第 16 回腸内細菌学会

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一般演題 A–7

Lactobacillus GG 発酵乳の炎症性腸疾患に対する作用の検討
Potent Effects of Fermented Milk Containing Lactobacillus GG
on Inflammatory Bowel Disease○依田一豊 1，何1

方 1，宮澤賢司 1，川瀬学 1，久保田晃 1，平松

優 1，Fang Yan2

タカナシ乳業株式会社・商品研究所，2Vanderbilt 大・医【目的】近年，日本でも炎症性腸疾患（IBD）と総称される潰瘍性大腸炎やクローン病が増加している．
この疾患では，炎症性サイトカインの産生増加，上皮細胞のアポトーシス，免疫細胞の浸潤によって，腸管上皮細胞の完全性が損なわれる．Lactobacillus GG（LGG 菌）は，その培養上清中に腸管上皮の損傷やアポトーシスを抑制する機能性タンパク質を分泌することが報告されている．そこで，食品の摂取による IBD の予防や症状軽減効果の可能性を模索するために，LGG 菌を含む発酵乳（LGG 菌発酵乳）を用いた試験を実施した．
【方法】雌 C57BL/6 マウスに LGG 菌発酵乳を 10 日間経口投与した．投与 6 日目より飲水中に DSS を加え大腸炎を誘導した．試験期間終了後にマウスから大腸を取り出し，炎症の度合い（炎症スコア）および長さを観察した．一方，培養細胞を用いた試験では LGG 菌発酵乳の遠心上清を用いた．マウス結腸上皮細胞に遠心上清を添加し TNF-α およびシクロヘキサミドでアポトーシスを誘導し，フローサイトメトリーおよび TUNEL 染色を行った．また，遠心上清を添加したマウスおよびヒト結腸上皮細胞に，過酸化水素を加えタイトジャンクションの破壊を誘導したのち，抗 ZO-1 抗体を用いた免疫染色法にて細胞のZO-1 の局在を蛍光顕微鏡にて観察した．さらに遠心上清を添加したマウス結腸上皮細胞の細胞溶解液を，抗リン酸化 Akt 抗体もしくは抗リン酸化 EGF 受容体-Tyr1069 抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った．
【結果】LGG 菌発酵乳を投与した DSS 誘導大腸炎マウスでは，非投与群のマウスと比較して腸管上皮のダメージが軽減され，炎症スコアが有意に低下した．また，結腸の長さも正常マウスと違いが見られなかった．LGG 菌発酵乳を添加した結腸上皮細胞では，アポトーシスおよびタイトジャンクションの破壊が抑制され，さらに EGF 受容体が用量依存的に活性化された．
【考察】LGG 菌発酵乳の経口投与が，マウスの DSS 誘導大腸炎に予防効果を示した．また，その予防効
果は，LGG 菌発酵乳が EGF 受容体に間接的に作用し，宿主の腸管上皮細胞をダメージやアポトーシスから保護することによるものだと考えられた．

一般演題

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腸内細菌学雑誌

26 巻 2 号

2012

一般演題 A–8

Lactobacillus gasseri SBT2055 による腸管での IgA 産生誘導とその機構解明
Mechanisms for the Augmentation of IgA Productionin the Mouse Intestine by Lactobacillus gasseri SBT2055○浮辺健 1，細谷知広 1, 2，小川哲弘 1，大町愛子 1，門岡幸男 1，塩崎拓也 2，中山洋祐 2，酒井史彦 1, 2，宮崎忠昭 2

1

雪印メグミルク株式会社，2 北海道大学遺伝子病制御研究所【目的】プロバイオティクス乳酸菌である Lactobacillus gasseri SBT2055（ガセリ菌 SP 株）の経口投与
は，ウイルス感染に対し予防効果を有することから生体防御機能を高めることが示唆されている．これら生体防御機構の最前線である粘膜組織では，IgA 抗体が病原体排除に重要な役割を担っている．そこで，本研究ではガセリ菌 SP 株による腸管での IgA 産生誘導作用とその機構について解析した．
【方法】（1）7 週齢 Balb/c 雄マウスに，ガセリ菌 SP 株を 0.35 ％（w/w）含む餌（SP 群），または無添加餌（対照群）を 5 週間毎日摂取させ，小腸組織中の IgA 量，IgA 陽性細胞の割合，および各種遺伝子発現量を測定した．（2）Balb/c 雄マウスのパイエル板由来 CD11c 陽性細胞と脾細胞由来 IgM 陽性細胞との共培養系にガセリ菌 SP 株を添加し，培養上清中の IgA 量を測定した．
【結果・考察】（1）小腸組織中の IgA 量と，小腸のパイエル板細胞および粘膜固有層細胞における IgA 陽性細胞の割合は，SP 群では対照群よりも有意に高い値を示した．また，SP 群では小腸組織の APRIL とRALDH2 の遺伝子発現量が対照群よりも高いことが明らかとなった．（2）CD11c 陽性細胞と IgM 陽性細胞との共培養系にガセリ菌 SP 株を添加した結果，培養上清中の IgA 量は無添加の場合に比べ顕著に増加することが認められた．これまでに腸管に存在する樹状細胞（CD11c 陽性細胞）は，APRIL や RALDH2の発現を介して IgA 産生を制御することが知られている．これらのことから，ガセリ菌 SP 株は腸管の樹状細胞に作用し，APRIL や RALDH2 の発現を制御することにより IgA 産生を誘導し，生体防御機能を高めている可能性が示唆された．

第 16 回腸内細菌学会

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一般演題 A–95 種類の Lactobacillus 属乳酸菌由来ゲノム DNA の抗炎症作用機構に関する研究
Study on Anti-inflammatory Effect of Genomic DNA
from Five Different Lactobacilli○平松征洋 1，佐藤朝光 1，入江圭一 2，椎村翔太 1，中島幸彦 1，見明史雄 1，鹿志毛信広 1
1

福岡大学薬学部微生物薬品化学教室，2 福岡大学薬学部臨床疾患薬理学教室【目的】多くの研究者が乳酸菌の抗炎症作用について報告しているが，その有効成分に関する研究は十分に行われていない．我々は，乳酸菌に含まれる有効成分として，乳酸菌ゲノム DNA に注目した．本研究では，H2O2 を用いてヒト腸管上皮由来 Caco-2 細胞に炎症を誘発させ，炎症の指標である IL-8 の遊離量を測定することで，乳酸菌ゲノム DNA が抗炎症作用を持つかどうかを調べた．さらに，小胞体やエンドリソソームに分布し，細菌の DNA を特異的に認識する受容体 Toll-like receptor 9（TLR9）と炎症性サイトカインなどの発現を誘発する転写因子 NF-κB および IκB-α との関連性を検討し，抗炎症作用機構の解明を試みた．
【方 法 】Caco-2 細 胞 に H2O2 と 5 種 類 の Lactobacillus 属 乳 酸 菌 （L. acidophilus, L. casei, L. gasseri,L. plantarum, L. reuteri）および大腸菌から抽出したゲノム DNA を曝露し，培養上清中への IL-8 遊離量を ELISA で測定した．さらに，作用機構を解明するために，以下の項目を行った．1）各種乳酸菌の16s rRNA 遺伝子に対する PCR 法により，乳酸菌ゲノム DNA の Caco-2 細胞内への侵入を確認した．
2）RNAi 法により TLR9 の発現を抑制した Caco-2 細胞を用いて，乳酸菌ゲノム DNA の IL-8 遊離抑制作用を評価した．3）H2O2 と乳酸菌ゲノム DNA を曝露した Caco-2 細胞から，時間依存的に細胞質と核を分画し，NF-κB の核内移行および IκB-α の分解を Western Blot で解析した．
【結果・考察】すべての乳酸菌ゲノム DNA は，Caco-2 細胞において H2O 2 により誘発された IL-8 の遊離を抑制することを明らかにした．しかし，大腸菌ゲノム DNA にこの作用は観察されなかった．また，作用機構を検討した結果，1）H2O2 の存在下で，乳酸菌ゲノム DNA が Caco-2 細胞内に侵入すること，
2）TLR9 の発現を抑制した Caco-2 細胞では，乳酸菌ゲノム DNA の IL-8 遊離抑制作用が減少すること，
3）乳酸菌ゲノム DNA は，H2O2 を曝露した Caco-2 細胞において NF-κB の核内移行および IκB-α の分解を抑制すること，さらに，この作用は TLR9 シグナルに依存していることを明らかにした．これらの結果は，乳酸菌ゲノム DNA が細胞内へ侵入後，TLR9 シグナルを介して，NF-κB の核内移行・ IκB-α の分解を抑制することで，H2O2 により誘発される IL-8 の遊離を抑制することを示している．

一般
演題

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腸内細菌学雑誌

26 巻 2 号

2012

一般演題 A–10

Bifidobacterium bifidum G9-1（BBG9-1）の経口投与がマウス腸管免疫に及ぼす影響
Effects of Oral Administration of Bifidobacterium bifidum G9-1 (BBG9-1)
on Mucosal Immunity in Mice
○川原知浩，常峰ビオフェルミン製薬株式会社

智神戸研究所【目的】これまでに我々は，アレルギーモデル動物に対して Bifidobacterium bifidum G9-1（BBG9-1）の経口投与が，血清中 IgE 産生量の抑制およびアレルギー症状の改善効果を示すことを報告しており，BBG9-1 の経口投与が免疫系に影響を及ぼすことが推測されている．
本報告では，抗原による感作や惹起処置を施さない無処置のマウスに BBG9-1 を経口投与した場合，その腸管免疫系にどのような影響を及ぼすか検討した．
【方法】5 週齢の雄性 BALB/c マウスに BBG9-1 を 0.5 または 5.0 mg/animal/day で 7 日間連続経口投与した．1 週間後，各群のパイエル板細胞を調製し，BBG9-1 熱処理菌体（50 µg/ml）を添加して 3–7 日間培養した．培養終了後，培養上清を回収しパイエル板細胞からのサイトカイン産生量（IFN-γ）および抗体産生量（total IgA）を ELISA 法にて測定した．
【結果】各群のパイエル板細胞からのサイトカインおよび抗体産生量を検討した結果，対照群に比してBBG9-1 0.5 mg および 5.0 mg 投与群で，投与濃度依存的に IFN-γ および IgA 産生量が増加した．さらに，各群のパイエル板細胞を BBG9-1 熱処理菌体と共に培養すると IFN-γ および IgA 産生量共に増加するが，特に BBG9-1 5.0 mg 投与群においては IFN-γ 産生が強力に誘導された．
【考察】BBG9-1 の経口投与は，パイエル板細胞の免疫機能を亢進し，サイトカインおよび抗体産生能を増強することが示された．さらに，BBG9-1 投与群のパイエル板細胞を BBG9-1 熱処理菌体と共に培養すると強力にサイトカイン産生を誘導することから，BBG9-1 の反復投与は腸管の BBG9-1 菌体に対する反応性を向上させる可能性が示唆された．すなわち，BBG9-1 の経口投与による免疫調節作用は，単回よりも反復投与の方がより効果的であると考えられる．

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一般演題 A–11Bifidobacterium longum JBL05 産生多糖の構造とアレルギーモデルマウスへの経口投与効果
Structure of Extra-cellular Polysaccharide Produced by Bifidobacterium
longum JBL05 and Oral Administration Effect on Allergy-model Mouse○河野麻実子 1，庄條愛子 2，松本卓也 2，橋本賀世子 2，小崎敏雄 1，北村進一 21

森下仁丹株式会社 研究開発本部，2 大阪府立大学 生命環境科学研究科【目的】Bifidobacterium longum JBL05 が産生する菌体外多糖（BPS）は，ガラクトース，グルコース，ラムノースおよびピルビン酸が結合した 7 糖の繰り返し構造からなることが明らかとなっている 1）．これまでに，B. longum JBL05 または BPS を経口投与することにより，耳介に誘発したアレルギー様皮膚炎を抑制することを，本学会にて報告した 2）．本研究では，この多糖の構造特徴と皮膚炎抑制作用との関係を明らかにすることを目的とした．
【方法】BALB/c マウスの右耳介に 2,4,6-trinitro-1-chlorobenzene（TNCB）を塗布することで感作し，4日目以降 1 日毎に TNCB を塗布することでアレルギー様皮膚炎を誘発させた．感作 4 日前から，BPS，低分子化 BPS，脱ピルビン酸化 BPS を 1 回/日の頻度で経口投与した．対照群にはリン酸緩衝液，陽性対照群にはプレドニゾロンを，同様の頻度で経口投与した．感作日および感作 4 日後から，1 日おきに TNCB塗布前の耳介厚測定を行い，アレルギー抑制効果として評価した．一方，C3H/HeJ マウスよりパイエル板を採取し，各多糖を添加して 5 日間培養後，培養上清中のサイトカイン量および IgA 量を ELISA 法で定量した．
【結果】BPS 投与群（20 mg/kg/日，2 mg/kg/日）において，対照群と比べて，耳介肥厚化の有意な抑制効果が認められた．抑制効果は，いずれも陽性対照群であるプレドニゾロン投与群（3 mg/kg/日）と同等であった．同様に，低分子化 BPS 投与群（20 mg/kg/日）においても抑制効果がみられたが，脱ピルビン酸化 BPS 投与群（20 mg/kg/日）の抑制効果は低いことが明らかとなった．また，BPS を添加したパイエル板細胞培養上清中で，多糖非添加培養に比べ，IL-4，IL-6，IL-10 および IgA 量の有意な増加が認められた．一方，脱ピルビン酸化 BPS を添加したパイエル板培養上清中では，それらの有意な増加は認められなかった．
【考察】これらの結果より，BPS の経口投与によるアレルギー様皮膚炎抑制作用には，ピルビン酸を含む側鎖構造が関与していることが示唆された．
参考文献1）Kohno M, Suzuki S, Kanaya T, Yoshino T, Matsuura Y, Asada M, Kitamura S. 2009. Carbohydrate Polymers, 77 : 351–357.
2）河野麻実子，庄條愛子，小崎敏雄，浅田雅宣，大野徹，北村進一，2010．腸内細菌学雑誌，24(2) : 96.

一般
演題

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腸内細菌学雑誌

26 巻 2 号

2012

一般演題 A–12

インフルエンザウイルス M2e 抗原を表層発現する
遺伝子組換えビフィズス菌による抗原特異的免疫応答の誘導
Recombinant Bifidobacterium Displaying Influenza M2e Protein Induced
the M2e Specific Immune Responses in Mouse Model
甲斐宏樹 1，○竹井咲希 1，川端眞人 2，片山高嶺 3，白川利朗 41

神戸大学医学研究科，2 神戸大学医学研究科，3 石川県立大学，4 神戸大学保健学研究科【目 的】本研究は抗原タンパク質を産生する遺伝子組換えビフィズス菌による，腸管免疫を介した抗原特異的免疫応答を誘導するための技術開発を目的とした．ここでは，A 型インフルエンザ抗原タンパク質である Matrix 2 extracellular domein（M2e）をターゲットとしたビフィズス菌によるインフルエンザワクチンの開発を試みた．
【方 法 】M2e タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 を ，ビ フ ィ ズ ス 菌 の ABC ト ラ ン ス ポ ー タ ー で あ る
GNB/LNB 基質結合膜タンパク質（GL-BP）遺伝子に結合させて，ビフィズス菌-大腸菌シャトルベクターを構築した．このベクターを電気穿孔法により B. longum に遺伝子導入し，GL-BP を分子アンカーとした M2e 抗原タンパク質を表層発現する組換えビフィズス菌を作製した．この M2e 抗原発現 B. longumを，1 × 109 CFU/ml の PBS 希釈菌液として 8–12 週齢のメスの BALB/C に 1 回あたり 50 µl，週 3 回の胃内強制経口投与を行った．投与開始後，隔週の尾静脈採血を行うと同時に，28 日目にマウスから脾臓細胞を取得した．ELISA 法により血清中の M2e 抗原特異的 IgG, IgM 抗体の検出を実施した．また，マウスの脾臓細胞由来 RNA を用いてリアルタイム PCR 法により IFN-γ, GATA3, IL-4 の遺伝子発現を ∆∆Ct 法により比較定量した．
【結 果】図 1 に示す ELISA 法の結果から，投与を開始して 14 日目以降において顕著な M2e 抗原特異的IgG, IgM 抗体の産生を確認した．また，図 2 に示すリアルタイム PCR 法の結果より M2e 発現 B. longum
投与群において IFN-γ, GATA3, IL-4 遺伝子の発現増幅が確認された．
【考 察】GATA3 や IL-4 遺伝子は，Th2 細胞を主体とした液性免疫応答を観測するための重要なマーカー遺伝子である．図 2 に示すリアルタイム PCR の結果から，PBS 投与群に対して M2e 発現 B. longum 投与群では GATA3, IL-4 遺伝子発現の顕著な増加を確認することができた．また，抗ウイルス因子でありマクロファージなどの食細胞を活性化させる IFN-γ も同様に顕著な発現増強が確認された．図 1 および図2 の結果より，抗原特異的な免疫応答が腸管を介して全身性の免疫にまで及ぶという，本研究において非常に重要な事実が示唆された．
これらの結果により，抗原を菌体表層に発現させることで抗原特異的な抗体産生を促すことが可能であり，本システムがビフィズス菌による経口ワクチンとして幅広い応用性を持つことが示された．

図1

ELISA 法による M2e 抗原特異的抗体の検出

図2

リアルタイム PCR 法による各種遺伝子群の比較定量