2022 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書
㻌

タウオパチーにおける形態特異的タウ重合モデルの開発
田中稔久㻌㻌
㻌三重大学医学部㻌 神経・筋病態学㻌
㻌共同研究者㻌 ：㻌 福森亮雄㻌 （大阪医科薬科大学㻌 薬学部㻌 薬物治療学 㻵㻵 研究室）㻌
㻌

【研究の背景】 
高齢化社会を迎えた現在、認知症の病態メカニズムの解明とそれにもとづく早期診断・治療法の開発は緊急の課題である。この中でタウが異常蓄積するものはタウオパチーと総称されている。アルツハイマー病（㻭㼘㼦㼔㼑㼕㼙㼑㼞㻌 㻰㼕㼟㼑㼍㼟㼑㻦㻌 㻭㻰）に加え、
㻼㼞㼕㼙㼍㼞㼥㻌 㻭㼓㼑㻙㻾㼑㼘㼍㼠㼑㼐㻌 㼀㼍㼡㼛㼜㼍㼠㼔㼥㻌 （㻼㻭㻾㼀）、慢性外傷性脳炎（㻯㼔㼞㼛㼚㼕㼏㻌 㼀㼞㼍㼡㼙㼍㼠㼕㼏㻌 㻱㼚㼏㼑㼜㼔㼍㼘㼛㼜㼍㼠㼔㼥㻦㻌 㻯㼀㻱）、ピック病（㻼㼕㼏㼗㻌㻰㼕㼟㼑㼍㼟㼑㻦㻌 㻼㼕㻰）、大脳皮質基底核変性症 （㻯㼛㼞㼠㼕㼏㼛㻮㼍㼟㼍㼘㻌 㻰㼑㼓㼑㼚㼑㼞㼍㼠㼕㼛㼚㻦㻌 㻯㻮㻰）、嗜銀顆粒性認知症（㻭㼞㼓㼥㼞㼛㼜㼔㼕㼘㼕㼏㻌 㻳㼞㼍㼕㼚㻌㼐㼕㼟㼑㼍㼟㼑㻦㻌 㻭㻳㻰）、㻭㼓㼑㼕㼚㼓㻙㻾㼑㼘㼍㼠㼑㼐㻌 㼀㼍㼡㻌 㻭㼟㼠㼞㼛㻳㼘㼕㼛㼜㼍㼠㼔㼥㻌 （㻭㻾㼀㻭㻳）㻌 、㻌 進行性核上性麻痺㻌 （㻼㼞㼛㼓㼞㼑㼟㼟㼕㼢㼑㻌 㻿㼡㼜㼞㼍㼚㼡㼏㼘㼑㼍㼞㻌 㻼㼍㼘㼟㼥㻦㻌㻼㻿㻼）㻌 、㻌 㻳㼘㼛㼎㼡㼘㼍㼞㻌 㻳㼘㼕㼍㼘㻌 㼀㼍㼡㼛㼜㼍㼠㼔㼥㻌 （㻳㻳㼀）㻌 などが含まれている。タウ蛋白の超微形態は 㻭㻰 脳に見いだされる 㻼㼍㼕㼞㼑㼐㻌㻴㼑㼘㼕㼏㼍㼘㻌㻲㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㼟（㻼㻴㻲）（直径約 㻝㻜～㻞㻜㻌㼚㻹、約 㻤㻜㻌㼚㻹 周期の規則的な凹凸があるフィラメント構造体）と特に 㻼㻿㻼 脳等に見いだされる 㻿㼠㼞㼍㼕㼓㼔㼠㻌 㻲㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㼟（㻿㻲）の 㻞 種類が知られていたが、近年のクライオ電子顕微鏡法の開発と進歩により、病態ごとのタウの超微形態の分子モデルが明らかにされた。それによると、それぞれのタウオパチー性疾患において特徴的なタウ分子のフォールディング構造があり、従来は 㻼㻴㻲 と 㻿㻲 の 㻞 種類に見えていたものは、少なくとも 㻤 種類のパターンの分子重合体に類型化されている 㻝）。そしてこの構造の基本構造は、まず 㻞 つのタウ分子が 㻞 量体を形成し、その 㻞 量体が形成する平面とは垂直方向に重層的にこれらが重なっていくことによりタウ線維が形成されているということである。そこで、各タウオパチー性疾患に見いだされるタウ 㻞 量体を個別に作成することができれば、これをもとに重合シードを形成させ、さらにこれを鋳型として複製して十分量の疾患別タウ線維（神経原線維変化）を保有することができると想定できる。そして、これをもとに特異抗体を作成するなどの方法で各タウオパチーに特異的な診断薬・治療薬の開発に貢献することができると考えられる。そこで、こういった問題に対応するために、我々はフォトクロスリンク法を用いて人工的に単一の重合タウ分子モデルを作成することを発案した。このフォトクロスリンク法とは紫外線照射により蛋白間で架橋させる方法であり、ある蛋白と結合親和性のある蛋白を同定する、あるいは複合体を形成することが既知の蛋白間において結合の接合部位を同定して複合体の立体構造を明らかにする際などに用いられている。例えば、アミロイド前駆体蛋白はγセクレターゼの複合体により切断されてアミロイドβが産生されるのであるが、蛋白切断という酵素反応の際に両者の結合した複合体が形成されることが想定されるが、このフォトクロスリンク法により両者の接合部位が明らかとなりアミロイド前駆体蛋白とγセクレターゼの複合体の構造が明らかにされている 㻞）。㻌㻌【目  的】本研究では、様々な超微形態を有するタウ重合体モデルの作成のために、前述のフォトクロスリンク法を用いてタウ蛋白同士の接合面の異なるタウ 㻞 量体を作成することにした。㻌
㻌【方  法】
㻝）変異挿入型タウ遺伝子の作成㻌
リコンビナントタウ蛋白を作成するにあたって、ヒト由来のタウ遺伝子を大腸菌における産生量を増やすためにコドン最適48

先進医薬研究振興財団

2023 年度

研究成果報告集

2022 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書化法を使用した。ほとんどのアミノ酸は複数のコドンから翻訳されるが、コドンバイアスは種によって異なっている。このため、ヒト遺伝子を大腸菌で翻訳させる場合、翻訳量が減少することが指摘されている。そこで、翻訳効率を改善するために 㻠㻠㻝 ア
ミノ酸に翻訳される全長型ヒトタウ遺伝子を大腸発現に適した配列に改変し、さらにその 㻟’末端側に 㻴㼕㼟 タグ配列を接合したものをベクター㼜㻼㻭㻸㻣（㻮㼕㼛㻙㻾㼍㼐）のマルチクローニングサイトに挿入した。結果として、発現するタウ蛋白の 㻺 末端には㼜㻼㻭㻸㻣 にある 㼑㼄㼍㼏㼠 タグ、㻯 末端には 㻴㼕㼟 タグを付加したものになるが、これらはアフィニティクロマトグラフィにより蛋白精製を効率化するために行ったものである。㻌
そして、病態機序に関与するタウ 㻞 量体を作成するために光反応性アミノ酸である 㼜㼍㼞㼍‐㻮㼑㼚㼦㼛㼥㼘‐㻸‐㼜㼔㼑㼚㼥㼘㼍㼘㼍㼚㼕㼚㼑㻌 （㼜㻮㼜㼍）をリコンビナントタウ蛋白への導入を試みた。このアミノ酸は数オングストロームの距離で近接したアミノ酸に対して、紫外線（㼁㼂）照射下では分子間でクロスリンク（架橋）する性質を有している。アンバーコドン（㼁㻭㻳）は通常は終始コドンであるが、このコ ドンに対応し て 㼜㻮㼜㼍 を翻訳時に組み込むことのできる 特殊トランスファ ー 㻾㻺㻭（㼜㻮㼜㼍㻙㼟㼜㼑㼏㼕㼒㼕㼏㻌 㼍㼙㼕㼚㼛㼍㼏㼥㼘㻙㼠㻾㻺㻭㻌㼟㼥㼚㼠㼔㼑㼠㼍㼟㼑㻌㼍㼚㼐㻌㼠㼔㼑㻌㼏㼛㼞㼞㼑㼟㼜㼛㼚㼐㼕㼚㼓㻌㼍㼙㼎㼑㼞㻌㼟㼡㼜㼜㼞㼑㼟㼟㼛㼞㻌 （㻼㼑㼠㼑㼞㻌㻳㻚㻌㻿㼏㼔㼡㼘㼠㼦 博士（㼀㼔㼑㻌㻿㼏㼞㼕㼜㼜㼟㻌㻾㼑㼟㼑㼍㼞㼏㼔㻌㻵㼚㼟㼠㼕㼠㼡㼠㼑）より供与）を蛋白産生用の大腸菌（㻱㻚㻌㼏㼛㼘㼕㻌㻾㼛㼟㼑㼠㼠㼍㻌 （㻺㼛㼢㼍㼓㼑㼚））に導入したもの（㻻㼞㼕㼜㻙㻿㼡㼜）を用いた。そしてタウ遺伝子コンストラクトの特定部位にアンバーコドンを置換するにあたっては、部位特異的変異導入法（㻿㼕㼠㼑㻌 㻰㼕㼞㼑㼏㼠㼑㼐㻌 㻹㼡㼠㼍㼓㼑㼚㼑㼟㼕㼟）を用いた。前述の㼜㻼㻭㻸㻣 にタウ遺伝子を組み込んだものをテンプレートとし、テンプレート 㻜㻚㻡μ㼘、フォワードプライマー㻜㻚㻡㻌 μ㼘、リバースプライ
マー㻜㻚㻡μ㼘、㻼㼞㼕㼙㼑㻿㼀㻭㻾®㻌㻹㼍㼤㻌㻰㻺㻭㻌㻼㼛㼘㼥㼙㼑㼞㼍㼟㼑（タカラバイオ）㻝㻞㻚㻡μ㼘 を混和し、超純水を加え最終 㻞㻡μ㼘 にしたうえで 㻼㻯㻾で増幅した。㻼㻯㻾 プロトコルとしては、㻥㻤℃㻝㻜 秒、㻡㻡℃㻝㻡 秒 㼟㼑㼏㻌 、㻣㻞℃㻡㻜 秒で 㻟㻜 サイクル行い、最終的に 㻠℃で保存した。
どの部位にアンバーコドンを導入するかに関して、つまり蛋白に翻訳したレベルではどの部位に 㼜㻮㼜㼍 を挿入するかに関して、今までクライオ電顕で明らかにされたタウ 㻞 量体形成における接合面部位の配列から選定した 㻟）。今回は 㻭㻰 脳に見いだされる 㻼㻴㻲 の構造からタウの 㻟㻟㻞－㻟㻟㻢 番目の各アミノ酸部位と、㻼㼕㻰 脳に見いだされる 㼣㼕㼐㼑㻌㼒㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㼟㻌 の構造から 㻟㻟㻞－㻟㻟㻢 番目の各アミノ酸部位に対して変異を導入することにし、プライマーを設計した。㻼㻯㻾 で増幅したあとは、㻼㻯㻾㻌 産物に混じっているメチル化された鋳型プラスミドを㻌 消化するために、㻰㼜㼚㻝 処理（㻼㻯㻾 産物に 㻰㼜㼚㻝㻌 （タカラ）㻝μ㼘 を加え、㻌 㻟㻣℃にて㻝 時間反応）を行った。そして、これを大腸菌 㻰㻴㻡α株に形質転換して、抗生物質の入ったアガロースプレートに塗布し、㻟㻣℃でインキュベート（㼛㼢㼑㼞㼚㼕㼓㼔㼠）した。翌日コロニーの出現を確認し、これらを少量培養したうえで、キットを用いて 㼙㼕㼚㼕㼜㼞㼑㼜
作業をおこない（㻼㼘㼍㼟㼙㼕㼐㻌㻹㼕㼚㼕㼜㼞㼑㼜㻌㻷㼕㼠（㻽㻵㻭㻳㻱㻺））、得られたプラスミドの中のタウ遺伝子の配列をシークエンスによって確認した。㻌
㻞）変異挿入型リコンビナントタウ蛋白の作成㻌
出来上がった変異タウ遺伝子コンストラクトについては、通常は終始コドンとして認識されるアンバーコドンに特殊アミノ酸である 㼜㻮㼜㼍 が導入されて翻訳されるために、特殊トランスファー㻾㻺㻭 を組み込まれた大腸菌 㼛㼞㼕㼜㻙㻿㼡㼜 に作成した遺伝子コンストラクトを形質転換した。また、変異導入を行っていない野生型タウ遺伝子コンストラクトについては通常の大腸菌 㻰㻴㻡α株に形質転換した。そして、同様に抗生物質の入ったアガロースプレートに塗布し、㻟㻣℃でインキュベート（㼛㼢㼑㼞㼚㼕㼓㼔㼠）した翌日にコ ロニーの出現を確認し 、こ れらを 㻡㼙㼘 の培地に移し て培養し たう えで、 㻜㻚㻠㼙㻹㻌 の 㻵㻼㼀㻳 （㻵㼟㼛㼜㼞㼛㼜㼥㼘㻌 β 㻙㻰㻙㻝㻙㼠㼔㼕㼛㼓㼍㼘㼍㼏㼠㼛㼜㼥㼞㼍㼚㼛㼟㼕㼐㼑）および 㻜㻚㻡㼙㻹㻌 㼜㻮㼜㼍 の投与により発現を誘導し、添加 㻟 時間後の菌体を遠心により回収し、これに直接 㻿㻰㻿 サンプルバッファーを添加したものをサンプルとして電気泳動（㻿㻰㻿㻙㻼㻭㻳㻱）を行って、一次抗体として抗タウ抗体（㻴㻙㻝㻡㻜）（㻿㼍㼚㼠㼍㻌㻯㼞㼡㼦㻌㻮㼕㼛㼠㼑㼏㼔㼚㼛㼘㼛㼓㼥）および抗 㻴㼕㼟 タグ抗体を用いたウエスタンブロットにより発現確認を行った。㻌
少量培養による発現確認を行った後、菌体を 㻝㻸 の培地にて大量培養を行い、㻵㻼㼀㻳 を添加して 㻟 時間培養の菌体を遠心によって回収し、これを㻙㻤㻜℃に凍結保存した。後日、凍結した菌体にバッファー（㻡㻜㼙㻹㻌 㻴㻱㻼㻱㻿㻙㻺㼍㻻㻴㻌 㼜㻴㻣㻚㻠、㻡㻜㻜㼙㻹㻌㻺㼍㻯㼘、㻞㻜㼙㻹㻌㻵㼙㼕㼐㼍㼦㼛㼘㼑、および㻌 㻝㼙㻹㻌㻰㼀㼀（㻰㼕㼠㼔㼕㼛㼠㼔㼞㼑㼕㼠㼛㼘））を加えて溶解し、氷上にて超音波破砕を行った。そして、サンプ
ルを 㻜㻚㻞㻞㻌 μ㼙㻌 シリンジフィルター㻌 （大阪ケミカル㻌 㻼㻱㻿㻜㻟㻜㻜㻞㻞）に通して不溶性成分を除去したうえで、以下の 㻟 種類のカラムを組み合わせて精製を行った。㻌
①㻌 㻴㼕㼟㼀㼞㼍㼜™㻌 㻴㻼㻌 （㻯㼥㼠㼕㼢㼍）（㻴㼕㼟 タグを利用したアフィニティカラム）㻌
カラムを結合バッファー（㻡㻜㼙㻹㻌 㻴㻱㻼㻱㻿㻙㻺㼍㻻㻴㻌 㼜㻴㻣㻚㻠、㻡㻜㻜㼙㻹㻌 㻺㼍㻯㼘、㻞㻜㼙㻹㻌 㻵㼙㼕㼐㼍㼦㼛㼘㼑）で平衡化しておき、これにサンプ
ルをアプライし、同バッファーを流した後に、溶出バッファー（㻡㻜㼙㻹㻌㻴㻱㻼㻱㻿㻙㻺㼍㻻㻴㻌㼜㻴㻣㻚㻠、㻡㻜㻜㼙㻹㻌㻺㼍㻯㼘、㻡㻜㻜㼙㻹㻌㻵㼙㼕㼐㼍㼦㼛㼘㼑）を流してリコンビナントタウ蛋白質を溶出した。㻌 㻌 㻌 㻌②㻌 㻴㼕㼀㼞㼍㼜™㻌 㻿㻼㻌㻴㻼㻌 （㻯㼥㼠㼕㼢㼍）（陽イオン交換カラム）㻌
カラムを初期バッファー（㻡㻜㼙㻹㻌 㻴㻱㻼㻱㻿㻙㻺㼍㻻㻴㻌 㼜㻴㻣㻚㻠、㻝㻣㻜㼙㻹㻌 㻺㼍㻯㼘）で平衡化しておき、これにサンプルをアプライし、同492022 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書
バッファーを流した後に、溶出バッファー（㻡㻜㼙㻹㻌㻴㻱㻼㻱㻿㻙㻺㼍㻻㻴㻌㼜㻴㻣㻚㻠、㻟㻜㻜㼙㻹㻌㻺㼍㻯㼘）を流してリコンビナントタウ蛋白質を溶出した。㻌
③㻌 㻼㼞㼛㼒㼕㼚㼕㼠㼥㻌㼑㼄㼍㼏㼠™㻌 㻼㼡㼞㼕㼒㼕㼏㼍㼠㼕㼛㼚㻌㻾㼑㼟㼕㼚㻌 （㻮㼕㼛㻙㻾㼍㼐）（㼑㼄㼍㼏㼠 タグを利用したアフィニティカラム）㻌
カラムに 㻼㼞㼛㼒㼕㼚㼕㼠㼥㻌 㼑㼄㼍㼏㼠™㻌 㻼㼡㼞㼕㼒㼕㼏㼍㼠㼕㼛㼚㻌 㻾㼑㼟㼕㼚 を充填し、初期バッファー（㻝㻜㻜㼙㻹㻌 㻿㼛㼐㼕㼡㼙㻌 㼜㼔㼛㼟㼜㼔㼍㼠㼑㻌 㼜㻴㻣㻚㻞）で平衡化しておき、これにサンプルをアプライし、同バッファーを流した後に、溶出バッファー（㻝㻜㻜㼙㻹㻌 㻿㼛㼐㼕㼡㼙㻌 㼜㼔㼛㼟㼜㼔㼍㼠㼑㻌 㼜㻴㻣㻚㻞、㻝㻜㻜㼙㻹㻌㻺㼍㻲）を流してリコンビナントタウ蛋白質を溶出した。㻌
㻟）変異挿入型リコンビナントタウ蛋白を用いた 㻞 量体タウ蛋白の作成㻌
作成した変異タウ蛋白および野生型タウ蛋白を希釈し 㻝㼙㼓㻛㼙㼘 にそろえ、タウ蛋白 㻡㻜μ㼘㻌 とバッファー（㻝㻜㻜㼙㻹㻌 㼀㼞㼕㼟㻙㻴㻯㼘㻌㼜㻴㻣㻚㻠）㻡㻜μ㼘 を 㻼㻯㻾 チューブに入れ混和し、㻟㻣℃にて加温振とう（㼛㼢㼑㼞㼚㼕㼓㼔㼠）してタウ線維形成の基礎となるコンフォーメーションを誘導した。そして、サンプルを氷上に配置し、そこに 㼁㼂 照射機（㻤㻌㼃㻘㻌㻞㻟㻜㻌㼂㻘㻌㻡㻜㻌㻴㼦㻧㻌㼁㼂㻼㻘㻌㼁㼜㼘㼍㼚㼐㻘㻌㻯㻭㻘㻌㼁㻿㻭）を設置して波長 㻟㻢㻡㼚㼙 の 㼁㼂 を 㻟㻜 分間照射した。そのサンプルを 㻿㻰㻿㻙㻼㻭㻳㻱 にて電気泳動し、抗タウ抗体を用いてウエスタンブロットを行って 㻞 量体形成を確認した。㻌
㻌【結  果】㻝）変異挿入型タウ遺伝子の作成㻌
得られたプラスミドの中のタウ遺伝子の配列をシークエンスによって確認し、目的とした部位へのアンバーコドンの変異導入を確認した。㻌
㻞）変異挿入型リコンビナントタウ蛋白の作成㻌
前述の①㻴㼕㼟㼀㼞㼍㼜™㻌㻴㻼、②㻴㼕㼀㼞㼍㼜™㻌 㻿㻼㻌㻴㻼、③㻼㼞㼛㼒㼕㼚㼕㼠㼥㻌㼑㼄㼍㼏㼠™㻌 㻼㼡㼞㼕㼒㼕㼏㼍㼠㼕㼛㼚㻌㻾㼑㼟㼕㼚 を組み合わせることで、純度の高いタウ蛋白を精製・抽出できた。①②の組み合わせでカラムから溶出したサンプルをチューブに 㻡㻜㻜μ㼘㻌 ずつ回収し、その一部を 㻿㻰㻿㻙㻼㻭㻳㻱 で泳動し、㻯㻮㻮（㻯㼛㼛㼙㼍㼟㼟㼕㼑㻌 㻮㼞㼕㼘㼘㼕㼍㼚㼠㻌 㻮㼘㼡㼑）にて染色したものである。他の蛋白成分がおおむね除去されていることが示唆された。㻌
㻟）変異挿入型リコンビナントタウ蛋白を用いた 㻞 量体タウ蛋白の作成㻌抗タウ抗体を用いたウエスタンブロットを行って 㻞 量体形成を確認した。野生型タウ、変異型タウ（㻯㻟㻞㻞→㻭㼙㼎㼑㼞）、変異型タウ（㻿㻟㻞㻠→㻭㼙㼎㼑㼞）を 㻟㻣℃にて加温振とうものと、それぞれに 㼁㼂 照射したものを比較したところ、加温振とうのみでは 㻞 量体形成は明瞭ではないが、これに 㼁㼂 照射を行うと変異型タウ（㻿㻟㻞㻠→㻭㼙㼎㼑㼞）においては 㻞 量体形成したバンドが視認できた。㻌
㻌【考  察】
タウ蛋白凝集体が脳内に異常値蓄積する疾患はタウパチーと呼ばれているが、㻭㻰、㻼㼕㻰、㻯㼀㻱、㻯㻮㻰、㻭㻳㻰、㻼㻿㻼、㻭㻳㻰、㻌㻼㻭㻾㼀、等がタウオパチーに含まれている。タウ遺伝子異常から認知症を発症する 㻲㼀㻰㻼㻙㻝㻣 の発見からタウは神経変性を引き起こす重要なキーファクターであるものと理解されているが 㻠）、単一ではなくさまざまな種類のタウオパチー性疾患が存在する理由は不明である。近年、プリオン性疾患に並んでタウオパチー性疾患におけるタウ蛋白の伝播仮説が提唱されてきた㻡）。この仮説において、凝集したタウ蛋白は神経細胞から他の神経細胞へ伝播し、長い期間を経て脳全体に拡散していくことが唱えられている。㻿㼍㼚㼐㼑㼞㼟 らは、㼕㼚㻌 㼢㼕㼠㼞㼛 で重合したリコンビナントタウ蛋白を超音波破砕後に限界希釈を行って重合の基礎となる重合シードを作成したところ、生化学的特性の異なる複数のタウ蛋白重合シーズを作成することに成功した 㻢）。この
タウ蛋白重合シーズはタウ発現培養細胞に導入した場合は同じ生化学的特性を有するタウ重合体が複製され、これをタウ発現マウス脳内に摂取した場合も同じ生化学的特性を有するタウ重合体が複製された。また、さまざまなタウオパチー性疾患から抽出したタウ凝集体をタウ発現細胞に導入すると、細胞内におけるタウ凝集体の分布パターンが異なることから、疾患ごとに異なるタウ凝集体の生化学的特性があることが考えられた。そして、この実験結果からは、さまざまなタウオパチー性疾患におけるタウ凝集体の構造は疾患ごとに異なっており、そのためその生化学的特性が異なるのではないかという考え方が示唆された。実際、以前より 㻭㻰 脳内で観察される神経原線維変化は微小形態としては 㻼㻴㻲 であり、㻼㻿㻼 脳内で観察されるタウ線維は 㻿㻲 という形態をとっていることが知られていた。但し通常の電子顕微鏡ではタウ凝集体の線維構造の概観は観察

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先進医薬研究振興財団

2023 年度

研究成果報告集

2022 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書
できても、㻝 つ 㻝 つのタウ蛋白分子の配合の仕方は観察することはできないため、構造の詳細な理解は困難であった。近年
クライオ電子顕微鏡法が開発されたが、これは生体試料をその溶液ごと急速凍結して非晶質の氷の中に埋め込む氷包埋法を用いて生体資料を高真空の電子線から守って撮像し、また同種のタンパク質の多数の投影像から立体構造を再構築する単粒子解析法を組み合わせることで、生体蛋白の構造を詳細に解析する方法である。この方法を用いてタウ凝集体の解析が進み、まず 㻲㼕㼠㼦㼜㼍㼠㼞㼕㼏㼗㻌 らにより 㻼㻴㻲 と 㻿㻲 の構造が明らかにされた 㻣）。そして、㻼㼕㻰、㻯㼀㻱、㻯㻮㻰 におけるタウ凝集体の構造が明らかにされ 㻤－㻝０）、現在ではタウ凝集体は少なくとも 㻤 種類のパターンに類型化されている 㻝）。よって、さまざまなタウオパチー性疾患には、それぞれに特徴的なタウ凝集体の構造があることが明確になりつつある 㻝㻝）。本研究では、このような流れで明らかにされたタウ凝集体の構造をもとに、リコンビナントタウ蛋白を用いて同型のモデルを作成することを計画した。タ
ウ凝集体の個別の構造モデルを作成すれば、疾患別にタウ蛋白重合のプロセスをより詳細に解析することができ、診断法・治療法の開発に貢献できると考えられるからである。そこで、まず凝集体の最小単位である 㻞 量体を作成することにした。㻞
つの蛋白を架橋する方法に関してはフォトクロスリンキング法を使用した。光反応性の特殊アミノ酸である 㼜㻮㼜㼍 をタウ蛋白の特定の部位に挿入するために、通常では終止コドンになっているアンバーコドンに対応して特殊アミノ酸を翻訳中の蛋白に取り入れる技法を使用した 㻝㻞）。そのため、アンバーコドンに 㼜㻮㼜㼍 を挿入する特殊トランスファー㻾㻺㻭 を発現するベクターを組み込んだ大腸菌 㼛㼞㼕㼜㻙㻿㼡㼜 を使用した 㻞）。このような特殊アミノ酸を組み込むとリコンビナント蛋白の収量は通常のリコンビナント蛋白の収量に比べて 㻝㻛㻟 から 㻝㻛㻡 に減じてしまう。そこで、大腸菌の収量を上げるためにコドン最適化法を使用した。
これによって、今回変異タウ蛋白は数 㼙㼓 レベルで抽出することができ、さらに複数のカラムで抽出したことにより純度の高いタウ蛋白が抽出できた。そして、㼁㼂 によるクロスリンクの結果としては 㻯㻟㻞㻞㻌 部位の変異では 㻞 量体が確認できなかったが、㻿㻟㻞㻠㻌 部位の変異では 㻞 量体が確認できた。クロスリンクにより単量体から 㻞 量体に変化したわけだが、この方法では 㻞 量体を形成できるのはせいぜい 㻝㻜％程度とされているので、全てが 㻞 量体に移行するわけではない。また、このクロスリンク法においては、光反応性のアミノ酸と反応してクロスリンクするためには対応するアミノ酸が数オングストロームまで近接している必要があることから、偶発的な結合ではなく複合体の形成が無いと起こりにくいものと想定される。よって、㻿㻟㻞㻠㻌 部位の変異で確認できた 㻞 量体は 㻼㼕㻰 脳に見いだされる 㼣㼕㼐㼑㻌㼒㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㼟㻌 の構造に由来するものではないかと推認できる。しかし、これを検証するためには、この 㻞 量体をシーズとしてさらに線維重合を誘導し、この形態を確認する必要がある。㻯㻟㻞㻞㻌 部位の変異では 㼁㼂 照射しても 㻞 量体形成が今回確認できなかったが、明確な理由は不明であるが、この方法論では光反応性アミノ酸である 㼜㻮㼜㼍 の反応基が相手の蛋白側に配向している必要があり、配向性が悪い場合は位置的に近接していても共有結合を引き起こせない可能性が考えられる。今回の研究では、タウ蛋白重合体の基礎となる 㻞 量体を純度の高いリコンビナント蛋白を用いて人工的に作成することを試みたが、接合面に位置するアミノ酸を光反応性アミノ酸に置換しても、おそらく配向性の問題から 㻞 量体形成ができる場合とできない場合があることが理解できた。前述のようにタウオパチーには様々な疾患が含まれており、それぞれの構造解明が進んでいることから、本研究の方法を用いて疾患別の 㻞 量体を作成し、それを重合・線維形成させることによって病態脳に由来しない単一の微小形態のタウ重合体を作成すれば、今後の診断法・治療法の開発に大きく貢献するものと考えられる。㻌
㻌【臨床的意義・臨床への貢献度】
本研究は、タウオパチーと称される様々な神経変性疾患におけるタウ蛋白の超微形態が異なっているということを前提に、タウ分子間の接合面に考慮したうえでその基本構造となる 㻞 量体を作成した。ここからさらに重合プロセスを進めることにより、オリゴマー、プロトフィブリル、フィブリルへと進めることが可能と考えられるが、単一の超微形態のタウオリゴマーあるいはタウプロトフィブリルを疾患ごとにそろえれば、これに対する特異抗体を作成してこれを診断法および治療法へ応用する、あるいは線維延長を阻害する重合阻害剤を検討して疾患特異的治療薬を開発する、などの臨床への貢献が期待できる。㻌
㻌【参考・引用文献】
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2022 年度 精神薬療分野 一般研究助成 研究成果報告書㻺㼍㼠㼡㼞㼑㻚㻌㻡㻥㻤㻔㻣㻤㻤㻜㻕㻦㻟㻡㻥㻙㻟㻢㻟㻘㻞㻜㻞㻝㻚㻌㻞㻕 Fukumori A, Steiner H. Substrate recruitment of γ㻙㼟㼑㼏㼞㼑㼠㼍㼟㼑㻌㼍㼚㼐㻌㼙㼑㼏㼔㼍㼚㼕㼟㼙㻌㼛㼒㻌㼏㼘㼕㼚㼕㼏㼍㼘㻌㼜㼞㼑㼟㼑㼚㼕㼘㼕㼚㻌㼙㼡㼠㼍㼠㼕㼛㼚㼟㻌㼞㼑㼢㼑㼍㼘㼑㼐㻌㼎㼥㻌㼜㼔㼛㼠㼛㼍㼒㼒㼕㼚㼕㼠㼥㻌㼙㼍㼜㼜㼕㼚㼓㻚㻌 㻌 㻱㻹㻮㻻㻌㻶㻚㻌㻟㻡㻔㻝㻡㻕㻦㻝㻢㻞㻤㻙㻝㻢㻠㻟㻘㻞㻜㻝㻢㻚㻌 㻌㻟㻕 㻿㼏㼔㼑㼞㼑㼟㻌㻿㻴㻘㻌㼆㼔㼍㼚㼓㻌㼃㻘㻌㻲㼍㼘㼏㼛㼚㻌㻮㻘㻌㻳㼛㼑㼐㼑㼞㼠㻌㻹㻚㻌 㻌 㻯㼞㼥㼛㻙㻱㻹㻌㼟㼠㼞㼡㼏㼠㼡㼞㼑㼟㻌㼛㼒㻌㼠㼍㼡㻌㼒㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㼟㻚㻌 㻌 㻯㼡㼞㼞㻌㻻㼜㼕㼚㻌㻿㼠㼞㼡㼏㼠㻌㻮㼕㼛㼘㻚㻌㻢㻠㻦㻝㻣㻙㻞㻡㻘㻞㻜㻞㻜㻚㻌 㻌㻠㻕 㻴㼡㼠㼠㼛㼚㻌㻹㻘㻌㻸㼑㼚㼐㼛㼚㻌㻯㻸㻘㻌㻾㼕㼦㼦㼡㻌㻼㻘㻌㻮㼍㼗㼑㼞㻌㻹㻘㻌㻲㼞㼛㼑㼘㼕㼏㼔㻌㻿㻘㻌㻴㼛㼡㼘㼐㼑㼚㻌㻴㻘㻌㻼㼕㼏㼗㼑㼞㼕㼚㼓㻙㻮㼞㼛㼣㼚㻌㻿㻘㻌㻯㼔㼍㼗㼞㼍㼢㼑㼞㼠㼥㻌㻿㻘㻌㻵㼟㼍㼍㼏㼟㻌㻭㻘㻌㻳㼞㼛㼢㼑㼞㻌㻭㻘㻌㻴㼍㼏㼗㼑㼠㼠㻌㻶㻘㻌㻭㼐㼍㼙㼟㼛㼚㻌㻶㻘㻌㻸㼕㼚㼏㼛㼘㼚㻌㻿㻘㻌㻰㼕㼏㼗㼟㼛㼚㻌㻰㻘㻌㻰㼍㼢㼕㼑㼟㻌㻼㻘㻌㻼㼑㼠㼑㼞㼟㼑㼚㻌㻾㻯㻘㻌㻿㼠㼑㼢㼑㼚㼟㻌㻹㻘㻌㼐㼑㻌㻳㼞㼍㼍㼒㼒㻌㻱㻘㻌㼃㼍㼡㼠㼑㼞㼟㻌㻱㻘㻌㼢㼍㼚㻌㻮㼍㼞㼑㼚㻌㻶㻘㻌㻴㼕㼘㼘㼑㼎㼞㼍㼚㼐㻌㻹㻘㻌㻶㼛㼛㼟㼟㼑㻌㻹㻘㻌㻷㼣㼛㼚㻌㻶㻹㻘㻌㻺㼛㼣㼛㼠㼚㼥㻌㻼㻘㻌㻯㼔㼑㻌㻸㻷㻘㻌㻺㼛㼞㼠㼛㼚㻌㻶㻘㻌㻹㼛㼞㼞㼕㼟㻌㻶㻯㻘㻌㻾㼑㼑㼐㻌㻸㻭㻘㻌㼀㼞㼛㼖㼍㼚㼛㼣㼟㼗㼕㻌㻶㻘㻌㻮㼍㼟㼡㼚㻌㻴㻘㻌㻸㼍㼚㼚㼒㼑㼘㼠㻌㻸㻘㻌㻺㼑㼥㼟㼠㼍㼠㻌㻹㻘㻌㻲㼍㼔㼚㻌㻿㻘㻌㻰㼍㼞㼗㻌㻲㻘㻌㼀㼍㼚㼚㼑㼚㼎㼑㼞㼓㻌㼀㻘㻌㻰㼛㼐㼐㻌㻼㻾㻘㻌㻴㼍㼥㼣㼍㼞㼐㻌㻺㻘㻌㻷㼣㼛㼗㻌㻶㻮㻘㻌㻿㼏㼔㼛㼒㼕㼑㼘㼐㻌㻼㻾㻘㻌㻭㼚㼐㼞㼑㼍㼐㼕㼟㻌㻭㻘㻌㻿㼚㼛㼣㼐㼑㼚㻌㻶㻘㻌㻯㼞㼍㼡㼒㼡㼞㼐㻌㻰㻘㻌㻺㼑㼍㼞㼥㻌㻰㻘㻌㻻㼣㼑㼚㻌㻲㻘㻌㻻㼛㼟㼠㼞㼍㻌㻮㻭㻘㻌㻴㼍㼞㼐㼥㻌㻶㻘㻌㻳㼛㼍㼠㼑㻌㻭㻘㻌㼢㼍㼚㻌㻿㼣㼕㼑㼠㼑㼚㻌㻶㻘㻌㻹㼍㼚㼚㻌㻰㻘㻌㻸㼥㼚㼏㼔㻌㼀㻘㻌㻴㼑㼡㼠㼕㼚㼗㻌㻼㻚㻌 㻌㻭㼟㼟㼛㼏㼕㼍㼠㼕㼛㼚㻌 㼛㼒㻌 㼙㼕㼟㼟㼑㼚㼟㼑㻌 㼍㼚㼐㻌 㻡㻓㻙㼟㼜㼘㼕㼏㼑㻙㼟㼕㼠㼑㻌 㼙㼡㼠㼍㼠㼕㼛㼚㼟㻌 㼕㼚㻌 㼠㼍㼡㻌 㼣㼕㼠㼔㻌 㼠㼔㼑㻌 㼕㼚㼔㼑㼞㼕㼠㼑㼐㻌 㼐㼑㼙㼑㼚㼠㼕㼍㻌 㻲㼀㻰㻼㻙㻝㻣㻚㻌 㻌 㻺㼍㼠㼡㼞㼑㻚㻌㻟㻥㻟㻔㻢㻢㻤㻢㻕㻦㻣㻜㻞㻙㻣㻜㻡㻘㻝㻥㻥㻤㻚㻌㻡㻕 㻳㼛㼑㼐㼑㼞㼠㻌㻹㻘㻌㻱㼕㼟㼑㼚㼎㼑㼞㼓㻌㻰㻿㻘㻌㻯㼞㼛㼣㼠㼔㼑㼞㻌㻾㻭㻚㻌 㻌 㻼㼞㼛㼜㼍㼓㼍㼠㼕㼛㼚㻌㼛㼒㻌㼀㼍㼡㻌㻭㼓㼓㼞㼑㼓㼍㼠㼑㼟㻌㼍㼚㼐㻌㻺㼑㼡㼞㼛㼐㼑㼓㼑㼚㼑㼞㼍㼠㼕㼛㼚㻚㻌 㻌 㻭㼚㼚㼡㻌㻾㼑㼢㻌㻺㼑㼡㼞㼛㼟㼏㼕㻚㻌㻠㻜㻦㻝㻤㻥㻙㻞㻝㻜㻘㻞㻜㻝㻣㻚㻌㻢㻕 㻿㼍㼚㼐㼑㼞㼟㻌㻰㼃㻘㻌㻷㼍㼡㼒㼙㼍㼚㻌㻿㻷㻘㻌㻰㼑㼂㼛㼟㻌㻿㻸㻘㻌㻿㼔㼍㼞㼙㼍㻌㻭㻹㻘㻌㻹㼕㼞㼎㼍㼔㼍㻌㻴㻘㻌㻸㼕㻌㻭㻘㻌㻮㼍㼞㼗㼑㼞㻌㻿㻶㻘㻌㻲㼛㼘㼑㼥㻌㻭㻯㻘㻌㼀㼔㼛㼞㼜㼑㻌㻶㻾㻘㻌㻿㼑㼞㼜㼑㼘㼘㻌㻸㻯㻘㻌㻹㼕㼘㼘㼑㼞㻌㼀㻹㻘㻌㻳㼞㼕㼚㼎㼑㼞㼓㻌㻸㼀㻘㻌㻿㼑㼑㼘㼑㼥㻌㼃㼃㻘㻌㻰㼕㼍㼙㼛㼚㼐㻌㻹㻵㻚㻌 㻌 㻰㼕㼟㼠㼕㼚㼏㼠㻌㼠㼍㼡㻌㼜㼞㼕㼛㼚㻌㼟㼠㼞㼍㼕㼚㼟㻌㼜㼞㼛㼜㼍㼓㼍㼠㼑㻌㼕㼚㻌㼏㼑㼘㼘㼟㻌㼍㼚㼐㻌㼙㼕㼏㼑㻌㼍㼚㼐㻌㼐㼑㼒㼕㼚㼑㻌㼐㼕㼒㼒㼑㼞㼑㼚㼠㻌㼠㼍㼡㼛㼜㼍㼠㼔㼕㼑㼟㻚㻌 㻌 㻺㼑㼡㼞㼛㼚㻚㻌 㻌 㻤㻞㻔㻢㻕㻦㻝㻞㻣㻝㻙㻤㻤㻘㻞㻜㻝㻠㻚㻌 㻌 㻌㻣㻕 㻲㼕㼠㼦㼜㼍㼠㼞㼕㼏㼗㻌㻭㼃㻼㻘㻌㻲㼍㼘㼏㼛㼚㻌㻮㻘㻌㻴㼑㻌㻿㻘㻌㻹㼡㼞㼦㼕㼚㻌㻭㻳㻘㻌㻹㼡㼞㼟㼔㼡㼐㼛㼢㻌㻳㻘㻌㻳㼍㼞㼞㼕㼚㼓㼑㼞㻌㻴㻶㻘㻌㻯㼞㼛㼣㼠㼔㼑㼞㻌㻾㻭㻘㻌㻳㼔㼑㼠㼠㼕㻌㻮㻘㻌㻳㼛㼑㼐㼑㼞㼠㻌㻹㻘㻌㻿㼏㼔㼑㼞㼑㼟㻌㻿㻴㼃㻚㻌 㻌 㻯㼞㼥㼛㻙㻱㻹㻌㼟㼠㼞㼡㼏tures of Tau filaments from Alzheimer’s disease brain. Nature. 2017 547(7662):185–㻝㻥㻜㻘㻞㻜㻝㻣㻚㻌㻤㻕 㻲㼍㼘㼏㼛㼚㻌㻮㻘㻌㼆㼔㼍㼚㼓㻌㼃㻘㻌㻹㼡㼞㼦㼕㼚㻌㻭㻳㻘㻌㻹㼡㼞㼟㼔㼡㼐㼛㼢㻌㻳㻘㻌㻳㼍㼞㼞㼕㼚㼓㼑㼞㻌㻴㻶㻘㻌㼂㼕㼐㼍㼘㻌㻾㻘㻌㻯㼞㼛㼣㼠㼔㼑㼞㻌㻾㻭㻘㻌㻳㼔㼑㼠㼠㼕㻌㻮㻘㻌㻿㼏㼔㼑㼞㼑㼟㻌㻿㻴㼃㻘㻌㻳㼛㼑㼐㼑㼞㼠㻌
M. Structures of filaments from Pick’s disease revea㼘㻌㼍㻌㼚㼛㼢㼑㼘㻌㼠㼍㼡㻌㼜㼞㼛㼠㼑㼕㼚㻌㼒㼛㼘㼐㻚㻌 㻌 㻺㼍㼠㼡㼞㼑㻚㻌㻡㻢㻝㻔㻣㻣㻞㻝㻕㻦㻝㻟㻣–㻝㻠㻜㻘㻞㻜㻝㻤㻚㻌㻥㻕 㻲㼍㼘㼏㼛㼚㻌㻮㻘㻌㼆㼕㼢㼍㼚㼛㼢㻌㻶㻘㻌㼆㼔㼍㼚㼓㻌㼃㻘㻌㻹㼡㼞㼦㼕㼚㻌㻭㻳㻘㻌㻳㼍㼞㼞㼕㼚㼓㼑㼞㻌㻴㻶㻘㻌㼂㼕㼐㼍㼘㻌㻾㻘㻌㻯㼞㼛㼣㼠㼔㼑㼞㻌㻾㻭㻘㻌㻺㼑㼣㼑㼘㼘㻌㻷㻸㻘㻌㻳㼔㼑㼠㼠㼕㻌㻮㻘㻌㻳㼛㼑㼐㼑㼞㼠㻌㻹㻘㻌㻿㼏㼔㼑㼞㼑㼟㻌㻿㻴㼃㻚㻌 㻌 㻺㼛㼢㼑㼘㻌㼠㼍㼡㻌㼒㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㻌㼒㼛㼘㼐㻌㼕㼚㻌㼏㼔㼞㼛㼚㼕㼏㻌㼠㼞㼍㼡㼙㼍㼠㼕㼏㻌㼑㼚㼏㼑㼜㼔㼍㼘㼛㼜㼍㼠㼔㼥㻌㼑㼚㼏㼘㼛㼟㼑㼟㻌㼔㼥㼐㼞㼛㼜㼔㼛㼎㼕㼏㻌㼙㼛㼘㼑㼏㼡㼘㼑㼟㻚㻌 㻌 㻺㼍㼠㼡㼞㼑㻚㻌㻡㻢㻤㻔㻣㻣㻡㻞㻕㻦㻌㻠㻞㻜–㻠㻞㻟㻘㻞㻜㻝㻥㻚㻌 㻌㻝㻜㻕 㼆㼔㼍㼚㼓㻌㼃㻘㻌㼀㼍㼞㼡㼠㼍㼚㼕㻌㻭㻘㻌㻺㼑㼣㼑㼘㼘㻌㻷㻸㻘㻌㻹㼡㼞㼦㼕㼚㻌㻭㻳㻘㻌㻹㼍㼠㼟㼡㼎㼍㼞㼍㻌㼀㻘㻌㻲㼍㼘㼏㼛㼚㻌㻮㻘㻌㼂㼕㼐㼍㼘㻌㻾㻘㻌㻳㼍㼞㼞㼕㼚㼓㼑㼞㻌㻴㻶㻘㻌㻿㼔㼕㻌㼅㻘㻌㻵㼗㼑㼡㼏㼔㼕㻌㼀㻘㻌㻹㼡㼞㼍㼥㼍㼙㼍㻌㻿㻘㻌㻳㼔㼑㼠㼠㼕㻌㻮㻘㻌㻴㼍㼟㼑㼓㼍㼣㼍㻌㻹㻘㻌㻳㼛㼑㼐㼑㼞㼠㻌㻹㻘㻌㻿㼏㼔㼑㼞㼑㼟㻌㻿㻴㼃㻚㻌 㻌 㻺㼛㼢㼑㼘㻌㼠㼍㼡㻌㼒㼕㼘㼍㼙㼑㼚㼠㻌㼒㼛㼘㼐㻌㼕㼚㻌㼏㼛㼞㼠㼕㼏㼛㼎㼍㼟㼍㼘㻌㼐㼑㼓㼑㼚㼑㼞㼍㼠㼕㼛㼚㻚㻌 㻌 㻺㼍㼠㼡㼞㼑㻚㻌㻡㻤㻜㻔㻣㻤㻜㻞㻕㻦㻞㻤㻟㻙㻞㻤㻣㻘㻞㻜㻞㻜㻚㻌㻝㻝㻕 㼂㼍㼝㼡㼑㼞㻙㻭㼘㼕㼏㼑㼍㻌㻶㻘㻌㻰㼕㼍㼙㼛㼚㼐㻌㻹㻵㻘㻌㻶㼛㼍㼏㼔㼕㼙㼕㼍㼗㻌㻸㻭㻚㻌 㻌 㼀㼍㼡㻌㼟㼠㼞㼍㼕㼚㼟㻌㼟㼔㼍㼜㼑㻌㼐㼕㼟㼑㼍㼟㼑㻚㻌 㻌 㻭㼏㼠㼍㻌㻺㼑㼡㼞㼛㼜㼍㼠㼔㼛㼘㻚㻌㻝㻠㻞㻔㻝㻕㻦㻡㻣㻙㻣㻝㻘㻞㻜㻞㻝㻚㻌㻝㻞㻕 㻾㼥㼡㻌㼅㻘㻌㻿㼏㼔㼡㼘㼠㼦㻌㻼㻳㻚㻌 㻌 㻱㼒㼒㼕㼏㼕㼑㼚㼠㻌㼕㼚㼏㼛㼞㼜㼛㼞㼍㼠㼕㼛㼚㻌㼛㼒㻌㼡㼚㼚㼍㼠㼡㼞㼍㼘㻌㼍㼙㼕㼚㼛㻌㼍㼏㼕㼐㼟㻌㼕㼚㼠㼛㻌㼜㼞㼛㼠㼑㼕㼚㼟㻌㼕㼚㻌㻱㼟㼏㼔㼑㼞㼕㼏㼔㼕㼍㻌㼏㼛㼘㼕㻚㻌 㻌 㻺㼍㼠㻌㻹㼑㼠㼔㼛㼐㼟㻚㻌 㻌㻟㻔㻠㻕㻦㻞㻢㻟㻙㻞㻢㻡㻘㻞㻜㻜㻢㻚㻌52

先進医薬研究振興財団

2023 年度

研究成果報告集