LC-MS/MS測定におけるサンプル注入量の増加に対するカラム保持力の評価

2P-17

タカラバイオ株式会社1・エーエムアール株式会社2○渡辺 淳1・比毛 浩2・安本 雅純1・堀江 征司1・板東 泰彦22.0 x 50

311

カラムF2

2.0 x 503112.0 x 50

5

カラムD1

11100%

0%

100%

100%

80%

80%

60%

10 µL

40%

20 µL

40%
20%

0%

0%

12Time, minMax. 4.5e4 cps.

12Time, minMax. 3.7e4 cps.

60%

20%1Time, min2

Figure 3.
様々な注入量での測定結果（カラムA）

80%
Rel. Int. (%)

XIC of +MRM (3 p...

60%30 µL
40%

青：Verapamil
赤：Reserpine
緑：Propranolol

20%0%

1Time, min2

なお、クロマト中の数字は、その測定に用いたサンプル注入量。

Figure 2. Allegro-AMR UHPLC Pump

EXPERIMENTAL
１．カラムの粒子径などの違いによる保持力の評価
まず、様々な粒子径の、同じ長さのカラムを用いて測定を行った。
測定条件、使用したカラムは次のとおりである。
HPLC System：HTC PAL AMR New Wash Station
Allegro-AMR UHPLC Pump
A液：0.1％ギ酸 B液：0.1%ギ酸含有アセトニトリル
グラジエントプログラム：
Time（min）
012
2.01
3
A（%） 9010109090
B（%） 1090901010
流速：400 µL/min
カラム温度：室温
注入量：2 µL ～ 50 µL

Figure 3に、カラムAにおける測定結果を示した。
注入量が5µLまでは、各化合物とも良好に保持され、シャープなピーク形状をしていたが、10µLでは、各化合物のピーク形状が崩れ、特にプロプラノロールの一部が保持されずに溶出した。さらに注入量を増やしていくと、各化合物とも保持されずに溶出される割合が多くなった。
したがって、良好なデータを得るためには、注入量は5µLが上限であると考えられる。
そのほかのカラムについても、様々な注入量で測定を行った。代表的なデータとして、Figure 4(a)に、各カラムの、注入量5µLと10µLの測定結果を示した。
これらの結果から、一般的に、2 x 50 mmのカラムにおいては、粒子径の大きさによらず、注入量5µLまでは、良好な保持が得られ、シャープなピーク形状を保つことができるが、10µLでは良好な保持が得られないことが分かった。
ただし、例外的に、カラムD1（Cadenza CD-C18；インタクト株式会社）とD2（Unison UK-C18 ；インタクト株式会社）については、10µLでも良好な保持が得られた。さらに、これらのカラムについては、注入量を50µLまで増加させても、良好な保持が得られた。（Figure 4(b)）

100%0%12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.6e5 cps.
100%0%

12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.1e4 cps.
100%0%
XIC of +MRM (3 p...

カラムF212Time, minMax. 3.9e5 cps.

100%0%

12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.9e5 cps.
100%0%

XIC of +MRM (3 p...

(b) カラムD11Time, min

220µL

0%

12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 1.3e5 cps.

20µL

0%

1Time, min

212Time, minMax. 6.2e4 cps.

Rel. Int. (%)

Rel. Int. (%)

100%0%
XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

Rel. Int. (%)
Rel. Int. (%)

12Time, minMax. 1.6e4 cps.

12Time, minMax. 5.3e4 cps.

100%

0%

1Time, min2

３．オンライン希釈による保持力改善の検討
次に、オートサンプラーのインジェクションバルブの前後にバイパスラインを作り、オンライン希釈を行うことができる系を構築した（Figure 6）。なお、希釈比率は約5倍となるようにした。

100%

Waste

0%

12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.3e5 cps.

Column

API5000
Bypass installed
From Pump

Loop

PAL Injection Valve100%

Figure 6. オンライン希釈流路図
赤のラインを追加し、赤：青の流量の比率が４：１となるように設定した。

0%12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.0e4 cps.
100%0%

12Time, minMax. 4.2e5 cps.

100%

この系にて同様に測定を行った結果、バイパスを使わない場合に5µLまでの注入が限界であった測定系において、10µLの注入においても良好なピーク形状を維持することができた。また、カラムの長さを2 x 100mmにして測定した際には、20μLの注入においても化合物のピーク形状の悪化が見られず、良好に測定を行うことができた（Figure 7）。
XIC ...
Max. 3.8e5 cps.
XIC ...
オンライン希釈なし；2x 50 mm
100%0%

12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.3e5 cps.
100%

100%5µL
50%0%

XIC ...

12Time, minMax. 4.2e5 cps.

0%1Time, min

20%

XIC ...

Max. 2.3e5 cps.

50µL

100%0%

12Time, min
XIC of +MRM (3 p...
Max. 3.6e5 cps.

50µL

100%0%

1Time, min2

Figure 4. 様々な注入量での測定結果(a) 左列は注入量 5µL、右列は 10µL。
上から、カラムA, B1, B2, C, D1, D2, E, F1, F2, F3の測定結果。
(b) カラムD1, D2において、注入量をさらに増やしたときの測定結果。
左列は注入量 20uL、右列は50µL。
２．カラム長さの違いによる保持力の評価
次に、同じ種類で長さの異なるカラムを用いて測定を行ない、長さの違いにより保持性能の違いがあるか検討を行った。上記のカラムB1の、2 x 50 mm、2x 75 mm、2 x 100 mmのものを用いた。測定結果をFigure 5に示した。
2 x 50 mm、2 x 75 mmでは、10µL注入で著しいピーク形状の劣化が見られたが、2 x 100 mmではある程度劣化が抑えられていた。カラムの長さにより保持性能が改善することがわかった。なお、測定時の最大圧力は、 2 x 75 mmのカラムで32MPa、 2 x 100 mmのカラムで39MPaであった。

100%XIC ...
100%

12Time, minMax. 7.8e5 cps.

12Time, minMax. 3.0e5 cps.

0%

100%
50%

12Time, min

12Time, minMax. 5.9e5 cps.

0%12Time, minMax. 1.6e6 cps.

20µL
50%
0%
XIC ...

12Time, minMax. 1.1e6 cps.

100%

10µL
50%
0%20µL50%

XIC ...

100%5µL

Max. 4.1e5 cps.

100%

10µL50%XIC ...
XIC ...
オンライン希釈あり；2x 100 mm

0%10µL

100%5µL
50%0%

Max. 2.9e5 cps.

50%

オンライン希釈あり；2 x 50 mm

XIC of +MRM (3 p...

カラムD2100%

Rel. Int. (%)

Rel. Int. (%)
Rel. Int. (%)

Max. 7.3e4 cps.

100%

0%

XIC of +MRM (3 p...

カラムF312Time, minMax. 3.6e4 cps.

100%

XIC of +MRM (3 p...

カラムF1Rel. Int. (%)

12Time, minMax. 3.2e4 cps.

Rel. Int. (%)

0%12Time, minMax. 3.3e4 cps.

0%
XIC of +MRM (3 p...

2XIC of +MRM (3 p...

Figure 5. 長さの違うカラムでの様々な注入量での測定結果
左列は注入量 5µL、右列は 10µL。
上から、2 x 50mm, 2 x 75mm, 2 x 100mmカラムでの測定結果。

100%カラムE

Rel. Int. (%)

20%

100%

Delay volumeはわずか70μL。
最大圧力100MPaまで使用可能。
流速は0.1μL－1000μL/minに対応。
Binary or Quaternaryに対応。
API5000の制御ソフトAnalyst1.4.2から操作可能

5 µL
40%

0%

XIC of +MRM (3 p...

Allegro-AMR UHPLC Pump

60%

20%

XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

2 µL

40%

Rel. Int. (%)

60%

Rel. Int. (%)

80%

Max. 2.9e4 cps.

Rel. Int. (%)

80%
Rel. Int. (%)

100%

Device & Method
サンプルには、レセルピン、ベラパミル、プロプラノロールの混合液を用いた。サンプルの溶媒は、アセトニトリル100％とした。
注入量を2, 5, ・・・, 50µLまで注入量を変えて測定を行った。
カラムは、固定相としてODSを用い、種々の粒子径（1.7～5.0µm）、長さ（50～100mm）のもので測定を行った。
超高圧HPLC-MS/MSシステムとして、質量分析装置はAPI 5000™ LC/MS/MS（Applied Biosystems MDS/Sciex）、オートサンプラーにAMR New Washタイプ
HTC PAL、高耐圧ポンプにAllegro-AMR UHPLC Pumpを用いた。いずれもAnalyst 1.4.2ソフトウエアから制御して測定を行った。なお、ポジティブESIにて、MRM Modeで測定を行った。

XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

Rel. Int. (%)

Figure 1. HTC-PAL AMR New Wash Station & Allegro-AMR UHPLC Pump
& API 5000™ LC/MS/MS System

Max. 1.2e4 cps.

100%

Rel. Int. (%)

XIC of +MRM (3 p...
カラムD2
XIC of +MRM (3 p...

12Time, minMax. 2.2e4 cps.

1Time, min

10µL

0%

Rel. Int. (%)

カラムF10%
XIC of +MRM (3 p...

0%Max. 1.6e4 cps.

100%

Rel. Int. (%)

1012Time, minMax. 2.6e4 cps.

XIC of +MRM (3 p...

12Time, min

Rel. Int. (%)

10.5

3100%

Rel. Int. (%)

32.1 x 50

2 x 100 mm

12Time, minMax. 3.2e4 cps.

Rel. Int. (%)

2.0 x 50

カラムE0%
XIC of +MRM (3 p...

12Time, minMax. 2.2e4 cps.

Rel. Int. (%)

カラムD2100%

12Time, minMax. 2.0e4 cps.

Rel. Int. (%)

130%

XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

2230%
XIC of +MRM (3 p...

5µL

2 x100%75 mm

Rel. Int. (%)

2.22.0 x 50

Rel. Int. (%)

2.0 x 50

カラムC

12Time, minMax. 3.2e4 cps.

Rel. Int. (%)

カラムC
カラムD10%
XIC of +MRM (3 p...

12Time, minMax. 2.0e4 cps.

100%

Rel. Int. (%)

24100%0%
XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

232

カラムB2

12Time, minMax. 2.5e4 cps.

Max. 2.1e4 cps.

2 x100%
50 mm

10µL

100%

Rel. Int. (%)

22.0 x 50

0%
XIC of +MRM (3 p...

XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

2.0 x 50

カラムB2

100%

0%

XIC of +MRM (3 p...

Max. 3.2e4 cps.

100%

Rel. Int. (%)

カラムB1

12Time, minMax. 2.7e4 cps.

XIC of +MRM (3 p...

Rel. Int. (%)

測定時の最大圧力（MPa）
345µL

Rel. Int. (%)

粒子径（µm）
1.7Max. 2.9e4 cps.

Rel. Int. (%)

Rel. Int. (%)
Rel. Int. (%)

カラムA

サイズ（mmID x mm）
2.1 x 50

Rel. Int. (%)

Table 1. Columns used for analyses

カラムF30%

XIC of +MRM (3 p...
カラムB1

Rel. Int. (%)

製薬の分野において、高感度、ハイスループットは必須である。ハイスループットには、簡単なサンプルの前処理、たとえば、有機溶媒添加による除タンパクのみが好ましく、高感度を得るには注入量を増やすことが望ましい。ただ、有機溶媒リッチなサンプルをたくさん注入するとカラム保持時間が早くなる、ピーク形状が悪くなる、といった症状が現れ、また、有機溶媒濃度を低くするためにはサンプルの前処理にステップが加わり、スループットが落ち、また、サンプルの吸着が生じるかもしれない。
今回、我々は、超高圧LC-MS/MSシステムを用い、種々のカラムにおいて、サンプ
ル注入量を増加させたときの保持力の変化を評価した。
また、オンライン希釈によりサンプル注入量の増加に伴う保持力劣化、ピーク形状劣化の改善を試みた。

XIC of +MRM (3 p...

(a) カラムA
100%

Mass Spectrometry：AB/MDS-Sciex API 5000™ LC/MS/MS
イオンソース：ターボイオンスプレー
測定モード：MRM Positive
Q1/Q3：455/165 （Verapamil）
609/195 （Reserpine）
260/116 （Propranolol）

Rel. Int. (%)

INTRODUCTION

20µL
50%
0%

12Time, minFigure 7. オンライン希釈を用いた、様々な注入量での測定結果
左列は注入量 5µL、中列は10µL、右列は 20µL。
上から、オンライン希釈を用いないときの測定結果（カラムB1；2x50mm）、オンライン希釈を用いたときの測定結果（カラムB1；2x50mm）、オンライン希釈を用いたときの測定結果（カラムB1；2x100mm）

CONCLUSION
Allegro-AMR UHPLC Pump, HTC PAL AMR New Wash Station, API 5000™
を組み合わせた超高圧LC-MS/MSシステムを用い、カラムの保持力（有機溶媒耐性）について評価を行った結果、
1. カラムの保持力は粒子径に依存しなかった。ただし、保持力が非常に優れたカラムもあり、保持力はカラム充填技術（固定相表面状態の均一性）などに依存する可能性があることが示唆された。
2. カラムの長さにより保持力は多少向上した。
3. オンライン希釈により保持力を改善することができた。