経皮吸収物質の体内動態のイメージング質量分析による解析
福井県立大学生物資源学部生物資源学科

平修

This research should be of interest to a broad readership, particularly those whose research involves the mass
spectrometric analysis of localization of xenobiotics. Because the present study describes emerging evidence suggested
environmental factors as causative agent such as methyl 2 -octynoate ( 2 -OAm). Not only does 2 -OAm have potential tocause visceral disease but importantly is used in environment such as lipsticks, hair dye, perfumes and food flavorings.
However, its disposition after percutaneous application is not revealed. We report the disposition and effect, visually, by
nano-PALDI-based imaging mass spectrometry. Generally, small molecule like 2 -OAm cannot be detected by LDI-basedmass spectrometry (MS) due to the interference of organic matrix signal. Previously, we have reported nano-PALDI MS
realize detection of small and high molecules (Anal. Chem. 2008 , 2011 . Analyst 2012 , 2015 ).
The ionization ability of the nano-PALDI for 2 -OAm was confirmed. 2 -OAm was applied to mice skin and it permeatedthrough the skin and accumulated in the liver. In livers of single dose mice, 2 -OAm was delivered to the liver for 6 hours
and excreted from the liver for 24 hours. On the other hand, in livers of long apply mice, 2 -OAm was retained in the liver.
Furthermore, we could be revealed that 2 -OAm was accumulated in bile ducts by analyzing at a high resolution. In addition,
CD 8 staining indicated that an inflamed bile duct was observed. 2 -OAm triggered the inflammation due to a coincident
localization of 2 -OAm and bile duct. This imaging approach is a promising technique for rapid quality evaluation ofxenobiotics 1）.

1. 緒のような」形で移動し生体に影響を及ぼすのか視覚的に表言すことができれば、安全性の知見を与えることができる。

我々は、日常より多くの生体異物（Xenobiotics）に囲まして使用される薬剤もあるが、それ以外に意図せずに摂食・

1. 1. 化粧品類に含まれる化学物質の体内動態の可視化と生体への影響摂取している物質、Xenobiotics がある。その中には「毒物」

最近、食品添加物や化粧品などに含まれる成分の中に自「薬」といった扱いをされていない物質も多い。個々の物質

己免疫疾患に関与していることが報告され、Xenobioticsは厳密な安全性試験をクリアしているが、それらが体内のとして注目されている。例えば、中年女性に好発する自どこに蓄積され、種々の代謝を受けた場合、どのような影

己免疫性の肝臓の炎症では、ミトコンドリアに対する自響を受けるのかについては十分に分かっていない。

己抗体が 100% の症例に出現するが、その対応抗原（ミトれて生活している。もちろん、病気になった際に治療薬と通常、こういった分析は生検材料、外科手術で摘出されコンドリア内膜の呼吸酵素である PDC-E2）と極めて類似た種々の臓器を用いて、ヘマトキシリン＆エオジン（HE）する構造を有する Xenobiotics が複数存在し、患者血清の染色などによる形態診断が基本である。しかし、多くがそれら Xenobiotics と反応することが報告されてい１. 経皮吸収後の標的物質自体の体内動態を視覚的に表る。共同研究者の常山らは、これらの Xenobiotics の１つである、２オクチン酸メチル（2-OAm: 分子量 154）をマウすのは困難。
２．標的物質と疾病との直接の因果関係を科学的に見る

スの腹腔内に連続投与し、抗ミトコンドリア抗体の出現とともに、PBC に特異的な胆管障害像が出現したことから、のは困難。
以上のことから、検査に 3 日以上を要することになる。そ2-OAm への持続的な曝露が PBC 発症のトリガーとなってこで、新しい技術や手法の導入が求められている（図１）。

いる可能性を報告している 2）。2-OAm は化粧品や食品添もし、肌に直接塗布する化粧品類に含まれる化学物質が、経皮吸収されているのか、吸収されたならば「どこ」の「ど加物に含有されており、2-OAm の皮膚から肝臓への移行、蓄積と、それを標的にした免疫異常が起きている可能性が示唆されるが、2-OAm などの低分子 Xenobiotics は、特異抗体が存在しないため、その体内での局在についてはこれ

Liver disease risk of xenobiotics due topercutaneous absorption revealed by
Nano-PALDI imaging mass spectrometry1）
Shu TairaFukui Prefectural University, Departmentof Bioscience

までまったく解析がなされていないのが現状である。
本報告では、マウスを用いて 2-OAm を Xenobiotics として経皮的に投与し、臓器中への移行と蓄積の有無について検討する。また、臓器移行が確認された際には、長期経皮曝露を行い、Xenobiotics の蓄積の有無を検討した。

− 96 −

経皮吸収物質の体内動態のイメージング質量分析による解析

経皮的に曝露された Xenobiotics が、どの細胞に蓄積し、に、ナノ微粒子をイオン化支援剤とするナノ微粒子支援型

周囲にどのような炎症が惹起されているか、という二次元レーザー脱離イオン化（Nano-Particle Laser Desorption/情報が極めて重要である。これまで経皮吸収の評価は投与

Ionization: Nano - PALDI）MS 法 3-6）が開発されている。本

皮膚、内臓サンプルを磨りつぶした後、クロマト手法で得法は、直径数ナノメートルの金属酸化物粒子に表面修飾なた結果と併せて、浸透イメージを想像してきた。本研究でどを施した物質で、レーザーエネルギーを受け取ると、ナは、2 つの技術をハイブリッドすることで、組織標本上のノ微粒子自体はイオン化せず、近接する物質のみをイオン

Xenobiotics の経皮吸収による体内動態の解析を目指した。

化する特性を示す。例として、農薬（カルベンダジム：分以下に、その本研究の核となる技術を簡単に記述した。

子量：191）をイオン化した場合の両者の MS スペクトルを図 2 に示す。Nano - PALDI 法（図 2a）ではサンプルのみイ

1. 2. Xenobiotics（低分子物質）の新規検出法

オン化しているのが分かる。ナノ微粒子自体はイオン化一般的にガスクロマトグラフィー（GC）や、液体クロせず（図 2b）、サンプルも自己イオン化していない条件（図マトグラフィー（LC）を組み合わせた質量分析法（GC - MS、2c）である。MALDI 法では（この場合、有機マトリクスとLC- MS）は、定量性に優れていることから、化学物質のして CHCA（Mw：189）を使用）、有機マトリクス自体が分析法として頻用される。通常、生体物質は複数の物質イオン化し、様々な付加体としてシグナルが低分子領域にから構成されており、検出する際には、標的物質である現れ、目的物質が検出できない（図 2d）。従来、MALDI 法

Xenobiotics を抽出するための前処理を行う必要がある。

は高分子解析に用いる手法であり、Nano -PALDI 法と使物質毎の特性によって前処理条件も異なり、複数の処理工い分けることで低～高分子までの広範囲な検出が可能に程を要するため煩雑である。マトリクス支援型レーザー脱なる。 さて、Xenobiotics は低分子量（>500）のものが多く、離イオン化（MALDI）
質量分析（MS）
法は、混合物でも高率

今回の標的物質の 2 - OAm（分子量：154）も例外ではないに検出が行えるため本研究に適している。ここで、一つ問ため、検出法として Nano - PALDI 法を採用した。

題がある。MALDI で用いるイオン化支援剤は、一般的に有機物が多用される。この有機物マトリクス自身がイオン7，8）

1. 3. イメージング質量分析（IMS）

化することで、低分子領域にシグナルとして検出され、標イメージング技術は、生物（例：免疫染色による神経細的物質がバックグラウンドに埋もれてしまい解析が困難に胞成長観察）、化学（赤外分光イメージングによる基板上のなる場合が多い。近年、低分子検出、イメージングを目的異物検出）、物理学（トンネル顕微鏡による薄膜解析）と多図 1 本研究の概要

図 2 Nano-PALDI 質量分析− 97 −

コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

くの分野で用いられる手法である。

（東京化成）を混合し、室温にて 60 分間攪拌した。遠心近年、組織切片上を 2 次元的に MS し、多数の MS スペ

分離操作により未反応物を除去したのち、超純水で洗浄

クトルか注目するシグナル（標的物質）のみを抽出し、2 次し、沈殿物をナノ微粒子サンプルとして回収した。得られ元画像とすることで標的物質の局在解析を行う、「IMS」法

たナノ微粒子について、赤外分光法（IR：Spectrum One;（図３）が開発された。利点として、一度の測定で、一枚のPerkin Elmer, USA）、透過型電子顕微鏡（TEM：H-7100；

切片から抗体や染色材を必要とせず、複数の標的物質の局Hitachi, Japan）と X 線回折（XRD：MiniFlex II；Rigaku,在を解析できることが挙げられる。また、特に特殊な MSJapan）を用いて評価を行った。

装置を必要とせず、MALDI MS 装置と専用ソフトがあればよい。主に、医学、生理学分野での研究例 9 -12）が多いが、

2. 4. Nano - PALDI MS

最近では工、農学分野でも注目されている技術である 13-18）。

2 - OAm（10 pmol）と酸化鉄ナノ微粒子（1 mg/mL：メIMS 法で農産物内の農薬の解析することは特殊な前処理タノール）と混合し、ターゲットプレートに滴下、乾燥さも必要とせず、得られた MS スペクトルから標的物質の質せてから MS 測定を行った。検出イオンはポジティブイオ量を選択するだけで、局在情報も得られることから簡便で、ンとした。

有用である。今回、標的物質である Xenobiotics、2-OAm は、低分子イメージングに相当するため、Nano-PALDI IMS

2. 5. Nano - PALDI IMS法を採用した。

マウスの肝臓の凍結切片（厚さ：25 µm）を導電性透明電2. 実極であるインジウムチンオキサイド（ITO）ガラス上に作験

成後、イオン化支援剤として、酸化鉄ナノ微粒子（1 mg/

2. 1. 2- OAm 単回塗布マウスの作成

mL：メタノール、8 mL）をスプレーヤーで塗布した。ポ

4 週齢の ICR（♀）マウスの背中に、2-OAm（0.1%）をジティブモードで IMS を行った。切片上から 2 -OAm が検出できるかを確認するために、コントロールマウスの切片単回塗布し、1, 3, 6, 24 時間後に肝臓を採取した。に 2 -OAm を滴下し、その部位をイメージングした。レー

2. 2. 2- OAm 長期塗布マウスの作成

ザー照射間隔は 70 µm とした。

4 週齢の ICR（♀）マウスの背中に、2-OAm（0.1%）を、イメージング MS の画像解像度は、レーザー照射間隔に1 週間に 1 回のペースで塗布、これを 19 週連続で行った。

依存しており、照射間隔が狭いほど画像が鮮明になる。通その後、肝臓を採取した。

常の MALDI では有機マトリクスを使用する。有機マトリクスが切片上で標的物質を抽出、共結晶（結晶の大きさ：

2. 3. Nano - PALDI 法で用いるナノ微粒子の合成30 - 50 µm）を形成する。そのために共結晶以下のレーザ

本研究で用いるナノ微粒子は金属酸化物をコアとし、そー照射間隔を用いてイメージングしても正しい局在解析がの表層を Si - O が覆い、表面より水酸基とアミノ基が露出できない場合がある。Nano - PALDI 法は、標的物質と共している構造である。以下、調製法を示す。3 - アミノプ

結晶を形成せずにイオン化を行う方法であり、高解像度イ

ロピルトリエトキシシラン（APTES）（信越化学）溶液（22メージングが可能になる（図４）。

M）と、8 種類の金属塩化物溶液（FeCl2・4H2O）（0.1 M）

図 3 イメージング質量分析− 98 −

経皮吸収物質の体内動態のイメージング質量分析による解析

2. 6. 高解像度 Nano - PALDI IMS

した結果、酸化鉄をコアとすることが分かった。また、鉱マウスの肝臓の凍結切片（厚さ：25 µm）を導電性透明電物に見られる、コランダム構造を単位とするマコーレート極であるインジウムチンオキサイド（ITO）ガラス上に作様構造であると決定した（図５a）。IR スペクトル測定では、成後、イオン化支援剤として、酸化鉄ナノ微粒子（1 mg/O - H（3,400 - 3,100 cm-1）、C - H（3,000 - 2,830 cm-1）、N-HmL：メタノール、8mL）をスプレーヤーで塗布した。ポジ（1,640 - 1,560 cm-1）および、Si - O（1,000 - 800 cm-1：デーティブモードで IMS を行った。レーザー照射間隔は 25 µm

タ非表示）の伸縮振動ピークが検出され、表面に水酸基、アとした。

ミノ基および Si - O 層が存在することが確認された（図５b）。
TEM 観察の結果、粒径は 3.6±0.1 nm であり、単分散にナ3. 結果と考察ノ微粒子が合成されていることが分かった（図５c）。これ

3. 1. ナノ微粒子の特性評価

らの結果より、Fe ナノ微粒子は、鉄酸化物をコア成分とし、合成したナノ微粒子の物理化学的性質を調べた。

その周りを水酸基およびアミノ基、シラノール基で被覆さFe をコアとして合成したナノ微粒子（以下、Fe ナノ微れたナノ微粒子であることが示された。

粒子）のデータを図４に示す。X 線回折（XRD）により構造解析を行った結果、
2θ= 35 °と、63 °に、ミラー指数（hkl）、（13. 2. 2- OAm の質量分析実験3 0）、（3 3 0）、（0 6 0）が観測され、データベースと照合

標的物質が Nano -PALDI MS 法で検出されることを確

図 4 Comparison of spatial resolution between MALDI and Nano-PALDI

図 5 The XRD pattern (a), the FT-IR spectrum (b) of and TEM image (c) of the iron oxide based nano-particle.

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コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

認するために、標準品を用いて実験を行った。
［M+H］++が確認され、24 時間後にはほぼ排出されていることが分と［M+Na］ である m/z 155.1，177.1 が検出された。次に、かった（図 2A）。強度比は、コントロール：投与後 1 時間：

肝臓切片上に 2 - OAm を滴下し、その部位を MS、IMS し

3 時間：6 時間：24 時間＝ 1：2：４：12：1

たところ、滴下していない肝臓と比較すると、2-OAm 滴

2- OAm 長期塗布マウスの IMSであった（図 6）。

2 -OAm を皮膚に長期間塗布したマウスの肝臓を用いて、下肝臓からは m/z 155.1，177.1 が検出された。強度比は 1：

2 -OAm の蓄積部位を検討した。その結果、2 -OAm が単10 であった。
組織上の 2-OAm が Nano-PALDI MS 法で検出可能なこ回塗布と違い、体外へ排出されず肝臓に蓄積していることとを示した。また、Nano-PALDI 法ではナトリウム付加が視覚的に分かった（図 7）。これは、化粧品や染毛剤など6）体を優先的にイオン化することが分かっている のでイメ長期に渡り使用している患者が肝臓疾患（炎症）を起こしてージする標的シグナルを m/z 177.1 とした。

いることに関係があることを示している。
2- OAm 長期塗布マウスの高解像度 IMS

3. 3. 2- OAm 単回塗布マウスの IMS

2 -OAm を皮膚に長期間塗布したマウスの肝臓をヘマト

マウスの皮膚に 2-OAm を塗布後、肝臓の Nano-PALDI

キシリン - エオジン（HE）染色したところ、コントロールでイメージング MS を行った。標的シグナルは 2-OAm のは胆管が観察できるのに対し、2 - OAm 群では胆管が潰れナトリウム付加体である m/z 177.1 である。その結果、ており観察が困難であった（図 8）。

2 - OAm を皮膚に塗布してから 6 時間後に肝臓に 2-OAm

そこで、連続切片を用いて、炎症の有無を確認するため

図 6 単回塗布のマウスの肝臓イメージング MS 像

図 7 長期塗布のマウスの肝臓イメージング MS 像

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経皮吸収物質の体内動態のイメージング質量分析による解析

それにより炎症が引き起こされることを初めて視覚的に明らかにした。

4. 2. 間接的から直接的なデータ表示へ
これまでの薬剤の経皮吸収の浸透具合、体内動態は、標本サンプルから抽出した溶液を HPLC などクロマトグラフ
ィカルなデータを基に浸透イメージ（想像）をコンピューターグラフィックに直すことで表す間接的な手法とも言える。
イメージング質量分析で表すイメージはサンプル切片上にある標的物質の局在を直接表した物であり、経皮吸収の

図 8 HE staining of liver without (a) and with 2-OAm(b)有無、浸透性、安全性の確保を一般消費者へ科学的根拠をに CD8 染色を行った。その結果、胆管付近は CD8 陽性を視覚的にアピールすることができる。

示し、炎症が強く引き起こされていることが分かった。その同一部分に対して IMS（レーザー照射間隔 25µm）を行った。炎症を起こしている部分に 2-OAm が局在していることが明らかになった（図 9）。

4. 3. 基礎 -、応用コスメトロジー両面の貢献へ
薬剤の経皮暴露による 2 - OA の肝臓へのダメージを視覚的に表すことを通して、安全性、有効性を示すことを目指別途、液体クロマトグラフィにより定量したところ、長す。得られた化粧品とはその殆どが皮膚への塗布であるか期塗布群のマウス肝臓からは 8.32 µg/g-liver の 2 - OAm がら、本研究で得られた知見はコスメトロジー分野において蓄積していた。

基礎的な情報（浸透性）と、生体への影響（応用）の両面に貢4. 総献できる。

括

4. 1. 薬剤送達・炎症の機序の視覚的解明

4. 4. 新規評価法の提示

本結果は非常に興味深い。2 -OAm はミトコンドリア内イメージング質量分析の化粧品学への応用は例が少なく、膜の呼吸酵素（mitochondrial intima respiratory enzyme）

今回の研究は特許取得可能であり、その普及は、国際競争の抗原として反応し、炎症を引き起こすことが知られてい力を高めるだけでなく、国際標準化策定にも、一つの方るが19）、2 - OAm が経皮吸収により内臓（肝臓）に送達されること、それが長期塗布により胆管付近に蓄積すること、向性を示すことになる。また、本評価技術が確立できれば、生物全般の幅広い分野に利用でき、イノベーションの創出

図 9 7 High-spatial resolution nano-PALDI IMS of 2-OAm from mouse liver for long period of application.
HE (a) and CD8 (b) stained images of liver tissues of 2-OAm-apppled; MS spectra reconstructed as ion
images of 2-OAm at 25 µm in mouse liver (c); merged CD8 and ion image(d). Scale bar is 200 µm.

− 101 −コスメトロジー研究報告 Vol.25, 2017

Saito; K. Inami; I. Makita; Y. Angata; T. Suzuki; M.につながる。

Yamashita; N. Sato; S. Nakamura; D. Yuki; Y. Sugiura;
謝辞N. Zaima; N. Goto-Inoue; T. Hayasaka; Y. Shimomura;M.

本研究を遂行するにあたり、適切なご助言をしていただ

Setou PLoS ONE, 6, e26721. (2011)いた徳島大学（医）、常山幸一先生、帝京大学
（医）
菊池先生

10）Sugiura, Y.; R. Taguchi;M. Setouに心から感謝申し上げます。イメージング質量分析を行う

PLoS One, 6,e17952. (2011)に辺り、装置を使用させていただいた北陸先端科学技術大11）Morita, Y.; K. Ikegami; N. Goto-Inoue; T. Hayasaka;

学院大学・ナノテクプラットホーム事業とご担当いただいN. Zaima; H. Tanaka; T. Uehara; T. Setoguchi; T.

た宮里明夫先生に感謝いたします。

Sakaguchi; H. Igarashi; H. Sugimura; M. Setou;H. Konno
Cancer Science, 101, 267-273. (2010)（引用文献）

12）Taira, S.; M. Hashimoto; K. Saito;O. Shido J. Biophys.

1） Taira, S.; N. Yamaguchi; S. Morimoto; Y. Tatsuta;

Chem., 3, 221-226. (2012)

H. Katano; Y. Ichiyanagi; K. Tsuneyama;K. Kikuchi13）Zaima, N.; T. Hayasaka; N. Goto-Inoue;M. Setou

International Journal of Recent Scientific Research, 7,International Journal of Molecular Sciences, 1 1, 5 0 4 0-12589-12592. (2016)

5055. (2010)2） Wakabayashi, K.; Z.-X. Lian; P. S. C. Leung; Y.

14）Zaima, N.; N. Goto-Inoue; T. Hayasaka;M. Setou

Moritoki; K. Tsuneyama; M. J. Kurth; K. S. Lam; K.

Rapid Commun. Mass Spectrom., 24, 2723-2729. (2010)

Yoshida; G.-X. Yang; T. Hibi; A. A. Ansari; W. M.

15）Suzuki, T.; H. Fujiwake;K. Iwai Plant Cell Physiol.,Ridgway; R. L. Coppel; I. R. Mackay;M. E. Gershwin

21, 839-853. (1980)16）Yoshimura, Y.; H. Enomoto; T. Moriyama; Y.

Hepatology, 48, 531-540. (2008)
3） Komori, H.; R. Hashizaki; I. Osaka; T. Hibi; H.

Kawamura; M. Setou;N. Zaima

Analytical andBioanalytical Chemistry, 1-11.

Katano;S. Taira Analyst, 140, 8134-8137. (2015)
4） Taira, S.; I. Osaka; S. Shimma; D. Kaneko; T. Hiroki;17）Taira, S.; D. Kaneko; K. Onuma; A. Miyazato;

Y. Kawamura-Konishi;Y. Ichiyanagi Analyst, 137, 2006-

T. Hiroki; Y. Kawamura-Konishi;Y. Ichiyanagi

2010. (2012)

International Journal of Inorganic Chemistry, 2 0 1 2, 7.

5） Taira, S.; Y. Sahashi; S. Shimma; T. Hiroki;Y.

(2012)18）Taira, S.; R. Ikeda; N. Yokota; I. Osaka; M. Sakamoto;

Ichiyanagi Anal. Chem., 83, 1370-1374. (2011)
6） Taira, S.; Y. Sugiura; S. Moritake; S. Shimma; Y.
Ichiyanagi;M. Setou Anal. Chem., 80, 4761-4766. (2008)
7） Stoeckli, M.; P. Chaurand; D. E. Hallahan;R. M.

M. Kato;Y. Sahashi Am. J. Chin. Med., 3 8, 4 8 5-4 9 3.
(2010)
19）Amano, K.; P. S. C. Leung; R. Rieger; C. Quan; X.
Wang; J. Marik; Y. F. Suen; M. J. Kurth; M. H. Nantz;

Caprioli Nat. Med., 7, 493-496. (2001)
8） Caprioli, R. M.; T. B. Farmer;J. Gile Anal. Chem., 69,A. A. Ansari; K. S. Lam; M. Zeniya; E. Matsuura; R. L.
Coppel;M. E. Gershwin The Journal of Immunology,4751-4760. (1997)
9） Waki, M. L.; K. Onoue; T. Takahashi; K. Goto; Y.

174, 5874-5883. (2005)− 102 −