ヒト血清アルブミン加水分解物由来のテトラペプチドによるビタミンEの抗酸化能の向上
水産大学校

幡手英雄

Antioxidative substances play an important role in depression of undesirable oxidat10n m
biological systems as well as in food processing. Although synthetic antioxidants such as
butylated hydroxytoluene are effective for preventing lipid peroxidatione, their safety has beenquestioned. Therefore, many researchers have been screening for useful antioxidants fromvarious natural materials. At present, vitamin E (a -tocopherol) is widely used as a safe naturalantioxidan. Furthermore, it has been demonstrated that peptides from various proteins, such as
soybean protein, sardine myofibril protein, and bovine serum albumin, enhanced the antioxidative
activity of a-tocopherol (Toc). These results suggest that peptides, which are produced
metabolically and incorporated dietetical!y, will serve as an effective synergist in biologicalsystems. Namely, these peptides are supposed to protect in vivo lipid peroxidation in cooperation
with antioxidants such as tocopherols. Nevertheless, the investigation on the synergisms ofpeptides originated from human serum albumin (RSA) is not made yet.
In the present study, S-carboxymethylated RSA (CM-RSA) was employed for thepreparation of synergistic peptide, instead of the intact RSA, because the disulfide bridges in theRSA molecule seemed to prevent the proteolytic digestion. The CM-RSA treated with pepsin
showed strong synergistic effect towards Toc. From the resulting hydrolysates a peptide, having
a strong synergism, was successfully separated by chromatography on a Sephadex G-25 column,
and then high-performance liquid chromatography on an ODS column. This peptide, designatedas HSA-H-5, was again hydrolyzed with a lysyl endopeptidase to give two peptide fragments.
Each fragment thus isolated was tested for its synergistic effect with Toc, and it was found that
one fragment had a potent synergism comparable to the original peptide, HSA-H-5, but the otherone had little effect. The structure of that active fragment was confirmed as the tetrapeptide,
Leu-Gln-Ris-Lys, by amino acid analysis and sequence determination. In addition, HSA-H-5
and the active fragment corresponded to the amino acid residues 103 to 112 and 103 to 106 of RSA,respectively. Although the role of that active fragment in the HSA was not apparent, it composedof only five amino acid residues. Therefore, it will be advantageous not only for the application
as a useful synergist but also for the elucidation of unknown synergistic mechanism of peptide
synergists

1緒

言

老化色素さらには皮膚癌との関連が指摘され、 重要な問題になっている。 一 方、 脂質酸化の防止に過酸化脂質は食品の品質劣化を引き起こすだけ使用されてきた合成抗酸化剤に関して、 発癌作用でなく、 様々な疾病、 老化あるいは発癌などにもなど人体に対する悪影響が報告され、 一 部の合成関与している。 コスメトロジ

一分野においても紫抗酸化剤の使用が禁止されたり、 使用量が制限さ外線による活性酸素（フリラジカル）の発生とれる傾向にある。 このような状況から、 様々な分ー野でこれら過酸化脂質の生成を抑制できる抗酸化性物質の開発が期待されている。 しかし、新たにEnhancement of Antioxidative Acti­
vity of Vitamin E using Tetrapeptide
Derived from Human Serum Albumin

開発された抗酸化性物質の多くは毒性や有効性の点で不充分なもの が 多 く 、 現在もビタミンE(a-トコフェロ — ル； Toe)が抗酸化剤として汎用

Hydrolysatesされているのが実状である。 したがって、新規抗Hideo Hatate
ぷ

酸化剤の探索と同様に、 既存の抗酸化剤の能力をNational Fisheries University高める物質、 すなわちシナ ー ジストの開発は重要

-9-

た。

な研究課題である。 シナ ー ジストは様々な物質 に存在しており、各種タンパク質の加水分解物も抗2. 3

酸化剤と強い相乗効果をもつことが報告されてい

CM-HSAの加水分解物の調製

CM-HSAを0. 02M HClに 0. 5% (w/v)となるようる 1 -6) 。 筆者は、人体の基本的構成分であり生体に 受け入れやすいヒト血清アルプミン(HSA)をに溶解し、 沸騰水浴中で5分間加熱処理した。 こ原料とし、 毒性のない有効なペプチ ド シナ ー ジスの0. 5%CM-HSA溶液にペプシンを100: 1 (HSA; 酵トの開発を試みた。 その結果、HSAのプロテ ー ゼ素、w/w)の割合で添加し、37℃で 9時間酵素反応処 理に よって生 成 さ れ た各 種の 加 水 分 解物させた。 反応終了後、 沸騰水浴中で5分間加熱し、(HSA-H)は、 予想どおりToeに 対して 強い相乗効酵素を失活させてCM-HSAの加水分解物(CM-HSA­

果を発現した。 しかし、 生成されたペプチドの分H)を調製した。

子サイズが大きく、 しかも多種類であったために2.4有効なペプチドシナ ージストの構造解明にはいた

s-s結合をCM-HSA-HのセファデックスG-25による分離

CM-HSA-Hを遠心分離した後 、 こ の上澄液をらなかった。 そこで、 本研究ではHSAの―3

M HC 1を溶出剤とし てセファデック ス

あらかじめ切断して酵素分解を受け易くした還元

1X10

カルボキシルメチル化HSA(CM-HSA)を原料タン

G-25(Super fine)カラム(2. 2cm x 111.5 cm)パク質 とした。 その結果、 Toeと強い相乗効果をで分画した（流速0.3ml/min)。
なお、 本研究ではペプチド量は、254nmの吸光もつテトラペプチドが分離されたので以下に報告

度あるいはTNBS法 ” で定量したアミノ基量 で評価する。

した。
2実

験
2. 5

2. 1

薬品

CM-HSA-Hの高速液体クロマトグラフィ ー(HPLC)による分離

リノ ー ル 酸（和光純薬製）、HSA (シグマ社製）、各種ペプチドは胃akosil 5Cl8-200T カラム

ペプシン（プタ胃粘膜、シグマ社製）、 リシル エ(4.6mm X 250mm、 和光純薬製）または TSKg 釦ンドペプチダ

ゼ(LEP、 和光純薬製）、Toe (和ODS-80Ts(4.6mm x 250mm、 東 ‘ノ ー 製）を用 い七光純薬製）、2、4、6ー トリニトロベンゼンスルホHPLC分析した（検出波長220nm)。 溶出剤と してン酸ナトリウム塩2水和物(TNBS、和光純薬製） 、は0.1 %トリフルオロ酢酸を含む水とアセトニトジチオトレイト ル（和光純薬製）。 その他、 高リルの混合液を使用した（流速 0.5 ml/min)。

ーー純度の市販試薬をそのまま使用した。
2.62. 2HPLCで 分離した有効なペプチドを、LEPで 0. lM

CM-HSAの調製—

0. SMトリス 塩酸緩衝液(pH 8. 5)に 0. 5%(w/v)となるようにHSAを溶解した。 この0. 5%
HSA溶液1ml当たりにジチオトレイトペプチドのLEPによる断片化

ーTris-HCl緩衝溶液( pH9. 0)中で、37℃、 3時間加水分解処理して断片化した。

ル3mgを加2. 7

え、 容器内の空気を窒素で置換して室温で2時間

各種ペプチドとToeとの相乗効果の測定

リノ ール酪の最終濃度が2.ox10-31,1になるよう還元した。 還元後、 このHSA溶液1ml当たり、 ヨ ーに、 エ タノ ー ル 2ml、ド酢酸7.5mgを加え暗所で30分間反応させた。 反0 . 05Mリン酸緩衝液

応終了後、暗所で脱イオン水に対して充分に透析(pH7.0) 2m l、 蒸留水 1mlの混合液を酸化モデルした。 透析内液を凍結乾燥してCM-HSAを調製し系として設定 した。 Toe(50µg)との相乗効果を-10-ヒト血清アルプミン加水分解物由来のテトラベプチドによるビタミンEの抗酸化能の向上判定するときは、各種 ペ プチド溶液の添加量に応た。このCM-HSA-Hの分離パターンは、還元処理さじてこの酸化モデル系から蒸留水の量を滅じ、 全れていないHSAを ペ プシン処理して同様に調製し量は常に5mlとした。これをネジ付試験管(20mmた加水分解物の分離パタ ー ンとは多少異なっていXl25mm)で密栓し、60℃の暗所で自動酸化させた。 しかしながら 、強い相乗効果をもつ ペ プチド

ル酸の陸化の程度は、チオシアン酸鉄（画分A)は両者ともほぼ同じ位置に溶出されてお法 . 4) で経日的に測定し、過酸化物価がlOOmeq/り、CM-HSA-HとHSA-Hに存在する有用 な ペ プチドkgに達するのに要する日数（誘導期）でToeとのシナ ー ジストが同様あるいは類似の物質であるこ相乗効果の強さを評価した。とが示唆された。

2. 83. 2た。 リノー3ペプチドのアミノ酸分析およびその配列CM-HSA-Hからのペプチドシナージストの分離

決定
HClで110℃、24時

Fig. 1に示した強い相乗効果をもつ画分Aを回収間加水分解し、アミノ酸自動分析計でアミノ酸組し、凍結乾燥して濃縮した。画分A中に存在する

また 、 ペ プチドのアミノ酸配列をToeと強い相乗効果をもつ ペ プチドを単離するた常法により、 ペ プチドを6N成を調べた。

果40

E u ozz :ie a�ueqJosqv

および各画分とToeとの相乗効果ペプシンで37℃ 、9時間加水分解して調製されたCM-HSA-HをセファデックスG-25で分離し、各画分 0. 1mlのToeとの相乗効果を検討した。Fig. 1に示すように、試験管番号23から42の範囲で相乗効果が認められた。その画分中で相対的に少ない ペ

20 0CM-HSA廿のセファデックスG-25による分離．

3. 1結)\f察 ）iJl!
UOlilJl!

3＿一＿

めに逆相カラムによるHPLC分析を行った。

Edman分解法を用いた自動分析装置で決定した。

プチドの溶出量であるにもかかわらず、強い相乗10効果をもつ一 群のペプチド（画分A)が認められ
A

250.2

40

506070

Fig.2―E onoEu)dnoJS0u1
E<3000
2ー5Fig.1

20- Am;nog『o,p40

HPLC of fraction A* obtained from CM-HSA-H Co I umn, Wakos i I 5C18-200T;
Flow rate, 0. 5ml/min. *Refer to Fig. 1

Fig. 2に示すように、画分Aには多数の ペ プチドが混在していた。これらをピ ー クごとに回収し、各画分 15nmolのToeとの相乗効果を測定した。すな80

わち、 各画分を凍結乾燥した後、少量の0. 001 M

Tube No. (8.0 mlll,be)Toe

30400一゜0110一ECマs"冨 ●2 •q』
0●qy51(AS )で 一』●duo11
gnpu120-,20Time (min).•.••••.• Aboo巾anco●t254nm

HClに再溶解し、ペプチドの濃度をTNBS法で測定

Separation of CM -HSA-H by chromate­graphy on a Sephadex G-25 column,andsynergistic effect of fractions withToc.

して各画分の酸化モデル系への添加量を15nmolに調整した。その結果、ピ ーク1. 5および9がToeと強い相乗効果を示した(Fig. 3)。ピ ー クlおよび-11-21016一3456789 10 11 12

Peak No.

Fig.3

Synergistic effect of fractions 拿·Refer to Fig.2
with Toc.

Fragment 5- bA:|＇,．
I゜2Euo NN lea::iueqJosqv(b p)poµedU<>tonpu1

05
1

Fragment 5- a:n,ta:uo:i.
E ,苓）a（0゜―――

209からは現在のところ有効なペプチドシナ ー ジス
トは単離されていないが、ピ ー ク5からは強い相乗効果をもつペプチドシナ
ーピーー10ジストが、明瞭な単3040

Ti me (min)クとして分離された。 以後このペプチドシ

Fig.4

ナージストをHSA-H-5と呼称する。
3.3

20HSA-H-5のLEPによる断片化

ペプチドシナ ー ジストの実用化あるいは不明な点の多いその機能の発現機構を解明するうえでHPLC of HSA-H-5•atter treatment withlysyl endopeptidase at 37 ℃ for 3h.
Column, TSK gel 0DS-80Ts; Flow rate,0. 5 ml/min.
·HsA-H-5 corresponded to peak 5 1 n
Figs.2 and 3は、分子サイズのできるだけ小さいペプチドの作製が望まれる。 そこで、CM-HSA-Hから分離されたペプチドシナ ー ジストHSA-H-5をLEPで再度加水分15解した。Fig. 4に示してあるように、LEPを3時間解され、新たに2つのピ ー ク（フラグメント5-aおよび5-b)を生じた。 このことは、HSA-H-5が少な
くとも2つのフラグメントから構成されているこ゜

5-aおよぴ5-bのToeとの相乗効果を示してある。

5とを示唆した。Fig. 5 に HSA-H-5、フラグメント0ー(�ep) popad uo1p npu

程度作用させると、HSA-H-5はほぼ完全に酵素分

フラグメント5-aはHSA-H-5と同程度の強い相乗効果を発現し、LEP処理により断片化（低分子化）されても依然として強い相乗効果を保持していControl

た。 一 方、フラグメント5-bは無効であった。 このことは、HSA-H-5の機能発現部位が、フラグメ

Fig. 5ント5-bではなく、 フラグメント5-aにあることを明示した。

-12-HSA-H-5

Fragment
5-a5-b

Synergistic effect of HSA-H-5 andits f r agments 5-a and 5- b with To c.

ヒト血清アルプミン加水分解物由来のテトラペプチドによるビタミンEの抗産化能の向上

3.4

Lysyl endopeptidase

ベプチドシナ ー ジストの構造解析

Table 1 にHSA-H-5、フラグメント5-aおよびのアミノ酸残基から構成されていること、 さ ら< - .....,

H-5は4個および6個のアミノ酸残基からなるフラグメント5-aおよび5-bのみを構成成分とすること

Fig.6が推察された。この組成と既報 8) のHSA-Hの一次
Table 1 Amino acid compositions of HSA-H-5,and its fragments 5-a and 5-b
HSA-H-5

Fragment 5·a

Fragment 5-b(4}'0 2'(0)36°(4)

Ser0.2(0)0I(0)

0.1(0)

Prol.O

(I)

11(I)

Glu

11(I)

I0(I)

Gly02(0)

02(0)

02(0)

Ala02(0)

03(0)

Val0I

(0)

02(0)

しu23(2)

I2(I)

IO

(I)

Tyr03(0)Lys10(1)I0(I)

His09(!)

08(1)

10To叫112← Fragment 5-a_... �に、アミノ酸残基数やその種類の 一 致からHSA­

38'

106 107

Leu-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu5-bのアミノ酸組成を示してある。HSA-H-5は10個

Asp

↓

103

Fragment 5-b�.,''·>HSA-H-5Amino acid sequence of HSA-H-5 andits fragments 5-a and 5-b.Amino acidsequence of HSA-H-5 coincided with
HSA residul!S 103-112.
Lysyl endopeptidase hydrolyzed HSA­
H-5 at the peptide bond indicated by
the vertica I arrow.

4考察

各種タンパク質やペプチドが抗酸化剤に対して相乗効果を発現することが報告されており、本研究で解明されたテトラペプチドLeu-Gln-His-Lys構造のみがそれらすべてにとって機能発現に不可

6'Mole rdl.io to l mole of Lys

欠とは考えにくい。さらに、この構造が最小単位"Number in parenthe.,;is indica応an approximate integer.
'Mole『a1io 10 I mole of Leuのペプチドであるか、あるいはHSA分子内におけるその役割なども現在のところ不明である。しか構造とを比較したところ、HSA-H-5はHSAのアミノしながら、このテトラペプチドは、Toeの抗酸化酸配列でアミノ酸残基103から112までの10個のア性を著しく向上し、しかも従来のペプチドシナ ーミノ酸残基に一 致した(Fig. 6)。また、フラグジスト 6) にくらべて低分子サイズである。現在でメント5-aはアミノ酸残基103から106の4個に、フも不明な点の多いタンパク質やペプチドの相乗効

ラグメント5-bは107-112の6個のアミノ酸残基に果の発現機構やそれらの生体内における役割を明それぞれ相当した(Fig. 6)。HSA-H-5の断片化にらかにするうえでは優れた研究対象になりうるも使用した酵素LEPは各種のポリペプチドに対してのと思われる。抗酸化剤やシナ ー ジストの効力

Lysのカルボキシル基の関与するペプチド結合のは、使用した実験系や対象とした試料などによりみを選択的に加水分解すると いう基質特異性を異なることが多く、本研究で得られたペプチドシ。すなわち、LEPによりHSA-H-5のア

ナ ー ジストについても各種のモデル実験系で再検

ミノ酸残基106と107との間のペプチド結合が切断討する必要があろう。しかし、HSAを原料としたされ、Lys残基をC末端とするフラグメント5-aをこのペプチドは人体に対して高い安全性が保証さ生じたものと推察される(Fig.6)。さらに、低分れ、今後の研究の進展にともなってさまざまな分子サイズでToeに対して強い相乗効果を示したフ野での応用が期待される。

もっている9)ラグメント5-aのアミノ酸配列を分析し、予想されたテトラペプチドLeu-Gln-His-Lysであることが確認された。

-13-

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