令和３年JRA畜産振興事業に関する調査研究等発表会 2021年12月1日（水）XY精子分離技術による雌雄産み分け～ 牛・豚の効率的な繁殖の実現 ～（精子発現遺伝子による雌雄産み分け法開発事業）

広島大学・大学院統合生命科学研究科・生殖生物学島田 昌之

哺乳類の受精システムと性別決定

♂

精子X

YⓍ

XX（雌）

Ⓨ
X染色体 or Y染色体X

X

受
精減数分裂

♀

受精

卵

XY
（雄）
X染色体のみ雄の生殖細胞である精子が有する性染色体によって，受精卵の雌雄は決定される．

哺乳類の精子形成機構と性染色体
精子幹細胞（２ｎ）

X

精祖細胞（２ｎ）

X

Y

Y

X

一次精母細胞（２ｎ）

Y

X
X

二次精母細胞（ｎ）

細胞間架橋（ブリッジ）

X

X

精子（ｎ）

Y

Y

X

精子細胞（ｎ）

X

変態

X

染色体数が変化する分裂X

染色体数が変化しない分裂mRNAやタンパク質

mRNAやタンパク質を受け渡す

Y

常染色体YX X染色体
Y Y染色体哺乳類の精子形成機構と性染色体
精子幹細胞
（２ｎ）

X

精祖細胞（２ｎ）

X

一次精母細胞（２ｎ）

X

Y

これまでの定説

Y

多くの哺乳類において，雌雄比が1:1となる．

Y

X精子細胞とY精子細胞の細胞間に，細胞間架橋（ブリッジ）が形成

X

二次精母細胞（ｎ）

両細胞でタンパク質が共有される

X

X＝X染色体の有無が影響しない

Y

X

X

X

精子（ｎ）

Y

X

精子細胞（ｎ）

Y

Y

X精子とY精子は同数作られ，両者は，同じ受精力を有する

定説に反する実例
ブタ凍結精液の人工授精
0.6における雌雄比率80100606040

バラツキ
増4020

d$y
雄比率(%)

802000液状凍結

和-196℃という非生理的条件下で，X精子とY精子の機能差が生じる可能性
日経産業新聞 2009年10月2日

仮説

学術的問い
特殊な環境（条件）下において，X染色体の有無に依存したX精子とY精子間の機能差が生まれるのではないか？

技術開発の可能性
特殊環境下で，簡易的に効率よくX/Y精子を分離でき，それによる雌雄産み分けが可能ではないか？

本研究のストラテジー

RNA抽出

断片化した遺伝子（RNA）の解読

Sp56陰性精子細胞（ブリッジ消失前）X

遺伝子の由来染色体を調べる（マッピング）

Sp56タンパク質

既知配列

X

X染色体由来の遺伝子を選抜

492 遺伝子YSp56陽性精子細胞（ブリッジ消失後）候補遺伝子のタンパク質受容体（環境センサー）の遺伝子を選抜

18 遺伝子このような発現パターンの候補遺伝子を探索（Sp56陽性精子細胞のうち半数で陽性となる遺伝子）

精子におけるX染色体由来 TLR7の局在精子におけるTLR7の局在

半数の精子にTLR7が発現する

80＝

The percent of sperm

1006040

X精子とY精子で異なるタンパク質を同定

200Tubulin + Tubulin +TLR7 +TLR7 -TLR7とTLR8とはKawai and Akira, Cell Death & Differentiation
volume 13, pages816–825(2006)

TLR7とTLR8は，細胞内部（小胞体上）に局在し，RNAウイルスを認識する受容体

TLR7/8を活性化する薬剤の効果

X精子にTLR7とTLR8が存在することを発見+既知情報①TLR7とTLR8は，ATP産生を抑制する②精子の運動は，ATP依存的③精子は，重力に逆らって上向する

仮説
TLR7とTLR8を刺激する薬剤（リガンド）により，X精子は不動化し，沈殿する？

300

リガンド添加による精子運動速度への影響

300

150
━100

*━━807060**

50*403020
1000-50

50-100100-150

150 -VAP (mm/sec)

50100

*50

TLR7とTLR8を刺激すると約半数の精子で，運動速度が低下し，それらが沈降する

00d$y150200

The number ofsperm per 200 motile sperm

250200250

VAP (µm/sec)

Control
R848
R83790Control
1

R848
2

R8373

TLR7とTLR8を刺激すると上層にY精子，下層にX精子に分離される100%

上層の精子のX/Y比率

90%

XY

**

80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%

Control

R848

R837

雌雄産み分け法の開発

体外受精

X精子とY精子の機能差を世界で初めて科学的に証明

簡易的雌雄見分け法の開発

TLR7/8処理精子を用いたマウス体外受精
体外受精胚の雌雄比率

体外受精-胚移植によって生まれた産仔

雌雄

リガンドなし上層精子 下層精子

簡便かつ安価に雌雄を産み分ける手法を開発した．

簡便かつ安価な雌雄産み分け方法の開発に成功！
～哺乳類のX精子とY精子に機能差があることを初めて実証～NHK，朝日新聞，毎日新聞，日経新聞，他国内新聞，
INDEPENENT, Newsweekなど海外50新聞以上に掲載

酪農，和牛生産における雌雄産み分けニーズ
1. 黒毛和種子牛の安定供給体制の構築による酪農経営の改善

黒毛和牛繁殖農家が減少し，黒毛和種子牛の生産頭数の減少と取引価格の高騰が起こっている¥1,000,000¥900,000¥800,000¥700,000¥600,000¥500,000¥400,000¥300,000¥200,000¥100,000¥-

子牛価格の推移

X/Y精子分離による体外受精技術の確立
価格の高い♂子牛の選択的生産

雄雌19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

年度

ホルスタイン種への受精卵移植

黒毛和種
♂受精卵•
•
•

♂黒毛和種の安定供給
黒毛和種の生産増
酪農家の収入増養豚業における雌雄産み分けのニーズ
2. 種豚の高効率生産と養豚業の家畜福祉への対応
３品種の雑種強制により，生産頭数が多い+成長が早い+肉質が良い＝生産効率が良いおいしい豚肉

東京五輪 アニマルウェルフェアに関する報道2018年01月11日 Japan Times Olympic athletes
unlikely to eat free-range eggs in 2020, if Japan’sfarmers have their way

2017年12月8日 朝日新聞 畜産、日本も「動物福祉」 五輪の食材条件に明記され広がる
D♀
LWWL

2017年4月8日 時事通信 家畜の「飼育環境」
重視＝欧米で関心、東京五輪の食材基準に♂

D
♀

LWWL

♂

肉豚

各国のブタの去勢に関する規制♂は去勢♀

種雌/種雄生産で半数誕生するD♀とLW/WL♂は，生産に利用されない．種豚生産の生産効率は50%ととなる．

日本

豚の麻酔無し去勢

欧州
米国
その他
ＥＵ2018年まカナダ
2016年7月
でに終了
規制なし スイス禁止
規制なし 以降禁止
ノルウェー禁止

X/Y精子分離による人工授精技術の確立• 種豚の目的別生産で，種豚業者や一貫生産者の生産効率改善• 肉豚は，♀の選択的生産により，アニマルウェルフェアに対応し，かつ肉質の維持が可能ウシ・ブタにおけるTLR7の局在

ブタとウシの精子においても半数でTLR7が発現しているブタとウシで雌雄産み分けが可能になる

本技術の有効性：現在行われている雌雄産み分け法との比較
セルソーターを用いたX/Y精子分離法

既存技術の問題点•

高額な機器（セルソーター）が必要．

•分離技術の利用には，海外とのライセンス契約が必要で，ライセンス料の支払いが発生．

•

X/Y分離過程の精子へのストレスが，精子の運動性や受精能を減退．

•射出精子数が500億以上，人工授精の必要精子数が30～50億のブタ人工授精では，処理時間が長時間となり，実用化不可．

•体外受精への利用では，受精卵移植技術が全く普及していないブタにおいては，実用化は難しい

本基礎知見を，産業家畜へと実用化することで，簡便かつ安価な新たな雌雄選別が可能となるのでは？

表３ 雄胚割合

ウシの体外受精技術による産み分け

リガンド添加捨てる

雄胚割合（数）

試験区

供試胚数

1区

2185.7（18） ab

2区

6193.4(57) ab

3区

4983.7(41) b

4区

6296.8(60) a

5区

5794.7(54) ab注1）統計処理：異符号間 p<0.05（χ二乗検定）

up層 不動化していない精子（Y精子）を多く含む→ XY胚作出に利用
low層 不動化している精子（X精子）を多く含む？
→ XX胚作出を目指す

体外受精

上澄み除去

XX

XY

XX (%)

17289.5

21387.5

19290.5

精子

体外受精培地で精子希釈

5分培養（キーポイント）

他（多）施設での実証へ

多施設実証試験により明らかとなった課題

1万倍希釈
リガンド（R837,R848）原液
1 mg/ mL; 3mM

100µL

R837, R848 0.3 µM
HTF 1 mL
（リガンド反応液）

試験場所

XY胚

XX胚

XY率（％）

A

205

4781.3%B

162

696.4%試験場所

XY胚XX胚XY率（％）

A

126

10953.7%

B673168.5%900µL①洗浄済の凍結精液と混ぜて前培養（30～45分）②リガンド反応液に①を載せて培養（10～30分）

結果

上層300～500µL
Y精子として回収

初期にはうまくいっていたXY胚の生産が，半年後に成績が急激に低下．

③洗浄後、体外受精

多施設実証試験により明らかとなった課題 ～リガンドの安定性～

TLR7

TLR8
マウスX精子において、TLR7・・・尾部TLR8・・・中片部のみに局在する(Umehara et al., PLOS Biol. 2019)結果

広島大学で実施

R848・・・TLR7/8のアゴニスト
R837・・・TLR7の特異的アゴニスト

しかし・・・

XY胚XX胚

XY率（％）

R837 (0.3 µＭ)

5741.7%

R848 (0.3 mM)

6460.0%12192.3%19290.4%

R837（Enzo社、Novus社、Sigma社製）
R837 (0.3 µＭ)
いずれも・DMSOへの溶解度が不安定（溶け残る、析出する） R848 (3 nM)
・安定性×（冷凍保存でも2～3週間で活性低下）

R848（Novus社、Sigma社製）
・新調すると高活性（至適濃度 300 nM→3 nM）に・Novus社製は数ヶ月で活性が下がる
・使用期限の厳守と使用毎のチューブ廃棄で活性安定的に⇒以後、R848（Sigma社）のものを使用することに

多施設実証試験により明らかとなった課題 ～実施者による成績差～

希釈R848 3nM
反応液 1ｍL

リガンドR848

結果①遠沈管中で精子ペレットにリガンド反応液を加え培養

精子②培養（30～60分）

試験場所

XY胚

XX胚

XY率（％）

A

129

4275.4%

B（作業者変更）682573.3%

C22388.0%

D85792.4%

最上層100µL・・・除去
上層300～400µL・・・Y精子として回収

新しいswim up法を開発する必要あり③洗浄後、体外受精

分離装置の活用
運動精子選抜装置ミグリス（メニコン社製）

運動性の高い精子のみがカベを越えて中央に集まることを利用
ヒトの不妊治療で使用①リガンド処理した精子を外側に入れる②30分後、リガンド反応液を足してさらに培養し運動精子（Y精子と期待される）を回収③精子を洗浄後、体外受精

試験場所

XY胚

XX胚XY率（％）

方法

広島大学

27

390.0%

遠沈管（1ｍL培養）

A

201066.7%遠沈管（1ｍL培養）

A

16288.9%ミグリス

ウシ体外受精におけるTLR7/8の効果
TLR7/8処理を行ったウシ凍結精子を用いたウシ体外受精胚の雌雄判定
X
Y
TLR7/8処理をしたウシ精子を用いて作出された胚盤胞期胚を移植し，生まれた雄子牛本技術で誕生した雄子牛本事業で開発している「ウシ凍結精液を用いたTLR7薬剤処理によるX/Y分離と，その分離精子を用いた体外受精による選択的胚生産の手法」が，Nature Protocols誌に掲載されました．

令和２年度補正予算国際競争力強化技術開発プロジェクト
輸出促進のための新技術・新品種開発
技術開発課題名：和牛肉輸出拡大に向けた性選別精液利用受精卵の受胎率改善による和牛生産力強化研究機関名：

国立大学法人広島大学

技術開発代表者：

島田昌之

技術開発グループ名「性選別精液利用受精卵の受胎率改善」
国立大学法人 広島大学
独立行政法人 農研機構 畜産研究部門
独立行政法人 家畜改良センター
広島県立総合技術研究所畜産技術センター
JA全農ET研究所

ブタの人工授精への応用
大分県農林水産研究指導センターにて，人工授精を実施．

人工授精

Created with BioRender.com

本手法を用いて，大分県農林水産研究指導センターにて，人工授精を実施．

①②W

2

L

不受胎L

不受胎L

8L50%

562%

186%

755025不受胎W③2100♂の割合(%)

No.

XY分離 AI試験
自然発情にて１～３回付け産子数
品種♂割合♂
♀

6不受胎

D④D7370%⑤LW8373%⑥W5550%

0Y率• バラツキや不受胎が認められた．
• 1回のAIに必要な精子を処理するのに遠沈管を4本以上使用する．
• 実用化のためには改善が必須．

本手法の問題点①
インキュベーターは養豚場に基本的にない．
特に，低酸素インキュベータ―は特殊で高額．
温度管理ができる遠心機は高額で養豚場にない．

回収操作が，分離比率に直結する＝作業者間差が大きい大量処理かつ操作を簡便化したX精子分離技術の開発• 激しく泳ぐ精子は，引き続いて先体反応を誘起する• 先体内の酵素が流出した精子は，受精能力を消失する• R848処理は，運動を抑制する＝先体反応を抑制する可能性がある

分離しなくてもX精子のみが受精能を保持する精液を作成できる

X精子のみ受精力を保持させる精子処理方法
1. 射出精液をヒロスワインB液で希釈する（50億/100ml）
2. 室温で放置後（１５度で保存しておいた精子でもよい），500g，5分，室温条件で遠心分離する
3. 上澄みを回収する（回収した上澄みは，1000g以上で遠心分離し，上澄みを回収して，室温で保管しておく）
4. 精子を分離溶液で懸濁する
5. ６０分，３７度で培養する
6. 500g，5分，室温条件で遠心分離する
7. 上澄みを除去し，3.で回収した上澄みで懸濁する
8. １５度で保管し，人工授精に用いる

発表した論文
Umehara T, Kawai T, Goto M, Richards JS, Shimada M.
Creatine enhances the duration of sperm capacitation: a novel factor for improving in vitro fertilization withsmall numbers of sperm. Hum Reprod. 2018 Jun 1;33(6):1117-1129.
Zhu Z, Umehara T, Okazaki T, Goto M, Fujita Y, Hoque SAM, Kawai T, Zeng W, Shimada M.
Gene expression and protein synthesis in mitochondria enhance the duration of high-speed linear motility inboar sperm. Front Physiol. 2019 Mar 12;10:252.
Zhu Z, Kawai T, Umehara T, Hoque SAM, Zeng W, Shimada M.
Negative effects of ROS generated during linear sperm motility on gene expression and ATP generation inboar sperm mitochondria. Free Radic Biol Med. 2019 Sep;141:159-171.
Umehara T, Tsujita N, Shimada M.
Activation of Toll-like receptor 7/8 encoded by the X chromosome alters sperm motility and provides a novel
simple technology for sexing sperm. PLoS Biol. 2019 Aug 13;17(8):e3000398.
Umehara T, Tsujita N, Zhu Z, Ikedo M, Shimada M.
A simple sperm-sexing method that activates TLR7/8 on X sperm for the efficient production of sexed mouseor cattle embryos. Nat Protoc. 2020 Aug;15(8):2645-2667.
Zhu Z, Umehara T, Tsujita N, Kawai T, Goto M, Cheng B, Zeng W, Shimada M.
Itaconate regulates the glycolysis/pentose phosphate pathway transition to maintain boar sperm linear motility
by regulating redox homeostasis. Free Radic Biol Med. 2020 Nov 1;159:44-53.
Umehara T, Tsujita N, Goto M, Tonai S, Nakanishi T, Yamashita Y, Shimada M.
Methyl-beta cyclodextrin and creatine work synergistically under hypoxic conditions to improve thefertilization ability of boar ejaculated sperm. Anim Sci J. 2020 Jan;91(1):e13493.
Md. Mazharul Islam, Umehara T, Tsujita N, Shimada M
Saturated fatty acids accelerate linear motility through mitochondrial ATP production in bull sperm. Reprod
Biol Med, 2021 20(3): 289-298.

主な講演••••••••••••

第2回 JISRAM公開講座 「コープイン京都」大会議室 平成31年3月24日 「精巣、精嚢腺と精子の酸化ストレス」
香川県立保健医療大学 大学院保健医療学研究科臨床検査学専攻 博士後期課程第3回学術セミナー 令和含年10月2日「精子と卵のバイオロジーとテクノロジー」
東北大学大学院農学研究科セミナー 令和元年10月18日(金) 「簡便かつ安価な雌雄産み分け方法の開発に成功！」
第50回精子研究会 郡山商工会議所会議室 2019年10月19日「精子の代謝機構解析を基盤とした繁殖技術開発」
生殖補助医療技術者のためのリカレントセミナー 大阪セミナー 令和含年12月15日 「生殖生物学からの生殖技術」
第4回ART Clinical Research Conference 令和2年2月21日 「生殖生物学から考える生殖工学技術，精子処理と体外受精」
第19回生殖バイオロジー東京シンポジウム 2020年9月13日（日）「X/Y精子選別の新手法」
第113回日本繁殖生物学会大会 市民公開シンポジウム 2020年9月25日（金）「哺乳類の雌雄比が1:1となる仕組み，～その制御による新たな雌雄産み分け法～」
広島大学 畜産酪農拠点セミナー 2020年11月配信 「簡便かつ安価な雌雄産み分け方法の開発に成功」
第23回日本IVF学会学術集会 生殖細胞のエネルギー代謝解析からARTへのトランスレー
ション「精子，卵，受精卵の代謝機構とその人為的制御，ARTへの応用」
東京海洋大学セミナー 2020年12月8日（火）「精子特異的な発現遺伝子TLR7/8を刺激する哺乳類の雌雄産み分け法」
日本胚移植技術研究会鳥取大会 特別講演 2021年2月3日（水）「X精子特異的な発現遺伝
子TLR7/8を刺激する哺乳類の雌雄産み分け」

研究室メンバー
助教
梅原 崇, PhD
川合 智子, PhD
辻田 菜摘, PhD
岡本 麻子，PhD
研究員
古家後 雅典, PhD
山中 貴寛，PhD
岡部 綾美Moustafa Elhamouly, PhD
Mahmoud Awad, PhD
博士課程後期
後藤 雅昭
Adetunji Adedeji Olufemi
Mazharul Islam
博士課程前期
藤田 航平，川島 千佳
俵 孝輔，日比 勇馬
Pallas Christos
学部生
新井 彩恵，佐藤 亜美
坂井 美月，小島 潤也

本研究に関する共同研究先
帯広畜産大学 宮本教授，東海大学 今川教授，近畿大学 谷准教授
大分県農林水産研究指導センター，家畜改良事業団，全農ETセンター，（株）ノベルズ，（株）プリマハム，（株）フリーデン本研究に関する研究費平成30年～令和2年度 公益財団法人 全国競馬・畜産振興会（JRA） 精子発現遺伝子による雌雄産み分け法開発事業