アプリケーションレポート

水産物の倍数性およびゲノムサイズの解析法
CyStain DNA染色キットを用いたフローサイトメトリー

水産養殖において、染色体操作技術による性の統御や不妊個体の作出など、いわゆる倍数性育種が注目されています。このような育種技術の開発にあたって、作出された個体の倍数性およびゲノムサイズを判定することは非常に重要です。CyFlowシリーズのフローサイトメーターとCyStain DNA染色キットを用いた解析では、それらを迅速かつ正確に判定することが可能です。ここでは、フローサイトメトリーによる魚類・貝類の倍数性およびゲノムサイズの解析におけるサンプル調製方法についてご紹介します。

フローサイトメトリーによる倍数性およびゲノムサイズの解析
細胞あるいは核をDNA特異的に結合する蛍光色素（DAPI、PIなど）で染色し、その蛍光強度をフローサイトメーターで測定します。内部標準試料の蛍光強度との相対値から倍数性およびゲノムサイズを算出します。

ニジマス

核数2C

核数

DNA指数変動係数

中央値

3C

DAPI蛍光強度

図1 二倍体、三倍体のニジマス血液を混合し、CyStain DNA 2 stepを用いてサンプル調製後、CyFlow
Ploidy Analyserで測定。
※二倍体、三倍体のニジマス血液は近畿大学農学部水産学科水産生物学研究室

小林徹教授よりご提供いただきました。

ピーク蛍光強度の中央値（Median）は二倍体ニジマス（2C）が14,222、三倍体ニジマス（3C）が21,238であり、これらの相対値から算出したDNA指数（DI）は二倍体を1.00とした時、三倍体が1.49でした。これは、三倍体ニジマスが二倍体ニジマスのおよそ1.5倍の倍数性およびゲノムサイズであることを示しています。

Application Note Vol.14

Ploidy and the size analysis of the genome

Vol.14

水産物の倍数性およびゲノムサイズの解析法

CyStain DNA染色キットを用いたフローサイトメトリー

試薬・装置
●

CyStain DNA染色キット
ー DAPI染色：CyStain DNA 2 step（品番：AT803834）
ー PI染色：CyStain PI Absolute T（品番：AN695184）●

CellTrics50 μm（前処理用ろ過フィルター）（品番：BM786910）●

その他，各キットのプロトコールに準ずる●

フローサイトメーター：（対応可能機種）CyFlow Ploidy Analyserなど
ー DAPI検出（最大励起波長：345 nm，最大蛍光波長：455 nm）：365 nm UV-LEDまたは355 nm，375 nmレーザーを搭載した装置
ー PI検出（最大励起波長：530 nm，最大蛍光波長：630 nm）：532 nmレーザーまたは488 nmレーザーを搭載した装置

血液サンプルの調製
1.

腹側尻ビレ後部から針を刺し、背骨にあたる所まで差し込み、背骨下部にある血管から採血します（図2）。

2.

血液1滴を1 mlのPBS（1.5 mg/ml EDTA-2K）に加え、良く混合します。

3.

50 μlを各キットのNuclei Extraction Bufferに加え、軽くボルテックスミキサーで撹拌し、5分間静置します。

4.

再度、軽くボルテックスミキサーで撹拌した後に、CellTrics 50 μmでろ過します。

5.

ろ液に各キットのStaining Bufferを加え染色後、フローサイトメーターで解析します。

図2

キンギョ

核数

ニジマス

ニジマスからの採血

DAPI蛍光強度

図3

ニジマス、キンギョの血液からCyStain DNA 2 stepを用いてサンプルを調製し、CyFlow PloidyAnalyserで測定。全てのサンプルを同じGain値で測定しています。

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Ploidy and the size analysis of the genome

水産物の倍数性およびゲノムサイズの解析法

CyStain DNA染色キットを用いたフローサイトメトリー

固形組織サンプルの調製
1.

魚類では尾ビレ（図4A）、貝類では外A套膜（図4B）などから約5 mm角の組B織を採取します。
2.

各キットのNuclei Extraction Bufferに入れ、軽くボルテックスミキサーで撹拌し、5分間静置します。

3.

再度、軽くボルテックスミキサーで撹拌した後に、CellTrics 50 μmでろ過します。

4.

ろ液に各キットのStainingBufferを

図4

加え染色後、フローサイトメーターで解魚類・貝類の固形組織片の採取
A：ニジマス尾ビレ

析します。

B：カキ外套膜

カキ

キンギョ

アワビ

核数

ニジマス

DAPI蛍光強度

図5

魚類・貝類の固形組織からCyStain DNA 2 stepを用いてサンプルを調製し、CyFlow Ploidy
Analyserで測定、全てのサンプルを同じGain値で測定しています。

ゲノムサイズの解析における内部標準試料と蛍光色素の選択定量性を高めるために、解析する試料と同程度のゲノムサイズを持つ生物種を内部標準試料とします。蛍光色素は塩基対非選択的に結合する蛍光色素（PIなど）を使用します。内部標準試料は解析する試料と同時に調製します。

Application Note Vol.14

Ploidy and the size analysis of the genome

CyFlow Ploidy Analyser
品番

製品名

希望小売価格製品説明CC994237 CY-S-3039̲V1 CYFLOW PLOIDYUV-LED ‒ 365nm, 1パラメーター

AN834999 CY-S-3039̲V2 CYFLOW PLOIDY532nm, 30mW green laser, 2パラメーター

3,000,000
3,900,000

BG111836 CY-S-3039̲V3 CYFLOW PLOIDYUV-LED ‒ 365nm, 532nm 30mW green laser, 2パラメーター

4,500,000

CC270652 CY-S-3080-6 CUBE 6 AUTOLOADERCube 6用オートローダー

2,430,000

別売品
CJ100861

06-500-1040 KEYBOARD

PC用キーボード

BV637599

06-500-1041 MOUSE

PC用マウス

BY622643

07-1434 FCS Express RUO

解析ソフトバンドルパック（CyFlow CubeとCyFlow PA購入時）

160,000

アクセサリボックス（PA）

85,000AU070850 09-701-0001 Accessories box

7,000
5,000

設置時消耗品
品番

製品名

包装単位
5L

CU521416 04-4007̲R Sheath Fluid

250 ml

AE45449404-4009̲R Cleaning Solution

BK728861

04-4010̲R Decontamination Solution

CB632918 04-2000 Sample Tubes 3.5 ml

250 ml500 packs

製品説明

希望小売価格

シース液

5,000

クレンジング液

4,500

除染液

7,900

サンプルチューブ 3.5 ml

8,500

ビーズ・コントロール試薬（レーザーにあわせて）
BY978539

05-4022 Calibration Beads UV

AE733976

05-4006̲R Green Calibration Beads

品番

製品名

1.5 mlキャリブレーションビーズ 2.5 μm, UV

56,000200 tests, 2 ml

キャリブレーションビーズ Green laser

56,000倍数性やゲノム解析用試薬で定評ある CyStain
包装単位

製品説明

希望小売価格CU246612 05-5001 CyStain UV Ploidy

250 tests

DAPI染色による植物細胞核染色用1ステップ試薬（中性）
500 ml Staining Solution

AF009546

05-5002 CyStain UV Precise P

250 tests

DAPI染色による植物細胞核染色用2ステップ試薬（強酸性）
125 ml Nuclei Extraction Buffer
500 ml Staining Buffer

35,000CK250398 05-5003 CyStain UV Precise T

250 tests

DAPI染色による植物細胞核染色用2ステップ試薬（弱酸性）
125 ml Nuclei Extraction Buffer
5 x 0.525 g Buffer Reagent
500 ml Staining Buffer

35,000

CY696051

250 tests

DAPI染色による動物細胞核染色用1ステップ試薬（中性）
500 ml Staining Solution

15,000250 tests

DAPI染色による動物細胞核染色用2ステップ試薬（弱酸性）
125 ml Nuclei Extraction Buffer
5 x 0.525 g Buffer Reagent
500 ml Staining Buffer

35,000

BH251553 05-5022 CyStain PI Absolute P

250 tests

PI染色による植物細胞核染色用2ステップ試薬（強酸性）
125 ml Nuclei Extraction buffer, 500 ml Staining buffer,
2x1.5 ml Propidium Iodide, 1x5 mg RNaseA

85,000AN695184 05-5023 CyStain PI Absolute T

250 tests

PI染色による植物、動物、ヒト細胞核染色用2ステップ試薬（弱酸性）
125 ml Nuclei Extraction buffer, 500 ml Staining buffer,
5 x 0.525 g Buffer Reagent, 2x1.5 ml Propidium Iodide,
1x5 mg RNaseA

85,000AT803834

05-5004 CyStain DNA 1 Step

05-5005 CyStain DNA 2 Step

15,000CellTrics（前処理用フィルター）フローサイトメーターの詰りの原因となる細胞塊などを除去できる前処理用フィルター。
3-15mlのチューブに対応し、傾斜したフィルターガーゼと減圧孔でスムーズにフィルトレーションが行えます。
BN285567 04-0042-2313 CellTrics 5 μm

250 packs

未滅菌セルストレイナー, black&white, 5 μm

45,000AP275603

04-0042-2314 CellTrics 10 μm

250 packs

未滅菌セルストレイナー, black, 10 μm

45,000

AN777717 04-0042-2315 CellTrics 20 μm

250 packs

未滅菌セルストレイナー, red, 20 μm

45,000BP486257

04-0042-2316 CellTrics 30 μm

250 packs

未滅菌セルストレイナー, green, 30 μm

45,000BM786910 04-0042-2317 CellTrics 50 μm

250 packs

未滅菌セルストレイナー, yellow, 50 μm

45,000

CB364744 04-0042-2318 CellTrics 100 μm

250 packs

未滅菌セルストレイナー, blue, 100 μm

45,000BE337612

250 packs

未滅菌セルストレイナー, white, 150 μm

45,00004-0042-2319 CellTrics 150 μm※希望小売価格は消費税別です。

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