ヒト培養表皮におけるアスコルビン酸の経皮吸収および紫外線 UVB による細胞障害に対する予防、回復効果の検討
東京都健康長寿医療センター研究所

近藤嘉高

Several studies have reported the effects of vitamin C (L-ascorbic acid, AA) on ultraviolet B (UVB)-induced cell damage
using cultured keratinocytes. However, the epidermis consists of multiple cell layers, and the effect of AA on UVB-induced
damage to the human epidermis remains unclear. Therefore, we investigated the effect of AA on UVB-induced skin damage
using reconstituted human epidermis. The reconstituted human epidermal surface was treated with 100 and 500 mM AA
and cultured for 3 h before (pre-AA treatment) or after (post-AA treatment) 120 mJ/cm 2 UVB irradiation. Pre- and postAA treatments of the epidermal surface suppressed UVB-induced cell death, apoptosis, DNA damage, reactive oxygenspecies (ROS) production, and the inflammatory response by downregulating tumour necrosis factor-α (TNF-α) expression
and release. Moreover, the pre-AA treatment was more effective at preventing UVB-induced skin damage than the post-AAtreatment. In summary, pre- and post-AA treatments of the epidermis prevent UVB-induced damage.

1. 緒のくらい表皮に吸収されるのか、吸収された表皮のアスコ

言

ルビン酸は活性酸素種を消去して細胞障害やアポトーシス、皮膚は、表皮、真皮、皮下脂肪という構造をとる。表皮炎症を抑制するのか、塗布するタイミングはいつが効果的の角質層は、保湿や異物の侵入を防ぐバリア機能を担う。

なのかなど、科学的な知見が不足しているのが現状である。

地上に届く太陽光には、表皮から真皮上層までしか到達し本研究では、ヒト正常皮膚細胞より再構築された 3 次元培ない紫外線 UVB（280 - 320 nm）と、真皮深層まで到達す養表皮を用いて、アスコルビン酸の経皮吸収および UVBる UVA（320 - 400 nm）が含まれる。私たちは、紫外線をによる日焼けに対する予防、回復効果を明らかにする。

浴びると日焼け、すなわち、皮膚が赤く炎症を起こす急性2. 方症状とメラニン色素の沈着が起こる。この時、表皮細胞で発生する種々の活性酸素種によって、細胞障害さらにはア法

2 . 1. ヒト培養表皮へのアスコルビン酸の取り込みポトーシスが起こり、炎症が惹起される。また、表皮細胞初めに、皮膚に塗布したアスコルビン酸が経皮吸収されるの DNA は、紫外線により傷害されて、その蓄積は皮膚がかどうかを明らかにするため、ヒト正常皮膚細胞より再構築んの原因となる。従って、第一の対策としては、日焼け止された 3 次元培養モデルの表皮を用いてアスコルビン酸の経めを皮膚に塗り、サンスクリーンによって紫外線を遮断する皮吸収を調べた。培養カップ内のヒト培養表皮は、最下層ことが重要である。しかし、完全には紫外線を遮断できなの基底膜側にはアスコルビン酸を含まない培地を入れ、最いことから、第二の対策として、細胞内で発生する活性酸上層の角層はバリア機能を持つため空気と接した状態で培素種を消去できる抗酸化物質を摂取することが肝要となる。

養した。表皮上にアスコルビン酸ナトリウム溶液（0 , 10 , 100 ,アスコルビン酸（ビタミン C）は、紫外線で生ずる一重項500 , 1000 mM）を添加して、3 時間後および 6 時間後に表酸素をはじめ、種々の活性酸素種を消去できる水溶性の強皮を回収した。表皮中の総アスコルビン酸（アスコルビン酸と力な抗酸化物質である。私たちヒトは、進化の過程でアスデヒドロアスコルビン酸）は、高速液体クロマトグラフィーおコルビン酸の合成能を欠損したため、食事など外からアよび電気化学検出器を用いた方法により高感度に定量した。

スコルビン酸を摂取する必要がある。従って、紫外線対策としては、アスコルビン酸の経口摂取にくわえて、アスコ

2 . 2 . UVB 照射によるヒト培養表皮の細胞障害評価

ルビン酸が含まれる日焼け止めを利用することも有効であ

次に、ヒト培養表皮に UVB（50 , 80 , 120 mJ/cm 2）を照ろう。しかし、ヒトの皮膚に塗布したアスコルビン酸がど射して、24 時間後に細胞障害を評価した。細胞生存率は、MTT アッセイで測定した。表皮の厚さは、培養表皮の凍結切片をヘマトキシリン・エオシン染色した後、染色画像

Protective effect of pre- and post-vitamin
C treatments on UVB-irradiation-induced
skin damageの表皮厚を測定した。表皮の層構造は、凍結切片を用いたシトルリン化タンパク質や filaggrin、loricrin、keratin10、keratin 14、collagen type IV、trichohyalin の 免 疫

Yoshitaka Kondo

蛍光染色により評価した。アポトーシス頻度は、凍結切Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology

片を TUNEL 染色した後、TUNEL 陽性細胞数を定量した。

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ヒト培養表皮におけるアスコルビン酸の経皮吸収および紫外線 UVB による細胞障害に対する予防、回復効果の検討

DNA 損傷は、DNA 二重鎖切断の指標である γ-H 2 A.X の前に添加した培養表皮は、照射後に添加した時に比べて、免疫蛍光染色により、陽性細胞率を定量した。

UVB による細胞障害がより抑制された。

4 . 考察、総括

2 . 3 . UVB 照射によるヒト培養表皮の細胞障害に対するアスコルビン酸の効果

ヒト 3 次元培養表皮に添加したアスコルビン酸は、経皮

ヒ ト 培 養 表 皮 に UVB（120 mJ/cm 2）を照射す る 前 ま吸収されることが明らかとなった。アスコルビン酸は、角たは後の 3 時間、アスコルビン酸ナトリウム溶液（100 ,層のバリアがあるものの、おそらく細胞間隙を通過して表500 mM） を 表 皮 表 面 に 添 加 し た。UVB 照 射 24 時 間 後皮中に入り、ナトリウム依存性ビタミン C トランスポータに、細胞生存率やアポトーシス頻度、DNA 損傷、酸化ー（SVCT）により角化細胞に取り込まれると考えられる。

ストレスを評価した。酸化ストレスは、脂質過酸化の指

3 次元培養表皮は、ヒトの表皮構造を再現したモデルであ標 で あ る 4 -hydroxynonenal（4 -HNE） の 免 疫 蛍 光 染 色ることから、ヒトの皮膚に塗布したアスコルビン酸も経皮により、活性酸素種は、スーパーオキシドアニオンを検吸収されることが示唆される。

出する dihydroethidium（DHE）染色により評価した。まこれまでに、表皮の角化細胞を用いた単層培養の試験かた、UVB 照射 3 時間後に定量的 PCR 法により培養表皮のらは、抑制効果と増悪効果のいずれも報告されており、議TNF-α 遺伝子発現量を、照射 9 時間後に ELISA 法により論が続いていた。しかし、生体内により近いヒト 3 次元培

培養上清の TNF-α タンパク質量を測定した。

養表皮を用いた本研究により、経皮吸収されたアスコルビ

3. 結ン酸は、UVB による細胞障害を抑制することが明らかと果なった。表皮中のアスコルビン酸は、UVB により産生さアスコルビン酸を添加しないヒト培養表皮では、表皮中れる活性酸素種を消去することにより酸化ストレスを抑制に総アスコルビン酸は全く検出されなかった。一方、アスして、DNA 損傷やアポトーシスなどの細胞障害を防いだ

コルビン酸を添加したヒト培養表皮では、総アスコルビンと考えられる。さらに、アスコルビン酸塗布のタイミング酸が検出され、添加濃度（10 , 100 , 500 , 1000 mM）が高いについて、UVB 照射の前の方が後よりも効果的であるこ群ほど、総アスコルビン酸量は多かった。とも明らかとなった（図）。この研究成果は、皮膚における次に、ヒト培養表皮に UVB（50 , 80 , 120 mJ/cm 2）を照射して、24 時間後に細胞障害を評価した。照射量が多いアスコルビン酸の機能解明や紫外線対策に貢献することが期待される。

培養表皮は、細胞生存率が低く、アポトーシス細胞や細胞の空胞化、DNA 損傷が多かった。しかし、表皮の厚さ（引用文献）や層構造に明らかな差は認められなかった。一方、UVB1） Kawashima S, Funakoshi T, Sato Y, Saito N,

照射の前または後にアスコルビン酸を添加した培養表皮

Ohsawa H, Kurita K, Nagata K, Yoshida M, Ishigami

は、添加しない群に比べて細胞生存率が高く、アポトーシ

A. Protective effect of pre- and post-vitamin C

ス頻度や細胞の空胞化、DNA 損傷、酸化ストレス、活性treatments on UVB-irradiation-induced skin damage.

酸素種が少なかった。特に、アスコルビン酸を UVB 照射

Sci Rep. 8（1），16199（2018）

図 皮膚へのアスコルビン酸塗布は、紫外線照射による細胞障害を抑制
UVB 照射の前または後にアスコルビン酸を表皮表面に添加すると、表皮にアスコルビン酸が取り込まれて、UVB 照射による細胞障害を抑制した。特に、UVB 照射前にアスコルビン酸を塗布した方が、後から塗布するよりも効果的であった。
AA：アスコルビン酸、ROS：活性酸素種、UVB：紫外線− 97 −