南太平洋海域調査研究報告 No．
３６（２００２年１２月）
OCCASIONAL PAPERS No．
３６（December ２００２）

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ハブ毒腺アイソザイムの加速進化
Accelerated Evolution of Trimeresurus flavoviridis
Venom-gland Isozymes
大野 素徳Motonori OHNO

崇城大学工学部応用生命科学科
Department of Applied Life Science, Faculty of Engineering, Sojo University

はじめにハブ（Trimeresurus flavoviridis）は奄美大島，徳之島，沖縄，久米島などの南西諸島に棲息する．クサリヘビ科マムシ亜科に属する毒ヘビである．毒成分として，ホスホリ
パーゼA２（PLA２），金属（亜鉛）プロテアーゼ，セリンプロテアーゼ，ヒアルロニダー
ゼ，L- アミノ酸酸化酵素，血小板凝集阻害タンパク質など多くの生理活性成分を含む．
PLA２， 金属プロテアーゼ，セリンプロテアーゼなどはアイソザイム系を構成している．
これまでの研究から，これらアイソザイム系では，遺伝子が加速進化をして，多様な生理機能をもつアイソザイムをつくりだしてきたことを明らかとした１，２．ここではマムシ亜科ハブ属ヘビの毒腺 PLA２アイソザイムの加速進化について述べる．

１．ハブ毒腺 PLA２アイソザイムの構造と生理機能
ハブ毒より各種クロマトグラフィーを組合せて，PLA２，PLA-B，PLA-N，BPI 及び BPIIと呼ぶ PLA２アイソザイムを精製し，アミノ酸配列を決めた．PLA２，PLA-B 及び PLAN は［Asp４９］PLA２型であり，BPI と BPII は［Lys４９］PLA２型である．すべてのアイソザイムは１２２アミノ酸残基よりなり，配列は５５％以上の相同性を示す．
１４ハーフシスチン残基の位置は同じであり，高次構造も同じと考えられる３．
PLA２のリン脂質（ミセル）分解活性は高いが，BPI 及び BPII のリン脂質分解活性はPLA２の１−２％であった．逆に，BPI と BPII をマウスに筋注したときの血液中のクレアチンキナーゼのレベルは PLA２を与えたときの数倍のレベルに達し，
BPI 及び BPII の筋壊死活性は PLA２のそれより数倍高いことがわかった．
BPI と BPII は５９位のアミノ酸残基が Asp と Asn の違いのみであるが，筋収縮作用において，BPII は BPI の１０−１００倍の活性を示した．BPI と BPII は筋細胞の脱分極を起こしたが，PLA２にはこの活性は認められなかった．PLA-B のみが浮腫を誘起し，PLA-N は神経毒性を示した．BPI と BPII
はガン細胞に対してアポトシスを誘起したが，PLA２にはこの作用は認められなかった．
このようにハブ毒 PLA２アイソザイムはそれぞれが特有の生理機能をもつことが明らかとなった．

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大野 素徳

２．PLA２アイソザイム遺伝子の新規な構造
ハブ（徳之島）毒腺 PLA２ アイソザイム（PLA２，BPI，BPII，PL-X 及び［Thr３８］
PLA２）の cDNA をクローニングした４．塩基配列の相同性は５ 及び３ 非翻訳領域でそれぞれ９８及び８９％であるのに対し，翻訳領域の相同性は６７％であった．通常のアイソザ
イム cDNA では翻訳領域の相同性が非翻訳領域のそれより高いので，ハブ毒腺 PLA２アイソザイム cDNA は全く逆の関係となっている．ハブ毒腺 PLA２アイソザイム cDNA が構造的に新規な特徴をもつことが明らかとなった．タンパク質翻訳領域のコドンの第１，第２，第３座位における塩基の置換率はそれぞれ３２，３０，２９％であった．通常のアイソザ
イム cDNA では第１及び第２座位の置換率は第３座位のそれよりかなり低いのが普通である．第１及び第２座位の塩基置換はほとんどの場合アミノ酸置換を起こす．ハブ毒腺 PLA２アイソザイム cDNA で第１及び第２座位の塩基置換率が高いことは，これらがコードするタンパク質に多くのアミノ酸置換があり，配列に多様性があることを意味している．
つぎにハブ（徳之島）毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子６種とグリーンハブ（台湾）毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子４種をクローニングした５，６．４個のエキソンと３個のイントロンよりなる共通構造をもつ．ハブ毒腺 PLA２アイソザイム cDNA の５ 及び３ 非翻訳領域にみられたように，これら遺伝子間でイントロンの相同性は９３−９９％と高いものであった．

３．PLA２アイソザイム遺伝子の加速進化
PLA２アイソザイム遺伝子のすべての対について進化学的数理計算を行った５，６．非翻訳領域では座位あたりの塩基置換数 KN を求めた，翻訳領域では，同義座位あたりの塩基置換数 KS と非同義座位あたりの塩基置換数 KA を求めた．KN/KS 値が１より小さいときは，タンパク質翻訳領域が非翻訳領域より塩基置換が多いことを意味する．KA/KS 値が１より大きいか或いはそれに近いときにはタンパク質翻訳領域に加速進化が起こっていると考えることができる．
何故なら通常のアイソザイム遺伝子ではこの値は０．
２程度であるからである．
ハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子対について KN/KS 値は０．
２５程度となり，翻訳領域が非翻訳領域より４倍ほど塩基置換が多いこと，すなわち翻訳領域の多様性を示した．
７５−１．
８であり翻訳領域に加速進化が起こっていることがわかった．ハブ毒KA/KS 値は０．
腺 PLA２アイソザイムの機能の多様性は加速進化によりもたらされているものと考えられる．
グリーンハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子内の比較でも，またハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子とグリーンハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子との比較でも同じ結論が導かれた．
１９クサリヘビ科ヘビ毒腺 PLA２ アイソザイム cDNA の１３種についての KA/KS 値は１．
で，一方哺乳類膵臓などからの PLA２アイソザイム cDNA の４種についての KA/KS 値は０．
２９であった７．ヘビ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子のタンパク質翻訳領域が加速進化をしており，一方哺乳類内臓由来の PLA２アイソザイム遺伝子のタンパク質翻訳領域は中立的進化をしていることがわかる．

ハブ毒腺アイソザイムの加速進化

２５４．毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子の加速進化の機構
ヘビ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子の加速進化には２つの可能性が考えられる．１つは，非翻訳領域は通常の遺伝子と同じ程度の変化であるのに対し，タンパク質翻訳領域が速い変化をしている．２つめは，タンパク質翻訳領域は通常の遺伝子とおなじ変化速度であるのに対し，非翻訳領域が非常に遅い変化をしていて，みかけ上タンパク質翻訳領域が速い変化をしているようにみえるというものである．この２つの可能性のいずれであるかを検討するために，対象の遺伝子として TATA ボックス結合タンパク質を選んだ．このタンパク質遺伝子は通常の進化速度をもつと考えられたからである．このためハブ（徳之島）とグリーンハブ（台湾）の肝臓を用いて TATA ボックス結合タンパク質遺伝子をクローニングした８．この２つの遺伝子を比較して，７個のイントロンの KN 値
及び８個のエキソンの KS 及び KA 値を求め，そしてハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子対の３個のイントロンの KN 値と４個のエキソンの KS 及び KA 値と比較した６．ハブ毒腺PLA２アイソザイム遺伝子対の平均的 KN 値（０．
０７）と TATA ボックス結合タンパク質遺伝子対の平均的 KN 値（０．
０４）はほぼ同等であった．これよりハブ 毒腺PLA２アイソザイム遺伝子のイントロンの進化速度は TATA ボックス結合タンパク質遺伝子のイントロンの進化速度とほぼ同じといえる．一方ハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子対の KS 値（０．
２２−０．
３５）及び KA 値（０．
２５−０．
４３）は TATA ボックス結合タンパク質遺伝子対の KS値（＜０．
０１）及び KA 値（０．
００）に比べてはるかに大きい．これらのことよりハブ毒腺PLA２アイソザイム遺伝子の加速進化はタンパク質翻訳領域の速い進化に基づくものといえる．
TATA ボックス結合タンパク質遺伝子では KN＞KS であり，ハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子では KN＜KS である．これはハブ 毒腺PLA２アイソザイム遺伝子のタンパク質翻訳領域における多様性を意味する．このハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子の多様性の獲得は遺伝子変換によるものではないかとも考えられる．ヒメハブ（奄美大島）の毒腺PLA２アイソザイム遺伝子をクローニングしたところ，３種の PLA２アイソザイム遺伝子しか存在しなかった９．３種のアイソザイム遺伝子について数理計算をすると KA/KS 値は１より大きく，加速進化を示した．僅か３種の遺伝子間で遺伝子変換が起こると，３種の遺伝子は均質化に向けて収斂し，KA/KS 値は１よりはるかに小さい値となるはずである．したがって毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子の多様性は遺伝子変換によるものではないと結論できる．毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子のタンパク質翻訳領域の多様性は点変異の蓄積により獲得されたものと考えられる．

５．毒腺 PLA２アイソザイムの地域特異的進化
奄美大島，徳之島，沖縄のハブ毒の中分子量画分を CM セルロースカラムで分画した
とき，奄美大島と徳之島ハブ毒に存在する BPI と BPII が沖縄ハブ毒には欠落していることが明らかとなった１０． BPI cDNA を用いた奄美大島，徳之島，沖縄のハブ毒腺 RNA のNorthern blot 解析から，沖縄ハブ毒腺には BPI と BPII をコードする mRNA が発現していないことが確認された．ハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子由来の様々なプライマーを用いて沖縄ハブゲノムに対して PCR を行うと，BPI 遺伝子の上流部分（第２エキソンの中程まで）と BPII 遺伝子の下流部分（第２イントロンの中程以降）は増幅されたが，これらの間の部分は増幅することができなかった．これから沖縄ハブゲノムでは BPI 遺伝子と BPII 遺伝子が融合して偽遺伝子となっていることがわかった．沖縄古陸が水面下に大野 素徳２６沈み，奄美大島，徳之島，沖縄などが島となって１００−２００万年経つ．沖縄が島となった
とき，沖縄ハブは BPI 遺伝子と BPII 遺伝子をともにもっていたが，その後両遺伝子は偽遺伝子となってしまった．奄美大島，徳之島両島と沖縄島のハブの棲息環境の違いがBPI 遺伝子と BPII 遺伝子の運命に影響を与えたことになる．近年の調査によると，奄美大島ハブの食性はネズミ８６％，鳥，爬虫類，両生類あわせて１４％である．一方，森に覆われた沖縄山原地域ではハブは９０％以上ホルストガエル（沖縄県指定天然記念動物）を餌としているといわれている．山原地域は太古の沖縄の環境を反映しているものと思われる．沖縄ハブは主としてカエルを餌としているために強力な筋壊死活性をもつ BPI やBPII を毒成分として必要とせず，BPI 遺伝子と BPII 遺伝子を適応的に偽遺伝子にしてしまったものと考えられる．他のハブ毒腺 PLA２アイソザイムでも島間でアミノ酸置換がみられ，島特異的進化が観察されている．

６． おわりに
ハブ毒腺 PLA２アイソザイム遺伝子が，加速進化により，タンパク質翻訳領域の全領域において点変異に基づく塩基置換を蓄積し，多様な生理機能をもつアイソザイムをつくりだしていることを述べた．この加速進化はハブ毒腺のセリンプロテアーゼアイソザイム遺伝子１１や金属プロテアーゼアイソザイム遺伝子（未発表）にもみられる．ハブ毒腺アイソザイムにおける加速進化の発見は分子進化の分野で画期的なものである．近年
コブラ科コブラ亜科ヘビの神経毒タンパク質遺伝子でも加速進化してきたことの証拠が提出されはじめており，加速進化はヘビ毒腺アイソザイム遺伝子に普遍的である．

参考文献
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