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植 物 防 疫第 64 巻 第 12 号 （2010 年）

植物ウイルス病ワクチンの製品化と普及展開
りょう株式会社微生物化学研究所

ほうせいかたぎり

京都府農林水産技術センター生物資源研究センター

はじめ

のぶゆき

やすはら

ひさ お

梁 宝成・片桐 伸行・安原 壽雄
こさかよしたか小坂能尚

軽微な症状を現すにとどまったことから，ZYMV ― 2002には製造用株として，‘えびす’ は増殖植物として優れてい全国のキュウリ産地では多くのウイルス病被害が発生ることが明らかとなった。さらに，ZYMV ― 2002 を接種している。なかでも，ズッキーニ黄斑モザイクウイルスしたカボチャから，試作製剤を作製した（図― 1）。各葉（ZYMV）によるモザイク病は，急性萎凋症（I WASAKI

位の展開状況に合わせて感染葉を適時採取し，磨砕汁液and INABA, 1988）や奇形果実を引き起こして大きな経済を限外ろ過法により濃縮した。その後，濃縮液に等量の的損失を招いている。こうしたウイルス病に対し，有効安定剤を加え，凍結乾燥して製剤化した。得られた製剤な抗ウイルス剤がない現状では，媒介虫に対する薬剤やは，ほぼ理論値どおりに濃縮されており，本法の有用性忌避資材の使用，罹病株の抜取り等の防除対策を講じてが確認された。

いるのが実情である。その一方で，ウイルス病の効果的次に，製剤に最適なウイルス含有濃度と容量を検討し，な防除対策の一つとして，病原性が弱いかほとんどない保存安定性を検証した。ウイルスの感染性の指標は生物弱毒株（以下ワクチン株と称する）の実用化も進んでき検定による 50％感染価（logID 50/0.3 ml）で算出した。ている（小坂，2005）。

製剤の希釈溶媒として水道水を供しても，リン酸緩衝液

筆者らは，ZYMV に対して高い防除効果を示すワクまたは蒸留水とは明瞭な差がなかった。また，キュウリ

チン株 ZYMV ― 2002（KOSAKA et al., 2006）を有効成分と苗が 100％感染する接種濃度は，ほぼ 102.0ID50/0.3 ml 以する凍結乾燥製剤「キュービオ ZY ― 02」の開発に取り上であることが明らかとなった。さらに，製剤を 4℃で組み，新規農薬として登録された。

保存しウイルス含有濃度を検定したところ，保存 24 か

本稿では，「キュービオ ZY ― 02」の製品化に至るまでI月後まで安定して活性が保たれることが確認された（表― 1）。の研究概要と農薬登録後の利用状況を紹介する。

以上のように，ZYMV ― 2002 製剤のキュウリへの感染

高力価ワクチン製剤の作製率を高めるための製造方法および接種条件を確立し，長全国のキュウリ生産者に防除効果の高いワクチン株
ZYMV ― 2002 の接種苗または製剤を供給するためには，期保存による製剤感染価の安定性などが確認されたことによって，製剤の実用化に目途がついた。

高い感染率を付与する高力価の製剤を作製する必要があIIる。そこで，好適な増殖植物と増殖条件の検討を行うと

ZYMV ― 2002 の生物農薬としての登録

ともに，植物ウイルスでは初めてとなる中空糸膜フィルZYMV ― 2002 製剤を全国のキュウリ産地で利用できるターを用いた限外ろ過法による簡易迅速濃縮法の確立をためには，その農薬登録が必要である。生物農薬の登録目指した。

申請で要求される資料は「微生物農薬の安全性評価に関まず，製剤作製用のカボチャ品種を選定するため，接する基準（9 農産第 5090 号）」に規定されている。ここ

種したカボチャにおける ZYMV ― 2002 の増殖性を比較では，「環境生物に対する影響試験」および「ヒトに対したところ，西洋カボチャ品種の ‘えびす’ が適しているする安全性試験」に関する成績を紹介する。と判断された。また，ZYMV ― 2002 を 10 代まで ‘えび1す’ で継代増殖したところ，弱病原性を決定している

農薬登録に必要な要求項目である環境生物に対する影HC ― Pro 領域の四つの遺伝子配列（WANG et al., 2006）

響試験は，悪影響が懸念されない根拠理由が明確に示さに変異はなく，キュウリに接種しても原株と同様のごくれる場合にはその成績を除外できる。

Diffusion of a Registered Plant Virus Vaccine.
By Bo-SongRYANG, Nobuyuki KATAGIRI, Hisao YASUHARA and Yoshitaka KOSAKA（キーワード：キュウリ，ズッキーニ黄斑モザイクウイルス，防除，ワクチン，生物農薬）

環境生物に対する影響試験

そこで，ZYMV ― 2002 のキュウリやカボチャの根からの分泌あるいは遊離，水中や土壌中での生残性等を簡易かつ的確に調査できる手法を確立し，淡水魚，淡水無脊椎動物および土壌微生物に影響を及ぼす可能性があるか―― 44 ――

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植物ウイルス病ワクチンの製品化と普及展開
磨砕汁液

メッシュろ過（150M）

遠心上清

バルク作製

限外ろ過

予備凍結

濃縮液

↓

＋

中空糸膜
400 kD フィルター

1 次乾燥

等量の母液

（20 〜 30 培濃縮）

↓中間乾燥（10％ショ糖，5％L―リシン，感染葉＋2.5 倍量0.1Mリン酸緩衝液（pH 7.0）
凍結乾燥分注2％ポリペクトン）↓2 次乾燥

図 −1 ZYMV ― 2002 製剤の製造工程

表 −1 ZYMV ― 2002 製剤の感染価の推移 a）

表 −2 ZYMV ― 2002 の環境生物に対する影響試験
試験の種類

ZYMV ― 2002 の性状根からの遊離栽培収量後の残根
土壌，農業用水水を介した伝染性
アブラムシを介した伝搬性
強毒株への復帰変異
他のウリ科作物での病徴

感染性ウイルスは検出されず速やかに失活速やかに失活なし
なしまたは極めて低い
10 代継代接種してもなし
なしまたは軽微

感染価
試作製剤
Lot9
Lot10

製造直後

保存 24 か月後

3.84.24.04.0a）
製剤の保存は 4℃で，感染価（logID50/0.3 ml）はカボチャ品
種えびすで検定した．

否かを検証した。また，アブラムシによる伝搬性試験と表 −3 ZYMV ― 2002 の実験動物を供試した安全性試験

各種ウリ科作物への接種試験を行い，植物への影響を評

試験の種類

被験動物・細胞被験動物への影響

単回経口マウス

感染性および全身的影響なし

単回経皮ウサギ

局所刺激性および全身的影響なし

単回経気道マウス

感染性および全身的影響なし

単回静脈内マウス

感染性および全身的影響なし

生物への影響は問題にならないと評価された（表― 2）。

眼一次刺激性ウサギ

刺激性なし

さらに，製剤の使用法や生物学的性質から，鳥類，標皮膚感作性

モルモット

皮膚感作性あり

的外昆虫，蜜蜂および蚕に対して影響を与える可能性は培養細胞霊長類由来

感染性・毒性なし

価した。
ZYMV ― 2002 は感染キュウリまたはカボチャの根から感染性ウイルスの遊離がないこと，収穫後のキュウリ残根から全く感染性が確認されないこと，自然条件下の土壌中や農業排水中では速やかに失活すること，水を介して根から根に伝染しないこと，アブラムシにより伝搬される可能性はないか，または極めて低いこと等が明らかになった。これらの成績から，ZYMV ― 2002 は生態系に拡散・残留する可能性は極めて低く，淡水魚などの環境ほとんどないと判断された（文献検索による）。
2

ヒトに対する安全性試験

ZYMV ― 2002 の経口，静脈内，経気道による各単回投験では，ZYMV ― 2002 の感染性および毒性は確認されな与試験では，高濃度の ZYMV ― 2002 を投与したマウスかった。さらに，ZYMV ― 2002 製剤の単回経皮投与，眼に臨床的，病理学的影響はなく，ZYMV ― 2002 の感染性，一次刺激性試験では，皮膚と眼への刺激性はなかった。

病原性，体内生残性および毒性はいずれも認められなか

皮膚感作性試験では，製剤に皮膚感作性が認められたった。また，霊長類由来培養細胞を供試した細胞培養試（表― 3）。

―― 45 ――

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植 物 防 疫第 64 巻 第 12 号 （2010 年）

以上のように，製剤としては皮膚感作性が確認された

水産消費安全技術センター農薬検査部に提出し，資料整

ものの，ZYMV ― 2002 がヒトに対して感染や悪影響を及備を重ねながら，2007 年 10 月 10 日付けで農林水産大ぼす懸念はないと評価された。

臣宛申請書が受理された。その後，微生物農薬検討会お「環境生物に対する影響試験」と「ヒトに対する安全よび使用時安全性検討会を経て，2008 年 4 月に生物農性試験」をとりまとめ，ZYMV ― 2002 製剤（“京都微研”

薬として新規に登録された（図― 2）。

キュービオ ZY ― 02）の新規農薬登録申請願を（独）農林

III

ワクチンの特徴・使用方法

本剤の特徴として，① ZYMV によるモザイク病と萎凋症を予防できる，初めての生物農薬であること，②キュウリモザイクウイルスまたはカボチャモザイクウイル
スと重複感染しても，病徴を強めず，干渉効果も低下しないこと，③定植前に本剤を 1 回接種するだけで防除効果を発揮すること，④ワクチン接種によって果実の品質や収量が低下しないこと，⑤他の作物や環境への影響が小さい農薬であること，⑥農薬散布回数にカウントされず，有機栽培・減農薬栽培等に適合することが挙げられる。
ワクチンの接種は，凍結乾燥された製剤を水で 25 倍になるように溶解，希釈し，添付のカーボランダムを加えた後，接種液に十分浸した綿棒またはコットンパフ等で葉の表面をこする（図― 3 および表― 4）。2 ml 製剤で図 −2 “京都微研” キュービオ ZY ― 02

166 株分，6 ml 製剤で 500 株分となる。

育苗業者または自家育苗農家

接ぎ木前のキュウリ子葉にワクチンを接種

ワクチン接種苗

キュウリ苗が到着

キュウリ本葉にワクチンを接種定植・栽培

溶解前と溶解後苗を購入する農家

図 −3 ワクチンの利用手順

表 −4 ワクチンの適用病害虫と使用方法
対象
作物名

適用病害虫

希釈
倍数

使用量/株

使用時期 a）

使用
農薬の使用方法
回数
使用回数

きゅうり

ZYMV の感染によるモザイク病および萎凋症25 倍0.3 ml

子葉または第 1 本葉1回a）

定植前に接種，苗のステージは完全展開期．

―― 46 ――有傷接種

―

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植物ウイルス病ワクチンの製品化と普及展開
100
無処理ワクチン

50旬
中
7月

上7月

中
6月

旬

0旬

発病株率︵％︶

ワクチン区

無処理区

図 −4 農家圃場におけるキュービオ ZY ― 02 の防除効果の一例（2009 年度）

IV

ワクチンの普及事例と課題

おわりにワクチンを接種したキュウリの苗数は，2008 年度でZYMV による被害は年間数十億円以上と概算されるは 7 府県 37,000 株，09 年度では 24 府県 81,000 株と利が，発生が慢性的な産地もあれば，数年ごとというとこ用の途についたところである（口絵および図― 4）。これろもある。一度でも ZYMV による甚大な被害を経験しまでに，ワクチンを利用した農家または現地関係者の意た生産者には，ワクチンの「保険」的な利用は高く評価

見として，①毎年モザイク病に悩まされていたが，ワクされている。今後の現地試験などの取り組みにより，ワチンを使った今年は全く出なかった（宮城県，神奈川県，クチン＝「保険」という考え方を広く定着させたいと思長野県および宮崎県），②ワクチンを導入してから凸凹っている。また，キュウリでは ZYMV 以外のウイルス果実や急性萎凋症状が見られなくなった（滋賀県および病も発生しており，数種混合ワクチンを求める声も少な愛媛県），③ワクチンを接種しておくと安心して栽培でくない。さらに，最近では，温暖化に伴うエマージングきるので今後も保険的に使いたい（京都府および岡山

ウイルス病の脅威もある。誰でも，いつでも，どこでも県），等が挙げられた。

利用できるキュービオ ZY ― 02 のような安全・安心なワク

一方では，今後の普及の鍵を握る重要な課題も顕在化

チンの開発とその生物農薬登録は喫緊の課題と考えている。

している。まず，技術的には，接種作業の機械化などに現在，生物農薬市場が占める割合は，全農薬市場の約よる簡易・効率化である。過去にプロトタイプの接種装3,500 億円の 1％にも満たない状況にある（土井，2009）。

置が開発されているが（小坂，2005），感染率が安定しこのキュービオ ZY ― 02 が植物ウイルス病ワクチンといなかったことから，再度，機械での噴霧接種試験を実施

う新しい分野を創生し，今後の生物農薬市場に活性化を中であり，早期の実用化を目指している。次に，農家のもたらすことを期待したい。

要望に応じて実証試験に踏み切る事例が多いが，その地

本稿の研究成果の一部は，農林水産省「先端技術を活域で被害をもたらしている病原ウイルスが ZYMV によ用した農林水産研究高度化事業「安心感・信頼感の高いるものか明らかにされている場合は極めてまれである。

ワクチン接種キュウリ苗のオンデマンド供給」（2005 〜

当該地域の主要病原ウイルスの発生情報をあらかじめ把07 年度）により得られたものである。

握しておくこと，ウイルス診断では地元の公的機関と連

引 用 文 献携することが不可欠と考えられる。さらに，ワクチンが1）土井清二（2009）: 日本植物病理学会バイオコントロール研究会レポート 11 : 49 〜 54．
2）IWASAKI, M. and T. INABA（1988）: Ann. Phytopath. Soc. Japan 54 :584 〜 592.
3）小坂能尚（2005）: 植物防疫 59 : 337 〜 340．
4）KOSAKA, Y. et al.（2006）: Plant Dis. 90 : 67 〜 72.
5）WANG, W.-Q. et al.（2006）: J. Gen. Plant Pathol. 72 : 52 〜 56.

上市した例は全くなかったことから，ウイルス感染を防ぐ農薬として十分に周知されておらず，化学農薬とは異なる特質を生産者に認識してもらうことも重要と考えている。

農林水産省プレスリリース（22.10.16 〜 22.11.15）
農林水産省プレスリリースから，病害虫関連の情報を紹介します。
http://www.maff.go.jp/j/press/syouan の後にそれぞれ該当のアドレスを追加してご覧下さい。
◆ 平成 22 年度病害虫発生予報第 9 号の発表について（11/11）―― 47 ――/syokubo/101111.html