ヒト皮下脂肪由来成体幹細胞培養マニュアル■脂肪細胞への分化誘導方法■① 液体窒素から凍結アンプルを取り出し、37℃の湯浴で、内容物(細胞)が約半分程度融解するまで攪拌する。この際、アンプルが暴発する恐れがあるので、プロテクターや手袋を装着して作業することが望ましい。

② 約半分程度融解したことを確認したら、湯浴から取り出し、アンプルを攪拌させながら、余熱ですべて融解する。
③ 15mL の遠沈管に脂肪前駆細胞培養用培地（注文 Cat.No.：BBPM1）を 10mL 入れる。
④ 遠心管にアンプル中の細胞浮遊液を全量移し、数回ピペッティングしたのち 1,500rpm で 1 分間遠心する。
⑤ 上清を取り除き、脂肪前駆細胞培養用培地を 2mL 添加し細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液を少量とり、トリパンブルーで染色したあと、細胞数を計測する。

⑥ 脂肪前駆細胞培養用培地を用い、下記表に示した必要培地量で、細胞濃度を 4×104cells/cm2 に調製し、播種する。
培養容器

培地量/well必要培地量

96well プレート

150μL

14.4mL

48well プレート

500μL

24.0mL

24well プレート

1.0mL

24.0mL

12well プレート

2.0mL24.0mL

6well プレート

3.0mL

18.0mL

220mL

20.0mL

27mL

7.0mL

75cm フラスコ
25cm フラスコ⑦ インキュベーター内(37℃、5%CO2)で培養する。
⑧ コンフルエントに達したことを確認したら、下記表に従い、脂肪前駆細胞培養用培地を脂肪細胞分化培地（カタログ番号：BBDM2）に全量交換し、分化誘導を開始する。
※コンフルエントが不十分であれば、脂肪細胞への分化率が悪くなりますので、十分コンフルエントになるまで、分化誘導は開始しないこと。

培養容器

BBPM1 から BBDM2 への交換取り除く培地量

加える培地量96well プレート

150μL/well

150μL/well

48well プレート

500μL/well

500μL/well

24well プレート

1.0mL/well

1.0mL/well

12well プレート

2.0mL/well

2.0mL/well

6well プレート

3.0mL/well

3.0mL/well

220mL/フラスコ

20mL/フラスコ

27mL/フラスコ

7mL/フラスコ

75cm フラスコ
25cm フラスコ

⑨ 分化誘導開始から 7 日目に、下記表に従い、脂肪細胞分化培地を適量取り除き、脂肪細胞培養用培地（注文Cat.No.：BBAM1）を適量加える。

培養容器

BBDM2 から BBAM1 への交換
取り除く培地量

加える培地量96well プレート

90μL/well

120μL/well

48well プレート

300μL/well

400μL/well

24well プレート

0.6mL/well

0.8mL/well

12well プレート

1.2mL/well

1.6mL/well

6well プレート

1.8mL/well

2.4mL/well

212mL/フラスコ

16mL/フラスコ

24.2mL/フラスコ

5.6mL/フラスコ

75cm フラスコ
25cm フラスコ⑩ 実験まで 3 日おきに脂肪細胞培養用培地を半量ずつ交換する。

培養容器

BBAM1 から BBAM1 への交換
取り除く培地量

加える培地量96well プレート

90μL/well

90μL/well

48well プレート

300μL/well

300μL/well

24well プレート

0.6mL/well

0.6mL/well

12well プレート

1.2mL/well

1.2mL/well

6well プレート

1.8mL/well

1.8mL/well

212mL/フラスコ

12mL/フラスコ

24.2mL/フラスコ

4.2mL/フラスコ

75cm フラスコ
25cm フラスコ■骨芽細胞への分化誘導方法■① 液体窒素から凍結アンプルを取り出し、37℃の湯浴で、内容物(細胞)が約半分程度融解するまで攪拌する。この際、アンプルが暴発する恐れがあるので、プロテクターや手袋を装着して作業することが望ましい。

② 約半分程度融解したことを確認したら、湯浴から取り出し、アンプルを攪拌させながら、余熱ですべて融解する。
③ 15ｍL の遠沈管に脂肪前駆細胞培養用培地を 10mL 入れる。
④ 遠心管にアンプル中の細胞浮遊液を全量移し、数回ピペッティングしたのち 1,500rpm で 1 分間遠心する。
⑤ 上清を取り除き、脂肪前駆細胞培養用培地を 2mL 添加し細胞懸濁液を調整する。細胞懸濁液を少量とり、トリパンブルーで染色したあと、細胞数を計測する。

⑥ 脂肪前駆細胞培養用培地を用い、次ページ表に示した必要培地量で、細胞濃度を 3×104cells/cm2 に調製し、播種する。

培養容器

培地量/well

必要培地量

96well プレート

150μL

14.4mL

48well プレート

500μL

24.0mL

24well プレート

1.0mL

24.0mL

12well プレート

2.0mL24.0mL

6well プレート

3.0mL

18.0mL

220mL

20.0mL

27mL

7.0mL

75cm フラスコ
25cm フラスコ⑦ インキュベーター内(37℃、5%CO2)で培養する。
⑧ 24 時間後に、脂肪前駆細胞培養用培地を全量取り除き、骨芽細胞分化培地（注文 Cat.No.：BBOB1)を下記表に従い交換する。

培養容器

BBPM1 から BBOB1 への交換
取り除く培地量

加える培地量96well プレート

150μL/well

150μL/well

48well プレート

500μL/well

500μL/well

24well プレート

1.0mL/well

1.0mL/well

12well プレート

2.0mL/well

2.0mL/well

6well プレート

3.0mL/well

3.0mL/well

220mL/フラスコ

20mL/フラスコ

27mL/フラスコ

7mL/フラスコ

75cm フラスコ
25cm フラスコ⑨ インキュベーター内(37℃、5%CO2)で培養する。
⑩ 3 日おきに骨芽細胞分化培地を交換する。
■軟骨細胞への分化誘導方法■① 液体窒素から凍結アンプルを取り出し、37℃の湯浴で、内容物(細胞)が約半分程度融解するまで攪拌する。この際、アンプルが暴発する恐れがあるので、プロテクターや手袋を装着して作業することが望ましい。

② 約半分程度融解したことを確認したら、湯浴から取り出し、アンプルを攪拌させながら、余熱ですべて融解する。
③ 15ｍL の遠沈管に脂肪前駆細胞培養用培地を 10mL 入れる。
④ 遠心管にアンプル中の細胞浮遊液を全量移し、数回ピペッティングしたのち 1,500rpm で 1 分間遠心する。
⑤ 上清を取り除き、脂肪前駆細胞培養用培地を 2mL 添加し細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液を少量とり、トリパンブルーで染色したあと、細胞数を計測する。

⑥ 遠心管中の細胞懸濁液を脂肪前駆細胞培養用培地 10mL で懸濁し、再度 1,500rpm で 1 分間遠心する。
⑦ 上清を取り除き、細胞を 1.2%アルギン酸溶液で 4×106cells/mL の濃度になるように調製する。この際、泡立てないように注意する。

⑧ 6well プレートに 102mM CaCl2 溶液を 3mL 入れる。
⑨ ⑦で調製したアルギン酸懸濁液を 10cc シリンジ（22G）で吸い取り、102mM CaCl2 溶液 3mL を入れた 6well プレートにゆっくりと丁寧に 10-30 滴入れる。

⑩ 10 分間室温で放置する。

⑪ ガラス製ピペットを用い、CaCl2 溶液を取り除く。この際、アルギン酸ビーズ（アルギン酸懸濁液）を吸い出さないように注意する。

⑫ アルギン酸ビーズ（アルギン酸懸濁液）を 150mM NaCl 溶液で 3 回洗浄後、DMEM（high glucose）で 1 回洗浄する。
⑬ 軟骨細胞分化培地（注文 Cat.No.：BBCM1100）を 3mL 加え、インキュベーター内(37℃、5%CO2)で培養する。
⑭ 3 日おきに軟骨細胞分化培地を交換する。