PFビームラインでの全自動測定開発の現状
山田悠介
KEK IMSS PF/SBRC

タンパク質X線結晶構造解析
発現/
精製
精製試料

結晶化
結晶

放射光ビームライン
での実験

回折実験
回折イメージ

回折
データ処理
回折強度リスト

構造解析

放射光ビームラインでの作業
試料交換

試料センタリング

回折データ測定

試料交換

回折データ処理なぜ自動化か？
• 省力化– プロジェクトの進行に集中できる• 高速化– 多量の試料を用いた実験– 削減していくビームタイム• 公平な実験– 常に同一条件で実験– 試料の間の比較が可能• 装置使用の敷居を下げる– 結晶構造解析の経験を有しない生化学者でも構造決定を可能に

現在PFで出来る自動測定
PAM

サンプル交換

試料センタリング

回折データ測定

サンプル交換ループ形状認識
結晶認識
X線センタリング

ソフトウェア開発
既存ソフトウェアのスク
リプト作成・実行

データ処理
回折能評価
データ収集条件
実験前に条件設定

ビームライン制御の改良

自動結晶交換システム(PAM)
回折計への測定試料のマウントと測定後の回収を行うロボット。

PAM

2種類のカセットが扱える
Uni-puck

通常利用、SPring-8でも使用可
16 x 12 = 192 サンプル

SSRL

大規模スクリーニング向き
96 x 3 = 288 サンプル

PAMデュワー内の様子

Unipuck(上)とSSRL(右)カセット試料センタリング
1. ループの形状を画像認識
2. 結晶を画像認識
3. X線センタリング
ループ形状の認識
現在2つのソフトウェアが選択可
1. Calib(PF独自開発)• ナイロンループに特化
2. C3D(EMBLで開発)• 様々なループに対応(ナイロン、リソループ、マイクロマウント)

簡易、PFで利用可能
困難
自動センタリング法としては最良
現在開発中ループセンタリングを用いた自動測定• ループのセンタリングだけでもある程度の測定は可能– 結晶のサイズに合ったループ– 結晶がループの中心にいる– ビームサイズが大きい

PFでは比較的ビームの大きなビームライン
BL-5A, AR-NW12A, AR-NE3A (~ 200 um)において効果的に自動測定を行うことが出来る

回折データ測定• 回折データセット収集条
件– 測定角度範囲– 振動角– 露光時間
– カメラ距離– ・・・• デフォルト条件ないし予めサンプルリストファイ
ル設定した条件で測定

123456789101112

列名ContainerID
Port
CrystalID
ProteinDirectory
Comment
Screening
Exp_result
Run
Start
Total_frame
Start_omega

13

Snap_omega

14
15
16

Osc_width
Exp_time
Wavelength17

Max_resolution

18

Camera_height

19
20
21
22
23

HwidthVwidthAtten
Binning
Divergence

24以 SG_N, A_N, B_N,
降 C_N, Alpha_N,…

説明
カセットのID
カセット中のポート番号
結晶のID
タンパク質の名前
データを保存するディレクトリ名
コメント
自動スクリーニングを0: 行わない1: 行う
実験後の結果出力用
Run番号データセット収集時の開始番号
データセット収集時のフレーム数
データセット収集時の回転軸の開始角
スナップショット時の回転軸の開始角(複数指定の場
合は空白で区切る、deg.)
1フレームあたりの振動角 (deg.)
1フレームあたりの露光時間 (sec.)
入射X線の波長 (Å)
期待する最大分解能。検出器の端がその分解能になるようにカメラ距離を算出する。
ダイレクトビームに対する鉛直方向の検出器のオフ
セット量
水平方向のスリット幅
鉛直方向のスリット幅
アテネータの厚み (mm)検出器の読み出しモード(0~2ビームの発散空間群に関する情報

サンプルリストファイルに記述できるの設定項
目事項

全自動測定の流れ
サンプルのPAMへのセット

サンプルリストファイルの読み込み全自動測定の実行
1. スナップショットのみ
2. データセット収集のみ
3. スナップショットもしくはデータセット収集(サンプルごとに指定)

結果の確認

PFの測定自動化の現状

サンプル交換

試料センタリング• ループセンタリングを利用した全自動測定– 測定条件を記載したサンプルリスト– PAMによる結晶交換– ループ形状認識によるセンタリング

回折データ測定• calib.exe (松垣さん)• C3D (EMBL)

データ処理

サンプル交換– 大きなビーム(〜200 um)を用いて決められた測定条件でデータ測定• 利用ユーザー– 製薬企業の大規模スクリーニング– 大学ユーザー• 大学ユーザーからの積極的な利用希望はない• 2015年秋から一部のユーザーにモニター依頼– ほぼ毎週金曜日 AR-NE3A– 試用から有効性の確認、新たなニーズ探索– データセット測定、翌週のビームタイムに向けた予備測定– 東大 藤間さん、京大 藤橋さん、北大 尾瀬さん、東大 大戸さん、
茨大 海野さん、早大 堀越さん、JAXA 木平さん

• 使ってもらうとそこそこ評判は良い

第１回タンパク質結晶構造解析ビームライン中級者向け講習会(今更聞けないビームラインの使い方)より
http://research.kek.jp/group/pxpfug/katsudo/shiryo.html

新しい全自動測定システ
ム開発篠田 晃 博士（現PSI）による開発
全自動測定に特化
手動制御する機能は極力排除
SIROCC:
Sophisticated Interface for
Routine Operation including
Crystal Centeringより確実なループの認識

0度

45度

90度

135度

180度

225度

270度

315度

8枚の画像を利用

立体再構成元の立体立体を横から見た様子

立体再構成立体の断面再構成グリッド

立体再構成立体の断面再構成グリッド

立体再構成立体の断面再構成グリッド

立体再構成立体の断面再構成グリッド

立体再構成立体の断面再構成グリッド

立体再構成立体の断面再構成グリッド

立体再構成立体再構成はノイズに強い（回転に付随するノイズが殆どないため）立体の断面再構成グリッド

様々な環境でループを認識
BL-1A
BL-5A
BL-17A

CUDAを用いて約0.3秒の高速計算
NE-3A

NW-12

X線を用いたスキャン

X線を用いたスキャン
NE-3Aで測定
ビームサイズ：200μm x 80μm
グリッドサイズ：100μm x 40μm①

（ビームよりグリッドを小さくしてるのでX線のあたる場所の一部は隣のグリッドと重なる）④

X線を照射する領域を認識

②

90度方向

反射数の多い領域0度方向認識したループ全体（緑の線はゴニオの回転中心）

90度回転
X線を照射するグリッドを作成

③

0度方向

X線を照射して反射数をプロット③で反射の多かった領域にグリッドを設定（測定時間の短縮に役立つ）

⑤

90度方向

X線を照射して反射数をプロット

自動測定システムの構築撮影した写真CCDカメラ
360度撮影立体認識
SIROCCで制御する機器・結晶交換ロボット(PAM)
・X線（波長、シャッター）・ディテクター・ゴニオ
・CCDカメラ・バックライト

結晶写真の撮影

結晶交換・コリメーター
・クライオ制御

制御
自動測定システム(SIROCC)

計算制御、計算
グリッドスキャンデータセット
Thaumatin
Data collection

Beam line

PF NE-3A

Space group

P41212Cell dimension (Å)

a=57.53, c=150.78

Resolution (Å)

50-1.86

Completeness (%)

97.7

R-work (%)

16.7

R-free (%)

19.7

Oscillation (°)

1

Exposure time (sec)

0.1

Total number of frame

180自動測定を活用した新しいビームライン利用制度
ビームタイム枠

定期的に確保
(毎週金曜日のAR-NE3Aまたはそれに相当するビームライン)

対象ユーザー

G,P,T型課題を持つユーザー

利用申請方法

希望ユーザーは該当する週の月曜日正午までに申請を行う。(申請先はMX BL秘書)
申請はPACの評点に関係なく受け付けるが、測定の優先度はPACの評点で決定される(後述)。

KRS「全自動測定」ビームタイム枠を設定する。
実験責任者はビームライン担当者とする。
化学安全、遺伝子組み換え安全に関する申請はビームライン担当者またはその代理人が行う。
ビームタイムの利用状況に関して情報開示を行う。

実際の実験

ビームタイム前日までに試料を送付する。
施設スタッフが試料をビームラインにセットし、全自動測定システムにより回折データ測定を行う。データ測定はPACの評点順に行い、測定しきれなかった資料については次の全自動測定ビームタイムに回される。
実験終了後、試料およびデータを郵送にて返送する。

費用負担

試料の郵送費はユーザー負担
測定スタッフの人件費は施設負担(将来的に課金制度によりユーザー負担を目指す)

2018年4月からの開始を目標に制度設計中

まとめ• PFではループセンタリングを利用した全自動測定が実装され、活用されています。
• X線センタリングを利用した全自動測定に特化した新しい測定システムを開発しています。
• 2018年4月から全自動測定を利用した新しいビームライン利用を開始する予定です。

謝辞 篠田 晃 博士 (PSI)
KEK構造生物学研究センター スタッフの皆様