食薬用植物からの育毛活性物質の探索
筑波大学生命環境系

繁森英幸

Hepatocyte growth factor (HGF) has mitogenic, motogenic, and morphogenic activities in epithelial cells. Induction ofHGF production may be involved in organ regeneration, wound healing and embryogenesis. HGF is also known to act onhuman and animal hair follicles to promote hair growth. In this study, the effects of naturally occurring compounds, whichwere isolated from edible and medicinal plants, on HGF production in Neonatal Normal Human Dermal Fibroblasts (NHDF)
were investigated. Clovamide, one of the caffeic acid derivatives significantly induced HGF production dose-dependent
manner. To know the important substructure for HGF production activity, we next investigated the effect of the partial structure of these caffeic acid derivatives. From the results, clovamide showed strong activity on the promotion of HGF production. It was suggested that the caffeoyl moiety of caffeic acid derivatives such as clovamide and its related compounds isessential for accelerated production of HGF. The compound which has the caffeoyl moiety may be useful for the treatmentof some intractable organ diseases in addition to hair growth activity.

1．緒

材から新たな HGF 産生促進活性物質を探索するとともに、

言

CQA 類、PHEG 類や Daphnane 型ジテルペン化合物と併肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor, HGF）は、せて、それらの化合物の機能を解明することを目的とする。

当初肝細胞に対する最も強力な増殖促進因子として同定さ２．方れていたが、腎尿細管や気管支上皮、ケラチノサイトなど様々な上皮系細胞に対しても増殖促進因子として機能する
1）

ことが知られている 。また最近では、血管内皮細胞、軟法

2. 1. 天然由来化合物のHGF産生促進活性２．
１．
１．活性試験用化合物

骨細胞、造血幹細胞などの間葉系細胞の増殖を促進させる

当研究室で食薬用植物や微生物から単離した化合物 6 - 10）：ことも明らかにされている。さらに、HGF はヒトおよびActeoside、Arctigenin、Antimycin A 3 a、Palmaenone A、動物の毛包に働き、発毛・育毛を促進することも知られてPalmaerin A、Daphnodorin C、Clovamide、Piceatannol お2）いる 。成長期毛包の毛乳頭細胞からは、HGF、インスリ

よび Scirpusin B

ン様増殖因子 - 1、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、

２．
１．２．細胞培養

退行期にはトランスフォーミング増殖因子 -β などの因子

正常ヒト皮膚線維芽細胞（Normal human dermal fibroblastsが産生され、これらが毛母細胞などに作用することで、ヘ：NHDF）（Kurabo Co.）を、10 % FBS を加えたダルベッコ

3）

アサイクルが制御されていると考えられている 。また、

改変イーグル培地（DMEM）（Sigma-Aldrich Co.）を用いて、毛髪の成長期移行シグナルであるシグナル伝達兼転写活性37 ℃、5 % CO 2 加湿雰囲気中で培養し、各実験に使用した。

化因子 3（STAT 3）は、HGF により活性化されることが知

２．
１．
３．NHDF 細胞への化合物投与られている。当研究グループでは、これまでに寄生植物のフラスコで培養した NHDF 細胞をトリプシン処理し、アメリカネナシカズラやヤセウツボから単離したカフェオ

96 well plate に 5 . 0 × 104 cells/mL になるように 100 µL ずイルキナ酸（CQA）類ならびにフェニルエタノイド配糖体つ播種して、コンフルエントになるまで培養し、化合物を（PHEG）類などのカフェ酸誘導体に、正常ヒト皮膚線維芽0 . 5 % FBS DMEM で希釈し、培地交換の要領で 96 well細胞に対する顕著な HGF 産生促進活性があることを見出

plate に 100 µL/well で添加し 96 h 培養した。

した 4）。また一方で、ジンチョウゲから単離した Daphnane

２．
１．
４．サンドイッチ酵素結合免疫吸着検査法（Enzyme-型ジテルペン化合物にも顕著な HGF 産生促進活性を見出5）している 。そこで本研究では、食薬用植物を含む天然素

linked immuno-sorbent assay： ELISA）
ELISA用の 96well plate（Nunc）に抗ヒトHGF抗体（R&DSystems）を播種し、4 ℃で一晩インキュベートした。各well を 0 . 05 % Tween 20 in PBS（TBS/T）で洗浄し、ブロS ea rch for ha ir g rowt h-promot ing
compounds from edible and medicinal
plants
Hideyuki Shigemori
Faculty of Life and Environmental
Sciences, University of Tsukuba

ッキング剤（5 % Tween 20、5 % Sucrose 含有 PBS で溶解した 1 % BSA）を添加し 1 h 静置した。これ以降の実験操
作は室温で行った。溶液の除去ならびに TBS/T 洗浄を行い、上記の細胞上清を添加した。同時に、標準曲線用に
human HGF standard（R&D Systems）を 0～50 ng human− 120 −

食薬用植物からの育毛活性物質の探索

図1

HGFが関与する生理作用

HGF/mL の範囲で添加した。2 h 静置した後、溶液の除去に、0 . 2 mL クロロホルムを添加し室温で 3 min 静置した後、ならびに TBS/T 洗浄を行い、ビオチン化抗 HGF 二次抗体

遠心（12000 rpm、15 min、4 ℃）し、水層（上層）を新しい（R ＆ D Systems）を添加し 2 h 静置した。溶液の除去およチューブに移した。0 . 5 mL イソプロパノールを添加してび TBS/T 洗浄を行い、ストレプトアビジン標識ホースラ

室温で 5 - 10 min 静置した。遠心（12000 rpm、10 min、4 ℃）

ディッシュ・ペルオキシダーゼ（Horseradish peroxidase:した後、上清を除去して 70 % エタノール（1 mL）を添加し、HRP）（R&D Systems）を添加した。インキュベート（30さらに遠心（7500 rpm、5 min、4 ℃）した後、上清を除去min）後、溶液の除去ならびに TBS/T 洗浄を行い、酵素基して風乾し、水で希釈して total RNA 溶液を調製した。

質 2 , 2 '-Azinobis（3 -ethyl- 2 , 3 -dihydrobenzothiazole- 6 -一方で、氷上で試薬と RNA 溶液を混ぜ、65 ℃で 5 minsulfonic acid）（ABTS）
溶液を添加してアルミホイルで遮光（RNA 変性）、37 ℃で 5 min（ゲノム DNA 除去）、37 ℃でし 30 min 静置した。最後に反応停止剤として 2 M 硫酸を15 min、50 ℃で 5 min、98 ℃で 5 min（逆転写活性および添加した後、410 nm で吸光度を測定した。得られた値よ酵素失活反応）の条件で反応終了後にサンプルを回収した

り検量線を作成し、1 well あたりの HGF 産生量を求めた。

（cDNA）。この cDNA サンプルと試薬およびプライマーを

２．
１．
５．BCAタンパク質定量法

混ぜ PCR 用の 96 well plate に播き、フィルムをして定量

ELISA アッセイに用いる上清を取り除いた後の 96 wellplate を TBS/T で 軽 く 洗 浄 し、0 . 5 % Triton X- 100 含 有的逆転写 PCR（RT-qPCR）を行った。
２．
１．７．HGF 産生経路に関わる酵素に対する阻害剤を用PBS を添加して 20 min ほどシェイカーで振盪し細胞層をいた HGF 産生促進活性回収した。新たな 96 well plate に回収した細胞サンプルま阻 害 剤：KT 5720（ プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ A ：PKA）、

たは BSA standard と Working solution を添加し、562 nm

PD 98059（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ／細胞で吸光度を測定した。得られた値より検量線を作成し、サ外シグナル調節キナーゼ：MAPK/ERK）、SB 203580（p 38

ンプル内のタンパク質量すなわちプレートに生着していた分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ：p 38 MAP）、細胞数を求めた。

SP 600125（c-Jun N-terminal kinase：JNK）、Wortmannin

上記の 2 つのアッセイ結果より、単位タンパク質量あた（ホスファチジルイノシトール 3 - キナーゼ：PI 3 K）およびりの HGF 産生量（pg/µg protein）を算出し、各化合物によBisindolylmaleimide 1（プロテインキナーゼ C ：PKC）
2 . 1 . 1 . における活性試験用化合物中で最も顕著な HGF

る HGF 産生促進活性を調べた。
２．
１．６．HGF 産生に関与するmRNAの発現量測定

産生促進活性が認められた Clovamide を用いて上記の阻害NHDF を 6 cm dish に播種しコンフルエントになってか剤を添加して NHDF 細胞からの HGF 産生量を 2 . 1 . 4 . サ

ら化合物を添加した。化合物処理後、培地を除去して PBS

ンドイッチ ELISA 法と 2 . 1 . 5 . BCA タンパク質定量法とで洗浄後、RNA 抽出用試薬 ISOGEN 1 mL/well を添加し、同様の方法を用いて測定した。

かき取ってチューブに回収して 5 min 室温静置した。これ− 121 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

３．結

HGF 産生促進活性を調べた。その結果、Acteoside および果

Clovamide に顕著な HGF 産生促進活性が認められた（図３．
１．
１．天然由来化合物によるHGF 産生促進活性２）。Acteoside の HGF 産生促進活性についてはすでに当

HGF 産生促進活性が知られている血小板由来成長因子（platelet-derived growth factor: PDGF）をポジティブコ研究室で報告していることから、これ以降の実験では、Clovamide（図 3）を用いて検証することとした。

ントロールとして、9 種類の天然由来化合物（Acteoside、そこで、Clovamide の濃度（0 . 5、1、5 および 10 µM）をArctigenin、Antimycin A 3 a、Palmaenone A、Palmaerin A、変えて経時変化（48 h および 96 h）を調べたところ、濃度依

Daphnodorin C、Clovamide、Piceatannol および Scirpusin B）

存的ならびに時間依存的に HGF 産生促進活性が増強したについて、各 5 µM を用いてサンドイッチ ELISA 法により（図４）。

図2

天然由来化合物のHGF産生促進活性

図3

図4

Clovamideの構造式

Clovamideの濃度および時間依存的なHGF産生促進活性− 122 −

食薬用植物からの育毛活性物質の探索

３．
１．２．HGF 産生に関与するmRNAの発現量測定

KT 5720 を添加した際に HGF 産生量が減少することが観RT-qPCR を用いて Clovamide の添加（5 および 20 µM）
による HGF mRNA 発現量を調べた結果、6 h 処理では有測された（図６）。したがって、HGF 産生には PKA 経路の関与が重要であることが示唆された。

意差は見られなかったが、48 h 処理において Clovamide

４．考（20 µM）
では有意差が見られた
（図 5）
。
３．
１．
３． Clovamide によるHGF 産生促進経路の解明

察

9 種類の天然由来化合物を用いてサンドイッチ ELISA

HGF 産生経路に関わると想定した酵素の阻害剤（KT 5720、法により HGF 産生促進活性を調べた結果、Acteoside およPD 98059、SB 203580、SP 600125、Wortmannin お よ び

び Clovamide に顕著な HGF 産生促進活性が認められたこ

Bisindolylmaleimide 1）を用いて、Clovamide との共処理にとから、先行研究で活性が認められた CQA 類や PHEG 類

よ る HGF 産 生 量 を 調 べ た 結 果、PKA 阻 害 剤 で あ るなどのカフェ酸誘導体と同様にカフェ酸構造に含まれるカ

図5

図6

Clovamide処理によるHGF mRNA発現量

酵素阻害剤を用いた Clovamide によるHGF 産生量の変化− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

テコール構造が活性発現に重要であることを明らかにした。 （引用文献）
そこで本研究では、Clovamide を用いて HGF 産生促進活1） Matsumoto K, Nakamura T. Hepatocyte growth

性についてさらなる機構解明を行った。Clovamide の濃度factor: Renotropic role and potential therapeutics forを変えて経時変化を調べたところ、濃度依存的ならびに時

renal diseases. Kidney Int. 59: 2023-2038, 2001.

間 依 存 的 に HGF 産 生 促 進 活 性 が 増 強 し た こ と か ら、

2） Lee Y-R, Yamazaki M, Mitsui S, Tsuboi R, Ogawa H.

Clovamide に顕著な HGF 産生促進活性を有していること

Hepatocyte growth factor（HGF）activator expressedを確認した。また、RT-qPCR を用いて Clovamide の添加

in hair follicles is involved in in vitro HGF-dependent

による HGF mRNA 発現量を調べた結果、時間依存的に発hair follicle elongation. J Dermatol Sci 25: 156-163, 2001.

現量が増加してることから、遺伝子発現レベルでも HGF

3） Philpott MP, Sanders DA, Kealey T. Effects of insulin産生が促進されていることを明らかにした。さらに、酵素and insulin-like growth factors on cultured human hair阻害剤を用いた実験において、Clovamide による HGF 産

follicles: IGF-I at physiologic concentrations is an

生促進活性発現機構には PKA 経路が重要であることを明important regulator of hair follicle growth in vitro. Jらかにした。

Invest Dermatol. 102: 857-861, 1994.
4） Kurisu M, Nakasone R, Miyamae Y, Matsuura D,

５．まとめKanatani H, Yano S, Shigemori H. Induction of

HGF は健康状態の時はあまり産生されておらず、病気

hepatocyte growth factor production in human dermalになった時に血中の HGF 量が増加する。実際に、肝炎のfibroblasts by caffeic acid derivatives. Biol Pharm Bull

患者では数倍から 10 数倍にも上昇することから、HGF は

36: 2018-2021, 2013.

組織や臓器に傷害が加わることで産生されることが知られ

5） Nakasone R, Kurisu M, Onodera M, Miyamae Y,ている。一方で、加齢とともに HGF 産生能力は低下し、Matsuura D, Kanatani H, Yano S, Shigemori H.

このことが高齢化に伴う生活習慣病が発症しやすくなる原

Promoting effects on hepatocyte growth factor因とも言われている。さらに、HGF は育毛・発毛作用がproduction of daphnane diterpenoids from Daphne

あり、頭髪の再生も行うため、加齢に伴う HGF 産生量のodora. Heterocycles 87: 1087-1092, 2013.

低下が脱毛や薄毛の原因ともなっている。すでに筋萎縮性6） Kurisu M, Miyamae Y, Murakami K, Han J, Isoda H,側索硬化症（ALS）や脊椎損傷などに対しての HGF 投与にIrie H, Shigemori H. Inhibition of amyloid β aggregation

よる臨床試験が行われているが、脱毛や薄毛の治療の場合

by acteoside, a phenylethanoid glycoside. Biosci Biotech

はそこまでの療法は適していないと思われる。そこで、Biochem. 77: 1329-1332, 2013.

HGF 産生を促進する化合物を食品やサプリメントまたは75）Higashinakasu

K, YamadaK, Shigemori H,

化粧品として摂取することで体内の HGF 産生を向上させ

Hasegawa K. Isolation and identification of potent

ることが有効な方法と考えられる。すでに、先行研究におstimulatory allelopathic substances exuded from

いて顕著な HGF 産生促進活性が認められた CQA 類ならび

germinating burdock（Arctium lappa）seeds. Heterocyclesに PHEG 類は、サツマイモ、ゴボウ、プロポリス、コーヒ

65: 1431-1437, 2005.

ーならびにオリーブなどの食用植物に含まれている。また、

8） Matsumoto T, Hosoya T, Tomoda H, Shiro M, Shigemori

今回活性が認められた Clovamide もカカオ豆やコーヒー豆

H. Palmaenones A and B, two new antimicrobialに含まれている成分でもあることから、ココア、チョコレ

chlorinated cyclopentenones from discomycete Lachnum

ートおよびコーヒーにも含まれている。したがって、これpalmae. Chem Pharm Bull 59 : 1559-1561, 2011.

らを日常的に摂取することによって加齢に伴って減少した

9） Tanabe Y, Matsumoto T, Hosoya T, Sato H, Shigemori

HGF の産生を促進することで、脱毛や薄毛を予防する育H. Palmaerins A-D, new chlorinated and brominated毛剤の開発につながるものと思われる。このような化合物

dihydroisocoumarins with antimicrobial and plant growthは皮膚への安全性はもちろんのこと、生体内に投与してもregulating activities from discomycete Lachnum palmae.

健康に対する害はほとんどないことが示唆される。したがHeterocycles 87: 1481-1491, 2013.って、これらの化合物を配合したサプリメントや化粧品の10）Tsunoda T, Takase M, Shigemori H. Structure-activity

安全性は高く、このような天然由来化合物を配合した育毛

relationship of clovamide and its related compounds for剤の開発に貢献するものと考えられる。

the inhibition of amyloid β aggregation. Bioorg Med
Chem 26: 3202-3209, 2018.

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