ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用
筑波大学生命環境系

青柳秀紀

Fecal matter of Horornis diphone has been used as a cosmetic (facial cleanser and skin stain remover, etc.) for the last
1,000 years until recently. Due to the enforcement of the Law for the Protection and Management of Birds and Animals, it
has become difficult to obtain fecal matter and to manufacture the cosmetic products utilizing this component. The mechanism of the cosmetic effects of feces of H. diphone has been little investigated, and one of the main components of the feces(the intestinal microflora) is still unknown. In this study, I attempted to analyze the properties of feces as well as the intestinal bacterial flora present in the feces of H. diphone. Elemental analysis of the fecal matter showed that the nitrogen content
of the feces was higher than that of their feed. This suggests that the feed is digested and degraded as it passes through thedigestive tract of the warbler and that the feces may contain proteins such as enzymes. In addition, the fecal matter exhibited
weak activity of protease and trypsin, and also possessed antioxidant activity. Next-generation sequencing was used to analyze the intestinal bacterial community structure in the fecal matter of H. diphone. Analysis at the genus level, Lactococcus,Macrococcus, and Weissella were detected as abundant bacteria.

1．緒

きれば、現在は入手困難なウグイスの糞に代わる、より優言れた新規化粧品（素材）を開発できるのではないかと考えた。

ウグイス（Horornis diphone）は日本全域に分布し、その糞は化粧品（洗顔料）や肌のシミ抜きとして古くは平安時代

さらに私は、ウグイス糞に含まれる微生物（腸内細菌）が化粧品機能に関与しているのではないかとも考えた。

（1 , 000 年以上前）より用いられ、海外にも輸出販売されて以上の背景を基盤に本研究では、ウグイスの糞が化粧品きた。1980 年、鳥獣保護管理法によりウグイスの捕獲や的効能を示す機構の解明とその利用を最終目的に、今回は飼育は禁止され、糞の入手が困難となった。その後、ウグその基礎として、ウグイス糞の諸特性と糞の主要な要素でイスの代わりにソウシチョウ（Leiothrix lutea）、メジロある細菌叢（ウグイス腸内細菌由来）の解析と培養化を試み（Zosterops japonicus）の糞を使用して類似の化粧品の製造た。

販売がなされてきたが、2002 年の鳥獣保護管理法により２．方捕獲や飼育は禁止され、糞の入手が困難となり、製造がで

法

2. 1. ウグイスの糞の成分元素分析と諸活性の測定きなくなった。
ウグイス糞が化粧品として使用されてきたことはよく知

任意の量のウグイスの糞をオートクレーブ滅菌後、凍結られているが、“なぜ、ウグイスの糞が優れた化粧品機能乾燥した試料の C、H、N元素量を、2400 II CHN Elementalを示すのか？” については学術的に解明されておらず未知

Analyzer（Perkin-Elmer）
を用いて定量した。

な部分が多い。一つの説として、ウグイスは昆虫食である

ウグイスの糞のプロテアーゼ活性の測定は、1 %（w/v）

ため、腸内で強いタンパク質分解酵素が分泌されており、カゼイン溶液に種々の濃度に希釈した糞の試料液を加えて消化管が短いため、消化酵素（プロテアーゼ）が糞に含まれ、混和後、37 ℃、30 min 反応させた。5 %（w/v）トリクロロ

それがヒトの肌に作用していることが言われている。さら酢酸（500 µL）を加えて反応を停止させた後、遠心分離を行に、ウグイスの糞の主な要素である細菌叢（腸内由来）につい、 そ の 上 清 の 吸 光 度（A 280）を 測 定 し た。1 min あ た り

いても未解明である。

A 280 を 1 上昇させる反応液全体のプロテアーゼ量を 1 U と

このような現状を踏まえ、私はウグイスの糞に興味を持定義した。

ち、これまで未解明であったウグイスの糞が化粧品機能をウグイスの糞のトリプシン活性の測定は、96 ウェルプ示す仕組みを解明し、その知見を活用・模倣することがでレートに、100 mM Tris･HCl（pH 8 . 0）+ 0 . 1 % Tween 20 を60 µL、種々の濃度に希釈した試料液を 30 µL、100 µM MCA（ 蛍 光 基 質：Boc-Gln-Ala-Arg MCA［Peptide Institute］）

Characteristics and bacterial flora ofHorornis diphone fecal and its utilization
Hideki Aoyagi
Faculty of Life and Environmental
Sciences, University of Tsukuba

溶液を 90 µL 添加し、37 ℃、30 min 反応後、遊離したAMC（7 -Amino- 4 -methylcoumarin）の 蛍 光 強 度（ 励 起 波 長355 nm、測定波長 460 nm）を測定した。活性は 1 nmol の
AMC が 1 分間に遊離する量を 1 mL あたりに換算し、1 mUと定義した（1 mU = 1 nmol AMC/min/mL）。

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ウグイス糞の諸特性と細菌叢の解析とその利用

ウグイスの糞の抗酸化活性は DPPH ラジカル消去活性に得られた。一方、ウグイスの餌のプロテアーゼ活性やトリプシン活性を測定した結果、いずれの活性も検出されなか基づき測定した。

った。この結果は、ウグイスの餌が消化管内を通過する間

2. 2. 次世代シークエンサー（MiSeq）によるウグイスの糞の細菌群集構造解析に、プロテアーゼやトリプシンが糞に含まれることを示唆

ウグイスの糞試料をQuickGene DNA tissue kit S（Kurabo）される消化酵素由来なのか？、糞に含まれる腸内細菌由来を用いて調製後、Quick Gene-Mini 80（Kurabo）で DNA をなのか？、について解析中である）。今回、得られたウグ抽出した。16 S rRNA 遺伝子の V 4 領域を増幅するため、イスの糞のプロテアーゼやトリプシンの活性は高くはなく、している（現在、プロテアーゼやトリプシンが腸内で分泌

1 st_PCR_ 515 F プライマーと 1 st_PCR_ 806 R プライマー、

これまで、ウグイスの糞が化粧品的効能を示す一つの説とExTaq HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用いて１段して、ウグイスの消化酵素（プロテアーゼ）が糞に含まれて階目の PCR 反応をおこなった。PCR 産物を AMpure XPいることが言われてきたが、その真偽については引き続きビーズ（Beckman Coulter）で精製し、20 µL で溶出した。

検証する必要がある。

さらに、溶出液 2 µL を鋳型とし、MiSeq での解析に必要

ウグイスの糞の DPPH ラジカル消去活性に基づく抗酸化な共通配列とサンプル識別をおこなうための MID 配列でデ活性を測定した結果、ウグイス糞の懸濁液の抗酸化活性はザインされたプライマーを用いて、20 µL の反応系で 2 段

125 〜 500 µg/mL で容量依存的に増加したが、アスコル階目の PCR を行った。PCR 産物を再び、AMpure XP ビビン酸の IC 50 値（DPPH を 50 % 消去できる濃度）と比較しーズ（Beckman Coulter）で精製し、20 µL で溶出し MiSeq

た場合、その活性は 1 / 60 程度の低いものであった（ウグでペアエンドシーケンシングした。MiSeq から得られたリイスの餌には抗酸化活性はほとんど検出されなかった）。

ードデータは以下の①〜③の基準に基づき、sickle ver

次世代シーケンサーを用いてウグイスの糞に含まれる細1 . 33 を用いてフィルタリングをおこなった。①両鎖の読菌群集構造を属レベルで解析した結果、14 試料から計 74

み始めがプライマーと完全一致する配列であること、②プ属が検出された（図 1）。優占属は、Lactococcus（22 . 43 %）、ライマー領域、および低精度配列のトリムをおこない両鎖

Macrococcus（14.73%）、Weissella（14.39%）、Leuconostocaceaeとも規定以上の長さを保っていること、③両鎖が結合でき科の同定されなかった属（14 . 19 %）であった。しかしながら、試ること。Fastx toolkit ver 0 . 0 . 13 . 2 を用いて低品質の塩基料によってその存在比は大きく異なった（Lactococcusで 2 . 3 〜

対 を 除 去 し た。 ト リ ミ ン グ し た リ ー ド は FLASH ver

60 . 8 %、Macrococcus で 2 . 9 〜 41 . 3 %、Weissella で 0 . 2 〜

1 . 2 . 10 を用いてペアエンド結合した。キメラ配列チェッ50 . 4 %、Leuconostocaceae 科の同定されなかった属で 0 . 2

クには USEARCH ver 8 . 0 . 1623 _i 86 linux 64 を用いた。微〜 29 . 0 %）。ウグイスの糞に含まれる細菌叢は腸内由来の生物群集構造は QIIME ver 1 . 9 . 0 を用いて分析した。配列細菌であることが考えられる。これまで国内外を通じて野は相同性 97 % を基準とし、操作的分類単位（Operational

鳥の腸内細菌（叢）に関する研究は少なく 1 - 3）、ウグイスにTaxonomic Unit=OTU）にクラスタリングし、Greengenesついては初めての報告である。

database に基づいて分類学上の決定をおこなった。

また、種々の寒天平板培地を用いてウグイスの糞に含まれる細菌の単離培養を試みたところ、ウグイス糞に存在す３．結果および考察る全微生物の 0 . 5 % 程度の種類しか単離培養できなかった。

成分元素分析の結果を表 1 に示した。C（炭素）は約 0 . 78

また、ウグイスの糞の試料からプロテアーゼ産生細菌を対倍、H（水素）は約 0 . 77 倍に減少していた。一方、N（窒素）

象に、単離培養を試みた結果、16 種類の細菌の単離培養は約 1 . 35 倍に増加していた。窒素はタンパク質や酵素のに成功したが、いずれも次世代シーケンサーを用いた細菌構成元素である。今回の結果から、消化管を通る間に糞に群集構造解析において存在比が非常に低い細菌のみであっ窒素源であるタンパク質や酵素などが含まれた可能性が考た。
以上の結果から、ウグイス糞中には未培養微生物が多くえられた。
ウグイスの糞のプロテアーゼ活性とトリプシン活性を測存在していることが示唆され、今後、これらの未培養微生定した結果、それぞれ約 11 . 8 U/mg、1 . 75 U/mg の活性が物の培養化が求められる。現在、ウグイス糞からの細菌の表1試料
餌糞ウグイスの餌と糞の元素分析
C44.7235.00

含量（w/w ％）H7.105.48

N4.906.60

培養効率の向上や、毒素除去能、メラニン生成抑制能、皮膚炎症抑制能、バイオサーファクタント生産能、金属ナノ粒子の生成能などの機能を有する新規細菌の培養化、取得についても検討中である。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 29, 2021

図１

次世代シーケンサー（MiSeq）を用いたウグイスの糞に含まれる属レベルでの細菌群集構造の解析．

４．総（引用文献）

括1） Waite, D. W., Taylor, M. W. Characterizing the avian

ウグイスの糞は洗顔料やシミ抜きとして古来より国内外

gut microbiota: membership, driving influences, andで商業利用されてきたが、これまで学術的検討が乏しく、

potential function. Frontiers in Microbiology, 5, 2 2 3

その諸特性や糞の主要な要素である細菌叢（ウグイス腸内（2014）．

細菌由来）は未解明であった。本研究において、これまで

2） Ushida, K., Segawa, T., Tsuchida, S., Murata, K. Cecal

未解明であったウグイス糞の諸特性や腸内細菌群集構造をbacterial communities in wild Japanese rock

はじめて解析し、その一端を明らかにした。今後、本研究ptarmigans and captive Svalbard rock ptarmigans.

成果を基盤に研究を推進することで、ウグイス糞が化粧品

The Journal of Veterinary Medical Science, 78, 251-257

機能を示す仕組みの解明や有用な新規微生物の取得が期待（2016）．

できる。さらに、得られた知見を模倣したり、取得した有

3） Wang, W., Zheng, S., Sharshov, K., Cao, J., Sun, H.,

用微生物を活用することで、現在は入手困難なウグイスのYang, F., Wang, X., Li, L. Distinctive gut microbial

糞に代わる、より優れた新規化粧品（素材）の開発が期待でcommunity structure in both the wild and farmed

きる。

Swan goose（Anser cygnoides）．Journal of Basic
Microbiology, 56, 1299 -1307（2016）．

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