Microb. Resour. Syst. 33
Dec.
（2）
：55
2017─ 62, 2017Vol. 33, No. 2

酵母共培養法を用いた乳酸菌の新規分離法の開発とミャンマー産発酵食品からの分離
乙黒美彩1）＊，前田康太郎1），岸本宗和1），山村英樹2），安藤勝彦3），Nyunt Phay4），
早川正幸2），柳田藤寿1）
山梨大学ワイン科学研究センター 〒400-0005 山梨県甲府市北新 1-13-1
2）
山梨大学大学院生命環境学域 〒400-0035 山梨県甲府市武田 4-4-37
3）
独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE），バイオテクノロジーセンター（NBRC）〒292-0802 千葉県木更津市かずさ鎌足 2-5-8
4）
Pathein University, Pathein, Myanmar
1）

乳酸菌の分離に一般的に用いられているのは集積培養法や希釈平板法であるが，分離される乳酸菌の種類は優占性や増殖速度に依存している．本研究では酵母との共培養を利用したこれまでに報告例のない新規乳酸菌を効率的に分離することを目的に方法を構築した．さらに，開発した方法を用いてミャンマーの伝統的発酵食品から乳酸菌の希少種を分離し，本手法が多様性評価に有用であるか検証した．
予備試験として既知の乳酸菌 18 種 2 亜種と酵母 6 種を用いた共培養試験（組み合わせ 114 通り）において，特定の乳酸菌と酵母の組み合わせは，ともに培養することにより乳酸菌の生育を促進あるいは抑制することが明らかとなった．この現象を応用し分離源試料を Saccharomyces cerevisiae 等の酵母とともに液体培地中で共培養し，次いで平板分離する酵母共培養法を構築した．本法の有効性を評価するため，ミャンマーの発酵食品 8 点（魚やエビのなれ鮨，発酵ペースト）を用いて，酵
母共培養法および希釈平板法により 52 株の乳酸菌を分離し，16S rDNA 解析による簡易同定を行った．ミャンマー産乳酸菌
は 3 属，15 種に配属され，Lactobacillus 属が最も多く 85％（44 株）を占めた．16S rDNA 解析に基づく新種推定株は希釈平板法から 1 株，酵母共培養法から 2 株が分離された．Lactobacillus 属分離株のなかには近年台湾やタイの発酵食品から分離例のある L. futsaii や L. plajomi が含まれていたが，いずれも希釈平板法で分離された．一方，Weissella 属は S.
cerevisiae との共培養分離法でのみ分離することが可能であった．これらから，開発した共培養法を発酵食品に適用すること
で，通常の希釈平板法では分離することができない乳酸菌種が得られることが示された．

キーワード：isolation of lactic acid bacteria，co-culture with yeast

自然環境中ではさまざまな生物や微生物が共生し多えられる．酵母と乳酸菌の共存に関する研究は古く，様な生態系を形成している．特に，微生物はさまざま

乳酸菌と酵母の共培養において，乳酸菌や酵母の生育な宿主と共生関係を構築することが可能で，その代謝が有意に変化することが報告されている（Nakamura

機能は共生により過酷な環境中でも生育ができるよう& Hartman, 1961）．近年では，酵母が共存すると酵母に進化してきたものと推察できる．われわれに身近なが有機酸を資化するために，乳酸などの過剰な酸の生

微生物の共生環境としては発酵食品が挙げられる．伝成による乳酸菌の死滅を防ぐことが可能であることな

統的な発酵食品は国や地域などにより多様な食文化がどが明らかにされ（古川・片倉，2012），微生物間の相発達しており，特に乳酸菌と酵母の共存により製造さ互作用がさまざまな角度から研究されている（Onaka

れる数多くの発酵食品が知られている．乳酸菌は栄養

et al., 2011; Furukawa et al., 2015; Sawada et al.,要求性が高いため，生育にはアミノ酸やビタミンなど

2015）．

多くの栄養素が必須である．乳酸菌が酵母と共生する

ミャンマー連邦は東南アジアのインドシナ半島の西ことの利点として，これらの栄養源の供給を酵母が担部に位置し，北に中国，東にタイ，ラオス，西にはイ

うとともに，酸化ストレスが軽減されることなどが考

ンド，バングラディッシュに国境を接している．広大な自然環境を擁し，哺乳類，爬虫類，鳥類，植物類を＊Corresponding author

含めるとおよそ 7000 種以上の動植物が生息している．

E-mail: motoguro@yamanashi.ac.jp

また，乾期と雨期が明確に区別される典型的な熱帯性

Accepted: August 22, 2017

気候を示す．他の東南アジアの国々同様に部族や民族
─ 55 ─

乳酸菌の新規分離法の開発と分離

乙黒美彩ら

ごとにさまざまな発酵食品文化が受け継がれている．

社製）で生育し，シクロヘキシミドに感受性であるこミャンマーにはエビやカニ，魚といった魚介類を原料とを確認した菌種を使用した．乳酸菌，酵母をそれぞにした発酵食品や，豆や野菜といった植物を利用した

れ MRS 液体培地（Difco 社製）に接種し，30℃，2 日

発酵食品が多く，ンガピ（エビの発酵ペースト），パゾ

間，好気条件下前培養し，MRS 液体培地 3 ml をあら

ンチン（エビの馴れずし），モヒンガ（発酵麺）などがかじめ分注した 12 ウェルプレート（Thermo scientif-

知られている．一方で，これまでにミャンマー産発酵

ic 社製）に乳酸菌と酵母の前培養液をそれぞれ 50 μl

食品に由来する乳酸菌の網羅的な研究は行われておらずつ接種した．比較対象として乳酸菌のみを接種した

ず，ごく最近になり微生物探索が可能となったためものも調整した．本培養はアネロパック角形ジャーに，微生物遺伝子資源保有地域としての潜在的な価値（三菱ガス化学社製）にアネロパック・ケンキ（三菱ガは非常に高いと考えられる．

ス化学社製）を入れ，30℃，2 日間嫌気培養を行った．

本研究ではさまざまな発酵食品から新規乳酸菌を効

培養液を適宜希釈し，100 μl をシクロヘキシミド（和率的に分離するために乳酸菌の新しい分離方法として

光純薬，50 mg/l）を添加した MRS 寒天平板に塗布

酵母共培養分離法を開発するとともに，ミャンマーのし，再度 30℃，2 日間嫌気培養し出現コロニー数を計

伝統的発酵食品から乳酸菌を分離することで酵母共培測した．実験は同一条件で 2 回行い，S. cerevisiae，

養分離法の有用性を検証し，さらにミャンマーの発酵

Kluyveromyces marxianus お よ び Pichia fermentans

食品における乳酸菌の系統学的多様性を調査することに関してはさらに追試を行い，計 3 回の実験から有意を目的とした．

差検定を行った．なお，出現コロニー数は平均値で示

各種酵母が乳酸菌の生育に及ぼす影響を調査するた

した．

め，山梨大学ワイン科学研究センターに保存している

全部で 114 通りの組み合わせを試験したところ，S.

酵母 6 属 6 種と乳酸菌 7 属 18 種 2 亜種（Table 1）を

cerevisiae，K. marxianus および P. fermentans は 1

供試菌株とした．酵母はあらかじめ MRS 培地（Difco

回目と 2 回目の結果は促進や抑制の影響が同様な傾向

Table 1 List of strains used in this study
StrainOther No.

Yeast
Cryptococcus albidus RIFY 2036
Kluyveromyces marxianus RIFY 4040
Pichia fermentans RIFY 4078
Saccharomyces cerevisiae RIFY 1001
Schizosaccharomyces pombe RIFY 4021
Zygosaccharomyces rouxii RIFY 2078
Lactic acid bacteriaEnterococcus faecalis RIFY 5051
Lactobacillus alimentarius JCM 1095
Lactobacillus amylovorus JCM 1126
Lactobacillus collinoides JCM 1123
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM 1002
Lactobacillus farciminis JCM 1097
Lactobacillus fructivorans JCM 1117
Lactobacillus gasseri JCM 1131
Lactobacillus helveticus JCM 1120
Lactococcus lactis subsp. lactis RIFY 5050
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides NRIC 1541
Pediococcus acidilactici RIFY 5030
Pediococcus pentosaceus RIFY 5031
Streptococcus salivarius subsp. salius RIFY 5053
Streptococcus salivarius subsp. salivarius RIFY 5052
Weissella confusa JCM 1093
Weissella halotolerans JCM 1114
Weissella paramesenteroides NRIC 1542
Weissella minor JCM 1168
─ 56 ─NBRC 1320
NBRC 0690
NBRC 1164
W-3
NRRL Y-2548

Type strain
No
No
No
No
No
No
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
No
Yes
No
No
No
No
Yes
Yes
Yes
Yes

Microb. Resour. Syst. Dec. 2017Vol. 33, No. 2を示したが，Cryptococcus albidus，Zygosaccharomy-

ianus RIFY 4040，P. fermentans RIFY 4078）を 30℃

ces rouxii，Schizosaccaromyces pombe の 3 菌 種 は 1
回目と 2 回目の結果に同一の傾向が見られなかった．

で 2 日間培養したものを本培養とし，各酵母培養液 50
μl とサンプル希釈液 50 μl を，MRS 液体培地 3 ml を

そ こ で，S. cerevisiae，K. marxianus お よ び P. fer-

分注した 12 ウェルプレート（Thermo scientific 社製）

mentans の 3 菌種を選び 3 回目の試験を行った．これに接種し，30℃で 48 時間嫌気培養を行った．培養後，ら 3 菌種においてコントロールと比較して有意に乳酸共培養液を適宜希釈し，100 μl を分離培地に塗布し菌の生育に促進効果が認められた組み合わせが 15 通た．また，比較対象としてサンプル希釈液を段階希釈り，反対に乳酸菌の生育に対して有意に抑制効果が示

後，各溶液 100 μl を分離培地に塗布する希釈平板法もされたのは 18 通りであった（Table 2）．促進効果が大行った．各分離法により生育したコロニーを色，形状

きかったのは P. fermentans と L. delbrueckii subsp.

の違いから選択し，単離，純化した．

bulgaricus の組み合わせで約 47 倍であった．抑制効

乳酸菌の同定は PrepMan® ultra reagent（Applied

果が大きかったのは L. farciminis と K. marxianus ま

Biosystems, CA, USA）を用い分離株のゲノム DNA

たは P. fermentans と共培養した場合で，それぞれを抽出し，これを鋳型として PCR にてほぼ全長の1/14，1/18 にまで生菌数が減少した．一方，K. marx-

16S rDNA を増幅させ，ダイレクトシーケンスにて塩

ianus と共培養すると，試験した乳酸菌の 7 種 2 亜種

基配列を決定した．各菌株の塩基配列は ATGC（ゼネの生育が抑制される結果となった．P. fermentans はティックス）でアッセンブルを行い，1,200 bp 以上の10 種 2 亜種に促進または抑制作用があり．S. cerevi-

塩基配列について EzTaxon（Kim et al., 2012）にて相siae は乳酸菌の生育に及ぼす影響が最も大きく，11

同性検索を行った．なお，L. pentosus と L. planta-

種 2 亜種で促進あるいは抑制の作用が認められた．

rum の同定には相同性検索において上位の結果を採一方，2 回の試験結果で一貫した傾向が認められず用した．

有意差は求めていないが，Z. rouxii と L. helveticus

はじめに，酵母共培養法が新規乳酸菌の分離に有効の組み合わせで約 24 倍，Schizo. pombe と Pediococ-

であるかを確認する目的でパゾンチン（エビの馴れず

cus acidilactici の組み合わせで約 22 倍の促進作用がし，No. 198）を用い乳酸菌の分離実験を行った．比較あった．C. albidus は調査した菌株の生育に及ぼす影対象として，希釈平板法による分離も行い，各分離方

響 は 小 さ く，Lactococcus lactis subsp. lactis お よ び

法から 1 株または 2 株を選抜し同定した．希釈平板法

Streptococcus salivarius subsp. salivarius に対して影では L. farciminis および L. pentosus が認められ，希響があったのみであった．しかしながら，これら C.

釈平板法では分離されなかった L. tucceti が酵母共培

albidus，Z. rouxii，Schizo. pombe の 3 菌種について

養分離法により検出された．また，新種推定株も分離は，結果のばらつきが大きく詳細な共培養条件を検討することができた．以上より共培養分離法により通常する必要があると考えられた．

の希釈平板法では検出されなかった種や新種推定株が以上の結果から試験した酵母 6 菌種は乳酸菌の生育分離され，新規乳酸菌の分離に本法が有効であると考に影響を与えることが明らかとなった．特に S. cerevisiae

えられた（Table 3）．次に，魚の馴れずし（ンガチン）

RIFY 1001，K. marxianus RIFY 4040，P. fermen-

やエビの馴れずし（パゾンチン）から同様に希釈平板tans RIFY 4078 の 3 菌種は乳酸菌の生育に一貫した法と共培養法を用いて乳酸菌の分離を試みた．L. far-

影響を与え有意差が認められたことから，これら 3 菌

ciminis，L. plantarum，L. pentosus はいずれの分離

種を乳酸菌との共培養分離法に用いることとした．

法でも検出可能であったが，L. formosensis，L. mu-

ミャンマーのパテイン地区周辺のマーケットより発danjiangensis，L. songhuajiangnesis，L. tuccetei，

酵食品を取得し分離源とした．乳酸菌の分離培地にはWeissella 属は共培養分離法でのみ分離することがで

MRS 寒天培地（Difco 社製）を基本培地として，これきた．ミャンマーの発酵食品合計 8 点（エビの馴れずに抗カビ剤としてシクロヘキシミド 50 mg/l と炭酸し，No. 198 を含む）から分離した乳酸菌は 3 属，15カルシウム 0.1 g/l を添加したものを用いた．培養は種に配属され，Lactobacillus 属が最も多く 85％（4430℃にてアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）

株）を占めた（Table 4）．16S rDNA 解析に基づく新を用いて嫌気培養を行った．各サンプル 1 g を 0.75％

種推定株は希釈平板法から 1 株，酵母共培養法から 2

生理食塩水に懸濁しサンプル希釈液とした．共培養法株が分離された．

は，酵母 3 属 3 種（S. cerevisiae RIFY 1001，K. marx─ 57 ─

原記載によれば L. formosensis は Aspergillus 属と─ 58 ─

76
43
406
95
22
66
3
295

20
47
2
240

39
31
135
12
46
15

54
56
42
7
229
23
27
93
277
208

54
24
10
40
10

Cryptococcus
albidus
RIFY 2036a

22
21
28
20
4

Control

23
70
2
85

33
58
93
320

6
92
32
169
114
14

350
10
73
13
8

Zygosaccharomyces
rouxiiRIFY 2078a

10
67
3
77

592
893
85
149

2
47
15
14
212
307

101
192
53
11
10

23
122＊
4
132

62＊
67
99†
78†

5†
162＊
296＊
69＊
22†
6†

199＊
7
77＊
32
11

11
40
0
78

13
26†
140†
40†

4†
51
14†
3†
46†
11†

108＊
7
32
22
29＊

Schizosaccharomyces Saccharomyces Kluyveromyces
pombe
cerevisiae
marxianus
RIFY 4021a
RIFY 1001b
RIFY 4040b

Co-culture with

130＊
88
1
77

29
43
76†
61†

3†
42
251＊
13
44†
100＊

194＊
6
67＊
4†
187＊

Pichiafermentans
RIFY 4078b＊

a, value is the mean of duplicate test; b, value is the mean of triplicate test. S. cerevisiae, K. marxianus and P. fermentans performed a statistical analysis.
significant differences compared to control (P<0.05; t-test), growth acceleration. † significant differences compared to control (P<0.05; t-test), growth suppression.

Enterococcus faecalis RIFY 5051
Lactobacillus alimentarius JCM 1095
Lactobacillus amylovorus JCM 1126
Lactobacillus collinoides JCM 1123
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM
1002
Lactobacillus farciminis JCM 1097
Lactobacillus fructivorans JCM 1117
Lactobacillus gasseri JCM 1131
Lactobacillus helveticus JCM 1120
Lactococcus lactis subsp. lactis RIFY 5050
Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides
NRIC 1541
Pediococcus acidilactici RIFY 5030
Pediococcus pentosaceus RIFY 5031
Streptococcus salivarius subsp. salius RIFY 5053
Streptococcus salivarius subsp. salivarius RIFY
5052
Weissella confusa JCM 1093
Weissella halotolerans JCM 1114
Weissella paramesenteroides NRIC 1542
Weissella minor JCM 1168

StrainNumber of lactic acid bacteria (7 log CFU/mll)

Table 2 Effect of co-culture with yeast strains for growth of lactic acid bacteria

乳酸菌の新規分離法の開発と分離
乙黒美彩ら

Microb. Resour. Syst. Dec. 2017Vol. 33, No. 2

Table 3 Effect of co-culture method for the isolation of lactic acid bacteria from a food product of fermented shrimp
and rice (Pazon Chin, sample No. 198) in Myanmar
Number of strains
Co-culture with
Klyveromyces
Saccharomyces
marxinus
cerevisiae
RIFY 4040
RIFY 1001

Closest species based on 16S rRNA gene
Ditution methodsequence similarity rate (%)(Control)Lactobacillus farciminis
Lactobacillus tucceti
Lactobacillus pentosus
Lactobacillus plantarum subsp. planatarum
Lactobacillus sp.
＊

1

1

1

Pichiafermentans
RIFY 4078
1
1

1
1＊

A new species candidate with 16S rDNA similarity of 98.5% compared to the most homologous prototype species.

Table 4 Effect of co-culture method for the isolation of lactic acid bacteria from a food products of fermented
shrimp and rice (Pazon Chin) and fermented fish and rice (Ngar Chinin) Myanmar (8 samples)
Closest species based on 16S rRNA genesequence similarity rate (%)
Lactobacillus farciminis
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus formosensis
Lactobacillus futsaii
Lactobacillus mudanjiangensis
Lactobacillus namurensis
Lactobacillus plajomi
Lactobacillus pentosus
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus songhuajiangensis
Lactobacillus tucceti
Lactobacillus sp.
Pediococcus pentosaceus
Weissella cibaria
Weissella paramesenteroides

Number of strains
Co-culture with
Klyveromyces
Saccharomyces
marxinus
cerevisiae
RIFY 4040
RIFY 1001
21
1
2

Ditution method(Control)
4

1
1
1
1
1

1＊
1

Pichiafermentans
RIFY 4078

8
2

1

2

1
1
1
1

1
5

2
1

1＊

1＊
1

1
1
2

2
＊

New species candidate

Lactobacillus 属の菌株により発酵した大豆粕から分た種である（Gu et al., 2013）．サワードウーは酵母と離されている（Chang et al., 2015）．L. formosensis 分

乳酸菌を共発酵させて作製する伝統的なパン種であ離株 8 株はいずれも P. fermentans との共培養でのみり，共培養分離法はこれに着想を得ている．L. song-

分離され，S. cerevisiae や K. marxianus との共培養

huajiangnesis と同定した分離株のエタノール耐性はでは分離されなかったことは，エタノール耐性の違い

未調査であるが本研究において S. cerevisiae との共培が影響しているものと考えられた．Clemente-Jimenez

養法でのみ分離することが可能であったことを考慮す

et al.（2005）の報告では P. fermentans のアルコール

ると，L. formosensis 分離株とは異なり，L. songhua-

生成量は最小培地およびブドウ果汁による発酵試験でそjiangnesis 分離株は高いアルコール耐性を有している

れぞれ 2.0 mg/l，5.0 mg/l となり S. cerevisiae（4.0 mg/l

ものと推察できる．

および 10.6 mg/l）のおよそ半分であることが示され

本研究では魚やエビを原料とする馴れずし 8 点からて い る．L. songhuajiangnesis は 2013 年 に 中 国 の サ

乳酸菌を 52 株分離した．新種推定株も含めるとそのワードウーから分離された菌株として初めて記載され内訳は 3 属 17 種に及んだ．16S rDNA 解析に基づく
─ 59 ─

乳酸菌の新規分離法の開発と分離

乙黒美彩らを行うべきである．

新種推定株は希釈平板法から 1 株，酵母共培養法から2 株が分離された．Lactobacillus 属分離株のなかには

謝

近年台湾やタイの発酵食品から分離例のある L. futsaii

辞（Chao et al., 2012） や L. plajomi（Miyashita et al.,

本研究は JSPS 科研費 JP26304006 ならびに公益財2015）が含まれていたが，いずれも希釈平板法で分離

団法人発酵研究所大型研究助成「熱帯地域に生息するされた．一方，Weissella 属は S. cerevisiae との共培

超希少微生物の分離探索基盤の構築」を受けて行われ養分離法でのみ分離することが可能であった．Moe etたものです．

al.（2015）もミャンマーの馴れずし 8 点から 43 株の乳酸菌を分離し，その微生物フローラを解析している．

文

Miyashita et al.（2012）はタイの発酵食品 114 点からChang, C.H., Chen, Y.S., Lee, T.T., Chang, Y.C. & Yu,

945 株を分離し，410 株について 16S rDNA 塩基配列

B. 2015. Lactobacillus formosensis sp. nov., a lacticを行い，6 属が認められたことを報告している．また，acid bacterium isolated from fermented soybean

Nguyen et al.（2013）はベトナムの伝統的な発酵食品

meal. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 65: 101-106.

21 サンプルから 881 株を分離し，その分布を明らかに

Chao, S.H., Kudo, Y., Tsai, Y.C. & Watanabe, K. 2012.

している．その結果 L. fermentum が 56.6％，次いでLactobacillus futsaii sp. nov., isolated from fu-tsai

L. pentosus（24.4％），L. plantarum（17.1％）が数多

and suan-tsai, traditional Taiwanese fermented

く分離され，Pediocuccus 属がごくわずかに分離されmustard products. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62:たと報告している．これらの研究結果と比較すると本研究では供試した試料数，分離株数は少ないながらも，酵母共培養法により効率的に多様な乳酸菌が分離

489-494.
Clemente-Jimenez, J.M., Mingorance-Cazorla, L.,
Martínez-Rodríguez, S., Las Heras-Vázquez, F.J. &できたと考えられた．

Rodríguez-Vico, F. 2005. Influence of sequential

本研究においては酵母との共培養法を利用した乳酸

yeast mixtures on wine fermentation. Int. J. Food

菌の新規分離方法を開発し，さらに実際に発酵食品か

Microbiol. 98: 301-308.

ら多様な乳酸菌を分離することができた．本研究で考古川壮一，片倉啓雄 2012．乳酸菌と酵母の共存と共案した共培養分離法は発酵食品中の微生物が共生関係

生．日本生物工学会誌にあることに発想を得ている．したがって，共培養に利用した S. cerevisiae RIFY 1001，K. marxianus RIFY

Yamagishi, A., Kobayashi, M., Suzuki, C., Ogihara,
H. & Morinaga, Y. 2015. Screening of lactic acid

力が高く，エタノールや炭酸ガス以外にも多くの一bacteria that can form mixed-species biofilm with

次，二次代謝産物を生産する（Clemente-Jimenez etSaccharomyces cerevisiae. Biosci. Biotechnol.

al., 2005; Gethins et al., 2015; López-Malo et al., 2013）．
分類学的にも近縁な S. cerevisiae と K. marxianus でBiochem. 79: 681-686.
Gethins, L., Guneser, O., Demirkol, A., Rea, M.C.,

は試験した乳酸菌の生育パターンはいずれも同様の傾Stanton, C., Ross, R.P., Yuceer, Y. & Morrissey, J.P.

向を示したが，L. gasseri や L. helveticus の生育には

2015. Influence of carbon and nitrogen source on

異 な る 影 響 を 示 し た． 一 方，P. fermentans で は L.

production of volatile fragrance and flavour

delbrueckii および W. confusa の生育に促進作用が高metabolites by the yeast Kluyveromyces marxianus.

く認められたことは，酵母の代謝産物が乳酸菌の生育

Yeast 32: 67-76.

に促進や抑制の作用を示したものと考えられる．本研

Gu, C.T., Li, C,Y., Yang, L.J. & Huo, G.C. 2013.

究 で 選 択 し た S. cerevisiae，K. marxianus，P. fer-

Lactobacillus mudanjiangensis sp. nov., Lactobacillus

mentans は生成量に差はあるが，発酵によりいずれもsonghua jiangensis sp. nov. and Lactobacilus

エタノールと炭酸ガスが生成する．今後，これらの物

nen jiangensis sp. nov., isolated from Chinese

質が生育に与える影響を明らかにすることで分離方法

traditional pickle and sourdough. Int. J. Syst. Evol.

の改良が期待できるが，共培養においては共生菌の存あることから，これらのことを考慮し分離方法の改良

90：188-191．

Furukawa, S., Isomae, T., Tsuchiya, N., Hirayama, S.,

4040，P. fermentans RIFY 4078 の 3 種の酵母は発酵

在や共生する細胞同士の接着が必要であるとの報告も献Microbiol. 63: 4698-4706.
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乳酸菌の新規分離法の開発と分離

乙黒美彩ら

Development of a new method for isolating lactic acid bacteria, and application of the method
to fermented foods in Myanmar
Misa Otoguro1), Kotaro Maeda1), Munekazu Kishimoto1）, Hideki Yamamura2）, Katsuhiko Ando3）,
Nyunt Phay4）, Masayuki Hayakawa2） and Fujitoshi Yanagida1）
1)

The Institute of Enology and Viticulture, University of Yamanashi,

Faculty of Life and Environmental Sciences, Graduate School, University of Yamanashi,

2)

NITE Biological Resouce Center, 4)Pathein University

3)

Enrichment or dilution methods are generally used for isolating lactic acid bacteria (LAB) from natural samples.
However, these methods depend on the microbe's predominant characteristics or growth rate. Here, we developed a new
method for isolating minor LAB by co-culture with yeast strains. We then used this method to isolate rare andindigenous species in the traditional fermented foods of Myanmar, thus enabling us to determine the taxonomic diversityof LAB there. To analyze the effects of co-culture we tested a combination of 18 species and 2 subspecies of LAB and 6
species of yeast. Interestingly, some specific combinations either accelerated or suppressed LAB growth. Eight fish or
prawn products fermented with rice (ngachin and pazun-chin) were then obtained from the Ayeyawady market in
Myanmar for testing. By using co-culture and dilution methods we isolated 52 LAB from these products. Co-culture withyeast resulted consistently in LAB isolation from all samples. The LAB were assigned to 3 genera and 15 species; thegenus Lactobacillus accounted for 85% (44 strains) of the bacteria in these products. 16S rDNA analysis showed that one
new species candidate was isolated by the dilution method, whereas 2 new species candidates were isolated by the
co-culture method. Lactobacillus futsaii and Lactobacillus plajomi, isolated recently from Taiwanese fermented mustard
products and from Thai fermented food, respectively, were also detected by the dilution method. However, the genus
Weissella was isolated only by co-culture with Saccharomyces cerevisiae. Thus, co-culture enabled the isolation of rare
LAB that are otherwise difficult to isolate by using the normal dilution method. Our results suggest that thedevelopment of new methodologies for isolating LAB is highly important for expanding our understanding of theirecology, taxonomy, and distribution.

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