第5回タンパク質結晶構造解析中級者向け講習会
2020/11/4(水), オンライン

全自動とリモートでのデータ収集を通した
リン位置同定の試み
京都大学大学院理学研究科 藤橋雅宏

この研究でやりたいことClass IBテルペン合成酵素の作用機構の解析

BsuTS(n=35)

二リン酸基の脱離で反応が始まる

Sato, T. et al., JACS (2011)

BalTS

全体構造(n=20,25,30,35)

Ueda, D. et al., ChemBioChem (2015)

BclTS

Fujihashi, M. et al., Chem. Sci (2018)(n=20,25,30)

基質は見えるけれども…
D85
D92

D88

D rich
motif
D249
D257
D253

・Asp近傍にリン酸基があるが、bridgeする金属等は見えない
・リン酸基の電子密度が弱い

方針・Mgを含む複合体を得るために
 結晶化条件の再検討

D92

D85

D88

D richmotif

・リン酸部分の電子密度が弱い
 リン原子の異常分散

D249

D257
D253

・長波長データは分解能が出ない(2θ=60ºで波長と分解能は同じ) 同じ結晶から、波長1Åと2.7Åの両方でデータを取得する
・長波長データは溶媒の影響が大きい
 UVで結晶周りの溶媒を切り落とす

PFで行うことD92

・新しい結晶化条件の結晶を用い
D rich
波長1 Å, 2.7 Å 両方の光でmotif同じ結晶からデータを取得する

D85

D88

D249

D257
D253

①BL5Aで全自動データ収集 (λ=1.0 Å) 短波長データ収集と、結晶のスクリーニングを兼ねる②リモート操作で結晶のカット③リモート操作で、BL1Aを用いてのデータ収集 (λ=2.7 Å) ヘリカルスキャンをしたかったので、リモート操作

①BL5Aにおける全自動データ収集
サンプルリストファイルの設定
Screening
Run
Start
Total_frame
Start_omega
Snap_omega
Osc_width
Exp_time
Wavelength
Max_resolution
Camera_flowight
HwidthVwidthTransmittance

211
1800
00.2
0.4
11.6
00.2
0.2
100

0.4 sec/frameで1800 framesなので720sec/dataset
この照射時間で、おおむね1.3 MGy(http://www.raddo.se/rd3d/prepare.php)
osc widthは0.1または0.2にしています
Max_resolutionは、期待される分解能より高めに設定しています。
高分解能をとれる設定にすると、spot同士が近づいて積分しにくくなりますが、よほど格子の大きい結晶で無ければ、積分不可にはならないと思います。

①BL5Aで取得したデータの統計値
結晶1Resolution (Å)

結晶248.52-1.81 (1.85-1.81) 48.65-1.95 (2.00-1.95)

Total osc. range (deg)
Total Dose (MGy)360
1.33601.3Space group

P1

P1

a , b , c (Å)

51.43, 53.63, 76.98

51.48, 53.80, 76.94

α , β , γ (º)

94.48, 104.46, 112.71

94.47, 104.32, 112.80# obs. reflections

213,802 (14,153)

180,090 (12,655)# uniq. reflections

61,219 (3,741)

51,455 (3,552)

Completeness0.932 (0.952)

0.976 (0.960)

Rmeas

7.2% (58.0%)

6.3% (49.3%)

CC1/2

0.996 (0.884)

0.995 (0.878)

I/σ(I)

10.8 (1.9)

11.4 (2.2)

悪くないデータがとれています

②結晶のカット by リモート操作

白い線を引っ張ってカットの形を決める

②結晶のカット

③BL1Aにおけるデータ収集
・リモート測定・5Aにおける全自動測定で、結晶の質の順位付けができている●データ取得の方針
・吸収線量 ~5 MGyでデータを取得する
BL1Aはtransmittance 100%, 36sec照射で78MGy
下の式に従って、transmittanceを決める。total照射時間は36sec
78 MGｙ結晶の水平方向長さ L (μm)
ビームの幅 13 (μm)

xtransmittance (%) = 5 MGｙ
LBeam (幅 13 μm)

③BL1Aで取得したデータの統計値
結晶1

結晶2Resolution (Å)

50-2.76 (2.83-2.76)

50-2.76 (2.83-2.76)

Total osc. range (deg)

1440†

1440†

Total dose (MGy)

5.2

5.2

Space group

P1

P1

a , b , c (Å)

51.52, 53.68, 77.10

51.47, 53.78, 77.01

α , β , γ (º)

94.47, 104.46, 112.72

94.48, 104.34, 112.78# obs. reflections

206,892 (2,905)

191,807 (2,317)# uniq. reflections

33,269 (888)33,127 (844)Completeness0.893 (0.317)

0.887 (0.301)

Rmeas

8.0% (16.8%)

10.1% (24.4%)

CC1/2

0.995 (0.964)

0.991 (0.926)

I/σ(I)

18.9 (6.5)

17.0 (6.0)

SigAno

1.178

1.147

# ano

16000

15701

†κ=0とκ=90のそれぞれで、ωstart=0º, 90ºの計4つの 360º helical scan

基質の電子密度図

短波長X線(1.0Å)
polder map(4.5σ)

長波長X線(2.7Å)
anomalous map(3.0σ)

結晶2: R/Rfree = 22.4%/25.4% (精密化進行中)
リンのanomalous mapを、基質の電子密度に重ねることが出来ました。
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全自動測定? リモート? 実訪問?
全自動でできること
・UGUIS（制御ソフト)に事前に数値を入力して行う全ての操作

全自動でできないこと・ビームタイム途中での、UGUISへの入力数値の変更(ビームタイム前に確定が必要で、反射の具合を見ての変更はできない)・マウスの操作を伴う操作(現状ではヘリカルスキャンは出来ません)スクリーニング的な実験に向いています
多種類のリガンド/変異体の構造解析,ビームタイム前にどの結晶の質が良いかのチェック,クライオ条件探索, 重原子置換体探索 etc.

全自動測定? リモート? 実訪問?
リモート測定でできること
・UGUIS（制御ソフト)を用いた全ての操作

リモート測定でできないこと・ビームライン内への立入
ビームタイム途中に結晶を追加することは出来ません
霜を取るために結晶に液体窒素をかけることは出来ませんヘリカルスキャン(とプレートスキャン)に向いています
5A, NE3A, NW12Aでの通常のデータ収集は、全自動測定で十分と、個人的には思っています。

反射の様子を見ながら次の手を打てます
僕の経験では、「実験中に決めるしか無いこと」は、意外と少なく大抵はある程度の数の結晶を準備して、条件を振っておけば問題無いです全自動測定? リモート? 実訪問?
実訪問のメリット
・全ての操作を行える
・実体験の教育効果は大きい

実訪問のデメリット
・出張にかかる経費・時間

実訪問が適すること
反射の様子を見ながらクライオ条件を決めたいとき(僕は多数の結晶を用意して、全自動測定で決めるようにしています)
現場は学生のモチベーションをあげる

PFとSPring-8の自動測定・申込からデータ測定までの日数
PFは最短4日, SPring-8は2週間程度 (どちらも要課題)

・結晶の潜在力を活かしたデータ収集
PFは基本的に1カ所からデータ収集するのみ
SPring-8はzoo systemで、ヘリカルスキャンやマルチスキャンが可能

・ビームの強さ
吸収線量10 MGy程度の条件でデータ収集するには・BL5A, NE3A, NW12Aの180秒照射では無理・BL1A, BL17Aの180秒照射では可能だが、ある程度の大きさの結晶だと、ビームが当たらない場所が出る
・SPring-8のundulatorビームラインなら、18秒照射で十分PFとSPring-8の使い分け
・早くビームにアクセスしたい  PFの全自動データを撮って、その結果を見て次の実験を行うサイクルを早く回すのに向いています

・長波長が使いたい  PF BL1A
SやPの異常分散を見たいなら1Aが向いています・小さな結晶、細長い結晶、クラスタ状結晶  SPring-8
ZOO systemは、手持ちの結晶で良いデータがとれるように考えてくれます．
素晴らしいです.

・短波長が使いたい  SPring-8
波長0.9Åより短いX線を使いたいとき…あくまで藤橋の考えです私見
最近のシンクロトロン利用は、SPring-8もPFも第一選択は全自動
全自動ではどうしても無理なことをするならリモートどうしても必要な時だけ実訪問という方針にしています

全自動を使うと、すぐにデータが大量に集まります。
大量のデータのうち、どのデータを詳細に解析するかを見極める方法が、とても重要と感じます。

Acknowledgements
・PF, SPring-8 beamline staffのみなさま・京都大学大学院理学研究科 化学教室
生物構造化学研究室の皆様
・新潟大学 農学部 佐藤努先生ならびに研究室の皆様
・大阪市立大学 理学部 品田哲郎先生ならびに研究室の皆様