牛伝染性リンパ腫（EBL、牛白血病）に抵抗性のある牛の遺伝子の同定〜 牛伝染性リンパ腫の発症防止・清浄化に向けて 〜
JRA畜産振興事業（平成30年～令和2年）
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業
（代表者）
堀 正敏

東京大学

（共同研究者）
今川 和彦
小林 朋子
須田 義人
草間 和哉

東海大学 東海大学総合農学研究所教授
東京農業大学 農学部 動物科学科准教授
宮城大学
食産業学群教授
東京大学 大学院農学生命科学研究科 特任助教

大学院農学生命科学研究科教授

1【講演者略歴】

2

事業の概要牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

背景：牛伝染性リンパ腫ウイルス（BLV）とは・ 日本の農場への浸潤率、牛への感染率が増加している・ 牛白血病（EBL）の原因となる・ EBL発症牛は全廃棄され、年間30億円以上の損害が発生→有効な治療法がなく、早急な対策法の開発が必須
本事業のねらい：
BLV感染・EBL発症抵抗性牛の作出を最終目標とし、
1. BLV感染およびEBL発症に抵抗性を示す牛群から特異的な遺伝子情報および因子を同定する
2. 選抜育種の指標となる因子を同定する

BLVの清浄化およびEBL発症の防止に繋げる
2

事業の概要牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

研究体制
統括責任者
東京大学 大学院農学生命科学研究科
堀 正敏 教授

共同研究

東海大学
総合農学研究所
今川和彦 教授

宮城大学
食産業学群
須田義人 教授

東京大学
大学院農学生命科学研究科
草間和哉 助教

東京農業大学農学部 動物科学科
小林朋子 准教授

外部評価委員
長崎大学 熱帯医学研究所 新興感染症学分野 安田二朗 教授
東京大学 大学院農学生命科学研究科 内田和幸 准教授

3

①背景

牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

牛伝染性リンパ腫とは（牛白血病）
1. 全身に腫瘍ができるウシの疾病
2. BLVというウイルスが原因
3. 全国的にリンパ腫発症牛が増加(年間約4000頭が発症）
4000
3500
3000

発
生 2500
頭 2000
数 15001000（頭）5000

平成 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 （年）

牛白血病発生報告数（農林⽔産省より）枝肉の腫瘤

牛白血病検査マニュアル 4
岐阜県中央食肉衛生検査所

①背景
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業
BLV感染と牛伝染性リンパ腫

30％
牛伝染性リンパ腫
ウイルス（BLV）
臨床症状

数％

感染無症状

持続性リンパ球増多症

牛伝染性リンパ腫（EBL) 発症なし

ほとんどなし体表リンパ節の腫脹、元気消失、削痩

感染経路
アブ・サシバエなどによる機械的伝播
母子感染も成立する（子宮内、母乳）ほとんどが導入牛により牛群に持ち込まれる（社団法人中央畜産会）

①背景
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業求められる、汚染状況に応じた対策方法

ウイルス検査
抗体検査

BLV
陽性
農家
約90 %

抗体陽性
約50 %

高ウイルス量約30 %
低ウイルス量約70 %

直接的な損失は発症後に発生
と畜場発見
発症
全部廃棄
重要な約5 %
違い
非発症
約95 %

抗体陰性
約50 %
病態進行

感染しやすい/しにくい牛を知りたい→感染リスク指標

発症ハイリスク牛を知りたい

生前に転帰を知りたい→発症リスク指標→発症を早期に診断する指標

②目的

牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

BLV感染抵抗性、EBL発症抵抗性の原因遺伝子情報を明らかにする

RNA-seq

SNP解析

血統解析

クローナリティ解析

リンパ腫発症抵抗性遺伝子の探索
RNAseqによる解析

RNAseq解析
清浄農場非感染暴露非感染
感染低ウイルス量
感染高ウイルス量発症

発症

N
910101015
合計54

清浄農場非感染(C)暴露非感染(U)
感染低ウイルス量(L)高ウイルス量主成分解析

感染高ウイルス量(H)

発症(EBL)高ウイルス量の牛と発症牛とで有意に発現が変動している遺伝子について、さらに解析を行った

リンパ腫発症指標の探索

牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

リアルタイムPCRによる指標遺伝子発現の解析
遺伝子A

遺伝子B

p-value<0.01

非発症

発症遺伝子Cp-value<0.01

非発症

発症

p-value<0.01

非発症

発症

遺伝子E

遺伝子D

p-value<0.01

p-value<0.01

神奈川食肉センター搬入
健康畜および発症牛リンパ節（気管気管支リンパ節）でのmRNA発現

非発症

発症

非発症

発症

発症牛特異的な遺伝子発現の上昇が末梢血、リンパ節でも確認できた
これらの遺伝子発現が、発症の指標となりうることが示唆された

リンパ腫発症指標の探索
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業
BLV感染細胞のクローナリティ解析
BLV感染細胞
ポリクローナル

BLV感染細胞のクローナリティ
低オリゴクローナル

モノローナル
高 リンパ腫発症？
Ohnuki et al., Sci.rep. 2021
宿主DNA

BLV プロウイルスゲノム

宿主DNA

BLV DNA-capture-seq法（クローナリティ簡易解析法）を開発

リンパ腫発症指標の探索

牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

感染
低BLV

感染
高BLV

EBL発症

発症牛におけるBLV挿入部位の特定
四頭のリンパ腫発症牛の腫瘍組織において、BLV挿入部位特定法を確立

クローナリティ解析
発症牛はクローナリティが高かった
感染高PVLやEBL発症牛の診断にクローナリティ解析は有効であり、生前に発症の転帰を知る手がかりとなる(Ohnuki et al., 2021)

BLV感染・EBL発症抵抗指標の探索
BLV感染・EBL発症抵抗に関するSNP・近傍遺伝子（発症6 無症状67）： 高度に有意なSNP; 第3番染色体
有意なSNP；第20番染色体および第22染色体（感染73 非感染27 ) ： 高度に有意なSNP; なし
有意なSNP（P<0.01)；第6番染色体（プロウイルス量) ：候補SNP;第１番, 第２番, 第４番,第５番,第７番,第８番,第１７番染色体

ゲノムアノテーションの結果プロウイルス量で得たSNPに候補遺伝子検出

SUGCT、HCFC2、YIPF5、PTPRD、USP38
protein tyrosine phosphatase receptor type D （PTPRD）：腫瘍抑制遺伝子

PTPRD近傍のA⇒C置換が、プロウィルス量の有意な低下を引き起こすことが推察

①
事業の概要
リンパ腫発症抵抗指標の探索
発症抵抗性種雄牛の同定

S13
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業と畜検査にて発症が確認された雌牛（娘・孫）6,022頭におけるEBL発症頭数
牛の頭数
総頭数

EBL(%)

non-EBL(%)

オッズ比 [ 95% Cl]

p値

種雄血統

父方祖父の血統により、発症オッズ比が低い血統を同定
牛伝染性リンパ腫の遺伝率は0.19(Inagaki et al.

2020)

①
事業の概要
本事業のまとめ

S14
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業◎抗体検査＋プロウイルス量測定＋感染細胞クローナリティ解析→正確な伝染性リンパ腫発症診断法樹立→発症転帰を予測可能◎伝染性リンパ腫発症牛を識別する候補遺伝子を同定→発症リスクの定量化へ◎発症牛/非発症牛、感染牛/非感染牛、プロウイルス量に関連するSNP解析→標的になるSNP候補がそれぞれ見つかった
特にプロウイルス量を制御するPTPRD近傍のA→CのSNP置換を発見◎世界で初めてBLV感染するがEBL発症抵抗性の種雄牛を同定

①事業の概要
本事業のまとめ
清浄農場

＜評価系＞
病理解剖
抗体検査
プロウイルス量

感染細胞クローナリティ
特異的遺伝子発現
SNP解析
育種遺伝学的特色

S15

牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

未感染

B

非感染

LV 汚

感染
低BLV

染

農

感染
高BLV

場

EBL発症
死後診断のみ抗体量だけでは発症指標にならない
ウイルス量だけでは発症指標にならない

プロウイルス量と相関・発症転帰の指標
発症指標
プロウイルス量を制御するSNP、非感染と感染を分ける候補
SNP
EBLを発症しない種雄牛

①
事業の概要
今後の展望

S16
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業★RNAseq解析結果
牛伝染性リンパ腫発症牛を識別する候補遺伝子→キット化してEBL発症転機の診断へ利用可能★SNP解析結果（プロウイルス量制御に関与するSNP)→PCRキット化して感染抵抗性牛診断へ利用可能★クローナリティ解析による牛伝染性リンパ腫発症診断技術→簡便な方法への代替を実証し、牛伝染性リンパ腫発症の診断や発症転帰診断への利用可能

これらは、いずれも補助診断方法として全国の家畜保健所や食肉衛生検査所にて利用可能である

①
事業の概要
今後の展望

S17
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業★発症抵抗性種雄牛→日本全国において人工授精などに用いることにより、抵抗性牛の作出が可能である。

★これらを総合的に利用しBLV感染・牛伝染性リンパ腫発症
リスク総合診断技術の開発による牛伝染性リンパ腫の撲滅へ
各農場でリスク評価

MHC ウイルス量血統

クロナリティ

SNP
特異的遺伝子発現

血統
ウイル
ス量
特異的遺伝子発現

MHC

SNP

クロナリティ

①
事業の概要
本事業成果による学術論文

S18
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業［１］ Ohnuki N*, Kobayashi T*, Matsuo M, Nishikaku K, Kusamam K, Torii Y,
Inagaki Y, Hori M, Imakawa K and Satou YA target enrichment high through-put sequencing system forcharacterization of BLV whole genome sequence, integration sites,clonality and host SNP
Scientific Reports 2021

［２］ Inagaki Y, Kobayashi T, Suda Y, Kusama K and Imakawa K
Genetic variation in Japanese Holstein cattle for EBL development
BMC veterinary research 2020
［３］ 稲垣靖子, 小林朋子, 須田義人, 今川和彦
牛個体識別番号を利用した牛白血病の疫学的解析と家畜育種学的アプローチ
畜産の研究 2017［４］ Kobayashi T, Inagaki Y, Ohnuki N, Sato R, Murakami S, Imakawa K.
Increasing Bovine leukemia virus (BLV) proviral load is a risk factor for
progression of Enzootic bovine leucosis: A prospective study in Japan.
Pre Vet Med 2019

①
事業の概要
謝辞

S19
牛白血病感染・発症抵抗性牛の指標開発事業

研究にご協力いただいた方々に感謝いたします。
神奈川食肉衛生検査所
神奈川農業共済組合
宮城農業共済組合
神奈川県央家畜保健衛生所
神奈川県湘南家畜保健衛生所
岩手県県北家畜保健衛生所
釧路丹頂農業協同組合
北海道ひがし農業共済組合
採材にご協力いただいた獣医師、農家の方々

熊本大学
佐藤賢文先生松尾美沙希先生
東京農業大学
稲垣靖子先生村上覚史先生野口龍生先生

大学院生
大貫永輝
西角光平