公益財団法⼈⼩児医学研究振興財団
令和４年度研究報告書（令和４年４⽉〜令和５年 3 ⽉）

令和６年２⽉

公益財団法⼈⼩児医学研究振興財団

⽬次

21-001 ⼩児遺伝性疾患のゲノム・エピゲノム異常を含めた全変異種の同時検出法の開発：
ネルソン・プロジェクト
代表研究者：⼭⽥茉未⼦（慶應義塾⼤学医学部臨床遺伝学センター） ·····································1
21-002 ⼩児がん検体を⽤いた Deorphanization と新規がん治療法の開発
代表研究者：吉⾒ 昭秀（国⽴研究開発法⼈国⽴がん研究センター）
共同研究者：⼤⽯ 篤郎（杏林⼤学 医学部 ⾁眼解剖学教室） ············································621-003 マルチオミックス解析を⽤いたアミノアシル tRNA 合成酵素異常症の病態解明
研 究 者：坂野 公彦（奈良県⽴医科⼤学） ······································································· 10
21-004 左⼼室筋分化からみる先天性⼼疾患発症および重症化機構の理解
代表研究者：渡邉 裕介（国⽴循環器病研究センター研究所、⼼臓再⽣制御部）
共同研究者：⼭岸 敬幸（慶應義塾⼤学医学部・⼩児科学教室）
⽵内 純 （東京医科⻭科⼤学・難治疾患研究所）
中川 修 （国⽴循環器病研究センター研究所、分⼦⽣理部） ······················· 14
21-005 GH-IGF 系シグナル蛋⽩遺伝⼦変異が関与する成⻑障害の病態解明
代表研究者：鞁嶋 有紀（島根⼤学医学部⼩児科学教室）
共同研究者：和⽥ 啓介（島根⼤学医学部⼩児科学教室）
⼩林 弘典（島根⼤学医学部附属病院検査部）
⻤形 和道（島根⼤学医学部附属病院卒後研修センター）
⽵⾕ 健 （島根⼤学医学部⼩児科学教室）
伯野 史彦（東京⼤学農学部）
⾼橋伸⼀郎（東京⼤学農学部） ··········································································· 18
21-006 エリスロポエチンの抗肥満・抗糖尿病作⽤の機序解明
代表研究者：杉本 哲 （京都府⽴医科⼤学⼩児科学）
共同研究者：⻄⽥ 望 （京都府⽴医科⼤学⼩児科学）
宮垣 知史（京都府⽴医科⼤学⼩児科学）
河辺 泰宏（京都府⽴医科⼤学⼩児科学） ························································ 21
21-007 ミトコンドリア機能異常症における⾄適栄養摂取のためのバイオマーカー探索研究−治療可能代謝疾患の個別化医療に向けて−
代表研究者：武内 俊樹（慶應義塾⼤学医学部⼩児科）
共同研究者：末松 誠 （慶應義塾⼤学医学部医化学教室）
⼩川 恵梨（慶應義塾⼤学医学部⼩児科） ························································ 24
21-009 学⼒および⾮認知能⼒に影響を与える乳幼児期因⼦の解明
代表研究者：⻄⼭ 将広（神⼾⼤学⼤学院 ⼩児科学） ························································ 27

21-013 市中発症⼩児敗⾎性ショックの疫学調査−実情に基づいた⼩児救急医療体制の提唱に向けてー
代表研究者：三浦 慎也（帝京⼤学⼤学院公衆衛⽣学研究科）
共同研究者：道端 伸明（千葉県がんセンター研究所） ························································ 30
21-014 診療情報および学校健診情報データベースを⽤いた児童思春期の神経性やせ症に関連する要因の検証
代表研究者：福屋 吉史（東邦⼤学医学部 精神神経医学講座） ········································· 35

21-001

⼩児遺伝性疾患のゲノム・エピゲノム異常を含めた全変異種の同時検出法の開発：ネルソン・プロジェクト

代表研究者：⼭⽥ 茉未⼦（慶應義塾⼤学医学部臨床遺伝学センター）
１）研究内容① 研究⽬的
⼩児の死亡原因において、０歳から４歳までの第⼀位は「先天奇形、変形及び染⾊体異常」であり、その診断と早期介⼊が求められている。診断に際して、短鎖型次世代シーケンサーがこれまで⼤きな貢献を果たしてきたが、数塩基のサイズの遺伝⼦変異の検出には優れるが、構造異常やメチル化異常症の検出は困難であるという課題があった。そのため、網羅的な遺伝⼦診断を⾏った場合に、診断がつく患者は約３割に留まっていた。近年、ナノポア技術に基づく⻑鎖型シーケンサーによるゲノム解析が注⽬され、診断率の向上につながる解析技術として期待されている。⻑鎖型シー
ケンサーによるゲノム解析では、従来よりも誤判定率が⾼く、その打開のためには同じ部位を多数回シーケンスしなければならずコスト⾯での課題もあった。
申請者は解析対象を全ゲノム領域ではなく、予め電⼦データとして定義したゲノム領域のみを解析するアダプティブサンプリングという⼿法を応⽤して実臨床へ適⽤可能な、従来のゲノム解析⼿法の弱点を克服した解析技法の開発が必要であると考え、本研究を着想した。つまり、アダプティ
ブサンプリング法という⼿法を加えたナノポア技術に基づく⻑鎖型シーケンサーによるゲノム解
析を⾏うことで、ゲノム構造異常やメチル化異常症の検出を⽬指す。ナノポア技術では、DNA１分
⼦がナノスケールの細孔を通り抜ける際に⽣じる微弱な電流の変化を検出し、塩基を順に読み出している。アダプティブサンプリング法は、読み出し始めた塩基配列が⽬的としているゲノム領域であるかどうかを超⾼速コンピュータを⽤いて判定し、標的としている領域であれば DNA 分⼦の読み込みを継続し、標的領域外であれば読み込みを停⽌する⽅法である。全ゲノム領域を評価するのではなく、予め決めておいた領域に特化して充分数の反復解析を⾏うことで、誤判定の問題を克服しつつ解析コストの低下を図ることが可能となる。
さらにナノポア技術では、メチル化した DNA（具体的には CG 塩基対の C のメチル化）と⾮メチル化した DNA を区別することが可能であり、⼩児疾患の発症に関与している Differentiallymethylated regions（DMR）に対してアダプティブサンプリング法を適⽤することにより、インプ
リンティング異常症（プラダー・ウィリー症候群（PWS）、アンジェルマン症候群（AS）、ベックウ
ィズ・ヴィーデマン症候群、シルバー・ラッセル症候群、新⽣児糖尿病等）の診断も可能となる。
これらのメチル化異常症の診断については、現在、バイサルファイトによる患者ゲノム DNA の化
学的前処理を含む別途の検査を要しているが、本研究が成功すれば、他のメンデル遺伝病と同⼀の解析系の中で、メチル化異常症も診断可能となる。また、染⾊体構造異常における正確な切断点解
析はこれまで、⼗分に⾏われてこなかった。症状を伴う申請突然変異の均衡型転座や、各種染⾊体
構造異常において、切断点における具体的な遺伝⼦が特定されることは、患者の症状を説明する知−1−

⾒が得られることが期待される。
本研究は、遺伝性疾患が疑われる⼩児の診断における包括的遺伝学的解析⼿法の開発・実臨床の現場への医療実装により、精度の⾼い遺伝学的診断に基づく医療の提供を⽬指すことを⽬的とする。
② 研究⽅法本研究において、下記 3 研究を実施した。本研究のプロトコルは、申請者の所属施設に現有する検体で遺伝学的解析について既に患者本⼈・両親の同意が得られ、倫理委員会により承認済みである。
①インプリンティング異常症に対するアダプティブサンプリング法による再解析。
②染⾊体構造異常の解析。
②−1：新⽣突然変異による 3 番染⾊体 7 番染⾊体の均衡型転座の患者の切断点解析②−2：カフェ・オ・レ斑に⼝蓋裂を伴う患者に対する⽋失断端解析① 患者は、臨床的に PWS または AS と診断され、FISH 法、患者と両親のトリオのマイクロサ
テライトマーカー分析、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応により確認された。4 ⼈の PWS 患者のうち、2 ⼈は 15q11.2 染⾊体の⽋失、1 ⼈は⺟親の 15 番染⾊体の⽚親性ヘテロダイソミー、
1 ⼈はインプリンティングセンターの⽋失であった。AS 患者 3 名のうち、1 名は 15q11.2 染⾊体の⽋失、1 名は 15 番染⾊体の⽗⽅⽚親性ヘテロダイソミー、1 名は 15 番染⾊体の⽗⽅⽚親性ア
イソダイソミーだった。これら 7 名の患者のゲノム DNA サンプルに対し、ナノポアアダプティブ
サンプリング技術を⽤いたターゲットシークエンスを⾏った。AS や PWS 関連疾患 Schaaf-Yang
症候群を引き起こす病原性変異体である UBE3A や MAGEL2、その他 ZFP57、KCNK9、CDKN1C、

IGF2、DLK1、MKRN3、GNAS 等のインプリント障害に関する遺伝⼦を含めた。SNURF:TSSDMR として知られる SNRPN プロモーター領域の CpG ジヌクレオチドを含む、医学的に関連する親由来メチル化の対象となるゲノム領域が BED 形式ファイルのターゲット領域として設定した。さらに、3,601 個の既知のヒト疾患原因遺伝⼦の全コード配列（すなわち、開始コドンから停⽌コドンまで）とその 10kb のフランキング配列をカバーする領域も適応的サンプリングの対象として選択された。対象領域の総サイズは 259,114,649bps であった。ベースコールは、Oxford
Nanopore Technologies 社の Guppy ソフトウェア（v6.0.6）を⽤い、Minimap2（v2.24）を⽤いてヒト参照ゲノム（GRCh37）にアライメントした。ハプロタイプを考慮したバリアントコール
は、ナノポアロングリードを使⽤して隣接する⼀塩基変異体を連結し、マッピングされたリードを相殺してハプロタイプを推論する PEPPER-Margin-DeepVariant（v0.8）を使⽤して達成した。
構造変異は、Sniffles（v2.0.3）を使⽤して呼び出した。ナノポアデータから CpG メチル化を呼び出すために、Megalodon pipeline（v2.3.4）を使⽤した。パイプラインでは、Guppy ソフトウェアと dna_r9.4.1_450bps_modbases_5mc_hac モデルを使⽤して、CpG モチーフに 5 mC の修飾を加えた⽣リードをベースコールした。得られたリードを GRCh37 の参照ゲノム配列にアライメント
し、その結果を BAM ファイルとして⽣成し、参照アンカー付きのリード毎の修飾塩基コールを Mm
および Ml タグで記録した。これらのタグは、Integrative Genomics Viewer（v2.11.2）において−2−

PEPPER-Margin-DeepVariant によって推測されるハプロタイプ情報を⽤いてメチル化状態を可視化するために使⽤された。Minimap2 を⽤いて⽣成したアライメント済み bam データから、読み取
り深度と対⽴遺伝⼦不均衡を利⽤する CNVpytor ソフトウェアを⽤いてコピー数異常を検出した。
バリアントコールデータから、H3M2 ソフトウェアによりホモ接合性の領域を検出した。
②−1 患者は均衡型転座 t(3;7)(q26.2;q36.1)が既に知られている⾃閉症スペクトラム障害 3 歳男児である。転座切断点の解析のため、アレイ CGH および、⻑鎖型シーケンサーによる解析を⾏った。標準プロトコル（Oxford Nanopore technologies の PromethION システム）により定義され、ベースコールは Guppy 4.0.11 を使⽤した。ヒト参照ゲノム（GRCh37）へのマッピングとアライメ
ントは NGMLR で⾏った。構造変異は Sniffles2 により検出された。構造的変異に対して、アレル頻度（0.05 未満）、遺伝⼦間領域・転写開始／終了の上流と下流の領域にあるバリアントの除外、第3 染⾊体または第 7 染⾊体にマップされ、10 以上のリードでサポートされる de novo バリアントを抽出した。ブレイクポイントの近傍にマッピングされた配列リードを、dnarrange ソフトウェアパ
ッケージを⽤いてアライメントし、コンセンサス配列に統合し表現されたドットプロットにより、再配置の順序と⽅向を確認した。
②−2 患者は⼝蓋裂、⼼房中隔⽋損症、カフェ・オ・レ斑・発達遅滞を伴う 26 歳⼥性である。神
経線維腫や Lisch 結節は認めなかったが、カフェ・オ・レ斑は背中と両脇の下、腕、⼤腿に 5 箇所
以上散在し、臨床的には神経線維腫 1 型が鑑別疾患として含まれた。患者の末梢⾎由来ゲノム DNAのエクソーム解析、bam 形式のエクソームデータを⽤いたコピー数変異をスクリーニングするソフ
トウェア EXCAVATOR2 により評価した。15q14 領域にヘテロ接合性⽋失を認め、⻑鎖型シーケ
ンサーにより、正確な⽋失断端を同定した。
２）研究結果① 解析の結果、PWS 患者では SNRPN 遺伝⼦座のプロモーター領域のメチル化領域内の CpG のほぼすべてがメチル化され、⼀⽅、AS 患者では CpG のほぼすべてが⾮メチル化されていた。正常なコントロールでは、リードの約半分がメチル化され、残りの半数は⾮メチル化されていた。PWSと AS の患者の診断に有⽤であっただけでなく、⽋失・⽚親性アイソダイソミー・⽚親性ヘテロダ
イソミーの病因解析にも有⽤であった。さらに、他のインプリンティング疾患における有⽤性の評
価のため、健常者、PWS 患者 4 名、AS 患者 3 名において 15 番染⾊体以外の既知のインプリンテ
ィング領域について解析したところ、⼀⽅の対⽴遺伝⼦がメチル化され、他⽅の対⽴遺伝⼦が⾮メ
チル化されていた。
②−1 アレイ CGH 検査では、3q26.2、7q36.1 には⽋失は検出されず 11q22.3 に 5.9-MB の⽋失が存在した。11 番染⾊体の⽋失区間内には、PLI スコアが 0.9 を超える 3 つの遺伝⼦、すなわちGUCY1A2、CUL5、ZC3H12C が存在することが判明したが、いずれもヒトの病気を引き起こすことは知られていない遺伝⼦であった。⻑鎖型シーケンサーによる解析の結果、合計 32,208 個の構造的変異があることが判明しうち、20,006 個はアレル頻度が 0.05 未満であった。さらに、遺伝⼦間領域、転写開始／終了の上流と下流の領域にあるバリアントを除外し、第 3 染⾊体または第 7 染⾊
体にマップされ、10 以上のリードでサポートされる de novo バリアントを保持した、3 番染⾊体と7 番染⾊体の転座に関わるバリアントは 1 つに絞られた。ドットプロットで表現されたブレイクポ−3−

イントをサンガー配列決定により正確に決定し、SLC7A14 遺伝⼦の chr3 (GRCh37):g.170183554と KMT2C 遺伝⼦の chr7 (GRCh37):g.151857653 と定まり、Kleefstra syndrome 2 と診断した。
②−2 患者の末梢⾎由来ゲノム DNA のエクソーム解析により、患者は NF1 に変異を持たないこと、EXCAVATOR2 により 15q14 領域にヘテロ接合性⽋失を有することが判明した。⻑鎖型シー
ケンサーによる解析の結果、⽋失領域は chr15: 35,674,498-40,083,579 であった。⽋失範囲内に存在する遺伝⼦のうち、MEIS2、SPRED1 が患者の症状を説明するものであった。
３）考察① ⻑鎖型シーケンサーにより病因精査も含めた PWS および AS の診断を⼀元的に⾏うことができることが⽰された。正確な遺伝カウンセリングのために不可⽋な疾患メカニズムの解明も効率的に⾏うことができた。また、他のメチル化異常症についても解析の有⽤性が⽰唆された。
②−1 新⽣突然変異による 3 番染⾊体 7 番染⾊体の均衡型転座の患者に対して本解析⼿法を実装し、正確な転座切断点を決定し、切断点上に存在する遺伝⼦を特定し、患者の症状の成因を解明することができた。今回報告した患者は、従来の G バンド染⾊体解析やアレイ CGH 検査では解決できない、⽐較的⾮特異的な知的障害や染⾊体転座を有する患者の正確な遺伝的病因を解明する上で、
⻑鎖型シーケンサーの有⽤性を⽰している。
②−2 ⼼疾患、知的障害、カフェ・オ・レ斑の組み合わせは、MEIS2 と SPRED1 を含む 15q14 の⽋失に起因すると考えられ、正確な⽋失範囲を特定することができ、カフェ・オ・レ斑と⼝蓋裂の組み合わせの成因を明らかにした。MEIS2 および SPRED1 の同時⽋失を有する患者の⼝蓋形成術を計画する場合、知的障害に伴う発話の遅れの可能性を予期することや⼿術前に適切な循環器の評
価を⾏うことが求められる。また、神経線維腫や悪性腫瘍に罹患する可能性がないことが⽰された
ことは患者の医療管理において⾮常に有益と考えられる。さらに、次⼦再発率は 50％であることも⽰され、将来的な家族計画にも寄与できる結果であった。
これらの研究結果を通じて、⻑鎖型シーケンサーにより幅広い範疇の変異をカバーすることにより、異なる検査⼿法を逐次実施するのではなく、単回の検査で患者やその家族に適切な情報を提供することができると考えられる。本研究により従来を凌ぐ⾼い診断率を得られることが期待され、臨床医はゲノム情報を⼿がかりに臨床情報を収集し、患者の病態⽣理をより深く理解することが可能となる。患者本⼈への治療や合併症へのアプローチに加えて、病態の解明・治療法の開発など⼩児疾患全般の研究・診療の発展に果たす役割が極めて⼤きいと期待される。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
論⽂
１．Diagnosis of Prader-Willi syndrome and Angelman syndrome by targeted nanopore long-readsequencing. Yamada M, Okuno H, Okamoto N, Suzuki H, Miya F, Takenouchi T, Kosaki K. Eur
J Med Genet. 2023 Feb;66(2):104690. doi: 10.1016/j.ejmg.2022.104690. PMID: 36587803
２ ． Precise definition of the breakpoints of an apparently balanced translocation between
chromosome 3q26 and chromosome 7q36: Role of KMT2C disruption. Yamada M, Suzuki H,−4−

Miya F, Kosugiyama K, Ujiie T, Tonoki H, Kosaki K. Congenit Anom. 2023 Mar 22. doi:
10.1111/cga.12514. PMID: 36946065
３．Café-au-lait Spots and Cleft Palate: Not a Chance Association

Mamiko Yamada, Katsumi

Tanito, Hisato Suzuki, Daisuke Nakato, Fuyuki Miya, Toshiki Takenouchi, Kenjiro Kosaki Cleft
Palate Craniofac J. 2023 Jul 14:10556656231188205. doi: 10.1177/10556656231188205.
学会発表
１．第 66 回⽇本形成外科学会総会・学術集会（アワードセッション・⼝演）（2023 年 4 ⽉ 26 ⽇）（⻑崎)Cafe-au-lait 斑と⼝蓋裂の合併時、 神経線維腫症 1 型ではなく 15q14 ⽋失によるレジウス症候群を想起する⼭⽥茉未⼦、鈴⽊寿⼈、宮冬樹、⼩崎健次郎
２．第 126 回⽇本⼩児科学会学術集会（2023 年 4 ⽉ 16 ⽇）（東京）
カフェオレ斑に⼝蓋裂を合併する場合には神経線維腫症 1 型ではなく 15q14 ⽋失によるレジウス症候群を想起すべきである
⼭⽥茉未⼦、鈴⽊寿⼈、宮冬樹、⼩崎健次郎
３．第 67 回⽇本⼈類遺伝学会⼤会（⼝演）（2022 年 12 ⽉ 15 ⽇）（横浜）
Whole-genome long-read sequencing for breakpoint analysis of de novo balanced reciprocaltranslocations.
Mamiko Yamada, Hisato Suzuki, Hidefumi Tonoki, Kiyotaka Kosugiyama, Takeshi Ujiie, Fuyuki
Miya, Toshiki Takenouchi, Kenjiro Kosaki
謝辞
公益財団法⼈⼩児医学研究振興財団の助成を賜わり、多くの研究成果を得て、患者さんやご家族の医療に還元することができました。感謝申し上げます。

−5−

21-002

⼩児がん検体を⽤いた Deorphanization と新規がん治療法の開発

代表研究者：吉⾒ 昭秀（国⽴研究開発法⼈国⽴がん研究センター）
共同研究者：⼤⽯ 篤郎（杏林⼤学 医学部 ⾁眼解剖学教室）
１）研究内容① 研究⽬的G タンパク質共役型受容体（GPCR）はヒトゲノム中最⼤の膜蛋⽩質ファミリーであるが、現在約 100 種類の GPCR が未だリガンドが⾒つかっていない Orphan 受容体である。本研究は Orphan
受容体のリガンド同定を通じ、⼩児がんの全く新しい治療法を創⽣することを⽬的とする。Orphan
受容体のリガンド同定が進まない理由として、(1) リガンドが存在する適切な環境で研究がなされなかった（主に正常組織を⽤いて研究された）。(2) GPCR が活性化した際の下流シグナルの検出に漏れがあった、の 2 点が考えられる。
⼀⽅、我々は⾁腫や造⾎器腫瘍で Orphan 受容体の発現が上昇していることを発⾒した。
そこで、本研究では、これら 2 つの問題点について、それぞれ次のように解決する。
(1) ⼩児がん患者の⾎漿検体を⽤いてスクリーニングを実施する。
(2) 我々が独⾃に開発する世界初のバイオエレクトロニクスを組み合わせて、漏れがなく、
かつ high-throughput screening（HTS）が可能なプラットフォームを構築する。本提案では研究期間内に上記のプラットフォームの完成および本格的 HTS の実施を⽬指す。
② 研究⽅法
上記の⽬的を達成するために、我々はまず計 668 種類の GPCR を標的として、⽩⾎病や⾁腫を含む 5 種類のがん細胞株で CRISPR Dropout スクリーニングを実施した。
さらに、本研究では、⾮嗅覚受容体に属する GPCR のうち、CRISPR スクリーニングで同定された Orphan 受容体 15 種類のリガンドを同定するために、バイオエレクトロニクス技術を⽤いて独⾃に⾼感度バイオセンサーを各種開発し、がん患者⾎漿検体を実際に⽤いてハイスループットスク
リーニング（HTS）を実施するためのセンサーの最適化を⾏った（図 1）。
２）研究結果Orphan 受容体を含めた GPCR ががんにおける創薬標的となるかどうかを検討するために、我々は CRISPR-Cas9 システムを⽤いて⾮嗅覚受容体の約 9 割に当たる 349 種類の遺伝⼦を標的とした
ノックアウトスクリーニングを肺がん・膵がん・⼤腸がん・膀胱がん・⽩⾎病の細胞株において実施した。その結果がん細胞の依存度が⾼い 26 種類の GPCR を⾒出し（図 2）、その中には、⾁腫において治療標的となることが最近報告された GPR20 を含む（Iida et al. Cancer Discov. 2021）、
Orphan 受容体が 15 種類含まれていた。このことから、本 CRISPR スクリーニングの結果が有望であると考えられ、また同時にこれまでに創薬研究の対象となっていない Orphan 受容体で、がん細胞の⽣存に寄与するものが数多く存在することが⽰唆された。
−6−

図 1：本研究で開発した各種バイオセンサー

図 2：⾮嗅覚受容体 CRISPR Dropout Screen

図 3：嗅覚受容体 CRISPR Dropout Screen

嗅覚受容体は動物において外界の情報を検出する⾮常に重要な機能を担い、実際に嗅覚受容体が匂い物質と結合することが⽰されたが、視覚や⾔語コミュニケーションが発達したヒトにおいては⽣きるのに必須ではない退化した機能として扱われてきた。そのため医学研究の対象・創薬対象として認識されてこなかったが、匂いを感知する器官以外でも嗅覚受容体が⾼発現する事象が観察されることから、嗅覚受容体には匂いを感知する以外の機能が存在する可能性が⽰唆される。
我々は、上記の⾮嗅覚受容体の CRISPR スクリーニングに平⾏して、319 種類の嗅覚受容体についても同様の CRISPR スクリーニングを実施したところ、驚くことに⾮嗅覚受容体と同様にがん細胞の依存性が⾼い 26 種類の嗅覚受容体が検出された（図 3）。
嗅覚受容体は⾮嗅覚受容体と異なり、Golf（Golf）という特殊な G 蛋⽩質とのみ共役し、細胞
内シグナルを惹起する。匂いを感知する嗅細胞においては 1 細胞に 1 種類の嗅覚受容体しか発現しないという特殊性があり、治療標的とした際の嗅覚への副作⽤は限定的と考えられるが、がん細胞での嗅覚受容体の発現状態や機能はあまりわかっていない。そこで、今後は正確な細胞内シグナルの評価のため、既に開発済みの G15 センサーを応⽤し、Golf 特異的発光バイオセンサーを開発する。
さらに、本研究では Orphan 受容体に対するリガンドスクリーニングに並⾏し、CRISPR-Cas9 を−7−

⽤いて CRISPR スクリーニングで得られた個々の候補 Orphan 受容体・嗅覚受容体をノックアウト
し、機能的 Validation を⾏った。対象とする GPCR をノックアウトする guide RNA を導⼊した細胞を GFP で、コントロールの Luciferase guide RNA を導⼊した細胞を mCherry で標識して導⼊直
後に 1:1 の⽐率で混合し、経時的に flow cytometry で GFP:mCherry の⽐率を観察する系を⽴ち上げた。現在、本項⽬は進⾏中であり⼀部の候補 GPCR についての validation が終了した段階であるが、すでに肺がん細胞株 A549 が“GPCR-1”（遺伝⼦名とは異なる）への依存度が⾼いことが確認された（図 4）。

図 4：CRISPR スクリーニングの機能的 Validation の結果

また、がん種によっては GPCR のノックアウトが細胞増殖ではなく細胞分化に影響することも考えられることから、分化に関わる表⾯マーカーを上記の flow cytometry に組み合わせることにより解析を⾏う（例えば急性⾻髄性⽩⾎病由来細胞における CD11b など）。また、個々にノックアウトしたがん細胞株の RNA シークエンス（RNA-seq）を実施し、それぞれの受容体のがんにおける分⼦⽣物学的な役割を解析する。特に依存性の⾼い Orphan 受容体・嗅覚受容体の候補を 2 つ〜3つに絞り、対象となるがん種を選定し、今後の抗体医薬創⽣へとつなげる。
また、今後は HTS を実施し、同定している Orphan 受容体のリガンドの同定を試みる。同時に
CRISPR スクリーニングで得られた候補受容体 52 種類を機能的に validation し、有望な候補についてその分⼦⽣物学的・⽣物学的な機能を解析し、治療標的としての意義を確認する。Validation された受容体を不活化ないし活性化するような抗体を創薬し、がん治療への有効性を検証する。将来的なアウトカムとして、前臨床試験を経て研究開発後の知財獲得および企業導出、そして First-inHuman の臨床試験へと開発を進めることを⽬指す。本研究開発により同定される受容体・リガン
ドはバイオマーカーとしても有⽤な可能性があり、臨床的有⽤性を評価する。liquid biopsy が可能になれば、患者に優しい診断・経過フォローの⼿段となることが期待される。
３）考察
本研究により、⼩児がん患者由来⾎漿検体を⽤いた Deorphanization のためのスクリーニング体制が整った。構築されたプラットフォームを⽤いて、今後本格的な HTS を実施する。
また、CRISPR dropout screening から有望な結果が得られており、今後は機能的 validation をさ−8−

らに進め、ヒット GPCR を特定するとともに、ヒット GPCR のがんにおける役割の解明、および創薬に向けた研究を加速させる。本研究により⼩児がんを含めたがん全般に、これまで創薬対象となっていない GPCR が存在する可能性が強く⽰唆された。このような GPCR を標的とした新しいがん治療の開発が⼩児がんの治療成績向上につながる可能性がある。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
無し−9−21-003

マルチオミックス解析を⽤いたアミノアシル tRNA 合成酵素異常症の病態解明

代表研究者：坂野 公彦（奈良県⽴医科⼤学）
１）研究内容① 研究⽬的
乳児肝不全症候群 type I（Infantile liver failure syndrome type I; ILFS1）は、ロイシン-tRNA 合成
酵素遺伝⼦（leucyl-tRNA synthetase 1 gene; LARS1）の変異により⽣じる常染⾊体潜性遺伝疾患として同定され、乳児肝不全の原因の 1 つである。LARS1 タンパクは、タンパク質ポリペプチドを翻訳して合成する際に、アミノ酸のロイシンを取り込ませる働きを有する。しかし全⾝の各臓器に関与し得る本酵素の機能喪失が、肝臓特異的に⼤きな傷害を⽣じさせる病態は不明である。

LARS1 遺伝⼦変異が、本疾患の病理所⾒に⾒られる肝細胞壊死を⽣じさせ、肝不全を引き起こす機序は何か。転写→翻訳の過程の障害が想定されることを踏まえると、トランスクリプトームとプ
ロテオームを同時に解析することで、特徴的な異常所⾒を検出できるのではないか。また、胎児期早期から重症肝不全を呈する本疾患こそ、疾患特異的 iPS 細胞からの肝細胞分化誘導による病態再現が有効な⼿段となるのではないか、と考える。
本研究では、LARS1 変異 iPS 細胞と正常コントロール iPS 細胞を肝細胞へ分化誘導する。両細胞のライセートを⽤いてマルチオミックス解析を⾏い、本疾患に特徴的なプロテオーム異常や、トランスクリプトームとの対⽐所⾒を検討したい。本疾患の詳細な病態解明を契機として、他の新⽣児
肝不全の病態解明に寄与するような発⾒に繋げたいと考える。
② 研究⽅法
１．LARS1 変異 iPS 細胞の樹⽴：患者剖検組織から培養して増殖させて線維芽細胞に、センダイウ
イルスベクターを導⼊する⽅法を⽤いて、疾患特異的 iPS 細胞を樹⽴した。
２．LARS1 変異 iPS 細胞における、ドキシサイクリン誘導性の LARS1 正常遺伝⼦産物の発現シス
テムの導⼊：今回の研究協⼒者である、かずさ DNA 研究所⼩原收博⼠の助⾔に従い、ゲノム
背景をなるべく均⼀にした状態で、LARS1 変異細胞のマルチオミックス評価を⾏う⽅針とした。そのため、LARS1 変異 iPS 細胞に対し、正常 LARS1 遺伝⼦産物をドキシサイクリン誘導性に強制発現できるベクターをトランスフェクションし、薬剤選択を⾏うことで、上記細胞株を複数樹⽴した。樹⽴した細胞株にドキシサイクリンを投与して、RNA 発現の変化を検証した。
３．LARS1 変異 iPS 細胞（LARS1mut-iPSCs）とドキシサイクリン誘導性の LARS1 正常遺伝⼦産物（wild-type; WT）の強制発現（overexpression; OE）細胞（LARS1mut-OEWT-iPS）の両者の肝細胞分化誘導：肝細胞分化誘導は、Cellartis Hepatocyte Differentiation Kit（Takara Bio）
を⽤いて definitive endoderm を経て、肝前駆細胞へと 21 ⽇間分化誘導を⾏った。分化誘導した肝前駆細胞、分化誘導前の iPS 細胞、強制発現ベクター導⼊前の iPS 細胞、それぞれについ−10−

て、ドキシサイクリン投与群および⾮投与群のサンプルを 2 サンプルずつ調整し、Trizol で溶解したのち、マルチオミックス解析に提出した。
２）研究結果１．LARS1 変異 iPS 細胞の樹⽴：樹⽴した iPS 細胞は、典型的なヒト iPS 細胞の形態を呈した（Figure 1A）。また、RT-PCR にてセンダイウイルス由来の RNA は検出されなかった。ダイレ
クトシークエンス解析にて、患者由来線維芽細胞と同じ複合ヘテロ変異（c.213+1G>A,
c.1351A>T）を認めた（Figure 1B）。

Figure 1：LARS 変異 iPS 細胞（LARS1mut-iPSCs）の樹⽴

２．LARS1 変異 iPS 細胞における、ドキシサイクリン誘導性の LARS1 正常遺伝⼦産物の発現シス
テムの導⼊：Figure 2A に⽰すようなトランスポゾンベクターを作製し、LARS1 変異 iPS 細胞にトランスフェクションおよび薬剤選択を⾏うことで、ドキシサイクリン誘導性に LARS1 正常
遺伝⼦産物を発現する iPS 細胞クローンを樹⽴した。ドキシサイクリンに対して外因性 LARS1
発現量が最も⾼いクローン#3 を選択した（Figure 2B）。

Figure 2：ドキシサイクリン誘導性の LARS1 正常遺伝⼦産物の発現システムの導⼊

３．LARS1 変異 iPS 細胞（LARS1mut-iPSCs）とドキシサイクリン誘導性の LARS1 正常遺伝⼦産物（wild-type; WT）の強制発現（overexpression; OE）細胞（LARS1mut-OEWT-iPS）の両者の肝細胞分化誘導：Definitive endoderm への分化効率を内胚葉マーカーである CXCR4 発現をフローサイトメトリーにて検討したところ、Dox の投与の有無に関わらず、発現細胞は 90％以上で分化誘導効率は良好であった（Figure 3）。そのまま分化誘導を継続し、21 ⽇後の肝前駆細胞（Hep）の状態で細胞を回収した。プロテオーム解析は、肝前駆細胞への分化誘導を⾏った−11−

LARS1mut-OEWT-iPS #3 のクローンでのみ⾏った（分化前後かつ Dox on/off）。なお、トランスクリプトームは、肝前駆細胞への分化誘導を⾏ったものと別クローン（LARS1mut-OEWT-iPS#1）および、強制発現ベクターをトランスフェクションする前の LARS1 変異 iPS 細胞においても⾏った（Dox on/off）。

Figure 3：ドキシサイクリン誘導性の LARS1 正常遺伝⼦産物の強制発現細胞（LARS1mut-OEWT-iPS）の肝細胞分化誘導

４．マルチオミックス解析結果（途中経過）：上記のサンプルをかずさ DNA 研究所に提出したとこ
ろ、トランスクリプトームに関して以下の結果が得られている（単純化して表すため、
LARS1mut-OEWT-iPS #3 の結果のみ抜粋）。
Figure 4 では、iDEP（http://bioinformatics.sdstate.edu/idep/）を⽤いた k-Meansclustering の結果を⽰す。特異的に enrich している GO pathway の上位 3 つを抜粋したところ、iPS 細胞で enrich
している cluster A は細胞周期や細胞分裂に関する pathway であり、肝前駆細胞で enrich している
cluster B, C, D には、脂質代謝、タンパクリモデリングなど肝臓で特徴的な pathway が含まれており、分化誘導を反映している結果と考えられた。⼀⽅、LARS1 正常遺伝⼦の強制発現の有無に応じた⼤きなトランスクリプトームの差は認められなかった。

Figure 4：トランスクリプトーム解析結果１−12−

Figure 5 では、iDEP を⽤いた DEG（Differential Expressed Genes）の結果を⽰す。こちらも、
iPS 細胞と肝前駆細胞の各サンプルの差は顕著であるが、同じ iPS 細胞や肝前駆細胞におけるLARS1 正常遺伝⼦の強制発現の有無に応じた⼤きなトランスクリプトームの差は認められなかった。

Figure 5：トランスクリプトーム解析結果 2

３）考察
今回我々は、
患者由来線維芽細胞から乳児肝不全症候群の疾患特異的 iPS 細胞を誘導でき、かつ、その細胞に正常遺伝⼦産物を強制発現させる実験系を確⽴できた。強制発現の有無に関わらず、疾患特異的 iPS 細胞を肝前駆細胞へ効率良く分化誘導させることに成功した。複合ヘテロ変異（常染
⾊性潜性遺伝形式）で発症する本疾患において、Tet システムを⽤いることで正常 LARS1 遺伝⼦産物を強制発現させれば、表現型が正常に近づくと考えられる。その細胞を疾患細胞と⽐較検討する
ことで、疾患表現型が明らかになると考えられたが、トランスクリプトーム解析結果において有意な差は得られてない。引き続き、プロテオームデータの検討や、プロテオームデータとトランスク
リプトームデータの⽐較検討を進め、転写翻訳制御機能の障害が⽰唆される本疾患の病態解明に取り組んで⾏きたい。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
現在データ解析中であるため、本助成成果に関する論⽂・学会発表はありません。

−13−

21-004

左⼼室筋分化からみる先天性⼼疾患発症および重症化機構の理解

代表研究者：渡邉 裕介（国⽴循環器病研究センター研究所、⼼臓再⽣制御部）
共同研究者：⼭岸 敬幸（慶應義塾⼤学医学部・⼩児科学教室）
⽵内 純 （東京医科⻭科⼤学・難治疾患研究所）
中川 修 （国⽴循環器病研究センター研究所、分⼦⽣理部）
１）研究内容① 研究⽬的過去 20 年間において先天性⼼疾患の原因遺伝⼦が多数同定されてきたが、それら遺伝⼦の変異・⽋失によって形態異常が⽣じる過程については未解明点が多く残されている。
T-box 転写因⼦の TBX5 は Holt-Oram 症候群の原因遺伝⼦である。マウスにおいて Tbx5 は、⼼臓形成の最も初期にあたる⼼原基形成期から⼼原基内に存在する⼀次⼼臓形成領域と呼ばれる⼼臓前駆細胞が存在する領域で発現を開始し、⼼臓発⽣が進⾏した時期では左⼼室筋および⼼房筋で発現する。Tbx5 ヘテロ⽋失マウスでは Holt-Oram 症
候群で認められる⼼房・⼼室中隔⽋損の形成異常などの表現型が再現される（図 1）。また Tbx5 ホモ⽋失マ
ウスでは重篤な⼼臓形成異常により胎⽣ 9.5 ⽇で致死となる（Bruneau BG et al., Cell 2001）。しかしながら Tbx5 の発現低下が、どのように細胞レベルで影響を与え、⼼臓形態異常発症に繋がっていくかについては未解明点が多い。
申請者は胎仔期の⼼室筋で発現する bHLH 転写因⼦である Hey2 遺伝⼦の⼼室筋特異的な転写調節領域（Hey2 エンハンサー）を同定している（Ihara D etal., Dev. Biol. 2020 にて責任著者として報告）。また、
⼼原基形成の前期において、Hey2 エンハンサー活性

図1：⼼臓形成と先天性⼼疾患

化細胞は Tbx5 が発現する⼀次⼼臓形成領域より吻側の傍⼼臓形成領域と呼ばれる前駆細胞領域内に存在している。さらに、この時期の Hey2 エンハンサー
活性化細胞と Tbx5 発現細胞は、共に左⼼室筋に分化するものの、2 つの細胞系譜はほとんど重複しないことを⾒出した（図 2、3、Watanabe Y et al., PNAS.
2023）。以上の事実は、⼼原基形成前期の傍⼼臓形成領域内には、⼀次⼼臓形成領域とは異なる左⼼室筋
前駆細胞が存在していることを⽰している。

−14−

図2：⼼原基形成前期におけるTbx5 発現とHey2 エンハ
ンサー活性の関係

Tbx5 と同様に⼼臓形成初期から発現する T-box 転写因⼦として Tbx20 が知られている。Tbx5 と Tbx20 の標的
遺伝⼦は類似しており、Tbx5 ⽋失マウスおよび Tbx20 ⽋
失マウスでは Anf, Cx40, Hey2 遺伝⼦などの発現減少を含めて複数の遺伝⼦発現変化が共通して⽣じ、重篤な⼼臓形成異常により胎⽣致死となる（Bruneau BG et al., Cell
2001, Singh MK et al., Development 2005）。これらの事実から、Tbx5 と Tbx20 は左⼼室筋分化において重複した発現と機能を担っていることが⽰唆されるが、⼼疾患発症における両者の機能的差異について詳細に検討された事例

図3：⼼原基形成前期のTbx5 発現細胞とHey2 エン
ハンサー活性化細胞の系譜は存在しない。
本申請研究では、⼼原基形成前期における Tbx5 および Tbx20 と、Hey2 エンハンサー活性の関係を解析することにより、両 T-box 転写因⼦による傍⼼臓形成領域の左⼼室筋前駆細胞分化の制御と、その破綻による⼼疾患発症機構を理解することを⽬的とした。
② 研究⽅法Ⅰ．⼼原基形成前期の Tbx20 発現細胞と Hey2 エンハンサー活性化細胞の局在関係解析
胎⽣ 7.5 ⽇の Hey2 エンハンサー-LacZ トランスジェニック (Tg) マウス胚（Ihara D et al.,Dev Biol. 2020）を⽤いて、RNAScope による Tbx20 mRNA と LacZ mRNA の同時染⾊により、⼼原基形成前期における Tbx20 発現細胞と Hey2 エンハンサー活性細胞の局在関係を解析する。
Ⅱ．Tbx5 ⽋失マウス胚における Hey2 エンハンサー活性化細胞の解析

Hey2 エンハンサー-LacZ Tg マウスと、共同研究者・⽵内純准教授より提供頂いた Tbx5 ⽋失マウス（Bruneau BG et al., Cell 2001）を交配して得られた胎⽣ 7.5 ⽇の⼼原基形成前期胚を⽤いて Xgal 染⾊を⾏い、Tbx5 ⽋失による Hey2 エンハンサー活性への影響を解析する。
Ⅲ．Tbx20 ⽋失マウス胚における Hey2 エンハンサー活性化細胞の解析

Hey2 エンハンサー-LacZ Tg マウスと⾃家作製した Tbx20 ⽋失マウス（Ihara D et al., Dev Biol.
2020）を交配して得られた胎⽣ 7.5 ⽇の⼼原基形
成前期胚を⽤いて Xgal 染⾊を⾏い、Tbx20 ⽋失による Hey2 エンハンサー活性への影響を解析する。
２）研究結果Ⅰ．⼼原基形成前期の Tbx20 発現細胞と Hey2 エンハ
ンサー活性化細胞の局在関係解析
⼼原基形成前期では、Tbx20 mRNA は⼼原基（⼀次⼼臓形成領域）・⼼原基内側（⼆次⼼臓形成領域）
・⼼原基吻側（傍⼼臓形成領域）に発現していた（図 4）。同じ胚で Hey2 エンハンサー活性は⼼−15−

図4：⼼原基形成前期におけるTbx20 発現とHey2 エンハンサー活性の関係

原基吻側の傍⼼臓形成領域にて Tbx20 発現と重複していた。
Ⅱ．Tbx5 ⽋失マウス胚における Hey2 エンハンサー活性化細胞の解析胎⽣ 7.5 ⽇の⼼原基形成前期での野⽣型胚およびTbx5 ⽋失マウス胚での Hey2 エンハンサー活性を LacZ レポーター発現を指標として解析した。
その結果、Tbx5 ⽋失により Hey2 エンハンサー活

図5：Tbx5 ⽋失胚でのHey2 エンハンサー活性性はほぼ消失していた（図 5）。
Ⅲ．Tbx20 ⽋失マウス胚における Hey2 エンハンサー
活性化細胞の解析
胎⽣ 7.5 ⽇の⼼原基形成期での野⽣型胚およびTbx20 ⽋失マウス胚での Hey2 エンハンサー活性を LacZ レポーター発現を指標として解析した。
その結果、Tbx20 ⽋失により Hey2 エンハンサー
活性はほぼ消失していた（図 6）。
図6：Tbx20 ⽋失胚でのHey2 エンハンサー活性３）考察
⼼原基形成前期において、Tbx20 発現は⼀次⼼臓形成領域・⼆次⼼臓形成領域・傍⼼臓形成領域の全ての⼼臓前駆領域で発現していた。
よって、
傍⼼臓形成領域の Hey2 エンハンサー活性も Tbx20
発現領域内に含まれている。Tbx20 ⽋失胚では Hey2 エンハンサー活性は消失することが明らかとなった。申請者らは以前に胎仔期（胎⽣ 8.5〜9.5 ⽇）の⼼室筋でにおいて Tbx20 が Hey2 エンハン
サーを活性化していることを報告しているが（Ihara D et al., Dev. Biol. 2020）、今回の解析により⼼臓発⽣の最も初期から Tbx20 は Hey2 エンハンサーの活性化に必須の上流因⼦であることが⽰された。
また、⼼原基形成期前期の Tbx5 ⽋失胚においても Hey2 エンハンサー活性はほとんど消失していた。⼼原基形成期前期において、⼀次⼼臓形成領域で発現する Tbx5 は傍⼼臓形成領域での Hey2
エンハンサー活性とはほとんど重複して局在していないため、Tbx5 はパラクライン的に機能する
下流のシグナル伝達因⼦を介して間接的に Hey2 エンハンサー活性を誘導している可能性がある。
別の可能性として、検出できていないレベルで傍⼼臓形成領域で Tbx5 が発現しており、Hey2 エン
ハンサーの活性化を誘導しているのかもしれない。Tbx5 は⼀次⼼臓形成領域の発⽣において必須の因⼦であり、加えて傍⼼臓形成領域の左⼼室筋前駆細胞での転写制御を⾏っているデータが得らえたことから、左⼼室筋発⽣のマスター因⼦であるといえる。
今回の解析により、Tbx5 および Tbx20 が傍⼼臓形成領域での左⼼室筋前駆細胞の遺伝⼦発現を制御することが明らかとなった。TBX5 は Holt-Oram 症候群の原因遺伝⼦でありそのハプロ不全により先天性⼼疾患を⽣じるが（Bruneau BG et al., Cell 2001）、その原因として Tbx5 が発現している⼀次⼼臓形成領域に加えて、傍⼼臓形成領域からの左⼼室筋分化に影響を及ぼしている可能性が⽰された。Tbx5、Tbx20 はどちらも Hey2 エンハンサー活性に必須であり、傍⼼臓形成領域の左⼼−16−室筋前駆細胞での遺伝⼦発現制御において重複した機能を担っていると考えらえる。しかし、どち
らか⼀⽅の⽋失のみで Hey2 エンハンサー活性が消失するということから、Tbx5 と Tbx20 を統合
した T-box 転写因⼦の発現閾値が遺伝⼦発現制御には重要なのかもしれない。現在、Tbx5 と Tbx20の⼆重ヘテロ⽋失マウスでの⼼臓表現型の解析を進⾏中であり、得られる結果によって左⼼室筋分化における Tbx5 と Tbx20 の機能的重複および発現閾値の重要性を直接的に証明可能であると考えている。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
第 46 回⽇本分⼦⽣物学会年会にて発表予定。
関連データを含めた論⽂を投稿準備中。

−17−

21-005

GH-IGF 系シグナル蛋⽩遺伝⼦変異が関与する成⻑障害の病態解明

代表研究者：鞁嶋 有紀（島根⼤学医学部⼩児科学教室）
共同研究者：和⽥ 啓介（島根⼤学医学部⼩児科学教室）
⼩林 弘典（島根⼤学医学部附属病院検査部）
⻤形 和道（島根⼤学医学部附属病院卒後研修センター）
⽵⾕ 健 （島根⼤学医学部⼩児科学教室）
伯野 史彦 （東京⼤学農学部）
⾼橋伸⼀郎 （東京⼤学農学部）
１）研究内容① 研究⽬的成⻑障害（低⾝⻑）は、⼩児科領域では⾮常に頻度の⾼い疾患であるが、約 8 割は原因が不明で未だに治療法がない。また、近年の網羅的な遺伝⼦解析研究より、成⻑障害に関与する原因遺伝⼦は明らかにされつつあるが、約 10%しか同定されておらず、成⻑障害研究はいまだに未開拓分野である。さらに、本疾患の診療において、遺伝⼦解析は⼀般的には⾏われていないため、本邦における遺伝⼦変異を起因とする成⻑障害の正確な頻度も未だに不明である。
本来、成⻑障害は、癌と同じく多因⼦遺伝である。遺伝⼦変異を起因とする成⻑障害の診断は、網羅的な遺伝⼦解析に加え詳細な機能解析および環境要因の探索を加えた包括的な研究により病態解明を⾏うことができる。しかし、世界でも成⻑障害の包括的研究を⾏い、正確な成⻑障害の診断を⾏える施設は限られている。
我々は、世界的にやられている⼿法とは別に、GH-IGF 系シグナル蛋⽩遺伝⼦に注⽬し、成⻑障
害との関連について検討し、軽微な成⻑障害患者の中に、これらの遺伝⼦変異による成⻑障害が含まれることを明らかにしてきた。本研究ではこれまでの経験を⽣かして、原因不明の成⻑障害患者に対して網羅的なエクソーム解析と SNP アレイ解析により得られた原因遺伝⼦の機能解析を⾏いながら、GH-IGF 系シグナル蛋⽩遺伝⼦変異が関与する成⻑障害の病態解明を⾏い、成⻑障害の診断および治療構築を⽬指す。
② 研究⽅法１．原因不明の−2.5SD を下回る特発性低⾝⻑もしくは SGA 性低⾝⻑患者で、他の既存の疾患（成⻑ホルモン分泌不全性低⾝⻑、ヌーナン症候群など）や微⼩⽋失症候群などが否定され、同意の得られた患者および両親の⾎液を採取し、DNA 抽出を⾏う。
２．抽出した DNA サンプルを⽤い、全エクソームシークエンスおよび SNP アレイ解析を⾏い、成⻑障害の原因遺伝⼦変異の同定を⾏う。探索する遺伝⼦については、PubCaseFinder(https://pubcasefinder.dbcls.jp/text2hpo)を⽤い、成⻑障害の原因となる遺伝⼦リストを作成、さらに、GH-IGF シグナル関連蛋⽩遺伝⼦（GHR, STAT3STAT5, IGF-1, IGF-2, IGFALS,−18−

IGFBP3, IGFBP5, IGF1R, IRS1, IRS2, PAPPA2 ）について、リストに載ってない場合は加えて、解析し、⾒出された変異を機能予測ソフト、データベースを⽤いて希少変異かの検討を⾏う。
３．病的変異が疑われた遺伝⼦を細胞導⼊し、機能解析を⾏う。病的変異が GH-IGF シグナル関連
蛋⽩遺伝⼦であった場合は以下の⽅法で⾏う。
・IGF1R, IRS1, IRS2 遺伝⼦変異：変異体および正常遺伝⼦を IGF-IR KO3T3-like 細胞（R-細胞）に導⼊し DNA 合成能、IGF-IRβ鎖および IRS1 および 2 の⾃⼰リン酸化能を評価する。
・IGFALS, IGFBP(1,3,5), PAPPA2 遺伝⼦変異：変異体および正常遺伝⼦を HEK293 細胞へ導⼊し、発現について確認する他、患者⾎清を⽤いウェスタンブロット法で変異蛋⽩の発現を⾏う。
・GHR､STAT5, STAT3 遺伝⼦変異：変異体および正常遺伝⼦を CHO 細胞へ導⼊し、GH の結合能および GH 刺激後の STAT5 のチロシンリン酸化について検討する。
・IGF1 遺伝⼦変異：タグ付き変異 IGF1 遺伝⼦を CHO 細胞へ導⼊してタンパク発現を検討し、フローサイトメトリー法で IGF1 受容体との結合能を検討する。
４．機能解析結果の結果、病的変異の可能性が⾼くなった場合、患者の線維芽細胞でもなるべく同様の機能解析を⾏い、病的変異かどうか検討する。その結果さらに、病的変異が疑わしい場合は、可能であれば Crisper cas９システムを⽤いて、ノックインマウスを作成し、ノックインマ
ウスの成⻑率などを検討し、成⻑障害の原因遺伝⼦かどうかの詳細な検討を⾏う。
２）研究結果島根⼤学医学部倫理委員会に本研究の認可を得、11 名に全エクソーム解析を⾏った。うち、現在6 名の結果が判明した（うち 5 名は現在解析中で結果は未定である）。なお、バリアント評価は、前述の成⻑障害原因遺伝⼦リストの遺伝⼦のうち、0.5％未満のレアバリアントについて抽出し、⾒出された変異を機能予測ソフト、データベースを⽤いて病的バリアントかどうかの評価を⾏った。6
名のうち 2 例に IGF1R 遺伝⼦の病的バリアントが検出され（c.953+2T>C, c.473_476dupCCCT）、
2 例ともスプライス部位あるいはフレームシフト変異であり、ACMG ガイドラインに照らし合わせても、本バリアントによる成⻑障害と予測され、IGF1R 異常症と考えられた。2 例とも⾎清 IGF1
値⾼値あるいは GH 頂値⾼値例であった。1 例に IRS1 遺伝⼦ VUS（c.2062G>A p.Ala688Thr）が同定された。本バリアントは、機能予測ソフト、データベースでは、Benign の評価であるが、これまでの私の研究の中で、機能予測ソフト、データベース上、Benign の評価の IRS1 遺伝⼦バリアント（p.Ser685_Ser686del）が患者線維芽細胞および組み込み細胞にて、IRS1 の発現の減少、IGF1 の⻑期刺激での IGF1 シグナル低下および増殖能の低下を起こすことを明らかにしてきた（図 1、2
論⽂投稿中）が、本バリアントは、このバリアントの近傍であり、本バリアントが成⻑障害をきたす可能性があると考え、現在共同研究者伯野先⽣とともに、本バリアントの機能解析を⾏っている
ところである。

−19−

図1

図2

３）考察
研究期間内には、エクソーム解析について、完了することができなかったが、エクソーム解析を完了した 6 例のうち明らかな病的バリアントを 2 例に同定し、IGF1R 異常症と考えられた。
成⻑障害の病態に、IGF1 ⾼値あるいは GH ⾼値を⽰した場合は IGF1R 異常症を念頭に置くべきであると考えられた。１例に認められた、IRS1 遺伝⼦の VUS については機能解析中ではあるが、あらたな成⻑障害の原因解明につながる可能性がある。本研究を通して、成⻑障害の原因として遺伝的素因の重要性、また単⼀遺伝性疾患の重要性がより明らかになった。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
Kawashima-Sonoyama Y, Hotsubo T, Hamajima T, Hamajma N, Fujimoto M, Namba N, Kanzaki
S. Various phenotypes of short stature with heterozygous IGF-1 receptor (IGF1R) mutations. Clin
Pediatr Endocrinol. 2022;31(2):59-67.
（機能解析後あらたに 論⽂および学会発表予定）−20−

21-006

エリスロポエチンの抗肥満・抗糖尿病作⽤の機序解明

代表研究者：杉本 哲 （京都府⽴医科⼤学⼩児科学）
共同研究者：⻄⽥ 望 （京都府⽴医科⼤学⼩児科学）
宮垣 知史（京都府⽴医科⼤学⼩児科学）
河辺 泰宏（京都府⽴医科⼤学⼩児科学)
１）研究内容① 研究⽬的
未熟児貧⾎、腎性貧⾎の治療薬であるエリスロポエチン（Erythropoietin:EPO）は造⾎作⽤以外に多様な⽣理作⽤を有し、その⼀つに抗肥満・抗糖尿病作⽤が報告されているが、その機序は完全には解明されてない。EPO が未熟児において臨床で汎⽤されていることからも、そのオフターゲ
ット効果の機序を解明し、⼩児肥満・メタボリック症候群で安全に使⽤できる新規薬開発につなげることの意義は⼤きい。申請者らは過去に、EPO が褐⾊脂肪組織（BAT: brown adipose tissue）の
β3 アドレナリン受容体（β3AR）の下流のシグナル伝達経路を活性化し、BAT 増殖と熱産⽣を促しエネルギー消費を亢進し抗肥満作⽤を導くことを発⾒した（Kodo, Sugimoto et al. PLOS ONE
2017）。
⾷品由来のオメガ脂肪酸より代謝合成される脂質メディエーター（LM: lipid mediator）は、シグナル伝達分⼦として特異的受容体を介し、様々な⽣理活性を⽰す。これまでの基礎/臨床研究によって LM が肥満・糖尿病における糖脂質代謝において重要な役割を持つことがわかっている（Masoodi et al. Biochim Biophys Acta, 1851(4):503-18, 2015）（Shamsi, Sugimoto, et al. Nat
Commun, 11, 1421, 2020）。BAT は熱産⽣を促進するのみならず、内分泌臓器として蛋⽩、脂質、
microRNA などを分泌し全⾝代謝に影響することが近年確⽴した概念となっている（Villarroya F etal. Nat Rev Endocrinol 2017）。申請者は Joslin Diabetes Center での留学期間に⾏った研究において（2017〜2021 年）、寒冷刺激によるβ3AR を介した BAT の活性化がオメガ 3 脂肪酸由来 12hydroxyeicosapentaenoic acid （12HEPE）分泌を促し、糖代謝を改善することを発⾒した（Leiria,
Sugimoto et al. Cell Metabolism 2019）。
また、
β3AR を介して同じくオメガ 3 脂肪酸由来の Maresin2 が肥満起因性の肝臓炎症を低下し、インスリン抵抗性改善を導くことを筆頭著者として報告した（Sugimoto et al. Nature Metabolism2022）。申請者は、これら 2017 年と留学先の研究を基盤に、仮説「EPO による BAT 活性化は、LM 分泌を促し、EPO の抗肥満・抗糖尿病作⽤を媒介する」を⽴てた。
本研究はその仮説を検証し EPO の抗肥満・抗糖尿病作⽤の新たな機序の⼀つを明らかとし、⼩児肥満・糖尿病患者への臨床応⽤につなげることを⽬的とする。
② 研究⽅法
１）4 週齢の C57BL6 雄性マウスに⾼脂肪⾷（high fat diet: HF, 60%kcal fat, Research Diet 社）−21−

を４週間与え⼩児肥満モデルマウスとする。HF に加えて⽣⾷を投与する群 (HFC 群)と EPOを投与する群（HFE 群）を設定する。EPO 投与量は過去の申請者も含めた過去の⽂献報告を参考とし、ヒトリコンビナント EPO（200IU/kg）を 1 週間のうち週 3 回腹腔内投与する。通常⾷に⽣理⾷塩⽔を投与する群（NC 群）も設定する。
２）体重、摂⾷量を 1 週間毎に測定する。
３）最終的に⼀晩絶⾷後に⾎糖値を tail カットにて測定し、⿇酔薬にて安楽死させる。⼼臓穿刺による⾎液採取後に遠⼼にて⾎漿を回収し、また、インスリン感受性臓器（BAT,⽩⾊脂肪、筋⾁、肝臓）の摘出を⾏い snap freezing した後に−80℃に保管する。
４）組織像の観察のため、各種臓器の⼀部をホルマリン固定し、パラフィン包理組織標本を作成し、抗 F4/80 抗体による免疫染⾊によって、マクロファージの浸潤の程度を評価する。
５）⾎中インスリン値、⾎中サイトカイン値（TNFa、レプチンなど）を ELISA 法にて測定する。
HOMA-IR（インスリン抵抗性）を算出する。
６）各種臓器の qPCR、Western blot を⾏い、12HEPE、Maresin2 を含めた LM 合成酵素に関わる酵素の遺伝⼦・蛋⽩発現量を評価する。
７）各種臓器のインスリンシグナル、炎症マーカーなどの mRNA、蛋⽩発現量を評価する。
８）臓器と⾎液検体のリピドミクス解析を⾏い 114 種の LM を網羅的に測定する。
９）Cre 依存性 CRISPR-Cas9 システムを⽤い LM 合成に必須の酵素を BAT 特異的にノックアウトしたマウス、または外科的に BAT を除去したマウスに EPO を投与し、LM ⽋損が EPO の効果に影響するか検証する。
10）EPO を投与したマウスから摘出した BAT が LM を放出するか Ex vivo にて検証する。
11）マウス・ヒト不死化褐⾊脂肪細胞に EPO を添加し細胞・培養液を採取し、LM 解析を⾏う。
２）研究結果Figure 1

8 週齢（解剖）時、HFC 群は NC 群に⽐較して、体重増加率が有意に⾼く、HFE 群は HFC 群よりも体重増加率が低下する傾向にあった（p=0.186）（Figure 1）。HFC 群は空腹時⾎糖値が NC 群に⽐べて有意に⾼く、HF 下において EPO 投与は空腹時⾎糖値に影響しなかった。HF 下において、EPO は BAT、精巣周囲⽩⾊脂肪（内臓脂肪）、⿏径部⽩⾊脂肪組織（⽪下脂肪）、肝臓、⾻格筋の重量に有意な変化を与えなかった。
内臓脂肪において、
HFE 群は HFC
群よりも F4/80 陽性細胞（マクロファージ)の数が少なかった（Figure 2）。

Figure 2

HF 下にて、BAT において EPO 投与
は脂質メディエーター合成関連酵素である Alox5、Alox15、Ptgs1、Ptgs2,
Ephx2 の遺伝⼦発現量に影響しなかったが、Alox12 の遺伝⼦発現量を増加した（P＝0.060）（Figure 3）
。

−22−

✱✱
✱✱✱

Figure 3

３）考察
本研究においては、先⾏研究（Kodo, Sugimoto et al. PLOS ONE 2017）よりも効果は減弱したものの EPO 投与によって体重増加率が低下する傾向にあった。本研究は先⾏研究と異なり、⾼脂肪⾷を世界標準である Research diet 社のものを⽤いて⾏ったことから飼料の脂肪酸組成などが異なり、⾼脂肪⾷を与えたマウス⾃体の体重増加が先⾏研究ほど顕著ではなく EPO の体重減少効果が控えめとなった可能性は考えられる。今後、飼料の給餌期間を延⻑しての検討も必要と考える。
肥満進⾏につれてマクロファージなどの免疫細胞が脂肪組織、肝臓などに浸潤し、インスリンシ
グナルを障害し、インスリン抵抗性の原因となることが知られている（Dalmas E et al. Trends
Immunol 2011）。EPO は⽩⾊脂肪重量に影響を与えなかったものの、マクロファージの浸潤を抑制
し、内臓脂肪において肥満起因性の炎症を低下する可能性が⽰唆された。
興味深いことに、EPO 投与は BAT の Alox12 発現量を増加させた。Alox12 は、先述したように
12HEPE 合成に必須の酵素であり、よって、BAT の 12HEPE 分泌が EPO の耐糖能改善作⽤を媒介する可能性がありえる。Alox12 は炎症収束性脂質メディエーターの⼀つである Docosahexaenoic
acid 由来 Maresin の合成酵素に必須の酵素でもある。Maresin は Maresin1 と Maresin2 の 2 種類がこれまでに同定されており、Maresin2 の合成は Ephx2 によって媒介されるが、EPO は Ephx2 の発現量に影響しなかったことから、EPO は Maresin1 合成を促進する可能性が考えられる。Maresin1
は肥満モデルマウス（⾷餌性や ob/ob マウス）において内臓脂肪炎症を低下させインスリン感受性を改善した報告（Martínez-Fernández et al. FASEB J 2017）や、マクロファージを標的として⾮ア
ルコール性脂肪性肝炎の改善を導いた報告がある（Han YH et al. J Clin Invest. 2019）ことから、
BAT から分泌された Maresin1 が⾎液循環に移⾏し、内臓脂肪のマクロファージに作⽤し抗炎症効果を導いた可能性も考えられる。現在、EPO 投与したマウスの BAT の網羅的脂質メディエーター
解析を依頼中であり、上述した研究⽅法を含めて、更なる検討をすすめる。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
なし。

−23−

21-007

ミトコンドリア機能異常症における⾄適栄養摂取のためのバイオマーカー探索研究−治療可能代謝疾患の個別化医療に向けて−

代表研究者：武内 俊樹（慶應義塾⼤学医学部⼩児科）
共同研究者：末松 誠 （慶應義塾⼤学医学部医化学教室）
⼩川 恵梨（慶應義塾⼤学医学部⼩児科）
１）研究内容① 研究⽬的新⽣児期発症の治療可能な先天性代謝異常症では、迅速な診断と治療開始が重要である。
⼀⽅で、特に重症新⽣児では⾮特異的な症状を呈し、臨床診断が困難であることが多い。
本研究では、治療可能な中⼼炭素代謝経路異常症の代表的疾患であるピルビン酸脱⽔素酵素複合体⽋損症について、迅速な分⼦遺伝学的診断と治療開始におけるマルチオミクス解析の臨床的有⽤性を検討した。
② 研究⽅法・対象患者
在胎 33 週 2,492g で出⽣し、脳室拡⼤を認めた⼥児。出⽣後から筋緊張低下があり約 1 か⽉間新⽣児集中治療室に⼊室した。著明な⾼乳酸⾎症、⾼ピルビン酸⾎症、⾼アンモニア⾎症、⾼アラニン⾎症を認めた。中⼼性無呼吸と四肢の痙性⿇痺、尿細管性アシドーシス、正球性貧⾎の進⾏を認めた。ピルビン酸脱⽔素酵素複合体⽋損症の診断に基づき、ビタミン B1 補充、続いてケトン⾷療法を⾏ったところ、貧⾎と無呼吸の改善を認めた。
・DNA および RNA の解析
両親から研究参加について書⾯で同意を得たのちに、両親と患者本⼈から末梢⾎の採⾎を⾏い、DNA および RNA を抽出した。短鎖シーケンサー型の次世代シーケンサーを⽤いて全ゲノム解析を⾏った。
・代謝物の解析
治療開始前、ビタミン B1 開始後、ケトン⽐ 2：1 のケトン⾷開始後 7 ⽇⽬、ケトン⽐ 3：1 のケ
トン⾷に変更後 10 ⽇⽬の各時点において、患者の尿、髄液、動脈⾎を採取した。すぐに-80℃に凍結、代謝物を抽出し、Agilent 社の CE/ESI/MS を⽤いて、解糖系からクエン酸回路に⾄る中⼼炭素代謝経路およびアミノ酸等を中⼼としたメタボローム解析を⾏った。
２）研究結果・ゲノム解析
次世代シーケンサーから得られた粗データをイルミナ社の超⾼速集積回路とバリアント解釈のための⼈⼯知能で処理した結果、 PDHA1 遺伝⼦にヘミ接合性アミノ酸置換変異（PDHA1:−24−

chrX(GRCh37): g.19369472G > T, NM_001173454.1: c.479G >T, p.(Gly160Val)）を新⽣突然変異として認めた。
臨床経過と合わせて、ピルビン酸脱⽔素酵素複合体⽋損症と確定診断した。
・トランスクリプトーム解析
健常者である⺟親の末梢⾎から抽出した RNA を⽤いて、PDHA1 の転写産物が末梢⾎中に発現していることを確認した。続いて、患者の末梢⾎から抽出した RNA 解析では、変異のないアリルを持つ mRNA のみが検出された。不活化に偏りがない場合には、不活化を逃れた X 染⾊体ア
リルに存在する遺伝⼦変異が致死性を有することの証左と考えた。
・メタボローム解析
ビタミン B1 内服治療開始後から、尿中総アミノ酸量の減少を認めた。N アセチルグルコサミン
やベータ 2 ミクロアルブミンなどの尿細管機能を反映するバイオマーカーと動態が⼀致していた。
炭⽔化物摂取制限とケトン⾷療法開始後から、臨床的には⾼乳酸⾎症と⾼ピルビン酸⾎症が解消
し、貧⾎も改善、無呼吸発作も減少した。同時に、⾎液および髄液のメタボローム解析では、クエン酸回路の総基質量の増加、⾎清・髄液中のグルタミン酸の増加を認めた。
３）考察
全ゲノム解析とトランスクリプトーム解析を組み合わせた網羅的解析系により、迅速に候補遺伝
⼦変異の同定とその病的意義の判定を⾏うことができた。さらに、尿、髄液、⾎液のメタボローム
解析により、ビタミン B1 療法およびケトン⾷療法に伴う代謝変化を詳細に明らかにすることができた。すなわち、ビタミン B1 治療により、臨床症状の改善に先⾏して尿中へのアミノ酸漏出が減
少した。また、ケトン⾷治療のケトン⽐を 3：1 まで増加させたところで、初めて髄液中にグルタミン酸が検出された。グルタミン酸は、アミノ酸代謝と炭素代謝をつなぐハブとしての役割があり、また精神疾患等では髄液中のグルタミン酸が低下することが知られている。髄液中のグルタミン酸
は、ピルビン酸脱⽔素酵素⽋損症をはじめとする中⼼炭素代謝経路異常症における神経機能回復のバイオマーカーである可能性が⽰唆された。治療により、クエン酸回路の各代謝物の量は変化しな
かったが、クエン酸回路全体の基質量が増加した。
本研究を通じて、メタボローム解析で検出された代謝変化が診断治療のバイオマーカーとなる可能性が⽰唆された。治療可能な先天性代謝異常症の迅速な診断治療のために、全ゲノム解析、トランスクリプトーム解析、メタボローム解析を組み合わせた acute multi-omics は有⽤であることが⽰された。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
英⽂論⽂
１．Eri Ogawa, Takako Hishiki, Noriyo Hayakawa, Hisato Suzuki, Kenjiro Kosaki, Makoto Suematsu,
Toshiki Takenouchi (corresponding author). Ketogenic diet in action: Metabolic profiling of
pyruvate dehydrogenase deficiency. Mol Genet Metab Rep. 2023 Mar 20;35:100968. doi:
10.1016/j.ymgmr.2023.100968. (PMID: 36974075)

−25−

学会発表
１．⼩川恵梨、菱⽊貴⼦、早川典代、⾼橋哲朗、鈴⽊寿⼈、⼩崎健次郎、末松誠、武内俊樹、⾼橋孝雄「治療可能な先天性中⼼炭素代謝経路異常症におけるマルチオミクス解析の有⽤性」
第 64 回⽇本⼩児神経学会学術集会 ⼀般演題（⼝演）代謝性疾患１
２．武内俊樹 「Rapid Genetic Diagnosis in Sick Neonates in Japan」⽇本⼈類遺伝学会第 67 回
⼤会 シンポジウム 2022 年 12 ⽉ 17 ⽇
３．武内俊樹 「新⽣児集中治療室における精緻・迅速な遺伝⼦診断の現状と展望」第 45 回⽇
本⼩児遺伝学会学術集会 教育講演 2023 年 1 ⽉ 28 ⽇
４．武内俊樹 「新⽣児集中治療室における精緻・迅速な遺伝⼦診断」第 349 回新⽣児診療相互援助システム (NMCS) 例会 特別講演 2023 年 2 ⽉ 17 ⽇

−26−

21-009

学⼒および⾮認知能⼒に影響を与える乳幼児期因⼦の解明

代表研究者：⻄⼭ 将広（神⼾⼤学⼤学院 ⼩児科学）
１）研究内容① 研究⽬的⼦どもの発達は、新⽣児期、乳児期、幼児期、学童期と連続的にすすみ、それぞれの発達段階はそれに先⽴つ発達段階の影響を受ける。欧州のコホート研究では、乳幼児期の発達マイルストーン
到達時期が、学童期の認知能⼒と関連することが報告されているが（Murray GK et al. Ann Neurol
2007., Peyre, H et al. Eur J Paediatr Neurol 2017）、本邦では学童期の認知能⼒や学⼒と乳幼児期因⼦との関連は明らかとなっていない。さらに、不登校やこころの問題が増加する現代社会において、学⼒や認知能⼒などの数値化できる能⼒ではない⾮認知能⼒が注⽬されている。⾮認知能⼒には意欲を持って取り組む⼒、⾃⼰肯定感、他者を思いやる⼒などがあり、社会を⽣き抜くためには認知能⼒や学⼒よりも重要とされるが、⾮認知能⼒と乳幼児期因⼦との関連も不明である。
本研究では、周産期の状況、乳幼児期の発達段階や⽣活習慣、学童期の学⼒や⾮認知能⼒を縦断的に追跡したコホートデータを解析することで、児童の学⼒や⾮認知能⼒に影響する乳幼児期因⼦の解明を⽬指す。
② 研究⽅法尼崎市の出⽣、乳幼児期、就学期までの⼈⼝ベースの縦断的コホートを後⽅視的に解析した。まず、尼崎市より提供されたデータより、周産期の状況、乳幼児健診の情報、学童期の学⼒試験や個別アンケートの情報などを抽出し、固有 ID により連結したデータセットを作成した。対象は、2011
年 4 ⽉〜2012 年 3 ⽉または 2013 年 4 ⽉〜2014 年 3 ⽉に尼崎市で出⽣した児のうち、3 歳児健診
および⼩学 1 年⽣の学⼒試験の情報がある者とした。該当期間に出⽣した 8,092 ⼈のうち、⼩学校就学までフォローされ、学⼒試験の情報がある者は 4,395 ⼈であった。
児童の学⼒や⾮認知能⼒への影響を検証するための乳幼児期因⼦は、性別、在胎週数、出⽣⽉、出⽣時の⺟年齢、経済状況、3 歳児健診での精神発達の通過状況、3 歳時点での⽣活習慣（就寝時
刻、テレビや電⼦メディアの視聴時間）とした。出⽣⽉は 4〜9 ⽉⽣まれ、10〜3 ⽉⽣まれの 2 段階に分類した。⺟の出産時年齢は 20 歳未満、20〜34 歳、35 歳以上の 3 段階に分類した。性別、経済状況、3 歳児健診での精神発達の通過状況、3 歳時点での⽣活習慣もそれぞれ 2〜4 段階のカテゴリーに分類した。児童の学⼒評価項⽬を⼩学 1 年⽣での国語の学⼒とし、児童の⾮認知能⼒評価項⽬を⼩学 1 年⽣での⾃⼰評価に基づく勤勉性とした。勤勉性は「じぶんには、よいところがあるとおもいますか」という質問への選択式の回答で判定した。
解析１）国語の学⼒を⽬的変数として、前述の乳幼児期因⼦を説明変数として、単変量および多変量解析を⾏った。
解析２）勤勉性を⽬的変数として、前述の乳幼児期因⼦を説明変数として、単変量および多変量−27−

解析を⾏った。
統計解析は、線形回帰モデル、ロジスティック回帰分析を⾏い、統計学的有意⽔準を P 値＜0.05とした。
２）研究結果多変量解析により、性別、出⽣⽉、出⽣時の⺟年齢、経済状況、3 歳児健診での精神発達の通過状況、3 歳時点での⽣活習慣（就寝時刻、テレビや電⼦メディアの視聴時間）は国語の学⼒との関連を認めた（表 1）。
表 1：国語の学⼒と乳幼児期因⼦との関係
単回帰分析(n= 4395)
性別
男⼥
在胎週数 ( 週)
22-32
33-36
37-43
出⽣ ⽉
4-9⽉
10-3⽉
出⽣ 時の⺟ 年齢 ( 歳)
<20
20–34
≧35
経済状況
就学援助 保護なし
就学援助 準保護
就学援助 保護
精神発達, 3 歳
チェックなしチェックあり就寝時刻, 3 歳
18:00–20:00
21:00
22:00
≧23:00
テ レ ビ 視聴 ( 時間) , 3 歳
<2
2–3
≧4

重回帰分析
(n= 3420)(Intercept) 65.65
6.26

0.42
0.59

<0.001<0.0010 (Reference)
6.31

–7.08
–1.58
(Intercept) 68.84

3.43
1.5
0.31

0.039
0.289
<0.001–5.58–1.73
0 (Reference)(Intercept) 71.31
–5.33

0.42
0.6

<0.001<0.001(Intercept) 55.6
12.59
15.33

2.57
2.6
2.65

(Intercept) 70.14–7.61–16.780.65<0.001

3.8
1.61

0.143
0.283

0 (Reference)
–6.54

0.65

<0.001<0.001<0.001<0.0010 (Reference)
8.42
11.23

2.6
2.66

0.001
<0.001

0.32
0.87
1.96

<0.001<0.001<0.0010 (Reference)–6.11–15.120.97
2.19<0.001<0.001(Intercept) 69.19–13.560.3
1.64<0.001<0.0010 (Reference)
–11.2

1.76

<0.001(Intercept) 71.18
–1.86
–2.90
–8.65

0.88
0.98
1.01
1.46

<0.001
0.059
0.004<0.0010 (Reference)
–2.24
–3.03
–6.95

1.06
1.09
1.6

0.034
0.005
<0.001(Intercept) 70.73
–2.31
–4.24

0.57
0.7
0.95

<0.001<0.001<0.0010 (Reference)
–1.75
–2.75

0.75
1.02

0.007
<0.001

多変量解析により、性別、経済状況、3 歳時点での⽣活習慣（就寝時刻）は勤勉性との関連を認めた（表 2）。
３）考察
本研究では、周産期、乳幼児期から学童期まで縦断的に分析することで、周産期の状況、乳幼児期の環境がどのように学⼒や⾮認知能⼒と関連するかが明らかとなった。
性別、在胎週数、出⽣⽉などの周産期の状況は出⽣後には変えられない。⼀⽅で、睡眠やメディ
ア視聴などの乳幼児期の環境は変えることができる。本研究では、⼩学校１年⽣での国語の学⼒と乳幼児期の⽣活習慣（就寝時刻やメディア視聴の⻑さ）との関連を認めた。さらに、乳幼児期の就寝時刻が早いほど、⼩学校１年⽣での勤勉性が⾼くなる可能性も⽰唆された。本研究の結果から、−28−

表 2：勤勉性と乳幼児期因⼦との関係

性別⼥
男
在胎週数 ( 週)
22-32
33-36
37-43
出⽣ ⽉
4-9⽉
10-3⽉
出⽣ 時の⺟ 年齢 ( 歳)
<20
20–34
≧35
経済状況
就学援助 保護なし
就学援助 準保護
就学援助 保護
精神発達, 3 歳
チェックなしチェックあり就寝時刻, 3 歳
18:00–20:00
21:00
22:00
≧23:00
テ レ ビ 視聴 ( 時間) , 3 歳
<2
2–3
≧4

勤勉性 低いn= 450 (11.0% )勤勉性 ⾼ いn= 3637 (89.0% )オッ ズ ⽐ （ 単変量解析）

オッ ズ ⽐ （ 多変量解析）

171 (8.5%)
279 (13.5%)

1846 (91.5%)
1791 (86.5%)

1 (Reference)
1.68 (1.38–2.06)

1 (Reference)
1.69 (1.34–2.12)

2 (6.5%)17 (9.9%)431 (11.1%)

29 (93.5%)
155 (90.1%)
3452 (88.9%)

0.55 (0.09–1.84)
0.88 (0.51–1.42)
1 (Reference)

0.75 (0.12–2.61)
0.73 (0.37–1.32)
1 (Reference)

222 (10.5%)228 (11.6%)

1899 (89.5%)
1738 (88.4%)

1 (Reference)
1.12 (0.92–1.37)

1 (Reference)
1.21 (0.97–1.53)

6 (10.7%)
270 (11.3%)
82 (10%)50 (89.3%)
2120 (88.7%)
740 (90%)

1 (Reference)
1.06 (0.49–2.79)
0.92 (0.41–2.46)

1 (Reference)
1.12 (0.49–3.03)
0.94 (0.40–2.60)

376 (10.9%)56 (10.3%)
18 (18.8%)3073 (89.1%)
486 (89.7%)
78 (81.3%)

1 (Reference)
0.94 (0.69–1.26)
1.89 (1.08–3.11)

1 (Reference)
0.81 (0.56–1.14)
2.02 (1.07–3.61)

431 (10.9%)
19 (14.4%)3524 (89.1%)
113 (85.6%)

1 (Reference)
1.37 (0.84–2.26)

1 (Reference)
1.21 (0.67–2.05)

33 (7%)
214 (11.3%)
167 (11.5%)
36 (13.7%)

437 (93%)1682 (88.7%)
1291 (88.5%)
227 (86.3%)

1 (Reference)
1.68 (1.17–2.51)
1.71 (1.18–2.57)
2.10 (1.27–3.47)

1 (Reference)
1.99 (1.29–3.21)
2.16 (1.39–3.51)
2.34 (1.29–4.27)

124 (10.8%)243 (11%)75 (12%)1024 (89.2%)
1967 (89%)
552 (88%)

1 (Reference)
1.02 (0.81–1.29)
1.12 (0.82–1.52)

1 (Reference)
0.94 (0.72–1.22)
1.06 (0.75–1.49)

乳幼児期の⽣活習慣と将来の学⼒および⾮認知能⼒が関連することが⽰唆された。しかしながら、本研究の結果だけで因果関係として「⽣活習慣を整えることで学⼒および⾮認知能⼒が向上する」
かどうかは不明であるため、今後の研究課題としたい。
少⼦化の進む我が国において、⼩児の健やかな育ちはますまず重要となっている。⾃⼰肯定感・
勤勉性・困難の克服・思いやりを伴う健全な育ちへと導くための⼿がかりとして、本研究の成果は⼩児保健分野の向上に貢献することが期待される。将来的には、⾏政と協⼒することで、『健全な育ちと関連する乳幼児期の⽣活習慣の啓蒙活動が、実際に学童期の⾃⼰肯定感向上や不登校減少に寄与するか』の実証実験に発展させることが可能となる。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
１）⻄⼭ 将広、徳元 翔⼀、⼭⼝ 宏、冨岡 和美、野津 寛⼤、永瀬 裕朗. 幼児期の⽣活習慣と⼩学
1 年⽣の学⼒との関連 3 歳時点での就寝時刻が遅いと学⼒が低下する. 第 125 回⽇本⼩児科学会学術集会２）⻄⼭ 将広、京野 由紀、川村 葵、⽼川 静⾹、徳元 翔⼀、⼭⼝ 宏、冨岡 和美、野津 寛⼤、
永瀬 裕朗. 3 歳時の就寝時刻または睡眠時間と⼩学 1 年⽣の学⼒との関連：尼崎市の⼈⼝ベースの研究. 第 65 回⽇本⼩児神経学会学術集会−29−21-013

市中発症⼩児敗⾎性ショックの疫学調査−実情に基づいた⼩児救急医療体制の提唱に向けて−

代表研究者：三浦 慎也（帝京⼤学⼤学院公衆衛⽣学研究科）
共同研究者：道端 伸明（千葉県がんセンター研究所）
１）研究内容① 研究⽬的近年、全国規模の電⼦カルテデータベースの中から、データベースに適合した形に修正した敗⾎症の定義を⽤いることで、全国での敗⾎症のサーベイランスが可能となり、それを⽤いた⼤規模な記述研究が成⼈領域では広く⾏われている。この⼿法は、学会主導のデータベースで得られる⼀部の⾼度医療機関の診療情報だけでなく、全国の急性期病院の診療情報を含むことから、⾼い悉皆性と実社会を結果に反映しえることが強みである。しかしながら、⼩児敗⾎症での本⼿法の適⽤は殆どなく、その結果、⼩児集中治療室以外での⼩児敗⾎症の実態はまだ明らかにされていない。そこ
で、本研究では、この敗⾎症サーベイランス法によって、死亡リスクが⾼いとされる敗⾎症⼩児の抽出精度を、死亡予測能の観点から評価し、また、このサーベイランス法の臓器障害の基準に改善の余地があるかどうかを評価した。
② 研究⽅法2019 年に Pediatrics 誌で提唱された⼩児敗⾎症サーベイランス法を利⽤し、リアルワールドデー
タ社データベース（⽇本の 200 以上の急性期病院を含む⼊院患者データベース）から、⼩児敗⾎症患者を抽出した。具体的な患者抽出法としては、2014 年から 2021 年までに⼊院し、⾎液培養検査を受け、4 ⽇以上の抗菌薬治療を受けた 21 歳以下の重症感染症⼩児を抽出した。これらの重症感染症を持つ⼩児患者のうち、臓器障害の有無により、敗⾎症⼩児と⾮敗⾎症⼩児に分類した。臓器障害の評価は、呼吸、循環系、中枢神経系、肝臓、腎臓、凝固系の６項⽬を⽤いて、患者年齢に応じた正常値に基づいて⾏った。主要アウトカムは院内死亡とし、敗⾎症診断、臓器障害数、および修正された敗⾎症診断による、院内死亡の予測能を評価した。
予測能の評価には、感度、特異度、および area under the receiver operating characteristic curve（AUC）を使⽤した。ロジスティック回帰モデルを使⽤して、共変量を調整した上で、臓器障害数
別の院内死亡率を推定した。共変数として、年齢、性別、および院内発症の感染症を含めた。変数
増減法を⽤いて最終モデルに使⽤する共変量を選択した。臓器障害基準の修正案としては、i）肝障害を除外する、ii）肝障害の指標としてのビリルビンをアラニントランスアミナーゼに置き換える、
iii）凝固系障害の指標としての⾎⼩板数をプロトロンビン時間に置き換える、iv）乳酸値を含める、といった４つの⽅法を試みた。解析は STATA 17 を⽤いて⾏った。

−30−２）研究結果
2-1）患者の特徴対象となった 6,553 例の重症感染症⼩児のうち、875 例（13.4％）が敗⾎症の基準を満たした（図 1）。6,553 ⼈の⼩児の年齢中央値は 3 歳（四分位範囲（IQR）は 1〜8 歳）で、692 ⼈（10.6％）が 1 つ以上の基礎疾患を有していた。最も多い基礎疾患は神経筋疾患（142 例、2.2％）、⼼⾎管疾患（139 例、2.1％）、および悪性腫瘍（123 例、1.9％）だった。敗⾎症⼩児 875 ⼈のうち、207 ⼈（23.7％）が院内で発症した敗⾎症だった。⼀⽅、⾮敗⾎症⼩児 5,678 ⼈のうち、1,103 ⼈（19.4％）
が院内発症の感染症だった。

図１：患者フロー

死亡率の予測院内死亡率は、敗⾎症⼩児では 7.2％（875 例中 63 例）、⾮敗⾎症⼩児では 0.2％（5,678 例中 12例）だった。敗⾎症診断による院内死亡率の判別は、感度 0.84、特異度 0.87 だった。院内死亡率
は、臓器機能障害の数が増えるにつれて上昇した。0 つの臓器障害では死亡率 0.2％、1 つの臓器障害で 3.4％、2 つの臓器障害では 12.7％、3 つの臓器障害では 20.9％、4 つの臓器障害では 33.3％、
5 つの臓器障害では 50.0％だった（図 2）。臓器障害数による院内死亡予測の AUC 値は 0.88（95％信頼区間: 0.84〜0.93）だった。共変量で調整した多変量ロジスティック回帰モデルに基づく、臓器障害数に応じた推定院内死亡率（95％信頼区間（CI））は以下の通りでだった：0 臓器障害、0.0％（0.0〜0.0％）; 1 臓器障害、3.9％（1.9〜5.9％）; 2 臓器障害、13.2％（7.1〜19.3％）; 3 臓器障害、26.5％（13.3〜39.7％）: 4 臓器障害、39.8％（16.7〜62.9％）; 5 臓器障害、61.3％（13.8〜100.0％）。

−31−図 2：臓器障害数と死亡率

⿊い菱形は観察された実死亡率を⽰す。
丸印は、共変量調整後の推定死亡率と 95％信頼区間を⽰す。
各臓器障害別の死亡率
敗⾎症の⼩児 875 ⼈のうち、最も多かったのは肺障害をもつ 531 ⼈（60.7％）で、次いで⼼⾎管障害をもつ 232 ⼈（26.5％）、凝固系障害を持つ 198 ⼈（22.6％）だった。腎障害は 188 ⼈（21.5％）、
肝障害は 117 ⼈（13.4％）に認められた。臓器障害の種類別では、⼼⾎管障害を持つ⼩児の死亡率が最も⾼く、20.7％だった。次いで凝固系障害と腎障害の死亡率がそれぞれ 10.1％と 9.6％だった。
肺障害（8.3％）および肝障害（8.5％）を持つ⼩児の死亡率は、敗⾎症の⼩児全体の死亡率（7.2％）とほぼ同じだった（図 3）。

図 3：敗⾎症⼩児 875 ⼈における臓器障害の種類による死亡率−32−

臓器障害基準の修正案
肝障害の基準としてビリルビンの替わりにアラニントランスアミナーゼを⽤いた場合、敗⾎症診
断の院内死亡率に対する感度は 0.88、特異度は 0.86 で、臓器障害数に基づく AUC 値は 0.90（95％CI：0.86〜0.94）であり、精度の上昇がみられた。他の修正案では、これらの精度の変化はわずかだった。ビリルビンを除いた場合（感度 0.84、特異度 0.89、AUC 値 0.88（95％CI：0.84〜0.93））、
⾎⼩板数をプロトロンビン時間に置きた場合（感度 0. 84、特異度 0.89、AUC 値 0.88（95％CI：
0.84〜0.93））、乳酸値を基準に加えた場合（感度 0.84、特異度 0.86、AUC 値 0.88（95％CI：0.83〜0.92））だった。
３）考察200 以上の全国の急性期病院を含むデータベースにおいて、⼩児敗⾎症サーベイランス法を利⽤して、重症感染症⼩児の中から、⾼い死亡リスクを有する敗⾎症⼩児を抽出することに成功した。
敗⾎症診断および臓器障害数は院内死亡率と強く関連することが確認された。
以前の研究では、⼩児臓器障害（pSOFA）スコアまたは臨床的な⼩児敗⾎症の国際定義を⽤いて敗⾎症⼩児を抽出したものがある。しかしながら、これらの⽅法は詳細な患者の病状やバイタルサ
インに関する情報を必要とするが、これらの情報は診療データベースには記録されていない、または記載がある場合も不正確であることが多く、全国的な⼩児敗⾎症の報告はこれまで困難であるとされてきた。そこで、私たちは、データベースに適合した形に修正が⾏われている⼩児敗⾎症サーベイランス法を利⽤し、全国の様々な規模の急性期病院で⼊院診療を受けた敗⾎症⼩児を抽出した。
本研究のような⼤規模な適応はこれまでになく、この研究が世界初となる。敗⾎症診断の死亡予測における感度は 0.84、特異度は 0.87 であり、本サーベイランス法の重症感染症⼩児における有⽤性が⽰唆された。
しかしながら、注意すべき点として、⾼い感度や特異度が必ずしも⾼い陽性的中率や陰性的中率を意味するわけではないことがある。つまり、それはコホートにおける死亡リスクに依存する。例
えば、⾼所得国の救急外来を受診した⽣来健康な⼩児を多く含む死亡リスクの低いコホートでは、
陽性的中率は低くなる。⼀⽅で、低所得国での敗⾎症⼩児や、複数の基礎疾患を持つ⻑期⼊院⼩児などを多く含む死亡リスクが⾼いコホートでは、陽性的中率は⾼くなると考えられる。
過去の pSOFA スコアを⽤いた死亡予測の精度に関する⼆つの研究では、
AUC 値がそれぞれ 0.83と 0.94 であった。われわれの研究では、より簡略化された臓器障害基準を⽤いる中で、AUC 値は0.88 であり、同等の死亡予測精度があることが⽰された。さらに、本研究で⽤いた⼿法は、診療上で電⼦カルテに⾃動的に蓄積される臨床情報に基づいており、敗⾎症診断のアラートを電⼦カルテが⾃動で発することも可能である。それにより、診療補助や、セーフティーネットシステムの構築への可能性があると考えられる。
私たちは、臓器障害基準の修正案を⽐較検討し、肝障害の基準をビリルビンからアラニントラン
スアミナーゼに変更した場合に、死亡予測精度が改善することを⽰した。今後も研究を進め、精度のより⾼い臓器障害基準の探索が重要と考えられる。
本研究にはいくつかの限界がある。データベース内の情報の制限から、死亡予測精度を従来使⽤されている他の基準（pSOFA スコアや⼩児敗⾎症の国際定義）と⽐較することができなかった。し−33−

かしながら、本研究の感度と特異度は、過去の研究に⽐較して遜⾊ない結果だった。また、私たちの研究の患者抽出法が、臨床診療の現場での使⽤できるとは⾔えない。敗⾎症の診療においては、早期診断と早期治療が最優先であるために、臨床診療においては従来の⼩児敗⾎症の国際基準を⽤いることが妥当であることに変わりはない。当研究⼿法は、⼩児敗⾎症を集団としてモニタリング
することを⽬的としているために、その⽬的が異なることを留意するべきである。
結論
急性期病院に⼊院した重症感染症⼩児を対象とし、電⼦カルテ情報に基づく本サーベイランス法
により、⾼い死亡リスクの敗⾎症⼩児を効果的に抽出することに成功した。本研究で⽤いた敗⾎症
診断と臓器障害数が、院内死亡率に対して⾼い予測精度を持つことが⽰された。臓器障害基準の修正案に関しては今後さらなる検討が望ましい。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など
本 研 究 内 容 は 、 Journal of Infection and Chemotherapy 誌 か ら 出 版 さ れ た (doi: 10.1016/
j.jiac.2023.11.016)。研究成果は、第 127 回⽇本⼩児科学会学術集会（2024 年 4 ⽉福岡）
、第 51 回
⽇本集中治療医学会学術集会（2024 年 3 ⽉、札幌）で発表予定である。

−34−

21-014

診療情報および学校健診情報データベースを⽤いた
児童思春期の神経性やせ症に関連する要因の検証

代表研究者：福屋 吉史（東邦⼤学医学部 精神神経医学講座）
１）研究内容今回、診療情報および学校健診情報データベースを⽤いた児童思春期の神経性やせ症に関連する要因を検証するにあたって、診療情報データベースを⽤いる研究として、①児童思春期の神経性やせ症の発症に関連する要因に関する研究と②治療効果と予後に関する研究、また学校健診情報デー
タベースを⽤いる研究として③学齢期の児童の体重変化に関する研究を想定した。だが、診療情報
データベースを⽤いる研究のうち②に関しては、解析可能な対象者が少なかったため、検証が出来なかった。また、学校健診情報データベースを⽤いる研究については、研究期間内の実現可能性が限定的であったため、学校健診情報データベースの提供は受けなかった。そのため、本研究では、提供を受けた診療情報データベースを⽤いて、①児童思春期の神経性やせ症の発症に関連する要因に関する研究のみを実施したため、その結果について報告する。
① 研究⽬的
神経性やせ症は、思春期に好発する精神疾患の⼀つであるが、成⼈以降も慢性的に経過することが多く、経済的な⾯も含めて、個⼈だけでなく、社会に与える影響は⼩さくない。神経性やせ症がもたらす影響を踏まえると、神経性やせ症の発症を予防していくことが必要であると考えられるが、現在までに有効な予防⽅法は確⽴されていない。そのため、神経性やせ症の発症に関連する要因を明らかにしていくことが喫緊の課題となっている。
2020 年から新型コロナウィルス感染症が世界的に流⾏する中で、⽶国、カナダ、オーストラリア
およびヨーロッパ諸国から、新型コロナウィルス感染症の流⾏後より、若年の神経性やせ症の患者数が経時的に増加していることが報告されている。だが、現在までにアジア地域での若年の神経性やせ症の患者数の変化については明らかになっていない。
本邦では、2020 年 1 ⽉から新型コロナウィルス感染症が全国的に広まり、外出の⾃粛や学校閉鎖などの対策が⾏われた。学校に通う⼦どもにとっては、新型コロナウィルス感染症が流⾏してから、⾃宅でのオンライン授業や学外活動の中⽌などによって、⽣活様式が⼤幅に変化することになった。
そのような⽣活様式の変化は、他の先進諸国でも同様に⽣じていることを踏まえると、本邦においても若年の神経性やせ症の患者数が増えている可能性が考えられた。これまでに本邦では、若年の神経性やせ症の患者数が増加しているという横断的な調査報告はあるが、新型コロナウィルス感染症の流⾏後の患者数の変化を経時的に実証した研究はない。そこで本研究の⽬的は、診療情報デー
タベースを⽤いて、新型コロナウィルス感染症の前後における 10 代の神経性やせ症の患者数の変化を明らかにすることを⽬的とする。

−35−

② 研究⽅法
リアルワールドデータ株式会社から提供を受けた⼤規模診療データベース（リアルワードデータ
ベース：Real World Data [RWD] database）を⽤いて、同データベースに登録している医療機関の⼩児科、⼼療内科および精神科で、神経性やせ症（ICD-10 分類: F50.0）と新規に診断された 7 歳〜19 歳までの患者を対象とした。また、RWD データベースに登録された医療機関のうち、2017 年
1 ⽉以前から同データベースに登録し、および 2022 年 1 ⽉まで継続して診療データが更新されている医療機関を対象とした。そのため、2017 年 2 ⽉以降に同データベースに登録した医療機関および 2021 年 12 ⽉までに診療更新が中断している医療機関は除外した。
そこで、本研究では新型コロナウィルス感染症の流⾏前後における上記対象患者数の経時的な評価をするために分割時系列解析（Interrupted time series analysis）を⾏った。本邦では、2020 年 3
⽉から 5 ⽉までの学校閉鎖以降、⼦どもの⽣活様式が⼤幅に変化していることから、その⽣活様式の変化が神経やせ症の発症に与える影響を考慮するために、全国的に学校閉鎖が⾏われた 2020 年
3 ⽉以前を新型コロナウィルス感染症の流⾏前、同年 5 ⽉以降を新型コロナウィルス感染症の流⾏後と定義した。そのため、①2017 年 1 ⽉から 2020 年 2 ⽉までの期間（38 か⽉）と②2020 年 3 ⽉から 2022 年 1 ⽉までの期間（23 か⽉）に新規に神経性やせ症と診断された若年者の患者数の経時的な変化を、ポアソン回帰分析を⽤いて⽐較した。
２）研究結果新型コロナウィルス感染症の流⾏前の期間（2017 年 1 ⽉から 2020 年 2 ⽉まで）に神経性やせ症と診断された 7〜19 歳までの患者数は 41 ⼈（1.08 ⼈/⽉）で、新型コロナウィルス感染症の流⾏後の期間（2020 年 3 ⽉から 2022 年 1 ⽉まで）に同様に診断された患者数は 34 ⼈（1.48 ⼈/⽉）であった。男⼥別では、男性が新型コロナウィルス感染症の流⾏前が 1 ⼈（0.03 ⼈/⽉）で、流⾏後が 5
⼈（0.22 ⼈/⽉）に対して、⼥性が流⾏前で 40 ⼈（1.05 ⼈/⽉）に対して、流⾏後が 29 ⼈（1.26 ⼈/⽉）で、
両期間ともに総患者数は⼥性が多かった。
また新型コロナウィルス感染症の流⾏の前後で、男⼥ともに 1 か⽉あたりの患者数の増加を認めた。年齢別では、神経性やせ症と診断された 7〜14歳の患者数が、新型コロナウィルス感染症の流⾏前後において、15〜19 歳の患者数よりも多かった。特に 7〜14 歳の 1 か⽉あたりの患者数は新型コロナウィルス感染症の流⾏前は 0.74 ⼈/⽉（28⼈）であったのに対し、流⾏後は 1.13 ⼈/⽉（26 ⼈）で約 1.5 倍の増加を認めた。15〜19 歳の患者数は流⾏の前後の期間は、それぞれ 0.35 ⼈/⽉（8 ⼈）、0.34 ⼈/⽉（13 ⼈）でほぼ同等であった。
診療科別では新型コロナウィルス感染症の流⾏前後ともに⼼療内科で診断された患者数が最も多く、そのあとは⼩児科と精神科が続いた。⼩児科においては、新型コロナウィルス感染症の流⾏後に⽉あたりの患者数が 0.48 ⼈/⽉（11 ⼈）で、流⾏前の 0.26 ⼈/⽉（10 ⼈）と⽐べて約 1.8 倍の増加が認められた。医療機関の病床数別では、新型コロナウィルス感染症の流⾏前後ともに 100〜299
床の医療機関で診断された患者数が最も多かった。また 100〜299 床と 500 床以上の医療機関で診断された患者数は、新型コロナウィルス感染症の流⾏前がそれぞれ 0.76 ⼈/⽉、0.29 ⼈/⽉で、流⾏
後はそれぞれ 1.04 ⼈/⽉、0.39 ⼈/⽉であった。医療機関の地域別では新型コロナウィルス感染症の流⾏前後で中部地⽅が最も多かった［流⾏前：29 ⼈(0.76 ⼈/⽉)、流⾏後：23 ⼈(1.00 ⼈/⽉)』］であった。その後に東北地⽅［流⾏前：10 ⼈(0.26 ⼈/⽉)、流⾏後：9 ⼈(0.39 ⼈/⽉)』］が多く、近畿−36−

地⽅と関東地⽅［ともに流⾏前：1 ⼈(0.03 ⼈/⽉)、流⾏後：1 ⼈(0.04 ⼈/⽉)』］がその後に続いた（表 1）。
また分割時系列解析では、新型コロナウィルス感染症の流⾏前の期間では、神経性やせ症と診断された患者数の経時的な変化は減少傾向（Incidence rate ratio (IRR) 0.961; 95%信頼区間(CL) 0.9320.990; p=0.009）であったが、流⾏後の期間では経時的に有意な増加の傾向を認めた（IRR 1.096;
95%CL 1.032-1.176; p=0.003）。図 1 は⽉別の神経性やせ症と診断された患者数を⽰し（〇印）、2020 年 3 ⽉の縦の⼀点鎖線は学級閉鎖の時期を⽰している。実線はその経時的な変化を⽰しているが、2020 年 3 ⽉以降その実線の傾きが、新型コロナウィルス感染症が起こらなかったと仮定したときの予測値（点線）よりも急になっている。
表 1：新型コロナウィルス感染症の流⾏前後における新規に神経性やせ症と診断された若年患者（7〜19 歳）の背景

新型コロナウィルス感染症
流⾏前（2017 年 1 ⽉〜2020 年 2 ⽉）

新型コロナウィルス感染症
流⾏後（2020 年 3 ⽉〜2022 年 1 ⽉）

患者数

1 か⽉当たりの患者数（38 か⽉）

患者数

1 か⽉当たりの患者数（23 か⽉）

41

1.08

34

1.48

男性

1

0.03

5

0.22

⼥性

40

1.05

29

1.26

7〜14 歳

28

0.74

26

1.13

15〜19 歳

13

0.34

8

0.35

⼩児科

10

0.26

11

0.48

⼼療内科

30

0.79

22

0.96

精神科

1

0.03

1

0.04

100〜299

29

0.76

24

1.04

300〜499

1

0.03

1

0.04

500≦

11

0.29

9

0.39

中部地⽅

29

0.76

23

1.00

東北地⽅

10

0.26

9

0.39

合計⼈数
性別

年齢

診療科

病床数

地域

近畿地⽅

1

0.03

1

0.04

関東地⽅

1

0.03

1

0.04

−37−

図 1：神経性やせ症と診断された若年患者数の経時的変化（⼀点鎖線は 2020 年 3 ⽉の学級閉鎖の時期を⽰している）

３）考察
本研究では、本邦において新型コロナウィルス感染症の流⾏後から 10 代の神経性やせ症と新規に診断された患者数が経時的に増えていることを明らかにした。特に学童期から思春期前期の患者数が増加していることが、新型コロナウィルス感染症の流⾏後の患者数の経時的な増加に寄与していると考えられた。
本研究の結果は、欧⽶諸国からの先⾏研究と同様の結果であった。現在までにアジア地域からの新型コロナウィルス感染症と若年者の神経性やせ症の関連についての報告はないため、本研究の結果はアジア圏の国からの初めての報告である。欧⽶やアジア地域で若年の神経性やせ症の患者数が増加していることを踏まえると、その増加の要因としては、地域や国ごとの社会⽂化的な背景以外の要因が関与している可能性が⽰唆された。
新型コロナウィルス感染症の流⾏と 10 代の神経性やせ症の患者数が増加した要因として、①本
⼈⾃⾝、②親⼦の関係性、③友⼈との関係性といった 3 つの要因が関与している可能性が考えられた。まず、本⼈⾃⾝の要因としては、新型コロナウィルス感染症の流⾏に対する不安感と完璧主義の影響が挙げられる。これまでに不安感は神経性やせ症のリスクを⾼めることが知られているが、新型コロナウィルス感染症の流⾏後から不安を抱える若年者の割合が報告されており、そのために神経性やせ症を発症するリスクが⾼まっている可能性がある。また本⼈の気質として完璧主義は、神経性やせ症のリスク要因であることがよく知られているが、これまでに完璧主義の傾向にある⼈
は⼼理的なストレスを感じると、より不安を感じやすいことが報告されている。さらに近年の研究では、新型コロナウィルス感染症に対するストレスや不安が、完璧主義と病的な摂⾷⾏動との関連を媒介していることが明らかになっている。そのため、完璧主義の傾向にある⼦どもは、新型コロ−38−

ナウィルス感染症の流⾏後の⼼理的なストレスや不安によって、神経性やせ症の発症のリスクが⾼まったのではないかと考えられた。
次に、新型コロナウィルス感染症の流⾏後の⽣活様式の変化は、親との関係にも影響を与えている可能性がある。新型コロナウィルス感染症の流⾏以降、親は⾃宅でのリモートワークのため、⼦どもは学校閉鎖のために、親と⼦が⾃宅で⼀緒にいる時間が増えている。これまでに、親の権威主
義的な養育態度や⼦どもに無関⼼な養育態度というのは、病的な摂⾷⾏動との関連が指摘されている。さらに海外の研究では、新型コロナウィルス感染症流⾏時のロックダウンの際の親のストレス
は、親⼦関係の悪化に関連していることが明らかになっている。したがって、特に権威主義的な養育態度や⼦どもに無関⼼な養育態度をとる親を持つ⼦どもは、新型コロナウィルス感染症の流⾏以降、親と⼦が⼀緒にいる時間が増えたことで、親⼦の関係の影響を強く受ける頻度が増えると可能があるため、神経性やせ症の発症リスクが⾼まったのではないかと考えられた。
また、新型コロナウィルス感染症の流⾏後の⽣活様式の変化による友⼈との関係性の変化も神経性やせ症の発症に関与している可能性がある。最近の研究では、新型コロナウィルス感染症の流⾏
後、思春期の⼦どもは友⼈からのソーシャルサポートの低下を感じていることが報告されている。
これまでに、友⼈からのソーシャルサポートは、⾃⾝の体型を前向きにとらえることを助ける働きがあり、逆に、友⼈からのソーシャルサポートが少ないと⾃⾝の体型に不満をもちやすくなることが明らかになっている。さらに、新型コロナウィルス感染症の流⾏後に孤独を感じる思春期の⼦どもが増えていることも報告されているが、孤独感は病的な摂⾷⾏動のリスク要因であることが知られている。そのため、新型コロナウィルス感染症の流⾏後の友⼈からのソーシャルサポートの低下や孤独感の増⼤といった友⼈との関係性の変化によって、神経性やせ症の発症のリスクを⾼まったのではないかと考えた。
だが実際には、本⼈の要因や家族および友⼈との関係性に関する要因が単独で影響するのではな
く、それらの要因が影響して、若年者の神経性やせ症のリスクが⾼まった可能性がある。さらに、新型コロナウィルス感染症の流⾏は、もともと神経性やせ症のリスク要因を有していた⼦どもにより強く影響を与えたと考えられる。しかしながら、現在までに新型コロナウィルス感染症の流⾏後に若年者の神経性やせ症の患者数が増加した理由については明らかになっていないため、その機序を解明するために、今後さらなる実証研究が必要であると考えられた。
４）本助成成果に関する論⽂・学会発表など＜論⽂＞
１．Fukuya, Y., Miyamura, K., Funatogawa T.,Yamaguchi T., Katagiri N., Sakuma K., & Nemoto T.
(2023). Association of COVID-19 Pandemic with Newly diagnosed Anorexia Nervosa among
youth in Japan (投稿済み).
＜学会発表＞
１．Yoshifumi Fukuya, Kei Sakuma, Takahiro Nemoto, Association of COVID-19 pandemic withAnorexia Nervosa in Japan, 43rd Annual Canadian Academy of Child and Adolescent
Psychiatry Conference, Calgary, September 9-12, 2023.

−39−

賛助会員（個⼈）
相原 雄幸
⾚司 俊⼆
⾚坂真奈美
旭 壮⼀郎
芦⽥
明
安次嶺 馨
東
寛
⾜⽴ 雄⼀
熱⽥
裕
鮎沢
衛
新垣 義夫
荒川 浩⼀
有賀
正
飯島 ⼀誠
家原 知⼦
五⼗嵐 隆
池⽥ 裕⼀
⽯井アケミ
⽯井 尚吾
⽯井 正浩
⽯倉 健司
⽯﨑 朝世
⽯崎 優⼦
位⽥
忍
井⽥ 博幸
井⽥ 孔明
市⽥ 蕗⼦
伊藤 悦朗
伊藤 秀⼀
伊藤 末志
伊藤
進
伊藤 ⾠夫
伊藤 保彦
伊藤 雄平
稲垣
稲垣
井上
井原
井原
今井
今泉
今村
今村

治
由⼦
哲志
健⼆
幸⼦
秀⼈
益栄
俊彦
孝

岩⽥
敏
岩⽥
⼒
岩元 ⼆郎
内⽥ 正志
内⽥ 祐⼦
漆原 真樹
江⼝ 尚彦
江⼝真理⼦
衞藤
隆
衞藤 義勝
遠藤 ⽂夫
⼩⽳ 慎⼆
⽼⽥ 礼⼦
尾内 ⼀信
⼤賀 正⼀
⼤川 洋⼆
⼤澤真⽊⼦
⼤嶋 勇成
⼤久保美登⾥
太⽥ 和秀
⼤塚
晨
⼤友 孝信
⼤⻄ 正純
⼤野 耕策
⼤守 伊織
岡
明
岡⽥
賢
岡⽥ 純⼀
緒⽅
勤
岡本
賢
⼩川 俊⼀
沖
潤⼀
⼩⼝
学
奥⼭眞紀⼦
⼩栗 絢⼦
⼩坂
仁
⼩⽥
慈
⼩⽥切美知⼦
⼩野 靖彦
賀川 治美
河⻄ 紀昭
加治 正⾏
勝部 康弘
加藤 剛⼆

加藤 達夫
賀藤
均
加藤
誠
加藤 正彦
加藤 元博
加藤 有⼀
加藤 陽⼦
⾨脇 弘⼦
⾦⼦ ⼀成
加納 芳郎
鴨下 和⼦
河
敬世
川⼝ 浩史
川⼜はるみ
神崎
晋
貴⽥岡節⼦
北中 幸⼦
北本 育⼦
⽊野
稔
⽊村
宏
⽇下
隆
楠⽥
聡
楠原 浩⼀
⼯藤 協志
久保 政勝
窪⽥
満
倉辻 忠俊
呉
繁夫
桑原 尚志
郡
建男
⼩池 健⼀
⼩泉 晶⼀
⼩泉ひろみ
河野 幸治
河野 陽⼀
神⼭
潤
幸⼭ 洋⼦
児⽟ 浩⼦
後藤 彰⼦
後藤 敦⼦
後藤 雄⼀
⼩林 繁⼀
⼩林 正夫
是松 聖悟

⼩⼭ 典久
⼩⼭ 佳紀
犀川
太
齋藤 和由
齋藤 伸治
斎藤 博久
佐伯 進⼀
嵯峨 六雄
酒井 規夫
酒井 康成
坂本 由美
佐久間弘⼦
櫻井 嘉彦
佐々⽊ 望
椎⾕佐由⾥
四⽅あかね
重松 陽介
柴⽥瑠美⼦
嶋⽥ 泉司
清⽔ 俊明
下条 直樹
下野 昌幸
下村 国寿
⽩井 真美
⽩⽯裕⽐湖
⽩川 嘉継
末延 聡⼀
杉浦 壽康
杉本 圭相
杉本 久和
鈴⽊英太郎
鈴⽊
孝
鈴⽊ 敏雄
鈴⽊ 康之
須⽥ 憲治
須磨崎 亮
清野 佳紀
関
秀俊
関⼝進⼀郎
瀬島
⻫
⾼島 俊夫
⾼橋
協
⾼橋 孝雄
⾼橋
勉

⾼橋 尚⼈
滝沢 琢⼰
滝⽥ 順⼦
宅⾒
徹
⽵内 則夫
⽵重 博⼦
⽵島 泰弘
⽵⾕
健
武知 哲久
⽵広 茂⼦
⽥島
剛
橘
雅弥
⽥中
篤
⽟井
浩
⽥村 正德
千⽥ 勝⼀
⻑
秀男
塚⽥ 明⼦
辻
章志
續
晶⼦
堤
裕幸
鶴澤 正仁
デュプラ尚⼦
寺井
勝
寺⽥ 春郎
寺本 貴英
照井 君典
遠⼭ 拓郎
⼾苅
創
外⽊ 秀⽂
富沢 修⼀
永井 崇雄
永尾 尚⼦
⻑澤 克俊
永島 哲郎
中坪 希美
中⻄ 浩⼀
中野 貴司
中畑 ⿓俊
中原 智⼦
中村 公俊
永光信⼀郎
成⽥ 雅美
鳴海 覚志

賛助会員（法⼈）

協賛企業

アサヒグループ⾷品株式会社
エーザイ株式会社
第⼀三共株式会社
株式会社ナチュラルサイエンス
Meiji Seika ファルマ株式会社
医療社団法⼈ メディカル・プロ

アサヒグループ⾷品株式会社
アステラス製薬株式会社
株式会社オグラ
JCRファーマ株式会社
武⽥薬品⼯業株式会社
中外製薬株式会社
⼤⽇本住友製薬株式会社
⽇本マクドナルド株式会社
ノボノルディスクファーマ株式会社
ファイザー株式会社
マルホ株式会社

※敬称略

難波 範⾏
新津 直樹
⻄久保敏也
⻄澤嘉四郎
⻄巻
滋
新⽥ 康郎
根来 ⺠⼦
橋⼝ 玲⼦
橋本 和廣
⻑⾕川俊史
⻑⾕川奉延
⻑⾕川茉莉
⻑⾕川美⾹
⻑⾕川有紀
⻑⾕川⾏洋
⽻⽥野爲夫
服部 元史
⾺場 常嘉
濱⽥ 洋通
早川依⾥⼦
原
寿郎
張⽥
豊
波呂久美⼦
⽇暮
眞
平尾 敬男
平⼭ 雅浩
廣瀬 伸⼀
深澤 隆治
福重淳⼀郎
藤井 達哉
藤枝 幹也
藤岡 雅司
藤⽊ 伴男
藤村
匠
藤脇 建久
⼆村 真秀
船⼾ 正久
船曳 哲典
⾈本 仁⼀
平家 俊男
別所 ⽂雄
逸⾒ 睦⼼
保坂シゲリ
星加美恵⼦

保科 弘毅
細井
創
細⽮ 光亮
堀川 玲⼦
前川 喜平
前多 治雄
前⽥ 美穂
前野 泰樹
正⽊ 拓朗
増⾕
聡
松井 智⼦
松尾 宣武
松尾 雅⽂
松尾 宗明
松平 隆光
松原 知代
真部
淳
丸⼭ 剛志
丸⼭
博
三池 輝久
三浦健⼀郎
⽔⾕ 修紀
⽔野 克⼰
三渕
浩
南 志保⼦
南沢
享
三牧 正和
宮⼊
烈
宮尾 晃代
宮城 雅也
宮島
祐
宮代 英吉
宮本 晶恵
⻨島 秀雄
村上 巧啓
村瀬 雄⼆
村⽥ 要⼀
本村知華⼦
元⼭ 福祥
森
哲夫
森内 浩幸
森尾 友宏
森⼝ 直彦
森下 秀⼦

五⼗⾳順

守⽥ 利貞
盛武
浩
森脇 浩⼀
⼋⽊ 信⼀
安⽊ ⼤地
安⽥ 寛⼆
柳川 幸重
⼭内 秀雄
⼭内 穣滋
⼭形 崇倫
⼭川
毅
⼭岸 敬幸
⼭⼝ 清次
⼭下
薫
⼭下裕史朗
⼭下 亮⼦
⼭城雄⼀郎
⼭⽥ 恭聖
⼭野 恒⼀
⼭本 威久
⼭本 ⽟路
⼭脇 英範
横⽥俊⼀郎
横⽥ 俊平
横⾕
進
横⼭
茂
横⼭ 義正
吉川 哲史
吉⽥ 康⼦
吉⽥ゆかり
吉原 重美
脇
研⾃
脇⼝
宏
和⽥ 和⼦
渡邊 信雄
渡辺
博
渡部 礼⼆

寄付者
加我 牧⼦
松永 雅道
村上まゆみ
吉川 武志

寄付法⼈
公益社団法⼈ ⽇本⼩児科学会
特定⾮営利法⼈ ⽇本⼩児医療研究センター