ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響
徳島大学大学院医歯薬学研究部

石田竜弘

Polyethylene glycol (PEG) is considered as non-toxic and non-immunogenic material, and surface modification with
it can improve the immunogenicity and pharmacokinetics of nanocarriers. However, we recently reported that PEGylated
liposome loses their long circulating properties when they are administered twice in same animal with certain interval(accelerated blood clearance (ABC) phenomenon). We elucidated that anti-PEG IgM, secreted in response to the first doseof PEGylated liposome, is responsible for the rapid clearance of the second dose via initiation of complement activation. We
further elucidated that such anti-PEG IgM production is caused in nude mice (no T-cells), while it was not caused in SCID
mice (no B and T cells) and splenectomized mice (no spleen). These suggest that spleen B cells produce the anti-PEG IgM
in a T-cell independent manner. It appears that PEGylated liposome activates the immunity in spleen as T-cell independent
antigens do. In addition, we recently reported that nucleic acids such as siRNA and pDNA in SL further enhances anti-PEG
IgM production via tall like receptors (TLRs) (TLR 7 for siRNA, TLR 9 for pDNA) in their sequence dependent manner.
Our studies clearly demonstrate that any PEGylated formulations may display unexpected pharmacokinetic behavior upon
repeated injection if such formulation induce anti-PEG IgM production and, as a consequence, may show less therapeutic
efficacy or even cause undesirable side-effects. In this study, we paid an attention to PEG in the cosmetics and studied if thePEG induces anti-PEG immunity after sequential addition for 60 days. The result clearly demonstrated that the cosmetic
containing PEG induces anti-PEG IgM, not anti-PEG IgG, and accordingly the cosmetic may be a major cause to induce preexisting anti-PEG IgM observed in sera of healthy volunteers.

1. 緒

よって 2 回目に投与した PEG 修飾リポソームが速やかに言血中から排除されることを報告した 1）。

PEG（ポリエチレングリコール）はエチレングリコール

これらの抗体はあくまで、PEG を修飾した医薬品の投が重合した構造からなるポリマーであり、皮膚への刺激性与によって誘導されたものと考えられていたが、最近のや毒性がほとんど認められないことから化粧品成分として臨床研究から、PEG 修飾医薬品による治療歴のない患者広く使用されている。化粧品における PEG の用途としての一部が抗 PEG-IgM を保有していることを明らかとした。

は界面活性剤、クレンジング剤、乳化剤および保湿剤など

実際、東京大学医学部・女性外科・松本医師との共同研究があり、これらに含まれている PEG の一般的な分子量はにおいて、これらの患者に卵巣がんの特効薬である Doxil

200 ～ 10,000 程度である。また、分子量の調節や脂溶性（ドキソルビシン封入 PEG 修飾リポソーム）を投与した場基の導入により、さまざまな物性を持たせることができる

合、Doxil の血中濃度の急激な低下が観察され、通常得らため、数百種類以上の誘導体も使用されている。このようれる治療効果がほとんど得られないことも明らかとした。に PEG には幅広い用途があるため、化粧品成分として汎これらの患者が抗 PEG 抗体を保有するに至った原因は用されており、我々も日常的に PEG に暴露されている。

明らかではない。前述のように、日常的に使用する化粧品

一方、PEG は医薬品においても重要な役割を果たしての中に PEG を含むものが多く存在するため、これらの化いる。PEG を修飾した医薬品は、有効成分がゆるやかに粧品の日常的な使用により、PEG に対する抗体が誘導さ放出され、血中濃度が長時間保たれるという特徴を有するれたのではないかと考えた。PEG の皮膚透過性について、ため、血中で分解を受けやすい薬や、抗がん剤など毒性が分子量 4,000（PEG-75）以上の PEG は皮膚から吸収されな発現しやすい薬においてよく用いられる。一方、我々は、いが、それよりも小さい分子量の PEG は皮膚から最小限PEG 修飾リポソームの投与によって PEG に対する抗体（抗に吸収されることが知られている 2）。また、傷害された皮PEG-IgM）の分泌が誘導されることを明らかにし、これに膚に対しては PEG の分子量に関係なく、透過性を示すことが明らかとなっている 3）。また、化粧品に含まれている
PEG の毒性について、Bárány らは PEG や PEG 誘導体はヒトの皮膚に対してはほとんど刺激を与えないが、経表皮水

Immunological response against PEG incosmetics
Tatsuhiro Ishida
Tokushima University, I nst itute of
Biomedical Sciences

分消失（TEWL）を増加させ、角質バリア機能を目に見えないレベルで傷害していることを報告しており 4）、透過した PEG が PEG に対する免疫反応を誘導していても何ら不思議ではない。

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ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響

このような仮説を検証するため、PEG 含有化粧品をラロリド、イソデシルグリセリルエーテル、ポリクオタニウ

ットに塗布した際の抗体産生評価ならびに化粧品によって

ム -10、ポリクオタニウム -52、ラウレス-4、ラウレス-16、誘導される抗 PEG 抗体による PEG 修飾医薬品の動態変化

ラウレス-23、ラウレス硫酸 Na、ビスセテアリルアモジメについて検討を行った。

チコン、ステアロキシプロピルジメチルアミン、ジメチコン、

2. 方

水酸化 Na、安息香酸 Na、ベンジルアルコール、フェノ法

キシエタノール、香料

2. 1. 実験動物
実験動物として HWY 雌性ラット（体重 150 ～ 250 g）を

2. 3. 上記化粧品の塗布

日本 SLC（静岡、日本）より購入して用いた。実験動物はガムテープを用いて腹部に 10 回程度テープストリッピSPF（specific pathogen free）環境下で生育させた。また、ングを行い、コットンに適量の PEG 含有化粧品を染み込全ての実験動物は徳島大学動物実験委員会によって承認をませ、腹部に塗布した。この操作を 1 日 1 回行った。

受けた上で行った。

2. 4. Anti-PEG antibodies の測定

2. 2. 塗布用化粧品

麻酔下で化粧品処置したラットから血液を採取し、血液を血清分離剤入りチューブ（栄研、東京、日本）に採取した。採取しPEG 含有化粧品として以下の 3 種類を用いた。
・化粧水：資生堂

AQUALABEL

モイスチャーローシ

た血液は 30 分間室温で放置した後、3000 rpm（KUBOTA2800）

ョン（S）

で 20 分間遠心分離し、上清のみを回収した。血清は使用するま含有成分：水、DPG、エタノール、グリセリン、PEG-6、で－20℃で保存した。

PEG-32、PEG/PPG-14/7 ジメチルエーテル、エリスリト

ELISA 用 96 ウェルプレート（Costar®、Corning、NY、ール、アセチルヒアルロン酸 Na、ヒアルロン酸 Na、乳酸、USA）を用意し、
mPEG2000-DSPEを 50µL各ウェルに分注し、

塩化 Mg、PCA、アンズ果汁、塩化 Ca、水添レシチン、室温で 1 晩インキュベーションした。Blocking Solution をポリクオタニウム -51、水溶性コラーゲン、PEG/ポリブ

350µL 分注し、1 時間インキュベーションした。インキュチレングリコール -44/15 メチルエーテル水添ダイマージ

ベーション後、Wash Solution を用いて 3 回洗浄した。血清

リノレイル、クエン酸 Na、EDTA-2Na、クエン酸、BG、をそれぞれを 100µL 分注し 1 時間インキュベーションした。

水酸化 Na、トコフェロール、PEG-30 ダイズステロール、Wash Solution を用いて 5 回洗浄後、Blocking Solution を用

水酸化 K、EDTA-3Na、フェノキシエタノール、香料

いて 5000 倍希釈した二次抗体を 100µL 分注し、1 時間イン・日焼け止め：資生堂メンUV プロテクター

キュベーションした。Wash Solution を用いて 5 回洗浄後、含有成分：水、シクロメチコン、BG、変性アルコール、メEnzyme Substrate を 100µL 分注し、5 〜 30 分インキュベ

トキシケイヒ酸オクチル、ジメチコン、ポリメチルシルセーションした。酵素反応を止めるために Stopping Solution

スキオキサン、PEG-9 ポリジメチルシロキシエチルジメチを 100µL 分注した。その後 Microplate reader（TECAN、コン、ジステアルジモニウムヘクトライト、グリセリン、エMännedorf、Switzerland）
を用いて吸光度を測定した（λ=492

リスリトール、スクワラン、フルオロ（C9-15）アルコールリnm）。Goat anti-Rat IgM Antibody HRP Conjugated, Goat

ン酸、トリメチルシロキシケイ酸、PEG/PPG-14/7 ジメ

anti-Rat IgG-Fc Fragment Antibody HRP Conjugated を二チルエーテル、グルタミン酸 Na、メントール、ポリクオタ次抗体として使用した。

ニウム-51、ワイルドタイムエキス、チオタウリン、イソステアリン酸、（アクリル酸アルキル/ジメチコン）コポリマ

2. 5. Doxil の血中濃度測定

ー、ジステアリン酸 Al、水酸化 Al、PEG-150、EDTA-

ラット尾静脈よりDoxilを急速投与した。投与 5 日後に、血液3Na、DPG、BHT、フェノキシエタノール、香料、酸化亜を採取した。採取した血液は 30 分間室温で放置した後、20 分鉛、酸化チタン

間遠心分離し、上清のみを回収した。血清中のドキソルビシン

・シャンプー：花王

エッセンシャル リッチダメージケア シ

濃度は定法に従ってHPLCを用いて測定した。

ャンプー3. 結含有成分：水、ラウレス硫酸アンモニウム、エタノール、ラウレス-4 カルボン酸 Na、ラウリルヒドロキシスルタイン、果3. 1. PEG 含有化粧品によるanti-PEG IgM 産生

ジステアリン酸グリコール、ラノリン脂肪酸、リンゴ酸、まず、PEG 含有化粧品によってanti-PEG IgM が誘導されクエン酸、ヒマワリ種子油、ミリスチルアルコール、スるか検討を行った。PEG 成分が含まれている化粧水、日テアリルアルコール、PPG-7、PPG-3 カプリリルエーテル、焼け止め、シャンプーのいずれかを 1 日 1 回ラットの腹部に塗コカミド MEA、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムク

布し、塗布開始 16、37、60 日後に血清を採取した。採取− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

した血清中の anti-PEG IgM 量を ELISA により評価した。

3. 2. PEG含有化粧水誘導anti-PEG IgMの抗体力価

その結果、化粧水塗布ラットにおいて anti-PEG IgM 量

続いて、化粧水で誘導された anti-PEG IgM の抗体力価の増加が確認された。抗体量は塗布開始 37 日後にピークの評価を行った。Fig. 1 において最も anti-PEG IgM 量がとなったが、60 日後には抗体量が減少していることが明多かった化粧水塗布 37 日後 No.4 の血清を用い、この血清らかとなった。また、日焼け止めとシャンプーを塗布した

中の anti-PEG IgM が PL 投与によって誘導される anti-PEG

ラットにおいては anti-PEG IgM の誘導が確認されなかっIgM と比較してどの程度の抗体力価を持っているのか検討た。この理由の一つとして、日焼け止めとシャンプーは化を行った。

粧水に比べて皮膚透過性が低く、表皮樹状細胞であるラン

その結果、化粧水塗布によって誘導された anti-PEG IgMゲルハンス細胞にまで到達しなかったために、抗体産生がは、PL を 10-4 µmol phospholipids/kg 静脈内投与したとき生じなかった可能性が考えられる。また、IgG の誘導に関に誘導される anti-PEG IgM と同程度の抗体力価を持つこ

しても同様の検討を行った結果、PEG 含有化粧品によるとが確認された（Fig. 2）。

anti-PEG IgG の誘導は生じないことが確認された。

次に、この抗体力価が Doxil をどの程度クリアランスすFig. 1 Anti-PEG IgM and IgG production following putting PEG-including cosmetics on skin.
Face lotion（A, D）or sunscreen（B, E）or shampoo（C, F）including PEG was put on hairless rat’ s skin every day,respectively. Serum was collected on day 16, 37, 60 after putting. Anti-PEG IgM and IgG were determined using ELISA. Data
are presented as absorbance at 492 nm.

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ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響るのかを検討するために、PEG 修飾リポソーム（10-2, 10-4,-6同程度の抗体力価を持つ PEG 修飾リポソーム（10-4 µmol

10 µmol phospholipids/kg）静脈内投与によって anti-PEG

phospholipids/kg）で誘導された anti-PEG IgM は、PEG 修

IgM が 誘 導 さ れ た ラ ッ ト に Doxil（0.7mg doxorubicin/飾リポソームを投与していない無処置のラットと比較して、kg）を静脈内投与し、投与 4 時間後の Doxil の血中濃度をDoxil の血中濃度を投与 4 時間後に 50 ％程度低下させるこHPLC で測定した。とが明らかとなった。

その結果、化粧水によって誘導された anti-PEG IgM とFig. 2 Titer of anti-PEG IgM induced by putting lotion.
Face lotion was putting on hairless rat’ s skin every day and serum was collected on day 37（●），
the serum which has highest titer among 4 sera was used as sample. PL was intravenously injected-6-4
into hairless rat at a dose of 10 µmol phospholipids/kg（◇），10 µmol phospholipids/kg（□），or-2
10 µmol phospholipids/kg（△）
and serum was collected on day 5 after injection. Each value（PL pretreated）
represents the mean ± S.D.（n=3），Face lotion treated（n=1）．

Fig. 3 Blood retention of Doxil in PEGylated liposomes-pretreated rat.
-2-4-6PEGylated liposomes（10 , 10 , 10 µmol phospholipids/kg）was intravenously injected into hairlessrat. Five days later, Doxil（0.7 mg doxorubicin/kg）was intravenously injected into the rat. Serum wascollected at 4 hr after injection. Serum concentration of Doxil was determined using HPLC. Each value
represents the mean ± S.D.（n=3）．The p-value indicates the statistcal difference between the controlrats and PL pretreated rats. *p ＜ 0.05, ***p ＜ 0.001.

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コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018

3. 3. PEG 含有化粧水誘導 anti-PEG IgM の特性評
価（親和性、補体）
Fig. 3 において、化粧水塗布によって得られた抗体力PEG 含有化粧水を塗布し（Fig. 4）、これによって誘導された anti-PEG IgM の PEG 修飾リポソームへの結合性と補体活性化能の有無を評価した。

価と同程度の anti-PEG IgM を PEG 修飾リポソーム投与にこれまでの結果と同様に、化粧水の塗布によって anti-よって誘導した場合、Doxil の血中からの速やかなクリアPEG IgM の誘導が確認された（Fig. 4）。また血液中に anti-ランスが確認された。しかし、化粧水塗布によって誘導

PEG IgM を分泌すると考えられる PEG 特異的細胞の存在された anti-PEG IgM と、PEG 修飾リポソーム投与によっも確認された。さらに PEG 修飾リポソームと競合 ELISAて誘導された anti-PEG IgM は性質が異なる可能性が考えを行った結果、化粧水で誘導された anti-PEG IgM は、られる。Doxil に対して ABC 現象が発現するには、anti-PEG 修飾リポソームで誘導された anti-PEG IgM と同様に、PEG IgM の Doxil に対する親和性や補体活性化能の有無がPEG 修飾リポソームに対しても結合性を示すことが確認重要となる。化粧水で誘導された anti-PEG IgM の性質をされた（Fig. 5）。このことから、化粧水で誘導された anti-調べるため、これまでとは別に、へアレスラットに新たにPEG IgM は PEG 修飾リポソームを認識する抗体であるこFig. 4 Anti-PEG IgM production following putting of PEG-including face lotion.
Face lotion including PEG was put on hairless rat’ s skin every day. Serumwas collected on day 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 after putting. Anti-PEG IgM was-2
determined using ELISA. Serum from PL-pretreated rat（10 µmol phospholipids/kg）was used as a positive control. Data are presented as absorbance at 4 9 2nm. Each value represents the mean ± S.D.（n=7）．The p-value indicates thestatistcal difference between the control rats and PL pretreated rats. *p ＜ 0.05,**p ＜ 0.01, ***p ＜ 0.001.

Fig. 5 Affinity of anti-PEG IgM induced by face lotion to PL.
Face lotion was putting on hairless ratʼs skin every day. Forty two days
later, serum was collected. Binding of anti-PEG IgM to PL was determined bycompetitive ELISA. The binding of anti-PEG IgM in 1 0 0-times diluted serum tomPEG2000-DSPE on the plate were determined in the presence of competitor（PL-20.5µmol phospholipids/mL）．Serum from PEGylated liposome-pretreated rat（10µmol phospholipids/kg）was used as a positive control.

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ポリエチレングリコール（PEG）含有化粧品使用による抗 PEG 抗体誘導と PEG 化製剤の薬理効果への影響とが明らかになった。続いて、anti-PEG IgM による補体ての血清において PEG 修飾リポソーム添加による溶血率活性化が生じているか、CH50キットを用いて検討を行った。の減少は生じなかった。一方で、PEG 修飾リポソームを投本実験では血清中の補体量に比例して抗体依存的な補体与したへアレスラット由来の血清に PEG 修飾リポソームの活性化が生じ、EA（感作ヒツジ赤血球）が溶血する。そを添加した場合は、溶血率の減少が生じた。このことから、のため、PL に血清中の anti-PEG IgM が結合して補体を化粧水で誘導された anti-PEG IgM による補体活性化は生活性化すると、血清中の補体量が減少するため EA の溶血じていないことが明らかとなった。補体活性化が生じなか量が減り、溶血率は低下すると考えられる。また、本実った原因として、①化粧水で誘導された anti-PEG IgM に験で用いた血清に、補体を消費することが知られている補体活性化能がない、②化粧水誘導の anti-PEG IgM は補zymosan を添加すると溶血率が低下したことから、いず体活性化能を持つが、抗体価が低いため古典経路を活性化れの血清も補体が含まれていることを確認している（Fig.

させるのに十分な抗体量が得られていなかった、の 2 点が6）。

考えられる。以前の検討においても、PEG 修飾リポソー

Fig. 6 より、化粧水を塗布したへアレスラット由来の全ムによって誘導された anti-PEG IgM が PEG 修飾タンパク

Fig. 6 Complement consumption following incubation of serum with PL.
Face lotion was put on hairless rat’ s skin every day. Forty two days later, serum
was collected. Complement consumption following incubation with either PL or-2zymosan was measured using CH5 0 kit. Serum from PL-pretreated rat (1 0 µmolphospholipids/kg）was used as a positive control.

Fig. 7 Blood retention of Doxil in rat treated with face lotion.
Face lotion was put on hairless rat’s skin every day. Forty two dayslater, Doxil（1.5 mg/kg）was intravenously injected into the hairlessrat. Serum was collected at 4 hr after injection. Serum concentrationof Doxil was determined using HPLC. Each value represents themean ± S.D.（n=7）．The p-value indicates the statistcal difference
between the control rats and face lotion pretreated rats. ***p ＜0.001.

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コスメトロジー研究報告 Vol.26, 2018に結合した後、補体活性化を生じさせないことを明らかに

Doxil を投与しても、血中濃度の低下は確認されなかった。

しており、化粧水によって誘導された anti-PEG IgM も同

本検討の結果より、PEG 含有化粧水によって anti-PEG
IgM が誘導されるが、補体活性化は生じないため、他の様の現象を引き起こしたと考えられる。

PEG 修飾製剤の体内動態変化を発現させる可能性は低い

3. 4. PEG 含有化粧水誘導 anti-PEG IgM が Doxilの血中滞留性に与える影響ことが示唆された。そのため、Doxil のような血中濃度と次いで、化粧水で誘導された anti-PEG IgM によって能性は低いと考えられる。その一方で、PEG 化タンパク

Doxil のクリアラスが生じるか検討を行った。PEG 含有化製剤のような中和抗体の存在を考慮しなければならない薬粧水塗布 42 日後に Doxil を 1.5 mg doxorubicin/kg 静脈内剤に対してはその薬効を減弱させる可能性も考えられるた

投与し、その 4 時間後の Doxil 血中濃度を HPLC で測定した。

め、注意が必要である。

薬効が相関する薬剤に対しては治療効果に影響を及ぼす可その結果、Doxil 投与 4 時間後の血中濃度は化粧水塗布

5. 総ラットと無処置ラットで大きな差はなく、Doxil のクリア括ランスは生じないことが確認された。Fig. 3 において PEG

本検討により、PEG を含有する化粧品によって実際に修飾リポソームで誘導された anti-PEG IgM によって Doxil

抗 PEG-IgM が誘導されることが明らかとなった。今後、のクリアランスが生じたにも関わらず Fig. 7 において大き化粧品によって誘導された抗 PEG-IgM による PEG 修飾医

な血中濃度の低下が確認されなかった原因として、抗体薬品の効果減弱が実際に引き起こされるかについて検討を力価が低いことや Fig. 6 において化粧水誘導の anti-PEG行いたいと考えている。

IgM による補体活性化が生じなかったことが考えられる。

PEG 修飾医薬品は、血中濃度が長時間維持されるといその結果、マクロファージによる取り込みがみられず、血う利点を有しており、がんや肝炎などの疾患の治療薬とし中濃度の劇的な低下が生じなかったと考えられる。て重要な位置を占めている。化粧品によって誘導された抗4. 考体がこれらの治療薬の効果を減弱してしまうことが証明さ察れた場合、これまで化粧品成分として安全と考えられてき本研究では、PEG 含有化粧品によって anti-PEG IgM のた PEG の使用が望ましくないと考えられる。

分泌が生じるか、さらに、この anti-PEG IgM によってDoxil の血中濃度に影響が生じるか検討を行った。本検討（引用文献）の結果から、皮膚に浸透しやすい化粧水によって anti-PEG

1） Abu Lila AS, Kiwada H, Ishida T, The acceleratedIgM の分泌が生じ、このピークは塗布開始 35 日前後とな

blood clearance（ABC）phenomenon: Clinical

ることが分かった。PEG 含有化粧水による anti-PEG IgMchallenge and approaches to manage. J. Control.

分泌量はラットの個体差が大きい結果となったが、最もRelease, 172, 38-47（2013）

anti-PEG IgM 分泌量の多かったラットの抗体価は PEG 修

2） Smyth Jr. HF, Some pharmacological properties

飾リポソームの 10-4 µmol phospholipids/kg 投与によってof polyethylene glycols of high molecular weight

誘導される anti-PEG IgM と同程度の抗体力価を持つこと（“carbowax” compounds）J. Ind. Hyg. Toxicol., 24, 281-が確認され、これは Doxil 投与 4 時間後の血中濃度を 50%284（1942）程度低下させる力価を保持していた。また、PEG 含有化

3） Herold DA, Rodeheaver GT, Bellamy WT, Fitton LA,

粧水誘導の anti-PEG IgM は PEG 修飾リポソームに対しBruns DE, Edlich RF, Toxicity of topical polyethyleneて高い親和性を持っていた。しかしながらこの anti-PEG

glycol. Toxicol. Appl. Pharmacol., 65, 329-335（1982）

IgM は、補体活性化能はなく、Doxil の動態変化を引き起

4） Bárány E1, Lindberg M, Lodén M., Unexpected skin

こす可能性は低いと考えられる。実際に PEG 含有化粧水

barrier influence from non-ionic emulsifiers. Int. J.

塗付によって anti-PEG IgM が誘導された状態のラットにPharmacol., 195, 189-195（2000）− 62 −