ISSN 0910−0865

環境変異原研究
Environmental
MutagenResearch

Vol.24 No.3 2002

Coden：KHKEEN

環境変異原研究
Environmental Mutagen Research

目次

特別企画「食品ならびに食品成分による抗変異原性作用」「特別企画─食品ならびに食品成分による抗変異原性作用─」を企画するにあたって
矢嶋信浩……………………………………………………………………………………………………………… 111
乳酸菌を用いた発酵乳の抗変異原性
細野明義……………………………………………………………………………………………………………… 113
発がん抑制性フードファクター：食によるがん予防を目指して大東

肇……………………………………………………………………………………………………………… 123

抗変異原に関する研究
木苗直秀，増田修一………………………………………………………………………………………………… 129

第 13 回公開シンポジウム「環境変異原と遺伝子不安定性」
DNA Polymerase κ による DNA 損傷のバイパスと突然変異の誘発
大森治夫……………………………………………………………………………………………………………… 145
微生物由来のトランスリージョン DNA ポリメラーゼ
能美健彦……………………………………………………………………………………………………………… 153
ほ乳類細胞における DNA 二本鎖切断修復と，p53 によるゲノム安定化機構
本間正充……………………………………………………………………………………………………………… 161
ラットおよびヒト乳腺発がんにおける一塩基不安定性
大河内江里子，牛島俊和…………………………………………………………………………………………… 169

Letter to Editor
環境変異原研究の光と陰：これから進むべき道
鈴木孝昌……………………………………………………………………………………………………………… 179
Author Index ……………………………………………………………………………………………………………… 185
Keyword Index …………………………………………………………………………………………………………… 186

付 記
日本環境変異原学会

入会申込書
学生会員申込書

環境変異原研究

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Environ. Mutagen Res., 24：111（2002）「特別企画─食品ならびに食品成分による抗変異原性作用―」を企画するにあたって
矢嶋 信浩＊
雪印ラビオ株式会社開発研究所〒 485-0059 愛知県小牧市小木東 3-45

Preface ： Antimutagenicity by foods and foods containing materials
Nobuhiro Yajima
Research and Developmental Institute, SNOW BRAND LABIO CO., LTD.
3-45, Kokihigashi, Komaki, Aichi, 485-0059, Japan「食品」はヒトが生きていくうえで毎日摂取しなけれていただき，化学物質ではない生きた乳酸菌の効用を抗ばならないものであり，ヒトの健康にもっとも関わりの

変異原性の立場からレビューしていただいた．京都大学

ある「環境」のひとつといえる．本学会の創世も食品保大学院の大東肇教授には，新しい概念としての「フー存料 AF2 にあるといって過言ではない．さらに，本邦のド・ファクター」ならびに発がん抑制物質を検出する斬

環境変異原研究の推進に多大な貢献を与えたものとし新なスクリーニング法についてご紹介いただき，ラジカて，食品の焼けこげ中に存在するヘテロサイクリック・

ル産生抑制から発がん抑制まで広い範囲に渡る最新の研アミンを否定する環境変異原研究者はいないと思われ究成果をご紹介いただいた．また，前会長である静岡県

る．一方，変異原性物質の活性を低減化させる作用をも立大学の木苗直秀教授には，食品あるいは食品成分に含つ物質，即ち，抗変異原性物質が環境中に存在することまれる抗変異原性活性について各種変異原性試験法を用が解り，食品あるいは食品成分に含まれる抗変異原性物

いて証明した事例をご紹介いただき，「カテキン」や質に関する研究も本学会における大きな潮流のひとつと「フラボノイド」などについてはその抗変異作用機序まなっている．

で言及していただいた．

今回の特別企画では，これまでとは少し違った新しい

近年，空腹を満たす機能，味覚を満たす機能に次ぐ，切り口をもとめ，昔から普段よく口にしている食品や食食品の第 3 の機能に対する関心が各方面から寄せられ，品成分に含まれている抗変異原性物質，抗プロモーター

学術研究の対象としてばかりではなく，広く一般消費者

物質，発ガン抑制物質などをテーマとした．また，このからも興味がもたれている．特定保健用食品や栄養機能ような企画を考案したもうひとつの背景に，抗変異原性

食品に加え，栄養補助食品にも関心が広がっている中で，や発ガン抑制物質の研究，特に食品関連のそれらの分野

誇大な表示や学術的根拠が薄いものも混在し，食品の機に携わる研究者で環境変異原学会の会員でない先生方の能を謳うことで，逆に誤解や混乱を与えるというマイナ研究を紹介する目的もあった．したがって，著者の選択

ス面も浮き彫りにされている．学術的な根拠という意味

にあたって，本学会以外の場で抗変異原性や発がん抑制では，抗変異原性を示す食品や食品成分に関する研究はの研究を長年続けられているお二人の先生を加えるとと歴史もあり，科学としてしっかりと学会内に根付いていもに，本会を代表する立場から，前日本環境変異原学会

る．治療の世紀から予防の世紀へ移行し，食品ならびに会長に執筆を依頼した．

食品成分に含まれる抗変異原性物質に関する研究分野が信州大学大学院の細野明義教授には「乳酸菌」を用い新たな視点から成長し，発展することを祈り，本特別企

た発酵乳による抗変異原についてその歴史からひもとい画を編纂した．「警告の科学から推奨の科学へ」を本特別企画へ寄せることばとしたい．

＊

E-mail ： n-yajima@snowlabio. com
受付： 2002 年 10 月 10 日 受理： 2002 年 10 月 15 日
日本環境変異原学会
111

総Environ. Mutagen Res., 24：113-121（2002）

説

乳酸菌を用いた発酵乳の抗変異原性細野 明義＊
信州大学大学院農学研究科〒 399-4598 長野県上伊那郡南箕輪村 8034

Antimutagenicity of fermented milk with lactic acid bacteria
Akiyoshi Hosono
Graduate School of Agriculture, Shinshu University
Nagano-Minamiminowa 399-4598, Japan

Summary
Fermented milk and lactic acid bacteria have been considered to provide potential health benefits to humanbeings. Milk containing casein has been shown to be highly antimutagenic, and fermentation by lactic acidbacteria produces various hydrolytic peptides which contribute to the high antimutagenicity of fermented
milk. The antimutagenic property of fermented milk was dependent on the strains of lactic acid bacteria andthe fermentation time. Not only the proteolytic products of casein, but polysaccharides, fatty acids and thebacterial cells all contributed to the antimutagenic properties. Lactic acid bacteria isolated from various fermented products of dairy and non-dairy origin, traditional fermented foods, and animal and human faeces
have shown antagonism against the mutagenicity of known chemical mutagens and also to food-borne mutagens. Most of the anticancer studies with lactic acid bacteria showed that colon tumours can be controlled tosome extent by the consumption of dairy products supplemented with lactic acid bacteria. By identifying themolecules of lactic acid bacterial cells involved in mutagen binding（as binding and antimutagenicity are
well correlated and the bound mutagens were inactive）, it may be possible to modify cell walls of lactic acidbacteria to enable inactivation of a wide spectrum of chemical mutagens and carcinogens.
Keywords ： antimutagenicity, lactic acid bacteria, streptomycine-dependent strain, fermented milk, bindingof mutagen

はじめに我が国を含む先進国では栄養バランスのとれた健康的で豊かな食生活が可能になっている反面，食生活における

今日，生活習慣病としてあげられている疾患には従来

栄養バランスが崩れ，多種多様の食品汚染物質や環境汚用いられてきた成人病と重複するものが多い．成人病と染物質が人体や生活環境を悪化させるという深刻な問題いう言葉には成人になってから気をつければいいとするがある．特に，食物由来の変異原性物質や癌原性物質は安易な気持ちを抱かせる反面，意欲を醸成させにくいと人体に対して癌を惹起させる虞のあることから，食物のする語弊があった．その語弊を一掃させ，健康のうちに

安全性の面から大きな関心が寄せられている．そのため，日常的に疾病予防を心がけていくことこそ最良の方策で癌予防に効果のある食品（あるいは食成分）や微生物をあるとして公衆衛生審議会成人病難病対策部会が 1996

日常的に摂取することは，癌予防や初期段階の癌の病状

年に「生活習慣病」という用語を定め，各人が意欲的にを改善させるうえで有効な手段と考えられている ．そ認識することの重要性を指摘した．このことの背景には，の中にあって，我が国では発酵乳や乳酸菌飲料を積極的1）に求める傾向が強まり，またメーカー側も新しいタイプ＊

E-mail ： ahosono@gipmc.shinshu-u.ac.jp
受付： 2002 年 6 月 10 日 受理： 2002 年 6 月 10 日
日本環境変異原学会の製品を次々と市販している．それらの製品の中には，
特定保健用食品の認可を受けた製品も数多く含まれるようになり，高い保健機能をもつ発酵乳や乳酸菌飲料の開113

Fig. 2 シュメール人の描いた石刻に雅やかな華を添えた酥や醍醐は釈尊（B.C. 566 〜 486）
Fig. 1 平成 13 年度特定保健用食品の市場規模が入滅（涅槃）の前一昼夜の間に説かれたとして知られて6）いる大般若涅槃経に記されている ．その中で醍醐は酥からつくられる滋養豊富な乳製品であり，これを服用す

発がますます盛んになってきている．
（財）日本健康・栄ると衆病皆除の効ありと説明されている．発酵乳のこの養食品協会の調べによると，厚生労働省が平成 13 年度

ような広範囲にわたる伝播の軌跡を辿ると，シルクロー

までに認可した 293 品目の特定保健用食品のうち乳酸菌

ドが一大舞台になったことは事実である．シルクロード

関連のものが 167 品目で，特定保健用食品の売り上げ市

を経由して発酵乳中心の乳加工技術は中央アジアおよび2）

場規模 4121 億円の 77 ％を占めている （Fig. 1）．

内陸の遊牧生活を営む民族，例えば，コザック，キルギ

本稿では乳酸菌を用いた発酵乳の抗変異原性に関するス，アルタイ，ヤクートといったトルコ民族，ブラジェ

最近の研究の動向を紹介し，乳酸菌がヒト健康に果たすス，カルムイク，ツビン，タタールといったモンゴル民役割について解説するものである．

族，それにアゼルバイジャン，タジクといった民族によ1．発酵乳の歴史
発酵乳についての記載は古い時代の伝記や聖書の中に3）って西アジアからモンゴル，インド，チベット方面へと7）

伝播されていったものと考えられる ．「東方見聞録」で有名なマルコポーロ（1254 〜 1324 年）もこのシルクロー

見 い 出 す こ と が で き る ． ロ ー マ 皇 帝 Elogabalum

ドを通り，その旅行記にダッタン人（モンゴル人）が酸（A.D. 218 〜 222）の伝記には二種類の発酵乳， Opus

乳飲用の習慣を有していることを伝えている ．このよlactorumの製造が記されている．また，

うに世界の各地に定着した発酵乳はそれぞれの地域の生

旧約聖書には三人の天使に凝乳でもてなしたアブラハム

活様式を表象しつつ長い歴史の流れの中に受け継がれての善行が記されている（創世記 18 ・ 1 ─ 10）．メソポタ

今日に至っている．その過程で消滅してしまった発酵乳

ミア文明を生み出したシュメール人が B.C. 3000 年頃にがある反面，全世界に広まっていった発酵乳もいくつか刻んだ石刻には搾乳，土器による集乳，牛乳の濾過とバある．その代表的なものがヨーグルトである．20 世紀とOxygala8）

ター製造などの様子が描かれている（Fig. 2）．この地方の初頭，メチニコフ（1845 〜 1916）はブルガリア地方

では紀元前 7,500 年から 5,500 年位の間に農耕牧畜を基を旅し，ブルガリア菌と呼ばれる桿菌がヨーグルトの主盤とする社会が生まれ，やがてメソポタミア文明を開花

叢をなすことを明らかにした ．メチニコフはブルガリさせた都市国家へと発展するのである．都市が形成されア人がブルガリア菌を多量に含有するヨーグルト（トラるにつれ，民族間の交流が盛んになり，それに伴って乳キア語でヨグは「固い」，ルトは「乳」を意味する）を利用の様式や乳加工の技術が磨かれ，再びその技術が各常食しており，このことがこの地方の人達の長寿を保つ

地へ伝播されて今日各地に伝わるさまざまな乳製品がつ秘訣になっていると考えた．つまり，ヨーグルトに含有くり出されていったが，やはりその中心をなすものが発されるブルガリア菌を生菌の状態で多量に摂取すると大酵乳（酸乳，凝乳）である ．搾乳された生乳に細菌等

4）

腸で腐敗菌が抑制されて早期の老衰と短命を防止させるが混入し，自然発酵によって酸乳や凝乳ができ上がったとするものである．この説はヨーグルトの価値を過大評のが発酵乳の誕生であると推測しても誤りはないと思わ価したものではあったが，ヨーグルトが当時のヨーロッ

れる．酸乳や凝乳についての古い時代の記録が世界各地

パに広がるきっかけをつくった．メチニコフが出合ったに分布しており，ウシやヒツジが飼育されていた所にはヨーグルトと今日我々が口にしているヨーグルトの構成

酸乳が存在していたことがわかる．すなわち，発酵クリ菌叢を比較することは当然できないにしても，メチニコームはメソポタミアで紀元前 1300 年頃に，ロシアのクフによる不老長寿説の提唱はヨーグルトの栄養・生理学

ーミスは紀元前 4 世紀にそれぞれ存在していたことが知的効用についての多彩な研究を促すきっかけにもなっ5）9）られている ．さらに，トルコのヨーグルトは 8 世紀，

た．そして，世界中に販売されているヨーグルトの栄

インドのバターミルクは B.C. 800 〜 300 年，ダヒは B.C.

養・生理的効果を巡って本格的な科学的検証がなされ，800 〜 300 年，アイランは 13 世紀，ロシアのケーランは優れた栄養効果に加えて整腸作用，抗コレステロール効

15 世紀，ハンガリーのターホは 14 世紀にそれぞれすで果，抗変異原効果，抗腫瘍効果，降圧効果，抗鬱効果な

5）に実在していたことが判明している ．また，大和朝廷
114

どの生理効果が次々と実証されつつあり，新たな展開をTable 2 発酵乳・乳酸菌飲料中にふくまれる L（＋）, D（−）
乳酸

Table 1 乳酸菌の一般的特性
グラム陽性稈菌または球菌
カララーゼ陰性
運動性なし
嫌気性
内性胞子をつくらない
ブドウ糖から 50 ％以上乳酸をつくる
従属栄養性

98 -＞ 108 - 105-67-8

酸乳およびバターミルク
ヨーグルト
欧州（プレーン） 日本
乳酸菌飲料
ケフィア

10 〜 18）

みせている

総乳酸含量
（g/l）

製品の種類

乳酸の異性体
（％）
L（+）
D（-）
95 - 98＜ 70 - 85
82 - 98
30 - 98
95 - 9815 -＞ 30いるのが Ames 株である．Ames 株はカリフォルニア大．

20）

学の B. N. Ames ら

2．乳酸菌の定義

によってつくられ，よく知られた株として Salmonella typhimurium TA1537，TA1538，

乳酸菌とは，炭水化物（ブドウ糖，乳糖，蔗糖など）

TA100，TA98，TA97 などがある．とりわけ，TA1537 かを発酵し，エネルギーを得て生育する一群の細菌類の総らつくり出された TA100 と，TA1538 からつくり出され称である．明確な定義がなされているわけではないが，た TA98 が今日もっとも広く用いられている．しかし，乳酸菌には形状から桿菌と球菌があり，乳酸桿菌として

TA100 と TA98 はヒスチジン要求性からヒスチジン非要求

Lactobacillus 属，乳酸球菌として Streptococcus 属，性への転換を指標にしていることから，ヒスチジンを含Lactococcus 属，Leuconostoc 属などがあり，通称ビフィズ

む試料に対しては操作が煩雑になる欠点を有しているス菌といわれる Bifidobacterium 属を含むこともある．

22）

この欠点を改善するために，Kada ら21）．

は TA100 およびStreptococcus 属の中には病原性のある乳酸菌も存在する

TA98 にストレプトマイシン依存性（SMd）から非依存が，一般にはそれらの菌種は乳酸菌という通称名で呼ばれ性（SMind）への変異を指標に，試料の変異原性を判定ることはない．乳酸菌の一般概念の中で，通常乳酸菌と呼ばし得る株を造成している．また，筆者ら

18）

23）

は TA98 とれる細菌群は共通して Table 1 に示す特性を有している ．

TA100 からストレプトマイシン依存性株の造成を試み，乳酸菌は乳酸を主要な酸として生成することから，乳それぞれの株から目的株（SD510 と SD4）を得るのに成酸菌のブドウ糖代謝，つまり乳酸発酵は特筆すべき事項

功した．SD510 株は食品由来の物質の変異原性試験に対である．乳酸菌の行う発酵は，その発酵様式からホモ乳してきわめて有用な指標菌であり，利用範囲の広いこと

18）

酸発酵とヘテロ乳酸発酵とに大別される ．ホモ乳酸発が特筆される．また，SD510 株はネコやイヌの糞の温水酵を行う乳酸菌をホモ発酵型乳酸菌といい，ブドウ糖か抽出液のもつ変異原性

らほぼ 100 ％に近い収量で乳酸が生成される．一方，ヘレンジアミンとの反応により生成するレゾルシノール

テロ乳酸発酵を行う乳酸菌をヘテロ発酵型乳酸菌といなどを検出することも可能である．なお，動物糞の変異

24）や，硝酸ナトリウムと m-フェニ
25）い，ブドウ糖から乳酸とエタノールおよび炭酸ガスを発原性試験には Escherichia coli E/r WP2 trp- や E. coli B/r

生する．乳酸菌の仲間に入れられるビフィズス菌は上記

WR2 trp-hcr- の使用も可能であることを筆者らは認めてのヘテロ発酵とは異なり，1 モルのブドウ糖から 1 モル

いるが ，実験操作としては SD510 株を用いたときのほの乳酸と 1.5 モルの酢酸を生成する．

うが遥かに簡便であるように思われる．

なお，仮性乳酸発酵することで知られる大腸菌はグル

26）

また，SD510 株は各種スパイス

27 〜 31），脂質加熱物32）

33,34）

コースから乳酸，酢酸，エタノール，炭酸ガスそれに水

それにタンパク質加熱物

素を生成する．

て有用であり，検出スペクトルがかなり広い株であるとの変異原性試験にはきわめ

乳酸菌が生成する乳酸には L（＋）乳酸，D（−）乳酸そ判断される．さらに，アミノ酸の加熱分解物である Trp-

れにそれらの混合物（ラセミ体）があり，乳酸菌の種類

P1，Trp-P2，Glu-P1 などによって SD510 株は敏感な復19）によって生成される乳酸のタイプが異なる ．Table 2

帰変異を起こすため，加熱タンパク質に対する変異原性には主な乳酸菌が生成する乳酸のタイプを示した．乳酸試験に有用である．とりわけ，Trp-P1 を変異原性物質と菌の中には特殊な耐塩性や耐アルコール性をもつものがして用いた場合，SD510 株は S-9 mix の非存在下で抗変知られている．

異原性試験ができることも操作の簡便化につながってい35）

3．Ames 株のストレプトマイシン依存性株

る ．
なお，筆者

36）

らはタマネギ種子を用い，根長と染色

変異原性物質を検出するための種々の方法がここ 30

体の増加，減少さらには染色体の転座，欠失，切断等の年間に開発されてきたが，大量の試料について変異原性異常から変異原性を知る方法も確立したが，感度の点でを調べなくてはならない場合，微生物の変異を指標にす

は SD510 株を用いた変異原性試験法が優れている．

るのがもっとも便利であり，その目的で広く用いられて
115

Table 3 N-ニトロソジメチルアミン（NDMA），N-ニトロソピロリジン（NPYR）ならびに N-ニト
ロソピペリジン（NPIP）の変異原性に対する乳酸菌の減弱効果

コントロール+ Leu. paramesenteroides R-62
3mg
5mg
7mg
+ Leu. paramesenteroides R-8
3mg
5mg
7mg
+ St. lactis subsp. diacetylactis R-63
3mg
5mg
7mg
+ St. cremoris R-48
3mg
5mg
7mg
a
b

NDMAa

復帰変異コロニー／プレート
NPYRa

NPIPa

1029

1041

1100

396（61.52）b263（74.44）
215（79.11）1035（0.58）b1024（1.63）1025（1.54）

1042（5.27）b1000（9.09）
1000（9.09）

375（63.56）
298（71.04）
279（72.89）1015（2.50）
962（7.59）
940（9.70）

1046（4.91）
1020（7.27）
1023（7.00）

659（35.96）
419（59.28）
295（71.33）

1043（-）
984（5.48）
985（5.38）

1013（7.91）
989（10.09）
991（9.91）

567（44.90）309（69.97）
286（72.21）960（7.78）
938（9.89）
946（9.13）

968（12.00）
964（12.36）
966（12.18）

NDMA，NPYR，NPIP の量はそれぞれ 60，50，50
括弧内数値は減弱率（％）

4．発酵乳の抗変異原性食品（およびその成分）中には変異原性物質や発癌物

Table 4 Lactobacillus acidophilus LA2 を用いて製造した発酵乳をヒトに投与したときの大便の変異原性の変化 59）

質に対してそれらの毒性を軽減させるものが多々見い出

復帰変位コロニー数 1

されている．変異原性物質を減弱させる物質（抗変異原

被験者

摂取前

摂取後

────── No./100g ─────
─
─
X
SD
X
SD
140
13
36
3
345
12
50
4
203
12
19
2
99
11
55
3
59
7
45
3
62
7
50
3

1
2
3
4
5
6
─
X
SEM

42.5＊＊
12.5

151.3
100.2

減少率
（％）

異原性物質に直接作用し，その変異原性を減弱または不活化させる作用をもった変異原不活化因子（desmuta74.3
85.5
90.6
44.4
23.7
19.4

能が知られており，筆者らは主として抗変異原性効果を71.9中心にした関連論文をこれまでに紹介してきたgen）であり，もう一つは細胞に作用して細胞の突然変異誘発を著しく低下させる作用をもった抗突然変異原因子（antimutagen）である．
ところで，発酵乳の栄養生理的効用について多くの機
38 〜 43）．

具体的には，各種乳酸菌を用いて調製した発酵乳が変

＊＊
1

37）

性物質）は通常次の二つに分けられる ．その一つは変摂取前に対する摂取後の有意差（p ＜ 0.01）
発酵乳 100g を日に 3 回，7 日間にわたり投与

異原性をもつ 4NQO や AF2
物

46, 47）44, 45），各種スパイスエキス
51），各種アミノ酸加熱分解

48）

アフラトキシン ，加熱醤油，N-ニトロソ化合物

52, 53）49, 50），等に対し，抗変異原性のあることを SD510 株や E. coli B/r WR2 trp-hcr-を指Table 5 カゼインならびにアルブミンの抗変異原性 48）
試料

コントロール（H2O + コショウ）
全カゼイン
αs1-カゼイン
β-カゼインκ-カゼイン
卵アルブミン
ウシ血清アルブミン

標菌に用いて明らかにしてきた．Table 3 はインドネシ
アのスマトラ地方に伝わる発酵乳，ダデイヒから分離し復帰変異コロニー数/プレート

た Leuconostoc paramesenteroides R-62 および R-8，

2012
844
1085
609
1741
495
760

Lactococcus lactis subsp. diacetylactis R-62，Lc. cremoris
R-4

54）

を用いて調製した発酵乳による N-ニトロソピロリ

ジン（NPYR），N-ニトロソジメチルアミン（NDMA），
ニトロソピペリジン（NPIP）に対する抗変異原性を調べ，カッコ内に抑制率（％）を示した

50）．Table 3 から明らかなように，いずれの菌株を用いて調製した発酵乳においても NDMA，NPYR，NPIP に対する抑制率の高

116

C

2 5 4nmでの吸光

Trp-2

D

0

Glup-1

B

Trp-1

A

E

2

4

6

8

10

0

F

2

4

6

8

10

0

2

4

6

8

10

保持時間（分）Fig. 3 Lactococcus lactis subsp. lactis 菌体による Trp-P1 の結合 67）

いことが認められたが，とりわけ NDMA に対する抑制
55 〜 57）率が高い値を示した．この実験と併行して，筆者ら同時に確認された．さらに，筆者ら

59）

はヒト糞便から分離した Lb. acidophilus LA-2 を用いてつくった発酵乳
8は世界各地に伝わる種々の発酵乳より乳酸菌を分離し， （2.5 × 10 cfu/g）を健康な成人男子（平均年齢 32.6 歳）
それら分離菌株を用いて発酵乳を調製した後，SD510 株に 1 日 100g 摂取させ（その他の食事と水分の摂取は自を指標菌に用いて種々の変異原性物質に対する抗変異原由），摂取後 5 〜 7 時間に採取した糞便全量を用いて，性を調べた．その結果，いずれの供試菌株を用いて調製

発酵乳を摂取しなかったグループの糞便の示す変異原性した発酵乳にも強い抗変異原性のあることが認められと比較した．Table 4 に結果を示したとおり，発酵乳摂

た．

取によって糞便の示す個人差はあるものの変異原性は有一方，発酵乳（乳酸菌）が in vitro のみならず in vivo
でも抗変異原性を発揮していることの確認はきわめて重58）

要と思われる．筆者らはまず，ラット（Wister 系雄，意（p ＜ 0.05）に減少し，ヒトによっては 90 ％以上も減少していることが認められた．
一方，発酵乳の他にチーズにおいても抗変異原性のあ60, 61）8 週齢）に Trp-P1 投与（一匹当たり 2mg）とともに，ダることが一部のチーズで認められているデイヒから分離した Lb. casei susp. casei R-52 菌体を市

反応溶液へのチーズ試料の添加量により抗変異原性に違

販飼料に添加（1 ％ないし 9 ％）して与え，投開始後 4いがあるものの，熟成日数の経過に伴い抗変異原性が増

日目の糞と尿中の Trp-P1 の量を調べた． その結果，加することが認められた．

．その結果，

Trp-P1 投与後の糞便中の Trp-P1 の累積値は，コントロ

抗変異原性の発現には乳酸菌の菌体と牛乳成分，特にール群，1 ％乳酸菌添加群，9 ％乳酸菌群ともに 24 時間

乳タンパク質成分，またはその分解物に依存しているこ

以内にほとんどが排泄され，24 時間および 48 時間の間とはいうまでもないが，乳酸菌菌体による抗変異原性のではわずかな量しか排泄されないことが確認された．一

発現は生菌においてはスーパーオキシドジスムターゼ

方，尿中の Trp-P1 の累積値では 9 ％乳酸菌添加によっ（SOD）活性て Trp-P1 の排泄量が有意（p ＜ 0.05）に増加することもいては後述するように変異原性物質の吸着の関与が考え

61, 62）とも密接な関係がある反面，死菌にお117Table 6 Lactobacillus gasseri の菌体に対するアミノ酸加熱分解物（混合物）の結合 75）
初発濃度 µg（IQ + Trp-P1 + Trp-P2）

IQµg

Trp-P1µg

Trp-P2µg（IQ + Trp-1 + Trp-P2）
µg

600
600
600
600

53.98 ± 20.19
62.39 ± 28.73
63.92 ± 13.25
65.21 ± 16.83

119.57 ± 10.33
132.87 ± 4.79
141.24 ± 6.43
137.11 ± 5.07

86.87 ± 9.24
104.98 ± 2.89
110.39 ± 8.61
108.04 ± 6.54

260.42 ± 39.71
300.24 ± 36.34
315.55 ± 18.23
310.36 ± 28.27

SBT0274
SBT1703
SBT10239
SBT10241

Glu-P1，Trp-P1，Trp-P2 をそれぞれ 200 を調製し，これに 2mg の凍結乾燥菌体を加え，全量を 1ml にして 37 ℃で 30 分間インキュベー
ションした

Table 7 48 時間培養の Lactobacillus gasseri 菌体のコレステロールとの結合 81）株

結合率（％）1

SBT10241
SBT10240
SBT0278
SBT0291
SBT2055
SBT10238
SBT1753
SBT0273
SBT10239
SBT0311
SBT0274
SBT0270
SBT0312
SBT2056
SBT0276
SBT0293
SBT1702
SBT0292
SBT0315
SBT0290
SBT0267
SBT2059
SBT2061
SBT0299
SBT0257
SBT1703
SBT2054
SBT031786.5 a77.0 ab74.3 abc
73.0 abc
67.6 abc
66.2 abcd
65.2 abcd
63.5 abcd
60.9 abcdef
59.5 abcdef
57.6 abcdef
56.8 abcdef
54.1 abcdef
52.7 abcdef
47.3 bcdefg
46.0 bcdefg
45.5 bcdefg
45.5 bcdefg
44.6 bcdefg
43.2 cdef
41.9 cdefgh
40.9 cdefgh
33.8 efg
32.4 fg
29.7 gh28.8 gh28.8 gh6.0 h

菌a, b, c, d, e, f, g, h 異文字間で有意差あり（p ＜ 0.05）
1
60 ％エタノール（100 mg/ml）に溶解したコレス
テロールを菌体 10mg と結合は Bigelow の平均残基疎水性が 1330

64）と，タンパク質の中でもっとも高い値をもつことを考慮すると，β-カゼ
インの疎水性が抗変異原性の発現に密接に関係しているのではないかと推測される．

5．乳酸菌菌体による変異原性物質の結合
筆者ら

65, 66）は Streptococcus faecalis IFO 12965 の細胞壁とアミノ酸加熱分解物である Trp-P1，Trp-P2，Glu-P1とを混ぜた後，その上澄液中の Trp-P1，Trp-P2，Glu-P1の濃度が極端に減少する事実を認めた．この顕著な減少を詳細に検討することによって次のことが明らかになってきた．（1）多くの細菌の細胞壁が変異原性物質（発癌性物質も含む）と結合する性質を有しているが，とりわけ乳酸菌の細胞壁にこの性質が顕著に見い出され，かつ結合能も他種細菌に比べて高い．
（2）細胞壁画分のうち，ペプチドグリカンにその性質がみられる．（3）乳酸菌の死菌体でもその能力を有しており，生菌と死菌との間の結合能に有意な差が認められない．（4）結合は瞬間的に起こり，かつ安定な結合を保つ．（5）結合に際し，SDS（Sodium dodecyl sulfate） との拮抗性が認められる，な
どである．
筆者ら

67）

はモンゴル地方に伝わるケフィアから分離した Lc. lactis subsp. cremoris，St. faecalis， Lacto-bacillus plantarum，Lb. brevis それに Leuconostoc dextranicumの死菌体の Trp-P1，Trp-P2，Glu-P1 に対する結合性を調べた結果，分離株のほとんどが Trp-P1，Trp-P2，Glu-P1
に対して結合能力を有し，とりわけ Trp-P1 と Trp-P2 に対する結合能力がきわめて高かったことを認めた．同様の結果が中国原産発酵乳，ナイゲダから分離した Lc.
lactis subsp. cremoris ， St. faecalis，Lc. lactis subsp.
68）

られる．また，乳タンパク質成分またはその分解物によdiacetylactis などの乳酸菌 ，それに種々の発酵乳からる抗変異原性の発現は用いる変異原性物質との関連性も分離した乳酸球菌

48）

69, 70）

や乳酸桿菌

71）

にも認められた．

はコショウのアルコール抽出液を試

ちなみに，乳酸菌の菌体が Trp-P1，Trp-P2，Glu-P1 に料にして牛乳タンパク質より，全カゼイン，αs1-カゼイ

対して結合性を有していることを示す一例として Lc.

ン，β-カゼイン，κ-カゼインを調製し，これらタンパク

lactis subsp. lactis T80 の場合

質の抗変異原性を調べた．その結果，Table 5 に示すよ

Fig. 3 は上記 3 種類のアミノ酸加熱分解物を T80 株の死

大きい．筆者ら67）について説明したい．

うに，全カゼインと β-カゼインに強い抗変異原性がある

菌体と混ぜ，37 ℃で 15 分間放置した後，上澄液をことが認められた．β-カゼインが強い抗変異原性を示す

HPLC にかけて Trp-P1，Trp-P2 および Glu-P1 の上澄液中ことの理由については不明な部分があるが，β-カゼインの残量を示したものである．Fig. 3 から明らかなように，

118

上澄液中の各アミノ酸加熱分解物がほとんど，または全イオティックスのヒト健康に対する機能性を高めるうえく検出されず，加えたアミノ酸加熱分解物が乳酸菌の細でシンバイオティックスの考え方がますます重要になっ

胞壁に吸着されてしまったことが理解される．

てくるものと思われる．

一方，
アミノ酸加熱分解物として Trp-P1 を用いた場合，乳酸菌は古来人類が発酵食品を通じて体内に入れてき

SDS の濃度を上げていくと，濃度依存的に TRP-P1 の菌た細菌群であり，経験的にみて安全性の高いことが保証

72, 73）

されていることから， GRAS （Generally Recognized体への結合が著しく阻止されることが認められた．

このことは結合様式が疎水結合であることの可能性を強As Safe） Bacteria

く示唆している．

プロバイオティックス

74）と呼ばれており，また保健上重要な84, 85）の筆頭にあげられている細は 28 株の Lb. gasseri と 2 株の Bifidobacterium

菌群である．発酵乳はそうした乳酸菌で発酵させてつく

longum のアミノ酸加熱分解物に対する抗変異原性につられることから，発酵乳のもつ機能性への追及は今日でいて調べ，2 株のビヒズス菌も Lb. gasseri に匹敵して高は学術上のみならず産業界においても大きな期待が寄せい抗変異原性を有していることを認められている．かつ，られている．

筆者らいずれの株の菌体も RNase ならびに DNase で精製処理することにより，Trp-P1 に対する結合性が際立って高く引用文献なることも認められた．さらに，Lb. gasseri SBT10293

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加熱分解物とを組み合わせた場合にもっとも高い結合が起こることが確認された75）（Table 6）．同時に，Lb.

gasseri 菌体と上記のヘテロサイクリックアミンとの結合において細胞壁を構成するタンパク質を含まない多糖体が関係していることも明らかになった

76）．

乳酸菌の菌体は死菌体であっても，生菌体と同様にア
ミノ酸加熱分解物のみならず N-ニトロソ化合物
アフラトキシン69, 79）77, 78）やなどの発癌物質とも結合する性質を有していることを述べてきた．近年，それら物質だけではなく，Table 7 に示すように，コレステロール

80 〜 83）にも結合性を有していることが明らかになり，今後における乳酸菌の更なる有効利用が期待される．

おわりに健康に対する国民の関心の高まりを反映して発酵乳の消費量は年ごとに増加の傾向をたどっている．それに呼応して発酵乳の製造における乳酸菌やビフィズス菌の菌数を高く維持させるための技術も向上した．高菌数を可能にさせた理由の一つに優れたプレバイオティックスの開発があげられる．例えば，ビヒズス菌に対し優れた増殖促進効果を発揮するフラクトオリゴ糖（FOS） はその代表的なものである．プレバイオティックスは腸管内で分解されたり，吸着されたりしないことが重要であり，
プロバイオティックスの増殖を促して，間接的に宿主に対する保健機構に寄与するものである．
今日，シンバイオティックス（synbiotics）という用語も盛んに用いられるようになった．シンバイオティッ
クスとはプレバイオティックス（prebiotics）とプロバ
イオティックス（probiotics）を一体化させながらプロ
バイオティックスの機能を十分に発揮させようとするものであり，この考えのもとに乳児や老人に対し優れた効果を発揮したとする報告がなされている．今後，プロバ

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予防，ヘルシスト，25（5）

121

総

Environ. Mutagen Res., 24：123-128（2002）

説

発がん抑制性フードファクター：食によるがん予防
を目指して
大東 肇＊
京都大学農学研究科・食品生物科学専攻〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町

Toward the cancer prevention by diet: exploration of promising food factors
Hajime Ohigashi
Division of Food Science and Biotechnology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University
Oiwakecho, Kitashirakawa, Sakyoku, Kyoto 606-8502, Japan

Summary
Chemoprevention with food phytochemicals is currently regarded as one of the most promising avenues
for cancer control. To search for chemopreventive food phytochemicals（FOOD FACTORS）, the authors
have hitherto carried out screening studies of dietary plants for their anti-tumor promoting properties. In theextensive screening test using an in vitro method, the Epstein-Barr virus（EBV）activation inhibition test,
high potential was found in the plants from Southeast Asian countries. In particular, those in the families
Zingiberaceae, Rutaceae, Labiatae, Cruciferae and Umbelliferae were shown to contain potent anti-tumor
promoters at high proportion of species. More than 40 EBV activation inhibitors have thus far been identified. Of the inhibitors, 1’-acetoxychavicol acetate（ACA）and zerumbone（ZER）from zingiberaceous
plants and auraptene（AUR）and nobiletin（NOB）from citrus fruits were shown to be promising chemopreventors by a variety of animal model tests; e.g. skin, oral, oesophagus and colon carcinogenesis in mouseor rat. Inhibition of free radical generation including O2 and NO as well as the related biological and physiological activities were found to be the most striking biochemical characteristics of these 4 compounds. Thus,
the inhibition of free radicals is thought, at least in part, to be one of the effective mechanisms for cancer
prevention. An outline of our researches in this area is reviewed.
Keywords ： chemoprevention, food factor, 1’-acetoxychavicol acetate, auraptene, zerumbone, nobiletin,superoxide, nitrogenoxide緒言にされつつある．著者らは，ここ 10 余年，「食によるがん予防」を目標に，予防に期待できる食素材や食成分の「がん」を克服するための一戦略として予防の重要性

探索・解析を行ってきた．本稿では，スクリーニング試が叫ばれている．ヒトがんの多くはいわゆる化学発がん

験から出発し，活性因子の化学的究明，動物試験や作用であり，食品成分をも含む環境中の化学因子が重要な鍵性解析など，一連の研究のあらましについてまとめてみを握っている．したがって，この予防には，これら発がる．

ん因子の究明とその環境からの駆逐が重要であるが，他方では，発がんに抑制的に働く因子を積極的に取り入れてゆくことも考えられよう．この考え方は「Chemo-prevention」と呼ばれ，近年多様な予防候補成分が明らか

1.

エプスタイン−バーウイルス（EBV）活性化抑制試験法による植物性食素材のスクリーニング試験

野菜や果物が種々のがんに抑制的であることは多くの＊

E-mail ： ohigashi@kais.kyoto-u.ac.jp
受付： 2002 年 6 月 10 日 受理： 2002 年 6 月 10 日
日本環境変異原学会

疫学研究で示されている．このような背景下，これまで，
抗酸化性ビタミンやカロテノイド，さらにはフラボノイ
ドなど，植物に普遍的に含まれる成分についての評価が123

Table 1 Modyfying effects of ACA, AUR, NOB and ZER on carcinogeneses in animal modelType of carcinogenesis

AnimalCarcinogena

Skin
OralOesophagus＊
Colon（ACF）
Colon
Liver
Cholangiocellular-

Mouse
Rat
Rat
Rat
Rat
Rat
Hamster

DMBA/TPA
4-NQO
NMBA
AOM
AOM
CDAA diet
BOP

Effectb
ACA

AUR

NOB

ZER

↓
↓
↓
↓
↓
↓
↓

↓
↓
↓
↓
↓
↑＊＊
NT

↓
NT
NT
↓
NT
↓↑＊＊
NT

↓
NT
NT
↓
NT
NT
NT

a

DMBA/TPA: dimethylbenz［a］anthracene/12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, 4-NQO: 4-nitroquinoline 4-oxide,
NMBA: N-nitrosomethylbenzylamine, AOM: azoxymethane, CDAA diet: choline-deficient（L）-amino acid defined diet,-amine
BOP: N-nitrosobis（2-oxopropyl）b↓: suppression, ↑: enhancement, ↓↑: no effect, NT: not tested＊
short term method for colon cancer by detection of aberrant crypt foci formation＊＊
unpublished data

性化する事実（Ito et al., 1981）に基づいており，その抑制成分の多くは多様な発がん抑制動物実験で良好な結果を与えている．
このアッセイ法を用いて，まずはわが国においてよく食べられている野菜や果物 120 種余りについて活性を調べてみた．その結果，強く EBV 活性化を抑制した種は14 種（全体の約 12 ％），以下，中程度に抑制した種が 7
種（6 ％），弱いながらも抑制が認められた種が 13 種
（10 ％）で，全体として 4 種に 1 種は何らかの抑制活性があるとの結果であった（Koshimizu et al., 1988）．一方，目を東南アジア諸国に転じると活性を示す種は大幅に増加し，強力な活性種のみに絞っても，日本のそれよりも倍以上の種数であった（大東肇，2002）．一連のスクリーニング試験で得られたもう一つの興味ある結果は，強力な活性を示す種がショウガ，セリ，コショウ，ミカン，シソ科など，一般的には薬味や調味用として，あるFig. 1 Chemical structures of highly promissing food factors forchemoprevention

いは半薬用的利用があるなど，非栄養的に食べられる植物科に頻度高く分布していたことである．この事実は，がん予防において，非栄養性特殊成分の重要性を再認識させるもので，興味深い．

行われてきたことは周知のところである．一方，著者ら（亜）熱帯地域の食用植物にこのように頻度高く強いの着眼点は，各種疫学的示唆がこれら栄養素や食用植物

活性が認められる決定的な理由は定かではないが，例え中に普遍的に含まれる成分のみでは説明できないことかば強光下で生存するための植物側の化学戦略として，抗ら，特殊成分（フードファクター）に目を向けたことで酸化性物質の高度な蓄積もその一因と考えられるのではある．「フードファクター」はあいまいな語句であるが，ないだろうか．

著者らは生体に対して微量で生理機能を発揮する非栄養
素食成分と理解し，使用している．
さて，広く食用植物の発がん抑制効果を評価するためには簡便な試験管内試験法が必要となる．著者らは，が2. 発がん抑制性フードファクター：動物実験成績とその作用性の解析
広範なスクリーニング試験により選択された種より，ん予防においては化学発がんにおけるプロモーション過著者らはこれまでに 50 種近い EBV 活性化抑制成分を単程の抑制が重要と考え，この抑制を検定する手段として離・同定し，また，その一部については動物実験にて発EBV 活性化抑制試験法を用いてきた（Ohigashi et al.,

がん抑制効果を確認してきている．一方，他のグループ

1994）．本試験法は TPA をはじめとする発がんプロモーからも種々の in vitro 法にて多様な予防候補成分が提出

ターが B リンパ球細胞に潜伏感染した EBV を強力に活され，これまでその数は数百にも及ぶ．しかしながら，

124

Table 2 In vitro and in vivo biological or physiological activities of ACA, AUR, NOB and ZER
Effect ＊Activity
Suppression of:
EBV activationaO2- generation（NADPH oxidase system）
O2 generation（xanthine oxidase）b
NO generation（INOS expression）
Cyclooxygenase-2（COX-2）
expressionb
PGE2 releaseb
TNF- α releaseb
Edema formation（mouse ear）
Edema formation and H2O2
cproduction（mouse skin）
Induction of:
GST activity（mouse liver）
P450 activity（mouse liver）
GST & QR activity（rat liver & colon）

ACA

AUR

NOB

ZER

↓
↓
↓
↓↓
─
─
↓↓
─
↓↓＊1

↓
↓
─
↓
↓
↓
↓
─
↓↓＊1

↓
↓
─
↓
↓
↓
↓
↓
↓＊2

↓↓
↓
─
↓↓
↓↓
↓↓
↓
↓
NT

−
NT
↑

↑
−
↑

−
NT
NT

↑↑
NT
NT

a
tested with DMSO-differentiated HL-60 cells, b tetsed with RAW or RAW264.7 cells stimulatedwith LPS or/and interferon-γ, c tested by a double TPA application experiment in mouse skin↓↓＊: strong suppression, ↓: suppression, ↑↑: strong enhancement, ↑: enhancement, ─: noeffect, NT: not tested＊1and ＊ 2 inhibition of activation phase and both priming and activation phases, respectively, ina double TPA application experiment

動物実験を通してその効果が突き止められた成分は限ら考えられるが，著者らは AUR の代謝産物が関与していれている．その理由は，動物実験は長期を要し，また大るのではないかと考えている．実際，AUR は肝酵素系

量の試料を必要とする点にあろう．著者らのケースも例

で代謝され，側鎖のゲラニル基が切れ，水酸基に変換さ外ではなく，発がん抑制性フードファクターとして現在れた umbeliferone になり，さらにクマリン環の数ヵ所がまで生き残ってきた成分は Fig. 1 に示すショウガ科由来

水酸化された数種の化合（esculetin や 3,7-dihydroxy-の 1’-acetoxychavicol acetate（ACA）と zerumbone

coumarin など）が生まれることがわかっている（ZER），およびミカン科由来の auraptene（AUR）と（Murakami et al., 2000a）．これら代謝物のあるものには

nobiletin（NOB）の 4 種である．

毒性をもつ化合物があるのかもしれない．いずれにしろ，

上記 4 種の成分について，これまで得られてきた動物

化合物により標的となる組織・臓器があることは実験結果を Table 1 にまとめた．ZER や NOB では現在

chemoprevention の観点からは重要なポイントであり，進行中の試験が多いが，ACA や AUR ではすでに多くの予防候補物質に関する多彩な動物実験的アプローチが必

成績が蓄積されてきている．これは，いずれも EBV 活須となる．

性化抑制試験を初めとする in vitro 実験で優れた結果が上記 4 種の化合物については発がん抑制に関連する認められたことのほか，合成的に，あるいは天然より大種々の in vitro および in vivo 活性をも検討してきた．試量入手が可能であったこと，さらには独特の優れた実験

みた試験は多彩であるが，Table 2 にはそのうちいずれ系をもった多数の共同研究グループに恵まれたことよりかに有意な活性が認められたものを取り上げ，まとめて進展させることができた結果である．個々の詳細についある．興味あることに，4 種に共通した活性として，細ては原著または総説等（大東村上明，2001 ；村上

明と大東

-

肇と

胞レベルでラジカル（スーパーオキシド（O 2）や NO）

肇，1998 ；大東の産生を抑える効果が認められた．例えば ACA では，肇，2002 ；大東肇ら，1998 など；原著論文についてはこれら総説中に従前に知られていたキサンチンオキシダーゼの阻害作用示してあるので参照のこと）に譲るが，例えば ACA や（Noro et al., 1988）以外に，分化 HL-60 細胞（好中球様AUR ではマウス皮膚二段階発がん，ラット口腔，食道，細胞）を TPA で刺激した際発生する O2を極度に減少さ-

大腸発がんを有意に抑制するとの結果を得ている．ACAせること（Murakami et al., 1996），また，リポ多糖

ではこの他，BOP によるハムスター胆管発がんを強力（LPS）またはインターフェロン-γ刺激によるマウスマに抑制した（Miyauchi et al., 2000）．一方，AUR のコリ

クロファージ RAW 細胞からの NO 産生を阻害する

ン欠乏食ラットによる肝発がん実験系では促進効果が認（Ohata et al., 1998）活性などである．炎症性細胞であるめられた（未発表；中江，私信）．この理由として種々

前者では NADPH オキシダーゼ系の阻害と思われ，また125

Fig. 2 Activity exhibiting pattern of edible plants in inhibition of NO generation
Plant species were divided into 4 ranks（+++ 〜-）
according to ther inhibitory activities（IR）.
Top: Data tested at 200 µg/ml
Bottom: Data tested at 40 µg/ml
Left: Inhibitory effect determined by NO2 level
Right: Inhibitory effect determined by L-citrulline level

後者では誘導性の NO 合成酵素（iNOS）の de novo 合成

抑制とは逆に増強される活性として，in vivo での代謝阻害であり，これはその転写因子の一つである NF-κ B

酵素の誘導がある．部分的な結果ではあるが，ACA，の活性化の阻害によることが明らかにされている

AUR および ZER など化合物によってはグルタチオン-S-（Ohata et al., 1998）．de novo の iNOS 合成阻害は ZER

トランスフェラーゼ（GST）やキノンレダクターゼ（Murakami et al., 2002），AUR（ Murakami et al., 2000b） （QR）などの薬物代謝第 2 相酵素の誘導が見られた．口および NOB（Murakami et al., 2000c）で共通していた．

腔や大腸発がん動物実験において，ACA（Ohnishi et al.,

一方，ACA を除く 3 種では，マウス皮膚またはラット大

1996; Tanaka et al., 1997）や AUR（Tanaka et al., 1998a;

腸で誘導性シクロオキゲナーゼ（COX-2）の合成を阻害

1998b）ではプロモーション期のみならずイニシエーシ

していることが明らかとなり（Murakami et al., 2002;

ョン期の投与においても有意な抑制活性が確認できてい2000b; 2000c），特に ZER の COX-2 阻害は顕著であった

た．この事実は，これら第 2 相薬物代謝酵素の誘導活性（Murakami et al., 2002）．一方，炎症性白血球から産生で一部説明できるかもしれない．

-

された O2 で負荷される酸化ストレスが各種化合物

以上示してきた種々の活性のうち，いずれが発がん抑（ZER は未試験）で抑制されることは，マウス皮膚レベ

制に直接関与しているかについてはいまだ明確な結論は

ルでの二段階炎症実験（double TPA application experi-

出せない．しかしながら，すべてではないとしても，生ment）にても実証された（Nakamura et al., 1998）．マウ

体内のラジカル産生の制御が炎症に基づく発がんの抑制

ス皮膚を適量の TPA で刺激すると，その塗布部からに繋がるものと推測される．

種々の炎症性サイトカインが放出され，炎症性白血球細胞が患部に集積してくる．24 時間後に再度この部位を-3.

NO 産生抑制活性スクリーニング試験

TPA 処理すると，集積した白血球から大量の O2が発生

最近，iNOS による NO 産生と各種発がんとの関連がし，過剰な酸化ストレスを招くことになる（Wei et al.,

注目されている．しかしながら，食成分の NO 産生抑制

1993）．結果として炎症（浮腫の形成）が起こるが，炎を総合的に評価した例はなかった．そこで，著者らは，症性白血球の集積段階は priming 期と，また炎症段階はわれわれが日常的に摂取している野菜や果物 48 種（60activation 期と区別され，前者はミエロパーオキシダー

部位：基本試験濃度は 200µg/ml）について，マウスマ

ゼの活性で，また後者は組織中の過酸化水素発生量で判

クロファージ RAW264.7 細胞を用いた試験系で NO 産生

定できる．興味あることに，ACA や AUR は activation 期制御活性を総合的に評価してみた（Kim et al, 1998）．

に特異的に，また NOB は priming および activation 両期

RAW264.7 細胞をリポ多糖とインターフェロン-γで刺激に作用する化合物であると特徴づけられた．ちなみに，

し，基質 L -arginine より生じる NO 量を NO 2 としてpriming 期に特異的な発がん抑制物質として genistein や

Griess 法で定量し，一方 L-アルギニンより生じた L-cit-

pheophorbide a など，両期に作用するそれとして cur-rulline の量を diacetyl monoxime で誘導体化した後，比cumin が指摘できた（Nakamura et al., 2000）．

色定量法により求めた．L-arginine → L-citrulline の反応

126

については，現在，各種動物実験で発がん抑制効果を検討中である．

結語

以上のように，本稿ではがん予防に期待できる植物性
食素材やフードファクターについて紹介してきた．すでに述べたように，がん予防性食品成分については著者らのみならず他のグループによっても盛んに研究がなされ，特に抗酸化作用に基づいたそれらが多数報告されている．しかしながら，その多くはラジカルや活性酸素種の消去（捕足）型である．一方，ここで取り上げた化合Fig. 3 Highly active plant families and the species in NO generation inhibition

物類はラジカル産生阻害型と特徴づけられる点で興味がOf the strongly active species（ 17）, 6, 4 and 4 species
belong to the plant families Cruciferae, Liliaceae andUmbelliferae, respectively

硬化や糖尿病など広く生活習慣病に関連していることがあろう．生体の酸化ストレスは，がんのみならず，動脈示されつつある．一方最近，抗酸化成分のプロオキシダ
ント効果が問われており，このような観点からも，ラジカル産生抑制型発がん抑制物質に意義があるように思わは 1:1 であるので，NO2 量と L-citrulline の量差は便宜的れる．

に NO 消去活性とみなすことができる．抑制活性を 4 段

期待の大きい本分野の今後は，実際のヒト発がんに有階（＋＋＋〜─）で評価し，その活性発現パターンをま効か否かであろう．時代は「ヒトでどうか？」を問うてとめたのが Fig. 2（図の左は NO2 の量で検定した阻害，いる．幸い，最近，「食品成分によるヒト発がん予防」

右は citrulline の量で検定した阻害である）である．なの可能性を示唆する介入試験データが出つつある．種々

お，標準的な試験濃度（200 µg/ml）では 15 種に細胞毒難題はあろうが，著者らもこの目標に向かってさらに研性が認められたので，これらについては試験濃度を 40

究を進めてゆく所存である．

µg/ml に下げ実施した（Fig. 2 の下図）．試験した種のおよそ 1/3 に強い活性が認められ，NO 産生に抑制的な野謝辞

菜や果物をわれわれは頻度高く食していることがわかっ

本稿は多数の共同研究者の協力のもとに進展してきた

た．細胞毒性が低く，強い NO 産生活性を示す 17 種を一連の成果を筆者が代表してとりまとめたものである．

植物科に分けてみると，主にアブラナ科（Cruciferae）6

研究全般にわたって共同実施していただいた小清水弘一

種，ユリ科（Liliaceae）4 種およびセリ科（Umbelliferae）

教授（近畿大学・生物理工学部），村上 明博士（近畿大

4 種に分布していた（Fig. 3）．これらの種の多くは，米学・生物理工学部，現京都大学農学研究科）および中村国のデザイナーフーヅプログラムにおいてがん予防食素宜督博士（現名古屋大学生命農学研究科）たち，動物実材として高く評価されたものであり（大澤俊彦，1999），

験にて共同研究していただいた森 秀樹教授（岐阜大・その対応性には興味がもたれる．

医），田中卓二教授（金沢医大），小西陽一教授および中NO 産生抑制と EBV 活性化抑制との間には相関は認め

江 大博士（奈良県医大），西川秋佳および広瀬雅雄両博られなかったが，著者らは最近，両試験で強い活性を示士（国立衛試）たち，さらには作用特性解析につきご指した種（アボカド）より persenone A を初めとする脂肪導・ご示唆をいただいた若林敬二博士（国立がんセンタ

酸類縁化合物を単離・構造決定した（Kim et al., 2000a）．

ー研）らに本紙面を借りて厚く御礼申し上げます．

これら化合物は，顕著な NO 産生阻害性をもち，その作用は ACA や AUR と同様転写因子 NF-κB の活性化阻害に

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抑制や O2産生抑制，さらには COX-2 誘導阻害活性を示し，マウス皮膚レベルでの二段階炎症実験において特にactivation 期に阻害を示すなど，前記各種化合物とよく似た特性をもっている（Kim et al., 2000a）．また，
persenone A などの合成法の確立により，構造―活性相関の究明を行い，各種の活性発現におけるエノン部や水酸基の意義を指摘できた（Kim et al., 2000b）．本化合物

127

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総Environ. Mutagen Res., 24：129-144（2002）

説

抗変異原に関する研究
木苗 直秀＊，増田 修一
静岡県立大学食品栄養科学部〒 422-8526 静岡市谷田 52-1

Studies on antimutagens（ A review ）Naohide Kinae and Shuichi Masuda
School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka, 52-1 Yada, Shizuoka 422-8526, Japan

Summary
In recent years, because people have become more health and lifespan concious, interest has increased
over how to prevent life-style related diseases, including cancer, by consuming daily foods or supplements.
It is well known that several mutagens play an important role in the early stage of carcinogenesis. Therefore,
intake of antimutagens should be effective in reducing cancer incidence and mortality. In this article, many
experimental studies on antimutagens are reviewed. These chemicals have been isolated mainly from vegetables and fruits, and their antimutagenic activity studied in vitro with bacteria, yeast, and cultured animalcells, and in vivo in rats and mice. The mechanism of action of antimutagens in inhibiting carcinogenesis isalso discussed. As recommended by the World Cancer Research Fund and the American Institute forCancer Research, proper intake of vegetables and fruits might be a useful and important means for prevention of cancers.
Keywords ： antimutagen, mutagenesis, carcinogenesis, catechin, flavonoid

はじめにドを用いて Medline（Table 1）および STN system（Table 2）による文献検索の結果から十分に読み取るこ

我々の生活環境中にはおよそ 8 万種類の化学物質が存とができる．変異原物質はヒトのがん発生を惹起する第在するといわれており，それらの多くは大気，土壌，水，1 段階に関与する化学物質である．Doll（1977）はヒト

食品中に微量ながら混在している．近年，それら環境内のがん発生の原因は日常食品が 35 ％，喫煙が 30 ％，ウ

化学物質の中で細胞の遺伝子に損傷を与える変異原物質

ィルスが 10 ％であると考えている．現在では全がんのや変異細胞を悪性腫瘍細胞に導く発がん物質，さらにホ70 〜 80 ％が化学物質に由来すること，我が国では 2001

ルモン作用を乱す内分泌攪乱化学物質，奇型を誘起する

年のがん死亡者が 30 万 600 人で 20 年来死因の第 1 位

催奇形成物質などが注目されている．特に 1975 年に米（31.0 ％）を占めていること，さらに他の疾病の治療方

国の Ames 博士ら（1975）がサルモネラ菌を用いる復帰法が改善されるとがんによる死亡率はさらに上昇するこ

変異試験いわゆる「エームス試験」を開発して以来，環と，医療費の高騰などを考え合わせると，がんにかかり

境中の変異原，がん原物質の検索とともにそれらの作用にくくするために個人個人が抗変異原物質を有効に摂取を阻害する抗変異原，抗発がん物質の分離，同定が急速することが極めて重要になってくる．

に進められた．抗変異原に関する研究成果が 1976 年以

本稿では変異原物質についてがん発生とのかかわりと降に急増したことは antimutagen を中心としたキーワー

ともに天然物，主として野菜，果物から分離された抗変異原物質とそれらの作用機作について著者らの研究成果＊

E-mail ： kinae@fns1.u-shizuoka-ken.ac.jp
受付： 2002 年 8 月 20 日 受理： 2002 年 8 月 20 日
日本環境変異原学会を含めて文献に記載されたものをここに紹介する．

129

Table 1 The Number of articles in the literature（from Pub Med）
Keywords
antimutagen
antimutagen-tea
antimutagen-catechinantimutagen-polyphenol
antimutagen-vegetable
antimutagen-fruit
antimutagen-plant
antimutagen-vitamin

Period1976 -1985

1986 -1995

1996 〜

9
1
1
0
0
0
0
1

54
0
1
0
0
2
16
9

45
2
1
1
5
3
12
7

Table 2 The Number of articles in the literature（from STN）
Keywords
antimutagen
antimutagen-tea
antimutagen-vegetable
antimutagen-fruit
antimutagen-dietary fiber
antimutagen-plant
antimutagen-vitamin

Period1976 -1985

1986 -1995

1996 〜

78
3
2
0
0
9
8

313
15
19
15
3
43
29

333
29
24
24
5
36
20

Fig. 1 Multistep carcinogenesis and its inhibition by des-mutagen and bio-antimutagen

1．変異原物質とがん発生とのかかわりおよび抗変異原物質の検索

がん物質については下位ら（1991），Hayatsu ら（1993），
Ferguson ら（1999），Kumpulainen ら（1999）がレビューしている．抗変異原作用については主としてある特定細胞のがん化は Fig. 1 に示すように考えることができの化学物質または植物成分を加えることによって突然変る．正常細胞が化学物質（変異原・発がん物質），紫外異の頻度を減少させる場合と，細胞が有する遺伝的背景

線，放射線，ウイルス等に暴露されると DNA が損傷をに変化をもたらせる場合，さらには細胞の内外で作用さ受け，遺伝情報が乱され突然変異が起こる（イニシエー

せる場合などに分類して説明されている．

ション）．ついでその変異が固定され，潜在的ながん細我が国では，国立遺伝学研究所の故賀田恒夫博士が抗胞の増殖を促進して前がん状態の腫瘍細胞に変化する

変異原に関する概念を述べており，それによると細胞外（プロモーション）．さらに細胞が遺伝的な変化を受け，で作用する抗変異原を desmutagen（消変異原），細胞内無制限な増殖を繰り返し，転移能も有する悪性腫瘍細胞で作用する抗変異原を bioantimutagen（生物的抗変異原）を形成する（プログレッション）．大量暴露の場合を除と呼んでいる（Kada et al., 1981 ; 黒田, 1995）．

くと 1 個の正常細胞が突然変異を起し臨床がんとして検発がんの進行過程における抗変異原物質の作用機構に知されるまでに 10 年から 30 年を要すると考えられていついては De Flora と Ramel（1988）が詳細に提唱している．それゆえ，がんを予防するにはできるだけ早い時期

る（Table 3）．彼らは，細胞外で作用するもの，細胞内に変異原物質を分解，消去するか，変異した細胞を修復で作用するもの，イニシエーションを起した細胞またはして正常細胞に戻すことなどが考えられる．そのためにがん細胞で作用するものに大別している．なお，抗変異抗変異原物質の活用が必要とされるに至った．なお，食原性の検定には従来変異原性の検定に用いられている遺品中の変異原物質，発がん物質については von Borstel

伝子突然変異を指標とする試験（サルモネラ菌や大腸菌（1998）や Sugimura ら（1996）が，抗変異原物質，抗発を用いる遺伝子突然変異試験，哺乳動物の培養細胞を用

130

Table 3 Mechanisms of inhibitors of mutagenesis and carcinogenesisa（De Flora and Ramel, 1988）b

Classification

Examples

1. Inhibitors of mutagenesis acting extracellularlyc
1.1. Inhibiting the uptake of mutagens or of their precursors
1.1.1 Hindering their penetration
1.1.1.1. Into the organism
1.1.1.2. Into cells
1.1.2 Favoring their removal
1.2. Inhibiting the endogenous formation of mutagens
1.2.1 Inhibiting the nitrosation reaction
1.2.2 Modifying the microbial intestinal flora
1.3. Deactivating mutagens
1.3.1 By physical reaction
1.3.2 By chemical reaction
1.3.3 By enzymatic reaction

Body shielding devices, washing
Fatty acids, putrescin, aromatic amino acids, iodide
FibersAscorbic acid, tocopherols, phenols
Fermented dairy products
Maintenance of physiological pH in body fluids
Thiols, antioxidants
Vegetables with peroxidase activityd

2. Inhibitors of mutagenesis acting intracellularly
2.1. Modulators of metabolisme
2.1.1 Inhibiting cell replication
2.1.2 Favoring sequestration of mutagens in non-target cells
2.1.3 Inhibiting the activation of promutagens
2.1.4 Inducing the detoxifying mechanisms
2.2. Blocking reactive moleculese
2.2.1. Reacting with electrophiles
2.2.1.1 By chemical reaction
2.2.1.2 By enzymatic reaction
2.2.2. Scavenging reactive oxygen species
2.2.3. Protecting nucleophile sites of DNA
2.3. Modulators of DNA replication or repairf
2.3.1. Increasing the fidelity of DNA replication
2.3.2. Fovoring the repair of DNA damage
2.3.3. Inhibiting error-prone repair pathways
3. Inhibitors acting on initiated or neoplastic cellsg
3.1. Modulators of tumor promotion
3.1.1 Inhibiting genotoxic effects
3.1.2 Scavenging free radicals
3.1.3 Inhibiting cell proliferation
3.1.4 Inducing cell differentiation
3.1.5 Modulating signal transduction
3.2. Modulators of tumor progression
3.2.1 Inhibiting genotoxic effects
3.2.2 Acting on hormones or growth factors
3.2.3 Acting on the immune system
3.2.4 Physical, chemical or biological antineoplastic agents
3.2.5 Modulating signal transduction

Retinols
ThiolsModulators of phase-I reaction
Phenols, thiols

Sulfur compounds
Inducers of phase-II reactions
A variety of antioxidants
Ellagic acid, retinols
Cobaltous chloride, sodium arsenite
Cinnamaldehyde, coumarin, umbelliferone, vanillin, thiols
Protease inhibitors

See 1 and 2
A variety of antioxidants
Retinoids, glucocorticoids, hyperthermia
Retinoids, glucocorticoids, calcium, vitamin D3
Inhibitors of protein kinase C
See 1 and 2
Hormonal treatments, dopamine antagonists, protease inhibitors
Immunoregulators (e.g., retinoids, lipotropes), vaccines, monoclonal
antibodies
Radiation, antiblastic drugs, interferon
Inhibitors of protein kinase CaFrom De Flora（1987）, modified.
See text for more details and for references.
cStage-1 inhibitors according to Ramel et al.（1986）. Those acting in vitro outside target cells have also been referred to as desmutagens
by Kada et al.（1985）.
dStage-2 inhibitors according to Ramel et al.
（1986）.
e
Blocking agents according to Wattenberg（1981）.
f
Bioantimutagens or antimutagens in strict sense according to Kada et al.
（1985）.
g
Suppressing agents according to Wattenberg（1981）
.
b

131

Table 4 Studies on antimutagenicity of tea polyphenols（Kuroda, 1999）
Tea polyphenols

Mutagens

Test systems

References

ECG, EGCG

Trp-P-2, N-OH-Trp-P-2

Okuda et al.［1984］

EGCG

［a］
P diol oxide
B

EGCG
Tannic acid
EC, ECG, EGC, EGCG

Spontaneous mutations
UV, 4NQO, γ-rays, MNNG
UV, 4NQO, MNNG

Green and black tea extracts

MNNG

Black and green tea extracts
Polyphenols 60, 100, B

PhIP
Aryl-and heterocyclic amines,
AFB1, B［a］
P, DBE, 2-NP
PhIP

Salmonella typhimurium
TA98, TA100
S. typhimurium
TA98, TA100
B. subtilis NIG1125
E. coli B/r WP2 WP2s
E. coli B/r WP2 WP2s,
ZA159
E. coli B/r WP2
S. typhimurium TA100
S. typhimurium TA98
S. typhimurium TA98,
TA100, TA1535
S. typhimurium TA98
S. typhimurium TA104
S. typhimurium TA98,
TA100
Chinese hamster V79
cells, 6TGr mutation
Rat bone marrow cells,
chromosome aberrations
S. typhimurium TA98

Shiraki et al.
［1994］
Shiraki et al.
［1994］

Gallc acid, methyl gallate,cathechins, TF, tannic acid
Black tea TF, TF2A, TFDG
Black tea extract

H2O2
IQ, B
［a］
P, AFB1, Trp-P-1, Glu-P-1

ECG, EGCG

4NQO, EMS

Green tea extract

AFB1

Green tea extracts

P, DMBA,IQ, Glu-P-1, B［a］
2AF, 2AA, 9AA, MNNG

Okuda et al.［1984］
Kada et al.［1981］
Shimoi et al.［1985］
Shimoi et al.［1986］
Jain et al.［1989］
Apostolides et al.
［1996］
Weisburger et al.［1996］
Apostolides et al.
［1997］［1999］
KurodaIto et al.［1989］
Bu-Abbas et al.［1994］

Fig. 2 Inhibitory effect of green tea samples on the formation of 2-amino-3,8-dimethylimidazo［4,5-f］
quinoxaline（MeIQx）and 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo［4,5-b］pyridine（PhIP）in hamburger.
Cooking conditions : 200 ℃, 10min/sideいる遺伝子突然変異試験），染色体異常を指標とする試どを有することから抗変異原活性，抗発がん活性につい験（哺乳動物の培養細胞を用いる染色体異常試験，げっても細菌，培養細胞，動物個体を用いて積極的に研究が歯類を用いる小核試験），DNA 損傷を指標とする試験進められている．なお，ヒトの緑茶摂取量と各種がんの（哺乳動物の細胞を用いる不定期 DNA 合成や姉妹染色分発生率や死亡率との間に相関性が認められた場合（Blot,

体交換試験，コメットアッセイ）などが利用されている．

1996 ; Oguni, 2000 ; Nakachi et al., 2000）と相関性がみら

2．食品あるいは食品成分の抗変異原性
1）茶葉抽出物およびカテキン類の抗変異原性れなかった（Bushman, 1998 ; Tsubono et al., 2001）場合があるなど矛盾した疫学調査の結果が報告されている．
Kuroda ら（1999）は茶ポリフェノールの抗変異原性

緑茶抽出物の生理作用については多くの報告がある．

と抗発がん性について総説としてまとめており，Table

なかでも茶カテキン類が抗酸化性，ラジカル捕捉活性な4 に示すように特に緑茶や紅茶のカテキン類あるいはそ132

Table 5 Contents of catechins, caffeine, ascorbic acid and phenolic compounds of various tea extracts（mg/g）（Yen et al., 1996）
Tea samples

Green

Pouchong Oolong

Black

EC
ECG
EGC
EGCG
Total catechins

a,d

23.50
12.58 a153.62 a77.18 a266.88 a

b

b

c

16.58
8.68 b
77.37 b55.31 b157.94 b

17.30
10.63 c137.89 c
66.53 c232.35 c

4.54
3.47 d59.94 d16.53 d43.48 dCaffeine
Ascorbic acid
Phenolic compounds

54.63 a,d
3.05 a285.46 a

56.53 a2.70 b281.28 a

83.10 b2.93 a323.94 b

50.38 c＊−88.97 c＊a

Values are means of three replicate analyses.
Tea（20g）was extracted with boiled water（400 ml）for 5 min and the filtrate was freeze-dried. The yields of tea extracts for green tea, pouchong tea, oolong tea and black tea were 4.09, 4.11, 5.27 and 3.86g, respectively.
c
Catechin content in tea leaf on a wet-weight basis.
c＊
Content in tea leaf on a wet-weight basis.
bの二次成績体に多環芳香族炭化水素の benzo（ a）pyreneを添加することにより変異原活性が減少したことを報告（B（a）P），加熱食品由来の変異・がん原物質 3-amino-1,

している．著者ら（Kinae et al., 1997）もすでに緑茶の4-dimethyl-5H-pyrido［4,3-b］indole（Trp-P-1）, 3-amino-1-

粗抽出物および粗カテキンを挽肉に添加してハンバーグ

methyl-5H-pyrido［ 4,3-b］indole（ Trp-P-2）, 2-amino-3-を調理し，変異活性の変化を調べた．その結果，粗カテ

methylimidazo-［4,5-f］quinoline（IQ）, 2-amino-1-methyl-6-

キン抽出物の方が粗抽出物より変異活性を低下するこ

phenylimidazo［4,5-b］pyridine（PhIP）のほか UV，γ線，と，特に 2-amino-3,8-dimethylimidazo［4,5-f］quinoxaline

過 酸 化 水 素 ， Aflatoxin B 1 , dimethylaminobenzan-（MeIQx）と比べて PhIP の生成量が無添加の場合に比べthracene（DMBA）, N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidineて 1/4 〜 1/5 程度に減少していることを明らかにした（MNNG）などの変異原性を減弱する作用があることな（Fig. 2）．このことは還元糖とアミノ酸の間でメイラー

どが報告されている．Dhawan ら（2002）は紅茶などにド反応が進行してピラジン類を生成する過程をカテキン

含まれる単量体，二量体カテキン類がヘテロサイクリッ類が抑制している可能性を強く示唆していた．茶葉中にクアミンで損傷を受けたヒトのリンパ球の DNA 損傷をはカテキン類のほかアスコルビン酸やトコフェロール，軽減することをコメットアッセイを用いて見出していその他フラボノイドが含まれている．Constable らる．Hernaez ら（1998）は緑茶や紅茶が IQ の活性体で（1996）はインスタントティー（緑茶，紅茶）抽出物をある 2-hydroxyamino-3-methylimidazo［4,5-f］quinoline の

逆相 HPLC にかけたところカテキンとは異なる画分がヘ直接変異活性を阻害すること，この場合茶葉の浸出液のテロサイクリックアミンの MeIQx, IQ, PhIP などの生成濃度とともに浸出時間（1 〜 2 分）により阻害活性が変を抑制したことを報告している．また，Ohe ら（2001）

化することを見出している．Metz ら（2000）は緑茶抽

は umu 試験を用いて緑茶，ウーロン茶，紅茶，プアー

出物を投与した場合，結腸粘膜における cyclooxyge-

ル茶などがニトロアレン類の変異活性を阻害することを

nase-2 活性を阻害し，アゾキシメタンで誘導された前がSOS 応答により明らかにした．さらに緑茶抽出物を分画ん病変が退縮することを見出している．このことは緑茶したところ，抗変異活性はカテキン類とは異なる画分がの化学予防と抗炎症作用に新しい情報を提供するもので示していることを報告した．このように茶葉抽出物の抗ある．Jia（2001）らはラットに投与した 1,2-dimethylhy-

変異活性の発現にはカテキン類とともに他の茶成分が関drazine による aberrant crypt foci が緑茶の飲用により抑与していることが明らかになってきた．Standley ら

制されることを報告している． Higashimoto ら（2001） （2001）は Rooibos 茶（Aspalathus linearis）の抗変異原
は醤油より見出され，亜硝酸処理後に変異原性を発現す

性，抗酸化性について醗酵時間との関連で言及している．

る 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-3-carboxylic acid の変異原

処理時間の延長がポリフェノンの減少を引き起こし，両性はハーブ茶やハーブ抽出物の添加で抑制され，さらに活性を低下させることを明らかにした．Yen ら（1996）

エタノールの添加により抑制作用が増強されることから

は 4 種の茶葉抽出物中のカテキン類，カフェイン，アス

飲酒ががんのリスクを軽減する可能性があることを指摘

コルビン酸，フェノール化合物を定量し（Table 5），さしている．Weisburger（2002）は獣肉よりハンバーグ

らに IQ, Trp-P-1, 2-amino-6-methyldipyrido［1, 2-a : 3’, 2’-d］

Rを調理した場合，茶ポリフェノール（polyphenon 60 ）imidazole（Glu-P-1）, B（a）P, AFB1 に対する変異原性抑制
133

Table 6 Inhibitory effect of tea extracts on the activity of mutagensa to S. typhimurium TA98 and TA100（Yen et al., 1996）c
His+ revertants/plateb（％ of inhibition）

Tea extracts

IQ

B
［a］
P

AFB1

Trp-P-1

Glu-P-1

TA98
ControldGreen tea
Pouchong tea
Oolong tea
Black tea
Spontaneous revertantse

1739
1287（26.7）
1564（10.4）
1568（10.1）
1642（5.7）
49

380
230
（45.3）
215（49.8）
209（51.7）
255（37.8）

448
203（61.4）
170（69.7）
243（51.4）
335（28.3）

1737
1319（21.8）
1278（27.2）
1144（35.1）
1341（23.5）

911369（62.9）
406（58.6）
690（25.6）
742（19.6）

TA100
Control
Green tea
Pouchong tea
Oolong tea
Black tea
Spontaneous revertants

911
378（69.8）505（53.1）442（61.4）815（12.6）
147

797
443
（54.5）
332（71.5）
295（77.2）
346（69.4）

388
275（46.9）
186（83.8）
230（65.6）
253（56.0）

534
487（12.1）
495（10.1）
419（29.7）
505
（7.5）

596
274
（71.7）
282（69.9）
263（74.2）
455（31.4）abc

Mutagen was preincubated with tea extracts（0.35 mg/plate）
at 37 ℃ for 20 min before antimutagenicity assay.
Data presented are the means of three experiments.
Inhibition（％）= 1-

number of His+ revertants in the presence of tea extracts
number of His+ revertants in the absence of tea extracts

× 100 ％The number of spontaneous revertants was subtracted from the numerator and denominator.
The number of control was determined without tea extract.
e
The number of spontaneous revertants was determined without tea extract and mutagen.
dTable 7 Correlation between antimutagenicity toward S. typhimurium TA98 and TA100 and ascorbic acid, caffeine, phe（Yen et al., 1996）
nolic compounds and catechins contents of tea extracts
IQ

B
［a］
P

AFB1

Trp-P-1

Glu-P-1

TA98
Ascorbic acid
Caffeine
Phenolic compounds
EC
ECG
EGC
EGCG
Total catechins

0.604a- 0.152
0.466
0.827
0.789
0.768
0.752
0.765

0.873
0.728
0.939
0.671
0.702
0.494
0.749
0.696

0.879
0.124
0.825
0.829
0.753
0.413
0.789
0.686

0.360
0.943
0.523
0.082
0.199
0.206
0.239
0.253

0.653
- 0.334
0.520
0.759
0.637
0.339
0.646
0.553

TA100
Ascorbic acid
Caffeine
Phenolic compounds
EC
ECG
EGC
EGCG
Total catechins

0.985
0.451
0.951
0.982
0.989
0.850
0.997
0.976

- 0.1440.600
0.030- 0.447- 0.370- 0.389- 0.320- 0.333

0.204
0.201
0.284
- 0.066- 0.115- 0.444- 0.041- 0.163

0.507
0.991
0.634
0.334
0.477
0.594
0.489
0.551

0.996
0.549
0.995
0.917
0.925
0.732
0.950
0.908

a

134

Correlation coefficients.

Table 8 Chemical structure of flavonoids（Shimoi et al., 1994）
Chemicals
FlavoneLuteolin
FlavonolQuercetin
Quercetin（OMe）
4
Kaempferol
Morin
Rutin
Fisetin
Myricetin
Flavanol
Epicatechin
Isoflavone
Genistein
Flavanone
Eriodictyol

Substituents
3

5

7

OH
OH
OH
OH
OH
OH

2’

3’

4’

OH

OH

OH

OH
OCH3

OH
OH
OH

OH
OCH3
OH
OH
OH
OH
OH
OH

OH
OCH3
OH
OH
O-Rut
OH
OH

OH

OH
OCH3
OH
OH
OH
OH
OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

5’

OH

OH

効果を Ames 法により検定した（Table 6）．その結果，物で B 環の結合部位，C 環の二重結合の有無などにより用いる変異原の種類により抗変異活性は変化しており，

フラボン，フラボノール，フラバノール，イソフラボン，green tea ＞ pouchong tea> oolong tea ＞ black tea の順でフラバノン，カルコンなどに分類されている（Table 8）．

あった．また，抗変異活性と各化学成分含量との関連を

これらフラボノイドは植物の種子中では遊離型アグリコ

調べたものを Table 7 に示した．サルモネラ TA100 におンとして存在しているが，植物体ではグルコースやラム

いて IQ や Glu-P-1 の変異原性に対する抑制効果はカテキ

ノースが結合した配糖体としては存在している（下位ら，ンやアスコルビン酸量に比例していた．また，TA98 と1997）．フラボノイドの多くがカテキンと同様に抗酸化TA100 を用いて Trp-P-1 に対する抗変異活性は茶葉粗抽性やラジカル捕捉活性など多様な生理作用を有すること

出物により差がみられた．このことは茶葉抽出物中の化がすでに報告されている．ここでは抗変異活性について

学成分の組成が異なることに帰因するものと考えられ述べる．Edenharder ら（1997）は IQ のサルモネラ菌

た．

TA98 に対する変異原性についてフラボノイド類の抑制

2）フラボノイド

効果と構造活性相関を検討している．その結果，Table

フラボノイドは植物中に広く存在する C6-C3-C6（左よ9 に示すようにフラボン，フラボノール，フラバノン，

り A, C, B 環と呼称）骨格を有するポリフェノール化合

カルコン類の中に強い抗変異原性を示す成分が存在する
135

Table 9 Antimutagenic effects of flavonoids on the S105-mediated mutagenicity of IQa induced in S. typhimurium TA98
（Edenharder et al., 1997）
Flavonoidb
Flavones
Flavone6-Hydroxyflavone
6-Methoxyflavone
Apigenin
Luteolin
Tangeretin
Flavonols
Flavonol
Kaempferol
Fisetin
Morin
Robinetin
Myricetin
Flavanones
Flavanone
2’-Hydroxyflavanone
Naringenin
Hesperetin
Isoflavones
Genistein
Biochanin A
Chalcone and related compounds（benzylideneacetophenone）
Chalcone
Benzylideneacetone

IC50（nmol/ml top agar）％ Inhibition at 500 nmol/plateb

Antimutagenic potency

1.89
19.9
2.19
2.19
2.64
4.61

91.1
84.1
88.4
95.5
88.4
83.5

+++
+
+++
+++
+++
+++

2.85
2.40
10.8
20.0
32.3
25.2

90.6
92.0
85.5
76.3
77.2
70.2

+++
+++
++
+
+
+

3.55
10.4
23.7
6.00

98.2
88.9
80.7
80.8

+++
++
+
++

17.9

20.2
80.7

+

5.04
26.7

88.1
75.2

+++
+

IC50 is the concentration of a flavonoid in nmol/ml top agar required to inhibit the mutagenic activity of IQ by 50 ％, calculated fromcorresponding does-response curves. +, weak; ++, moderate; +++, strong antimutagenic potency; - , inactive.
a
25 ng IQ/test produced 659±47 revertants/plate.
b
Mutagenic activity was not completely eliminated, but reduced, as indicated.

ことを確認した．フラボノイドは強力な抗酸化性を有するが，その作用機構としてはフリーラジカルの捕捉作用，金属イオンとのキレート形成作用，脂質過酸化連鎖反応の停止作用などが考えられる．Shimoi ら（1994）は 12
種の既知フラボノイドを用いてフェントン試薬
2+（Fe /H2O2）によるリノール酸メチルの過酸化抑制効果とγ線照射によるマウス末梢血網赤血球中の小核誘発頻度の抑制効果を検討した．その結果，Fig. 3 にみられる
ように脂質の過酸化の度合い（OD532nm）と小核の誘2発頻度が正の相関性（r ＝ 0.717）を示すことを確認した．さらにγ線照射 2 時間前にルテオリンをマウスに経Fig. 3 Relationship between antioxidant activity（OD532nm）and（MNRETs, ％）of flavonoids.
anticlastogenic activity
The dose of flavonoids used for determination of both activities was 0.2 µmol/ml and 5µmol/kg, respectively.
A simple linear regression analysis was performed on all
data. Closed circle represents mean value of each group.
4 : quercetin-3,7,3'4'-tetramethylether.
Quercetin（OMe）

口投与したのち骨髄と脾臓における脂質過酸化度を調べると有意に抑制されることがわかった．これらの結果か
らフラボノイド類が生体内でも抗酸化性を発現していることが示唆された．Win ら（2002）はФ X-174 プラスミ
ド DNA を用いて活性酸素を介した DNA 一本鎖切断に対する genistein と resveratrol の作用を検討した．その結果，genistein が H 2O 2/Cu（Ⅱ）により生成する活性酸素が引き起す DNA 損傷を抑制するのに対して resvera-

136

trol では DNA の一本鎖切断を促進した．このようにフの Mesona procumbens の水，メタノール，酢酸エチルのラボノイド類は化学構造により DNA に対して作用が全各抽出物を用いて B（a）P や IQ に対する抗変異活性を調く相反する場合が存在することが示された．Lautraite ら

べたところ，用量作用曲線が得られ，その活性はポリフ（2002）はフラボノイド，ケルセチン，アピゲニン，クェノールとアスコルビン酸量に比例することを報告してリシンの IQ や B（a）P の遺伝毒性に対する影響をチャイいる．

ニーズハムスター V79 細胞を用いて検討した．ヒトの4）含硫化合物CYP1A2 を発現する細胞系では IQ による遺伝毒性はケ

Morse ら（1989）はアブラナ科の植物に含まれるルセチンで抑制された．CYP1A1 を発現する細胞では B

phenethyl isothiocyanate を飼料に混合してラットに投与（a）P で処理した場合アピゲニンやクリセンで抑制されすると，肺における DNA のメチル化が有意に低下する

たが，ケルセチンは影響を与えなかったと報告していこと，Wargovich ら（1988）は，ニンニクやタマネギにる．

含まれる dially sulfide が N-ニトロソメチルベンジルアミ

3）フェノール化合物

ンのラットにおける食道がん誘発実験で食道表皮細胞のRompelberg ら（1995）は eugenol の cyclophos-

核異常の誘発頻度を低下すること，Zhang ら（1992）はphamide, mitomycin C, ethylmethansulfonate, B（a）P に対

ブロッコリーに含まれる（-）-1-isothiocyanato-（4R）-する抗変異活性をマウス骨髄を用いた小核試験を適用し（methylsulfinyl）butane が薬物代謝第 2 相酵素の glu-て調べた．eugenol の経口投与により cyclophosphamide

tathione-S-transferase を誘導することなどを報告していによる小核誘発頻度が有意に減少したことから in vivo

る．これらの実験から含硫化合物は薬物代謝における P-の利用が期待できると考えた．しかし，他の変異原に対450 が関与する第 1 相反応を抑制し，第 2 相反応を促進

しては効果が認められなかった．de Mejia ら（1999）はしているものと推測している．

サルモネラ YG1024 株を用いて 1-NP および B（a）P に対

Nakamura ら（1993 ; 1996）はカリフラワー抽出物かするタチナタマメ（Phaseolus vulgaris）抽出物の抗変異

ら S-methyl methanethiosulfonate を分離し，本化合物が活性を調べた．マメ抽出物と ellagic acid は両変異原に紫外線照射した大腸菌 B/r wp2 に対する変異原性を抑制

対して用量作用曲線を有する明瞭な抗変異活性を示しすることを報告した．その後，当該物質が十字花科

た．

（Cruciferae）やユリ科（Liliaceae）などの植物ホモジネ

Loarca-Pina ら（1996 ; 1998）は穀物や豆類に寄生するート中にも存在し，前駆体が S-methyl-L-cysteinesulfox-

カビの代謝産物である Aflatoxin B1 に対するエラーグ酸

ide であることを明らかにしている．著者ら（Kinae etなどの抗変異活性を調べた．その結果，エラーグ酸は複al., 2000）は沢ワサビの根茎や葉，西洋ワサビや中国ワ

合体を形成し変異活性の低下を引き起こした．飲料中のサビの根茎抽出物が間接変異原の MeIQx や Trp-P-1，直ポリフェノールについてもいくつかの報告がある．ビー

接変異原の 3-chloro-4-dichloromethyl-5-hydroxy-2（5H）-

ル 1 L 中には総ポリフェノールが 50-500mg 存在しており

furanone（MX）に対して変異原性抑制活性を有することアントシアノーゲンやケルセチン，ケンフェロール，キを報告した（Table 10）．また市販のチューブ入りワサ

サントクモールなどが代表的なものである（佐久間，

ビにも抗変異活性を認めた．現在までにワサビの透析画

2000）．コーヒー中にはカフェ酸，フェルラ酸などの桂（R）-methylsulfinylalkyl isoth分より 3 種の抗変異原（ - ）皮酸誘導体とともにクロロゲン酸が存在しており，Trp-（CH2）n-NCS, n=5-7, MSITC）を分離しiocyanate（CH3SO-

P-1, 2-aminodipyrido［1, 2-a : 3’, 2’-d］imidazole（Glu-P-2）,

た．代謝機構については Fig. 4 に示すように A 〜 D の作

AF-2 などに抗変異活性を示している（西澤ら，2000）．

用点を想定した．Ames 試験で検討した結果，B の代謝

ワインにはカテキン類のほか，プロトシアニジン，フラ酵素（S9mix）を阻害していることが明らかになった．

ボノールとともに resveratrol が白ワインで 0.12ppm，赤さらに Nakamura ら（2001）は大腸菌 B/r wp2 に紫外線ワインで 1.04ppm 存在しているという（佐藤，2000）．

を照射した場合に誘発される変異を大根の n-ヘキサン抽

緑茶や紅茶にはカテキン類とともにその二次成績体が存

出物が抑制することを見出し，活性本体が 4-在するが，甜茶ではガーリック酸，エラグ酸，エラグタ（methylthio）-3-butenyl isothiocyanate（MTBITC）である

ンニンが，またウイスキーではバニリン酸，シリンガア

こと，さらに微量ながら phenethyl isothiocyanate の存在

ルデヒド，2-フェニルアルデヒド等が存在することが確を確認した．彼らは全 isothiocyanate（total ITC）量と認されている（幹，2000）．レモンやライム中のポリフ

抗変異原性が相関することを示している（Fig. 5）．最近，

ェノールとしては eriocitrin, neocriocitrin, hesperidin,

Fahmy ら（2002）は重クロム酸カリウムで誘発される

neohesperidin, narirutin, narinjin, diosmin 類縁体が含ま

骨髄や精子の染色体異常が解毒剤として用いられている

れている（三宅，2000）．さらにカテキン類の果汁中にthiola（2-mercaptopropionylglycine）や大豆抽出物の投は nobiletin, luteolin がそれぞれグレープフルーツやバレ与により抑制されることをマウスを用いた実験で証明しンシアオレンジに含まれている．Yen ら（2001）は薬草ており，大豆の場合，含まれる protease inhibitor が活性137

Table 10 Inhibitory effect of wasabi samples against mutagens
SampleSawa-wasabi root
Sawa-wasabi leaf
Horseradish root
Chinese wasabi root
Commercial wasabi

MX（TA100, -S9mix）（Kinae et al., 2000）
Trp-P-1（TA98, +S9mix）

MeIQx（TA98, +S9mix）

1

1/2

1/10

1

1/2

1/10

1

1/2

1/10

99
74
98
96
-

98
67
88
96
-

90
31
38
66
-

96
61
94
98
79

82
33
82
96
59

29
0
29
72
13

89
67
88
100
88

68
32
72
99
73

31
8
47
77
35

Fig. 4 Mechanism of antimutagenic activity of 6-methylsulfinylhexyl-isothiocianate（6-MSITC）

Fig. 5 Correlation between antimutagenicity and isothiocyanate contents:（○）0.1 g of daikon extract;（●）
0.3 g of daikon extracts. For quantification of total ITC, 50 µL of the diluted n-hexane extracts was reacted with 50 µL of 8 mM 1,2-benzenedithiol at 65 ℃ for 1 h, and then the absorption of the reactant was calculated at 365 nm.
MTBITC was analyzed with FID-GC. The correlation plots were applied with two site binding hyperbola.
The correlation was observed between RMA and total ITC content（r ＝─ 0.926）or MTBITC content（r ＝─ 0.882）.
Each point represents the mean of duplicate plates in one experiment.
138

Table 11 Effects of antimutagens on bleomycin, cisplatin, cyclophosphamide, and doxorubicin（Gentile et al., 1998）
Antitumor agent

Antimutagen

EffectBleomycin

β-carotene
vitamin C and E
vitamin C
vitamin C and E
galangincysteine
13-cis-retinoic acidtaurine3-aminobenzamide
prostacyclin
sodium thiosulfate
diallyl trisulfide
unsaturated fatty acids
stobadine
β-carotene
ethoxyquine
amifostine
diallyl trisulfide
vitamin C
chlorophyllin
myrceneeugenol
carboxymethylglucan
phenethyl isothiocyanate
chlorophyllin
ascorbic acidascorbic acidsaponindesferrioxaminetaurinecaptoprilchitin/chitosan

enhancement
no effect
inhibition
inhibition
inhibition
enhancement
inhibition
inhibition
no effect
inhibition
inhibition
enhancement
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition
inhibition

Cisplatin

Cyclophosphamide

Doxorubicin

In vivo

In vitro
+
+
+

+

+

+
+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

Endpoint
micronucleus
salmonella
chrom. aberration
micronucleus
chrom. aberration
chrom. aberration
chrom. aberration
salmonella
drosophila
chrom. aberration
drosophila
hepatocyte UDS
chrom. aberration
micronucleus
chrom. aberration
chrom. aberration
mouse HGPRT
hepatocyte UDS
mouse SCE
chrom. aberration
lymphocyte SCE
micronucleus
micronucleus
chrom. aberration
micronucleus
micronucleus
salmonella
micronucleus
micronucleus
salmonella
micronucleus
sce

Only articles which identified the active antimutagenic component were used as references for this table.
Those papers which showed the effect of complex mixtures against these antitumor agents were not included.

本体の可能性が高いとしている．このように含硫成分がを認めている．de Mejia ら（1998）はメキシコ人が 1 日

抗変異原として有効であることが報告されつつある．

に 40g のトウガラシを摂取していることに注目して β -5）ビタミン

カロテンやビタミン A の源として重要な 5 種類の green

Brockman ら（1992）は，各種変異原，発がん物質に

pepper の抽出物を用いて 1-nitropyrene, 1, 6-dinitropy-

対する retinol, retinoic acid, retinol acetate, retinal, retinol

rene, 1, 8-dinitropyrene に対する抗変異原性を調べた．

palmitate, β -carotene などの抗変異活性についてレビュ

いずれも抗変異原性を示し，相乗効果を認めた．Nefic

ーしている．これら retinoide が in vitro, in vivo で姉妹染（2001）は，cisplatin で誘導されたヒトの末梢リンパ球

色分体交換や染色体異常を指標とした場合に抗変異活性の染色体異常がビタミン C の投与により有意に抑制されを示していることを述べている．Rauscher ら（1998）

ることを報告した．またビタミン C は cisplatin の細胞毒

はアンズ，オレンジ，キャベツ，ニンニク，トウガラシ，

性の緩和作用を示した．Gentile ら（1998）は制がん剤

トマトから有機溶媒で抽出したものについて Aflatoxin

である cyclophosphamide, blomycin, doxorubicin, cis-

B1, B（a）P, IQ, cyclophosphamide に対する抗変異原性を

platin に対するビタミン C，クロロフィル，（+）-カテキン

Ames 法により検定した．その結果，carotenoid（α, β -などの抗変異活性を小核試験，染色体異常試験，姉妹染

carotene, lycopene）, xanthopyll（β -cryptoxanthin, lutein）,

色分体試験，Ames 試験などで検定した結果をレビュー

carotenolester を含む画分が陽性を示しており抗変異活している（Table 11）．β -カロテン，ビタミン C，ビタミ

性を確認できた．なお，小核試験においても同様の活性

ン E などが in vivo, in vitro で抗変異活性を示した．Aly
139

Table 12 The effects of various chlorophylls on AFB1-DNA adduction and tumorigenicity when co-injected into
（Dashwood et al., 1998）
rainbow trout embryosa
Chlorophyll

Dose
（µg）

None
CHL

−
10
100
1000

170± 25103± 24117± 11
47± 4

0
39
31
72

105 /144（73 ％）21 /42 （50 ％）21 /43 （49 ％）［21/25］Chlorine6

10
100
1000

138± 9142± 2497± 1419
17
43

24 /44 （55 ％）［12 /20］［12 /28］

Chlorophyll a

10
100
1000

142± 24164± 16143± 10174
16

32 /49 （65 ％）
［8/9］
［8/9］

pg AFB1/mg DNAb

Inhibition（％）

c
Tumor incidence（％）

a

For details of the methodologies for assessing AFB1-DNA adducts and liver tumor incidence
Mean ± SD.
c
Square brackets indicate groups with poor survival.
b

Table 13 Effects of Chl-chitosan on Trp-P-2-adduct formation in（Sugiyama et al., 2002）
mice lungGroup Treatment
1. 0.01 ％ Trp-P-2
2. 0.01 ％ Trp-P-2+1 ％ Chl-chitosan
3. 0.01 ％ Trp-P-2+2 ％ Chl-chitosan
4. 0.01 ％ Trp-P-2+3 ％ Chl-chitosan

DNA adduct（per 107 nucleotides）
Mean ± S.D.
（Found）
7.40 ± 2.8（7.9, 4.4, 10.0）
2.50 ± 0.29a）（2.3, 2.8. 2.3）
0.50 ± 0.09b）（0.60, 0.43, 0.46）
0.16 ± 0.1c）（0.11, 0.28, 0.10）a）Difference tendency from group 1（p=0.094）. b）Difference ten. c）Significantly different from groupdency from group 1（p=0.051）
1 at p<0.05.

Ames 実験において chlorophyllin がヘテロサイクリック
アミンや多環芳香族炭化水素，アフラトキシンなどに対して抗変異活性を示した．その場合，特に DNA との付加体形成を阻害していることが明らかになった（Table
12）．Sugiyama ら（2002）はクロロフィリンがヘテロサ
イクリックアミンやアフラトキシン B 1 など多環化合物の変異原性や発がん性を抑制することに着目してクロロ
フィリンとキトサンを結合させた Chl-chitosan を調製した．Chl-chitosan をマウスに投与すると Trp-P-2 DNA 付
加体の肝臓や肺での形成が有意に減少することを確認した．それゆえ，本物質がヒトのがん予防にも有効であるとしている（Table 13）．
7）その他の抗変異原
Camoirano ら（1994）は 90 種の化学物質について直接変異原性を示す 4-nitroquinoline 1-oxide（ 4NQO）と
S9mix を必要とするタバコ主流煙に対する抗変異活性をら（2002）は結核治療薬である rifampicin をマウスに投検定している．その結果，6-mercaptoethanol, 1, 4-dithio-

与後遺伝毒性を調べた．rifampicin は染色体異常を誘発

threitol, cysteamine, L-cysteine, N-acetyl-L-cysteine, disul-

したが，ビタミン C を投与するとその染色体異常能は低firan, glutathione, spermidine, curcumin, myricetin, biliru-

下した．ビタミン C の繰り返し投与実験で，染色体異常

bin が 4NQO に対して抗変異活性を示した．また，タバはさらに低下した．しかし，ビタミン E の場合は高濃度

コ主流煙に対しては disulfiran, phenyl isothiocyanate,でのみ効果を認めた．

phenethyl isothiocyanate, butylated hydroxytoluene, cur-6）クロロフィルを含むポルフィリン化合物

cumin, caffeic acid, vannillin, gallic acid, myricetin, rutin,

Odin（1997）らはクロロフィルやヘミン，ヘモグロ

catechin, bilirubin, chloropyllin, riboflavine, trans- β -ビンなどを含むポルフィリン化合物の抗変異原性についcarotene, ethoxyquin, oleic acid などが抗変異活性を示してレビューしている．彼らは細菌，酵母を用いた実験とた．

ともにポルフィリンとヘテロサイクリックアミンの結合

Stadler ら（1994）はコーヒーには H2O2 が含まれ直接様式が抗変異原性の発現に関与していることを報告して変異原性を示すが，抗酸化性と抗変異原性も有することいる．Dashwood ら（1998）は chlorophyll の AFB1 に対を報告している．ポリフェノールを含むコーヒー抽出液

する抗発がん作用および抗変異原作用をニジマスを用いは t-butylhydroperoxide で誘導される変異原性を抑制し，て検討している．ニジマスやラット肝酵素を用いた

さらに 2’-deoxyguanosine から 8-oxo-2’-deoxyguanosine

140

への水酸化も抑制した．Bakalinsky ら（1996）はヨーグ
ルトの抗変異原性について検討し，アセトン抽出物中の

ま

と

め

palmitic acid が MNNG に対する抗変異原であることをすでに述べたように野菜，果物などの植物には多くの

見 い 出 し た ． Motohashi ら （ 1997） は シ ョ ウ ガ

抗変異原物質が存在することが明らかとなった．本稿で（Zingerber officinalae）に含まれる dehydrozingerone 類は割愛したが，香料，香辛料，薬草にも多くの抗変異原

縁体の抗変異原性を UV 照射した大腸菌 WP2S（uvrA）

物質の存在が確認されており，さらに金属イオンや，食を用いて検定した．benzalacetone と 4-phenyl-3-butyn-2-物繊維も変異・発がん物質の活性を抑制することが報告

one が変異原抑制作用を示したことから環の置換位置よされている（黒田，1995）．我々は，常に抗変異原物質

りも二重結合，三重結合を有するカルボニル基の存在がを食品として摂取しているが，食品とともに体内に取り重要であることを明らかにした．トウガラシ中の辛味成込まれた変異原・発がん物質のいくつかを生体成分の唾分である capsaicin がリンパ球に対して小核や姉妹染色液（Nishioka, et al., 1986）やヘミンを含む血液成分

分体交換を誘発することが報告されている（Marques,（Hayatsu, et al., 1999）がそれらの毒性を低減するいわゆ2002）．しかし一方で，capsaicin を含む辛味成分が抗変る抗変異原物質としての活性を保有しているのも確かで

異原性，抗発がん性を有することも次第に明らかにされ，ある．また，調理，加工された日常食品中には抗酸化性

トウガラシやショウガ中の辛味成分の抗変異・抗発がんやラジカル捕捉活性を有するものが化学成分として数多作用についてレビューがある（Surh et al., 1998）．Sun

く分離されている．それら抗変異原物質が実際にヒトのら（2000）は薬用植物より anthraquinone, emodin,

発がん抑制に寄与するか否かについても多くの総説があchrysophal, rhein を見出し，anthraquinone が CYP1A1 のる（Hayatsu, et al., 1993 ; Ferguson, 1999 ; 黒田，1995 ;抑制により Trp-P-2 の N-水酸化を阻害することを見出し

大澤俊彦ら，1995 ; 1999 ; Kumpulainen, et al., 1999）．している．Nakahara ら（2001）は食用タイ植物 Oroxylum

かし，食品の中には変異原と抗変異原を同時に共存して

indicum Vent のメタノール抽出物が Ames 試験で Trp-P-1

いるものが多く，実際にそれらががん発生にどのようにの変異原性を強く阻害しており，bicalein は慢性肝炎にかかわっているのかは不明な点が多い．米国では 1990

用いられる小柴胡湯の有効成分でもあり，フリーラジカ

年から 5 年間，米国国立がん研究所によるデザイナーフ

ル捕捉能をもつことから Trp-P-1 の N-水酸化を抑制した

ードプログラムが実施され，ニンニクや茶葉を含むおよものと考えている．有元（2002）はビール中の抗変異原

そ 40 種の植物性食品についてがん予防効果を認めてい物質の検索を行った．サルモネラ TA98, TA100 株を用いる．さらに 1997 年にはアメリカがん研究財団と世界がる Ames 法により，Trp-P-2（NHOH）, Glu-P-1（NHOH）,

ん研究基金はがん予防 15 ヵ条を提唱し，「Five a day」1

2-chloro-4-methylthiobutanoic acid（CMBA）, MNNG,

日 5 種類以上の野菜と果物を摂取することを奨めていbenzo（a）pyrene-7, 8-diol-9, 10-epoxide（BPDE）に対するる．我が国においてはがん研究振興財団が「がんを防ぐ

変異原性抑制能を検定した．その結果，ferulic acid, caf-

ための 12 カ条」を，文部科学省が「健康日本 21」をそfeic acid, p-hydroxyphenethyl alcohol が強い抗変異原性

れぞれ提唱し，同様に野菜，果物を積極的に摂取するこを示した．また，vanillic acid, syringic acid, gallic acid, p-とががんの一次予防になるとしている．最近，抗変異原

coumaric acid, phloroglucitol にも活性を認めた．これら作用を有する食品が医薬品の副作用の軽減作用や免疫能の化合物が Trp-P-2（NHOH）の代謝を抑制し，肝臓にお賦活作用を有することが明らかにされてきた．それゆえ，ける DNA 付加体形成を阻害したものと推定している．

抗変異原の研究がさらに発展することを期待している．

Idaomar ら（2002）はショウジョウバエを用いる wingspot test により 3 種の生薬（Helichrysum italicum, Ledum

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クローム P-450 系酵素との相互作用により変異原の活性体生成を抑制するためであるとしている．Villasenor ら（2002）はハッカのクロロホルム抽出画分がテトラサイ
クリンに対して抗変異原性を示すことから，活性成分の検索を行い，6, 7-bis（2, 2-dimethoxyethene）-2, 11dimethoxy-2Z, 4E, 8E, 10Z-dodecatetraendioic acid を単離した．それ自身には変異原性がみられないことから，その利用方法が検討されている．

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Environ. Mutagen Res., 24：145-151（2002）

DNA Polymerase κ による DNA 損傷のバイパスと突然変異の誘発
大森 治夫＊
京都大学ウイルス研究所遺伝子情報解析研究分野〒 606-8507 京都市左京区聖護院川原町 53

Bypass of DNA lesions and induction of mutations by DNA Polymerase κHaruo Ohmori
Laboratory of Gene Information Analysis, Institute For Virus Research, Kyoto University
53, Shogoin-Kawaracho, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japan

Summary
We have identified Pol κ as a mammalian homologue of the Escherichia coli DinB protein（=DNA polymerase IV）. We overproduced and purified a truncated form of Pol κ lacking the C-terminal 310 amino acids,
which exhibited a very similar enzymatic activity with the intact form（870 amino acids）. Pol κ is unable to［a］
bypass UV-induced T-T cyclobutane pyrimidine dimer or（6-4）photoproduct, but it can bypass benzo
pyrene（B［a］P）-adducted guanine efficiently and accurately. We isolated mutants defective for the Pol κ
function from a mouse embryonic stem cell line. The Pol κ-defective mutant cells are highly sensitive both to［a］P. The spectrum of B［a］P-induced mutations in the Pol κ-defective
killing and mutagenesis induced by B
mutant cells is different from that in the wild-type cells, which suggested that Pol η might be involved inerror-prone bypass of B［a］P-adducted guanines in the absence of Pol κ. Thus, our results provide strong
evidence that Pol κ plays a crucial role in protecting cells from the genotoxic effects of B［a］P, and by implication of other polyaromatic hydrocarbons.
Keywords ： DNA polymerase κ, translesion synthesis, benzo［a］pyrene, mutation, cancer

緒

言

ほぼ同時期にヒト色素性乾皮症バリアント型の原因遺伝
子も同様な酵素（Pol η）をコードすることが明らかに

DNA 損傷によって突然変異が誘発されるメカニズム

なった（Goodman, 2002 の総説を参照）．筆者らはこれの研究はここ数年のうちに急速な展開を遂げた．大腸菌

らの構造的に類似し，機能的にも関連した一連の DNA

においてそのような突然変異の誘発に関わる遺伝子としポリメラーゼを Y-family と呼ぶことを提唱したて umuDC, dinB などが知られていたが，1999 年になっ（Ohmori et al, 2001）．それまで DNA ポリメラーゼの分てそのいずれもが DNA 損傷部位を乗り越えて DNA 合成

類は大腸菌の Pol I, Pol II, Pol III を代表例とする A-, B-,

を続ける新たな DNA ポリメラーゼ（それぞれ Pol V, Pol

C-family と，哺乳類において塩基除去修復に関わる Pol β

IV と呼ばれる）であることが明らかにされた．それとを代表例とする X-family の 4 群に分けられていた（Itoand Braithwaite, 1991）．哺乳類において染色体の複製に＊E-mail ： hohmori@virus.kyoto-u.ac.jp
受付： 2002 年 10 月 13 日 受理： 2002 年 10 月 13 日
日本環境変異原学会

関わる Pol α, Pol δ, Pol ε は B-family に分類され，ミトコ
ンドリア DNA の複製に関わる Pol γ は A-family に分類さ本稿は日本環境変異原学会第 13 回公開シンポジウム「環境変異原と遺伝子不安定性」で発表された．
This paper was presented at the 13th JEMS Annual Symposium at the Nagai Memorial Hall, Tokyo, May 25th, 2002. The symposium entitled“Environmental Mutagens and Genomic Instability”, was organized by Minako Nagao and Hitoshi Nakagama and sponsored by the JapaneseEnvironmental Mutagen Society.

145

Fig. 1 Activation of B［a］
Pれる．ヒトやマウスにおいては Y-family に属する酵素ととによって癌が発生することを報告している．その後，して上記の Pol η の他に，Pol ι， Pol κ，そして REV1 蛋

コールタールの主要な発癌原因物質が芳香族炭化水素

白が存在する．さらには B-family に属する Pol ζ, X-fami-（Polyaromatic hydrocarbon, PAH）であり，なかでもly に属する Pol λ，Pol µ なども in vitro で DNA 損傷をバ

BaP が最も強い発癌作用を持つことが明らかになった

イパスする活性を示すことが報告されている（Nelson（Phillips, 1983 の総説を参照）．現在でも BaP はタバコのet al., 1996b ； Duvauchelle et al., 2002 ； Maga et al.,

煙ばかりでなく，車の排気ガス中などからも大気中に多2002 ； Zhang et al., 2002c）．損傷バイパス（以下，

量に放出されているので非喫煙者といえども絶えず BaP

translesion synthesis を略して TLS とする）型の DNA ポに暴露されている．BaP などの PAH は肺癌の主要原因

リメラーゼは通常の複製型 DNA ポリメラーゼとは異な物質であると考えられている．

り 3’-5’エクソヌクレアーゼによる校正機能を持たないの

BaP を含む PAH そのものは反応性が低く，発癌作用

で複製の忠実度は低く，エラーを発生しやすいは持たない．BaP は生体内において P450 蛋白による代（Ohashi et al., 2000b）．したがって，突然変異の発生を謝反応を受けてその大部分は細胞の外に排出されるが，低く抑えておくためには，これらの TLS 酵素が必要な場

一部が核内に入って DNA，主にグアニンの N2 の位置，合にのみその機能を発揮するように制御されていると考そして低頻度でアデニンの N6 の位置で共有結合を作る

えられる．それでは，なぜ我々の細胞はこのようなエラことにより，発癌作用を示す（Fig. 1，参照）．BaP-7,8-

ーを起こしやすい DNA ポリメラーゼを数種類も持って

diol-9,10-epoxide（略して BPDE）は最終発癌物質（ulti-

いるのであろうか．本稿では Pol κ に関する筆者らのグ

mate carcinogen）と呼ばれる．BaP などの PAH は細胞

ループの研究を中心に概説する．

内に侵入するとまず AhR（Arylhydrocarbon Receptor,

1．ベンゾピレンによる発癌と DNA 損傷

dioxin とも強く結合することから dioxin receptor とも呼ばれる）と結合する．BaP などのリガンドと結合した

ベンゾピレン（benzo［a］pyrene, 以下 BaP と略す）とAhR は HSP90 との複合体から離れて核内に移行し Arnt

発癌の関連を探る研究の歴史は非常に古い（Friedberg（AhR nuclear translocator）と複合体を形成する．AhR-

et al., 1995）．約 200 年以上も以前に煙突掃除に従事す

Arnt 複合体は特定の遺伝子の promoter 領域に存在するる人たちの間には陰嚢癌が多く発生することが指摘さ

XRE（Xenobiotic Responsive Element）と呼ばれる DNA

れ，そのためデンマークの煙突掃除人組合は風呂に毎日配列に結合して，それらの遺伝子の発現を活性化する入ることを奨励したところ，陰嚢癌の発生率は顕著に減（Sogawa & Fujii-Kuriyama, 1997 の総説を参照）．マウス

少したという．日本においては 1915 年に山際らがウサの Cyp1a1 遺伝子はそのようにして発現が活性化される

ギの耳にコールタールを数ヵ月にわたって塗り続けるこ

遺伝子として最もよく研究されてきた遺伝子である．こ146

の 遺 伝 子 は ， cytochrome P450 蛋 白 の 一 つ で あ る
Cyp1A1 をコードしており，この蛋白が BaP などの PAH

3．ヒトの損傷バイパスにおける特異性の代謝反応に重要な役割をはたす．また，AhR 遺伝子欠一方，我々は精製したヒト Pol κ 蛋白を用いた in vitro

損マウスでは BaP 処理しても癌が起こらないことが示さ反応系において，Pol κ は紫外線照射によって生じるれている（Shimizu et al., 2000）．

cyclobutane pyrimidine dimer（CPD）や（6-4 ）photo-

2．ヒト Pol κの同定とその発現制御

product，あるいは cisplatin によって隣接したグアニン
塩基が架橋された損傷はバイパスできないが，塩基部分

筆者らのグループは大腸菌 DinB のホモログをコードを欠落した abasic site や acetylaminofluorene（AAF）がするヒトおよびマウスの cDNA を同定して，それぞれのグアニンの C8 の位置に結合した損傷をバイパスするこ

遺伝子を DINB1 および Dinb1 と命名した（Ogi et al.,とを報告した（Ohashi et al., 2000a ； Suzuki et al., 2001）．

1999）．後にヒトの DINB1 遺伝子産物をバキュロウイルしかし，Pol κ による abasic site, AAF 損傷のバイパス合スの系を利用して過剰生産させて精製し，それが in

成は高頻度にエラーを伴うことから，それらの損傷をバ

vitro 反応系において DNA ポリメラーゼ活性を持つことイパスすることが Pol κ の本来の機能であるとは考えらを示した（Ohashi et al., 2000a）．その酵素は HUGO 遺れなかった．上述のように，3-MC 投与 により Pol κ の伝子命名委員会の認証を受けて Pol κ と呼ばれることに発現が誘導されるという実験結果からその酵素の本来のなったので，DINBI, Dinb1 という遺伝子名は POLK,

機能の一つとして活性化された PAH によって生じた

Polk に改称された．マウスの Dinb1-cDNA（=Polk-cDNA）

DNA 損傷をバイパスする活性を持つことが予想された．

をマウス培養細胞中で一過的に過剰発現させると突然変

日本国内で BPDE による損傷を持つような DNA を入手

異の発生率が約 10 倍程度上昇することを見出した（Ogi

することは非常に困難であるが，アメリカでは NCI の

et al., 1999）．筆者らはそれ以前に，大腸菌の dinB 遺伝

一機関が活性型の BPDE を大量に作って研究者に分与す

子を過剰発現させるだけで，DNA に損傷を与えるようるというシステムが確立している．New York 州立大学

な処理無しにでも突然変異，取り分け同一塩基が並んでの渋谷博士らのグループとの共同研究により，Pol κ が存在する配列でのフレームシフト変異の発生率が顕著に

in vitro においてグアニンの N2 の位置に付加した損傷を上昇することを報告していた（Kim et al., 1997）が，こ

比較的効率良く，しかもその向側にシトシンを挿入してうして哺乳類の DinB ホモログは大腸菌 DinB と突然変エラーフリーにバイパスすることが明らかになった異の誘発という活性の面においても類似していることが（Suzuki et al., 2002）．同様なことは他のグループからも明らかになった．逆にこのことから，突然変異の発生を報告されている（Zhang et al., 2000a, 2002b ； Rechkoblit

防ぐためには Pol κ をコードする遺伝子の発現は厳密に

et al., 2002）．

制御されているはずであると推測された．我々はヒト
POLK, マウス Polk 遺伝子の発現を制御するメカニズムに明らかにするために，ゲノム配列の解析に着手した．

4．Polk 欠損マウス ES 細胞株の作製とその表現型

当時すでに HUGO によりヒトゲノム配列の解析が進め

しかしながら，ある DNA ポリメラーゼが in vitro 反応

られており，その結果が公表されるのを待つことも選択系において特定の DNA 損傷をバイパスするからといっ肢の一つではあったが，それがいつになるかは全く予測て，それが in vivo においてもそのような機能をはたしできなかったので，ヒト POLK, マウス Polk 遺伝子の発ているとは限らない．また逆にそのような酵素が in現制御に関わる領域の DNA 塩基配列を自分達で決定しvitro 反応系において特定の DNA 損傷をバイパスしない

た．また，並行してそれらの mRNA の転写開始点の位からといって in vivo においてもその酵素が同じ損傷の置を決定したところ，両遺伝子の promoter 領域には先バイパスに全く関与しないとも限らない．in vitro での述の XRE のコンセンサス配列に類似した配列が二個存

実験はきわめて限定された条件下でなされたものであ在することが明らかになった（Ogi et al., 2001）．実際，り，そこで得られた結果が in vivo の状況を忠実に反映

マウスの配列は精製した AhR-Arnt 複合体と in vitro で結しているという保証はどこにも無いからである．例えば，合すること，および PAH の一つであり，BaP と構造的

in vivo では補助因子の作用がある場合にのみ，あるに類似した 3-methylcholanthrene（3-MC）をマウス腹腔

DNA 損傷のバイパスにその酵素が関わるという可能性

内に注射すると Polk の発現が一時的に上昇することが，を否定できない．また，in vivo ではある DNA 損傷には

当時東北大学理学部の藤井教授らとの共同研究により明別な DNA ポリメラーゼが選択的にリクルートされて，らかになった（Ogi et al., 2001）．

その酵素が損傷箇所にアクセスできないかもしれない．
したがって，in vitro，in vivo の結果が一致する場合にのみ，我々は本来の機能（その一端）を窺い知ることが可能となる．我々は in vivo における Pol κ の機能を探るべ147く，同じ京大ウイルス研の眞貝博士らの協力を得て Polk

シトシンを挿入するのに対して Pol η はアデニンを最も遺伝子のノックアウトマウスの作製に着手した．まず，選択的に挿入することが明らかにされている（Zhang etY-family DNA ポリメラーゼにおいて共通に存在するモal., 2000b ； Chiapperino et al., 2002 ； Rechkoblit et al.,

チ ー フ 配 列 III, IV を コ ー ド す る exon 5, 6 の 部 分 を

2002）．一方，Pol ι や出芽酵母の Pol ζ は BPDE-N2-dG

neomycine 耐性遺伝子と置換したマウス ES 細胞を作製

損傷の向側にどの塩基も挿入することができない

し，それを用いて Polk+/-マウスを得た．そのようなヘ（Rechkoblit et al., 2002）．我々の突然変異スペクトラム

テロマウスの交配によって Polk-/-のホモマウスがの解析結果をこのような in vitro の実験結果と組み合わMendel 遺伝の予想通りの割合（1/4）で得られた．Polk

せて考えると，Pol κ が存在しない場合には Pol η が

ノックアウトマウスは一見して野生型マウスとの差はみBPDE による主要産物である BPDE-N2-dG 損傷のバイパ

られなかった．Polk 遺伝子は多くの組織で発現されていスに関わることになり，結果としてその向側に主にアデるが，特に精巣で発現が高い（後述参照）ことから精子ニンを挿入するために G-T 塩基置換変異が頻発すると結形成に関与することも考えられたが，Polk-/-遺伝子型を論される．一方，Pol κ が存在する場合には，それが持つ雄（および雌）のマウスは生殖能力を保持していBPDE-N2-dG 損傷のバイパスにおいて主要な役割をはたた．

し，その向側にシトシンを挿入してバイパスするために

我々は Pol κ の本来の機能の一つとして BPDE による突然変異の発生率が低いと考えられる．

DNA 損傷をバイパスすることであると考えていたので，

色素性乾皮症バリアント型（XP-V）患者が日光に当

上記の Polk 遺伝子のうち片方のコピーを破壊したマウ

たると皮膚癌を起こしやすい理由として，そのような患ス ES 細胞からもう一方のコピーも破壊して Polk 完全欠者においては紫外線による DNA 損傷箇所でエラーフリ

損変異 ES 細胞株を樹立し，BaP その他に対する感受性

ーにバイパスする Pol η が欠損しており，その結果他のを調べた（Ogi et al., 2002）．対照として，さまざまな

TLS 酵素がエラーを起こしながらバイパスするために突DNA 損傷の除去修復に働く Xpa 遺伝子を破壊した ES 細然変異を誘発するためであると説明される．上述のよう胞株を用いて実験を行った．その結果，Polk-/-変異 ESに，Polk-/- ES 細胞株が弱いながらも紫外線感受性を示細胞株は Xpa-/-変異 ES 細胞株に比べると低いが，明らすことは Pol κ が細胞内では何らかの形で紫外線損傷のかな BaP 感受性を示した．Polk-/-変異 ES 細胞株は DNA

バイパスに関わっていることを示唆しており，おそらく二重鎖切断を引き起こす X 線照射に対する感受性においその関与はエラーを伴うと考えられる．一方，そのようては野生型 ES 細胞と何らの差も認められなかったが，な Pol κ 欠損変異株においては BaP による突然変異率が紫外線照射に対しては弱い感受性を示した．この弱い紫上昇し，しかもそのような変異が Pol η によるものであ

外線感受性は，Pol κ 単独による in vitro 反応系においてると考えられることは，まさに XP-V 患者における紫外

CPD や（6-4）photoproduct をバイパスできないという in

線による損傷のバイパスのケースとはまさに裏返しの関vitro の実験結果から考えると意外であった．最近にな係にあるといえよう．

って，Prakash らのグループは T-T CPD の 3’-T の向側に挿入された dG, dA を効率良く延長できることを報告している（Washington et al., 2002）．彼らの in vitro の結果

5．細胞内における BaP による DNA 損傷のバイパスのメカニズムと我々の in vivo の結果を組み合わせると，Pol κ は細胞

上述の議論は紫外線による DNA 損傷のうち除去修復

内では紫外線照射によって生じる DNA 損傷にも関わっ機構によって取り除かれるのが遅い CPD のバイパスにていると結論される．取り分け Pol η が欠損したようなは Pol η が，BaP による主要産物である BPDE-N2-dG の細胞などでは Pol κ の紫外線損傷のバイパスへの寄与は付加体のバイパスには Pol κ が主たる役割をはたすと要より大きくなると考えられる．

約される．しかし，BaP による DNA 損傷のバイパスのさらに我々は，BaP 処理によって 6-thioguanine（6-TG）
耐性になった Hprt 遺伝子の突然変異の発生率は Polk-/-

in vivo におけるメカニズムはそう簡単に割り切ってしまうことはできないようである．

変異 ES 細胞株においては親株と比較して 10 倍ほど高い

出芽酵母の REV1 は TLS 酵素の中で最初にその in vitro

ことを見出した．次に，Polk-/-変異 ES 細胞株およびそでの活性が明らかにされた酵素である（Nelson et al.,の親株を BaP 処理して得られた 6-TG 耐性突然変異体を1996a）．出芽酵母では塩基部分が欠落したような損傷で多数分離し，Hprt-cDNA を RT-PCR により増幅して DNA

ある AP サイトの向側にはシトシンが多く挿入されるこsequencing によりそれらに生じた突然変異の位置を決とが明らかにされていたが，C. Lawrence らのグループ

定した．その結果，親株ではさまざまなタイプの塩基置は精製した REV1 は in vitro で AP サイトの向側にシトシ換変異がみつかるのに対して，Polk-/- ES 細胞株では G-T

ンを挿入してそこで DNA 合成を停止する dCMP trans-

変異が圧倒的に大多数（28/35）であった．これまでのferase 活性を持つことを明らかにした．この出芽酵母由

in vitro の結果から，BPDE-N2-dG 損傷の向側に Pol κ が来の REV1, あるいはそのヒトおよびマウスのホモログ

148

BPDE は主に（90 ％以上）グアニンの N2 の位置に付加体を作るが，一部はアデニンの N6 の位置にも付加体を作る．どの TLS 酵素が BPDE-N6-dA 付加体をバイパス
するか in vitro 系を用いて調べられた結果，Pol ι がその向側にチミンを効率良く挿入してそこで反応を停止することが明らかになった．この場合にも Pol κ が存在すると伸長反応が促進された（Frank et al., 2002）．Pol κ やPol η が BPDE-N6-dA 付加体の向側に塩基を挿入する効率は非常に低い（Rechkoblit et al., 2002）．
ヒト肺癌患者から手術により摘出された癌組織由来の細胞での Pol κ の発現は同じ患者からの周辺正常組織からの細胞よりも 29 例中 21 例において上昇していることが明らかになった（O-Wang et al., 2001）．POLK 遺伝子の発現亢進と喫煙歴との間には有意な関係はみつかっておらず，肺癌発生との因果関係は不明である．一つの解釈として次のようなシナリオを想像することができる．
タバコの煙あるいは大気中の BaP その他の PAH を吸引し続けることによって肺における Pol κ の発現誘導が起こり，次に過度の PAH による DNA 損傷によって突然変異が誘発され，その結果として癌抑制遺伝子の一部に変異が起こる．特にそのような癌抑制遺伝子が POLK 遺伝
子の発現の制御に関わっていれば，それに変異が生じる
Fig. 2 A model for bypass of BPDE-adductsと発癌に至ると POLK 遺伝子の発現は亢進され続けることになる．

は通常の DNA ポリメラーゼとは違い，基質としては主6．Pol κの本来の機能は何かに dCTP しか利用しないという特徴を持っている

上に述べた結果からは Pol κ は BaP などの PAH による（Masuda et al., 2001, 2002）．損傷を受けていないグアニ損傷を突然変異の発生を抑えるようにしてバイパスする

ンあるいは dU の向側にも dCMP を挿入する．最近，Z.

のに必要であると結論される．現在 Polk 欠損マウスにWang らのグループはヒト REV1 が BPDE-N2-dG 付加体

BaP 処理をして，その癌発生率を野生型と比較する実験の向側にも dCMP を効率良く挿入することを明らかにが進行中である．当然そのような化学発癌実験は BaP 以

した（Zhang et al., 2002a）．また彼らはその場合にも外の発癌物質，特に in vitro で Pol κ がエラーフリーにバ

REV1 による DNA 合成は通常そこで止まってしまうが，イパスするような DNA 損傷をもたらす化学物質につい

その後の伸長反応は Pol κ が存在すると鋳型の端まで合ても拡大していく計画である．しかしながら，ヒトある成されることを示した（Zhang et al., 2002b）．したがっいはマウスなどはそのような外部からの化学物質によるて，BPDE-N2-dG 付加体のバイパス合成は Fig. 2 に示し

DNA 損傷をバイパスする機能のためだけに複製忠実度たようなメカニズムで行われていると考えられる．

の低い Pol κ を保存してきたとは考えにくい．おそらく，

BPDE-N2-dG 付加体の向側に Pol κ あるいは REV1 がPol κ は体内で発生する内在的な DNA 損傷のバイパスに

dCMP を挿入し，その後の伸長反応は Pol κ が行う．Pol η

機能していると考えられる．Friedberg らのグループは，

は BPDE-N2-dG 付加体の向側に dCMP よりもむしろ

活性酸素によって発生する thymine glycols を Pol κ がエdAMP（あるいは dGMP, dTMP）をより高頻度で挿入すラーフリーにバイパスすることを報告している

るが，そのようなミスペアを伸長させずにそこで反応を（Fischhaber et al, 2002）．筆者らは BaP と構造的類似性

停止してしまいやすいと考えられる．Pol κ あるいはを持つ女性ホルモンがやはり BaP 同様にグアニンの N2

Pol ζ がそのようなミスペアも伸長させてしまうと突然およびアデニンの N6 の位置に付加体を形成する

変異が発生する．Pol κ は dC/BPDE-N2-dG を他のミス（Terashima et al., 1998）ことから，そのような DNA 損

ペアよりも効率良くバイパスするので，Pol η による誤傷のバイパス合成に Pol κ が関与する可能性を検証した

挿入の影響を軽減するが，それが存在しない場合にはいと考えている．マウスの Polk 遺伝子の発現は精巣でPol ζ がミスペアも区別なく伸長させてしまうので突然取り分け発現が高いが，むしろ減数分裂を終えたような変異が発生しやすいと考えられる．

細胞でも発現されていることが明らかになった（Ogi et149

al., 2001）．なぜ Pol κ は DNA が精子核に閉じ込められる

結

ような時期に発現されるのであろうか．筆者は Pol κ が語

DNA とともに精子核に含まれて卵子にまで運ばれ，受本稿において Pol κ についての in vitro, in vivo の機能

精卵においてその機能を発揮するのではないかと想像しについて概説し，最後には想像をたくましくした筆者自ている．

身の作業仮説を述べた．大腸菌ゲノム配列のコンピュタ

マウス Polk 遺伝子の発現は精巣においては幾重に渡ー解析から始まった大腸菌 dinB 遺伝子の解析から，数って固有の制御を受けている（Ogi et al., 2001）．まず，年間の間に哺乳類におけるそのホモログの解析にまで発

転写開始点は二ヵ所存在し，上流のものは多くの組織で展させることができたのは多くの優れた共同研究者たち使われるが，下流のものは精巣特異的である．またに恵まれたお陰である．取り分け，筆者以外には院生がPolk-mRNA の精巣特異的な alternative splicing が観察さたった二人だけというきわめて小さいグループでもここれ，抗 Pol κ 抗体を使った Western blotting には他の組織までの成果が挙げられたのは荻朋男，大橋英治両君の非でも共通な大きさのバンド以外に精巣固有のバンドが検凡な能力と不断の努力に負うところがきわめて大きい．

出される．さらには精巣で最も強く発現されている二人のうちどちらかが欠けても我々のグループは熾烈な

Polk-mRNA は約 3 kb であり，それ以外に他の組織にも国際競争の中でサバイバルすることはできなかったであ

共通の 5 kb の長さのものも観察される．これは転写開ろう．

始点の違いによるのではなく，異なる位置で PolyA 化が起こるためであると考えられる．多くの組織で発現され参考文献ている 5 kb の Polk-mRNA はその 3’非翻訳領域に ARE と

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呼ばれる mRNA を不安定にすることが知られている配列が 10 回繰り返して存在する（Gerlach et al., 1999）．一方，精巣特異的な 3 kb の Polk-mRNA は 3’非翻訳領域に
ARR 配列を全く持たない．これは精巣においては PolyA
化が通常のコンセンサス配列と異なる配列がシグナルとして用いられ，ARE 配列を全く持たないように翻訳終始コドンのすぐ下流で行われているためである．その結果として，3 kb の Polk-mRNA は安定であるために，それが蓄積するので Polk 遺伝子の発現が精子では高いようにみえる．
精巣では Polk 以外の遺伝子の mRNA も他の組織においてよりも短くなっていることが知られている（Fujii etal., 2002）．また PolyA 化において AAUAAA 配列を認識に重要な働きを持つ CstF-64 蛋白が精巣では減数分裂の一時期においてはバリアント型に置き換わることが知られている（Wallace et al., 1999）．このバリアント型はAAUAAA とは異なる配列を認識すると想定されている．
通常の組織では不安定であることが望ましい mRNA が精巣でその機能を充分に発揮するための手段としてそのmRNA を安定化させるメカニズムが存在し，CstF-64 バ
リアント型がそのために機能するのであろう．精巣では精子が成熟するに伴い DNA は精子核の中に包み込まれていくので，遺伝子の転写は制限されるようになる．したがって，精子形成の後期に機能を発揮するような遺伝子の mRNA やその翻訳産物である蛋白は安定であることが望ましい．Polk-mRNA の精巣特異的な発現制御はその他の多くの組織で Pol κ がはたす機能に加えてもう一つ別な機能を持つことを示唆している．

150

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151シンポジウム

Environ. Mutagen Res., 24：153-159（2002）

微生物由来のトランスリージョン DNA
ポリメラーゼ能美 健彦＊
国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部〒 158-8501 東京都世田谷区上用賀 1-18-1

Translesion DNA polymerases from microorganisms
Takehiko Nohmi
Division of Genetics & Mutagenesis, National Institute of Health Sciences
1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158-8501, Japan

Summary
DNA is continuously exposed to endogenous and exogenous genotoxic agents. To counteract genotoxicity, cells rely on a number of defense mechanisms, such as DNA repair. However, if DNA is damaged morethan the capacity of defense mechanisms, damaged DNA will be used as a template for DNA replication.
Bypass replication across DNA lesions is referred to as translesion DNA synthesis, which has been regarded as a key mechanism of mutagenesis. However, since most DNA polymerases responsible for chromosome replication have poor ability to bypass the lesions, the mechanism of how lesions are bypassed has
remained enigmatic. Recent discovery of Y-family DNA polymerase offered clues to the molecular basis ofmutagenesis ： this family of DNA polymerases efficiently bypasses a variety of DNA lesions, and appears to
be involved in mutagenesis and DNA damage tolerance. Here, I report the roles of DNA polymerase IV（DinB）, a proto-type of Y-family DNA polymerases in Escherichia coli, in targeted and untargeted mutagenesis, and discuss the possible mechanism by which DNA polymerase IV promotes mutagenesis.
Keywords ： Y-family DNA polymerase, DNA polymerase IV, dinB緒

言

ンポジウムのタイトルは「環境変異原と遺伝子不安定性」
であるが，この環境因子によって誘発される遺伝子の不我々はさまざまな内因性，外因性の変異原，がん原物

安定性に，DNA ポリメラーゼはきわめて重要な働きを質に曝されながら毎日を過ごしている．私たちの体をつしている．本稿では DNA 上の傷を乗り越えてゆくポリ

くる細胞は，こうした状況下でその遺伝情報を正確に複メラーゼについて，微生物の DNA ポリメラーゼ，特に製し，次世代，次細胞に伝えなければならない．このた大腸菌の DinB（DNA ポリメラーゼ IV）に焦点を絞り研

め細胞には遺伝子 DNA を変異原から防御し，複製のエ究の現状を紹介する．

ラーを低減するさまざまな工夫がこらされている．しかし，変異を防ぐこうしたシステムの容量を超えて遺伝子損傷が起こると，突然変異や細胞死が誘発される．本シ

1．突然変異の誘発と DNA ポリメラーゼ
突然変異の起こる仕組みを大きく 2 つに分類すると，
DNA 上の傷のところに起こる変異と，傷とは無関係に＊

E-mail ： nohmi@nihs.go.jp
受付： 2002 年 10 月 3 日 受理： 2002 年 10 月 8 日
日本環境変異原学会

起こる変異に分けられる（Fig. 1）．紫外線や発がん物質
によって DNA に付加体や脱塩基部位ができると，多く

本稿は日本環境変異原学会第 13 回公開シンポジウム「環境変異原と遺伝子不安定性」で発表された．
This paper was presented at the 13th JEMS Annual Symposium at the Nagai Memorial Hall, Tokyo, May 25th, 2002. The symposium entitled“Environmental Mutagens and Genomic Instability”, was organized by Minako Nagao and Hitoshi Nakagama and sponsored by the JapaneseEnvironmental Mutagen Society.

153

Fig. 1 Two major pathways of mutagenesis. Targeted mutations
occur when DNA polymerases bypass DNA lesions andmake sequence changes across them. The bypass DNA
synthesis is referred to as translesion DNA synthesis.
Untargeted mutations occur without exogenous treatments to damage DNA.

Fig. 2 The map position of five DNA polymerases in the chromosome of E. coli. DNA pol IV and V encoded by dinB and
umuDC, respectively, are members of Y-family DNA polymerases. DNA pol II encoded by polB as well as DNA pol
IV and V is an SOS-inducible DNA polymerase.

の場合 DNA ポリメラーゼによる複製はブロックされる．

の修復に関与する哺乳類の DNA ポリメラーゼ β や鋳型

しかし，Y ファミリー DNA ポリメラーゼ（後出）など

DNA なしに末端に dNMP を付加する terminal deoxy-

により，損傷部位を乗り越えて DNA 複製が起こり，もtransferase （TdT）が含まれる．

し損傷部位の向かい側に誤った塩基が取り込まれると，

本稿で紹介する DNA ポリメラーゼは，複製よりも修新しい塩基配列は次の複製で固定され突然変異体が生ず

復や突然変異誘発に関与し，しかも DNA ポリメラーゼ

る．このように損傷部位で起こる変異を targeted muta-

β とはホモロジーを持たないことから，現在では Y ファ

genesis と呼び，損傷部位を乗り越えて進む DNA 合成をミリーとして分類されている（Ohmori et al, 2001）．Y

トランスリージョン DNA 合成と呼ぶ（Friedberg et al.,ファミリー DNA ポリメラーゼには少なくとも 4 つのサ

1995）．これに対し，損傷部位に限局されない配列変化

ブファミリー（DinB/UmuC/RAD30/REV1）が存在すを untargeted mutagenesis と呼ぶ．DNA ポリメラーゼのる（Johnson et al., 1999a ； Goodman and Tippin, 2000）．

複製エラーによる自然突然変異がこれに当たる．しかしDinB サブファミリーには，大腸菌の DinB のほかに，好意図的に DNA に損傷を与えなくとも遺伝子には内因性熱古細菌のホモローグである Sso DNA pol Y1（DBH あ

変異原による傷がつくため，自然突然変異が本当にるいは Dpo4），マウスやヒトの DNA ポリメラーゼκがuntargeted mutagenesis であるかについては容易に判断含まれる．DinB サブファミリーは，出芽酵母には存在できない．いずれにせよ DNA ポリメラーゼは，変異誘しないが，大腸菌からヒトまでホモローグが広く存在し発においてきわめて重要な役割を果たしている．

ている点に特徴がある．これに対し UmuC サブファミ

DNA ポリメラーゼはこれまで 5 つのファミリー（A,リーは大腸菌を含む前核生物にのみ存在し，RAD30 サ

B, C, D, X）に分類されてきた（Ito and Braithwaite,

ブファミリーや REV1 サブファミリーは出芽酵母からヒ1991 ； Braithwaite and Ito, 1993）．大腸菌 polA にコードトまで真核生物にのみ存在している．ヒトの色素性乾皮

された DNA ポリメラーゼ I に相同性を持つ DNA ポリメ症バリアント（XP-V）の原因遺伝子 XPV がコードする

ラーゼのファミリーを A ファミリーと呼び，このファミ

DNA ポリメラーゼ η は，RAD30 サブファミリーの代表

リーには Taq や T7DNA ポリメラーゼが含まれる．大腸である（Masutani et al., 1999 ； Johnson et al., 1999b）．

菌 polB にコードされた DNA ポリメラーゼ II に相同性を持つ DNA ポリメラーゼは B ファミリー DNA ポリメラーゼと呼ばれ，この中には T4 DNA ポリメラーゼや哺乳類

2．大腸菌に存在する 5 種類のDNA ポリメラーゼの DNA ポリメラーゼ δ，酵母の REV3（これは現在 DNA

大腸菌や酵母などの微生物は，遺伝学的手法を用いる

ポリメラーゼ ξ と呼ばれる）が含まれる．C ファミリー

ことができるため，古くから「遺伝子不安定性」研究のは大腸菌 polC にコードされた α サブユニットを持つ大モデル生物として使われてきた．実際，自然突然変異の腸菌の DNA ポリメラーゼ III とそのホモローグが含まれ起こる頻度は 1 塩基当たり 10 〜 10る．D ファミリーには古細菌の DNA ポリメラーゼ，例

このきわめてまれな現象を定量的に測定するためには遺えば Pyrococcus furiosus の DNA ポリメラーゼ II が含まれ伝学的な選択法が必須である（Friedberg et al., 1995）．

る（Cann et al., 1998）．X ファミリーは，DNA 損傷部位

大腸菌に存在する DNA ポリメラーゼは，これまで 3 種

154

-9

-10

といわれており，

Fig. 3 Cellular contents of DNA pol II, DNA pol IV and DNA pol
V of E. coli. The content of DNA pol IV was measured bywestern blot analysis（Kim et al., 2001）. The contents of
DNA pol II and DNA pol V are based on the reports of Qiu
and Goodman, 1997 and Woodgate and Ennis, 1991,
respectively.

類だけだと考えられてきた（Fig. 2）（ Kornberg and

Fig. 4 λ phage untargeted mutagenesis. When the host E. coli
cells are pre-irradiated with UV at 100 J/m2, the mutation
frequency of λ phage that is not exposed to UV increases. However, this increase is only sevabout 100 fold（wild）. The deficiency caneral folds in the dinB mutant（∆dinB）
be complemented by the introduction of low-copy-number（∆dinB + dinB）. The introduction ofplasmid carrying dinB
the plasmid enhances the fold increase of untargetedmutagenesis in the wild-type strain（wild + dinB）. See
Kim et al., 1997.

Baker, 1992）．DNA ポリメラーゼ I は，DNA ポリメラー
ゼとして最初に見出されたものであり，現在では DNA
修復や岡崎フラグメントのプロセシングに関与することが知られている．DNA ポリメラーゼ II は，DNA 損傷にらかの働きをしていることを示唆していると思われる．

より発現が誘導される点に特徴があるが，その生理的意

実際，DNA ポリメラーゼ IV は DNA 損傷に基づく tar-

義は余りよくわかっていない．polC あるいは dnaE にコ

geted mutagenesis 以外に，DNA 損傷処理を行わない条ードされた α サブユニットは，DNA ポリメラーゼ III ホ

件下での untargeted mutagenesis にも関与している

ロ酵素の触媒サブユニットであり，このホロ酵素が大腸（Kim et al., 2001）．

菌の染色体複製を担当している．
1999 年，我々はフランスのグループと共同で大腸菌
dinB 遺伝子（din は damage inducible の略である）の産物に新規な DNA ポリメラーゼ活性を見出し，これを 43．大腸菌 dinB 遺伝子と untargetedmutagenesis
dinB 遺伝子は大腸菌の染色体上に存在する damage

番目に見つけられた大腸菌の DNA ポリメラーゼというinducible な遺伝子群の 1 つとして 1980 年に同定された意味で DNA ポリメラーゼ IV と命名した（Wagner et al.,（Kenyon and Walker, 1980）．同定された当時は，dinB1999）．ほぼ時を同じくして，umuC 遺伝子の産物にもの塩基配列も生理的機能も明らかではなかったが，そのDNA ポリメラーゼ活性が検出され DNA ポリメラーゼ V

6 年後，dinB は λ ファージの untargeted mutagenesis にと命名された（Tang et al., 1999 ； Reuven et al., 1999）．

関与することが明らかにされた（Brotcorne-Lannoye

5 つのポリメラーゼのうち，DNA ポリメラーゼ IV, ポリand Maenhaut-Michel, 1986）．

メラーゼ V は Y ファミリーに属し，その他のポリメラー

では，λ ファージの untargeted mutagenesis とはどの

ゼはそれぞれ A, B, C ファミリーに属す．そして DNA ポ

ような現象なのであろうか．λcI857 ファージが大腸菌にリメラーゼ II, IV, V の 3 つは，DNA 損傷によりその発現

感染すると溶菌斑（プラーク）を作るが，この中にはプが誘導される，いわゆる SOS 型の DNA ポリメラーゼでラークが透明に抜けた変異体（clear mutant）が検出さある．DNA 損傷により 3 種のポリメラーゼは，その発れる．Clear mutant は，λ ファージの DNA が大腸菌の中

現量が 7 から 10 倍増大するが，発現の絶対量は DNA ポで複製する際に生ずる複製エラーを反映していると考えリメラーゼ IV が最も高く，ついで DNA ポリメラーゼ II，られる．興味深いことに，あらかじめ宿主の大腸菌に紫DNA ポリメラーゼ V の順である（Fig. 3）．SOS 誘導型

外線を照射しておくと，ファージには照射しなくともではない DNA ポリメラーゼ I, DNA ポリメラーゼ III の

clear mutant の出現頻度が増大する．これは紫外線照射

細胞内分子数は，それぞれ 400, 10-20 といわれているにより大腸菌の中に誤りがちの複製系が誘導され，ファ（Kornberg and Baker, 1992）．DNA ポリメラーゼ IV がージの複製エラーが増大した結果と考えられる．ファー

DNA 損傷なしに比較的高い発現量を示すのは，DNA 損

ジには紫外線を照射していないので，この変異は DNA傷を受けていない条件下でも DNA ポリメラーゼ IV が何

損傷には基づかない変異，すなわち untargeted mutage155

Fig. 5 Possible mechanisms of mutagenesis promoted by DNA
pol IV（DinB）. Template G in runs of G6 is looped-out
during DNA synthesis across the region, thereby promoting -1 frameshift mutagenesis（1 bp deletions）. For basesubstitution, X represents the base that is substituted. C iscorrectly inserted opposite G when X is looped out. Then,
X pairs with C and another C is inserted opposite next G.
The primer can be extended from terminal G：C pairs
because it is a correctly matched terminus（base substitu. In either case, template strands tend to be loopedtions）out（or in）in the catalytic center of DNA pol IV（Wagner.
and Nohmi, 2000b）

Fig. 6 Relationship between spontaneous Lac+ revertants perplate and cellular contents of DNA pol IV. CC108 is astrain of E. coli whose phenotype, i.e., Lac-, can be reverted to Lac+ by -1 frameshift in G6 runs in the lacZ gene on
F’ plasmid. This strains carries two copies of dinB on
chromosome and F’ plasmid. YG2242 is the same as
CC108 but is ∆chromosomal dinB. YG2247 is a derivativeof CC108 and its dinB on F’ plasmid is deleted. FC1243
lacks both dinB genes on the chromosomal and F’ plasmid. The dinB genes on the chromosome and F’ plasmid
express 250 and 750 molecules, respectively, of DNA pol.
IV per cell without SOS induction（Kim et al., 2001）

nesis にあたる．Fig. 4 に示すように，野生型株にあらかー鎖を延長した可能性が考えられる．すなわち，スリッ

じめ紫外線照射を行ってから，非照射の λ ファージを感プエラーの場合も含めて，DinB による変異は鋳型鎖が染させると約 100 倍変異頻度が増大する（Kim et al.,

ループアウトすることにより生ずる場合が多いと考えら

1997）．しかし dinB 欠損株に同じ紫外線照射を行ってかれる．いずれにせよ，これらの結果は，dinB の発現増ら非照射の λ ファージを感染させても，変異頻度は数倍

大がフレームシフト変異を主体とした untargeted muta-

しか上昇しない．一方，欠損株に dinB 遺伝子を持つ

genesis の促進につながることを示唆している．同様の

low-copy-number plasmid pYG768 を導入すると，野生型

結果は，F’プラスミド，大腸菌染色体上の遺伝子をレポ

株にこのプラスミドを導入した場合と同様，きわめて高ーターにした場合にも得られている．

い変異頻度が観察される．以上の結果は，dinB が λ ファ

発現を増大させた時ばかりでなく，dinB 遺伝子を欠ージの untargeted mutagenesis に関与していることを示損させその発現量を減少させた場合にも，dinB は大腸唆している．

菌の自然突然変異頻度に影響を与える．Fig. 6 は大腸菌

dinB により促進される変異がどのようなタイプの変CC108 株の自然突然変異頻度と，細胞当たりの DinB 発

異であるかを明らかにするため，dinB を高発現させた現量をまとめたものである．CC108 株は染色体上に宿主の大腸菌に λ ファージを感染させ cII 遺伝子をレポ

dinB 遺伝子を持っているのみならず，lacZ の乗った F’

ーターに dinB により促進される変異のスペクトルを明プラスミド上にも dinB 遺伝子を持っている．これはらかにした（Wagner and Nohmi, 2000b）．野生型株とlacZ と dinB の染色体上での位置が近いために，F’上に

mutS ミスマッチ修復欠損株を宿主に 300 以上の変異体

lacZ が移った際に dinB もいっしょに移ったためと考えを解析した結果，dinB の発現増大は，G が 6 個並んだ配られる．そこで染色体上の dinB，F’上の dinB を破壊し，列から 1 つ抜けるフレームシフト変異が最も多いこと，

その発現量を測定するとともに，lacZ 変異を指標に自然

そしてフレームシフトの約半分の頻度で，塩基置換も促

突然変異頻度を測定した（Kim et al., 2001）．この株で進されることを明らかした（Fig. 5）．塩基置換の場合，は G が 6 個並ぶ配列から一つ G が抜けるフレームシフト

その約 70 ％は 5’-GX-3’ という配列で起こっていた．フレ

変異を観察している．その結果，両方の dinB を破壊しームシフト変異は，いわゆるスリップ・モデルによってた場合には-1G のフレームシフト自然突然変異頻度が，説明できるが，塩基置換の場合は，まず鋳型鎖側の X が

約 1/3 に減少することが明らかになった．この結果から，

ループアウトし，ついで X の隣にある G の向かいに C が高発現した場合だけでなく，通常の発現レベルの dinB

正しく挿入された後，鋳型鎖が延びて C が X と対合し，も大腸菌で起こる自然突然変異の促進に関与しているもその後新たに X の隣の G の向かいに C を入れてプライマのと結論した．また，定常期にある大腸菌の F’プラスミ

156

Fig. 7 Translesion bypass reactions by DNA pol IV of E. coli. A is predominantly inserted opposite abasic（AP）site
and uracil in DNA. A followed by C is inserted opposite 8-oxoguanine（8-oxoG）in DNA.

ド上で起こるフレームシフト型自然突然変異に dinB がに in vitro にてトランスリージョン DNA 合成を行った．

関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ McKenzie et al.,Fig. 7 は精製した DNA ポリメラーゼ IV を用いて in vitro

2001）．

4．大腸菌 DNA ポリメラーゼ IV によるトランスリージョン DNA 合成

でトランスリージョン DNA 合成を行った結果を示したものである．DNA 損傷は，自然条件下でできる損傷を選び，脱塩基部位，8-oxoguanine，uracil を用いた．
Uracil，8-oxoguanine 部位では，DNA ポリメラーゼ IV

DinB の生化学的機能について研究を始めた当時，は DNA 合成を停止せず鋳型鎖の末端までプライマーを

DinB は deoxynucleotidyl transferase 活性を持つ酵母の伸長した．一方，脱塩基部位では，DNA 合成は強く阻

Rev1（Nelson et al., 1996）と弱いアミノ酸配列上のホモ

害されたものの一部は末端までプライマーを伸長した

ロジーを示すのみで，生化学的機能を示唆する有力な証（Gruz et al., 2001）．損傷部位にどのような塩基が挿入さ拠はなかった．Rev1 の活性への類推から，DinB も同様れたかを見ると，G に対しては C が挿入されたが，脱塩なプライマー伸長活性を持つのではないかと考え，基部位には A，8-oxoguanine には A あるいは C が，

DinB 蛋白質を精製し in vitro で活性測定を行った．そのuracil に対しては A が挿入された ．こうした結果から，

結果，DinB 蛋白質は鋳型 DNA の配列に基づきプライマ

DNA ポリメラーゼ IV はある種の DNA 損傷を乗り越えー DNA を末端まで伸長させる DNA ポリメラーゼ活性のて DNA 合成を行い，傷に基づく突然変異 targeted muta-

あることが判明した（Wagner et al., 1999）．このポリメ

genesis を促進する可能性が示された．4-nitroquinoline

ラーゼは 3’-5’校正機能を欠いており，β サブユニットのN-oxide や，benzo［a］pyrene で起こる-1 フレームシフト

不在下では連続的な DNA 合成を行わず，比較的短いは，dinB により促進されることが大腸菌を用いた in

DNA 鎖の合成に関与していることが示唆された．このvivo の実験で明らかにされている（Kim et al., 2001 ；校正機能の欠如や，連続的な DNA 合成を行わない低い

Napolitano et al., 2000）．

プロセッシビティー，そして複製の誤りが多いという点
は，Y ファミリー DNA ポリメラーゼに共通する性質である．

5．DNA ポリメラーゼ IV の活性を修飾する因子DNA ポリメラーゼ IV と targeted mutagenesis との関DNA ポリメラーゼ IV の特徴の一つは，大腸菌 DNA係を明らかにするため，DNA 損傷を持った DNA を鋳型

ポリメラーゼ III ホロ酵素の連続的な DNA 合成を保証す157

る β サブユニットの存在下で活性が増大するという点での変化に対応するためには，突然変異によって遺伝的なある．β サブユニットは 2 量体でドーナッツのような構

多様性を高め，いずれかの子孫が環境に適応して生き延造をとり，DNA をその中空部分に通して DNA 上をスラ

びてゆく方策を採っている可能性が考えられる

イドし，DNA ポリメラーゼが鋳型 DNA から脱落するこ（Friedberg et al., 2002）．定常期の F’プラスミドで起こと を 防 い で お り sliding clamp と も 呼 ば れ て い る

る変異も，F’プラスミドの上で変異体を作り，その変異（Hingorani and O’Donnell, 2000）．真核生物では prolifer-が環境への適応にとって有利な時には，変異遺伝子を染ating cell nuclear antigen（PCNA）が sliding clamp として色体へ取り込んで適応能力を高めるという方策なのかもβ サブユニットと同様の機能をはたしている．ただししれない．進化が突然変異を抜きにして進まないことはPCNA は 3 量体であり，β サブユニットとはアミノ酸配明らかであり，微生物の進化，環境への適応に Y ファミ

列上の相同性は示さない．pUC118 由来の環状一本鎖

リー DNA ポリメラーゼがどのように関与しているかは，DNA あるいは 90mer の直鎖状鋳型鎖にプライマーをア

きわめて興味深い課題である．

ニールさせ，各種条件下でプライマーの伸長を比較した

一方，ヒトを含めた真核生物に誤りの多い DNA ポリ

ところ，どちらの鋳型鎖を用いた場合にも，β サブユニ

メラーゼが存在することは，「遺伝情報の恒常性の維持」

ットとそのローディング（ β サブユニットを DNA 上にという点から考えると矛盾しているようにも見える．し乗せること）に関与する γ コンプレックスさらに SSB がかし Y ファミリー DNA ポリメラーゼの特徴は「複製の存在する場合に顕著な活性の増大が観察された誤りが多い＝変異を起こす」ということよりも，通常の（Wagner et al., 2000a）．

DNA ポリメラーゼでは複製を続けることのできにくい

これとよく似た結果は，好熱古細菌 Sulfolobus solfatar-

損傷部位や二次構造領域において「複製を続けることがicus 由来の Y ファミリー DNA ポリメラーゼ Sso P1 DNAできる」という点にあるように思う．真核生物ではゲノ

pol Y1（別名を DBH）を用いた場合にも得られている

ムの 99 ％以上はイントロンであり，この領域に起きた（Gruz et al., 2001）．古細菌はその名のごとく細菌である

DNA 損傷に対しては，たとえ複製エラーにつながったが，その複製に関係する蛋白質の多くは前核生物よりもとしても「複製を続け」DNA 鎖切断を起こさないこと

真核生物と相同性を持っている．古細菌の PCNA は大腸が重要なのではないだろうか．真核生物の Y ファミリー菌の β サブユニットとはホモロジーを持たず，真核生物

DNA ポリメラーゼは，大腸菌の Y ファミリー DNA ポリの PCNA と相同性を示す．また興味深いことに S. solfa-

メラーゼよりも，細胞の生存すなわち DNA damage tol-taricus には複数の PCNA 分子が存在する（De Felice eterance に深く関与しているのかもしれない．

al., 1999）． PCNA による活性の増大は，酵母の DNA ポ

環境変異原との関連についていえば，多種多様な変異

リメラーゼ η（Haracska et al., 2001a），ヒトの DNA ポリ

原による DNA 損傷を複数ある DNA ポリメラーゼのうちメラーゼ η, ι, κ（Haracska et al., 2001b ； 2001c ； 2002）のどれが複製するのか，そしてどのような配列で起こるについても報告されている．β サブユニットや PCNA は，

トランスリージョン DNA 合成が突然変異につながるの

DNA 修復酵素や他の DNA ポリメラーゼなど多様な分子かは重要な問題である．薬物代謝の分野では多様な CYPと相互作用することが知られており，大腸菌 DNA ポリ（P-450）が，さまざまな薬物，化合物の代謝に関わってメラーゼ IV や 古細菌の Sso P1 DNA ポリメラーゼ Y1 だ

おり，同じ CYP であっても，ある場合には解毒に働き，けでなく，多くの Y ファミリー DNA ポリメラーゼの活またある場合には活性化（毒性の増大）に働く．同じ性調節に重要な役割をはたしているかもしれない．酵母

DNA ポリメラーゼであっても，DNA 損傷の構造や DNAの PCNA については，DNA 損傷を受けた際にユビキチ

配列（シークエンス・コンテクスト）により，異なったンや SUMO（small ubiquitin-related modifier）により修（誤りがちの複製と誤りの無い複製）役割をはたすので飾されることが報告されており（Hoege et al., 2002），

はないだろうか．新しく見出された Y ファミリー DNA

こうした PCNA の修飾とトランスリージョン型 DNA ポ

ポリメラーゼの研究は，環境変異原の研究においてきわ

リメラーゼの関係は今後追求されて行くべき課題であろ

めて重要な基盤的知見を提供すると考えられ，多くの学う．

会員がこの研究に参加されることを希望する．本稿がそ結語

以上，大腸菌の DNA ポリメラーゼ IV を中心に，微生
物の Y ファミリー DNA ポリメラーゼ研究の一端を紹介した．本稿の中に出てきた S. solfataricus は，イタリアのベスビオス火山付近にある熱水中から単離された古細菌であり，その生育至適温度は摂氏 80 度といわれている．微生物は多様な環境下で生育しており，急激な環境
158の一助となれば幸いである．
謝辞

推敲にあたり助言をいただいた国立医薬品食品衛生研究所の山田雅巳主任研究官に感謝します．

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159シンポジウム

Environ. Mutagen Res., 24：161-167（2002）

ほ乳類細胞における DNA 二本鎖切断修復と，p53 によるゲノム安定化機構
本間 正充＊
国立医薬品食品衛生研究所変異遺伝部〒 158-8501 東京都世田谷区上用賀 1-18-1

Double strand breaks DNA repair in mammalian cells and maintenanceof genomic integrity mediated by p53
Masamitsu Honma
National Institute of Health Sciences, Division of Genetics and Mutagenesis
1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158-8501, Japan

Summary
Chromosomal double strand breaks（DSBs）occurring in mammalian cells can initiate genomic instability.
They are usually repaired through either of two pathways ： end-joining（EJ）or homologous recombination（HR）, and their misrepairs result in deletion, amplification, and translocation, which are common in humantumors. The tumor suppressor protein p53 is involved in maintaining genomic stability. We demonstratehere that the deficiency of wild-type p53 protein may allow unrepaired DSB to initiate chromosomal instability, and mutant-type p53 protein promotes illegitimate recombination leading to translocation. These results
support a model in which p53 protein contributes to the maintenance of genomic integrity through recombinational repair. We also developed a system to trace the fate of DSBs occurring in a single copy gene ofhuman genome using restriction endonuclease I-SceI. DSBs at the I-SceI site were repaired 100 times more
frequently by EJ than HR. This system should be useful for understanding of mechanisms of DSB repair aswell as serving as a model for DNA damage induced by low-dose irradiation.
Keywords ： genomic instability, p53, double-strand break（DSB）, end-joining（EJ）, homologous recombination（HR）

緒

言つものと考えられる．多くの DNA 損傷の中で DNA の二本鎖切断（double strand break ； DSB）は，もっとも危生物はあらゆる種類の DNA 損傷に対抗するため，さ険性が高いように思われる（Khanna and Jackson, 2001）．

まざまな修復経路を進化させてきた．ヒトにおけるそれ

電離放射線等によってほ乳類細胞の染色体上に誘発されら修復経路の異常は，遺伝子突然変異を起因とする遺伝

た DSB は，主として End-Joining（EJ），または相同組

病やがんなどを引き起こすことが知られており，その修換え（Homologous Recombination ； HR）によって修復復経路の恒常性の維持はゲノム安定化の中心的役割をもされる（Harber, 2000 ； van Gent et al., 2001）．HR はエラーフリー型の修復機構で，基本的に染色体の構造変化＊

E-mail ： honma@nihs.go.jp
受付： 2002 年 10 月 3 日 受理： 2002 年 10 月 3 日
日本環境変異原学会

や，遺伝情報の消失を伴わない．一方，EJ は必ず染色体の部分欠失や転座をもたらすエラー発生型の修復機構

本稿は日本環境変異原学会第 13 回公開シンポジウム「環境変異原と遺伝子不安定性」で発表された．
This paper was presented at the 13th JEMS Annual Symposium at the Nagai Memorial Hall, Tokyo, May 25th, 2002. The symposium entitled“Environmental Mutagens and Genomic Instability”, was organized by Minako Nagao and Hitoshi Nakagama and sponsored by the JapaneseEnvironmental Mutagen Society.

161である．一般的に HR はバクテリアや酵母などの下等生物での主たる修復機構であり，ほ乳類細胞においては，
DSB の大部分は EJ によって修復されると考えられている（Lin et al., 1999 ； Tremblay et al., 2000）．しかしながら，その正確な寄与率に関しては明らかではない．このような基本的な DSB 修復経路に関する研究については，
本稿の最後に述べる．
近年，DSB 修復に関する理解が高まり，修復のメカ
ニズムやそれに関与するタンパクの役割などが解明されつつある．詳しくは他の総説に譲るが（Jeggo, 1998 ；Pierce et al., 2001 ； Jackson, 2002）, ATM, H2AX, p53 な
どの分子は DNA 損傷を認識し，その後，切断部位におFig. 1 A general model of recessive mutations in the tk locus.
The human tk gene is located on chromosome 17q and isheterozygous（tk-/+）in TK6 cells. DSBs occurring withinor near the functional tk locus are usually repaired byeither of two pathways ： end-rejoining（EJ）or homologous recombination（HR）. EJ brings about hemizygous
LOH, accompanied by interstitial deletions or translocations, while HR brings about homozygous LOH, but noapparent changes in chromosome structure.

いて Rad50-NBS1-MRE11 複合体が形成される．EJ によって修復される場合は Ku70, Ku80, DNA-PK, Xrcc4，
DNA リガーゼなどが働き，HR によって修復される場合
は Rad51 を中心とするそのパラログの複合体がその役割を担っていると考えられている．このように非常に多くの分子が DSB 修復に関与し，ゲノムの安定化に寄与していると考えられているが，その破綻と発がんとの関係は明らかではない．そもそも，DNA 修復の破綻による遺伝的不安定には 2 つのタイプがあり，1 つは修復機能の欠損により細胞が致死性，もしくは DNA 損傷に対して感受性となるタイプ，もう一方は修復機能の不完全性のため突然変異を誘発する，いわゆる mutator phenotype を示すタイプである．DSB に関与する上記タンパ
クを欠損する細胞の多くは前者のタイプを示すため，発がんには直接繋がらないものと考えられる．一方，後者の例としては p53 の異常があげられ（Livingstone et al.,1992 ； Lu and Lane, 1993），また，DSB 修復以外にはミスマッチ修復系の破綻などが知られている（Reitmair etal., 1997）．これら遺伝子の異常は実際に大腸がんを始めとする多くのヒトがん組織で観察されることからも発がん性との関係は強い．本稿では遺伝的不安定を後者のタイプに定義し，主に p53 変異，もしくは欠損細胞がもた
らす mutator phenotype の特徴と発がんとの関係について，我々の研究結果をもとに述べる．

1．DSB 二本鎖切断モデルとしてのTK 遺伝子突然変異
染色体ゲノムにおける DSB 修復機構を解析するためのモデル系としては，常染色体上の劣性型遺伝子突然変Fig. 2 Mutations at the heterozygous tk locus.（a）Schematic diagram of the tk locus and location of frame-shift dimorphism in TK6 cells.（b）Representative examples of LOH
in TK-deficient mutants analyzed with an ABI 310 genetic
analyzer. The mutants lacking peaks corresponding tofunctional alleles should have LOH, becoming either hemizygous or homozygous for the nonfunctional allele ；these can be distinguished by comparing the ratio of thepeak area of the nonfunctional tk allele.
162

異を利用した系が有用である（Liber et al., 1989）．ヒトリンパ芽球細胞株 TK6 は 17 番染色体長腕上に存在する
thymidine kinase 遺伝子（tk）をヘテロにもつため（tk+/-），この tk+ アリルをターゲットとした遺伝子突然変異の検出が可能である（Fig.1）．TK 欠損の変異細胞
はトリフルオロチミジン（TFT）抵抗性細胞として回収できるが，tk+ アリルに DSB が生じ，それが EJ，もしくは相同染色体間の HR によって修復されると，活性型 tk

しやすい系であることを理解しておく必要がある．しかしながら，癌抑制遺伝子である Rb や p53 のヒトがん組
織での LOH 頻度や，その機構はここで観察されたものと一致しており，本検出系は DSB 修復のモデル系であると同時に，細胞のがん化過程における遺伝子変化のモデルであることは確かである（Li et al., 1992）．LOH は
EJ もしくは HR 以外に，遺伝子変換，非相同型組換え，染色体不分離等のメカニズムによっても起こりうる．こ
れらメカニズムは染色体や，tk 近傍の遺伝マーカー等を解析することにより分類することができる（Honma etal., 2001）．LOH 発生のメカニズムを解明することは，
Fig. 3 Mutation frequencies and spectra of the mutations spontaneously occurring and induced by EMS（150 µM）and Xray（2 Gy）at the tk locus in TK6 cells. The mutations areclassified into 3 types ； intragenic mutations, hemizygous
LOH, and homozygous LOH.

ヒト細胞における DSB 修復機構だけでなく，細胞癌化を制御する因子の解明にもつながるものと考えられる．

2．p53 による遺伝的安定化機構
がん抑制遺伝子である p53 はヒトがん組織において最も高頻度に変異が観察される遺伝子であり（Hollstein et

アリルが消失した変異体，いわゆる LOH（loss of het-al., 1991），その役割として，損傷した DNA を認識し，

erozygosity）型の突然変異体をもたらす（Yandell et al.,

細胞周期の停止，アポトーシスの誘導を行うことにより1986）．この場合，EJ によって活性アリルの欠失が生じ損傷を受け細胞を排除し，ゲノムの安定化に寄与していた場合はヘミ型 LOH，HR によって不活化アリルがホモると考えられている（Kastan et al., 1991 ； Ko et al.,になった場合はホモ型 LOH となる．これら LOH 解析は1996）．しかしながら，これら機構の破綻だけでは p53

tk 遺伝子内に存在する多型性部位を利用することで可能

変異細胞のもつ遺伝的不安定性やがん細胞としての特性である．TK6 細胞の tk 遺伝子の exon4 と 7 にはフレームを完全に説明することはできないため，DNA 修復機構

シフト型の突然変異が存在する（exon4 のフレームシフへの関与も指摘されている．

トが tk 不活化の原因）（Giver et al., 1995）（Fig. 2a）．こ我々は，p53 が関与する DNA 修復機構と，p53 の異常の領域を PCR で増幅し，DNA シークエンサーによりフによってもたらされる遺伝的不安定性の特徴を明らかにラグメント解析することにより，両アリルを区別できするため，p53 欠損細胞，もしくは変異細胞を用い，そLOH を容易に判定できる（Fig. 2b）．また，PCR を定量

こで生じる遺伝子突然変異頻度や特徴を p53 正常細胞と化することにより，ヘミ型とホモ型を区別することもで比較した．TK6 細胞は p53 正常細胞であるが，TK6 と同きる．

一起源をもつ isogenic 細胞である WTK-1 細胞は p53 遺Fig. 3 に TK6 細胞の自然および，EMS（150µM），X伝子のコドン 237 にホモに突然変異をもつ p53 変異細胞線（2Gy）誘発 tk 遺伝子突然変異のスペクトルを示す．

である．また，TK6 細胞にヒトパピローマウィルスの自然誘発に関しては，全体の突然変異の 20 ％が点突然

E6 タンパクを発現させた TK6-E6 細胞，およびベクター

変異で，残り 80 ％が LOH であり，その大部分が HR にのみを導入した TK6-20C 細胞が樹立されている．E6 タ

起因していた（Honma et al., 1997a）．一方，EMS はア

ンパクは野生型 p53 タンパクと結合しすみやかに分解す

ルキル化剤であるため，変異のほとんどは LOH を伴わるため，TK6-E6 細胞は機能的に p53 を欠損しているない点突然変異が主であり，X 線では誘発される変異の（Yu et al., 1997）．したがって，WTK-1, TK6-E6 細胞は

大部分は DSB に由来するため LOH 型の変異が多い．興TK6 と遺伝的バックグランドを共通とする p53 変異，欠味深いことに X 線による損傷でもその多くはホモ型の損細胞と見なすことができる．Table1 に各細胞の hprt,

LOH をもたらす．このことは，ほ乳類細胞においてもtk 遺伝子座における自然突然変異頻度を示す．Tk 遺伝

DSB の修復に，HR が重要な役割をはたしていることを子座における WTK-1, TK6-E6 細胞での突然変異頻度は示すものである．ただし，この結果から単純にヒト細胞

p53 正常細胞である TK6 細胞に比べて，それぞれ 30 倍，での突然変異は DSB に由来する損傷が主であり，その10 倍高く，p53 変異，欠損細胞とも遺伝的に不安定であ多くは HR によって修復されるといいきることはできなり，mutator phenotype を示すことが示唆された．

い．突然変異スペクトルと突然変異メカニズムとの関係

p53 を欠損する TK6-E6 細胞で生じる突然変異の特徴については後述するが，常染色体性劣性型突然変異検出を明らかにするため tk 変異体の LOH 解析を行ったとこ

系では HR によって LOH を引き起こす DSB は必ずしも

ろ，p53 正常細胞である TK6 では生じる変異の大部分がtk 遺伝子内に生じる必要がなく，組換え型 LOH が検出

ホモ型の LOH だったのに対して，TK6-E6 ではそのほと
163

Table 1 Spontaneous mutation frequencies of TK6 and related cell lines
Cell lines

p53 status

TK6
WTK-1
TK6-E6
TK6-20C

Wild-type
MutantDeficientWild-type

Mutation frequency（×10-6；mean±SD）
HPRT

TK

2.1 ± 2.0
17.4 ± 5.9
2.3 ± 1.8
3.8 ± 4.0

3.3 ± 1.1
101.1 ± 6.8
33.5 ± 9.8
3.8 ± 1.0

Fig. 4 Extent of loss of heterozygosity（LOH）in the TK-deficient mutants from TK6, TK6-E6 and
WTK-1 cells. Twelve microsatellite loci on chromosome 17 that are heteromorphic in these celllines were examined. The approximate position of each locus is mapped on the right of theschematic chromosome 17. The human tk locus is mapped on 17q23.2. Open and closed bars represent hemizygous LOH and homozygous LOH mutants, respectively. Length of bars indicatesthe extent of LOH.

んどがヘミ型 LOH を示した．このことは TK6-E6 細胞での部分欠失，転座，増幅等の構造異常が同一クローン中は HR が起こらないため DSB の大部分は EJ によって修にモザイクとして観察された．このような染色体異常

復されることを示している．この LOH の範囲をマイク

は，G2 期において切断された染色分体間の自己融合

ロサテライトマーカーを用いて 17 番染色体上にマッピ（chromatid fusion）が原因と考えられる．chromatid

ングした（Fig. 4）．p53 正常細胞（TK6）由来の欠失型

fusion は，一時的には安定であるが，細胞分裂を迎える

LOH のほとんどは tk 遺伝子に限局する interstitial dele-と引きちぎられ，再び 2 本鎖切断が生じる．そしてこれtion か，tk より末端までの terminal deletion であり，染が DNA 複製を経て，再び chromatid fusion が繰り返さ色体の変化が最小限となっているのに対して，p53 欠損

れる，いわゆる Breakge-Fusion-Bridge（BFB）cycle を細胞（TK6-E6）のほとんどの変異体には，染色体広範引き起こす（Coquelle et al., 1997 ； Pipiras et al., 1998）．

にわたる terminal deletion が起きていた．また，このよ

このように，p53 欠損細胞が遺伝的に不安定である，そうな広範な LOH は p53 正常細胞ではすべて組換え型の要因は，すみやかに修復されない DSB であり，これ

LOH として観察されることから，本来 HR によって修復

が BFB サイクルの引き金となって，種々の染色体異常されるべき DSB が，p53 欠損細胞では EJ によって修復を引き起こすものと考えられる（Honma et al., 2000）．

され，その結果，大きな染色体異常をもたらしているも一方，p53 変異細胞である WTK-1 に由来する tk 変異のと考えられた．実際，TK6-E6 由来の LOH 変異体をク体を解析すると，ヘミ型だけでなく，ホモ型の LOH のロモゾームペイント法により解析すると，17 番染色体頻度も増加していた．このことから WTK-1 細胞では

164

Table 2 Yield of spontaneous mutation frequencies at tk locus in TK6 cells
Type of mutation

Target size（kb）

Mutat. Freq.
（×10-6）

Mutat. Freq./kb（×10-8）11

1.17

10.65（1805）

35,000
11

2.01
0.06

0.0059（1）0.51（86）

Intragenic mutation（including
small interstitial deletion）
Recombinational LOH
Gene Conversion

TK6-E6 細胞と異なり，組換え修復能は保持されているという問題に関してもこれまでの多くの研究結果と相反ものと考えられた（Honma et al., 1997a）．LOH 変異体するものである．この問題を理解するためには突然変異の染色体を解析すると（Fig. 4），組換え型と思われた変スペクトルと，突然変異のメカニズムの関係を正しく認

異体の染色体には転座を伴うものが多く，その転座は変識する必要がある．突然変異スペクトルは必ずしもゲノ

異体にクローナルに観察されたことから WTK-1 細胞でム中で起こるすべての突然変異のイベントを正確に反映

は組換え修復は起こるが，その fidelity が低いために非するものではなく，その突然変異検出系に強く依存する．

相同（illegitimate）性の組換えにより，他の染色体部位

たとえば，hprt や，トランスジェニックマウスの LacZとの転座を誘発するものと考えられた（Honma et al.,遺伝子などをターゲットとした突然変異検出系では HR

1997b）．また，WTK-1 細胞では染色体不分離によるや，大きな遺伝子の欠失を伴う EJ を検出することはで

aneuploid も高頻度に観察され，変異型 p53 は組換え修

きず，その変異はもっぱら点突然変異が対象となるため，復の異常に伴う染色体の構造的変異をもたらすだけでな

当然バイアスが生じる（Ikehata and Ono, 2001）．同様

く，細胞分裂や染色体分離機構にも影響を与え，染色体に，tk 遺伝子突然変異検出系でもそのスペクトルにはバの 数 的 異 常 も 導 く も の と 考 え ら れ た （ Cross et al.,

イアスが存在する．この系は点突然変異だけでなく，EJ

1995 ； Fukasawa et al., 1996 ； Honma et al., 2001）．

や HR による LOH 型突然変異を検出できることが最大以上のことから p53 による遺伝的安定化機構として，の特徴であるが，点突然変異は tk 遺伝子内の損傷を対ゲノム中に生じた DSB の相同組換え修復への関与を提象とするのに対して，LOH は 17 番染色体上のかなりの唱する．p53 欠損細胞ではこの相同組換えがすみやかに部分で生じる DNA 損傷から由来することが Fig.4 から理働かないため，修復を免れた DSB は BFB サイクルを介解される．また，LOH でも EJ 型と HR 型ではその範囲

して転座，欠失，増幅等のさまざまな染色体異常をもたはかなり異なる．このことは，Fig.3 で示したスペクト

らす（Livingstone et al., 1992 ； Agapova et al., 1996）．

ルにおける各イベントの突然変異のターゲットサイズがまた，p53 変異細胞では組換え修復能は保持されている違うことを示しており，これを大まかにターゲットサイ

ものの，その正確さが低いため逆に染色体転座を誘発す

ズ当たりで補正すると，点突然変異の方が圧倒的に頻度る．このように p53 の欠損，もしくは異常による遺伝的が高くなり，これまでの常識と矛盾がない（Table 2）．

不安定性は点突然変異のような小さな遺伝子変異よりもこのように突然変異スペクトルから，突然変異のメカニ

染色体レベルの大きなゲノム変化に関与している．多段

ズムを論じるにはきわめて注意が必要である．

階発癌過程におけるゲノム変化を考えると，p53 の異常

DSB の修復メカニズムを細胞レベルで理解するためは，相同，非相同性の組換えを介して，ゲノム中にに，放射線のような外来性の変異原によりゲノム中にラLOH 型の突然変異や染色体異常の蓄積を促しているもンダムに DSB を発生させて，特定の遺伝マーカーの変のと考えられる．

異スペクトルをレトロスペクティブに解析しても上記の

3．I-SceI 発現系を利用したほ乳類細胞における DSB 修復機構
Tk 遺伝子における突然変異スペクトルの結果からヒ

理由からあまり意味はない．一つの DSB のたどる運命を完全にトレースすることができてこそ，この目的は達成される．我々は，DSB の発生モデルとして制限酵素 ISceI に注目している．I-SceI は出芽酵母のミトコンドリ

ト細胞で起こる突然変異の大部分は DSB に由来し，そア DNA にコードされている酵素で，その認識部位はの多くは HR により LOH をもたらすことが示唆された．

18bp の非パリンドローム構造をもつ（Jasin, 1996）．ヒ

しかしながらこの結果は，これまでの遺伝子突然変異研

トゲノム中にはこの配列は 1 つも存在しないため，この究で常識とされてきた突然変異の大部分は外来性の変異

DNA 配列を特定のゲノム部位に挿入し，I-SceI 酵素を発原や，DNA の複製，修復のエラーによって生じる点が現させることにより，その部位に確実に DSB を発生さ突然変異が主であるということと矛盾するものである．

せることができる（Taghian and Nickoloff, 1997）．我々

また，冒頭でも述べたが，DSB の修復においても，ほはこの I-SceI 部位を，TK6 細胞の tk 遺伝子内にジーンタ

乳類細胞において EJ と HR のどちらが優先的に働くのかーゲッティング法により挿入することに成功し，この部
165

Fig. 5 Schematic representation of the experimental system to detect EJ and HR. Open and closed
rectangles represent the wild and mutant type of the tk gene, respectively. When a DSB
occurring at the I-SceI site is repaired by EJ and causes a deletion, TK-deficient mutants are
isolated from TSCE5 cells in TFT medium. When HR repairs it, on the other hand, TK-proficient revertants are generated from TSCER2 cells under HAT selection.

位に生じた DSB の運命を定性，定量的に解析できる系

すると生体にとって不利ではないのか？

を確立した．Tk ヘテロの TSCE5 細胞では I-SceI 部位で

HR の修復経路はどのように使い分けられているのか？

また，EJ と生じた DSB が EJ によって修復されると tk 遺伝子の一部

それらは競合したり，互いに相補するのか？

が欠失し，細胞は tk（-/-）の変異体として回収される．

以外の修復機構（たとえば single strand annealing）は，

一方，コンパウンドヘテロに変異をもつ tk（-/-）のどの程度関与しているのか？

TSCER2 細胞では，生じた DSB が染色体間の HR によっ

従来の分子生物学的，生化学的手法だけでは困難なようて修復されると tk（-/+）のリバータントとなる（Fig. 5）．

に思われる．今後，これらの問題を解明のために新しい

これら細胞に I-SceI の発現ベクターをトランスフェクシ

細胞遺伝学的手法を用いた Breakthrough を目指したい．

EJ や HR

これら問題の解決には，

ョンすると，変異体，リバータントの出現頻度はそれぞれ 40 倍，100 倍増加した．このことは DSB が直接 EJ お

参考文献

よび HR を誘発することを示している．しかしながら，

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両者の絶対頻度は EJ の方が HR の約 100 倍高く，このことは DSB の 99 ％以上は EJ によって修復されることを示している．本系はヒトゲノム中で生じた DSB の運命を公正にトレースすることができるため，DSB 修復のメ
カニズムや，それの関与するさまざまな生体内因子の研究に利用されることが期待できる（Honma et al., 投稿
中）．

おわりに
ここ最近，DSB の修復に関する研究分野は大きく進
歩し，ほ乳類細胞における DSB の認識から修復に至る
一連のカスケードと，それに関与するタンパク因子の役
割についてはほぼ解明されつつある．しかしながら，
DSB 修復の基本的な生物学的役割については不明な点が多い．どのような場合 DSB は修復され，また，修復されずその細胞はアポトーシスによって排除されるのか？

修復される場合，なぜ，エラー発生型の EJ が優先的に働くのであろうか？
166

これはゲノム安定性を考慮

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167

シンポジウム

Environ. Mutagen Res., 24：169-178（2002）

ラットおよびヒト乳腺発がんにおける一塩基不安定性
大河内 江里子＊，牛島 俊和
国立がんセンター研究所発がん研究部〒 104-0045 東京都中央区築地 5-1-1

Single nucleotide instability in rat and human mammary carcinogenesis
Eriko Okochi and Toshikazu Ushijima
Carcinogenesis Division, National Cancer Center Research Institute5-1-1 Tsukiji, Chuo-ku, Tokyo 104-0045, Japan

Summary
Genomic instability plays important roles in carcinogenesis. To analyze point mutation rates（MRs）in rat
mammary carcinomas, we established two cell lines from those induced in lacI-transgenic rats by 2-amino-1methyl-6-phenylimidazo［4,5-b］pyridine. The two cell lines showed 6-8 fold increases in the spontaneous
point MRs of the endogenous hprt gene and 12-15 fold increases in the lacI transgene. Since the cell lines
lacked microsatellite instability（MSI）and were capable of G/T mismatch-binding, the increase of spontaneous point MRs was considered to be due to a mechanism（s）different from mismatch repair insufficiency,
and this type of genetic instability was termed as single nucleotide instability（SNI）. SNI in the rat mammary carcinoma cell lines was characterized by an elevation of A：T to C：G transversions, which were rarely
observed in normal mammary epithelial cells. The elevation of the A：T to C：G transversions was also present in the lacI gene of the primary carcinomas of the two cell lines, which suggested that the molecularabnormality present in the cell lines was already present in their primary carcinomas. Spontaneous point
MRs of the hprt gene were measured in six human breast cancer cell lines, and an increase was found in fiveof them. These human breast cancer cell lines were reported to lack MSI, and were proficient in G/T mismatch binding. Therefore, it was shown that SNI existed also in five of the six human breast cancer celllines. Inactivation of Mth1, the mammalian homologue of E. coli the MutT gene, and overexpression of the
DNA polymerase κ, both of which were known to cause increases of A：T to C：G transversions, were analyzed in the rat mammary carcinoma cell lines and their primary carcinomas. However, neither of them waspresent. Considering that MSI is infrequent in human and rat mammary carcinomas, a wide role of SNI in
the development of such tumors was suggested.
Keywords ： genomic instability, mutation rate, breast cancer, point mutation, hprt

緒

言伴う自然突然変異の発生頻度では，ヒトの一生の間に，1 つの細胞の中にせいぜい 2 個か 3 個の突然変異しか起がんは，複数の突然変異が多段階的に蓄積することにこらないと計算される（Loeb, 1998）．発がんのためにより発生する遺伝子の病気である．しかし，細胞分裂には 6 -10 個の突然変異の蓄積が必要であることから，ほ＊E-mail ： eokochi@ncc.go.jp
受付： 2002 年 10 月 2 日 受理： 2002 年 10 月 2 日
日本環境変異原学会

とんどのがんには突然変異の発生頻度が高くなる ‘ゲノ
ム不安定性’ が関与していると考えられている（Fig. 1）（Jackson and Loeb, 1998 ； Loeb, 1991）．これまで，ゲ

本稿は日本環境変異原学会第 13 回公開シンポジウム「環境変異原と遺伝子不安定性」で発表された．
This paper was presented at the 13th JEMS Annual Symposium at the Nagai Memorial Hall, Tokyo, May 25th, 2002. The symposium entitled“Environmental Mutagens and Genomic Instability”, was organized by Minako Nagao and Hitoshi Nakagama and sponsored by the JapaneseEnvironmental Mutagen Society.

169

（Toyota et al., 1996），MSI とは異なるタイプのゲノム不安定性を解析するのに適切と予測された．その結果，

   

MSI を伴わずに点突然変異のみを特異的に上昇させる，
新たなタイプのゲノム不安定性をラット乳がん細胞株において見い出し，「一塩基不安定性（single nucleotide  

instability ； SNI）」と名付けた．さらに，SNI は，ラッ 

トのみならずヒトの乳がん細胞株でも認められ，乳腺発  がんに幅広く関与していることが示唆された．本稿では，

   

SNI を見い出した経過を概説し（Okochi et al., 2002c），
SNI の分子機構解明に関する現在までの成果について紹介したい．







Fig. 1 Multi-step carcinogenesis and genomic instability.
Genomic instability is considered to be involved in a wide
variety of tumors so that multiple mutations can accumulate in a single cell and multi-step carcinogenesis will becompleted（Jackson and Loeb, 1998 ； Loeb, 1991）.

ラット乳がん細胞株の樹立とそれらでの点突然変異率の上昇
1．ゲノム不安定性を評価するうえでの細胞株を用いる重要性
ゲノム不安定性に関する従来の多くの研究は，腫瘍に蓄積した突然変異の数を解析しているものである．しかし，ある細胞が同じ突然変異率を示す場合でも，多くのノム不安定性は主に，マイクロサテライト不安定性

細胞分裂を経てから観察すれば，たくさんの突然変異が（microsatellite instability ； MSI）と染色体不安定性

蓄積しているし，細胞分裂をあまり経ないで観察すれば，（chromosomal instability ； CIN）に大別されてきた．

突然変異はあまり蓄積していない．つまり，突然変異がMSI は，ミスマッチ修復系遺伝子の異常により，マイク

どの程度起こりやすいのかを調べるうえでは，1 回の細ロサテライト変異および点突然変異が増加するものであ

胞分裂あたりの突然変異が起こる確率，すなわち，MRる（Lengauer et al., 1998）．ヒト大腸がん，胃がんおよを算出する必要がある（Lengauer et al., 1998 ； Luria

び膵臓がんでは，高頻度に観察されるのに対し，乳がん

and Delbrück, 1943）．腫瘍そのものにおいては，腫瘍細ではほとんど認められない（Anbazhagan et al., 1999 ；胞として遺伝子変異が完成した時点からゲノム不安定性

Speicher, 1995）．CIN は，MAD2 や BUB1 などの細胞分を解析するまでの間に，何回の細胞分裂が起こっている

裂チェック機構に関与する遺伝子の異常により，染色体のかは不明である．一方，細胞株を用いれば，一定期間異常が増加するものである（Lengauer et al., 1998 ； Orr-

培養している間に生じている細胞分裂回数は計算するこ

Weaver and Weinberg, 1998）．

とができる．

多くのがん遺伝子やがん抑制遺伝子の突然変異は，マ

また，発がん物質により誘発された腫瘍では，発がんイクロサテライト配列のような反復配列中ではなく，ラ物質そのものによって誘発された突然変異と，ゲノム不ンダムな塩基配列中での点突然変異によって生じてい安定性によって誘発された突然変異との両者が検出される．したがって，がんにおけるゲノム不安定性を研究する．一方，細胞株では，培養中には発がん物質に暴露しるうえでは，ランダムな配列中で起こる点突然変異そのていないため，ゲノム不安定性によって誘発された突然ものを指標にして解析した方が良いと考えられる．また，変異だけを検出できる．これら二つの理由から，腫瘍に大多数のゲノム不安定性の研究においては，腫瘍に蓄積おけるゲノム不安定性は，細胞株を用いて解析することした突然変異の数だけを解析している．しかし，本来はが重要と考えた．

突然変異の蓄積速度を比較する必要があり，細胞分裂の回数を考慮した突然変異，すなわち突然変異率（muta-

2．ラット乳がん細胞株の樹立

tion rate ； MR）を算出することが重要である．しかし，

6 週齢の雌（lacI-transgenic F344 Big Blue × SD）F1

点突然変異率の解析は，その煩雑さゆえに，これまでは

ラット 33 匹に，PhIP・HCl 75 mg/kg/day を，週 5 回 2

ほとんどなされてこなかった．

週間，計 10 回強制胃内投与した．コントロール群 14 匹

我々は，ヘテロサイクリックアミンの一つである 2-には，同量の蒸留水を強制胃内投与した．10 回投与後，amino-1-methyl-6-phenylimidazo［4,5-b］pyridine（PhIP）で両群ともに 23.5 ％高脂肪食を与え，56-69 週目に屠殺解誘発したラット乳がんから細胞株を樹立し，点突然変異

剖した（Okochi et al., 1999）．2 個の乳がん（両者とも率を測定した．PhIP により誘発した乳がんでは，マイadenocarcinoma）から，2 系統の細胞株，PhIP12-1 およクロサテライト変異が非常に少ないことが知られび PhIP7-4 を樹立した（Watanabe et al., 2001a）．両細胞

170

（）

（）





lacl （×  ）









hprt （×  ）

















2

＊＊

±
＊
±

7

対数増殖期の細胞 10 個を，約 10 個まで増殖させた
後，全細胞数を計測した．実際の細胞数から開始の細胞
2

数（10 個）を減じ，観察した細胞分裂回数とした．回
収した細胞からフェノール抽出法によりゲノム DNA を

抽出し，lacI 突然変異体を常法に従って検出した（deBoer et al., 1996 ； Suzuki et al., 1996）．各細胞株について，この操作を 6 回繰り返した．得られた lacI 突然変異 ± 

体はすべて塩基配列を決定し，独立な突然変異数から突







 

Fig. 2 Increase of hprt MRs（A）and lacI corrected MnFs（B）inthe two PhIP-induced mammary carcinoma cell lines. hprt
MRs and lacI MnFs in the two mammary carcinoma celllines were increased, compared with that in RMEC.
Mean ± SE. ＊ P ＝ 0.0001, ＊＊ P ＝ 0.0000001.

然変異頻度（mutation frequency ； MnF）を算出した．
この lacI 突然変異の検出法では，検体試料すべての細胞について解析しているわけではなく，試料のごく一部の
DNA について測定しているに過ぎない．したがって，
Luria-Delbrück の 8 式（Luria and Delbrück, 1943）による MRs は求めることができない．そこで本研究では，求めた突然変異体の数から MnF を算出し，さらにこの値を，観察した細胞分裂回数で標準化した MnF を求め

株とも，中性脂肪およびカゼインの産生から乳腺由来のた．この方法で算出した MnF は観察した細胞分裂回数細胞であることを確認し，ヌードマウスにおける造腫瘍を考慮したものであり，突然変異の蓄積速度を正確に反能も陽性であった．核型は，PhIP7-4 は染色体数が 42 と映している．lacI MnF は，PhIP12-1 と PhIP7-4 および正常であったのに対し，PhIP12-1 は染色体数が 69 -102

RMEC では，それぞれ 59 ± 8.6×10 ，72 ± 4.1×10 お

-6

-6

-6

よび 4.7 ± 1.6×10 （mean ± SE）であり（Fig. 2B），樹と，高倍数性の変異を高頻度に認めた．

立した 2 系統の乳がん細胞株は RMEC に比べて 12-15 倍3．ラット乳がん細胞株における hprt MRs の増加

高い値を示し，これは統計的にも有意であった

樹立した 2 系統のラット乳がん細胞株における内在性（PhIP12-1 ； P ＝ 0.0001, PhIP7-4 ； P ＝ 0.0000001）

遺伝子 hprt の MRs を，以下の方法で測定した（Watanabe et al., 2001a）．

（Watanabe et al., 2001a）．対照にはラット正常乳腺上皮
5．ラット乳がん細胞株で誘発される lacI 突然変異の初代培養細胞（RMEC）を用いた．
26対数増殖期の細胞 10 個を，約 10 個まで増殖させた
後，全細胞数を計測した．実際の細胞数から開始の細胞
2

数（10 個）を減じ，観察した細胞分裂回数とした．約64

種類検出された lacI 遺伝子の突然変異を分類して Table
1 にまとめた（Watanabe et al., 2001a）．2 系統の乳がん10 個の全細胞を 96-well プレート 1 枚に（約 10 個/well）

細胞株では，RMEC に比べてすべてのタイプの突然変異接種し，24 時間後に 1.5 µg/mL の 6-thioguanine（6-TG）が増加していた．なかでも A：T から C：G への transver-を添加した．約 6-8 週間後に，6-TG 耐性コロニーを計測

sions は，RMEC では検出されなかったのに対しし，hprt 突然変異体数とした．各細胞株について，この（0 ％； 0/6），PhIP12-1 と PhIP7-4 では高頻度に観察され操作を 24 回繰り返した．MRs は Luria-Delbrück の 8 式

た（PhIP12-1 25 ％； 6/24，PhIP7-4 24 ％； 6/25）．A：（Luria and Delbrück, 1943）を用いて算出した．hprt

T から C：G への transversions は，自然突然変異として

MRs は，PhIP12-1 と PhIP7-4 および RMEC では，それは非常に低率にしか認められない．ラットの正常乳腺組

-7

-7

-7

ぞれ 8.2×10 ，11×10 および 1.4×10 変異／ hprt 遺伝

織（0 ％； 0/34）においても全く検出されていない

子／細胞分裂であり（Fig. 2A），2 系統のラット乳がん（Okochi et al., 1999）．A：T から C：G への transversions

細胞株では，RMEC に比べ，hprt MRs が 6-8 倍増加しては，hprt 遺伝子でも，PhIP12-1 と PhIP7-4 とで，それぞいた（Watanabe et al., 2001a）．

れ 15 ％（10/67）と 21 ％（19/92）と高頻度に観察され（Watanabe et al., 2001a），これらの細胞株での SNI に特4．ラット乳がん細胞株における lacI MnFs の増加

徴的と思われた．



本実験では lacI-transgenic Big Blue ラットを用いているため，樹立した細胞株には，マーカー遺伝子である
lacI が外来遺伝子として組み込まれている．これを利用

Single Nucleotide Instability（SNI）
1．マイクロサテライト変異と G/T ミスマッチ結合能

して，内在性遺伝子である hprt だけでなく外来性遺伝子

ミスマッチ修復系の異常があると，マイクロサテライ

である lacI を指標にして，点突然変異の蓄積速度を以下

ト変異だけでなく，点突然変異も増加が認められることの方法で測定した（Watanabe et al., 2001a）．

が知られている（Glaab and Tindall, 1997 ； Lengauer et
171

Table 1 Classification of lacl mutations in two rat mammary carcinoma cell lines and their primary carcinomas
Cell line

Primary carcinoma

PhIP12-1

PhIP7-4

12-1♯17-4♯1Normalmammary
tissue6（100）

24（100）25（100）38（100）33（100）34（100）1 （17）
2 （33）
2 （33）0 （0）0 （0）1 （17）

4 （17）
5 （21）
7 （29）
6 （25）
0 （0）
1 （4）

2 （8）
4 （16）
8 （32）
6 （24）0 （0）1 （4）

6 （16）
5 （13）
9 （24）
6 （16）
1 （3）
4 （11）3 （9）
6 （18）
6 （18）
8 （24）2 （6）1 （3）

7 （21）0 （0）
17 （50）
0 （0）
3 （9）
3 （9）

0 （0）
0 （0）
0 （0）

0 （0）
0 （0）
1 （4）

0 （0）
1 （4）
3 （12）2 （5）0 （0）5 （13）

3 （9）
1 （3）
3 （9）

0 （0）
1 （3）
3 （9）

RMEC
Total
Base substitution
G：C to T：A
C：G
A：T
A：T to C：G
T：A
G：C
Single base pair deletion
G：C
T：A
Other mutations

No. of mutations observed（％）.
This table was modified from Watanabe et al., 2001a.

al., 1998 ； Loeb, 2001）．我々が樹立したラット乳がん細らは，9 種類のヒトの大腸がん細胞株を用いて hprt MRs

胞株では点突然変異率の明らかな上昇が認められたが，の値を詳細に解析している（Eshleman et al., 1998 ；これがミスマッチ修復系の異常により引き起こされていEshleman et al., 1995 ； Eshleman et al., 1996）．これらのる可能性が考えられた．そこで，ラット乳がん細胞株に多くは，MSI を伴い点突然変異率が高い細胞株と，MSI

おける MSI の有無を解析した（Watanabe et al., 2001a）．

を伴わず点突然変異率が低い細胞株に分類されたが，唯2 系統のラット乳がん細胞株，PhIP12-1 および PhIP7-4

一，V410 のみは MSI がないにもかかわらず，hprt MRsのゲノム DNA（各 6 クローンの DNA），そして原発巣の 10 倍の上昇を認めた（Eshleman et al., 1995）．この細12-1♯1 および 7-4♯1 から得たゲノム DNA を用いて，21

胞も A：T から C：G への transversions が高頻度に検出さ座位のマイクロサテライト変異を解析した．しかし，いれており（Eshleman et al., 1998），我々が調べたラット

ずれの検体においても，21 座位すべてで変異は 1 個も検

乳がん細胞株と同一の現象を示している点が興味深い．

出されなかった．
さらに，ラット乳がん細胞株の核蛋白質について，ゲ

3．原発巣での SNI の存在

ルシフト解析により G/T ミスマッチ結合能の有無を調

ゲノム不安定性を評価するうえで，細胞株を用いるこべた．ミスマッチ修復系において，MSH2 と GTBP によとの重要性は前述した通りである．しかし，細胞株で観る G/T ミスマッチの認識と結合は重要である．しかし，察している現象はあくまでも in vitro のものであり，原いずれの乳がん細胞株でも，G/T ミスマッチ部分への特発巣そのもので起きている現象を観察していない可能性

異的結合によるバンドを検出できた．このことから，こがある．つまり，今回認められたゲノム不安定性は，株

れら乳がん細胞株は G/T ミスマッチ結合能には異常が化したことにより獲得しただけに過ぎないのではないか

ないと考えられた．

と危惧される．そういう点から，原発巣で SNI の存在を以上の結果から，本研究で樹立した 2 系統のラット乳がん細胞株は，MSI は認められないと結論した．

証明することは，きわめて重要なことである．
原発巣では細胞分裂回数は測定できないため，点突然変異の蓄積速度を求めることはできない．しかし，本研

2．SNI の存在

究では lacI トランスジェニックラットに誘発した腫瘍を2 系統のラット乳がん細胞株では，MSI が認められな用いているため，マーカー遺伝子である lacI 遺伝子の突いのにもかかわらず，自然点突然変異率の明らかな上昇

然変異を解析することが可能である．乳がん細胞株の樹を認めた．すなわち，従来，広く研究されてきたゲノム

立に用いた原発巣，12-1♯1 および 7-4♯1 では，A：T か

不安定性の一つである MSI とは異なる機構によるゲノら C：G への transversions を，それぞれ 16 ％（6/38）おム不安定性の存在が明らかとなった．そこで，我々はこよび 24 ％（8/33）と，いずれも高頻度に認められたの新たなタイプのゲノム不安定性を「一塩基不安定性（Table 1）．通常は認められない A：T から C：G への（single nucleotide instability ； SNI）」と名付けた．

transversions が原発巣でも高頻度に観察されたことか

SNI と同じ現象は，ヒトの大腸がん細胞株において認ら，原発巣と細胞株とで共通の突然変異増加機構が働いめられていることがすでに報告されている．Eshlemanていることが示唆された．すなわち，SNI が株化したこ

172

とにより獲得された異常ではなく，原発巣の段階からす

次的変化も多いため，きわめて多種多様である．したがでに存在していたと考えられた．

って，新たな現象を動物モデルで見い出し，その現象を一方，PhIP により誘発される特徴的な突然変異としヒト腫瘍で確認するというアプローチは，合理的かつ効て，G：C 欠失が知られている（Kakiuchi et al., 1995 ；率的と考えられる．ヘテロサイクリックアミンへの暴露

Okochi et al., 1999 ； Okonogi et al., 1997）．G：C 欠失ははヒト乳がんの誘発に関与していることが示唆されてお乳がん細胞株では全く検出されていなかったが，原発巣り（Sinha et al., 2000 ； Sugimura et al., 2000 ； Zheng et

では 5-9 ％検出されていた．このことは，原発巣で認め

al., 1998），PhIP で誘発したラット乳がん細胞株で認められる突然変異は PhIP の影響を強く受けているのに対られた SNI が，ヒト乳がん細胞株においても認められる

し，細胞株での突然変異は PhIP の影響を受けていない

か否かを検討した．
MSI が認められないことが報告されている 6 系統のヒことを示唆した．

ト乳がん細胞株（Anbazhagan et al., 1999）について，

ヒト乳がん細胞株における SNI

ラット乳がん細胞株のときと同様の方法で hprt MRs を測定した（Watanabe et al., 2001b）．対照にはヒト正常

実験動物モデルを利用すると，発がん物質の投与経路，
遺伝的背景，生活環境要因等の均一化が可能で，その結乳腺上皮細胞（HMEC）を用いた．解析した 6 系統のヒ

果，誘発された腫瘍は比較的均一であるという利点があト乳がん細胞株のうち，5 系統で HMEC と比べて MRsの上昇が認められた（Fig. 3）．hprt MRs の上昇が，がんる．一方，ヒト腫瘍は，遺伝的背景が複雑で腫瘍での二細胞では非特異的に認められる可能性を否定するために，MSI を欠くヒト大腸がん細胞株 SW480 でも MR を

ゲルシフト解析により，用いた乳がん細胞株では G/T＊

ミスマッチ結合能は正常であった（Watanabe et al.,

DFHJ  （×）

測定し，上昇を認めないがん細胞もあることを確認した．

2001b）．以上の結果から，少なくとも 5 系統のヒト乳が
ん細胞株では，MSI を伴わずに MRs が上昇しており，＊＊＊

SNI が存在することが示された．

＊

hprt MRs に関して，Eshleman らのヒトの大腸がん細胞株における解析結果（Eshleman et al., 1995）と，

 





 


     

  !! !"" "#

我々の解析結果（Watanabe et al., 2001a ； 2001b）を統合すると，興味深いことがわかる（Fig. 4）．MSI が存在 !$"$!! !"" "#

する場合には，MR の著しい上昇が認められる．一方，Fig. 3 hprt MRs in HMEC, six human breast cancer cell lines
and a human colon cancer cell line. Five of the six breast
cancer cell lines showed 2.9-12 fold increases in the hprt
MRs, compared with HMEC and the colon cancer cell line
negative for MSI, SW480. ＊ P ＜ 0.01. Modified from
Watanabe et al.（Watanabe et al., 2001b）.

上昇しないが，乳がん細胞株では MR が増加している．
この，MSI が存在するとき程ではないが明らかな MR の上昇が，SNI という現象である．大腸がん細胞株でも，

（）

（）

         （）（）     

DFHJ

（×

）









MSI が存在しない場合には，大腸がん細胞株では MR は

＊
＊

＊
＊

＊

＊

＊

＊

＊

    ! "   # $  & ' '('( )& + +*+  , - ,% ,  & ./ , % , * 
 %
*) )     Fig. 4 hprt MRs in rat and human cancer cell lines. ＊ SNI-positive cell lines. aData from Eshleman
et al.（Eshleman et al., 1995）.
173

V410 のみは SNI を示すと考えられる．大腸がんでは

logue であり，ヌクレオチドプール中の酸化的損傷を受MSI が広く関与しているため，V410 が示した現象は例

けた 8-OH-dGTP を加水分解する酵素をコードしている外的とされた．しかし，乳がんでは MSI がほとんど認（Maki and Sekiguchi, 1992 ； Sekiguchi, 1996）．大腸菌

められないことを考えると（Anbazhagan et al., 1999 ；では MutT ミューテーター株が存在し，A：T から C：G

Speicher, 1995），SNI が重要な役割をはたしているのかへの transversions が 100 倍から 10,000 倍に上昇するもしれない．腫瘍が発生する臓器間で，関与しているゲ（Fowler and Schaaper, 1997）．Mth1 ノックアウトマウス

ノム不安定性のタイプが異なる可能性が示唆された．

は，ES 細胞のレベルで突然変異率が野生型に比べ，2 倍

乳腺発がんにおける SNI の役割上昇している（Tsuzuki et al., 2001）．そこで，SNI を示した細胞株で Mth1 の不活化の有無を解析した（Okochi

MSI のようなゲノム不安定性は，発がんの初期過程でet al., 2002a）．PhIP で誘発したラット乳がんおよび樹立

起こっていると考えられている（Loeb, 2001）．一方，した乳がん細胞株について，ラット Mth1 遺伝子の PCR-SNI については，少なくとも動物モデルの原発巣では存SSCP 解析を行った（Fig. 5A）．エクソン 1 と 3 ではバン在している可能性が高い．一般に，動物の腫瘍はヒトのドの移動度変化は認められず，突然変異は検出されなか比較的初期の腫瘍に相当すると考えられ，SNI も発がんった．エクソン 2 では数個の腫瘍で移動度の変化を認めの比較的早期に誘発されていることが示唆される．我々るバンドを検出したが，塩基配列を調べた結果，アミノは現在のところ，ラット乳腺発がんにおける SNI の役割

酸変化を伴わない変異であった．これは，本実験で用いを，以下のように考えている．PhIP への暴露は，細胞たラットが（lacI-transgenic F344 Big Blue x SD）F1 ラ

ごとにさまざまな遺伝子の不活性化を誘発するが，なかットであるため，アウトブレッドである SD ラットのコには，SNI を誘発するような遺伝子が不活化された細胞

ロニー由来の多型であると考えられた．さらに，Mth1が出現する．その細胞では SNI が誘発され，ゲノム全体

遺伝子の mRNA 発現レベルが低下している可能性もあの遺伝子の状態が不安定となることによってがん遺伝子

り，解析した．定量的リアルタイム RT-PCR 法では，腫やがん抑制遺伝子に突然変異が入ったクローンが出現

瘍における発現低下は認められず，むしろ上昇傾向にあし，がん化に至る．

った（Fig. 5B）．以上により，Mth1 遺伝子の不活化は「SNI を誘発する遺伝子」に関しては，次項で述べる．

SNI の原因ではないと結論した．

SNI によって誘発された突然変異により活性化・不活化
されるがん関連遺伝子は，現在まだわかっていない．

2．DNA polymerase κ の発現増加

PhIP により誘発した乳がんにおいては，Ha-ras の突然

SNI 誘発の原因となる他の候補遺伝子として，error-

変異が 10-40 ％検出され，p53 の突然変異がまれに認めprone DNA polymerase の一つである polymerase κ（Polられる．しかし，これまでにさまざまながん関連遺伝子κ）に着目した．Pol κ は，in vitro において T から G への突然変異が広く調べられてきたが，突然変異が検出さの突然変異を上昇させる（Ohashi et al., 2000）．そこで，れた遺伝子の報告はほとんどない（Dashwood et al.,

SNI を示した細胞株において，Pol κ の過剰発現の有無

1998 ； Roberts-Thomson and Snyderwine, 1997 ；を検討した（Okochi et al., 2002a）．PhIP で誘発したラUshijima et al., 1994 ； Yu et al., 2000）．本実験で用いたット乳がん 9 個，および，樹立した乳がん細胞株 2 系統

ラットの乳がんでは，p53 の突然変異は検出されていなについて，Pol κ mRNA の発現量を定量的リアルタイム

い（Watanabe et al., 2001a）．

RT-PCR 法により調べた．しかし，解析した乳がんおよ

SNI 誘発の分子機構の探索

び乳がん細胞株のいずれにおいても発現上昇は認められず，むしろ発現レベルは低下していた（Fig. 6）．この発

SNI がどのような分子機構により誘発されているのか

現低下の原因は不明だが，少なくとも Pol κ の過剰発現

は，きわめて重要な問題である．そのヒントとなると思により SNI が誘発されているわけではないと考えられわれたのが，SNI をもつラット乳がん細胞株で認められた．

た高頻度の A：T から C：G への transversions であった．
我々はまず，このタイプの突然変異の増加を引き起こす

3．Brca1 の不活性化

可能性のある二つの遺伝子に着目したが，残念ながら，

BRCA1 遺伝子は，ヒト若年性乳がん家系の連鎖解析

関与は認められなかった．現在，Brca1 蛋白の発現低下により家族性乳がんの原因遺伝子としてその存在が明らを見い出しており，これが SNI に関与する可能性についかにされ，クローニングされた（Hall et al., 1990 ； Mikiても考慮している．

et al., 1994）．その突然変異は，家族性乳がんでは高頻度に認められるが（Castilla et al., 1994 ； Inoue et al.,1．Mth1 遺伝子の不活性化

1995 ； Martin and Weber, 2000），散発性乳がんではほMth1 遺伝子は，大腸菌 MutT の mammalian homo-

とんど検出されない（Futreal et al., 1994 ； Khoo et al.,

174



Exon 11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151617181920212223

Exon 2

Pol k /histone H4（×

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151617181920212223）

PhIP PhIP
Normal Mammary carcinomas BBR 12-1 7-4

（A）





1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314 151617181920212223


Exon 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314 15 16 17 18 19 20 21 22 23









 
 















  Fig. 6 Expression of Pol κ mRNA in rat mammary carcinoma celllines and primary tissues. mRNA levels were normalized
to histone H4. Samples are the same with those in Fig. 5（B）. Modified from Okochi et al.（Okochi et al., 2002a）
.
）

（B）

Mth1 histone H4（×10-2

1999）．しかし，散発性乳がんにおいても，蛋白質レベ
ルでは BRCA1 の発現が低下しているという報告がある（Miyamoto et al., 2002 ； Wilson et al., 1999 ； Yoshikawa
et al., 1999）．

/

我々は，PhIP で誘発したラット乳がんにおいて，ラット Brca1 蛋白質の発現，Brca1 mRNA の発現，プロモーター領域の DNA メチル化の状態，さらに，Brca1 翻
1
N

2

3
T

4

5

6

7

N

Culture8910 11 12 13 14 15
T

Primary tissue

N : Normal, T : Tumor

訳領域の突然変異の有無を調べた（Okochi et al., 2002b）．
ラット Brca1 と交叉する二種類の抗ヒト BRCA1 抗体を用いた免疫組織染色では，同一切片上の正常乳腺部分と比較して腫瘍部分での明らかな染色性の低下が認められFig. 5 Mutation and expression analysis of the Mth1 gene in the
PhIP-induced mammary carcinoma cell lines and the primary carcinomas.
（A）Mth1 PCR-SSCP analysis. Lanes 1-3, DNA from normal liver of SD, Big Blue rat and their F1 rats ； lanes
4-14, 11 primary mammary carcinomas ； lanes 15-17,
Big Blue  Rat 2（ BBR）fibroblast cell lines （triplicate）； lanes 18-20, mammary carcinoma cell line
PhIP12-1（triplicate）； lanes 21-23, mammary cancer
cell line PhIP7-4（triplicate）. In exon 2, shifted bands（shown by arrowheads）were observed in five primary mammary cancers, and found to be a polymorphism without amino acid changes.
（B）
Real-time RT-PCR analysis of Mth1mRNA. mRNA levels were normalized to histone H4, which reflects thenumber of cells in the S-phase（Lee et al., 1996）. The
RT-PCR was repeated five times, and the resultant
averages ± SE are shown. No. 1, RMEC ； no. 2 and3, mammary cancer cell line, PhIP7-4, PhIP12-1 ； no.
4-6, normal mammary glands obtained from three
non-treated, age-matched rats ； no. 7-15, primarymammary carcinomas. Modified from Okochi et al.
（Okochi et al., 2002a）.

（Fig. 7A），検索した乳がん 17 個のうち，ほとんどすべての乳がんで Brca1 蛋白の発現が著明に低下していた．
この Brca1 蛋白の発現低下は，ウエスタンブロットでも確認された（Fig. 7B）．一方，プロモーター領域の過剰
メチル化および翻訳領域の突然変異は認められず，
mRNA の発現は保たれていた．したがって，PhIP 誘発
ラット乳がんでは，Brca1 mRNA の翻訳効率の低下または Brca1 蛋白の安定性の低下が生じていると考えられた．ヒトにおいても，BRCA1 mRNA の発現低下を伴わずに BRCA1 蛋白質の発現低下を示す散発性乳がんが存在しており（Miyamoto et al., 2002），PhIP で誘発したラット乳がんは，このタイプのヒト乳がんの良いモデルとなると思われる．
BRCA1 は，BRCA2 とともに DNA 修復に関与する遺伝子であることが知られ，その機能欠損によって，ゲノ
ム不安定性，特に CIN が起こることが知られている（Venkitaraman, 2002）．最近，Brca2 を欠損したマウス
では，点突然変異頻度が 2.3 倍上昇していることが報告された（Tutt et al., 2002）．BRCA1 の機能喪失が点突然変異にどのような影響を及ぼすかについての報告は現在のところないが，BRCA1 の機能欠損により点突然変異
175

（A）
=

（B）
1

>

2

3

4

5

6

7

（KDa）

200

?

@

116
＊

97

66

Fig. 7 Reduced Brca1 protein expression in PhIP-induced mammary carcinomas.
（A）
A representative immunohistochemical analysis of Brca1 protein. Using an antibody that recognizes the
carboxyl terminal domain（a, b）and one that recognizes the amino terminal domain（c, d）of human
BRCA1, a PhIP-induced mammary carcinoma（b, d,×180）and the normal mammary glands（a, c,×180）
within the same specimens were stained. Immunoreactivity was clearly observed in mammary glands
while it was absent in carcinoma cells.
（B）
Immunoblot analysis of Brca1 protein. Lane 1 ： rat normal skeletal muscle as a negative control ； lane
2, RMEC ； lanes 3-7, PhIP-induced mammary carcinomas. A band for 220 KDa Brca1 protein（closed
arrow head）was detected in RMEC, while it was not detected in the five mammary carcinomas tested.
＊
A band for 116 KDa Brca1, a splice variant without exon 11, was also detected（open arrow head）. A
non-specific band. Modified from Okochi et al.（Okochi et al., 2002b）.

率が上昇する可能性も否定はできない．SNI が多くの乳結がんに関与していることと，BRCA1 蛋白の発現低下が多くの乳がんで認められることは符合する点である．

語

ラットおよびヒト乳がん細胞株において，ミスマッチ
修復系の異常とは異なる機構により点突然変異のみを増4．今後のアプローチ

加させる，新たなタイプのゲノム不安定性の存在を見い

近年，cDNA マイクロアレイ等を用いることで，遺伝出し，「一塩基不安定性（Single nucleotide instability ；子発現レベルをゲノムワイドに調べることが容易になっ

SNI）」と命名した．ラット乳がん細胞株で特徴的に認た．したがって，SNI を示すがん細胞と示さないがん細められた A：T から C：G への変異の増加は，原発巣でも胞での遺伝子発現レベルの相違を探索するアプローチが観察され，SNI は原発巣の段階から存在することが示唆考えられる．しかし，がん細胞での遺伝子発現は多岐にされた．SNI は，ヒトおよびラット乳腺発がんに幅広く渡り，単純にがん細胞同士を比較しただけではさまざま関与する可能性があり，その分子機構の解明が今後の重な違いが見つかり，SNI の原因遺伝子を探るのはきわめ要な課題である．

て困難である．SNI の原因遺伝子同定のためには，遺伝的背景等が同一で，しかも，SNI の有無がはっきりとし謝辞ているがん細胞株を複数樹立し，それらのがん細胞株間

本研究の発展に多大な貢献を頂いた国立がんセンター

で遺伝子発現レベルを比較する必要がある．一方，研究所発がん研究部の渡邉直子博士に感謝致します．ラDNA 複製時における fidelity の低下や DNA 修復系の異常

ット乳がん原発巣および細胞株移植腫瘍の病理組織診断

が，SNI の原因である可能性は高い．これらに関与するは，名古屋市立大学の高橋智博士にご協力頂きました．

遺伝子のうち，がんへの関与が考えられるものを一つず

正常乳腺上皮細胞の分離および乳がん細胞株の樹立は，

つ丁寧に解析することで，何らかの手がかりが得られる

放射線医学総合研究所の島田義也博士，国立がんセンタ可能性もある．

ー研究所の柳原五吉博士に，それぞれご指導頂きました．
細胞株の核型分析は吉田廸弘博士にご協力頂きました．
このほか，共立薬科大学望月正隆学長をはじめ，本研究176

にお力添えを頂いた多くの先生方に深謝致します．また，実験を遂行するうえで，貴重なご助言を賜りました杉村隆博士，長尾美奈子博士に心から感謝致します．
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Environ. Mutagen Res., 24：179-184（2002）

環境変異原研究の光と陰：これから進むべき道鈴木孝昌＊（国立医薬品食品衛生研究所遺伝子細胞医薬部）
この原稿は，今年の 7 月に淡路島で開かれた MMS 研

し，それなりの研究成果を残すことができた．しかし，究会第 31 回定例会での特別講演をもとに作成したもの

それと同時に，少しずつ現在の変異原性研究に関する疑です．これまで，10 年以上にわたり国立医薬品食品衛問も生じてきていた．その疑問が拡大したのは，まさに生研究所変異遺伝部において，環境変異原研究に携わっ

光の部分であった AF2 をこのトランスジェニックマウスてきましたが，この 4 月に部を移動になり，環境変異原を用いて試験した結果であった．

研究とは今後少し距離を置かざるを得なくなりました．

ご存じのように，AF2 は Ames 試験において代謝活性

この機会に自分としても一歩離れた立場からこれまで歩化なしに強い変異原性を示し，陽性対照物質としても使んできた道を振り返り，少し大胆に提言をさせていただ

われている．よってトランスジェニックマウスを用いた

きたいと考え，「環境変異原研究の光と陰」というタイ試験でも陽性結果が期待されたわけであるが，意に反し，トルで講演をさせていただきました．講演後の反響もあ

発がん標的臓器である前胃を始めすべての臓器においてり，内容に関する問い合わせもいただいたことから，今陰性であった．単純に考えると，トランスジェニックマ

回環境変異原研究の原稿として，まとめ直させていただ

ウスの試験の感度が低いという理論が成り立つようでもきました．これがきっかけとなり，環境変異原研究の方あるが，Ames 試験での活性の強さを考えれば，当然陽向性に関する議論が盛り上がることを期待します．

性になってもいいはずである．そこで見方を変えると，

AF2 事件と環境変異原研究

発がん性自体は当初陰性であり，再試験ではかなりの高用量を投与してやっと発がんした訳でもあるので，in

これまでに，変異原研究に光があてられたとすれば，vivo における遺伝子傷害性は低くてもおかしくないとも

それはおそらく AF2 の問題にまでさかのぼることができ考えられる．すなわち，バクテリアでの活性の高さが異る．ご存じのように，ソーセージ等の防腐剤として使わ常な訳である．元々抗菌剤であり，ニトロ基の還元能をれていた AF2 に，バクテリア等で強い変異原性が確認さ介して菌に対して選択的に働くメカニズムからすると，れたことより，その安全性が社会的な問題となり，発がマウスに対しては遺伝子傷害性が低くても不思議はな

ん性が再検討された結果，ラットの前胃にがん原性があい．

ることが確認され，結局その使用が禁止になったという事件である（杉村，1982）．それが発端となり，変異原

変異原性と発がん性の定量的相関性試験の重要性が認められ，当時の国立衛生試験所に変このことが発端となり，発がん性と変異原性の定量的異原性部が誕生した．現在では，がんは，がん遺伝子等

な相関について検討を行ってみた（小原，2002）．Fig. 1の突然変異の蓄積が原因となる遺伝子の病気であることに示すように，Ames 試験と発がん性の相関は良くないが明らかになっているが，当初は突然変異の発がんにおのは明らかである．一方トランスジェニックマウスの結ける意味合いもまだはっきりしておらず，この間に果は比較的良い相関を示している（Fig. 2）．これまでは，

Ames 試験を初めとしてさまざまな変異原性試験の開発

比較的陽性か陰性かという結果のみが取りざたされ，発を通じて，発がん物質が一般的に遺伝子傷害を示すこと

がん物質を何割検出できるかという議論がなされてきたを明らかにしてきたことは，まさに変異原研究の光の部

が，このような定性的な結果の積み重ねでは本質を見落分ともいえる．私自身も，10 年以上にわたり，トランとす危険性もあり，これからはより定量的な議論が重要

スジェニックマウスを用いた新しい変異原性試験に従事になると考える．
この Fig. 2 の中で Ames 試験の相関を乱している物質＊

E-mail ： suzuki@nihs.go.jp
受付： 2002 年 9 月 7 日 受理： 2002 年 9 月 26 日
日本環境変異原学会

として，ヘテロサイクリックアミン類が注目される．ヘテロサイクリックアミンはご存じのように，国立がんセンターの杉村博士らにより，魚などの焼けこげ中に存在179

0.0001
N-OH-2AAF

0.001

発がん性の強さ：TD50（mg）

0.01

0.1

1

AFB1

DEN
Melphalan
DMN
OchratoxinA
DES

diB［a,l］P DMBA

MeIQ
AF-2

STO
4-C-o-PDA

d-Limonene

1000
0.01

IQ

STZ

PhlP

Muconaldehyde
MMSo-Anisidine

Urethane

MNU

B［a］P

2AAF
Cyclophosphamide
TDBP AAT
Tamoxifen 2,4-DAT

10

100

MMC

2-N-p-PDA

0.1

1

10

100

1000

10000

1000001000000

サルモネラ菌に対する変異原性（復帰コロニー数/mg）

Fig. 1 Ames 試験での変異原性と発がん性の強さの比較

0.0001
N-OH-2AAF

発がん性の強さ：TD50（mg）

0.001

0.01

0.1

1

10

100

AFB1

MMC
DEN
Melphalan DMBA

OchratoxinA
DES

diB［a,l］P
DMN

MNU

B［a］P IQ
STZ
PhlP
TDBP Tamoxifen
Cyclophosphamide
AAT
Muconaldehyde 2,4-DAT
MeIQ
AND
MMS
AF-2
Urethane STO
2AAF

d-Limonene
1000
0.00014-C-o-PDA

0.001

2-N-p-PDA
0.01

0.1

1

10

100

トランスジェニックマウス における変異原性（fold-increase/total dose）

Fig. 2 トランスジェニックマウスでの変異原性と発がん性の強さの比較する強力な変異原性物質として単離，構造決定がなされ結果から比べて，かなり弱いものであった．

た物質群であり，まさに日本の環境変異原研究の光の部

Ames 試験は短期スクリーニング系として非常に有用分ともいえる．我々の日常接する物質の中に強力な変異であるが，前述のように得られた結果の解釈には注意が原性物質があったことは脅威であり，動物における発が必要である．より多くの発がん物質を陽性に検出するたん性も認められたものの，幸いその強さは Ames 試験のめ改良が加えられたこともあり，大変感受性は高められ180ている．除去修復能欠損，誤りがちな複製系の発現，膜保護派であった博士は，途中から立場を変え化学物質は

透過性の亢進などがあり，この結果を人でのリスクの評思ったほど危なくないという理論を展開し，議論を呼ん

価に当てはめるなら，色素性乾皮症の患者がさらに重篤だ．同じ環境変異原研究を行ってきた立場からも，考えな危険因子を兼ねあわせた状態での危険度ということもさせられることも多いので，以下にこの本で引用されてできる．Hazard identification としては意味はあるが，いた Ames 語録を紹介する．

risk evaluation としてはその結果を鵜呑みにするわけにはいかないだろう．しかし現状では，各種ガイドライン• 毎日コップ一杯のビールを飲んで子供に先天異常ををはじめ，ある程度リスク評価に使われていることは事引き起こす危険性は，「1ppm のダイオキシンに汚染実である．

された泥を毎日 1 キログラム食べる」のに匹敵す

これまでの毒性学における問題点
これまで，変異原性を含め毒性学の分野においては，
リスクはなるべく排除するという立場で，危険性を過大る．
• われわれは一杯のコーヒーで一日に摂取するすべての残留農薬よりも多くの発がん物質を取り入れている．

評価する傾向にあったと考える．特に人工的に作られた• 「人々の目はみな」人工化学物質ががんを多く発生

化学物質の安全性に関しては過敏であったともいえる．

させるという方向に向いているが，「科学」は実際

L.L. Smith（2001）は “Key challenges for toxicologists inst

21 century” と題した論文の中で，これまでの毒性試験のあり方に次のような疑問を投げかけている．

には「まったく違った見方」をしている．
• 人間は人工有毒物質の一万倍もの量の天然有毒物質を接種しており，生物学的影響はいずれの場合も最大許容量をもとに推測した動物実験によって誇張さ• 少数の動物への大量投与により，少量が曝露される
多数の人間への毒性を評価している．
• NTP で試験された 50 ％以上もの化合物が最大耐量にて発がん性を示した．
• 安全性と環境への蓄積性の問題から DDT の使用が中止されたが，それによってマラリアの患者が急増れている．
• 環境中の汚染物質が 10 億分の 1 レベルでも一般の健康に影響があるかどうか定かでないだけに，米国が公害の減少と抑制に年間 800 億ドルも費やしているのが，果たして賢明なことであろうか？
• 少数の人に対する小さいリスクよりも，多数の人に対する大きなリスクを問題にすべきだ．

した．
• 動物実験からの外捜に際し安全係数として 100 〜• もし政府がまじめに効率よくがんを減らしたいので1000 という値が用いられるが，日常ヒトが摂取すあれば，喫煙を減らす努力を大いにしなければならる量が 1000 倍になっても毒性を現す化合物は少なない．タバコの恐ろしさの前では，がんの危険はほいのではないか．

とんど影が薄くなってしまう．
• 何よりも重要なことだが，ほとんどの発がん物質に

NTP のデータに関しては，発がん性の疑いのあったものが選ばれているためという指摘もあるが，最近の報

おそらくこれ以下なら実際に安全という被爆の閾値があるのではないか．

告では，食品添加物に関しても 47 ％が発がん性ありという結果になっている点が注目される（Johnson, 2002）．

多少誇張された表現もあるかもしれないが，いずれも

そもそもそんなに発がん物質はたくさんあるものなのだ

重要な指摘である．さらに，Ames 博士（1997）は，

ろうか？

“Environmental Pollution, Pesticides, and the Prevention

やはり，これまでの発がん実験の結果に関しても，その解釈を見直す必要があると思われる．また，of Cancer: Misconceptions” という論文の中で，以下のその結果を絶対のものとして，それを漏れなく変異原性

ような多くの誤解があると指摘している．

試験で検出しようとしたこれまでの我々の方向性に関しても見直すべき時期が来ているのであろう．ちなみに，

誤解 1 ：がんの発生率は上昇している．

NTP で試験された食品添加物のうち Ames 試験で陽性と誤解 2 ：環境中の合成化学物質はヒトがん発生の重要ななったのはわずか 10 ％であった．

Ames 博士の主張
最近読んだ R. N. Procter 著（2000）の「がんをつくる
社会」という本の中で，Ames 試験の開発者である B. N.
Ames 博士の主張が紹介されており，大変共感を覚えた．
当初 Ames 試験により化学物質の危険性を主張して環境要因である．
誤解 3 ：農薬を減らすことは，食物由来のがん発生を抑えるための効果的手段である．
誤解 4 ：ヒトが曝露される発がん物質等の有害物質は，主に合成された化学物質である．
誤解 5 ：ヒトへの発がんリスクは，標準的な高用量動物試験により評価できる．
181

誤解 6 ：合成化学物質は天然化学物質よりも大きな発がんリスクを持つ．
誤解 7 ：合成化学物質の毒性は天然化学物質の毒性とは異なる．
誤解 8 ：農薬や他の合成化学物質はヒトのホルモン作用を攪乱している．
誤解 9 ：低用量で仮定されるリスクを規制することは，
公衆衛生の向上につながる．

の重要性が高まり，それに焦点を当てた研究も多くなされてきた．最終的には non-genotoxic carcinogen も何らかの遺伝子傷害を起こして発がんに結びつくと考えればこれも重要かもしれないが，そもそもこうした発がん物
質の重要性には疑問を持っている．一般的に，発がん試
験では比較的高用量を長期間にわたって投与されるため，ふつうの状態ではあり得ない量を投与される場合も多く，いわゆる non-genotoxic carcinogen には高用量でのみ陽性になるものが多い点には注意が必要である．

合成物質であれ，天然物質であれ，ヒトが実際に摂取

変異原性研究者の立場からすれは，そのようなものも何する量に基づいた定量的なリスク評価が大切であるといとか検出しようとするのではなく，そのようなものは重う主張である．これに対しては，科学的な根拠に乏しい

要ではないという主張を展開すべきではなかったのであという反対意見も出されているが（Tomatis et al., 2001），

ろうか？

既成の概念を見つめ直すという意味においては重要な主のではなく，発がん性ありとされたいくつかの物質は，張であり，かなり本質をついていると思う．これまでは

実は我々にとってさほど危険でないのではないか？

危険と思われていたものに対する安全性の評価が進め

かし，逆に発がん性のない変異原物質，つまり，“geno-

ば，今までの概念からはそれほど危険なものではなく，

toxic non-carcinogen” があるとすれば，その危険度には有用性の面が再評価される可能性もある．

注意が払われる必要がある．なぜなら，発がんだけが結

環境変異原研究における 9 つの誤解

発がん実験の結果は我々にとって絶対的なもし果として起きる毒性ではなく，その他多くの病気に遺伝
子傷害が深く関わっている可能性も高いからである．今

前述の Ames 博士の 9 つの誤解にならって，変異原性後は，がん以外のヒトの病気にいかに遺伝子傷害が関わ試験に関する 9 つの誤解なるものを個人的意見としてやっているかを研究していくことも，癌学会ではできない，

や大胆にまとめてみた．

変異原学会独自のテーマとして重要であると考える．

これから進むべき道誤解 1 ：変異原性試験は発がん性の短期スクリーニング試験である．

これからの環境変異原研究の方向性として，これまで

誤解 2 ：発がん実験の答えは絶対的である．

の hazard identification から脱却し，risk evaluation を意

誤解 3 ：いわゆる non-genotoxic carcinogen も検出した

識した研究なり，評価系が重要だと考える．たとえば，い．

Ames 試験であれば，より正常な状態に近い感度の低い

誤解 4 ：新規の変異原性物質がまだたくさん存在する．

菌株を使用することを推奨したい．また，ニトロ還元酵

誤解 5 ：生殖細胞での変異原性は体細胞を使って評価で素活性も低い株が望ましい．こうした低感受性の株で陽きる．
誤解 6 ：感度が高くより多くの発がん物質を検出できる試験が望ましい．
誤解 7 ：変異原性が陽性ならば危険なので開発をストップする．

性結果が得られれば，その結果の意味（level of concern）
は高いと評価できる．さらに，最近のヒト S9 を用いた研究や，ヒトの代謝酵素を組み込んだ菌株の利用は今後重要な課題であると考える．染色体異常試験においては，陽性率が高いため，陽性結果が得られたとしてもただち

誤解 8 ：ネガティブを保証することが重要である．

に危険だとはいえず，死んでしまう運命にある細胞での誤解 9 ：トランスジェニックマウスを用いる変異原性試現象を観察しているにすぎないという指摘もある．生殖験は感度が低い．

細胞および受精卵における染色体異常は，流産や奇形の原因としても重要であるが，がんにおいてはどうであろ

そもそも変異原学会というものは，経世代的ないわゆうか？

結果としてがん細胞には染色体異常が多く観察

る遺伝毒性というものに重きが置かれてスタートしたはされるが，これらはどの程度原因となりうるのであろう

ずであるが，試験法の難しさもあってかやがて関心は，か？

発がん性を短期にスクリーニングするという観点に完全な意味を持つので，これら viable なタイプの染色体異常に移行し，現在では癌学会の分科会的要素も否めない．

の検出は意味があると考えられる．こうした異常にまと

これまでは，発がん性のデータが絶対的なものであるとを絞り，たとえばヒトの培養細胞を使って chromosome

確かに，染色体の転座や LOH という現象は重要いう前提から，いかにもれなくこれを予測できる試験バ

painting 法により転座を検出することなどは今後重要でッテリーを作るかということに注意が払われてきたようある．

に思う．その結果，いわゆる“non-genotoxic carcinogen”
182

この他にも，in vivo 試験としてのトランスジェニック

マウス試験は，標的が導入遺伝子であるものの，エンド

間違えなければ，非常に有用な薬であったはずだ．こう

ポイントの持つ意味がはっきりしており，またメカニズ

した薬が，世の中から消えてしまうのはもったいない気ムの解析にも役立つため，リスク評価を考えるうえではがする．

重要な試験となるだろう．また，in vivo のコメットアッ

この話題と関連して現在トキシコジェノミクスプロジ

セイに関しては，操作が簡便であるという利点はあり，ェクトが目指す目標として，これまで毒性があって製品

hazard identification としては優れているが，リスク評価

化できなかった薬を世に出すことも含まれている．おそを考える場合，定量的な相関性の問題と何をとらえてい

らく，臨床試験で 100 人に 1 人でも重篤な障害がおきたるのかという本質的な疑問を解決しなければならない．

とすれば，その開発はストップするのであろうが，もしさらに，今後重要と考えられるテーマとして，ヒトサ

それが SNP に基づくヒトの個体差によるもので，事前ンプルを用いた遺伝毒性試験法の開発があげられる．臨に感受性なヒトを遺伝子診断で予測できるのであれば，床試験や，population monitoring を通じて得られる試料

そうした重篤な副作用を回避し，通常のヒトには有益なをもとに，遺伝子傷害性を直接評価可能な系は，ヒトで薬として使用することができるはずである．たとえば，のリスクを評価するうえで重要である．LC-MS などを

uvr 株でのみ陽性を示した薬は，色素性乾燥皮症患者に利用したアダクトの検出や，分子疫学的研究も今後の発は使わないということは，すでにあるデータからでも簡展が期待される．

単に応用できる事項である．大事なことは，uvr 株で陽--

これまでは，比較的定性的な発がん性の予測を目指し性になったらやめるのでなく，どのように注意するかでた議論がなされてきたが，今後はよりリスク評価を念頭ある．すでに研究は始まっているが，修復酵素や薬物代に置いたより定量的な議論がなされることを期待した

謝酵素の多型という問題もこの学会で取り組むべき課題

い．また，メカニズムに基づいた毒性の評価が重要だとであろう．SNP に関しても，その由来は生殖細胞におき思われる．そのためには，メカニズムの解析に迫れる試

た突然変異であるので，本来本学会にて取り組むべきテ

験系が望ましい．現在関心が払われているマイクロアレーマであると考えられる．

イを用いた遺伝子発現解析は，こうした観点からも，今最後重要視すべきテーマであると考える．数年前の学会で，後にこうした研究の重要性を指摘したものの，残念ながらト

最近ふと不安になることがある．これまで一生懸命変

キシコロジー学会などに比べると新しい試験系への取り

異原性試験を行ってきて，少しでも危険度のある物質は組みは出遅れたといえる．今後こうした研究を通じて，規制するなり，世に出さない努力をしてきたが，それが一般的な毒性学や病理学と遺伝毒性との境界線が取り払存在したときと比べ，どれだけ我々の暮らしに貢献した

われていくことが予想され，入り込む余地がなくならなのであろうか？

いためにも，こうした新しい研究を活性化していくことったヒトは何人いたのか？

も大事であろう．

あるが，ワラビを食べることを禁止した方がよっぽど効

AF2 を禁止したことでがんにならなか
これは非常に難しい問題でこれまで，会社の安全性部門というのは，開発をスト果的だったかもしれない．さらにいえば，たとえがんがップする側に働く，negative な役割を担っていたようで増えたとしてもそれは人類にとって悪影響を及ぼすのあるが，これからは毒性があるものをいかに世の中に出か？

すかという positive な役割を担うべきであるとも感じてってがんになって死ぬのは，自然の摂理かもしれず，むいる．既存の変異原性試験で陽性になったり，発がん性

しろ生物学的には有用なことかもしれない．ここまでい試験で陽性になったら開発が中止される訳であるが，たうと極論かもしれないが，このような立場にたった場合とえば Ames 試験でやや陽性になったぐらいで開発をやには，危険をなるべく回避するという姿勢でなく，危険めてしまうとすれば，むしろ有益な薬が世に出なかったをある程度受け入れ，それとうまく対処していくことがという意味で残念な結果だともいえる．本当に必要であ

今後は重要になると考える．ただし，環境変異原が経世れば，トランスジェニックマウスを使った試験なりの追代的に遺伝的悪影響をもたらすとすれば，それは人類に加試験を行ったり，メカニズムに基づいた議論をするこ

とって危険度は高い．その意味では，発がん物質よりも，とで，その陽性結果の重要性（level of concern）を落と

変異原物質の方が重要であるといえる．今こそ，環境変す努力をしてもいいのではないか．もちろん行政側とし異原学会がスタートした時の遺伝的影響という原点に戻ても，きちんとした検討がなされている場合には，多少って，新しい試験系の開発なりを行っていくことが重要の陽性結果を受け入れる姿勢は重要である．なるべく安であろう．これに関連して，最近放射線等による経世代

全な薬をという発想であまり効かない薬を世に出すより的な突然変異の伝搬や，untargeted mutation に関する報は，多少危険な薬でも，それをうまく使うことがより利告が相次いでなされている点は注目される．（Niwa and

益をもたらすのではないだろうか？

Kominami, 2001 ； Barber et al., 2002 ； Shiraishi et al,

サリドマイドやソ

リブジンのような副作用例もあるが，そもそも使い方を

小児のがんを除けば，ヒトがある程度の年齢にな

2002）
183

最後に，このごろ気になることとして，若い女性の喫煙者が急増している点がある．発がん性の観点からすれば，あれほど危ないものはない．また，最近は男性も含
め髪をカラフルに染める人も増えているが，結構過激な処理をしているようなので心配である．たばこを吸っていても肺がんにはならないヒトも多いので，ヒトは結構丈夫にできているものだと感心させられるが，遺伝的な影響は大丈夫であろうか？

今後，新生児の流産や奇形の発生率が上昇しないことを願うが，喫煙の遺伝的影響をきちんと評価して警鐘を鳴らすのもこの学会としての今後の役割の一つではないだろうか．
参考文献
Ames, B. N. and L. S. Gold（1997）Environmental pollution, pesticides, and the prevention of cancer: misconceptions, FASEB J., 11,1041-1052.
Barber, R., M. A. Plumb, E. Boulton, I. Roux and Y. E. Dubrova（2002）Elevated mutation rates in the germ line of first- and second-generation offspring of irradiated male mice, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 99, 6877-6882.

184

Johnson, F. M.（2002）How many food additives are rodent carcinogens? Environ. Mol. Mutagen., 39, 69-80.
Niwa, O. and R. Kominami R.（2001）Untargeted mutation of thematernally derived mouse hypervariable minisatellite allele in F1
mice born to irradiated spermatozoa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,98, 1705-1710.
Shiraishi, K., T. Shimura, M. Taga, N. Uematsu, Y. Gondo, M.
Ohtaki, R. Kominami and O. Niwa,（2002）Persistent induction ofsomatic reversions of the pink-eyed unstable mutation in F1 miceborn to fathers irradiated at the spermatozoa stage, Radiat. Res.,
157, 661-667.
Smith, L. L.（2001）Key challenges for toxicologists in the 21st century, Trends Pharmacol. Sci., 22, 281-285.
Tomatis, L., R. L. Melnick, J. Haseman, J. C. Barrett and J. Huff
（2001）Alleged misconceptions’ distort perceptions of environmental cancer risks, FASEB J., 15, 195-203.
Proctor, R. N.（著）平沢正夫（翻訳）（2000）がんをつくる社会，
共同通信社，東京.
小原有弘（2002）化学物質の構造の特徴と遺伝子突然変異の相関〜発がん原因物質の予測を目指した遺伝子突然変異のパターン
解析〜, 名古屋市立大学学位論文.
杉村 隆（1982）発がん物質，中央公論社，東京.

Author Index（Vol. 24）
A

Aoki, T.

24；29

Apibal, S.

24；37

Arai, F.

24；23

Klongpanichpak, S.

24；37

Sofuni, T.

24；48

Kuboniwa, H.

24；1

Sugimura, T.

24；63Sutou, S.

24；43

Suwannatrai, M.

24；37Suzuki, T.

24；179L
Lohman, P. H. M.

F
Fujita, R.

M
24；45

H

T

Maemura, S.

24；1Temcharoen, P.

24；37

Masuda, S.

24；129Toskulkao, C.

24；37Mori, H.

24；46

Morimoto, S.

24；17

Hayashi, M.

24；48

Hayashi, T.

24；23

Hayatsu, H.

24；43, 61

Hiramoto, K.

24；91

Nagase, H.

24；29

Honma, M.

24；17, 47, 161

Nohmi, T.

24；44, 75, 153

Hosono, A.

24；113

U
Ushijima, T.

N

24；169W

O

Wakata, A.

24；99

Waters, M.D.

24；45

I

Y
Ohigashi, H.

24；123Ikushima, T.

24；47

Ohmori, H.

24；145

Yajima, N.

24；111

Imaeda, A.

24；29

Ohnishi, Y.

24；81

Yanagisawa, T.

24；1Okochi, E.

24；169Yatagai, F.

24；17

K

S
Katami, M.

24；1

Kinae, N.

24；43, 69, 129

Shibuya, T.

24；46

185

Keyword Index（Vol. 24）

A

DNA polymerase IV

24；153

DNA polymerase κ

24；145

double-strand break（DSB）

24；1611’-acetoxychavicol acetate

24；123

Ames test

24；1

antimutagen

24；129antimutagenicity and anticarcinogenicity

24；81

antimutagenicity

24；113

antioxidant

24；29

asbestos

24；23

fermented milk

24；113asbestos substitute24；23

flavonoid

24；129auraptene

24；123fluvastatin

24；29

food factor

24；123E
end-joining（EJ）

24；161F

B
G
benzo［a］pyrene

24；145binding of mutagen

24；113genomic instability

24；161, 169

breast cancer

24；169genotoxicity

24；1, 75

C

H

cancer24；145heterocyclic amine

24；69

carbon-centered radical

24；91

heterocyclic amine mutagen

24；91

carcinogenesis

24；129homologous recombination（HR）

24；161

catechin24；129hprt

24；169chemoprevention

24；81, 123

HPRT（hypoxanthine phosphoribosyltransferase）mutation

chlorofuranone（MX）

24；69

chromosomal aberrations

24；23

human lymphoblastoid cell

24；17

cultured Chinese hamster cells

24；99

HUVEC

24；29

cytokinesis-block method

24；99

24；17

I
D
intestinal bacteria
dinB

24；153DNA damage

24；91

186

24；81

J
Japanese traditional herbal medicines（Kampo）

R
24；1

rats

24；99

reactive oxygen species

24；91

risk assessment

24；69

rodent bone marrow cell

24；37

K
KuralonRM182

24；23

L
lactic acid bacteriaS
24；113

single cell gel electrophoresis assay

24；29

stevioside

24；37

streptomycine-dependent strain

24；113superoxide

24；123M
Maillard reaction

24；91

micronucleus test

24；1, 37, 99

Tmultiplex PCR（polymerase chain reaction）analysis 24；17
mutagen

24；69transgenic assays

24；75

mutagenesis

24；129translesion synthesis

24；145mutagens

24；81

tumor induction

24；69

mutation

24；145mutation rate

24；169Uunscheduled DNA synthesis test

24；1

N
X
nitrogenoxide

24；123

nobiletin

24；123

1-nitropyrene

24；81

X-ray exposure

24；17

Y
O
Y family DNA polymerases
oxidative DNA damage

24；75, 153

24；29

Z
P
zerumbonep53

24；161point mutation

24；169PVA fiber

24；23

pyrazine cation radical

24；91

24；123187

入会手続きのご案内
入会申込書に必要事項をご記入の上，年会費とともに現金書留にて事務局宛てお送りください．
年 会 費

7,000 円（正会員）
5,000 円（学生会員）

事業年度 （1 月 1 日〜 12 月 31 日）（お申し込みについて）
1. 入会申込書に必要事項を楷書でご記入の上，年会費とともに現金書留にて事務局までお送りください．
2. 正会員は評議員の推薦を必要とします．推薦者がおられない場合は，事務局にご相談ください．
3. 学生会員は指導教官の推薦と在学証明書を必要とします．翌年の 3 月 31 日まで会員として登録されます．
4. 年度末に入会申し込みをされる場合で，翌年度から入会希望の場合は，その旨お知らせください．
5. 学会誌は入会後に発行した号からお送りしますが，当該年度で入会前の学会誌をご希望の場合は事務局までご連絡ください．
6. 住所変更（学会誌送付先の変更）の際は，会員番号（学会誌等送付する際，宛名ラベルに印刷されています），氏名，新・旧住所をご記入の上，事務局宛，書面にてご連絡ください．

日本環境変異原学会〒 170 ― 0003

東京都豊島区駒込 1 ― 43 ― 9

駒込 TS ビル 3F
電話

財団法人

口腔保健協会内

03 ― 3947 ― 8891（代） FAX

03 ― 3947 ― 8341

環境変異原研究 投稿規定
1． 掲載論文

4． 論文原稿の送付

環境変異原研究に関する未発表の「総説」，「原著」，

論文原稿は 5 部と本誌に綴じ込みの「投稿論文チェ「短報」，および「特別企画（受賞講演）」，「論説」，

ックリスト」を，下記に（簡易）書留便または宅配「資料・情報」などを掲載する．なお，投稿論文の便で送付する．

採否は編集委員会の審査により決定する．

〒 170 − 0003

「総説」 は，一つのテーマに関連する多くの研究論

東京都豊島区駒込 1 − 43 − 9

文の総括，評価，解説などである．原則として編集委員会より寄稿を依頼する．

日本環境変異原学会誌編集係「原著」 は，変異原に関する独創的研究の原著論文

Tel．03 − 3944 − 2591

で，それ自身独立して価値ある結論あるいFax．03 − 3947 − 8073

は事実を含むものとする．陰性データも受け付ける．

駒込 TS ビル

インテルナ出版

5． 著作権
本誌に掲載された記事，論文などの著作権は日本環「短報」 は，新しい技術の紹介や価値あるデータを

境変異原学会に帰属するものとする．従って，本会含む短い報告とする．陰性データも受け付が必要と認めた場合は転載し，また外部から引用のける．

申請があった場合には，編集委員会において検討の「論説」 は，一つのテーマに関連する多くの研究論上許可することがある．ただし，著作者自身が自分文の総括，評価，解説などで，会員からのの記事，論文などの一部の複製，翻訳などの形で利投稿によるものとする．

用することを妨げるものではない．しかし，著作者「資料・情報」は，環境変異原に関する調査の結果自身であっても，全文を複製の形で他の著作物に利などをまとめたもの，および公開シンポジ

用する場合には，事前に文書にて学会長に申し出をウム，研究会の要旨などとする．
（Letter to Editor も受け付ける．）
2． 投稿資格
共著者のうちの 1 人は日本環境変異原学会会員でなければならない．ただし，招待寄稿の場合にはこの限りではない．
3． 論文原稿の書き方
論文原稿の用語は英語または日本語とし，最新の執筆規定に従い簡潔にわかりやすく書く．総説，一般
論文，論説は，写真・図表を含めて刷り上がり 8 頁

行い，許諾を求めなければならない．
6． 校正
著者校正は原則として原稿に対する誤植の訂正に限る．原稿にない加筆・変更はしないこと．
7． 著者負担金
1） 投稿料は無料とする．ただし頁数の超過分や多額の経費を要する図表の実費は著者負担とする場合がある．
2） カラー印刷等の特殊印刷のため付加的に発生する費用は著者負担とする．

以内．短報は 4 頁以内とする．ただし規定の頁数を3） 別刷りはすべて著者負担とする．別刷り希望者

超えることが明らかな場合は，事前に編集委員に相は著者校正時に添付する申込書に 50 部単位で

談する．

申し込む．

編集委員会からのお願い「環境変異原研究 Environmental Mutagen Research」への投稿論文の，投稿から印刷までの時間の短縮を目指し，投稿論文の査読を評議員にお願いすることになりました．それに伴い，投稿規定の見直しも行い，今後は年大会での発表と同様に，投稿論文の分野を著者に申告していただき，同一分野を登録していただいている評議員に査読していただくことになります．今回投稿時のチェックリストをお届けしますので，投稿論文と一緒に必ずお送り下さい．
現在 7 名の編集委員が分担して学会誌，Jems News の編集作業を行っていますが，それぞれ自分の仕事を抱え
ボランティアとして活動しています．そこで，会員の皆様の積極的な雑誌作りへの協力として，年大会で発表されたものを一報でも多く論文にまとめ，本学会誌に投稿していただきますようお願い致します．また，Jems Newsへの投稿，情報，意見，公募等もお願いします．
本誌の将来像に関する議論を進めております．英文誌化の話も出ており，編集委員を中心に検討を始めたとこ
ろですが，皆様のご意見を是非お聞かせいただきたく思います．どんな些細なことでも結構ですから，学会誌に関することでコメント，提案等がありましたら，編集委員まで E − mail にてお知らせください．編集委員一同環境変異原研究 執筆規定
1．用語は日本語または英語とする．
2．原稿は原則としてワープロを用いて作成する．
日本文の原稿：

10．図と写真は原図またはキャビネ大の光沢写真版とし，裏面に Fig. 1, 2, …および上下を鉛筆書きする．
11．表は上部に一連の番号 Table 1, 2, …と英文の表題を原稿は A4 判用紙に 1 行約 40 字，1 頁 30 〜 31 行

記入する（文頭のみ大文字）．脚注を要するときに表で印字する（刷り上がりの約 1/2 頁に相当する）．

示の語句の右肩にａ, ｂ, ｃ, …を付記し，表の下欄

ただし，要約は英文（300 語以内）とする．また，別に題名，著者名（フルネーム），所属機関名ならびに所在地を英文で付ける．
英文の原稿：

外にそれぞれの説明を記す．
12．本文中の文献引用は著者名および年号をもってする．
13．参考文献は筆頭著者名のアルファベット順に配列し，原稿は A4 判用紙にダブルスペースで印字（12 ポ雑誌の省略名は Chemical Abstracts の記載方法に従イント）する．1 頁 25 〜 27 行を標準とする．原う．記載順序は著者氏名，（年），題名，雑誌名，巻，稿は著者の責任において英語の添削訂正を受けた頁（単行本の一部引用の場合は著者氏名，（年），題名，ものに限る．

編者名，書名，発行所，発行地，頁）の順とする．

3．論文の記述は，第 1 頁は表題，著者名，所属および単行本そのものを引用する場合は，編者名あるいは所在地，第 2 頁は英文の要約（Summary）およびキ

著者名，（年），書名，発行所，発行地の順とする．

ーワード（英文 5 語以内，固有名詞や遺伝子名など

文献の記載方法は下記の例に従う．

で大文字の使用が必要な場合を除き，原則として小Ames, B.N., J. MaCann and E. Yamasaki（1975）

文字表記とする），第 3 頁以下，緒言（Introduction），

Methods for detecting carcinogens and muta-

実験材料および方法（Materials and Methods），結gens with the Salmonella/mammalian-micro-

果（Results），考察（Discussion）または結果および考some mutagenicity test, Mutat. Res., 31, 347-

察，結語（Conclusion），謝辞（Acknowledgments），
参考文献（References），表，図の説明および図の順

364．
Ashby, J., F.J. de Serres, M. Draper, M. Ishidate

序とする．ただし，総説の記述は，第 3 頁以下，緒Jr., B.H. Margolin, B. Matter and M.D. Shelby

言，1. ……，2. ……，結語，謝辞，参考文献，表，（1985）Overview and conclusion of the IPCS

図の説明および図の順序とする．なお図と表の説明

collaborative study on in vitro assay systems,

文はすべて英文とする．
4．学名，遺伝子記号などはイタリックとし，その他まぎらわしい記号については原稿に適宜指示を与える．
5．化学物質名は原則として英語とし，一般名を用いる．
また，化学物質の CAS 登録番号を記載する．文中に用いる英語の単語あるいは句は固有名詞を除いて小文字で書きはじめる（文頭の場合は大文字）．
6．数字は算用数字を用い，単位は慣用による省略記号を用いる．
7．略語を使用するときは，論文中にはじめて使用する
ときに完全な語とその略語を括弧内に示す．
8．句読点はカンマ（，）
およびピリオド（．）とする．
9．表，図は本文と別にし，それらの挿入箇所を本文のIn ： J. Ashby, F.J. de Serres et al.（Eds）,
Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens, Elsevier, Amsterdam, pp. 117-174．
Friedberg, E.C., G.C. Walker and W. Siede（1995）
DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press,
Washington, D.C.
藤川和男，梁治子，近藤宗平（1984）
ハエの翅毛

スポットテスト―近ごろ注目されている短期試
験法，環境変異原研究，6，107-113．
佐々木正夫（1983）環境変異原と染色体異常，外村晶（編），染色体異常，朝倉書店，東京，pp．
107-113．
松影昭夫（編）（1996）DNA 複製，修復と発癌，羊土社，東京．

右余白に明示する．グラフ，写真，線画等はすべて図とし，一連の番号 Fig. 1, 2, …を付し，説明文（英文）
を別紙に添える．

（改訂

2000 年 12 月）

投稿論文チェックリスト
論文ご投稿の際，この用紙に必要事項をご記入のうえ，添付してください．

論文名（日本語）：（英語）：

窓口著者名：
連絡先（住所）（TEL）（FAX）（E-mail）

分類（該当するものに印をつけてください）□ 突然変異のメカニズム□ 変異原の検出□ 環境汚染物質□ 抗変異原□ DNA 損傷（付加体）□ 変異原の代謝□ 変異原の修飾，発現□ 試験法の開発，改良□ その他（）

送付前のチェック項目□ 投稿規定，執筆規定に沿っていますか（特に引用文献）□ 英文校閲はお済みですか□ 投稿論文は 5 部ありますか編集後記本号の特別企画は前編集委員長の時に立案した．海外にも著者を求めたが，期限の関係から快諾が得られなかった．しかし出来上がってみると，この分野の最新情報を凝集することが出来たと思う．4 年間に渡り編集委員を務め他の委員の足手まといにならぬようにお手伝
いしてきたつもりだったが，結果はインテルナ出版の方々に随所で助けて戴いた．学会誌編纂に携わり痛感したことは原稿の集まり難さであった．会員の皆様のご投稿をお待ち致しております．
担当編集委員

編

集

委

矢嶋

信浩

員

森田

健（委員長）（2002 ─）〒 151 ─ 8566 東京都渋谷区千駄ヶ谷 4 ─ 6 ─ 15 GSK ビル
グラクソ・スミスクライン株式会社
Tel ： 03 ─ 5786 ─ 5067 Fax ： 03 ─ 5786 ─ 5223
E-mail ： takeshi.5.morita@gsk.com

矢嶋

信浩（1999 ─）〒 485 ─ 0059 愛知県小牧市小木東 3 ─ 45
雪印ラビオ株式会社・開発研究所
Tel ： 0568 ─ 77 ─ 3235 Fax ： 0568 ─ 76 ─ 1046
E-mail ： n-yajima@snowlabio.com

若田明裕（2001 ─）〒 174 ─ 8511 東京都板橋区小豆沢 1 ─ 1 ─ 8
山之内製薬株式会社・安全性研究所
Tel ： 03 ─ 5916 ─ 2177 Fax ： 03 ─ 3960 ─ 5141
E-mail ： wakata@yamanouchi.co.jp

山田

雅巳（1999 ─）〒 158 ─ 8501 東京都世田谷区上用賀 1 ─ 18 ─ 1
国立医薬品食品衛生研究所・変異遺伝部
Tel ： 03 ─ 3700 ─ 1141
（ext 282）
Fax： 03 ─ 3707 ─ 6950
E-mail ： myamada@nihs.go.jp

栗忍（2002 ─）〒 257 ─ 8523 神奈川県秦野市落合 729 ─ 5
財団法人 食品薬品安全センター・秦野研究所
細胞毒性試験班
Tel ： 0463 ─ 82 ─ 4751 Fax ： 0463 ─ 82 ─ 9627
E-mail ： wakuri.s@fdsc.or.jp

赤沼高橋

三恵（2000 ─）〒 187 ─ 0011 東京都小平市鈴木町 2 ─ 772（財）
残留農薬研究所・試験企画部
Tel ： 042 ─ 382 ─ 2146 Fax ： 042 ─ 383 ─ 7640
E-mail ： mie.a@viola.ocn.ne.jp

和彦（2002 ─）〒 467 ─ 8603 愛知県名古屋市瑞穂区田辺通 3 ─ 1
名古屋市立大学大学院薬学研究科
医薬品代謝解析学分野
Tel ＆ Fax ： 052 ─ 836 ─ 3780
E-mail ： takahasi@phar.nagoya ─ cu.ac.jp

評
赤沼 三恵
大塚 雅則
木苗 直秀
下位香代子
寺尾 良保
根岸 和雄
藤川 和男
望月 正隆
山添
康

荒木 明宏
大西 克成
後藤 純雄
祖父尼俊雄
長尾美奈子
根岸 友恵
降旗 千恵
森
秀樹
吉川 邦衛

議

員

宇野 芳文
葛西
宏
佐々木 有
高橋 和彦
中嶋
圓
能美 健彦
本間 正充
森
幸雄
若田 明裕

環境変異原研究第 24 巻平成 14 年 11 月 13 日

印

刷

平成 14 年 11 月 20 日

発

行

発

行

者

大澤
鎌滝
島田
田中
糠谷
林
松元
森田
若林

浩一
太田 敏博
哲也
川西 正祐
弘康
清水 英佑
憲穂
出川 雅邦
東雄
布柴 達男
真
早津 彦哉
郷六
宮川
誠
健
矢嶋 信浩
敬二（五十音順）

第3号

2002 年

日本環境変異原学会

発行責任者

林

製

インテルナ出版作真環境変異原研究

Environmental Mutagen Research目

Vol. 24 No. 3 2002

次

特別企画「食品ならびに食品成分による抗変異原性作用」「特別企画─食品ならびに食品成分による抗変異原性作用─」を企画するにあたって
矢嶋信浩……………………………………………………………………………………………………………… 111
乳酸菌を用いた発酵乳の抗変異原性
細野明義……………………………………………………………………………………………………………… 113
発がん抑制性フードファクター：食によるがん予防を目指して大東

肇……………………………………………………………………………………………………………… 123

抗変異原に関する研究
木苗直秀，増田修一………………………………………………………………………………………………… 129

第13回公開シンポジウム「環境変異原と遺伝子不安定性」
DNA Polymerase κ によるDNA損傷のバイパスと突然変異の誘発
大森治夫……………………………………………………………………………………………………………… 145
微生物由来のトランスリージョンDNAポリメラーゼ
能美健彦……………………………………………………………………………………………………………… 153
ほ乳類細胞におけるDNA 二本鎖切断修復と，p53によるゲノム安定化機構
本間正充……………………………………………………………………………………………………………… 161
ラットおよびヒト乳腺発がんにおける一塩基不安定性
大河内江里子，牛島俊和…………………………………………………………………………………………… 169

Letter to Editor
環境変異原研究の光と陰：これから進むべき道
鈴木孝昌……………………………………………………………………………………………………………… 179
Author Index ……………………………………………………………………………………………………………… 185
Keyword Index …………………………………………………………………………………………………………… 186

付 記
日本環境変異原学会

入会申込書
学生会員申込書

環境変異原研究

投稿規定
執筆規定