基礎細胞学III
後期水曜1限 E131

• 方針
– 自分が担当分（5/15）の単位は原則的には出します。

• 出席– フルネームで名簿に署名すること。
– 代筆不可。
– 遅刻は入室時間を記入すること（自己申告）。

• 小テスト（11/4 担当の最終回）– 基礎、実験原理が中心、準備不要。
– 人の解答を絶対写さないこと。
– 自分の言葉で書くこと。

基礎細胞学III
後期水曜1限 E131
h?p://25.media.tumblr.com/tumblr_lcn6IAey11qezvqko1_500.jpg

細胞周期
細胞分裂
細胞死
遺伝がん

杉山伸

10/7, 10/14, 10/21

杉山伸

10/28, 11/4

荒木聡彦
松本邦弘
松本邦弘

杉山伸 発生成長制御学グループ講師 E207 内線5039
ssugiya@bio.nagoya-u.ac.jp

教えること•細胞周期とその制御因子の発見 10/7
•細胞周期の制御機構 10/14•S期の制御とM期開始の制御 10/21•有糸分裂のメカニックス 10/28•細胞周期の特殊例 11/4 （小テスト）

教えないこと• 原核生物の細胞周期は取り上げない• 減数分裂は取り上げない• DNA複製は取り上げない図の出典
EssenUal 細胞生物学 原書第3版（Bruce Alberts他著、中村桂子・松原謙一監訳、南江堂、2011年）
細胞の分子生物学 第5版（Bruce Alberts他著、中村桂子・松原謙一監訳、Newton Press、2010年）
The Cell Cycle an IntroducUon. Andrew Murray and Tim
Hunt. Oxford Univ. Press 1993
ECB

Wikipedia

教科書

MBoC

高価だけど、レフェランス本としては必要。

本日：細胞周期とその制御因子の発見
コンセプト

1 細胞周期とは何か?
2 細胞周期の理解の重要性。
3 細胞周期制御機構の存在を明瞭にした実験。
4 細胞周期制御因子の発見
キーワード
G1期、S期、G2期、 M期、間期、Cyclin、 MPF、Cdk、温度感受性変異

細胞周期とは？

h?p://25.media.tumblr.com/tumblr_lcn6IAey11qezvqko1_500.jpg

細胞周期って何？
What is the cell cycle？

培養細胞

ウニ

h?p://www.lonza.com/

h?p://worms.zoology.wisc.edu/urchins/SUcleavage_montage.jpg

h?p://geneUcssuite.net/ﬁles/Cell%20mulUplicaUon.jpg

どんな細胞も分裂を繰り返して増える

細胞周期の長さ

カエル卵割
酵母
小腸上皮繊維芽細胞
肝細胞

ECB 611頁
一般的に：

細胞周期で特徴的なのは有糸分裂(Mitosis)
h?ps://
upload.wikimedia.org/
wikipedia/commons/f/fe/
Walther_ﬂemming.gif

DNAtubulin

ドイツのWalther Flemmingが1882年に記載

h?ps://
upload.wikimedia.
org/wikipedia/
commons/6/6d/
Zellsubstanz-KernKerntheilung.jpg
h?p://25.media.tumblr.com/tumblr_lcn6IAey11qezvqko1_500.jpg

メンデルの法則が有名になってなかったので、染色体の分配の遺伝的意義には気付いていなかった。

細胞周期で特徴的なのは有糸分裂(Mitosis)

DNAを染色する
蛍光色素は他に何がある？

DNAtubulinh?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/
1/14/1D30_DNA_DAPI.png

DAPI (4‘,6-diamidino-2-phenylindole: DNA二重螺旋の小溝に結合する蛍光色素

h?p://25.media.tumblr.com/tumblr_lcn6IAey11qezvqko1_500.jpg

チューブリン（微小管蛋白質）
GFPか抗体で検出

h?p://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/cells/
images/Cytoskel.gif

細胞周期には見かけ上は2つの時期がある

M期/MitoUc phase (分裂期)
間期/Interphase （分裂の間）

MBoC 1055頁
間期に遺伝子の複製がおこる：S期

細胞周期では毎回すべての染色体のコピーが作られ2つの細胞に正確に分配される。
h?p://www.nature.com/
EssGen3-4_HumanChromosomesFi
g3_MID_0.jpg

例外は？
細胞周期は遺伝情報を増やして分ける機構として捉えることができる
今日の重要概念 1

S期とM期に注目した細胞周期でも実際はS期とM期の間には2つの間隔（Gap）がある

MBoC Fig17-04

MBoC 1055頁

細胞周期には４つの時期がある

G1、S、G2、M
MBoC 1054頁（細胞周期制御に注目すると明瞭）

MBoC 1055頁
MBoC Fig17-04

細胞周期の４つの時期のうちわけ
G1(G0)期 Gap1 phase ：休止または細胞成長、細胞周期のスタート
S期 Synthesis phase: DNA合成期
G2期 Gap2 phase：細胞成長（ない細胞もある）

間期

M期 分裂期 MitoUc phase： 有糸分裂+細胞質分裂

M期

単細胞生物も多細胞生物も真核生物は細胞周期の機構が進化的に保存されている。

MBoC 1056頁
h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/
S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg

MBoC 1058頁

個体発生では細胞周期が厳密に制御されている。

今日の重要概念 ２

細胞分裂と細胞分化の関係

未分化：分裂盛ん

分化：分裂低下（停止）細胞周期研究の重要性

細胞周期制御が破綻したらどうなる？

h?p://www.nature.com/principles/ebooks/principles-of-biology-104015/9523064

例えば：乳癌 Breast Cancer
今日の重要概念 ３

細胞周期
Cell cycle

培養細胞

ウニ

一般に細胞は何回分裂する？
h?p://www.lonza.com/

h?p://worms.zoology.wisc.edu/urchins/SUcleavage_montage.jpg
h?p://geneUcssuite.net/ﬁles/Cell%20mulUplicaUon.jpg

どんな細胞も分裂を繰り返して増える

Hayﬂick limit (1965)
Hayﬂick限界

みなさんの体の細胞は平均してあと何回分裂出来る？

h?p://images.the-scienUst.com/content/ﬁgures/images/yr1997/may/may_art/hayﬂick.jpg

知っている？

ヒト培養細胞は50回ほどで分裂停止.
個々の細胞にも寿命がある？
分裂停止=寿命？

人間の体の細胞数は？
60兆個?
（1013-14 = おおよそ 246）
平均分裂回数 47回
回数の余裕はあと数回？

h?ps://en.m.wikipedia.org/wiki/Major_systems_of_the_human_body#/
media/File%3AHuman_Body.jpg

Hayﬂick limit (1965)
Hayﬂick限界

h?p://images.the-scienUst.com/content/
ﬁgures/images/yr1997/may/may_art/
hayﬂick.jpg

ヒト培養細胞は50回ほどで分裂停止.
個々の細胞にも寿命がある？
分裂停止=寿命？
どうして50回で分裂は停止するのか？

DNA複製の機構を考えると….

染色体の末端で片鎖の複製が不完全(: end structures of chromosomes)
片方のDNA鎖では

h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/
commons/8/8f/DNA_replicaUon_en.svg

複製が不連続and DNA replicaUon「岡崎フラグメント」（100-200塩基）

h?p://telomereinformaUon.com/images/
imgNoblePrizeFig1.jpg“End ReplicaUonProblem”
Reiji and Tsuneko Okazaki

DNA複製の度に染色体が短くなる!

The telomere theory
老化のテロメア仮説

年齢とともにテロメアが短く

h?p://bioenv.gu.se/digitalAssets/1311/1311740_bpop_telomeres_picture3.jpg
h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4a/Telomere_caps.gif

テロメア：染色体末端の構造

染色体は複製の度、短くなる.

今日の重要概念 ４
h?p://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/telomere3.gifHayﬂick limit (1965)
Hayﬂick限界

h?p://images.the-scienUst.com/content/
ﬁgures/images/yr1997/may/may_art/
hayﬂick.jpg

ヒト培養細胞は50回ほどで分裂停止.
個々の細胞にも寿命がある？
分裂停止=寿命？
どうして50回で分裂は停止するのか： テロメア仮説（染色体を安定させる末端（テロメア）が無くなる）

ここから別の話し…

細胞周期研究の先駆的な実験
周期の異なる細胞を融合させると、細胞質中の因子が核に作用して位相を変更させる場合もあれば変更しない場合もある。
h?p://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0304419X97000334-gr1.jpg

法則性ある？

Johnson, R.T. & Rao, P.N., Mammalian Cell Fusion:
InducUon of Premature Chromosome CondensaUon inInterphase Nuclei.
Nature 226, 717–722 (1970)•細胞質中の核に作用する制御因子の存在が示唆•S期の細胞質はG1期の核をS期に進める。
•G2期の細胞質はS期の核をG2期に進められない。

細胞周期研究の先駆的な実験
周期の異なる細胞を融合させると、細胞質中の因子が核に作用して位相を変更させる場合もあれば変更しない場合もある。
細胞融合

h?p://www.cosmobio.co.jp/
export_e/products/cells/
products_ISK_20070518/
CF_02.gif

ウィルスやPEG(polyethylene glycol)で処理すると融合が誘導される。一部のウィルスはそもそも細胞融合で感染。PEGの作用機構は不明。
Johnson, R.T. & Rao, P.N., Mammalian Cell Fusion: InducEon ofPremature Chromosome CondensaEon in Interphase Nuclei.
Nature 226, 717–722 (1970)

ウィルスはどうやって細胞融合を引き起こす？

MBoC 1506頁
Figure 24-24 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

MBoC 1497頁

細胞周期研究の先駆的な実験
A.

S期の細胞とG1期の細胞を融合させるとG1期の核でDNA複製が誘導される。

現象を整理しよう
h?p://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0304419X97000334-gr1.jpg

B. しかし、S期の細胞とG2期の細胞を融合させるとG2期の核で２回目のDNA複製は誘導されない。
C.

S期の細胞とG2期の細胞を融合させるとG2期の核のM期への進行が阻害される。

G1 → S → G２ → M → G1

Johnson, R.T. & Rao, P.N., Mammalian Cell Fusion: InducEon ofPremature Chromosome CondensaEon in Interphase Nuclei.
Nature 226, 717–722 (1970)M

細胞周期研究の先駆的な実験(i) S期の細胞にはG1期の細胞のDNA複製を誘導する細胞質因子がある。
Licensing Factor(ii) G1期の細胞はDNA複製ができるけど、G2期の細胞はDNA複製ができない。
再複製防止機構

わかったことを整理しよう
h?p://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0304419X97000334-gr1.jpg(iii) S期の細胞にはG2期の細胞のM期への進行を防ぐ細胞質因子がある。
Check Point機構(iv) G2期の細胞はM期を経るとDNA複製が誘導可能になる。
リセット機構来週以降解説Johnson, R.T. & Rao, P.N., Mammalian Cell Fusion: InducEon ofPremature Chromosome CondensaEon in Interphase Nuclei.
Nature 226, 717–722 (1970)M

細胞周期の研究方法

Cyclin と Cdk の発見

細胞周期の研究には様々な実験材料が使われる
カエル卵=大きい細胞(直径1mm)

出芽酵母

h?p://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f05.jpg

h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d9/
S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg

h?p://www.lonza.com/

培養細胞

細胞周期が同調し h?p://worms.zoology.wisc.edu/urchins/た細胞が得られる SUcleavage_montage.jpg
材料が適している。
ウニ

フローサイトメーターで見た細胞周期

細胞数

出芽酵母

h?p://www.abcam.com/ps/CMS/Images/FlowCytometry-how%20it%20works-Diagram.jpg

h?p://www.lonza.com/

フローサイトメトリー/Cell
Sorterの原理

培養細胞周期の揃ってない細胞を分別すことが可能

CDNA 量細胞周期の研究には様々な実験材料が使われる
カエル卵=大きい細胞(直径1mm)

出芽酵母

h?p://www.lonza.com/培養細胞

h?p://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f05.jpg

細胞周期が同調した細胞が得られる材料が適している。

h?p://worms.zoology.wisc.edu/urchins/
SUcleavage_montage.jpg
h?p://worms.zoology.wisc.edu/urchins/
SUcleavage_montage.jpg

ウニカエル卵=大きい細胞(直径1mm)h?p://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f05.jpg

カエル卵細胞質をつかってin vitro (試験管内)で細胞周期を再現することが可能。

アフリカツメガエ
ル卵は細胞周期が同調する巨大細胞

h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/
commons/8/83/Xenopus_laevis_1.jpg

生化学的な解析（精製実験など）に適している。
MBoC 1058頁

h?p://www.brh.co.jp/s_library/j_site/scienUstweb/no25/img/
face.jpg

1971年

MPF(MaturaUon PromoUng Factor)の発見
1971年

h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d8/
Rana_sphenocephala.
jpg

Rana pipiens
ヒョウガエル/
Leopard FrogECB 616頁

G2期
Progesterone
処理卵細胞皆さんが知っている中でこれと似た実験は何？

h?p://www.brh.co.jp/
s_library/j_site/
scienUstweb/no25/img/
face.jpg• 卵巣から摘出した未成熟卵をプロゲステロン（黄体ホルモン）処理
すると、減数分裂途中まで細胞周期が進行して停止。
• M期の受精卵の細胞質を微量注射すると有糸分裂（減数分裂）が誘導される。
•間期の受精卵の細胞質を注射しても効果無し

Yoshio Masui 増井 禎夫
京大出身
1971当時Yale大学
後にToronto大学（カナダ） ECB 616頁

卵成熟の減数分裂に限らず、一般に有糸分裂を誘導させることが判明
細胞周期に依存した活性精製が試みられた(当然)1971• MPFの発見は1971年。
• その精製は1988年 （別の研究グループ）。
• その間に他の材料での研究が進展。
では、MPFはなんだったのか？

細胞周期の研究には様々な実験材料が使われる

カエル卵=大きい細胞(直径1mm)

出芽酵母

h?p://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/ch03f05.jpg

h?p://www.lonza.com/

培養細胞

細胞周期が同調した細胞が得られる材料が適している。

h?p://worms.zoology.wisc.edu/urchins/
SUcleavage_montage.jpg

ウニh?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/2d/
Echinometra_mathaei_MHNT_Philippines.jpg

ウニ！

同調した細胞が簡単に得られるKCl処理

h?p://www2s.biglobe.ne.jp/~nkazu/jugyou/image/uni_jusei/Resized800/sDSCN0920.jpg

h?ps://upload.wikimedia.org/
wikipedia/commons/4/48/
Sea_urchin_eggs.jpg

h?ps://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/images/b/b6/Sea_Urchin_early_embryo_cleavage_pa?ern.jpg

Tim Hunth?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/
commons/a/a3/Tim_Hunt_at_UCSF_05_2009_%284%29.jpg

Wood’s Hole
海洋学研究所h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/
commons/c/c6/
Marine_Biological_Laboratory%2C_Woods_Hole_by_Pam_Wilmot.jpg

ウニで受精後に新規合成される蛋白質を調べたら，一般の蛋白質が徐々に増加するのに対し、細胞周期に依存して劇的に増減する蛋白質があった（Cyclin）。1983年
The Cell Cycle an IntroducUon 25頁

h?p://www.cell.com/cell/abstract/
S0092-8674(08)00888-X

方法：放射性標識したアミノ酸を添加して蛋白質に取り込ませる事で新規合成された蛋白質を検出可能にし、ゲル電気泳動での分子量で識別。

SDS-PAGEで蛋白質を分子量に応じて展開

35S-メチオニンの取り込みで新規合成の蛋白質だけが放射性標識される。

ECB 167頁

Tim Hunt

Wood’s Hole
海洋学研究所ウニで受精後に新規合成される蛋白質を調べたら，一般の蛋白質が徐々に増加するのに対し、細胞周期に依存して劇的に増減する蛋白質があった（Cyclin）。1983年

h?p://www.cell.com/cell/abstract/
S0092-8674(08)00888-X

方法：放射性標識したアミノ酸を添加して蛋白質に取り込ませる事で新規合成された蛋白質を検出可能にし、ゲル電気泳動での分子量で識別。
h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/e/ed/Nobel_Prize.png

2001 生理医学賞

どうしてサイクリンと命名されたのか？
h?p://visit-hungary.com/site/upload/2009/12/Cycling.jpg"By the way the name cyclin,
which I coined, was really ajoke, it's because I like
cycling so much at the Ume
but they did come and go in
the cell..."ECB 614頁

サイクリンは酵母で同定された
Cdk1 に結合して制御

ECB 614頁

どうやってCdk は発見されたのか?

分裂酵母

出芽酵母

MBoC 1056頁

The size and shape of yeast indicate the phase of cell cycle
酵母では細胞のサイズと形から細胞周期の位相がわかる。
(possible with live cells/活きた細胞で可能)
Figure 17-5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

温度感受性変異という便利なもの（出芽酵母など）高温にすると変異遺伝子が本来働く時期に細胞周期が停止し、その時期の細胞が蓄積する。
常温ではいろんな周期の細胞がある。

MBoC 1057頁

低温に戻せば細胞周期は一斉に再開する。

温度制御で細胞周期を同調させらえる。

温度感受性変異 (Temperature-sensiUve mutaUons)の起きる原理•蛋白質は高次構造が機能に重要•高次構造は高温ほど不安定になる•高次構造維持に重要なアミノ酸の置換
変異が起こると高温感受性になり易い•低温感受性よりも高温感受性変異が得や
すい
h?p://jb.asm.org/content/193/23/6639/F3.large.jpg

例：サルモネラ菌のRNaseE の温度感受性変異の変異箇所は同一蛋白質内の異なる領域が接触している箇所

今日の重要概念 4

野生型は温度を30℃から36℃にしても細胞周期は進行する。

出芽酵母温度感受性変異を使って沢山の細胞周期制御遺伝子を同定
h?p://images.the-scienUst.com/content/
ﬁgures/images/yr2003/apr21/hartwell.jpg

温度感受性の細胞周期突然変異を探す

細胞周期の特定の時期に働く遺伝
子の温度感受性変異は細胞周期の特定の時期に止る。
（図ではG1, cdc28）
h?ps://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle

一般の（細胞周期性でない）温度感受性変異は細胞周期のいろんな時期に止る。
The Cell Cycle an IntroducUon 32頁

米国：Lee Hartwell

酵母ではこの種の変異をCdc(Cell divisioncycle)変異と呼び、32遺伝子座が知られている。
2001 生理医学賞

酵母の温度感受性変異を使って一番重要な細胞周期制御遺伝子を同定

The Cell Cycle an IntroducUon 49頁

イギリス：Paul Nurse

原因遺伝子の特定

h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/
a/ac/Paul_Nurse_portrait.jpg•いろんな遺伝子を導入し、•高温での生育を救済するものを特定する。
•得られた中でcdc2が最も有名。
別名Cdk1(Cyclin-dependent kinase 1)•出芽酵母cdc28遺伝子で分裂酵母cdc2変異を救済でした。
出芽酵母cdc28=分裂酵母cdc2: 進化的に保存。
後にヒトCdk1も同定。
h?ps://upload.wikimedia.org/wikipedia/

commons/b/b3/PBB_Protein_CDK2_image.jpg

2001 生理医学賞

MPF(MaturaUon PromoUng Factor)

MPFの実体はCdkとサイクリンの複合体だった!
Yoshio Masui 増井 禎夫

今週のまとめ

カエル卵からMPF(実験発生学)
細胞周期には４つのPhase

酵母から
Cdk
（遺伝学）

ウニからサイクリン（生化学）

細胞融合実験
から制御因子の存在（細胞学）

G1期、S期、G2期、 M期、間期、サイクリン、 MPF、Cdk

本日：細胞周期とその制御因子の発見
1 細胞周期とは何か?
2 細胞周期の理解の重要性。
3 細胞周期制御機構の存在を明瞭にした実験。
4 細胞周期制御因子の発見
キーワード
G1期、S期、G2期、 M期、間期、Cyclin、 MPF、Cdk、温度感受性変異• 細胞周期は遺伝情報の複製と分配が中心• 癌は細胞周期制御の異常• 細胞増殖と細胞分化の関係• Hayﬂick限界とテロメア仮説• 温度感受性変異の仕組み

質問は？

身につけて欲しいこと
最低限の知識（専門用語）
研究法の論理の理解