好熱菌由来カロテノイド化合物の生体膜安定化効果の研究

大阪府立大学大学院理学系研究科生物科学専攻

原正 之

Polar carotenoids are known to stabilize lipid bilayer membranes. We investigated the membrane-stabilizing
effect of three synthesized polar carotenoids, thermozeaxanthin (TZ), zeaxanthin-glucoside (ZG) and zeaxanthin(Z), using the fluorescent calcein-leakage measurement from the calcein-entrapped liposomes composed ofdipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC). The addition of TZ stabilized the liposomal membranes composed of DPPCat pH values ranging from 4.0 to 10.0. The addition of three carotenoids, TZ, ZG and Z, stabilized the membraneat acidic and neutral pH values ranging from 4.0 to 7.5. The values of leakage were lower at 30 ℃ and highest
at 40 ℃ and subsequently, gradually decreased at the higher temperature. The addition of TZ and Z stabilized
the membranes, whereas, ZG destabilized the membranes at a temperature higher than 50 ℃ . In addition, themembrane-stabilizing effect of the carotenoids with the calcein-entrapped liposomes composed of lipids extracted
from Thermus thermophilus were investigated. The addition of TZ resulted in stabilization of the membrane at allranges of pH values. However, the addition of Z and ZG destabilized the membrane.

１．緒
１・１

に対して、Thermus thermophilus の脂質組成の特徴として

言は分岐脂肪酸を含む糖脂質等を含むことや

好熱菌 Thermus thermophilus

１, ２, ３）

、膜中に黄色から橙色のカロテノイド類を含有していることが知ら温泉等の高温水域に生育する好熱性の細菌類が、常温れている

４, ５）。また、これらの糖脂質やカロテノイド類の性のそれらに較べて、なぜ高い耐熱能を持つのかについ含有量が菌の培養温度に依存して変わることなども報告さては、これまでに多くの研究者が興味を持ち、核酸、蛋れていることなどから、これらの脂質組成と菌の生体膜の白質、脂質などの生体分子の熱安定化機構が研究されて耐熱性との関与が考えられてきた。

きた。Thermus thermophilus は 50℃から 82℃（至適温度一般に長く伸びた共役二重結合を有するカロテノイド類は 70℃から 75℃）で生育する代表的な好熱性細菌であり、は抗酸化剤として知られており、ラジカル補足剤（radical

グラム陰性・好気性の細菌である。この菌は古細菌またはscavenger）としての働きを持つ場合が多いので、高温域始原菌（archaea）と呼ばれるグループではなく真性細菌で早く増殖する好熱菌において呼吸などの代謝活動に伴っ（eubacteria）に属している。生育温度だけを較べるならて生じる活性酸素を消去するのに、カロテノイド類が役立ば、さらに高温で生育可能な菌も他に多く存在するが、T.っているのではないかという可能性も考えられる。しかし、thermophilus の利点としては、その発見以来、我が国や米1995 年に Yokoyama 等により本菌から図１に示すような、国を中心として多くの研究者が微生物自体やその生産する糖と脂肪酸を結合した特徴的な構造を持つ極性カロテノイ蛋白質の耐熱性機構を研究するためのモデルとして用いてドである thermozeaxanthin（TZ）が発見されたことによきたため、すでに多くの学問的知見が蓄積していることがり、膜貫通型脂質として生体膜の熱安定化に寄与している上げられる。遺伝子操作を行うためのベクター系もすでにのではないかというモデルが提唱され、注目を集めるよう開発されているので、物質生産に適した組み替え体を作るになったなど、代謝工学的な研究にも極めて適した細菌であると言の極性カロテノイドが、膜貫通型脂質としてリベットの様える。にリン脂質膜に挿入され、細胞膜を安定する効果があると

６, ７）。また、これに先立ち、TZ 以外にも幾つか

８）いう説が Nakatani 等により提唱されていた 。

１・２

好熱菌とカロテノイド

常温で生育する多くの真性細菌がリン脂質を多く含むの

１・３

カロテノイドの膜安定化効果

我 々 は こ れ ま で に、 様 々 な リ ン 脂 質 ２ 分 子 膜 小 胞
Studies about the effect of carotenoids
f rom t her moph ilic bacter ia on t hestability of biological membranes
Masayuki Hara
Depa r t ment of Biolog ica l S cience ,Graduate School of Science, Osaka
Prefecture University（liposome）を作製してその性質を明らかにし、さらにこれらをそのまま、またはハイドロゲルなどを組み合わせて薬剤の徐放に生体材料（biomaterial）として利用するための技術についての基礎的な研究を行ってきた。以前に、水溶性の蛍光色素 calcein を封入した liposome からの色素の漏出により脂質膜の安定性を評価する実験系を用いて、T.

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thermophilus の菌体より抽出した TZ が脂質膜を安定化す
９）liposome の調製方法は、以前に報告したものとほぼ同9）ることを、実験的に証明した 。TZ の研究を始めた当初

じ で あ る 。 脂 質 と し て は dipalmitoylphosphatidylcholine

は、Hoshino 等が遺伝子工学的に作製した T. thermophilus（DPPC）を用い、100 mM calcein（pH7.5）を含む liposomeのカロテノイド大量生産株を 70℃程度の温度で振とう培の調製を行った。まず水和法と凍結融解操作にて多重膜養し、生産するカロテノイドを高速液体クロマトグラフィ

liposome（MLV）を作製した後、孔径 100 nm の膜を用いー（HPLC）等で精製、分取して実験に用いていた。しかし、

た限外濾過により一枚膜 liposome とし、Sephacryl S-300

この場合には脂肪酸の鎖長の揃った標品を大量に得ること

column ゲル濾過により外液の calcein を除去して 50mMが難しく、有る程度鎖長のばらついた混合物になりがちでTris HCl（pH7.5）に懸濁された一枚膜（LUV）の calceinあった。今回の実験では脂肪酸の鎖長の揃った TZ

封入 liposome 溶液を得た。

いて研究を行った

11）を用

この方法で得られた一枚膜 liposome の粒径を動的光散。

２．実２・１10）

乱測定法（DLS-6000 AS, Othuka Electoronics, Japan）で

験

測 定 し た。 そ れ ぞ れ control/liposome : 90.0±33.8 nm、liposome の調製方法

Z/liposome: 1012.4±38.2 nm、ZG/liposome: 127.8±29.8

Yamano 等が有機化学的に合成した thermozeaxanthin

nm、TZ/liposome : 93.9 + 31.1 となっており、実験試料（TZ） お よ び そ の 合 成 中 間 体 で あ る zeaxanthin（Z）、により多少のばらつきがあるものの、概ね 100 nm 前後のzeaxanthin-β-gludoside（ZG）を提供頂いて以後の実験粒径を持っている事が確認された。に用いた10）。

図１

実験に用いた３種のカロテノイドと TZ のリン脂質２分子膜への挿入モデル

図２ Calcein 封入 DPPC-liposome の調製方法
TZ:DPPC = 1:100 に混合した脂質をナス型フラスコにて減圧乾燥し、100 mM calcein (pH 7.5) 水溶液に懸濁して 10 mg lipid/ml とした。この懸濁液の凍結融解を５回行い、フィルター（孔径 100 nm）で限外濾過して粒径を揃えた後 Sephacryl S300 カラムでゲル濾過を行ってリポソーム外液のカルセインを除き、50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 緩衝液に懸濁された Calcein 封入 DPPC-liposome を得た。

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コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

２・２

蛍光色素を用いた膜安定性評価

された測定原理によると、漏出した calcein による蛍光強Calcein は本来強力な蛍光（Ex 488nm, Em 517nm）を度の経時的な増加のみで、現象は起きないはずであるが、発する蛍光色素であるが、高濃度では自己消光して蛍光を実 際 に は 図 ４ の（B），（D），（E） 等 に 見 ら れ る よ う に、発しない。Calcein が liposome の外部に漏出して希釈されバックグラウンドレベルの漸次的な減少が起きる場合があた場合にのみ蛍光を発するので、Calcein 封入 liposome 懸る。この原因として、漏出した calcein が希釈された状態濁液の蛍光を測定することで liposome 膜を横切る Calcein

では経時的に退色するのではないかと考え、その程度を確の漏出量を測定することが可能で、これが膜安定性の指標認するために calcein 水溶液の蛍光強度の時間経過を測定となる。懸濁液の蛍光強度の初期値を F0、ある条件でのした（図４（F））。

蛍光強度値を F’、0.03％（w/v）Triton X-100 を溶液に添

一般に DPPC-liposome 膜の安定性は pH に依存してお加して全ての liposome が溶解した後の封入 calcein 全量にり、酸性および塩基性 pH では、やや縦軸の数値が大きく基づく蛍光強度値を Ft とすると、以下の関係式により漏なる傾向がみられた。これは脂質の荷電の変化などによる出量を計算できる。

違いと思われる。図４の時間経過のグラフでは、測定値の点が control より下にあれば、膜が安定化されていると解漏出量（％） ＝ （F’− F0）／（Ft − F0）釈できることになる。

漏出量の数値が高いほど、liposome 膜が不安定化してZ，ZG，TZ の ３ 種 類 の カ ロ テ ノ イ ド の 添 加 に よ る

色素の漏出が促進されていると解釈できる。Liposome 調

DPPC-liposome 膜安定化効果の程度を、図４の時間経過製時に TZ をあらかじめ DPPC に対してモル比で１％添のグラフより 10 分（概ね、calcein 漏出の初期速度を表す加しておくと、TZ 添加 liposome となるので、非添加の場と考えられる）、および 200 分（概ね、calcein 漏出の到達合と比較して TZ の膜安定化効果を調べることができる。

定常値を表すと考えられる）における蛍光強度の数値について纏めた結果を表１に示す。表１では不等号または等号

２・３

好熱菌の脂質により膜安定化効果の強さの順序を表示してある。これら

DPPC で は な く T. thermophilus 由 来 の 脂 質 を 用 い たの結果より、TZ は pH4.0-10.0 の比較的広い pH 領域におCalcein 封入 liposome を作製する場合には、Hoshino 等にいて膜を安定化し、Z および ZG も少なくとも pH4.0-7.5

より作製されたカロテノイド欠損株である T. thermophilusの pH 領域では膜安定化効果を示すことが明らかとなった。

HB27Crt2 株を 70℃にて振とう培養し、菌体をリゾチーム

次に、Calcein 封入 DPPC-liposome を用いて様々な温処理した後に抽出した粗脂質を用いて、先述の方法と同様度での膜安定化効果を調べた。各温度で 30 分間インキュに Calcein 封入 liposome を作製した。

ベーションし、calcein 漏出量を調べた結果を図５に示す。

３．結３・１DPPC の相転移温度を超えると急に calcein 漏出量が増え果ること、相転移温度以上ではほぼ同程度のであることが判

DPPC-liposomeる。これは相転移により脂質の膜の流動性が大きく変化すCalcein 封入 DPPC-liposome を用いて様々な pH 条件でる為と思われる。の calcein 漏出を測定した（図４（A）-（E））。図３に示図３ Calcein 封入 liposome を用いた膜安定性の評価方法の原理
カルセイン封入リポソームを上記の緩衝液に希釈して各種の条件にてインキュベーションした後、カルセインの漏出を蛍光の自己消光解除により測定した（励起波長 488nm 発光波長 517nm）。各試料ごとの封入カルセイン量の違いを補正するために、界面活性剤を添加してリポソームを完全に崩壊させた場合のカルセイン放出量を 100% として放出の程度を表示した。

− 20 −

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図４ Calcein 封入 DPPC liposome を用いた膜安定性の評価試験の時間経過 (A)-(E)、および希釈後の calcein 自体の蛍光強度の経時変化 (F)。カロテノイドを添加しない control（●）、 DPPC に対して Z（○）、ZG（▲）、TZ（△）をそれぞれモル比で 1% 添加した liposome を、25℃で上記の各緩衝液中でインキュベーションし、calcein 漏出を測定した。control に較べて漏出量が少ないほど、膜が安定化されたと推測される。

表１

カロテノイドによる DPPC-liposome 膜安定化効果のまとめ− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol.16, 2008

図５ Calcein 封入 DPPC liposome を用いた膜安定性の温度依存性。
カロテノイドを添加しない control（●）、 DPPC に対して Z（○）、ZG（▲）、TZ（△）をそれぞれモル比で 1% 添加した liposome を、各温度で３０分間インキュベーションし、calcein 漏出を測定した。control に較べて漏出量が少ないほど、膜が安定化されたと推測される。 DPPC の相転移温度を超えると著しく膜が不安定になる。高温でも TZ = Z > Control >ZG の順番で安定化効果あり。

図６ Calcein 封入 Thermus themophilus 脂質 liposome を用いた膜安定性の時間経過 (A)-(E) 。
カロテノイドを添加しない control（●）、 脂質に対して Z（○）、ZG（▲）、TZ（△）をそれぞれ概算モル比で 1% 添加した liposome を、25℃で上記の各緩衝液中でインキュベーションし、calcein 漏出を測定した。control に較べて漏出量が少ないほど、膜が安定化されたと推測される。 膜安定化効果は概ね TZ > Control >Z >ZG の順で、 TZ は膜を安定化するが Z および ZG は逆に不安定化する傾向が見られた。

３・２ T. thermophilus 由来脂質 -liposomeしたことにならないのではないかという批判を受ける可能T. thermophilus は糖脂質などを含むことがすでに報告されを用いて Calcein 封入 liposome を作製し、同様の膜安定ているため、同菌の細胞（菌体）から抽出した脂質を用い性評価を行った結果を図６に示す。DPPC-liposome の場て TZ 等の膜安定化効果を検証しないと本来の役割を検証

合とは異なり、TZ の添加は全ての pH 領域で liposome 膜以上の実験は全て DPPC-liposome を用いて行ったが、性もある。このため、T. thermophilus から抽出した粗脂質− 22 −

好熱菌由来カロテノイド化合物の生体膜安定化効果の研究

安定化効果を示すが、Z や ZG はその添加により、しばし学、生物物理学的研究分野で用いられるほか、患部に必要ば逆に膜を不安定化させる傾向が認められた。

な薬剤を効率よく投与するための選択的薬物送達系（DDS４．考
４・１: drug delivery system）や、薬剤の血液中の滞留時間を察延長するための徐放技術（CR: controlled release）の担体実験結果の考察

として、すでに細胞への遺伝子導入系（非ウイルスベクタ

カロテノイド主骨格の両端部に OH 基を有する zeaxanthin（Z）等の極性カロテノイドが膜貫通型脂質として、リンー）、医薬品（抗ガン剤等）、化粧品（各種の生理活性物質）、などに利用されている。

脂質膜の安定化に寄与することは、Nakatani 等により報

今回の calcein 封入 liposome のように、水溶性の薬剤を８）告されている 。また、カロテノイド以外の膜貫通型脂質内部に封入して用いることもあるが、水に不溶性の疎水性のとしては、古細菌（始原菌）由来の脂質が報告された例

薬剤を懸濁させる素材として用いる場合もある。どちらにしもある。我々は以前に T. thermophilus から抽出した TZても、liposome の安定性は薬剤の患部への到達効率や放出がリン脂質膜を安定化させる効果を持つことを、calcein速度を決めるものなので、膜の安定性を制御することは重要

封入 liposome を用いて初めて実験的に示したのであるが、な課題である。liposome の安定化技術は、これまでにも研今回の研究はさらに膜安定化効果の分子メカニズムを詳細究されてきた。天然の脂質を用いて安定な liposome を調整に検討するため TZ だけでなく、Z および ZG の合成標品できる脂質を選択するだけでなく、分子設計に基づく特殊なを用いて実験を行った。

脂質の合成、脂質分子間の化学架橋や、liposome の膜表12）

一般にリン脂質からなる liposome 膜の安定性は DPPC面に高分子を付加して被覆する安定化方法など、様々な技法

等のような単一組成の脂質よりも大豆、卵黄、大腸菌などが発明されてきている。これらの方法は確かに膜の安定化天然物から抽出・精製した脂質を用いた liposome の方が技術として有効であるが、化合物の安全性については未確認高いことが多い 。おそらく様々な鎖長の脂肪酸を含む膜のものも多い。我々が研究対象とした TZ はこれまでにも食の方が、熱的な揺らぎに対して安定なのではないかと思わ品に添加されてきた天然のカロテノイド色素と類似の構造を一れる。今回の実験では化学合成した TZ に対して脂肪酸の部持った化合物であり、今後、DDS や CR の素材として医鎖長の揃った DPPC を先ず実験に用いた。天然の PC を薬品や食品への利用が期待される化合物である。今回の実用いて calcein 封入 liposome を作成した場合には、カロテ

験 では、有機 化学的に合成された TZ を実 験に用いたが、ノイドを添加しない liposome でも、室温（25℃）で、200

Hoshino 等により遺伝子組み替え技術を用いた TZ 大量生産分程度の時間ではほとんど calcein の漏出が起こらないた

株もすでに作られているので、将来的には微生物を用いた大め、同様の膜安定化試験を行うことが困難であった。

量生産も可能と思われる

９）

４, ５）

今 回 の 研 究 で、TZ は DPPC-liposome に お い て も T.

。

５．総

thermophilus 由来脂質 liposome においても、良好な膜安括定化効果を示したが、ZG 等は膜の安定化に効果のある場

我々は、TZ がその存在菌である T. thermophilus 由来脂合と、逆に不安定化させる効果のある場合が明らかになっ

質 liposome においても、良好な膜安定化効果を示すことた。この結果はどちらかと言うと意外なものであったが、を実験的に示した。TZ が天然物由来の安全な膜安定化剤

図１に示した構造式からも判るように、ZG はそもそも疎として、各種の liposome に添加され、DDS などに利用さ水性のカロテノイド主骨格の片側の末端にグルコースが付れることを期待している。

いた構造を持っているので、界面活性剤として作用しても謝おかしくない構造を有している。このため、脂質膜に対しては界面活性剤として作用し不安定化する場合もあるのかも知れない。

辞本研究ならびに関連の研究を遂行するにあたり、財団法人コスメトロジー研究振興財団より研究助成を賜りました

今回の実験では DPPC に対するモル比で１％程度の極こと、ならびに山野由美子（神戸薬大）、伊藤允好（神戸めて少量の TZ を脂質に加えただけであるにも関わらず、薬大）、苑輝卿（山東医科大）、三宅淳（産総研）、星野貴行（筑顕著な liposome 膜安定化効果を示しているので、TZ は図波大）、横山昭裕（東ソー）の各先生を含めた共同研究者

１のモデルに示されたような膜貫通型の脂質として強力なの皆様に御協力頂いたことを、感謝の意を込めて付記させ安定化効果を発揮しているものと結論できる。て頂きます。

４・２（参考文献）TZ の産業への利用の可能性

Liposome は、生体膜を構成する脂質や膜蛋白質の機能

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extreme thermophilic bacteria belonging to the genus− 23 −

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