戦略的プロジェクト研究推進事業「農林水産分野における気候変動対応のための研究開発」

令和元年度

最終年度報告書

中課題番号15650846

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の研究開発

研究実施期間平成27年度～令和元年度（５年間）

代表機関

国立研究開発法人

研究開発責任者

大藤

泰雄

TEL

：029-838-8916

FAX：029-838-8916

研究開発責任者
連絡先

農業・食品産業技術総合研究機構

E-mail：october@affrc.go.jp
国立大学法人岐阜大学流域圏科学研究センター

公立学校法人

秋田県立大学生物資源学部

共同研究機関
学校法人

普及・実用化
支援組織

龍谷大学農学部

中央農業研究センター

＜別紙様式３＞最終年度報告書
Ⅰ－１．年次計画
研究課題

研究年度

担当研究機関・研究室

２７ ２８ ２９ ３０ ３１

機関

研究室

１．遺伝子情報に基づく国内
未発生トスポウイルス類

検出同定技術の開発の網羅的簡易同定・検出技

農研機構・中央農 リスク解析グルー術とそのためのデータベ

研

プ

ースの開発
検出同定技術の開発

２．遺伝子情報に基づく国内
未発生アザミウマ種及び農研機構・果樹茶 虫害ユニット

系統の検出・同定技術とそ

研究部門のためのデータベースの開発
３．遺伝子情報に基づくカン
キツグリーニング病病原細菌個体群及び近縁
Liberibacter属細菌の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発

検出同定技術の開発

農研機構・果樹茶 カンキツ病害虫ユ（１）検出・同定・識別技
術およびデータベース

研究部門

ニット

の開発
同

種子検定技術の開発（２）種苗検査技術の開発

病害ユニット

農研機構・種苗管 病害検査課
理センター
農研機構・果樹茶 病害ユニット
研究部門

４．遺伝子情報に基づくポス
ピウイロイド属の検出・同定手法の改良及びそのためのデータベースの開発
農研機構・野菜花 生産管理ユニッ（１）主要な花き類を加害するウイロイド類

検出同定技術の改良

1

き研究部門

ト

（２）主要野菜類を加害す
るウイロイド類

農研機構・中央農検出同定技術の改良

研

リスク解析グループ

ダリア検定技術技術の改良（３）ダリア等を加害する

秋田県立大学・生

ウイロイド類５．遺伝子情報に基づく国内

物資源科学部
検出同定技術の開発

生物生産科学科

岐阜大学・流域圏

未発生Phytophthora属

科学研究センタ

病原糸状菌の検出・同定

ー

菌類生態学研究室

技術及びそのためのデー
タベースの開発
検出同定技術の開発

６．遺伝子情報に基づく国内

龍谷大学農学部

未発生有害線虫類の検資源生物科学科

出・同定技術とそのためのデータベースの開発
７．遺伝子情報に基づく植物検出同定技術の開発

農研機構・中央農検疫のためのサツマイモ業研究センターの害虫ゾウムシ類個体群

農研機 構・九州 ・ ープの検出・同定技術とそのた

沖縄農業研究セ

熱帯性病害虫管めのデータベースの開発

ンター

理グループ

生物的防除グル

農研機構・農環変研究センター

昆虫評価分類ユニット

８．重要有害動植物簡易同定

統合データベースの開発のためのDNAバーコーデ

農研機構・農環変研究センター

昆虫評価分類ユニット

ィング等遺伝子情報に基づく検索システムの構築

2

Ⅰ－２．実施体制
担当研究機関・研究室

研究項目
研究開発責任者

機関

研究担当者

研究室

農研機構・中央農研

１．遺伝子情報に基づく国 農研機構・中央農研
内未発生トスポウイルス

病害研究領域長◎

大藤泰雄

リスク解析グルー

○

奥田

プ

田中

類の網羅的簡易同定・検充穣(2019.4～）

出技術とそのためのデー
タベースの開発
２．遺伝子情報に基づく国 農研機構・果樹茶研究 虫害ユニット

○

土田

聡

内未発生アザミウマ種及 部門

前任者

び系統の検出・同定技術（～2016.3）とそのためのデータベー

後任者

スの開発

（2016.4～）

三代浩二
上地奈美

３．遺伝子情報に基づくカ 農研機構・果樹茶研究 カンキツ病害虫ユ ○冨村健太
ンキツグリーニング病病 部門

ニット

原細菌個体群及び近縁
Liberibacter属細菌の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発（１）検出・同定・識別 農研機構・果樹茶研究 カンキツ病害虫ユ △冨村健太
技術およびデータベー

ニット

部門

スの開発
病害ユニット（２）種苗検査技術の開 農研機構・種苗セ

病害検査課

藤川貴史
△佐藤仁敏

発
前任者星野はるな（～2016.9）
前任者小野塚信哉（2016.10～
2018.3）
後任者大崎康平(2018.4～）
農研機構・果樹茶研究 病害ユニット
部門
3

藤川貴史

４．遺伝子情報に基づくポ 農研機構・野菜花き研 生産管理ユニット ○松下陽介
スピウイロイド属の検究部門

出・同定手法の改良及びそのためのデータベースの開発（１）主要な花き類を加 農研機構・野菜花き研 生産管理ユニット △松下陽介
害するウイロイド類

究部門（２）主要野菜類を加害 農研機構・中央農研

リスク解析グルー △柳澤広宣

するウイロイド類

プ（３）ダリア等を加害す 秋田県立大学

生物生産科学科

るウイロイド類

△藤

晋一

対馬大希
(2017.4～）

５．遺伝子情報に基づく国 岐阜大学

菌類生態学研究室

内未発生Phytophthora属

○景山幸二
日恵野綾香

病原糸状菌の検出・同定(2017.4～)

技術及びそのためのデー
タベースの開発
資源生物科学科

６．遺伝子情報に基づく国 龍谷大学

○岩堀英晶

内未発生有害線虫類の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発
７．遺伝子情報に基づく植 農研機構・九州沖縄 熱帯性病害虫研究 ○吉武

啓

グループ

物検疫のためのサツマイ 農研
モの害虫ゾウムシ類個体群の検出・同定技術とそ 農研機構・中央農研

生物的防除グルーのためのデータベースの

プ

有本

誠

(2017.4～)

開発
８．重要有害動植物簡易同 農研機構・農環変研 昆虫評価分類ユニ ○中谷至伸
定のためのDNAバーコー

ット

究センター

ディング等遺伝子情報に

吉松慎一

基づく検索システムの構築（注１）

農研機構・農業情報 農業 AI 推進室

山中武彦

研究センター
研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。
4

中課題

15650846

中課題番号

研究期間

平成27～令和元年度

大課題名

農林水産分野における気候変動対応のための研究開発

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

代表機関・研究開発責任者名

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
中央農業研究センター

大藤泰雄

Ⅰ－３．研究目的
IPCC（気候変動に関する政府間パネル）第５次評価報告書（平成26年11月公表）においては、気候システムの温暖化は疑う余地はないとされており、地球温暖化は、我が国の農林水産物の生産にも重大な影響を及ぼす事が懸念されており，温暖化の影響や豪雨等の極端現象の増加に関する最新の科学的知見をベースとした政府全体の適応計画の検討が進められており，中長期的な視点を取り入れた適応策の策定が必要である。
そこで、本研究では、地球温暖化等により海外からの有害動植物侵入リスクが増加することを踏まえ、侵入が危惧される有害動植物種を特定し、その迅速な診断を可能とする検出・同定技術の開発を行うことを目的とする。
このため、本研究では、
１．遺伝子情報に基づく国内未発生トスポウイルス類の網羅的簡易同定・検出技術とそのためのデータベースの開発
２．遺伝子情報に基づく国内未発生アザミウマ種及び系統の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発
３．遺伝子情報に基づくカンキツグリーニング病病原細菌個体群及び近縁
Liberibacter属細菌の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発
４．遺伝子情報に基づくポスピウイロイド属の検出・同定手法の改良及びそのためのデータベースの開発
５．遺伝子情報に基づく国内未発生Phytophthora属病原糸状菌の検出・同定技術及
びそのためのデータベースの開発
６．遺伝子情報に基づく国内未発生有害線虫類の検出・同定技術とそのためのデー
タベースの開発遺７．遺伝子情報に基づく植物検疫のためのサツマイモの害虫ゾウムシ類個体群の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発
８．重要有害動植物簡易同定のためのDNAバーコーディング等遺伝子情報に基づく検索システムの構築を実施する。
これらの成果により、現在植物防疫法施行規則別表１－２に記された栽培地検査を要する
重要病害虫種を中心とする20種以上の有害動植物について、植物検疫において遺伝子情報に基づき24時間以内に検出・同定できるシステムの開発を目標とする。
その結果、従来迅速な検出・同定が困難であった病変部位や昆虫の卵・幼虫、もしくは死5骸の一部からであっても迅速な同定が可能な検査技術が確立されることにより、より効果的な防疫体制の確立につながり、国内の食料安定供給と国際的な重要植物病害虫の清浄国の地
位の維持や輸出時の検査の効率化等の実現を通じて、我が国の農産物・食品輸出拡大にも貢献することが期待される。

6

Ⅰ－４．研究方法（１）遺伝子情報に基づく有害動植物の検出・同定技術の開発
我が国未発生の有害動植物について、形態等での識別が困難で侵入リスクが高い病害虫、特に、植物防疫法施行規則別表１－２に記された栽培地検査を要する重要病害虫種を中心として、
発生国情報や標本、公開遺伝子情報を収集・分析し、優先して検出・同定技術開発対象とする種群を設定した。主要な有害動植物の類型として、ウイロイド、ウイルス、細菌、糸状菌、線虫・昆虫が含まれるように課題を設定した。対象とした種群について、検出・同定技術に利用可能な遺伝子情報を特定し、標本や付帯する生物学的情報と紐付けして、データベース化した。
さらにこれら遺伝子情報に基づき、資料入手からおおむね24時間以内に検出・同定結果が得られるよう、PCR法・PCR-RFLP法・定量PCR法・定温核酸増幅法等を用いた簡易同定技術を開発した。
（２）重要有害動植物簡易同定のための情報統合データベースの開発
植物で異常が発見されたときに、上記（１）の研究で得られたデータを参照して、利用可能な検出・同定技術を検索、利用し、同定結果を確認するための、統合情報データベースを農研機構データベースに構築した。
Ⅰ－５．研究結果（１）遺伝子情報に基づく有害動植物の検出・同定技術の開発
国内未発生(国内検疫対象を含む)の有害動植物について、トスポウイルス17種、ポスピウイ
ロイド6種、カンキツグリーニング病やCarrot yellowsを含むLiberibacter属細菌5種、Phytophthora属糸状菌4種、線虫12種、アザミウマ類26種、甲虫2種合計72種について、国内
既発生の近縁種52種との識別も可能な形で、簡易検出・同定技術を開発した。さらに、国内検疫対象となっているカンキツグリーニング病菌アジア型とサツマイモの害虫ゾウムシ類2種については、国内での発見時における入り込みの経路推定のために、国内の個体群と海外の個体群を識別する遺伝子マーカーを開発した。さらに、サツマイモのアリモドキゾウムシでは、国内の南西諸島における遺伝子型の分布状況の詳細を初めて明らかにし、未発生地域での発見時の起源推定に貢献している。これらの種群についての遺伝子情報とその提供元となる標本情報、
文献情報、画像、宿主・寄主植物等の情報を整理し、データベース化した。
（２）重要有害動植物簡易同定のための情報統合データベースの開発
病原体、宿主・寄主植物、標本情報、文献情報などの各種情報間の相互リンクを付けて、いずれかの情報から、他の情報を検索可能な形でデータベースを構築した。上記（１）で得られた、検出・同定技術と関連情報をこのデータベースに格納した。なお、実装先となる植物防疫所の特定されたユーザーを識別してアクセスを可能とするシステムでの運用としており、一般ユーザーは利用できない。
Ⅰ－６．今後の課題
開発期間中にも、テンサイシストセンチュウの国内発見などの事例もあり、新たな病害虫の侵入リスクに備えるためにも、侵入警戒調査や国内発見時に生産現場で使えるさらに簡易な同定技術の開発も必要である。また、ブドウのピアス病、トマトのToBRFV等の新たに世界的な脅威となっている病害虫に対する迅速・簡易な検出同定技術や、情報データベースの充実をはかってゆく必要がある。本課題では、寄生植物を除くほぼ全ての植物病害虫のカテゴリーに対7応した統合情報データベースを構築し、それぞれの病害虫のカテゴリーを代表する国内未発生の有害動植物の遺伝子情報に基づく迅速な検出・同定技術と、関連情報データベースを開発したが、引き続き、上記のような新たな脅威に対して、データベースの更新と新たな種に対応した迅速な検出同定技術の実装をはかるためにも、専門家による継続した取組が必要と考える。

8

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

１

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

小課題名

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づく国内未発生トスポウイルス類の網羅的
簡易同定・検出技術とそのためのデータベースの開発

小課題
農研機構
代表研究機関・研究室・研究者名 和元年）

中央農業総合研究センター・奥田充、田中穣（令Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的
トスポウイルスは、様々な作物に感染することやアザミウマにより永続的に媒介されることなどから発生域の拡大が危惧されており、国内既発生近縁種との異同識別ができる汎用性のある新たな検出・同定技術の開発が必要である。そこで、トスポウイルスの遺伝子情報に基づき迅速に検出可能かつ国内既発生種・系統と識別が可能な検出法を開発する。
また、海外の遺伝子情報データベースを参照して国内未発生種について海外の発生情報からの同定を迅速に行う事を可能にする技術の開発を目指す。
２）研究方法（１）文献情報、塩基配列データベース等から、我が国で既発生のトスポウイルス及び国内未発生のトスポウイルスについて、名称、初発年、発生国および被害作物の疫学的情報
ならびに媒介アザミウマ種および遺伝子情報等の生物学的情報を収集・整理した。
（２）複数ウイルス種の遺伝子領域を増幅できるプライマー（ユニバーサルプライマー）を用いたトスポウイルスの検出に関する文献を調査した。これらプライマーが実際に利用可能であることを我が国で発生しているトスポウイルスについて検証した。また、我が国で未発生のトスポウイルス21種のうち、L RNA分節の塩基配列が明らかになっている1７種について標的部位を含む領域の人工合成RNAを作成し、ユニバーサルプライマーを用いた
RT-PCRにより検出できるかどうか検証した。
（３）ユニバーサルプライマーを用いたリアルタイムPCRを行い、増幅DNAを高分解能融解
曲線（HRM）解析によりトスポウイルス種の識別を試みた。また、増幅産物のDNAをビオチ
ン化し、マイクロプレートハイブリダイゼーションによる識別を行った。
（４）文献情報、塩基配列データベース等から収集・整理した国内既発生及び未発生のトスポウイルスついて、種の情報、発生国、宿主、媒介アザミウマ種についてリレーショナ
ルデータベースに登録する。
３）研究結果（１）文献情報、塩基配列データベース等の調査から、The International Committee on
Taxonomy of Viruses (ICTV)の分類基準に基づき、これまでに独立した種として種名が提案されているトスポウイルスは29種あり、このうち8種が国内既発生であることが明らかとなった（表1）。トスポウイルスを媒介するアザミウマは全てアザミウマ科に属しており、
9このうちCeratothripoides属1種、Dictyothrips 属1種、Frankliniella属8種、Scirtothrips
属2種及び、Thrips属4種がトスポウイルスを媒介する主として報告されている。ただし、8種のトスポウイルスについては、現時点で媒介するアザミウマが特定されていない。
（２）我が国で発生しているトスポウイルス８種について、既報のユニバーサルプライマー（表2）により検出できるかどうかを確認した結果、gL2740とgL3920cならびにt2740とt3920cおよびgM410とgM870cは、我が国で発生しているトスポウイルス8種を検出できることが明らかとなった。さらに、t2740とt3920cを現在報告されている全てのトスポウイルスの標的領域の塩基配列に適合するように改変し、t2740#1とt3920c#1を作成した（図1）。
（３）ユニバーサルプライマーt2740#1とt3920c#1を用いたリアルタイムPCRを行なったところ、国内既発生8種トスポウイルスのRNAおよび国内未発生トスポウイルス19種の人工合成RNAからDNAの増幅が確認できた。その後、HRM解析を行なったが、得られた融解曲線から種を識別することは困難であった。このため、増幅DNAをビオチン化し、マイクロプレート
ハイブリダイゼーションによる判別を試みた。その結果、同種の増幅DNAの組み合わせの場
合のみ高い反応を示し、24時間以内に特異的識別が可能であることが示された。また、増幅DNAをビオチン化する代わりに、ビオチン化プライマーを用いてリアルタイムRT-PCRを行うことでさらに検出に要する時間を短縮することができた。
（４）国内未発生のトスポウイルス発生国に関する情報178件、媒介アザミウマ種に関する情報（86件）を収集・整理し、データベースとして登録作業を行なった。

図1. ユニバーサルプライマーt2740#1とt3920c#1による国内発生トスポウイルス種の検出

10

表1

トスポウイルスの発生状況

略称1)

初発国

初発

分布2)

媒介種 3), 4)

ANSV

コロンビア

2008

コロンビア

(Fo)

BeNMV

ブラジル

2006

ブラジル

未同定

1999

⽇本, インド, タイ, オーストラリア, 台湾

Cc, (Tp)

台湾

Tp

CaCV

オーストラリ
ア

CCSV

台湾

2001

CSNV

ブラジル

1994

GBNV

インド

1949

GCFSV

台湾

1992

GRSV

南アフリカ

不詳

GYSV

インド

1979

インド, 中国

Sd

HCRV

中国

2007

中国

未同定

⽇本, イラン, ブラジル, ベルギー*, イタリア, オランダ*, スロ
ベニア*, イギリス*
イラン, インド, インドネシア，ネパール，ベトナム，タイ，バ
ングラデシュ
台湾

Fo, FsFs , Tp
Sd

南アフリカ共和国, アメリカ合衆国, アルゼンチン, ブラジル,
フィンランドFg, Fo, Fs

⽇本, 中国, イラン, イスラエル*, ウガンダ, カナダ, アメリカ
合衆国, メキシコ, コスタリカ, チリ, 欧州(オーストリア, ベル
INSV

アメリカ

1980代

ギー, ボスニア・ヘルツェゴビナ, ブルガリア, チェコ, フィンラ

後半

ンド, フランス, ドイツ, ハンガリー, イタリア, オランダ, ポー
ランド, ポルトガル, スロベニア,スペイン,

Ff, Fi, Fo

イギリス), ニュージーランド
⽇本, インド, インドネシア, イラン, イスラエル, パキスタン,
スリランカ, タジキスタン, エジプト, ケニア, モーリシャス, 南
アフリカ共和国, ウガンダ, ジンバブエ, アメリカ合衆国, カナ
IYSV

オランダ

1992

ダ, グアテマラ, チリ, ペルー, ウルグアイ, ブラジル, 欧州(オーTt

ストリア, ボスニア・ヘルツェゴビナ, フランス, ドイツ, ギリシ
ャ, イタリア, オランダ, セルビア*, スロベニア, スペイン, イギリス), オーストラリア, ニュージーランド
LNRV

⽇本

2007

⽇本

未同定

MeSMV

メキシコ

2007

メキシコ

未同定

MVBaV

中国

2010

中国

未同定

MYSV

⽇本

1992

⽇本, 中国, 台湾, タイ, エクアドル

Tp

PCSV

台湾

2009

台湾

未同定

PNSV

ペルー

2010

ペルー

未同定

PolRSV

イタリア

2005

イタリア

Db

SVNV

アメリカ

2008

アメリカ合衆国

Sv

11アメリカ合衆国, アルゼンチン, ブラジル, ドミニカ共和国, プ

TCSV

ブラジル

不詳

TNRV

タイ

2008

タイ

Cc , Tp

TNSV

中国

2009

中国

未同定

エルトリコ

Fi, Fo, Fs

アジア(アフガニスタン, ⽇本, 中国, インド, インドネシア, イ
ラン, イスラエル, ヨルダン, 韓国, レバノン, マレーシア, ネパール, オマーン, パキスタン, サウジアラビア, スリランカ, シリ
ア, 台湾, タイ), アフリカ(アルジェリア, ブルキナファソ, コン
ゴ, コートジボワール, エジプト, ケニア, リビア, マダガスカ
ル, モーリシャス, ニジェール, ナイジェリア, セネガル, 南アフリカ共和国, スーダン, タンザニア, チュニジア, ウガンダ, ジンバブエ), カナダ, アメリカ合衆国, メキシコ, コスタリカ, 南⽶(アルゼンチン, ボリビア, ブラジル, チリ, コロンビア, ドミニ
TSWV

オーストラリア

1915

カ共和国, エクアドル, ガイアナ, ハイチ, ジャマイカ, パラグア
イ, プエルトリコ, スリナム, ウルグアイ, ベネズエラ), 欧州(アルバニア, アルメニア, オーストリア, アゼルバイジャン, ベル

Fb, Fc, Ff,
Fg, Fi, Fs,
Fo, Ts, Tt

ギー, ボスニア・ヘルツェゴビナ, ブルガリア, クロアチア, キプ
ロス, チェコ, デンマーク*, エストニア*, フィンランド, フランス, ジョージア, ドイツ, ギリシャ, ハンガリー, アイルランド,
イタリア, ラトビア*, リトアニア, マルタ, モルドバ, モンテネ
グロ, オランダ, ノルウェー*, ポーランド*, ポルトガル, ルーマ
ニア, ロシア, セルビア, スロベニア, スペイン, スウェーデン,スイス, トルコ, ウクライナ, イギリス), オーストラリア, クッ
ク諸島, ニュージーランド, パプアニューギニア
TYRV

イラン

2002

イラン, ケニア

Fo, Tt

TZSV

中国

2005

中国

Fo

WBNV

インド

1991

インド

Tf5)

WSMoV

タイ

1988

⽇本, 中国, インド, タイ, 台湾

Tp

ZLCV

ブラジル

不詳

ブラジル

Fz

１）ウイルス名称は本文を参照のこと． ICTVの認定種を下線で示した．
２）発生国の一部は，EPPO Global Databaseを参照した．アスタリスクのついた国は根絶された，または現在は発生が認められない国を示す．
３）Cc, Ceratothripoides claratris; Db, Dictyothrips betae; Fb, Frankliniella bispinosa;
Fc, センダングサアザミウマ（ F. cephalica ）; Ff, ウスグロアザミウマ(F. fusca); Fg, F.

gemina; Fi, ヒ ラ ズ ハ ナ ア ザ ミ ウ マ (F. intonsa); Fo, ミ カ ン キ イ ロ ア ザ ミ ウ マ (F.
occidentalis); Fs, F. schultzei; Fz, F. zucchini; Sd, チャノキイロアザミウマ(Scirtothrips
dorsalis); Sv, Sericothrips variabilis; Tf, キイロハナアザミウマ(Thrips flavus); Tp, ミ
ナミキイロアザミウマ(T. palmi); Ts, ダイズウスイロアザミウマ(T. setosus); Tt, ネギアザ
ミウマ(T. tabaci). 和名が無い種は国内未発生．
４）文献では媒介の可能性が示唆されているが，実験により確認されていない種はカッコ内に示した．
５）ミナミキイロアザミウマの誤同定の可能性が指摘されている（本文参照）．
12

表2. トスポウイルスの検出に用いたプライマー

プライマー
ターゲット領域

増幅サイ
ズ

報告され
た

リファレンス

上流側

下流側

gM410

gM870cNSm (M RNA)

約700bp12

Chen et al. (2012)

gL2740gL3920c

RdRp（L RNA）

約1200bp12

Chen et al. (2012)

t2740

t3920cRdRp（L RNA）

約1200bp５

Chao et al. (2010)

gL3637gL4435c

RdRp（L RNA）

約890bp10

Chu et al. (2001)

検出種数４）成果活用における留意点
５）今後の課題
検出対象としたトスポウイルス29種のうち、8種のトスポウイルスについては、媒介する
アザミウマが特定されていないため、万一、侵入した場合に速やかな対処が困難になる可能性がある。情報収集を引き続き行う必要がある。
＜引用文献＞（１）奥田充「我が国で発生しているトスポウイルスについて」日本植物病理学会報(2016) 82:
169-184.
（２）奥田充「トスポウイルスの検出に有効なユニバーサルプライマー 」関東東山関東病害虫研
究会報(2017) 64: 68-72

13

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

2

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

小課題名
小課題
代表研究機関・研究室・研究者
名

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づく国内未発生アザミウマ種及び系統の検出・同定技術の開発とそのためのデータベース開発

農研機構果樹茶業研究部門・生産・流通研究領域
虫害ユニット土`田聡・上地奈美

Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的近年の世界的な農産物輸出入量の飛躍的な増大により、農業害虫の世界的な分布拡大が重大な問題となっている。とりわけアザミウマ類は植物検疫で最も多く検出される害虫分類群の一つであり、侵入リスクの極めて高い害虫種といえる。特に幼虫等の未成熟ステー
ジでは形態による同定が極めて困難、あるいは不可能である。そこで、ウイルス媒介能力の高い国内未発生のアザミウマ種および未発生系統の、特に幼虫など未成熟ステージにおける簡易識別を可能にする技術を開発し、早期発見と迅速な検疫措置の遂行を可能にする。
２）研究方法
植物輸入検疫で検出されるアザミウマ種サンプルの提供を植物防疫所に依頼し、国内で採取できるアザミウマ種と合わせ、可能な限り多くの種・系統を入手する。得られたアザミウマ種は形態写真を記録するとともに、ミトコンドリアCOI遺伝子の塩基配列情報を解析する。塩基配列情報をもとに、種判別のための種特異的プライマーを設計する。得られた塩基配列情報、写真、文献情報等を統合してデータベースを作成する。DNAの抽出法、PCR条件等を検討し、アザミウマ類の種判別のための手順書を作成する。
３）研究結果（１）横浜、神戸および名古屋植物防疫所管内の４空港支所より、輸入検疫発見で発見されたアザミウマサンプル合計75種1028個体の提供を受けた。また、国内では53種256個体のアザミウマを採集、入手した。
（２）DNA抽出法を検討し、後に形態を観察するための非破壊DNA抽出法、短時間での診断を可能とするための簡易DNA抽出法をそれぞれ確立した。
（３）得られたアザミウマ種から非破壊でDNAを抽出し、103種256系統のミトコンドリア
COI塩基配列情報を明らかにした。うち82種184系統については、COI遺伝子の全長塩
基配列を明らかにしている。また、93種について、実体顕微鏡による形態写真データを蓄積した。
（４）ミトコンドリアCOI遺伝子DNAバーコード領域を増幅するための既報プライマーを改変し、アザミウマ類全般の増幅を可能とするユニバーサルプライマーを設計した。
（５）得られたミトコンドリアCOI塩基配列をもとに、67種アザミウマの種特異的プライマ
14

ーを設計した（表１）。得られたプライマーは、同属の近縁種、および寄主植物が共通するアザミウマ種のDNAを増幅しないことを確認し、特異性を実証した。また、統一したPCR条件を確立し、同一回のPCRにより複数種アザミウマを同時判別することを可能にした。
表１

種特異的プライマーを設計したアザミウマ種（６）複数種サンプルから同時抽出したDNAに対し、各々の種特異的プライマーでPCRする
ことにより、混合サンプルから複数種DNAを検出できることを明らかにし、同一植物体上に混在する複数種アザミウマの種構成を効率的に解明できることを確認した。
（７）トスポウイルス媒介種を中心とするアザミウマ種について、遺伝子解析関連、薬剤抵
抗性関係の文献を中心に413件の文献情報をリスト化した。93種アザミウマ標本の実体
顕微鏡写真、解析した103種256系統のCOI塩基配列情報、67種アザミウマの種特異的
PCRプライマー配列情報とともにデータベース構築に供した。
（８）DNAバーコーディングおよびPCRベースの診断法の2通りの手法を用いたアザミウマ類の種同定について、フローチャートで工程を示すとともに（図１）、DNA抽出法、PCR
条件等をまとめた手順書を作成した。

15

図１

DNAバーコーディング法およびPCRベース手法によるアザミウマ種判別フローチャート

４）成果活用における留意点
簡易種判別法は、開発した主要種アザミウマの特異的プライマーを用いることにより、
植物輸入検疫における、発見回数ベース（1997年～2017年）で約99％のサンプルをカバーできるが、67種以外の発見回数の少ないアザミウマ種の診断には対応できない。DNA
バーコーディング法による網羅的種判別においては、DNAデータベース（BOLD SYSTEM）
既登録の384種（2019年12月19日現在）について分子同定可能であるが、未登録の希少種
は種レベルでの同定はできない。分子同定不能種については、DNA非破壊抽出した標本を形態により同定する必要がある。
５）今後の課題
より正確な種判別を可能とするために、アザミウマ類COI塩基配列情報をさらに集積し、適宜データベースを更新していく必要がある。
＜引用文献＞なし

16

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

３－１

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

３．遺伝子情報に基づくカンキツグリーニング病病原細菌
小課題名

個体群及び近縁Liberibacter属細菌の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発
国立研究開発法人小課題
カンキツ研究領域
代表研究機関・研究室・研究者名 国立研究開発法人
生産・流通研究領域

農研機構
冨村

果樹茶業研究部門

健太

農研機構
藤川

果樹茶業研究部門
貴史

Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的カンキツグリーニング病原細菌に関しては現在日本国内における発生域が限定されているものの、新規発生地もしくは根絶した地域への再侵入のリスクがある。本病原細菌が再侵入するリスクに備え、侵入経路を推定する技術の構築が必要である。また、国内未発生である近縁Liberibacter属細菌種についても侵入リスクが高まっている。そこで本研究では、カンキツグリーニング病原細菌個体群を識別できる技術開発を行うとともに、近縁
Liberibacter属細菌種を迅速に同定・識別できる技術開発を目指す。
２）研究方法（１）InDelマーカーおよびSNPマーカーにより得られたLas集団に関する遺伝子情報をデータベースに登録する。
（２）現時点で知られているカンキツグリーニング病原細菌の全ゲノム情報をもとに挿入･欠失配列を検索する。さらに、検索した挿入･欠失配列を識別するInDelマーカーを作成する。
（３）塩基配列データベース情報を基に塩基多型が見られる遺伝子領域を特定しSNPマー
カーを作成する。
（４）作成したSNPマーカーおよびInDelマーカーのうち、どの遺伝子マーカーを用いれ
ばLasの国内集団と海外集団を識別できるか検討する。さらに、ステークホルダーである
植物防疫所等で利用可能な技術として提供するために、デモンストレーションを行うとともに、改善点等を反映させた手順書（マニュアル）を作成する。
（５）近縁Liberibacter属細菌５種(Las, Laf, Lam, LsoおよびLcr)を同時に検出できる遺伝子領域を選抜する。さらに、ステークホルダーである植物防疫所等で利用可能な技術として提供するために、デモンストレーションを行うとともに、改善点等を反映させた手順書（マニュアル）を作成する。

17３）研究結果（１）Lasに関する遺伝子情報（SNPおよびInDelマーカーを用いたジェノタイピングデー
タ）について、データベースに登録した。
（２）カンキツグリーニング病原細菌の全ゲノム情報が明らかになっている日本株、アメリカ株および中国株の３株についてゲノムワイドに比較を行った。その結果、プロファー
ジ遺伝子領域以外にも、少なくとも4遺伝子座において挿入･欠失配列の有無が確認されたことから、これら遺伝子座について５種類のInDelマーカーを作成した。
（３）塩基多型が観察されたomp遺伝子領域の2カ所およびcluster遺伝子領域の4カ所計6カ所のSNPについてマーカーを作成した。
（４）作成した５種類のInDelマーカーのうち、Domain I-aもしくはDomain IIマーカー
を用いることで両集団を識別することが可能と思われた。また６種類のSNPマーカーのうち、SNP-omp2415もしくはSNP-rpl8061マーカーを用いることでも両集団を識別することが可能と思われた。Lasに関する海外集団と国内集団の識別法のマニュアル化に向け、
門司植物防疫所でデモンストレーションを行い、改善点の洗い出しを実施した。デモンス
トレーションでの改善点を踏まえ手順書（マニュアル）を作成した。
（５）近縁Liberibacter属細菌５種を同時に検出できる遺伝子領域として nuoNおよびdnaA遺伝子座を選抜するとともに、いずれの遺伝子座についても安定して増幅することを確認した。次に、PCR-RFLP法を用いることにより近縁Liberibacter属細菌５種を種ごとに識別できることが明らかとなった。近縁Liberibacter属細菌種の識別法のマニュアル化に向け、横浜植物防疫所でデモンストレーションを行い、改善点の洗い出しを実施した。
デモンストレーションでの改善点を踏まえ手順書（マニュアル）を作成した。
４）成果活用における留意点
Lasに関する海外集団と国内集団の識別法については、今回開発した３遺伝子マーカーのいずれかを用いることで識別可能であるが、手順書に記載したが１遺伝子のみの結果をもってLasの集団の由来を誤推定する危険性を完全に否定できないので、複数の遺伝子マーカーを用いて推定することが望ましい。
５）今後の課題
これまでに得られた成果の論文化を行うとともに、本課題で開発した技術についてはス
テークホルダーに対してフォローアップを行う予定である。
＜引用文献＞
冨村健太、カンキツグリーニング病対策の現状と今後の展望、植物防疫 72(11),2-6(2018)

18

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

（３－２）

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づくカンキツグリーニング病病原細菌個体
小課題名

群及び近縁Liberibacter属細菌の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発（２）種苗検査技術の開発

国立研究開発法人・農研機構・種苗管理センター・大﨑康
小課題
代表研究機関・研究室・研究者名 平/佐藤仁敏、果樹茶業研究部門・藤川貴史
Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的Liberibacter属細菌の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発を目的とする。
特に、海外から種子検査が求められているCandidatus Liberibacter solanacearum（Lso）
については、伝搬経路とみなされるニンジン種子における検査技術を開発する。
２）研究方法フランス産Lso汚染ニンジン種子3ロットを用いて、①本病原体の種子伝染の可能性を明らかにし、また②ニンジン種子のLso検査法を確立した。
（１）H29およびH30年度に、汚染種子3ロット、それぞれ約240株を播種、栽培し、栽培期間中にLsoの病徴発現を観察した。また、病徴の有無にかかわらず、全ての育苗株から採葉し、遺伝子解析によってLso検出を試みた。この結果から、「相対的な寄生圧」を算出し、Lsoの種子伝染の可能性について明らかにした。
（２）ニンジン種子のLso検査法について、国内外の検査機関等で用いられている検査マニ
ュアルを入手した。それぞれの検査手順について、その妥当性評価試験を実施し、最適な検査手順を選択した。また、文献やデータベースからLso特異プライマーを入手または開発し、その特異性および検出感度について評価した。
この選択した検査手順および特異プライマーについて、ニンジン種子からのLso検出試験を実施し、検査マニュアル（案）を確立した。このマニュアル（案）について、植物防疫所
協力のもと実施した妥当性評価試験の結果をもとに、ニンジン種子の検査マニュアル（初版）を完成させた。
３）研究結果（１）H29およびH30年度の栽培試験において、Lso汚染種子由来の全ての実生苗に、Lsoと疑われる病徴は観察されなかった。またそれぞれの苗から採取した葉の遺伝子解析結果につい19

ても、全てLso陰性であった。それぞれの汚染種子ロットの汚染率を考慮し、「相対的な寄生圧」を計算した結果、Lso汚染種子由来の実生苗の汚染圧比は約0.0028であった。これはFisher流95％信頼度で、Lso汚染している種子に対してLso汚染種子由来のニンジン実生苗がLsoに汚染されている可能性が0.0028以下であることを示しており（1:0.0028）、数理的には、Lsoは汚染種子から苗に伝染する可能性が著しく低いことを示す（参考として、「事実上サクラはPPVに感染しない（汚染圧比0.87％）」場合と比べてもLso実生苗の汚染圧比は低い。）この値は、輸入検疫における不良植物の限界寄生率と比較しても充分に低い値である
ことから、種子伝染は起こらないと考えられた。本試験結果を論文として取りまとめた（JGPPに投稿・受理済）。
（２）Lso検査マニュアルについて、オーストラリア検疫、横浜植物防疫所およびISHI-Vegの検査法を評価し、最適な検査方法を確立した。その結果、無処理種子5000粒中の汚染種子1粒を検出できる方法が確立された。本法の妥当性について、横浜植物防疫所輸出検疫担当
および精密検定担当の協力のもと、確認試験を実施した結果、全ての供試試料について正しい結果が得られ、その妥当性が確認された。以上の結果を基に、ニンジン種子のLso検査マ
ニュアル（初版）を完成させた。
なお、確立した検査法（開発法）は、検疫等で用いられている従来法と比較して、1検体あたりの検査作業を約4時間短縮し、試薬消耗品コストをおよそ￥28,000削減させることができた（下表を参照）。

表 1．開発法と従来法とのコスト比較。
20,000 粒/サンプル、開発法は 5,000 粒/サブサンプル、従来法は 400 粒/サブ
サンプル、市販キットによる DNA 抽出、リアルタイム PCR 解析の条件で比較
項目

従来法

消耗品

￥9,515

開発法
￥940

差額
￥8,575

サブサンプリング

*1

*1

種子粉砕

*1

*1

DNA 抽出￥13,558￥1,085￥12,473

リアルタイム PCR 解析￥8,349￥1,237￥7,112*1

消耗品費に含まれる。

表 2．開発法と従来法との作業時間比較。
表 1 と同じ検査条件で比較（単位：時間）
項目

従来法

開発法

短縮時間

サブサンプリング

1.5

0.8

0.7

種子粉砕

1.5

0.5

1.0

DNA 抽出

4.0

1.5

2.5

リアルタイム PCR 解析

0.5

0.5

0.0

４）成果活用における留意点（１）ニンジンのLsoが種子伝染する可能性が極めて低く見積もられることについて、論文
20等による公表の他、検疫機関および種苗関連業者に情報共有し、検疫・品質管理検査や種子処理などの必要性に関する検討材料とさせる。
（２）まず、植物防疫所に実装してもらうために、本マニュアルを論文等により公表する。
また、民間（特に検査会社）へ実装させる際には、成果利用の許諾を得させる必要がある。
５）今後の課題・ニンジンLsoの種子伝染の可能性および検査マニュアル（検出技術）について、国内外の検査機関・種苗関連業者への情報提供を継続する。
・本検査マニュアルを論文等により公表する。
・検査機関および種苗業者の品質管理部門などへ本技術を移転する。
＜引用文献＞

・ Fujikawa et al. (2020) Seed transmission of ‘Candidatus Liberibacter
solanacearum’ is unlikely in carrot
・Fujiwara and Fujikawa (2016)Primers for both conventional and real-time
PCR in diagnosis of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’
・Australian Government, Department of Agriculture (2017)、Diagnostic protocol for theidentification and detection of Candidatus Liberibacter solanacearum, the causal agentof zebra chip of potatoes.
・Internatioal seed federation (2016)、Detection of Candidatus Liberibacter
solanacearum on carrot seeds
・大石ら（2017）、リアルタイムPCR法を用いたニンジン種子からのCandidatus
Liberibacter solanacearum検出プロトコルの検証、横植調研報 第53号
・山村（2011）、農学と統計学、計量生物学Vol. 32

21

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

4

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

小課題名

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づくジャガイモやせいもウイロイド属の検出・同定手法の改良及びそのためのデータベースの開発
国立研究開発法人

農業・食品産業技術総合研究機構

野菜

花き研究部門・松下陽介
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 中央
小課題
代表研究機関・研究室・研究者名 農業研究センター・柳澤 広宣
公立大学法人

秋田県立大学

学科植物保護学研究室

藤

生物資源科学部

生物生産科

晋一・対馬大希Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
実行課題名：主要な花き類を加害するウイロイド類
１）研究目的
ジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）等ポスピウイロイドは宿主への感染や種子伝染等を通じて新しい変異体が発生するリスクが非常に高く、特に無病徴感染した花き類を通じた侵入リスクが高い。ここでは輸入検疫上重要となる花き類に感染するPSTVdの病徴や宿主範囲、種子伝染等を含めた生物的性質と遺伝子塩基配列の変異体の情報をデータベース化する。また、変異が起こりにくい部位を特定し、普遍的な検出技術と的確な変異体
識別技術の開発を目指す。
２）研究方法国内外の花き類で発生したPSTVdの発生・宿主・塩基配列・病徴等の情報の収集分析を行い、侵入リスクに基づき、迅速な検出・同定技術開発の優先度が高い技術開発対象のPSTVd変異体を数種選抜する。それらを接種源として侵入リスクの高い花き類に接種して発病リスクと変異体発生のリスクを調査する。変異体がポスピウイロイド検出系において検出可能であることを示す。また、各変異体の病徴および種子伝染リスクについても検証し、それらの情報をデータベースに掲載する。開発したポスピウイロイド検出系（Pospi6-F/RのSYBR Greenの検出系：引用文献１）の導入とスムーズな運用をはかるた
めに、ウイロイド検出への影響・健全植物における非特異的反応の事例データを収集する。
検疫上検査対象となる植物種を対象とする。
３）研究結果約160のPSTVdの変異体から、由来が明確で塩基配列の情報として信頼できる変異体を抽出し、系統樹を作成した結果、PSTVdの変異体は宿主毎にクラスターが構成された。作成した系統樹上において宿主・塩基配列上異なるPSTVd株約10株を選抜した。この10変異体をトマトに接種して接種１か月時点での病徴を確認したところ、一部の花き由来の
22

PSTVdでは生理障害と区別困難な症状を示した。上記のPSTVd等を侵入リスクの高い花
き類に汁液接種を実施して感染を確認した結果新規の変異体が得られた。これら新規変異体は開発したリアルタイムPCR法（引用文献１）においても検出可能であった。これらの既報のウイロイドおよび変異体を検出できることが示されたことから、本検出系は普遍的な検出技術であることが示された。次に、ポスピウイロイド検出系のマニュアルを作成するために陽性と非特異反応（偽陽性）の判定を可能とする参考事例としての非特異反応データの収集は予定どおり検定対象となる花き類での非特異データは得られた。これらの非特異データは検査マニュアルの参考データに反映した。
植物防疫上有益となる情報として新たにPSTVdの近縁種であるPCFVd（Tomato
planta macho viroid）およびTPMVd（Pepper chat fruit viroid）についての宿主・病徴・
種子伝染（ペチュニアにおいて、TPMVdは、17.5－96.4％、PCFVdは、0－91.9％で種子伝染）等データが得られた（引用文献２・３）。
４）成果活用における留意点
ポスピウイロイド検出系の使用については、今後も増加すると予想される変異体や対象
植物種の増加に伴い、改良を継続する必要がある。
５）今後の課題
ウイロイドは変異発生の頻度が非常に高いことから、海外で発生したウイロイド変異体について継続して調査を行う必要がある。特に周辺国におけるポスピウイロイドの発生情報等には留意する必要がある。
＜引用文献＞
１ ） Yanagisawa H., Shiki Y., Matsushita Y., et al. (2017) Development of acomprehensive detection and identification system for eight Pospiviroids. Eur. J Plant
Pathol. 149(1),11-23.
２）Yanagisawa H., Matsushita Y. (2017) Host ranges and seed transmission of Tomato
planta macho viroid and Pepper chat fruit viroid. Eur. J Plant Pathol. 149(1),211–217.
３）Vertical and horizontal transmission of pospiviroids. Yosuke Matsushita, Hironobu
Yanagisawa, Teruo Sano. (2018) Viruses. 10(12), 22-31.

実施課題名：主要な野菜類を加害するウイロイド類
１）研究目的
ジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）等ポスピウイロイドは宿主への感染や種子伝染等を通じて新しい変異体が発生するリスクが非常に高く、特に無病徴感染した野菜類を通じた侵入リスクが高い。ここでは輸入検疫上重要となる野菜類に感染するPSTVdの病徴や宿主範囲、種子伝染等を含めた生物的性質と遺伝子塩基配列の変異体の情報をデータベース化する。また、変異が起こりにくい部位を特定し、普遍的な検出技術と的確な変異体識別技術の開発を目指す。
２）研究方法国内外で発生したPSTVdおよびその近縁種の発生・宿主・塩基配列・病徴等の情報の収集分析を行い、情報から得られたPSTVd等の変異体を数種特定し、それらを接種源として侵入リスクの高い野菜類に接種して発病リスクと変異体発生のリスクを調査する。得られ23

た接種源と感染植物体を元にして各接種植物のおける新規発生の変異体を解析し、得られた配列を集積する。侵入リスクが高い野菜類のPSTVdについて、宿主範囲等を含む生物学的性質と塩基配列の変異体の情報を集積・データベース化し、保存性の高い遺伝子の塩基配列部位を特定し、普遍的な検出技術と的確な変異体識別技術を開発する。また、各変異体の種子伝染リスクについても検証し、それらの情報をデータベースに付加する。また、
植物防疫所への開発中のリアルタイムPCRによる検定法の導入をはかるための準備を行い、実際の検定法導入のための必要な問題点を抽出する。
３）研究結果160のPSTVdの変異体から、野菜類に感染するPSTVdを抽出し、系統樹を作成した結果、PSTVdの変異体は宿主毎にクラスターが構成された。作成した系統樹上において宿主・塩基配列上異なる野菜類に感染するPSTVd株約10株を選抜し、発病リスクの高い植物である
トマトへ接種したところ、変異体により病原性に大きな差があり、トマト以外の野菜類（ピーマン、パプリカ、ナス）では病徴を示す植物は確認されなかったことから、病原性の低いPSTVdや無病徴感染する可能性の高い植物により侵入する可能性が考えられた。これら
変異体情報や病徴等の情報をデータベースに記載した。
国内外の野菜類で発生したPSTVd変異体を野菜類へ接種したところ、シュンギクやナスにおいて新規変異体が発生した。また、ピーマンにおいては強い矮化症状と葉脈壊疽が確認された。これらの変異体は全て開発したリアルタイムPCR（引用文献１）において検出可能であった。これらの既報のウイロイドおよび変異体を検出できることが示されたことから、本検出系（引用文献１）は普遍的な検出技術であることが示された。次に、本検出
系を植物防疫所に導入するため、これまでの検査データの蓄積によって得られたトラブル
シューティング等（偽陽性判別方法など含む）を記載したマニュアル作成を作成した。
植物防疫上有益となる情報として新たにPSTVdの近縁種であるPCFVdおよびTPMVdについての宿主・病徴・種子伝染のデータを得た。PCFVdおよびTPMVdはナス科のピーマン、
トウガラシ、パプリカ、ナス、ジャガイモ、ペピーノ等に感染し、感染ピーマンでは果実の奇形が生じ、ペピーノでは植物体の矮化が確認され、これらのウイロイドの感染リスクが明らかとなった（引用文献２）。
４）成果活用における留意点
本法では、トマト種子を例として400粒に１粒の汚染種子が混入したバルクサンプルからでも検出可能であることを確認している。しかし、植物や品種が異なる場合には破砕効率や夾雑物の含有量が異なることから、検査実施前に有効な検査数量の設定が必要である。
同時に、植物種毎に最適な核酸抽出法が異なるため、検査対象となる植物に合った核酸抽出法を選定することで偽陰性のリスクを軽減できる。
５）今後の課題
検査の有効性を確保するため、検査に用いる陽性コントロールRNAの使用は必須である。
そのため、本事業で開発した陽性コントロールRNAを安定的に供給できる体制作りが今後必要となってくると考えられる。
＜引用文献＞（ １ ） Yanagisawa H., Shiki Y., Matsushita Y., et al. (2017) Development of acomprehensive detection and identification system for eight Pospiviroids. Eur. J Plant
Pathol. 149(1),11-23.
24

（２）Yanagisawa H., Matsushita Y. (2017) Host ranges and seed transmission of Tomato
planta macho viroid and Pepper chat fruit viroid. Eur. J Plant Pathol. 149(1),211–217.

実施課題名：ダリア等を加害するウイロイド類
１）研究目的ダリアから検出されるPSTVdダリア株の塩基配列情報およびトマト等重要作物に感染した場合の病原性、また、PSTVdダリア株から他品目への感染リスクについての評価を行い、それらをデータベースに反映させる。また、今後感染ダリアを介した新たなPSTVd株の侵入リスクを想定して、病原性の異なるPSTVd株がダリアに感染した場合のダリアにおける症状の有無を明らかにする。加えて、PSTVd株の侵入を水際で防ぐために的確な検査部位を決定するため、ダリアにおける局在性の有無と全身移行速度を明らかにすることにより、ダリアにおける早期・高感度検出技術の開発をめざす。
２）研究方法国内のダリアに発生したPSTVdダリア株に特徴的な塩基配列を明らかにする。また、ダリアにダリア株および高病原性株感染した場合の症状、挙動ならびに感染後の遺伝的変異の有無、ダリア株についてはトマトでの病原性を明らかにし、塩基配列情報、病原性、種
子伝染リスクについて記載したデータベースを構築する。リアルタイムPCRを用いた
PSTVdの検出法について、感染ダリアにおける検出部位等の違いが検出精度に影響を及ぼすか調査する。ダリア株と高病原性株混合感染した場合を想定し、ダリア体内におけるPSTVdの挙動を調査するとともに、いずれの株が優位となるかと両株間での組換えが生じるかどうかを明らかにする。加えて、ダリア株と高病原性株を識別できる方法を開発し、検出限界と検出精度を明らかにする。得られた結果に基づいて、網羅的なPSTVd等の検出・識別技術としてマニュアルを作成する。
３）研究結果データベースに登録されている354種のPSTVd分離株と、国内ダリアから検出された9種のダリア分離株から系統樹を作成した結果、ダリア分離株は同じクラスターに分類された。ダリア株と高病原性株3種は、ダリア「アジタート」に無病徴感染し、他品種ダリアである「ポートライトペアビューティー」と「ポンポンショコラ」でも全ての分離株が感染したが、高病原性株が感染したポートライトペアビューティーは、明らかな矮化症状を示し、重症の感染株は開花前に枯死した。この結果から、ダリアは品種とPSTVd分離株の違いによって病原性に大きな差があることが示された。一方で、ダリア株をトマト「ルトガス」に接種したところ、全ての分離株が感染し、一部感染株で軽度な矮化症状が確認されたが、ダリア株は、トマトへ無病徴感染すると考えられた（引用文献１）。ダリアへのPSTVd接種試験で得られた感染株を用い、種子伝染率について調査を行っているが、今のところ、垂直伝染および水平伝染いずれも確認されていない。
横浜植物防疫所で実施しているリアルタイムPCRによる検出系について（引用文献２）、検出部位等の違いによる検出精度の違いの有無を調査した。組織部位ごとの調査では、塊茎を含むいずれの部位においても検出が可能であることが明らかになった。本課題で開発した検出系について（引用文献３）、栽培ダリアでも適用可能か調査した結果、問題なく
25

検出できることが明らかになった。以上のことから、本課題で開発した検出系により、ダリアから迅速かつ的確にPSTVdを検出できることが示された。
PSTVdダリア株と高病原性株がダリアに混合感染した場合、ダリア体内では、ダリア株が優位に複製し、低確率ながら重複感染することが明らかになった。また、重複感染株によって、キメラ変異体等は出現せず、各々が単独で感染していた。
リアルタイムPCRのHRM解析を活用して、増幅される遺伝子領域のMelting Curveでのパターンの違いによりダリア株と高病原性株ならびに重複感染株を識別できる方法を開発した。HRM解析によるPSTVd分離株の識別技術については、検査マニュアルの参考データとして記載した。
上記研究成果に基づいて、1. 「PSTVd感染ダリアの症状とその特徴」 2. 「ダリアからの塊茎を含む検出方法と検出に関する留意点」について記載した、国内検疫で利活用できる検査マニュアルを作成した。
表．本課題で用いた検出系（検査法）の作業時間および試薬消耗品費の試算
項⽬

Boonham (2004)

Yanagisawa (2017)

HRM 解析による識別法

１サンプルあたり *1

１サンプルあたり１サンプルあたり30 分〜1 時間

30 分〜1 時間

30 分〜1 時間

1 時間 30 分

2 時間 40 分

2 時間 40 分\250 *3

\280

\350

作業時間 *2
リアルタイム PCR
反応時間
試薬消耗品費*1: 作業内容は、RNA検定用試料の準備、反応液調整、リアルタイムPCR開始までを含む。サンプリング時間は、検査現場によって状況が異なるため考慮していない。
*2: 作業時間は概算であり、検査現場によっては数値が前後する。また、一度に解析できるサンプル数は、検査現場で用いるリアルタイムPCR装置により異なる。
*3: 試薬消耗品費は、時価の変動等により数値が前後する。

※Boonham (2004)の方法は安価で所要時間は短いが全ての変異体に対応していないので、検出漏れの可能性がある一方で、本事業で用いた方法は全ての既報の変異体に対応している。
４）成果活用における留意点
マニュアルは国内検疫に利活用できるものであるが、国内での発生に迅速に対応するた
め都道府県への配布も計画している。マニュアルに基づいて都道府県で陽性反応が確認された場合、直ちに農林水産省の関係機関に連絡し、検査結果の妥当性について検証することが重要である。
５）今後の課題
ダリアは営利栽培のほか趣味栽培が広く行われている花きであることから、本研究成果
を種苗会社、農家、愛好家等が一堂に会する「日本ダリア会」等で積極的に情報発信し、26

PSTVdについて広く知ってもらい、PSTVdの侵入・拡大が再び起こらないようにすることが重要である。
＜引用文献＞（１）Tsushima D., Nishimura, M., Toda T., Furuya H., Fuji S. (2019) Molecularcharacterization of Potato spindle tuber viroid cloned from Dahlia plants in Japan. Eur.
J Plant Pathol. 154(4), 1091–1102（２）Boonham N., González Pérez L., Mendez M. S., Lilia Peralta E., Blockley A., Walsh
K., Barker I., Mumford R.A. (2004) Development of a real-time RT-PCR assay for thedetection of Potato spindle tuber viroid. J.Virol. Methods 116(2), 139-146.
（ ３ ） Yanagisawa H., Shiki Y., Matsushita Y., et al. (2017) Development of acomprehensive detection and identification system for eight Pospiviroids. Eur. J Plant
Pathol. 149(1),11-23.

27

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

5

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

小課題名

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づく国内未発生Phytophthora属病原糸状菌の検出・同定技術及びそのためのデータベースの開発

小課題
岐阜大学 流域圏科学研究センター・植生管理学研究分野
代表研究機関・研究室・研究者名 景山幸二
Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的P. ramorum、P. kernoviae 等の検出技術を現場で実施可能な技術とするとともに、開発した技術を用いた一連の検査手順についてマニュアルとして確立し、関連情報の統合データ
ベースへのデータ登録を完了する。
２）研究方法
輸入検疫における輸入禁止対象となっているPhytophthora属菌及びその他の国内未発生の有害Phytophthora属菌と疑わしい事例が検疫及び国内において発生した際のDNA情報に基づく簡易同定、及び、それら以外の同属菌の場合に国内未発生であるかどうかを迅速に判断するためのデータベースを構築する。
３）研究結果データベースの整備
・全 188 種の Phytophthora 属菌について、基準菌株、分離年、分離源（宿主）、分離地（国）、
新種報告の文献および塩基配列情報を収集し、データベースに登録できる形で整備した。
・種の基準菌株あるいはそれと等価な菌株について、分譲および購入可能な全ての菌株
141 種を収集し、本属の系統解析によく利用されている rDNA-ITS、rDNA-LSU、β-tubulin、
tigA、cox1 および cox2 について、74.5～100％の塩基配列の取得を完了した。
・検疫で得られた塩基配列を解析するため、信頼できる塩基配列のみ登録した Local
BLAST 用のデータベースを整備した。
検出技術の開発、改良および省力化
・植物および土壌からの最適な DNA 抽出法を選定し、手順の省力化や抽出液に含まれる増幅阻害物への対策などを行った。
・LAMP 法による検出技術として、Phytophthora 属全体の検出プライマー、重要病原菌である P. ramorum、P. kernoviae、P. lateralis、P. phaseoli および唯一検疫対象外である P.
nicotianae の種特異的検出プライマーを設計した。蛍光検出では、属全体の検出プライマ
ーに P. nicotianae の種特異的消光プローブを組み合わせた同時検出法を開発した。また、
植物ユニバーサルプライマーとのマルチプレックス LAMP によって検定の成否の評価を可能にした。多様な現場に実装可能な技術とするため、リアルタイム PCR 機器、濁度測定器および目視による検出に対応させた。
28

・PCR 法による検出技術として、Phytophthora 属全体の検出プライマーを設計した。また、
P. nicotianae の種特異的プライマーおよび植物ユニバーサルプライマーとのマルチプレッ
クス PCR による同時検出法を確立した。
・PCR-RFLP 法による簡易種判別に最適な制限酵素を 2 種類選定した。また、宿主植物を指定してバンドサイズを入力すると、該当する Phytophthora 種、基準菌株名、Ypt1 塩基配列および泳動画像が検索できるバンドパターン検索システムを開発した。
開発した検出技術の各行程にかかる時間およびコスト（図１）
行程に必要な作業時間および対照区を除いた1反復分の試薬コスト（プライマーを除く、少数点以下繰り上げ）は以下の通りである。
・DNA 抽出法：一検体あたり植物組織 30 分 360 円、土壌 80 分 900 円
・マルチプレックス蛍光 LAMP による検出（属プライマー＋P. nicotianae 特異的消光プローブ＋植物プライマー）：一検体あたり 80 分 430 円
・マルチプレックス蛍光 LAMP による検出（種特異的プライマー＋植物プライマー）：
一検体あたり 70 分 253 円
・濁度 LAMP による検出（SYBR® Green I で検出した場合）：一検体あたり 60 分 177 円
・マルチプレックス PCR による検出（属プライマー＋P. nicotianae 特異的プライマー＋植物プライマー）：一検体あたり 3 時間 65 円
・PCR-RFLP による簡易種同定（一検体に対して AluI および HhaI で検出した場合）：一

検体（2 反応 1 セット）あたり 7 時間 291 円

図１

検出の各行程にかかる時間およびコスト

29４）成果活用における留意点
特になし
５）今後の課題
Phytophthora属菌は近年盛んに新種が報告されているため、一定期間ごとに情報の追加更新を行う必要があると考えられる。
＜引用文献＞
特になし

30

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

6

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

小課題名

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づく国内未発生有害線虫類の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発

小課題
龍谷大学・岩堀英晶
代表研究機関・研究室・研究者名
Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的
リスク評価に基づいて選定した国内未発生線虫類および既発生近縁種について、寄生性等の生物的情報および形態的情報並びに遺伝子情報を解明し、それら情報をデータベース
化して遺伝子情報に基づく分類・同定技術を開発する事を目指す。
２）研究方法
リスク評価により日本の農業上脅威となりうる要警戒検疫有害線虫を対象に、対象種および近縁種の生物的・形態的特性、ならびに分類・同定に関する遺伝子情報の収集・解析を行い、DNA バーコーディング等遺伝子情報を利用した検出・同定技術を開発し、迅速に検出・同定できるシステムを開発する。具体的には、要警戒検疫有害線虫を選定し、これらの生体またはDNAサンプルを収集する。また、これら生体（幼虫、成虫、シスト）や植物
体中の対象種から効率的なDNA回収法を確立し、種同定のための全ゲノムを得る。対象種の検出・同定のため、既報の文献やWeb情報、あるいは対象種の候補DNA領域を直接シークエ
ンスすることにより、それぞれの種に対するリアルタイムPCRにも利用可能な種特異的プラ
イマーを選定・開発する。開発された種特異的プライマーを用いて、実際に有効かどうかを実際の生体またはDNAサンプルに対して検証する。一方で、対象種に関する情報および本研究による成果を取りまとめたデータベースを構築する。データベースは、農研機構農業
環境変動研究センター担当者に取りまとめた情報を送ることにより構築され、プロジェク
トメンバーおよび植物防疫官等に限定してアクセス可能とする。
３）研究結果
リスク評価により日本の農業上脅威となりうる要警戒検疫有害線虫を19種選定し、12種についてこれらの生体またはDNAサンプルを収集した。また、収集の過程でオランダやフランス、スペインにおける線虫研究と線虫管理設備について知見を得ることができた。これ
ら対象種に対して、既報の文献やWeb情報、あるいは対象種の候補DNA領域を直接シークエ
ンスすることにより、リアルタイムPCRにも利用可能な種特異的プライマーを選定・開発した。また、線虫生体（幼虫、成虫、シスト）や植物体寄生中の対象種から、DNA抽出キット
およびビーズ破砕法を用いた効率的なDNA回収法を開発し、迅速な検出・同定法を確立した
1)。対象種に関する情報および本研究による成果を取りまとめたものについては、啓蒙活31

動に利用可能な解説冊子・マニュアルを作成した。利用者を限定して閲覧可能にする。
４）成果活用における留意点
本成果の活用のためには、いくつかの専門的な機器の整備が必要である。具体的には、線虫を観察できる生物顕微鏡、実体顕微鏡、PCR装置（リアルタイムPCR装置）、電気泳動装置、ゲル撮影装置、冷凍機等が必要となる。
５）今後の課題
植物防疫所や国および都道府県において病害虫検査（検出・同定）を業務としている機関へ本技術を普及すべく本技術に関する研修会を開催するなど、社会実装促進に必要な取組が必要である。
＜引用文献＞
1)

岩堀英晶（2017）根こぶ１個からの迅速・簡便なネコブセンチュウDNA抽出と種同定法．

植物防疫71(10) 669-671．

32

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

7

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

遺伝子情報に基づく植物検疫のためのサツマイモ害虫ゾウ
小課題名

ムシ類個体群の検出・同定技術とそのためのデータベースの開発

小課題
国立研究開発法人農研機構 九州沖縄農業研究センター・生
代表研究機関・研究室・研究者名 産環境研究領域 熱帯性病害虫管理グループ・吉武 啓
Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的
サツマイモの重要害虫であるアリモドキゾウムシとイモゾウムシについて、国内における未発生地域への侵入や根絶確認地域への再侵入、および輸入検疫において海外からの持ち込みに対して迅速な対応をとるために、遺伝子DNA情報に基づく、国内発生地域個体群
間並びに海外発生個体群と国内個体群の簡便な識別技術を開発した上で、当該昆虫群の種情報をデータベース化する。
２）研究方法
対象種となる昆虫群について、簡易識別に係る技術開発の分類学的基盤を確立するとともに、各種の侵入・定着リスクの評価に係る情報収集する。また、国内での網羅的なサン
プル（無水エタノール液浸標本）収集と国外の主要な発生地域でのサンプル収集を通じて各種群のDNA分析用標本コレクションを構築する。個体群識別に有用と想定される領域の塩基配列データを集積し、各個体群の遺伝的集団構造の解析を行う。同領域で識別できない個体群を識別するため、種特異的なバーコード領域を選定し、塩基配列データを蓄積する。その上で、各領域の塩基配列情報を用いた個体群識別技術のプロトコルを作成するとともに、各種群のDNAバーコードライブラリーを作成、各種の形態、生態、分布情報と分
子情報、標本情報をデータベース化する
３）研究結果欧州でのタイプ標本等の参照標本調査を通じて各種の形態的特徴を把握し、簡易識別技
術開発の分類学的基盤を確立するとともに、植物防疫所に保管されている検疫標本調査により台湾やフィリピン、インドシナ半島からの植物の持ち込みによるアリモドキゾウの侵入リスクは高いが同属他種の侵入リスクは低いことを明らかにした。また、国内外におけるサンプリングによって15,000点以上のDNA分析用標本を収集した。アリモドキゾウムシ
について、1,936検体分の該当領域のデータを解析した結果、国内からは複数の系統と多数
33

の遺伝子型が検出され、海外個体群と明確に識別できた。また、同領域の遺伝子型が同じ
鹿児島県本土捕獲8個体および国内24島産191個体について4つの種特異的なバーコード領域を選定し解析した結果、各領域の遺伝子型を組み合わせた場合多数の遺伝子型が認められ、複数の島において固有の遺伝子型となり、個体群識別の有用性が高まることが明らかとなった。一方、イモゾウムシでは95検体の該当領域を解析した結果、少数の遺伝子型が検出された。7島産34個体について2つの種特異的なバーコード領域を選定し解析した結果、各領域の遺伝子型を組み合わせた場合、複数の島において固有の遺伝子型となり、個体群識別の有用性が高まることが明らかとなった。これらの識別技術を解説した「アリモドキ
ゾウムシ及びイモゾウムシの個体群識別マニュアル」を作成し、植物防疫所に技術移転を行った。また、塩基配列データを含む種情報をデータベースに登録することにより、今後の個体群識別において利用可能な参照データを構築した。
４）成果活用における留意点
植物検疫業務の実践において既存のデータセットに新規データが追加され、データベースの内容が拡充されてゆくことにより、検疫現場での本個体群識別法の有用性が向上してゆくと思われる。
５）今後の課題
イモゾウムシについては、とくに多くの個体群の塩基配列データを追加する必要がある。
また、個体群識別の迅速化のためシステム上での塩基配列データの相同性検索や系統樹の自動出力が望まれる。
＜引用文献＞
無し

34

中課題

中課題番号

15650846

小課題番号

8

中課題名

有害動植物の検出・同定技術の開発

小課題名

研究期間
小課題
研究期間

平成27～令和元年度

平成27～令和元年度

重要病害虫簡易同定のためのDNAバーコーディング等遺伝子情報に基づく検索システムの構築

小課題
農研機構 農業環境変動研究センター・昆虫分類評価ユニ
代表研究機関・研究室・研究者名 ット・中谷至伸
Ⅱ．小課題ごとの研究目的等
１）研究目的
海外からの侵入や国内における分布拡大が懸念される有害動植物や病原菌等微生物の迅速な同定や侵入経路の特定にはバックグラウンドとして膨大なデータが必要となり、これらのデータの検索・閲覧が容易にできるシステムが必要となる。これらの検疫有害動植物
について、分子情報および形態、生態、分布等の分類群に関する情報や標本の情報を蓄積・収納したデータベースを構築することで重要病害虫等の同定の迅速化に貢献する。
２）研究方法昆虫標本に関わる情報を蓄積・発信を目的として公開している「昆虫インベントリーシ
ステム」をベースに、命名表記の異なるウイルス等の微生物にも対応可能なシステムを構築し、試験データを用いて格納試験を行う。特に、本研究ではDNAなどの塩基配列情報を主として扱うため、情報の閲覧・登録が簡易になるよう検索方法や登録手法について検討を行う。データベースについては、各課題担当者や検疫担当者が利用できるように運用方法を検討し、システムを構築する。
３）研究結果昆虫類を主な対象として作成されたシステムを基にデータ項目の見直しを行い、ウイル
ス等の微生物にも対応できるように改修した。また、各種データへのアクセスを容易にするために表示方法、データ間のリンクの見直しを行い、標本・サンプルデータのダウロー
ド機能を追加した。現時点でトスポウイルス、アザミウマ類、ポスピウイロイドをはじめとする病原菌や有害動植物約300種、約2200件のサンプルデータ、約500件の文献情報を格納している。情報の内容は対象の分類群によって異なるが、例えばトスポウイルスでは媒介するアザミウマ種の情報、国別の発生状況に関する文献が含まれる。データベースは農研機構サーバーで稼働し、IPアドレスによるアクセス制限を設けることで、各課題担当者、植物防疫所からのみ利用可能なシステムとして構築した。
４）成果活用における留意点
本研究で構築したシステムは非公開で植物防疫行政で活用する予定。
５）今後の課題
他の検疫有害動植物の検出・同定に係る技術開発と関連データの集積35

Ⅲ 研究成果一覧 【公表可】

課題番号15650846

中課題名 有害動植物の検出同定技術の開発

成果等の集計数
学術論文
課題
番号15650846

学会等発表（口頭またはポスター）

和文

欧文

国内

国際

5

9

45

15

国内特許権等
出版
図書

国際特許権等

PCT

出願

取得

出願

取得

出願

0

0

0

0

0

1

報道件
数

発表会
の主催 アウト
普及しうる（シンポ リーチ活
成果
動
ジウム・
セミナー

0

1

1

3

（１）学術論文
区分：①原著論文、②その他論文
機関名

掲載誌

掲載論文のDOI

発行 発行
掲載
巻（号）
年
月
ページ

区分

タイトル

著者

1

①

Seed transmission of Potato spindle tuber viroid,
Tomato chlorotic dwarf viroid, Tomato apical stuntviroid, and Columunea latent viroid in horticultural
plants.

Matsushita Y and
Tsuda S.

農研機構

Eur. J Plant Pathol.

2016

8

145(4)

10071011

2①

我が国で発生しているトスポウイルスについて,

奥田充

農研機構

日本植物病理学会報 0.3186/jjphytopat 2016

8

82(3)

169184

整理番号

https://doi.org/1
h.82.169
3①

Development of a comprehensive detection andidentification system for eight Pospiviroids

Yanagisawa Hら

農研機構

Eur. J Plant Pathol.

2017

9

149（1）

11-23

4

①

Host ranges and Seed transmission of Tomato planta
Yanagisawa Hら
macho viroid and Pepper chat fruit viroid

農研機構

Eur. J Plant Pathol.

2017

9

149（1）

2112175②

根こぶ１個からの迅速・簡便なネコブセンチュウDNA
抽出と種同定法

龍谷大学

植物防疫

2017

10

71(10)

669671

6①

我が国で発生する８種トスポウイルスを検出できるユ奥田充
ニバーサルプライマー

農研機構

https://doi.org/10.
関東東山病害虫研究
11337/ktpps.2017. 2017
会報
68

11

64

68-72

7

②

カンキツグリーニング病対策の現状と今後の展望

農研機構

8

②

9

①

岩堀英晶

冨村 健太

日本で発生するトスポウイルスを網羅的に検出できる奥田充
農研機構
ユニバーサルプライマー
Differences in dynamics of horizontal transmission of
Hironobu
Tomato planta macho viroid and Potato spindle tuber
Yanagisawa,
農研機構
viroid after pollination with viroid-infected pollen
Yosuke Matsushita

植物防疫

2018

11

72（11）

2−6

植物防疫

2018

8

７２（８）

34-38

Virology

https://doi.org/1
0.1016/j.virol.201 2018
8.01.023

3

516

258-264

Vertical and horizontal transmission of pospiviroids
10

11

12

①

YosukeMatsushita,
農研機構・弘前大
Hironobu
Viruses学
Yanagisawa, Teruo
Sano
Hironobu
Yanagisawa
農研機構・弘前大, Teruo Sano
Virology
学・山形大学, Shu Hase
, Yosuke
Matsushita①

Influence of the terminal left domain on horizontal
and vertical transmissions of tomato planta macho
viroid and potato spindle tuber viroid through pollen①

Rapid detection of Phytophthora nicotianae by
simple DNA extraction and Real-time Loop-Mediated
Isothermal Amplification Assay
Ayaka Hieno et al. 岐阜大学
Seed transmission of ‘Candidatus Liberibacter
solanacearum’ is unlikely in carrot

13

①

14

①

15

16

①

Fujikawa et al.

農研機構

Molecular characterization and eradication of new
Daiki Tsushima et.
potato spindle tuber viroid isolates from dahlia plants
秋田県立大学al.,in Japanhttps://doi.org/1
0.3390/v1012070 2018 12610(12)

706(ペー
ジ数は
無く論文
番号の
み）

10.1016/j.virol.20
201918.09.021

1

526

22-31

Journal of
Phytopathology

https://doi.org/1
2019
0.1111/jph.12785

2

167(3)

174-184

Journal of General
Plant Pathology

https://doi.org/1
0.1007/s10327- 2020
020-00927-1

5

86

266-273

Eur. J Plant Pathol.

https://doi.org/1
0.1007/s10658- 2019019-01730-1

4

154

1091–
1102

2019

12

71

1-2

https://doi.org/1
0.1094/PDIS-12- 2020
19-2523-RE

7

online公開未定First records of two invasive species of thrips(Insecta: Thysanoptera) from Kyoto and Wakayama
Prefectures

Kenji Fujimoto,Tadaaki Tsutsumi,
農研機構
Satoshi Toda,
Shiro Nakao

京都府立大学学術報
告Detection of the genus Phytophthora and thespecies Phytophthora nicotianae by LAMP with a
QProbeAyaka Hieno et al. 岐阜大学

Plant Disease（２）学会等発表（口頭またはポスター）
整理番号

タイトル

発表者名

機関名

発行年 発行月

関東東山病害虫研究会

2017

2

国内未分布アザミウマ種の分子診断法開発のための遺伝子情 土`田聡、中村有希、上地奈
農研機構 果樹茶業研究部門
報収集
美、三代浩二第61回日本応用動物昆虫学会
大会

2017

3

3

ダリアに感染しているジャガイモやせいもウイロイドの遺伝的多 藤 晋一・戸田 武・古屋廣様性とその病原性・宿主適応光

秋田県立大学

平成28年度日本植物病理学会
東北部会

2016

9

4

ジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）の変異体に感染したトマ
松下陽介・柳澤広宣
トにおける病原性比較農研機構

平成２８年度園芸学会秋季大
会

2016

9

1

「トスポウイルスを検出するユニバーサルプライマーの検討」

2

奥田充

農研機構

学会等名

LAMP法によるPhytophthora pseudolactucae の簡易検出技術 馮 文卓・須賀晴久・景山幸
岐阜大学
の開発
二
近藤 亨・大坪佳代子・景山
Phytophthora sp. によるデルフィニウム疫病（新称）岐阜大学
幸二
福田明美・冬廣吉朗・渡辺貴
Phytophthora sp.によるウメ枝の褐変症状について
弘・吉田貴寿・本多範行・景 岐阜大学
山幸二

日本植物病理学会報

2016

10

日本植物病理学会報

2016

10

日本植物病理学会報

2016

10

児玉不二雄・植松清次・
Mohammad Ziaur Rahman・
守川俊幸・古屋廣光・園田高
岐阜大学
広・堀越紀夫・平子喜一・小木曽秀紀・鐘ヶ江良彦・景山幸二日本植物病理学会報

2016

10

9

Phytophthora glovera によるナス根腐疫病の発生と本病に対す 楠 幹生・Yoshilia Rani・景山
岐阜大学
る各種薬剤の効果および台木品種の抵抗性程度の違い
幸二

日本植物病理学会報

2016

10

10

Phytophthora 属菌の簡易検出・同定技術の開発

日恵野綾香

東海植物病学研究会

2016

12

11

Establishment of global Phytophthora database for accurate
diagnosis

A. Hieno, M.Li, K. Otsubo, H.
岐阜大学
Suga, K. Kageyama

1st International symposium ofriver basin studies

2017

3

5
6
7

8

日本産アスパラガス疫病菌と米国産アスパラガス疫病菌

Phytophthora asparagi との比較

岐阜大学

根こぶ１個からの迅速・簡便なネコブセンチュウDNA抽出と種同
岩堀英晶
定法
鹿児島県におけるアリモドキゾウムシの近年の発生状況と遺
吉武啓
伝的多様性
ポスピウイロイドのウイロイド感染花粉による水平伝染の可能柳澤 広宣・松下 陽介
性龍谷大学

第61回日本応用動物昆虫学会
大会

2017

3

農研機構

平成28年度ゾウムシ研究会

2016

11

農研機構

日本植物病理学会報

2017

8

16

ダリアに感染しているジャガイモやせいもウイロイド各種クローンのトマトでの病原性とゲノム変異

藤 晋一・西村 真帆戸田武・古屋 廣光秋田県立大学

日本植物病理学会報

2017

8

17

ダリアに対するジャガイモやせいもウイロイドのリスク評価およびqRT-PCRでの効率的な検出対馬大希・西村 真帆・一関
優菜・戸田 武・古屋 廣光・ 秋田県立大学
藤 晋一

平成30年度日本植物病理学会

2018

3

18

First report of stem rot on hydrangea caused by Phytophthora R. Yoshilia, M. Morishima, H.
岐阜大学
Suga, K. Kageyama
hedraiandra in Japan

平成２９年度日本植物病理学
会大会

2017

4

19

LAMP法を用いたPhytophthora nicotianae の特異的検出

日恵野綾香・大坪佳代子・須
岐阜大学
賀晴久・景山幸二

平成２９年度日本植物病理学
会大会

2017

4

20

A. Afandi, Masanto, A.
Diversity of oomycetes in southern Sumatera and Central Java Wibowo, S. Subandiyah, S.
islands of Indonesia
Loekito, Afandi, H. Suga, K.
Kageyama

岐阜大学

第２回環境微生物系学会合同大会２０１７

2017

8

21

レタス圃場におけるPhytophthora およびPythium 属菌のLAMP
法による検出馮 文卓・日恵野綾香・楠幹生・須賀晴久・景山 幸二

岐阜大学

第２回環境微生物系学会合同大会２０１７

2017

8

22

輸入検疫での実用化に向けたTriplex PCR法による
Phytophthora 属の特異的検出法の確立

日恵野綾香・大坪佳代子・須
岐阜大学
賀晴久・景山幸二

第２回環境微生物系学会合同大会２０１７

2017

8

12
13
15

23

LAMP法による輸入検疫有害菌Phytophthora ramorum ，P.
kernoviae およびP. lateralis の特異的検出

日恵野綾香・大坪佳代子・須
岐阜大学
賀晴久・景山幸二

平成２９年度日本植物病理学
会関西部会

2017

9

24

Identification and population genetics of Phytophthora
nicotianae causing root rot of pineapple

A. Afandi, S. Loekito, Afandi,
A. Hieno, H. Suga, K.
岐阜大学
Kageyama

Asian Mycological Congress
2017

2017

10

25

Development of accurate DNA database of Phytophthora andgenus specific PCR-based detection

A. Hieno, M. Li, K. Otsubo, H.
岐阜大学
Suga, K. Kageyama

Asian Mycological Congress
2017

2017

10

26

Establishment of global Phytophthora database for quarantine
control

A. Hieno, M. Li, K. Otsubo, H.
岐阜大学
Suga, K. Kageyama

UGSAS-GU International
symposium

2018

3

27

Morphological and molecular identification of causal agent ofcocoa pod rot disease in Indonesia

Masanto, A. Wibowo, S.
Subandiyah, M. Shimizu, H.
Suga, K. Kageyama

岐阜大学

UGSAS-GU International
symposium

2018

3

28

First report of stem blight of lettuce by Phytophthora
crassamura in JapanR. Yoshilia, M. Kusunoki, H.
Suga, K. Kageyama

岐阜大学

2nd International symposium ofriver basin studies

2018

3

29

Specific detection of quarantine species, Phytophthora
ramorum , P. kernoviae and P. lateralis by loop-mediatedisothermal amplification (LAMP) assay

A. Hieno, K. Otsubo, H. Suga,
岐阜大学
K. Kageyama

2nd International symposium ofriver basin studies

2018

3

岐阜大学

2nd International symposium ofriver basin studies

2018

3

岐阜大学

平成30年度日本植物病理学会
大会

2018

3

日恵野綾香・大坪佳代子・須
岐阜大学
賀晴久・景山幸二

平成30年度日本植物病理学会
大会

2018

3

平成29年度ゾウムシ研究会

2017

11

2018

7

2019

3

2019

3

30

31

Masanto, A. Hieno, A.
Distribution of mating type of Phytophthora palmivora isolates Wibowo, S. Subandiyah, M.
from Indonesia and Japan
Shimizu, H. Suga, K.
Kageyama
Masanto, A. Hieno, A.
Genetic diversity of Phytophthora palmivora causing cocoa pod Wibowo, S. Subandiyah, M.
rot in Indonesia
Shimizu, H. Suga, K.
Kageyama

32

Quenching-loop-mediated isothermal amplification (Q-LAMP)
法によるPhytophthora 属菌およびP. nicotianae の同時検出

33

鹿児島県におけるアリモドキゾウムシの近年の発生状況と遺伝
吉武啓・有本 誠
的多様性（中間報告）

農研機構

34

Occurrence of tospovirus diseases in Japan

奥田充

農研機構

35

アザミウマ類の遺伝的多様性の解明と分子分類への活用

土`田聡

農研機構

36

Haplothrips属とLiothrips属群における食性転換と系統進化

土`田聡

農研機構

Taiwan-Japan Joint
Symposium on Plant Virus
Diseases
第63回日本応用動物昆虫学会
大会
第63回日本応用動物昆虫学会大会

37「根絶地域への再侵入と未発生地域への侵入を警戒するための新しいグリーニング病識別技術」

冨村 健太

農研機構

平成29年度果樹茶業研究会「常緑・落葉果樹病害虫研究会」カンキツグリーニング病分科会38「カンキツグリーニング病原細菌をはじめとした近縁Liberibacter
冨村 健太
属細菌種の識別法とその利用」

農研機構

平成30年度果樹茶業研究会「常緑・落葉果樹病害虫研究会」カンキツグリーニング病分
科会

2019

2

39

「カンキツグリーニング病原細菌集団を識別可能なSNPおよび
InDelマーカーの開発」

冨村 健太

農研機構

平成31年度日本植物病理学会
大会

2019

3

40

Vertical and horizontal transmission of Pospiviroids

Yosuke Matsushita, Hironobu
農研機構
Yanagisawa

Viroid-2018

2018

7

41

Development of a comprehensive detection and identification
molecular based system for eight Pospiviroids

Hironobu Yanagisawa,
Yosuke Matsushita, Shinya
Tsuda

農研機構

国際植物病理学会

2018

7

42

Molecular characterization of Potato spindle tuber viroid from
Dahlia plants in Japan

Daiki Tsushima, Shin-ichi
Fuji

秋田県立大学

Viroid-2018

2018

7

43

高分解能融解曲線（HRM）解析を用いたジャガイモやせいもウイ 対馬大希・戸田 武・古屋廣光・藤 晋一ロイド分離株の識別

秋田県立大学

平成３０年度日本植物病理学
会
東北部会

2018

9

44

ダリアにおけるジャガイモやせいもウイロイドの混合感染に対す 対馬大希・一関優菜・戸田
武・古屋廣光・藤 晋一
るリスク評価秋田県立大学

平成３１年度日本植物病理学
会

2019

3

45

Specific detection of quarantine species, Phytophthora
ramorum , P. kernoviae and P. lateralis by loop-mediatedisothermal amplification (LAMP) assay

A. Hieno, K. Otsubo, H. Suga,
岐阜大学
K. Kageyama

6th Int. Oomycetes Workshop＆
ICPP 2018

2018

7

46

Simple identification of Phytophthora species by using PCRRFLP

A. Hieno, K. Otsubo, H. Suga,
岐阜大学
K. Kageyama

第３回流域圏保全研究推進セ
ミナー

2019

3

47

PCR法によるPhytophthora 属菌の検出における土壌DNA抽出 日恵野綾香・大坪佳代子・須
岐阜大学
賀晴久・景山幸二
法の比較

平成31年度日本植物病理学会
大会

2019

3

48

A practical species-specific real-time PCR primer for
Heterodera shachtii

Hideaki Iwahori and Noritaka
龍谷大学
Nakamura

ヨーロッパ線虫学会2018

2018

9

49

テンサイシストセンチュウの侵入源と侵入経路の推定および
DNAによる土壌密度推定法

岩堀英晶・浅水恵理香・中村
龍谷大学
慎崇

第63回日本応用動物昆虫学会
大会

2019

3

50

アリモドキゾウムシの個体群レベルでの識別技術の開発に向け
吉武 啓て

九州沖縄農業研究センター

九州病害虫研究会第96回研究発表会、特別講演（於宮崎市民プラザ）．

2018

11

51

鹿児島県離島におけるアリモドキゾウムシの近年の分布状況及
吉武 啓
び遺伝的多様性

九州沖縄農業研究センター

門司植物防疫所植物防疫官研
修、講義（於門司植物防疫所）

2018

11

52

Emergence and spread of tospovirus diseases in Japan

農研機構

International Symposium on
Virus Diseases of Important
Crop（台中市）

2019

9

M. Okuda

2018

2

53

侵入警戒を要するポスピウイロイド

松下陽介

農研機構

54

PCR-RFLP法によるPhytophthora 属菌の簡易種同定

日恵野綾香・李 明珠・大坪
岐阜大学
佳代子・須賀晴久・景山幸二

日本植物病理学会第54回感染
生理談話会

2019

11

日本菌学会第63回大会

2019

5

令和元年度日本植物病理学会
関西部会

2019

9

植物ユニバーサルプライマーを内部コントロールとして用いた
日恵野綾香・大坪佳代子・須
岐阜大学
Multiplex LAMPによる輸入検疫有害菌Phytophthora ramorum ，賀晴久・景山幸二
P. kernoviae およびP. lateralis 各種の検出
Multiplex LAMP detection of Phytophthora ramorum , P.
A. Hieno, K. Otsubo, H. Suga,
岐阜大学
kernoviae and P. lateralis with plant universal primer set as an
K. Kageyama
internal control
Extraction and detection of woody plant DNA with universal
A. Hieno, K. Otsubo, H. Suga,
岐阜大学
LAMP primer
K. Kageyama

Asian Mycological Congress
2019

2019

10

第４回流域圏保全研究推進セ
ミナー

2020

3

58

バラ科植物に感染するPhytophthora 属菌のPCR-RFLPによる
簡易種同定

日恵野綾香・李 明珠・大坪
岐阜大学
佳代子・須賀晴久・景山幸二

令和2年度日本植物病理学会
大会

2020

3

59

コロンビアネコブセンチュウ、ニセコロンビアネコブセンチュウ、およびニセネコブセンチュウの種同定および定量に有効なリア
ルタイムPCRプライマー

吉田裕史・岩堀英晶

第64回日本応用動物昆虫学会
大会

2020

3

55
56
57

龍谷大学

（３）出版図書
区分：①出版著書、②雑誌（学術論文に記載したものを除く、重複記載をしない。）、③年報、④広報誌、⑤その他
整理番号

区分

1

①

著書名（タイトル）

著者名

機関名

シリーズ21世紀の農学 大変動時代の食と農 第8章増大する作物病害虫の進行リ 大藤泰雄（日本農学会編 分

農研機構

出版社
養賢堂

発行年 発行月20184（４）国内特許権等
区分：①育成者権、②特許権、③実用新案権、④意匠権、⑤回路配置利用権
整理番号

特許権等の名称

区分

発明者

権利者
（出願人等）

機関名

出願番号

出願年月日

取得年月日

権利者
（出願人等）

機関名

出願番号

出願年月日

取得年月日

該当なし

（５）国際特許権等
区分：①育成者権、②特許権、③実用新案権、④意匠権、⑤回路配置利用権
整理番号

特許権等の名称

区分
該当なし

発明者

出願国

（６）報道等
区分：①プレスリリース、②新聞記事、③テレビ放映、④その他
整理番号

記事等の名称区分

掲載紙・放送社名
等

機関名

掲載
年月日

備 考

該当なし

（７）普及に移しうる成果
区分：①普及に移されたもの・製品化して普及できるもの、②普及のめどがたったもの、製品化して普及のめどがたったもの、③主要成果として外部評価を受けたもの（複数選択可）。
整理番号

区分

成果の名称

1

②

国内未発生ポスピウイロイド8種の網羅的検出・同定技術

機関名

農研機構

普及（製品化）
年月

2019

4

主な利用場面

普及状況

植物検疫におけるトマト種子検査、国内発 植物防疫所（5本所及び主要空港4支所）
生事例における確定診断、根絶確認

（８）発表会の主催（シンポジウム・セミナー等）の状況
発表会の名称

整理番号1

ポスピウイロイド検出講習会

機関名

農研機構

開催場所

年月日

中央農研環境保全型病害虫防除技術 2018/10/31
開発共同実験棟

参加者
数

5

備 考

種苗メーカーの品質管理部門の担当者向けに本事業で開発した技術の利用のための技術講習を施した。

（９）アウトリーチ活動の状況
区分：①一般市民向けのシンポジウム・講演会及び公開講座・サイエンスカフェ等、②展示会及びフェアへの出展・大学及び研究所等の一般公開への参画、 ③その他（子供向け出前授業等）
年月日

参加者
数

2016/11/25

53

種苗業界関係者

主催:(株)ファスマック

農研機構

東京大学弥生講堂 2017/10/14

180

会社員、主婦、学生、行政等

主催：日本農学会①「Taiwan-Japan Joint Symposium on Plant
Virus Diseases ~ Tackling new threats on
agriculture ~」における講演「Occurrence oftospovirus diseases in Japan」

農研機構

筑波産学連携支援2018/7/3
センター

41

行政、公的研究機関、大学、一般

主催：農研機構①

日本ダリア会 大輪ダリア切り花出荷２０周
年記念大会

秋田県立大学ホテルメトロポリタ
2019/9/27
ン秋田

162

行政、公的研究機関、大学、種苗業界関係者、一般

主催：日本ダリア会

整理番号

区分

アウトリーチ活動

機関名

開催場所

1

③

松下陽介 第3回種苗検査セミナー「野菜のウイロイドの病徴・検査技術について」

農研機構

品川パドム

2

①

平成29年度日本農学会シンポジウム「大変動時代の食と農」における講演「増大する作物病害虫の新興リスクにどう立ち向かう
か」

3

4

主な参加者

備 考