高分泌酵母突然変異体を用いた蛋白質素材生産効率化システムについての研究
広品大学理学部鈴木

千葉県工業試験所

克周• 岡

生命工学工業技術研究所

千痔・地神芳文

Yeast supersecreting mutant strains were examined for their ability to produce lysozyme
protein. The ssll mutant strains secreted 10-fold more lysozyme than the wild type parent strain.
The efficiency was improved 10-folds by introduction of the lysozyme gene by multi-copy
plasmids. About 10-fold improvement was also achieved by supplying casamino acids in culture
media. New ssll host strains, which secreted 3-4 fold more lysozyme than the original ssll mutantstrain, were obtained by crossing the original ssll mutant strain and a wild type strain. The newssll transformant secreted 500-·fold more lysozyme in synthetic media supplemented withcasamino acids than the original ssll muant did in synthetic media. These data indicate that theabove factors help multiplicatively one another and yeast mutants can contribute to build up
highly efficient system to produce protein resources.

1

緒きない例も多い。 真核微生物であるパン酵母は、

言組み換え遺伝子宿主として大腸菌に近い扱い易さ報告されている。 これらの中にはコスメトロジ 一ることができる特質を持っている。 またパン酵母

素材として有効と考えられるものもあるが、 適用は、 真核生物として蛋白質への糖鎖付加などのプ例は少ない。 この原因として蛋白質の固有の特徴ロセシング機能を持つだけでなく、 突然変異を用である安定性や活性発現条件による制約もあるが、いてこれらの機能を人為的に制御 l) することがで純度の良い酵素蛋白質を多量に得る上での問題点きるという他の真核生物宿主では容易に行えないがあげられる。 天然の含有量が微量な有用蛋白質操作が可能である。 このパン酵母での蛋白質分泌を微生物で遺伝子発現させて生産しようとする試の高効率システムの構築原理を確立できれば、 様みは組み換え遺伝子技術が確立された早い段階か々な有用蛋白質素材を生産する場合の指針となりら行われている。 組み換え遺伝子の発現のために

Y●ast Coils Harboring HLY Gene、一Chemic>! Mutagenesisが多いが、 ハ クテリアを溶解する活性を持つリゾ

Growth on Ha!o Assay Agar Plateof protein resources by yeast super­secreting mutants
Katsunori Suzuki,
Facutly of ScienceHiroshima University，＾腸菌を用いて蛋白質を多量に作ることはできるが酵素としての高次構造を構築できず活性を発現で:omeKlocyhetMlola
旧 IVーa dc rlce AH MI呻
uaq ol otLh↓ L ↓ sy phn Lorw ih 5 cny wt , go oasr yd>·c G s5bI.:."発現のための宿主とすることができない例や、 大」ー ーチ ー ムの場合のように大腸菌を組み換え遺伝子の＼゜

遺伝子発現能力の高い大腸菌を宿主に用いること

Development of efficient system foヤproductionBA

生体の機能素子として多種多様な酵素蛋白質がを持ち、 バ クテリア固有の障害を被らずに生産す

Isolation of Supersecreting Yeast Mutants

図1 リゾチ ー ム高分泌突然変異体のスクリ ーニング
突然変異処理及びスクリ ーニング法の概要 (A) 、 ならびに細菌含有寒天培地平板を用いた酵母菌コロニー のリゾチ ー ム分泌能力検定 (B).
コロニ一 周縁の透明環はコロニ ー から分泌されるリゾチ ー ムにより寒天中のバクテリアが溶解されたため形成されるで 矢印 (P) の先のコロニー は野生型親株なのでコロニ ー 周縁に透明環は見えない 、-2-

高分泌酵母突然変異体を用いた蚕白質素材生産効率化システムについての研究

2うると期待される。 筆者等は先にリゾチー ム遺伝

実験子を染色体DNAに組み込んだパン酵母に突然変異を誘起して、 分泌量が 10 倍以上高まった変異体を2·1分離した 2) (図1)。 酵母宿主に限らず培養条件

培

養主にイ ストニトロゲンベ ース0. 67% とグルコーの改変や細胞•個体選抜による優良株の育成はこーれまでに多数行われているが、 どのような機構でンベ ー ス0. 67% とガラクト ー ス 2% (SG培地）を効率が変化したのか明らかにされている例は少な

基本培地として 30 ℃で振とう培養 した。 YPD寒い。 この高分泌変異体中の一つssll変異体では蛋天培地 Cl% イ ー ストエキス、 2% ボリペプトン、白質のソーテイング機構が変化しており（回2)、膜透過後輸送の過程が効率化されたものと考えられた。

PSM

M,ii.�,•S

2·2 宿主とプラスミド高分泌株I69(ssll)野生型株KS45-3DとKS51-3C、P脱抑制変異体株 KK4、 ならびに、 これらを交配後に減数分裂させ顕微操作 4) により四分子解離し•ProCPY
疇て菌株を作成して使用した。 プラスミドとして、

CPY.,
`• J’

リゾチ ー ム遺伝子 (HLY) を持つマルチコピ ー••．
，

図2型ベクタ ー YEpHLYSIG 5 ' および pESH 6i を用いた。

蛋白質輸送過程に変化のある高分泌変異体
培蓑液上清(M) 、 細胞壁画分(S) 、 及びプロトプ
ラスト画分(P)の蛋白質をアクリルアミドゲル電気泳動した後 、 抗CPY抗体を用いてCPY蛋白質を検出した. CPYは野生型細胞 (SSL1) ではプロトプラスト分に検出されるが 、 変異体(ss/1) では細胞壁画分に前駆体として検出される C

ヒトリゾチー ムはフレミングにより当初鼻水から発見され、 涙液に含有量が高いもののわずかしか得られない

3)2% グルコ ー ス）は主に交配や単細胞分離後の培養に用いた。

ssll

SSLlス 2% (SD 培地）、 およびイ ー ストニトロゲ。 この酵素は細菌細胞壁を溶解して細菌を殺菌するという人体防御作用を持つ

一

方YEpHLYSIGはHLYのプロモ ー タ ー としてGAP lOPを持ち、 pESHでは ENOlpを保持している。
2·3

活性測定

細胞から培養液中へ分泌されるリゾチー ムの活性測定は細菌を基質とする溺度減少法を用いて行った。

Micrococcus 乾燥菌体懸濁液 {50mM リン酸緩衝液 (pH6,4) 中0. lmg/ml} 0. 8mlに試料液0. 2mlを加えて経時的に吸光度をフォトメ ー タで炎症を低下防止するという安定化作用を合わせー持つ 蛋白質である。 リゾチー ムは蛋白質としては0. 001 減少するとき、 l ユニット活性とした。 培養

低分子巌のものであり、 立体構造も明らかにされ液の遠心上清を上記緩衝液で希釈して試料液としている。 酵母組み換え体のリゾチ ム分泌の量をた。 四分子解離して得た菌株での高分泌変異は細の段階で検出する手法も開発できたので菌含有平板で細菌溶解環を大きく形成するものと（図lB)、 制限要因を順次明らかにしてゆくのにして判定した他に、 カルボキシペプチタ ー ゼ Y 活ーコロニ ー好適な素材と考えられる。
本研究は宿主の設計上重要な点であり、 また高分泌変異体ssllにおいてさらに制限要因を明らかを用いて測定した。 450nmの吸光度が 1分間に性が欠損しているかどうかを検出して判定 2 ) した。
その他の変異は酵母遺伝学の一般的判定法 4 ) に従って確認した。にしてゆく上の基礎知見、 即ち、 交配・遺伝子量効果 ・ 培地の改変などの基本操作で分泌効率を相乗的に操作できるかどうかを知ることを第的としている。

一

2·4

蛋白質の検出

培養液中へ分泌されたリゾチー ムは HPLC及び電の目気泳動分析した。 電気泳動には培養液遠心上清に、-3-このことは、ssll変異の効果と遺伝子量効果がSDSとメルカプトエタノ ー ルを含むサンプル緩相乗的に作用していることを示している。

衝液を加えて、煮沸したものを試料とした。 アクリルアミドゲルで泳動の後、 銀染色で全蛋白質を3·2染色して確認した他、 PVD 膜へ転写した蛋白質を抗リゾチーム抗体を用いるWestern Blot法で検栄養の効果

培養液の成分を変更することによって分泌量が変動した。 合成培地へ添加するアミノ酸をカザミ出した。

ノ酸に置き換えると、10倍高い活性がみられた。
3結

野生型親株とssll変異体で同様に変動しているの果で、ssll変異の効果とカザミノ酸の効果は相乗的3·1に作用していると考えられた（表 l 、図 4)。

遺伝子量効果先に筆者らが分離したssll変異体は、野生型親株に比べて10倍高い効率を示すものの純粋に遺伝

表 1

生化学的見地から解析するために分離したもので、遺伝子発現も低い形態で設計されていたため、分泌量は低いレペルにとどまっていた。 そこで、リゾチ ー ムのmRNA量を増すために、多コピ ー 数プラ
スミドベクタ ー でリゾチ ー ム遺伝子をssll変異体と親株に導入したところ、 ssll変異体と親株の形質転換体は、共に10倍多いリゾチームを培養液中へ分泌した。性質の異なる2種のプロモ ー タ ー を用いた場合で同様な結果が得られた（図3)。

YPDによる抑圧作用
リゾチ ー ム活性(unit)

菌株培地

KS45-3D
KS45-3D
I69
!69
I85
I85

YPD
SD+C邸
YPD
SD+CASYPD
SD+CAS

2日後

゜

218
246

゜゜
゜

5日後
l27

56

2日及び5日間培養後の培養上清液中の活性を測定した。
(-; 測定せず）

40�20u<(10·- 15--゜5pESHYEpHLYSIG0

HLY in chr

10 5!

C 2530 25 20 1P VA!
!
E Jl!
(Un) A-i,....,_ 35
E 30

図3 遺伝子岳のリゾチ ー ム分泌に及ぽす効果
染色体 DNA上に 1 コピ ー 挿入したリゾチ ー ム遺伝子
(HLY in chr) 及び多コビ ー 数プラスミドベクタ ーに導入されたリゾチ ー ム遠伝子(YEpHLYS I G, pESH)を持つ細胞を比較した。soc培地(HLY in chr, pESH)
及び SGC培地 (YEpHLYSIG) を用いて培蓑したc 宿主として野生型親株 KS45-3D( ■）及び突然変異体 169(0)を用いたで 培蓑液上清中のリゾチ ー ム活性を示すでSDCSD+CAS

図4 培地のリゾチ ー ム分泌に及ぽす効果
SDC培地及び SD+ CAS培地を用いて染色体DNA 上に 1
コビ ー 挿入したリゾチ ー ム遠伝子を持つ野生型親株
KS45-3D(●）及び突然変異体 169 (口） を培蓑したe
培蓑液上清中のリゾチ ー ム活性を示すe-4-

高分泌酵母突然変異体を用いた蛋白質索材生産効率化システムについての研究

3·4

一方。 パ ン酵母を栄養増殖する目的で使用される培地YPDを用いた場合 は、 一過的に低い活性ss/1変異、 カザミノ酸、 遺伝子量の相乗作用がssll変異体で観察されその後消滅した （表1)。

前項までの 3 つの改善効果は互いに組み合わ培養液中へ分泌されたリゾチ ー ムが分解を受けてせると相乗的に効果が現れて分泌量を増やせるのいる可能性を示す興味深い基礎的知見である。

か、 それとも、組み合わせによってはそれほど付加的な効果が現れてこなくなるかということは、リゾチ ー ム生産の課題にとどまら ずに宿主の設計

3·3 交配の効果上重要な課題である。 そこで前節で得られたssll

パ ン酵母は菌株ごとに性質が少しずつ異なるの株にプラスミドを導入 し合成培地及びカサミノ酸

で、ssll変異体を他の菌株と交配して子孫を調べれば、分泌量が増大したものが得られる可能性が

表 3 新規宿主、 遺伝子量効果、 カザミノ酸間の相乗効果ある。 そこで生育の良い野生型細胞と交配して2倍体を作成 した。 この2倍体は表現型として高分

Strainリゾチーム活性(unit)

0 06 88 12倍体細胞を減数分裂させl倍体細胞を顕微操作に

pESH
SOC SD+CAS0 00 0
1 4KS58-2B
KS58-2D0 02 89 11 20 00 83 2

対して劣性の性質を持っていると解釈される。

YEpHLYSIGSGC SG+CASー泌ではなかった。ssll変異が野生型対立遺伝子により選別して か ら培養すると、 表2に示すよ うにリゾチ ー ムを多く分泌 する子孫(ssll) と、少添加培地で培養して分泌量を測定した。 図3と表 3

ししか分泌しない子孫 CSSLI) が 2対2の割合で得を比べるとプラスミドの導入とカザミノ酸添加培られる。 これらの中には元の変異体よりも 3-4 倍地により新規ssll宿主での分泌量は、 元のssll宿多い分泌量を示すものがあった。 高 効率な2株の培養液上清をイオン交換HPLCで分析したところ、表2に活性の値でみられたのと同様に天然のリで分離分析すると全構成蛋白質中で最も主要なバていることがわかった。

ンドとしてリゾチ ー ム蛋白質を検出できた（図5)。

交配体から得られた1倍体菌株の分泌量菌株

活性菌株(unit)

B2高まっており、 相乗的に 作 用したと判断される。
この培養液上清 中の蛋白質をSDSゲル電気泳動

ゾチ ー ム蛋白質と同じ性 質の蛋白質が著量存在し表主を合成培地で培養 した場合 に 比べて500 倍 にA

活性l 2l 2Ag Stain

Anti HLY(unit)

KS58-1A1-l B

43-lC99-l D

lKS58-3A- 38

643KS58-4A-4B-3C-3D14-4C

7-4Dl

KS58-2A- 2B

108-2C-2D127

゜

47

゜l54

- --------- -------------- - - Wild type & ss/ 7 strainsused for the d1plo1d construction
KS51-3C
l30I69図5分泌されたリゾチーム蛋白質の分析
KS58-2D(YEpHLYS I G)をカザミノ酸添加培地を用いて培蓑しに培蓑液上清(1 ; 1 Ou I 、 2 ; 20u I)中の全蛋白質をアクリルアミドゲル電気泳動した後、 銀染色(A)及び抗ヒトリゾチーム抗体(B)を用いて全蛋白質ならびにリゾチ ー ムをそれぞれ検出した，-5-

4考を用いて効率化する方法を検討した。遺伝子量効

察果によるmRNAの加重、栄養成分の添加による生育

徹生物を 宿主にして蛋白質を作成すると、製品条件の効果を分析した。リゾチ ー ム高分泌ssll変に混入する宿主由来の物質が副作用となることが異体は、野生型親株に比べて10倍高い分泌効率を示す。 mRNAを増すために、多コピ ー 数で複製する問題となると指摘されている。効率の高い生産シプラスミドベクタ ー としてリゾチ ー ム遺伝子をステムを作ることは、単に経済的な効果をもたらssll変異体に導入することによって10倍効率が上すだけでなく、副作用を低下する点でも役立つと期待されている。本研究ではssll変異、交配、カ昇した。合成培地の成分について検討しカザミノ

ザミノ酸添加、遺伝子量効果の各作用で分泌量を酸の添加によって10倍近く効率上昇した。ssll変増加させられることと、これらの要素の組み合わ異体と生育の良好な菌株との交配により3-4倍効せが相乗的な改善効果があることを示すことがで率の高い新規ssll宿主を得た。新規ssll宿主は、きた。蛋白質の分泌は遺伝子発現、蛋白質合成、これまでの 宿主と同様に天然型と同じ性質のリゾチ ーム蛋白質を多最に分泌していることを生化学

膜透過、輸送、分解など細胞内の多数の要素が組み合って行われる過程であるので、様々な制限要因を想定できる。筆者等は先にssll変異が転写に的に確認した。新規ssll宿主の利用・プラスミドの導入・ カザミノ酸添加培地での培養は相乗的に作用し得た。新規ssll宿主が天然型と同じ性質のは影響せず蛋白質分配機構に変化をもたらしていリゾチ ー ム蛋白質を培養液中に著量分泌しているることを明らかにした。この変異体において本研ことを生化学的に確認した。以上の知見は本変異究で試みた操作がすべて分泌量を増加させ得たこ体を基にさらに効率の高い変異体の分離や他の変とは制限要因がまだ多いことを示唆している。言い換えれば、 パ ン酵母での分泌効率は遺伝的改変あるいは遺伝子工学的操作を用いてさらに高められ よう。例えば、 YPD 培地を用いた場合のようにいったん培養液中に検出された酵素活性が消失異との組み合わせによる柔軟なシステム作りにも役立つと考えられる。

引用文献
1) T.Nagasu, Y.Shimma, Y.Nakanishi, J.Kuromi

してゆく現象が見られた（表1)。この現象に関与

tsu, K. I wama, K.Suzuki, Y. Jigami

する因子の遺伝子を破壊すればさらに効率の高い安定した 宿主を構築できるものと考えられる。

2) K. Suzuki , K. Ichikawa, Y. Jigami Mot. Gen.

酵母を分泌 宿主に用いると活性を持った蛋白質を分泌生産できるという報告例が多いものの、生産効率は高くないのが一般的である 7) 。一見、回Genet., 219 58-64 (1989)
3) A Fleming Proc. soc. Land., [B] 93 306-317(1922)

り道のようにも見えるか、 パ ン酵母でリゾチ ー ム4) K.Suzuki, N. Yanagishima Cut. Genet., 10 353を分泌するシステムを用いて遺伝子発現から酵素-357 (1986)の集積までの素過程を総合的にかつ遺伝生化学的

5) Y. Jigami, M. Muraki,に解明してゆくことと、関与している遺伝因子を改変してゆくことは、真に望ましい高効率なシステム作りに寄与できると考えている。

総

Yea.st., 8535-547 (1992)

N.Harada, H. Tanaka

Gene.,43 273-279 (1986)
6) K. Ichikawa, K.Komiya, K.Suzuki, T.Nakahara,Y. Jigami, Agric. Biol. Chem., 53 2687-26940989)

括7) D. T. Moir, L. S. Davidow
491-5075 (1991)

コスメトロジ ー 有用素材と考えられる蛋白質リ
ゾチ ームの生産を突然変異を有する パ ン酵母宿主-6-Meth. E加）,not., 194