Vol.19 No.1
Dec 2010

巻頭論文
STR/OrtCrlj マウスの病態とその評価
マウス臍帯血移植モデル

巻 頭 論 文STR/OrtCrlj マウスの病態とその評価
マウス臍帯血移植モデル

STR/OrtCrlj マウスの病態とその評価
内田健太郎 1、占部 憲 1、成瀬康治 1、高相晶士 1, 糸満盛憲 2
北里大学医学部整形外科学 1
九州労災病院 2１．

2-1. 軟 X 線を用いた STR/OrtCrlj
膝関節の形態学的検討

はじめに

STR/1N は、高脂血症を示す STR/N (F29)よりまだら模様で膝関節変形を呈する個体として分離

15,25,35,45 週齢 雌雄の STR/OrtCrlj の軟Ｘ線をされた。STR/Ort は STR/1N より派生した１系統撮影した。軟Ｘ線による評価では、大腿骨内顆であり[1]、欧米を中心に変形性膝関節症の基礎と外顆が完全に重なる側面像を用いることが極研究に用いられている。本稿においては、米国めて重要である。軟Ｘ線装置は、Softex 社（東京）チャールス・リバー社（ボストン）で SFP 化さ製 Type-CMB4 を用いた。撮影条件は、管球かられた後、日本チャールス・リバー株式会社（神の距離 40cm, 電圧 25kV, 電流 10mA, 焦点 R,奈川）から STR/OrtCrlj として 2005 年から 2008

照射時間 10 秒とした。臨床で用いられる膝 OA

年 12 月まで販売された。我々は、様々な側面かのＸ線分類である Kellren & Lawrence 分類及び

ら STR/OrtCrlj の病態について検討を行ってきた。

腰野分類を参考に評価した。評価項目を表１に、本稿では変形性膝関節症、高脂血症の二つの側各評価項目に対応する X 線像を図１に示した[2]。

面から検討した結果得られた STR/OrtCrlj に関す

軟Ｘ線上の異常所見 35 週齢以上の雄 STR/OrtCrlj

る知見と我々が行ってきた評価法を述べることで陽性率が高かったが、非発症齢、左右差を認にする。結果の詳細については文献を参照してめた[2]。45 週齢 雌 STR/OrtCrlj の膝関節に異常ほしい[2;3]。

所見は認められなかった。 これらの結果はこれまでの報告と一致するものであった。

2. 変形性膝関節症自然発症マウスとしての STR/OrtCrlj
STR/Ort は加齢とともに膝関節の変形性変化が進行する変形性膝関節症自然発症モデルマウス
として基礎研究に用いられている。これまでにいくつかの膝関節の変形性変化所見が報告されているが、それらの所見はいずれも個体差や左右差が存在する。我々は、これまでに報告されている STR/Ort の所見との比較検討を行うともに、個体差や左右差の少ない所見について検討した。本稿では評価法を中心に述べることにする。結果の詳細については文献[2;3]を参照してほしい。

12図 1.

35 週齢 雄 STR/OrtCrlj の軟 X 線像における異常所見
A. 関節裂隙の狭小化
B. 軟骨下骨の骨化像
C. 骨棘形成
D. 関節周囲の石灰化
E. 膝蓋腱の石灰化
F. 膝蓋骨横径の増大化
G. 膝蓋骨厚みの菲薄化
H. 膝蓋骨の骨折・断片化
I. 大腿脛骨関節の脱臼・偏位3

2-2-1. 矢状断面組織像を用いた評価

2-2. STR/OrtCrlj 膝関節の組織学的検討

STR/Ort を用いた論文の多くは、矢状断面組織像を用いて評価している。そこで、まず初めに矢ICR マウス、CBA/JN マウスをコントロールとし状断面での評価を行った。矢状断面を用いた評て 5, 10, 15, 20, 26, 35, 45 週齢 STR/OrtCrlj 膝関価では 26 週以降で異常所見陽性率が高くなった。

節の組織学的検討を行った。後肢を採取後、4%

組織学的異常所見は、脛骨側の前十字靭帯付着パラホルムアルデヒド燐酸緩衝液（Wako）にて部の関節軟骨と大腿脛骨関節の内側において早48 時間固定後、20% EDTA 溶液で 2-3 週間脱灰期から認められた。これまでの報告と同様、矢を行った。パラフィン包埋後、矢状断面、水平状段面を用いた大腿脛骨関節の組織学的評価で断面での薄切切片を作成した。切片の厚さはは個体差、左右差を認めた[2] 。

3µm とした。ヘマトキシリン、エオジン染色、サフラニン-O 染色を行った後、Mankinhistological-histochemical grading (表 2) を用いて評価した[2]。

42-2-2. 水平断面組織像を用いた評価

膝, 20 週齢 12 匹 24 膝に対水平断面組織像を軟Ｘ線による評価、矢状断面での組織学的検用いて膝蓋大腿関節の組織学的検討を行った。

討では、これまで同様個体差、左右差が認めら水平断面での薄切切片の作成法を図２に示した。

れた。我々は、個体差、左右差の少ない所見にその結果、大腿骨側の関節軟骨組織の異常所見ついて検討を行った。STR/OrtCrlj は加齢に伴っ(図 3)が個体差、左右差なく認められることが明て膝蓋骨脱臼の頻度が増加することから、早期らかとなった[2]。に膝蓋大腿関節に組織学的変化が認められる可能性があると考えた。我々は、10 週齢 10 匹 20

図 2. 水平断面での薄切切片の作成法
A. 凍結切片用包埋皿をトレイに固定後、大腿骨を包埋皿側にして膝蓋骨が真下になるよう設置する。
B. ３％アガロースゲルを包埋皿に流し込む。
C. アガロースが固まったら組織を包埋皿からはずし実線にそってカットする。
D. 薄切面が膝蓋骨軸と垂直になるよう包埋する。

5

図 3. 水平断面の組織像
A.

水平断面組織像の模式図

B.

水平断面組織のサフラニン-O 染色像

C,D,E.

領域 B の拡大像,

C-1, -2. 正常な膝蓋大腿関節のサフラニン-O 染色像
D-1, -2. サフラニン-O 染色性の低下、細胞勾配の異常, 細胞密度の増加が認められる
E-1, -2. サフラニン-O 染色性の著しい低下, 細胞勾配の異常, 細胞密度の著しい増加が認められる。
（文献[2]より一部抜粋、改変）

6

3-1-2. 総コレステロール、トリグリセリド

3-1. 肥満、高脂血症の観点から観た
STR/OrtCrlj の特性

1963 年、STR/1N は DBA/2JN, A/LN より血前述の通り STR/OrtCrlj は高脂血症を示す

漿コレステロール値が高いことが報告され

STR/1N より派生した系統である。STR/1Nて以来、著者の知るかぎり、STR/1N の高脂の高脂血症については、1963 年 Yamamoto血症に関する報告はなされていない。また、等によって報告されているが[4]、STR/Ort

STR/Ort に関する論文報告はなく、学会レベに関する報告はなされていない。また、

ルでの報告に限られている。我々は、

STR/1N, STR/Ort は肥満を呈するとの報告

STR/OrtCrlj の血清総コレステロール、トリがなされている[5]。我々は、肥満、高脂血グリセリドを ICR, CBA, C57BL/6J, db/db と症の観点から STR/OrtCrlj の特性を検討し比較した。測定にはラボアッセイシリーズた。結果の詳細については文献[3]を参照し（和光純薬工業（株））を用いた。STR/OrtCrljてほしい。

は他系統に比べ、コレステロール高値、トリグリセリド高値であることが明らかとな

3-1-1. STR/OrtCrlj における肥満った（図 4A, B）[3]。ヒトの高脂血症は WHO

これまでの STR/Ort の肥満に関する報告は、により、総コレステロール、トリグリセリ肥満であるとするものとそうではないとす

ド、リポ蛋白のプロファイルよって定義さるもの両方が存在する。これまで肥満であれているが、肥満と同様、マウスにおけるるとしているのは、体重を測定したもので定義は存在しない。今後、STR/OrtCrlj が高あり[5]、肥満でないとするものは皮下と腹脂血症モデルと成り得るかは、リポ蛋白等部の脂肪量を測定したものである[6]。我々さらなる詳細な検討が必要と考えられる。

は、ICR, CBA, C57BL/6J, BKS.Cｇ-Dock7m +/ + Leprdb/J（以下 db/db） マウスとの体重比較を行った。その結果 STR/OrtCrlj の体重は、3-1-3. インスリンインスリン抵抗性や高インスリン血症は、CBA, C57BL/6J マウスより高値を示したが、高血圧や高脂血症と密接に関連することがICR や肥満マウスとして知られる db/db より知られている。現在、インスリン抵抗性の低値を示した[3]。内臓周囲の脂肪重量につ実験モデルとしてマウスでは B6.V-Lepob/Jいても検討したが、過去の報告同様 CBA マ（以下 ob/ob）や db/db マウスなどが用いらウスと同等であった。ヒトにおける肥満はれている。我々は、STR/OrtCrlj が高インスBMI で定義され、近年は内臓脂肪蓄積型肥リン血症を示すかを検討した。測定にはマ満も注目されている。マウスにおける肥満

ウス・ラットインスリン ELISA キット（㈱の定義は存在しないが、体重の関点から見森永生科学研究所製）を用いた。STR/OrtCrljても内臓脂肪の蓄積（後述）の観点から見は C57BL/6J, CBA, ICR に比べ血清インスても、STR/OrtCrlj は少なくとも過度の肥満リン値が高値であったが、db/db マウスに比ではないと言えるだろう。

べると低値であった(図. 4D)。STR/OrtCrlj
がインスリン抵抗性を示すかについては更なる検討が必要であると考えられる。

7図 4.

10 週齢 STR/OrtCrlj, C57BL/6J, CBA, +/db, db/db マウス血清における生化学的検査値
A. トリグリセリド
B. 総コレステロール
C. グルコース
D. インスリン の濃度（文献[3]より一部抜粋、改変）

8

3-1-4. 肝臓への脂肪沈着
肝臓や筋肉への脂肪沈着は高インスリン血

グリセリドは C57BL/6J より高値を示した症やインスリン抵抗性を惹起することが知が、CBA, +/db との間に有意な差は認められられている。 我々は、STR/OrtCrlj の肝臓なかった（図 5）。また、内臓脂肪蓄積が認において脂肪沈着が認められるか否かを検められる db/db に比べると STR/OrtCrlj 肝臓討した。脂質の抽出には Folch 法を用いた。

におけるトリグリセリド量は 1/4 程度であ10 週齢 STR/OrtCrlj 雄における肝臓のトリった。

図 5. 肝臓トリグリセリド量
10 週齢 STR/OrtCrlj, C57BL/6J, CBA, +/db, db/db マウスの肝臓におけるトリグリセリド量（文献[3]より一部抜粋、改変）

93-2-3. アディポネクチン

終わりにヒト、サル、マウスにおいて、血中アディポネ

STR/OrtCrlj の変形性膝関節症、高脂血症の病態

クチン濃度は全身のインスリン感受性と強く相とその評価法について述べた。STR/OrtCrlj は変関することが明らかとなっている。我々は、

形性膝関節症、高脂血症の病態を持つユニーク

STR/OrtCrlj における血清アディポネクチン濃度なマウスである。STR/OrtCrlj は 2008 年 12 月ををマウス/ラットアディポネクチン ELISA キット

もって販売が終了したが、凍結受精卵として保（大塚製薬㈱製）を用いて測定した。

存されており、今後も日本チャールス・リバー

STR/OrtCrlj における血清アディポネクチン濃（株）より入手可能である。STR/OrtCrlj が変形度は、ICR, CBA, C57BL/6J, db/db に比して低値を性関節症や高脂血症のモデルとして使用される示した[3]。STR/OrtCrlj における高インスリン血ことを期待している。

症と低アディポネクチンとの関連性については今後更なる検討が必要である。

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10マウス臍帯血移植モデル
内田健太郎 1

占部 憲 1

成瀬康治 1

高相晶士 1

糸満盛憲 2

北里大学医学部整形外科学 1
九州労災病院 2

はじめに移植モデルについて紹介する。

臍帯血移植はドナーの負担がない、サイトメガロウイルスをはじめとして感染症

マウス臍帯血移植モデル

伝播の可能性が低い[1]、
急性 GVHD（Graftマウス臍帯血移植モデルを用いた臍帯由Versus Host Diease 移植片対宿主病）の発来 血造血 幹細胞 移植の研 究は 2003 年

症頻度が低い[2,3]などの利点を有するこMigishima 等、2007 年 Oikawa 等によってとから、造血器悪性腫瘍、骨髄不全症候

報告されている[10,11]。近年、我々は、こ群、骨髄異形成症候群、先天性代謝性疾のモデルを用いて臍帯血移植後の臍帯血患の治療の選択肢の一つとして注目され由来間葉系細胞の動態について報告したている。一方で、骨髄移植と比較して生[12]。ここでは、マウス臍帯血移植モデル着率が低いことが知られており[4,5]、生の作成手順と移植後のキメラ率測定、臍着率向上のための基礎研究が数多く行わ

帯血由来細胞の局在の観察法について述れている。臍帯血移植の基礎研究ではヒべる。

ト臍帯血由来の造血幹細胞を免疫不全マウスに移植するモデルが多く用いられている[6-9]。このモデルは実際に治療に使用されるヒト臍帯血由来造血幹細胞の特性を知る上で極めて重要なモデルである。
近年、遺伝子改変マウスを用いることによって造血幹細胞のホーミングや増殖、分化制御に関与する因子の同定が可能となった。従って、マウス臍帯移植モデルは臍帯血移植の生着率向上のための基礎研究に有用なツールであると考えられる。
ここでは我々が用いているマウス臍帯血11マウス臍帯血移植モデルの作成手順の入ったシャーレに移し、実体顕微鏡下（図 1）で臍帯を切断する。3-5 分後間静置後、シGFP トランスジェニックマウス オスとャーレ中の臍帯血を採取する。臍帯血中

C57BL/6J マウス メスを交配させる。GFPの有核細胞を分離後、10.5 Gy γ線照射しトランスジェニックマウス同士を交配した C57BL/6J に移植する。有核細胞分離かても良いが母親マウス由来の細胞が混入

ら移植までの時間をできるだけ短くするした場合に胎児由来のものと区別できなことが高いキメラ率を得るのに極めて重い。そのため、メスは C57BL/6J を用いた要である。そのため、１腹（6-8 胎児）ず方が良い。胎生 18 日の胎児を取り出し、つ臍帯血を採取し、移植することをお勧羊膜を切除する。
胎児をヘパリン含有 PBSめする。

図 1. マウス臍帯血移植モデルの作製手順

12移植後のキメラ率測定

強すぎるため、他のマーカーの検出の際移植後、フローサイトメトリーを用いてに妨げとなる。

末梢血中の GFP 陽性細胞の割合を測定する。3-4 胎児分の臍帯血由来の有核細胞を移植すると 3 ヶ月後 80-90% 程度のキメラ率が得られる（図 2A）。また、造血幹細胞の B 細胞、T 細胞など各細胞系統への分化が確認できる（図 2B-D）[10,11]。
ホモマウスを用いると GFP の蛍光強度が

図 2. マウス臍帯血移植後の造血系細胞の再構築
A.キメラ率B. CD45R
C. CD4
D.CD8
E. CD11b
F. Gr-113臍帯血由来細胞の局在の観察

蛍光は保たれる。凍結切片（硬組織の場4%パラホルムアルデヒド燐酸緩衝液を用合は非脱灰凍結切片）の作成により、骨いて還流固定を行った後に、組織をカル髄やその他の組織のマウス臍帯血由来細ボキシルメチルセルロース（硬組織でな胞（GFP 陽性細胞）の局在が観察できる

ければ OCT コンパウンドでも良い）に包（図 3）[12]。

埋すると GFP の蛍光が良く保たれる。浸漬固定の場合でも 4%パラホルムアルデ
ヒド燐酸緩衝液を用いて固定することで

図 3. マウス臍帯血移植後の骨組織におけるマウス臍帯血由来細胞（GFP陽性細胞）の局在の観察終わりに因子の同定を行っていきたいと考えてい今後、遺伝子改変マウスの臍帯血移植やる。また、本モデルを用いて生着を促進ドナーマウスに遺伝子改変マウスを用いする因子の模索も行っていきたい。

ることで臍帯血由来細胞の生着に重要な

14

参考文献
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15著者プロフィール
うちだけんたろう

内田 健太郎
平成 16 年 北里大学医療衛生学部卒業
平成 21 年 北里大学大学院医療系研究科博士課程終了
平成 21 年 北里大学医学部整形外科学 助教
研究テーマ
幹細胞研究、骨軟骨代謝に関する研究をおこなっている。

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