SHELXによる精密化の紹介

量子科学技術研究開発機構（QST）
量子ビーム科学研究部門
東海量子ビーム応用研究センター

平野 優
1Outline
1.

SHELXの概要

2.

SHELXLによる精密化

3.

実例（NADHシトクロムb5還元酵素を例にして）参考文献等
SHELX HP： http://shelx.uni-goettingen.de/
結晶構造精密化SHELXLの使い方、大場茂・植草秀裕著、三共出版
SHELXLの特徴を知ろう！、大場茂、日本結晶学会誌57, 87 (2015)2

1. SHELXの概要
SHELXは、X線回折および中性子回折による低分子と高分子の結晶構造解析のためのプログラム群
アカデミックフリー（Linux, Win, Mac OSXに対応）
SHELX-2017に含まれるプログラム
SHELXT：低分子の構造決定

SHELXS：低分子の構造決定（直接法）
SHELXL：低分子と高分子の精密化
SHELXL：低分子と高分子の精密化
PDB2INS：SHELXLのインプットファイル作成
CIFTAB, ShredCIF：SHELXLのCIFファイル編集

SHELXC, SHELXD, SHELXE：高分子の位相決定

この後の実習

AnoDe：異常散乱電子密度の作成等
SHELX HPより： http://shelx.uni-goettingen.de/3タンパク質の精密化に用いられるプログラム

Number of Entries

60000
50000

40000
30000

SHELXによる精密化の登録数は2361
X線結晶構造解析の約1.8%

20000
10000
0

Refinement software used

PDB HPより： https://www.rcsb.org/stats/distribution_software
4

SHELXLによる精密化の特徴
高分解能データの精密化に適している（2 Åより高分解能で、できるだけ高分解能が望ましい）

ディスオーダー、非等方性ADP（atomic displacement
parameter）、水素原子をモデルに含めた精密化が可能
結合距離、結合角度のesd値（estimated standard
deviation）が得られる
利用例：Asp, Glu側鎖のプロトン化状態
ChargedO
1.25 Å

C – O距離OC同じ

1.25 Å

Protonated
pKa

OH

O
3.8 (Asp)
4.3 (Glu)

1.21 Å

C

1.32 Å

異なる（~0.1 Å）
5完全行列最小二乗法による精密化
モデル構造の全ての変数

pi = 10×N、N = 原子数（座標×3、異方性温度因子×6、占有率×1）

𝑅=

𝑤 ℎ𝑘𝑙

𝐹𝑜 ℎ𝑘𝑙2

2 2− 𝐹𝑐 ℎ𝑘𝑙を最小にする条件

ℎ𝑘𝑙

𝜕𝑅
=0
𝜕𝑝𝑖

Taylor展開によって近似して連立一次方程式（normal equation）を求める
𝜀𝑖
𝑖

𝑤 ℎ𝑘𝑙
ℎ𝑘𝑙

𝜕 𝐹𝑐 ℎ𝑘𝑙
𝜕𝑝𝑖2

𝜕 𝐹𝑐 ℎ𝑘𝑙
𝜕𝑝𝑗

2

=

𝑤 ℎ𝑘𝑙

𝐹𝑜 ℎ𝑘𝑙ℎ𝑘𝑙

aij
𝜀𝑖 𝑎𝑖𝑗 = 𝑏𝑗

2−

𝐹𝑐 ℎ𝑘𝑙2

𝜕 𝐹𝑐 2𝜕𝑝𝑗

bj（ei ： piのシフト量）

全ての行列要素について計算

𝑖pjの標準偏差𝜎 𝑝𝑗 =−1𝑎𝑖𝑗
𝑅

𝑁𝑜 − 𝑁𝑝（A–B間距離 l については 𝜎 𝑙 =（No, Np ： データ数，パラメータ数）

𝜎𝐴 2 + 𝜎𝐵 2 ）6

結合距離のesdに対する制約の影響
Concanavalin A（0.94 Å分解能）における完全行列最小二乗法による精密化
Restrained

Unrestrained

C–C
C–N
C–O

誤差の見積り過小評価

Restrainedあり精密化の際の結合距離のs
2 𝑙 = 1 𝜎2
2
1 𝜎𝑟𝑒𝑠𝑑𝑖𝑓𝑓 𝑙 + 1 𝜎𝑔𝑒𝑜𝑚 𝑙

制約なし

結合距離の制約International Tables for Crystallography (2012). Vol. F, p. 503, Figure 18.5.4.2を改変
7

2. SHELXLによる精密化
Refmac, PHENIXなどのプログラムによる精密化（~1.5 Å分解能、等方性温度因子）

SHELXLへ移行（Rigid body refinement）
分解能の拡張（共役勾配法による精密化）（マルチコンフォメーションの追加、非等方性温度因子、制約の除外）

水素原子をモデルに付加して精密化
完全行列最小二乗法によるesdの計算
8精密化において必要なファイル
1. インプットファイル（ins）
TITL Rubredoxin in P1 (from 6RXN in PDB)CELL 1.54178 24.920 17.790 19.720 101.00 83.40 104.50
ZERR
1 0.025 0.018 0.020
0.05 0.05
0.05
LATT -1
SFAC CH
N O
S FE
UNIT 224 498 55 136 6 1

コマンド

DEFS 0.02 0.2 0.01 0.05

…

RESI
C1
O1
N

1
1
4
3

MET
-0.01633
0.010120.007120.35547
0.326810.354460.44703
0.48491
0.37983

11.00000
11.00000
11.00000

0.118170.178960.11863

原子座標、占有率、
温度因子

…

HKLF
END

4

2. 反射データファイル（hkl）
-1
1
-2
2
-3
3

0
0
0
0
0
0

0
0
0
0
0
0

273.70272.48585.06587.29471.76475.22

0.87
0.87
1.80
1.80
1.48
1.50

1
1
1
1
1
-1

（h k l Io s(Io) flag）…
9精密化に必要なファイル作成方法
1. insファイル
pdb2ins

PDB2INSを利用…

ins作成時”N”

Enter name of PDB file to read (To download a PDB file enter '@<PDBCODE>'): start-model.pdb

初期構造Enter HKLF code (3 for F, 4 for F-squared) [4]:44（default）選択

Please enter Z (number of molecules per cell):4

Z値

No wavelength found in file. Enter wavelength in Angstroms [1.54178]: 0.7

測定波長Reset water occupancy to unity? (y or n) [Y]: Y

水分子の占有率Enter .ins filename to be created [start-model.ins]:

insファイル名…

Create .hkl file from structure factor file (cif) or PDB code? (y or n) [N]: N

2. hklファイル
mtz2hklを利用

http://shelx.uni-ac.gwdg.de/~tg/research/programs/conv/
よりダウンロード可能

mtz2hkl data1.mtz

hklファイル出力（HKLF 4フォーマット）

CCP4のmtz2variousを利用
Format: SHELX, Label: I, s(I), FreeR-fｌag
10精密化における入出力の流れ
1. 入力
insファイル：精密化のコマンド、原子座標データ
hklファイル：反射データ

2. 実行
insファイル、hklファイルの拡張子前部分を揃える（例： refine-1.ins, refine-1.hkl）

shelxl refine-1（並列計算利用の場合 –t オプション、”-t4”など）

3. 出力
resファイル：insファイルと同じ形式、精密化後の原子座標データ
lstファイル：精密化のログ、結合距離・角度（esd）なども書き出される
pdbファイル：精密化後のpdb
fcfファイル：精密化後の反射リスト（Cootで電子密度図の描写に利用）（例： refine-1.res, refine-1.lst, refine-1.pdb, refine-1.fcf）

Cootで読み込み11

Cootにおけるファイルの読み込み

File→Open Coordinates
resファイル選択

File→Open MTZ, mmCIF, fcf or phs…
fcfファイル選択

モデル修正後、File→Save Coordinates…、で新しいinsファイルが保存される

12

insファイルの内容 1
コマンドの種類約80
コマンド ＋ 引数 という形式になっている
TITL converted from file start-model.pdb
CELL 0.70000 48.628 72.233 85.080
90.00
ZERR
4
0.049
0.072
0.085
0.00

TITL
CELL
ZERR

90.00
0.00

90.00
0.00

タイトル（76文字以内）
l, a, b, c, a, b, g
Z, esd(a), esd(b), esd(c), esd(a), esd(b), esd(g)REM Space group P 21 21 21
LATT -1
SYMM x+0.5, -y+0.5, -z
SYMM -x, y+0.5, -z+0.5
SYMM -x+0.5, -y, z+0.5

REM

コメント行

LATT
SYMM

空間格子の型、単純格子は“1”、対象心の無い場合（タンパク質）は負
対象操作
13insファイルの内容 2
SFAC C H N O P S
DISP $C
0.00328
DISP $H-0.00002

0.001640.00000

10.97565
0.66864

…

UNIT

SFAC
DISP
UNIT

6248 0 1664 4084 8 48

モデルに含まれる原子種
f’, f’’, 吸収断面積（Cu Ka, Mo Kaなど使用時は省略可）
結晶格子中の原子数

DEFS 0.02 0.1 0.01 0.04
CGLS 20 -1
SHEL 50 1.5
ANIS
FMAP 2
PLAN 200 2.3
LIST 6WPDB 2

DEFS
CGLS
SHEL
ANIS
FMAP
PLAN
LIST
WPDB

制約の標準偏差のdefault値（DFIX, CHIV, DELU, SIMU）
共役勾配法による精密化（サイクル数、-1の反射をRfreeの計算に使用）
分解能範囲
非等方性温度因子の適用
フーリエ合成の種類（“2”はFo-Fc）
フーリエ合成で探すピーク数、O, N等の原子からの距離（2.3 Å<d<4.0 Å）
反射リスト（.fcf）の種類（“6”の時Cootで読込み可）“1”（等方性）、“2”（非等方性）、負の時水素をPDBファイルに書出し

14

insファイルの内容 3
RIGU
DELU $C_* $N_* $O_* $S_* $P_*
SIMU 0.1 $C_* $N_* $O_* $S_* $P_*
XNPD 0.001
SWAT
MERG 4
ISOR_HOH 0.1 $O
CONN_HOH 0 O

RIGU,DELU,SIMU,ISOR
温度因子の制約XNPD
温度因子が非正定値にならないように下限値を設定
SWAT
バルク溶媒補正
MERG
反射データの平均化、“4”の時フリーデル対を含め平均化
CONN
非水素原子間の結合を設定、上記の場合水分子とタンパク質間の結合を回避
y

x
z

DELU

RIGU

DUzz = 0

DUzz = 0, DUyz = 0, DUxz = 0

SIMU

ISOR

15

insファイルの内容 4
RTAB_* Omeg CA_+ N_+ C CA
RTAB_* Phi C_- N CA C
RTAB_* Psi N CA C N_+…
REM HFIX_ALA 43 N
REM HFIX_ALA 13 CA
REM HFIX_ALA 33 CB…
CHIV_ALA C
CHIV_ALA 2.477 CA
DFIX_ALA 1.231 C O…
DANG_ALA 2.462 C N

…

RTAB
HFIX
CHIV
DFIX
DANG

指定した原子間の距離、角度等をlstファイルに出力
水素原子の発生、一桁目の3はriding model使用時
キラル体積（指定した原子に結合する4原子が形成する四面体の体積）の制約
結合距離の制約
結合角度の制約

HFIX 43
H
H
N

HFIX 13HC

HFIX 33
H

CHIV

H

CA

C
H

DANG
d (Å)

C

N
CA

16

insファイルの内容 5
WGHT
FVAR

0.100000
0.053370.50000.5000 0.5000…
RESI A:20
ASP
N
3
0.309465 0.212651 0.097415 11.00000 0.11078 0.07261 =WGHT
反射の重み付け係数
0.094190.01200
0.02966
0.02546
AFIX 𝑤
43 = 1 𝜎 2 𝐼 + 𝑎𝑃 2 + 𝑏𝑃
（default a = 0.1, b = 0）
H0
2 ℎ 0.301141 𝑜0.221550 0.102154 11.00000 -1.20000
AFIX 𝑃0= 𝑓 max 0 or 𝐼
（default f = 1/3）
𝑜 + 1 − 𝑓 𝐼𝑐
PART 1CA
10.325963 0.216598 0.083393 21.0000 0.10418 0.08829 =FVAR
スケール因子（1番目）、自由変数（1番目以外）
0.09001
0.022100.02400
0.02804…
PART 2CA
1

0.327029
0.08658

0.083769 -21.0000 0.10552
0.021620.024020.09058 =0.236547
0.032250.084662 11.00000 0.08949
0.01479
0.02792

0.08826 =…

0.216338
0.01954

PART 0C
10.335856
0.10989…
HKLF 4END

17

insファイルの内容 5
WGHT
FVAR

0.100000
0.053370.50000.5000 0.5000…
RESI A:20
ASP
N
3
0.309465 0.212651 0.097415 11.00000 0.11078 0.07261 =0.094190.01200
0.02966
0.02546
AFIX 43H020.301141 0.221550 0.102154 11.00000 -1.20000
RESI
アミノ酸残基（リガンド、水分子等）の指定
AFIX
0“A:20” Chain A, 20番目の残基（Chain IDはSHELX-2017で対応）
PART 1
Coot v.0.8.9で読み込み可能CA
1
0.325963 →0.216598
0.083393 21.0000 0.10418 0.08829 =
0.09001
0.022100.02400
0.02804
以前のバージョンのSHELXでは1020（chain
Aは+1000）などとしていた

…
PART
2
原子名、SFAC番号、x,y, z (fractional)、占有率、U11（iso のときUiso）, U22, U33, U23, U13, U12CA
1
0.327029 0.216338 0.083769 -21.0000
0.10552 0.09058 =“=”は改行後の行も同一行とみなす
0.08658
0.019540.021620.02402…

占有率の“11.00000”は1に固定を示す

PART 0C
10.335856
0.10989

0.236547
0.032250.084662 11.00000 0.08949
0.01479
0.02792

0.08826 =…
HKLF 4END

18

insファイルの内容 5
WGHT
FVAR

0.100000
0.053370.50000.5000 0.5000…
RESI A:20
ASP
N
3
0.309465 0.212651 0.097415 11.00000 0.11078 0.07261 =0.094190.01200
0.02966
0.02546
AFIX 43H020.301141 0.221550 0.102154 11.00000 -1.20000
AFIX
0PART 1CA
10.325963 0.216598 0.083393 21.0000 0.10418 0.08829 =AFIX 43~AFIX
0 直前の原子に対する水素原子の取り扱いを指定
0.09001
0.022100.02400
0.02804…
…

原子名、SFAC番号、x,y, z (fractional)、占有率、Uiso
PART 2CA
1
0.327029
0.216338 0.083769 eq-21.0000
0.10552 0.09058 =Uの1.2倍となるような制約
isoの“-1.20000”は直前の原子のU
0.08658 3などでは1.5倍とする
0.019540.021620.02402
OHやCH
1
PART 0
𝑈𝑒𝑞 = 𝑈11 𝑎𝑎∗ 2 + 𝑈22 𝑏𝑏 ∗ 2 + 𝑈33 𝑐𝑐 ∗ 2 + 2𝑈12 𝑎∗ 𝑏∗ cos 𝛾 + 2𝑈13 𝑎∗ 𝑐 ∗ cos 𝛽 + 2𝑈23 𝑏∗ 𝑐 ∗ cos 𝛼C
10.335856 0.236547 0.084662 11.00000 0.08949 0.08826 =
30.10989
0.032250.01479
0.02792…
HKLF 4END

19

insファイルの内容 5
WGHT
FVAR

0.100000
0.053370.50000.5000 0.5000…
RESI A:20
ASP
N
3
0.309465
0.09419
AFIX 43H020.301141
AFIX
0PART 1CA
10.325963
0.09001

0.212651
0.01200

0.097415 11.00000 0.11078
0.02966
0.02546

0.07261 =0.221550

0.102154

0.216598
0.022100.083393 21.0000 0.10418
0.02400
0.02804

0.08829 =0.216338
0.019540.083769 -21.0000 0.10552
0.021620.024020.09058 =0.236547
0.032250.084662 11.00000 0.08949
0.01479
0.02792

0.08826 =11.00000 -1.20000…
PART 2CA
1

0.327029
0.08658…
PART 0C
10.335856
0.10989…

PART 1,PART 2,PART 0

ディスオーダー（マルチコンフォメーション）部分の指定

HKLF 4原子の占有率“21.0000”はFVARの2番目の値を参照することを示す
END“-21.0000”は（1-FVAR(2)）を示し、占有率の合計が1となるようにしている20

insファイルの内容 5
WGHT
FVAR

0.100000
0.053370.50000.5000 0.5000…
RESI A:20
ASP
N
3
0.309465
0.09419
AFIX 43H020.301141
AFIX
0PART 1CA
10.325963
0.09001

0.212651
0.01200

0.097415 11.00000 0.11078
0.02966
0.02546

0.07261 =0.221550

0.102154

0.216598
0.022100.083393 21.0000 0.10418
0.02400
0.02804

0.08829 =0.216338
0.019540.083769 -21.0000 0.10552
0.021620.024020.09058 =11.00000 -1.20000…
PART 2
CA
1

PART 0C
1

反射データファイルフォーマットの指定“4”の時は（h k l Io s(Io) flag）

…

HKLF

0.327029
0.08658

0.335856
0.10989

0.236547
0.032250.084662 11.00000 0.08949
0.01479
0.02792

0.08826 =…
HKLF 4END

21

lstファイルの内容読み込んだinsファイルの内容
原子間結合のリスト
最小二乗法の各サイクルのまとめ

最終サイクル後の座標、温度因子
S値（Goodness of fit）

最終サイクル後のR値，S値等の結果

𝑆=ℎ𝑘𝑙 𝑤 ℎ𝑘𝑙

𝐹𝑜 ℎ𝑘𝑙 2 − 𝐹𝑐 ℎ𝑘𝑙
𝑁𝑜 − 𝑁𝑝

2 2

結合距離、角度等のリスト
フーリエ合成で検出したピークのリスト
resファイルの末尾にも出力
223. 実例（NADHシトクロムb5還元酵素を例にして）
酸化型

NADH

酸化型

E-FAD

H- transfer

二電子還元型
E-FADH- – NAD+

E-FAD - NADH

b5R
NADH
結合ドメインNAD+

E-FAD – NAD+

再酸化型

FAD
結合ドメイン
E-FAD- – NAD+e- (Cyt b5)一電子還元型(Red semiquinone)e(Cyt b5)
E-FADH – NAD+H+

一電子還元型(Blue semiquinone)

アミノ酸残基数：272
酸化型はFADを結合
非対称単位中に1分子
X-ray crystal structures of b5R from porcine liver
M. Yamada et al., J. Mol. Biol., 425, 4295-4306 (2013). Oxidized @0.78 Å, Fully-Reduced @1.68 Å
K. Takaba et al., Sci. Rep., 7, 43162 (2017). Oxidized @0.78 Å23

b5RのX線回折データ
統計値
Resolution range (Å)

50-0.87(0.89-0.87)

Space group

P212121

Cell parameters (Å) a

48.6

b

72.1

c

84.8

0.88 Å
Completeness (%)

100 (100)I/s(I)

76.1 (4.4)

Rmeas (%)

6.0 (45.5)

PF BL-5において回折データ収集
Wavelength 0.76 Å
Detector ADSC Q315
Distance 100 mm
24

b5Rの精密化の流れ
1. PHENIXプログラムによる精密化（50-1.5 Å分解能、等方性温度因子）
2. SHELXLへ移行（ 50-1.5 Å分解能、 Rigid body refinement）
剛体の範囲をAFIX 6 ~ AFIX 0で囲む

Rwork = 18.7%, Rfree = 23.0%

3. 分解能の拡張、マルチコンフォメーションの追加（ 50-0.9 Å分解能、 等方性温度因子）

Rwork = 17.9%, Rfree = 20.4%

4. 分解能の拡張、非等方性温度因子の適用（ 50-0.87 Å分解能）

Rwork = 13.9%, Rfree = 16.9%

5. 制約の除外、水素原子の導入（ 50-0.87 Å分解能）

Rwork = 13.1%, Rfree = 15.8%

6. 完全行列最小二乗法によるesdの計算（ 50-0.87 Å分解能）25

マルチコンフォメーションと水素原子の取り扱い
Asn198

Od1

PART 10.086200.06016 =0.126210.08844 =…

Nd2

PART 2RESI A:198
ASN
PART
1
N 3 0.128026 0.442065 -0.157955 251.00000

Cg

PART
N 3

Cb

2
0.130257

0.440773 -0.159804 -251.00000

…

PART

0

Ca
FVARの25番目の値

2Fo-Fc map contour 1.5s

PART 1の占有率：0.521、 PART 2の占有率：0.479
RESI A:68

VAL

…

Val68

0.52104

CB

Cg2

Cg1

Cb
Ca

1

0.169112 0.362774 0.029087 11.00000 0.07826 0.07741 =0.072810.010710.00458
0.00521
AFIX 13
HB 2 0.164677 0.362215 0.017819 11.00000 -1.20000
AFIX
0
CG1 1 0.183985 0.380865 0.031791 11.00000 0.08496 0.07917 =
0.08095
0.021530.005530.00089
AFIX 33
HG1A 2 0.171917 0.391006 0.029328 11.00000 -1.50000
HG1B 2 0.189550 0.381682 0.042636 11.00000 -1.50000
HG1C 2 0.199952 0.381420 0.025130 11.00000 -1.50000
AFIX
0

…

Fo-Fc H omit map contour 2.5s26

完全行列最小二乗法によるesdの計算
CGLS
1. 最小二乗法のコマンド
L.S. 1 （サイクル数1とする）

L.S.

2. 変数をシフトさせず、標準偏差のみを見積もる
DAMP 0 0（パラメータ数多い時はBLOC 1も使用し原子座標の標準偏差のみ計算）
3. 全ての制約を除外する（結合距離、温度因子に関するものなど全て）
BOND
4. 結合距離（角度）とesdの出力コマンド（水素原子を含む結合については BOND $H）
5. SHELXLの実行
shelxl refine-ls -b30000 -t4-bオプション：パラメータ数（defaultは3000）

𝑃𝑎𝑟𝑎𝑚 × 𝑡ℎ𝑟𝑒𝑑 < 65500

b5R計算時間
約1時間20分（Core i7-4930k CPU @3.4GHz、パラメータ数: 28020、thred数：4）
27

おわりに

高分解能データ（dmin ~ 1 Å）が得られた際には、
SHELXLを用いた精密化を検討してみてはいかがでしょうか

謝辞
データ収集でお世話になったPFビームラインスタッフの皆さまに感謝いたします28