Agilent AdvanceBio
Gly-X グリカンサンプル前処理と2-AB Express キット
シンプルなワークフローによる高速 FLD/MS グリカン分析

従来の色素、高度なワークフロー

N-グリカンの特性解析 は 生物製剤の開発においてきわめて需要です。一般的に、酵素によって遊離されたグリカンは、タグで誘導体化され、LC/FLD および LC/MS での蛍光検出が可能になります。ラベル化 N-グリカンのサンプル前処理は多くの場合、完了までに何時間も、あるいは何日もかかります。

Agilent AdvanceBio Gly-X (旧 ProZyme) は、シンプルな溶液内ワークフローを実現する次世代 N-グリカン前処理プラットフォームです。N-グリカンは、N-グリカナーゼによって 5 分以内に糖タンパク質から遊離されます。Agilent AdvanceBio
InstantPC (旧 ProZyme) などの次世代蛍光色素と組み合わせると、サンプル前処理プロトコル全体を 1 時間未満で完了することができます。InstantPC が優 れた蛍光信号および質量分析のための良好な特性を備え、低アバンダンスのグリカンを検出できるのに対し、2-AB (2-アミノベンズアミノ) 色素は 20 年以上の間 N-グリカンデータを生成するために使用され、多くのラボで使用法が確立されています。

従来型の 2-AB ラベリングを用いた高速 Gly-X ワークフローという要求に応えるために、オンマトリックス Agilent AdvanceBio 2-AB Express (旧 ProZyme) ラベリングが開発されました。高速ラベル化によって、従来のワークフローにおける非常に時間のかかる乾燥ステップが不要になりました。Gly-X と 2-AB Express は、乾燥ステップのない従来の還元的アミノ化ラベリングを実現し、同時に効率的 な真空プレートクリーンアップにより、余分な標識色素や変性剤を除去します。UHPLC用のサンプルをわずか 2 時間で用意できます。

糖タンパク質 40 μg
変性 3 分間

N-グリカナーゼ消化 5 分間

グリカンの遊離1 時間の 2-AB Express ラベリング(乾燥なし)

ラベル化グリカン

96 ウェルクリーンアッププレート
UHPLC、MS/MS

データ解析

生産性向上を実現する要素– 5 分の PNGase F による分解で、偏りのない N-グリカン遊離を実現– 2-AB Express でのラベリングにより、乾燥ステップが不要になりプロトコルを短縮– 確立された 2-AB ラベル化糖鎖の分析メソッドを用いることで、進行中の複数のプロジェクトでデータの継続性を確保– モジュール式のため、柔軟なキット使用が可能

糖鎖分析を加速する
トータルソリューション

アジレントのバイオ医薬品向 け 製品群に ProZyme の製品とサービスが加 わりました。今後は、糖鎖分析のあらゆるステップをサポートする機器および消耗品をすべてアジレントからご購入いただ

けます。サンプル前処理から始まり、確かな分析結果を得るまでの包括的 なグリカン分析ワークフローをアジレントが実現します。これにより、お客様の求める信頼性と再現性に優 れた結果を容易に得られるようになります。

詳しくはこちら:www.agilent.com/chem/jp

脱グリコシル化

Gly-X N-グリカンの高速遊離技術

Gyl-X は、高温条件下 (50 ℃ ) でも、偏りなく PNGase F の活性を保ちます。Gly-X 変性試薬は室温で安定し、特別な取り扱いは必要なく、MS にも適しています。Gly-X では、大半のタンパク質の溶液内での酵素脱グリコシル化が、1 ウェルにつき 40 μg まで、5 分以内に完了します (図 1)。

Gly-X N-グリカンの遊離とラベリングが、96 ウェルプレートの単一ウェル内で実行されます。独自の変性剤により N-グリカン部位の曝露が増進され、酵素による迅速な切断が実現し、5 分で N-グリカナーゼ (PNGase F) による Gly-X 脱グリコシル化が可能になります。

エタネルセプトAグリコシル化Fc 領域および TNF-α脱グリコシル化
Fc 領域および TNF-α2000■ 未処理の糖タンパク質

FU

1500

1000

■ Gly-X PNGase F 消化マーカー

500

PNGase F
051528466395150240kDa
セツキシマブB
5000

脱グリコシル化重鎖グリコシル化重鎖

FU

4000

3000

■ 未処理の糖タンパク質■ Gly-X PNGase F 消化

軽鎖1000

PNGase F2000

マーカー051528466395150240kDa
図 1: Agilent AdvanceBio Gly-X の酵素による脱グリコシル化の効率。エタネルセプト (A) は、N-結合型グリコシル化部位を IgG1 Fc 領域に 1 つ、TNF-α コンポーネントに2 つ含みます。セツキシマブ (B) には、2 つの重鎖 N-グリコシル化部位 (Fc 領域に 1 つと Fab 領域に 1 つ) あります。Gly-X による脱グリコシル化では、グリコシル化ピークのリテンションタイムが、Agilent バイオアナライザで検出されたとおりにシフトします。

2

ラベリングN-グリカンの高速ラベリング

糖タンパク質遊離 N-グリカンの高速ラベリングは、-NH2 グリコシルアミン型

CH 2O(R)から -OH 遊離還元末端型への溶液中での高速変換によって行われます。続いて、マトリックスにサンプルがロードされ、2-AB との還元的アミノ化反応によってオンマトリックスで N-グリカンがラベリングされます (図 2)。オンマトリックスラベリングのプロセスにより、サンプルの乾燥が不要となります。

グリカン

5 分の Gly-X

脱グリコシル化

NH2OHNHAc

H2O
NH310 分の仕上げ

CH 2O(R)グリカン

OHOHNHAc

1 時間の 2-AB 還元的アミノ化ラベリング

CH 2O(R)OH
グリカン

OHNHAc

図 2: 2-AB Express による N-グリカンのラベリング

32-AB Express ラベル化 N-グリカンのクリーンアップ

ラベリング後、2-AB ラベル化グリカンは、マトリックスに結合しGly-X 2-AB Express クリーンアップにより、80 ～ 90 % を超えるラベル化グリカンが保持され (データは示していません)、個々のグリカンについて偏りはありません (図 3)。また、図 4 に示すている間に遊離色素が洗浄され、溶出溶媒の極性を変えることによって溶出されます。

ように、クリーンアップではシアル酸付加されたグリカン種も保次のすべてのステップで、96 ウェル真空ろ過マニホールドが使用持されています。

されます。

• アセトニトリルを用いた 3 回の洗浄
• DI 水を用いた溶出25

NCU

Etanercept Relative %20CU151050G0F

G1[6]

G1F[6]

G1[3]+
Man5

G2G2F

G1FS1

G2S1

G2FS1

G2S2

G2FS2

図 3: グリカンの回収率。クリーンアップした場合 (■) とクリーンアップなしの場合 (■) について、エタネルセプト N-グリカンを UHPLC で測定しました。
N = 8 での個々のグリカン種の相対 % 面積において、データは偏りを示していません。

70

Sialylated Species Area %60

51.9251.94

Cleanup

No Cleanup

50403020100

図 4: シアル酸付加種の保持。エタネルセプト N-グリカンが UHPLC で測定され、シアル酸付加種の合計面積についてクリーンアップがある場合 (■) とない場合 (■) で比較しました。

グラフから、シアル酸付加グリカンの損失がないことが分かります。

4

分析2-AB Express ラベル化 N-グリカンのHILIC-FLD プロファイル

図 5 に、エタネルセプト 2-AB N-グリカンの HILIC 溶出プロファ

グリカンプロファイルの複雑さによって、HILIC メソッドの時間をなどの他のラベル化グリカンと類似しています (データは 示してネルセプト N-グリカンを示します。Gly-X クリーンアップによって変えることができます。図 5 に、60 分メソッドで分離されたエタイルを示します。溶出 の 順序 は、InstantAB および InstantPC

99.97% を超える遊離色素が除去されるため、遊離色素のピーいません)。

クは最小です (データは示していません)。

28G0F

2624G2FS1222018G2S116EU14G1F[6]12G2FS210Man58G2F6G1F[3]4G2S2G22G00G1FS1

G1[6]G0F-N-2910111213141516171819202122Minutes

23242526272829303132333435

図 5: Agilent AdvanceBio Gly-X および 2-AB Express Labeling キットを用いたエタネルセプト 2-AB ラベル化 N-グリカンの HILIC-FLD プロファイル。60 分間グラジエント。

5

仕様
タンパク質のロード範囲

脱グリコシル化効率

グリカン回収率

遊離色素の除去

Gly-X および 2-AB Express

1 ～ 40 μg (タンパク質のグリコシル化によってはこれ以上)

大半のタンパク質で > 99 %> 80 %> 99 %

シアル酸付加種の保持> 99 %精度(ウェル間、日間)

主なグリカンのピーク面積

総ワークフロー時間

CV 5 %未満

130 分 (24 サンプル)

サンプル安定性-20 ˚C で最小 6 か月、4 ～ 8 ° C で 5 日

製品情報

説明

部品番号

Gly-X および 2-AB Express キット (96 ct)

GX96-2AB

Gly-X および 2-AB Express キット (24 ct)

GX24-2ABとラベリングモジュールセット (96 ct)

Gly-X および 2-AB Express 脱グリコシル化

GX96-401ABとラベリングモジュールセット (24 ct)

Gly-X および 2-AB Express 脱グリコシル化

GX24-401AB

Gly-X 2-AB Express ラベリングモジュール(96 ct)Gly-X 2-AB Express ラベリングモジュール(24 ct)2-AB Express 用 Gly-X クリーンアップモジュール(96 ct)Gly-X 2-AB Express スタータキット(Gly-X 真空マニホールドスペーサ、および 2 個のヒーターブロックのふた)GX24-401
GX96-402

GX400

AssayMAP PA50 Protein-A アフィニティ
精製キット (96 ct)

G5524-60010 KIT

2-AB ラベル化 N-グリカンライブラリ

部品番号

ヒト IgG N-結合型グリカンライブラリ

GKSB-005

2antennary + 高マンノース
分割ライブラリ

GKSB-520

ヒト α1-酸性糖タンパク質

N-結合型グリカンライブラリ

GKSB-001

ライブラリ

ウシフェチュイン N-結合型グリカン

GKSB-002

グルコースホモポリマー標準

6

GX96-401

GKSB-503

ライブラリ

α(2-3) シアル化 2 本鎖糖鎖

GKSB-232

ライブラリ

α(2-6) シアル化 2 本鎖糖鎖

GKSB-262

ライブラリ

α(2-3) シアル化 3 本鎖糖鎖

GKSB-233

ライブラリα(2-6) シアル化 3 本鎖糖鎖

GKSB-263

ライブラリ

α(2-3) シアル化 4 本鎖糖鎖

GKSB-234

ライブラリα(2-6) シアル化 4 本鎖糖鎖

GKSB-264

製品情報2-AB ラベル化個別

部品番号2-AB ラベル化個別

部品番号

G0-N

GKSB-401

G0GKSB-301

A4GKSB-309

G0F-N

GKSB-402

G4GKSB-310

G0F

GKSB-302

HYBR

GKSB-111

G0FB

GKSB-303

NN

GKSB-100

G1GKSB-317

Man3GKSB-101

G1F

GKSB-316

Man3F

GKSB-102G2GKSB-304

Man5GKSB-103

G2F

GKSB-305

Man6GKSB-104

G2FB

GKSB-306

Man7GKSB-105

G2F w/1 α-gal

GKSB-318

Man8GKSB-106

GKSB-311

Man9GKSB-107

GKSB-315

GalGalNAc

GKSB-201

GKSB-312

3'-SLN

GKSB-203

G2FS2 α(2,6)

GKSB-313

6'-SLN

GKSB-204

A3GKSB-307

G3GKSB-308

G3S3 α(2,6)

GKSB-314

グリカン標準G2S1 α(2,6)

G2FS1 α(2,6)

G2S2 α(2,6)

グリカン標準7

ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2019
Printed in Japan, June 07, 20195994-1004JAJP