リステリア・モノサイトゲネス検査

リステリア属菌は家畜・魚類・河川・野生動物など自然界に広く分布する細菌で、特にリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)は、ナチュラルチーズや食肉、食肉加工品、野菜サラダなどを汚染して食中毒を引き起こすと考えられます。本菌は発育温度域が広く(0℃～45℃)低温でも発育し、また他の細菌と比べて強い耐塩性(食塩濃度10％でも発育する。) を示します。
また潜伏期間は24時間～数週間と幅が広く、初期症状は倦怠感・発熱を伴うインフルエンザ様症状を示します。妊婦・乳幼児・高齢者などは特に感染しやすいと言われ、感染すると髄膜炎や敗血症、流産などを引き起こし、死にいたる場合もあります。
我が国においては、本菌を原因とする食中毒事例の報告はありませんが、厚生労働科学研究班により非侵襲性リステリア感染症の集団発生事例が報告されています。
また、欧米では集団感染事例が多く報告されている重要な食中毒細菌とされています。

関東化学では、国際標準に適合したオクソイド社製の歴史と実績のある検査試薬やクロモアガー社製の酵素基質培地という新しい原理を利用した培地・検査試薬など、リステリア検査の増菌から鑑別までの様々な製品をご用意しております。

成分規格について

 海外での主な集団事例
発症年
１９９０
１９９２
１９９３
１９９５
１９９７
１９９８－９９１９９８－９９１９９８－９９
２００２
２００５
２００８
２００９-１０
２０１１
２０１２

発症国
患者数 死者数（％）
オーストラリア
１１６（54.5）
フランス
２７９ ８５（30.5）
フランス
３９ １２（30.8）
フランス
３７ １１（29.7）
イタリア
１５６６
０（0 .0）アメリカ
１０８ １４（13.0）
フィンランド
２５６（24.0）
オーストラリア
６５（83.0）
アメリカ
５４８（14.8）
スイス
１０３（30.0）
カナダ
５７２３（40.4）
ｵｰｽﾄﾘｱ・ﾄﾞｲﾂ・ﾁｪｺ
３４８（23.5）
アメリカ
１４７ ３３（22.0）
ｵｰｽﾄﾘｱ・ﾄﾞｲﾂ・ﾁｪｺ
２２４（18.0）

原因食品
パテ・ミートスプレット
豚タンのゼリー寄せ
リエット（豚肉調理品）
ソフトチーズコーンサラダホットドック等
バター
フルーツサラダ
調理済七面鳥の冷肉
チーズ
RTE デリミート
酸ﾐﾙｸﾁｰｽﾞ
ｶﾝﾀﾛｰﾌﾞﾒﾛﾝ
リコッタﾁｰｽﾞ・サラダ

食品中リステリア・モノサイトゲネス評価書 （食品安全員会資料：２０１３年５月）より抜粋

 リステリア汚染率の高い食品①非加熱食品・・・・・生ハム・ソーセージなど②乳製品・・・・・・・・・ナチュラルチーズ・未殺菌乳など③魚介類・・・・・・・・・スモークサーモン・いくら・明太子など④惣菜・・・・・・・・・・・ポテトサラダ・ホットドッグなど

 非加熱食肉製品及びナチュラルチーズの成分規格
非加熱食肉製品（食品、添加物等の規格基準（昭和 34 年厚生省告示第 370号）、食肉製品のうち、非加熱食肉製品について、これまでの規格に 、 リステリ
ア．モノサイトゲネスが、検体１g につき 100 cfu以下でなければならないことを追加する。
ナチュラルチーズ
乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和 26 年厚生省令第 52 号）の（三）乳製品の成分規格並びに製造及び保存の方法の基準に、ナチュラルチーズ（ソフト及びセミハードのものに限る。）の成分規格としてリステリア・モノサイトゲネス（1g当たり）100 cfu以下 （ただし，容器包装に入れた後加熱殺菌したもの又は飲食に供する際に加熱するものは，この限りでない。）を追加する。

薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より抜粋
2成分規格について

 規格基準設定の経緯
リステリア・モノサイトゲネス（以下LM） については、平成 19 年 7 月にコーデックスにおいて「食品中のリステリア・モノサイトゲネスの管理における食品衛生の一般原則の適用に関するガイドライン」（以下「コーデックスガイドライン」という。）が採択され、平成 21 年 7 月にコーデックスガイドラインの別添に微生物規格（以下「コーデックス基準」という。）が採択された。
我が国においては、コーデックス基準が策定されたこと、日・EU規制改革対話において、日本の規制をコーデックス基準に従ったものとすることの要望を受けたこと等から、平成23年 2月に開催した薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会において、我が国のLMに係る規制について検討を行った。
平成 25 年 5 月に食品安全委員会から食品健康影響評価結果が通知されたことを受け、これに基づくLMの規格基準設定について検討する。
今般、LMの規格基準設定について、厚生労働大臣から薬事・食品衛生審議会長あてに平成 26 年４月７日付けで諮問され、平成２６年10月、同分科会は本規格基準を承認した。これを受け、乳及び乳製品の規格などに関する省令及び食品添加物規格基準の一部を改正してリステリアの規格を付加する。パブリックコ
メントなどを経て速やかに施行の手続きとなる。
薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料より（要約） リステリアに係るこれまでの我が国の規制状況等
輸入される非加熱食肉製品及びナチュラルチーズ（ソフト及びセミソフトタイプに限る。）については、国、製造者、品目等を指定して、食品衛生法第 26 条第 3項に基づく検査命令の対象としている。検査の結果、LMが検出された場合には、輸入等が禁止される。
海外でのLMに汚染されたナチュラルチーズを原因とするリステリア症の発生等を受け、自治体に対し、国内の事業者に製造工場内の環境対策の管理強化や製品の自主検査、原料乳の殺菌などを指導すること、自治体においても必要に応じ製品の検査を実施する等の監視・指導を強化することを求めている。
妊娠中に注意が必要な食中毒菌としてLMを挙げ、食べる前の食品の加熱の啓発及び注意喚起を行っている。
薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料（要約）3成分規格について

 国内に流通している食品の LM 汚染実態
平成 21 年度に実施した Ready-to-eat 食品1（以下、「RTE 食品」という。）に係る汚染実態調査において、野菜類、チーズ、食肉製品、魚介類、豆類及び牛乳の調査が行われ、LM の分離率は 1.4％（21 検体/1,500 検体）であった。検出されたもののうち、LM の菌数は、1 検体（フランス産チーズ、490 cfu/g）を除き、10 cfu/g未満であった。
○ 国内流通食品の汚染実態調査結果のまとめ
食品名

検体数

陽性数

分離率％

乳製品合計

２，８６３３５１．２２

非加熱喫食食肉製品合計

３６０

１４３．８９

魚介類加工品合計

２，３４９１６９７．１９

野菜合計

８４４６０．７１

薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料（要約） コーデックスガイドライン及び基準①コーデックスガイドランでは、LMに対する衛生管理として、RTE食品の製造・輸送等にあたり6℃（できれば2～4℃）を超えないよう温度管理が重要であり、食品の保存期限はLMの増殖等を踏まえた設定が重要としている。
②食品のpHが4.4未満、水分活性が0.92未満又は冷凍保存の条件、LMの増殖を抑えることができるとしている。
コーデックス基準
増殖がおきるＲＴＥ食品
増殖がおきないＲＴＥ食品

ｎＣｍ５０

不検出／２５ｇ５０１００ｃｆｕ／ｇ

上記以外に、代替措置（alternative approach）として行政当局が消費者を保護できる他の有効な基準を採用することができるとしている。
＊規格の適用は、製造終了（輸入）時から販売点
薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産食品部会資料（要約）4検査法について リステリア・モノサイトゲネスの検査についての監視指導等に関する通知（食安発1128第3号：生食発0330第6号改正）要約
基準適合性対象となる食品検体 1g中にリステリア・モノサイトゲネス生菌数が100 を超えない事を定量試
験法により n=5 で評価する。
予備試験①予備試験を行う場合は、検体25ｇを対象とした予備定量試験法と定性試験法の併用により評価し、必要な場合は本試験を行う。
②検体：同一ロット200gの検体より3か所以上から25g採取し、定性試験法（下図：予備試験を行う場合のフロー）により生菌の有無を確認し本試験を行う必要性を決定する。
③基準適合性を迅速に評価する為に、予備定量試験を実施し、本試験の必要性を評価する。
本試験
4℃以下に保存してあった検体から10ｇずつを対象にn=5で定量試験を実施し何れかの1試料で3枚の酵素基質培地上に11集落以上のリステリア・モノサイトゲネスが検出された場合は規格違反とする（詳細は次項以降参照ください）

予備試験を行う場合のフロー図
リステリア・モノサイトゲネス
定性試験法

リステリア・モノサイトゲネス
予備定量試験法
定性試験法の一次選択増菌培養液1mL を分取し、定量試験法と同様の手法で培養を行う。

酵素基質培地の集落11以上

酵素基質培地の集落1－10

酵素基質培地の集落非検出

検出

性状確認

検出されず
結果判定（陰性）

本試験（n＝5 で定量試験法）

結果判定：集落 11 以上は規格基準違反、10以下は検出したが 100 ｃｆｕ/g 以下と判定。

5

検査法について
定性試験法（NIHSJ-08:2020 定性法）
フローチャート
試験試料25g ※＋一次選択増菌培地（ハーフフレーザー液体培地）（225mL）

30℃, 25±1時間
培養終了後72時間まで冷蔵保存可培養

培養後の一次選択増菌培養液 0.1mL を 10mL の二次選択増菌培地（フレーザー液体培地）に接種※通知法では、3 箇所以上から採取

第二選択分離寒天培
地に画線塗沫
例：パルカム寒天培地

第一選択分離寒天培
地に画線塗沫

例：
培養

37℃, 24±2時間
培養終了後 72時間まで冷蔵保存可又はｸﾛﾓｱｶﾞｰﾘｽﾃﾘｱ寒天培地

ｵｯｸｽﾌｫｰﾄﾞ寒天培地

培養

培養

37℃, 24～48±2時間
第一選択分離寒天培
地に画線塗沫
例：
ｸﾛﾓｱｶﾞｰﾘｽﾃﾘｱ寒天培地

第二選択分離寒天培地に画線塗沫規定された温度及び時間
培養終了後 48 時間まで冷蔵保存可

例：パルカム寒天培地

定型集落を5個釣菌又はｵｯｸｽﾌｫｰﾄﾞ寒天培地

非選択寒天培地に画線塗沫
培養

培養

培養
37℃, 24～48±2時間規定された温度及び時間
培養終了後 48 時間まで冷蔵保存可

定型集落を5個釣菌
非選択寒天培地に画線塗沫
培養37℃, 18～24時間

定型集落の確認培養＊1

L. monocytogenes確認試験＊2

結果判定（陽性／陰性）

37℃, 18～24時間

定型集落の確認培養＊1

L. monocytogenes確認試験＊2

結果判定（陽性／陰性）
6＊1 TSYEA培地に変えTSA培地を使用することが出来る＊2 CAMP法の代替法としてβｰリジンディスク法を用いることが出来る

検査法について
定量試験法（NIHSJ-09:2020 集落計数法）
フローチャート

滅菌ストマッカー用袋に入れた試料 Ｘｇ ※＋9 倍量のBPW（緩衝ペプトン水） 又は前増菌培地

1mL 全量を、滅菌ピペットを用いてよく乾燥させた3 枚の選択分離寒天培地上に分けて塗沫（必要に応じて段階希釈を行い、同様に塗布）※通知法では、10g ずつ n=5

Ottaviani and Agosti リステリア®
寒天培地（ALOA 培地） 又は同等性能を示す他の酵素基質培地（=クロモアガー リステリア寒天培地）

液が寒天に吸収されるまで 15 分程度放置

培養

37℃, 24～48±2 時間

3 枚の選択分離寒天培地上に形成された定型集落の合計数を計測
5 個を釣菌

非選択寒天培地上に単独集落が形成されるよう
画線塗沫
培養

37℃, 18～24時間

定型集落の確認培養＊1

L. monocytogenes の確認試験＊2

L. monocytogenes の集落数の算出＊1 TSYEA培地に変えTSA培地を使用することが出来る＊2 CAMP法の代替法としてβｰリジンディスク法を用いることが出来る
7

リステリア検査に使用する培地
定性試験法
一次選択増菌培養

二次選択増菌培養

分離培養
第一選択培地
第二選択培地確認培養

製品コード
製品名（一次選択増菌培地）
711895-5 フレーザー基礎ブイヨン
713166-1 ハーフフレーザーサプリメント

包装
500g
225mL用×10

製品コード
製品名（二次選択増菌培地）
711895-5 フレーザー基礎ブイヨン
713156-1 フレーザーサプリメント

包装500g500mL用×10

製品コード
製品名（第一選択分離培地）
08403-67 クロモアガー リステリア (1L用)
49958-19 クロモアガー リステリア 基礎培地
49958-20 クロモアガー リステリア サプリメント
72144
クロモアガー リステリア生培地
72145
製品コード
製品名（第二選択分離培地）
711877-5 パルカム寒天基礎培地
713150-1 パルカム選択サプリメント
711856-5 リステリア選択寒天基礎培地（Oxford）
713140-1 リステリア選択サプリメント（Oxford）

包装
1L用
5L用
5L用
10枚×1010枚
包装
500g
500mL用x10500g
500mL用x10

製品コード
製品名（確認培養用培地等）
711131-5 トリプトンソーヤ寒天培地
非在庫品 β－リジンディスク (メーカーコード：R21120)

包装
500g
25discs

製品コード
製品名（蘇生培養）
711895-5 フレーザー基礎ブイヨン
713166-1 ハーフフレーザーサプリメント
710001-3 緩衝ペプトン水（ISO処方）
717724-0 緩衝ペプトン水（ISO処方）リパックシステム
717724-1 緩衝ペプトン水（ISO処方）1L用分包
717724-4 緩衝ペプトン水（ISO処方）450mL用分包49957-00 BPW緩衝液 ISO処方 （225mL）

包装
500g
225mL用×10500g
300g
1L用×40450mL用×40
225mL×30

同定

定量試験法

蘇生培養

選択分離培養

確認培養

同定

8

製品コード
製品名（選択分離培養培地）
08403-67 クロモアガー リステリア (1L用)
49958-19 クロモアガー リステリア 基礎培地
49958-20 クロモアガー リステリア サプリメント
72144
クロモアガー リステリア生培地
72145

包装
1L用
5L用
5L用
10枚×1010枚

製品コード
製品名（確認培養用培地等）
711131-5 トリプトンソーヤ寒天培地
非在庫品 β－リジンディスク (メーカーコード：R21120)

包装500g25discs

リステリア検査・培養所見・特徴

 選択増菌培地
培地名

ハーフフレーザーブイヨン
フレーザー基礎ブイヨン

組成（711895-5）
ハーフフレーザーサプリメント（713166-1）
・クエン酸アンモニウム鉄：500 mg/L・ナリジクス酸： 10 mg/L・アクリフラビン塩酸塩：12.5 mg/L

フレーザーブイヨン
フレーザー基礎ブイヨン（711895-5）
フレーザーサプリメント（713156-1）
・クエン酸アンモニウム鉄：500 mg/L・ナリジクス酸： 20 mg/L・アクリフラビン塩酸塩： 25 mg/L・エスクリンを加水分解してエスクレチンにする。エスクレチンは鉄イオンに反応し黒色を呈する。このような原理からブイヨンの黒色化によりリステリアの存在が推定できます。しかし、ブイヨンが黒色化しないことで、リステリア属の存在を否定することはでき特徴ません。
・フレーザーブイヨンは食品および環境検体中のリステリア属の検出において非常に高い正確性が証明されISOで推奨されている方法です。
・肉製品の検査には、UVMブイヨンの2段階増菌が推奨される。

 選択培地培地名

特徴

パルカム寒天培地

オックスフォード寒天培地

・リステリア・モノサイトゲネスはエスクリ・リステリア・モノサイトゲネスはエスクリンンを加水分解し、その結果コロニー周を加水分解し、その結果コロニー周囲に黒囲に黒色ハローを形成します。

色ハローを形成します。

・リステリア・モノサイトゲネスはマンニッ

・一部の腸球菌・ブドウ球菌がリステリア・モノサイトゲネスと同様のコロニーで発育する。

ト非発酵性であるため、マンニットを発酵する腸球菌やブドウ球菌などの汚染菌は培地が黄変するので識別可能です。

9リステリア検査・培養所見・特徴

 各種 選択増菌培地
リステリア増菌ﾌﾞｲﾖﾝ（UVM）

増菌前増菌後この処方には選択剤量を変化させたUVMⅠとUVMⅡがあり二段選択増菌法に用いられる。これにより培養時間を大幅に短縮することが可能となった。また、熱損傷を受けた菌を回復させる増菌培地としても推奨される。
食肉製品のような夾雑菌の多いものに使用されることが多い。多くの国の公定法、国際機関でも認められている培地である。

リステリア増菌ﾌﾞｲﾖﾝ（ＦＤＡ）

増菌前増菌後Lovettらによる処方に基づき、食品中のリステリアの選択増菌に用いられる。乳や乳製品などを含め幅広い食品の検査に使用されることが多い。増菌培養開始後定期的に選択分離培地に継代して行くことが推奨されている。また培養時間を延ばすことで損傷菌が良好に回復される。日本の乳及びに乳製品に対する厚生労働省通知(平成５年）や食品衛生検査指針を初め多くの国の公定法、国際機関でも認められている培地である。
10

緩衝リステリア増菌ﾌﾞｲﾖﾝ

増菌前

増菌後

Lovettらによる処方に増菌効果を上げるためリン酸緩衝剤が添加された処方である。リン
酸緩衝剤を除いてはリステリア選択増菌培
地FDA法と同組成となる。幅広い食品のリステリア検出に用いることが出来る。本培地は
特にリステリア迅速テストキットの２次増菌培地に用いられる。

フレーザーブイヨン

増菌前増菌後ＦｒａｓｅｒとＳｐｅｒｂｅｒの処方に基づいており、食品及び環境材料からリステリア検出に推奨される。本培地は選択剤の量を変化させたハーフブレーザーブイヨンとブレーザーブイヨンが有り、二段選択増菌法に用いられる。
共雑菌の多い検査材料や食肉製品はこの二段選択増菌法が適している。またリステリ
アが存在すると培地中のエスクリンにより培養液が黒色化する特徴がある。ＩＳＯなど国際機関でも認められている。

リステリア検査・培養所見・特徴

 クロモアガーリステリア
特長・特殊酵素基質により リステリア・モノサイトゲ
ネスのスクリーニングが容易です。
・24時間で判定が可能です。（発育が弱い場合は48時間培養してください。）
・ISO法とのバリデーションをとっております。

酵素基質培地微生物の酵素活性を利用した培地です。特異性が高く、発色酵素基質の分解でコロニー自体が着色するためスクリーニングが容易です。

リステリア・モノサイトゲネス

その他の微生物

コロニー色調青色コロニー

青色のコロニー
無色のコロニー
抑制される

ハローの形成

形成する

形成しない

培養所見

11リステリア検査法について

 確認試験
グラム染色：グラム陽性， 短桿菌
カタラーゼ試験：陽性
VP試験：陽性
運動性試験：陽性
糖分解性試験 ： ラムノース 陽性
キシロース 陰性
マンニット 陰性CAMP試験＊：黄色ブドウ球菌の近くで溶血が増強される。
＊：確認試験のＣＡＭＰ試験では簡易法であるβｰリジンディスク法で代替可能である。

 主なリステリア属菌の鑑別性状
菌種名

S.aureus

R.equi

ﾗﾑﾉｰｽ

ｷｼﾛｰｽ

L.monocytogenes＋＋－＋－

L.ivanovii＋－＋－＋

L.innocua－－－v－L.welshimeri

－－－v

＋

L.seeligeri＋＋－－＋

L.grayi biovar grayi－－－－－

L.grayi biovar murrayi－－－＋－

V：+ or － , ＋：90 ％以上陽性,12CAMPﾃｽﾄ

溶血性－：陰性

糖発酵性

リステリア検査法について

 リステリア検査を迅速・簡便化するアイテム!!
O.B.I.S. MONO
テストカード上の反応サークルに選択分離されたリステリア疑いのコロニーを塗抹・反応させることで、リステリア・モノサイトゲネスの鑑別が容易にできます。
特徴・本試薬はD-アラニルアミノペプチダーゼ（DALAase）を検出する試薬です。
・リステリア属はDALAaseを産生しているが、リステリア・モノサイトゲネスはDALAaseを産生しないためDALAaseの有無により目的の微生物がリステリア・モノサイトゲネスかどうかを判定する事ができます。

O.B.I.S MONOの判定結果
DALAaseリステリア・モノサイトゲネス

その他のリステリア属

非産生産生

陰性

陽性

陽性

陰性

O.B.I.S.MONOの結果

判定

13

リステリア関連製品一覧
用途

コード08403-67

製品名
緩衝ペプトン水
緩衝ペプトン水（ISO処方）
緩衝ペプトン水（ISO処方）リパックシステム
緩衝ペプトン水（ISO処方）1L用分包緩衝ペプトン水（ISO処方）450mL用分包
BPW緩衝ペプトン水（225mL）ISO処方
フレーザー／ハーフフレーザー処方
フレーザー基礎ブイヨン
フレーザーサプリメント
ハーフフレーザーサプリメント
UVM処方
リステリア選択増菌培地（UVM）
リステリア選択増菌培地サプリメント（UVM-Ⅰ）
リステリア選択増菌培地サプリメント（UVM-Ⅱ）
FDA処方
リステリア選択増菌培地（FDA）
リステリア選択増菌サプリメント（FDA）
緩衝リステリア
緩衝リステリア増菌培地
リステリア選択増菌サプリメント（FDA）
パルカム寒天培地
パルカム寒天基礎培地
パルカム選択サプリメント
オックスフォード寒天培地
リステリア選択寒天基礎培地（Oxford）
リステリア選択サプリメント（Oxford）
酵素基質培地クロモアガー リステリア (1L用)

49958-1949958-20

クロモアガー リステリア 基礎培地
クロモアガー リステリア サプリメント

710001-3
717724-0
717724-1
717724-4
49957-00

前増菌培地

711895-5713156-1
713166-1
711863-5
713142-1
713143-1
711862-5
713141-1
711897-5
713141-1
711877-5
713150-1

分離培地

711856-5
713140-1

72144
72145
確認用培地
迅速確認キット

器材・消耗品

14711131-5
非在庫品
718600-655000-08
55000-0971532
96930-01
96930-02
96930-2196930-22
96930-23
96930-24

包装
500g
300g
1L用×40450mL用×40
225mL×30
500g
10バイアル
10バイアル
500g
10バイアル
10バイアル
500g
10バイアル
500g
10バイアル
500g
10バイアル
500g
10バイアル
1L用
5L用

クロモアガー リステリア生培地

10枚×1010枚

トリプトンソーヤ寒天培地
β－リジンディスク (メーカーコード：R21120)
O.B.I.S. MONO
滅菌ストマック袋（フィルター付）
滅菌ストマック袋
自立式ストマック袋
滅菌シャーレ・浅型
滅菌シャーレ・深型
滅菌スプレッダー
滅菌ディスポニードル
滅菌ディスポループ1μｌ
滅菌ディスポループ10μｌ

500g
25discs
60回
50枚×10
50枚×20
50枚
10枚×50
10枚×50
10本×100
20本×5020本×5020本×50FB-002(202204)