博

士

学

位

論

文

内容の要旨および審査結果の要旨

第

30

集

（平成 26 年度）

金

沢

医

科

大

学

は し が き
本集は、本学において博士（医学）の学位を授与した者の論文内容の要旨および審査の結果の要旨を収録したものである。

－ 第30集 目
学位授与
番
号

氏

名

次 （平成26年度） －
論

文

題

名

頁

修

右

Osteocytic cell necrosis is caused by a
combination of glucocorticoid-induced Dickkopf-1
and hypoxia

・・・・・・

1王

墨飛Pulmonary vascular and airway responses tosystemic vasoconstrictors in anesthetized BALB/cmice

・・・・・・

4

甲 第457号

湊貴浩・・・・・・

7

甲 第458号

藤

本

圭

司

・・・・・・

10

甲 第459号

松

江

泰

弘

・・・・・・

12

甲 第460号

中

村

智

美

・・・・・・

15

甲 第461号

清

水

義

朗

ラット脊髄切断モデルにおけるhyaluronidase-4の抑制
効果・・・・・・

18

・・・・・・

21

甲 第455号

植

甲 第456号

田

Binge Alcohol Consumption Aggravates Oxidative
Stress and Promotes Pathogenesis of NASH from
Obesity-Induced Simple Steatosis
Clinical significance of serum and urinary soluble
urokinase receptor (suPAR) in primary nephrotic
syndrome and MPO-ANCA-associatedglomerulonephritis in Japanese
Serum Osteopontin Predicts Degree of Hepatic
Fibrosis and Serves as a Biomarker in Patientswith Hepatitis C Virus Infection
CD14+ follicular dendritic cells in lymphoidfollicles may play a role in the pathogenesis of
IgG4-related disease

甲 第462号

東

川

俊

寛

Blood pressure and disability-free survival amongcommunity-dwelling diabetic and non-diabetic
elderly patients receiving antihypertensive
treatment

甲 第463号

柴

田

央

恵

静注用鉄剤に含まれる遊離鉄が生体に与える影響―遊離鉄の危険性―・・・・・・

24

甲 第464号

北

楯

祥

子

アミオダロン肺障害発症への肺サーファクタントリン脂質合成亢進の関与

・・・・・・

26

乙 第281号

及川陽三郎

液体培養法を用いたソフトコンタクトレンズ保存ケース
中におけるアカントアメーバの増殖抑制法に関する基礎的研究

・・・・・・

30

うえ

だ

田

しゅう

すけ

氏名（生年月日）

植

本

籍

大

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４５５号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

Osteocytic cell necrosis is caused by a combination

阪

修

右

（昭和 56 年 2 月 21 日）

府of glucocorticoid-induced Dickkopf-1 and hypoxia（ステロイドによる Dickkopf-1 誘発および低酸素環境が骨細胞壊死を引き起こす）論 文 審 査 委 員

主

査

古 家

大 祐

副

査

石 垣

靖 人

甲 野

裕 之

学位論文内容の要旨
研究目的
大腿骨頭壊死症は厚生労働省指定の難治性疾患であり，公費負担の対象疾患である。
その危険因子としてステロイド性，アルコール性，そして明らかな危険因子のない狭義の
特発性に分類されているが，年々増加の一途を辿っているのがステロイド性である。ステ
ロイド剤の服用については，一日の平均投与量が発症に影響しやすいと報告されているが，実際にはどの程度の量以上で発症しやすいとか，使用後どのくらいの期間で発症するのかということは分かっていない。したがって，ステロイド剤によってどのようなメカニズム
を介して大腿骨頭壊死症が発症するのかを解明することは，新たな治療手段の開発に繋がる。これまで，動物モデルにおいて最終的な原因は虚血-低酸素であるとの意見は一致しているが，酸化ストレスや血管内皮機能障害，血液凝固能亢進，脂質代謝異常，脂肪塞栓，
骨細胞のアポトーシスなどの関与も指摘されている。つまり，本疾患発生に至る一義的原因としての十分な科学的根拠までは得られていないのが現状であり，未だ動物モデルを用いた基礎的研究が続けられている。そこで，本研究では虚血-低酸素を模倣するためマウス培養骨細胞を低酸素に曝すとともに，ステロイド剤添加の有無によって骨細胞壊死が誘導されるメカニズムを，骨形成を抑制する Dickkopf (DKK-1) に着目して検討することを目的とした。
実験方法
対象

培養マウス骨細胞 (MLO-Y4)

方法
1．MLO-Y4 細胞を，1）20％酸素環境下，2）1％酸素環境下，3）20％酸素環境下にデキサ- 1 -メサゾン 1μM 添加，4）1％酸素環境下にデキサメサゾン 1μM 添加，の 4 群に分け 24
時間培養した後，細胞死の割合を Apoptotic/Necrotic Cells Detection Kit を用いて蛍光染色を行い，1 視野あたりの総細胞数に対する apoptosis と necrosis の割合を測定した。
2．骨細胞から内在性に産生され，骨芽細胞前駆細胞に発現する Wnt シグナルを介して骨芽細胞の分化，活性化を阻害し，骨形成を抑制する Dickkopf (DKK-1) の発現を，1）20％酸素環境下，2）1％酸素環境下，3）20％酸素環境下にデキサメサゾン 1μM 添加の培養細胞において免疫蛍光染色法にて組織学的に検討した。さらに，１％低酸素下にデキサメサゾンを添加した細胞に，siRNA DKK-1 をトランスフェクションして DKK-1
発現をノックダウンされた細胞と，スクランブル siRNA をトランスフェクションしてDKK-1 発現がノックダウンされていない細胞において，DKK-1 発現をウエスタンブロッ
ト法にて確認した。その後，低酸素下における 1 視野あたりの総細胞数に対する
apoptosis と necrosis の割合を，1）20％酸素環境下，2）1％酸素環境下，3）1％酸
素環境下にデキサメサゾン 1μM 添加した培養細胞において検討した。
実験成績1．20％酸素環境下にて培養した細胞と比較して，20％酸素環境下にデキサメサゾン添加および 1％酸素環境下にて培養した細胞において有意な apoptosis の増加はみられたが，necrosis はみられなかった。一方，1％酸素環境下にデキサメサゾンを添加した細胞においては，他の 3 群と比較して apoptosis と necrosis の割合が有意に増強されていた。
2. 20％酸素環境下および 1％酸素環境下にて培養された細胞と比較して，20％酸素環境下にデキサメサゾンを添加して培養された細胞において DKK-1 発現が有意に増強した。
3. 20％酸素環境下にて培養された細胞と比較して，1％酸素環境下にデキサメサゾン添加した培養細胞においてみられた有意な apoptosis と necrosis の増強が，DKK-1 発現をノックダウンされた細胞においてのみ改善された。
総括および結論
低酸素下およびステロイド単独では apoptosis が主であり，necrosis に至る細胞は少なかった。しかし，ステロイド添加は，骨形成を抑制する DKK-1 の発現を増強した。さらに，in vivo を模倣する低酸素環境下においてステロイドを添加した細胞においてnecrosis の増強がみられたことから，虚血-低酸素に骨細胞の代謝障害が加わると骨壊死が生じることが明らかとなった。最後に，このような条件下の necrosis の増強が，骨形成を抑制する DKK-1 siRNA により抑制されるとの結果から，DKK-1 をターゲットとした新たな治療戦略が，大腿骨頭壊死症の予防に繋がる可能性が示唆された。
論文審査結果の要旨
大腿骨頭壊死症は厚生労働省指定の難治性疾患 である。なかでも，増加の一途を辿っているのがステロイド性である。そこで，本研究ではマウス培養骨細胞を低酸素に曝すと- 2 -ともに，ステロイド剤添加の有無によって骨細胞壊死が誘導される分子機構を，Dickkopf(DKK-1) に着目して検討しており，その着眼点は斬新である。
培養マウス骨細胞 (MLO-Y4 細胞) を，20％酸素環境下，1％酸素環境下，20％酸素環境下にデキサメサゾン 1μM 添加，1％酸素環境下にデキサメサゾン 1μM 添加に分け 24 時間
培養した後，細胞死の割合を総細胞数に対する apoptosis と necrosis の割合を測定している。Dickkopf (DKK-1) の発現を，20％酸素環境下，1％酸素環境下，20％酸素環境下にデキサメサゾン添加の MLO-Y4 細胞において検討している。さらに，1％低酸素下にデキサメサゾンを添加した DKK-1 発現をノックダウンされた MLO-Y4 細胞において，DKK-1 発
現を確認している。その後，低酸素下における apoptosis と necrosis の割合を，20％
酸素環境下，1％酸素環境下，1％酸素環境下にデキサメサゾン添加した MLO-Y4 細胞において検討している。本研究で採用された実験方法は医学研究レベルから判断して妥当であり，解析統計処理も適切である。
20％酸素環境下にて培養した MLO-Y4 細胞と比較して，20％酸素環境下にデキサメサゾ
ン添加および 1％酸素環境下にて培養した MLO-Y4 細胞において有意な apoptosis の増加はみられたが，necrosis はみられなかった。一方，1％酸素環境下にデキサメサゾンを添加した細胞においては，他の 3 群と比較して apoptosis と necrosis の割合が有意に増強されていた。20％酸素環境下および 1％酸素環境下にて培養された MLO-Y4 細胞と比較して，20％酸素環境下にデキサメサゾンを添加して培養された MLO-Y4 細胞において DKK1 発現が有意に増強した。20％酸素環境下にて培養された MLO-Y4 細胞と比較して，1％酸
素環境下にデキサメサゾン添加した MLO-Y4 細胞においてみられた有意な apoptosis とnecrosis の増強は，DKK-1 発現のノックダウンによって改善された。これらの実験成績
は極めて興味深いものである。
in vivo を 模 倣 す る 低 酸 素 環 境 下 に お い て ス テ ロ イ ド を 添 加 し た 細 胞 に お い てnecrosis の増強がみられたこと，この条件下の necrosis の増強が，DKK-1 siRNA により抑制される結果を見出した。したがって，DKK-1 をターゲットとした新たな治療戦略が
大腿骨頭壊死症の予防に繋がる可能性が示唆された。本結論は目的に合致したものであり，
実験成績から導きだせる妥当なものであると認められる。なお，審査において，本研究の実験方法に関する質問，apoptosis と necrosis の違いの質問があったが，申請者から的確な返答がなされた。加えて，今後の本研究の展開も質問されたが，DKK-1 をターゲットとした新たな治療法を探索していくとの返答がなされた。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
Medical Molecular Morphology Vol.48，No.2，69-75，2015

- 3 -

ワン

モ

王

本

中華人民共和国

籍墨フェイ

氏名（生年月日）

飛（1978 年 3 月 3 日）

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４５６号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

Pulmonary vascular and airway responses to systemic
vasoconstrictors in anesthetized BALB/c mice
（麻酔下 BALB/c マウスにおける血管収縮物質に対する肺血管と気道の反応）

論 文 審 査 委 員

主

査

土 田

英 昭

副

査

石 橋

隆 治

長 内

和 弘

学位論文内容の要旨
研究目的
遺伝子工学の進歩により，気管支喘息，肺線維症，肺炎，呼吸促迫症候群などの実験モデルとして遺伝子改変マウスが使用されている。しかし，種々の生理活性物質に対するマ
ウスの肺循環の反応性については，摘出灌流肺や摘出肺動脈での解析報告はあるものの，

in vivo で左心房圧 (LAP)，肺動脈圧 (PAP)，心拍出量 (CO) を同時測定して肺血管抵抗(pulmonary vascular resistance, PVR) を体系的に検討した報告はない。本研究は，麻酔下マウスにおいて，総末梢血管抵抗 (total peripheral resistance, TPR) と PVR，
気道内圧 (AWP) とを測定することにより，種々の体血管収縮物質に対する肺血管と気道の反応を検討するとともに，それらに及ぼす TPR および LAP 上昇の影響について解析した。
実験方法
実験には雄性BALB/cマウス (27±1g，n=51) を用いた。ペントバルビタール麻酔にて開胸人工呼吸下に，平均動脈圧 (MAP)，中心静脈圧 (CVP)，LAP，PAP，CO を直接同時測定
し，TPR［=(MAP-CVP)/CO］とPVR［=(PAP-LAP)/CO］を算出した。(1) angiotensin (AT)
II，(2) thromboxane A 2 受容体アゴニストU46619，(3) endothelin (ET)-1，(4)vasopressin (VP)，(5) α 1 アドレナリン受容体アゴニストphenylephrine (PE)，(6)time control (生理食塩水投与) の各実験群 (いずれもn=7) に対し，当該薬剤 0.01〜
300nmol/kg を低用量より間歇的にボーラス (50μL) で静脈内投与し，体循環および肺循
環動態の変化を測定した。また，LAP上昇実験 (n=9) では，大動脈周囲に留置した絹糸により一過性に大動脈を狭窄させ，LAP，PAP および PVR の変化を測定した。

- 4 -

実験成績
すべての血管収縮物質投与群で TPR は用量依存性に上昇したが，VP 群の最高投与量
100nmol/kg では TPR が減少に転じた。高用量の血管収縮物質を投与すると，TPR 最大上
昇時には LAP も上昇し，それに一致して PAP と AWP も上昇したが，PVR は逆に低下した。別に行った LAP 上昇実験では，LAP の上昇にしたがって PAP と AWP も上昇したことから，TPR 最大上昇時の PAP と AWP の上昇は LAP 上昇に伴って生じる肺うっ血によることが示唆された。一方，ATII，U46619 および ET-1 は，TPR の最大上昇時点とは異なる
時期に PVR を増加させた。VP の 100nmol/kg 投与時には，LAP が増加しないにもかかわらず AWP が増加した。なお，time control 群ではいずれの測定量において有意な変化はなかった。
総括および結論
本研究では，麻酔下マウスにおいて，MAP，CVP，PAP，LAP および CO の直接測定から
TPR と PVR を正確に求め，体循環と肺循環の血管収縮状態を評価する実験系を確立し，

in vivo マウスにおける体循環血管収縮物質に対する肺循環と気道の反応特性を解明した。
検証した血管収縮物質はすべて用量依存性に TPR を増加させたが，VP のみ脱感作を示した。各血管収縮物質の高投与量では，TPR 最大上昇時に左室後負荷増大によると考えられ
る LAP 上昇がみられ，それによる肺うっ血のために PVR は低下することが示された。
ATII，U46619 および ET-1 は，LAP が最大となる前後で PVR を増加させたことから肺血管収縮を惹起することが判明したが，VP と PE の投与では肺血管収縮は見られなかった。
AWP はいずれの収縮物質においても高用量で LAP の上昇とともに増加したが，LAP 上昇
実験から，この AWP 上昇は肺うっ血に伴うものと考えられ，血管収縮物質の能動的な気道収縮作用の評価は困難であった。しかしながら，VP の最高用量投与時には気道収縮作用を呈することが示唆された。以上，in vivo マウスにおいて，体循環血管収縮作用が強い物質に対する肺血管と気道の反応を解析する際には，肺うっ血による肺血管抵抗低下と気道内圧上昇の影響を考慮する必要があると考えられた。結論として，in vivo マウスにおいて，血管収縮物質である ATII，U46619，ET-1 は肺血管収縮を惹起するが，VP と PEにはそれがみられない。また，VP は気道収縮を惹起する。
論文審査結果の要旨
通常，血管の薬剤反応性を検証する実験では太い摘出血管を用いるのが一般的であり，薬剤の収縮弛緩作用を等尺性張力の変化で代用している。しかし，生体内にあって薬剤の収縮弛緩作用を最も鋭敏に受けるのは細動脈領域であり，太い動脈との間には，反応性に差のある可能性が指摘されている。加えて，肺血管は体血管と同量の血液量が流れているにも拘らず，その圧は体血圧の 1/3〜1/4 と低く調整されており，体血管系反応性との間に違いのあることは容易に想像がつく。しかし肺血管，特に細い肺血管の反応性を検討す
ることは難しいのが現状である。
申請者は，麻酔下の BALB/c マウスの心腔および血管内にカテーテルを挿入して内圧を- 5 -測定するとともに，上行大動脈血流量をパルスドプラー血流計で測定することで，ATII，
U46619，ET-1，VP，PE という 5 種類の体血管収縮物質の血管反応性を，血管抵抗の変化として捕らえた。また，気道内圧も同時測定し，気管平滑筋への影響も併せて検討した。
その結果，これら 5 種類の体血管収縮物質は体血管抵抗を用量依存性に増加させ，体血管を収縮させていることを明らかにした。一方，肺血管系に関して，ATII，U46619，ET-1
は肺血管抵抗を上昇させたことから，肺血管を収縮させているものと考えたが，VP と PE
は肺血管抵抗を上昇させなかったため，肺血管反応性には影響していないと推察した。また，高用量の血管収縮物質投与時には気道内圧も上昇するが，大動脈狭窄実験より，これは肺うっ血によるものと推察し，VP の最高用量投与時以外は気管平滑筋への影響は無視しうると考えた。
これまで，マウスの摘出灌流肺や摘出肺動脈を用いた in vitro の実験において，これら 5 種類の血管収縮物質はすべて，肺動脈も収縮させるという結果がでていた。しかし今
回，申請者が行った in vivo の実験では，薬物により肺血管の反応性が異なるという対照的な結果となった。この結果の違いがどこにあるかは今回の研究からは明らかでないが，

in vivo と in vitro とでは，薬剤による血管反応性に違いのある可能性を示した重要な研究であると評価された。これらの基礎データは，今後のマウスを用いた実験的研究の進展に大いに寄与するものと思われる。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
Journal of Cardiovascular Pharmacology- 6 -Vol.65，No.4，325-334，2015

みなと

たか

ひろ

氏名（生年月日）

湊

貴

本

籍

石

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４５７号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

Binge Alcohol Consumption Aggravates Oxidative Stress and Promotes

川浩（昭和 59 年 1 月 26 日）

県Pathogenesis of NASH from Obesity-Induced Simple Steatosis（肥満に伴う単純性脂肪肝において，機会飲酒は酸化ストレスを悪化させ，NASH への進展を促進する。
）
論 文 審 査 委 員

主

査

小 林

淳 二

副

査

米 倉

秀 人

森 本

茂 人

学位論文内容の要旨
研究目的
メタボリック症候群とは，肥満をベースに高脂血症，耐糖能異常，高血圧を合併する症候群であるが，その肝臓での表現型が非アルコール性脂肪性肝疾患 (nonalcoholic fatty
liver disease: NAFLD) である。NAFLD には単純性脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis: NASH) があるが，後者は飲酒歴がなくても病理組織学的にアルコール性肝炎と類似した所見を認め肝硬変や肝癌に進展する点で前者と区別される。NASH の病態の成立には，“two hit theory”，すなわち，first hit である肥満に伴う肝への脂肪沈着に酸化ストレス，脂質過酸化，エンドトキシンなどの second hit が加わり NASH が発症すると想定されている。NASH とアルコール性肝炎は，その原因は異なると考えられるが，いずれにおいても肝の cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) の誘導が明らかにされている。この CYP2E1 の誘導，活性化亢進が活性酸素種 (ROS) の産生に関与しており単純性脂肪肝から NASH への進展に働く可能性が示唆されている。一方，NAFLD の診断基準はエタノール摂取量が 20g/日あるいは 140g/週以下とされるが，CYP2E1 が誘導された状態ではたとえ機会飲酒でも，エタノールは CYP2E1 によって代謝され，その結果
ROS が産生されることになる。以上より，肝への脂肪沈着から NASH への進展に機会飲酒が second hit として作用する可能性が示唆される。そこで，本研究では機会飲酒が肥満に伴う肝への脂肪沈着から NASH への進展に“second hit”として働くかどうかを，体重増加と共に 2 型糖尿病，高脂血症，脂肪肝を自然発症する Otsuka Long-Evans Tokushima
Fatty (OLETF) ラットを用いて検討した。
実験方法

- 7 -

雄の OLETF ラットおよびその wild type である Otsuka Long-Evans Tokushima (OLET)
ラットを用いたが，先ず 10，20，30 週齢にそれぞれを屠殺し，肝組織の病理学的変化，
CYP2E1 の誘導状態および酸化ストレスの状態について検討した。次いで，30 週齡のラットを用い，週 5，3，2 および 1 日，水あるいは 10％ エタノール 10 ml を胃管にて投与し，3 週目に屠殺した。採取した血液を用い，血清 AST，ALT，γGTP，総コレステロール，中性脂肪 (TG) ，グルコース，およびインスリン値を測定するとともに，肝組織中の TG も測定した。また，ホルマリン固定肝組織切片の H&E 染色を行い，脂肪化，炎症および肝細胞の風船化の程度を 0-3 のスコアで評価し，5 以上を NASH とした。さらに，CYP2E1 お
よび 4-hydroxy-nonenal (4-HNE) を免疫組織学的に染色した。
実験成績
OLETF では，OLET に比べ，加齢とともに体重は増加し，肝組織の CYP2E1 および 4HNE の染色性も有意に強くなった。また，30 週齡では，OLETF では，肝への脂肪沈着を認め，血清グルコース，インスリン，ALT，TG 値は，OLET に比べ有意に高値を示した。
エタノール投与により，OLETF では，肝細胞の風船化を伴う強い脂肪肝炎が認められたが，OLET では明らかな異常所見は認められなかった。OLETF では，血清グルコース，インス
リン，ALT，TG 値は，エタノール非投与群に比べエタノール投与群でいずれも有意に高値を示した。一方，OLET では，それらの血清値にエタノール投与の有無による差は認められなかった。
総括および結論
OLETF ラットは，加齢とともに体重が増加し，30 週齢では，肝への脂肪沈着，耐糖能異常および高脂血症が認められ，ヒトのメタボリック症候群に伴う脂肪肝の研究に極めて適した動物モデルであることが示された。その OLETF ラットに，10％ エタノール 10ml を
週 1 日， 3 週間投与することによって，肝の脂肪沈着から NASH が発生したが，OLETFの wild type である OLET では，同量のエタノールを週 5 日投与しても，肝組織には明らかな変化が認められなかった。今回行った研究成績から，週 1 日 (1 回) の飲酒であっても，誘導された CYP2E1 によってエタノールが代謝される際に ROS が産生され，その結果，肥満に伴って発生した単純性脂肪肝から NASH が生じることを強く示唆していると考えられた。以上のことは，機会飲酒が，肥満に伴う単純性脂肪肝から NASH への進展の“second hit”として働くことを強く示唆しており，単純性脂肪肝を有する肥満者では，たとえ機会飲酒であっても避けるべきであると考えられた。
論文審査結果の要旨
NASH は単純性脂肪肝と異なり，肝硬変ひいては肝癌発症の原因となることが注目されている。NASH の成因として second hit theory が有名であり, 肥満, インスリン抵抗性などの要因が first hit, それを基盤として酸化ストレスなどが second hit として病態を形成すると考えられている。本研究は肥満モデル動物を用いて, 比較的少量のエタノール摂取でも NASH 形成の second hit に深く関与する可能性を明らかにし，更に，エタノ- 8 -ール摂取により誘導され酸化ストレスを起す可能性のある因子を同定した。
副査の先生方から，OLETF ラットは何故食欲亢進するのか，ラットへ投与されたエタノ
ール量のヒトでの換算量はいかほどか，エタノール摂取により誘導される因子の中で 4HNE はどのような働きをしているのか，また OLETF ラットと高血圧症とのかかわりはどうか，の貴重なご質問が提起された。申請者はそれらに文献的な考察に自身の考えを加えながら適切に回答していたと考えられる。
本研究は，ヒトにおいて，肥満や脂肪肝のある場合の機会飲酒について, NASH 発症を予防する上での重要な問題点を提起したと考えられ，今後， 肥満者や脂肪肝患者の生活指導を行うに際し，重要な指針を示した点で意義が深いと思われる。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
Molecular Medicine

Vol.20，No.1，490-502，2014

- 9 -

ふじ

藤

もと

氏名（生年月日）
本

籍

香

川

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４５８号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第２項該当
Clinical significance of serum and urinary soluble

学 位 論 文 題 目

けい

本

圭

じ

司 （昭和 51 年 11 月 5 日）

県urokinase receptor (suPAR) in primary nephrotic syndrome
and MPO-ANCA-associated glomerulonephritis in Japanese（本邦の原発性ネフローゼ症候群ならびに MPO-ANCA 関連腎炎における血清・尿中可溶性ウロキナーゼ受容体（suPAR）の臨床的意義）論 文 審 査 委 員

主

査

梶 波

副

査

本 多 隆 文
古

康 二

家 大 祐

学位論文内容の要旨
研究目的
原発性ネフローゼ症候群 (NS) およびミエロペルオキシダーゼに対する抗好中球細胞質
抗体関連腎炎 (MPO-ANCA-GN) における可溶性ウロキナーゼ受容体 (suPAR) の臨床的意義について臨床病理学的指標と対比検討した。
実験方法
原発性 NS 37 例[FSGS 8 例，微小変化型 (MCNS) 12 例，膜性腎症 (MN) 15 例，膜性増殖性糸球体腎炎 (MPGN) 2 例]，MPO-ANCA-GN 13 例，健常コントロール 20 例を対象として，
特異的酵素抗体法により s-/u-suPAR 測定を行った。疾患および正常コントロールの治療
前 s-/u-suPAR を比較した。次に，治療前 s-/u-suPAR と臨床指標[尿蛋白量 (UP)，推算糸
球体ろ過率 (eGFR)，血清 CRP，尿蛋白選択性指数 (Selectivity Index)，半月体形成率，
MPO-ANCA-GN 臨床学的重症度]との相関について検討した。さらに，治療前，治療開始後
2 カ月目 (2M) の s-/u-suPAR (0M s-/u-suPAR，2Ms-/u-suPAR) ならびに治療開始後 2 カ
月間の s-/u-suPAR 変化 (Δ2M s-/u-suPAR) による NS 治療反応性予測および MCNS とFSGS の鑑別能について ROC 解析により検討した。
実験成績（１）治療前 s-/u-suPAR は，健常コントロールと比較して，原発性 NS および ANCA-GNで有意に高値であったが，原発性 NS 各組織間および原発性 NS と MPO-ANCA-GN の間には差を認めなかった。
- 10 -

（２）原発性 NS および MPO-ANCA-GN において，治療前 s-suPAR と eGFR に負の相関を認めた。また，原発性 NS において治療前 u-suPAR と UP に正相関を認めた。さらに，ANCAGN において治療前 s-suPAR と CRP/半月体形成率/臨床学的重症度に正相関を認めた。
（３）治療前 s-/u-suPAR は，難治性 NS と非難治性 NS の鑑別指標とはならなかった。一
方，非難治性 NS において治療開始後 2 カ月間に s/u-suPAR は有意に低下したが，難治性
NS においては増加する傾向を認めた。さらに，難治性 NS と非難治性 NS との鑑別が 2M
s-suPAR (AUC-ROC=0.913 ， p=0.002 ， cut off 値 : 3373 pg/ml) ， Δ 2M u-suPAR (AUCROC=0.906，p=0.007，cut off 値: -127 pg/mg・Cr)，Δ2M s-suPAR (AUC-ROC=0.881，
p=0.005，cut off 値: -189 pg/ml) により可能であった。
（４）治療前 s-/u-suPAR は，FSGS と MCNS の鑑別指標とはならなかった。一方，治療開始後 2 カ月間に s-/u-suPAR は MCNS において有意に低下したが，FSGS においては不変であり，Δ2M s-suPAR (AUC-ROC=0.905，p=0.007，cut off 値: -268pg/ml)，Δ2M usuPAR (AUC-ROC=0.816，p=0.048，cut off 値: -718pg/mg・Cr) により FSGS と MCNS との鑑別が可能であった。
総括および結論
本研究により，原発性 NS のうち非難治性症例，特に MCNS において治療開始後に s/usuPAR が有意な低下を認めることが示され，suPAR が初期治療における治療反応性評価および臨床上重要である MCNS と FSGS との鑑別に有用なバイオマーカーとなることが明らかとなった。また，MPO-ANCA-GN においては，s-suPAR が臨床学的・病理学的重症度を反映した初期重症度評価に有用な指標であることが示された。
論文審査結果の要旨
原発性 NS および MPO-ANCA-GN は有効な疾患特異的治療が少なく，重大な有害事象の多い副腎皮質ステロイドを主体とする非特異的免疫抑制療法に依存しているのが現状であり，これら疾患の病態解明と新たな治療標的分子の同定が望まれている。
本研究は，治療開始後の血清ならびに尿 suPAR 変化と NS 病勢変化との関係および治療
前血清 suPAR と MPO-ANCA-GN の臨床/病理学的重症度との相関を初めて明らかにした。また，現在，治療開始後 6 カ月時点の状況によって判断されている NS 治療反応性について，治療開始後の血清および尿 suPAR 変化を指標に治療 2 カ月時点において治療反応性を同定できる可能性を提起した。さらに，腎生検によっても時に困難である FSGS と MCNS との鑑別を，治療開始後の血清および尿 suPAR 変化によって非侵襲的に高い精度で行える可能性も示唆している。今後，suPAR 測定がこれら疾患の新しい診療指針となることが期待されるとともに，suPAR の病因への関連と治療標的分子としての可能性を示唆した点で画期的と評価される。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値すると認められる。

（主論文公表誌）
Clinical and Experimental Nephrology Vol.19，No.5，804-814，2015- 11 -

まつ

え

江

やす

松

本

籍

石

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４５９号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

Serum Osteopontin Predicts Degree of Hepatic Fibrosis and

川

泰

ひろ

氏名（生年月日）弘（昭和 59 年 3 月 26 日）

県

Serves as a Biomarker in Patients with Hepatitis C Virus
Infection（C 型慢性肝炎患者における肝線維化マーカーとしての
血清オステオポンチン値の有用性）
論 文 審 査 委 員

主

査

元 雄

良 治

副

査

米 倉

秀 人

湊

宏

学位論文内容の要旨
研究目的
Osteopontin (OPN) は, multifunctional cytokine として炎症・骨成長・がんの浸潤・血管増生・肝線維化に重要な役割を演じていることが明らかにされつつある。一方，
C 型肝炎ウイルス (HCV) の感染者は, 世界で１億 7000 万人いると推定されており, 肝硬変あるいは肝細胞癌の主な原因になっている。C 型慢性肝炎では, 肝の線維化が進行するにしたがって, 肝細胞癌の発生頻度が高くなることから, 肝線維化の程度の把握は, 肝癌の早期診断や慢性肝疾患の治療のために極めて重要である。従来から, 肝線維化の程度を評価するため様々なバイオマーカーが用いられているが, 肝線維化を正確に反映する血清
マーカーがないのが現状である。そこで今回, 血清 OPN が C 型慢性肝炎患者の肝線維化の程度を反映するか否かを検討した。
実験方法
2012 年 4 月から 2014 年 10 月までに, 診断および治療のために金沢医科大学病院に入院した HCV マーカー陽性の患者 115 名を対象とした。腹部エコーや CT 検査により肝癌患者を除外するとともに, 飲酒歴がなく, B 型肝炎ウイルスマーカーも陰性であることを確認した。対象患者すべ てに肝生検を施行し, ホルマリン固定生検肝 組織を用いて,Masson’s trichrome 染色と α-smooth muscle actin (αSMA) の免疫染色を行った。なお，肝線維化の程度は，Desmet らの方法に従って, F0～F4 に分類した。血清 OPN は
OPN-ELISA kit を用いて測定した。また，従来の肝線維化マーカーである血小板数，血清
ヒアルロン酸および血清Ⅳ型コラーゲンを測定し, 血清 OPN と比較した。統計解析として,- 12 -

測定値の比較には

ANOVA を , 相 関 の 解 析 はPearson and Lee’s correlation

coefficient を, 診断的評価に関しては ROC curve による解析を用いた。また, 最適
cut off 値は Youden index を基に決定し, AUC の比較は Delong らの方法に従った。
実験成績
Masson’s trichrome および αSMA の染色性は, 線維化が F0 から F4 に進展するにしたがって強くなり, いずれも 5 群間で有意差が認められた。次に, 肝線維化の程度別 (F0～F4) に, 従来の肝線維化マーカーである血小板数, 血清ヒアルロン酸および血清 IV 型
コラーゲンをみたが, いずれも一部の群間のみしか有意差がつかなかった。一方, 血清
OPN は肝線維化の進展に従って増加し, すべての群間で有意差を認めた。そこで, 血清
OPN の肝線維化マーカーとしての有用性を評価するために, 全コホートを解析群(derivation cohort 群) と検証群 (validation cohort 群) に分けて検討した。解析群は65 例で (F1=15，F2=16，F3=17，F4=17)，F1 と F2/3/4 および F1/2 と F3/4 の識別において，血清 OPN の AUC (area under the curve) はそれぞれ 0.996 (cut-off 値:
83ng/mL, 感度 92%, 特異度 100%)，0.997 (cut-off 値: 124ng/mL, 感度 97.1%, 特異度100%) であり, 他の 3 つの肝線維化マーカーに比して有意に高値を示した。次に, 39 例
(F1=21，F2=10，F3=5，F4=3) の検証群でも解析したが，同様に血清 OPN は F1 と F2/3/4，
F1/2 と F3/4 の識別において，他の肝線維化マーカーに比して有意に AUC が高かった。
総括および結論
以上のごとく，血清 OPN は C 型慢性肝炎患者の肝線維化の進展度を極めて良く反映することが明らかとなり, 肝生検を施行し得ない患者の肝線維化を評価するために血清 OPN の測定は有用と考えられた。
論文審査結果の要旨
C 型慢性肝炎では HCV の持続感染により, 肝線維化が進行すると, 肝硬変に進展し,肝硬変患者では肝細胞癌を高率に発症する。肝生検は侵襲的な検査であり, 血清学的に肝線維化を正確に知ることができれば, 臨床的意義が高い。これまで血小板数・ヒアルロン
酸・Ⅳ型コラーゲンなどが血液生化学的な肝線維化マーカーとして利用されてきたが, 必
ずしも正確に肝線維化を反映しているとは言えなかった。
OPN は 1986 年にクローニングされた細胞外マトリックス蛋白であり，自然免疫・細胞の生存・がん細胞の浸潤・血管新生など, 多くの機能を有する。OPN は線維芽細胞やマク
ロファージなどさまざまな細胞に発現しているが, 静止期の肝星細胞を活性化させ, 肝線維化を促進する作用があり，また肝星細胞自身にも OPN の発現が増加する。最近血清
OPN 値がアルコール性肝障害における肝線維化マーカーになり得ることが明らかになった。
申請者は C 型慢性肝炎患者における肝線維化マーカーとしての血清 OPN の有用性について, 肝生検組織を用いて解析した。病理組織学に診断した C 型慢性肝炎患者のうち, 65
例を derivation cohort 群, 39 例を validation cohort 群に分けて検討した。これら各
cohort 別でも, また全 cohort でも, 血清 OPN のみが肝線維化の F0 から F4 までの各群- 13 -

間のすべてで有意差を示した。また ROC 曲線で評価した肝線維化の程度の識別能においても, 血清 OPN の AUC が他の肝線維化マーカーに比較して有意に高値を示した。とくに従来の肝線維化マーカーでは十分わからなかった, F1 と F2, F2 と F3 の識別において血清 OPN が有用である点が本研究で特筆すべきことと考えられた。これらの結果から，血清OPN は, C 型慢性肝炎の肝線維化を最も正確に反映する, 臨床的有用性の高いバイオマー
カーであると評価された。本研究成果は今後の臨床肝臓病学の進歩に大きく寄与するものと考えられた。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
PLoS One

Vol.10，No.3，2015- 14 -

なか

むら

村

とも

中

本

籍

岐

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４６０号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

CD14+ follicular dendritic cells in lymphoid follicles may

阜

智

み

氏名（生年月日）美（昭和 56 年 5 月 7 日）

県

play a role in the pathogenesis of IgG4-related disease（IgG4 関連疾患における濾胞樹状細胞での CD14 発現）論 文 審 査 委 員

主

査

中 村

晃

副

査

上 田

善 道

松 井

真

学位論文内容の要旨
研究目的
IgG4 関連疾患は高 IgG4 血症と IgG4 陽性形質細胞の増加に伴う全身諸臓器の腫瘤形成
または肥厚性病変を特徴とする原因不明の疾患である。しかしながら，高 IgG4 血症や組織中の IgG4 陽性細胞増加は，癌，悪性リンパ腫，血管炎，サルコイドーシス，多中心性
キャッスルマン病などの疾患でも起こることが報告されており，臨床経過や予後が異なる
これらの疾患を厳密に鑑別することが重要となっている。本疾患の病理組織学的な特徴は，リンパ濾胞の過形成と花筵様線維化で，これまで IgG4 陽性細胞の過増殖や制御性 T 細胞などの局在が報告されているが，他の免疫細胞の関与については不明のままである。そこで本研究では，リンパ濾胞において，単球，マクロファージ，濾胞樹状細胞に関する病理学的検討を行った。
実験方法
金沢医科大学病院において，IgG4 関連疾患包括診断基準によって IgG4 関連疾患と診断された治療開始前の 22 例 (男性 15 例，女性 7 例) の病理組織検体を用いて行った。生検
組織は，口唇小唾液腺 5 例，顎下腺 8 例，胆管 2 例，リンパ節 2 例，涙腺 2 例，後腹膜 1
例，十二指腸 1 例，精巣 1 例である。またコントロールとして，リンパ濾胞形成を有した良性疾患で，治療開始前の反応性リンパ節炎 3 例 (リンパ節)，多中心性キャッスルマン
病 3 例 (リンパ節)，シェーグレン症候群 13 例 (口唇小唾液腺) の病理組織検体を用いた。
各種病理検体に対して，HE 染色に加えて IgG，IgG4，CD68 (マクロファージ)，CD163(M2 マクロファージ)，CD21 (濾胞樹状細胞)，CD14 (単球など)，CD16 (単球)，CD3 (T 細胞)，CD20 (B 細胞) の免疫染色を行った。CD14 染色において IgG4 関連疾患群の組織のみで特徴的所見を認めたため，各標本において平均 5 濾胞ずつ濾胞内 CD14 陽性細胞数を測- 15 -

定した。また CD14 と CD21 の蛍光抗体による二重染色を行った。
実験成績
免疫染色の結果 CD14 陽性細胞の分布について有意差が認められた。IgG4 関連疾患患者
群ではリンパ濾胞を有した 22 例中 13 例において，リンパ濾胞胚中心に CD14 陽性細胞を認め，また CD14 陽性組織では組織中の IgG4/IgG 比が有意に高くなっていた。対照群では全例リンパ濾胞内に CD14 陽性細胞を認めなかった。さらに CD14 と CD21 の二重染色を行ったところ，CD14 陽性細胞と CD21 陽性細胞が共局在しており，リンパ濾胞肺中心内のCD14 陽性細胞は濾胞樹状細胞であると考えられた。一方，単球やマクロファージの分布は対照群との大きな差は見られなかった。
総括および結論
CD14 は Lipopolysaccharide (LPS) を認識する Toll-like receptor (TLR) 4 の共受
容体として働き，細胞の活性化に関与していることが知られている。濾胞樹状細胞は，胚中心の形成に必須の免疫細胞であり，胚中心でのB細胞 (中心細胞) への抗原提示に重要な役割を果たしている。本研究ではIgG4 関連疾患において，リンパ濾胞胚中心にCD14 陽性細胞を認め，CD21 陽性細胞と共局在することから，濾胞樹状細胞がCD14 を発現していることを明らかにした。IgG4 関連疾患では，濾胞樹状細胞が CD14 を発現することで，TLR下流のシグナル伝達がさらに亢進して活性化し，IgG4 陽性形質細胞産生の誘因となっていると考えられた。
論文審査結果の要旨
IgG4 関連疾患は，IgG4 陽性形質細胞が組織内で過増殖し，唾液腺炎や硬化性膵炎，間質性肺炎，後腹膜線維症など全身の様々な臓器に病変を起こす慢性炎症性疾患である。本疾患は，IgG4 高値に加えて IgE 高値や，自己抗体の出現，末梢血における制御性 T 細胞の増加などを認めることから，免疫異常が関与していると考えられているが，その発症機序は不明のままである。本研究では，治療開始前の IgG4 関連疾患患者群の病理組織において，T 細胞や B 細胞に加えて単球，マクロファージ，濾胞樹状細胞の局在を免疫染色により検討を行った。その結果，IgG4 関連疾患患者群の 6 割の組織で，主に単球で発現する CD14 陽性細胞がリンパ濾胞，特に胚中心に存在していることを明らかにした。対照群
ではリンパ濾胞内に CD14 陽性細胞は検出されないことから，IgG4 関連疾患に特徴的な所見と考えられた。また，CD14 陽性細胞 CD21 陽性の濾胞樹状細胞の分布と一致していることに着目し，CD14 と CD21 の二重染色を行ったところ，CD14 陽性細胞の殆どが CD21 陽性細胞と共局在しており，CD14 陽性の濾胞樹状細胞であることを見出した。さらに CD14
陽性細胞患者群では，IgG4 分画の割合が増加していることを明らかにした。CD14 は LPSを認識する TLR4 受容体の複合体を形成し，TLR シグナル伝達に関与していることが判明している。濾胞樹状細胞は，胚中心において B 細胞に抗原提示を行い，形質細胞分化に重要な役割を果たしている免疫細胞である。これまで TLR4 が濾胞樹状細胞を活性化することが報告されている。本研究結果は，IgG4 関連疾患においては，濾胞樹状細胞が CD14 を- 16 -

発現することによりさらに活性化し，IgG4 陽性形質細胞の分化に寄与している可能性示
した点で極めて重要な発見と考えられる。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
Biomedical Research Vo.36，No.2，143-153，2015- 17 -

し

みず

水

よし

清

本

籍

愛

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４６１号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

ラット脊髄切断モデルにおける hyaluronidase-4 の抑制効果

論 文 審 査 委 員

主

査

飯 塚

秀 明

副

査

田 中

惠 子

媛

義

あき

氏名（生年月日）朗（昭和 55 年 11 月 30 日）

県

湊

宏

学位論文内容の要旨
研究目的
脊髄の損傷後，損傷部周囲に反応性アストロサイトが凝集してコンドロイチン硫酸プロ
テオグリカン (以下 CSPGs) を発現し，中心部が空洞化したグリア瘢痕を形成することで軸索再生を阻害することが報告されている。CSPGs は，動物細胞の細胞表面や，結合組織の細胞外マトリックスに普遍的に存在するが，中枢神経系では発生の段階でのみ発現し，軸索の伸張方向を制御する細胞外抑制分子として作用し，正常な成体の脊髄内には認められない。CSPGs は細菌由来の酵素である ChondroitinaseABC (ChABC) による消化が可能であり，ChABC による脊髄損傷部の CSPGs の消化は軸索の再生と機能回復を促進するとの報告がある。また，ラット脊髄挫傷モデルにおける CSPGs の発現は，損傷後約 2 週でピークとなり以後も残存し軸索の伸張を阻害するが，ラット脊髄切断モデルでは，切断後約 3 週でピークに達した後に，自然に減少したとの報告がある。CSPGs が自然に減少する過程において，ChABC と同様の作用をもつ内因性の消化酵素の存在は明らかになっていな
いが，生体内の酵素であるヒト hyaluronidase-4 (Hyal-4) がコンドロイチン硫酸 (CS)に特異的な加水分解酵素であるとの報告があり，さらに，ラット脊髄切断モデルにおいて，脊髄の損傷部にその Hyal-4 の存在が確認され，CSPGs の周囲を取り囲むように Hyal-4が発現していることから，Hyal-4 が CSPGs を消化している可能性があると申請者らの研究グループから報告されている。申請者は，この現象を検討するために，ラット脊髄切断
モデルを使用し，損傷部で発現している Hyal-4 に対して抗 Hyal-4 抗体を中和抗体として使用し，その作用を抑制することで CSPGs の消化が妨げられるとの仮説に基づき，抗Hyal-4 抗体の局所投与後の CSPGs の変化について組織学的に検討を行った。
実験方法
10 週齢の雌性 Sprague-Dawley (SD) ラットに対して，ペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与し深麻酔とし，第 9・10 胸椎の椎弓を切除して脊髄を露出し，かみそりの刃- 18 -

を用いて，同レベルの脊髄の右側を，正中を越えて切断した。切断後，抗 Hyal-4 抗体，
コントロールとして IgG を，切断部から近位 2mm，遠位 2mm，切断部左側の計 3 ヶ所にニューロシリンジを用いて 1µL ずつ注入し単回投与を行った。注入後 1，4 日，1 週で，再びペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与し深麻酔とし，4％パラホルムアルデヒド
で灌流固定を行った。次に，抗 Hyal-4 抗体，IgG を，浸透圧ポンプを用いて，第 12，13胸椎間から硬膜下にチューブ先端が切断部を越えるように挿入し持続投与を行った。留置後 1，2，3，4 週で還流固定を行った。固定後，損傷部脊髄を摘出し，凍結切片を作製した。作製した凍結切片に対して 1 次抗体に CS56，抗 GFAP 抗体を用い，2 次抗体にAlexa488，594 を用いて蛍光免疫染色を行い，BZ-9000 (KEYENCE) にて観察し画像を撮影した。
実験成績
単回投与では，抗 Hyal-4 抗体，IgG 投与群ともに，投与後 1 日目から CSPGs，GFAP の
淡い染色性を認め，1 週までその染色性は漸増したが，染色性を示した面積の定量では，どの時点においても有意差は認めなかった。一方，持続投与では，抗 Hyal-4 抗体投与群
では 1 週から 4 週まで CSPGs の染色性は漸増したが，IgG 投与群では 3 週までは漸増し，4 週で染色性は低下した。CSPGs の染色性を示した面積を計測したところ，4 週で有意差を認めた。
総括および結論
脊髄損傷の際に反応性アストロサイトからグリア瘢痕が形成され CSPGs が軸索再生を阻害しているが，ChABC を損傷部に投与してグリア瘢痕内の CSPGs を消化することにより，軸索の再生が促進されて機能的な回復が起こる。Hyal-4 は，CSPGs の CS に特異的な内因性の消化酵素であり，ラット脊髄切断モデルの損傷部では，Hyal-4 が発現し
CSPGs を消化しているならば，その作用を抑制することで CSPGs は消化されずに残存すると考えられる。IgG 持続投与群では，CSPGs は 3 週でピークに達した後 4 週で減少したが，抗 Hyal-4 抗体持続投与群では，4 週でも CSPGs はさらに増加していた。IgG 投与群
では内因性に CSPGs が消化されているが，抗 Hyal-4 抗体投与群では CSPGs は消化されずに残存していると考えられる。このことから，脊髄切断モデルの損傷部では，内因性のHyal-4 が発現し，CSPGs を消化していることが強く示唆された。近年では，脊髄損傷に対する様々な治療方法が研究され，臨床研究へ移行しており，その中でも，CSPGs を消化することは軸索再生に有効であるというエビデンスが多数ある。ChABC は細菌由来の酵素であるため，脊髄内注射や髄腔内注射でしか投与できないが，Hyal-4 は生体内の酵素であり，その分泌・産生は反応性アストロサイトの可能性も示唆されている。Hyal-4 の分
泌・産生機序は未だ不明な点が多いが，今後その機序が解明されれば生体内での増幅が可能となり，内服薬や注射薬など低侵襲な方法で，損傷部での Hyal-4 の発現量を増幅させ，内因性に CSPGs を消化できる可能性があると考えられる。

論文審査結果の要旨- 19 -

脊髄の損傷後に損傷部周囲に反応性アストロサイトが凝集し，正常の中枢神経系では発現がすることがない CSPGs を発現してグリア瘢痕を形成され軸索再生を阻害することが報告されている。また，CSPGs を細菌由来の酵素である ChondroitinaseABC によって消化すると軸索の再生と機能回復が促進されたとの報告がある。一方，生体内の酵素である
hyaluronidase-4 がコンドロイチン硫酸に特異的な加水分解酵素であるとの報告があり，さらに，ラット脊髄切断モデルにおいて，脊髄の損傷部にその CSPGs の周囲を取り囲むように Hyal-4 が発現していることから，Hyal-4 が CSPGs を消化している可能性があることが申請者らの研究グループから報告されている。
申請者は，この現象を検討するために，ラット脊髄切断モデルを使用し，損傷部で発現している Hyal-4 に対して抗 Hyal-4 抗体を中和抗体として使用し，その作用を抑制することで CSPGs の消化が妨げられるとの作業仮説に基づき，抗 Hyal-4 抗体の局所投与後のCSPGs の変化について組織学的に検討を行った。その結果，抗 Hyal-4 抗体の単回局所投与では，IgG 投与のコントロール群と差異はなかったが，浸透圧ポンプを使用した持続投与の実験では，IgG 投与群では 3 週までは漸増し，4 週で染色性が低下したのに対して，
抗 Hyal-4 抗体投与群では 1 週から 4 週まで CSPGs の染色性は漸増し，画像解析による定量結果で有意差を認めた。
申請者は，CSPGs を消化する内因性の消化酵素である CSPGs を中和抗体でブロックすることにより，CSPGs の発現が持続することを明らかにした。このことは，Hyal-4 が脊髄損傷部に発現し，CSPGs を消化していることを強く示唆するものである。
脊髄損傷は，中枢神経損傷の中でも四肢あるいは下肢麻痺をきたす悲惨な病態であり，その損傷機序や治療についてこれまで数多くの研究がなされてきた。最近は，再生治療の最も重要な分野のひとつとして新たな研究の発展も期待されているが，未だ有効な治療法がないのが現状である。申請者の研究結果は，CSPGs を消化する Hyal-4 が損傷部に発現していることを示唆しており，Hyal-4 の分泌・産生機序は未だ不明な点が多いが，内服薬や注射薬など低侵襲な方法で損傷部での Hyal-4 の発現量を増幅させることにより，内因性に CSPGs を消化することで，新たな脊髄損傷に対する治療法の開発の可能性に結びつくものと考えられる。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
金沢医科大学雑誌

Vol.40，No.1，9-16，2015- 20 -

ひがし

かわ

川

とし

ひろ

氏名（生年月日）

東

本

籍

大

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４６２号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

Blood pressure and disability-free survival among

阪

俊

寛

（昭和 54 年 3 月 5 日）

府

community-dwelling diabetic and non-diabetic elderly
patients receiving antihypertensive treatment（降圧薬治療中の地域在住糖尿病・非糖尿病高齢者における血圧と生活機能との関係）
論 文 審 査 委 員

主

査

有 沢

富 康

副

査

小 林

淳 二

森 河

裕 子

学位論文内容の要旨
研究目的
大規模試験において, 糖尿病例では高率に高血圧を合併し, 糖尿病合併高血圧例では心血管疾患発症・死亡のリスクが上昇することが知られている。それゆえ, 降圧薬治療は,
特に糖尿病合併高齢者高血圧例において重要である。しかし, 収縮期血圧 (SBP) 130mmHg
未満あるいは 120mmHg 未満の過度の降圧は, 脳卒中を除く心血管疾患の発症・死亡率の減少にはつながらず, また重篤な副作用例も出現することが報告されるようになり, 糖尿病合併高齢者高血圧例の降圧目標については確定していない。さらに, これら糖尿病合併
高血圧例の地域における自立した生活機能維持に関する降圧目標についての報告もない。
そこで, 高齢者における糖尿病合併高血圧の治療目標を明らかにする目的で, 降圧薬治療中の地域在住糖尿病・非糖尿病高齢者における血圧と生活機能との関係につき検討した。
実験方法
平成 20 年の初年に健康診査データを有し, 降圧薬治療を受けた 579 例のうち, 転出した 9 例を除外した 570 例 (男性 225 例, 女性 345 例) を対象とした。年齢は 65-94 歳で,降圧薬治療中の 139 人の糖尿病例 (平均年齢 76.3±5.9 歳) と, 431 人の非糖尿病例 (平均年齢 73.6±6.0 歳) に分類した。本研究のエンドポイントは, 平成 20 年から平成 23 年に至る 4 年間における初回要支援・要介護認定または死亡とした。収縮期血圧 (SBP) お
よび拡張期血圧 (DBP) は, それぞれ 4 群に分類した (SBP: <120, 120～139, 140～159,≥ 160mmHg; DBP: <70, 70～79, 80～89, ≥ 90mmHg）。初回要支援・要介護認定または死亡
ヘの交絡因子を推定するために, Mann-Whitney U検定, χ2検定, ANOVA を用いた。年齢,- 21 -

性, および同検定にてP<0.20 を与える全ての因子を交絡因子とした。非糖尿病例群のSBP: 140～159mmHg群および DBP: 70～79mmHg群を対照群とし, 他血圧群におけるエンド
ポイント発生のハザード比 (HR) および 95% 信頼区間 (CI) をCox比例ハザード回帰分析
にて算出した。
実験成績
4 年間での全イベント (初回要支援・要介護認定または死亡) の発生率は, 糖尿病例群
では非糖尿病例群と比較して有意に高率であった［糖尿病例群 29 件 (20.8%), 非糖尿病
例群 48 件 (11.1%) HR=1.99，95% confidence intervals (CI)=1.26-3.16，p=0.003］。年
齢, 性別を含む交絡因子で調整後のエンドポイントの発生リスクは, 非糖尿病例群のSBP: 140 ～ 159mmHg 群 を 対 照 と し た と き , 非 糖 尿 病 例 群 に お け る SBP<120mmHg 群(HR=3.61 ， 95% CI=1.21-10.8 ， p=0.022) お よ び

SBP≥160mmHg 群(HR=3.90 ， 95%

CI=1.32-11.5，p=0.014) で有意に高かった。また, 同じ対照群に対し糖尿病例においては, SBP≥160mmHg 群 (HR=22.8，95% CI=4.83-118，p<0.001) で有意に高かった。DBP の4 群間では有意差を認めなかった。
総括および結論
糖尿病合併高血圧例では SBP 130mmHg 未満あるいは 120mmHg 未満の過度の降圧は脳卒
中を除く心血管疾患の発症・死亡率が逆に上昇するＪ字現象を示すことが報告されている。
要支援・要介護認定および死亡をエンドポイントとした本研究では, 糖尿病合併高血圧例において明らかなＪ字現象はみとめなかったものの, 地域における自立した生活の維持に,降圧薬治療における SBP 目標値を 160mmHg 未満とすることが極めて重要であることを示した。
論文審査結果の要旨
高齢者では糖尿病や高血圧を有する者が多く, また両者が合することもめずらしくはない。これらの合併は, 心血管系イベントの発症リスクを一層増加させることも明らかにされており, それぞれの薬物治療によるコントロールは臨牀上重要な課題である。一方で,高血圧に関しては, 過度の血圧低下はイベント発症の抑制にはつながらず, むしろ副作用を増加させることも明らかとなってきている。さらには, 多くの研究は心血管系イベントの発症をエンドポイントとしているが, 日常の社会生活では高齢者が自立した生活をおくれるか否かは重要な問題であるが, そこにエンドポイントを設定した検討は少ない。そこ
で, 本研究は, いまだ明らかにされていない, 自立生活が可能であるための糖尿病を合併した高血圧の治療目標を明らかにすることを目的とし計画されたものである。
地域住民を対象に, 高血圧治療を受けているものを糖尿病を有するものと有さないものに分類し 4 年間追跡, 要介護支援または死亡をエンドポイントとしてそのイベントに対するリスクが有意に高くなる拡張期血圧または収縮期血圧を明らかにすることで, 治療目標を推定しようとするものである。結果として, ある時点の収縮期血圧が 160mmHg 以上のものでは, 多変量解析により有意にイベント発症のリスクが増加することが明らかとなり,- 22 -

糖尿病を有する高齢者高血圧の治療は収縮期血圧が 160mmHg 未満にコントロールすることが望ましいと結論付けている。
本研究は, case-control study であるポイントがあいまいであることや, 対象数が解析に耐えうるものであるか, エンドポイントとして要介護支援という主観的バイアスのかかるものが妥当であるかなど，様々な limitation は存在するものの, 高齢化社会を迎え,今後増加するであろう糖尿病を合併した高血圧の治療状況によって, その後の要介護支
援・死亡のリスクが異なることを明らかにしたことで, 日常診療における高血圧治療にひとつの目標を与える有益なものである。さらには, 本研究の結果は, 治療介入による前向き試験によりさらに降圧目標値を明確にするための土台となるなど, 今後の研究の発展にもつながるものであり，臨牀上極めて有意義なものであると考えられる。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
Geriatrics and Gerontology International- 23 -

Vol.16，No.3，365-373，2016

しば

た

田

ひさ

柴

本

籍

三

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４６３号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

静注用鉄剤に含まれる遊離鉄が生体に与える影響

重

央

え

氏名（生年月日）恵（昭和 53 年 4 月 27 日）

県―遊離鉄の危険性―論 文 審 査 委 員

主

査

犀 川

太

副

査

西 尾

眞 友

岡 崎

俊 朗

学位論文内容の要旨
研究目的
鉄補給を目的として実施される静注用鉄剤の鉄代謝制御系に与える影響をヘプシジンの反応様式から検討した。
実験方法
8 週令の SD 雄ラットを用いて，世界で使用されている 5 種類の静注用鉄剤 (デキストラン鉄 FeD，クエン酸加デキストリン鉄 FeDC，スクロース鉄 FeS，含糖酸化鉄 SFeO，およびグルコン酸鉄 FeG) を検討した。なお，日本では含糖酸化鉄 SFeO のみが使用可能である。以下の 5 項目を測定した。①静注用鉄剤に含まれる遊離鉄量と②トランスフェリン飽
和度は電気泳動法を用いて鉄結合トランスフェリンをアポ体，モノ体，ホロ体に分画して算出した。③血漿中の製剤鉄，④血漿ヘプシジン濃度，および⑤血漿 IL-6 はラットに製剤鉄 5 mg/kg を静脈投与したのち経時的にヘパリン採血による血漿を用いて測定した。
実験成績
1) 遊離鉄量: 含糖酸化鉄 SFeO (日本で唯一使用可能），グルコン酸鉄 FeG，およびスクロ
ース鉄 FeS 製剤には遊離鉄が多く含まれ，一方，デキストラン鉄 FeD とクエン酸加デ
キストリン鉄 FeDC にはその含有量が少ないことが明らかとなった。
2) 静脈投与された製剤鉄の動態: 投与された製剤鉄を含むラット血漿鉄は製剤の種類によらず１-5 分後に最大値に至り，その後半減期 6 時間で減少し，12 時間後には正常域に戻った。トランスフェリン飽和度はやや遅れて１-3 時間後に最大値に至り，血漿鉄と同様に 12 時間後には正常域に戻った。
3) 血漿ヘプシジンと IL-6 値の変動: ラット血漿ヘプシジンは，クエン酸加デキストリン
鉄 FeDC の投与では投与 24 時以内での有意な上昇を認めなかった。デキストラン鉄- 24 -

FeD では 6 時間後に，含糖酸化鉄 SFeO，スクロース鉄 FeS，およびグルコン酸鉄 FeG
では 12 時間後にそれぞれ最大値を示し，24 時間後には正常レベルに戻った。一方，いずれの製剤の投与においても IL-6 値に変動は認められなかった。
4) 血漿鉄とヘプシジンの相関: 血漿鉄の 12 時間の総和 (AUC 0-12 ) はヘプシジンの 24 時間の総和AUC 0-24 と強い相関を示した
総括および結論
本研究により，世界で使用されている静注用鉄剤の大部分は，その投与により血中に遊離鉄が過剰に増えるリスクを有することが示された。さらに，ヘプシジンの発現が誘導されることにより，その後の細胞内に蓄えられた鉄の回転利用が低下し，血中ヘの鉄供給を抑制する可能性が示唆された。特に日本で使用されている含糖酸化鉄 SFeO 製剤には遊離鉄の含有量も多く，ヘプシジンの発現誘導も強いことからリスクを回避する製剤への検討が必要と考えられた。
論文審査結果の要旨
静注用鉄剤は鉄補充療法として臨床現場では広く行われており，その効果も確認されている。しかし，総鉄量がわずか 3〜4mg の血液中にその 10 倍を越える静注用鉄剤が投与されることは，鉄代謝系に大きな影響を与えると推察される。静注用鉄剤の有効性ばかりが注目されるなか，鉄の危険性を理解し，安全な領域での鉄利用を提唱する本研究の目的の意義は高い。
本研究では，世界で使用されている 5 種類の静注用鉄剤中の遊離鉄含有量を半定量的に解析し，日本で唯一使用可能な含糖酸化鉄 SFeO には多くの遊離鉄が含まれていることを示した。さらに，鉄剤を静脈投与されたラットの経時的解析から，ヘプシジンは遊離鉄含有量の多い製剤で強く誘導されることを明らかにした。過剰の遊離鉄は取り込まれた細胞
内で障害性の強いハイドロキシラジカルを発生させる原因となる。また，鉄回転の制御に関わるヘプシジンの発現誘導は鉄の回転利用をむしろ低下させる。このように，鉄の静脈投与は本来の目的に反する危険性を生じさせる可能性があることを示した。一方，遊離鉄を含まない製剤ではヘプシジンの発現誘導が極めてわずかであることも明らかにし，静注用鉄製剤の選択に重要な指標を与えた。本研究は静注用鉄製剤の安全性を考慮する上での基礎的かつ重要な知見を提供するものと評価された。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
金沢医科大学雑誌

Vol.40，No.1，17-26，2015- 25 -

きた

だて

楯

しょう

こ

氏名（生年月日）

北

本

籍

山

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

甲

第４６４号

学位授与の日付

平成２７年３月２６日

学位授与の要件

学位規則第４条第１項該当

学 位 論 文 題 目

アミオダロン肺障害発症への肺サーファクタントリン脂質

形

祥

子

（昭和 51 年 6 月 12 日）

県

合成亢進の関与論 文 審 査 委 員

主

査

上 田

善 道

副

査

岩 淵

邦 芳

梶 波

康 二

学位論文内容の要旨
研究目的
アミオダロンは第Ⅲ群抗不整脈薬に属し，難治性の頻脈性不整脈に対し有用な薬剤である。しかし，約 5％の頻度で全身に及ぶ多彩な副作用が生じる。なかでも肺障害は，重症化や致死例も報告されており，臨床上最も重要な副作用である。アミオダロン肺障害では，肺胞マクロファージへのリン脂質の過剰蓄積を特徴とする。その機序として，アミオダロ
ン分子の親水性・親油性両親媒性性質やアミオダロンによる肺胞マクロファージにおけるlysosomal phospholipase A2 をはじめとするリン脂質分解系の抑制がこれまで報告されている。リン脂質は細胞膜の主成分であるとともに，表面張力の低下作用により肺胞虚脱を防ぐ肺組織特異的なサーファクタントの主成分でもある。サーファクタントは II 型肺胞上皮細胞から多量に合成・分泌され，肺胞表面で機能した後，肺胞マクロファージによる貪食あるいは II 型肺胞上皮細胞による再取り込みが行われる。アミオダロン肺障害におけるサーファクタントの代謝に注目した研究はこれまでなされていない。申請者は，ア
ミオダロン肺障害の肺胞マクロファージへのリン脂質過剰沈着に，サーファクタント合成
系の亢進が関与する可能性を明らかにすることを目的に研究を行った。
実験方法
雄性Fisher 344 系ラットを用い，アミオダロン 100mg/kg/日 4 週と 200mg/kg/日 2 週の経口胃管投与により 2 種のアミオダロン肺障害モデルを作製し (各々 n=12，6），気管支肺胞洗浄液の回収，II型肺胞上皮細胞の単離と肺組織を採取した。対照群として溶媒のみ
を同量，4 あるいは 2 週注入し，同様の検体を採取した (各々 n=12, 6）。II型肺胞上皮細胞は，fluorocarbon-albumin乳剤貪食による肺胞腔内からのマクロファージの除去と肺組織の豚膵エラスターゼによる分解の後，密度勾配遠心法により単離・培養した。気管支
肺胞洗浄液中の沈渣細胞の分画，細胞面積の光学顕微鏡的計測，貪食空胞の電子顕微鏡的- 26 -

観察と上清中のサーファクタント蛋白 A，B，D 各成分のWestern blot法による定量を行った。単離Ⅱ型細胞を用い，電子顕微鏡による形態観察，細胞面積・層状封入体貯留空胞の形態計測に加え，培養液中への[3H]塩化コリン添加後，脂質成分を Bligh-Dyer法で抽出し，液体シンチレーションカウンターによる放射活性の計測により単位細胞蛋白量当たりのホスファチジルコリン合成能を算定した。さらに，肺組織を用い，病理学的形態観察，
サーファクタント蛋白とde novo・リモデリング両経路のリン脂質合成酵素群のreal time
RT-PCR法による遺伝子発現定量解析と総リン脂質ならびに二次元薄層クロマトグラフィー法を加えたホスファチジルコリン，リゾホスファチジルコリン，ホスファチジルグリセロ
ール各分画量をBligh-Dyer法による脂質抽出とBartlett法により定量した。
実験成績
アミオダロン 200mg 投与群では，体重減少と 2 週目後半での呼吸促迫・自発体動の低下が観察された。非投与群と比較しアミオダロン投与群では，気管支肺胞洗浄液中の肺胞
マクロファージ数は約 2.9 倍と有意に増加し，細胞質は泡沫化し，面積は 2.1 倍に拡大した。電子顕微鏡観察では，貪食空胞の拡大と増加を認めた。気管支肺胞洗浄液上清中のサーファクタント蛋白 A，D 成分の増加も検出された。アミオダロン投与群の単離Ⅱ型細胞は，非投与群の II 型細胞と比較し面積が約 1.4 倍に増大し，サーファクタント貯蔵層状封入体小胞構造が 1.8 倍に拡大するとともに，ホスファチジルコリン合成能が約 2.2 倍と有意に亢進していた。アミオダロン投与群の肺組織では，肺胞中隔への単核細胞浸潤・充血など間質性肺炎所見に加え，肺胞マクロファージの細胞質の泡沫化と II 型肺胞上皮細胞の細胞質の多空胞形成を伴う大型化が観察された。さらに，de novo・リモデリング
両経路のホスファチジルコリン合成酵素遺伝子が，各々1.6 倍，2.2 倍と発現亢進し，単位肺組織当たりの総リン脂質とホスファチジルコリン，リゾホスファチジルコリン，ホス
ファチジルグリセロール各成分が，各々1.8 倍，2.0 倍，2.1 倍，3.1 倍と有意に増加していた。肺組織中のサーファクタント蛋白 A～D 遺伝子発現にはアミオダロン投与群と対照群の肺組織間で有意差は認めなかった。
総括および結論
気管支肺胞洗浄液ならびに肺組織で，肺胞マクロファージ細胞質の泡沫化と間質性肺炎
所見，肺組織中の総リン脂質量の増加など，これまでヒトならびに実験動物におけるアミ
オダロン肺障害で報告されている所見が確認され，今回作製したラットモデルのアミオダ
ロン肺障害モデルとしての妥当性が検証された。今回の検討では，アミオダロン投与 II型肺胞上皮細胞におけるリン脂質，特にサーファクタントの主成分であるホスファチジル
コリンの合成亢進が，単離 II 型肺胞上皮細胞を用いた合成能の解析，肺組織おけるホスファチジルコリン合成に関わる 2 経路の酵素遺伝子の発現定量解析とリン脂質分画の定量解析により明らかとなった。肺サーファクタントに特異的なホスファチジルグリセロール
分画の増加と単離及び肺組織中 II 型肺胞上皮細胞での貯留小胞構造の増大もアミオダロ
ンによる II 型肺胞上皮細胞におけるサーファクタントリン脂質の産生亢進を支持する。
サーファクタント蛋白に関して，疎水性アポ蛋白でリン脂質との親和性が高く，リン脂質と共に表面張力低下機能に関わるサーファクタント B の蛋白ならびに遺伝子レベルの発- 27 -

現亢進は認めなかった。以上の実験成績から，アミオダロン肺障害の発症には，従来報告されている肺胞マクロファージにおけるリン脂質分解系の抑制に加え，II 型肺胞上皮細胞におけるリン脂質合成系の亢進が関わっていることが示唆され，アミオダロン肺障害に対する新たな予防法や治療法の確立に繋がることが期待される。
論文審査結果の要旨
アミオダロンは，難治性不整脈の治療に有用な抗不整脈薬である。しかし，その副作用，
特に重症化も来す肺障害が問題であり，その機序の解明とそれに基づく予防法の確立は臨床上重要な研究課題である。アミオダロンはヨードを含む分子量 682 kilodalton の分子で，リン脂質過剰症との関連が推定されている親水性・親油性両親媒性性質を有する。ア
ミオダロン肺障害では，肺胞マクロファージ細胞質の泡沫化と肺組織中のリン脂質量の増加を特徴とする。アミオダロン肺障害発症の機序に関し，肺胞マクロファージのlysosomal phospholipase A2 をはじめとするリン脂質分解系の抑制がこれまで報告されている。申請者は，肺サーファクタントの主成分がホスファチジルコリンを中心とするリン脂質であり，II 型肺胞上皮細胞で多量に産生・分泌された後，肺胞マクロファージにより貪食・分解されることに注目し，「II 型肺胞上皮細胞でのサーファクタントリン脂質の産生亢進がアミオダロン肺障害の発生に関わっているのではないか」という仮説をたて，その実証に向け研究を行った。
Reasor MJ ら (1988) の方法に準拠し，ラットを用い 100mg/kg/日 4 週と 200mg/kg/日
2 週の経口胃管投与により 2 種のアミオダロン肺障害モデルを作製した。気管支肺胞洗浄液と肺組織での肺胞マクロファージ細胞質の泡沫化と間質性肺炎所見，肺組織中のリン脂質量の増加など，これまでヒトならびに実験動物におけるアミオダロン肺障害で報告されている所見を確認し，今回作製したラットモデルのアミオダロン肺障害モデルとしての妥当性を検証した。
アミオダロン投与 II 型肺胞上皮細胞におけるリン脂質，特にサーファクタントの主成分であるホスファチジルコリンの合成亢進を，単離 II 型肺胞上皮細胞を用いた合成能の解析と肺組織におけるホスファチジルコリン合成 2 経路の酵素遺伝子の発現定量解析ならびにリン脂質分画の定量解析により示した。肺サーファクタントに特異的なホスファチジ
ルグリセロール分画の増加と単離及び肺組織中 II 型肺胞上皮細胞の貯留小胞構造の増大
も，アミオダロンによる II 型肺胞上皮細胞におけるサーファクタントリン脂質の産生亢進を支持した。肺障害実験モデルとして確立されているブレオマイシン肺障害では，II型肺胞上皮細胞でのリン脂質産生は低下するという情報から，今回認めたサーファクタン
トリン脂質の産生亢進は，アミオダロンに特徴的な現象である可能性を考察した。
アミオダロンによる II 型肺胞上皮細胞におけるリン脂質産生亢進に関わる分子機構，
リン脂質産生抑制によるリン脂質産生亢進の肺障害への関与の実証，サーファクタント蛋- 28 -

白産生との解離など今後解明すべき課題は残るが，今回の研究成果はアミオダロン肺障害
発症に関するこれまでにない新たなデータであり，今後の予防法の確立に向けた貴重な情報となることが期待される。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
金沢医科大学雑誌

Vol.40，No.1，27-35，2015- 29 -

おいかわ

川

よう さぶろう氏名（生年月日）

及

本

籍

岩

学 位 の 種 類

博士（医 学）

学 位 記 番 号

乙

第２８１号

学位授与の日付

平成２７年２月１２日

学位授与の要件

学位規則第４条第２項該当

学 位 論 文 題 目

液体培養法を用いたソフトコンタクトレンズ保存ケース中

手

陽三郎 （昭和 28 年 3 月 14 日）
県におけるアカントアメーバの増殖抑制法に関する基礎的研
究論 文 審 査 委 員

主

査

八 田

副

査

飯 沼 由 嗣佐々木稔 久洋

学位論文内容の要旨
研究目的
アカントアメーバは，池や土壌などに生息する自由生活性のアメーバであり，そのシストにより身近な生活環境は広く汚染されている。アメーバ角膜炎は，ソフトコンタクトレ
ンズ (SCL) 使用者を中心に症例が報告されており，その主な原因は SCL 保存ケース中で発育増殖した病原アメーバによる感染であると考えられている。SCL 保存ケースは SCLの洗浄・消毒・保存液である multi-purpose solution (MPS) で洗浄後風乾することが推奨されているが，この風乾の過程でシストのケース内への混入を許す可能性が高いと考えられる。本研究では，アカントアメーバ角膜炎の予防法を確立するため，SCL 保存ケース内における病原アメーバの発育増殖要因，MPS によるシストの発育増殖抑制作用およびケースへの付着抑制作用について，申請者らが考案した液体培養法を用いて検討した。
実験方法
液体培養法で維持されているアカントアメーバ臨床分離株 20 株を実験に用いた。アメーバ生理食塩水に一定数の大腸菌死菌 (約 1010個/ml) を添加したものを液体培地とし，アカントアメーバを接種後，27℃で液体培養を行った。MPS は抗アメーバ作用を有する薬剤である poly-hexamethylene biguanide を含有する 2 種類の MPS と，含有しない 1 種類を用いた。アカントアメーバの発育増殖要因を検討するため，培養温度 (5-40℃) およ
び給餌細菌数 (104-107個/ml) を段階的に変動させ，発育増殖を観察した。また，水道水
や生理的食塩水における発育増殖についても検討した。MPS に対する感受性は，以下の方法を用いて検討した。A法: MPS 中でのシストの発育増殖抑制効果を検証するために大腸菌を添加した MPS 中でアカントアメーバのシストを培養した。B法: 遊離しているシストに対する MPS の発育増殖抑制効果を検証するために遊離シストを MPS に一晩浸漬後，ア- 30 -

メーバ生理食塩水にて培養した。C法: シャーレに強固に付着しているシストに対するMPSの発育増殖抑制効果を検証するために付着シストをMPS処理後，アメーバ生理食塩水にて培養した。臨床分離株 20 株が形成するシストのシャーレへの付着性の違いは，培養シャーレに加えた振動により剥離するシストの数により判定した。MPS のシストの付着抑制効
果を検討するために，臨床分離株のうち培養シャーレへの付着性が強い株のシストを MPSで満たした保存ケースおよびシャーレに添加・付着させ,容器洗浄後に残留するシストの数を計測した。シストを剥離する薬剤として，トリプシンおよび SDS についても同様に
検討した。
実験成績
アメーバ生理食塩水中では，アカントアメーバは培養温度 20-35℃で活発に発育増殖し，給餌細菌数は 106個/ml 以上が必要であった。蒸留水や水道水中では，アメーバ生理食塩
水と同様に発育増殖し，生理的食塩水や PBS など浸透圧の高い溶液中でも，やや発育開始が遅れるが増殖は良好であった。MPS に対するシストの感受性試験では，MPS の種類に関係なく，A法ではアカントアメーバは全く発育増殖できなかった。また，抗アメーバ薬を含有する 2 種類の MPS の場合においては，B法ではアカントアメーバの発育増殖は完全に抑制されたが，C法では発育増殖抑制効果が不完全であった。抗アメーバ薬を含有しな
い MPS ではB法C法ともにアカントアメーバの活発な発育増殖が認められた。保存容器別のシスト付着抑制試験では，SCL保存ケースでは洗浄後にもごく少量のシストがケースに残留していたが，シャーレではシストの付着は完全に抑制され，洗浄後に残留するシストは認められなかった。また，シャーレに付着しているシストは，トリプシンやSDS で剥離できたが，MPS ではほとんど剥離できなかった。
総括および結論
アカントアメーバは生活環境温度で一定の数になれば，水道水や生理的食塩水中でも十分に発育増殖できることより，SCL の保存液としてこれらを MPS の代わりに使用することの危険性が示された。一方，アカントアメーバの発育増殖は MPS 中では起こらないこと
より，常に SCL 保存ケースを MPS で満たしておくことで，ケース内で発育増殖したアカントアメーバを角膜に運ぶ危険性は阻止できると考えられた。また，付着性が強いシストをアメーバ生理食塩水で満たした保存ケースに添加した場合，短時間でケースの内面に付着し，洗浄後も大部分が残留するが，保存ケースを MPS で満たした場合はシストの付着が抑制されることが明らかとなった。しかし，MPS には，ケースに付着したシストに対する剥離作用は認められなかった。MPS に含有される抗アメーバ薬に対する付着シストの感受性は，遊離シストに比べ低かった。以上の結果より，アカントアメーバ角膜炎の予防に
はシストを SCL 保存ケースに付着させないことが重要であり，外界から混入するシストの付着および増殖を防止するためには，ケースを洗浄後，風乾せず直ちに MPS で満たしておくことが効果的であることが示された。さらに，シストの付着を防止する保存ケースの形状や材質の検討および付着シストを効果的に剥離することが可能な MPS の開発が，今後の検討課題として示された。

- 31 -

論文審査結果の要旨
申請者は，これまでソフトコンタクトレンズ (SCL) 保存ケース内における病原アメー
バの発育増殖抑制に関する研究を系統的に行ってきた。本研究は，SCL を介したアカント
アメーバ角膜炎の予防法確立を目指す基礎的研究である。本研究では，申請者らが独自に考案・確立した液体培養法が実験の基礎となっている。この液体培養法を用いることで，従来の固形培地を用いた培養法では困難である様々な定量的解析を，客観的かつ簡便に行うことが可能となった。この培養法を用いて，培養温度，給餌細菌数，培養液の組成等の環境要因がアカントアメーバの発育増殖に及ぼす影響を調べた。その結果，アカントアメ
ーバは 20-35℃で活発に発育増殖し，給餌細菌数は 106個/ml以上が必要であることが明らかとなった。また蒸留水，水道水，生理的食塩水および PBS のいずれの溶液中でも，ア
カントアメーバは発育増殖することから,これらをSCL保存液として使用することの危険性が示された。さらに，SCL の洗浄・消毒・保存液である multi-purpose solution (MPS)に対するアカントアメーバの感受性について検討を行った。その結果，抗アメーバ薬を含有する MPS は遊離シストに対して発育増殖抑制効果を示すものの，付着性シストに対しては不完全であった。また，MPS は付着シストに対する剥離効果を有していないことが明らかとなった。さらに興味深いことに，容器の形状・材質によりシストの付着性が異なる
可能性が示された。
失明原因として重要なアカントアメーバによる角膜炎の原因の多くは，コンタクトレン
ズによる感染症である。日本コンタクトレンズ学会やコンタクトレンズメーカーは，「レンズケースは毎日しっかり洗い，自然乾燥させる」ことを推奨しているが，本研究はその予防に関する全く新しい知見を提示している。すなわち，MPS にはアカントアメーバの増殖およびシストの付着を抑制するものの，いったん付着したシストの剥離については有効ではないことを明らかにした。これらの結果より，保存ケース洗浄後に，風乾させず直ぐに MPS を満たしておくことによりシストの付着・増殖を予防できることが示された。容器の洗浄・乾燥は一般細菌の汚染除去には非常に有効な手法であるが，アカントアメーバ
においては，逆に付着のリスクとなることを示唆する興味深い所見と考えられる。今後，風乾させる方法およびそれによるシストの付着リスクと，洗浄後ただちに MPS を満たす
方法の比較を行い，本法の有用性を証明し，ケアの常識を変えていくことが出来れば，その貢献はきわめて大きいと思われる。また，SCL 保存ケースへのアカントアメーバの付着性については，容器の素材とともに形状も重要な因子と考えられることから，洗浄が有効になされる形状 (角に丸みを持たせた形状等) に関する検討・開発が期待される。
本研究で得られた知見は，アカントアメーバ感染症の予防にきわめて有用である可能性があると評価できる。
以上により，本論文は博士(医学)の学位を授与するに値するものと認められる。

（主論文公表誌）
金沢医科大学雑誌

Vol.40，No.1，1-8，2015- 32 -