水研センター研報，第36号，57−106，平成24年
Bull. Fish. Res. Agen. No. 36, 57‑106, 2012

クルマエビのホワイトスポット病 WSD（white spot disease）の防除対策に関する研究
佐藤

＊1

＊2

純

Studies on prevention measure of white spot diseaseof kuruma shrimp
Jun SATOH
Abstract : WSD（white spot disease）, the equivalent of penaeid acute viremia（PAV）, has
become one of the most serious problems not only in the shrimp farming industry but also
in hatchery production in Southeast Asian countries and the Americas. The major infection
route of the causative virus（WSSV: white spot syndrome virus= PRDV）is considered tobe vertical transmission from spawners to larvae/juveniles via eggs in the seed production
process of kuruma shrimp（）. Therefore, in order to inhibit vertical trans mission, eggs are selected based on PCR（polymerase chain reaction）detection of
WSSV from the receptaculum seminis after spawning. In addition, the fertilized eggs are
disinfected with povidone iodine（5 mg/l for 5 min）.In order to prevent horizontal transmission, larval and juvenile rearing seawater is treated with UV irradiation. Stable productionof specific-pathogen-free shrimp was accomplished by these countermeasures for the prevention of WSSV transmission. However, in kuruma shrimp farms, horizontal transmission
by cannibalism and waterborne routes is also very important among reared shrimp and cohabiting crustaceans in those environments. Thus, it is still difficult to prevent horizontal infection by WSSV at shrimp farms. Recently, a quasi-immune response was founded in kuruma shrimp, wherein naturally survived from WSD were protected against a re-challengewith WSSV. Moreover, we developed oral vaccine with WSSV recombinant proteins, rVP26
and rVP28, meaning that shrimp protection against WSSV-infection was inducible by theoral vaccine with rVPs.
Chapter 1. - In 1996, a hatchery of Japan Sea-Farming Association obtained kuruma
shrimp（）eggs for seedling culture from wild broodstocks, among
which some were found to be white spot syndrome virus（WSSV）infected by PCR test.
Eggs were washed once with filtrated seawater and reared in the hatchery. During the culture, those post-larval groups in which WSSV were detected were excluded. Although no
WSSV was found in the seedlings prior to the transportation to the nursery by PCR test,
WSD occurred among them during the culture in the nursery facilities. In 1997, the hatcheryagain obtained prawn eggs from wild broodstocks. However, in this year, PCR-check was applied to select non-WSSV infected spawners. Furthermore, eggs were disinfected with iodine
before being served for rearing. No WSD infection occurred throughout the culture in thehatchery and the nursery facility in this year. These results strongly suggest that the infec2011年 月18日受理（Received on May18,2011）＊1
北海道大学審査学位論文（掲載するに際し投稿規定に沿って一部修正した）＊2増養殖研究所上浦庁舎 〒879‑2602 大分県佐伯市上浦大字津井浦（Kamiura Station, National Research Institute of Aquaculture, Fisheries
Research Agency, Kamiura, Saiki,Oita 879‑2602, Japan）

Jun SATOH

tion source of WSD occurred in 1996 originated from spawners.
Chapter 2. - Conditions suitable for disinfection of fertilized eggs ofusing povidone-iodine were investigated. Eggs 10 h after fertilization were exposed to 0,
2.5, 5.0 and 10.0 mg/L of active iodine for 5, 10, 15 and 20 min. Hatching rate showed no significant difference between control and test groups in concentration of 2.5 mg/L of active iodine for 5 to 20 min and 5.0 mg/L for 5 to 15 min. Viable bacterial counts in these conditions
decreased by more than 90% when compared with those of control groups. There was no
significant difference in the hatching rates of eggs with eight different developmental stages
between control and tested groups exposed to 5.0 mg/L of active iodine for 5 min.
Chapter 3. - We compared WSSV infection induction in kuruma shrimp by oral, immersion,and intramuscular injection（IM）exposure methods and evaluated the oral vaccine prepared from the recombinant WSSV proteins rVP26 and rVP28. The 50% lethal doses（LD 50）
of WSSV by oral, immersion, and IM challenges were 10 −0.4, 10 −4.4, and 10 −7.7 g shrimp −1, respectively, indicating that WSSV infection efficiency by oral challenge was significantly lessthan the other 2 challenge routes. However, in shrimp farms it is believed that WSSV infection is easily and commonly established by the oral route as a result of cannibalization of
WSSV-infected shrimp. Kuruma shrimp vaccinated orally with WSSV rVP26 or rVP28 werechallenged with WSSV by oral, immersion, and IM routes to compare protection efficacy.
The relative percent survival values were 100% for oral challenge, 70 to 71% for immersion,and 34 to 61% for IM. Thus, the protection against WSSV-infection that was induced in kuruma shrimp by oral vaccination with rVP26 or rVP28 seemed equivalent to that obtained
through IM vaccination.
Chapter 4. - The phylaxis against WSSV was also inducible by oral vaccination with recombinant WSSV proteins, rVP26 and rVP28. In the present study, kuruma shrimp orally
vaccinated with rVPs were sequentially challenged with WSSV to evaluate onset and duration of phylactic response and booster effect. The phylactic response of shrimp against
WSSV-challenge peaked at day 45 after the vaccination with rVP26（RPS: 100%）and at day
55 with rVP28（RPS: 93%）
, and decreased within 10-20 days. The phylaxis against WSSVchallenge was boosted by the secondary vaccination with homologous rVPs, but not by
those with heterologous rVPs. Phylactic responses by the secondary vaccination appeared
more rapid than those by the primary vaccination. These results demonstrated that the duration of phylaxis induced by oral vaccination with rVPs was relatively short, but could be
extended by booster vaccination with homologous rVPs.
Key words: WSD, PAV, kuruma shrimp,

目次, vaccine

第章

WSSV の rVP26および rVP28を経口投与したクルマエビの感染防御効果の持続期間，免
疫記憶および特異性

序

論

第

章

種苗生産過程における WSD の発生状況

総合考察

第

章

ポビドンヨード剤を用いた受精卵消毒の安全

謝

辞

性と効果

文

献

第

章

WSSV の rVP26および rVP28を経口投与したクルマエビの WSSV 攻撃に対する感染防御効果

クルマエビホワイトスポット病の防除対策
序論

戸内海西部海域の現状を解析することで，クルマエビ
資源の変遷が解明されると考えられる（浜崎，北田，．クルマエビ漁業⑴

2005）。

漁獲量，生産額および種苗放流

一方，エビ類の人工的な増養殖は，1930年代後半

クルマエビ科に属するクルマエビ属28種のうちのに故藤永元作博士によって完成された（Hudinaga,

は，沿1942）。クルマエビの完全養殖技術（の完成）は，岸から大陸棚にかけての泥底，砂泥底に棲息し，イン

日本のみならず，アジア諸国を中心に世界的な発展

ド・西大平洋に広く分布する体長30cm に達する大型を見るエビ類の増養殖生産の基礎をなした。また，のエビ類である。日本沿岸では本州北部以南に分布しクルマエビの種苗生産技術の完成は，放流と漁業管（三宅，1982），沿岸漁業の重要な対象種となってい理による資源管理漁業への転換期においても，いちる。漁業・養殖業生産統計年報（農林水産省統計部）

はやく技術開発に取りかかることを可能にした（橘によると，日本国内におけるクルマエビ漁業の漁獲量

高 ら，1996）。2006年 度 の 国 内 に お け る 放 流 用 エ ビ

は，1970年の1 263トンを記録した以降徐々に増加し，類の種苗生産は，クルマエビ，クマエビ（種であるクルマエビ）， ヨ シ エ ビ（

1985年にはこれまでの最高となる3 741トンまで達し）およ

た（Fig. 1）。しかし，近年では1 000トン程度にまでびホッカイエビ（

落ち込み，
1970年頃の水準にまで減少している。また，総生産尾数は2 1億尾，そのうちクルマエビは1 5億尾

イセエビ（spp.）とクルマエビを除いたエ

（74％）
を占めた
（水産庁・
（独）
水産総合研究センター・

ビ類の集計でも漁獲量は1985年以降全国的に減少傾向（社）全国豊かな海づくり推進協会，2008）。また，養にあり（浜崎，北田，2005），クルマエビを含めたク

殖用としても，クルマエビは

ルマエビ類における現在の漁獲量は，過去最低レベル

ルマエビ種苗の国内生産数はホタテガイに次いでにある。この漁獲量の減少原因は，漁獲努力量との関目であり，栽培漁業ならびに養殖漁業対象種として重係から見てもクルマエビ資源の再生産過程に問題があ要である。国内のクルマエビの種苗放流尾数は，1987

ると考えるのが妥当であり，漁獲量の安定している瀬

年に

億

）の

種で行われ，

千万尾が生産され，ク番千万尾と過去最高を記録した。旧日本栽培

Fig. 1. Fishery production of kuruma prawn in Japan. Data from Ministry of Agriculture Forestry Fisheries(1964-2004).

Jun SATOH
漁業協会志布志事業場（現増養殖研究所志布志庁舎，

ルマエビの栽培漁業が成立する可能性もある（浜崎，

以下：志布志庁舎と記す）では，1967年から本種の種

北田，2005）。

苗生産に取り組み，その後関係府県が行うクルマエビ

⑵

養殖生産

放流事業の支援を目的に2000年まで33年間にわたり，養殖生産に目を移すと，国内の生産量は1988年に稚エビあるいは種苗の供給を行ってきた。1970年代にこれまでの最高値となる3 020トンの生産量を記録しは，億尾前後の種苗を生産できるようになた（Fig. 3）。この時の経営体数は159で施設面積はったが，1971年に民間の養殖場のクルマエビ種苗生産

6 035 000m2であった（使用施設当たりの生産量：5 00

過程でバキュロウイルス性中腸腺壊死症（baculoviral

トン /ha）。平成17年（2005年）の生産量は1 824トンで，mid-gut gland necrosis: BMN）
（桃山，1981; Sano

経営体数は120，施設面積は4 570 000m2にまで減少し年間に, 1981）が発生して以降，クルマエビ種苗の計画的ている（4 00トン /ha）。1993年の国内における PAV

な生産に多大な支障を来たした。また，1996年には，の発生以来，単位面積当たりの生産量がピーク時の80

志布志庁舎で種苗放流を目的とした中間育成中のクル％程度にまで減少していることを示しており，PAV

マエビに急性ウイルス血症（penaeid acute viremia:

あるいはビブリオ病の予防対策の一環としてPAV）が発症し（Inouyeから., 1996），種苗放流事業

期作

期作への転換や放養密度の低下（桃山，室賀，の大きな障害となった。1995年以降，種苗期の疾病の2005）などの，セーブした飼育養成を行っている状況

流行による放流用種苗数の減少や，放流種苗の平均体が窺える。しかし2000年以降，養殖生産量は漁業生産

長の大型化に伴う尾数減少により，種苗の放流数が急量を安定して上回っており，国内の重要なクルマエビ

激に減少している（Fig. 2）。種苗放流の効果について

供給産業である。なお，以下の記述において，PAV

は，放流効果が高いと考えられる大型種苗を放流するをホワイトスポット病（white spot disease, WSD）と，ようになったものの，漁獲量は減少しており，クルマ

ま た PAV の 原 因 ウ イ ル ス penaid rod-shaped DNA

エビ資源の変遷は種苗放流と無関係に動いていると考

virus（PRDV）（Inouye

えられている（浜崎，北田，2005）。しかし，種苗放syndrome virus（WSSV）と記す。

流とクルマエビ資源量の増加が直接的に結びつく，高い回収率が得られた事例もあり，地域的な規模ではク, 1996） を white spot

クルマエビ類には，大型の食用種が多く含まれ，ホワイトレッグシュリンプ（），

Fig. 2. Fishery production and release project of kuruma prawn in Japan. Data from Ministry of Agriculture
Forestry Fisheries (1964-2004).

クルマエビホワイトスポット病の防除対策
ウ シ エ ビ（）， コ ウ ラ イ エ ビ，Banana

ると（FAO Fish stat 1970-2006），1980年以降東南ア）， イ ン ド エ ビ

ジアでの養殖生産量が増加するにつれて，右肩上がり

prawn（（），
クルマエビ，
blue shrimp（）を中心としたで生産量が増加し続け，2006年における世界のクルマ

種が東南アジア地域で盛エビ類養殖生産量は，3 175 856トンに達している（Fig.

んに養殖されている（Fig. 4）。FAO の漁獲統計によ4）。中国においては，2001年以降それまでの対象種でFig. 3. Aquaculture of kuruma prawn in Japan. Data from Ministry of Agriculture Forestry Fisheries (1964-2004).

Fig. 4. Production volume of penaeid shrimp aquaculture in region of the world (FAO).

Jun SATOH
あったコウライエビに加えて，ホワイトレッグシュリ

に対して約

ンプ（

）の生産を開始し，2003年以降は，的な生産が可能であることから，主要生産国での対象倍の収容密度で飼育することができ効率

クルマエビ，ウシエビも加わり中国国内の生産量が，種がウシエビからホワイトレッグシュリンプへと切り2006年は1 242 385トンと2001年の倍以上に達し，替えられたことが生産量増大の背景にある。また，先中国一国で総生産量の39％を占めるまで急速に増加し進国を中心に健康食品としての水産物が注目され，消た。特にホワイトレッグシュリンプは，その生産量費されるようになり，世界的に需要の拡大が見られて

2 136 048トン（総生産量の67 3％）の47％を中国一国いるのと同時に，経済発展めざましい中国での消費拡で生産しており，
世界で最も多い生産量を誇る（Fig. 4,大による需要の増加が増産の背景にある。

5）。一方，クルマエビの生産量は2006年に53 098トンを記録し，総生産量に占めるクルマエビの生産量が1 7．クルマエビ類の増養殖における感染症による病害％にまで急激に増加した。なお，2006年のクルマエビ⑴

国内における病害問題の生産量である53 098トンの95 5％は中国で生産され

日 本 の 養 殖 ク ル マ エ ビ に お け る 病 害 問 題 は，桃た。2003年と2006年の総生産量に占める種類別の生産

山，室賀（2005）によって，また，種苗生産過程の漁を比較するとホワイトレッグシュリンプの生産量が海産魚介類の疾病発生状況（1994〜1999）は，鴨志

約

倍となり，
総生産量の67％を占めるまでとなった。

田ら（2005）によって詳しくレビューされている。

ホワイトレッグシュリンプは，病害に強く，ウシエビ

それによると細菌性疾病は，1970年頃のクルマエビ

Fig. 5. Production volume of penaeid shrimp aquaculture in the world (FAO).

クルマエビホワイトスポット病の防除対策
養殖場において，死亡個体からビブリオ属細菌が分発生して以降，ビブリオ病（17 1％）の被害率が減少し，離され，現在においても継続的に発生が確認されてWSD（80 2％）に置き換わった様に見えるが，2004年

いる感染症である（Fig. 6，水産資源保護協会デー

では WSD（9 3％）の被害は減少しビブリオ病（68 2％）タ）（ 桃 山， 室 賀，2005）。

の被害率が再び増加した。2005年はビブリオ病が49 0％，WSD が35 8％で，それらの被害額は同程度となは，しばしばクルマエビ類養殖生産におり，クルマエビ病害ではこれら疾病が常に問題にないて分離される細菌であり，種苗生産過程においてっている。種苗生産過程においても，1999年に体長20もの分離が報告されてい〜25mm の個体でビブリオ病の発生事例があり，そのる（Lightner, 1996）。1980年 代 以 降， 日 本 の ク ル マ

発生率（疾病発生時例数 / 飼育事例数）および死亡率

エビ養殖場での被害が問題となったビブリオ病（高の高さが問題となったことが報告されている（鴨志田

橋ら，1985；Takahashi

ら，2005）。

1998）の原因細菌は，
1995）
，クルマ

真菌病としては，フサリウム症の被害が WSD およエビに対して強い病原性を示すことが確認されておりとされ（Ishimaru

びビブリオ病に次いで多く報告されている（Fig. 6）。

（高橋ら , 1985；de la Peña

, 1993, 1995；江草ら ,フサリウム症は，クルマエビの鰓が黒色になるのが1988），日本のクルマエビ養殖場に常在する典型的な特徴で，鰓における呼吸障害と中枢神経や腹行動脈機

条件性病原体となっている（魚介類の感染症・寄生虫能障害が起きることで死亡すると考えられている（桃病，2004）。2005年には，鹿児島県内のクルマエビ養山，室賀 , 2005）。病原菌は殖場において高温下（27℃）で大量死をもたらした新

1978; 畑井，江草，1978）である。有効な治療法が知種の原因菌である

られていないことから，予防的にエビの収穫後の砂床オ病が報告されている（Sakaiによるビブリ, 2007）。
Fig. 6には，

中の

（畑井ら，

を殺菌することが推奨されている（畑各年の全疾病被害額に占める疾病別の被害率を示し

井ら，1978）。一方，種苗生産過程においては，1994

た。1992年のビブリオ病の被害率は，63 8％と当時の年から1999年まで毎年本症の発生が報告され，甲殻類

最も深刻な病害であった。1993年に西日本で WSD がの種苗生産を行う上で大きな問題となっている（鴨志Fig. 6. Occurrence of infectious disease in aquaculture of kuruma shrimp in Japan. Source : Japan Fisheries
Resource Conservation Association

Jun SATOH
田ら，2005）。フサリウム症の発病時期は，クルマエ

Kiddi shrimp（

ビ類ではノープリウスからポストラーバ10日齢期にかに感染が確認された（Table 1）。WSSV は，ワタリガ

）の

属22種

けて発生し，死亡率は非常に高く，発病すると全滅す

ニ科およびイセエビ科の数種で，また餌料生物に用いるケースが多い（鴨志田ら，2005）。

られるアルテミア（sp.）やワムシ（

一方，ウイルス病であるバキュロウイルス性中腸）でも感染が確認され，さらに昆虫類からも腺壊死症（Baculoviral mid-gut gland necrosis virus:

WSSV が検出された事例があり，現在までに12目21BMN）は，クルマエビのポストラーバ期10日齢前後

科に発生する。急性で致死性の高いウイルス感染症でいウイルスである。

ある。病原体は，Baculoviral mid-gut gland necrosis

亜科51属の生物で感染が確認される宿主範囲の広virus（BMNV）で，エンベロープを有する大型の桿状 DNA ウイルスである（Sano

WSD は， 我 が 国 で 報 告 さ れ た PAV と 同 一 の 疾病と考えられている（Takahashi

1981）
。本病は，

中腸腺と腸管の一部の白濁を特徴とし，症状は過急性, 1996; Wang., 1996；Lo, 2000））。 前 述 の 如 く，PAVの 原 因 ウ イ ル ス は PRDV と 命 名 さ れ た（Inouyeに経過することが多く，感染後数日間で死亡する。本, 1996）。本病および原因ウイルスは，国際的には病の対策として，種苗生産過程における受精卵の回収

WSDV あるいは WSSV と呼ばれるが，WSD たる病時に親エビの糞などを清浄な海水で洗浄することで垂名の由来となっている罹病個体の外骨格の白点もし直感染の防除が可能とされる（Sano and Momoyama,

くは白斑の症状が，必ずしも本病に特有の症状では

1992）。ただ現在では，本疾病による病害の報告はほないことから，日本では現在も PAV の病名が一般的

とんどなく（水産資源保護協会データ），種苗生産過に使われている。ICTV（International Committee on

程においても1991年以降の発生報告はない（鴨志田ら，

Taxonomy of Viruses）第

2005）
。

では，本疾病の病源ウイルスは white spot sydrome⑵

WSD による病害問題版（Fauquet

2005）

virus（WSSV） で， ニ マ ウ イ ル ス 科（

1993年，日本国内のクルマエビの増養殖は WSD にウ ィ ス ポ ウ イ ル ス 属（））に分類される

より甚大な被害を受けた。2000年以降，被害のピーク（Fauquet

は過ぎたものの，2004年には86 7億円の生産額に対しで覆われた卵形あるいは長楕円の桿状で，大きさは幅て7 3億円の被害が報告され，WSD は現在もなお深刻

が120‑150 nm，長さが270‑290 nm で，粒子の一端にな問題である（Nakano

鞭毛様の構造物が付属している（Wongteerasupaya, 1994； Momoyama and, 2005）。WSSV 粒子は，エンベロープ

Muroga., 2005）（Fig. 6）
。WSD は，中国から輸入さ, 1995）。ビリオンは，最も外側に脂質のれたクルマエビ種苗を発生源とし，西日本各地のクらなるエンベロープタンパク質があり，その内側に存

ルマエビ養殖場へ瞬く間に伝播したと考えられてい在するテグメントタンパク質によって桿状のヌクレオる（中野ら，1994）。本病は，十脚目のエビ・カニ類

カプシッドが包含されている。WSSV は，約300 kbpが感染するウイルス性疾病で，アジアおよび中近東ののクルマエビ類養殖でも甚大な被害をもたらしている質由来の VP19および VP28，テグメントタンパク質（Lightner, 1996； Wang

由来の VP24および VP26，ヌクレオカプシッドタン, 1998；Jory and Dixon,

本鎖 DNA をゲノムとし，エンベロープタンパク

1999）。WSD はこれまでに東南アジア諸国の養殖ク

パク質由来の VP15，VP664の計

ルマエビ，ウシエビ，アカオエビ（

ンパク質から構成される（van Hulten），

およびコウライエビなどで発生が報告されている（Table 1）。
この他のクルマエビ科に属するクマエビ（）， イ ン ド エ ビ（
shrimp（），Banana），フトミゾエビ（），Blue shrimp（

Northern brown shrimp（
Northern pink shrimp（
Ginger prawn（b；van Hulten., 2001；Chen

種類の主要構造タ, 2001；Tsai, 2000 a,, 2006；Yang., 2002a）。クルマエビの WSD

罹病個体は，外骨格の白斑あるいは白点の形成に加え，体色が赤変もしくは褪色化し（Fig. 7），感染末期），White leg shrimp，White shrimp（

層かにはウイルス血症となる（Momoyama, 1995）。

），病理組織学的には，感染エビの胃の上皮細胞層，結），合組織，リンパ様器官，造血組織の中胚葉・外胚葉起），ヨシエビ，

源細胞の核の肥大と無構造化が観察される（桃山ら，），Kadal shrimp（

1994；井上ら，1994）。また最近の研究で，実験感染），Fine shrimp（），トラエビ（エビの心臓心筋組織に顕著な壊死が観察され，これが）， ア カ エ ビ（）
， キ シ エ ビ（

WSD 罹病クルマエビの致死病変であるとする報告が）， サ ル エ ビ（），

ある（Miyazaki, 2008）。

クルマエビホワイトスポット病の防除対策
Table 1. List of WSSV confirmed naturally and/or experimentally infected host species

Jun SATOH

クルマエビホワイトスポット病の防除対策

Fig. 7. WSSV infected kuruma shrimp. upper；health,lower；infected

クルマエビの種苗生産施設では，1995年に初めて2）。原因ウイルスの検出には，特異的プライマーを用

WSD の発生が報告され，1999年までほぼ毎年報告さ

いて WSSV の遺伝子を検出する PCR 法（Takahashi

れている（鴨志田ら，2005）。本疾病の発生は，ヨシ, 1996；木村ら , 1996；Lo., 1996b）が開発

エビにおいても報告があり，近年でもクルマエビおされ，病エビの診断をはじめ，キャリアーや親エビ

よびヨシエビの種苗生産機関の10％程度で WSSV のからのウイルス遺伝子の検出法として用いられてい検出あるいは WSD の発生が認められ，計画的な種苗る。その他，外国では in situ hybridization（Durand

放流事業の妨げとなっている。クルマエビの種苗生産, 1996，Wongteerasupaya

過程における WSSV の主たる感染経路は，垂直伝播体法（Loであることから（Mushiake2001），dot blot hybridization（Chang, 1998; Satoh,, 1997; Zhan., 1996），蛍光抗1999; Poulos

1999），その防除対策として WSSV フリー親エビの選

dot immunoblot assay（Poulos

別，ヨード剤を用いた受精卵の消毒および飼育水の殺2002），ウェスタンブロット法（Poulos菌が重要である（Mushiake

ELISA 法（Chen, 1998, 1999；Satoh, 1999, 2001； 佐藤ら2003）。これらの対策により，

.,

1998）
，

, 2001; You,, 2001），, 2002b），初代培養細胞を用いたウイルス分離法も報告されている（Tapay

陸上施設等を用いた種苗生産過程での WSSV 防除対

1997）。従来の PCR 法（木村ら , 1996）では，nested

策はほぼ確立されたが，中間育成場や養殖施設におい

PCR 反応が終了するまでに約ては，飼育環境中に生息する甲殻類からの，あるいはに産卵水槽毎に管理している卵の発生が進み，種苗生

飼育海水を介した WSSV の水平伝播が起こる危険性

産水槽に収容するまでの間にふ化への悪影響が懸念さがあり，未だ解決されていない。事実，Maeda

れた。そのため，虫明ら（1999学会発表）＊4 は，木村（1998）, Momoyama

ら（1996）の開発した PCR 法を若干改良し，PCR 法,（2003）は養殖場に生息す

る甲殻類から WSSV が検出されることを，また Wu（2001）は共食いによる水平感染が WSSV の重時間を要し，この間の熱変性，アニーリング及び伸長のつのステップの反応のうち，アニーリングのステップを省略する

ス

要な伝播経路であることを報告しており，養殖場や放テップ PCR 法（シャトル PCR 法）により反応時間の流用種苗の中間育成場における水平感染対策も重要な短縮を図った。その結果，従来法（木村ら，1996）と課題である。
⑶

ステップ PCR 法を用いて WSSV の検出感度を比較

WSD の診断あるいは WSSV の検出方法

しても，全く遜色のない結果が得られるとともに，

WSD 罹病エビの血リンパを用いた診断法は，暗視

nested PCR までの反応時間を半分の約2 5時間に短縮

野顕微鏡下で観察すると約0 5μm の多数の微粒子がすることに成功した。現在も多くのクルマエビ種苗認められることや，胃上皮層の感染細胞の核が10〜生産機関では，WSSV 陽性親エビを選別するために15μ m の円形あるいは楕円形の輪郭明瞭で無構造のPCR 法による検査が行われているが，PCR 法による白色物体として観察されることから簡便な方法とし検出系が報告（木村ら，1996）されてから既に10年以て報告されている（Momoyama

上が経過し，最近では簡便で高効率，高精製度の核

1995）（TableJun SATOH
Table 2. Diagnostic methods for WSD Diagnostic methods Reference

酸抽出キットや高速 PCR 機器あるいは高温耐性に優が，逆に養殖生産においては，WSSV 検査に多大なれた DNA 合成酵素などが市販されている。最新の情

労力とコストを要するウイルスフリーの種苗の生産に報を踏まえつつ適材適所に改良された検査手法の導入

は力点を置かず，養殖過程に実施可能な効果的で効率を図る必要がある。また，高感度な検出法であること

的な水平伝播対策の構築が望まれている。

から，感染性がないウイルスを検出することも考えら

甲殻類の生体防御機構については，産業上重要なエれることからその判定は慎重に行わなければならない

ビ類の増養殖生産過程で病害が多発することから，そし，確定診断を行う場合は病理組織学的検査も必要での解明・研究が注目され始めている。高橋ら（1995）あろう。

の総説では，無脊椎動物に病原微生物の死菌あるいは生菌を投与することで誘導される生体防御は，病．クルマエビ類の生体防御能を利用した WSSV 防除原体特異抗体の産生を行わないので，免疫賦活効果として考えることが適当とし，抗体を持たない無脊椎動

クルマエビの種苗生産過程においては WSSV フリ

物のワクチンに関する開発・研究はほとんど行われなー産卵親魚の選別，
ポピドンヨードによる受精卵消毒，かったとしている。しかし，高橋ら（1995）の総説か

ならびに殺菌海水での飼育により中間育成に至るまでら10年以上が経過した現在，クルマエビ類をはじめ多の WSSV の垂直伝播による感染防除対策が構築されくの甲殻類の生体防御機構に関する新たな研究が次々（Mushiake, 2001；佐藤ら，と報告されている。その一つに，WSSV 感染耐過エ

2003），主に放流を目的とする種苗生産機関において

ビ類は再感染に対し抵抗性を獲得すること（Venegas., 1999；Satoh

継続的に実施されている（Fig. 8）。中間育成および, 2000; Wu, 2002），またクルマエビにおい養殖過程では，WSSV の重要な感染経路とされる環て実験的に誘導された WSSV に対する感染防御効果

境生物の捕食，共食いあるいは水系感染による水平感

はビブリオ感染に対して無効であったこと，さらに染（Maeda, 2001；Momoyama

WSSV 感染耐過クルマエビの血リンパ液には，WSSV, 2003）の防止対策がない。ウイルスフリーの放を特異的に中和する活性が認められることが明らか

流種苗に対して，水平伝播対策を施すことは主にコスになり（Wu, 2003），エビ類の感染防御機構にも一種トの面から，現実的でないため対策が行われていないの免疫様現象が存在する可能性が示唆された。さら＊４., 1998；Wu

虫明敬一，清水 健，森広一郎，有元
春季大会講演要旨集，40．

操，佐藤純，1999．親エビ受精嚢の PRDV の存在量と PAV 発生との関係．平成11年度日本魚病学会

クルマエビホワイトスポット病の防除対策

Fig. 8. Disease control in shrimp hatchery.

に，組換え大腸菌で発現した WSSV 構造タンパク質

第章

種苗生産過程における WSD の発生状況（recombinant viral protein, rVP）をクルマエビ，ウ
シエビ，White leg shrimp，アメリカザ１．目

的リガニに筋肉接種あるいは経口投与することで，自国内の種苗生産機関（主として中間育成期）での然感染耐過エビと同様に WSSV に対する防御効果が

WSD の発生は，クルマエビ以外では，これまでヨ誘導されることが確認されている（Namikoshi

シエビでの発生事例（Momoyama.,, 1997）が報2004; Witteveldt, 2004a, b 2006; Vaseenharan

告されているに過ぎない。本章では，1996年および, 2006; Jha, 2006, 2007）。ワクチン様効果とも

1997年の志布志庁舎におけるクルマエビ種苗生産過程

言うべき現象の防除技術へ応用が期待されている。
本研究では，クルマエビにおける WSSV の防除対策を確立することを目的に，第（中間育成も含む）での WSSV の検出および WSD の発生状況について述べる。なお，クルマエビの幼生期

章において種苗生産の名称は，我が国では伝統的にノープリウス，ゾエア，

過程における WSD の発生状況について報告した。第ミシスおよびポストラーバという通称が使われている章においては，クルマエビ受精卵のポビドンヨード

が，これらの通称は十脚甲殻類の国際的な名称とは必剤による消毒の安全性と効果について調査を行った。

ずしも一致しない（倉田，1986；本尾，1988）。国際

第的な名称に従えば，各ステージの呼称は，ノープリウ

章では，WSSV の攻撃量の把握と発現タンパク

質の経口投与による WSSV 防御効果に関する試験をス（〜

令）= ノープリウス，ゾエア（

〜

令）

行った。第

章では，WSSV 発現タンパク質の経口= プロトゾエアあるいはゾエア，ミシス（10〜13令）

投与によって誘導される WSSV に対する防御効果の= ミシスあるいはゾエア，ポストラーバ（13〜14令）

発現時期，持続期間および追加投与効果に関する試験= メガロパ，（15令以降）= 稚エビとのように修正さを行った。

れる。しかし，我が国の種苗生産現場では，いまだにこれらの通称が慣用されている現状から，本研究におJun SATOH
いてはこれらの名称を用いることとした。その際，ポたが，1997年は，輸送中の産卵を抑制するため15℃前

ストラーバ期の記載方法は Hudinaga（1942）の報告後とした。

した記載とは異なり，通例ポストラーバ期に達した段まず，1996年は，志布志庁舎に到着した後，購入し階からの日齢で表記する方法が使用されているため，たすべての親エビを角型コンクリート製産卵水槽（25

それに準じた。

kL）に収容し，飼育水温24〜29℃で種苗生産に必要な卵数に応じて〜日間産卵させた。親エビ検査に．材料および方法

ついては，産卵後の一部の個体の胃上皮（約50μg）⑴

を個体別に採取し，後述する PCR による WSSV 検査

親クルマエビの購入と採卵

1996年および1997年の志布志庁舎における種苗生産用試料とした。

用天然親クルマエビ（以下 親エビ）の購入から採卵

翌1997年は，生検法（宮島・松本，1996）による成までの概要を Table 3に示した。1996年の種苗生産で熟個体の判別を行うため，ディスポーザブル・シリン

は月17日にかけて，九州および四国のジ（容量 3 mL：注射針 18 G）で親エビ卵巣の一部を各沿岸海域で漁獲された親エビを6 639尾購入した。

月24日から採取して検鏡し，卵巣卵の表面に表層胞が形成された

また，1997年は，日にかけて，九個体（前成熟期および成熟期）を選別した。なお，採州沿岸海域で漁獲された親エビ2 748尾を購入した。

取した卵巣の一部（約100μg）は，個体別に PCR に

いずれも，購入地において目視による透視観察によりよる WSSV 検査に供した。選別された成熟個体は，卵巣が発達した親エビを選別した。

ウイルス検査結果が判明するまで，エアレーションを

月11日から月

1996年の種苗生産では，
砂濾過海水の入った水槽（容施した小型水槽（10 L）に個別に収容し，白色ランプ（東量 1 6 kL）に300〜600 尾の親エビを収容し，志布志

芝ライフテック製 D400）3 基を全水槽を照らすよう庁舎まで輸送したが，1997年は，輸送中の親エビ間のに配置し，光照射と飼育水温の冷却（15℃）により小接触の機会を少なくする目的で，紫外線殺菌処理（日型水槽内での産卵を抑制した。卵巣検査で WSSV 陰

本フォトサイエンス製 NPL-10, 22）海水を入れた発性と判定された個体

泡スチロール製容器（10 L）に，尾ずつ収容し水槽（0 5 kL）に収容した。その際，産卵水槽には紫輸送した。輸送時間は，購入地と志布志庁舎の距離の外線殺菌処理海水（30 000μW・sec ／ cm2 照射）を関係で，1996年は3 5〜10 時間を1997年は3 5〜

給水し，水温を24〜28 ℃として〜時間を要した。1996年の輸送中の水温は，20〜25℃を保っ〜12尾をグループとして産卵〜日間産卵させた。

Table 3. Outline of wild broodstocks of kuruma prawn employed for seed production and countermeasures
for WSD at Shibushi Station of JASFA in 1996 and 1997

クルマエビホワイトスポット病の防除対策
水槽内に産出された卵の採集は，ネット（目合 100

EDTA）100μL に 溶 解 し た。WSSV の 検 出 は， 親μm）でろ過する方式を採用した。採集した卵は，エビおよび飼育種苗から抽出した DNA（1μL）を1996年は清浄な濾過海水を用いて卵洗浄を行った。

鋳型とし，木村ら（1996）の方法を一部改変した2

1997年は紫外線処理海水で洗浄した後にヨード剤によstep PCR（nested PCR）により行った。すなわち，る消毒（有効濃度 5 mg ／ L, 5 分間）（Mushiake

PCR 反応液の全量を25μL とし，DNA ポリメラーゼ, 1999）を行った。

Takara Ex Taq（タカラバイオ）を用い，PCR プライ⑵

マーとして1st-step PCR では P1（5 -ATC ATG GCT

種苗生産

採卵後，洗浄あるいは消毒した卵は，屋外コンクリ

GCT TCA CAG AC-3 ） お よ び P2（5 -GGC TGG

ート製飼育水槽（150〜2 500 kL）に収容し，水温24

AGA GGA CAA GAC AT-3 ）を，2nd-step PCR で〜28℃でふ化させた。ふ化時のノープリウスの収容密は，P3（5 -TCT TCA TCA GAT GCT ACT GC-3 ）度は，0 4〜10 8 万尾 /kL であった。飼育餌料には，

お よ び P4（5 -TAA CGC TAT CCA GTA TCA

テトラセルミス，アルテミアCG-3 ）を用い，DNA サマールサイクラー（9600, パ

および市販の人工配合

ーキンエルマー）で標的遺伝子を増幅した。増幅反応

飼料を用いた。
飼育水の換水はミシス期以降に開始し，の条件は，72℃・10分間および95℃・ 分間の反応後，換水率は種苗の成長に応じて増加させ，最終的には95℃・

日200% とした。なお，1996年の飼育用水には砂濾過サイクルとし25あるいは30サイクルの後，72℃・

海水を，また1997年には紫外線処理海水を用いた。飼間の反応を行った。増幅サイクル数は親エビ検査ではノープリウス

分間，57℃・

分30秒間，72℃・分間を分

育期間中の水温は加温により23℃を維持したが，夏期

30サイクルとし，種苗の検査では水産庁のマニュアル

は25 ℃以上に上昇するため，自然水温とした。

（1996）に準じて 25 サイクルとした。

種苗の検査は，1996年は卵（whole 50μg を
とし，

検体
．結

検体：以下 whole 50μg ×5と記す），ノー

果

プリウス（whole 50μg ×5），ゾエア（whole 50μg⑴

×5），ミシス（whole 50μg ×5），ポストラーバ

1996年の種苗生産においては，計

齢期（P1, ふ化後11日目；whole 5 尾を日検体とし10中

WSD の発生状況
回の飼育事例例（飼育事例 No. 6〜9）で，中間育成配付前の検体：以下 whole 5尾×10），
P5（P4）（ふ化後15日目，種苗から WSSV が検出され，飼育を中止した（Table

whole 5 尾×10）および配付直前の P20（P9）（ふ化4）。これらの飼育過程で，WSSV が最初に検出され後30日目，whole 1尾×30）を検査した。なお，括弧た種苗のステージは，卵から P10の発育段階で，その内に，幼生の形態観察により Hudinaga（1942）の分

時の飼育水温は 22 1〜29 4℃であった。一方，種苗生類に基づく幼生の名称を併記した。1997年の種苗生産

産事例 No. 1〜5では，P20まではいずれの発育段階ででは，P5まで前年と同様に行い，以後 P30（P11）（ふも WSSV 陰性で，WSD の発生も認められなかった。

化後 40日目）までは日間隔で検査（whole 1尾×

しかし，事例 No. 1〜5の種苗を中間育成場に輸送し30）し，最終的には中間育成場へ輸送する各ロットにた後，一部のエビを志布志庁舎で継続飼育していた

ついて輸送

ところ，事例 No. 3および

れ検査（
胸部

日前（P25〜 P30；P10〜 P11）にそれぞ
尾の頭胸部を検体とし30検体：以下 頭尾×30）を行った。なお，中間育成場に輸送すの P51および P29の一部

が PCR により WSSV 陽性と判定された。これと符合するように，事例 No. 3およびの種苗を用いた中間る際，種苗の一部は中間育成が終了するまで事業場で育成

引き続き飼育し，その間育成場においては，種苗を輸送した

日毎に PCR によるウイル

ス検査（頭胸部 1 尾 × 30）を行った。
⑶

中間育成

事例全てで WSD が発生した（Table 4）。中間
日後から18日後の発育ステージ（P27〜 P55）で WSD が発生し，大量死に至った。瀕死の個体には，体色の赤変，褪色お飼育水槽で生産された種苗は，関係各機関に配付し，よび甲皮に白点が認められ，約10日間での累積死亡率

中間育成に供した。中間育成過程の飼育施設は，コン

は50〜100 % に達した。種苗生産事例 No. 5の種苗をクリート水槽，キャンバス水槽，築堤式あるいは囲い用いた中間育成場での死亡個体では，70 % の個体が1網式で，飼育水温は何れも25 7〜28 2 ℃であった。

step PCR でも WSSV 陽性と判定された。

⑷

PCR による WSSV 遺伝子の検出

親エビおよび種苗からの鋳型 DNA の抽出は，水産種苗生産に用いた親エビについて，産卵終了後，一部の個体の胃上皮を WSSV 検査に供した結果，

月

庁が提示したマニュアル（1996）に準じて行った。抽下旬以降に購入した親エビから WSSV が検出された

出した核酸は，TE（10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM

（Table 4）。これらの親エビを用いた種苗生産（No. 5

Jun SATOH
Table 4. Detection of WSSV from spawners and juveniles in seed production at Shibushi Station of
JASFA and occurrence of WSD in nursery culture in 1996

Table 5. Detection of WSSV from spawners and juveniles in seed production at Shibushi Station of
JASFA and occurrence of WSD in nursery culture in 1997〜8）では，結果的にはいずれの種苗からも WSSV

ビの卵巣から WSSV が検出されたものの，これらのが検出され，親エビにおける WSSV の存在と種苗か

PCR 陽性個体を排除した陰性個体のみから得た卵をらの WSSV の検出結果とがよく一致した。ただし，種苗生産に用いた結果，種苗生産事例 No. 9 に用いた親エビの胃上皮からは回の中間育成事例のいずれにおいても WSSV は検出

WSSV は検出されなかったにもかかわらず，その後されず，WSD の発生も認められなかった（Table 5）。

の種苗生産過程で，種苗（P5）から WSSV が検出さ

なお，旧日栽協上浦事業場（現水産総合研究センター

れた。

増養殖研究所上浦庁舎，以下上浦庁舎と記す）で1997

一方，1997年には月および月に搬入した親エ

年月と回の種苗生産事例および17月に搬入した PCR 陽性個体を含む親エビクルマエビホワイトスポット病の防除対策から採卵して得たノープリウスを飼育試験に供したになると WSSV が検出される傾向を示した。一方，ところ，回の事例とも種苗（P8，P22）から WSSV

1997年においては，天然親エビの調査結果（虫明ら，が検出され，その後 P35および P55において WSD が1998）から親エビの WSSV 陽性率が比較的低いと考発生し，大量死が認められた。

えられる

⑵

採卵時期と種苗からの WSSV の検出

月から種苗生産を開始し，親エビ選別と卵消毒による防除対策を講じた結果，種苗生産および親エビの選別および卵の消毒を行わなかった1996年

中間育成のいずれの段階においても WSD は発生しなの志布志庁舎（Table 4）における親エビからの採卵かった。また，上浦庁舎で行った飼育試験で，WSSV

時期と種苗からの WSSV 検出時期との関係を Table

陽性個体が混入した親エビから得られた種苗において6にまとめた。

WSSV が検出され，WSD が発生した（Mushiake

月および月に搬入した親エビからの卵を用いて種苗生産を開始した事例では，種苗の1999）。これらの結果から，クルマエビ種苗生産

いずれの発育ステージにおいても WSSV は検出され過程における WSSV の主たる感染経路は，親エビかなかった。しかし，らの垂直伝播であると考えられた。

月に購入した親エビから得た卵で種苗生産を行った事例では，

事例の種

1996年の種苗生産事例において，産卵後の一部の親苗（P29および P51）が WSSV 陽性となった。また，

エビ胃上皮を検査した結果 WSSV 陰性と判定された

月および

事例中

月に開始した場合では，すべての事例でにもかかわらず，それらの親エビから得た種苗から

WSSV 陽性となった。特に， 月開始の事例では P20

WSSV が検出された事例が 2 事例（飼育事例 No. 3と以前に WSSV 陽性となり，親エビからの採卵時期が9）あった。これは，親エビの検査部位と検査尾数に遅くなるほど種苗からの WSSV の検出率が高くなる問題があったためと考えられる。この点について，そとともに，WSSV が検出される種苗の発育ステージの後の研究により雌親エビの場合には卵巣（虫明ら ,が早まる傾向がみられた。

1998）もしくは受精嚢（交尾により雄から獲得した精子を貯蔵しておく小嚢）（Mushiake．考察, 1999）から

効率的に WSSV が検出されることが判明した。したWSSV の防除対策として，採卵に使用する親エビがって，胃上皮のみの PCR 検査結果に基づく親エビの選別とヨード剤による卵消毒を行わなかった1996年の選別法は，WSSV キャリアーの排除には不充分では，月採卵分の種苗において，中間育成場にあることが明らかになった。検査尾数に関しては，大配付する前の P20までは WSD による死亡はみられな型水槽を用いて種苗を量産する場合，まとまった量のかったものの，配付後の中間育成段階において，一卵を確保するために300〜600 尾の親エビを使用して部（No. 3，5）の種苗で WSD が発生した。

月以降いることから，産卵に供した親エビの一部を検査するに得られた卵を用いた事例では，配付前の種苗からだけでは，親エビ全体の WSSV の保有状況を把握で

WSSV が検出されたため生産を中止した。また，採きるとは考え難い。以上のことから，種苗生産に用い

卵後に調べた親エビの胃上皮からは，るすべての親エビの卵巣および受精嚢について，PCR

〜

月下旬以降

Table 6. Season of egg collection and first appearance of WSSV at each developmental stage of kuruma
prawn in seed production at Shibushi and Tamano Stations of JASFA in 1996

Jun SATOH
Table 7. Detection of WSSV from juveniles of kuruma prawn in seed production at Shibushi
station of JASFA and occurrence of WSD in nursery culture in 1996 and 1997

法による WSSV 検査を実施する必要があることが示に対する耐性を明らかにすることが必要である。さらされた。

に，種苗生産施設において卵消毒を行う場合には，ふ中間育成場での WSD の発生率は，月以降に採卵化率に大きな影響を及ぼさない範囲で消毒する必要がし飼育された種苗において高い傾向にあった。
これは，ある。ポビドンヨード剤が海産魚介類の受精卵消毒剤

虫明ら（1998）が明らかにしたように，天然親エビでとしては未承認であるため，水産総合研究センターでは夏期に漁獲される親エビほど WSSV 陽性率が高い

は，その効能拡大を最終的な目的とし受精卵の消毒条ことに起因すると考えられる。したがって，表の結件の把握に関する実験を実施している。本報告では，果から推察しても，親エビの WSSV 陽性率が比較的

ポビドンヨードがクルマエビ受精卵に影響を及ぼす濃低いと考えられる

月の間に得た卵を種苗生

度と処理時間を卵発生段階毎に検討するとともに，受産に利用することも，WSSV の防除には有効な方法

精卵の一般生菌数の変化からヨード剤の殺菌効果につであることが示された。以上の結果を基に防除対策をいても検討した。

月から実施した1997年の種苗生産では，幼生からの WSSVの検出および中間育成場での WSD の発生は一切認め．材料と方法られず（Table 7），本法による親エビ選別が，WSSV⑴

有効ヨウ素濃度と消毒時間が安全性と消毒効果に与える影響防除対策に極めて有効であることが確認された。

ポビドンヨード剤として水産用イソジン液（明治製第章

ポビドンヨード剤を用いた受精卵消毒の安全菓）を用い，上浦庁舎および旧日栽協五島栽培漁業セ性と効果ンター（現西海区水産研究所五島庁舎，以下五島庁舎と記す）の濾過海水で所定濃度に希釈して消毒液（以．目

的下，ヨード液）を作製した。

種苗生産過程における本疾病の防除対策の一つとし有効ヨウ素濃度と消毒時間が受精卵のふ化に与えるて，親エビからの垂直感染を防止するためにヨード剤

影響と消毒効果を把握するための指標として用いられによる受精卵消毒が栽培漁業センターなどで広く実施ている生菌数の減少効果（笠井ら，2001）について試されている（Mushiake

験を行った。なお，種苗生産における卵消毒実施時期, 1999; 佐藤ら，2003）。

また，ウシエビにおいては，WSSV が卵巣卵内に存を考慮して，水温22℃で受精後在すると卵の発育が阻害され，垂直伝播が起こらないに環状帯が形成された以降のステージの受精卵を用い〜時間経過し，胚とされているが，卵およびふ化幼生については洗浄また。

たは消毒を実施することが有効な垂直伝播の防除にな

1）採卵親エビる（Lo

採卵には捕獲直後の天然クルマエビ（以下，親エビ）, 1997）。WSSV は，有効ヨウ素濃度2 5mg/L 海水で10分間（中野ら，1998），2 5 mg/L 以上を用い，異なるで0 2分 以 内，1 0 mg/L で個体の親エビから得られた受精卵を分 以 内（ 桃 山， 谷 村，

供試した。それぞれの親エビの全長，体重および産出

2004）に不活化されるとの報告がある。受精卵の消毒

卵の受精率は，個体 A：24 9 cm, 104 0 g で95 7％，による垂直感染防除効果を得るために，病原体の消個体 B：21 2 cm, 113 4 g では 98 2％，個体 C：24 5

毒剤に対する感受性の検討に加え，受精卵の消毒処理

cm, 107 2 g では97 5％であった。親エビは，個体毎

クルマエビホワイトスポット病の防除対策に500 L ポリエチレン水槽に収容し，微通気，無注水到達した段階でルゴール液により固定し，未ふ化生で産卵させた。水温は，加温装置を用い22℃に維持し残卵（発生は正常に進んでいるがふ化していない受精た。産卵の確認された水槽から卵を集め，75 L のプ卵），死卵，正常ノープリウス，死亡ノープリウスおラスチック容器（三甲）に0 02 g/L（2 000個 /L）とよび異常ノープリウスを実体顕微鏡下で計数し，ふ化なるように収容した。

率（正常ノープリウス数 / 総数×100）を算出した。

2）ヨード剤の濃度と消毒時間

4）生菌数の測定

ヨ ー ド 液 は， 有 効 ヨ ウ 素 濃 度2 5, 5 0お よ び10 0
mg/L の濃度とし，それぞれの濃度で生菌数は，滅菌ペプトン水で洗浄した受精卵に, 10, 15およ

倍量の滅菌人工海水を加えて磨砕し，10倍希釈液列をび20分間消毒した。消毒は，目的のステージに達し作製し，海水平板培地（ポリペプトン5 g, 肉エキス1た各受精卵0 6 g を所定濃度に希釈したヨード液1 8 L

g, プロテオースペプトン1 g, 寒天15 g, 酵母エキス1 g,に浸漬して行った。所定時間に達した段階で，直径6Herbst s 人工海水750 mL, 蒸留水250 mL, pH 7.8）にcm，深さ2 cm，目合い200μm のネット（ニッタル

塗抹後，25℃で日間培養し，コロニー数を測定した。

7xx-200）で取りあげた。生菌数の測定に供試するた⑵

め0.1 g の受精卵を取り，1 mL の2％ペプトン水でヨ

卵発育段階ごとの受精卵のヨード剤に対する感受性ードの反応を止めた。また，受精卵2 mg をろ過海水試験を，前記試験と同様に捕獲直後の親エビから自然の流水中（600 mL/min）に置いたネットに収容して産卵によって得た受精卵を用いて実施した。

分間洗浄し，新しいシャーレ（直径9 cm，深さ1 5cm，水量13 mL）に移して22℃の室内でふ化させた。
対照区は，ろ過海水に所定時間浸漬した（Fig. 9）。
3）ふ化幼生の観察
ふ化を確認後，ノープリウス

受精卵の発育段階と消毒の安全性

1）採卵親エビ
供試した個体の親エビの全長，体重および産出卵の受精率は，
個体 D：22 2 cm, 90 0 g が92 3％，
個体 E：
20 2 cm, 88 0 g が92 0％および個体 F：20 8 cm, 77 0期（藤永 1935）に

g では90 8％であった。

Fig. 9. Procedure of povidone-iodine treatment in experiment of disinfection eggs of kuruma shrimp.

Jun SATOH
2）採卵の各ステージでの消毒試験

1935）。なお，試験水温は，加温装置を用いて21 8〜

産卵方法は，前述と同様に行った。産卵が確認され

22 4℃に保った。

た水槽から直ちに卵を採取し，卵管理水槽として用いた75 L のプラスチック容器に0 03 g/L となるよう収．結果および考察

容し，死卵などの異常卵の取り除きは行わなかった。

⑴

消毒試験には，卵管理水槽から90％以上が所定のステージに達したことを確認した受精卵の2 mg を直径

有効ヨウ素濃度と消毒時間が卵消毒と受精卵の発育に及ぼす影響

有効ヨウ素濃度2 5 mg/L で〜20分間消毒した場

6 cm, 深さ2 cm, 目合い200μm のネット（ニッタル

合および5 0 mg/L で

7xx-200）に取り，有効ヨウ素濃度5 mg/L のヨード合のふ化率は，対照区との間に有意差は認められなか

液6 mL の入ったシャーレ（直径9 cm，深さ1 5 cm）った（ ＜0 05；Fisher s PLSD による多重比較検定，に収容し，分間の処理を行った。対照区として，ろFig. 10）。種苗生産を成功させるためには経験的に50

過海水を用いて同じ処理を行う区および未処理区を設％以上のふ化率の受精卵を供試することが望まれるこけた。 分後，受精卵を流水のろ過海水中（600 mL/ 分）とから，いずれの濃度においてもに置いたネットに収容して終える必要があると考えられた。有効ヨウ素濃度5 0

分間洗浄し，新しいシャ，10および15分間消毒した場

分間以内に消毒をーレ（前出）に移して22℃の室内でふ化させた。受精

mg/L で20分および10 0 mg/L で卵の発育段階は，

場合は，ふ化率が対照区と比較して有意（ ＜0 01ま出現期，第細胞期，128細胞期，胚に環状帯

触角の始痕の形成期，附属肢の分叉肢のたは〜20分間消毒した＜0 05）に低下した（Fig. 10）。このときすべ形成期，外肢および内肢の形成期，卵内ノープリウスての実験区の生菌数は約

初期および卵内ノープリウス後期の有意に減少した（ ＜0.01；Fisher s PLSD による多期とした（藤永

桁減少し，対照に比較してFig. 10. Sensitiveness of kuruma prawn eggs (1st antenna is formed above the 2nd
appendage stage) on treatment of povidon-iodine. Experiments in triplicate wereconducted for 5, 10, 15 and 20 min. Values are means and standard deviations.
Significant differences from the control values are indicated by *（ < 0.05) or **（<0.01）.

クルマエビホワイトスポット病の防除対策

Fig. 11. Viable bacterial counts of iodine treated eggs (means andstandard deviations). Significant differences from the control values
are indicated by**( <0.01).

Fig. 12. Influence of povidon-iodine treatment on hatching rate at different developmental
stages in kuruma prawn. Eggs were treated with 5 mg/L active iodine for 5 min. Eggs in
the control of each developmental stage were incubated in sea water for 5 min. Experiments
were done three times and each bar represents the mean value and standard deviations.
Developmental stages are categorized as : A ; 2 or 4 cell stage, B ; 128 cell stage, C ; embryowith a ring-shaped middle part, D ; embryo with 1st antenna formed above 2nd appendage, E ;embryo with biramous 2nd and 3rd appendages, F ; embryo with appendages with exopodite
and endopodite, G ; egg containing nauplius at an early developmental stage, H ; egg containing
nauplius at a later developmental stage. Significant difference from the non-treatment groupis indicated by*( <0.05). Non-treatment group represent eggs maintained in the original tankthroughout the experiment period.

Jun SATOH確認された卵密度（0 33 g/L）で，かつウイルスの不重比較検定）（Fig. 11）。
次いで2 5 mg/L のヨード液を作製し，作製直後と活化が確認されている有効ヨウ素濃度2 5〜5 0 mg/L

20分経過後に有効ヨウ素濃度を測定した。また，受精の海水に，クルマエビ受精卵を卵を今回の試験条件である0 33 g/L 濃度となるよう安全かつ効果の期待できる卵消毒方法であると考えらに2 5 mg/L のヨード液に収容し，20分間消毒処理をれる。

行った後，ヨウ素濃度を測定した（日本工業規格（JISk 0102工場排水試験方法33 3

残留塩素）
（日本規格

第

章

WSSV の rVP26および rVP28を経口投与したクルマエビの WSSV 攻撃に対する感染防協会編2005）を改変）。その結果，作製直後のヨード

御効果

液のヨウ素濃度に対し，受精卵を入れない場合の減衰率は11 5％±1 65，受精卵を入れた場合の減衰率は19 7％±2 69となった。Student s 検定の結果，有意分間浸漬することは，

1．目

的差は認められなかったことから（ >0 05），
今回の試験

クルマエビの種苗生産過程における WSSV 防除

条件では受精卵の有無によるヨウ素濃度の減衰はなか対策として，PCR による WSSV フリー産卵親魚のったものと考えられた。

選別，ポピドンヨードによる受精卵消毒，ならびに⑵

WSSV フリー飼育水での育生が有効であり（Mushiake

受精卵の発育段階と消毒の安全性

128細胞期以外のふ化率は，すべて80％以上の値を1999; Satoh2001; 佐藤ら，2003），これ示したが，128細胞期におけるふ化率は，対照区おらの対策により WSSV フリーのクルマエビ種苗の産

よびヨード区でそれぞれ63 5％±21 4および71 6％±生が可能になった。しかしながら，中間育成および23 3となった。128細胞期の対照区のふ化率は，未処養殖過程では，飼育環境中に生息する他の甲殻類か理区と比較し，有意（ ＜0 05，Dunnett 法による多らも WSSV が検出されること（Maeda

重比較検定）に低下した。ヨード区のふ化率は未処理

Momoyama

区と比較し有意差は認められなかった（Fig. 12）。こ

経路とされる共食いや水系感染による水平感染（Wu1998，, 2003），また WSSV の重要な感染ステージに対しヨード剤によ, 2001）の防止対策が確立されていないことから，る影響はないと考えられた。しかしながら，128細胞

WSD はクルマエビ養殖産業において未だ深刻な問題期におけるハンドリングの影響は，他のである。

れらのことから，このステージより大きいことが明らかになった。128 細胞期は，水温

Venegas（2000）は，WSD 生残クルマエビが時間後に到達するが，一般的な種苗生産

WSSV の再感染に対し抵抗性を示すこと，また本現現場では夜間産卵するクルマエビの採卵は朝行われる

象が実験的にも再現されることから，無脊椎動物であため，消毒時にはすでにこの時期は経過していて，実るエビ類に quasi-immune response （免疫様現象）

際には問題ないと考えられる。しかし，ハンドリングが存在することを報告した。また，感染耐過クルマエの影響を受け易いこの時期での消毒の実施は避けるべ

ビに認められた WSSV に対する抵抗性は，感染後きであると考えられた。

週間から認められ始め，約22℃で産卵ヨード剤は有効ヨウ素濃度5 mg/L で10分まではか月間持続すること（Wu

2002），本抵抗性にはある程度の特異性が認め

クルマエビ受精卵に毒性がないとする報告（桃山，られることが報告された（Venegas

1990）の他，有効ヨウ素濃度5 mg/L で分間の卵消らに，ホルマリン不活化 WSSV および大腸菌で発

2000）
。さ

毒で安全性を確認した報告（Mushiake

1999）

現した WSSV の主要構造タンパク質である rVP26おなどがあり，これらと本実験結果は大きく変わらない

よび rVP28を筋肉内接種することで，同様の抵抗性ことが確認された。受精卵に対する安全性が確認されが誘導されることも明らかにされた（Namikoshi

分間の消毒2003）。現在までに，クルマエビ科の white leg

処理により，本報における生菌数の減少率は，90％以

shrimp お よ び ウ シ エ ビ に も 同 様 の quasi-immune

上であり，殺菌効果が認められた。一方，WSSV は，

response が存在ことが明らかにされ，WSSV に対す

有効ヨウ素濃度2 5 mg/L で10分間（中野ら，1998）

るワクチン効果の検討が成されている（Witteveldt

た有効ヨウ素濃度2 5および5 0 mg/L でや2 5 mg/L 以上で0 2分以内，1 0 mg/L では

分以, 2004a, Witteveldt, 2004b, Witteveldt

内（桃山，谷村，2004）で不活化されると報告されて

2006, Vaseeharanおり，今回のヨード剤による安全な卵消毒条件はウイ

養殖エビにおける WSSV の感染経路としては，共食

ルスの不活化も期待できると考えられる。

いによる水平感染が重要であることが既に示されていこれらの結果からヨウ素の減衰が起こらないことがることから（Wu, 2006）。先にも述べた如く，

2001），経口ワクチンの可能クルマエビホワイトスポット病の防除対策
性が強く示唆される。そこで本研究では，まず大腸菌

g 同様の方法で投与するグループを設けた。経口接種

発現 WSSV rVP26および rVP28を用いた経口ワクチ試験に用いた WSD 死亡個体の筋肉は，注射および浸ンを作成し，その効果について筋肉内注射法，浸漬法

漬接種に用いた WSSV 磨砕液の作成源と同じものを

および経口法による感染実験を行い，比較検討した。

用いた。
⑶

1）ウイルス DNA 試料の調製．材料と方法⑴

VP26および VP28遺伝子のクローニングと発現供試クルマエビと WSSV 源の調製

野中ら（1998）の RNase-PEG 沈法により，WSSV

供試したクルマエビは，上浦庁舎で WSSV フリーに感染したクルマエビ組織から WSSV の DNA 抽出として種苗生産されたものを，また WSD の罹病歴の液を調製した。すなわち，WSD 病エビ組織約0 2 gない宮崎県の養殖場の種苗生産施設で生産された平均を300μ L のプロティナーゼ K（0 1 mg/mL）と SDS

体重4 0〜7 0g の個体を用い，事前に nested PCR（木（10 mg/mL）の混合液とともに磨砕した後，37℃で村ら，1996；野中ら，1998）にて WSSV 陰性である

15分間静置した。これに等量の TE 緩衝液（50 mMことを確認した。クルマエビは，二重底に施した砂敷

Tris-HCl, pH 8 0, 1mM EDTA）- 飽和フェノールを加きの水槽に収容し，電気分解による殺菌海水をかけ流え約して飼育し（24±1 8℃），市販の配合飼料をり平均体重の日当た％量で給餌した。

分間激しく攪拌した後，遠心分離（12,000× g，分間）を行って水層を回収した。再度フェノール抽出を行った後，等量のクロロホルム・イソアミルア

攻撃用に用いた WSSV 磨砕液の作製は，野中ら

ルコール（24:1）混液を加えて約分間激しく撹拌し（1998）に準じて行った。すなわち，WSD による瀕た。次いで，遠心分離（12 000× g，1min）を行って死個体の筋肉細胞を水層を回収し，1/10量の5M 酢酸アンモニア溶液およ

倍量の PBS（リン酸緩衝液；

Invitrogen）を加えて磨砕し，℃，3 000× g 10分

び2.5倍量の100% エタノールを加えて混合した後，遠間の遠心分離後の上清を回収したものを WSSV 源と心分離（12,000× g，15分間）により沈殿を得た。得ら

し，使用まで−85℃で保管した。

れた沈殿物を200μ l の RNase A 溶液（20μ g/μ L，⑵

クルマエビに対する WSSV の病原性試験

TE 溶液）に溶解し，37℃で20分間処理した。その2

供試エビは150L 水槽に47‑63尾 /m （底面積）の後，半量の20％ポリエチレングリコール（PEG‑6 000）

密 度 で 収 容 し， 筋 肉 注 射， 浸 漬 お よ び 経 口 に よ る‑2 5M NaCl 溶液を加えて撹拌し，遠心分離（12 000

WSSV の攻撃試験を行った。WSSV の接種後，供試

× g, 5 min）を行い，上澄み液を完全に除去した。さエビを14日間飼育し，累積死亡数を観察した。半数致らに，1.5mL の70％エタノールを加えて数秒間撹拌し死量（LD50）は，
Behrenes-Kärber 法により産出した。

た後，遠心分離（12,000× g, 2 min）を行い，上澄み

3

筋肉注射攻撃に用いる WSSV 源は PBS で10 倍か
7液を完全に除去し，1.5mL の100％エタノールを加えら 10 倍まで段階希釈した。筋肉注射による接種に供た。これを，遠心分離（12,000× g, 2 min）して上澄試するエビ（MBW 6.8 g, n = 15 ）は，15 ℃に冷却しみを除去し，得られた沈殿を室温で約10分間乾燥させ，た海水に1分間に浸漬し麻酔状態にした後，所定の濃20μ L の TE に懸濁して DNA 抽出液とした。なお，

度 に PBS で 希 釈 し た WSSV を100μ L/shrimp で 筋

遠心分離は全て室温で行った。

肉注射した（陰性対照：PBS）。浸漬接種試験では，
供試エビ（平均体重 4.4 g, n=20）は，WSSV を海水で10 3，10 4 および 10 5倍となるよう希釈した3L のウ
イルス液に外被タンパク質遺伝子クローニング用 PCR プ
ライマー
GenBank に 登 録 さ れ て い る WSSV VP26お よ び

時間浸漬した。陰性対照は，健康エビ

VP28タンパク質遺伝子の塩基配列（GenBank 登録番

3の磨砕液を10 に希釈した海水に同様に浸漬した。浸号：AF173992および AF173993）に基づき，VP26F（5漬攻撃が終了後，供試エビはネットに取り出し，清浄-GTA AAG GAA GAA CTT CCA TC-3 ），VP26R

な海水により分間の流水洗浄を行い，飼育水槽に再（5 -TAT ATT TGT ACA ATT CCC ACT TTA- 3 ）度収容した。経口接種試験では，供試エビ（平均体重および VP28F（5 -CAA GCA ACG TTC GAT AAA

3 1 g, n=15）に対して，WSD 死亡個体の筋肉を0 25

GA-3 ），VP28R（5 -GAA GGT TAA GTA GGTg，0 4 g，0 65 g および 1 02 g/shrimp で投与した。

CAA TAA-3 ）を作製した。

供試エビの平均体重の15％を上限として，

日当たり

上 記 プ ラ イ マ ー セ ッ ト VP26F-VP26R は，WSSVの投与量を決定し（≦0 47 g/shrimp），0 65 g およびVP26遺 伝 子 の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム

1 02 g 投与グループは日間に分けて投与を（ORF, nt 35-649）を含む670塩基を増幅標的とし，行った。対照として，健康なクルマエビの筋肉を1 02

VF28F-VP28R は VP28遺伝子の ORF（nt 33-647）をまたは

Jun SATOH
含む754塩基を標的とするものである。なお，増幅反社）を用い，定法に従い行い，自動シークエンサー

応の反応条件は，72℃ ‑10分間および95℃ ‑分間の（373A DNA シークエンサー , ABI 社）
により解析した。

分間

解析結果より，VP26および VP28遺伝子がクローニン

反応後，95℃ ‑を分間，55℃ ‑分間，72℃ ‑サイクルとし計30サイクル行った後，72℃ ‑分

グされていることが確認された（Fig. 13，14）。
4） rVP26および rVP28発現系の構築間とした。
3） VP26および VP28遺伝子のクローニング
VP26F-VP26R お よ び VF28F-VP28R を 用 い，

VP26遺伝子の発現用プライマーとして VP26F の5
端側に

I および

RI の認識配列を含む11塩基

WSSV DNA 試料から VP26および VP28遺伝子の増のリンカー配列（5 -aaagaattcat-3 ）を付加した計31幅産物を，付属のプロトコールに従いプラスミドベク

塩基長の VP26expF プライマー（5 -aaagaattcat-ATG

ター pCR-Script SK（+）（Stratagene）の

GAA TTT GGC AAC CTA AC-3 ） お よ び VP26R

I 部位へ挿入した後，大腸菌 DH5αコンピテント細胞を形質の5転換した。得られた形質転換菌はアンピシリンを含む

ー 配 列（5 -gctgtcgac-3 ） を 付 加 し た 計31塩 基 長

LB 寒天培地上で培養し，同培地上で青色コロニーをの VP26expR プ ラ イ マ ー（5 -gctgtcgac-TTA CTT

選択することで DNA 断片を有する組換え菌を選択しCTT CTT GAT TTC GTC C- 3 ）を作製した。また，た。

VP28遺伝子発現用プライマーとして，VP28F の5

ク ロ ー ニ ン グした遺伝子の塩基配列は， ダ イ タ

側に

端側に

I の認識配列を含む9塩基のリンカ

I および

端

RI の認識配列を含む11塩基のーミネーターサイクルシーケンシングキット（Dyeリンカー配列（5 -aaagaattcat-3 ）を付加した計34塩

primer thermal cycle sequence kit）
（ABI 社 ） お よ

基長の VP28expF プライマー（5 - aaagaattcat-ATG

び T3/T7ダイプライマー（T3/T7 dye primer）（ABI

GAT CTT TCT TTC ACT CTT TC - 3 ） お よ び

Fig. 13. Nucleotide sequence and amino acid sequence of structural protein (VP26) of WSDV. Primer sequences
underlined（̶̶），Green coloring indicate the nucleotide sequence of VP26 coded gene.

クルマエビホワイトスポット病の防除対策

Fig. 14. Nucleotide sequence and amino acid sequence of structural protein (VP28) of WSDV. Primer sequences
underlined（̶̶），Green coloring indicate the nucleotide sequence of VP28 coded gene.

VP28R の5端側に Sal I の認識配列を含む

塩基のリンカー配列（5 -gctgtcgac-3 ）を付加した計27塩基
長の VP28expR プライマー（5 - gctgtcgac-TTACTCGGTCTCAGTGCC- 3 ）を作製した。

rVP26および rVP28発現系を用いた rVP26および rVP28の発現
大 腸 菌 pET VP26お よ び pET VP28を LB-amp 液
体 培 地（1% bact-trypton, 0.5% bact-yeast extract,

VP26expF-VP26expR および VP28expF-VP28expR

1% NaCl，pH7.4，50μ g/mL ampicillin） を 用 い，を用い，WSSV VP26および VP28遺伝子を PCR 増幅

菌 体 濁 度（OD660） が0 5程 度 に な る ま で（ 約（72℃ ‑10 min, 95℃ ‑9 min, 30 cycles of 95℃ ‑1 min,間 ），37 ℃ で 振 と う 培 養 し た。 培 養 液 に 終 濃 度 が

55℃ ‑

分間，
72℃ ‑1 min, and 72℃ ‑5 min）した後，1mM と な る よ う IPTG（isopropyl − β − D（-）-

フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿

thiogalactopyranoside）を添加し，さらに37℃で3時により増幅産物を濃縮した。増幅産物は１% 低融点ア間培養することで標的遺伝子を発現させた。培養液

ガロースゲル電気泳動に供した後，GeneClean kit をを4℃で一晩静置し，遠心分離（930× g, 20min, 4℃）

用いて目的の DNA 断片を回収し，Iした後細胞を TE 緩衝液に懸濁し，Triton X-100およで処理した後，発現ベクター pET-25b（+）（Novagen）

びリゾチームを終濃度が0.1% および100 μ g/mL とのI 部位にライゲーションキット（タカなるよう添加し，30℃で15分間処理した。菌体懸濁ラバイオ社）を用いて組み込み，大腸菌 BL21のコン液を超音波破砕処理した後，遠心分離（12,000× g, 15

ピテント細胞の形質転換に用いた。得られた rVP26

min, 4℃）に供し，遠心分離後の沈殿物を rVP26およおよび rVP28遺伝子を発現する大腸菌株を各々 pET

び rVP28の発現タンパク質ワクチンとして15mL の

VP26および pET VP28株と呼ぶ。

PBS に懸濁した。

I‑

I および

時

Jun SATOH

Fig. 15. SDS-PAGE analysis of expressed proteins, rVP26
and rVP28 of WSSV. The proteins in the 12% gel were
stained with Coomassie brilliant blue.
lanes M : molecular marker, lanes 1 : rVP26, lanes 2 : rVP28.

rVP26および rVP28懸濁液は，SDS-PAGE 電気泳動

日，および PBS 配合飼料を各々 15日間投与した。

（Laemmli, 1970）に供した後，クマーシーブリリアン

経口ワクチン投与25日後，各供試エビをさらに4区

トブルー（CBB）で染色を施した。その結果，rVP26（n=12〜15）に分け，筋肉注射摂取，浸漬摂取およびおよび rVP28の分子量は，各々 25 5 kDa および27 8

経口摂取による WSSV の攻撃試験に供した（rVP26

kDa で，WSSV VP26および VP28の分子量と一致しおよび rVP28投与区は duplicate）。筋肉注射では，た。さらに，rVP26および rVP28の SDS-PAGE 電気

第泳 動 像 を 画 像 解 析 ソ フ ト（Image J：NIH :National

WSSV を100μ L/shrimp ずつ接種した。浸漬攻撃でInstitutes of Health，米国国立衛生研究所）により解は，WSSV を10−4に希釈した海水に析 し た 結 果，rVP26と rVP28の 純 度 は， 各 々 20 3%

口攻撃では WSD 死亡個体の筋肉を 0.6 g/ shrimp/

および30 8% であった（Fig. 15）。

日間 で投与した。これらの WSSV 攻撃量は，Table 8，

rVP26および rVP28の経口投与と WSSV によ
る攻撃試験

と第

腹 節 の 間 か ら，PBS で10−4 に 希 釈 し た
時間浸漬し，経Fig. 16に示した半数致死量から，ワクチン非投与区の累積死亡率が70％となる量である。

rVP26 あ る い は rVP28を 配 合 飼 料 の5 ％ 量 PBS

感染実験中，死亡個体は日に度回収し，これらに 懸 濁 し， 市 販 配 合 飼 料 に 添 加 し（Maruha Co.,

が WSSV の感染による死亡であることを確認するた，Ltd），混合撹拌後，配合飼料の0 5% 量の展着剤（SD

後に PCR に供するまで ‑30℃で保管した。

Tenchaku 1 Gou, Schering - Plough Animal Health

有意差検定および相対生残率k.k.）を添加し乾燥させ，クルマエビの経口ワクチン

各試験区の累積死亡率は，χ2検定による有意差検として使用した。rVP26 および rVP28懸濁液の配合定を行った（5% 水準）。期待度数が

飼料添加量は，

合は，Fisher の直接確率計算法で検定を行った。

%（W/W）とした。

供試クルマエビ（平均体重 6 8g）を以下となる場

試験区に分

相対生残率（relative percent survival RPS）は，計け（n=150），rVP26あるいは rVP28添加飼料を35μ

算式 1- ワクチン投与区の累積死亡率 / 非投与対照区

g/g shrimp/ 日（rVP 濃度：10μ g/g shrimp/ 日）ずつ，の累積死亡率）× 100）
（Amend, 1981）により算出しまた E. coli タンパク質添加飼料を25μ g/g shrimp/

た。

クルマエビホワイトスポット病の防除対策

Fig. 16. Cumulative mortality of kuruma shrimp after experimental WSSV
challenge by three routes. (A) IM challenge with 0.1 ml of diluted WSSV
solution, (B) Immersion challenge with diluted WSSV solution, and (C) Oral
challenge with WSD shrimp muscle.

Jun SATOH
．結
⑴

果

⑵

クルマエビに対する WSSV の病原性

rVP26および rVP28経口投与による WSSV に対する防御効果

WSD 罹病エビ筋肉およびその磨砕液の希釈液をWSSV rVP26および rVP28を経口投与したクルマ

用い，筋肉内注射，浸漬および経口的に WSSV 攻撃

エビに対し，対照区の累積死亡率が70% となるようを行い，各攻撃法における WSSV の病原性についてな WSSV 量で経口，浸漬および筋肉内接種攻撃した

検討した結果を図16に示した。まず，WSSV 原液の場合の死亡率の変化を Fig.17に示した。経口攻撃区で5.0

10 倍希釈液を筋肉内接種した区では，ウイルス攻撃

は，rVP26および rVP28を投与したクルマエビに死亡の翌日から死亡が認められ始め，飼育は認められなかったが，大腸菌タンパク質を投与区なに累積死亡率は80% に達した。10内接種した区では，攻撃後

6.0

週間後まで

倍希釈液を筋肉日目から死亡が認められらびに対照区では攻撃日後ないし日後から死亡が始まり，累積死亡率は各々 31% および67% であった

始め，累積死亡率は73％であった。これに対し，107.0（Fig. 17-A）。浸漬攻撃区では，攻撃後倍希釈液を筋肉内接種した区では，攻撃後

日後から

日目に

日後に死亡が認められ始め，rVP26，rVP28，大腸菌

尾が死亡したが，その後の死亡は認められず，累タンパク質投与区および対照区の累積死亡率は，各々積死亡率は6 7％であった（Fig. 16-A）。以上の結果よ21%，22%，57% お よ び73% で あ っ た（Fig. 17-B）。

り，供試 WSSV 磨砕液の半数致死量（LD50）は10‑7.0

一方，筋肉内接種攻撃区では，攻撃後日目から死

mL/shrimp と算出された（Table 8）。同 WSSV 原液

亡がはじまり，rVP26，rVP28，大腸菌タンパク質投の10 3.0，10 4.0および105.0倍希釈液を用いた浸漬攻撃で与区および対照区の累積死亡率は，各々 31%，52%，

3.0

は，10

4.0

および10 倍希釈液攻撃区で，攻撃後〜日目から死亡がはじまり，各々の累積死亡率は85%
5.0

93% および79% であった（Fig. 17-C）。なお，WSSV
非攻撃区における死亡は，認められなかった。

および30% であった。これに対し，10 倍希釈液攻撃

経口ワクチンを投与したクルマエビを，経口，浸漬，区では死亡は認められなかった（Fig. 16-B）。したが筋肉内注射により WSSV 攻撃し，死亡および生残しって，供試 WSSV 磨砕液の浸漬攻撃における LD50はた個体からの PCR による WSSV 検出結果を Table 9

10

‑3.7

mL と算出された（Table 8）。上記実験に用いたに示した。非投与対照区（PBS 区）における全ての

WSSV 源と同じ WSD 罹病エビ筋肉を0.25 g/ 尾，0 40

死亡個体から1step PCR で WSSV が検出され，生残g/ 尾，0 65 g/ 尾および1 02 g/ 尾ずつ経口投与した個体でも66 7％以上から nested PCR で WSSV が検出

攻撃区での累積死亡率は，各々 15%, 67%, 87% およされた。rVP26および rVP28投与群の生残個体からは，

び93% で，本罹病エビ筋肉の LD 50は，0 37 g/shrimp

33‑60％が1step PCR で，73.3‑100％が nested PCR でと算出された（Fig. 16-C，Table 8）。なお，何れの攻WSSV 遺伝子が検出された。しかし，rVPs 投与個体

撃法においても，対照区での死亡は認められなかった。

の攻撃試験後の生残個体は，経口攻撃の生残個体の一部（≦10％の陽性率）から nested PCR で WSSV 陽性となったものの，ほとんどの個体は WSSV 陰性で

Table 8. Virulence of WSSV in kuruma shrimp challenged by intramuscular,
immersion and oral routes

クルマエビホワイトスポット病の防除対策

Fig. 17. Cumulative mortality of kuruma shrimp vaccinated orally with
WSSV rVP26 or rVP28 and challenged with WSSV by. (A) Oral challenge, (B)Immersion challenge, and (C) IM challenge.

Jun SATOH
Table 9. PCR detection of WSSV in orally vaccinated shrimp after experimental challenge with WSSV by oral,
immersion, and IM routes

あった。すなわち，rVPs 投与個体群の生残エビにおける WSSV 陽性率は，非投与群に比べ有意に低いことが確認された。

ことが明らかになった（Table 7）。Escobedo-Bonilla.（2005, 2006）は，WSSV の 攻 撃 量 の 標 準 化 を行い，経口法により筋肉注射法と同程度の累積死亡

以上の結果から，rVP26，rVP28および大腸菌タンを誘導するためには，10倍の WSSV が必要であるこ

パク質投与区の RPS を算出した結果，rVP26経口投とを報告している。しかし，本実験結果では，経口

与し，経口，浸漬および筋肉注射により攻撃した区の感染と筋肉注射感染の効率の差は，10 7.3倍であり，

RPS は各々 100%，71% および61%，一方 rVP28投与

Escobedo-Bonilla

区では，100%（経口），70％（浸漬）および34％（筋異なっていた。半数致死に必要な WSSV 量は，実験肉注射）となった。rVPS の経口投与群の RPS 値は，供試種あるいはウイルス株により異なる可能性があ

rVP28投与区の筋肉注射攻撃（34％）を除けば，全てるが，何れにせよ経口法による感染効率が他の攻撃60% 以上であった。一方，大腸菌タンパク質投与区法に比べ明らかに低いことが改めて確認された。Wuの RPS（%）は，経口攻撃区で54% であったが，浸漬（2001）および Momoyama and Muroga（2005）

および筋肉注射攻撃では各々 22% および0% と，累積は，クルマエビの飼育密度の軽減，あるいは共食いの死亡率でも rVP26および rVP28投与群とは有意に低阻止により WSD による累積死亡率が大幅に軽減するいことが確認された（Table 9）。

ことを明らかにし，さらに WSSV の感染経路として（2005, 2006）の結果と大きく共食いが重要な要因であることを指摘した。すなわち，．考察

経口感染における WSSV の感染効率は極めて低いが，本研究では，WSSV rVP26および rVP28を用いた

罹病エビ筋肉を摂餌することで大量の WSSV が体内

経口ワクチンの開発を目的に，まず筋肉内接種，浸に取り込まれ，結果的に累積死亡率に大きく影響する

漬および経口投与攻撃による WSSV の病原性についのではないかと考えられる。本実験においても，共食て検討した。各攻撃法での LD50は10
10

‑3.7

‑7.0

mL/shrimp,

いが頻発していたことを確認しており，共食いが累積

mL/shrimp お よ び0 37 g/shrimp と 算 出 さ れ

死亡率に影響した可能性が高い。共食いによる経口感た（Table 7）。各攻撃法に用いた WSSV 源は，何れ染の影響を排除するためには，Wu

も同一ロットの罹病エビ筋肉から調製したものであった個別飼育実験法が不可欠である。しかし，本研究ることから，各攻撃法の LD 50を罹病エビ筋肉量に換の目的は，WSSV rVPs を経口投与したエビの防御効算したところ，筋肉注射攻撃では10‑7.7 g 筋肉組織

果の検討であり，エビ養殖場では共食いが頻発するこ‑4.4（2001）が行/shrimp，浸漬では10g 筋肉組織 /shrimp，およびとを考え合わせると，養殖現場に近い飼育環境下で効‑0.4

g 筋肉組織 /shrimp となり，果判定を行う必要があると考え，本研究ではあえて集経口攻撃法では10

経口感染では浸漬攻撃の10 4.0倍量，筋肉注射感染の10

7.3

倍量の WSSV が必要となり，経口感染による感染効率は，浸漬感染と筋肉注射に比較して大幅に低い

約的飼育法により感染実験を行うこととした。
と こ ろ で Namikoshi（2004）は，WSSV

rVP26，rVP28およびホルマリン不活化 WSSV をククルマエビホワイトスポット病の防除対策
ルマエビに筋肉内接種することで，また Wittevedt

WSSV に対する感染防御効果が誘導されることを報（2004b, 2006）は，rVP28をウシエビおよび White

告している。本実験結果では，rVP26あるいは rVP28

leg shrimp に 経 口 投 与 す る こ と で，WSSV に 対 すを経口投与したクルマエビが，浸漬感染あるいは筋肉る感染防御効果が誘導されることを報告している。

注射感染よりはるかに多量（Table 8）の WSSV が接しかし，Namikoshi（2004）ではワクチンを筋種された経口攻撃に対してもまた十分な防御効果を示

肉内接種し，筋肉内注射による攻撃を行っており，

し，さらに経口攻撃試験における RPS 値が浸漬攻撃

Wittevedt

あるいは筋肉注射攻撃での RPS を上回っていた。こ（2004b, 2006）は，ワクチンを経口投与して，浸漬攻撃による効果をみたものであり，ワクの結果は，Wu（2001）および Momoyama and

チンを経口投与したエビの経口攻撃による効果判定をMuroga（2005）が指摘した「共食いによる WSSV の行った報告はみあたらない。

経口感染」の重要性を強く支持するものであり，さら先に示した如く，共食いは WSSV の感染経路としに rVP26および rVP28の経口投与によりクルマエビて重要であることから，経口ワクチンエビの経口攻撃

養殖場で危惧される「共食いによる WSSV の水平的による検証が必要であると考え，本研究では rVP26，

伝播」を阻止できる可能性を示唆するものと考える。

rVP28および大腸菌タンパク質を経口投与し，経口攻

本実験では，Fig. 15に示すように rVPs に撃に加え，浸漬および筋肉内接種で攻撃し，各攻撃

ンパク質が含有したため，法における経口ワクチンの効果を比較検討した。ま一つとして準備したところ，その RPS は経口攻撃

ず，各攻撃法実験対照区におけるクルマエビの累積死で54％，浸漬攻撃で22％と，低いレベルではあるも亡率が各々 67〜79% であったことから，各攻撃法にのの WSSV に対する防御効果が認められた（Table

おける WSSV 量が適切であったと考えられた（Table9）。Itami

10）。一方，このような攻撃強度でも rVP26あるいStritunyalucksana

は rVP28を経口投与したクルマエビの経口攻撃でのパク質を投与することで，エビの生体防御能が賦活化

RPS は何れも100% で，同エビを浸漬攻撃した場合にされ，WSSV に対しても抵抗性を示す，いわゆる免おいても，RPS はいずれも70% 以上となり，十分な

疫賦活効果を報告している。本実験結果で認められた防御効果が認められた。さらに，経口ワクチン区と非タ

投与区を対照群の（1998），Cheng（2005）および（1999）は，

由来タン

由来タンパク質を投与区の WSSV に対する防投与区の WSSV 陽性率の明らかな違いが確認された

御能は，Itami（Table 9）。したがって，rVP26および rVP28の経口

よび Stritunyalucksana

投与は，WSSV の経口感染に対しても十分な防御効

活効果に起因したのもであると推察している。

果を誘導できることが確認できた。特に，rVP26ある（1998），Cheng

ところで，Wu（2005）お（1999）の示した免疫賦（2002）は，WSSV 感染体過エ

いは rVP28を経口投与したクルマエビに対し，注射

ビの WSSV に対する抵抗性は，感染後週間後から攻撃をした時の RPS は，各々 61% および34% であり，誘導され，その後，約か月間持続することを報告しその感染防御効果は経口あるいは浸漬攻撃法で認めらているが，Namikoshi（2004）は，ホルマリン不れた効果に比べ低かった（Table 9）。Namikoshi

活化 WSSV を筋肉内接種により誘導された防御効果（2004）は，rVP26，rVP28を筋肉内接種することでが自然感染による防御効果ほど長期間持続しないこと

Table 10. Protection against WSSV challenge by oral, immersion, and IM routes in kuruma shrimp vaccinatedorally with rVP26 and rVP28.

Jun SATOHを報告している。本研究で，rVP26および rVP28を経口投与することで，十分な感染防御効果が誘導可能で合飼料を毎日〜回給餌した。

攻撃試験に用いる WSSV 液の調整は，第章に記あることが明らかになったが，本感染防御効果の誘導した方法で行った。すなわち，WSD 罹病クルマエビ開始時期ならびに持続期間については，重要な課題で

の筋肉を

あり，第

g, 10 min, 4℃）により得た上清を回収し，WSSV 源

章にて別途検討した。

倍量の PBS で磨砕し，遠心分離（3 000×として使用するまで ‑85℃に保存した。
第章

WSSV rVP26および rVP28を経口投与した⑵

WSSV rVP26および rVP28含有配合飼料の調クルマエビの WSSV に対する感染防御能の持続期間と特異性

製
WSSV の rVP26お よ び rVP28の 発 現 お よ び rVPs
含有配合飼料の調製は，第．目的章に示した方法と同様に行った。すなわち，pET-VP26あるいは pET-VP28でWSSV に 自 然 感 染 し 生 き 残 っ た ク ル マ エ ビ が形質転換した大腸菌を LB-Amp 液体培地に接種し，

WSSV に対する再感染に抵抗性を示すこと，その抵37℃で時間振とう培養し，濁度（OD660）が0 5程度に抗性が感染後か月間持続達したところで，遠心分離により大腸菌を回収し，1することから，無脊椎動物であるクルマエビの免疫様

mMIPTG 含 LB - Amp 液体培地に再懸濁し，37 ℃で週間から認められ始め約現象の存在が明らかにされた（Venegas

2000；

時間振とう培養した。大腸菌細胞を遠心分離（930, 2002）。また，本免疫様現象は，WSSV の× g, 10分，4℃）により回収し，Triton X-100で処理

構造タンパク質を大腸菌で発現させた rVPs を筋肉した後，超音波処理により核酸を破壊し，さらに遠心接種することでも誘導可能であることが確認され，分離（12,000× g，15分，4℃）により rVPs を回収し

WSSV に対するワクチン開発の可能性が示唆されたた。rVPs を PBS に懸濁した後，市販配合飼料と1：（Namikoshi

Wu

2004）
。さらに，第3章において，19の割合で混合，攪拌し，さらに配合飼料に対して0 5

rVPs を経口投与したクルマエビは，WSSV による経％量の展着剤（武田シェリング・アニマルヘルス）を口，浸漬および筋肉内接種攻撃に対し十分な抵抗性

加え乾燥させることで，rVPs 含有配合飼料を調製しを示すことが明らかになり，実用的な「WSSV 経口

た。

ワクチン」の開発が具体化されつつある。WSSV の⑶

rVPs を用いた経口ワクチンの効果については，ウシ
エビ，ホワイトレッグシュリンプでも実証されている

rVP26および rVP28の経口投与と WSSV による攻撃試験

実験Ⅰ．WSSV に対する感染防御効果の発現時期および持続期間（Witteveldt, 2004a；Witteveldt, 2004b；

Witteveldt

2006；Vaseeharan2006）。しクルマエビ780尾（平均体重 92±34 mg）を210 L

かしながら，rVPs を経口投与したエビの WSSV に対容量の FRP 製水槽に収容し，rVP26および rVP28をする防御効果の持続期間については，ほとんど明らか

10μ g/g shrimp/ 日，大腸菌タンパク質（投与対照区）にされていない。

を25μ g/g shrimp/ 日，PBS（非投与対照区）を含む

そこで本章では，WSSV rVP26および rVP28を経配合飼料を1日当たり体重の20 ％量の給餌率で，15日口投与したクルマエビを経時的に WSSV 攻撃するこ間連続して経口投与した。Table 11のスケジュールにとで，経口ワクチンによる防御効果の発現時期および従い，投与開始から29，36，45，55，75，106，112，

持続期間について検討するとともに，rVPs 経口ワク

119，126および135日目に WSSV による攻撃試験を行チンの追加投与効果について検討した。

い，それぞれの累積死亡率から RPS を算出した。なお，
WSSV による攻撃は，全て浸漬法で行った。すなわち，．材料と方法

20〜25尾のエビをバケツに収容し，対照区の累積死亡⑴

率がおおよそ70％となるように調整した WSSV 攻撃

供試クルマエビと接種 WSSV

宮 崎 県 の 養 殖場の種苗生産施設で飼育さ れ た，液（WSSV 液を海水で104.0倍希釈）に1時間浸漬した。

WSD 感染履歴のないクルマエビ（平均体重0.08-0.09g）

浸漬後，クルマエビを清浄な海水により流水洗浄し，を，予め nested PCR（Kimura

1996）で WSSV

150 L 容の二重底仕様の FRP 製水槽に収容した。攻陰性であることを確認した後，実験に供した。供試エ

撃後30日間にわたり，各区の累積死亡の推移を観察し，ビは，二重底の上面に砂を敷き詰めた FRP 製の水槽

また死亡個体は毎日を用い，電解処理海水（0 3 mg/L, 23±1℃）を脱塩

る死亡であることを PCR により確認するためで -30℃

素処理をして飼育し，体重のに保存した。

〜20％に当たる市販配度回収し，WSSV の感染によクルマエビホワイトスポット病の防除対策
実験Ⅱ．rVPs 経口ワクチンの追加投与効果

22および31日目）に，各区より20〜25尾ずつ新たな水実 験 I で rVP26，rVP28， 大 腸 菌 タ ン パ ク 質， あ

槽に移し，実験Ⅱと同様の方法で WSSV による攻撃

るいは PBS を経口投与した各区クルマエビを本実を行った。

験にも供した。初回ワクチン投与により誘導された

実験Ⅳ．感染防御効果の特異性

WSSV に対する感染防御能が半減した時期，すなわ

次に新たなクルマエビ飼育群（平均体重0 08g）をち初回投与から75日目に各ワクチン投与区のクルマ

210 L 容 FRP 製水槽

エビを65尾ずつ150 L 容量の FRP 製水槽と同様 rVP26，rVP28あるいは PBS を含む配合飼料

つに分槽

つに500尾ずつ収容し，実験 I

し，初回投与と同じタンパク質を含む配合飼料をを15日間給餌した。ワクチン投与量および投与法は，

日間追加投与した。投与量は，rVP26および rVP28

全て実験は10μg/g shrimp/ 日，大腸菌タンパク質は25μg/g

45，55および106日後に，各区より20〜25尾を新たなshrimp/ 日とした初回経口投与から106および135日後水槽に分槽し，実験Ⅰと同様に WSSV 攻撃試験を実に，各試験区から20尾を新たな水槽に移し，実験 I と施し，初回投与による WSSV に対する感染防御能が同様の手順で WSSV による攻撃を行った。

一度上昇した後，減衰したことを確認した。さらに，と同様に行った。初回投与開始から35，

実験Ⅲ．感染防御効果の免疫様記憶

初回投与開始から106日目に，初回 rVP26投与群から

実 験 I で rVP26，rVP28， 大 腸 菌 タ ン パ ク 質， あ

210 L 容 FRP 水槽につに60尾ずつ分槽し，一方にるいは PBS を経口投与した各区のクルマエビを本実は rVP26含配合飼料を（rVP26-rVP26区），他方には験にも供した。初回ワクチン投与により誘導された

rVP28含配合飼料（rVP26-rVP28区）を各々WSSV に対する感染防御能が完全に消失した時期，追加投与した。同様に，初回 rVP28投与群からも60すなわち初回投与から104日後に，各ワクチン投与区

尾ずつをより各々 100尾のクルマエビを210 L 容量の FRP 製水を（rVP28-rVP26区），他方には rVP28含配合飼料を槽4つにそれぞれ分槽し，初回投与と同じタンパク質（rVP28-rVP28区）を各々を含む配合飼料を日間追加投与した。初回投与から対照として，初回 PBS 含配合飼料投与群より60尾を112，119，126および135日目（追加投与から8，15，

分槽し，PBS 含配合飼料を追加投与した。さらに，

日間水槽に分槽し，一方に rVP26含配合飼料
日間追加投与した。なお，

Table 11. Cumulative mortality and relative percentage survival (RPS) in kuruma shrimp vaccinated with
WSSV rVP26, rVP28 andproteins by WSSV challenge at different times after the initial vaccination

Jun SATOH

Fig. 18. Time-dependent changes of relative percent of survivor (RPS) against
WSSV challenge in kuruma shrimp vaccinated with WSSV rVP26, rVP28 orproteins.

初回投与から113日目に，各区から20尾ずつ新たな水．結槽に分槽し，実験 I と同様の手順で WSSV による攻実験Ⅰ．WSSV に対する感染防御効果の発現およ

撃試験を行い，各ワクチン投与区の累積死亡率の推移
を30日間観察した。
⑷

法で行った。

び持続期間
rVP26，rVP28，大腸菌タンパク質および PBS を有意差検定および相対生残率

有意差検定および相対生残率は，第果

経口投与したクルマエビを WSSV で攻撃した際の累章と同様の方

積死亡率を Table 11に，また rVP26，rVP28および
大腸菌タンパク質投与区の PBS 投与区に対する相対
生残率（RPS）を Table 11および Fig. 18に示した。
rVP26投与区の WSSV に対する感染防御能は，初回 投 与36日 目 か ら 認 め ら れ，45日 目 に 最 高 値（100クルマエビホワイトスポット病の防除対策％，累積死亡率0％， ＜0 01）に達し，その後減衰

完全に消失した時期，すなわち初回投与から104〜108

し75日目まで持続したが，106日目以降では WSSV に

目日に実験 II と同様に追加免疫を行い，追加投与に対する防御能は全く認められなかった。rVP28投与区

よる感染防御能の変化を表10および図15に示した。

では，初回投与から55日目に認められると同時に最rVP26を追加投与した区では，112日目（追加投与

高値（93%, 累積死亡率5%,＜0 01）に達し，その後日目）および119日目（追加投与15日目）の攻撃で感rVP26投与区と同様の経過が観察された。一方，大腸

染防御能は認められなかったが，126日目（追加投与

菌タンパク質投与区では，初回投与から36日目に認め

22日目）の攻撃では RPS が57%（累積死亡率30%）とら始めると同時に最高値（71%, 累積死亡率28%,＜

なり，比較的高い感染防御能が認められた。しかし，

0 01）に達し，55日目まで持続したが，75日目以降で135日目（追加投与31日目）の攻撃では，RPS は24%

は防御反応を観察できなかった。なお，PBS 含配合（累積死亡率65%）となり，感染防御能は126日に比べ飼料投与区での累積死亡率は，106日目の攻撃試験で減衰していた。

60% と若干低かったものの，その他の攻撃試験では

rVP28を追加投与した区では，112日目（追加投与70‑96％と安定していた。

日目）の攻撃で感染防御能は認められなかったが，これらの結果から，rVP26投与区の感染防御能のピ

119日目（追加投与15日目）の攻撃で感染防御能が認ークは，rVP28投与区に比べ若干早いことが明らかにめられ始め（RPS: 24%），さらに126日目（追加投与なった。また，大腸菌投与区でも WSSV に対する感22日目）の攻撃では RPS が93%（累積死亡率5%）と染防御能が認められたが，そのピークは rVP26あるなり，高い感染防御能が認められた。しかし，135日

いは rVP28投与区に比べさらに早い時期に認められ目（追加投与31日目）の攻撃では，感染防御能は消失た（Fig. 18-A）。また，rVP26あるいは rVP28を15日していた。

間経口投与した際に誘導される WSSV 感染防御能は，大腸菌追加投与区では，112〜135日目の攻撃で何れ

30〜40日程度しか持続しないことが明らかになった。

も RPS は0% で，追加投与による WSSV に対する感実験Ⅱ．経口ワクチンの追加投与効果

染防御能は認められなかった。なお，PBS 追加投与

rVP26を投与したクルマエビに初回投与から75日目

区の累積死亡率は，何れも65% 以上であった。

に rVP26を日間追加投与し，初回投与から106日お実験Ⅳ．感染防御効果の特異性よび135日目に WSSV で攻撃した結果，106日目に高rVP26あるいは rVP28を経口投与し，さらに同種あい感染防御能（RPS: 80%, 累積死亡率 :15%）が認めら

るいは異種タンパク質を追加投与した場合の WSSVれたが，135日目には感染防御能は認められなかった

感染防御能の推移を Table 12に示した。まず，rVP26（RPS: 0%, 累 積 死 亡 率 : 76%）
（Table 11, Fig. 18）。

あるいは rVP28を経口投与し35日，45日，55日およrVP28を投与したエビに rVP28を追加投与した場合でび106日目に WSSV により攻撃を行ったところ，35

も同様に，
106日目に感染防御能が認められたが（RPS:日および45日目の攻撃では感染防御能は認められな40%, 累積死亡率 : 45%）
，135日目には認められなかかったが，55日目の攻撃で WSSV 感染防御能が上昇っ た（RPS: 0%, 累 積 死 亡 率 : 79%）
（Table 11, Fig.

し（rVP26投与区の RPS: 72%，rVP28投与区の RPS:

18）
。rVP26あるいは rVP28を追加投与した区で106日59%），さらに106日目の攻撃では感染防御能が減衰あ目に認められた感染防御能は，追加投与前（実験 I 区

るいは消失していた。

75日目）および非追加投与区（実験 I 区106日目）と次いで，初回投与106〜112日目に初回投与ワクチン

比べ明らかに高く，追加投与により WSSV 感染防御と同種あるいは異種タンパク質を追加投与し，初回投能が上昇することが明らかになった。しかしながら，

与から113日目（追加投与

各追加投与により上昇した感染防御能は，初回投与よった。その結果，rVP26投与区に rVP26を追加投与しり135日目（追加投与より60日目）には完全に消失した場合（rVP26-rVP26）の RPS は100% であったのにていた。一方，大腸菌タンパク質を初回および追加投対し，同区 rVP28を追加投与した場合（rVP26-rVP28）

与したクルマエビでは，106日目および135日目の累積の RPS は33% で， 同 種 抗 原 を 追 加 投 与 し た 場 合

死亡率は，75%（RPS: 0%）および71%（RPS: 0%）との RPS は異種抗原を投与した場合に比べ明らかになり，追加投与による感染防御能の上昇は認められな

高 か っ た。 ま た，rVP26-rVP26区 の RPS は 追 加 投

かった。なお，PBS 追加投与区の累積死亡率は，何与直前の RPS（21%）に比べ明らかに高かったが，れも71% 以上であった。

rVP26-rVP28区と追加投与直前の RPS に有意な差異日目）に WSSV 攻撃を行実験Ⅲ．感染防御効果の免疫様記憶は認められなかった。一方，rVP28投与区に rVP26あ初回ワクチン投与により誘導された感染防御能がるいは rVP28を追加投与した場合，rVP28-rVP26およJun SATOH
Table 12. Booster effect of homologous and heterologous rVPs in shrimp phylaxis induced by oral vaccination
with recombinant WSSV proteins, rVP26 and rVP28

び rVP28-rVP28の RPS は，各々 42% および67% で，5g のホワイトレッグシュリンプでも同様に，投与後先と同様に同種ワクチンを追加投与により誘導された

日目に高い防御反応が観察されている（Witteveld

感染防御能の方が，異種ワクチンを追加投与に比べ高, 2006）。この様に，rVPs 経口投与により誘導さいことが明らかになった。さらに，rVP26追加投与区

れる感染防御能の時期は，クルマエビとその他のエビである rVP26-rVP26区（RPS: 100%）と rVP28-rVP26

類では大きく異なるように見えるが，実際には，供試区（RPS: 42%）を比較した場合，同じ rVP26を追加

エビの種類のみでなく，体重，接種抗原の種類，接種投与したにもかかわらず同種ワクチン投与区の RPS

方法あるいは飼育水温等の条件が実験結果に大きく影が異種ワクチン投与区の RPS の倍以上高いもので響すると考えられる。特に体重は，防御反応の誘導時あった。逆に，rVP28追加投与区で比較しても同様期に影響する最も重要な要因の一つであると考えていに，rVP28-rVP26区（RPS: 33%） の 感 染 防 御 能 は，る。なぜなら，予備的な実験ではあるが，平均体重0 1

rVP28-rVP28区（RPS: 67%）に比べg，0 8 g および2 5 g のクルマエビに rVP26を経口投倍以上高かった。

与した場合，0 1 g および0 8 g のエビでは rVP26投．考察

与後45日目まで感染防御能が認められなかったが，0 8

実験Ⅰの結果から，rVPs をクルマエビに経口投与

g のエビでは投与後36日で検出され，サイズの大きいした場合，WSSV に対する感染防御能は，投与45-55

エビの方が速やかに感染防御能が出現する傾向が認め

日目に出現し，その後20〜30日間維持されることが明られている。

らかになった（Fig. 18-A，
B）。Namikoshi（2004）

実験Ⅰにおいて，rVPs の経口投与による防御効果

は，rVPs をクルマエビに筋肉注射投与した場合，の持続期間は20〜30日間であり，感染耐過エビに比べ

WSSV に対する抵抗性は接種30日目以降に確認され短いことが明らかになり，養殖現場での rVPs 経口ワることを報告している。また，WSSV 感染体過エビクチン使用を想定した場合，大きな課題が残された。

の場合では，WSSV に対する抵抗性は感染後週目

そこで，実験Ⅱでは，rVPs の追加投与により感染防か月間持続されたとしている

御効果への影響を検証した。実験 II では，rVPs 初回

2002）。したがって，クルマエビの場合は，投与による WSSV 感染防御能のピークが過ぎ減衰しワクチンの投与方法にかかわらず，WSSV 感染防御

たものの，まだ防御能が残存する時期，初回投与75〜能の誘導に約20〜30日程度必要であると考えられる。

81日目に追加投与を行った（Table 11，実験Ⅰ，75日）。

しかし，rVPs により誘導された感染防御能の持続期

その結果，初回投与後106日目の攻撃試験で，非追加から出現し，その後約（Wu

間は，感染耐過エビで認められた防御能に比べ明らか

投与区に比べ明らかに高い感染防御能が確認されたに短いことが示唆された。一方，ウシエビに rVP28（Table 11）。本感染防御能は，追加投与直前の感染防を経口投与した場合，投与後日目に最も高い防御御能と比較しても明らかに高かったことから（Table

効果が確認され（Witteveldt, 2004），また体重11），rVPs を追加投与することで WSSV 感染防御能クルマエビホワイトスポット病の防除対策を維持することが可能であると考えられる。しかし

応に類似した感染防御機構が備わっている可能性を示ながら，初回投与から135日目（追加投与より60日目）

唆する結果であると考えられる。

に行った WSSV 攻撃試験において，rVPs 追加投与区

そ こ で 実 験 IV で は，rVPs 投 与 に よ り 誘 導 さ れのエビに WSSV 感染防御能が認められなかったこと

る WSSV 感染防御能の特異性について検討するたから，追加投与により WSSV 感染防御能の持続期間

めに，初回投与と同種あるいは異種の rVPs を追加を延ばすことが可能であるが，追加投与により延びる

投与した場合の感染防御能の変化について検討した

持続期間は比較短く，WSSV 感染防御能を維持し続（Table 12）。その結果，同種 rVPs を追加投与した

けるためには少なくとも30〜40日毎に rVPs を追加投場 合（rVP26-rVP26お よ び rVP26-rVP26） の RPS

与する必要があると考えられる。

は， 異 種 rVPs を 追 加 投 与 し た 場 合（rVP26-rVP28

実験Ⅲでは，rVPs の初回投与により誘導されたおよび rVP28-rVP26）に比べ明らかに高く，また追WSSV 感染防御能が完全に消失した時期，すなわち加投与直前と比べても感染防御能が亢進しているこ

初回投与から104〜108日目に rVPs を追加投与し，感とが明らかになった。さらに，rVP26追加投与区で染防御能の推移を観察した。その結果，rVPs を追加

あ る rVP26-rVP26区（RPS: 100%） と rVP28-rVP26

投与した区では，追加投与直後（初回投与112日目，

区（RPS: 42%）とを，また rVP26追加投与区である追加投与8日目）の攻撃で感染防御能は認められなか

rVP26-rVP28区（RPS: 33%）と rVP28-rVP28区（RPS:

ったが，119〜126日目（追加投与12‑15日目）の攻撃

67%）とを比較した場合，同じ rVP26あるいは rVP28

で高い感染防御能（rVP26追加投与 : 57%, rVP28追加を追加投与したにもかかわらず同種ワクチン投与区

投与 : 93%）が認められた。しかしながら，135日目の RPS が異種ワクチン投与区の2倍以上高いことが（追加投与31日目）の攻撃で，WSSV 感染防御能が既明らかになった。一方，予備的に行った試験では，に大幅に減衰あるいは消失していることが明らかにな

WSSV 感染防御能を誘導されたクルマエビは，ビブった（Fig. 18）。残念ながら，初回非投与群を設けてリオ感染に対する防御能を示さなかったこと，WSSV

いなかったことから，rVPs 追加投与による感染防御

感染防御能を誘導されたクルマエビの血リンパ上清能の出現時期について正確に比較することは出来ない

中には，WSSV を中和する活性が認められること，が，追加投与による感染防御の誘導（約12〜15日前後）

さらに本血リンパ液は他の魚類病原ウイルスであるは初回投与（約30日前後）に比べ速い可能性が示唆さ

infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV），れた。また，先にも述べた如く，追加投与による感染

viral hemorrhagic septicemia virus（VHSV）および防御能の持続期間は，初回投与あるいは感染耐過エビ

infectious pancreatic necrosis virus（IPNV）を 中 和に比べ，明らかに短いことが再確認された。

することができなかった（Wu, 2003 博士論文）＊5。

ところで，Namikoshi（2004）は，クルマエ

これらの結果は，クルマエビが rVP26と rVP28を異

ビに rPVs を筋肉内注射により追加投与することで，なるタンパク質として認識している可能性を示唆する

WSSV に対する感染防御能が亢進することを報告しものであり，さらに先の実験では明らかにできなかっている。本実験結果では，初回投与による感染防御能た同種 rVP を追加投与することで，WSSV 感染防御が RPS 93% 以上と高かったこともあり，残念ながら

能が亢進されることを示す結果であると考える。すな

追加投与により感染防御能の亢進は認められなかった

わち，クルマエビも，抗体こそ持たないが，脊椎動物

が，追加投与による感染防御の誘導が速まる傾向が認の免疫に相当する生体防御機構を備えている可能性がめられた。これらの現象は，脊椎動物における免疫のあると考える。

二次応答に極めて類似した現象である。無脊椎動物でと こ ろ で， 本 研 究 で 大 腸 菌 タ ン パ ク 質 を 経 口投あるエビ類は抗体を持たないことから，狭義の免疫は与 し た ク ル マ エ ビ に お い て も，WSSV 感 染 防 御 能ないと考えられてきた。しかしながら，WSSV 感染が認められた。これまでの研究で，ペプチドグリカ

耐過エビが WSSV 再感染に抵抗性を示す，いわゆるン，β−1,3−グルカンもしくはリポ多糖体（LPS :免疫様現象が発見され（Venegas

lipopolysaccharide）の経口投与によって誘導される

2000）
，rVPs

を投与することで WSSV 感染防御能が誘導されるこ

感染防御反応は，細菌感染のみならず（Sunと（Wu1994；Teunissen, 2002），さらには rVPs を追加投与により感染防御能が持続されることは，エビ類にも免疫反＊51998； Sritunyalucksana, 1999），WSSV に対しても効果が認められている

Wu, J. L., 2003. Studies on quasi-immune responce of kuruma shrimp
against white spot syndrome virus(WSSV). Applied
Biological Sience, Graduate School of Biosphere Sciences, Hiroshima University, Doctoral Thesis 62-81.

Jun SATOH（Itami, 2000）。また最確立したが，飼育環境をウイルスフリーの状態に保つ

近，β -1,3- グルカンおよび LPS に対する結合タンパ

1998； Takahashi

ことが困難な育成段階における水平感染対策は，これ

ク質遺伝子がまで無策であった。しかし，クルマエビにおける免疫（Cominetti（Luo2006）および, 2002）からクローニングされ，さらに Toll 受容体遺伝子が（Yang, 2007）から単離されている。本実験結果におい様現象の発見により（Venegas

1999），エビ類においても十分に免疫様現象を利用したワクチン技術の開発が可能であると考えるに至った。第章では，て，大腸菌タンパク質投与区では，感染防御能のピー

rVPs の経口投与による WSSV 攻撃への防御効果を注ク（RPS 値71％）が投与後36日目から認められおり，

射，浸漬および経口攻撃によって検討した。第rVPs 投与区のピークに比べ10〜20日程早かったこ

は，防御効果の発現時期，持続期間および追加投与効と（実験Ⅰ），さらに大腸菌タンパク質の追加投与に果について検討し，経口ワクチンによる水平感染対策

よる効果は一切認められなかったことから（実験Ⅱ．

の構築を目的として研究に取り組んだ。

章で

III）
，大腸菌タンパク質により誘導された WSSV 感染

ここでは，これまでの結果を総合的にとりまとめ，

防御能は，rVPs により誘導された感染防御能とは異クルマエビの WSSV 防疫対策の展望について考察すなる機序によって誘導されたのではないかと考える。

る。
第

総合考察

章において，1996年以降の志布志庁舎における種苗生産過程の WSD の発生状況を検討した。その結果，産卵親エビの卵巣から WSSV が検出されたこクルマエビ種苗生産過程における WSSV の防除対と，これらの PCR 陽性個体由来の受精卵を排除した策の現状を Fig. 8に模式的に示した。種苗生産に供す

ところ，種苗生産の成功事例は23事例中21事例（91 3

る受精卵を確保するのに必要な雌親エビの養成技術は％）になり，WSSV の防除効果を確認できる結果がまだ確立されていない。採卵用の成熟した親エビは，示され（Table 13），親エビにおける WSSV の検出結

ほとんどの場合天然由来の親エビに依存している。

果と種苗からの WSSV の検出および WSD の発生が良天然親エビが WSSV に感染していれば，種苗生産現く符合した。また，WSSV 陽性の親エビを排除した

場にウイルスを持ち込むことになり，飼育過程におけ種苗生産での成功率の上昇から，種苗生産過程におる WSD 発生の危険性が高くなる。また，天然海域にける WSSV の主たる感染経路は親エビからの垂直伝

生息する甲殻類や海水を介しての水平的な伝播が起こ播と考えられた（佐藤ら，1999）。虫明ら（1998）は，る可能性がある。従って，種苗生産場へ WSSV を持

1996年

ち込まないために感染経路の遮断を中心とした防除対された天然親エビ合計1 269尾（雌955，雄314）の9 2策の構築が求められる。現在では，産卵に供試した親％から WSSV を検出し，検出率は，夏期（

エビの PCR 法による WSSV 検出結果に基づくウイル

月から1998年月までに国内主要漁場で漁獲月から月）に漁獲される親エビで高まる傾向がみられ，反ス陽性エビの排除と受精卵のヨード剤による消毒の実

対に施，および飼育用水の殺菌を中心とした防除対策を講い傾向があるとした。これとは別に，2002年から2007

じることにより，WSSV フリーの種苗を確保する技

年までの実際の種苗生産において採卵に供試された雌術が確立した。次のステップとして，クルマエビの免

親エビ6 312尾からの WSSV 検出状況の推移を Fig. 19

疫様現象を利用した水平感染防除対策の構築が可能とに示した。2002年に東海沿岸および九州東岸2の海域

なれば，ウイルスフリーの種苗の有効利用につながる

で50％に達する検出率を示した後，2003年以降15 0％とともにクルマエビにおける WSD の総合的な防除対の検出率を最高にほぼ10％前後で推移し，検出される策の構築が可能となる。本研究第1章および地域が特定の場所に偏った傾向がみられるとともに，章においてクルマエビ種苗生産における WSD の発生状況と

月から

月あるいは

月にかけて漁獲される雌親エビでは低月頃に検出されやすい傾向がみられ

垂直感染の防除を中心とした防除対策の効果についてた。天然海域での棲息個体から WSSV が検出される検討した。第1章では種苗生産過程における WSD のことはウシエビ（Lo

発生状況の詳細な検討により，WSSV の主たる感染経路の推定を行った。また，第1997）やヨシエビ（Wang1997）でも報告され，ウシエビでは産卵期であ章ではポビドンヨー

る夏から秋の漁獲個体の方が冬の漁獲個体より検出

ド剤による安全で効果的な受精卵の消毒条件を把握す率が高くなることが報告されている。この現象はクルる目的で，クルマエビ受精卵に対する安全濃度，消毒

マエビと同様であり，クルマエビにおいては多回産卵処理時間および消毒効果について検討した。

がストレッサーとなって，親エビに不顕性感染してい前述の如くウイルスフリーの種苗を生産する技術をる WSSV の増殖を誘発することに起因すると考えらクルマエビホワイトスポット病の防除対策れている（Mushiake, 1999）。このような検出率

産卵後の方が検出率が高く，また，産卵後の検出率はに季節的な変動が起こる現象を踏まえ，種苗生産にお卵巣卵より受精嚢の方が高くなっている（Table 13）

いては，WSSV の感染率が比較的低い4月から6月に（Mushiake

漁獲される親エビを搬入し，それらの親エビから得ら

WSSV 検出結果に基づく受精卵の選別を行う防除対れた卵を飼育に用いることも WSSV の防除対策の一策においては，産卵後の受精嚢を検査部位に選択するつとして有効とされている（虫明ら，1998）。また，ことが重要であると考えられる。

1997年から1999年の1999）。以上の結果から，親エビの年間における，親エビの産卵前Fig. 19に示した天然クルマエビの WSSV 検出状況

後の卵巣卵および受精嚢（交尾により雄から獲得したの調査において，2002年から2003年にかけて検出率の精子を貯蔵しておく小嚢）からの WSSV 検出率を比低下とともに四国東岸での検出率が比較的高く推移し較すると，卵巣卵および受精嚢のいずれも産卵前よりた。いずれについても要因は不明であるが，九州東岸

Table 13. Occurrence of WSD at Shibushi and Kamiura station of JASFA in 1996 to 2000

Fig. 19. Seasonal change of prevalence of WSSV in wild female kuruma prawn cought from each major landing
places in Japan.

Jun SATOH
海域で検出率が低下した要因の一つとして病原体と宿止せざるを得ない事例があった。その後，この原因

主の平衡関係の成立が考えられる。室賀（2000）は，は，産卵後の受精嚢は PCR 陰性であったが，卵巣がオーストラリアの野ウサギの撲滅に用いたミクソー

PCR 陽性の個体が含まれていたことが判明し（虫明マウイルスとの平衡関係成立までの世代数でみると

ら , 未発表）（Table 14），産卵後の受精嚢検査結果だ

世代かかったとされる事例から，国内のニジマス（

けに基づく卵の選別では，WSSV の検出漏れを起こ世代がすことが判明した。この検査漏れを防ぐには，

年）における IPN（伝染性膵臓壊死症）の発個体症（1964年頃）から終息まで（20年弱）の事例とも良について卵巣卵と受精嚢のく符合し，病原体と宿主の平衡化が流行の終息に関わ要になるが，コストおよび検査時間の延長など問題点っている可能性を論している。クルマエビの WSD ががあることから，最も現実的な防除対策として，親エ発生するようになった1993年から現在までに15年経過

ビの PCR 陽性率が低い

し，クルマエビの世代が，期に漁獲される親エビを用い，産卵後の受精嚢からの世代が経過したと考えられ，クルマエ

WSSV 検出結果に基づく受精卵の選別が有効かつ効

年とすれば

世代を

年とすれば

ビと WSSV の平衡化が起こっているかもしれない。

部位を検査することが必

月から月の比較的早い時率的であると考える。

WSD が国内で発生後，WSSV は天然の甲殻類から検WSSV がクルマエビ受精卵に侵入するのか，単に出あるいは分離されていることから，このウイルス表面に付着しているだけなのかについては明らかでは国内に定着したものと考えられる。天然クルマエはない。また，受精卵の消毒に関しても，今のとこビの検出率が低下傾向にある地域もあるが，継続してろ効果を厳密に確認した例は報告されていない。台湾

検出される地域も存在し，天然の甲殻類にいかにしてにおけるウシエビの WSD では興味深い報告がある。

WSSV の感染が定着していったのか，天然海域におWSSV が卵巣卵内に存在すると卵の発育が阻害され，ける WSSV の感染環については興味深いところであ垂直伝播が起こらないとされている。しかし，このる。魚類のベータノダウイルスにおいては，分子疫学

場合でも，卵およびふ化幼生については洗浄または的な調査手法により天然マアジから検出されるベータ消毒を実施することが有効な垂直伝播の防除になるとノダウイルスの遺伝的多様性が調べられ，天然マアジしている（Lo

間でのベータノダウイルスの伝播に地理的・季節的要の卵表面に存在するウイルスを不活化することを目的

因が関係していると考えられている（菅谷ら，2007学

として，1997 年以降，ヨード剤（有効ヨウ素濃度 5＊61997）。志布志庁舎では，受精卵

会発表） 。WSSV の検出状況においても地理的あるmg/L）を含む紫外線処理海水で分間の消毒を行っ

いは季節的な変動がみられることから（Fig. 19），こている。最近の研究報告では，WSSV は有効ヨウ素のような，分子疫学的手法によるデータの蓄積を行う

濃度2 5 mg/L 以上では0 2分以内，1 0 mg/L ではことで，天然域での WSSV の分布および動体を把握分以内に不活化されるとされていることから（桃山，することが可能となれば，流行予測という観点から，

谷村，2004），上述の消毒条件は十分に受精卵表面のより高度な WSSV 防除対策の構築が可能となると考WSSV を不活化できているものと推定される。さらえる。

に，第2章で述べたように受精卵の発育段階が128細胞

前述のように，種苗生産過程での WSD の発生状況

期以外の段階に有効ヨウ素濃度の減衰が起こらないこから，WSSV の感染経路として垂直伝播が強く示唆とが確認された卵密度（0 33 g/L）で有効ヨウ素濃度

され，産卵後の親エビ受精嚢を検査し，陰性と判定

2 5および5 0 mg/L でされた親エビ由来の卵のみを選別して種苗生産を実施

ドを含まない海水で消毒操作のみを行った対照区の正したところ，Table 13に示したように1998年から2000

常ふ化率と遜色ない正常ふ化率が得られることが確認年までのクルマエビ種苗生産の成功率は97 9％となっされ，安全かつ効果の期待できる卵消毒方法であるとた。したがって，親エビの受精嚢検査に基づく卵選考えられる（佐藤ら，2006）。

分間の消毒処理により，ヨー別と次項目で述べる卵消毒とを組み合わせた方法は，種苗生産過程における WSD の発生には，WSSV の種苗生産過程におけるクルマエビの WSSV 防除対策

親エビからの垂直伝播のほかに，水平伝播も重要な要として極めて有効であると考える。しかし，48事例中因の一つと考えられる（佐藤ら，2003）。特に高密度わずか例ではあるが種苗から WSSV が検出され，の飼育環境下では，共食いや飼育水を媒介とした水WSD の発生には至らなかったものの，種苗生産を中平感染が容易に成り立つことが報告されている（Wu＊6菅谷琢磨，森広一郎，西岡豊弘，沖中 泰，中井敏博，池田和夫，2007．天然マアジから検出されたベータノダウイルスの遺伝的多様性．平成19年度日本魚病学会春季大会講演要旨集 p. 37.

クルマエビホワイトスポット病の防除対策
Table 14. Prevalence of WSSV in ovary and receptaculum seminis of kuruma prawn spawners by nested
PCR before and after spawning during 1997-1999, 2001）。従って，予防措置として極端な高密度の水平感染対策の具体策は，薬剤での治療が困難で飼育を避け飼育環境に配慮する必要があるとともに飼あることから，養殖用種苗としては，ワクチンを利用

育水槽間の器具の共用の禁止，エアレーションなどにする方法や SPR（specific pathogen resistant）種苗のよる飛沫感染の防止等に注意を払う必要がある。これ導入を図ることが最良と考えられる。Venegasu

らの水槽や使用器具については，WSSV に有効な不（1999）によるクルマエビにおける免疫様現象の発見

活化効果のある薬剤が報告されているので（中野ら ,により，エビ類でも免疫抗原の投与によるワクチンに1998；Chang, 1998），用途

類似したウイルス感染症防除の確立が十分に期待できに見合った消毒剤を使用すれば，容易に消毒は可能でると考えられる。WSSV は株化細胞による培養がであると考える（Table 15）。

きないため，免疫抗原の効率的作成が困難であるが，, 1998；Maeda

前述の如く，WSSV フリーの種苗を作る技術は確

大腸菌発現系等を用いた WSSV 構造タンパク質の発立したが，中間育成過程あるいは養殖漁業における種現精製が可能であり，現在では最も効率的な免疫抗原

苗の育成環境は，自然環境に近い条件で行う場合が多の作成方法の一つとして用いられている（Namikoshi

く，前述の如く環境生物や飼育水からの水平伝播による感染が起こる可能性がある（Maeda
Wu, 2004；Witteveldt, 2004,2006；Jha,, 1998；

2006, 2007）。 本 研 究 で は，WSSV の 構 造 タ ン パ ク, 2001；Momoyama, 2003）。ウイルス感染症

質 で あ る rVP26（tegument タ ン パ ク 質 由 来 ） お よJun SATOH
Table 15. Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of WSSVび rVP28（エンベロープタンパク質由来）の経口投が示された。一方，rVP26投与区にホモあるいはヘテ

与による WSSV 防御効果を明らかにした（Satohロで追加投与した場合，ホモ追加投与区がヘテロ追加

2008）。経口投与方法は，育成場へ導入する前の投与区に比較して，明らかに高い防御効果が認められウイルスフリーの種苗に WSSV に対する抵抗性をた。この結果から，クルマエビに認められる免疫様現付与する最も現実的で効率的な投与法である。既に

象には，改めて特異性と記憶が存在する可能性が考え発現タンパク質を経口投与することで WSSV に対られた。WSSV の VP26および VP28の抗原特異性にする防御反応を誘導した事例は前述の如く

ついては，家兎あるいはマウスを用いた in vitro 実験，で報告されているが（Namikoshi
2006; Jha

, 2004; Witteveldt., 2004,

で調べられている。VP28に対する家兎血清は WSSVを中和することが確認されたが（van Hulten,., 2006, 2007），クルマエビにおける検討2001），VP26に対するマウス由来の抗血清では WSSVがなかったことから，本種における防御効果の誘導がを中和できなかったとされ（Xie and Yang., 2005），

確認できたことは意義深い。また，実際の育成環境で何らかの感染に関わる抗原特異性を示すことが報告さ頻発するであろう共食いによる水平感染の拡大を想定れている。クルマエビにおいて観察された，ヘテロ追した経口攻撃試験に対する強い防御効果の誘導につい加投与区で抵抗性が確認されなかったのは，クルマエても確認ができた。

ビが抗原の特異性を認識した可能性が考えられた。今第章において，誘導される WSSV 防御反応の発後，クルマエビにおいて免疫抗原に対する記憶や特異

現時期，持続期間および追加投与の効果について調べ

性の存在をメカニズムの面から明らかにすることがでた結果，rVPs の経口投与開始から約35〜45日後に発きれば，より効率的な防御効果を誘導できるワクチン

現すること，その防御反応の持続期間が10日間程度で開発につながるデータになると考える。

あるが，rVPs を追加投与することで，防御効果を再Venegas（2000）は，WSSV 感染耐過エビが度得られることを確認し，効果的な投与スケジュール

WSSV 再 感 染 に 対 し 抵 抗 性 を 示 す 現 象 を「quasi-の設計の可能性を示した（Satoh, 2009）。この

immune response（免疫様現象）」として説明してい実験結果のデータによれば，具体的には，発現時期のるが，これに対し Flegel（2007）は「Accommodation

ピークを挟んで前後10日間ほどである程度の防御効果

concept（適応概念）」を提唱し，甲殻類のウイルスが認められたことから，最初に確認された時点から30

感 染 に 対 す る 防 御 機 構 を 説 明 し よ う と し て いる。

〜40日間隔で追加投与を行うことで維持できる可能性「Accommodation concept」とは，宿主がウイルスにクルマエビホワイトスポット病の防除対策
対する免疫記憶等の特異的機能を働かせることで，宿（Lightner and Redman, 1998）。しかし，放流種苗生

主がウイルスの持続感染を許容し（Accommodaion: 適

産のための親エビは遺伝的多様性も考慮に入れる必要

応），結果的にウイルス感染により引き起こされる宿があることから，放流水域から得られたものが妥当で主細胞のアポトーシスが抑制されることで発症を抑えあり，そうすることにより，その水域にしばしば起こている，宿主と病原ウイルスの相互作用であると説明り得る疾病の生き残りを親として使用する可能性が高している（Flegel, 2007）。一般的に脊椎動物ではアポくなる（室賀 , 2000）。さらに，安定した親エビの入トーシスの一部の働きに，ウイルス感染細胞などの有手を確実にするためにも，このような天然親エビから害化した細胞を除去する生体防御反応が存在するとさ得られた種苗からの採卵用親エビの養成技術の開発がれる（永田ら，2003）。事実，WSSV や yellow head

強く望まれ，ウイルスフリーの親エビ養成技術が確立

disease virus（YHDV）に感染し死亡したウシエビにされれば，垂直伝播の防除対策の最も大きな対策となおいて，アポトーシス細胞が増加していたことが確り得るものと考えられる。そして，本研究で明らかに認され（Wongprasert

なったように，あらゆる対策を総合的に講じることに, 2003；Khanobdee

,

2002）
，また banana prawn ではアポトーシスに関連

より，WSSV 防除を図ることができると言える。

するカスパーゼ3プロテアーゼが発見され（Phongdara

元来，抗体を持たない無脊椎動物のワクチン開発

2006），アポトーシスがウイルス感染に対するは無意味であると考えられてきたが，これまでの室エビ類の生体防御において重要な働きをしていると考賀らの研究により，感染耐過エビが再感染に対し抵抗えられる。しかし，Wu and Muroga,（2004）は，免性を獲得することなどが解明された（Venegas

疫様現象による WSSV 感染防御能の誘導の有無に関1999）。この現象は脊椎動物の免疫現象に極めて類似

わらず，WSSV 攻撃により誘導されたクルマエビ体した反応であり，クルマエビにおいても免疫様現象

内のアポトーシス細胞数に顕著な差が認められなかっを利用して WSD の防除技術の開発が十分に可能であたことから，アポトーシスはエビ類の免疫様現象に重ると考える。これまでに，クルマエビにおいては，要な役割を果たしていないこと述べている。しかし，

WSD への防御反応を組換え大腸菌発現の WSSV タン

アポトーシスを起こさない免疫様現象においても抵

パク質の筋肉注射投与によって誘導できることが報告

抗性の付与が液性因子によってもたらされることからされているが（Namikoshi（Wu

実用性に優れた，組換えタンパク質の経口投与による, 2002a；Wu and Muroga, 2004），Venegas（2000）の発見した免疫様現象を強く支持した。

2004），本研究では，

WSSV 防御効果を明らかにし（Satoh

2008）
，

しかし，免疫様現象を裏付ける血リンパ液中の抗体様

さらに誘導される防御反応の発現時期および持続期間

物質についての科学的な根拠が薄いことから，その機について明らかにした（Satoh

能解明について興味深いし，免疫様現象と同様の防御

この反応の機序の解明に関しても基礎データの収集を効果を誘導していると推察できるいくつかの報告にお目的に実験に着手し，これらの研究から得られる免疫

いても防御効果の機能解明が行われることが大いに期

様現象を利用した防除に関する基礎データを応用し，待される。

増養殖過程におけるより積極的な WSSV 防除対策の最後に，産卵後の受精嚢からの WSSV 検出に基づ., 2009）。今後は，構築を目指したいと考えている。

く受精卵の選別とヨード剤を用いた卵消毒とを組み合わせた方法は，種苗生産過程における WSD 防除対策

謝

辞に有効な方法であることが判明した。しかし，シーズ
ン中にすでに産卵を繰り返している可能性がある夏期

本論文をとりまとめるにあたり，終始懇切なるご指に漁獲される親エビにおいて WSSV 検出率の上昇が導とご助言そして本稿の校閲を賜った北海道大学大学

みられる傾向があることから，親エビで陽性率が上昇

院水産科学研究院海洋生物工学分野教授 吉水 守 博

した際には，必要な受精卵数を確保できず種苗生産が士に深甚なる謝意を表します。本研究を遂行するにあ困難になるケースも考えられる。そのためにも，前述

たり，旧日本栽培漁業協会当時からこれまでにわたり，した早い時期（実験計画の詳細な検討など終始懇切なるご指導ならび〜

月）に漁獲される親エビから採卵を行うことも防除対策の一つになると考える。
中南米におけるに本稿の校閲を賜った北海道大学大学院水産科学研究などの養殖業院海洋生物工学分野准教授 西澤豊彦博士）（現韓国国

では IHHNV（伝染性皮下造血器壊死症）や TS（タウ立全南大学校水産生命医学科教授）に厚く感謝の意をラ症候群）等のウイルス病対策として SPR（specific表します。また，本論文の校閲の労を賜った北海道大

pathogen resistant） 種 苗 の 導 入 が 報 告 さ れ て い る

学大学院水産科学研究院海洋生物学分野教授 五嶋聖Jun SATOH
治博士，同海洋生物工学分野准教授 笠井久会博士に長），山元栄一氏，元上浦栽培漁業センターの西岡豊

謹んで感謝の意を表します。

弘主任技術員（現増養殖研究所

本研究を遂行するにあたり，旧日本栽培漁業協会に

魚病診断・研修セン

ター主任研究員），元古満目栽培漁業センターの 今泉

おいて当時の広島大学生物生産学部教授の 室賀清邦

均技術員（現増養殖研究所養殖技術部ウナギ量産研

博士に共同研究者として有益な御助言を賜った。ここ究グループ主任研究員）および 由利ゆかり氏，榎谷に記して感謝の意を表します。

恵子氏，吉岡康美氏，山路郁子氏，上甲美保氏，萩原本研究の機会を与えていただき，多くの便宜をはかっていただいた独立行政法人水産総合研究センターの古澤ひとみ氏，ならびに 束田香織氏の臨時職員の方々にこころよりお礼申し上げます。

徹 元理事，今村茂生元理事，増養殖研究所

元所長

酒井保次博士，前所長

長・元病害防除部長
杜多

中野哲博士，業務推進部長

防除部長

文

広博士，現所献飯田貴次博士，前業務推進部長
伊藤文成博士，前病害

佐野元彦博士，病害防除部長

乙竹充博

士に深謝の意を表します。

Amend, D.F., 1981. Potency testing of fish vaccines.
In: Anderson, D. P., Hennessen, W.（Eds.）Fish
Biologics: Serodiagnostics and Vaccines. S

当初より本研究テーマに関わるチャンスを与えていKarger Basel, pp. 447‑454.

ただいき，種々のご指導ご協力を頂だくとともに当初

Chakrabprty, A., Otta, S.K., Joseph, B., Kumar, S.,

より暖かい激励を頂いた水産総合研究センターの増養

Hossain, M.S., Karunasagar, I., Venugopal, M.N.,

殖研究所

Karunasagar, I., 2002. Prevalence of white spot

研究所

資源生産部長有元

操博士，西海区水産

まぐろ増養殖研究センター長

虫明敬一博士に心からお礼を申し上げます。

syndrome virus in wild crustaceans along the, 82, 1392‑1397.

coast of India. Current

本研究にあたり，種々のご指導ご協力を頂きました

Chang, P.S., Chen, H.C., Wang, Y.C., 1998a. Detection

増養殖研究所 病害防除部 種苗期疾病研究グループのof white spot syndrome associated baculovirus

池田和夫元グループ長，同 元栽培技術開発センター

in experimentally infected wild shrimp, crab and栽培技術研究グループ長 渡辺研一博士（現東京農業

lobsters by in situ hybridization.

大学教授），同 元栽培技術開発センター 栽培技術研

164, 233‑242.

究グループ主任技術開発員

照屋和久博士（現西海区

Chang, P.S., Chen, H.C., Wang, Y.C., 1998b.

水産研究所亜熱帯研究センター生産技術グループ長），

Development and evaluation of a dot blot

同 病害防除部 種苗期疾病研究グループ主任技術開発

analysis for the detection of white spot

員森

syndrome baculovirus （WSBV） in

広一郎博士（現本部研究推進部 研究開発コー, 33, 45‑52.

ディネーター），同栽培技術開発センター 栽培技術研
究グループ 菅谷琢磨博士（現中央水産研究所 水産遺Chen, L.L., Leu, J.H., Huan, C.J., Chou, C.M., Chen,

伝子解析センター 主任研究員）に厚くお礼申し上げ

S.M., Wang, C.H., Lo, C.F., Kou, G.H., 2002a.

ます。また，元 五島栽培漁業センターの 服部圭太場

Identification of a nucleocapsid protein（VP35）

長（現本部研究推進部研究開発コーディネーター）な

gene of shrimp white spot syndrome virus

らびに元上浦栽培漁業センター場長

雅一博士

and characterization of the motif important（現西海区水産研究所 まぐろ増養殖研究センター 成

岡for targeting VP35 to the nuclei of transfected

熟制御グループ長）をはじめとする職員諸氏には，絶insect cells.

大なるご協力を頂き，厚くお礼を申し上げます。
最後になりましたが，種苗生産現場で早朝から深夜まで，時には炎天下での作業，毎回100検体を越える検査業務等の共同作業を行った当時志布志栽培漁業センターの 今泉圭之輔主幹場長，岩本, 293, 44-53.

Chen, Z.L., Wan, C.S., Shin, H.H., 2002b. An assay
for quantification of white spot syndrome virus
using a capture ELISA.

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Cheng,W.T., Liu, C.H., Tsai, C.H., Chen, J.C., 2005.

浩専任技術員，Molecular cloning and characterization of a

加治俊二主任技術員（現増養殖研究所 養殖技術部 健

pattern recognition molecule, lipopolysaccharide-

苗生産研究グループ長），西and beta-1,3-glucan binding protein（LGBP）

明文当時技術員（現西海区水産研究所奄美庁舎まぐろ増養殖研究センター
種苗量産グループ研究員），
技術員

濱田和久博士（現

増養殖研究所養殖システム部養殖実証研究グループ

from the white shrimp, 18, 297‑310.
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