九州大学中央分析センター
vol.35 No.3, 2016
Center of Advanced Instrumental Analysis, Kyushu University

Center News 133
vol.37 No.2, 2018

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137

vol.35
No.3, 2016

センターニュース

九州大学中央分析センター
Center of Advanced Instrumental Analysis, Kyushu University
分析機器解説シリーズ（137）

九州大学中央分析センター

センターニュース

高速 AFM の仕組みと、様々な分子挙動の動画観察 ..................................................................
株式会社 生体分子計測研究所

小谷1

則遠

Center of Advanced Instrumental Analysis, Kyushu University

vol.37 No.2, 2018

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分析機器解説シリーズ（137）

高速 AFM の仕組みと、様々な分子挙動の動画観察

137

センターニュース

株式会社 生体分子計測研究所 小谷則遠

九州大学中央分析センター
1

初めに蛍光顕微鏡は生命科学の分野では広く使用されている。蛍光顕微鏡観察は、溶液中において、動画で挙動が観察できるという「百聞は一見に如かず」とのことわざがあるように、研究開発において、イメージングは強い説得力をもつ重要な実験方法である。
様々なサンプル・実験方法に合わせた、様々な種類の顕微鏡や実長所がある。しかし、蛍光物質を介した間接的な動きを観察しているので、構造が観察できないという弱点がある。また、同様に広く使用されている電子顕微鏡では、ナノスケールで構造が観察で験手法が開発されている。高速原子間力顕微鏡（High-Speed

きるが、真空中のため、反応の過程が観察できないという弱点がAtomic Force Microscope, 高速 AFM. 図1）はナノスケーある。

ルの構造とその経時変化をとらえることができるユニークな顕これに対して、AFMは鋭い探針をもつカンチレバーを用いて、微鏡である。

サンプル表面を走査し、形状を可視化する。このため、大気中、溶液中でも蛍光等の染色なしで、サンプルの構造がナノスケールで直接観察できる。しかしながら、従来型AFMでは、画像取得速度が遅く、1枚の画像を得るために、数分から十数分の時間が必要
で、反応過程や構造変化の様子をとらえることができない。
この点を克服し、動画のAFM観察を実現するため、金沢大学の安藤らは高速 AFMの開発に着手した。様々な技術革新の結果、高速 AFMの開発に成功し［1］、これまでとらえることのできなかった興味深い結果が次々に報告されている［2、3、4］。

2

高速 AFM のしくみ

高速化のために、様々な技術が開発された。主な技術として
図1①高速スキャナ、②微小カンチレバー、③スキャナのアクティ

高速 AFM のヘッド
1

分析機器解説シリーズ（137）ブダンピング、④高速フィードバック等がある。ここでは、高しながら、従来型のカンチレバーでは、共振周波数が低く、動速スキャナと微小カンチレバーについて、解説する。

画に必要な十分な量のデータを得ることができない。
高速化のためには、共振周波数が高いカンチレバーが必要

2-1. 高速スキャナであった。共振周波数が高いカンチレバーのためには、レバー［4、5、6、7］の長さを短くすればよい。しかし、共振周波数とレバーのバ高速走査において発生する振動を抑制することが必要とな

ネ定数は相反するパラメータで、長さを短くすると、カンチレる。振動の抑制のためには重心が動かないこと、AFM ヘッドバーのバネ定数が上がってしまい、壊れやすい生体試料を破本体の共振周波数を高く保つことなどが重要となる。このた壊してしまう恐れがある。このため、高速 AFM 用のカンチレ

め、スキャナの内部に振動を抑制する仕組みが内蔵されていバーは長さだけでなく幅も小さく、厚さも薄くして、低いバネる。走査のための駆動はピエゾによって行われている。スキャ定数を実現した。実際のサンプルに与える力は22 pN ほど

ナには XYZ 方向それぞれに対し、積層型のピエゾが使用されであると考えられている［6］。このようにして動画観察に必要ている。振動を抑制するために、X 方向のピエゾに関して、板な高い共振周波数と、サンプルを壊すことなく観察するためバネで固定し片端にサンプルを、もう片端に同じ重さの重りの、低いバネ定数を両立させてある。

（カウンターバランス）を固定している（図2A）。このような構造で走査が行われると、重心はXピエゾの中心にあり、動かないので振動を抑制することができる。Zピエゾに関して、2つの同じピエゾを逆方向に取り付け、同期させ、同時に反対方向3に動かしている。このようにすることで、Z 方向の重心は2つ

様々なサンプルの観察

高速 AFM は溶液中でミリ秒の過程観察・ナノスケールの構の Z ピエゾの間で動かない（図2B）。このように X、Z 方向の造を直接観察ができることから、生命科学を中心に様々な分振動を抑制して、高速走査においてもナノスケールのイメー野で用いられつつある。DNA（直径2nm）、タンパク（抗体 : 約ジングを実現している。

15nm）、ナノ粒子などから、数μ m のバクテリア、数10μm の真核生物の培養細胞など、多様なサイズのサンプルの観A察例がある。
ここでは、いくつかの特徴的な報告を紹介する。

3-1. IgG 抗体
抗体は体液性免疫で異物の認識を担う重要なタンパク質である。Y 字型の構造をしており、3つの腕のうち2つは抗原（異物）を認識する Fab 領域と1つの Fc 領域をもつ。高速 AFM
で抗体を観察したところ、Y 字型の構造が鮮明に観察された（図3）。詳細に観察したところ、2つの Fab と1つの Fc の構造の違いも識別できた［8］。

B＊

図2 スキャナ内部の防振機構（A: X 方向、B: Z 方向）* で示した重心が静止しているため、振動が発生しにくい
図32-2. 微小カンチレバー

高速 AFM で観察された IgG 抗体

Y 字型構造が鮮明に観察できるだけではなく、Fab 部位とFc 部位の構造の違いも識別できる。

高速 AFM は AC モードを用いて観察を行っている。しか2

分析機器解説シリーズ（137）

3-2. ミオシンⅤ運動過程、挙動観察

3-3. CRISPR/Cas9 反応過程観察

AA

B

B

図4 ミオシンⅤがアクチンフィラメント上を「歩く」様子

図5 A：DNA に結合するCas9分子。Cas9のサブユニットが詳細に観察されている。
B：DNA 切断過程の観察像（連続写真）

A：高速 AFM による観察像
B：模式図 アクチンフィラメントは脂質膜上にストレプトアビジン（粒子状構造）で固定されている。ミオシンⅤはストレプトアビジンを「またいで」歩く様子が観察された。このことより、handover hand modelが正しいと証明された。

遺伝子工学、遺伝子治療等の分野において、標的の遺伝子配列を任意に変えられるゲノム編集の技術が注目されている。
CRISPR/Cas9はゲノム編集に用いられる酵素の1種であ

ミオシンは生体内で運動の原動力となるモータータンパクる。CRISPR/Cas9は任意の配列をもつガイド RNAを組みの1種である。レールのような役割をもつ、ポリマー状のアク込み、そのガイドRNA と相補的なDNA を切断する。切断しチンフィラメント上を運動する。ミオシンは様々なサブクラたい配列のガイドRNA を使用することで、これまでより正確

スが報告されており筋肉の動きはミオシンⅡが主体となってにゲノムを編集することができる。

いる。ミオシンⅤは神経細胞中で細胞内輸送を担っており、2高速 AFM を用いて、Cas9を観察した報告を紹介する［9］。

つの頭部を結合させ、アクチンフィラメントに沿って運動す

ガイド RNA と結合していないときと結合状態の挙動の違る。このとき、2つの頭部を①ヒトが歩くように交互に動かす

い、DNA 上の配列を確認し結合する様子、DNA と結合した“hand over hand model”、②シャクトリムシのように常Cas9の詳細像（図5A）など、この酵素の挙動がステップごに決まった頭部が前側となる“inch worm model”の2つとに観察された。DNA と結合後、Cas9が構造変化をおこし、の仮説があった。蛍光一分子の観察により、①が優勢であっDNA が切断される様子が観察された（図5B）。

たが、蛍光物質では構造変化が観察されない（蛍光分子の光点3-4. フォトレジストの現像過程、燃料電池の触媒の開発のみしか観察されない）。高速 AFMは構造と時系列変化が同時に観察できるので、①の決定的証拠として高い評価を得た

高速 AFM の観察対象は、溶液中で起こる様々なナノス（図4）。また、これまで観察されなかった、ミオシンがアクチケールの反応過程であるなら、生体分子の挙動に限定されなンフィラメント上で「足踏み」のような挙動を示すことが確認い。フォトリソグラフィはシリコンなどの半導体基板上にナされた。

ノスケールの構造を作成する技術である。基板上に光に反応するレジストを塗布し、パターンの描かれたフォトマスクをかけて露光を行う。現像液に浸すと露光された部分が除去される（ポジ型の場合）。
高速 AFMを用いることにより、これまで観察できなかったレジストの現像過程の観察に成功した。フォトリソグラフィ
はより微細な構造、高い精度・歩留まりが要求されている。現3

分析機器解説シリーズ（137）

参考文献

像の過程
（進行の方法、速度等）を観察することで、レジストの開発に大きな寄与ができると期待されている［₁₀］。

［1］ Ando et al., PNAS, 2001, 98, 12468-12472

また、基板を電極として、電位を制御しながら高速 AFM 観［2］ Kodera et al., Nature, 2010, 468, 72-76

察を行った実験例がある。この電気化学の方法は燃料電池の［3］ Ando et al., Chem. Rev. 2014, 114, 3120-3188

触媒の開発やめっきなどの開発に応用できる。燃料電池の触［4］ Ando et al., Jpn. J. Appl. Phys. 2002, 41,

媒となる白金粒子の開発に応用された例では、基板に白金触4851–4856

媒を吸着させ、電位を制御して触媒の挙動を観察した。白金［5］ Ando et al., Eur J Physiol 2008, 456, 211–225の構造によって寿命が異なることが示され、より効率のよい触媒の設計に寄与すると考えられている［6］ Edited by Yuri L. Lyubchenko , An introduction。

to single molecule biophysics CRC Press［₁₁］（2017）［7］ 秦信宏編

4秋永広幸監修

走査型プローブ顕微鏡入門

オーム社（2013）

おわりに［8］ Kotani et al., 62nd Biophysical Society Meeting

高速 AFM の特徴はナノスケールの構造が直接観察できる

2018 in San Francisco

こと、さらにこれが経時変化する様子が観察できることであ［9］ Shibata et al., Nat Comm 2017 8, 1430

る。これまでは生命科学分野での利用が多かったが、近年物［₁₀］ Itani et al., J. Photopoly. Sci. Technol., 2010, 23,

質科学分野でも積極的な使用が増えてきている。

639-642

これまでは高速 AFM は構造がシンプルに設計できるサン［₁₁］ Hoshi et al., Electrochemistry Communications,

プルスキャンタイプが主流だった。サンプルスキャンタイプ

2016, 72 5–9では、光学顕微鏡との組み合わせが困難となる。最近開発されたプローブスキャンタイプの高速 AFM ではこの問題を克服し、光学顕微鏡と組み合わせて両者の長所を生かした実験ができるようになってきた。

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