皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析
昭和大学薬学部社会健康薬学講座衛生薬学部門

原俊太郎

Microsomal prostaglandin (PG) E synthase-1 (mPGES-1) and prostacyclin synthase (PGIS) are PG terminal synthasesthat function downstream of inducible cyclooxygenase (COX)-2 in the PGE2 and PGI2 biosynthetic pathways, respectively.
In the present study, to reveal the role of these PG terminal synthases in skin diseases, we investigated the effects of genetic
deletion of mPGES-1 and PGIS on skin disease models in mice. As the results, we found that both mPGES-1- and PGISdeficient mice exhibited a significantly decreased contact hypersensitivity response, indicating that mPGES-1 and PGIS
cooperatively exacerbate skin inflammatory reactions. Chemical-induced skin carcinogenesis was also suppressed bymPGES-1 deficiency, but PGIS deficiency did not affect skin carcinogenesis. mPGES-1 plays an important role in skincarcinogenesis, but contribution of PGIS might be little.

１．緒言

プロスタグランジン（PG）類は様々な生理現象に関わるばかりでなく、炎症やがんといった幅広い病態の発症や進行にも関わることが知られている。各々の PG 類はシクロオキシゲナーゼ（COX）によりアラキドン酸から産生された PGH2 に、それぞれの PG 類に特異的な PG 最終合成酵素が作用することにより産生される（図 1）。アスピリンなどの非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）は COX を抑制しこの PG 類の産生を抑えることで、抗炎症作用、抗がん作

図1

プロスタグランジン類の合成経路用といった薬理作用を発揮するが、従来用いてこられた
NSAIDs は胃粘膜保護作用など重要な生理作用を示す PG

mPGES-1 と PGIS はいずれもこのうち COX-2 と選択的に類を含め、すべての PG 類産生を抑えてしまうために、多機能連関し、それぞれ PGE2、PGI2 を産生する酵素である1）。

くの副作用を併せもつことが問題となっている。また、皮本研究では、mPGES-1 および PGIS の遺伝子欠損マウス

膚疾患においては、NSAIDs がアレルギー性皮膚炎を逆にを用い、皮膚炎や皮膚がんを惹起した際に、野生型マウス増悪化すること、一部の NSAIDs が光過敏症を誘発すること、病態の発症や進行にどのような違いがみられるか検討とも知られており、NSAIDs の皮膚疾患への適用を妨げるした。また、病態の発症や進行に伴い産生される各 PG 類を、大きな要因となっている。そこで、本研究では、皮膚疾

LC-MS/MS を用い経時的に定量解析した。

患にも適用可能な新たな NSAIDs の創製を指向し、従来の本研究で解析を行う mPGES-1 の特異的阻害剤について

NSAIDs が標的とする COX に代わる新たな創薬標的としは、現在、副作用の少ない NSAIDs として国内外でそのて、COX の下流ではたらく PG 最終合成酵素、中でも PGE開発が進んでいるが、この新たな阻害剤は、これまでの合成酵素の 1 つ、膜結合型 PGE 合成酵素 -1（mPGES-1）

NSAIDs とは作用点だけでなく構造もかなり異なり、それと、PGI 合成酵素（PGIS）に注目した。NSAIDs の標的でゆえに光過敏症等を起こさない可能性も期待できる。これある COX には、生体の恒常性維持に主に関わる構成型らの研究は、PG 最終合成酵素群を標的とする新たな皮膚の COX-1 と、炎症やがんの発症や進展に伴い発現誘導さ疾患の治療薬の可能性を示すだけでなく、今まで明らかとれる誘導型の COX-2 の 2 つのアイソザイムが存在するが、なっていなかった皮膚疾患の新たな発症、進展の機構の解明にもつながることが期待される。

２．実
Role of prostaglandin terminal synthases
in skin disease
Shuntaro Hara
Division of Health Chemistry, Department
of Healthcare and Regulatory Sciences,
School of Pharmacy, Showa University験

2. 1. 動物
mPGES-1 の遺伝子欠損マウス 2）は大阪大学の審良静男教授より寄贈された mPGES-1 遺伝子ヘテロ欠損（+/-）マウス（C57BL/6×129Sv 系）を、PGIS の遺伝子欠損マウス 3）− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016は神奈川工科大学の横山知永子先生より寄贈された PGISール中でホモジネートした。3000 rpm、4 ℃、5 分間遠心遺伝子ヘテロ欠損（+/-）マウス（C57BL/6 系）を交配したした後に、上清を回収し脂質を抽出した。調製したライゼものおよび、それぞれ Balb/c 系に 10 代以上戻し交配しートに内部標準として LTB4-d4 を加え、3 mL の PBS にてたものを用いた。これらのマウスの尻尾先端部から DNA希釈後、塩酸を 1 滴加えた試料を事前にメタノール 5 mL、を抽出後、常法によりジェノタイピングし、KO、ヘテロ、蒸留水 5 mL で洗浄した SEP-PAK C18（Waters）カラムにWT に識別し、各実験に使用した。

吸着させ、蒸留水、15 ％エタノール、ベンゼンの順に各5 mL で洗浄後、酢酸エチル・メタノール（9：1）溶液 3 mL

2. 2. DNFB 誘導アレルギー性接触皮膚炎モデル

で溶出して PG 類を抽出した。溶媒を除去し、水：アセト

アレルギー性接触皮膚炎における mPGES-1、PGIS の役割を検討するために、dinitrobenzene sulfonic acid（DNFB）ニトリル：ギ酸（63：37：0.02）に再度溶解し、測定用サンプルとした。

によるアレルギー性接触皮膚炎を惹起した。DNFB はア

PG 類の測定は LC-MS/MS の系 4） で行った。液体クロ

セトン：オリーブオイル＝ 4：1 溶液として用いた。まず、マトグラフィー（LC）の分離は Prominence HPLC システ

Balb/c 系マウスの腹部の毛をバリカンで剃り、翌日に 0.5ム（島津）を用いて以下の条件で行った（カラム：TSKgel％ DNFB を塗布した後 5 日間おいて感作を成立させた。5ODS-100 V column（2.0×150mm 内 径、5 µm particle、

日後、マウスの右耳介皮膚に 0.3 ％ DNFB を塗布し、耳介Tohso）、サンプル流入量：5 µL）。移動相は水：アセトニの厚さを 1、2、3、5、7、14 日と継時的に測定し、アレルトリル：ギ酸（63：37：0.02）とアセトニトリル：イソプロギー性皮膚炎の指標とした。また、コントロールとして左パノール（1：1）のグラジェントでカラムに保持された試料

耳介にはアセトンのみを塗布した。DNFB を耳介に塗布しを流速 300 µL/min で溶出させた。MS/MS 解析はトリプて 2 日後の耳介組織を摘出し、組織標本の作製、組織中のル四重極質量分析装置 QTRAP5500 システム（AB Sciex）

PG 類の定量に用いた。

を用いてイオンを検出した。

2. 3. TPA 誘導一次刺激性接触皮膚炎モデル

2. 6. RNAの調製、逆転写、定量的 PCR

一次刺激性接触皮膚炎における mPGES-1、PGIS の役

摘 出 し た 組 織 に TRIZOL（Invitrogen）500 µL を 加 え

割 を 検 討 す る た め に、12-O-tetradecanoylphrobol-13-て細胞を破砕し、常法により RNA を抽出した。抽出しacette（TPA）による皮膚炎を惹起した。TPA はエタノ

た RNA を High Capacity cDNA Reverse Transcriptionールに溶解して 16 mM に調製してストックし、使用時にKit（Applied Biosystems）を用いて逆転写反応を行い、16 µM になるようにアセトン溶液とした。マウスの右耳介

cDNA を得た。合成した cDNA を用いて定量的 PCR を行に TPA 3.2nmol（200 µL/mouse）を塗布後、耳介の厚さを 1、い、mRNA 発現を解析した。反応は Applied Biosystems

3、5、6、24 時間と継時的に測定し、皮膚炎の指標とした。

Step OneTM Real-Time PCR SystemによってPower SYBRR

また、コントロールとして左耳介にはアセトンのみを塗布

Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いてした。

行った。

2. 4. DMBA/TPA 誘導皮膚発がんモデルを用いた
解析

2. 7. 組織標本の作製摘出した組織を中性緩衝ホルマリン溶液によって固定後、皮膚での化学発がんにおける mPGES-1、PGIS の役割パラフィン包埋して薄切した。ヘマトキシリン・エオジンを 検 討 す る た め に、7, 12-dimethylbenz [a] anthracene

染色には、マイヤーヘマトキシリン溶液（WAKO）および（DMBA）/TPA を 用 い た 2 段 階 発 が ん モ デ ル に よ る 解

1 ％エオシン Y 液（武藤化学）を用いた。

析 を 行 っ た。DMBA は 2 mM ア セ ト ン 溶 液 と し、TPA

３．結は 16 µM ア セ ト ン 溶 液 と し た。 マ ウ ス の 背 部 皮 膚 に、果1 週間に 2 度ずつ TPA 3.2 nmol（200 µL/mouse）を塗布し3. 1. mPGES-1の欠損はアレルギー性接触皮膚炎を抑制するた。20 週間後に皮膚に生じたポリープ数をカウントする

はじめに、mPGES-1 の接触性皮膚炎における役割を明とともに、皮膚組織の病理学的解析、PG 類の定量、PG 産らかとするために、DNFB を用いたアレルギー性接触皮膚生酵素の発現レベル解析を行った。

炎モデルによる解析を行った。DNFB を腹部に塗布し、感DMBA 0.4 µmol（200 µL/mouse）を塗布し、1 週間後から作させたのち、DNFB を耳介に塗布すると、野生型マウス

2. 5. 組織中 PG 類の定量では 2 日後をピークに耳介が肥厚し、その後緩やかに寛解摘出した組織を Bead Crusher（Taitec）を用いてメタノした。

− 130 −

皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析

一方、mPGES-1 欠損マウスでは、野生型マウスと同じくPGIS の欠損は PGI2 産生を抑制し、アレルギー性接触皮膚2 日目をピークに耳介の肥厚が認められたが、野生型マウ炎を抑制することが示唆された。

スと比較すると肥厚の程度は抑制されていた。

さらに、一次刺激性皮膚炎への PGIS の関与を調べるた
めに、TPA を耳介に塗布して皮膚炎を惹起し、耳介の肥3. 2. PGIS の欠損はアレルギー性接触皮膚炎を抑制する厚を測定した。TPA による耳介の肥厚は PGIS 欠損マウス
においても野生型マウスと同程度であった。

次に、PGIS の接触性皮膚炎における役割を検討するために、同様に、DNFB を用いてアレルギー性接触皮膚炎を3. 3. mPGES-1 の欠損は皮膚化学発がんを抑制する惹起した。PGIS 欠損マウスにおいても DNFB を耳介に塗さらに、mPGES-1 の皮膚化学発がんにおける役割を明布してから 2 日目に最も肥厚が認められたが、野生型マウらかとするために、DMBA/TPA による皮膚化学発がんモスと比較して、耳介の肥厚は抑制された（図 2）。

デルによる解析を行った。野生型マウスでは DMBA/TPA

野生型マウスの耳介組織中の PG 類の量を測定したとの塗布により 12 匹中 11 匹のマウスに皮膚腫瘍が形成されころ、DNFB を塗布してから 2 日後には PGI2 代謝物であたのに対し、mPGES-1 欠損マウスでは 8 匹中 2 匹にしかる 6-ketoPGF1α 量が増加していたが、PGIS 欠損マウスで腫瘍は観察されず、発がん率の顕著な低下が認められたは 6-ketoPGF1α は検出されなかった。これらの結果より、（図 3）。さらに、腫瘍数を測定したところ、野生型マウス

図2

野生型および PGIS 欠損マウスにおけるアレルギー性接触皮膚炎反応
HE 組織染色（bar：100μm）

図3

野生型および mPGES-1 欠損マウスにおける皮膚化学発がん
上：肉眼所見、下：HE 組織染色（bar：100μm）− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol.24, 2016では 12 匹中 4 匹において 10 個以上の腫瘍が認められたが、DNFB による接触性皮膚炎が抑制されたのは、mPGES-1/mPGES-1 欠損マウスでは腫瘍が形成された 2 匹においてPGE2/EP1 のシグナルが抑制されたためであると考えらも 5 個または 6 個しか認められなかった。これらの結果よれる。また、PGI2 受容体である IP の欠損マウスにおいてり、mPGES-1 の欠損は発がん率、腫瘍数ともに顕著に抑も IFNγ 産生の減少に伴い、DNFB によるアレルギー性制することが示唆された。

接触皮膚炎の抑制が認められている 8）。また、PGI2 誘導

野 生 型 マ ウ ス の 皮 膚 組 織 中 の COX-2、mPGES-1 の体は Th1 分化を促進することも報告されていることから、mRNA 発現を定量的 PCR にて解析したところ、未処理のmPGES-1 と PGIS は PGE2 および PGI2 産生を介してとも皮膚組織と比較して DMBA/TPA 塗布により顕著に COX-に Th1 分化を促進し、アレルギー性接触皮膚炎に関与す

2、mPGES-1 発現が促進され、腫瘍組織ではさらに増加しることが考えられた。

た。このときの PGE2 産生を LC/MS を用いて測定したと一方、皮膚化学発がんにおいては、mPGES-1 は促進的ころ、COX-2、mPGES-1 発現の増加に伴い、腫瘍組織にに作用することに対し、PGIS は関与しないことが明らかおいて顕著に増加していた。一方、mPGES-1 欠損マウスとなった。PGE2 は多くの組織において発がんを促進する

では DMBA/TPA による PGE2 産生が抑制されていた。

ことが報告されており 2）、皮膚においても EP2 の欠損によ

これらの結果より、mPGES-1 の欠損は PGE2 産生を抑って DMBA/TPA による発がんが抑制されること 9）や、反制し、DMBA/TPA による皮膚における化学発がんを抑制

対に EP1、2、4 を過剰発現させたマウスでは発がんが促することが明らかとなった。

進されること 10~12）が報告されている。今回 mPGES-1 の欠損が皮膚においても化学発がんを抑制することが明らか

3. 4. PGIS の欠損は皮膚化学発がんに関与しないとなったことで、皮膚においても mPGES-1 によって産生

さらに、PGIS の皮膚化学発がんにおける役割についてされた PGE2 が EP 受容体を介して発がんを促進しているも解析を行った。Balb/c 系 PGIS 欠損マウスでは DMBA/ことが裏付けられた。PGI2 とがんの関連については PGISTPA によって 8 匹中 7 匹に皮膚に腫瘍が形成され、野生の遺伝子多型が発がんリスクに関わるといった報告 13）が型マウスと同程度の発がんが認められた。Balb/c 系マウあるものの、その機構についてはほとんどわかっていな

スは発がん率が高く、ほぼすべてのマウスに発がんが認めい。我々はこれまでに PGIS の欠損が大腸における化学発られている。我々はこれまでに大腸においては PGIS の欠損がんを促進することを見出してきた 5）が、皮膚発がんへのは化学発がんを促進することを見出しており 5）、より発がPGIS の関与については全く不明であった。本研究によりんしにくい条件下では皮膚においても PGIS の欠損が発がん組織によって PGIS の発がんへの寄与は異なる可能性が示を促進する可能性も考え、次に C57BL/6 系マウスを用いて唆された。今後どのような要因が PGIS と発がんを結びつ同様に皮膚発がんを誘導した。その結果、C57BL/6 系マけるのか解明していく必要がある。

ウスにおいても、PGIS 欠損マウスでは野生型マウスと同程度の発がんが認められた。また、皮膚においては PGI2 代

５．総謝物である 6-ketoPGF1α はほとんど検出されなかった。

括本研究により、アレルギー性接触皮膚炎においてはこれらの結果より、皮膚組織中の PGI2 産生量は少なく、mPGES-1 と PGIS がともに促進的に作用し、協調的な働

PGIS の欠損は DMBA/TPA による皮膚発がんには関与しなきをしていることが明らかとなった。また、皮膚化学発がいと考えられた。

んにおいては mPGES-1 が促進的に働く一方で、PGIS の４．考関与はないことが示唆された。

察以上の結果より、mPGES-1 と PGIS はそれぞれ、PGE2および PGI2 産生を介して接触性皮膚炎を促進することが示唆された。PGE2 受容体には EP1 〜 EP4 の 4 種類が知ら

謝

辞本研究の遂行にあたり、コスメトロジー研究振興財団より研究助成を賜りましたこと、心より感謝いたします。

れているが、このうちの EP1 の欠損マウスでは Th1 への分化が抑制されることで DNFB によるアレルギー性接触皮膚炎が抑制される 6）。しかし、EP3 欠損マウスでは反対
7）に増悪することが報告されている 。これは、ケラチノサ
イトに発現する EP3 が CXCL1 の発現を抑制することで好（引用文献）
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中球の浸潤を抑制し、抗炎症作用を示すため、EP3 の欠2） Sasaki Y, Kamei D, Ishikawa Y, Ishii T, Uematsu

損によって抗炎症作用が抑制されてしまったことによる

S, Akira S, Murakami M, Hara S, : Microsomalと報告されている。今回、mPGES-1 欠損マウスにおいて

prostaglandin E synthase-1 is involved in multiple− 132 −皮膚疾患におけるプロスタグランジン最終合成酵素群の機能解析

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