遺伝子改変マウスを用いたヒスタミンの接触性皮膚炎に与える影響の研究
東北大学大学院工学研究科応用量子医工学

大 津浩

Since its discovery in 1910, histamine has been regarded as one of the most important biogenic amines in medical andbiological field. Histamine regulate smooth muscle contraction, immune response, vascular permeability, neurotransmission,and stimulation of gastric acid secrestion. Histamine is synthesized from histidine through oxidative decarboxylation byhistidine decarboxylase (HDC; EC 4.1.1.22), a pyridoxal 5'-phosphate (PLP)-dependent enzyme. We generated histidne
decarboxylase gene-knockout (HDC-/-) mice and previously revealed that scratching behavior was exclusively inducedin HDC+/+ mice whereas it was barely observed in HDC-/- mice. Histological examination revealed that both HDC+/+and HDC-/- mice displayed similar extent of inflammatory cell infiltration, hyperplastic epidermis and newly spreadingof neuronal processes in the skin tissue. Since several metal are ingredient of cosmetic material we started to consider
that metal allergy is important for the cosmetics. The first step for the metal allergy is elution of metal ion into the skin.
Therefore it is important to establish the measuring system of trace ionized metal in the skin. In this study we assessed metalallergy in mice using nickel wire implantation in their back skin and revealed that the amount of nickel ion in the tissue
seems to be paralleled with the extent of inflammation. The amount of ionized metal in the skin tissue was measured using
inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES) and the surface of the metal wire was analyzed with
X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscopy/energy dispersed X-ray analysis (SEM-EDX) method. To assess
the extent of allergic reaction we generated HDC-promoter (1.1Kb) plus ZsGreen gene transgenic mice. It was shown that
peritoneal macrophages in these mice were positively glittered under the fluorescent microscopy but we found that othercells which do not express HDC gene also glittered non-specifically. In this regards, we started to generate BAC based
reporter mice to attain the accurate reflection of HDC expression in mice.

１．緒に塗布して誘導した接触性皮膚炎のモデルにおいて，2 週

言目から 4 週目に表皮肥厚を起こすがノックアウトマウス

化粧品学において，皮膚の炎症は重要な問題点である．

や H1 拮抗剤によってその程度が抑制され，ヒスタミンは私たちは，先にヒスタミンを欠くヒスチジン脱炭酸酵素遺痒みの発症に不可欠であり，痒みのシグナルは脊髄後角を伝子ノックアウトマウスを作製し（Ohtsu, Tanaka et al.

伝達していくことを明らかにしている（Seike, Ikeda et al.

2001），皮膚の炎症反応におけるヒスタミンの役割につい2005; Seike, Takata et al. 2005）．また H1 受容体拮抗剤をて研究を続けている．例えば，皮下に木綿糸を植え込ん使った実験から，少なくとも H1 受容体を介する経路はこだ慢性炎症モデルでは，ヒスタミンによって肉芽種が形成の接触性皮膚炎の発病に重要であることを報告している

され，血管新生にヒスタミンが必須であり，マクロファー（Hamada, Seike et al. 2006）．このようにヒスタミンはマジ由来のヒスタミンによって VEGF が誘導され，それにウス皮膚において，慢性炎症，皮膚創傷治癒，接触性皮膚よって血管新生が誘導されることを明らかにした（Ghosh,炎など多岐に渡り重要な影響を与え化粧品学的に重要であHirasawa et al. 2002）．また，皮膚に創傷を作製し，ヒスると考えられる．

タミンの影響を見る実験系において，ヒスタミンの存在はそこで，本研究においてヒスタミンの合成を触媒するヒ

創傷治癒過程に重要であり，ヒスタミンが存在しないと創スチジン脱炭酸酵素遺伝子のプロモーター領域に蛍光色素傷の治癒過程に遅れることが判明している．この過程でものレポーター遺伝子を繋いだトランスジェニックマウスを血管新生が重要であるものの，この血管新生においては作製し，上述した皮膚疾患モデルのどの細胞にどういう時bFGF の作用がヒスタミンによってコントロールされ，創期にヒスタミン産生の遺伝子の発現が起きるのかについて傷の治癒を促していることを明らかにしている（Numata,の検討を進めようと考えた．

Terui et al. 2006）．また，ハプテンを繰り返して背部皮膚The effect of histamine on contact
dermatitis using gene manipulated miceHiroshi Ohtsu
Applied Quantum Medical Engineering,Tohoku University School of Engineering

また，装飾品などの含まれているニッケル，コバルトなどを考えてみると美容と金属アレルギーの関連は非常に重要な課題である．実際に金属によって起きるアレルギー性接触性皮膚炎（ACD）は多くの皮膚反応が起き，この病態は皮膚や全身性に化粧品や，タトゥー，洗剤，装飾品，ピアス，皮のなめし，人工関節，歯科インプラントなどに暴露されることによって引き起こされる．ニッケルによって ACD が起きることはよく知られているが，その他にア− 106 −遺伝子改変マウスを用いたヒスタミンの接触性皮膚炎に与える影響の研究

ルミニウム，ベリリウム，クロミウム，コバルト，銅，金，変化する場合とがある．入射 X 線と同じ場合を Rayleigh

イリジウム，水銀，パラジウム，白金，ロジウム，チタン散乱と呼び，互いに干渉しあって回折（diffraction）現象が皮膚過敏を起こすことが知られている．このことにアプを生じる．結晶面の格子間隔を d，X 線の入射角を θ とす

ローチするため，生体内に溶け出す金属イオンの測定できると，X 線が回折を起こす条件は，nλ=2d sinθ で表わさるシステムがあると診断や重症度および治療効果，予後のれる．ここで n は任意の整数で回折の次数を表す．この判定などに大いに役立つ．そこで工学的な機器開発の現状

式は Bragg の式と呼ばれる．この解析によって，元素のと問題点に関して検討した．

化合状態の分析が可能となる．従って，この分析法を用い２．実
2．1てプレートの表面の酸化状態の解析を行った．

験マウスの金属ワイアーの植え込み実験

４種類のマウス C57Bl/6, BALB/c, C3H/He, DBA/2 マ

2．4 走査型電子顕微鏡Scanning electron microscopy/
energy dispersed X-ray analysis（SEM-EDX）によ

ウスの背部皮下に 13G の implant needle を用いて麻酔下る金属プレート表面の解析で金属ワイアーを打ち込む．金属ワイアーは Ni, Co, Fe,金属を植え込んだ実験系ではマウスの生体反応を起こしAl で直径 0.8 ㎜であり，長さは 5 ㎜とする．植え込み後８た Ni wire のみが黒く変色していた。走査型電子顕微鏡と時間，24 時間，3 日後にマウスを処理して，組織学的な観エネルギー分散型 X 線分光法を用いて Ni wire および Ni

察や血管透過性について検討する．また，RT-PCR 法にてplate の表面の組成について分析した。走査型電子顕微鏡

HDC や COX-2 の発現を検討する．

は電子を標本の表面に当て，散乱および放出してくる電子を検出器でとらえて，微細な表面の変化を観測できるため，

2．2

ICP-AES 法による組織内金属イオンの測定

生体内で影響を受けた後の金属プレートの変化を観察でき

ICP-AES 法（誘導結合プラズマ発光分光法）は，三重る．

管の石英トーチを用い，その中にアルゴンガスを通して，最外周管にはアルゴンガスをプラズマを形成するべく通す．

2．5

レポーターマウスの作製

またこのガスはトーチの冷却も兼ねる．また中間の管のアヒスチジン脱炭酸酵素（Histidine decarboxylase: HDC）

ルゴンガスは補助ガスと呼ばれ，プラズマを上方に浮かはヒスチジンからヒスタミンを合成する生体内で唯一のせてトーチの中央と中間の管が溶けるのを防ぐ役割をする．

酵素である．私たちはこの遺伝子をクローン化後，この遺トーチの外側上部に巻いた誘導コイルに高周波電流を流す伝子における転写調節機構について研究してきた．そのと，高周波がトーチ内のガス中に誘導されてプラズマを発後，遺伝子ノックアウトマウスを作製し，ヒスタミン関与生するようになっている．中心管からアルゴンキャリアーの種々の病態を明らかにしている（Ohtsu, Tanaka et al.

ガスとともに試料溶液を霧状にして送ると，プラズマ中を2001）．その中で接触性皮膚炎についての実験ではヒスタ通る間に試料は原子化，一部はイオン化されて，さらに励ミンの有無に関わらず，病理像は大きな変化はないものの，起される．励起状態となった原子から放電によって発光ス

痒みの対してはヒスタミンの役割が大きいことを明らかにペクトルが得られて，スペクトルを分析することによって，している（Seike, Ikeda et al. 2005）．その後，ヒスタミン各元素のスペクトル線の波長が各元素固有のものであるこの産生細胞を判断できるように，HDC 遺伝子プロモータとを利用して元素の存在を確認するとともに，スペクトルーに蛍光色素遺伝子をプラスミッド上で繋ぎ，トランスジ線の強度を測定することによって，試料中の定量成分元素ェニックマウスを作製した．当初 HDC 遺伝子のプロモーの濃度を計算する．

ター 1.0kb に市販されているうちで最強の蛍光色素遺伝子と言われている pZsGreen1.1 を繋いだプラスミッドよりト2．3 XRD（X-ray diffraction） 法による Ni プレートの表面の性状分析

ランスジェニックマウスを作製したが，思ったほど蛍光発Ni ワイアーを埋め込み，その表面を観察すると，植えは bacterial artificial chromosome（BAC）を用いたトラ込み後数日経過すると黒ずんでくることが観察され，実験

光が強くないこと，非特異的な発光がみえることから現在ンスジェニックマウスを作製中である．

当初表面が酸化するものと考えた．そこで，X 線回折法を用いて，表面性状について検討した．Ni ワイアーでは X

2．6

レポーターフィッシュの作製線回折法によっての観察が困難であるため，Ni のプレー

緑色の蛍光はゼブラフィッシュの場合，色素細胞の自トを代わりに植え込み，黒ずんだ部分と光っている部分を家発光と重なってしまい，特異的な発光と非常に区別し解析した．X 線回折分析法は，X 線が物質に当たって散乱にくいことがわかった．そのため，赤色の蛍光であるされたとき，その波長は入射 X 線と同じ場合と長波長にmCherry という遺伝子を HDC promoter に繋いだプラス− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

ミッドをトランスジェニックしたフィッシュを作製した．
このフィッシュでは脳の深部まで見えるものの，躯間部の筋組織も発光し特異性に乏しかった．現在は，フィッシュにおいては考えられる negative enhancer 部位を除いたレポーターフィッシュの作製を目指しており，それで期待される結果が得られない場合はマウス同様に BAC を用いたトランスジェニックフィッシュを用意する予定である．

３．結
3．1

果

溶出金属イオンの測定法の開発

マウスの背部皮下に種々の金属を植え込み炎症反応を惹起させると、ニッケルに特異的に血漿成分の漏出や組織の壊死などがおきる。植え込んだニッケルの周辺組織中におけるニッケル濃度を Newport Green を用いた蛍光法および ICP-AES 法で測定した（図１）。両方法の結果を比較するために，横軸に蛍光法縦軸に ICP-AES 法の測定値をとり，Ni 濃度の測定結果を比較した。その結果両方法は良く相関し、ともに正確な測定法であると考えられた。また、
Newport Green による測定では特異性がなかったニッケ
ルと亜鉛を ICP-AES 法では分離して測定できることがわかった。測定の感度はほぼ同程度であった。また、Ni ionの周囲組織内への溶出経過の結果と、周囲組織における血漿成分の溶出反応をエバンスブルーという色素を用いて測定した結果を比較してみた（図２）。Ni イオンは Ni wireを植え込んでから８時間で溶出を開始し、その時間経過はエバンスブルーによる血漿漏出反応の時間経過とよく一致

図２ Ni wire を植え込んだマウスの植え込み周囲の Ni イオンの濃度とエバンスブルーの組織内濃度
植え込み後の周囲組織内における Ni の濃度の経時変化 A と組織内への血漿成分の漏出反応をエバンスブルーを静脈内注射して測定した結果 Bしていた。この結果、Ni ion が組織に溶け出すことが、血漿成分の血管外漏出にとって必要なことであろうと推察さ

3．2

金属表面の分析

SEM-EDX（Scanning electron microscopy /energyれる。

dispersed X-ray analysis）による解析
走査型電子顕微鏡で、マウスの背部に植え込んだあとの Ni プレートを観察すると、黒く変色している部分⒜と金属本来の部分⒝が同時に存在していた（図３）。変色のあった部分⒜を EDX 法にて分析すると、Ni のピークを検出した他に C、N、O、Cl、Na、P、S、K などの元素のピークも検出し、Ni プレートに生体内成分が付着あるいは浸潤していることがわかった。その中ではとくに C 元素のピークが高く、炭素元素が多量にプレートに付着あるいは浸潤していることがわかった。プレートは測定前に念入りに洗浄しているため、これらの生体内成分は恐らく金属表面よりやや内側に浸潤していっているものと考えられるが、今後はさらに別の実験系を組みその点を明らかにする必要
図１ Ni wire を植え込んだマウスの植え込み周囲の皮膚からのサンプル中における Ni ion の濃度
ICP-AES 法と New Port Green を使った蛍光法を用いた時の検出値の比較があるのかも知れない。
XRD（X-ray diffraction）法による解析
マウスに Ni ワイアーやプレートを植え込み、X 線回折法にて Ni の化合状態の分析をおこなった（図４）。その結− 108 −遺伝子改変マウスを用いたヒスタミンの接触性皮膚炎に与える影響の研究

量は少なく、植え込み前のプレートとしての性状と変化がなかった。従って黒く変色した金属プレートは酸化による変化ではないことが判明した。

3．3

レポーター動物の作製について

トランスジェニックマウス
HDC promoter+ZsGreen1.1 マウスは肥満細胞が発光するものの、その発光強度は弱く、非特異的な部位における発光も見られるため、金属アレルギー反応において使用に耐えうるものであるかどうかには疑問がある．おそらく、使用した promoter 部分が 1kb と短いため発現の特異性を担うのに充分な領域を持たず、発現特異性に問題のあるト図３ Ni 板の SEM-EDX による解析
Ni プレートについて、黒くなった部分⒜と金属光沢を残している部分⒝の表面性状を SEM-EDX 法にて解析した。

ランスジェニックマウスができた可能性が高い。そこで、実験のアプローチの方法を変えて、現在は HDC 遺伝子を含む BAC を入手して、プロモーター直後に GFP 遺伝子を挿入して HDC 遺伝子近傍 100kb の DNA を丸ごとつかったトランスジェニックマウスを作製するべく実験を開始した。これによって、本来 HDC 遺伝子がもつ近傍の情報を充分に含んだ DNA を導入できるため、本来の遺伝子の発現パターンを表すレポーターマウスが作製できると考えている。
トランスジェニックフィッシュ
緑色の蛍光はゼブラフィッシュの場合、色素細胞の自家発光と重なってしまい、特異的な発光と非常に区別しにくいことがわかった。このため、赤色の蛍光である
mCherry 遺伝子を HDC promoter に繋いだプラスミッドをトランスジェニックしたフィッシュを作製した。このフィッシュでは脳の深部まで見えるものの、躯間部の筋組織も発光し特異性に乏しかった。現在は、コンストラク
ト内に Negative Enhancer がある可能性を考えて、全長300bp 程度の短いプロモーターによってコントロールされるレポーター遺伝子をもつトランスジェニックフィッシュを作製中である。

４．考
4．1
図４ Ni 板の XRD による解析
上段から、植え込み前の Ni プレートの一部分、植え込んだ
ものの Ni プレートに変色を認めなかった部分、変色を認めた部分、それぞれの XRD 解析を示している。

察

溶出金属イオンの測定法の開発

Ni wire を使った系では、今まで行われている Newport
Green を用いた蛍光色素を用いた解析でも Ni の量を定量可能であると思われる。今回、生体内のしばしば用いられるステンレス鋼である SUS316 を植え込んだ周囲に Ni の溶出が測定され、臨床的には問題がないと考えられている

果、Ni ワイアーにおいて Ni のピーク以外に高いピークがステンレス鋼からも Ni の溶出があることが明らかになっ認められない（上段）ことから、Ni の酸化物などの化合た。このことは、臨床的に問題となってくる Ni の溶出に物は少ないことがわかった。また Ni プレートを植え込んは閾値があるか、あるいは、臨床的には問題にならない程だ後で、黒く変色していた部分（下段）も、金属の光沢の度でも組織において反応している可能性があると考えられあった部分（中断）と同様に Ni の酸化物などの化合物のる。したがって、動物体内でのニッケルの溶出を正確に評− 109 −コスメトロジー研究報告 Vol.17, 2009

（文価する必要性が確認された。

献）

今後、生体にしばしば用いられる金属を対象に、感度の１）Ghosh, A. K., N. Hirasawa, H. Ohtsu, T Watanabe

より高い測定法を見つけ、どのような金属がイオン化しに

and K Ohuchi. (2002). "Defective angiogenesis in

くいかについて検討を進めていきたいと考えている。

the inflammatory granulation tissue in histidine
decarboxylase-deficient mice but not in mast cell-

4．2

HDC promoter-reporter 動物の作製

deficient mice." J Exp Med 195(8): 973-82.

作成したマウスにおいては、ZsGreen1.1 の発光の特異２）Hamada, R., M. Seike, R. Kamijima, M. Ikeda, H.

性に問題があり、プロモーター内にすべての制御領域がは

Kodama, H. Ohtsu (2006). "Neuronal conditions of spinal

いっているかどうか問題がある。

cord in dermatitis are improved by olopatadine." Eur J

今 後、 マ ウ ス で は BAC を 用 い た レ ポ ー タ ー マ ウ ス

Pharmacol 547(1-3): 45-51.の 作 成 を、 フ ィ ッ シ ュ に お い て は 考 え ら れ る negative３）Numata, Y., T. Terui, R. Okuyama, N. Hirasawa, Y.

enhancer 部位を除いたレポーターフィッシュの作製を目

Sugiura, I. Miyoshi, T. Watanabe, A. Kuramasu, H.

指す。

Tagami, and H. Ohtsu (2006). "The accelerating effect

５．総of histamine on the cutaneous wound-healing process括

through the action of basic fibroblast growth factor." JNi の金属アレルギーに対して、組織内で Ni イオンの量を測定することが可能になっている。また、金属表面の性Invest Dermatol 126(6): 1403-9.
４）Ohtsu, H., S. Tanaka, T. Terui, Y. Hori, Y. Makabe-状変化についても、２種類の方法で解析できる。

Kobayashi G. Pejler, E. Tchougounova, L. Hellman,

HDC promoter によるレポーター動物の作製は非特異的なM. Gertsenstein, N. Hirasawa, E. Sakurai, E. Buzás, P.

発光を示していたため、方法を変えて再度作製を開始して

Kovács, G. Csaba, Á. Kittel, M. Okada, M. Hara, L. Marいる。

, K. Numayama-Tsuruta, S. Ishigaki-Suzuki, K. Ohuchi,
A. Ichikawa, A. Falus, T. Watanabe and A. Nagy (2001).

謝辞"Mice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormal

本研究を遂行するに当たり，ご支援を頂きました㈶コスmast cells." FEBS Lett 502(1-2): 53-6.

メトロジー研究振興財団および共同研究者に深く感謝いた５）Seike, M., M. Ikeda, H. Kodama, T. Terui, and H.

します。また、本研究をすい行するにあたり東北大学大学

Ohtsu. (2005). "Inhibition of scratching behaviour

院薬学研究科平澤典保教授、東北大学工学研究科成島尚之

caused by contact dermatitis in histidine decarboxylase

教授およびヘルシンキ大学ペルティ・パヌラ教授にじん大gene knockout mice." Exp Dermatol 14(3): 169-75.

なる支えんをいただいた事を報告し、深く御礼申し上げます。

６）Seike, M., T. Takata, M. Ikeda, H. Kodama, T. Teruiand H. Ohtsu. (2005). "Histamine helps development ofeczematous lesions in experimental contact dermatitis
in mice." Arch Dermatol Res 297(2): 68-74.

− 110 −