令和 3 年度 循環医学分野 一般研究助成 研究成果報告書

心筋梗塞に対する骨髄由来 M２マクロファージの心嚢内移植の開発
白石 学
自治医科大学 総合医学第二講座 心臓血管外科【研究の背景】
近年、心筋梗塞の救命率は上昇したものの、心不全患者は増加傾向であり、死亡率も極めて高いことから、心不全の根本的な病因究明と新たな治療法の確立が急務である。

【目  的】本研究の目的は、心筋梗塞発症後の十分な組織修復の誘導と心機能確保のために、虚血侵襲から線維芽細胞を保護するための主要調節因子及びメカニズムを特定することである。心筋梗塞時に障害を受けた線維芽細胞の長期的予後に対する影響も少なくないことが予想され、本研究によって得られる研究成果は、心筋梗塞後の心不全発症の病態解明と梗塞時に線維芽細胞のダメージを抑制することに焦点を当てた新たな切り口からの治療法開発の基盤になると期待され、心筋梗塞後の生命予後向上に重要な意義を有している。

【方  法】Nrg1 の受容体抗体を心筋梗塞モデル動物に投与し、線維芽細胞の細胞死・老化制御に Nrg1 が関与していることを invivo で証明する目的で、組織学的検査により心筋梗塞領域・線維化の程度の評価を行った。更に蛍光活性化セルソーティング法により心臓から線維芽細胞を収集し、RNA 抽出の後に qRT-PCR 法により炎症・細胞老化に関連する遺伝子発現を評価し、Nrg1 による線維芽細胞に対する細胞死・細胞老化制御作用を明らかにした。次に In vitro で M2 マクロファージが分泌する Nrg1 が線維芽細胞の細胞死・細胞老化制御及び組織修復に関与するシグナル伝達経路を明らかにする目的で線維芽細胞とマクロファージの共培養実験を行い、Nrg1 を介した線維芽細胞の細胞死・細胞老化制御に関わるシグナル伝達経路を Western Blot 法及び qRT-PCR 法を用いて評価を行った。

【結  果】1．心筋梗塞発症時の線維芽細胞の細胞老化、アポトーシスの進行と関連遺伝子発現の変化
8 週齢 C57BL/6J マウスを全身麻酔下に左前下行枝を結紮して心筋梗塞を作成し、心筋梗塞発症前、発症後 7、14、28
日 目 の 解 析 を 行 っ た 。 infarct 領 域 に 集 積 す る線 維 芽 細 胞 が ア ポ ト ー シ ス （ Caspase3 ＋ ） を 起 こ す と同 時 に SA-βGalactosidase 染色陽性を示し細胞老化の進行も観察された（図 1）。また、同時に心臓切片の qRT-PCR による遺伝子発現解析でも、細胞老化関連遺伝子 SA-βgal, p16, p53, p21 の発現が有意に増加しており、心筋梗塞後の線維芽細胞の細胞死・細胞老化の進行を確認した。同時に、個体の発生や成長、維持に重要な役割を担う Neuregulin1 の遺伝子発現上昇をinfarct 領域でみとめ、その受容体（ErbB2/4）の発現を線維芽細胞上で確認した。次に正常心臓および心筋梗塞発症の心臓から FACS で CD11b+F480+CD206+M2 型マクロファージを採取し、遺伝子発現を Micro-array で網羅的に解析したところ、心筋梗塞発症後の M2 型マクロファージで有意に遺伝子発現量が増加する extracellular ligand として Neuregulin 1（Nrg1）を同定した。

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図1．infarct領域に集積する線維芽細胞のアポトーシス
心筋梗塞発症後 7 日目には梗塞領域に線維芽細胞が集積し、その内約 40％が Cleaved caspase3 陽性を示していた。
Scale bars: 100 μm. n = 4 in each group. Data represent the mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 versus
the remote area; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.005 versus the no-MI heart; 1-way ANOVA.
2．マクロファージによる細胞老化、アポトーシス制御機構
Neuregulin 1 の線維芽細胞に対する直接作用を明らかにするために Boyden-chamber を用いた in vitro の共培養実験を行った。マクロファージは骨髄単核球から分化誘導した細胞 Bone marrow derived macrophages （BMDMs）を使用した。正
常心筋線維芽細胞群（Control 群）、過酸化水素水（H2O2）で細胞障害を与えた心筋線維芽細胞群（H2O2 群）、H2O2 群にBMDMs を共培養した群（H2O2＋BMDMs 群）、H2O2＋BMDMs 群に ErbB4 receptor blocker を加えた群（H2O2＋BMDMs＋ErbB4 Ab 群）、H2O2 群に recombinant Neuregulin1（re-Nrg1）を加えた群（H2O2＋Nrg1 群）、正常心筋線維芽細胞に reNrg1 を加えた群（Nrg1 群）の計 6 群を作成し、線維芽細胞に対する BMDMs から分泌される Neuregulin 1 の作用を検証した。各群の線維芽細胞を位相差顕微鏡（形態による細胞老化の評価）、SA-β-gal 染色（細胞老化の評価；図 2）、Cleavedcaspase3 染色（アポトーシスの評価）、Ki-67 染色（細胞の分裂能の評価）で評価を行った。H2O2 処理による障害により細胞死・細胞老化が進行した培養線維芽細胞は、共培養した BMDMs から分泌される Neuregulin 1 の作用による抗細胞老化、抗アポトーシスおよび細胞分裂促進が観察された。また、αSMA、Collagen I, III の発現を評価し、培養線維芽細胞の活性化や膠原線維産生にはマクロファージの存在が必要であることを明らかにした。次に培養線維芽細胞 6 群の PI3K, Akt のリン酸化タンパク質を評価し、Neuregulin 1 による PI3K-Akt シグナル伝達経路の活性化を確認した（図 3）。また、心筋虚血により線維芽細胞が受ける細胞障害により進行する細胞老化・細胞周期停止・アポトーシスへのシグナル伝達経路及びこれらを抑制する Neuregulin 1-ErbB-PI3K-Akt シグナル伝達経路の遺伝子発現量を qRT-PCR で定量した。H2O2 により細胞周期の減速、細胞老化・アポトーシスの進行を示した線維芽細胞は、マクロファージとの共培養により Neuregulin 1-PI3KAkt シグナル伝達経路を介して細胞周期の促進及び、細胞老化・アポトーシスの抑制が観察された。

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図2．培養線維芽細胞の細胞老化
H2O2により細胞老化の進行を示した線維芽細胞は、マクロファージとの共培養により細胞老化の抑制が観察された。Scalebars: 100 μm. n = 4 in each group. Data represent the mean ± SEM. #P < 0.05 versus control, ＊P < 0.05 versus H2O2, ‡P< 0.05 versus H2O2+BMDMs, ♭P < 0.05 versus H2O2+BMDMs+Ab, §P < 0.05 versus H2O2+Nrg1; 1-way ANOVA.

図3．Neuregulin 1-ErbB-PI3K-Akt シグナル伝達経路の活性制御機構
H2O2 により細胞周期の減速、細胞老化・アポトーシスの進行を示した線維芽細胞は、マクロファージとの共培養によりNeuregulin 1-PI3K-Akt シグナル伝達経路を介して細胞周期の促進及び、細胞老化・アポトーシスの抑制が観察された。
Data represent the mean ± SEM. #P < 0.05 versus control, ＊P < 0.05 versus H2O2, ‡P < 0.05 versus H2O2+BMDMs, ♭P <0.05 versus H2O2+BMDMs+Ab, §P < 0.05 versus H2O2+Nrg1; 1-way ANOVA.
3．Trastuzumab 投与による線維芽細胞老化の進行
心筋梗塞発症時に生体内で Neuregulin 1 の作用を明らかにするため、Trastuzumab（抗 ErbB2 抗体）を用いた。
Trastuzumab 投与群（Trastuzumab 群）と PBS 投与のコントロール群（Control 群）を作成し比較検討を行った。Trastuzumab群で infarct 領域のみならず remote 領域においても有意なアポトーシス・細胞老化関連の発現上昇がみられた（図 4）。
infarct 領域における膠原線維の沈着量及び線維化関連遺伝子（αSMA, Col1a1, Col3a1）の発現は Trastuzumab 群で有意に増加していた。過剰な線維化進行は、Trastuzumab 投与により Neuregulin 1 による抗細胞老化機序が阻害されることで、心筋梗塞など不可逆的な障害が生じた際に線維芽細胞老化が進行し、炎症性サイトカインの産生増加から M2 型マクロファージの集積が増加することが原因と考えられた。M2 型マクロファージから分泌される Osteopontin により線維芽細胞の活性化から膠原線維産生が増強されることは、我々の以前の研究内で明らかにしている 1)。

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図 4．Trastuzumab 投与による線維芽細胞老化の進行
上図：Trastuzumab 群で infarct 領域において、線維芽細胞の有意なアポトーシスの発現上昇がみられた。 Scale bars:
100 μm. 下図：Trastuzumab 群で infarct 領域において有意な老化細胞集積がみられた。Scale bars: 20 μm. Data
represent the mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005 versus each group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.005
versus the non-MI heart; one-way ANOVA.

【考  察】本研究では虚血障害による線維芽細胞の老化やアポトーシスを制御する分子としてマクロファージが分泌するNeuregulin1 （Nrg1） を同定した。更に線維芽細胞のNrg1受容体をブロックすると線維芽細胞の老化が進行し、心筋梗塞領域のみならず遠隔領域にも過剰に線維化が亢進することをin vitro、in vivoの実験で明らかにした。

【臨床的意義・臨床への貢献度】
慢性心不全の病態に対する心臓線維芽細胞の異常性の果たす重要な役割を考慮すると 2）、梗塞時にダメージを受けた線維芽細胞の長期的予後に対する影響も少なくないことが予想される。Neuregulin 1による細胞老化やアポトーシスの制御機構の一端が本研究で明らかとなり、今後心不全予後に対する新たな戦略に繋がる可能性がある。

【参考・引用文献】
1）

Shiraishi M, Shintani Y, Shintani Y, Ishida H, Saba R, Yamaguchi A, Adachi H, Yashiro K, Suzuki K. Alternatively activatedmacrophages determine repair of the infarcted adult murine heart. J Clin Invest. 2016 Jun 1;126(6):2151-66.
doi:10.1172/JCI85782. Epub 2016 May 3. PMID: 27140396; PMCID: PMC4887176.

2）

Thum T, Gross C, Fiedler J, Fischer T, Kissler S, Bussen M, Galuppo P, Just S, Rottbauer W, Frantz S, Castoldi M, Soutschek
J, Koteliansky V, Rosenwald A, Basson MA, Licht JD, Pena JT, Rouhanifard SH, Muckenthaler MU, Tuschl T, Martin GR,Bauersachs J, Engelhardt S. MicroRNA-21 contributes to myocardial disease by stimulating MAP kinase signalling infibroblasts. Nature. 2008 Dec 18;456(7224):980-4. doi: 10.1038/nature07511. Epub 2008 Nov 30. PMID: 19043405.

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