アッケシソウ根圏に⽣息する植物⽣育促進細菌の同定
広島⼤学⼤学院⽣物圏科学研究科
上⽥晃弘【研究の背景】
⼈間の健康状態は体内や体表に⽣息する細菌群の影響を受ける。例えば、腸内細菌や⼝腔内細菌はそれぞれ腸の活動や⾍⻭の発⽣などに関わっているが、そこに⽣息している細菌種を解析することは宿主⽣物への影響を把握するうえで重要である。植物の根にも多くの細菌種が⽣息しているが、その細菌が植物に与える影響は不明な部分が多い。
アッケシソウは⾼等植物では極めて⾼い耐塩性を有しており、植物の耐塩性機構の解明のための研究材料として⾮常に有⽤であるが、その植⽣の減少から絶滅が危惧されている。本研究では、野⽣環境に⾃⽣するアッケシソウの⽣態系理解やその保護を⽬的として、アッケシソウの根の表⾯および内部に⽣息する細菌を単離し、これらの細菌群が持つ植物⽣育促進効果について調査を⾏った。
細菌が持つ植物⽣育促進効果の仕組みにはいくつかあるが、本研究ではそのうち、（１）
⼟壌に蓄積された無機能難溶性リン（リン酸カルシウム）の可溶化能、（２）⼟壌に蓄積された難溶性鉄を可溶化するシデロフォアの⽣産能、（３）植物ホルモンの⼀種であるオーキシン⽣産能、（４）植物根圏や⼟壌粒⼦表⾯での細菌の定着能に関わるバイオフィルム、の４種類について調べた。
なお、リンや鉄は植物の⽣育に必須な元素であるが、⼟壌中では植物にとって利⽤することが容易ではない形態（難溶性）で蓄積されることが多く、多くの植物にとってこれらの元素の⽋乏症がしばしば起こっている。また、オーキシンは植物の⽣⻑促進機能を待つホルモンであり、細菌によるこれら物質の供給は植物の⽣育に寄与すると考えられている。バイオフィルムとは細菌が物質表⾯に定着する時に形成する膜であり、細菌が⽣産・放出する粘性多糖類に細菌⾃⾝が取り込まれた複合体である。

【材料および⽅法】
１．材料
本研究では、平成 28 年９⽉２〜６⽇まで別寒辺⽜湿原に滞在し、アッケシソウ群⽣の有無の調査を⾏うとともに、そこに⾃⽣するアッケシソウ 10 個体の採取を⾏った。
アッケシソウ 10 個体の根を滅菌⽔中で激しく数回洗浄し､付着している⼟壌を取り除いた。その後、アッケシソウの根を滅菌した乳棒と乳鉢を使って滅菌⽔中ですりつぶし1た。すりつぶした根抽出液の上清を LB 寒天培地 (10g/L Tryptone, 5g/L Yeast extract,10g/L NaCl, 15g/L Agar) に塗布し、28℃で 48 時開静置培養を⾏った後、コロニーを形成した 625 種類の細菌を単離した。単離した細菌は終濃度 15％(v/v) Glycerol を添加して、超低温冷凍庫内で保存した。
単離された細菌 625 種はそれぞれ LB 液体培地 (10g/L Tryptone, 5g/L Yeastextract,10g/L NaCl)で振盪培養器内で 28℃で 24 時間、125 rpm の条件で培養を⾏った。その培養液の⼀部を使⽤して、以下の活性を測定した。

２．リン酸カルシウム可溶化能
難溶性リン酸カルシウム可溶化能の有無は以下の通りに検定を⾏った。LB 液体培地
で 24 時間振盪培養を⾏った細菌培養液５µL を NBRIP 培地(5g/L Ca3(P04)2, 5g/LMgCl26H2O, 0.25g MgSO47H2O, 0.2g/L KCI, 0.1g(NH4)2SO4, 10g/L Glucose, 15g/LAgar)に塗布した。NBRIP 培地は 120℃、20 分間、オートクレーブ器で⾼圧滅菌を⾏った。恒温培養器内で 28℃、３〜５⽇開静置培養を⾏った。NBRIP 培地は難溶性リン酸カルシウムのため、⽩濁した培地となるが、リン酸カルシウム可溶化能を持つ細菌コロニー周辺ではリン酸カルシウムの可溶化により培地が透明化される。コロニー周辺に透明化ゾーンが形成されるかどうかでリン酸カルシウム可溶化能の有無を判断した。

３．シデロフォア⽣産能
シデロフォア⽣産能の有無は以下の通りに検定を⾏った。 LB 液体培地で 24 時間振盪培養を⾏った細菌培養液５µL を CAS 培地に塗布した。CAS 培地は 760mL 蒸留⽔に100mL 改変 M9 最⼩培地塩 (6g/L Na2HPO4, 3ｇ KH2PO4, １ｇ NH4Cl, ５ｇ NaCl,30ｇ PIPES, ８mL 50％(w/w)NaOH)、10mL 20％ Glucose、30mL 10％ Casaminoacids, 60mL CAS 溶液(60.5mg Chrome azunol S in 10mL of 1mM FeCl36H2O, 10mMHCI)、40mL 1.8％(w/v) Hexadecyltrimethyl ammonium)に 15g/L Agar を加えて作成した。各培地成分は 120℃、20 分間、オートクレーブ器で⾼圧滅菌を⾏った。恒温培養器内で 28℃、１〜２⽇開静置培養を⾏った。 CAS 培地は⻘⾊の固形培地であるが、細菌がシデロフォアを⽣産して培地から Fe を遊離させた際には培地が⾚⾊へと変化する。
コロニー周辺に⾚⾊ゾーンが形成されるかどうかでシデロフォア⽣産能の有無を判断した。

４．オーキシン⽣産能
オーキシン⽣産能の有無は以下の通りに検定を⾏った。１µg/mL の L-tryptophan を2添加した LB 液体培地で 28℃、125rpm、48 時間振盪培養を⾏った。その細菌培養液
50µL に 100µL の Salkowsky 溶液 (81.11mg FeCl36H2O in 50mL of 35％ HClO4) を添加し、恒温培養器内で 28℃で１時間、静置した。反応後、培養液が⾚⾊に変化したものをオーキシン⽣産能有り、と判断した。

５．バイオフィルム形成能
バイオフィルム形成能の以下の通りに検定を⾏った。それぞれの細菌コロニーを200µL の LB 液体培地を添加した 96 ⽳プレートに接種し、恒温培養器内で 28℃、24 時間静置培養を⾏った。その後、96 ⽳プレート内に付着していない細菌を⽔道⽔で３回洗浄した後、付着した細菌および形成されたバイオフィルムを 0.1％(v/w) Crystalviolet 溶液で 30 分間、室温で染⾊した。染⾊後、96 ⽳プレートを⽔道⽔で３回洗浄して余分な Crystal violet 溶液を除去した後、95％(v/v)エタノールを添加した。細菌がバイオフィルムを形成してよく付着した場合、Crystal violet による紫⾊の染⾊が濃くなるため、染⾊の濃淡によリバイオフィルム形成能の有無を判断した。

【結果および考察】
トキタイ川河⼝域を中⼼に⼲潮時にアッケシソウ植⽣分布を調べた。湖⾯よリ１〜５ｍ程度の泥湿地帯にアッケシソウ群落が数か所⾒られたが、最⼤のものでも 10 ㎡程度の群落であった。湖⾯よりもさらに内地の植⽣はヨシ群落がほとんどを占めており、アッケシソウ植⽣は湖⾯からヨシ群落までの間に限られていた。群落を構成するアッケシソウはほとんどが草丈 20cm 以下であったこと、また下位葉が枯死している個体が多かったことから、アッケシソウの⽣育には好ましくない要因の存在が⽰唆された。アッケシソウ群落の⼟壌環境は、pH は弱アルカリ性であったほか、塩分濃度（EC 植）は２〜３dS/m と海⽔の約半分程度であった。
アッケシソウ根圏から単離された 625 種の細菌について、植物の⽣育促進に関わる特性の評価を⾏った。その結果、難溶性リンの可溶化能を特つものが 318 種、難溶性鉄の可溶化に関わるシデロフォア⽣産能を特つものが 155 種、植物ホルモンであるオーキシン⽣産能を持つものが 263 種、存在することが分かった。これらの細菌のうち、根圏定着能に関与するバイオフィルム形成能を有するものは 290 種あった。バイオフィ
ルム形成能の⾼さは植物根圏や⼟壌粒⼦表⾯での定着能の⾼さと関係があると考えられている。これら植物⽣育促進効果を特つ細菌の多＜がバイオフィルム形成を⾏うことで、アッケシソウ根圏やその⼟壌で定着し、アッケシソウの⽣育を促進しているのかもしれない。

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