理科教養講義

細胞の構造生物学
遠くを見る望遠鏡

遺伝子だけでなく教育や環境が人を作る機構
Nurtureの分子機構

個性や能力を分子レベルから理解したい：
構造生理学

創薬基盤技術の開発
構造に基づいて1

名古屋大学大学院創薬科学研究科 細胞生理学研究センター 藤吉好則

電子顕微鏡で原子分解能が達成できる

塩化フタロシアニン銅の 1.8Å分解能 の電子顕微鏡像

Chlorinated Copper Phthalocyanine
Chemica Scripta., 14, 47-61 (1978/79)

Yoshi's Lab.

21

銀・TCNQ複合体

電子線最少照射装置開発

Nature, 285, 95-97 (1980)

MDS (Minimum Dose System)3

電子線損傷による分解能限界
電子線損傷の軽減が必須

Adv. Biophys. 35, 25-80 (1998)
冷却電子線損傷のために、１００Å
より高い分解能での観察は不可能
8K

８K以下で、室温の20倍の電子線照射が可能

極低温電子顕微鏡の開発が必要

原子爆弾の爆心地と同じ程度のエネルギー
20K

T4ファージの電子線損傷
4

Yoshi's Lab.

2極低温電子顕微鏡開発の歴史：第７世代まで

1st G
1986

2nd G
1988

Kyoto U

3rd G1994PERI

For single particle
method

4th G

Harima, Tokyo

2001

5th GTokyo

2004

Helium stage

Kyoto U

Review:Adv. Biophys. 35, 25-80 (1998)

For Tomography

6th G
2006

電子線結晶学・膜の中で構造研究が出来る・小さい結晶でも構造解析可Kyoto U

57th G with U-SET system

H+K+-ATPase by K Abe
PNAS, 109, 18401-6 (2012)
Nature Comm. 1154, 1-7 (2011)
EMBO J 28, 1637-43 (2009)

・結晶の両側が開いている・位相が像から直接計算される

Henderson R, Unwin PNT,

Nature, 257, 28-32 (1975)
Bacteriorhodopsin

Nature, 389, 206-211 (1997)

Yoshi's Lab.

6H+を１００万倍の濃度勾配までpumping

3Bacteriorhodopsin
3Å分解能の構造
Nature, 389, 206-211 (1997)５Å以下の穴

脂質分子が観察できる

Nature, 389, 206-211 (1997)

7Image shift caused by charge up

UntiltedNature, 389, 206-211 (1997)

Yoshi's Lab.

極低温では電気抵抗が飛躍的に増加

良い像が撮影できる割合が飛躍的に増加
2％ から 95％へ
J. Structural Biol., 146, 325-333(2004)84典型例：AChRの構造

チューブ状結晶からの構造解析
AChR：アセチルコリン受容体

Nature, 423, 949-955 (2003)
by N Unwin

9Gating Mechanism
AChR
AChAChAChR
5mS
神経筋接合部

by N Unwin

Nigel Unwin, Nature 373, 37 (1995)

JMB, 422, 617-634 (2012)

Yoshi's Lab.

105

Gating Mechanism

Nature, 423, 949-955 (2003)

JMB, 422, 617-634 (2012)by N Unwin

11

アセチルコリン受容体のGating Mechanism
by N Unwin

Na+8Å

JMB, 422, 617-634 (2012)

Yoshi's Lab.

6

単粒子解析法：脊椎動物由来の構造解析を考えたが高分解能解析はできず
Na-channel,

Nature, 409, 1047-1051 (2001)

Vestibules

IP3R.,

J. Mol Biol., 336, 155-164 (2004).

Vestibules

13

イオン選択性の機構

K+-channel

D.A. Doyle et al. Science 280,69-77 (1998)
Y. Zhou et al. Nature414, 43-8 (2001)

1) K+>>Na+, 2) 108 K+/sec

K+-channel YYYY
Na+-channel

Roderick MacKinnon

Ca2+-channel

24TM
S1～S6×4Domain
DEKA(Nav) EEEE(Cav) motif
Na2+ channel to Ca2+ selective
DEKA→ＥＥＥＥ
イオン選択性もまだなぞ

Y

K+>>Na+, 2) 108 K+/sec

Yoshi's Lab.

YWilliam N Zagotta, Nature 440, 429 (2006)147

Nav channels Nature Communications, 3, 793 pp1-8 (2012)
Sulfitobactoer pontiacus
J. Biol. Chem., 286, 7409-7417 (2011)
J. Biol. Chem., 285, 3685-3694 (2010)
BBRC., 399, 341-346 (2010)Chimera of NavSulp

WT:50msec

Inactivated state？

DM:691msec

構造はまったくボールアンドチェインモデルとは異なる

15by K Irie

Overallstructure of Na channel
電位感受性チャネルの模式図

S1-4
123++++

S5,64

Voltage sensor
domain5P

6Ion selective
pore domain

VSDPD？Linker helix
VSD

PD

Linker helix

Yoshi's Lab.

8

AQP0:白内障、細胞接着

水チャネルの構造と機能

AQP1:腎臓はじめ多くの場所に発現
AQP2:ダイナミックな機構、心臓疾患
等多くの病気治療対象
AQP3:水だけでなくグリセロール透過、美容、怪我などに関係、肺、消化管
AQP4:細胞接着、躁鬱病や多発性硬化症等にも関連し高次の脳機能とAQP5:ドライアイ、唾液分泌、汗腺、肺AQP6:水チャネルのファミリーながら、陰イオンチャネル、脳での機能、腎AQP7:グリセロール透過、脂肪細胞、腎AQP8:グリセロール消化管、膵臓、腺房、肝臓研究進捗の程度
高い

AQP9:グリセロール、肝細胞、脳、白血球
AQP10:グリセロール、消化管

肝細胞
低い AQP11:NPAがNPC腎性嚢胞症、脳、
17

AQP12:NPAがNPT、オルガネラに発現aquaporin-1の機能
水銀イオンはどの様に水透過を阻害するか? => 水銀イオンの利尿作用!
どの様な機構で水だけを選択透過するのか?
非常に速い水の透過性はどの様にして実現されるか (１秒間に３０億もの水分子を透過)?

速い水透過をしながらプロトンをも透過しない機構は？
水チャネルの構造解析が必要

Yoshi's Lab.

189

２次元結晶と構造

地球上のほとんどすべての生命に発現
Nature, 387, 624-7 (1997)
Nature, 407, 599-605 (2000)

NPA

すべてのＡＱＰｓが４量体を形成

水選択透過の分子機構

19

Nature, 407, 599-605 (2000)

H-bond isolation mechanism
Ar/RHENPA
HB

C189

Courtesy of Grubmueller

Analysed at 3.8Å resolution
・ Global orientation turning
・ Desolvation effect of ions

Yoshi's Lab.

NN
20

10

1.9Å 分解能でのAQP0の構造解析

Nature, 438, 633-638 (2005)

by T Walz

Lens fibre cells
Ciliary muscle

Related withcataract

N192
N76

21 in
Cartoon of AQP1 channel
Nature, 407, 599-605 (2000)

Water molecules in the AQP0 channel at closed state

脳の水チャネル
脳室上衣細胞Ependymal cells

イオンチャネルの機能を支える脈絡膜叢
Choroid prexus

AQP4
AQP1

脳の水含量は８５％

AQP4
Endfoot of
astrocyte

星状膠細胞
視床下部
グリアルラメラ細胞膜
AQP1

Glial lamellae of
Hypothalamus

AQP4

AQP4

速い水透過
M.A. Moghaddam, O.P. Ottersen, Nature
Rev. Neurosci., 4, 991-1001(2003)

Yoshi's Lab.

2211

AQP4の構造解析？常識と異なる？

電子線結晶学2.8Å分解能

X線結晶学

1.8Å分解能
W1
W2

ar/R

W3

ar/R

W4

NPA

W5

NPA

W6
W7
W8

８個の水分子を分離

23
水分子の分離不良

J. Mol. Biol., 389, 694-706 (2009)

JD Ho et al., PNAS 106, 7437-42 (2009)

比誘電率とHelix Dipole

比誘電率: ε双極子モーメント: μMembrane

Durba Sengupta et al.,
Structure 13, 849-55 (2005)

ε=80HE
ε=2Membrane
HB
ε=80
Nature, 407, 599-605 (2000)

Yoshi's Lab.

24D. A. Doyle et al. Science 280, 69-77 (1998)12電子線結晶学の優位性：
AQP4の膜の中での構造‐比誘電率とHelix双極子

ε=80

ε=2+‐電子線結晶学
2.8Å分解能

ε=80

X線結晶学

1.8Å分解能W1W2ar/Rar/R

W3
W4NPA

W5

NPA

W6
W7W8
ミセル中で水分子の分離不良
25
JD Ho et al., PNAS 106, 7437-42 (2009)

膜内で８個の水分子を分離
J. Mol. Biol., 389, 694-706 (2009)

チャネル内の水分子と選択透過AQP4の構造解析で１秒間に３０億の水分子を選択透過する機構解明

H-bond isolation mechanism

Temperature factors

W1

ar/R

3.9Å

W33.9Å
W53.8Å

NPA3.8Å

3.7Å
W8

Stepping stones configulation
26
J. Mol. Biol., 389, 694-706 (2009)

Yoshi's Lab.

13

脳における血流の制御機構
Speaking English
Japanese

Native speaker
By T. Nakata
astrocyte

AQP4 in brain

脳の毛細血管には血管平滑筋がない！

AQP4M23

AQP4 はグリア細胞の endfeet でorthogonal arrayを形成し、その大きさは制御されている
AQP4M1AQP4M1AQP4M23
27

The orthogonal arrayの制御機構

２次元結晶はarray構造を表現

arrayJMB, 355, 628-639 (2006)

AQP4M1AQP4M23by Y Hiroaki et al
28

Yoshi's Lab.

14

AQP4のCysteineの脂質修飾がarray制御
J. Mol. Biol., 402, 727-39 (2010).
J. Mol. Biol., 389, 694-706 (2009)
Biochem. Biophys. Acta., 1778, 1181-9 (2008).

N末端

J. Mol. Biol., 355, 628-39 (2006)

N末端の構造は低分解能でのみ観察可能

アレイ構造
安定化機構

29

細胞接着機能AQP4

AQP1

Glial Lamellae of Hypothalamus

310helices

AQP4
L-cells(Fibroblast)Osmo-, thermo-,
glucose-sensory

Gushing water model

S. Nielsen et al., J. Neurosci., 17,
171-180 (1997)

バソプレッシンへ

Yoshi's Lab.

3015

脳の多機能性水チャネル, AQP4

視神経脊髄炎インフルエンザ脳症脳浮腫

１） 速く高い水選択性チャネル
２） 細胞接着機能
Weak adhesion３） 脂質分子:PEとの直接結合
４） arrayの形成と制御
Lipid modification
５） PDZ domainとの結合？
６） dopamineによるgating？
７） multiple sclerosis, neuromyelitis optica(視神経脊髄炎) and manic depression (bipolar disorder,mesial temporal lobe epilepsy)８） 細胞分化との関連？
M. Zelenina et al. , Am. J.
Physiol. Renal Physiol.,
283, F309-F318 (2002)

AQP4 binds withlipid molecules
J. Mol. Biol., 402, 727-39 (2010).
J. Mol. Biol., 389, 694-706 (2009)
BBA, 1778, 1181-9 (2008).
J. Mol. Biol., 355, 628-39 (2006)

Ser180Asp

phosphorization

31

Gushing water model-2: HypotheticalHeberle J et al., (1994) Proton migration along
the membrane surface and retarded surface tobulk transfer. Nature 370: 379-382.

Array of
AQP4

Pial surface

Pia

H+H+Astrocyte

Cerebrum

Cerebellum
32

Yoshi's Lab.

16

新しい生理学概念；

AQP0

Adhennels；
Multifunctional cell adhesive channels
concatenating
AshuraNature, 438, 633-638 (2005)

AQP4

JMB, 355, 628-639 (2006)
JMB, 389, 694-706 (2009)
JMB, 402, 727-739 (2010)

Gap Junction channels
Cardiac development, fertility, theimmune system, electrical signalling

1011 neural cells, 1015 synapses

個性や能力の形成機構を分子レベルから理解したい
氏より育ち

PNAS, 104, 10034-10039 (2007)

33

Adhesive Ion channel X

Cx26M34A mutantの解析
by A Oshima
PNAS, 104, 10034-10039 (2007)8Å
Constrictions arenarrower than 8Å

栓：PlugPlugモデル提案
6 aa deletion

34

J. Mol. Biol., 405, 724-35 (2011)

Yoshi's Lab.

17

Cx26のX-rayによる構造解析
Nature, 458, 597-602 (2009)by S Maeda

Plug helix

35

Gating by transjunctional voltage, Vj
Nature, 458, 597-602 (2009)
Multiple gating mechanisms
by voltage (Vm, Vj), pH,Ca2+, phosphorylation

WT

M34A/WT
M34A

36

Yoshi's Lab.

18

細胞質の構造
Multiple gating mechanisms
by voltage (Vm, Vj), pH, Ca2+, 2D crystal for EM
phosphorylation
Complex structure

3D crystal for X-ray

Longitudinal interactions

Nature, 458, 597-602(2009)

Horizontal interactions

PNAS, 104, 10034-10039(2007)

Plug structure

JMB, 405, 724-3537(2011)

電子線結晶学で解析した膜タンパク質

Yoshi's Lab.

19

Electron tomography of innexin-gap junction of crayfish
J. Struct. Biol., 175, 49-61 (2011)

トモグラフィーによる立体構
造：染色39

Tomography of GJ
Gap Junction from rat Brain
Slice image of cryo-tomography

脂質２重膜を分離して観察

Ｇ７極低温電顕

40

Yoshi's Lab.

20

Postsynapseの足場蛋白質
構造と機能研究

Structure of Homer 1 (CRH1)
LRRTM
PSD-95 PRR7
HomerIP3R

J. Mol. Biol., 318, 1117-1126 (2002)
BBRC, 327, 183-191 (2005)
New membrane protein
associated with PSD-95,
NMDAR

構造に基づいたKOマウス
Importance of 2nd PDZ in PSD-95

J. Neuroscience, 18,763-774 (2006)
Importance of bB/bC
loop of PDZ in PSD-95

J. Biol. Chem., 277, 3640-3646 (2002)
Eur. J. Neurosci.,24,1955-1966 (2006)
Neurosteroid atpresynapse

多様な研究手法で総合的に膜蛋白質の大量発現と精製
Sf9，expresSF＋TM，HEK293細胞等を活用

電子線結晶学による構造解析
水チャネルの構造と機能解析
AQP4

AQP0

電子線結晶学を中心に多様な手法で・ 速い透過・選択機構解明
・ ゲーティング機構解明
・ 生理機能解明

２）チャネル構造・機能研究３）ギャップ結合チャネル研究

Adhennelsをはじめイオンチャネル研究で新しい神経ネットワーク形成機構の解明

・ 複雑ゲーティング機構解明
・ Cx26以外の構造解析
・ トモグラフィー解析

４）Adhennelの構造・機能・ synapse形成機構の解析

JBC, 284, 33139-50 (2009)
JBC, 285, 3685-94 (2010)

・ AQP4のPDZ結合モチーフ、細胞接着、結晶性配列形成等の生物学的機能解明
・ AQP4ノックアウトと、アレイ制御機構のマウスの解析からAQP4の高次機能の解明
・ X+チャネルのノックアウト等による神経活動による標的細胞認識の機構解明

電気生理
電子線トモグラフィーによるシナプスなどの立体構造の解析
第７世代の極低温電顕活用
・ 遺伝子改変（GM）マウスのシナプスなどの立体構造解析

多機能性チャネルの理解と構造生理学の確立

Nature & Nurture

Yoshi's Lab.

遺伝子改変（GM）マウスを用いた解析（ノックインマウス、ノックアウトマウスなど）

・ ギャップ結合チャネルの解析

Muse cells

イオンチャネル NachBac, Kv12.2 etc

Polshinyascope

１）水チャネル構造・機能研究・ イオン選択性機構解明
・ ゲーティング機構解明

JMB, 355, 628-39 (2006) Nature, 438, 633-8 (2005)

各種光学顕微鏡法

41

・神経活動による標的細胞
42

認識機構解明などの理解21