水研センター研報，第36号，143−145，平成24年
Bull. Fish. Res. Agen. No. 36, 143‑145, 2012

和文要旨
透明・光るメダカ（/STII-YI 系統）を用いた内分泌かく乱化学物質の影響評価に関する研究/STII-YI 系統仔魚に EE2を35日間飼育水から曝露（羽野健志（瀬戸内海区水産研究所），25 2，45 1，80 1，158，447，880，1710ng/L）し生殖腺組織を観察した結果，158 ng/L の10日令オスで蛍光面積が有意に増加した。さらに、35日

化学物質は現代社会にとって極めて重要であるが，令では，45 1 ng/L 以上の処理区の遺伝的オスで卵巣それらの中には生物の内分泌系に作用して発生や生殖を持つ個体が見られ，メスへの性転換が起こっていた。

等に影響を与える物質（内分泌かく乱化学物質）が存同様に女性ホルモン様作用を持ち汚染が報告されて在することが明らかにされており，その影響評価が急いるノニルフェノール（NP）を受精直後の胚に注入務となっている。一般的に内分泌かく乱化学物質によ（る性分化・再生産への影響を評価する場合，多数の実ての処理区で10日令仔魚の蛍光面積，100日令成魚と験動物を用いて長期間の曝露・飼育を実施した後，生もに遺伝子型の性と表現型の性は一致しており，性分殖腺組織を観察する等，多大な労力と時間を必要とす化異常は観察されなかった。これは，NP の女性ホルるため，これらの影響を迅速かつ少ないコストと犠牲モン様作用が弱い，もしくは NP がメダカ体内で代謝，で検出できる試験系の開発が求められている。

排泄されたためと考察した。

本 研 究 で は， 体表に色素が殆ど存在しない 透 明，2 0，10，50，125，250 ng/egg）した結果，全さらに EE2による/STII-YI 系統の成熟な メ ダ カ（STII 系 統 ） に， 生 殖 細 胞 で 常 時 発 現 すした生殖腺への影響を調べるため，60日令成魚を EE2る（遺伝子の調節領域に緑色蛍光タンパク質遺伝子（）を結合したトランスジーン（，47 8，94 8，216，522 ng/L） に週間飼育水）から曝露後，生殖腺 GFP 蛍光面積の測定を行った結を導入した生殖腺が光るトランスジェニックメダカ

果，遺伝的オスでは216 ng/L 以上の処理区で蛍光面（積が開始時の約30％にまで減少していた。その生殖腺/STII-YI 系統）を用い，内分泌かく乱化学物質の影響評価系への適用を検討した。
最 初 に， 無 処 理 の ふ 化 後，組織を観察した結果，精巣は萎縮して結合組織が大，10，15日 令部分を占めており，再生産に大きな障害が予想される/STII-YI 系統仔魚を用い，蛍光顕微鏡およ状態であった。また EE2濃度依存的に精巣に卵母細胞び画像解析装置により生殖腺の GFP 蛍光面積を測定が見られた。遺伝的メスでも，卵巣の蛍光面積は522するとともに，生殖腺部位を取り出して GFP 蛍光をng/L 区で曝露開始時の約50％にまで減少していた。

持つ生殖細胞数を調べた。その結果，ふ化後次に，60日令オス成魚を EE2（ ，43 7，85 8，215，

日令から遺伝的メスの GFP 蛍光面積および生殖細胞数は遺473 ng/L）に伝的オスに比べ有意に増加し，10日令では約10倍となして同一個体における生殖腺蛍光面積の変化を経時的っていた。よって，性分化の過程で生じる雌雄の差異に観察した。その結果，曝露を，10日令仔魚の生殖腺の GFP 蛍光面積を測定する

以上で精巣の蛍光面積は25％にまで減少したが，清水ことにより生きた状態で観察可能であると結論した。

飼育終了時の精巣の蛍光面積は曝露開始時の値にまで次に，女性ホルモン様作用を持ち自然界の河川に回復した。組織観察の結果では，結合組織は殆どなくおいて検出例が多数報告されているエチニルエスト

正常な精子形成が観察され精巣の回復が確認された。

ラジオール（EE2）を，ナノインジェクション法により受精直後の胚に微量注入（週間曝露した後，清水下で以上の研究の結果，週間飼育

週目には215 ng/L 区/STII-YI 系統を用，0 1，0 5，2 5，5 0

いてその生殖腺の GFP 蛍光画像を解析することにng/egg）し，性分化への影響を生殖細胞の観察によより，化学物質の生殖腺の発達と分化に及ぼす害作り調べた。その結果，0 5 ng/egg 以上の処理区で10用を生きた状態で検出可能であることが明らかとな

日令仔魚の遺伝的オスの中に生殖細胞数，蛍光面積った。また成熟した生殖腺への影響および清水飼育ともに対照区遺伝的オスの−10倍と遺伝的メスとによる回復過程の観察も同一個体で可能となった。

同等にまで増加した個体が観察された。さらに，仔/STII-YI 系統は，内分泌かく乱化学物質の魚を100日令成魚まで飼育して生殖腺組織を調べたと影響評価やそのメカニズムを解明する上で有用なモデ

ころ，0 5 ng/egg 以上の処理区の遺伝的オスが卵巣ルになるものと期待される。

を持ち，表現型がメスとなる現象，つまり，オスからメスへの性転換が観察された。よって，EE2が性分化異常を引き起こす作用は，10日令仔魚生殖腺のGFP 蛍光面積を測定することにより迅速かつ簡便に検出可能であることが示唆された。また，ふ化直後のクルマエビのホワイトスポット病 WSD（white spotる。日本における本種の分布は伊豆半島以南であるが，disease）の防除対策に関する研究

産卵の北限は南西諸島であり，その産卵個体数は非常佐藤純（増養殖研究所 上浦庁舎）に少ない。本種は，古くからタンパク源の一つとして肉や卵が食用に供されてきただけではなく，剥製や甲WSD は，クルマエビ種苗生産過程あるいは養殖生羅を用いた工芸品（日本ではべっ甲細工）の原料とし産過程において被害をもたらすウイルス感染症であても世界各地で利用されてきた。しかし，乱獲などにる。元来抗体を持たない無脊椎動物のワクチン開発

よって生息数は減少し，本種は国際自然保護連合のレは無意味であると考えられて来たが，感染耐過クルマ

ッドリストの絶滅危惧ⅠＡ類に記載されている。
また，エビが WSD 原因ウイルスである WSSV（wihte spot

本種をはじめとしたウミガメ類の保護対策の一環としsyndrome virus）の再感染に対しある程度の特異性て，ワシントン条約によって国際的な商取引が禁止さを有する抵抗性を獲得することが解明された（免疫様れている。そして，このことによって日本のべっ甲産現象）。本研究では，これらの免疫様現象を利用した業は原料の調達が不可能となり，存亡の危機に直面しより積極的な水平伝感染除技術の開発を目的の一つとている。このようなことを背景として，1999年から独した。第章では，種苗生産過程における WSSV の立行政法人水産総合研究センター西海区水産研究所石

感染経路を検討し，種苗生産過程における WSSV の垣支所は人工飼育した仔ガメの放流（Head-Starting）

主たる感染経路は垂直感染の可能性が高いと判断しによる本種資源の回復を目指し，本種の増殖技術の研た。第章では種苗生産過程において実施される受精究開発を開始した。Head-Starting を行うためには，卵のヨード剤による消毒の安全性と効果について検討

安定的な採卵と仔ガメの確保が不可欠であり，そのし，クルマエビの受精卵は128細胞期においてハンドためには親ガメの繁殖機構を解明することが重要であリングの影響を受けやすいことを確認した。また，ヨる。そこで，本研究は飼育条件下における本種の繁殖ウ素濃度生理や繁殖生態を解明することを目的とした。

mg/L で分の処理が安全であり，安全な処理条件で卵表面の生菌数を90％以上減させた。第第章では，雄の血漿テストステロン濃度の変動と章では大腸菌発現の WSSV の rVP26と rVP28

交尾行動を調べ，性成熟とテストステロン濃度との関の経口投与ワクチンの有効性を検討した。その結果，係を明らかにし，雄の繁殖周期は毎年であることがわ

経口攻撃，浸漬攻撃および注射攻撃の何れにおいてもかった。また，直甲長，尻尾の長さ，TE（直甲長に防御効果が確認できた。特に，経口攻撃試験で高い防対する尻尾の長さの比率）などの外部形態を指標とし御効果が得られたことは，共食いによる水平的な感染て雄の性成熟の状態を調べたところ，TE を指標とすの拡大を特徴とする WSD の実用的な防除対策の一つることで簡便に雄の性成熟を判定できることがわかっになると考えた。

た。

，

以上，現時点で考えられる最も有効な防除対策技術

第章では，雌の血漿エストラジオール−17β濃度．卵消毒，の変動と卵巣の発達状態を調べ，エストラジオール−．飼育水の管理，飼育水の殺菌管理が難しくなる天17β濃度と卵巣の発達の関係を明らかにした。また，をとりまとめると，．親エビの選抜，然海面を利用した養殖生産過程での対策としては，生雌の繁殖周期は野生個体と同様に体防御能を利用した水平感染対策が考えられ，rVPsと，飼育条件によっては毎年成熟できる可能性があるの経口投与とブースターの必要性について検討したとことが示唆された。

ころ，WSSV に対する防御効果が誘導できること，第〜年であるこ

章では，2006年から2009年にかけて雌の繁殖生さらに誘導される防御反応の発現時期および持続期間態を調べ，産卵数，産卵回数，産卵間隔，ふ化仔ガメも明らかにした。の大きさは，野生タイマイの既存の報告例と大きな違いは認められなかったが，ふ化率は野生個体の事例よ飼育条件下におけるタイマイの繁殖に関する生態，行動および生理学的研究りも著しく低いことが明らかになった。
第章では，第章から第章までの結果をもとに小林真人

総合考察を行った。飼育条件下のタイマイの性ホルモ（西海区水産研究所亜熱帯研究センター八重山庁舎）

ンの動態は，野生個体のものと同様の変動パターンを示し，飼育条件下であっても正常に性ホルモンが分泌されていることがわかった。交尾期は本研究の対象種であるタイマイ

月下旬から種月であったが，雌が雄の交尾を受け入れる期間は短いで，主に熱帯から亜熱帯のサンゴ礁海域に生息していことが示唆された。このことから，確実に交尾をさせは，ウミガメ科に属するウミガメ類のるためにはこの期間を逃さずに雌雄を同居させて交尾育条件下ではふ化率が非常に低いことが明らかとなっさせる必要がある。交尾からふ化までの繁殖生態は，た。今後タイマイの増養殖をさらに推進するためには，野生個体の報告事例と大きな差はなかったものの，飼ふ化率を向上させる研究が急務である。