骨髄由来表皮細胞の分化ならびに遊走機序の解明

北海道大学大学院医学研究科皮膚科

阿 部理一郎Recent studies have suggested that bone marrow (BM) cells transdifferentiate to regenerate a variety of cellularlineages. Due to the relatively small population of BM-derived cells in each organ, it is still controversial whether
these BM-derived cells are really present in sufficient numbers, for effective function. Conversely, it is speculated
that chemokine/chemokine receptor interactions mediate this migration of the tissue specific precursor cells fromBM into the target tissue.
Here we show that cutaneous T-cell attracting chemokine (CTACK) /CCL27 is the major regulator involvedin the migration of keratinocyte precursor cells from BM into skin. By screening various chemokine expression
patterns, we demonstrated that CTACK is constitutively expressed in normal skin and upregulated in wounds andthat approximately 20% of CD34+ BM cells expressed CCR10 the ligand for CTACK.
These results provide direct evidence that recruitment of BM keratinocyte precursor cells to the skin isregulated by specific chemokine/chemokine receptor interactions, which makes possible the development of newregenerative therapeutic strategies.

１．緒造を形成し、かつ適切な部位に留まらなければならないこ言とである。よって、骨髄移植で、標的の臓器（皮膚）に骨これまで再生医学領域の研究により、種々の体細胞成分が骨髄幹細胞から分化可能であることが明らかとなった。

髄由来表皮細胞が遊走し、かつ欠損タンパクを産生し、機能的に働くかは全く不明である。

骨髄幹細胞から表皮細胞への分化の可能性も示唆されてい

また、組織幹細胞を用いた再生医療は、胚性幹細胞（ESるが、なお確定はえられていない。一方先天的酵素欠損症細胞）と比較し、倫理的にも ES 細胞が胎児由来であるの（Hunter 症候群など）は同種骨髄移植によりドナー由来細に対し、骨髄幹細胞は本人由来である。加えて採取が格段胞から欠損酵素を供給する治療が試みられ臨床的にも有用に容易という画期的利点があり、臨床適応が切望されていであることが証明されている。しかしながら同種骨髄移植る。しかしながら、現在骨髄幹細胞を用いた再生医療へのを用いた、構造タンパク欠損症に対する治療法の研究はな

応用の実現化において、乗り越えるべき大きな課題がある。

されていない。

これまでの検討で、各臓器において骨髄幹細胞由来の分化構造タンパク欠損症である表皮水疱症に対する根本的治した臓器細胞が存在することは確認できているが、その頻療法は、主に病因である欠損タンパクを遺伝子導入するこ度は非常に低く、生物学的機能を有しうるか疑問視されてとで産生させる、遺伝子治療が検討されている。しかしないる。一方、特異的細胞遊走はケモカイン、ケモカインレ

がら現在遺伝子治療に関しては技術的問題、安全性の問題セプターの相互作用により起こることが知られており、他などで、一般的な臨床応用までにはなお時間がかかると予臓器細胞に分化する骨髄幹細胞においても同様の機序が予想される。先天的酵素欠損症（Hunter 症候群など）は同想される。我々は遊走能の観点から、すでに骨髄由来線維種骨髄移植によりドナー由来細胞から欠損酵素を供給する芽細胞の創傷部位への遊走はケモカイン（SLC）ケモカイ治療が試みられ臨床的にも有用である。しかしながら同種ンレセプター（CCR7）interaction により起こることを明

骨髄移植を用いた、構造タンパク欠損症に対する治療法のらかにしている。以上から、ケモカイン、ケモカインレセ研究は皆無である。

プターの相互作用を用いることで、骨髄由来の表皮細胞の一方、構造タンパク欠損症と先天的酵素欠損症の相違は、頻度を増加させることができ、より生物学的機能を発揮さ産生させるタンパクが産生されるのみならず、機能的な構せうる可能性があると考えられる 。

１）

本研究課題において、創傷部皮膚において発現されるケTransdifferentiation and migration ofbone marrow-derived kerationcytes

モカインの同定、および骨髄細胞中のケモカインレセプター発現細胞の検索を行った。

Riichiro Abe
Department of Dermatology, Hokkaido
University Graduate School of Medicine

２．実
２．１

験

骨髄細胞からの表皮細胞への分化の同定

正常マウスに対し、GFP トランスジェニックマウス（全− 49 −コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

身の細胞が GFP 産生し緑色に蛍光を発する）から骨髄移14 もともに陽性であったため、骨髄由来表皮細胞を確認植を行う。骨髄由来細胞が置換された移植マウス（レシピできた（Fig. 1A）。またこの細胞は血球マーカーであるエントマウス）に皮膚創傷を作成し経時的に創傷部皮膚をCD45 やランゲルハンス細胞のマーカーである CD11c は採取し、レシピエントマウスにおいてドナー骨髄幹細胞由陰性であった。加えてこの細胞の多くは基底層に存在し、来表皮細胞が分化しているか確認する。

毛包のバルジ領域に存在するものほとんど認めなかった。
創傷部の全表皮細胞中における骨髄由来表皮細胞の割合

２．２ 骨髄細胞由来表皮細胞の表皮への効率的遊走機序の検討

は 0.025％ ±0.009％であり、基底細胞中の割合は 0.1% 程度であった。

効率的な骨髄幹細胞の皮膚への遊走を促すため、骨髄移植の際のドナー、レシピエントの条件の検討を行う。あわせて、皮膚発現のケモカイン中で特異的に骨髄由来表皮細３．２ 骨髄細胞由来表皮細胞の表皮への効率的遊走機序の検討

胞の表皮への遊走を促進するケモカイン、またその候補ケ再生の場である皮膚創傷における骨髄由来表皮細胞の集モカインに対するケモカインレセピターの骨髄幹細胞にお積は、再生現象が生じている時期にのみ特異的に起こるとける発現を検討する。具体的には、皮膚再生が強力に誘導予想される。よって皮膚創傷部には組織特異的なケモカイされる創傷部において、骨髄由来表皮細胞の表皮遊走誘導ンが発現し、それに対するケモカインレセプターを持つ骨ケモカインの発現が亢進すると予想されるので、創傷部位髄由来表皮細胞が遊走してくると思われる。

におけるケモカイン発現を検討する。次に候補となるケモ

最 初 に 創 傷 部 に お け る ケ モ カ イ ン の 発 現 を RT-PCR、カインを用い、in vitro における骨髄幹細胞遊走能の検討、Western blot、免疫染色で検討したところに示すようにin vivo における骨髄由来表皮細胞誘導能の検討を行い、SDF-1α、SLC、CTACK の発現が特異的にみられた（Fig. 1）。

骨髄由来表皮細胞特異的ケモカインを同定する。

３．結３．
１

次にこれらのケモカインに対するケモカインレセプ
ターの発現を、骨髄幹細胞（CD34 陽性細胞）において

果FACS を用いて検討を行った。それぞれのケモカインに対ドナー骨髄幹細胞由来表皮細胞の分化するレセプターの発現を確認できた（SDF-1α：CXCR4、GFP トランスジェニックマウス骨髄を移植した正常マ

SLC:CCR7、CTACK:CCR10）（Fig. 2A）。

ウスを解析した。表皮のなかに GFP 陽性の骨髄由来細胞

さらにこのレセプターが機能的に発現しているか、inがあり、この細胞は表皮細胞のマーカーであるケラチン

vitro migration assay を用いて検討した。それぞれのケモFIGURE 1
Bone marrow (BM) derived keratinocytes (BMDK) wereidentified and CTACK was expressed in wounded skin.
(A) Engrafted BMDK in wounded skin expressed both GFP,
as a marker of bone marrow origin (green), and keratin14,
as a marker of basal keratinocyte (red), (arrows) (e:epidermis, d: dermis).
(B-D) Normal (N) or wounded (W) skin tissue samples werecollected and analyzed for chemokine expression as shownin Table 1. The expressions of SDF-1α, SLC and CTACK
were detected by RT-PCR (B) and Western blot analysis (C)in normal skin and also in skin 24 hours after wounding.
These experiments of RT-PCR and Western blot analyses
were performed in triplicate. Immunofluorescence staining
in the wound edge 3 days after wounding, particularly
CTACK expression was upregulated (green) (D). SDF-1αand SLC were weakly expressed (data not shown). Nuclei
were counterstained with propidium iodide (red) (e:epidermis, d: dermis).

− 50 −

骨髄由来表皮細胞の分化ならびに遊走機序の解明

カインによって、ある程度の CD34 陽性の骨髄幹細胞は遊走を特異的に誘導することが明らかになった。
さらに、二つの系を用いて骨髄幹細胞を増加させたとこ走することが示された（Fig. 2B, C）。

ろ（G-CSF 投与、または CD34 陽性細胞静注）、骨髄由来

３．３ 創傷皮膚における特異的骨髄由来表皮細胞の遊走能表皮細胞の数は有意に増加したが、同時に CTACK を投与するとさらに増加した（Fig. 3A）。

次に創傷皮膚において特異的骨髄由来表皮細胞についてり 検 討 し た。SDF-1α、SLC、CTACK そ れ ぞ れ 投 与 し、３．４ CTACK は骨髄由来表皮細胞を増加させることにより創傷治癒を促進させる

治癒した表皮における骨髄由来表皮細胞数をカウントした

CTACK による骨髄由来表皮細胞増加の創傷治癒に対するところ、CTACK のみが有意に増加させた（Fig. 3A）。ま影響に関して検討を行った。創傷辺縁に CTACK を局所た中和抗体局所投与により有意に減少した（Fig. 3B）。以投与すると、有意に創傷治癒が促進された（Fig. 4A,B）。

上から CTACK が生体内において骨髄由来表皮細胞の遊また CTACK 投与により血管新生は促進されず（Fig. 4C）、それぞれのケモカインを創傷辺縁に局所投与することによFIGURE 2
CCR10, a receptor for CTACK, was expressed in CD34+ BM cells and these CD34+ BM cells migrated in response toCTACK in vitro.
(A) CXCR4, a receptor for SDF-1
α, CCR7, a receptor for SLC, and CCR10 expression on CD34+ BM cells wereanalyzed by flow cytometry. The staining with a specific antibody for each chemokine receptor (solid line) and thebackground staining with the non-specific Ig antibody (negative isotype matched control; shaded profile) by the gatedCD34-positive population. CD34+ BM cells expressed CXCR4 (97.4%), CCR7 (12.9%), and CCR10 (19.1%).
(B, C) Chemotaxis assays were undertaken in vitro. Isolated CD34+ BM cells purified by FACS were added to the upper
well of a 3-μm pore Transwell. Recombinant SLC, SDF-1α or CTACK was added to the upper and/or lower plate. CD34+
BM cell migration rates increased in response to media containing recombinant SLC, SDF-1α or CTACK (100ng/ml) (*P< 0.05, **P < 0.001) versus media alone (n=4) (B). CTACK (0-500ng/ml) induced CD34+ BM cell migration was in dosedependent manner (n=4) (*P < 0.05) (C). SDF-1
α and SLC were also induced it in dose-dependent manner (data notshown).

− 51 −

コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

FIGURE 3
CTACK specifically accumulated BMDK in wounded skin.
(A) The number of BMDK was quantified as a percentage of the total number of keratinocytes in wounded skin from
untreated mice or those treated with G-CSF for cytokine mobilization or those that received CD34+ BM cells adoptivetransfer. SLC, SDF-1α or CTACK (1μg in 30μl) were intradermally injected into the periphery of wounded skin (5 mice ineach group). CTACK significantly accumulated large numbers of BMDK as compared with SLC, SDF-1α and PBS (**P <0.01). Furthermore, the number of BMDK increased in mice treated with G-CSF for cytokine mobilization or those thatreceived CD34+ BM cells adoptive transfer (***P < 0.005).
(B) CTACK neutralizing antibody (0-16μg in 120μl) was injected to the periphery of wounded skin. The numbers of BMDK
were decreased by CTACK neutralizing antibody in dose-dependent manner (5 mice) (*P < 0.05, ***P < 0.005).

FIGURE 4
Increased BMDK by CTACK accelerated wound closure without angiogenesis or keratinocyte proliferation.
(A, B) Wound size was measured at 10 days after wounding and subsequent CTACK treatment (total 3μg in 100μl) or PBS (100μl), as control (6 mice in each group). Full-thickness cutaneous wounds were made and subsequently monitored daily.
Intradermal injection of CTACK significantly accelerated wound closure (*P < 0.05) (A). Representative photographs of PBS, ascontrol (mouse 1-3), or CTACK (mouse 4-6) treated wound appearance at 10 days after wounding (B).
(C) The numbers of capillaries in the dermis treated by CTACK (1μg in 30μl) or PBS (30μl) as control vehicle at 3 days after
wounding were quantified. There was no statistical difference between CTACK and control (2 sections at each 5 mice).
(D) Keratinocytes were cultured with or without CTACK (0-100ng/ml) for 72h and viable cells were determined by proliferation
assay. There was no statistical difference in proliferation of keratinocytes between the two treatment groups (9 mice).

− 52 −

骨髄由来表皮細胞の分化ならびに遊走機序の解明

CTACK は表皮細胞の増殖を促進しないことからも（Fig.

また最近我々は間葉系幹細胞（MSC）も同様に、特異4D）、CTACK の創傷治癒促進効果は主に骨髄由来表皮細的ケモカイン、ケモカインレセプターにより創傷皮膚に遊胞誘導により惹起された。

走することを見出した 。幹細胞を用いる再生医療におい４．考２）てケモカイン、ケモカインレセプターを用いた治療の可能察性が開かれたと期待する。

本研究課題により、骨髄由来表皮細胞の皮膚遊走機序の詳細が解明された。特定された特異的骨髄由来表皮細胞遊（引用文献）

走因子：CTACK を用いた新たな再生医療の可能性がある

１）Inokuma D, Abe R, FujitaY, et al.: CTACK/CCL27と考える。またこの本研究の手法および成果は、多の組織

accelerates skin regeneration via accumulation of

細胞においても応用可能なものであり、本研究成果がブレ

bone marrow derived-keratinocytes. Stem Cells 24.

ークスルーとなり、他臓器についても解明されると予想さ2810-2816, 2006.

れる。さらに構造タンパク欠損を同種骨髄移植で補えるこ２）Sasaki M, Abe R, Fujita Y, et al.: Mesenchymal stemとが示されれば、根本治療の全くない重症表皮水疱症へのcells are recruited into wounded skin and contribute to

画期的治療に結びつくと思われる。あわせて、他臓器の多wound repair by transdifferentiation into multiple skin

種の構造タンパク欠損症に対しても治癒の可能性を示すとcell type. J Immunol 180, 2581-2587, 2008.

考える。

− 53 −