再構築培養表皮モデルを用いた遺伝毒性の評価

国立医薬品食品衛生研究所

小 島

安全性生物試験研究センター

肇 夫、新 井薬理部新規試験法評価室晶 子、北 條麻 紀

【Objective】 To evaluate a risk assessment of genotoxicity when human skin is affected by chemicals, we tried to performa Comet assay using a 3-dimensional human epidermal model (LabCyte EPI-MODEL, Japan).
【Materials & Methods】 Mitomycin C, methylmethanesulfonate (MMS) and 4-NQO (4-Nitroquinoline 1-Oxide) wereutilized as test chemicals. Each test chemical solution was applied directly to the surface of the models and treated for4 hours, then washed off and incubated for 20 hours after the treatment and maximal dosage was calculated according
to the cytotoxicity. As to the Comet assay, each test chemical solution refer to the cytotoxicity was applied to them andtreated for 4hr. Cells were detached by Liberase solution (Roche) or Trypsin solution (GIBCO), and an adequate cellsuspension was obtained.
【Results】More single cells could be efficiently retrieved using Trypsin solution, especially with treatment for 25min, thanusing Liberase solution. Comet signals mediated by Mitomycin C (150μM<) and 4-NQO were shown by our protocol.
However, those by MMS were not clear response.
【Discussion】We established a practical, rapid and easy Comet assay protocol using a 3-dimensional human epidermal
model. To define the difference in genotoxical action between the epidermal model and in vivo, it is necessary to perform
additional researches for minimal dosage of unknown chemicals that show genotoxicity to the human epidermis.

１．緒

試験法は 2009 年以降、化粧品原料の開発に実験動物を持言いた小核試験が利用できなくなる。その場合、多数検出さ安全性試験の中でも大きな比重を占める遺伝毒性試験にれる in vitro 試験の結果を受け入れ、新成分の開発を断念

は、遺伝子突然変異を評価する微生物を用いるエイムス試するならともかく、その検証を行うには、より実験動物に験や哺乳類の培養細胞を用いるマウスリンフォーマアッセ

近いモデルを用いてリスクを評価する必要がある。

イがある。また、染色体突然変異の評価には、分裂中期のそこで、より実験動物に近いモデルとして化粧品の安全

染色体構造を観察する哺乳類の培養細胞や実験動物を用い性を考慮した場合、成分が皮膚に直接暴露した際の遺伝毒る染色体異常試験や小核試験がある。これらの試験の中か性の検出を、3 次元培養表皮モデルを用いて調べられれば、ら、医薬品の安全性評価には、微生物を用いる復帰突然変リスクを評価できると考えた。評価系としては、作用機構異試験、哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験やマウが明確なコメットアッセイを用いることとした。コメット

スリンフォーマ試験ならびにげっ歯類を用いる小核試験のアッセイとは、培養細胞や動物組織をシングルセルに分散三試験が必須と定められている 。

し、アガロースゲルに包埋してアルカリ電気泳動にかける１）

一方、医薬部外品の有効成分又は添加剤については、遺ことにより、個々の細胞が受けた DNA 初期傷害を検出す

伝子突然変異および染色体異常の有無の確認を目的としたる手法である。図１に示すように、障害を受けた DNA の微生物および哺乳類の培養細胞を用いる in vitro 試験が求電気泳動像によりすい星が流れるように見えることから、められる。ただし、これらの試験で遺伝毒性が疑われた場コメットアッセイと名づけられた。この試験法では、非分合には、各々の目的に応じ動物の個体を用いる in vivo 試

裂細胞に対する遺伝毒性が評価できることや、感受性の異験の提出が求められるとされているなる細胞が混在する細胞集団でも細胞レベルで評価可能

2, 3）。しかし、in vitro

６）

試験の中で特に、哺乳類の培養細胞を用いるマウスリンフなこと、また、近年では、Honma ら

ォーマ試験および染色体異常試験は発がん性試験と比較し用いた簡便な in vitro コメットアッセイが考案されるなど、により培養細胞を４）て疑陽性が検出されやすい 。今後、 EU における化粧５）

品規制第 7 次改正により 、動物実験代替法が開発された
Ev a lu at i o n o f g e n o t ox i c it y u s i ng
3-dimensional human epidermal model
Hajime Kojima, Ph.D.
Japanese Center for the Va lidationof A lternat ive Met hods（ JaCVA M），
National Center for Biological Safety andResearch National Institute of HealthSciences（NIHS）− 57 −

図１

細胞に生じたコメット

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

% Tail Intensity の値が高いほど遺伝毒性が強いことにな有用な遺伝毒性試験として注目を集めている。
本研究では、3 次元培養ヒト表皮モデルを用いたコメッる。
２・２・２

トアッセイの試験法開発を目的として、実験を行った。

２・２・２・１

２．材料および方法
２・１

細胞解離条件の検討

培養皮膚モデルにリベラーゼ（Roche）で 30 分間処理７）

材料

２・１・１

条件検討

すればコメットを検出できるとの報告がある 。
3 次元培養表皮モデル

一方、培養皮膚モデルからの小核誘発の検出にはトリプ
８）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング（J-TEC）

シンが使われている 。どちらの条件がラボサイトに適し株式会社が製造販売している 3 次元培養ヒト表皮モデルているのか、リベラーゼ（0.28 Wunch Unit/HBSS）およLabCyte

EPI-MODEL12 または 24 を実験に用いた。図

びトリプシン（0.25%/0.02%EDTA リン酸緩衝液：PBS）

2 に示すように、本モデルは表皮構造を呈しており、培養溶液で 30 ～ 50 分処理後の①得られる細胞数 , ②解離溶液液と合わせキットとなっている。

が細胞に及ぼす遺伝毒性の有無を調べた。

本キット到着日あるいはその翌日から実験を開始した。
２・１・２

被験物質

次に、それぞれの解離条件から得られた細胞を用いてコメットアッセイを行い、解離溶液がモデルに及ぼすコメッマイトマイシン C（和光純薬株式会社）、メチルメタン

ト出現頻度を調べた。

スルフォネート（MMS: 和光純薬株式会社）および 4 ニト

２・２・２・２

ロキノリン N オキシド（４-NQO：和光純薬株式会社）を非水溶性物質の溶媒として用いるエタノールの細胞毒性溶媒に溶解してモデルに供した。

溶媒濃度の検討

およびコメットアッセイに及ぼす影響を検討した。細胞毒

MMC および MMS の溶媒としては蒸留水、4-NQO の溶媒としてはエタノール溶液を用いた。

性試験の条件を２・３・３に示す。エタノール溶液の濃度
３、６、12.5 および 25% で４時間処理した場合の条件を検討した。

２・２

試験法

２・２・１

２・２・３

コメットアッセイ基本操作

LabCyte６ウェルプレート（Falcon）の各ウェルの中に、キットに付いている培養液を加え、LabCyte EPI-MODEL12

被験物質を用いた細胞毒性の検出

EPI-MODEL24 を 37 ℃ の CO2 イ ン キ ュ ベ ー

ター中で 1 時間培養した後、溶媒および被験物質溶液 100μL を加え、4 時間処理後さらに 20 時間培養した。

を置いた後、37℃の CO2 インキュベーター中で１時間培

マイトマイシン C においては、限界溶解度である 1500養した。培養後、すぐに酵素処理してセルストレイナー

μM を最高濃度として、10 倍希釈系列を調整して細胞毒（Falcon）を通して単一細胞を得た。1×10 細胞 /mL に性 を 検 出 し た。MMS に お い て は、1800μM を 最 高 濃 度

PBS で調整した細胞懸濁液 10μL を寒天 0.5％液 80μL ととして、10 倍希釈系列を調整した。４-NQO においては、ともに、スライドグラス（マツナミ）にのせ、Lysis 緩衝

100％エタノールに溶解した 10 mM 溶液をエタノールの最液中で 1 時間処理後に電気泳動を行った。電気泳動条件は、終濃度が２％になるように加え（最高処理濃度 200μM）、pH 13 の泳動液（４℃）で 15 分放置した後、300 mA/90V10 倍希釈系列を調整した。

6PBS で LabCyte

で 15 分間とした。得られた細胞を 70％エタノール溶液でEPI-MODEL24 を 4 回 洗 浄 し、MTT洗浄し、乾燥後、SYBR gold（1 : 10000）で染色し、スラ（sigma）0.5mg/mL を含む培養液で 3 時間処理した後、モイド当り 100 個観察した。コメットシグナルの検出には、デルをイソプロパノールで抽出した。溶媒および被験物『COMET ASSAY Ⅳ（PERCEPTIVE, UK）』という解析

質 の 抽 出 液 0.2 mL を 96 ウ ェ ル に 移 し、OD570 お よ び

ソフトを使用し、% Tail Intensity（コメット部分の蛍光OD650 における吸光度を測定し、以下の式から細胞生存強度／ 1 細胞あたりの DNA 蛍光強度）を求めた。つまり、率を求めた。
OD =［570nm OD 被験物質 – 570nm OD ブランク］−［650nm OD 被験物質 – 650nm OD ブランク］
細胞生存率（%）＝
２・２・４

OD 被験物質×100
OD 溶媒

被験物質を用いたコメットの検出

図３に試験法の概略を示す。LabCyte EPI-MODEL12に溶媒および被験物質溶液 200μL ウェルを加え、4 時間
図２

LabcyteEPI-MODEL24 の HE 染色処理した後、PBS で 3 回洗浄した。細胞毒性で得られた− 58 −

再構築培養表皮モデルを用いた遺伝毒性の評価

図３

試験方法概略結果から最高適用濃度を決定し、それぞれ 10 倍希釈系列

様々なタイプの確率分布に従うわけだが、箱ひげ図はそのを調整してコメットアッセイを実施した。

ような仮定に関係なく、データの分布を表現している。箱

３．結
３・１の各部分の間隔から分散や歪度の程度、また外れ値を示し果ている。

解離条件の検討

それぞれの解離条件でラボサイトを処理し、１ウェルか３・３被験物質を用いた細胞毒性の検出ら回収することのできた細胞数をカウントした。その結果、

図７～９に３物質の細胞生存率の結果を示した。

図４に示すように、トリプシン処理によりリベラーゼよ図７に示すように、マイトマイシン C の限界溶解度はりも 20 倍以上多くの単一細胞を得ることができた。また、

1500μM であり、4 時間暴露後、20 時間培養しても細胞毒トリプシンの処理時間を 35 分、50 分と延長しても得られ性は全く検出されなかった。よって、コメットアッセイでる細胞数に差はなかった。また、リベラーゼ , トリプシン

は 1500μM を最高濃度として、10 倍希釈系列を調整して共に細胞毒性を誘導することはなかった。しかし、図５に検出することにした。

示すように、トリプシンの処理時間を 50 分に延長するとコメットシグナルが検出されるようになった。

MMS は 180μM 以上の濃度において、図 8 に示すように強い細胞毒性を認めた。よって、18μM を最高濃度とし以上の結果から、ラボサイトの細胞解離には、トリプシンの短時間（25 分）処理が適していることが明らかとなて、10 倍希釈系列を調整してコメットアッセイを行うことにした。

った。

４-NQO は最高濃度 200μM のみにおいて、図 9 に示すように細胞毒性を認めた。よって、20μM を最高濃度とし３・２

溶媒濃度の検討て、10 倍希釈系列を調整してコメットアッセイを行うこエタノールの細胞毒性は 25％まで検出されなかった（デとにした。

ータは示していない）。しかし、図６に示すように、12.5%以上の濃度で中央値に変化はないものの、コメットを引き起こす細胞を認めた。以上の結果から、溶媒の最適濃度は６３・４

被験物質を用いたコメットの検出試験

コメットアッセイを実施する被験物質の最高処理濃度は、％以下、可能な限り薄くすることを目指し、２％と設定した。

４時間処理後、さらに 20 時間培養した場合、細胞が 50％

ちなみに、箱ひげ図は、最小値、第 1 四分位点、中央値、以上生存している濃度でなければいけないと設定した。そ第 3 四分位点と最大値を示している。母集団は実際にはの最高濃度から公比 10 で希釈して得られた 3 被験物質に− 59 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

おけるコメットアッセイの結果を求めた。その結果、図た。一方、図 11 に示すように、MMS のコメット出現頻

10 に示すようにマイトマイシン C では 150μM 以上の濃度の増加は検出されなかった。また、図 12 に示すように、度で濃度依存的なコメット出現頻度の増加が明らかとなっ

４-NQO のコメット出現頻度は 20μM でわずかに増加した。

図４

解離条件の検討

酵素処理による単一細胞出現頻度

図５

解離条件の検討

酵素処理によるコメット出現頻度

120100Intensity (%)

80604020006312.5Conc. (%)

図６

エタノールのコメット出現頻度− 60 −25再構築培養表皮モデルを用いた遺伝毒性の評価

マイトマイシン C の細胞毒性試験結果

MMS の細胞毒性試験結果

図９4-NQO の細胞毒性試験結果

100908070605040302010001.515150Conc. (μM)

図 10 マイトマイシンＣによるコメット出現頻度
90807060
Intensity (%)

Intensity (%)

図８

図７50403020
10001.818Conc.（μM）

図 11MMS によるコメット出現頻度− 61 −1500

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 20097060

Intensity (%)

50403020
10000.2

220Conc.（μM）

図 12４．考４-NQO によるコメット出現頻度

Maurici D, Meunier JR, Müller L, Nohynek G, Parry J,察Parry E, Thybaud V, Tice R, van Benthem J, Vanparys

酵素処理条件、最適な溶媒濃度を決定でき、3 次元培養

P, White P.
（2007）How to reduce false positive results

表皮モデルを用いたコメットアッセイの試験法開発というwhen undertaking in vitro genotoxicity testing and

目的を達成できた。マイトマイシン C は DNA のクロスリ

thus avoid unnecessary follow-up animal tests: Report ofンカーとして遺伝毒性を起こし、MMS や 4-NQO は DNA

an ECVAM Workshop. Mutat Res. 628（1）: 31-55

をアルキル化して遺伝毒性を引き起こす著名な遺伝毒性

５）Commission Staff Working Documents（2004） ;物質である。しかし、得られた結果からマイトマイシン CTime Tables for the phasing-out of animal testing inおよび 4-NQO はコメット出現頻度を増加させるが、MMS

the framework of the 7 Amendment to the Cosmetics

はその強い細胞毒性からコメットを明確に引き起こさないDirective（Council Directive 76/768/EEC）; EN, SECと判断した。

（2004）1210

th

以上の結果から、遺伝毒性物質の検出感度における課

６）Honma M.（2007） A Multi-endpoints in vitro

題も明らかになった。今後は、マイトマイシン C、MMS、

Genotoxicity Test SAYstem Consisting of Comet,４-NQO 以外の遺伝毒性物質についても、同様の検討を行

Micronuclei and Gene Mutation Test, 6

うとともに、小核の検出を行う予定である。得られたデー

Congress on Alternatives & Animal Use in the Life

タベースからを他の in vitro および in vivo データと比較しSciences, abstract pp.88.て、遺伝毒性に対する感受性にどの程度違いがあるのかをthWorld７）Flamand N, Marrot L, Belaidi JP, Bourouf L,

明らかにする予定である。

Dourille E, Feltes M, Meunier JR.（2006）Development

なお、これらの成果の一部は日本環境変異原学会第 36of genotoxicity test procedures with Episkin, a９）回年次大会（2007 年 11 月、北九州）にて発表した 。

reconstructed human skin model: towards new tools
for in vitro risk assessment of dermally applied（参考文献）

compounds? Mutat Res. 606（1-2）: 39-51.

１）医薬品非臨床試験研究会監修（2002）医薬品非臨床試

８）C u r r e n R D , M u n G C , G i b s o n D P , A a r d e m aMJ.（2006）Development of a method for assessing験ガイドライン解説、薬事日報社

micronucleus induction in a 3D human skin model２）化粧品・医薬部外品製造販売ガイドブック 2008、薬（EpiDerm）．Mutat Res. 607（2）: 192-204.

事日報社
３）厚生労働省医薬食品局審査管理課（2006）医薬部外品

９）Arai S, Saitoh M, Tajashima Y, Honma M, Kojimaの製造販売承認申請及び化粧品基準改正要請に添付する

H（2007）A new trial for in vitro Comet assay using

資料に関する質疑応答集（Ｑ＆Ａ）について

3-dimensional human epidermal model, 36４）Kirkland D, Pfuhler S, Tweats D, Aardema M,Corvi R, Darroudi F, Elhajouji A, Glatt H, Hastwell P,Hayashi M, Kasper P, Kirchner S, Lynch A, Marzin D,− 62 −thAnnualMeeting of the Japanese Environmental Mutagen
Society, Abstracts, p111.