アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求
東北大学大学院

鈴薬学研究科木巌

We synthesized lipophilic cyclodextrins (CDs) having ionizable amino groups to investigate their abilities to form
ion pair compounds with a biologically important reducing agent of ascorbic acid (vitamin C, AsA). Although permethylation on the hydroxy groups of hydrophilic CD derivatives to make them lipophilic is unsuccessful, peracetylation affords lipophilic CD derivatives having amino groups with excellent yields. The preliminary studies usinghydrophilic amino-CDs revealed that the amino group introduced to the β-CD platform is able to form an ion pair withAsA. The binding constants of two monoamino-β-CDs, one of which has an amino group at the primary hydroxy side(1) and the other has it at the secondary hydroxy side (2), for AsA are 140 and 220 M − 1, respectively, indicating thesuperiority of the secondary hydroxy side modification. β-CD itself may bind AsA, but the binding constant for theβ-CD-AsA complex cannot be obtained spectroscopically. Guest binding studies with adenine nucleotides, which have
similar negative charges support the ion pair formation between amino-CDs and AsA even in the highly polar aqueoussolutions. Binding AsA by the amino-CDs is also supported by the retardation effect on the oxidative degradation ofAsA. Ion pair formation between lipophilic CDs having amino groups and AsA is indicated by liquid-liquid extraction
and liquid membrane transportation experiments. When the hydroxy groups of 1 and 2 are acetylated (Ac1 and Ac2,respectively) to make them lipophilic, they successfully extract AsA dissolved in aqueous phase into ethyl acetate phase
where the lipophilic amino-CDs exist. The extraction abilities of Ac1 and Ac2 are greater than tetrabutylammnonium
bromide, a well know ion pair agent, indicating that both amino group and CD framework are critical for the uptake ofAsA from aqueous to organic phases. As the binding strength difference observed for the corresponding hydrophilicCDs, 1 and 2, the secondary hydroxy side modification is superior to the primary hydroxy side modification indicated by
the greater extraction ability of Ac2. The results obtained in this study suggest that (1) lipophilic amino-CD derivatives
may be useful in uptake of AsA across an organic layer, especially those which have amino groups at the secondaryhydroxy side, and (2) the transmembrane permeation abilities of lipophilic CD derivatives for AsA may be estimatedfrom simple binding studies in aqueous solutions using corresponding hydrophilic CD derivatives.

１．緒

がら，脂溶化 AsA 誘導体は脂質膜中に滞留する傾向が高言

く，細胞内への AsA の導入には AsA を直接吸収させる

アスコルビン酸（AsA; Fig. １）はその標準酸化電 E'º方が効率が良いといえる．本研究では，AsA 同様，生体が 0 . 127 V（vs. NHE, pH 5 . 0）であり，容易に酸化されるに対する毒性が著しく低いシクロデキストリン

物質，すなわち還元剤であり，生体に対する著しい低毒性（CD; Fig. 2）３）に正電荷を持たせ，かつ脂溶化することで，とあわせ，生体内で発生する酸化作用を有するラジカル種

AsA と脂溶性のイオン対を形成させ，AsA の膜透過を実を還元することで抗酸化作用の主要な部分を担っている物

現可能か否かについての検討を行うこととした．

質である ．一般に AsA のような高い親水性を有する化
１）

２．実合物の場合，生体はそれらの物質が必要とされる標的細胞

験に，それらに対する輸送タンパクを生体膜上に具備し，そ２．１の膜輸送を行っている．しかしながら，輸送タンパクがな

水溶性 β-CD の過アセチル化：β-CD あるいは既報４- ６）にい細胞や，AsA を積極的に外部か投与しその優れた抗酸より合成したアジ化 -β-CD あるいは 2 , 3 - マンノエポキシ化作用を発揮させる場合には，細胞表面にて親水性物質を

ド -β-CD をピリジンに溶解させ無水酢酸を加え，50℃にて本質的には透過させない生体膜の存在は大きな障害となる．

２日間反応させた後，溶媒溜去．残滓にクロロホルムを加AsA の経皮投与などを考慮する場合，疎水性の細胞膜やえ，硫酸水素ナトリウム溶液，炭酸水素ナトリウム溶液，細胞間脂質を透過させる必要があり，この観点から AsA

および飽和食塩水にて洗浄後，シリカゲルカラムクロマトに脂溶性側鎖を導入する試みがなされている ．しかしな

グラフィーに附し（溶媒は酢酸エチル - メタノール系），２）

Development of Carrier Molecules Capableof Transmembrane Permeation of Ascorbic
Acid and Exploration of Its Mechanism

合成

目的物を収率 83 〜 92％で得た．
Ac 1 の合成：上で得られた過アセチル化 - アジ化 -β-CD をメタノール - 酢酸溶媒中，水素雰囲気下でパラジウム触媒

Iwao Suzuki

による接触還元を常温，常圧で行い目的物を収率 75％で得た．

Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Tohoku University

Ac 2 の合成：上で得られた過アセチル化 - 2 , 3 - マンノエポ
キシド -β-CD に，ベンジルアミンを作用させ，シリカゲルショートカラムクロマトグラフィーにて精製（溶媒は酢酸− 84 −アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

エチル - メタノール）した後，このベンジル基を Ac 1 での濃度になるよう，各種水溶性 β-CD 誘導体を添加し，円行ったのと同じ条件下，パラジウム触媒による接触還元に二色性スペクトルを測定し，265 nm 付近の円二色性強度て除去し，目的物を収率 44％で得た．

変化より，ベネジ - ヒルデブランドプロット８）より，結合定数を算出した．

２．
２

AsA の安定性

AsA 1 . 0 mM と各種水溶性 CD 誘導体と 5 . 0 mM 含むリ

２．４液 - 液抽出実験

ン酸緩衝液（100 mM; pH 7 . 2）を恒温槽中に放置し，定期

AsA 1 . 0 mM リ ン 酸 緩 衝 液（5 . 0 mL） と 各 種 脂 溶 性的にサンプルを採取し，HPLC（UV 検出，波長 284 nm；β-CD 誘導体を 1 . 0 , 2 . 0 , 3 . 0 mM になるよう溶解させた酢

ODS カラム 4 . 6 × 150 mm；溶離液 pH 5 . 0 リン酸緩衝液：酸エチル溶液をマグネチックスターラーにて 900 rpm の角

アセトニトリル（８：２），5 mM の臭化テトラエチルア

速度にて 10 分間攪拌し，２相に分離後，水相および有機ンモニウム（TBAB）を含む）にて AsA を定量し ，擬２に同じ）にて AsA を定量，相を採取し，HPLC（条件は２．

一次反応速度式に従い AsA の見かけの消失速度定数 k を分配係数 Kp（=[AsA] 有機相 /[AsA] 水相）を求めた．

７）算出した．温度は７，15，25，35，45℃の各温度で行い，アレニウスプロットおよびアイリングプロットより活性化‡２．５

エネルギー Ea，頻度因子 A，活性化エンタルピー ΔH ，‡および活性化エントロピー ΔS を求めた．

液膜輸送実験AsA の液膜輸送には内径 20 mm，高さ 70 mm，連結部の長さ 50 mm，連結部の内径 20 mm の H 型セルを用いた．
送 出 相 と し て 10 mM の AsA の pH 5 . 0 リ ン 酸 緩 衝 液

２．
３結合定数の算出

5 . 0 mL，受取相として pH 5 . 0 リン酸緩衝液 10 . 0 mL を用い，

AsA の 7 . 5 × 10 M 水溶液（pH 5 . 0 リン酸緩衝液）に種々-5有機相には各種脂溶性 β-CD 誘導体を 5 . 0 mM 含む酢酸エチル溶液 30 mL を用いた．定期的に２つの水相から 10 mL２をサンプリングし，適宜希釈した後，HPLC（条件は２．に同じ）にて AsA を定量した．なお，実験中，２つの水相はマグネチックスターラーにて 100rpm の角速度にて攪拌した．

３．結
３．１

果CD 誘導体の合成

本研究で用いた，あるいは合成を試みた β-CD 誘導体をTable 1 に示した．CD の１つの水酸基にを常法によりトシル化した後，アジドあるいはエポキシドに導き，これら中間体の残存する水酸基をピリジン中で無水酢酸を用いる
Fig.1 Structures of ascorbic acid (AsA), its deprotonatedform, and dehydroascorbic acid.

Fig.2

アセチル化７）あるいは DMF 中 NaH- ヨウ化メチルを用いるト
Table 1Structures and space filling model of β-CD.

− 85 −

Structures of β-CD Derivative Used in This Studyリメチル化，あるいは DMF-DMSO 混合溶媒中 Ba（OH）
2 -BaO

β-CD およびその誘導体について，AsA の包接が起こるか共存下でジメチル硫酸で処理するジメチル化により脂溶化否かを検討した．Fig. ４に AsA の円二色性スペクトルとを試みた．最後にアジド基は還元し，エポキシ基はベンジそれに及ぼす各種水溶性 β-CD 誘導体の影響を示す．AsA

ルアミンによる環解裂後，接触還元によりアミノ基へと変と β-CD との包接化合物形成は，すでに AsA の吸光度と換した．メチル化した場合には，副生物が多く中間体の精電極反応に及ぼす β-CD の影響よりその結合定数が pH １製が困難であった．一方，アセチル化を施した Acb，Ac 1，

で K= 1200 M - 1 と報告されている９）が，われわれが行った

Ac 2 では，一般に良好な収率で目的とする CD 誘導体を円二色性ならびに NMR の結果では pH 5 および 7 で β-CD得ることができた．CD に複数のアミノ基を導入した Ac 3が AsA を包接しているという確証は得られなかった．しは，副生物が多く目的物を純品で得ることはできなかった

かしながら，Table 2 に示したように，AsA の酸化分解をが，予備的に実験に用いた．

抑制するため，弱いながらも包接は起こっている可能性が高い．一方，アミノ化した β-CD である１および２では，３．
２

水溶性 CD 誘導体による AsA の包接の確認

AsA の円二色性スペクトルが１および２の添加により変

脂 溶 性 CD 誘 導 体 を 用 い る 前 に， 脂 溶 化 し て い な い化したことから，１と２は AsA を包接していることが示唆された．この円二色性スペクトルの変化より，結合定数が算出可能であり，１は K= 140 M - 1，2 は K= 220 M - 1 にてAsA を包接することが明らかとなった．
AsA の水溶液中（pH 7 . 2）での安定性に及ぼす各種 CD誘導体の効果をみたところ，円二色性スペクトル上にて包接が示唆された１と２では，顕著に AsA の安定性を増大させた（Table 2）．また，AsA の分解過程の DH と DS に及ぼすこれら CD 誘導体の影響は小さく（Table 3）10），AsA の酸化分解祖素反応には CD は関与しない，すなわち，包接することで AsA の酸化分解を抑制していることが強く示唆される．
β-CD のメチル化体である 2 , 6 - ジメチル -β-CD（DM）と 2 , 3 , 6 -トリメチル -β-CD（TM）は両親媒性物質であり，水溶性を具備していることから円二色性による包接の確認を行ったところ，AsA の円二色性スペクトルに影響を与え，包接化合物形成が示唆された．しかしながら，結合定数解析では，１：１の包接を仮定しても，結合定数が得られず，他の化学両論比の包接化合物の形成が考えられるが，現時点ではその詳細は不明である．また，他の β-CD 誘導体とは異なり，DM と TM は AsA の安定性を減少させたことから，あるいは溶存酸素を含んだ形の包接化合物を形成している可能性も考えられる．
水溶液中におけるイオン対形成が可能なことは，AsAと同様の負電荷を生理学的 pH において負電荷を有し，かつ５炭糖部分を持つアデニンヌクレオチドを用いて，さらに検討した．円二色性スペクトルによる検討から，各種アデニンヌクレオチドと１および２との間の包接化合物の結合定数を得ることができた（Table 4）．その結果，やはり
CD 上にアミノ基を導入することにより，ゲストアニオンとの間の効果的なイオン対形成が起こり，電荷を持たない
β-CD よりも各種アデニンヌクレオチドを強く認識できる

Fig.4 Circular dichroism spectra of AsA (7.5×10-5M) in phosphate buffer solutions (pH7.4), alone or in the presence of
5.0mM of β-cd (top), 1 or 2 (middle), and DM (bottom).

ことが明確に示された．さらに，1 H-NMR スペクトルを検討したところ，リボースのアノマープロトンが CD 誘導体添加によって大きくシフトし，アデニンヌクレオチドで− 86 −

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

Table 2. Apparent Pseudo-First Order Rate Constants for Auto-Oxidation of AsA in at
Various Temperaturea,b)でより効果的なイオン対形成が期待された．そこで，有機相に酢酸エチルを用い，その中に各種脂溶化 CD 誘導体を溶解させ，水相中に存在する AsA の抽出能を検討した．なお，有機相の溶媒として酢酸エチル以外にもクロロホルムや n- ブタノールを用いたが，その場合には混合・振とう時にエマルジョン形成が起こったため，抽出能を評価することは不能であった．液 - 液抽出の結果を Table 5に示す．β-CD の過アセチル化体である Acb は AsA の有機相へのTable 3. Activation Eneregy (Ea), Activation Enthalpy (∆H‡), and Activation Entropy(∆S‡) for the Auto-oxidation of AsA

抽出には何ら効果を示さなかったの に 対 し， ア ミ ノ 基 を 有 す る
Ac 1 では小さいながらも抽出能が認められた．さらに，Ac 2 はAc 1 よりも効果的に AsA を有機相へと移行させることがわかった．
両親媒性物質である DM およびTM はアゾ色素の液膜輸送に有効であることが報告されているが，AsA の液 - 液抽出においては，

11）

全くその効果を示さなかった．これらは上述の通り，水溶液中でTable 4 Binding Constants of β-CD Derivatives for Adenine Derivatives in pH 7.4
Aqueous Solutions at 25℃

AsA を包接することが示唆されており，かつ有機溶媒に可溶であるにもかかわらず，AsA の有機相への移行を行いえなかったことから，有機相への AsA の移行には CD の空洞のみではなく，正荷電を持ちうるアミノ基の存在が重要であること，したがって，水相- 有機相の界面でのイオン対形成が必要であることが示唆された．
このことは対照実験として行った
TBAB をイオン対形成剤として用いた場合に，わずかではあるが，はアデニン環ではなく，リボース部分が包接されることが有機相への移行を観察できたことからも支持される．また，判明した．

TBAB と Ac 1 や Ac 2 の AsA に対する分配係数 Kp を比較すると，Ac 1 で約２倍，Ac 2 では約４倍の抽出能が認

３．
３

脂溶性 CD 誘導体による AsA の液 - 液抽出められた．このことから，単なるイオン対形成ではなく，水溶性 CD 誘導体による結果から，アミノ基を導入した界面での包接に CD 空孔も関与していることが示唆された．

β-CD 誘導体はイオン対形成を補助駆動力として AsA を包接することが示唆された．したがって，より疎水的な環境３．４下では Ac 1，Ac 2 などの脂溶化した β-CD 誘導体との間− 87 −脂溶性 CD 誘導体による AsA の液膜輸送

前節での結果をふまえ，H 型セルを用いる AsA の液膜

Table 5 Partition Co-efficient (Kp) of AsA between Aqueous and Ethyl Acetate Layersa)

４．考察

AsA は 親 水 性 物 質 で あ り，主として疎水性相互作用を駆動力とする β-CD とは包接化合物を形成しにくい物質である．しかしながら，CD は安息香酸アニオンを包接する際に，極めて親水的であるはずのカルボキシラート部分を疎水性空孔内に取り込んでいることが知られており 12），AsA についても，すでに 報 告 さ れ て い る よ う に，Table 6 Transmembrane Transportation Rates (unit in mM h-1) at 25℃ for AsA Mediated by Lipophilic CD Derivativesa)

β-CD に包接される可能性は否定できない．それが AsA の安定性改善に対する要因であると思われるが，他の分光学的手法
では包接化合物形成を確認できず，その結合定数値は小さいもの と 推 定 で き る． 対 照 的 に，輸送について検討した．ここでも有機相として酢酸エチル

pH ５あるいは pH 7 . 2 にてプロトン化し，正電荷を有するを使用した．その結果を Table 7 に示す．液 - 液抽出にて１および２では，水溶液中においても AsA を包接しうる効果のなかった Acb と DM, TM は，予想通り AsA の液ことが示唆された．これは，ホスト側に正電荷，ゲストで膜輸送を行い得なかった．これに対し，液 - 液抽出にて効ある AsA に負電荷があり，その間でイオン対形成が起こ果を示した Ac 1 および Ac 2 は，おそいながらも液膜輸送

り，AsA が β-CD 空孔に包接されたものと考えることがでを行いえた．すなわち，Ac 1 は 0 . 0146 mMh の速度で，きる．このことは，AsA と同じく生理学的 pH にて負電

また Ac 2 は 0 . 0201 mM h の速度で送出相から受取相へ荷があり，かつ５炭糖構造を有するアデニンヌクレオチドと AsA を輸送した．Ac 1 および Ac 2 は本来，荷電を持に対する CD 母核上のアミノ基のイオン対形成に基づく包たない形であり，プロトン化することで正荷電を獲得する．

接力の増強からも確認することができる．

-1-1

したがって，Fig. 3 に示したように，界面で AsA ととも

ここで，CD の修飾位置に関する違いを見てみると，１にプロトンを送出相から受け取り，受け取り相との界面に級水酸基側にアミノ基を導入したものより，２級水酸基側て AsA とプロトンとを放出する機構が考えられる．また，にアミノ基を導入したものの方が，AsA の安定性の増大

精製が不充分ではあるが，２つのアミノ基を有する Ac 3に対する効果が大きい．このことは，２倍の水酸基が存在を液膜輸送の単体として用いたところ，界面が時間の経過し，より親水的な環境であると考えられる CD の２級水酸とともに白濁し，長時間での測定は不能であったが，初期基側に正電荷を導入することで，より効果的な AsA の包の輸送速度は 0 . 0226 mM h であり，この結果は複数のア接を行うことが可能になることを示している 13）．

-1

ミノ基の CD への導入により，より効果的な AsA の膜輸

この２級水酸基側への正電荷の導入の優位性は，CD を送担体とすることができる可能性を示唆するものである．

脂溶化した Ac 2 においても，液 - 液抽出ならびに液膜輸送実験にも現れた．すなわち，対応する１級水酸基側修飾体である Ac 1 に比べ，液 - 液抽出能で約２倍，液膜輸送能で約 1 . 4 倍の効果を AsA の有機相移行に対して示した．
また，イオン対試薬として汎用されている TBAB とも比較して，Ac 2 は約４倍の液 - 液抽出能，および約 2 . 5 倍の液膜輸送能を AsA に対して示した．このことは，液 - 液界面にて AsA と Ac 1，そして特に Ac 3 は単なるイオン

Fig.3 Proposed mechanism for Ac1- or Ac2-mediated transportation of AsA across liquid membrance.

対形成によって AsA を有機相に移行させるのみでなく，AsA の形状を認識して包接することを示唆している．し− 88 −

アスコルビン酸膜透過促進キャリアーの開発と機構探求

かしながらアミノ基のない Acb や，水溶液中でも AsA を

Extracellular Matrix Construction: Nippon Rinsho, 57 ,包接することが示唆された DM および TM では界面でのAsA の捕捉を行い得なかったことから，界面における2223 - 9 , 1999 .
２）

For example; Schmid E, Figala V, Roth D, et al.,

AsA 認識の主たる駆動力はイオン対形成であり，CD 空孔:Antioxidant and Nuetrophil-Inhibiting Properties ofの関与する認識力（おそらくは van der Waals 力であろう）

New 2 -O-Methyl- 6 -(alkylthio)ascorbic Acid Derivatives:は補助的な役割を担っていると考えられる．

J. Med. Chem., 36 , 4021 - 4029 , 1993 .

アミノ基を有する CD 誘導体について，本研究から得ら３）れた示唆の１つとして，水溶液中で AsA を包接しうるもSupramolecular Chemistry, Volume 3 , Cyclodextrins:のは，界面においても有効なホストとして機能し，水溶液中での包接の強さと界面での捕捉力にはある程度の相関がPergamon, Oxford, 1996 .
４）認められたことである．まだ例数が少ないため，確定的な18 , 29 - 37 , 1971 .
５）の AsA 輸送キャリアーをスクリーニングする手段として，簡便である水溶液中での各種分光的手法による包接化合物

戸田不二緒監修・上野昭彦編集，：シクロデキス

トリン−基礎と応用−：産業図書，東京，1995，第４章．
６）

形成を確認することで代用できる可能性がある．

５．総Melton LD, Slessor KN, :Synthesis of

Monosubstituted Cyclohexaamylose: Carbohydr. Res.,

ことはいえないが，仮に水溶液中での結果と界面での捕捉力とがパラレルな関係にあるとすると，今後，このタイプ

Szejtli J, Osa T (eds), :Comprehensive

Teranishi K, Watanabe K, Hisamitu M. Et al.,:Efficient Regioselective Synthesis of Mono- 2 -O-SulfonylCyclodextrins by the Combination of Sulfonyl

括Imidazole and Molecular Sieves: J. Carbohydr. Chem.,

本研究でこれまでに得られた成果は上述の通りである．
すなわち，β-CD にわずか１つのアミノ基を導入すること

17 , 489 - 494 , 1998 .
７）Pappa-Louisi A, Pascalidou S, :Optimal

で，水溶液中での AsA の安定性を向上させることが可能

Conditions for the Simultaneous Ion-Pairing HPLCであった．これはこれら CD を基盤とする分子がホスト分

Determination of L-Ascorbic, Dehydro-L-Ascorbic,

子として AsA を包接し，溶存酸素による酸化を抑制する

D-Ascorbic, and Uric Acids with On-line Ultraviolet

機能を有していること示すものである．さらに，これらのAbsorbance and Electrochemical Detection: Anal.

水溶性 β-CD を過アセチル化により脂容化することで，少Biochem., 263 , 176 - 182 ( 1998 ).

なくとも酢酸エチル相への AsA の移行を促進することが８）

Benesi HA, Hildebrand JH, :A Spectrophotometric

可能であった．予備的に行った２つのアミノ基を有する脂Investigation of the Interaction of Iodine with

溶性 β-CD 誘導体は１つのアミノ基のみを有する β-CD 誘

Aromatic Hydrocarbons: J. Am. Chem. Soc., 71 , 2703 -導体よりも効率的に AsA の有機相への移行を促進する結2707 ( 1949 ).

果が得られており，今後，２つのアミノ基を有する β-CD９）

Manzanares MI, Sol s V, de Rossi RH, :Effect of

誘導体の効率的合成法および精製法を確立することで，あCyclodextrins on the Electrochemical Behaviour of

るいはより効果的なキャリアー分子を開発できる可能性がAscorbic Acid on Gold Electrodes: J. Electroanal.

ある．

Chem., 407 , 141 - 147 ( 1996 ).

本研究では，AsA の脂質膜透過を促進するキャリアー

10）分子を，生体に対する毒性の低い CD 誘導体にて実現させる系についての検討を行う予定であったが，肝心の脂質膜中間報告に記載のデータに誤りがありました．謹

んでお詫びいたします．
11）

Harada A, Takahashi S, :Transport of Neutral

透過性を検証するには至らなかった．この点については，

Azobenzene Derivatives by Methylated Cyclodextrins:今後も引き続き検討する予定である．

J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1987 , 527 - 528 .
12）Suzuki I, Obata K, Anzai J, Ikeda H, Ueno A,

引用文献:Crown Ether-tethered Cyclodextrins: Superiority of１）

Kaneko K, Nagao N, Miwa N, :Vitamin C:

the Secondary Hydroxy Side Modification in Binding

Atructure-activity Correlation and Cytoprotective

Tryptophan: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 , 2000 , 1705 -Actions through Free Radical Scavenging and1710 .

− 89 −