全自動測定のすすめ-­‐現状と具体例
東京大学大学院薬学系研究科	  藤間祥子

1.	  PFでの自動測定の説明
何ができるか	  手続きなどの方法について

2.現状と具体例
実際の測定例	  実験を施行して感じたこと	  （できること、できないこと）

自動測定とは？（何が自動で出来るのか）
結晶構造解析の流れ(大量発現系の構築、発現精製系の確立)結晶化する蛋白質の調製

結晶化(結晶化スクリーニング、結晶化条件の最適化)
自回折実験	  :	  	  センタリング、スナップショットの撮影	  動(適切な結晶化条件の選別、クライオ条件などの検討)
自回折実験：データ収集	   動	  (露光時間、X線強度などの検討)
回折データの処理

自動

構造解析

現在、放射光施設のビームラインで行っている実験の多くを自動に出来ます。

自動測定の実際の流れ
山田さんに自動測定希望のメールをだす
結晶を凍結する（@研究室）
結晶を送付する
測定条件を決定し、PReMoにWEBから入力（@どこでも	  ex.	  家、外出先	  etc…)
ビームラインに結晶がセットされる測定が開始される測定開始を確認し、データを確認する（@どこでも）回折データ処理を自動で行ってもらう
測定データをPReMoからダウンロードし構造解を行う（@どこでも）結晶凍結から結晶送付まで
1.	  結晶を凍結し、ユニパックにつめる。
2.	  ドライシッパーに入れPFに送付
バックアップ用のHDも同封します3.	  測定条件を決定しサンプルファイル(CSV形式)に登録し、PReMoにWEBから入力
サンプルファイルの入力方法の詳細	  :	  http://www2.kek.jp/protein/manual/ja/samplelist_prep.html
PReMoへの入力方法の詳細:	  http://www2.kek.jp/imss/pfweis/manual/ja/premo_Screening.html

サンプルファイルの具体例
結晶のIDなど測定条件を設定する項目…

細かく条件を	  決められます測定開始
データ測定の様子をPReMoで確認する
測定が開始すると、PReMoに情報が掲載されます。情報は随時更新されます。

クリックすると	  測定の詳細がみれます。

測定終了後、直ちに回折データの自動処理が行われ、データの評価ができます。

結晶の写真、回折点、統計データをユニパック単位で、一覧として表示することもできます。

クリックして拡大表示もできます回折データのダウンロード
自動で処理された回折データを確認しダウンロードする②See	  Resultから測定条件、	  XDS処理結果の詳細を見ることができる。

③XDS処理結果(XDS_ASCII.HKL)を	  クリックしてダウンロードする①処理結果の一覧を表示	  (ざっとデータを評価する)

1.	  PFでの自動測定の説明
何ができるか	  手続きなどの方法について

2.現状と具体例
実際の測定例	  実験を施行して感じたこと	  （できること、できないこと）

自動測定を行うきっかけ
サイズも大きく、きれいな単結晶構造解析の目的
新規のリガンドとの複合体構造を決定したい
良質な結晶データを収集するだけではダメ

分解能が1.8~2.0Åくらいはいつも出る。
スポットもきれい。

共結晶化は？!
ソーキング時間は？!
リガンドの濃度は？!
リガンドの種類は？!
結晶化のpHは？!
結晶化の沈殿剤の種類は？!
リガンド結合部位の変異体は？

←~2.0Å

難しいセンタリングもない。	  
指数付けに苦労することもない。	  
ただただ、測定すべき結晶が沢山ある。	  
リガンドが結合するまで。。

取り組んだ(取り組んでいる)ケース
リガンド結合構造の決定	  -­‐>	  約100個の結晶を様々な結晶化条件で測定したが、リガンド結合	  は確認できていない。。-­‐>	  タンパク質の調製方法から再検討することに。。
重原子置換法での位相決定	  	  	  	  	  -­‐>	  Hg置換体のデータ測定に成功。構造決定できた。
良質な回折を与える結晶の選別	  	  	  	  	  -­‐>	  スクリーニングを行ったら数十条件で一見良さそうな結晶が析出した場合に。	  
どの結晶が回折能が良いか選別を行うため。比較的良好な反射が観測されたもの	  について、結晶の再現をとることにしている。
構造決定に向けて、必要な実験であるが、ビームラインで行う作業がルーチーンである実験には自動化したほうが良い。(私見)。

自動測定での測定例(重原子誘導体からの構造決定)
自動処理結果20160220	  AR-­‐NE3A	  (自動測定)

Hg誘導体結晶測定条件

Hgのf”,	  f ’プロット(理論値)1.0	  Åhttp://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_form.html

同型性がなく、SIR(AS)では構造決定できなかった

XDSの結果(COLLECT.LPファイルより）Hgが入っている？

Shelx	  解析結果

AutoSHARP解析結果

結合サイトが見つかった

自動モデル構築結果(program	  buccaneer)

Hg	  site	  :17カ所(位相決定に使用した数)	  非対称単位の分子数	  :	  4分子	  分解能:3.0	  ÅHg	  SADで構造決定することに成功した

HgSADで測定した結晶は実は自動測定に不向きな結晶
20160522	  AR-­‐NE3A(手動測定)

2016年5月	  BL44XU_SPring-­‐8(手動測定)
多結晶結晶に対して、細いX線ビームを照射を測定することで、	  1.5Å分解能データの収集に

spot	  (○)	  resolution	  (○)

spot	  (×)	  resolution	  (○)

成功

ビームサイズ、入射X線量、振動角、露光時間などを細かく検討しました。。

高分解能データからの構造によって、新たにドメイン構造を見いだ
すことができた

良質な回折データを取得するために、輝度が高く細いビームのX線を入射する必要がある場合は、測定条件の検討を丁寧に行う必要がある。	  
これは、現状自動測定では行えない。

多結晶は自動測定に(現在は)むかない
20160617	  AR-­‐NE3A(自動測定)	  20160618	  BL1A(手動測定)	  	  結晶の選別を目的としたDiffraction	  scan結果(Heat	  map表示)

測定条件

測定結果(自動処理)

自動測定は分解能の確認程度にして、本番データは手動で測定したほうが良い(結晶の選別は自動が楽)自動測定と手動測定どちらのデータが良いか？
良い回折データとなる時は、	  （私見ですが）	  結晶の状態	  ビームラインのスペック	  測定方法	  解析方法	  がベストマッチした時。	  

!

測定条件を検討することで、自動測定でもベストデータを収集出来る。	  

京大院理藤橋先生より提供いただく

自動測定でも条件を検討すれば良いデータが十分にとれる測定時間早い？遅い？

自動_snapshotを撮る	  (約2分)	  2016-­‐02-­‐28

手動_snapshotを撮るケース1(約10~15分)

18sec	  (dismount-­‐>exchange)

~2min

39sec

~6min
~7min

4sec
57	  sec	  (exchange-­‐>centering?)

センタリングが難しいものはこの時間が律速(でも時間かけてでも、丁寧に作業するべき。)

自動_データを撮る	  (約３分半)	  2016-­‐02-­‐20

手動_snapshotを撮るケース2(約３分)

16sec(測定開始まで)	  +3min(data	  collection)	  +19	  sec	  (dismount-­‐>exchange)
3sec
59	  sec	  (exchange-­‐>centering?)

センタリングが簡単だと機械と同等の時間で作業出来る

センタリングが簡単な結晶の場合は自動測定が早い。

XDSでの自動処理はどれだけ信頼できる？
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S-­‐SAD測定での例



同一の結晶から合計29のデータセット	  を取得1/3は指数付けを失敗	                                     

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問題なく処理できた。

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結晶(反射の質)によっては、ほぼ全て

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問題なく処理できる場合もあるし、全て失敗するケースもある。測定する結晶の回折点の見極めや、測定方法を改良することで、成功率は大きく改善できる。

自動処理の別の使い方(ビームラインで使う)Se-­‐SADの測定例

結晶を１から４の順番で測定

結晶４

まあ良い

結晶３

全然ダメ かない回折データは自動処理が上手くい
質が悪いという潔い考え方も出来る。

結晶２データが	  良くないデータが良い。	  
連続して４周測定

2周分のデータで	  結晶１構造決定に成功

測定とほぼ平行して解析結果が得られるので、効率よくデータ収集が行える。	  
上手くいかなかったデータのみ再処理すれば良い点でも効率的。

課題	  (実験者の立場から)結晶の凍結方法	  -­‐>凍結方法を工夫することでもっと改善できる。	  
個人差が大きい（私見）。ノウハウの蓄積が必要	  （ビームラインで気流下で凍結したら問題ないのに。。）
ループ内での結晶の位置	  -­‐>上手な人は真ん中に入れれるけど。	  
ループの選択などで改善はできるけど。。	  
結晶の位置を判断してセンタリングしてくれるともっと良いのに。
大量に取得できるデータの解析方法	  簡単に大量にデータは取得できるので、どのデータが良いのか判断をつけるのが	  難しい。１つ１つ丁寧に解析すると膨大な時間がかかる。	  
自動解析ができると良いのに。
大量に取得できるデータの保存	  
再処理、再解析、データのマージを考えると、データは簡単には消去できない。	  
大量のデータの保存方法は。。。

どこまで自動化できる？（現状の課題を解決できる？）
結晶構造解析の流れ結晶化する蛋白質の調製(大量発現系の構築、発現精製系の確立)

結晶化(結晶化スクリーニング、結晶化条件の最適化)
完全自動回折実験	  :	  センタリング、スナップショットの撮影	  （希望）

(適切な結晶化条件の選別、クライオ条件などの検討)
回折実験：データ収集	  (露光時間、X線強度などの検討)
回折データの処理
構造解析

完全自動（希望）完全自動（希望）

今は出来なくても。。	  
もっと、もっと、自動化できるはず！(開発は進んでいます)

完全自動（希望）自動化を組み合わせることで、現状より良い構造解析	  が行えます！	  
自分なりのスタイルを確立してる中級者の方こそ、	  既存の方法に、自動測定を取り入れて、	  実験、研究の高効率化をはかりませんか？

自動測定にご興味のある方はPF 山田さんまでご連絡ください謝辞
東京大学大学院薬学系研究科	  清水敏之	  清水光	  日比亮太	  !

KEK-PF
千田俊哉
松垣直宏
山田悠介
ビームラインスタッフの皆様!

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SPring-8!
BL44XUスタッフの皆様23

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