2022.11.24
PF-UA タンパク質結晶構造解析グループ
第7回中級者講習会

構造生物学者が知るべき
ColabFold活用方法
名古屋大学シンクロトロン光研究センター
小野田 浩宜本日の実習内容
題材: インスリン

1) Alphafold DBの予測を再現

10 min2) シグナルペプチドのトリミングの効果

10 min3) ヘテロダイマーの予測

10 min4) ホモダイマーの予測

10 min5) 高難度な複合体予測

20 min6) テクニックを生かして再挑戦

30 min7) まとめ※最後の結果は発表後に各自確認してみてくださいヒト+20生物種のプロテオーム

EMBL-EBI press release

7 Days > 36万 22 Jul 2021 16:00 London

大腸菌
大豆
シロイヌナズナ
サシチョウバエ
線虫
ヒト
メタン菌
マウス
ゼブラフィッシュ
カンジダ
キイロタマホコリカビ 結核菌
マラリア原虫 ラット
ショウジョウバエ

出芽酵母 分裂酵母
黄色ブドウ球菌
トリパノソーマ原虫
トウモロコシアジアイネなど

We plan to release an updated set of AlphaFold structure predictions
on AFDB in the coming weeks. Alphafold DB FAQs. Update on upcoming release of structure predictions
5 Month > 80万

Swiss-Prot
病気の原因生物のプロテオーム

6 Month > 100万
1 Year> 2億

ズボアジ型ヒストプラスマ症の原因菌
リンパ系フィラリア症の原虫
カンピロバクター感染症の原因菌
ヒト病原性黒色真菌の原因菌×2
メジナ虫症の原虫
腸球菌（耐性菌の課題）

ピロリ菌
肺炎桿菌感染症の原因菌
リーシュマニア症の原因菌
マイセトーマの原因菌
らい菌（ハンセン病原因菌）
結核菌など

UniProt 2021_04 (Model_4_ptmのみ)「例外や失敗」を除き天然蛋白質を予測する必要はない

EMBL-EBI press release

7 Days > 36万 22 Jul 2021 16:00 London

5 Month > 80万 Swiss-Prot> 6億もの予測構造を公開
6 Month > 100万
1 Year> 2億400aaまで1分以内に予測

UniProt「例外や失敗」を除き天然蛋白質を予測する必要はない

UniProt: P01308
シグナルペプチド

NMR構造
PDB: 2KQP
Nter

Cter

UniProt accession Q9NRX4PDBID: 2A16

UniProt accession P01308
PDBID: 2KQP

UniProt accession O60927

AlphaFold heralds a data-driven revolution in biology and medicine
Nat Med. 2021 Oct;27(10), Comment. doi: 10.1038/s41591-021-01533-0.

インスリンの予測は失敗するとされている区別しなければいけないAlphaFoldの種類
AlphaFold v2.0

AlphaFold2.ipnyb (Deepmind)

model_1~5
model_1~5_ptm

ColabFold (本実習で使用)

AlphaFold v2.1
LocalColabFold v1.0

multimer_1~5複合体予測対応_batchLocalColabFold v1.2

multimer_1~5_v2
複合体予測のバグ修正

GitHub版

ChimeraMMseqs2

Advanced実習1※失敗しますColabFoldを使用してインスリンの構造を予測する

MMseqs2

Advanced実習1(Pre-pro-)Insulinを予測（準備2分, 実行3分）
UniProt
https://www.uniprot.org/uniprotkb/P01308/entry.fasta Download link
https://rest.uniprot.org/uniprotkb/P01308.fasta
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

ColabFold
https://github.com/sokrypton/ColabFold
Notebooks
AlphaFold2_mmseqs2
AlphaFold2_batch
RoseTTAFold
ESMFold New!!
OmegaFold
AlphaFold2_advanced

monomers
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes
Yes

complexes
Yes
Yes
No
Maybe
Maybe
Yes

mmseqs2
Yes
Yes
Yes
No
No
Yes

jackhmmer
No
No
No
No
No
Yes

templates
Yes
Yes
No
No
No
No

実習1

(Pro-)Insulinを予測（準備2分, 実行3分）←インスリンのアミノ酸配列を入力

出力ファイルのフォルダ名
none (標準) か pdb70でどちらでも← Run all
（すべてのセルで実行）
で予測を開始する

実習1(Pre-pro-)Insulinを予測（準備2分, 実行5分）

実習1
NMR構造
PDB: 2KQP
Nter

Cter

ヒト由来インスリン（isoform1）の構造を調べると5件ヒット
NMR構造との重ね合わせ

UniProt: P01308

I3WAC9A6XGL2C9JNR5F6MZK5

実習1
予測構造:白NMR構造
PDB: 2KQP
Nter

Cter

F6MZK5の予測構造は実験構造のS-S結合を再現
NMR構造との重ね合わせ

UniProt: P01308

I3WAC9A6XGL2C9JNR5F6MZK5

実習1

シグナルペプチドの欠損と予測
Signal Peptide

B-Chain

C-Peptide

NMR構造
PDB: 2KQP
Nter

A-ChainCter

C9JNR5A6XGL2
P01308I3WAC9F6MZK5

予測成功の配列はシグナルペプチドが欠損していた
NMR構造との重ね合わせ

UniProt: P01308

I3WAC9A6XGL2C9JNR5F6MZK5

実習2

シグナルペプチドを取り除きインスリンの構造を予測する実習2

シグナルペプチドの欠損と予測
Signal Peptide

B-Chain

C-Peptide

NMR構造
PDB: 2KQP
Nter

A-ChainCter

C9JNR5A6XGL2
P01308I3WAC9F6MZK5

UniProt: P01308

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCNNMR構造との重ね合わせ

シグナルペプチドを削って予測（実行5分）※Advanced はMSAのトリミングが可能

F6MZK5

実習2

シグナルペプチドの欠損と予測
Signal Peptide

B-Chain

C-Peptide

NMR構造
PDB: 2KQP
Nter

A-ChainCter

C9JNR5A6XGL2
P01308I3WAC9F6MZK5

UniProt: P01308

MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCNNMR構造との重ね合わせ

シグナルペプチドを削って予測（実行5分）

NMRと同様の予測結果が得られる

2kqp_12kqp_22kqp_3F6MZK5

実習2

結果の確認
Signal Peptide

B-Chain

C-Peptide

A-Chain

C9JNR5A6XGL2
P01308I3WAC9F6MZK52kqp_12kqp_22kqp_3

Animate outputs

B-Chain

A-ChainB
Chain

A vs B

C-Peptide

B vs AA
Chain

B鎖とA鎖のアミノ酸の相対位置（距離）が予測値と予測構造間で少ないエラーを示した

C-ペプチドはモデル毎に相対値が大きくずれた説明

PCAで構造変化を追跡する
Animate outputsの利用

実習2

PCAで構造変化を追跡するAnimate outputs

GSTのOpen-Close

酸化還元酵素の電子伝達

α-ヘリックス→β-バレル

実習2

MSAの情報量を削減した構造多様性予測

GSTのOpen-Close

酸化還元酵素の電子伝達
ColabFold (MMseqs2)

max_recycles=3
max_msa=16:512
num_models=5
num_samples=50

Diego del Alamo et al., eLife 2022

α-ヘリックス→β-バレル
ColabFold (advanced)
max_recycles=1
max_msa=512:1024
subsample_msa (1000)
is_training=True
num_models=1
S. Ovchinniokv
num_samples=32 @sokrypton

実習2

MSAの情報量を削減した構造多様性予測
MSA

AlphaFoldが学んだポテンシャルマップ
≃モデルパラメーター

Subsampled MSA Provides
Poor Initial Guess
Subsample MSA

State-of-the-art estimation of protein model accuracy using AlphaFold
doi: https://doi.org/10.1101/2022.03.11.484043 Figure 1 (modification)

ColabFold (MMseqs2)

max_recycles=3
max_msa=16:512
num_models=5
num_samples=50

Diego del Alamo et al., eLife 2022

ColabFold (advanced)
max_recycles=1
max_msa=512:1024
subsample_msa (1000)
is_training=True
num_models=1
S. Ovchinniokv
num_samples=32 @sokrypton

実習2

MSAの情報量を削減した構造多様性予測
AlphaFoldが学んだポテンシャルマップ
≃モデルパラメーター

MSA

Subsampled MSA Provides
Poor Initial Guess
Subsample MSA

max_msa=main_msa:exstra_msa

MSAの欠損は
シグナルペプチドの
pLDDTを低下させ
A鎖-B鎖のpLDDTを向上させた

doi: https://doi.org/10.1101/2022.03.11.484043 Figure 1 (modification)

512:1024

32:64

4:8

実習2

翻訳後処理

Signal Peptide

B-Chain

C-Peptide

A-Chain

C9JNR5A6XGL2
P01308I3WAC9F6MZK5Signal Peptide

シグナルペプチド
切断の効果を再現している？

※「東ソー株式会社/イムノアッセイ/糖尿病」より画像を転載

B-Chain
A-Chain

C-Peptide

MSA

インスリンは2本のポリペプチド鎖で構成されるので構造予測の工夫が必要

説明

単量体の構造予測プログラム
で複合体予測を行う方法

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.
※後に「/」から「：」に変更され「/」はリンカー切断になる

YouTubeより一部転載Twitterで話題に
公開後1週間ColabFoldに実装
3カ月

3週間

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGBBBBBBB
特徴のないアミノ酸リンカーを挿入する

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGBBBBBBB
特徴のないアミノ酸リンカーを挿入する

フレキシブルなリンカーでつながったマルチドメイン蛋白質の予測≒ ヘテロ複合体の予測
PAE map

A

A

B
B

C
D

E

AドメインとBドメインが相互作用する

フレキシブルなPolyGリンカー

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGBBBBBBB
特徴のないアミノ酸リンカーを挿入する
1

5

12

206

212

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
BBBBBBBBBBBBBB
残基番号を+200する

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGBBBBBBB
特徴のないアミノ酸リンカーを挿入する
1

5

12

206

212

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
BBBBBBBBBBBBBB
残基番号を+200する

Twitterの記載がColabFoldの論文やAlphaFold-MultimeｄのbioRχivで引用される

実習3

複合体予測の課題とアプローチ
Alphafold DB FAQs. What use cases does AlphaFold not support?

The version (ver 2.0) of AlphaFold used in this database
does not output multi-chain predictions.

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGBBBBBBB
特徴のないアミノ酸リンカーを挿入する
1

5

12

206

212

AAAAAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
BBBBBBBBBBBBBB
残基番号を+200する
Notebooks

monomers

complexes

AlphaFold2_mmseqs2 Yes

Yes

AlphaFold2_batch

Yes

Yes

RoseTTAFold
OmegaFold

Yes
Yes

No
No

AlphaFold2_advanced Yes

Yes

AlphaFold ver. 2.1以降のmultimerパラメーターを使用
AlphaFold ver. 2.0のmonomerパラメーターを使用

実習3

インスリンのA鎖とB鎖をヘテロダイマーとして予測※「東ソー株式会社/イムノアッセイ/糖尿病」より画像を転載
A鎖

A鎖
B鎖

←N末端
シグナルペプチド

B鎖実習3

Insulinのヘテロダイマーを予測（5分）
A鎖とB鎖を「:」でつなげて予測する

UniProt: P01308
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA
B-Chain FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
C-peptide RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR
A-CHain GIVEQCCTSICSLYQLENYCN「/」と「：」ではMSAの探索と処理が違うので結果が変わる実習3

ジスルフィド結合の再構成
分子内S-S結合、分子外S-S結合が織り交ざる複雑な配列
B鎖

FVNQHLCGSHLVEALRLVCGERGFFRTPKT
分子間

A鎖

分子間

分子内

GLVEQCCTSLCSLYQLENRCN

B鎖

A鎖

C末端
N末端

PAEマップ

実習3

適切な処理で予測の信頼性が高まる※「東ソー株式会社/イムノアッセイ/糖尿病」より画像を転載

シグナルペプチド
切断

C-ペプチド切断

ヘテロダイマー

=
単量体

Zn

結晶化

六量体

対象のサンプルに詳しい人が予測する必要がある

二量体

実習3

詳しい人は予測の修正依頼をかけられる2億の網羅的予測
P01308_v3.pdb(UniProt ID)???????_v4.pdb

一部の構造は修正されている実習4

インスリンのホモ二量体を予測
PDB:5BTS

A鎖

B鎖
B鎖
A鎖

実習4

インスリンのホモ二量体を予測（10分）
A鎖とB鎖2つずつ「:」でつなげて予測

インスリン
ヘテロダイマー

=
単量体

Zn

六量体

homooligomerを2に変える

二量体

実習4

インスリンのホモ二量体を予測
結晶構造(5BTS)の ColabFoldで予測したインスリン二量体
インスリン二量体

A鎖
A鎖

B鎖

A鎖

B鎖

B鎖
B鎖

A鎖
B鎖同士が相互作用を形成した二量体が予測された

実習4

ColabFold_Advancedでは2状態が予測された

実習5

インスリンのホモ六量体を予測※これまでの経験を生かして自力で予測してください実習5インスリンのホモ六量体を予測（準備5分）
A鎖とB鎖6つずつ「:」でつなげて予測

インスリン
ヘテロダイマー

=
単量体

Zn

六量体

homooligomerを6に変える

二量体

実習5

インスリンのホモ六量体を予測（予測10分）
PDB: 5E7W (generate symetory)

二つの界面が予測できるなら六量体も予測できるはず説明

高難度な複合体予測を成功させるためのテクニック1「リサイクル」と「モデルパラメーター」

実習5

ヒストンオクタマーの複合体予測
model_1_ptm

model_2_ptm

model_3_ptm

複合体を形成していない

H3
H4
H2A
H2B
H3
H4
H2A
H2B

H2A
H2B
H3 H4
H3 H4
H2A H2B H2A H2B

H2A H2B

あえて、失敗したmodel1を使用して複合体予測する実習5

リサイクル数とヘテロ複合体予測の結果
model_1_ptm
Recycle0

Recycle=3 (標準)3pTMscore
8量体
H3.1/H4 4量体
H2A/H2B 2量体

6

リサイクル前後のCα-RMSD= tol (tolerance)

Å

3
標準

9
リサイクル数9※今のAdvancedはtolが機能していない

リサイクル数を増やすと8量体が形成される

H3.1
H3.1
H4
H4
H2A
H2A
H2B
H2B
H3.1
H3.1
H4
H4
H2A
H2A
H2B
H2B
H3.1
H3.1
H4
H4
H2A
H2A
H2B
H2B
H3.1
H3.1
H4
H4
H2A
H2A
H2B
H2B

実習5

モデルパラメーターとリサイクル数【Database/parms】

We found that models 1, 3, and 5 would be
the minimal set of AlphaFold models
that keep maintaining its performance(complex TM-score 87.2 vs. 87.8)
I. R. Humohreys et al. Science. 2021

pTMモデルの種類と予測結果

model1model3model5model2model4

pTMscore
Histon Octamer

H3/H4 Tetramer

H2A/H2B Dimer

初期値
3

H3 DimerModel1_ptm
Model2_ptm
Model3_ptm
Model4_ptm
Model5_ptm

Recycle 24, Ensemble 1

リサイクル数実習5

モノマーモデルで複合体予測する際の注意点【Database/parms】

model_1 model_1_ptm

Paired MSA

28.7 %

28.7 %

AF2 MSA

31.5 %

26.4 %

AF2+Paired MSA 39.4 %32.4 %P Bryant et al. Nature Commn. 2022

non-ptm model vs ptm model

Histon Octamer形成数 n=3 (seed=0~2)
non-ptm
Model1Model2Model3Model4Model5ptm
初期値

3Model1_ptm
Model2_ptm
Model3_ptm
Model4_ptm
Model5_ptm※non-ptmではPAEマップが書けない実習5インスリンのホモ六量体の予測結果の確認
PDB: 5E7W (generate symetory)

おそらく惜しい構造が出た人はadvancedのmonomer_ptmモデル

実習6インスリンのホモ六量体の予測（再挑戦）※ 「リサイクルを増やす」
コツを生かして予測してください実習6インスリンのホモ六量体の再挑戦（準備5分）

homooligomerを6に変える

max_recycleを6に変える

説明

高難度な複合体予測を成功させるためのテクニック2「MSAのサイズ」

実習6

MSAでアミノ酸同士のコンタクトを予測できると考えられてきた経緯
E

R

R

E

R

E

R

M

E

R

入力配列

1) 構造形成に関与しないアミノ酸は変異しても失活しにくい
E

K

R

R

D

2) 構造形成に関与するアミノ酸はペアで変異する（共進化）実習6

AlphaFoldのMSA処理
Supporting process 「Extra_MSA」
use 5120 seq. (AF)1024 seq. (CF)Column

N

C

Max
5120

Main MSA process
only use 128 seq. (AF)512 seq. (CF)※colabの標準では増やされている
N

1) Row

2) Column

C

Max
128

PDB template process

Suppl. Fig. 1(modification)
J. Jumper et al.
Nature 2021

負荷が大きいメインの処理と負荷を軽減したExtra_MSA処理が存在する

実習6

Extra_MSA情報量と複合体の予測
Alphafold2 (model3_ptm)
Max_extra_msa

PAE (Å)

H3
H4
H2A
H2B
H3
H4
H2A
H2B
Sequence

H3

H4

H2A H2B

H3

H4 H2A

H2B

比較 PDB: 1KX5 (灰色)Exstra_MSAで用いるシーケンスの数によって複合体の形成度合が変化実習6

Extra_MSA情報量と複合体の予測

H3

H4

H2A

H2B

ヒト ACE2

SARS-CoV2
スパイク

対象によって配列が変わる抗体や変異しやすいウイルスは複合体予測が難しい→MSA未使用に特化したOmegaFoldやESMFold実習6

インスリンのホモ六量体の再挑戦_結果確認
PDB: 5E7W (generate symetory)

recycle_3: 9分

Recycle_6: 16分

リサイクル数の増加で
pTMscoreが増加し、コンパクトな構造を形成した
Recycle_12: 30分

実習6

インスリンのホモ六量体の再挑戦_結果確認
PDB: 5E7W
Colored by chain

AF2予測構造
3次元モデルAF2予測構造灰色

本日の実習で行ったこと
題材: インスリン

1) Alphafold DBの予測を再現

2) シグナルペプチドのトリミングの効果
3) ヘテロダイマーの予測

4) ホモダイマーの予測
5) 高難度な六量体予測6) 「リサイクル」を増やして再挑戦
まだ発展途上の技術なので面白い使い方をしてみてください