Vol.18 No.1
April 2009

巻頭論文

糖尿病モデル動物の解析

2

巻頭論文

糖尿病モデル動物の解析（インスリン受容体基質(IRS)欠損マウスを用いて）
東京大学大学院

医学系研究科

糖尿病・代謝内科

はじめに

1. インスリンシグナル伝達機構について

食生活の欧米化や車の普及などによる運動不足といったいわゆる ライフスタイルの変化

窪田哲也、窪田直人、門脇孝

生理的なインスリンシグナル伝達は、インスリンが細胞に伴い、個々膜上のインスリン受容体と結合し、内在するチロシンキ

人のインスリン抵抗性は増悪し、糖尿病のみならず、ナーゼが活性化され、活性化されたインスリン受容体よ肥満・高血圧・脂質代謝異常などの動脈硬化症の危り4種類のIRSがリン酸化される。IRS-1,2はインスリン標険因子が重積し、いわゆるメタボリックシンドロームを的臓器のみならず広範な組織分布を示し、インスリン作発症する。その結果、我が国では心筋梗塞や脳梗塞用の主要な担い手と考えられている。IRS-3は主としといった動脈硬化性疾患の発症率が増加の一途をたて脂肪に、IRS-4は腎臓、胸腺、視床下部に高発現しどっている。従って、インスリン抵抗性発症メカニズムている。チロシンリン酸化したIRS蛋白にSH2ドメインとインスリン抵抗性がメタボリックシンドロームや動脈を有するp85が結合し、ホスファチジルイノシトール硬化症を惹起するメカニズムを解明し、それに立脚し(PI)3キナーゼが活性化する。PI3キナーゼの下流分た根本的治療法の確立が極めて重要である。

子には、atypical PKCとAktがある。Atypical PKCはインスリン抵抗性は、生理的なインスリンシグナル伝相互に高い相同性を示すPKCλとPKCζからなり、達機構のいずれかの段階に異常が生ずることによって脂肪細胞や筋肉細胞においてインスリン依存性糖輸発生すると考えられている。そこで我々は、インスリン送を行う。一方、3種類のアイソフォームからなるAkt作用の初期シグナルであるインスリン受容体基質(IRS)は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)3βを介しに着目し、IRS欠損マウスあるいは臓器特異的なIRS欠てグリコーゲン合成酵素を活性化しグリコーゲンを合損マウスを作製・解析し、インスリン抵抗性、糖尿病、成したり、内皮型NO合成酵素(eNOS)を活性化しNO動脈硬化症におけるIRSの役割を明らかにしたいと考を産生させる。またインスリンは、ShcからRas を介しえ、取り組んでいる。本稿では、これまでに報告してきてMAPキナーゼを活性化し、細胞増殖を促す。

たIRS欠損マウスや臓器特異的IRS欠損マウスについ以上をまとめるとインスリンシグナルは、インスリン受て概説するとともに、インスリン感受性や耐糖能を検討

容体・IRSのチロシンリン酸化を介し、PI3キナーゼをするときの一般的な実験方法について概説したい。

活性化する経路とMAPキナーゼを活性化する経路があり、PI3キナーゼ経路は主として糖新生、インスリン依存性糖輸送、グリコーゲン合成などのインスリンの代謝作用やNO産生を、MAPキナーゼ経路は細胞増殖などを司っていると考えられている。

2. インスリン感受性や耐糖能の評価方法
A.インスリン負荷試験（全身のインスリン抵抗性の評価）
インスリン負荷試験は安楽死させることなく、簡便に全身のインスリン抵抗性を評価できる実験方法である。体重あたり一定量のインスリンをマウスに投与し、1

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血糖値を測定する。インスリン抵抗性は、インスリンに使用したものや、放射性同位体でラベルしたグルコーよる血糖降下の程度がコントロールマウスに比べ減弱スを使用した方法など、さまざまなバリエーションが存しているかどうかで判断する。スタート時の血糖値が在するが、本稿では放射線同位体を使用しない、最も異なる場合には、血糖値の低下率（100%表示）で評

簡便で基本的な方法を以下に記す（2）。

価する。以下にその概要を記す（1）。

① 頚静脈に留置するカテーテルは、ポリエチレンチュー① 生食20mlに15μlのインスリン(Humalin R 100)をブPE50とシリコンチューブを組み合わせて作製する入れたものを用意し、体重1gあたり10μlを27G（図1）。また、インスリンとグルコースを同時に注入す前後の注射針でマウス腹腔内に投与する（体重るために使用する2又カテーテルは、23G針（針先を30ｇのマウスであれば300μlの投与量となる）。

カットしたもの）、30G針（針先をカットしたもの）、腹腔内投与が安定しないと、血糖降下の程度にPE50、PE10を組み合わせて作製する（図1）。

ばらつきを生じるため、慣れるまではひとりがマウスを固定し、もう一人が投与するとより確実である。なお試験中は絶食とする。

図1

頚静脈カテーテル

シリコンチューブ

② タイムコースとしては0分・20分・40分・60分・80分・100分・120分の7ポイントで血液を採取し、血糖値をPE50測定する。
2又カテーテル

B. グルコースクランプ試験

23G

PE10

23G

（hyperinsulinemic-euglycemic clamp：インスリン抵抗性の責任臓器の評価）
インスリン抵抗性の主な責任臓器は、肝臓、骨格筋と考えられている。インスリン負荷試験では全身のインスリン抵抗性の有無は判定できるが、どの臓器30G

PE50がインスリン抵抗性の責任臓器かは区別できない。
グルコースクランプ試験では全身の糖利用率（GIR：② グルコースクランプを施行する2〜5日前に、頚静glucose infusion rate）だけでなく、肝臓での糖産生率脈にカテーテルを留置する。麻酔下に頚静脈を露（HGP：hepatic glucose production）と骨格筋の糖取込

出後、遠位部を6-0のシルクで結紮して頚静脈にみ率（Rd：rate of glucose disappearance）を測定でき、カテーテルを留置する（図2）。このとき他の血管を全身のインスリン抵抗性のみならず、各臓器のインス傷つけないことが重要である。

リン抵抗性の状態についても評価できる。グルコースクランプ試験では、一定量のインスリンに対し、一

図2 頚静脈カテーテルを留置した図定の血糖値を維持するようにグルコースを投与し、そ頚静脈の投与量が全身のGIRとなる。骨格筋で代謝を受けないデオキシグルコースを混合して使用することで、拡大図投与したデオキシグルコース量と血中で検出されたデオキシグルコース量から、骨格筋に取り込まれたグルコース量(Rd)が算出される。さらにこれをもとに肝臓の糖産生量(HGP)を求める。グルコースクランプには、インスリン分泌を抑制するためにソマトスタチンを頚静脈カテーテル6-0のシルク

2

③ グルコースクランプ当日は朝から3時間絶食を行い、50%グルコースとグルコースの安定同位体でD.グルコース負荷試験（耐糖能とインスリン分泌能の評価）ある6.6D2グルコースを4:1の割合で混合して、2又耐糖能とインスリン分泌能を評価する最も基本的なカテーテルの30G針側にシリンジを接続する。体方法がグルコース負荷試験である。体重あたり一定量重を測定してインスリンの量を決定する。インスリのグルコースをマウスに投与し、血糖値やインスリン値

ン抵抗性の状態あるいは実験内容によってインスを測定する。複数のバリエーションが存在し、実験のリン投与量を変更する必要があるが、コントロール目的に応じて各々最適な条件を設定する。以下にそマウスなどでは5mU/kg/minで十分である。インスの概要を記す（1）。

リン溶液で3回カテーテルをフラッシュした後、イ① グルコース3gを生理食塩水20mlに溶かしたものを、ンスリン溶液を2又カテーテルの23G側にシリンジマウスの体重1gあたり10μl投与する（体重30gのマを接続し、ハーバードポンプにセッティングする。

ウスであれば300μlの投与量となる）。

まずインスリンを25mU/kg/minで5分間投与した② 経口投与(OGTT)では専用のゾンデを使用し、確後、5mU/kg/minで120分間持続注入する。5分毎

実に胃内に投与する。過度の力をかけると消化管に血糖値を測定し、血糖値が120mg/dlになるようを損傷する恐れがあるので注意を要する。腹腔内にグルコースを投与する。90分、105分、120分の注射(IPGTT)や静脈注射(IVGTT)によりグルコースグルコースの注入率の平均からGIRを算出する。

を投与する場合もある。OGTTでは消化管ホルモ④ 0分、90分、105分、120分後だけ約30μlの血液をンの作用も含めた生理的なインスリン分泌能を評採取する。血液を遠心して、蛋白を除去する目的で価できる点がIPGTT・IVGTTと大きく異なる。

血漿10μlに対して60μlの100%エタノールを混合③ タイムコースとしては0分・15分・30分・60分・120分し、15,000回転10分間遠心して、上清を取る（この検の5ポイントで血液を採取し、血糖値を測定する。

体は−20℃保存が可能である）。次に窒素ガスで蒸また、0分・15分・30分ではインスリン値も測定する。

発させた後、ピリジンと無水酢酸を1：2の割合で混合した溶液を100μl添加して撹拌する。そのサンプルをガストロクロマトグラフィー質量分析計にてグルコー

図3 24Gサーフローの外筒を下大静脈に留置した図
下大静脈

スの同位体比を算出し、Rdを求める。GIRとRdからHGPを算出する。

拡大図
C. インスリンシグナルの検討
上記の方法で、各臓器のインスリン抵抗性を把握した後、各臓器におけるインスリンシグナル障害の程度を検討することとなる。麻酔の後、出血させないように下大静脈を露出させ、24Gのサーフローの外筒を下大静脈に留置する（図3）。
留置した24Gのサーフローよりヒューマリン100Rを5単位投与し、肝臓は70秒後、骨格筋は2分後に組織をすばやく採取、液体窒素にて凍結保存する。その後、各組織をホモジナイズし、western blotあるいはphosphatidylinositol (PI)3kinase活性にて評価する（2）。

324Gサーフローの外筒

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3. IRS-1,-2欠損マウスとインスリン抵抗性、耐糖能異常について
我々は、インスリン受容体の主要な基質であるIRS-1とIRS-2のインスリン抵抗性及び糖尿病発症における役割を明らかにするため、IRS-1欠損マウス及びIRS-2欠損マウスを作成し、上記2で述べた方法をしたが、骨格筋での上昇は野生型マウスの約25％であった。従ってIRS-1欠損マウスのインスリン抵抗性は骨格筋が責任臓器と考えられた。一方、IRS-2欠損マ
ウスの場合のPI3キナーゼは、肝臓では野生型マウスに比べ約50％に低下し、骨格筋でも野生型マウスに比べわずかであったが低下したことから、IRS-2欠損マウスのインスリン抵抗性の責任臓器は、肝臓と骨格用いて解析した（3、4）。
まずはじめにIRS-1欠損マウスとIRS-2欠損マウスの筋であると考えられた。
次に、両欠損マウスの耐糖能について検討すると、成長について検討したところ、IRS-1欠損マウスの大きさは胎児期より野生型マウスの2/3の大きさであったが、IRS-2欠損マウスは野生型マウスとほぼ同等であった。次に、インスリン感受性について検討したところ、両マウスとも、インスリン抵抗性を示した
（図4）
。両マウ
スのインスリン抵抗性の機序を明らかにするため、肝臓及び骨格筋でのインスリン依存性のPI3キナーゼ活性の上昇を検討した。IRS-1欠損マウスの肝臓では、

IRS-1欠損マウスは、高インスリン血症による代償により、糖負荷前後いずれにおいても血糖値は野生型マウスと同程度であった。一方、IRS-2欠損マウスは、６週齢では高インスリン血症による代償により、糖負荷前後での血糖値は野生型マウスと同程度であったが、10週齢になると糖負荷後に野生型マウスに比べ高血糖を呈した（図4）。

野生型マウスとほぼ同程度のPI3キナーゼの上昇を示

図4 IRS-1欠損マウス、IRS-2欠損マウスは同程度のインスリン抵抗性を示すが、IRS-2欠損マウスのみが糖尿病を発症する

IRS-1 欠損マウス

インスリン感受性試験

IRS-2 欠損マウス
160＊

＊＊

150

＊＊

＊

10050

血糖値(mg/dl)

血糖値(mg/dl)

200140120＊＊100＊＊＊

80600015304560020 40 60 80 100 120（分）（分）

野生型マウス
IRS-1 欠損マウス
IRS-2 欠損マウス

ブドウ糖負荷試験

500450血糖値(mg/dl)

血糖値(mg/dl)

500400300
200400350300
250200150

100

10003060（分）12001530 60（分）1204そこで、膵組織切片を作製し、抗インスリン抗体にていた（図5）。このことから、IRS-1欠損マウスではインよる免疫染色で膵β細胞の面積を検討すると、IRS-1スリン抵抗性に対し膵β細胞が増殖するのに対し、欠損マウスでの膵β細胞の面積は野生型マウスに比IRS-2欠損マウスではインスリン抵抗性があるにもかかべ1.83倍に増加していたが、IRS-2欠損マウスの膵βわらず、膵β細胞が増殖できないことにより、10週齢よ細胞の面積は、野生型マウスの0.85倍とむしろ縮小しり耐糖能異常を呈したと考えられた。

図5 IRS-1欠損マウス、野生型、IRS-2欠損マウスの膵組織IRS-1 欠損マウス

野生型マウス

IRS-2 欠損マウス

膵組織に占める割合（％）

0.80.6
IRS-1 欠損マウス

0.4

野生型マウス
IRS-2 欠損マウス

0.20
β細胞

4. IRS -1,-2欠損マウスと動脈硬化についてIRSの動脈硬化に対する役割を解明するために、まずIRS-1欠損マウス、IRS-2欠損マウスがメタボリックシンドロームを来すかどうかを8週齢と20週齢で検討した（5）。その結果、IRS-1欠損マウス、IRS-2欠損マウスは共に8週齢よりメタボリックシンドロームを認めたが、その程度はIRS-2欠損マウスの方がIRS-1欠損マウスに比べ重篤であった。次にIRS-1欠損マウス、
IRS-2欠損マウスにカフ傷害モデルによる血管内膜肥厚を検討したところ、8週齢ではIRS-2欠損マウスは野生型マウスやIRS-1欠損マウスに比べ血管内膜肥5

non-β細胞厚は増大していたが、IRS-1欠損マウスは野生型マウスと同程度であった。そこで血管におけるIRS-1とIRS-2の分布を検討したところ、野生型マウスの血管においてIRS-2蛋白は検出されたがIRS-1蛋白は検出されなかった。一方、20週齢ではIRS-1欠損マウス、IRS-2欠損マウスは共に野生型マウスに比し有意な血管内膜肥厚の増大を示したが、その程度はIRS-2欠損マウスの方がIRS-1欠損マウスより増大していた（図6）。以上のことより、IRS-1欠損マウスとIRS-2欠損マウスではそれぞれ骨格筋、肝臓におけるインスリン抵抗性の結果、共にメタボリックシンドロームを呈したが、カフ傷害誘導性の内膜肥厚は8週齢ではVol.18 No.1

図6 20週齢ではIRS-1欠損マウスは野生型マウスに比し、カフ傷害に対する内膜肥厚が大きかった

野生型

IRS-1 -/-

血管内腔

血管内腔

IRS-2 -/-

血管内腔

IRS-2欠損マウスでのみ認められたことから、メタボ

ことから、肝臓における糖・脂質代謝調節には主にリックシンドロームが重積した状態ではその程度がIRS-2が重要な役割を果たしていると考えられた。そ重篤なものほど動脈硬化が進展しやすくなるというこで我々はまず肝臓特異的IRS-2欠損マウスを作製可能性と、血管に存在するIRS-2が抗動脈硬化作用し解析した（6）。驚いたことに肝臓特異的IRS-2欠損マを有する可能性が示唆された。また、メタボリックシ

ウスでは、絶食時にインスリン抵抗性を呈したが、再ンドロームを有する状態ではIRS-1のみならず、IRS-2摂食時にほとんど糖・脂質代謝に異常を認めなかっも動脈硬化抑制に重要な働きがあると考えられた。

た。このことは、肝臓にあるもう一つのIRSであるIRS-1が再摂食時にインスリンシグナルを伝達してい5．肝臓特異的IRS-1,-2欠損マウスについて
上記で述べたIRS-1,-2欠損マウスは、生体内すべての臓器において欠損するため、全身の影響を受けてしまい、個々の臓器における遺伝子の機能について十分な解析が不可能である。そこで我々は、Cre-loxPシステムを使用し、臓器特異的欠損マウスを作成した。上記で述べたように、我々が作成したIRS-1欠損マウスは骨格筋のインスリン抵抗性を呈していたが、肝臓ではインスリン抵抗性を認めなかった。一方、
IRS-2欠損マウスは、骨格筋のインスリン抵抗性のみならず、肝臓のインスリン抵抗性を呈していた。このる可能性を示唆するものと考えられた。そこで我々は、肝臓特異的IRS-1欠損マウスを作製し解析した。
肝臓特異的IRS-1欠損マウスは、絶食時にインスリン抵抗性を認めなかったが、再摂食時にインスリン抵抗性を呈していた。このことは、絶食時にIRS-2が、再摂食時にはIRS-1が重要な働きをしている可能性が示唆された。そこでさらにIRS-1、IRS-2の生理的な役割を明らかにするために、野生型マウスを使用し、絶食時から再摂食時におけるIRS-1やIRS-2に結合したPI3キナーゼ活性について検討した。絶食時にIRS-2に結合したPI3キナーゼ活性は上昇し、再摂食直後をピークに再摂食30分後には速やかに低下した。

6

一方、IRS-1は再摂食数時間後よりIRS-1に結合した

異IRS-1/IRS-2欠損マウスでは、絶食、再摂食時どちPI3キナーゼ活性が上昇することを明らかにした（図7）。

らにおいても、重度のインスリン抵抗性を認め、糖尿これらの結果から、IRS-2は主に絶食時と再摂食直病を呈しており、この表現型は肝臓特異的IR欠損マ後に、一方IRS-1は主に再摂食時に糖脂質代謝の調ウスに似ており、肝臓におけるインスリンシグナルは、整を行っていることが明らかとなった。また、肝臓特ほとんどIRS-1、IRS-2で伝えられていると考えられた。

図7 IRS-2にassociateするPI3キナーゼ活性は絶食後半から再摂食直後に増加し、IRS-1にassociateするPI3キナーゼ活性は摂食数時間後から増加が認められた

PI3キナーゼ活性

絶食時

再摂食-24 -21 -18 -12 0 0.5 13456 時間

IP:IRS-160

150

再摂食

-24 -21 -18 -12 0 0.5 1

arbitrary unit

arbitrary unit

30

2絶食時

23456 時間

IP:IRS-2300(Cell Metab. 8:49-64,2008)

おわりに今後さらに肝臓以外の臓器特異的IRS-1,-2欠損マウスを作成・解析することにより、その個々の組織におけるIRSの詳細なメカニズムを解明することができ、この解析結果をもとに、インスリン抵抗性、糖尿病、動脈硬化に対するまったく新しい予防法や治療法を確立していきたいと考えている。

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著者プロフィール
くぼた

てつや

窪田哲也

平成9年
平成15年
平成16年
平成20年

東邦大学医学部卒業
東邦大学医学部大学院終了
東京大学大学院医学系研究科糖尿病・代謝内科 研究生
独立行政法人国立健康・栄養研究所 臨床栄養プログラム
栄養療法プロジェクトリーダー

研究テーマ
インスリン抵抗性・糖尿病の動脈硬化発症メカニズムの解明、特に血管内皮細胞やマクロファージに着目し研究を行っている。

参考文献（1） Kubota N, et al. J Clin Invest. 114:917-927, 2004.
（2） Suzuki R et al. J Biol Chem. 279: 25039-25049, 2004.
（3） Tamemoto H et al. Nature. 372:182-186,1994.
（4） Kubota N, et al. Diabetes. 49:1880-1889,2000.
（5） Kubota T, et al. Circulation. 107: 3073-3080, 2003.
（6） Kubota N, et al. Cell Metab. 8:49-64, 2008.

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