静岡県立大学短期大学部研究紀要第９号
1995年度

放射性物質封入マイクロスフェアによる膵癌局所療法の開発 (第三報)-in vitroおよびin vivoにおける焼成マイクロスフェアの 32P固定安定性の検討

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放射性物質封入マイクロスフェアによる膵癌局所療法の開発 (第三報)-in vitro および in vivo における焼成マイクロスフェアの 32P固定安定性の検討

高林ふみ代１

原田昇１

五島廉輔２

１) 静岡県立大学短期大学部看護学科
２) 静岡県立大学大学院生活健康科学研究科環境物質科学

要旨
今回は､ オリフィス法によって作成された非晶質リン酸カルシウム含有アルギン酸カルシウ
ムのマイクロスフェアに1250℃の焼成を加え､ リン酸カルシウムハイドロキシアパタイトの焼結マイクロスフェア作成を試みた｡ 充分な硬度の焼結体を得るには､ 小粒内のCa 2＋とPO4 3-のモル比が重要となるため､ マイクロスフェア内におけるCa 2＋の供給源となるアルギン酸ナトリウ
ム､ PO4 3-を供給する (NH４)２HPO４について組成の再検討とともに硬化液のCa(NO３)２溶液濃度についても再検討した｡ その結果､ 滴下液組成が (NH４)２HPO４0.1M､ アルギン酸ナトリウム1.5％､ 硬化液は､ [Ca(NO３)２]＝0.4M (pH＝9.0) の場合に得られる焼結小粒がin vitro条件下では安定であることが示された｡ また､ その焼結マイクロスフェアの成分をX線回折解析法､赤外吸収スペクトル法により同定した結果､ 少量のCaOを含むハイドロキシアパタイトであることが確認された｡
さらに､ 32P焼結マイクロスフェアを作成し､ 32P固定の安定性をin vivo について検討した｡
その結果､ 正常ラット腹腔内に 32P固定焼結マイクロスフェアを留置した場合､ 48時間経過後の 32Pの分布は､ 肝臓で投与量の0.058％､ 腎臓・肺で0％､ 骨髄 (両下肢大腿骨骨髄) で7.29×10 -7 ％であり､ 32P焼結マイクロスフェアにおける 32P固定は安定であることが示された｡
はじめに
第二報１) において､ 著者らはオリフィス法によって得られたマイクロスフェアの安定性について検討した｡ その結果､ in vivoで長時間の体内留置の際､ リン固定あるいは形状の安定性に関し問題のあることが示された｡ そこで今回は､ これらの安定性の向上を目指してマイクロスフェアに焼成を試みた｡ 焼成とは､ 構成成分の熱分解､ 合成､ 置換などの化学反応や焼結等の目的で鉱物類に高温処理を行うことである２) が､ 焼成によってマイクロスフェア内で網目状骨格的役割を担っているアルギン酸鎖を燃焼させ､ アルギン酸鎖から遊離したカルシウムの移動により非晶質リン酸カルシウムのハイドロキシアパタイト化を図り､ これを主成分とする焼結マイクロスフェアが作成できると考えられた｡
まず､ リン固定､ 形状の安定性の高い焼結マイクロスフェアを得る条件を検討した｡ その後､得られた条件に従って 32P焼結マイクロスフェアを作成し､ 正常ラット腹腔内に投与しin vivo
で 32P固定の安定性を検討した｡

266

実験1

高林ふみ代 ・ 原田昇 ・ 五島廉輔

焼成加工に適したマイクロスフェア作成条件の検討とその焼成

実験材料と実験方法
一般に､ 目的とする焼結体を得るためには焼成材料の組成が重要であるが､ 本実験においても､ 焼成に適するマイクロスフェアを得るに必要な原料組成比はこれまでに得られた非焼成マイクロスフェアの原料組成比と異なることが予想された｡ そこで､ アルギン酸ナトリウム濃度2.0％と1.5％においてコアセルベーションを起こさない濃度の (NH４)２HPO４を滴下ゲルとし､それらをpH9.0に調整した濃度0.2､ 0.3､ 0.4､ 0.5MのCa(NO３)２溶液に滴下し､ 得られたマイクロスフェアを焼成した｡
焼成は､ 次の手順で行った｡ 小粒を50℃で24時間減圧乾燥した後､ 電気炉 (KBF 333､ (株)光洋リンドバーグ) を用い､ 10℃／minで1250℃まで昇温､ 1時間保った｡ 電気炉中で自然放冷の後取り出した｡
得られた焼結マイクロスフェアは､ 光学顕微鏡により直径を､ Quick Coater (SC-701H､ SANYU DENSHI Co., Ltd) により表面に金蒸着後､ 走査型電子顕微鏡 (JSM-6300F､ (株) 日本電子) により表面形状を観察された｡ また､ 焼結マイクロスフェアに蒸留水 (1ml／焼結マイクロスフェア1mg) を加え､ 37℃で48時間インキュベートし､ 蒸留水のpHの変化､ 蒸留水中に溶出したカルシウムを原子吸光光度法 (原子吸光光度計AA-782､ (株) 日本ジャーレルアッシュ)
により､ リンをモリブデンブルー法により測定した｡
さらに､ インキュベーションの結果､ カルシウムとリンの溶出の少なかったサンプルについて､

KBr tablet methodにより赤外吸収スペクトル分析 (赤外分光光度計270-30､ HITACHI)及びX線回折解析法 (粉末X線回折装置JDX3500､ JEOL) により成分を検索した｡
実験結果
１

小粒作成条件と得られる焼結小粒の性質

Fig.１に小粒焼成過程の熱重量分析と比差熱分析の結果を示した｡ その結果､ 焼成過程は200℃付近までの緩やかな重量減少と吸熱反応､ 400℃付近までの急激な重量減少､ 450℃付近の発熱反応及び500℃以上の重量とエネルギー収支の安定した期間からなることが示された｡ また､
Table１に作成条件と得られた焼成マイクロスフェアの特徴を示した｡ 滴下ゲルのアルギン酸ナトリウム濃度が2.0％のマイクロスフェアを焼成したものは､ いずれも空気中に放置するとひびが入って割れるものが多く､ 37℃水中48時間インキュベート後の水のpHも12.0をこえていた｡ 一方､ 滴下ゲルのアルギン酸ナトリウム濃度が1.5％のマイクロスフェアを焼成したものは､ 硬化液の硝酸カルシウム濃度が0.1Mの場合を除いて､ 空気中に放置後も形状が安定かつ37℃水中48時間インキュベート後の水のpHの変化もない､ もしくはわずかであった｡ また､ イ
ンキュベート中に水中に溶出したカルシウムとリンの濃度に関しても､ 滴下ゲルのアルギン酸ナトリウム濃度が1.5％のマイクロスフェアを焼成したものでは､ アルギン酸ナトリウム濃度が2.0％のものと比べ少なかった｡
２焼結マイクロスフェアの構造と成分解析
Fig.２ にTable１ に示された条件で作成した焼結マイクロスフェアのうち代表的な表面形状を示した｡ 滴下ゲルのアルギン酸ナトリウム濃度が2.0％から得られた焼結小粒の表面 (Fig.２,a and b)は､ いずれも粗であり焼結小粒の周囲には表面から剥離したとみられる粉末が確認できる｡ これと比較して､ 滴下ゲルのアルギン酸ナトリウム濃度が1.5％から得られた焼結マイクロスフェアの表面 (Fig. ２, c and d)は密に整っていた｡

放射性物質封入マイクロスフェアによる膵癌局所療法の開発 (第三報)-in vitroおよびin vivoにおける焼成マイクロスフェアの 32P固定安定性の検討

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10TG(％)−10−30−50−70DTA(uV)60

10−40200450700950Temp.(℃)
Fig. 1 Burning process of microsphere. Smooth progress of burning was shown with the rise oftemperature. Up is thermal gravimetry and bottom is difarential thermal analysis.

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高林ふみ代 ・ 原田昇 ・ 五島廉輔

Fig. 2 Surface of sintered-microsphere. a〜d are sample 2,3,6,8 on Table 1, respectively. The
surface of sintered-microsphere made from 1.5％ sodium alginate gel (c and d) are smooth, as c
ompared with the surface of which made from 2.0％ sodium alginate gel (a and b). (Electron
microscopic photograph ×160)

Table 1

Dropping Condition and Property of sintered-microsphere

Dropping Gel(NH 4 ) 2 HPO ４ Sodium Alginate

0.1M

0.2M

0.5M

Ca(NO 3 )2

Diameter ofsintered- microsph(pH＝9.0)
ere

2.0％

0.1M
0.2M
0.3M
0.4M

1.5％

0.1M
0.2M
0.3M
0.4M
0.5M

1.0％

0.5M

Rinsing water after incubation

Sample

pH

P＊

Ca＊

No

2.2
12.1
12.1
12.0

0.96×10-3
3.83×10-3
0.72×10-3
4.78×10-4

0.017
0.014
0.025
0.074

12
3
4

400 〜 500
(μm)

7.6
7.2
6.5
6.7

3.64×10-4
3.64×10-4
3.64×10-4
4.86×10-4

0.011
0.007
0.002
0.004

5678＃----

400 〜 500(μm)＃＊ : mg／ml of H２O＃ : microspheres were not formed放射性物質封入マイクロスフェアによる膵癌局所療法の開発 (第三報)-in vitroおよびin vivoにおける焼成マイクロスフェアの 32P固定安定性の検討

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インキュベーション時安定性の高かったサンプル8の赤外吸収スペクトル法及び､ X線回折解析法による成分分析の結果､ 焼結マイクロスフェアの主成分はハイドロキシアパタイトでありCaOをわずかに含んでいることが示された｡
実験2

32

P焼結マイクロスフェアの作成と 32P固定率の測定

実験材料と実験方法
32

Pは､ PHOSPHORUS-32 (37Bq

H３ 32PO４､ 日本アイソトープ協会) を用いた｡ 滴下ゲルおよび硬化溶液は､ 実験１で得られた条件により作成した｡ 滴下ゲルは [(NH4 )２ HPO4 ]＝0.2Mの1.5％アルギン酸ナトリウム溶液とし､ 硬化液は[Ca(NO３)２]＝0.4M (pH9.0) に調整したものを用いた｡
滴下ゲル中への 32P添加は､ 第２報に従った｡ 0.01Nアンモニア水を H３ 32 PO４ に加え (NH４ )２
H 32PO４化したものの一部を蒸留水に溶解させ､ これにリン酸1水素2アンモニウム､ アルギン酸ナトリウムを添加し､ 最終的に400μCi／mlの滴下ゲルとした｡ この滴下ゲル5mlを100mlの硬化溶液に33G針を用い滴下し 32Pマイクロスフェアを得た｡ そして､ 焼成を行い 32P焼結マイクロスフェアを得た｡
得られた 32P焼結マイクロスフェアの数と硬化溶液のβ線量を液体シンチレーションカウン
ター (SLC-3100､ Aloka) で測定し､ 1粒当たりの平均β線量と固定率を求めた｡
実験結果
Table ２は､ 滴下マイクロスフェアを取り出した後の硬化溶液､32P焼結マイクロスフェア1

32

粒平均及び､ 全 P焼結マイクロスフェアのβ線量を示したものである｡ 32 Pのマイクロスフェア中への固定率は約50％であり､ dpm数から換算するとおよそ622μCiが固定されていた｡
実験３

32

P焼結マイクロスフェアの正常ラット腹腔内投与時における安定性の検討

実験材料と実験方法
実験２で作成した 32P焼結マイクロスフェアを､ ペントバルビタール40mg／kg body weight i
p麻酔下ラット (6週令ウィスター系雄性､ 日本SLC) 腹腔内投与し閉腹後､ 1時間 (5匹)､ 6時間 (5匹)､ 24時間 (5匹)､ 48時間 (6匹) に肝臓､ 腎臓､ 肺､ 大腿骨骨髄を摘出し､ β線量を液体シンチレーションカウンター (SLC-3100､ Aloka) で測定した｡
実験結果
測定結果をTable ３に示した｡ 全体に､ 32Pの漏出はマイクロスフェアを焼結しなかった第2報の場合と比較して､ 著しく改善された｡ 投与量に対する臓器ごとの線量の割合でも､ 最も大きい肝臓で48時間後に0.058％であった｡ また､ 一定の上昇傾向も示されなかった｡
Table 2 Rate of 32P fixed in microspheredisintegration per minute321204583000 ／ 100 ml of solution

32

1499736.5±220459.7 ／ one microsphere
1244781295 ／ total (830 microspheres) (B)P leaked into Ca(NO３)２ solution
P fixed in microsphere

Rate of 32P fixed in microsphere(B／A＋B)

50.8 ％(A)

270

高林ふみ代 ・ 原田昇 ・ 五島廉輔

Table 3 Time course change of 32P in organ after hot sintered-microsphere
administration (dpm／ mg of organ sample)
group (n: rat)
32

Padministered ＊1 hour (5)6 hour (5)24 hour (5)48 hour (6)

21.0

21.4

21.9

21.2

liver

0.069±0.050(0.022％)＊＊0.179±0.157(0.05％)

0.052±0.035(0.0146％)

0.166±0.148(0.058％)kidney0.073±0.076(3.74×10-3 ％)0.053±0.089(2.68×10-3 ％)0.027±0.036(1.78×10-3 ％)-0.018±0.052
(0％)

lung

0.146±0.183(4.23×10-3 ％)0.277±0.249(7.5×10-3 ％)-0.009±0.055(0％)-0.009±0.031(0％)

born marrow

0.785±0.188(9.00×10-7 ％)＃1.343±0.822(1.57×10- ％)＃0.550±0.361(5.23×10-7 ％)＃0.622±0.416(7.29×10-7 ％)＃＊ : dpm ／ mg of body weight＊＊ : (dpm of whole organ ／ dpm all administered)×100＃ : (dpm of femur born marrow×2 ／ dpm all administered)×100

考察
ハイドロキシアパタイトはすでに､ 整形外科や歯科領域で生体内適用が実用化されている素材であり､ 様々な報告がある｡ ３〜７今回の実験では､ 水溶液反応を利用して得られた非晶質リン酸カルシウムを高温で焼結させることを試みたが､ 通常ハイドロキシアパタイトを空気中で加熱すると1000℃付近から少しずつOH - が脱離し､ 1300℃前後からCa10 (PO４ )６ (OH)２ → 3Ca３ (PO４ )２ ＋CaO＋H２ O↑の分解反応が起こる｡ したがって､ 分解を招かずに確実にハイドロキシアパタイト焼結体を得るには1300℃以下の高温で焼成を行う必要があり､ 本研究では焼成温度を1250℃とした２｡ 今回の焼成では､ Fig. １ の熱重量分析､ 比差熱分析より､ 200℃付近までは非晶質リン酸カルシウムCa３(PO４)２・nH２Oの結晶間水分の蒸発､ 400〜500℃にかけてアルギン酸炭素鎖の熱分解､ 600℃以上でのアルギン酸鎖から開放されたCa 2＋の移動と焼結の完成へと順調に移行していることが示された｡
Table １ において､ アルギン酸ナトリウム2.0％滴下ゲルから得られた焼結マイクロスフェア
でインキュベート水のアルカリ化やリン､ カルシウムの溶出､ さらには焼結マイクロスフェアの空気中放置後のひび割れがみられたのは､ 焼成時アルギン酸鎖の焼失にともなって生じたフリーのCa 2＋が､ 存在するPO4 3-に対し過多であったため､ 大量の酸化カルシウムCaOを生成し､これが吸湿しCaO＋H２O→Ca(OH)２により水酸化カルシウムとなりハイドロキシアパタイト構造を崩壊させたことによると考えられた｡ マイクロスフェア中のCa 2＋の主な供給源となるアルギン酸の濃度を減じ､ (NH４)２HPO４濃度を上昇させることによって､ このような変化が減少していることからも上記は支持される｡
今回得られた焼結マイクロスフェアは少量のCaOを含むハイドロキシアパタイトであることが示されたが､ 本法ではCa／Pモル比がハイドロキシアパタイトの化学量論量の1.67になるようマイクロスフェア作成時調整するとカルシウム不足のハイドロキシアパタイトが形成されることが確かめられており､ 今回得られた焼結小粒の成分構成は､ 本法によって得られるハイド放射性物質封入マイクロスフェアによる膵癌局所療法の開発 (第三報)-in vitroおよびin vivoにおける焼成マイクロスフェアの 32P固定安定性の検討

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ロキシアパタイトとしてはほぼ理想的であると判断できた｡
32

P固定率は焼結マイクロスフェアにおいても約50％を示し､ 焼結工程によるリンの新たなロスは考慮しなくてもよいことが示された｡ また､ 予備実験で滴下ゲル中の 32 P濃度を変化させても焼結マイクロスフェアの 32P固定率の変化がほとんどみられないことを確認しており､滴下ゲルの 32P添加量を多くすることで焼結マイクロスフェアのβ線量が調節可能であるといえた｡
正常ラットの腹腔内への 32P焼結マイクロスフェア投与では､ 脱血の行われない状態の臓器をサンプルとして用いているので正確には臓器への移行とは異なるが､ 32 Pの漏出は反映されていると考えられ､ 32Pの移行は第２報で示された焼成加工をしないマイクロスフェアの場合と比較して著しく改善されていた｡ このことより､ 32P焼結マイクロスフェアの 32 P固定は､ 腹腔内で少なくとも48時間までは安定した状態を保っていると考えられた｡ 今後は､ ハムスター
皮下移植膵癌内へ 32P焼結マイクロスフェアを直接注入し､ 32Pの半減期である14.3days以上留置し､ 32Pの臓器への移行等を検討する方針である｡
文献１) 高林ふみ代､ 原田

昇：放射性物質封入マイクロスフェアによる膵癌局所療法の開発 (第二報) ーin vitro 及びin vivo における 32P固定の安定性の検討､ 静岡県立大学短期大学部
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高林ふみ代 ・ 原田昇 ・ 五島廉輔

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