第２回タンパク質構造解析BL講習会：
スクリーニングで析出した結晶をうまく回折実験にもって⾏こう測定に向けた結晶の取り扱いについて
JAXAおよびDiamond Light Sourceの取り組みと現状

宇宙航空研究開発機構（JAXA)
きぼう利⽤センター
岩⽥茂美

○きぼう利⽤PCG実験の最近の進展○Diamond Light Sourceのin situ測定

宇宙での結晶⽣成の特徴
地上

周囲のタンパク質分⼦を取り込みながら結晶が成⻑
→ 結晶周囲のタンパク質濃度が部分的に低下

密度差対流により濃度が均⼀化（乱れ）・分⼦配列の乱れ
・クラスター状（⼩さな結晶が多数集まった塊）に成⻑

宇宙(微⼩重⼒)

密度差対流抑制により濃度勾配が維持
・結晶品質の向上（不純物の取り込み抑制など）・単結晶の⽣成

宇宙では、地上よりも不純物が少なく、分⼦配列の揃った⾼品質の結晶が⽣成

タンパク質結晶⽣成の原理－カウンターディフュージョン法－
ゲルチューブ法
キャピラリー（0.5 mm)

結晶化溶液

ゲルチューブ（アガロース）タンパク質溶液⇧結晶化溶液の拡散⇩タンパク質溶液の拡散Crystal

JAXA-PCG実験
ゲルチューブ法：液-液拡散法を⽤いた結晶化
結晶化温度：20℃(ロシア便）
温度
搭載試料の種類・結晶化⼿法の充実
浸透チューブ法、透析法、サンドイッチプレート(LCP)
嫌気条件下での結晶化、結晶化開始コントロール
運⽤⾯の改善：打ち上げ機会増、搭載量増など

SpaceXを利⽤したPCG4℃実験✔︎4℃での結晶化✖スケジュールが不安定で延期が多い→実験開始のタイミングをコントロールする仕掛けを導⼊結晶化実験開始コントロール
沈殿材とたんぱく溶液を仕切るアガロース部分を圧迫して溶液を隔離する↓
宇宙ステーションの「きぼう」まで輸送↓「きぼう」でクルーが圧迫を解除して結晶化開始↓
国内へ輸送後結晶観察・取り出し・回折実験
温度は全⾏程で4℃

JAXA-PCG実験の選択肢
軌道上結晶化実験

結晶化温度

20℃および4℃

結晶化法

ゲルチューブ法
浸透チューブ法（蒸気拡散法に相当）
透析法

その他

軌道上結晶化実験へ向けた検討
簡易結晶化診断・嫌気条件下での結晶化・⼤型結晶作成（検証中）・LCP法、20℃のみ（検証中）

・提供していただいた試料について、基本的な性状確認と各種結晶化スクリーニング、結晶が得られた場合回折計での回折実験を実施します。
（結果にかかわらず最⻑6か⽉）

問い合わせ：PCGメンバーまたはメール（Z-CRYSTAL@ml.jaxa.jp)まで

○in situ Experiment at
Diamond Light Source

DLSのin situ測定
Membrane Protein Laboratory (MPL) 2007~
膜たんぱく質の構造解析
膜たんぱく質に適した回折データ収集システムの開発（＋I24ビームライン)
得られた技術の普及（オープンラボ）
微⼩・回折強度の弱い結晶からのデータ収集システム（単結晶＆複数結晶）
迅速な結晶評価（プレートスクリーニング）による結晶化条件の最適化

DLSのin situデータ測定
現在in situ実験ができるビームライン：I24・I03
Beamline

I24
Micro-focusPlate

All SBS format
All SBS format
LCP sandwich platePlate Storage

×I03
P2/P3 containment

5 plates

Plate mounting

Manually

Manually/Robot

Rotation Range-10 ~+38-20~+20

Goniometerchange

2 min

Remote access

測定可,ただしプレートマウントは⼿動

建設中：VMXi (in situ専⽤)
⾃動プレート測定、４℃実験が可能に

DLSのin situデータ測定の流れ（I24)
課題がある：結晶とプレート⽤のゴニオはすぐに切り替わるので⾃分のビームタイム内で⾃由にやる
課題がない：通常のビームタイム申請（採択まで6か⽉）
ラピッドアクセス（ビームラインスタッフに相談）
MPLのユーザはMPLのビームタイムも利⽤可
誰か課題のある⼈に頼む
以前はゴニオの取り換えはスタッフがやり、時間もかかっていたため・プレート⽤ビームタイムが定期的にあった。
・プレートモードでスクリーニング→ゴニオ交換→凍結して単結晶測定

In situ測定のアプリケーション
結晶化条件最適化：
Additive/Ligand/Detergent Screen
結晶取り出し・凍結時のばらつきを抑えることができるので⽐較しやすいデータ測定Structure determination of an integral membrane protein at room
temperature from crystals in situ
D. Axford et.al. Acta Cryst. (2015). D71, 1228–1237

TehA：インフルエンザウイルス由来イオンチャンネル
凍結条件が⾒つからない、取り出し困難な結晶でもデータを取ることができる。
マイクロビームなら1ドロップ中の複数の結晶を1結晶ずつ測定できる。
多数の結晶から集めた部分データをBLENDでマージ・解析してよいデータを抽出
凍結していないので結晶間のデータのばらつきは⼩さい。

デハイドレーション実験
Using high-throughput in situ plate screening toevaluate the eﬀect of dehydration on protein crystals
A. Douangamath et. al., Acta Cryst. (2013). D69, 920-923

XFEL HubとしてのDLS➣XFELハード・ソフト開発➣インジェクションシステムを⽤いた試料調整・試料評価の最適化➣世界のXFELへのインターフェース➣データ処理のサポート➣ Europian XFELへの旅費サポート

In situ測定のPros &Cons✓ハンドリングエラーやクライオ条件を気にしなくてよい✓塩や低分⼦であれば微結晶からでも回折点が測定できる✓格⼦定数や対称から⽬的物かどうかある程度推測できる✓多数の条件を迅速に評価できる→結晶化条件の最適化を加速✓データ収集も可能✗どこでもいつでもできるわけではない✗プレートをマウントできるセットアップが必要✗ビームサイズ、プレートの形状・素材に制約がある

PCG4℃実験の意義
PDBに登録されているタンパク質結晶構造の約13%の結晶化温度は低温(<10℃）
Ø 20℃で徹底的にスクリーニングすれば4℃実験はいらないか？
--おそらくNoØ 変性しやすいたんぱく質に有利
Ø 低温で結晶化することは意味がある
4℃でないと結晶化しない
20℃条件より良質結晶性や空間群が違う結晶になる☆スクリーニング（キット）で結晶がでた◎時間や試料を無駄にしないために、⽬的の結晶かどうかすぐ確認する。
低分⼦：キットや溶液中の成分、精製からの持込み・溶液中に疑わしい成分がないか？
・リザーバーに同じ結晶が出ていないか？
・偏光や蛍光は⾒えるか（参考程度）
たんぱく：コンタミ、サブユニット、部分構造・⾊付きでも確認したほうがよい

どうしてもＸ線で確認したい◎再現するか？
同⼀精製ロットの試料から結晶が再現するか別の精製ロットの試料から結晶が再現するか再現する→複数の結晶で検討できるので落ち着いて試せる
再現しない場合、コンタミや分解物かも。⽬的物だったとしても後々まで苦労することになるので別条件を探すか精製までのステップを⾒直すことも考慮。

◎X線に照射する→回折像が得られれば確実。
すぐにX線に当てられない。
待っていると結晶がだめになってしまうかも1個（1ドロップ）しかないので取り出し時にダメになってしまうかも
微結晶や反射強度の弱い結晶だとわからない時もある

プレートのまま放射光でチェックできたら…