研究論文

天然高分子系複合膜の成膜
加藤一徳＊１

金山賢治＊１

Preparation of Hybrid Membranes Made of Natural Polymers
K a z u n o r i K AT O H , K e n j i K A N AYA M A
Owari Textile Research Center, AITEC*1
羊毛から抽出したケラチンを溶解した水溶液にキトサン水溶液を滴下することによって、カプセルを作製することができた。アニオン性のケラチンとカチオン性のキトサンが双方の溶液の接触面（球面）上で会合して成膜されたためとと考えられた。この膜を赤外分光分析で調べた結果、ケラチンとキトサンに起因する吸収バンドが観察された。また、カプセル内にヘモグロビンを導入し、その放出挙動を調べた。ヘモ グ ロ ビ ン の 放 出 速 度 は 、カ プ セ ル 作 製 時 の ケ ラ チ ン 水 溶 液 と キ ト サ ン 水 溶 液 の 濃 度 に 依 存 し て 変 化 し た 。

１. はじめにや DDS（ドラッグデリバリーシステム）材料、など医用

ケラチンは髪、羊毛、爪などを構成する繊維状タンパ材料として使用するためには、スポンジやマイクロカプク質である。タンパク質のアミノ酸配列から、ケラチンセルなどに成形されなければならない７) 。そこで、筆者の分子骨格には比較的たくさんのシステイン残基（5〜ら ８） は、NaCl を細孔の鋳型とした新規な成型方法によ10 mol%）が存在し、それらが分子間ジスルフィド架橋り、気孔率 90%以上、細孔径 100〜500μm のケラチンス

１）。また、細胞接着性タンパク質でポンジを作製した。フィルム上における細胞培養と同様あるフィブロネクチンと同様に、細胞の接着に関与するに、スポンジ上においても細胞は多数増殖することが認

アミノ酸配列（RGD、LDV）が羊毛ケラチンには存在するめられた。

結合で結ばれている

２），３）。したがって、ケラチンを動物細胞の培養担体などの医用材料として利用できると期待される。
山内ら

４)

本稿では、ケラチンから成るカプセルを作製する方法を検討した。アニオン性高分子とカチオン性高分子とのは還元剤と界面活性剤を併用して羊毛から間でポリイオンコンプレックス（PIC）を形成させるカケラチンを高収率で抽出する方法を開発した。筆者ら ５）

プセル化方法は以前から知られ、現在においてもカプセは、羊毛から抽出したケラチン水溶液をスプレードライ

ル作製方法の主流である９）−１４）。ケラチン単独でのカプ乾燥して、粉末とし、その粉末を圧縮成型して緻密なフセル化は知られていないが、ケラチンはアニオン性であィルムを作製した。このフィルム上で動物細胞を培養しるため、代表的なカチオン性高分子のキトサンと複合化たところ、細胞はフィルム表面に接着し、活発に増殖ししてカプセルを作製することを試みた。また、モデル薬た。

物としてヘモグロビンをカプセル内に導入してその徐放

現在、医用に使用される高分子素材として、コラーゲン、キトサンやポリ乳酸などが挙げられる

６)性を検討した。

２. 実験方法。このような高分子は、元々体内に多く存在している、または、そ2.1 試料の加水分解物が代謝中間体である。外科手術用縫合糸と羊毛を二亜硫酸ナトリウム、尿素、ドデシル硫酸ナトして商品化されているほか、再生医療における細胞の足リウムの混合水溶液に加えて 100℃、30 分間還元処理す場材料として検討されている。コラーゲンはウシ由来のることにより、羊毛からケラチンを抽出した。そして、ものが多いので、BSE 問題などでその使用が危惧されて得られたケラチン水溶液をセルロースチューブ（分画分いる。また、こうした状況の中で、コラーゲンやポリ乳子量：12,000〜14,000）に充填し 3 日間透析した後、ロ酸以外の天然および合成高分子、例えば、キチン、キトータリーエバポレーター（N-11、東京理科器械㈱製）でサンやアルギン酸もまた医用高分子素材として活発に研濃縮した。そして、精製ケラチン水溶液を 60℃でスプレ究されている。

ードライ乾燥（Pulvis Mini-Spray GA32、ヤマト科学㈱上記の高分子を損傷被覆材、Scaffold（ 細胞足場材料）＊

1 尾張繊維技術センター

加工技術室製）して、微粉末を作製した。

３. 結果および考察

表１に示す 3 種類のキトサン粉末を共和テクノス㈱か

3.1 ケラチン-キトサン複合膜の成膜と IR 分析ら提供された。
表１

キトサンの分子量と脱アセチル化度
分子量脱アセチル化度（％）

フローナック C

70,00085

フローナック NSW

200,000

85

フローナック N

750,00085

ケラチンの等電点 １５） は弱酸性（ｐI：4.8〜6.0）領域にあるため、中性〜弱アルカリ性の水溶液中ではケラチンはアニオン性である。一方、キトサンは、図１に示すようにアミノ基を豊富に持つため、酢酸などの酸性水溶液に溶解する代表的なカチオン性高分子である。したがって、両者の間でイオン的に結合した複合体であるポリイオンコンプレックス（PIC）を形成する可能性がある。ケラチンとキトサンとの間で PIC が形成されるかど2.2 ケラチン-キトサン複合フィルムの成膜と IR 分析うかを調べるために、キトサンフィルム上にケラチン水

まず、3.0％酢酸水溶液にキトサン粉末（フローナッ溶液を滴下して複合フィルムを作製後、フィルム表面をク N）を加え、室温で１日間攪拌して、1.0％キトサン水洗浄した後、IR-ATR 法により、フィルム表面の赤外吸収溶液を作製した。また、蒸留水にケラチンを加え、室温を測定した。

で 3 時間攪拌して 1.0％ケラチン水溶液を作製した。
シャーレ上に 1.0％キトサン水溶液を 2ml キャストし、風乾してキトサンフィルムを作製した。そして、キトサンフィルム上に 1.0％ケラチン水溶液をキャストし、1分経過した後、ケラチン水溶液を除去した。0.5N 水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、中和後、蒸留水で洗浄した。
フィルムを風乾した後、シャーレから剥がした。
図１赤外分光分析（IR）−ATR 法により、得られたフィルキトサンの分子構造ムの表面（ケラチン側）における赤外吸収を調べた。
2.3 ケラチン-キトサンカプセルの作製

図２に複合フィルムおよびケラチンとキトサンの IR

まず、3.0％酢酸水溶液にキトサン粉末（フローナッチャートを示す。複合膜の IR チャートには、ケラチン

ク C,NSW,N）を加え、室温で１日間攪拌して、0.5、1.0、とキトサンの特性吸収バンドが認められた。したがって、1.5％キトサン水溶液を作製した。また、蒸留水にケラキトサンのキャストフィルム上にケラチンが吸着してチンを加え、室温で 3 時間攪拌して 1.0、3.0％ケラチンいることが確認され、キトサンとケラチンとの間で PIC水溶液を作製した。そして、１N 水酸化ナトリウム水溶が形成されることが示唆された。

液でケラチン水溶液のｐH を 10〜10.5 に調整した。

(a)

キトサン 2.5ml を 20ml ガラス製注射器に充填し、ケラチン水溶液 50ml に滴下して、30 分間攪拌後、生成した直径約 5mm のカプセルをｐH7.4 生理的リン酸バッファ（PBS）に移し、5℃で保存した。

(b)

2.4 カプセルへヘモグロビンの導入とその徐放
直径約 5 ㎜のケラチン-キトサンカプセルを 0.2％ヘ(c)モグロビン水溶液に約 1 週間浸漬した。そして、PBS15mlにカプセルを移し、カプセルから PBS に放出されるヘモグロビン量を可視紫外分光分析により測定した。
2.5 ケラチン-キトサンマイクロカプセルの作製
キ ト サ ン 水 溶 液 を ス プ レ ー ド ラ イ ヤ ー （ Pulvis
Mini-Spray GA32 、 ヤ マ ト 科 学 ㈱ 製 ） の ノ ズ ル （ 孔 径0.5mm）から 200ml ケラチン水溶液へ噴射した。ケラチン水溶液を吸引ろ過して、マイクロカプセルをろ別した。
単離したマイクロカプセルを光学顕微鏡で観察した。

図２

複合フィルム、ケラチン、キトサンの IR チャート、(a);ケラチン,(b);複合フィルム,(c);キトサン

3.2 ケラチン-キトサンカプセルの作製

トサン水溶液からカプセルを作製した後 0.2％ヘモグロ

3.2.1 カプセル形成性とキトサンの分子量ビン水溶液に浸漬してカプセル内にモデル薬物のヘモグ

分子量の異なる３種類のキトサンを用いて、ケラチンロンを導入した。そして、カプセルを pH7.4 生理的リン-キトサンカプセルの作製を試みた。1.0%キトサン水溶酸バッファ（PBS）に移した。カプセル内のヘモグロビ液を 20ml ガラス製注射器に充填し 1.0%ケラチン水溶液

ン量を調べるためにすべてのカプセルを潰して遠心分離に滴下したところ(図３)、キトサンの分子量が 70,000

後、可視紫外分光分析で上澄み液のヘモグロビン量（吸と 200,000 の場合、カプセルは形成されず沈殿した。一収ピーク 410nm）を測定した。図４に結果を示す。

方、分子量 750,000 では、カプセルが生成した。得られ3たカプセルの直径は約 5mm で、その表面には膜が形成されており、内容物であるキトサン水溶液を封じ込めるにされた膜は、アニオン性のケラチンとカチオン性のキトサンとの間で形成された PIC 膜であると考えられる（図３）。
キトサン水溶液

吸光度（Abs) 400nm

十分な強度を持っていた。ここで、カプセル表面に形成

キトサン0.5％

2.5

カプセル

キトサン1.0％

21.5
10.5
01.0%

図４3.0%
ケラチン
カプセル内へのヘモグロビン導入量

ケラチン-キトサン PIC 膜

カプセル内にヘモグロビンを導入することは可能で(表面)あったが、ケラチンの濃度が高いとヘモグロビン導入量ケラチン水溶液が減少した。生成したカプセル表面の PIC 膜が緻密で、外部からのヘモグロビンが PIC 膜を通過しにくいためと

図３

カプセルの作製とカプセルの概念図考えられる。
3.4 ケラチン-キトサンカプセルからヘモグロビンの徐3.2.2 カプセル形成性とケラチンおよびキトサンの濃度

放

種々の濃度のケラチンおよびキトサン水溶液からカ上記のカプセルからヘモグロビンの徐放性とケラチプセルの作製を試みた。ここで、使用したキトサンの分ンおよびキトサンの濃度との関係を検討した。ヘモグロ子量は 750,000 である。まず、ケラチンとキトサンの濃ビンの徐放量の径時変化を図５〜８に示す。

度がそれぞれ 1.0 および 0.5％より低いと、カプセルが100生成されず、沈殿物が得られた。また、キトサンの濃度が 2.0％以上であると、溶液の粘度が高いため、注射器80得られた。ケラチンの濃度が 1.0〜3.0％、キトサンは0.5〜1.5％において、球形のカプセルが生成した。
3.3 ケラチン-キトサンカプセルへのヘモグロビンの導放出量（%)

から滴下が困難となり、球形でなく紡錘形のカプセルが60

キトサン0.5%
キトサン1.0%40

キトサン1.5%

入薬物をカプセル内に導入する方法として、溶液（例え20ば、キトサン水溶液）に予め薬物を溶解した後カプセル化する方法が知られているが、溶液中で薬物が変性して00活性を失ったり、カプセル作製中に薬物の殆どが放出さ1.0、3.0％ケラチン水溶液および 0.5、1.0、1.5％キ100

150

時間(h)れることが問題とされる。したがって、本実験では、カプセルを作製した後、薬物を導入する方法を採用した。

50

図５

ヘモグロビンの徐放性（ケラチン 1.0％一定）

スプレーの噴射圧やキトサン水溶液の吐出量などを100変更しても、カプセルの直径は大きく変化しなかったが、直径 100〜500μm のマイクロカプセルを作製することは80放出量(%)

可能であった。
60

４. 結び

キトサン0.5%

ケラチンを医用材料として利用することを目的とし

キトサン1.0%

40て、ケラチンから成るカプセルの作製を目指した。以前からアニオン性高分子とカチオン性高分子との間でポリ20イオンコンプレックス（PIC）を形成させるカプセル化方法は知られている。ケラチン単独でのカプセル化は知0050100150時間(h)図６

ヘモグロビンの徐放性（ケラチン 3.0％一定）られていないが、等電点が弱酸性域にあるアニオン性のケラチンとカチオン性のキトサンとの間で PIC が形成されることがわかった。このことによりケラチン-キトサンカプセルを作製することができた。モデル薬物である

ここで、放出量は、カプセル内のヘモグロビンがすべヘモグロビンをカプセルに導入して徐放させることも可て放出された場合に 100%とした規格化した値である。ケ

能で、また、キトサン水溶液の滴下液の粒径を小さくす

ラチン、キトサン水溶液ともに比較的低濃度で作製したることでマイクロスケールのカプセルを作製することがカプセルから、ヘモグロビンは 20〜30 時間以内で殆どできた。

放出された（図５）。濃度の増加に伴い、放出速度が低文献下した（図５、図６）。特に、3.0％ケラチン、1.0％キ1)Dowling L.M. et al.: Biochem. J.,236,705 (1986)

トサン水溶液から作製したカプセルでは、100 時間（約2)Hynes R.O.: Scientific American,254,32 (1986)４日間）以上経過してもヘモグロビンの放出が認められ

3)Dowling L.M. et al.: Biochem. J.,236,695 (1986)

た（図６）。

4)Kiyoshi Yamauchi et al.: J. Biomed. Mater.

3.5 ケラチン-キトサンマイクロカプセルの作製

Res.,31,439 (1996)

上記のカプセルを作製する際、キトサン水溶液を注射

5)Kazunori器で滴下すると直径 5mm 程度のカプセルが得られた。こ(2004)のカプセル寸法は滴下液の粒径とほぼ一致した。したがって、マイクロスケールのカプセルを作製するためには、滴下液の粒径を小さくする必要がある。そこで、キトサン水溶液をスプレーノズルから噴射した。ここで、キトサン、ケラチン水溶液の濃度はそれぞれ 1.0％である。
得られたカプセルの光学顕微鏡写真を図７に示す。
250μm6)筏

Katoh

etal.:

Biomaterials,25,2265

義人編：化学フロンティア③「再生医工学」,化学同人 (2001)7)Jeffery R.M. et al.: Tissue Engineering Methods
and Protocols, Humana Press (1999)
8)Kazunori

Katoh

etal.:

Biomaterials,25,4255(2004)
9)Nilsson K. et al.: Nature,302,629 (1983)
10)Lim F. et al.: Science,210,908 (1980)
11)Lim F. et al.: J. Pharm. Sci.,70,351 (1981)
12)Lim F.: Appl. Biochem. Biotechnol.,10,81 (1984)
13)Kierstan M. et al.: Biotechnol. Bioeng.,19,387(1977)
14)Toshimitsu

Yoshioka

etal.:Biotechnol.

Bioeng.,35,66 (1990)
15)Feughelmann M. et al.: Encyclopedia of Polymer
Science and Engineering Vo.8,566 (1985)

図７

マイクロカプセルの光学顕微鏡写真