乳酸菌オリゴDNAによる上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開
信州大学農学部

下里剛士

Research into the action of probiotics against infectious and inflammatory diseases and allergies has recently attracted
considerable attention in both the medical and food sciences. My research group has identified immunomodulatory DNA
sequences from immunoregulatory probiotics (immunobiotics) and confirmed that several synthetic oligodeoxynucleotides(ODNs) derived from these sequences maintain the immunomodulatory properties. To develop ODNs that retain functionality
after oral administration, my research group attempted to produce acid-resistant ODN particles by encapsulating ODNs incarbonate apatite particles (ODNcaps) using a cell transfection method with carbonate apatite particles. These edible ODNs
retained their immunomodulatory activity when taken up by intestinal mucosal cells. We have also developed ODN particles
for transdermal absorption. The ability to produce particles containing immunomodulatory ODNs opens the possibility ofusing ODN particles in studies involving mouse disease models. If the therapeutic efficacy of ODN particles can be achieved
without parenteral injection, the cost, complexity and inconvenience of immunomodulatory therapy could be dramaticallyreduced. In addition, this approach may lead to the development of novel immunobiotic foods and cosmetics that willcontribute to the prevention or suppression of many types of infectious, allergic, inflammatory, and autoimmune diseases.

1．緒

癒効果（マウス試験）1）、ⅱコラーゲンタンパク質 + オリゴ

言DNA の混合液の創傷治癒効果（サル試験）2）、ⅲアセトン +細菌由来のゲノム DNA が免疫増強作用を有するというオリゴ DNA の混合液の抗腫瘍作用 3）。いずれの報告も、発見（Nature, 374 , 546 - 549 , 1995）以降、多彩な免疫機能大容量のオリゴ DNA を傷口や炎症部位に直接塗布する手を有するオリゴ DNA（ODN，DNA 短鎖）が次々と見出さ法が採用されており、オリゴ DNA の簡便かつ経済的な経れている。とくに、感染症・ガン・アレルギー・炎症性疾皮ルートはいまだ確立されていない。筆者は、オリゴ DNA患の予防や治療を目的とした機能性核酸分子として研究がの経皮ルートの構築を目指し、コスメトロジーの概念を組進められてきた。オリゴ DNA を用いた臨床試験も進んでみ合わせたスキンケア素材の開発研究を行った。

おり、「核酸医薬」領域で実現に向けた段階に突入した。これまでに ODN を用いて、様々な動物試験が行われ、その投与方法としては、腹腔内投与（i.p.）、皮下投与（s.c.）、鼻2. 方法

2. 1. ODNODNの合成はIntegrated DNA Technologies, Inc（Coralville,腔に滴下（i.n.）などの手法が一般的で、尾静脈からの投与（i.v.）例もある。またオリゴ DNA の投与量としては、マウIA, USA）社に合成を外注委託した。

ス 1 匹あたり 100 - 500 µg といった報告が多い。すなわち、・GpC-ODN1612 , 5 '-G*C*T*A*G*A*G*C*T*T*A*G*G*C*T- 3 ' 4）

注射器を用いて、直接血管内部や組織内に注入する方法が・CpG-ODN 1555 , 5'- G*C*T*A*G*A*C*G*T*T*A*G*C*G*T -3' 5）採用されている。筆者は、注射に頼らない─食べる乳酸菌

・CpG-ODNMsST, 5 '-C*A*G*G*A*C*G*T*T*G*T*A*T*C*A*C*DNA ─を掲げ、2015 年、胃液に溶けず腸まで届く DNA

T*G*A*A- 3’ 6）

ナノカプセルの開発に成功した。本成果により、オリゴ

以上の Phosphorothioate bond（PS）-ODN、Phosphodiester

DNA を有効成分とする機能性食品や家畜飼料・ペットフbond（PO）-ODN をそれぞれ合成した。なお、* は PS bondードなどの開発に向けた展開が可能となった。残された投を示している。

与ルートは経皮ルートであるが、オリゴ DNA を経皮ルー
トから動物試験を実施した例は、以下 3 例に限定される。

2. 2. ODN-炭酸アパタイト微粒子の合成
ODN- 炭酸アパタイト微粒子の合成は、Wang らの方法

ⅰコラーゲンタンパク質 + オリゴ DNA の混合液の創傷治を 参 考 に 一 部 改 変 し て 作 製 し た 7）。 す な わ ち、ODN を1 mg/mL となるよう滅菌 PBS で希釈し、ODN 溶液とした。
Regulation of Inflammation in Epithelial
Cells by Lactobacillus Oligodeoxynucleotides
and Development to Novel Transdermal
Oligodeoxynucleotide Materials

次に、塩化カルシウム二水和物 CaCl 2・2 H 2 O（ナカライテ

Takeshi Shimosato

1 M CaCl 2 とした。さらに、滅菌済み 200 mL ビーカーにFaculty of Agriculture, Shinshu University

DMEM（Invitrogen, CA, USA）を 26 mL ×チューブ 4 本分スク , Kyoto, Japan）を 7 . 35 g 電子天秤で秤量し、50 mL チ
ューブに取り、ミリ Q 水で final 50 mL にメスアップして− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021に当たる約 100 mL（+α）を取った。50 mL チューブ 4 本にJapan）に よ り 解 析 し た。 画 像 は、（Fluoview software

DMEM を 26 mL ずつピペッターで正確に分注した。事前Olympus）を用いて分析した。にウォーターバスを 37 ℃に設定し温めておき、DMEM
26 mL に ODN 溶 液 150 µL（ODN 量 150 µg）を 加 え た。

2. 5. 走査型電子顕微鏡による粒子形態観察

ODN+DMEM と 1 M CaCl 2 を 37 ℃、5 min ウ ォ ー タ ー バ

ODN 微粒子懸濁液をナノパーコレータ試料載台（JEOL,スで温めた後、ODN 含有 DMEM に 1 M CaCl 2 を 4 mL 加Tokyo, Japan）に 35µL添加した。
10mLシリンジ（TERUMOえた。37 ℃、5 min ウォーターバスで温めた後、3 , 000 g ×Corporation, Tokyo, Japan）を用いて液体を吸い、試料を20 min 遠心分離し、アスピレーターで上清を丁寧に除去よく定着させたのち、12 -well plate（Nippon Genetics）にした。2 mL の滅菌済み PBS で懸濁し、2 mL チューブ（ア500 µL ずつ分注した 2 . 5 % グルタルアルデヒド（TAABズ ワ ン 株 式 会 社 , Osaka, Japan）に 回 収 し た。8 , 000 g ×

Laboratories Equipment, Ltd, Berks, UK）に 1 hr 十分に浸5 min 遠心分離し、ピペッターで上清を丁寧に除去した上すことで固定した。以降液体試薬による静置および洗浄はで、−30 ℃冷凍庫に一晩静置した。翌日、フリーズドラ

12 -well plate に 500 µL ずつ試薬を分注し行った。完全にイヤー DC 401（ヤマト科学株式会社）を用いて凍結乾燥し脱 水 す る た め、100 % エ タ ノ ー ル に て 30 min 静 置 し、た。作製した ODN 微粒子は−80 ℃にて保存した。特性解100 % エタノールを交換して静置する工程を 2 回行った。

析として、1 wt % リン酸カルシウム水分散液を調製し、1脱水完了後、t- ブチルアルコール（Nacalai Tesque）に浸し分間の超音波照射の後、粒径を測定した（FPAR- 1000，大52 ℃、30 min で 2 回静置し、−80 ℃で保管した。フリー塚電子株式会社，Osaka，Japan）。

ズドライヤ DC 401（Yamato Scientific）で凍結乾燥したの
ちオスミウムコーター Neoc-AN（Meiwafosis CO., Ltd., Tokyo,

2. 3. マウス細胞を用いた免疫機能解析Japan）を用いてオスミウムコーティングを行い、卓上走C 57 BL/ 6 マウスを、頸椎脱臼により安楽死させ、脾臓細胞および腹腔マクロファージを回収した。細胞は、遠心査型電子顕微鏡 JCM- 7000 F（JEOL, Tokyo, Japan）により観察した。

分離（2 , 000 rpm, 20 ℃ , 5 min）し、10 mL の RPMI- 1640 培

３．結地（Sigma Co., St. Louis, MO, USA）に 10 % fetal calf serum

果（FCS ; Sigma），
100 U/mL penicillin, 100mg/mL streptomycin,

本研究は、感染症、アレルギーなどの予防や治療に有効

2 5 mM HEPES, 1 . 0 mM sodium pyruvate, nonessential

な ODN 化粧品、医薬品の創製へと繋げる基盤研究として、

amino acids, 0 . 0035 % 2 -mercaptoethanol を加えたコンプリ

ODN 微粒子を作成する技術の開発研究を実施した。

ート培地に懸濁した。細胞懸濁液はセルストレイナー（日本 BD, Tokyo, Japan）、メッシュサイズ 40 µm に通すこと

3. 1. ODN-炭酸アパタイト微粒子の特性解析

で凝集細胞を除去した。上記コンプリート培地にて 2 回洗

核酸成分の細胞へのトランスフェクションには、主にカ浄後、細胞を回収し、カウンテス自動セルカウンター

チオン性脂質などが採用されている。近年では、新たに金（Invitrogen）を用いてトリパンブルー染色法により生細胞ナノ粒子、カーボンナノチューブ、生分解性ポリケタルナ数をカウントした。細胞を 12 well plate（Thermo Fisher

ノ粒子と核酸成分との結合・包接技術が開発され、哺乳類

6Scientific, IL, USA）に 2 × 10 cells/well で 播 き、37 ℃、細胞への新たな遺伝子導入技術として開発が進められてい

5 %CO 2 条件下で 3 hr 培養した。その後、GpC-ODN 微粒子、る。とくに（a）分解酵素による消化から核酸を保護する（b）

CpG-ODN 微 粒 子 で 刺 激 し、6 hr 後 の 細 胞 を 回 収 し た。

核酸の生体内における滞留時間を延ばす（c）核酸のエンド®

Total RNA と Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa Bio，

サイトーシスによる取り込み効率を向上させる（d）標的細Kusatsu, Japan）を用い、逆転写反応により cDNA を合成し胞に核酸を安定的に届ける（e）長い時間をかけて核酸をゆた。cDNA を鋳型としてマウスプライマーを用いて、リアっくりと運搬体の外へと放出する（f）核酸量を抑えること

ルタイム PCR 法により発現解析を行った。

による低コスト化など、優れた運搬媒体が検討されている。
本研究では、Wang らの開発した炭酸アパタイト粒子を用

2. 4. 共焦点レーザー走査顕微鏡による6FAM-ODN微粒子の取り込み解析

いた微粒子作成技術を改良し、その特性解析を行った。

腹腔マクロファージをPBS, 6FAM-ODN微粒子（500µg/ンに吸着させ、ナノサイズにまで成長させたものである。

mL, containing 5 µg/mL ODN）を用いて 37 ℃、1 h 処理しその粒子は直径 100 nm- 150 µm のナノ - マイクロサイズた。そして腹腔マクロファージに 4 %PFA を添加し室温でであることが示された（図 1）。

ODN- 炭酸アパタイト微粒子は、ODN をカルシウムイオ15 min 固定した。6 FAM-ODN 微粒子の取り込みを共焦点レーザー走査顕微鏡（FV 1000 D-IX 81 , Olympus，Tokyo，− 14 −

乳酸菌オリゴ DNA による上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開

図 1 ODN- 炭酸アパタイト微粒子（A）の特性解析．リン酸カルシウ
ム水分散液を調製し、1 分間の超音波照射（B）を行い、粒径を解析した（C）

図3

図 2 腹腔マクロファージ細胞における 6FAM-ODN お
よ び 6FAM-ODN カ プ セ ル の 取 り 込 み 解 析（Bar ＝5µm）
無処理細胞
（A）
，ODN 微粒子処理細胞（B）

ODN 微粒子で処理したマウス脾臓細胞における Il 4，Il 6，Il 1β，Tnfa mRNA の発現解析

3. 4. ODN微粒子を塗布したマウス耳介における影響

3. 2. ODN微粒子の取り込み解析
マウス腹腔マクロファージ細胞を調製し、6 FAM-ODN

これまでに乳業用乳酸菌 Streptococcus thermophilus ゲ

微粒子を用いて取り込み解析を in vitro で行った。SP 細胞

ノム配列中より同定した CpG-ODN が、マウスの脾臓細胞を PBS および 6 FAM-ODN 微粒子で処理し、蛍光標識を培養系において IFNγ および IL- 33 を強く誘導することを追 跡 し た。 コ ン ト ロ ー ル に お い て、16 . 01 %，9 . 83 %，発見している 8 , 9）。4 週間にわたる連続投与試験を実施し16 . 88 % であった蛍光値に対し、6 FAM-ODN 微粒子におた後、マウスより耳介を採取し、耳介組織切片（パラフィける値は 66 . 64 %，69 . 64 %，64 . 36 % を示した。共焦点レン切片）を作成した。HE 染色により、濃い紫色で染色さーザー顕微鏡による解析の結果からも、6 FAM-ODN 微粒れている箇所が表皮（Epidermis）である。光学顕微鏡下に子を取り込む腹腔マクロファージ細胞が観察された（図 2）。

おいて、各群より表皮の厚さを 5 ポイント測定した。Ctrl

生体防御システムの最前線に分布するマクロファージおよ群および GpC-ODN 微粒子群と比較して、CpG-ODN 微粒

び樹状細胞は、抗原を取り込み後、抗原提示して免疫応答子群において有意に高い数値となり、皮膚の肥厚が細胞組を誘導することが知られている。すなわち、腹腔マクロフ織レベルで観察された（図 4）。

ァージにおける ODN 微粒子の取り込みは、能動的に行わ

3. 5. 高機能ODN微粒子および乳化剤の開発れている可能性が示唆された。

高 機 能 微 粒 子 作 成 装 置（ フ ァ ル マ バ レ ー セ ン タ ー，3. 3. ODN微粒子の免疫特性解析

Shizuoka，Japan）を用いた微粒子作成技術の提供を受け、C 57 BL/ 6 雄マウスから脾臓細胞を調製し、コントロー球状粒子のオリゴ DNA 微粒子の試作を行った。コーティル（Ctrl）として PBS、GpC-ODN 微粒子、CpG-ODN 微粒

ング基剤として、アルギン酸ナトリウムを採用し、水溶性子で 6 時間培養後、リアルタイム PCR 法を用いて、IL- 4，のアルギン酸ナトリウムとオリゴ DNA を高機能微粒子作

IL- 6、IL- 1 β と炎症性サイトカインである TNF-α を測定成装置により均一に射出後、ドライヤーにより粒子化し、した。GpC-ODN 微粒子と比較して、CpG-ODN 微粒子で中間体［アルギン酸ナトリウム -ODN］を得た。さらに［アは Il 1 β、Il 6、Tnfa の発現増加が見られた。一方で、Il 4

ルギン酸ナトリウム -ODN を塩化カルシウム溶液に投入については強力に抑制された（図 3）。

し、水に不溶で球体を呈する粒子体を得ることに成功した− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図4図5図6

マウス耳病理組織切片の観察 Bar ＝ 200 µm

球状を示す ODN 微粒子の走査型電子顕微鏡画像（Bar ＝ 5 µm）

ODN 微粒子噴霧用スプレー（試作品）（A），ODN ヒアルロン酸ナトリウム乳化液（B, C）（図 5）。

４．考

また、噴霧型 ODN 微粒子の作成を目指し、ODN 粒子体

察の調製液をエアゾール缶に充塡した試作品を作製した。さO D N や m i R N A（ m i c r o R N A ）、 s i R N A（ s m a l l

らに微粒子の乳化、分散、破砕技術を駆使して、経皮投与interfering RNA）、さらには plasmid DNA（pDNA）など、を目的とした ODN の粒径均一化に取り組んだ。1 % ヒア

核酸成分の細胞へのトランスフェクションには、カチオンルロン酸ナトリウムに混合した ODN に対して乳化処理（ナ性リポソームなどの脂質分子が長年利用されてきた。しかノヴェイタ-電動式C-ES，三重ナノテク生産技術センター）

しながら、脂質性のトランスフェクション試薬は非常に高を繰り返すことで、均一に分散した乳化 ODN 微粒子の開価であることから、近年では、ポリケタル粒子、金ナノ粒発に成功した（図 6）。

子、カーボンナノチューブ（CNT）や四塩化ケイ素ナノ粒
子と核酸成分との結合・包接技術が開発され、哺乳類細胞− 16 −

乳酸菌オリゴ DNA による上皮細胞の炎症制御と経皮核酸素材への展開への新たな遺伝子導入技術として期待されている。これら（引用文献）

すべて in vitro 細胞培養系レベルでの transfection を想定

1） T. Sato, M. Yamamoto, T. Shimosato, D. M. Klinman,

したデリバリーシステムであるが、最近では、siRNA やAccelerated wound healing mediated by activation ofCpG ODN の in vivo デリバリーシステムが検討されている。

Toll-like receptor 9. Wound Repair Regen 18, 586-593

Titta らは、界面活性ポリオール（Pluronic F- 127）とプロ（2010）．

ピ レ ン ス ル フ ィ ド よ り 合 成 し た ナ ノ 粒 子（NPs）と CpG

2） M. Yamamoto, T. Sato, J. Beren, D. Verthelyi,ODN の複合体（NP-CpG）を用いて、メモリー型細胞傷害

D. M. Klinman, The acceleration of wound

性 T 細胞（メモリー CD 8 T 細胞）の再活性化を強力に誘導

healing in primates by the local administration ofすることを発見した。また、マウスフットパッドへの皮下immunostimulatory CpG oligonucleotides. Biomaterials

投与（intradermal injection, i.d.）によって、ガン細胞の移

32, 4238-4242（2011）．

+植に対してマウスの生存率を高め、抗ガン作用を示すこと

3） H. Ikeuchi, T. Kinjo, D. M. Klinman, Effect of。Fanらは、カーボンナノチューブ（CNT）

suppressive oligodeoxynucleotides on the developmentとCpG ODNの複合体（CNT-CpG）の皮内投与（subcutaneousof inflammation-induced papillomas. Cancer Prev Res

injection, s.c.）、頭蓋内投与（intracranial, i.c.）が、同じく（Phila）4, 752-757（2011）．

を明らかにした10）。その他、プロ

4） S. Klaschik, I. Gursel, D. M. Klinman, CpG-mediated

タミン -CpG ODN、脂質性リン酸カルシウム -pDNA など

changes in gene expression in murine spleen cells

様々な核酸キャリアーが提案されている。しかしながら、

identified by microarray analysis. Mol Immunol 4 4,核酸分子は安定性に乏しく、腸管粘膜への経口送達は、い1095-1104（2007）．

抗ガン作用を示すことを報告している

11）

まだ課題とされているが、筆者は、これまでに胃酸耐性を

5） T. Sato, T. Shimosato, A. Ueda, Y. Ishigatsubo,

有する ODN ナノカプセル（ODNcap）の開発に成功した 7）。

D. M. Klinman, Intrapulmonary Delivery of CpG

本成果を踏まえ、本研究で作成した改良型 ODN 微粒子は、Microparticles Eliminates Lung Tumors. Mol Cancer

これまで様々な核酸分子キャリアーが提案されている中で、Ther 14, 2198-2205（2015）．

大幅なコストカットを達成した。一方で、包摂率が約 706） S. Nigar et al., Synergistic oligodeoxynucleotide% であることから、さらなる包摂効率の改善が望まれる。

strongly promotes CpG-induced interleukin-6
production. BMC Immunol 18, 44（2017）．

現在、上皮細胞培養系を用いて、粒子化、乳化 ODN 微粒子による抗炎症効果について検証を進めている。今後は、

7） Y. Wang et al., Inhibitory/suppressive oligodeoxynucleotide

ヌードマウスを用いた塗布試験も計画しており、経皮的に

nanocapsules as simple oral delivery devices for

浸透した ODNA の皮内における分布状況について経時的preventing atopic dermatitis in mice. Mol Ther 2 3,に解析を行う予定である。ODN の経皮投与は、前人未到

297-309（2015）．の投与ルートである。併行して実施した ODN 微粒子の粒

8） T. Shimosato et al., CpG oligodeoxynucleotides

度分布の狭小化により、気管支関連リンパ組織（BALT）やinduce strong up-regulation of interleukin 33 via Toll-腸管関連リンパ組織（GALT）への送達性と取り込み効率のlike receptor 9. Biochem Biophys Res Commun 3 9 4,向上が期待された。経気道投与法の構築にあたっては、

81-86（2010）．

ODN 微粒子体調整液を充填したエアゾール缶の試作を行

9） T. Shimosato et al., Identification of a potent

い、最適なデバイス構築に向けた研究開発を開始しており、

immunostimulatory oligodeoxynucleotide from

将来的には呼吸器アレルギー疾患や呼吸器悪性疾患、さらStreptococcus thermophilus lacZ. Anim Sci J 80, 597-には呼吸器感染症に対する吸入核酸医薬の研究開発につな

604（2009）．

がる成果と考える。また核酸医薬の耐胃酸性の問題は、炭1 0）A. de Titta et al., Nanoparticle conjugation of CpG

酸アパタイトを基材とすることで克服されたことから、

enhances adjuvancy for cellular immunity and memory

ODN 炭酸アパタイト粒子体を作成し、ファルマバレーセ

recall at low dose. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 19902-

ンターとの協働による高機能微粒子作成装置を用いること

19907（2013）．

で、狭い粒度分布が再現され、経口摂取後の GALT への

11）H. Fan et al., Intracerebral CpG immunotherapy with送達・取り込み向上が期待された。このように、ODN 微

carbon nanotubes abrogates growth of subcutaneous粒子体の特性を明らかにし、経口、経気道に加えて、経皮melanomas in mice. Clin Cancer Res 1 8 , 5 6 2 8 - 5 6 3 8

ルート開発に向けた道筋を見出した。以上本研究は、抗炎（2012）.

症作用の知られた ODN を有効性成分とする、スキンケア化粧品等の開発に向けた取り組みとして位置づけられる。

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