「植物病原微生物の分類・同定支援システム」ご利用の手引き

細菌ver. 202109「植物病原微生物の分類・同定支援システム」では、DNA データを検索ボックスに貼ることで、NAROジーンバンクに登録保存されている（DNA データを公開している）微生物株との相同性を検索できます。登録保存株の分類学的所属については可能な範囲で検証を行い、妥当と思われる分類体系に沿って表示学名の更新を行っており、主にその印付け(✓マーク)をした学名と対比することで、微生物株の同定の参考となることを期待します。
以下に、ご利用について示します。個々の事情に応じて適宜、工夫が必要になる場合があります。また、ご利用の前に、免責事項をご一読下さい。
DDBJ/EMBL/Genbank での BLAST 検索の農業生物資源ジーンバンク版とお考え下さい。そちらも参考になります。

①被検菌の属レベルの所属が推定できている場合は④から、推定できない場合は②から開始する。
②「指標遺伝子とプライマー（下表参照）」において、「共通」欄に示された16S rRNA遺伝子用のプライマーを用いて被検菌の配列を決定し、本システムのデフォルト条件下でBLAST検索を実行。
③検索結果をもとに、被検菌の属レベルの所属を推定する。あるいは、検索結果を全選択した上で系統樹を作成し、その結果をもとに被検菌の属（〜種）レベルの所属を推定する。
> この段階で目的が達成できた場合はここで終了。
> さらに下位の分類階級についても検討したい場合や同定の精度を上げたい場合は、④へ。
④「指標遺伝子とプライマー」の、「③の段階で推定された属」の欄に示されたプライマーを用い、指標遺伝子の配列を決定した上で、本システムのデフォルト条件下でBLAST検索を実行。
⑤検索結果を全選択した上で系統樹を作成し、その結果をもとに被検菌の種（〜亜種）レベルの所属を推定する。
分類学的な位置づけを検証した菌株について、表示学名に以下の記号を付しています：
V： 分類検証済み

A： 推奨菌株

T： 基準株pT： パソタイプ

BLAST検索を行う際、「分類検証済み」欄の「限定する」にチェックを入れ、検索対象を「分類検証済みの菌株」に限定することが可能です。この方が判定しやすい場合もあります。

指標遺伝子とプライマー a)
分類群

共 通Acidovorax
Burkholderia,
Robbsia,
Trinickia
Pseudomonas

Ralstonia

指標遺伝子

16SF3
16S rRNA 16SR3
遺伝子
16SF4
16SR2
gltA-F
gltA
gltA-R
pilT-FpilT
pilT-R
recA

rpoD

egl

atpD
植物病原性
Rhizobium（Agrobacterium ） recA
glnA
Xanthomonas
Dickeya,Enterobacter,
Erwinia,
Pantoea,
Pectobacterium

プライマー名b)

gyrB

gyrB

各指標遺伝子を増幅・配列決定するために用いたプライマー
アニーリング 増幅産物
配列 （5'>3'）
備考
用途d)
温度 c)のサイズ
CTCAACTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
増幅・配列決定54 ℃
1500 bp 強 配列決定にも使用するCCAGCCGCAGGTTCYCCTACGGCTACCTTG
増幅・配列決定ACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG
配列決定
16SF3/16SR3の産物と組み合わせて使用する——
CCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTC
配列決定
GAAGTCCACGTTCGGGTAGA
増幅・配列決定55 ℃
489 bp
TACATGTACCCGCAGAACCA
増幅・配列決定GAGTACATCTGCGCCACCTT
増幅・配列決定
本属の解析は、pilT を用いるのが望ましい
60 ℃
404 bpGAATACGGGCACATCCTGAC
増幅・配列決定

SpilkerF

AGGACGATTCATGGAAGAWAGC

増幅・配列決定

SpilkerR

GACGCACYGAYGMRTAGAACTT

増幅・配列決定PsrpoDFNP1
PsrpoDnprpcr1
PsEG30F
PsEG790R
eglF1eglR3
atpD352F
atpD871R
atpD273F
atpD782R
41F
640R
144F
900R
XgyrB1F
XgyrB1R
gyrB 01-F
gyrB 02-R
gyrB 07-F
gyrB 08-R
UP-1
UP-2r

TGAAGGCGARATCGAAATCGCCAA
増幅・配列決定YGCMGWCAGCTTYTGCTGGCA
増幅・配列決定ATYGAAATCGCCAARCG
増幅・配列決定CGGTTGATKTCCTTGA
増幅・配列決定CGACGATGCATGCCGCTGGT
増幅・配列決定GTGCCGTACCAGTTCTGGTT
増幅・配列決定GGCCGCATCATSAACGTCATC
増幅・配列決定
AGAGCCGACACTTCMGARCC
増幅・配列決定SCTGGGSCGYATYMTGAACGT
増幅・配列決定GCCGACACTTCMGAACCNGCCTG
増幅・配列決定TTCGGCAAGGGMTCGRTSATG
増幅・配列決定
ACATSACRCCGATCTTCATGC
増幅・配列決定GTCATGTTCGACGGCTCCT
増幅・配列決定CCTTGGCATGCTTGATGAT
増幅・配列決定ACGAGTACAACCCGGACAA
増幅・配列決定CCCATCARGGTGCTGAAGAT
増幅・配列決定
TAARTTYGAYGAYAACTCYTAYAAAGT増幅
CMCCYTCCACCARGTAMAGTT増幅
GTVCGTTTCTGGCCVAG
配列決定
CTTTACGRCGKGTCATWTCAC
配列決定
GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA
増幅
AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT 増幅a) ここに示したプライマーを用いて決定した各指標遺伝子の配列データが、ジーンバンクの遺伝資源データベースに格納されている。
b) 1つの指標遺伝子に対して2組以上の増幅用プライマーセットが示されている場合は、菌株・系統によってプライマーセットの使い分けが必要である。
c) ここに示した値はあくまでも目安であり、実験条件に応じて再調整が必要な場合がある。
d) 標的領域に挿入・欠失が存在するために、ここに示したサイズとは異なる産物が得られる場合もある。
e) 各文献の詳細は次ページの文献リストに示した。

文献e)

澤田ら （2011）

Feng et al. (2009)
Feng et al. (2009)

55 ℃

704 bp60 ℃

703 bp菌種によって、プライマーセットを使い分ける必要がある

Parkinson et al. (2011)

56 ℃

742 bp菌種によって、プライマーセットを使い分ける必要がある

Mulet et al. (2010)

69 ℃

884〜
890 bp60 ℃

539 bp

菌種・菌株によって、プライマーセットを使い分ける必要がある

58 ℃

540 bp

菌種・菌株によって、プライマーセットを使い分ける必要がある

58 ℃

550 bpVinuesa et al. (2005)60 ℃

778 bpAujoulat et al. (2011)

60 ℃

904 bpYoung et al. (2008)

51 ℃

971 bp——Spilker et al. (2009)

澤田ら （2019a, 2019b）
Martens et al. (2008）
Merabet et al. (2010)
Vinuesa et al. (2005)

増幅のみに使用する
Brady et al. (2008)

55 ℃

gyrB 01-F/gyrB 02-Rの産物と組み合わせて使用する菌種･菌株により、このプライマーで増幅後、Yamamoto and

約 1200 bp gyrB 07-F/gyrB 08-Rで配列決定する必要がある Harayama (1995)

文献
1. Aujoulat et al. (2011). Multilocus sequence-based analysis delineates a clonal population of Agrobacterium (Rhizobium )radiobacter (Agrobacterium tumefaciens ) of human origin. J. Bacteriol. 193: 2608-2618.
2. Brady et al. (2008). Phylogeny and identification of Pantoea species associated with plants, humans and the naturalenvironment based on multilocus sequence analysis (MLSA). Syst. Appl. Microbiol. 31: 447-460.
3. Feng et al. (2009). Multilocus sequence typing reveals two evolutionary lineages of Acidovorax avenae subsp. citrulli.
Phytopathology 99: 913-920.
4. Martens et al. (2008). Advantages of multilocus sequence analysis for taxonomic studies: a case study using 10 housekeeping
genes in the genus Ensifer (including former Sinorhizobium ). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 200-214.
5. Merabet et al. (2010). Multilocus sequence analysis of root nodule isolates from Lotus arabicus (Senegal), Lotus creticus ,Argyrolobium uniflorum and Medicago sativa (Tunisia) and description of Ensifer numidicus sp. nov. and Ensifer
garamanticus sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60: 664-674.
6. Mulet et al. (2010). DNA sequence-based analysis of the Pseudomonas species. Environ. Microbiol. 12: 1513-1530.
7. Parkinson et al. (2011). Rapid phylogenetic identification of members of the Pseudomonas syringae species complex using therpoD locus. Plant Pathol. 60: 338-344.
8. 澤田宏之ら(2011). Xanthomonas arboricola によるブドウ斑点細菌病（新称）. 日植病報 77: 7-22.
9. 澤田宏之ら(2019a). 青枯病菌のegl 遺伝子用PCRプライマーの設計とジーンバンクにおけるその配列整備. 日植病報 85: 46.
10. 澤田宏之ら(2019b). 農業生物資源ジーンバンクにおけるRalstonia 属細菌の学名の見直し. 植物防疫 73: 167-174.
11. Spilker et al. (2009). Expanded multilocus sequence typing for Burkholderia species. J. Clin. Microbiol. 47: 2607-2610.
12. Vinuesa et al. (2005). Population genetics and phylogenetic inference in bacterial molecular systematics: the roles of migration
and recombination in Bradyrhizobium species cohesion and delineation. Mol. Phylogenet. Evol. 34: 29-54.
13. Yamamoto, S. and Harayama, S. (1995). PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers andtheir application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains. Appl. Environ. Microbiol. 61: 11041109.
14. Young et al. (2008). A multilocus sequence analysis of the genus Xanthomonas. Syst. Appl. Microbiol. 31: 366-377.