アジレントのリピドミクスソリューション

脂質代謝物の網羅的解析

70+1 ions

Ion Mobility Drift Time (ms)60

+2 ions50+3 ions40+4 ions

30
20
10
0

0

500

1000
Mass (Da)

1500

2000

リピドミクスを理解する

リピドミクスとは「リピドーム」という言葉は、有機体に存在するすべての脂質、および多様な細胞プロセスにこれらの脂質が与える影響を表しています。
リピ
ドームを理解するには、脂質を集合的にそして個別に分析し、定量化することが重要です。質量分析法は、
リピドミクス研究のための有効な脂質プロファイリングをサポートする強力な分析検出ツールとして用いられています。

HO
リピドミクスワークフロー
ショットガンリピドミクスワークフローは、内部標準物質を使用して少数の脂質についての
定量的な脂質クラスデータを迅速に得るための確立された技術です。この手法は、脂質クラス、組成、アルキル基に関する情報を提の脂質クラスをターゲットとすることができまの分離手法の開発を検討するうえで重要な検す。Q-TOF 機器は、スキャンモードでは QQQ 機

討事項です。

器よりも高い感度、高い質量精度を備えてい
ますが、QQQ のニュートラルロススキャン測定のような特異性は備えていません。
ショットガンリピドミクスは、脂質の化学的多リピドミクスのプロファイリングは、分離ベースの手法です。より包括的な手法として登場
し、数百種類の脂質の相対的な定量および同定を 1 回の分析で提供します。この手法の開供しますが、脂質の明確な同定は提供しませ様性や、きわめて異なるイオン化効率を原因

発は、クロマトグラフィーの進歩、
イオンモビリん。ショットガンリピドミクスは、
トリプル四重とするイオン抑制が重大な制約となっていま

ティ質量分析法 (IMS) の開発、最先端のソフト

極 (QQQ) 質量分析計または四重極飛行時間

す。脂質を分離せずに、MS および MS/MS 情報

ウェア解析ツールによって可能となりました。

型 (Q-TOF) 質量分析計のどちらかで実行するのみで、二重結合の場所やアルキル基の位置ことができます。研究者は、
プリカーサイオンなどの生体に関連した構造の差違を解決する

スキャンモードまたはニュートラルロススキャ

ことはできません。脂質クラスの多様な化学

ンモードを QQQ 質量分析計で使用して、特定的性質は、個別の脂質を分離し同定するため

2

さまざまなアプリケーションに対応する
アジレントのリピドミクスツール
複数のアプリケーション分野にわたるグローバルリピドミクス研究を推進するため、アジレントはクロマトグラフ、質量分析機器、消耗品、インフォマティクス、テクニカ
ルサポートを提供しています。
基本研究および臨床研究

す。包括的なリピドミクス研究では、食品と健複雑な生体サンプル中の脂質を研究対象と康との新しい関連性が発見されています。

して、脂質バイオマーカーを同定できます。また、従来の解析メソッドよりも詳細に、細胞代謝物を理解することができます。
リピドミクスは、脂質プロファイルのドキュメント化、代謝疾
患で生じる脂質変化の解明に使用されます。
また、
アテローム性動脈硬化症、脳卒中、高血
圧症、肥満のメカニズムを理解するうえで中
心的な役割を果たしています。
農業
土壌および植物生物学への影響を通じ、農業分野での脂質の機能性を解明します。

医薬品
脂質を同定することにより、衰弱性疾患に対し、創薬および効果的な治療の基盤を提供し
ます。
バイオ燃料
脂肪酸および石油を産出する微細藻類の脂質を、エンジン適合性およびバイオディーゼルの性能指標を決定するための重要なマーカー
としてプロファイリングします。リピドミクス
は、バイオディーゼルの成分である脂肪酸エ
チルエステル (FAEE) を製造するための新しい食品および栄養ストレインのエンジニアリングで役割を果たし

脂質、
またはタンパク質と脂質が、
どのように

ています。

「私たちは、低濃度の脂質を検出するための高度なワークフローをアジレントと共同開発しました。ワー
クフローでは、捕捉、分離、ナノ流体クロマトグラフィーを 使 用した
後、高分解能のタンデム質量分析計を使用します。この手法により、重要な知見が得られます。アジレン
トとのパートナーシップにより、私たちはメタボロミクス、グリコミク
ス、プロテオミクスに加えリピドミ
クスに関する分野まで研究を拡大しています」MARKUS WENK 博士
シンガポール国立大学

細胞やサブ細胞機能、例えばシグナル伝達や遺伝子発現を調整するかを特定し、評価しま3

リピドミクス研究における分離の課題

複数の手法と複数のソリューション
脂質の構造は多様であるため、すべてのクラスに適した単一のソリューションは存在せず、多くの分離手法を必要とします。ガスクロマトグラフィー／質量分析法 (GC/MS) は従来より脂肪族アシルの特性解析に使用されてきました。
しかし、
アルキル基情報の詳細は得られますが、サンプル前処理法 (けん化) が原因で脂質レベルの情報は失われます。GC/MS では、優れたクロマトグラフィー分
離およびイオン化によって、
テルペンおよびステロール類を優先的に分析できます。
液体クロマトグラフィー (LC) および超臨界流体クロマトグラフィー (SFC) は、非常に広範囲に適用可能な手法です。脂質レベルの情報を維持し、誘導体化を必要とせず、大気圧イオン化質量分析計と容易に接続できます。
クロマトグラフィーメソッドの選択は、分離および検出される脂質のクラスに影響を与えるため、アプリケーションに最適なものを選ぶことが重要です。

脂質カテゴリ

GC/MS

LC/MS

SFC/MS

脂肪酸 (アシル)

•••

••

••

グリセロ脂質 (トリグリセリド)

•

•••

••

グリセロリン脂質•••••

スフィンゴ脂質

•••

••

••

••

プレノール脂質••••

サッカロ脂質•••••ステロール脂質•••

テルペン (植物)

•••

••

••

ポリケタイド•••••表 1. 脂質クラスごとの異なるクロマトグラフィーによる分離の相対的な強度の概要。
••• は所定のクラスの最高の分離テクニックを示しています。

4

アジレントは、
GC/MS、LC/MS、SFC/MS などの装置からデータ分析ソフトウェアまで、さまざまなリピドミクスソリューションを提供しています。

データ取り込み

フィーチャー抽出
MassHunter ソフトウェア

アラインメントと統計解析

同定

パスウェイ解析

Mass Profiler Professional ソフトウェア

分析機器

定性

分析と視覚化

Profinder

Agilent METLIN データベースと KEGG などの公的データベースを使用した
Agilent Fiehn ライブラリを
Pathway Architect
使用した ID Browser

図 1. アジレントのリピドミクスワークフローソリューション

5

強力かつ柔軟で信頼性の高い
リピドミクス研究を支える技術

脂質の分離
順相 LC と逆相 LC には、脂質の分離においてそれぞれ異なる利点があります。順相 LC は脂質クラスをすばやく評価できます (図 2)。逆相LC は優れたリテンションタイムの再現性と 1つの脂質クラス内での脂質の分離を実現しています (図 3)。包括的な脂質分析では、順相 LC
はクラスベースの分離のために使用され、続

PC

5.0
4.0

LPC
SM

セラミド

3.0

PE

スフィンゴシン
2.0

LPE

1.0

PI

いて分離された各フラクションが逆相 LC で各0

個別の脂質に分離されます。

1

5

10

15

20

25

30

35

カウント vs. 取り込み時間 (分)図 2. 順相 LC/MS 分離による肝臓抽出物の脂質クラスごとの分離。
PE =ホスファチジルエタノールアミン、LPE = リゾホスファチジルエタノールアミン、PI = ホスファチジルイノシトール、PC = ホスファチジルコリン、LPC = リゾホスファチジルコリン。

x10

脂肪酸、LysoPls
スフィンゴシン6セラミド、SM、PLs

DAGs

TAGs

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

1

5

10

15

20

カウント vs. 取り込み時間 (分)図 3. 逆相 LC/MS による肝臓抽出物の脂質クラス内の分離。
PL = リン脂質、SM = スフィンゴミエリン、DAG = ジアシルグリセロール、TAG = トリアシルグリセロール。

6

25

30

35

超臨界流体クロマトグラフィー (SFC)
SFC は、非常に高密度の二酸化炭素を、SFC 移動相での主成分として使用します。順相クロマトグラフィーの一様態の SFC は逆相 LC と直交し、極性脂質と非極性脂質の高い分離を 1 回の分析で実現します。SFC は、複雑な脂質混合物の分離においてきわめて効果的です (図 4)。Agilent 1260 SFC システ
ムは、シンプルなバルブスイッチによって、LC と SFC モード間を簡単に切り替えられるようにデザインされています。

x10

x10

6

DGs

3
2

6

1.5

1

x10

Vit D

プリカーサ

2

カウント vs. 取り込み時間 (分)

x10

3

0.5
1

TGs

4

1
0

6

5

2

0

1

6

1.4

カウント vs. 取り込み時間 (分)

1.8

1

7
0
6

3

4

5

カウント vs. 取り込み時間 (分)

6

7

5
4
3
2
1
0

1

2

3

4

5

6

7

カウント vs. 取り込み時間 (分)図 4. 市販の栄養補助食品中の魚油の SFC/MS 分析。抽出イオンクロマトグラムから、高分解能の SFC が複雑な脂質混合物の分析能力を備えていることが分かります。

Agilent 1260 Infinity 分析 SFC/UHPLC ハイブリッド
システムは、質量分析計 (MS) を追加の検出器として組み込むことによって、汎用性を大幅に向上させます。SFC/MS と HPLC/MS 間の迅速な切り替え機能は、
リピドミクス研究においてき
わめて強力な機能です。

Agilent 1260 SFC システム• 統合されたシステム – すべての Agilent LC/MS プラットフォームで最先端の SFC による単一ソフトウェアコントロールを実現• 環境への配慮 – LC メソッドでは容易に分離できない化合物を、使用する有機溶媒の量を制限して、高速かつ高分解能で分離可能• 強力な分離能力 – 極性および非極性の脂質を 1 回の実行で分離可能• 汎用性の高さ – 最高の信頼性に加え、高い柔軟性を実現

7

イオンモビリティの利点
イオンモビリティテクノロジーにより、脂質などの複雑なサンプルに対し、直交型の分離次元が加わります。クロマトグラフィー分離の後に、脂質はガス相でさらに分離され、脂質イオンの衝突断面積を基に分離されます (図 5)。イオンモビリティでは、複雑なサンプルを脂質クラスで分離することもできます。Agilent 6560 IM Q-TOF システム (図 6) は、正確な質量測定をクラス最高水準の分解能の移動度分離とともに提供します。

イオンモビリティドリフト時間 (ms)70

+1 ions60+2 ions50+3 ions40+4 ions30
20

図 5. ホスファチジルエタノールアミン (PE) の10

導入混合物の IMS 分離。ドリフト時間の増大は、炭素原子の数の増大と関連付けられます。

0

0

500

1000
質量 (Da)

1500

2000

図 6. イオン濃縮用のフロントファンネル、
トラッピングイオンファンネル、ドリフトチューブ、集束用のリアーファンネルで構成される

フロントファンネル
トラッピングゲート

ダイナミックなファンネルアセンブリの各要素が、コリジョンセル

細心の注意を払って設計されています。
これにより、イオン源から Q-TOF 高分解能
マスアナライザへのイオン透過率が向上してトラッピングファンネル
イオンソース

8

います。このため、LC/IM/MS 分析を使用した

IBC

四重極
ドリフト リアー マスフィルタ
チューブ ファンネル

イオンパルサ

複雑なサンプルの分離および特性解析を高感度で実行でき、ターゲット分子の構造的多様性の研究手段を提供します。

脂質の同定LIPID Metabolites and Pathways Strategy (LIPID MAPS) は、国際的に最初に認められた脂質分類システムを開発するために設立された研究施設のコンソーシアムです。多数の脂質を同定するために必要となる脂質の学名および構造表現も開発対象に含まれます。LIPID MAPS 分類システムは、8 つの脂質カテゴリ (図 7) で構成されています。各カテゴリは、脂肪族鎖、立体異性、キラリティ、頭部に起因する広範な構造的および機能的多様性によって特性分析されます。
完全な脂質のアノテーションおよび同定には、
クラス、元素組成、アルキル基のサイズと位置、二重結合の数と場所、二重結合の位置関係 (シス/トランス) が含まれます。

スフィンゴ脂質

グリセロリン脂質

ポリケタイドグリセロ脂質脂肪族アシル

アセチル CoA

イソペンテニル - PP
サッカロ脂質

ステロール
プレノール

図 7. LIPID MAPS コンソーシアムで定義されている 8 つの異なる脂質クラス

アジレントは、脂質のアノテーションまたは同定のための 3 つのソリューションを提供しています。
データベース照合、MS/MS スペクトルライブラリ照合、MS/MS 理論スペクトル照合を用いることができます。データベースとの一致は、Agilent-METLIN データベースか SimLipid (PREMIER Biosoft のサードパーティソフトウェア) を使用して実行できます。MS/MS スペクトルライブラリマッチングは、化学標準を使用して生成される Agilent-METLIN MS/MS ライブラリのみを使用して実行されます。
SimLipid は、脂質スペクトルの MS/MS 理論照合もサポートしています。
Agilent-METLIN データベースおよび MS/MS ライブラリは、脂質のアノテーションおよび同定に使用できます。MS/MS スペクトル標準がある約 640 種類の脂質のエントリに加え、LIPID MAPS からの約
36,600 種類の脂質のエントリが含まれています。SimLipid データベースには、8 つの脂質カテゴリと
36,224 の脂質エントリが含まれています。

9

柔軟性の高いソフトウェア

MH Profinder

プ間の脂質の差違を比較し、発見するために複数のサンプルが分析されます。アジレント

SimLipid

MPP

~
~
~
~

脂質プロファイリングでは、サンプルグルー
MS のみ

アライン

SimLipid3

アノテートは、脂質フィーチャー抽出法およびサンプル

MH Profinder

全体のアライメント向けに、Agilent MassHunter

MPP

結果は SimLipid にエクスポートされ同定されるか、または Mass Profiler Professional (MPP) にエ

SimLipid~~~

Profinder ソフトウェアを提供しています。MS の
MS のみ

クスポートされ、統計解析されます。SimLipid

アライン

MH Qualが同定に使用されない場合、ビルトインのSimLipid3

MPP

ID Browser

ID Browser と正確な質量照合のために AgilentMETLIN データベースを使用して脂質は MPP

MS のみ

アライン

で同定されます。アジレントのソフトウェアソ

MH Qual

データ解析手法によりさまざまなワークフ
ローを採用できます。

MS または
MS/MS

MPP

SimLipid~~~~

リューションを組み合わせて使用し (図 8)、

SimLipid3

アラインと
アノテート

MS/MS データが取り込まれる場合、MassHunter
Qualitative Analysis ソフトウェアを使用して分析は実行されます。SimLipid または Agilent METLIN

図 8. MassHunter ソフトウェアに統合されたリピドミクスワークフロー

Metabolite パーソナル化合物データベースおよびライブラリ (PCDL) のどちらかにより、同定も行われます (図 9)。
SimLipid は、PREMIER Biosoft International のWeb サイトから入手できます。
www.premierbiosoft.com/lipid/index.html
実験による MS/MS スペクトル

スペクトルの差異

MENTLIN PCDL スペクトル

図 9. ヒトの血漿サンプルの MassHunter 定量分析と METLIN Metabolite PCDL の MS/MS ライブラリ検索の結果の比較。上のスペクトルは、化合物 １ つについての Agilent Q-TOF で採取された MS/MS スペクトル、
下のスペクトルは METLIN からのライブラリスペクトルを示しています。中央は、スペクトルの差異を示しています。化合物リスト (92.6) のスコアは高品質のヒットを示しています。

10

Pathway Architect が解明する重要な生物学的コンテキスト
脂質サンプルの LC/MS による分析には、
クロマトグラフィーの適切な選択、および検出された化合物のアノテーションと同定に特別な課
題が伴います。ノンターゲットプロファイリングの手法では、生物学的コンテキストがなくても多数の候補脂質が提示されます。
MPP の Pathway Architect モジュールは、
データ
を検索し、
フィルタリングして、生物学的パス
ウェイにマッピングして視覚化します。2 つのタイプのパスウェイ解析がサポートされています。1 つは文献情報由来ネットワーク解析
で、発行済みの文献の自然言語処理をベースとしています。もう 1 つは、KEGG、BioCyc、
Wikipathways などの公表されている洗練された生物学的パスウェイを解析するためにデザインされています。実験データは、これらのパスウェイに投影され、ユーザはデータを対話形式でフィルタリング、
ズーミング、選択することができます。パスウェイは選択でき、脂質、
タ
ンパク質、
代謝物、
転写物、
遺伝子のリストをエクスポートし、他のプログラムで使用して新し

図 10. KEGG パスウェイデータベースを使用した、Pathway Architect でのヒト血漿サンプルのパスウェイ
解析の結果。3 つの脂質化合物が SimLipid を使用して同定され、スフィンゴ脂質代謝物パスウェイ内にいパスウェイから導かれた実験を作成するこ

存在することが分かりました。化合物がパスウェイ上に黄色のドットで強調表示され、現在選択されてとができます。

いる化合物 (スフィンゴシン) は緑色の背景色で描かれています。

この例では (図 10)、脂質分析のワークフロー
は MS および MS/MS によるサンプルのノンターゲットプロファイリングから始まり、可能な限り多くの脂質化合物を検出します。SimLipid
同定ソフトウェアを使用して結果にアノテート
した後、KEGG パスウェイ上の Pathway Architect
で視覚化できます。

11

リピドミクスを自動化する

分析結果を向上するための手動プロトコルと半自動化プロトコルでの手順の比較

サンプル前処理法の自動化
リピドミクス研究におけるサンプル前処理の自動化プロトコルは再現性を高め、サンプル

手動での抽出半自動化抽出

サンプルをオリジナルチューブからより小さなフラクションに手動で分取サンプルをオリジナルチューブからより小さなフラクションに自動で分取

抽出溶媒を手動で移動して追加抽出溶媒を自動で移動して追加超音波洗浄と遠心分離

超音波洗浄と遠心分離(機器に手動で移動)

MS 分析のために上清をバイアルに手動で移動

MS 分析のために上清を96 ウェルプレートに自動で移動

前処理の時間を短縮します。さらに、
自動化により、研究者はより複雑な課題に時間を割くことが可能になり、人為的誤差が無い高い再現性を得ることができます。これは、長期間にわたる研究では特に重要なことです。一例として、ヒト血漿からのリン脂質およびスフィン
ゴ脂質の半自動化抽出メソッドが、
シンガポー
ル国立大学のリピドミクスインキュベーター(SLING) の Markus Wenk 博士のラボで Agilent
Bravo Automated Liquid Handling Platform を使用して開発されています。

図 11: Wenk 博士のラボではリン脂質およびスフィンゴ脂質についてサンプル前処理の 4 つの手順のうち3 つの手順が Bravo Liquid Handling Platform を使用した自動化メソッドに置き換わります。

12

アジレントの自動化リキッドハンドリングソリューションは、
液体の取り扱い、
ラべリング、
シーリングなどのミスの原因となりやすい作業を簡略化することによってデータ品質の低下を損なうことなくスループットを向上させます。

Bravo で抽出した血漿の nmol/mL

140
y = 0.9076x + 0.3895

120

R 2 = 0.9964

100
80

脂質標準

RSD (%)
半自動化

RSD (%)
手動

PE 14:0/14:0

4.80

7.13

PC 14:0/14:0

5.85

5.72

60

C17 セラミド

7.32

11.97

40

LysoPC 20:0

5.27

5.05

20

SM 30:1

3.79

4.96

0

GluCerd18:1/8:0

6.81

6.34

0

50

100

150

手動で抽出した血漿の nmol/mL
図 12: 回帰プロットは、半自動の Bravo Liquid Handling Platform を使用した前処理メソッドと手動の前処理メソッドの定量結果の比較を示しています。
右の表から、標準脂質の定量において半自動メソッドの方が優れていることが分かります。

13

リピドミクス研究に対応する
AGILENT GC/MS および LC/MS ソリューション
GC/MS 機器

5977A シリーズ GC/MSD システム

7200B GC/MS Q-TOF システム

ターゲット分析に加え、未知化合物のスクリー

7000C および 7010 トリプル四重極
GC/MS システム

ニングに最適です。Agilent 5977A GC/MSD は、高より条件の厳しいターゲット分析においても、定できます。Agilent 7200B GC/MS Q-TOF は、連続い信頼性と使いやすさを備え、大量のサンプ

最高の MS/MS 定量を可能にし、7010 ではさら的な高分解能データによって、7890B GC の分

ルをスクリーニングすることができます。

に低い検出限界を達成します。

離能力を補完します。

アジレントの豊富な種類の GC/LC カラムと消耗品は、
リピドミクスの研究をサポートします。
お客様のラボニーズに合わせて豊富なラインナップのなかからお選びいただけます。

14

未知の脂質を高分解能の MS/MS データで同

LC/MS 機器

1260 Infinity 分析 SFC システム

6500 シリーズ Accurate-Mass Q-TOF

1290 Infinity II LC

Agilent 1260 SFC/MS は、LC メソッドでは容易に分

6500 シリーズ Q-TOF は、低分子量の化合物の優れた分離性能と検出性能で、最高品質の離できない脂質を高速かつ高分解能で分離しプロファイリングおよび同定に最適で、MS/MS

データを提供し、信頼性が飛躍的に向上しまます。極性の脂質および非極性の脂質を、高機能を備えています。代表的な質量精度によす。優れたサンプル数および注入サイクル速

い柔軟性、高精度、優れた信頼性で、わずか 1り、脂質の同定の信頼性が向上し、データベー度を新しい操作性と組み合わせて、最高のス回の分析で網羅的に分離解析できます。

ス検索での偽陽性が低減します。

ループットを実現しています。

6400 シリーズトリプル四重極
LC/MS システム

Agilent Bravo Automated Liquid Handling
Platform (自動分注器)

6400 シリーズトリプル四重極 LC/MS システム

Bravo を用いると、脂質分析において、捕集は、極めて高速の MRM トランジションおよび

チューブからウェルプレートへのサンプル分

堅牢で信頼性の高い性能を備え、最大の稼働

注、液体添加、サンプル濃縮を自動で行うこと時間を実現し大量のサンプルセットを分析でができます。

きます。フェムトグラムレベル以下の感度により低濃度の脂質を検出できます。

15

詳細については、
リピドミクスワークフローの概要
およびガイド (英語) をダウンロードしてご覧ください。MassHunter 定量分析、Profinder、SimLipid、MPP ソフ
トウェアを使用した、
リピドミクス分析の手順について示されています。ガイドには、
リピドミクスワー
クフローの手順が詳細に記載されています。それぞれ、5991-1643EN および 5991-1644EN を、www.
agilent.com/chem/library で検索してください。

お問い合わせ先カストマコンタクトセンタ
0120-477-111
www.agilent.com/chem/jp
email_japan@agilent.com
本製品は薬事法に基づく登録を行っておりません。
また、本資料記載の情報は予告なしに変更されることがあります。
アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2015
Published in Japan, May 11, 2015
5991-5419JAJP