和歌山県立医科大学の研究

和歌山県立医科大学
理事長・学長 岡村 吉隆
2017.2.6

先端研究発表【対象】
・がん、免疫樹状細胞の新機能の発見
先端医学研究所 生体調節機構研究部 教授 改正 恒康

・がん
血中循環腫瘍細胞を用いた肺がん薬物療法における効果予測バイオマーカーの開発とその診断技術の確立
内科学第三講座 教授 山本 信之

・心疾患
光干渉断層法(Fourier-domain Optical Coherence Tomography)
循環器内科学講座 教授 赤阪 隆史

平成29年2月6日
関西8大学シンポジウム

樹状細胞の新機能の発見

和歌山県立医科大学
先端医学研究所 生体調節機構研究部教授 改 正 恒 康

樹状細胞は自然免疫と獲得免疫を連関し、生体防御応答に関与する
抗原提示ウイルス

細菌

貪食T細胞
ヘルパーT細胞

異物
腫瘍細胞（抗原）（がん細胞） 樹状細胞
サイトカイン抗体

細胞傷害性T細胞
抗体産生細胞B細胞

XCR1を発現する樹状細胞は細胞傷害性T細胞を誘導し、感染やがんを防いでいる
抗原提示ウイルス

細菌貪食異物腫瘍細胞（抗原）（がん細胞）XCR1陽性
樹状細胞

細胞傷害性T細胞

T細胞

XCR1を発現する樹状細胞はヒトにも存在する。

その役割は？
生理的意義
病理的意義
XCR１陽性樹状細胞欠失マウスの作成、解析

XCR1陽性樹状細胞欠失マウスでは腸管T細胞が減って、腸炎が悪化した
XCR1陽性樹状細胞

体重変化 (%)
1.5% DSS

110
1009080

野生型マウス

70*0246 7 8 9 10
日数

下痢・血便のスコア（0-7）

XCR1陽性樹状細胞欠失マウス

765432100

1.5% DSS***

24*

6 7 8 9 10
日数XCR1陽性樹状細胞は、腸管T細胞の生存、活性化を支持し、腸炎の病態にブレーキをかけXCR1陽性樹状細胞欠失マウスでは皮膚がんが発症しなかった
XCR1陽性
樹状細胞皮膚腫瘍の数（平均）

野生型マウス

10864208

10 12 14 16 18 20

化学物質塗布後週数
XCR1陽性樹状細胞欠失マウス

XCR1陽性樹状細胞は皮膚がんの発がんに関与

XCR1陽性樹状細胞欠失マウスの移植により移植片対宿主病（GVHD)の病態が改善した
XCR1陽性樹状細胞欠失マウスの骨髄、脾細胞を移植 (n=6)

生存率（％）

100
75
502500p=0.0449
50100

野生型マウスの骨髄、脾細胞を移植 (n=6)
150

200

日数

XCR1陽性樹状細胞は移植片対宿主病（GVHD)の病態に関与

XCR1陽性樹状細胞欠失マウスを作成した。
その結果、XCR1陽性樹状細胞の新機能を発見した。
腸炎にブレーキをかける。皮膚がんやGVHDの病態に関与する。など。

ヒトの難治性腸炎、皮膚がん、GVHDではどうか？
抗ヒトXCR1抗体による解析、治療へ平成29年2月6日
関西8大学シンポジウム

血中循環腫瘍細胞を用いた肺がん薬物療法における効果予測バイオマーカーの開発とその診断技術の確立

和歌山県立医科大学
内科学第3講座
教授 山 本 信 之血中循環腫瘍細胞を用いた肺がん薬物療法における効果予測バイオマーカーの開発とその診断技術の確立
血中循環細胞 (circulating tumor cells: CTCs)診断による治療選択の最適化の実現～患者に優しい非侵襲的な治療効果予測バイオマーカーの開発～

本研究における開発項目① CTCを用いた抗PD-L1抗体治療における効果予測バイオマーカーの開発②

EGFR阻害剤耐性獲得肺がんにおけるCTC診断の開発③

次世代自動化CTC濃縮実用装置の設計開発
12血中循環細胞 (circulating tumor cells: CTCs)
CTC（末梢血循環腫瘍細胞）：原発巣であるがん組織から剥離して血液中を循環しているがん細胞• 進行乳がん、前立腺がん、大腸がんにおける予後診断として米国FDAにおいて承認されている（CellSearchシステムによる測定）• 肺がんにおいても予後マーカーとなることが報告されている• 肺がんにおける分子標的治療の進歩により、リアルタイムでの診断の必要性が高まっているが、高度な侵襲を伴う最生検は難しい

CTC• 低侵襲で簡便で、繰り返しての生体試料の採取が可能となる方法確立が必要• 従来のCTC測定システムは検出感度不足

13自動化マイクロキャビティアレイ・システム～日立化成との共同研究～
CTC entrapment and staining
Cartridge

蛍光顕微鏡による自動撮影

Metal filter

自動化装置の評価 (n=105)

CTCの判定

CTC

WBC
14

PD-L1検出の確立と臨床検体での測定
前臨床検討でのPD-L1染色確立
DAPI

CK

CD45

PD-L1

臨床検体でのPD-L1検出 (n=67)
DAPI

Merge

CK

CD45 PD-L1

Merge

CTC
(PD-L1-)

H820

H441
CTC
(PD-L1+)

A549
H23

CTCにおけるPD-L1陽性率

組織とCTCにおけるPD-L1発現の乖離例

Number of CTCs (cells/3mL)

120

DAPI
100
80

CK+/PD-L1PD-L1 -ve

CK+/PD-L1+
PD-L1 +ve

PT #5360

CK CD45 PD-L1 Merge

No PD-L1-positive
CTCs（PS 0%）

PD-L1-positive tumor（PS＞90%）4020

PT #340

PD-L1-positive
CTCs（PS 100%）

症例（n=67）

同一症例内のCTCにおいてもPD-L1の発現は一定でない

PD-L1-negative tumor（PS 0%）

Scale bar : 10 um15

薬物治療におけるバイオマーカーとしての検証①抗PD-1抗体（ニボルマブ）の効果予測マーカーとしてのCTCの評価（和歌山医大）• ニボルマブ治療を受ける非小細胞肺がん患者50例において評価

対象：進行肺がん症例• ニボルマブの投与前と投与後に経時的に末梢血を採取し、CTCにおけるPD-L1の発現を測定
腫瘍組織採取免疫チェックポイント阻害剤治療

PD

血液採取
０W

４W

８W

１２W

２４W

増悪時

• 各採血ポイントにおいて、血清中のサイトカインの発現を、網羅的に測定• 組織とCTCから抽出したDNAを用いて、NGSで全エクソーム解析を実施し、mutation burdenを評価

西日本がん研究機構（WJOG)における多施設臨床試験におけるvalidation studyへ②EGFR阻害剤耐性肺がんにおける臨床検体での検討（和歌山医大）
Merged

DAPI

CK

CD45

PC-9
（AXL陰性）AXL• EGFR阻害剤耐性原因をCTCを利用して行う（従来の組織生検の代替検体として）• HER、AXL等のEGFR阻害剤耐性獲得の原因となる分子の発現の検出を行う

MB-231（AXL陽性）• 測定系の確立後に臨床検体での評価を行う予定
細胞株を用いたAXL発現検出の確立

16今後の展望CTCを用いたゲノム解析（シングルセル解析）

Single Cell Controller (10X Genomics)

がんにおける不均一性（heterogeneity）の重要性が高まっており、がんを全体として捉えるのではなく、シングルセル単位で検討する必要性が高まっている。CTCについてもシングルセル単位での解析が必要であるが、技術的には困難であった。この課題の解決のために、シングルセルシーケンシングを可能とするテクノロジー導入を行い、シングルセルレベルでのゲノム解析を実施することで、がんの正確な分子生物学的特徴の解明を行う。

CTC研究開発よるイノベーション創出
本研究開発を通して、 CTCを対象として基礎研究のさらなる飛躍、発展が期待でき、CTCを標的とした創薬につながる可能性がある。診断法の開発にとどまることなく、創薬、研究の分野においても波及効果が期待でき、次世代のイノベーション創出につながる可能性がある。

CTC診断検査サービス事業整備へ向けた取り組み
ハイスループット処理を可能とする次世代CTC診断実用機の設計および製作を行い、将来的にはCTC診断検査サービス事業を目指す
17

平成29年2月6日
関西8大学シンポジウム

光干渉断層法(Fourier-domain Optical CoherenceTomography)

和歌山県立医科大学
循環器内科学講座
教授 赤 阪 隆 史光干渉断層法 (Fourier-domain Optical Coherence Tomography)
原理

心筋梗塞責任病変所見
Plaque rupture 60 – 70 %Plaque erosion 20 – 30 %Calcified nodule 5 – 6 %近赤外線（1300nm）を使った血管内のイメージング装置
高解像度（10-20 µm）
鮮明な画像（ high frame rate：100 frames/sec)
高速イメージ収集（ high speed pull back:20 mm/sec )Pre-PCI OCT (65 y.o. male, UAP)OFDI at culprit siteThrombus
Pre-PCI

20130410kh4089302

Plaque rupture
Pre-PCI

Plaque rupture
Pre-PCIPrototype short-wavelength infrared OCT (SWIR-OCT) system
in cooperation with Sumitomo Electric Inc.
Motor Drive Unit

OCT catheter

Imaging core
Torque wireProtective resin

Silicone oil

2.7Fr

OCT optics

Optical fiber
OCT light

Spectrometer

ComputerPrototype SWIR-OCT

Lipid

Infrared spectrum(raw data)

Power

Light source

Wavelength

SheathLens + Mirror

Fourier analysis
Spectroscopicanalysis

 近赤外線（1600nm）を使った
血管内のイメージング装置
Lipid スペクトロスコピー同時解析 高解像度（10-20 µm）
 脂質成分をカラー表示

Fourier-Domain μ-OCT
in corporation with Associate Professor Nobuhiko Ozaki,
Department of System Engineering, Wakayama University• 超広帯域発光InAs量子ドットを種光源とした波長掃引型レーザー（SS）を使った
血管内のイメージング装置• 超高解像度（3-5 µm）
左上図：内皮細胞上のリンパ球と単球
左下図：血小板血栓と多核球
右上図：コレステロール結晶
右下図：内皮細胞を穿通す
るコレステロール結晶と血小板血栓LM30µm

Liu L, et al. Nat. Med. 2011;17:1010-1014