ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発
北海道大学大学院薬学研究院

山田勇磨

Mitochondria, which have a variety of functions, are attracting the interest of scientists, since they are organelles thatcan contribute to the realization of innovative disease treatments, the maintenance of beauty and health, and development in
the life sciences. To date, data related to commercially available cosmetic products that deliver functional molecules to mitochondria to exert cosmetic effects have not been reported. The aim of this study is to develop a nanocapsule-type functional
cosmetic product that targets mitochondria. To accomplish this, we propose to use a nanocapsule (MITO-Porter) to deliver
molecules to mitochondria in human skin cells. The proposal includes "Construction of drug-encapsulated nanocapsules","Verification of cellular uptake and mitochondrial delivery of the nanocapusule" and " Functional evaluation of mitochondria”.

1．緒価 ）」 の 順 に 研 究 を 進 め た。 本 報 告 書 で は、 特 に、「1 .

言CoQ 10 -MITO-Porter の構築」および「2 . 培養細胞を用いた多彩な機能を有するミトコンドリアは、革新的疾患治療細胞内動態観察」について詳細を報告する。の実現、美容・健康の維持、ライフサイエンスの発展に寄２．方与するオルガネラとして注目されている。本オルガネラは、法

抗酸化効果およびアンチエージング効果に深く関連する、

2. 1. CoQ10 -MITO-Porterの調製

活性酸素シグナル調節、エネルギー（ATP）産生を担うた

２．
１．
１.

め、化粧品のターゲットとしても注目される。現在までにマイクロ流体デバイスを利用したナノカプセル調製の検討

市販されている化粧品において、細胞内部のオルガネラに本研究では、ATP 酸性の補酵素であり抗酸化能を有す機能性分子を送達・作用させ、美容効果を発揮させた商品

る CoQ 10 を MITO-Porter 1）に内封した CoQ 10 -MITO-Porterの報告例は皆無である。の調製を行った。MITO-Porter は北海道大学・大学院薬本研究では、皮膚細胞のミトコンドリアに作用して細胞学研究院・薬剤分子設計学研究室（以下、当研究室と略す）の ATP 産生能・代謝能を亢進させるアンチエージング効で開発したミトコンドリア標的型ナノカプセルであり、ミ果の獲得、ミトコンドリアで産生される余剰活性酸素を除トコンドリア膜融合を有する脂質二重膜小胞（リポソーム）去し抗酸化能の獲得を可能とする『ミトコンドリアを標的からなる（Fig. 1）。MITO-Porterを用いた戦略では、ミトとするナノカプセル型機能性化粧品』の開発を目指す。ミコンドリア膜との膜融合を介して内封分子を放出させるため、トコンドリアの分子送達に関しては、ミトコンドリア標的送達分子の種類やサイズによらない送達が可能となる 2 - 4）。

型ナノカプセル・MITO-Porter 1 - 3）を基盤カプセルとし、当研究室では、CoQ 10 -MITO-Porter の構築を種々の調

ヒト由来皮膚細胞のミトコンドリア内部に機能性分子を送製法を用いて検討を進めていた。単純水和法、逆相蒸発法、達する戦略を試みる。送達分子候補としては、ATP 酸性エタノール希釈法を用いた検討において、エタノール希釈の補酵素であり抗酸化能を有するコエンザイム Q 10（CoQ 10）法（以下、従来法）を用いた際に、CoQ 10 の搭載率が高いなどを用いる。

CoQ 10 -MITO-Porterを構築できることを報告していた 5）。

本申請研究では、「薬剤封入ナノカプセルの構築（1 .
CoQ 10 -MITO-Porter の構築）」、
「細胞導入、ミトコンドリアへの分子送達の検証（2 . 培養細胞を用いた細胞内動態観察）」、および「機能評価（3 . ミトコンドリアの機能評

Development of na nocapsu le -t y pefunctiona l cosmetics for ta rgeting
mitochondria
Yuma Yamada
Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Hokkaido University

Fig. 1− 181 −

Mitochondrial delivery using a MITO-Porter systemコスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

一方で、CoQ 10 の難水溶性により、リポソーム調製の効率終工程として、iLiNP で調製した CoQ 10 -MITO-Porter 溶を低下させ、粒子径が不均一であり、1 回の調製に得られ液は、透析（2 時間、4 ℃）を行い含有するエタノールを除る収量が微量であることなどが問題であった。

去した。粒子物性の測定方法については次項に記載する。

本申請研究では、実用化を見据え、均一性の高いナノ粒２．１．２.

CoQ10 -MITO-Porter の物性評価および 保存子を無菌的に大量調製が可能なマイクロ流体デバイスを利安定性の検証用した粒子調製を試みた。具体的には、共同研究者である

前項に記載の方法で、CoQ 10 を含有した CoQ 10 -MITO-

北海道大学・大学院工学研究院・渡慶次学教授、真栄城正Porter を調製し、粒子径、PdI（均一性の指標であり、値寿助教が開発したマイクロ流体デバイス（invasive lipidが小さい方が均一性が高い）、ゼータ電位（表面電位）を測

nanoparticle production（iLiNP）device）を用いて、エタ定し、構築した粒子物性の最適化を図った。粒子径およびノール希釈法の原理を利用した CoQ 10 -MITO-Porter の構

PdI は動的光散乱法を、ゼータ電位は電気泳動法を利用し6）築を検討した 。エタノール希釈法では、脂質のエタノーた原理に基づき、Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments

ル溶液に水系緩衝液を加え脂質の溶解度を下げることで脂Ltd., Malvern, WR, UK）を用いて測定した。

質の自己集合化を促し脂質を粒子化する。iLiNP によってまた、調製した粒子の安定性を評価するために、4 ℃お脂質懸濁液（CoQ 10 を含む）と緩衝液を急速に混合・攪拌す

よび 25 ℃、遮光下にて 14 日間保管し、経時的に物性を評ることで均一な粒子調製、連続調製を可能とする（Fig. 2）。

価した。

iLiNP を用いた脂質粒子調製では、①脂質相の組成、②水相の種類、③総流速、④流速比（水相 / 脂質相の流速の2. 2. 培養細胞を用いた細胞内動態観察

比率 =EtOH 希釈濃度に相当）を変化させることにより多彩

マ イ ク ロ 流 体 デ バ イ ス で を 用 い て 調 製 し た CoQ 10 -な粒子設計が可能となる。①脂質相の組成には、MITO-MITO-Porter［µ］および従来法で調製した CoQ 10 -MITO-Porter を 構 成 す る ナ ノ カ プ セ ル 材 料［1 , 2 -Dioleoyl-sn-Porter［ED］の細胞内動態を観察した。ヒト由来皮膚細胞

glycero- 3 -phosphoethanolamine（DOPE）/ sphingomyelinを含む培養細胞で検討を行ったが、特許出願準備中のため、（SM）/ 1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol, methoxy polyethylene

ここではヒト子宮頸がん由来細胞（HeLa 細胞）を用いた研

glycol 2 0 0 0 （DMG-PEG 2 0 0 0）/ Stearylated R 8

究成果を紹介する。

（STR-R 8）］および CoQ 10 を含有するエタノール懸濁液を

２．２．
１.

細胞取り込み能評価準備した。②水相には、
phosphate buffered saline（PBS）（‒）

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］および従来法で調製した CoQ 10 -およびHEPES glucose を用いて検討を進めた。③総流速はMITO-Porter［ED］の細胞導入能を評価するために、蛍光標

500 µL/min に固定し、④流速比は、EtOH 希釈濃度が 10 %、識（DOPE-N-（7 -nitro- 2 - 1 , 3 -benzoxadiazole- 4 -yl）

20 %、30 %、40 ％となるように設定して検討を進めた。最（NBD-DOPE）を脂質量の 0 . 5 mol% 含有）を施した。粒子をFig. 2 Schematic image showing the preparation of the CoQ 10 -MITO-Porter by ethanoldilution（A）and by using microfluidic device named iLiNP device（B）．

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ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発

HeLa 細胞に添加し、１時間インキュベーションした（37 ℃ , 5 %を評価するために、ミトコンドリア酸素消費量（OCR）を

CO 2）。細胞に取り込まれた粒子の蛍光量をフローサイトメ

Agilent Seahorse XFp extracellular flux analyzer

リー（FACS）（Gallious; Beckman Coulter Inc., Pasadena, MA,（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いてUSA）を用いて平均蛍光強度を測定し、細胞取り込み能を評価した。ミトコンドリア機能の指標として基礎呼吸能評価した。

（mitochondrial basal respiration）お よ び 最 大 呼 吸 能

２．
２．２.

細胞内局在観察（Maximal respiration）を計測した。本評価の詳細な方法

上記に従い調製した蛍光標識粒子（緑色）を HeLa 細胞添は既報を参考にして頂きたい 7）。

加し、インキュベーションした（37 ℃ , 5 % CO 2）。赤色の３．結果・考察

ミトコンドリア染色試薬 Mito Tracker Deep Red（ThermoFisher Scientific）でミトコンドリアを染色した後、粒子添

3. 1. CoQ10 -MITO-Porterの調製

加より 3 時間後の細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡

３．
１．
１

マイクロ流体デバイスを利用したナノカプセル調（CLSM）を用いて観察した。緑色の粒子が赤色に染色した製の検討

ミトコンドリアに局在した場合には、黄色のシグナルとしiLiNP を用いた CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の調製において、て観察される。また、画像解析を行い、下記の式 1 に従い、①脂質相の組成、②水相の種類、③総流速、④流速比（水ミトコンドリア占有率を算出した。

相 / 脂質相の流速の比率 = EtOH 希釈濃度に相当）の条件をミ
トコンドリア占有率（%）
１細胞中の黄色領域（共局在）の面積平均×100＝１細胞中の赤色領域（染色したミトコンドリア）の面積平均検討した。Fig. 3 に検討結果を示す 6）。本検討では、①脂質 相 に は MITO-Porter を 構 成 す る ナ ノ カ プ セ ル 材 料…式１

2. 3. ミトコンドリアの機能評価［DOPE/SM/DMG-PEG/STR-R 8］および CoQ 10 を含有するエタノール懸濁液を充填し、③総流速は 500 µL/min に固定して検討を進めた。

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］添加時のミトコンドリア機能④流速比は、エタノール希釈濃度が 10 %、20 %、30 %、Fig. 3 Effect of ethanol dilution concentration on the physicochemical properties of the CoQ 10 -MITO-Porter［μ］. Particle size and PDI of the CoQ 10 -MITO-Porter［μ］prepared in PBS（-）（A）and HEPES glucose（B）
are shown.

− 183 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

Fig. 4 Comparison of physicochemical properties between the CoQ 10 -MITO-Porter［ED］and the CoQ 10 MITO-Porter［μ］． The particle size（A）, dispersibility（B）and ζ-potential（C）are shown.

40 ％となるように検討を進めた。②水相の種類を PBS（-）とした際の粒子形成後の物性評価結果を Fig. 3 A（a）に、HEPES glucose とした際の結果を Fig. 3 B（a）に提示する。
エタノール希釈濃度の低下に依存して粒子径が小さくなった。水相に PBS（-）を用いた群では、エタノール希釈濃度が 20 ～ 30 % の時、PdI は約 0 . 12 と単分散であったが、エタノール希釈濃度 10 % では他の希釈濃度よりも多分散であった（Fig. 3 A（a））
。一方、水相に HEPES glucose を用いた場合には、PBS（-）群と比較して PdI 値が大きく単分散性は低かった（Fig. 3 B（a））
。
最終工程として、iLiNPで調製したCoQ 10 -MITO-Porter 溶液を透析した際の粒子物性を（Fig. 3 A（b））および（Fig. 3 B（b））に示す。粒子径は両溶媒とも小さくなる傾向を認めた

Fig. 5．
Evaluation of the stability of CoQ 10 -MITO-Porter［μ］

が、PdI については増加が認められた。特に HEPES glucoseを用いた際には、PdI の増加が顕著であった。ここまでの検討より、②水相の種類をPBS（-）
、④流速比を 20％に設定しCoQ 10 -MITO-Porter［µ］を調製することとした。

保存温度であることを確認した（Fig. 5）。
調製量も従来技術では µL オーダーであったが、iLiNPを用いた方法では実験室でも L オーダーでの大量調製が見込める。調製時間も大容量になるほど iLiNP を用いた調製

３．１．２

CoQ10 -MITO-Porter の物性評価および 保 存法の方が、短時間で調製ができる。従って、iLiNP を用い安定性の検証

た CoQ 10 -MITO-Porter［µ］調製は微小化・均一・大量調従来技術を用いて調製した CoQ 10 -MITO-Porter［ED］製を可能にする技術として期待できる。と比較し、
iLiNPを用いた調製したCoQ 10 -MITO-Porter［µ］は、粒子径が小さく（Fig. 4 A）、PdI も小さい傾向にあっ

3. 2. 培養細胞を用いた細胞内動態観察

た（Fig. 4 B）。特に透析後は、均一な精度の高い粒子が調３．２．
１細胞取り込み能評価製できた 6）。iLiNP を用いることにより粒子径は約 50 nm

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］（粒子径 48 nm）および従来法と従来技術より 1 / 2 倍小さな粒子となった（Fig. 4 A）。ゼ

で調製した CoQ 10 -MITO-Porter［ED］（粒子径 96 nm）のータ電位においても約 + 20 mV であり（Fig. 4 C）、ほぼ一定細胞導入能を評価した 6）。その結果、50nm 程度の CoQ 10 -

して正電荷ペプチドである Octaarginine（R 8）を修飾できMITO-Porter［µ］の細胞取り込みを評価した結果、従来型たと考えられる。

MITO-Porter（100 nm 程度）と比較して有意に高い細胞取調製した CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の安定性を評価するり込みを確認した（Fig. 6）。

ために、4 ℃および 25 ℃、遮光下にて 14 日間の安定性試

３．
２．
２ 細胞内局在観察験を行った 6）。その結果、25 ℃においては経時的に粒子径CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の細胞内局在を観察した 6）。そが増大した。一方、
4 ℃では粒子径が約 50 nm 付近を維持し、の結果、従来法（CoQ 10 -MITO-Porter［ED］）と比較して細安定な CoQ 10 -MITO-Porter［µ］の保存には 4 ℃が適切な胞内に多くの緑蛍光シグナルが観察され、細胞への導入効− 184 −

ミトコンドリアを標的とするナノカプセル型機能性化粧品の開発率が優れていることを確認した（Fig. 7 A（a）,（c））。さらに、

3. 3. ミトコンドリアの機能評価

緑色の CoQ 10 -MITO-Porter［µ］と赤色に染色したミトコ

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］をヒト由来皮膚細胞に添加し、ンドリアとの共局在を示す黄色シグナルが観察され（Fig.

その後にミトコンドリア機能の指標としてミトコンドリア7 A（b）,（d））
、CoQ 10 -MITO-Porter［µ］がミトコンドリア基礎呼吸能およびミトコンドリア最大呼吸能を計測した。に集積することを確認した。

特許出願準備中のため、詳細は開示できないが、構成を最顕微鏡で取得した画像を解析し、粒子のミトコンドリア適化した CoQ 10 -MITO-Porter［µ］を用いた際には、CoQ

占 有 率 を 算 出 し た 結 果 を Fig. 7 B に 示 す。 そ の 結 果、単独投与では観察されなかったミトコンドリア機能の向上

CoQ 10 -MITO-Porter［µ］は、CoQ 10 -MITO-Porter［ED］とが確認されている。

比べて優位に高いミトコンドリア占有率を示した。

４．総

過去の報告で、理論計算および実験データより、効率的な細胞取り込みに最適な粒子径は 40～60 nm との報告がある。従って、iLiNP で調製した約 50 nm の CoQ 10 -MITOPorter［µ］、効率よく細胞に取り込まれ、ミトコンドリアへ集積量も向上したと推察される。

括

本報告書では、以下の内容を報告した。
（1）マイクロ流路デバイスを利用して微小なCoQ 10 -MITOPorter［µ］を調製することに成功した。
（2）CoQ 10 -MITO-Porter［µ］が高効率に細胞に取り込まれミトコンドリアへ集積することを確認した。
（3）CoQ 10 -MITO-Porter［µ］が細胞のミトコンドリア機能を向上させることを確認した。
市販されている化粧品には、抗酸化効果やアンチエージング効果を宣伝している商品があるが、機能性分子が作用部位である皮膚細胞膜や細胞内部に導入されていることは示されていない。美容効果が得られることは確認されていると思われるが、その能力を最大限には発揮できていないと思われる。さらに、細胞内部のオルガネラに機能性分子を送達・作用させ、美容効果を発揮させた商品の報告例は皆無である。そのため、抗酸化効果およびアンチエージン

Fig. 6 Cellular uptake of the CoQ 10 -MITO-Porter by
HeLa cells.

グ効果に深く関連するミトコンドリアに機能性分子を導入

Fig. 7 Intracellular trafficking of the CoQ 10 -MITO-Porter. Intracellular observation of the CoQ 10 -MITO-Porter using CLSM（A）．
Based on such images, mitochondrial occupancy rate（B）was estimated.

− 185 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

する本研究で開発するナノカプセル型機能性化粧品は、化（引用文献）
1） Y. Yamada et al., Biochimica et biophysica acta, 1778,

粧品分野に新たな市場を創生すると確信している。
現在は、「皮膚組織を用いたナノカプセルの皮膚細胞ミトコンドリアへの分子送達の検証」を進めており、3 D 細胞培養法を用いた新しい評価法を確立中である。今後は、本研究をさらに発展させ、ミトコンドリアを標的とするナノ423-432（2008）．
2） Y. Yamada, H. Harashima, Adv Drug Deliv Rev, 6 0,1439-1462（2008）．
3） Y. Yamada et al., Adv Drug Deliv Rev, 154-155, 187209（2020）．

カプセル型機能性化粧品の基盤技術の確立を目指す。

4） Y. Yamada et al., J Control Release, 3 2 7, 5 3 3-5 4 5
謝辞（2020）．

ここで紹介した研究成果は北海道大学・大学院薬学研究院・薬剤分子設計学研究室【Team Mitochondria】に所属す

5） Y. Yamada et al., Biological & Pharmaceutical
Bulletin, 40, 2183-2190（2017）．

る学生諸氏の日々の努力の賜物であり、学生各位に心より

6） M. Hibino et al., J Pharm Sci, 108, 2668-2676（2019）．

感謝する。また、本研究を遂行するにあたり、公益財団法

7） Y. Yamada et al., Mitochondrion, 55, 134-144（2020）．

人コーセーコスメトロジー研究財団のご支援を頂きました
ことに深く御礼申し上げます。

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