タンパク質分解酵素を応用した新しい皮膚代謝促進治療薬の開発

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科医療科学専攻 生命医科学講座 口腔病態薬理学分野

筑波隆幸

Cathepsin E is an endolysosomal aspartic proteinase predominantly expressed in immune related cells. In our previous study,
cathepsin E-deficient mice displayed atopic dermatitis. In addition, macrophages derived from cathepsin E-deficient mice showed
an accumulation of the lysosomal membrane sialoglycoproteins, LAMP-1 and LAMP-2, and, consequently, an elevation inlysosomal pH. However, the molecular mechanism by which cathepsin E deficiency causes atopic dermatitis remains unclear. In
this report, we demonstrate that cathepsin E-deficient macrophages showed an increased reactive oxygen species production andup-regulation of oxidized peroxiredoxin-6, but decreased antioxidant glutathione. Moreover, cathepsin E-deficient macrophages
displayed higher sensitivity to cell death by oxidative stress treated with H2O2 and paraquat. Higher-sensitivity of cathepsin
E-deficient macrophages to infection with Staphylococcus aureus was observed. These results indicate that cathepsin E deficiency
causes increased oxidative stress, suggesting that these abnormalities in cathepsin E-deficient cells are presumably involved in theabnormal host defense of these mice.

１．緒近、カテプシン E のノックアウトマクロファージでは酸化言ストレスの上昇している可能性を示唆するデータを得た。

アトピー性皮膚炎の有病率は年々増加してきており、現そこで本研究では、カテプシン E をターゲットにした創薬

代社会において国民病といっても過言ではない。2001 年

研究に応用するため、マウスおよびマクロファージで酸化および 2002 年に行われた厚生労働省の調査では、小学生ストレスが関与しているのかどうかの基礎的研究を行った。の実に 11％がアトピー性皮膚炎に罹患していると報告さ２．実れた。しかしながら、同疾患は遺伝的要因と環境的要因が複雑に影響するため、分子メカニズムは良く分かっていないのが現状である。

２．
１

験マウス

カテプシン E のノックアウトマウスはスピードコンジェ

我々は、偶然にもアトピー性皮膚炎の発症にはプロテア

ニックにより C57BL/6 に 99.5% 以上遺伝的背景が同じマウーゼ（タンパク質分解酵素）であるカテプシン E が、アトスを用いたピー性皮膚炎発症に関与している事を見出した

用いた。

１, ２）

。カテ1 ～ 4）。また野生型マウスは C57BL/6 マウスを

プシン E は動物細胞に存在するアスパラギン酸プロテアー
ゼの一種であり、免疫担当細胞や皮膚上皮細胞など細胞特異的に存在する。我々はカテプシン E のノックアウトマウ

２．２

腹腔マクロファージの調製

実験には８～ 12 週齢のマウスを 4.0％のチオグリコレー
３）スを作製したところ、このマウスがアトピー性皮膚炎様症

トを腹腔内投与した方法

状を呈した 。すなわち、引っ掻き行動を繰り返し、顔面、血球溶解バッファーで腹腔内を洗浄しながらマクロファー頸部、背部にアトピー性皮膚炎様症状を呈するようになる。

ジを採取した。採取後、10％牛胎児血清、100U/mL ペニ

病理組織学的解析では、表皮の肥厚と皮下組織への細胞浸シリンおよび 100μg/mL ストレプトマイシン含有 RPMI-潤が認められた。さらに、血清学的解析でも高好酸球血症

1640 培地にて 37 ℃で培養した。

１）を用いた。投与３．５日後に赤と高 IgE 血症が認められた。
この分子メカニズムを解明するために、我々は野生型お２．３

二次元電気泳動法
３）

よびカテプシン E のノックアウトマウス由来のマクロファ

二次元電気泳動法は以前報告した方法で行った 。簡単ージを使って比較解析を行ったところ、リソソーム膜タンに述べると、細胞抽出液を IPG ストリプスに掛け、マルチパク質の蓄積が起こっている事を見出した

フォアー II を用いて等電点電気泳動を行った。その後、

３，４）。さらに最ストリプスを 15 分間６M urea, 30% glycerol, １% SDS，
Development of a novel therapeutic
application for allergic skin diseases
using intracellular proteasesTakayuki Tsukuba
Department of Dental Pharmacology,Graduate School of Biomedical Sciences,
Nagasaki University

and 64 mM dithiothreitol 含有 50 mM Tris-HCl バッファー，
pH 8.8 で平衡化した後、更に 135 mM iodoacetamide を含む同バッファーに 15 分間浸漬した。その後、10 % SDS- ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後、銀染色でタンパク質を染色した。切り出されたタンパク質はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析− 103 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

機（島津製作所製）で解析した。タンパク質の同定にはマ酸化型のペルオキシレドキシンー６である事を精査するた

スコットサーチエンジン（マトリクスサイエンス社製）をめ、マクロファージに過酸化水素（25μM）を 37 ℃、20 時用いて行った。

間マクロファージを培養して、細胞抽出液を２次元電気泳３．結動で比較した。両タンパク質スポットを比較すると、還元果型ペルオキシレドキシンー６が酸化型へ移行している事が３．
１ 二次元電気泳動の解析による変動するタンパク質の同定確認された（図１B）。以上の結果より、カテプシン E のノ

我々は野生型およびカテプシン E のノックアウトマウス

ペルオキシレドキシンー６が増加し、還元型ペルオキシレ由来のマクロファージにおける細胞内のタンパク質を比較

ックアウトマクロファージでは、アネキシン A1 と酸化型ドキシンー６が減少している事が明らかになった。

する目的で、両細胞の抽出液について２次元電気泳動を行った。図１に示すように、野生型に比べてカテプシン E ノ

３．２

酸化ストレス関連分子の解析

ックアウトマクロファージでは約 38kDa のタンパク質のアネキシン A1 はストレスタンパク質の一種として知らスポットが増加していた。さらに約 31kDa のタンパク質れており、さらにペルオキシレドキシンー６は細胞内で抗に関して、酸性側のスポットが増加していたが塩基性側の酸化ストレスタンパク質として機能する。これらの事実かスポットが消失していた（図１A）。これらのタンパク質

ら、カテプシン E ノックアウトマクロファージは酸化ストに関してプロテオーム解析を行ったところ、それらの N 末レスを受けているために、これらのタンパク質が増加して端アミノ酸配列から 38kDa のタンパク質はアネキシン Aいる可能性が考えられた。

１であり、31kDa の増加、減少しているタンパク質は、両そこで、酸化ストレスに関連する分子について解析を行

者共にペルオキシレドキシンー６であることが分かった

った。細胞内のスーパーオキサイド（O ）、及び過酸化水（図１A）。

素（H2O2）を定量すると、有意に野生型に比べカテプシンペルオキシレドキシンー６は細胞内で抗酸化タンパク質として機能し、還元型と酸化型として存在することが知られている。そこで、同定されたタンパク質が還元型および

2−

E ノックアウトマクロファージで多量に存在した（図２Aおよび B）。
他方、還元物質の量を定量した。細胞内に最も多量に存

図１
Ａ：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロファージの２次元電気泳動像（上段）カテプシン E のノックアウトマウスでアネキシン A1 が増加している（下段）カテプシン E のノックアウトマウスで還元型ペルオキシレドキシンー６が増加し、酸化型ペルオキシレドキシンー６が減少している。
Ｂ：野生型マクロファージの過酸化水素による変動− 104 −

タンパク質分解酵素を応用した新しい皮膚代謝促進治療薬の開発

在する還元物質はグルタチオンである。そこで、還元型グルタチオン（GSH）を定量すると、逆にカテプシン E ノッ

３．３

酸化ストレスによる細胞死の影響

もしカテプシン E ノックアウトマクロファージにおいて、クアウトマクロファージでは有意に減少している事が明ら

細胞内で酸化ストレスが上昇しているならば、同細胞は酸かになった（図２C）。

化ストレス刺激に対する感受性も上昇していることが考え

生体内でも酸化ストレスの影響が観察されるのかどうか、られる。この事を確かめるために、野生型およびカテプシマウスの血清に関して検討した。過酸化水素（H2O2）を定

ン E ノックアウトマクロファージにおいて活性酸素種によ量すると、野生型に比べカテプシン E ノックアウトマウス

る刺激に対する細胞死の影響について検討した（図 3）。両で有意に多量に存在した（図２D）。これ等の結果より、生マクロファージに過酸化水素（H2O2）（0 ～ 200μM）とミト体及び細胞レベルにおいて、カテプシン E が欠損すると酸コンドリア依存性酸化ストレス誘導剤であるパラコート（0化ストレスが起こる事が示唆された。

～ 2000μM）を加えた後、37 ℃ 24 時間でインキュベーシ

図２
Ａ：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロファー
ジの細胞内スーパーオキサイド（O2 −）量。両マクロファージをザイモサン刺激後、ケミルミネッセンス反応で計測した。
B：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロファー
ジ の 過 酸 化 水 素（H2O2） 量。 両 細 胞 を 24 時 間 培 養 後、Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit で定量した。
Ｃ：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロファー
ジの還元型グルタチオン（GSH）量。マクロファージの細胞抽出液を合成基質 DTNB と反応後、吸光度 420nm で測定し、算出した。
Ｄ：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスの血清中の過 酸 化 水 素（H2O2） 量。 両マウス 血 清を 24 時 間 培 養 後、
Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit で定量した。

図３
Ａ：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロファー
ジの過酸化水素による細胞生存率。 両マクロファージに過酸化水素（H2O2）（0 ～ 200μM）37℃、24 時間でインキュベーションし、Cell counting kit-8 を用いて細胞生存率を算定した。
B：野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロファー
ジのパラコートによる細胞生存率。 両マクロファージにミトコンドリア依 存 性酸 化ストレス誘導 剤であるパラコート（0 ～2000μM） を 37 ℃、24 時 間でインキュベーションし、Cellcounting kit-8 を用いて細胞生存率を算定した。

− 105 −

コスメトロジー研究報告 Vol.19, 2011

ョンし、Cell counting kit-8（同仁化学）を用いて細胞生存胞内のタンパク質を比較した。変動する分子として同定し率を算定した（図 3 A 及び B）。野生型に比べ、カテプシン

たのは、アネキシン A1 とペルオキシレドキシンー６であE ノックアウトマクロファージは、過酸化水素 50 およびり、特に後者に関しては酸化型が増加し、還元型が減少し100μM で、パラコートは 250 および 500μM の濃度で統計ていた。従って、カテプシン E ノックアウトマクロファー

学的に有意に高い細胞死を起こす事が分かった。従って、ジは酸化ストレスを受けている可能性が推測された。事実、カテプシン E ノックアウトマクロファージは、酸化ストレ

カテプシン E ノックアウトマクロファージでは活性酸素種スに対して高い感受性を持つ事が示され、細胞内酸化ストであるスーパーオキサイド（O ）、及び過酸化水素（H2O2）レスを受けている事がこの実験でも確認された。

が有意に増加し、逆に還元物質であるグルタチオンは有意2−に減少していた。また、酸化ストレス刺激である過酸化水

３．４

黄色ブドウ球菌による細胞死の影響

素とパラコート処理を行ったところ、カテプシン E ノック

アトピー性皮膚炎患者は黄色ブドウ球菌に対する感受性

アウトマクロファージはいずれも低濃度で細胞死を起こしが高いため、皮膚炎が起こる事が知られている。そこでカた。また、アトピー性皮膚炎発症の原因菌の 1 つである黄テプシン E ノックアウトマクロファージが野生型に比べて色ブドウ球菌に対して、カテプシン E ノックアウトマクロ細胞死を起こしやすいのか否かについて検討を行った。マファージは低濃度で細胞死を起こした。このような結果か

クロファージと黄色ブドウ球菌の比率を１：100 で 37℃

ら、カテプシン E ノックアウトマクロファージは、酸化ス

30 分間貪食させた後、１～４時間インキュベーションし、トレスを受けているために様々な異常を惹起していると考Cell counting kit-8 を用いて細胞生存率を算定した（図 4）。

えられる。

処理後４時間の野生型のマクロファージが 80％以上生存では、なぜカテプシン E 欠損が酸化ストレスを引き起こしていたのに対して、カテプシン E 欠損マクロファージですのであろうか。我々は、酸化ストレスの直接的原因の１は生存率が有意に減少しており、65% しか生存していなかつとして、カテプシン E ノックアウトマクロファージでは、った。これらの結果から、カテプシン E ノックアウトマク

オートファジー不全とそれに伴うミトコンドリアの代謝不ロファージは、黄色ブドウ球菌感染による生存率も減少し全を起こしている事を見出している。オートファジーは生ている事が分かった。

体内の不要なタンパク質をリソソーム系で分解する生理反４．考応であり、古くなったミトコンドリア等のオルガネラは、察このメカニズムで除去される。従って、カテプシン E 欠損

本研究では、免疫担当細胞であるマクロファージを用いにより、リソソーム分解能が低下し、そのためにオートフて、野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスの細ァジーによる古くなったミトコンドリアが除去されないために、酸化ストレスが上昇している可能性が高い。
一方、カテプシン E ノックアウトマウス由来の血清中でも過酸化水素レベルが上昇していた事から、個体レベルでも酸化ストレスが上昇している可能性が示唆された（図２D）。興味深い事に、酸化ストレスの上昇とアトピー性皮膚炎の発症には、相関関係があることは多くの研究で示唆されている（総説参照５）。従って、本研究で示したように、カテプシン E 欠損が、酸化ストレスの上昇をもたらし、酸化ストレスの上昇がアトピー性皮膚炎の発症の原因となっている可能性が高いと考えられる。

５．総括

カテプシン E の欠損により、細胞レベルでの酸化ストレスの上昇が認められた。この酸化ストレスは個体レベルでも同様に認められる事から、酸化ストレスの上昇が、アトピー性皮膚炎の発症と関連するのではないかと考えられる。
図４ 野生型およびカテプシン E のノックアウトマウスマクロ
ファージの黄色ブドウ球菌取り込み後の細胞生存率。 両マ
クロファージと黄色ブドウ球菌の比率を 1：100 で 37℃、
30 分間貪食させた後、１～４時間インキュベーションし、Cell counting kit-8 を用いて細胞生存率を算定した。

本研究で得た知見が、今後アトピー性皮膚炎治療薬への分子基盤になる事を期待したい。

− 106 −

タンパク質分解酵素を応用した新しい皮膚代謝促進治療薬の開発（参考文献）

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Association of cathepsin E deficiency with development

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contributed equally to this work２）T s u k u b a T , Y a m a m o t o S , Y a n a g a w a M , e t４）Kakehashi H, Nishioku T, Tsukuba T, et al :al : Cathepsin E-deficient mice show increased

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