中国浙江省龍游県産 烏衣紅曲
和久の黒麹菌の諸性質

豊・村井總一郎・建昌＊

菅間誠之助＊＊〈(株)ビオック・＊龍遊龍窖酒廠・＊＊浙江工業大学軽工系>
平成 7 年 9 月 5 日受理
Properties of Black Aspergilli Isolated from "Wuyihongqu"
Made in Longyousheng, Zhejiang，P.R. China
Yutaka WAGU, Soichiro MURAI,Jian Chang ZHONG＊ andSeinosuke SUGAMA＊＊(Bio'c Co., Ltd., Muro‑cho, Toyohashi,Aichi‑ken 441,
＊Longyou‑Longjiao Brewery, Longyousheng 3244003,

P.R.China and ＊＊Zhejiang University of Technology,
No.6 Zhaohui District, Hangzhou 310014 P.R. China)
From Wuyihongqu prepared for Wuyihongjiu‑making at Longyous‑Longjiao Brewery,Zhejiang, P.R. China, 107 spores of mold, 105〜l06 cells of bacteria and 104 cellsof yeast were isolated per g of qu, respectively. A11 nine strains purely isolated
from the qu were identified as Aspergillus saitoi SAKAGUCHI et al.. Activitiesof α‑amylase, gluco‑amylase, acid‑protease and acid‑carboxypeptidase of rice‑quprepared by the above nine strains were over two times as high as those of rice‑quinno‑culated with A.saitoi strain KBN 2200, which is practically used inAwamori‑qu making.
Key words：烏衣紅曲・黒麹菌・酵素活性
words

緒 言
中国で黄酒醸造に用いられる散麹には熟麦曲(原料は粗割砕小麦)，紅曲(米，陸稲米，粳米)，烏衣紅曲( 米)などがあり，いずれも原料穀類は蒸して使われる 1)。福建省から浙江省南西地域でつくられている烏衣紅曲は紅麹菌，酵母，黒麹菌の混合培養麹である。1960 年代に浙江省平陽県などで生産されていた烏衣紅曲より，糖化力が強く，生酸力が弱く，増殖の速やかなことを指標に分離，選択された黒麹菌は，中国科学院微生物研究所において Aspergills awamori NAKAZAWA と同定され，中国菌種保蔵委員会にAS 3.4319 として保存されている 2)。筆者らは浙江省龍游県産黄酒用烏衣紅曲より黒麹菌を分離・同定し，その酵素活性，生酸性を調べるとともに，烏衣紅曲と泡盛黒麹との関連性についても考察した。

実 験 方 法1. 供試試料龍游県龍游龍窖酒廠において 1993 年 10 月に製造した烏衣紅曲を供試した。本曲は精米歩合 90%前後の米(硬質米)を多少芯に生が残る程度に蒸し(吸水歩合 130%未満)，これに紅麹菌・酵母の混合前培養液(紅曲酒膠)と黒麹菌種麹(龍窖酒廠で斜面培養より蒸米を基質としてフラスコ培養したもの)を接種し，床麹法により，品温を最高 42℃から徐々に 30℃まで下げ，種付け後 7 日で出麹したものであり，製麹中に麹の水分補正と品温調節のため，製麹 3 日目から白米重量の 12〜16%に相当する水を 3 回に分けて散水している。本曲は完全粒と半割れ程度の米粒とからなる散麹(出麹歩合 60%)で，紅色の麹粒表面は黒色の分生胞子を着生した黒麹菌の菌糸で被われている。
2. 糸状菌，酵母，細菌の分離(1) 使用培地i) 麦芽エキス寒天培地：グルコース 2%，ペプトン O.1%，麦芽エキス 2%，寒天 2%。
ii) YM 培地：グルコース 1%，ペプトン 0.5%，麦芽エキス 0.3%，酵母エキス O.3%，寒天 2%。
iii) Nutrient Agar Difco(2) 分離法
試料 5g を 50m1 の滅菌生理食塩水(0.1% Tween80 を含む)に懸濁し，撹拝後，10 倍段階希釈を行い，糸状菌は麦芽エキス寒天培地の平板塗抹法，酵母は YM 培地，細菌はnutrient agar を使用し，混釈法により菌数を測定した。なお,耐然性胞子を形成する好気性細菌は試料希釈液を 85℃，10min 熱処理後同様に測定した。また，糸状菌及び酵母の分離・計数には細菌の生育を抑えるため，培地にクロラムフェニコール 50ppm，ペニシリン 50 単位/ml を加え，細菌の分離には糸状菌を抑えるためカビサイジンを0.1mg/m1 添加した。
3. 糸状菌の同定
麦芽エキス寒天培地による平板培養で得られたコロニ一を釣菌し，平板培養を繰り返すことにより，純粋分離して得られた菌株を坂口他 3）の方法により同定した。
4. 酵素活性の測定
麹のα‑アミラーゼ(以下 AAase と略)，グルコアミラーゼ(GAase)，酸性プロテアーゼ
pH3.O(APase)，酸性カルボキシペプチダーゼ(ACPase)の活性は国税庁所定分析法 4)にしたがい測定した。たお，試料より純粋分離した糸状菌は岡崎他 5)の方法により製麹し，出麹について酵素活性を調べた。すなわち，分離糸状菌の斜面培養より分生胞子を釣菌し，これを O.1%Tween80 添加滅菌生理食塩水に懸濁し，熱風乾燥法で調製したα化米に5×105 胞子/g・α米となるように接種するとともに最終的なα米の水分含量を 33.3%に調整した。製麹は恒温恒湿器内で温度 35℃，相対湿度 95%に 24 時間，以後は温度 30℃，相対湿度 90%で 18 時間の計 42 時間行った。

実 験 結 果1. 烏衣紅曲の菌相烏衣紅曲から分離された糸状菌，酵母，細菌の菌数を Table1 に示した。曲 1g 当たり分生胞子として 8.6×107 存在する糸状菌はすべて黒色分生胞子を着生する菌株であり,紅麹菌は分離されなかった。ホモジナイズした曲を接種しても，培地に CZAPEK DOX 寒天・加糖馬鈴薯寒天・オートミール寒天を使用しても，また，培養温度を 30，35，40℃としても紅麹菌は分離されず，試料の保存，運搬中に死滅したものと思われる。
曲 1g 当たり 104 のオーダーで存在する酵母の大部分は球形〜卵形を呈し，出芽により増殖する発酵性酵母であった。烏衣紅曲黄酒の醪(酒母を兼ねる)は烏衣紅曲に対して5 倍量の水を加える全麹仕込みで，24℃から 3O℃にいたる品温経過をとり，4〜5 日目に蒸煮軋砕米を投入する(投入前の pH は 4 前後)。通常，仕込み時に酵母添加は行わず，
曲が酵母の供給源となっている。分離した酵母の性質については別に報告する。
曲の細菌数は,わが国の清酒用米麹(麹 1g 当たり一般細菌が 102〜105，耐熱性細菌が101〜104 存在)に比べて約 10 倍多く，両者の製麹時における微生物管理の違いによるものと思われる。
2. 分離糸状菌の同定
烏衣紅曲から純粋分離した 9 株の糸状菌について，分生子頭の形状，菌糸の隔壁の有無など各器官の形態的性質を調べた結果，すべて Aspergillus 属菌であった。
これらは共通して，①分生胞子の色は黒褐色，②分生胞子柄の長さは 0.5〜O.9mm，③基底梗子(metu1a)を有す。④分生胞子の表面はほとんど滑面という形態的特徴を有し，さらに坂口他 3)の方法で亜硝酸資化性を調べたところ，9 菌株はすべて亜硝酸を資化せず，坂口他の分類表 3)により Aspergillus saitoi SAKAGUCHI et al.と同定した。
3. 烏衣紅曲より純粋分離した黒麹菌の特性(1)

製麹特性対照として使用した(株)ビオック保存の A.saitoi の標準菌株 KBN 2200 に比べ烏衣紅曲から純粋分離した菌株は，①蒸米上での比較増殖速度はほとんど同じで，かつ菌体生産能はやや低いが，誘導期が短く(Tab1e2)，②麹の締まりが極めて弱く，③分生胞子の着生も良好という特性を示し，製麹の容易な菌株であったが，出麹にややカビ臭があった。
カビ臭は菌株固有の特質と考えられ，製麹操作などでカビ臭の生成を抑制することは極めて困難である。しかし，烏衣紅曲ではカビ臭は認められず，Monascus 属菌や酵母との混合培養によりカビ臭がマスクされるとすれば，カビ臭のある有用麹菌の利用を図るうえで極めて興味あるところで，今後検討する予定である。

(2) 純粋分離菌で製麹した米麹の酸度と酵素活性分離した 9 菌株についての測定結果を Table3 に示した。対照株である KBN 2200 に比べ生酸性は同等乃至やや高い程度であった。また AAase，GAase，APase，ACPase の活性は，すべての分離株で対照株の約 2 倍乃至それ以上に強かった。

考 察9)

鈴木 ，小泉10)は烏衣紅曲に生育している黒麹菌を A.niger と紹介しているが，中国科学院微生物研究所 2)で A.awamori と同定されて以来，中国の研究者は烏衣紅曲の黒麹菌は A.awamori とみなしている。しかし，筆者の一人，菅間が 1994 年 10 月，中国浙江省の文成県醸造廠で烏衣紅曲用種菌として保存されている 3 本の斜面培養を観察した
ところ，分生胞子の色は黒色で，A.awamori ではなく A.saitoi であろうと思われた。
なお，菅間他 11)が 1974 年，泡盛麹及びその製麹環境試料について黒麹菌相を調査した
結果，56%が A.saitoi で，残りの 44%が A.awamori であった。烏衣紅曲酒の製法は泡盛の国産化開始の約 100 年前に始まる琉球国と中国との人的交流の窓口であった福建省
より浙江省へ伝えられたものであり，烏衣紅曲から A.saitoi が分離されたことは，泡盛黒麹菌の起源を探るうえで興味あることである。

要 約(1) 供試した烏衣紅曲より糸状菌が胞子として 107/g，細菌が 105〜106/g，酵母が 104/g分離された。
(2) 烏衣紅曲よリ純粋分離した 9 株の糸状菌はすべて A.saitoi であった。
(3) 烏衣紅曲より分離された A.saitoi で製麹した米麹のα‑アミラーゼ，グルコアミラーゼ，酸性プロテアーゼ，酸性カルボキシペプチダーゼ活性は泡盛用として使用されている A.saitoi に比べて約 2 倍以上の活性を示した。
文 献1) 景泉，洪森，海波編：酒曲実用技術，中国食品出版社(1988)
2) 傳金泉：中国醸造，No.4，16(1988)
3) 坂口謹一郎，飯塚 広，山崎千二：応用菌学，3，53，65，97(1949)；応用菌学，
4，1(1950)
4) 注解編集委員会編：第 4 回改訂国税庁所定分析法注解，(財)日本醸造協会(1993)
5) 岡崎直人，弘中吉雄，島崎順一，菅間誠之助：醸協，73(5)，402‑404(1978)
6) N.OKAZAKI and S.SUGAMA：J.Ferment.Technol., 57，413‑417(1979)
7) 五味勝也，岡崎直人，田中利男，熊谷知栄子，井上 博，飯村穣，原 昌道：醸協，82(2)，130‑133(1987)
8) J.L.REISSIC，J.L.STROMINGER，L.F.LELOIR：J.Biol.Chem.，217,959(1955)

9) 鈴木明治：藤巻ら編『食品工業』初版，p.403，恒星社厚生閣(1985)
10) 小泉武夫：野白ら編『醸造の辞典』，p.392，朝倉書店(1988)
11) 菅間誠之助，西谷尚道，大場俊輝，河内邦英，照屋比呂子，原昌道，村上英也：

醸協，70(8)，595‑598(1975)
Table 1Numbers of Viable cells detected from
Wuyihongqu tested.(Cell numbers/g‑Qu)

Bacteria

2.3×106

Ditto(aerobic spore formers)

1.7×105

Yeast

3.1×104

Mold

8.6×107

Table 2 Growth Characteristic values of A.saitoi isolated
from Whyijongqu

Strain No.

Ｔ１．０

μＯ２ｍａｘ

1

17.1

0.240

3.24

2

16.7

0.241

3.14

3

16.4

0.234

3.19

4

16.5

0.237

3.15

5

17.4

0.239

3.23

6

16.5

0.241

3.11

7

17.4

0.248

3.22

8

16.5

0.235

3.19

9

16.6

0.243

3.11

Average

16.8

0.240

3.18

KBN2200*

18.60.2473.41

Growth characteristic values was determined by themethod of OKAZAKI and SUGAMA６）.
* A.saitoi KBN2200 is practically used forAwamori-qu-making.

Table 3Properties of rice-qe prepared by strains of A.saitoi isolated from
Wuyihongqu as seed.
(acidity: ml N/10 NaOH/2g wet koji; enzymatic activity: unit/g wet Qu)

Acidity
Strain No.

NAcGlc-NH2

Enzyme activities a

Enzyme activities b

AAase GAase APase ACPaseAAase GAase APase ACPas
e19.3

1981

197

174

17418

8522

99888793

4302

27.3

1815

192

179

19786

9717

10699

10901

5354

3

8.2

1865

216

211

17072

8252

116

113

9154

4425

4

7.3

2060

200

188

20576

8329

97

91

9988

4043

58.0

1959

210

192

19391

6979

107

98

9898

3563

6

7.3

1887

214

192

19984

7095

113

102

10590

3760

79.0

2004

233

218

19243

6632

116

109

9602

3309

8

9.0

2094

211

197

20477

7057

101

94

9779

3370

98.8

1856

220

182

19046

5167

119

98

10262

2784

Average

8.2

1947

210

193

19221

7528

108

99

9885

3879

A.saitoi

7.2

2220

95

105

8635

3201

43

44

3890

1442

* Acidity : ml N/10 NaOH/2g wet koji.
** Rice-qe was digested with enzyme solution containing 0.5%
each of Novozym,Yatalase and Chitinase(Sigma)by GOMI’S７）
method and Liberated N-acetylglucosamine(abbreviated asAG)was measured by REISSIG’S method.