常在菌フローラ育成を目指す
肌表面微小環境応答性ポリアミノ酸の開発
東京工業大学科学技術創成研究院化学生命科学研究所

武元

宏泰

Skin flora plays an essential role in skin health conditions. Conventional cosmetic strategies can deliver nutrients tothe flora, which often facilitates the growth of not only beneficial bacteria but also bad bacteria. In the present study, a new
methodology that delivers the nutrients to beneficial bacteria for the selective growth was developed. In design, glucose
as a nutrient was conjugated with poly (amino acid) side chains via boronic ester. Thus, the developed system can release
glucose in response to weakly acidic pH, which is suitable for the growth of beneficial bacteria. In fact, incubation of thedeveloped polymer system at pH 5 facilitated the release of glucose payload relative to the incubation at pH 8. Ultimately, when
Staphylococcus epidermidis was selected as a beneficial bacterium, the growth was selectively accelerated in the presenceof the developed polymer at pH 5, relative to the conditions at pH 8 which is suitable for the growth of bad bacteria. The
obtained results suggest that the developed polymer system potentially achieves the selective growth of beneficial bacteria
for good skin health conditions.

1．緒

言

表皮常在菌は肌表面の環境構築を司るため、その健全な育成は肌の保湿や肌荒れ防止へと直結する。実際に、荒れた肌表面での善玉菌の比率を大きくすることで、肌の保湿能力や肌荒れを改善できる 1）。これに関し、表皮常在菌は肌表面に均一に分布するわけではなく、種々の外的要因（pH や栄養物質量等）に応じて異なる集団を形成するため、善玉菌と悪玉菌の数や比率（肌常在菌フローラ）は微小領域ごとに異なると考えられる。そこで本研究では、肌表面の環境の差異に応じて最適な作用を発現する機能性分子（ア図1

ミノ酸ベース）の開発を通じて、肌常在菌フローラの局所皮膚付属器を有する三次元再生皮膚器官系の構築制御を通じた理想的な育成を目指す。具体的には、機能として「善玉菌環境選択的な栄養補充」が組み込まれた分子に設計することで、悪玉菌が多く存在する領域では pH 上を開発する（図 1）。

昇に伴ってオリゴ糖放出が阻害される。このような方針の肌常在菌フローラの育成には適した pH 環境と栄養補充もとに、「善玉菌選択的な栄養補充」を可能とする高分子のが有用だと考えられる。既存の方法論で pH 調整は可能な開発を着想した。PEG を開始剤とした NCA 重合法によりものの、栄養補充においては多くがオリゴ糖を用いるためポリアミノ酸誘導体を作成し、側鎖改変によりオリゴ糖を善玉菌（代表的には Staphylococcus epidermidis）だけでな導入する。オリゴ糖の導入には酸性条件選択的に開裂するく悪玉菌（代表的には Staphylococcus aureus）への栄養供給ボロン酸エステル構造を採用した。ボロン酸はジオール構が懸念される。そこで本研究では、細菌に取り込まれづら造と可逆的なエステル形成を行うが、ボロン酸エステルはい高分子にオリゴ糖が担持された構造体を着想した。ポリpH 7 以下にて速やかに加水分解し、ジオール誘導体が放エチレングリコール（PEG）を有する高分子は PEG の排除出される 3）。これに関し、常在菌の育成に有用なオリゴ糖

体積効果のために細胞に取り込まれづらい 2）。さらに、善の多くはジオール構造を含む。そのため、善玉菌育成に適玉菌が好む弱酸性 pH においてオリゴ糖が徐放されるようした pH 約 5 でオリゴ糖の放出の加速が期待される。本研究では、善玉菌の生育に適した pH 環境では栄養を補充し、The development of poly(amino acid)that recognizes microenvironment ofskin for healthy growth of skin flora

善玉菌選択的な育成を促すことで、肌表面の理想的な常在菌フローラを構築するための手法を提案する。

２．方Hiroyasu Takemoto
Laboratory for Chemistry and LifeScience, Institute of Innovative Research,
Tokyo Institute of Technology法

2. 1. ポリアミノ酸誘導体の合成
反応手法は図 2 に従った。MeO-PEG -NH（分子量10 , 000）
2− 141 −コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図２高分子の合成スキームと Lys（TFA）-NCA とを DMSO 中で混合した。反応溶液

2. 4. 高分子に基づく善玉菌の増殖促進試験は室温にて 3 日間撹拌し、ジエチルエーテルに対して再沈PEG -P（Lys-FPBA 49）100 に対してグルコースを 49 倍量殿を行った。得られた PEG-P（Lys-TFA）はメタノール／混合し、Staphylococcus epidermidis を培地にて培養する

5 M NaOH aq.（4 / 1、v/v）に再溶解し、室温にて一晩撹拌際に添加した。この際、培地の pH を 5 . 0 あるいは 8 . 0 とした。0 . 01 M HCl での透析、純水での透析の後に凍結乾した。定期的に培地中の Staphylococcus epidermidis 量を燥を行い、PEG-PLys を白色粉末として得た。

600 nm の濁度にて測定した。

PEG-PLys へのボロン酸の導入は脱水縮合反応にて実施

３．結した。PEG-PLys と FPBA、DMTMM を MeOH と 50 mM炭酸バッファーの混合溶液（1 / 1、v/v、pH 8 . 5）に溶解し、果3. 1. ポリアミノ酸誘導体の合成一晩撹拌した。反応溶液は 0 . 01 M HCl、純水にて透析しPEG-PLys を 1 H NMR 解析すると、その PLys 鎖由来のた後に凍結乾燥を行うことで、PEG-P［Lys（FPBA）］を白プロトン強度から Lys 重合度は 40 のものと 100 のものの色粉末として得た。

2 種類の合成に成功した。続けて、PEG-P［Lys（FPBA）］とした後に 1 H NMR 解析すると、FPBA 由来のプロトン

2. 2. 善玉菌を育成するための糖のスクリーニング

強度より、PLys 鎖への導入率はそれぞれ 50 % であった。

Staphylococcus epidermidis を培地にて培養する際、50これ以上 FPBA 導入率を上げると水溶性が著しく低下す

mM のグルコース、グルコサミン、スクロース、ラクトーるため、本研究ではこの導入率を採用した。結果として、

スを添加し、Staphylococcus epidermidis の増殖を観察しPEG-P［Lys（FPBA）49 ］100 と PEG-P［Lys（FPBA）20 ］40 とのた。Staphylococcus epidermidis の培養液中の量は 600 nm

2 種類のポリアミノ酸誘導体の合成に成功した。

での濁度にて測定した。

3. 2. 善玉菌を育成するための糖のスクリーニング

2. 3. グルコース放出のpH応答性

善玉菌を増殖するのに適した糖成分を選別するために、

PEG -P（Lys-FPBA 20）40 に対して 20 倍量のグルコースグルコース、グルコサミン、スクルース、ラクトースを添を混合し、50 mM の酢酸バッファー（pH 5 . 0）あるいはト加した際の Staphylococcus epidermidis の増殖を評価した

リスバッファー（pH 8 . 0）に対して透析した。定期的に外液（図 3）。ここでは、Staphylococcus epidermidis の量を濁度を採取し、外液に含まれるグルコース量をグルコース定量にて測定している。糖の添加なしの系に比較して、グルコキット（BioVision）にて測定した。

ースを添加した系では顕著に Staphylococcus epidermidis の− 142 −常在菌フローラ育成を目指す肌表面微小環境応答性ポリアミノ酸の開発

図３

糖を添加した際のStaphylococcus epidermidisの増殖

図４ 開発したポリアミノ酸誘導体からのグルコース放出とpH応答性増殖が促進されたことが示された。一方で、ラクトースやスクロースでは目立った増殖の促進はみられず、なおかつグルコサミンでは増殖の低下が確認された。このため、本研究ではポリアミノ酸誘導体に結合させる糖分子として、グルコースを選出した。

3. 3. グルコース放出のpH応答性
Staphylococcus epidermidis の増殖に適した糖としてグルコースを選定した。そこで、合成したポリアミノ酸誘導体とグルコースとを混合し、会合体調製をした後に、pH 5および pH 8 でのグルコース放出能を評価した（図 4）。pH 8で処理した系においては、5 時間後に 25 % 程度のグルコース放出が観察されたのに対し、pH 5 で処理した系においては 33 % 程度のグルコース放出が観察された。このことから、開発した系において、善玉菌育成環境に適した pHにおいて、グルコース放出の加速が確認された。

図５ 開発したポリアミノ酸誘導体を用いた善玉菌増殖とpH応
答性

3. 4. 高分子に基づく善玉菌の増殖促進試験
善玉菌育成環境下において、開発したポリアミノ酸誘導

４．考体がグルコースの放出を加速させることが確認されていた。

察

次に、実際に Staphylococcus epidermidis を培養する際、本研究では、善玉菌環境選択的に栄養物質を放出し、そ開発したポリアミノ酸誘導体を添加して増殖速度を評価しの育成を促進する高分子材料の開発を行った（図 1）。善玉た。ここでは、培養する際の pH も 5 と 8 に設定した（図 5）。

菌は弱酸性環境が育成に適するため、弱酸性 pH に依存しpH 8 においては、開発したポリアミノ酸誘導体の添加にて栄養物質（糖）を放出する分子設計が必要となる。これに関わらず、2 時間後に増殖をみせたものの、それ以降は目関し、本研究ではボロン酸エステル結合に着目した。ボロ立った増殖を誘導しなかった。一方で、pH 5 においては、ン酸は糖の有するジオール結合とボロン酸エステル結合をpH 8 の系に比較して培養液中の Staphylococcus epidermidis

容易に形成するが、それは pH 7 以下の弱酸性環境下にての増殖が顕著であり、その増殖はポリアミノ酸誘導体の添開裂が促進される。一方で、悪玉菌環境である弱塩基性加によってさらに加速された。特に、8 時間後では相対的pH では糖分子の放出が抑制されるため、悪玉菌の増殖へな Staphylococcus epidermidis の数は 6 % ほど増大していは寄与しないことが期待される。高分子の合成から糖分子た。の選定、糖分子の放出挙動の評価、善玉菌の一つである− 143 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Staphylococcus epidermidis を用いた増殖評価等を介して、実現する可能性が示された。一方で、pH 5 において PEG-P

善玉菌フローラの育成における一つの方法論を提唱する。

［Lys（FPBA）］とグルコースとの会合体を添加していない糖分子を担持する高分子としては、ポリエチレングリコ系と比較すると、Staphylococcus epidermidis の増殖促進ール（PEG）とポリアミノ酸のブロック共重合体を選択した。

は 8 時間後で 6 % 程度であり、改善の余地が残されている。

ポリエチレングリコールは化粧品に汎用されるバイオマテ

これに関し、PEG-P［Lys（FPBA）］とグルコースとの会合リアルであり 2）、そしてポリアミノ酸は生分解性・生体適体の添加量や、会合体からのグルコース放出能等を最適化

4）合性に優れる 。なかでも、ポリリシン（PLys）のようにする必要があると言える。

側鎖に反応性官能基を有するポリアミノ酸は種々の化学構

肌フローラの状況は個人によって千差万別であり、それ造を導入可能である。まず、PEG を開始剤として PEG-に応じて育成を促進するべき菌の種類・量も異なると予想

PLys を合成した。得られた PEG-PLys に対して脱水縮合される 5）。本研究では善玉菌としてStaphylococcus epidermidis

反応を介して FPBA（ボロン酸）を導入した（図 2）。FPBAを選定し、担持する糖分子としてグルコースを選択した。

は疎水性を有するが、PLys 側鎖への導入率を約 50 % に調しかしながら、本研究にて開発されたシステムでは、今回節することで、良好な水溶性を有する PEG-P［Lys（FPBA）］

スクリーニングしなかった他の糖も担持することができる。の取得に成功した。

そのため、種々の糖分子を同時に担持し、個別の菌の育成得られた PEG-P［Lys（FPBA）］を用いて糖分子の担持体を作成する前に、善玉菌の育成を促進するための糖分子のに最適化した分子設計も可能であり、今後の展開として期待される。

選定を行った。図 3 に示すように、糖分子を処置していない群に比較してグルコースを添加した群では明らかな

謝

辞Staphylococcus epidermidis の増殖促進が観察された。そ本研究は、公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財のため、本研究ではグルコースを PEG-P［Lys（FPBA）］へ団の 2019 年度の研究助成を受けて行ったものである。同と担持させることにした。グルコース分子とボロン酸との財団に心より感謝する。

反応性は広く知られており、すでにグルコースセンサー等への展開が行われている。そのため、FPBA とグルコースとの速やかなエステル形成反応かつ pH 依存的な脱離が期待される。

（引用文献）
1） Y. Nodake, et al., Pilot study on novel skin caremethod by augmentation with Staphylococcus

PEG-P［Lys（FPBA）］とグルコースとの会合体は、pH 8epidermidis, an autologous skin microbe –A blindedに比較して pH 5 においてグルコース放出能が促進された

randomized clinical trial. J. Dermatol. Sci., 79, 119-126（図 4）。透析開始後 5 時間において、pH 5 では約 30 % 多（2015）．

くのグルコースが pH 8 の系に比較して放出されており、

2） K. Knop, et al., Poly（ethylene glycol）in Drug Delivery:

弱酸性 pH でのグルコース放出の促進が確認された。これ

Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angew.

に関し、放出は数十分〜数時間をかけて徐々に進行したとChem. Int. Ed., 49, 6288-6308（2010）．

推察される。実際に使用する際、数秒の時間単位でのグル

3） G. Springsteen, et al., A detailed examination of

コース放出は扱いづらいと予想されるが、比較的緩やかなboronic acid-diol complexation. Tetrahedron, 58, 5291-

グルコース放出は容易なハンドリングへ繋がると期待される。

5300（2002）．
4） K . M i y a t a , e t a l . , R a t i o n a l d e s i g n o f s m a r t

最後に、開発したPEG-P［Lys（FPBA）］とグルコースとの会

supramolecular assemblies for gene delivery: chemical

合体を用いて、善玉菌であるStaphylococcus epidermidis のchallenges in the creation of artificial viruses, Chem.

増殖を評価した。本研究の仮説通り、pH 5 にてPEG-P［LysSoc. Rev., 41, 2562-2574（2012）．

（FPBA）］とグルコースとの会合体を添加した群において最も

5） T. Iwase, et al., Staphylococcus epidermidis Esp

Staphylococcus epidermidis の増殖が促進された。このこ

inhibits Staphylococcus aureus biofilm formation andとから、弱酸性条件下でグルコース放出を促進させる高分

nasal colonization, Nature., 465, 346-349（2010）．

子を添加することで、善玉菌環境選択的なフローラ育成を− 144 −