自動逐次架橋による生分解IPNゲルを用いた細胞移植
東京理科大学
理学部第一部
応用化学科教授 大塚 英典
2022年11月8日（火）1

軟骨損傷
ロコモティブシンドローム：
足腰が弱くなり、転倒・骨折などで介護が必要になる危険性が高くなった状態のこと。
超高齢社会になり、寝たきりや介護を必要とする人が急速に増加。そのうち４～５人に１人は、骨・関節・筋肉といった体を動かす「運動器」の障がいが原因

2020

65歳以上の人口が、全人口に対して21%を超えると「超高齢社会」

2

ゲルのネットワークデザイン
繊維状ネットワーク
擬似細胞外マトリックス

優れた細胞生息環境の提供（＝生体適合性）


繊維状の“構造”が機能を発現••

コラーゲンゲルフィブリンゲル 高い生体適合性✖ 抗原性・感染性•

合成ペプチドゲル

 安全性・生体適合性✖ 力学的強度ポリマーネットワーク

Stevens, M. M. et al. Science 2005, 310, 1135.

※ポリエチレングリコール＝PEG
ペプチド繊維網目

高分子網目：キトサン＋PEG

3D network＋ネットワークが複合化されたIPNゲル•
•

合成高分子
天然多糖類

 性質制御性（強度・分解性・化学修飾）✖

細胞生息環境の提供

生体適合性＆強度・生分解性を併せ持つ足場材料（scaffold）
3

IPN(Interpenetrating Polymer Network)
definition
An Interpenetrating Polymer Network (IPN) is defined by IUPAC as “A polymer comprising two or more networks which
are at least partially interlaced on a molecular scale but not covalently bonded to each other and cannot be separated unlesschemical bonds are broken.
The reason for the development of these structures is to combine the favorable properties of each constituent polymer
within a new overall hydrogel network and to modulate the mechanical and biological properties of each constituent.
Generally, the resulting hydrogel system possesses enhanced properties due to the synergistic effects.
.

1st network

Physically cross-linking；
RADA peptide hydrogel→differentiation, condrogenesis

2nd network

二つ以上の高分子が独立に存在する状態で互いに絡み合ったネットワーク

Chemically cross-linking；Chitosan-PEG hydrogel→mechanical strength

力学強度、細胞活性の相乗的向上（シナジー効果）4

研究目的
ペプチドおよび糖鎖のネットワークを構成成分とする
注射可能なインジェクタブル型IPNゲルの合成
 RADA16 ペプチドゲル(細胞親和性ネットワーク)

Ac- RADARADARADARADA -CONH2

RADA peptide (Pura Matrix)
 in the presence of salt (e.g. in PBS)

 Chitosan/PEG ゲル(力学支持ネットワーク)

Carboxymethyl Chitosan
Mw = 100,000
DS 0.61, DAC 63.3%
R : -H, or –CH3COOH
R’ : -H, or COCH3

 self-assembly (β-sheet structure)

Nagai, Y. et al., J. Control. Release 2006, 115, 18.

 Self-assembling peptide
 Fiber network structure (scaffold)Poly(ethylene glycol) (PEG)
Mn = 2,000
NHS substitution > 99%

 Biocompatible gel Improvement of mechanical strength5本研究で取組むゲル化のメカニズム
 高機能細胞足場の創出に向けて繊維状ネットワーク を保持しOne-pot 合成

より高い力学強度 (IPN 構造) を有した
インジェクタブルなOne-pot ゲル化 システム
ペプチド繊維状ネットワーク(組織誘導性)
Chitosan/PEGの化学架橋ネットワーク(力学的支持)IPN 構造は一般に、逐次的なゲル化による多段階反応ゲル化メカニズム・反応速度のタイムラグを利用した
IPN 構造のOne-pot 形成！
6

Condition
Wavelength: 300-205 nm
Bandwidth: 0.5 nm
Scan rate: 200 nm/min
3 times scan for average
Path length: 0.1 mm
Temperature: 20°C

IPNのCD スペクトル測定
5CD/ mdeg

0

Chitosan/PEG
1.0/1.0 wt%-5

CD(Chitosan/PEG/RAD16)-CD(Chitosan/PEG)-10-15200

βシート構造由来

RADA160.25 wt%

Chitosan/PEG/RADA161.0/1.0/0.25 wt%
220240260

Wavelength/ nm280300RADA16 の組織構造はChitosan/PEG ゲル中で安定に保持
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; CHEM MATER, 2020, 32(6), 2353 – 2364.
7

ゲルの力学強度測定(IPN の相乗効果1: 力学物性)
800

Condition

600

Stress/ Pa

Sample: 300 μL
Stress: 1.0-3000 Pa
Sensor: PP20
Mode: CS
Frequency: 1 Hz
Shear amplitude: ~0.5 N
Temperature: 20°C

Chitosan/PEG/RADA161.0/1.0/0.25 wt%

Chitosan/PEG
1.0/1.0 wt%

400

2000

RADA160.25 wt%
02040

60

80

Strain/ %IPN 構造に由来する力学的強度の向上
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; CHEM MATER, 2020, 32(6), 2353 – 2364.

8

S Ishikawa, H Otsuka*et al.; CHEM MATER, 2020, 32(6), 2353 – 2364.
Condition:
Gel composition: atelocollagen 0.5 wt%
CH/PEG/RADA16
2.0/1.0/0.25 wt%
Gel volume: 50 μL
Medium: DMEM
Cell: chondrocyte (P1)
Cell density: 1.0×107 cells/mL
Incubation: 37°C, 5% CO2

in vitro ゲル培養

(IPN の相乗効果2: 細胞活性)250

 細胞存在下でのIPN-CD スペクトルGAG concentration in medium

5atelocollagen
CH/PEG
CH/PEG/RADA16

2000CD/ mdeg

Cumulative amount of GAG/ μg per sample

 グリコサミノグリカン(GAG)産生量

150100-5-10RADA16chondrocyte-15

CH/PEG/RADA16
with chondrocyte
CD(CH/PEG/RAD16)-CD(chondrocyte)

-20
50

0-25
200

5102030

40

Days of culture

50220

240

260

280

Wavelength/ nm

300

60

CH/PEG/RADA16 ゲルを足場とした細胞機能の向上

細胞存在下でのRADA16繊維構造の保持を確認

9in vivo 移植実験
Gel composition: atelocollagen 1.0 wt%
Chitosan/PEG/RADA16
2.0/1.0/0.25 wt%
Cell: human auricular chondrocyte (P1)
Cell density: 106, 107, 108 cells/mL
Scaffold: PLLA scaffold (KRI), porosity >95%
Nude mouse: Balb/c nu/nu (6 wks, ♂)Incubation time: 8 weeks
Characterization: gross pathology,toluidine blue staining, GAG

 Effect of cell density(cells/mL) on GAG production
atelocollagen

106

107

108

IPN (Chitosan/PEG/RADA16)

pre-transplant106

post-transplant

107

108

Atelocollagen

炎症有IPN(Chitosan/PEG/RADA16)

炎症無300post-transplant

炎症無アテロコラーゲンゲルよりも優れたヒト軟骨の再生

Amount of GAG/μg/mg total protein

pre-transplant

S Ishikawa, H Otsuka*et al.; CHEM MATER, 2020, 32(6), 2353 – 2364.

250

atelocollagen
Chitosan/PEG/RADA16200
150
50250106

107

Cell density/ cells mL-110810IPN 構造を有する
インジェクタブルゲルへの生分解性付与
ONO

生分解性架橋剤の合成 (PEG-PLA-PEG)
PEG

OCOO

OnOOCOmCO4

PEG

PLA ;
degradable unit

ECM

Water ;nOCONOO

S Ishikawa, H Otsuka*et al.; ACS BIOMATER SCI
ENG, 2019, 5(11), 5759 – 5769.

PLA ; degradable unit
Growth Factor(IGF-1)

OmO

O

O

ECM

Proteoglycan,
Collagen

3D-cell culture
andgel degradation

CH/PEG-PLA-PEG/RADA16
Injectable gel

Tissueregeneration

Host ECM structure(Produced by cultured cell)

成長因子内包型IPN ゲルの物性評価と再生組織置換性評価

11分解挙動評価
 生理条件下分解試験 (in PBS at 37 ºC)

重量損失挙動40

Weight loss/ %Gel volume : 300 μL
Temp. : 20 ºC

CPLR(Chitosan/PEG-PLA-PEG/RADA16)CPR(Chitosan/PEG/RADA16)

30201000102030

Day

405060

力学強度変化

120100Decrease rate ofelastic modulus/ %Weight loss = (Wdo-Wd)/WdWs : weight of swollen gel
Wdo : Initial weight of dry gel
Wd : weight of dry gel

8060
40200020

Day

4060

時間経過につれてCPLR の重量損失向上、力学強度減少

CPLR はPLA のエステル加水分解に基づき分解
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; Materials Today Advances 9 (2021) 100131

12軟骨細胞機能評価（生分解性IPN）
 タンパク質産生量 sGAG ➠ DMMB assay (570 nm), COL ➠ Hydroxyproline assay (570 nm)

240180CPRCPLR**120600102030

Days of culture

40

Deposited amount of COL/pg per cell

Deposited amount of sGAG/
pg per cellsGAG; Sulfated glycosaminoglycan(ゲルでの蓄積量)

4.5

COL; Collagen type II(ゲルでの蓄積量)
*

3.6
*

2.7

*

1.8
0.90102030

Days of culture

40(n = 3, *p < 0.05 (Student’s t-test))

CPR(Chitosan/PEG/RADA16)CPLR (Chitosan/PEG-PLA-PEG/RADA16)CPLR のsGAG, COL 蓄積量向上

RADA16 複合化とゲル分解による細胞機能向上
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; Materials Today Advances 9 (2021) 100131

13軟骨細胞機能評価
 遺伝子発現量評価 (RT-PCR)

遺伝子増幅後、電気泳動を行いバンド強度にて相対的なmRNA 発現量(GAPDH で規格化した後、Day0 のウシ膝軟骨細胞との相対値) を評価

軟骨分化性

硝子軟骨性（関節軟骨）

線維軟骨性（椎間円板）

硝子軟骨への選択性(n=3, *p < 0.05 (Student’s t-test))

ACAN・・・ CPLR ＞CPR
COL2A1・・・ CPLR ＞CPR

COL1A1 ・・・ CPLR ＜ CPR

分解性IPN ゲル中での硝子軟骨細胞への分化
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; Materials Today Advances 9 (2021) 100131

14

総括

1.
2.
3.

切らずに注射のみで関節の軟骨再生を助け、自然に起こる加水分解で術後の炎症を防ぐ、注射可能なゼリー状物質「インジェクタブルハイドロゲル」の開発

体を傷つけず、かつ低炎症性な関節軟骨の再生を実現

組織再生

グリコサミグリカン
コラーゲン

4.

S Ishikawa, H Otsuka*et al.; Materials TodayAdvances 9 (2021) 100131
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; CHEM MATER,
2020, 32(6), 2353 – 2364.
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; J. Appl. Polym. Sci.
2019, 137, 48893.
S Ishikawa, H Otsuka*et al.; ACS BIOMATERSCI ENG, 2019, 5(11), 5759 – 5769.

注射器 軟骨細胞
 CMキトサン ポリエチレングリコール
 ＲＡＤＡ

1st.ペプチド架橋

ゲルの分解 (加水分解)

2nd.CH/PEG架橋
15従来技術とその問題点
細胞の足場となっている実際の生体内の細胞外マトリックス(ECM)は、さまざまなタンパク質などから構成されている。そのため、生体外で細胞を培養する際に足場として用いる材料も、複数の物質が組み合わさって立体的な骨格を形成するものが望ましいとされている。
そのため、複数の独立した材料が機能的なネットワークを形成しているIPNゲルが注目されている。
従来、IPNゲルを合成するには、薬剤の添加や放射線の照射を含む多段階の合成反応系が必要であった。しかし、医療応用のためには、余分な刺激物などを添加せずにone-pot(単一の反応容器内)で簡便合成でき、細胞毒性を生じさせず、損傷部位で効率よく三次元構造を構築できるゲル材料であることが求められる。
16

新技術の特徴・従来技術との比較
 従来、薬剤の添加や放射線の照射を含む多段階の合成反応系が必要であった人工ECMを、簡便にone-pot合成できる合成経路の確立に成功した。
 軟骨細胞の足場となる材料は、まだ十分に生体内の足場材を模倣できていなかったが、本研究で開発した細胞足場材料の簡易な合成系は再生効率が良く、生体に問題を引き起こしにくい。
 ペプチドが自律的に繊維状の構造を形成する現象(自己組織化）と、それに続くキトサンとポリエチレングリコールの共有結合形成によって形成されたIPNゲルは足場材料として適した構造を持ち、かつ軟骨細胞がIPNゲルを足場として自律的に増殖することも確認された。
 現状では、損傷した軟骨は自然に修復することはないため、唯一の治療法である人工関節に代わる軟骨の再生医療の発展に大きく寄与すると期待できる。

17

想定される用途
 本技術の特徴を生かすためには、研究材料製造に適用することで細胞培養用基材としてのメリットが大きいと考えられる。
 また、達成された細胞増殖や分化能力に着目すると、生体外三次元培養や薬物スクリーニングといった分野や用途に展開することも可能と思われる。
 上記以外に、代替動物実験の効果が得られることも期待される。
 軟骨以外の組織再生に適用可能な足場材料となることが期待できる。
18

実用化に向けた課題
 現在、in vivo実験について組織再生が可能なところまで開発済み。しかし、安全性試験の点が未解決である。
 今後、細胞ソースや施術法について実験データを取得し、臨床応用に適用していく場合の条件設定を行っていく。
 実用化に向けて、材料合成の精度を大量生産、均一な品質確保まで向上できるよう技術を確立する必要もあり。
19

企業への期待 未解決の細胞ソースの確保や施術法の確定については、医学部との連携により克服できると考えている。
 生体高分子の大量合成技術、安全性試験、ヒトへの臨床応用などの経験を持つ、企業との共同研究を希望。
 また、タンパク質医薬を開発中の企業、医療分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：生分解性インジェクタブルゲル• 出願番号：特願2017-536444（国内登録6886402）、15/754393（US登録10835637）• 出願人：東京理科大学、（株）スリー・ディー・マトリックス• 発明者：大塚英典、松隈大輔、松田範昭
21産学連携の経歴• 2008年- 2011年 JST（ＣＲＥＳＴ）事業に採択• 2010年-2014年 NEDO実用化促進事業に採択• 2007年-2009年 NEDO健康安心プログラム・再生医療評価
研究開発事業に採択• 2007年-2011年 三菱レイヨン株式会社と共同研究実施• 2012年- 2013年 JST（ＣＲＥＳＴ）事業に採択• 2011年-2016年 日本バイリーン株式会社と共同研究実施• 2016年-2018年 株式会社スリー・ディー・マトリックスと共同研究実施
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お問い合わせ先
東京理科大学
産学連携機構 是成 幸子
ＴＥＬ 03-5228-7431
ＦＡＸ 03-5228-7442
e-mail ura@admin.tus.ac.jp

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