委託プロジェクト研究「ゲノム情報を活用した農産物の次世代生産基盤技術の開発」
平成２９年度

最終年度報告書

13405844

園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発
研究実施期間

平成２５年度～平成２９年度（５年間）

代表機関

国立研究開発法人

研究開発責任者

山本

農業・食品産業技術総合研究機構

果樹茶業研究部門俊哉

国立大学法人

岩手大学農学部

国立大学法人東北大学大学院農学研究科

学校法人

京都産業大学総合生命科学部

共同研究機関京都府公立大学法人
国立研究開発法人

京都府立大学大学院生命環境科学研究科
農業・食品産業技術総合研究機構（野菜花き研究部門）

公益財団法人 かずさDNA研究所
普及・実用化
支援組織
研究開発責TEL ：029-838-6474

任者

FAX ：029-838-6437

連絡先

E-mail：toshiya@affrc.go.jp

別紙様式３．最終年度報告書

１頁

～

82頁

＜別紙様式３．最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９担当研究機関・研究室
機関

研究室

農研機構 野菜花

ウリ科・イチゴユ

き研究部門

ニット

（２）抵抗性遺伝子候補の特定

農研機構 野菜花

ウリ科・イチゴユ

き研究部門

ニット

（３）抵抗性遺伝子の同定

農研機構 野菜花

ウリ科・イチゴユ
ニット

１．マップベースクローニ
ング法によるキュウリの黄化えそ病抵抗性遺伝子の単離（１）抵抗性遺伝子領域
の絞り込み

き研究部門

２．ハクサイ根こぶ病抵抗性遺伝子の単離（１）CRb遺伝子の単離
発

農研機構
き研究部門

ト

（２）Crr1b遺伝子の単離

岩手大学

植物育種学研究室

農研機構

野菜花 アブラナ科ユニッ（３）CRk遺伝子の単離（４）抵抗性遺伝子アレ
ルの機能解析と高精度
マーカーセットの開発

1

野菜花 アブラナ科ユニッ

き研究部門

ト

岩手大学

植物育種学研究室

農研機構

野菜花 アブラナ科ユニッ

き研究部門

ト

岩手大学

植物育種学研究室

研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９担当研究機関・研究室
機関研究室

３．トマト単為結果性およびトマト黄化葉巻病抵抗性に関与する新規遺伝子の単離（１）花粉への変異原処理

農研機構

による突然変異集団の育き研究部門

野菜花 野菜育種・ゲノ
ム研究領域

成

ゲノム解析ユ①花粉へのUV照射条件のニット検討と突然変異体集団の育成②花粉への化学変異原等
処理条件の検討と突然変異体集団の育成（２）超並列シークエンサ

かずさDNA研

先端研究部

ーを用いた変異検出手法

植物ゲノム・遺と一塩基多型タイピング

伝学研究室

法の開発
①突然変異体集団の変異検索手法の検討と変異検索②遺伝資源の変異検索手法の検討と変異検索③戻し交雑個体の選抜法の確立（３）トマト単為結果性お農研機構

よびトマト黄化葉巻病抵

き研究部門

野菜花 野菜育種・ゲノム研究領域

抗性に関与する遺伝子のゲノム解析ユ新規変異体の獲得

ニット①トマト単為結果性関連
遺伝子の選定②トマト黄化葉巻病抵抗性関連遺伝子の選定③突然変異体および遺伝資源の選抜と表現系評価

2

研究課題

研究年度

担当研究機関・研究室

２５ ２６ ２７ ２８ ２９４．ナス単為結果性を制御する原因遺伝子の単離（１）ナス単為結果性遺伝子Cop8.1の単離①候補領域の全塩基配列
決定形質転換用コンス
トラクトの構築と遺伝
子組み換えナスの作出

機関

研究室

農研機構野菜花き ゲノム解析ユ部門

ニット②網羅的マーカー開発③遺伝子発現解析④形質転換用コンストラ
クトの構築と遺伝子組
み換えナスの作出⑤原因遺伝子の同定とDNAマーカーの開発⑥バイサルファイトシー
ケンス法によるメチル化状態の性状解析
ゲノム解析ユ農研機構野菜花き ニット
部門（２）ナス単為結果性遺伝子Cop3.1の単離①ラフマッピング②網羅的マーカー開発③詳細マッピング

農研機構野菜花き(３) ナス遺伝資源内に存在する単為結果性遺伝
子の多様性調査部門

3

ゲノム解析ユ
ニット

研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９５．ナスにおける花粉稔性回復遺伝子の単離（１）Rf候補遺伝子領域の絞り込み
Rf遺伝子の分離集団を用いて、Rf遺伝子のDNAマーカーを開発する。まず、Rf遺伝子に近接したDNA
マーカーを検索する。その一方で、ナスの高密度連鎖
地図を活用して、連鎖地図
上でのRf遺伝子座位を特定しながら、Rf遺伝子の候補ゲノム領域を狭めていく。
（２）Rf遺伝子のクロー
ニング
Rf遺伝子を含む候補ゲ
ノム領域を狭めた上で、候補ゲノム領域におけるRf候補遺伝子の塩基配列および推定アミノ酸配列を、稔性回復機能を持たない対立
遺伝子座のものと比較する。また遺伝子産物の細胞
内局在、遺伝子発現パターンを調べ、稔性回復との対応関係を評価する。さらに得られたDNAマーカーを用いて、我国内外のナスの遺伝資源について、広くRf遺伝子の有無を調査する。

担当研究機関・研究室
機関

京都産業大学研究室

総 植物育種学

合生命科学部
農業・食品産業技 野菜育種・ゲノム術総合研究機構

研究領域・ナス科
ユニット

京都産業大学

総 植物育種学

合生命科学部
農業・食品産業技 野菜育種・ゲノム術総合研究機構
研究領域・ナス科
ユニット（３）Rf遺伝子による稔性回復機構の解明
大腸菌の系を利用して、Rf候補遺伝子が増殖速度に与える効果を調べる。またRf候補遺伝子を導入した形質転換ナスを作成し、植物体内での発現と、実際の花粉稔性を調査する。

京都産業大学

総 植物育種学

合生命科学部
農業・食品産業技 野菜育種・ゲノム術総合研究機構
研究領域・ナス科
ユニット

4

研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９担当研究機関・研究室
機関研究室

６．ダイコンのグルコシノ
レート含量を制御する遺伝子の単離農研機構野菜花き アブラナ科ユ
研究部門
ニット

（１）4MTB-GSL合成酵
素遺伝子の単離①遺伝子同定と機能解析（２）グルコエルシン含量を制御する遺伝子の単離①グルコエルシン含量を制御する遺伝子座の同定

農研機構野菜花き アブラナ科ユ
研究部門
ニット
東北大学
植物遺伝育種学分野②グルコエルシン含量を制御する遺伝子の同定と選抜マーカー開発

東北大学

植物遺伝育種
学分野
農研機構野菜花き アブラナ科ユ
研究部門
ニット

７．アルタナリア病原菌と宿主植物との分子病理学的解析によるリンゴ斑点
落葉病およびナシ黒斑病
罹病性原因遺伝子の単離（１）リンゴ斑点落葉病
高度罹病性遺伝子の単離農研機構果樹茶

リンゴ育種ユ

業研究部門

ニット、ゲノムユニット（２）ニホンナシ黒斑病
罹病性遺伝子の単離

農研機構果樹茶

ナシ・クリ育業研究部門

種ユニット、
ゲノムユニッ
ト

5

研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９担当研究機関・研究室
機関

研究室

農研機構果樹茶

リンゴ育種ユ業研究部門

ニット（２）カラムナー候補遺
伝子の単離

農研機構果樹茶

リンゴ育種ユニット、リンゴ
栽培生理ユニット（３）カラムナー選抜マーカーの開発農研機構果樹茶（４）カラムナー候補遺
伝子の機能解析

農研機構果樹茶業研究部門

８．リンゴの省力栽培に適したカラムナー樹形を制御する原因遺伝子の単離（１）「Wijcik」の突然変異箇所の特定

業研究部門

業研究部門

リンゴ育種ユニット
リンゴ栽培生理ユニット、
リンゴ育種ユニット

９．カンキツのβ-クリプト
キサンチン高含有化のための遺伝子単離
農研機構果樹茶（１）シス因子で制御さ

業研究部門

れるカロテノイド代謝遺伝子のアリルマーカーのカンキツゲノムユニット/カ
ンキツ品種育成ユニット

開発（２）トランス因子で制農研機構果樹茶

カンキツゲノ

業研究部門

ムユニット/カ

御されるカロテノイド代

ンキツ品種育謝遺伝子のアリルマーカ

成ユニット

ーの開発
（３）カロテノイド代謝

農研機構果樹茶

カンキツゲノに関与する転写因子遺伝

業研究部門

ムユニット/流子の機能解析

通利用・機能
性ユニット

6

研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９担当研究機関・研究室
機関

研究室

農研機構果樹茶

ナシ・クリ育

業研究部門

種ユニット

農研機構果樹茶

ナシ・クリ育

業研究部門

種ユニット

（３）ニホングリ再分化
系確立に向けた条件検討

農研機構果樹茶

ナシ・クリ育

業研究部門

種ユニット

（４）渋皮剥皮遺伝子座(Peeling) のファイン
マッピング

農研機構果樹茶

ナシ・クリ育

業研究部門

種ユニット

鳥取大学

農学部

京都府立大学

生命環境科学
研究科

鳥取大学

農学部

京都府立大学

生命環境科学研究科

京都府立大学

生命環境科学

１０．ニホングリ易渋皮剥皮遺伝子の単離（１）ニホングリ標準連
鎖地図の構築（２）ニホングリBACラ
イブラリーの構築

１１．ニホンナシ果実の糖組成に関するDNAマーカーの開発（１）スクロース分解に関わる酸性インベルターゼの発現制御機構の解明とDNAマーカーの開発（２）スクロース蓄積に関わるスクロースリン
酸合成酵素の発現制御機構の解明とDNAマーカーの開発（３）実生集団を用いて網羅的発現解析による原因遺伝子の探索

研究科

7

研究課題

研究年度
２５ ２６ ２７ ２８ ２９担当研究機関・研究室
機関研究室（１）集団ACを用いたブ
ドウべと病抵抗性DNA
マーカーの開発

農研機構果樹茶

ブドウ・カキ

業研究部門

育種ユニット（２）ブドウ属近縁野生種由来のブドウべと病
強度抵抗性DNAマーカーの開発

農研機構果樹茶

ブドウ・カキ

業研究部門

育種ユニット（３）国内べと病菌系統の収集並びに病原性調査

農研機構果樹茶１２．ブドウべと病抵抗性のDNAマーカー開発

業研究部門

ブドウ・カキ病害虫ユニット、ブドウ・
カキ育種ユニット8

Ⅰ－２．実施体制
課題
番号

HOR
1001

担当研究機関・研究室

研究項目

機関

研究担当者

研究室

研究開発責任者

農研機構 果 品種育成研究 ゲノムユニッ ◎樹茶業研究部 領域
ト門

マップベースクロー
ニング法によるキュウリの黄化えそ病抵
抗性遺伝子の単離

農研機構 野 野菜育種・ゲ ウリ科・イチ ○ 川頭 洋一
菜花き研究部 ノム研究領域 ゴユニット（H25～H29）
門山本 俊哉

農研機構 野 野菜育種・ゲ ウリ科・イチ 下村 晃一郎
菜花き研究部 ノム研究領域 ゴユニット（H25～H29）
門
農研機構 野 野菜育種・ゲ ウリ科・イチ 杉山 充啓
菜花き研究部 ノム研究領域 ゴユニット（H25～H29）
門
HOR
1002

ハクサイ根こぶ病抵
抗性遺伝子の単離

農研機構 野 野菜育種・ゲ
菜花き研究部 ノム研究領域
門
岩手大学

農学部

○ 畠山 勝徳（H25～H27）
植物育種学研 ○ 畠山 勝徳
究室（H28～H29）

農研機構 野 野菜育種・ゲ アブラナ科ユ 吹野 伸子
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門
農研機構 野 野菜育種・ゲ アブラナ科ユ 柿崎 智博
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門
HOR
1003

トマト単為結果性およびトマト黄化葉巻
病抵抗性に関与する
新規遺伝子の単離

農研機構 野 野菜育種・ゲ ゲノム解析ユ ○ 布目 司
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門（公財）かず 先端研究部
さDNA研究所

植物ゲノム・ 白澤 健太
遺伝学研究室 （H25～H29）

農研機構 野 野菜育種・ゲ ゲノム解析ユ 山口 博隆
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門
HOR
1004

ナス単為結果性を制御する原因遺伝子の単離

農研機構 野 野菜育種・ゲ ゲノム解析ユ ○ 宮武 宏治
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門
農研機構 野 野菜育種・ゲ ゲノム解析ユ 福岡 浩之
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H27）
門

9

HOR
1005

ナスにおける花粉稔性回復遺伝子の単離

京都産業大学 総合生命科学部○ 山岸 博
（H25～H29）

農研機構 野 野菜育種・ゲ ナス科ユニッ 齊藤 猛雄
菜花き研究部 ノム研究領域 ト（H25～H29）
門
農研機構 野 野菜育種・ゲ ナス科ユニッ 松永 啓
菜花き研究部 ノム研究領域 ト（H29）
門農研機構 野 野菜育種・ゲ ナス科ユニッ 新村 芳美
菜花き研究部 ノム研究領域 ト
（H29）
門
HOR
1006

ダイコンのグルコシ
ノレート含量を制御する遺伝子の単離

農研機構 野 野菜育種・ゲ アブラナ科ユ ○ 吹野 伸子
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門
東北大学

大学院農学研 植物遺伝育種 西尾 剛
究科学分野
（H25～H29）

東北大学

大学院農学研 植物遺伝育種 北柴 大泰
究科学分野（H25～H29）

農研機構 野 野菜育種・ゲ アブラナ科ユ 柿崎 智博
菜花き研究部 ノム研究領域 ニット（H25～H29）
門
農研機構 野 野菜生産技術
菜茶業研究所 研究領域
HOR
2001

アルタナリア病原菌と宿主植物との分子病理学的解析による
リンゴ斑点落葉病およびナシ黒斑病罹病
性原因遺伝子の単離石田 正彦（H25～H27）

農研機構 果 品種育成研究 ナシ・クリ育 ○ 寺上 伸吾
樹茶業研究部 領域
種ユニット（H25～H29）
門

農研機構 果 リンゴ研究領 リンゴ育種ユ 森谷 茂樹
樹茶業研究部 域
ニット（H25～H29）
門
農研機構 果 リンゴ研究領 リンゴ病害虫 伊藤 伝
樹茶業研究部 域
ユニット（H25～H29）
門
農研機構 果 生産・流通研 病害ユニット 足立 嘉彦
樹茶業研究部 究領域（H25～H29）
門
農研機構 果 生産・流通研 病害ユニット 中畝 良二
樹茶業研究部 究領域（H25～H28）
門

10

農研機構 果 品種育成研究 ゲノムユニッ 山本 俊哉
樹茶業研究部 領域
ト（H25～H29）
門
農研機構 果 品種育成研究 ナシ・クリ育 齋藤 寿広
樹茶業研究部 領域
種ユニット（H25～H29）
門
HOR
2002
HOR
2003

リンゴの省力栽培に適したカラムナー性
樹形を制御する原因
遺伝子の単離カンキツのβ－クリプトキサンチン高含有化のための遺伝子単離

農研機構 果 リンゴ研究領 リンゴ育種ユ ○ 岡田 和馬
樹茶業研究部 域
ニット（H25～H29）
門
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツゲノ ○ 島田 武彦
樹茶業研究部 領域
ムユニット（H25～H27）
門
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツゲノ 藤井 浩
樹茶業研究部 領域
ムユニット（H25～H27）
門
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツゲノ 遠藤 朋子
樹茶業研究部 領域
ムユニット（H25～H27）
門
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツ育種 野中 圭介
樹茶業研究部 領域
ユニット（H25～H27）
門
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツ育種 今井 篤
樹茶業研究部 領域
ユニット（H25～H27）
門
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツ流通 生駒 吉識
樹茶業研究部 領域
利用・機能性 （H25）門
ユニット
農研機構 果 カンキツ研究 カンキツ流通 松本 光
樹茶業研究部 領域
利用・機能性 （H25～H27）
門
ユニット

HOR
2004

ニホングリ易渋皮剥
皮遺伝子の単離

HOR
2005

農研機構 果 品種育成研究 ナシ・クリ育
樹茶業研究部 領域
種ユニット
門
ニホンナシ果実の糖 鳥取大学
農学部
分子園芸学研組成に関するDNAマ
究室ーカーの開発京都府立大学 大学院生命環 資源植物学研
境科学研究科 究室

農研機構 果 品種育成研究 ナシ・クリ育 ○ 西尾 聡悟
樹茶業研究部 領域
種ユニット（H25～H29）
門

鳥取大学

農学部

11

寺上 伸吾
（H25～H29）○ 板井 章浩（H25～H27）○ 板井 章浩（H28～H29）

植物病理学研 児玉 基一朗
究室
（H27)

HOR
2006

ブドウべと病抵抗性 農研機構 果 ブドウ・カキ ブドウ・カキ ○ 河野 淳のDNAマーカー開発 樹茶業研究部 研究領域
育種ユニット （H25～H29）
門
農研機構 果 ブドウ・カキ ブドウ・カキ 佐藤 明彦
樹茶業研究部 研究領域
育種ユニット （H25～H29）
門
農研機構 果 ブドウ・カキ ブドウ・カキ 須崎 浩一
樹茶業研究部 研究領域
病害虫ユニッ （H25～H29）
門ト
農研機構 果 ブドウ・カキ ブドウ・カキ 清水 健雄
樹茶業研究部 研究領域
病害虫ユニッ （H29）
門
ト

（注１）

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

1213405844

中課題番号

研究期間

平成２５～２９年度

大課題名

ゲノム情報を活用した農産物の次世代生産基盤技術の開発

中課題名

園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発

代表機関・研究開発責任者名

国立研究開発法人

農業・食品産業技術総合研究機構

果樹茶業研究部門・山本俊哉

Ⅰ－１．研究目的
わが国の農業において、野菜類や果樹類などの園芸作物は農家経営の安定と向上および消費者の食生活向上に欠かせない基幹作物である。今後園芸作物の利用技術の推進と生産者・消費者・産業界への目に見える成果が期待されており、そのための画期的な形質をもつ先導的な新品種の開発が強く求められている。園芸作物特有の多様性から求められる形質も様々であり、土壌病害や虫媒性ウイルス病などの重要病害に対する抵抗性、生産安定性の確保および省力低コスト化に資する果菜類の単為結果性や果樹のカラムナー性などの生理形態学的
形質、消費者や産業界への訴求効果が高い良食味性や加工適性、易剥皮性などの品質・機能性成分関連形質など多岐にわたっている。
このため、本研究では、
１．キュウリの黄化えそ病抵抗性、ハクサイの根こぶ病抵抗性、トマトおよびナスの単為結果性、ダイコンの辛み成分特性、リンゴの斑点落葉病抵抗性とカラムナー性、
カンキツのβ－クリプトキサンチン高含有化、クリの易渋皮剥皮性等を対象として、
これら有用形質に関わる遺伝子もしくは遺伝子領域を同定して、新品種の開発に利用可能なDNAマーカーを開発することを目的とする。
その結果、
１．本プロジェクトの対象となる園芸作物の有用形質を選抜できるDNAマーカーを開発し、先導的な新品種の育成により、生産コストの低減、生産安定、消費拡大や新需要創出による生産規模の拡大など生産者と消費者へ様々なメリットの還元が期待される。

13

Ⅰ－２．研究結果
１．HOR1001 マップベースクローニング法によるキュウリの黄化えそ病抵抗性遺伝子の単離（農研機構野菜花き研究部門）
抵抗性系統を用いたこれまでの解析から、黄化えそ病抵抗性に関する主要なQTLが第3連
鎖群の約30 cMの領域に存在することが明らかになっている。本課題では、このQTLに存在する抵抗性遺伝子の領域を絞り込み、抵抗性遺伝子を単離する。具体的には、これまでに報告されているキュウリのゲノム配列やSSR情報を利用して、抵抗性系統と罹病性系統の間に多型のあるSSRや一塩基多型をQTL領域内に高密度に設定する。次に、QTL領域内の様々な場所で組換えが生じた系統を育成し、育成した系統の抵抗性検定を行うことにより、目的遺伝子の領域を絞り込む。さらに、絞り込んだ領域の塩基配列を明らかにし、抵抗性系統と罹病性系統間の塩基配列や遺伝子発現の比較により候補遺伝子を特定する。本委託プロ
ジェクト期間中に、黄化えそ病抵抗性の「きゅうり中間母本農７号」を育成するとともに、黄化えそ病抵抗性遺伝子の領域を約20cM（約6,000kb）から約45kbに絞り込んだ（第3染色体）。
２．HOR1002 ハクサイ根こぶ病抵抗性遺伝子の単離（岩手大学農学部、農研機構野菜花き
研究部門）
ハクサイ類において同定されている8つの抵抗性遺伝子座のうち、４つの病原型（G1〜G4）に対する抵抗性反応が異なる３つの主働遺伝子座、すなわち、G3, G4に抵抗性を発揮する

CRb、G1, G4に抵抗性を発揮するCrr1b、G2, G3, G4に抵抗性を発揮するCRkについて、抵抗性遺伝子を単離する。中間期までにCRb遺伝子の単離を完了し、終了時までにCrr1bとCRkを単離する。既に単離済みであるCrr1aを加えた4つの抵抗性遺伝子のハクサイ品種群内の対立遺伝子（アレル）多様性と抵抗性程度の関係を解析し、高精度な選抜マーカーセットを構築する。本委託プロジェクト期間中に、CRb遺伝子を単離し、Crr1b遺伝子のゲノム構造を明らかにして２つの候補遺伝子を特定し、CRk座に病原型特異性が異なる２つの抵抗性遺伝子が存在することを明らかにしそれぞれの座乗領域を50kb、75kbに絞り込むことに成功した。
３．HOR1003 トマト単為結果性およびトマト黄化葉巻病抵抗性に関与する新規遺伝子の単離（農研機構野菜花き研究部門、かずさDNA研究所）
大規模な突然変異体集団・遺伝資源の網羅的選抜を可能とする超並列シークエンサー（NGS）を活用した効率的なDNA変異検出技術、およびDNA解析による変異検出に供試する解析集団を育成するために花粉への変異原処理による突然変異体集団作出技術を開発し、ト
マト単為結果性関連遺伝子およびトマト黄化葉巻病抵抗性関連遺伝子を標的として新規有用変異体を検索・獲得する。本委託プロジェクト期間中に、トマト種子への化学変異原ENU処理による突然変異体集団を育成し、NGSを用いたTAS法による標的遺伝子の変異体選抜手法を確立し、トマト単為結果性関連遺伝子やトマト黄化葉巻病抵抗性関連遺伝子を標的遺伝子に選定し、効率的な戻し交雑による新規育種素材の育成方法を確立した。
４．HOR1004 ナス単為結果性を制御する原因遺伝子の単離（農研機構野菜花き研究部門）
ナスの生産現場において、環境条件に左右されずに果実が肥大する単為結果性は非常に利用価値の高い形質である。しかし、単為結果性個体の選抜には多大な時間と労力を要することから、効率的な品種育成が困難であることが問題となってきた。そこで、我々は単為結果性ナス品種「あのみのり」が有する単為結果性遺伝子を単離し高精度な選抜マーカーを開発することを目標とする。まず、「あのみのり」が有する２つの単為結果性遺伝子14

Cop3.1とCop8.1について、非単為結果性系統LS1934を遺伝的背景に同遺伝子座を挿入した
大量の分離集団を作出し、形質評価することにより遺伝学的に候補領域を絞り込む。次に絞り込んだ領域について、同じナス科に属するトマトのゲノム情報や独自に有するナス遺伝資源を利用して候補遺伝子の探索と絞り込みを進め遺伝子組換え植物により原因遺伝子を単離する。本委託プロジェクト期間中に、Cop3.1、Cop8.1を有する個体の選抜を可能にするマーカーを作出し、Cop8.1座の同定ではGENE2の発現をRNAiで抑制することにより
AE-P03の単為結果性の発現も抑制されることを確認し、Cop8.1座近傍のメチル化解析ではGENE2を含む7.5kbの領域についてAE-P03と中生真黒のメチル化状態を確認し、GENE2のORFのメチル化状態がAE-P03において優位に低いレベルにあることを確認した。
５．HOR1005 ナスにおける花粉稔性回復遺伝子の単離（京都産業大学総合生命科学部、農研機構野菜花き研究部門）
我国の重要な野菜の１つであるナスは、極めて顕著な雑種強勢を示す。このため古くか
らF1育種が行われており、我国の実用的な品種はほぼすべてF1品種である。しかしながら、ナスのF1育種は今日まで、人工的な除雄と人工授粉によって行われており、効率的で確実なF1採種には至っていない。ナスのF1育種の効率化ならびにナスの生産性向上のために、
現在、細胞質雄性不稔−稔性回復系の開発と利用が強く期待されている。本研究課題では、
細胞質雄性不稔を利用したナスのF1育種に必須である稔性回復遺伝子（Rf遺伝子）を単離するとともに、我国内外のナスの遺伝資源において、稔性回復遺伝子の有無を判定するために利用可能なDNAマーカーを開発することを目的とする。本委託プロジェクト期間中に、Rf遺伝子は第6染色体上に密接に連鎖して複数存在することが明らかにし、これらのRf遺伝子のうち、回復力の大きい遺伝子についてＤＮＡマーカーを開発した。
６．HOR1006 ダイコンのグルコシノレート含量を制御する遺伝子の単離（農研機構野菜花き研究部門、東北大学大学院農学研究科）
遺伝学的・生化学的な解析により4MTB-GSL合成酵素遺伝子を同定するとともに、本遺伝子内に選抜マーカーを設計することで新品種育成の際に利用可能な高精度選抜マーカーを開発する。4MTB-GSLを欠失しグルコエルシン含量に差のある両親系統より育成した90個
体・系統以上のF2およびF3解析集団を用いたQTL解析により、グルコエルシン含量を制御する染色体領域を正確に捕捉する。1カ所以上のQTLについて、原因遺伝子のポジショナルク
ローニングを行い、グルコエルシン含量を決定する遺伝子を同定する。本委託プロジェク
ト期間中に、4MTB-GSL合成酵素遺伝子の単離では遺伝子の単離および機能解析を完了し国内特許を出願し、グルコエルシン含量を制御する遺伝子の単離ではグルコエルシン含量に関わるQTLを検出し効果を確認するとともに座乗領域を絞り込んだ。
７．HOR2001 アルタナリア病原菌と宿主植物との分子病理学的解析によるリンゴ斑点落葉病
およびナシ黒斑病罹病性原因遺伝子の単離（農研機構果樹茶業研究部門）
リンゴ斑点落葉病およびニホンナシ黒斑病は、病原菌Alternaria alternataによって引き起こされるリンゴ・ニホンナシ栽培における最重要病害の一つである。その発病メカニ
ズムや宿主範囲は、それぞれの病原菌が生産する宿主特異的毒素によって決定されている。
リンゴ斑点落葉病菌、A. alternata（リンゴ病原タイプ）はAMトキシンを生産し、栽培の60%以上を占める主要品種「ふじ」、「王林」、「陸奥」などが罹病性であるため、5月下旬の落花期頃からその年の防除が終了するまで、殺菌剤の散布が欠かせない（我々の試算では約70億円の殺菌剤散布が必要）。一方、ニホンナシ黒斑病菌、A. alternata（ニホン
ナシ病原タイプ）はAKトキシンを生産し、「二十世紀」、「巾着」、「南水」などが罹病
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性である。本研究課題では、リンゴ斑点落葉病およびニホンナシ黒斑病の原因遺伝子の単離と品種育成に有用なDNAマーカーの開発を目的とする。本委託プロジェクト期間中に、リンゴ斑点落葉病高度罹病性遺伝子、リンゴ斑点落葉病中度罹病性遺伝子およびニホンナシ
黒斑病罹病性遺伝子が第11連鎖群の相同な領域に存在することを同定し、それぞれの候補
領域の延期配列を決定し、リンゴ斑点落葉病高度罹病性、リンゴ斑点落葉病中度罹病性およびニホンナシ黒斑病罹病性を選抜可能なDNAマーカーを開発した。
８．HOR2002 リンゴの省力栽培に適したカラムナー性樹形を制御する原因遺伝子の単離（農研機構果樹茶業研究部門）
我が国のリンゴ産業は、生産者の高齢化や安価な外国産リンゴの輸入などの問題に直面しており、それを克服する研究アプローチとして、特徴のある樹形を持つ品種を利用した省力的な栽培技術の確立が望まれている。リンゴ品種「McIntosh」の突然変異体として発見された「Wijcik」は、普通の栽培品種に比べて節間が短く、側枝の発生が少ないため、円柱状の樹形に生長する。この性質はカラムナー（columnar）性と呼ばれ、樹形が単純でコンパクトになるため、「密植ができる」、「収穫やせん定作業が極めて容易になる」といった利点があり、リンゴ生産の省力化が大いに期待できる。農研機構果樹茶業研究部門
では、カラムナー性樹形を示す良食味リンゴの育種を進めているが、カラムナー性の表現型の評価に播種後3年程度を要することが育種の効率化を阻む要因となっている。カラムナ
ー性は単一の優性遺伝子Coによって制御されることから、我々はカラムナー性個体をマー
カー選抜するために、カラムナー遺伝子のマッピングを進めてきた。本課題では、カラム
ナー性を制御する原因遺伝子の単離と機能解析、品種育成に有用なDNAマーカーの開発を進める。本委託プロジェクト期間中に、リンゴのカラムナー樹形を制御する突然変異箇所を特定し、候補遺伝子を絞り込み、選抜マーカーを開発し、候補遺伝子の機能解析を行ない
目標を完全に達成した。
９．HOR2003 カンキツのβ－クリプトキサンチン高含有化のための遺伝子単離（農研機構
果樹茶業研究部門）
カンキツ類におけるカロテノイド類の代謝については生合成経路が解明されており、カロテノイド類の組成や含有量の多様性には、カロテノイドの生合成遺伝子の発現量のバランスが関与し、β-クリプトキサンチンを高含有する品種や系統では、β-クリプトキサン
チンよりも上流の生合成遺伝子の発現量が高く、下流の生合成遺伝子の発現量が低いことが明らかとなっている。また、カンキツ類にはカロテノイドの代謝遺伝子には配列や発現パターンが異なる複数のアリルが存在することが明かとなり、カロテノイドの代謝系において最適な遺伝子の組合せを持つ系統を選抜することでβ-クリプトキサンチンを高含有する品種の育成が期待できる。本委託プロジェクト期間中に、シス因子で制御されるカロ
テノイド代謝遺伝子のアリルマーカーの開発、トランス因子で制御されるカロテノイド代
謝遺伝子のアリルマーカーの開発、およびカロテノイド代謝に関与する転写因子遺伝子の機能解析を行った。
１０．HOR2004 ニホングリ易渋皮剥皮遺伝子の単離（農研機構果樹茶業研究部門）
農研機構では2006 年に、果実の渋皮がチュウゴクグリ並みに剥ける易渋皮剥皮性を持つ
画期的なニホングリ品種「ぽろたん」を初めて育成した。「ぽろたん」は、電子レンジやオーブンで加熱することにより簡単に渋皮を剥くことができ、食味も優れていることから、
今後、和洋菓子などを始めとする新たな需要開拓と国産グリの需要拡大、さらに国内のクリ関連産業の活性化、6次産業への貢献など攻めの農林水産業への寄与が大いに期待される。
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今後は、易渋皮剥皮性がニホングリの標準となると考えられることから、易渋皮剥皮性を持ち、さらに異なる収穫期や食味・果実品質に優れる品種の育成が必要となるが、渋皮剥
皮性は果実形質であることから、従来型の選抜では、多大な圃場面積、労力や期間を必要とする。そこで本課題では、易渋皮剥皮性のクリ品種育成に利用可能なDNAマーカー開発のために、ニホングリ易渋皮剥皮遺伝子を単離することを目的とする。本委託プロジェクト
期間中に、ニホングリ標準連鎖地図を構築し渋皮剥皮遺伝子座 (Peeling) を第1連鎖群に同定し、ニホングリ｢丹沢｣のBACライブラリーからファインマッピングにより、1.1 cMの領域に渋皮剥皮遺伝子座を絞り込み、実用的な易渋皮剥皮性の選抜用マーカーセットを開発した。
１１．HOR2005 ニホンナシ果実の糖組成に関するDNAマーカーの開発（京都府立大学生命環
境科学研究科）
ナシ果実における良食味性は、糖、有機酸、アミノ酸、肉質、香り、色などの要因によって決定されており、生食としての利用が多いニホンナシでは甘味を構成する糖の組成と含量が良食味性を決定する上で最も重要である。一方、ニホンナシでは、糖の含量と組成に関連する遺伝子やその制御機構は十分に解明されておらず、良食味性を選抜するためのDNAマーカーも開発されていない。これまでの研究から、ナシ果実における主な糖成分はス
クロース（ショ糖）、グルコース、フルクトース、ソルビトールであり、品種間でこれら糖の組成割合は大きく異なることが明らかとなっており、中でもスクロース含量について
は、品種によっては50％を越えるものから、ほとんど蓄積しない0％に近い品種まで著しい差異が認められている。特に第二次世界大戦以降に育成された品種では、晩生品種を除いて高いスクロース含量を示すものが多く、良食味性とスクロース含量との関連が強く示唆されている。このため、ニホンナシ良食味品種の育成においては、スクロース蓄積の分子メカニズムを明らかにし、スクロース蓄積型を判別できるDNAマーカーの開発を目的とする。
本委託プロジェクト期間中に、スクロース分解に関わる酸性インベルターゼ遺伝子のDNA
マーカーの開発と発現機構の解明では、PpAIV1、PpAIV2、PpAIV3のDNAマーカーを開発してスクロース低含量系統の選抜が可能となった。
１２．HOR2006 ブドウべと病抵抗性のDNAマーカー開発（農研機構果樹茶業研究部門）
これまでの研究により、醸造用ブドウを用いたべと病抵抗性DNAマーカーが欧米諸国で開発されている。一方、日本の生食用ブドウにおけるべと病抵抗性や日本国内のべと病菌系
統に関する研究は進んでいない。そこで、本課題では、生食用ブドウ品種マスカットオブ
アレキサンドリア（アレキ）やキャンベルアーリー（キャンベル）が有する抵抗性について、アレキ×キャンベルの集団（集団AC）を用いて葉および花穂・幼果での抵抗性の評価を行い、QTL解析により抵抗性遺伝子座を検出する。この抵抗性遺伝子座の有効性について、国内から単離した複数のべと病菌株を用いて検証する。その上で、ブドウのゲノム情報を利用して新規マーカーを設計し、抵抗性QTLを両側から挟み込むDNAマーカーを開発する。
上記の解析を通じて、生食用ブドウ新品種育成の際にべと病抵抗性を効率良く選抜するためのDNAマーカーを開発することが本研究の目的である。本委託プロジェクト期間中に、べと病抵抗性に関与する毛じ量を制御するQTLをマーカー化することで、生食用ブドウ新品種
育成にすぐに応用できるべと病抵抗性DNAマーカーを開発した。

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Ⅰ－３．今後の課題
今後、遺伝子領域→遺伝子同定を進めてより高精度のDNAマーカーを作成すること、育種素材集団で利用可能かどうかの検証を進めること、民間・公設試等と共同で新品種育成を開始することで、社会実装への道筋を付ける。
具体的には、育種を行っている民間企業、公設研究機関や大学に成果を受け渡すこと、全国対応の育種を行っている農研機構果樹茶業研究部門や野菜花き研究部門での新品種育成の効率化と普及を進めることで、画期的新品種の短期間での開発を進める。
（１）加工時に臭わず黄変しないダイコン新品種「悠白（ゆうはく）」と「サラホワイト」の品種登録（農食推進事業にて育成）、（２）民間4社と共同で辛み成分に特徴あるダイコン品種を育成中、（３）なすの単為結果性では共同研究5件、（４）キュウリ黄化えそ病抵抗性では、「きゅうり中間母本農７号」を育成し、種苗会社９社に種子を配布、（５）ハクサイ根こぶ病抵抗性では民間4社と共同研究、（６）りんごのカラムナー性では14県で利用、（７）リンゴ斑点落葉病抵抗性やくりの易渋皮剥皮性では農研機構果樹茶業研究部門の育種
での利用

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR1001
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: マップベースクローニング法によるキュウリの黄化えそ病抵抗性遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 野菜花き研究部門・野菜育種・ゲノム研究領域・
ウリ科・イチゴユニット・川頭洋一
１）研究目的
キュウリは年間に約 1,400 億円の産出額をあげるわが国の主要野菜の一つであるが、近年、メロン
黄化えそウイルス（MYSV）によるキュウリ黄化えそ病の被害が深刻化し、九州、四国、東海、関東地域の産地に大きな被害を及ぼしている。キュウリ黄化えそ病はミナミキイロアザミウマによって永続伝搬される日本が初発生のウイルス病であり、MYSV に感染し発病すると生育が抑制され、最大 7割程度の著しい減収となる。キュウリ産地では農薬散布や防虫ネットの設置など様々な防除法が試みられているが、本病の発生を抑制するのは困難であり、発生地域は拡大傾向にある。そのためキュウ
リ産地は抵抗性品種の導入を求めており、キュウリの育種を行っている種苗会社も本病に対する抵抗性育種を重要視している。しかしこれまで抵抗性素材が無かったことから、抵抗性品種は育成されていない。
一方、農研機構 野菜花き研究部門ではこれまでの研究で、キュウリ遺伝資源の中から黄化えそ病に抵抗性を示すタイ原産のキュウリ系統 27028930 を世界で初めて見いだした。本素材は強度抵抗性
ではないものの、罹病性品種の収量が 5〜6 割以上減少する場合でも、抵抗性素材は 1〜2 割程度の減収率に抑制できるため、実用上有効な育種素材である。今後、抵抗性素材を用いて効率的に抵抗性品種を育成するためには、抵抗性遺伝子を単離し、高精度の DNA 選抜マーカーを開発することが重要である。そこで本課題では、黄化えそ病抵抗性系統を用いて抵抗性遺伝子を単離することを目的とする。
２）研究成果黄化えそ病抵抗性を有する「きゅうり中間母本農 7 号」
（図 1）を育成し、品種登録出願した。本中
間母本は、黄化えそ病抵抗性のキュウリ系統 27028930 と固定品種「ときわ」を交雑した F5 世代にF1 品種「アンコール 10」を交雑し、抵抗性検定による選抜と自殖を繰り返すことにより育成したものである。
次に、「きゅうり中間母本農 7 号」（抵抗性）と「きゅうり中間母本農 4 号」（罹病性）を交雑して得られた F2 集団を用いて黄化えそ病抵抗性の QTL 解析を行った。その結果、以前に由来の異なるF2 (27028930 ×ときわ) 集団を用いた時に検出された第 3 染色体の QTL と同様の位置に QTL が検出されたことから、この領域に抵抗性遺伝子が存在すると考えられた。F2 (きゅうり中間母本農 7 号×
きゅうり中間母本農 4 号) 集団における DNA マーカーのタイプと抵抗性との関係を調べた結果、この QTL 領域に位置するマーカー CSN251 を用いることで、効率的に抵抗性個体を選抜することができることが分かった（図 2）。

HOR100119

第 3 染色体の抵抗性遺伝子の領域を絞り込むため、QTL 領域を含む 36cM の領域について、1〜
3cM 程度の間隔で多型マーカー（SSR マーカー A〜O）を設定するとともに、この領域内で組換えが生じている個体を選抜し、採種した。採種した組換え系統を用いて MYSV 抵抗性検定を行い、発病程度とマーカー遺伝子型の関係を調査した結果、抵抗性遺伝子はマーカー C と E の間 (約 4cM) に存在することが示唆された（図 3）。さらにマーカー C と E の間で組換えが生じている 17 系統を用いて、同様に調査した結果、抵抗性遺伝子の領域が 1.2cM まで絞り込まれた。
抵抗性遺伝子の領域をさらに絞り込むため、この 1.2cM を含む 2cM 程度の領域について、13 個の多型マーカー（SSR マーカー a〜m）を設定するとともに、この領域内で組換えが生じている個体を

HOR100120

選抜し、採種した。採種した組換え系統を用いて MYSV 抵抗性検定を行い、発病程度とマーカー遺伝子型の関係を調査した結果、抵抗性遺伝子はマーカー e と g の間 (約 45kb) に存在することが示唆された（図 4）。

次に「きゅうり中間母本農 7 号」を用いて、BAC ライブラリーを作製し、絞り込んだ約 45kb の領域を含む BAC クローンを単離し、塩基配列を決定した。キュウリのリファレンスゲノム情報との比較から、絞り込んだ領域には 7 個の遺伝子があると考えられた。絞り込んだ領域の両側の遺伝子を含む合計 9 個の遺伝子 A〜I について、転写量を調査した結果、抵抗性系統と罹病性系統の間で差がある
遺伝子 A、B、H を見いだした。遺伝子 E は特段の差は見られなかったが、アミノ酸配列は 4 箇所異HOR100121

なっており、転写因子と考えられることから、抵抗性遺伝子の候補として A、B、H、E を選定した。
これらの候補遺伝子が抵抗性遺伝子であるかどうかを確かめるため、候補遺伝子を罹病性キュウリに導入した。遺伝子 E および MYSV（病原ウイルス）を接種すると抵抗性系統の方が高い発現量を示した遺伝子 A については、全長タンパク質が発現するコンストラクトを作製した。罹病性系統の方で発現量が高かった遺伝子 B および H については、発現を抑制するベクター（RNAi コンストラクト）を作製した。作製したベクターをアグロバクテリウム法により、キュウリ「霜しらず地這」に導入した。遺伝子 E については現在、形質転換体を作製中である。遺伝子 A、B、H については、形質転換体から得られた種子を用いて抵抗性検定中である。
以上をまとめると、本プロジェクトでは黄化えそ病抵抗性の「きゅうり中間母本農７号」を育成し、品種登録出願を行い、種苗会社 9 社に種子を配布した。また、抵抗性遺伝子の単離までは至っていな
いが、第 3 染色体上の黄化えそ病抵抗性遺伝子領域を、約 20cM（約 6,000kb）から約 45kb まで絞り込むことができた。
３）成果活用における留意点
本プロジェクトで開発した「きゅうり中間母本農 7 号」を育種素材にして黄化えそ病抵抗性品種を育成することが可能であり、第 3 染色体領域の DNA マーカーを用いることにより、効率的に抵抗性個体を選抜することができる。ただし、「きゅうり中間母本農 7 号」と同程度の抵抗性を持つ F1 品種を育成するためには、複数の遺伝子の集積が必要であり、抵抗性検定による選抜も行う必要がある。
４）今後の課題
候補遺伝子 A、B または H のコンストラクトを導入したキュウリについて、抵抗性の有無を明らかにする。候補遺伝子 E について、コストラクトを導入したキュウリを作製し、抵抗性の有無を明らかにする。もし抵抗性の系統が得られなかった場合には、これまでに絞り込んだ領域内で組換えが生じた系統を複数育成し、抵抗性検定を行うことにより、目的の遺伝子を確実に絞り込んでいく。

HOR1001

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR1002
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ハクサイ根こぶ病抵抗性遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 岩手大学・農学部・植物育種学研究室・畠山勝徳
１）研究目的
根こぶ病はハクサイの重要病害であり、主要産地では防除のために大量の農薬が使用されている。
強度抵抗性のカブを素材とした抵抗性品種が販売されているが、圃場内には病原型の異なる菌が混在しているために、単一の抵抗性遺伝子をもつ品種は容易に発病してしまう。多様な病原型に対応した
強度抵抗性の獲得のためには、複数の抵抗性遺伝子の導入が必須である。我々は、ハクサイの８つの抵抗性遺伝子座のうち、Crr1a 遺伝子を単離し、根こぶ病菌で同定されている４つの病原型（G1〜G4）のうち G2 と G4 に抵抗性を発揮することを明らかにしたが、Crr1a だけでは G1 と G3 には対応できない。本研究では、４つの病原型に対する抵抗性反応が異なる３つの抵抗性遺伝子座、すなわ
ち、G3, G4 に抵抗性を発揮する CRb 、G1, G4 に抵抗性を発揮する Crr1b 、G2, G3, G4 に抵抗性を発揮する CRk を単離し、抵抗性品種育成のための高精度遺伝子マーカーを開発する。
２）研究成果1) CRb の単離：CRb 座の候補領域に位置するマーカーを用いてフォスミドライブラリーをスク
リーニングし、DNA マーカー B1005 から B4701 までカバーすると考えられる３つのフォスミド
クローンを単離した。そのうちの２つ（P007G12 と P005H06）について全長の塩基配列を決定し、抵抗性 1074RR 系統における約 64kb のゲノム配列を得た。罹病性ハクサイ（Chiifu-401-42）に由来するリファレンスゲノム配列と比較すると、1074RR には大きな挿入や欠失が認められ、
NLR(Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing protein) をコードすると推定される ORF が同一方向にタンデムに存在していた。このうち B4732 と B1005 間に存在す
る 5 つの ORF（CRb α, CRb β, CRb γ, CRb δ, CRb ε）について、形質転換シロイヌ
ナズナを作出し、根こぶ病病原型 G3 に属する No.14 菌を接種した。その結果、CRb αを導入した系統のみ抵抗性が認められた（図 1）。CRb αは既報の CRa 遺伝子と同一の配列であったことから、CRb と CRa は同一の遺伝子であることを明らかにした。
2) Crr1b の単離：Crr1b 連鎖マーカー No.82 と BSA1 間で組換えを起こしている F2 は 20 個体選抜されたが、この中で Crr2 を抵抗性ホモ型あるいはヘテロ型で有するものは 12 個体であった。不稔性の 1 個体を除いた 11 個体から F3 種子を採種し、根こぶ病検定に供試した。組換え
11 個体に由来する F3 系統は全て罹病性を示したことから、Crr1b の座乗領域は No.88-No.96
間の約 52kb と推定された。さらに No.88-No.96 間に新たに DNA マーカーを作出し、組換え
F3 系統の遺伝子型を決定した結果、抵抗性遺伝子の座乗位置を Sp 034-Sp 079 間の約 13kb にまで絞り込むことができた。一方、Crr1b 推定座乗領域上のマーカー No.82、BSA1、BSA2 を用いて根こぶ病強度抵抗性系統 G004 に由来する BAC ライブラリーを用いて 1 次スクリーニ
ングを行い、ポジティブクローンについて周辺マーカーを用いた整列化を行った（図 2）。その結果、BSA2 は含まず BSA1 を含む 3 クローン、No.82 を含む 6 クローンを同定した。しかし、SP 034〜No.96 間をカバーするクローンは得られなかった。そこで、BSA1 と No.96 を含むクローン B224D04f の全長の塩基配列を決定し、No.96 側末端の塩基配列からマーカーを作成し、BAC ライブラリーをスクリーニングした。得られた 2 クローンの末端配列からマーカーを作成
HOR100223

し、これまでに単離した BAC クローンの PCR スクリーニングを行い、No.88〜No.96 間の領域をカバーする３つの BAC クローン、284B06、B220B08、B224D04f を特定した。単離したBAC クローンのシーケンス結果から、公開リファレンスゲノム上での Sp 034 と Sp 079 で挟まれる推定座乗領域は 13kb であるが、抵抗性系統 G004 においては約 55kb と推定された。この領域には４つの ORF（ORF1〜ORF4）が推定された（図 2）。ORF2 と ORF4 は G004 のみで発現が認められたことから、これらについて全長の cDNA の塩基配列を決定した。ORF2 および ORF4 について全長を含むゲノムクローンを Crr1a プロモーターの下流に連結した導入遺伝子を構築し、シロイヌナズナ Col-0 に形質転換した。また、Crr1b と共存することで機能する
Crr2 の２つの候補 ORF について、プロモーター、ターミネーターを含むゲノムクローンを増幅し、導入遺伝子を構築した。Col-0 に形質転換した。

HOR100224

3) CRk の単離：CRk 座候補領域であるマーカー 7219(14.3Mb) から 429850(15.4Mb) 間の組換え F4 系統のうち、当該領域のゲノムがホモ型である 155 系統を選抜し、そのうち 144 系統から F5 種子を採種した。90 系統の F5 系統について、2 回に分けて No.14 菌の接種試験を行い、推定座乗領域の絞り込みを試みた（図 3）。その結果、4050-BrSTS61 間と 25712-4050 間の２カ所に抵抗性遺伝子の存在が示唆され、それぞれ CRk 1 と CRk 2 とした。さらに、2 カ所の候補領域において組換えを起こした F5 系統を供試し、病原型 G3 の No.14 菌を用いて接種検定を行い、グラフ遺伝子型と表現型の関係から抵抗性遺伝子の座乗領域の絞り込みを行った。
BrSTS78-BrSTS61 間の組換え F5 系統では、4 系統が抵抗性あるいは部分抵抗性を示し、1 系
統が罹病性であった。このことから、このマーカー間の 50kb 内に CRk 1 が存在すると考えられた。また、26330-4050 間の組換え F5 系統では、1 系統が抵抗性、1 系統は罹病性を示した。
よって、このマーカー間で挟まれる 75kb 内に CRk 2 が存在すると推定された。

HOR100225

CRk 1 と CRk 2 の座乗領域周辺で組換えを起こしている９系統について、G1, G2, G4 の菌株を接種した。G1 の菌株には全ての系統が罹病性を示した。G2 と G4 に対する抵抗性反応は、No.0174 06 を除いて G3 に対する表現型と同じであった。グラフ遺伝子型から、No.2068 02，
No.2548 02, No.3539 03 は CRk 1 のみを有するので、CRk 1 は G2, G3, G4 の病原型に抵抗性を付与すると考えられた。No.0174 06 は BrSTS78-BrSTS61 間で組換えを起こしているが、G2に対して罹病性を示すことから、CRk 2 のみを有すると考えられた。以上のことから、CRk 1と CRk 2 は病原型に対する特異性が異なると示唆された。CRk は G2, G3, G4 に対して抵抗性を付与する遺伝子座であることから、その条件を満たす CRk 1 についてフォスミドクローンのスクリーニングを開始した。BrSTS78 マーカーを用いてフォスミドライブラリーをスクリーニングし、30 以上の陽性 well が検出されたが、このうち BrSTS61 マーカーをもつ well はな
かった。そこで、BrSTS61 と反対側の 22671 マーカーをもつ１クローン（3 D01）と任意の１クローン（1 C06）についてシングルクローンを単離し、両末端のシーケンスの相同性検索を行ったが、いずれのクローンについても期待される A03 とは異なる染色体と相同性を示した。
1 C06 について、シーケンスショットガンクローンの塩基配列を解析中である。
4) Crr1a の単離：根こぶ病抵抗性品種に見出された 3 つの Crr1a アレルを導入したシロイヌナズ
ナに根こぶ病病原型 G4 に属する Ano-01 菌を接種したところ、Kinami90 アレルを導入した形質転換体で抵抗性が認められた（図 4）。機能を有する G004 と Kinami90 アレル特異的なマーカーを用いた解析から、この 2 つのアレルは根こぶ病抵抗性 48 品種中、それぞれ 3 品種、2 品
種に保持されていることが示唆された。Crr1a に見出されたアレルのうち、罹病性を示す 2 つのアレルではいずれも C 末ドメインが欠失していることから、この領域が抵抗性付与に重要な部位である可能性が示唆された。非機能型 Kiko85 アレルに G004 アレルの C 末を付加した遺伝子（Kiko85+G004C−ter ）の形質転換体では、全ての T1 系統で抵抗性を示し表現型が回復し

HOR100226

た（図４）。一方、同じく非機能型 Hiroki アレルのコンストラクト（Hiroki+G004C−ter ）では
9 系統中 4 系統で部分抵抗性を示したが、残りの系統は明らかな罹病性を示し、完全には表現型が回復しなかった。Hiroki アレルに Kinami90 アレルの C 末ドメインを付加したキメラ遺伝子を導入したシロイヌナズナの表現型を調査したところ、得られた 6 系統で病原型 G4 の Ano-0１を接種したところ、明らかな抵抗性が認められた。Hiroki アレルには C 末ドメインの欠失とLRR 内に 24 アミノ酸の欠失がある。Hiroki+G004C−ter は抵抗性が不安定であったが、同じくLRR 内に 24 アミノ酸欠失をもつ Kinami90 の C 末を連結した Hiroki+Kinami90C−ter が抵抗性を示したことから、LRR と C 末ドメインとの間に相互作用があり、これが病原体の認識ある
いはシグナル伝達に必要である可能性が示唆された。現在、複数の系統で追試実験を行うとともに、同じく罹病性 Kiko85 アレルに Kinami90 アレルの C 末ドメインを付加したキメラ遺伝
子の構築と形質転換を進めている。

３）成果活用における留意点

1) 抵抗性遺伝子の座乗領域周辺の DNA マーカーを利用することで効率的に抵抗性個体を選抜することが可能であるが、あらかじめ素材のマーカー遺伝子型と表現型の関係を調査して目的の抵抗性遺伝子の有無を確認しておく必要がある。
2) Crr1b については、はくさい中間母本農９号を素材として利用することができる。
3) CRb を選抜するための DNA マーカーは、Kato et al. Breed Sci (2013)63: 116., Hatakeyama
et al. Mol Genet Genomics (2017) 292: 397. に記載されている。

４）今後の課題

HOR100227

1) Crr1b , CRk 1 , CRk 2 については、抵抗性遺伝子を特定するまで至っていないが、いずれも本プロジェクトを通じた研究により、選抜には支障のない程度に遺伝子近傍のマーカーが得られている。さらに責任遺伝子を明らかにすることによってより高精度な DNA マーカーの開発が可能になる。
2) 根こぶ病の接種検定に用いている菌系の多くは、圃場において罹病した個体の根から調整したものであり、多様な病原型が混在している。病原型と抵抗性遺伝子の関係をより詳細に解析するためには、単胞子分離した菌系と単独の抵抗性遺伝子を有する同質遺伝子系統を用いて解析する必要がある。

HOR100228

「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR1003
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: トマト単為結果性およびトマト黄化葉巻病抵抗性に関与する新規遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 野菜花き研究部門・野菜育種・ゲノム研究領域・
ゲノム解析ユニット・布目司
１）研究目的
単為結果性は受粉・受精しなくても果実が着果・肥大する形質であり、訪花昆虫の利用や植物ホル
モン剤散布による着果・果実肥大促進作業の軽減および高温期の着果安定が期待できる有用形質である。しかし、育種に利用されているトマト単為結果性遺伝子 pat-2 は、多面発現により種子生産が不安定になる栽培時期があるため、新たな単為結果性遺伝子が求められている。一方、トマト黄化葉巻病は、物理的な遮断が難しいタバココナジラミによって媒介される難防除病害であり、薬剤耐性の発達した個体群への置換により薬剤防除が難しくなっている。抵抗性育種に利用可能なトマト黄化葉巻
病強度抵抗性遺伝子は現時点では存在しないため、新たな強度抵抗性遺伝子に対するニーズは極めて高い。いずれの問題においても、解決のためにはこれまでに知られていない新規の遺伝子素材の獲得・作出が重要である。しかし、個体が大きく栽植密度が限定される園芸作物では大規模な集団を供試した選抜の実施は困難である。そのため、DNA 解析により標的遺伝子に変異を持つ系統を選抜して形質評価を行う逆遺伝学的解析手法が有効である。本課題では、大規模な突然変異体集団・遺伝資源の網羅的選抜を可能とする超並列シークエンサー（NGS）を活用した効率的な DNA 変異検出技術、および DNA 解析による変異検出に供試する解析集団を育成するために花粉への変異原処理による突然変異体集団作出技術を開発し、トマト単為結果性関連遺伝子およびトマト黄化葉巻病抵抗性関連遺伝
子を標的として新規有用変異体を検索・獲得する。獲得する新規有用変異体は、民間種苗企業などと連携してトマト新品種の育成への利用をはかる。
２）研究成果1. 花粉への変異原処理による突然変異体集団の育成

1) 花粉への UV 照射による突然変異体集団の育成
UV 照射が花粉発芽に与える影響を調査した。また、UV 照射花粉を受粉に用いて、着果した果実の果実重および採種量を調査した。UV 照射量に比例して花粉発芽率、果実重、採種量は減少した。花粉発芽率が未処理花粉の 50%程度となる UV 照射条件の花粉を用いて交配を行ったが、種子は得られなかった。UV 照射が花粉に与える生理的影響が大きいために受精できなかったと推測される。着果して種子が得られる花粉への UV 照射条件を検討し、交配・採種により変異体集団を育成した。UV 照射花粉に由来する個体の全ゲノム配列データを取得し、UV照射により引き起こされた DNA 配列の変異を検出した。UV 照射量と変異頻度には相関は見られず、1 変異体あたり平均 45〜63 の変異（15〜20 Mb あたりに一つの突然変異）が検出されたが、種子への EMS 処理やガンマ線照射よりも変異頻度が低かった。また、種子への EMS 処理やガンマ線照射と比較して A/T > T/A 変異の割合が高かった。標的遺伝子の変異体検索を効率よく行うためには、他の変異原処理による変異体集団育成の検討が必要と考えられた。
2) 花粉へのガンマ線照射による突然変異体集団の育成
旧農業生物資源研究所・放射線育種場において、トマト花粉へガンマ線照射を行った。ガン
マ線照射した花粉を受粉に用いて採種を行い果実重と採種量を調査することで、突然変異体集

HOR100329

団の育成に適したガンマ線照射条件を選定し、突然変異体集団を育成した。ガンマ線照射した花粉に由来する個体のゲノム配列の一部を RAD 解析により取得し、ガンマ線照射により引き起こされた DNA 配列の変異を検出した。トマト花粉へのガンマ線照射による突然変異頻度は、花粉への UV 照射や種子への EMS 処理やガンマ照射にくらべて低かった。標的遺伝子の変異体検索を効率よく行うためには、他の変異原処理による変異体集団育成の検討が必要と考えられた。

3) 花粉への化学変異原処理
花粉へ化学変異原を処理するため、花粉が破裂せず発芽しない花粉懸濁溶液の組成、花粉を交配に用いるための溶液条件等の検討を行った。浸透圧を調整した溶液に懸濁することで花粉は発芽せずに化学変異原を処理する条件を設定した。しかし、この花粉を交配に用いた場合には着果頻度が低く、採種量が少なかった。花粉懸濁液の影響により花粉の発芽および受精の頻度が低くなったことが原因と推測された。そのため、突然変異体集団の育成には、花粉への化
学変異原処理は適用できないと判断した。

4) 種子への化学変異原処理による突然変異体集団の育成
トマト種子への化学変異原 ENU (N-ethyl-N-nitrosourea)、MNU (N-methyl -N-nitrosourea)、
DEB (Diepoxy butane)、EMS(Ethyl methane sulfonate) の処理条件を検討した。1 日浸水して催芽したトマト種子に各濃度で化学変異原を処理し、種子発芽率と幼苗の生育を調査した。
すべての化学変異原で処理濃度に応じて種子の発芽率が減少したが、突然変異体集団の育成には ENU 処理を採用し、突然変異体集団を育成した。

ENU 処理による突然変異体 M1 植物のゲノム配列の一部を RAD 法により取得し、変異頻度を調査した。M2 植物の変異頻度も同様に調査したところ、M1 植物に比べて変異頻度が低く、M1 植物で検出された変異のうち約 7 ％の変異が M2 植物で検出され（データ省略）、M1 植物の変異の多くはキメラだったと推測された。種子への ENU 処理は変異頻度が EMS 処理よりも高く、A/T > T/A および A/T > G/C の変異が多く、EMS とは変異誘導スペクトルが異なる
ため、突然変異体集団の育成に有効と考えられた。
2. 超並列シークエンサーを用いた変異検出手法と一塩基多型タイピング法の開発
遺伝資源や突然変異体集団から標的遺伝子の変異個体を効率良く検索するためには、超並列シーク
エンサを用いた変異検索手法の開発が必要である。そこで、個体別に異なる組み合わせの 2 種類のイ
ンデックス配列を付加した PCR 産物を作成し、シークエンス分析により各系統を識別できる TAS 法を適用し、有効性を検討した。
また、有用形質を示す突然変異体は農業上の利用価値が高いが、突然変異体のゲノム背景には標的遺伝子以外の領域にも突然変異が潜んでおり、これら変異のいくつかは表現型に予想外の影響をもたらす可能性がある。したがって、ゲノム背景に潜む不要な突然変異を連続戻し交配により排除する必要がある。そこで、突然変異体の戻し交配親に遠縁の品種・系統を用いる場合と、近縁ないし原品種を用いる場合の 2 つの状況を想定し、ゲノムワイドな遺伝子型分析としてそれぞれに RAD-Seq 法とTAS 法を適用し、分析精度と有効性を検討した。
1) ターゲットアンプリコンシークエンス法 (TAS)NGS 解析に使用するアンプリコンは 2 回の PCR によって作製した（図 1）。トマト突然変
異体 7 系統に存在する突然変異から、ランダムに 69 個の突然変異（うち 39 個がホモ接合、残り 30 個がヘテロ接合）を選抜し、それぞれを含む DNA 断片を増幅するプライマー対を設計した。１回目の PCR では、トマト突然変異体 7 系統のゲノム DNA を鋳型として 4 種類のプライ
HOR100330

マー対を混合したマルチプレックス PCR により増幅産物を得た。得られた増幅産物は系統ごとに混合後に希釈し、これを鋳型として 2 回目の PCR を行った。増幅産物の塩基配列を NGS により分析し、得られた配列から低品質のものを除去後、トマト品種 Heinz 1706 の標準ゲノム配列上に位置付けて、突然変異を検出した。その結果、調査した突然変異のうち 65 個の突然変異（うち 36 個がホモ接合、残り 29 個がヘテロ接合）の遺伝子型を正確に決定することができた。
したがって、本実験条件における TAS 分析法の変異検出効率は 94.2%であり、精度は 100%であると推定された。なお、遺伝子型が決定できなかった座のうち１個は非特異的な断片の増幅によるものであり、残り 3 個では配列データが得られていないことが原因であった。

2) RAD-seq
トマト 6 品種の葉から全ゲノム DNA を抽出し、二種類の制限酵素（Pst I と Msp I）で切断した。それぞれの切断末端にアダプターを付加し、PCR により各 DNA 断片を増幅し、同時に各品種を識別するタグ配列を付加した（図 2）。得られた DNA 断片を混合し、精製後に NGS
で配列分析を行った。得られた配列は低品質のものを排除した後にトマト品種 Heinz 1706 の標
準ゲノム配列上に位置付け、各品種と Heinz 1706 との間の SNP を検出した。

6 品種において合計 1736 個の SNP を検出した（表 1）。各染色体あたりの SNP の数には偏りがあり、第 7 染色体や第 8 染色体では SNP 数が少ないのに対して、第 5 染色体などでは多数の SNP が検出された（データ省略）。この偏りは、前プロジェクト（SGE1001）で行った、トマト 6 品種の全ゲノムリシークエンス解析で見出したゲノムワイドな SNP の偏り方と一致している (Shirasawa et al. 2013)。
さらに、本 RAD-Seq 分析に使用した品種のうち 3 品種は、前プロジェクト（SGE1001）の全

HOR100331ゲノムリシークエンス解析に用いた材料であるため (Shirasawa et al. 2013)、ゲノムワイドな
SNP 情報が整備されている。そこで、RAD-Seq で検出した SNP の精度を調べるため、RAD-Seqと全ゲノムリシークエンス解析で検出した SNP の異同を調査した。その結果、RAD-Seq で検出した SNP のうち約 75%は全ゲノムリシークエンス解析で明らかにした SNP と一致した（表2）。残りのうち、4%は両者間で不一致だったが、22%は RAD-Seq 分析で新たに見出された
SNP であった。したがって、RAD-Seq 分析で検出される SNP の精度は 74%〜96%であると推定された。

3. トマト単為結果性およびトマト黄化葉巻病抵抗性に関与する遺伝子の新規変異体の獲得
HOR100332

1) 標的遺伝子の変異体検索
トマト遺伝資源（736 系統）を用いて、単為結果性関連遺伝子とトマト黄化葉巻病抵抗性関連遺伝子を対象にした変異検索を行った。個体別に異なる組み合わせの 2 種類のインデックス配列を付加した PCR 産物を作成し、シークエンス分析により 736 系統を識別できる方法を確立した。配列データのバイオインフォマティクス解析により、標的遺伝子の変異を検出した（表3）。標的遺伝子の機能欠損やリーキー変異を持つ系統を選抜し、サンガー法により変異の確認を行った。

2) トマト単為結果性関連遺伝子の変異体
トマト遺伝資源から単為結果性遺伝子に変異をもつ変異体 3 系統を見出した（図 3）。変異体
系統の単為結果性を評価したところ、いくつかの系統は弱い単為結果性を示した。今後、ゲノム背景を大玉トマト栽培品種に置換し、形質評価を行い、育種素材化を図る。

HOR1003333) トマト黄化葉巻病抵抗性関連遺伝子の変異体
トマト黄化葉巻病ウイルス TYLCV との相互作用が推測される 4 つの宿主遺伝子を標的としてトマト遺伝資源から変異体を検索し、アミノ酸置換を生じる変異体 13 系統を見出した。自殖
後代から変異を固定した個体を選抜し（図 4）、TYLCV 感染に対する応答の評価を行ったところ、少数系統でウイルス増殖の抑制が観察された。今後、標的遺伝子の変異とウイルス増殖の抑制との関係について、詳細な解析を進め、育種素材化を図る。

３）成果活用における留意点
・超並列シークエンサーを用いた変異検出手法と一塩基多型タイピング法は、十分なデータ量を確保することでエラーを軽減できる。
４）今後の課題
・遺伝資源から見出した突然変異体の評価を進め、育種素材化する。
・突然変異体集団から標的遺伝子の変異体を選抜し、表現型評価および栽培品種への戻し交雑により育種素材化する。
・育成した突然変異体集団の活用を図り、新たな標的遺伝子変異体を検索するとともに、突然変異
体集団の表現型調査を行い遺伝学的解析により新たな育種素材を開発する。

HOR1003

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR1004
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ナス単為結果性を制御する原因遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 野菜花き研究部門・野菜育種・ゲノム研究領域・
ゲノム解析ユニット・宮武宏治
１）研究目的ナスの施設栽培において、低温あるいは高温環境下で生じる花粉稔性の低下は落花や果実の肥大不良を引き起こし、収量確保の大きな妨げとなってきた。これに対して、ホルモン剤（4-CPA）の散布
等によってこれまで対策が取られてきたが、多大な時間と労力（全作業労働時間の 27%）を要することから、生産コストの増大を招く要因となっていた。そこで、我々はこの問題に対する抜本的な解決策の１つとして単為結果性ナス品種「あのみのり」、「あのみのり 2 号」を育成し、普及に努めている。「あのみのり」の発表を１つの契機として、ナスにおける単為結果性の利用が民間種苗会社や公立研究機関等の注目を集めることとなり、野茶研と素材を共有した単為結果性品種の育成が広範囲に広がりつつある。本課題では、これら単為結果性品種育成の効率化に利用可能な遺伝子マーカーの作出を目的とし、「あのみのり」の両親と兄弟関係にある AE-P03 が有する単為結果性遺伝子座のうち効果の大きい 2 つ（Cop3.1 , Cop8.1 ）に座乗する原因遺伝子を単離する。
本課題において対象とする単為結果性遺伝子は、実用上問題となる劣悪形質を伴わないことから、非常に有望な遺伝子として期待されている。代表的なナス科果菜類であるトマトにおいては、すでに数多くの先行研究が報告されているが、採種性、果実肥大性等が不安定であることが問題となっており、実用化には克服すべき課題が多く存在する。このことから、本課題において原因遺伝子が単離され、そのメカニズムの一端が明らかになることは、安定した単為結果性の発現誘導に資する新たな知見となり、得られた成果はナスだけにとどまらず、他のナス科果菜類に波及することも十分に期待できる。
２）研究成果（1）解析材料の育成と単為結果性検定方法
単為結果性系統 AE-P03 を 1 回親、非単為結果性系統 LS1934 を反復親とした BC4F2 個体どうしを交配後、自殖した後代（便宜上 CSSLF2 世代とする）について、Cop3.1 、Cop8.1 のいずれかがAE-P03 ホモ型に固定し、もう一方がヘテロ型の集団をそれぞれ作出した。これらの後代集団を用いて以下の試験を実施した。検定試験は最低気温 15 度を目標に加温したビニルハウス内で 30cm ポットにて栽培し、各株につき７から 10 花を除雄して約１ヶ月後、単為結果性の有無を調査した。単為結
果性の判断基準として「LS1934」の除雄果の最大果実長、65mm を指標とした（11 月〜翌年 4 月）。
（2）Cop3.1 遺伝子座の同定
1）AE-P03 が有する 2 つの単為結果性遺伝子座のうち、初期肥大に関わることが示唆されている
Cop3.1 座について、ナスとトマトのオルソログマーカー（Fukuoka ら、2012）を手掛かりに、同領域に対応するトマトのゲノム配列（SL2.40）と、座乗するトマトの unigene 配列（Sol Genomics
Network: https://www.solgenomics.net）を取得した。トマトの unigene 配列と同祖関係にあるナスの unigene 配列（SME r2.5.1、Hirakawa ら、2014）を抽出し、これら遺伝子が座乗するナスのゲノ
ム配列（Hirakawa ら、2014）を明らかにした。この配列上に 100kb 間隔を目標に各ブロックにつき
10-20kb を増幅するプライマーペアを設計した。
2）上記プライマーペアによって増幅した 2 つのナス系統（単為結果性系統・AE-P03、非単為結果
性系統・LS1934）由来の PCR 産物を Miseq ライブラリ調整キット（NexteraXT、Illumina 社）に

HOR100435

よって調整し、MiSeq Reagent Kit v3（Illumina 社）を用いて塩基配列を取得した。
3）2）で得られた２つの系統の配列を比較解析し、系統間多型情報を得た。その結果、候補領域を100kbp ごとに区切ったブロックのうち、トマトにおいて座乗遺伝子が推定された 44 箇所について上記プライマーペアの設計を試みたところ、42 箇所について PCR 産物の増幅が確認できた。このうち、Miseq によって配列が正確に得られた 38 箇所の系統間変異を調査したところ、マーカー候補となる
大量の変異を検出した。
4）これら系統間多型候補をダイレクトシーケンスで確認した結果、38 個の新規マーカーが作出された。それぞれの由来配列をもとに、マーカーの座乗位置を検証したところ、候補領域 5.2M（53.3M58.5M：推定値）を 100kbp ごとに区切ったブロック 52ヶ所のうち、既存のマーカーが 9ヶ所、新規マーカーが同領域を除く 21ヶ所に座乗することが明らかとなった（図 1）。

5）Cop3.1 座近傍をヘテロ型に有する個体の自殖次世代集団（CSSLF3）1,800 個体に対して、候補領域に等間隔に配置した 9 つの SSR マーカーを供試し、各個体の遺伝子型を決定した。同領域内
で乗り換えが生じていることが確認された個体を選抜後、自殖次世代（CSSLF4）の中から、候補領域の一部が AE-P03 ホモ型に置換した個体を選抜し、単為結果性検定に供試した。その結果、56.5M57.6M(1.1Mbp) の範囲に原因遺伝子が座乗することが示唆された（図 1）。さらなる候補領域の絞り込みと原因遺伝子の単離を目指したが、数百個体の個体を扱う必要があり、もう一つの主働的に働く
単為結果性遺伝子座 Cop8.1 と並行して遺伝子単離を進めることは困難であると判断した。また、当該遺伝子座は果実の初期肥大に関わることが示唆されており、日本型ナスの多くは潜在的にその能力を有することが期待されることから、Cop8.1 の遺伝子単離に集中することとした。
（3）Cop8.1 座に座乗する単為結果性遺伝子の単離
１）候補領域に座乗するマーカー配列を手掛かりに同領域に座乗する BAC クローンをスクリーニ
ングし、配列情報を得た。この配列上に存在する系統間多型を元に 16 個の新規マーカー（M1-M16）を作出した。昨年度の CSSLF4 集団を用いた単為結果性検定結果と併せて検証したところ、2 つのマーカー間（M4-M13）に原因遺伝子が座乗することが明らかとなった。これは、68kbp の物理距離に相当する（図 2）。

HOR1004362）2 つの系統（AE-P03、LS1934）に由来する BAC ライブラリーから上記候補領域をカバーする
BAC クローンをそれぞれ単離し、配列を決定した。それらを比較することにより、系統間に 4 つの変異が存在することが明らかとなった（図 3：B-E）。
3）CSSLF6 世代の中から、M4-M13 の間で組換えが生じた個体を選抜し、単為結果性検定に供試した結果、B、C の変異のいずれかが原因であることが示唆された（図 3）。

4）B、C の変異について、ナス遺伝資源約 1000 点の遺伝子型を確認したところ、それぞれ 31、143
系統において AE-P03 型の遺伝子型を示した。B の変異を AE-P03 ホモ型、あるいはヘテロ型に有する個体は全て単為結果性を示すことが確認された。一方で、変異 C については単為結果性の有無とは無関係であった。

HOR1004375）遺伝的背景を LS1934 とし、候補領域近傍のみをヘテロ型に有する個体の自殖後代から得られた系統 A と系統 B について、網羅的遺伝子発現解析により候補領域内で発現している領域を確認した
ところ、B、C の近傍領域に系統間で違いが見られる領域が存在することが明らかとなった。これをGENE2 とする。GENE2 の詳細な発現解析を実施したところ、AE-P03 ではあらゆる部位・ステー
ジで発現が確認されたのに対して、中生真黒（NKT）ではほとんど発現していないことが明らかとなった。ごく限られた候補領域内に存在し、発現パターンと単為結果性の有無が同調していることから、GENE2 が新たな候補遺伝子として有望であることが示唆された。この転写産物について、得られた配列を NCBI の nr/nt データベースに対して BLASTN を用いて相同性検索したが、相同性の高い遺伝子は検出できなかったことから、機能の推定には至っていない。
6）図 4 に示すとおり、GENE2 をターゲットとした 3 つのコンストラクトを構築し、それぞれ GFP
発現植物形質転換用バイナリベクターの T-DNA 領域に挿入し形質転換ナスを作出した。

上記のコンストラクトのうち、C01、C02 を導入した組換え個体においては、単為結果性を付与することはできなかったが、C03 を導入した AE-P03 において単為結果性が抑制される現象が T0 世
代で確認された。
7）GENE2 近傍領域のメチル化解析4）で選抜した変異 B をヘテロ型に有する単為結果性個体の自殖次代において、変異 B の有無とは関係なく GENE2 が発現し、単為結果することが確認されたことから、変異 B が直接原因ではない
ことが示唆された。塩基配列上のいずれの変異も GENE2 の発現の直接の原因ではないことから、メチル化状態に着目し解析することとした。中生真黒と AE-P03 のゲノム DNA を抽出しバイサルファ
イト処理したのち、候補領域をカバーする PCR プライマーで増幅した。約 8kb の領域を 12 ペアのプライマーで増幅した。その後、増幅した PCR 産物をプラスミドベクターでクローニングしシーケ
ンスデータを取得した。両系統の該当する DNA 領域のメチル化程度を確認したところ、転写開始点を含むと思われる上流領域についてはメチル化程度の違いは確認されなかった。

HOR100438３）成果活用における留意点
2 つの単為結果性遺伝子座のうち、効果の小さい Cop3.1 については初期の着果肥大に関与している可能性が高い。育種に用いる母本が未受粉時に初期肥大しない場合、当該遺伝子座の利用を強く推奨する。一方で、日本で一般的に栽培されているナスの中には、未受粉時に初期肥大が生じる品
種が数多く存在する。こういった母本を利用する場合には、Cop8.1 座の利用を優先し、可能であれ
ば Cop3.1 についても考慮することが望ましい。いずれにしても、本課題で対象とした単為結果性素
材は Cop3.1 、Cop8.1 座以外にも遺伝的背景の影響により単為結果していることが示唆されている。
マーカー選抜した個体の中でも単為結果性の程度に強弱が生じることを想定し育種規模や選抜方法を検討する必要がある。
４）今後の課題
Cop8.1 遺伝子座にほぼ同定された単為結果性の原因遺伝子 GENE2 （仮）については、機能が不明であり、制御メカニズムについても明らかになっていない。得られた原因遺伝子の情報をナス科全体に利用拡大する為には、遺伝子機能の同定と制御方法の解明が必要である。また、対象とする単為
結果性は Cop3.1 、Cop8.1 以外にも遺伝的背景の影響を受けることが示唆されている。今までに検出されていない単為結果性に関わる遺伝子座をゲノム全体において明らかにすることであらゆる交配
組み合わせでの利用の促進につなげることが今後の課題である。

HOR100439

「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR1005
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ナスにおける花粉稔性回復遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 京都産業大学・総合生命科学部・山岸博
１）研究目的我国の重要な野菜の 1 つであるナスは、極めて顕著な雑種強勢を示す。このため古くから F1 育種が行われており、我国の実用的な品種はほぼすべて F1 品種である。しかしながら、ナスの F1 育種は今日まで、人工的な除雄と人工授粉によって行われており、効率的で確実な F1 採種には至っていな
い。ナスの F1 育種の効率化ならびにナスの生産性向上のために、現在、細胞質雄性不稔−稔性回復系の開発と利用が強く期待されている。本研究課題では、細胞質雄性不稔を利用したナスの F1 育種に必須である稔性回復遺伝子を単離するとともに、我国内外のナスの遺伝資源において、稔性回復遺伝子の有無を判定するために利用可能な DNA マーカーを開発することを目的とする。
本研究を担当する２機関の共同研究によって、ナス属野生種に由来する細胞質雄性不稔の原因遺伝
子候補がミトコンドリアゲノム上に同定され、単離されている。この細胞質雄性不稔に対する稔性回復遺伝子を単離することは、雄性不稔−稔性回復系という、農業生産の向上を目指す植物育種とりわ
け F1 育種にとって、極めて重要な現象のメカニズムを明らかにする意義をもつ。また稔性回復遺伝
子の DNA マーカーの開発は、この系を利用した効率的な F1 育種を、民間育種機関を含めて世界的に広く普及させることに貢献する。
２）研究成果（1）ＤＮＡマーカーの開発
ナスの台木用品種である「耐病 VF」と栽培ナスとの交雑後代を材料として用いた。
「耐病 VF」は、ナス属野生種の雄性不稔細胞質を持つと同時に、この雄性不稔に対する稔性回復遺伝子（Rf 遺伝子）を有することが明らかになっている。交雑後代のうち、雄性不稔細胞質を持ち、かつ Rf 遺伝子をヘテロに持つと考えられる個体を自家受粉することによって、花粉稔性について分離する大規模な集団を作出した。この大規模集団を用いて、Rf 遺伝子のＤＮＡマーカーを開発しようとした。
予備的な調査によって Rf 遺伝子と連鎖すると考えられる２つのＤＮＡマーカー（マーカーＡおよびマーカーＢ）が得られた。そこでこれらのマーカーについて、多数の個体を含む花粉稔性分離集団
を用いて、マーカー間の連鎖および Rf 遺伝子とマーカーの間の連鎖を調査した。調査した 1012 個体の集団において、Rf 遺伝子とマーカーＡとの組換え個体が 11 個体、Rf 遺伝子とマーカーＢとの組換え個体が 7 個体観察された。その一方で、マーカーＡとマーカーＢの間の組換え個体は 18 個体認められた（表-1）。これらのことから Rf 遺伝子は２つのＤＮＡマーカー（マーカーＡとマーカーＢ）の間に存在すると考えられた。
上記の結果と栽培ナスのゲノム解析情報に基づいて、栽培ナスにおいてマーカーＡとマーカーＢの間に存在すると考えられる８個の Scaﬀold 上にＤＮＡマーカーを作出して、さらに大規模な集団を用
いて、Rf 遺伝子とＤＮＡマーカーとの関係をより詳細に調査した。約 3400 個体について Rf 遺伝子とＤＮＡマーカーとの関係を観察した結果、可稔個体の中に Scaﬀold 5〜Scaﬀold 8 上のマーカーにおいて不稔個体特異的なパターンを示す個体（表-2 の No.188）が認められた。その一方で、同じく可稔個体の中に Scaﬀold 1〜Scaﬀold 6 上のマーカーにおいて、不稔個体特異的なパターンを示す個
体（表-2 の No.633）が観察された。これらのことは、調査した花粉稔性分離集団には、マーカーＡから Scaﬀold 5 に至る領域に Rf 遺伝子を持つ個体と、Scaﬀold 7 からマーカーＢに至る領域に Rf 遺HOR100540

伝子を持つ個体が存在することを示した。このためこの領域には、当初想定されたような単一遺伝子（Saito et al. 2009）ではなく、密接に連鎖した２つの Rf 遺伝子が存在すると推定された。

HOR100541

そこで、これら２つの個体（No.188 および No.633）について花器の形態と葯の発達および花粉を詳しく観察した。その結果、No.188 の個体（図-1 中央）は花弁の展開、葯の発達が正常で、高い可
稔花粉率を示した。これに対して、No.633 の個体（図-1 右）は花弁と葯がやや委縮している形態を示すものの、花粉稔性は正常であった（図-1）。このことから、No.188 がより高い稔性回復力を持つと考え、この Rf 遺伝子について優先的にＤＮＡマーカーを開発しようとした。

一方、表-2 のうち Rf 遺伝子を持たない不稔個体において、Scaﬀold 1〜Scaﬀold 4 上のマーカー
が可稔ヘテロ個体特有のパターンを示す個体（No.218，No.270）が存在した。これらの不稔個体とNo.188 の可稔個体のＤＮＡマーカーのパターンから、Rf 遺伝子は栽培ナスのゲノムにおける Scaﬀold
4、Scaﬀold 5 およびこれらの間のギャップに対応した領域に存在すると判断し、より密接に連鎖する
ＤＮＡマーカーの開発を試みた。そのために、後述するフォスミドクローンで明らかになった塩基配列を利用して、Scaﬀold 4 と Scaﬀold 5 およびそれらの間に対応する領域に新たにマーカーを作出して、花粉稔性との関係を調査した。その結果、先の大規模集団において、Scaﬀold 4 上のマーカーとScaﬀold 5 上のマーカーの間で組換えを起こしていた個体（No.188，No.199，No.270）について、花
粉稔性と完全に連鎖したＤＮＡマーカーが２つ（Sca4-seq01-2，Sca4-seq07）見出された（表-3）。このうち Sca4-seq01-2 は Rf 遺伝子をホモに持つ個体とヘテロに持つ個体を識別することができる共優性マーカーである。また、Sca4-seq07 は Rf 遺伝子をホモまたはヘテロで持つ個体で、ＤＮＡの増幅が見られる優性マーカーである（表-3、図-2）。以上の結果より、今回調査した領域に存在する２つの Rf 遺伝子のうち、より高い稔性回復力を持つ Rf 遺伝子との間で、極めて密接に連鎖した２タイプのＤＮＡマーカーが開発された。

HOR1005

42

HOR1005

43

開発されたＤＮＡマーカーがナスの育種素材として利用される近縁野生種で有効であるかを試すた
めに、S. aethiopicum を用いて調査した。S. aethiopicum は細胞質雄性不稔の原因遺伝子として推定されているミトコンドリアの orf218 を持ち（Yoshimi et al. 2013）、かつ正常に花粉を形成する。調査の結果、S. aethiopicum の２系統はいずれも Rf 遺伝子をホモに持つ個体に特有のＤＮＡマーカーを持つことが明らかになった（図-3）。このことから、今回開発されたＤＮＡマーカーは、ナスの育種において、1）交雑後代で Rf 遺伝子を持つ個体を迅速かつ効率的に選抜するマーカーとして、また 2）育種素材として用いる近縁野生種での Rf 遺伝子の有無を判定するマーカーとして、ともに利用できると判断された。

（2）Rf 遺伝子の単離（1）で推定された２つの Rf 遺伝子のうち稔性回復効果が大きい Rf 遺伝子を単離することを目的
として、Scaﬀold 4 と Scaﬀold 5 上のＤＮＡマーカーを優性ホモの形で持ち、正常な花粉稔性を示す個体からフォスミドライブラリーを作成した。この可稔個体は Rf 遺伝子をホモに持つと考えられた。
作成されたフォスミドライブラリーから、上記２つの Scaﬀold 上の塩基配列を指標として、３個のフォスミドクローンを選抜した。
得られたフォスミドクローンの塩基配列を決定したところ、１つのクローンは栽培ナスにおけるScaﬀold 5 に対応する塩基配列を含んでいた。また他の２つのクローンは互いに一部の塩基配列が重複しており、全体として Scaﬀold 4 に対応する塩基配列および Scaﬀold 4 と 5 の間のギャップに対応
する約 16.7kbp の塩基配列を持つことが明らかになった。しかし、これら３つのクローンの塩基配列は完全に連続したものとはならず、栽培ナスの２つの Scaﬀold に対応した領域の完全な塩基配列を明らかにするには至らなかった。このため、さらにフォスミドクローン間の塩基配列を約 23kbp 新しく
明らかにするとともに、残された配列の決定を進めている（図-4）。その一方で、フォスミドクロー
ンで明らかになった塩基配列を利用することによって、（1）で示したように、大規模な花粉稔性分離
集団や近縁野生種において、Rf 遺伝子と極めて密接に連鎖したＤＮＡマーカーが開発された。また、
さらに Rf 遺伝子が存在する領域を絞り込むＤＮＡマーカーも開発された。

HOR100544なお、フォスミドクローンの解析によって現在までに塩基配列を明らかにした領域には、他の植物で単離されている Rf 遺伝子と相同性のある遺伝子は見出されていない。このように、ナス属野生種に由来する Rf 遺伝子が存在する領域には、栽培ナスのゲノムに比較して未知の大規模な挿入配列があることが推定された。今後早急にこの領域の全塩基配列を決定することによって新たな Rf 遺伝子が単離されることが期待される。
３）成果活用における留意点
開発されたＤＮＡマーカーは、育種素材として利用するナス属野生種の選択および交雑後代における Rf 遺伝子の有無の識別に有効なマーカーである。ただし今回マーカーを開発した遺伝子を含めてRf 遺伝子が、複数存在することに留意する必要がある。
４）今後の課題
複数存在する Rf 遺伝子のうち、１つについてはＤＮＡマーカーが開発され、それらの有効性が示された。しかしもう一方の Rf 遺伝子に関しては、存在する領域が推定できたものの、極めて密接に連鎖するマーカーの作出には至っていない。今後この Rf 遺伝子についてもマーカーを開発し、Rf 遺伝子の有無を高い精度で判定することを可能にする必要がある。
また現在のところ、Rf 遺伝子の単離には至っていない。このため今後さらにフォスミドクローンのスクリーニングとその塩基配列の決定を進めることによって、Rf 遺伝子を最終的に単離する必要がある。

HOR100545

「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR1006
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ダイコンのグルコシノレート含量を制御する遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 野菜花き研究部門・野菜育種・ゲノム研究領域・
アブラナ科ユニット・吹野伸子
１）研究目的
ダイコンは作付面積が約 35,000ha と第 1 位の重要野菜であり、生産物の約 6 割が加工業務用途に使用されている。ダイコン根部に含まれる 4-メチルチオ-3 ブテニルグルコシノレート（4MTB-GSL）
はダイコンの主要なグルコシノレート成分であり、辛味成分 4-メチルチオ-3 ブテニルイソチオシア
ネートの前駆物質として食味に大きく寄与している。平成 24 年度に野菜茶業研究所が育成した「だいこん中間母本農 5 号」は遺伝的に 4MTB-GSL を欠失していることから 4MTB-GSL 合成酵素遺伝子の変異体であることが予想される。4MTB-GSL は辛味成分の前駆物質であると同時に加工・保存時に発生する黄変や硫黄臭の起因物質であるため、4MTB-GSL を全く含有しない「だいこん中間母本
農 5 号」は優れた加工適性を持つ新奇な育種素材である。現在、民間種苗メーカー数社において「だいこん中間母本農 5 号」を用いた新品種開発が進行しているが、本形質は劣性遺伝するため高精度選抜マーカーの開発が望まれている。一方、「だいこん中間母本農 5 号」は従来のダイコンでは硫黄臭のために使用出来なかった用途への利用が計画されており、その場合 4MTB-GSL に替わり蓄積する
グルコエルシン由来の辛味や微量の硫黄臭が問題となる可能性がある。このことから 4MTB-GSL を欠失した品種開発を行う際には、グルコエルシン含量をコントロールすることが重要である。本研究
課題ではダイコンのグルコシノレート組成および含量を制御する遺伝子を単離し、品種開発に有用なDNA マーカーの開発を目的とする。
２）研究成果1) 4MTB-GSL 合成酵素遺伝子の単離（平成 25-26 年度）
1 遺伝子座の劣性変異により 4MTB-GSL を含有しない「だいこん中間母本農 5 号」の兄弟系統（grs1-1 変異体）と、野生型個体の交雑 F2 ならびに F3 集団を使ったポジショナルクローニン
グにより候補遺伝子を同定し、形質転換による gain-of-function 実験により 4MTB-GSL 合成酵素をコードしていることを確認した。
1 − 1.ポジショナルクローニング
grs1-1 変異体と野生型個体の分離集団、5,294 個体を使ったポジショナルクローンングにより、
4MTB-GSL 合成酵素遺伝子（GLUCORAPHASATIN SYNTHASE 1 （GRS1 ））は、第１連鎖群末端の約 23kb の領域に座乗することが予測された（図 1a）。この領域について ORF 予測プログラムである Ausustus（http://augustus.gobics.de）による検索を行ったところ、7 つのORF が推定された。このうち、ORF3 と名付けた領域は grs1-1 変異体でほとんど発現が検出されず、GRS1 の有力な候補遺伝子であると考えられた（図 1b）。

HOR100646

1 − 2.形質転換実験
ORF3 の機能を確かめるため、シロイヌナズナを使った形質転換実験を行った。シロイヌナズ
ナはダイコンと同じアブラナ科に属し、グルコエルシンと呼ばれるグルコシノレートの一種を蓄積する。grs1-1 変異体では、グルコエルシンが過剰蓄積するため、GRS1 の基質はグルコエ
ルシンであることが示唆されていた。ORF3 の cDNA を CaMV 35S プロモーターに連結したコンストラクトが導入されたシロイヌナズナでは、本来全く検出されないグルコシノレートである 4MTB-GSL の蓄積が観察された（図 2）。加えて、グルコエルシン含量が低下していたことから、ORF3 の翻訳産物は、グルコエルシンの側鎖を不飽和化することにより 4MTB-GSLを合成する機能を有していることが推察され、ORF が 4MTB-GSL 合成酵素遺伝子・GRS1 であると結論づけた。

HOR100647

1 − 3.GRS1 の構造と選抜マーカーの開発
相同性検索の結果、GRS1 は 2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（2OGD）に属する酵素をコードしていることがわかった。2OGD は動植物や細菌などに広く存在する酵素であり、水酸化や脱メチル化などの様々な酸化反応を触媒する酵素である。GRS1 遺伝子について、変異体型の対立遺伝子の塩基配列を決定した結果、第 1 エクソンの約 9kb にわたり LTR 型レトロ
トランスポゾンである Ty1-copia 様配列の挿入変異が見られ、挿入部位の直下に新たなストップコドンが in-frame で生じていた（図 3a）。その結果、変異体では 2OGD の活性に必須なドメ
インを全て欠失している可能性が示唆された。このことにより変異体では GRS1 の機能が喪失していると推察された。次に、DNA マーカー選抜に利用可能なプライマーの設計を行った。挿入配列をまたぐプライマーセットと、挿入配列上のプライマーの計 3 種を混合した PCR により、簡便に遺伝子型を決定できる選抜法を開発した（図 3b）。次に「だいこん中間母本農 5 号」と 3 系統の固定系統との分離集団（BC2 F2 ）をそれぞれ作成し、開発した DNA マーカーにより判別された遺伝子型と表現型が一致することを確認した（表 1）。これにより、時間のかかる後代検定や、複雑な操作を必要とする HPLC 分析を行うこと無く確実に 4MTB-GSL の有無を予測することが可能となった。

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48

HOR100649

本課題で開発した DNA マーカーによる選抜法については、特許出願済みでありリサーチツー
ル特許として、要請に応じて広く許諾する予定である。

2) グルコエルシン含量を制御する遺伝子の単離QTL 解析によりゲノム上の位置を調査するとともに、メタボローム解析およびグルコシノレー
ト合成系酵素遺伝子の発現解析により原因遺伝子の推定を行った。さらに、交雑後代系統のマーカー遺伝子型とグルコエルシン含量との関係を解析することにより、QTL 座乗位置の絞り込みを行った。
2 − 1.QTL 解析
4MTB-GSL を欠失しグルコエルシン含量に差のある両親系統より育成した F2 364 個体および F2 の個体別次代 F3 134 系統を栽培してグルコエルシン含量を測定した。F3 系統は、各系
統 10 個体を 2 反復で栽培して、平均的な 8 個体について測定を行った。QTL 解析の結果、F2では第 6、7、8 連鎖群に、F3 では第 2、3、6、8 連鎖群にピークが検出された（図 4）。

2 − 2.メタボローム解析
両親系統それぞれ 3 個体の生育途中および収穫期の葉および根を採取し、グルコシノレートおよび一連の代謝経路の前駆物質、中間体についてメタボローム解析を行った。両親間で有意な差があるピークは最終産物およびその前駆体のみであり、特定の物質の蓄積は見られなかった。
このことから、両親系統間でのグルコエルシン量の差異には、合成酵素ではなく転写因子が関与している可能性が示唆された。

2 − 3.グルコシノレート合成関連遺伝子の連鎖地図上への配置
青首ダイコン自殖系統由来の、76,592 scaﬀolds (N50: 46,262 bases, total 402 Mb) からなるド
ラフトゲノム塩基配列（Kitashiba et al. 2014）は、ダイコン高密度連鎖地図（2,556 の DNA
マーカー、1,156cM 、Kitashiba et al. 2014） 上に 1,345 本の scaﬀold が配置され、ゲノムのHOR100650

21.8 ％に相当する 116 Mb をカバーする。青首ダイコン由来の次世代シーケンサーで決定し構築された 100 kb 以上の長さを持つ scaﬀold のうち、59 個の scaﬀold の両端塩基配列情報から
DNA マーカー（CAPS と SNP マーカー）を作成し、高密度連鎖地図構築で使用した F2 個体に対して遺伝子型分析を行った。その結果、解析した scaﬀold の 9 割でその両端が連鎖関係にあることが分かり、scaﬀold の構築精度が高いことが分かった。このゲノム情報を使い、シロ
イヌナズナの遺伝子情報から抽出したグルコシノレート代謝に関連する遺伝子をダイコンのドラフト塩基配列に対して検索したところ、26 の遺伝子について対応する scaﬀold が見いだされた。このうち、高密度連鎖地図上に配置されている scaﬀold との対応関係が分かったものについては連鎖地図に配置した。また、座乗位置が不明なものについては、scaﬀold の塩基配列情報
を基に DNA マーカーを設計し、高グルコエルシン親系統と低グルコエルシン親系統との交雑
F2 または F3 集団の遺伝子型分析を行って連鎖地図上に配置させた。その結果、31 個のグルコ
シノレート合成関連遺伝子の座乗位置が推定された（図 5）。検出された QTL との連鎖地図上の位置関係を解析したところ、QTL 周辺に存在するのはそれぞれ第 2 および第 6 連鎖群に座乗する 2 遺伝子（B および C ）のみであった。なお、転写因子は 5 つマッピングされたが、いずれも QTL 近傍には座乗しなかった。

2 − 4.グルコシノレート合成系酵素遺伝子の発現解析
scaﬀold に座乗したグルコシノレート合成系酵素遺伝子については、そのゲノム塩基配列をもとにプライマーを設計し、高グルコエルシン親系統と低グルコエルシン親系統の根から抽出した RNA から合成した cDNA を鋳型に半定量的 RT-PCR にて遺伝子発現を分析した。
その結果、3 つの遺伝子 A 、 B 、C で高含有系統と低含有系統間で発現量に差があることが示された（図 6a）。A 、 B 、C 遺伝子はそれぞれ第 5 連鎖群（R5）、第 6 連鎖群 (R6)、第 2 連

HOR100651

鎖群 (R2) に座乗する（図 6b）。これらの遺伝子がグルコエルシン含量の系統間差に関与する遺伝子の候補と考えられるため、以降で遺伝子の構造を明らかにした。

2 − 5.候補遺伝子の構造・発現解析および多型マーカー作成
両親間で顕著に根における遺伝子発現差がみられた 3 つの遺伝子 A 、 B 、C については、
scaﬀold のゲノム塩基配列情報をもとにプライマーを設計し、高グルコエルシン親系統と低グ
ルコエルシン親系統のゲノム DNA を鋳型に PCR 法にて遺伝子領域を増幅した。両系統由来の塩基配列を決定し、比較解析をした。また、両系統における各遺伝子の挿入・欠失多型を利用し、その領域を PCR で増幅するプライマーをデザインして、高含有系統と低含有系統のゲノム DNA を鋳型に PCR を行い分析した。

A 遺伝子はイントロン領域に多数の挿入・欠失が見出され、さらに翻訳開始点より 5 側上流
では、両系統間で 2ヶ所の欠失・挿入多型が見つかった（表 2）。後者の挿入断片はトランスポ
ゾン様の特徴を有していた。イントロン領域の挿入・欠失多型を挟み込むようにプライマーをデザインし共優性マーカーを作成した（図 7a）。しかしながら、グルコエルシン含量に関する
QTL は第 5 連鎖群には検出されなかったため、以降の解析は中断した。

HOR100652

B 遺伝子の座乗位置周辺に、グルコエルシン含量に関する QTL が検出された（図 6b）。B
遺伝子はダイコンドラフト塩基配列 (Kitashiba et al. 2014) の Rsa1.0 00718 scaﬀold 上に座乗する。Brassica rapa における B 遺伝子のオルソログ情報と B 遺伝子の塩基配列情報をもとに
B 遺伝子の構造を調査すると、その領域からスプライシング位置により 2 種類の転写産物が生じる可能性が示された (B-a , B-b とする)。B-a と B-b それぞれに対する特異的なプライマー対で半定量的 RT-PCR をしたところ、高グルコエルシン親系統においては、根と葉で B-a 、 B-b
HOR100653

の両転写産物はともに検出され、低グルコエルシン親系統においては、根で両転写産物は検出されず、葉では両転写産物は検出された（図 8a）。ただし、葉ではサイズの異なる 2 つの転写産物が確認された。B 遺伝子のゲノム構造を両系統間で比較した結果、第 2 エキソンに 3ヶ所、第 10 エキソンに 1 箇所の非同義的塩基置換が見出され、さらに翻訳開始点から上流域には、3ヶ所で DNA 断片の挿入・欠失が見られた（表 2）。ここまでの解析から、QTL 領域の B 遺伝子の根での発現差異とグルコエルシン量の高低が相関し、その原因はプロモーター領域に見られる挿入/欠失多型であると考えられた。以上の解析を踏まえて、5 上流域の挿入・欠失多型を利用し DNA マーカーを作成した（図 7b）。

第 2 連鎖群の C 遺伝子の塩基配列情報からプライマーを設計し、半定量的 RT-PCR をしたところ、根では先の解析（図 6a）と同様に高グルコエルシン親系統でのみ発現が見られ、葉では両系統ともに発現が見られた (図 8b)。遺伝子構造を解析した結果、第 7 イントロンに、高グルコエルシン親系統において 466 bp の挿入が見られた（表 2）。上流約 2kb の塩基配列を両系統間で比較したところ、一塩基多型が 1ヶ所のみであったことから、C 遺伝子の根での発現差異をもたらしている要因として、466 bp の挿入配列の影響が第一に考えられた。以上の多型のうち、466 bp の欠失・挿入多型を利用して DNA マーカーを作成した（図 7c）。

2 − 6.QTL 座乗領域の絞り込み検出された QTL のうち寄与率の高い第 2 および第 6 連鎖群の一部領域について遺伝子型が異なる F3 個体別次代 F4 系統、および F4 個体別次代 F5 系統を供試して、QTL 領域のマーカー
遺伝子型とグルコエルシン含量を同一個体由来の系統ごとに比較した。その結果、第 2 連鎖群の QTL 領域全体（M01〜M04）が高グルコエルシン親系統のアレルである系統は低グルコエ
ルシン親系統のアレルである系統と比較して有意にグルコエルシン含量が大きいこと、並びにHOR100654

M02 から M04 のマーカー遺伝子型はグルコエルシン含量と関係がないことが示唆された（図9）。第 6 連鎖群では、M05 から M07 のマーカー遺伝子型が高グルコエルシン親系統のアレルである系統は低グルコエルシン親系統のアレルである系統と比較して有意にグルコエルシン含量が大きいこと、並びに M06 から M09 までのマーカー遺伝子型はグルコエルシン含量と関係がないことが示唆された（図 10）。これらより、第 2 連鎖群の QTL は M01 から M02 の間の約
8cM の領域に、第 6 連鎖群の QTL は M05〜M06 間の約 7cM の領域に座乗すると推測され、当初候補とした C および B 遺伝子が原因遺伝子とは異なる可能性がある。

2 − 7.マーカーの汎用性確認
上記で絞り込んだ第 2、6 連鎖群および第 3 連鎖群の QTL 領域に座乗する 5 マーカーを用いて市販 13 品種の遺伝子型を分析したところ、グルコシノレートが高い 2 品種のうち 1 品種（市販

HOR100655

品種 02）は供試 5 マーカー中 4 マーカーにおいて高グルコエルシン親系統のアレルをホモもし
くはヘテロで持っていることがわかった（表 3）。もう一方の高グルコシノレート品種（市販品
種 01）は低グルコシノレート品種（市販品種 08）と同様 3 マーカーにおいて高グルコエルシ
ン親系統のアレルをホモもしくはヘテロで持っていた。これらのマーカーの汎用的な利用は困難であるが、用いる育種素材によってはこれらマーカーが利用できる可能性もある。

３）成果活用における留意点

1) 4MTB-GSL 合成酵素遺伝子から設計したマーカーを用いて選抜した実用品種「悠白」と「サラホワイト」が品種登録されている他、選抜法に関する特許が公開されている。本遺伝子の塩基配列情報は DDBJ に登録されている (LC077856)。
2) 本研究で開発されたマーカーを利用する際には、用いる材料でのマーカー遺伝子型とグルコシ
ノレート含量の遺伝について確認する必要がある。

４）今後の課題
本研究で作成したフォスミドライブラリーや現在別のプロジェクト研究で進めている高度化したダ
イコンゲノム情報を利用して QTL 近傍に密に DNA マーカーを設計し、迅速に分析を進めていくことが課題である。

HOR1006

56

「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR2001
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: アルタナリア病原菌と宿主植物との分子病理学的解析によるリンゴ斑点落葉病およびナシ
黒斑病罹病性原因遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 果樹茶業研究部門・品種育成研究領域・ナシ・ク
リ育種ユニット・寺上伸吾
１）研究目的
リンゴ斑点落葉病およびニホンナシ黒斑病は、病原菌 Alternaria alternata によって引き起こされるリンゴ・ニホンナシ栽培における最重要病害の一つである。その発病メカニズムや宿主範囲は、それぞれの病原菌が生産する宿主特異的毒素によって決定されている。リンゴ斑点落葉病菌、A. alternata(リンゴ病原タイプ) は AM トキシンを生産し、栽培の 60%以上を占める主要品種「ふじ」、「王林」、「陸奥」などが罹病性であるため、5 月下旬の落花期頃からその年の防除が終了するまで、殺菌剤の散布が欠かせない (我々の試算では約 70 億円の殺菌剤散布が必要)。一方、ニホンナシ黒斑病菌、A.
alternata (ニホンナシ病原タイプ) は AK トキシンを生産し、「二十世紀」、「巾着」、「南水」などが罹病性である。本研究課題では、リンゴ斑点落葉病およびニホンナシ黒斑病の原因遺伝子の単離と品種育成に有用な DNA マーカーの開発を目的とする。
特筆されるのは、リンゴ斑点落葉病・ニホンナシ黒斑病とも、各々の病原菌が生産する毒素 AM ト
キシンおよび AK トキシンに罹病性を示す品種のみが発病し、病原菌の毒素 vs. 植物側の原因遺伝子(罹病性が優性) の関係を示す事例として、世界的に注目の高いモデルケースになっていることである。病原菌側の毒素の構造や生合成遺伝子の解析が進む一方、植物側の解析は希少で、遺伝子単離による相互関係のメカニズム解明が喫急の課題である。
２）研究成果1) リンゴ斑点落葉病罹病性遺伝子 (Alt) の単離解析集団には、リンゴ斑点落葉病罹病性遺伝子をヘテロに持つ「スターキング・デリシャス」（Alt /alt ）を片親、異なる抵抗性品種（alt /alt ）を別の片親とする合計 15 種類の F1 集団（合計 797 個体）を用いた。各実生および両親品種の幼葉から、核酸自動分離装置（PI-50 α）を用いてゲノム DNA を抽出した。
「スターキング・デリシャス」×「ジョナサン」の解析集団（114個体）で、Alt との連鎖が認められている Mdo.chr11.27 および Mdo.chr11.44（図 1）を用いて、Alt 近傍領域で染色体の組換えを起こしている実生をスクリーニングした。その結果、23 実生
で組換えが確認された。組換えが確認された実生については、Mdo.chr11.27 と Mdo.chr11.44の間に座乗している SSR によるタイピングを行うとともに、リンゴ斑点落葉病菌の胞子接種により表現型を判定した。斑点落葉病菌の胞子接種検定は、各個体から採取した切離葉 5 枚に対して、2 × 105 個/mL に調整した斑点落葉病菌 AKI-3 株の胞子懸濁液を噴霧接種した。20 ℃暗黒下で 48 時間保持した後、定法に従い壊死斑の形成程度を調査して葉ごとに 0-5 の 6 段階に区分した。各個体 2 回の反復試験を行い、葉ごとのスコアの平均値を個体のスコアとした。各実生個体について、壊死斑形成程度が 0.5 以下を抵抗性、2.5 以上を罹病性とし、0.5-2.5 の間は中程度抵抗性と判定した。グラフィカルジェノタイプの結果、Alt は Mdo.chr11.3 と Mdo.chr11.34の間に座乗していると考えられた（図 1）。Mdo.chr11.3 と Alt の間で組換えを起こした実生が2 個体、また Alt と Mdo.chr11.34 で組換えを起こした実生が 1 個体得られた。リンゴ公開ゲノム配列上における Mdo.chr11.3 と Mdo.chr11.34 の座乗位置はそれぞれ、第 11 連鎖群の 3,064

HOR200157

kb と 3,166 kb であることから、Alt 遺伝子座の物理距離は、リンゴ（「ゴールデン・デリシャス」）ゲノムで約 102 kb の領域と推定された（図 1）。
Alt の単離を行うため、「スターキング・デリシャス」の BAC ライブラリーを構築した。
「ス
ターキング・デリシャス」の未展開葉から核を単離し、アガロースプラグを作製した。制限酵素（Hin d III）で DNA を部分消化した後、パルスフィールド電気泳動により double-size
fractionation を行い、DNA をサイズ分画した。100-180 kb の分画をゲルから切り出し、精製した DNA 断片を pIndigoBAC-5 vector にライゲーションした。エレクトロポレーションにより大腸菌（DH10B）に形質転換し、BAC ライブラリーを作製した。合計 49,920 クローンからなるリンゴ BAC ライブラリーを得ることができた。パルスフィールドゲル電気泳動から、BAC
クローンのインサート長を推定した結果、作成した BAC ライブラリーの平均インサート長は、
約 180 kb と推定された。今回構築した BAC ライブラリーは、推定ゲノムサイズ（742.3 Mb）の 12X をカバーすると考えられる。現在、Alt の最近傍領域に座乗する Mdo.chr11.3 およびMdo.chr11.34 を起点として、Alt 遺伝子座をカバーする BAC コンティグの構築を進めている。
2) ニホンナシ黒斑病罹病性遺伝子 (Aki ) の単離ファインマッピングの解析材料として、ニホンナシ黒斑病に抵抗性を示す「豊水」と罹病性である「巾着」の F1 実生集団（621 個体）を用いた。各実生および両親品種の幼葉から NucleoMag
Plant を用いてゲノム DNA を抽出した。ニホンナシ黒斑病の接種検定には、5 × 105 個/mL に調整した胞子懸濁液（菌株：No. 15A）を用い、各実生の第 2-4 位の展開葉裏面に噴霧接種し、接種 48 時間後に発病を調査した。各実生での病徴の評価は、黒変が現れた個体を罹病性、黒変の現れなかった個体を抵抗性と判定した。接種試験の結果、309 個体は病徴を示さなかったた
め、抵抗性と判定した。残る 312 個体は黒変を生じたことから罹病性であると判定した。抵抗性個体と罹病性個体の分離比は 1:1 に適合したことから（χ 2 = 0.014、P value = 0.904）、「巾着」の黒斑病罹病性は優性 1 遺伝子支配であることが示された。
既存のリンゴおよびナシの連鎖地図に座乗する SSR マーカーを用いて Aki の位置をスク
リーニングした結果、第 11 連鎖群の上部に座乗していると考えられた。そこで、リンゴおよびナシの連鎖地図に座乗する SSR マーカー、およびリンゴ「ゴールデン・デリシャス」の公開配列を利用し、第 11 連鎖群上部に設計した SSR マーカー（Mdo.chr11.1-45）を用いて、連
鎖解析と連鎖地図の構築を行った。SSR マーカーによる各増幅産物は、DNA シーケンサーにより分離・検出した。連鎖解析と連鎖地図の構築には、JoinMap 4.1 ソフトウェアを用いた。
グルーピングは Independence LOD score 7.0 で行い、regression mapping 法により連鎖地図を作製した。遺伝地図距離の推定には Kosambi の地図関数を用いた。連鎖解析の結果、Aki
は Mdo.chr11.28 と Mdo.chr11.34 のマーカー間、1.5 cM の領域に座乗していることが明らかとなった（図 2A）。また、完全連鎖するマーカー Mdo.chr11.30 を獲得した。Mdo.chr11.28
および Mdo.chr11.34 はリンゴの公開ゲノム配列（Malus × domestica Whole Genome v1.0;
https://www.rosaceae.org/species/malus/malus x domestica/genome v1.0）から開発したマーカーである。それぞれのマーカーを開発したコンティグ（MDC001444.132 および MDC021160.236）
間の物理距離は約 250 kb（2,915-3,165 kb）であった（図 2B）。
ニホンナシのゲノム解読は進んでいないが、近縁のチュウゴクナシではドラフトゲノム配列が公開されている（http://peargenome.njau.edu.cn/）。そこで、Aki と連鎖が認められた
Mdo.chr11.28、Mdo.chr11.30 および Mdo.chr11.34 のマーカー領域を含むチュウゴクナシのス
キャフォールドを検索した。その結果、スキャフォールド 355.0 に高い配列類似性が認められた。
よって、3 マーカー（Mdo.chr11.28、Mdo.chr11.30 および Mdo.chr11.34）で構成される Aki 遺

HOR200158

伝子座の物理距離は、チュウゴクナシゲノムで約 107 kb の領域（272 kb-379 kb）と推定された（図 2C）。

Aki の単離を行うため、「巾着」の BAC ライブラリーを構築した。「巾着」の未展開葉から核を単離し、アガロースプラグを作製した。制限酵素（Hin d III）で DNA を部分消化した後、パルスフィールド電気泳動により double-size fractionation を行い、DNA をサイズ分画した。
100-180 kb の分画をゲルから切り出し、精製した DNA 断片を pIndigoBAC-5 vector にライ
ゲーションした。エレクトロポレーションにより大腸菌（DH10B）に形質転換し、BAC ライブ
ラリーを作製した。合計 68,170 クローンからなるニホンナシ BAC ライブラリーを得ることができた。パルスフィールドゲル電気泳動から、BAC クローンのインサート長を推定した結果、作成した BAC ライブラリーの平均インサート長は、約 123 kb と推定された。ニホンナシの推定ゲノムサイズは明らかとなっていないが、ゲノム解読の終了したチュウゴクナシとほぼ同等であると考えられる。チュウゴクナシの推定ゲノムサイズ（527 Mb）を基にすると、今回構築したニホングリ BAC ライブラリーは、推定ゲノムサイズの 16X をカバーすると考えられる。
Aki と連鎖が確認された Mdo.chr11.28、Mdo.chr11.30 および Mdo.chr11.34 を起点として、各マーカー領域を含む BAC クローンの単離と、Aki 遺伝子座をカバーする BAC コンティグの構築を進めた。その結果、Mdo.chr11.28 と Mdo.chr11.34 のマーカー間は 2 種類のクローンからなる BAC コンティグでカバーすることが出来た。各 BAC クローンは pUC18 にサブクロー
ニング後、サンガー法により塩基配列を決定した。BAC クローンの長さはそれぞれ 132 kb と
129 kb であり、2 種類の BAC クローンから構成される BAC コンティグの配列長は 230 kb であった。現在、アノテーション付けを進めている。

HOR200159

HOR200160３）成果活用における留意点
今回開発したマーカーを用いてマーカー選抜を行う際には、交配に用いた両親の多型性を考慮しなければならない。
４）今後の課題
リンゴ斑点落葉病およびニホンナシ黒斑病の罹病性メカニズムを明らかにするには、原因遺伝子の単離が不可欠である。BAC クローンやゲノム情報を用いた詳細な配列解析および形質転換体による候補遺伝子の機能確認などを進める必要がある。
リンゴやニホンナシには多くの遺伝資源があるが、斑点落葉病や黒斑病に対する表現型が明らかとなっていない品種・系統が多く存在する。よって、マーカー選抜を効率的に行うためには、これら遺伝資源の表現型を網羅的に調査するだけで無く、使用する選抜マーカーの遺伝子型を確認しデータベース化しておく必要がある。

HOR2001

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR2002
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: リンゴの省力栽培に適したカラムナー性樹形を制御する原因遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 果樹茶業研究部門・リンゴ研究領域・リンゴ育種
ユニット・岡田和馬
１）研究目的我が国のリンゴ産業は、生産者の減少や高齢化の問題に直面しており、省力栽培できる品種の育成が望まれている。リンゴ品種「McIntosh」の枝変わり（突然変異体）として発見された「Wijcik」は、普通の栽培品種に比べて節間が短く、側枝の発生が少ないため、細長い円柱状の樹形に生長する。この性質はカラムナー（columnar）性と呼ばれ、樹形が単純でコンパクトになるため、「整枝・剪定作業を省力化できる」、「平面的な結実層を持つので、収穫・運搬作業などを機械化できる」と期待されている。
農研機構果樹茶業研究部門では、カラムナー性を示す良食味リンゴの育種を進めているが、カラム
ナー性の表現型の評価に播種後 3 年程度を要することが育種の効率化を阻む要因となっている。カラムナー性は単一の優性遺伝子 Co によって制御されることから、我々は Co 遺伝子のマッピングを進めてきた。本課題では、カラムナー性を制御する原因遺伝子の単離と品種育成に有用な DNA マーカーの開発を目的とする。
２）研究成果（1）「Wijcik」の突然変異箇所の特定
我々はこれまでに、Co 遺伝子が第 10 連鎖群の SSR マーカー Mdo.chr10.11-1 と Mdo.chr10.15 の間に座乗することを明らかにしている。Co 遺伝子の座乗領域をさらに絞り込むため、Co 遺伝子周辺
で染色体の乗換えを起こした 3 個体（9、7-4121、7-4189）を、Co 遺伝子に連鎖する SSR マーカー
（Bai et al. 2012) を用いて解析した。SSR マーカー C1753-3520、C18470-25831、C7629-22009 は 3
個体の全てで co と相引に連鎖する染色体由来の遺伝子型を示したことから、Co 遺伝子の座乗領域はSSR マーカー Mdo.chr10.11-1 から C1753-3520 の間に絞り込まれた（図 1）。この領域は、 ゴールデン・デリシャス の公開ゲノム配列に換算して、約 140 kb に相当していた。

HOR200262

突然変異箇所を特定するため、「Telamon」（Co/co）の BAC ライブラリーから単離した Co 遺伝子
座乗領域全体をカバーする BAC クローン 116H3 の全塩基配列を決定した。また、原品種 「McIntosh」（co/co）の BAC ライブラリーから単離した co 遺伝子座乗領域全体をカバーする BAC クローン 16N16と 112G10 の全塩基配列を決定した。Co と co 遺伝子座乗領域の塩基配列を比較した結果、Co 遺伝子
座乗領域に約 8 kb の LTR 型レトロポゾンが挿入されていることが明らかになった（図 2）。その他に塩基配列の違いは見られなかったので、カラムナー性はこの挿入変異によって生じたと考えられた。

（2）カラムナー候補遺伝子の単離Co 遺伝子を単離するため、Co 遺伝子座乗領域に位置し、「Wijcik」と「McIntosh」の茎頂で発現量に差がある遺伝子を探索した。まず、7 月上旬に採取した「Wijcik」と「McIntosh」の茎頂から抽出した mRNA を次世代シーケンサーで解析した。「Wijcik」と「McIntosh」のリードをまとめて denovo assembly を実施した結果、109,451 個のコンティグが作製された。次に、Co 遺伝子座乗領域に位置する遺伝子を探すため、これらのコンティグを BAC クローン 116H3 の塩基配列にマッピングしたところ、116H3 と 95%以上配列が一致するコンティグが 58 個見つかった。58 個のコンティグのうち「Wijcik」と「McIntosh」で発現量に差がある遺伝子を同定するため、Normalized RPKM 値を用
いて t 検定と倍率変化調査を行った。コンティグ 91071、38029、12053、44905、41231 は、「Wijcik」と「McIntosh」の 2 群間で発現レベルに差があり (P<0.05)、「Wijcik」において発現レベルが 2 倍以上に上昇していた（表 1）。これらのコンティグの特徴は、Co 遺伝子が優性遺伝子であるという特徴と一致していた。コンティグ 91071 は挿入配列の約 16 kb 下流に位置し（図 2）、blastx で検索した結果、Medicago truncatula の 2OG-Fe(II) oxygenase family oxidoreductase と高い相同性 (E-value 1e-124)を示した。一方、コンティグ 38029、12053、44905、41231 は約 8 kb の挿入配列内に位置し、blastx
で検索した結果、コンティグ 38029 は Malus x domestica の uncharacterized protein LOC103403681と低い相同性 (E-value 4e-06) を示したが、コンティグ 12053、44905、41231 と相同性を示す配列は見られなかった。以上の結果から、コンティグ 91071（91071 遺伝子）が Co 遺伝子の最有力候補と考えられた。91071 遺伝子は 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase をコードすると考えられたが、その機能は不明であった。

HOR200263

（3）カラムナー選抜マーカーの開発
挿入変異を利用して、カラムナーリンゴを特異的に選抜できる DNA マーカーの開発を試みた。Co
と co 領域に共通の塩基配列からプライマー Normal-F と Normal-R を、Co 領域に挿入されていた約
8 kb の塩基配列からプライマー Columnar-R を設計した（図 3）。これら 3 種類のプライマーを用いた PCR には GoTaq Hot Start Master Mix (Promega) を使用し、94 ℃ 2 分を 1 サイクル、94 ℃ 30
秒、60 ℃ 30 秒、72 ℃ 1 分を 30 サイクル、72 ℃ 5 分を 1 サイクルの条件で反応を行った後、2%ア
ガロースゲルで電気泳動した。「ふじ」(co/co) と「5-12786」 (Co/co) の交雑実生のゲノム DNA を
鋳型に PCR を行ったところ、表現型がカラムナー性の個体からは約 250 bp と 128 bp の断片が増幅されたが、表現型が普通樹形の個体からは約 250 bp の断片しか増幅されなかった（図 4）。128 bp の断片はカラムナー性の個体に特異的であったことから、カラムナー性の選抜マーカーとして利用することができる。

HOR200264

（4）カラムナー候補遺伝子の機能解析
Co 遺伝子の有力な候補である 91071 遺伝子の発現部位を調査した。普通樹形を示す 4 年生自根苗の co ホモ系統 (co/co) では、91071 遺伝子は主に根で発現しており、葉や茎頂ではほとんど発現していなかった。一方、カラムナー性を示す 4 年生自根苗の Co ホモ系統 (Co/Co) では、91071 遺伝子は葉・茎頂・根で発現していた。以上の結果から、野生型では根で発現していた 91071 遺伝子が、突然変異によって茎頂や葉でも発現するようになり、カラムナー性を引き起こしたと考えられた。
91071 遺伝子の発現部位をさらに詳細に解析するため、in situ hybridization を行った。普通樹形を示す co ホモ系統 (co/co) の根では、側根原基や根の先端で染色が見られた。同様に、カラムナー
性を示す系統（Co/Co、Co/co）の根でも、側根原基や根の先端で染色が見られた。一方、「Wijcik」の茎頂では、メリステムと葉原基が染色されていた。以上の結果から、91071 遺伝子は分化・伸長が盛んな分裂組織で発現していることが明らかになった。
91071 遺伝子の機能を調べるため、91071 遺伝子を 35S プロモーター下に挿入し、アグロバクテリ
ウム法によりタバコ SR1 およびリンゴ JM2 の葉片に形質転換した。カナマイシン耐性の 91071 遺伝
子形質転換タバコ T1 世代の表現型は、系統により差が見られた。系統 2-4、2-9、2-12 の草丈と節間長は、対照の SR1 よりも有意に短かった。一方、系統 2-2 と 2-6 の草丈と節間長は、SR1 と有意な差は見られなかった（図 5）。91071 遺伝子の発現は、系統 2-4 と 2-12 で高く、2-9 でやや低く、2-2 と2-6 では見られなかった。このように、91071 遺伝子の発現量が多い系統ほど、草丈や節間長が短くなることが明らかになった。また、カナマイシン耐性の 91071 遺伝子形質転換リンゴが 6 系統得られた。これら 6 系統は全て節間が短く、91071 遺伝子を強く発現していた。以上のように、91071 遺伝
子を過剰発現させたタバコおよびリンゴ形質転換体の結果から、91071 遺伝子は草丈や節間長を短くする機能を持つことが示唆された。

また、91071 遺伝子の根における役割を調べるため、91071 遺伝子を過剰発現させたリンゴ形質転換体を調査した。系統 3-3 と 3-4 では、コントロールの「JM2」や「NB2-8」に比べて不定根が長く、側根数が多くなる傾向が見られたが、3-3 の側根数を除いて有意な差は見られず（図 6）、91071 遺伝
子の根における役割を明らかにすることはできなかった。非形質転換リンゴの根においても 91071 遺伝子は十分な量が発現していたことから、過剰発現させても顕著な効果が出なかったのかもしれない。

HOR200265３）成果活用における留意点
本研究で開発したカラムナー選抜マーカーは、アガロースゲル電気泳動により検出できるので、シーケンサーを保有していない研究室でも利用可能である。また、プライマー Normal-F と Normal-R により増幅される約 250 bp の断片は、PCR が成功したかどうかを確かめるポジティブコントロールとして利用できる。
４）今後の課題
本研究では、下記の 2 点を明らかにすることができなかった。
（1） 91071 遺伝子はどのような物質の代謝に関与しているのか？
（2） 91071 遺伝子は根でどのような役割を果たしているのか？
これらの点を明らかにすることにより、リンゴの樹形や生育を制御する新たな知見が得られることが期待される。

HOR2002

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844

研究期間: 平成25～29年度

中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発(HOR)
小課題番号: HOR2003

研究期間: 平成25～27年度

小課題名: カンキツのβ-クリプトキサンチン高含有化のための遺伝子単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構果樹茶部門・カンキツ研究領域・カンキツゲノ
ムユニット・島田武彦
１） 研究目的
ウンシュウミカンに豊富に含まれるβ-クリプトキサンチンはカロテノイド類の一つで、発がんの抑制、骨粗鬆症や糖尿病などの生活習慣病の予防に役立つことが明らかとなり、β-クリプトキ
サンチンの機能性を訴求した商品開発や機能性表示食品制度の活用促進が進められている。一方、近年の国内におけるウンシュウミカン類の消費は低迷し、生産量は最盛期の約 4 分の１にあたる
90 万トンを推移しており、β-クリプトキサンチン含有素材を安定的に供給するための生産体制の確立や消費拡大に向けて様々な健康機能性を持つβ-クリプトキサンチンを高含有化した商品性の高い新品種の育成が急務となっている。
カンキツ類におけるカロテノイド類の代謝については生合成経路が解明されており、カロテノ
イド類の組成や含有量の多様性には、カロテノイドの生合成遺伝子の発現量のバランスが関与し、β-クリプトキサンチンを高含有する品種や系統では、β-クリプトキサンチンよりも上流の生合成遺伝子の発現量が高く、下流の生合成遺伝子の発現量が低いことが明らかとなっている。また、
カンキツ類にはカロテノイドの代謝遺伝子には配列や発現パターンが異なる複数のアリルが存在することが明かとなり、カロテノイドの代謝系において最適な遺伝子の組合せを持つ系統を選抜することでβ-クリプトキサンチンを高含有する品種の育成が期待できる。本研究課題では、カロテノイドの生合成に関わる 5 種類の遺伝子の発現量を制御する要因をトランスとシスの両面から解析してカンキツのカロテノイドの代謝制御機構の全貌を解明し、β-クリプトキサンチンの高含有化に必要な遺伝子を選抜するための DNA マーカーを開発する。
２）研究成果（１）シス因子で制御されるカロテノイド代謝遺伝子のアリルマーカーの開発
農研機構果樹茶業研究部門で育成したカンキツ品種や系統の家系解析を行った結果、14種類の品種が由来親となっていることが明らかとなり、国内で栽培されるカンキツ類の果実のカロテノイド組成や含有量の多様性は、この祖先14品種が保有するカロテノイド代謝遺伝子のアリルの組
み合わせにより生じている可能性が示唆された。そこで、遺伝子発現がシス因子で制御されているフィトエン合成酵素遺伝子（PSY）、β-リングハイドロキシラーゼ(HYb)、ゼアキサンチンエポ
シキダーゼ遺伝子（ZEP）について祖先14品種の一塩基多型（SNP）情報をシュアセレクト・ター
ゲット・エンリッチメント・システムで収集し、各遺伝子の翻訳領域内におけるSNP情報を整理した結果、各遺伝子にはそれぞれ、192個、39個、75個のSNPsがみられ、それらの配列上の位置を明らかにした。また、翻訳領域内の配列を比較した結果、祖先14品種における各遺伝子のアリル数
はそれぞれ、21個、15個、10個であることを明らかにした。サイバーグリーン定量PCRにより果実の遺伝子発現量を調査した結果、PSYはキングマンダリンやクネンボで発現量が高く、HYbやZEP
はウンシュウミカンで発現量が低いことが明となり、これらの祖先品種由来のアリルをβ-クリプ
トキサンチ高含有のための候補アリルとして選定した。

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図１．PSY、 HYb、 ZEPの遺伝子構造と祖先１４品種間で見られたエクソン内のSNPとアリル数（２）トランス因子で制御されるカロテノイド代謝遺伝子のアリルマーカーの開発
クレメンティンのゲノム解読配列から設計したカスタムマイクロアレイを作成し、β-クリプト
キサンチンの含有量に分布がみられるA255とG434の交雑実生集団を用いて、全遺伝子を対象とした発現遺伝子の量的形質遺伝子座（eQTL）解析をマイクロアレイ解析で実施した。その結果、フィトエンデサチュラーゼ酵素遺伝子（PDS）とζ-カロテンディサチュラーゼ（ZDS）の遺伝子発現を制御する第8連鎖群のゲノム領域には、新たに色素体の形成に関わるカロテノイドアソシエーションタンパク、カロテノイド酸化開裂酵素遺伝子（CCD）や約60個の転写調節因子などのeQTLsが座乗することが明かとなった。このゲノム領域内には、シス因子で制御される約40種類の転写調
節因子が存在しており、その中からマーカー候補となる転写因子を複数選定した。

図２．第８連鎖群に座乗するPDSとZDSの遺伝子発現を制御するゲノム領域（３）カロテノイド代謝に関与する転写因子遺伝子の機能解析
カンキツのカスタムオリゴアレイを用いたマイクロアレイ解析により、異なる植物ホルモンで処理した果実においてカロテノノイド代謝遺伝子と発現相関がみられる遺伝子をスクリーニング
し、複数の候補遺伝子を見出した。このうち、ブラシノステロイドのシグナル制御に関わるbHLH
型の転写調節因子(CubHLH1)は、カンキツのカロテノイド代謝遺伝子のプロモーター領域に対してDNA結合活性を有することを明らかにした。さらに同遺伝子をアグロバクテリウム法によりトマト
で過剰発現させた結果、CubHLH1はトマト果実中のカロテノイド代謝のHYbやCCDなどの遺伝子の発現を高め、リコペンの代謝を下流に進め、アブシジン酸を増加させる機能を有することを明らかにした。また、PDSとZDSの遺伝子発現を制御するゲノム領域に座乗するRNA結合型タンパク質（Tf0271）をトマトに遺伝子導入した結果、果実中のリコペンβ-リングハイドロキシラーゼ遺伝子（LCYb）やリコペンε-リングハイドロキシラーゼ遺伝子（LCYe）の転写を促進し、果実中のカ68ロテンやルテイン含有量の上昇を伴い総カロテノイド量を増加する機能を持つことを明らかにし、
トランス因子で制御されるカロテノイド代謝遺伝子のアリルマーカーの候補遺伝子とした。

図３．カロテノイド代謝を制御する2種類の転写因子（CuｂHLH、Tf271）の制御機構の概要
３）成果活用における留意点
β-クリプトキサンチンを高含有化した新品種の育成を効率化するためには、高含有化個体を高頻度に出現する親組み合わせを予測する必要があることから、アリル識別マーカーを用いて既存の品種や育種素材のアリル型を併せて調査する必要がある。
４）今後の課題
β-クリプトキサンチン高含有化のためのアリルマイニングを行い、最適アリルを保持する育種
実生の選抜のためのDNAマーカーの開発を進める予定である。

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR2004
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ニホングリ易渋皮剥皮遺伝子の単離小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 果樹茶業研究部門・品種育成研究領域・ナシ・ク
リ育種ユニット・西尾聡悟
１）研究目的農林水産技術会議が策定した「作物育種研究の今後の進め方について」(平成 24 年 5 月 25 日決定)
では、クリの重点課題として「ぽろたん」より早生で渋皮がむきやすい品種の開発、改良ターゲットとして「ぽろたん」より早生で渋皮がむきやすい良食味性が明記されており、現在のクリ育種において、易渋皮剥皮性は最も重要かつ有用な形質である。
ニホングリは、果実の大きさに優れるが、チュウゴクグリと比べて渋皮が剥きにくいという致命的な欠点がある。果樹研究所（現在の農研機構果樹茶業研究部門）では 2006 年に、果実の渋皮がチュウ
ゴクグリ並みに剥ける易渋皮剥皮性を持つ画期的なニホングリ品種「ぽろたん」を初めて育成した。
「ぽろたん」は、電子レンジやオーブンで加熱することにより簡単に渋皮を剥くことができ、食味も優れていることから、今後、和洋菓子などを始めとする新たな需要開拓と国産グリの需要拡大、さらに国内のクリ関連産業の活性化、6 次産業への貢献など攻めの農林水産業への寄与が大いに期待される。今後は、易渋皮剥皮性がニホングリの標準となると考えられることから、易渋皮剥皮性を持ち、さらに異なる収穫期や食味・果実品質に優れる品種の育成が必要となるが、渋皮剥皮性は果実形質であることから、従来型の選抜では、多大な圃場面積、労力や期間を必要とする。そこで本課題では、
ニホングリ易渋皮剥皮遺伝子領域を同定し、近傍領域の配列から、易渋皮剥皮性品種の育成に有効なDNA マーカーを開発することを目的とする。
２）研究成果1) ニホングリ標準連鎖地図の構築
ニホングリ標準連鎖地図の構築には、国見× 709-34（111 個体）の解析集団を用いた。各実生
および両親品種の幼葉から NucleoMag Plant を用いてゲノム DNA を抽出した。供試マーカーには、250 種類のチュウゴクグリ由来 SSR マーカーおよび 374 種類のニホングリ由来 SSR マー
カーを用いた。SSR マーカーによる増幅産物は、DNA シーケンサーにより分離・検出するとともに、GeneMapper 5.0 ソフトウェアを用いてサイジングおよびアレルコールを行った。連鎖解
析と連鎖地図の構築には、JoinMap 4.1 ソフトウェアを用いた。グルーピングは Independence
LOD score 4.0 で行い、regression mapping 法により連鎖地図を作製した。遺伝地図距離の推定には Kosambi の地図関数を用いた。
供試したチュウゴクグリ SSR マーカーの内、239 種類のマーカーはニホングリにおいても増幅が認められた。144 種類のマーカーが、国見および 709-34 の両親間で多型を示した。同様に、ニホングリ由来の SSR マーカーでは、238 種類のマーカーで多型が認められた。連鎖解析により、352 マーカーが座乗するニホングリ連鎖地図を構築することができた（図 1）。12 連鎖群によって構成され、全長 700.3 cM、平均マーカー間距離 1.8 cM である。供試したチュウゴクグ
リ SSR マーカーは、チュウゴクグリ標準連鎖地図上にマッピングされており、座乗連鎖群が判明している。SSR マーカーの対応付けから、今回構築したニホングリ連鎖地図は、染色体基本数（n=12）に収束しており、すべての連鎖群でチュウゴクグリ標準連鎖地図との対応付けが可能であった。

HOR200470渋皮剥皮遺伝子座は PRD58 と PRD52 の間に座乗していることが報告されている。これらのマーカーの座乗位置から、「乙宗」に由来する渋皮剥皮対立遺伝子は第 1 連鎖群の中央付近に座乗していることが示唆された。

2) ニホングリ BAC ライブラリーの構築
易渋皮剥皮対立遺伝子と難剥皮対立遺伝子を有する「丹沢」を用いて BAC ライブラリーの構築を行った。
「丹沢」の未展開葉から核を単離し、アガロースプラグを作製した。制限酵素（Hind III）で DNA を部分消化した後、パルスフィールド電気泳動により double-size fractionation
を行い、DNA をサイズ分画した。100-200 kb の分画をゲルから切り出し、精製した DNA 断片を
pIndigoBAC-5 vector にライゲーションした。エレクトロポレーションにより大腸菌（DH10B）に形質転換し、BAC ライブラリーを作製した。
合計 69,120 クローンからなるニホングリ BAC ライブラリーを構築した。パルスフィールドゲ
ル電気泳動から、BAC クローンのインサート長を推定した結果、作成した BAC ライブラリーの平均インサート長は、約 159 kb と推定された。ニホングリの推定ゲノムサイズは明らかとなっていないが、チュウゴクグリとほぼ同等であると考えられる。チュウゴクグリの推定ゲノムサイズ（800 Mb）を基にすると、今回構築したニホングリ BAC ライブラリーは、推定ゲノ
ムサイズの 14X をカバーすると考えられる。

3) ニホングリ再分化系確立に向けた条件検討
ヨーロッパグリやアメリカグリでは、未熟胚からの不定胚誘導が報告されていることから、材料として、「筑波」×「ぽろたん」の交配集団より得られた未熟胚を用いた。交配約 6-7 週
後（43-49 日）に毬果から鬼皮を含む子実を取りだし、鬼皮ごと滅菌を行った。滅菌条件は、80%EtOH で 1 分、1%NaClO で 20 分、滅菌蒸留水による洗浄 3 回である。
未熟胚からの不定胚誘導には、ヨーロッパグリ等で再分化の成功報告のある KTI 培地もしく
は WD4G 培地を用いた。KTI 培地および WD4G 培地の組成は以下である。KTI 培地： MS +Kinetin（2 mg/L）+ TDZ（0.1 mg/L）+ IBA（0.01 mg/L）+ L-glutamine（250 mg/L）+
Sucrose（30 g/L）+ gelrite（2.1 g/L）（pH5.8）、WD4G 培地： WPM salts + NN vitamins+ 2,4-D（4 mg/L）+ L-glutamine（1 g/L）+ Sucrose（30 g/L）+ gelrite（2.1 g/L）+ myoinositol（100 mg/L）（pH5.8）。
培養時、胚の大きさは 1mm 以下-10mm の範囲に分布していたが、6mm 以下のものが多かった。KTI 培地でのみ不定胚形成が観察され、不定胚形成率は約 60%であった。不定胚形成は、茎頂部に多く観察され、子葉部、下胚軸部分にも散見された（図 2）。下胚軸部分での胚形成の例は少なかった。形成される不定胚数には変動が大きかった。不定胚形成は、茎頂部に多く観察され、子葉部、下胚軸部分にも散見された。不定胚形成は、置床後 3-7 週位まで観察されたが、4-5 週が多かった。置床する胚が大きい（8mm 以上）と、不定胚形成率は低下した。形成された不定胚は、MS ホルモンフリー培地へ移植し、植物体の再分化を試みたが、子葉の肥厚など異常な生育を示し、再分化系の確立には至らなかった。

4) 渋皮剥皮遺伝子座（Peeling ）のファインマッピング
渋皮剥皮性が分離する遺伝解析集団（「ぽろたん」×クリ筑波 43 号、689 個体）について、既存の渋皮剥皮遺伝子座と連鎖するマーカー（PRD58 および PRD52）によるジェノタイピングを行った。「ぽろたん」は易渋皮剥皮性（p /p ）、クリ筑波 43 号は難渋皮剥皮性（P /p ）である。ジェノタイピングの結果、易渋皮剥皮遺伝子型の実生が 304 個体、難渋皮剥皮遺伝子型の実生が 325 個体、マーカー間で遺伝子型の組み換わっている実生が 60 個体であった。マーカー

HOR200471

間で遺伝子型の組み換わっている 60 実生については圃場に定植し、開花・結実まで維持・管理を行った。また、定植実生および両親品種の幼葉から NucleoMag Plant を用いてゲノム DNAを抽出した。
収穫した果実について、HOP（high-temperature oil peeling）法により渋皮剥皮性の評価を行った。収穫果実を 4 ℃で１ヶ月貯蔵後、個体毎に 10 果実を 190 ℃の油で 4 分揚げ、10 果実の平均渋皮剥皮率を記録した。剥皮処理後に、健全な表皮が表面積全体に占める割合を目視で0-100 ％まで 10%単位の 11 段階に評価した値の平均値を、各実生の渋皮剥皮率（%）とした。
渋皮剥皮率が 75 ％以上の個体を易渋皮剥皮性、剥皮率が 75 ％より低い個体を難渋皮剥皮性と判定した。
これまでに、チュウゴクグリではドラフトゲノム情報（v1.1）が公開されている（http://www.
hardwoodgenomics.org/chinese-chestnut-genome）。41,260 scaﬀolds（N50, 39.6 kb）の総塩基
長は 724.0 Mb であり、推定ゲノムサイズの 91.2%をカバーしている。BLAST による配列類似性検索から、渋皮剥皮遺伝子座と連鎖している PRD58 と PRD52 のマーカーが座乗している
scaﬀold を調べたところ、異なる scaﬀold であった。
渋皮剥皮遺伝子座のファインマッピングのため、更なる連鎖マーカーの獲得を進めた。渋皮剥皮遺伝子座は第 1 連鎖群に座乗していることが明らかとなっているが、チュウゴクグリの各 scaﬀoldは染色体（連鎖群）との対応が不明である。そこで、既存の連鎖地図に座乗している SSR マー
カー領域が含まれていると思われる scaﬀold を除き、残った scaﬀold について、Tandem Repeats
Finder と Primer3 により SSR マーカーを設計した。多型性を考慮し 2 塩基モチーフの SSR のみに限定し、異なる scaﬀold から 1,280 種類の SSR マーカーを選定した（CmSSR0001-1280）。
新たに開発したマーカーについて、「ぽろたん」×クリ筑波 43 号における多型性および座乗連鎖群のスクリーニングを行うとともに、渋皮剥皮性との連鎖解析を行った。その結果、24 種
類の SSR マーカーが、PRD58 と PRD52 の間に座乗しており、渋皮剥皮遺伝子座の座乗位置
は、CmSSR0338 と CmSSR0731 マーカー間、およそ 1.1 cM の間に座乗していることが示唆された（図 3）。また、渋皮剥皮性と完全連鎖するマーカー（CmSSR0055）を獲得した。
渋皮剥皮遺伝子座と連鎖するマーカー、および完全連鎖するマーカーを起点として、渋皮剥
皮遺伝子座をカバーする BAC コンティグの構築を進めた。しかしながら、現在保有する BAC
ライブラリーでは、一部の領域で該当する BAC クローンが含まれておらず、渋皮剥皮遺伝子座をカバーする BAC コンティグを構築することは出来なかった。

HOR2004

72

HOR2004

73３）成果活用における留意点
今回開発したマーカーを用いてマーカー選抜を行う際には、交配に用いた両親の多型性を考慮する必要がある。
４）今後の課題
今後ロングリード型のシーケンサーなどを用いることで、ニホングリでもゲノム解読が容易となる。渋皮剥皮遺伝子座をカバーする BAC コンティグの構築を行うことが出来なかったが、ニホング
リおよびその近縁種のゲノム情報を用いることで渋皮剥皮性のメカニズムの解明および原因遺伝子の単離が進むと考えられる。
現在、渋皮が剥けやすいニホングリ品種として、「ぽろたん」および「ぽろすけ」が育成されているが、両品種の有する易渋皮剥皮対立遺伝子はともに在来品種「乙宗」に由来している。また、渋皮の剥けやすい品種育成に利用可能な品種・系統は、すべて「乙宗」由来であることから、これらを用いた交雑を続けることで近交弱勢が生じることが危惧される。よって、様々な在来品種の渋皮剥皮性を調査し、易渋皮剥皮品種の育成に利用可能な育種素材を探索する必要がある。

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「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR2005
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ニホンナシ果実の糖組成に関する DNA マーカーの開発
小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 京都府立大学・大学院生命環境科学研究科・資源植物学研
究室・板井章浩
１）研究目的農林水産技術会議が策定した「作物育種研究の今後の進め方について」では、良食味性を基本にして、複合病害抵抗性や自家和合性などの様々な特徴を合わせ持つナシ品種の育成が重点課題となっている。ナシ果実における良食味性は、糖、有機酸、アミノ酸、肉質、香り、色などの要因によって決定されており、生食としての利用が多いニホンナシでは甘味を構成する糖の組成と含量が良食味性を決定する上で最も重要である。一方、ニホンナシでは、糖の含量と組成に関連する遺伝子やその制御機構は十分に解明されておらず、良食味性を選抜するための DNA マーカーも開発されていない。これまでの研究から、ナシ果実における主な糖成分はスクロース（ショ糖）、グルコース、フルクトー
ス、ソルビトールであり、品種間でこれら糖の組成割合は大きく異なることが明らかとなっており、中でもスクロース含量については、品種によっては 50 ％を越えるものから、ほとんど蓄積しない 0％に近い品種まで著しい差異が認められている。特に第二次世界大戦以降に育成された品種では、晩生品種を除いて高いスクロース含量を示すものが多く、良食味性とスクロース含量との関連が強く示
唆されている。このため、ニホンナシ良食味品種の育成においては、スクロース蓄積の分子メカニズ
ムを明らかにし、スクロース蓄積型を判別できる DNA マーカーの開発を目的とする。
２）研究成果1. 酸性インベルターゼ (PpAIV2 ) のゲノム構造の差異による糖組成に関する DNA マーカーの開発と発現調節機構の解析
スクロース高蓄積型を 2 品種、低蓄積型を 4 品種、チュウゴクナシを 2 品種の発育中期から成熟果まで経時的に採取した果実、および収穫適期に採取した 25 品種の果実の糖組成を HPLC により分析した。また、同じサンプルを用いて PpSPS1 および PpAIV2 の発現解析を行った。ナシ果実の経時的な糖組成の変化およびスクロース代謝関連酵素遺伝子を調査した結果、スクロース高蓄積型品種
は、成熟期に PpAIV2 の発現が減少する一方、PpSPS1 の発現が急激に増加していた。低蓄積型
品種では、PpAIV2 の発現が高く、PpSPS1 の発現が低いことから、PpAIV2 および PpSPS1 の発現がスクロース蓄積において関連性が高いことが示唆された。また、チュウゴクナシでは成熟期にPpAIV2 および PpSPS1 の発現が高いタイプと常に両遺伝子の発現が低いタイプの 2 タイプがみられ、どちらもスクロース蓄積が生じないことが確認された。そのため、成熟期の PpSPS1 と PpAIV2
発現の高低がスクロース蓄積を決定する最も重要な要因であることが改めて示唆された。
そこで、スクロースの分解に関わる PpAIV2 について、スクロース高蓄積型品種の 長十郎
由来のクローン 7-5 の配列と、一方、 スクロース低蓄積型品種の 晩三吉 由来のクローン 55 の配列を比較し、さらにプロモーター領域について 14 品種でシーケンスを行ったところ、低蓄積型品種でみられた転写開始点より上流約 0.6kb の CAPS サイトは、 太平 、 津軽青 など例外品種を除き、高蓄積型品種にはみられないことが明らかとなった。そこで、スクロース低・中・高蓄積型の 31 品種のプロモーター領域の Eco R サイトを増幅するようにプライマーを構築し、増幅断片を Eco R
で消化する CAPS 法を用いた結果、ゲノムのサザン解析の結果とすべて一致し、スクロース高蓄積型品種は全く切断されず、低蓄積型品種は一部の例外を除きすべて切断された。また、クローン 7-5にはクローン 55 に比べて、18bp の挿入をみられ、この領域含む配列を増幅した結果、スクロース高HOR200575

蓄積型品種は長いバンドのみが確認され、スクロース低積型品種は長いバンドと短いバンドのヘテロ
もしくは短いバンドのホモしか確認されなかった（第１図）。以上の結果から、これらマーカーは、
スクロース低・中蓄積型品種のみが切断されることが確認できたため、スクロース低蓄積型判別のマーカーとしての有効であると思われた。また、スクロース分解に関わる PpAIV2 の発現制御機構
において、メチル化状態の違いが明らかになったことから発現に関与するシス因子の同定やエピジェ
ネティックな制御機構の有無について検討し、PpAIV2 のプロモーターのゲルシフトアッセイを行った結果、糖応答シスエレメントを含む上流 330bp 断片とまた上流 418bp 断片も両品種の核タンパク
質との結合が見られたことから、これらの領域が PpAIV2 の発現制御機構に関与する可能性が示唆された。

2. スクロース合成に関わる PpSPS1 のマーカー開発
糖蓄積の異なる約 40 品種の成熟果実の cDNA を用いてリアルタイム PCR を行った。その結果、ス
クロース高蓄積品種においては、PpSPS1 の発現量が高い傾向にあった。そこで高発現型および低発
現型 PpSPS1 の塩基配列多型情報より、SNP、CAPS などのマーカー候補を選抜し、選抜したマーカーの多型性を発現解析および糖組成を調査した。糖組成の異なる様々な品種から PpSPS1 転写開始点上流約 2,000bp を含む配列を得ることができた。品種間でかなり多数の塩基配列多型が得られた。そのなかで PpSPS1 の翻訳開始点上流約 200bp の配列には、CT 繰り返しからなる配列 (SSR) が存在し、この領域の長さが品種間で大きくことなっていることが明らかとなった。そこで、配列を増幅するために構築した蛍光プライマーを用いて、フラグメント解析を行ったところ、160bp、152bp、150bp、144bp、141bp、139bp、137bp、135bp の計 8 種類のアリルが得られた。
これらのアリルの違いと糖組成の異なる品種の成熟果実の cDNA を用いてリアルタイム PCR を行った。その結果、160bp のアリルを持つ品種において、発現が多い傾向がみられたものの、その他のアリルを持つ品種でも発現が多いもののもあり、一定の傾向が得られなかった。
3. 糖組成の異なる実生集団（ あきづき ｘ 373-55 ）におけるマーカー選抜
あきづき ｘ 373-55 の 100 系統以上の糖組成を明らかにした結果、スクロース含量はほぼ 0％から 50 ％を越えるものまで系統間で大きな差が見られた。開発した PpAIV2 第 1 イントロン部分

HOR200576

の挿入を利用した PCR マーカーと上述の PpSPS1 転写開始点上流の SSR を利用したマーカーについて、系統のスクロース含量とマーカーの相関について調査した。結果、PpAIV2 と PpSPS1 の両マーカーともスクロース含量の相関が見られなかった。そこで、高スクロース含量系統、中程度の含量の系統および低含量の系統果実から RNA を抽出し、スクロース合成および分解に関与する遺伝子の発現解析を行った。その結果、PpSPS1 と PpAIV2 の発現量とスクロース含量の間には、相関が見られなかったのに対して、PpAIV1 の発現量は、高スクロース蓄積系統では、ほとんど発現が見られず、PpAIV1 遺伝子の発現がこの集団では鍵になっていると考えられた。また糖組成に関するＱ
ＴＬ解析を行ったところ第 1,7 連鎖群にＱＴＬを検出した。QTL 領域である第 7 連鎖群においては、
PpAIV1 が存在し、PpAIV1 が原因遺伝子である可能性が推察された。そこで、 あきづき および
373-55 において PpAIV1 プロモーター上流 2 ｋｂについてシーケンス情報を得た結果、50 カ所
以上のＳＮＰ情報が得られた。SNP および欠失領域からプライマーを構築し、マーカー開発を行った（第２図）。結果、PpAIV1 プロモーター由来配列マーカーは糖組成に関する QTL のピークの信頼区間に存在し、また成熟果実での発現量とマーカータイプに相関がみられた。また、開発したマーカーを現在の栽培品種および育種親系統の合計約 180 アクセションについて，遺伝子型を決定した。さらに一方の QTL 領域である第 1 連鎖群において、現在原因遺伝子の可能性のある PpAIV3 についてク
ローニングを行い、PpAIV3 プロモーター上流 2 ｋｂについてシーケンス情報を得た結果、20 カ所
以上のＳＮＰ情報が得られた。SNP および欠失領域からプライマーを構築し、CAPS マーカー開発を行った（第 3 図）。結果、PpAIV3 プロモーター由来配列マーカーは糖組成に関する QTL のピー
クの信頼区間に存在し、また成熟果実での発現量とマーカータイプに相関がみられた。開発したマーカーを現在の栽培品種および育種親系統の合計約 120 アクセションについて，遺伝子型を決定した。
これらの情報は、今後の良食味系統育成の際の育種親の決定に有効と考えられた。

HOR200577

4. 実生集団を用いて網羅的発現解析による原因遺伝子の探索
実生集団においてスクロース含量の異なる 9 系統（高スクロース 3 系統、中スクロース 3 系統、低スクロース 3 系統）の成熟果実より RNA を抽出し、次世代シークエンス用ライブラリーを作製し、RNA-seq 解析を行った。高スクロース系統、中スクロース系統、低スクロース系統の 3 者間で発現量の異なる遺伝子群の選抜を行い、高スクロース系統、中スクロース系統、低スクロース系統の 3
者間で明らかに差がみられ、スクロース合成に関与すると考えられる新規 SPS 遺伝子、スクロース-6リン酸フォスファターゼ遺伝子、インベルターゼインヒビター遺伝子などを合成の鍵遺伝子候補として選抜した。これらの遺伝子は、今後の良食味品種育成のマーカー開発の候補遺伝子となり得る。
３）成果活用における留意点
スクロース分解に関わる機構を解明がすすみ、3 つのインベルターゼ遺伝子（PpAIV1, 2, 3 ）のDNA マーカーが利用できる状態である。全国のニホンナシの育種に関わる公設試験場での DNA マー
カー選抜育種で利用は可能になる。しかし、PpAIV2 に関しては、メチル化が関与しており、完全に識別できるマーカーとなっていない点を留意する必要がある。
４）今後の課題
スクロース分解に関わる機構およびマーカー開発が進み、食味の良くない系統を除外することが可能になりつつある。しかし、スクロース合成に関わる制御機構に関しては候補遺伝子の選抜が行われてはいるが、まだまだ解明が進んでいない部分が存在する。今後、スクロース合成に関わる候補遺伝子を利用してマーカー開発を行い、より正確に良食味品種を選抜する方法を確立する必要がある

HOR200578

「園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発」最終年度報告書
中課題番号: 13405844
研究期間: 平成 25〜29 年度
中課題名: 園芸作物の有用遺伝子の同定とＤＮＡマーカーの開発 (HOR)
小課題番号: HOR2006
研究期間: 平成 25〜29 年度
小課題名: ブドウべと病抵抗性の DNA マーカー開発
小課題代表研究機関・研究室・研究者名: 農研機構 果樹茶業研究部門・ブドウ・カキ研究領域・ブド
ウ・カキ育種ユニット・河野淳
１）研究目的
ブドウべと病は国内外のブドウ生産に大きな被害をもたらしている重要病害であり、近年も主産県で甚大な被害が生じている。特に、平成 22 年のべと病の大発生などにより、主産県である山梨県のブドウ生産量が前年比約 10 ％減となり、同県のワイン生産にも大打撃を与えた。更に、ストロビル
リン系殺菌剤やメタラキシルといった薬剤に耐性のべと病菌が山梨県などで確認されており、べと病
抵抗性品種の育成が以前にも増して重要な課題となっている。
これまでの研究により、醸造用ブドウを用いたべと病抵抗性 DNA マーカーが欧米諸国で開発されている。一方、日本の生食用ブドウにおけるべと病抵抗性や日本国内のべと病菌系統に関する研究は進んでいない。そこで、本課題では、生食用ブドウ品種マスカットオブアレキサンドリア（アレキ）やキャンベルアーリー（キャンベル）が有する抵抗性について、アレキ×キャンベルの実生集団（集団 AC）を用いてべと病抵抗性の評価を行い、QTL 解析により抵抗性遺伝子座を検出する。この抵
抗性遺伝子座の有効性について、国内から単離した複数のべと病菌株を用いて検証する。その上で、ブドウのゲノム情報を利用して新規マーカーを設計し、抵抗性 QTL を両側から挟み込む DNA マー
カーを開発する。上記の解析を通じて、生食用ブドウ新品種育成の際にべと病抵抗性を効率良く選抜するための DNA マーカーを開発することが本研究の目的である。
２）研究成果（１）集団 AC を用いたブドウべと病抵抗性 DNA マーカーの開発
研究方法：べと病抵抗性に関与する QTL を検出するため、アレキ×キャンベル実生集団（集団 AC）
について殺菌剤無散布条件下でべと病抵抗性を 3 年間評価した。抵抗性評価は新梢完全展開葉について分生子（遊走子嚢）が観察された葉の割合（発病葉率）および葉の発病程度から算出した品種・系統の発病程度（発病度）の 2 通りの方法で行った。また、生食用ブドウ品種系統（27 品種系統）においても同様の調査を 2 年間行った。新梢完全展開葉の葉裏について実体顕微鏡観察結果を基に、毛じ量を 1〜6 段階のスコアで評価した。アークサイン変換した発病葉率および発病度を葉裏毛じ量で線形回
帰し決定係数を求めた。集団 AC の抵抗性調査結果および葉裏毛じ量調査結果に関して、MapQTL6
により QTL 解析を行った。
葉裏毛じが非常に多いあるいはほとんど無い品種・系統のリーフディスクを作成し、界面活性剤処理区（0.01 ％（v/v）NP-40 処理後に蒸留水で四回洗浄）と無処理区を設け、べと病菌を両区に接種
し界面活性剤の有無で発病に差が生じるか調査した。
研究結果：葉におけるべと病抵抗性について集団 AC を用いた QTL 解析を行った結果、いずれの抵抗性調査手法においても調査した全ての年次でアレキ由来の効果の高い QTL が検出された（表１）。
この結果はこの座がアレキ由来の罹病性をもたらす座であることを示す。この集団で葉裏毛じ量が大きく変動すること、また以前に葉裏毛じ量がべと病抵抗性に寄与しうることが示唆されていたため、この集団における葉裏毛じ量についても同様の QTL 解析を行ったところ、非常に高い寄与率でべと病抵抗性と同じ領域が検出された（表１）。アレキには葉裏毛じがほとんど無いことから、この座は
葉裏毛じ量を著しく減少させる優性の効果を有するといえる。集団 AC 以外にもこの座の効果があるか確認するため、2 つの異なる実生集団について解析したところ、この座における遺伝子型別のグ

HOR200679

ループ間に大きな毛じ量の差が検出された。以上より、この座がべと病抵抗性に関与する葉裏毛じ量の DNA マーカーとして広く利用可能な座であることが示唆された。
生食用ブドウ品種・系統のべと病抵抗性に毛じが及ぼす影響について解析したところ、発病葉率を毛じ量達観評価値で回帰した決定係数は集団 AC で 0.50、生食用ブドウ品種系統（27 品種系統）で0.77 となった。キャンベルなどの葉裏に毛じの非常に多い品種では、ほとんど発病が見られなかった。
また、寺井と矢野（1977）による 27 品種・系統のべと病発病葉率調査結果を用いて同様の回帰分析を行ったところ、決定係数は 0.71 とやはり高かった。これは、葉裏の毛じ量に応じて発病が抑制されることを示すとともに、少なくとも供試した品種・系統内では毛じ量に起因しない抵抗性の効果は低いと考えられた。ただし、この抵抗性は完全なものでなく、発病の程度を軽減させるいわゆる圃場
抵抗性である。
葉裏毛じの撥水性が感染に影響を与えているか異なる手法で確認するため、界面活性剤処理により毛じの撥水効果をなくした条件下での接種試験を行った。その結果、キャンベルなどの通常ほとんど
発病しない毛じの非常に多い品種や野生ブドウでも分生子の形成が見られた。これは、毛じの多いブ
ドウにおいて、べと病菌が侵入してしまえば発病する場合があることを示唆した。
以上より、生食用ブドウ集団において、葉裏の毛じによる撥水効果により、べと病菌が気孔から侵入する過程を阻害する構造的な圃場抵抗性（静的抵抗性）が存在することが示された。また、抵抗性に関与する葉裏毛じ量を制御する効果の高い QTL を生食用ブドウ品種から見出した。この QTL 領
域は葉裏毛じ量によるべと病圃場抵抗性の DNA マーカーとして用いることが出来る。以上の結果から、5 年間の目的を達成した。
また、集団 AC の過去の果粒重調査結果から、果粒重に関する QTL 解析を行ったところ、葉裏毛
じ量制御 QTL の近傍に果粒重 QTL が検出された。そこで、集団 AC における分離を調べたところ、
この葉裏毛じ量を減少させるアリルと果粒重を増加させるアリルが連鎖していることを見出した。そこで、農研機構で育成保存している実生個体からこの連鎖の切れた個体を探索したところ、1 個体を見出した。今後はこの個体あるいは新たに見出された組換え個体由来の果粒重のみを増加させ、葉裏毛じ量を減少させないハプロタイプを育種に利用することが望ましいと考えられる。

（２）ブドウ属近縁野生種由来のブドウべと病強度抵抗性 DNA マーカーの開発
研究方法：野生ブドウと既存品種・系統の交雑実生集団のべと病抵抗性の分離について予備的に調べるため、V. coriace ×リザマート（19 個体）、エビヅル和歌山×安芸津 7 号（20 個体）、エビヅル
和歌山×赤嶺（20 個体）、サンカクヅル×リザマート（55 個体）の実生集団および親品種について

HOR200680

リーフディスクによる接種試験を行った。達観調査は接種 7 日後に行った。
研究結果： V. coriacea の後代はすべて罹病性であり、リザマートの罹病性より遺伝的に上位な優性抵抗性遺伝子は無かった。日本在来の野生ブドウであるエビヅル後代の抵抗性は分離したが、毛じ量と抵抗性に強い相関が観察された。これらすべての実生は野外の殺菌剤無散布圃場で最終的にはす
べてべと病に罹病したことから、目的とした強度抵抗性遺伝子は無いと判断した。日本在来の野生ブドウであるサンカクヅルにべと病菌を接種したところ、過敏感反応様の褐変を生じた。また、殺菌剤
無散布条件下の樹も非常に強い抵抗性を示した。V. coriacea やエビヅル、ヤマブドウなどの野生ブドウの多くが葉裏に非常に密な毛じを生じるのに対し、サンカクヅルには毛じが全く無い。これはサンカクヅルには毛じとは全く機構の異なる強い抵抗性を有することを意味する。そこで、リーフディ
スク法によりサンカクヅル×リザマート実生群の 55 個体について抵抗性を調査したところ、抵抗性は罹病性に偏った分布となり、サンカクヅル並みに抵抗性の強い個体は得られなかった（図１）。これは、この集団から優性の強度べと病抵抗性を分離することは不可能であることを示唆した。プロジェ
クト 3 年目（平成 27 年度）の時点で上記のような研究進展状況であったことから、野生ブドウから強度べと病抵抗性遺伝子座を見出す計画は平成 27 年度までで終了した。

（３）国内べと病菌系統の収集並びに病原性調査
研究方法：国内各地（青森、秋田、山形、山梨、長野、岡山、佐賀）のブドウ園から計 19 菌株のべと病菌を収集した。各べと病菌はリザマート葉上で培養し分生子を形成させた。分生子を筆先で集め 10 ％スキムミルク液に懸濁し、− 80 ℃で保存した。凍結保存した分生子はスキムミルクごと凍結
乾燥、粉砕し、DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて DNA を抽出した。上記 DNA を用いて
ITS 領域、28S リボゾーム RNA 遺伝子、アクチン遺伝子、β-チューブリン遺伝子を増幅し塩基配列を決定した。決定された塩基配列は既報のデータと比較し、国内のべと病菌の所属を検討した。
これまでに収集したべと病菌菌株をブドウ属植物に接種し、反応に差がみられるかどうかを調査するため、ブドウ属植物として、Vitis vinifera （欧州ブドウ）4 品種、V. labrusca (米国野生ブドウ)1
系統、V. sylvestris （欧州野生ブドウ）2 系統、V. coignetiae （ヤマブドウ）、メキシコ野生ブドウ（学名不明）を供試した。遊走子嚢懸濁液を、接種植物のリーフディスク（1 品種あたり 10 枚）に滴下した。接種したリーフディスクは 20 ℃で培養し、約 1 週間後に遊走子嚢形成程度を達観評価した。
研究結果：収集したべと病菌株の ITS 領域の部分塩基配列（736 bp）から、国内で収集された菌株

HOR200681

はすべてブドウべと病菌（Plasmopara viticola ）であることを確認した。28S リボゾーム RNA 遺伝
子（629 bp）、アクチン遺伝子（454 bp）、β-チューブリン遺伝子（518 bp）の部分塩基配列から、国内で収集されたブドウべと病菌はすべて既報の B 系統に所属し、単一の系統であると考えられた。
接種に用いたべと病菌には病原力の強いものと弱いものが含まれていた。欧州種ブドウに対しては病原力の強い菌株、弱い菌株のいずれも感染した。V. labrusca （米国野生種）、ヤマブドウ、メキシ
コ野生ブドウは、すべての菌株に感染しなかった。葉裏の毛じが豊富な品種（V. labrusca 、メキシ
コ野生ブドウ）は、いずれもべと病に感染しなかった。これは非常に密な葉裏毛じが、安芸津における菌株のみならず、今回供試した国内で収集された菌株に共通して有効であることを示している。以
上の結果から、5 年間の目的を達成した。
３）成果活用における留意点
他国で報告されているべと病抵抗性遺伝子は、アメリカ野生種と欧州ブドウの交雑品種であるフレ
ンチハイブリッドあるいは野生種そのものなどに由来し、国内生食用ブドウ集団には導入されていない。そのため、その利用には遺伝資源の導入あるいは過去に導入されたフレンチハイブリッドなどから交雑により導入する必要があり、非常に長年月がかかる。一方、本研究で見出された葉裏毛じによる圃場抵抗性は生食用ブドウ集団ですぐに応用可能である点で実用性が高い。具体的には、アレキなどに由来する葉裏毛じ量を大きく減少させるアリルを実生集団から排除する方向で育種を進める必要がある。しかし、この抵抗性は発病を完全に抑える抵抗性ではない点には注意が必要である。また、果粒重を増加させる QTL が連鎖していることにも注意が必要であり、単純に毛じ量減少アリルを排除すると果粒重が一定程度減少することが想定される。
４）今後の課題
アレキに由来する座以外にもキャンベルからも効果は弱いものの葉裏毛じ量を増加すると想定される座が見出されており、その他にも葉裏毛じ量に関与する座がある可能性がある。今後はこうした他の座も考慮しつつ、葉裏毛じ量をキャンベル並みに多い個体を育成・選抜することが、葉裏毛じによるべと病強度抵抗性品種育成に不可欠である。

HOR200682

Ⅴ これまでの研究実施期間における研究成果（論文発表、特許他）【一般公表可】

課題番号 13405844

成果等の集計数
学術論文
課題
番号学会等発表（口頭またはポスター）

和文

欧文

国内

国際

3

9

15

0

13405844

出版
図書1

国内特許権等

国際特許権等

出願

取得

出願

取得

2

0

0

0

発表会
の主催 アウト
報道件 普及しう（シンポ リーチ活
数
る成果
動
ジウム・
セミナー
1

2

2

6

（１）学術論文
区分； ①原著論文、 ②その他論文
整理番
タイトル
区分
機関名
号
農研機 Glucosinolate metabolism, functionality and breeding for the improvement
構野菜 of Brassicaceae vegetables.
1
①
花き研究
部門
農研機 Construction of a citrus framework genetic map anchored by 708 gene構果樹 based markers.
茶業研
2
①
究部門

3

4

5

掲載
巻
発行 発行
ペー
（号）
年
月
ジ

著者

掲載誌

Ishida M, M. Hara, N. Fukino,
T. Kakizaki and Y. Morimitsu

Breeding Science

64

48–
2014
59

T. Shimada, H. Fujii, T. Endo,
T. Ueda, A. Sugiyama, M.
Nakano, M. Kita, T. Yoshioka,
T. Shimizu, H. Nesumi, Y.
Ikoma, T. Moriguchi, M.
Omura

Tree Genetics &Genomes

101001– 20141013①

農研機 Mapping of quantitative trait loci for Melon yellow spot virus resistance in
構野菜 cucumber (Cucumis sativus L.).
花き研究
部門

M. Sugiyama, Y. Kawazu, N.
Fukino, Y. Yoshioka, K.
Shimomura, Y. Sakata, M.
Okuda

Euphytica

205

615–
2015
625

Fine mapping of the susceptible gene to black spot disease in Japanesepear (Pyrus pyrifolia).

①

農研機
構果樹
茶業研
究部門

Terakami S, S. Moriya, Y.
Adachi, M. Kunihisa, C.
Nishitani, T. Saito, K. Abe
and T. Yamamoto

Breeding Science

66

271–
2016
280

かずさ
DNA研

Genome-wide survey of artiﬁcial mutations induced by ethyl
methanesulfonate and gamma rays in tomato.

Plant
Biotechnology
Journal

14

51–
2016
60

①

K. Shirasawa, H. Hirakawa, T.
Nunome, S. Tabata and S.
Isobe

1

6

7

8

9

①

農研機
構果樹
茶業研
究部門

①

農研機 キュウリ黄化えそ病抵抗性を有する’きゅうり中間母本農7号’の育成経過
杉山 充啓・川頭 洋一・下村
構野菜 とその特性
晃一郎・吉岡 洋輔・坂田 好
花き研究輝・吹野 伸子・野口 裕司
部門

②

①

10

①

11

①

12

①

Overexpression of a citrus basic helix-loop-helix transcription factor(CubHLH1), which is homologous to Arabidopsis activation-tagged
bri1suppressor 1 interacting factor genes, modulates
carotenoidmetabolism in transgenic tomato.

農研機 トマト単為結果性pat-2遺伝子
構野菜
花き研究
部門
農研機 Expression of a putative dioxygenase gene adjacent to an insertion
構果樹 mutation is involved in the short internodes of columnar apples (Malus ×
茶業研 domestica)
究部門

農研機 ダイコンの辛味成分合成遺伝子の同定と育種への利用
構野菜
花き研究
部門
農研機 A 2-Oxoglutarate-Dependent Dioxygenase Mediates the Biosynthesis of
構野菜 Glucoraphasatin in Radish
花き研究部門
The tandem repeated organization of NB-LRR genes in the clubroot岩手大 resistant CRb locus in Brassica rapa L.
学、農研
機構野
菜花き研
究部門

2

T. Endo, H. Fujii, A. Sugiyama,
M. Nakano, N. Nakajima, Y.
Ikoma, M. Omura, T. Shimad

243

35–
2016
48

野菜茶業研究所研15
究報告1-10 2016

植物の生長調節 51(1)372016
40

5

129(
6)

1109
- 20161126

11

柿崎智博、石田正彦

バイオサイエンスと52275(6)####
インダストリー523

11

Kakizaki T, Kitashiba H, Zou
Z, Li F, Fukino N, Ohara T,
Nishio T, Ishida M.

Plant Physiol

173(
3)

1583
- ####
1593

3

Hatakeyama, K., Niwa, T.,
Kato, T., Ohara, T., Kakizaki,T., Matsumoto, S.

Mol. Genet.
Genomics

292( 397####2) 405

4布目司
Okada K, Wada M, Moriya S,
Katayose Y, Fujisawa H, Wu
J, Kanamori H, Kurita K,
Sasaki H, Fujii H, Terakami S,
Iwanami H, Yamamoto T, Abe
K

Plant Science

J Plant Res

（２）学会等発表（口頭またはポスター）
整理番
タイトル
号

発表者名

機関名

学会等名

発行年

発行
月

Detailed genetic analysis of fertility restorer genes in eggplant.

Y. Gyawali, T.Saito,
京都産業大学、農研機構・野 日本育種学会第１H.Fukuoka,
菜茶業研究所
２９回講演会H.Yamagishi

2016

3

2

ハクサイ根こぶ病抵抗性遺伝子CRbのゲノム構造

畠山勝徳, 丹羽智
岩手大学、農研機構野菜花久, 加藤丈幸, 小原
き研究部門、（株）日本農林
隆由, 柿崎智博, 松社、農研機構東北農研
元哲

日本育種学会第129回講演会 講
演要旨集育種学研
究

2016

3

3

ブドウべと病抵抗性に寄与するブドウ葉裏の毛じについて

河野淳, 須崎浩一,
伴雄介, 尾上典之, 東京農業大学
佐藤明彦

園芸学会平成28年度春季大会 園芸
学研究

2016

3

柿崎智博

日本育種学会第130回講演会 講
農研機構野菜花き研究部門
演要旨集 育種学
研究

2016

9

布目司

園芸学会平成２８
年度秋季大会シン
農研機構野菜花き研究部門
ポジウム講演要旨
園芸学研究

2016

9

2016

9

2016

9

1

4

5

6

7

ダイコンのグルコシノレート合成経路の解明と育種への利用

トマトの単為結果を制御する転写因子

ハクサイ根こぶ病抵抗性遺伝子の単離と育種への応用

畠山勝徳

岩手大学

日本育種学会第130回講演会 講
演要旨集育種学研
究

リンゴ根でのカラムナー候補遺伝子の発現解析

和田雅人, 岡田和馬, 森谷茂樹, 花田
農業・食品産業技術総合研
俊男, 守谷(田中)友究機構紀, 本多親子, 岩波宏, 阿部和幸園芸学会平成28年度秋季大会 講演
要旨集 園芸学研
究

3

8

アブラナ科野菜育種におけるゲノム育種の現状：遺伝子同定か柿崎智博
ら品種育成まで

第24回 育種学会
中部地区談話会

2016

11

ダイコンF3系統を用いたグルコエルシン含量に関するQTLの効
果の確認

吹野伸子, 柿崎智博, 西尾剛, 北柴大第24回 育種学会
農研機構野菜花き研究部門
泰, 板橋悦子, 小原
中部地区談話会
隆由, 石田正彦

9

2016

11

ナス単為結果性に関与する原因候補変異の探索

宮武宏治, 齊藤猛雄, 山本英司, 山口 農研機構野菜花き研究部
博隆, 大山暁男, 福 門、タキイ種苗株式会社
岡浩之, 布目司

育種学会中部地区
談話会

2016

11

リンゴのカラムナー樹形変異の解析

和田雅人、岡田和馬、岩波宏、森谷
第35回日本植物細茂樹、花田俊男、
胞分子生物学会
農研機構果樹茶業研究部門
守谷（田中）友紀、（さいたま）大会
本多親子、清水講演要旨集
拓、阿部和幸20178

ハクサイ根こぶ病抵抗性遺伝子Crr1bの詳細マッピング

高橋美紗子，松元哲，柿崎智博，湯 岩手大学、農研機構野菜花澤彰太，高畑義き研究部門
人，畠山勝徳

2017

10

13

トマト花粉への変異原処理による変異誘導

布目司、白澤健太、宮武宏治、山
口博隆

2017

10

14

ダイコンにおける成分育種：グルコシノレートを例に

柿崎智博

2017

10

ダイコンのグルコエルシン含量に関するQTL座乗位置の絞り込み吹野伸子、柿崎智博、西尾剛、北柴育種学会第133回
大泰、小原隆由、 農研機構野菜花き研究部門
講演会
板橋悦子、石田正
彦

2018

3

10

11

12

15

農研機構野菜花き研究部門

4

日本育種学会第132回講演会 講
演要旨集育種学研
究

日本育種学会第132回講演会 講
農研機構野菜花き部門
演要旨集育種学研究
平成29年度野菜花
き課題別研究会「野菜のゲノム情農研機構野菜花き研究部門
報を活用した育種
選抜の現状と展望」

（３）出版図書
区分； ①出版著書、 ②雑誌（注）（１）学術論文に記載したものを除く、重複記載をしない。）、 ③年報、 ④広報誌、 ⑤その他
整理番
号

区分

1

②

著書名（タイトル）

著者名

育種学研究(育種学と農学のこれからを考える32)（４）国内特許権等
整理番
特許権等の名称号「きゅうり中間母本農７号」

2

柿崎智博、石田正
機能欠損型グルコラファサチン
彦、小原隆由、吹野
合成酵素遺伝子及びその利用
伸子（５）国際特許権等
整理番
特許権等の名称
号

特許権
等の種
類

機関名

杉山充啓 、川頭洋
一、下村晃一郎、吉 農業・食品産業技 農業・食品産業技 品種登
岡洋輔、坂田好輝、 術総合研究機構 術総合研究機構 録
吹野伸子、野口裕司

1

農業・食品産業技 農業・食品産業技術総合研究機構 術総合研究機構

権利者（出願人等）

発明者

出版社

吉津祐貴・上原（別所）奏子・
矢部志央理・世古智一・宮武 日本育種学会
宏治

権利者（出願人等）

発明者

機関名

機関名

日本育種学会

番号

出願年月日

発行 発行
年
月
2017

取得年月
日

第30332号（品種登2015年10月30日
録出願公表）

特許権

特開2016-086761

公開日 平成28年5月23日 (2016.5.23)

特許権
等の種
類

番号

出願年月日

取得年月
日

「該当無し」（６）報道等
区分；①プレスリリース、②新聞記事、③テレビ放映、④その他
区分

記事等の名称①

キュウリ黄化えそ病に強いキュウリの育成が可能に !- キュウリ黄化えそ病抵抗性の育種素材の育成 -掲載紙・放送社名等

掲載年

掲載月

掲載日

2015

12

2

5

3

機関名

備 考

出願国

（７）普及に移しうる成果
区分；①普及に移されたもの、製品化して普及できるもの、②普及のめどがたったもの、製品化して普及のめどがたったもの、③主要成果として外部評価を受けたもの
普及（製品化）
成果の名称
機関名
主な利用場面
普及状況
区分
年月
③

ポスター賞(ナス単為結果性に農研機構野菜花き研究部門関与する原因候補変異の探索)

2016

11

③

若手農林水産研究者表彰(ナシとリンゴの省力栽培形質に関す 農研機構果樹茶業研究部門
るDNAマーカーの開発)

2017

10

（８）発表会の主催の状況（シンポジウム・セミナー等を記載する。）
整理番
発表会の名称
号

年月日

開催場所

参加者
数

機関名

1

日本育種学会ワークショップ

2016

9

24

鳥取大学

100

農研機構野菜花き研究部門

2

野菜花き課題別研究会「ウリ科野菜生産を取り巻く現状と今後の課題」(「黄化えそ病・退緑黄化病抵抗性育種研究の現状と展望」（発表者：杉山充啓）および「ウリ科野菜における選抜
マーカー開発の現状と展望」（発表者：川頭洋一）)

2016

10

25

アスト津（三重県津市）

219

農研機構 野菜花
き研究部門

6

備 考

（９）アウトリーチ活動の状況
当事業の研究課題におけるアウトリーチ活動の内容は以下のとおり。
区分； ①一般市民向けのシンポジウム、講演会及び公開講座、サイエンスカフェ等、 ②展示会及びフェアへの出展、大学及び研究所等の一般公開への参画、③その他（子供向け出前授業等）
整理番
参加者
アウトリーチ活動
年月日
開催場所
主な参加者
機関名
区分
号
数

①

「果実研究と未来の食料生産シンポジウム2013」 （主催：国立大学法人筑波大学）、「トマト単為結果性遺伝子pat-2の同定」（講演者：布目 司）

2013

12

2

筑波大学東京キャンパス文京校舎①「果実研究と未来の食料生産シン
ポジウム2013」 （主催：国立大学
法人筑波大学）、「ナス単為結果
性研究の現状と今後の展望」（講演者：宮武宏治）

2013

12

2

筑波大学東京キャンパス文
京校舎

3

①

園芸学会シンポジウム、園芸作物の多様性を生み出す転写因子遺伝子の機能解明とその利用「トマトの単為結果性を制御する転写因子」（講演者：布目司）

2016

9

10

名城大学

4

①

PCR法で植物のDNAの違いを調
べてみよう

2017

7

1

岩手大学

5

①

リンゴのカラムナー樹形を探る 省力樹形化のメカニズムと育種利
用-

2017

11

7

リジェール松山70

6①

農研機構におけるブドウべと病抵
抗性育種

2017

11

25

広島大学

60

1

2

7

10

高校生
公設試験研究機関、大学、国立研
究開発法人、行政・普及組織、生産者
学生、国公立研究所・大学所属研究者

岩手大学

農研機構果樹茶業研究部門

第9回 中国地域育種談話会備考