ISSN 1347－6602

昭和62年６月９日学術刊行物認可

家畜衛生
家畜衛 生 学 雑 誌
The Japanese Journal of Animal Hygiene（附） 日本家畜衛生学会第90回大会

要旨集

日本家畜衛生学会
Vol .45 No.1-2
2019. JUL.

The Japanese Society ofAnimal Hygiene

家

畜

衛

生

学

雑

日本家畜衛生学会

発行

誌

理 事 長：白井淳資
副理事長：宮﨑編集委員長：宮﨑茂

茂

編集委員：末吉益雄・髙井伸二・長井誠

野上貞雄・福士秀人"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""The Japanese Journal of Animal Hygiene
Published by the Japanese Society of Animal Hygiene
President : Junsuke SHIRAI（Tokyo Univ. of Agric. and Technol.）Vice President : Shigeru MIYAZAKI（Res. Inst. for Anim. Sci. in Biochem. and Toxicol.）Editor-in-Chief : Shigeru MIYAZAKI（Res. Inst. for Anim. Sci. in Biochem. and Toxicol.）Editorial Board : Masuo SUEYOSHI（Miyazaki Univ.）
Shinji TAKAI（Kitasato Univ.）
Makoto NAGAI（Ishikawa Pref. Univ.）
Sadao NOGAMI（Nihon Univ.）
Hideto FUKUSHI（Gifu Univ.）
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「家畜衛生学雑誌」第45巻第 1 − 2 号の送付にあたって
会員の皆様におかれましては，ますますご清栄のこととお慶び申し上げます．ここに，「家畜衛生学雑誌」第45巻
第 1 − 2 号を刊行する運びとなりました．
本号では，総説 1 編の他，
「第90回大会講演要旨」を掲載しています．
家畜衛生学雑誌では，原著論文・短報以外にも，総説，数ページ程度のミニレビュー，技術資料等の原稿を受け付
けております．原著論文，総説はもちろんでございますが，ミニレビューや技術資料も含め，会員の皆様の積極的なご投稿をよろしくお願い致します．ご不明な点はご遠慮なく編集委員会事務局へお問い合わせください．

日本家畜衛生学会理事長

白井淳資

家畜衛生学雑誌編集委員長

宮﨑茂（日本家畜衛生学会副理事長）

日本家畜衛生学会・学会費納入のお願い
ご承知のように，学会は会員の皆様からの会費をもって運営されております．学会の運営を円滑に運ぶために，所定の会費を納入していただきますようお願い致します．
＊会費は，正会員5,000円，学生会員2,000円です．
＊2015年度までの未納分をお支払いいただく場合，正会員年会費は4,000円です．
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2017

2018

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家畜衛生学雑誌
第45巻
目

第１−２号

2019

次

〈総説〉
動物由来のパスツレラ科に属する細菌の PCR による同定・検出及び血清型の同定法ならびに RTX 毒素について････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 伊藤博哉 ･･････････････････････････ 1〜38
〈第90回大会一般講演要旨〉
散歩中の犬間の接触率および狂犬病に対する犬飼育者の行動････････････････････････････････････････････ ナイジェル クワン・井上 舞・山田章雄・杉浦勝明 ･････････････････････････ 42〜43
携帯品で持ち込まれた非加熱肉等のウイルス汚染状況調査････････････････････････････････････････････････････････ 小林芳史・柴田明弘・稲垣麻由子・栁澤成江
尾坂優之・遠藤明仁・岩中麻里・大友浩幸 ･････････････････････････ 44〜45
養豚場72戸における2015〜2017年の抗菌剤使用量の記述的調査･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 雷 志皓・山根逸郎・山崎久則
内藤 恵・呉 克昌・杉浦勝明 ･････････････････････････ 46〜47
クレブシエラ乳房炎の重篤度と分離された原因菌の好中球貪食抵抗性の関連････････････････････････････････････････････････････････ インペラトリス瑠伽・楠本周平・石村麻莉乃
澤松祐人・篠塚康典・河合一洋 ･････････････････････････ 48〜49
食性の異なる各種動物からのウェルシュ菌の分離調査･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 清水かな・上塚浩司 ･････････････････････････ 50〜51
競走用馬の感染性とみられる皮膚炎からの細菌・真菌の分離同定と薬剤感受性調査（ 2 ）･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 牛屋重人・上塚浩司 ･････････････････････････ 52〜53〈第90回大会教育講演要旨〉
家畜の下痢症から検出されるウイルスについて････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 長井

誠･･････････････････････････ 55〜56

会員へのおしらせ ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 57
家畜衛生学雑誌投稿規程
日本家畜衛生学会会則････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 59〜60･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 61〜62

家畜衛生学雑誌

The Japanese Journal of Animal HygieneVol. 45  No. 1-2

2019

Contents〈Review〉
Identification, detection and serotyping of Pasteurellaceae species from animals by PCR and their RTX toxins･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ Hiroya Ito ･･････････････････････････････････････････････ 1〜38
〈Abstracts of oral presentations on 90th academic meeting〉･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 39〜53〈Abstracts of the educational lecture on 90th academic meeting〉･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 55〜56
Information for Members ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 57
Instruction for Authors ････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 59〜60
The Regulations of The Japanese Society of Animal Hygiene ･････････････････････････････････････････････････････････････････････ 61〜62

Jpn. J. Anim. Hyg.

総

1

説

動物由来のパスツレラ科に属する細菌の PCR による同定・検出及び血清型の同定法ならびに RTX 毒素について伊藤博

哉 1 ）＊

Identification, detection and serotyping of Pasteurellaceae
species from animals by PCR and their RTX toxins
Hiroya ITO 1）＊（1）National Institute of Animal Health, NARO, 3-1-5 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-0856, Japan）（2019. 3. 31  受付／2019. 6. 19  受理）

Summary
Here, I review the current knowledge on (i) PCR identification and detection of Pasteurellaceae from animals, (ii)serovars of the Pasteurellaceae and (iii) PCR identification of serovar of the Pasteurellaceae as well as (iv) RTX
toxins of the Pasteurellaceae and PCR detection of their genes. I hope that information above will be helpful for
identification, detection and serotyping of Pasteurellaceae from animals as well as for understanding of the RTX
toxins.  
Key words：Pasteurellaceae, diagnosis, serovars, RTX toxins, PCR
  家畜衛生学雑誌

1 ．はじめに家畜・家禽に病原性を示す family Pasteurellaceae（パスツレラ科）に属する細菌は多いが，表現型のみでは同定が容易ではない菌種が多数存在する．本稿では，家45， 1 〜38（2019）

異性にも関連する．さらに，RTX 毒素遺伝子の検出は，菌種同定の参考になる菌種も存在するため紹介する．

2 ．PCR による同定及び検出について
2.1．はじめに畜・家禽に病原性を示す病原性パスツレラ科細菌の（i）

パスツレラ科には，2019年 1 月現在17の属，74の菌種

PCR による菌種の同定及び検出，（ii）パスツレラ科細が認められている137）．これらの菌種は，家畜・家禽の菌の血清型，（iii）PCR による血清型の同定，（iv）病原

扁桃等に存在する常在菌が多いが，病原性を示す菌種も性因子である RTX 毒素（パスツレラ科細菌のいくつか

多数存在する，またパスツレラ科細菌には，生物学的・の菌種が産生する毒素）と PCR による RTX 遺伝子の検

生化学性状等の表現型の性状のみでは同定・識別しにく

出法について概説する．RTX 毒素はパスツレラ科細菌

い菌種が多い．そのため既存の菌種とは異なるが，菌種のいくつかの菌種が分泌する病原性因子であり，宿主特名の命名までには至らず，未整理のままの taxon（分類群）も多い，しかし，近年，遺伝子の性状を利用するこ 立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
国動物衛生研究部門〒305−0856 茨城県つくば市観音台 3 − 1 − 5＊
連絡著者：伊藤博哉（itohiroy@affrc.go.jp）1）とによって，未整理であったパスツレラ科に属する
taxon が次々と新菌種として提唱されている，細菌の分類・同定のためのgold standardは，DNA-DNA
ハイブリダイゼーション法（DNA-DNA hybridization

家畜衛生学雑誌

2

第45巻第 1 − 2 号（2019）（DDH））である．しかし，DDH は操作が煩雑であり，の種類や，PCR 反応の条件が菌種によって違うだけでさらに基準となる株を全て揃えなければならず，どこであり，使用する機械や酵素は同一で良いので，あらゆるでも実施できる方法ではない．そのため，現在では各菌病原体に対応可能である．さらに操作方法も基本的には種でその塩基配列が保存されている16S rRNA 遺伝子

同一である．

（16S rrn）の配列を決定して，菌種同定の際の参考にし

2.2.2．PCR による同定・検出法の問題点と注意点ている検査室や研究室も多いと思われる． 異なる菌種

生化学的性状等の表現型の検査等と併せて，総合的にと判断して構わないと考えられる16S rrn の塩基配列の診断する必要がある．さらに，陽性対照株を準備してお

相同性は，当初（かつて）は97％と言われていた（注：

くことが重要である．また一番重要な点であるが，誤診

細菌分類学の世界では，厳密に言うと，97％以上の相同につながる非特異反応の増幅が認められることもあり，性を示しただけでは，その菌種であると同定はできな

その際には見極める能力が必要である．非特異的な増幅

い．すなわち，その菌種である可能性が高いため，引きかどうか確認するためには，サザンハイブリダイゼー

続き，上述の DDH を実施して，その菌種であるか，まションや，増幅された PCR 産物の塩基配列の決定等をたは新種であるかを確定する必要があると言われてい行えば良い．使用している酵素の違い及び PCR 装置の

154）．しかしながら，病性鑑定の現場では，同定目的

機種の違いによって，DNA 伸張（複製）の能力や，温でそこまでする検査室はほとんどに無いと思われる．
）．

度上昇の度合いに差があるため，文献どおりに PCR をしかしその後，異なる菌種であっても相同性の高い近縁実施してもうまくいかないことがある．その時は，使用な菌種が多数存在し，閾値を98.7〜99.0％程度にすべきしている酵素や機種に適応した反応時間や温度等の調節るとされている

154，160）．しかし，この数値は菌種によってが必要な場合がある．

は例外もあり，たとえば牛の慢性肉芽腫性炎を主徴とす

3 ．PCR による血清型の同定法についてる 牛 ア ク チ ノ バ チ ル ス 症（ 木 舌 症 ） の 原 因 菌
Actinobacillus lignieresii の基準株の16S rrn の塩基配列

3.1．はじめにを用いて BLAST 相同性検索すると，豚胸膜肺炎の原因

細菌は表層に存在する構造物の抗原性の違いに基づ

菌 Actinobacillus pleuropneumoniae の基準株の16S rrn

き，複数の血清型に型別される．細菌種によっては，ワク

配列と99％以上の相同性を示す．さらに豚のアクチノバチンの有効性が血清型特異的であること120，151，157，165，166）

チルス・スイス感染症の原因菌 Actinobacillus suis の基及び血清型によって病原性が異なることがある等の理準株の16S rrn の塩基配列を用いて BLAST 相同性検索

由75） や，疫学解析の目的で，臨床材料から分離された

すると，子馬病の原因菌 Actinobacillus equuli の基準株

細菌の血清型別は，古くから行われてきている．血清型の16S rrn 配列と約98.7％の相同性を示す．このように別を行うためには，通常，細菌をホルマリン等で不活化

16S rrn の配列のみでは，種を同定することが困難な菌したのち，ウサギ等の動物に接種して作製した高力価種も存在するが，16S rrn 解析は，両菌種を識別可能なで，かつ特異性の高い免疫血清（抗血清）を使用する必生物学的性状，生化学性状及び他の遺伝学的性状の検査要がある．しかし，動物由来の重要な細菌の多くについを加えて総合的に判断する際の有用な情報となる．

ては，血清型別用の抗血清は市販されておらず，自家製

Christensen らの総説では，一部の例外（A. equuli．後の血清型別用抗血清を作製するか，各菌種のリファレンに説明）を除いて，Actinobacillus 属では，分離宿主をスラボラトリーに依頼して血清型別を実施する必要があ

同定のための参考性状としてもよいと記載されている

る．

31）

．

本稿では，重要と考えられる動物由来の主要なパスツ

このように16S rrn の塩基配列は，菌種同定に大いに

レラ科細菌の血清型及び抗血清を用いずに PCR で血清役立つ方法であるが，塩基配列の決定は一部の検査機関

型を同定する方法について，文献を紹介して概説を行

しか実施できないまたは実施していないのが実態である

う．

と考えられる．本稿では，現在ではおそらくほとんどの検査室で実施可能と思われる PCR による遺伝学的菌種

3.2．PCR による血清型の同定法の利点と限界同定法や臨床材料からの検出法を紹介する．

3.2.1．PCR による血清型の同定法の利点
抗血清を用いた血清型別を実施するには，実験動物を

2.2．PCR による同定・検出法の利点と限界

用いて抗血清を作製する必要があるが，PCR 法の場合

2.2.1．PCR による同定・検出法の利点はその必要がない．また抗血清を用いた血清型別を行う

操作が定型的で簡便である．また，用いるプライマー

ためには，全ての血清型に対する抗血清を用意する必要伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素があるため，全ての各血清型の参考株を入手しなければならないが，PCR 法の場合，PCR プライマーや PCR 酵
素等の試薬等は簡単に購入でき，PCR の装置があれば型別が可能である．PCR 装置の価格はやや高額である

3

4 ．動物由来のパスツレラ科に属する細菌のRTX 毒素について
4.1．はじめにが，現在では多くの検査室が保有していると思われる．

RTX 毒素は，菌体外に分泌される外毒素であり，赤また一般的に抗血清を用いた血清型法では，異なる血清

血球，好中球等の白血球，マクロファージ等の細胞膜に型間での交差反応が認められる例が多いが，PCR では穴を開ける孔形成毒素（pore forming toxin）である，

その問題を克服できる例が多い．

ほとんどの RTX 毒素は溶血活性をもっているため，赤3.2.2．PCR による血清型の同定法の問題点及び注意点

血球の溶解が各疾病の出血性病変の一因と考えられてお変異によって，血清型に関係する抗原が発現されなくり，さらに RTX 毒素は上記の生体防御に関連する細胞なった場合には，表現型 phenotype（抗血清を用いた検に対して細胞障害性を示すため，宿主の免疫機能から回査による血清型）と遺伝子型 genotype（PCR による血避できると考えられ，RTX 毒素は病原細菌の重要な病清型）が一致しなくなることがあり，我々もその例に遭

原性因子の一つと考えられている．RTX 毒素はタンパ

73）

遇したことがある ．さらにその事例では， 2 種の異なク質毒素で，その大きさは，100-200 kDa である．RTX

る PCR 法で検査すると，異なる結果が得られた（片方毒素の C 末端部分にはグリシンが多く含まれるカルシウ

は 血 清 型15， も う 一 方 は 型 別 不 能 と 同 定 さ れ た

ムイオン結合性のモチーフが10〜40個繰り返し並んでいA. pleuropneumoniae）73）．その原因は，遺伝子の変異

る特徴的な構造（グリシンが豊富な繰り返し領域）を有による欠失であり， 2 種類の PCR のうち片方の PCR はしていることから RTX（repeats in toxins）毒素と呼ば欠失した遺伝子領域に結合するプライマーを設定していれており，様々な菌種が RTX 毒素を産生する（図 1 −たが74），もう一方の PCR は，欠失していない他の DNA

3 ）44，46）．

領域に結合するプライマーを設計していたためであった

168）．結局その株は，元々血清型15であったが，血清型に関与する遺伝子の一部を欠失したために，抗血清を本項では，動物由来のパスツレラ科に属する RTX 毒素について概説するとともに，それらの RTX 毒素のPCR 法による検出法について，紹介する．

用いた血清型別では型別不能となる株であった73）．
4.2．RTX 毒素の概説
RTX 毒素の構造タンパク質は， 4 つの遺伝子からなるオペロン（rtxCABD）によって，まず細胞質内で産生・活性化され，そして菌体外に分泌される．それぞれ

図 1 ．A. pleuropneumoniae の ApxI，ApxII 及び ApxIII 毒素遺伝子オペロンのフィジカルマップ21，42，69，72，130，140）．
実線の長方形，機能している遺伝子．破線の長方形，一部を欠損しているために機能していない遺伝子．長方
形の横の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．

4

家畜衛生学雑誌

第45巻第 1 − 2 号（2019）

図 2 ．A. pleuropneumoniae 以 外 の 細 菌 の Apx 毒 素 遺 伝 子 オ ペ ロ ン の フ ィ ジ カ ル マ ッ プ．var. suis，var.
porcitonsillarum，var. rossii，var. lignieresii 及 び var. Glaessereella は， そ れ ぞ れ，A. suis，A.
porcitonsillarum，A. rossii 及び A. lignieresii 及び Glaesserella sp. における apx のバリアントである．白い長方形からなるオペロン，Apx 毒素が発現しているオペロン . 黒色の長方形からなるオペロン，Apx 毒素の発現が認められないオペロン．A. porcitonsillarum の aspC（縦線の入った長方形）の毒素との関係は不明である．
長方形の横の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．

図 3 ．Actinobacillus 属細菌以外（Glaesserella sp. を除く）の RTX 毒素遺伝子オペロン．縦線の入った長方形，他の典型的な RTX 毒素よりも遺伝子が長く，5’- 末端領域部分は他の RTX 毒素遺伝子の塩基配列との相同性がない
rtxA．黒色の長方形，他の典型的な RTX 毒素遺伝子オペロンには認められない遺伝子．

の遺伝子は，rtxC，rtxA，rtxB，rtxD の順番にタンデム

RtxB 及び RtxD）によって，菌体外に分泌される．本稿に 並 ん で い る．rtxA は，RTX 毒 素 の 構 造 タ ン パ ク 質では，動物由来のパスツレラ科細菌の RTX 毒素（図 1（RtxA）をコードし，さらに rtxC にコードされた RtxC

〜 3 ）について概説する．

のアシル化作用によって，RtxA は細胞質内で活性化さパスツレラ科細菌に属する菌種の病原性は，宿種特異れる．活性化された RtxA は，さらにタイプ I 分泌シス性を示すものが多いが，RTX 毒素の各動物の細胞に対テム（type I secretion system（TISS））（rtxB 及び rtxDする毒性が，宿種特異的であることがその一因であるとにコードされた細胞内膜に存在する分泌タンパク質

考えられている46，90，170）．例えば，Kuhnert ら90） は豚に伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

5高い宿種特異性を示す A. suis の RTX 毒素（ApxI 及び特異的であるため，毒素遺伝子プロファイルで，おおよApxII 毒素）
（図 2 ）は，馬のリンパ球よりも豚のリン

その血清型（群）を推定できる43，45，52，69）（図 1 ）（ “5.1.4．

パ球により高い毒性を示し，逆に馬に高い宿種特異性を

A. pleuropneumoniae” の項参照）また，それぞれの菌

示 す Actinobacillus equuli subspecies haemolyticus の種に特有な RTX 毒素も存在する（図 1 − 3 ）ことから，

RTX 毒素（Aqx 毒素）（図 3 ）は，豚のリンパ球よりもRTX 毒素遺伝子の検出を実施することによって，菌種

馬のリンパ球により高い毒性を示すことを明らかにしてまたは亜種の同定の参考にすることができる．

いる．

5 ．豚から分離されるパスツレラ科に属する
病原細菌

4.3．P CR による動物由来のパスツレラ科細菌に属する細菌の RTX 毒素遺伝子の検出法について

5.1．Actinobacillus pleuropneumoniae

RTX 毒素タンパク質の発現，産生及び分泌を確認す

A. pleuropneumoniae は 豚 胸 膜 肺 炎 の 起 因 菌 で あるには，RTX 毒素に特異的な抗体を用いたウエスタンブ

る66，67，69，141）．

ロッティング等のタンパク質解析や，細胞を用いた細胞5.1.1．A . pleuropneumoniae の PCR による同定・検出法について（表 1 ）障害性試験が必要である．さらに，PCR を用いて RTX
毒素遺伝子の存在を確認する方法が各種細菌で開発されSirois らは，A. pleuropneumoniae の同定・検出用のPCR を本菌で初めて開発している150）（表 1 ）．しかし，ている．
A. pleuropneumoniae には 4 種の RTX 毒素及びその遺A. pleuropneumoniae と非常に近縁な A. lignieresii でも伝子が存在するが，その組み合わせはほぼ血清型（群）陽 性 と な り， 必 ず し も 種 特 異 的 で は な い． し か し，

表 1 ．A. pleuropneumoniae の種同定用または検出用 PCR
文献

異なる菌種での増幅 a, b

未同定の DNA

150

A. lignieresii 陽性 b

未同定の DMA（文献150と同じプライマー使用）

51

A. lignieresii 陽性 b99

A. lignieresii 陽性 a

omlA

50

A. lignieresii 陽性 b

omlA

29

A. lignieresii 陽性 b

aroA

58

A. equuli 陽性 b

tbpA/tbpB ＋ RFLP

35

RFLP を併用すれば，なし b

omlA

143

なし b

omlA（5’-nuclease assay）

7

なし b

apxIV

144

なし b

dsbE

30

A. lignieresii 及び A. porcitonsillarum 陽性 b

標的遺伝子等

同時に型別可能な血清型

cpx

5

omlA

2, 5, 676

A. lignieresii 陽性（n ＝50）a

cpxD

1, 2, 8148なし（ただし，A. lignieresii や A. genomospecies 1の検査なし）a

apxIV

3

180

A. genomospecies 1で陽性（n ＝2/3）aapxIV

3, 6, 8181

A. genomospecies 1で陽性（n ＝2/3）aomlA

1, 7, 12

Metalloprotease 遺伝子

4A. genomospecies 1で陽性（n ＝4/6）

149

なし b

18

Pig onlya, c

apxIV

61

なし b

apxIV（RT-PCR）

161

なし b

168

Actinobacillus の 3 菌種で非特異バンド a, d．

138

A. lignieresii 陽性 bapxIV1-3, 5-8, 10, 12

omlA

1, 5, 7, 12, 15

BOX-SCAR-PCR
omlA

1, 2, 5, 7, 15

74

apxIV

16

20

Pig onlya, capxIV

1-8, 10, 12, 15

19

Pig onlya, c

13, 14, 16-18

19

Pig onlya, c

apxIV
a, b

a

b

オリジナルの論文 または総説47 から転用．
Pig only, 豚由来の菌種全て陰性，豚以外の動物から分離された菌種の検査なし．
d
ウサギ由来の Actiobacillus capsulatus（ 1 株）と豚由来の A. indolicus（ 1 株）及び A. suis（ 1 株）で非特異増幅．
ｃ

家畜衛生学雑誌

6

第45巻第 1 − 2 号（2019）

Actinobacillus 属に分類される菌種の種特異性は極めて感染抗体を特異的に検出する ApxIV ELISA の抗原にも高く（後述する A. equuli を除く）
，分離された宿主は使用されているため，apxIV を A. pleuropneumonie 種特同定のために参考となる重要な性状と考えられているた

異的 PCR の標的遺伝子にすることは理にかなっているめ31），現時点では実用的には大きな問題とはならないとと 考 え ら れ る．apxIV PCR は，omlA PCR 同 様 に，A.

考えられている．以降も A. pleuropneumoniae 特異的と

pleuropneumoniae と 近 縁 な A. lignieresii 及 び A.

謳った様々な PCR 法（表 1 ）が開発されているが，A.

genomospecies 1で も 陽 性 と な る（ 表 1 ）． し か し，lignieresii でも陽性となる例が多い．

Angen らは，omlA PCR と apxIV PCR の他菌種との特さ ら に い く つ か の 遺 伝 子 が A. pleuropneumoniae のPCR による同定または検出のための標的遺伝子に適し異性を比較した結果，omlA PCR の方が高い特異性を示すことを報告している 3 ）．

ていると報告されている（表 1 ）．それらは，（i）omlA

Xiao らは，omlA 及び apxIV の 2 つの遺伝子を標的と（outer membrane lipoprotein gene（外膜リポタンパク

した PCR 法を開発している177）．本法は，高感度で特異

50）

質遺伝子）
） ，
（ii）apxIV（A. pleuropneumoniae toxin

性が高く，同定だけで無く，材料からの直接検出に効果

IV gene（A. pleuropneumoniae 毒素 IV 遺伝子）144），（iii）

的方法としている

dsbE（a thiol：disulfide interchange protein gene（ チdsbE を 標 的 に し た PCR が 開 発 さ れ た が， 近 縁 な

オール：ジスルフィド交換タンパク遺伝子）30）及び（iv）

A. lignieresii でも陽性となる30）．Actinobacillus 属に分cpxD（capsular polysaccharide export gene（莢膜輸送

類される細菌は宿主特異性が高く，A. lignieresii は豚かタンパク質 D 遺伝子）99 ）等である（表 1 ）．

ら分離されたことはないため，大きな支障にはならない

著者は，A. pleuropneumoniae 用の omlA を標的としと考えられるが，しかし，豚から分離されるActinobacillus

た PCR を菌種同定の参考にすることが多い52，74）．Gram

porcitonsillarum でも陽性となることが明らかになって

50）

らは，omlA を標的とした PCR を開発し ，Savoye らいる41）．

は，さらなる特異性の上昇及び解析時間の短縮のため

cpx PCR は，血清型 1 〜12のうち，血清型 4 では増幅に，プライマーと PCR の条件に若干の変更を加え，新が認められないので，全ての血清型を同定できるわけで． そして，さらに PCR

は な い99）． ま た A. lignieresii や 豚 か ら 分 離 さ れ るの阻害による偽陰性反応を除去するために，internal

Actinobacillus minor，Actinobacillus indolicus 及びpositive control を ア ッ セ イ 系 に 加 え た． そ れ 故，A.

A. suis でも陽性となった報告がある 3 ）．

たな omlA PCR 法を開発した

143）

pleuropneumoniae に特異的で，他の細菌が高度に汚染

aroA（3- ホスホシキミ酸 -1- カルボキシビニルトラン

されたサンプルであっても A. pleuropneumoniae を検出

スフェラーゼ）を標的とした aroA PCR も開発されてい可能としている．また論文には種特異的 PCR であるとるが，本 PCR では豚から分離される A. equuli や A. suis

いう記載は無いが，Osaki らは，omlA PCR-restrictionでも陽性となる41，58）．

fragment length polymorphisms（PCR-RFLP） に 用 い

このように A. pleuropneumoniae の種特異的 PCR が複る PCR も種特異的であることを日本で分離された野外数開発されているため，それぞれの方法を比較・評価し株で確認している125）．詳細は公表されていないが，海た報告がある 3 ）．上記の 4 つの遺伝子を標的にした PCR

外では omlA を標的とした PCR 診断キットも市販されて（omlA PCR，apxIV PCR，dsbE PCR 及び cpx PCR）のいる29）．omlA PCR は，他の PCR 法と同様に，残念なが特異性を比較した結果，omlA を標的とした omlA PCR

ら A. lignieresii 及び Actinobacillus genomospecies 1等，の特異性が最も高かった 3 ）．反芻獣由来 A. lignieresii 45

近縁な菌種でも陽性となる株があると報告されている

株，馬由来 A. lignieresii（A. genomospecies 1） 6 株，

（表 1 ）． し か し 繰 り 返 し に な る が，Actinobacillus 属

豚由来の A. indolicus 8株，A. minor 13株，A. porcinusの 菌 種 は 一 部 の 例 外 を 除 い て 宿 主 特 異 性 が 高 く，

8株，A. suis 30株を用いてそれぞれの PCR の特異性を

A. lignieresii は反芻獣，A. genomospecies 1は馬を宿主

調 べ る と，omlA PCR は 馬 由 来 の A. lignieresii（A.

とするため，大きな問題はないと考えられている．

genomospecies 1） 4 株で PCR 増幅が認められた（特異apxIV は，全ての A. pleuropneumoniae が保有と言わ性96.4％）．一方，dsbE，apxIV 及び cpxD を標的とするれている遺伝子である．この apxIV を標的とした PCRPCR の場合，反芻獣及び馬由来の A. lignieresii の全て

は，A. pleuropneumoniae の同定及び検出が可能とされまたは92％で陽性を示すほか，非病原性と考えられてい144）．Schaller の開発した apxIV PCR は，感度を上るが，豚の上部呼吸器官から分離される NAD 要求性のげ る た め に，nested PCR を 採 用 し て い る．apxIV がA. indolicus，A. minor，A. porcinus では，少数である

コードする ApxIV タンパク質は，A. pleuropneumoniae

が PCR 陽性となった．cpxD PCR では，A. suis 全てのている伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

7株（30株），反芻獣及び馬由来の A. lignieresii のほとん

2015年に提唱された血清型16は，ユニークな莢膜（K16

ども（46/51株）陽性を示すほか，豚由来の A. minor抗原）合成遺伝子構造を保有しているが20）（図 4 （D）），（2/13株）及び A. indolicus（1/8株）でも陽性を示した．

血清型16の O 抗原合成遺伝子に関する情報はない．

さ ら に Fittipaldi ら は，（i）arbitrary PCR 150），（ii）
omlA PCR

143）

試験108，133）及び共凝集試験110−112）等が分離株の簡易・迅（v）apxIVA nested PCR，（vi）cps-cpx multiplex

速な方法として広く用いられている．血清型別には，高，（iv）aroA PCR

58）

抗血清を用いた古典的な血清型別では，スライド凝集，，（iii）dsbE PCR

30）

144）

99）

52）

及び（viii）海外

力価で特異性の高い血清型別用抗血清が必要であるが，で市販されている multiplex PCR キット（Adiavet App

市販されていない．そのため通常は ホルマリン不活化

PCR test； Adiagène）の 8 種の A. pleuropenumoniae 用

した各血清型参考株の全菌体をウサギに免疫して作製しPCR について，扁桃のバイオプシーサンプルを用いた

た自家製の抗血清が用いられている．しかし，この方法

PCR，（vii）omlA multiplex PCR

41）

比較試験を行った ．その結果，omlA PCR の感度がで作製した抗血清中には，血清型特異抗原に対する抗体

93％と最も高く，次いで83％の Adiavet App PCR と続だけでなく，共通抗原を含む様々な菌体抗原に対するポくと報告している143）．

リクローナルな抗体を含有すると考えられる．そのた

A. pleuropneumoniae の PCR による同定または検出法について，上記に説明した方法以外のものも含めて，表1 にまとめたので，参照されたい．

め，異なる血清型間で交差反応がしばしば認められ，血清型別不能となることがある107，113）．
交差反応が認められた場合には，間接赤血球凝集反応5.1.2．A. pleuropneumoniae の血清型について

法（indirect hemagglutination assay（IHA））109） や 免

A. pleuropneumoniae は，莢膜の抗原性の違いに基づ

疫沈降試験111）による確定診断を実施することが推奨さ

き型別される．2002年までは15の血清型の存在が知られれている．なお莢膜合成遺伝子の欠失変異によって，ゲ15）ていた ．しかし，2015年には血清型16140），2018年には血清型17（かつては型別不能株と処理されていた）21）
及び血清型18（かつては血清型 K2：O7とミスタイピン
21，86，121）

ル内沈降反応（gel immunodiffusion（GID））では型別
できずに型別不能株となる株73）も存在する．
型別用抗血清の入手が難しいこと，凝集反応等の迅速があらたに提唱され，現在まで

法での交差反応性や，確定診断の IHA や GID では迅速に18の（莢膜）血清型の存在が報告されている21）．しか性に少し難があること等から，PCR による血清型の同し，野外株の血清型別を実施すると，しばしば異なる血定法の開発が多数試みられてきている．

清型間での交差反応が認められる．この理由の大きな原

5.1.3．A . pleuropneumoniae の PCR による血清型の同グされていた）因はリポ多糖（lipopolysaccharide（LPS））によるもの定法について（表 2 ）と考えられている．すなわち，血清型1-9-11，血清型3-6-

筆者の2016年に刊行された家畜衛生学雑誌の総説69）

8-15，血清型4-7-13の LPS の O 多糖抗原の化学構造及びでは血清型 1 〜15までの莢膜抗原遺伝子の遺伝子構造の抗原構造は同一であるか，あるいは類似しているため，

図を示したが，あらたに 3 つの血清型が増えた．血清型

これらの血清型間ではしばしば交差反応が認められるとの同定用 PCR の開発には，血清型特異的遺伝子または考えられている13，39，66，67，69，129）．このように，莢膜だけ特異的な塩基配列をもった DNA 領域の同定が必要であ

でなく，LPS の O 抗原も血清型別に影響を与えるため，

る．血清型 1 〜18までの莢膜合成遺伝子の塩基配列が莢膜抗原（K 抗原）及び LPS の O 抗原の抗原性に基づい決定されているので，それらの遺伝子構造を図 4 に示し

た K：O 血清型別が提唱されている．血清型 1 〜15までた19−21，69，178）．A. pleuropneumoniae の莢膜抗原にはこ

13，39，66，67，69，129）の K：O 血清型については，既報を参照

れまで 3 種の莢膜タイプがあったが，血清型16はタイプされたい． 2018年に新しく提唱された血清型17は，ユ

I 〜 III と共通する遺伝子がなく，全く新しい莢膜タイプ

ニークな莢膜（K17抗原）合成遺伝子構造を保有してい（タイプ IV）であった19，20）（図 4 （D））．一方，血清型1719）

るが （図 4 （A）），血清型 3 ， 6 ， 8 ，15と同じ O 抗原

は，血清型 2 ， 3 ， 6 ， 7 ， 8 ， 9 ，11及び13が属する合成遺伝子構造を保有するため K17：O3と言える．一タ イ プ I（ タ イ コ 酸 グ リ セ ロ ー ル 転 移 酵 素 遺 伝 子

方，血清型18（かつては K2：O7とミスタイピングされcps17 A，グリセロール -3- リン酸シチジル転移酵素遺伝ていた）は，ユニークな莢膜（K18抗原）合成遺伝子構

子 cps17 B，機能不明な遺伝子 cps17 C 及びタイコ酸合成

造を保有しているが19）（図 4 （B）），血清型 7 と同じ O 抗酵素遺伝子 cps17 D が存在する）19）（図 4 （A）），血清型

原合成遺伝子構造を保有するため，K18：O7と言える．

18は，血清型 1 ，4 ，12，14及び15が属するタイプ II（莢K2とされた理由は不明であるが，おそらく O7抗原を発膜のリニアバックボーンを構築するリン酸結合に関与す

現することがミスタイピングの理由であると思われる．

る莢膜多糖リン酸転移酵素 cps18 A が存在する）に属し

家畜衛生学雑誌

8

第45巻第 1 − 2 号（2019）

（ Ａ）

（ Ｂ）

（ Ｃ）

（ Ｄ）
図 4 ．A. pleuropneumoniae の莢膜合成遺伝子の遺伝子構造．
（A），Type I；（B），Type II；（C），Type III；（D），
Type IV19，69，178）．両側に矢尻がある小さな矢印は，血清型特異的 PCR のプライマーで増幅されるおおよその位置（遺伝子）をあらわす．その上の数字は，文献番号をあらわす．全ての血清型の莢膜合成遺伝子の上流には，cpxDCBA（莢膜輸送遺伝子）（cps と逆方向．血清型15のみ cps の下流に順方向），さらにその上流にはmodF（莢膜合成に無関与）（cps の順方向）が存在する．一方，Type I，III 及び IV の下流には，552-555 bpのオープンリーディングフレーム（orf）（cps の順方向），さらにその下流には ydeN（cps の逆方向）が存在す
る．Type II の下流には，順方向に partial lysA 及び114bp orf が存在し，さらにその下流には他の Type と同様に，ydeN（cps の逆方向）が存在する．modF，552-555bp orf，partial lysA，114bp orf 及び ydeN は，莢膜の合成には関与しないと考えられている．実線のボックス内の遺伝子，各 Type のコア遺伝子（Type I，
cpsABC；Type II，cpsA；Type III，kdsAB-kpsF；Type IV，不明）．破線のボックス内の遺伝子，各血清型間で有意な相同性を示す cps 遺伝子．矢印の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

9

表 2 ．A. pleuropneumoniae の血清型同定用に開発された PCR 法（菌種同定または検出と血清型同定を同時に行える
PCR を含む）の一覧 aab

菌種同定または
検 出 用 PCR の標的遺伝子 a文献

cps
（cps5 A ＋ cps5 B）

cpx

99

2, 5, 6cps
（cps2 D, cps5 A ＋ cps5 B, cps6 D ＋ cps6 E）

omlA

76

2

cps
（cps2 B ＋ cps2 D）

1, 2, 8cps
（cps1 A ＋ cps1 B, cps2 B ＋ cps2 D）

cpx

148

3

cps
（cps3 A）

apxIV

180

3, 6, 8cps & cpx
（cpxD ＋ cps2 A, cps6 D ＋ cps6 E, cps8 A ＋ cps8 B）

apxIV

181

1, 7, 12cps
（cps1 B ＋ IRb between cps1 B/cps1 C, cps7 C ＋ cps7 D, cps12 B）

omlA

4

1, 2, 5cps
（cps1 B ＋ IR between cps1 B/cps1 C, cps2 D, cps5 A ＋ cps5 B）

血清型の同定が可能な血清型

血清型同定用 PCR の標的遺伝子

5

他菌種での増幅63

A. lignieresii 46株中 1 株：
血清型 1 用プライマーで DNA 増幅
A. lignieresii 46株中 5 株：
血清型 7 用プライマーで DNA 増幅

65

cps & hypothetical protein（cps1 B, hypothetical protein downstream of cps2 D, cps9 D’,
1-3, 5-8, 10, 12
cps5 B, cps6 D ＋ cps6 E, cps 2 D, cps8 A ＋ cps8 B, cps10 A,
cps1 A）

apxIV

18

cps & cpx
1, 5, 7, 12, 15, （cps1 B ＋ IR between cps1 B/cps1 C, cps5 A ＋ cps5 B, cps7 C ＋
cps7 D, cps1 2 B, cpxD ＋ cpx15 C）

omlA

168

2, 1/9/11

cps（cps2 D）
lps
（ORF17 （rhamnosyl transferase gene））

1, 2, 5, 7, 15

cps（cps1 B ＋ IR between cps1 B/cps1 C,
cps2 D, cps5 A ＋ cps5 B, cps7 C ＋ cps7 D, cps15 C）

omlA

74

16

cps
（cps16 C ＋ cps16 D）

apxIV

20

1-8, 9/11, 10,
12, 15cps（cps1 B, cps2 E, cps3 F, cps4 B, cps5 B, cps6 F, cps7 E, cps8 F ＋
cps8 G, cps9 E ＋ cps9 F, cps10 A, cps1 2 A, cpxD ＋ cps15 C）

apxIV

19

13, 14, 16-18

cps（cps13 E, cps14 G ＋ ydeN, cps16 C ＋ cps16 D, cps17 F, cps18 B

apxIV

19

105

菌種同定または検出と血清型同定を同時に行える multiplex PCR における種同定用 PCR プライマーの標的遺伝子．
IR（intergenic region）， 2 つの遺伝子間の非翻訳 DNA．

ていた19）（図 4 （B））．

ための PCR 型別法が開発されてきた，筆者も日本での

莢膜多糖遺伝子を標的にした PCR 以外にも種々の型

分離率が高い血清型 1 ， 2 ，5 65）や，その後，豪州で最別法がいくつか報告されており43，45，52，57），過去の総説も良く分離が認められている血清型15の分離例が，我がでもそれらの一部を紹介した69）．しかし，各血清型の抗原国でも増加してきたことから，血清型 1 ， 2 ， 5 ， 7 ，性は莢膜多糖によって決定されるため，本稿では莢膜多15の同定用 multiplex PCR を開発した74）．さらに，型別糖を合成する遺伝子を標的にした血清型の同定用 PCR

可能な血清型の数は増え，血清型 1 〜 3 ， 5 〜 8 ，10及に絞り，それらを中心に表 2 にまとめた．流行しているび12（ 9 種の血清型）同定用の multiplex PCR が開発さ血清型は，国及び地域に特徴的であるため， 1 種類またれた18）．さらにその後，血清型 9 と11とを識別できないは数種類のその国・地域に関心の高い血清型を型別するが， 血 清 型1-8，9/11，10，12，15及 び 血 清 型13，14，

家畜衛生学雑誌

10

第45巻第 1 − 2 号（2019）16-18を型別可能な PCR が，開発されている19）．なお，素，ApxII 毒素及び ApxIII 毒素の構造遺伝子である．

血清型 7 と13の莢膜合成遺伝子の塩基配列は，ほぼ同一

apxIC，apxIIC 及 び apxIIIC は， そ れ ぞ れ ApxI 毒 素，であるというドラフトゲノム塩基配列解析の報告があApxII 毒素及び ApxIII 毒素を活性化（アシル化）するり178），莢膜合成遺伝子を標的にした PCR による血清型

タ ン パ ク を コ ー ド す る 遺 伝 子 で あ る．apxIBD 及 び

7 と13の識別は困難であると考えられていた．しかし，

apxIIIBD は，それぞれ ApxI 毒素及び ApxIII 毒素を菌

Bosse19）らは，既報の血清型13の莢膜合成遺伝子の配列

体外に分泌する機能を持った内膜タンパク質をコードす

19）に誤りがあることを明らかにした ．さらに，血清型 7る遺伝子である．ApxII 毒素遺伝子オペロンは，ApxIIと13の莢膜合成遺伝子の配列の違いを利用して，両血清毒素の菌体外への分泌に必要な apxIIBD を欠く．しか型を識別できると報告している．すなわち，血清型 7 とし，ApxI 毒素遺伝子オペロンの apxIBD の産物（ApxIB

13のそれぞれのタイコ酸合成遺伝子 cps13 D と cps7 D の及び ApxID）を利用して，ApxIIA 毒素が分泌される

ア ミ ノ 酸 レ ベ ル で の 相 同 性 は43％ で あ り，cps13 E に（図 1 ）．分泌する Apx 毒素のパターンは各血清型で概至っては，異菌種の Gram 陽性菌の hypothetical protein

ね保存されており，Apx 毒素の発現及びその Apx 毒素と相同性（＜35％）を示すユニークなタンパク質をコー

遺伝子の保有パターンで，血清型を推定できる42，43，52）．

ドしている．そのため，cps13 E を標的とした PCR 法がしかし，典型的な株とは apx の保有パターンが異なる非開発された（図 4 （A））

典型的な株の存在も報告されている70，72，141，158）．血清型

なお Zhou ら181）の血清型 3 用及び血清型 6 用の両方の

3 は非溶血性で，病原性がないか弱いと考えられている

PCR プライマーで増幅が認められる新しい非典型的なが，apxIBD を欠く（図 1 ）ために，ApxII 毒素は分泌遺伝子型の血清型 6 野外株が日本で見つかり71，152），そできず，ApxIII 毒素のみ分泌することがその一因であの後欧州18） や，米国49） でも同様に，非典型的な遺伝子ると考えられている42）．

型の血清型 6 が見つかっている． Bosse らはその後，そApxIII 毒素の白血球溶解性に豚のβインテグリンのれらの非典型的な血清型 6 にも対応できる新しい改良型

CD18が 関 係 す る こ と が わ か っ て お り， そ の た め にの PCR 法を開発している18）．

ApxIII 毒素の細胞毒性は豚に宿主特異性を示すことがA. pleuropneumoniae の PCR による血清型の同定法について表 2 にまとめたので，参照されたい．

わかっている170）．
A. pleuropneumoniae の ApxIV 毒素は ApxI 〜 ApxIII

5.1.4．A. pleuropneumoniae の RTX 毒素と PCR による
RTX 毒素遺伝子の検出法について毒素とは違い，apxICABD 等の RTX 遺伝子で認められる 4 つの遺伝子からなる典型的な遺伝子構造（図 1 ）を

A. pleuropneumoniae は，赤血球，白血球や，マクロ持たない145）．ApxIV 毒素の推定アミノ酸配列は，ヒト

ファージの細胞膜に穴を開け溶解する Apx 毒素を分泌すの髄膜炎菌 Neisseria meningitidis の FrpA 及び FrpC タ

る．その機能によって，A. pleuropneumoniaeは血液寒天

ンパク質のアミノ酸配列と有意な相同性を有する145）．

平板上で溶血性を示し，上記の免疫に重要な細胞に障害

apxIV の上流には ORF1が存在する．ORF1は apxIV と同を与える．そのため，Apx 毒素は A. pleuropneumoniae

じ mRNA で転写されることがわかっているが，その機の重要な病原因子であると考えられている42）．Apx 毒能はまだ解明されていない．apxIV の下流には，apxIV

素 に は，ApxI，ApxII，ApxIII 及 び ApxIV 毒 素 が あとは一緒に転写されない lacZ が存在する．

る42，66，67，69，141，145）．ApxI 毒素は非常に強い溶血性及びApxIV 毒 素 は in vivo で し か 発 現 し な い145）． ま た，

細胞毒性をもち，ApxII 毒素は弱い溶血性と中程度の細ApxIV 毒素を産生しない株も何株か報告されている

胞毒性を示す．ApxIII 毒素には溶血能はないが，細胞が141），ほとんど全ての株は，ApxIV 毒素を分泌する．そ

毒性が非常に強い42，66，67，69，145）．ApxIV 毒素の溶血性及のため，ApxIV 毒素は，豚胸膜肺炎の血清診断用 ELISA．A.

抗原に用いられ141），海外や日本でも体外診断薬として

pleuropneumoniae の ApxI 〜 ApxIII 毒 素 は， 豚 胸 膜 肺

市販されている．また apxIV は A. pleuropneumoniae の炎対策用ワクチンの主成分の一つとして用いられてい同定・検出用 nested PCR の標的遺伝子に用いられている．一方，ApxIV 毒素はワクチン成分には用いられてる 144）．apxIV の 塩 基 配 列 に は variation が あ り，

いないが，下記のように，A. pleuropneumoniae 感染のRayamajhi らは，彼らが設計したプライマーを用いた

診 断 用 抗 原 に 用 い ら れ て い る 66，67，69，141）．A.

PCR で増幅される DNA のサイズは，血清型によって異pleuropneumonia は ApxI 〜 ApxIII の 3 種 の RTX 毒 素

な る と 報 告 し て い る（（i）1600 bp（ 血 清 型 4 ， 9 ，のうち， 1 つあるいは 2 つの RTX 毒素を分泌する42）（図11），（ii）2000 bp（血清型 6 ），（iii）2400 bp（血清型 1 ，1）．apxIA，apxIIA 及び apxIIIA は，それぞれ ApxI 毒3 ，12，13，14），2800 bp（ 血 清 型 2 ， 5 ， 7 ， 8 ，び細胞毒性については検討されていない

141）伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素
10，15）134）．しかし，筆者も血清型 6 等の株で試した

11

5.2．Actinobacillus porcitonsillarum

経験があるが，増幅される DNA のサイズが比較的大き

A. porcitonsillarum は， 豚（porci-） の 扁 桃（tonsil）

いためか，PCR 増幅が認められない株もあった．またに生息する菌で，A. pleuropneumoniae と表現型性状が最近の某県での病性鑑定で分離された血清型15の株の場似ており，同定の際に注意が必要である48）．本菌は非病合も，増幅が認められなかったと聞く（私信）．

原性と考えられているが，日本の食肉衛生検査所で，リ5.1.5．A . pleuropneumoniae の PCR による生物型の型

ンパ節炎の豚から分離されたという報告もある123）．

別法について5.2.1．A. porcitonsillarum の PCR による同定・検出法について（表 3 ）A. pleuropneumoniae には，培地での発育にニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（nicotinamide adenine

A. porcitonsillarum と近縁な A. pleuropneumoniae とdinucleotide（NAD））を要求する生物型（生物型 1 ）と，の識別が可能な duplex PCR 開発の報告がある162）（表NAD を要求しない生物型（生物型 2 ）の 2 つの生物型

3）， 詳 細 に つ い て は， “5.2.4．A. porcitonsillarum のが存在する．近年，生物型 1 と 2 を識別可能な NAD 合

RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺伝子の検出法につい成に関与する遺伝子 nadV を標的とした PCR 法が開発さて ” を参照されたい．

19）

れている ．この PCR では，PCR 産物が生物型 2 では

5.2.2．A. porcitonsillarum の血清型について（表 4 ）増幅されるが，生物型 1 では増幅されない．臨床材料か

A. porcitonsillarum 分 離 株 に お い て，A.

ら分離される A. pleuropneuminiae のほとんどは生物型 1pleuropneumoniae の血清型 1 及び 9 と血清学的交差性であり，生物型 2 分離の報告は非常に少ない66，67，69）．

が認められる株が，それぞれ分離されている48）．さらに

その理由としては，生物型 2 は生物型 1 よりも病原性が

血 清 型12抗 血 清 で 凝 集 す る 株 も 日 本 で 分 離 さ れ て い

弱いか75），あるいは NAD 非要求性である生物型 2 の認る123），したがって，A. porcitonsillarum には血清型が存

知度が低いことから，他の類縁菌と誤認されてきたため

在 す る 可 能 性 が あ る と 推 測 さ れ る が（ 表 4 ），と考えられている．A. suis は NAD 非要求性であるが，systematic な 血 清 型 別 を 行 っ た 研 究 報 告 は な い．A.

上記の A. pleuropenumoniae 用の nadV PCR は，陰性でporcitonsillarum は非病原性と考えられており，本菌感

19）

ある ．そのため，nadV PCR は A. pleuropneumoniae

染による重大な被害の恐れは少ない．しかし，本菌に感生物型 2 と A. pleuropneumoniae 以外の NAD 非要求性

染している豚は，北米で開発された LPS を抗原に用い細菌との識別にも利用可能と考えられる．

た A. pleuropneumoniae の血清型1-9-11に対する抗体検
出用の ELISA では陽性反応になり，豚胸膜肺炎の正確

表 3 ．豚から分離される A. pleuropneumoniae 以外の細菌の同定用 PCR
菌種

同定用 PCR の有無

標的遺伝子

文献 a

備考

A. porcitonsillarum

なし（備考参照）

apsC & apxC

162

左記のプライマーを用いた PCR で，
A. pleuropneumoniae との識別可能

他の細菌同定用
PCR で の 非 特 異 増幅の報告ありA. pleuropneumoniae dsbE

30

A. pleuropneumoniae 同定用の dsbE PCR で陽性

A. suisあり

23S rrn80[A]. rossi

なし[P]. aerogenes

なし[P.] mairii

なし[H.] parasuis

あり

16S rrn

124

16S rrn

9

P. multocida

a

あり

infB

167

HPS_219690793

59

16S rrn61（124）

kmt1

61（163, 164）

kmt1 ＋ （DNT 毒素遺伝子 toxA）

101（163, 164）

kmt1 ＋ （DNT 毒素遺伝子 toxA）

135（163, 164）

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

家畜衛生学雑誌

12

第45巻第 1 − 2 号（2019）

表 4 ．豚から分離される A. pleuropneumoniae 以外の細菌の血清型同定用 PCR
菌種

血清型

血清型同定用PCR の有無

A. porcitonsillarumあり？ 48，123）

なし

A. pleuropneumoniae 血清型 1 ，9及び12と血清学的に交差する株がある48，123）

A. suisあり22, 104）

なし

3 種の莢膜血清型（K1～ K3）;2 種の LPS O 抗原血清型（O1～ O2）[A]. rossi？

なし[P]. aerogenes？

なし[P.] mairii？

なし[H.] parasuis

あり60，103）あり

Glasserella sp.

？

標的遺伝子

文献 a

莢膜合成遺伝子59

莢膜合成遺伝子173（59）莢膜合成遺伝子94（59）

莢膜合成遺伝子102（59）莢膜合成遺伝子97（59）

莢膜合成遺伝子77

備考

莢膜血清型 1 ～ 4 ，5/12b， 6 ～11，13～15

莢膜血清型 1 ～15cなしa

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．
血清型 5 と血清型12は識別できない．
c
血清型 5 と血清型12を識別可能．
b

な診断の妨げになることが示唆されている48）．最近の A.

A. pleuropneumoniae との識別が可能な duplex PCR の

porcitonsillarum の 全 ゲ ノ ム 解 析 の 結 果，A.

開発の報告がある162）（表 3 ）．

pleuropneumoniae の血清型 1 と血清学的交差反応性の認 め ら れ る A. porcitonsillarum で は， 血 清 型1-9-11の
LPS O 抗原合成遺伝子と相同性の認められる遺伝子が検

A. suis は豚の扁桃や上部気道に存在し，哺乳豚等若．したがって，A. pleuropneumoniae

齢の子豚に病気を起こす細菌として知られている31，103）．

の血清型 1 と A. porcitonsillaru の LPS O 抗原との共通

しかし，カナダのオンタリオ州では1990年代初め頃か性が，A. porcitonsillarum で認められた交差反応の原因

ら，哺乳豚，離乳豚だけでなく肥育豚や成豚でも A. suisであると思われる．

感染症が認められるようになってきた．日本では，文献5.2.3．A. porcitonsillarum の PCR による血清型の同定法

レ ベ ル で は， ま だ 幼 若 豚 で の 発 生 報 告 し か 無 い156）．

出されている37，48）

5.3．Actinobacillus suisについて（表 4 ）A. suis 感染症による臨床症状は衛生状態のきわめて高A. porcitonsillarum の PCR による血清型の同定法にい環境に飼育されている豚群で主に認められる．すなわ

関する報告は無い（表 4 ）．

ち A. suis に対する特異的抗体や A. suis と血清学的に交5.2.4．A . porcitonsillarum の RTX 毒 素 と PCR に よ る

差する細菌等に対する抗体をもたない豚群が，特にRTX 毒素遺伝子の検出法について

A. suis に易感染性・易感受性であると考えられる．哺乳A. porcitonsillarum は血液寒天平板状上で溶血性を示豚においては，抗体等の免疫防御物質を含む初乳の摂取

すが，それは A. pleuropneumoniaeと同様に，溶血活性をが十分でないことが発症の大きな原因と考えられる103）．

もつApxII 毒素を分泌するためである．興味深いことに，“2.1．はじめに” で記載したように，A. suisとA. equuli

42）

A. pleuropneumoniae は，apxIIBD を欠くが（図 1 ） ，を16S rrn の塩基配列で識別することは困難である．生A. porcitonsillarum は完全な apxIICABD オペロンを保物学的・生化学性状も両菌種は非常に類似しているが，92）有する（図 2 ） ．A. porcitonsillarum の構造タンパク

A. suis はマンニトールを分解しないが，豚から分離さ質 ApxIIA は，A. pleuropneumoniae の ApxIIA と ア ミ

れる A. equuli（A. equuli subsp. equuli）は，マンニトー

ノ酸レベルで，99.8％の非常に高い相同性を示す．

ルを分解する31）．さらに，A. suis は溶血性陽性である

A. porcitonsillarum の apxIC の上流には，他の菌種のが，豚から分離される A. equuli subsp. equuli は溶血性RTX 毒素の遺伝子の上流には存在しない aspC（アスパ

陰性であること等が，両菌種を識別する数少ない性状でラギン酸アミノ基転移酵素遺伝子）が存在する92）．aspCある31）．

の有無の違いを利用して，A. porcitonsillarum と近縁な

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

135.3.1．A. suis の PCR による同定・検出について（表 3 ）ルカンに対する低レベルの抗体を保有しているため，

23S rRNA 遺 伝 子 を 標 的 と し た real-time PCR（RT-（ 1 → 6 ）-β-D- グルカンを発現する血清型 O1の A. suis

PCR）による A. suis の検出法に関する報告がある80）．

は，（ 1 → 6 ）-β-D- グルカンを発現しない血清型 O2の（表 3 ）

A. suis よりも病原性が弱い可能性があると考察されて5.3.2．A. suis の血清型について（表 4 ）い る114）． 血 清 型 O1：K1，O2：K2，O2：K3の A. suis

A. suis は，K1，K2，K3の 3 種 の 莢 膜（K） 抗 原，のゲノム塩基配列が決定されており22，24，104），血清型 K1

O1，O2の 2 種類の O 抗原の存在が知られている22，104）．

（O1：K1）及び K2（O2：K2）には莢膜合成に関与する

これまで O1：K1，O2：K2，O2：K3の組み合わせの株と思われる 7 つの遺伝子が検出される（図 5 ）．Ito らはが確認されているが，血清型により病原性の差がある．

A. pleuropenumoniae 血 清 型14の 莢 膜 合 成 遺 伝 子 は，

O1：K1は低病原性または病原性がなく，O2：K3は中間

A. suis 血清型 K1の莢膜合成遺伝子とほぼ同じ塩基配列の病原性を示し，O2：K2は最も病原性が高いと考えらを有することを明らかにした68）（図 5 ）．後に Bosséらも，22）れている ．血清型別には主にスライド凝集反応等が用

A. pleuropneumoniae 血清型14のゲノム塩基配列を決定いられている169）．

し，A. pleuropneumoniae が A. suis 莢膜合成遺伝子を獲なお A. suis の O1：K1の株は，酵母，真菌及び苔が共得した可能性を示唆するデータを提供している19）．一通して保有する物質で，通常は細菌では報告されていな

方，血清型 K3（O2：K3）は， 7 つの遺伝子のうち， 4

い（ 1 → 6 ）-β-D- グ ル カ ン を 産 生 す る

または 5 個の遺伝子を欠く22）（図 5 ）．

114）．A. suis の（ 1 → 6 ）-β-D- グルカンと交差反応する抗体は，様々な5.3.3．A. suis の PCR による血清型の同定法について

動物や SPF 豚からも検出されるが，この交差反応性は，

血清型 K1（O1：K1），K2（O2：K2）及び K3（O2：（ 1 → 6 ）-β-D- グルカン を含む周囲環境に存在する上K3） の A. suis の ゲ ノ ム 塩 基 配 列 が 決 定 さ れ て い記生物による免疫刺激によって惹起されている可能性がる22，24，104）．そのため，O 抗原及び K 抗原の合成遺伝子

ある．Monteiro らは，A. suis の血清学的検査において等の塩基配列を元にした PCR 開発法が可能と思われる

高頻度に経験する偽陽性は，このためではないかと考察

が，A. suis の K 抗原血清型及び O 抗原血清型の同定用

している

114）

．同様に，環境中に存在する酵母，真菌やPCR は開発されていない（表 4 ）．

苔と接触する機会の多い多くの豚は（ 1 → 6 ）-β-D- グ

図 5 ．A. suis の莢膜合成遺伝子の遺伝子構造22）．cpxABCD，莢膜輸送遺伝子；その他の遺伝子，莢膜合成遺伝子；
同じデザインの矢印，有意な相同性をもった遺伝子．－，他の血清型または株で認められる orf がない．矢印の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．

家畜衛生学雑誌

14

第45巻第 1 − 2 号（2019）

5.3.4．A . suis の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺伝子の検出法についてを示す．
［A.］rossii は ApxII 毒素を産生するが，菌体外に分泌されない．その理由としては，apxIIA を分泌す

A. suis は A. pleuropneumoniae が分泌する ApxI 及びる apxIBD が［A.］rossii にはないためと考えられる（図ApxII（図 1 ）とほぼ同じアミノ酸配列を有する ApxI2 ）．一方，理由は不明であるが ApxIII 毒素の産生は，及 び ApxII を 産 生・ 分 泌 す る

23，78）（図 2 ）．A. suis の認められていない（図 2 ）．

ApxIA 及び ApxIIA は，A. pleuropneumoniae の ApxIA及び ApxIIA と高いアミノ酸相同性（それぞれ99.4％及5.5．［Pasteurella］aerogenes

び98.7％）を示す．そのため，両菌の ApxI 及び ApxII［P.］aerogenes は，豚の産道や腸管から分離される日

毒素はそれぞれ血清学的交差抗原性を示す

169）

和見感染菌であるが，流産例からも分離される106，153）．

．

apxI 及び apxII の検出は，A. pleuropneumoniae で用い
45，52）

る方法

現在は一時的に Pasteurella 属に分類されているが，16Sで行えば良い．後述する A. equuli と A. suis

rrn の塩基配列解析から Pasteurella sensu stricto（真のの生物学・生化学性状は非常に類似しており，また16S

Pasteurella）ではなく，将来他の属に移すべきであると

rrn 遺伝子配列では，A. equuli と A. suis を識別するこ考えられている菌種である．

とは困難であるため，apxI 及び apxII を標的とした PCR

5.5.1．
［P.］aerogenes の PCR による同定・検出法につは， 2 菌種間の識別に有用な方法の一つであると思われ
31）

る ．

いて（表 3 ）［P.］aerogenes の PCR による同定・検出法に関する報告は無い（表 3 ）．
5.5.2．
［P.］aerogenes の血清型について（表 4 ）5.4．
［Actinobacillus］rossii［A.］rossii は，豚の産道や腸管から分離される日和見
106，153）

感染菌であるが，流産例からも分離される．現在は一時的に Actinobacillus 属に分類されているが，16S［P.］aerogenes の血清型に関する報告は無い（表 4 ）．
5.5.3．
［P.］aerogenes の PCR による血清型の同定法について（表 4 ）rrn 配 列 解 析 か ら Actinobacillus sensu stricto（ 真 の［P.］aerogenes の PCR による血清型の同定法に関するActinobacillus）ではなく将来他の属に移すべきである

報告は無い（表 4 ）．

と考えられている菌種である．このように一時的にその5.5.4．
［P.］aerogenes の RTX 毒素と PCR による RTX 毒属に分類されている菌種の属名は，［ ］で囲っている

素遺伝子の検出法についてが，以降にもそのような菌種が出てくる．

［P.］aerogenes は RTX 毒素ファミリーの Pax 毒素を5.4.1．
［A.］rossii の PCR による同定・検出法について

分泌する91，106）．Pax 毒素遺伝子は RTX 毒素に典型的な（表 3 ）

オペロン構造 paxCABD を保有する（図 3 ）．paxC は毒［A.］rossii の同定・検出法に関する報告は無い（表素の活性化に関わる遺伝子，paxA は毒素の構造遺伝子3 ）．

で，paxBD は TISS に関わる遺伝子で毒素の菌体外への5.4.2．
［A.］rossii の血清型について（表 4 ）分泌に関わる．［P.］aerogenes の PaxA のアミノ酸配列［A.］rossii の血清型に関する報告は無い（表 4 ）．

は，後述の［P.］mairii の PaxA，A. pleuropneumonaie

5.4.3．
［A.］rossii の PCR による血清型の同定法についの ApxIIIA，［A.］rossii の ApxIIIA と そ れ ぞ れ99.7，て（表 4 ）

84.9，84.9％のアミノ酸相同性を示す．

［A.］rossii の PCR による血清型の同定法に関する報告は無い（表 4 ）．

5.6．［Pasteurella］mairii

5.4.4．
［A.］rossii の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺［P.］mairii は，豚の産道や腸管から分離される日和伝子の検出法について

見感染菌であるが，流産例からも分離される106，153）．現［A.］rossiiには，ApxII 毒素遺伝子 apxIICA及び ApxIII

在は一時的に Pasteurella 属に分類されているが，16S毒素遺伝子 apxIIICABD を保有する株と，ApxIII 毒素遺

rrn 配 列 解 析 か ら Pasteurella sensu stricto（ 真 の伝子 apxIIICABD のみを保有する株の 2 種類ある106）（図Pasteurella）ではなく，将来他の属に移すべきであると

2）．
［A.］rossii の ApxIIA の N 末端の部分的アミノ酸配考えられている菌種である．

列（521アミノ酸）は，A. pleuropneumonaie の ApxIIA

5.6.1．
［P.］mairii の PCR による同定・検出法についての配列と同一である．一方，［A.］rossii の ApxIIIA の N（表 3 ）

末 端 の 部 分 的 ア ミ ノ 酸 配 列（523ア ミ ノ 酸 ） は，A.

［P.］mairii の PCR による同定・検出法に関する報告

pleuropneumonaie の ApxIIIA と98.4％のアミノ酸相同性は無い（表 3 ）．

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

15

5.6.2．
［P.］mairii の血清型について（表 4 ）ライマーに，機能不能の遺伝子（HPS_219690793 ）を標［P.］mairii の PCR による血清型に関する報告は無い的遺伝子とした種特異的 PCR 用のプライマーを混合（表 4 ）．

し，［H.］（G.）parasuis の検出と血清型の同定を同時に

5.6.3．
［P.］mairii の PCR による血清型の同定法につい行える multiplex PCR を開発した59）．

て（表 4 ）

5.7.2．［H.］（G.）parasuis の血清型について［P.］mairii の PCR による血清型の同定法に関する報

現在までに少なくとも15の血清型の存在が確認されて告は無い（表 4 ）．

おり，型別不明の株もよく分離される60，103）．日本では

5.6.4．
［P.］mairii の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺血清型 5 の分離率が最も高かったが，後に血清型 2 が増伝子の検出法について加したと報告されている157）．Takahashi らは，血清型 2［P.］mairii は RTX 毒素ファミリーの Pax 毒素を分泌
106）

不活化全菌体ワクチンを免疫した豚では，血清型 2 また．Pax 毒素の遺伝子は，典型的な RTX 毒素同様

は 5 の株を用いた気管内攻撃に対してホモの血清型菌にに，活性化遺伝子 paxC，構造遺伝子 paxA，分泌遺伝子よる攻撃を防御したが，ヘテロの血清型菌に対しては防paxBD からなる paxCABD オペロン構造を持つ（図 3 ）．

御しなかったと報告しており，不活化全菌体ワクチンに［P.］aerogenesの PaxAのアミノ酸配列は，［P.］aerogenes

よ る 交 差 防 御 は 完 全 で は 無 い157）． し た が っ て，［H.］の PaxA，A. pleuropneumonaie の ApxIII，［A.］rossii（G.）parasuis 浸潤農場ではどの血清型が浸潤しているの ApxIII とそれぞれ99.7，84.8，84.8％のアミノ酸相同のか知ることは，グレーサー病の対策を行う上で重要で性を示す．

ある．我が国では血清型 2 及び 5 の不活化全菌体を混合する

した 2 価ワクチンが開発され，市販されている122）．
5.7．
［Haemophilus］（Glaeserrela）parasuis

近年の［H.］（G.）parasuis の日本における分離株の［H.］（G.）parasuis は，髄膜脳炎，多発性漿膜炎及び血清型については，農林水産省動物医薬品検査所が，平多発性関節炎を主徴とし，肺炎の原因ともなる豚の急性成23〜27年度までの成績をホームページで報告しているのグレーサー病の原因菌である．特に衛生状態が良い農38）

場での発生が多い

103）．平成23年度に収集された［H.］（G.）parasuis 合計．すなわち，通常の豚飼育農場に18株の血清型は，血清型 4 が22.2％と多く，次いで血清

おいては，本病は散発的かつ限局的な発生であるが，型 1 及び 5 がそれぞれ11.1％と続き，血清型12及び13もSPF 豚飼育農場においては本菌フリーの SPF 豚群に本それぞれ5.6％認められた．平成24年度に収集された合菌が感染した場合，月齢に関係なく高い罹患率と死亡率

計28株 の 血 清 型 は， 血 清 型 5 が21.4％， 血 清 型 1 がを示し，大きな損害をもたらす．そのため，本病は特に17.9％，血清型 4 が14.3％と多く，血清型 2 及び12がそ

SPF 豚飼育農場において重要視されている122）．

れぞれ3.6％認められた．平成25年度に収集された合計

近 年 本 菌 は Haemophilus 属 か ら 新 し い 属 で あ る

38株 の 血 清 型 は， 血 清 型 4 が28.9％， 血 清 型 5 がGlaesserella 属に再分類するべきであるという提唱が行

13.2％，血清型12が10.5％と多く，型別不能の株も36.8％

64）

われている ．しかし， “Glaesserella” をキーワードにと多かった．その他には血清型 1 ， 2 及び 7 も分離されして PubMed で文献検索を行うと，2019年 4 月現在で 1

た．平成26年度に収集された合計18株の血清型は，血清報（G. parasuis とは種が異なる Glaesserella sp.）しか型 4 が33.3％，血清型 5 が27.8％であった．型別不能の検索結果に表示されない175）．

株も22.2％あり，その他には血清型12や13も認められ

5.7.1．
［H.］（G.）parasuis の PCR による同定・検出法

た．平成27年度に10道県から収集された合計 21株の血について（表 3 ）清型は，血清型 4 が42.9％，血清型 5 が19.0％と多く，Oliveira は，［H.］（G.）parasuis の16S rrn の塩基配列
124）

次 い で 血 清 型12（9.5％）， 血 清 型13及 び15（ そ れ ぞ れ．

4.8％）と続き，型別不能株（19％）も認められた．こ

その後，Angen らは，Oliverira と同様に16S rrn を標のように近年の我が国で流行している血清型は，かつて的とした改良型の［H.］（G.）parasuis 検出用 PCR を開の傾向とやや違っていた．すなわち，血清型 5 は例年最発した 9 ）．さらにその後，Turni らは，infB を標的にしも多いか，あるいは 2 番目に多く認められる血清型であを元に［H.］（G.）parasuis 診断用 PCR 法を開発した

た RT-PCR を開発した

167）．本法は，培養菌，組織，液体のスワブのいずれからも［H.］（G.）parasuis を検出

り，主要な血清型であるが，近年はむしろ血清型 4 が最もよく認められる血清型のようである．

することができ，高い特異性及び感受性をもった診断

現在の抗血清を用いた血清型別法は，菌体表層抗原のツールとして理想的な方法であると記載されている．

反応に基づき15の血清型に型別されるが，型別法としてそして Howell らは，血清型特異的 PCR 用の複数のプ

GID 法の一つである Kielstein-Rapp-Gabrielson 血清型別第45巻第 1 − 2 号（2019）

法，次いで IHA が開発されている60）．しかし，後者の方が型別不能となる例が少ないため，現在，IHA は GIDに取って代わっている． 2 つの方法では異なる抗原を用いており，GID 法は耐熱性の多糖類からなるオートク
レーブ抽出抗原を用いる．一方，IHA は煮沸加熱抗原または生理食塩水抽出抗原を用いており，LPS が主成分であると考えられてきた（現在では，［H.］（G.）parasuis
は LPS で は な く， リ ポ オ リ ゴ 糖（lipooligosaccharides（LOS））を発現すると考えられている60））が，他にも様々な抗原を含むと考えられている．しかし， 2 つの血清型別法における重要な抗原は多糖類であることは間違いが無い．現在は，莢膜多糖抗原が［H.］（G.）parasuisの血清型を規定する主要抗原と考えられている60）．
5.7.3．
［H.］（G.）parasuis の PCR による血清型の同定法について（表 4 ）Howell らは，PCR 等による血清型の同定法の改良及び開発を目的として，［H.］（G.）parasuis の血清型 1 〜15の莢膜合成遺伝子領域の塩基配列を決定した60）．［H.］（G.）parasuis の血清型 1 〜15の莢膜合成遺伝子領域の概略図を図 6 に示した．さらに彼らは莢膜合成遺伝子領域の塩基配列情報60）をもとにして，［H.］（G.）parasuisの莢膜血清型を決定するための multiplex PCR を開発した59）．本法は15ある血清型うち，血清型 5 と12は識別できないが，血清型 1 〜 4 ，5/12，13〜15の14種の血清型（群）に型別できる（5/12は，血清型 5 と12を識別できないことを意味する），この multiplex PCR 法は，血清型別法の gold standard である IHA よりも，より迅速，高い感度，高い特異性をもった方法であると報告している．なお彼らの開発した PCR 法は，上述したように血清型の同定だけでなく，［H.］（G.）parasuis の検出も同時に行える59）（表 3 ）．
Jia らは，Howell らが決定した莢膜合成遺伝子の塩基配列60） をもとに［H.］（G.）parasuis の莢膜血清型を決定するための multiplex PCR を開発した77）．彼らの方法
は，Howell らの方法（血清型 5 及び12ともに増幅する
PCR プライマーの標的遺伝子は wcwK 59） では識別できなかった血清型 5 （標的遺伝子は funK 77））と12（標的遺伝子は Hypothetical 遺伝子77））を識別可能である．
Wang らは，Howell らが開発した PCR 59） を，中国四川 省 で 分 離 さ れ た［H.］（G.）parasuis 254株 の 同 定（・検出）及び血清型の同定に利用した173）．血清型 5 及
び12は，Howell らの方法では識別できないため，これら 2 つの血清型のいずれかであると判定された場合は，さらに GID を実施している．
Ma ら は Howell ら の 方 法59） に 若 干 の 改 変 を 加 え た
multiplex PCR 法と GID を実施し，両者を比較した102）．

図 6 ．［H.］（G.）parasuis の莢膜合成遺伝子の概略図60）．tra3 ＊この遺伝子のみ他の遺伝子と逆方向に読み取られる；文字及び枠線が太字の遺伝子，糖合成遺伝子；背景がグレーの遺伝子，糖転移酵素；文字が白色で背景が黒色の遺伝子，エピメラーゼ（異性化酵素）；その他の遺伝子，機能が未分類又は不明な遺伝子．＃，その血清型のみに特異的な遺伝子．枠の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．

家畜衛生学雑誌16伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

17

その結果，multiplex PCR 法では100株中 7 株が型別不A. pleuropneumoniae の ApxIII とのアミノ酸レベルでの能であった．彼らは，型別不能の理由は，莢膜合成遺伝

相同性は，84％である．しかし，Frey らの apxIIICA を子の欠損等が理由であることを，全ゲノム解析によって標的とした PCR は陰性である43，45）．その理由としては，明らかにした．一方，GID では100株中27株が型別不能

プライマーの配列に合計 5 つのミスマッチがあるためでであったが，multiplex PCR 法では そのうち20株を型別あると考察されている175）．Actinobacillus 属以外の菌種

でき，multiplex PCR の方がより識別能力が高いことをで Apx 毒素遺伝子を保有する菌種は，現時点ではこの示した．Lacourte らも，カナダのケベック州で分離さ菌種のみである．

れた90株の［H.］（G.）parasuis を用いて，Howell らの方法59） を改変した multiplex PCR 法と IHA の識別能を比較した94）．その結果，IHA では90株中34株が型別不能であったが，multiplex PCR 法では 90株は全て血清型 1

5.9．豚 から分離される複数の病原細菌を同時に同定・検出するための multiplex PCR（表 3 ）Hričínová ら は，Xiao ら の apxIV を 標 的 と し た A.の PCR 177），Townsend ら〜 9 ，13，14のいずれかに型別できた．Lin らも同様に，

pleuropneumoniae 用Howell らの方法59） を改変した方法で，124農場155頭のPasteurella multocida 用の PCR 163，164）及び Oliveira らの豚から分離された［H.］（G.）parasuis の PCR による血16S rrn を標的とした［H.］（G.）parasuis 用の PCR 124）

清型の同定を行ない，台湾で分離される血清型の傾向をにそれぞれ用いられている PCR プライマーを混合し97）明らかにした ．

のて，上記の 3 菌種を同時に検出可能な multiplex PCR を

Kang らは，多漿膜炎の豚のホルマリン固定したパラ用いて，スロバキアの食肉衛生検査所由来の肺サンプル

フィン包埋材料から，［H.］（G.）parasuis を検出できるについて上記 3 菌種の検出を試みた61）（表 3 ）
．その結

79）

multiplex nested PCRを開発した ．
［H.］（G.）parasuis

果，PCR に よ る 直 接 検 出 法 と 培 養 法 の 感 度 に つ い てを検出するための標的遺伝子は，16S rrn である．

は， 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た が， 迅 速 性 の 点 で5.7.4．
［H.］（G.）parasuis の RTX 毒 素 と PCR に よ る

multiplex PCR 法の方が優れていたと報告している．

RTX 毒素遺伝子の検出法について［H.］（G.）parasuis が RTX 毒素及び RTX 毒素遺伝子を保有するという報告は無い．

6 ．馬から分離されるパスツレラ科に属する
病原細菌
6.1．A ctinobacillus arthritidis 及び Actinobacillus
genomospecies 2

5.8．Glaesserella sp.
オーストラリアのビクトリア州で飼育されていた約20

A. arthritidis は， 馬 の 敗 血 症 や 関 節 か ら 分 離 さ れ

週齢の豚の肺病変からこれまでにない新しい菌種

る31，32）．一方，A. genomospecies 2は，馬の敗血症や脾（Glaesserella sp.）が近年分離された175）．

臓から分離される31，32）．さらに両菌ともに健康な馬の口

5.8.1．Glaesserella sp. の PCR による同定・検出法につ腔からも分離される．通常は DDH での相同性が70％あいて（表 3 ）れば同一菌種と考えられているが，最近ではお互いに近Glaesserella sp. の PCR による同定・検出法に関する

縁な菌種間では，より高い DDH 相同性値（例えば約報告は無い（表 3 ）．同じ Glaesserella 属の［H.］（G.）

80％以上）とした方が良いという報告もある32）．ちなみ

parasuis 同定用 PCR

124）

175）

では，陰性であった．

5.8.2．Glaesserella sp. の血清型について（表 4 ）Glaeserella sp. の血清型別に関する報告は無い（表に Actinobacillus arthritidis 及び Actinobacillus
genomospecies 2間の DDH での相同性は76％である32）．
さらに，A. genomospecies 2の16S rrn の塩基配列は，
A. arthritidis で は な く， 人 か ら 分 離 さ れ る

4 ）．
5.8.3．Glaesserella sp. の PCR による血清型の同定法について（表 4 ）Actinobacillus hominis と最も高い相同性（98.2−98.5％）を示す．このように両菌種は，DDH や16S rrn の塩基配

Glaesserella sp. の PCR による血清型の同定法に関す列の相同性試験による遺伝学的レベルでの解析では，異る報告は無い（表 4 ）．

なる菌種である可能性が示されている32）．しかし，生化

5.8.4．G laesserella sp. の RTX 毒素と PCR による RTX

学性状ではソルビトール発酵の性状以外に差は認められ毒素遺伝子の検出法についてず，両者を生化学性状等の表現型で識別することは困難

Glaesserella sp. は，A. pleuropneumoniae の ApxIIIである．そのため，A. genomospecies 2はまだ正式に新毒素のホモログ遺伝子を保有することが，全ゲノムのしい新種としての提唱はされていない遺伝子種

175）

塩基配列解析で明らかになっている （図2）．

（genomospecies）である32）．

家畜衛生学雑誌

18

第45巻第 1 − 2 号（2019）

6.1.1．A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の PCR による同定・検出法について
A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の PCR による

子，16S rrn の 3 種の PCR プライマーセットを組み合わせた M. haemolytica，M. glucosida 及び M. ruminalis 同
定用の multiplex PCR を開発している 1 ）．

同定・検出法に関する報告は無い．表現型での両菌種の

牛 呼 吸 器 病 症 候 群（Bovine respiratory disease

識別は困難であるため，PCR 等による識別法の開発がcomplex（BRDC）） の 原 因 と な る M. haemolytica プ ラ

望まれる．

スその他の細菌の複数の病原体を同定・検出するマルチ

6.1.2．A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の血清型にプレック PCR も開発されているので， “7.3．反芻獣のついて
A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の血清型に関する報告は無い．
6.1.3．A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の PCR による血清型の同定法について
A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の PCR による

BRDC や生殖器から分離される複数の病原細菌を同時に同定・検出するための multiplex PCR” を参照されたい．
7.1.2．M. haemolytica 及びその他の Mannheimia 属細菌の血清型について
M. haemolytica は，莢膜の抗原性により血清型 1 ，2 ， 5 − 9 ，12−14，16及び17の12種類の血清型に型別

血清型の同定法に関する報告は無い．

される 8 ）．欠番があるのは，M. haemolytica は，かつて

6.1.4．A. arthritidis 及び A. genomospecies 2の RTX 毒は Bibersteinia trehalosi 及 び M. glucosida と と も に素とPCRによるRTX 毒素遺伝子の検出法について

Pasteurella haemolytica という同一菌種に分類されていA. arthritidis 及び A. genomospecies 2の RTX 毒素にたためである．上記の12種類の血清型は M. haemolytica，

関する報告は無い．

7 ．反芻獣から分離されるパスツレラ科に属する病原細菌7.1．Mannheimia haemolytica及びその他のMannheimia属細菌
M. haemolytica は，牛や羊の肺炎の原因菌である．生
化学性状を利用した市販の菌種同定用キットでは M.
haemolytica と識別が困難な菌種として，M. glucosida，

血清型11は M. glucosida に1999年に再分類され 8 ），さらに血清型 3 ， 4 ，10及び15は2007年に B. trehalosi（1990
年には，Pasteurella trehalosi 153））に再分類され，現在に至っている14）．
日本では，牛の病巣から分離される M. haemolytica のうち，血清型 1 ， 2 ， 6 が90％以上を占め，そのうち，約半数が血清型 1 であると報告されている82）．
7.1.3．M . haemolytica の PCR による血清型の同定法について（表 6 ）M. ruminalis，M. granulomatis 及び M. varigena の存在

牛の病巣から分離される血清型のほとんどを占める血が知られている．これらの 4 菌種は，かつては真の M.

清型 1 ， 2 ， 6 の血清型の同定用 PCR が近年開発され

haemolytica と は 性 状 が 少 し 異 な る 生 物 型 の M.

ている85）．

haemolytica と考えられ，M. haemolytica とあわせて M.

7.1.4．M. haemolytica の RTX 毒素と PCR による RTX 毒haemolytica complex と呼ばれていた．しかし，20年ほど前に，DDH や16S rrn の塩基配列解析によって，M.

素遺伝子の検出法について
M. haemolytica は，RTX 毒素ファミリーの一員であhaemolytica とは異なる菌種に再分類された 8 ）．

るロイコトキシン（Lkt）を分泌する40）．Lkt は反芻獣

7.1.1．M. haemolytica 及びその他の Mannheimia 属細菌の白血球の膜に穴を開けて溶解し，宿主の免疫防御機能の PCR による同定・検出法について（表 5 ）に障害を与える M. haemolytica の重要な病原性因子でGuenther ら は，Mannheimia 属 に 分 類 さ れ る M.

あるが，その作用は宿主特異的である．Lkt のレセプ

glucosida，M. ruminalis，M. granulomatis 及び M.

ターは反芻獣の白血球上に存在する CD18（β2 - インテ

varigena の同定・検出のための RT-PCR 法を開発してい53）

る ．RT-PCR の標的遺伝子は，sodA である．
勝 田 ら は，gyrB を 標 的 と し た M. haemolytica，M.
glusosida，M. varigena の同定用 PCR を開発した81）．そ

グリンのβサブユニット）である95）．

日本では血清型 1 から精製した Lkt のトキソイド及び莢膜抗原を主成分とした牛用の不活化ワクチンが市販されている117）．

の 後， 勝 田 ら は，M. glucosida，M. granulomatis，M.

M. haemolytica 感染牛の肺の病理組織学的検査では，

haemolytica，M. ruminalis，M. varigena の Mannheimia

多発性凝固壊死の形成を特徴とする広範な肺炎病巣が観属菌 5 菌種の同定用 PCR 法（標的遺伝子は recN）を開察されるが，凝固壊死層の周囲は，燕麦（ “oat” ）とそ発した83）．

の形態が類似していることから名付けられた多数の燕麦

Alexander らは，lktD，機能不明のタンパク質遺伝様細胞（ “oat-like cells” ）または燕麦細胞（ “oat cells” ）伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

19

表 5 ．反芻獣から分離される細菌の同定用 PCR
菌種

同定用 PCR の有無

標的遺伝子

文献 a

M. haemolytica

あり

gyrB

81

recN

83

multiplex PCR（Hypothetical gene（＋）,lkt（＋）,lkt2 （-）,16S rrn（＋））

1

lktD

100

sodA

84

非公開のため不明

176

lktA

159

artJ-lktC

179

sodA

53

sodA

11（53）

gyrB

81

recN

83

multiplex PCR（Hypothetical gene（＋）,lkt（＋）,lkt2 （＋）,16S rrn（＋））

1

sodA

53

recN

83

sodA

53

recN

83

multiplex PCR（Hypothetical gene（＋）,lkt（-）,lkt2 （＋ -, 16S rrn（＋））

1

sodA

53

gyrB

81

sodA

53

recN

83

M. glucosida

M. granulomatis

あり

M. ruminalis

あり

M. varigena

H. somni

P. multocida

a

あり

あり

あり

あり

16S rrn

6

31 kDa 抗原遺伝子100

16S rrn84

非公開のため不明

176

16S rrn

159（ 6 ）16S rrn

142（ 6 ）16S rrn11（ 6 ）

転写調節遺伝子（Pm0762 及び Pm1231 ）98

転写調節遺伝子（Pm1231 ）

100

kmt-1

84

非公開のため不明

176

転写調節遺伝子（Pm0762 ）

159

kmt-1

179

転写調節遺伝子（Pm0762 または Pm1231 ）11（98）

kmt-1

2 （163, 164）

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

で包囲される27，54，174）．燕麦様細胞は，M. haemolytica

クロファージを溶解する RTX 毒素（ApxI 及び ApxII）の産生する Lkt によって好中球が急速に変性壊死したもを分泌する．一方， “7.2.4．H. somni の RTX 毒素と PCRのと考えられている27，54，174）．M. haemolytica 感染症でによる RTX 毒素遺伝子の検出法について ” に記載した認められる燕麦様細胞と類似した細胞は，豚の肺炎の起ように，H. somni が RTX 毒素及び RTX 毒素遺伝子を因菌 A. pleuropneumoniae による豚胸膜肺炎26，36） や，

保有するという報告は無い．しかし，H. somni 感染症

A. suis 感染症でも認められる

156）．両菌種は白血球やマにおいても，白血球の壊死による燕麦様細胞が認められ家畜衛生学雑誌

20

第45巻第 1 − 2 号（2019）

表 6 ．反芻獣から分離される細菌の血清型同定用 PCR
菌種

a

血清型
8）

血清型同定用 PCR の有無

標的遺伝子

文献 a

備考

あり
（血清型 1 ， 2 ， 6 ）莢膜合成遺伝子85

かつての M.. haemolytica complex の血清型 1 ， 2 ， 5 - 9 ，12-14，16，17

M. haemolytica

あり

M. glucosida

あり 8 ）なし

M. granulomatis？

なし

M. ruminalis？

なし

M. varigena？

なし

B. trehalosi

あり14）

なし

P. multocida

あり

実証試験

H. somni？

なし

かつての M.. haemolytica complex の
血清型11

かつての M.. haemolytica complex の血清型 3 ， 4 ，10，15
莢膜合成遺伝子

2 （163，164）

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

るため27，174），H. somni 感染症における燕麦様細胞の出るという報告は無い．

現の要因は，RTX 毒素以外にもあるように思われる．
Lkt 遺伝子オペロンは，他の RTX 毒素と同様に， 4

7.3．反芻獣の BRDC や生殖器から分離される複数の病

つの遺伝子（lktCABD．それぞれ毒素の活性化遺伝子，

原細菌を同時に同定・検出するための multiplex

構造遺伝子及び分泌に関与する 2 つの TISS 遺伝子）か

PCR（表 5 ）ら構成され，活性化された Lkt は菌体外に分泌される．

反芻獣の BRDC から分離される病原細菌の場合， 1 菌

上記のように，Alexander らは，lktD を標的 DNA にし種のみを同定・検出する singleplex PCR よりも，BRDC

た M. haemolytica 同 定 用 の PCR を 開 発 し て い る 1 ，100）の原因となる病原体を同時に検出可能な multiplex PCR（表 5 ）．

の方が多数開発されている．
Loy ら は，BRDC の 原 因 と な る 4 種 種 の 細 菌（M.

7.2．Histophilus somni

haemolytica，Mycoplasma bovis，H. somni 及び P.

H. somni は，牛の髄膜脳脊髄炎や肺炎の原因菌であ

multocida）を検出するための multiplex RT-PCR 法を開る．H. somni は，かつては Haemophilus somnus に分類

発し，肺組織，鼻腔スワブ及び咽喉頭深部のスワブを材されていたが，2003年に新しい属である Histophilus 属料として，その有効性を評価した100）．

に再分類された 5 ）．

また16種の牛の呼吸器病の原因となる細菌，マイコプ

7.2.1．H. somni の PCR による同定・検出法について（表5）

ラズマ及びウイルス検出のための RT-PCR 法に関する報告がある．対象菌種のうちパスツレラ科に属する菌種はAngen ら は16S rrn を 標 的 と し た H. somni 同 定 用

M. haemolytica，P. multocida，H. somni で，RT-PCRのPCR を開発している （表 5 ）．H. somni プラスその他

標的遺伝子はそれぞれ sodA，kmt-1 ，16S rrn である84）．

の BRDC の原因となる複数の病原体の検出法が開発され

牛の主要な細菌性呼吸器病の原因菌であるているが（表 5 ），それらについては “7.3．反芻獣のP. multocida，M. haemolytica，H. somni 及び

BRDC や生殖器から分離される複数の病原細菌を同時にTrueperella pyogenes（パスツレラ科に属さない）を牛同定・検出するための multiplex PCR” を参照されたい．

の肺胞洗浄液から検出するための RT-PCR キットが海外

7.2.2．H. somni の血清型について（表 6 ）では市販されているが176），日本では体外診断薬として

6）

H. somni の血清型に関する報告は無い（表 6 ）．

の承認を受けていないと思われる．なお，上記論文で7.2.3．H . somni の PCR による血清型の同定法について

は，感度・特異性に関する情報は記載されているが，プ（表 6 ）
H. somni の PCR による血清型の同定法に関する報告

ライマー等の詳細な情報は公開されていない．
さらにまた，H. somni，M. haemolytica，P. multocida，は無い（表 6 ）．

M. bovis 及び 5 種のウイルスを検出・識別可能な BRDC

7.2.4．H. somni の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺伝

multiplex PCR-microarray assay に 関 す る 報 告（H.

子の検出法について
H. somni が RTX 毒素及び RTX 毒素遺伝子を保有す

somni，M. haemolytica，P. multocida の標的遺伝子は，それぞれ16S rrn，lktA，転写調節遺伝子 Pm0762 ）159）

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

21や，M. haemolytica，H. somni，P. multocida，T.

（HI）test）により群別または型別する． HI test を実施

pyogenes 及び M. bovis の 5 種の主要 BRDC 起因菌検出用するためには，高力価のウサギ免疫血清，グルタールア

11）の RT-PCR の検出法に関する報告がある ．その他にルデヒドで固定した鶏の赤血球及び赤血球凝集能を持っは，Zhang ら は，M. haemolytica 及 び P. multocida とた抗原が必要である． さらに Kume scheme による試験

T. pyogenes（ パ ス ツ レ ラ 科 に 属 さ な い ） 検 出 用 のでは，複雑な吸収試験によって血清型特異的な抗血清を

multiplex PCR 法を開発している179）．

作製する必要がある．このため，（特に Kume scheme

BRDC 以 外 の 疾 病 で は， 羊 の 精 液 か ら H. somni，［Actinobacillus］seminis，Brucella ovis を 検 出 す る

できる検査室は世界的にも少ないと思われる．
8.1.3．A. paragallinarum の PCR による血清型の同定法

142）

multiplex PCR 法が開発されているによる）A. paragallinarum の血清群または型別を実施．

について（表 8 ）8 ．鳥類から分離されるパスツレラ科に属する病原細菌

multiplex PCR 及び PCR–RFLP 法による A.
paragallinarum の 血 清 型 群 の 同 定 法 が 開 発 さ れ て い

8.1．Avibacterium paragallinarumる139）．この方法は，HMTp210遺伝子の高度変異領域及A. paragallinarum は，養鶏産業に経済的損失を与えび感染防御抗原であるヘマグルチニンタンパク質をコーる鶏の呼吸器系疾患である伝染性コリーザの原因菌であド す る 領 域 2 の 配 列 に 基 づ き 型 別 す る 方 法 で あ り，る．かつては，Haemophilus 属に分類されていたが，Page scheme に よ る 血 清 型 を 同 定 で き る．Patil は，

2005年に，Avibacterium 属に移された16）．

Chen ら の 種 特 異 的 PCR（HPG-2 PCR）28） 及 び

8.1.1．A. paragallinarum の PCR による同定・検出法に

Sakamoto ら の 血 清 型 の 同 定 用 の PCR 139） 用 の プ ラ イ

ついて（表 7 ）マーを用いて追試を行った127）．しかし，血清型 A，B，Chen ら は，A. paragallinarum 用 の PCR 法（HPG-2

C それぞれ 1 株しか検査しておらず，さらに多くの検査

PCR）を開発している．本法はスワブから直接検出する株を調べて，確実性を確認する必要がある．一方，上記

28）

ことも可能である ．Muhhanmad らは，56検体 の眼窩の multiplex PCR 及び PCR-RFLP を併用した方法139） に下洞スワブ及び22検体の鼻腔スワブを材料に用いて，よる A. paragallinarum の血清型の同定法の有用性に否

Chen らの開発した種特異的 PCR 28）を実施した116）．その定的な論文115，172）も複数存在する．

結果，PCR は，conventional な培養法に代わる迅速で高8.1.4．A. paragallinarum の RTX 毒素と PCR による RTX
毒素遺伝子の検出法について

感度な診断法であると結論づけている．
8.1.2．A. paragallinarum の血清型について

A. paragallinarum は Avx と呼ばれる RTX 毒素を分泌

A. paragallinarum の 血清型（または群）別には 2 つ

す る こ と が 報 告 さ れ て い る93，126）．Avx の 遺 伝 子 構 造の scheme が 存 在 す る 172）． 一 つ は Page scheme

は，古典的な RTX 毒素遺伝子オペロン 構造を取ってい（serogroups A–C の 3 つの血清群に群別）で，もう一つる93）（図 3 ）．すなわち毒素の活性化遺伝子 avxC，セリは Kume scheme（serogroups A–C の 3 つの血清群に群

ンプロテアーゼ活性を保有する RTX 毒素の構造遺伝子

別．さらに各群は 血清型 A- 1 〜 A- 4 ，B- 1 及び C- 1 〜

avxA，そして毒素を菌体外に分泌させる遺伝子 avxB 及C- 4 にそれぞれ型別）と呼ばれる． そして両 scheme とび apxD の 4 つの遺伝子から構成される．AvxA は avxC

も 赤 血 球 凝 集 抑 制 試 験（hemagglutination inhibitionの遺伝子産物 AvxC で活性化され，AvxB 及び AvxD に

表 7 ．鳥類から分離される細菌の細菌の同定用 PCR
菌種

同定用 PCR の有無

標的遺伝子

文献 a

A. paragallinarum

あり

HPG-2

28

HPG-2

116（28）

G. anatisa

異なる菌種での増幅

HPG-2

127（28）あり

16S-23S rrn

17

G. genomospecies 1及び 2 でも増幅するが，サイズの違いで識別可能あり（RT-PCR）

gyrB

171

G. genomospecies 1及び 2 は陰性あり
gtxA（異なる菌種での増幅あり）

62

G. genomospecies 1及び 2 でも増幅LAMP 法155

sodA

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

家畜衛生学雑誌

22

第45巻第 1 − 2 号（2019）

表 8 ．鳥類から分離される細菌の血清型同定用 PCR
菌種

血清型

血清型同定用PCR の有無

A. paragallinarumあり172）あり

G. anatis
a

?

標的遺伝子

文献 a

備考

ヘマグルチニン蛋白遺伝子
HMTp210（mPCR 及び PCR-RFLP）

139

血清型 A, B 及び C を型別ヘマグルチニン蛋白遺伝子
HMTp210（mPCR）

127（139）

血清型 A, B 及び C を型別ヘマグルチニン蛋白遺伝子
HMTp210（mPCR）

115（139）

文献139の評価
否定的な結論（非推奨）ヘマグルチニン蛋白遺伝子
HMTp210（mPCR 及び PCR-RFLP）

172（139）

文献139の評価
否定的な結論（不適）なし

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

よって菌体外に分泌される．興味深いことに，AvxA のGallibacterium genomospecies 2（上述の Actinobacillus

アミノ酸配列から推定される分子量は238kDa であり，

genomospecies 1や 2 と 同 様 に， 遺 伝 子 レ ベ ル で は他の典型的な RTX 毒素（約110kDa）44，46）の 2 倍以上のGallibacteirum 属の新菌種と考えられるが，現時点では大きさである（図 3 ）93）．Avx の C 末端部分（703アミ

新菌種の提案には至っていない遺伝子種）でも，PCR 産ノ酸，全長の約 3 分の 1 に相当）には，グリシンに富ん物が増幅される．しかし，サイズの違い（G. anatis ではだ繰り返しアミノ酸配列が存在する等，典型的な RTX

1080 bp，G. genomospecies 1 及び G. genomospecies 2毒素に特有な配列を示す．しかし，Avx 毒素（AvxA）

では，1030 bp）で，G. anatis と 2 つの genomospeciesのアミノ酸配列は，Pseudomonas putida のセリンプロ

を識別できるとしている．その後 Wang らは，gyrB をテアーゼと38％の同一性と55％の類似性を示す N 末端部標的にした G. anatis の同定及び定量が可能な RT-PCR

分（1491アミノ酸，全長の約 3 分の 2 に相当）を有するを開発した171）．この方法では，G. anatis は陽性（n ＝ために，他の一般的な RTX 毒素よりもサイズが大きい．

32）であったが，G. genomospecise 1（n ＝ 3 ）及び G.

AvxA 毒素は，A. paragallinarum 血清型 A，B 及びgenomospecies 2（n ＝ 2 ）を含む G. anatis 以外の菌種

C のいずれの型からも分泌される．そのため，Avx 毒素（22株）では陰性であった．さらにその後，Huangfu らは，A. paragallinarum 血清型 A，B 及び C に共通したは，後述の RTX 毒素遺伝子（gtxA）を標的とした定量病原因子であると考えられる93）．AvxA 毒素は，鳥類のPCR を開発した62）．本法は G. anatis の同定，検出及びマクロファージ由来細胞の株化細胞 HD11に対して細胞定量に有用な方法であると記載されているが，彼らは上毒性を示すが，牛由来のマクロファージ株化細胞 BoMac

記の16S-23S rRNA 遺伝子を標的とした Bojesen らの G.

93）に対して細胞毒性を示さない ．パスツレラ科に属する

anatis 同定用の PCR 17）で陽性を示した G. anatis の近縁

細菌は，宿主特異性を示す例が多く，A. paragallinarum菌である G. genomospecies 1 及び G. genomospecies 231）も同様に，鳥類のみに病原性を示すため ，この宿主細を用いた試験は実施していない．なお同定や検出の目的

胞特異性を示すデータは非常に興味深い．

では無く，Gtx 毒素の保有を目的とした PCR であるが，Kristensen が開発した gtxA を標的にした PCR では，G.

8.2．Gallibacterium anatis
Christensen ら は2003年 に，Gallibacterium と い う 新
しい属を提案し，新しい菌種として，G. anatis を提案

anatis 以外にG. genomospecies 1 及び G. genomospecies
2でも PCR 陽性である88）．
Stepien-Pysniak らは，PCR 法でないが，sodA を標的した33）．

と し た 迅 速・ 特 異 的 な loop-mediated isothermal

8.2.1．G . anatis の PCR による同定・検出または検出に

amplification procedure（LAMP）を開発した155）．

ついて（表 7 ）Bojesen らは，16S-23S rRNA 遺伝子を標的にした G.
anatis の同定用 PCR 法を開発した17）．なお G. anatis 以
外 の 菌 種 で は，Gallibacterium genomospecies 1 及 び

8.2.2．G. anatis の血清型について
G. anatis の血清型に関する報告は無い．

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素
8.2.3．G . anatis の PCR による血清型の同定法について（表 8 ）

23

9.1.1．P . multocida の PCR による同定・検出法について（表 3 ， 5 及び 9 ）G. anatis の PCR による血清型の同定法に関する報告

Townsend らによって，P. multocida の種特異的 PCRは無い（表 8 ）．

が 開 発 さ れ て い る163，164）．Liu ら は， 転 写 調 節 遺 伝 子

8.2.4．G . anatis の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺（Pm0762 及び Pm1231 ）を標的にした P. multocida 同伝子の検出法について

定の用の PCR を開発している98）．

G. anatis は 溶 血 性 及 び 細 胞 毒 性 を 保 有 す る Gtx と“5.9． 豚 か ら 分 離 さ れ る 複 数 の 病 原 細 菌 を 同 時 に呼ばれる RTX 毒素を分泌することが報告されている

同 定・ 検 出 す る た め の multiplex PCR” で 述 べ た よ う（図 3 ）87，88，128）．Gtx 毒素の遺伝子構造は，他の典型的に，Hričínová ら は， 既 報 の P. multocida，A.

な RTX 毒素遺伝子オペロン構造とは異なる構造を取っ

pleuropneumoniae 及び H. parasuis 用の PCR プライマー

87，128）．すなわち毒素の活性化遺伝子 gtxC，RTXを混合した 3 菌種検出用の multiplex PCR を用いて，ス毒素の構造遺伝子 gtxA，そして毒素を菌体外に分泌さロバキアの食肉衛生検査所由来の肺サンプルについて上せる機能を有する TISS 遺伝子である gtxEBD の 3 つの記 3 菌種の検出を試みた61）．

ている遺伝子から構成される

87，128）．また典型的な RTX 毒素遺P. multocida で豚の萎縮性鼻炎の原因となるのは，毒伝子オペロンを構成する 4 つの遺伝子はタンデムに並ん

素産生性の P. multocida 株のみである．一方，毒素産生

でいるが，gtxCA 及び gtxEBD は隣接しておらず，離れ性及び毒素非産生性のいずれの P. multocida も豚の肺炎た位置にある．gtxBD は，他の典型的な毒素の分泌遺伝の原因となる．そのため，P. multocida の場合，種の同子 rtxBD と相同性な遺伝子であるが，gtxE は，大腸菌の定及び検出と同時に，毒素産生性の株であるか調べるこ

tolC のホモログ遺伝子である86，87，128）．Gtx 毒素の構造と は 意 義 が あ る．Register ら は，P. multocida 及 びタンパク質である GtxA は2038個のアミノ酸からなり，

Bordetella bronchiseptica（パスツレラ科に属しない豚

上述の A. paragallinarum の Avx 毒素の構造タンパク質の萎縮性鼻炎の原因菌）の同定用 multiplex PCR を開発

AvxA 同様に，他の典型的な RTX 毒素よりもサイズがした135）．さらに本法は，毒素産生性の P. multocida と大きく，アミノ酸長は約 2 倍ある．Gtx 毒素の C 末端部

毒素非産生性の P. multocida を識別可能である135）．ま分（951〜2038番目のアミノ酸）は，典型的な RTX 毒素

た，Lung ら も，P. multocida の kmt1 及 び toxA（P.

の C 末端ドメインと相同性を示すアミノ酸配列を保有す

multocida の毒素遺伝子）を標的とした multiplex PCR をる．しかし，N 末端部分（ 1 〜950番目のアミノ酸）は，開発した101）．本法は，毒素産生性及び毒素非産生性の既知のタンパク質のいずれにも相同性がなく，その機能

P. multocida 以外には，Streptococcus suis，Salmonellaは不明である．G. anatis，G. genomospecis 1 及び G.

Cholerasuis，Mycoplasma hyopneumoniae 及び PRRS ウ

genomospecies 2 は，gtxA 及 び gtxEBD PCR を 標 的 とイルスの検出も可能である．さらに，Scherrer らは，した PCR ともに陽性であるが，他の Gallibacterium 属

RT-PCR による豚の鼻腔スワブから萎縮性鼻炎の原因と細菌（Gallibacterium genomospecies 3，Gallibacterium

なる毒素産生性 P. multocida の検出法を開発した（標的salpingitidis，Galibacterium melopsittaci 及び遺伝子は toxA）147）．反芻獣については，P. multocida

Galibacterium trehalosifermentans） は 陰 性 で あ る87）．

及びその他の複数の BRDC の原因細菌を同時に検出可能

したがって，Gtx 毒素遺伝子は，G. anatis だけでなく，な multiplex PCR が開発されているが，これらは “7.3．

G. genomospecies 1 及び G. genospecies 2 も保有する

反芻獣の BRDC や生殖器から分離される複数の病原細と推測される．

菌を同時に同定・検出するための multiplex PCR” を参9 ．複数の動物種の宿主から分離される
パスツレラ科に属する病原細菌
9.1．Pasteurella multocida

照されたい．
9.1.2．P. multocida の血清型について
P. multocida は莢膜の抗原性の違いに基づき 5 つの莢膜血清型（A，B，D，E，F）に型別される25，136）． 血

P. multocida は，牛，豚，ウサギ，犬，鳥類等様々な

清型 C が欠番となっているが，当初提唱された血清型 C

哺乳動物や鳥類から分離される宿主域の広い細菌であの株は，イヌ及びネコの咽喉頭部由来のものが多かった

る．各動物種で認められる疾病は，牛や水牛の出血性敗が，1955年以後血清型 C の標準菌（株）が R 型変異をお血症，牛や豚の肺炎，豚の萎縮性鼻炎，鳥類の家禽コレ

こし，かつ血清型 C の分離はきわめてまれであるという

ラ，ウサギのスナッフル（鼻性呼吸）等である．

のが，欠番の理由のようである119）．P. multocida は，さらに somatic antigen（菌体抗原）の抗原性の違いに基家畜衛生学雑誌

24

第45巻第 1 − 2 号（2019）

づ き，Namioka ら は10種 の 型119），Heddleston ら は16種

ビンによる綿状物形成試験でも推測が可能であるが，最の型56）に分けられることを提唱した．P. multocida の血

終的な型別は血清学的な方法が必要である．

清型は， 2 種類の抗原性を同時に表記する A： 1 ，B：

9.1.3．P . multocida の PCR による血清型の同定法につ2 という方式がとられる．IHA 及び GID によって，それぞれ莢膜抗原と菌体抗原の血清型を決定する

55b，56）．

P. multocida の LPS は，一般的なグラム陰性細菌と異いて（表 6 及び10）
Townsend ら は，P. multocida 血 清 型 A，B，D 〜 Fの莢膜合成遺伝子領域の塩基配列を決定している163）（図なり，O 抗原の繰り返しユニット（O 多糖抗原）を欠7 ）．さらに，それらの塩基配列情報に基づき，莢膜合く55a）． そ し て，P. multocida で は O 多 糖 抗 原 で は な

成遺伝子を標的とした血清型 A，B，D 〜 F 型別用 PCRく，一部の例外を除いて，LPS のコア部分の抗原性がが開発されている163）（表10）．

P. multocida の菌体抗原血清型に強く関与すると考えら
れている

55a）

．すなわち，Heddleston の血清型 2 と 5 の
55a，55b）

一方，Harper らは，P. multocida の LPS の外側コア
合成領域の塩基配列を決定した55a，55b）．その結果，LPS（図 8

外 側 コ ア 合 成 領 域 の 遺 伝 子 構 造 に 基 づ き，16の（A）），Heddleston の血清型 1 ，2/5， 3 ， 4 ， 6 〜16のHeddleston の血清型参考株は，L1（血清型 1 及び14），

LPS 外側コアの糖の化学構造は血清型特異的（15種類）

L2（血清型 2 及び 5 ），L3（血清型 3 及び 4 ），L4（血であり，LPS 外側コアと菌体抗原血清型との深い関係性

清型 6 及び 7 ），L5（血清型 9 ），L6（血清型10〜12及

外側コア糖抗原の化学構造は同一であるが55a，55b）（図 8 （A）及び（B））． 血清型 2び15），L7（血清型 8 及び13），L8（血清型16）の 8 つ及び 5 の外側コアの化学構造が同一なのにも関わらず，の外側コア遺伝子群に型別された55a，55b）（図 8 ）．L1，

両血清型の株が異なる Heddleston の菌体抗原血清型に

L3，L6及び L7に型別される株は，それぞれ同じ型の遺型別されるのは，LPS 内側コアの化学構造が異なるため

伝子構造の LPS 外側コア合成遺伝子を保有するが，いが示されている

55a，55b）と考えられている．

くつかの遺伝子には，塩基の置換，欠失または挿入が認

莢膜抗原 A，D，F 型の株はムコ多糖分解酵素処理にめられる．そのために，同じ LPS 外側コア遺伝子型でよる脱莢膜試験（簡易法）で，D 型の株は アクリフラ

あっても，異なる化学構造の LPS 外側コアを合成し，

図 7 ．P. multocida の莢膜合成遺伝子の遺伝子構造163）．血清型 A，D 及び F では phyA（リン脂質置換遺伝子ホモログ）及び hexD（莢膜輸送遺伝子）の間に，血清型 B 及び E では lipB 及び lipA（リン脂質置換遺伝子ホモログ）の間に，莢膜多糖合成遺伝子が存在する．破線のボックスで囲んだ遺伝子，他の血清型の遺伝子と相同性を示す遺伝子．ボックス内の数字は血清型 A の遺伝子（上図）及び血清型 B の遺伝子（下図）か推定されるアミノ酸配列との相同性値（％）を示す．両側に矢尻がついているる小さな矢印は，血清型特異的 PCR のプライマーで増幅されるおおよその位置（遺伝子）をあらわす．矢印の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

25

（ Ａ）

（ Ｂ）

図 8 ．P. multocida の LPS 外側コアの化学構造，合成遺伝子の遺伝子構造及び PCR プライマーの標的遺伝子55a，55b）．
（A）LPS 外側コア遺伝子型 L1〜 L4；（B）LPS 外側コア遺伝子型 L5〜 L8．LPS 外側コア化学構造において，外側コアと結合する全血清型で保存されている内側コアの最後の糖（グルコース）を一番左側に示した．LPS
外側コアを構成する糖のうち，白丸◯で示したものは， 1 種類の糖ではなく，ホスホエタノールアミン等 4 種
類の糖のいずれかである．詳細は文献55bの原図を参照されたい．白い矢印（実線），LPS 外側コア合成遺伝子；
縦線の入った矢印（実線），PCR プライマーの標的となる LPS 外側コア合成遺伝子；白い矢印（破線）及び縦線の入った矢印（破線），変異によって機能しなくなった LPS 外側コア合成遺伝子の偽遺伝子；黒い矢印で示した遺伝子，LPS 外側コア合成とは無関係な遺伝子 rpl31 _2 （リボソームタンパク L31遺伝子）；★及び☆のついている遺伝子，同一の L 遺伝子型間で認められた塩基の欠失，挿入，置換等の変異が認められる遺伝子．矢印の長さは，遺伝子の長さに基づいてはいない．LPS 外側コア化学構造において示した各糖の結合に関与する遺伝子，遺伝子の変異部位及び同一 L 型内における LPS 外側コア合成遺伝子の相同性等については，Harper らの（彼女らの研究グループの論文）に詳細に記載されているので参照されたい．
総説55a）が引用している文献34〜40

家畜衛生学雑誌

26

第45巻第 1 − 2 号（2019）

異なる Heddleston 血清型に型別されると考えられてい9.1.4．P. multocida の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素
遺伝子の検出法についてる（図 8 ）．
さらに，LPS 外側コア合成領域を標的とした PCR 法も開発されている55b）．LPS 外側コア合成領域の塩基配P. multocida が RTX 毒素及び RTX 毒素遺伝子を保有するという報告は無い．

列を決定しなくても，PCR によって，16の Heddlestonの血清型株を 8 つの LPS 外側コア遺伝子型（L1〜 L8）に型別可能である（図 8 ）．

9.2．Actinobacillus equuli
Actinobacillus 属に分類される細菌種は，宿主特異性

Armugamu らは，Townsend らの方法163） にいくつかが非常に高いことが知られているが，唯一の例外は，A.

の改変を加えた方法で，15種の動物・鳥類から分離され

equuli である31）．A. equuli には 2 つの亜種が存在し，A.

た P. multocida の PCR による血清型の同定を実施し，

equuli subsp. equuli は，主に哺乳豚や子豚の敗血症及び10）

抗血清を用いた古典的な血清型別法と比較した ．Al-

子馬病（Sleeping foal disease，joint illnes）の起因菌で163）が開発した P. multocida

あり，宿主特異性を示さない31）．一方 A. equuli subsp.

の同定用 PCR 及び莢膜血清型の同定用 PCR を用いて，

haemolyticus は，馬のみに病気をおこし，本亜種に関しMaary らも，Townsend ら反芻獣由来の株の型別を行った ．その結果66.8％（105ては宿主特異性が高い31，34）．

株）が A 型で，33.2％（52株）が E 型と型別された．

9.2.1．A . equuli の PCR による同定・検出法について

2）（表 9 ）
A. equuli subsp. equuli は上記の RTX 毒素ファミリー
表 9 ．複数の宿主から分離される細菌の同定用 PCR
菌種

同定用 PCR の有無

標的遺伝子

文献

備考

A. equuli

なし（亜種の識別に応用可能）

aqxA

12

A. equuli subsp. haemolytica と A. equuli
subsp. equuli との識別可能．

なし（亜種の識別に応用可能）

aqxA

132

A. equuli subsp. haemolytica と A. equuli
subsp. equuli との識別可能．

なし（ 他 の 細 菌 同 定 用 PCR での非特異増幅の報告あり）

A. pleuropneumoniae aroA58

A. pleuropneumoniae 同定用の aroA PCR で
陽性

反芻獣由来
A. lignieresii

なし（ 他 の 細 菌 同 定 用 PCR での非特異増幅の報告あり）

A. pleuropneumoniae aroA
A. pleuropneumoniae cpx
A. pleuropneumoniae omlA
A. pleuropneumoniae dsbE
BOX-SCAR-PCR

29，30，50， 複 数 の A. pleuropneumoniae 同 定 用 の PCR
52，76，99， （未同定の DNA，cpx，omlA，dsbE を標的
138，150にした PCR 及び BOX-SCAR-PCR）で陽性

A. pleuropneumoniae omlA

345株中 4株（ 0 %）が，A. pleuropneumoniae
同定用の omlA PCR で陽性

A. pleuropneumoniae apxIV3

45株中45株（100%）が，A. pleuropneumoniae
同定用の apxIV PCR で陽性

A. pleuropneumoniae dsbE

3

45株中45株が，A. pleuropneumoniae 同定用の dsbE PCR で陽性

A. pleuropneumoniae omlAまたは
A. pleuropneumoniae apxIV

4 ，179，180

複数の A. pleuropneumoniae 同定用の omlAまたは apxIV PCR で陽性

A. pleuropneumoniae omlA

3

6 株中 4株が，A. pleuropneumoniae 同定用の omlA PCR で陽性

A. pleuropneumoniae apxIV

3

6 株中 6 株が，A. pleuropneumoniae 同定用の apxIV PCR で陽性

A. pleuropneumoniae dsbE

3

6 株中 6 株が，A. pleuropneumoniae 同定用の dsbE PCR で陽性反芻獣由来 A. lignieresii なし
及び馬由来 A. lignieresii （ 他 の 細 菌 同 定 用 PCR で（A. genomospecies 1）の非特異増幅の報告あり）

A. pleuropneumoniae cpx

3

50株中46株が，A. pleuropneumoniae 同定用の cpxD PCR で陽性

P. multocida

kmt1

163，164

kmt1

10（163，164）

馬由来 A. lignieresii（A. genomospecies 1）

aなし（ 他 の 細 菌 同 定 用 PCR での非特異増幅の報告あり）

あり

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素

27の 一 員 で あ る Aqx 毒 素 を 分 泌 し な い が，A. equuli

equuli は Aqx 毒素，A. suis は ApxI 及び ApxII 毒素といsubsp. haemolyticus は Aqx 毒素を分泌するため，そのうように，両菌種は異なる RTX 毒素を分泌する．Aqx

遺伝子 aqx を標的とした PCR によって，亜種の識別が可毒素は馬由来の細胞のみ，ApxI 及び ApxII 毒素は豚由能である12，132）．また今のところ Aqx 毒素を分泌する菌

来の細胞のみに宿主細胞特異的な障害性を示すため，

種は A. equuli subsp. haemolyticus 以外には報告されてRTX 毒素が宿種特異性に関与する要因の一つであるといないため，aqx を標的とした PCR は，本菌の同定にも考えられる90）．

使用できると考えられる．

Pusterla らは，Aqx 毒素の発現を調べるために aqxA

9.2.2．A. equuli の血清型について（表10）の転写活性を測定可能な RT-PCR 法を開発した132）．一方，Berthoud らは，aqx 検出のための PCR 法を開発し

A. equuli の血清型に関する報告はない（表10）．
9.2.3．A . equuli の PCR による血清型の同定法について

た12）．

（表10）
A. equuli の PCR による血清型の同定法に関する報告

9.3．Actonobacillus lignieresii

はない（表10）．

反芻獣から分離される A. lignieresii は慢性肉芽腫性炎

9.2.4．A. equuli の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素遺伝子の検出法についてを主徴とする牛アクチノバチルス症（牛の木舌症）や羊
ア ク チ ノ バ チ ル ス 症 の 原 因 菌 で あ る31）． ま た A.

豚と主に子馬から分離される A. equuli subsp. equuli

lignieresii は，馬の胃炎等や，健康馬の口腔内ならびには，RTX 毒素を産生せず，非溶血性である．一方，成馬に咬まれたヒトの咬傷からも分離される32）．反芻獣由

馬からも分離される A. equuli susp. haemolyticus は，好来の A. lignieresii 及び馬由来の A. lignieresii は，生化学

中球・リンパ球に対して細胞毒性を示すとともに溶血活

性状で異なる性状は見つかっておらず，表現型レベルで12）性をもった Aqx 毒素という RTX 毒素を分泌する （図の識別はできないため同一菌種と見なされていた．しか3）．A. equuli と A. suis は， “2.1．” の項にも記載した

し，16S rrn の塩基配列及び細菌の分類・同定の gold

ように，非常に近縁であり，生化学的性状や16S rrn のstandard 法である DDH を用いた遺伝子レベルでの解析

塩基配列解析では，識別が難しい菌種である．A. equuli

では，異種レベルの相同性しか示さない32）．すなわち，

subsp. haemolyticus は溶血性を示すため，過去には馬の両遺伝子種間の16S rrn の塩基配列の相同性は，96.4−

A. suis と 考 え ら れ て い た． し か し，A. equuli subsp.

96.7％（近縁種間の閾値は，98.7−99.0％程度）しかなく，

表10．複数の宿主から分離される細菌の血清型同定用 PCR
菌種
P. multocida

血清型25, 136）あり（莢膜血清型）

血清型同定用PCR の有無

標的遺伝子

文献 a

備考

あり

莢膜合成遺伝子163

莢膜血清型 A, B, D, E, F のいずれかに同定可能

莢膜合成遺伝子

10（163）

文献163の PCR プライマーを利用

LPS outer core 合成遺伝子

55a，55b

Heddleston の LPS 外側コア血清型56）
は16種（O1 ～ 16） あ る が， 8 種 の
い ず れ の LPS 遺 伝 子 型（L1 ～ L8）であるか同定可能─

A. pleuropneumoniae 血清型 4 及び7 と血清学的に交差する株がある96）．

4

A. pleuropneumoniae 血清型同定用の cps PCR で．46株中 1 株が血清型
1 ，46株中 5 株が血清型 7 と型別される．

─A. pleuropneumoniae 血清型 3 と血清学的に交差する株がある32）．

あり55a，55b）
あり（LPS 外側コア血清型）
A, equuli
反芻獣由来 A. lignieresii

馬由来 A. lignieresii（A. genomospecies 1）

a

？
あり？

なし
96）

あり？

？
（PCR 陽性の莢膜多糖抗原の化学構造及び遺伝子構造の解析が必要）あり？ 32）？
（PCR 陽性の莢膜多糖抗原の化学構造及び遺伝子構造の解析が必要）A. pleuropneumoniae cps1
A. pleuropneumoniae cps7

括弧内の数字は，既報の文献のオリジナルな方法をそのまま使用したか，または改変して用いた PCR におけるオリジナルの文献．

家畜衛生学雑誌

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第45巻第 1 − 2 号（2019）

DDH での相同性は70％しかなかった（近縁種間の閾値ある（表 1 及び 9 ）．さらに，発現はしないが apxICABD

は，80％程度）．そのため馬由来の A. lignieresii を反芻毒素遺伝子と相同な DNA を保有（図 2 ）し146），両菌種

獣 由 来 の A. lignieresii と 区 別 す る た め に，A.

は DNA レベルでいくつかの共通性を示す．さらに両菌

genomospecies 1 と暫定的に名付けている32）．

種は生化学性状も類似しており31），抗原性・血清学的レ

9.3.1．A . lignieresii の PCR による同定・検出法についベルでも類似性を持っている（ “9.3.2．A. lignieresii の血清型について ” 参照）32，96）．それにも関わらず，A.

て（表 9 ）
A. lignieresii の PCR による血清型法に関する報告はpleuropneumoniae 及び A. lignieresii はそれぞれ豚及びないが，本菌と細菌学的に類縁な A. pleuropneumoniae

牛（または馬）に高い宿主特異性を示すことは非常に興を同定するために開発された PCR で陽性となる株があ味深い．

る 3 ，29，30，50，51，99，150）．この事からも，A. pleuropneumoniaeと A. lignieresii の高い近縁性が垣間見られる．
9.3.2．A. lignieresii の血清型について
A. lignieresii には凝集反応による血清型別によって，6 つの血清型が存在することが確認されている

131）

10．動物由来のパスツレラ科細菌のRTX 毒素について
豚 か ら 分 離 さ れ る A. pleuropneumoniae，A.

．40

porcitonsillarum，A. suis，A. rossii 及び Glaesserella sp.

年前の報告であるが，日本では黒毛和種の牛から分離さは，いずれも最初は A. pleuropneumoniae で初めて検出れた A. lignieresii を GID によって血清型別した結果，された apxI，apxII 及び apxIII のうち，一つあるいは二血清型 5 が最も多く，次いで血清型 4 ， 1 ， 6 ， 3 ， 2つの遺伝子を保有し，それらの遺伝子にコードされたの順に多かったと報告されている．これは血清型 1 ，

ApxI，ApxII または ApxIII 毒素を産生する（図 1 及び

2 ， 3 及び 4 の順に多かったという牛及び羊由来の株を2）．一方，馬の病原細菌 A. equuli subsp. haemolyticus，

調べた海外の成績と異なっていた

118）

反 芻 獣 の 病 原 細 菌 M. haemolytica， 家 禽 の 病 原 細 菌．

牛のアクチノバチルス症から分離される A. lignieresii

A. paragallinarum 及び G. anatis からは，Apx 毒素以外

は，A. pleuropneumoniae 血清型 4 及び 7 と血清学的にの各菌種に特有な RTX 毒素を産生・分泌する（図 3 ）．

96）

交差する LPS を保有することが報告されている （表また全ての RTX 毒素について調べられているわけでは

10）．一方，馬由来の A. lignieresii（A. genomospecies

ないが，上述のように RTX 毒素の毒性には細胞宿主特1）では，A. pleuropneumoniae 血清型 3 と血清学的に異性が認められるものがある．このことから，豚を宿主交差する株が存在する32）（表10）．

とする Actinobacillus 属細菌と Apx 毒素との間に深い関9.3.3．A . lignieresii の PCR による血清型の同定法につ係性が認められ，非常に興味深い．

いて（表10）

11. おわりに

A. lignieresii の PCR による血清型の同定法は開発されていない（表10）．
9.3.4．A. lignieresii の RTX 毒素と PCR による RTX 毒素
遺伝子の検出法について

PCR による同定・検出及び血清型の同定法は，簡便であり，非特異反応が少なく優れた方法であると思われる．今回様々な動物由来のパスツレラ科に属する菌種の反芻獣由来の A. lignieresii は，A. pleuropneumoniae

PCR 法について紹介したが，同定・検出のための PCRの ApxI 毒素遺伝子 apxICABD と高い相同性を示す DNAについては，様々な遺伝子が PCR の標的遺伝子の候補を保有することがサザンハイブリダイゼーションの成績として提唱されている．複数の研究者によって，様々なで示されているが，ApxI を分泌するという報告は無遺伝子を標的とした PCR の比較の実験も行われているい146）．その理由は ApxI 毒素の上流にある転写に関する上，特異性向上のために改良が行われている．さらに，

プロモーター領域（−35及び−10配列）の変異によるこ

既報の PCR 法を用いた実証試験を行っている PCR 法もとが塩基配列解析によって示されている146）．馬由来のある．しかし，論文では限られた数の株（特に限られた

A. lignieresii（A. genomospecies 1）では，RTX 毒素及国・地域で分離された株）しか検査していない．さらびその遺伝子を保有するという報告は無い．

に，既報の報告を否定する論文もあるため，PCR によ9.4．A. lignieresii と A. pleuropneumoniae についてる菌種の同定・菌検出及び血清型の同定を実施する場合

こ れ ま で 述 べ て き た よ う に A. lignieresii の16S rrn
は，A. pleuropneumoniae の16S rrn と高い相同性を示には，多くの研究者によって確認された方法を用いた方がよいと思われる．

し（ “2.1．はじめに ” 参照），A. pleuropneumoniae 同定

例えば，A. pleuropneumoniaeの菌種同定用PCRでは，

用 omlA PCR でも陽性反応を示す株があるという報告がomlA や apxIVA を標的にした PCR3， 4 ，29，50，52，74，76，125，

伊藤博哉：動物由来のパスツレラ科細菌の PCR による同定・検出・血清型の同定法ならびに RTX 毒素
143，168，177）29，が多く（表 1 ），H. parasuis の血清型の同定8 ） Angen, Ø., Mutters R, Caugant, D. A. (1999)

用 PCR では，莢膜多糖抗原遺伝子を標的にした PCR がTaxonomic relationships of the [Pasteurella]

59，77，94，102，173）（表 4 ）．遺伝子解析

haemolytica complex as evaluated by DNA-DNA

等単一の遺伝子検査で菌種の最終確定を行うことは困難

hybridizations and 16S rRNA sequencing withであるため，生物学的・生化学的性状検査の成績等と併

proposal of Mannheimia haemolytica gen. nov.,

せて総合的な診断に PCR を有効に利用すべきと考える．

comb. nov., Mannheimia granulomatis comb. nov.,

本稿が動物由来のパスツレラ科細菌の同定，検出及びMannheimia glucosida sp. nov., Mannheimia

血清型を行う際の参考となるとともに，パスツレラ科細ruminalis sp. nov. and Mannheimia varigena sp.

多いように思われる菌の病原性因子であり，宿主特異性や進化にも関連性のnov. International Journal of Systematic

ある RTX 毒素について興味を持つきっかけとなればあBacteriology. 49, 67-86.
9 ） Angen, Ø., Oliveira, S., Ahrens, P. et al. (2007)

りがたい．

引

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要173）Wang, Z., Zhao, Q., Wei, H. et al. (2017) Prevalence旨and seroepidemiology of Haemophilus parasuis in

家畜・家禽に病原性を示すパスツレラ科に属する細菌

Sichuan province, China. PeerJ. 5:e3379. doi:は多いが，表現型のみでは同定が容易ではない菌種が多10.7717/peerj.3379.

数存在する．本稿では，家畜・家禽に病原性を示す病原174）綿村崇宏（2018）牛の細菌性呼吸器病の病理．家
畜感染症学雑誌． 7 ，137-143．

性パスツレラ科細菌の（i）PCR による菌種の同定及び検出法，（ii）パスツレラ科細菌の血清型，（iii）PCR に175）Watt, A. E, Browning, G. F, Legione, A. R. (2018)  

よる血清型の同定法，（iv）RTX 毒素とその遺伝子のA novel Glaesserella sp. isolated from pigs with

PCR による検出法について概説する．RTX 毒素は，菌

severe respiratory infections has a mosaic

種同定の参考にも利用できる上に，パスツレラ科細菌のgenome with virulence factors putatively

宿主特異性にも関係する重要な病原性因子である．

acquired by horizontal transfer. Applied andEnvironmental Microbiology. 84, pii: e00092-18.

キーワード：パスツレラ科細菌，診断，血清型，RTX

doi: 10.1128/AEM.00092-18.

毒素，PCR

176）Wisselink, H. J., Cornelissen, J. B. W. J., van der日本家畜衛生学会
第90回大会

講演要旨集

主 催：日本家畜衛生学会

日本家畜衛生学会第90回大会とき：2019年 7 月20日（土） 発表会 13：30〜16：20（総会 13：00〜13：30）
ところ：麻布大学（獣医学部棟， 7 階大会議室）

一般講演
座長

宮﨑

13：30〜15：00
茂（安全研）

13：30〜13：45
1 ．散歩中の犬間の接触率および狂犬病に対する犬飼育者の行動
ナイジェル
座長

クワン・○井上舞・山田章雄・杉浦勝明

白井淳資（農工大）13：45〜14：00

2 ．携帯品で持ち込まれた非加熱肉等のウイルス汚染状況調査
小林芳史・柴田明弘・稲垣麻由子・栁澤成江・尾坂優之・遠藤明仁・
岩中麻里・○大友浩幸
座長

嶋﨑智章（動薬検）
14：00〜14：15

3 ．養豚場72戸における2015〜2017年の抗菌剤の使用量の記述的調査○雷座長

志皓・山根逸郎・山崎久則・内藤恵・呉克昌・杉浦勝明

廣瀬和彦（MeijiSeika ファルマ）
14：15〜14：30

4 ．クレブシエラ乳房炎の重篤度と分離された原因菌の好中球貪食抵抗性の関連○インペラトリス瑠伽・楠本周平・石村麻莉乃・澤松祐人・篠塚康典・
河合一洋
座長

須藤慶子（群馬県）
14：30〜14：45

5 ．食性の異なる各種動物からのウェルシュ菌の分離調査○清水かな・上塚浩司

座長

山本孝史（前東京農大）
14：45〜15：00

6 ．競走用馬の感染性とみられる皮膚炎からの細菌・真菌の分離同定と薬剤感受性調査（ 2 ）○牛屋重人・上塚浩司

休憩

15：00〜15：20

教育講演
座長

15：20〜16：20

白井淳資（農工大）

家畜の下痢症から検出されるウイルスについて
長井

誠

先生

家畜衛生学雑誌

421

第45巻第 1 − 2 号（2019）

散歩中の犬間の接触率および狂犬病に対する犬飼育者の行動
ナイジェル

クワン 1 ）・◯井上

舞 1 ）・山田章雄 2 ）・杉浦勝明 1 ）（ 1 ）東京大農学国際， 2 ）東京大学獣医）
Key words：contact, dog walking, practices, rabies, survey【背景】
犬の散歩は，飼い主と犬双方に健康上有益な身体活動とされているが，一方でいくつかの研究では散歩中の犬同士の触れ合いや関係が狂犬病と関連しているのではないかということが論じられている．日本は狂犬病清浄国であり，飼い犬は年 1 回の予防注射が義務付けられている．また日本は島国であり，厳しい輸入検疫により侵入リスクは低いが，仮に違法に持ち込まれるペットなどを通じて感染動物が侵入した際の飼い主の知識や行動は感染拡大に大きく影響することが考えられる．本研究では，保険加入犬の飼い主に対してインターネット調査を使用して日本の犬の散歩習慣および散歩中の犬同士の接触等について調査し，狂犬病侵入のリスクを評価することが目的である．

【材料と方法】
アンケートフォームは無料の web フォームを使用して作成され，アニコム損保の犬の契約者208,509人に対して調査協力を，メールマガジンを通じて依頼した．2017年 4 月17日〜 5 月17日の間で1,151人から回答を得た．犬との接触回数は散歩の頻度や散歩中に他の犬と出会う頻度，出会った場合の接触回数などに基づき推定した．加えて， 5 段
階のリッカート尺度を用いた10の設問を作成し，狂犬病発症の潜在的な可能性がある状況に遭遇した場合の飼い主の行動意識（正しい行動をとれるかどうか）を評価した．

【結果と考察】回答者の96.4％は，飼い犬を散歩する習慣があり，散歩の頻度は 1 日に 1 〜 2 回が最も多く（75.9％），散歩時間は30分〜 1 時間が最も多かった（83.1％）．散歩中の犬が他の犬と接触する確率は，0.83（95％信頼区間：0.81〜0.85）で，一日あたりの接触率は平均2.73（2.42〜3.11），標準偏差6.39（5.18〜7.84）であった．これは，日本の犬の83％が散歩
中に他の犬と触れ合う可能性があり， 1 日平均2.73回接触していることを意味する．重回帰分析より，この接触率は
主に飼い主の社交的な行動に影響されることがわかっており，地理的な特徴や，犬のサイズや飼い主の年齢などの影
響度合いは低かった（Table 1）．
仮に狂犬病の発生が疑われる（につながる）状況を想定したリッカート尺度を用いた設問への回答を分析した結果（n ＝972），犬の散歩中の犬の咬傷事故や野良猫に引っかかれるケガに関連する状況時の行動意識（正しい行動をとれるかどうか）は 4 段階評価で平均2.99（標準偏差0.9）であった．また，犬の散歩中に野良や野生の動物を見かけた
場合の飼い主の行動意識は，平均3.70（0.58），狂犬病の特徴的な臨床症状がない野良犬や野生動物に犬の散歩中に咬まれるなどの状況での行動意識は，3.84（SD ＝0.34）であった．また，飼い主の行動意識は，居住地域と関連しており，関西居住の飼い主に比べ，関西以外の地域の居住者の方が意識が高いことが明らかとなった（Table 2）．

「日本家畜衛生学会第90回大会」要旨集

43

Table 1.  Association of the log-transformed daily contact rate between companion dogs during a walk（N contact, log ）with significant predictors including nature and duration of the walk, whether the walk is during peak
hours, companion dog density of the prefecture where the owner lives, breed size of the dog and age ofthe owner modelled by multiple linear regression

Table 2.  Association of the level of best practice towards potential cases of rabies among Japanese dog owners
with significant predictors including age and region of residence of the owner and breed size of the dog（s）modelled by multiple linear regression

家畜衛生学雑誌

442

第45巻第 1 − 2 号（2019）

携帯品で持ち込まれた非加熱肉等のウイルス汚染状況調査
小林芳史・柴田明弘・稲垣麻由子・栁澤成江・尾坂優之・遠藤明仁・岩中麻里・○大友浩幸（農林水産省動物検疫所）
Key word：Animal Quarantine, hand carry, meat products, PCR【背景と目的】動物検疫所では，鳥インフルエンザウイルス（AIV），アフリカ豚コレラウイルス（ASFV），口蹄疫ウイルス（FMDV）等により引き起こされる越境性動物疾病の発生地域から持ち込まれ，携帯品検査で不合格となった非加熱の家きん肉（平成27年度〜），偶蹄類動物の肉（平成28年度〜）について，ウイルス汚染状況調査を実施している．
また，昨年 8 月に中国でアフリカ豚コレラが発生したことから，ハム・ソーセージ・ベーコン，調整品についても検査を開始した．調査に当たっては，調査結果を積極的に公表することで国内侵入に対する危機意識の共有を図るとともに，検体に付随する情報（製品情報，所有者情報等）も収集し，より効果的で厳しい手荷物検査を実施した．さらに本年 4 月22日からは，海外からの肉製品の違法な持込みに対して，個人消費用やお土産用であっても，罰則の適用について厳格に対応をすることとした．

【材料と方法】
平成27年 6 月〜平成31年 4 月末までに携帯品旅具検査の結果，任意放棄され精密検査に供した非加熱の肉等，24か国・ 2 地域の計 1 ，056件（家きん由来の畜産物： 9 か国・ 2 地域の443件，偶蹄類由来の畜産物：24か国・ 2 地域の613件）を対象（表 1 ，2 ）とし，病原学的検査として，①家きん肉等は発育鶏卵接種によりウイルス分離を実施し，陽性時には AIV 亜型の特定等の性状確認を，②偶蹄類動物の肉等は PCR を実施し，陽性時にはウイルス分離及び性状確認を実施した．また，検体・旅客に付随する情報として，搭載国，動物種，所有重量，入国目的，入手経路等の持込み状況を収集した．

【結果】
家きん由来の畜産物では，中国，台湾及びベトナムから持ち込まれたあひる肉又は鶏肉から AIV20株及びニューカッスル病ウイルス 2 株が分離された．AIV20株のうち高病原性の AIV は 9 株（H5亜型： 6 株，H7亜型： 3 株）であった（表 3 ）．偶蹄類動物の肉等では，中国及びベトナムから持ち込まれた豚肉，ソーセージ等から ASFV 遺伝子
30例が検出され，うち17例について塩基配列解析を実施した結果，2018年中国分離株と VP72領域205bp の比較において100％の相同性を示した．また，これら30例のうち 9 例について動物衛生研究部門でウイルス分離を実施した結果，中国から持ち込まれた豚ソーセージ 2 検体から感染性を有する ASFV が分離された（表 3 ，図）．

【考察】
調査の結果，非加熱の肉等から感染性のある AIV，ASFV が分離されたことから，これら疾病が発生している中国，ベトナム等から持ち込まれる肉等については，携帯品畜産物を介して我が国へ越境性動物疾病が侵入するリスクは少なからず存在することが確認された．引き続き本調査を継続的に実施し，その結果を踏まえ違法な肉製品の持込みに対する検疫を強化していくこととしている．

「日本家畜衛生学会第90回大会」要旨集
表 1 ．ウイルス汚染状況調査検体数（平成27年 6 月〜平成31年 4 月末）

表 2 ．ウイルス汚染状況調査国別検体数（上位 5 か国）（平成27年 6 月〜平成31年 4 月末）

表 3 ．非加熱畜産物からのウイルスの分離状況

図．ASFV 遺伝子検出検体写真（ 1 〜30例目）

45

家畜衛生学雑誌

463

第45巻第 1 − 2 号（2019）

養豚場72戸における2015年〜2017年の抗菌剤使用量の記述的調査〇雷志皓 1 ）・山根逸郎 2 ）・山崎久則 2 ）・内藤

恵 2 ）・呉克昌 3 ）・杉浦勝明 1 ）（ 1 ）東京大農学国際， 2 ）農研機構動物衛生研究部門， 3 ）バリューファームコンサルティング）
Key word：pig production, antimicrobial use, farrow-to-finish farm

【背景】
獣医療分野での薬剤耐性菌の出現は，動物における治療効果の低下につながるのみならず，家畜等を介してヒトへ感染する可能性も指摘されている．抗菌剤の慎重使用によって耐性圧を下げることは薬剤耐性菌の出現を抑制する重要な柱であり，抗菌剤使用量の継続的なモニタリングが必要である．現在日本における動物用抗菌剤の最大の用途は養豚分野であるが，農家レベルでの抗菌剤使用量のモニタリングデータが十分あるとは言えない．本研究では肉豚として出荷された肥育豚 1 頭あたりの有効成分重量という指標を用いて，養豚農家における2015年から2017年の抗菌剤
使用量の記述的調査を行った．

【材料と方法】
2015年，2016年および2017年に日本養豚開業獣医師協会（JASV）に所属する獣医師と契約し PigInfo に参加していた養豚農家のうち，繁殖農家，肥育農家以外の農家（すなわち，一貫経営農家）かつ 3 年間通して使用量測定の対象となった72戸を調査対象とした．PigInfo のデータベースから農家の所在都道府県名，出荷された肉豚頭数，母豚
更新用に保留された雌豚頭数，さらに各抗菌剤の投与経路別有効成分重量をデータとして収集し，WHO の ATCvet
分類システムに基づき抗菌剤を13種類に分類した．72戸の農家を北海道・東北（16戸），北関東（25戸），南関東（20戸），中部（ 5 戸），九州（ 6 戸）の 5 地域に，また，肉豚出荷頭数と更新豚頭数の合計の 3 年間の平均値をもとに，
小規模（24戸），中規模（24戸），大規模（24戸）と区分した．各年の抗菌剤使用農家の割合を当該抗菌剤の使用農家数を分析対象農家数で割り算出した．また，各農家における抗菌剤使用量については，使用された抗菌剤の有効成分
重量を出荷された肉豚頭数で割り，肉豚 1 頭当たりの有効成分重量（g/ 頭）を計算し，一元分散分析（対応あり）
で全国レベルでの年次間での有意差の有無を調べるとともに，二元分散分析（対応あり）で地域別および農場規模別
で年次間の有意差の有無を調査した．

【結果】
分析対象となった72戸のうち全戸および69戸（96％）において2015年から2017年まで 3 年間を通じ何等かの抗菌剤がそれぞれ注射および経口投与されていた．
2015年，2016年 お よ び2017年 の 出 荷 肉 豚 1 頭 当 た り の 全 有 効 成 分 重 量 の 総 計 値 は そ れ ぞ れ 平 均23.29（SD ＝17.34），22.74（SD ＝18.34）および26.00（SD ＝22.16）g/ 頭であり，97％の抗菌剤が経口投与されていた（Figure）．
最も使用割合が高い抗菌剤はテトラサイクリンであり，続いてマクロライド，ペニシリンおよびサルファ剤であった．地域別に見た場合，北関東，南関東および九州地方では増加傾向が見られた一方，中部では減少傾向が見られた．また，北海道・東北では 3 年間に有意な差は見られなかった．2015年は北海道・東北に比べ南関東での使用量が有意に多く，2016年と2017年では北関東および南関東の両地域で北海道・東北に比べて使用量が多かった．規模別では，2017年の中規模グループと大規模グループとの間に有意差があった．また，小規模グループ，大規模グループでは増加傾向にあったが，中規模グループでは 3 年間の使用量に有意差は見られなかった．

「日本家畜衛生学会第90回大会」要旨集

47

Figure.  B ox-and-whisker plot of total usage of antimicrobials (A), oral antimicrobials (B) and injectable
antimicrobials (C) in grams of active ingredient per fattening pig for the years from 2015 to 2017. The
dots stand for range out of ±1.5×interquartile range (IQR)

家畜衛生学雑誌

48

4

第45巻第 1 − 2 号（2019）

クレブシエラ乳房炎の重篤度と分離された原因菌の好中球貪食抵抗性の関連〇インペラトリス瑠伽・楠本周平・石村麻莉乃・澤松祐人・篠塚康典・河合一洋（麻布大学獣医学部衛生学第一研究室）
Key word：Klebsiella, mastitis, neutrophil, severity, resistance to PMN exposure【背景・目的】クレブシエラ乳房炎の症状には全身症状を示し死に至る重篤なものから局所症状のみの軽度なものまであることが知られている．近年，大腸菌群による乳房炎の重篤度の違いが乳房炎罹患分房内の菌量と関連していることが報告された．乳房内の菌量は生体の免疫機能だけでなく原因菌側の要因によっても影響されると考えられる．
本研究は，クレブシエラ乳房炎野外発生症例から分離された菌株の好中球貪食抵抗性と乳房炎の重篤度との関連を明らかにすることを目的とした．

【材料・方法】
ⅰ）実験供試菌 野外発生症例から分離されたクレブシエラ属菌14株のうち重症株 9 株（Klebsiella. pneumoniae 7 株，K. oxytoca
2 株），軽症株 5 株（K. pneumoniae 5 株）を用いた．菌種は PCR を用いて遺伝子学的に同定した．実験供試菌は
BHI 培 地 を 用 い，24時 間37℃ で 増 菌 培 養 し た 後，PBS で 2 回 洗 浄（3500rpm 15分 ） し，RPMI-1640 with
L-Glutamin，Phenol Red and HEPES（和光純薬株式会社）に再浮遊し104個 /ml に調整した．
ⅱ）好中球
 臨床上健康な麻布大学飼育牛の頸静脈から採血した血液から比重分離法を用いて好中球を分離した．分離した好中球は純度95％以上（チュルク染色），生存率99％以上（トリパンブルー染色）を確認後，RPMI-1640（前述）で希釈し103個 /ml に調整した．
ⅲ）実験供試菌と好中球の感作
 菌液と好中球浮遊液は MOI 10（好中球 1 個に対して菌体10個）になるよう 1 ml ずつ混合した．感作（ 0 時間）
1 時間後まで振盪培養し，その後2.5時間後まで 5 ％炭酸ガス培養した．
ⅳ）吸光度の測定
 感作時と感作0.5，1 ，
1.5，2 ，
2.5時間後にマイクロプレートリーダー（Thermo Scientific）により吸光度（600nm）を計測した．
ⅴ）統計処理 実験供試牛の生体要因（日齢，分娩後日数，初診時体温，発症から淘汰までの日数）の比較にはマンホイット
ニーの U 検定を用いた．生存率はカイ 2 乗検定を用いた．吸光度の群間比較はマンホイットニーの U 検定を用いた．

【結果】
生体要因（日齢，分娩後日数，初診時体温，発症から淘汰までの日数）はいずれも群間に有意差は見られなかったが，生存率は重症群のもので有意に低かった．菌液のみ（ポジティブコントロール）の吸光度は両群に差が見られなかったが，好中球を感作させた試験群では感作1.5時間後の軽症群の吸光度が重症群に比べ有意に低下していた．

「日本家畜衛生学会第90回大会」要旨集

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【考察】
本実験では重症例と軽症例では好中球との感作1.5時間後の吸光度に有意な差がみられた．予備実験によりクレブ
シエラ属菌において吸光度と菌量の相関がみられたことから，両群に好中球の貪食に抵抗する能力の差がある可能性が考えられた．好中球による貪食への抵抗性は好中球存在下でも生存しやすく，罹患分房内で増殖しやすいと考えられることから，重篤度の違いに影響を与えている可能性が考えられた．

表 1 ．重症群と軽症群の生体要因と予後の比較

図 1 ．試験群，対照群における重症群と軽症群由来菌株の吸光度の経時的変化

家畜衛生学雑誌

50

5

第45巻第 1 − 2 号（2019）

食性の異なる各種動物からのウェルシュ菌の分離調査〇清水かな・上塚浩司（茨城大学大学院農学研究科農学専攻動物保健衛生学研究室）
Key word：Clostridium perfringens, animal zoo, feeding relationship, high protein requirement【背景と目的】
私たちの研究室ではこれまでに，カラス 1 ），スズメ 2 ），ムクドリ及び野生ネズミ 3 ）の腸内容物からウェルシュ菌の分離を行ってきたが，分離割合（ウェルシュ菌が分離された数 / 総数）および分離菌量には動物種間で違いがあり，調べた中ではどちらもカラスが最大であった．分離菌量には死後変化の影響も考えられるが，実験モデルを用いて検討から 4 ）その可能性は低いと考えている．そこで今回は，ウェルシュ菌の発育が高タンパク質要求性であることか
ら，食餌による影響を検討した．この目的のため，日立市かみね動物園に協力をあおぎ，食性が様々な飼育動物の糞の提供を受け，ウェルシュ菌の分離を実施した．また，分離されたウェルシュ菌株は毒素遺伝子の保有についても調査を行った．

【方法】
日立市かみね動物園で採取された47種の動物からの糞便サンプル98個を滅菌リン酸緩衝液で段階希釈し，カナマイ
シン入り10％卵黄 CW 寒天培地に塗布し38℃で一晩培養した．純化された菌株が得られるまで分離培養を行い，培地上の卵黄反応を示すコロニーに対して性状検査を実施した．性状検査の結果ウェルシュ菌と同定された菌株の毒素型
は PCR で決定した．さらにエンテロトキシン遺伝子・β2毒素遺伝子の保有の確認も PCR で決定した．ウェルシュ菌のコロニー数と希釈倍率から腸内容物 1 g 中の菌量（CFU/g）を算出した．

【結果】
今回調査した飼育動物47種のうち，ウェルシュ菌は13種の動物から分離された．食性別に整理すると，種別の分離
割合は肉食動物で83.3％（5/6種），雑食動物で25.9％（7/27種），草食動物で7.1％（1/14種）であった（表 1 ）．また，
ウェルシュ菌の分離菌量は草食動物と雑食動物に比較して，肉食動物からの方が多量であった（表 2 ）．毒素型はすべて A 型であり，エンテロトキシン遺伝子・β2毒素遺伝子はどの菌株においても検出されなかった．

【考察】
ウェルシュ菌の分離割合は肉食動物で高かったことから，ウェルシュ菌の保有には食餌内容が影響し，腸内に動物性タンパク質の多いことがウェルシュ菌の発育に適していると推察された．これは壊死性腸炎の予防の上で，家禽飼料の組成の検討に有用な情報となる．分離されたウェルシュ菌の毒素型がすべて A 型であったことは，他の多くの報告と同様であった．また，今回得られた分離菌株の遺伝学的近縁性の有無については今後検討を行う予定である．
1 ）野生カラスの腸内容物からの Clostridium perfringens の分離および分離菌株の遺伝学的解析．日本家畜衛生学会
第88回大会．2018年 7 月．
2 ）スズメの腸内容物からの CW 卵黄寒天培地を用いたウェルシュ菌分離．日本家畜衛生学会第85回大会．
2016年12月．
3 ）野生ネズミの腸内容物中と糞でのウェルシュ菌の菌量の対応．日本家畜衛生学会第85回大会．2016年12月．
4 ）腸内のウェルシュ菌量の死後変化についての検討モデルの開発（ 2 ） 日本家畜衛生学会第89回大会．2018年12月．

「日本家畜衛生学会第90回大会」要旨集

表 1 ．ウェルシュ菌が分離された食性別の動物種一覧と分離割合

表 2 ．分離されたウェルシュ菌の菌量（CFU/g・全個体）

51

家畜衛生学雑誌

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6

第45巻第 1 − 2 号（2019）

競走用馬の感染性とみられる皮膚炎からの細菌・真菌の分離同定と薬剤感受性調査（ 2 ）○牛屋重人 1 ）・上塚浩司 2 ）（ 1 ）うしや競走馬クリニック， 2 ）茨城大学農学部）
Key word：dermatitis, resident bacteria, opportunistic infection, race horse【はじめに】
前回の発表では，競走用馬の皮膚炎から分離された細菌の多くが常在菌であり，日和見感染に因ることが示唆された．しかしながら，実際の病変は多様であり，感染様式や関与病原体の相違があることが窺われる．そこで今回の調査では，49頭の症例をさらに追加して，病変を発生部位と性状から分類し，分離同定された細菌・真菌の組み合わせに一定の傾向がないか検討した．

【材料と方法】
2016年 8 月から2019年 5 月に当クリニックで治療したサラブレッド種競走用馬のうち，感染性とみられる皮膚炎を発症した122頭について，患部の体毛，鱗屑，痂皮を採取し，細菌・真菌の好気性培養を実施した．このうち19頭は複数回調査したため，調査対象は延べ141頭となった．この中には，なかなか治癒しないため同じ部位から複数回採材したものや，同じ馬が異なる部位に異なるタイプの皮膚炎を発症したものも含まれる．
細菌培養は主に SCD 培地を使用し，単離したコロニーについてグラム染色後の光学顕微鏡検査を行った．真菌培
養は皮膚糸状菌鑑別培地を用いた．細菌・真菌・酵母の同定は大半を（株）テクノスルガ・ラボに委託し，細菌では
MALDI-TOF/MS 法もしくは16S rDNA 解析，酵母・真菌では微視的な形態観察，もしくは28S rDNA 解析を依頼した．

【結果】
細菌は141頭から254菌種が分離され，105頭から Staphylococcus 属，30頭から Corynebacterium 属が分離同定された．これらは単独で分離された場合もあれば，他の細菌や真菌が同時に分離された場合もあった．病変を発生部位から背腹部，頚肩部，肢部，顔部，臀部，その他の 5 つに分類し，発生部位と分離された細菌・真菌の組み合わせで整理 し た 結 果， 調 教 中 に 装 着 す る 馬 装 具 に よ っ て 皮 膚 に 擦 傷 が 生 じ や す い 背 腹 部 で は65頭 中53頭（81.5％） で
Staphylococcus 属菌が分離同定された．しかし外傷の生じにくい顔部，臀部の病変で Staphylococcus 属菌が分離されたのはそれぞれ36％，21％と低値であった．背腹部の病変を，さらにその特徴から米粒大丘疹，調教ゼッケン擦れ，結節性丘疹の 3 つに細分類したところ，調教ゼッケン擦れの病変では 8 検体すべてで Staphylococcus 属菌が分離されたのに対して，結節性丘疹からは，Staphylococcus 属菌と同時にそのほかの細菌や真菌が分離される割合が高く，55.0％（17頭中11頭）であった．

【考察】
今回49頭の症例を追加しても，前回同様に常在菌である Staphylococcus 属と Corynebacterium 属が分離菌の主体を占め，競走馬の皮膚炎は常在菌に起因する傾向が推察された．さらに病変の分類からは，馬装具や踏着などによって損傷が生じやすい部位の皮膚炎から Staphylococcus 属が分離されることが多いこと，難治性である結節性丘疹からは複数の病原体が分離される傾向があったことから，皮膚炎の発生には常在菌の急性的な単純増殖だけではなく，皮膚環境の変異に呼応した細菌フローラの緩徐な変化が関与していることが示唆された．

「日本家畜衛生学会第90回大会」要旨集

表 1 ．分離された細菌・真菌の組み合わせと発生部位との関係

53

55

教育講演

家畜の下痢症から検出されるウイルスについて
長

井

誠＊

Enteric viruses from feces of diarrheic animals
Makoto Nagai ＊（＊ Laboratory of Infectious Disease, School of Veterinary Medicine, Azabu University）
  家畜衛生学雑誌

45，55〜56（2019）

家畜の下痢症は生産性の低減につながる要因であり，れていないのが現状である．近年，次世代シークエン

米国での子牛の下痢症による被害額は年間100-200億円

サーの登場で，培養不能の病原体のメタゲノム解析が可と試算されている．家畜の下痢症の原因はウイルスが起能となり，これまで原因不明であった症例への応用が期因するものも多く，牛では牛 A 群ロタウイルス，牛コロ

待されている．著者らはこれまで次世代シークエンサー

ナウイルスおよび牛アデノウイルス，豚では伝染性胃腸を用いて家畜の糞便中のウイルスを網羅的に探索してき炎ウイルス，豚流行性下痢ウイルスおよび豚ロタウイル

た．本手法を用いることで，下痢症の原因となるウイル

スが下痢症の原因となる病原体として知られている 1 ）．

スが下痢症から検出されるのは当然のことであるが，健

比較的近年になって培養法の確立や遺伝子情報の蓄積に康な家畜の正常な糞便からもかなりの数のウイルスが検より，牛の B 群および C 群ロタウイルスおよび牛トロウ

出されることがわかった．このことは，下痢便からウイ

イルスなどが新たな家畜下痢症の病原体であることが明

ルスが検出されても必ずしもそれが下痢症の原因である

らかとなった 2 − 4 ）．遺伝子診断技術の進歩により，家畜とは言えないことを示している．遺伝子診断技術が発展

保健衛生所，食肉衛生検査所などでは PCR 法および RT-すると，糞便から見つかるウイルスの遺伝子情報も増PCR 法による診断法がルーチンで行われるようになえ，プライマーが開発されて PCR および RT-PCR の実り，かつてウイルス分離法しか病原診断の手法がなかっ施が可能となる．ウイルス遺伝子検査は簡便であるゆた頃に比較すると，診断可能な症例が増えている．しかえ，それだけに頼ると，下痢症の本当の原因を誤診してしながら PCR 法はプライマー情報のある疾患しか診断しまう可能性があることは十分に留意すべきことで，総できないこともあり，現在でも原因が特定されず原因不合的に慎重に診断を行うことが重要と考えられる．腸管明と診断される症例は少なくなく，感染性と考えられる

ウイルスには分離培養の困難なものが少なくなく，これ下痢症の原因調査では依然として何割かは原因が特定さらは分離して感染実験を行うことが不能であるゆえ，病

長井

誠（ながい

まこと）

石川県出身
昭和61年 3 月に麻布大学大学院獣医学研究科獣医学専攻修士課程修了．昭和61年 4 月より石川県庁へ入庁し，平成24年 1 月に退職するまで畜産試験場及び家畜保健衛生所に勤務した．平成15年 6 月に東京大学大学院農学生命科学
研究科にて博士号を取得．平成24年 2 月より東京農工大学農学部共同獣医学科獣医伝染病学研究室及び農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センターに特任准教授として，学部生及び大学院生の教育及び主に家畜伝染病についての研究に従事．平成28年 4 月から石川県立大学生物資源環境学部生産科学科動物繁殖学研究室に教授として着任
し，豚の体外受精などを通じた教育・研究を行った．平成30年 4 月より現職．学生の指導の傍ら，家畜及び野生動
物のウイルス感染症を中心とした診断，予防に関する研究を行っている．
＊
麻布大学獣医学部獣医学科伝染病学研究室 教授

家畜衛生学雑誌

56

第45巻第 1 − 2 号（2019）

原性を明らかにすることは容易ではない．そこで我々

引は，次世代シークエンスでケースコントロールスタディ
を重ね，糞便中のウイルスの家畜に対する下痢原性と進化過程を調べている．

用

文

献

1 ）病性鑑定マニュアル第 4 版，農林水産省消費・安全局監修

我々が行ってきた次世代シークエンス成績から，糞2 ）Chang, K.O., Parwani, A.V., Smith, D., et al.（1997）

便からは多様なウイルスが検出され，下痢症の原因とな

Detection of group B rotaviruses in fecal samples

るウイルス以外に家畜に対する影響は現在のところ無視

from diarrheic calves and adult cows and

できる範囲内と思われるウイルスも少なくないことが分

characterization of their VP7 genes. J Clin

かった．しかし，次世代シークエンスで検出されたウイ

Microbiol. 35, 2107-2110.

ルス遺伝子全体を解析してみると，遺伝子再集合や遺伝

3 ）Hoet, A.E., Saif, L.J., （2004） Bovine torovirus

子組み換えでウイルスが進化している状況が確認され，（Breda virus）revisited. Anim Health Res Rev. 5,

現在無視できるレベルの糞便ウイルスが突然病原性を獲

157-171.

得する可能性も否定できない．現在，次世代シークエン

4 ）Mawatari, T., Taneichi, A., Kawagoe, T., et al.

スはコストもかかり，得られた膨大なデータの解析にも（2004）Detection of a bovine group C rotavirus

高価なソフトが必要であり，ルーチンで行うことができfrom adult cows with diarrhea and reduced milk

るようになるには時間がかかりそうだ．しかし糞便中のproduction. J Vet Med Sci. 66, 887-890.

ウイルスを監視していくことは意義のあることと考えられるため，新規ウイルスを含む糞便中に存在するウイル
スデータの集積を続けていくため今後も効率的なサーベ
イランスが必要と考えられる．

57

会員へのおしらせ①「家畜衛生フォーラム2019」の開催について
主催：日 本 家 畜 衛 生 学 会
共催：（一財）生物科学安全研究所
後援：農

テーマ：「牛乳房炎の診断，治療及び予防の最前線」
日時及び場所
日時：2019年12月20日（金）13：00〜17：10
場所：Meiji Seika ファルマ（株）本社講堂
東京都中央区京橋 2 − 4 −16（東京メトロ銀座線「京橋駅」下車徒歩 1 分，
JR「東京駅」下車徒歩10分）
 牛の乳房炎は，乳牛の疾病の中で最も大きな損害を与えている疾病で，その経済損失は年間800億円にも上るといわれており，生乳生産上の最も大きな損耗要因として，また公衆衛生上，安全な原料乳の生産を行う上でも酪農業界にとって喫緊の課題となっている．
 一方，近年では酪農環境の変遷により，乳房炎の治療法についても多様化してきている．特に抗菌薬の薬剤耐性については乳房炎の治療においても例外ではなく，適正治療，慎重使用に基づく使用が強く求められている．昨年 9 月に農林水産省の HP に公表された「牛乳房炎抗菌剤治療ガイドブック」は現時点での最新の診断・治療の考え方を示している．今回は，その概要についての講演をいた
だき，難治性乳房炎や新たな抗菌剤以外の治療法，また今注目の乳房炎ワクチンの効果についても講演いただく．

座長
河合一洋

先生（麻布大学），林

智人

先生（農研機構動物衛生部門）

13：00−13：06
学会理事長および共催機関理事長挨拶（各 3 分）
13：06−13：09
今回の企画について（ 3 分）
演題および講師
13：10−14：10①乳房炎の診断と治療の考え方（60分）

河合一洋

先生（麻布大）14：10−14：40② Coliform 乳房炎の病態と治療戦略（30分）

篠塚康典

先生（麻布大）

林

水

産

省（予定）

58

14：40−15：25③マイコプラズマ・ボビスの病原因子とその対策 （45分）

樋口豪紀

先生（酪農大）15：25−15：45
休憩（20分）
15：45−16：15④サイトカイン療法（30分）

菊佳男

先生（農研機構動物衛生部門）

16：15−16：45⑤乳房炎ワクチンとその効果（30分）

検崎真司

先生（鹿児島 NOSAI）

16：45−16：50
会場設営（ 5 分）
16：50−17：10
総合討論（20分）②第91回大会の開催について「家畜衛生フォーラム2019」を開催する12月20日（金）の午前中に，フォーラムと同じ会場で第91回大会の開催を予定しています．詳細については改めてお知らせします．

59「家畜衛生学雑誌」投稿規程
Key words（キーワード）をつける .

1 ．本誌には原則として，家畜衛生に関する総説，原著論文，短報を掲載する．なお，原稿は編集委員会事

6 ）英語論文および和文論文の英文 Summary は，務局へ電子メール添付（PDF ファイル）で提出す

投稿前にしかるべき校閲を受けること．

る．印刷原稿 3 部（うち 2 部は鮮明なコピーでもよ

7 ）原著論文で刷り上り 8 頁（30文字×25行＝750い）の書留郵便あるいはレターパックによる提出も文字で，図表を含めて16枚程度）までは，印刷可とする．

費を本学会で負担する．ただし，超過ページに

2 ．投稿にあたり，論文掲載までの対応を行う連絡著者

ついては，その費用を著者の負担とする．な（コレスポンディングオーサー）は，投稿原稿が他

お，総説についてはこの限りではない．また，誌にすでに掲載あるいは投稿中ではないこと，著者

カラーや特殊な用紙での印刷は，その費用を著者の負担とする．

全員が投稿論文の内容及び掲載に同意していることを記載した文書（カバーレター）を提出すること．

8 ）使用する動植物・微生物などの学名はイタリッ
ク体で表記する．

3 ．筆頭著者あるいは連絡著者は本学会会員であるこ9 ）度量衡の単位，略記は SI 単位系を基本とし，と．

以下の例に従う．

4 ．掲載論文は原著論文，短報，総説（刷り上がり 4 頁
以下のミニレビューを含む），技術資料とする．

［例］m，cm，mm，µm，nm，kg，g，mg，µg，ng，L，mL，µL，nL M，mM，µM，％，cm2，
m3，

5 ．全ての投稿論文は編集委員及び複数の審査員が審査し，編集委員長が掲載の採否を決定する．

hr，min，sec，℃，pH，Pa（血圧は mmHg，

6 ．投稿論文は和文または英文とし，次の指示（記述順序など）に従うこと．

生体内圧力は Torr）など．
10）表および図（写真を含む）は用紙 1 枚に 1 つと

1 ）論文原稿は別に定める注意に従って作成するこ

し，個々に番号と表題を記入し，投稿原稿の最と．用紙サイズは A4とし，和文の場合は30字後に添付する．

で25行程度，英文の場合はダブルスペース（7011）引用文献は下記の例にならって，アルファベッ

字で25行程度）とする．原稿本文の左側に行番

ト順にならべ，本文中では 1 ，3 − 6 ） のように上号を表記すること．

付き（superscript）で記入する．ただし，著者

2 ）和文の場合も句読点は，「 ，」，「 ．」を用いること．

名 は 3 名 ま で と し， 4 人 目 以 降 は 省 略 し，「ら」，「et al」で示す．

3 ）論文原稿は第 1 ページに表題，著者名，所属機［例］

関名およびその所在地を和文と英文で記載する

雑誌とともに，連絡著者とその電子メールアドレスを記載する．また，和文の場合は20字，英文の場合は40字以内の略表題（running head）を記載する．
4 ）原著論文の構成は原則として，Summary（本文が和文の場合も英語），序文（Introduction），
材料および方法（Materials and Methods），結果（Results）， 考 察（Discussion）， 引 用 文 献（References），要旨（本文が和文であっても英文であっても，和文の要旨）とする．ただし，謝辞は，別項目を設けず，本文の最後に 1 行の空白をとった後に記載する．
5 ）英文 Summary は250語以内，和文要旨は600字以内とし，それぞれの最後の行に 5 つ以内の1 ）内田孝治・藤井武・高山公一ら（1991）ブロ
イラーにおける実験的大腸菌症に対するラノ
フロキサシンの治療効果および用量設定試
験．家畜衛生研究会報．33，19-24．
2 ）Oshida, T., Fukuyasu, T., Kohzaki, K., et al.
(1993) A new treatment system for animal
waste water using microorganism, soil andvagetation. Asian-Australasian Journal ofAnimal Sciences. 6, 205-209.
電子ジャーナル3 ）Wilson, D.J., Rood, K.A., Bunnel, J., et al. (2014)
Johne’s disease, mycoplasma and BVD in
Utah-Bulk tank milk testing and comparison

60

英文では200字以内の和文，和文では100語以内の英to previous regional prevalence andindividual herd results over time. Journal of
Veterinary Science and Technology. 5:182.
doi: 10.4172/2157-7579.1000182.

文をつける．原稿の長さは刷り上りで， 2 頁以内とする，その他の規定については原著の場合に準じる．
8 ．総説及び技術資料の構成については特に規定を設けないが，引用論文の記載法は原著論文の場合に準じ単行書ることとする．

4 ）伊予部志津子（1980）薬剤耐性因子（R）の9 ．別刷りは50部に限り無料とする．追加分についてその費用を著者の負担とする．

検出法，薬剤感受性測定法．22-48頁．三橋

10．本誌の発行は原則として，年 4 回（ 4 月， 7 月，10

進編，講談社，東京．

月および 1 月）とする．

5 ）McDonrd, P. (1976) Trends in silage making,Microbiology in Agriculture, Fisheries and  

11．編集委員会事務局を下記に置く．
〒252−0132

Food. pp109-121. Shinner, F.A and Carr, J.G.

神奈川県相模原市緑区橋本台 3 − 7 −11

eds. Acad. Press, London, NY.

（一財）生物科学安全研究所内
12）図はグラフィックソフトウェアで作成すること

日本家畜衛生学会編集委員会

が望ましい．手書きで作成する場合は，そのまTel

ま製版できるよう，白色紙または青色方眼紙にFax 042（762）7979

タイプやレタリングなどにより作成する．
13）投稿原稿が受理（掲載決定）されたならば，著

042（762）2775

E-mail：jjah@riasbt.or.jp
12．本誌に掲載された論文の著作権は，日本家畜衛生学

者 は す み や か に 最 終 原 稿 の Microsoft Word

会に帰属する．

ファイルを電子メールで提出すること．図については，グラフィックソフトウェアで作成した

附則ファイルも併せて提出する．

本規程は，2015年 1 月 1 日以降の投稿論文に適用する．

7 ．短報は，その内容を成績および考察（Results and本規程は，2015年 7 月12日以降の投稿論文に適用する．

Discussion） と し て ま と め， 要 旨（Summary） は

本規程は，2016年11月 5 日以降の投稿論文に適用する．

論文原稿を作成する上での注意
1 ）執筆にあたり，投稿規定をもう一度，熟読すること．
2 ）各行の行末での強制改行をしないこと．
3 ）投稿論文が和文，英文のいずれの場合も数字，欧文6 ）図は，Microsoft PowerPoint，Excel，Adobe Photoshop，Illustrator 等のソフトウェアで作成するのが望ましい．

は全て 1 バイト文字（いわゆる半角）で入力するこ

7 ）論文受理後の最終原稿は，Microsoft Word（あるいと．ただし和文ではかっこ（ ）は 2 バイト文字

は Microsoft Word 互換ソフトウェア）ファイルと（いわゆる全角）とする．
「µ」（マイクロ）は半角して提出する．ただし，Microsoft Word 互換ソフ

立体で入力すること．

トウェアを使用した場合は，Microsoft Word で正4 ）投稿論文原稿は PDF ファイルとして事務局まで電しく表示されることを確認すること．グラフィック

子メールで提出すること．その際には必ずパスワー

ソフトウェアで作成した図データは，jpeg，tiff 等

ドロックし，パスワードは別メールで事務局まで連の汎用フォーマットで提出する．

絡すること．特段の理由がある場合は，印刷原稿 3部（うち 2 部は鮮明なコピーでも可）を事務局まで
書留郵便あるいはレターパックで送付すること．
5 ）写真は印刷に耐えうる鮮明なものを使用すること．

日本家畜衛生学会
編集委員会

61

日本家畜衛生学会会則
（総
第１条

則）

第８条

理事長は常務理事の互選により選出する．

本 学会は，日本家畜衛生学会（英文表記：

２．理事長は学会を代表し，会務を総理する．

The Japanese Society of Animal Hygiene）

３．理事長は常務理事の中から庶務・会計を担当する事務局担当者を委嘱する．

（以下，「学会」とする．
）と称する．
第２条
第３条

第４条

４．理事長は第4条の事業を達成するため常設の学会の事務局は，原則として理事長の所属する機関におく．

学術企画委員会，編集委員会を設置する．

学会は，家畜衛生とその関連領域における学（1）委員会の委員は原則として理事長が常務

究の向上を図り，畜産の進歩発展に寄与する

理事の中から指名する．但し，常務理事ことを目的とする．

会が必要と認めた場合には会員の中から指名することが出来る．

学会は，前条の目的を達成するために，次の（2）委員会の委員長は，委員の互選により選事業を行う．

出し，理事長が指名する．

（1）研究発表会及び学術講演会等の開催（2）学会誌「家畜衛生学雑誌」の発行

第９条

事長を補佐する．

（3）学会の発展に貢献した者への表彰（4）その他学会の目的達成のために必要な事業

副理事長は常務理事の互選により選出し，理第１０条

常務理事および監事は理事の互選により選出
し，総会において承認を受ける．
２．常務理事は常務理事会を組織し，理事長を補（会員および会費）
第５条

佐し，学会の運営に関して第４条の事項を行う．

学会の会員は正会員，学生会員，賛助会員お３．監事は理事長を補佐し，会務と会計を監査する．

よび名誉会員より構成する．
（1）正会員：学会の趣旨に賛同し，会費を納

第１１条

２．理事は理事会を組織し，理事長を補佐し，学入した個人会の運営に関して第４条の事項を行う．

（2）学生会員：学会の趣旨に賛同し，会費を納入した学生，大学院生．た

第１２条

役員の任期は２年とし，再任を妨げない．
２．役員の補欠又は増員は，第８条第１項，第９だし会員期間は単年度とす

条，第10条若しくは第11条の規定により選任る．

し，その任期は前任者又は現任者の残任期間（3）賛助会員：学会の趣旨に賛同し，その事業を援助するため所定の会費とする．ただし，常務理事会が会務の運営にを納入した個人又は団体支障がないと認めたときは，この限りでない．

（4）名誉会員：学会に永年功労があり，総会第１３条

常務理事会および理事会は理事長が随時招集する．

において承認された個人
第６条

理
 事は理事長が委嘱し，総会の承認を受ける．

会
 費は正会員にあっては年額5,000円，学生会員にあっては年額2,000円，賛助会員にあって（総は１口年額10,000円とし，毎年７月末までに

第１４条

会）
通常総会は毎年１回，理事長が招集する．

納入するものとする．

第１５条

理事長が必要と認めた場合は，臨時総会を招集することができる．

第１６条（役員および役員会）
第７条

総会では次の事項を議決する．

学会に次の役員をおく．

（1）事業計画および事業報告に関する事項（1）理 事 長

１名（2）予算および決算に関する事項（2）副理事長

１名（3）会則の改正に関する事項（3）常務理事若干名（4）その他，学会の目的を達成するために必

（4）監

事

２名

（5）理

事

35〜45名

要な事項

62

（会

計）

第１７条

（3）こ の会則は平成15年7月5日に改正し，

学会の経費は会費その他の収入をもって，これにあてる．

第１８条

会計年度は４月１日より，翌年３月31日までとする．

同日に施行する．
（4）こ の会則は平成16年7月3日に改正し，同日に施行する．
（5）こ の会則は平成17年7月2日に改正し，同日に施行する．

附則（6）こ の会則は平成21年7月4日に改正し，（1）この会則は平成14年7月6日より施行する．
（2）学会設立時の役員は家畜衛生研究会（以下「研究会」と略す）の役員が暫定的に同日に施行する．
（7）こ の会則は平成23年7月2日に改正し，同日に施行する．

就任することとし，理事長は研究会の会（8）こ の会則は平成27年7月11日に改正し，長が，常務理事は研究会の幹事が，理事同日に施行する．ただし，平成27年度のは研究会の評議員が，監事は研究会の監

会費は4,000円とし，平成28年度から会事がそれぞれ就任する．

費を5,000円とする．

63

協賛企業一覧
日本家畜衛生学会は以下の企業から協賛を受けています．ここに記して謝意を表します（五十音順）．
MSD アニマルヘルス（株）

エランコジャパン（株）（株）科学飼料研究所

共立製薬（株）住化エンバイロメンタルサイエンス（株）

ゾエティス・ジャパン（株）

田村製薬（株）日生研（株）

日本全薬工業（株）

日本ハム（株）

バイエル薬品（株）

Meiji Seika ファルマ（株）

日本家畜衛生学会入会のすすめ
日本家畜衛生学会は家畜衛生とその関連領域における学術の交流を図り、畜産の進歩発展に寄与することを目的とした学会です。
＜主な活動＞
・ 年２回（７月、12 月）の研究発表会
・ 年１回のフォーラム（12 月ごろ）の開催
これまでの主なテーマ「狂犬病」、「口蹄疫」、「鳥インフルエンザ」、「BSE」、「家畜ふん尿」など
・ 年４冊の機関誌「家畜衛生学雑誌」の発行
・ 学会賞の授与
年会費5,000円（但し、学生は2,000円）
御請求戴ければ、見本誌を贈呈します!!

家畜衛生学雑誌

The Japanese Society of Animal Hygiene
日 本 家 畜 衛 生 学 会〒183-8509

東京都府中市幸町3-5-8
東京農工大学農学部獣医伝染病学講座内TEL ／ FAX：042－367－5780
http://www.kachiku-eisei.jp/
e-mail：k-eisei@cc.tuat.ac.jp
Hpで活動内容がご覧になれます!!（日本家畜衛生で検索）

第45巻第 1 − 2 号

2019年 7 月20日発行（会員配布）
発

行

印 刷 所

日本家畜衛生学会
理事長 白井淳資〒183－8509 東京都府中市幸町 3 − 5 − 8
東京農工大学農学部獣医伝染病学講座内☎／ FAX：042−367−5780
ホームページ：http://www.kachiku-eisei.jp/
e-mail：k-eisei@cc.tuat.ac.jp
振替口座：00240－ 3 －43171
明誠企画株式会社〒208－0022 東京都武蔵村山市榎 2 － 25 － 5☎ 042−567−6233 FAX 042−567−6230

平成日本家畜衛生学会

年

月

日

御中

入 会 申 込 書
貴会への入会を下記の通り申込ます．

記
フリガナ
氏

名：

所属名称：
部

署：

役

職

所属住所：〒TEL：

FAX：

e-mail：

自宅住所：〒

TEL：
e-mail：会員の種類 ： ○正 会 員 ・ ○学生会員 ・ ○名誉会員
会報送付先 ： ○自宅 ・ ○勤 務 先○内にチェックを付して下さい．

１．入会申込書は必要事項をすべて正確に記入し，郵便またはFAX（042－367－5780）にてご送付下さい．
２．年会費は個人会員 5,000円，賛助会員 10,000円／口（１口以上）を郵便振替口座（加入者名：日本家畜衛生学会，No. 00240－3－43171）へお振込下さい．
３．申込先は〠183－8509

東京都府中市幸町３－５－８

日本家畜衛生学会事務局宛

東京農工大学農学部獣医伝染病学講座内

TEL／FAX：042－367－5780

４．ホームページからも申し込めます：http://www.kachiku-eisei.jp/

平成
日本家畜衛生学会

年

月

御中

変
変更手続きを下記の通り致します．

更

届

記

フリガナ
○

氏

名：

○

所属名称：

○

部

○

所属住所：〒

署：

○

役

TEL：

○

自宅住所：〒

○

TEL：

職

FAX：

e-mail：e-mail：○会員の種類：○正会員 ・ ○学生会員 ・ ○名誉会員○会報送付先：○自宅 ・ ○勤務先全てご記入の上，上記変更部位の○内にチェックを付して下さい．

１．変更届出書は必要事項を正確に記入し，郵便またはFAX（042－367－5935）にてご送付下さい．
２．届け先は〠183－8509

東京都府中市幸町３－５－８

日本家畜衛生学会事務局宛

東京農工大学農学部獣医伝染病学講座内

TEL／FAX：042－367－5935（042－367－5780）

３．ホームページからも手続きできます：http://www.kachiku-eisei.jp/

日乳剤