総説

POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開
三浦大明 *，浅 野1．はじめに竜太郎 *厳密な管理が可能となった．一方，我々の研究グループ

患 者 の 生 活 の 質（Quality of life: QOL） の 向 上 には最近，動物細胞培養における管理を志向し，その主要

寄 与 す る 臨 床 現 場 即 時 検 査（Point-of-care testing:

な栄養素である L-グルタミンの新規原理に基づく連続

POCT）は，迅速性，操作の簡便性，および定量性が必

検出法の開発を行った６）．L-グルタミン結合タンパク質要とされており，これらを満たすには電気化学検出原理

が，結合により構造が変化することに着目し，酸化還元に基づく手法が好適である．高い親和性と特異性を有すプローブで修飾しておくことで，結合に伴う構造変化をる抗体を分子認識素子として用いたセンサは，イムノセ

電気化学シグナルとして捉えることに成功した．
しかし，ンサと呼ばれ，既に種々の疾病の確定診断などにも用いこれらの原理に基づくセンサで測定可能な分子は多くのられているが，汎用的な POCT を目指した電気化学イ

場合，低分子化合物に限定され，疾患関連タンパク質なムノセンサの開発には未だ多くの障壁がある．本稿では，

どの測定例は限られている７）.

イムノセンサの一例を紹介すると共に，高感度検出の達成に欠かせない抗体酵素複合体の調製に関して，我々の最近の取り組みも含めて紹介する .

3．イムノセンサ
抗体は，生体内の免疫系を担う主要な分子であり，侵入してきた外敵に強力かつ特異的に結合する能力を有す

2．POCT
POCT とは，患者のすぐそばで行われる検査であり，様々な疾患の早期発見や患者の QOL の向上に寄与する．

る．この抗体の特徴を生かして，分子認識素子として応用したセンサは，イムノセンサと呼ばれ，検出抗体の標識の有無によって大別される８）.

これは，従来の患者または医療従事者が検体を採取後，抗体を標識せずに利用する検出系は，表面プラズモン

検査機関へ送付する体制とは異なり，検査における迅速共鳴（Surface plasmon resonance: SPR）法に代表さ性と操作の簡便性，さらには定量性も求められる場合がれる．このようなイムノセンサは，高感度での検出を可ある．POCT には，特定の分子のみを認識し，その有無

能とするものの，検出までに時間がかかり，検出機器もや量を正確に使用者に伝える必要があることから，高い大型となることから，POCT への適用は困難である．一選択性を有する分子認識素子が必要となる．既に糖尿病方で，抗体を標識して利用する場合，標識物質が検出感

患者の血糖管理のための POCT 機器として汎用されて度および POCT への適用可否を左右する．例えば，妊いるグルコースセンサは，グルコース酸化酵素（Glucose

娠検査薬やインフルエンザの確定診断には，イムノクロ

oxidase: GOx)１,２）やグルコース脱水素酵素（Glucose

マトグラフィー法に基づく POCT 機器が用いられていdehydrogenase: GDH) 3－5）を分子認識素子として用いるが，着色されたビーズを抗体に修飾することで，定性ており，血中のグルコースに応答した電気化学シグナル的な診断を可能としている一方で，その結果から定量的から，即時に血糖値を算出し患者に知らせることが出来な議論をすることは難しい．

る．そのため，適切なタイミングでのインスリンの投与

酵素によって標識された抗体を検出素子として用い

や，低血糖を防ぐためのブドウ糖の摂取など，血糖値のた イ ム ノ セ ン サ は，Enzyme-linked immunosorbent＊東京農工大学大学院工学府生命工学専攻

総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開

assay（ELISA） と 呼 ば れ て い る９）．ELISA の 感 度 は，り，それぞれが異なる特徴を有することから，適切な手修飾する酵素に大きく依存することから，西洋ワサビペ法の選択が求められる．サイクリックボルタンメトリー

ルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase: HRP）やア（Cyclic voltammetry: CV)12）や電気化学インピーダン

ルカリホスファターゼ（Alkaline phosphatase: ALP）

ス分光法（Electrochemical impedance spectroscopy:の他に，β-ガラクトシダーゼ10）や GOx11）を応用した

EIS)13）を測定原理とした電気化学イムノセンサは，捕例が報告されている．ELISA の多くは，比色や化学発光，

捉抗体を電極に固定し，測定対象である抗原の結合に伴および蛍光による検出を基本原理としており，検出機器

うピーク電流値や抵抗値変化を捉える手法である．これの小型化は難しい．加えて，抗体抗原反応および洗浄操らの手法の利点は，抗体への抗原の結合を直接電気化学

作，
検出試薬の添加など操作が煩雑で時間がかかるため，シグナルに変換可能であることであり，抗体の修飾を必

POCT への適用はやはり困難である .

要としない．しかし，夾雑物の電極への非特異吸着によっても抗原結合と同様のシグナルが観察される恐れがある
ため，高感度化が難しい場合がある12）.

4．電気化学イムノセンサ
電気化学検出は，定量的な POCT を達成する上で，一方でクロノアンペロメトリー（Chronoamperom-

重要な検出手法である．電気化学検出技術も様々であ

etry: CA）を測定原理とした電気化学センサは，世界中

図 1 電気化学 ELISA の模式図
電極に捕捉抗体を固定し，酸化還元酵素標識抗体で抗原をサンドイッチする．洗浄後に，酵素の基質を添加すると，基質の酸化に伴って生じた電子が，電子メディエータなどを介して電極に渡され，抗原依存的な応答電流値として観察される．



総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開で汎用されているグルコースセンサに代表される．酸化

近年，Sortase A に代表される酵素が触媒するタンパ還元酵素を検出素子として用いることで，測定対象で

ク質間連結反応を利用した抗体酵素複合体の調製が注目ある基質の酸化に伴い補因子が還元されるため，電子メされている18）．タンパク質間連結反応による抗体酵素複

ディエータなどを介させれば電極に電子が渡され，その合体調製におけるの最大の利点は，抗体と酵素を量論的応答電流値から基質の定量を行うことができる．しかしに反応させることができ，その反応点を制御することがイムノセンサへの応用を考えた場合，抗体の抗原への結できることから，均一な抗体酵素複合体を調製できるこ合シグナルを電気化学シグナルに変換するためには，酸とである．しかしながら，Sortase A は逆反応を伴うた化還元酵素や酸化還元プローブによる抗体の修飾などのめ，連結効率は必ずしも高くなく，反応させた後も精製工夫が必要である．特に，電極表面上で捕捉抗体と検14）プロセスを必要としてしまう .

出抗体で抗原をサンドイッチする電気化学 ELISA の大半は，酸化還元酵素修飾された検出抗体，いわゆる抗体

6．Catcher/Tag を利用した抗体酵素複合体の調製

酵素複合体を用いた CA を測定原理としているが，いか連結モジュールである SpyCatcher/SpyTag は，化膿にして機能的な抗体酵素複合体を簡便かつ汎用的に調製

レンサ球菌由来フィブロネクチン様タンパク質 CnaB2

するかが課題となっている （図１)．

を人工的に二分割（スプリット）させたものである．ス

15）

プリットされた SpyCatcher タンパク質と SpyTag ペプ
5．抗体酵素複合体の調製法

チドは共存させると自発的に会合し，両者の間で共有

電気化学 ELISA で用いられる抗体酵素複合体は，ア

結合性のイソペプチド結合が形成される19）．この会合

ミンカップリングなどの手法を用いて抗体に酵素を化学

は，４℃下でも安定的に進行するだけでなく，反応効

的に修飾させている場合が多い．システイン残基を利用率も 80% 以上と非常に高く，塩や界面活性剤などの影したチオールカップリングによる抗体酵素複合体の調製

響も受けない．さらに本手法を用いることで，抗体の例も報告されているが，システイン残基間のジスルフィ

Ｎ末端に酵素を融合することなく抗体酵素複合体を調製

ド結合は，抗体の高次構造維持に必要であることから，することが可能であるため，抗体結合の妨げとなりに

抗体の機能に大きな影響を与える可能性がある16）．遺伝

くい．化膿レンサ球菌由来タンパク質であるため，生体子工学的手法を用いて抗体表面に新たなシステイン残基

内での使用を考えた場合にはその抗原性が懸念されるを導入する場合もあるが，組換え生産時のミスフォール

が，in vitro でのセンシングを志向する場合は問題とはディングや凝集，
さらには発現量の低下をしばしば伴う．

ならない．しかし，前述の他のタンパク質間連結法と比また，このような化学修飾法は，抗体および酵素の反応

べての欠点は，抗体酵素複合体形成後に，SpyCatcher/

点を制御することが困難であるため，均一な分子を調製

SpyTag がそのまま残存してしまうことであり，抗体おすることが困難で，特に低濃度の抗原の電気化学検出によび酵素本来の機能に影響を及ぼす可能性は捨てきれな

おいては測定結果の再現性に影響を与えうる .

い.

均一な抗体酵素複合体の調製法のひとつとして，抗体

我々はこの SpyCatcher/SpyTag 反応の堅牢さに着目

を低分子化し，酵素と遺伝子工学的に融合させて組換えし，抗体に SpyTag を，酵素に SpyCatcher を融合する

生産する方法がある17）．しかしこの場合も，分子量の増ことで抗体酵素複合体を調製し，イムノセンサへの応用

大に伴う組換え生産時の発現量の低下や，不溶性の凝集（図2A)．遺伝子工学的に SpyTag を融を検討した20－22）

体が主として生成してしまう懸念がある．また，抗体の合した抗体を組換え生産する場合，より安価に調製でき結合部位は通常，Ｎ末端領域に位置するため，Ｎ末端へるという点から大腸菌を宿主とすることが望ましく，その酵素の融合は，抗体の結合能に大きな影響を与える可の場合抗体の低分子量化が求められる．低分子抗体とし能性がある．このため，親和性を向上させるために複数ては，単一ドメインで親和性を示す VHH (Variable do-の抗体を縦列に融合させても期待する効果が得られにく

main of heavy chain of heavy chain antibody) や一い．

本 鎖 抗 体（Single-chain variable fragment: scFv） が総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開用いられる．そこで我々は，がんマーカーのひとつであ

SpyTag システムによる抗体酵素複合体の調製に成功

るヒト上皮増殖因子受容体（Epidermal growth factor

したことが示された．SpyCatcher を２つ融合させた

receptor: EGFR）に対する VHH，および scFv のＣ末GDH の場合も同様に，２分子の低分子抗体との会合

端に SpyTag を融合した分子を，大腸菌を用いて組換えに相当するバンドがみられた（図2B)．さらに，他の生産し，金属イオン固定化アフィニティークロマトグラ

VHH や scFv を用いて，本手法の汎用性も確認するこフィー，次いでゲルろ過クロマトグラフィーにより精製とができた．

した .

続いて，作製した抗体酵素複合体の機能評価を行っ

一方，酵素は，Aspergillus flavus 由来の GDH を用た．抗体の結合能を SPR により評価した結果，SpyTag

いた．GDH はその高い触媒活性を有していることから，の融合や GDH との複合体化に伴う親和性の低下は確認

市販のグルコースセンサにも実装されており，グルコー

されなかった．また期待通り VHH を２つ有する場合

スの酸化に伴う電気化学シグナルを得ることが出来る．

に，より高い親和性が認められた．酵素の活性は，グルそこで，GDH のＮ末端，あるいはＣ末端，および両末コースを基質とした場合の人工電子受容体および呈色試

端に SpyCatcher を遺伝子工学的に融合し，同様に大腸薬の酸化還元に伴う吸光度変化により評価した．その結菌を用いて調製した．GDH の両末端への SpyCatcher果，SpyCatcher の融合および複合体化により，それぞの融合により，２分子の低分子抗体との会合が可能となれ活性値の低下はみられたものの，検出素子としては十るため，親和性の向上が期待される .

分な活性を保持していた．今回使用した GDH の両末端

SpyTag 融合 VHH と SpyCatcher 融合 GDH を量論的は，活性部位から離れていることが結晶構造により明らに混合し，４℃で静置することで，抗体酵素複合体の調かになっている．そのため，比較的大きな SpyCatcher

製を行い，SDS-PAGE による会合の評価を行った．そ(15 kDa) の 融 合 や， そ の 後 の 抗 体 と の 複 合 体 化 後の結果，混合後に新たに抗体酵素複合体の理論分子量付

も，酵素活性を保持していたと考えられる．以上より，

近に明瞭なバンドが観察されたことから，SpyCatcher/

SpyCatcher/SpyTag を利用した本抗体酵素複合体の調図 2 SpyCatcher/SpyTag システムによる抗体酵素複合体の調製（A）SpyTag（ST）融合単ドメイン抗体（VHH）と SpyCatchrer（SC）融合グルコース脱水素酵素（GDH）とのSpyCatcher/SpyTag システムによる抗体酵素複合体形成の模式図．SpyCatcher と SpyTag は 4℃下でも自発的に会合し，共有結合を形成する．（B）抗体酵素複合体形成評価のための SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
解析結果．時間経過に伴って ST 融合 VHH および SC 融合 GDH に由来するバンドの強度が弱くなり，代わりに抗体酵素複合体由来のバンドの強度が強くなっている．

総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開

製法は，組換えタンパク質に与える影響が低い低温でもCatcher/SnoopTag 23）の利用を考えた．SnoopCatcher/

反応は効率的に進行し，抗体および酵素の機能に大きなSnoopTag は，肺炎レンサ球菌由来のタンパク質であり，影響を与えることなく２分子の低分子抗体の融合も容易

SpyCatcher/SpyTag と同様に自発的に会合してイソペである他，その汎用性も示すことができた .

プ チ ド 結 合 を 形 成 す る が，SnoopCatcher/SnoopTag

続いて，開発した抗体酵素複合体を検出素子としてと SpyCatcher/SpyTag 間での交差性はない．そこで，

ELISA による EGFR の蛍光検出を試みた（図3A)．血GDH の両末端に SnoopCatcher および SpyCatcher を

中 EGFR の濃度は非常に低く，高感度での検出が求めそれぞれ融合させ，互いに EGFR 上の異なるエピトー

られる．結果は，EGFR の濃度依存的な蛍光強度の増加

プを認識する２種類の scFv に SnoopTag と SpyTag をは見られたものの，臨床検査で求められている感度を満それぞれ融合させた分子と混合，反応させることで，二たすことは出来ず，より親和性の高い２分子の scFv と重特異性抗体酵素複合体を調製した．SDS-PAGE の結会合させた２価抗体酵素複合体を用いても改善は見られ果，期待する複合体に相当する分子量付近に均一なバン（図3B)．EGFR は単量体性の抗原であるた
なかった21）

ドが観察された．作製した複合体を検出抗体として用い

め，低濃度では GDH に融合させた２分子の scFv が同て EGFR の蛍光検出を行った結果，EGFR 濃度 0-5 nM時に結合可能な範囲に EGFR が存在し得なかったことの範囲で濃度依存的な蛍光強度の増加が確認されたことに起因すると考えられた .

から，２種類の scFv を組み合わせることの有用性が示された .

7．2 種の Catcher/Tag を利用した二重特異性抗体酵

続いて，この二重特異性抗体酵素複合体を用いた電素複合体の調製と電気化学イムノセンサへの展開

気化学イムノセンサの開発を進めた（図4A)．捕捉抗

単量体性の抗原である EGFR をより高感度に検出

体固定化磁気ビーズと微小電極を用いることで，洗浄

す る た め に， 新 た な 連 結 モ ジ ュ ー ル で あ る Snoop-

操作が不要，かつ迅速な検出系の構築を目指した．結図 3 抗体酵素複合体を用いた EGFR の蛍光検出（A）抗体酵素複合体を用いた EGFR の蛍光検出の模式図．
（B）EGFR の蛍光検出結果．黒色で scFv を１つ有する１価
抗体酵素複合体を用いた結果を，赤色で scFv を２つ有する２価抗体酵素複合体を用いた結果を示している．

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図 4 抗体酵素複合体を用いた EGFR の電気化学検出（A）抗体酵素複合体を用いた EGFR の電気化学検出の模式図．微小電極の下に磁石を置くことで，磁気ビーズ上の捕捉抗体と EGFR をサンドイッチした抗体酵素複合体のみが集積される．
（B）
バッファー中の EGFR の電気化学検出結果．
電流値変化は，グルコース添加前後での電流値変化を記録し，EGFR 濃度 0 nM の際の値を０と換算した時の値を示している．（C）ヒト血清中の EGFR の電気化学検出結果．

図 5 抗体酵素複合体を用いたヒトヘモグロビンの蛍光および電気化学検出（A）抗体酵素複合体を用いたヒトヘモグロビンの蛍光検出結果．黒色で scFv を１つ有する１価抗体酵素複合体を用いた結果を，赤色で scFv を２つ有する２価抗体酵素複合体を用いた結果を示している．
（B）バッファー中のヘモグロビ
ンの電気化学検出結果．電流値変化は，グルコース添加前後での電流値変化を記録し，ヘモグロビン濃度 0 nM の際の値を０と換算した時の値を示している．
（C）汎用されている溶血剤成分を添加したヒト血清中のヘモグロビンの電気
化学検出結果．

総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開

果，操作時間 25 分程度で EGFR を検出することができ，続いて，２価抗体酵素複合体を検出素子として，磁0-10 nM の範囲で高い直線性も確認された（図4B)．さ

気ビーズを用いたヒトヘモグロビンの電気化学検出をらに，血中での検出を視野に，夾雑物の影響を評価す試みた．結果，ヒトヘモグロビン濃度依存的な電流値るため，ヒト血清中での検出を行ったところ，やはりの増加が見られ，その直線範囲は 10-300 nM であっ

EGFR の濃度依存的な電流値の上昇が確認され，実サン

た（図5B)．これは，臨床的に求められている検出濃度

プル測定の応用可能性が示された（図4C)．洗浄操作不範囲を満たす性能であった．また，血中ヘモグロビン

要の検出には，二重特異性抗体酵素複合体の高い親和性を検出する際には，溶血させる必要がある．そこで実測に加え，磁気ビーズを利用することによる反応液の攪

定の際の夾雑物の影響を評価するため，希釈したヒト

拌，および磁石を用いることで電極近傍に抗原と結合し血清に対し，汎用されている溶血剤の主成分を含むバッ

た検出素子を集積させることによる，
GDH と電子メディ

ファーを添加し，測定を行った結果，測定値にほとんど

エータの効率的な酸化還元サイクルが寄与したと考えて影響は確認されなかった（図5C)．以上の結果より，多いる .

量体抗原を測定対象とすることで，1 種の抗体で構成される抗体酵素複合体を用いた場合でも，高感度測定を達8．Catcher/Tag を利用した抗体酵素複合体を用いた成することが出来た .

多量体分子の電気化学検出
二重特異性抗体酵素複合体を調製することで，単量9．おわりに体性の抗原であっても高感度に検出することができ

POCT を 志 向 し た 電 気 化 学 イ ム ノ セ ン サ は， 患 者

た．一方で，捕捉抗体も含めると３種のエピトープがの QOL 向 上 に 大 い に 役 立 つ こ と が 期 待 さ れ る も の異なる抗体を用意する必要があり汎用性には欠ける．まの，実用化までは解決すべき課題が多くある．我々は，た，SpyTag 融合抗体，SnoopTag 融合抗体，および両Catcher/Tag システムを用いることで，汎用的な抗体酵

Catcher 融合 GDH と，３種類の組換えタンパク質を調素複合体の調製方法を開発，さらには検出素子として用製する必要があるのも実用化には障壁となる．そこで，いたイムノセンシングシステムを構築してきた．しかし１種の検出抗体でも高感度の検出を達成するために，多依然として，検出までに 25 分程度要すること，磁気ビー量体性の抗原検出に着目した．ヘモグロビンはα鎖とβズ上に捕捉抗体を固定する必要があることなど，改善す

鎖が２分子ずつ会合した四量体構造を有しており，貧血べき点はまだ残されており，現在さらなる迅速簡便化をや脱水症状の診断マーカーになるだけでなく，緊急手術

目指した検出系の構築を進めている．近年，ナノマテリの際の輸血量の迅速な推定のために，POCT 機器の開発

アルの応用による新規電極素材やデバイスなどの開発にが求められている24, 25).

よるセンサの高感度化を目指した研究が数多く報告され抗ヘモグロビン scFv のＣ末端に SpyTag を遺伝子工ているが，我々はタンパク質工学的手法を駆使したアプ

学的に融合し，両末端に SpyCatcher を融合した GDH

ローチを試みている点に特色がある．新規材料やデバイと量論的に混合することで，抗体酵素複合体を調製しスとうまく融合させることで，さらにより良い POCTた．前述と同様の機能評価を行った結果，複合体形成に機器，あるいはこれらに資するセンサ素子の開発に繋がよる酵素活性への影響は確認されず，また親和性に関しることを期待している .

ては，scFv を２つ有する場合に著しい向上が確認された．これを用いて，ELISA によるヒトヘモグロビンの参考文献

蛍光検出を行ったところ，抗体を２分子含む２価抗体

１）Suzuki, N. et al.: Engineered Glucose Oxidase

酵素複合体を用いた方が明らかに高い検出感度を示し

Capable of Quasi-Direct Electron Transfer afterた（図5A)．これらの結果から，同一の scFv を２つ有a Quick-and-Easy Modiﬁcation with a Mediator.

する抗体酵素複合体は，多量体性の抗原検出を目指した

Int. J. Mol. Sci. 2020, Vol. 21, Page 1137, 21,場合，有望な検出素子となることが示された．

1137（2020).

総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開

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総説－ POCT を志向した均一かつ汎用的な抗体酵素複合体の調製法の開発と電気化学イムノセンサへの展開

10

総

説

RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御
林

眞

理＊，＊＊

取りうる機能的なゲノム領域としてテロメアが挙げら

１．はじめにRECQ ヘリカーゼは，菌界，植物界，動物界にわたっれる．テロメアは染色体末端の保護構造であり，そのて広く保存されたタンパク質ファミリーであり，DNA

DNA 配列の反復性から DNA 複製，転写，修復が比較

複製，転写，傷害修復において重要な機能を果たす．ヒ的困難な領域で，その維持において RECQ ヘリカーゼ

トでは５つの RECQ ヘリカーゼが保存されており，中の機能が重要な役割を果たすことが徐々に明らかになっでも BLM, WRN，及び RECQ4 はそれぞれブルーム症ている．本総説では，主に哺乳類細胞 RECQ のテロメ

候群，ワーナー症候群，及びロスムンド・トムソン症候

アにおける機能に焦点を当てて最近の知見を紹介する．

群２型，ラパディリーノ症候群，バレーゲロルド症候群の原因遺伝子として知られる．さらに RECQ1, RECQ5

２．RECQ ファミリーヘリカーゼ

も含め，全ての因子の遺伝性変異は，がん化頻度を上昇

RECQ ヘリカーゼファミリーは，高度に保存されたさせることが報告されており，ゲノムの正常な維持に

ヘリカーゼコアドメインを有する．ヒトにおいては，必須の因子群である．RECQ ヘリカーゼの基質として，

RECQ1 ( 又は RECQL, RECQL1), BLM, WRN, RECQ4

DNA フォークや複製バブル，Ｄループ構造，グアニン( 又は RECQL4), RECQ5 ( 又は RECQL5) の計５つが同４重鎖（G4）構造，ホリデイジャンクション（HJ）な

定されている（図１）．ヘリカーゼコアドメイン (DEAD/

ど様々な構造が知られているが，これら全ての構造を

DEAH BOX) に加えて，相同性の高い RecQ C-terminal

図1

ヒト RECQ ファミリーヘリカーゼの構造＊ IFOM（イタリア分子腫瘍研究所）（Junior Principle Investigator）＊＊京都大学大学院医学研究科 先端・国際医学講座 IFOM-KU 国際共同ラボ

11

総説－ RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御(RQC), Helicase and RNase D-like C-terminal (HRDC)

必要であり，有糸分裂期後期においても姉妹染色分体のドメインを保持しているものが多い（図１）．それぞれ分離を保障している６）．ブルーム症候群患者由来の細胞の RECQ ヘリカーゼは，互いにオーバーラップする様々では，欠失，切断，転座等の様々な異常が確認され，特な核酸を基質とし（図２），DNA 複製，転写，DNA 傷に姉妹染色分体交換の頻度が 10 倍以上増加する７）．

害修復からテロメア維持に至るまで，核内における核酸の維持・継承に関わる様々な反応を触媒する１）．

WRN は非相同末端修復，相同組換え修復，マイクロホモロジー媒介末端修復，一本鎖アニーリング修復等のRECQ1 は多くのがん細胞で発現亢進が報告されてお様々な DNA 傷害修復経路に関わる８）．ワーナー症候群

り，ノックダウン実験により，がん細胞の増殖に必要で患者は成人型早老症の症状を示し，様々な悪性新生物のあることが確かめられている ．RECQ1 のノックダウ

出現頻度が数倍から数十倍に亢進している９）．患者由来

ンにより転写活性が低下する遺伝子群のプロモーター領の細胞では染色体の欠失や転座，DNA 変異の蓄積など域では G4 形成能を持つ配列が有意に検出される３）．しが検出され，染色体維持における WRN の重要性を示し

かし G4 構造の開裂活性はほとんどないため４），どのよている10）．

２）

うに遺伝子活性を制御しているかは良くわかっていな
い．

RECQ4 のＮ末端領域は，様々なタンパク質と相互作用し，DNA 複製フォークが停止した際の複製再開や11），BLM はヘリカーゼ活性に加え，IA 型トポイソメラー

非相同末端修復，相同組換え修復等の経路に寄与するこ

ゼ TOP3A, RMI1, および RMI2 と BTR 複合体を形成とが報告されている12）．RECQ4 を原因遺伝子とした症

し，
ダブルホリデイジャンクションの分離（Dissolution）

例に関わる変異の多くはヘリカーゼドメインとユニークを促進する５）．この分離活性は，相同組換え修復の最後

な C 末領域に同定されている 13）．

のステップにおいて，修復した鎖を正常に分離するのに

図２

RECQ5 の細胞における機能として，相同組換え修復

様々な基質に対する RECQ ファミリーヘリカーゼのインビトロ活性

それぞれの基質の下に各 RECQ ヘリカーゼの活性の有無を示す．RECQ2 は BLM, 3 は WRN を表す．+RPA は，RPA
非存在下ではほとんど活性を示さない．BLM のダブルホリデイジャンクションに対するディゾルーション活性には，
TOP3A, RMI1, RMI2 との複合体形成が必要．

12

総説－ RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御の抑制が報告されている14）．また RNA ポリメラーゼ II

150bp 程度の一本鎖突出部位（3’オーバーハング）からと相互作用し，ゲノム上で共局在することが分かってお成る．テロメア二本鎖配列と結合する TRF1 と TRF2，

り，転写伸長を抑制的に制御することで，過剰な転写に一本鎖配列と結合する POT1，及び RAP1, TIN2, TPP1

よるゲノム上のストレスを抑制しているとの仮説が提唱という因子が相互作用し，シェルタリン複合体を形成すされている15）．

る（図3A）．テロメア配列は末端複製問題により DNA
複製の度に短くなる．この問題を解決するため，多くの真核生物ではテロメラーゼという逆転写酵素により，テ

３．テロメアの構造と機能
真核生物の線状染色体の末端は，テロメアによってロメア末端を伸長している17）．ヒトの場合，ほとんどのDSB として認識されないように保護されている16）．多体細胞ではテロメラーゼの発現は抑制されているが，幹くの生物において，テロメアの DNA 配列は単純なリ細胞や生殖細胞系列ではテロメラーゼが発現し，世代をピート配列で，ヒトでは 5’-TTAGGG-3’というリピー

超えたテロメア長の維持を担っている．また，無限増殖

トユニットが２～10kb ほど連なる二本鎖部位と，50～能をもつがん細胞においても，テロメア長の維持は必須

図3
Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｄ
Ｅ

テロメアの核酸構造

テロメアリピートの二本鎖部位には TRF1 と TRF2 が，一本鎖末端には POT1 がそれぞれ直接結合する．RAP1 はTRF2 と，TIN2 は TRF1, TRF2 と結合し，TPP1 は TIN2 と POT1 の間を架橋する．
テロメアの 3’末端は二本鎖部位にもぐりこみ，T ループを形成する．
Ｔループのジャンクションでは，D ループ，シングルホリデイジャンクション，ダブルホリデイジャンクション等の構造が形成されると考えられる．
４つグアニンは一価イオンの存在下で，水素結合（転線）を介した安定した平面上の構造を形成する．G4 構造が複数重なることで，さらに安定した G4 重鎖が形成される．
テロメアリピートを含む RNA(TERRA) がテロメア DNA に潜り込み，R ループを形成する．１本鎖の G 鎖側にG4 構造が形成された場合を G ループと呼称する．

13

総説－ RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御

であり，ほとんどのがん細胞はテロメラーゼによって４本並ぶことで形成される４重鎖構造である26）（図3D）．

この問題を解決している．一方，10％程度のがん細胞

G4 構造を形成しうるモチーフ配列は (GGGN1-7)4 であでは，テロメラーゼ非依存的な経路（ALT: Alternativeり27），４本の配列の方向性の組み合わせから複数のバリ

Lengthening of Telomeres）が活性化されており，通エーションが生じる（図3D）．テロメアリピートは完璧

常は抑制されている相同組換え経路を異常活性化するこな G4 モチーフ配列であり，G4 構造の形成確率が特にとでテロメア長を維持すると考えられている18）．

高い領域であると考えられる．テロメラーゼによる末端

以前は転写不活性と考えられていたテロメア領域であ伸長反応の際に，G4 構造がテロメラーゼと物理的に相るが，現在ではテロメアリピート配列を含むノンコー

互作用することで伸長反応の効率が増強されることが示

ティングな転写産物（TERRA）が検出されている

19）．

唆されている28）．また転写反応の際に，Ｇリッチ鎖側のつまりテロメア領域では，DNA 複製，転写，テロメラー

DNA や，転写産物であるテロメア RNA(TERRA)，さらゼによる末端伸長，DNA 傷害修復等の核酸反応の際に，にはＧリッチ DNA と TERRA の DNA-RNA 間においてそのリピート配列の性質ゆえに生じる様々な立体構造にも G4 構造が生じうることが報告されている29－31）．G4

対処しなければならない．中でも特に重要な核酸構造と構造は DNA 複製フォークの障害である一方，Ｔループ

して T (Telomere) ループ，G4，及び R (RNA) ループ

構造の安定化に寄与することが示唆されており25），そのが挙げられる．

形成と解消のタイミングは制御されていると考えられる．

３-a．Ｔループ構造

3-c．Ｒループ構造

テロメア末端 3’オーバーハングは，二本鎖部位に潜Ｒ ル ー プ と は，DNA 二 本 鎖 が 開 裂 し た 領 域 にり込み，ループ構造を形成することができる（図3B）．

RNA が 潜 り 込 み， 核 酸 の ３ 重 鎖 が 生 じ た 構 造 で あ

その形成・維持には，TRF2 が必要である一方，TRF1

り（図4E），出芽酵母，ヒト正常細胞やがん細胞で検出や POT １ の 機 能 は 必 要 な い20, 21）．TRF2 の 阻 害 時 にされている32）．相同組換えの効率を上昇させると報告

はＴループ構造の解消によってテロメアが DSB としされており，Ｒループの RNA を分解できる RNaseH1て認識され，テロメア保護異常のマーカーである TIF

を過剰発現すると，TERRA の減少や相同組換え効率の(Telomere-dysfunction-Induced Foci) を 形 成 す る22）．

低下が見られる33）．二本鎖 DNA を開裂状態にするこ

３’末端が潜り込んだ部分の構造の詳細はまだ諸説あるとで，相補的な DNA 末端の潜り込み反応が促進されが，TRF2 のＮ末塩基性ドメインが，Ｄループで生じると考えられる．Ｒループにおいて一本鎖となったＧ

る 3-Way Junction や，ホリデイジャンクションで生じ

リッチ鎖側が G4 構造をとった場合を特にＧループと呼る 4-Way Junction に対して優先的に結合することが知（図3E）．Ｔループ形成において TERRA が何らか
ぶ 34）られており，これらの構造を保護すると考えられていの機能を果たすと仮定すると，Ｒループ構造やＧループ（図3C）．Ｄループは相同組換え反応の中間体である23）構造もＴループ形成と機能的な関連を持つことが示唆さり，そのまま反応が進行すると鎖交換反応（クロスオー

れる．

バー）によるＴループの切断に至ってしまうため，テロ
メア領域における相同組換え反応は抑制されている必要

4．テロメアにおける RECQ ヘリカーゼの機能がある24）．一方テロメア配列を含むプラスミドを用いた

以上のように，様々な DNA 構造を基質とする RECQ

インビトロ解析では，TERRA の転写がＴループ形成を

ヘリカーゼは，DNA 複製や転写，組換え修復等の反応促進することが報告されており25），細胞内でのＴループにおいて重要な機能を果たすが，このような構造が生形成における TERRA の機能については今後の解析が待じやすいテロメア領域では，その機能は特に重要となたれる．

る（図４）．

3-b．G4 構造

4-a. テロメアにおける RECQ １の機能核酸が取りうる高次構造の一種であり，１価イオンがインビトロ解析では，非テロメア配列と比較してテロ存在する生理条件下においてグアニンに富む核酸配列がメア配列のＤループの方が RECQ1 の良い基質となる．

14

総説－ RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御

この活性は，TRF2 によって阻害されるが，TRF1 の影ト・マウスの TRF1 は，BLM と結合する塩基性のモチー

響は受けず，POT1 によって促進される35）．RECQ1 とフを有しており，このモチーフを欠いた TRF1 を発現

TRF2 は U2OS 細胞エクストラクトから共沈降するこする細胞では，テロメアのラギング鎖複製に異常が生じとが報告されており，さらに RECQ1 のノックダウンにる39）．テロメア末端方向へと進行する複製フォークのラより，テロメア配列の喪失や，TIF の増加，テロメアのギング鎖では，鋳型のＧリッチ鎖で G4 構造が形成され姉妹染色分体間交差（T-SCE）が引き起こされる35）．テ

る可能性があり，BLM による G4 の解消が円滑なテロ

ロメアに局在した RECQ1 は，ラギング鎖複製に関わる

メア複製に必要であることを示唆している（図４）．まFEN-1 をリクルートすることでテロメアの円滑な複製た活性酸素によって実験的に生じたＧループ（G4＋R

を補佐することが示唆されている （図４）．また ALT

ループ構造）の解消に必要であることが示唆されてい細胞のテロメア維持には RECQ1 が必要であり，テロメ（図４）．BLM は，正常な細胞では複製ストレスのる40）

アで亢進した組換え反応に関わっていることが示唆され解消を通じて相同組換えに依存した ALT 細胞の出現をる35）．

抑制するが41），ひとたび ALT 細胞が出現した際にはテ4-b. テロメアにおける BLM の機能

ロメア維持に必要であることを支持する結果が複数報告

36）

BLM の欠損マウスではテロメアの複製速度が遅延する37）．同じ系において G4 構造安定化剤 PhenDC3 でされている42－44）．
4-c. テロメアにおける WRN の機能処理した細胞では，テロメア配列特異的に，BLM 欠損

DNA フォーク基質に対する WRN のヘリカーゼ活性によるテロメア複製障害が悪化した．この表現型は，は TRF2 によって促進される45）．一方，シングルホリ

BLM と WRN を両方欠失した細胞でさらに亢進されデイジャンクション上では，TRF2 はテロメア配列への．BLM をノックダウンした細胞においても，テロ結合を介して WRN の活性を阻害する46）
（図４）
．WRN

メア配列の消失や，Ｍ期後期においてテロメア配列を含シンドローム患者が早期老化の症状を呈し，健常人と比む染色体架橋構造の形成等が認められる38）．また，ヒ較してテロメアが有意に短いことは特筆に値する47, 48）．

た

37）

図４

RECQ ヘリカーゼが対処する様々なテロメア構造

テロメアリピートでは，T ループ，G4 重鎖，R/G ループ，酸化ダメージ等の様々な構造が形成され，これらは DNA
複製や転写・修復の際の障害となる．RECQ ヘリカーゼはこれらの構造を解消する役割を担う．一方，T ループのジャンクションは機能的に重要であるため，解消されないように TRF2 によって保護されている．

15

総説－ RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御

患者由来の細胞では，ラギング鎖特異的なテロメア喪失

TERRA の制御を介してテロメア長制御に寄与しているや，染色体不安定化が検出されるが，これらの表現型はのかもしれない（図４）．

テロメラーゼの過剰発現によって抑制されることから，
テロメアの短小化による染色体末端保護機能の消失がこれらの表現型の原因と考えられる49, 50）．

5. おわりにRECQ ヘリカーゼは，テロメアの複製・転写・傷害

蛍光毒性を持つタンパク質によってテロメアに酸化ダ

修復等の反応において，核酸の高次構造を解消するとメージを与える細胞実験で，酸化ダメージを受けたテロいう重要な機能を担っている（図４）．一方，相同組換

メアに TRF1 依存的に WRN が局在し，WRN をノックえに依存した一部の ALT がん細胞においてはテロメアダウンした細胞では，テロメア酸化ストレス後の生存率の維持に関与しており，ドラッグターゲットとしても注が低下することが示された51）．テロメアはゲノム上で特目されている．ここで取り上げた RECQ の機能は，細に酸化ストレスを受けやすい領域であり52），テロメアに胞周期間期におけるものがほとんどであるが，我々は近おける酸化ダメージの修復が WRN の主要な機能の一つ

年，RECQ ヘリケース因子が有糸分裂期においてもテであることが示唆される（図４）．また ALT 細胞のテロ

ロメア保護構造の制御に関わることを指示する解析結果

メアに局在し，Ｄループの開裂を介してテロメア維持にを得ている．今後の研究の進展によりテロメアにおける機能している可能性が示唆されている53）．

RECQ のさらに多様な機能が明らかになることが展望される．

4-d. テロメアにおける RECQ4 の機能
ロスムンド・トムスン症候群患者由来細胞では，テロメア構造異常が報告されている．RECQ4 のノック

54）

ダウンは，がん細胞において TIF の増加，T-SCE の増

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ロメア配列では見られず，８オキソグアニンをもつテ３）Li, X. L. et al.: Identiﬁcation of RECQ1-regulated

ロメア配列では促進される54）．また BLM, WRN と異なtranscriptome uncovers a role of RECQ1 in

り，酸化損傷の一種であるチミングリコール化を受けた

regulation of cancer cell migration and inva-

テロメア配列からなるＤループに対して，比較的高い活

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（図４）
．

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ん患者の血液サンプルを用いたテロメア長と一塩基多６）Chan, K. L. et al.: BLM is required for faithful型（SNP）の相関解析から，短いテロメア長と Recq5

chromosome segregation and its localization de-の SNP との間に有意な相関があることが明らかになっ

ﬁnes a class of ultraﬁne anaphase bridges. Theているが 58, 59），どのようにテロメア長の制御に関わっ

EMBO Journal 26, 3397-3409 (2007).

ているのかは良く分かっていない．転写伸長や相同組

７）Chaganti, R. S. K. et al.: A Manyfold Increase

換えを抑制的に制御するという報告から鑑みるに14, 15），in Sister Chromatid Exchanges in Bloom’s Syn-

16

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19

総説－ RECQ ファミリーヘリカーゼとテロメア制御

20

総

説

アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－
大垣隆

一＊, ＊＊

酸の種類，共役イオン（Na＋, K＋, H＋, Cl－など）の有無，

１．はじめに
生体内には，20 種類のタンパク質構成アミノ酸をは臓器・組織・細胞・オルガネラレベルの発現・局在といっじめ様々なアミノ酸が存在する．生体膜を介したアミノた諸性質が異なる多彩なアミノ酸トランスポーターが，酸の輸送は，「アミノ酸トランスポーター」と呼ばれる生体内のアミノ酸分布と動態を制御する分子基盤となっ膜輸送タンパク質が担っている．ヒトでは約 60 種類がている．

同定されており，ATP 非共役型の溶質キャリア（SLC;

その生理機能の重要性を反映して，アミノ酸トランス

Solute carrier）ファミリーに属する．輸送基質アミノ

ポーターの異常は，上皮輸送障害に起因するアミノ酸尿

図１

アミノ酸トランスポーター LAT1 の分子機能と構造

Ａ．LAT1 は，補助サブユニット CD98hc とのヘテロ二量体として機能する．高親和性の輸送基質である大型中性アミノ酸（赤色：必須アミノ酸）を細胞外から取り込むと同時に，細胞内からはグルタミン（Gln）などの，低親和性ながら豊富に存在する非必須アミノ酸を運び出す．
Ｂ．LAT1-CD98hc 複合体の立体構造（PDB：6JMQ）７）のリボンモデル．LAT1（レインボーカラー）と CD98hc（薄紫色）は，ジスルフィド結合を介して共有結合する．CD98hc の細胞外ドメインは，N 型糖鎖（スティックモデル）
による修飾を受ける．LAT1 の膜貫通領域表面には，複数のコレステロール（マゼンダ）が結合している．
Ｃ．基質結合状態の LAT1 の TM1 と TM6 の構造（PDB：6IRT）６）．TM1 および TM6 の膜貫通ヘリックスは，膜内部で部分的にほどけている．この構造では，阻害薬（輸送基質でもある）BCH（ボールモデル）が結合し，LAT1は細胞の内側に向かって開いている（外側に向かっては閉じている）．TM6 の 262 番目フェニルアラニンの側鎖が上方に配置し，BCH の側鎖と疎水的に相互作用する．図には表示していないが，BCH のカルボキシル基の酸素原子（赤色）とアミノ基の窒素原子（青色）は，それぞれ TM1 および TM6 の主鎖との間に水素結合を形成する．

＊大阪大学大学院医学系研究科・生体システム薬理学 ＊大阪大学先導的学際研究機構・生命医科学融合フロンティア研究部門

21

総説－アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－症，神経変性疾患，代謝異常を伴う肥満や糖尿病，がんのシステイン残基間でジスルフィド結合を形成する．膜などの疾患と深く関連する１）．がん細胞では，アミノ酸

内部では CD98hc の膜貫通へリックスと LAT1 の TM4や糖といった栄養の取込み活性が亢進し，その活発なとの間に，複数の疎水性残基を介した相互作用が見られ増殖や成長を支えている．高い腫瘍選択性をもって幅る．また，CD98hc の細胞外ドメインと，それに向き合広いがん種で高発現するアミノ酸トランスポーターとしう LAT1 の細胞外表面の間には親水的相互作用も認めらて，LAT1 (L-type amino acid transporter 1; SLC7A5)れる．これらの多点的な相互作用が，複合体の構造安定が知られている．LAT1 阻害薬は，がん細胞へのアミ２）性に寄与する．

ノ酸供給の遮断による優れた抗腫瘍効果を示し，新たな抗がん薬として臨床応用が期待されている３）．本稿は，３．がんにおける LAT1 の重要性

LAT1 阻害薬を用いたがん治療研究を概説するととも正常臓器・組織における LAT1 の発現は，血液脳関に，in vivo における意外な抗腫瘍効果の発現機序に関門，胎盤，精巣，膵臓，活性化 T 細胞などに見られるが，する最近の知見を紹介する．

比較的限定的である2, 4, 9, 10）．一方で，大腸がん，前立
腺がん，胃がん，肝臓がん，膵がん，肺がん，乳がんといっ

２．アミノ酸トランスポーター LAT1

た主要がん種をはじめ，殆どあらゆる臓器・組織由来の

LAT1 のアミノ酸輸送機能には，補助サブユニット

腫瘍で LAT1 の発現亢進が報告されている11, 12）．さらに，

CD98hc (CD98 heavy chain または 4F2 heavy chain;

様々ながん種において，LAT1 の高発現が，細胞増殖能，

SLC3A2) が 必 須 で あ る．CD98hc と の ヘ テ ロ 二 量 体

ステージ，予後不良などと相関を示す11, 12）．LAT1 はい形成によって，LAT1 の細胞膜への移行が可能になる．

わば「がん細胞型必須アミノ酸トランスポーター」であLAT1 は，大型中性アミノ酸（ロイシン，イソロイシン，

る．

バリン，フェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，

腫瘍特異的な LAT1 の発現亢進に関する報告は，免疫メチオニン，ヒスチジン）を，高親和性の基質として細組織染色を主な手法としたタンパク質レベルでの知見で胞内に輸送する２,４）．実際には LAT1 は，アミノ酸を 1ある．がん細胞において，これほどまでに広範に LAT1

分子取り込むと同時に，細胞内から１分子のアミノ酸をが高発現する分子機構には未だに不明な点が多い．転運び出す交換輸送体である．しかし，細胞内の大型中性

写レベルでは，がん遺伝子 c-Myc13, 14）や低酸素誘導因

アミノ酸に対する LAT1 の親和性は低い５）．しかも細胞

子 HIFs (Hypoxia-inducible factors)15, 16）による直接的

内には低親和性ながら LAT1 により輸送される中性の非制御が報告されている．ER 陽性乳がんでは足場タンパ

必須アミノ酸（がん細胞ではグルタミンなど）が豊富に

ク質 LLGL2 が，細胞内局在の制御を介して細胞膜上の存在しており，
これらが細胞外へと排出される．したがっLAT1 を増加させることも報告されており17），転写以外て， LAT1 は大型中性アミノ酸の濃度勾配に逆らったの制御機構についても更なる解明が待たれる．

取り込みに実質的に寄与する（図1A）．

LAT1 の選択的輸送基質の多くは，生体内で合成でき

近年，著者らも参画したグループを含め，複数の研究ない必須アミノ酸である．これらは，タンパク質合成のグループが，低温電子顕微鏡（Cryo-EM）によって解材料として利用されることはもちろん，ロイシン，バ

かれた LAT1-CD98hc 複合体の立体構造を報告した６,７）

リン，イソロイシンといった分岐鎖アミノ酸（BCAA;（図1B）．LAT1 は，12 回の膜貫通へリックス（TM1～

Branched-chain amino acids）は多様な役割を担う．

12）を持つ．このうち TM1～5 と，TM6～10 が回転

BCAA は細胞質およびミトコンドリアの分岐鎖アミノ

対称で配置した特徴的な構造「LeuT フォールド」８）をと酸トランスフェラーゼ（BCAT1 および 2; Branched-

る．TM1 と TM6 は，膜内部で部分的にほどけており，

chain aminotransferase 1 or 2）が触媒する脱アミノ

この部分が基質結合に重要な役割を果たす（図1C）．

反応により，分岐鎖α-ケト酸に代謝される．アミノ基

CD98hc は，大きな細胞外ドメインを有する１回膜貫通は共基質のα-ケトグルタル酸に受け渡されてグルタミ型の糖タンパク質である．LAT1 と CD98hc は，細胞外ン酸を生じ，さらにグルタミンに変換されて核酸合成（お22総説－アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療

よび非必須アミノ酸合成）の窒素源となる．また分岐鎖－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－

る（図２）．

α-ケト酸の更なる代謝産物であるアセチル Co-A やス
クシニル Co-A は，TCA サイクルに供給されて ATP 産
生や脂質合成にも利用され得る．

４．LAT1 阻害薬によるがん治療研究の展開
がん病態との深い関わりから，LAT1 は治療と診断の

18）

さらに，ロイシンやグルタミン（BCAA の代謝によっ分子標的として期待されてきた．LAT1 によってがんても生じる）といったアミノ酸は，タンパク質・核酸・細胞へと運搬される治療薬として，抗がん薬（DNA ア脂質合成の制御において中心的な役割を果たすセリンス

ルキル化薬）のメルファランがある４）．これは，フェニ

レオニンキナーゼ複合体 mTORC1 (mechanistic target

ルアラニンにナイトロジェンマスタードが結合したもので，

of rapamycin complex 1) の活性化に必須のシグナル

LAT1 によってがん細胞に取り込まれる．同様に，ホ分子でもある19）．BCAA 代謝の意義は，がんの種類や

ウ素中性子捕捉療法（BNCT; Boron neutron capture

ドライバー変異などによっても異なるため，一般化した

therapy）やアルファ線内用療法といった，次世代放射記述が難しい面もある．しかし，いずれにしても LAT1

線療法においても，LAT1 の輸送基質が治療薬として研は，がん細胞の代謝を支える栄養としてのアミノ酸の究されている３）．LAT1 を薬物送達に利用するというア供給口であると同時に，多様な生体反応の制御を担うア

イデアは，陽電子放射断層撮影（PET: Positron emis-

ミノ酸シグナリングの起点としての役割を併せ持っていsion tomography）や単一光子放射断層撮影（SPECT;

図２

がん細胞において LAT1 が担うアミノ酸輸送の意義

LAT1 によりがん細胞に取り込まれたアミノ酸は，タンパク質合成の材料となる（図中央）．また分岐鎖アミノ酸（BCAA）のアミノ基は，分岐鎖アミノ酸トランスフェラーゼ（BCAT1 および 2）により，α-ケトグルタル酸（α-KG）に受け渡されてグルタミン酸を生じ，グルタミンを経て核酸合成の窒素源となる．分岐鎖α-ケト酸（BCKA）の更なる代謝産物であるアセチル Co-A やスクシニル Co-A は，TCA サイクルに入り ATP 産生や脂質合成に利用される（図右側）．さらに，ロイシンやグルタミン（BCAA の代謝によっても生じる）は，タンパク質合成・核酸合成・脂質合成といった多様な生体内反応の制御を司る mTORC1 の活性化に必須のシグナル分子でもある（図左側）．図はロイシンによる
mTORC1 活性化の経路を示す．一般的な増殖因子のシグナル経路は，受容体チロシンキナーゼ -PI3K-Akt-TSC1/2 を介して mTORC1 に入力する．しかし，アミノ酸は mTORC1 をリソソーム膜へとリクルートし，増殖因子とは異なる仕組みで mTORC1 の活性化に寄与する．

23

総説－アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－

Single photon emission computed tomography） の，織での発現が高い LAT2（SLC7A8）には作用しない．

がん診断プローブとして開発されている診断薬（陽電子LAT1 との相互作用には，かさ高い疎水性側鎖が重要で放出核種や単一光子放出核種で標識した LAT1 の輸送基あり，このアイデアを基に T3 を構造展開して得られた質）にも共通する．本稿では，これらとは異なり LAT1

高親和性の LAT1 選択的阻害薬 JPH203 (KYT-0353)21）

阻害薬によってアミノ酸供給を遮断するというアプロー

は，がん細胞のアミノ酸輸送を阻害しその増殖を抑制す

チによるがん治療研究について解説する．

る．また，がん細胞株の免疫不全マウス皮下移植モデル

古典的な LAT1 阻害薬の環状アミノ酸 BCH (2-ami-など，複数の腫瘍モデルでの抗腫瘍効果が実証されていnobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid) は，種々る21－25）．進行性固形がん患者を対象にした第Ⅰ相臨床の前臨床試験で抗腫瘍効果を示す．しかし，BCH は試験（UMIN000016546）では，JPH203 が充分な認容

LAT1 に対する親和性と特異性が低く，しかも実際に性を示し，胆道がん患者の一部で奏功および病勢制御を

は LAT1 の輸送基質（アミノ酸と競合して細胞内に取認めた26）．現在，進行性胆道がん患者に対する第Ⅱ相臨

り込まれることで，相対的にアミノ酸の取り込みを抑制

床試験が実施中である (UMIN000034080）．

する）である．現在では，LAT1 に高親和性で結合し，JPH203 以外にも，様々な LAT1 阻害薬が開発されてかつ実質的に殆ど輸送されない化合物が開発されていいるが 27－31），in vivo での抗腫瘍効果はまだ示されている（図３）．大きな疎水性側鎖を持つアミノ酸でもある

ない．幾つかの化合物については LAT1 に対する選択

甲状腺ホルモン T3 (Triiodothyronine) は，LAT1 に高性も報告されておらず，その薬理作用の詳細な評価が待親和性で結合して阻害効果を示すが，殆ど輸送されない

たれる．最近，二環式メタチロシンを骨格とする LAT1

．しかも，LAT1 の近縁のトランスポーターで正常組阻害薬（JX-075, JX-078, JX-119）が結合した状態の

20）

図３

LAT1 阻害薬

LAT1 阻害薬の構造と，LAT1 のアミノ酸輸送機能に対する IC50（50% 阻害濃度）の値を示す．BCH は古典的な低親和性・低特異性の LAT1 阻害薬，甲状腺ホルモン T3 は JPH203 の原型化合物である．JX-075, JX-078, JX-119 は二環式メタチロシンを骨格とする27）．LAT1 とのジスルフィド結合形成による阻害を機序とする 1,2,3- ジチアゾール化合物（1,2,3-Dithiazoles）29）を除いて，いずれもアミノ酸骨格を有する．

24

総説－アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－

LAT1-CD98hc 複合体の立体構造が報告された27）．両者

きっかけとなった観察は，膵管がん組織において，がの結合に関する分子構造情報を基に，化合物の構造改変

ん細胞のみならず腫瘍間質の血管内皮細胞にも LAT1 のも一層加速することが予想される．

高発現を見出したことである（図4A）．一方で，正常な膵臓組織の血管内皮細胞には LAT1 の発現は見られな

５．LAT1 阻害薬が in vivo で示す血管新生抑制作用かった．同様の所見は，免疫不全マウスの皮下移植腫

従来の研究では，LAT1 阻害薬の抗腫瘍効果は，がん瘍モデル（ヒト膵臓がん MIA PaCa-2 細胞，ヒト肺が細胞に対する直接的な増殖抑制作用によるものと解釈さん H520 細胞）や，マウスメラノーマ B16-F10 細胞のれてきた．しかし著者らは近年，in vivo で LAT1 阻害

同種同所移植腫瘍モデルでも確認される．腫瘍血管内皮薬の抗腫瘍効果の一端を担うと考えられる血管新生抑制細胞における LAT1 の発現亢進は，ある程度の一般性を作用を報告した23）．腫瘍組織は，血管新生促進因子を分持った病態特異的な現象であると想定される．

泌し，周辺組織から新たな血管の形成を誘導する．新生

血管内皮細胞の LAT1 遺伝子を欠損させたコンディ

血管は，酸素・栄養を供給して腫瘍組織の成長に寄与す

ショナルノックアウトマウスを用いて作製したマウスメラノー

るとともに，老廃物の排泄経路や，転移経路としても機

マ B16-F10 細胞の皮下移植腫瘍モデルでは，野生型マ．この病的な血管新生を標的とするがんの治療

ウスに比べて腫瘍組織内の血管密度が低下し，腫瘍成長法が血管新生阻害療法であり，既に抗 VEGF-A 抗体なが有意に抑えられる（図4B）．すなわち，腫瘍血管内皮どが臨床で実用化されている．

細胞の LAT1 は，血管形成を介して腫瘍の増大に寄与し

能する

32）

図４

腫瘍血管内皮細胞における LAT1 の発現と LAT1 の阻害による血管新生抑制効果

Ａ．ヒト膵管がん組織では，がん細胞（黒矢印）に加えて，腫瘍間質の血管内皮細胞（赤矢頭）にも LAT1 が発現する．
正常な膵臓組織の血管内皮細胞には，LAT1 の発現は見られない．
Ｂ．血管内皮細胞の LAT1 遺伝子が欠損したコンディショナルノックアウトマウス（赤）では，野生型マウス（白）に比べてマウスメラノーマ B16-F10 細胞の皮下移植腫瘍の成長が抑制され，腫瘍組織内の血管密度も有意に低下する．
Ｃ．LAT1 阻害薬 JPH203 投与群（赤）では，対照の非投与群（白）に比べて免疫不全マウス皮下移植腫瘍（ヒト膵臓
がん MIA PaCa-2 細胞）の成長が抑制され，腫瘍組織内の血管密度も有意に低下する．JPH203 投与量：25 mg/
Kg/Day．

25

総説－アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－ていることがわかる．また，ヒト膵臓がん MIA PaCa-2胞から腫瘍組織内に放出される血管新生促進因子の作用

細胞の免疫不全マウス皮下移植腫瘍モデルでは，LAT1が，血管内皮細胞の LAT1 発現亢進の一因となっている

阻害薬 JPH203 の投与によってやはり腫瘍成長が抑制可能性がある．

されると同時に，内部の血管密度が有意に低下する（図が ん 細 胞 株 に 対 す る 報 告 と 同 様 に，JPH203 は4C）．以上より，LAT1 阻害薬の in vivo での抗腫瘍効

HUVEC の 増 殖 を 抑 制 す る． さ ら に LAT1 の 阻 害 は，果には，がん細胞の LAT1 を標的とした増殖抑制効果に

VEGF-A 刺激による遊走・浸潤・管腔形成といった血管

加えて，腫瘍血管内皮細胞の LAT1 を標的とした血管新内皮細胞の血管新生関連機能をも抑制する．細胞内リン生抑制作用も寄与していると考えられる．

酸化シグナルの解析では，VEGF-A の受容体チロシンキ
ナーゼ VEGFR2 の下流に位置する mTORC1 の活性化

６． が ん 細 胞 - 血 管 内 皮 細 胞 間 に お け る LAT1 とが，JPH203 で顕著に阻害されることが示されている．
VEGF-A の刺激は，一般的な増殖因子のシグナル経路

VEGF-A の協調的機能
腫瘍血管内皮細胞で LAT1 の発現が亢進する仕組み（受容体チロシンキナーゼ -PI3K-Akt-TSC1/2）を介してはまだ充分に明らかになっていないが，ヒト臍帯静脈

mTORC1 へと伝わる（図２参照）．しかし，LAT1 の阻内皮細胞 HUVEC (Human umbilical vein endothelial

害はこの経路の活性には影響しない．アミノ酸（ロイシ

cells) を用いた解析では，VEGF-A (Vascular endothe-

ンやグルタミンなど）は，リソソーム膜への mTORC1

lial growth factor - A) や FGF-2 (Fibroblast growthのリクルートを制御し，増殖因子とは異なる仕組みで

factor-2) などの血管新生促進因子によって，転写レベmTORC1 の活性化に寄与することが多くの研究で明ら

ルで LAT1 の発現が誘導される．したがって，がん細かになっている19）．VEGF-A 刺激下の腫瘍血管内皮細図５がん細胞と腫瘍血管内皮細胞間の LAT1 と VEGF-A の協調的機能

腫瘍血管内皮細胞における LAT1 の発現は，血管新生を促進してがんの成長と進展に寄与する．LAT1 によるアミノ酸の取り込みは，VEGF-A 依存的な血管新生促進シグナル経路において，血管内皮細胞の遊走・浸潤・管腔形成といった細胞機能を制御する mTORC1 の活性化のスイッチング機構として機能する．また，血管内皮細胞における病態特異的な LAT1 の発現誘導には，がん細胞から放出される VEGF-A（および FGF-2）の作用が寄与している可能性がある．

26

総説－アミノ酸トランスポーター阻害薬によるがん治療

胞では，LAT1 がこのアミノ酸シグナルの入力を担い，－研究の展開と解明が進むユニークな抗腫瘍効果の発現機序－(1998).

mTORC1 活性化のスイッチング機構として血管新生に

３）Kanai, Y.: Amino acid transporter LAT1 (SLC7A5)

寄与するものと考えられる．以上より，がん細胞と腫瘍

as a molecular target for cancer diagnosis and血管内皮細胞の間には，血管新生への寄与を通じてがん

therapeutics, Pharmacol. Ther., 107964 (2021).

の成長と進展を促進する，LAT1 と VEGF-A の協調的

[Online ahead of print]

な機能の存在が想定される（図５）．

４）Yanagida, O. et al.: Human L-type amino acidtransporter 1 (LAT1): Characterization of func-

７．おわりに
LAT1 阻害薬によるがん治療研究は，近年著しい進展

tion and expression in tumor cell lines, Biochim.

Biophys. Acta., 1514, 291 (2001).

を見せている．最近の研究では，in vivo での抗腫瘍効

５）Meier, C. et al.: Activation of system L heterodi-

果の新たな発現機序として血管新生抑制作用が示されmeric amino acid exchangers by intracellularた23）．がん細胞の LAT1 を標的とした増殖抑制効果に加substrates, EMBO J., 21, 580 (2002).

えて，腫瘍血管内皮細胞の LAT1 を標的とした血管新生

６）Yan, R. et al.: Structure of the human LAT1–抑制作用を併せて持つ LAT1 阻害薬は，ユニークな機序

4F2hc heteromeric amino acid transporter com-の抗がん薬として期待される．このような知見は，効果

plex, Nature, 568, 127 (2019).

的な治療法の提案にも重要な示唆を与える．たとえば，

７）Lee, Y. et al.: Cryo-EM structure of the human

LAT1 阻害薬と既存の血管新生阻害薬（抗 VEGF-A 抗体

L-type amino acid transporter 1 in complex withや抗 VEGFR2 抗体など）は，併用療法の組み合わせとglycoprotein CD98hc, Nat. Struct. Mol. Biol.,

して興味深い．腫瘍組織の成長は，がん細胞と様々な非

26, 510 (2019).

がん細胞（腫瘍関連マクロファージ，がん関連線維芽細

８）Yamashita, A. et al .: Crystal structure of a胞，骨髄由来免疫抑制細胞，腫瘍血管内皮細胞，その他

bacterial homologue of Na ＋/Cl －-dependentの免疫細胞など）の間の相互作用で支えられている33）．

neurotransmitter transporters, Nature, 437, 215

腫瘍血管内皮細胞と同様に LAT1 の発現が病態特異的に(2005).

亢進していれば，これらの間質細胞も LAT1 阻害薬の新９）Kageyama, T. et al.: The 4F2hc/LAT1 complex

たな作用標的となり得る．
またそうでなかったとしても，

transports L-DOPA across the blood-brain bar-

LAT1 阻害薬が腫瘍血管新生の抑制を介して，多様な腫

rier, Brain. Res., 879, 115 (2000).

瘍構成細胞の挙動にどのような影響をあたえるのかを検₁₀）Sinclair, L. V. et al .: Control of amino-acid

討する意義は大きい。LAT1 阻害薬が，腫瘍 - 間質相互transport by antigen receptors coordinates the

作用にどのように介入するのかを明らかにすることは，

metabolic reprogramming essential for T cell

その抗腫瘍効果の全容理解と実用化に向けてますます重diﬀerentiation, Nat. Immunol., 14, 500 (2013).

要になると思われる．

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₂₂）Yothaisong, S. et al.: Inhibition of L-type aminoacid transporter 1 activity as a new therapeutictarget for cholangiocarcinoma treatment, Tumor

Biol., 39, 1010428317694545 (2017).
₂₃）Quan, L. et al.: Amino acid transporter LAT1

5740 (2016).
₃₁）Singh, N. et al.: Discovery of potent inhibitors
for the large neutral amino acid transporter 1(LAT1) by structure-based methods, Int. J. Mol.

Sci., 20, 27 (2018).
₃₂）Hanahan, D. & Weinberg, R. A.: Hallmarks ofcancer: The next generation, Cell, 144, 646(2011).

in tumor-associated vascular endothelium₃₃）Bejarano, L. et al.: Therapeutic targeting of thepromotes angiogenesis by regulating cell prolif-

tumor microenvironment, Cancer Discov., 11,eration and VEGF-A-dependent mTORC1 activa-

933 (2021).

tion, J. Exp. Clin. Cancer Res., 39, 266 (2020).
₂₄）Enomoto, K. et al.: A novel therapeutic approach for anaplastic thyroid cancer throughinhibition of LAT1, Sci. Rep., 9, 14616 (2019).
₂₅）Rosilio, C. et al.: L-type amino-acid transporter 1

28

39 (2017).

研究報告

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究
酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究

酸化還元酵素融合低分子抗体を用いた次世代型電気化学イムノセンサーの開発
浅野させた場合のみ，酵素活性を保持しており，抗原への結合活性も認められた．そこでセンシング素子として用いて EGFR の検出検討を行った結果，蛍光検出に加えて，

竜太郎

濃度依存的な電気化学的な検出にも成功した．
一方，
カー（東京農工大学大学院工学研究院）

ボンナノチューブ結合性ペプチドを融合させた抗 EGFR
抗体は，大腸菌を用いた発現は認められたものの発現量が低く，精製には至らなかった．

【目的】
現在，高感度，簡便，迅速に診断が可能なセンシン【考察】

グ技術の開発が求められている．電極に固定化した捕連結モジュールを用いた手法は，グルコース脱水素酵

捉抗体と，酸化還元酵素で標識した検出抗体を用いて素（GDH）では良好な結果が得られていたが，AvLOx

ELISA 様に測定する電気化学イムノセンサーに期待がでは酵素活性の著しい低下がみられた．これは，使用し寄せられているが，検出抗体の不均一な酸化還元酵素修た連結モジュールが基質の結合を阻害したためであると飾，捕捉抗体の電極表面への不均一な固定化が実用化に考えている．

向けた課題となっている．

【文献】

そこで，低分子抗体と酸化還元酵素を遺伝子工学的に

１）Kimura, H., Miura, D., Tsugawa, W., Ikebukuro,

融合させると共に，捕捉抗体も電極結合性ペプチドを融K. Sode, K. & Asano, R.: Rapid and homoge-

合させることで，電極表面への簡便な固定化と配向性のneous electrochemical detection by fabricating

制御を目指した．

a high aﬃnity bispeciﬁc antibody-enzyme com-【方法】

plex using two Catcher/Tag systems, Biosens.

がんマーカーである上皮増殖因子受容体（EGFR）のBioelectron., 175, 112885 (2021).

計測をモデルに，抗 EGFR 抗体と Aerococcus viridans
由 来 の 乳 酸 酸 化 酵 素（AvLOx） の 融 合 を 目 指 し た．

AvLOx はホモ四量体を形成するため，融合させた抗体

腸管における硫酸基転移酵素を介した炎症抑制機構の結合価数も四価となり，親和性の向上による高感度検の解明出が期待できる．また独自に，変異導入による脱水素酵

安

保

博

仁
（千葉大学薬学研究院）

素化に成功しており，溶存酸素の影響を著しく低減させている．
一方，
電極結合性ペプチドはカーボンナノチュー
ブ結合性ペプチドを用いた．

【目的と意義】
炎症性腸疾患は日本を含む先進国で患者数が増加して【結果】
申請者は近年，連結モジュールを利用した抗体酵素いる疾患で，腸管において過剰な炎症が持続する難治性複合体の簡便な創製法の開発と，これをセンシング素の慢性疾患である．遺伝的要因，環境的要因が複雑に組子として用いた電気化学検出を報告した ．そこで，抗み合わさり発症することから，決定的な治療ターゲット

EGFR 抗体と AvLOx の遺伝子工学的な融合に加えて，は未だ見つかっておらず，さらなる研究が求められてい連結モジュールを用いた融合も試みた．それぞれ，大腸る．

１）

菌発現系を用いて調製したところ，遺伝子工学的に融合

Muc2 ムチンは大腸および小腸において，腸管上皮細29

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

胞，
特に杯細胞から分泌され粘液層を形成する．そのノッ【考察】

クアウトマウスは，腸組織への細菌の侵入が増加し腸本研究により，腸管における硫酸化糖鎖が持つ機能が炎を自然発症することから，Muc2 は腸管上皮のバリア

明らかになり，未解明な点が多い硫酸基転移酵素の生理機能に大きく寄与していると言える．また Muc2 は多機能に関する知見を蓄積することができた．今後は，腸数の O-型糖鎖修飾を受けるが，これら O-型糖鎖の欠損

炎病態における更なる機能解析を進めていく計画であマウスは DSS 腸炎の悪性化が報告されている．つまり，る．

Muc2 の O-型糖鎖修飾は腸炎病態と深く関わることが示されており，この糖鎖修飾を理解することは炎症性腸疾患の病態を解析する上で非常に重要である．
申請者らは，硫酸基転移酵素 GlcNAc6ST-2 ノックア

糸状菌 P450 酸化酵素の反応改変および立体構造解析
淡ウトマウスを作製し，腸管における Muc2 糖鎖の硫酸

川孝

義（東京大学大学院薬学系研究科）

化について解析したところ，O-型糖鎖の硫酸化が欠損することを見出した［Tobisawa., et al. J Biol Chem.
2010］．そこで本研究では，GlcNAc6ST-2 ノックアウ【目的】

トマウスを用いて，「ムチン糖鎖硫酸化は炎症性腸疾患

微生物の酸化酵素は反応性に富む．医薬品骨格生合成

病態にどのように寄与するか」を明らかにすることを目に関わるものも多く，この有用な生体触媒の構造解析を的とした．

行い，触媒機能の改変を行うことで，新たな医薬品合成【方法】に繋げることができる．細菌由来 P450 酸化酵素は構造①

解析が容易である一方，糸状菌由来の酵素は膜結合型でマウス腸炎モデルを用いた解析
GlcNAc6ST-2 ノックアウトマウスに腸炎モデルでああり，構造解析は容易ではない．研究代表者は，糸状菌る DSS 腸炎を適用することで，GlcNAc6ST-2 は腸炎病由来でありながら，膜結合部位を持たず，大腸菌可溶化態を悪化させるか，あるいは抑制するのかを明らかにすP450 酸化酵素 AscE を同定し，その反応解析に成功しる．また，qPCR により炎症性サイトカインの発現も同た１,２）．AscE 骨格を糸状菌酸化酵素へ適応することで時に解析する．

可溶化酵素を作成し，その構造解析につなげることを計②

カルノア固定法を用いたムチン層の観察
大 腸 組 織 切 片 を Muc2 抗 体 お よ び 腸 内 細 菌 を 染

色 す る EUB338 プ ロ ー ブ で 染 色 す る こ と に よ り，GlcNAc6ST-2 が腸内細菌の侵入に影響を与えるかを解
析する．
【結果】
GlcNAc6ST-2 ノックアウトマウスは，DSS 腸炎において顕著な体重減少を示した．また，qPCR を用いた解析から，GlcNAc6ST-2 ノックアウトマウスにおいて炎

図１

糸状菌 P450 融合キメラ酵素のデザイン

症性サイトカインの発現上昇がみられた．また，カルノ
ア固定法を用いたムチン層の解析から，GlcNAc6ST-2
ノックアウトマウスの大腸では，腸管上皮細胞と腸内細菌の距離が近接していた．以上の結果から，ムチン糖鎖
硫酸化修飾は腸管バリア機能に必須の糖鎖修飾であり，炎症抑制的に働くことが示唆された．

30

図２

L-valine からの TqaLFM 反応による 2-aminoisobutyric acid (AIB) 合成反応

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成画した．さらに新たな糸状菌由来酸化酵素発掘を目指し

egyptiacum. Proc. Natl. Acad. Sci. 1, 19254て，アミノ酸より特異な化学骨格を合成する酸化酵素の(2019).

発掘を行った．
【方法】

２）Quan, Z., Awakawa, T., Wang, D., Hu, Y. & Abe,I.: Multidomain P450 Epoxidase and a Terpene

AscE の ヘ ム 結 合 ド メ イ ン と， 糸 状 菌 由 来 膜 結 合

Cyclase from the Ascochlorin Biosynthetic Path-型 P450 の対応部位を入れ替えることで，糸状菌由来

way in Fusarium sp. Org. Lett. 21, 2330 (2019).

P450 酸化酵素の大腸菌での発現，可溶化について検討

３）Lv, J. M. et al.: Biosynthesis of Biscognienyne

を行った．
有用物質合成に関わる糸状菌酸化酵素の発掘，

B Involving a Cytochrome P450-Dependent Al-

機能解明のため，アジリジン生合成酵素の同定，触媒機

kynylation. Angew. Chemie-Int. Ed. 59, 13531

能の同定を試みた．

(2020).

【結果】

４）Bunno, R., Awakawa, T., Mori, T. & Abe, I.:

AscE のヘム結合ドメインと膜結合型 P450 PesE３）を

Aziridine Formation by a FeII/α-Ketoglutarate

入れ替えることで，これまで不可能だった糸状菌由来

Dependent Oxygenase and 2-Aminoisobutyrate

P450 酸化酵素の大腸菌での発現，可溶化酵素を用いてBiosynthesis in Fungi. Angew. Chemie-Int. Ed.

の活性検出を試みた（図１)．その結果，三重結合を持60, 15827 (2021).

つ PesE 生産物がわずかに検出され，膜結合型 P450 酵
素が機能を保ったまま，可溶化された．現在，N 末膜結合型領域，Loop との細胞膜との相互作用に注目して，膜結合型 P450 酸化酵素の大腸菌でのさらなる可溶化，
機能向上のための検討を進めている．

Penicillium 属糸状菌より見出したα-ketoglutarate 依

視覚における活性酸素産生酵素（Nox）の全く新しい機能・生理的意義の解明
上

山

健

彦

（神戸大学バイオシグナル総合研究センター）

存性酸化酵素 TqaL を大腸菌で His-tag 付き組換え酵素として発現，精製し，in vitro 反応を試験した．その結【目的】

果，TqaL は L-valine よ り pleurocybellaziridine を 生

活性酸素産生酵素（NADPH oxidase: Nox）の網膜成することを明らかにした ( 図２)．次いで，TqaL タンでの発現や生理的機能については，全く不明と言ってパク質結晶構造解析によって，2.0 Å解像度の回折デーも過言ではない．本研究では，Nox promoter の下流にタを取得した．さらに，TqaL 産物の加水分解に関わる

Nox に代わり Cre recombinase を発現するノックイン

TqaF，その産物を酸化的脱炭酸する金属酵素 TqaM をマウス（Nox-CreKI）を作製し，Nox 発現細胞が赤色蛍同定し，新規酸化酵素発掘に成功した４）．以上より，ア

光 tdTomato で標識されるマウスを作出する．このマジリジン骨格の合成，修飾に関わる生合成酵素の同定にウスを用いることで，網膜での Nox 発現細胞を同定し，初めて成功した．

Nox 由来 reactive oxygen species (ROS) の視覚におけ【考察】る機能解明，Nox 由来 ROS が関与する網膜疾患の機序

糸状菌酸化酵素の大腸菌での機能化に成功し，構造解解明と新規治療法開発に繋げようというものである．

析のための基盤となる知見を取得した．また，自然界に【方法】

おいて初の糸状菌由来アジリジン骨格合成酸化酵素の同１．Nox promoter の下流に Nox に代わり Cre recom-

定とその結晶構造解析に成功し，今後の構造情報を基盤

binase を発現するノックインマウス（Nox-CreKI）をとしたエンジニアリング，物質生産の道を開いた．

作製し，レポーターマウス CAG-STOPflox-tdTomato【文献】との交配により，Nox 発現細胞が赤色蛍光 tdTomato１）Araki, Y. et al.: Complete biosynthetic pathways

で標識されるマウス（Nox-CreKI; tdTomato）を作出

of ascofuranone and ascochlorin in Acremonium

する．

31

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

２．このマウスを還流固定し，眼球を摘出，網膜を観音

ROS 産生を誘発し，産生された ROS が，自身及び周囲状開きにし，網膜全体での tdTomato 陽性細胞数を蛍の細胞を脱落させるため」である事を，Nox-KO マウス

光顕微鏡下で経時的（開眼前の生後７日，開眼後の生を用いた実験により明らかにした．

後 21日, 28日, 2, 4, 6, 12 ヶ月齢）に計測する．又，【参考文献】

網膜切片を作製し，tdTomato 陽性細胞が，網膜 10

論文準備中

層中どの層に分布し，どの細胞種なのかを種々の抗体を用いた免疫染色により明らかにする．
３．2, 4, 6 ヶ月齢のホモ Nox-KO 及びヘテロ KO マウ
スに，網膜毒性で有名な抗癌剤シスプラチン（CDDP）
を腹腔内投与する．
投与７日後にマウスを還流固定し，皮膚バリア機能修復療法の提唱に向けた新規膜貫通型因子のリパーゼ活性の実証
大

垣

隆

一
（大阪大学大学院医学系研究科）

眼球を摘出，上記の要領で網膜全体での tdTomato 陽性細胞数を計測・比較する．
【結果】

【目的】

１．Nox-Cre ; tdTomato を作出した．
KI

表皮組織特異的発現を示す新規因子 LIPX の遺伝子

２．網膜全体での tdTomato 陽性 Nox 発現とその細胞

ノックアウトマウス（KO マウス）は，皮膚バリア機能

数と経時的変化を観察すると，tdTomato 陽性細胞数の破綻を示し，過度の水分蒸散によって出生直後に死亡

は，開眼後，経時的に増加することを発見した（未報する．野生型マウスの表皮最外層の角質層では，規則告）．

的に配列した脂質の周期構造を反映した「角質細胞間脂３．網膜切片を用いて，網膜 10 層内での tdTomato 陽質ラメラ」が観察され，これが皮膚バリア機能の実体を性細胞の存在を確認した．神経系細胞を標識するた成す重要な生体内構造であることが知られている．しかめ Pax6, Thy1 染色，双極性細胞標識のため Chx10,

し，KO マウスの角質層では，角質細胞間脂質ラメラにPKCα染色，水平細胞標識のため Calbindin 染色，ミュ

構造的な異常が見られ，脂質恒常性が破綻していること

ラ ー グ リ ア 細 胞 標 識 の た め Glutamine synthetase,が想定される．LIPX はリパーゼ様の膜タンパク質であS100b 染色を行った結果，tdTomato 陽性細胞種を同るが，その分子機能の詳細は未だに不明である．本研究定した（未報告）．

は，LIPX のリパーゼ活性を実証するとともに，その反４．網膜毒性で有名な抗癌剤シスプラチン（CDDP）の応基質および生成物の脂質分子種を同定し，LIPX が皮

腹腔内投与後，網膜全体での tdTomato 陽性細胞数を膚バリア機能の形成と維持に果たす役割の解明を目的と比較したところ，ヘテロ KO マウスで見られる CDDPして実施した．

投与による tdTomato 陽性細胞減少が，ホモ Nox-KO【方法と結果】

では統計学的有意差を持って低下する事を見出した
（未報告）
．
【考察】

リピドミクス解析による LIPX の反応基質と生成物の絞り込みに向けて，野生型新生仔マウスの表皮組織およ
びその角質層から，Bligh-Dyer 法によって脂質を抽出

現在に至るまで，網膜での Nox 発現やその生理機能するプロトコールを確立した．また，ヒト胎児腎臓由について言及された論文は，極めて少ない．本研究で来 HEK293 細胞を改変した Flp-In T-REx293 細胞を用

我々は，網膜にも ROS の発生源として Nox が発現していて，ドキシサイクリン誘導性の発現系を構築した．こおり，その発現細胞数が，開眼後に増加することを見出の細胞に，LIPX 分子のＣ末端に 3xFlag タグを付加しした．加えて，Nox 発現細胞種を同定した．更に，抗た LIPX-3xFlag を発現させ，細胞を破砕して調製した癌剤シスプラチン（CDDP）の有名な網膜・視神経毒性（球粗膜画分から，抗 Flag 磁気ビーズを用いて精製タンパ

後性視神経炎による霧視が最多）の原因・機序の少なくク質を得ることに成功した．リパーゼファミリーで高度とも１つとして，「シスプラチンが Nox 陽性細胞からのに保存されているセリンプロテアーゼ様の触媒三つ組残32

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

基（セリン，アスパラギン酸，ヒスチジン）は，LIPX

種であるが，膵臓がんとの関係は不明である．さらに，においても予想される活性中心に保存されている．そこ

RF 経路と MEK の阻害剤の組み合わせは，4-hit ハエので，LIPX の三つ組み残基をアラニンに置換し，ネガティ

生存率を大幅に回復させた．そこで本研究では，膵臓がブコントロールとして用いるための活性消失変異体の発んのがん形質における RF 経路の役割を解明し，RF 経

現・精製系も同様に構築した．

路と MEK の共阻害が新規膵臓がん治療法として有効性【考察】であるか検討する．

本研究の成果として，表皮組織および角質層からの脂【方法】

質抽出法と，精製 LIPX タンパク質の発現・精製法が確

まず，ヒト膵臓がん細胞を三次元培養し，RF 経路と立され，反応基質と生成物を同定するためのリピドミク

MEK の阻害剤の添加がスフェロイドの大きさや数に与ス解析実施に向けた重要な技術基盤を整えることが出来える影響を調べた．次に，膵臓がん細胞を RF 経路阻害

た．今後，野生型および変異体 LIPX の精製タンパク質剤で処置し，液体クロマトグラフィー質量分析法によると，角質抽出脂質を反応させて，反応前後のサンプル間

細胞内の RF 経路の代謝産物（FMN・FAD）の測定との比較リピドミクス解析を実施することで，反応基質とMTS 試験（CellTiter 96

生成物の候補となる脂質分子種の絞込みをおこなう予定

Proliferation Assay; Promega）を実施した．さらに，

である．LIPX の反応生成物である脂質分子種には，角マウスへの阻害剤投与の予備実験として，マウスの体重

質層の脂質の恒常性を回復させて，破綻した皮膚バリア減少や行動異常の見られない RF 経路阻害剤の最大投与機能を改善する機能が期待できる．そこで，KO マウス

量を決定し，その量で薬物動態試験を行った（メディシの皮膚に塗布することで，皮膚バリア機能修復効果の有

ロン社に委託）．

無を検証する．本研究の成果は，アトピー性皮膚炎や先【結果】

天性魚鱗癬などの皮膚バリア疾患の病態理解と新規治療法の提唱にも繋がるものと期待している．

Aqueous One Solution Cell

本研究ではまず，膵臓がん細胞における RF 経路と
MEK 阻害剤の影響を検討した．その結果，10μM のRF 経路阻害剤や 10nM の MEK の阻害剤の単独処置は

RF 経路による膵臓がん形質の促進機構の解明
大

塩

貴

子
（北海道大学遺伝子病制御研究所）

スフェロイド形成を抑制し，それらを組み合わせるとその効果が増強した．また，RF 経路阻害剤は，膵臓がん
細胞内の FMN と FAD の量とミトコンドリアの呼吸鎖の活性を濃度依存的に低減した．さらに，マウスへの腹腔内投与時の RF 経路阻害剤の最大耐用量は 10mg/kg，【背景と目的】膵臓がんは種々のがんの中で最も予後が悪く，その最高血中濃度は 7.6μM だった．
【考察】

発生機序の解明や新規治療法の開発は極めて重要な福RF 経路阻害剤を最大耐用量でマウスに投与した時の祉課題である．申請者らは最近，膵臓がん患者の中でも最高血中濃度は，膵臓がん細胞のスフェロイド形成を抑最も予後不良の群で観察される４遺伝子変異（がん遺制した濃度とほぼ同等であり，RF 経路と MEK の共阻伝子 KRAS の活性化，がん抑制遺伝子群 TP53・P16・

害が膵臓がんの新規治療法として有効であることが示唆

SMAD4 の不活性化）を模倣した初の動物モデル，4-hit

された．今後は，膵臓がん細胞を同所移植したマウスにショウジョウバエの作出に成功した．この 4-hit ハエは，RF 経路と MEK の阻害剤を同時投与し，腫瘍の大きさ

腫瘍細胞の過剰な増殖・浸潤により，成虫になる前にや転移能，マウスの生存期間への影響を検討する予定で全個体が死亡した．申請者らは，このハエを用いて全キある．

ナーゼの遺伝学的スクリーニングを実施し，リボフラビ【文献】

ン（RF）経路や MEK の阻害がこのハエの致死表現型

Yamamura, R.*, Ooshio, T.*, & Sonoshita, M.: Tiny

を救済することを見出した．RF は水溶性ビタミンの一

Drosophila makes giant strides in cancer research.
33

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

Cancer Sci., 112, 505-514 (2021). *equal contribu-

移する α-マンノシド -Gal f 転移酵素 (Mgf) に関する情tion

報は全く知られていなかった．近年，我々は Mgf は「ゴルジ体に局在する機能未知Ⅱ型膜タンパク質の中にあ糸状菌より見出された新規な α -マンノシドβ-ガラク
トフラノース転移酵素の機能解明
岡拓る」という仮説に基づいて遺伝子の同定を試みた．その結果，MgfA と名付けたタンパク質が Man 残基に Gal fを転移する酵素であることを明らかにすることができ二た（図１）．本研究では MgfA およびそのオルソログ酵（崇城大学生物生命学部）

素の性状と機能を明らかにすることを目的とした．
【結果および考察】
MgfA と５個のパラログ（MgfB〜MgfF）について大【目的】
真 菌 型 ガ ラ ク ト マ ン ナ ン (FTGM) は， -(1→ 5)-/

腸菌発現系を用いた組換え酵素の発現を試みた．その-(1→6)-ガラクトフラノース（Gal f ）残基と α-(1→ 2)-/

結果，６個すべてのタンパク質に関して組換えタンパ

α-(1→ 6)-マンノース（Man）残基で構成される糖鎖でク質を得ることが出来た．特に，MgfA と MgfB では大あり，α-マンナン鎖と Gal f 糖鎖は -(1→ 2)-,-(1→ 3)-量に発現（＞5 mg/L）した．組換え酵素を Gal f 転移酵

あ る い は -(1→ 6)-結 合 で 連 結 さ れ て い る（ 図 1）．

素活性測定系に供したところ，MgfA と MgfB で 4-メチ

FTGM は，細胞外や細胞の表層に局在することから，

ルウンベニフェリル- α -マンノシド（4MU-α -Man）を

病原性真菌の「宿主細胞と最初に接触する分子」であ

受容基質，UDP-Gal f を糖供与基質したときに，酵素る．このことから FTGM は，病原性真菌の感染機構や反応産物への転換が認められた（図２）．MgfC, MgfD,

毒性の発揮に関与していると考えられている．我々は，

MgfE および MgfF については Galf 転移活性が認めら

これまでの研究においてマンナン主鎖生合成を担う α-れなかった．MgfA および MgfB の酵素反応産物を -ガ

マンノシド α-( 1→ 2 )-Man 転移酵素である CmsA およ

ラクトフラノシダーゼによって消化したところ，全てび CmsB と Gal f 糖鎖生合成を担う -ガラクトフラノシ

4MU-α-Man に変換された．また，酵素反応産物を精製

ド -(1→ 5)-Gal f 転移酵素である GfsA および GfsC をし，1H-NMR およびメチル化分析によって構造の決定

同定してきた．しかし，α-マンナン鎖に Galf 残基を転を行ったところ共に Gal f - -(1→ 6)-Man-α-4MU である
ことが明らかになった（図３）．以上のことから，MgfA
お よ び MgfB は α-マ ン ノ シ ド -(1→ 6 )-Gal f 転移酵素

図２

図１

34

FTGM の構造と生合成酵素

MgfA および MgfB の α-マンノース残基に対するガラクトフラノース転移活性

図３

MgfA 酵素反応産物の 1H-NMR 解析

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成であることを明らかにした．すなわち，MgfA および酵素を４種同定した．そこで，本研究課題の目的・意義

MgfB は，α-Man 残基の６位の水酸基に -結合で Gal f

はこれまで申請者が確立した膨大な解析手法や材料を駆残基を転移する反応を担う酵素であり，これは全生物を使し，全く新たな概念「カルシウムによって制御される

通じて初めての発見であった．

PDI ファミリー酵素による基質認識」の作用機序を明らかにすることで，「幅広い基質をターゲットとする酵素

カルシウムによる PDI ファミリー酵素の構造機能
制御の理解
奥

村

基質反応」の理解の深化を目指す．以上，本計画課題の意義は，酵素による多種多様な基質の「分子認識」，「品質管理」，「ジスルフィド結合の触媒反応」という重要な正樹（東北大学学際科学フロンティア研究所）

問題を対象とし，未だ明らかでない小胞体内カルシウムの生理学的意義を探究する点にある．
以上，原子，分子，細胞レベルで，カルシウムにより【目的】
細胞内小器官の１つである小胞体は新たに合成された制御される PDI ファミリー酵素の構造機能相関を探究
し，小胞体におけるタンパク質品質管理に関する新たな蛋白質が立体構造を獲得する環境であり，蛋白質の品質概念を打ち立てることを目指す．

が管理されている．小胞体は他の細胞内小器官と比べ比【方法】

較的酸化的な環境にあり，蛋白質内のシステイン残基間■ PDI ファミリー酵素による基質認識のカルシウム依でジスルフィド結合の形成が促進される．全タンパク質

存的な制御の約 1/3 はジスルフィド結合の形成を伴う蛋白質の立

等温滴定型熱量計を用いて，PDI ファミリー酵素であ体構造形成を小胞体で受けると言われており，その基る P5, ERp57, ERp72, PDI がカルシウムと結合するこ質には生物学的にも医学的にも重要な免疫グロブリンやとを見出した．そこでＸ線結晶構造解析および NMR をインスリンなどが知られている．例えばインスリンの場

用いて，カルシウムが結合する部位を同定する．これま合 A-B 鎖間の天然型ジスルフィド結合様式が形成されでに我々は，他の PDI ファミリー酵素 ERp46 (Kojima#,

ないとアミロイド線維を形成するといった性質があり，

Okumura# et al., Structure 2014 (# 同 等 貢 献 ))，P5

ジスルフィド結合形成は天然構造の構築だけでなく，ア(Sato#, Kojima#, Okumura#, et al., Sci Rep 2013 (#ミロイド線維に伴った疾病との強い関係性がある．しか同等貢献 )) の構造決定に成功しノウハウを蓄積していしながら，たった３本のジスルフィド結合で構成されてるため，遂行が可能である．カルシウム結合によっているインスリンでさえ，未だジスルフィド結合形成経路

PDI ファミリー酵素による基質触媒反応にどのように影やその触媒のしくみは不明であり，その根底にある個々響を与えるのか，① RP-HPLC と MALDI-TOF/MS を用の酵素による触媒システムの理解は急務であった．そいジスルフィド結合位置のモニタリング，②アミロイドの触媒システムの根幹を担う 20 種類以上もの Protein

線維を特異的に検出するチオフラビン蛍光を用いたシャ

DisulﬁdeIsomerase (PDI) ファミリー酵素は特定の基質

ペロン機能の評価，により検証する．得られた成果は，を標的にしているのではなく，幅広い基質をターゲット

小胞体内カルシウム枯渇剤タプシガルジンを用い，細胞にしており，「１酵素に対して１基質の概念」が通用し生物学的検証にフィードバックし，生理的意義を追求すないため，PDI ファミリー酵素による基質認識に関するる．

普遍的知見は得られていない現状である．

■カルシウム存在下酵素基質反応の可視化

また細胞内小器官の１つである小胞体は細胞内のカカルシウム結合型 PDI ファミリーによって基質を触ルシウム貯蔵庫として働き，約〜１mM のカルシウム

媒する様子をリアルタイムで可視化する．手法は，既濃度が保たれている．そこでカルシウムが PDI ファミにノウハウの蓄積がある高速原子間力顕微鏡（高速リー酵素の機能制御に関わっていると仮説を立て，これAFM）を用いる．本手法は構造と動的挙動を同時に調までに申請者はカルシウムと結合する PDI ファミリー

べることができ，PDI ファミリー分子をサブ 100 ms の35

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

時間分解能，数 nm オーダーの空間分解能で直視する

わち，カルシウム非存在下の方が存在下に比べ，複合体

ことが可能であり，酵素基質反応の可視化が可能であるを強く形成することを ITC や 2D-PAGE により検証した．

（Okumura*, et al., Nature Chemical Biology 2019）．

さらに，これら複合体は酸化的フォールディングの触媒「大きさ」や「形」そして「ジスルフィド結合の本数」の加速と，凝集抑制効果を示し，複合体形成とその機能が 違 う 基 質， す な わ ち HLA (Human leukocyte anti-

について新たな機序を明らかにした２）．

gen) や BPTI (Bovine Pancreatic Trypsin Inhibitor) を【考察】

使用することで，カルシウムにより制御される PDI ファ

PDI family は小胞体内のタンパク質品質管理に関わ

ミリ−酵素の構造機能相関を探究し，各論的および普遍

り，品質管理の破綻によるミスフォールド体の蓄積を起的知見を得る．

因とする様々な疾患の原因となっていることが指摘され【結果】ているが３），未だ根底にある分子メカニズムが不明であ哺乳動物細胞の小胞体において，酸化的フォールディ

る．近年申請者らのグループによって，高速 AFM によ

ングの触媒や小胞体ストレス応答因子である IRE1 の機

る PDI による基質認識の可視化に成功し４），１分子レ能制御能に関わる P5 はこれまで構造未知なためその作

ベルでの触媒機序の一端を明らかにしつつあり，今後１

動原理は不明であった．今回Ｘ線小角散乱と SEC によ

分子観察による PDI family による酵素基質反応の可視る構造解析より，そのＮ末端に存在するチオレドキシ化の研究が本格化すると予測される５）．

ン様ドメイン a0 が二量体化に関わることを明らかにし一方で，これら PDI family が局在する小胞体内は，た．これまで解かれていた結晶構造を基に，新たに a0カルシウムが 〜1 mM と豊富に存在するが，これまでカドメインに二量体化に重要な Leu-Val adhesive motif

ルシウム存在下での PDI family の構造機能相関の理解を見出した．二量体形成 motif として遺伝子調節に関は殆ど進んでいなかった．特に，本課題で構造決定した

わる Leu-zipper motif が非常によく知られるが，このP5 はカルシウム結合型の PDI family としても知られて

motif はアルファヘリックス２巻きごとに外側に露出しいたが，カルシウム非結合型の全長構造を本課題で決定た Leu 残基同士が平行に接着することで機能を発現す

した１）．さらに，ERp57 と CNX 複合体形成にカルシウる．
一方，
この Leu-Val adhesive motif はアルファヘリッムが関わることも証明し２），今後カルシウムによる PDI

クス１巻きごとに外側に露出した Leu/Val 残基同士がfamily の構造機能制御の研究が深化し，PDI family が逆並行に接着することを見出した．これら接着力を in

関与する疾患の理解が深まることを期待したい．

silico 比較すると，20 種類の Leu-zipper motif では−【文献】

15 から−20×10−3 (kcal/mol/A2) 程度の範囲の接着

１）Okumura, M., Kanemura, S., Matsusaki, M.,

力が見積もられたことに対し，Leu-Val adhesive motif

Kinoshita, M., Saio, T., Ito, D., Hirayama, C.,は−10×10−3 (kcal/mol/A2) であった．したがって，

Kumeta, H., Watabe, M., Amagai, Y., Lee, Y.H.

こ の motif は Leu-zipper motif よ り も 接 着 力 が 弱 く，

Akiyama, S. & Inaba, K.: A unique leucine-

Leu-zipper motif の母集団から外れ，新規な motif であvaline adhesive motif supports structure and

ることが示唆された．さらに，このモノマー化変異体はfunction of protein disulﬁde isomerase P5 via

artifact な分子間ジスルフィド結合種を生成するだけでdimerization, Structure (Cell Press) 29, 1-14

なく，部分構造の崩壊を起こしており，細胞内で小胞体(2021).

ストレスを引き起こしていた．以上の結果は，2021 年
Structure 誌に研究成果として発表した１）．

２）Tanikawa, Y., Kanemura, S., Ito, D., Lin, Y.,
Matsusaki, M., Kuroki, K., Yamaguchi, H.,

ERp57 と CNX の複合体形成が HLA (Human leuko-

Maenaka, K., Lee, Y.H., Inaba, K. & Okumura,cyte antigen) の酸化的フォールディングの触媒及び凝M.: Ca2+ Regulates ERp57-Calnexin Complex

集抑制に効果を示すか検証した．その際，本複合体形成

Formation. Molecules. 11; 26(10): 2853 (2021).

がカルシウムによって制御されることを見出した．すな

３）Matsusaki, M., Kanemura, S., Kinoshita, M.,36

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

Lee, Y.H., Inaba, K. & Okumura, M.: The Pro-

表データのため遺伝子名の詳細は非公開）．細胞増殖能tein Disulﬁde Isomerase Family: From Proteos-

は各 siRNA による遺伝子発現抑制の２日後に細胞数をtasis to Pathogenesis” Biochimica et Biophysica

測定することにより評価した．また，各 siRNA による

Acta-General Subjects 1864, 129338, (2020).

遺伝子発現抑制の２日後から低血清培地による筋分化を

４）Okumura, M., Noi, K., Kanemura, S., Kinoshita,

誘導し，分化マーカーであるミオシン重鎖（MyHC）を

M., Saio, T., Inoue, Y., Hikima, T., Akiyama, S.,

蛍光免疫染色し形態的な変化，筋管細胞の長さ，分化指Ogura, T. & Inaba, K..: Dynamic Assembly of

数を算出することで筋分化能を評価した．

Protein Disulﬁde Isomerase in Catalysis of Oxi-

【結果】

dative Protein Folding, Nature Chemical Biology
15, 499-509, (2019).

は じ め に，siRNA 処 理 の ２ 日 時 点 に 筋 芽 細 胞 株
C2C12 における各アミノペプチダーゼ遺伝子の発現が５）Okumura, M., Noi, K. & Inaba, K.: “Visualization

抑制されることを確認した．同様の条件において，アミof structural dynamics of protein disulﬁde isomerase enzymes in catalysis of oxidative folding
and reductive unfolding”

Current Opinion in

Structural Biology 66, 49-57 (2021).

ペプチド分解酵素による骨格筋量調節機構の解明
長名シオン（東北大学医工学研究科）

図１

アミノペプチダーゼ遺伝子発現抑制が筋芽細胞の増殖能に与える影響

図２

アミノペプチダーゼ遺伝子発現抑制が筋芽細胞の分化能に与える影響

図３

アミノペプチダーゼ遺伝子発現抑制が筋管細胞の形成に与える影響【目的】
骨格筋は日々の生活動作や運動を行うために不可欠な組織である．超高齢社会を迎える本国においてはサルコ
ペニア（加齢性筋萎縮）に伴う要介護者の増加が問題となっている．このような課題を解決するためにも骨格筋量の調節メカニズムを明らかにし，予防法などを開発する事が喫緊の課題である．本研究では骨格筋におけるア
ミノペプチダーゼの機能・役割を明らかにすることを目的とし，骨格筋におけるアミノペプチダーゼは骨格筋量の調節に寄与するという仮説を立てた .
【方法】
アミノペプチダーゼは基質特異性の異なる複数の分子が報告されている．それら種々のアミノペプチダーゼが骨格筋量の維持に必須となる筋芽細胞の増殖・分化にどのような役割を持つのかを明らかにするため，siRNAによるアミノペプチダーゼ遺伝子発現抑制が筋芽細胞の細胞増殖能・筋分化能に与える影響を検証した．ア
ミノペプチダーゼ遺伝子として Aminopeptidase-A〜
Aminopeptidase-K までの 11 遺伝子に着目した（未発37

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

ノペプチダーゼ遺伝子発現抑制が細胞増殖能に与える影響を検証した結果，アミノペプチダーゼ遺伝子 B, E, D,
F, G, H, I の発現抑制は細胞数を有意に減少させることヘテロクロマチンによる血管老化制御機構の解明
神

吉

康

晴

（東京大学アイソトープ総合センター）が明らかとなり，筋芽細胞の増殖に寄与するアミノペプ
チダーゼ遺伝子特定することができた（図１）．さらに，
アミノペプチダーゼ遺伝子発現抑制が筋管細胞への分化【目的】

能に与える影響を検証した結果，アミノペプチダーゼ遺申 請 者 は 最 近， ヒ ト 血 管 内 皮 細 胞 に 炎 症 性 刺 激

伝子 D, E, F, B, G, H, I の発現抑制は筋管細胞への分化を 加 え た 際 に Hi-C を 行 い， ヒ ス ト ン 修 飾 酵 Lysineに著しい影響を与えることが明らかとなった（図２）．

demethylase 7A (KDM7A) が働いて染色体構造を変化

また，形態評価として筋管細胞の長さや分化指数を算出させることが，炎症惹起に必須であることを証明した

した結果，興味深い結果として，Aminopeptidase-D は(2020 EMBO J ). Kdm7a は抑制系ヒストン修飾である筋分化を促進することが明らかとなった（図３）．

H3K9me2 を脱メチル化する酵素であり，血管発生や神【考察】

経発生に関わる遺伝子を転写活性化する可能性が報告さ本研究ではアミノペプチダーゼ発現抑制が筋芽細胞のれている．しかしながら，生体における役割はほとんど

増殖・分化に異常をもたらすことが明らかになった．こ

明らかにされていない．そこで本研究では，Kdm7a ののことから，アミノペプチダーゼにはペプチド分解酵素

生体での機能を明らかにすることを目的とした．

としてだけでなく，細胞増殖や筋分化の制御といった【方法】

様々な生理現象に寄与する可能性が考えられる．今後，

CRISPR/Cas9 システムを用いて Kdm7a 酵素活性ド

それぞれのアミノペプチダーゼ分子の役割について解明

メインにフレームシフト変異を導入することで Kdm7aを進めていく .

ノックアウトマウスを作成し，その表現系解析を行った．

【文献】

また，その分子機構を解明するために RNA-seq, ChIP-

・Shion, Osana., Yasuo, Kitajima., Naoki, Suzuki.,

seq を行った．

Aki, Nunomiya., Hiroaki, Takada., Takahiro,【結果】

Kubota., Kazutaka, Murayama. & Ryoichi, Na-

出生直後のマウスの骨形態を詳細に解析したところ，

gatomi.: Puromycin sensitive aminopeptidase is

ノックアウトマウスにおいて，胸椎・腰椎および腰椎・

required for C2C12 myoblast proliferation and

仙椎の境界がそれぞれ１つ後方にシフトする，すなわちdifferentiation. Journal of cellular physiology .

体節のアイデンティティに変化が生じることが判明し236(7), pp5293-5305, (2021).

た．胎生 9.5 日齢，10.5 日齢のマウス胚尾側領域（耳・Shion, Osana., Yasuo, Kitajima., Naoki, Suzuki.,胞を目印としてそれより尾側）の遺伝子発現パターン

Yidan, Xu., Kazutaka, Murayama. & Ryoichi,

を RNA-seq により網羅的に調べたところ，野生型マウ

Nagatomi.: siRNA knockdown of alanine ami-

スと比較してノックアウトマウスでは，後方の体節形成

nopeptidase impairs myoblast proliferation andに関わる Hox 遺伝子群が有意に減少していることが明diﬀerentiation. Experimental cell research. 397(1),

らかとなった．次に，ChIP-seq を用いて H3K9me2 修112337, (2020).

飾領域をゲノムワイドに解析したところ，この結果と一・Shion, Osana., Kazutaka, Murayama. & Ryoichi,

致して，ノックアウトマウスでは，Hox 遺伝子群後方

Nagatomi.: The impact of intracellular aminopep-

領域に H3K9me2 修飾が強く分布することが分かった．

tidase on C2C12 myoblast proliferation and dif-

以上より，Kdm7a はマウス発生期において Hox 遺伝子

ferentiation. Biochemical and biophysical research

群の発現調節を行うことで，前後軸形成を制御する可能communications. 524(3), pp608-613, (2020).

性が示唆された．

38

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【考察】
Hox 遺伝子の発現制御における H3K9me2 の関与についてはこれまで報告がなかった．本研究で H3K9me2の脱メチル化が Hox 遺伝子の転写制御に重要な可能性を示したことにより，それ以外のヒストン修飾やその修飾酵素による厳密な時空間的制御機構の存在が考えられ，今後の発展に繋がる成果である．
【文献】
Higashijima, Y., Nagai, N., Yamamoto, M.,
Kitazawa, T., Kawamura, YK., Taguchi, A., Nakada,N., Nangaku, M., Furukawa, T., Aburatani, H., Kurihara, H., Wada, Y. & Kanki, Y.: Lysine demethylase
図１

7a regulates murine anterior-posterior development

BCAA 分解系

by modulating the transcription of Hox gene cluster.

Commun Biol.; 3(1): 725., 2020 Nov 30（muscle: 心筋・骨格筋）特異的 BDK-musKO マウス，
脳神経系（neuron: 主に前脳興奮性ニューロン）特異的

分岐鎖アミノ酸分解促進による走運動持久力への影響
北

浦

靖

之

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

BDK-neuKO マウスの走運動持久力（走行可能距離）を
トレッドミルにより測定した．さらに，走運動トレーニ
ングを負荷した後の走運動持久力を再度測定し，それぞれのマウスの血中代謝物を GC-MS で測定した．また，既存薬ライブラリーを用いて，BDK の活性測定を行っ【目的】
必須アミノ酸であるロイシン，イソロイシン，バリン
は， 分 岐 鎖 ア ミ ノ 酸（Branched-ChainAmino Acids:

た．さらに，阻害活性が認められた薬剤をラットに投与
し，血中 BCAA 濃度を測定した．
【結果】

BCAA）と呼ばれ，他のアミノ酸と異なり肝臓以外の組

Control マ ウ ス に 比 べ て，BDK-musKO マ ウ ス，

織（主に骨格筋，脳神経系など）で分解される．BCAA

BDK-neuKO マウスでは，走運動持久力に有意な差は認分解系（図１）の最初の２つの反応は３つの BCAA にめられなかったが，BDK-KO マウスでは有意に増加した．

共通であり，第二反応は不可逆的反応で，律速段階とさ

さらに，走運動トレーニング後，走運動持久力を測定しれている１）．この反応を触媒する分岐鎖α-ケト酸脱水

た結果，Control マウスに比べて BDK-musKO マウス

素酵素 (BCKDH) は BCKDH キナーゼ（BDK）によるでは有意な差は認められなかったが，BDK-neuKO マウ

リン酸化により不活性化される．

ス，BDK-KO マウスで有意に増加した．それぞれのマ

安静状態における BCAA 分解は強く制御されており

ウスで走運動持久力と関連するいくつかの代謝物を見出

その消費は少ないが，運動中ではその制御が一部解除した．また，既存薬の中から高血圧の治療に使用されるバ

されてエネルギー源になると考えられる．本研究では，

ルサルタンに BDK 阻害活性が認められ，バルサルタンをラッBDK を阻害することでエネルギー代謝に対する BCAA

トに投与すると，血中 BCAA 濃度が有意に低下した．

分解系の貢献度を高めることにより，走運動持久力が向【考察】上するか，それに関連する代謝物について解析した．ま全身での BCAA 代謝の亢進は走運動持久力を増大さた，新たな BDK 阻害剤を見出すことを試みた．

せ，また，走運動トレーニングによる走運動持久力を増【方法】

加させるには，主に前脳興奮性ニューロンでの BCAA

全身で BDK を欠損させた BDK-KO マウス，筋組織

代謝の亢進が重要であることが示唆された．
このことは，

39

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

バルサルタンなどの BDK 阻害剤により走運動持久力が間質 HA 代謝・沈着との関連について検討するととも増加する可能性が考えられる．

に，各マウスから単離・培養した間質細胞の HA 分解【参考文献】

活性を解析した．また，ヒト潰瘍性大腸炎組織における

１）Shimomura, Y. & Kitaura, Y.: Physiological and

HYBID 発現や各種間質変化を解析した．さらに，これpathological roles of branched-chain amino ac-

までに in vitro において同定した HYBID 阻害候補物質

ids in the regulation of protein and energy me-

に関して，DSS 誘導性腸炎に対する薬効を評価した．

tabolism and neurological functions. Pharmacol【結果】

Res. 133: 215-217 (2018).

DSS 誘導性大腸炎モデルでは，Hybid KO マウスは野

２）Mizusawa, A., Watanabe, A., Yamada, M., Ka-

生型マウスと比較して体重減少が軽度であり，生存率のmei, R., Shimomura, Y. & Kitaura, Y.: Nutrients.

改善傾向が認められるとともに，DSS 投与後も上皮細BDK Deficiency in Cerebral Cortex Neurons

胞障害および腸管バリア破綻が抑制されていることが示

Causes Neurological Abnormalities and Aﬀects

された．HYBID は主に線維芽細胞をはじめとする間質Endurance Capacity. 12(8): 2267 (2020).

細胞で発現しているとともに，Hybid KO 培養線維芽細

３）Kitaura, Y., Shindo, D., Ogawa, T., Sato, A. &胞ではより高分子量 HA が培養上清中に蓄積している傾

Shimomura, Y.: Antihypertensive drug valsartan

向が認められた．以上の結果から，HYBID-HA 代謝系

as a novel BDK inhibitor. Pharmacol Res. 167:

が大腸炎の進展に寄与している可能性が示唆された．現105518 (2021).

在一部の HYBID 阻害候補物質が DSS 誘導性腸炎の重症度を抑制する可能性を見出している．腸炎関連大腸癌

新規ヒアルロン酸分解系を介した炎症・発癌制御機構の解明
下モデルに関しては，引き続き Tp53＋/− Hybid−/− 複合
遺伝子変異マウスを用いて解析を進めていく予定である．
【考察】

田

将

之

本研究では，ヒト潰瘍性大腸炎のマウスモデルである（慶應義塾大学医学部）

DSS 誘導性大腸炎モデルおよびヒト潰瘍性大腸炎手術
検体を用いて，HYBID-HA 分解系が大腸炎進展に寄与【目的】

することを明らかにするとともに，一部の HYBID 阻害

ヒアルロン酸（Hyaluronic acid＝HA）は，細胞外 マ

候補物質が大腸炎に対する新規創薬となりうる可能性をトリックス（extracellular matrix＝ECM）の一種で，組見出した．今回のデータから，炎症時の HYBID-HA 分

織や体液中に存在し，組織形成や恒常性維持に深く関解系促進に伴う腸管内 HA 蓄積量・分子量変化が大腸わっている．本研究では，生体内 HA 分解に中心的役炎の進展に関与している可能性が考えられる．一方，近割を果たす新規糖鎖分解酵素として HYBID (HYaluro-

年我々は HYBID-HA 分解系が脂肪細胞分化を制御し細

nan-Binding protein Involved in hyaluronan Depoly-

菌感染防御に関わることを報告しており（Cell Rep 30:

merization) に着目し，Hybid 遺伝子欠損（KO）マウ

61-68. e4, 2020），腸管内脂肪組織代謝変化も大腸炎のスおよびヒト潰瘍性大腸炎手術検体を用いて，腸炎及び進展や腸内細菌叢変化に影響を与えている可能性も考え

腸炎関連大腸癌発症・進展における HYBID-HA 代謝系

られ，そのメカニズムについては今後さらなる検討が必の役割を明らかとすることを目的とする．

要と考えられる．引き続き腸炎関連大腸癌モデルの解析【方法】

を継続し，HYBID-HA 分解系，炎症および炎症性発癌

はじめに Hybid KO マウスおよび野生型マウスを用との関連を詳細に調べていく予定である．

いて DSS 誘導大腸炎マウスモデルを作製し，各種手法【文献】

により経時的に腸炎の重症度を検討した．また，腸管Dokoshi, T., Zhang, LJ., Li, F., Nakatsuji, T., Butch-

組織における HYBID 発現細胞の同定，組織学的変化と

er, A., Yoshida, H., Shimoda, M., Okada, Y. & Gallo,40

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

RL.: Hyaluronan degradation by cemip regulatesに機能改変させることを目的とした．また，機能改変を通しhost defense against staphylococcus aureus skinて基質識別メカニズムについて考察することを目指した．

infection. Cell Rep. 2020; 30: 61-68. e4.

【方法】
LyPls-PLD のＸ線結晶構造解析は未完了であっため
立体構造モデル予測と基質類似化合物のドッキングシ

リゾ型血小板因子特異的ホスホリパーゼＤの創製と体外臨床診断薬キットへの応用
杉森

大た（図１）．基質認識に関与すると推測した５ヶ所のアミノ酸残基に置換を導入し，基質特異性が変化した変異助（福島大学共生システム理工学類

ミュレーション解析により，酵素基質複合体予測を行っ型酵素を取得した．顕著な変化を示した変異体について
物質科学コース）

は精製し，速度論解析により基質識別メカニズムについて考察した．

【目的】【結果】

放 線 菌 Thermocrispum sp. RD004668 が 分 泌 生 産

211 番フェ ニ ル ア ラ ニン（F211）を側鎖体積がよりするリゾプラズマローゲン（LyPls）特異的ホスホリ

小さな疎水性アミノ酸に置換した変異体において興味深い

パーゼ D（LyPls-PLD）はコリン型リゾプラズマローゲ

結果を得た（図２）．なかでも F211L 変異体は LysoPAF

ン（LyPlsCho）に対して最も良く作用し，その活性をに対する活性が WT の約２倍向上し，LyPlsCho に対す

100% とした場合，リゾ型血小板活性化因子（LysoPAF）

る活性が約 1/13 まで低下した．また，LysoPAF に対すには約 50％の活性を示した．LysoPAF は冠動脈性心疾る kcat /Km は WT の約５倍に達した（表１）．

患（Coronary Heart Disease:CHD）リスク評価のバイ【考察】

オマーカーであることから，LyPls-PLD は CHD リスク

F211 が 基 質 特 異 性 に 深く関 与するという結 果 は，

評価検査キットに応用可能である．そこで本研究では，

図 3 に示すように F211 が基質結合ポケットの入口に位置

学術的な興味も含め LyPls-PLD の基質特異性を逆転させる，つまり LyPlsCho よりも LysoPAF に作用するよう

図１

LyPls-PLD と基質類似化合物との複合体予測モデル

H46 と H88 は触媒残基と予想され，F211 は基質分子の sn-1 位アルキルエーテル鎖が結合するポケット入口に存在すると予想された．基質類似化合物のサーフィス表
示は各原子の van der Waals 半径を示している．

図2

LyPls-PLD (WT) とF211変異体の基質特異性

Ａ：LyPlsCho（白棒），LysoPAF（黒棒）に対する比活性，Ｂ：両基質に対する比活性の比（LysoPAF/LyPlsCho）

41

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成なって，Spring8 において WT, F211L, ES 複合体の３種類の回折データが取得できたため，現在構造解析を進
めている．
【文献】
１）Takayuki, Oyama., Kazutaka, Murayama. &表１

LyPls-PLD (WT) と F211L 変異体の動力学
定数

Daisuke, Sugimori: Switching the substrate speciﬁcity of lysoplasmalogen-speciﬁc phospholipase
D, FEBS Open Bio, 11(4), 1132-1143 (2021).
２）杉森大助，オレオサイエンス ，偏在性リン脂質定量用ホスホリパーゼの開発，Vol.21 No.8, P.3-10,(2021).
３）旧式酵素探索法・非データ駆動型ウエット実験で発図3

基質類似化合物と WT, F211L 変異体の複合体予測モデルおよび基質特異性

見したホスホリパーゼの試験管内分子進化と社会実
装，化学と生物（解説），Vol,59 No.10, P.488-494,(2021).

すると予想された点からもリーズナブルな結果といえる．
次に，表１に示す動力学パラメーター（kcat , Km）か

マルトトリオシル配糖体合成酵素における糖転移反ら，
基質認識メカニズムについて以下のように考察した．

応の分子基盤

まず，基質である LyPlsCho と LysoPAF の構造の違い

炭

谷

順

一

（大阪府立大学生命環境科学研究科）に注目すると，LyPlsCho の sn-1 位は剛直なアルケニ
ルエーテル結合のためアルキル鎖の回転を伴う屈曲が制限されるのに対し，LysoPAF はアルキルエーテル結【目的】

合のためそのアルキル鎖は LyPlsCho のそれよりも柔軟

本研究では，Ｘ線結晶解析や NMR を用いた構造生物な回転・屈曲が許容される．結果として，LyPlsCho より

学的アプローチと変異酵素を用いた酵素化学的アプロー

も LysoPAF は酵素の疎水ポケットに結合しやすいものの，

チを組み合わせて，マルトトリオシル配糖体合成酵素のポケット内で動くために触媒作用を受け難いと考えられる．

糖転移活性が上昇した変異酵素 L191R に着目し，糖転F211L 変異体の速度論解析の結果から，F211L 変異体
ではフェニルアラニンよりもアミノ酸側鎖体積が小さいロイ
シンに置換されたことによって LyPlsCho はやや結合しやすくなるものの，それでもなおアルケニルエーテル鎖の剛直さゆえ触媒作用を受ける前に酵素基質複合体から解離してしまうために WT よりも kcat が低下したのだろうと考えた．
一方，LysoPAF に関してはアルキルエーテル鎖の柔軟さから，より一層基質結合ポケットに結合しやすくなり，ポケッ
ト内で動いてもサイズの小さいロイシンになったことによりその動きが許容されスムーズに酵素基質複合体を形成して触媒作用を受けやすくなったと考えられる．
最 後 に，報告者は，より詳細な考察 を 行 う た め に
LyPls-PLD のＸ線結晶構造解析を進めてきた．最近に

42

図１

WT および L191R のアポ型および G3 複合体のマイナス側サブサイト構造の比較

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

移活性が上昇した構造基盤と作用機序を明らかにするこのに対し，G3 複合体では側鎖がサブサイト−２側にとで，糖質加水分解酵素の加水分解活性と糖転移活性を

向 い て い た． ま た，L191R の 求 核 残 基 欠 失 変 異 酵 素

別つ分子機構について知見を得ることを試みる．

L191R/D225A と G4 の共結晶を解析したところ，マイ【方法】

ナス側サブサイトには微弱ながら残存する触媒作用を変異酵素遺伝子の作製は，メガプライマー PCR 法を用受けた G3，プラス側サブサイトには G4 が配置していいて行い，Brevibacillus を宿主，pBIC3 を発現プラス

たが，R191 側鎖はサブサイト− 2 とサブサイト＋ 1 にミドとして各種変異酵素遺伝子を導入した形質転換体の存在するグルコース残基に向いていた（図2A）．さらに培養上清から，各種クロマトグラフィーを経て変異酵素

L191R/D225AG3-G4 複合体結晶を G6 溶液に浸漬するを精製し，濃縮した．得られた精製酵素を Sitting dropことで作製した L191R/D225A G6 複合体では，R191

蒸気拡散法により針状結晶を取得し，SPring-8 にて回側鎖の配置については揺らぎが大きく電子密度として確折データを取得することで X 線結晶構造解析を行った．

認することができなかった（図2B）．以上の結果から，【結果と考察】

糖転移活性が上昇した変異酵素 L191R は，R191 側鎖

WT と L191R のアポ型と G3 複合体のＸ線結晶構造がマイナス側サブサイトに存在する糖転移反応の供与体解析を行ったところ（図１），触媒残基（D225, E256）となる G3 のグルコース残基と相互作用しながら，プラの位置は一致しており，WT のアポ型と G3 複合体に

ス側サブサイトに存在する糖受容体となるグルコース残

おける L191 の配置も一致していた．しかし L191R の基とも相互作用することで糖転移反応を促進している可アポ型と G3 複合体における R191 の配置を比較する能性が考えられた．

と，アポ型では側鎖がサブサイト＋１側に向いている

また，糖転移反応の際に G3 受容体となる基質が配置するプラス側サブサイトに存在する F258, P259, G260から構成されるループに着目してみると，プラス側サ
ブサイトに基質が存在しない L191R のアポ型や G3 複合体での配置と，プラス側サブサイトに基質が存在す
る L191R/D225A-G3-G4 複合体や G6 複合体における配置では異なっていることがわかった（図３）．このF258-G260 ループは，アノマー保持型酵素の二段階目

図２

L191R-G3-G4 複 合 体（A）と L191R/
D225A-G6 複合体（B）における R191
側鎖の比較の加水分解と糖転移の分かれ目となる反応に関与する酸塩基触媒である E256 と非常に近く，このループの配置の変化は二段階目の反応に大きく影響する可能性が考えられた．プラス側サブサイトにおける基質の存在が酸塩
基触媒の配置を制御している可能性が考えられ，その制御に F258-G260 ループが大きな影響を与える可能性が示唆された．

図３

L191R-apo と L191R お よ び L191R/
D225A 基質複合体の重ね合わせ43

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

流行性耳下腺炎のウイルス酵素阻害剤の探索による抗ウイルス剤および診断薬の開発
高

橋

忠

伸
（静岡県立大学大学院薬学研究院）

ミニダーゼ（HN）の酵素活性「シアリダーゼ活性」はウイルス増殖に必須である．本研究は，HN の認識構造のシアル酸（N-アセチルノイラミン酸，Neu5Ac）の誘導体から酵素活性を特異的に強力に阻害する低分子化合物を探索することで，ムンプスウイルスの増殖を直接抑制する抗ウイルス剤の開発をめざす．これにより，ムン【目的】

プスウイルス感染による重篤な合併症や後遺症を直接防

流行性耳下腺炎（おたふくかぜ）は日本国内だけで毎ぐことができる．将来，代表者らが開発したムンプスウ

年 40 万人〜140 万人に感染する小児を中心とする急性

イルス HN 酵素活性の蛍光イメージン剤を利用して１），

ウイルス性疾患である．現状の治療は対症療法のみであムンプスウイルスを特異的，高感度に検出する診断薬のり，病因のムンプスウイルスに直接作用する特異的な抗開発をめざす．

ウイルス剤は無い．任意接種の国内ワクチンは費用が自【方法】

己負担で接種率 30％と低く，国内流行を制御できていムンプスウイルスの表面酵素である HN が認識するない．
青年期の発症では精巣炎や卵巣炎を起こし，「不妊」

基質構造 Neu5Ac の誘導体でムンプスウイルスの増殖の原因になる．無菌性髄膜炎，脳炎，難聴は，ムンプス阻害剤として唯一報告されている，シアリダーゼ阻害剤

ウイルスによる中枢神経障害の合併症である．特に難聴の 2- デオキシ -2,3- ジデヒドロ-N-アセチルノイラミン

は代表的な合併症で「ムンプス難聴」と呼ばれ，乳幼児・２）を骨格構造に DANA の誘導体を合酸（DANA）（図１）

小児の感染時に気づかずに，回復して相当な時間が経っ成して，37℃，30 分間，10 mM 酢酸緩衝液（pH 4.5）てから発覚することが多い．ムンプス難聴，不妊は完治に お け る HN 発 現 293T 細 胞 の シ ア リ ダ ー ゼ 活 性 のすることの無い永続的な後遺症となる．発症すると回復50%阻害濃度（50% inhibitory concentration，IC50）を，の見込みの無いムンプス難聴，不妊などの合併症は，ム4-メチルウンベリフェリル-Neu5Ac を蛍光基質としてンプスウイルスが神経組織や内分泌腺に直接侵攻したこ使用して測定した．すべての実験で DANA の IC50 値をとに起因する．現状ではウイルスに直接作用する薬剤は基準に実験誤差を補正し，各誘導体の独立した３回の結無く，予測できない後遺症の発症を直接防ぐことはでき

果から，各誘導体の IC50 値を， 統計表計算ソフトウェ

ない．ムンプスウイルスに特異的に直接作用して抗ウイ

ア GraphPad Prism v5.0 を用いて計算した．

ルス効果を示す治療薬を開発することで，ムンプスウイ

シアリダーゼ阻害効果の高い（IC50 値の低い）３つ

ルス感染による重篤な合併症や後遺症を直接防ぐことがの誘導体の安全性の指標として，細胞毒性を測定した．

できる．学校などで集団流行の発生時，ワクチンを接種

DANA は既報のシアリダーゼ阻害剤として用いた．ム

しても即時的な予防効果は期待できない．一方，ウイル

ンプスウイルスの感染や増殖に使用されるアフリカミスに直接作用する抗ウイルス剤は投与後すぐに予防効果

ドリザル腎臓由来 Vero 細胞に，DANA および各誘導が期待でき，周囲への流行拡大を防ぐ即効性の高い予防

体を添加後，37℃，24 時間培養した．細胞毒性を起こ薬としても利用できる．抗ウイルス剤を患者に適切に処し，細胞内から培養上清中へ漏出した乳酸脱水素酵素

方するため，臨床現場で高感度，簡易，迅速に感染を確定する診断薬が必須である．そのため，抗ウイルス剤と診断薬はセットで開発することに意義がある．ムンプス
ウイルスに特異的な化合物の構造を利用して，ウイルス
特異的な酵素活性の検出剤を開発することで，ムンプス
ウイルス感染による流行性耳下腺炎を確定する診断薬を開発できるものと考えられる．
ムンプスウイルスの表面酵素ヘマグルチニン-ノイラ

44

図１

Neu5Ac と DANA の構造

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成（Lactate dehydrogenase，LDH）量を，CytoTox-ONE

添加時において測定した．

Homogeneous Membrane Integrity Assay kit を 使 用【結果】して測定した．キット付属の Lysis 試薬により，実験条

既知のムンプスウイルスシアリダーゼ阻害剤の件において全細胞を溶解して最大の LDH 放出量を求め

DANA（IC50 5μM）を基準に各誘導体の IC50 値を測定た．この時の最大 LDH 量をポジティブコントロールのし（図２），DANA よりも高いシアリダーゼ阻害効果を100% として，各誘導体の濃度依存的な細胞毒性（相対示す誘導体を創出した．

LDH 放出量）を測定した．

シアリダーゼ阻害効果の高い３つの誘導体で，Vero

シアリダーゼ阻害効果を示す誘導体が実際に，ムン細胞に対する細胞毒性は 100μM まで見られなかった．

プスウイルスの増殖を抑制するのか評価した．コン

細胞毒性を示さなかった誘導体の中の１つの誘導体１

フルエント Vero 細胞に，25〜6×10−3 赤血球凝集活性は，既存の DANA よりも高いウイルス増殖抑制効果を（hemagglutination units, HAU）のムンプスウイルス示した（図３）．

１）
を 37℃，１時間感染させた．細胞を（13V165E2 株）

抗インフルエンザ薬として市販されているシアリダー

洗浄後，10 段階希釈した誘導体（0.01〜100μM）を

ゼ阻害剤は，インフルエンザウイルスに対して極めて高含有する無血清培地（ウイルス感染を促進する２μg /ml

い特異性を示す．宿主細胞の内在性シアリダーゼに影響

アセチル化トリプシン含有）で感染細胞を 37℃，48 時を与えないと予想されることから，重大な副作用のリス間培養して，ウイルスを増殖させた．回収した培養上清クは極めて低くなる．このように，抗ウイルス薬としては遠心（４℃, 800×g, ９分間）により浮遊した細胞を利用するためにはウイルス特異性が重要と考えられる．

沈降させ，遠心後の上清は感染価測定まで−80℃で保ムンプスウイルス HN のシアリダーゼ活性は，10μM存した．上清中のウイルス感染価として focus-forming

および 100μM の誘導体 1 および DANA 添加のすべて

units (ﬀu) を，フォーカス形成アッセイで求めた．

でほぼ消失した．一方，インフルエンザウイルス NA

誘導体のムンプスウイルスに対する特異性を検討するのシアリダーゼ活性は，10μM および 100μM の誘導ため，ムンプスウイルスの IC50 測定時と同条件で，ム体１添加でほぼ阻害されず残存していた．10μM およンプスウイルス HN 発現 293T 細胞とＡ型インフルエン

び 100μM の DANA 添加ではインフルエンザウイルス

ザウイルス（A/Hong Kong/1/1968 H3N2 型株）のノ

NA のシアリダーゼ活性はほぼ消失した．ムンプスウイ

イラミニダーゼ（NA）発現 293T 細胞のシアリダーゼ

ルス HN で，誘導体１は DANA と比較して高いシアリ活性を，10μM または 100μM の誘導体および DANA

ダーゼ阻害効果を示す．一方，インフルエンザウイルス
NA では，DANA と比較して誘導体１は明確なシアリダーゼ阻害効果を示さなかった．誘導体１はムンプスウ
イルス HN に高い特異性を示すことが示唆された．
【考察】
最近，代表者は緑茶成分で代表的なカテキン類について抗ムンプスウイルス効果とそのメカニズムを調べた

図２

誘導体の IC50 比較（J. Funct. Foods に受理）．しかし，ムンプスウイルスのシアリダーゼ活性阻害をターゲットにした低分子化
合物のウイルス感染増殖抑制剤は 1986 年に DANA が報告されて以降２），報告されていない．本研究では，シアリダーゼ阻害効果およびウイルス増殖抑制効果が既報の DANA よりも高い低分子化合物を得た．さらに，

図３

ウイルス増殖抑制効果

DANA はいろいろなウイルスや菌，哺乳動物細胞のシアリダーゼ活性に阻害効果を示すため，ムンプスウイル

45

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成ついて，今回開発したシアリダーゼ阻害剤を用いて薬剤耐性化機構を調査していく．
【文献】
１）Takahashi, T., Agarikuchi, T., Kurebayashi, Y.,
図４

代表者らの開発したシアリダーゼ蛍光イメー
ジング剤

Shibahara, N., Suzuki, C., Kishikawa, A., Fukushima, K., Takano, M., Suzuki, F., Wada, H.,
Otsubo, T., Ikeda, K., Minami, A. & Suzuki, T.:スに対する特異性は無い．本研究では，インフルエンザ

Easy and Rapid Detection of Mumps Virus by

ウイルスのシアリダーゼ活性と比較して，ムンプスウ

Live Fluorescent Visualization of Virus-Infected

イルスに対して明らかに特異性の高い低分子化合物を得

Cells, PLoS ONE, 10, e0144038 (2015).

た．今回得た化合物構造は，今後，抗ムンプスウイルス２）Waxham, M. N. & Wolinsky, J. S.: A fusing

薬のシード化合物として貢献することが期待される．まmumps virus variant selected from a nonfus-

た，インフルエンザウイルスなど他のウイルス，菌など

ing parent with the neuraminidase inhibitorのシアリダーゼとの違いや基質認識機構を研究するため

2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminic acid,のツールとしても貢献する．

Virology, 151, 286-295 (1986).

代表者は，共同研究者（広島国際大学薬学部 池田潔

３）Kurebayashi, Y.*, Takahashi, T.*(*equally as ﬁrst

先生，大坪忠宗先生）とシアリダーゼ蛍光イメージング

authors), Otusbo, T., Ikeda, K., Takahashi, S.,剤を開発してきた．イメージング剤は，疎水性の緑色蛍

Takano, M., Agarikuchi, T., Sato, T., Matsuda,

光物質（2-ベンゾチアゾール-2-イル）-4-ブロモフェノー

Y., Minami, A., Kanazawa, H., Uchida, Y.,ル（BTP3 と省略）のフェノール性 OH 基に，シアル酸

Saito, T., Kawaoka, Y., Yamada, T., Kawamori,の Neu5Ac を付加して蛍光性を OFF 制御させた化合物

F., Thomson, R., von Itzstein M. & Suzuki, T.:である．シアリダーゼ活性により Neu5Ac が加水分解

Imaging of inﬂuenza virus sialidase activity in

されると，疎水性蛍光物質の BTP3 がその酵素活性の存

living cells, Sci. Rep., 4, 4877 (2014).

在部位に沈着して，固定化や抗体を必要とせずに 5〜15分程度で蛍光イメージングできる（図４）１,３,４）．

４）Kurebayashi, Y.*, Takahashi, T.* (*equally asﬁrst authors), Miura, T., Otsubo, T., Minami, A.,

BTP3-Neu5Ac 構造のシアリダーゼが認識する基質構

Fujita, Y., Sakakibara, K., Tanabe, M., Iuchi,

造 Neu5Ac を，ムンプスウイルスに特異性の高い構造

A., Ota, R., Ikeda, K. & Suzuki, T.: Fluorogenicに変換することで，ウイルスのシアリダーゼ活性を特異probes for accurate in situ imaging of viral and

的に検出するムンプスウイルス診断薬に利用できる蛍光mammalian sialidases, ACS Chem. Biol., 14,

イメージング剤が開発できるものと期待される．BTP3-

1195-1204 (2019).

Neu5Ac によるインフルエンザウイルスのシアリダー

５）Kato, D.*, Kurebayashi, Y.*, Takahashi, T*

ゼ検出法の改良により，市販のイムノクロマト法を原理(*equally as first authors), Otsubo, T., Otake,とするインフルエンザ診断薬以上の検出感度で，15 分

H., Yamazaki, M., Tamoto, C., Minami, A.,

程度でウイルス検出可能な方法を確立した ．本研究でIkeda, K. & Suzuki, T.: An easy, rapid, and明らかになってきたムンプスウイルスのシアリダーゼに

sensitive method for detection of drug-resistant

特異性の高い誘導体構造を，BTP3-Neu5Ac の Neu5Ac

inﬂuenza virus by using a sialidase ﬂuorescent

構造に導入することで，ムンプス診断薬に利用できるム

imaging probe, BTP3-Neu5Ac, PLoS ONE, 13,

ンプスウイルス特異的なシアリダーゼ蛍光イメージング

e0200761 (2018).

５）剤を開発していく．また，インフルエンザウイルスでは
薬剤耐性ウイルスが出現してきた．ムンプスウイルスに46

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

青色光受容体フォトトロピンキナーゼが制御する光
シグナル伝達ネットワークの解明
武

宮

淳

史
（山口大学大学院創成科学研究科）

膜 H＋-ATPase の活性化に加え，光合成による葉内 CO2濃度の低下が同時に起こることが必要であることを明らかにした．また，フォトトロピンは気孔開口を誘導するのみならず，気孔が開き過ぎないように開口を抑制し，気孔開度を厳密に制御する働きをもつことを明らかにした．本研究を通じて，植物が変動する光環境下において気孔開度を最適化する分子機構の一旦が明らかとなっ【目的】
植物の表皮に存在する気孔は青色光に応答して開口た．

し，光合成に必要な二酸化炭素の取り込みを促進し，植【文献】

物の成長を促進する．我々はモデル植物シロイヌナズナ

Hosotani, S., Yamauchi, S., Kobayashi, H., Fuji, S.,を用いた順遺伝学的解析から，青色光受容体キナーゼ

Koya, S., Shimazaki, K. & Takemiya, A.: A BLUS1であるフォトトロピンのリン酸化基質として BLUS1 キ

kinase signal and a decrease in intercellular CO2

ナーゼを同定し，BLUS1 が気孔開口の駆動力を形成す

concentration are necessary for stomatal opening

る細胞膜 H -ATPase の活性化に必須であることを明ら

in response to blue light, Plant Cell, 33, 1813-1827

かにした．本研究では，BLUS1 が H＋-ATPase の活性(2021).

＋

化を導く分子機構をさらに理解するために，BLUS1 のＣ末端領域に着目した機能解析を行った．
【方法】

マクロファージの極性化を制御するタンパク質架橋

BLUS1 はＮ末端側にキナーゼドメインをもち，Ｃ末

酵素の解析

端側に機能未知の配列をもつ．このＣ末端領域の機能を辰明らかにするために，BLUS1 のＣ末端領域を 30 アミ

川

英

樹

（東海国立大学機構名古屋大学大学院創薬科学研究科）

ノ酸ずつ欠損させた断片タンパク質を blus1 変異体に導入し，気孔応答を詳しく解析した．
【結果】

【目的】
慢性腎臓病は日本国内で 1,330 万人（成人の 13％）

上記形質転換体を用いた機能解析から，BLUS1 のＣが罹患する国民病であり，組織の硬化（線維化）を伴末端領域には自身のキナーゼドメインを抑制する自己阻う末期の機能不全に至る共通所見として，組織へのマ

害領域が存在することを示した．さらにフォトトロピン

クロファージの広範囲の浸潤がある．実際に虚血再灌流

によるこの領域内の Ser 残基のリン酸化はこの抑制のや尿管結紮による腎障害モデルにおいて，特定のマクロ解除に働き，BLUS1 を活性化させることを示した．こファージの抑制は病態を有意に改善する（Sung SA etの形質転換体では H＋-ATPase が常に活性化されている

al. 2007, Kim MG et al. 2015）ことから，病態の治療にも関わらず，暗所では気孔開口を示さず，光合成が飽標的としての重要性が示されている．

和する強い赤色光下で大きな開口を示すことを見出し

マクロファージは組織の微小環境の変化によって感染た．詳細な解析により，この現象には光合成による葉内防御や死細胞除去に関わる M1 型と障害を受けた組織のCO2 濃度の低下が関係することが分かった．さらにこ再生に関わる M2 型の極性の異なる２種類のサブタイプの形質転換体では青色光を照射すると気孔が著しく閉鎖に大別される．慢性炎症組織の過剰な修復を伴う線維化する現象がみられ，これにはフォトトロピンが関与する疾患では，M2 型マクロファージの組織浸潤が病態形成ことが明らかとなった．

に寄与する．申請者はこれまでに特定のグルタミン残基【考察】とリジン残基の間にイソペプチド結合を形成するタンパ

本研究では，BLUS1 を介した詳細なシグナル伝達機

ク質架橋酵素トランスグルタミナーゼ 2（TG2）が M2

構に加え，光による気孔開口には BLUS1 を介した細胞型マクロファージの極性化と組織浸潤に関わることを見47

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成出した．本研究は TG2 を標的として，
M2 型マクロファー

肪酸の代謝に関わる因子が多く抽出されたことは興味深

ジの極性化に関わる分子機構を解明し，制御方法に繋げい．

ることを目的とする．
【方法】

次に，一側尿管結紮法による腎線維化モデルマウス
を用いて，病態形成に伴い腎臓に浸潤する分極化マク

細胞レベルで M2 マクロファージの極性化機構を調べ

ロファージを解析した．TG2 欠損マウスにおいては腎るため，マウスから単離した腹腔マクロファージおよび臓内に浸潤した M2 マクロファージ（F4/80highCD11b＋

線維芽細胞（L929）上清培地により骨髄から分化させ

MRC-1＋ ）が顕著に消失した．さらに，GFP を発現す

たマクロファージを用いた．加えて，ヒト急性単球性白る骨髄細胞の移植により TG2 依存的に誘導される M ２

血病細胞株（THP-1）由来のヒトマクロファージも併せ

マクロファージの由来について調べたところ，同細胞はて解析し，一部の mRNA について次世代シーケンスに骨髄由来ではなく，常在性の細胞からの形質転換由来でよる網羅的遺伝子発現解析を行った．これらの細胞に対あることが示唆された．同様に，TG2 欠損マウスの骨して，M2 マクロファージの誘導因子である IL-4 を処

髄移植実験により，常在性の細胞での TG2 の欠失が腎理し，TG2 siRNA や TG2 阻害剤処理下での比較検討

線維化の誘導に影響することを見出した．

により，M2 マクロファージの極性化における TG2 の【考察】

役割を解析した．

今回の解析から，腎線維化の分子機構において TG2TG2 欠損マウスが腎線維化および腎臓に浸潤するマがマクロファージの腎浸潤および M2 型の極性化に関わクロファージを有意に抑制することから，腎臓浸潤したること，さらに同 M2 マクロファージは常在性の細胞由

マクロファージを解析するため，一側尿管結紮法（UUO）

来で誘導されることが明らかになった．

処置したマウスを用いてフローサイトメトリー（FACS）【文献】

により細胞特性を調べた．さらに，GFP 発現マウス由

Tatsukawa, H. & Hitomi, K.: Role of Transglutamin-

来の骨髄細胞を単離してＸ線照射レシピエントマウスに

ase 2 in Cell Death, Survival, and Fibrosis., Cells.,

移植し，病態増悪と共に腎臓に浸潤する細胞の系譜解析

10, 1842 (2021).

を行った．同様に野生型および TG2 欠損マウス由来の骨髄を単離し，それぞれ野生型および欠損マウスに移植した後に UUO による腎線維化の程度を比較解析した．
【結果】

タンパク質凝集体代謝酵素の構造・機能解析
田

中

元

雅

（理化学研究所脳神経科学研究センター）

IL-4 処理したマウスおよびヒト由来のマクロファージ
では，TG2 の発現量が増加すると共に M2 マクロファー
ジ の マ ー カ ー 遺 伝 子 が 顕 著 に 増 加 し た． 一 方，TG2【目的】

siRNA や TG2 阻害剤の処理下では，M2 マクロファー

神経変性疾患には中高年で発症するものが多く，アルジの極性化は有意に抑制された．TG2 は潜在型 TGF-β

ツハイマー病やパーキンソン病，プリオン病などを含む．

結合タンパク質を細胞膜表面に架橋固定し，TGF-βのこれらの神経難病では，原因タンパク質が細胞内または活性化を誘導することが知られているため，TG2 の細外で凝集し，βシートを多く含む線維状の凝集体である

胞透過性および非透過性阻害剤の効果を検証したとこ“アミロイド” を脳内に蓄積する１−３）．このようなアミろ，細胞透過性の阻害剤のみ M2 マクロファージの極性

ロイドの蓄積は，細胞毒性や脳内および脳−末梢間での化を抑制した．TG2 による M2 マクロファージの極性

凝集体伝播に深く関与すると考えられている．アミロイ化機構をさらに解析するため，次世代シーケンスを実施

ドは自発的に生成するが，複数の細胞内因子によってそしたところ，IL-4 処理により発現が上昇し，かつ TG2の凝集化の速度が変化することが知られている．また，阻害剤により発現が低下する遺伝子群の抽出に成功しアミロイドは細胞内因子によって分断，脱凝集されるこた．これらの遺伝子については現在解析中であるが，脂とも最近，分かってきている４）．このように，細胞内因48

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

子がアミロイドの生成および断片化に関わると示唆されいく過程を調べる実験系を確立した．それによって，アるが，その詳細には不明な点が多い．

ミロイドの生成および脱凝集反応において，細胞内因子

そこで本研究では，これまでに我々が新たに開発してによって受けている精密な制御機構の一端を明らかにしきた実験系を応用しアミロイド研究に適した酵母プリオ

た．本研究で得られた技術や成果は，他の多くのアミロ

ンタンパク質 Sup35 の実験系を用いて，アミロイドのイド研究にも応用が可能であると期待される．

生成・代謝のメカニズムを明らかにすることを目的とした．

【文献】

【方法】

１）Tanaka, M. & Komi, Y.: Layers of structure and

酵母プリオンタンパク質 Sup35 の凝集ドメインである Sup35NM と各種細胞内因子をリコンビナントタン

function in protein aggregation. Nat . Chem .

Biol., 11, 373 (2015).

パク質として高度に精製し，Sup35NM の凝集化および

２）Ohhashi, Y., Yamaguchi, Y., Kurahashi, H.,

Sup35NM アミロイドに対する細胞内因子の添加の影響

Kamatari, Y.O., Sugiyama, S., Uluca, B., Pie-を調べるため，アミロイドに特異的に結合する蛍光色素

chatzek, T., Komi, Y., Shida, T., Müller, H.,

チオフラビンＴを用いた蛍光法やウエスタンブロッティ

Hanashima, S., Heise, H., Kuwata, K. & Tanaka,

ングを用いた沈降実験，原子間力顕微鏡による観察など

M.: Molecular basis for diversiﬁcation of yeast

から，細胞内因子の影響を評価した．

prion strain conformation, Proc. Natl. Acad. Sci.

【結果】

U. S. A., 115, 2389 (2018).

チオフラビンＴを用いた蛍光法から，Sup35NM タン３）Shida, T., Kamatari, Y.O.*, Yoda, T.*, Yamagu-

パク質の凝集化が，各種細胞内因子によって著しく促進

chi, Y., Feig, M., Ohhashi, Y., Sugita, Y., Ku-

することを見出した．また，その凝集加速化は，温度やwata, K. & Tanaka, M.: Short disordered protein

緩衝液の組成などの反応条件によっても大きく変化する

segment regulates cross-species transmission of

ことが明らかになった．また，原子間力顕微鏡による観a yeast prion. Nat. Chem. Biol., 16, 756 (2020).

察により，各種細胞内因子によって Sup35NM の凝集

４）中川幸姫，田中元雅：シャペロンによるプリオン凝化が促進されることを見出し，促進化される際には多く集体の形成と伝播の制御 , 蛋白質代謝医学 −構造・の短いアミロイド断片が観察されることが明らかになっ機能の研究から臨床応用まで , 医学のあゆみ , 医歯た．一方で，細胞内因子の条件によっては，アミロイド

薬出版 , 1111 (2018).

の凝集化を阻害する可能性があることも見出した．これ
らの結果は，アミロイド生成における複雑な制御機構を示唆している．

【謝辞】
公益財団法人日本応用酵素協会の酵素研究助成に深謝いたします．

さらに，Sup35NM アミロイドを基質に用いて各種細胞内因子の影響を詳しく調べたところ，アミロイドが脱凝集されること，Sup35NM アミロイドの構造に依存して脱凝集効率が大きく異なることを明らかにした．また，それぞれの細胞内因子がアミロイドに対して協調的に働RNA- タンパク質複合体の再編成を駆動する RNA
ヘリカーゼの網羅的同定方法の開発
谷

口

一

郎

（京都大学ウイルス・再生医科学研究所）

くことによって，アミロイドが効率的に断片化されることを見出した．その結合パラメータの生物物理的な解析から，複数の細胞内因子がアミロイドに順番に結合することを明らかにした．また，その実験結果は，超遠心を【目的】
RNA ヘ リ カ ー ゼ は ATP 依 存 的 に RNA と タ ン パ ク

用いた沈降実験実験からも支持された．

質との複合体（Ribonucleoprotein: RNP）の形成また【考察】

は解体（再編成）を促進する．ただし，細胞には多く

本研究によって，アミロイドが生成および代謝されての RNA ヘリカーゼが存在し RNP も膨大にあり，どの49

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

RNA ヘリカーゼがどの RNP 再編成に関与するか，不存的に RNA から解離することがわかった．さまざまな明な点が多い．そこで本研究では，RNP 再編成に関与

RNA ヘリカーゼの組換えタンパク質を用いた結果，特する RNA ヘリカーゼを同定するための統一的な方法の定の RNA ヘリカーゼ群に解離活性があることがわかっ開発を目的とした．

た．今後，それらが hnRNP 解体に関与するかを HeLa

【方法】

細胞のノックダウン実験を利用して検証する．

RNP 再編成に関与する RNA ヘリカーゼを同定する
ため，HeLa 細胞の核抽出液を用いた RNP 再編成の試
験管内再構成系を構築する．その実験系において ATP

メチル化DNA酸化酵素による全能性獲得機構の解明
束依存性を調べる．RNP 再編成が ATP 依存的である場

田

裕

一

（九州大学稲盛フロンティア研究センター）合，何らかの RNA ヘリカーゼの関与が推測されるので，
RNA ヘリカーゼを生化学的に探索する．
次に，候補となった RNA ヘリカーゼが RNP 再編成【目的】に関与するかを検証するために，その組換えタンパク質

生殖は生物個体が自己と同じ種に属する個体をつくりを試験管内再構成系へ添加する．その結果，RNP 再編

出すという，全ての生物に見られる本質的な生命現象で成が促進されるかを調べる．

ある．その生殖において，細胞の全能性 [totipotency]（単最後に，
試験管内再構成系で同定された RNA ヘリカー

独の細胞が自律的に発生を開始し個体を作り出す能力）

ゼが細胞内で機能するかを検証する．そのために，アフは，極めて重要な役割を果たしている．しかし，「全能リカツメガエル卵母細胞への顕微注入実験やヒト培養細性細胞とはどのような細胞であるか？」という学術的な胞でのノックダウン実験を行う．

問いに対し，全能性の分子基盤は未解明である．本研究【結果と考察】では，これまでに報告例のない体細胞核移植胚特異的再①

輸送 U snRNP 形成を促進する RNA ヘリカーゼ

プログラム化因子として，申請者らが同定した DNA 酸

スプライシングに関わる U snRNA に着目し，その化酵素 TET3 に着目し，体細胞核移植胚の全能性獲得機

核外輸送複合体（輸送 U snRNP）形成の試験管内再構

構解明を目指す．

成系の構築に成功した．輸送 U snRNP 形成は ATP 依【方法】

存的であることがわかり，候補 RNA ヘリカーゼとして申請者らは上述の研究目的のもと，2018 年度，2019

輸送 U snRNP と相互作用する UAP56 を同定した．試年度の「酵素研究助成」により以下のことを明らかにし験管内において，UAP56 の組換えタンパク質が輸送 U

た．TET3 欠損体細胞核移植胚は，①着床前の胎生 3.5

snRNP 形成を促進した．アフリカツメガエル卵母細胞

日までは発生率に顕著な影響がないが，②全く着床せず，

では，UAP56 に対する抗体が U snRNA の核外輸送を③胚が着床する胎生 4.5 日において壁栄養外胚葉形成に阻害した．以上の結果は，UAP56 が U snRNA 核外輸

異常を生じる．④着床前の胎生 3.5 日では顕著な変化は送に関与することを示す．以上の研究成果に関して，現ないが，⑤胚が着床する胎生 4.5 日では栄養膜細胞の分在，論文投稿準備中である．

化に関連する遺伝子群の発現が低下している．⑥着床前②の胎生 3.5 日において顕著にメチル化レベルが上昇してhnRNP 解体を促進する RNA ヘリカーゼ
mRNA は核内で転写後に一群のタンパク質と安定ないる．そこで本研究では，全能性に必要なメチル化状態

複合体（hnRNP）を形成する．その後，hnRNP 中のタを明らかにするために，胎生 4.5 日の受精胚，体細胞核

ンパク質は RNA から解離し，mRNA の核外輸送を担

移植胚，TET3 欠損体細胞核移植胚の単一胚 RNA-seq

うタンパク質群（輸送 mRNP）に置き換わる必要があ

解析およびその情報解析を行い，壁栄養外胚葉形成異常

る．hnRNP の中心的因子である hnRNP C に焦点を絞に関連する hub genes を探索し，TET3 欠損によるそり，hnRNP C の RNA からの解離の試験管内再構成系

れらの遺伝子領域の DNA メチル化状態への影響を調べを構築した．この実験系において hnRNP C は ATP 依

た．

50

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

そうした影響を受けにくい新たな創薬手法として期待さ【結果】
受精胚，体細胞核移植胚，TET3 欠損体細胞核移植胚れている．しかしながら一方で，この手法はユビキチン間の遺伝子発現を比較し，TET3 欠損体細胞核移植胚でリガーゼと標的タンパク質の相性が問題となる場合があ

特異的な発現状態を示す遺伝子群を抽出した．抽出したる．そこで，プロテアソームと標的タンパク質を直接近

遺伝子群の PPI (protein-protein interaction) networks

づけることでユビキチンを介さずにタンパク質を分解で解析を 12 種類の異なる方法を用いて行い，それぞれのきれば，これまで標的とならなかったタンパク質を分解方法でトップ 10 の hub genes を同定した．重複を除く

できる（図１下），と考えた．そこで本研究では，酵素と 12 種類の方法で 46 個の hub genes が同定された．

複合体であるプロテアソーム上のユビキチン受容体を利同定した hub genes について，そのプロモーター領域，

用し，標的タンパク質に直接近づける分子による「ユビgene body 領域の DNA メチル化状態に TET3 欠損が与キチン非依存的な分解誘導剤の開発」を行うことを目的

える影響を調べた結果，顕著な影響を受けている領域はとした．

存在しなかった．

【方法】
我々が最近報告したプロスタグランジン D 合成酵素【考察】
本研究により，TET3 欠損体細胞核移植胚において壁（HPGDS）分解誘導剤（PROTAC (HPGDS)-1，
E3 リガー

栄養外胚葉形成異常を引き起こす原因となっている可ゼとしてセレブロン CRBN を利用するために CRBN

能性のある hub genes を同定した．しかし，同定したリガンドの Pomalidomide を搭載）１）をモデルとして，

hub genes のプロモーター領域，gene body 領域では，

HPGDS 阻 害 剤（TFC007） と プ ロ テ ア ソ ー ム に 存 在TET3 欠損による DNA メチル化異常が生じなかったこするユビキチン受容体（Rpn13）に結合するリガンドとから，hub genes のエンハンサー領域において DNA（RA190），および，ユビキチン受容体（Rpn6）に結合メチル化異常が生じている可能性が示唆された．

するリガンド（TXS8）をそれぞれリンカーで繋いだキ

ユビキチン非依存的な標的タンパク質分解誘導剤の
開発
出

水

庸

介
（国立医薬品食品衛生研究所）【目的】
新たな創薬モダリティとして，有機小分子を用いてユビキチン・プロテアソーム系（UPS）を利用し，標的タ

図１

プロテインノックダウン法による標的タンパ
ク質の分解誘導

ンパク質の分解を誘導する手法が注目されている．本手法のひとつである，
Crews 教授（Yale 大）や内藤博士（東大）らにより開発されたの PROTAC は，標的タンパク
質のリガンドとユビキチンリガーゼリガンドを有したキ
メラ化合物であり，標的タンパク質とユビキチンリガー
ゼを物理的に近づける分子（分子糊）として機能し，標的タンパク質のユビキチン化およびプロテアソームによる分解を誘導する（図１上）．従来の有機小分子阻害剤
はフィードバックシグナルによる薬理効果の低下が問題となる一方で，標的タンパク質を分解する PROTAC は，

図２

HPGDS 分解誘導剤の設計

51

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

メラ分子（TFC-RA190，TFC-TXS8）を設計-合成した．

今回設計したユビキチン受容体リガンドを搭載した

更に，PROTAC (HPGDS)-1 の PEG リンカー長についキメラ分子では，ユビキチン非依存的な HPGDS 分解ての検討（n＝0−5）も行なった（図２）．合成した化を誘導できなかった．現在，異なるユビキチン受容体合物の HPGDS 分解誘導活性は，KU812 細胞を用いたリガンド，リンカー長等を検討し，目的を達成できるウエスタンブロット法により評価した．さらに，活性を分子の開発を継続している．一方で，UPS を介して高示した化合物については，分解メカニズム評価，標的タ

活性および高選択的に HPGDS を分解できる PROTAC

ンパク質特異性評価，モデルマウスによる in vivo 評価(HPGDS)-6 を見い出すことに成功した２）．
本研究の遂行に多大なるご協力を賜りました，国立医についても検討した．

薬品食品衛生研究所の柴田識人博士，横尾英知博士，東【結果と考察】ウエスタンブロットの結果，残念ながら現在まで

京都医学総合研究所の遠藤彬則博士，佐伯泰博士，第一にユビキチン非依存的な分解誘導剤の発見には至っ

薬科大学の有竹浩介教授，東京大学の内藤幹彦教授に感て い な い． 一 方 で，PROTAC (HPGDS)-1 の PEG リ

謝申し上げます．また，多大なるご支援を賜りました，公ンカー長の検討を行なった結果，リンカーが短くな

益財団法人日本応用酵素協会に深く感謝申し上げます．

る に 伴 い HPGDS 分 解 活 性 が 向 上 し， リ ン カ ー を 持【文献】

た な い PROTAC (HPGDS)-6 が 非 常 に 高 い 分 解 活 性１）Yokoo, H., Shibata, N., Naganuma, M., Muraka-（DC50=17.3 pM, DC50: 50% のタンパク質を分解する

mi, Y., Fujii, K., Ito, T., Aritake, K., Naito, M.

濃度）を有することが明らかとなった（図３）．更に，& Demizu, Y.: Development of a hematopoietic

PROTAC (HPGDS)-7 は，CRBN を利用し UPS によりprostaglandin D synthase-degradation inducer,

HPGDS を分解すること，タンデム MS/MS によるプロ

ACS Med. Chem. Lett., 12, 236 (2021).

テオーム解析により，8194 種類のタンパク質が検出さ

２）Yokoo, H., Shibata, N., Endo, A., Ito, T., Ya-

れた中で HPGDS のみを特異的に分解することが明らか

nase, Y., Murakami, Y., Fujii, K., Hamamura,となった．また，デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデ

K., Saeki, Y., Naito, M., Aritake, K. & Demizu,

ルマウスである mdx マウスに PROTAC (HPGDS)-6 を

Y.: Discovery of a highly potent and selective

投与し指標となる血中のサイトカインを測定した結果，degrader targeting hematopoietic prostaglandin

HPGDS 阻害剤 TFC-007 と比較して高い治療効果を示

D synthase via in silico design, J. Med. Chem.,

した．

64, 15868 (2021).

温度変化に応答した膜脂質代謝を介するミトコンド
リア機能制御機構の解析
長尾
図３

耕治郎
（京都大学大学院工学研究科）

PROTAC (HPGDS) 1-6 の HPGDS 分 解 誘
導活性評価
【目的】

環境温度の変化に対して，柔軟に適応することは細胞機能を維持するために重要である．しかし，温度変化を感知する機構やその適応機構については不明な点が
図4

PROTAC (HPGDS)-6 の評価

多く残されている．我々はこれまでに，ショウジョウバ
エ培養細胞 S2 を用いた解析から，脂肪酸のΔ9 位に二52

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

重結合を導入することで膜リン脂質組成の制御において中心的な役割を担うΔ9-脂肪酸不飽和化酵素 DESAT1

ニトロ化タンパク質の脱ニトロ化・還元酵素の探索・に依存して，低温曝露時にミトコンドリア内膜の F1F0-

同定・機能解析ATPase の多量体形成及び酵素活性が亢進することによ那須野り，ミトコンドリア電子伝達経路の活性化が引き起こさ亮（奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科）れることを明らかにした．電子伝達経路の活性化は細胞内での熱産生に繋がるため，本現象は環境温度の低下に【背景と目的】

抗うために重要であると考えられる．しかし，温度変化

シグナル分子である一酸化窒素（NO）に依存的なタに応答して小胞体に局在する DESAT1 がどのようにしンパク質翻訳後修飾の一つであり，タンパク質のチロシてミトコンドリア内膜に局在する F1F0-ATPase の機能

ン（Tyr）残基をニトロチロシン（NT）残基へ変換すを制御しているのか，
その機構は不明であった．そこで，るニトロ化（Protein Tyrosine Nitration; PTN）修飾は，

本研究課題では小胞体に局在する DESAT1 がミトコン

脱修飾に酵素反応が必要と考えられているが，酵素は同ドリア機能を制御する機構の解明を目指した．

定されていない．

【方法】

本 研 究 で は， 酵 母 Saccharomyces cerevisiae を 用 い，

DESAT1 の細胞内局在は共焦点顕微鏡観察および分PTN シグナルの消去経路として，NT を Tyr へ変換す

画遠心により評価した．膜リン脂質組成は三連四重極型

る脱ニトロ化酵素（DNTase），AT へ還元する NT 還元

質量分析装置 LCMS8040 により分析した．

酵素（NTred）を同定することを目的とした．

【結果・考察】【方法】

GFP 融合型 DESAT1 をショウジョウバエ S2 細胞に

2-1．酵母抽出液の調製

発現させると，小胞体マーカー（Bip-GFP-KDEL）との最少培地で培養した酵母 S. cerevisiae をガラスビー

共局在が観察された．しかし，一部の DESAT1 タンパ

ズ に よ り 破 砕 し， 遠 心 上 清 を 20 mM Tris-HCl ̀(pHク質はミトコンドリアマーカー（Mito-GFP）と近接し7.4), 5% glycerol 緩衝液により透析した．酵素活性測て存在していた．さらに，生化学的なミトコンドリアの定の際は，15 N ラベルした窒素源を用いて酵母を培養した．

分画実験から，DESAT1 がミトコンドリア膜画分にも2-2．DNTase，NTred 活性の測定存在することが示された．また，ミトコンドリア画分の酵母抽出液と 1 mM NT を，Tris-HCl (pH 7.4) 緩衝

膜リン脂質組成を分析したところ，DESAT1 の産物で液，NADPH, NADH, FAD, FMN, ATP, GTP, MgSO4,

ある一価不飽和脂肪酸を含むリン脂質の割合が低温暴

CaCl2 と と も に 37 ℃ で 反 応 さ せ，InertSustain

露により，DESAT1 依存的に増加することが示された．

カ ラ ム（GL science），QTRAP4500 質 量 分 析 計（ABF1F0-ATPase の構造と機能は膜リン脂質組成変化の影響

SCIEX）を用いた逆相系 LC/MS/MS に供し，Tyr およを受けやすいことが報告されている．このため，ミトコ

び AT を定量した．

ンドリアに近接した DESAT1 が低温暴露時にミトコン

2-3．NT 結合タンパク質の探索と同定

ドリア膜のリン脂質組成を制御することにより，電子伝

C18

NT と NHS-activated Sepharose™ 4 Fast Flow

達経路が活性化されると考えられる．

(Cytiva) を用いて作製した NT 結合樹脂を，酵母抽出液【文献】と反応させた後，10 mM NT により溶出した．続いて，Murakami, A., Nagao, K., Juni, N., Hara, Y. &溶出画分に含まれる NT 結合タンパク質を質量分析にて

Umeda, M.: An N-terminal di-proline motif is es-

同定した．

sential for fatty acid-dependent degradation of Δ9-【結果と考察】desaturase in Drosophila, J . Biol . Chem ., 292,3-1． 酵 母 粗 酵 素 液 中 の 遊 離 NT に 対 す る DNTase,

19976 (2017).

NTred 活性の解析
遊離 NT をモデル基質として用い，酵母抽出液中の53

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

DNTase お よ び NTred 活 性 を 測 定 し た 結 果， 明 確 な
Tyr および AT 合成活性を検出した（Fig. 1）．このことから，酵母が DNTase 活性，NTred 活性を有することが示された．
3-2．NT 結合タンパク質の同定
NT 結合樹脂を用いたプルダウン法と質量分析の結果，生理機能未知の還元酵素 R を NT 結合タンパク質
Fig.1

DNTase および NTred 活性の測定

N ラベルした最少培地で培養した酵母由来の抽出液を NT と反応させ，経時的に LC/MS/MS にて解析した．14N-Tyr の定量により (A) DNTsse 活性
15を，AT の定量により (B) NTred 活性を解析した．
N-Tyr の 定 量 は 182.0 か ら 136.1, AT は 1970.0から 134.2 の transition による MRM にて行った．
14

として同定した（Fig. 2）．
3-3．R 遺伝子破壊株の DNTase，NTred 活性の解析
還 元 酵 素 R の 遺 伝 子 破 壊 株 を 用 い， 抽 出 液 中 の
DNTase および NTred 活性を測定した．その結果，野生株と破壊株で NTred 活性に大きな差はなかったものの，破壊株の DNTase 活性は野生株の３分の１以下に低下した（Fig. 3）．この結果から，還元酵素 R が
DNTase 活性に寄与する可能性が示唆された．

CRISPR-Cas 系が誘導する新規な DNA 転移メカ
ニズムの解明沼田倫

征（九州大学大学院農学研究院）

Fig.2

NT 結合樹脂を用いた NT 結合蛋白質の探索・
同定

NT 結合樹脂を酵母抽出液と混合した後，NT 溶液にて溶出した．NT を樹脂リガンドとして用いた条件
でのみ得られたタンパク質を質量分析にて解析し，機能未知の還元酵素 R を NT 結合タンパク質として
同定した．

【目的】
CRISPR-Cas 系は様々な生物種において利用可能なゲノム編集ツールとして大きな注目を集めており，生命科学研究に革命を起こしつつある．一方で，ゲノム上の予期しない場所の遺伝情報をランダムに書き換えてしまうオフターゲット効果も確認されており，ゲノムを人為的に改変する上での大きな支障となっている．今後，
CRISPR-Cas 系をさらに有益な分子ツールとして多方面において利活用するためには，オフターゲット効果を抑制する技術の開発，既存のゲノム編集技術の改善，さらには大規模な塩基配列の挿入や欠失を可能にする新たなゲノム編集技術の開発が不可欠である．これを実現する
ためには，CRISPR-Cas 系の作動原理を詳細に理解する

Fig.3

遺伝子破壊株の抽出液中の DNTase および NTred 活性（A）野生株および（B） 遺伝子破壊株由来の抽出液を用いて２時間酵素反応を行い，DNTase およびNTred 活性を測定した．

ことが不可欠であると同時に，新たな分子特性をもった
CRISPR-Cas 因子の発見と開発が強く求められる．
自然界において，CRISPR-Cas 系は原核生物における獲得免疫に重要な役割を果たしている．Cas タンパク質が crRNA と結合してエフェクター複合体を形成し，こ54

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成のエフェクター複合体が crRNA の塩基配列と相補的な【考察】

ウイルス核酸を配列特異的に認識して分解する．この海洋および温泉に由来する環境メタゲノムから，従

配列特異的な DNA 切断活性を利用してゲノム編集技術

来のものとは配列相同性の低い多数の cas12 候補遺伝が開発されており，現在，Cas タンパク質の一種である子を同定した．当該遺伝子の周辺領域を含んだ DNA 配

Cas9 を用いたゲノム編集が主流となっている．本研究

列を大腸菌発現ベクターにクローニングし，大腸菌内では，環境メタゲノムからの新規な Cas 候補遺伝子をで Cas12 タンパク質を合成した．精製した Cas12 タン

発掘するとともに，新たな Cas タンパク質を利用した

パク質サンプル中には核酸が含まれており，Cas12 とゲノム編集技術の基盤を確立するための基礎的な研究の結合する crRNA である可能性が推定される．今後，こ遂行を目的としている．

の核酸を同定するとともに，Cas12 による DNA 切断【方法】

活性を測定する計画である．また，結晶構造解析もし海洋および温泉に由来するメタゲノムデータベースを

くはクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析により，構築するために，
海水および温泉水サンプルを濾過して，Cas12 の立体構造を決定し，構造と機能の両面から新バクテリアおよびアーキア画分，およびウイルス画分を

規 Cas12 の性状解析を行う計画である．さらに，様々分画した．得られたバクテリア / アーキア画分およびウな生物を用いたゲノム編集を試み，当該 Cas12 タンパ

イルス画分サンプルから DNA を抽出し，メタゲノムをク質がゲノム編集に応用展開可能かどうか検討する．

調製した．次世代シーケンサーを用いて塩基配列を決定【文献】

し，配列解析によってメタゲノムデータベースを構築し特になした．得られたデータベースを解析し，これまでに報告されている Cas9 や Cas12 と配列相同性の低い Cas タン
パク質を検索した．

トポイソメラーゼ３酵素によるＭ期テロメア脱保護

配列相同性の低い Cas12 に注目し，その性状を解機構の解明析するため，メタゲノム由来 Cas12 およびその周辺林眞理（京都大学大学院医学研究科）の DNA 領 域 を PCR に よ り 増 幅 し， 発 現 ベ ク タ ー にクローニングした．このプラスミドを用いて大腸菌
BL21(DE3) 株を形質転換し，大腸菌内において Cas12【目的】

タンパク質を大量産生した．超音波破砕によって大腸菌

染色体 DNA の末端は，テロメアというタンパク質から目的タンパク質を抽出し，各種クロマトグラフィー-DNA の複合体によって，DNA 二本鎖切断末端としてを用いて Cas12 タンパク質を精製した．

認識されることを免れている．テロメア配列は，脊椎動【結果】

物では TTAGGG の単純リピート配列で，その末端は 3ʼ

メタゲノムデータベースを構築し解析した結果，こが突出している．さらに，テロメアリピート配列を認識れまでに報告されている Cas12 と配列相同性の低いして結合する Shelterin 複合体の働きにより，3ʼ 突出

Cas12 タンパク質をコードすると推定される遺伝子を末端が二本鎖リピート領域にループして潜り込むＴルー

多数同定することに成功した．これら遺伝子を含む周プと呼ばれる構造をとることで，末端が保護されている．

辺 DNA 配列を大腸菌発現ベクターにクローニングし我々や他のグループは，細胞周期の有系分裂（M）期停て，大腸菌内で発現させ，アフィニティークロマトグラ

止が，テロメア T ループの乖離による脱保護を引き起フィー，イオン交換クロマトグラフィー，ゲルろ過クロ

こすことを報告した１,２）．本計画では，Ｍ期テロメア脱マトグラフィーを用いて Cas12 タンパク質を精製した．

保護の分子メカニズム解明を目指し，トポイソメラーゼ

精製した Cas12 タンパク質は核酸を含んでいた．この

３酵素を含む BTR 複合体 (BLM-TOP3A-RMI1/2) の酵

核酸は，cas12 遺伝子の周辺領域にコードされている

素活性が本反応に関与するという仮説の検証を目的としcrRNA であると推定される．

た．

55

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成【方法】
ヒト繊維芽細胞 IMR-90 をモデルとし，微小管融合阻
害剤コルセミドによってＭ期停止を誘導，テロメアの脱保護状態を，DNA 傷害マーカーであるγ-H2AX で検出

霊長類特異的 TRIM ファミリーによるユビキチン
修飾制御機構の生物学的意義の解明
平

田

祐

介
（東北大学大学院薬学研究科）

した．BTR 複合体のうち，酵素活性を担う TOP3A，及び BLM を shRNA によってノックダウンし，さらに正常，
及び酵素活性変異を持つそれぞれの因子の cDNA を細胞に導入することで，それぞれの酵素活性が M 期テロ【目的】
TRIM48 をはじめとする霊長類特異的 TRIM ファミ

メア脱保護に寄与する可能性を解析した．

リーは，遺伝子重複等によって生じた遺伝子群で，染色【結果】体上で遺伝子クラスターを形成しており，ファミリー分

shRNA に耐性をもった BLM, TOP3A の野生型をノッ

子内の配列相同性が極めて高い（40−80% の相同性）．

クダウン前の細胞へ導入したところ，
脱保護が回復した．

我々は，このユニークな特徴に着目し，ファミリー分子

一方，BLM の酵素活性変異である D795A や，double-全般を対象とした解析から，TRIM48 とファミリー分子

holiday junction (DHJ) への結合を失活する K1270V

間の機能的な類似性や，共通の転写・翻訳レベルでの発変異，及び TOP3A の酵素活性変異である Y337F は，

現制御機構が存在することを見いだした（Cell Reports,

表現型を回復することができなかった．

2017）．本研究では，本ファミリーが関連するがんや希【考察】

少難治性の遺伝性疾患である顔面肩甲上腕型筋ジストロ

BLM, TOP3A の点変異についての報告から，BTR 複

フィー（FSHD）に焦点を当て，本ファミリー分子群に合体の持つ，DHJ 乖離活性こそが，Ｍ期テロメア脱保

よるユビキチン化修飾の進化学的・生物学的な重要性お護に必要であることが強く示唆された．試験管内反応によび病態生理学的意義の解明を目的として以下の解析を

よってこの仮説を検証するために，国外グループとの共行った．

同研究を進めている．Ｔループの乖離は Shelterin 因子【方法】

である TRF2 によって抑制されるため，今後は TRF2 と各 TRIM ファミリー分子を過剰発現，あるいは発現

BTR 複合体との関係について解析を展開する．

抑制した際の，過酸化水素処置時（酸化ストレス時）お【文献】

よび DUX4（FSHD の原因遺伝子として知られる転写

１）Hayashi, MT., Cesare, AJ., Fitzpatrick,因子）誘導性の細胞死への影響を評価した．その際の関JA.,Denchi EL. & Karlseder, J.: A telomere-

連分子の活性化，本ファミリー分子との結合性や発現のdependent DNA damage checkpoint induced by

変動について，ウェスタンブロットによる生化学的解析，

prolonged mitotic arrest, Nat. Struct. Mol. Biol.,qPCR による mRNA の発現解析を行った．

19 (4), 387-394 (2012).

【結果】

２）Ly, DV., Low, RRJ., Frolich, S, Bartolec, TK.,

TRIM48 を含む複数のファミリー分子について，エKafer, GR., Pickett, HA., Gaus K. & Cesare, AJ.:

フェクター分子 PRMT1 や他の関連分子との結合性が確

Telomere Loop Dynamics in Chromosome End

認できた．酸化ストレス時および DUX4 誘導性の細胞

Protection, Mol. Cell, 71, 510-525 (2018).

死について，TRIM48 単独あるいは他のファミリー分子を同時に発現抑制することで，細胞生存率の増加あるいは減少が認められた．またこの時，TRIM48 の下流で制御を受ける p38/JNK MAP キナーゼ経路の活性化抑制が認められた．
【考察】
本研究より，本ファミリー分子がファミリー間で同様

56

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成の機能を保持し，がんや FSHD などの病態に関与して【方法と結果】

いることが示唆された．本ファミリー分子群は，霊長類

１．ハイスループットスクリーニング（HTS）を用いたが進化の過程で獲得し，高度なユビキチン化制御に関Fut8 阻害剤の開発与していると考えられ，今後はその病理的意義だけでな

コアフコースの機能解明・制御に利用可能な Fut8 阻

く，生理的意義も含めた機能的役割の全容解明が期待さ害剤の開発を目指した．その結果，Figure 1 に示す８れる．

個の化合物が 10μM で Fut8 の酵素反応を阻害した．

【文献】

HTS で得られた Fut8 阻害剤の中で，8-12 は共通構造

Hirata, Y., Katagiri, K., Nagaoka, K., Morishita, T.,を保持していた．我々は，これを Fut8 阻害剤のファー

Kudoh, Y., Hatta, T., Naguro, I., Kano, K., Udagawa,T., Natsume, T., Aoki, J., Inada, T., Noguchi, T.,
Ichijo, H. & Matsuzawa, A.: TRIM48 promotes
ASK1 activation and cell death through ubiquitindependent degradation of the ASK1 negative regulator PRMT1. Cell Reports, 21(9), 2447-2457 (2017).

Ｔ細胞上のコアフコースを標的とする炎症性腸疾患
治療薬候補の検討深瀬浩

一（大阪大学大学院理学研究科）
Scheme 1. FUT8 によるコアフコース形成反応【目的】
クローン病は，潰瘍性大腸炎とならぶ主要な炎症性腸疾患（inﬂammatory bowel disease：IBD）であり，主に小腸や大腸などの消化管に炎症を繰り返す慢性疾患
で，近年その患者数が増加している．クローン病患者の腸管炎症部において，非炎症部に比べ浸潤Ｔ細胞にコア
フコースが増加することが見出された．Fut8 をノックアウトしたコアフコース欠損マウスに対して TNBS を作用させて誘導した実験的クローン病モデルでは，腸炎が劇的に抑制されることが見出された．
コアフコースは，
アスパラギン結合型糖タンパク質（N-グリカン）の修
飾糖鎖の一つであり，上記の Fut ８という糖転移酵素によってアスパラギンに結合した N-アセチルグルコサミ

SFigure 1. FUT8 阻害剤の HTSンの６位に導入される（Scheme 1）．我々は，以上のことからコアフコースならびに Fut8 をクローン病治療の新しい糖鎖治療の標的として期待し，Fut8 阻害剤の開発，さらには，これを標的とする治療法の POC 取得を目的とした．

Figure 2. FUT8 阻害剤の HTS

57

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

マコフォアと考えた．そこでこの構造をもとに構造活性できた．種々の検討の結果，化合物 16 が PBS 中で十相関研究を進めることで，細胞抽出液を用いた酵素アッ

分な安定性を保持した（半減期：＞12 h）．この化合物セイ系で，IC50 が 10μM 程度の Fut8 阻害剤 13 の創製

16 は，膜透過性を有しており，培養細胞系で再現性良に至った（Figure 2）．

く Fut8 を阻害することをフローサイトメトリーで確認

２．Fut8 阻害剤 13 の作用機構解析した．

続いて，13 の Fut8 阻害の作用機構について考察しさらに本化合物のマウス脾臓細胞に対する抗炎症効果

た．我々は，化合物 13 が PBS 緩衝液中で速やかに分を，サイトカイン誘導能で評価した．その結果 100 nM

解し，15 を生じていることを見出した（半減期：＜1

レベルで炎症生サイトカインの産生を抑制し，抗炎症性h, Figure 3）．これは，13 のアミンユニットが脱離し，サイトカインの産生を誘導した．またそのフェノタイプ

エキソメチレン 14 が生じ，ここに水が付加したと考えは，Fut8 ノックアウトに類似していた．この結果はＴられる．この結果から，13 から分解して生じた 14 が細胞を標的とした Fut8 阻害剤による炎症制御が可能でFut8 と共有結合を形成することで，Fut8 を阻害していあり，Fut8 がクローン病治療の新しい標的となり得るると考えた．そこで，
MS 解析を行ったところ，予想通り，ことを示唆している．

Fut8 と 14 の共有結合複合体の生成を確認することができた．

現在は，実験的クローン病モデルにおける本薬剤の腸炎抑制効果を検証中である．

また発現させた Fut8 と阻害剤 13 のアフィニティー
を等温滴定型カロリメーター（ITC）によって測定したところ，結合には GDP が必要であることがわかり，
GDP 存在下での乖離定数は 50 nM であった．またその結合は，エントロピー駆動型であった．

HER2 陽 性 乳 癌 細 胞 に お け る EGFR/HER2
phosphatase の活性化機構の解明
前

川

大

志
（慶應義塾大学薬学部）

３．Fut8 阻害剤のプロドラッグ化と細胞系での機能評価
化合物 13 を用いて細胞系での Fut8 阻害活性を測定したが，再現性の低い結果であった．これは，２で示し【目的】

た分解反応が原因であると考えた．そこで，13 のプロ研究代表者は今までに，種々の乳癌サブタイプの中ドラッグ化による安定化を検討した．ナフトールのヒでも，HER2 陽性乳癌細胞特異的に作動する細胞増殖

ドロキシ基を保護することで，13 の分解を防ぐことが

制 御 分 子 と し て， ユ ビ キ チ ン (Ub)-E3 複 合 体 CUL3/
KCTD10/RhoB を 同 定 し て い る１）．CUL3/KCTD10/
RhoB 軸による細胞増殖機構を更に解析した所，CUL3
または，KCTD10 の発現抑制によって蓄積した RhoBが原因となり，EGFR/HER2 のリン酸化レベルが著しく低下する事が分かった．そこで本研究では，この RhoB
依存的な EGFR/HER2 のリン酸化制御機構の分子基盤を詳細に解明する事を目的とした．

Figure 3. FUT8 阻害剤 13 の推定作用機構【方法】
RhoB に結合するタンパク質を愛媛大学プロテオサイ
エンスセンターが保有するヒトプロテインアレイ（今回は約 4000 タンパク質のアレイを使用）の中から，アルファスクリーンを用いて探索した．また，質量分析法にFigure 10. FUT8 阻害剤 13 のプロドラッグ化

よっても，HER2 陽性乳癌細胞の細胞抽出液中の中から
RhoB 結合タンパク質の同定を試みた．この時，ベイ58

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

トタンパク質として RhoB の dominant-negative 体と十分な EGFR/HER2 のリン酸化が生じている．一方で，constitutive active 体の両方を用意し，両者の結合タン

RhoB のタンパク質量が増えると，足場タンパク質Ｘに

パク質を比較した．同定された RhoB 結合タンパク質

RhoB が強く結合し，細胞膜型ホスファターゼ PTPs がに結合するホスファターゼをヒトホスファターゼアレ

遊離して，活性化し，EGFR と HER2 の脱リン酸化をイ（171 分子）の中から，アルファスクリーンを用いて促し，HER2 陽性乳癌細胞の増殖が阻害される．RhoB

探索した．最後に，RhoB 結合タンパク質及び，同定さの恒常的タンパク質分解が OFF になるような生理的条れたホスファターゼの細胞レベルでの機能を EGFR と件は未だ不明であるので，追加の検証が必要である．まHER2 のリン酸化を指標に HER2 陽性乳癌細胞を用いた，質量分析を用いた RhoB 結合タンパク質探索で，足て解析した．また，各タンパク質の細胞内局在を免疫染場タンパク質Ｘも PTPs も検出されなかったのは，これ色し，共焦点顕微鏡で観察した．

らのタンパク質のイオン化効率が著しく悪い可能性や，【結果】発現量が低い可能性，可溶化効率が悪い可能性が挙げら

コムギ無細胞タンパク質合成系を用いてビオチン化れる．今後は，足場タンパク質Ｘと PTPs の HER2 陽性

RhoB の dominant-negative 体 と constitutive active

乳癌細胞における機能解析を更に進め，当該分子基盤に体に直接結合するタンパク質をヒト 4000 タンパク質

対する人為的制御剤を HER2 陽性乳癌治療薬の新規シー

ア レ イ の 中 か ら 探 索 し た 結 果，RhoB の constitutive

ズとして導出していきたい．

active 体に特異的に結合するタンパク質として，足場タ【文献】

ンパク質Ｘを同定した（論文投稿中）．この足場タンパ

１）Murakami, A., Maekawa, M., Kawai, K., Na-

ク質 X は幾つかの癌細胞で増殖シグナルを正に制御すkayama, J., Araki, N., Semba, K., Taguchi, T.,る事が知られている一方で，HER2 陽性乳癌細胞におけ

Kamei, Y., Takada, Y. & Higashiyama, S.: Cul-

る機能の報告は一切無い．重要な事に，HER2 陽性乳癌

lin-3/KCTD10 E3 complex is essential for Rac1細胞で足場タンパク質Ｘを発現抑制した結果，EGFR とactivation through RhoB degradation in human

HER2 のリン酸化が著しく減少し，細胞増殖が強く阻害

epidermal growth factor receptor 2-positive

された．
更に，
足場タンパク質Ｘに結合するホスファター

breast cancer cells. Cancer Science. 110(2):ゼとして，複数の細胞膜型ホスファターゼ PTPs の同定

650-661. (2019).

に成功した（論文投稿中）．それぞれ単独の PTP の発現抑制では EGFR と HER2 のリン酸化に対する影響は弱かった．一方で，過剰発現系では単独でも，EGFR とHER2 のリン酸化レベルを著しく低下させ，細胞増殖も強く阻害した．この表現型はホスファターゼ活性を失っ

D-サイクロセリン生合成に関わる金属酵素の活性制御機構に関する研究
的

場

康

幸
（安田女子大学薬学部薬学科）

た CS 変異体では見られなかった．興味深い事に，質量分析を用いた RhoB 結合タンパク質探索では，足場タン
パク質Ｘも PTPs も検出される事は無かった．また，in【目的】

vitro での結合実験から，RhoB と PTPs は足場タンパク

一酸化窒素（NO）は，アルギニンを原料として，ヘ質Ｘの同じドメインに相互排他的に結合する事が分かっム 結 合 酵 素 で あ る NO 合 成 酵 素（NOS） に よ り 合 成た．

される．この反応では，中間体として Nω-ヒドロキシ【考察】

アルギニン（NOHA）が生じる．中間体として生じた本研究の解析から，次のモデルが提唱できる．通常はNOHA は，二核マンガン酵素であるアルギナーゼを阻

CUL3/KCTD10 により常に RhoB が分解され，その発害し，アルギニンの分解を抑制する．このため，生体内現が低く保たれる事で，細胞膜型ホスファターゼ PTPs

で NO が必要なとき，効率よくアルギニンから NO をが足場タンパク質Ｘに結合し，不活性化され，増殖に合成できる．研究代表者らは，抗生物質 D-サイクロセ

59

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

リンの生合成機構を研究する過程で，アルギニンからNOHA までの反応しか触媒しないヘム酵素 DcsA と，
NOHA を特異的に加水分解するアルギナーゼ類似酵素
DcsB を発見した．本研究では，DcsA と NOS の違い，

西洋わさび由来ペルオキシダーゼ反応による任意ペプチド抗原を提示可能なタンパク質ポリマーの創製
南

畑

孝

介
（九州大学大学院工学研究院）

DcsB とアルギナーゼの違いをもたらす構造学的要因を明らかにすることを目的とした．
【方法】

【目的】

高分解能で明らかにした DcsA と DcsB の結晶構造を本研究では，西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（HRP）

もとに，種々の部位特異的変異を導入し，変異体の酵素の酵素反応を用いたタンパク質重合化技術を用い，任意

活性や，三次元構造を明らかにした．

のペプチドを提示可能な高免疫原性タンパク質ポリマー【結果および考察】の構築を試みた．戦略として SpyTag(ST) と自発的に結DcsA と NOS の 全 体 構 造 は 著 し く 異 な る． ま た，

合する SpyCatcher (SC) を用いた．ST に任意のペプチ

DcsA の基質結合ポケットは小さくなっており，NOHA

ド配列を融合し，SC と共発現することで，大腸菌内にに対する活性を示さない原因になっていると考えられ

おいて任意ペプチドを SC 上に提示する．このペプチドた．ただし，DcsA と NOS では，その遠位配位子がシ

提示 SC を HRP によって重合化させることで，高い免

トクローム P450 と同じくシステインのチオール基であるが，チオール基からヘム鉄への電子供与性が，P450に比べて弱いことが明らかとなった．チオール基への水素結合が電子供与性を弱める要因として考えられたため，水素結合が消失すると考えられる F60P 変異体を作成した．ただしこの変異体では，ヘムと結合した酵素が得られなかった．
DcsB の全体構造はアルギナーゼと似ている．しかしながら，活性に関わる複数の残基で置換が見られた．特に，MnA に対する配位子のひとつが，アルギナーゼ
ではヒスチジン，DcsB ではシステインになっている．
DcsB の C86H 変異体では，酵素活性が著しく減少した．
また，その結晶構造を解析したところ，MnB の一部が

図１

高免疫原性ペプチド提示 SC ポリマー

別の位置に移動していることが判明した．このことは，
DcsB の活性中心における通常の架橋分子は水であり，電子供与性を弱めると２つの Mn (II) の間に反発が生じること，および，DcsB の酵素反応中に陽イオンが生じ，それを保持する機構が備わっていることが示唆された．

図２

60

大腸菌菌体内における SC-ST 複合体形成

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

疫原性を有するタンパク質ポリマーの創製を目指し検討(Y-tag) を N/C 両末端に導入した SC 遺伝子および，STを行った（図１）．

とモデルペプチドを融合したペプチド遺伝子を大腸菌で【実験方法】

発現することで，ペプチド提示 SC を調製した（図２）．

１）ペプチド提示 SC の調製

２）ペプチド提示 SC の HRP 酵素反応による重合化

共発現ベクターを用い，チロシンを含むペプチドタグ

ペプチド提示 SC に対して，HRP および H2O2 を添加することで，HRP 酵素反応処理を行った．SDS-PAGE
解析によってポリマー化の有無を評価した．
３）ペプチド提示 SC ポリマーの樹状細胞への取り込み評価
ペプチド提示 SC ポリマーを樹状細胞，DC2.4 細胞に添加し，取り込み挙動を共焦点顕微鏡観察によって評価した．
【結果および考察】
１）ペプチド提示 SC の調製結果
図３にペプチド提示 SC の精製結果を示す．溶出画分において，20 kDa 付近にバンドが確認され，ペプチド

図３

大腸菌菌体内におけるペプチド提示 SC の調製結果

提示 SC の調製に成功した．
２）HRP による重合化反応結果
ペプチド提示 SC に対して HRP および H2O2 を添加した条件において，高分子量側にバンドが確認され，重合化を確認した（図４）．H2O2 濃度が 25μM の条件において，モノマーのバンドが完全に消失した．
３）ペプチド提示 SC ポリマーの樹状細胞への取り込み
評価結果
図５にペプチド提示 SC ポリマーを添加した樹上細胞の共焦点顕微鏡観察結果を示す．ペプチド提示 SC ポリ
マーにおいて有意に細胞内への取込が観察された．この

図４

HRP 酵素反応によるペプチド提示 SC ポリマーの調製結果より，ポリマー化によって免疫原性が向上したことが示唆された．今後，実際にマウスに免役することを検討する．
【学会発表】
化学工学会 第 52 回秋季大会「がんペプチド抗原を提示したポリマー型キャリアタンパク質の開発」，上野利晃，南畑孝介，若林里衣，神谷典穂，後藤雅宏

図5ペプチド提示 SC ポリマーの樹状細胞による取
込評価結果

61

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成

新奇酵素が担う過酸化タンパク質除去によるバイオフィルム維持のメカニズム
三

原

久

明

精製した．次に，この trHbO をモデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）および AAPH を含む溶液に添加し，過酸化した BSA への凝集抑制能を評価した．
【結果】（立命館大学生命科学部）

酸化剤耐性への影響

yjbI 破壊株では，AAPH による生育抑制が，野生株と比較してより顕著にみられた（図１）．また， yjbI【目的】
切断型ヘモグロビン（trHbO）はグラム陽性細菌や植破壊株では次亜塩素酸の感受性が著しく上昇しており物などに広く分布しているが，その生理機能は不明であった．我々はこれまでの研究から，Bacillus subtilis
において，「過酸化タンパク質」を trHbO が除去し，タンパク質の酸化変性・凝集を防いでいる可能性を見出した．本研究では，trHbO が種々の酸化要因に対してどのような役割を果たすかを評価した．また，他の細菌種において，trHbO の役割が B. subtilis と同様であるかを検証した．
【方法】
酸化剤耐性への影響評価
trHbO 破壊株（ yjbI −）をラジカル開始剤である 2,2アゾビス（2-アミノジプロパン）二塩酸塩（AAPH）存在下で培養し，酸化剤への影響を評価した．また，同様にタンパク質を過酸化することが報告されている次亜塩
素酸を用いて，
破壊株における最小殺菌濃度を算出した．
Mycobacterium の trHbO 評価

M. tuberculosis 由来のリコンビナント trHbO を発現・

表１

＋
−

62

生育を確認
生育無し

次亜塩素酸の最小殺菌濃度

図１

AAPH 下における各破壊株の生育

図２

過酸化タンパク質の凝集評価

酵素の応用研究および生命科学に関連する酵素の研究助成（表１），野生株と比較して約 100 倍差がみられた１）．

として PDGFRα陽性の傍血管線維芽細胞（PVF）の存

Mycobacterium の trHbO 評価

在が報告された．従って本研究は PVF が脳内 PG 合成

SDS-PAGE の 結 果，trHbO を 含 ま な い 試 料 で は 泳の場となる可能性について迫ることを目的とした．

動開始点付近に巨大分子が観察された．一方，trHbO【方法】

を添加した場合は同様のバンドは確認されなかった

⑴

（図２）
．

LPC をマウスに投与し脳細胞の分散後，PDGFRα陽性【考察】

細胞を TF 陽性および陰性細胞に分け，RNAseq 解析を

yjbI の破壊が，酸化剤への感受性を著しく高めている

蛍光ラベル脂肪酸含有 LPC である TopFluor (TF)-

行なった．

ことがわかった．この結果は，酸化剤耐性の低下が不完⑵

全なバイオフィルム形成を引き起こしている可能性を示

脳内における COX2 の局在を検討した．

唆している．

⑶

また，M. tuberculosis の trHbO も過酸化タンパク質

マウスにリポポリサッカライドを投与し，炎症時の脳内 PDGFRα陽性細胞を単離し，各種 PG の産生

を LC-MS により検討した．

の凝集抑制能を有していることが確認された．この結果【結果】

は，細菌種横断的に trHbO が過酸化タンパク質の凝集⑴を抑制する生理機能を担っていることを示唆しており，部の細胞集団が TF-LPC を取り込むことを明らかにして病原性細菌の酸化剤耐性を狙った新たな薬剤開発に繋がいた．今回の RNAseq 解析の結果，TF 陽性細胞で高発るものと期待している．

現となる上位遺伝子の多くが線維芽細胞マーカーである【文献】

ことが確認された．従って，TF-LPC を蓄積する細胞集

１）Imai, T., Tobe, R., Honda, K., Tanaka, T.,

団が PVF であるという仮説がトランスクリプトーム解

予備検討により脳内 PDGFRα陽性細胞の中でも一Kawamoto, J. & Mihara, H.: Group II truncated析から強く支持された．

haemoglobin YjbI prevents reactive oxygen⑵

species-induced protein aggregation in Bacillus

られたが血管周囲部にも認められた．これら非血管内皮subtilis, bioRxiv., doi: https://doi.org/10.1101/2

性の COX2 染色が PDGFRα染色と重なることから，炎021.05.28.446166, (2021).

症時脳において血管内皮細胞と並んで PVF で COX2 が既報通り COX2 は主に血管内皮細胞に発現が認め

発現していることがわかった．
傍血管線維芽細胞は脳内プロスタグランジン産生の
場となるか
柳

田

⑶

単離 PDGFRα陽性細胞において，カルシウムイオ

ノフォア刺激により PGE2 をはじめとする PG 類の産生が確認された．

圭介（国立国際医療研究センター研究所）【考察】
以上より，PVF が脳内 PG 産生の場となる可能性が極めて高いと考えられた．一方，PG 産生を確認したの【目的】

は ex vivo 実験であり，かつ PVF を含むヘテロな集団

プロスタグランジン（PG）はアラキドン酸からシクでの実験である．現在のところ PVF の特異的な細胞表

ロオキシゲナーゼ（COX）および各種 PG 合成酵素によ面マーカーとなりうる分子は見いだせていない．そこり産生される脂質メディエーター群であり多彩な生理機

で Col1a1-Cre マウスを用いて「PVF レポーターマウ

能を発揮する．PG は脳においても様々な機能に深く関ス」を作成したため，これにより純粋な PVF での PG

わるが，その産生場所には不明な点が多い．これまでの産生能について今後検討を行う．また，新たに PVF 特予備検討により，リゾホスファチジルコリン（LPC）の異的 COX2 欠損マウスを樹立したため，in vivo におけ形態で投与した脂肪酸が脳内で PDGFRα陽性細胞に蓄る PVF による PG 産生の意義を明らかにしていきたい．

積することを見出しており，また近年新規脳細胞クラス

63

研究報告

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成
成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

肥満に伴う高インスリン血症における肝臓が及ぼす影響とその機序の探索浅井洋一郎（東北大学大学院医学系研究科）

３．高脂肪食群において類洞内皮細胞の篩板孔の減少が観察された．
４．高脂肪食群の類洞内皮細胞では，炎症や細胞外基質に関わる遺伝子群が上昇していることがわかった．
【考察】
高脂肪食負荷マウスにおいて肝臓のインスリンクリア【目的】

ランスの低下を認めたが，インスリン分解に関わる遺伝

肥満や脂肪肝では，肝臓におけるインスリン分解が低子の発現は変化がなかった．類洞内皮細胞の篩板孔の減下することが報告されている．そのため，高インスリン少は肝臓におけるインスリン取り込み低下に関与するこ血症が助長され，肥満がさらに加速する悪循環が考えらとが報告されており，高脂肪食群における肝臓インスリ

れる．脂肪肝における肝臓でのインスリン分解低下の機

ンクリアランス低下の原因の一つである可能性が考えら

序はこれまで十分に明らかとなっておらず，本研究ではれた．また，高脂肪食群の類洞内皮細胞において発現が肥満・脂肪肝モデルマウスを用いて，肝臓でのインスリ

上昇していた炎症や細胞外基質に関わる遺伝子群が，篩

ン取り込み/分解が低下する機序の検討を行った．

板孔減少に関与しているか今後検証を行う予定である．

【方法】

肥満に伴う高インスリン血症における肝臓の役割を検討

１．野生型マウスに対し高脂肪食の負荷を行い，肥満

し，肥満を予防するための基盤となる知見を得ることをと脂肪肝を形成させ，ブドウ糖負荷試験における血目指して研究を進める予定である．

中インスリンと血中Ｃペプチドとのモル比の測定を行うことで肝臓のインスリンクリアランスを評価した．
２．肝臓におけるインスリン分解に関与するインスリ
ン 分 解 酵 素（IDE: Insulin degrading enzyme),

免疫学的アプローチによる腎臓病に対する新規治療
戦略の開発
畔

CEACAM1 ( carcinoembryonic antigen-related

上

達

彦

（慶應義塾大学保健管理センター）

cell adhesion molecule 1）について遺伝子発現を評価した．
３．走査型電子顕微鏡を用いて類洞内皮細胞の形態学的評価を行った．

【目的】
慢性腎臓病（CKD）は末期腎不全や脳心血管疾患の発症・死亡のリスク因子で，患者数は本邦で 1330 万人，４．MACS (Magnetic-activated cell sorting) を用いて世界で８億 5000 万人にのぼる．CKD，末期腎不全やそ特異的に類洞内皮細胞を単離し，RNA sequenceの合併症の治療に要する医療費は，医療保険財源を逼迫による網羅的遺伝子解析を行った．

する一因となるが，CKD に対する根本的な治療法は確【結果】

立していない．したがって，CKD に対する新たな治療

１．高脂肪食群では肝臓のインスリンクリアランスが低戦略を構築することは，患者個人の生命予後，健康寿命

下することがわかった．
２．肝臓における IDE, CEACAM1 の遺伝子発現は通常
食群と高脂肪食群で同等であった．

64の観点だけでなく，医療経済的な側面からも，喫緊かつ重要な医療課題であると考えられる．
CKD を制御するために，本研究では，原因として最成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

多である糖尿病性腎臓病（DKD）と，進展機序の ﬁnal

た．ワクチン接種により産生された抗体は，in vitro にcommon pathway である間質線維化に着目した．特にて，RAGE の下流シグナルを抑制しており（内皮細胞に

DKD の発症・進展に深く関与する終末糖化産物受容体

おける AGE 刺激後の VCAM-1, ICAM-1 の発現抑制），（RAGE） と， 線 維 化 の key factor で あ る connectivein vivo，in vitro の両面から，抗 RAGE ワクチンの効果

tissue growth factor (CTGF) を治療標的に選択した．
CKD は一般に，慢性の経過で進行するため治療が長期間に及ぶ．ワクチン接種により，標的分子の機能を阻害する抗体を誘導することができれば，少ない投薬回数
で長期間にわたる治療効果を得ることが可能となり，医療費の軽減や治療アドヒアランスの向上に寄与することができる．
このような背景を踏まえ，本研究では，アンメット・
メ デ ィ カ ル・ ニ ー ズ の 高 い CKD に 対 し て，RAGE，
CTGF を標的とした治療ワクチンの開発に取り組み，腎臓領域における新たな治療戦略の構築を目指している．
【方法】
１．RAGE ワクチンによる DKD 治療・予防効果の検討
１型糖尿病モデルとして，DBA/2J マウスに膵β細胞毒性を持つストレプトゾトシンを投与する．また，２型
糖 尿 病 モ デ ル と し て，BKS.Cg+Leprdb/Leprdb マ ウス（db/db マウス）を利用する．DKD モデルマウスに，
RAGE ワクチンを隔週で計３回投与し，尿中アルブミン
排泄，光学顕微鏡解析（メサンギウム基質面積，糸球体径），電子顕微鏡解析（糸球体基底膜厚）を行う．
２．CTGF ワクチンによる CKD 治療・予防効果の検討
腎線維化モデルとして片側尿管結紮（UUO）マウスを，腎不全モデルとしてアデニン負荷マウスを利用する．マウスに，CTGF ワクチンを隔週で計３回投与し，腎間質線維化を評価する．
【結果】
１．RAGE ワクチンによる DKD 治療・予防効果の検討
抗 RAGE ワクチン接種により，尿中アルブミン排泄が軽減し，糸球体肥大，メサンギウム基質拡大，糸球体
基底膜肥厚が，いずれも軽減された
２．CTGF ワクチンによる CKD 治療・予防効果の検討
抗 CTGF ワクチンにより，アデニン投与マウスの血清クレアチニン上昇が軽減された．
アデニン投与マウス，
UUO マウスにて，腎間質線維化の軽減が確認された．
【考察】
本研究にて，抗 RAGE ワクチンの腎保護が確認され（Azegami T et al. Diabetes. In press）

65

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成を確認することができた．

MS/MS を用いて測定できる系を確立した．この測定

抗 CTGF ワクチンに関しては，in vivo にて，腎間質系で解析した結果，これまでほとんど知られていな線維化の軽減が確認されており，今後，in vitro 検討をか っ た iso-allo-LCA や 3-oxo-allo-LCA な ど の allo 体

含め，多角的にワクチンの効果を評価していく．

（5alpha）の二次胆汁酸が百寿者の便中で有意に増加していた．このことから，iso-allo-LCA や 3-oxo-allo-

腸内細菌異常による疾患発症メカニズムの解明
新幸二

LCA が長寿に関与している可能性が考えられた．そこ
で 次 に， こ の iso-allo-LCA や 3-oxo-allo-LCA を 合 成できる細菌種を探索するため百寿者の便から細菌株を（慶應義塾大学医学部）

単離し，in vitro において基質と考えられる一次胆汁酸であるケノデオキシコール酸（CDCA）やヒト便中【目的】に豊富に存在する二次胆汁酸の一種であるリトコール

本年度は長寿者特異的な腸内細菌種の同定とその機能酸（LCA），中間産物と考えられる 3-oxo-Δ4-LCA を加解析を行った．当研究室では慶應義塾大学百寿総合研究

えそれぞれの細菌株を培養し，どのような細菌種が百センターと共同で日本全国の百歳以上の方（百寿者）の寿者特異的な二次胆汁酸の変換を行うことができるか

健康診断，血液・便の採取を行っている．百寿者は健康を解析した．培養 48 時間後の培養上清を回収し，LC-

長寿の一つの理想型であり，百寿者の腸内細菌を解析す

MS/MS により胆汁酸量を測定したところ，CDCA やることで長寿の秘訣を明らかにできる可能性があると考LCA か ら は iso-allo-LCA, 3-oxo-allo-LCA と も に 検 出えた．そこで，百寿者，高齢者（平均 85 歳），若者（平されなかったが，3-oxo-Δ4-LCA を培養液に加えた場

均 30 歳）の腸内細菌叢の比較および代謝物の比較を行

合 に は Parabacteroides merdae や Odoribacteraceae

い，百寿者特異的に存在する腸内細菌種および代謝産物などの細菌株が iso-allo-LCA を産生できることが明らの解析を通して百寿者の長寿の秘訣の一端を明らかにすかになった．一方で CDCA を基質として加えた場合は C.

ることを目指した．

scindens が LCA へと変換することができること，LCA【方法】

を基質として加えた場合は E. lenta が iso-LCA へと変

百寿者，高齢者，若者（n ＝ 47）から提供を受けた

換できることも明らかになった．さらに，P. merdae

便を用いて，16S rRNA 解析，メタゲノム解析を行い，や Odoribacteraceae が iso-LCA か ら も iso-allo-LCA

腸内細菌叢を検討した．また同時に GC-MS, LC-MS/を合成できることがわかり，これらの C. scindens, E.

MS を使用して便中の短鎖脂肪酸・胆汁酸を測定した．

lenta, Odoribacteraceae の共培養系に一次胆汁酸であ

その後，百寿者に特徴的な二次胆汁酸について検討を行る CDCA を加えたところ，3 種の菌の組み合わせによ

うため，便から細菌株の培養・単離を行い，in vitro にり iso-allo-LCA が産生された．以上のことから，百寿おける責任細菌の同定・責任遺伝子の同定を行った．

者に多く存在する複数の腸内細菌種を介した二次胆汁酸【結果】の代謝経路によって CDCA から iso-allo-LCA へと変換

細 菌 叢解析の結果，高齢者・若者と 比 較 し て 百 寿されていることが明らかになった．次に，二次胆汁酸者で有意に多く存在して腸内細菌種として，Alistipes

である DCA や iso-LCA がグラム陽性の Pathogen の増Parabacteroides 属 の 細 菌 や Clostridium scindens,

殖を抑えることが知られていたため，この iso-allo-LCA

Eggerthella lenta, Neglecta timonensis な ど の 細 菌 種も同様の機能を有しているのかを解析した．In vitro のを特定した．これらの細菌のうち，C. scindens や E.

解析結果から，DCA や iso-LCA と比較して 3−10 分のlenta はこれまで二次胆汁酸代謝に関与していること

１の低濃度で Clostridium difﬁcile や VRE, MRSA などが報告されていたため，便中の二次胆汁酸組成に違いのグラム陽性菌の増殖を抑え，さらにマウスを用いたがある可能性が考えられた．そこで，百寿者の便中のin vivo の解析においても Odoribacteraceae を定着さ

胆汁酸定量を行うため，53 種の胆汁酸化合物を LC-せることで有意に C. difﬁcile の感染を抑制することが66

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成できた．

階 酵 素 で あ る ミ ト コ ン ド リ ア 型 HMG-CoA 合成酵素

【考察】

(Hmgcs2) の deletion mutant を樹立し，表現型を検討

本研究では，百寿者に特徴的な新規二次胆汁酸を特定した．

し，長寿に関与する腸内細菌種の同定を行った．百寿者【結果】の便中に有意に多く存在していた iso-allo-LCA がグラ

Hmgcs2 KO マウスの肝臓は，授乳開始後より急速にム陽性 Pathogen の腸内での増殖を抑え炎症抑制に寄与

腫大し，顕著な異所性脂肪沈着を呈した．電子顕微鏡にしていること，それが長寿につながっている可能性が考て Hepatocyte の形状を確認すると，Hmgcs2 KO マウ

えられた．また，胆汁酸は宿主の FXR や TGR5 などをスの Hepatocyte では小滴性の脂肪沈着を認め，ミトコ

介し，コレステロール代謝や糖代謝に関与していること

ンドリアの変性所見も確認された．

が知られていることから，今後は iso-allo-LCA の宿主

生後３日目の肝臓サンプルを用いてメタボロームへの影響を詳細に解析していく予定である．同時に百寿解析を実施した結果，KO マウスにおいて解糖系は抑者に有意に多く存在していた 3-oxo-allo-LCA などの他制されている一方で，アセチル CoA は有意に上昇しの二次胆汁酸についてもの腸内細菌による代謝経路の同ていた．しかしながら，TCA サイクル内の代謝産物

定，その役割の解明を行って行きたいと考えている．

は Hmgcs2 KO マ ウ ス で 有 意 に 低 下 し て お り， 単 離【文献】

し た Hepatocyte を 用 い て 酸 素 消 費 量 測 定 を 行 う と，Sato, Y., Atarashi, K., Plichta, DR., Arai, Y., Sasa-

Hmgcs2 KO 由来の Hepatocyte において有意に酸素消

jima, S., Kearney, SM., Suda, W., Takeshita, K., Sa-

費量が低下していることが確認された．

saki, T., Okamoto, S., Skelly, AN., Okamura, Y., Vla-

翻訳後修飾の関与に注目し，アセチル化プロテオミク

makis, H., Li, Y., Tanoue, T., Takei, H., Nittono, H.,

ス解析を実施した結果，Hmgcs2 KO マウスで有意にミNarushima, S., Irie, J., Itoh, H., Moriya, K., Sugiura,

トコンドリアタンパクのアセチル化が亢進していた．単Y., Suematsu, M., Moritoki, N., Shibata, S., Littman,

離ミトコンドリアを用いた検討でも，アセチル化の亢進DR., Fischbach, MA., Uwamino, Y., Inoue, T., Hon-に伴い TCA サイクルにおける酵素連続反応が低下する

da, A., Hattori, M., Murai, T., Xavier, RJ., Hirose, N.

ことが確認された．

& Honda, K.: Unique bile acid-metabolizing bacteria
in centenariansʼ microbiome, Nature (accepted)

一方核においては，Hmgcs2 KO マウスでヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 活性が亢進し，ヒストンタンパ
クの脱アセチル化が亢進していることを確認した．βヒ

新生児期のケトン体合成はミトコンドリアタンパクのアセチル化修飾を調節して機能を維持する．
有馬勇一郎（熊本大学大学院生命科学研究部）

ドロキシ酪酸の投与により HDAC 活性が抑制されることから，Hmgcs2 KO ではβヒドロキシ酪酸を失うことにより，内因性の HDAC 阻害作用が低下すると考えられた．
【考察】
新生児期におけるケトン体合成能の生理的意義とし【目的】て，ミトコンドリアタンパクの過度のアセチル化を緩和

ケトン体は主に肝臓において産生され，空腹時のエネ

し，ミトコンドリア機能を保護する働きがあることを確

ルギー基質として知られる．しかしながら，新生児期に認した．新生仔期は，胎盤栄養から母乳由来の脂肪酸をおいては，摂餌状態に関わらずケトン体濃度が高い．我々多く含んだ栄養環境へと変化する．ケトン体合成はこのは，周産期におけるケトン体合成には，エネルギー基質

過程で，急激に増加する脂肪酸の一部をケトン体へと変供給以外の作用があると考えて検討を進めた．

換することで，ミトコンドリア内でのアセチル CoA の【方法】

蓄積を回避し，細胞保護的に作用すると考えられる．まCRISPR/Cas9 法 を 用 い て ケ ト ン 体 合 成 の 律 速 段

た，HDAC 活性を介してケトン体がエピゲノム修飾に67

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

作用することも確認され，これらの影響がどの程度遺伝的手法による検証を実施し，CNP の Ca２＋ を介した新子発現に影響しているのか，検討を進めている．

たなシグナル経路の同定を試みた．さらに，鍵となる分【文献】

子の欠損器官培養軟骨を用いて骨伸長に与える影響を検Arima, Y., et. al .: Murine neonatal ketogenesis

証した．

preserves mitochondrial energetics by preventing【結果】

protein hyperacetylation. Nature Metabolism, Feb;
3(2): 196-210, (2021).

CNP 処置により軟骨細胞内 Ca２＋ が活性化されていることが明らかとなった．薬理的阻害・活性化実験と膜電位測定等で多角的に検討した結果から，CNP 刺激

Ｃ型ナトリウムペプチドによる軟骨細胞内 Ca２＋活性化と骨伸長作用の解析
市

村

敦

彦
（京都大学大学院薬学研究科）

により活性化した PKG が大コンダクタンス Ca２＋ 依存性 K＋ (BK) チャネルを活性化して過分極を引き起こし，
TRPM7 を介した Ca２＋ 流入を活性化していることが示唆された．実際に，Trpm7 欠損器官培養軟骨では CNP
による伸長促進効果は観察されなかった．また，
BK チャ
ネル活性化薬の処置により骨伸長が Trpm7 発現依存的【目的】
本研究では，Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）
が軟骨細胞内 Ca２＋に与える影響の解析と骨伸長促進作に促進されることがわかった．
【考察】
一連の結果から CNP が細胞内 Ca２＋ を介して骨伸長用との関連の解明を目的とした．

を促進する新たな細胞内シグナル経路を同定した．これ【背景】

らの知見は臨床応用間近の CNP の作用の改善に寄与す

Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（CNP）は強力な骨伸る基盤情報となると期待される．

長促進効果を持つことが知られている．現在，CNP ア
ナログを用いて軟骨無形成症への適用を目指した臨床第III 相試験が進められている．CNP は膜型グアニル酸シクラーゼである受容体 NPR2 を介して cGMP 産生を促し，cGMP 依存性タンパク質キナーゼ (PKG) が MAPK

疾患特異的 iPS 細胞を用いた特発性拡張型心筋症の病態解明と治療化合物の探索
伊

藤

正

道
（東京大学医学部附属病院）

経路を抑制することが報告されていたが，細胞内シグナ
ル経路には不明な点が残されていた．我々は，生理的な軟骨細胞内 Ca２＋動態をイメージングできる新たな実験【背景】

系を構築するとともに，TRPM7 チャネルを介した軟骨

特発性拡張型心筋症 (DCM) は，心腔の拡大，心臓収細胞内 Ca２＋自発変動が骨伸長を促進していることを最縮力の低下を特徴とする症候群で，心不全や致死的不整近発見した．TRPM7 軟骨特異的欠損マウスは CNP や脈を合併する難治性の疾患である．我々は DCM 患者の

NPR2 の遺伝子欠損マウスと類似した表現型であったこ

約 10％を占めるラミン遺伝子 (LMNA) 変異陽性の患者とから，CNP が TRPM7 を介した Ca２＋シグナルを活性は既存薬物療法に反応せず，特に予後不良であることを化することで骨伸長に寄与しているのではないかと考え報告した１）．さらに DCM 患者の心臓組織検体を用いたて検証を行った．

解析により，診断時心筋細胞における DNA 損傷の蓄積【方法】

程度が高度な患者ほど予後不良であることを見出し２），マウス胎児軟骨に CNP を処置し Ca２＋ イメージング

LMNA 変異患者の検体でも著明な DNA 損傷蓄積を認を行った．想定されるシグナル経路上の分子群に対してめた．

阻害薬や活性化薬を用いて CNP による影響について検【目的】

討した．膜電位感受性色素によるイメージングや免疫学

68

予後不良な LMNA 変異を有する DCM の病態を明ら成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

かにし，同疾患患者の新規治療薬候補化合物の同定を試

【文献】

みる．

１）Sci Rep. 2018, 31; 8(1):1998.

【方法・結果】

２）JACC: Basic Transl Sci. 2019, 4(6), 670-80① LMNA 変異 DCM 患者の同定と iPS 細胞株の樹立

３）Nat Commun. 2017, 24; 8: 15104.

家 族 性 DCM の 患 者 ２ 名 を 対 象 に 遺 伝 子 解 析 を 実
施 し，LMNA に ヘ テ ロ ミ ス セ ン ス 変 異 を 同 定 し た（p.Q353R）．これらの患者から末梢血単核球を分離し，脂肪肝再生過程で生じる細胞死様式の誘導メカニズ

初期化因子を導入することにより iPS 細胞を樹立した．

ムの解明

また，CRISPR/Cas9 を用いて該当変異を修復したコン

稲

葉

有

香
（金沢大学新学術創成研究機構）

トロール株を作成した．以上より，LMNA 変異 iPS 細胞株と編集株を各 2 クローン作製し，これらから心筋細胞（iPSCM）を誘導して実験を行った．
② iPSCM の DNA 損傷程度の評価【背景・目的】
脂肪肝における再生障害は，肝障害の遷延化・重症化

iPSCM を 用 い，DNA 二 重 鎖 切 断 の マ ー カ ー で あを惹起するという危険性が知られる一方で，その病因・るγH2A.X の染色を行いその定量化を試みた．結果，治療法の詳細は，解明されていない．我々は，脂肪肝再LMNA 変異株では有意に高度に心筋細胞核の DNA 損

生障害誘導メカニズムの解明を進める過程で，肝再生過傷が蓄積していることが判明した．

程の統合的ストレス応答に伴う細胞死の増加が，肝再生③化合物スクリーニング障害に重要であることを見出している．肝再生過程で発先行研究で，DNA 損傷の蓄積は DNA 損傷応答シグ症する細胞死の様式は，脂肪肝の重症化に伴い変化する．

ナルを引き起こして心機能低下をもたらすことを示し

実際，中等度脂肪肝ではアポトーシスが，高度脂肪肝でていたことから３），DNA 損傷の蓄積軽減をリードアウ

は Ripk3 誘導性のネクロプトーシスが誘導される．我々

トとして化合物のスクリーニングを行った．その結果，は，高度脂肪肝で発症するネクロプトーシスが，ストレvitamin D2 が再現性のあるヒット化合物として抽出さス応答性転写因子 Atf3 の欠損により阻害されることをれた．同化合物は心不全モデルマウスの心機能を改善すin vitro 解析を中心として，明らかにしている．本年度は，ることが分かった．

ネクロプトーシス誘導における Atf3 の役割を解明する同定した vitamin D2 が DNA 損傷を軽減する機序を明らかにするため，LMNA 変異 iPSCM に同薬剤を投与ことを目的とした．
【方法・結果】

して RNA-seq を行った．その結果，投薬後に DNA 修

野生型マウスから単離した初代培養肝細胞において，復に関与する酵素群の発現が誘導されていることが判明

アデノウィルスにより Atf3 を過剰発現した．Atf3 過剰した．

発現により，ネクロプトーシス誘導因子 Ripk3 発現が【考察】増加した．そこで，Ripk3 プロモーター領域を有するレ

LMNA の変異は Hutchison-Gilford 症候群に代表さポーター遺伝子アッセイを行った．Atf3 は，−540 かれるように老化の促進と関与するが，それらの詳細な

ら＋210 までの配列から成るマウス Ripk3 プロモーター

メカニズムは明らかになっていない．本研究によって，の活性を容量依存的に亢進させた．Atf3 依存的なプロ

vitamin D が DNA 修復酵素の誘導により DNA 損傷を

モーター活性化は，−60 から＋210 までの配列では誘軽減し，心機能悪化を防ぐ可能性が示唆された．今後は導されたが，−12 から＋210 のみの配列では誘導されLMNA 変異で DNA 損傷が蓄積する機序，同薬の臨床なかった．また，クロマチン免疫沈降法では，Atf3 は，応用に向けた知見の獲得を目指して研究を行う見込みで

Ripk3 プロモーターの−139 から−9 の配列に結合した．

ある．

次に，ネクロプトーシスを特異的に検出する FRET プ
ローブの安定発現細胞株を用い，Atf3 によるネクロプ

69成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

トーシス誘導の検討を行った．当該安定発現細胞株におを抑制 ② Aβ線維を分解，さらに ③ Aβの細胞毒性をいても，アデノウィルスによる ATF3 過剰発現が Ripk3

抑制するという全く新しい作用機序を見出した．

の遺伝子発現を誘導した．そこで，ネクロプトーシスを【目的】

FRET により，細胞死を SYTOX（破綻した細胞膜のみ

α-エノラーゼの Aβ毒性制御機構のメカニズムを解を通過する核酸染色試薬）により評価した．Atf3 過剰

明すること．

発現により FRET 陽性細胞死を誘導した．また，TNFα【方法】

刺激は，FRET プローブ安定発現細胞株において，アポα-エノラーゼがプロテアーゼ作用を介して，Aβタン

トーシスの特徴である細胞収縮を伴う FRET 陰性細胞

パクを切断するとの仮説を立てた．そこで，複数のプロ死を誘導した．一方，Atf3 過剰発現下では，TNFα刺テアーゼ阻害剤を用いて，αエノラーゼによる Aβ線維

激により細胞死が増加し，細胞の膨張を伴う FRET 陽形成抑制効果が減弱するか否かを検討した．セリンプロ

性細胞死を来した．

テアーゼ阻害剤：Pefabloc，アスパラギン酸プロテアー【考察】

ゼ阻害剤：PepstatinA，システインプロテアーゼ阻害剤：

Atf3 は，Ripk3 発現を誘導し，TNFαなどの刺激にE-64，金属プロテアーゼ：Phosphoramidon と EDTAより誘導される細胞死の様式を，アポトーシスからネクを用いた．

ロプトーシスに変容させることが示唆された．

【結果】
セリンプロアーゼ阻害剤である Pefabloc SC を用い

ムーンライト解糖系酵素に焦点を充てた脳アミロイ
ド血管症の治療開発
井

上

泰

輝
（熊本大学大学院生命科学研究部）

た際に，αエノラーゼの線維形成抑制効果が阻害されることが判明した．まず，チオフラビンＴ吸光度を用いた解析を行った．チオフラビンＴはアミロイドのβシート構造を認識し，それに応じて吸光度が上昇し線維形成を間接的にモニタリングする測定手法である．αエノラー
ゼの添加により抑制されていた吸光度の上昇（1A緑）が，Pefabloc SC の添加によって，吸光度が上昇した（1A【目的】
申請者は CAA 罹患血管のプロテオミクス解析を行い，紫）．透過型電子顕微鏡を用いた検討でも，α-エノラー

特異的な発現分子を同定した．その中でα-エノラーゼ

ゼによる Aβ線維形成抑制（B右上）が Pefabloc SC のに着目し検討を行い，α-エノラーゼが ① Aβ線維形成

添加によって線維が形成された（B, 左下）．ウェスタンブロット法を用いた検討でも，α-エノラーゼの添加により Aβ線維に該当するバンドが消失するが（C, 矢頭,
2 レーン目）（D, 右から 2 つ目の棒グラフ）, Pefabloc
SC の添加によって Aβ線維に該当するバンドが出現した（C, 矢頭, 3 レーン目）（D, 右から 3 つ目の棒グラフ）（論文投稿中）．
【考察】
α-エノラーゼがセリンプロテアーゼ活性を介し Aβを分解し，Aβの細胞毒性を軽減させる可能性を示した．

図 セリンプロテアーゼ阻害剤の影響

70

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
アルドステロン産生腫瘍におけるコルチゾール合成の意義

本研究より，アルドステロン産生腫瘍において，アル馬

ドステロンのみならずコルチゾールも産生することが示越洋宜唆された．副腎皮質由来細胞では複数のステロイドホル（九州大学病院）

モン産生能を有する可能性が考えられる．

【背景】
アルドステロン産生腫瘍はミネラルコルチコイドであるアルドステロンの自律的過剰分泌を認める腫瘍だが，近年グルココルチコイド過剰分泌の併存が示唆され，その心血管および代謝合併症への寄与に関する報告も蓄積

Bodywide transcriptome landscape inmouse models and human
浦

山

恭

次

（国際電気通信基礎技術研究所佐藤匠徳特別研究所）

されつつある．しかしグルココルチコイド過剰は血中・尿中代謝産物での評価にとどまっており，腫瘍内における生合成を直接的に評価した報告はないため，グルココ【目的】
従来の疾患研究は，少数の器官や組織に限定されていルチコイド過剰の由来は明らかでない．

ました．しかし，生体はより複雑な多臓器連関ネットワー【目的】

クで成り立っており，多くの疾患は一つの器官だけではアルドステロン産生腫瘍において，主要なグルココル

なく，複数の器官に影響を及ぼすことがわかってきていチコイドであるコルチゾールの合成を直接的に評価する．そこで本プロジェクトではこの多臓器連関ネット

る．

ワークの成り立ちと作動性を理解し，Disease science【方法】に役立てることを最終目的として研究を行っている．

副腎摘除術を施行したアルドステロン産生腺腫 11 例，

現在までに，我々は，各種疾患において従来考えられ対照群として非副腎皮質腺腫である副腎神経節細胞腫３ていたよりも，生体内において広範囲に変化が起きてい例，および軽度のグルココルチコイド自律的過剰分泌をるのではないかと考え，ヒト疾患モデルマウス（心筋梗認める副腎性サブクリニカルクッシング症候群 7 例の塞，糖尿病，がん，老化促進，腎障害）における全身で腫瘍内コルチゾール含有量を液体クロマトグラフィー質の遺伝子発現パターンレベルの変化を解析し，全身レベ量分析法で測定した．ついで，コルチゾールの質量分析

ルでのトランスクリプトームデータベース（全身網羅

イメージングを施行し，腫瘍内におけるコルチゾールの的多器官遺伝子発現地図，iOrgans Atlas）を構築した．

産生の局在を評価した．ターゲットキャプチャー法を用

これらのデータベースを活用し，先行研究では解明されいて，副腎皮質腫瘍関連の体細胞遺伝子変異を網羅的にていない新たな臓器連関を見出し，それら臓器連関の詳検索した．

細な解明を行っている．

【結果】

【方法】

アルドステロン産生腺腫における単位重量当たりの腫我々が発見した新たな臓器連関の Key となる臓器特瘍内コルチゾール含有量は、副腎神経節腫より有意に高異的に発現している遺伝子群の各種ノックアウトマウス

値，副腎性サブクリニカルクッシング症候群より低値でを CRISPR/Cas9 システムを用いて作製し表現型の解析あった．質量分析イメージングではアルドステロン産生を行った．これらの表現型を全身網羅的に解析するため腫瘍内で均一にコルチゾールが検出され，その強度は副に，多臓器 RNA-seq 解析・scRNA-seq 解析や生理学的

腎神経節細胞腫より高値，副腎性サブクリニカルクッシ

および組織学的実験手法により全身網羅的に解析を行っ

ング症候群より低値であった．アルドステロン産生腺腫た．また，ヒト由来検体を用いた臨床研究も行い，ヒトにおいて，コルチゾール自律性分泌に関連する体細胞遺における役割の解明も行っている．

伝子変異は検出されなかった．

71

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

摂食行動における異常が明らかとなった．さらに高脂肪【結果＆考察】多臓器 RNA-seq 解析及び scRNA-seq 解析の解析結食摂取にも関わらず肥満になりにくく，代謝調節におけ果より，新たな臓器連関の Key となる遺伝子の発現臓る異常も推察された．詳細に調べた結果，エネルギー代器と発現細胞種を同定する事が出来た．また，生理学的謝の有意な増加が判明し，これが抗肥満作用の原因であ

解析結果より，Key となる遺伝子が生体内恒常性を維持ると示唆された．このように，VMP GABA 作動性神経するのに重要な因子と作用する事で，多臓器連関に寄与

は睡眠・躁病様行動・摂食行動・代謝調節など多岐にわしている可能性を示唆するデータが得られた．現在，ヒたる機能を持つことが判明した．

ト由来検体を用いた臨床研究にて，この Key となる遺【文献】

伝子の発現の変化が特定の疾患のバイオマーカーになり

１）Honda, T., Takata, Y., Cherasse, Y., Mizuno, S.,

うるか解析を行っている．

Sugiyama, F., Takahashi, S., Funato, H., Yanagisawa, M., Lazarus, M. & Oishi, Y.: Ablation of

短眠を作る神経メカニズムの研究
大石陽（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

Ventral Midbrain/Pons GABA Neurons Induces
Mania-like Behaviors with Altered Sleep Homeostasis and Dopamine D2R-mediated Sleep
Reduction., iScience. 23(6): 101240 (2020).

【目的】
哺乳類において睡眠制御に重要とされる遺伝子やシス
テムは数多く提案されているが，多くの場合，それらを抗酸化物質キヌレン酸増加の分子機構とその意義
大

橋

一

登
（群馬大学生体調節研究所）欠損させたとしても顕著な行動変化は起きない．我々は最近，
モチベーションによる睡眠覚醒制御の解析過程で，ある神経群の欠損によって生じる，短眠状態を長期間維【背景および目的】

持可能なマウスを見出した．本研究ではその神経メカニ

キヌレン酸はトリプトファン（Trp）代謝化合物の一ズム解明を目的とし，解析を行った．また，同マウスのつであり，キヌレン酸の増加は二型糖尿病やうつ病で認

代謝調節に関わるパラメータを測定し，短眠との関連性

められているが，キヌレン酸の増加の原因や意義はよくを探った．

分かっていない．

【方法・結果】

これまでに真核生物のモデル細胞である出芽酵母を用

中脳と橋をまたぐ脳部位・腹側内側中脳橋（VMP）

いて細胞内におけるキヌレン酸の機能を調べてきた．そをジフテリア毒素の発現により GABA 作動性神経選択の結果，キヌレン酸は過剰な Trp を分解した結果で生的に欠損させ，睡眠量が顕著に少ないマウスを作り出しじた排泄物の一種であることが示唆された．すなわち，た．同マウスの睡眠恒常性を解析したところ，断眠後にキヌレン酸増加の一因は，Trp の蓄積であると考えられ通常みられる睡眠リバウンドの消失が判明した．また，る．したがって，過剰な Trp による細胞毒性の解析が，ドーパミン D2 受容体欠損マウスでは VMP GABA 神経

病態の理解につながると期待される．実際，高 Trp 血欠損による睡眠量の減少が大きく損なわれたため，ドー症という代謝疾患も知られており，高濃度の Trp は有パミン系を介しての睡眠減少メカニズムが示唆された．

害であると考えられている．しかし，その原因は不明で

しかし D2 受容体の欠損は睡眠リバウンドの消失に影響あり，高濃度の Trp が細胞にどのような影響を及ぼすしなかったため，この睡眠恒常性調節は D2 受容体を必かもよく分かっていない．本研究では高濃度 Trp によ

要とせず，かつ睡眠量調節とは異なるメカニズムである

る細胞毒性の原因を明らかにする．

と示唆された．一方，VMP GABA 神経欠損マウスに高【方法と結果】

脂肪食を摂取させた結果，摂食量が多いことが判明し，

72

出芽酵母の非必須遺伝子変異株ライブラリ（5,153 遺成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

伝子の欠損株）を用いて，高濃度 Trp への耐性に必要

レプチン抵抗性，糖代謝異常が誘発されることを報告しな遺伝子のスクリーニングを行った．その結果，1,111

た（Cell Rep 2016）．本研究では，視床下部 Rap1 と遺伝子の欠損株が，高濃度 Trp に感受性を示すことを

糖代謝制御の相互作用を解明することを目的とした．

見出した．この中には，細胞膜や細胞壁へのストレス応【方法】

答に必要な Cell Wall Integrity (CWI) 経路の遺伝子欠

AAV 活性型 Rap1 (GTP-locked Rap1 variant) およ

損株がいくつか含まれていた．そこで，CWI 経路の遺び AAV-Cre の視床下部内側野への局所投与または視床

伝子欠損株について，改めて高濃度 Trp への感受性を下部腹内側核特異的な Rap1 欠損マウスの作製により，調べた．その結果，CWI 経路上流の分子（細胞膜や細視床下部特異的に Rap1 を活性化/欠損させたマウスを胞壁のセンサーなど）の遺伝子欠損株は高濃度 Trp に作製し，それぞれのマウスにおける糖代謝やインスリン感受性を示さなかったが，その下流のキナーゼカスケー

感受性の表現型を解析した．

ドや転写因子の遺伝子欠損株は高濃度の Trp に感受性【結果】を示した．このことから，CWI 経路の下流のシグナル

視床下部内側野における Rap1 活性化の誘導または抑が高濃度 Trp への耐性に必要であることが示された．

制により，急速に血糖が変化することを見出した．さら

また，細胞内に Trp が蓄積する遺伝子変異株を用いて，に，糖代謝への関与が知られている視床下部腹内側核特

細胞内 Trp の蓄積は細胞壁ストレスへの感受性を引き異的な Rap1 欠損マウスを作製した結果，高脂肪食飼育起こすことも示唆された．

条件下において，欠損マウスでは体重変化を伴わずに血【考察】

糖値が正常化すること，耐糖能やインスリン感受性が増以上の結果から，過剰な Trp によるアミノ酸恒常性

大すること，高脂肪食によるレプチン抵抗性やインスリの異常への応答に CWI 経路が必要であり，細胞内のン抵抗性が改善されること，を明らかにした．加えて，Trp の蓄積は細胞壁ストレスへの正常なシグナル伝達を薬理学的に脳の Rap1 を阻害することにより，肥満マウ妨げる可能性が示された．すなわち，Trp の蓄積によるスにおける糖代謝異常の改善効果を示した．

正常な CWI シグナルのかく乱が，Trp の毒性に寄与している可能性がある．

以上より，視床下部 Rap1 が糖代謝制御における重要分子であり，Rap1 経路が糖尿病治療における新しいターゲットであることを明らかにした（JCI insight2021）．
【考察】

食品由来シグナルによる視床下部の摂食調節ホルモ

Rap1 シ グ ナ ル は，GPCR-Gs/cAMP/Epac シ グ ナ ルンの感受性変容

により活性化される．最近，腸管ホルモン GIP による

金子

視床下部 GPCR/Rap1 活性化を介したレプチン抵抗性発

賢太朗（京都大学大学院農学研究科）

症機構を報告した（J Clin Invest 2019）．つまり，視床下部 Rap1 が腸脳連関を介した内・外因性の GPCR リ【背景】

ガンドの制御下にあると考えられる．そこで現在，食由視床下部は栄養状況に応じたエネルギー・糖代謝の制

来 GPCR シグナル（Peptides 2021）と視床下部 Rap1

御中枢であり，栄養情報を脳に伝えるホルモンにより調シグナルのクロストークの実態解明に向けた研究を遂行

節されている．外因性の食シグナルが視床下部機能に介している．

入していることが想定されるが，その分子的全容はほとんど分かっていない．
【目的】
我々はこれまでに高脂肪食飼育マウスの脳において，
低分子量Ｇタンパク質 Rap1 の活性化に起因し，肥満や73成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
細胞内滞留型γ-グルタミルトランスペプチダーゼ
活性検出蛍光プローブの開発とがんイメージングへの応用
神

今後，外科手術で摘出した臨床検体に適用し，感度・特異度，細胞内滞留性などを評価し，実臨床で利用できる性能を有するか評価していく．

谷

真

子

【文献】

（東京大学大学院医学系研究科）

１）Angew. Chem. Int. Ed. 55, 9620-9624 (2016).
２）Angew. Chem. Int. Ed. 60, 2125-2129 (2021).

【目的】
がんの外科手術において，蛍光物質を用いてがん部位を可視化する「術中イメージングガイダンス」が注目されている．我々はこれまでに，がんに特徴的な酵素活性により蛍光が大きく増強する蛍光プローブを開発し，そ副腎ペリリピン 1 は高血糖状態でのステロイドホ
ルモン合成増加に関与する
亀田啓（北海道大学病院）

れを用いたがんイメージング法の確立に取り組んできた．しかしながら，これらの蛍光プローブは，酵素反応により生成する蛍光性生成物の細胞内滞留性が十分でな【目的】

いことが課題であった．そこで本研究では，我々が確立

脂肪滴周囲蛋白であるペリリピン１（PLIN1）に着目しした細胞内滞留型蛍光プローブの設計法に則り１），特定

２型糖尿病の病態における副腎ステロイド産生の亢進のがんで活性が亢進しているγ-glutamyltranspeptidaseのメカニズムを明らかにし，新たな治療標的を見つけ出(GGT) を標的とした新たな細胞内滞留型蛍光プローブ

す．2019 年度の実験では db/db マウスの副腎においての開発とがん蛍光イメージングへの応用を検討した．

PLIN1 の発現増加を認め，また代謝変化によりステロ【方法・結果】

イドホルモン合成が亢進することが示唆された．2020

具体的には，GGT との反応によりアザキノンメチド

年度は PLIN1 を副腎癌細胞株に過剰発現・ノックダウ

活性中間体を産生し，それが細胞内求核分子と反応すンした際の代謝関連遺伝子群の変化を検討した．

ることで，蛍光性と細胞内滞留性を同時に獲得する細胞【方法】

内滞留型蛍光プローブ 4-CH2F-HMDiEtR-gGlu を開発

マウス副腎癌細胞株 Y-1 細胞に PLIN1 の過剰発現プした．GGT を高発現・低発現する培養がん細胞に適用

ラスミドならびに siRNA を投与した状態でブドウ糖濃したところ，GGT 発現量に応じた蛍光シグナルを示し，度を変え，ステロイドホルモン産生ならびに代謝へのさらにその蛍光シグナルは洗浄・固定操作に耐性があ影響を検討した．ブドウ糖濃度は 100mg/dL, 450mg/

り，既存プローブ（gGlu-HMRG）に比べて細胞内滞留

dL で 24 時間培養後 ACTH 投与を３時間行い，上清，性が向上したことが示された．次に，動物個体におけるRNA，蛋白を回収し解析を行った．同様の系で脂肪滴がんを高い細胞内滞留性で可視化できるか，すい臓がんの観察も行った．

の患者腫瘍組織移植（PDX）モデルマウスを用いた評【結果】価を行った．その結果，gGlu-HMRG を用いた場合にはPLIN1 の Y1 細胞への過剰発現によりステロイド合時間とともに蛍光性生成物が拡散してしまうのに対し，成酵素のベースの発現が増加し，Dhcr24 のベースの発

4-CH2F-HMDiEtR-gGlu を用いた場合には長時間のがん現も増加した（図１）．Irs1, Acc の発現は低下しインス

in vivo イメージングが可能であることを示した．また，リンシグナルと脂肪酸合成の低下が示唆された．PLIN1

in vivo 蛍光イメージング後に腫瘍組織を摘出して免疫過剰発現によりプロゲステロン分泌量は増加し，PLIN1染色を行うことも可能であり，4-CH2F-HMDiEtR-gGlu

siRNA 投与によりベースならびに ACTH 投与時の分は既存プローブに比べて高い細胞内滞留性・固定処理耐泌量は低下傾向を認めた（図２）．脂肪滴の観察では性を有することが示された２）．

PLIN1a, 1c の過剰発現で脂肪滴発現は増加し，siRNA74

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成投与により低下した（図３）．
【考察】
PLIN1 の発現は副腎内の代謝を調整しステロイドホ

AT1/RAGE

複合体を介した AGE

による新規シグナル伝達メカニズム

ルモンの合成を制御する可能性が示唆された．治療標的

河

合

達

男

としての検討を進めていく．

（Temple University School of Medicine）【文献】
１）Dipeptidyl peptidase-4 inhibitor may exacerbate【目的】

Graves' disease: a multicenter observational

生体内を循環する脂質や蛋白は，加齢や生活習慣等でcase-control study. Sekizaki, T., Kameda, H.,

様々な修飾を受け細胞傷害の原因となる物質に変化し，

Nomoto, H., Cho, KY., Nakamura, A., Taka-

血管・臓器障害をきたす．また，RAAS の過度の亢進は，

hashi, K., Miyoshi, A., Wada, N., Takeuchi, J.,

Ang II の増加から，主にＧ蛋白共役型受容体（GPCR）

Nagai, S., Miyoshi, H., Atsumi, T.: J Diabetes

である Angiotensin receptor type 1 (AT1) の過剰な活

Investig. 2021 May 17. (corresponding)性化をきたし臓器障害に繋がる．我々は既報において，酸化 LDL のパターン認識受容体である LOX-1 が AT1と細胞膜上で結合しており，加齢等により増加した酸化LDL は AT1 活性化を介して血管障害・組織障害を促進することを報告した．今回我々は，最終糖化産物 (AGE)のレセプター RAGE が同様に細胞膜上で AT1 と結合しており，AGE は AT1/RAGE 複合体を介して細胞内シグナル伝達を起こすとの仮説を立て検討をおこなった．
【方法と結果】

図１

PLIN1 過剰発現 リアルタイム PCR

我々はまず RAGE とともに AT1, AT1 変異体（細胞内シグナル伝達を惹起しないよう変異をおこしたもの），
AT2 をそれぞれ共発現させた CHO 細胞を作成し，共免疫し沈降や in situ PLA 法にて細胞膜上で RAGE とAT1 が結合していること，および RAGE と AT2 は近接していない事を確認した．また AT1 拮抗薬である ARBの投与によって RAGE と AT1 の複合体は影響を受けなかった．RAGE および AT1 を発現させた CHO 細胞
を RAGE リガンドで刺激すると，AngII で刺激した場

図２

合と同様に細胞内 cAMP 濃度が低下したが，RAGE のみ，もしくは RAGE と AT1 変異体を共発現させた細胞ではこうした結果は見られなかった．Gai 阻害薬および ARB の前処置によりこれらの影響が阻害されたことから，RAGE リガンドは AT1/RAGE 複合体を介してGai 依存的にシグナル伝達を惹起していることが示された．ラット腎由来の上皮細胞 NRK52E を RAGE リガン
ドで刺激することにより ERK リン酸化が起こり，これ

図３は ARB で前処置をすることにより抑制された．また，
RAGE リガンドの刺激による ERK リン酸化は，RAGE

75

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成のノックダウンのみならず，AT1 のノックダウンによっても抑制された．同様に，RAGE リガンドによる NF ｋ
B の活性化も ARB および RAGE 阻害薬によって抑制さがんによる宿主生理変容のメカニズム
河

岡

慎

平

（京都大学ウイルス・再生医科学研究所）

れた．RAGE リガンドは NRK52E に上皮間葉転換を起
こすが，この反応も ARB の前投与により抑制された．
一方，RAGE を介さない TGF beta による刺激による上皮間葉転換は ARB の前投与では抑制されなかった．
【考察】

【目的】
本研究の目的は，がんに起因する宿主の病態生理のメ
カニズムを理解することである．がんは宿主個体にさまRAGE と AT1 が細胞膜上で複合体を形成しており，

ざまな悪影響を及ぼす．例えば，がんに起因する脂肪やRAGE リガンドはこの複合体を介して Gi を活性化し，筋肉の減少，体重の減少などを代表例として挙げること

AT1 依存的な細胞内シグナル伝達を惹起することが証ができる．これらの症状は臨床的にはがん悪液質として

明 さ れ た． こ の こ と は，Ang II お よ び 最 終 糖 化 産 物知られる．現時点では，がん悪液質を強力に制御する方

AGE が共通の受容体を介して血管・臓器障害を促進す

法は存在しない．がん悪液質の実態がきわめて複雑である，という全く新規の概念を提唱するものである．最終り，その詳細なメカニズムがわかっていないことが原因

糖化産物は糖尿病など高血糖状態で増加しており，それであると考えている．実際，ある臓器（例えば脂肪）のらによる RAGE 活性化は ROS 産生や炎症などを介して異常について，どのような因子がどのようにその異常に動脈硬化，糖尿病，腎疾患，アルツハイマー病など多関わっているのか，ということに関する我々の理解は極くの疾患に関与することが示されている．一方，高血圧

めて限定的である．そこで，本研究では，がんに起因し患者において AT1 の活性化が臓器障害を惹き起こすこて起こる宿主臓器の異常について，そのメカニズムを明とも広く知られている．本研究により，糖尿病患者等でらかにすることを目指した．

AT1 を重要な治療標的と考えることにより，血管・組【方法】

織障害の発症・進展に対する革新的な介入が可能となる

マウスにがんを移植し，宿主臓器を採取，その状態をことが期待できる．

マルチオミクスによって調べる，という戦略を採用して【研究総括，現状および今後の抱負】

いる．がんによって起こるマルチオミクスの変化を手が

私は，大阪大学の医学部及び大学院医学系研究科を卒かりとして責任因子の候補をリストアップし，当該遺伝業した後，2014 年からアメリカにわたって研究を続け

子を欠失または過剰発現させたマウスを作る．当該マウています．そのため，応用酵素協会の活動への参加がでスに改めてがんを移植し，がんに起因して起こる病態生

きない期間が長くなっていましたが，昨年 2020 年は新理に変化があらわれるかを観察する，という流れである．

型コロナ感染症の広がりもあり，研究会もオンライン発【結果】表となるなど，卒業の年度依頼ひさしぶりに参加するこ

これまでに，本助成の支援を受けながら，乳がんが肝とができ，大変刺激を受けました．日本にいてこの助成

臓の概日リズムを撹乱するということや（Hojo et al.,を受けた本テーマについては，大阪大学老年総合内科学

Oncotarget, 2017），腸のがんが肝臓のコレステロールの先生方に引き継いでもらいながら，ともに研究を続け代謝を乱し，炎症をひき起こす，ということを見出しててくることができました．また，アメリカにおいても，

．
本年度は，
きた
（Enya et al., Dis. Model. Mech., 2018）

同様の研究テーマである心血管病や老化・炎症・代謝

これらの成果をもとに，がんに起因する肝臓の異常に関といったことを主な研究テーマとして研究を続けていまわる新規因子を探索した．その結果，肝臓に起こる異常

す．応用酵素協会でサポートいただいたことや，また研の一部の責任を担う新規因子を発見することができた．

究会でいろいろな刺激をもらったことを糧にして，今後【考察】も引き続き，こうした疾患の病態の解明や治療につながる礎となるような研究を続けていきたいと思います．

76

本研究の進展により，がんに起因する肝臓の異常を，
新規宿主因子の立場から捉えることができるようになっ成人病の病因・病態の解明に関する研究助成た．特に，がんによって起こる多様な異常を，本因子に請者はこのシグナルの異常が自閉症児に見られる前頭前依存するものとそうでないものに分けることができるよ野肥大化に関与する可能性を考え解析を進めている．

うになった点が重要であると考えている．今後も，上記【方法と結果】の戦略に基づいた研究を展開し，がん悪液質という複雑

前年度までに，Fgf シグナル関連因子の変異マウスにな現象を丁寧に理解していきたい．

おいて前頭前野を含む大脳前方領域が肥大すること，ま【文献】

た，成体において変異マウスが自閉症様行動を示すこと参考として，本年度に執筆した和文の総説を２件，付を明らかにした．また，自閉症患者においてみられる特

記させていただく．

徴である神経活動のバランス異常（E/I バランス異常）

１）小西理予，河岡慎平．
（2020）．エンハンサーを利用が観察された．これらの結果から，Fgf シグナルの異常した細胞の制御. 実験医学 . 38, 17: 100-106.

は脳肥大を引き起こすことで自閉症発症につながる可能

２）北條広朗，水野林，河岡慎平．
（2020）．マルチオミ
クスを活用したがん悪液質の理解. 実験医学 . 38,性が示唆された．
自閉症児や脳局所肥大モデルマウスは生後初期に脳肥大が見られるため，肥大の原因は胎生期の神経幹細胞の8: 1300-1305.

増殖異常に起因する可能性を考えた．そこで本年度にお成体における社会的行動異常に関与する大脳形成不全の原因の解明川口

大いては，胎生期神経幹細胞においてどのような分子的異常が引き起こされるのかを調べた．その結果，胎生早期の大脳領域特異的な遺伝子発現の変化が明らかになっ地た．

（東京大学大学院薬学系研究科）【考察】
本年度の結果から，局所脳肥大を伴う自閉症の発症メ【目的】

カニズムの一旦として，胎生期における脳局所的な遺伝

自閉症スペクトラムは，言語障害・コミュニケーショ

子変化が関与する可能性が示唆された．自閉症研究は主

ン障害・限定された興味・反復行動などを主徴とする発に生後の自閉症症状を担う分子メカニズムの解析が中心達障害である．自閉症発症率は子供の 50 100 人に１人となってきたが，本研究により胎生期において既に発症と高く，社会的にも大きな問題となっている．しかし，に関わる異常が引き起こされている可能性が考えられその発症原因について多くは不明である．これまでに，る．

数割にのぼる多くの自閉症児について脳の局所（前頭前野など）における肥大が起こることが報告されている．
前頭前野は言語機能や社会的行動の調節などを担う領域であり，前頭前野肥大化が自閉症発症に関与する可能性が十分に考えられるが，その関連は明らかになっていな

腹内側核 PACAP

発現細胞の双方向性摂食調節メ

カニズムの解明と肥満症への関与
神

戸

悠

輝

（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）

い．そこで本研究では，局所肥大を起こす分子メカニズ
ムを明らかにすることを目指している．これにより，多くの自閉症患者に共通する疾患発症メカニズムの解明に繋がることを期待している．

【目的】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド

近年，自閉症患者に特徴的な遺伝子変異を網羅的に探（PACAP）は，視床下部に高発現する神経ペプチドで，索する試みが活発に行われており，複数の Fgf シグナル

摂食調節に関与することが明らかとなっている．これま関連因子が自閉症原因候補遺伝子として挙げられていでの研究から，PACAP の脳内投与は摂食を抑制するが，る．Fgf シグナルは発生過程において細胞増殖を制御しPACAP をノックアウト（KO）しても摂食を抑制する事て組織のサイズ決定に関与することが知られており，申から，PACAP には相反する正負の摂食制御メカニズム77成人病の病因・病態の解明に関する研究助成が存在すると推察されるが，その詳細は不明であった．

発現マウスでは，昼の摂食量の減少，夜の摂食量の増加

近年申請者は，視床下部・腹内側核に存在する PACAPが観察された（図２上段）．特に，同マウス視床下部・発現細胞は昼と夜の間で役割を変え，昼は摂食抑制，夜弓状核において，昼間では POMC（摂食抑制ペプチド）は摂食促進に寄与することを報告し (Nguyen, Kambeの，夜間では AgRP（摂食亢進ペプチド）の発現が増加(2020) Mol. Neurobiol.)，GPCR 研究会にて松尾研究奨した事は興味深い（図 2 下段）．このメカニズムを追求

励賞を受賞した (Nguyen (2020))．すなわち，PACAP・すると，腹内側核に存在する PACAP 発現細胞からの神KO マウスでは，昼の摂食量の増加，夜の摂食量の減少

経投射が，弓状核の POMC 発現細胞（摂食抑制神経細が観察され ( 図１)，一方で，腹内側核への PACAP 過剰胞）と，AgRP 発現細胞（摂食促進神経細胞）の間で交代し，昼では POMC 発現細胞を，夜では AgRP 発現細胞を選択的に活性化する可能性を世界で初めて見出した （図３）．本研究では，腹内側核 PACAP 発現細胞からの神経投射が，POMC および AgRP 発現細胞間で交代するメカニズムと，同メカニズムの肥満症における病理学的な関与を解明する．
【方法】
申請者は，POMC あるいは AgRP プロモータの下流
で RCaMP あるいは GCaMP（赤色あるいは緑色のカル
シウムセンサータンパク質）を発現するアデノ随伴ウ

図１

昼夜間における PACAP KO マウスの摂食量（ｎ＝8）

イルス（AAV）を開発した．さらに，申請者は腹内側核 PACAP 発現細胞の活動を特異的に調節するために，
PACAP-Cre マウスを導入した．PACAP-Cre マウスの腹内側核に hM3D（人工リガンド CNO で特異的に活性化される Gq 共役型受容体）を発現する AAV を，POMC
あるいは AgRP プロモータの下流で RCaMP あるいはGCaMP シウムセンサータンパク質を発現する AAV を
マウス弓状核に感染させ，CNO 投与後の弓状核における赤色あるいは緑色の蛍光をファイバーフォトメトリー

図３
図２

78

昼夜間における腹内側核 PACAP 過剰発
現マウスの摂食量と遺伝子発現量（ｎ＝8)

昼夜間における腹内側核 PACAP 発現細胞と弓状核 AgRP 発現細胞のシナプス結合数（ｎ＝5）

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

で計測すると，腹内側核 PACAP 発現細胞を活性化したしているマウスを灌流固定し，組織学的な解析に供する

ときにおける，POMC あるいは AgRP 発現細胞の神経と，ファイバーフォトメトリー用オプティカルフェルー

活動を同時に，自由行動下のマウスから測定できる．こルが挿入されていた部位において RCaMP 陽性神経細胞の実験系を利用して，夜間に CNO を投与した後，グが多数検出されたのに対して，GCaMP 陽性の細胞はほレリンを脳室内投与した後において，POMC あるいは

とんど観察されなかった（図５）．このことが，GCaMPAgRP 発現細胞の神経活動を計測した．

の蛍光の増減が観察出来なかった理由と推察される．

【結果】

【考察】

夜間に CNO を投与しても，弓状核 AgRP 発現細胞の以上の解析から，夜間に腹内側核 PACAP 発現細胞を発現する GCaMP 蛍光強度の変化は観察されなかった

活性化させると，摂食抑制系の弓状核 POMC 発現細胞

ものの，弓状核 POMC 発現細胞の発現する RCaMP 蛍を抑制する可能性が明らかとなった．申請者らはこれま

光強度の減弱が観察された．すなわち，夜間に腹内側核での報告において，腹内側核 PACAP 発現細胞は夜間にPACAP 発現細胞を活性化させると，弓状核 POMC 発現

摂食亢進作用を惹起する可能性を示唆しており，その細胞の活動を抑制する可能性が示された（図4a）．さら

結果をサポートする重要なデータである．今回は AgRPに，同様の処置をしたマウスの脳室内にグレリンを投与

発現細胞の神経活動を記録することが出来なかったが，すると，弓状核 AgRP 発現細胞の発現する GCaMP 蛍光

今後は，AgRP プロモータの下流に最小のサイトメガロ

強度の変化は観察されなかったものの，弓状核 POMC

ウイルスプロモータを組み込むなど，GCaMP の発現を発現細胞の発現する RCaMP 蛍光強度の増強が観察され増強する処置を施した AAV を調製し，AgRP 発現細胞

た．この結果は，グレリンによる POMC 発現細胞の活が上記と同条件において活性化することが確認できれ性化を示唆する．一方，RCaMP および GCaMP を発現ば，非常に興味深い結果となる．一方で，グレリンは摂食亢進ホルモンであることから，グレリンの投与によって摂食を抑制する働きのある POMC 発現細胞を活性化したことは意外であった．この理由は不明であるが，今後詳細に解析していく．

骨格筋再生を主導する多細胞間相互作用ネットワー
図４ａ）夜間に CNO を脳室内投与した後の，RCaMP (POMC
発現細胞，下段 ) および GCaMP (AgRP 発現細胞，上段）の蛍光強度，ｂ）夜間にグレリンを脳室内投与した後の，RCaMP (POMC 発現細胞，下段）および GCaMP（AgRP
発現細胞，上段）の蛍光強度

クの解析
小

池

博

之

（日本医科大学大学院医学研究科）【目的】
本研究では，３次元ライブイメージング技術および経時的なシングルセルトランスリプトーム解析技術を組み合わせることで，筋衛星細胞を起点とした筋組織の再生過程を時空間的に捉えることを試みた．
【方法】

図５

オプティカルフェルールが留置された位置
お よ び 弓 状 核 に お け る RCaMP あ る い は
GCaMP の発現分布⑴細胞局在の経時的な変動追跡
筋衛星細胞とマクロファージとの空間的配置情報を取得するため，マクロファージ特異的な蛍光レポーターマ

79成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ウスを対象に，組織透明化処理を行い，共焦点レーザー
顕微鏡を用いて筋組織中の三次元的な局在情報を取得した．
⑵シングルセル RNA シークエンスを用いた筋再生を制御する分子基盤の解析

グレリン分泌細胞におけるGPCR 発現解析および新規調節因子の探索
小

山

博

之

（名古屋市立大学大学院医学研究科）

筋組織の炎症や再生が見られる時期を対象に，筋組織中の筋衛星細胞，マクロファージおよび周囲の間葉系細胞を対象としたシングルセル RNA シークエンスを実施【背景および目的】
サルコペニアは筋力低下を主徴とする老年症候群であし，相互作用解析を進めた．

り，超高齢社会を迎える我が国においてサルコペニアの【結果】

病態解明および予防・治療法の確立は喫緊の課題である．

⑴細胞局在の経時的な変動追跡

サルコペニアのメカニズムは不活動な生活習慣や不十マクロファージ特異的な蛍光レポーターマウスを対象

分な栄養など外的要因にくわえ，神経変性や ( 同化・異化 )に，カルジオトキシン誘導性筋損傷モデルを作出し，筋ホルモンの異常，慢性炎症，ミトコンドリア機能の低下，組織中の三次元的な局在情報を取得した結果，炎症反応

オートファジーやプロテアソーム系の亢進など多岐にわの活性化が見られる損傷３日目の組織では，一部のマクたる．メカニズムの更なる解明や新規治療法の探索のた

ロファージが骨格筋線維の周囲に密接に集積しているこ

めには実験モデルマウスが必要であるが定まったものはとが確認された．

なく，骨格筋内の主要分子の遺伝子改変マウスや後肢懸⑵シングルセル RNA シークエンスを用いた筋再生を制垂モデル，あるいは老化マウスが用いられることが多い．

御する分子基盤の解析

我々は現在 AKR/J をベースとした交配のなかで寿命短炎症期の骨格筋組織からフローサイトメトリーで単離縮を呈した近交マウス SAMP (Senescence-Accelerated

した筋衛星細胞，マクロファージおよび周囲の間葉系細

Mouse) に注目し，モデルマウスとしての妥当性を検証

胞を対象に，シングルセル RNA シークエンスを実施しするため本マウスのヒトサルコペニアとの類似点の検討

た．組織に含まれる細胞集団を特定するために Seuratを行っている．

を用いてクラスターへ分割した．分割されたクラスター【方法および結果】のうち，筋衛星細胞と筋芽細胞を含む集団を抽出し，擬SAMP1 マウスは対照マウス (SAMR) と比較し有意に時間解析を用いて連続的な細胞分化状態を捉えることを

四肢握力が低下し，ヒラメ筋骨格筋量も減少していた．

試みた．未分化なマーカーと分化マーカーの発現量を比

また，トレッドミルを用いた走行試験にて走行距離が有較したところ，擬時間軸の進行に伴って，筋衛星細胞の意に低下し，試験終了時における血中乳酸値上昇を認め分化が進むことが確認され，また，分化途上にある細胞

運動耐容能の低下が示唆された．また，SAMP1 マウス

集団では，細胞周期に関わる遺伝子発現が亢進しており，は血中 T-chol や ALB，テストステロンの有意な低下を活発に増殖していることが示唆された．さらに増殖の活認め，ipGTT を行うと０分および 30 分における血糖値性化している時期特異的に発現増加が見られるシグナルが有意に上昇していた．一方で 18 週齢における血中デ候補を抽出することに成功した．

スアシルグレリン・IGF-1 は SAMP1 マウスが有意に上80

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成昇していた．両マウスの表現型の差異を図に示す．

立されていない．そこで本研究では，同一骨格を有する【考察】

リガンドの開発を目指し，独自に開発した三次元的骨格

今回の検討により SAMP1 マウスがヒトサルコペニアを活用するライブラリースクリーニングから構造最適化

診断に必須の筋力・筋量が低下し，運動耐容能の低下，までを実施した．

（体重減少はないが）低栄養，
耐糖能異常，慢性炎症亢進，【方法】

テストステロン低下という共通する表現型を複数有して

1,3,5-Trioxazatriquinan は，我々の研究室で見出しいることが明らかとなった．本マウスを用いて昨年度はた新奇複素環化合物であり，その骨格は堅牢で半球状のEPA/DHA が視床下部・肝臓・骨格筋の慢性炎症改善を構造を取るため，骨格上の置換基を３次元的に配置する

介してサルコペニアを改善させることを報告したが，今ことを可能とする．この特性に注目し，様々な置換基を後，受容体アゴニストが臨床応用可能となったグレリン

有する 1,3,5-trioxazatriquinan フォーカスドライブラの抗サルコペニア作用に期待し検討を進めていく予定でリーを構築し，OXR に対する活性を評価した．

ある．

【結果】

【文献（2020 年度実績）】

ニトロアセトフェノンを出発物質として 1,3,5-trioxa-

１）Koyama, H., Yasuda, S., Kakoi, S. et al.: ʻEﬀect

zatriquinan 骨格を構築後，種々のファーマコフォアをof Asfotase Alfa on Muscle Weakness in a Japa-

導入することで 72 化合物からなるライブラリーを構築

nese Patient Diagnosed as Adult-onset Hypo-

した．まず，OXR 拮抗活性を評価した結果，５化合物

phosphatasia.ʼ Intern Med. 2020 Mar 15; 59(6):が１μM 以下の濃度で OXR に対し結合親和性を示した．

811-815得られた Hit 化合物に対し置換基の最適化を行うこと
で，マウス腹腔内投与にて薬効を示す強力な OX1/2R デュ独自骨格を用いる三次元ライブラリーアプローチによる新規オレキシン受容体リガンドの創製
斉藤毅（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）

アル拮抗薬 YNT-2293 (Ki ＝ 3.99 nM for OX1R, 6.01
nM for OX2R) および OX1R 選択的拮抗薬 YNT-2294 (Ki＝ 1.87 nM for OX1R) の創出に成功した５）．
一方，OXR 作動活性を評価したところ，いずれの化合物も作動活性を示さなかった．そこで，本骨格からさらに誘導化を行ったところ，弱いながらも作動活性を示【目的】
オレシキンは視床下部外側野で産生される神経ペプチ

す化合物を見出すことに成功した．
【文献】

ドであり，２つのオレキシン受容体（OX1R, OX2R）に１）T, Sakurai. et al.: Cell 92, 573-585 (1998).

結合することで睡眠覚醒や情動を制御する１）．特に，オ２）M, Mieda. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

レキシン受容体の活性化は覚醒を安定化することから，
その拮抗薬は不眠症治療薬として利用されている．一方，
脳内オレキシン量が減少すると，深刻な睡眠障害である
ナルコレプシーを発症することが知られ，特に OX2R 作
動薬はナルコレプシー治療薬として期待される２）．これまでに我々は，世界初の OX2R 選択的作動薬 YNT-185

101, 4649-4654 (2004).
３）T, Nagahara. et al.: J. Med. Chem. 58, 79317937 (2015).
４）Y, Irukayama-Tomobe. et al.: Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 114, 5731-5736 (2017)５）T, Saitoh. et al.: J. Med. Chem. under revision.

を見出し３），OX2R 選択的作動薬がナルコレプシー症状の抑制に有効であることを立証してきた４)．このようにオレキシン受容体は創薬上有用な標的であるものの，これまでに同一骨格を共通して有する拮抗薬，作動薬は見出されておらず，リガンドの合理的な設計指針は未だ確

81

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
膵β細胞高血糖毒性感受性遺伝子の新規同定と解析
下直樹（大阪大学大学院医学系研究科）

これまでの結果からは，Tmem163 は SG の成熟に必須で，膵β細胞機能に密接に関わることが示唆された．
上記インスリン分泌亢進や電顕における SG 成熟障害の像は，いずれも 2 型糖尿病初期に認められる所見であり，【背景】
２型糖尿病における慢性的な高血糖は膵β細胞機能障
害を引き起こすことが示されており，高血糖毒性として

その病態形成への関与が想定される．本因子と細胞内亜鉛制御との関連や，インスリン分泌亢進の機序に関し，昨年度に引き続き解析を進めている．

知られている．一方，糖尿病治療による膵β細胞機能の改善も経験されるが，これら膵β細胞機能障害および改善に関わる分子メカニズムは明らかではない．
【目的】
高血糖毒性に対する感受性が高く，膵β細胞機能におドパミン-D1R シグナルが心不全に果たす役割の解
明
住

田

智

一
（東京大学大学院医学系研究科）

いて重要な役割を果たす新規因子を同定し解析する．
【方法・結果】
我々は，過食２型糖尿病モデルの db/db マウスに対【目的】

する１週間の SGLT2 阻害薬投与により，高血糖毒性を神経伝達物質ドパミンは運動調節や情動に関わり，選択的に軽減し得ることを報告している（Shimo, N. et

パーキンソン病等神経疾患の発症と治療 に重要な役割

al., 2015）．今回，本系の治療群と非治療群の膵島由来を持っている．一方，ヒトの心不全においても，ドパミ

mRNA を用いて microarray 解析を実施し，非治療群

ンアナログ，D１ドパミン受容体（D1R）アゴニストのに比べ治療群で２倍以上の有意な高発現を示す 43 因子

長期投与はその予後を悪化させることが報告されているを抽出した．高血糖毒性に対し感受性の高いこれら遺が，心臓におけるドパミンの生理的作用や心不全におけ

伝子の中には，膵β細胞機能における役割は未知だが，る役割はほとんど明らかにされていない．本研究は，ドGWAS において２型糖尿病疾患感受性遺伝子として報パミン-D1R シグナルが心不全の発症・進展に関与する

告（Tabassum, R. et al., 2013）されている Tmem163という仮説を検証することで，心不全発症および進展にが含まれており，
ヒトの糖尿病病態との関連性を想定し，おける新たな分子機構の解明に取り組む．

同因子に着目した．マウスにおける局在に関し，免疫染【方法】

色および免疫電顕での解析において膵β細胞インスリン心不全の進展とともに顕著に変化する遺伝子として分泌顆粒（SG）の顆粒膜への高度の限局が示唆された．

D1R を見いだし，その発現が主に心筋細胞に多く認め

膵β細胞特異的 Tmem163 ノックアウトマウス（KO）られることから，心筋細胞におけるドパミン-D1R シグの経口ブドウ糖負荷試験において，血糖値は対照群に比ナルの機能解析を，心筋細胞特異的 D1R ノックアウト

べ有意な低値を，血漿インスリン値は有意な高値を示し

マウス及び心筋細胞特異的 D1R 強制発現マウスを用いた．単離膵島のグルコース応答性インスリン分泌も対照て行った．さらにはアデノウイルスによる D1R の強制群に比べ有意な高値を示した．また電顕での解析におい発現培養心筋細胞の系を確立し in vitro による心筋のて，対照群に比べ SG の dense core の密度低下が確認

Ca２＋シグナル伝達異常との関連を検討した．最後にシされた．さらに免疫染色により，対照群に比べ KO では

ングルセルレベルでのヒト心不全患者の遺伝子発現プロ

インスリンの前駆体であるプロインスリンの分布が核周ファイルの解析を用いて D1R の発現上昇と不整脈との囲から細胞質全体へと変化しており，定量評価において関連を検討した．

膵島プロインスリン含量が増加傾向を示すことが明らか

【結果】

になった．

82

心筋特異的 D1R ノックアウトマウスでは心不全モデ

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ルにおいて致死的不整脈の頻度が減少しており，予後が【結果】改善した．その分子メカニズムとしては，心不全時に増iPSC になる細胞を特異的に認識する TRA-1-60 抗体

加する心筋 D1R が心筋細胞内カルシウムハンドリングを同定し，iPSC 前駆細胞を経時的に分離することにに異常をきたすことで致死的不整脈の惹起に寄与してい成功した．この技術を用いて，iPSC 前駆体が高確率ることを明らかとした．さらに，重症心不全患者の不整で再び体細胞様状態に戻ってしまい iPSC にならない

脈イベントに関する後ろ向き解析を行うことで，D1R

こと１）や，iPSC 前駆細胞がヒト内在性レトロウイルス

がヒト心不全における致死的不整脈の惹起に関与して２）いる可能性も明らかとし，動物実験結果が実際にヒトでとを明らかにした．また，体細胞が TRA-1-60 陽性にも保たれていることを示した．この研究結果は Nature

変化する際に細胞周期阻害因子 p21 の発現上昇によりCommunications (PMID: 32868781) に掲載された．

Retinoblastoma 経路が活性化され，細胞増殖が停止す【考察】ることを見出した４）．これらの成果を受けて，分化多能および中内胚葉関連遺伝子３）を一過的に発現するこ

持続的なドパミンシグナルの増強は心不全の病態を悪性細胞におけるタンパク質翻訳の役割について興味を持化させ，代償機構の破綻として D1R の持続的発現増加

ち，翻訳開始因子 NAT1 が多能性幹細胞の自己複製おが生じているという仮説を立てた．多くの臨床試験によよび神経分化能に必須であることを示した５）．

りβ遮断薬の予後改善 効果は十分に検証されてきたも【考察】のの，ドパミン受容体拮抗薬に関する検証は行われておiPSC になる過程を解析した他の類似研究とは異なり，らず，ドパミンシグナルの遮断をターゲットとした治療

本研究では独自に開発した系を用いて iPSC 前駆体を純

は臨床応用可能な現実的治療方法と予想される．

化することにより詳細な解析結果を得た．その結果，一過的に発現する遺伝子群を同定することができ，iPSC

体細胞核初期化に関する分子機構の解析
高

橋

和

利

ができる過程に関して新たな知見を多く見出すことができた．また，同定した遺伝子のいくつかは iPSC の樹立
効率を改善する効果を持ち，標準的な iPSC 作製技術に（京都大学 iPS 細胞研究所）

採用されている．
【文献】

【目的】

１）Tanabe. et al.: “Maturation, not initiation, is the

転写因子を強制発現させることにより体細胞を多能性

major roadblock during reprogramming toward

幹細胞（induced Pluripotent Stem Cell: iPSC）へと変

pluripotency from human fibroblasts.” PNAS.

換する技術に関して，詳細な分子機構を解明することを

110, 12172-12179 (2013).

目標とした．主に，iPSC へと変化する過程における細２）Ohnuki. et al.: “Dynamic Regulation of Human

胞の性質に焦点を当て解析を行った．

Endogenous Retroviruses Mediates Factor-【方法】

induced Reprogramming and Differentiation

体細胞が iPSC へと形質転換する確率は 1％程度であPotential.” PNAS. 111, 12426-12431 (2014).

ることから，iPSC ができる過程において 99％の細胞は３）Takahashi. et al.: "Induction of pluripotency in

iPSC にならないと考えられた．そこで本研究では，将human somatic cells via a transient state resem-

来 iPSC になる細胞のマーカーを同定し，それを用いてbling primitive streak-like mesendoderm." Nat.

選別した細胞の遺伝子発現およびエピジェネティクス状

Commun. 5, 3678 (2014).

態を解析した．また，解析結果により同定した遺伝子群

４）Rand. et al .: "MYC Releases Early Repro-の機能解析を行い，iPSC の樹立効率や性質に関する分

grammed Human Cells from Proliferation Pause

子機構に迫った．

via Retinoblastoma Protein Inhibition." Cell

Reports 23, 361-375 (2018).
83成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

５）Takahashi. et al.: "Critical roles of translation

は古くからフットケアの重要性が周知されてきたはずだ

initiation and RNA uridylation in endogenous

が，我々は，重症虚血肢を発症した糖尿病患者のうちretroviral expression and neural diﬀerentiation

ABI の受検既往がある患者は３分の１に過ぎない実態を

in pluripotent stem cells." Cell Reports 31,

明らかにした．さらに，虚血性潰瘍・壊疽を発症しても107715 (2020).

すぐには循環器内科・血管外科の受診にはつながらず，
創傷発生から受療までの期間が長くかかっている症例がリスク因子が各アウトカムに及ぼす影響の差異の検出
髙

原

充

佳

少なくない実態も明らかにした．末梢動脈疾患の診療の質の向上には，エビデンスの累積と診療体制の構築が欠かせないと考える．

（大阪大学大学院医学系研究科）
糖尿病をはじめとする代謝異常が動脈硬化性疾患のリスクであることはよく知られているが，それぞれのイン
パクトは必ずしも一様とは限らない．たとえば「内臓脂肪蓄積が代謝異常のリスクとなる」というメタボリック

ブタ LES において神経型ニコチン受容体刺激が引き起こす弛緩反応の機序
田

中

義

将
（九州大学大学院医学研究院）

シンドロームの概念は，高血糖，血圧上昇，脂質異常が
各々内臓脂肪蓄積と関連する，という臨床データで裏付

嚥下時の LES 弛緩反応は迷走神経に由来する壁内神

けられている．だが，これは内臓脂肪蓄が代謝異常の共経叢のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）及通の病態基盤であることの証明にはならない．我々は共びカハールの介在細胞（ICC）により調節されていると分散構造解析を用いることにより，内臓脂肪蓄積とそれ推測されるため，前回申請書に記載した内容のとおり屠

に関連する低アディポネクチン血症は，代謝異常の共通殺場より得た新鮮なブタ食道胃接合部より神経終末，壁基盤を７割説明しうるという，メタボリックシンドロー

内神経叢，ICC を含む 5mm╳2mm のブタ LES 輪走平ムの概念を支持する知見を得た．一方で，各代謝異常が滑筋条片を作成，nAChR 刺激による弛緩反応に対して，共通基盤により説明される割合は，代謝異常によって大各種阻害剤を使用し等尺性張力を測定して検討した．

きく異なることも見出した．別の例として，末梢動脈疾

前回，申請書に記載した内容に加えてブタ LES にお患は冠動脈疾患と同じ動脈硬化性疾患であるが，リスク

いて，nAChR 刺激による弛緩反応には，主に ICC/過因子の関連については大きく異なる．一般に動脈硬化性分極因子が関与する機序を P2X アンタゴニストである疾患において糖尿病は死亡リスクの上昇と関連すること

NF279 を用いることで P2X 受容体の関与を明らかにすが示されているが，我々は，重症虚血肢症例では糖尿病

るなど P2 受容体のサブタイプ毎の役割の違いを明らかは死亡リスクとは関連しないことを見出した．さらに末にするなど，さらに詳細に薬理学的に明らかにした．

梢動脈疾患患者と冠動脈疾患患者における動脈硬化リス

以 上 の 結 果 に て 現 在 こ こ ま で の 研 究 は Otsuka Y,

ク因子の集積状況は大きく異なることも示した．末梢動

Tanaka Y. Eur J Pharmacol 2021 にて報告した．

脈疾患，とくに重症虚血肢の診療に関するエビデンスは【抗生剤投与マウスにおける消化管機能の解析】

極めて少なく，診療ガイドラインでも，そのリスク管理

現在，さらに消化管生理学についての研究を進めていに関しては，同じ動脈硬化性疾患である冠動脈疾患領域

くうえでここまでの研究の延長線上の研究として，アカで得られたエビデンスが借用されることも珍しくない．

ラシア患者のヒト筋層サンプル解析を行っている．ましかし，我々のこうした知見は，末梢動脈疾患を冠動脈た，消化管機能と腸内細菌や脳腸相関の影響などの検討

疾患と同列に論じるには注意が必要であることを示唆しを進めており，まずは腸内細菌の影響を調べるためアンている．末梢動脈疾患はエビデンスが不足しているのみ

ピシリン，バンコマイシン，ネオマイシン，メトロニダゾー

ならず，実地での認知度も低い．たとえば糖尿病診療でル投与による糞便中の 16S rRNA gene copies を調べ84成人病の病因・病態の解明に関する研究助成ることで腸内細菌が 99% 以上除去できることを確認しタボロミクス解析を実施した．

ている（図）．この結果をもとにさらにこれらの消化管【結果と考察】機能へどのように影響するかについて現在各種実験をすすめているところである．

社会ストレスがリボソームタンパクやミトコンドリア
関連タンパクの遺伝子発現を低下し，タンパク分解系の遺伝子発現が亢進することが分かった．また，プロテオ
ミクス解析によりシナプトソーム分画特異的にオートファジータンパクの著明な発現亢進やミトコンドリアの構成タンパク・転写翻訳機構の発現低下を示すことを，さらに生化学解析によりシナプトソーム分画のミトコン
ドリア選択的に機能低下を示すことを明らかにした．これらの知見はシナプス分画のミトコンドリア機能破綻の背景にタンパク質の合成・分解バランスの破綻が生じていることを示唆する．また，ミトコンドリアを含むシ
ナプスにおいて構造退縮が顕著であること，及びエネル
ギー代謝や核酸代謝経路を担う酵素群がシナプス特異的に変容していることも分かった．これらの知見はストレスによる神経機能変化と並行して代謝変化が生じている

社会ストレスによる脳組織の超微細な細胞生物学的変化とその機序・役割の解明
永井裕

ことを示唆する．今後はストレスによる認知情動変容や神経形態変化における代謝変化の機能的意義やその分子機序について検討する．

崇（神戸大学大学院医学研究科）【目的】
社会や環境より受けるストレスは抑うつや不安亢進な

心臓圧負荷時におけるの分子メカニズム

の解明
中

田

康

紀
（奈良県立医科大学医学部）

ど情動変容を誘発し，うつ病など精神疾患のリスクとなる．うつ病患者やマウスのストレス病態モデルにおいては，前頭前皮質神経細胞の樹状突起萎縮や樹状突起スパ【目的】

インの喪失などの神経形態変化が情動変容に重要である

NADPH オキシダーゼ（NOX）は，体内の活性酸素ことが示唆されてきているが，それらの神経形態変化の種（ROS）の主要な供給源である１）．NOX ファミリー

分子細胞生物学的機序は殆ど不明である．従って本研究の７つのメンバーのうち，NOX2 および NOX4 は心筋

では，最先端イメージング技術やマルチオミクス解析を細胞でも豊富に発現している２）．NOX1-4 は，膜貫通タ用いてストレス病態を担う神経細胞の機能形態変化のメンパク質である分子量 22.0kDa の p22 phox と 1：1 の複カニズムを明らかにすることを目的とする．

合体を形成している３）．p22 phox の主な生理学的役割は，【方法】

NOX と形成するヘテロダイマーの安定化であり，さま

社会挫折ストレスによる神経細胞や細胞内小器官の形

ざまな臓器での ROS 産生に関与している．しかしなが態変化を調べるため，マウスの内側前頭前皮質を連続電ら，心筋細胞における p22 phox の正確な役割は未だ解明

子顕微鏡法及び膨張顕微鏡法による超解像イメージングされておらず，本研究では心臓における内因性 p22 phoxにより観察した．さらに形態変化に関わる分子機序を明の役割を明らかにすることを目的とした．

らかにするため，RNA-seq やプロテオミクス解析，メ

85

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【方法と結果】
はじめに，ヒトの心臓サンプルで p22 phox の発現を確認したところ，心不全患者では健常者に比較して，

p22 phox の発現が有意に増えていた．また，マウスの胸神経ガイダンス因子による神経 - 免疫 - 代謝連関メ
カニズムの解明中西由光（大阪大学大学院医学系研究科）

部大動脈狭窄（TAC）後も同様に p22 phox の発現が有意に増えていた．そこで，心臓特異的 p22 phox ノックアウ
トマウス（ p22 phox-cKO）を作成した．p22 phox-cKO マウ
スに TAC を施行したところ，p22phox-cKO マウスでは【目的】
セマフォリンを介した神経 ‒ 免疫 ‒ 代謝連関の制御機

コントロールマウスに比較して，有意に心収縮能の低構の解明下を認め，肺重量も増加していた．次に，質量分析で【方法】

p22 phox と結合するタンパクを調べたところ，心筋筋小セマフォリン 6D (Sema6D) 欠損マウス由来ミクログ

胞体 Ca2＋-ATPase (SERCA2a) が最も多い結果であっリアを用いて in vitro phagocytosis assay を行なった．

た．p22 phox-cKO マウスではコントロールマウスと比較

次に，同マウスを用いて行動試験を行い，Sema6D をし，
SERCA2a の mRNA の発現量に差は認めなかったが，介したミクログリアの機能と中枢神経応答の関連を探索

SERCA2a のタンパク発現量が有意に減少していた．

した．さらに，同マウスを用いてクプリゾン誘導脱髄モ【考察】

デルを行い，脱髄疾患における Sema6D の機能解析を

今後は，p22 phox がどのように SERCA2a を安定化しているかについて検討し，p22phox の心臓における分子メカニズムを明らかにする．

行なった．
【結果】

in vitro phagocytosis assay を 行 な っ た と こ ろ，【文献】

Sema6D 欠 損 ミ ク ロ グ リ ア で は 貪 食 能 の 低 下 を 認 め１）Maejima, Y., Kuroda, J., Matsushima, S., Ago

た（ 図 １）．Open ﬁeld test, Elevated maze test な ど

T. ＆ Sadoshima, J.: Regulation of myocardialの行動試験を行なったところ，Sema6D 欠損マウスでgrowth and death by NADPH oxidase. J Mol

は不安様行動の亢進を認めた（図２）．また，クプリゾ

Cell Cardiol. 50, 408-16. (2011).

ン誘導脱髄モデルでは Sema6D 欠損による脱髄増悪を２）Schulz, E. & Munzel, T.: NOX5, a new "radical"
player in human atherosclerosis? J Am Coll Car-

diol. 52, 1810-1812. (2008).

認めた（図３）．
【考察】
以 上 の 結 果 か ら， ミ ク ロ グ リ ア の 貪 食 作 用 に は３）Bedard, K. & Krause, KH.: The NOX family of

Sema6D シグナルが必要であり，Sema6D 欠損による

ROS-generating NADPH oxidases: physiology

貪食異常は不安用行動の亢進や脱髄の進行を引き起こす

and pathophysiology. Physiol Rev. 87, 245-313.

ことが明らかとなった．ミクログリアの貪食作用には細(2007).

胞内脂質代謝の変容を伴うことが近年明らかにされており，代謝変容を介したミクログリアの機能制御が注
目を集めている．先行研究において我々は，Plexin-A4Sema6D シグナルが脂肪酸代謝を介して抑制性マクロ
ファージ分化を制御することを報告している（Nature

Immunol 2018）．ミクログリアは中枢神経系における組織常在性マクロファージであり，先行研究と同様にSema6D がミクログリアの脂質代謝制御を介して貪食能の維持を担う可能性がある．
一方で，Sema6D は神経細胞やオリゴデンドロサイ

86成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

ト，血管内皮細胞など中枢神経系を形成する多様な細関しては，Cx3cr1-CreERT2; Sema6d f l / f l, VEcad-CreERT2;胞集団に発現しており，行動異常や脱髄進行などの表

Sema6d f l / f l マウスなどのコンディショナルノックアウ

現系における各細胞集団の寄与は不明である．この点にトマウスを作製し，解析を行う予定である．
【結論】
Sema6D はミクログリアの貪食能制御を介して中枢神経系の恒常性維持を担う．

新たな心機能制御要素としての心臓マクロファージ
の機能解析
中

山

幸

輝
（東京大学医学部）

図１ Sema6d 欠損ミクログリアでは貪食能の低
下を認める

【目的】
高齢化社会において心不全症例の増加が顕著になっているが，従来の心不全治療では，健康寿命の延伸は得られていない．繰り返す心不全と多臓器合併症を予防する新たな治療戦略を創出することは喫緊の課題である．我々はこれまでに，心臓間質に存在する組織マクロ
ファージが，恒常性維持に重要な役割を担っていることを解明した．そこで，①一度心不全を経験すると心臓常在マクロファージの表現型が変わって，心臓の恒常性維
持を破綻させる，②心不全になると，マクロファージの細胞起源となる造血幹細胞 (HSC) レベルで変化する，という仮説に基づき心不全の新たな病態解明を図る．

図２ Sema6d 欠損マウスでは不安様行動の増強を認める【研究成果】
心不全が骨髄の HSC に与える影響を評価するため，心不全マウスの骨髄を移植したところ，自然経過で慢性期に心筋線維化が進んで収縮能が低下した．心不全時の
HSC の変化が心臓マクロファージの表現型を与える影

図３ Sema6d 欠損マウスではクプリゾンによる脱髄の進行を認める

87

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

響を解析するために，心不全マウスの HSC を野生型マ

ダイウイルス（SeV）ベクターを使用して初期化４因子

ウスの HSC と競合的に移植した後の分化様式を解析し（Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc）を遺伝子導入し，iPS 細た．すると，心不全を経験した HSC はエピゲノム変化

胞誘導をおこなった．CAEBV は様々な病態をもつことにより，末梢血では骨髄系細胞に分化しやすくなった一から，なるべく多数の患者からの樹立を試みており，今方で，心不全マウスの HSC 由来単球は心保護的な心臓後も増やす計画である．作製した iPS 細胞の評価は，ア

マクロファージに分化しにくくなるということが分かっ

ルカリホスファターゼ染色と未分化マーカー（Nanog,

た．このことは，老化や心不全を起こした心臓で外的スSox）の発現を蛍光免疫染色法を行った．またリアルタ

トレスに対する忍容性を低下させ，さらなる心機能低下

イ ム PCR で 未 分 化 マ ー カ ー（Nanog, Sox2, Oct3/4）を引き起こすと考えられた．

の発現をみた．SeV ゲノムの消失確認は抗 SeV 抗体で【今後の展望】の免疫蛍光染色法を行った．

心不全になると脳，神経を介して骨髄に構造的リモデ【結果】リングを起こし， HSC の幹細胞維持に関わるニッチの初期化遺伝子導入後，約 20-30 日でコロニーは大きく，

サイトカイン発現が変化することがわかった．このこと

内部の細胞が緊密に接着し均質な形態を示した．EB ウが，末梢血の白血球分化のみならず，多臓器の組織マクイルスＴ細胞感染型，NK 細胞感染型，様々な病態を持

ロファージの表現型に影響を与え，外的ストレスに対すつ患者６名からの樹立に成功した．

る忍容性を低下させることが分かった．これらが，心不作製した iPS 細胞の評価はアルカリホスファターゼ染全に伴う多臓器合併症の一つの要因になりうると考えら

色，未分化マーカーの発現を免疫蛍光染色法とリアルタれた．今後は，ヒトの心不全症例における HSC の解析

イム PCR 法で確認した．SeV ゲノムの消失を確認した．

を行い，心不全の早期診断，治療に繋げていく．

【考察】
COVID19 感染の拡大の影響で予想以上に来院者数が慢性活動性 EB ウイルス感染症（CAEBV）患者由来 iPS 細胞の作製
西尾美和子（東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科）

減少し，患者検体の収集に時間を要した．すでに６株の様々な CAEBV 患者由来 iPS 細胞の樹立に成功したが，引き続き検体収集と iPS 細胞樹立を進め，様々な病態を有する CAEBV 患者さんの病態解明と新規治療法開発につなげていきたい．

【目的】
慢性活動性 EB ウイルス感染症（CAEBV）は，EB ウ
イルスがＴもしくは NK 細胞に感染し，活性化，腫瘍化
して発症する．希少かつ難治性疾患であり，唯一の根治

オートファゴソーム形成とグリセロリン脂質生合成系の密接な関係
西村

多喜（東京大学大学院医学系研究科）

療法は造血幹細胞移植である．造血幹細胞移植以外の根治療法は未だない．
本研究では，CAEBV 患者の末梢血単核細胞からヒト【目的】

iPS 細胞を作製し，CAEBV 患者由来 iPS 細胞から各種

オートファジー関連（ATG）分子はダイナミックな細胞に分化誘導することで，これまで誰もが実現しな膜動態を伴うオートファゴソーム形成に必須の役割を果かった in vitro での CAEBV 発症を実証し，病態解明にたしており，一部の ATG 分子は両親媒性αヘリックス

つなげることを目的とする．

（AH）を介して膜脂質と直接結合することが知られてい【方法】

る１）．しかしながら，これらの AH 領域が具体的にどの本学血液内科 CAEBV 専門外来で同意を取得した．具ような機能を果たしているのか全く分かっていない．そ体的には，CAEBV 患者 6 名の末梢血単核細胞からセン

こで本研究では，特に，LC3 脂質化に関与する ATG3

88

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成に注目した解析を行い，ATG3-AH の機能解明に取り組
む．
【方法】
まず Human ATG3 の AH 部分を他の AH に置換した

栄養への応答と代謝恒常性を支える全身性およびエ
ピジェネティック制御機構の解明
服部佑佳子（京都大学大学院生命科学研究科）

ATG3 キメラのコンストラクトを準備した．レトロウイ
ルス発現系を使って ATG3 ノックアウト細胞に ATG3
野生型や ATG3 キメラを発現させることで，ATG3 の【背景・目的】

機能が正常に回復するかどうか解析を行なった．また，栄養環境は，個体の成長のみならず，成体や次世代にATG3 の機能を正常にレスキューした ATG3 キメラとまで影響を与える．しかし，様々な栄養環境に動物がどそうでないものの違いを調べるため，trRosetta を用いのように応答し適応しているかには，不明な点が多い．

た全長 ATG3 の構造解析を行なった．さらに，ATG3

これまでに，ショウジョウバエ近縁種群のマルチオミク

で機能的な AH に共通した特徴を見出すため，Graphスによる比較解析から，高炭水化物食条件下での個体成

Splitting 法によるアミノ酸配列比較や様々なパラメー

長に TGF-β/Activin シグナリングが機能していること

ターを考慮した多変量解析も行なった．

を見出した１,２）．本研究課題では，ヒストン修飾酵素に【結果】よるクロマチン構造の変化が，高炭水化物食への適応に

他のタンパク質由来の AH 領域に置換した ATG3 キ
メラでは ATG3 の機能を完全に回復させることが出来果たす意義とその分子機構について解析を行う．
【方法・結果】

なかったのに対して，他の生物種 ATG3 ホモログの AH

キイロショウジョウバエの野生型および変異体，そしに置換した ATG3 キメラは野生型の human ATG3 と同て，セイシェルショウジョウバエの幼虫全身を用いて，程度にまで回復させることが分かった．全長 ATG3 の

CUT&RUN 法によるヒストン修飾のゲノムワイドなプ

構造予測解析から，AH 領域と酵素活性部位の距離がロファイリングを行った．その結果，遺伝子型間，あるATG3 キメラの活性にある程度の正の相関があること，いは，食餌間でヒストン修飾パターンが有意に異なる領

また AH 領域のアミノ酸配列にも特徴的な配列があるこ

域，および，その近傍にある遺伝子群を同定した．

とが示唆された．

【考察】

【考察】

今後，栄養バランス変化に対して，クロマチン構造がATG3 の AH 領域は活性部位の近傍に位置しているこどのように調節されて適応を支えているか，栄養適応にとが必要なこと，また種を超えて保存された独自の機能

おいてクロマチン構造の調節機構と TGF-β/Activin シを果たしていることが考えられた．今後は詳細な分子機

グナリングとの間に関係があるか，そして，高炭水化物

構を明らかにしていきたい．

食に適応できないセイシェルショウジョウバエでは適応【文献】

を支えるクロマチン制御が機能しているかを中心に解析

１）Nishimura, T.#, Tooze, S.A.#: Emerging roles ofを進めていく．また，ショウジョウバエ近縁種間での，ATG proteins and membrane lipids in autopha-

成虫期における寿命や生殖を指標にした栄養環境への適

gosome formation. Cell Discov., 6, 32 (2020).

応能力の違いも明らかにしており３），成熟個体の栄養適応におけるクロマチン制御機構の役割についても解析を行っていきたい．
【文献】
１）Watanabe, K., Kanaoka, Y., Mizutani, S., Uchiyama, H., Yajima, S., Watada, M., *Uemura, T.,& *Hattori, Y.: Interspecies comparative analyses reveal distinct carbohydrate-responsive sys-89

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

tems among Drosophila species. Cell Reports.

し た． 次 は 反 対 に HDAC10 が MCHR1 シ グ ナ ル 系 に28, 2594-2607.e7 (2019).

与える影響について解析を行った．MCHR1 発現細胞

２）上村匡，渡辺佳織，服部佑佳子．モデル生物と非に MCH を添加すると cAMP 応答配列結合タンパク質

モデル生物との対比で迫る栄養環境への適応機構．

（CREB）が活性化するが，この活性化は HDAC10 過剰

生化学 特集「食・栄養から健康を拓く生化学」93,

発現下で抑制した．また CRE 活性も HDAC10 過剰発

67-77 (2021).

現で有意な抑制を示した．一方，分裂促進因子活性化タ３）Watada, M., Hayashi, Y., Watanabe, K., Mizu-

ンパクキナーゼ（ERK1/2）は HDAC10 過剰発現によtani, S., Mure, A., *Hattori, Y. & *Uemura, T.:る影響を受けなかった．さらに，MCHR1 は Gi/o，Gq

Divergence of Drosophila species: Longevityと共役するが，Gi/o 阻害剤である百日咳毒素（PTX）

and reproduction under diﬀerent nutrient bal-により HDAC 活性や細胞内シグナルに対する影響を

ances. Genes to Cells. 25, 626-636 (2020).

与えなかったことから，HDAC10 は Gq 経路選択的に関与する可能性が推測された．以上より， MCHR1 は摂食関連 GPCR の活性化・不活性化における分子メカニズム解析濱本明

MCHR1 シグナル系を部分的に抑制する HDAC10 を抑制することが分かった．本研究により HDAC と摂食関連受容体との関係が解明され，肥満の新規メカニズム解恵明に繋がることが期待される．
（岐阜大学工学部）

また MCHR1 が微小膜小胞エクソソームに存在することを見出した．そこで，MCHR1 含有エクソソームの【背景】
ヒストンがヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）によ

機能を解析し，GPCR 含有エクソソームを薬物輸送シス
テムのように活用可能か今後検討する．

り脱アセチル化されると DNA の巻き付きが固くなり転写が抑制される．これまで一部のＧタンパク質共役型受容体（GPCR）と HDAC が相互作用すると報告されて腎臓病における DNA 損傷修復応答とエピゲノム変いるが，摂食関連 GPCR と HDAC の関係については全化の関連く不明であった．そこで肥満との関連性が高いメラニ

林香（慶應義塾大学医学部）

ン凝集ホルモン受容体（MCHR1）に着目し，昨年度はMCHR1 と HDAC との相関を明らかにした．今年度は
MCHR1 と同じ脳領域における発現が報告されている
HDAC10 に焦点を当てて解析を行った．
【方法】【背景・目的】
慢性腎臓病の増加は，近年日本のみならず世界的な問題となっている．近年，腎臓病の発症・進展にエピゲノ

MCHR1 が 安 定 発 現 し た HEK293 細 胞 を 使 用 し，ム変化が関与していることが報告されている．我々もこHDAC 活性測定やウエスタンブロット，リアルタイム

れまで糸球体上皮細胞（ポドサイト）を中心に，エピゲ

PCR 法，細胞免疫染色法などを行った．

ノム変化の病態に及ぼす影響に関して検討し報告してき【結果・考察】た１,２）．更に，基本的に分裂・補充されない最終分化細MCH 添加により MCHR1 安定発現細胞の HDAC 活胞であるポドサイトにおいてエピゲノム変化を惹起する性が有意に低下し，内在性 HDAC10 のタンパク質お原因として，DNA 損傷修復応答に注目し，多様な腎臓

よび mRNA 発現も有意に低下した．さらに，細胞質構成細胞におけるエピゲノム変化と DNA 損傷修復応答に広く発現していた HDAC10 が MCH 添加により細胞の関連性，及び腎機能および病態に果たす役割を明らか

内で凝集し，分解されることが推測された．以上より，にすることを目的とした．

MCHR1 シグナル系が HDAC10 を抑制することが判明

90

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成に大きく減少する．また，成人においては，通常よりも【方法・結果】
まずポドサイト特異的 KAT5 ノックアウト（KO）マ

レム睡眠が少ないと認知症の発症リスクが高まることか

ウスおよびタモキシフェン誘導型ポドサイト特異的ら，レム睡眠が脳の恒常性維持に関わる可能性が考えら

KAT5KO マ ウ ス を 用 い て， 二 本 鎖 DNA 切 断（DNAれる．しかしながら，レム睡眠が脳の発達や恒常性維持

DSB）修復因子 KAT5 がポドサイト維持に必須であり，に関わることの直接的な証拠はない．レム睡眠の生理的糖尿病性腎症においては，KAT5 発現低下，DNA メチ

意義を解明することで，睡眠障害に着目した全く新しい

ル化増加によってポドサイト形質遺伝子発現低下，尿蛋

脳機能・認知症の改善方法の開発が期待される．

白バリア破綻に関与している可能性を報告した３）．また【目的】

DNA 損傷と DNA メチル化等のエピゲノム変化の関連

本研究の目的は，レム睡眠の脳における役割を解明すについてヒトにおける関連についても示した４,５）．一方，ることである．そのため私たちは，これまで主に２つのKAT5 は近位尿細管上皮細胞において，DNA 修復のみ

アプローチに取り組んできた．一つ目は，レム睡眠を有ならず，Cl チャネル発現制御を介して糸球体濾過量調

効に阻害または増加させる方法がこれまでなかったこと

節にも関与する可能性が示唆された６）．更にポドサイトを踏まえて，レム睡眠の ON／OFF を司るニューロンをや近位尿細管上皮細胞特異的に二本鎖 DNA 切断を誘導同定し，遺伝学的にその機能を阻害または亢進させるこするトランスジェニックマウスを作成し，DNA 損傷ととで，レム睡眠を外部からの刺激に依存することなく増DNA メチル化との関連，腎老化と全身老化との関連に

加または減少させて，その影響を調べる，というものでついて現在解析を進めている．

ある．もう一つは，生体内イメージングによって，レム【考察】

睡眠中に脳でどのような変化が生じているかを調べる，

腎臓病における DNA 損傷とエピゲノム変化の理解にというものである．この２つのアプローチから，レム睡より，新たな治療法や診断法の開発につながる可能性が眠の脳における役割を解明することを目指してきた．

期待される．

【方法】
古典的な研究からレム睡眠を制御するニューロンは脳【文献】
１）Hayashi*., Sasamura*. et al.: JCI 2014

幹の橋にあることが支持されているが，ニューロンのサ

２）Hayashi*. et al.: Kidney Int 2015

ブタイプは分かっていない．そこで私たちはこの領域に

３）Hishikawa., Hayashi*. et al.: Cell Rep 2019

選択的に発現する Cre ノックインマウスを多数作製し，４）Hishikawa., Hayashi*. et al.: Sci Rep 2020

Cre 依存的な遺伝子発現技術を用いることで，レム睡眠

５）Hayashi*. et al.: Sci Rep 2020の制御を担うニューロンの同定と操作に取り組んだ．さ６）Hishikawa, Hayashi*, et al.: iScience, 2021

らに，レム睡眠操作の効果を，脳活動や行動実験によっ*Corresponding authorて評価した．また，２光子励起顕微鏡下で，睡眠中または覚醒時のマウスの脳の毛細血管の血流を観察した．
【結果】

レム睡眠の脳の恒常性維持における役割の解析
林悠

これまでに，活性化するとレム睡眠を阻害できる
ニューロン，すなわちレム睡眠を強く抑制するニュー（京都大学医学系研究科）

ロ ン と し て， 橋 の Atoh1 陽 性 細 胞，Nts 陽 性 細 胞，Cpne7 陽性細胞等を同定することに成功した．これら【背景】の細胞の機能操作によるレム睡眠操作実験から，レム睡

哺乳類の睡眠はノンレム睡眠とレム睡眠から構成さ眠には徐波と呼ばれる脳の可塑性に重要な脳活動を促す

れる．レム睡眠は睡眠全体の 15％程度にしか満たない作用があることを見出した．また，レム睡眠を誘導するが，この間，脳が活発に活動し，鮮明な夢が生み出されニューロンについても複数同定することに成功し，こうる．レム睡眠は新生児期に最も多く，成長や加齢とともしたニューロンの遺伝学的破壊により，レム睡眠がほぼ91

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成消失したマウスの作出にも成功した（Kashiwagi et al.,Shin, JW., Suzuki, H., Itohara, S., Yanagisawa,．こうしたマウスでは，様々な行動
Liu et al., 未発表）

M. & Hayashi, Y.: Widely distributed neuro-

異常が見られたことから，レム睡眠が脳の恒常性維持に

tensinergic neurons in the brainstem regulate

必須な役割を担うことが強く支持された．また，自然なNREM sleep in mice. Current Biology 30:

睡眠覚醒の条件下で，脳の毛細血管の血流を観測するこ1002-1010 (2020).

とに成功した．その結果，レム睡眠中は，大脳皮質の血

３）Liu, CY., Tsai, CJ., Yasugaki, S., Nagata, N.,

流量が覚醒時やノンレム睡眠中と比べて大幅に上昇する

Morita, M., Isotani, A., Yanagisawa, M. &ことが判明した．活発に運動している時と比べても，多Hayashi, Y.: Copine-7 is required for REM sleep

くの皮質領域でレム睡眠中は 2 倍前後まで毛細血管のregulation following cage change or water im-

血流が上昇した．

mersion and restraint stress in mice. Neurosci-【考察】

ence Research doi: 10.1016/j.neures. 2020. 04.

本研究を通じて，レム睡眠の ON／OFF を司る神経

002. (2020).

回路の理解が大きく進み，当初の目的通り，マウスにお４）Maezono, SEB., Kanuka, M., Tatsuzawa, C.,

いてレム睡眠を人為的に操作できることに成功した．そMorita, M., Kawano, T., Kashiwagi, M., Nond-の結果，レム睡眠による徐波の促進作用など，新たな作

halee, P., Sakaguchi, M., Saito, T., Saido, TC. &用を見出すことに成功した．さらに，私たちが開発した

Hayashi, Y.: Progressive changes in sleep and

レム睡眠が不可逆的に消失したマウスの様々な行動異常

its relations to amyloid-β distribution and learn-を踏まえると，レム睡眠が脳の恒常性維持に必須な役割

ing in single App knock-in mice. eNeuro doi:を担う可能性が高い．ただし，私たちがレム睡眠阻害の10.1523/ENEURO. 0093-20. 2020. (2020).

ために破壊したニューロンが，レム睡眠制御以外の役割

５）Nakai, A., Fujiyama, T., Nagata, N., Kashiwagi,も担っている可能性が否定できないため，今後，別の角

M., Ikkyu, A., Takagi, M., Tatsuzawa, C., Tana-

度からのアプローチも重要となる．そのような視点から

ka, K., Kakizaki, M., Kanuka, M., Kawano, T.,

取り組んだのが，レム睡眠中に脳で起こる変化のイメー

Mizuno, S., Sugiyama, F., Takahashi, S., Funato,

ジングによる観察である．その結果，レム睡眠中に，大H., Sakurai, T., Yanagisawa, M. & Hayashi, Y.:

脳皮質の脳血流が大幅に上昇することが判明した．１日

Sleep Architecture in Mice Is Shaped by the

約１時間のレム睡眠中の大脳皮質の広範な血流上昇は，Transcription Factor AP-2β. Genetics 216: 753

広く栄養を届けるとともに，脳の不要な老廃物を回収す(2020).

ることに貢献している可能性がある．
最後に，貴財団に８年もの間，研究をご支援頂くとともに多くの貴重なご指導を頂けたことを心より感謝申し上げます．貴財団の今後の益々のご発展をお祈り申し上

虚血性心疾患に対する精密医療の推進原弘

典（アムステルダム大学病院）

げます．
【文献】
１）Hayashi, Y., Kashiwagi, M., Yasuda, K., Ando,【背景・目的】R., Kanuka, M., Sakai, K. & Itohara, S.: Cells

本邦における心臓疾患に伴う死亡者数は年間約 20 万of a common developmental origin regulate

人（死因原因別で第２位）と多い．特に，生活習慣病のREM/non-REM sleep and wakefulness in mice.

増加に伴い，冠動脈内の動脈硬化の進行が原因で起こる

Science 350: 957 (2015).

虚血性心疾患（狭心症や心筋梗塞）は，今後も増加する

２）Kashiwagi, M., Kanuka, M., Tatsuzawa, C., Su-

ことが予想される．狭窄・閉塞した冠動脈に対し，冠動zuki, H., Morita, M., Tanaka, K., Kawano, T.,

脈バイパス術 (CABG)，経皮的冠動脈形成術（PCI）が92

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

広く普及しているが，どちらの治療を選択すべきか，長pact of Peri-Procedural Myocardial Infarction

期予後の改善という観点では課題が多い．本課題では，

on Outcomes After Revascularization. J Am Coll

大規模臨床試験をもとに予後予測因子を検討し，患者背Cardiol. 2020; 76(14): 1622-1639.

景に応じた最適な治療の提供を目標とする．
【方法・結果】
複雑冠動脈病変患者における CABG，
PCI の選択では，
年齢，性別，腎機能，左室駆出率，左冠動脈主幹部病変，
冠動脈病変の解剖学的な複雑さ（SYNTAX score），慢

概日リズム障害発症メカニズムの理解に向けた睡眠リズム制御機構の解明
平

野

有

沙
（筑波大学医学医療系）

性閉塞性肺疾患，末梢動脈疾患が予後規定因子となることが，1800 例の複雑冠動脈病変患者を CABG, PCI に
無作為に割り付けた SYNTAX 試験の４年時点の結果か【目的】

ら証明されていた．現在 10 年フォローの結果が得られ睡眠は動物に不可欠な生理行動である．一時的な断眠はており，糖尿病や喫煙も予後予測因子となること，さら認知・学習機能や注意力の低下をもたらすが，断続的なに，CRP，
ヘモグロビン，
HbA1c といったバイオマーカー

不眠によって生物は様々な失調をきたし，重篤な場合にも予後と関連することを見出しており，機械学習を用いは死に至る．重要なことに，睡眠の量に加えてタイミン

た新規予測モデルの構築に取り組んでいる．

グ（位相）も我々の健康に強く影響を与える．生物の行

日常臨床では術後に生じる心筋梗塞や脳卒中も治療選動や代謝は約１日周期のリズムを示し，このような概日

択に影響を与えるため，PCI と CABG において周術期

性の生理リズムは概日時計と呼ばれる体内時計によって心筋梗塞が予後に与える影響の検討を試みた．検討に制御される．24 時間型社会と呼ばれる現代社会においおける前提として，定義が定まっている必要がある．しては，不規則な生活による概日リズム障害が社会問題とかし，様々な定義が臨床試験に適応されており，心筋なっている．規則正しいリズミックな生理現象は生体恒逸脱酵素の上昇のみで定義されたものもあれば，心筋常性の維持に必須であり，概日リズム障害とメタボリッ

逸脱酵素の上昇に加えて梗塞を示唆する心電図変化やクシンドロームや精神疾患の発症には強い相関が見られ壁運動の低下を要する定義もあった．さらに，PCI とる．そのため，概日時計から生理リズムへの出力経路の

CABG にて定義が異なることもあった．これらの定義

理解は，概日リズム障害によるメタボリックシンドロー

を SYNTAX 試験に適応したところ，周術期心筋梗塞とム発症メカニズムとその予防に大きく寄与すると期待でその後の死亡との関連の程度は定義に応じて大きく変化

きる．概日時計の中枢は視床下部の視交叉上核（SCN）

し，さらに，心筋梗塞のイベント数の変化に伴い臨床試に存在し，個々の神経細胞は自律振動する分子時計を内験の結論が変わりうることも明らかとなった１）．

在する．SCN 時計は外界の明暗サイクルに同調し，他【考察】の脳領域や末梢組織に時刻情報を出力することで生理リ

CABG, PCI ともに確立された治療である一方で，適ズムを作り出す．概日時計から生理リズムの基本である

切な治療選択が長期予後の改善には必要であり，複数

睡眠覚醒リズムへの出力は極めて重要なプロセスであの大規模臨床試験における患者レベルでの統合解析かる．そのため，概日時計の出力系の理解なくしては生理ら，日常臨床で有意義なスコアリングシステムの確立を

リズム形成の根幹を理解したとは言い難いが，SCN の目指したい．その一方で，適切な臨床試験を推進する“細胞内” の時計発振機構に比べて生理リズムの出力系ため，申請者も関わり，国際的な Academic Researchを司る “SCN 外” の神経ネットワークの理解は進んでConsortium にて臨床的に妥当な心筋梗塞の定義の作成いない．そこで本研究計画では概日時計の重要な出力をすすめている．

である睡眠リズムに着目し，SCN から投射される神経【文献】

細胞の時刻・細胞特異的な操作を行うことで，睡眠覚醒

１）Hara, H., Serruys, PW., Onumna, Y. et al.: Im-

リズムの制御メカニズムとその破 綻がもたらす個体への93成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

影 響を明らかにする．さらに，今年度は SCN において

【結果】

第三の細胞集団を形成しながらその生理的役割のよくわ

TeNT-LC でを用いて SCN→VLPO 神経を阻害したとかっていなかったガストリン放出ペプチド（GRP）産生神

ころ，マウスの自発行動リズムが消失した．このマウス経に着目し，その概日リズム形成における役割を調べた．

において SCN における概日時計を可視化したところ，【方法】

コントロールのマウスと変わらない細胞リズムが観察さ本研究は，神経トレーサーを利用して SCN から神経れた．１細胞レベルでの解析の結果，神経細胞間のリ投射される細胞群の同定を行うとともに，人為的に神経ズム同調にも変化は観察されなかった．つまり，TeNT-

活動を操作することでその神経連絡の睡眠覚醒サイクル

LC の発現による行動リズムの消失は SCN の時計細胞制御における役割を明らかにする．我々は既に，睡眠中における時計機能の変化ではなく，出力系への影響が原枢である視索前野 POA に投射する SCN の神経細胞の因である可能性が高い．

みを特異的にラベルする手法を確立している．神経毒素

Grp-iCre マウスにおいて TeNT-LC を発現させると，であるテタヌス毒素（TeNT-LC）を用いて細胞の分泌同様に行動リズムの消失が観察された．このマウスにお小胞を阻害するとマウスの行動リズムが消失した．今年

いても PER2::LUC の測定により，SCN における時計

度は，このマウスにおいて SCN の時計機能が破壊され機能を解析した．その結果，GRP 神経を阻害した条件

たのか，出力経路が阻害されたのかを明らかにするため

では，PER2::LUC の発光シグナルが減弱し，リズム振SCN における細胞リズムの可視化を行った．具体的に幅も大幅に低下することが明らかとなった．この結果

は，PER2 タンパク質にルシフェラーゼを融合させたタは，SCN→VLPO 神経の阻害とは対照的に GRP 神経がンパク質を発現する PER2::LUC ノックインマウスを用

SCN の時計発振機能の維持おいて重要な役割を果たす

いて PER2 タンパク質量を可視化する．PER2 の量はリことを示している．GRP 神経からのシグナルが細胞時

ズミックに変動するため，細胞の概日時計が機能してい計そのものに必要なのか，神経細胞間の同調に必要なのるのか，細胞間で同調しているのかを明らかにすることかは今後明らかにするべき課題である．一方，GRP 神が可能である．我々は，TeNT-LC を発現させて行動リ

経の投射地図を作成したところ，SCN 神経の投射パター

ズムが消失したマウスから SCN 切片を作成し，CCD カンと似たパターンを示した．ただし，視床下部の腹内側メラによるイメージングおよび光電子倍増管（フォトマ

核（VMH）にはほとんど軸索が見られず，これは他のル）による測定を行った．CCD カメラから得られた画

SCN の神経とは異なっている．このことから，GRP 神像から 1 細胞レベルで輝度の変化を解析し，神経間で経は時計出力にも関与していること，GRP 神経特異的

細胞時計が同調しているかどうかを調べた．

な制御機構の存在が示唆される．

一方，SCN における GRP 神経の生理的役割を明ら【考察】かにするため，Grp-iCre ノックインマウス（富山大学

本研究では，SCN から VLPO への神経投射に焦点を森寿教授との共同研究）を導入した．Grp-iCre マウス

あててその性状解析および機能解析を行なっている．この SCN に Cre 依存的に TeNT-LC を発現するアデノ随れまでに，SCN→VLPO 神経は GABA および VIP 神経伴ウイルス（AAV）ベクターを導入し，GRP 神経でので構成されており，SCN の中でも特異的な細胞集団をみ神経連絡を阻害した．そのマウスの行動リズムおよび形成することを見出した．さらに，人工 GPCR を用い

PER2::LUC を用いた細胞リズムの測定を行い，GRP 神て一過性に神経を活性化させた際にはマウスの行動量の経の阻害による概日リズムへの影響を解析した．さらに，減少と睡眠量の増加が観察された．また，神経毒素を用GRP 神経がどのような脳領域に軸索を伸長しているか

いて SCN→VLPO 神経の神経連絡を阻害したところ行を調べるため，Cre 依存的に蛍光タンパク質とシナプス

動リズムの減弱が観察された．SCN の時計機能の可視局在タンパク質であるシナプトファイジンの融合タンパ化実験により，SCN の時計機能が消失したのではなく，ク質を発現させて，GRP 神経の投射地図を作成した．

SCN から VLPO に至る出力経路の異常が行動リズム消失に寄与していると考えられた．さらに我々は SCN 神

94

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成経の中でも機能のわかっていない GRP 神経を特異的にによる組織透明化を用いた観察法の確立に取り組んだ．

操作することで，その生理リズム形成における役割を【結果】明らかにした（Li and Hirano et al., 投稿準備中）．興ERK-FRET バイオセンサー発現マウス胎仔の成長板

味深いことに，我々は Grp 遺伝子を欠損させたマウス

軟骨を器官培養条件下で生組織イメージングした結果，では行動リズムの減弱は起こらず，光による位相シフト

生理的条件下では肥大化軟骨細胞層近傍の軟骨膜下でのみが影響を受けることを見出している．つまり，Grp

ERK が活性化されていることが明らかとなった．また，の遺伝子が重要なのではなく，GRP 神経に発現してい本実験系を用いて CNP の添加実験を行った結果，肥大る神経伝達物質などによる制御が重要である可能性が高化軟骨細胞層近傍の軟骨膜下の ERK 活性が CNP によい．最近，SCN の VIP 神経は GRP 陽性神経と陰性神経り抑制されることが明らかとなった．

の 2 種類の集団に分別されることがシングルセル RNA-

さらに CNP による肥大化軟骨層における ERK 活性

seq の解析により明らかとなった．このことから，我々の抑制と成長板軟骨伸長との関連を明らかにするため，は現在 GRP 神経に発現する GRP と VIP が時計発振にマウス胎仔成長板軟骨を透明化し観察する方法の確立に必須である可能性を検証している．

取り組んだ．その結果，マウス胎仔橈骨の近位成長板軟骨の形態を組織全体で個々の細胞レベルで描出すること

FRET イメージングによる CNP の骨伸長作用とERK 活性制御機構の時空間的解析
廣

田

圭

昭
（京都大学大学院医学研究科）に成功した．
【考察】
ERK-FRET バイオセンサー発現マウス胎仔の成長板
軟骨の生組織イメージングの系を用いて CNP による局
所的な ERK 活性の抑制を明らかにした．今後は，組織透明化を用いて CNP による成長板軟骨における ERK【目的】
長 管 骨 の 伸 長 は 内 軟 骨 性 骨 化 に よ り 達 成 さ れ る．

活性の抑制と組織伸長との関連の解析を継続する予定である．

CNP は強力な骨伸長促進因子であり，その受容体である Guanylyl cyclase-B (GC-B) の活性化を介した cGMP
産生により生理作用を発揮する．しかし，生体内でのERK 活性の検出は難しく，このモデルは十分に検証されているとは言いがたい．そこで本研究では，どのよう直鎖状ユビキチン鎖が惹起する疾患の検索と制御戦略
藤

田

宏

明
（京都大学医学部医学研究科）にして CNP/GC-B 系が ERK 活性制御を介して成長板軟
骨細胞分化と組織全体の伸長を制御しているのかという

新規のタンパク質翻訳後修飾である直鎖状ユビキ点を明らかにし，さらに，これらの知見をもとに成長板

チン鎖 ( 直鎖 ) を特異的に生成する唯一の酵素である

軟骨組織局所での ERK 活性制御に基づく新たな発想のLUBAC ユビキチンリガーゼ（E3）は，催炎症性転写

低身長症の治療法のコンセプト確立を目的とする．

因子である NF-κB 活性化，細胞死の抑制に関与する．

【方法】

LUBAC は直鎖生成の活性中心を有する HOIP，アクセ

生体内の ERK 活性を FRET の原理に基づき定量化できる ERK-FRET バイオセンサー発現マウスの胎仔成長

サリー分子である HOIL-1L, SHARPIN の三者複合体から構成される（図１）．

板軟骨を器官培養条件下で二光子顕微鏡を用いて生組織

これまでに我々は LUBAC の３サブユニット全てを欠イメージングし，生理的条件および CNP 添加条件での損させた細胞を樹立し，細胞死の制御に必須な LUBAC

成長板軟骨での軟骨細胞の分化状態と ERK 活性の関連のドメインを探索した．その結果，LUBAC の３量体を解析した．また，CNP による成長板軟骨伸長作用を形成に必要な HOIP の２つの UBA ドメインと HOIL-

組織全体で個々の細胞レベルで解析するため，CUBIC

1L と SHARPIN に存在する UBL ドメインを欠損させる

95

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成と，LUBAC が不安定化し，直鎖状ユビキチン鎖生成活

LTM 結合を阻害する低分子化合物の開発を行なってい性が顕著に減弱することで細胞死が起こることを発見しる．これまでに LUBAC3 サブユニットの結合領域を大た１）．とりわけ，HOIL-1L の UBL と HOIP との結合が腸菌から精製し，精製タンパク質を用いて３サブユニッより重要であるとの知見を得て，HOIL-1L の UBL 欠損

トの結合を評価する FRET 系を構築した．その FRET

マウスを作成したところ，LUBAC 複合体が消失し活性系を用いて LTM 結合を阻害する小分子化合物のスク

中心の HOIP を欠失したマウスと同時期に胎生致死にリーニングを行った．またカウンターアッセイとしてなることを見出した１）．

HOIL-1L/HOIP 間の結合を得られた化合物が阻害しな

LUBAC の安定化に着目してさらに解析したところ，

いか解析を行った．得られた化合物でＢリンパ腫細胞を生化学的実験より HOIL-1L と SHARPIN の UBL のＮ処理すると，LUBAC 発現量の減少に加え，細胞増殖を末側に存在するα-ヘリックスに富んだ領域（LTM モチー抑制できることを見出し，化合物の検討を行なっている．

フと命名）が安定な複合体形成に不可欠であることにまた別の視点から LTM 阻害剤の開発もすすめている．

気付いた．そこで LUBAC の３サブユニットの結合に必HOIL-1L LTM/SHARPIN LTM の結合部位は数十アミ

要な領域の共発現系を構築し，共結晶構造解析に成功

ノ酸からなる非常に小さな領域であるが，それぞれのした（図２）．その結果，HOIL-1L と SHARPIN の２つ領域を大腸菌に共発現させ精製したところ，HOIL-1Lの LTM モチーフが１つドメインを形成することで安定

LTM/SHARPIN LTM 二者複合体を大腸菌からほぼ夾雑

な結合体形成に寄与することを発見した．また LTM モ

物なく精製することに成功している．この二者タンパク

チーフの変異によって LUBAC が著減し，細胞死が誘発

質に特異的に結合する化合物の探索をこれまでに行っされることを見出した．これまでに LUBAC 阻害によりた．得られた化合物に関して，LTM 結合を阻害するか，

Ｂ細胞リンパ腫の増殖を抑制できることが報告されていまた LUBAC の発現量を減少させるか，などを指標に解たが，LTM の相互作用を抑制するステープルペプチド

析を進める予定である．

は LUBAC を減少させることでＢリンパ腫細胞の増殖を抑制することも示した．
現 在， 臨 床 応 用 を 視 野 に HOIL-1L LTM/SHARPIN

上記解析に加え，LUBAC の機能賦活化に向けた解析を行なっている２）．LUBAC は直鎖を生成する活性中心である HOIP に加え，HOIL-1L にもユビキチンリガー
ゼ活性が存在する．これまでに HOIL-1L の同活性を消失させると LUBAC の直鎖状ユビキチン鎖生成能が亢進して，LUBAC の２つの機能，NF-κB 活性化能と細胞死抑制能が顕著に亢進することを見いだしている２）．その詳細なメカニズムを解析から，HOIL-1L は自分自身を

図１

LUBAC リガーゼの模式図

モノユビキチン化し，さらに HOIP がそのモノユビキ
チンを認識し，直鎖を付加することで LUBAC 自身が直鎖化されること，さらに LUBAC の直鎖化が LUBAC の機能を抑制することを見出している．また HOIL-1L のE3 活性を欠失させたマウスを作出し，12 ヵ月齢までは顕著な症状は示さないが，全ての臓器において直鎖の生成が顕著に亢進することを見出している．
上記より HOIL-1L のユビキチンリガーゼ阻害剤は
LUBAC 機能賦活剤となると考えられる．既に HOIL-1Lのユビキチンリガーゼドメインのタンパク質を大腸菌よ

図2

LUBAC 三量体形成部位の構造り大量精製しており，そのタンパク質を用いて HOIL1L ユビキチンリガーゼ阻害剤の探索を進めていく予定96成人病の病因・病態の解明に関する研究助成である．またマウスの詳細な解析を行い，疾患との検索術を行った．同時に脳波・筋電電極も挿入した．さらを検討中である．

に視床の神経群がノンレム睡眠時特異的脳波の生成に果【文献】

たす役割を解析するために，ジフテリアトキシンを視

１）Fujita, H., Tokunaga, A., Shimizu, S., Whiting,

床の各神経核に AAV を用いて導入して細胞死を誘導しAL., Aguilar-Alonso, F., Takagi, K., Walinda,

た．これらのマウスにおいても脳波・筋電電極を挿入し，E., Sasaki, Y., Shimokawa, T., Mizushima, T.,

AAV 局所注入から四週間にわたって睡眠覚醒パターン

Ohki, I., Ariyoshi, M., Tochio, H., Bernal, F.,を解析した．

Shirakawa, M. ＆ Iwai, K.: Cooperative domain【結果】

formation by homologous motifs in HOIL-1L

まず脳波，筋電シグナルをもとに 24 時間の睡眠覚醒

and SHARPIN plays crucial roles in LUBAC sta-

段階判定を行った．同時に大脳皮質運動野，および視床bilization. Cell reports, 23, 1192-1204 (2018)の微小電極から取得した局所電位の解析を行い，活動電２）Fuseya, Y., Fujita, H., Kim, M., Ohtake, F.,

位の抽出および Spike Sorting を行った．次に，ノンレ

Nishide, A., Sasaki, K., Saeki, Y., Tanaka, K.,ム睡眠時特異的脳波・徐波に対して視床神経の活動電位

Takahashi, R. & Iwai, K.: The HOIL-1L ligaseのタイミングを解析した結果，大脳皮質で徐波が起きる

modulates immune signaling and cell death viaと視床神経の発火が低下する事を見出した．

monoubiquitination of LUBAC. Nature Cell Biol-ogy (2020), 6, 663-673

AAV によりジフテリア毒素を遺書的に導入してから
1, 2, 3, 4 週間後に 24 時間の睡眠覚醒記録，睡眠覚醒段階判定を行った．さらに，ノンレム睡眠中の脳波のパノンレム睡眠特異的脳波パターンを作り出す神経回路の解析

ターンを解析したところ，高周波数成分は変化しないのに対し，0.5-4Hz の低周波数成分は二週間目から顕著に低下していた．

本城

咲季子（筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構）【考察】
我々の結果から，視床マトリックス細胞の発火は大脳皮質のノンレム睡眠特異的脳波，徐波と同調している事

睡眠・覚醒を通じた大脳皮質神経活動における視床マが明らかとなった．また，マトリックス細胞から構成さトリックス細胞の役割を明らかにするれる視床 VM 核，および視床 CM 各の神経を除去する【背景】

事により，睡眠の深さの指標である徐波が減弱する事が視床は末梢の感覚情報を大脳皮質に伝達する必須の役

明らかとなった．

割を担っている．睡眠時，我々は外部感覚情報を認識しないため，視床の活動が低下する事が睡眠に重要ではな
いかと考えられてきた．これまでに我々は，視床の感覚情報の伝達を担う神経群（コア細胞）は睡眠覚醒制御に

血糖変動と認知機能の関連の解明のための前向き観察研究−血糖変動と頭蓋内血管狭窄の関連について関与しない事，大脳皮質のほぼ全域に広く，非特異的にのサブ解析−

投射している神経群（マトリックス細胞）が高頻度で発松

火すると覚醒を促進する事を報告した．しかし，これら

原

正

樹

（国立循環器病研究センター病院）の神経群が睡眠時に果たす役割は明らかではなかった．
【方法】

現在，血糖変動と認知機能の関連の解明を目的とした

自由行動下のマウスの睡眠覚醒サイクルを通じて，大２年間の観察研究（PROPOSAL 研究）を行っており，

脳皮質の神経活動を測定するために NeruoNexus 社製

研究終了は 2022 年６月を予定している．今回，登録時

シリコン微小電極をマウス脳内に慢性的に留置する手の血糖変動と頭蓋内血管狭窄の関連について解析を行っ

97

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成たので報告する．

た．

【背景】

【考察】

２型糖尿病患者において，心筋梗塞，脳卒中などの動MCI を認める高齢２型糖尿病患者において，頭蓋内脈硬化性疾患（ASCVD）が増加する．２型糖尿病患者

内頚動脈狭窄は血糖変動指標である SD, %CV, MAGE

において，ACCORD, ADVANCE, VADT といった大規との関連を認めた．頭蓋内血管狭窄病変を同定するにあ模臨床研究では，HbA1c を管理目標とした厳格な血糖たり，血糖変動指標に注目することが有用である可能性

コントロールを行っても心筋梗塞，脳卒中などは減少が示唆された．

せず，ASCVD と重症低血糖や血糖変動との関連が注目されるようになってきた．血栓性脳梗塞のリスクである
頭蓋内動脈狭窄についても，空腹時血糖値や HbA1c との関連は報告により異なり一定した見解が得られていな
い．最近になり，持続血糖モニタリング（CGM）を用Long non-coding RNA から翻訳される新規ポリペプチドの解析による疾患の病因解明
松本有樹修（九州大学生体防御医学研究所）

いて評価した血糖変動と，冠動脈疾患，内頚動脈の内膜
中膜複合体厚（IMT），
上腕 ‒ 足首脈波伝播速度（baPWV）などとの関連が報告されているが，我々の知る限り頭蓋内動脈狭窄との関連は報告されていない．
【目的】
本解析では，血糖変動と頭蓋内動脈狭窄との関連を明【目的】
Long noncoding RNA (lncRNA) はタンパク質を翻訳しない RNA と定義されているが，われわれは一部のlncRNA が翻訳されてポリペプチドを産生していること

らかにする．

を明らかにした [Matsumoto A. et al., Nature (2017)]．

【方法】

そこで，これら新規ポリペプチドがどのような機能を持2019 年２月〜2020 年６月に PROPOSAL 研究に登録した，当院糖尿病・脂質代謝内科外来に通院中の高つかを明らかにしていく．
【方法と結果】

齢２型糖尿病患者で軽度認知機能障害（MCI）を認める

今回われわれは，ケラチノサイト特異的に発現する

患 者 109 例 に お い て， 血 糖 値，HbA1c，FreeStyle リ

lncRNA から翻訳される新規タンパク質を同定した．こブレから得られた SD, %CV, mean amplitude of gly-のタンパク質は TINCR という lncRNA にコードされて

cemic excursions (MAGE) と，頭部 MRA で Warfarin-

い た が，TINCR は 2013 年 の Nature 誌 に lncRNA と

Aspirin Symptomatic Intracranial Disease 法（WASID）

して報告された RNA である．興味深いことに，この新法で評価した血管狭窄との関連をロジスティック回帰分

規タンパク質はユビキチン様ドメインを持っており，タ析にて解析を行った．

イプ２ユビキチン様タンパク質であることがわかった．

【結果】

そこでわれわれは，この新規ユビキチン様タンパク質を登録患者全 109 例中 103 例が対象となった．WASID
法で 70％以上の高度狭窄がみられた８例は全て内頚動

TUBL (Tincr-encoded UBiquitin Like protein) と名付けた．

脈サイフォン部の狭窄であり，高度狭窄のない 95 例と比TUBL の ORF のＣ末端に FLAG 配列をノックインし較し，SD 53 12 mg/dl vs. 39 10 mg/dl, ％ CV 36 7 %たマウスを作製して，マウスのケラチノサイトで内在性vs. 29 6 %, MAGE 114 18 mg/dl vs. 90 23 mg/dl との TUBL の発現を検出した．

いずれも有意に高値であった（p＜0.01）．またロジスティッ

TUBL を過剰発現したケラチノサイトで RNA-seq 解

ク回帰分析では，性別で調整した高度狭窄群のオッズ析を行ったところ，細胞周期関連遺伝子の発現が上昇し比（OR） は SD (OR, 3.00; 95% conﬁdence intervalていた．BrdU assay により，TUBL 過剰発現ケラチノ(CI), 1.32-6.84), ％CV (OR, 5.55; 95% CI, 1.23-25.2),

サイトで増殖が亢進していることを見出した．

MAGE (OR, 1.52; 95% CI, 1.06-2.19) と 有 意 で あ っ

98

次に，TUBL ノックアウトマウスを作製したところ，

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成

このマウスから採取した初代培養ケラチノサイトの増殖えられる．本研究ではその機序を解析することを通してが低下していた．さらに TUBL ノックアウトマウスを生体内のプリン・尿酸代謝制御における腸内細菌叢の役用いて，パンチによる皮膚の傷害実験を行ったところ，割を明らかにすることを目的とした．

ケラチノサイトの増殖低下に伴う，皮膚の再生遅延が観【方法】
通常マウスと無菌マウス，およびそれぞれのアデニン察された．

誘発腎不全モデルを作成し，血漿，尿，糞便中のプリン【考察】
以 上 の 結 果 よ り，lncRNA と し て 同 定 さ れ て い た

核酸代謝物を含むメタボローム解析，およびプリン体代

TINCR が，TUBL という新規ユビキチン様タンパク質

謝関連酵素の遺伝子発現量を評価した．

を翻訳することを明らかにし，TUBL はケラチノサイト【結果・考察】の増殖と皮膚の再生促進に重要であることが明らかと無菌マウスではプリン体代謝酵素であり，アデニンなった．今後，TUBL がどのようにして増殖を制御してから腎毒性物質 2,8-DHA への変換も担うキサンチン還いるのかという分子機構を明らかにしていく必要があ

元酵素（XDH）の発現が上昇していることを見出した．

る．

また無菌マウスは通常マウスと比較してプリン体最終代謝物である尿中アラントインの増加に加え糞便中のプリ

腸内環境をターゲットした慢性腎臓病の病態解明と新規治療法の開発
三

島

英

ン代謝物に大きな変化が生じていた．無菌環境による腸内細菌の消失はプリン代謝酵素の発現増加を介してアデニンから腎毒性物質 2,8,DHA への変換を促進し，その換（ヘルムホルツ研究センター）

結果アデニン腎障害の病態を悪化することを明らかにした．本知見はプリン体代謝制御における腸内細菌の新たな関与機序を明らかにしたものである．

【目的】
尿酸を含むプリン体の代謝異常は痛風のみならず動脈【文献】
Mishima, E. et al.: Toxins. 2020; 12: 547

硬化性の心血管疾患や慢性腎臓病における残余リスクとして重要である．したがって生体内の尿酸を含むプリン
核酸の制御メカニズムの解明は臨床的に重要な課題である．尿酸を含む生体内のプリン代謝は食事摂取，腎排泄，白血病を維持する腫瘍エンハンサーの検索
村

川

泰

裕
（京都大学高等研究院）

腸管排泄が主な規定因子とされてきた．しかし近年，腸内細菌叢も生体内プリン・尿酸代謝に関わることが示唆されている．申請者はこれまで腎臓病における腸内細菌【目的】

叢の関与を腸管と腎臓の臓器連関「腸腎連関」の観点か

成人病の柱の一つに悪性疾患が含まれる．とりわけ白ら研究を進めてきたが，その過程で通常マウスと腸内細血病は，発症年齢が若く，社会的にも重大な疾病である．

菌叢を有さない無菌マウスをそれぞれアデニン誘発性の本課題では，オリジナルなゲノム解析法から，病態解明，腎不全状態にすると無菌マウスでは腎障害がより高度に新たな分子標的薬やバイオマーカー検索を目指す．

なることを見出しているがその機序は不明であった．ア

そのため，がんの細胞で特異的に発現している RNA

デニン誘発腎不全モデルはプリン塩基であるアデニンを

分子をゲノムワイドにとらえ，正常細胞との比較解析を

経口過剰負荷することでキサンチン脱水素酵素（XDH）

行う．興味深いことに，ヒトゲノム 90％以上の領域かを介して代謝された不溶性代謝物 2,8-DHA が腎臓に蓄ら RNA 分子が転写されており，この中には，⑴蛋白質積し腎障害を引き起こすモデルである．したがって，腸をコードする mRNA の他にも，⑵蛋白質をコードしな

内細菌叢の有無がプリン体であるアデニン代謝自体に影いノンコーディング RNA (lncRNA)，そして⑶エンハ

響を及ぼすことで腎障害悪化に寄与している可能性が考

ンサー領域から合成されるエンハンサー RNA (eRNA)99

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成などが挙げられる．しかし，特に eRNA の大多数がゲ
ノム配列上にアノテーションさえされておらず，未知分
子・未踏分子となっている．本研究では，独自のゲノム

がん免疫の成立機構に関する研究
諸

石

寿

朗

（熊本大学大学院生命科学研究部）

解析法を確立することで，こうした一連の RNA 分子を世界で初めて包括的に同定し，医学応用を試みる．
【方法】

【目的】

① CAGE 法は，RNA の 5' 末端を次世代シークエン

腫瘍微小環境においてはがん細胞と免疫細胞が相互作

サーにより網羅的に解析する技術である．我々は，短寿

用し，拮抗しながら腫瘍の運命を決定していく．細胞は命で低発現の lncRNA や eRNA も超高感度に同定でき

常に自らの置かれた状況を感知し，細胞内外の環境変化

る NET-CAGE 法（Hirabayashi et al. Nature Genetics,に即応して増殖・分化・死などの細胞運命を適切に選択2019）を開発した．

する．このメカニズムには，「細胞内シグナル伝達系」②また，プロトコールを大幅に改良することで，従来による環境変化に応じた細胞内プログラムの改変と，「代では１週間かかる工程を２日に短縮し，さらにインデッ

謝調節」による動力供給が協調して働くことが必要であクスライブラリー法を導入し，１週間程度で約 1,000

り，その制御の中心を酵素が担う．われわれはこれまで

検体のサンプルを処理できる基盤を 2021 年から構築しの研究で，Hippo 細胞内シグナルや鉄代謝が広範な生ている（論文執筆中）．

命機能に必須の役割を担うことを明らかにしてきた．そ③さらに，ドライ解析においても工夫することで，飛こで，本研究においては，腫瘍微小環境においてがんに躍的な正確度・感度で真の転写開始点のみを同定する新対する免疫応答が成立する仕組みを Hippo シグナルやしい方法を確立した．本手法は１細胞トランスクリプ

鉄代謝の制御機構から理解することを目指している．特トーム解析にも応用することができ，一細胞レベルでに，本年度は腫瘍微小環境における鉄代謝の役割を中心

mRNA, lncRNA, eRNA を網羅的に同定することに成に研究を進めた．昨年度までの研究では，肝細胞（肝臓功している（論文執筆中）．

がん細胞）における鉄の蓄積が，肝臓がんの進行を促進

こうしたオリジナルのゲノム解析基盤をもとに，京都大することを明らかにした [ J. Exp. Med. 216, 950-965

学血液・腫瘍内科との共同研究により，約 100 人の造(2019)]．そこで，次に腫瘍微小環境に存在する免疫細血器悪性腫瘍の患者検体からゲノム解析を実施してい胞における鉄代謝が，腫瘍運命の決定に及ぼす影響を検

る．

討した．

【結果】

【方法】

白血病に特異的に活性化している mRNA, lncRNA,

ヒト大腸がん組織を用い，腫瘍微小環境における鉄のeRNA などが新しく数万の単位で同定された．これらは，蓄積と免疫細胞の関係を調べた．マクロファージに分化病態解明の手掛かりにもなり，新規の診断マーカーや治誘導した THP1 細胞を用い，鉄量の変化が遺伝子発現

療標的候補になりえる．今後，臨床データとも紐付けしに及ぼす影響を RNA シーケンス解析により調べた．また統合解析や，新規分子の機能解析を行い，白血病の病

た，鉄代謝の変容により遺伝子発現パターンが変化する

因・病態の解明を目指す．

分子メカニズムを探索した．

【考察】

【結果】

本研究により同定された数万もの新規 RNA 分子が，腫瘍微小環境に鉄の蓄積が見られた症例は予後が悪患者毎にどのような発現分布をするのか，どのような機

く，鉄の蓄積は主にマクロファージに認められることが能を担っているのか，そして実際に臨床現場に実装するわかった．RNA シーケンス解析の結果，マクロファー

ことが可能なのかを今後明らかにする．

ジに分化誘導した THP1 細胞において鉄量を増減すると遺伝子発現パターンが変化し，鉄が多い環境下では炎症性サイトカインの産生が増加することがわかった．こ100

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成の炎症性サイトカインの増加は NFkB シグナルに依存していた．鉄量が少ない状態では，NFkB の核内移行に変化は認めなかったものの，その抑制性リン酸化が増強しており，これにより炎症性サイトカインの遺伝子発現

生体の恒常性システム解明に向けた研究プロテオス
タシスからオルガネラホメオスタシスへ
柳

谷

耕

太
（九州大学生体防御医学研究所）が抑制されることを見出した．
【考察】
腫瘍微小環境に存在するマクロファージに鉄が蓄積す

熱力学第二法則によると，秩序のある状態は，やがて，ると，NFkB シグナルの増強により炎症性サイトカイン

無秩序になることが自然であると考えられている．生命の産生が亢進し，慢性炎症環境をつくりだすことが示唆

体は，究極に秩序を持った存在であり，外部からエネルされた．本現象の分子メカニズムは今後詳細を明らかに

ギーを注入することで，その秩序ある状態を保っている．

していく必要があるが，マクロファージにおける鉄代謝

恒常性は，ある秩序が保たれた状態を指す概念で，生体が腫瘍運命に影響を及ぼす可能性が示された．そこで，内においては，分子から個体まで，様々な階層で，恒常今後の課題として，Ｔ細胞など他の免疫細胞における鉄性を保つシステムが張り巡らされている．私は，TMFC の

代謝と腫瘍増殖の関係をさらに調べていきたい．

期間には，タンパク質の恒常性（プロテオスタシス）とオ【発表論文】（2020 年度）

ルガネラ量の恒常性に興味を持ち，その解明を目指した．

１）Moroishi, T.: ANXious for YAP. Nat . Chem .

【プロテオスタシスについての研究】

Biol. in press, doi: 10.1038/s41589-021-00766-x(2021).

タンパク質は，単量体で働くものと，複合体で働くものがある．私は，サイトゾルで異常なタンパク質を見つ

２）Yamauchi, T., & Moroishi, T.: The Yin and Yang

けて，分解する因子を探索する過程で，複合体からあぶof tumor-derived extracellular vesicles in tumor

れた，みなしごサブユニットを見つけて処理する因子

immunity. J. Biochem. 169, 155-161 (2021).

UBE2O を見出した（Science, 2017）．この遺伝子に変３）Horiguchi, H., Kadomatsu, T., Miyata, K.,

異を有するマウスは極度の貧血になることから，生体内Terada, K., Sata, M., Torigoe, D., Morinaga, J.,

においても，みなしごサブユニットの処理が重要である

Moroishi, T., & Oike, Y.: Stroma-derived ANG-

ことが示唆された．

PTL2 establishes an anti-tumor microenviron-

小胞体に構造異常タンパク質が蓄積すると，小胞体膜

ment during intestinal tumorigenesis. Oncogene

上で転写因子 XBP1 の前駆体 (XBP1u) mRNA がスプラ

40, 55-67 (2021).

イシングされて，転写因子 XBP1 が合成されるように

４）Luo, M., Meng, Z., Moroishi, T., Lin, K. C.,なり，異常タンパク質を処理する因子群が誘導される．

Shen, G., Mo, F., Shao, B., Wei, X., Zhang, P.,

私は，前駆体である XBP1u mRNA から合成されるタWei, Y., & Guan, K.L.: Heat stress activates

ンパク質が，自身をコードする mRNA を小胞体膜上YAP/TAZ to induce the heat shock transcrip-に局在化させることを明らかにした（Mol Cell, 2009;

tome. Nat. Cell Biol. 22, 1447-1459 (2020).

Science, 2012; PNAS, 2016）．

５）Shimoda, M., & Moroishi, T.: The Emerging Link
between the Hippo Pathway and Non-coding
RNA. Biol. Pharm. Bull. 43, 1-10 (2020).

【オルガネラ量ホメオスタシスに関する研究】
生体内で，同じ種類の細胞間では，オルガネラの量はよく似ていることから，オルガネラ量の恒常性が存在することが示唆される．私は，オルガネラ量を人為的に減らす方法を樹立し，オルガネラ量に摂動を与えることで，オルガネラ量恒常性を司るシステムの解明を目指した．
ミトコンドリアに関しては，そのシステムの一端が明らかになりつつある（投稿準備中）．

101

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【考察】
甲状腺ホルモン脱ヨード酵素を標的とした脂質・エ
ネルギー代謝促進薬の開発
山

内

一

郎
（京都大学大学院医学研究科）

化合物を出発点とするケミカルバイオロジーに臨床データを統合させる新たな手法を考案し実施した．チロ
シンキナーゼ阻害薬による D3 増加は既知ではあるが，臨床的エビデンスを追加する成果を得た．またリトドリ
ンが，甲状腺ホルモン脱ヨード酵素調節因子としてだけ【目的】
甲状腺ホルモン脱ヨード酵素には，１型（D1），２型

でなく，その有意な生体作用を有することを明らかとした．

（D2），３型（D3）の３種類があり，それぞれ臓器毎に分布が異なっている．我々はこれらの発現制御により臓器特異的な甲状腺ホルモン作用調節を可能とし，治療へ応用することを目指している．

腸管 NAMPT NAD＋合成系を標的とした NAD＋中間代謝産物 NMN によるインスリン抵抗性発症予2018 年度は，プロモーターアッセイを基盤としたハ防法の開発研究

イスループットな系を開発し，臨床応用されている薬剤

山口慎太郎（慶應義塾大学医学部）のライブラリー（2480 種類）を用いたスクリーニング（HTS）を実施した．2019 年度は，ヒット化合物が生体作用を示すかを検証するにあたり，患者コホートを構【目的】

築し，各ヒット化合物の内服前後での変化をレトロスペ

哺乳類 NAD＋合成系の鍵酵素である NAMPT は環境・クティブに解析した．2020 年度は，コホート研究でも栄養状態に応答することで NAD＋ 量を調節し，代謝，有意な変化が確認された化合物について，臓器における老化などの生物学的な多彩な局面で重要な役割を果たす

甲状腺ホルモン脱ヨード酵素の変化を確認するため，マことが明らかにされてきた．申請者は脂肪細胞特異的

ウスへの投与実験を行った．

Nampt 欠損マウスを作製し，脂肪細胞 NAMPT-NAD＋【方法】

合成系が，インスリン抵抗性・エネルギー代謝を制御す

６週齢雄の C57BL/6 マウスに化合物を給水投与し，甲状腺機能（血清），遺伝子発現（甲状腺，肝臓，下垂体）を評価した．
【結果】
HTS において，正と負に制御するものについてそれ
ぞれ，D1 は６個，７個，D2 は 34 個，０個，D3 は５個，２個のヒット化合物が得られた．次いでこの結果を元に患者コホートにおける甲状腺機能の変化を検証し，アド
レナリン受容体作動薬であるリトドリンによる TSH 低
下と fT3/fT4 比上昇， PDE5 阻害薬であるタダラフィ
ルによる fT3 上昇，チロシンキナーゼ阻害薬による fT3
低下・fT4 低下・TSH 上昇が認められた．
マウスへの投与実験へ進み，リトドリンにより血清
fT3/fT4 上昇，甲状腺 Dio2 mRNA 増加，チロシンキナーゼ阻害薬であるスニチニブにより血清 fT4 減少，肝臓
Dio3 mRNA 増加が生じることを確認した．

102

図１
（生化学

哺乳類 NAD 合成系および代謝疾患制御第 87 巻２号 239-244, 2015 山口ら , 改）

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成る事を報告した (PNAS. 2019, Cell Rep. 2016)．
さらに，代謝疾患において NAMPT の酵素反応産物

多能性幹細胞を用いた体節時計の再現である NMN (nicotinamide mononucleotide) などの

戎

家

美

紀

（EMBL Barcelona Ebisuya Group）

NAD 中間代謝産物が主要代謝臓器の NAD 量を回復＋＋

し，病態を改善することも報告されている（図１）．重要なことに，最近 NMN のトランスポーターが小腸に存【目的】

在することが報告され（Nature Metab. 2019），主要代それぞれの生物種は固有の生物時間を持っており，一謝臓器の NAD＋ 合成系を制御する主座として腸管が注

般的に体の大きな動物ほどゆっくりした時間を示す．例

目されている．

えば，ヒトの妊娠期間は９か月だが，マウスは 20 日，

また，高脂肪食により生じる腸管の炎症が，脂肪組

ゾウだと２年である．生物時間の種間差は面白い問題だ

織の炎症に伴うインスリン抵抗性発症に先行することが，良いモデル系が存在しないためか，研究がすすんでが報告され（Cell Metab. 2016），代謝疾患発症においない．そこで私たちは，体節時計と呼ばれる，発生過ける腸管の重要性も認識されている．以上の知見を元

程の遺伝子発現振動現象に注目した．ヒトやマウスの多に，２型糖尿病の発症予防法を確立するために，腸管の能性幹細胞を用いて体節時計を再現し，生物時間の種間

NAMPT-NAD＋合成系に着目した．

差の原因を探った．

【方法・結果】【方法】①高脂肪食と腸管 NAMPT-NAD＋合成系

ヒ ト iPS 細 胞 あ る い は マ ウ ス ES 細 胞 を，Wnt・

高脂肪食を負荷した C57BL/6 マウスでは，通常食群

FGF・BMP 阻害剤・TGFb 阻害剤などで処理することと比較して腸管 NAMPT-NAD 合成系が有意に低下し，により，体節時計を示す時期の細胞（未分節中胚葉と呼一方で随時血糖は上昇した．これらの結果は，肥満によばれる）を分化誘導した．体節時計のマーカーである

る糖代謝障害には NAMPT-NAD＋ 合成系の低下に伴う

HES7 遺伝子の発現状態が振動する様子をライブイメー

腸管の変化が寄与している可能性を示唆する．

ジングで測定した．次に，体節時計の振動周期に影響す②腸管 NAMPT-NAD＋合成系と糖代謝る生化学反応の速さをヒトとマウス細胞で測定した．

＋

腸管上皮細胞特異的 Nampt ノックアウト（KO）マウ【結果】

スを新規に作製した．腹腔内ブドウ糖投与試験での血糖マウスとヒト未分節中胚葉での測定の結果，マウスの値の変化にはコントロール群と有意な差は認めなかった

体節時計の振動周期は 2−3 時間であるが，ヒト体節時が，経口投与では，KO マウスで血糖値は有意に上昇し計の振動周期は 5−6 時間であった．そしてこれは，ヒた．その背景病態として，KO マウスではインクレチン

ト細胞においてはマウス細胞よりも，HES7 タンパク質

およびインスリン分泌障害を認めた．

の分解速度が遅く，転写翻訳による時間遅れが長いため③ NMN を用いた肥満マウスへの介入だとわかった．この結果は，数理モデルを用いたシミュ

高脂肪食負荷肥満マウスに NMN を投与したところ，

レーションでも確認できた．つまり，ヒト細胞では種々

インクレチン分泌が回復し，食後高血糖が改善した．

の生化学反応が遅く，これが生物種特有の時間の原因か【考察】もしれないと示唆された．

腸管の NAMPT-NAD＋ 合成系の障害が，肥満におけ【考察】るインクレチン分泌不全および食後高血糖の原因である

一般的になぜヒトの時間はマウスより遅いのかということが示された．本研究内容は，
現在論文投稿中である．

問いにつながる面白い手掛かりを得ることができた．今後は，なぜヒトの細胞では種々の生化学反応が遅いのかという疑問を追求する．さらに研究を発展させるため，
ヒトとマウス以外の生物種の多能性幹細胞も試す予定で
ある．

103

成人病の病因・病態の解明に関する研究助成【文献】（下線はラボメンバー，* は責任著者）
１）Matsuda, M., Hayashi, H., Garcia-Ojalvo, J.,
Yoshioka-Kobayashi, K., Kageyama, R., Yamanaka, Y., Ikeya, M., Toguchida, J., Alev, C.
& *Ebisuya, M.: Species-specific segmentation
clock periods are due to diﬀerential biochemical reaction speeds. Science, 369, 1450-1455(2020).
２）Martínez-Ara, G., Taberner, N., Takayama,
M., Sandaltzopoulou, E., Villava, C., Takata,N., Eiraku, M. & *Ebisuya, M.: Optogenetic
control of apical constriction induces synthetic
morphogenesis in mammalian tissues. bioRxiv,
doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.20.440475(2021).

104

研究報告

Vascular
Vascular Biology
Biology Innovationに関する研究助成
Innovationに関する研究助成

of Mineralocorticoid Receptor in Pressure

ミネラロコルチコイド受容体の活性化機構とその意義
鮎澤信Overload-Induced Cardiac Injury. Hypertension.
67, 99-106 (2016).

宏（東京大学先端科学技術研究センター）

２）Ayuzawa, N. et al .: Two Mineralocorticoid
Receptor-Mediated Mechanisms of Pendrin Ac-

アルドステロン受容体であるミネラロコルチコイド受

tivation in Distal Nephrons. J Am Soc Nephrol.
31, 748-764 (2020).

容体（MR）は高血圧性疾患の発症に関与する．我々はMR の活性化機構とその意義につき研究を行っており，
助成期間に得た成果を報告する．

免疫学的介入に基づく循環器病に対する新規治療法

１）病的状態における MR 活性化は必ずしもリガンド量のみに依らない．我々は低分子 G 蛋白 Rac1 がリガの開発

ンド非依存性に MR を活性化し，臓器障害を引き起こ安西淳（慶應義塾大学医学部）

すことを示してきた．マウス圧負荷性心不全モデルでは心臓における Rac1 および MR の活性化が起こるが，Rac1 阻害薬や心筋特異的 Rac1 ヘテロ欠損，MR 拮抗【研究目的】
本研究では遺伝子Ｘを中心とした心筋梗塞後の炎症・薬による介入は Rac1-MR 経路を遮断し，酸化ストレスを減じて心不全を抑制した．

修復過程の新たな分子機序を明らかにし，新規治療法へ

２）腎遠位ネフロンにおける NaCl 再吸収は血圧の調節と発展させることを目的とする．

に深く関与するが，最近接合尿細管・皮質集合管のβ-【研究方法・結果】

間在細胞に発現する pendrin が新規 NaCl 再吸収関連因

X-KO マウスに MI を作製し，28 日間観察すると，そ子であることが示された．pendrin はアンジオテンシンの生存率は WT マウスと比較して改善傾向にあり，左II 刺激時や１次性のアルドステロン過剰時に活性化する

心機能は有意差を持って良好であった．梗塞部位に集が，その機序には MR が関わる．定常状態では間在細積 す る 炎 症 細 胞 を ﬂow cytometry 法 で 解 析 す る と，

胞 MR は特異的リン酸化を受けてリガンド結合能が抑X-KO マ ウ ス で は Ly6Chigh 単 球 (CD45＋CD11b＋F4/80

制されているが，アンジオテンシン II 刺激時には間在−細胞 MR は脱リン酸化・活性化して pendrin 活性化を

1β, IL-6 などの炎症性サイトカイン， CCL2/CCL7 など

起こす．間在細胞特異的 MR 欠損マウスでは減塩時ののケモカインの遺伝子発現を検討すると，X-KO マウス

アンジオテンシン II 増加による pendrin 活性化が抑制

で有意に減少していた．梗塞部においてどの細胞由来のされており，低血圧を示した．一方，１次性のアルドスＸが重要かを骨髄移植モデルで確認すると，間質系細胞

テロン過剰時には主細胞の MR-ENaC 経路活性化によの重要性が示唆された．Flow cytometry 法によりＸのり起こる代謝性アルカローシスが直接 pendrin 活性化発現を検討すると，内皮細胞と線維芽細胞でＸの発現をを起こし高血圧発症に寄与することが示された．これら認めた．一方，各細胞群を FACS でソートし，CCL2 と経路は高血圧治療における新規標的となり得る．

CCL7 の遺伝子発現を検討すると，線維芽細胞でのみ有【文献】

意な発現を認めた．以上より，心臓線維芽細胞由来のＸ

１）Ayuzawa, N. et al.: Rac1-Mediated Activationの重要性が示唆されたため，心臓線維芽細胞特異的Ｘコ

Ly6Chigh) の浸潤が有意に低く，qPCR で解析した IL-

105

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

ンディショナル KO マウス（Tcf21Cre/＋ Xflox/flox）に MI

かった．今後詳細な解析が必要だが，仮にこれまでに知を作製し，４週間後の生存率，心機能，梗塞部炎症性られている K-ATP チャネル活性の細胞応答として知らサイトカインや CCL2/CCL7 などのケモカインの発現，れているペリサイト内 Ca2＋変動と心疾患の関連が認め

炎症細胞浸潤などを検討すると，X-KO マウスで見られられない場合は，ペリサイト内 Ca2＋異常がトリガーでた表現型が再現された．

はない可能性が予想される．
一方，発生初期では Kcnj8 は心外膜細胞にも発現す【今後の展望】
XGFP/＋ レポーターマウスで MI ４日後に GFP＋(X＋)

ることを見出し（図２），当初予想していたペリサイトと GFP−(X−) 線維芽細胞を FACS でソートし，RNA-異常が心疾患を惹起するという仮説以外の新たな機序

seq による網羅的解析を行う．本研究が成就された時，の可能性が浮上した．これまでに，心外膜細胞はペリサ

心臓線維芽細胞を標的とした，MI 後心不全を予防する

イトだけではなく線維芽細胞や心筋細胞など，異なる

新たな治療方法の開発に繋がる可能性があると考えられ細胞種へと分化する可能性が示唆されていることから，た．

Kcnj8 遺伝子変異性心疾患がペリサイト以外の細胞腫に起因する可能性が浮上した．今後 Kcnj8 遺伝子変異性

ペリサイトにおける ATP 依存性カリウムチャネルの心・脳における機能解析安藤康

心疾患の分子メカニズムを明らかにするためには成獣マウスにおいてペリサイト選択的な遺伝子欠損により心機能に与える影響を検討することが重要であると考えられ

史（日本医科大学先端医学研究所）【目的】
ペリサイト選択的に発現する ATP 依存性カリウムチャネル（K-ATP チャネル）の心・脳機能に対する生理的・病態時における役割の解明を通して，ペリサイトを基軸とした脳・心疾患発症機構の理解と治療法開発の実現を目指す．
【結果・考察】K-ATP チャネル活性は細胞膜電位変化を促し，膜電位依存性カルシウムチャネルを介したカルシウムイオンの流入促進，抑制へと変換される．しかし，ペリサイトにおいて Abcc9/Kcnj8 から為る K-ATP チャネルが細胞内 Ca2 ＋調節に関わるのかは十分には明らかではな
かった．そこで，カルシウムイオン変化を指標としてペ

図１

ペリサイトにおける K-ATP による細胞内Ca2 ＋調節

Ａ．ペリサイト内 Ca2 ＋変動を解析可能な遺伝子改変ゼ
ブラフィッシュシステムの模式図にする為，ペリサイトでカルシウムバイオセンサーをＢ．受精後 4 日目のゼブラフィッシュ脳血管のペリサ
イトは abcc9/kcnj8 陽性であり，Glibenclamide により細胞内 Ca2 ＋オシレーション頻度が増加する．

発現する改変ゼブラフィッシュを樹立し（図1A），検討

Ｃ．Ｂで認められる Glibenclamide による細胞内 Ca2 ＋

リサイトにおける K-ATP チャネルの基本特性を明らかを行った．その結果，K-ATP チャネル遮断薬はペリサ
イトにおいてＴ型 Ca2＋チャネルを介して Ca2＋オシレー
ション頻度を増加させることが分かった（図3B, C）．
しかし，K-ATP チャネルの活性化剤は予想に反して，
細胞内 Ca2＋ オシレーション頻度を抑制することはな

106

オシレーション頻度上昇は，T 型 Ca2 ＋チャネル阻害剤 ML218 によってキャンセルされる．

Ｄ． 受 精 後 4 日 目 の ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ 大 動 脈 腹 側の 壁 細 胞 は abcc9 陰 性 で あ る こ と と 一 致 し て，Glibenclamide は細胞内 Ca2 ＋オシレーション頻度に影響しなかった．

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

心筋梗塞後心破裂における Hif-1αの役割と心破裂に至る分子機序の解明
池

田

昌

隆
（九州大学大学院医学研究院）【目的】
梗塞後心破裂は一旦発症すると致死的な転帰に至る急性心筋梗塞の機械的合併症である．我々はがん抑制遺伝子である p53 のノックアウトマウスでは梗塞後心破裂が著明に抑制されることを示し，p53 およびアポトーシ
スが梗塞後心破裂において重要な役割を果たしていることを報告した１）．しかしながら，心筋梗塞において p53が増加し，心破裂に至る分子機序は依然として不明である．本研究では，低酸素応答の主制御を担う hypoxia
inducible factor (Hif)-1αが p53 の誘導分子であることに着目し，p53，アポトーシス，さらに心破裂におけるHif-1αの役割を検討した．
【方法】
C57BL/6J マウスおよび心筋特異的 Hif-1αヘテロノッ
図２

胎生期および成獣マウス心臓におけるKcnj8 陽性細胞の同定

Ａ．Kcnj8 陽性細胞を可視化できるレポーターマウス（Kcnj8-CreERT2, Rosa26-mTmG）の模式図
Ｂ．成獣心臓における Kcnj8 陽性細胞（GFP: 緑）は毛細血管（CD31; 青）周囲のペリサイト（PDGFRâ: 橙）に限局し，動脈（アスタリスク）周囲の血管平滑筋細胞やその他の細胞では認められない．
Ｃ．胎生期（E11.5, 13.5）の心臓ではペリサイトに加え，心臓表面の心外膜細胞に Kcnj8 の発現が認められる．
右図 : 左側黄色線での断面図．

クアウトマウス（caHif1aHetKO）に心筋梗塞モデルを作成し，梗塞後心破裂について解析した．ラット培養心筋細胞に低酸素を模擬した塩化コバルトを添加し，p53
およびアポトーシスについて解析した．
【結果】
梗 塞 境 界 部 の 心 筋 組 織 の 解 析 で は，Hif-1α が 増 加
し，p53 お よ び cleaved caspase-3（CC-3） が 誘 導 された．培養心筋細胞に塩化コバルトを添加したところ，
Hif-1α・p53・CC-3 が上昇し，細胞死が誘導された．
siRNA を用いて Hif-1αを silencing したところ，塩化る．本期間では予定していた CreERT2 ラインに問題がコバルトにより誘導される p53, CC-3 および細胞死あり成獣において Kcnj8 欠損の心機能への影響を検討は抑制された．さらに caHif1aHetKO では，境界部のすることはできなかった．今後，新たに実験系を整備しHif-1α・p53・CC-3 および梗塞後心破裂が有意に抑制

ペリサイトの役割を検証することで，ATP 依存性カリされた．

ウムチャネルの機能異常が心疾患を誘発するメカニズム【考察】の全容解明を目指す．

本研究は，心筋梗塞において過剰な Hif-1αが p53 を介してアポトーシスを惹起し，心破裂を誘導している
ことを明らかにした．一般的に Hif-1αは虚血傷害に対して低酸素に対する適応応答として保護的に働くが，過剰な Hif-1αが蓄積した場合には p53 を介した不適切応107Vascular Biology Innovation に関する研究助成

答として心破裂を誘導し得ることを明らかにした２）．

していることを見出した（Yamamoto, Kato et al. Nat【文献】

Commun. 2015）．また，複数の遺伝子改変マウスとマ

１）Matsusaka, H. et al.: Targeted deletion of p53

ウス肺厚切り切片の三次元的形態観察法を用いることでprevents cardiac rupture after myocardial in-

肺ペリサイトからのシグナル分子が肺胞形成を制御して

farction in mice. Cardiovascular Res. 2006; 70:

いることの証明に成功した（Kato et al. Nat Commun.

457-465.

2018）．脳ペリサイトの機能異常が脳梗塞などの疾患の

２）Ikeda, M. et al.: Excessive Hif-1α expression in-

重篤化に寄与することを見出した（Diéguez-Hurtado,

duces cardiac rupture via p53-dependent apop-

Kato et al. Nat Commun. 2019）．さらに受容体型チロ

tosis after myocardial infarction. J Am Heart

シンキナーゼである EphB4 は，心臓の毛細血管網特異Assoc. in press.

的に細胞間接着および脂質輸送を制御することで，心筋細胞の恒常性を維持していること（Luxan, Kato etal. Elife. 2019），各臓器における組織中の酸素レベル
臓器特異的な血管網の機能解析
加

藤

勝

洋
（名古屋大学医学部附属病院）の違いが，臓器特異的な血管網の特徴を規定する一因になっていることを見出した（Sivaraj, Kato et al. Elife.
2020）．現在，各臓器血管網の性状の違いに着目して，疾患との関連を明らかにすることを目指して研究を進めている．

私は，シグナル伝達経路と組織形成・恒常性維持機構の関係性解明が疾患の原因及び治療法確立に重要であると考えて，細胞外シグナルから細胞内シグナル因子の解析を in vivo 及び in vitro の実験系を用いて行ってきた．
それぞれの細胞は生体内で特有の形態を呈し極性を獲VEGF-A の質に着目した ANCA 関連血管炎の治療効果評価に寄与する評価法構築に向けて
菊

地

良

介
（名古屋大学医学部附属病院）

得し，これらの過程は細胞が臓器や組織で特有の機能を発揮するために必要不可欠である．一方，これらの過程が障害されると多様な疾患が引き起こされる．極性形成【目的】の制御機構を解明することで生物の基本原理を明らかに

抗好中球細胞質抗体（ANCA）関連血管炎（AAV）は，するだけでなく，様々な疾患の原因や治療法を確立する

顕微鏡的多発血管炎（MPA），多発血管炎性肉芽腫症

上で欠くことができない．私は遊走細胞における前後軸（GPA），好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（EGPA）の３形成の分子メカニズムに着目し，ホスファチジルイノシ

つの異なる疾患から構成されている．AAV の寛解導入

トール-(3,4,5)-三リン酸に対する脱リン酸化酵素である療法による治療効果を早期に予測できる場合，綿密なSHIP2 を新規 RhoA 標的蛋白質として同定し，SHIP2-

フォローアップや追加療法を選択できる可能性がある．

RhoA の相互作用が PIP3 の局在を制御し細胞の極性形

し か し， 急 性 期 指 標 で あ る C-reactive protein (CRP)

成及び遊走を調節していることを明らかにした（Katoをはじめ，これまで報告があった候補因子は，AAV の

et al. Mol Biol Cell. 2012）．

寛解までの期間を予測するには不十分であった．一方

私は渡独後より一貫して血管新生の制御メカニズム，

で，血管内皮細胞成長因子（VEGF-A）は CRP と抗ミ

臓器特異的な血管細胞（内皮細胞及びペリサイト，血エロペルオキシダーゼ（MPO）抗体価との相関が示さ

管周囲細胞）機能および性状解析，血管自体からのシれており，VEGF-A は抗 MPO 関連血管炎の疾患活動

グナルに注目して研究に取り組んできた．細胞外基質をモニタリングするための潜在的なマーカーであるこを認識するインテグリンβ１が，VE カドヘリンの細胞とが示唆できる．しかし，VEGF-A および抗血管新生

内輸送を制御することで，血管内皮細胞間接着を調節

因子（VEGF-A165b）と AAV の寛解までの関係は不明

108

Vascular Biology Innovation に関する研究助成であった．そこで， AAV 患者での寛解導入療法前後のcohort study. Ann. Clin. Biochem. 58(2). 86-94

VEGF-A と VEGF-A165b の血中濃度変化と寛解までの日(2021).

数との関連について評価することを目的とした．
【方法】
AAV を有する日本人患者の「抗好中球細胞質抗体

新規単球サブセットによる高次血管ネットワークの関連血管炎・急速進行性糸球体腎炎の寛解導入治療の編成機構の解明

現状とその有効性と安全性に関する観察研究（RemIT-

木戸屋浩康（福井大学学術研究院）

JAV-RPGN）」に登録された患者検体（n＝172）のうち，AAV の寛解導入療法開始前と開始後 6 か月の血清サンプルが取得できた 57 人を対象とし，血中 VEGF-A(sVEGF-A) 及び VEGF-A165b (sVEGF-A165b) 濃度を測

【目的】
血管新生などにより形成された血管は，リモデリング

定した．

されることで階層性を持った機能的な高次血管網へと成【結果】熟していく．私は発生過程のリモデリング過程において，対象患者の sVEGF-A 及び sVEGF-A165b の濃度変化

静脈が組織内を動脈近傍へと移動することによって動・について AAV サブタイプ毎に評価した結果，MPA 患静脈の併走構造が完成することを発見し，
この現象を
「血

者 で は，sVEGF-A ( p＜0.001) が，EGPA 患 者 で は，管束移動」と名付けた．また，その過程には新規単球サ

sVEGF-A165b ( p＝0.023) が寛解導入療法前後で有意ブセットが関与していることを見出している．本研究でな減少が認められた．その一方で，GPA 患者におけるは，腫瘍組織内における「血管束移動」の解析を進めた．

治療 6 か月後の sVEGF-A および sVEGF-A165b 濃度は腫瘍血管に対しては血管新生の抑制による兵糧攻めのコ

治療前と同等のレベルにもかかわらず，相関分析からンセプトに基づく癌治療法の開発が進められてきたが，

sVEGF-A および sVEGF-A165b は寛解までの日数と負の期待に反して単独で使用した場合には抗腫瘍効果が得ら相関があることが明らかになった（r＝−0.67, p＝0.046

れていない．血管新生阻害剤が効果的でない理由は未解および r＝−0.78, p＝0.014）．

明となっているが，この血管新生阻害剤への治療抵抗性【考察】に「血管束移動」が関与しているのではないかと考え研

今 回 の 結 果 か ら，sVEGF-A 及 び sVEGF-A165b は GPA究を行った．

症例での寛解導入療法による寛解までの日数を評価でき【方法および結果】

るマーカーとなる可能性が示唆された１）．

血管束移動は動的な現象であり，従来の組織学的な解【文献】

析ではその動態を確認することは不可能である．
そこで，

１）Kikuchi, R., Tsuboi, N., Sada, K., Nakatochi, M.,

多光子共焦点レーザー顕微鏡を用いた生体内イメージン

Yokoe, Y., Suzuki, A., Maruyama, S., Murohara,

グ解析系を構築し，血管新生阻害剤を投与した際の腫瘍

T., Matsushita T, and Research Committee of

血管の変化を経時的に観察した．その結果，血管新生阻Intractable Vasculitis Syndrome and Research

害剤の投与は新たな血管の形成を抑制する一方で，腫瘍Committee of Intractable Renal Disease of the

組織中の残存血管の移動を誘導することで，腫瘍増殖のMinistry of Health, Labour and Welfare of Ja-

再開を誘導していることが明らかとなった．また，この

pan; Amanoj, K., Atsumi, T., Takasaki, Y., Ito,

腫瘍組織における血管束移動に関しても発生期と同様に

M., Hasegawa, H., Dobashi, H., Ito, T., Makino,

特殊な単球サブセット（血管制御ミエロイドと命名）が

H. & Matsuo, S.

関与していることをシングルセル遺伝子発現解析から発VEGF-A and VEGF-A165b are associated with

見した．さらに，血管制御ミエロイドから産生される血管

time to remission of granulomatosis with poly-

束移動の誘導分子を幾つか同定し，その阻害によって抗angiitis in a nationwide Japanese prospective

腫瘍効果が得られることをマウスモデルで明らかにした．

109

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

る．その心筋達を scRNA-seq で解析（Perturb-seq）す【考察】
本研究にて発見された腫瘍組織における血管束移動とることでサイレンシングにより生じた表現系を確認する．

現象の解明から，血管新生阻害剤への治療抵抗性という大きな壁を乗り越える大きなヒントが得られた．現在はヒトの病理サンプルでの解析を進め，実際に血管束移動や血管制御ミエロイドが癌治療における治療標的となるかの検討を進めている．今後も「腫瘍血管を標的としたがん治療」という血管研究分野の大きな目標の実現に向けて，引き続き研究を進めていく所存です．日本応用酵素協会からの支援は本年で終了となるが，私の研究人生の礎となるであろう本研究を進めることができたことに，この場をお借りして感謝申し上げます．

⑵ scRNA-seq デ ー タ の 解 析 に よ る 心 不 全 治 療 タ ー
ゲットの絞り込み

一細胞解析とCRISPR/Cas9 システムの融合による心不全リプログラミング因子スクリーニ
ング

scRNA-seq デ ー タ を 用 い て 重 み 付 け 遺 伝 子 共 発 現ネットワーク解析（WGCNA）やリガンド - 受容体解析（LR 解析），Pathway 解析を行うことで，効率よく重要そうな標的候補を探索する．

候聡

志（東京大学大学院医学系研究科）【結果及び考察，今後の方針】(1) in vivo Perturb-seq 実験系の確立
心 筋 特 異 的 dCas9-KRAB-MeCP2 マ ウ ス を 樹 立 し，

【背景と研究目的】

実験系が確立されていることを示すために，各種心筋症

申請者らはこれまで心不全モデルマウス及び心不全患や先天性心疾患の原因として報告されている計 43 種類

者の心筋細胞を用いて，Single-cell RNA-seq (scRNA-の遺伝子の各々に対して，gRNA 搭載 AAV9 ベクターseq) という手法によりに解析を行い，心筋細胞の遺伝を全て設計・作成した．その機能を in vivo Perturb-seq

子発現プロファイルは心不全発症過程において，肥大型により網羅的に調べることで，各心筋症・心疾患間での状態を経て代償型心筋細胞もしくは不全型心筋細胞に変分子病態やその差異が明らかになると期待される．予備化していくことを明らかにし，各細胞状態に特徴的な遺実験の結果，gRNA 搭載 AAV9 ベクターの感染効率が伝子シグナルネットワークを同定した．scRNA-seq 解析は近年急速に普及しつつあるが，得られた膨大なデー
タを如何に処理し，有用な情報を抽出 ( 新規心不全治療
ターゲットの探索 ) するのかが課題と言える．申請者らは本研究助成を受け，この課題に対して以下のように取り組み，一定の成果を得た．
【方法】⑴ in vivo Perturb-seq 実験系の確立
dCas9-KRAB-MeCP2 という gRNA 依存性に対象遺伝子をサイレンシングする分子を心筋細胞特異的に発現するマウスを作し，複数の対象遺伝子に対する gRNAを各々搭載した AAV9 ライブラリーを投与・感染させることで，個々の心筋で異なる遺伝子の発現が抑制され

110

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

高すぎると複数種のベクターが同じ細胞に共感染して効gRNA 搭載ウイルスの量の制約から，一度に調べられ果を判定しづらくなることから，10% 未満の感染率とる遺伝子の種類は 30-50 種類程度に限られる．そのたなるようなウイルス投与量（2-5x10^11GC/ 匹）を決め，やはり scRNA-seq のデータを解析して事前にあめた．感染した細胞で GFP を発現するようにベクター

る程度解析対象の絞り込みを行う必要がある．Perturb-

設計し，それを FACS による single cell sort する方針

seq の技術開発を行うと同時に，ターゲット絞り込みのとした．通常，心筋細胞はその大きさ故に FACS にかけための効果的な解析方法の開発にも取り組んだ．まずることはできないが，新生児マウスの心筋細胞は比較的

Sham/TAC マウス心筋細胞の scRNA-seq データを用い小さいため，FACS のノズルを通る．各種実験の結果，て細胞系譜解析や WGCNA を行って代償型心筋と不全

生後 4 日目の新生児マウスに AAV9 を感染させ，14 日型心筋を比較すると，有意に変化している遺伝子は数百目に（新生児心臓用に改良したランゲンドルフ灌流法を種類以上に上った．だが細胞の性質を決める上で重要な用いて）マウス心筋を単離し，かつ FACS により AAV9のは転写因子であるため，代償型心筋のみで発現が高く

感染心筋 (GFP+) のうち，形態が杆状に保たれている良保たれている転写因子に限定して WGCNA のデータを質なもののみを Sort 単離できる系を確立した．これに細かく分析した結果，候補は一気に約 10 種類に狭まっより in vivo Perturb-seq を実施する上での技術的障壁

た．将来的には in vivo Perturb-seq によってこれらのを乗り越え，現在 gRNA 搭載ベクターを順次マウスに役割を解明していくが，試しにその中から 5 種類を選投与して感染心筋のサンプリングを行っている最中である．シークエンスをする上での Batch eﬀect を避けるた
め，心筋検体は今後十分に数が揃ってから一斉に RNAseq を行う予定だが，先に一部の心筋細胞検体を用いて，いくつかの対象遺伝子の発現を qPCR で確認すること
で，dCas9-KRAB-MeCP2 による対象遺伝子のサイレン
シング効率を検証した．
その結果，元々どの遺伝子についてもシングルセルレ
ベルで見ればその発現量にばらつきはあるものの，いずれも AAV9 感染によって gRNA が細胞内に導入された
心筋 (Perturbed CM) では対象遺伝子の発現量が元々の平均の 5% 未満まで抑制されていることが判明し，サイレンシングが十分機能していることが分かった．今後は前述の通り，Perturbed 心筋の検体が十分揃ったところでまとめてシークエンスし，サイレンシングされた遺伝子別にトランスクリプトームがどのように変化するのかを解析していく予定である．

⑵シングルセル解析データの解析による心不全治療ター
ゲットの絞り込み

in vivo Perturb-seq は マ ウ ス に 感 染 さ せ ら れ る
111

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

んで AAV9 による TAC マウスへの過剰発現実験を行ったところ，特に心機能保護効果が強いものとして，転写因子Ｘ（以下 TF-X とする）を見出した．

神経−免疫ネットワークを介して高血圧の臓器障害を抑制するニューロモデュレーション治療の開発
朔

TF-X を過剰発現させたマウスはその後の TAC 手術に

啓

太（国立循環器病研究センター）

よる圧負荷に耐性があるだけでなく，圧負荷後 8 週経
過した晩期心不全の状態のマウスに TF-X を過剰発現させても，左室壁の代償性肥大が再度見られ，心拡大や【目的】

収縮能の改善を認めた．晩期心不全の段階で TF-X が過

本研究は，高血圧における電気的ニューロモデュレー

剰発現された心筋細胞は，Control に比べて胎児化ミオ

ションの効果を検証することを目的としている．本期間

シンの発現や DNA 損傷の蓄積が有意に減っており，逆では，電気刺激装置開発と平行し，有効性を確認するたに細胞の肥大に重要な Akt や心筋発生 / 分化時の転写

めに，薬理学的迷走神経刺激治療（ドネペジル）の肥満因子として知られる Nkx2.5 の発現が増えていた．今性高血圧＋心不全を示すラットモデルにおいて検証し

後 scRNA-seq やエピゲノム解析を通してさらに TF-X

た．

の機能を明らかにしていきたい．WGCNA 自体も優れ【方法】

た scRNA-seq 解析法の一つだが，そこからさらに発展

８週令の肥満性高血圧ラットを用いて，麻酔下に血圧して，異なる細胞種の WGCNA で判明した遺伝子ネッ

テレメトリ装置を埋め込んだ．１週間の回復期を置き，トワークのうち，特にリガンド / 受容体（LR）遺伝子

麻酔下に左冠状動脈の基部を閉塞し，30 分後に再灌流を抜き出し，LR データベースを基に対応するリガンドを行った．生存したラットを無作為に非治療群（UT, n- 受容体 (LR) 同士をつなげることによって細胞種間コ＝16），ドネペジル（DT, n＝16, 3mg/kg/日）治療群にミュニケーションを可視化し，さらに Pathway 解析に割り付け，治療を開始した．10 週後に，ドネペジルのより重要なリガンド受容体関係を明らかにすることがで治療効果を血行動態，神経体液性因子，炎症因子及び組

きた．こうした LR 解析や Pathway 解析も scRNA-seq

織学検査で評価した．

データからの対象遺伝子の絞り込みに有用であると考え【結果】られる．現在こうした解析結果から，線維芽細胞特異的

UT 群に比べて，DT 群では心筋梗塞巣が有意に縮小に発現する Htra3 という分子に着目し，機能解析を進しており（17±2vs. 24±2%, P＜0.05），心機能が保ためている．Htra3 KO マウスは圧負荷に脆弱であり，圧れていた（心係数：91±4 vs. 73±9ml/min/kg, P＜0.01;

負荷後に線維芽細胞で TGF βシグナルの過剰活性化が左心室拡張末期圧 : 11±1 vs. 20±2mmHg, P＜0.01）．

生じ，それがさらに心筋細胞にも影響してこれを不全心

また，心臓重量低下や梗塞周辺の血管新生増加も認めた．

筋化させることが scRNA-seq 解析から明らかとなった．

また，DT 群において血中のカテコラミン，BNP, AngII

逆に Htra3 の過剰発現は心保護的であり，新たな治療および CRP はいずれも有意に低下していた．

ターゲットであると考えられる．
（Ko, Komuro et al.

【考察】

Nat Commun, in revision）

ドネペジル治療は，再灌流心筋梗塞を伴う肥満性高血圧ラットの心不全モデルにおいて，著明な心臓リモデリ
ング抑制効果および心機能障害の改善効果を示した．
【文献】
研究推進の過程で得られた知見を基に以下の論文報告を行った．
１）A novel method of trans-esophageal Doppler
cardiac output monitoring utilizing peripheralarterial pulse contour with/without machine112

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

learning approach. J Clin Monit Comput. 2021,
in press. Uemura, K*., Nishikawa, T., Kawada,

心筋梗塞における骨格筋異常の発症機序
髙T., Zheng, C., Li, M., Saku, K., Sugimachi, M.

田真

吾（北翔大学生涯スポーツ学部）（順位 / 著者数：6/7）
２）Development of an automated closed-loop
β-blocker delivery system to stably reduce【背景】

myocardial oxygen consumption without in-

心疾患は，質と量の両方で “骨格筋異常” を伴うこと

ducing circulatory collapse in a canine heart

が多く，日常生活動作や生活の質を著しく損なう主原因

failure model: a proof of concept study. J Clinとなっている．これらの異常に対して，運動療法は心疾

Monit Comput, 2021, in press. Nishikawa, T*.,

患の予防や治療にさえ有益であることが知られている

Uemura, K., Hayama, Y., Kawada, T., Saku, K.,が，しばしば運動が実施できない患者が存在するため，

Sugimachi, M. （順位 著者数：5/6）

運動療法の代替法の発見も重要な課題となっている１）．

３）Aging steepens the slope of power spectrum

また，心臓リハビリテーションを含め，骨格筋異常の発density of 30-minute continuous blood pressure症後における治療のエビデンスはわずかながら蓄積されrecording in healthy human subjects. PLoS One.

つつある２,３）．一方で，骨格筋異常は心疾患発症直後か

2021, 16(3): e0248428. Mano, J., Saku, K*.,ら開始される虚血/再灌流，酸化ストレス，炎症，神経Kinoshita, H., Mannoji. H, Kanaya, S., Suna-

体液性因子により生じると考えられているが，その発症

gawa, K. （順位 著者数：2/6）

機序・時期も未だ不明な点が多い．

４）Prediction of haemodynamics after interatrial【結果】

shunt for heart failure using the generalized

心筋梗塞（MI）マウスの骨格筋は一時的な低酸素環

circulatory equilibrium. ESC Heart Fail. 2020,

境により，キサンチンオキシダーゼ由来の活性酸素種

7(5): 3075-3085. Nishikawa, T., Saku, K*., Uike,（XO-ROS）産生が急性期にのみ増加した．この MI 急

K., Uemura, K., Sunagawa, G., Tohyama, T.,

性期における XO-ROS の産生増加の抑制は，慢性期にYoshida, K., Kishi, T., Sunagawa, K., Tsutsui, H.

おける骨格筋異常および運動耐容能の低下を予防した．

（順位 著者数： 2/10）【結論】５）Prediction of hemodynamics after atrial septal

今回の研究結果は，MI 後から心不全に至る過程で生

defect closure using a framework of circula-

じる骨格筋異常の発症機序の一つであることを示唆し

tory equilibrium in dogs. Am J Physiol Heartた４）．

Circ Physiol. 2020, 319(5): H938-H947. Uike,【引用文献】（* contributed equally to this work.）

K., Saku, K*., Nishikawa, T., Yamamura, K.,

１）Takada, S., (corresponding author), Sabe, H. &Nagata, H., Muraoka, M., Ohga, S., Tsutsui, H.,

Kinugawa, S.: Abnormalities of skeletal muscle,

Sunagawa, K. （順位 著者数：2/9）

adipocyte tissue, and lipid metabolism in heart６）The Partial Support of the Left Ventricular Assist Device Shifts the Systemic Cardiac Output

failure: practical therapeutic targets. Front Car-

diovasc Med 12; 7: 79, 2020.

Curve Upward in Proportion to the Effective２）Matsumoto, J*., Takada, S*., Kinugawa, S. et al.:Left Ventricular Ejection Fraction in Pressure-Brain-derived neurotrophic factor improves lim-

Volume Loop. Front Cardiovasc Med . 2020,

ited exercise capacity in mice with heart failure.

7:163. Kakino, T., Saku, K*., Nishikawa, T.,

Circulation 138: 2064-2066, 2018.

Sunagawa, K. （順位 著者数：2/4）

３）Matsumoto, J*., Takada, S*.,, Kinugawa, S.:

Brain-Derived Neurotrophic Factor Improves

113

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

Impaired Fatty Acid Oxidation Via the Activa-

られた．DI-E-RAMP2-/-では，リンパ節内に存在する，

tion of Adenosine Monophosphate-activated

高内皮細静脈（HEV）の構造異常が認められた．さらP r o t e i n K i n a s e - α- P r o l i f e r a t o r - A c t i v a t e dに，リンパ節内のＴ細胞の減少，樹状細胞の分布異常がReceptor-r Coactivator-1α Signaling in Skeletal

認められた．HEV は CCL21, CCL19, CXCL12 などのMuscle of Mice With Heart Failure. Circulation

ケモカインや，ICAM-1, L-selectin といった接着因子

Heart Fail 13: e005890, 2021.

を産生し，リンパ球を誘引，接着させ，リンパ節内に引

４）Nambu, H., Takada, S. (corresponding author),

き込むことが知られている．DI-E-RAMP2-/-のリンパ, Kinugawa, S.: Inhibition of xanthine oxidase

節において，これらのケモカインや接着因子の遺伝子発in the acute phase of myocardial infarction

現を解析すると，癌を移植して２週間の早期の段階で，prevents skeletal muscle abnormalities and ex-

すべて有意に低下することが明らかとなった．一方で，ercise intolerance. Cardiovasc Res 22; 117(3):DI-E-RAMP2-/-とは異なり，リンパ管内皮細胞特異的

805-819, 2021.

RAMP2-/-（DI-LE-RAMP2-/-）ではリンパ節転移に変化を認めなかった．
【考察】

アドレノメデュリン-RAMP2 系による血管恒常性制御機構による腫瘍転移抑制薬の開発
田中愛

以上の結果から，血管恒常性の破綻は，癌細胞の血行性転移だけでなく，リンパ節転移亢進にもつながることが明らかとなった．AM-RAMP2 系が有する血管恒常性（信州大学医学系研究科）

維持作用は，心血管疾患だけでなく，癌転移抑制のための新しい治療標的となることが期待される．

【目的】
アドレノメデュリン（AM）は血管作動性のペプチドとして同定されたが，それ以外にも様々な作用を有することが知られている．我々は，AM とその受容体活性調
節タンパク RAMP2 が血管の発生と恒常性維持の双方に不可欠であり，それらのノックアウトマウスは血管の多能性幹細胞における代謝機構に基づく細胞作製と心臓再生医療への応用
遠

山

周

吾
（慶應義塾大学医学部）

異常で胎生致死となることを報告してきた．本研究では，
AM-RAMP2 系の癌増殖や転移における役割を明らかと

ヒト多能性幹細胞は心筋細胞を含む様々な細胞に分化するために，誘導型血管内皮細胞特異的 RAMP2 ノッする能力を有するため，心臓再生医療への応用が期待さ

クアウトマウス（DI-E-RAMP2-/-）を用いた検討を行っれている．一方で，ヒト多能性幹細胞を用いた心臓再生

た．

医療における臨床応用を実現化するためには多くの課題【結果】を克服する必要がある．その最も重要な課題の１つは，

DI-E-RAMP2-/-では，皮下移植した癌細胞の原発巣

分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，効率よく心における血管新生と癌増殖が抑制される一方で，足底部筋細胞のみを作製する技術の確立であった．我々はこれにメラノーマ細胞を移植し，一旦それを切除した後に生らの課題に対して，ヒト多能性幹細胞と分化心筋細胞のじる自然肺転移が著明に亢進していた．RAMP2 欠損誘

代謝プロファイルを詳細に解析することにより，培養環

導後の肺では，細胞骨格異常を伴う内皮細胞の形態異常

境により分化後に残存する未分化幹細胞を取り除き，分や血管透過性亢進が生じ，癌細胞遊走因子の高発現を認化心筋細胞のみを効率よくかつ大量に純化精製するとめ，「転移前土壌」が形成されることが明らかとなった．

いう画期的手法を構築することにより克服することに成次に，ルイス肺癌細胞を用いたリンパ節転移の検討にお功した（Cell Stem Cell 2013, Cell Metab 2016, Stem

いても，DI-E-RAMP2-/-ではリンパ節転移の亢進が見

Cell Rep 2017）．さらに，我々は多能性幹細胞特異的

114

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

な代謝機構に着目することにより，残存する未分化幹細胞を特異的に除去する手法を確立し（iScience 2020），
これまで確立してきた培養液による純化精製法との組み制御性Ｔ細胞による脂肪組織恒常性維持機構および
脂肪細胞分化機構の解明
中合わせによりさらに安全な心筋細胞の作製が可能となっ島啓（東京大学大学院薬学系研究科）

た．
しかしながら，依然として課題が存在する．それは，ヒト多能性幹細胞を用いた再生医療における臨床応用さ【目的】

らには産業化を実現化するためには，大量の細胞を作製

転写因子 Foxp3 を発現した制御性Ｔ細胞（Treg）は，する必要があり，それに伴い多くのコストが発生するこさまざまな組織環境，炎症環境に適応することで機能とである．この課題を克服するためには，ヒト多能性幹

し，この適応性が炎症制御と組織の恒常性維持に重要細胞を安価かつ効率よく作製する必要がある．一方で，である．組織特異的な Treg の機能を調べるためには，

ヒト多能性幹細胞における従来の培養液は，未分化維持

Treg を特異的に操作したマウスを用いる必要があるが，および増殖において最適な条件ではなかった．そこで，Foxp3 欠損マウスや Treg 除去マウスは致死性の炎症反我々はヒト多能性幹細胞の増殖に最適な培養条件を探索

応を全身で発症してしまうため，この目的には適さない．

し，必須アミノ酸の１つとして知られるトリプトファン

そのため，Treg の組織適応メカニズムはこれまで十分

代謝を制御することにより，ヒト多能性幹細胞の増殖がに明らかにされていなかった．

促進されることを見出した（iScience 2021）．本研究成

当研究室はこれまでに，ヒト自己免疫疾患 IPEX で同果は，安価に大量のヒト多能性幹細胞および分化心筋細定されている Foxp3 遺伝子変異 A384T を導入したマウ胞を作製することに繋がるため，再生医療における臨床スの解析から，A384T Treg が，AP-1 転写因子 BATF

応用あるいは産業化の推進に貢献することが期待できる．

や GATA3, ST2 の発現制御異常を引き起こし，結果的さらに，ヒト iPS 細胞由来心筋組織球を小動物大動物に非リンパ組織に局在する Treg の恒常性を特異的に破心不全モデル心臓に移植し，心機能が有意に改善するこ

綻させることを見出だした．さらに，A384T マウスは，とを確認している（JACC-BTS 2021）．現在，これら

全身性の致死的な自己免疫疾患は発症せず，炎症組織がの技術を用いて臨床グレード心筋細胞を作製し，重症心末梢組織に限定しているため，組織特異的な Treg の機不全患者への移植に向けて準備を進めている．

能解明が可能なマウスである．

【文献】
１）Tohyama, S. et al.: (2013) Cell Stem Cell 12,127-137.
２）Tohyama, S. et al.: (2016) Cell Metabolism 12,
663-674.
３）Tohyama, S. et al .: ( 2017 ) Stem Cell Rep .
9,1406-1414.
４）Tanosaki, S., Tohyama, S. (Corresponding author), et al.: (2020) iScience 23, 101535.
５）Someya, S., Tohyama, S. (Corresponding author), et al.: (2021) iScience 24, 102090.

本研究は，この発見を手がかりとして，BATF, GATA3,
ST2 の発現がその機能性維持に重要とされている脂肪
組織中の Treg に着目し，A384T 変異マウスの解析から脂肪組織における Treg の適応性を制御するメカニズムを明らかとし，Foxp3＋Treg を介した脂肪組織恒常性維持機構および脂肪細胞分化機構を解明する事を目的とした．
【方法】
Foxp3 遺伝子変異 A384T 変異マウス，および野生型
マウスの白色・褐色脂肪組織について，組織形態，免疫応答（Th1/Th2/Th17 etc.），免疫細胞集団を免疫学的

６）Tabei, R., Kawaguchi, S., Tohyama, S. et al.:に解析し，Foxp3 依存的な脂肪組織の恒常性維持およ(2019) J Heart Lung Transplant 38, 203-214.

び脂肪細胞分化を検証した．また，A384T 変異マウス

７）Kawaguchi, S., Soma, Y., Tohyama, S. et al.:と野生型マウスをそれぞれ通常食，または高脂肪食を摂(2021) JACC-BTS 6, 239-254.

取させ，エネルギー代謝変化を比較解析した．

115

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【結果】

で，脂肪細胞の肥大を抑制していることが報告されていA384T マウスの脂肪組織を解析した結果，当初の予る．すなわち，脂肪組織の Treg は脂肪組織の２型炎症

想通り，脂肪組織中の Treg の数・割合が野生型マウを抑制することで，脂肪細胞の正常な分化を促進していスに比べて非常に少ないことが分かった．さらに Th1/

る可能性が示唆される．しなしながら，肥満と脂肪組織

Th2/Th17 応答を解析したところ，A384T マウスの脂の Th1 型炎症亢進には正の相関があることが良く知ら肪組織では Th2 応答が過剰に起こっており，２型炎症

れているものの，A384T マウスで見られているようなのマーカーである好酸球の割合が顕著に増えているこ

脂肪組織の Th2 型炎症亢進が全身の代謝にどのようにとが分かった．さらに A384T マウスの脂肪組織重量は寄与しているかは現在のところ不明である．今後は脂肪野生型マウスと比較して低い傾向にあることも分かっ

組織が Th2 型に亢進している生物学的意義（褐色化のた．肺組織などでは，IL-33 シグナル依存的に活性化亢進など）を明らかにし，脂肪組織における Treg の役した病原性の高い Th2 細胞が２型サイトカイン（特に割を解明したいと考えている．

IL-5 と IL-13）を高産生し，炎症性好酸球の集積を促進

さらに，脂肪組織の Treg の抑制標的細胞も明らかにすることで，アレルギー病態の増悪に寄与することがしたいと考えている．Foxp3＜A384T＞ x ST2 KO マ

知られている．そこで，A384T マウスの脂肪組織で見ウスの解析から，A384T マウスの脂肪組織では ST2られる Th2 型炎症破綻のメカニズムを解明する目的で，を高発現するエフェクターＴ細胞や２型自然免疫細胞

A384T マウスを IL-33 受容体（ST2）欠損マウスと掛（ILC2）などが活性化している可能性が考えられる．今

けあわせた（Foxp3＜A384T＞ x ST2 KO）マウスを作後は，シングルセル解析などを行い，脂肪組織における製した．Foxp3＜A384T＞ x ST2 KO マウスの脂肪組

Treg の抑制メカニズムも明らかにしたいと考えている．

織を解析した結果，A384T マウスで見られていた Th2
サイトカイン，好酸球の浸潤が顕著に減少することが分かった．さらに，それと相関して Foxp3＜A384T ＞ x
ST2 KO マウスの脂肪組織重量は，A384T マウスよりも増加していることが分かった．

高血圧発症機序の解明−血管内皮機能調節と食塩感
受性規定因子の研究−
西

本

光

宏
（国際医療福祉大学三田病院）

次に，A384T マウスで見られている脂肪組織の恒常性破綻の意義を解明する目的で，WT マウスと A384T
マウスに通常食・高脂肪食を摂取させ，体重をモニタリ【目的】

ングしたが，
体重に有意な差は認められなかった．また，食塩感受性高血圧の病態形成には腎，脳，血管など様々

通常食で飼育させた WT と A384T マウスの糖代謝（イな臓器・経路が寄与している．血管内皮は種々の生理活

ンスリン抵抗性試験，グルコース負荷試験）を比較した性物質を通じて血管の機能調節を通じて血圧を制御すが，糖代謝にも有意な差は認められなかった．

る．内皮機能の中心を担う NO の産生は Ca２＋シグナル【考察】

によって調節されている．この細胞内 Ca２＋を調節する

A384T マウスの脂肪組織は Treg の数が少なく，過STIM1 に着目し，血管内皮機能調節の分子機構の検討

剰な Th2 応答が起こっているものの，糖代謝や高脂肪を行った．また個体によって異なる食塩感受性を規定す

食負荷に伴う体重増加については，野生型マウスと比べる因子の一つとして，胎児期の過剰ストレス暴露が報告

大きな差は認められなかった．一方で，A384T マウス

されている．胎児期に何らかのプログラミンが行われるの脂肪重量は野生型マウスと比較して顕著に少ない傾向との仮説が提唱されており，この機構にエピジェネティにあることが分かり，過剰な Th2 反応が脂肪細胞の分

クス調節異常，特に長期に持続する変化として DNA メ

化や分解に寄与している可能性が考えられる．実際，2チル化の異常が想定されている．母体ストレスが胎児に型サイトカインである IL-4 は脂肪細胞に直接的に作用過剰なコルチゾール負荷を与えることに着目し，産仔のし，脂肪分化を抑制し，さらに脂肪分解を促進すること

DNA メチル化調節を検討した．

116

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【方法】
１）血管内皮特異的 STIM1 ノックアウトマウスを作成し，血管内皮細胞の Ca２＋ 濃度調節 /NO 産生能，大心臓疾患における細胞・分子挙動の網羅的理解野村

征太郎（東京大学大学院医学系研究科）

動脈リの血管拡張能，血圧日内変動を検討した．２）妊娠期に低蛋白食を与えたラットおよび妊娠後期に合成コ
ルチコステロイドであるデキサメサゾンを投与した妊娠【目的】

時ストレス動物モデルについて食塩負荷時の血圧変化，心臓疾患はゲノム要因と環境要因の組み合わせによっ

血圧制御に関与する遺伝子発現，ならびに DNA メチルて生じる．その詳細は明らかにすれば，心臓疾患におけ化制御について検討した．

る精密医療を加速できると思われる．

【結果】

【方法】

１）血管内皮特異的 STIM1 ノックアウトマウスでは患者の組織検体を用いたオミックス解析・患者から樹血管内皮のアゴニスト依存性 NO 産生，ない非依存性

立した iPS 細胞を用いた疾患 iPS 細胞解析・疾患モデル

血管拡張が有意に抑制された．血圧については拡張期血動物のオミックス解析によって心臓疾患のゲノム要因・

圧および活動性の亢進する夜間で収縮期血圧の有意な上環境要因を明らかにし，それに基づいた精密医療を発展

昇を認めた．２）低蛋白食ストレス負荷および妊娠後期させる．

糖質コルチコイド過剰の母体からの産仔は成人後食塩感【結果】

受性高血圧を示した．負荷モデルの産仔では視床下部室

高血圧・弁膜症・心筋症・心筋梗塞は心臓に病的な血傍核においてアンジオテンシン受容体遺伝子の DNA メ

行力学的ストレスを誘導して心不全を惹起する．これをチル化の低下と遺伝子発現の亢進を認めた．腎において模倣する圧負荷心不全マウスモデルを用いて我々は世界

は Na 輸送体の発現亢進を認めた．

で初めて心筋細胞のシングルセル RNA-seq 解析を確立【考察】し，肥大型心筋が代償型・不全型心筋に分岐すること，

血管内皮の STIM1 が内皮機能調節・血圧制御自体に不全型心筋の誘導には DNA 損傷・p53 シグナル活性化

大きな役割を担っていることが明らかになった．活動期が必須であることを明らかにした１）．そして組織においと休止期において血圧制御に寄与するアゴニスト依存て位置情報を保持して遺伝子発現を解析できる１分子性の血管内皮機能と shear stress に代表されるアゴニ

RNA in situ hybridization によって，圧負荷で胎児化

スト非依存性の役割の違いが示唆された．また妊娠時スする心筋細胞は中間層で多く認められるだけでなく，形トレスが成人後の食塩感受性高血圧を発症させる機序に態的に小さく肥大していないことを解明した．さらに心ついて中枢での部位特異的な DNA メチル化の異常が寄不全患者の治療前の心筋生検検体の分子病理解析によっ与し，腎での Na 輸送体発現制御に至ることが明らかにて，DNA 損傷を定量評価することで治療応答性や予後なった．

を予測できることを実証した２）．また心不全患者の心筋【文献】

シングルセル RNA-seq 解析によって，致死的不整脈を

１）Nishimoto, M., Mizuno, R., Fujita, T. & Isshiki,

有する心不全患者で特異的に認められるドパミン D1 受

M.: Stromal interaction molecule 1 modulates

容体陽性心筋を同定し，このシグナルがリアノジン受容blood pressure via NO production in vascular体のリン酸化を介して細胞内カルシウム挙動を撹乱する

endothelial cells. Hypertens Res. 2018; 41(7):ことを解明した３）．さらに拡張型心筋症のゲノム解析に

506-514.

よって，LMNA 遺伝子変異が予後不良な心不全の遺伝

２）Kawakami-Mori, F., Nishimoto, M. et al.: Aber-

要因であることを解明した．その成果を診療ガイドライ

rant DNA methylation of hypothalamic angio-ンに反映させて精密医療の実現へと結実した４）．そして

tensin receptor in prenatal programmed hyper-

LMNA 変異患者由来の iPS 心筋細胞および LMNA 変異

tension. JCI Insight. 2018

マウスの心臓をシングルセル解析し，分化異常・細胞内117

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

構造異常・DNA 損傷がその病態であることを解明した．
さらに心筋梗塞のゲノム解析によって，糖尿病・高血圧・肥満・脂質異常・炎症と関係する原因遺伝子を同定し，遺伝要因を統合したポリジェニック・リスクスコアを構

リプログラミング法を利用した新たな心臓形成転写
ネットワークの探索
橋

本

寿

之
（慶應義塾大学医学部）

築した５）．また心筋梗塞モデルマウスの空間的遺伝子発現解析によって，梗塞直後に梗塞境界部で発現上昇する
メカノセンシング遺伝子による心臓リモデリングの保護的効果を明らかにした．
【考察】
ゲノム・シングルセルオミックス解析によって疾患シ【目的】
心臓発生に重要な複数の転写因子を強制発現させ る こ と に よ り 線 維 芽 細 胞 を 心 筋 様 細 胞（induced
cardiomyocyte: iCM）に直接分化転換することができ

ステム構造を理解し，精密医療の実現を加速できる．

る１）．最近我々はリプログラミングと心臓発生の間にはエ【文献】

ピジェネティックなプロセスにおいて多くの共通点があるこ

１）Nomura. et al.: Cardiomyocyte gene programsとを見出した２）．このような知見から，今度は逆にリプ

encoding morphological and functional signa-

ログラミングの研究成果を参考にして，心臓発生を司tures in cardiac hypertrophy and failure. Nat

る新たな転写制御機構を解明できるのではないかと考Commun. 9, 4435 (2018).

えた．よって，我々は先行研究結果３）において最も強く

２）Nomura. et al.: Quantiﬁcation of DNA Damage

iCM への転換効率を改善した転写因子 ZNF281/Zfp281

in Heart Tissue as a Novel Prediction Tool forに着目し，ZNF281 の司る心臓発生の新たな転写制御

Therapeutic Prognosis of Patients With Dilated

機構を解析することを目的として，研究計画を立案した．

Cardiomyopathy. JACC Basic Transl Sci . 4,

【方法】

670-680 (2019).

本研究では胚性幹細胞（ESC）およびモデルマウス

３）Yamaguchi, Nomura. et al.: Cardiac dopamine

を利用し，心臓形成における ZNF281 の役割を明らか

D1 receptor triggers ventricular arrhythmia inに す る． そ の た め に は ZNF281 を 過 剰 発 現 も し く は

chronic heart failure. Nat Commun. 11, 4364

ノ ッ ク ア ウ ト（KO） し た ESC を 作 成 し，ZNF281 の(2020).

発現量が心筋分化効率に及ぼす影響を解析する．また，

４）Nomura. et al.: Genetic basis of cardiomyopathy

CRISPR/Cas9 を用いて ZNF281 を心筋特異的に KO しand the genotypes involved in prognosis andたマウスラインを樹立し，ZNF281 が心臓発生に必須

left ventricular reverse remodeling. Sci Rep. 8,の遺伝子かを明らかにする．

1998 (2018).

【結果】５）Koyama, Nomura. et al.: Population-speciﬁc and我 々 は ZNF281 を ノ ッ ク ア ウ ト し た マ ウ ス ESC

trans-ancestry genome-wide analyses identify(ZNF281KOmESC) を樹立した．そして野生型の mESC

distinct and shared genetic risk loci for coro-と同様のプロトコルで心筋分化誘導を行ったところ，

nary artery disease. Nat Genet. 52, 1169-1177

ZNF281KOmESC は心筋細胞に分化することができな(2020).

かった（図１）．
また，我々は同様に CRISPR/Cas9 を用いて ZNF281
遺伝子領域を Cre リコンビナーゼ標的配列 loxP で挟んだ遺伝子組み換えマウス（ZNF281 ﬂox）を作成した．
このマウスを用いて心臓特異的に ZNF281 を欠損したマウスを作製したところ，胎生致死の表現型が確認できた（図２）．

118

Vascular Biology Innovation に関する研究助成【考察】
我々の in vitro 及び in vivo の解析結果から，ZNF281
は心筋分化及び心臓発生に必須の因子である事が明らかとなった．今後はマルチオミクス解析を用いて ZNF281
がどのように心筋形成の転写ネットワークを司っているのかを明らかにする予定である．
【参考文献】
１）Ieda, M. et al.: Direct reprogramming of ﬁbroblasts into functional cardiomyocytes by deﬁned
factors. Cell, 142, 375-386, (2010).
２）Hashimoto, H. et al.: Cardiac Reprogramming
Factors Synergistically Activate Genome-wide
Cardiogenic Stage-Speciﬁc Enhancers. Cell StemCell, 25, 69-86 e65, (2019).
３）Zhou, H. et al.: ZNF281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inﬂammatory gene expression. Genes & development, 31,
1770-1783, (2017).

ミネラロコルチコイド受容体経路を標的とした糖尿病性腎症の新規治療法開発
広浜大五郎（帝京大学医学部）【背景・目的】
糖尿病に伴う腎障害（糖尿病性腎臓病，DKD）は腎
図１

ZNF281KOmESC の樹立と心筋分化誘導における未分化マーカーと心筋マーカーの発現変動

不全の原疾患として最も多いが，根本的な治療法は未確立である．これまで DKD に対する治療法開発を妨げていた要因の一つとして，ヒトの病態と類似するモデル動
物の欠如があげられる．申請者らは，低分子量Ｇ蛋白質
Rac1 がミネラロコルチコイド受容体（MR）転写活性化を促進し，この経路が生活習慣病に伴う腎障害の病態に関与する可能性を明らかにしてきたが (Shibata et al.

Nat Med 2008, Shibata et al. JCI 2011, Hirohama etal. Int J Mol Sci 2020), DKD における意義は未解明である．本研究は（1）ヒト DKD と類似した病態を示す
図２

心臓特異的 ZNF281KO マウスの胎生致死の表現型

マウスモデルを確立すること（2）確立したマウスモデ
ルを用い，主に MR に焦点をあてて DKD 進行の分子基盤の一端を解明することが目的である．

119

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

エネルギー代謝調節に関与することを明らかにした１）．

【方法】
肥満 2 型糖尿病モデルの db/db マウスに対して４

その過程で，GLP-1 受容体遺伝子改変マウスは，高脂週齢で片腎摘出を施行後，10 週間高食塩食を投与し肪食誘導性肥満に対して抵抗性を示すことを見出した（UNx-HS db/db マウス）
，その表現型を評価した．db/（unpublished data）．加えて，野生型と GLP-1 受容体

m マウスに同様の処置を行った群をコントロール群と遺伝子改変マウスの腸内細菌を解析した結果，全く異なした．MR 拮抗薬，Rac1 阻害薬を UNx-HS db/db マウ

る腸内細菌の構成を示すことを見出した．そこで，本研

スに投与し効果を検討した．

究では，腸内環境変化と GLP-1 シグナルの相互作用が【結果】

生体エネルギー代謝調節に及ぼす影響を明らかにするこ

UNx-HS db/db マウスは高アルドステロン血症を認め，上皮性ナトリウムチャネル活性化，低カリウム血症，とを目的とした．
【方法】

高血圧を呈した．UNx-HS db/db マウスは顕著なアルGLP-1 受容体遺伝子改変マウスの腸内細菌変化が，ブミン尿に加え，糸球体結節性病変を認めた．UNx-HS

遺伝子型による影響か，高脂肪食による影響かを評価す

db/db マウスの腎皮質と糸球体で，Rac1 活性化，MRるために，若齢期（高脂肪食負荷前）における腸内細菌

標的遺伝子 Sgk1 発現の上昇を認めた．これらの結果か解析を実施した．また，GLP-1 受容体遺伝子改変マウら遠位ネフロン，糸球体両者での Rac1-MR 経路活性化

スで観察された高脂肪食誘導性肥満に対する腸内細菌のが示唆された．MR 拮抗薬，Rac1 阻害薬によりこれら影響を評価するために，抗生物質処置することで腸内細の所見は改善された．

菌の影響を消失したマウスを作出した．これまでと同様【考察】に，４週齢から３ヶ月間，高脂肪食負荷による肥満を誘

本研究を通して DKD の新たなモデルマウスとして導した．その際，抗生物質カクテル（アンピシリン，ネUNx-HS db/db マウスを確立した．UNx-HS db/db マ

オマイシン，バンコマイシン及びメトロニダゾール）を

ウスは，これまで一般的な糖尿病マウスでは認められ自由飲水で摂取させ，肥満発症に及ぼす影響を評価した．

なかった高血圧を呈し，顕著なアルブミン尿，DKD に【結果】特徴とされる糸球体結節性病変を伴っていたため，ヒ

若齢期における腸内細菌解析の結果，野生型と GLP-1

ト DKD に近い病態を示している可能性が考えられた．

受容体遺伝子改変マウスの間で顕著な差は認められな

UNx-HS db/db マウスを用いた検討により，糸球体でかった．加えて，抗生物質処置による高脂肪食負荷誘導の Rac1-MR 経路活性化と，遠位ネフロンでの Rac1-性肥満への影響もまた，野生型と GLP-1 受容体遺伝子

MR 経路活性化によってもたらされる血圧上昇の両者

改変マウスの両方で，体重増加が抑制された．

が DKD の進展に重要な役割を果たしていることが明【考察】らかとなった（Hirohama et al.: Hypertension 2021,
publish ahead of print）．

本研究によって，GLP-1 受容体遺伝子改変マウスの肥満に伴う腸内細菌の及ぼす影響は微弱であることが示唆された．しかしながら，別のグループの研究報告

腸内環境変化に着目した肥満症に関する基礎的研究
宮

本

潤

基
（東京農工大学大学院農学研究院）

で，無菌マウスの GLP-1 分泌は顕著に亢進していることが報告されていること (Wichmann et al., Cell Host

Microbe. 2013)，そして，GLP-1 受容体遺伝子改変マ
ウスは若齢期の段階で，体重が軽いことに着目し，今後，胎児期や乳児期における GLP-1 シグナルが，生後に伴【目的】
これまでの研究で，食事脂質由来腸内細菌代謝物群

う肥満や腸内細菌の定着などと関与している可能性を明らかにする．

が腸管ホルモンでインクレチンの一つである GLP-1【文献】(glucagon like peptide-1) の分泌亢進を介して，生体

１）Miyamoto, J., Igarashi, M., Watanabe, K.,

120

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

Karaki, S.I., Mukouyama, H., Kishino, S., Li, X.,

そこで，注目したのが低分子化合物である．低分子化

Ichimura, A., Irie, J., Sugimoto, Y., Mizutani, T.,

合物はコスト，安全面，簡便さから臨床応用に向け優れ

Sugawara, T., Miki, T., Ogawa, J., Drucker, D.J.,

た選択肢と考えられる．低分子化合物のライブラリーのArita, M., Itoh, H. & Kimura, I.: Gut microbiota

中から用いて，マウス新生児期および成体期線維芽細

confers host resistance to obesity by metaboliz-

胞から心筋細胞への誘導を促進する化合物を網羅的に

ing dietary polyunsaturated fatty acids. Nat

探索した．その結果，これらの細胞で心筋誘導を顕著にCommun. 10, 4007 (2019).

改善するとして，日常臨床で汎用されている非ステロイ
ド性抗炎症薬ジクロフェナクを同定した（Muraoka N,

低分子化合物による新生児期及び成体期線維芽細胞
からの心筋直接誘導促進
村

岡

直

人

Nature Commun）．そのメカニズムとして，加齢に伴い線維芽細胞においてシクロオキシゲナーゼ -2，プロス
タグランジン E2/ プロスタグランジンＥ受容体４，インターロイキン -1β/インターロイキン１受容体タイプ（ワシントン大学医学部）

１経路により炎症及び線維化が活性化していること，また，シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるジクロフェナク

再生能力の限られている心筋細胞は，障害を受けるとはこの経路を抑制することにより活性化されている炎症

失われ，線維芽細胞に置換されることで，心機能は低下

さらには線維化特性を抑え，心筋誘導を改善することをしていく．多能性幹細胞由来心筋細胞の移植は心筋再生明らかとした．

の代表的な手法として大きく期待されているが，その使用には多能性幹細胞の残存による腫瘍形成のリスク，移植心筋細胞の生着率などの課題が残されている．一方で，心臓に内在する線維芽細胞をその場で直接，高率に心筋細胞に転換できればこれらの問題を解決できる．こ遺伝性大動脈瘤・解離症の病態生理の探索と創薬に向けたトランスレーショナルリサーチ
八

木

宏

樹

（東京大学医学部附属病院医学系研究科）

れまでの研究により心筋特異的転写因子である Gata4/
Mef2c/Tbx5 (GMT) ま た は GMT/Msep1/Myocd を 導入することでマウスの in vitro, in vivo, さらにはヒト細【目的】

胞で線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導することが可能

遺伝性胸部大動脈瘤・解離症の代表疾患であるマルファとなった（Ieda M, Cell, Inagawa K, Circ Res, Wada

ン 症 候 群（MFS） はフィブリリン 1 をコードする FBN1

R, PNAS, Yamakawa H, Stem Cell Rep, Miyamoto

遺伝子の変異によって大動脈瘤などを生じる常染色体

K, Cell Stem Cell）． ま た， 心 筋 細 胞 で 高 発 現 す る

優性遺伝の全身性結合織病である．その病態形成には

miR-133 によりマウス及びヒト線維芽細胞からの心筋

TGF-βシグナルの過剰な活性化が深く関与している．ロ

誘導効率が改善すること，
そしてそのメカニズムとして，

サルタンは TGF-βシグナルの過剰な活性化を抑制するこ

上皮間葉移行のマスター因子である Snai1 を miR-133とで大動脈瘤に対する治療効果が期待されたが，無作為が直接抑制することで線維芽細胞の特性を消去し，心化比較対照臨床試験ではβ遮断薬を上回る効果が得られ筋誘導が促進されることを明らかとした（Muraoka N,

なかった．本疾患の問題点は，原因遺伝子が同定されてEMBO J）．しかしながら，従来の心筋直接誘導法は胎いるにもかかわらず，FBN1 遺伝子変異により大動脈瘤

児期の線維芽細胞においては高効率であるものの，臨床が形成される分子病態については依然として不明な点が多で治療対象となる小児期及び成体期の線維芽細胞では効く残され，有効な治療法が確立されていないことである．

率が低いという課題があった．さらに，この加齢や老化

我々は，MFS 患者と Fbn1C1039G/＋ マウスの大動脈組に伴って心筋誘導効率が低下するメカニズムは不明で織を用いて，活性酸素種 (ROS) が血管全層で亢進し，あった．

血管内皮細胞（vECs）において ROS の産生起源である

121

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

キサンチンデヒドロゲナーゼ（Xdh）の遺伝子発現，キたところ，p38-MAPK と focal adhesion kinase (FAK)

サンチンオキシドレダクターゼ (XOR) の蛋白発現と活のリン酸化が有意に亢進した．また HAEC に低浸透圧性が有意に亢進していることを見出してきた．血管内皮

刺激と伸展刺激をしたところ FAK，p38-MAPK のリン

特異的 Xdh ノックアウト Fbn1

マウスを作成し，

酸化とともに Egr-1, XOR の発現が有意に亢進した．低或いは Fbn1C1039G/＋ マウスに XOR 阻害剤（フェブキソ

浸透圧刺激をした HAEC に FAK 阻害剤や p38 阻害剤，

スタット）を投与したところ，共に大動脈径の拡大が有Egr-1 をノックダウンしたところ，XOR の発現上昇が意に抑制され，細胞内シグナル伝達系である Smad2 と抑制された．

ERK1/2, p38-MAPK のリン酸化の亢進が減弱した．以【考察】

C1039G/＋

上から，MFS の大動脈瘤形成に vECs の XOR が重要

MFS の大動脈瘤形成において vECs に端を発したメな役割を果たしていることが明らかとなった．さらに，

カニカルストレスの異常応答に伴う XOR の過剰発現とMFS 患者と Fbn1C1039G/＋ マウスの大動脈でメカニカル

ROS が重要な要因であることを初めて見出した点で画ストレス転写因子の Egr-1 が有意に上昇していたことか期的であり，新たな分子標的治療を提唱できる可能性がら，FBN1 遺伝子変異に伴う vECs のメカニカルストレ示唆された．

ス応答異常が XOR 活性を上昇させると仮説を立て，以下の実験を試みることとした．
【方法】

Fbn1C1039G/＋ マ ウ ス の 大 動 脈 に 横 行 大 動 脈 縮 窄 術

生体膜リン脂質の “質” 制御による血管内皮機能調（TAC）で圧負荷をかけ，或いはヒト大動脈内皮細胞

節戦略（HAEC）に低浸透圧刺激と伸展刺激をし，XOR の発現

柳

田

圭

介

（国立国際医療研究センター研究所）とシグナル伝達系がどのように変化する検証する．
【結果】

Fbn1C1039G/＋ マウスの大動脈に TAC で圧負荷をかけ【目的】
申請者は生体膜リン脂質中の脂肪酸の「質」の変容が成人病リスクや進行に関わる可能性を考えている．本研
究では，マウスの生体膜リン脂質脂肪酸組成を遺伝学的に in vivo レベルで操作し，血管機能検証や成人病モデ
ルにおける病態観察により，「血管内皮細胞リン脂質の“質” の違いによるその機能変容」仮説を検証する．
【方法】
本年度はまずリゾリン脂質アシル基転移酵素群欠損マ
ウスのうち，８種類の酵素欠損マウスを用いて，血管新生における機能について検証を行った．具体的には６日
齢マウスの網膜の血管内皮細胞やペリサイト，血管平滑筋細胞の染色を行い，その血管構造について比較を行った．
【結果】検討したリゾリン脂質アシル基転移酵素遺伝子欠損マ

図マルファン症候群の大動脈瘤形成における新
たな分子メカニズム

ウス 8 系統のうち 6 系統については著明な変化が認められなかった．一方，酵素遺伝子ＸおよびＹの欠損マウスにおいて血管新生異常が認められた．具体的には，遺122

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

伝子ＸおよびＹのいずれの欠損マウスにおいても，対照病態生理におけるドパミンシグナルの役割を解明すると群である野生型マウスに比較し血管網の進展が遅延してともに，D1R を介した心不全の新規治療法の開発をすおり，また分岐数も減少していた．一方，ペリサイトにることである．

よる被覆や動静脈分化についてはいずれの系統において【方法・結果】

も異常は認めなかった．網膜血管内皮細胞のリン脂質脂心不全時に増加する D1R を in situ hybridization 法肪酸組成については現在検討中であるが，単離脳血管内で評価したところ，D1R は心筋細胞で増加していた．

皮細胞を用いたリピドミクス解析により，ＸおよびＹ欠

そこで心筋特異的に D1R を欠失するマウスを作成した

損マウスにおいてそれぞれ特定の脂肪酸を含有するリンところ，圧負荷心不全時の心室性不整脈が抑制され，生脂質が減少していることが確認された．これらの遺伝子

存率も改善した．他方，心筋特異的に D1R を過剰発現

が血管新生に関わるその責任細胞を同定すべく，遺伝子すると心室性不整脈は増加した．以上より，心不全時にＸについては ﬂox マウスを用いて，血管内皮細胞およ増加する心筋 D1R は致死的心室性不整脈の発症に寄与

びペリサイト特異的欠損マウスの作製を開始した．

すると考えられた．不整脈発症の機序として心筋細胞【考察】

内の Ca2+ handling 異常が知られるため，培養心筋細以上の遺伝子欠損による in vivo リン脂質脂肪酸組成

胞に D1R を強制発現させたところ D1R は細胞内 Ca2+

操作アプローチにより，リン脂質脂肪酸組成変動が血管

handling に異常をきたし，その機序としてリアノジン

新生に影響しうることが示された．今後，リン脂質脂肪受容体のリン酸化が関与していることが示唆された．さ酸の質が血管新生やその他の血管機能に影響するその分らに，東京大学医学部附属病院及びコロラド大学附属病子メカニズムに迫るとともに，糖尿病や脂質代謝疾患を院の２施設において心筋症患者より採取した心筋の遺はじめとする病的な背景において血管のリン脂質の脂肪

伝子発現解析を行ったところ，持続性心室頻拍の既往

酸の質が如何に変動するかを明らかにし，リン脂質脂肪あるいは植込み型除細動器を持つ患者群 において特に酸の質をターゲットとした血管病変の治療戦略の開発へ

D1R の発現が増加しており，ヒト心臓でも同様の表現とつなげていきたい．

型をとることが確認された．研究者は以上の結果をまとめ，2020 年８月 Nature Communications 誌に報告した．（Nature Communications. Cardiac dopamine D1

ドパミンシグナルを介した心不全の新規病態生理の解明と治療法の開発
山口敏

Receptor Triggers Ventricular Arrhythmia in Chronic
Heart Failure. Toshihiro Yamaguchi et.al. DOI 10.
1038/s41467-020-1812-x）

弘【考察と今後の展望】（東京大学医学部附属病院）

本研究の結果，心筋 D1R は慢性心不全治療薬の新たなターゲットとして期待できることが明らかとなった．

【背景】

さらにヒト臨床応用へと進めるべく，現在 Yale 大学

従来の心不全の基礎研究では「モデル動物とヒトとのPET center と共同して，D1R トレーサーの開発及び評

種差及び心不全の病態の差異」が臨 床応用を妨げる重価系を樹立し，マウスの予備実験を経て，ヒト臨床試験

要な課題となってきた．我々は，ヒト心不全及び圧負荷へ進めるための予備実験を行っている．また，心不全にモデルマウスのいずれの心臓においても発現が著増する

おいて心臓 D1R が発現上昇しているメカニズムを明ら共通の遺伝子としてドパミン受容体 D1 (D1R) を同定しかとするために，心不全時の心臓 D1R の転写因子モチーている．

フ解析によって抽出したファクターに着目した検証実験【目的】に引き続き取り組んでいるところである．

本研究の目的は，種を超えた心不全の本質的な病態形
成に心臓 D1R が寄与するという仮 説のもと，心不全の123Vascular Biology Innovation に関する研究助成【考察】
血管壁の機械刺激応答と病態形成を誘導するシグナ
ル分子の解析
山

城

これらの結果から，細胞外マトリクスの刺激と細胞表面受容体 PAR1 の活性化が，大動脈瘤発生に関与してい義人（筑波大学生存ダイナミクス研究センター）

ることを明らかにしました．また，メカ二カルストレス
応答の中心を担う，YAP の活性化が細胞外マトリクスを介して制御されていることを明らかにしました．さら【目的】
血管壁は絶えずメカニカルストレスに晒されており，に，Thbs1/YAP のシグナル伝達経路は，血管病態の発生にも重要な働きを示すことを明らかにしました．

その制御機構の破綻が血管疾患の根本原因ではないか【文献】と注目されています．本グループはこれまでに，大動１）Yamashiro, Y. et al.: Abnormal mechanosensing

脈瘤において，メカニカルストレス応答異常と細胞骨格

and coﬁlin activation promote the progressionのリモデリングが瘤の形成に重要な役割を担っているof ascending aortic aneurysms in mice. Sci. Sig-こ と１）， 大 動 脈 瘤 病 変 で Thrombospondin-1 (Thbs1)

nal. 8(399): ra105, 2015.

と Thbs1 の 発 現 を 制 御 す る 転 写 因 子 Early growth２）Yamashiro, Y. et al.: Role of thrombospondin-1

response 1 (Egr1) が過剰に発現していること，またin mechanotransduction and development of

Thbs1 の抑制が大動脈瘤発症の抑止に効果的であるこ

thoracic aortic aneurysm in mouse and humans.

とを示してきましたが２），血管のメカノトランスダク

Circ. Res. 123(6): 660-672, 2018.

ション機構における細胞外マトリクスや細胞表面受容体３）Shin, SJ., Hang, HT., Thang, BQ., Shimoda,の役割と，血管疾患発症の分子メカニズムの詳細は明ら

T., Sakamoto, H., Osaka, M., Hiramatsu, Y.,

かにされていませんでした．

Yamashiro, Y*. & Yanagisawa, H*.: Role of【方法・結果】

PAR1-Egr1 in the initiation of Thoracic Aortic

Egr1 の欠損マウスを作成し，大動脈瘤の抑制効果

Aneurysm in Fibulin-4 deﬁcient mice. Arterio-を検証したが，部分的な効果しか認められなかったた

scler. Thromb. Vasc. Biol. 40(8): 1905-1917,

め，大動脈瘤の初期シグナルとしてʻ別の分子の関与が2020. *責任著者示唆された．遺伝子発現解析と相互作用解析の結果か

４）Yamashiro, Y*. et al.: Matrix mechanotransduc-ら，プロテアーゼ活性化型の受容体 Protease activatedtion mediated by thrombospondin-1/integ-

receptor 1 (PAR1) がマウスやヒトの大動脈瘤血管壁でrin/YAP signaling pathway in the remodeling

高発現していることを見出した．マウス大動脈瘤モデル

of blood vessels. Proc. Natl Acad. Sci. USA.

においては，PAR1 は大動脈瘤発生の初期から発現亢進117(18): 9896-9905, 2020. *責任著者

しており，PAR1 が Egr1-Thbs1 のシグナルを制御する事を見出した３）．また，伸展刺激において分泌されるタ
ンパク質を網羅的に解析し，Thbs1 を含む，85 つのタ
ンパク質を同定した．分泌された Thbs1 は，integrin
αvβ1 と結合し，転写調節因子 Yes-associated protein(YAP) の核内移行（活性化）を制御する事を見出した．

分岐鎖ケト酸とその代謝酵素に着目した肥満症に対する新規治療薬の開発
吉

田

尚

史
（神戸大学大学院医学研究科）

さらに，マウスを用いた解析において，Thbs1 欠損マ
ウスは，横行大動脈縮窄術（TAC）による圧負荷により，肥満に起因する多くの疾患が増加しており社会問題と血管の破裂・解離を引き起こす一方，頸動脈狭窄術によなっているが，肥満そのものに対する治療法は，限定的る新生内膜の形成時に，新生内膜細胞の増殖を抑制するな抗肥満薬や外科手術しか存在しない．近年，腸内細菌ことを明らかにしました４）．

が肥満の発症に関与する事が数多く報告されており，腸124

Vascular Biology Innovation に関する研究助成

内細菌への介入による肥満治療の開発が期待されていする指標である P-BCKDHA/BCKDHA 比で検討を行っる．我々は既に，ヒトとマウスの 1000 種類に及ぶ血漿た（図1A）．

メタボロミクスにおいて，分岐鎖アミノ酸（BCAA）と【結果】

その cognate である分岐鎖ケト酸（BCKA）が体重と強１．SPF マウス-普通食飼育下では，週齢があがり体重

く正に相関する唯一の共通代謝物である事を同定した．

が増加しても，褐色脂肪組織における P-BCKDHA/BCAA/BCKA は褐色脂肪組織でエネルギーとして利用

BCKDHA 比の変化は認めなかった（図1B）．

される事で熱産生能が高まり，肥満の抑制に繋がる事が

２．SPF マウス-高脂肪食飼育下では，体重依存的に，既に報告されているが，腸内細菌が，遠隔臓器である褐

褐色脂肪組織における P-BCKDHA/BCKDHA 比が色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝に与える影響は未だ解増加した（図1C）．

明されていない．

３．無菌マウス-高脂肪食飼育下では，体重依存的に，褐色脂肪組織における P-BCKDHA/BCKDHA 比が【目的】
本研究の目的は，腸内細菌と褐色脂肪組織におけるBCAA/BCKA 代謝の関連を解明する事である．これに劇的に増加した（図1D）．
４．我々が同定した動脈硬化抑制腸内細菌

Bacteroi-より，プロバイオティクスを含む肥満症に対する新規治

des” を SPF マウス-高脂肪食飼育下に投与すると，療の開発が期待される．

腸内細菌叢が大きく変わり，体重増加が抑制され【方法】(図1E)，褐色脂肪組織における BCAA/BCKA が低

SPF マウスと無菌マウス（共に野生型）を用いた動物実験を行った．褐色脂肪組織における BCAA/BCKA 代
謝は，同代謝の律速酵素である BCKDH の活性を反映下した（図1F）．
【考察】
結 果 1-3 か ら は， 腸 内 細 菌 叢 は 褐 色 脂 肪 組 織 の
BCAA/BCKA 代 謝 に 保 護 的 に 働 い て お り， 高 脂 肪 食
負荷に伴う腸内細菌叢の異常が褐色脂肪組織におけるBCAA/BCKA 代謝を停滞させる一因である事が示唆された．さらに結果 4 では， Bacteroides は肥満において停滞する褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝を亢進させる役割があり，それにより抗肥満効果を発揮する事が示唆された．これらの事から，腸内細菌が褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝を制御する環境因子である事が分かった．2021 年度は，腸内細菌がどのように褐色脂肪組織の BCAA/BCKA 代謝を制御しているのかについて，解明を試みたい．

心血管系分化における BMP-Smad シグナルの役
割の解明
閔

庚

徳
（国立循環器病研究センター）

図１

BCAA/BCKA 代謝経路と各マウスにおける褐色脂肪組織の P-BCKDHA/BCKDHA 比，および，Bacteroides 投与による変化【目的】
心臓発生を正常に進めるにあたっては緻密な分化過程の制御が重要であり，BMP シグナルは中心的役割

125

Vascular Biology Innovation に関する研究助成をになっている．BMP シグナルの細胞内シグナルはクダウンで Smad9 が蓄積し，Tbx2 シグナルが過剰と

Smad1/5/9 の３種類が担っているが，このうち Smad9なることで心筋細胞分化が抑制される可能性が示唆されの役割については，ほとんどわかっていない．本研究でた．

は Smad9 を介した BMP シグナルが担う心血管分化における役割を解明することを目標とした．
【方法】
Smad9 の結合タンパクの同定し，心臓分化への影響をゼブラフィッシュモデルで検討した．また転写因子である Smad9 の標的遺伝子を同定しその働きについて解
析した．
【結果】

In silico で Smad9 の結合タンパクとして新規 E3 リ
ガーゼである Asb2 を発見した．Asb2 は Smad9 と結合し，Smad9 をユビキチン化し分解に導くことが示された．In situ にて Asb2 はマウス発生初期においては心臓にきわめて限局した発現を示すことが分かった．心臓分化の解析のため行ったゼブラフィッシュモデルでは，
Smad9 のノックダウンでは表現型が見られなかったが，Asb2 のノックダウンでは拡張型心筋症様の表現型が認められたことから，Smad9 の蓄積は正常な心臓分化を阻害すると考えられた．実際に Smad9 を過剰に発現す
る P19CL6 細胞を作成すると，野生型にくらべ心筋細胞への分化が抑制された．同細胞を用いて Smad9 の標的遺伝子を検索したところ，心臓分化に重要な Tbx2 遺伝子が Smad9 によって誘導されることがわかった．先に示されたゼブラフィッシュの Asb2 ノックダウンモデ
ルでは，Tbx2 過剰発現によると考えられるアルシアン
ブルー染色陽性で示される結合織増生などの心筋組織表
現型が確認された．
【考察】
我々の研究結果から，心臓発生のごく早期の段階でAsb2 による Smad9 の量的制御が行われている可能性が示唆された．Smad9 の量的抑制はなんら表現型を示さない一方，Smad9 の蓄積は心筋細胞分化を抑制し正常な心臓発生を阻害していた．このことは，Smad1/5
による Redundancy が存在する一方，Smad9 の過剰な転写促進は心臓発生を抑制することを示唆していた．さらに我々の結果からは Smad9 が Tbx2 を誘導している
ことが示された．Tbx2 は心筋細胞分化を抑制し非心筋組織への分化を誘導することが知られており，Asb2 ノッ

126

研究報告

全身性炎症疾患の病因
・病態の解明に関する研究助成
全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成【結果】
血 中 エ ク ソ ソ ー ム 由 来 miRNA 解 析 に よ る ベ ー
チェット病のバイオマーカーの探索
石戸みづほ

BD 患者群において有意に変動するエクソソーム由来の miRNA を複数同定した．また，特定の臨床症状と特異的に相関を示す miRNA も複数同定した．

（横浜市立大学医学部）【考察】
本研究により同定された miRNA は，BD のバイオマー【目的】

カーとなる可能性が考えられ，BD の早期診断およびベーチェット病（BD）は全身の諸臓器に急性の炎症

BD の臨床症状分類といった臨床医学への応用に繋がるを繰り返す原因不明の難治性疾患である．BD は口腔内ことが期待される．本研究で同定した miRNA の発現量

アフタ性潰瘍，眼症状，皮膚症状，外陰部潰瘍を主症状

変動の再現性を評価し，BD の診断に有用な真のバイオとし，しばしば関節炎，精巣上体炎，消化器症状，血管マーカーを特定するため，今後新たな BD 患者および健病変，中枢神経病変などの副症状を伴う．BD の発症に常者を用いて追認試験を実行する予定である．

は，遺伝要因と環境要因が複合的に関与していると考えられているが，その全容は未だ明確ではない．BD の眼症状は重篤な視力障害をしばしば引き起こし得るとともに，BD の特殊型症状は生命予後に大きな影響を及ぼすため，早期診断・早期治療が必要とされる．

炎症性腸疾患における IFN-1 誘導性細胞死制御機
構の解明
伊

藤

剛
（東京医科歯科大学高等研究院）

近年，エクソソーム由来の分子（主にマイクロ RNA（miRNA））が癌を含む様々な疾患のバイオマーカーとして有用であることが報告されているとともに，エクソ【目的】

ソーム由来の分子をターゲットとした治療薬の開発もIBD の発症・再燃因子の一つとしてウィルス感染等を行われている．したがって本研究では，BD 患者のエク契機としたＩ型インターフェロン（IFN-1）を中心としソソーム由来 miRNA を対象に網羅的な発現解析を実行
し，BD に特異的なエクソソーム由来 miRNA（バイオマーカー候補）を探索する．また，BD の各臨床症状と特異的に相関するエクソソーム由来の miRNA の探索も行い，BD の早期の臨床症状診断・予後予測の確立を行う．
【方法】
日 本 人 BD 患 者 20 例 と 日 本 人 健 常 者 20 例 か ら 採取した血液から分離した血漿を実験試料とした．血漿から単離したエクソソーム由来の miRNA を対象に，
SurePrint miRNA マイクロアレイ（Agilent 社）を用いて，ゲノム全域に位置する miRNA の網羅的な発現解析を実行した．

図１

これまでに明らかにした大腸炎の新たな憎悪機構

127

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

た免疫応答があるが，腸上皮における IFN-1 応答の意義・【方法】

役割の詳細は明らかでない．また IBD の疾患感受性遺本研究では JAK-STAT 経路，細胞死（アポトーシス・

伝子の一つとしてオートファジー関連遺伝子 Atg16L1

ネクロプトーシス）経路の遺伝子変異・欠損マウスからが同定されている．我々は IFN-1 受容体の阻害により，作成した腸上皮オルガノイドを用いて解析を行う．細胞Atg16L1 欠損マウスにおける IL-22 を介した DSS 腸炎

死応答の定量的・網羅的評価には FACS, Western Blot,の増悪が抑制されることを報告した（図１）．以上から

RNA-Seq などを用いる．

腸上皮におけるオートファジーと局所炎症の惹起・遷延【結果】に繋がる IFN-1 応答に焦点を当て，その分子機構の全貌を明らかにすることを目的とする．

IFN-1 は腸上皮細胞において細胞死を誘導すること，同作用は Atg16L1 欠損腸上皮で著しく増幅・促進されることを明らかとした（図２）．次に細胞死制御におけるキー分子の一つである RIP1 に着目し，RIP1D138N（RIP キナーゼ不活化）マウスと Atg16L1 欠損マウスを交配し解析を行った．RIP1D138N オルガノイドはIFN-1 誘導性細胞死に抵抗を示し，Atg16L1 欠損下における細胞死増強作用も抑制することを明らかとした．
また RNA シークエンスの結果，Atg16L1 欠損により細胞周期に関わる遺伝子の発現は低下するが，RIP1 キ
ナーゼ不活性化により改善を認めることを明らかとした（図３）．
【考察】
細胞内オートファジーが障害された環境では IFN-1
応 答 が 増 強・ 促 進 さ れ る こ と か ら， 腸上皮におけるIFN-1-オートファジー相互作用が，炎症性腸疾患の病態

図２

腸上皮において IFN-βは細胞死を誘導する

図３

128

RIP1 は IFN1 誘導性細胞死・増殖のmaster regulator

図４

まとめ

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成において重要な役割を担っていることが考えられ，同作から筋線維芽細胞への分化やその後の細胞外基質の産生用において RIP1 キナーゼ活性が重要な役割を果たしてを促進して線維化が生じ，血管平滑筋細胞の増殖や血管いる可能性が示唆された（図４）．

の破壊・減少による顕著な血管障害が認められる．上皮【文献】

細胞や内皮細胞が段階的に移行して，上皮または内皮細１）Welz, L., Ito, G., Aden, K. et al.: Epithelial

胞と間葉系細胞の両方の性質を様々な程度に併せ持つハ

XBP1 coordinates TP53-driven DNA damage

イブリッド移行細胞の存在することが方臆されている．

responses and suppression of intestinal carcino-

我々は，全身性強皮症の病態形成において上皮細胞や血genesis. Gastroenterology. Sep 29: S0016-5085

管内皮細胞の間葉系細胞への移行が重要ではないかと考(21) 03606-4 (2021).

え，1200 種類以上の化合物の中から TGF-βによる上皮

２）Kuno, R., Ito, G., Okamoto, R. et al.: Notch and

間葉移行を強く抑制する化合物をスクリーニングし，いTNF-α signaling promote cytoplasmic accumula-

くつかの候補を見出すことに成功した．今回はその候補

tion of OLFM4 in intestinal epithelium cells and

薬剤の中でもすでにヒトへの投与試験が行われ，生体内

exhibit a cell protective role in the inflamedの安全性が非常に高い化合物である LG283 に関して検mucosa of IBD patients. Biochem Biophys Rep.

討を行った．

Jan, 11; 25: 100906 (2021).

【方法】

３）Tsuchiya, M., Ito, G., Okamoto, R. et al.: Func-

TGF-βで刺激した培養ヒト皮膚線維芽細胞の増殖・

tional analysis of isoflavones using patient-

遊走・分化・活性化，線維芽細胞からの細胞外基質の産derived human colonic organoids. Biochem Bio-

生能，線維芽細胞での TGF-βの発現や Smads やそれ以

phys Res Commun. Jan, 20; 542: 40-47 (2021).

外のシグナル伝達分子のリン酸化に対する LG283 の抑４）Stengel, ST., Ito, G., Rosenstiel, P. et al.: Activat-

制作用を検討した．同様にヒト上皮細胞を TGF-βで刺ing Transcription Factor 6 Mediates Inﬂamma-

激した際にみられる間葉系細胞への移行を LG283 が抑tory Signals in Intestinal Epithelial Cells Upon

制するか検討した．さらに TGF-βによる培養ヒト血管

Endoplasmic Reticulum Stress. Gastroenterol-

内皮細胞の内皮間葉移行を誘導する際に LG283 を添加

ogy. Oct; 159(4): 1357-1374 (2020).

し，血管内皮と間葉系マーカー，内皮間葉移行に関与す

５）Aden, K*., Tran, F*., Ito, G*., Rosenstiel, P. etる転写因子の発現を確認した．最後にマウスにブレオマ

al.: ATG16L1 orchestrates interleukin-22 signal-

イシンを連日皮下注射して真皮の線維化を誘導した．こ

ing in the intestinal epithelium via cGAS-STING.

のモデルに LG283 を経口投与することで生体での抗線

J Exp Med . 5; 215 ( 11 ) : 2868-2886 ( 2018 )維化作用や副作用を確認し，作用機序を詳細に解析した．

(*equal contribution)

全身性強皮症病態における上皮・内皮間葉転換阻害に関する検討宇都宮慧（福井大学医学部）【目的】
全身性強皮症は，皮膚や内臓諸臓器の線維化と血管障害を呈する膠原病である．先行して局所に浸潤するマク
ロファージなどが産生するサイトカインが，線維芽細胞129

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

デスなどの研究により，リツキシマブ投与後に残存する【結果】
TGF-βで刺激した培養ヒト皮膚線維芽細胞とコラー

わずかなＢ細胞は，この治療抵抗性に関わる重要な一因

ゲ ン や フ ァ イ ブ ロ ネ ク チ ン １ の 発 現 が 増 加 す る が，と考えられるが，これまで single B cell を蛋白質レベ

LG283 を加えると mRNA，タンパクレベルでその変化ルで解析する技術はなく，これらのＢ細胞の解析は困難が抑制された．上皮・内皮間質転換において重要な転写であった．

因子 SNAIL1, 2 の発現の上昇が有意に抑制された．さ

本研究の目的は，全身性強皮症（Systemic Sclero-

らに Smad2/3 のリン酸化も抑制された．また，ヒト上

sis；SSc）患者や SSc モデルマウスの末梢血中Ｂ細胞の皮細胞を TGF-βで刺激すると上皮マーカーである E カ

うち，血管内皮細胞と反応する自己応答性Ｂ細胞を単一ドヘリンの発現は低下し，間葉系マーカーであるファイ

細胞解析することである．さらに，その自己応答性Ｂ細ブロネクチン 1，α-smooth muscle actin の発現が上胞中のエフェクターＢ細胞とレギュラトリーＢ細胞との昇した．LG283 を共培養するとその変化は有意に抑制

バランスが，SSc の重症度や治療抵抗性に影響するのかされた．また，線維芽細胞での検討と同様に SNAIL1,を解明する．

2 の発現上昇と Smad2/3 のリン酸化も有意に抑制され【方法】

た．さらに内皮細胞に間葉転換を誘導した際に発現の低マイクロチャネル内で，ヒトまたはマウスの血管内皮

下する内皮細胞マーカーの CD31，発現の上昇する間葉系細胞を培養し，毛細血管モデルを構築した．そこに SSc

マーカーのファイブロネクチン１の変化は LG283 により有患者またはトポイソメラーゼＩ誘発 SSc モデルマウス

意に抑制された．ブレオマイシンによる強皮症モデルではのＢ細胞を導入した．血管内皮細胞と結合できるＢ細胞

コントロール群に比較し LG283 を投与した群では皮膚の内は，マイクロチャネル内の血管内皮細胞に付着した状

肥厚，線維化が有意に抑制された．また，Smad2/3 の態となる．

リン酸化と SNAIL1，２の上昇が有意に抑制された．

このＢ細胞の回収し，個々に刺激して放出された自己抗体やサイトカインの産生量を，マイクロ流路 ELISA【考察】
今回の成果や知見を統合すると，LG283 は TGF-βにシステムを利用して測定した．

よる上皮間葉移行を抑制する化合物としてスクリーニン

また，血管内皮細胞と接着したマウスＢ細胞を回収グされたが，TGF-βのシグナル制御などにより局所のし，これらを他の野生型マウスに移植してからトポイソ

線維芽細胞からのコラーゲン産生，内皮間葉移行などをメラーゼＩ誘発 SSc モデルマウスを作成した．これら抑制することで，強皮症のモデルマウスの皮膚の線維化のマウスについて，背部皮膚や肺の組織学的評価を行っを抑制したと考えられた．

た．同様の評価を，抗 CD20 抗体のみを投与したマウス，
抗 BAFF 受容体抗体のみを投与したマウス，双方を投マイクロ空間-微小血管モデルを用いた強皮症におけるＢ細胞の病原性解析
江畑慧（東京大学医学部附属病院医学部）与したマウス，コントロールのみを投与したマウスの４群でも再度行った．
【結果】
SSc 患者やトポイソメラーゼＩ誘発 SSc モデルマウ
スでは，それぞれ健常人やコントロール群のマウスと比べて，マイクロ血管モデル内で多くのＢ細胞が血管内皮【目的】

細胞に接着した．この傾向は，線維化の程度が強く重症

Ｂ細胞は全身性強皮症（systemic sclerosis; SSc）で度が高い SSc 患者や SSc モデルマウスで顕著であった．

中心的な役割を果たし，我々の施行した医師主導治験

これらのＢ細胞をマイクロ ELISA で単一細胞解析した（DesiReS 試験）では，リツキシマブの強皮症に対するところ，抗血管内皮細胞抗体や抗トポイソメラーゼＩ抗高い効果が示されている．しかし，リツキシマブに対し体を産生する，自己応答性Ｂ細胞の比率が高かった．

治療抵抗性を示す症例も存在する．全身性エリテマトー

130

この自己応答性Ｂ細胞の亜集団は，血管内皮細胞との全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

接着力が強い集団（強接着Ｂ細胞）と接着力が弱い集にマウスモデルで抗 CD20 抗体と抗 BAFF 受容体抗体

団 ( 弱接着Ｂ細胞 ) とに分けることができ，このうち強を併用することで皮膚や肺の著明な線維化改善効果が確

接着Ｂ細胞の数が重症の SSc 患者や SSc モデルマウス

認されたことにより，血管内皮細胞との反応性が強い病では増加していた．弱接着Ｂ細胞は抗炎症サイトカイン

原性のＢ細胞を効率的に除去し，血管内皮細胞との反応

IL-10 を産生するものが多かったのに対して，強接着Ｂ

性が弱い制御性のＢ細胞との比率を拡大させないことが細胞は炎症性サイトカイン IL-6 を産生するのに加えてSSc に対する新たな治療戦略になりうることが初めて示

抗トポイソメラーゼＩ抗体産生量や BAFF 受容体発現された．

量が増加していた．
続いて，強接着Ｂ細胞を移植してからトポイソメラー
ゼＩによる誘発を行ったマウスでは，対照群と比較して皮膚や肺の線維化が増悪した．逆に，弱接着Ｂ細胞を移植した場合では，線維化の程度は抑制された．また，強腸管マクロファージにおける IL-1R を介した IL-10
産生機序の解明黒沼智（北里大学北里研究所病院）

接着Ｂ細胞の亜集団は抗 CD20 抗体によるＢ細胞除去に抵抗性を示したが，抗 BAFF 受容体抗体を併せて投与すると，効率的に除去された．さらに，トポイソメラー【背景と目的】

ゼＩ誘発 SSc モデルマウスにおいて抗 CD20 抗体は単

腸管は腸内細菌叢と宿主の免疫担当細胞が常に相互作

独でも線維化病変を改善したが，抗 BAFF 受容体抗体用している特殊な環境である．中でも腸管マクロファーと併用すると線維化抑制効果が増強された．

ジ (Mφ) は中心的役割を果たしている．病原体に対して【考察】

は IL-12 や IL-23 などの炎症性サイトカインを産生する

本研究により，SSc の増悪には血管内皮細胞との反ことで炎症反応を誘導し，病原体を排除する．しかし，応性が強い自己応答性のＢ細胞が関与しており，それその一方で炎症抑制性サイトカインである IL-10 を恒常

らのＢ細胞は IL-6 を産生し，自己抗体の産生量が多く，的に産生することで，腸内細菌や食餌高原に対する過剰BAFF 受容体の発現量が高いものが多いことが明らかにな免疫応答を抑えている．このように腸管の恒常性維持なった．また，これらのＢ細胞は抗 CD20 抗体を投与には腸管 Mφによる恒常的な IL-10 産生が重要な役割をしても他のＢ細胞より相対的に残存しやすく，その残存果たしているが，その産生機序は明らかになっていない．

数が抗 CD20 抗体投与後の治療反応性を予測する因子

我々はこれまで腸管 Mφの IL-10 産生が腸内細菌非になりうることが示された．加えて，血管内皮細胞と強依存的かつ MyD88 依存的であることを明らかにしてく接着するＢ細胞は抗 CD20 抗体投与後にも残存しやきた．また，マウスにおいて他の臓器 Mφに比べ腸管

すいが BAFF 受容体の発現が強いため，抗 BAFF 受容

Mφ特異的に Il1r1 が高発現であったことから，マウス

体抗体を追加投与すると効率的に除去されること，実際

マクロファージ由来細胞株を用いて IL-1R 過剰発現株を作製し検討してきた．IL-1R 過剰発現株に対し，IL-1β刺激を行ったところ Il10 の発現誘導が観察された．
これらの結果を踏まえ，本研究では腸管 MφからのIL-10 産生機序を明らかにするために，作製した IL-1R
過剰発現株を用いて細胞シグナル伝達経路の探索を行う．
【方法】
１）Western Blotting (WB) によるシグナル伝達の検討
IL-1R 過剰発現 RAW264.7cells に LPS, IL-1β刺激を行い，細胞質分画と核分画の蛋白を抽出した．それぞれの蛋白を用いて WB にてシグナル伝達経路の探索を行っ131

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

た．

２）IL-10 産生経路として WB で確認した CREB が関与

２）small interfering RNA (siRNA) による発現抑制

していると考え，siRNA で発現抑制を行い，IL-1 β刺IL-1R 過剰発現 RAW264.7cells に siRNA Negative

激における Il10 の発現を確認したところ，発現上昇がControl (NC) と CREB をトランスフェクションし，IL-1β抑制されていた（図４）．また，IL-10 の産生も抑制さ刺激による Il10 の発現，IL-10 の産生について qPCR,

れており（図５），IL-10 の産生には IL-1β/IL-1R-CREB

ELISA を行った．

が関与している．

【結果】

【考察】

１）Mφの LPS 刺激を介した IL-10 産生について p38,

IL-1β/IL-1R の 下 流 で CREB の リ ン 酸 化 を 介 し て

extracellular single-regulated kinase (ERK), 転写

IL-10 を産生している経路が腸管免疫恒常性の維持に関因子として cAMP-response element-binding pro-

与していると考えられた．今後はクロマチン免疫沈降

tein (CREB) が関与していることが示されており（Chip 法）による免疫沈降による転写因子の同定や臨床

１），それらについて検討を行った．LPS 刺激と同様検体を用いて IL-1R の発現を検証することでヒト IBDに IL-1β刺激にて細胞質分画において p38，ERK

における IL-1R/IL-10 経路の意義について検討する．

のリン酸化，核分画において CREB のリン酸化を【文献】

認めており，これらが IL-1β/IL-1R の刺激経路の１）Margarida, Saraiva. & Anne, OʼGarra.: (2010).

一つと考えた（図1～3）．

The regulation of IL-10 production by immune
cells. Nature Reviews Immunology, 10, 170-181.

図１

LPS, IL-1β刺激による p38 のリン酸化

図２

LPS, IL-1β刺激による ERK のリン酸化

図３

LPS, IL-1β刺激による CREB のリン酸化

132

図４

siRNA CREB による Il10 発現量の変化

図５

siRNA CREB による IL-10 産生量の変化

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成【考察】
全身性強皮症患者の病態における MAIT 細胞の関与
外村香

SSc とくに lcSSc 患者において MAIT 細胞の頻度は低子下していたが，活性した MAIT 細胞と考えられる CD69

（大阪大学大学院医学系研究科）

陽性細胞の頻度が上昇していた．今後 SSc の MAIT 細胞におけるサイトカイン産生，末梢血中サイトカイン濃【目的】
自然リンパ球のサブセットとして主として粘膜や腸間度を測定し，MAIT 細胞と各種サイトカインとの相関がないかどうかについて検討予定である．

膜リンパ節および肝臓に局在する mucosal-associatedinvariant T (MAIT) 細胞が近年発見された．ヒト MAIT

人工多能性幹細胞（iPS 細胞）由来免疫抑制性細胞

細胞は T 細胞受容体としてセミインバリアントα鎖（ヒによるぶどう膜炎軽症化の検討

ト Vα7.2 Jα33）を発現し，MHC class I 関連分子 1(MR1) に提示された微生物由来ビタミン B2 代謝中間産

長谷敬太郎（北海道大学大学院医学研究院）

物を抗原として認識して活性化され，IL-17, IL-10 などのサイトカインを分泌する．抗原特異的なＴ細胞としては非常に大きな集団で様々な免疫応答に関与すると考え【目的】

られる．MAIT 細胞が多発性硬化症，関節リウマチ，全

実験的自己免疫性ぶどう膜炎（EAU）マウスにおけ身性エリテマトーデスなど種々の自己免疫疾患の病態へるマクロファージ様人工多能性幹細胞由来免疫抑制性細の関与が報告されているが，病態の増悪と抑制の両方に胞（iPS-SCs）による免疫抑制効果について検討するた

関与することが知られ，その病態調節は非常に複雑であめる．本研究では，全身性強皮症（以下，SSc）における【方法】

MAIT 細胞の病態形成への関与を解明する．

C57BL/6 マウスの脾臓細胞からＢ細胞を抽出し，レ【方法】

トロウイルスベクターを使用して Oct3/4, Sox2, Klf4,

１）SSc 患者の末梢血における MAIT 細胞の頻度およc-Myc の遺伝子を移入した後に，17 日間培養し，iPS

びその活性化の有無

細胞のコロニーを得た．iPS 細胞にマクロファージコロ

SSc 患者末梢血より単核球を単離し，CD3, CD161,

ニー刺激因子，顆粒球単球コロニー刺激因子，インターTCRVα 7.2 などの蛍光色素で標識した抗体で表面染色

ロイキン（IL）-4 などのサイトカインを順次添加し，26

しフローサイトメトリーにより検出し，MAIT 細胞の頻日間培養し，iPS-SCs を誘導した．この細胞は Sasaki H

度を正常人と比較する．

et al. Transplantation. 2015 で報告されたものであり，

２）SSc 患者の病変皮膚における MAIT 細胞の検出

誘導方法は確立されている．EAU はヒト視細胞間レチ

患者から採取した皮膚を蛍光色素で標識した CD3,ノイド結合タンパク質（hIRBP）由来合成ペプチドをマ

CD161, TCRV α7.2 の抗体を用いて染色し，蛍光顕微

ウスに皮下注射（免疫）することにより，誘導した．そ

鏡にて MAIT 細胞の有無を確認する．

の後，EAU マウスの所属リンパ節から抽出した CD4＋T【結果】細胞の細胞内に蛍光色素を取り込ませ，hIRBP 合成ペ

末梢血中の MAIT 細胞は，SSc 患者全体および限局

プチドとともに４日間培養した後に，蛍光強度をフロー

皮膚硬化型 SSc (lcSSc) において健常人と比較し有意にサイトメーターで計測することにより，Ｔ細胞の増殖率

頻度が低下していた．その中で CD69 陽性細胞の頻度を測定した．培養時に iPS-SCs を添加することにより，が SSc 患者において上昇していた．次に，MAIT 細胞

Ｔ細胞の増殖が抑制されるかどうかについて検討した．

の頻度の異常と SSc 患者における臨床症状との関連に

また，培養後の上清中の炎症に関わるサイトカイン濃度

ついて検討した．消化管病変のない患者で MAIT 細胞

を ELISA で測定し，比較した．さらに，in vivo 実験との頻度が有意に低かった．

して免疫の１日前に iPS-SCs を腹腔内投与し，EAU マ

133

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

ウスの炎症が軽症化するかどうかについて，免疫１週後から 3, 4 日毎に眼底検査を行い，炎症の程度を評価した．
【結果】

慢性腸管炎症により生じる腸管マクロファージのエ
ピジェネティック変化の継代的持続についての検討
和

田

晴

香
（杏林大学医学部）

iPS-SCs は細胞数に応じて，hIRBP に特異的な T 細胞の増殖反応を有意に減少させた．さらに，iPS-SCs は
T 細胞との接着がなくても T 細胞の増殖反応を抑制し【目的】たことから，何らかの液性因子が関与していることが推腸炎状況下で誘導された腸管レジデントマクロファー

察された．また，
培養上清中のヘルパーＴ細胞１型（Th1）ジにおけるエピジェネティック変化の少なくとも一部がサイトカインである腫瘍壊死因子-αとインターフェロ

炎症鎮静後も継代的に残存し，炎症再燃に寄与するのでン（IFN）-γは，
iPS-SCs を添加した群では有意に減少し，はないかという仮説を検証するため，本研究では，以下

抑制性のサイトカインであるトランスフォーミング増殖の３点を目的とした．

因子-βや一酸化窒素や IL-13 は上昇していた．一方で，

目的１：デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘導性腸

培養上清中のヘルパーＴ細胞 17 型（Th17）サイトカ炎により生じるマクロファージにおけるエピインである IL-17A や IL-17F は iPS-SCs を添加した群

ジェネティック変化の評価では有意に上昇していた．In vivo 実験では，iPS-SCs

目的２：DSS 誘導性腸炎改善後のマクロファージにおを事前に投与したマウスの眼底所見では EAU の炎症がけるエピジェネティック変化の評価

有意に軽症化されていた．

目的３：炎症誘導性のエピジェネティック変化のうち炎症改善後も残存する変化の評価【結論】
iPS-SCs は EAU マウスにおいて Th1 による免疫応答を減少させ，炎症を軽症化することが示唆された．

【方法】
SPF 環 境 下 で 腸 管 微 生 物 叢 を 均 一 化 し た ８ 週 齢 の【文献】

C57BL/6 雄マウスを４群（Group 1-4）に分ける（図１）．

Sasaki, H., Wada, H., Baghdadi, M., Tsuji, H., Ot-

Group 2, 4 では DSS による慢性腸炎を誘導し，腸炎時

suka, R., Morita, K., Shinohara N. & Seino, K.: New（Group 2）および腸炎改善後（Group 4）の解析に用Immunosuppressive Cell Therapy to Prolong Sur-いる．それぞれ Group 1, 3 を対照群とする．DSS によvival of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Allografts, Transplantation, 99(11): p. 2301-10 (2015).
本 研 究 成 果 は，Hase, K. et al.: Macrophage-like
iPS-derived Suppressor Cells Reduce Th1-mediatedImmune Response to a Retinal Antigen, Curr EyeRes., Jul 19; 1-9 (2021) に報告した．

図１

本研究における動物実験デザイン

Group 2 および４において (ⅰ)-(ⅲ) のように DSS投与を繰り返す．DSS 投与は１周期あたり DSS 摂取を５日間，通常飲水を７日間とする．Group 3
および４における回復期は 21 日間とする．

134

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

る慢性腸炎誘導後に解剖を行い，各群の比較により炎症了後，Group 1 および２について解剖を行い，肉眼的誘導性のエピジェネティック変化の中で残存するものに

所見上，腸管壁肥厚，腸管長の短縮を認めた（図２）．

ついて検討する．腸管炎症について臨床所見（体重変化，大腸の一部を病理組織学的検討のため採取した後，磁気

糞便の性状）および糞便中 LCN-2 濃度，病理組織学的ビーズ法により大腸粘膜固有層 CD11b 陽性細胞を回収

スコアにより評価する．大腸粘膜固有層のマクロファー

し，DNA を抽出した．16S rRNA 遺伝子シーケンシン

ジにおけるエピジェネティック変化について DNA メ

グ解析，LCN-2 測定のため，糞便を回収した．これら

チル化をビーズアレイ法により解析する．結腸粘膜固の解析は現在継続中である．

有層に存在する細胞を回収し，磁気ビーズ法によってGroup 4 は現在 DSS による慢性腸炎誘導後の回復期

CD11b 陽性細胞をマクロファージとして単離して解析間中であり，回復期間を終えた後に Group 3 とともにに用いる．糞便を用いた 16S rRNA 遺伝子シーケンシ

解剖して， Group 1 および２と同様の検体採取，検討

ング解析により腸管細菌叢の構成について評価する．

を行う．

【結果】

【考察】

Group 2 および４では，体重変化を含む臨床症状か

DSS 腸炎は動物の性別，週齢，飼育環境などのさまら，本研究で用いた DSS 投与プロトコルにより慢性腸ざま条件により，腸炎誘導の強度が異なることが知られ炎を誘導できたと考えられた．DSS 投与３周期目を終ている．本研究では，３周期の DSS 投与を実施して慢性腸管炎症を生じることができた．また Group 1 および２についてマクロファージ DNA 抽出を含め予定通りの検体回収が可能であったことから，同様のプロトコル
を Group 3 および４にも用いることで，当初の目的に対する解析用検体を全て回収できると考えられる．検体解析用の試薬類等は準備済みであり，検体採取後に速やかに解析を実施する．

難治性眼炎症性疾患における抗 TNF-α製剤の役割と治療法の確立國見敬子（東京医科大学医学部）【目的】
ぶどう膜炎眼は白内障，緑内障，網膜上膜などを発症することがあり，その際に内眼手術が施行される．これらの内眼手術後に炎症が再燃することがあり，その予防として術前の消炎が重要である．非感染性ぶどう膜炎治
療にはステロイド点眼，内服に加え，消炎目的で生物学的製剤を併用することがある．インフリキシマブ（IFX）
図２

解剖時の消化管所見（ Ａ ）Group 1: DSS 投 与 な し，（ Ｂ ）Group 2:
DSS 投与あり DSS 投与群で腸管の壁肥厚および腸管長の短縮を認める．

とアダリムマブ（ADA）は，免疫関連炎症疾患に関与する腫瘍壊死因子に対する生物学的抗体製剤として，本邦で承認されている．これらの製剤は副作用として術後感染症を誘発する可能性がある．ぶどう膜炎眼における135

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

IFX や ADA 使用下での内眼手術の安全性については，安全に施行できた症例報告はあるものの，まとまった報告はない．そこで本研究では，ADA 使用下で内眼手術に至ったぶどう膜炎眼 23 眼の術後について，その有効インドメタシン腸炎に対する水素水の抗炎症作用の
検討
秋

田

義

博
（防衛医科大学校医学部）

性と安全性を分析した．
【方法】
2016 年から 2019 年に東京医科大学病院眼科で非感【目的】

染性ぶどう膜炎と診断後，ADA 治療中に内眼手術が施

NSAIDs は解熱鎮痛剤として広く使用されているが，行された症例を対象として，術前後の視力，眼圧，炎症

消化管障害が臨床上問題になる．特に小腸病変に関しての活動性，硝子体混濁（OCV），ぶどう膜炎性黄斑浮腫

病態が徐々に解明されてきているが，効果的な治療は未（UME），感染症の有無を分析した．

だない．小腸病変の一因と考えられるフリーラジカルに【結果】注目し，水素水の効果を検討した．

内眼手術に至った 23 眼すべてにおいて，術後感染症【方法】の発症はなかった．非感染性の炎症再燃は３眼で観察さ８ 週 齢 の C57BL/6J を 用 い て， 水 素 水 (1.0mg/L)

れ，２眼は UME，１眼は OCV であった．UME を再発を自由飲水させた．４日目にインドメタシン（IND）

した２眼のうち，１眼は施術時に UME が認められていた．

10mg/kg を腹腔内投与し，５日目に安楽死させた．小【考察】腸を採取し，腸管長・エバンスブルーによる潰瘍面積のADA 治療下での非感染性ぶどう膜炎に対する内眼手測定，絨毛・陰窩長による組織学的評価を行った．小腸術は感染症を惹起することなく，安全に施行することがの一部を用いて RT-PCR による TNFα, IL-1β, IL-6 のできた．術後成績は，非ぶどう膜炎眼と同等と考えられmRNA 発現と MPO 活性を測定した．また FITC デキス

た．また，手術施行時に UME が存在する場合，術後に再燃する可能性があるため注意が必要である．
【文献】
１）Kunimi, K., Usui, Y., Tsubota, K., Mitsuhashi,R., Umazume, A., Kezuka, T., Sakai, J. & Goto
H.: Changes in Etiology of Uveitis in a Single
Center in Japan. Ocul Immunol Inﬂamm. 18, 1-6(2020).
２）Kunimi, K., Usui, Y., Asakage, M., Maehara,C., Tsubota, K., Mitsuhashi, R., Umazume, A.,
Kezuka, T., Sakai, JI. & Goto H.: Anti-TNF-α
Therapy for Refractory Uveitis Associated withBehçetʼs Syndrome and Sarcoidosis: A Single
Center Study of 131 Patients. Ocul Immunol

Inﬂamm. 20, 1-8 (2020).
３）Kunimi, K., Usui, Y., Tsubota, K., Kezuka, T. &Goto, H.: Intraocular surgery under adalimumab
therapy in patients with refractory uveitis: asingle center study of 23 eyes. Jpn J Ophthal-mol. 65, 836-842 (2021).
136

全身性炎症疾患の病因･病態の解明に関する研究助成

トランを用いた小腸粘膜透過性を評価した．同じモデルを用いて麻酔下で小腸粘膜面を露出し，Aminophenyl
Fluorescein (APF) を添加することで，Reactive oxygen species (ROS) の産生量を蛍光強度で評価した．
【結果】
IND による腸管長の短縮や小腸潰瘍は水素水の自由
飲水により有意に軽減された（図1, 2）．また絨毛 / 陰窩比の低下や陰窩長の短縮も有意に軽減された（図３）．
IND に よ る TNFα, IL-1β, IL-6 の mRNA 発 現 の 上 昇
は水素水の自由飲 水により有意に低下しており（図４），MPO 活性も同様だった ( 図５)．IND により亢進した腸管
粘膜の透過性は，水素水の自由飲水により有意に軽減された ( 図６)．IND により増加した小腸粘膜の ROS 産生
量は，水素水の自由飲水により有意に軽減された ( 図７)．
【考察】
水素水の自由飲水によりインドメタシン小腸炎が軽減された．NSAIDs によるミトコンドリア障害に伴うフリーラジカルの産生が水素の抗酸化作用により抑制された可能性が考えられた．病態の一因として想定されるタイトジャンクションや腸内細菌への水素の直接・間接的な効果に関しては今後の検討を要する．

137

研究報告

Front Runner
Runner ofFront
of Future
Future Diabetes
Diabetes Researchに関する研究助成
Researchに関する研究助成

膵β細胞における MEK/ERK シグナルの役割の解明とその治療応用生

島芳

Morimoto, Y., Soeda, K., Adachi, J., Muratani, M.,
Charron, J., Mizukami, H., Takahashi, N. & Ueki, K.:
MEK/ERK Signaling in β Cells Bifunctionally Regu-

子（国立国際医療研究センター研究所）

lates β-cell Mass and Glucose-stimulated Insulin-secretion Response to Maintain Glucose Homeostasis,

Diabetes 2021 Jul; 70(7): 1519-1535.
【目的と方法】
MEK/ERK シグナルの膵β細胞における役割は未解明であったため，膵β細胞で MEK/ERK シグナルを欠損したマウス（MIP-CreERT＋/Mek1f/f/Mek2ko/ko (Tmx＋）
マウス（以下βDKO マウス））を作成し，解析を進めた．

GLP-1 の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に対する臓器保護効果の機序の解明
井

上

智

彰
（株式会社

【結果と考察】麻生飯塚病院）

βDKO マウスは，高脂肪食負荷時に随時血糖値の上昇・随時インスリン値の低下を呈し，また長期高脂肪【目的】

食負荷後の糖負荷試験では，耐糖能障害とインスリン糖尿病合併非アルコール性脂肪肝疾患（NAFDL）で分泌の低下を示した．また，高脂肪食負荷後のβDKO

は肝線維化が進展し，非アルコール性脂肪肝炎 (NASH)

マウス膵臓切片では膵β細胞領域の減少と Ki67＋細に進展するリスクが高く，有効な治療戦略の確立が喫緊

胞/Insulin＋細胞の割合の低下を認め，単離膵島ではの課題である．新規糖尿病治療薬である GLP-1 受容体

CyclinD1 の発現低下と Cdkn1a ( p21) の発現上昇がアナログが NASH 患者を対象とした臨床研究（LEAN

認められた．２光子顕微鏡を用いた膵β細胞でのグル試験）において，肝の線維化進行を抑制することが報告

コース刺激時のインスリン顆粒開口放出数測定では，されている．しかしながら，肝細胞には GLP-1 受容体

βDKO マウスで開口放出数が低下していた．以上から，が存在しないなど，組織分布とそれに対応する臓器保護

MEK/ERK シグナルは膵β細胞の量と分泌能の両者を制効果には解離があり，機序の詳細は明らかではない．そ

御していると考えられた．さらに，単離膵島を用いたリこで本研究では GLP-1 受容体組織特異的欠損マウスをン酸化プロテオミクス解析からは，MEK/ERK シグナル用いて詳細な機序の検討を行い，GLP-1 が持ち合わせが開口放出関連因子や細胞骨格関連因子のタンパクリン

る臓器保護効果のメカニズムの解明を目指す．

酸化制御を介して開口放出を制御している可能性が考え【方法】られた．また，グルコース刺激有り/無しの条件で採取申請者らが独自に作出した loxP 配列で glp1r 遺伝子された膵β細胞株サンプルでのリン酸化プロテオミクスのエクソン 4，5 を挟む，ﬂox マウス（GLP-1r ﬂox/ﬂox

解析からは，細胞骨格関連因子の一部が，acute なグルmice）と，LysM-Cre マウスとの交配によって，単球・コース刺激下で MEK/ERK シグナル依存的なリン酸化

マクロファージ特異的 GLP-1 受容体欠損マウスを作出

制御を受ける可能性が見出された．

する．単球・マクロファージ特異的 GLP-1 受容体欠損【文献】

マウスに 10 週間高脂肪食負荷を行い，コントロールマ

Ikushima, YM., Awazawa, M., Kobayashi, N., Os-

ウスと比較検討することで，単球・マクロファージに発

onoi, S., Takemiya, S., Kobayashi, H., Suwanai, H.,

現する GLP-1 受容体と肝臓との関連を検討する．

138

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

刺激してインスリン分泌能を評価した．更に MIN6 細【結果】
GLP-1R ﬂox/ﬂox LysM -Cre マウスの GLP-1 受容体胞に対して PRSS8 発現抑制および PRSS8 過剰発現を行の発現が単球特異的に欠損していることを RT-PCR 法

い，特異的 EGFR 阻害薬 Erlotinib による EGFR 活性化で確認した．
コントロールマウス及び単球・マクロファー

及びその下流シグナルとインスリン分泌を比較した．

ジ特異的 GLP-1 受容体欠損マウスを 10 週齢から 20 週

【結果】

齢まで高脂肪食負荷を行い，血糖値，体重，肝臓の線維

βKO マウスの血糖値は IPGTT にて有意に高値を示化について評価を行ったが，両群に差を認めなかった．

し，血清インスリン値曲線下面積 AUC と，単離膵島の肝逸脱酵素 ALT，炎症性サイトカイン TNFα，肝臓マインスリン分泌の有意な低下を認めた．反対にβTG マ

クロファージについては，単球・マクロファージ特異的ウスの単離膵島ではインスリン分泌が有意に増加した．

GLP-1 受容体欠損マウスで増加していた．

同様に MIN6 細胞を用いた検討でも PRSS8 の強制発現【考察】

によってインスリン分泌は増強し，特異的 EGFR 阻害

肝臓マクロファージ GLP-1 受容体を介したシグナル
が，高脂肪食負荷での肝臓炎症・肝細胞障害に寄与して薬 Erlotinib によってキャンセルされた．
【考察】いる可能性が示唆された．
しかしながら今回の検討では，

膵β細胞 PRSS8 はインスリン分泌を刺激するため，肝臓の線維化はきたしておらず，長期間の高脂肪負荷モ

新規糖尿病治療のターゲットとなり得る可能性が示唆さ

デルによる検討を行う必要があると考えられた．

れた．
【文献】

プロスタシンを介した新規インスリン分泌機序の解明
内

村

幸

平

１）The serine protease prostasin regulates hepatic
insulin sensitivity by modulating TLR4 signalling. Uchimura K, et. al.: Nat Commun. 2014

（山梨大学医学部）

Mar 11【目的】
プ ロ ス タ シ ン（PRSS8） は 分 子 量 40kDa の GPI ア
ンカー型及び分泌型のトリプシン様セリンプロテアー
ゼであり，我々は肝細胞特異的 PRSS8 ノックアウトマ

副腎由来ホルモンの多様性に基づいた糖尿病および慢性合併症進展機構の解明
馬

越

真

希
（九州大学大学院医学研究院）

ウスで慢性炎症による肝糖代謝異常を惹起することを報告した１）．インスリン抵抗性患者の血中では分泌型
PRSS8 レベルが低下しており，糖尿病における PRSS8【背景】の関与が示唆された．ヒト胚性腎細胞由来細胞株では，副 腎 に 由 来 す る Dehydroepiandrosterone sulfate

PRSS8 によって上皮成長因子受容体（EGFR）が切断さ(DHEAS) は，性ホルモン合成のためのプロホルモンでれ，その下流シグナルの活性化が報告されている．膵βある．DHEAS は成人早期にピークに達し，年齢ととも細胞において，EGFR はインスリン分泌に関与するが，に著明に低下する．これは「副腎閉経」とも表現され，

PRSS8 との関連は知られていない．本研究の目的は，DHEAS の相対的欠乏は加齢性疾患に関連するとされる

膵β細胞において PRSS8 が EGFR を介してインスリンが，観察研究では DHEAS と糖尿病，あるいは糖尿病合分泌に及ぼす影響を明らかにすることである．

併症として知られる骨粗鬆症との関連は一定の見解が得【方法】

られていない．

膵β細胞特異的 PRSS8 ノックアウト（βKO）及び【目的】

PRSS8 過剰発現（βTG）マウスを作製し耐糖能異常に

遺伝子多型を操作変数として用いて形質間の因果関係ついて表現型を観察した．次に単離膵島をグルコースでを推測するメンデルランダム化（MR）研究を用いて，

139

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

DHEAS と糖尿病および骨粗鬆症との因果関係を検討す
る．
【方法】
操作変数は健常人対象のゲノムワイド関連解析

血管内皮における O GlcNAc 修飾による糖尿病合併症進展機構の解明
大

橋

夏

子
（滋賀医科大学）（GWAS） よ り， 血 清 DHEAS 濃 度（n＝9,722） に 関
連する 4 つの一塩基多型を選択した．アウトカムの
GWAS 要約統計量は，血糖関連形質として，空腹時血糖・【目的】

インスリン値，HOMA-IR, HbA1c，糖尿病の有無，骨糖尿病や肥満の世界的な急増は克服すべき重要な臨床

関連形質として，DXA 法による大腿骨頸部，腰椎骨密度，課題である．それらの疾患では高血糖やインスリン抵抗

超音波法による踵骨骨密度，骨折の有無を用いた．

性に伴う高インスリン血症により，全身の血管の内皮機【結果】能障害から様々な臓器障害が惹起される．O-GlcNAc 修

DHEAS は 空 腹 時 血 糖・ イ ン ス リ ン 値，HOMA-IR,

飾は，全身の血管障害により引き起こされる糖尿病合併

HbA1c，糖尿病の有無と関連を認めなかった．一方症の成因進展機構の一つとして着目されてきたが，詳細

で，DHEAS は踵骨骨密度の上昇と関連し（β, 0.120;

な機序に関しては明らかにされていない点が多い．そこ

95%CI, 0.081-0.158, P＝9e-10），大腿骨頚部あるいはで，血管内皮細胞における O-GlcNAc 修飾の生理学的腰椎骨密度でも一貫していた．DHEAS は骨折リスク減

役割と，糖尿病及び肥満状態における病態生理に与える少と関連した（オッズ比 , 0.989; 95%CI, 0.981-0.996,

影響に関して検討する．

P＝0.005）．DHEAS と骨密度および骨折の関連は，身長，【方法】

体重，テストステロン，エストラジオール，IGF-1 によタモキシフェン誘導性血管内皮細胞特異的 Cre 発現

る補正後も有意であった．DHEAS と骨折の関連は，転マウス (VEcad-BAC-CreERT2 マウス）と Ogt-ﬂox マウ

倒歴，握力，身体活動度による補正後も有意であったが，スとの交配を行い，タモキシフェンを腹腔内投与し血骨密度による補正後に消失した．MR ベイジアンモデル

管内皮細胞特異的 Ogt 欠損（Ogt-VEKO）マウスを作製

平均化法では，骨密度が DHEAS と骨折の関連におけるした．通常食モデル，高脂肪食摂餌による肥満モデル，

最上位の媒介因子であった．

STZ 投与による高血糖モデルを作製し，その表現型を

【考察】

解析した．

DHEAS は血糖関連形質に因果関係を認めなかった．

【結果】

一方で，DHEAS は骨密度上昇と骨折リスク減少に因果

Ogt-VEKO マウスは対照マウスと比較し通常食モデ関係を認めた．DHEAS は主に骨量の増加を介して骨折

ルにおいて体重増加不良を呈し，高脂肪食モデルでは，を抑制することが示唆され，加齢性骨粗鬆症に対する体重増加がより顕著に抑制された．空腹時血糖，耐糖能

DHEAS の保護的役割が明らかとなった．

及びインスリン感受性は改善し，皮下脂肪及び褐色脂肪【文献】

組織の肥大化の抑制，肝臓への異所性脂肪沈着の軽減と，

Yokomoto-Umakoshi, M., Umakoshi, H., Iwahashi,

それに伴う血中 AST 及び ALT の上昇の抑制を認め，脂N., Matsuda, Y., Kaneko, H., Ogata, M., Fukumoto,肪肝炎の改善が示唆された．収縮期血圧は通常食群ではT., Terada, E., Nakano, Y., Sakamoto, R. & Ogawa,

対照マウスと Ogt-VEKO マウスは同等であったが，肥Y.: Protective Role of DHEAS in Age-related Changes

満モデル・高血糖モデルにおいて，Ogt-VEKO マウス

in Bone Mass and Fracture Risk: A Mendelian Ran-は対照マウスと比較して有意に収縮期血圧が低値であっdomization Study. J Clin Endocrinol Metab, In press

た．Apo-E と Ogt の double KO マウスに高脂肪食を摂(2021).

餌させる動脈硬化モデルでは，大動脈弓部における動脈硬化巣面積に差異を認めなかったが，収縮期血圧は
double KO マウスにおいて有意に低下していた．

140

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

感受性に関する表現型を検証する．また，通常食下で【考察】
Ogt-VEKO マウスは病態モデルにおいて血圧が低値

Fbln5KO の酸素消費量は WT と同等であったが，活動であった事から，O-GlcNAc 修飾は肥満/高血糖で誘発量は有意に低下を認めた．現在 30℃温室での飼育によされる高血圧発症に関わる重要な因子であることが示唆る表現型解析を進めている．

された．これまでの検討で，Ogt-VEKO マウスは肥満【考察】及び高血圧に対して抵抗性を示しているが，両表現型に関して，それぞれ詳細な機序を現在検討している．

Fbln5 欠損により全身におけるインスリン感受性の亢
進と体重増加の抑制を認めたものの，組織特異的 Fbln5欠損マウスの解析により，Fbln5 欠損による代謝表現型

弾性線維関連蛋白 Fibulin-5 によるインスリン抵
抗性制御機構の解明
奥

山

朋

子

の変化は臓器連関や間接作用を介した作用であると考えられた．弾性線維による，皮膚を介したエネルギー代謝
制御や，血管を介したインスリン移行性の制御といった
新たな代謝制御機構が示唆された．

（横浜市立大学医学部医学研究科）【目的】
弾性線維形成に必須の細胞外マトリックス分子である
Fibulin-5 (Fbln5) による糖代謝およびエネルギー代謝の制御機構を解明する．

肥満時の癌発症・進展における M2 マクロファー
ジの役割
角

朝

信
（富山大学医学部附属病院）【方法・結果】
Fbln5 欠損マウス（Fbln5KO）および野生型マウス（WT）に生後８週齢より通常食あるいは高脂肪食負荷【目的】を行った．Fbln5KO は体重非依存性のインスリン感受肥満は乳癌，大腸癌，子宮体癌など数種の癌リスクを性の亢進を認め，高脂肪食誘導性の肥満・肝脂肪蓄積・増加させる．しかしながら，肥満がどのように癌発症・

脂肪細胞肥大化が抑制された．グルコースクランプを進展に関与するか根本的な機序は充分に解明されていな用いた解析により，Fbln5KO では全身においてインス

い．肥満者は世界的に増加傾向であり，肥満がどのようリン感受性が亢進していると考えられた．Fbln5KO でに癌発症・進展に関与するか根本的な機序が解明できれは皮脂腺の萎縮を認め，高脂肪食負荷時の皮膚におけば社会的な貢献は大きいものと考えられる．血管新生やる各種脂肪酸代謝関連分子の発現誘導が消失しており，免疫抑制を介して癌細胞の増殖や転移に寄与するマクロ

WT に比較し寒冷刺激に対する体温低下が顕著であったファージが存在する（Cell. 141: 39-51, 2010.）．乳癌，が，脂肪組織における熱産生・脂肪酸燃焼に関連する遺肺癌，メラノーマ等の数種類の癌においてマクロファー

伝子群の発現はむしろ上昇した．Fbln5-ﬂoxed マウス

ジの浸潤が高度であるほど予後が悪いことが知られ，マを入手し各組織特異的 Fbln5KO を作成したところ，肝クロファージを標的とした癌治療が有望である可能性が細胞特異的 Fbln5KO，脂肪細胞特異的 Fbln5KO，皮膚指摘されている．マクロファージは細胞表面マーカーを（表皮）特異的 Fbln5KO，血管平滑筋特異的 Fbln5KO

用いて M1 マクロファージ，M2 マクロファージに大別

は体重変化やインスリン感受性の変化を呈さなかった．

して解析されてきた．しかしながら，それぞれのマクロ

Fbln5KO は血管の脆弱性を呈することから，標識イン

ファージが癌の発症・進展にどのような役割を果たしてスリンをマウス下大静脈より投与し直後の肝臓におけいるか，in vivo モデルでの検討は充分に行われておらるインスリン取り込みを評価したところ，Fbln5KO でず分子機構についても未だ明確ではない．本研究の目的

は野生型に比較し取り込みの亢進を認めた．現在血管は１）CD206＋M2 マクロファージが癌発症・進展を促

内皮特異的 Fbln5KO を樹立しており，今後インスリン

進していないか．２）肥満による CD206＋M2 マクロ141

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

ファージの表現型や細胞数の変化が，癌の発症・進展をの加速が癌発症・進展促進と関連することが示唆された．

促進していないかを解明することである．

また，CD206＋M2 マクロファージの数を減らすと癌の【方法】

発症，進展は抑制されることが明確となった．今後，そ乳癌を発症する遺伝子改変マウスを高脂肪食群と通常の機序の解明を進める予定である．CD206＋M2 マクロ

食群に分けて，腫瘍の発生時期や，重量，体積，数を測

ファージの数を減らす方法の開発が臨床応用するにあた

定．摘出した腫瘍を FACS, MACS, IHC, qPCR などをり重要と考えられる．

用いて解析した．

【文献】

また，独自に作製した乳癌マウスモデルで CD206 ＋

１）Kado, T., Nawaz, A., Takikawa, A., Usui, I. &M2 マクロファージの数を減らした際の癌の発症・進展

Tobe, K.: Linkage of CD8+ T cell exhaustionへの影響を評価した ( 腫瘍の発生時期，腫瘍重量，腫瘍with high-fat diet-induced tumourigenesis. Sci

体積 )．摘出した腫瘍について組織学的評価，遺伝子発Rep. 22; 9(1): 12284 (2019).

現解析，FACS などを行った．
【結果】

２）Nishida, Y., Nawaz, A., Kado, T., Takikawa,A., S,Kunimasa, Y., Tobe, K. et al.: Astaxanthin

高脂肪食負荷で腫瘍の発生が早まり，腫瘍の重量・体

stimulates mitochondrial biogenesis in insulin

積・数が増加した．高脂肪食負荷群の腫瘍では通常食群

resistant muscle via activation of AMPK path-と比較して，アポトーシス抑制などを介した癌細胞増殖

way. J Cachexia Sarcopenia Muscle . 11 ( 1 ) :促進作用をもつ OPN が上昇していた．通常食群と高脂241-258 (2020).

肪食群の腫瘍内マクロファージの Opn の遺伝子発現レベルに差はなかった．FACS で腫瘍においては CD11c＋ M1-like macrophages が多数を占めており，通常食群と高脂肪食群で差はなかった．よって，高脂肪食負荷で腫瘍の OPN の発現が上昇する原因となっている細グルコース応答性高分子ゲルを用いた自律型インス
リン投与デバイスの開発
木村真一郎（名古屋大学環境医学研究所）

胞はマクロファージ以外と考え，次に CD8＋Ｔ細胞を解析した．FACS では正常乳腺と比べ腫瘍では PD-1＋
CD8＋ Ｔ細胞が増加しており，通常食群と比較して高【目的】

脂肪食群で著明であった．PD-1＋ CD8＋ Ｔ細胞の遺本研究では，グルコース濃度に応答して物理的性質が伝子発現を解析すると PD-1−CD8＋ Ｔ細胞と比較して変化するフェニルボロン酸を含む高分子ゲル（ゲル）を

Opn を高発現し，細胞障害性の指標となる Ifng, Gzmb

利用して，エレクトロニクスフリーで，人工膵臓様の機は低発現であった．免疫組織化学でも PD-1＋細胞が能を有する，インスリンデバイスを開発する．ゲルとシ

OPN を高発現していた．

リコンカテーテルを融合させて，マウスを用いた機能実

独自に作製した乳癌マウスモデルで CD206＋M2 マ証に成功しており（Sci. Adv. 3: eaaq0723, 2017），さクロファージの数を減らすと癌の発症，進展は抑制されらなるケールアップを目指して，血液透析用中空糸をゲた．摘出した腫瘍について組織学的評価，遺伝子発現解ルと融合したデバイス（中空糸融合型デバイス）を開発

析 (qPCR, RNA seq)，FACS などを行い，CD206＋M2

した．既にラットを用いて，大幅なスケールアップ，イマクロファージの減少による癌周囲微小環境の変化につンスリン放出特性の個体レベルでの評価などに成功していて確認した．

おり，本年度は，ヒトとほぼ同等の体重を有するブタに【考察】装着して効果を検証した．さらに，新たに開発したマイ

高脂肪食による肥満で細胞障害性が低く，OPN を発現し癌細胞増加促進作用をもつ PD-1＋ CD8＋ Ｔ細胞が腫瘍内で増加した．肥満による CD8＋ T 細胞の疲弊

142

クロニードルとゲルを融合したデバイス（マイクロニー
ドル融合型デバイス）を用いて機能を評価した．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

一晩培養したマウス単離膵島の定量的プロテオーム解析【方法】
我々は，ラットの約 100 倍の体重を有するブタを用を行った．Lira 添加により，Alpha-amylase 1 (Amy-1)

いて，ストレプトゾトシン（STZ）を投与し，翌日に中などの膵腺房細胞に発現する外分泌酵素関連タンパ

空糸融合型デバイスを装着することで，経時的な血糖上クが，発現上昇したタンパク質として多数同定され，昇に対するデバイスの効果を評価した．また，更なる低GLP-1 により膵島と周囲の腺房細胞の接着が促進する

侵襲化，スケールアップを図るために，新たにマイクロ可能性が想定された．また Lira 添加により，膵腺房細ニードル融合型デバイスを開発した．STZ 誘発１型糖胞に発現し膵β細胞へ作用する可能性が報告される分泌尿病モデルマウスを作製し，STZ 誘発１型糖尿病モデ因子である Lithostatine-1 (Reg1) が発現上昇すること

ルマウスもしくは，通常マウスにマイクロニードル融合に着目した．我々は単離膵島と膵腺房細胞の共培養系を型デバイスを装着し，その効果を検証した．

確立し，膵島における Reg1 遺伝子発現が，膵島単独の【結果】

培養では Lira 添加では変化を認めないが，腺房細胞と中空糸融合型デバイスを８個装着したブタでは，STZ共培養することで，Lira 添加により上昇することを確

投与後の血糖値の上昇が抑制されるとともに，デバイス認した．また膵島において，Amy-1 などの膵外分泌酵から血糖依存的にインスリンが放出された（Commun.

素や，P-Cad や Cx26 など特定の細胞接着因子の発現もBiol. 3: 313, 2020）．また，マイクロニードル融合型

同様に，腺房細胞と共培養することで，Lira 添加によ

デバイス装着後，通常マウスと比較して，１型糖尿病モり上昇することを確認した．免疫染色にて，P-cad は膵

デルマウスで，有意に高く，デバイス由来のインスリン

島と腺房細胞の細胞表面に発現し，Lira により細胞表が放出されており，血糖値も抑制されていた．

面における発現が上昇したことから，Lira は接着分子【考察】の発現誘導により膵島と腺房細胞の接着を促進し，腺房

中空糸融合型デバイスにより，ブタに対して一定の効

細胞由来の Reg1 の発現が上昇したと考えられた．

果が得られたが，臨床応用に向けては，さらなる低侵襲

次に Reg1 欠損マウスを用いた解析を行い，免疫染色化とスケールアップが必要と考えられた．そこで，新たにおいて，Reg1 は膵腺房細胞に発現し，膵島での発現にマイクロニードル融合型デバイスを開発し，マウスレを認めなかった．Reg1 欠損マウス（KO）単離膵島では，

ベルでの機能実証に成功した．次年度は，ヒト用デバイ

野生型マウス（WT）に比較し，Lira 添加時の ATF2 遺ス作製の基盤となるデータの取得のために，マイクロ伝子発現が低下した．WT 膵島を WT 腺房細胞と共培

ニードル融合型デバイスを用いて，ラットによる詳細な養すると，Lira による膵β細胞増殖は促進された．一方，

機能解析を行うとともに，ブタを用いて，臨床応用の基WT 膵島と KO 腺房細胞の共培養では，Lira による膵β盤となるデータを取得する予定である．

細胞増殖は低下した．また，マウスへの Lira 皮下注による膵β細胞増殖は，WT に比較し KO で低下した．
【考察】

膵島と腺房細胞の相互作用による GLP-1 を介した
膵β細胞制御機構の解析
京

原

麻

由
（横浜市立大学大学院医学研究科）

Lira は膵島に作用し，接着分子の発現誘導により膵
島と腺房細胞の接着を促進し，腺房細胞由来の Reg1 の誘導により ATF2 を介して，膵β細胞増殖を促進する可能性がある．

【目的】
GLP-1 による膵β細胞増殖制御における新規経路を同定する．
【方法・結果】
GLP-1 受容体作動薬のリラグルチド（Lira）を添加し143

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

エピゲノムを介した肥満・糖尿病遺伝機構の解明と応用させ，同一ケージ内で飼育することで環境因子の影響をできる限り排除しつつ，胎盤機能と個体を紐づけして表現型を追えるシステムを確立した．胎盤血管ネットワー

小塚

智沙代

（理化学研究所生命医科学研究センター）

ク構造の可視化には透明化手法を用い，透明化条件の最適化を行った．物質輸送能の評価には，トレーサーを用いて，妊娠マウスに投与したトレーサーを胎児で検出す【目的】
肥満や２型糖尿病に罹患した親を持つ子では生活習慣るための条件検討を行っている．
【考察】

病の発症率が高い．本研究では，この遺伝機序のひとつ

今後は子どもの表現型に相関する胎盤機能を絞り込として卵子のエピゲノム変化とそれに伴う胎盤異常に注み，子ども世代の肥満・二型糖尿病を予防する方法の開目している．胎盤は母親から胎児への栄養供給のほか，発に繋げていきたい．

ガス交換，物質交換，ホルモン分泌，免疫寛容など妊娠を支える重要な役割を担っており，
これまでの報告から，
胎盤機能と産仔の代謝機能には関連があることが示唆されている．また，胎盤肥大と胎盤機能の低下は肥満女性の妊娠時においても高頻度で認められる．そこで，母親

Activin Bによる糖・エネルギー代謝制御機構の解明
小

林

直

樹

（国立国際医療研究センター研究所）の代謝異常が胎盤機能の異常を介して子供の代謝疾患リ
スクを上昇させるのではないか，そして母性肥満と胎盤

Activin B が絶食やケトジェニック食摂取などの代謝肥大を繋ぐメカニズムとして肥満女性の卵子におけるエ

ストレス時に肝臓において発現が強く誘導されたことか

ピゲノムに異常が起こっているのではないかと仮説を立ら，代謝制御における役割を明らかにすべく検討した．

て，検証を行っている．

Activin B の強制発現によって耐糖能は著明に改善され，【方法】

これには複数の作用，すなわち，全身インスリン感受性

我々は卵子のヒストンメチル化修飾が欠損すると，着の亢進，インスリン分泌の亢進およびインスリン非依存

床後発生において胎盤が過形成することを見出してお的な肝糖産生の抑制が関係することが明らかとなった．

り，卵子のエピゲノムを操作することで母子ともにゲノ

まず，Activin B による全身インスリン感受性の亢進

ムは正常，胎盤にのみ異常をきたすモデルマウスを作出の作用機序について検討した．Activin B は肝臓においした（Mei H et al. Nat Genet 2021）．このモデルマウて FGF21 の発現を亢進させ，FGF21 欠損マウスを用い

スを用いて，胎盤の異常が成長後の産仔の代謝に及ぼすた検討からインスリン感受性亢進作用には FGF21 が寄影響を検討した．また，母体の代謝異常が胎盤の異常を与することが明らかとなった．また，肥満モデルマウス

介して産仔の代謝に影響する可能性を検証するため，高において AAV を用いた持続的なアクチビンシグナルの脂肪食誘導性の肥満・糖尿病モデルでも同様の検討を増強による効果を検討したところ，除脂肪体重・筋重量・行った．また，胎盤の機能を評価するため，母体血と胎

握力には影響せず，酸素消費量の亢進を伴って体重・脂児血との間の物質交換の場である胎盤血管ネットワーク

肪量を低下させた．一方で，FGF21 欠損マウスにおい構造の可視化と胎盤を介した母子間での物質輸送能の評ては，AAV による持続的なアクチビン過剰発現による価に取り組んだ．

インスリン感受性の改善作用および脂肪量減少効果は明【結果】

らかに減弱していた．これらの結果から，Activin B に

高脂肪食モデル，胎盤異常モデルともに，対照群の母体由来の卵子から生まれた子どもに比べて大きな体重のよるインスリン感受性亢進作用および肥満改善効果はFGF21 の亢進を介した効果であると示唆された．

増加を認めた．しかし，いずれのモデルにおいても大きActivin B による耐糖能異常改善作用は，STZ マウス

な個体差が見られた．そこで，出生後に同じ母親に哺育においても認められた．Activin B 強制発現はピルビン

144

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

酸からの糖産生を著明に抑制しており，実際に培養細胞【方法】

系でも確認されたことから，直接肝細胞に作用して糖産

滋賀県草津市住民から無作為抽出された 40-79 歳の生を抑制していると考えられた．一方で，これらの効果

男性 739 名を対象とした．血中 n-3 PUFA（エイコサペ

は FGF21 欠損マウスにおいても認められたことから，ンタエン酸［EPA］＋ドコサヘキサエン酸［DHA］）濃インスリン非依存的な肝糖産生抑制作用は FGF21 と独度を測定した．脳血管病変として，脳動脈狭窄
（＞１％），

立した作用であると考えられた．

ラクナ梗塞，微小出血および白質病変（グレード 3 以上）

Activin B の強制発現によって，グルコース応答性イ

を MRI により評価した．ロジスティック回帰分析を用

ンスリン分泌（GSIS）の亢進を認めた．また，膵イン

い，血中 n-3 PUFA 濃度の１標準偏差増加あたりの脳血

スリン含量，β細胞量には著変を認めず，単離後にリ管病変の多変量調整オッズ比および 95% 信頼区間を算コンビナント Activin B 存在下で培養した膵島における出した．

GSIS にも差を認めなかったことから，Activin B は直【結果】

接膵β細胞に作用してインスリン分泌を亢進させないと脳動脈狭窄，ラクナ梗塞，微小出血および白質病変の結論した．一方で，我々は Activin B によって肝臓にお有所見率はそれぞれ，30.0%, 21.9%, 13.9%, 22.2% でいて活性化する細胞内シグナル経路のうちの一つを肝臓あった．血中 n-3 PUFA 濃度１標準偏差（9.6mg/dL）

において人為的に活性化させることで，GSIS の亢進を増加あたりの脳動脈狭窄の多変量調整オッズ比（95%

観察したことから，Activin B によって変化する肝臓に信頼区間）は，0.80 (0.67-0.97) と有意に低かった．まおける何らかのシグナルが膵β細胞におけるインスリンた，血中 EPA (4.8mg /dL) および DHA (5.5mg/dL) 濃分泌に影響していると考えられた．

度 1 標準偏差増加あたりの脳動脈狭窄の多変量調整オッ

上記の結果から，代謝制御における Activin B の多面

ズ比（95% 信頼区間）は，それぞれ 0.88 (0.74-1.04), 0.76

的な効果を明らかにすることができた．基礎研究の結果(0.62-0.92) と低かった．一方，その他の脳血管病変（ラに基づいた糖尿病・代謝性疾患における新規治療法の開クナ梗塞，微小出血，白質病変）と n-3 PUFA 濃度との発を進める．

明らかな関連は認めなかった．
【結語】

日本人一般男性における血中 n-3 系多価不飽和脂肪酸濃度と脳血管病変との関連
近藤慶n-3 PUFA は脳内大血管病変に対して保護的に作用する可能性が示唆された．
【文献】
１）Kondo, K. et al.: J Atheroscler Thromb 17(6):子（滋賀医科大学）628-37, 2010.
２）Kondo, K. et al.: Metabolism 63(7): 930-40,

【背景】

2014

魚および n-3 系多価不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）摂取量を増やすことによる抗動脈硬化作用について，我々を含めた介入研究の結果より報告されている１,２）．また，長期に追跡した疫学研究では，n-3 PUFA の摂取が多い

欠損によるβ細胞脱分化とインクレチンの効
果および人の糖尿病病態と膵内分泌細胞脱分化に関ほど冠動脈疾患死亡リスクが低いことが報告されていする研究る．しかし，n-3 PUFA と脳卒中の関連は研究により異椎木幾久子（山口大学医学部）なり，結果が一致していない．
【目的】
日本人一般男性において MRI で評価した脳血管病変と血中 n-3 PUFA 濃度との関連を検討した．

【これまでの研究概要】
インスリン依存性糖尿病を主徴とする遺伝性疾患

145

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Wolfram 症候群の疾患モデル Wfs1 欠損マウスは，膵
β細胞が進行性に減少し高血糖を来す．我々は本モデル
におけるβ細胞消失の要因としてβ細胞が脱分化する

膵α細胞におけるインスリンシグナル依存性機能制
御メカニズムの解明
渋ことを突き止めた．一方，Wfs1 欠損β細胞では WFS1

江公

尊（北野病院）の機能障害により小胞体ストレスおよび酸化ストレスが亢進する．我々は Wfs1 欠損マウスにおいて，小胞体・ 酸 化 ス ト レ ス 応 答 分 子 Thioredoxin-interacting【背景】

protein (Txnip) を欠損させることで，β細胞脱分化お膵α細胞より分泌されるグルカゴンは１型糖尿病患者

よび糖尿病の発症を抑制することを明らかにした．加えや進行した２型糖尿病患者において低血糖からの回復にて，Wfs1 欠損マウスに GLP-1 受容体作動薬 Exendin-4

重要なホルモンであるが，その詳細な機能制御機構は明(Ex-4) を慢性投与することにより，膵島での Txnip 発

らかではない．助成者はα細胞におけるインスリンシグ

現の抑制と，インスリン分泌機能の改善を認めた．

ナルに注目し，インスリンシグナル依存性のグルカゴン

さらに，人の糖尿病におけるβ細胞脱分化の意義を明らかにするため，２型糖尿病（T2D）の膵島の病理と脱分化の関連を病態進展（正常耐糖能群，T2D 早期制御機構について研究することとした．
【目的】
インスリンシグナル依存性のグルカゴン制御機構を明群，T2D 進展群）の中で検討した．脱分化細胞数は病らかにする態進展にともなって増加し，β細胞機能の指標である【方法】

C-peptide index と有意な逆相関を示すことを報告した

IRS1, IRS2 ノ ッ ク ダ ウ ン 細 胞 株（alphaIRS1KD,(JCI insight, 6, e143791, 2021)．人β細胞の病態進展

alphaIRS2KD）に対してグルコース応答性のグルカゴ

における脱分化の重要性が示唆された．

ンの変化を観察すると同時にマイクロアレイ解析を行【今後の研究計画】

い，インスリンシグナル下流にある新規調節因子を検討

これまでの研究成果を踏まえ，主に下記の２点について研究を発展させる．

した．
また膵α細胞特異的 IRS1 および IRS2 ノックアウト

１．インクレチンによる膵β細胞脱分化抑制効果の解明

マウスに対して糖負荷試験，インスリン低血糖試験，さWfs1 欠損マウスに対する Ex-4 のβ細胞脱分化抑制

らに単離膵島を用いたグルコース依存性のグルカゴン分効果を検討するため，β細胞を YFP で永久標識した

泌の検討を行った．

Wfs1−/−; RIP-Cre; Rosa26-YFP マウスに Ex-4 を６週【結果】

齢より４週間投与し，投与終了時点での膵組織切片を用

alphaIRS1KD ではインスリンによるグルカゴン抑制

いて免疫染色を行いβ細胞脱分化について評価する．

が対照群および alphaIRS2KD に比べて有意に障害され２．人の糖尿病におけるα細胞脱分化の解明ており，AKT リン酸化の減弱に加えてカルシウムイオ

前述の T2D 膵島の病理解析では，病態進展にともなンの応答とミトコンドリア機能も減弱していた．各細胞

いα細胞の増加を認める一方，進展群ではα細胞数の株のマイクロアレイ解析ではカルシウム応答に関連する減少およびグルカゴン染色性の低下を示す症例も存在し

Trpc3 遺伝子が alphaIRS1KD で変化していた．

た．そこで，進展群の膵組織を中心にα細胞の分化マー

マ ウ ス モ デ ル の 検 討 で は、alphaIRS1KO マ ウ ス にカー（MafB, Arx, Pax6 など）の免疫染色を行い，α細おいて低血糖時のグルカゴン応答が障害され，単離膵

胞の細胞可塑性と糖尿病病態との関連を明らかにする．

島ではインスリンによるグルカゴン分泌抑制が対照群および alphaIRS2KO マウスで見られていたのに対して alphaIRS1KO マウスでは分泌抑制が障害されていた．

146

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

生型マウスの骨髄を野生型マウスに移植した群（WT →【考察】
インスリンシグナル依存性のグルカゴン制御にはIRS1 が主要な役割を果たしていることが示された．

WT）をそれぞれ移植後８週経過したところから高脂肪食とし，体重推移・耐糖能を評価した．高脂肪食開始前の耐糖能は両群で差はなかった．高脂肪食負荷後の耐糖

脂肪組織マクロファージを介した GIP 受容体シグ
ナルの作用
清

水

能は有意差を認めなかったものの KO → WT 群においてインスリン感受性・血糖など耐糖能において良い傾向を認めた．また高脂肪食負荷後の体重増加は KO → WT

辰徳

マウス群において有意に抑えられており，興味深い結果（秋田大学大学院医学系研究科）と考えている．骨髄移植モデルの問題点として，移植細胞による置換は 100% とならず，また移植される骨髄【目的】

量に個体差が生じ得ることが挙げられ，高脂肪食負荷後

近年，世界の肥満人口が急増する中，抗肥満薬の開の有意な耐糖能の改善がみられなかった原因と考えてい発が進められている．Gastric inhibitory polypeptide

る．また，末梢血での移植細胞の置換率は確認している(GIP) 受容体アンタゴニストや Glucagon-like peptide

が，脂肪組織内での置換率の把握は困難であり，遺伝子(GLP)-1 受容体・GIP 受容体のダブルアゴニストは有力

改変技術を用いて作成した新たなモデルマウスでの再検な候補として注目を集めており，脂肪組織における GIP

証が必要である．現在，CRISPR-Cas9 を用いたゲノム

受容体シグナルの解明は極めて重要である．我々はこれ編集によりマクロファージ特異的 GIP 受容体欠損マウまでに，他組織 ( 精巣 ) において，高脂肪食下（高 GIPスの作製を進めており，完成後は，当マウスの摂餌量・血症下）での GIP 受容体の発現低下（Endocrinology

体重推移・耐糖能を通常食下で評価する．その後，骨髄2017）を示しており，脂肪組織においても同様の発現移植モデルで示された高脂肪食下の肥満耐性について，低下を確認している．また，脂肪組織においては，脂肪当マウスで確認を行う．具体的には，高脂肪食開始前後

細胞に加え，マクロファージに GIP 受容体が高発現しの耐糖能・インスリン抵抗の調査，高脂肪食開始後の体ていることを見出した．本研究では，脂肪組織マクロ

重推移，脂肪組織の炎症性サイトカインの多寡について

ファージに対する GIP 受容体シグナルの作用とその基検討を行う．

盤となる分子メカニズムを解明することを目的とする．
【方法・結果】
脂肪組織からマクロファージを含む SVF (Stromal

臨床情報，ゲノム情報を活用した 2 型糖尿病のサ

Vascular Fraction) を分取し，これを CD45 抗体付き

ブタイプ分類

マグネットビーズによって CD45(＋) 分画と CD45(−)

鈴木顕（大阪大学大学院医学系研究科）

分画を作成．RT-PCR により，マクロファージを有する
CD45(＋) 分画に GIP 受容体遺伝子が強く発現していることを見出した．発現量は脂肪細胞を含む分画よりも【目的】

多く，GIP のシグナルは脂肪細胞のみならず，脂肪細胞

本研究では，我々が実施してきた 2 型糖尿病疾患ゲに近接して存在するマクロファージにも生理作用を及ノム研究１‒３）をさらに発展させる形で，様々な斬新なアぼしていることが強く推測された．これまでに，GIP 受

ルゴリズムを駆使し，２型糖尿病のリスク層別化および容体欠損マウスの骨髄を野生型マウスに移植すること

疾患のサブタイプ分類を行う．本研究により，「遺伝情により，脂肪組織のマクロファージを GIP 受容体欠損

報により２型糖尿病の発症リスクおよびその表現型はど

マクロファージに置換するモデル ( 以下，骨髄移植モデのように規定されるか」，という疾患ゲノム研究の重要ル ) を用いた検討を重ねている．GIP 受容体欠損マウス

課題が明らかになることが期待される．

の骨髄を野生型マウスに移植した群（KO → WT），野147

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

【方法】

【考察】

2020 年度は，遺伝情報により２型糖尿病発症リスク

パスウェイ・クラスター PRS の算出により，同一のおよびその表現型はどのように規定されるか，という医

PRS を有する被検者であっても，そのパスウェイ・ク

学的に重要な問いに対して，以下の３つの方法で取り組ラスター PRS の分布は異なることが明らかとなった．

んだ．

これは，２型糖尿病発症に関して同程度の遺伝的リスク①：トレーニングデータを用いた２型糖尿病感受性遺伝を有する被検者であっても，そのパスウェイ特異的な遺子変異の選定伝的拝啓は異なることを示唆しており，本成果は２型糖②：各種既存アルゴリズムを適用した２型糖尿病発症リ尿病の病態の理解を促進し，２型糖尿病の個別化医療のスクの層別化とサブタイプ分類促進に寄与することが期待される．

③：新規アルゴリズムの開発によるリスク層別化・サブ【文献】

タイプ分類の精度向上

１）Suzuki, K. et al.: Identiﬁcation of 28 new suscep-【結果】

tibility loci for type 2 diabetes in the Japanese2020 年度は１．トレーニングデータを用いた２型糖

population. Nat. Genet. 51, 379‒386 (2019).

尿病感受性遺伝子変異の選定，２．各種既存アルゴリズ

２）Ishigaki, K., Suzuki K. et al .: Large-scaleムを適用した２型糖尿病発症リスクの層別化，３．新規

genome-wide association study in a Japanese

機械学習アルゴリズムの開発によるリスク層別化の精度

population identifies novel susceptibility loci

向上，の３つの課題を実施した．１．については，バイ

across diﬀerent diseases. Nat. Genet. 52, 669‒

オバンク・ジャパン 20 万人（うち糖尿病４万人，非糖679 (2020).

尿病 16 万人）のデータを活用し，ゲノムワイド関連解３）Spracklen, C. N., Suzuki K. et al.: Identiﬁcation

析（GWAS）を実施し，２型糖尿病に関連する遺伝子変of type 2 diabetes loci in 433, 540 East Asian

異を選択した．２．については，１．で同定した２型糖

individuals. Nature 582, 240‒245 (2020).

尿病感受性遺伝子変異に関するジェノタイプデータを用

４）Sakaue, S., Suzuki K. et al .: Dimensionality

いてバイオバンク・ジャパンのサンプルにおいてゲノム

reduction reveals fine-scale structure in the

データの主成分（PCA）による次元縮約やポリジェニッ

Japanese population with consequences for

ク・リスク・スコア（PRS）によるリスク層別化を実施

polygenic risk prediction. Nat. Commun. 11,

した．既存の高次元圧縮技術などのアルゴリズムが抱え

1569 (2020).

ている問題点を克服するため，高次元圧縮技術の組み合
わせ (PCA-UMAP) を適用し４），２型糖尿病のリスク層
別化の精度を向上させた．さらに，分子生物学的経路（以下，パスウェイ）のデータベースからパスウェイ情報を網羅的に取得し，各パスウェイに属する遺伝子が存在す

メタボローム解析を用いた脂肪細胞分化・褐色化制御に関する研究高橋

春弥（京都大学大学院農学研究科）

るゲノム領域の SNP に限定してポリジェニック・リス
ク・スコアを計算した（パスウェイ PRS）．パスウェイ
PRS 同士の相関係数を算出し，相関が強いパスウェイ【研究背景・目的】

同士を同一のクラスターに所属させるクラスタリングを

脂肪組織は生命維持に必要なエネルギーを脂肪として実施し，パスウェイのクラスターごとに PRS を算出し蓄積する役割に加え，アディポカイン分泌等を介した生た．また，各パスウェイの全ゲノム SNP のカバー率や体恒常性維持にも重要な役割を担う．脂肪組織を構成す

パスウェイ同士の重複率を求めた，パスウェイ・クラス

る細胞の中で，脂肪細胞の機能についてはこれまでの多ター PRS を代謝疾患に関わる形質との関連に基づき特くの先行研究において多面的に解析されており，特に脂徴付を行った．

肪細胞の分化過程，及び熱産生能を有するベージュ脂肪148

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

細胞への変換（褐色化）過程は，主に遺伝子やタンパク
質発現制御に関する知見に基づくメカニズム解析が盛んである．他方，これらの過程における低分子代謝物の挙動についての知見は限られており，低分子代謝物の量

ニューロメジン U が膵β細胞機能に与える影響とその分子機序の解析張維

東（宮崎大学医学部）

的・質的変化の全体像については不明確な点が多く存在する．そこで，本研究では低分子代謝物の網羅的解析手法の一種であるメタボローム解析を活用し，脂肪細胞の分化過程及び褐色化過程における代謝変動の全体像の把【目的】
Neuromedin U (NMU), a highly conserved pep-

握を目的とし，研究を行った．

tide in mammals, is involved in a wide variety of【方法】

physiological processes. NMU has two receptors,

脂肪細胞の分化過程に関するメタボローム解析：マウNMU receptor 1 (NMUR1) and NMUR2, both ofス白色脂肪組織由来不死化培養細胞（cell line）についwhich are G-protein-coupled receptors (GPCRs).

て分化誘導処理を行い，分化誘導直後から 48 時間後にOnly NMUR1 is expressed in mouse islets and β至るまで経時的に細胞内代謝物を抽出し，得られた抽

cell-derived MIN6-K8 cells. We previously reported

出液を LC-MS を用いたメタボローム解析に供した．まthat NMU produced in β cells suppresses GSIS and

た，得られた不死化培養細胞について分化度が異なる

causes β-cell failure via NMUR1１,２）. NMU was up-

cell line 間での代謝変化の相違について差分解析を実施

regulated both after chromic palmitate treatment

した．

and in diabetic db/db mice islets, and then partici-

脂肪組織の褐色化に関するメタボローム解析：β3 アド

pated in β-cell dysfunction and development of

レナリン受容体のアゴニストである CL316243 (CL）を

diabetic pathogenesis via induction of mitochondrial

投与し，脂肪細胞の褐色化を進行させた C57BL/6J マ

dysfunction and endoplasmic reticulum (ER) stress２）.

ウスの血中及び褐色脂肪組織（BAT），鼠径部脂肪組織

However, the downstream signal transduction of（IWAT），精巣周囲脂肪組織（EWAT）の代謝物を LC-

NMUR1 in β cells has not been elucidated. In this

MS を用いて分析し，得られた超精密質量データを活用

study, we aimed to investigate the molecular mecha-

したメタボローム解析により，代謝変動の全体像を解析

nisms underlying the insulinostatic action mediated

した．

by NMUR1 in β cells.

【結果・考察】【方法】

脂肪細胞分化過程でのメタボローム解析の結果，分化All types of Gα proteins are expressed in β cells促進に寄与する可能性がある代謝物として，核酸関連代and are involved in the regulation of insulin se-

謝物に属する低分子代謝物Ａと脂質関連代謝物に属する

cretion. Given that NMUR1, but not NMUR2, is

低分子代謝物Ｂを特定した．また，脂肪組織の褐色化に

expressed in β cells, and NMU suppresses intracel-

関するメタボローム解析の結果，褐色化促進に寄与する

lular calcium mobilization and insulin secretion, we

可能性がある代謝物として，核酸関連代謝物に属する低hypothesized that NMUR1 might use Gαi /o for signal

分子代謝物Ｃを特定した．代謝物ＡとＣは構造が異なる

transduction in β cells. Using β cell-derived MIN6-K8

一方，共に核酸関連代謝物に属することから，脂肪細胞

cells, isolated mouse and human islets, and single is-の分化・褐色化過程において，核酸に関連する代謝経路

let cells, we identiﬁed the molecular mechanisms byの活性化が重要であることが示唆された．

which NMU and NMUR1 regulate insulin secretionin β cells.
【結果】
The results were published in PLoS ONE in 2021３）.

149

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

We showed that NMUR1 in β cells uses Gαi/o signal-

would have major therapeutic potential in diabetes

ing to mediate the detrimental effects of NMU on

and obesity.

insulin secretion. Pretreatment with the Gαi/o in-

Despite the fact that NMUR1 and NMUR2 were

hibitor Bordetella pertussis toxin (PTX), but not thediscovered as GHSR homologs, it remains to be de-Gαq inhibitor YM254890, abolished NMU-induced

termined whether such dimerization occurs between

suppression of glucose-stimulated insulin secretion

NMUR1 and somatostatin receptors. Although theand calcium response in β cells. Knockdown of Gαi2mechanisms underlying the involvement of Gαi andand Gαo in β cells counteracted NMU-induced sup-Gαo signaling in NMU inhibitory effects on insulinpression of insulin secretion and gene alterations

secretion require detailed investigation, including

related to mitochondrial fusion (Mfn1, Mfn2), ﬁssion

studies at the structural level, our ﬁndings provide(Fis1, Drp1), mitophagy (Pink1, Park2), mitochon-

important leads regarding the endogenous NMUR1

drial dynamics (Pgc-1α, Nrf1, and Tfam), ER stresstransduction pathway. In addition, the diversity of(Chop, Atp2a3, Ryr2, and Itpr2), intracellular ATP

GPCR coupling to various types of G-proteins andlevel, and mitochondrial membrane potential. NMU

the subsequent activation of distinct intracellulardecreased forskolin-stimulated intracellular cAMPsignal transduction may be explained by altera-in both mouse and human islets. We concluded

tions in guanine nucleotide exchange factor or Gαthat upon NMU binding, NMUR1 coupled to PTX-

subunit-regulated GTP hydrolysis. In this study, PTX

sensitive Gαi2 and Gαo proteins in βcells, reduced in-abolished NMU-suppressed calcium inﬂux in β cells,

tracellular Ca

inﬂux and cAMP level which in turnsuggesting that using diﬀerent Gα proteins, NMUR1

suppresses insulin secretion, thereby causing β-cellapparently exhibits opposite eﬀects on calcium mo-dysfunction and impairment. These results highlightbilization, depending on diﬀerent cell types.

2＋

a novel signaling mechanism of NMU and provide

Previously, we showed that NMU induced β-cellvaluable insights into the further investigation of

failure by triggering mitochondrial dysfunction and

NMU functions in β-cell biology.

ER stress２）. In this study, we showed that knock-【考察】

down of Gαi2 and Gαo inβ cells restored NMU-

Here, we showed that PTX abolished the suppres-induced mitochondrial dysfunction and ER stress.

sive eﬀects of NMU in β cells, whereas knockdown

These findings suggest that Gαi2 and Gαo proteinsof Gnai2 and Gnao1 abolished NMUʼs eﬀects, sug-couple to NMUR1 and induce β-cell dysfunction. In

gesting that Gαi2 and Gαo are involved in signal

addition, Gαi2 and Gαo proteins are crucial in thetransduction of NMUR1 in β cells. Both Gαi and Gαo

NMU-NMUR1 regulating glucose-stimulated Ca 2＋

belong to the Gαi /o subfamily, and it is usually as-

signaling and insulin secretion in β cells. Knowledge

sumed that if a receptor couples to Gαi, it will alsoof the NMU signaling cascades, NMU-NMUR1-Gαi2couple similarly to Gαo. In addition, GPCRs canand Gαo-cAMP-calcium- insulin, may provide insightbind to distinct classes of heterotrimeric G-proteins

into β-cell biology and the pathogenesis of diabetes

in different cell types. A G α s and G α q signaling

related to NMU.

switch in β cells exposed to chronic hyperglycemia【文献】

underlies the diﬀerential insulinotropic potential of１）Zhang, W., Sakoda, H., Miura, A., Shimizu, K.,

incretins in diabetes. Understanding more about

Mori, K., Miyazato, M., Takayama, K., Hayashi,these endogenous G-proteins opens the door to

Y. & Nakazato, M.: Neuromedin U suppresses

pharmaceutically targeting their activation, which

glucose-stimulated insulin secretion in pancre-150

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

atic β cells. Biochem. Biophys. Res. Commun.

術群において，摂餌量と体重の低下，血管透過性の亢

493: 677-683 (2017).

進，肺組織中の TNF-α, IL-6, CXCL2 の発現の亢進が抑

２）Zhang, W., Sakoda. & H., Nakazato, M.: Neuro-

制された．迷走神経切断群においては，グレリンの投与

medin U suppresses insulin secretion by trigger-

による摂餌量の低下の抑制は認められなかったが，肺組

ing mitochondrial dysfunction and endoplasmic

織中の IL-6, CXCL2 の発現の亢進の抑制が認められた．

reticulum stress in pancreatic β-cells. FASEB J.

次に GHSR-KO マウスと野生型マウスにおいて，LPS

34: 133-147 (2020).

気管内投与 24 時間後の肺炎症の程度を比較した結果，

３）Zhang, W., Sakoda, H., Nakazato, Y., Islam,

GHSR-KO マウスでは，血管透過性の亢進，P/F 比の低

MN., Pattou, F., Kerr-Conte, J. & Nakazato, M.:

下の抑制，肺組織中の 炎症性サイトカインの発現の亢

Neuromedin U uses Gαi2 and Gαo to suppress

進の抑制，72 時間生存率の低下の抑制が認められた．

glucose-stimulated Ca2＋ signaling and insulin【考察】secretion in pancreatic β cells. PLoS ONE., 16:e0250232 (2021).

急性肺損傷モデルにおいて，迷走神経切断群においてグレリン投与は肺炎症を一部抑制することが死された．GHSR-KO マウスを用いた検討では，予想に反して交感神経過活動によるグレリンの発現の低下と疾患との関連の検討坪

内

拡

GHSR-KO マウスが野生型と比較して肺炎症が軽度であることが確認された．以上の結果から，薬理量のグレリ
ン投与と内因性のグレリンが LPS 誘導性肺傷害におけ伸る役割が異なること，内因性のグレリンは肺炎症の誘導（宮崎大学医学部）

または維持に重要であることが示唆された．

【背景・目的】
グレリンは胃から分泌される生理活性物質であり，摂食亢進作用と強力な抗炎症作用を有する．グレリンの抗炎症効果のメカニズムは不明である．本研究では，迷走解糖系代謝物による TOR シグナルの活性化
野村亘（京都大学大学院農学研究科）

神経切断処置を行ったマウスに対して，グレリン抗炎症作用の効果を検討した．
【方法】【背景・目的】10 週齢の C57BL6 マウスに，迷走神経切断術またTOR (target of rapamycin) は，酵母から哺乳類に至は sham 手術を行い，リポポリサッカライド（LPS）

るまで高度に保存されたタンパク質リン酸化酵素であ

5mg /kg の気管内投与による急性肺損傷モデルを作成

り，栄養シグナルの中心因子として異なる２つの複合体し た． そ れ ぞ れ，PBS ま た は グ レ リ ン（3 nmol /kg）

である (m)TORC1 および (m)TORC2 を形成することでを腹腔内投与し，摂餌量，体重変化，気管支肺胞洗浄

糖代謝や脂質代謝などに関与する．

液（BALF）中の総細胞数，肺組織中の炎症性サイト

生体のエネルギー産生経路における代謝物の中には，

カインとケモカインの発現を検討した．次に，グレリ

単なるエネルギー獲得のための代謝中間体としてだけでン の 受 容 体 で あ る Growth Hormone Secretagogue

はなく，細胞や生体機能に積極的に関与する機能性を有receptor(GHSR）の欠損マウス (GHSR-KO マウス）へした代謝物も存在する．そのような代謝物の中で，我々

LPS を気管内投与し，GHSR の有無が肺炎症にもたらはシグナル伝達の制御に機能する “代謝性シグナル分

す影響を検討した．

子” として，解糖系由来の代謝物であるメチルグリオ【結果】

キサール（MG）に着目し，MG が (m)TORC2 シグナ

急性肺損傷モデルにおいて，グレリン投与は sham 手ルを活性化することを見出した（Mol. Cell. Biol. 35:

151

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

1269-1280, 2015）．一方，MG は古くから糖尿病病態するための新規レポーターマウス“Gcg-Timer”を作製しとの関連が指摘されているが，その因果関係についてはた． 本 マ ウ ス は eGFP-IRES-mRFP を proglucagon 遺不明な部分が多い．本研究では，MG の TOR シグナル

伝子に挿入しており，IRES の影響により，eGFP の緑への影響に着目することで，MG と糖尿病病態との関連

色蛍光と mRFP の赤色蛍光との検出にタイムラグが生性の理解に資する知見の獲得を目指した．

じる．内分泌前駆細胞から分化したばかりの新生α細【方法・結果】

胞は緑色蛍光，より分化したα細胞は緑色および赤色

脂 肪 細 胞（3T3-L1 細 胞 ） を 用 い た 解 析 で，MG が蛍光を呈するため，共焦点レーザー顕微鏡および ﬂow

mTORC2 シ グ ナ ル に 加 え て mTORC1 シ グ ナ ル を 活

cytometry を用いて両者を識別し経時的に観察できる．

性化することを見出した．mTORC2 は Akt を介して「α細胞がいつ・どこで生まれるのか？」を明らかにす

mTORC1 の活性化に寄与するが，MG による mTORC1

るとともに，α細胞新生・分化過程における遺伝子発現

シグナルの活性化は Akt に依存しなかった．その代わり，

プロファイルの変化を解析する．

MG はストレス応答性 MAP キナーゼである p38 を介し【結果】て mTORC1 シグナルを活性化した．

Gcg-Timer マ ウ ス 膵 を 摘 出 し， 顕 微 鏡 お よ び ﬂow

mTORC1 の基質である S6K は，インスリン受容体基

cytometry で新生α細胞数を定量化した結果，新生α細質（IRS-1）をその標的分子の一つとする．また，IRS-1

胞は生理条件下では胎生期から生後７日未満の新生仔にのセリン残基のリン酸化はインスリン抵抗性の発症に関観察され，成体マウスでは認めなかった．そこで成体与する．IRS-1 のリン酸化状態に及ぼす MG の影響につ

マウスにおいてα細胞新生が誘導されうるか検討した．

いて検討した結果，MG は mTORC1 依存的に IRS-1 のGcg 欠損マウスなどグルカゴンシグナル抑制下でα細セリン残基（Ser307）のリン酸化を亢進した．さらに，

胞過形成が生じることが報告されており，その過程にαMG はインスリン刺激によるインスリンシグナル伝達経細胞新生が寄与するかを明らかにするため，Gcg 欠損

路の活性化，および細胞内への糖取り込み活性を阻害しGcg-Timer マウスを作製した．３〜10 週齢の膵切片にた．

おいて緑色蛍光陽性，赤色蛍光陰性の細胞が観察され，【考察】

成体マウスでも新生α細胞を認めた．

以上のことは，MG が mTORC1 シグナルの活性化に【考察および今後の展望】よる IRS-1 のリン酸化を介してインスリン抵抗性様の作

Gcg 欠損 Gcg-Timer マウスの結果から，成体マウス

用を引き起こすことを示唆しており，この作用が糖尿病においても，グルカゴンシグナルの抑制によって生理的病態の増悪化における MG の作用機序の一つとなる可条件下では認めなかったα細胞新生を誘導できることが能性が考えられた．

明らかとなった．既報においては，グルカゴンシグナル
によるα細胞過形成は自己増殖によると考えられてきた

新規レポーターマウスを用いた膵α細胞新生・分化
機構の解明
氷

室

が，α細胞新生も寄与していることが新たに示された．
ただし，今回の実験系は genetic ablation による特殊な条件下での観察であるため，他の実験系を用いて再現性美和を確認する必要がある．現在 Gcg-Timer マウスにグル（順天堂大学大学院医学研究科）

カゴン抗体を投与することによりグルカゴンシグナルを抑制する新たな実験系を構築中であり，上記知見の再現【目的・方法】
近年，膵α細胞の可塑性が明らかとなってきており，α細胞の分化機構を明らかにすることは，α-to-β
reprogramming を介したβ細胞再生医療へと繋がる可能性がある．我々はα細胞分化を時間軸に沿って解析

152

性を確認するとともに，その機序を明らかにしたい．

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

NFIA が褐色脂肪細胞分化を制御するメカニズム及び全身代謝への影響の解明
平池勇

写因子 PPARγのエンハンサーへの結合を促進すること
で BAT の遺伝子プログラムを正に制御する．またヒトBAT においても WAT と比較して NFIA は高発現してお雄り，かつその発現は UCP1 を含む BAT 特異的な遺伝子（東京大学保健・健康推進本部）

群の発現と正に相関した（Hiraike Y. et al. Nature Cell

Biology 2017）．
【背景】【結果（Project 1）】

肥満症や２型糖尿病などの生活習慣病は遺伝因子，環中胚葉系の細胞が褐色脂肪細胞に分化するためには

境因子および両者の相互作用により発症する．2017 年

BAT の遺伝子プログラムの活性化に加えて，骨格筋の時点で世界には 6 億人の肥満患者が存在し（Afshin A.

遺伝子プログラムが不活性化される必要がある．申請

et al. N Engl J Med. 2017），また成人における肥満の者は NFIA がその脂肪細胞分化作用とは独立に，骨格有病率は 1975 年から 2020 年までに３倍に上昇した筋分化のマスター転写因子 MyoD をコードする Myod1(WHO, 2020)．現時点で上市されている抗肥満薬はすのエンハンサー上で KLF5 を含む他の転写因子と競合

べて「エネルギーの摂取を抑制する」という考え方に基し Myod1 の転写を抑制すること，その結果として骨格づいて開発されたものだが，副作用等の懸念から現実には実臨床において十分に活用されていない．高度肥満症に対する減量手術の有効性は確立されつつあるが，適応が限られることは明らかである．そのため現時点で肥満

NFIA は褐色脂肪遺伝子プログラムの促進と骨格筋
遺伝子プログラムの阻害の双方を介して褐色脂肪細胞分化を制御する症の治療は食事や運動といった生活習慣に関する指導が主体となっており，安全かつ効果的な新たな治療法の開発が望まれている．
褐色脂肪組織（brown adipose tissue, BAT）はミト
コンドリアにおける uncoupling protein-1 (UCP1) の機能を介して熱を産生しエネルギーを消費する点において，主にエネルギーの貯蔵を担う白色脂肪組織 （white
adipose tissue, WAT）とは対照的な組織である．リニ
エージトレーシングの結果から BAT と WAT は発生学的な由来が異なる一方，BAT と骨格筋は共に Myf5 陽性の前駆細胞から分化すると報告されている．また近Hiraike Y et al.

2020 より引用改変

体重増加や BMI 上昇に対して、FTO 遺伝子近傍の肥満感受性 SNP と運動習慣は gene-environment interaction を呈する

年になってヒト成人においても機能的な BAT が存在すること，BAT の活性と BMI は負に相関することが示されており，BAT は「エネルギー消費の促進」に基づく肥満症，メタボリックシンドローム，肥満 2 型糖尿病の新しい治療標的になり得るとして注目されている．
我々は以前，マウス BAT/WAT に対するゲノムワイド
なオープンクロマチン解析と BAT 特異的オープンクロ
マチン領域のモチーフ解析から，BAT の分化を正に制御する因子として転写因子 NFIA (nuclear factor I-A)を同定した．NFIA は BAT 特異的遺伝子エンハンサー

Hiraike Y et al.

. accepted より引用改変を分化に先駆けて活性化し，脂肪細胞分化のマスター転153

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

筋の遺伝子プログラムを不活性化し褐色脂肪細胞分化を

interaction はこれまで十分に検討されていなかった．

担保することを明らかにした．また NFIA の褐色脂肪細我々は台湾 biobank の約 2 万人のデータを用いて，胞分化促進作用にはその C 末端に位置する 17 アミノ酸

もっともよく知られた肥満感受性 SNP であり白色脂肪残基が必須である一方，この 17 アミノ酸残基を欠失さ細胞の褐色化を介して作用する FTO rs1421085 と定せた変異型 NFIA も骨格筋分化の抑制作用は保持してお期的な運動習慣（なし，≦20METs/週，＞20METs/週

り，NFIA の褐色脂肪細胞分化促進作用と骨格筋細胞分の ３ 群 ） の 間 に 体 重 や BMI の 増 加 に 対 す る gene-化抑制作用は異なるドメインが担っていると考えられenvironment interaction が存在することを明らかにした．従来，脂肪細胞と骨格筋細胞それぞれのマスター転た．Risk allele を有する被験者であっても，定期的な運写因子である PPARγと MyoD はお互いにその発現を動習慣によって追跡期間中の体重増加が抑制された．更抑制することで運命決定の一意性を担保することが知に baseline で定期的な運動習慣がないと回答した被験られていた．今回の結果により NFIA が PPARγ依存的者に注目したサブグループ解析を実施し，baseline でな経路による褐色脂肪細胞分化の促進及び PPARγ依存

定期的な運動習慣がなかったとしても，追跡期間中に的な MyoD の発現抑制を介した骨格筋分化の抑制に加運動習慣を獲得することで risk allele 保有者の体重増えて，PPARγ非依存的に Myod1 のエンハンサー上で加が抑制されることを明らかにした．この知見は遺伝的

KLF5 と競合し骨格筋分化を抑制することによって褐色な高リスク群に対して最適な生活指導を行うことで生活

脂肪細胞分化を担保する機能を有していることが判明し習慣病の発症を予防する精密医療の実現に向けた重要なた（Hiraike Y. et al. PLoS Genetics 2020）．

示唆に富んでいる (Hiraike Y. et al. J Clin Endocrinol【結果（Project 2）】

Metab. Accepted)．

前述の通り，肥満症を含む生活習慣病は遺伝因子と環【今後の展望】

境因子およびこれらの相互作用によって発症する．遺伝

褐色脂肪細胞における NFIA が全身代謝に及ぼす影

因子は BMI (body mass index) の約 40% 程度を説明す

響及び作用メカニズムの全貌が明らかになれば，「エると考えられており，ゲノムワイド関連解析（genome-

ネルギー消費の促進」に基づく新たな抗肥満治療のwide association study, GWAS）によって数百の肥満実現が期待される．またバイオバンクを用いた gene-

感 受 性 SNP (single nucleotide polymorphism, 一 塩

environment interaction の解析は，遺伝的リスクに基基多型 ) が明らかとなっている．中でも FTO 遺伝子

づいた最適な生活指導という形で生活習慣病領域におけの intron 1 と intron 2 の間に位置する SNPs は最大のる精密医療の実現につながることが期待される．

eﬀect size を有すると報告されており，risk allele を【文献】

１つ有することによって BMI は 0.25-0.41kg/m2 上昇

１）Hiraike, Y.*, Yang, CT., Liu, WJ., Yamada, T. &し， 肥 満 の odds risk を 1.18-1.27 程 度 上 昇 さ せ る と

Lee, CL.: FTO obesity variant-exercise interaction

報告されている．遺伝因子と環境因子それぞれの研究

on changes in body weight and BMI: The Taiwanに加えて，これら２つの相互作用（gene-environment

Biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology

interaction）を検討する研究が近年盛んに行われてい& Metabolism Accepted * Corresponding author

る．例えば運動習慣や食事摂取，喫煙習慣，アルコー

２）Yamada, T., Yoneoka, D., Hiraike, Y., Hino, K.,ル 摂 取 と 疾 患 感 受 性 SNP の 間 の gene-environment

Toyoshiba, H., Shishido, A., Noma, H., Shojima, N.

interaction がよく検討されており，定期的な運動習慣& Yamauchi, T.: Deep Neural Network for Reducing

が FTO SNP の BMI に対する効果を減弱させるという

the Screening Workload in Systematic Reviews forinteraction が複数の文献で報告されている．しかしこ

Clinical Guidelines: Algorithm Validation Study.

れら文献は cross-sectional に評価された BMI に対す

Journal of Medical Internet Research 2020; 22(12):

る検討であり，臨床的により重要な「追跡期間中におe22422

ける BMI や体重の変動」に対する gene-environment３）Hiraike, Y., Waki, H., Miyake, K., Wada, T.,154

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Oguchi, M., Saito, K., Tsutsumi, S., Aburatani, H.,

共陽性の血管周皮細胞（pericyte）に，T-cad とともに

Yamauchi, T. & Kadowaki, T.: NFIA differentially

局在していた．

controls adipogenic and myogenic gene program

pericyte は内皮細胞の支持細胞として，血管構造のthrough distinct pathways to ensure brown and維持に重要な役割を果たすだけでなく，組織常在性の間

beige adipocyte diﬀerentiation. PLoS Genetics 2020;

葉系幹細胞として，組織修復もしくは線維化にも関与

16(9): e1009044

することが近年報告されている．そこで，腎虚血再灌流

４）Hiraike, Y., Waki, H., Yu, J., Nakamura, M.,（IRI）による急性腎障害モデルを用いて，腎臓におけるMiyake, K., Nagano, G., Nakaki, R., Suzuki, K.,

APN/T-cad の役割を評価した．その結果，APN-KO お

Kobayashi, H., Yamamoto, S., Sun, W., Aoyama,

よび Tcad-KO マウスの IRI 腎では，野生型（WT）マT., Hirota, Y., Ohno, H., Oki, K., Yoneda, M.,

ウスに比して，著しい血管透過性亢進と尿細管壊死所見

White, AP., Tseng, YH., Cypess, AM., Larsen, TJ.,の増悪が認められた．続いて，IRI 後の腎微小血管構造

Jespersen, NZ., Scheele, C., Tsutsumi, S., Aburatani,の変化を確認したところ，Tcad-KO マウスの IRI 腎で

H., Yamauchi, T. & Kadowaki T.: NFIA co-localizesは血管内皮細胞に隣接する PDGFRβ陽性細胞が顕著にwith PPARγ and transcriptionally controls the brown

減少しており，重篤な pericyte loss が示唆された．

fat gene program. Nature Cell Biology 2017; 19(9):マウスの primary pericyte を用いた細胞実験では，精製高分子多量体 APN の添加により，APN の集積と1081-92.

培養上清への Exo 亢進促進を認めたが，T-cad のノッ
クダウンによりキャンセルされた．
【考察】
アディポネクチンの組織修復機構の解明
藤島裕

腎臓において APN は，T-cad を介して尿細管周囲毛

也

細血管の pericyte に存在しており，急性腎障害モデル（大阪大学大学院医学系研究科）

における血管透過性亢進を抑制することで，腎保護効．現果を発揮することが示された（AJP-endo 2021）【背景】

在 T-cad ﬂox マウスおよび PDGFRα CreERT2 マウスを脂肪細胞特異的分蛋白アディポネクチン（APN）は，入手しており，これらのマウスを掛け合わせることで，

T-カドヘリン（T-cad）への特異的な結合を介して，血pericyte/間葉系幹細胞 特異的な T-cad 欠損マウスを樹管内皮細胞（JCI Insight 2018）
・骨格筋細胞（Sci Rep

立し，糖尿病性腎症等への病態形成の影響について検討

2019）
・間葉系幹細胞（Mol Ther 2020）からのエクソする予定である．

ソーム（Exo）産生を促進し，臓器保護作用を発揮することを明らかとしてきた．そこで，APN および T-cadの腎臓における局在と，その腎保護作用への関与について検討した．
【方法・結果】

非侵襲的膵β細胞イメージング技術を用いた，膵β
細胞量を標的とした糖尿病の予防・治療法の開発
村

上

隆

亮
（京都大学医学部附属病院）

腎臓では心血管組織と比較すると相対的に少ないものの，APN および T-cad 蛋白の存在を認めた．次に，蛍光免疫染色により腎臓における APN の局在を評価した【背景・目的】ところ，細動脈の血管内皮だけでなく，特に近位尿細管

本邦では軽微な肥満であっても糖尿病を発症する患者

周囲の毛細血管で APN が検出された．このような尿細が急増しており，耐糖能異常が出現する段階から既に膵

管周囲毛細血管の APN は，血管内皮細胞マーカーであ

β細胞量は減少していることが報告されている．このたる CD31 とはほとんど共染せず，PDGFRα/PDGFRβめ，糖尿病の発症・重症化予防のためには，膵β細胞量155

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

を指標に，より早期に介入することが有用と考えられる．
また，膵β細胞量の減少は，食事・薬物など各種治療効
果の減弱または治療抵抗性の可能性に直結するため，膵
β細胞量の減少を予防，または維持・回復させることがうつ様行動制御遺伝子 USP46 によるエネルギー
代謝制御に関する研究
村

田

知

弥
（筑波大学医学医療系）

求められる．一方で，これまで非侵襲的な膵β細胞量評価が困難であったために，糖尿病治療薬の膵β細胞量保護効果については評価が定まっていないものも多い．わ【目的】

れわれは，Glucagon like-peptide-1 (GLP-1) 受容体に脱 ユ ビ キ チ ン 化 酵 素 USP46 は 神 経 系 に 高 発 現 し，

特異的に結合する Exendin-4 を骨格とした放射性同位Usp46 欠損マウスはうつ様行動をほとんど示さない．

元素標識プローブを用いた非侵襲的膵β細胞イメージン

我々は培養細胞を用い，近位依存性ビオチンラベリン

グ技術を開発し，Positron emission tomography (PET)

グ（BioID）によるタンパク質相互作用の解析を行い，や Single photon emission tomography (SPECT) での

USP46 がエネルギー代謝関連因子と相互作用すること

生体マウス膵描出，同法を用いた膵β細胞量の縦断的評を見出した．また Usp46 欠損マウスは生後２週の時点価が可能であることを複数の糖尿病モデルマウスで示しより低体重を示す．そこで本研究では，USP46 とエネ

た．この技術を応用することで，非侵襲的かつ経時的にルギー代謝の関連の解明を目指し，Usp46 欠損マウス

膵β細胞量の変化を捉え，糖尿病発症・進展または各種の解析と USP46-BioID ノックイン（KI）マウスを用い治療における，個体のインスリン分泌能，インスリン抵

た in vivo BioID を実施する．

抗性，食欲・食行動の変化などと膵β細胞量との互いの【結果】

時相的な相互関係性については明らかにし，膵β細胞量⑴ 脳特異的 Usp46 欠損マウスの作製を標的とした糖尿病の予防・治療法の開発を目的とする．
【方法】

体重減少の原因となる組織を特定するため，組織特異的ノックアウト（cKO）マウスの作製に着手した．まず

本 年 度 は，SPECT 用 プ ロ ー ブ で あ る (Lys12[111In-

Usp46 が高発現する脳の寄与を検証すべく，昨年度にBnDTPA-Ahx]) exendin-4 (111In-Ex4) を 用 い， マ ウ ス

樹立した Usp46flox マウス卵子に対し，Nestin-Cre マウ

個体の中枢神経系領域に有意集積を描出できるかを検討

スの精子を体外受精した．現在解析に向け繁殖中である．

した．

⑵ Usp46 Exon4 欠損マウスの解析【結果】目的に記載の Usp46 欠損マウスは，Usp46 遺伝子座

In-Ex4 を 投 与 し た マ ウ ス の 頭 蓋 内 視 床 下 部

Intron 1 にトラップベクターが挿入されており，遺伝相 当 領 域 に，SPECT に て 有 意 集 積 を 検 出 し た．

的背景が C57BL6/J と CBA の mixed である．一方 (1)Biodistribution Study にても，大脳などと比し，視床に用いた Usp46flox マウスは Cre 依存的に Exon4 を欠下部で有意に高い分布を認めた．さらに，SPECT 画像損し，また C57BL6/J 背景であるため，両モデル間でから算出されたプローブ集積値と視床下部での GLP-1

体重表現型が一致するか検証した．Usp46flox マウス作受容体 mRNA 発現量は有意な相関関係を示した．

製時に副次的に得られた Usp46 Exon4 欠損マウスを解【考察】析した所，このマウスも生後２週より体重低下を示した．

111

In-Ex4 SPECT にて，視床下部領域の GLP-1 受容111

体発現量を Mass として評価できる可能性を示した．

このことから，Usp46flox マウスを用いた cKO による体重表現型の解析が可能であることが示された．
⑶ USP46-miniTurbo-KI マウスを用いた in vivo BioIDの確立
昨年度樹立した USP46-ビオチンリガーゼ（miniTurbo）-KI マウスを用い，in vivo BioID によるマウス生体内における USP46 の相互作用タンパクの網羅的解析を

156

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

実施し，脳内における USP46 の相互作用因子候補を多療のアドヒアランスの継続の価値を最大化するモデルを数見出した．

作成検証した（ISPOR 他）．さらに現在は糖尿病専門医【今後の展開】と同じ処方パターンを提案できる AI 構築準備を進めて本研究に必要な遺伝子改変マウス，in vivo BioID のいる．糖尿病専門医の暗黙知を機械学習によってアプリ確立が完了した．次年度より USP46 による新生仔期の化し利用できれば，非専門医（医師，患者，製薬会社）

代謝制御のメカニズムを探るとともに，in vivo BioID

でも専門医と同等の治療選択方法をあらかじめ知ることの結果を精査していく．

ができる．
２．ヘルスケアの集団的アプローチ〇Real-time Systematic Review and Metaanalysis の実現化

ネットワークメタアナリシスによる糖尿病の最良の治療選択エビデンスの確立：人工知能による臨床エ
ビデンスの統合と体系化
山田朋

システマティックレビュー・メタアナリシスは臨床ガ
イドラインの礎である．この一連のプロセスを人工知能に自動化させ，常に最新の臨床治験をアップデートする

英

研究を進めている．我々は深層学習の技法を用い文献検（東京大学大学院医学系研究科）

索の 10 倍の省力化を報告した（JMIR）．また，メタア
ナリシスの国際共同研究に参加した（Nature 他）
．本研

【目的】

究の発展により全疾患領域で，現時点で最もエビデンス

本研究は人工知能を用いたヘルスケアの個別化アプレベルが高い臨床知見を迅速かつ精密に提供することがローチと集団的アプローチの統合と展開への挑戦を目標

できる．ネットワークメタ解析に関し多くの報告を行っとし，以下のプロジェクトを中心に進めており，SDGs

た（Diabetes Care 他 ）， そ の 成 果 は 米 国 内 科 学 会 のの理念に一致する．

ACP-Journal Club (Annals of Internal Medicine) や米【方法と結果】

国の救急治療ガイドラインに引用され，現場の臨床医の１．ヘルスケアの個別化アプローチ

治療方針の意思決定に寄与した．本研究は全疾病領域に〇 Precision Nutrition

応用可能である．

精密栄養（精密治療）は，最適な健康のための栄養素【考察】の必要量，生活習慣が個人間で大幅に異なるという認識

人間の経験値・暗黙知を学んだ人工知能が代行するこに起因する考え方である．我々は，ある個別の食生活やとで人類はより創造的かつ生産的な作業に従事すること

生活習慣によってその後の生存期間が改善するという個が可能となる．

人を人工知能でクラスター化するためのアルゴリズムを【謝辞】開発した．つまりある種の食事や生活習慣介入を個別に長い期間支えてくださった財団様，ご推薦いただいた

提案し，また薬剤反応性が個人で異なるという点で，最門脇先生他，すべての諸先生方に御礼申し上げます．お適な個別薬剤介入の設計も行う．

かげ様で留学することができ，かつ当初の課題から大き〇 Dynamic Treatment Regimes

く変わって視座を広げることができ，様々な経験を積む

最良の個別化治療の提案と，糖尿病専門医と同じ処方ことで，Front の研究へ変えることができました．

パターンを提案できる AI を作る．Dynamic Treatment
Regimes は，ある状態の各糖尿病患者さんに最適の治
療法を強化学習（Q-Learning）で予測するものである．
単に今ある治療法を選ぶのではなく，その結果こうなった場合にはどのように治療するか，など，あたかも将棋の手を読むかのように動的に予測する．我々は糖尿病治

157Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

Depletion of CD206 M2-like macrophageactivates fibro-adipogenic progenitors,
and enhances myogenesis during recovery
process

site, followed by a switch from proinﬂammatory MΦ
to anti-inﬂammatory M2-MΦ1, 16, 17), consistent withthe previous reports 19, 21-23). Although, proinﬂammatory M1-type MΦ reportedly have a negative eﬀect
on the repair process 19, 21, 24-26), the role of Mrc1＋

Nawaz AllahMΦ is reported to be involved in the tissue repair（富山大学医学部）and inﬂammation resolution 7, 27, 28). Evidence to support this hypothesis is not suﬃciently accumulated.

Skeletal muscle has a remarkable regenerative ca-

We recently reported that Mrc1＋ M2-like MΦ-pacity that is clinically important for muscle injury

derived TGF- 1 inhibited the proliferation ofand other myopathies 1, 2). Previous reports havebeige and white adipocyte progenitors in adipose

shown that the recovery of muscle after injury re-tissue 29-31). These mesenchymal stem cell (MSC)-likequires the coordinated activation of muscle satellite

progenitors also reside in muscle as FAPs, where

cells, non-myogenic progenitor cells and immune

they secrete various paracrine factors to support thecells 2-7). Several pieces of research have clearlyrecovery of muscle following injury. Therefore, we

demonstrated a potential role of FAPs during thepresumed that the depletion of Mrc1＋ MΦ might af-

recovery of muscle 2, 5, 8, 9). These newly identified

fects the activation of FAPs in muscle after injury,

FAPs play a critical role in the recovery process andthereby promoting recovery.

potentially secrete various paracrine factors that

To investigate the role of Mrc1＋ MΦ in muscle

support the recovery process in response to injury

recovery, we will utilize previously generated CD-

2, 5, 9-11). To understand the hierarchical organization

206DTR mice in which conditional depletion ofof various stem/progenitor cells, single-cell RNA

Mrc1＋ MΦ is possible 29). Depletion of Mrc1＋ MΦsequencing (scRNA seq) analyses unveiled the char-during the early phase of repair considerably accel-

acteristics of stem/progenitor cells in adipose tissue

erated the recovery of the injured skeletal muscle.

and muscle 1, 16, 17). Consistent with previous

We will proceed with this project to further dissect

reports 2, 9), recent advances in scRNA seq analysis

how Mrc1＋ M2-like MΦ contributes to the recovery

have revealed a distinct myogenic subpopulation

process.

during the recovery process 1, 16, 17). These reports

References

also explored a newly discovered cell hierarchy

１）Giordani, L., He, GJ., Negroni, E., Sakai, H.,

during the recovery process that emphasizes the po-

Law, JYC., Siu, MM., Wan, R., Corneau, A.,

tential role of FAPs. Various subtypes of FAPs have

Tajbakhsh, S., Cheung, TH. et al.: High-Dimen-

been identiﬁed using scRNA seq analysis. Activatedsional Single-Cell Cartography Reveals Novel

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Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

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160

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Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成【考察】
脂肪組織量規定因子の同定とその機能解析
Shin Jihoon

脂肪組織のコラーゲンマトリックスは病態的な繊維化因子としてよく知られていたが，その生理的意義や重要（大阪大学大学院医学系研究科）

性については解明されていなかった．本研究ではヒトやマウスで脂肪組織に高発現し，脂肪組織量を規定する因【目的】

子として HSP47 を同定した．HSP47 は脂肪細胞外の栄

ヒトの脂肪組織量は個人差が大きく，遺伝的，環境的，養状態もしくは遺伝的 SNP により発現が制御され，脂病態的要因が総合的に関与しているが，その主要な因子

肪細胞のコラーゲンのフォールディング状態を変化させの報告はまだない．本研究では脂肪組織量を規定する因ることで細胞内の PPARγタンパク発現を調節し，脂肪子の同定とその機能解析を目的とする．

組織量を規定していることが分かった．現在その詳しい【方法】

分子メカニズムを解明中であり，今後ヒト肥満脂肪細胞

脂肪組織量に関わる遺伝的，環境的，病態的要因トの研究に大きく寄与できると考えられる．

ランスクリプトームの解析から脂肪組織量を規定する
可能性の高い因子を探索する．マウスモデルを用いた

In vivo の実験及び 3T3-L1 脂肪細胞を用いた In vitroの実験系でその因子の機能解析を行う．

血管内皮 PDK1 の病態生理学的役割の解明
小

畑

淳

史
（川崎医科大学医学部医学科）【結果】
脂肪組織量を規定する因子のスクリーニングの結果，
HSP47 を同定した．HSP47 はコラーゲン特異的シャペ【背景】

ロンとして知られており，脂肪組織に高発現し，遺伝

我々は血管内皮特異的に PDPK1 を欠損させること的（SNP），環境的 ( 過食，肥満，運動，絶食 )，病態的で，生理的または高脂肪食負荷条件下では，主に脂肪(Cachexia) 環境の脂肪組織量と相関して発現が制御さ組織における血管新生が抑制され，脂肪の縮小に伴うアれることを見出した．HSP47 阻害剤をマウスに投与す

ディポカイン発現の改善に伴い，全身でのインスリン抵

ると脂肪組織が小さくなり，脂肪細胞のマスターレギュ抗性が改善することを明らかにした．一方で，血管内皮

レーターである PPARγのタンパク発現が低下した．脂特異的に PDPK1 を欠損させることで，膵β細胞におけ肪細胞特異的 HSP47 ノックアウトマウスでも同様に脂る血流が低下し，血管内皮構造の構築の乱れを生じ，膵

肪組織量が少なく，PPARγのタンパク発現が低下した．

β細胞機能が低下することを明らかにした．これらの研3T3-L1 脂肪細胞を用いた In vitro の実験でも同様の結究は主に生理的条件または高脂肪食負荷下での表現型で果で，HSP47 のノックダウン及び阻害により PPARγあり，高血糖状態での血管内皮 PDPK1 が果たす役割はのタンパク発現が低下した．そのメカニズムとして，明らかにされていない．また，これまで「恒常的に発現

HSP47 は脂肪細胞のコラーゲンのフォールディング状している」とされていた PDPK1 は，ヒト大動脈血管内態を調節し，これら細胞外基質と細胞膜インテグリン

皮では肥満に相関して発現が低下していることも明らかとのバインディングを介し細胞内 FAK シグナルを誘導，にしている．

PPARγを安定化させ，脂肪組織量を規定していること【目的】が分かった．HSP47 の発現は摂食により増加し，絶食

高血糖状態における血管内皮 PDPK1 の役割を解明すにより低下することから，ホルモンによる発現制御を考ること，及び血管内皮における PDPK1 の発現制御のメえた．3T3-L1 脂肪細胞を用いた実験ではインスリンのカニズムを明らかにする．

添加により HSP47 の発現が増加し，コルチゾールによ【方法】

り低下した．

血管内皮特異的 PDPK1 欠損マウスを用いて，STZ で高血糖を誘発し，全身の糖代謝に及ぼす影響を解明する

161

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

こと，及び様々なモデルを用いて血管内皮 PDPK1 の発3388-3393, 2014）．同マウスを用いることにより新

現がどのように制御されているかを明らかにする．

生β細胞を単離しその遺伝子プロファイル解析に成功【結果】したものの，新生β細胞の位置情報を得ることが困難

STZ によって高血糖を誘発すると，血管内皮特異的であった．本研究課題では，この問題を克服するため

PDPK1 マウスではインスリン抵抗性が惹起された．まに新たなレポーターマウス Ins1-eGFP; Timer double

た Akt のリン酸化を評価したところ，その主たる臓器

transgenic mouse (Ins1-Timer; GFP マウス ) を作製し，は骨格筋であることが明らかになった．骨格筋におけ

蛍光顕微鏡下で新生β細胞を緑色蛍光細胞として観察する vascularity は PDPK1 欠損マウスで有意に低下してることに成功した．新生β細胞と膵管，血管との位置関

おり，TUNEL assay でも有意に血管内皮の apoptosis

係を解析した結果，胎生期膵臓には起源の異なる 2 種の亢進が確認された．In vitro でもヒト臍帯動脈血管内

類の新生β細胞，すなわち膵管近傍にある内分泌前駆細皮細胞を用いて PDPK1 をノックダウンすると cleaved

胞がその場で，即ち膵管に接したまま，β細胞へと分化

caspase3 の発現が有意に増加し，血管増殖に重要な役した “膵管近接型” 新生β細胞（βduct 細胞）と， 膵管

割を果たす VEGFR2 の発現は有意に低下していた．電近傍の内分泌前駆細胞が血管周囲に移動した後に分化す

子顕微鏡による評価では，骨格筋のミトコンドリア構造

る “血管近接型” 新生β細胞（βvessel 細胞）が存在するの乱れや脂肪の蓄積が確認された．以上から血管内皮特ことが明らかとなった．さらに，免疫組織学的染色を行っ

異的 PDPK1 欠損マウスは STZ 誘導性高血糖下では骨た結果，大部分のβduct 細胞は Mafb を，大部分のβvessel

格筋の vascularity を低下し，さらには mitochondria細胞が Mafa を発現していることが明らかとなった．

biogenesis を低下することで骨格筋においてインスリ

次に，新生β細胞の遺伝子発現プロファイルを１細ン抵抗性を惹起することが明らかになった．血管内皮

胞レベルで明らかにするために ﬂuorescence-activated

PDPK1 の発現については db/db マウス及び高脂肪食負cell sorting (FACS) により新生β細胞を単離し，single-

荷 C57BL/6J マウスにおいては有意に発現が低下してcell RNA-sequencing (scRNA-seq) を行った．得られおり，一方で STZ 誘導高血糖モデルでは有意に発現がた scRNA-seq データをもとに t-SNE プロットを作成し，増加していた．

新生β細胞間の heterogeneity を１細胞レベルで解析し【結論】たところ，新生β細胞は高発現する遺伝子の特徴から，

血管内皮 PDPK1 欠損は STZ 誘導性高血糖下では骨① Neurog3, Pax4 を高発現する “βNeurog3 細胞”

格筋でのインスリン抵抗性が惹起される．また，様々な② somatostatin (Sst) を高発現する “βSst 細胞”

条件により血管内皮 PDPK1 の発現は「恒常的ではない」③ glucagon (Gcg) を高発現する “βGcg 細胞”

ことが明らかになった．

④ Pdx1, Mafb を高発現する “βPdx1 細胞”⑤ Ins2, Ins1 を高発現する “βIns2 細胞”

single-cell RNA sequencing を用いたβ細胞新生経路の解明鈴

木の ５ つ に 再 分 類 さ れ， そ の う ち の １ つ βPdx1 細 胞が Mafb を 高 発 現 し て お り， イ メ ー ジ ン グ 解 析 に おけβduct 細胞に相当する可能性が示唆された．さらに路

可pseudotime 解析において擬似的に設定した時間軸に（順天堂大学大学院医学部）

沿って，上記 5 つの細胞集団を unbiased に解析した結果，βNeurog3 細胞からβSst 細胞へと分化した後，α細胞

我々はこれまで，胎生期および成体におけるβ細系譜の特徴を具有するβGcg 細胞と，Pdx1, Ins2 といっ

胞新生に焦点を当てて研究を行ってきた．具体的にたβ細胞特異的遺伝子を高発現するβPdx1 細胞・βIns2 細は，“Ins1-Timer マウス” を用いて新生β細胞数を定量

胞へと別れて分化する可能性が示唆された．

し，新生β細胞の遺伝子発現プロファイルや細胞周期

さらに “分化したβ細胞（緑色蛍光陽性かつ赤色蛍の特性を明らかにした（Miyatsuka T et al. Diabetes,光陽性）” と新生β細胞（緑色蛍光のみ陽性）とを合わ

162

Front Runner of Future Diabetes Research に関する研究助成

せて pseudotime 解析を行った結果，２つのβ細胞は擬似的な時間軸に沿って２つの細胞集団に分けて展開された．このことは Ins1-GFP; Timer マウス胎生期膵
臓より FACS で単離された新生β細胞が，unbiased な
pseudotime 解析においてもより未分化な細胞集団として同定されることを示しており，GFP と Timer 蛋白の蛍光特性の差を利用した本実験系の妥当性を異なる角度から示す結果となった．
抗 MAFB 抗体を用いて免疫染色を行った結果，胎生 15 〜18 日の膵臓において 80％以上のβduct 細胞がMAFB を発現し，βvessel 細胞における MAFB 陽性率は20% 以下であったことから，前述のβPdx1 細胞は主に
βduct 細胞で構成されることが示唆された．
上記マウス胎生膵における遺伝子発現プロファイルのheterogeneity と，ヒト ES 細胞からβ細胞への分化過程もおける遺伝子発現プロファイルの heterogeneity との類似性，相違性を解析するため，ヒト ES 細胞由来イ
ンスリン産生細胞を用いて scRNA-seq を行った結果，
ヒト ES 細胞由来インスリン産生細胞においても，ソマ
トスタチンやグルカゴンを強く発現する細胞集団が存在することを見出した．
以上のように高時間分解能で新生インスリン産生細胞を解析することにより，その位置情報や遺伝子発現プロ
ファイルの不均質性を明らかにすることができた．

163

酵素情報

Cas9ヌクレアーゼ

activator-like eﬀector nuclease (TALEN) に次ぐ第三【はじめに１,２）】
Clustered regularly interspaced short palindromic
repeat-CRISPR associated protein (CRISPR-Cas) シス

世代のゲノム編集技術として，遺伝子改変に広く活用されている．

テムは，真正細菌や古細菌などの多くの原核生物にお本稿では，2020 年ノーベル化学賞の対象にもなった

いて，ウイルスなどの外来性遺伝子を排除するために

Cas9 ヌクレアーゼを中心に，その改変体や臨床応用に用いられる獲得免疫機構である．過去に感染した外来ついて概説する．

核酸に由来する CRISPR RNA (crRNA) が，別の短鎖
RNA である transactivating CRISPR RNA (tracrRNA)【CRISPR-Cas システムのクラスと型３）】および Cas タンパク質と複合体を形成し，crRNA と相CRISPR-Cas システムは，複数のタンパク質複合体か補的な外来核酸を認識し切断することで，外来因子のら構成されるクラス１と単独のタンパク質から構成され再感染を防いでいる．この crRNA と tracrRNA を１本るクラス２に大きく分けられる．生物学的研究・臨床応の guide RNA (gRNA) とし，任意の配列に Cas タンパ

用には，利便性に長けたクラス２の CRISPR-Cas シス

ク質をリクルートできる事が判明しており，このシステ

テムが主に使用されている．クラス２は構成されるタン

ムは Zinc-ﬁnger nuclease (ZFN) および transcription

パク質の種類に応じてⅡ型, Ⅴ型, Ⅵ型の３タイプがあ図164

Cas9 ヌクレアーゼによる DNA 二本鎖切断

Cas9 ヌクレアーゼ

り，Ⅱ型の Cas9 ヌクレアーゼ及びⅤ型の Cas12 ヌク【Cas9 の臨床応用５）】

レアーゼが主に DNA エンドヌクレアーゼとして機能す

CRISPR Therapeutics や Beam Therapeutics といっるのに対し，Ⅵ型の Cas13 ヌクレアーゼは DNA よりた 複 数 の 企 業 が，CRISPR-Cas9 及 び そ の 関 連 技 術 をも RNA を切断しやすいという特徴を有している．

βサラセミアや鎌状赤血球症などのヘモグロビン症治療に活用しようとしている．例えば CRISPR Therapeu-【Cas9 の酵素反応３,４）】

tics は，患者自身の造血幹細胞を化学的に除去した後にCas9 ヌクレアーゼは RNA 依存性 DNA エンドヌク

CRISPR-Cas9 でゲノム編集した造血幹細胞を患者に注

レアーゼであり，crRNA または gRNA に存在する 20

入する治療を実施しており，2020 年 11 月には４人の塩基程のガイド配列と相補的な二本鎖 DNA を認識して患者が輸血を必要としなくなったと報告している．
また，切断する．DNA 切断には，標的配列近傍の非相補鎖配Editas Medicine が手掛けるレーバー先天性黒内症など

列に protospacer adjacent motif (PAM) と呼ばれる塩のように，in vivo ゲノム編集が臨床の場で検証される

基配列が必要である．例えば，広く使用されている化ケースも出てきている．更に DNA 二本鎖切断を起こさ膿レンサ球菌由来の SpCas9 (Streptococcus pyogenes

ない Cas9 改変体についても創薬への実用化が検討されCas9) ヌクレアーゼでは，NGG（Ｎは任意の塩基）がて お り， 例 え ば Beam Therapeutics は，Cas9 改 変 体

PAM と し て 知 ら れ て い る．DNA 切 断 反 応 は， ま ずにシチジンデアミナーゼ（シトシンをチミジンに変える

Cas9-RNA 複 合 体 が PAM を 認 識 し， 二 本 鎖 DNA を酵素）やアデノシンデアミナーゼ（アデノシンをグアニ

ほどきながら Cas9-RNA 複合体中のガイド配列と標的ンに変える酵素）を結合させる事で点変異異常を治療す

DNA が RNA-DNA ヘテロ二重鎖を形成する事で開始さる base editing 技術の臨床応用を目指している．

れる．続いて，R ループ形成に伴う Cas9 ヌクレアーゼの立体構造変化が，ヌクレアーゼドメインの活性化を促【おわりに】

す．Cas9 ヌクレアーゼは２つの既知ヌクレアーゼ（HNH

CRISPR-Cas9 によるゲノム編集が初めて報告されておよび RuvC）と相補的な領域を有しており，HNH ド

以降，ノックアウトマウスの迅速な作製や gRNA ライ

メインがガイド鎖と相補的な DNA 鎖を切断し，RuvC

ブラリーを用いた網羅的スクリーニングなど，ライフサ

ドメインが逆側の DNA 鎖を切断する事で，DNA の二

イエンスはこの技術の多大なる恩恵を受けてきた．そし

本鎖切断が引き起こされる（図）．

て，早くもその技術は難病治療にも活かされようとしなお，ヌクレアーゼドメインのうち片方に点変異ている．無論，オフターゲット効果による意図しないゲ（RuvC ドメインの D10A）を入れて片側のみの DNA

ノム編集の懸念や Cas タンパク質の免疫原性懸念など，を切断できるようにした Cas9 ニッカ―ゼや，両側に安全面には細心の注意を払わなければならない．その前

点 変 異（RuvC ド メ イ ン の D10A と HNH ド メ イ ン の提の下で，今後さらに研究が進み，難病に苦しむ多くのH840A）を入れて切断活性を消失させた dCas9 (dead患者さんの治療に役立つ日が来る事を期待したい．

Cas9) が報告されている．前者の Cas9 ニッカ―ゼは，異なる 2 カ所にニックを入れる事でオフターゲット切【参考文献】

断リスクの低下を図る目的等で使用されてきた．近年で

１）西増弘志 : Cas9 の結晶構造，日本結晶学会誌，57,

は逆転写酵素と融合させ，Indel（ランダムな挿入・欠失）頻度を抑えた状態で塩基置換や短鎖の挿入や欠失を行う
プライム編集にも活用されている．また後者の dCas996-103 (2015).
２）西増弘志 : CRISPR-Cas9 の構造と機能，生化学，87, 686-692 (2015).

は，主に別の機能性タンパク質と融合させて任意の塩基

３）Andrew V. Anzalone, Luke W. Koblan, David R.

配列近傍へリクルートする目的で使われており，機能性

Liu: Genome editing with CRISPR-Cas nucleas-

タンパク質の種類に応じて転写制御やエピジェネティッ

es, base editors, transposases and prime editors,

ク制御など様々な用途に活用されている．

Nat. Biotechnol., 38, 824-844 (2020).
165

Cas9 ヌクレアーゼ

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【著者】
田辺三菱製薬株式会社
小笠原

166

モダリティー研究所

創薬本部

モダリティー研究所

彬

田辺三菱製薬株式会社
小寺

創薬本部

淳

酵素情報

自己免疫疾患における Tyk2 の役割
自己免疫疾患における創薬標的としての免疫プロテアソーム

しかし，炎症性サイトカインであるインターフェロン【序】
細胞内で役割を終えたタンパク質や不良品タンパク質（IFN）
γや腫瘍壊死因子（TNF）
α の刺激などによってもの大半は，ユビキチン化されたのち，プロテアソームと免疫プロテアソームは形成される．その構造は，構成型呼ばれる巨大な分解酵素複合体によってペプチド断片にプロテアソームのβ1c（カスパーゼ様活性）, β2c（トまで分解され，新たなタンパク質の合成に再利用されリプシン様活性），β5c（キモトリプシン様活性）がそる．そのプロテアソームは，プロテアーゼ活性を有する

れぞれ low molecular mass polypeptide (LMP) 2（β1i;

20S プロテアソームに制御ユニットである 19S 複合体

キモトリプシン様活性），multicatalytic endopeptidase（PA700）がその両端または片側に結合した構造をしてcomplex-like (MECL) 1（β2 i ; トリプシン様活性）, LMP7いる（合わせて 26S プロテアソームと呼ばれる）．また，（β5 i ; キモトリプシン様活性）に置き換わった形になっ

20S プロテアソームは，７種類のαサブユニットからなている（図（A））．

るαリングと７種類のβサブユニットからなるβリング

免疫プロテアソームは，全身に発現している構成型プがαββαの順番に積み重なった樽状の構造を取っていロテアソームと違い，免疫特異的であるゆえに毒性の回る．このサブユニットのうち，触媒活性を有しているの避が期待でき，近年様々な自己免疫疾患に対する治療標はβ1, β2, β5 のみであり，内壁にプロテアーゼ活性中的として注目を集めている．本稿では，その免疫プロテ心が露出している．

アソームに着目し，機能，疾患との関連及び創薬標的とプロテアソームにはいくつかのアイソフォームが存在しての可能性について概説する．

しており，その中でも，構成型プロテアソームと免疫プ
ロテアソームが良く知られている．構成型プロテアソー【免疫プロテアソームの機能】

ムは全身の細胞に広く発現しているのに対し，免疫プロ

プロテアソームの働きの一つとして，主要組織適合

テアソームは通常，免疫細胞に特異的に発現している．

遺伝子複合体（MHC）クラスＩによる抗原提示がある．

図 （A）構成型プロテアソームと免疫プロテアソーム，（B）MHC クラスⅠへの抗原提示経路

167

自己免疫疾患における創薬標的としての免疫プロテアソーム

プロテアソームの分解産物であるペプチドの一部が抗原

動物モデルにおける病態進行が抑制され，プラズマ細胞

処理関連トランスポーター（TAP）を介して小胞体内へ数の減少とともに血清中の総 IgG 及び抗 dsDNA 抗体レ輸送され，MHC クラスＩのペプチド収容溝に結合してベルの低下が見られている４）．

細胞表面へと運ばれる．その後，細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）
が MHC クラスＩを介して提示された抗原を認識することで，免疫応答が開始される（図（B））．

【免疫プロテアソームの創薬標的としての可能性】
プロテアソーム阻害薬であるボルテゾミブは，米国

免疫プロテアソームでは，カスパーゼ様活性を有する

FDA により多発性骨髄腫の治療薬として承認されていβ1c からキモトリプシン様活性を有する LMP2 に変換

る．そのボルテゾミブは最近，難治性 SLE 患者を対象されることで，基質特異性が構成型プロテアソームとはにした臨床試験にて高い有効性を示したが，構成型プロ

異なってくる．すなわち，酸性アミノ酸のＣ末端側の切テアソーム及び免疫プロテアソームともに阻害する薬

断活性が低下する一方で，疎水性及び塩基性アミノ酸の剤であるために，血液毒性や末梢神経障害などの重篤

Ｃ末端側を切断する活性が上昇する．MHC クラス I 結

な副作用が課題となっている．そこで，免疫プロテア合ペプチドはそのＣ末端がアンカーとなるが，その大部

ソームを特異的に阻害する薬剤の研究が活発に行われ分が疎水性アミノ酸，一部が塩基性アミノ酸であり，酸ている５）．現在臨床入りしている KZR-616 は LMP7，性アミノ酸がアンカーとなることはない．そのため，免LMP2 に対する特異的な不可逆的共有結合型化合物であ疫プロテアソームでは MHC クラスⅠに対して高い親和り，自己免疫疾患（ループス腎炎，多発性筋炎，皮膚筋性を持ち，抗原提示に有利なペプチドを効率的に産生す炎）にて開発が進められている．また，M3258 はβ5c

るようになる．

との選択性が非常に高い LMP7 特異的な可逆的共有結

また，最近の研究により，抗原提示以外の機能も明ら

合型化合物であり，多発性骨髄腫を適応症として開発中かになってきている．免疫プロテアソームの活性化は，である．両薬剤とも現在のところ，ボルテゾミブで見ら制御性Ｔ細胞（Treg 細胞）の誘導を抑制する一方で，れているような末梢神経障害などの重篤な毒性は報告さ

Th1 及び Th17 細胞の分化促進にも関与している１）．されていない．このような共有結合型化合物以外にも，非らには，Ｂ細胞の分化にも関与しているという報告もあ

共有結合型化合物も報告されており，免疫プロテアソー

る ．

ム阻害薬の利用は，現在治療選択肢が限られている疾患

２）に対して新規クラスの薬剤となり得ることが期待されて【疾患との関連】いる．

様々な自己免疫疾患や炎症性疾患において，免疫プロ
テアソームの発現上昇が報告されており，免疫プロテア【参考文献】

ソーム阻害薬である ONX-0914 は，関節リウマチ（RA）

１）Kalim, K.W. et al.: Immunoproteasome Subunit

や全身性エリテマトーデス（SLE），炎症性腸疾患（IBD），

LMP7 Deﬁciency and Inhibition Suppresses Th1

多発性硬化症（MS）などの動物モデル試験で有効性をand Th17 but Enhances Regulatory T Cell Dif-示している．また，免疫プロテアソーム阻害により，

ferentiation, J. Immunol., 189, 4182 (2012).

Th1 及び Th17 の分化抑制，Treg の分化促進が観測され，

２）Hensley, S.E. et al.: Unexpected Role for the

IL-6, IFNγ, TNFα, GM-CSF 及び IL-23 などのサイトカ

Immunoproteasome Subunit LMP2 in Antiviral

インの発現抑制も見られている３）．

Humoral and Innate Immune Responses, J. Im-

代表的な自己免疫疾患の一つである SLE は何らかの

munol. 184, 4115 (2010).

原因により種々の自己抗体を産生し，それらによる全身

３）Basler, M. et al.: The immunoproteasome: a性の炎症性臓器障害を引き起こす疾患であるが，その患novel drug target for autoimmune diseases,

者では抗体産生細胞であるプラズマ細胞の増加が知られClin. Exp. Rheumatol., 33, S74 (2015).

ている．ONX-0914 の投与により，NZB/NZW などの168４）Ichikawa, H.T. et al.: Beneﬁcial Eﬀect of Novel自己免疫疾患における創薬標的としての免疫プロテアソーム

Proteasome Inhibitors in Murine Lupus via Dual
Inhibition of Type I Interferon and Autoantibody-Secreting Cells, Arthritis Rheum., 64, 493(2012).
５）Huber, E.M. et al .: A Nut for Every Bolt:
Subunit-Selective Inhibitors of the Immunoproteasome and Their Therapeutic Potential, Cells,
10, 1929 (2021).

【著者】
田辺三菱製薬株式会社 創薬本部 免疫炎症創薬ユニット
舌間裕晃

田辺三菱製薬株式会社 創薬本部 免疫炎症創薬ユニット
柳田

哲哉

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