2 Mar, 2012, 名古屋大学理学研究科生命理学専攻 最終講義

蛋白質間相互作用のおもしろさ、奥深さ：
アクチン研究の現場から

前田雄一郎
名古屋大学大学院理学研究科
構造生物学研究センター（生命理学専攻兼任）

1

問題意識の源流

大沢文夫
1922 アクチン重合過程を凝集過程として再発見
本人撮影

江橋節郎
1922-2006

筋収縮のカルシウム調節の発見

http://www.brh.co.jp/s_library/j_site/scientistweb/no12/より

名取礼二
1912-2006
脱鞘筋繊維（名取の筋繊維）の創出

名取禮二「名取禮二撰集
康寧を求めて –私の歩いてきた道-」㈱医学書院出版サービス、2003年
2より

所属研究組織の変遷
1980

MPI

1978.8 理学博士（大沢文夫教授）
1979.7 マックスプランク研究所（Heidelberg)
PD (K.C.Holmes教授）
1984

欧州分子生物学研究所(EMBL) Hamburg

EMBL

大学は最も優れ、かつ社会的に重要な研究の場である

1990
1993

松下電器産業（株）国際研究所

Panasonic

20101998

理化学研究所播磨（SPring-8)

2003
2004
2007

ERATOアクチン動態プロジェクト
名古屋大学理学研究科生命理学
構造生物学研究センター

RIKEN
ERATO

2000

◆人文・社会科学研究者との対話◆研究と教育の統一講義をすることが重要

Nagoya Univ.
3筋肉細胞中のアクチンフィラメント複合体

4

筋肉アクチンフィラメント複合体の構成蛋白質の高分解能構造

Troponin (Tn)

Tropomyosin(Tm)

F-Actin

110-115
191-199

171-178
39-42

S.Takeda et al. (2003)
Nature 424:35-41

265-271201-203285-2 86

Oda et al., (2009) Nature, 457:441-446

Nitanai et al., (2007) Adv.Exp.Med.592:137-151
Minakata et al., (2008) Biophys.J. 95:710-719

一般細胞中でのアクチン分子運動＜ アクチントレッドミリング ＞

6

polymerization[Actin]monomer or within polymer

大沢文夫の生物物理学

Critical conc.

[Monomer][Monomer]Time (min)Polymerization Process＝ Nucleation＋elongation

Polymerization isa condensation phenomenon.
End concentration is in equilibrium withMonomers.

Oosawa & Kasai, “Actin” in “Subunits in Biological Systems” ed. Timasheff, Marcel Dekker, 1971.
Oosawa & Asakura “Thermodynamics of the Polymerization of Protein” Academic Press, 1975

7

アクチン分子運動が展開される構造
Lamellipodia 葉状仮足

GFP-actin-transfected melanoma cellby J.V.Small at http://cellix.imba.oeaw.ac.at/lamellipodium-in-3d/

Filopodia 糸状仮足Filopodia in live growth cone of Aplysia bag cell neurons
observed with Pol-Scope
K. Katoh, K. Hammar, P. J. S. Smith, and R.Oldenbourg
Molecular Biology of the Cell 10, 197–210, (1999)

8

アクチン・トレッドミリング
ADPATP

ATP-G-actin

ADP-G-actin

Pi
B-end
(Barbed end)

P-end
(Pointed end)
F-actin (ATP-F  ADPPi-F  ADP-F)

Polymerization

De-polymerization[G-actin] at
Steady state

speed

Purified actin(in vitro)

0.1 mM

3 mm / 90 min

Lamellipodia(in vivo)

2 mM

3 mm / 1 min

From Pantaloni, D., Le Clainche, C. & Carlier, M. F. (2001). Science 292, 1502-6.

9トレッドミリング運動の調節蛋白質

Arp2/3 complex
Nucleation promoter

B-end

P-end

Capping Protein
Elongating ends blocker

ADF/cofilin
Depolymerization promoter

profilin
Actin recycler

Pollard, TD (2007) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:451–77

10アクチン・アクチン分子間相互作用

1.

重合に伴うアクチン分子の変形 (G型  F型)
F型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている

2.

重合反応におけるATP加水分解の役割
ATP加水分解は重合を駆動するのではなく、脱重合を準備する

3

重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用である

4

アクチン重合体に結合する蛋白質の結合の強さは分子構造が固くなると弱くなるのではないか？

11

重合に伴うアクチン分子の変形 G型 F型
a43ab4Cleft2 cb42

Yellow = G
Cyan = F
1groove331d44223311G-actin

F-actinOda T, Iwasa M, Aihara T, Maeda Y , Narita A, Nature (2009) 457:441-44612結晶を用いることなくアクチン重合体の高分解能構造を解明
Diffraction limit 3 ÅSuper-conducting
magnet 18.3 T
X-ray fiber diffraction intensities
fromhighly oriented F-actin sol

Crystal structureof G-actin

aCryo-EM
13.8 Å resolution

139,140,143
191-199258-289b110-115
171-178
39-42265-271

Computer sciencenormal modes analysis,
MD

38-49

201-20361-65
241-247

200-208285-286

Oda T, Iwasa M, Aihara T, Maeda Y , Narita A, Nature (2009) 457:441-446

13

Fujii, T., Iwane, A. H., Yanagida, T. & Namba, K. (2010). Direct visualization ofsecondary structures of F-actin by electron cryomicroscopy. Nature 467, 724-8.

Murakami, K., Yasunaga, T., Noguchi, T. Q., Gomibuchi, Y., Ngo, K. X., Uyeda, T. Q.
& Wakabayashi, T. (2010). Structural basis for actin assembly, activation of ATPhydrolysis, and delayed phosphate release. Cell 143, 275-87.

14F型はG型よりエネルギー的に不安定
F型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている
変形は重合時に分子から分子に伝搬するUnits in neutral position are not able
to self-assemble

423
1G-formmonomer

4DLD Caspar (1991) CurrBiol. 1:30-32.
LS Penrose (1959) SciAm. 200:105-114.

23

Altered units can self-assemble

F-form
1In F-actin

Oda T et al. Nature (2009) 457:441-446

15不安定なF型から構成される重合体の安定化
分子間接触による
ban+2

c139,140,143

n+2171-178

265-271283294285-286239-42110-115

c2 38-49

461-65b241247

201-203n+1
41191-199

331 220-208
nnOda T, Iwasa M, Aihara T, Maeda Y , Narita A, Nature (2009) 457:441-446

16

アクチン・アクチン分子間相互作用

1.

重合に伴うアクチン分子の変形 (G型  F型)
F型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている

2.

重合反応におけるATP加水分解の役割
ATP加水分解は重合を駆動するのではなく、脱重合を準備する

3

重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用である

4

アクチン重合体に結合する蛋白質の結合の強さは分子構造が固くなると弱くなるのではないか？

17

アクチン・アクチン分子間相互作用

1.

重合に伴うアクチン分子の変形 (G型  F型)
F型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている

2.

重合反応におけるATP加水分解の役割
ATP加水分解は重合を駆動するのではなく、脱重合を準備する

3

重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用である

4

アクチン重合体に結合する蛋白質の結合の強さは分子構造が固くなると弱くなるのではないか？

18

重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用

MolFeatMolFeat Control
Control v3.6
v3.6
File:
File:
Caption:Caption: Off
Off Medium
MediumComComm
ment:
ent: Off
Off Sm
Small
all
View
Auto
Rotation:
View Auto Rotation: Off
Off
Traje
Trajectory
ctory Anim
Animation:
ation: Off
Off
Current
Current Scene
Scene no:no: 00
Mouse
Mouse Operation:
Operation: Rotation/Scale
Rotation/Scale
UpdateUpdate View
View Position:
Position: ONON

Oda T et al, Nature (2009) 457:441-446

1919

アクチン重合体 P端 の構造
新規接触 D-loop (P-1) / H-loop (P)
A

B

C IV
P-1

IIIIIPI

P-2

F I
DNase

P-3P-4

DbindingloopPhydrophobicplugE
P-1

P-2

Narita et al, EMBO J. (2011) 30, 1230-1237.

20

アクチン重合体の端の構造解析のための方法開発
Single particle analysis of cryo-EM pictures

Cryo-EM picture of single F-Actin/CP complex
Narita,A & Maéda,YJ.Mol.Biol. (2007)
365:480-501

To average many images, the axial and azimuth position of individual
protomers should be correctly determined.
• To do so, the known filamentous structure is used as the reference (b)• From comparison between image (a) and the reference (b), y（the axialcoordinate）and f （azimuth coordinate）are obtained.
• Then, it is relatively easy to specify (by choosing an integer number)the protomer to which a biding protein is attached.
21• Obtained initial structure should be refined.

P端に新規ループ・ループ結合
 P端での重合、脱重合双方の速度を減速
 B端方向に移動
ATP-actin
ADPPi-actin
ADP-actinr = 1.0

r = 0.1

B-end
X=k+k-

CC= k-/k+ATP

10 mM-1s-1

1 s-1

0.1 mMADPPi

3 mM-1s-1

0.3 s-1

0.1 mM

ADP

3 mM-1s-1

6 s-1

2 mM

P-end, for r = 0.1
X=k+k-

CC= k-/k+ATP

1 mM-1s-1

0.1 s-1

0.1 mM

ADPPi

0.3 mM-1s-1

0.03 s-1

0.1 mM

ADP

0.3 mM-1s-1

0.6 s-1

2 mM

r = kPX+/kBX+ = kPX-/kBXr = 10

ATP hydrolysis in F-actin = 0.3 s-1
Pi release rate at either end = 2 s-1 22
Pi release rate in F-actin = 0.003 s-1

アクチン・トレッドミリングのメカニズム
ATP-Gアクチン濃度を 1mM と仮定する
1． ATP-Gアクチンが重合体端に結合する
B端での重合速度 （10 s-1) は ATP加水分解速度 0.3 s-1より速い
P端での重合 速度 （1 s-1) は ATP加水分解速度 0.3 s-1と同程度
よってB端はほとんど常にATP-Fアクチン。P端はADP-Fアクチンである頻度が高い
この差は端の特性による （P端のkinetic barrierが上昇した）
2. ATP-Fアクチンが存在するB端の臨界濃度は 0.1 mM ( < 1mM)
ADP-Fアクチンが存在するP端の臨界濃度は 2 mM ( > 1mM)
よってB端は伸張し、P端は短縮する
この差は（端とは関係なく）結合ヌクレオチドによる
ADP-Fアクチンの端がより不安定 （ATP加水分解による）23

アクチン・アクチン分子間相互作用
チューブリン・チューブリン相互作用
重合に伴うアクチン分子の変形 (G型  F型)
F型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている
1． 重合に伴うチューブリン分子の変形 （湾曲型 直線型）
直線型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている
1.

2.
2.

重合反応におけるATP加水分解の役割
ATP加水分解は重合を駆動するのではなく、脱重合を準備する
重合反応におけるGTP加水分解の役割
GTP加水分解は重合を駆動するのではなく、脱重合を準備する

33.

重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用である重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用である

4

アクチン重合体に結合する蛋白質の結合の強さは分子構造が固くなると弱くなるのではないか？
24

微小管プロトフィラメントの多型
GTP結合型/GDP結合型、湾曲型/直線型
In vitro、(+)end
Tc = GTP-bound, slightly curved

Ds = GDP-bound, straightcatastroph
Ts = GTP-bound, straightrescueGTP-tubulin
GDP-tubulin
Dc = GDP-bound, curved
伊藤知彦 蛋白質・核酸・酵素 51:529-534 より25Illlustration by T.Itoacb(+)
H7GDP

L6-7

H7L6-7

H6b2

H6H10a2
RB3-SLD

H10COLGTP

RB3-SLD

baGDPb11JFF(-)

1SA0COL

Crystal structures of tubulin dimer
1SA0 : Ravelli, R.B., B. Gigant, P.A. Curmi, I.
Jourdain, S. Lachkar, A. Sobel, and M. Knossow.
2004. Nature. 428:198-202.

GTP

a1
1SA026

g-Tubulin Ring Complex (gTRC)

付加

多型変換伝搬Moritz M et al, Nature Cell Biology (2000) 2:365-370 より

27

アクチン・アクチン分子間相互作用

1.

重合に伴うアクチン分子の変形 (G型  F型)
F型には力学的歪みのエネルギーが蓄えられている

2.

重合反応におけるATP加水分解の役割
ATP加水分解は重合を駆動するのではなく、脱重合を準備する

3

重合体中の分子間相互作用は主にループ間相互作用である

4

アクチン重合体に結合する蛋白質の結合の強さは分子構造が固くなると弱くなるのではないか？

28

トレッドミリング運動の調節蛋白質

Arp2/3 complex
Nucleation promoter

Capping Protein
Elongating ends blocker

B-end

P-end

ADF/cofilin
Depolymerization promoter

profilin
Actin recycler

Pollard, TD (2007) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36:451–77

29

CP 単独の結晶構造、アクチン重合体B端への結合

zCP
Crystal structure of CP
Yamashita A, Maeda K,Maéda Y. (2003)
EMBO J. 22: 1529-1538.

CPEM structure ofCP/B-end of F-actin

Narita A, Takeda S,
Yamashita A, Maéda Y. (2006)
EMBO J. 25:5626-33.

30

CP /V-1 複合体の結晶構造
V-1 sequesters CP by binding CP on the actin B-end binding region

3AAA
Takeda, S. et al. (2010) PLoS Biol 8, e1000416.

31V-1 の結合によるCPの変形
2つの部分が相反ローリング
CP is divided into two domains, and the twisting angle between the two is variable.

Takeda, S. et al. (2010) PLoS Biol 8, e1000416.

32

CP/CARMILペプチド 複合体の結晶構造
CP単独の構造とほぼ同一
CARMIL peptides binding groove on CP is remote from the actin binding regionand spans the two domains across the boundary

33

Takeda, S. et al. (2010) PLoS Biol 8, e1000416.

Normal Mode Analysis with elastic body approx.
Free CP

Normal Mode Analysis with elastic body approx.
With CARMIL peptide

CP-SCP-L

β

Takeda, S. et al. (2010)
PLoS Biol 8, e1000416.

34

今後の課題蛋白質相互作用の解明： ３つの研究方向

１．分子の会合動態
 分子の構造動態の変化を解明する
２． 複合体の高分解能構造を解明する
３． 細胞内での分子の会合動態と複合体の構造を解明する
35

研究方向 1 蛋白質分子の構造動態を知る
CP 分子内の各部の「柔らかさ」を直接測定する（SAIL-NMR法）

CPSAILアミノ酸 (Stereo Array IsotopeLabeling)： 原子を選択的に同位体標識
 芳香環の回転を測定可能
 分子各部の「柔らかさ」の計測

CP： 19個のTyrが分子全体に分布
CARMILペプチド結合による回転速度の変化?
甲斐莊らとの共同研究

36

37

研究方向 2．蛋白質複合体の構造解明：（１）重合の開始、（２）脱重合加速のメカニズム解明
核形成促進因子(Arp2/3)（１）最初のアクチン分子、「誰」がいつ、どのように変形するか？

N-WASP

From M.F.Carlier

アクチンの変形は伝搬する
自発的には重合ははじまらない
1

2

34

ループ・ループ結合
Arp2/3複合体

３．アクチン重合体の柔らかさ
ループ・ループ結合の部分的破綻？

脱重合促進因子(cofilin)（２）どのようにループ間結合すべてを同時に外すのか？
cofilin

Bamburg, McGough, & Ono (1999).
38
Trends Cell Biol 9, 364-70.

研究方向 3．細胞内の会合動態と複合体の構造解明：
膜近傍でのアクチン伸張点・分岐点の配置（電子線トモグラフィ）
アクチン重合体の分岐構造 (Lamellipodium)
Small 研が撮影、成田が解析
新規試料調製法を開発中（臼倉研と共同）

細胞外細胞内 J.V.Small,
Nature Cell Biol.
(2010)y 分岐構造A.Narita, J.Müller, J.V.Small.

Un-published39

Acknowledgement:
ERATO project /Nagoya University
Structural Biology Res. Cntr.
Akihiro Narita,
Yasushi Nitanai
Shuichi Takeda,
Shiho Minakata,
Atsuko Yamashita,
Mitsusada Iwasa,
Kayo Maeda,
RIKEN, Spring-8 Center
Toshiro Oda,
Tomoki Aihara

Nagoya University,
Structural Biology Res. Cntr.
Masatsune Kainosho
Youhei Miyanoiri
Mitsuhiro Takeda
Nagoya University,
Ecotopia Science InstituteJiro Usukura

The Institute of Molecular Biotechnology(IMBA), the Austrian Academy of Sciences
John Vic Small
Nagoya University,
Bio-informatics
Motonori Ota
Ryotaro Koike40