広島工業大学紀要教育編
第 19 巻（2020）61-69

論文

蛍光タンパク質の各種変異体を用いた生命系学生実験教材の開発
中井忠志＊（令和元年10月31日受付）

Development of a Fluorescent Protein-based Laboratory Course for Life Science StudentsTadashi NAKAI（Received Oct. 31, 2019）

概要
DNA からタンパク質への遺伝情報の流れは生命系の学生にとって重要で基礎的な学修内容であるが、深い学びのためには学生実験で DNA とその産物のタンパク質をともに細胞から抽出・精製し、それらの性質を調べるといった実習が望まれる。しかし、学生実験では １ つのテーマに割ける時間は限られているので、短期間でそれらの関連分野をまとめて学修できる内容を検討した。その結果、緑、赤、藍、橙の ４ 色の蛍光タンパク質（それぞれ、GFP、RFP、CFP、OFP）の各遺伝子を大腸菌に導入し、少量の培養液から各蛍光タンパク質を精製できる系を開発した。構築したプラスミドは、高コピーの複製起点とアンピシリン耐性遺伝子をもち、ポリヒスチジンタグを融合させた各蛍光タンパク質の高発現を可能とする。各蛍光タンパク質を発現した大腸菌はいずれも明瞭な色を呈し、Ni アフィニティカラムにより容易に発現タンパク質を精製できる。

Key Words: fluorescent protein, protein expression, protein purification, GFP mutantには以下の条件を設定した。

１ ．はじめに⃝主 要な生体分子として遺伝子（DNA）とタンパク質の両方を物質として取り扱う。

大学の生命系学部でもっとも重要で基礎的な学修内容の一つとしてセントラルドグマがあげられる。DNA の遺伝⃝遺伝子型と表現型を簡単に観察できる。

情報に基づいてタンパク質が細胞内で生合成されるという⃝ DNA とタンパク質を精製し、電気泳動で検出する。

流れやその仕組みは大学の授業科目でも初期に学ぶ内容でこれらの条件を満たすものとして、発現タンパク質自体があるが、学生実験においてもその分野に対応するテーマを色をもち、目視で観察が可能な蛍光タンパク質やそれらの扱うことにより、より理解が深まることが期待できる。ま各種変異体が有用であると考え、学生実験で扱いやすいプた、この分野は遺伝子組換えによるタンパク質の生産といラスミドの構築と実験プログラムの検討を行った。

うバイオテクノロジーによる物質生産の重要なテーマであ緑色蛍光タンパク質（GFP; green fluorescent protein）

るため、工業的応用という意味でも実践的な学びが期待さは、最初に単離された蛍光タンパク質で、野生型では238れる。本学では2020年にカリキュラム改訂を行うが、そのアミノ酸残基から構成される⑴。GFP の由来はオワンク

機会に食品生命科学科の学生実験の １ テーマとして DNA

ラ ゲ Aequorea victoria で あ り、1962年 に 下 村 脩 に よ りからタンパク質、遺伝子型と表現型の分野の実験内容を再タンパク質が単離された⑵。その後、1992年に Douglas検討し、学生実験教材の開発を進めることとした。その際

Prasher により全長の遺伝子がクローン化され⑴、1994年

＊広島工業大学生命学部食品生命科学科― 61 ―

中井忠志に Martin Chalfie により細菌や線虫で発現させても蛍光をもたらす）が cycle- ３ GFP には含まれない。また、組み示すことが証明された⑶。このことは、蛍光をもつために換え型タンパク質の精製において現在主流の方法ではア外来の基質や他の遺伝子が不要であること意味しており、フィニティタグを用いて少ないステップで高純度に精製す

その後は急速に GFP を利用した研究が拡大した⑷。

るが、pGLO の GFP にはそのようなタグが付加されておGFP は11本のβストランドからなる樽形のβバレル構らず疎水性カラムクロマトグラフィー等で精製することが造をもち、その内部を通るポリペプチド鎖に位置する ３ ア想定されている。そのため、pGLO を用いて純度の高い精ミノ酸残基（Ser65、Tyr66、Gly67）が発色団を自己触媒製タンパク質を得るためには複数の種類のカラムクロマト的に形成することで蛍光を示す。Roger Y. Tsien らは、グラフィーが必要であるという欠点が存在する。

GFP 遺伝子のクローン化の直後から変異導入を開始し、既報の GFP の精製を題材とした教育プログラムとして1994年に青、藍、黄の蛍光タンパク質（それぞれ、blue、は、ポリヒスチジンタグ（H６ タグ）融合 GFP タンパク質

cyan、yellow の頭文字とり、BFP、CFP、YFP と略される）を用いて、ニッケル（Ni）アフィニティクロマトグラフィーを作製するとともに⑸、1996年に Remington らと GFP ので精製を行うという内容が東京薬科大学の玉腰により報告

結晶構造を決定し⑹、発色団の構造と機能の関係を明らかされている⑽。そこでは、タンパク質の高発現のためににした。2008年には下村、Chalfie、Tsien の ３ 氏にノーベ幅広く用いられている pET 系発現プラスミドと宿主としル化学賞が授与された。て大腸菌 BL21（DE３）を用いて GFP を生産し、Ni-NTA

蛍光タンパク質の色は GFP への変異導入により青、樹脂を用いてアフィニティ精製が行われている。用いた藍、黄が初期に開発されたが、赤などの黄よりも長波長のGFP の変異についての記述はないので、その安定性や輝蛍光タンパク質を GFP の変異により作り出すことは困難度については不明である。一方、プラスミド DNA を調製であった⑷。赤色蛍光タンパク質（RFP; red fluorescent

する場合にはタンパク質発現用の上記大腸菌とは異なる遺protein） と し て は、1999年 に サ ン ゴ 類 に 属 す る イ ソ ギ

伝子操作用の株（例えば、JM109や DH５αなど）を通常

ン チ ャ ク の 一 種 Discosoma striata か ら DsRed が 単 離 さ用いる。また、pET プラスミドを用いた場合には、pUCれ、遺伝子がクローン化された⑺。DsRed は低いながらプラスミドの １ 割程度のプラスミド DNA の収量となり、も GFP と相同性をもち（アミノ酸配列上は19% が同一残収率が低いことも初心者には不利となる。したがって、実基）、その立体構造も GFP に類似したβバレル構造をも習内で発現タンパク質だけでなくプラスミド DNA の精製つ。DsRed の野生型は四量体で存在するため、融合タンも行う場合には、時間の制約を考慮すると同一の大腸菌株

パク質として用いるには扱いづらいという欠点があったを用い、収量の高い pUC などの高コピーのプラスミドベが、変異導入により単量体化した mRFP１が開発された。

クターの使用が望まれる。

その後、赤付近に他の蛍光色をもつ mRFP１変異体（orange

本研究では、新しいカリキュラム内の学生実験で用いるfluorescent protein（OFP）である mOrange をはじめ、実験教材として、限られた実習時間の中で効率よく手法をmCherry、mStrawberry など蛍光波長が異なるもの）が学ぶために、以下の ２ つの条件を満たす GFP 発現系の開開発された。GFP や mRFP１の誘導体である様々な蛍光タ発を試みた。⑴蛍光タンパク質の発現プラスミド DNA とンパク質は、生物系の研究で広く用いられており、現在そ発現した蛍光タンパク質そのものを、同じ大腸菌株を宿主れらの融合タンパク質は、遺伝子発現やタンパク質の局在として大量に生産できる。⑵ Ni キレートアフィニティーマーカーとして多方面で利用されている。

クロマトグラフィーにより、一段階で蛍光タンパクの高純GFP を用いた学生実験用の教材としては、バイオラッ度精製ができる。一方、これまでの蛍光タンパク質研究のド 社 の 製 品 で あ る pGLO プ ラ ス ミ ド が 知 ら れ て い る。

進歩により、様々な特長をもつ蛍光タンパク質変異体が報pGLO は、GFP 遺伝子、アンピシリン（Ap）耐性遺伝子、告されている。その中には、より高い安定性をもち扱いやaraC 遺伝子、ColE１複製起点を含む5,371bp のプラスミド

すく、より蛍光強度が高く、緑以外にも幅広い色を示すもである。GFP 遺伝子の上流にはアラビノースオペロンののなど多くの報告がなされている⑷。そこで、本研究では、プロモーター（PBAD）が配置され、pGLO で形質転換した種々の既知の蛍光タンパク質から ４ 種類のアミノ酸配列情

大腸菌はアラビノースを含む培地で培養することで GFP報を利用して、上にあげた条件を満たす発現系の構築を試を発現し、アラビノースを含まない培地では GFP が発現みた。その結果、 ４ 種類いずれの配列の場合でもすべてのしないため、原核生物での遺伝子発現調節を学ぶためにも条件を満たす実験系を開発できたので報告する。

有用である。一方、pGLO は cycle-３ GFP ⑻という改良型の変異型遺伝子をもつが、それより高性能な EGFP ⑼がもつ F64L と S65T の変異（成熟が早く輝度が高い特長を― 62 ―

蛍光タンパク質の各種変異体を用いた生命系学生実験教材の開発

除いてハイフィデリティー（HF）版を使用した。PCR に

２ ．実験方法
2.1

用いたプライマーの配列を表 １ に示した。
2.2

実験材料

蛍光タンパク質発現プラスミドの構築

プラスミドの構築およびタンパク質の発現には大腸菌構築した ４ 種類のプラスミドを代表して pUC-GFP-H６JM109株のコンピテントセル（ECOS Competent E. coliの模式図を図 １ に示した。その他のプラスミド（pUC-JM109、ニッポンジーン）を使用した。大腸菌の培養はRFP-H６ 、pUC-CFP-H６ 、pUC-OFP-H６） に つ い て は、

LB 培地（液体培地の組成は1.0% トリプトン、0.5% 酵母

pUC-GFP-H６ の GFP 遺伝子（NdeI/NheI 間の703bp）をエキス、0.5% 塩化ナトリウムを用い、固形培地ではさらその他の蛍光タンパク質遺伝子で置換することにより構築に1.5% 寒天を加えた）を用い、好気性条件下、37℃で行っした。いずれの蛍光タンパク質遺伝子も化学合成した人工た。プラスミドの形質転換体の培養では、各プラスミド内遺伝子を用い、N 末端側に NdeI、C 末端側に NheI の制の薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質を以下の終濃度にな限酵素部位を配置した（表 ２ ）。また、大腸菌において発るよう培地に加えた。50µg/mL Ap、30µg/mL ストレプ

現量が最大になるように使用コドンを大腸菌にあわせて最トマイシン（Sm）。

適化した塩基配列を使用した（表 ２ ）。

カ ル ボ キ シ 末 端（C 末 端 ） に H６ タ グ を 付 加 し た

pUC-GFP-H６ の 構 築 方 法 を 以 下 に 示 す。

タ ン パ ク 質 の 発 現 プ ラ ス ミ ド を 作 製 す る た め、C 末

pBBR-sQhpC-H６ の pBBR１複 製 起 点 を 含 む 領 域（XbaI/端 H６ タ グ 融 合 sQhpC タ ン パ ク 質 の 発 現 プ ラ ス ミ ド

PstI 間 の1704bp）、Sm 耐 性 遺 伝 子 を 含 む 領 域（SphI/（pBBR-sQhpC-H６ ）⑾を骨格として使用した。このプ

EcoRV 間 の1373bp）、sQhpC を コ ー ド す る 領 域（NdeI/

ラスミドは、T７プロモーター下流の NdeI/BamHI 部位にNheI 間 の158bp） を、 ぞ れ ぞ れ、 プ ラ ス ミ ド pUC19の

sQhpC 遺 伝 子、NheI 部 位、 ６ 個 の His コ ド ン、 終 止 コ

ColE１複 製 起 点 を 含 む 領 域（ 図 １ の XbaI/PstI 間 の1056

ドンをその順序で挿入したものである。その中の NdeI/bp、表 １ のプライマー P１、P２が対応）、pUC19の Ap 耐

NheI 部位に目的遺伝子を挿入することで、C 末端側にア性遺伝子を含む領域（SphI/StuI 間の1245bp、表 １ のプラミノ酸配列 ASHHHHHH（AS は NheI 部位の ６ 塩基に対イマー P３、P４が対応）、GFP 遺伝子（図 １ の NdeI/NheI応）が付加されたタンパク質が発現できる。制限酵素はす間の703bp）で置換することにより構築した。その過程でべて New England Biolabs Japan の製品を用い、NdeI をは、必要な制限酵素部位を ５ ' 末端に付加したプライマー（表 １ ）を用い、pUC19を鋳型として PCR により増幅して得られた断片を制限酵素で切断した。次いで各断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、FastGene Gel/PCRExtraction Kit（日本ジェネティクス）を用いて抽出・精製した。T４ DNA リガーゼ（DNA Ligation Kit、MightyMix、タカラバイオ）を用いて断片同士を接続した後、ライゲーション反応溶液を用いて形質転換した大腸菌を LB寒天培地（Ap 入り）に塗布し、37℃で一晩培養することで形質転換体のコロニーを得た。シングルコロニーを２mL の LB 培地（Ap 入り）に移し、37℃で一晩振盪培養した。培養液を6,000rpm、10分間の遠心分離により集菌し、菌体からのプラスミドの精製は、基本的にはアルカリ抽出法⑿にスピンカラム法を組み合わせた方法⒀に従い、

図１
表１

プラスミド pUC-GFP-H6 の模式図

FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス）を用プラスミド構築に用いたプライマー― 63 ―

中井忠志

いて行った。構築した ４ 種類の発現プラスミドはすべて
表２

DNA シークエンシングを行い、塩基配列に意図しない変本研究で用いた蛍光タンパク質の人工遺伝子― 64 ―

蛍光タンパク質の各種変異体を用いた生命系学生実験教材の開発
表３

本研究で用いた蛍光タンパク質のアミノ酸配列異が入っていないことを確認した。

500mM 塩化ナトリウム）10mL で非特異的にカラムに結2.3合した夾雑タンパク質を洗浄し、溶出バッファー（10mM

蛍光タンパク質の発現と精製それぞれの蛍光タンパク質発現プラスミドで大腸菌を形リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、500mM 塩化ナトリウ質転換し、LB 寒天培地（Ap 入り）を用いて37℃で一晩ムを含む、500mM イミダゾール）で溶出した。蛍光タン培養することでコロニーを得た。シングルコロニー １ 個をパク質を含む溶出液は、いずれも特有の色をもつため目視

100mL の LB 培地（Ap 入り）に移し、37℃で24時間振盪により蛍光タンパク質を含む溶出液を試験管に分取した。

培養した。培養終了後、培養液を50mL の遠沈管に移し、各画分について、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリ6,000rpm、 ４ ℃、20分間の遠心分離を ２ 回繰り返すことアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を行った。なお、で、100mL の培養液中の菌体を １ 本の遠沈管に沈殿としSDS-PAGE では、基本的には Laemmli の方法⒁に従って集めた。遠沈管の上澄みの培地を取り除いた後、使用すたが、ゲルには市販品である Any kD ミニプロティアン

るまで菌体を遠沈管内で−20℃にて冷凍保存した。

TGX プレキャストゲル（バイオラッド）を用いた。泳動

氷上で解凍した菌体に40mL の溶菌バッファー（10mM

後のゲルはコロイド CBB 染色⒂を行い、タンパク質バンリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、500mM 塩化ナトリウドを検出した。精製タンパク質濃度の定量は Bradford 法ム）を加え十分に懸濁した後、超音波破砕を行い20,000×g、⒃に従い、プロテインアッセイ CBB 溶液（ ５ 倍濃縮）（ナ４ ℃、60分の遠心分離により上清を回収し、抽出液を得カライ）を用いて定量した。

た。なお、超音波破砕では、菌懸濁液の入った遠沈管を氷３ ．結果上に置き、超音波破砕機 Sonifier250（Branson）を用い、

3.1

output５、duty50%、 １ 分破砕、 １ 分休止の過程を合計 ３回繰り返した。

蛍光タンパク質のアミノ酸配列の選択

本研究では蛍光波長の異なる ４ 種類の蛍光タンパク質の遠心後の各抽出液は、溶菌バッファーで平衡化した人工遺伝子を用いた。使用したアミノ酸配列を表 ３ に示し

Ni キレートカラム（ベッド体積１mL、cOmplete His-tag

た。GFP については、高い構造安定性をもつ superfolder

purification resin、ロシュ）に吸着させた。次いで、洗浄（sf）型の GFP（sfGFP）をさらに改良した GFPopt のアミバッファー（10mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、ノ酸配列⒄を用いた。なお、GFPopt は ３ 本のポリペプチ― 65 ―

中井忠志

ド鎖に分割して発現させても、それらの再会合により蛍

１ 回 の 培 養 液100mL あ た り、0.9mg（GFP-H６ ）、0.7mg

光を示す改変型 GFP である⒄。RFP については、単量体（RFP-H６ ）、3.5mg（CFP-H６ ）、3.6mg（OFP-H６ ）であっである mCherry の高安定型の sfCherry のアミノ酸配列た。精製タンパク質の SDS-PAGE を行い、タンパク質バ⒅を用いた。CFP についても、単量体であり高安定型のンドを CBB 染色で検出したところ、いずれの蛍光タンパsfCFP のアミノ酸配列⒆を用いた。OFP については、単ク質も90% 以上の純度で溶出画分に存在していることが量体である mOrange のアミノ酸配列⒇を用いた。

判明した（図 ６ ）。

3.2

形 質転換体コロニーの発色とプラスミド DNA の精製構築した ４ 種類の蛍光タンパク質発現プラスミドで形質転換され、LB 寒天培地に生じた大腸菌コロニーは白色光
では着色はわずかであり、ほぼ白色を示した。一方、プラスミドを調製するために、シングルコロニーを２mL の LB培地に接種し37℃で一晩培養した場合には、集菌後の菌体

図３集菌前の培養液⒜と集菌後の菌体⒝の写真はそれぞれに特有な色を呈していた（後述の発現時の培養液と同様の着色）。また、最初に生じた白色のシングルコロニーを、終濃度１mM の IPTG を含む LB 寒天培地に接種して一晩培養した場合には寒天培地上で強い着色がみられ、青色光を照射することで特有の蛍光色を示した（図 ２ ）。
これらの２mL の培養液から、いずれのプラスミドについても約10µg の DNA が精製により得られた。

図２

 天培地で培養した蛍光タンパク質発現大腸菌の写真。白寒色光（左）と青色光（右）を下から照射して撮影した。青色光使用時には橙色フィルターを用いた。

3.3

蛍光タンパク質の発現と精製蛍光タンパク質発現プラスミドで形質転換した大腸菌をそれぞれ培養し、各蛍光タンパク質を発現させた後、集菌した（図 ３ ）。次に菌体の抽出液から、H６ タグを融合した蛍光タンパク質を Ni アフィニティクロマトグラフィーにより精製した（図 ４ ）。精製タンパク質の各種条件下の写図４

 光タンパク質の Ni アフィニティカラム精製。CFP と蛍OFP の 場 合 に つ い て の み 示 す。 精 製 で は、Ni ア フ ィ
ニティ樹脂をエコノパッククロマトグラフィー用カラム（#7321010、 バ イ オ ラ ッ ド ） に 充 填 し、PD-10 Spin
Adapter（GE ヘルスケア）を用いてカラムを50mL 遠沈管に装着して精製をすすめた。

真を図 ５ に示した。溶出画分の精製タンパク質の収量は、

図５ 製した蛍光タンパク質の写真。白色光⒜、青色光⒝、紫外線⒞を照射して撮影した。左から、GFP-H６ 、RFP-H６ 、CFP-H６ 、精OFP-H６ の順に蛍光タンパク質の入ったマイクロチューブを配置した。

― 66 ―

蛍光タンパク質の各種変異体を用いた生命系学生実験教材の開発

生産とタンパク質の発現を同じ菌株を宿主として用い、DNA とタンパク質をともに十分な収量で精製することができた。 ２ 種類の宿主を用いる pET を用いた系に比べると簡潔であり、プラスミド DNA の調製とタンパク質の精製を短期間で修得できるという点で有利な系が構築できたと考える。
今回構築したプラスミドでも、これまでの多くの報告例と同様であるが、ラクトースプロモーターを用いて IPTGの添加により発現の誘導が可能であることが判明した。その一方で、IPTG などの誘導物質を添加しないでも、プラスミド調製やタンパク質発現における長時間培養（一晩以上）では発現が誘導されることが判明した。これは、ラク
トースプロモーター上流に存在する CAP 結合部位（図 １ ）図６

 光タンパク質の Ni アフィニティ精製。精製時の各画分
蛍について SDS-PAGE を行った。可溶性（S）、素通り（FT１、FT２）、 洗 浄（W）、 溶 出（E１、E２、E３） の 画 分 に つ いて 電 気 泳 動 し た。 溶 出 画 分 の 主 要 な バ ン ド が GFP-H6（27.3kDa）および RFP-H6（26.5kDa）に対応する。の存在によるものと考えられる。長時間培養にともなうグルコース枯渇により cAMP が増加し、生じた CAP-cAMP複合体が CAP 結合部位に結合することで転写が活性化されたためと解釈できる。このように、誘導物質を加えなくても長時間の培養により組み換えタンパク質を高発現でき

3.4

連続 ５ 日間の実習案の作成るという性質は実習においても有用と考えられる。誘導物

半期14回の学生実験を ３ 教員で分担するため、 １ 教員あ質の添加のタイミングが重要である場合、誘導のために継たり ４ ～ ５ 回の実習内容を今後用意したいが、まずその準続した注意が必要であるし、並行して他の実験を進めるこ備として連続 ５ 日間の実習案を作成した。そこでは、一週とは初心者には難しいためである。一方、もう一つの利点間の集中講座で使いやすいような内容とした。

として、今回発現に用いたラクトースプロモーターによる１ 日目：寒天培地（IPTG の添加の有無による ２ 種類）

発現調節機構は生命系学生の必修の内容であるため、授業と液体培地（２mL、100mL）の準備、蛍光タンパク質発現科目とともに本実習に参加することにより相乗効果が期待

プラスミドによる大腸菌の形質転換、形質転換体の寒天培できる。既製品の pGLO による発現調節ではアラビノー地への塗布。

スプロモーターが使われ、より正確な発現調節が可能であ

２ 日目：寒天培地の観察（IPTG の添加の有無による着るという利点をもつが、分子生物学を初めて学ぶ生命系の色の違いを考察）、シングルコロニーを １ 個ずつ液体培地（２学生にはより基本的な内容であるラクトースプロモーター

mL と100mL の ２ 種類）に植菌して、培養を開始。の方がふさわしいと考える。

３ 日目：培養液（２mL）からのプラスミド精製、制限酵

今回開発した系の特長として次の点が挙げられる。まず、素による切断処理、アガロースゲル電気泳動。培養液（100緑色だけではなく、その他の色の蛍光タンパク質も容易にmL）の遠心分離による蛍光タンパク質発現大腸菌の集菌精製が可能な点である。次に、いずれの蛍光タンパク質でと冷凍保存。

も、コロニーや培養液のままで着色を観察でき、発現の有４ 日目：菌体（前日凍結したものを解凍）の超音波破砕無を判定できる点である。また、宿主の大腸菌株としてカによる発現タンパク質の抽出と Ni キレートカラムクロマ

ルタヘナ法の規制対象外の JM109株（それ自体は遺伝子トグラフィーによる精製（複数の光源を利用した精製タン組換え体でない）を利用することもあげられる。pET 系パク質の観察）。すべての画分を冷蔵保存。

を用いる場合には BL21（DE３）株（DE３がゲノム DNA

５ 日目：精製画分の SDS-PAGE と CBB 染色。タンパ制対象の菌株を購入する必要があるため、組織の事情等でク質バンドの解析（精製タンパク質の分子量の計算）。

４ ．考に組み込まれた遺伝子組換え体）などのカルタヘナ法の規入手が難しい場合にも本実験系なら利用が可能である。

察

本研究により、いずれの蛍光タンパクとも、100mL の本研究では ４ 種類の蛍光タンパク質（GFP-H６ 、RFP-H６ 、培養液から0.7～3.6mg の精製物を90% 以上の純度で容易

CFP-H６ 、OFP-H６ ）の C 末端に H６ タグを融合した発現に調製できることが判明した。この程度の収量であれば、プラスミドを構築し、それぞれのタンパク質を高収量でこの系を用いたタンパク質の結晶化実験の実習にも用いら精製できることを示した。その際に、プラスミド DNA のれるかもしれない（結晶化の可否は前もって調べておく― 67 ―

中井忠志必要がある）。タンパク質の結晶が析出した際には低分子Aequorea victoria green fluorescent protein, Science,の塩の結晶と見分ける必要があるが、それ自体に色をもつ

273, 5280, 1392-1395 (1996)．

蛍光タンパク質なら容易に判別が可能である。また、その⑺

Matz, M. V., Fradkov, A. F., Labas, Y. A., Savitsky,

他に追加できる実習内容として、変異導入実験があげられ

A. P., Zaraisky, A. G., Markelov, M. L., Lukyanov,る。蛍光タンパク質は １ アミノ酸の変異により、GFP かS. A., Fluorescent proteins from nonbioluminescent

ら CFP、BFP、YFP への変換が可能であるため⑸、本系

Anthozoa species, Nat. Biotechnol., 17, 10, 969-973に適用することで目的の変異導入の有無をコロニーのまま(1999)．

で蛍光色の違いにより判定できると考えられる。したがっ⑻Crameri, A., Whitehorn, E. A., Tate, E., Stemmer, W.て、遺伝子型を変異導入により変化させることにより、生P., Improved green fluorescent protein by molecular

きた細胞のまま容易に表現型の変化を観察できることを意

evolution using DNA shuffling, Nat Biotechnol., 14, ３,

味し、変異導入の実習のための実験系としても本系が有用

315-319 (1996)．

であろう。今後の課題として、本稿で示した実習案を １ 週⑼

fluorescence, Nature, 373, 6516, 663-664 (1995)．

間おきの学生実験にどのように調整するかをさらに検討する必要があるが、今回構築した蛍光タンパク質の発現プラ

Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Improved green⑽

玉 腰雅忠、緑色蛍光タンパク質の精製を題材とした

スミドは上述のように応用範囲も広いため、さまざまな実教育プログラム、東京薬科大学研究紀要、14, 35-41

習の基礎となる実験教材として有用と考える。プラスミド（2011）．の入手を希望される方は筆者まで連絡していただきたい。

謝⑾Nakai, T., Ito, H., Kobayashi, K., Takahashi, Y., Hori,H., Tsubaki, M., Tanizawa, K., Okajima, T., The辞

radical S-adenosyl-L-methionine enzyme QhpD

広島工業大学生命学部食品生命科学科の宮城尚弥氏、横catalyzes sequential formation of intra-protein sulfur-

田愛実氏、高見直樹氏、土屋響生氏、松場匠哉氏、湯場亮

to-methylene carbon thioether bonds, J. Biol. Chem.,
290, 17, 11144-11166 (2015)．

太氏、芳田陸氏には開発途中の教材を用いた実験練習に参⑿加いただいた。この場を借りて感謝申し上げる。

文⑴procedure for screening recombinant plasmid DNA,

献

Nucleic Acids Res., ７, ６, 1513-1523 (1979)．

P rasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W.,⒀

of the Aequorea victoria green-fluorescent protein,

⒁

⑹

⒂

D y b a l l a , N . , M e t z g e r , S . F a s t a n d s e n s i t i v ea bioluminescent protein from the luminous

colloidal Coomassie G-250 staining for proteins inhydromedusan, Aequorea, J. Cell. Comp. Physiol.,polyacrylamide gels. J. Vis. Exp. 30, 1431 (2009)．

59, 223-39 (1962)．

⒃

Bradford, M. M. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)．

C halfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W.,⒄

C abantous, S., Nguyen, H. B., Pedelacq, J.-D.,

Prasher, D. C., Green fluorescent protein as a markerKoraïchi, F., Chaudhary, A., Ganguly, K., Lockard, M.

for gene expression, Science, 263, 5148, 802-805 (1994)．

a, Favre, G., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S., A newDay, R. N., Davidson, M. W., The fluorescent protein

protein-protein interaction sensor based on tripartite

palette: tools for cellular imaging, Chem. Soc. Rev.,

split-GFP association, Sci. Rep. ３, 2854 (2013)．
⒅

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