β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製
芝浦工業大学システム理工学部生命科学科

須原義智

We synthesized a collagen-mimetic peptide for the purpose of increasing of biological and physical stability. Collagenis one of the most important proteins in mammalian body that maintains structural integrity of the organs and tissues. It
has been used for a biomaterial such as regenerative medicine because of excellent biological compatibility. The consensus
sequence of a general collagen model peptide is known as (X-Y-Gly)n (for X and Y, it corresponds to proline (Pro) or
hydroxyproline (Hyp)), however, it is unstable to hydrolytic enzymes. Most collagen used as biomaterials derived fromanimals, which can be supplied inexpensively and in large quantities. But many problems such as immune reactions andcontamination of pathogens are existed. In order to increase the stability to hydrolytic enzyme and its thermodynamic
stability and overcome those problems, we synthesized a collagen mimetic by converting one of the basic sequence ProHyp-Gly into β-amino acid. In short, our mimetic contains one of β-proline (βPro), β-hydroxyproline (βHyp) and β-alanine(βAla), which is substituted from one of Pro, Hyp, and Gly in the consensus sequence.
The synthetic strategy was following. First, three amino acid residues of the basic sequence Pro-Hyp-Gly containing
β-amino acid such as Pro-βHyp-Gly, βPro-Hyp-Gly and Pro-Hyp-βAla were respectively synthesized, and then they wererepeatedly elongated to 30 amino acids residues such as (Pro-Hyp-Gly) 10 , (Pro-βHyp–Gly) 10 , (βPro-Hyp-Gly) 10 , and (ProHyp-βAla) 10 by a solid-phase synthesis method. The resulting collagen mimetics were investigated the helical formation andstabilities for application to biomaterials. Furthermore, we also studied an anti-skin cancer activity of those tripeptide residue
to apply for a biologically active agent.

1.

緒ある L- ヒドロキシプロリンの類縁体を合成して組み込む

言

ことが試みられているが未だ有効な手法は見つかっていな

コラーゲンは腱、軟骨、骨の有機間質、眼の角膜のようい。

な結合組織や皮膚に見られる重要なタンパク質であり、人そこで我々は α -アミノ酸を、コラーゲンの元々の性質工臓器をはじめとした再生医療へ応用するための材料としを保持しながら安定に存在できる人工コラーゲンの創製をて注目されている。コラーゲンを構成するトリペプチド目指した。体内の加水分解酵素に安定なペプチド化合物と（Collagene Tripeptide: CTP）は、X-Y-Gly を基本配列として、β -アミノ酸から構成される β -ペプチドが知られてしてもっている（X および Y は通常 Pro か Hyp が相当する）いる。β- ペプチドは天然の α -ペプチドに最も近く、特有（図 1 A）。この CTP が多数繋がることで螺旋構造をもつポの堅いコンフォメーションをもっている。我々は、コラゲリペプチド鎖を形成する。さらに、その左巻きのポリペプ

ナーゼをはじめとする各種の加水分解酵素に耐性をもつ安チド鎖が寄り集まって右巻きの３本鎖ヘリックス構造をと定な人工コラーゲンの創製を目的として、コラーゲンを構ることで、線維組織や骨格の構造維持に必要な性質を示す成する α -アミノ酸を β-アミノ酸に変換した化合物の創製ことが知られており、化学的にも興味深い物質である。しを行った（図 1 B）。

かしながら、天然のコラーゲンは α-アミノ酸から形成されているため、コラゲナーゼをはじめとした体内の加水分

２．方法となっている。これまでにコラーゲン三重鎖ヘリックスの2. 1. コラーゲンペプチドに組み込むためのβ-アミノ酸の選択構造や化学的安定化をはかるための類縁体研究が本研究では、コラーゲンを構成する Pro -Hyp-Gly のそHolmgren らや Goodman らを中心に世界中で行われていれぞれの α -アミノ酸を、β -アミノ酸に変換した人工コラ解酵素に対する安定性の問題などが実用化への大きな障壁る

1 , 2）。それらは主にコラーゲンを構成する α- アミノ酸でーゲンを構築して天然のコラーゲンとの比較を行うことにした。これら β-アミノ酸の中でグリシン（Gly）を β -アミノ

Synthesis of artificial collagen-mimetic
peptide derived from β-amino acids酸に変換したものは、市販の β-アラニン（β Ala) が相当する。一方、β -ヒドロキシプロリン（β Hyp）や β -プロリン

Yoshitomo Suhara（β Pro）は、カルボン酸が環に沿って移動した 1 とカルボ

D epa r t ment of B io s cience a ndE ng i ne er i ng , C o l leg e of Sy st em sEngineering and Science, Shibaura
Institute of Technology

ン酸側へ一炭素増炭した 2 の 2 種類が考えられる（図 2）。
本研究では合成の簡便さから、2 の形式をとった β -アミノ酸を合成して、Pro -Hyp- Gly に組み込んだ β-ペプチド化− 18 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製

図1

コラーゲンの構造とβ-ヒドロキシプロリンを含む人工コラーゲンの創成

図2

α-アミノ酸からβ-アミノ酸へ変換した化合物

図3

人工コラーゲン（30 mer）の合成方法合物を創製することにした。本研究では合成の簡便さから、

30 mer を得る。
（4）得られたペプチド鎖から三重鎖ヘリッ2 の形式をとった β- アミノ酸を合成する。

クスを形成させる。以上で得られたコラーゲンペプチドの物理化学的性質を調べ、天然型と β- アミノ酸を組み込ん

2. 2. コラーゲンペプチド鎖の合成方法

だペプチドの違いを検討した。

目的とするコラーゲンペプチド鎖の合成は図 3 に示す方法で行う。まず（1）上記で示した β- アミノ酸を合成する。

2. 3. 扁平上皮がんにおけるCTPの生物活性解析

次に（2）Pro、Hyp、Gly もしくはそれらの β - アミノ酸をCTP は経口投与や皮膚塗布によって紫外線誘発性の皮液相法により順次カップリングして、N 末端を Fmoc で保膚障害が改善されたことが報告されている 3）。しかし、護 し た CTP 残 基（Fmoc•Pro-Hyp-Gly-OH、Fmoc•β Pro-CTP の作用メカニズムや紫外線が発症要因とされる皮膚

Hyp-Gly-OH、Fmoc•Pro-β Hyp-Gly-OH、Fmoc•Pro-がんの治療法は未だ報告されていない。現在の皮膚がんのHyp-β Ala-OH）を得る。
（3）無保護の C 末端を樹脂に固定

治療法は副作用を起こすものが殆どであるため、低抗原性、化し、自動ペプチド合成装置により上記の CTP とのカッ

低アレルゲン性である CTP と皮膚がんの関連を解明する

プリングを９回繰り返した後、樹脂からの切り離しと保護ことができれば、低リスクの治療法開発への寄与が期待で基の脱保護を同時に行い、HPLC で精製して目的とする

きる 4）。そこで、本研究で合成した CTP に関して生理活− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

性物質への応用を検討する一助として、扁平上皮がん培養

ルボン酸 11 とし、最後にアミノ基を Fmoc 基で保護するこ細胞株を用いて扁平上皮がんにおける CTP の生物活性評とで、90 % 収率で目的とする 4 を得ることができた（図 5）。

価を行った。

３．結

3. 2. CTPの合成

果

上記のようにして合成した β - アミノ酸をビルディング

3. 1. ビルディングブロックとなるβ-アミノ酸（βPro、βHyp）の合成ブロックとして、液相法により N 末端を Fmoc で保護したコラーゲンペプチドを合成するためのビルディングブロ

OH、Fmoc•Pro-β Hyp-Gly-OH、Fmoc•Pro-Hyp-β Ala-CTP 残基（Fmoc•Pro-Hyp-Gly-OH、Fmoc•βPro-Hyp-Gly-ックとなる β Hyp 誘導体 3 は、図 4 に示すようなスキームOH）の合成を行った。

で合成した。まず、Z-O-tert-butyl-L-hydroxyproline（5）3 . 2 . 1. βPro を組み込 んだ CTP（Fmoc•βPro-HypGly-OH）（12）の合成を出発原料として、ジアゾメタン存在下でクロロギ酸エチルを反応させ、アゾ化合物 6 を 80 % 収率で得た。次にトβPro を組み込んだ CTP 誘導体は、以下のように合成しリフルオロ酢酸銀、トリエチルアミンによって転位反応にた。最初に、上記で合成した β Pro（11）のアミノ基を Z 基より、60 % 収率で一炭素増炭したカルボン酸 7 に変換した。

で保護した 15 を 90 % 収率で得た。ペプチドカップリング

最後にアミノ基の保護基を Z 基から Fmoc 基に付け替える試薬である COMU を用いて、15 のカルボン酸残基と Hypことで目的とする 3 を得ることができた（図 4）。

（tBu-Hyp-Me）のアミノ基の間でカップリングさせ、74 %次に N 末端を Fmoc 基で保護した β Pro 誘導体 4 は、図 5の収率で二量体 16 とした。さらに 16 のメチルエステルをに示すスキームで合成した。すなわち、（S）-pyrrolidin-加水分解してカルボン酸 17 にした後、同様に Gly のアミ2 -ylmethanol（8）を出発原料として、そのヒドロキシ基にノ基とカップリングさせて高収率で三量体 18 を得た。最p-toluene sulfonyl 基を導入して 9 とした後、KCN により後に N 末端と C 末端の Z 基と Bn 基を脱保護して、N 末端高収率でシアノ基に変換した 10 とした。その後、濃塩酸のみを Fmoc 基で保護することで、目的とする CTP（Fmoc•と酢酸の混合溶液によって、シアノ基を酸加水分解してカβPro-Hyp-Gly-OH）（12）を得ることに成功した（図 6）。

図4βHyp 誘導体の合成

図5

βPro 誘導体の合成− 20 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製

3. 2. 2.

βHyp を組み込んだ CTP（Fmoc•Pro-βHyp-

後にベンジル基と Z 基の脱保護と N 末端の Fmoc 化を行い、Gly-OH）（13）の合成目 的 と す る CTP（Fmoc•Pro-βHyp-Gly-OH）（13）を 得 る

β Hyp を組み込んだ CTP 誘導体 13 の合成は、以下のよことができた（図 7）。

うな方法で行った。上記で合成した 6 をメチルエステル体

3. 2. 3.

βAla を組み込んだ CTP（Fmoc •Pro-Hyp-β19 に変換した後、接触水素化により、アミノ基のみを無Ala-OH）（14）の合成保護とした 20 を高収率で得た。この 20 のアミノ基を Z 基

β Ala を組み込んだ CTP 誘導体 14 の合成は、以下のよで保護した Pro（ZPro）のカルボン酸とカップリングさせ、うな方法で行った。まず、ZPro（24）を出発原料とし、こ60 % の収率で二量体 21 とし、さらにアルカリ加水分解にれに Hyp をカップリングさせ、二量体 25 を得た。次に Cよりカルボン酸体 22 とした。22 に C 末端をベンジル基で末端のメチルエステルをアルカリ加水分解してカルボン酸保護した Gly をカップリングさせ三量体 23 を得た後、最体 26 とし、引き続き βAla ベンジルエステルとカップリン

図6

βPro を組み込んだ CTP（Fmoc◦βPro-Hyp-Gly-OH）（12）の合成

図7

βPro を組み込んだ CTP（Fmoc◦Pro -βHyp - Gly-OH）（13）の合成− 21 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

グすることで三量体 27 とした。最後に接触水素化により

3. 5. 計算化学により推定した立体構造

ベンジル基と Z 基の脱保護を行い、N 末端の Fmoc 化を行

3 . 5 . 1.

うことで目的とする CTP（Fmoc•Pro-Hyp-β Ala-OH）（14）を得ることができた（図 8）。

CPTの立体構造

このように合成したコラーゲン類縁体のうち、それらを構成する CTP である Pro-Hyp-Gly と Pro-β Hyp-Gly の構造を、計算化学によって解析した。本研究では、合成した

3. 3. 固相合成による30merの合成

30 mer の Gly-Hyp-Pro の繰り返し構造であるトリペプチ

上記で得られた CTP 13 は、上記の 2 . 2 . に示した方法

ドについて最安定化構造を求めた。このとき、C- 末端とに従って 30 mer を合成した。それぞれレジンに固定し、N- 末端はメチル基で置換し、計算方法は BLYP/DNP//固相合成法により 9 回繰り返してカップリングした後、レMMFFs（COSMO in Water）で行った。その結果、天然のジンから切り離して、最後に HPLC 精製することで（Pro-コラーゲンは Gly-Hyp-Pro で一回転し、Gly から Pro までβ Hyp-Gly）10 を得ることができた。の距離は 6 . 509 オームストロングであったのに対し、Hypを β -アミノ酸に置換した Pro-βHyp-Gly では 6 . 970 オーム

3. 4. 合成した（Pro-β Hyp-Gly）10の熱安定性ストロングであった。この結果より、β- アミノ酸を組み合 成 し た コ ラ ー ゲ ン ペ プ チ ド の 30 mer で あ る（Pro-込むことによって、ヘリックス構造の一回転あたりの距離

β Hyp-Gly）10 について、天然型の（Pro-Hyp-Gly）10 と比較はわずかに変化するものの、構造自体は天然のヘリックスした。CD スペクトルにより熱安定性を調べたところ、構造に類似していると予想できた（図 9）。

（Pro-Hyp-Gly）10 は 58 ℃でヘリックス構造が壊れたもの

10 および10
3 . 5 . 2 . （Pro-Hyp-Gly）（Pro-Hyp-βAla）の、興味深いことに β- アミノ酸を組み込んだ（Pro-β Hyp-の立体構造Gly）10 では 80 ℃以上でもヘリックス構造を維持していた。

コラーゲンペプチドの 30 mer について、計算化学の手

このことからも今回我々が合成した人工コラーゲンは熱安法 に よ り（Pro-Hyp-Gly）10 と β -ア ミ ノ 酸 を 組 み 込 ん だ

定性が非常に高いことが示された。

図8

βAla を組み込んだ CTP（Fmoc◦Pro - Hyp -βAla-OH）（14）の合成

Pro-Hyp-Gly

Pro-βHyp（2）-Gly

図 9 計算化学による CTP の推定構造
計算方法：BLYP/DNP//MMFFs（COSMO in Water）− 22 −

β-アミノ酸から構築する人工コラーゲンの創製（Pro-Hyp-β Ala）10 を比較した（図 10）。その結果、二つのがん細胞においても同様に、CTP および CTP 誘導体の高ペプチドは類似した立体構造を有していることが明らかと濃度曝露による細胞生存率の有意な減少を確認したが、コなった。また、β -アミノ酸を組み込んだペプチドのほうがラーゲンコートの有無による細胞生存率の変化はみられな安定に存在できることも示唆された。

かった。以上の細胞生存率測定では、CTP の違いによる細胞生存率の違いは観察されなかった。

3. 6. CTPの生物活性評価

CTP および CTP 誘導体による細胞生存率減少のメカニ

次に、合成した CTP（Gly-Hyp-Pro）とその誘導体（Gly-ズムを解明するために、ウエスタンブロットを行った。細

β Hyp-Pro）を様々な濃度でヒト扁平上皮がん細胞（A 431）胞周期制御に関与するタンパク質の一つである p 21 の検に添加して、その細胞生存率を調べることでがん細胞増殖出を行ったところ、CTP および CTP 誘導体曝露による抑制効果を評価した。さらにウエスタンブロット法により、

p 21 の発現量の変化は観察されなかった。

タンパク質の発現量解析を行い、がん細胞に対する CTP

４．考および CTP 誘導体の作用メカニズムの探索を行った。

察

その結果、それぞれを 10 µM および 100 µM の添加濃度

これまでにコラーゲンを模倣した化合物の研究が世界中では、がん細胞の生存率に有意な変化はみられなかった。

で行われているが、その多くは Hyp を別の化合物に置きそこで、CTP および CTP 誘導体を高濃度の 1000 µM で曝換えたものである。それに対し本研究では、CTP（Gly-露したところ、図 11 に示すように有意な生存率の減少がHyp-Pro）を基にして、構成するアミノ酸を β - アミノ酸に確認された。コラーゲンコート上で培養したヒト扁平上皮変換したコラーゲンペプチドを創製したため、計算化学に

length：80.36 Å，potentioan energy：432.0 kJ/mol

length：75.16 Å，potentioan energy：232.1kJ/mol
図 10

図 11

計算化学による 30mer の立体構造

CTP および CTP 誘導体 1000 µM 曝露時の細胞生存率− 23 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

よる構造解析の結果からも、天然に近い性質をもっている

したがって、今後もさらに詳細に研究を続けることにより、と考えられる。さらに、得られたペプチドは熱安定性の高再生医療やコスメトロジーの分野への新規の機能性材料へい強固なヘリックス構造をもっていることが明らかとなっ応用可能な人工コラーゲンを創出することは、十分可能でた。このコラーゲンペプチドの加水分解酵素に対する安定あると考えられる。

性はまだ調べていないが、もしも天然のコラーゲンに比べて著しく高い安定性を有していれば、新しい機能性材料と謝辞本研究の遂行にあたり、御援助を賜りました公益財団法して生物化学分野に応用できる可能性がある。
また、創薬科学分野への応用の可能性についても検討した結果、今回は予備的な実験ではあるが、CTP および人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げます。

CTP 誘導体はヒト扁平上皮がん細胞に高濃度で曝露することで細胞増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。

（引用文献）

CTP および CTP 誘導体による細胞生存率減少のメカニズ

1） Holmgren SK, Bretscher LE, Taylor KM, Raines RT.

ムとして、細胞周期やアポトーシスへの関与が考えられる。

A hyperstable collagen mimic. Chem. Biol. 1999, 6, 63-

CTP により細胞生存率が減少したのに対し、細胞周期制70.

御タンパク質の一つである p 21 は CTP による影響がみら

2） Goodman M, Bhumralkar M, Jefferson EA, Kwak J,

れなかったため、今後他の細胞周期に関わるシグナルや、Locardi E. Collagen mimetics. Biopolymers, 1 9 9 8, 4 7,

アポトーシス誘導タンパク質においても同様の実験が必要

127-142.

である。

3） Pyun HB et al. Effects of Collagen Tripeptide

５．総Supplement on Photoaging and Epidermal Skin Barrier

括in UVB-exposed Hairless Mice. Prev Nutr Food Sci.
2012 Dec; 17（4 ）:245-53.

β-アミノ酸を組み込んだ人工コラーゲンは、天然のコラーゲンと類似した立体構造をもち、さらに天然に比べて熱4） Hakuta A et al. Anti-inflammatory effect of collagen

安定性が非常に高いことを見出した。またそれを構成する

tripeptide in atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2 0 1 7

CTP は、生理活性物質に応用できる可能性も示された。

Dec; 88（3）:357-364− 24 −