ISSN 0910−0865

環境変異原研究
Environmental
MutagenResearch

Vol.24 No.2 2002

Coden：KHKEEN

環境変異原研究
Environmental Mutagen Research

目

次

第 30 回大会基調講演
日本環境変異原学会創生の頃と今考えるべき改革
杉村

隆 ……………………………………………………………………………………………………………… 63

環境変異原研究がめざす道
木苗直秀 ……………………………………………………………………………………………………………… 69

第 30 回大会特別講演
変異原性試験で何がわかるか： 21 世紀の展望
能美健彦 ……………………………………………………………………………………………………………… 75

第 30 回大会受賞講演
学術賞
変異・癌原性物質の産生・代謝とその活性抑制に関する研究
大西克成 ……………………………………………………………………………………………………………… 81
研究奨励賞
フリーラジカルを経由する環境変異・発がん物質の生成と発現に関する研究
平本一幸 ……………………………………………………………………………………………………………… 91
げっ歯類の培養細胞と個体を用いる小核試験法の検討
若田明裕 ……………………………………………………………………………………………………………… 99

付 記
日本環境変異原学会

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環境変異原研究

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基調講演

Environ. Mutagen Res., 24：63-68（2002）

日本環境変異原学会創生の頃と今考えるべき改革杉村 隆
国立がんセンター名誉総長〒 104-0045 東京都中央区築地 5-1-1

Recollections on the early stages of the Japanese Environmental Mutagen
Society and thoughts on how to revolutionize its Society
Takashi Sugimura
President Emeritus, National Cancer Center
1-1, Tsukiji 5-chome, Chuo-ku, Tokyo 104-0045

辻：おはようございます．この第 30 回記念大会を記

は大変なことでありまして，これまで学会の運営にあた

念いたしまして，座長を承りました静岡県立大学薬学部

られた方々ならびに会員の皆様に，まずお祝いを申し上の辻でございます．杉村先生の座長を務めさせていただ

げたいと思います．

くわけでございますが，私は今から約 25 年前，杉村先この日本環境変異原学会が 30 年前にできた頃のこと

生の研究室と東大の薬化学教室，それから私たちの研究をお話ししろというようなことだろうと思うんですが，室の三者共同でアミノ酸の熱分解の研究をしたことがごそこに「日本環境変異原学会の創世の頃」，創「世」とざいます．それから約 25 年が過ぎました．今にして考なっているので，これは間違って本当は創「生」であっ

えますと，まさにその 25 年前はこの環境変異原学会のたという正誤表が付いているのですが，考えてみると創設期にあたったのではないかと思っております．

「創世」のほうがよかったと思っています．本当に何も今回，杉村先生の座長をするにあたりまして杉村先生なかったところから，もやもやっと生まれてきたんです．

のいろいろなご紹介をしようと考えていたんですが，本

環境変異原学会が混沌の中から生まれてきた．まさに日お集まりの皆様方には杉村先生をご紹介するまでもな「創世」されたのだと思っております．今日はどうぞ気いことであります．それよりも杉村先生のお話を長くお楽にお聞きください．

聴きしたほうがいいと思い，杉村先生のご経歴のご紹介

考えてみると，この創生の頃に関わった方々は遺伝研は失礼させていただきます．ご存じのように杉村先生はの田島弥太郎先生，それから大阪大学の近藤宗平先生，

文化勲章，日本国際賞，いろいろな賞を受賞なさってお非常に残念ながら早くお亡くなりになった遺伝研の賀田ります．この環境変異原学会の始めからいろいろ面倒を恒夫先生，同志社大学の西岡一先生，京大の武部啓先生

見ていただいております．

等です．それから私どものグループでは松島泰次郎，河先ほど控室でお話ししておりまして，先生は若い頃か

内卓，長尾美奈子，佐藤茂秋の諸君が参画いたしました．

らいろいろな役員をなさっていらっしゃいますが，もう慶應大学からは加藤隆一先生が馳せ参じられました．い今では「仙人みたいになってきた」というお話をなさっ

ろいろな背景のある人が自然体で集まってきたのです．

ていましたけれども，先生の目の輝きは 25 年前とまっ

それで，まさに創世でありました．戦国時代みたいな

たく変わりなく鋭い目というのをつくづく感じました．

ものです．何となく田島先生の旗の下に集まって，このでは先生，よろしくお願いいたします．

会ができたのが 1972 年です．第 1 回の会を東京の教育

杉村：辻先生，どうもありがとうございました．今回会館で開いたのであります．その辺のことは本会を記念は第 30 回の大会であります．30 回を迎えるということして発刊された日本環境変異原学会第 30 回大会プログ
ラム・要旨集の 12 頁に書いてございますので，お読み

受付： 2002 年 3 月 11 日 受理： 2002 年 3 月 11 日
日本環境変異原学会いただけるとありがたい．ちょうどその頃，世界がやは

本稿は日本環境変異原学会第 30 回大会において発表された基調講演である．
This paper is the keynote lecture presented at the 30th JEMS annual meeting, 2001.

63

りこの environmental mutagen science に関して創生期で京都で行われましたが，この学会は，日本にとりひとつあったと思います．

のエポックだったと思います．1988 年に黒田行昭先生

ただ，今とはいろいろと違っていたことがあるのではが伊豆の大仁で mechanisms of antimutagenesis and anti-

ないかと思います．初期には，この environmental muta-

carcinogenesis の，第 2 回国際会議を開催されたことがgen は子孫に遺伝病を起こすのに大きな因子であろうとあります．Environmental mutagen の作用に対して拮抗

感じていました．われわれの周辺にはどんどん新しい化する物質，その作用機構の科学も非常に盛んになってき学物質が生まれてくるから，それは人類の将来にとってました．もともと賀田先生が antimutagen とか desmuta-

非常に重要な問題である．子孫にいろいろな遺伝が蓄積

gen とか，かなり先駆的に言っておられました．だんだ

するということが，主な 1 つの領域だったんだと思うの

ん現実のものとなってきたと思っております．

です．ところが，それがなかなか証明困難です．なぜか

わが学会のこれまでの研究の課題を考えてみると，新しというと，いま地球の人口が 50 億〜 60 億ですが，そのい mutagen を探す，新しい carcinogen を探すことが 1 つ

中でどういう遺伝病が新しく発生したかというのを広いとしてありました．我が国から一連のヘテロサイクリッ

範囲にわたって研究し，それと原因とを関係づけるといクアミンが見つかったり，8 −ヒドロキシグアノシンをう科学が難しいことが判ってきたのです．

葛西宏君が見つけました．その DNA の修復を関口睦夫

一方では我々の体というのは数十兆個の細胞でできている．その中で，幹細胞だけを考えてみても数兆個はあるでしょうから，それから体細胞変異でがん細胞が出るというチャンスは非常に高い．現に 3 人に 1 人はがんに博士と西村暹博士が見つけました．本学会は世界的にいろいろな貢献をしました．
これからの事を考えると，だいたい 5 つぐらいのことを考えたほうがいいと思っています．

なるわけですから．勿論，実験も可能でありました．あ第 1 番目は，がんというのは決して 1 つの遺伝子変異

る条件で動物実験をすれば，100 匹のうち 100 匹ががんが起こってできるのではなく，multiple な，階段を上がになるのです．そういうわけだから，どうしても重点はっていくように，たくさんの変異が溜まってできるのでだんだん変異原からがん原のほうにシフトしていったのす．しかし，その階段も，ある場合には遺伝子の変化でであります．
これはやむをえないことではありますが，やむをえなあります．他の場合は epigenetic，遺伝子自身には変化がないけれど，その遺伝子が silence になったり，

いだけで済むのか．本当はもう少し environmental muta-

expressed state になるということで起こります．down-

gen science というものは，どういうものを目的とする

regulation あるいは upregulation されることで起こってべきであるかを考える必要もあるのではないかと思っています．もっと研究を深化させねばなりません．1 つのおります．しかし，当面のところはそういう体細胞の変遺伝子変異が起こることによって，その後は変異原なし

異…我々の 1 人 1 人の体が数十兆個の細胞から成立してに自然に突然変異がどんどん溜まっていく genomic

いる．その数十兆個の細胞の中に起こる，1 個 1 個の細instability もあります．細胞増殖に伴う DNA の replica-

胞の中，数万個ある遺伝子の中に起こる変異の蓄積の結tion は，変異の機会を増します．細胞分裂に密接に関与

果としての発がんを研究する，また変異原による DNA

する蛋白の変異による chromosome instability も，このの修飾と修復を研究することが優先的になっているのは

環境変異原学会にとっては避けて通れない重要な問題とやむをえないのです．だから，創生期の頃の考えからシ思っております．

フトしてしまって，Environmental Mutagen Society から

第 2 番目に非常に重要だと思うことは，変異原がある

Environmental Carcinogen Society になったのは，時のとかないとか，変異発生が予防されたとか何とか，いろ流れと研究の発展の経過であると思います．しかし，そいろ言われています．しかし，問題はそのリスクや効果

れで本当にいいのか，これからもいいのか，というのはを定量化することが非常に重要な，そして難しい 21 世

ここで考えてみる必要があると思います．

紀の課題です．ヒトのがん化は階段を上がって進むわけ

ところで，体細胞の mutation が正常細胞をがん細胞に変え，しかも，いくつも溜まってがんになるというのですから，1 つの原因で 1 つのがんがすぐ起こるような簡単な事ではありません．

は正しい．変異そのものは多分，非特異的に起こる．体さまざまな原因が微量ですがたくさんあります．それ

細胞変異の蓄積の中で発がんに関係している特定の遺伝に加えて拮抗するものもあります．定量的なリスクを決子が何個か変化するとがん細胞になるのです．At ran-

めなければいけないのですが，これは大変複合的なもの

dom に起こる非特定的な変異の蓄積は，老化細胞の生成だから，新しく難しい科学の誕生が必要だと思います．

にも関係すると思われます．あるいは自己免疫疾患にな

どうしてもそれを解かなければいけない．数学者とか，ります．新しく変異した蛋白ができるから，それに対す

バイオインフォマティクスとか，そういう領域の関与がる抗体ができて自己免疫疾患ができるのだと思います．

必要になってくると思います．

第 3 回国際環境変異原学会は 1981 年に東京と三島と64

第 3 番目には，閾値の問題が非常に重要だろうと思いFig. 1

ます．1 つ 1 つの物質について閾値を決めていくという最後に第 5 番目として，環境科学の中でこの環境変異ことが，リスクを考えるため非常に大切です．環境変異原学会がどういう立場にあるのか，ということを考える

原学会ができた頃から，メガマウスの実験とか，閾値の必要があると思います．地球全体の環境との関連はどうことを考えてきました．最近ホルミシスと言われる，ごあるべきなのでしょう．日本にも環境科学会があります．

く少量だと作用がバックグラウンドよりもかえって減っ

私も環境科学会には入っています．雑誌は来るのだけどてしまう現象があります．ラドンの exposure が少ない

1 回も会場には出たことがないんです．『環境科学会』

ある地域では，ラドンが全くないところよりも肺がんのという雑誌に環境変異原のことが出たことは一度もない発生が低いことがあります．しかしそれも 1 つの要因にに近い．それから，環境科学会の会で環境変異原学会のついて考えればそうだけど，たくさんの物質が同時に関人が何か大きな意味を持つ発言をしたとか，講演をした

与していたときには，どうなるのかまだわかりません．

とかいうこともあまりないようです．

複合露出の閾値を解く科学も，これから大切になると思っています．

月の環境なんていうのもある．月の環境なんていうのは，あまりわれわれに関係ない．だけど，「環境科学」

第 4 番目には，1 人 1 人の人相が違うように，ゲノムの人はそういうものにもやたらと熱心なんです．私たちから考えても変異原やがん原物質に対する感受性が 1 人

は，仲間が，友人が，そして子孫の健康がどうなるかを

1 人違っています．本学会発足後，30 年経ってここに集

先見的に考える必要があります．積極的に環境科学全体

まってみると，だいたいお若い方々になってしまったが，に大きく寄与していく必要があると思っています．

まだずいぶん創生の頃に関わった人がいるんです．見る

それでは，これからちょっとスライドを見ていただきと，かなり aging が進んだ人と，進み方の遅い人がおらます．懐かしき良き時代の想い出，あまり今みたいにイれるようです．これはやはり，お 1 人お 1 人のゲノムのライラ心配しないで済んだ頃のことであります．

問題です．そういうことが，SNPs 分析を含むゲノム科

思えば，第 1 回の日本環境変異原学会は，田島先生が学で明らかにされます．1 人 1 人が環境変異原に対する1972 年に開かれました．外村晶先生，菅原努先生，近感受性がいろいろ違っているのだと思っております．本

藤先生，賀田先生，岩原繁夫先生，早津彦哉先生，石館

日はいろいろとこれから後，リスクの estimation に関し

基先生と続き，やがて松島先生，長尾先生も登場されて，ては木苗直秀先生，能美健彦先生，福島昭治先生から，

今年 30 回にきております．いろいろな地方で年会が行

また閾値の問題についても，多くの方のお話を聞くことわれました．

になるわけです．

一方，日本の環境変異原学会ができた翌年の 1973 年
65

Fig. 2ノ体に活性化され，ついで，あるアミノ酸活性化酵素でアシル化されるものですから，原核細胞（procaryote）と多くの真核細胞（eucaryote）と共通の機構で DNA を修飾します．XP 細胞も UV 同様 4NQO に対しても sensitive です．それから，細菌の DNA の除去修復欠損株は
4NQO に対して感受性が高いのです．P450 を含む代謝活性化の関与なしに，微生物でも培養哺乳動物細胞でも研究が同じように進歩したのです．これは日本での特徴だったと思っております（Fig. 1）．有名な変異原であった N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンに発がん性があることを知ったのも，この学会のすべり出しには好都合でした．
第 3 回の国際環境変異原学会の時に，皆さん想い出さ
れると思いますが，フレデリック・デセレス，アレキサン
ダー・ホレンダー，フリッツ・ソーベルス，シャーロッ
ト・アウェルバッハ，ブルース・エイムス，それから私のFig. 3

写真があります．この年までにアメリカの環境変異原学会賞を受賞した人々の 6 人が並んでいます（Fig. 2）．
これは Cancer Research の表紙ですけれども，静岡県に，第 1 回目の国際環境変異原学会がアシロモアで行わ

立大学の小菅卓夫先生が中心におられます（Fig. 3）．小れました．2 回目が 4 年後にエジンバラで行われ，3 回

菅先生はヘテロサイクリックアミンの構造を明らかにす目に東京と三島，京都で行われたのであります．ついでるのに，最初に貢献されたのです．いま辻先生がおっし1985 年はストックホルムでした．1989 年にクリーブラ

ゃった通りであります．この頃，橋本嘉幸先生が東京のンドで行われた時は，ものすごく暑かったのを覚えてお生化研から東北大学の教授になられ，出川雅邦先生が張られると思います．そして，今回の 8 回目が静岡で開催

り切ってチトクロム P450 のレスポンスの性差による違されるのです．

い等をご研究になりました．

日本が非常にこの環境変異原研究で有利だったことが先ほど申しましたように，mechanisms of antimutage-

たくさんあるのですが，その 1 つは，4-ニトロキノリン

nesis and anticarcinogenesis のミーティングの時，まだ1-オキシド（4NQO）という化合物がありました．

ソーベルス先生もお元気だった．それでデルバ−アト・

4NQO はチトクロム P450 の関与なしにヒドロキシアミ

シェンケル博士と黒田先生が素晴らしい会を組織されま66

Fig. 4

べてもっと穏やかでした．世界中も穏やかだった．たとえば，会を行うにしてもチャールストン，ウィリアムズ
バーグ，下田とか，歴史的な場所を選んでやるというよ
うな余裕のある時代でありました．日米協力は今もずっと続いておりますが，米国のチェアマンはデセレスの後にバーニー・ワインシュタイン，最近カール・バレット
がチェアマンになりました．さらに今年からチェリル・
ウォーカー博士になりました．日本側は山本正先生から
鈴木武夫先生，松島先生，寺田雅昭先生を経て，今年から若林敬二博士になったわけです．
私は沖縄で会をやることを若林部会長におすすめしま
した．科学のうえでも沖縄を日米協力のテリトリーとして，沖縄の科学をおおいに盛んにする必要があると，そう考えたからであります．事実，バレット博士と若林博
士が，G8 サミットが行われた沖縄の万国津梁館で 2001
Fig. 5年 2 月に日米合同会議を開催しました．
最後になると思いますが，この日米医学の environ-

した（Fig. 4）．時代も非常によい雰囲気でありました．

mental mutagenesis and carcinogenesis というパネルは，

この黒田先生の会の proceedings の表紙，何の意味もな

今度新しく environmental genomics and carcinogenesis

い表紙だろうと思っておられるかもしれませんが，これというふうになりました．

は実は物事を，とくに環境変異原のことを議論するとき考えてみると創生の頃から 30 年間，いろいろなことがに，絶対白，絶対黒というのは正しくなく，その間がもありました．皆様の熱意によって大きな進歩がなされま

やもやとしているんです．白からだんだん灰色，ついにした．ただし，これからは，またちょっと違った熱意，ある

黒になるということが，この表紙に出ているのでありまいは違った厳しさ，あるいは違った方向．何となくこのまして，この概念は今でも本当に大切です（Fig. 5）．

まいけばいいというわけでは決してない．どうもそうい

フレデリック・デセレス博士は，長く日米医学研究協力プログラムの環境変異原のパネルでずいぶん日本を助う感じがいたしますので，31 年からの発展を祈ってやみません．どうもありがとうございました．

けてくれた人だと思います．その後いろいろな会がずっ

辻：この環境変異原学会，あるいはこの環境変異原研と行われましたが，当時の日米関係というのは，今に比究に対しまして，非常に示唆に富んだお話，本当にあり67

がとうございました．先ほど先生が，aging のお話をなておりません．これからもひとつよろしくご指導をお願さいましたが，本当に先生の目の輝きといいますのは，

いしたいと思います．どうもありがとうございました．

私が先生にお会いして 25 年間いまだにまったく変わっ（録音終了）

68

基調講演

Environ. Mutagen Res., 24：69-74（2002）

環境変異原研究がめざす道
木苗 直秀＊
静岡県立大学食品栄養科学部〒 422-8526 静岡市谷田 52-1

Our research on environmental mutagens, now and future
Naohide Kinae
School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka
52-1 Yada, Shizuoka 422-8526, Japan

Summary
There are many kinds of mutagens and/or carcinogens in our environment. To isolate and to identify thesecompounds is very important in assisting the protection of human and ecological health. The toxicity and thedegradation efficiency of 3-chloro-4-dichloromethyl-5-hydroxy-2（5H）furanone（MX）, a potent mutagen in tap
water, were examined. It showed strong promoting effects on rat glandular stomach cancer initiated by Nmethyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine. It decomposed with an increase of pH and temperature. The mutagenic
activity also decreased by treatment with serum, but not with saliva.
In other work undertaken, several heterocyclic amines containing 2-amino-3, 4-dimethylaminoimidazo [4,5f ] quinoxaline (MeIQx) and 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo [4,5-b] pyridine (PhIP) were formed duringcooking of hamburger. But the addition of green tea extracts to the patty decreased the contents of bothmutagens. Therefore, tea catechins may play an important role to inhibit the formation of heterocyclic
amines. To elucidate the adverse biological effects of environmental mutagens, several mutagenicity tests
using bacteria, yeast, cultured cells and animals are applied. To convey the implications of these results tosociety, skills in risk communication and risk management will be required.
Keywords ： mutagen, tumor induction, chlorofuranone（MX）, heterocyclic amine, risk assessment

ただ今，御紹介頂きました日本環境変異原学会長の木
苗と申します．月日が経つのは早いもので日本環境変異

話させて頂きます．最後にまとめとして皆様に今後の研究課題を投げかけてみたいと考えております．

原学会が発足して 30 年という節目の年を迎えることができました．特に今回は，日本環境変異原学会第 30 回

我々の生活環境中には多種多様の変異原，発がん物質

大会と第 8 回国際環境変異原学会の両大会を時期を同じが存在しています．実際には Fig.1 に示すように陸上でくして静岡で開催することになりました．皆様には格別使われた化学物質や汚染物質（例：ダイオキシン）は直の御協力をよろしくお願い致します．

接，あるいは 2 次的に代謝・分解を受けながら生態系をさて，前演者の杉村隆先生が日本環境変異原学会の設

循環しています．河川や海洋に到達した化学物質は食物

立時およびその後の発展状況の多くを語られました．そ連鎖を通して水生生物に取込まれ，生体濃縮することがこで，私は私なりに 20 数年間環境変異原研究に関して知られています．

泥くさい仕事をやってきましたので，それらを含めておヒトは呼吸を通して，あるいは経口的に多くの化学物
質いわゆる異物を生体内に取込んでいます．また，紫外＊E-mail ： kinae@smail.u-shizuoka-ken.jp.ac
受付： 2002 年 8 月 9 日 受理： 2002 年 8 月 9 日
日本環境変異原学会

線，放射線，電磁波などにも常に暴露されています．それらは，いずれも量的に少ないながら日常的に我々の体

本稿は日本環境変異原学会第 30 回大会において発表された基調講演である．
This paper is the keynote lecture presented at the 30th JEMS annual meeting, 2001.

69

Fig. 1 Circulation of dioxins in ecological system

Fig. 2 Intake of mutagens and/or carcinogens and multi-steps in tumor induction

Fig. 3 Biological effect of free radicals
70

Table 1 Contents of MX in tap and pool water samples
Tap water （1987 〜 1997）
Country

Pool water（Japan, 1994）

Contents（ng/L）U.S.A （1987） ND 〜 33
Russia （1987） ND 〜 15
〜 67
Finland（1988） 15
Japan （1990） ND 〜 9Japan （1990） 0.1 〜 33
U. K. （1990） ND 〜 3Japan （1991） 0.18 〜 1.05
China （1995） 3.8 〜 58.4
Spain （1997） 5.6 〜 10Contribution（％）

Type of poolContents（ng/L）

Contribution
（％）

〜 33
〜 36
19 〜 46〜 23
0.2 〜 36〜 60
0.5 〜 2.2
15 〜 57
8.3 〜 20

A private/indoor
〃
B
〃
C
〃
D
〃
E
F public/indoor〃G
H public/outdoor
〃
I

0.6
1.4
0.6
13.9
1.1
2.0
1.0
0.9
1.6

1.0
2.2
0.5
17.0
3.4
8.1
5.6
1.8
3.2

Table 2 Risk evaluation of environmental mutagens
Mutagens

Revertants colonies/mg（A）

Production（Comsumption）volume
（B）

A×B

1.0 × 103

290 × 109 cigarettes

5.8 × 1015

5.1 × 105
1.9 × 101
8.0 × 100

422 tons
15,000 tons
（as fresh fish）9,860,000 tons

2.2 × 1017
2.9 × 1014
5.1 × 1015

1.1 × 101
3.9 × 101
770/L
13/ng

134,000 tons
222,000 tons
2L × 365days × 1.2 billion people
12ng/L × 2L × 365days × 1.2 billion people

1.5 × 1015
8.7 × 1015
6.7 × 1013
1.4 × 1013

Tabacco（20mg/cigarette）
CaptanCaramelRoasted Fish
（3.9g burning/60g fish）
CoffeeGreen tea
Tap water
MX（Kawachi, Food Sanitation Research, 35,679,（1985）modified）に少なからぬ影響を与えているものと考えています

質が我が国の水道水やプール水からも検出されました（Fig.2）．

（Table1）（Kinae et al., 1992; 木苗ら，2001）．

すなわち，それら化学因子，物理因子とともにウイル

水道水中の MX の含量は女性の胆管腫や男性胞状腫のスなどの生物因子がヒトのがん発生に深くかかわってい発生と関連することが指摘されています．そこで MX をることが明らかになってきました．

別途合成し，発がん性を含む毒性を検討しました．さらさらに，近年注目されているフリーラジカルは虚血，
再灌流，炎症など，あるいは飲酒や喫煙を含む生活習慣に温度，pH，生体成分である唾液，血清に対する安定性を調べることにしました．

によって容易に生成し，DNA に作用して損傷・切断をMX の前駆体としては従来からフルボ酸やフミン酸な起し，がんを含む疾病や老化を惹起しているものと思わ

どの腐食物質が知られておりましたが，我々は，緑茶中のれます（Fig.3）．

カテキン類や柑橘類中のジオスミンも前駆体になること

私は，1970 年代後半より水環境中の変異・発がん物を明らかにしました（Kinae et al., 2000）．ついで変異原性

質と魚の腫瘍発生とのかかわりについて検討してきましを指標として安定性を調べた結果を Fig.4 に示しました．

た（Kinae et al., 1981; Kimura et al., 1984; Kinae et al.,MX は温度の上昇により分解が進むこと，しかし，

1990）．また多くの化学物質が最終的にヒトにどのよう

100 ℃では 10 分間加熱しても安定であることから，MXな影響を与えるのかというリスク評価を行ってきましたがトリハロメタンとは異なりきわめて揮発しにくい性質（木苗，1993）．

を有する物質であることがわかりました．唾液中では

それではまず，我々の研究の 1 つを紹介しましょう．

MX の変異原性が若干上昇する傾向を示したのに対し水道水や製紙工場排水中には塩素処理工程で生成する多て，血清中では変異原性が消失，または低下しました．

くの有機塩素系化合物が含まれております．その中の難さらに，pH が 9 以上になると変異原性は著しく低下し揮発性塩素化合物である 3-chloro-4-dichloromethyl-5-

ました（木苗，1994）．

hydroxy-2（5H）-furanone（MX）に注目しました．MX

MX については西川らとの共同研究で MNNG を用いは 1980 年代初頭に製紙工場排水より見出され，サルモ

た二段階発がん実験によりラット胃粘膜に腺がんを誘発

ネラ TA100 で強い直接変異原性を示しており，この物することを明らかにし（Nishikawa et al., 1999），広瀬ら
71Fig. 4 Effect of pH, temperature, saliva and serum on the mutagenic activity of MX

Table 3 Change of HCA content in cooked hamburger
with and without green tea samples
Tea samples added
None
Crude extracts
Catechin fractions
PowderContent（ng/g raw beef）

題となってくるものと思われます．
次に，ハンバーグ中のヘテロサイクリックアミン（HCA）の抑制方法を検討した結果を Table3 に示しました．

MeIQx

PhIP

1.130（100）1.382（122）0.611（54）0.289（26）

3.931（100）0.926（24）0.845（21）0.368 （9）Ground beef patty（65g）, green tea samples（0.975g）
were used.
The figures in parentheses show the ratio（％）to thecontrol.

カテキン混合物とカテキンをほぼ同量含む緑茶の粗抽
出物をそれぞれ添加すると前者で MeIQx の生成量が54 ％に低下しました．一方，PhIP の場合，いずれも
9 − 24 ％と有意に生成が抑制されることを観察しました（Kinae et al., 1997）．このことから緑茶およびその有効成分であるカテキンが HCA の生成を抑制していることが明らかになりました．杉村先生には実際に緑茶入りハンバーグを試食して頂きましたところ，おいしいといって頂いたことを数年近く経った今でも記憶しています．

とともにヒトへのリスク評価を行いました（Hirose etal., 1999）．

ところで従来，焼け焦げ由来の変異原・発がん物質は食品を加熱することにより生成します．私はメイラード

Table2 には，生活環境中の各種変異原物質の活性値，反応に関する研究をライフワークの 1 つとしておりまし

存在量と人への暴露量（コロニー数換算）を示しました．

たので，それらが生理的条件すなわち pH7.4，37 ℃で生

1 人あたり 1 日に 2 L の水道水を消費すると，コロニー数成していないかという疑問が生じました．というのは，

13が 6.7 × 10 リバータントとなり，MX については 1ng が13

メイラード反応は反応系内の鉄イオンや水分含量の影響

13 リバータントですので 1.2 億人では，1.4 × 10 リバー

を大きく受けること，また，活性酸素などのラジカルもタントとなり，国民が消費するカラメルに近似した総変

この反応を促進することなどを考えると生体内で HCA

異原活性を示しました．しかし，すでに水道原水の塩素が生成する可能性が十分に推測できました．そこで，グ処理とヒトの発がん率との関連が指摘されていることをルコースとフェニルアラニン，クレアチンを 1 ： 1 ： 2

考えると MX を含めた副生成物の除去が今後の重要な課に混合し，pH 7.2 のリン酸緩衝液に溶解して 37 ℃で72

水道水中に存在するきわめて微量の MX が他の化合物と共存した場合に変異原性が上昇することから今後，各種化学物質間の相互作用，特に複合作用について十分に検討していく必要があると考えています．
我々は現在，環境試料や魚類について Ames 法，小核試験法，コメットアッセイ等を用いて変異原性を検定しております．生体に取込まれた化学物質は主として肝臓で第 1 相，第 2 相の反応を受け，代謝され抱合体を形成します．しかし，PCB を含む塩素化合物では解毒よりむしろ抱合体が活性化体となり，DNA adduct を作り，また芳香族アミンの場合，トランスフェラーゼにより硫酸誘導体となり，DNA に作用するものと考えられます．
これらのことは異物を環境における存在形態だけで捉えるのではなく，生体に取込まれて生ずる二次あるいは三次成績体についても変異原性を検定する必要がありま
Fig. 5 Mutagenicity of MX in the presence and absence of heterocyclic amines

す．
我々は実際に河川水や沿岸海域に棲息する魚類の血液や鰓を用いて小核試験やコメットアッセイを適用し，さ50 − 80 日間静置したところ，原液のブルーコットン吸らにそれら環境水に和金を暴露して両試験を行い，変異

着物がサルモネラ TA98，＋S9mix で変異原性を示しま

原，発がん物質のモニタリングをしてきました（谷所

した．分画した PhIP 画分のトータルイオンクロマトとら, 1998; Hayashi et al., 1998）．それらデータをもとにしマスクロマトのデータは標品と完全に一致しました．して変異原性の定量化，数値化を行い，COD や BOD 値，

かし，これは定性的なものですので現在，定量実験を進

個別の化学物質の定量値などを考え合わせてリスクアセ

めております．また，グルコースとグリシン，クレアチ

スメントを行うことになります．ついでリスクコミュニ

ニンを 1 ： 2 ： 2 の割合で 37 ℃でインキュベーションしケーションを通して情報交換を行い，最終的にはリスクた場合にも同様に，経時的に変異原性が上昇し，活性画

マネージメントで法的規制を行うことになるでしょう．

分を精製したのちマス分析したところ，MeIQx とスペ

このようにしてリスクアナリシスを完了することにな

クトルデータが完全に一致しました．それゆえ，37 ℃

り，このプロセスはきわめて重要になってきました．なでこれら HCA が生成することを確認しました（Kinae et

お，疫学的調査研究を含めたフィールドワークも是非実

al., in press）．

施され，総合的に評価することを推奨したいと思います

すでに同様のモデル系において 128 ℃で 2 時間反応し（Fig. 6）．

た場合の HCA の生成メカニズムについて報告されておここ数年の間に，細菌，培養細胞，動物個体などを用ります（Nagao and Sugimura, 2000）が，本実験から実いて DNA 損傷性や発がん性のスクリーニングを行い，際に生体内でも HCA が生成する可能性が強く示唆され定量化するためチップを用いたマイクロアレイ法などがたのでマウスを用いて in vivo での HCA 生成実験を試み

取り入れられてきました．実際に，ヒトの発がんとそのています．

治療，予防を考える時，遺伝情報を解析するためそれらところで化学物質については，従来単独での変異原性の活用が大きな戦力になってきました．

が数多く報告されております．しかし，先に述べたよう

10 数年前から，日本や欧米での詳細な研究から各種に微量ながら多くの変異原・がん原物質が共存している

がん発生に関与する危険因子と予防因子の作用機構がことを考えると複合毒性を明らかにする必要がありま

次々に明らかにされています．しかし，時には 1 つの食す．そこで，演者らは赤沼らと共同で大腸菌 WP2 を用品の中に変異原と抗変異原が共存していることも多く，

いて，MX 単独では変異原性を示さない濃度のものにそれゆえ，当該食品が実際に変異原として作用するのか

MeIQx や Trp-P-1 を添加したところ，コロニー数が有意

抗変異原として作用するのかを検討していくことが大切に上昇することを確認しました（Fig.5）（Watanabe-であると考えています．これからの変異原研究は変異原

Akanuma et al., 1997）．また，佐々木らとの共同研究でや抗変異原を探索するだけでなく，それらが DNA にど

MX を鉛化合物や DDT を含む各種有機塩素化合物と共のように作用し，どのような発がん遺伝子やがん抑制遺存させた場合にも同様の複合毒性が観察されました

伝子の発現に関与するのか，さらにがんの防御法につい（佐々木と木苗, 1995）．このように MX に対する他の化学ても遺伝子レベルで十分な知見の蓄積が望まれていま

物質の変異原性増強作用を確認することができました．

す．また，変異原ががんのみならず，内分泌攪乱作用や73

Fig. 6 Monitoring of mutagens in aquatic environment and their risk analysis

加齢，その他炎症に対して単独または複合的にどのようにかかわりあいをもつのかを明らかにしていく必要があると考えています．それゆえ，今後 genotoxicogenomics
や toxicogenomics などの考えを取り入れた毒性評価シ
ステムの構築が必須のものとなってきたものと思われます（Sasaki et al., 2001）．
結びに会員の皆様の御研究が益々発展することを祈願し，私の講演を終了させて頂きます．本日は御静聴あり
がとうございました．
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特別講演

Environ. Mutagen Res., 24：75-80（2002）

変異原性試験で何がわかるか： 21 世紀の展望
能美 健彦＊
国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部〒 158-8501 東京都世田谷区上用賀 1-18-1

The past, present and future of genotoxicity assays
Takehiko Nohmi
Division of Genetics & Mutagenesis, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku,
Tokyo 158-8501

Summaryth

The year 2001 was the 30 anniversary of the Japanese Environmental Mutagen Society. This is a good
opportunity to look back over the development of genotoxicity assays during that period and envision the
future perspective. At the beginning of the Society, the most important issue appeared to be the establishment of efficient screening systems to identify potential mutagens in the environment where millions ofchemicals were present. Microbial gene mutation assays, such as the Ames test, and chromosome aberration tests using cultured mammalian cells were developed in the era. The mutagenicity and carcinogenicity
of AF2, a food additive, and the heterocyclic amines in burnt food were discovered and these findings caused
heated debate in the Society. In the 1980s and 90s, the genotoxicity assays seemed to have evolved mainly in
two directions. The first one is the development of assays whose sensitivities were enhanced by genetic
engineering. Examples include sensitive bacterial strains, such as Salmonella typhimurium YG1024 andYG1021, which are highly sensitive to mutagenic aromatic amines and nitroarenes, and Salmonella
typhimurium YG7108 which is sensitive to the mutagenicity of alkylating agents. The second direction was
the development of assays using experimental animals. Examples include transgenic assays, in vivo
micronucleus assay and comet assay. The rodent assays are less sensitive than the microbial assays but may
be more appropriate to evaluate the potential risks of chemicals to humans. At present, we still face a number of unsolved problems, such as how to evaluate the risk of exposure to multiple chemicals. Establishment
stof the molecular bases for the risk assessment of chemicals is a major challenge in the 21 century. Current
topics for the development of genotoxicity assays are presented and future directions are discussed.
Keywords ： genotoxicity, transgenic assays, Y family DNA polymerases

緒言る．化学物質がヒトの体細胞に突然変異や染色体異常を起こせば，発がんリスクを高め，生殖細胞に変異を起こ

日本環境変異原学会の大会も 2001 年 10 月で 30 回目をせば，世代をへて有害な変異がヒトの集団中に蓄積する迎えた．これを機会にこれまでの環境変異原研究の流れ可能性が高まる．しかし環境中に存在する化学物質の数を「試験法」という観点から振り返り，今後のありようは膨大であり，この中からヒトの遺伝子に影響を与えるを展望してみたい．

恐れのある物質をどのようにしてふるい分けるかという

環境変異原研究は，環境中の因子，特に化学物質がヒトの遺伝子に与える影響を調べることを目的にしていことが，学会発足当時からの大きな問題であったと思う．
変異原が遺伝子 DNA に作用すると，DNA に付加体を＊E-mail ： nohmi@nihs.go.jp
受付： 2002 年 6 月 27 日 受理： 2002 年 6 月 27 日
日本環境変異原学会

形成し，また DNA 鎖の切断を起こす．DNA 付加体は，後で述べるトランスリージョン DNA 合成を経て遺伝子

本稿は日本環境変異原学会第 30 回大会において発表された特別講演である．
This paper is the special lecture presented at the 30th JEMS annual meeting, 2001.

75

Fig. 1 Typical genotoxicity assays. MLA, mouse lymphoma assay; CA, chromosome aberration
assay; MN, micronucleus assay; UDS, unscheduled DNA synthesis assay.

突然変異を誘発する．一方，DNA 鎖切断は染色体の欠失や転座といった染色体異常を誘発する．そして DNA
損傷は，多くの場合，修復酵素などの特異的な遺伝子発現を促進する．したがって環境変異原の検出は Fig. 1 に示すいくつかの方法を組み合わせて行われてきた．すな
わち end point としては①遺伝子突然変異, ②染色体異常, ③ DNA 損傷, ④損傷により誘導される遺伝子発現が用いられ，テスター生物としては①微生物, ②ほ乳類培養細胞, ③齧歯類（ラット，マウス）が用いられてきた．

Fig. 2 Factors affecting the sensitivity of genotoxicity assays

このうちいくつかの試験法は行政が定めたガイドライン
や法律で実施が求められている．たとえば厚生労働省の「遺伝毒性試験ガイドライン」では，細菌を用いる遺伝
子突然変異試験，ほ乳類細胞を用いる遺伝子突然変異試

1．遺伝毒性試験のハイ・スループット化

験（MLA ＝マウス・リンフォーマ試験）あるいは染色

現在，製薬企業等では「創薬プロセスの変化」「創薬体異常試験，そして齧歯類を用いる小核試験という 3 種

パラダイムのシフト」ということがいわれている．これ

類の試験の実施が求められている．さまざまな目的で作は「ゲノム創薬」という言葉に代表されるゲノム情報をられた新規化学物質を遺伝毒性試験にかけてその遺伝的基にした新しい薬作りというものを意味している．また，影響を調べ，その後に市場に放出するという社会のしく薬の候補化合物も「コンビ・ケム（combinatorial chem-

み（行政や法律）が整えられたことは，これまでの環境

istry）」と呼ばれる手法を用いて，きわめて少量かつ多変異原研究の成果の一つであるといえる．特に 1980 年

数生み出されるようになってきた．したがって従来以上代のなかばからは，GLP（Good Laboratory Practice）制に微量の試料を短期間に処理しうる新しい毒性試験が求度が導入され，法的な規制に結びつく遺伝毒性試験の実められている．また，大気，水，食品などの complex mix-

施を手堅いものにしている．しかし，GLP 試験だけで環

ture に含まれる微量の変異原を，迅速に検出・同定する

境変異原のすべてを検出できるわけではない．食品や天ことは，従来にもまして重要性を増している．こうした状

然物，大気や生体成分などに含まれる化学物質の遺伝的況に鑑み，我々は微生物を用いたより高感度で迅速な遺な影響を調べる場合には，GLP 試験とは別の取り組みが

伝毒性試験の開発を目指して研究開発を進めている．

必要となる．また創薬研究部門では，これまでとは比較

Fig. 2 は，遺伝毒性試験のテスターに使われるバクテにならない多数の候補化合物の中から，より迅速に毒性

リアの感受性を支配する因子を示している．変異原物質の少ない物質を検索する手法の確立が求められている．

の多くはチトクローム P-450 をはじめとする薬物代謝酵

さらに遺伝毒性試験によって検出された「変異原」が，素により活性化され DNA 付加体を生ずる．DNA 付加体

はたしてどれほどヒトの遺伝子に対して有害かという根の多くは DNA 修復酵素により除かれるが，修復されず

本的な問題も解決されてはいない．したがって GLP 試に残った付加体は DNA ポリメラーゼによる複製の際に験を超えた新しい遺伝毒性試験をどのように作って行く

誤りを起こす原因となり突然変異を生ずる．したがって

かということが，これからの大きな課題である．

Fig. 2 に示す 3 つの因子は，テスター株の感受性を支配する重要な因子である．

76

Fig. 3 Mutagenic sensitivities of Salmonella typhimurium strains deficient in mutMST to methylene blue（A）, neutral red（B）, 4-nitroquinoline N-oxide（C）, 2-nitrofluorene（D）and hydrogen peroxide（E）. In the panels of（A）and（B）, solid and dotted lines indicate the results with and without visible light, respectively.
Arrows indicate the doses used for the calculation of the number of His+ revertants per plate per nmol
（Suzuki et al., 1997）. Open symbols（○，□，△）and closed symbols（●，■，▲）represent the resultsof mutMST deficient（YG3001, YG3002, YG3003）and proficient strains（TA1535, TQ1975, TA102）, respectively. The genotypes of strain TA1975 are the same as those of TA1535 but TA1975 is uvrB+.

受性を示し，ニトロ還元酵素を高発現する YG1021,
YG1026 はニトロアレーンを含む芳香族ニトロ化合物に高感受性を示す．北海道大学の鎌滝らは，この菌株にヒトの CYP1A2, NADPH-CYP reductase 遺伝子を導入発現
し，ヘテロサイクリックアミンに対してきわめて高い感受性を示す菌株を作製している（Suzuki et al., 1998）．
この菌株を用いることにより 1 pmol というきわめて低濃度の MeIQ の変異原性を S9 による活性化なしに検出することが可能である．サルモネラのアセチル転移酵素
Fig. 4 Translesion bypass reactions. To bypass the lesion, i.e.,benzo［a］pyrene-guanine adduct（BP-G）, DNA polymerase will incorporate either a correct cytosine（C）
opposite undamaged guanine（G）in the template strand
having 1 bp loop-out or an incorrect A opposite BP-G. The
bypass reactions will result in frameshift or base substitution after the next round of DNA replication.

については，最近，その結晶構造が解かれ触媒機構の詳細が明らかにされている（Sinclair et al., 2000）．
2）DNA 修復酵素遺伝子を破壊したテスター株
感受性を支配する第 2 の因子は DNA 修復である．既存のエームス株でも除去修復能を欠損させた uvrB 株が用いられているが，我々はさらに酸化 DNA 損傷の一つ

1）薬物代謝酵素遺伝子を導入したテスター株である 8-oxoguanine の修復酵素である mutMST 遺伝子をテスターの感受性を支配する第 1 の因子は，薬物代謝破壊した菌株（YG3001）を作製した（Suzuki et al.,

酵素活性である．我々はこれまでに Salmonella1997）．YG3001 は methylene blue ＋ 可視光線，neutral

typhimurium（以下，サルモネラと略）のアセチル転移

red ＋ 可視光線などの活性酸素を介して DNA 損傷を起酵素遺伝子をクローニングし，これをエームス・テスト

こす変異原に対して高い感受性を示す（Fig. 3）．4-nitro-に用いるサルモネラ TA1538 株に導入して芳香族アミン

quinoline N-oxide（4-NQO）は uvr 機能を持った mutMSTやニトロアレーンに高感受性なテスター株を作製してき欠損株 YG3002 に対しては mutM ST 株（TA1975）より＋た（Josephy et al., 1997; 能美, 2001）．アセチル転移酵素

も高い変異原性を示すが，uvr 機能を欠損した YG3001

を高発現する YG1024, YG1029 株は芳香族アミンやニトに対してはその親株である TA1535 と同等の変異原性をロアレーンから生ずる芳香族ヒドロキシルアミンに高感示す．これは 4-NQO が DNA に酸化損傷（8-oxoguanine）
77

Fig. 5The Y-family DNA polymerases. This family consists of at least four sub-families, i.e., DinB,
UmuC, RAD30 and REV1. Boxes represent highly conserved amino acid sequences of theproteins.

を形成するとともに，付加体を形成するためと考えられ

Y ファミリー DNA ポリメラーゼの遺伝的多型やその阻る．uvr 機能を持ったテスター株では DNA 付加体が効率害剤を探索することは，リスク評価，リスク低減化に大よく除去されるため，酸化損傷の量が変異原性の発現のきな役割を果たすと予想される．

律速になると考えられる．uvr 機能を欠損した場合には酸化損傷の多少に関わらず DNA 付加体が変異原性発現

4）機械化によるハイ・スループット遺伝毒性試験の律速となるため，mutMST を欠損させても感受性の増エームス試験や umu テストの試験規模を小さくし，大はみられないものと考えられる．

機械化を図ることで，遺伝毒性試験をハイ・スループット化する試みがなされている（Reifferscheid et al., 1991;

3）DNA ポリメラーゼを高発現するテスター株

Brooks, 1995; Burke et al., 1996; Wilson and Cariello,

感受性を支配する第 3 の因子は DNA ポリメラーゼで1997; Gee et al., 1998）．フラクチュエーション法を用いある．Benzo［a］pyrene の付加した DNA を鋳型に DNA

たエームス試験や高感受性株を用いた umu テストでは，

ポリメラーゼが複製を行うと，付加体のある塩基を飛ば

従来のエームス法に比べ必要な化合物の量が 20 〜 100

して合成したり，その向かい側に誤った塩基の挿入を行

倍少なくなる（富田と森田，2000）．この値は機械によう（Fig. 4）．こうしてできた DNA 鎖をもとにもう一度る自動分注を行わない時の値であるので，分注機械を使DNA 合成が起こると，塩基配列の変化が固定されて突用することにより，さらに試験化合物の量をダウンサイ

然変異，すなわちフレームシフトや塩基置換が生ずる．

ジングすることができると予想される．生物学的手法に損傷部位を乗り越えて進む DNA 合成を「トランスリー

よるハイ・スループット化と機械化によるハイ・スルー

ジョン DNA 合成（translesion DNA synthesis）」と呼び，プット化を結合することにより，遺伝毒性試験の高性能

環境変異原に由来する突然変異の多くは，トランスリー化を図ることが，今後考慮すべき重要な一つの方向では

ジョン DNA 合成により生じていると考えられる．

ないかと考える．

この 3 年あまりの間にトランスリージョン DNA 合成

2. 評価を目指す遺伝毒性試験に関わると考えられる新しい DNA ポリメラーゼが同定され，Y ファミリー DNA ポリメラーゼと名付けられた

近年，発生工学技術の進歩により，さまざまな特性を（Friedberg and Gerlach, 1999; Johnson et al., 1999;

持つトランスジェニックマウス，ノックアウトマウス，

Friedberg, 2001; Ohmori et al., 2001; Friedberg et al.,

トランスジェニックラットが開発されている．遺伝毒性

2 0 0 2 ）． こ の フ ァ ミ リ ー に は 少 な く と も D i n B /研究の分野においても大腸菌の gpt, lacI, lacZ 遺伝子など

UmuC/RAD30/REV1 の 4 つのサブファミリーが存在すを導入した変異検出用のマウス，ラットが開発されている（Fig. 5）．異なる DNA ポリメラーゼは一部重複しつる（Nohmi et al., 2000; Heddle et al., 2000; 能美と増村，つも異なるタイプの DNA 損傷のトランスリージョン

2000）．

DNA 合成に関与しているようである．環境変異原→
DNA 付加体→ DNA 修復→トランスリージョン DNA 合1）標的臓器の予測

成→突然変異という流れをさまざまな角度から探求する

発がん物質についてはその発がん性に臓器特異性のあことが，これからの環境変異原研究において重要である．

ることが知られており，変異検出用のトランスジェニッ

78

Fig. 6 Mutant frequencies in various organs of PhIP-treated and untreated male gpt delta mice.（A）gpt mutant frequencies and（B）Spi ─ mutant frequencies. Bars represent mean values andstandard deviations.

クマウスが開発された当初から，in vivo における遺伝毒

スジェニックラットを開発した．このトランスジェニッ性を指標に，発がんの標的臓器を予測できないかというクラットの 4 番染色体の片方には，ラムダー EG10 が数期待があった．これに関連して，2-amino-1-methyl-6-

コピー挿入されている．

phenylimidazo［4,5-b］-pyridine（PhIP）を雄の gpt delta

このトランスジェニックラットに ethyl nitrosourea

mouse に投与し，各臓器で起こる gpt 突然変異体頻度な（ENU）100mg/kg を腹腔内投与し，7 日目に屠殺して肝らびに Spi ─突然変異体頻度を測定した（Masumura et

臓を摘出し gpt, Spi ─ assay を行うと，gpt 突然変異体頻度

al., 1999）．臓器別でみると gpt，Spi ─いずれの場合も，は無処理群に比べ約 7 倍上昇していた．一方，欠失変異

大腸で最も突然変異体頻度が高くなり，ついで脾臓，肝を検出する Spi ─ assay では陰性の結果となった．この結臓の順であった（Fig. 6）．PhIP については雄のラット

果は，ENU が主に塩基置換を誘発するというこれまでに投与すると大腸と前立腺に腫瘍を発生することが報告の知見とよい一致を示す．またトランスジェニックラッ

されており，この結果は発がんとの相関を示しているよ

トに benzo［a］pyrene を 62.5 mg/kg, 125 mg/kg 投与し，うにみえる．しかし，雌の gpt delta マウスに PhIP を投

7 日目に肝臓における gpt, Spi ─ 変異体頻度を測定すると，与した場合にも変異体頻度は大腸が肝臓よりも高くな

gpt, Spi ─ともドーズに応じて変異体頻度が上昇し，トラる．ラットでは PhIP を雌に投与すると乳がんを誘発す

ンスジェニックラットにおいても欠失変異を検出するることが知られており，ラットの発がんでみられた性差Spi ─ アッセイが使えることを示した．

をマウスの変異では必ずしも反映していない．一般的に，

結

変異体頻度の上昇が観察された臓器の中に発がんの標的語

臓器が含まれていることが多いと思うが，変異体頻度の今から約 20 年前の日本環境変異原学会第 11 回大会にもっとも高い臓器が必ずしも発がんの標的臓器になるとおいて，当時国立遺伝学研究所の変異遺伝部長であったは限らない．変異体頻度は上昇しながら発がんには至ら

賀田恒夫博士は抄録に次のような文を書かれた（賀田，ない原因を考えることは，発がんの抑制を考えるうえで

1983）．

重要な示唆を与えてくれるのかもしれない．最近，「環境変異原研究とは何であるか？環境中に存在する

C57BL/6N マウスに PhIP を投与すると，雄，雌ともに変異原がわれわれに与える影響毒性を正しく知ることを

小腸に腫瘍を発生することが報告され，PhIP の発がん起点としている．まさしく，ヒトの健康の向上を目的と性は遺伝的な背景によって影響されることが示唆されてした実学である．従って，このような目的にかなうこと

いる（Ochiai et al., 2002）．

が必要である．ただ，毒物を検出して人命を救う場合のような直接的な場合よりも，むしろ，毒性を予見する方

2）トランスジェニックラット法を開発するといった間接的な場合が多い．とくに，環遺伝毒性試験の分野では小核試験をはじめ in vivo の境変異原の場合では，がんとか遺伝的影響のような慢性実験にマウスを用いることが多いが，発がん試験をはじの毒性を対象としているがゆえに，種々な仮説の上に立め他の毒性試験や薬物代謝の分野ではラットが多く使わった予測が必要になってくる．実験生物におけるデータ

れており，変異検出用のトランスジェニックラットの開から，ヒトへの影響の評価を行う所以である．ここに難発が求められてきた．明治製菓安全性研究所の林，近藤，しさがある．」

進藤らのグループは，我々と共同してトランスジェニッ

我々はサルモネラからトランスジェニックラットまで

クマウスの開発に用いたラムダー EG10DNA を Sprague

様々なモデル生物を使って化学物質の遺伝毒性を調べてDawley ラットの受精卵に導入し，変異検出用のトランいる．大切なことはその結果（陽性，陰性）を直接ヒト
79

に当てはめるのではなく，その結果からより普遍的なルール（原則，教訓，原理）をみつけ，これをヒトに適用するという姿勢ではないだろうか．遺伝毒性を含む毒性研究の目指すところは，ヒトへの影響を評価（予測）す
ることである．しかし私たちの前には「ヒトを含む動物の種差」や「複合状態での影響評価」「低用量域におけるドーズレスポンス」と数々の難問が立ちはだかっている．「毒性の予測」は，天候や地震など自然現象の予測と同様に社会的に大きな意味を持つ問題である．我々の「毒性に関する予測能力」は，いまだ稚拙な段階にあるのかもしれないが，その頂をきわめることは社会が求めており，「（遺伝）毒性の予測」は，この分野に携わる専門家が他の分野の研究者と共同して解決してゆかねばな
らない 21 世紀における大きな挑戦であると考える．
謝

辞本論文で紹介したハイ・スループット遺伝毒性試験な
らびにトランスジェニックラットを用いる遺伝毒性試験の開発は，財団法人ヒューマンサイエンス振興財団の援助で進めている創薬等ヒューマンサイエンス総合研究の一環として行われているものである．原稿にコメントを寄せてくれたグラクソ・スミスクライン株式会社，森田健博士，明治製菓薬品総合研究所，林宏行修士，国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部，山田雅巳博士，増村健
一修士に感謝いたします．
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学術賞受賞講演

Environ. Mutagen Res., 24：81-90（2002）

変異・癌原性物質の産生・代謝とその活性抑制に関する研究
大西 克成＊
徳島大学大学院医学研究科プロテオミクス医科学専攻生体制御医学講座分子細菌学分野〒 770-8503 徳島市蔵本町 3-18-15

Studies on production and metabolism of mutagenic andcarcinogenic substances and inhibition of their activities
Yoshinari Ohnishi
Department of Molecular Bacteriology, Graduate School of Medicine,
The University of Tokushima, 3-18-15 Kuramoto-cho, Tokushima 770-8503, Japan

Summary
Dr Bruce Ames developed a simple procedure for assaying bacterial mutation, i.e. the Ames test, using
Salmonella Typhimurium his mutant strains. We have used this procedure to measure mutagenicity of complex mixtures such as those in airborne particulates, automobile exhaust, small engine exhaust, wastewater,
kerosene-heater exhaust and yakitori as well as nitroarenes in the mixtures, especially 1-nitropyrene（1-NP）
and dinitropyrenes（diNPs）. We measured the amounts of 1-NP and diNPs by a new procedure in which
specific nitroreductases are used to convert NP to aminopyrene（AP）and the fluorescent AP is assayed efficiently and sensitively by high-pressure liquid chromatography. Metabolism of 1-NP in germ-free and conventional rats was elucidated: it appears that the liver is primarily responsible for ring hydroxylation and Nacetylation of 1-NP and for O-glucuronide conjugation, while intestinal bacteria play a dominant role innitroreduction of 1-NP and its metabolites and in glucuronide cleavage. In addition, we showed that glutathione conjugates of 1-NP oxides produced in the liver were excreted into the bile and those in the upper
intestine were metabolized to the corresponding cysteinylglycine and cysteine conjugates by γ-glutamyltransferase and aminopeptidase of pancreatic juice. The cysteine conjugates were then metabolized by βlyase of the normal bacterial flora in the lower intestine to the reactivated metabolites and reabsorbed, partly
producing DNA adducts in the intestinal mucosa. We observed in vivo formation of mutagens induced byintraperitoneal administration of pyrene in animals during exposure to nitrogen dioxide, and we concluded
that 1-hydroxypyrene is nitrated in the body when the animal is exposed to NO2 gas after hydroxylation of［a］
pyrene in the liver. We studied the carcinogenicity of 1,6-diNP, which is stronger than that of benzo
pyrene, the augmenting effect of a nonmutagenic fraction in soy sauce on mutagenicity of 3-diazotyramine
produced in nitrite-treated soy sauce, the antimutagenicity and anticarcinogenicity of spices and medicinal
plants, lemon grass（ Cymbopogon citratus Stapf）, roselle（ Hibiscus sabdariffa Linn.）, bitter melon（Momordica charantia Linn.）and Murdannia loriformis, and the interaction among drugs, antibiotics andintestinal bacteria. We developed new bacteria that produce lycopene or human lactoferrin, which arechemopreventive substances.
Keywords ： mutagens, 1-nitropyrene, intestinal bacteria, chemoprevention, antimutagenicity and anticarcinogenicity＊

E-mail ： ohnishi@basic.med.tokushima-u.ac.jp
受付： 2002 年 6 月 10 日 受理： 2002 年 6 月 10 日
日本環境変異原学会
本稿は日本環境変異原学会第 30 回大会において発表された 2001 年度学術賞受賞講演である．
This paper is the lecture of the JEMS Award（2001）presented at the 30th JEMS annual meeting, 2001.

81

緒

異原物質もあることを明らかにした（Tokiwa et al.,言1980）．また，自動車排ガス中の粒子状物質の変異原性-を Ames 法で測定し，ガソリンエンジンの乗用車の排ガ

株による高感度で代謝活性化を加えた変異原性試験の改ス 1m 当たり TA98 株 S9（+）で 500 revertants，TA100 株

Ames ら（1973 a,b）が Salmonella Typhimurium his

良法を発表して以来，殺菌性物質が入っていなければ混＋3

S9（+）で 960 revertants を示したが，ディーゼルエンジン
3

合物でもその変異原性を細菌の His 復帰変異集落数でバスの排ガスではそれぞれ 19,600，5,780 revertants/m

測定することが容易になった．しかも変異原性が強けれを，ディーゼルエンジントラックでは 9,140，3,780

ば化学的測定限界を超えて，変異原性物質の存在を証明

revertants/m を示した（Ohnishi et al., 1980; Ohnishi,3

できるようになった．我々はこの Ames 法を利用するこ1988）．さらに，発電気用の小型ガソリンエンジンでとによって環境中の混合物の変異原性を測定し，その中1000W 発電させると排出粒子状物質の変異原性は TA98のニトロ化合物の変異原性を測定し，新しい化学的測定

株 S9（ +）で 20,500 His revertants/plate/m を示した法を開発して含有量を明らかにした．1-nitropyrene（1-（Ohnishi et al., 1982）．これらの大気やエンジン排出粒

NP, CAS : 5522-43-0）をモデル化合物としてその生体内子状物質を抽出分画すると中性画分に S9 画分による代代謝経路を明らかにした．特に，1-NP oxides の glu-

謝活性化を必要としない直接変異原性を認め，ニトロ化

tathione 抱合体は膵液中のγ-glutamyltransferase と合物の存在が推定された．その中の高変異原性物質であ

aminopeptidase によってラット小腸内で分解され，生じる 1-NP と 1,6-diNP（Tokiwa et al., 1981b）の定量法を確た cysteine 抱合体は大腸内の腸内菌によって分解されて立するために，まず，腸管内に常在する嫌気性細菌であ+

3チオール化合物になることを明らかにした．自動車排ガる Bacteroides fragilis の 4 種のニトロ還元酵素 nitrore-

スや石油ストーブ中の NO 2 によって多環芳香族炭化水

ductase（NRase）を精製した（Kinouchi et al., 1982;

素（PAH）がニトロ化されることを追試し，さらに生体

Kinouchi and Ohnishi, 1983）．それぞれ基質特異性が異内でも NO2 暴露によって pyrene（CAS: 198-55-0）がニなっており，NRase I は 1-NP を還元して蛍光性の 1-

トロ化を受ける機序を明らかにした．また，1,6-dini-aminopyrene（1-AP, CAS: 1606-67-3）に，NRase III は

tropyrene（1,6-diNP, CAS: 42397-64-8）の発癌性は benzo

1,6-diNP を 1,6-diAP に変換した．高速液体クロマトグラ［a］pyrene（CAS: 50-32-8）より強いことを示した．食品

フィーでこれらのアミノ体を高感度に定量する方法を確に関しては醤油の亜硝酸処理後の変異原性について，立した（Kinouchi and Ohnishi, 1983; Manabe et al., 1984;

ethanol やいろいろな食品との相互作用について，さらManabe et al., 1985）．1-NP と 1,6-diNP の検出感度は，そに香辛料や医薬用植物の抗変異・抗発癌作用について調れぞれ 1.1×10 と 1.3×10 pmol であった（Manabe et

べた．また，癌治療薬の副作用と腸内菌の関係について

al., 1984; 大西, 1985）．

-2-2の研究も行った．腸内菌の大腸発癌促進と抑制作用を調Ames 法とアミノ体で高感度に定量する方法によっ

べ，最近では抗発癌作用をもつ生理活性物質を産生するて，ディーゼルトラック排ガス（Manabe et al., 1985），

腸内菌を作製して，癌の化学予防を試みている．過去

ディーゼル小型エンジン排ガス（Ohnishi et al., 1982;大27 年間に多くの共同研究者とともに以上のようなこと

西と木内, 1983），ディーゼルエンジン内燃焼ガス（大西を研究してきたのでその要点について述べる．

と木内, 1983; Hayano et al., 1985），石油ストーブ燃焼中の室内空気（Ohnishi et al., 1985; Kinouchi et al., 1988），

1．ニトロアレーンの検出と定量

給油所排水（Ohnishi et al., 1983; Manabe et al., 1984），

大気中の浮遊粒子状物質をハイボリュームサンプラー

使用済みエンジンオイル（Manabe et al., 1984），さらにでガラス繊維濾紙上に集め，methanol でソックスレー

食品である焼き魚，焼肉，焼き鳥の変異原性を測定し，抽出を行い，S9 画分を加えてネズミチフス菌 TA98 株を
3

NP 類の定量を行った（Ohnishi et al., 1985; Kinouchi et

使った Ames 法で変異原性を測定すると，大気 1m 当たal., 1986a; Ohnishi et al., 1986a）．そして 1-NP が多い試＋料には diNP 類が含まれており，変異原性に占める割合＋

も大きいことを明らかにした（大西，1985）．

り工場地帯（1974-75 年の大牟田市）で 22-445 His
3revertants/m ，都市・住宅地帯（福岡市）で 7-78 His
3

revertant/m の変異原性を示した（Tokiwa et al., 1977）．
中に含まれる化学物質として benzo［ e］pyrene（CAS:2．1- NP の生体内代謝

192-97-2），chrysene（CAS: 218-01-9），fluoranthene

Bacteroides fragilis から精製した NRase I と NRase III（CAS: 206-44-0），benzo［ghi］perylene（CAS: 191-24-2），

は in vitro でそれぞれ 1-NP と 1,6-diNP を代謝活性化してbenz［a］anthracene（CAS: 56-55-3），benzo［a］pyrene，DNA, RNA, poly（G）, poly（dG）に結合させ付加体を形成

pyrene（CAS: 129-00-0），coronene（CAS: 191-07-1），

した．1-NP の DNA 付加体の酵素的分解産物の主要産物

perylene（CAS: 198-55-0）などの polycyclic aromaticは N（deoxyguanosin-8-yl）-1-aminopyrene であり，哺乳動hydrocarbons（PAH）以外に S9（-）で測定される直接変物の NRase である xanthine oxidase によって形成される

82

付加体と同じであった．SD ラットの各臓器と腸管内容

NP 4,5-oxide）と 1-NP 9,10-oxide の glutathione，cys-

物の NRase 活性を測定すると, 肝臓, 小腸, および腸管内

teinylglycine，および cysteine 抱合体であり，1-NP 4,5-

容物で高かった．腸管内容物ではその菌数に比例し, 特oxide と 1-NP 9,10-oxide との glutathione 抱合体はそれぞに嫌気性菌数に依存していた（Kinouchi and Ohnishi,

れ 2.6 ％と 10.4 ％であった．胆汁中に排出された 1-NP
4,5-oxide と 1-NP 9,10-oxide の glutathione 抱合体が小腸

1986）．
次に，1-NP の生体内代謝を明らかにするために，無3内において膵液中のγ-glutamyltransferase と aminopep-菌ラットと通常ラットを使用して，［ H］1-NP を経口投

tidase（Ohnishi et al., 1990）によって分解されて cys-

与後，各臓器の放射能と尿や糞便中の代謝産物を分析し

teine 抱合体となり，さらに大腸内で腸内菌，特にた．無菌ラット糞便中の主たる代謝産物は，3-nitropy-

Peptostreptococcus magnus と Eubacterium limosum の cys-renol ＞ 1-NP ＞ 4,5-dihydroxy-4,5-dihydro-1-NP ＞

teine conjugate β-lyase によって分解されて，再吸収され6-nitropyrenol ＞ 8-nitropyrenol の順に少なかった．無たり，活性化されて腸管粘膜内で DNA 付加体を形成す

菌ラット尿中には 1-NP を除いた同様の化合物の glu-

ることを明らかにした（Kinouchi et al, 1990; Kinouchi etcuronide 抱合体が証明された．通常ラットではニトロ還al., 1992; Kinouchi et al., 1993; Kataoka et al., 1995）．また，

元反応とアセチル化反応が起こっており，糞便中の代謝

1-NP の代謝産物としてアセチル化体が出現するが，ア

産物は 1-NP ＞ 1-aminopyrene ＞ 8-acetylaminopyrenol ＞

セチル化には腸内菌はほとんど関与せず肝臓で起こるこ6-acetylaminopyrenol ＞ 3-acetylaminopyrenol であった．

とを示した（Kinouchi et al., 1987）．

尿中の主たる代謝産物は 6-と 8-acetylaminopyrenol の1-NP のリスクを動物実験の結果からヒトに外挿する

glucuronide 抱合体であった．通常ラットの胆汁中の抱ために，肝臓での 1-NP の酸化的活性化と不活性化のヒ合体を分析すると，4,5-dihydroxy-4,5-dihydro-1-NP，3-，

トと 5 種の動物における差を in vitro で調べた．ヒトの6-，および 8-nitropyrenol の glucuronide 抱合体であった

1-NP oxides 生成活性は ICR マウスに似て低く，1-NP

が，時間がたつと 6-と 8-aminopyrenol，および 6-と 8-

4,5-oxide の epoxide hydrolase による加水分解はヒトでacetylaminopyrenol の glucuronide 抱合体が増加した．

最大であった．1-NP 4,5-oxide からのグルタチオン抱合

また， β -glucuronidase に反応しない硫酸抱合体や glu-体生成活性は 9,10-oxide からより高かったが，ヒトとイ

tathione 抱合体の存在も推定された．以上の結果から，

ヌでは極端に低かった．このようにヒトの 1-NP の代謝

NRase はあるにも関わらずニトロ還元反応は肝臓では行経路の酵素活性と同じ動物はおらず，種差があることをわれず，腸管内細菌によることが明らかになった．また，明らかにした（Kataoka et al., 1991; Ohnishi et al., 1991）．

通常ラットの胆汁中の代謝産物の解析から，肝臓ではピさらに，腹腔内に 1-NP を投与した膵管胆道合流異常

レン環の水酸化反応，N-アセチル化反応，および抱合反のモデル犬では，解毒抱合体に膵液中のγ-glutamyl-

応が起こり，腸管内常在細菌ではニトロ還元反応と脱抱

transferase や aminopeptidase と感染細菌の sulfatase が作合反応とが起こることを明らかにし，1-NP，主として用して，抱合体の再活性化が胆道内で起こっていること

glucuronide 抱合体のラット生体内代謝経路を推定したを示し，膵管胆道合流異常症のヒトでの胆道癌の発生率（Kinouchi et al., 1986b; Ohnishi et al., 1986b）．

が高い原因の一つを示唆した（Dong et al., 1993）．

3．腸内菌による 1- NP の代謝と第 3 相反応

4．diNP の発癌性

肝臓での第 1，2 相反応に対して，胆汁中に排出され1-NP と 1,6-diNP を精製して各 0.1 mg を週 1 回 20 週間

た変異原代謝産物の腸管内での主として腸内菌による反雄 BALB/c マウスの皮下に投与し，45 週後に観察したと応を第 3 相反応と呼んでいる．この腸内菌の役割を明らころ，1-NP 投与群では腫瘍は発生しなかったが，1,6-

かにするために通常の SPF（specific pathogen-free）マ

diNP 投与群では 20 匹中 10 匹に投与部位に悪性線維性組ウスに比べて腸内生菌数を 0 に近づけるための抗生物質

織 球 腫 が 生 じ た （ Tokiwa et al., 1984; Tokiwa and処理法を確立した．bacitracin，neomycin sulfate，strep-

Ohnishi, 1986）．雄 F344/DuCrj ラットの左肺に 1.5 mg

tomycin sulfate の 3 剤を 1 日 2 回 5 日間胃内強制投与する

1-NP, 0.15 mg 1,6-diNP, または 0.5 mg 3-methylcholan-と生菌数が減少するだけでなく，腸内容物中の腸内菌由

threne（MCA, CAS: 56-49-5）を含む beeswax-tricaprylin

来の cysteine conjugate β -lyase， β -glucuronidase，を注入し，72 週後に観察すると，1,6-diNP 投与群ではnitroreductase 活性が減少した．それに対して，膵液由

28 匹中 21 匹（75 ％）に扁平上皮癌，2 匹（7 ％）に未分

来のγ-glutamyltransferase や aminopeptidase 活性は減少

化癌，2 匹（7 ％）に扁平上皮化生が生じていたが，1-しなかった．さらに，glucose の腸管からの吸収や肝臓NP 投与群では 32 匹すべて癌も扁平上皮化生も誘発されの酵素活性には影響が無かった（Kinouchi et al., 1993）．

ていなかった．MCA 投与群 19 匹では，1,6-diNP 投与群

3［ H］1-NP をラットに経口投与後 48 時間の胆汁中の代謝より早く 100 ％扁平上皮癌が誘発された（Maeda et al.,産物の 21.4 ％は 4,5-epoxy-4,5-dihydro-1-nitropyrene（1-1986）．さらに，用量依存性を調べるために 0.003, 0.01,
83

0.03, 0.1, 0.15 mg の 1,6-diNP を肺内に投与したところそ
れぞれ 0/39（0 ％）, 4/30（13 ％）, 13/31（42 ％）, 22/26

6．亜硝酸処理醤油の変異原性（85 ％）, 6/9（67 ％）に未分化癌が，0.03, 0.1, 0.3, 1.0 mg

Nitrate 摂取量と胃癌死亡率は正の相関を示すの benzo［ a］pyrene 投与で 1/29（3 ％）, 7/30（23 ％）,（Hartman, 1983）．nitrate は口腔内や腸管内で nitrite に

22/29（76 ％）, 9/13（69 ％）に扁平上皮癌が用量依存的還元され，食品中の amines や amides と容易に反応してに誘発されており，同じ用量では benzo［a］pyrene より

発癌性の N-nitroso 化合物を生成する（Magee et al.,1,6-diNP の方が発生頻度が有意に高かった（Iwagawa et1967）．Wakabayashi et al.（1983）は亜硝酸処理した日

al., 1989）．

本の食品中で醤油が最も高い変異原性を示すこと，およ5．NO2 暴露によるニトロ化反応
大気中で PAH を NO2 ガスに暴露すると直接変異原性

び 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro- β -carboline-3-carboxylicacid（MTCCA）が亜硝酸処理醤油中に生じる変異原の前駆体であることを報告した．また，醤油中の tyramineのニトロ体が生じることを明らかにしていた（Pitts etは亜硝酸処理で強力な変異原になり（Ochiai et al.,al., 1978; Tokiwa et al., 1981a）が，20 ppm の NO2 ガスに

1984），その産物 3-diazotyramine はラット口腔内に扁平暴露している雄 ICR マウスの腹腔内に 800 mg/kg 体重の上皮癌を誘発することが報告された（Fujita et al., 1987）．

pyrene を投与し，さらに 24 時間 NO2 ガスに暴露したとそこで共同研究者の Higashimoto et al.（1988）は 25 種

ころ，生体内でニトロ化反応が起こり，β-glucuronidase

類の日本の醤油について 5 ％の濃度で 50 mM sodium

処理した尿中に変異原性の 1-NP の水酸化体である 3-

nitrite（pH 2）と 37 ℃，1 時間保温したところ，その反hydroxy-1-NP, 6-hydroxy-1-NP, 8-hydroxy-1-NP，および

応 液 は TA100 株 S9（ - ）で 368 ± 228（ 34-834）

1-hydroxypyrene を検出した（Kanoh et al., 1987）．また，

revertants/µl 醤油の変異原性を示すことを報告した．生

1-hydroxypyrene 投与の場合にも NO2 暴露で同様のニト

じた変異原は光に対して不安定であり，黄色灯ないし暗ロ化合物を証明した（Kanoh et al., 1990）．400 mg/kg 体

所で安定であった．醤油中の変異原前駆体としては既知

重の 5 種類の PAH（pyrene, fluoranthene, fluorene,の tyramine や MTCCA の他に変異原性が弱い 1-methyl-

anthracene, chrysene）をそれぞれ腹腔内に投与した ICR

1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline（MTC）が証明された．とマウス，pyrene，または fluoranthene を投与した Wistar

ころが，これら 3 種類の成分の亜硝酸処理後の変異原性ラット，Syrian golden ハムスター，Hartley モルモットの合計は亜硝酸処理醤油の変異原性の一部しか証明できをそれぞれ 20 ppm の NO2 ガスに暴露し，尿中のグルクなかった．さらに分析を進めて，醤油中には亜硝酸処理

ロン酸および硫酸抱合体を分析した．脱抱合後のtyramine すなわち 3-diazotyramine の変異原性を 9 倍に増pyrene，または fluoranthene を投与した NO2 暴露のマウ

強する因子が含まれていることを示した．したがって，

スとハムスターの尿の変異原性はネズミチフス菌 TA98

tyramine が亜硝酸処理醤油中に産生される変異原の主た

株と TA100 株に対して非常に高かったが，ラットとモる前駆体であり，上記 3 前駆体と 3-diazotyramine の変異

ルモットではそれほど高くなかった．5 種類の PAH を混

原性の増強因子とで亜硝酸処理醤油の全変異原性を説明合して与えると NO2 暴露マウス尿の変異原性は 1.5 倍にすることができることを明らかにした．この変異原性増増加した．NRase 欠損変異株 TA98NR や acetyltrans-

強因子は非変異原性であり，亜硝酸処理前後で熱にも光ferase 欠損変異株 TA98/1,8-DNP6 に対しては変異原性がにも安定であった（Higashimoto et al., 1988）．

減少した（Ohnishi et al., 1990; Miyanishi et al., 1996）．

醤油を 1.25-10 ％ ethanol 存在下で亜硝酸処理した場合

生体内でのニトロ化の機序を明らかにするために，10には ethanol の濃度に比例して，生じる変異原性が減少µg/ml の pyrene，または 1-hydroxypyrene を含む 50 mMした．ethanol の代わりに市販のアルコール飲料である

Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4），または dichloro-methane 溶

日本酒，ワイン，焼酎，ウイスキー，ブランディーが有液に NO 2 ガスを吹き込んだところ，pyrene は両溶液で効であったが，ビールは効かなかった．醤油成分の tyra-

NO2 によってニトロ化されず，1-hydroxypyrene は Tris-

mine を ethanol, n-propanol, または isopropanol 存在下でHCl 緩衝液中で NO2 によってニトロ化されたが，有機溶

亜硝酸処理すると変異原性が減少したが，methanol 存

媒中ではニトロ化されなかった．ascorbic acid や α -在下が最も強く減少した．しかし，glucose や sucrose

tocopherol を加えると 1-hydroxypyrene の水溶液中でのなどの糖存在下では変異原性が 2 倍増強した．この亜硝NO2 によるニトロ化反応が阻害された．さらに，ascorbic

酸処理 tyramine の変異原性の減少には，tyramine を亜acid や α-tocopherol を経口投与したマウスでは pyrene と硝酸と ethanol とで同時処理することが必要であった．

NO2 によるニトロ化反応が阻害された．これらの結果か

この減少は tyramine からの変異原性 3-diazotyramine のら，1-NP は肝臓で水酸化を受けてから，イオン反応で 1-生成が減少した結果であることを明らかにしたhydroxypyrene がニトロ化されるという機序を明らかに（Higashimoto et al., 1995）．

した（Kinouchi et al., 1994; Miyanishi et al., 1996）．
84

一方，醤油成分の MTCCA を 7.5 ％ ethanol 存在下で

37 ℃，60 分間，pH 3 で 50 mM 亜硝酸処理すると，変異とを示唆しているので，15 菌種 23 株の好気性細菌，16

原性が ethanol 非存在下より強く増加した．この変異原

菌種 16 株の嫌気性細菌，1 真菌，合計 32 菌種 40 株の粗性増強効果は MTCCA を亜硝酸と ethanol とで同時処理

抽出液の PyNPase 活性を測定したところ，腸内最優勢

することが必要であり，methanol, n-propanol, iso-菌である Bacteroides 属の B. eggerthii, B. fragilis, B. ova-

propanol も増強効果があったが，glucose や sucrose は無tus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. vulgatus が効であった．また，日本酒と焼酎は強い増強効果があり，

sorivudine を BVU に分解する高い活性を保有しているこ

ワイン，ウイスキー，ブランディー，ビールにも増強効とがわかった．ラットに 100 µmol/kg の sorivudine を投果があった（Higashimoto et al., 1996）．MTCCA の与すると血清中の BVU 濃度は 8 時間後に最高になり，

ethanol 存在下で亜硝酸処理のときにさらにスダチ

血清中濃度 AUC（area under the curve）は 101µM×h で，（Citrus sudachi Shirai），レモン（C. limon Burm.），ユ

半減期は約 4.2 時間であった．in vivo での腸内菌叢によズ（C. junos Tanaka）などの柑橘類を反応液に入れるとる BVU 産生を調べるために，3 日間抗生物質を投与した生じる変異原性が減少した．特に，果汁の部分より外皮ラットに sorivudine を投与して血清中の BVU を測定しの部分の方が変異原性減少効果が強かった．このときのた．好気性菌と嫌気性菌に有効な ampicillin，または

柑 橘 類 中 の 抗 変 異 原 性 物 質 と し て は lignin, pectin,

bacitracin, neomycin, streptomycin の 3 剤混合液を前投与

D-limonene，naringin，hesperidin，ascorbic acid，citric

したラットに sorivudine を投与すると，少量の BVU しacid が示唆された（Higashimoto et al., 1998）．柑橘類のか血清中に検出されなかった．また，嫌気性菌の数を減代わりに緑茶，紅茶，ウーロン茶の熱湯抽出液，さらに少させる metronidazole で前処理すると血清中の BVU 濃

ハーブ茶（バナバ，テンチャ，カキノハ，カキドオシ，

度は同様に低かった．このことは in vivo においても，

ヨモギ，トチュウ，センナ）やハーブ抽出液（ジオウ，

腸内菌叢の優勢菌である嫌気性菌が BVU を産生していトウキ，オウバク）を加えても変異原性は減少した．そることを示唆している．ところが，好気性菌に作用するの抗変異原性の有効成分としてカテキン類が考えられ

kanamycin で前処理すると血清中の BVU 濃度は約 3 倍にた．これらのお茶やカテキン類の抗変異原性はこれらの増加し，BVU の半減期も 3 倍以上に増加した物質の還元力と正の相関を示した（Higashimoto et al.,（Nakayama et al., 1997）．このことは 5-FU と sorivudine，

2000; Higashimoto et al., 2001）．

さらに抗生物質が加わった薬物相互作用によって 5-FU

7．抗癌剤や発癌予防薬使用時の副作用の副作用が出現した可能性を示唆している（大西，1997）．

1- β -D-arabinofuranosyl-5-（E）（2-bromovinyl）
uracil非ステロイド系抗炎症剤 nonsteroidal antiinflammato-（sorivudine）は抗ヘルペスウイルス剤として開発され，ry drugs（NSAID）は抗炎症・鎮痛剤として使われるだ

varicella-zoster virus と herpes simplex virus type 1 に対けでなく，家族性大腸腺腫症の患者に対して化学予防

して非常に有効であった（Machida et al., 1981; Machida

薬・治療薬として使用される（Marnett, 1992; Weiss andand Sakata, 1984; Machida, 1986）．sorivudine は 1993 年

Forman, 1996）．しかし，ヒトに対しては使用者の 15 ％に日本で抗ウイルス経口薬として認可されたが，fluo-に胃潰瘍，8.4 ％に小腸潰瘍を誘発し（Allison et al.,rouracil 系抗癌剤である 5-fluorouracil（5-FU）や Tegafur

1992），ラットには回腸潰瘍を形成する．NSAID の一種で治療していた癌患者に上記のウイルス感染が発症し，5-bromo-2-（4-fluorophenyl）-3-（4-methylsulfonylphenyl）

sorivudine を併用して副作用として血液疾患がおこり，

thiophene（BFMeT）を使ってラット回腸潰瘍形成と抑5-FU による骨髄抑制がひどい 15 人の患者が死に至った

制の機序を明らかにした（Uejima et al., 1996; Kinouchi

ために使用禁止となった（Swinbanks, 1994）．sorivu-

et al., 1998; Shan et al., 1998）．SPF の Wistar ラットに

dine が（E）-5-（2-bromovinil）uracil（BVU）に分解され，500-1500 mg/kg の BFMeT を 1 回胃内投与すると 72 時間

BVU が肝臓において 5-FU の分解酵素である dihydropy-

後に 28 匹中 20 匹（71 ％）に回腸潰瘍が形成されたが，rimidine dehydrogenase を非可逆的に阻害して，5-FU の腸内生菌数を抑えるために bacitracin, neomycin sulfate,

血中濃度を異常に上昇させて副作用を引き起こすと考え

streptomycin sulfate の 3 剤を毎日投与したときには，26られていた（Desgranges et al., 1986）．そこで我々は匹中 1 匹しか潰瘍は形成されなかった．無菌ラット（10sorivudine がどこで BVU に分解されるのかを知るため匹）や Bifidobacterium adolescenetis ATCC15703 株のノに，その分解酵素 pyrimidine nucleoside phosphorylase

トバイオートラット（5 匹），Lactobacillus acidophilus（PyNPase）活性の分布を Sprague-Dawley 雄ラットで調ATCC4356 株のノトバイオートラット（5 匹）に BFMeT

べた．肝臓，腎臓，胃，盲腸，大腸，および胃内容物とを投与しても回腸潰瘍は形成されなかった．ところが，小腸内容物の酵素活性は低いか検出されなかったが，盲Eubacterium limosum ATCC8480 株や Escherichia coli

腸内容物と大腸内容物の酵素活性が非常に高いことがわ

K12 株（その中の W3110 株）のノトバイオートラット

かった．このことは腸内菌叢が重要な役割をしているこに BFMeT を投与すると潰瘍が形成された．もちろん，
85これらのノトバイオートラットを抗生物質 3 剤で処理し2 0 0 2 ）． r o s e l l e は P h I P の A C F 形 成 も 抑 制 し たておくと潰瘍は形成されなかった．これらのことは， （Chewonarin et al., 1999）．これらの薬用植物の抽出物，
BFMeT による回腸潰瘍形成に関与している腸内菌と関および含有成分である citral，geraniol，β-myrcene が大与しない腸内菌があることを示している．SPF ラットで腸発癌の化学予防に使用可能であることを示唆した

回腸潰瘍が形成されているときには，回腸の優勢菌であ（Ohnishi et al., 1998）．

る Lactobacillus が相対的に減少し，グラム陽性菌は9．新機能獲得腸内菌による大腸発癌初期過程の抑制

97.4 ％から 56.4 ％に減少し，Escherichia coli，Klebsiella，Proteus，Bacteroides が増加して，これらのグラム陰性桿菌は回腸内容物の総菌数の 1.2 ％から 37.3 ％まで増加

腸内菌は （1）発癌物質の生成，（2）脱抱合による再活

した．BFMeT による回腸潰瘍形成は上記の性化，（3）発癌物質の吸着，（4）二次胆汁酸の生成，（5）Lactobacillus や Bifidobacterium の一夜培養液，または細胞増殖の調節，（6）免疫系の賦活などで大腸発癌に影

Bifidobacterium breve と Streptococcus thermophilus を含む

響を与えているといわれている．たとえば，bacitracin,

ヨーグルトを投与すると減少した（Uejima et al., 1996）．

neomycin sulfate, streptomycin sulfate の 3 剤混合液を前

L. acidophilus や B. adolescentis の培養上清を飲料水とし投与したラットの生きた腸内菌数は 0.01 ％以下に減少して与えても潰瘍形成を抑制し，回腸粘膜の過酸化脂質形ているが，このラットに大腸発癌物質である 1,2-成を抑制した（Kinouchi et al., 1998）．ascorbic acid，

dimethylhidrazine を投与すると，生じる ACF 数は，抗dimethyl sulfoxide，glutathione，β- carotene が潰瘍形成

生物質を投与していない通常ラットに生じる ACF 数のを抑えたので，脂質過酸化の重要性を指摘し，粘膜障害22.6 ％であった（木内ら，1995）．このことからも腸内の機序を明らかにした（Shan et al., 1998）．

菌が大腸発癌の初期過程に影響を与えていることがわか

8．香辛料や薬用植物の抗変異・抗発癌作用

る．
数種の腸内菌の培養液または培養上清が AOM 投与

caraway，coriander, black pepper などの香辛料の熱水

Sprague-Dawley ラットの大腸粘膜 ACF 形成に与える影抽出液は，N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，

響を調べ，Lactobacillus acidophilus ATCC4356 株とdimethylnitrosamine，ICR-170 の変異原性を減少した．

Clostridium perfringens GAI0668 株が ACF 形成を抑制し，しかし，black pepper の熱水抽出液や methanol 抽出液を前者の培養上清による ACF 形成抑制は，発癌に関係が亜硝酸処理するとネズミチフス菌 TA100 株に対して強ある DNA 付加体 O -methylguanine の半減期が短くなる

6

い変異原性が出現した（Higashimoto et al., 1993）．タイのが原因であることを明らかにした（Arimochi et al.,

王 国 の 薬 用 植 物 で 食 品 で も あ る lemon grass1997）．

（Cymbopogon citratus Stapf）の 80 ％エタノール抽出液は大腸癌を促進する腸内菌の遺伝子を潰し，その菌株を抗変異原性であるが，ラット大腸における野生株と入れ替えて定着させれば，ある程度発癌を押さ

6azoxymethane（AOM）誘発 DNA 付加体 O -methylgua-

えることができるものと考えられる．その遺伝子の一つ

nine 形成と前癌病変である aberrant crypt foci（ACF）形として，発癌物質の代謝産物のグルクロン酸抱合体を脱成を発癌初期過程と post-initiation 過程において抑制し抱合する β-glucuronidase の遺伝子が考えられる．AOM

た．特に，post-initiation 過程において，腫瘍形成と相関

誘発 ACF 数は，β-glucuronidase 欠損大腸菌培養液投与

している focus 当たり 4 個以上の aberrant crypt をもつ大では減少しなかったが，ACF 数は糞便の β-glu-

きな ACF 形成を抑制した（Suaeyun et al., 1997）．さら

curonidase 活性と正の相関を示した（Arimochi et al.,に，β-glucuronidase を阻害し，抗酸化活性をもっている1999）．大腸内の大腸菌数は少ないが，β-glucuronidase

ことを明らかにした．これらのことは lemon grass 抽出

活性は強いので，大腸内の大腸菌をすべて β-glu-液がラット大腸において glucuronide 抱合体から活性化

curonidase 欠損大腸菌と交換できればある程度大腸発癌した aglycon である methylazoxymethanol の放出を阻害を予防できるかも知れない．

し，DNA 付加体形成と ACF 形成を減少させることを示

大腸発癌の予防として発癌の化学予防物質を産生する

唆している（Suaeyun et al., 1997）．同じくタイ王国の薬

腸内菌を定着させる方法がある．大腸菌が属する腸内細用植物である roselle（Hibiscus sabdariffa Linn.），bitter

菌科の菌種 Erwinia uredovora の lycopene 生合成遺伝子

melon（Momordica charantia Linn.）および Murdannia

crtE, crtB,および crtI を組み込んだプラスミド（Misawa

loriformis の 80 ％ エ タ ノ ー ル 抽 出 液 は ， 2-amino-1-

et al., 1990; Misawa and Shimada, 1998）保有の lycopene

methyl-6-phenylimidazo［4,5-b］pyridine（PhIP）などのヘ産生大腸菌細胞浮遊液（lycopene 濃度 97.7 ng/ml）を投

テロサイクリックアミンの変異原性を減少させ，AOM

与すると，AOM 誘発 ACF 数が減少した．lycopene はト

誘発 ACF 形成を発癌初期過程で抑制した（Chewonarin

マトの赤い色素であるので，トマトが沢山入った野菜ジ

et al., 1999; Chiampanichayakul et al., 2001; Intiyot et al.,ュース（lycopene 濃度 51,300 ng/ml 大腸菌細胞浮遊液の86

525 倍）を経口投与しても同じ程度に AOM 誘発 ACF 数謝辞を抑制した．糞便中の lycopene 濃度は lycopene 産生大

参考文献に引用しました論文の共同研究者，特に筆頭

腸菌細胞浮遊液投与群では 177 ng/g feces であり，野菜研究者には御協力を感謝申し上げます．なかでも，環境

ジュース投与群では 10,300 ng/g feces で前者の 58 倍で，変異原の研究を開始した当初からの共同研究者であり，このことを勘案すると，lycopene 産生腸内菌投与は効果

今回の学術賞の受賞候補者に推薦して下さいました常盤

的に大腸発癌を予防できる可能性を示唆した（Arimochi

寛博士，長年に渡っての共同研究者でありました故木内et al., 1999）．

武美助教授，片岡佳子博士はじめ現教室員の方々に深謝

さらに，新機能獲得腸内菌を作るために，ヒト lacto-

いたします．また，本学会の初代会長の田島弥太郎先生，

ferrin の cDNA を大腸菌と Bacteroides uniformis のシャト

第二代会長の杉村隆先生，その後の歴代の会長であられ

ルベクタープラスミド pVAL-1（Valentine et al., 1988）

た賀田恒夫先生，松島泰次郎先生，早津彦哉先生，祖父にクローン化してプラスミド pVLFK を作成し，接合伝

尼俊雄先生，木苗直秀先生，林真先生，さらに，本学会

達で腸内常在菌の最優勢菌種の一つである Bacteroides

会員の皆様には，いろいろな形で御援助をいただきましuniformis の BU1001 株（Shoemaker et al., 1986）に入れた．心から感謝申し上げる次第です．多くのタイからのて TCTK101 株とした．ベクタープラスミド pVAL-1 保有

留学生を引き受けるきっかけを作って下さいました松島

B. uniformis である TCTK11 株の培養液をラットに投与

泰次郎先生とその後共同研究を続けていますタイのチェ

すると，水投与群よりも AOM 誘発 ACF 数と 4 個以上のンマイ大学医学部の Usanee Vinitketkumnuen 準教授，

aberrant crypt をもつ大きな ACF 数を増加させた．しか文部（科学）省・厚生（労働）省の研究班の班長，班員

し，ヒト lactoferrin 産生菌である TCTK101 株の培養液の先生方には大変お世話になりました．また，国からは投与群では発癌初期過程における ACF 数が TCTK11 株

もちろん，各種財団からの研究費の御援助，およびいろの培養液投与群よりも有意に減少した．このことは腸内いろな分野の方々からの研究材料の御提供なくしては今菌が産生するヒト lactoferrin がラット大腸の ACF 形成を回の受賞に至ることはなかったものと思っています．心抑制することを示唆している（Chewonarin et al., 2001）．

から御礼申し上げる次第です．

結語

以上，主として nitroarene の研究と癌予防のための研究を行い，腸内常在菌との関係やその利用を考えてきた．
我々が lycopene 産生腸内菌の大腸癌予防の可能性の論
文（Arimochi et al., 1999）を発表した翌年の 2000 年 1 月の Science に同じ catotenoid であり vitamin A の前駆体である β-carotene の産生米“golden rice”の論文（Ye et al.,2000）が発表された．これは vitamin A 不足のために約25 万人の東南アジアの子供達が毎年失明しているために開発されたものであり，関連する多くの特許が他の企業から放棄されることによって実用化されようとしているものである．したがって，新機能獲得腸内菌としての栄養素産生腸内菌も今後は利用されるようになるものと考えられる．また，interleukin-10 分泌性の Lactococcus
lactis をヒトの炎症性腸疾患であるクローン病や潰瘍性大腸炎の治療に使える可能性が示された（Steidler et al.,2000）．さらに，2001 年になると，Vogelstein らが lethal
toxin を持たない偏性嫌気性菌 Clostridium novyi と通常の抗癌剤を併用することによって combination bacteriolytic therapy（COBALT）を開発して治験に持って行こ．また, Klebsiella pneuうとしている（Dang et al., 2001）
moniae が産生する microcin E492 が一部の human cellline で apoptosis を誘発することが示されている（Hetzet al., 2002）. このように新機能獲得腸内菌やある種の細菌が癌予防・治療に応用されようとしており, この分野の研究にこれからも貢献して行きたいと考えている．

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研究奨励賞受賞講演

Environ. Mutagen Res., 24：91-98（2002）

フリーラジカルを経由する環境変異・発がん物質の生成と発現に関する研究
平本 一幸＊
東京薬科大学薬学部〒 192-0392 八王子市堀之内 1432 ─ 1

Formation and development of mutagenic and/or carcinogenic compounds
through free radical mechanisms
Kazuyuki Hiramoto
School of Pharmacy, Tokyo University of Pharmacy and Life Science,
1432-1 Horinouchi, Hachioji, Tokyo 192-0392, Japan

Summary
Free radicals including carbon-centered radicals, oxygen-centered radicals and pyrazine cation radicals
were found to be involved in the DNA damage and the formation mutagens in foods. Carbon-centered radicals generated from aryldiazonium salts directly modified DNA bases and induced DNA strand breaks.
The DNA damages by the carbon-centered radicals were prevented by ethanol and phenolic antioxidants.
Reactive oxygen species generated from furanone and pyranone reductones produced by Maillard reaction
in many foods or from hydroxyhydroquinone in roasted coffee beans induced DNA strand cleavage under
the atmospheric conditions. However, dietary supplementation with these reductones did not cause DNA
damage in animals. Pyrazine cation radicals produced in the Maillard reaction participated in the formationof heterocyclic amine mutagens. Decreasing pyrazine cation radicals by controlling sugar content or scavenging pyrazine cation radicals with ascorbate or erythorbate were effective in preventing the mutagenicity
of cooked hamburger.
Keywords ： carbon-centered radical, reactive oxygen species, pyrazine cation radical, Maillard reaction,
DNA damage, heterocyclic amine mutagen

緒

言

カルの生成が食物中の加熱変異・発がん物質の生成に関与していることが明らかになった．さらにこれらフリー

本研究では電子スピン共鳴（ESR）法を駆使することラジカルを消去することにより，変異・発がん物質のによって，フリーラジカルが環境変異・発がん物質の生DNA 損傷を阻止できること，および変異・発がん物質

成と発現に深く関与していることを明らかにした．環境の生成を低減できることが明らかになった．以下に具体

変異・発がん物質が DNA に損傷を与える過程で，炭素的な研究結果を紹介するが，多くの部分はすでに本誌に中心ラジカル，酸素中心ラジカル（活性酸素種）を発生

紹介されている（菊川ら，1996 ；菊川ら，2000）．

し，これらフリーラジカルが DNA に損傷をきたすメカ
ニズムが明らかになった．また，ピラチンカチオンラジ＊

E-mail ： Hiramoto@ps.toyaku.ac.jp
受付： 2002 年 6 月 11 日 受理： 2002 年 6 月 11 日
日本環境変異原学会

1.

炭素中心ラジカルを経由する DNA 修飾とその阻止

環境，食物，医薬品に由来するアリルジアゾニウム塩などのアゾ化合物が炭素中心ラジカルを発生することを

本稿は日本環境変異原学会第 30 回大会において発表された 2001 年度研究奨励賞受賞講演である．
This paper is the lecture of the JEMS Achievement Award（2001）presented at the 30th JEMS annual meeting, 2001.

91

Fig. 1 Reaction of DNA with HMBD through generation of carbon-centered radical

ラジカルを生成していることがわかった．これらはヌク
レオシドレベルおよび DNA レベルでの反応でアデニン
およびグアニンの 8 位の炭素に炭素−炭素結合で付加することがわかった．さらにこれらジアゾニウム塩はDNA 鎖切断を誘発し，この切断は活性酸素の消去酵素
では阻害されなかった．この反応はエタノールやフェノール性抗酸化剤の添加で効率的に阻害された（Hiramoto et al., 1995a, 1995b）（Fig. 1）．HMBD はマウスに投与すると小核誘発能を示し，ビタミン E の欠乏にFig. 2 Structures of fragrant furanone and pyranone derivatives

よって増強されたことから，in vivo でも抗酸化剤がこの反応を阻止しうることが示された（加藤ら, 1995）．またマウスへの投与により肝臓 DNA に付加体が生じている

ESR 法によりつきとめ，これらが酸素中心ラジカルを介することなく直接 DNA のグアニン，アデニン塩基に反ことがわかった（Hiramoto et al., 1998b）．
ラジカルイニシエーターのアゾ化合物 AAPH も炭素ラ

応し，さらに DNA 鎖切断をひき起すことをつきとめた．

ジカルを生成し（Hiramoto et al., 1993a），変異原性を示

くん製品に含まれるフェノールは胃内の酸性条件で亜硝した（加藤ら，1994）．抗ウイルス作用をもつジアゾウ酸と反応して変異原性をもつ p-および o-ジアゾキノン

ラシル（Hiramoto et al., 1994b），2 -アミノフルオレンの（p-, o-DQ）を生成する（Kikugawa and Kato, 1988）こと

亜硝酸処理により生成するフルオレンジアゾニウム塩がわかっていたが，p-, o-DQ はヌクレオシドレベルでア（Hiramoto et al., 1994a）も炭素中心ラジカル経由のデニン，グアニン塩基の 8 位に炭素−炭素結合して付加

DNA 鎖切断作用を示した．醤油のチラミンと亜硝酸の体を与え，DNA レベルで鎖切断を引き起こした反応によって生成するジアゾチラミン，医薬品のバメタ（Kikugawa et al., 1992; Kato et al., 1992）．この反応は活

ンやエチレフィリンと亜硝酸の反応によって生じるジア性酸素の消去酵素では阻害されず，水素供与体のエタノ

ゾバメタン，ジアゾエチレフィリンなども変異原性を有ールやブチルヒドロキシアニソール（BHA）などのフェするが，炭素中心ラジカル経由の反応によるものと考え

ノール性抗酸化剤で阻害され，ESR スピントラップ剤のられる．炭素中心ラジカルはエタノールやフェノール性DMPO 添加によっても阻害され，DMPO ─炭素ラジカル

抗酸化剤で消去されることも明らかになった．

の特徴的な ESR シグナルを与えた．
西洋きのこ Agaricus bisporus には発がん性をもつヒド
ロキシメチルベンゼンジアゾニウム塩（HMBD）が存

2．酸素中心ラジカル（活性酸素種）を経由する DNA 鎖切断

在することがわかっていた（Toth et al., 1981）が，この糖／アミノ酸の固相（Hiramoto et al., 1993b）および化合物は化学的に不安定で，スピントラップ剤として水相（Hiramoto et al., 1994c）の加熱メイラード反応物,

DMPO, PBN および DBNBS を用いて調べると，炭素中醤油（Hiramoto et al. 1996c）およびコーヒー（Kato et

心ラジカルが生成していることが明らかになった．水素

al., 1994）に大気下の反応条件で DNA 鎖切断作用がある

供与体のエタノールを添加すると，ベンジルアルコール

ことがわかり，その活性成分はレダクトンによる活性酸を与え，炭素中心ラジカルのヒドロキシメチルフェニル

素種の発生が原因であることをつきとめ，その意義につ92

Fig. 3 Possible mechanisms for DNA strand breaking of furanone and pyranone derivatives through reactive oxygen species

分による DNA 鎖切断反応は Fig. 3 のように推定された．
これら成分は，生理条件下のメイラード反応でも生成し（Hiramoto et al., 1998a），マウスの経口投与実験でも速やかに吸収され，小核を誘発した（Hiramoto et al.,1998c）．これらの成分による DNA 鎖切断反応はエタノ
ールや BHA などのフェノール性抗酸化剤，金属キレー
ト剤により阻害された．
2）コーヒー成分の DNA 鎖切断作用
Fig. 4 Generation of reactive oxygen species from HHQ

コーヒーに含まれる DNA 鎖切断作用物質を溶媒抽出
および弱酸性条件下での HPLC によって単離した結果，強い還元性をもつヒドロキシヒドロキノン（1,2,4-ベン

いて考察を加えた．

ゼ ン ト リ オ ー ル ）（ H H Q ） で あ る こ と が わ か っ た（Hiramoto et al., 1998d）．HHQ はベンゼンの代謝物とし1）メイラード 反応生成物の DNA 鎖切断作用て知られており，すでに活性酸素種を生成して DNA 鎖

ブドウ糖を始めとする六単糖とグリシンの混合水溶液を切断することが報告されていた（Kawanishi et al.,の加熱により生成した DNA 鎖切断作用物質を HPLC に1989）．コーヒーには他の食品に比較して過酸化水素がより単離した結果，Fig. 2 に示す HHMF（Hiramoto et

多いことがわかっており，その発生原はコーヒー酸など

al., 1995c）および DDMP（Hiramoto et al., 1997）であが考えられていたが，HHQ であることがつきとめられることがわかった．醤油にも類似の DNA 鎖切断作用をた．HHQ は他のポリフェノール類に比較して多量の活も つ 成 分 HMF（ Hiramoto et al., 1996c）， DMHF

性酸素種を生成し，大気下の酸性条件では安定であるが，（Hiramoto et al., 1996a）および HEMF（Li et al., 1998）

中性条件ではスーパーオキシド，過酸化水素，ヒドロキが見い出された．これら成分は食品の香成分として知ら

シルラジカルを発生する．HHQ は中性条件下で 0.5 - 0.6

れており，これら成分の量によって醤油などの品質管理

モルの過酸化水素を発生し，スピントラップ剤 DMPO

がなされている（Kikugawa et al., 1999a）これらの成分を用いた ESR によってヒドロキシルラジカルの生成がはいずれも Fe（III）イオンを還元するレダクトンで，弱確認された．HHQ の自動酸化はスーパオキシドジスム

酸性のメイラード反応液や醤油の中では安定であるが，ターゼ（SOD）によって抑えられたことから，発生し中性水溶液中で加水分解を受けることがわかり，その際たスーパーオキシドが触媒的に自動酸化を促進している

ヒドロキシルラジカルを生成することが DMPO をスピことがわかった（Hiramoto et al., 2000）（Fig. 4）．HHQ

ントラップ剤として用いた ESR で確認された．DNA 鎖による DNA 鎖切断反応もエタノール，金属キレート剤

切断作用はスーパーオキシド，過酸化水素，ヒドロキシによって抑えられる．

ルラジカルなどの活性酸素種によることが，それらの消去酵素の添加で阻害されることからわかった．これら成93

も，作用する場の違いによって全く逆の抗酸化作用とプ
ロオキシダント作用を示すことがわかった．
これらのレダクトンは生体内ではどのような作用を示
すのかを検討した．高濃度の HHQ をラットに経口的に投与すると，酸素分圧の比較的高い肺，心臓に脂質過酸化が誘導されたが，肝の脂質過酸化は誘導されなかった．
また，いずれの臓器の 8 -ヒドロキシデオキシグアノシンも昂進することなく，これらレダクトン由来の酸素ストレスによる DNA 傷害は認められなかった（Yasuhara etal., 2002）．また，高濃度の DMHF と HHQ をマウスに投与した場合，肺の脂質過酸化は昂進したが，他の臓器の脂質過酸化は昂進しなかった．しかし，DMHF，HHQ
ともに化学物質で誘導される I 型および IV 型アレルギー
反応の増悪が認められた（Mi et al., 2001）．これらレダ
クトンの摂取は生体内では，酸素分圧の比較的高い肺などでは脂質過酸化を引き起こし，アレルギー反応の増悪を引き起こす可能性があることを示しているが，DNAの酸化的損傷にはつながらないことを示している．酸素分圧の高い組織でも生じる酸化ストレスは脂質過酸化を誘導することによって DNA 傷害が阻止され，酸素分圧が低い組織では酸化ストレスの程度が低いためと考えられる．
HHQ を含むコーヒーの飲用によって尿中の過酸化水
Fig. 5 Urinary hydrogen peroxide levels after drinking of a cup
of canned coffee

素の排せつが上昇するというシンガポールの実験が報告された（Long and Halliwell, 2000）．筆者らもコーヒーの飲用による尿中過酸化水素の上昇を日本人の健常者について調べた（Hiramoto et al., 2002）．その結果，10 人の

3）レダクトンが示すプロオキシダント作用の生理的意義

被験者ともに一杯のコーヒー飲用直後の尿に過酸化水素が排せつされ（Fig. 5），尿中に排せつされた HHQ が過メイラード反応生成物フラノンおよびピラノン類およ

酸化水素を発生しているらしいことがわかった．尿中にびコ−ヒ−成分の HHQ は還元性をもつレダクトンであ排せつされた過酸化水素量は飲用したコーヒーが発生すり，相手により還元性を示すとともに，前述のように大る過酸化水素量の 1 ／ 10 以下であり，大部分の HHQ は

気下では活性酸素種を発生して DNA 切断のような酸化代謝されたか，体内に留まり酸素分圧の高い組織で酸素ストレスを与えるプロオキシダントとして働く．フェン

ストレスを与えているか，または SOD，カタラーゼ，

トン反応によって発生したヒドロキシルラジカルによるグルタチオンペルオキシダーゼにより消去されているとDNA 鎖切断作用に対する各種ポリフェノール類の作用考えられる．コーヒーの飲用が体内で DNA の傷害に寄を検討した結果，多くのものに阻害作用が認められたが，与している可能性は少ないが，脂質の過酸化，アレルギ

茶葉に含まれるエピガロカテキンガレート（EGCG）にー反応へ寄与している可能性はある．レダクトンが与えは切断促進作用が認められた（Hiramoto et al., 1996b）．

る生体への影響はさらなる検討が必要と考えられる．

HHQ と同様に種々のポリフェノ−ル類は活性酸素種を産生するプロオキシダント作用が報告された（Long etal., 2000 ； Yang et al., 2000）．また，多くのポリフェノール類に活性酸素種を経由する DNA 傷害作用が報告されている．

3．ピラチンカチオンラジカルを経由するヘテ
ロサイクリックアミン変異原の生成とその低減
加熱調理や食品の加工によって生成する MeIQx などのイミダゾキノキザリン型の変異・発がん性ヘテロサイ

しかし，一方で，醤油の成分 HEMF は in vitro で Fe

クリックアミンの生成メカニズムにピラチンカチオンラ（III）イオンによる赤血球膜やリポタンパク質の酸化をジカルが関与していること，およびこのラジカルを消去阻害する抗酸化作用を示す（Ando et al., 2000）．この局することにより変異・発がん性ヘテロサイクリックアミ

面では，DNA 鎖切断にみられる酸化性とは逆の作用をン生成が低減できることが明らかになった．

示していることになる．同じ大気下の試験管内の反応で94

変異・発がん性ヘテロサイクリックアミンは食肉やモ

Fig. 6 ESR signal and structure of pyrazine cation radical

Fig. 7 Possible pathway for the generation of pyrazine cation radical and the mutagen formation in the reaction of
glucose/glycine/creatinine

デル系のブドウ糖／グリシン／クレアチニン混合物の加1987）ことがわかっている．

熱によって生成し，ブドウ糖／グリシンから生成するメ

ブドウ糖／グリシンのメイラード反応によってピラチ

イラード反応物にクレアチニンが反応することによってンカチオンラジカル（Fig. 6）が生成することがわかっ生成するメカニズムが提唱されていた．これら変異原は，ていた（Namiki and Hayashi, 1975）が，筆者らはこのいわゆるにできるのではなく，加熱加工した

ラジカルに目を付け，ESR 法を用いてブドウ糖／アミノ

肉質に生成する．加熱の条件によってその生成量が異な酸／クレアチニンのモデル系における加熱変異・発がん

り，水分量が最も大きく関与している．同一の加熱条件

物質ヘテロサイクリックアミンの生成にピラチンカチオ

でも水分のロスを伴う

方法が変異原が生成しやンラジカルが関与していることを明らかにした．ブドウ方法ではできない（Kikugawa and Kato,

糖／アミノ酸の溶液の加熱反応で生成するピラチンカチ

こげ目

すく， 煮る焼く

95

オンラジカルの ESR シグナル強度とブドウ糖／アミノられたものの，実用的な濃度ではほとんど効果がなかっ酸／クレアチニン溶液から生成する変異原性の強さはブた（Kato and Kikugawa, 1999）．EGCG，システイン，

ドウ糖とアミノ酸のモル比が 1 ： 2 のとき最大になり，アスコルビン酸，エリソルビン酸をハンバーグの変異原

ピラチンカチオンラジカルの生成と変異原性物質の生成低減に試みた．EGCG，システインは高濃度用いれば，

ともにブドウ糖の量依存性が認められ，ピラチンカチオ

変異原低減効果はあるが，0.33 ％程度の実用的に用いら

ンラジカルが変異原物質の生成に関与することが示唆される濃度では効果がなかった．アスコルビン酸，エリソ

れた（Kikugawa et al., 1999b）．

ルビン酸は実用的濃度で変異原性を 1 ／ 2 にまで低減しピラチンカチオンラジカルの生成と変異原物質の生成た（Kato et al., 2000a）．以上のことから，食肉の加熱調との関連は反応系に両者の生成に共通して影響を与える

理において生成する変異原の低減には，メイラード反応

物質の添加によって確認された．ポリフェノール類をブにおけるピラチンカチオンラジカルの生成を抑制する糖

ドウ糖／アミノ酸／クレアチニン溶液へ添加することに濃度の調節，アスコルビン酸，エリソルビン酸の添加がよって変異原物質の生成が抑えられることがわかってい実用的に用いられうることが明らかになった．

た（Weisburger et al., 1994）が，筆者らは，ポリフェノール類はピラチンカチオンラジカルを消去するとともに結語

変異原物質の生成を抑えることを見出し，ピラチンカチ

本研究はフリーラジカルが環境変異・発がん物質の生オンラジカルの生成と変異原物質の生成が関連している成と発現に深く関与していることを明らかにしたものでことを確かめた（Kato et al., 1996 ； Kikugawa, 1999）．

ある．環境変異・発がん物質が DNA に損傷を与える過反応系にエタノールを添加してもピラチンカチオンラジ

程で，炭素中心ラジカル，酸素中心ラジカルを発生し，カルも変異原物質の生成も抑制されず，システインなど

これらフリーラジカルが DNA に損傷をきたすメカニズのチオール化合物，アスコルビン酸，エリソルビン酸なムが明らかになった．また，ピラチンカチオンラジカル

どのレダクトンの添加によってピラチンカチオンラジカの生成が食物中の加熱変異・発がん物質の生成に関与しルの生成も変異原物質の生成も抑えられた．メイラードていることが明らかになった．さらにこれらフリーラジ反応で生成するレダクトンの芳香性フラノン類の添加はカルを消去することにより，変異・発がん物質の DNA

ピラチンカチオンラジカルの生成を増大させ，変異原物

損傷を阻止できること，および変異・発がん物質の生成

質の生成は抑制しなかった．このことは，メイラード反を低減できることが明らかになった．ESR 法による環境

応においてフラノン類はピラチンカチオンラジカルの前変異・発がん物質とフリーラジカルの関わりの研究は，駆体になっていることを示唆している（Kikugawa et al.,

対象をさらに広げることにより，多くのフリーラジカル

2000a,b）（Fig. 7）．

の消去が環境変異原発現の低減につながる研究に発展すモデル系においてブドウ糖の添加量によってピラチンることが期待される．

カチオンラジカルと変異原の生成量が左右されたので，調理したハンバーグの変異原生成に適用を試みた．もと謝

辞

もと 0.07 ％の還元糖を含んでいる牛ひき肉を用いてハン本研究を遂行するにあたり，東京薬科大学薬学部 菊

バーグを調理する際に異なる量の還元糖を添加してハン

川清見教授，加藤哲太助教授ならびに第一衛生化学教室

バーグの変異原性を調べた．その結果，終濃度 0.3 ％のの諸氏に多大なご指導とご協力をいただいた．ここに深還元糖濃度では変異原性は 2 倍に増強され，終濃度約

甚なる謝意を表します．

0.7 ％以上では変異原性は約 1 ／ 2 に減少した（Kato etal., 2000b）．牛ひき肉に 33 ％の赤ワインまたは白ワイン

参考文献を添加すると糖の量は 0.3 ％となり，調理したハンバー

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グの変異原性は 2 倍に上昇した．ハンバーグの調理時に33 ％のタマネギを加えると還元糖濃度は 0.9 ％になり，変異原性は 1 ／ 2 に低下した（Kato et al., 1998）．このよ
うに，ハンバーグを調理する際には糖濃度が微妙に変異
原生成に影響を与え，0.7 ％以上の糖濃度が変異原生成を低減するのに有効であることがわかった．日本の家庭で行われる多量のタマネギ添加のハンバーグ調理法は変異原生成を低減する方法といえる．
モデル系で変異原物質の生成を抑えた化合物のうち，ポリフェノールの EGCG を多量に含む茶葉抽出液でか
つお節の変異原低減に応用を試みた．若干の効果は認め96

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研究奨励賞受賞講演

Environ. Mutagen Res., 24：99-109（2002）

げっ歯類の培養細胞と個体を用いる
小核試験法の検討
若田 明裕＊
山之内製薬株式会社安全性研究所〒 174-8511 東京都板橋区小豆沢 1-1-8

Studies on in vitro and in vivo micronucleus tests using rodents
Akihiro Wakata
Safety Research Laboratories, Yamanouchi Pharmaceutical Co. Ltd.
1-1-8 Azusawa, Itabashi-ku, Tokyo, 174-8511

Summary
The cytokinesis-block method using cytochalasin B that was developed by Fenech and Morley for micronucleus assay using human lymphocytes was applied to the rodent CHL cell line. Consistent dose-response
relationships were obtained in cultures treated with clastogens and an aneugen. Comparison with the chromosome aberration frequencies indicated that approximately 30 ％ of acentric chromosomes are expressed
as micronuclei in the cells treated with mitomycin C and caffeine. The size distribution of the micronuclei
suggested that the base-line frequency of micronuclei is mainly a reflection of mitotic dysfunctions rather
than chromosome structural aberrations.
Conditions for route and frequency of administration in the mouse micronucleus test were evaluated. Bothintraperitoneal injection and oral gavage were acceptable as routes of administration in this test. Double
dosing, with a 24 h interval and sampling 24 h after the second dosing, was the most sensitive protocol compared to single, triple, or quadruple dosing protocols. The micronucleus test using bone marrow and peripheral blood from exposed rats was evaluated. It was concluded that the rat micronucleus test, using eitherbone marrow or peripheral blood, can be used as an alternative to the mouse micronucleus test.
Keywords ： micronucleus test, cytokinesis-block method, cultured Chinese hamster cells, rats

緒

言

遺伝毒性評価において染色体異常誘発性は重要な指標細胞においてはその分裂を経過した細胞が不明であることから，培養細胞を用いる小核試験は定量性に欠けることが問題となっていた（Pincu et al., 1984; Brock et al.,の一つである．小核は染色体の構造異常や分裂異常の結1985）．そこで，近年ヒトリンパ球を用いて開発された果生じるもので（Heddle and Carrano, 1977），その分析

cytochalasin B により分裂細胞を特定する方法（Fenech

が比較的簡単なことから，小核試験として染色体異常のand Morley, 1985）を，哺乳類培養細胞での染色体異常検出に in vivo の試験（Schmid, 1975），特にマウスの骨試験に繁用されているチャイニーズハムスターの樹立細髄細胞を用いて広く実施されている（Mavournin et al.,胞株（CHL）に応用し，染色体異常試験に代わりうる培

1990）．しかし，小核形成には細胞分裂が必要で，培養養細胞での定量性の高い小核試験法の検討を行い，その試験法を用い小核生成の機構の解明を行った．

＊

E-mail ： wakata@yamanouchi.co.jp
受付： 2002 年 6 月 21 日 受理： 2002 年 6 月 21 日
日本環境変異原学会

また，動物個体を用いるマウス小核試験の標準試験方法の確立を目的とし，種々の処理方法における至適条件

本稿は日本環境変異原学会第 30 回大会において発表された 2001 年度研究奨励賞受賞講演である．
This paper is the lecture of the JEMS Achievement Award（2001）presented at the 30th JEMS annual meeting, 2001.

99

Fig. 1 Schematic diagram of the principal mechanism of
micronucleated cells formation by a clastogen with and.
without cytochalasin B（Cyt-B）の検討を行った．さらに，医薬品等のげっ歯類を用いる
毒性試験では主にラットが用いられているため，ラットが小核試験にマウスと同様に用いることができれば他の毒性試験の結果と関連させることができ大変有用である
ことから，ラットを用いた小核試験の検討を行った．

1．哺乳類培養細胞を用いる in vitro 小核試験の検討および小核生成機構の解析

Fig. 2 Effects of cytochalasin B on the frequency of CB cells andmicronuclei. The cells were grown for 24hr in the presence of cytochalasin B.（a）Frequency of cells with one（open circle）, two（closed circle）, three（closed triangle）, and four（open triangle）nuclei.（b）Frequency of
micronuclei in CB cells.

日本において in vitro 染色体異常試験で汎用されているチャイニーズハムスター肺由来株化細胞である CHL細胞を用いた．分裂細胞を識別するために用いられる
cytochalasin B（cyt-B）は microfilament の合成阻害物質（Carter, 1967）で，細胞質の分裂を阻害するが核の分裂は阻害しない（Wright and Hayflick, 1972）ので cyt-B を含む培養液で細胞を培養していると 1 回分裂期を経た細胞
は 2 核細胞となる．このことから，cyt-B で処理した場
合，変異原等で小核を誘発された細胞は小核を持った 1
つの二核の細胞として観察される．一方，cyt-B で処理しない場合は，1 核の小核を持つ細胞と小核を持たない
2 つの細胞となる（Fig. 1）．このように cyt-B で処理することにより分裂細胞を二核細胞として容易に識別できその細胞で小核を観察することでより定量的な小核誘発性の評価が可能になる（Fenech, 2000）．
1）Cytochalasin B（cyt-B）処理条件の検討
まず最初に cyt-B の処理濃度の検討を行った．Cyt-B の処理濃度を変化させたときの出現する 1, 2, 3 および 4 核細胞の頻度を Fig. 2a に示す．
Cyt-B の処理濃度を高くするに従い 2 核細胞（以下 CB細胞と呼ぶ）の割合が高くなり，それに従って単核細胞の割合が低下した．しかし，cyt-B 3µg/ml 以上の濃度では CB 細胞の割合が増えず，むしろ減少した．CB 細胞
100

Fig. 3 Relationship between the frequency of CB cells and culture time in the presence of 3µg/ml Cytochalasin B. Cells
with one（open circle）, two（closed circle），three（closed triangle）, four（open triangle）, five（closed
square）and six（open square）nuclei.

Fig. 4 Dose-response relationship of the frequencies of micronuclei and chromosome aberrations.
（a）mitomycin C,（b）caffeine,（c）colcemid. Closed circle: micronuclei, open circle:
chromosome aberrations, open triangle: number of chromosome aberrations from which ahalf number of exchange-type aberrations is subtracted.

の出現頻度の最大値は cyt-B 3µg/ml 処理時の 80.6 ％であ察されるようになり 6 核の細胞まで現われた．このことった．この結果は，ヒトリンパ球での至適濃度

は，cyt-B は細胞分裂時に，細胞が 2 つに分裂する過程（Fenech and Morley, 1985）と同じであった．さらにを阻害する薬物であり，核の分裂は阻害しないため，核

cyt-B の濃度が高くなると単核細胞の割合が上昇する傾は細胞周期に従って分裂を繰り返すためだと考えられた向が認められた．このことより過剰濃度の cyt-B は核の（Wakata and Sasaki, 1987）．以上の結果より，2 核細胞分裂をも阻害することがわかった．また，cyt-B の濃度の出現ピークは 24 〜 30 時間培養後であること，cyt-B 処が高くなると 3 核以上の細胞の出現が認められた．しか理をあまり長い時間行うことはよくないことがわかっ

し，このような細胞は用量依存的には増えず，3 核以上た．用いた CHL 細胞の倍加時間が約 12 時間であることの細胞をすべて合わせても最高で 8 ％以上にはならなかを考えると 3 核以上の細胞は倍加時間の約 3 倍の 36 時間った．各濃度における CB 細胞 1000 個あたりの小核の出後あたりより顕著に増加することがわかった．以上のこ現頻度を Fig. 2b に示す．小核の自然出現頻度は cyt-B のとより，培養時間は 24 時間とした．

濃度に関わりなく 10µg/ml までほぼ一定の値を示した．
このことより，cyt-B それ自体は小核誘発性（染色体異2）染色体異常出現頻度と小核出現頻度との比較

常誘発性）がないことが示された．以上の結果より，Fig. 4a, b, c にそれぞれ mitomycin C（MMC），caf-

CHL 細胞に対しての cyt-B の至適処理濃度は 2 〜 3µg/ml

feine，colcemid で処理したときの，染色体異常の出現であることがわかった．これより，以後の実験での cyt-

頻度と CB 細胞中の小核の出現頻度の濃度相関性の比較

B の濃度は 3µg/ml とした．

を示す．染色体異常および小核の頻度は 1 細胞あたりの次に cyt-B 処理時間の検討を行った．細胞を cyt-B とと数として示した．染色体異常には染色体の断片を生成しもに培養した時間と 1 および 2 核さらにそれ以上の核をないと考えられているギャップは含めなかった．MMC

持つ細胞の出現頻度の変化を Fig. 3 に示す．

および caffeine で処理した場合，染色体異常および小核培養時間とともに 2 核細胞の出現頻度が上昇し，それの出現頻度は濃度依存的増加した（Fig. 4 a, b）．ここで，に伴って単核細胞の頻度が減少した．最大の 2 核細胞の小核の自然発生頻度は 0.024/cell であり，染色体異常の出現頻度が得られたのは 24 〜 30 時間であった．しかし，自然発生頻度は 0.017/cell とあまり変わらないにも関わ

30 時間以上培養を続けると，2 核細胞の頻度は培養時間

らず，MMC や caffeine で誘発される染色体異常の数はの延長とともに減少していった．また，単核細胞は培養

小核の数よりもはるかに多くなる．このことは，1 つの時間に従って減少する一方であった．それに対して，培

染色体断片が 1 つの小核を作るとは限らない（Evans et

養時間とともに 3 核以上の細胞の出現頻度が上昇し，48

al., 1959；Carrono and Heddle,1973）ことで説明できる

時間培養後では全細胞の約 50 ％にまで達した．さらに，し，1 つの小核が複数の染色体断片を含んでいるとも考

培養時間が長くなると，さらに多数の核を持つ細胞が観えられる．また，この染色体異常の数と小核の数との差
101

Fig. 5 Distribution of size of micronuclei in untreated control culture and cultures treated with mitomycin C（MMC）, caffeine and colcemid.（a）untreated culture,（b）MMC 0.01 µg/ml,（c）MMC 0.1 µg/ml,（d）colcemid 0.002 µg/ml,（e）colcemid 0.05 µg/ml,（f）caffeine 1mg/ml. Diameters of fifty micronuclei were
measured in each treatment.

は MMC の方が caffeine より大きくなっている．これはは染色分体型のものがほとんどであるため，断片の大きMMC と caffeine の誘発する異常の型が違うためで，さの違いにより小核を形成する割合が異なることが大き

MMC は交換型の異常を多く誘発しそれに比べ caffeine

な要因であると考えられた．

でははるかに少ない．最高濃度での交換型異常の割合は，Colcemid は紡錘糸の形成を阻害し細胞分裂時に染色

MMC 処理で 62.2 ％，caffeine では 14.3 ％であった．染体の不分離を起こす物質として知られているが，染色体色分体交換型異常は，対象型の異常は染色体断片を生成の構造異常はほとんど誘発しない．しかし，in vivo の小しないとされていて，その割合は全染色分体交換型異常

核試験では小核を誘発する．今回の結果も，染色体の構の半数である（Buckton et al, 1978; Heddle, 1965;

造異常はほとんど認められなかったが，小核は用量依存

Seabright, 1978; Wolff, 1961）ため，染色分体交換型異常

的に直線的に増加した（Fig. 4c）．この結果より染色体の半数を減じた異常の数を，生成する染色体断片の数との構造異常を起こす物質だけではなく，染色体の不分離

して図に示した（△）．この染色体断片の生成率（△）

を起こす物質も定量的に検出できることがわかった．

と小核誘発率（●）を比べてみると MMC と caffeine のFig. 4 に示されているように染色体の構造異常誘発物質

差は小さくなった．このように化学物質によって一見染および数的異常誘発物質でも小核誘発率は濃度とともに色体異常と小核の出現頻度の差があるようにみえるの

ほぼ直線的な増加を示し，高濃度でもその傾きが減少すは，その化学物質によって誘発される染色体異常の型とることなく定量性が高いことが示された．

割合によることが示唆された．また，ここに示した濃度

また，それぞれの化学物質での無処理（濃度 0）では範囲では 2 個以上の異常を持った細胞はまれで，ほとん小核の出現頻度が染色体の出現頻度を上回っていた．こどの細胞が 1 つの異常しか持っていなかったため，単純のことは，染色体の構造異常を起こさずに小核が生成さに染色体断片の数と小核の数を比較してみると，MMCれているということで，無処理での小核を形成するもの

処理では約 30 ％の染色体断片が小核を形成するというは化学物質で誘発されるような染色体断片ではなく染色結果になった．しかし，Evans ら（Evans et al., 1959）

体の不分離により取り残された染色体によることが大きおよび Carrano と Heddle（Carrono and Heddle, 1973）

いことが示唆された（Wakata and Sasaki, 1987）．

は電離放射線による染色体異常の誘発率と小核の誘発率との比較の結果はそれぞれ 60 ％と 70 ％の染色体断片が3）小核の大きさに関する解析

小核を形成すると報告していて，今回の結果はこの報告

無処理，MMC 0.01 µg/ml，MMC 0.1 µg/ml, col-と大きな差がある．これは，電離放射線による染色体断

cemid 0.002 µg/ml，colcemid 0.05 µg/ml，caffeine 1

片は染色体型のものがほとんどで，化学物質によるもの

mg/ml で処理した時に出現した小核の主核に対する大102

きさの分布をそれぞれ Fig. 5a, b, c, d, e, f に示す．

質である．このような物質の場合毒性が強く出る ip 投

これは，それぞれの処理で出現した小核 50 個を計測

与では小核の観察可能な用量範囲が狭くなることがわかしその大きさの分布を示したものである．無処理で観察った．それに対し，po 投与では低用量であまり小核誘された小核の大きさの分布（Fig. 5a）はある程度の広さ

発が観察されないが，ip 投与と同じ程度に骨髄に影響をを も っ て 分 布 し て い た が ， MMC 0.01 あ る い は 0.1

与える量投与すると ip 投与と同程度の小核が観察されµg/ml 処理でのものは無処理のものに比べて小さいもの

ることがわかったが，そのためには大量の投与が必要でが多く分布の範囲も狭かった（Fig. 5b, c）．これはあった（Wakata et al., 1989）．

MMC 処理によって生ずる小核は染色分体の断片に由来

この研究は 34 機関の共同研究として 17 化合物を用いするものであるが，無処理のものはこのような染色体のて行われた 1 つであるが，全化合物についてのそれぞれ構造異常によって生じた染色体断片とは異なるものが小の投与経路での小核誘発率を比較した結果を Table 2 に

核のもととなっていると考えられた．また，低濃度の示す．

colcemid で処理（0.002 µg/ml）した場合は出現した小Benzene を除くすべての化合物で，同用量を投与した

核のサイズの分布は，小さいサイズの小核の頻度がやや場合には po より ip の方が小核誘発率が高いかあるいは減少していたものの無処理のものと同様に広いものであ同程度であったが，投与量をそれぞれの投与経路でのった（Fig. 5d）．サイズが大きくて様々な大きさの小核

LD 50 値に対する比に換算した同投与量（例えば，po のが出現するのは，colcemid による紡錘体の異常で生じたLD50 が 200 mg/kg で ip の LD50 が 100mg/kg であった場

取り残された染色体が小核を形成するためだと考えられ

合，po での 100 mg/kg と ip での 50 mg/kg はともにそのている（Yamamoto and Kikuchi, 1980；Hogsted and

投与経路の LD 50 の 1/2 量であるので，LD 50 値に対するKarlsson, 1985）．このことより自然発生の小核は紡錘体

比としては同投与量と考える）では，7 化合物で po したの機能不全による染色体不分離によることが多いことが場合の方が高い小核誘発率がえられることがわかった

示唆された．また高濃度の colcemid 処理（0.05 µg/ml） （Hayashi et al., 1989）．このことより，in vivo 小核試験
ではさらに大きなサイズの小核が大半を占めるようになに関しては投与経路はあまり大きな影響がなく，毒性をる（Fig. 5e）．このように，ほとんど主核と変わらない指標とした適切な投与量が設定されている場合は，投与

大きさのものが出現することから，これらは核の異常分経路のいかんにかかわらず，同程度の感度で小核誘発率裂によるものだと考えられた（Wakata and Sasaki, 1987）．

が測定できることがわかった．しかし，ip では検体量がまた，caffeine では MMC と同様にサイズの小さな小核

少なくて済むこと，po より小核誘発率は低くなる化合が多く（Fig. 5f）染色体構造異常による小核であること

物がほとんどなく，高くなる化合物が多いこと，手技がが示唆された．

po に比べ簡単であることより，どちらかといえば ip をIn vitro 小核試験は近年注目度が高くなり，国際的な選んだ方がよいと考えられた．

検討がなされている（Kirsch-Volders et al., 2000）．

2. げっ歯類個体を用いる小核試験法の検討
1）マウス小核試験における投与経路による小核誘発率の差の検討
制癌剤であり小核試験において陽性対照物質として広2）マウス小核試験における投与回数に関する検討
Methotrexate（MTX）を 1, 2 および 4 回腹腔内投与後，6, 24, 48 および 72 時間後に骨髄塗抹標本を作製し（1 回投与では 24 時間後から），小核の誘発を観察した．その結果を Fig. 6 に示す．

く用いられている Cyclophosphamide（CP）をマウスに

1 回 投 与 で は 16 mg/kg 投 与 48 時 間 後 に 最 大 値 の腹腔内投与（ip）あるいは経口投与（po）したとき誘発0.50 ％の有意な小核誘発性が認められた．2 回投与ではされた小核を持つ多染性赤血球の頻度を Table 1 に示す．

明らかに 1 回投与より高い小核誘発率が得られた．また，

CP 投与後 24 時間に骨髄細胞標本を作製し小核を持つ

4 回投与では，低投与量から高い小核誘発率が得られた

多染性赤血球を計数した．腹腔内投与では 50 mg/kg でが，最大誘発率は 2 回投与とあまり変わらず，高用量に1.78 ％の小核出現頻度であったのに対し，po の 50

なると骨髄毒性が強く出て観察不可能になり，小核の誘mg/kg では 0.59 ％であり 100 mg/kg では 1.89 ％と，同発が逆に減少した．以上の結果より，MTX は投与回数

じ投与量では ip の方が小核誘発率が高い結果となった．

を多くすればするほどより低用量で小核を効率よく誘発

しかし，骨髄細胞に対する影響の指標である，PCE 比することがわかったが，骨髄抑制も強く現われ，最大のは同様な小核誘発率が観察された，ip の 50 mg/kg 投与

小核誘発率に大きな増加は認められなかった．また，では 28.2 ％であり，po の 100 mg/kg 投与では 20.8 ％とSchmid が小核試験のプロトコールとして最初に提案し同様な値を示した．この結果より，ip 投与の方が少ない

た方法（Schmid, 1975）は，2 回投与後の 6 時間後に観投与量で小核誘発が観察されることがわかった．しかし，察する方法であるが，今回の結果より，2 回投与後の 24

CP は骨髄細胞に強く毒性を示すことが知られている物

時間後に観察する方がより感度が良いことがわかった．
103

Table 1 Results of micronucleus test with cyclophosphamide administered by ip and po to CD-1 mice
ip

po

Dose
（mg/kg）

MNPCE（％）

PCE（％）

MNPCE（％）

PCE（％）

Saline
25
50
100
200
400

0.03 ± 0.05（4）0.42 ± 0.13（4）1.78 ± 1.44（4）4.46（1）na
nt

49.5 ± 0.7
35.8 ± 5.6
28.2 ± 2.3
8.8 ± 2.1
2.8 ± 2.5
nt

0.05 ± 0.06（4）nt
0.59 ± 0.03（4）1.89 ± 0.88（4）2.09 ± 0.17（3）1.33 ± 0.81（3）46.1 ± 3.2
nt
39.6 ± 8.8
20.4 ± 4.2
10.7 ± 2.2
8.7 ± 5.2（）: number of animals analyzed, nt : not tested, na: not analyzed because of too low frequency of PCE,
PCE: polychromatic erythrocyte, MNPCE: micronucleated polychromatic erythrocyte

Table 2 Comparative sensitivity of administration routes, intraperitoneal
injection and oral gavage, at same dosage
Compounds

Sensitivity
Dose（mg/kg）

Dose（％ of LD50）

ip ＞ poip ＝ poip ＞ poip ＜ poip ＞ poip ＞ poip ＞ poip ＜ poip ＞ poip ＝ poip ＞ poip ＝ poip ＝ poip ＝ poip ＝ poip ＞ poip ＜ poip ＝ poip ＝ poip ＜ poip ＞ poip ＜ poip ＞ poip ＞ poip ＞ poip ＞ poip ＝ poip ＞ poip ＜ poip ＞ poip ＜ poip ＞ poip ＜ poip ＝ po

Nucleic acid analogs
Ara-C
6-MP
polycyclic hydrocarbons
B
（a）
P
DMBA
Aromatic amines
2AAF
Phenacetin
Alkylating agents
Cyclophosphamide
EMS
ENU
MMS
Cross-linking agents
MMC
Spindle poisonsColchicine
Vincristine
Inorganic chemicals
KBrO3
K2CrO4
Miscellaneous
BenzeneProcarbazine

Dose（mg/kg）: absolte dosage
Dose（％ of LD50）: relative dosage to LD50 in each administration route.
（a）
P: benzo［a］
Ara-C: 1-β-arabinofuranosylcytosine, 6-MP: 6-mercaptopurine, B
pyrene, DMBA: 7, 12-dimethylbenz［a］anthracene, 2AAF: 2-acetylaminofluorene,.EMS: ethyl methanesulfonate, ENU: N-ethyl-N-nitrosourea, MMS:
methyl methanesulfonate, MMC: mitomycin C

MTX については，以上の結果より，1 回投与では小核のを Table 3 に示す．また，それぞれの化合物で得られた誘発が弱いものでも 2 回投与することにより，明らかな小核誘発率の最高値を太字下線で示し，2 番目の値を太小核の誘発が認められることがわかった．

字で示した．

この研究は 33 機関による共同研究で 11 化合物についその結果，2 回投与で最高値あるいは 2 番目に高い小て投与回数を検討したうちの 1 つである．その 11 化合

核誘発率を示す化合物が 1 番多く，1 回投与と 4 回投与

物のそれぞれの投与回数で得られた小核誘発率の最高値

ではほぼ同数であった．また，4 回投与では 2 回投与よ104Table 3 Effect of frequency of administration on micronucleus
induction
MNPCE（％）
Compounds

Frequency of administration
1
2
4

5-FU
6-MP
Ara-C
DMBA
2AAF
Phenacetin
ENU
EMS
K2CrO4
Benzene
MTX

3.13
5.74
5.12
2.54
1.16
1.23
3.13
2.43
0.93
1.08
0.50

4.17
8.45
4.18
3.67
1.63
2.38
4.72
1.48
0.85
1.40
0.97

1.60
11.8
7.26
2.08
0.63
0.95
6.06
1.63
0.80
1.52
0.83

Maximum（bold underlined）and Second（bold）value in earhchemical
5-FU: 5-fluorouracil, 6-MP: 6-mercaptopurine, Ara-C: 1-β-arabinofuanthracene, 2AAF:
ranosylcytosine, DMBA: 7, 12-dimethylbenz［a］
2-acetylaminofluorene, ENU: N-ethyl-N-nitrosourea, EMS: ethyl
methanesulfonate, MTX: methotrexate

り高い小核誘発率を示すものもあったが，逆に小核誘発率が低下するもの，骨髄抑制のため観察が不可能になるものがあった（CSGMT, 1990）．投与回数を増すことは操作も煩雑になり，また毒性のある物質では投与量の設定も容易ではなく，あまり実用的ではないことがわかった．また，MTX のような 1 回投与では小核誘発性が弱く適切な標本作製時期（投与 48 時間後）を設定しなければ，陽性結果を得られない化合物であっても，2 回投与の 24 時間後には有意な小核誘発性が観察されることがわかった．これらをまとめると，スクリーニング的にある物質の小核誘発性を知るための試験としては，24
時間間隔の 2 回投与後，24 時間目に骨髄標本を作製して観察すればよいことがわかった．
3）ラットを用いる小核試験の検討
医薬品等のげっ歯類を用いる毒性試験においてマウスはあまり用いられず，ラットが用いられることがほとんどである．そこで，小核試験においてもラットが用いられないかを検討した．試験化合物として，マウス小核試
験陽性でラットに発癌性が認められている 28 化合物，
マウス小核試験陽性でラットでの発癌性は不明の 6 化合物，マウス小核試験陰性でラットに発癌性が認められている 2 化合物およびマウスとラットで小核試験において相違が報告されている 3 化合物（George et al., 1990;
Fig. 6 Mean Induction of micronucleated polychromatic erythrocytes treated with methotrexate. MNPCEs were counted
in 1000 PCE in the bone marrow cells of mice treated bysingle, double or quadruple dosing.

WestmorelandandGatehouse,1991;

Meli

and

Seeberg,1990）を選んだ（Table 4）．
これらの化合物についてラットを用い骨髄細胞と末梢血液で小核誘発性を調べた．まず，ラットの骨髄細胞お105Table 4 List of chemicals tested in the rat micronucleus assay
Mouse MN ＋ ve rat carcinogens
Acetaldehyde
2-Acetylaminofluorene
p-Aminoazobenzeneo-Aminoazotoluene
Arsenic acid solution
BenzeneBenzidine
4-Chloro-o-phenylenediamine
Daunomycin
N, N’-Diacetylbenzidine
1, 2-Dibromo-3-chloropropane
Diepoxybutane
Diethyl sulfate
Ethy methanesulfonate
N-Ethyl-N-nitrosourea
Hydrazine
Nitrogen mustard
2-Methylaziridine
Methyl methanesulfonate
N-Methyl-N-nitrosourea
N-Methyl-N-nitro-N’-nitrosoguanidine
N-Nitrosomorpholine

Oil orange SS
Phenacetin
1, 3-Propane sultone
Propylene oxide
Triethylenemelamine
Urethane
Mouse MN +ve chemicals
Azathioprine
Colchicine
5-Fluorouracil
6-Mercaptopurine
Methotrexate
Vincristine
Mouse MN -ve carcinogens
Acrylonitrile
4, 4’-Methylene bis（2-chloroaniline）
Species difference reported chemicals
Azobenzene
1, 2-Dimethylhydrazine
Solvent yellow 14

Fig. 7 Distribution of MNPCE frequencies in the solvent control
rats（the present study）and mice（CSGMT, 1986; 1990;.
1992; Hayashi et al., 1989a; Morita et al., 1997）

Fig. 8 Distribution of MNRET frequencies in untreated rats（the present study）and mice（CSGMT, 1992; Morita et.
al., 1997）

よび末梢血における自然発生の小核を持つ幼若赤血球の検出できなかった化合物が 4 化合物とマウスの 1 化合物

頻度を調べた．それらをマウスと比較した結果を Fig. 7に比べ少し多かったが，マウスでは試験されていない化および Fig. 8 に示す．

合物も多く，従来ラットでは脾臓において小核を持つ赤骨髄細胞における小核を持つ幼弱赤血球の頻度は，ラ

血球が除去されるためその能力のないマウスに比べ検出

ットで 0.123 ％，マウスで 0.203 ％，末梢血においては，力が落ちると思われているほど大きな検出力の差はな

ラットで 0.064 ％，マウスで 0.145 ％といずれの場合もく，ラットの末梢血でも十分小核誘発性の評価が可能なラットがマウスの約 1/2 と低かった．今回試験した化合ことを示した．また，小核誘発率を比較してみると，小物については，マウス骨髄細胞において検出されなかっ核誘発率の絶対値で比較するとマウスが高く，すべてのたのは 5 化合物であるのに対し，ラット骨髄細胞では 4化合物においてラットと同じか高かった．しかし，先に化合物とほとんど変わりなく，骨髄細胞を用いる場合は示したようにラットでは小核を持つ幼若赤血球の自然発

マウスとラットで検出力に差はなく，全く同等であるこ

生頻度が低いので，コントロールと比較しての誘発率にとが示された（Table 5）．

換算すると，マウスより高く小核を誘発する化合部があ

またこれまで，末梢血を用いた場合は，小核誘発性を106ることがわかった（Table 6）．

Table 5 Rat and mouse micronucleus assay 39 chemicals with peripheral blood and bone marrow
Mouse

No. of Chemicals

24

Rat

PB

BM

PB

BM

＋ ND ─

＋ ND ─

＋ INC ─＋ ND ─

14

1

28

6

5

31

3

4

34

1

4

PB: peripheral blood, BM; bone marrow, ＋; positive, ND; no data, INC; Iinconclusive, ─; negative

Table 6 Comparative sensitivity of rat and mouse micronucleus assay
Bone marrow
Chemicals

p-Aminoazobenzeneo-Aminoazotoluene
BenzeneDiepoxybutane
Ethyl methanesulfonate
N-Ethyl-N-nitrosourea
5-Fluorouracil
Hydrazine
6-Mercaptopurine
MNNG
Nitrogen mustard
1, 3-Propane sultone
Propylene oxide
Triethylenemelamine
UrethaneVincristine

Species

Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
＊
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse
Rat
Mouse

Route

Dose

Peripheral blood

MNPCE

Dose

（mg/kg）（％）（Fold） （mg/kg）
inc.

ip
ip
ip
ip
po
po
po
po
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip
ip

80
150
600
400
2000
2000
144
72
300
200
75
100
40
50
75

0.41
0.70
0.11
0.60
2.34
2.75
4.00
8.68
1.36
1.48
2.78
7.85
1.39
3.13
0.58

3.4
5.0
0.9
3.0
16.7
34.4
22.2
36.2
45.3
8.2
27.8
60.4
10.7
24.1
2.8

50
50
100
150
2
2
60

0.92
6.98
1.20
2.55
3.24
7.17
2.15

6.1
27.9
4.0
10.2
23.5
29.6
13.4

200
300
0.5
1
1000

0.33
0.53
5.58
7.52
1.29

2.2
8.8
11.8
32.7
11.7

ip
ip

0.2
0.125

0.99
11.68

7.6
89.8

MNRET
（％）

（Fold）
inc.

80
150
600

0.38
1.14
0.16

3.5
8.1
8.0

2000
2000
144

2.16
2.75
0.78

18.0
8.1
26.0

300

0.75

12.5

75
50
80
50
12.5
50
25
25
100
100
2
2
30
72
300
300
0.125
1
1000
1000
0.08
0.25

1.36
3.78
0.69
2.54
0.15
1.18
0.53
2.9
0.75
0.8
0.66
4.98
0.66
1.92
0.4
0.4
1.08
6.64
1.6
3.28
0.26
4.34

12.4
11.8
34.5
18.1
2.5
5.9
5.3
7.3
3.75
3.1
7.5
21.4
7.3
11.3
3.1
6.7
6.8
66.4
40
16.4
4.3
54.3

Light shadow: frequency in mice was more than twice that in rats
Dark shadow: frequency in rats was more than twice that in mice＊
MS/Ae strain mice

このことにより，他の一般毒性試験の動物を用いて小核の評価が行える可能性が示唆された（Wakata et al.,1998）．

結語

小核は染色体異常を観察する簡便で感度の高い検出法であるが，培養細胞では分裂細胞の特定という技術的な問題点がありその定量性が確保できなかったが，今回検討した方法により培養細胞でも in vivo での骨髄細胞と同様に定量的に小核誘発性を評価することができるよう
107

になった．このことにより，培養細胞を用いる小核試験が染色体異常試験の代わりとなる可能性があることが示された．また，小核試験にラットを用いることができると示されたことにより，他の毒性試験との関連もとれ小核試験にラットを用いる有用性を示した．
謝辞

In vitro 小核試験の研究は，京都大学放射線研究セン
ターの佐々木正夫教授のもとに染色体異常試験を教えて頂きに伺った時に運良く出会い，研究の機会を与えて頂き，多くの御指導を受けて成し得たものです．ここに心より感謝申し上げます．マウスおよびラットを用いた小核試験の検討は，本学会 MMS 研究会の共同研究の一環として行われたものであり共同研究者の皆様の御協力なしでは成し得なかったものです．本研究を進めるに当たって多くの御助力を頂きました国立医薬品食品衛生研究所

林真部長，グラクソ・スミスクライン株式会社

森

田健博士ならびに日本環境変異原学会，MMS 研究会，
小核共同研究グループ（JEMS/MMS･CSGMT）の皆様に深く感謝致します．本研究を行うにあたり多くの御助
力と御配慮を頂きました，山之内製薬株式会社

大島稔

彦，山下智子，玉起美恵子，湯野幸一郎，宮内美津江，
永井由美子諸氏に深く感謝致します．学生時代から現在まで長きにわたり広く御指導頂きました，就実女子大学
早津彦哉教授，岡山大学遺伝子実験施設 根岸和雄助教
授，同薬学部 根岸友恵助教授，有元佐賀惠助教授に深く感謝致します．
参考文献
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109

入会手続きのご案内
入会申込書に必要事項をご記入の上，年会費とともに現金書留にて事務局宛てお送りください．
年 会 費

7,000 円（正会員）
5,000 円（学生会員）

事業年度 （1 月 1 日〜 12 月 31 日）（お申し込みについて）
1. 入会申込書に必要事項を楷書でご記入の上，年会費とともに現金書留にて事務局までお送りください．
2. 正会員は評議員の推薦を必要とします．推薦者がおられない場合は，事務局にご相談ください．
3. 学生会員は指導教官の推薦と在学証明書を必要とします．翌年の 3 月 31 日まで会員として登録されます．
4. 年度末に入会申し込みをされる場合で，翌年度から入会希望の場合は，その旨お知らせください．
5. 学会誌は入会後に発行した号からお送りしますが，当該年度で入会前の学会誌をご希望の場合は事務局までご連絡ください．
6. 住所変更（学会誌送付先の変更）の際は，会員番号（学会誌等送付する際，宛名ラベルに印刷されています），氏名，新・旧住所をご記入の上，事務局宛，書面にてご連絡ください．

日本環境変異原学会〒 170 ― 0003

東京都豊島区駒込 1 ― 43 ― 9

駒込 TS ビル 3F
電話

財団法人

口腔保健協会内

03 ― 3947 ― 8891（代） FAX

03 ― 3947 ― 8341

環境変異原研究 投稿規定
1． 掲載論文

4． 論文原稿の送付

環境変異原研究に関する未発表の「総説」，「一般論

論文原稿は 5 部と本誌に綴じ込みの「投稿論文チェ

文」
，「短報」
，および「特別企画（受賞講演）」，「論ックリスト」を，下記に（簡易）書留便または宅配説」，「資料・情報」などを掲載する．なお，投稿論便で送付する．

文の採否は編集委員会の審査により決定する．

〒 170 − 0003

「総説」 は，一つのテーマに関連する多くの研究論

東京都豊島区駒込 1 − 43 − 9

文の総括，評価，解説などである．原則として編集委員会より寄稿を依頼する．

日本環境変異原学会誌編集係「一般論文」 は，変異原に関する独創的研究の原著

Tel．03 − 3944 − 2591

論文で，それ自身独立して価値ある結論あFax．03 − 3947 − 8073

るいは事実を含むものとする．陰性データも受け付ける．

駒込 TS ビル

インテルナ出版

5． 著作権
本誌に掲載された記事，論文などの著作権は日本環「短報」 は，新しい技術の紹介や価値あるデータを

境変異原学会に帰属するものとする．従って，本会含む短い報告とする．陰性データも受け付が必要と認めた場合は転載し，また外部から引用のける．

申請があった場合には，編集委員会において検討の「論説」 は，一つのテーマに関連する多くの研究論上許可することがある．ただし，著作者自身が自分文の総括，評価，解説などで，会員からのの記事，論文などの一部の複製，翻訳などの形で利投稿によるものとする．

用することを妨げるものではない．しかし，著作者「資料・情報」は，環境変異原に関する調査の結果自身であっても，全文を複製の形で他の著作物に利などをまとめたもの，および公開シンポジ

用する場合には，事前に文書にて学会長に申し出をウム，研究会の要旨などとする．
（Letter to Editor も受け付ける．）
2． 投稿資格
共著者のうちの 1 人は日本環境変異原学会会員でなければならない．ただし，招待寄稿の場合にはこの限りではない．
3． 論文原稿の書き方
論文原稿の用語は英語または日本語とし，最新の執筆規定に従い簡潔にわかりやすく書く．総説，一般
論文，論説は，写真・図表を含めて刷り上がり 8 頁

行い，許諾を求めなければならない．
6． 校正
著者校正は原則として原稿に対する誤植の訂正に限る．原稿にない加筆・変更はしないこと．
7． 著者負担金
1） 投稿料は無料とする．ただし頁数の超過分や多額の経費を要する図表の実費は著者負担とする場合がある．
2） カラー印刷等の特殊印刷のため付加的に発生する費用は著者負担とする．

以内．短報は 4 頁以内とする．ただし規定の頁数を3） 別刷りはすべて著者負担とする．別刷り希望者

超えることが明らかな場合は，事前に編集委員に相は著者校正時に添付する申込書に 50 部単位で

談する．

申し込む．

編集委員会からのお願い「環境変異原研究 Environmental Mutagen Research」への投稿論文の，投稿から印刷までの時間の短縮を目指し，投稿論文の査読を評議員にお願いすることになりました．それに伴い，投稿規定の見直しも行い，今後は年大会での発表と同様に，投稿論文の分野を著者に申告していただき，同一分野を登録していただいている評議員に査読していただくことになります．今回投稿時のチェックリストをお届けしますので，投稿論文と一緒に必ずお送り下さい．
現在 7 名の編集委員が分担して学会誌，Jems News の編集作業を行っていますが，それぞれ自分の仕事を抱え
ボランティアとして活動しています．そこで，会員の皆様の積極的な雑誌作りへの協力として，年大会で発表されたものを一報でも多く論文にまとめ，本学会誌に投稿していただきますようお願い致します．また，Jems Newsへの投稿，情報，意見，公募等もお願いします．
本誌の将来像に関する議論を進めております．英文誌化の話も出ており，編集委員を中心に検討を始めたとこ
ろですが，皆様のご意見を是非お聞かせいただきたく思います．どんな些細なことでも結構ですから，学会誌に関することでコメント，提案等がありましたら，編集委員まで E − mail にてお知らせください．編集委員一同環境変異原研究 執筆規定
1．用語は日本語または英語とする．
2．原稿は原則としてワープロを用いて作成する．
日本文の原稿：

10．図と写真は原図またはキャビネ大の光沢写真版とし，裏面に Fig. 1, 2, …および上下を鉛筆書きする．
11．表は上部に一連の番号 Table 1, 2, …と英文の表題を原稿は A4 判用紙に 1 行約 40 字，1 頁 30 〜 31 行

記入する（文頭のみ大文字）．脚注を要するときに表で印字する（刷り上がりの約 1/2 頁に相当する）．

示の語句の右肩にａ, ｂ, ｃ, …を付記し，表の下欄

ただし，要約は英文（300 語以内）とする．また，別に題名，著者名（フルネーム），所属機関名ならびに所在地を英文で付ける．
英文の原稿：

外にそれぞれの説明を記す．
12．本文中の文献引用は著者名および年号をもってする．
13．参考文献は筆頭著者名のアルファベット順に配列し，原稿は A4 判用紙にダブルスペースで印字（12 ポ雑誌の省略名は Chemical Abstracts の記載方法に従イント）する．1 頁 25 〜 27 行を標準とする．原う．記載順序は著者氏名，（年），題名，雑誌名，巻，稿は著者の責任において英語の添削訂正を受けた頁（単行本の一部引用の場合は著者氏名，（年），題名，ものに限る．

編者名，書名，発行所，発行地，頁）の順とする．

3．論文の記述は，第 1 頁は表題，著者名，所属および単行本そのものを引用する場合は，編者名あるいは所在地，第 2 頁は英文の要約（Summary）およびキ

著者名，（年），書名，発行所，発行地の順とする．

ーワード（英文 5 語以内，固有名詞や遺伝子名など

文献の記載方法は下記の例に従う．

で大文字の使用が必要な場合を除き，原則として小Ames, B.N., J. MaCann and E. Yamasaki（1975）

文字表記とする），第 3 頁以下，緒言（Introduction），

Methods for detecting carcinogens and muta-

実験材料および方法（Materials and Methods），結gens with the Salmonella/mammalian-micro-

果（Results），考察（Discussion）または結果および考some mutagenicity test, Mutat. Res., 31, 347-

察，結語（Conclusion），謝辞（Acknowledgments），
参考文献（References），表，図の説明および図の順

364．
Ashby, J., F.J. de Serres, M. Draper, M. Ishidate

序とする．ただし，総説の記述は，第 3 頁以下，緒Jr., B.H. Margolin, B. Matter and M.D. Shelby

言，1. ……，2. ……，結語，謝辞，参考文献，表，（1985）Overview and conclusion of the IPCS

図の説明および図の順序とする．なお図と表の説明

collaborative study on in vitro assay systems,

文はすべて英文とする．
4．学名，遺伝子記号などはイタリックとし，その他まぎらわしい記号については原稿に適宜指示を与える．
5．化学物質名は原則として英語とし，一般名を用いる．
また，化学物質の CAS 登録番号を記載する．文中に用いる英語の単語あるいは句は固有名詞を除いて小文字で書きはじめる（文頭の場合は大文字）．
6．数字は算用数字を用い，単位は慣用による省略記号を用いる．
7．略語を使用するときは，論文中にはじめて使用する
ときに完全な語とその略語を括弧内に示す．
8．句読点はカンマ（，）
およびピリオド（．）とする．
9．表，図は本文と別にし，それらの挿入箇所を本文のIn ： J. Ashby, F.J. de Serres et al.（Eds）,
Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens, Elsevier, Amsterdam, pp. 117-174．
Friedberg, E.C., G.C. Walker and W. Siede（1995）
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Washington, D.C.
藤川和男，梁治子，近藤宗平（1984）
ハエの翅毛

スポットテスト―近ごろ注目されている短期試
験法，環境変異原研究，6，107-113．
佐々木正夫（1983）環境変異原と染色体異常，外村晶（編），染色体異常，朝倉書店，東京，pp．
107-113．
松影昭夫（編）（1996）DNA 複製，修復と発癌，羊土社，東京．

右余白に明示する．グラフ，写真，線画等はすべて図とし，一連の番号 Fig. 1, 2, …を付し，説明文（英文）
を別紙に添える．

（改訂

2000 年 12 月）

投稿論文チェックリスト
論文ご投稿の際，この用紙に必要事項をご記入のうえ，添付してください．

論文名（日本語）：（英語）：

窓口著者名：
連絡先（住所）（TEL）（FAX）（E-mail）

分類（該当するものに印をつけてください）□ 突然変異のメカニズム□ 変異原の検出□ 環境汚染物質□ 抗変異原□ DNA 損傷（付加体）□ 変異原の代謝□ 変異原の修飾，発現□ 試験法の開発，改良□ その他（）

送付前のチェック項目□ 投稿規定，執筆規定に沿っていますか（特に引用文献）□ 英文校閲はお済みですか□ 投稿論文は 5 部ありますか編集後記本号は第 30 回（記念）大会の特集号です．ご存じのように，昨年は国際環境変異原学会と合同開催されたことにより，大会としては基調講演，特別講演それと受賞講演のみでした．
そのため，例年のように大会シンポジウム等の論文もなく，少し寂しい号になってしまいま
した．しかし，このように本号を発行することができました．投稿して頂いた講演者の先生方に感謝いたします．ただ残念なことに，本号にはそれ以外の投稿論文がありません．これまでの編集委員も申していますように，本学会の発展には本誌の充実が欠かせません．皆様からのご投稿を切望いたします．
担当編集委員

編

集

委

若田

明裕

員

森田

健（委員長）（2002 ─）〒 151 ─ 8566 東京都渋谷区千駄ヶ谷 4 ─ 6 ─ 15 GSK ビル
グラクソ・スミスクライン株式会社
Tel ： 03 ─ 5786 ─ 5067 Fax ： 03 ─ 5786 ─ 5223
E-mail ： takeshi.5.morita@gsk.com

矢嶋

信浩（1999 ─）〒 485 ─ 0059 愛知県小牧市小木東 3 ─ 45
雪印ラビオ株式会社・開発研究所
Tel ： 0568 ─ 77 ─ 3235 Fax ： 0568 ─ 76 ─ 1046
E-mail ： n-yajima@snowlabio.com

若田明裕（2001 ─）〒 174 ─ 8511 東京都板橋区小豆沢 1 ─ 1 ─ 8
山之内製薬株式会社・安全性研究所
Tel ： 03 ─ 5916 ─ 2177 Fax ： 03 ─ 3960 ─ 5141
E-mail ： wakata@yamanouchi.co.jp

山田

雅巳（1999 ─）〒 158 ─ 8501 東京都世田谷区上用賀 1 ─ 18 ─ 1
国立医薬品食品衛生研究所・変異遺伝部
Tel ： 03 ─ 3700 ─ 1141
（ext 282）
Fax ： 03 ─ 3707 ─ 6950
E-mail ： myamada@nihs.go.jp

栗忍（2002 ─）〒 257 ─ 8523 神奈川県秦野市落合 729 ─ 5
財団法人 食品薬品安全センター・秦野研究所
細胞毒性試験班
Tel ： 0463 ─ 82 ─ 4751 Fax ： 0463 ─ 82 ─ 9627
E-mail ： wakuri.s@fdsc.or.jp

赤沼高橋

三恵（2000 ─）〒 187 ─ 0011 東京都小平市鈴木町 2 ─ 772（財）
残留農薬研究所・試験企画部
Tel ： 042 ─ 382 ─ 2146 Fax ： 042 ─ 383 ─ 7640
E-mail ： mie.a@viola.ocn.ne.jp

和彦（2002 ─）〒 467 ─ 8603 愛知県名古屋市瑞穂区田辺通 3 ─ 1
名古屋市立大学大学院薬学研究科
医薬品代謝解析学分野
Tel ＆ Fax ： 052 ─ 836 ─ 3780
E-mail ： takahasi@phar.nagoya ─ cu.ac.jp

評
赤沼 三恵
大塚 雅則
木苗 直秀
下位香代子
寺尾 良保
根岸 和雄
藤川 和男
望月 正隆
山添
康

荒木 明宏
大西 克成
後藤 純雄
祖父尼俊雄
長尾美奈子
根岸 友恵
降旗 千恵
森
秀樹
吉川 邦衛

議

員

宇野 芳文
葛西
宏
佐々木 有
高橋 和彦
中嶋
圓
能美 健彦
本間 正充
森
幸雄
若田 明裕

環境変異原研究第 24 巻平成 14 年 9 月 24 日

印

刷

平成 14 年 9 月 30 日

発

行

発

行

者

大澤
鎌滝
島田
田中
糠谷
林
松元
森田
若林

浩一
太田 敏博
哲也
川西 正祐
弘康
清水 英佑
憲穂
出川 雅邦
東雄
布柴 達男
真
早津 彦哉
郷六
宮川
誠
健
矢嶋 信浩
敬二（五十音順）

第2号

2002 年

日本環境変異原学会

発行責任者

林

製

インテルナ出版作真環境変異原研究

Environmental Mutagen Research目

Vol. 24 No. 2 2002

次

第30回大会基調講演
日本環境変異原学会創生の頃と今考えるべき改革
杉村

隆 ……………………………………………………………………………………………………………… 63

環境変異原研究がめざす道
木苗直秀 ……………………………………………………………………………………………………………… 69

第30回大会特別講演
変異原性試験で何がわかるか：21世紀の展望
能美健彦 ……………………………………………………………………………………………………………… 75

第30回大会受賞講演
学術賞
変異・癌原性物質の産生・代謝とその活性抑制に関する研究
大西克成 ……………………………………………………………………………………………………………… 81
研究奨励賞
フリーラジカルを経由する環境変異・発がん物質の生成と発現に関する研究
平本一幸 ……………………………………………………………………………………………………………… 91
げっ歯類の培養細胞と個体を用いる小核試験法の検討
若田明裕 ……………………………………………………………………………………………………………… 99

付 記
日本環境変異原学会

入会申込書
学生会員申込書

環境変異原研究

投稿規定
執筆規定