ビームラインの現状と今後の予定

松垣直宏
⾼エネルギー加速器研究機構
タンパク質結晶構造解析ユーザーグループミーティング
2022年3⽉4⽇（⾦）@Zoom

Contents

ビームライン概要
ビームタイム利⽤状況
今年度の整備・開発トピックス
今後の予定

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PFタンパク質結晶構造解析ビームライン
Small beam

High-throughput

Beamline

BL-1A

BL-17A

BL-5A

AR-NW12A

AR-NE3A

Starting year

2010

2006

2004

2003

2009

0.96 - 1.052
2.7 – 3.3

0.9 - 2.2

0.75 - 1.9

0.75 - 1.9

0.75 - 1.9-

2.5 × 10-4

2.5 × 10-4

2.5 × 10-4

2.5 × 10-4

13 x 1340 x 16200 x 200

200 x 130

Φ100

4.0 x 1010(@ 1.052 Å)

1.5 x 1011(@ 0.98 Å)

1.5 × 1011(@ 1.0 Å)

1.3 × 1011(@ 1.0 Å)

2.5 × 1011(@ 1.0 Å)

Eiger X4M (x2)

Eiger X16M

Pilatus3 S6M

Pilatus3 S2MPilatus 2M-F

Detector distance (mm)60 – 450

65 - 750

90 - 950

75 - 950

60 - 500

Sample exchanger

PAM-HC(Uni-puck)

TargetNative-SAD

Wavelength available (Å)
Energy resolution (deltaE/E)
Typical beam size
(H x V, µm2)
Photon flux (photons/sec)
Detector

PAM(Uni-puck, SSRL)
Native-SAD
In-situHigh resolution Spectroscopy

Fullyautomated3体制スタッフ
松垣直宏（BL-1A, BL-5A）
⼭⽥悠介（BL-17A , AR-NE3A）
引⽥理英（AR-NW12A）
平⽊雅彦（Robotics）

ビームラインサポート
出村⼀貴
久保⽥孝幸
⽥辺嶺川崎健⼀
⿊屋浩太郎
菊池太希
眞⼭栄（試料輸送）

研究⽀援渡部正景（ロボット開発）
⽣⽥⼀之（ソフトウェア開発）

代⾏測定
千⽥美紀
引⽥理英
⼭⽥悠介
菅原隆広

博⼠研究員
篠⽥晃（SIROCC）

学⽣
菅原隆広（in-situ測定開発）

事務銭⾕智⼦⽥中牧⼦
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有効課題数の推移•

有効課題数は近年減少傾向

コロナ関連のU課題（２）5ビームタイム配分状況
運転キャンセル（Covid‐19）

3週間運転
AR運転停止

AR運転停止AR10日運転• 希望シフト数の減少や新たな利⽤形態（BINDS, Raid）による利⽤で、最近の配分率はほぼ100%• 留保ビームタイムの増加
6実験スタイルの変化

アカデミック利⽤

企業利⽤

110.8

0.8

0.60.6

来所0.40.4

代⾏測定

0.20.2

リモート実験

00201620172018

201920202021(05-12)• ⼀般ビームタイムにおいても公開した2020年より全⾃動測定、リモート実験が増加。
• 2021年度は全⾃動測定が減少し、リモート実験が増えた。

全⾃動測定
20162017

2018

2019

2020

2021(05-12)• 全⾃動測定が増え続けている。
• 2021年度は低分⼦結晶の測定が増えたために、来所実験が増加した。

7

留保ビームタイム
PFにおける留保ビームタイムの⾒直し→従来の申請書は廃⽌マニュアルページにあるフォームより申請してください（随時）配分決定は16⽇前ごろになります。
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Deposited PDB structures per year9Swiss Light Sourceの利⽤
期間︓
課題番号︓
ビームライン︓
測定︓••

2021年8－9⽉
20191094, 20191134
Ｘ06SA & X06DA (計23シフト）
全⾃動測定及びSBRCスタッフによるリモート測定

KEK – PSI 間のMOUに基づくビームタイム利⽤
SLSへのサンプル輸送はKEK-SBRCが取りまとめ
FY2021の実績
申し込み数

1428
1224

525585G, U型課題

27 課題

BINDS

5 課題

結晶個数1274

全⾃動 879
リモート 395154

全⾃動 16
リモート 138

本ビームタイムを利⽤して得られた成果を発表する際は、必ずPSIに対する謝辞及び課題番号の記載をお願いいたします。
来年度も実施予定ですので、積極的にご利⽤ください。

2021年3⽉以降の整備・開発トピックス• 全⾃動測定の⾼度化• In-situ測定（BL-17A）• 湿度気流下での室温測定環境（BL-5A）• タンパク質結晶加⼯機の⾼度化• Native SAD 位相決定（BL-1A）• 制御ソフトウェア、サンプルチェンジャー等の安定化
112021年3⽉以降の整備・開発トピックス• 全⾃動測定の⾼度化• In-situ測定（BL-17A）• 湿度気流下での室温測定環境（BL-5A）• タンパク質結晶加⼯機の⾼度化• Native SAD 位相決定（BL-1A）• 制御ソフトウェア、サンプルチェンジャー
等の安定化
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BL-17Aでのin-situ測定
2つのゴニオモード
クライオピンモード
回転ステージ:
360度フリー

ソフトウェアにて制御切り替え時間: ~5分

プレートモードでのUGUIS
プレートモード
回転ステージ:-15 ~ +15度

プレートタイプの選択
ウェルの選択利⽤例1: 結晶化スクリーニング後の結晶評価
⾦属タンパク質Aの結晶化
⾦属イオン再構成のためFeSO4ないしMnSO4がサンプルに含まれる
384条件で結晶化スクリーニング

38条件で結晶析出
低分⼦結晶
タンパク質結晶(うち4 Å以上の回折)
判別不能
合計

30 % (w/v) PEG 4000
0.1 M Sodium acetate pH
4.6 0.1 M Magnesium
chloride

10 % (w/v) PEG 8000
0.2 M Magnesium acetate

測定時間は約4時間 (6分/ウェル)
3結晶/ウェルをチェック
結晶位置の選択に要した時間が⼤半を占める

In-situ測定

低分⼦結晶

306(3)
238

タンパク質結晶利⽤例2: 構造解析のためのデータ収集
⾦属タンパク質Aヘリカル
データ収集

100 µmData range (deg.)-15 〜 +15Osc. width (deg.)

0.25

Exp. time (sec.)

0.05

Camera distance (mm) 288 (dmin = 2.0Å)
Number of data sets

14 (from 6wells)

On-line data processing with KAMO
100 µm11 data sets were mergedwith a reasonable statistics.
Max. resolution is 2.2 Å.

利⽤例2: 構造解析のためのデータ収集

KAMOMOLREPREFMAC/COOT
R/Rfree = 0.18/0.23

湿度気流下での室温測定（BL-5A）
Humid gasnozzle

Cryostreamscreen(temperaturecontrolled)

Sample

RH95%95%85%

85%

80%

75%

Flush cooling controlled from UGUI
cryostream

Humid air•

Cryostream temperaturechanged to 95K•

Cryo nozzle is approaching
to the sample (the streamis kept shut off)••

Humid-air valve CLOSE
Cryostream screen OPEN

at the same time

Flash cooling – data statistics
RH=85%

Data setISa:
26.7
Mosaicity: 0.09
Resolution: 2.6A

t(0h)

t(9h)

Cryo0.1

0.15
1/d^20.2

5040I/sigI• No (or less) cryoprotectant solution
needed.
• Allow freezing the crystal at the best
humidity condition.

302010000.050.250.3

タンパク質結晶加⼯機の整備
ユーザーインターフェースの変更

Solvent removalLine••

ビームラインの制御ソフトウェアであるUGUISを使⽤して結晶加⼯実験ができるようソフトウェアの改良を⾏った。
ビームラインと同じサンプルリストの使⽤が可能となり、試料の交換・結晶センタリング等を⼀つのソフトウェアで操作ができるようになった。

新機能Translationの追加•結晶をレーザーの光軸⽅向に動かしながら加⼯を⾏うことが可能になった。
→ 巨⼤な結晶や、⼀⽅向からのレーザー照射では加⼯が困難な結晶において有効2mm 近 く あ る 結 晶 の加⼯前後の写真(左) 加⼯前(右) 加⼯後Native SAD phasing at BL-1A• ⻑波⻑X線を利⽤したNative SAD・MR‐native SADによる⾼精度位相決定• 試料中の軽原⼦の⾃動同定試料結晶のレーザー加⼯との連携

試料を最適に加⼯す
ることによるデータ精度の向上••••

⾼輝度⻑波⻑ビーム：2.7 - 3.5 Å
常時ヘリウム環境による低バックグラウンド
極低温（〜30K）測定
ミニカッパーゴニオ・検出器のV字配置による多⽅位・⾼分解能全⾃動測定

結晶加⼯装置21

ビーム照射位置の登録⽀援機能22登録したすべての位置での⼀括データ収集

良いデータをマージする(今は⼿動)
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Challenging Native SAD phasing
Wavelength:
Osc width:
Exposure time:
Osc range:
Beam size:
Photon flux:
Detector config.

2.7 Å
0.1 deg
0.01 sec
360 deg
13 um(20％ transmit. )3 x1010 photons/s
Normal (max. resolution ~3 Å)

Dose: ~ 2MGy / data set••~100kDa enzyme
921 residues (20 Met, no Cys)
Bijvoet ratio: 1.68%@2.7 Å

39 data sets at 10 positions, Kappa=0, 90deg
Additional 17 data sets with 100% transmit, at 9 positions, Kappa=0, 60deg
Data redundancy ~340
AutoSharp
3623 residues built in 16 chains - with 3570 sequenced

Following AutoBuster
R/Rfree: 25.7/30.8%

4 molecules (~400kDa) in ASU

今後の予定• RFIDタグによる試料の識別• in-situ測定の⾃動化• レーザー加⼯機の⾼度化

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RFIDタグを⽤いた試料の識別
RFID• 安定（霜などの影響を受けない）• ⾼速（液体窒素下での読み取り）

RFIDtag
Uni-puckの逆側を使うロボットの場合でもRFIDタグを取り付けて読み取ることは可能。
将来的には、PAM-HCにも搭載。

Uni-puckとアダプタの改造
RFID tag

RFID Reader（Coil）

Uni-puckアダプタの対応する位置にリーダーを設置
26

RFIDタグの液体窒素中での読み取りテスト

27

試料交換ロボットへの組み込み

ケーブル
ケーブル

セレクタ回路ボックスを完全にLN2中に沈める

セレクタ•

セレクタ回路ボックスを液体窒素デュワー内に設置

カセット検出率ゼロに。。。
（アダプタは読める）
28

in-situ測定の⾃動化
1. BL併設インキュベータ開発•••

ドロップの経時観察 (PXSPReMoへ取り込み)
結晶位置の事前登録(リモートアクセス化)
2022年度中に公開予定

2. プレート交換ロボット開発•••

回折計上のプレート交換を⾃動化
最⼤10枚のプレートを搭載(ランダムアクセス可)2022年度中に公開予定

3. 測定ソフトウェア開発•

事前登録位置に従った⾃動測定タンパク質結晶加⼯機の⾼度化• PReMoへの情報登録、及び加⼯結果の閲覧• 結晶の⽅位を変更するためのミニカッパーゴニオの設置• レーザー加⼯⾏う際、回折スキャンの情報を直観的に使⽤できるユーザーインターフェースの開発