一総説一蛍光マグネシウムイオンプロープの開発とそれを利用した新たな染色体凝縮メカニズムの解明
前島一博1)、松田知己2) 、永井健治2)

1)情報・システム研究機構

国立遺伝学研究所・ゲノムダイナミクス研究室

2) 大阪大学産業科学研究所生体分子機能科学研究分野

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TheInstituteofScientificandIndustria

マグネシウム(Journa1 of]apaneseSocietyforMagnesiumResearch)VoL
37.No.
2
日本マグネシウム学会

JJSMgRVoL37N022
0
19
一緒観ー

蛍光マグネシウムイオンプロープの開発とそれを利用した新たな染色体凝縮メカニズムの解明
前島一博1l、松田知己2) 、永井健治2)

1l情報・システム研究機構

国立遺伝学研究所・ゲノムダイナミクス研究室

a大阪大学産業科学研究所生体分子機能科学研究分野

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2+isreleasedbyATPhydrolysisandcontributesωmitotic chromosome
永井健治
干 567-0047

大阪府茨木市美穂が丘 8-1

TakeharuNagai
Mihogaoka8・1. Ibaraki, O
saka567-0047, J
apan
TEL:06-倒79-8480 E‑
mail:ngl@sanken.
osaka‑
u.
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向。

JjSMgRVoL
37No.
220
19condensationwithincreasedrigidity.

キーワード:マグネシウムイオン、蛍光指示薬、染色体操集

要旨

細施が分裂する際、ヒトにおいて全長 2m にもおよぶゲノム DNA はコンパクトに凝縮し、「染色体」と呼ばれる DNA の束を作り、ゲノム DNA を 2 つの細施に正確に分配しなくてはならない。半世紀以上前、細胞に大量に存在するマグネシウムイオン (Mg2+)がゲノム DNA 凝縮の鍵となりうることが提唱されていたが、証明する手段がなかった。今回筆者らを含む共同研究グループは、蛍光タンパク質工学の技術を駆使して細胞内 Mg2+濃度の変化を鋭敏に感知できる蛍光 Mg2+プロープタンパク質 MARIO を作製することに成功した。さらに、 MRIO を発現させた細施のタイムラプスイメージ

ングにより、 Mg2+濃度が細胞分裂の際に一過的に上昇することを示すとともに、負に帯電しているDNA の反発を弱め、染色体の凝縮を促進していることを明らかにした。本総説では Mg2+の動態解析により新たな染色体凝縮メカニズムを解明した筆者らの仕事を簡単に紹介したい。

研究の背景
私たちの体は約 40 兆個の細施からできている。その 1 個 1 個の細胞に、全長約 2m にも達するゲノム DNA が収められている。ゲノム DNA は、細胞が分裂する際に切れたり、絡まったりするのを防ぐために凝縮し、染色体と呼ばれる 46 本の DNA の束になる。近年、コンデンシンなどの染色体を形作るタンパク質群が同定され、染色体レベルでの接縮メカニズムが明らかにされつつある。一方、DNA は直径 2nm のとても細い糸で、負電荷を持っている (Fig. l)。この DNA は正電荷を有するヒストンタンパク質の複合体に巻かれて、直径約 llnm のヌクレオソーム線維を作ることが知られている (Fig. l)。しかしながらヌクレオソームには負の電荷が残っていて、互いに反発するため、細施などの小さな空間に折り畳むことが困難であることが知られていた1l。そこで、細胞内に1O -20mM と多量に存在する Mg2+Z> がヌクレオソームの負電荷を中和して反発を弱め、染色体の凝縮を引き起こすのではないかと半世紀以上前から予想されてきた九しかしながら、細胞内にフリーで存在している Mg2+の変化を細施周期を通じて計測する手法が存在しなかったため、実際に Mg2+が染色体凝縮に働いているのかは未解明のままであった。

細施内の Mg2+の変化を計測する方法として蛍光プローブの利用が先ず想起されるが、長い歴史と豊富なデータの蓄積があるカルシウムイオン (CaZ +) を可視化する蛍光プロープに比して、 Mg2+のそれはほとんど開発が進んでいないと言っても過言ではない。その理由は、競合する CaZ +結合能を抑えて Mg2+選択性を向上させることが難しいことにある。既存のプローブでも、 CaZ+選択性が完全に失われているわけでは無く、生理的条件下の Mg2+濃度測定に影響がない程度に CaZ+親和性を低下させることにより細胞内の Ca2+濃度変化による影響が無視できるようになっている。有機小分子を用いた Mg2+プローブは、開発が精力的に行われてきた CaZ + プローブには及ばないものの多数報告があ‑14‑

JjSMgR Vo.
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生非難 拡大図~ヌクレオソーム @Mg"8 負電荷

Fig.
1 DNA がヒストンに巻かれたヌクレオソーム総維は 負 電荷を持 つ ため、反発して伸びている(左 ) 0 Mg2" イオンが増えてくると負 電荷が中和され、反発が抑えられることによりヌクレオソ ーム同 士が結合し、染色体の凝縮が進む (右 ) 。 文献 4 より修正後転載。

り、市販されているものを購入して用いることもできる 5) 。 我々の染色体凝縮メカニズムの解明でも、細胞周期の各ステップでのスナ ッ プショットを解析する場合には市販のプロ ー ブ Mag-Fura-2 を用いていた 1) 。

しかし、アセトキシメチルエステル化により Mag-Fura-2 の細胞内への取り込みは効率 よく行われるものの、 長 時間観察 している間に細胞外へ排出されてしまい、同 一 細胞内で細胞周期を通して起こる Mg 2 +濃度変 化を H寺系列観察するのは困難であ っ た 。 長 H寺間観察に適した蛍光タンパ
ク質を用いた遺伝子コードされたプロープも開発され始めてはいたが、あとで紹介する MARIO が13FJ発 さ れる以前はわずかに 2 例の報 告 のみであ っ た 6. 7) 。

また、その仁1) で もよ り実 用に即した プ ロー

プと 考 えられた MagFRET は、 M g2+ に対する結合親和性が高 す ぎ 、かつ Mg 2 " が結合した l時 の蛍光シグナル変 化が微小なため、細胞内の Mg 2 +濃度変化を検出することが不可能であった 。

そこで、我々は新たに原核 生 物の Mg 2 +輸送タンパク質 Cor A の利 II !J包内 MgZ+ 感受性領域 ( CorA-CD )に 着 目し 、 立体構造情報が既知であ っ た趨好熱性の 細 菌 Thermotoga maritima と超好熱性のメタン菌

Methanocaldcoccusjannasc如l 、および 当 H寺 は 立 体構造が解かれていなか っ た大腸菌からクローニングした CorA-CD に 2 程鎖の蛍光タンパク質を組み 合 わせて蛍光 Mg 2 ' プ ロープを作製し、 評 価を行 った へ その中で、 Mg2+濃度変化によりも っ とも大きな変化率を 示 した大腸菌由来の CorA-CD を用いたプロープにさらに改良を加えることにより、細胞内の Mg 2 +動態を 高精 度に検出可能な蛍光 MgZ+ フーロープ MARIO (MAgnesiumRatiometricIndicatorforOpt
icalim a gin g ) を開発した ( Fig.2 ) .l) o MARIOは細胞内の M g2+濃度に合わせた結合力 (解離定数んは mM レンジ ) を 有 するように CorA-CD を改変されており、 Mg2+ が結合すると、 2 種類の蛍光タンパク質が近くに引き寄せられて FRET が起こる
結果、:蛍光色が青から黄緑に大きく変化する 。

この MARIO の遺伝子 をヒト HeLa 細胞内に導入して、プローブタンパク質を安定的に発現させ 、 蛍光顕微鏡で細胞周期を通してタイムラプス観 察 をお こ

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黄色蛍光ヲンパク貿

Mg2+・.

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Fig.
2 新しい M g2+ プロープ MARIO の原理

2 種類の蛍光タンパク質 青 色と黄色が、 CorA-CD ( ß凡色 ) でつながっている (左 ) 0 Mg 2 + イオンが CorA-CD に結合していない状態では青色蛍光タ
ンパク質を励起すると背色の蛍光が放射される 。一 方、 Mg 2 + イオンが CorA - CD に結合すると立体構造が変 化 する結果 、 2 種類の蛍光タンパク質が引き寄せられる 。

こ の構造変 化 により F RET (Frsterres
onanceenergytransfer ) が生じ、 青色蛍光タンパク質 ( 供与体) の励起エネルギーが黄色蛍光タ ンパク質(受容体 ) に移動し 、 黄色蛍光が放 出される (右 ) 。

なった ( Fi g. 3 )" ) 。 その結果、細胞が分裂する際にフリー Mg 2 + ìJ::ミ度が顕著に上昇する ことを発見した( F i g.3 ) 。 一 方で 、もう 一 つの綱11 胞内の重要なイオンである Ca 2 ゐ の濃度動態を、研究グル ー プが以前開発した蛍光 Ca 2 + プロ ー プ YC3. 60 9 ) で調べたと こ ろ 、 変化が見られなかった。

A

分裂前期

B

分裂中期

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50 100 150 200 250 300
時間 (min)Fig.
3 (A)M A RIO を安定的に発現させた HeLa 細胞 のタイムラプスイメージング 。 上段の DIC 画像シリーズにより、分裂する細胞の形態を 『確認できる 。 下段の岡像シリースは MARIO のFRET 蛍光強度比を 示したもの 。 H寺間経過と共に分裂している矢印の細胞において蛍光強度比 が上昇し、 2 つの細胞に分裂完了後、低下しているのが分かる 。 (B ) 蛍光強度比を定 量 化したグラフ o tllillilli は時間を表し、分裂開始付近で上昇し、中則付近でピークになっている 。 文献 4 より修正後 ]1記載。
それではこの増加した Mg 2 + はどこからやってきたのであろうかつ筆者らは 細胞内の Mg 2 + の多くは ATP やタンパク質と結合していることが知られていたため、 ATP の動態に注目する こと にした 。
そ こで現 ・ 京大の今村 らが開発 し た蛍光 ATP プ ロー ブ ATeam l O ) を 細胞内 に発現させ、細胞内の ATP量 の変 化を 調べてみた 。 その結果、細胞が分裂する際に A T P 脱皮が lm M 程度減少していることが司 EApbJJSMgR Vo.
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22019わかった (Fig.4) 九 この ATP の減少は細胞分裂を進めるために、紡3主体形成や染色体凝縮・分間Ir によって、この H寺期エネルギーを貯蔵している ATP が多く消費されることによると思われた 。 その ATP減少の際に ATP に結合し、 ATP 一 Mg として存在していた Mg 2 + が放出され、Mg 2 + 濃度が上昇し、染色体の凝縮が促進されると考えられた ( Fi g. 4) 。 実際、 in vitro 実験では、 ATP の存在下では Mgよる染色体凝縮が阻害され、 ATP の加水分解により、再び、染色体凝縮が起こ った 心 。

また、細胞内のATP 量を減らすと Mg 2 + 濃度が上昇し、染色体はさらに凝縮した 。 逆にキレーターを用いて Mg 2 +濃度を低下させると、染色体は脱凝縮した九 以上の結果は Mg2 + が反発するヌクレオソームの電荷を弱め、ヌクレオソ ー ムを互いに近づけて、染色体凝縮を促進していることを示している ( F i g. 1)0 invitro
では Mg 2 + 濃度の上昇により、染色体は強度が増加することがま[1られている 。 Mg2 + の上昇は染色体にストレスがかかる、 2 つの娘細胞への染色体運搬過程にも都合が良いと思われる 。 以上、本成果はゲノム DNA の「新たな凝縮メカニズム 」 を提唱するものである ( Fig. 4) 。
細胞分裂
前期

中期

後期ー→ーl 染色体
前期..
. Mg‑ATP • Mg"

細胞分 裂 中期

rノ後期\\ーMg'‑

ヤE

BrATEEEEEE
IA

Fig.
4 細胞が分裂する際に Mg2 + イオンが増加し、染色体の凝縮が促進される 。 Mg2 + イオンは ATPの減少により Mg-ATP から遊離することによ っ て供給される 。 文献 4 より修正し転載。

細胞分裂の際に染色体が正 常に形成されないと 、 遺伝情報が均等に受け継がれなくなり、遺伝情報の発現異常が起こる 。 また 、 DNA が損傷することによ って 細胞死ゃがん化などのさまざまな異常が起こると考えられている 。

また、 Mg 2 + はk.1H 胞内に多 量 に存在して多くのタンパク質の働きを助けており、欠乏するとさまざまな細胞異常が現れることがま[1られている 。 本研究で得られたゲノム DNAが凝縮する仕組みゃ、蛍光 Mg 2 + プ ロープ MARIO の利用により、細胞機能の破綻によって引き起こされる関連疾病の理解が進むことが期待される 。

ヴt‑A

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l37N
O.
22019
謝辞

本研究の共同研究者の皆さま、とりわけ、細胞内 Mg2+測定に協力頂いた慶膳義塾大学理工学部・
岡浩太郎教授・新藤豊特任助教、細胞内 ATP 測定に協力頂いた京都大学生命科学研究科・今村博臣准教授・東京大学工学研究科・野地博行教授に深く感謝いたします。本研究で用いた Thermotoga
maritima および Methanocaldcoccus jannaschii のゲノム DNA は、文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトを通して理研 BRC から提供を受けました。本研究は文部科学省科研費・新学術領域「少数性生物学」、科学技術振興機構

戦略的創造研究推進事業 (CREST) (J PMJCR15G2, JPMJCR15N3) 、および科研費(1 6H04746) の支援を受けました。

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