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Ｎ−Nitrosobis(2- oxopropyl)amine(BOP)投与後の組織酸化とDNA中8- hydroxydeoxiguanosine(8- OHdG)の量の変化の関連

静岡県立大学短期大学部
研究紀要第10号
1996年度

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N ‑Nitrosobis(2‑oxopropyl)amine(BOP)投与後の組織酸化とDNA中
8‑hydroxydeoxiguanosine(8‑OHdG)量の変化の関連
高林

ふみ代・原

田昇

The Relation between Lipid peroxidation and the amont of 8- hydroxydeoxiguanosine ( 8OHdG), after Single Treatment with N- Nitrosobis(2- oxopropyl)amine (BOP)

TAKABAYASHI, Fumiyo
HARADA, Noboru

要旨
本実験は、組織の酸化障害の経過と、DNA 酸化障害の指標として近年注目されている DNA
中8- OHdG 量の変化との関連を検討することを目的とした。
BOP 投与によるハムスター膵臓組織酸化障害の経時的変化を、従来から組織酸化指標として用いられている過酸化脂質値（TBA 値）を用いて測定し、組織 DNA 中の8- OHdG 値の変化と比較した。TBA 値は BOP 投与後上昇し、１時間でピークを示し48時間後までには BOP投与前の値に回復した。また、8- OHdG 値は TBA 値の変化に遅れ２時間でピークを示し、48時間後までには BOP 投与前の値に回復した。更に、肝臓においても同様の比較をしたところ、TBA 値、8- OHdG 値共に BOP 投与後にごくわずかの上昇の後、共に12時間までに回復した。
これらの結果より、組織の酸化障害の発生と DNA 中8- OHdG 量には関連のあることが明らかになった。
はじめに様々な条件により細胞や組織内で oxygen- free- radical が産生されると、引き続きそれらに起因する酸化性の障害が誘発される。これらの酸化性の障害を測定する方法として TBA 値が汎用されている。一方、8- OHdG は DNA の酸化障害を測定する指標として注目されているが、特に発癌物質投与後に上昇することから発癌性との関連が近年研究されている。酸化障害の測定指標が前者は組織内脂質、後者は組織 DNA と異なってはいるが、どちらも oxygen- freeradical に起因する変化を測定している。しかし、これらの測定値について比較した報告はこれまでになく、今後の発癌性の指標の選択とも関連して重要な問題であるといえる。
そこで今回は、動物実験で標的臓器に酸化障害を招くことが報告されているＮ−ニトロソ化合物の一種で、ハムスター膵癌誘発物質である BOP をハムスターに皮下投与し、経時的に標的臓器である膵臓と、非標的臓器の肝臓を摘出し、それらの組織 TBA 値と DNA 中8- OHdG値を測定し比較した。

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高林ふみ代・原田昇

実験方法
１）動物
シリアンゴールデンハムスター

６週令

雌性105匹

２）実験方法
一週間の通常飼育の後、ハムスターは15匹ずつ７群に分けられ BOP を20mg/kg body weight
皮下注射により投与された。その後、０,１,２,６,12,24,48時間後に各実験群の動物をネンブ
タール麻酔下開腹し、腹部大動脈から脱血屠殺し、生理食塩水で肝臓と膵臓を潅流後摘出した。
各群中５匹を過酸化脂質値測定用とし、10匹を8- OHdG 測定用とした。過酸化脂質値は TBA法により測定し、Lowry 法によって求めた組織タンパク質量当たりに換算して求めた。また、
DNA 中8- OHdG 量は、組織から DNA を抽出した後、EC- detector と組み合わせた高速液体
5クロマトグラフィー(HPLC)により測定し、UV- detector と HPLC によって測定した10 グアノシン残基当たりの数値に換算して求めた（1）。
また、有意差検定は Student’ t test により、p< 0.05をもって有意とした。
結果
１）膵臓組織 TBA 値の変化
膵臓における TBA 値の変化を Fig.1(A)に示した。BOP 投与後上昇し１時間に於いてピーク（0.541±0.045nmol of malondialdehyde/ mg of protein、n= 5）を示した後低下し、24時間で投与前の値（0.455±0.037、n= 10）に回復した。1時間値は、初期値より有意に高値であった（p< 0.01）。
２）膵臓 DNA 中8- OHdG 量の変化
膵臓 DNA 中8- OHdG 量の変化を Fig.1(B)に示した。BOP 投与後６時間に最高値を示した
後低下し、48時間までに投与前の値に回復した。２時間値（2.488±0.626 8- OHdG/105dG、n= 7）及び６時間値（2.586±0.791、n= 10）は、初期値（1.414±0.212、n= 10）より有意に高値であった（ともに p< 0.001）。
３）肝臓組織 TBA 値の変化
肝臓における TBA 値の変化を Fig.2(A)に示した。BOP 投与後２時間でわずかな上昇（0.377±0.021、n= 5）がみられたものの、６時間で投与前の値（0.36±0.042、n= 10）に回復した。
４）肝臓 DNA 中8- OHdG 量の変化
肝臓 DNA 中8- OHdG 量の変化を Fig.2(B)に示した。BOP 投与後１時間でわずかな上昇（1.352±0.533、n= 3）がみられたが24時間までに投与前の値（0.88±0.102、n= 6）に回復した。

Ｎ−Nitrosobis(2oxopropyl)amine(BOP)投与後の組織酸化とDNA中N
8- hydroxydeoxiguanosine(8- OHdG)の量の変化の関連

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Fig.1 膵臓のBOP投与後の（A)TBA値、(B)8‑OHdG値の経時的変化
TBA値は、投与後１時間でsteady state levelと比較して有意な上昇（p<0.01）を示し、24時間で回復した。8‑OHdGは、投与後２および６時間でsteady state levelと比較して有意な上昇（p<0.001）を示し、48時間で回復した。

Fig.２ 肝臓のBOP投与後の（A)TBA値、(B)8‑OHdG値の経時的変化
TBA値は、投与後２時間でわずかに上昇した。8‑OHdGは、投与後１、２時間でわずかに上昇した。
考察
8- OHdG は、DNA のデオキシグアノシン残基の C- 8位に - OH の結合したものであり、DNAの酸化障害の指標であるが、 oxygen- free- radical を発生する物質あるいは条件によって生成

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高林ふみ代・原田昇

することが知られている。また、発癌物質投与によって標的組織の DNA 中の8- OHdG 量が上昇することや8- OH グアノシンに相対する部分やその付近で DNA の複製ミスが誘発されることが in vivo, in vitro 両方で示されており、発癌との関係が指摘されている（1- 3）。一方、TBA値は組織の過酸化脂質量を測定したもので、組織酸化指標として汎用されている。これも、oxygen- free- radical を発生する物質あるいは条件によって値が上昇する。
発癌物質である N- ニトロソ化合物は、initiation dose 投与で一過性の標的組織の脂質過酸化を招くことが報告されているが（4）、今回の実験でも BOP による標的臓器（膵臓）の一過性の組織脂質過酸化が示された。更に、脂質過酸化の後に DNA 内8- OHdG の一過性の上昇も示された。これらの結果は、 BOP 投与によって標的組織で oxygen- free- radical の発生があったことを示している。しかし、脂質過酸化と DNA 酸化の上昇には時間的なずれがあり、双方が発生した oxygen- free- radical に単純に反応しているとはいえない。現段階では、例えばSOD（superoxide disumutase)などの oxygen- free- radical 消去系の酵素の処理からオーバーフローしたものが脂質過酸化の原因となり、更に処理に余った oxygen- free- radical が DNA 酸化を招くといった因果関係を結論はできない。さらに、oxygen- free- radical の消去系物質の動態をあわせて調べる必要がある。
また、今回の結果は、組織脂質過酸化を招く物質が同時に、DNA の酸化障害の原因つまり発癌性を有する可能性のあることが示唆され、今後検討の必要な課題であるといえる。
文献１ ） Kaneko T , Tahara S , Matsuo M .

Non- linear accumulation of 8 - hydroxy- 2 ’-deoxyguanosine , a marker of oxidized DNA damage , during aging.

Mutat Res 1996;

316:277- 85
２ ） Floid RA ,Watson JJ ,Harris J ,West M ,Wong PK .

Formation of

8-hydroxydeoxyguanosine, hydroxyl free radical adduct of DNA in granulocytes exposed tothe tumor promoter, tetradecanoylphorbolacetate. Biochen. Biophys. Res. Commun
1986;137:841- 6３）Kasai H , Nishimura S, Kurokawa Y, Hayashi Y. Oral administration of the remnal
carcinogen, potassium bromate , specifically produces 8- hydroxydeoxyguanosine in rat
target organ DNA. Carcinogenesis 1987;8:1959- 61４）Chung FL, Xu Y. Increased 8- oxodeoxyguanosine levels in lung DNA of A/J mice andF344 rats treated with the tabacco- specific nitrosoamine 4- (methylnitrosamine)- 1- (3- pyridyl)- 1- butanone. Carcinogenesis 1992;13: 1269- 72５ ） Ahotupa M, Bussacchini- Griot V, Bereziat JC, Camus AM, Bartsch H . Rapid
oxidative stress induced by N- nitrosamines Bioch. Biophys . Res . Commu 1987;146:
1047- 1054
［1996年10月30日受理］

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