Skyline プロテオミクスソフトウェアによるターゲットプロテオミクス研究

アジレントのソリューションによる新たなパスウェイの発見

研究に最適なツール: アジレントの LC/MS とSkyline ソフトウェア

ターゲットタンパク質の分析では、どのようなツールを用いたかによって、結果が大きく異なる場合があります。適切な機器とソフトウェアを用いると、研究を順調かつスピーディに進めることができます。Agilent LC/MS 機器とシアトルのワシントン大学の MacCoss グループの Skyline ソフトウェアの組み合わせは、まさにタンパク質の分析と定量のための最適なツールといえるでしょう。
Skyline は、無料の Windows クライアントアプリケーションで、世界中のリーダー的なラボで広く使用され、高く評価されています。また、アジレントの機器およびソフトウェアとは特別に密接に統合されています。

カスタマイズされた機能

シームレスな統合

2 つのプログラム

Skyline ソフトウェアは、プロテオミクス

アジレントは、Agilent Automation と呼ばれ研究用に特別に設計されています。イる独自のソフトウェアを開発しました。

MassHunter

ンタフェースはタンパク質からペプチ

このソフトウェアは、MRM メソッド開発• 日常的な定量ドまで、さらに MRM トランジションまを簡素化し、生産性を向上させます。

でを取り扱うことができ、プロテオミク

Agilent Automation は、Agilent トリプル四重スに携わる研究者は、直観的に作業を極システムと Skyline を接続して、最適化進めることができます。

されたリテンションタイムでスケジュー

アジレントは、長期間にわたる Skylineのサポーターとして、MacCoss ラボの科学者たちと緊密に研究を発展させてきました。この結果、Skyline はアジレントの装置用にカスタマイズされた機能も備えています。私たちは共同でAgilent Automation ソフトウェアにリンクする Skyline のユーティリティを、オープンソースソフトウェアとして作成しました。

ルされた MRM メソッドを自動的に作成• 異常値検出のための有用なフラッギングおよび視覚化ツール• tMRM スペクトルをライブラリと照合することによるペプチドの確認します。

Skyline• アミノ酸組成に配慮したアルゴリズム• データ検証用の優れた視覚化ツール• 有用なペプチドの MRM 予測• リテンションタイムを予測し、スペクトルを照合するための強力なツール• ユーザのフィードバックに基づく継続的な改善
Skyline は、ペプチドメソッドおよび目的タンパク質のデータ検証を開発するための優れた環境を提供します。MassHunter
Quant ソフトウェアは、ペプチドの日常的な絶対定量に最適です。

2

Agilent 製品と Skyline の接続

Spectrum Mill

Skyline ソフトウェア
Agilent Q-TOF システム

Agilent トリプル四重極システム

Mass Profile Professional

Pathway Architect3従来の MRM 測定の限界を打破

既知のタンパク質の定量分析においては、トリプル四重極質量分析計が一般的に使用されてきました。しかし、サンプルが複雑化し、適切な定量シグナルおよび定性シグナルを捕捉する機能がマルチプルリアクションモニタリング(MRM) メソッド設定の実用限界に達しました。
その結果、プロテオミクスの研究者はさまざまな方法でこの問題に取り組み、アジレントの機器と Skyline ソフトウェアが多く使用されてきました。

自動化された最適化プログラム
アジレントの Skyline 自動化ツールは、重要なメソッドの開発および最適化プロセスを自動化することによって新しいメソッドの作成をより簡単にします。
Skyline と MassHunter は連携して動作し、容易に設定可能なソリューションを提供します。サンプルをバイアルに置きパラメータをセットアップするだけで、残りはソフトウェアが実行します。プログラ
ムによってメソッドが作成され、サンプルを実行する準備が整います。
カラムやメソッドの交換時、複雑なメソッ

2 つのモード
Skyline は、トリプル四重極 LC/MS システ
ムの MRM 測定法の限界を超えるためにアジレントが開発した 2 つのモードをサポートしています。
1 つはダイナミック MRM モードで、ペプチドの溶出時にのみ MRM トランジションを実施します。これにより、多数のペプチドアッセイの実施と狭いピーク幅の正確な定量が可能になります。ダイナミッ
ク MRM は、任意のポイントでモニタリングされるトランジションの数がタイムセ4グメントメソッドよりも大幅に少ない場合によい結果が得られます。さらに高速の MS スキャンとより長いデュエルタイ
ムの測定を実現できます。
もう 1 つは、トリガ MRM モードです。
データ依存のロジックを追加し、ペプチド確認のためにトランジションをさらに測定します。
トリガ MRM は、従来のデータ依存型 MS/MS スキャンよりも高速かつ高感度で、擬似 MS/MS スペクトルを生成し MassHunter Quant でライブラリ照合に使用することができます。

ドでのリテンションタイムの調整に時間がかかる場合があります。MassHunterのリテンションタイムキャリブレーションツールはリテンションタイムの変更に対処するためにメソッドを容易に調整できるように設計されています。Skyline
は、ペプチドリテンションタイムを保存し予測できる iRT 機能も備えています。
Agilent MassHunter と Skyline ソフトウェア
は連携して、ペプチドの定量分析をより高速、より容易、より高い生産性で実現します。

Agilent Automation ツールを使用した、簡易な 3 ステップの自動化 MRM 測定

1

RT の決定2

CE の最適化3

最終メソッドの作成• Skyline のドキュメントの作成• MRM 結果のインポート• CE 最適化の結果のインポート• タンパク質 / ペプチド情報の追加• CE 最適化メソッドのエクスポート• 最終ダイナミック MRM
メソッドのエクスポート• MRM メソッドのエクスポート• CE 最適化の実行• 最終メソッドの実行• MRM 分析の実行

1
2

3

Agilent Automation ツールを使用すると、MRM メソッド開発用のステップやパラメータを選択できます。

5データを答えに変えるソフトウェア

トリプル四重極質量分析装置は、少数のタンパク質のターゲット定量プロテオミクスに最適な機器です。一方、多数のタンパク質をモニタリングする場合、Q-TOF 質量分析計がターゲット MS/MS プロテオミクス用に最適な機器です。
ターゲット MS/MS プロテオミクスは、ペプチド MS/MS スペクトルをターゲットリストに基づく分析手法で収集します。
測定したスペクトルをペプチド MS/MS ライブラリで確認することによって、対象となる特定のタンパク質の配列からペプチドを同定します。

柔軟なデータ取り込み
Skyline と MassHunter は様々なデータ測定法をサポートします。ターゲットリストを使用しない網羅的測定では、wideband
isolation や All Ions MS/MS を用いることができます。All Ions MS/MS は、四重極でのアイソレーション、2 つ以上のコリジョンエネルギーによるコリジョンセル内のフラグメントイオンを使用しません。これらの手法はいずれも、Agilent Q-TOF シ

S k y l i n e は 、探 索 的 な 実 験 の デ ー タ(discovery data) からスペクトルライブラリを構築し、MS1 フィルタリング用に設定できます。この MS1 フィルタリングはAgilent TOF および Q-TOF 機器で使用可能です。このシナリオでは、MS1 データは目的の特定のペプチドの定量に使用され、ペプチドの同定にはには MS/MS スペクトルからのスペクトルライブラリが使用されます。

知見の獲得手法に関係なく、最初にあるのはスペクトルデータです。データから答えを導出する際に、Agilent Mass Profiler Professional(MPP) ソフトウェアを使用すると、複雑なタンパク質実験の多変数解析が可能になり、生物学的差異と相関のある主なタンパク質を正確に特定できます。Skyline
ソフトウェアからアジレント機器で得られた結果を MPP にエクスポートできます。

ステムから得られる非常に高精度な質

Agilent Q-TOF は、非常に汎用的な機器で、Skyline はタンパク質の情報を基に解析さ量測定値により、適切に機能します。こディスカバリープロテオミクスおよびれるため、エクスポートされた結果にはタの結果、スペクトルデータのマイニング

ターゲット MS/MS プロテオミクスにも使ンパク質アクセッション番号が含まれまおよび照合を容易に実行できます。さ用することができます。MRM モードのトす。この番号により、生物学的パスウェイらに、
Skyline は、Agilent Spectrum Mill ソフト

リプル四重極型質量分析装置は究極のでのタンパク質を Mass Profiler Professional

ウェアで生成されるライブラリなど、公感度を提供しますが、同定および定量すの Pathway Architect モジュールで視覚化で的に利用できる、またプライベートに作るための Q-TOF の機能はラボにとってよきます。

成されるペプチド MS/MS ライブラリをり重要になることもあります。Skyline ソ作成するために使用可能です。

フトウェアは、ターゲット定量モードでの動作時に、Q-TOF データをシームレスに処理するために設計されました。

6

Skyline による Agilent Q-TOF のすべての捕捉モードでのサポート
MS1 full-scan フィルタリング
四重極でのプリカーサ
アイソレーション

コリジョンセルターゲット
ペプチドライブラリ

Skylineコリジョンセルターゲット
ペプチドライブラリ

Skylineコリジョンセルターゲット
ペプチドライブラリ

SkylineWide-band isolation
四重極でのシーケンシャル
アイソレーションタイム
ウィンドウ

All Ions MS/MSAB

C

precursor - 575.3111++
precursor [M+1] - 575.8126++
precursor [M+2] - 576.3140++

12.5+1.9 ppm

1.216080

1.00.40.260

Intensity (10^3)0.650403068101214

Retention Time

16181201008060

2040

1020

29.2

00.005

1015

12.6

140

12.6

70

0.8

Intensity (10^3)

Intensity (10^6)

y8 - 937.4625+
y7 - 823.4196+
y6 - 694.3770+
b2 - 213.1598+

y8 - 937.4625+
y7 - 823.4196+
y6 - 694.3770+
y5 - 595.3086+
b2 - 213.1598+
b4 - 456.2453+

20

Retention Time

2530

13.1
15.0

005

1015

20.7
21.9
202530Retention TimeA) MS1 Full-scan filtering を使用した分析、B) Wide-band isolation を使用した分析、C) Agilent All Ions MS/MS を使用した分析

7

お問い合わせ先
カストマコンタクトセンタ
0120-477-111
www.agilent.com/chem/jp
email_japan@agilent.com
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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2014
Printed in Japan, October 22, 2014
5991-5248JAJP