HDLC と LDLC の直接法を評価する日米共同実験計画(US-Japan Evaluation of Homogeneous HDL and LDL Cholesterol Methods)
2008 年 3 月
HECTEF 理事長、櫻林 郁之介
Tufts 大学 客員教授、中嶋克行

US National Cholesterol Reference Method Laboratory Network
大阪府立健康科学センター 脂質基準分析室 室長 中村 雅一
2005 年 7 月 25 日（月）、フロリダ州のオーランドで開催された米国臨床化学会(AACC)のリポ蛋白分科会 Lipoproteins and Vascular Diseases Division (LVDD) の会合で、HDLCの直接法を開発した熊本大学(当時)の杉内先生に対する PBRF 賞の表彰式が行われた。式典の終了後、CDC の Dr. Myers(2007 年 AACC 学会長)と Virginia Commonwealth 大学(VCU)の Dr. Miller の 2 人から、「日本で開発された全 7 社の HDLC と LDLC の直接法を米国で評価したい」という提案がなされた。これが、「HDLC と LDLC の直接法を評価する日米共同実験計画」のスタートとなった。
その後、2 年ばかりの空白時間が流れたが、2007 年 7 月 17 日（火）、サンディエゴで開催された AACC の International Lipoprotein Standardization Forum の場において、Dr.
Miller による”Report on US-Japan Evaluation of Direct LDL Methods” と題する報告を受け、あらためて米国側から実験計画の実施に向けての作業を始めたいという意向が伝えられた。これを受けて、カリフォルニアの燦燦と明るい太陽の降り注ぐ学会会場の国際会議室を借り、米国側を代表する Dr. Miller と日本側から櫻林を総括責任者とする 3 委員との間に、共同実験計画の細目を取り決めるための地道な日米交渉が始まった。
国際間で共同研究を始めるに当たって重要な事は、スタート地点の研究目的から着地点の発表(論文化)までの全過程について、当事者間できちんとした合意を形成することである。
本研究においては、日本側からは HECTEF(理事長：櫻林)、米国側からは PBRF(代表：Dr.
Warnick) が代表となって、合意文書 “Collaborative Research Agreement” を交換し、署名 す る こ と に よ っ て 始 ま っ た 。 そ の 後 、 ”Evaluation of homogeneous methods formeasuring HDL and LDL cholesterol” と題する研究計画書が作成され、これに従って計画は遂行されることになった。本研究の概略については、Dr. Miller が AACC の LVDD の機関紙である The Fats of Life の Winter 2008, Vol.XXII, No.1 に概略を記述している。以下には、研究計画書の項目に従って、計画内容を簡単に解説する。日本側の 3 委員は、櫻林が総括責任、中嶋が米国との折衝、中村が国内の調整・連絡を分担した。

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以下、項目別に計画の概略を述べる。
①計画の実行委員： 日本側委員は、櫻林、中嶋、中村の計 3 名。米国側委員は次の 5 機関の計 11 名。G Miller(VCU), G Vetrovec(VCU), B Korzun(VCU), L Bachmann(VCU),G Myers(CDC), M Kimberly(CDC), S Caudill(CDC), A Remaley(NIH), B
Shamburek(NIH), R Warnick(BHL), E Leary(PBI)②

評価の対象となる日本の試薬メーカー： 北から順に、セロテック、デンカ生研、積水メディカル(旧 第一化学)、UMA、協和メデックス、和光純薬、シスメックスの計 7 社。
米国から本計画に協賛する施設は、Genzyme、Pointe Scientific and Roche、BHL、
Pacific Biometrics Research Foundation の計 4 箇所。

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評価の目標：CDC の基準分析法による目標値をターゲットにして、7 社の直接法の正確度と特異性を検証する。

④検体：検体の 60％はリポ蛋白異常症例、40％は健常例。採血量は、一人につき 40 mL。
VCU と NIH の 2 施設で「新鮮な、個人の、非凍結血清」を 150〜200 検体、採取する。
検体は、4〜8℃で保冷輸送する。直接法と基準分析法ともに、採血後、24〜48 時間以内に測定を完了する。本計画の特徴は、凍結血清等の多少なりとも人工の手の加わった検体を一切使用しない点にある。九州大学の栢森先生は、「HDL-C 及び LDL-C の日常測定法評価のための比較対照法」と題する論文の中で、「第 3 世代といわれている各社の直接測定法は、測定対象とする血清中のリポタンパク質の“無傷性”に大きく正確性が左右される。すなわち、生理的で正常な構造を持つ LDL あるいは HDL では、各々のコレステロールを測定する場合には正確な測定値が得られるが、生理的ではあるが異常な形をとるリポタンパク質あるいは物理化学的な変性を伴った異常な形のリポタンパク質は各社とも反応性が異なり、測定値に大きく影響することが知られてきた。」と指摘する。このことからも、HDL や LDL を対象とする測定においては、研究対象にどのような検体を選定するのかによって、得られる評価成績が異なることに特に注意を払いたい。臨床化学は、あくまでも、「患者個人」を対象としているのであり、プール血清などの人工物を対象とするものではない。研究結果は、個人検体を反映するものでなければならない。この点において、多くの人血清をプールし、それに安定化剤や保存剤などの添加を施し、ろ過や凍結加工された標準血清やサーベイで提供される試料が、乖離の問題をも含めて、果たしてこのような問題に応えているのか、あるいは、それを十分に吟味・考察・実証した後に、提供されているだろうか？HDL やLDL を含むリポ蛋白を対象とするサーベイの評価が、思わぬところで、臨床検査の現場に混乱と当惑を招いているのではないだろうか？その懸念が拭いきれない。

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測定の分担： CDC は Beta-Quantification 法を担当する。VCU は日立 917(日立 7170と同型)により直接法で HDLC と LDLC を測定する。さらに、総コレステロール、トリグリセライド、ALT、AST、総ビリルビン、IgG の測定も VCU で実施する。PBI はDCM で HDLC を測定し、BHL は Gradient Gel Electrophoresis を担当する。

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直接法による測定の手順： 日立 917 型自動分析装置の保守点検を実施後、試薬メーカーの指示書に従い、パラメーターを入力して、キャリブレーターと管理血清と検量線点検用試料等を用い、精密度、分析可能範囲、キャリーオーバー、相関性等の有効性の確認を 8 週間に渉って行い、分析担当者は BHL から派遣された一人の検査技師を専任として固定し、習熟期間に当てる。その後、15 週を要して、150〜200 検体を対象に1 検体につき 3 重測定をする。

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解析：CDC の数理解析と統計を専門とする Dr. Caudill が担当する。

⑧結果報告： 研究成果は、2008 年、ワシントンで開かれる AACC 学会期間中のInternational Lipoprotein Standardization Forum で Dr. Miller(VCU)が公表。更に、論文化して Clin Chem に投稿予定。その後、Dr. Miller を日本に招聘して、講演を依頼する予定である。

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視察： 2008 年 2 月 26 日（火）、中嶋が VCU の Dr. Miller の分析室を訪問した。VCUは、1800 年創立の州立大学であり、その検査部は近隣の病院からの依頼も含めて１日当たり 25,000 検体の測定をこなす能力を有すると言うことであった。検査部全体では、300 人の検査技師と医師を擁し、Dr. Miller は臨床化学検査部門の長として 70 名の検査技師を統轄している。報告によれば、プロジェクトは順調に進展し、日立 917 は十分に整備され、実験の開始に向けて準備は万全に整っているということであった。

本実験結果から、厚生労働省が 2008 年 4 月から開始するメタボリック健診で重要検査項目に指定されている HDL コレステロールと LDL コレステロールの測定精度に関する科学的根拠が明らかになる可能性がある。このことから、3 委員は、本実験計画の趣旨と期待される成果について、日本動脈硬化学会の標準化関連委員に詳細な説明をした。

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