National Agriculture and Food Research Organization

農業・食品産業技術総合研究機構
表紙

早期開花遺伝子の活用による果樹世代促進育種法「第２回新たな育種技術研究会、2013’10/29」（独）農研機構・果樹研究所
品種育成・病害虫研究領域
上席研究員 山本俊哉
農研機構は食料・農業・農村に関する研究開発などを総合的に行う我が国最大の機関です内容
1. 果樹における早期開花遺伝子＋世代促進の意義

2. 果樹における「早期開花遺伝子の活用による果樹世代促進育種法」の現状と展望
a) 開花促進遺伝子を利用したカンキツ育種期間の短縮
技術開発b) 植物潜在性ウイルスベクターの機能を活用したカンキツ類の遺伝子機能解析技術および開花促進技術の開発

c) カルタヘナ法、食品安全について
3. その他（果樹、花きでのNBTの可能性）

早期開花遺伝子 (FT)
●フロリゲン（florigen）：植物において花芽形成を誘導するシグナル物質として提唱された植物ホルモン（様物質）●1936年に提唱されてから2007年に至るまで約70年間存在が確認されず、幻の植物ホルモンともいわれていた●1999年に京都大学の荒木らによって、シロイヌナズナでFT（FLOWERING LOCUS T）遺伝子が発見された●フロリゲンの正体は、FTタンパク質であるという結果が2007年に示された果樹研のグループ（大村、遠藤ら）が、公的データベースに登録していたカンキツ果実由来の発現遺伝子（機能不明EST）の中に、FT遺伝子があった（果樹研が本家！？）。

果樹研でFT遺伝子の解析と早期開花への利用

Science (1999)

果樹における遠縁交雑・連続戻し交雑の例－早期開花技術の必要性－
リンゴ黒星病抵抗性育種 M. floribunda 由来
Vf 遺伝子の栽培リンゴへの導入⑥1972交配⑤④Prima1970発表
GoldRush 1994発表`Rome Beauty’Malus floribunda③②①1926交配821●6世代50年で、ようやく一定の品質まで到達●1世代を1-2年で経過できれば、飛躍的に育種が進展

早期開花技術＋世代促進育種法の開発が大いに期待EUでの早期開花技術＋世代促進の試み●リンゴ鑑賞用品種‘Evereste’・火傷病抵抗性保有・黒星病抵抗性保有●MADSbox
遺伝子導入リンゴ
・播種後1年以内に開花●2018年に早期開花遺伝子を抜いた育種素材が開花予定？

Fast-track breeding早期開花遺伝子の活用による果樹世代促進育種法
次世代ゲノム基盤プロジェクト「作物に画期的な形質を付与する新しいゲノム育種技術の開発」
a) 開花促進遺伝子を利用したカンキツ育種期間の短縮技術開発（GMO1003）
農研機構果樹研究所
遠藤朋子、島田武彦、藤井 浩b) 植物潜在性ウイルスベクターの機能を活用したカンキツ類の遺伝子機能解析技術および開花促進技術の開発（GMO1002）
岩手大学農学部
吉川信幸

a) 開花促進遺伝子を利用したカンキツ育種期間の短縮技術開発

カンキツ組換え体における早期開花
カラタチにCiFT 遺伝子（カンキツFT ホモログ：花成促進遺伝子） を導入・異所発現させると、組換え体が早期開花・結実し、雑種後代にも遺伝

CaMVP35S

CiFT

Tnos
pCGN1547

接ぎ木・順化●カラタチ胚軸にP35S::CiFT を導入
不定芽を選抜・育成

珠心胚実生または交雑●導入から1年程度で開花開始●2年程度で果実結実●早期開花・結実性を示す雑種後代が得られる

CiFT 組換え体交雑による世代促進
カラタチがもつ優性１遺伝子支配のカンキツトリステザウイルス（CTV）抵抗性をカンキツ実用品種へ取り込む
35S/CiFT×

CTV抵抗性遺伝子＊CiFT 組換えカラタチと実用カンキツ品種を交配する

F1

×＊外来CiFTとCTV抵抗性遺伝子を有する個体をDNAマーカーで選抜し、世代を進める

BC1

×＊ゲノムを広範囲にカバーするマーカーでカンキツ型への遺伝子座置換を推定する

カラタチ
カンキツ
実用品種

非組換え体

＊育種の最終段階で外来遺伝子を分離除去する

研究目標と期待される成果
研究目標（5年間）①カンキツ類における世代促進育種法の開発
通常の交雑育種では、安定して開花・結実するまで7-10年程度要するとこ
ろを、1世代あたり2-3年程度に短縮した世代促進育種技術を開発する。
●カラタチ由来のCTV抵抗性遺伝子をカラタチから3世代進んだカンキツ育種素材に導入する。
●外来遺伝子が分離除去された個体を解析して、外来遺伝子をもたないCTV抵抗性カンキツ品種や育種素材の作成が可能であることを検証する。

期待される成果●カンキツの育種期間を短縮する、NBT利用（遺伝子操作は途中利用のみ・導入遺伝子フリー）の新規育種技術が開発される。

b) 植物潜在性ウイルスベクターの機能を活用したカンキツ類の遺伝子機能解析技術および開花促進技術の開発＜研究目的＞
既にリンゴや各種作物で実績のある植物潜在性ウイルス（リンゴ小球形潜在ウイルス、ALSV）ベクターを用いて、先ず（１）カンキツ類の有効なVIGS系を開発する。続いて、植物の開花関連遺伝子、例えば開花促進に働く遺伝子（Flowering locus T, FT）の発現、また開花の抑制遺伝子（Terminal flower 1, TFL1）のVIGSによる抑制、さらにFT発現とTFL1発現抑制を同時に行うウイルスベクターを構築し、（２）カンキツ類実生苗の幼若期間を数ヶ月に短縮する開花促進技術ならびに（３）１世代を１年以内に完了する世代促進技術を開発することを目的とする。

ALSVの特徴
1) 潜在感染 （病気を起こさない）
2) 宿主範囲が広い （果樹、野菜、花など各種植物に感染する）
3) 茎頂分裂組織に侵入する
4) 果樹（リンゴ）園での水平伝染はない（花粉や昆虫などによる自然伝染は認められない）
5) 日本オリジナル

早期開花用ALSVベクター
pUC, Ti ベクター

RNA1 (pEALSR1)P35SPRO-co

HEL

Vpg

C-PRO

POL

Tnos

RNA2 (pEALSR2L5R5)

Q/G

Q/G
P35S

MP

VP25

抑制したい
遺伝子

E/G

VP20

VP24

Tnos

Xho I -Sma I- Bam HI

Q/GQ/G

発現したい
遺伝子

リンゴ由来
TFL1遺伝子(MdTFL1)

抑制したい
遺伝子

AtFT

シロイヌナズナ由来
FT遺伝子(AtFT)ALSV-AtFT/MdTFL
MdTFL-1

ALSV感染葉の全RNAをパーティクルガン接種
発根種子

100%感染(Incubate in a Petri dish)

接種後２〜３週間からALSVの全身感染が確認される

２〜３週間
ALSV-rbcS

ポットに移植

４週間後

ALSV ベクターのリンゴ実生苗への接種法

BAC

B

A

1.5 mpi

9 mpi

3 mpi

11 mpiDC

7 mpi

リンゴ実生苗（本葉）からのALSVの検出

検定法

検定時期
（発芽後月）

ELISA

22／381 （0.52%）

42／381 （0.52%）

80／132

感染試料数／検定試料数（種子伝染率）qPCR＊ 2および4カ月の試料でALSVが検出された2試料のELISA値は1.49と1.89で、TaqManプローブ法ではCt値が23.3と23.9であった。

ミカン科果樹（種子胚）へのALSVの感染
属
ミカン属

類

種類

感染/接種個体
全RNA

濃縮RNA

オレンジ類

バレンシアオレンジ

0/10

3/3

グレープフルーツ類

グレープフルーツ

－

6/6

香酸柑橘類

ユズ
カボス
レモン
スダチ－
－

6/6
3/3

5/6－

15/15
5/5

ヒュウガナツ8/20－

甘夏
サンフルーツ

2/10
5/6－
－

タンゴール類

イヨカン

－

5/5

ブンタン類

晩白柚

－

5/5

ミカン類

ウンシュウミカン

－

5/5

キンカン属

キンカン類

キンカン

－

6/6

カラタチ属

カラタチ類

カラタチ－

5/5

雑柑類

CiFT 組換え体カラタチの形態
カラタチCiFT組換え体系統と非組換え体の葉の形態と樹形
組換え体

非組換え体

●組換え体では、①葉が小さく、カールする傾向がある、②樹形が、分枝が多くなり、わい化する傾向がある●外来遺伝子が抜けた個体では形態変化なし

組換え体組換え体

非組換え体

Endo T., T. Shimada, Y. Kobayashi, T. Araki, H. Fujii, M. Omura. (2005) Ectopic expression of an FT homolog from Citrus
confers an early flowering phenotype on trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.), Transgen. Res., 14: 703-712.

CiFT 組換え体カラタチの香気性成分●カラタチ非組換え体（WT）とCiFT組換え体（CNT）の香気性成分（モノテルペン）組成比較→果実、花とも、主要な3成分の比はほぼ同じ

花果実

Table 2. Peak area percentages of b-myrcene, d-limonene, and (E)-b-ocimene in flowers andfruit of transgenic plants and controls
b-myrcened-limonene(E)-b-ocimene
Plant material(Rt=7.95)(Rt=8.95)(Rt=9.46)
FlowerPeak area (%)
Total
35.5 (1.00)
33.08 (0.93)
15.32 (0.43)
83.9
1-7
37.07 (1.00)
3.45 (0.09)
21.82 (0.59)
62.34
1-15
2-39
34.23 (1.00)
24.07 (0.70)
17.41 (0.51)
75.71
33.63 (1.00)
10.56 (0.31)
19.75 (0.59)
63.94
4-1
35.72 (1.00)
10.77 (0.30)
19.21 (0.54)
65.7
4-34
5-4
36.27 (1.00)
15.84 (0.44)
25.7 (0.71)
77.81
P. trifoliata (WT)29.06 (1.00)
26.05 (0.90)
17.07 (0.59)
72.18
P35S::CiFT (CNT) 34.58 (1.00)
38.21 (0.94)
14.26 (0.41)
87.05
Peel
Peak area (%)
Total
37.9(1.00)
36.91(0.97)
3.58(0.09)
78.39
1-7
2-39
30.5 (1.00)
33.51 (1.10)
2.97 (0.10)
66.98
44.25 (1.00)
16.35 (0.37)
2.32 (0.05)
62.92
4-34
5-4
46.1 (1.00)
20.06 (0.44)
3.41 (0.07)
69.57
P. trifoliata (WT)40.25 (1.00)
39.74 (0.99)
7.38 (0.18)
87.37
P35S::CiFT (CNT) 36.74 (1.00)
34.55 (0.94)
4.66 (0.13)
75.95
Values are averages of two experimental replications
Numbers in parentheses indicate the ratio to peak area of b-myrcene

Endo T., T. Shimada, H. Fujii, F. Nishikawa, A. Sugiyama, M. Nakano, T. Shimizu, Y. Kobayashi, T. Araki,L. Peña, M. Omura. (2009) Development of a CiFT co-expression system for functional analysis ofgenes in citrus flowers and fruits. J. Japan. Soc. Hort. Sci., 78: 74-83.

FTについて、生物多様性について●カンキツのFTは、果実の発現遺伝子＝ESTとして見出された●カンキツのFTのmRNAは、果実で高発現する●他の植物（リンゴ等）においても、FTホモログのmRNAは果実で蓄積している●FTのmRNAやタンパクに毒性や害があるという報告は、調べた限りでは無い●通常の交雑育種で、カラタチが持つCTV抵抗性遺伝子をカンキツ品種に取り込み、カンキツ中間母本農7号、農８号、オーラスターの３品種が果樹研で育成されている●ミカン科の野生植物は、広く日本の暖地に自生分布し、自然交雑する

ブドウの果皮色改変
シャインマスカット＝ブドウの希望の星

着色あり（Myb活性あり）

Myb

着色なし

Myb

（Myb活性なし）
レトロトランス
ポゾンの挿入2006年品種登録
ブドウの女王「マスカットオブアレキサンドリア」の孫●マスカット香●肉質良好●日持ち性良●裂果性なし●栽培容易★もう二度と育種できないほどの芸術品

ゲノム編集技術を用いて、レトロトランスポゾンを転移させる

果皮色の異なる「シャインマスカット」シリーズ

攻めの切り札リンゴ「ふじ」を自家和合にふじの特徴●きわめて高い
日持ち性●良食味、良食感●日本での生産１位（52％）●世界での生産１位（21％）

結実が不安定●リンゴは自家不和合性●開花期の低温･長雨で結実率が低下●授粉や結実管理が全労働時間の約10%238 Kbpの欠失

花粉側因子

花柱側因子
S4-RNase

S2S2-RNase

S4sm

S4-RNase

ニホンナシでは、S-RNaseが欠失した
自家和合性品種「おさ二十世紀」あり
ゲノム編集技術を用いて、S-RNaseを破壊・改変
自家和合の「ふじ」
攻めの切り札