補助事業番号

2023M-279

補助事業名

2023年度 生体内環境の機械的特性を可視化するプローブ分子の開発補助事業

補助事業者名東京工業大学 生命理工学院 金原 数

１ 研究の概要
9,10-ジ(ピペラジニル) アントラセン（AnP2）の生体内環境用蛍光プローブとしての応用範囲を拡大することを目的とし、9,10-ジ（ピペラジニル）アントラセン単分散オリゴ(エチレングリコール)修飾
AnP2の生体モデル分子集合体に対する応答性と分子構造の相関を調べた。
２ 研究の目的と背景
両親媒性分子は分子のパッキング・パラメーターに依存するユニークな特性に応じて、水中でベシクルやミセルのような様々なタイプの分子集合体を形成する。例えば、天然の二分子膜を構成するリン脂質は、細胞膜を構成する両親媒性物質として知られている。また、リポソームを形成する合成両親媒性分子は、薬物送達システムの担体として注目されている。これまでに，両親媒性物質が作るこれらの分子集合体の物理化学的性質を明らかにするために，張力測定，光学測定，熱分析などが用いられてきた。これらと並行して，発光性分子プローブを用いた分子集合体の検出も重要である。環境変化に対して応答性を有する分子プローブは，分子集合体形成の可視化や，ベシクルやミセルなどの物理的性質の異なる分子集合体間の転位の検出などに用いられてきた。これまで開発されてきた分子プローブのほとんどは，疎水領域の顕在化や両親媒性分子の集合化に由来する粘度の上昇などにより，発光性が変化するものであった。
われわれは最近、小西らが報告した最小エネルギー円錐交差の制約によってユニークな発光特性を示す9,10-ビス(N,N-ジアルキルアミノ)アントラセン骨格を基に、親水性オリゴ(エチレングリコール)鎖と疎水性芳香族基が交互に連結したマルチブロック型の両親媒性分子であるAnP2-OEGを細胞内粘度プローブとして開発した。これまでに我々が開発してきたマルチブロック型両親媒性分子のほとんどは、脂質二重膜内に取り込まれることで様々な機能を発揮してきた。これに対し、
AnP2-OEGは興味深いことに高い細胞膜透過性を示す一方で細胞膜を可視化しなかった。本研
究では，これらの知見をもとに，生体内にある様々な分子集合体に適用可能な粘度プローブの開発を目指し検討を行った。
３ 研究内容（ 助成を受けた研究の成果 ）まず分子設計については，オリゴ（エチレングリコール）鎖の長さが両親媒性分子の会合感度に重要な役割を果たすと予想されたため、本研究では、9,10-ジ（ピペラジニル）アントラセン骨格に導入された側鎖の長さを変えた３種類の分子（AnP2-H、AnP2-TEG、AnP2-OEG、図1）について検討を行なうこととした。これらの分子のミセルおよびベシクルに対する発光特性を評価した。また，
AnP2は塩基性の窒素原子を有するため，pHの影響についても検討を行った。

AnP2 がミセル/ベシクルに取り込まれると、周囲環境の粘度が上昇するため、AnP2 の発光が強くなると考えられる。そこで，非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤として、それぞれTriton X-100、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロ

図１ 検討したプローブ分子の化学構造

ミ ド （ C16TAB ） 、 3-[(3cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate（CHAPS）を用い， AnP2 の発光スペクトルに対し，これらが作るミセルが与える影響を調べた。AnP2 のアミノ基のプロトン化／脱プロトン化の平衡点がpH 10.1であるため、AnP2はpH 7.1ではカチオン性、pH 10.6では中性であると考えられる。このため、分子電荷の影響を調べるためにpH 7.1およびpH 10.6における挙動を検討することとした。具体的な実験条件としては，pH 7.1の場合は20 mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液、pH=10.6の場合はN-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPS）緩衝液を用いて，50 mMのNaCl溶液，20mMの界面活性剤、10μMのAnP2、という条件下で発光スペクトルを測定した。界面活性剤の濃度は, 水中での各界面活性剤の臨界ミセル濃度（CMC）（Triton X-100: 0.24 mM, SDS: 8.2 mM, C16TAB: 0.98 mM, CHAPS：7.4 mM）よりも十分に高い20 mMに固定した。
まず， pH 7.1においては，検討した界面活性剤存のうちSDSは、他の界面活性剤と比較して、特異的にAnP2に由来する発光が短波長シフトを示した。一方で、SDSにおいて見られた特異的なシフトはpH = 10.6では観察されなかった。このことはカチオン性AnP2がSDSのアニオン性ヘッドグループと何らかの相互作用を持つことが示唆している。一方、すべての界面活性剤において、AnP2H、AnP2-TEG、AnP2-OEGの発光強度は、緩衝液中のものと比較して増大した（図2bおよびd）。興味深いことに、発光増強の程度（I/Ibuffer）は、界面活性剤ごとに異なっていた。例えば、pH 10.6では、Triton X-100とCHAPSは他の界面活性剤に比べて比較的強い発光を示す傾向があった。この傾向は、AnP2-H、AnP2-TEG、およびAnP2-OEGで共通していた。一方、pH 7.1では、pH 10.6とは異なる傾向が見られた。AnP2-TEG、AnP2-OEGではC16TABが最も強い発光を示したが、AnP2-Hでは最も弱い発光であった。これらの結果から、荷電していないAnP2はミセルの疎水性領域内に局在し、プロトン化したAnP2の局在がカチオン性部位による相互作用に大きく影響されることが示唆された。
AnP2の発光強度の増大が界面活性剤依存性を示したことから、AnP2-TEGとAnP2-OEGの発光強度の濃度依存性を調べた（pH≈7）。その結果、C16TABの場合、AnP2-TEGとAnP2-OEGのいずれについても、CMCを越えたところで発光が急激に増大した。一方、CHAPSの場合、発光はCMC後も継続的に増大した。これらの結果から、先に述べた発光の増強は、AnP2-TEGとAnP2-OEGがミセル内に取り込まれ、疎水性領域の粘性を反映していると考えられる。
次に、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）からなる脂質二重膜に対するAnP2由来の発光の応答性も調べた。AnP2-Hの発光強度は、pH 7.1および10.6のいずれにおいても、DOPCベシクルの存在下では、緩衝液中と比較して約2倍に増加した。一方、AnP2-TEGはpH 10.6で発光強度が2.7倍増加したが、pH 7.1ではほとんど増加しなかった。さらに、AnP2-OEGはAnP2-HやAnP2-TEGに比べて、pH 7.1と10.6の両方でベシクルに対する応答性が極めて低かった（それぞれ約1.3倍と約1.1倍）。このように、ミセルに対する感受性とは対照的に、pHとPEG置換基はAnP2のベシクルに対する応答性に大きく影響することが分かった。
ベシクルからミセルへ、あるいはミセルからベシクルへの転移は、膜タンパク質を科学的・実用的に利用する上で重要なプロセスである。また、界面活性剤によるベシクルの可溶化は、膜に関連する分子機能の研究に利用されている。そこで、ベシクルをミセルに変換することで知られる
Triton X-100で処理し、DOPCベシクル存在下でのAnP2の発光強度の変化を観察した。 AnP2-Hの場合、Triton X-100添加後、pH 7.1で発光強度がわずかに減少（0.92倍）したが、pH 10.6では2.2倍の増加が観察された。一方、AnP2-TEGはpH 7.1とpH 10.6の両方で発光強度の増加（それぞれ1.7倍と2.2倍）を示した。対照的に、AnP2-OEGはpH 10.6でのみ明らかな発光強度変化を示した。
オリゴ(エチレングリコール)で修飾していないAnP2-Hは、溶液のpHに関係なくベシクルとミセルの両方に感受性があったことから、AnP2の親水性が両親媒性分子の集合体に対する感受性を制御する重要な因子であると考えられる。プロトン化とオリゴ(エチレングリコール)修飾により、AnP2はミセル/ベシクルに対する応答性が低くなり、その効果はオリゴ(エチレングリコール)が長くなるほど大きくなった。発色団はどのAnP2も同じであることから、AnP2間の発光増強の違いは、おそらくベシクル/ミセル中に取り込まれた分子の量の違いによるものと考えられる。
これらをまとめると，(a) AnP2-HはpH 7.1とpH 10.6でミセルとベシクルの両方で発光性を示したが、pH 10では両者の応答性に差が見られた。 (b) AnP2-TEGはpH 7.1とpH 10.6でミセルとベシクルの両方で発光性を示し，それぞれのpHで応答性に若干の差が見られた。(c) AnP2-OEGはpH 7.1ではベシクルとミセルにはほとんど発光性示さなかったが、pH 10.6ではミセルに対して発光性を指名した。このように，AnP2の窒素原子上に導入したオリゴ(エチレングリコール)側鎖の鎖長依存的な性質が見られたことから，導入するオリゴ(エチレングリコール)側鎖の長さと単分散性の重要性が明らかとなった。
４ 本研究が実社会にどう活かされるか―展望
近年，細胞内に存在する非膜オルガネラと疾病の関係が大きな注目を集めているが，これを可視化する技術はまだ発展途上である。非膜オルガネラは，細胞内のサイトゾル等と比べて粘度が高いことが知られており，本研究の成果は，これを可視化し定量的に評価するための重要な手段へと発展する可能性がある。特に神経変性疾患に関連する現象の早期発見をもたらす可能性があり，将来的に健康社会実現に向けた活用が期待される。

５ 教歴・研究歴の流れにおける今回研究の位置づけ
これまで，事業者は新奇物性を示す化合物の開発を中心とした基礎研究を進めてきたが，本研究は，その成果の社会還元を目指すという重要な位置づけにある。
６ 本研究にかかわる知財・発表論文等該当なし。
７ 補助事業に係る成果物（１）補助事業により作成したもの該当なし。
（２）（１）以外で当事業において作成したもの該当なし。
８ 事業内容についての問い合わせ先
所属機関名： 東京工業大学生命理工学院(トウキョウコウギョウダイガク セイメイリコウガクイン）
住所： 〒226-8501
横浜市緑区長津田町4259 B58

担当者： 教授 金原 数 （キンバラカズシ）

担 当 部 署： 金原研究室 （キンバラケンキュウシツ）E - m a i l： kkinbara@bio.titech.ac.jp
UR

L： https://www.kinbaralab.jp/