黒毛和種繁殖雌牛における栄養水準の増減が過剰排卵処置時の卵胞数および採胚成績に及ぼす影響

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黒毛和種繁殖雌牛における栄養水準の増減が過剰排卵処置時の卵胞数および採胚成績に及ぼす影響

林 武司*，上田修二 1），磯崎良寛
本研究は，体内胚を採取するために過剰排卵処置を施す黒毛和種雌牛に対し，配合飼料の給与量を変更することで栄養状態の切替え（配合飼料減量→増量）を行い，小中卵胞数，過剰排卵処置の反応性や採胚成績に及ぼす影響について検討を行った。試験は黒毛和種雌牛 9 頭を用い，試験区は，配合飼料を減量給与（TDN:90％，CP:100％）で 2 週間維持し，増量給与（TDN:115％，CP:140％）に切り替えたのち，1 週間後に CIDR を挿入し過剰排卵処置および採胚を実施した。対照区は基準量（TDN:106％，CP:110％）を試験区と同等の期間給与した。試験期間中の体重変動は，試験区，対照区との間に差はなかった。試験期間中の小中卵胞数について，試験区では，減量給与中，大きな変動はなかったが，増量給与に切り替わると小中卵胞数は増量給与前と比べて増加した（P<0.05）。しかしながら，その後実施した過剰排卵処置時の大卵胞数は，両区で差は認められなかった。採胚成績では総回収卵数は両区で差は認められなかったが，試験区では対照区と比べ，正常受精胚数が有意に多くなり（P<0.05），AB ランク胚数は多い傾向がみられた（P=0.069）。また，未受精卵数は試験区が有意に少なくなった（P<0.05）。これらの結果から，過剰排卵処置前の黒毛和種雌牛において，配合飼料の給与量を減量から増量し，栄養水準を切り上げると小中卵胞数が増加するものの，過剰排卵処置後の大卵胞発育への反応性には影響しないと考えられた。一方で正常受精卵数が向上し，未受精卵数が減少する等，採胚成績を向上させる可能性があることが示唆された。
［キーワード：栄養，過剰排卵処置，黒毛和種雌牛，採胚成績，卵胞数］
Effect of Nutrition Change on Superovulation Follicles Response and the Quality of Recovered Embryos in Japanese Black Cow.
HAYASHI Takeshi・Shuji UEDA and Yoshihiro ISOZAKI, (Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center, Chikushino, Fukuoka
818-8549, Japan) Bull. Fukuoka Agric. For. Res. Cent. 10 : 25 - 31 (2024)
The aim of this study was to examine the effect of controlling nutritional status (i.e., low to high nutrition) on the following outcomesin Japanese Black cows: 1) the number of small and medium follicles in the ovaries, 2) the response to superovulation, and 3) thenumber of normal fertilized oocytes. Specifically, nine Japanese Black cows were fed a low nutritional diet for two weeks (TDN:90%,CP:100%) and then they were subjected to a high nutritional diet (TDN:115%, CP:140%). Finally, after one week, CIDR was inserted.
In addition, superovulation treatment, periodic artificial insemination, and uterus flashes were performed. Moreover, the control group
was fed the standard nutrients (TDN:106%, CP:110%) for the same period as the test group. Throughout the study, the test and control
groups did not differ in terms of their body weight. Although the number of small and medium follicles did not change during the lownutrition period, this number significantly increased when a high-nutrition diet was implemented. However, the number of large follicles(i.e., as driven by superovulation) was not different between the two groups. Regarding the uterus flash results, there was no differencein the number of oocytes obtained during embryo collection, but the number of normal fertilized embryos was significantly higher intest group (P<0.05). We also found that the number of non-fertilized oocytes was significantly lower in the test group. Overall, we
found that pre-superovulatory nutritional control in Japanese Black cows contributes toward the small-medium follicle, but thisapproach does not affect follicular development responsiveness after superovulation. We also found that pre-superovulatory nutritional
control may reduce the rate of non-fertilization and increase the number of normal fertilized embryos.
[Keywords: Japanese Black Cow, normal fertilized embryo, nutrition, superovulation, the number of follicles]緒

言

黒毛和種牛繁殖農家の生産性を向上させ，収益を改善するためには，母牛能力の継続的な改良が必要である。
その改良方法として，人工授精および胚移植を用いたものが一般的であるが，なかでも優良雌牛の過剰排卵処置（SOV）による採胚とその胚移植による改良方法（MOET）は，農家内の優良遺伝子を効率よく活用でき，牛群改良速度を飛躍的に高めることが可能となる。しかしながら，＊連絡責任者（畜産部：hayashi-t4389@pref.fukuoka.lg.jp）
1) 前 畜産部

ホルモン剤に対する反応性や，人工授精に使用する種雄牛精液の差により，採取される移植可能な胚数や品質に安定を欠くのが現状である。ホルモン剤の種類や投与量による採胚成績を検討した報告では，回収された胚は最小 5 個，最大 26 個とあり，個体差によるものであるとしている（余谷ら 1991）。また岡田ら（1998）は，複数の種雄牛を用いて体外受精を行い，胚盤胞発生率などを調査したところ，種雄牛によって受精率や発生率に差が認められたことを報告している。さらに SOV 採胚は経費が高
受付 2023 年 7 月 20 日；受理 2023 年 11 月 21 日

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福岡県農林業総合試験場研究報告 10 （2024）

いため，利用可能な高品質胚が少数しか採取されない場
合は農家の利益が乏しくなるのが現状である。このことは，SOV による採胚技術の活用の幅広い普及を妨げる要因になっている。
SOV における採胚成績の不安定要因として，投与されるホルモン製剤に対する卵胞の反応性や，正常胚率の差があげられる（余谷ら 1991）。SOV における卵胞の反応性向上および正常胚率の向上は，優良雌牛を活用した母牛能力の改良に役立つ。SOV と卵胞の反応との関係性について，福田ら（2008）は処置前の小卵胞数と処置後の大卵胞数に正の相関があることを報告している。Nolan etal.（1998）は SOV 前の短期的な栄養水準低下が卵胞数を増加させることを報告している。また，飼料給与量を増加させることで卵胞数が増加したという報告もある（Freret et al. 2006）。他にも，給与飼料の変更により，血中尿素窒素（BUN）/血糖（Glu）比が低下すると，採胚時の正常胚率が向上するという報告もある（細川ら 2008）。
これらの報告は，牛の栄養状態を変化させることで，SOV に反応する小中卵胞数の増加や正常胚率向上等により採胚成績を改善できる可能性があることを示唆している。
そこで本試験では，黒毛和種繁殖雌牛の飼料給与量の増減により，一定期間の低栄養状態から，高栄養状態に切替え，その後に SOV を行った場合の採胚成績を調査した。
第１表
区

材料および方法
１

供試牛および体重測定・血液検査
供試牛については，黒毛和種雌牛 9 頭，体重は 502kg～662kg の経産雌牛（産次数 1～4 産）を供試した。個体ごとに試験区と対照区を反転させて試験を行い，人工授精は供試牛ごとに試験区と対照区で同じ種雄牛精液を用いた。また SOV 後の卵巣回復のため，反転まで 2 カ月以上の休止期間を設けた。
体重測定および採血は，試験開始から 1週間ごと，および採胚日に実施し（第 1 図），総コレステロール（T-cho），
アルブミン（Alb），尿素窒素（BUN），血糖（Glu）および BUN/Glu 比について調査した。採血は飼料給与から 2時間後に実施し，血液は富士ドライケム（NX500V：富士フィルム，東京）を用いて分析した。体重については個体差の影響を除外するために，試験開始時を起点とする増減（kg）を調査した。
２ 飼料給与栄養量と試験開始のタイミング
飼料給与栄養量と試験開始のタイミングを第 1 表，第 2表および第 1図に示した。試験開始前の試験牛の体重から必要養分量（日本飼養標準肉用牛（2008 年版））を計算し，配合飼料給与量を変更することで試験牛の基準量（可消飼料給与栄養量と給与期間給与栄養量

対照区：

給与期間

基準量（TDN:106％，CP:110％）

全期間減量（TDN:90％，CP:100％）

CIDR 挿入 3 週間前～CIDR 挿入 1 週間前まで増量（TDN:115％，CP:140％）

CIDR 挿入 1 週間前～採胚まで

試験区：1) 馴致期間として両区とも試験開始まで 1 週間基準栄養量を給与
2) 減量，増量は配合飼料給与量で制御した

第２表

飼料給与内容および配合飼料内訳

給与飼料内容飼料名

給与量（現物 kg）

クレイングラス
オーツヘイ
ヘイキューブ
供試牛配合飼料

330.80.6～1.21）

供試牛配合飼料内訳
飼料名
ヘイキューブ
圧ぺんトウモロコシ
大麦圧ペン
大豆粕
ふすま

供試牛配合飼料成分/kg（現物）

成分 2）

DM 含（%）

0.1
0.1
0.05
0.10.65

DMCP
TDN
EE
NFC
CF
ADF
NDF

88.9
19.9
75.0
3.7
43.9
10.9
14.230.91) 試験区分によって変動
2) DM：乾物，CP：粗蛋白，TDN：可消化養分総量，EE：粗脂肪，NFC：非繊維性炭水化物，CF：粗繊維，
ADF：酸性デタージェント繊維，NDF：中性デタージェント繊維

黒毛和種繁殖雌牛における栄養水準の増減が過剰排卵処置時の卵胞数および採胚成績に及ぼす影響

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化養分総量（TDN）:106％，粗蛋白質（CP）:110％），減量 給 与 量 （TDN:90％ ，CP:100％ ）， 増 量 給 与 量（TDN:115％，CP:140％）を設定した（第 1 表，第 2 表）。
給与量を切り替える区を試験区とし，対照区は全期間を通して基準量を給与した。栄養量の変化は配合飼料給与量を増減させることで行い，粗飼料は両区とも一定量を給与した。すべての区において試験開始の 1週間前から基準量の飼料を給与し，試験牛を適応させる馴致期間を設けた。試験区では試験開始から 2週間減量給与量を与えた後，増量給与量に変更した。変更から 1週間後に膣内留置型プロジェステロン製剤（CIDR:Zoetis Japan，東京）を挿入し，採胚による試験終了まで増量給与を維持した（第 1表，第 1 図）。発情周期をそろえるために試験区，対照区ともに黄体が確認された試験牛に対し，試験開始（D0）の 2 週間前にプロスタグランジン F2α（PGF2α）（ダルマジン：共立製薬株式会社，東京）を 4mL 投与し，試験を実施した。とし、分割していない胚を未受精卵とし，採胚成績とした。

３ 過剰排卵処置および採胚および採取胚の処理
SOV のホルモン剤投与プログラムについて第 1 図に示した。試験開始を D0 として，D21 に CIDR を挿入し，6日 目（D27）から卵胞 刺激ホ ル モン（FSH）（ アントリン：共立製薬株式会社，東京）を 18AU，3 日間朝夕漸減投与し，CIDR 挿入後 8 日目（D29）の朝に PGF2α を 3mL筋肉注射し，同日の夕方に CIDR を抜去した。PGF2α から
48 時 間 後 （D31） に 性 腺 刺 激 ホ ル モ ン 放 出 ホ ル モ ン（GnRH）（エストマール：MSD アニマルヘルス株式会社，東京）を 4mL 投与し，同日の夕方に人工授精（AI）を行った。AI から 7 日目（D38）の朝，子宮内にバルーンカテーテルを挿入して非外科的に子宮内を生理食塩水で灌流し，胚を回収した。回収した胚は実体顕微鏡下でInternational Embryo Technology Society（IETS）マニュアルにしたがってランク付けし，excellent と good の胚を A ランクとし，fair を B ランク，excellent から poor を正常受精胚とした。また，著しく発育の遅れている胚はランク外

５

第１図

４ 卵胞数の観察
卵胞数の観察時期について第 1 図に US（UltraSonic）として示した。卵巣の観察は超音波画像診断装置（My LaboneVet；Esaote，イタリア）を用い，小中卵胞数，大卵胞数等の卵胞数の変化について調査した。試験開始から CIDR挿入までの 4 週間は 1 週間ごと（Day（D）0，D7，D14，D21），
CIDR挿入後は FSH投与前（SOV前）（D27），AI時（D31），
AI 翌日の排卵確認日（D32），採胚時（D38）に超音波画像診断装置を用いて観察し，卵胞数を調べた。卵胞の分類については，直径 2～4mm を小卵胞，5～8mm 中卵胞，9～19mm を大卵胞，20mm 以上を巨卵胞とした。
（第 3 図，第 3表）。また小中卵胞数の変化率として，試験開始の D0 からD14，D14 から D27 までの小中卵胞数の変化を調査した（第1 図）。さらに，D31 の AI 時の大卵胞数を SOV 前の小中卵胞数で割ることで SOV 反応率を求めた（第 3 表）。
統計
統計処理は統計ソフト EZR（Ver1.6）を用い，小中卵胞数の推移には反復測定分散分析を実施した（Kanda 2013）。
体重変動，血液成分値，卵胞数，卵胞変化率，SOV 反応率，採胚成績についてはデータが正規分布の場合は対応のある t 検定を実施し，正規分布を示さない場合はWilcoxon の符号付順位和検定を実施した。

結果および考察１

体重および血液性状の変化
試験期間中の体重変動および血液性状を第 2図に示した。
体重の変動について，試験区で減量給与の開始 2 週間後の体重が減少したが，増量給与に切り替えると増加に転じた。ただし対照区と試験区との間に有意な差は認められなかった。T-cho は両区に大きな差は認めらなかった。
Alb については試験期間中両区に差は認められなかった。

飼料給与水準およびホルモン投与プログラム

1) 基準量…TDN:106％，CP:110％，減量…TDN:90％，CP:100％，増量…TDN:115％，CP:140％2) 馴致期間：基準量を給与

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BUN は試験開始後の D0～D14（試験区における減量給与期）においては両区とも 10mg/dL 程度であったが，D14～D38（試験区における増量給与期）に移行すると試験区が上昇し，採胚時（D38）には対照区に比べ有意に高くなった（P<0.05）（第 2 図）
。一方で Glu については，試験期間中（D0～D38）に両区に有意な差は認められなかった。
BUN/Glu 比では D35 から採胚時（D38）までは試験区が対照区に比べ高い傾向が認められた（P<0.10）（第 2 図）。繁殖雌牛の栄養水準切替えによる体重増減について，
Admaiak et al.（2005）は成牛に対し栄養水準を通常の 2 倍濃度とすることで，約 40 日間で体重および BCS が増加したことを報告している。本試験では，一度低栄養状態にすることで，試験区の体重変動は一時的に減少している。
また本試験における対照区と試験区の TDN 差は低栄養時-16％，高栄養時で 9％となっており，試験期間内での体第２図重変動に差がでにくかったと考えられる。血液性状について，T-cho，Glu には差がでなかったものの，BUN は採卵時に有意に高くなった（P<0.05）。T-cho は体重の増減と同じく，飼料給与量として有意差がでるには不十分な量であり，Glu については，体内での恒常性が保たれたものと考えられる。福島ら（2018）は，黒毛和種繁殖牛において栄養水準を切り替えた場合，速やかに変化するのは BUN であると報告しており，本研究と一致する。BUNは CP 給与量増減に短期的に変動する指標であり，本研究と一致する。BUN は CP 給与量増減に短期的に変動する指標であり，本試験でも BUN が上昇したと考えられる。
Alb は長期的な CP 給与量を示す指標であり，本試験の期間中（38 日間）では比較的測定期間が短く，差が生じにくかったと考えられる。

体重変動および血液成分1) *：P<0.05 †：P<0.102) 対応のある t 検定または Wlicoxon の符号順位和検定

黒毛和種繁殖雌牛における栄養水準の増減が過剰排卵処置時の卵胞数および採胚成績に及ぼす影響

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卵胞数の変動について増量給与への切替えに伴う小卵胞数の増加は SOV 後の大試験期間中の小中卵胞数の推移について第 3図，栄養給卵胞数の増加にはつながらなかった。給与飼料と SOV 時与量切替えによる小中卵胞数変化と SOV に対する反応性の卵胞の反応性について Molle et al.（2017）は，SOV 時について第 3表に示した。試験期間中は両区の小中卵胞にに乾物飼料給与量を増加させると，血中インスリンが増おいて差は認められなかった（第 3 図）
。SOV 前の小中卵加することで，SOV 時の FSH への反応性が低下し，大卵胞数は，対照区 50.9±7.8，試験区 64.9±9.6 と有意差は認胞数が低下することを報告している。また，ヒトでは高められなかったが試験区が多かった（P=0.511）。一方で， インスリン状態では，卵巣莢膜細胞からのアンドロステ
小中卵胞数の経時的変化は試験開始時から増量給与へのロン分泌を促し，FSH 誘導性の卵胞発育や排卵を妨げる切替えまで（D0～D14）変わらず，変化率に差は認めらことが知られている（折坂 2012）。本試験では試験区におれなかった。しかし，減量給与から増量給与へ切り替えいて，配合飼料の増量給与により TDN，CP ともに増加した 2 週間後（D14～D27）では試験区の小中卵胞変化率はたため，このことが原因となり FSH の反応性が低下し，有意に高くなった（第 3 表）。（対照区：-3.1％，試験区：
SOV 前に小中卵胞数が増加したにもかかわらず SOV 置後30.9％；P<0.05）。Nolan et al.（1998）は，短期間低栄養の大卵胞数増加につながらなかったと推察された。
状態にすることで卵胞数が増加することを報告している。
また，連続経膣採卵（OPU）中に通常栄養量から栄養水
３ 採胚成績
準を増加させた場合，回収可能な卵胞数が増加したとの採胚成績は第 4 表に示した。SOV 後の子宮灌流により報告もある（Freret et al. 2006）。一方で肉用牛未経産牛の回収された総回収卵数は，試験区と対照区との間に差は給与飼料内容をサイレージ＋濃厚飼料，サイレージのみ， 認められなかった。AB ランク胚は，対照区 4.8 個，試験乾草飼料のみとして，栄養水準の異なる飼料給与を行い， 区 10.0 個と試験区が多い傾向にあった（P=0.069）（第 4卵胞数変動を比較したところ，卵胞数の変化に差は認め表）。正常受精胚は対照区 5.4 個，試験区 11.1 個と試験区られなかったという報告もある（Yakkub et al. 1999）。本が有意に多くなった（P<0.05）。未受精卵数は対照区 12.3
試験では，SOV 前（D27）の小中卵胞数と AI 時（D31）
個 ， 試 験 区 3.4 個 と 試 験 区 が 有 意 に 少 な く な っ たの大卵胞数を比較した SOV 反応率は試験区分間の差が認（P<0.05）。
められなかった（対照区 61.0％，試験区 48.0％，P=0.316）
東山ら（2018）は，TDN 充足率を 130％となる飼料を（第３表）。
SOV 開始から採胚日まで給与することにより正常受精胚SOV と卵胞数の関係性について，SOV 前の小中卵胞数AB 胚数が向上することを報告している。また，SOV 処置と過剰排卵処置に反応する大卵胞数との間には高い相関
前の短期間に低栄養飼料を給与することで，採取胚の細が あ る と す る 報 告 が あ る （ 福 田 ら 2008）。 ま た ，胞数が有意に多くなるなど，胚の品質を向上させた報告
Kawamata（1994）は，SOV 前の小卵胞（直径 3～6mm）がある（Nolan et al. 1998）。一方で，飼料給与水準を通常の数は SOV 後の大卵胞数，回収卵数および正常受精胚数量の 2 倍給与した場合，OPU 後の正常受精胚率が低下すと強い相関関係にあり，SOV 前の小卵胞数で SOV 後の大ることが報告されている（Admaiak et al. 2005）。このこと卵胞数や採胚後の胚数をある程度予測可能であると報告
は採卵牛の SOV 前の適度な栄養水準の切り上げは受精卵している。しかしながら，今回の試験では減量給与から品質向上に寄与するが，あまりに過度な栄養水準の増加
２

第３図

小中卵胞数推移

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福岡県農林業総合試験場研究報告 10 （2024）

は胚の正常発生を阻害する可能性を示唆している。本試
験では，TDN の増加は 90％から 115％であり，栄養水準の切り上げが比較的緩やかであったことが正常受精胚数の増加等，採胚成績向上に寄与した可能性がある。
血液性状と OPU 処置時に得られる卵子について，血中BUN と体外受精時の胚盤胞発生率が高い良質卵子の割合には有意な正の相関があることが報告されている（鍋西・中 2022）。一方で血中成分と受胎率の関係について，
受 胎 率が 高い個 体の 血 中 成 分 は BUN<11mg/dL，Glu≧
50mg/dL，BUN/Glu<0.2 で あ る と 報 告 が あ る （ 福 島 ら2016）。これらのことは良好な胚品質および繁殖能力に適する血中 BUN にはある程度の制限された幅があることを示唆している。細川ら（2008）は採胚時に採血を行い，採胚成績により個体を分類したところ，正常受精胚率の高い個体の BUN は 13mg/dL 以下であり，BUN/Glu 比は0.2 以下となっていることや，給与飼料の非繊維炭水化物（NFC）/分解性蛋白質（DIP）比を 5 以下に変更し，採胚時の BUN/Glu 比を 0.2 以下に抑えることで正常受精胚が増加することを報告している。本試験において BUN/Glu比は試験区が対照区に比べ，SOV 開始以降は高い傾向があるものの，試験区が SOV 開始時において BUN/Glu 比0.2 を超えた以外は，両区とも採胚時の BUN/Glu 比は 0.2US1
試験区配合減量開始

対照区
試験区
P値

A51.8 ± 6.25
48.4 ± 6.840.555以下となっている（第 2 図）
。また，採胚時において試験区の BUN は対照区よりも高い傾向にあった（第 2 図）。
これらのことから，採胚時の BUN/Glu 比が 0.2 以下である場合，血中の BUN がより高い方が正常受精胚の向上，未受精卵率の低下等の採胚成績向上につながる可能性が示唆された。血液成分と採胚によって得られる胚の品質は個体差もあり，より多くの試験牛による検証を重ねる必要がある。
これらの結果から，飼料給与量の増減による栄養水準の減少から増加への変更は小中卵胞数の増加につながる。
一方でその後 SOV を実施した場合，事前の小中卵胞数の増加は SOV に対する大卵胞数の増加につながらないことがわかった。また採胚成績については，SOV 前に飼料給与量を減量から増量へ変更することで，AB ランク胚数，および正常受精胚数が増加し，未受精卵数が減少することが明らかになった。

謝 辞
本研究は，公益財団法人伊藤記念財団の研究助成事業による支援を受け遂行された。多大なご援助を賜りました公益財団法人伊藤記念財団に厚く御礼申し上げる。

第３表 過剰排卵処置に対する反応性
小中卵胞数
US3
SOV 前（US5）小中卵胞変化率減量から増量へ増量切替え後（US1～US3）（US3～US5）
切替え
2 週間
B
C（B-A）/A（C-B）/B
54.3 ± 9.03
50.9 ± 7.77
2.1％
-3.1％
5.2％
30.9％
49.1 ± 5.79
64.9 ± 9.58
0.176
0.511
0.7700.015
大卵胞数対照区
試験区
P値

SOV 前
（US5）
D
1.4 ± 0.41
0.9 ± 0.310.219

SOV 反応率
AI 時（US6）

OV 確認時（US7）E
30.7 ± 6.10
31.0 ± 7.94
0.847

F
10.9 ± 3.50
15.6 ± 1.73
0.539

E/C
61.0％
48.0％
0.316

採胚時黄体数

21.1 ± 5.52
14.4 ± 3.260.1041) 対応のある t 検定または Wilcoxon の符号順位和検定
2) 平均値±標準誤差

対照区
試験区
P値

総回収卵数
19.3 ±5.516.7 ±3.80.470

第４表 採卵成績
AB ランク胚4.8 ±1.7 a
10.0 ±3.1 b0.069

1) 対応のある t 検定または Wilcoxon の符号順位和検定
2) 平均値±標準誤差

正常受精胚5.4 ±2.2
11.1 ±3.3未受精卵
12.3 ±3.8
3.4 ±1.4

0.044

0.034

黒毛和種繁殖雌牛における栄養水準の増減が過剰排卵処置時の卵胞数および採胚成績に及ぼす影響

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