 定 す る こ と が 可 能23) と な っ て き て お り ， SPring-8移の振動子強度の主要な部分は 200 nm より短い真空紫外

BL39XU などで既に利用が可能である2426)。

域に存在する。例えば Fig. 2 に放射光を用いて測定された

真空紫外域や軟 X 線領域といった透過型光学素子の利フェニルアラニン（ Phe  C9H11NO2 ）の吸収スペクトル用が困難な領域では，偏向電磁石放射の上部と下部がそれを示す。真空紫外域には化学結合に関わる価電子の p お

ぞれ左右惰円偏光になっていることや，光源として円偏光

よび s 共鳴やイオン化による強い吸収構造が観測され，アンジュレーターを利用することで NCD スペクトルの測

真空紫外域の NCD の研究が重要であることを示してい定が試みられてきた。これらの方法の長所は，光源からのる。

光がもともと（楕）円偏光になっており，透過型の光学素

真空紫外域における NCD の研究が進展するのには，放射光がほとんど決定的な役割を果たした。Brookhaven 研

364 ● 放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6子を用いないので，波長に関係なく円偏光が得られる点にある。

トピックス ■ 生体分子の軟 X 線自然円二色性

産業技術総合研究所（旧電子技術総合研究所）では，間，および反対称な固有状態と反対称な固有状態との間でOnuki ら27)によって開発された直交磁場型偏光可変アンジ許容となる。 E1M1 過程の遷移行列要素は，回映対称をュレーターを用いた105 nm 以下の真空紫外域にも対応しもたない点群すなわち掌性の点群でだけゼロにならず，遷た NCD 測定システム開発が渡辺一寿博士らと筆者の中川移は許容される。

と田中らによって行われている2830) 。この直交磁場型偏可視紫外域の生体分子の NCD は，その全てが E1M1 過光可変アンジュレーターは 2 組の互いに直交した磁石列

程で説明されてきた。また数少ないが E1E2 過程で説明さから成り，お互いの位相を調節することによって左右円偏

れた可視紫外域の NCD スペクトルの例として，Barron40)

光や直線偏光を発生することができる。位相駆動はモーらが測定したコバルトトリスエチレンジアミン錯イオン

ターによる機械的スイッチングによって行い，最高 5

Co ( en )33＋ 結晶などがあげられる。一方，硬 X 線領域で

Hz ，通常 2 Hz の偏光切り替えが可能である。現在 120

は， Goulon ら31) は錯体イオンの NCD スペクトルを測定

nm までの真空紫外域での NCD 測定に成功しており，現し ， そ の 起 源 を E1E2 過 程 で 説 明 し た 。 E1M1 過 程 か

在は100 nm 以下の測定を目指している。この研究に関し

E1E2 過程かを決定する要因は，上に述べたその系のもつては別の文献2830)を参照してほしい。

対称性と，遷移のエネルギーの大きさの 2 つがある。電また ESRF（欧州連合）では偏光可変アンジュレーター

磁波のエネルギーが高くなるとその波長は短くなり，相互を用いて，Goulon ら3133)が主に結晶試料の硬 X 線領域に作用する分子内部の電子密度の不均一さの距離と同程度における NCD などを測定することに成功した。彼等は左右なる。すると電気 4 重極子モーメントの寄与が大きくな

円偏光照射時における試料の吸収係数に相当する蛍光収量

り，エネルギーの高い硬 X 線領域では E1E2 過程の断面スペクトルを測定し，その差分を取ることで NCD スペク

積 は大き くなると 考えら れる。 Goulon ら32,41) の硬 X 線

トルの測定に成功した。また彼等34) は偏向電磁石放射を

NCD の測定結果が E1E2 過程で説明された背景にはこの利用して，キラル金属錯体試料の軟 X 線領域（チタン L

ことがあろう。軟 X 線領域では，電磁波の波長は硬 X 線殻）での NCD 研究の端緒的な結果を得た。

の場合よりも長いので電気 4 重極子モーメントの効果はアンジュレーターを用いた NCD 測定は今後いろいろな

硬 X 線の場合よりも小さくかつ可視紫外よりも大きいと放射光施設で新たな試みの対象となっていく可能性があ考えられるが，実験的検証が困難であったことから研究はる 。 本 稿 で 述 べ る 軟 X 線 領 域 で の 測 定 は ， SPring-8

進んでいない。軟 X 線領域の NCD は，E1M1 過程主体の

BL23SU の可変偏光型挿入光源を用いて行った。測定の可視紫外領域から E1E2 過程主体の硬 X 線領域へと NCD

詳細35)は2.2章で述べる。また SPring-8 の BL25SU36,37)でのメカニズムが移っていく遷移領域の NCD の現象である

も ， NCD 測 定 を め ざ す 計 測 系 の 調 整 が 進 ん で い る 。

と期待され，実際に Link äoping 大学（スウェーデン）のBL25SU では，挿入光源を二台設置し，各々の光源を通Ågren らのグループ42,43) によって E1M1 過程を基にした

る蓄積電子の軌道をキッカーで電気的に制御して10 Hz 及

理論計算の報告があるが，いまだ実験結果の報告はほとん

び 1 Hz で左右円偏光を切り替え，これにタイミングを合どなく未開拓の研究分野と言える。

わせて光子エネルギーを挿引して信号計測を行う方式が採

軟 X 線は波長が短く，そのエネルギーは物質の化学結用されている。キッカーを用いる方法は偏光切り替えを高合エネルギーと同程度になる。生体分子を構成する主な元

速で行うことが出来るが，光源が二点あるので光源点が重素である炭素，窒素，酸素の 1s 電子の束縛エネルギーはなるように挿入光源を調整する必要がある。

Fig. 2 に各原子の既知の光学定数44)を用いて計算された原NCD の実験的研究の一方，理論的理解も進められてい子の光吸収係数のスペクトルで示されるように軟 X 線領る。電子遷移に起因する NCD は，光学遷移の電気双極子域にある。炭素，窒素，酸素の局在した内殻電子である

モーメントと，遷移磁気双極子モーメントあるいは電気 41s 電子を軟 X 線により励起したときに起こる吸収過程は重極子モーメントとの干渉で書き表される38,39)。準位 a か双極子選択則に従い，それぞれの 2p 空軌道の電子状態を

ら準位 b への電子遷移では，光学遷移の電気双極子モー反映する。ところが炭素，窒素，酸素という軽元素ではメントと遷 移磁気双極 子モーメン トの干渉に 起因する

2p 軌道が価電子として分子軌道を形成しているので，光〈 b |me| b 〉の
NCD の強度は遷移行列要素の積〈 a | me| b 〉

学遷移の終状態は分子全体に広がっている。軟 X 線領域

虚数項で与えられ E1M1 過程と呼ばれる。また，光学遷において NCD が観測される理由は，この終状態がカイラ移の電気双極子モーメントと電気 4 重極子モーメントのリティーをもっているからに他ならない。例えば，Phe の干渉に起因する NCD の強度は遷移行列要素の積〈a|me|b〉

窒素原子 1s 電子の光学遷移の終状態は，Fig. 3 にイメージ
〈 b | Qe | a 〉の虚数項で与えられ E1E2 過程と呼ばれる。

をやや誇張して示したように，L 体の中の窒素原子と，D

群論の言葉で言えば，対称心をもつ分子では反転に対して体の中の窒素原子では鏡映対称になっており，これが左右対称な表現に属する固有状態（以下，対称な固有状態と略

円偏光に対する吸収強度の差として観測されると考えられ記）と反対称な表現に属する固有状態間で E1 遷移は許容る。軟 X 線は物質との相互作用が強いため NCD の発現機となり，M1 遷移は対称な固有状態と対称な固有状態との構に関する基礎的研究がすすめば，NCD によって光学異放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6 ● 365

る限り高める必要がある。しかしながらアミノ酸は軟 X
線によって非常に壊れやすいため，測定毎に試料位置を変化させる必要がある。各測定位置においても常に一定の測定条件を得るため，我々は試料形態として均一な薄膜を採用した。
これらのアミノ酸薄膜は抵抗加熱真空蒸着法を用いてBeCu 基板上に約 300 nm の厚さで作製した。アミノ酸粉
末試料は市販のものをそのまま使用した。この際，精製などは特に行わなかった。アミノ酸の熱分解を防ぐために真空蒸着は約100 °C という低温条件下で行い，かつ作製した複数枚の薄膜のうちの 1 枚を水溶させて高速液体クロマ
トグラフィーで分析し，蒸着時に熱分解が起きていないことを 確認した 。アミノ酸 薄膜作製の詳 細に関して は既
報11,12)を参考にされたい。
Fig. 3

Schematic illustration of electronic transition responsible forNCD.

軟 X 線放射光による実験のように高真空中における実験設備の多くでは，低分子有機物は真空を汚染するために敬遠される。しかしアミノ酸は予想に反してその蒸気圧が低く（ 10－8 Pa 以下），高真空中での実験に充分に耐えう性体を識別し光化学反応を制御するのに応用できる可能性

ることが分かった。アミノ酸は固体中では両性イオンとしがある。

て存在していることが知られており，固体中で隣接する両

本稿では，生体分子のカイラリティーによる軟 X 線領性イオン間の負電荷と正電荷とがクーロン力で引き合って域での NCD に焦点を当てて論じ，また今後の課題を展望いるためこのように低い蒸気圧を示すものと思われる。こする。これは我々が初めて成功した生体分子の軟 X 線領のように強い力で結びついているアミノ酸が100°C 程度の域での NCD スペクトルの例である。

熱で容易に蒸着できてしまうこともまた予想に反していた。さらにこの両性イオンとして存在していることは，次2. 実験章で述べる NCD 測定とそれに先立つ X 線吸収端近傍構造（X-ray absorption near edge structure: XANES）の測定に

2.1

試料作製

も有利となった。軟 X 線領域での XANES 測定法として生体分子の軟 X 線 NCD スペクトルの測定は，アミノ酸

簡便な方法の一つである表面電流測定による全電子収量法

を試料に選びその薄膜を作製して実験を行った。前述したは，一般には絶縁体への応用は困難である。実際，一般的ように生体アミノ酸には L 体， D 体の光学異性体が存在な有機分子の測定では数 nm 程度の膜厚しか許されない。

し，生体アミノ酸の L 体，D 体とそれらの等量混合物であ

ところがアミノ酸は両性イオンであるためか電流が流れやるラセミ体（本稿では DL 体とも書く）は容易に入手可能

すく，膜厚を 1 mm 程度と厚くした場合でもチャージアッ

である。NCD はその強度が約 1～0.1程度という非常にプの効果がほとんど無くきれいな XANES スペクトルが微弱な信号であるため，絶対値は等しいが符号が互いに反測定できた。この膜の厚さは光分解による分子数の減少や対のスペクトルを示す L 体と D 体，そして信号を示さな

基板の露出などによる測定途中でのスペクトルの変化を軽い DL 体の NCD スペクトルを比較することによって，ノ減する効果もあった。また試料に異方性がある場合，そのイズと信号を区別して正確な NCD 測定を行うことができ

NCD 測定は困難になることが知られているが45)，我々のる。特にまだ黎明期の軟 X 線 NCD 研究において，これは作製した薄膜はマクロにみて一様である12) ため，異方性必須の事項であると思われる。またアミノ酸は比較的分子の寄与等を考慮することなく NCD を測定することができ

量の小さい分子であり，理論計算が可能である。前述のた。

E1M1 過程に基づいて，軟 X 線領域でのアミノ酸分子の以上のようにアミノ酸は， 1 ) L, D, DL 体が容易かつ安

NCD の理論的予測が Ågren らのグループ42,43)によってす価に入手できる， 2 )理論計算が先行している， 3 )高真空でになされ た。我々は ，彼らの計 算結果の中 でも強い実験が可能， 4 )表面電流測定が容易に可能などの理由に

NCD を示すと予想された Phe の窒素 K 殻 NCD とセリン

おいて，最初の軟 X 線領域での NCD 測定に適切かつ準備（ Ser  C3H7NO3 ）の酸素 K 殻 NCD を最初の観測対象にし易い試料である。

選択した。

NCD 強度は弱いことが予想されるので，なるべく多くの測定を繰り返し行うことでスペクトルの統計精度をでき

366 ● 放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6

2.2

測定方法

本項で紹介する軟 X 線領域での NCD スペクトルの測定

トピックス ■ 生体分子の軟 X 線自然円二色性

Fig. 4

Experimental conˆguration (a) and procedure (b) of measurement of NCD spectra.

は ， 大 型 放 射 光 施 設 SPring-8 の 軟 X 線 ビ ー ム ラ イ ン

引できる46,47)。

BL23SU4650)において，室温（およそ 300 K ）で全電子収

軟 X 線領域の NCD 測定で検出を目指す信号強度は極め

量法によって行った。測定系全体の概念図を Fig. 4(a)に示て微弱である。そのため入射光の偏光，エネルギー，スポす。全電子収量法は，試料に照射した X 線によって放出

ット位置，強度，及び試料電流を精度よく制御しかつ測定される光電子またはオージェ電子の数に応じて試料に流れしなければならない。右円偏光と左円偏光それぞれでの吸る全電流（ Fig. 4 (a)右，I1）を計測する方法である。軟 X

収スペクトルの強度差を測定するには，右（あるいは左）

線は試料面に垂直に入射し，スポットサイズはおおよそ横円偏光での吸収スペクトルを測定し終わったあと，左（あ1 mm ×縦 0.5 mm であった。また，試料前の後置鏡の全るいは右）円偏光での吸収スペクトルを測定する手順がも電子収量（Fig. 4 (a )中ほど，I0）を測定し，これを入射光

っとも簡便であるが，この手順ではエネルギー挿引に関す強度（に比例する量）とした。 I1 / I0 を規格化された吸収る分光器の機械精度や，左右それぞれの円偏光に対する吸強度（ A ）とした。左右円偏光照射時における吸収強度

収強度の計測時点の時間差など，信号精度を劣化させる要（ AL ，および AR ）を測定し，それらの単純な差分（ AL 因が入り込み易くなる。これを抑制するには偏光反転とエAR）を NCD 信号とした。

ネルギー挿引の組み合わせのタイミングを工夫することが自然円二色性測定では，入射光の偏光を右円偏光と左円有効である。

偏光に切り替えることが必須である。 BL23SU には挿入

Fig. 4(b)に，偏光反転，エネルギー挿引，吸収強度測定

光 源 と し て APPLE 2 型 可 変 偏 光 ア ン ジ ュ レ ー タ ーのタイミングの例を示す。例えば Fig. 4(b.1)の場合，まず（ID23）が設置されている。この型の挿入光源は Fig. 4(a )

入射光を左円偏光にし，また光子エネルギーを hn1 にして左上に図示されているように上下各 2 列，計 4 列の磁石

AL を測定する。さらにエネルギーはそのままで偏光を右列をもつ。この磁石列の位相を制御することで放射光の偏円偏光に反転し AR を測定する。次に偏光はそのままでエ光を任意に変えることができる49) 。このため光源点は一ネルギーを hn2 に変え AR を測定，さら偏光を反転し AL

点と考えることができる。また， BL23SU の分光器50) にを測定する。続けて，偏光はそのままでエネルギーを hn3

は不等間隔回折格子が採用されており，回折格子を回転すに変え AL を測定し，さらに偏光を反転し AR を測定することによってスリットから取り出す分散光の波長が変わる。このような手順を繰り返し（左右→右左→左右り（ Fig. 4 ( a )中ほど），比較的単純な制御でエネルギー挿→…）測定し，エネルギーが同じで偏光が右円偏光と左円放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6 ● 367

偏光とを反転させることで得られたそれぞれの吸収強度A の差が NCD スペクトルとなるこれとは別に Fig. 4 (b.2 )のようにエネルギー挿引ごとに偏光反転する（左右→左右→左右→…）手順も考えられる。この手順では信号計測時に先になる偏光に片寄りができてしまう。また Fig.

4 ( b.2 )の手法は，偏光反転の頻度が Fig. 4 ( b.1 )より多くなる。 ID23 の場合，偏光反転は挿入光源の磁石列に設置されたモーターを駆動して磁石列の位相を 30 mm / sec の速度で機械的に動かして行うため，切り替えに数秒を要する。このため Fig. 4 (b.1)のほうが全体として計測時間が短くできる。実際の測定は， Fig. 4 (b.1 )の手順で行った。また，統計精度を上げるために同様の測定を繰り返し，吸収強度の和平均を算出した。この同様の手順を行う際に，測定開始時の偏光が片寄らないように，左右→右左→左
右→…の系列での測定と，右左→左右→右左→…
の系列での測定の回数が同じになるようにした。例えば，

Fig. 6 の測定の場合それぞれ 4 回，計 8 回測定し平均を採った。
先に述べたように本測定での偏光反転は磁石列の機械的駆動によって行った。その際，互いの磁石列には大きな吸引反発力が働いている。このため，磁石列を右偏光から左偏光，左偏光から右偏光に動かしたときに必ずしも同じ
計測条件を与えない場合があるようであった。また，挿入
光源及び分光器は細心をもって整備されているが，放射光の回折格子や後置鏡にある僅かなミスアライメントなどがFig. 5(a) Normalized XANES spectrum of L-Phe ˆlm near thenitrogen K-edge. (b) Normalized ALAR spectra of Phe
ˆlms. Red line: L-Phe. Blue line: D-Phe. Green line: DL-Phe.
(c) Calculated NCD of Phe by Yang et al. (1999)43).

あれば ， I0 や I1 に反 映され ，信号の 精度 を下げ てしまう。本研究では，左右→右左→左右→…の系列による測定と，右左→左右→右左→…の系列による測定ぞれ示す。XANES スペクトルの最大ピーク強度が 1 になを組み合わせて測定の手順に偏りがないようにし，測定器るように規格化を行い，その規格化定数を Fig. 5(b)の AL

の機械的精度から混入してくる要因を打ち消すように工夫

AR スペクトルにも乗算した。正確な NCD 強度の算出にした。第 1 章でも紹介したように Goulon ら31)は硬 X 線領は実際の円偏光度で除算する必要がある。しかし本実験で域での NCD スペクトル測定の先駆的実験を報告したが，はまだそれほどの精度が得られていないことと斜入射光学

彼等も測定信号の統計精度を上げるために測定手順に同様

系では円偏光度の低下は少ないとみなせることなどから，の工夫をしている。

円偏光度を 1 として NCD 強度を算出した。

また，試料周りの真空ポンプからの振動など，他の精度－
Phe は分子式 NH＋
3 CH ( COO ) CH 2C6H 5 で表わされ，劣化の要因も排除した。さらに試料の光分解による劣化の分子中に窒素原子をただ一種類アミノ基（NH＋3 ）に有す影響をさけるため，入射光が長時間同じ場所に照射されなる（分子構造は Fig. 5 挿入図参照）。実験の結果， Phe のいように，測定ごとに試料位置を数 mm ずつ移動した。

窒素 K 殻近傍の XANES スペクトルは，同様に窒素原子これが可能であったのは，試料作成の項で述べたように均－をアミノ基に一つしかもたないグリシン（NH＋3 CH 2COO ）一な蒸着膜が作成できたからであった。軟 X 線領域でのなどとほぼ同じスペクトルとなることが分かった51) 。こNCD 測定で期待される信号強度は極めて微弱であるが，の窒素原子は隣接の炭素（不斉炭素）や水素と一重結合以上に述べたような方法をもって精度を上げるように工夫（ s 結合）をしており，一般的にイオン化準位より高いエした。

ネルギーレベルに反結合性の空軌道（ s軌道）をいくつ

3. 実験結果および考察の電子遷移とイオン化が起こる。Fig. 5(a)の XANES スペ

かもつ。窒素原子の内殻励起によって主にこの s軌道へ
クトルの 405 eV の肩構造は窒素 1s 電子のイオン化， 407

Fig. 5 に Phe の窒素 K 殻近傍で測定した( a ) XANESeV のピークは窒素 1s 電子が励起されていくつかの s軌

スペクトル，（ b ) AL AR スペクトルの実験結果，（ c )道へ遷移する（窒素 1s → s遷移）ことによるものと考え

Yang ら43) による NCD スペクトルの理論計算結果をそれられる。

368 ● 放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6

トピックス ■ 生体分子の軟 X 線自然円二色性

次に Fig. 5(b)に示す差分スペクトルを検討する。図から明らかなように，L Phe の AL AR スペクトルは約406 eVに負のピーク， D Phe は正のピークを示している。それらとは対照的に DLPhe はピーク構造を示さないことがわ
かる。L 体と D 体とで絶対値が等しいが符号が互いに反対の構造を示し， DL 体では構造を示さないというこの実験
結果は一般的な可視紫外域の CD スペクトルの特徴と同じである。このことから我々は，観測された Phe の AL AR
スペクトルに現れている構造はノイズではなく NCD によるものであると結論した。406 eV の NCD ピーク強度が L
体で約－0.1 ，D 体で約0.2とばらつきがあるなどまだ精度の高い実験結果とはいえないものの，これは生体分子の軟 X 線領域での NCD の初めての観測結果である。また
我々はこの NCD ピークを上記の XANES スペクトルとの比較から，窒素の 1s→s遷移に帰属した。403 eV 付近にも NCD らしきピークが見えている。 Fig. 4 ( c)の理論計算
結果43) と比べてみるとエネルギーの絶対値や強度比の違いはあるもが，実験結果とほぼ同様のスペクトルの特徴を示しており，我々の実験結果の妥当性を支持しているといえよう。ただし，この計算が L 体と D 体どちらにおいてなされたかは文献中に明示されていないため，正負に関する議論は現段階では留意を要する。

Fig. 6 には Ser について，酸素 K 殻近傍の(a)XANESスペクトル，（b)ALAR スペクトル，（c)Plashkevychら42)による L Ser の NCD スペクトルの理論計算結果をそFig. 6(a) Normalized XANES spectrum of L-Ser ˆlm near the oxygen K-edge. (b) Normalized ALAR spectra of Ser ˆlms. Red
line: L-Ser. Blue line: D-Ser. (c) Calculated NCD of L-Ser by
Plaskevych et al. (1998)42).

れぞれ示す。ここでも Fig. 5 の Phe と同様に XANES の最大ピーク強度が 1 になるように規格化を行い，その規格化定数を Fig. 6(b)の ALAR スペクトルに乗算した。Ser

Fig. 6(b)の ALAR スペクトルを検討する。LSer に対し－の分子式は NH＋
3 CH (COO )CH 2OH であり，Fig. 6 挿入図ては約 540 eV に強い正のピーク， D Ser では負のピークにその分子構造を示す。Ser では先ほどの Phe のフェニルが見られ，またこれら強度もほぼ同じ（約0.25）である

基（C6H5）がヒドロキシ基（OH）に置き換わっている。

ことから，このピークも Phe 同様に NCD 由来とみなした。

ここで Ser は 3 つの酸素原子を持っている。そのうちカ

XANES との対応から，このピークはヒドロキシ基の酸素

ルボキシ基（COO－）には 2 つの酸素原子が存在するが，1s → s遷移であると帰属した。理論計算結果42) でも 538

これらは共鳴しているため区別することはできない。つまeV 付近にヒドロキシ基の酸素 1s 由来の正の NCD ピーク

り Ser の酸素原子はカルボキシ基に存在するものとヒドが 2 本予言されている。これらは実験結果の非対称な正ロキシ基に存在するものの 2 種類に分けられる。カルボのピーク構造とその符号も含めて非常に良い一致を示してキシ基の酸素は炭素と一重結合だけでなく二重結合（p 結いる。Phe の場合とは異なり，Ser のヒドロキシ基は不斉軌道の両合）もしているため，空軌道として s軌道と p

炭素に直接結合していない。それにも関わらず同様の強度軌道ができる。ヒドロキシ基にはアミノ基同様に s軌道の NCD が見られていることは，カイラリティーをもつ電しかない。概して述べると，内殻励起の結果として，イオ

子準位は不斉炭素周辺のみならず分子全体に広がっている

ン化，カルボキシ基の s準位と p準位，ヒドロキシ基のことの証左であろう。

s準位への電子励起が生じる。

またその近傍にも NCD らしき構造が見出せる。532 eV

Fig. 6 (a)の XANES スペクトルには，実際にいくつかのから 535 eV にかけての複雑な構造はカルボキシ基の酸素ピークが観測された。グリシン51,52)やメタノール53)など類

1s → p遷移に帰属されるもので，理論計算42) でも予言さ似物質の XANES スペクトルの比較などから， 532 eV のれている。約 548 eV のピークはカルボキシ基の酸素 1s →ピークはカルボキシ基の p準位，540 eV はヒドロキシ基s遷移と見られるが，理論計算でも予言されていない。

の s準位， 548 eV はカルボキシ基の s準位への電子遷

これらの NCD 構造はその強度が L 体，D 体で大きく異な移によると考えられる。NCD も同様にこれらの準位へのるなど疑問点も未だ残るため，今後より詳細な再現性の測電子遷移によって生じると考えられる。

定が肝要であると思われる。

放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6 ● 369

Phe および Ser ともに軟 X 線領域での NCD の信号強度

し，その結果生じる医療分野を中心とした知的財産や疾病は0.1 のオーダーであった。これは Ala などのアミノ酸治療，予防による健康促進などその利益は計り知れないもの真空紫外領域における NCD 測定結果30)と比べて十分ののと期待されている。また，軟 X 線はそのエネルギー領

一程度の強度である。電子遷移の終状態は真空紫外線でも域が分子の化学結合エネルギーと同程度であり物質との相軟 X 線でも同じであることを考えてみると，この強度の互作用が強いので， NCD を利用することで光学異性体を差は始状態である 1s 電子軌道の広がりが小さいため遷移

識別し光化学反応を制御できると期待されている。今回の行列要素の値が小さいことに大きく起因していると考えら

成果は創薬や生命の起源研究に有益なヒントを与えるものれる。

である54)。

本実験では窒素および酸素 K 殻の測定を行ったが，炭本研究において我々が NCD の微弱な信号を検出できた

素 K 殻，特にカイラリティーの中心となっている不斉炭のは，可変偏光アンジュレーターの整備と，その性能を最素の NCD 測定は非常に興味深い。しかしながら，アミノ

大限に活用するため細心の測定技術に負うところが大きか酸は分子内に多種の炭素原子を含んでおり，理論計算42)った。軟 X 線～X 線領域での NCD 測定は長い間技術的困においても予言されているように，それらが様々な正負の難を極めていたが，近年，偏光制御技術は確実に進化してNCD を有していると考えられる。このため，それらの和おり，軟 X 線領域をはじめ様々なエネルギー領域でのとして観測される実際の NCD スペクトルは結果として非NCD の研究がより進歩することを期待している。

常に複雑なものになるか，ほとんどゼロに近いものと考え
られ観測には困難が予測される。今回測定した窒素や酸素

謝辞

原子はアミ ノ酸分子内 に数少ない ので，比較 的単純な本研究の実行にあたり，ビームラインの始まりを作ってNCD スペクトルになると予想されていた。そのため，計下さった日本原子力研究所横谷明徳博士に感謝いたしま

算との比較等も容易に行うことができ，本測定の妥当性をす。本稿の測定で利用した，挿入光源，分光器，計測器の論じることができたものと考えている。

制御システムの構築は，高輝度光科学センターの松下智裕
博士との協力により実現した。ここに感謝いたします。早4. まとめと展望

稲田大学朝日透教授の有益な討論と助言に感謝いたします。また，挿入光源 ID23の運用にあたり，高輝度光科学

異方性のない蒸着膜ができたのをきっかけに，アミノ酸センター田中均博士，高雄勝博士，日本原子力研究所

を対象として生体分子では初めての軟 X 線領域の NCD を

中谷健博士，吉越章隆博士にご尽力いただいたことに感謝

測定することに成功した35) 。軟 X 線領域での NCD 研究

します。NCD 実験のサポートをしていただいた日本原子は Ågren ら42,43) の理論計算が先行していたが実験による

力研究所藤井健太郎博士，赤松憲博士に感謝します。最

研究は遅れており，NCD の研究自体がはまだ始まってい後に，この研究は中川研究室の歴代の大学院生である古結なかった。この状況のなかで我々は軟 X 線領域での円二俊行氏，埴岡（児玉）洋子氏，成田悟氏，金子房恵氏，大色性検出をめざして 2000 年頃から SPring-8 で研究を開始

田佳美氏，北田朋氏ならびに Jin Zhaohui 博士らとともにした。今回紹介したように，生体分子で軟 X 線領域の行ったものである。皆様の協力に感謝します。本研究は，NCD の検出に成功したものの，E1M1 過程のみを考えた

SPring-8 共同利用 2000B0132 NS n ， 2002A0123 NS1 

計算結果を実験と比較して E1E2 過程がどの程度重要かを

np ，2002B0487 NS1 np および2003B0360 NSb np によ問題提起するには我々の実験の精度もまだ不足している。

ってなされました。

軟 X 線領域の分子の NCD の発現機構は何か，平たく言え

引用文献

ば軟 X 線領域の NCD とは何かという問題は，実験家理論家双方にとって未解決の課題である。
軟 X 線分光は軽元素の内殻を元素選択して励起できるため，特にタンパク質， DNA ，糖鎖といった生体高分子の構造情報を，原子近傍の構造に特化して得ることがで

1)
2)
3)
4)

き，従来の可視紫外域の NCD よりも詳細な構造情報を得られると期待できる。また NCD は結晶化が不可能な試料でも測定可能であるから，糖鎖や膜タンパク質など今ま5)6)で構造解析が困難であった生体試料にも応用可能である。

NCD の測定領域を軟 X 線領域にまで拡張することによって，構造未解明の生体物質の構造を明らかすることができ7)
8)る。そして，その構造解明は新規の医薬品開発等に大きな知見を与え，各種疾病の予防，治療に大きな貢献をもたら

370 ● 放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6

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トピックス ■ 生体分子の軟 X 線自然円二色性

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放射光 Nov. 2005 Vol.18 No.6 ● 371

● 著者紹介 ●中川和道

安居院あかね神戸大学発達科学部自然環境基礎講座
E-mail: nakagawa＠kobe-u.ac.jp
専門放射光物性，生命の起源，環境物理学［略歴］
1978 年名古屋大学大学院工学研究科博士課程（後期）修了，
1980 年東京大学教養学部助手， 1989 年神戸大学教育学部助教
授，1995年神戸大学発達科学部教授，現在に至る。

独立行政法人日本原子力研究開発機構量子ビーム応用研究部門
放射光科学研究ユニット
E-mail: agui＠spring8.or.jp
専門光物性，磁気光学［略歴］
1996 年東京大学大学院工学系研究科博士課程（後期）修了，
1996 年日本学術振興会博士特別研究員， 1997 年 Uppsala 大学（スウェーデン）ビジティングリサーチャー，1999 年日本原子力研究所関西研究所研究員，現在に至る。

田中真人
独立行政法人産業技術総合研究所計測フロンティア研究部門
E-mail: masahito-tanaka＠aist.go.jp
専門キラル光物性，磁気科学［略歴］
2003年神戸大学大学院自然科学研究科博士（後期）課程修了，2004 年早稲田大学大学院理工学研究科客員研究助手， 2005 年
産業技術総合研究所研究員，現在に至る。

Soft X-ray circular dichroism of biomolecules
Kazumichi NAKAGAWA
Makoto TANAKA

Akane AGUIFaculty of Human Development, Kobe University
Tsurukabuto, Nada-ku, Kobe 6578501, Japan
Research Institute of Instrumentation Frontier, National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology (AIST),
Tsukuba Tyuou2, AIST, Umezono 111, Tsukuba, Ibaraki, 3058568,
Japan
Synchrotron Radiation Research Unit, Japan Atomic Energy Ageucy,111 Kouto, Sayou-cho, Sayou-gun 6795148, Japan

Abstract We succeeded to observe natural circular dichroism NCD for biomolecules in soft X-ray region forthe ˆrst time. Evaporated ˆlms of amino acids, phelylalanine (phe) and serine (ser) were prepared in vacuumwith the thickness of about 300 nm. Measurement was carried out at the soft X-ray undulator beamline
BL23SU of the Spring-8, where left- and right-circularly polarized light (LCPL and RCPL) was available from an
APPLE-2 undulator. DiŠerence spectra DA (h n) was plotted as a function of photon energy h n of soft X-ray tobe the diŠerence between absorption coe‹cient AL for LCPL and absorption coe‹cient AR for RCPL, namely,
DA (h n)≡AL (h n)
AR (h n). Values of AL and A R were determined by means of the photoelectric drain current
measurement. In the DA (h n) spectra for L-phe ˆlms, negative peak was observed at 407 eV. On the contrary,for D-phe ˆlms, positive peak was observed at 407 eV with the same magnitude but opposite sign. Moreover,no signal was observed for racemic phenylananine (DL-phe). In the wavelength region of visible to ultraviolet,
there is well-known general law in which NCD signals for D- and L-enantiomers are the same magnitude but
opposite sign and racemic compound does not show NCD spectra. Characteristic features in DA (h n) spectraof the L- phe, D-phe and DL-phe were of good agreement with this well-known general law. Based on this good
agreement, we concluded that peaks at 407 eV in the DA (h n) spectra are true NCD peaks. For ser ˆlms, weassigned peaks at 540 eV and 548 eV to be NCD peaks in the same manner. We hope that our ˆrst observation of NCD for biomolecules at soft X-ray region will open new science and technologies such as basic
science including elucidation of fundamental mechanism of NCD and application to manipulate biomolecules
using circularly polarized soft X-ray beams.

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