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O

2・メチルプロペンアミドのチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

厚生省生活衛生局委託

財団法人食品薬品按驚ヨヒ乍窃型
秦 野 研 発i
手i
所

[目次]
頁
要約

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 1

緒言…一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一‑ 2
一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 2

材料と方法

1 細胞

一一一一一一一一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一‑‑ 2

2 被験物質および陽性対照物質

3 S9反応液一一一一一一ー一一一一一一一一一一一一一一 3

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 34 細胞増殖抑制試験

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 35 染色体異常試験

一一一一…一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一一一 46 染色体分析

結果および考察一一一一一一一一一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一 5

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 6

特記事項‑‑‑‑一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 6

参考文献…ー一一…一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一…一一一 6

F
ig.
l

Tabl
e1、2

[要約]

2・メチルプロペンアミド (MPA) は、 CHL
月U細胞(チャイニーズ・ハムスター、肺)に染色体異常を誘発しなかった。
四 Aは CHL/lU細胞を連続処理(新鮮培地中で 24時間処理)した場合、 CHL/lU細胞の 増 殖 を 抑 制 し な か っ た 。 ま た 、 短 時 間 処 理 の S9mix存 在 下 (S
9反応液中で 6時間8時間の回復時間)および S9mix非存在下 (S
9反応液の代わりに11EM 培地を使処理後 1用)についても増殖抑制は認められなかった。
このことから染色体異常試験では、連続処理 (24時間および 48時間処理)、

短時間処mL (10mM) を最高処理濃度
理の S9mix存 在 下 お よ び 非 存 在 下 に お い て 、 0.90mglとし、公比 2で以下計 3濃度を設定し、染色体分析を実施した。
染色体分析の結果、 MPAはいず、れの処理条件下においても、染色体の構造異常および倍数性細胞を誘発しなかった。

[緒言]

化学物質の遺伝毒性を評価するための短期検索法のーっとして、日南乳動物培養細胞を用いる染色体異常試験がある。化学物質によって誘発される染色体異常には、大別して構造異常(ギャップ、切断、交換)と数的異常(倍数性細胞、異数性細胞)があり、前者はDNA傷害、後者は細胞の分裂機構の異常などを反映している。本試験で用いた CHLIIU細胞は、染色体数が少なく、一般的に化学物質に対して染色体異常の検出感度が高いため、染色体異常試験によく用いられる。
変異原物質の細胞内の標的 (DNAまたは紡錘糸など)に対する作用は、直接作用する場合と、代謝活性化されて変異原活性が現れる場合に大別される。しかしながら、試験管内の変異原性試験に用いる微生物や培養細胞では、代謝活性化能が無いかあるいはあっても活性が低いことから、一般的にはラットの肝臓から調製した肝ホモジネート 9000>
くg上清(S9) を化学物質の代謝活性化を検出するために用いる。染色体異常試験においては、直接作用を検出するための処理系列として、連続処理および S9mix非存在下での短時間処ix存在下での短時間理があり、加えて代謝活性化作用をみるための処理系列として S9m処理がある。
OB∞既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として、 MPAの細胞遺伝学的影響を評価するため、 CHL
月U 細胞を用いる染色体異常試験を実施した。なお本試験は、1日、環保業第 237号、薬発「新規化学物質に係る試験の方法について J (昭和 62年 3月 3第 306号
、 62基局第 303号)および rOECD毒性試験ガイドライン:473J に準拠し、「化

1日、環保業第 39号、薬発第 229号
、 59基局第 85号、学物質 GLP基準J (昭和 59年 3月 3改訂昭和 63年 11月 18目、環企研第 233号、衛生第 38号、 63基局第 823号)に基づいて実施した。

[材料と方法]1 細胞CHL/I
U細胞 (JCRB細胞バンクより入手)は、牛血清 (CanseraInternational、ロット番号:2608311) を 10%含むイーグル I¥1EM 培地(日水製薬)を用い、 CU2インキュベーター
‑2‑)

∞、 37C) 内で培養した。また、解凍後継代 10代以内で試験に用いた(親株の継(5%20988年 2月に入手した時点で 4代、現在は 21代)。
代数は、 12 被験物質および陽性対照物質被験物質である MPA (CASNo.79‑39‑0) の物理化学的性状等は A
ppendix1に示した。

MPAはから提供された後、室温遮光保管し、使用のつど局方注射用水(大塚製薬工業、ロット番号:K7G78) に溶解して希釈した。
、 SigmaC
hemical、ロット番号:
陽性対照物質として用いたシクロホスフアミド (CPA73H0846) およびマイトマイシン C (MC、協和醗酵工業、ロット番号:147AFK) は用時調製とし、局方注射用水(大塚製薬工場、ロット番号:K7G78) に溶解して用いた。

3 S9反応液S9 (キッコーマン、ロット番号 :Rんι367、 1997年 8月 製 造 お よ び ロ ッ ト 番 号 :RAA‑376、 1998年 1月製造)は、 8および 7週齢の雄 S
pragu
e‑Dawley系ラットのフェノバ
ルピタールと 5.6・ベンゾフラボンを投与した肝臓から調製したものを購入し、使用時まで‑800Cに保管した。グルコース 6・リン酸 (O‑6‑P、SigmaChemical) 、βニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸(酸化型、 s‑NADP+、オリエンタル酵母)および KClを蒸留
0

水に溶かし、混合液として ‑80Cに保管し、使用時はこれに S9、MgC12 および HEPESを加え、 S9mixとした。 S9mix存在下で短時間処理する場合、 S9mix、 2倍濃度 h但 M 培地
(血清不合で、 S9mixと被験物質調製液の添加量の合計と等量)および MEM培地(血清.
83m M0・6‑P、0.
67m Ms‑NADP+，0.
83不含)を混和して S9反応液とした (5%S9、 0.
5mMKCl、0.
67m M田 PES) 。一方、 S9mix非存在下で短時間処理する場
mMMgC12、5合は、 S9反応液の代わりに MEM培地に 2倍 濃 度 悶M 培地(被験物質調製液の添加量と等量)を混合したものを使用した。

4 細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため、被験物質の細胞増殖にお3

月U 細胞を 0.25%トリプシンを用いてはがした後、 4X10個よぽす影響を調べた。 CHL40個)をプラスチックディッシュ(直径 6cm、コー加 Lの細胞懸濁液とし、その 5mL (2X1‑3帽ニング)に播種して 3日間培養した。

.
5mLと培地交換した後、被験物質調製液を 0.
5mLずつ添連続処理では、新鮮培地 4加し 24時間処理した。

S9mix存在下における短時間処理では、 S9反応、液 2.7mLと培地交換した後、被験物質223mLずつ添加し 6時間処理した。リン酸緩衝塩類溶液 (Ca+および Mg+を含調製液を 0.

む)で洗浄後、新鮮培地 5札 に 交 換 し 、 さ ら に 18時間培養した。一方、 S9mix非存在下の処理群においては、 S9反応液の代わりに MEM培地を用いた以外の操作は、 S9mix存在下の処理群と同様に行った。

.
028‑‑0.
90mg/mL (10mM) の濃度範囲で処理した。培養全ての処理系列において、 0.
1%クリスタルバイオレット液で染色した。単終了後、 10%ホルマリン溶液で固定し、 0層培養細胞密度計 (Monocellater™、オリンパス光学工業)を用い、溶媒対照群と比較した各処理群の相対増殖率を計測した。 1濃度あたり 2枚のディッシュを用いた。

5 染色体異常試験
問

A は細胞増殖抑制試験の連続および短時間処理において、 CHL/IU細 胞 の 増 殖 を 抑Pig.1)。
制しなかった (.
90mg!
mL (10mM) を最このことから染色体異常試験において、すべての処理系列で 0高処理濃度とし、公比 2で計 3濃 度 を 設 定 し た (0.
23、 0.45 お よ び 0.90mg/mL)。

8時間処理群の濃度についても同じ濃度に設定した。また、染色体異なお、連続処理の 4常試験においては 1濃度あたり 4枚のディッシュを用い、そのうちの 2枚は染色体標本を作製し、別の 2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した。試験操作は、細胞増殖抑制試験とほぼ同様に行った。連続処理では 24時間と 48時間の被験物質処ix存在下と非存在下で 6時間処理した。な理群を設け、短時間処理では、被験物質を S9m
お、処理群の他、溶媒対照群、陽性対照群および無処理対照群を設けた。
陽性対照群については、 MCを新鮮培地 5mLに最終濃度が 0.
05μg/mLとなるように添

fiM培地 3mLに最終濃度が 5μg加 L となるよう加した。また、 CPAを S9反応、液および恥fに添加した。
染色体標本作製用のディッシュについては、培養終了の 2時間前に、コルセミドを最終濃度が 0.
1μg/mLとなるように添加した。培養終了後、培地を除き、 0.02%EDTA含 有‑4‑ー22リ ン 酸 緩 衝 塩 類 溶 液 (Ca+および Mg+ を含まない)により細胞をはがし、 10mLの遠1000‑.
.1200rpm、5分)。上清を捨てた後、沈殿した細胞に 0.
075
沈管に集め遠沈した (MKCl水溶液 3mLを加え、 30分間低張処理を行った。低張処理後、固定液(メタノール:氷 酢 酸 =3:1v/v) を 6mL加え遠沈した後、上清を除き、再び新鮮な固定液を加えて遠沈した。固定液の交換を数回行った後、少量の回定液で、細胞を懸濁し、その少量をスライドグラス(あらかじめフロスト部分に試験系識別番号、コード番号およびスライド番号を枚のスライド標本を作製し記入)上に滴下し、そのまま風乾した。 1ディッシュあたり 6た。

3%ギムザ液 (pH6.
8の 1/15M リン酸緩衝液で希釈調製)でスライド標本を染色後、水ですすいで風乾した。試験計画番号、試験系識別番号および標本作製の日付を明示したスライドケースに、スライド標本をコード番号順に入れて保存した。

6 染色体分析Table1、2) から、 24時間連続処理および短時間処理の S9mix
細胞増殖率の測定結果 (存在下および非存在下においては、細胞増殖抑制試験の結果と同様に、細胞増殖抑制は認められなかった。一方、 48時間連続処理においては、 0.
90mg/mL (10mM) の濃度で細胞毒性の兆候はみられたものの、 50%を越える増殖抑制は認められなかった(細胞増殖率:74.0%、Table1) 。染色体分析は設定した 3濃度群について実施した。染色体分析は、日甫乳動物試験研究会 (MMS) 1) による分類法に基づいて行った。よく本環境変異原学会 .n
広がり、かつ染色体が散逸していない分裂中期像を観察した。各群ごとに、観察細胞数、染色体型および染色分体型の構造異常の種類と数、倍数~I生細胞の数を記S淵紙に記入した。

ディッシュ 1枚から得られたスライド標本 4枚を、 4人の観察者がそれぞれ処理条件が分か群 200個、倍数性細胞は 1群800個の分らないようにコード化して分析した。構造異常は 1裂中期細胞を分析した。
溶媒対照と被験物質処理群問および陽性対照群問で、フイツシャーの直接確率法却により、有意水準を 1%として有意差検定を実施した。また、コクラン・アーミテッジの傾向性検定3) (pく 0.
01) により、用量依存性の有無を検討した。これらの検定結果を参考とし、生物学的な観点からの判断を加味して染色体異常誘発性の評価を行った。

‑
5‑

[結果およ び考察]F

連続処理および短時間処理において、 MPAは 染 色 体 の 構 造 異 常 を 誘 発 し な か っ た(Tableム 2) 。 倍 数 性 細 胞 に つ い て は 、 短 時 間 処 理 の S9mix存 在 下 に お け る 中 濃 度(0.45mg/mL) においてのみ有意な増加 (p<O.Ol) が認められたものの (Table2) 、出Table1，
現頻度は 1.00%と低く、濃度依存性もないことから生物学的には陰性と判定した (2) 。なお、本物質または関連物質の変異原性に関する文献情報は得られなかったが、本試験と並行して実施された細菌を用いる復帰突然変異試験においても変異原活性は認められていない(食薬セ研第 9・1869号)。
rv
1
Cは、連続処理において染色体の構造異常を誘発し一方、陽性対照物質として用いた :(Table1) 、 CPAは短時間処理の S9mix存在下において染色体の構造異常を誘発した(Table2) 。これらの陽性対照物質の結果より、本実験系の成立が確認された。

[特記事項}

本試験の実施にあたり、試験の信頼性に悪影響を及ぼす疑いのある予期し得なかった事態、および試験計画書からの逸脱は無かった。

[参考文献]

r1) 日本環境変異原学会・附乳動物試験分科会編: 化学物質による染色体異常アトラス J，朝倉書庖，東京(1988)

2) 吉村

r

功編: 毒性・薬効データの統計解析、事例研究によるアプローチ J，サイエン87)
テイスト社，東京(193) 吉村

r功，大橋靖夫編集: 毒性試験講座 14、毒性試験データの統計解析J，地人書館，

東京 (1992)

‑
6‑

100

・・・・・・・・・・・・・・・・・』
ーa・ーーー4

一 ー ー 圃 圃 圃 園 周 回 同(ち﹂ HCOυ=ωυO渓)苦言︒﹂︒

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圃 圃 骨 圃 圃•

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tS9mix
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6Concentration(mg/mL)

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1 Grow
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ion01CHL/IUcellstreatedw
ith2‑methylpropenamidenalysisofαlInesehamstercells(CHL/IU)continuouslytreatedw
ith2・methylprope
namide(MPA)**withou
tS9mix
Table1 Chromosomea
Others)nunUAunununu

0000146

コ戸

2319

nunUAUAU

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0010&・也0・ゐ00a︒

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司'eedcnunununununv

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2∞
2∞
2∞
2∞
2∞
222222OGoo‑50000000000

A﹃ 泊 斗A斗A斗A斗

Solvent1)0MPA
0.
2
3加1P
A0.
45MPA
0.
90MC0.
0000
54444422222

Non‑treatment1Solvent)0MPA0.
2345MPA0.
MPA0.
90MC0.
00005晶papukuNo.ofstructuralaberrationsConcen‑ Timeof NO.ofxposurec
Group tlOn eratellshr) a(mg/mL) (tenalysedg
apctbcNo.ofcells6)
PolyploidJ)1:rend附 5)Concurrentwithaberrationsytotoxicity(%)(%)
SA NA cTAG(%)TA(%)

o(0.0) o(0.0)

0.
00o(0.0) o(0.0) 0.00
o(0.0) o(0.0) 0.13o(0.0) o(0.0) 0.
38
1(0.5) o(0.0) 0.
00(47.
0) 0.
00
97*(48.
5) 94*
1 ( 0.5) 1 ( 0.5)
1 ( 0.5) 1 ( 0.5)
1 ( 0.5) 1 ( 0.5)2(1.
0) 1 ( 0.5)14
2*(71.0)140*(70.
0)

0.
1
30.
000.
00.
000.
38。

ap:chromatidgapandchromosomeg
ap，ctb:chromatidbreak，cte:chromatidexchange，csb:chromosomeb
reak，Abbrev
iations，gcse:
chromosomee
xchange(dicentric組 dring)，mul:multipleaberrations，TAG:
totalno.ofcellsw
ithaberrations，TA:
totalno.ofcellswit
haber
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sexceptg
ap，
SA:
structuralaberration，NA:
numer
icalaberration，MC:m
i
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i
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aterwasusedぉ solvent.2)Morethannineaber
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ations.4)Eighthundredc
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9.
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00.
0
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5
87.
587.
0
100.
0
93.
587.
5
74.
0

nalysisofαlineseh
amstercells(CHL/lU)treatedwi出 2・methylpropenamide (I¥在PA)**w
it
handw
ithou
tS9mix
Table2 Chromosomea

免U&‑L‑‑EOthers)

No.ofcells
withaberrations
TAG(%)
TA(%)
Jtk︐
f k・r‑J・'1JEK・/1nu1A 今''MAunu M0.
0)
0.
0)
1.0 )

︐
ゥハUAunununu/E︑︐︐ E1r1rs r・1 ・r1・︑・1AtA 今'MnunU うん

nunununununu

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nunununu‑‑

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o(0.0) o(0.0)
o(0.0) o(0.0)

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5)
0.
5)
1.0 )4)ω
6Polypμloid)T，rend総t
ωe
側S坑制t幻5) C∞
on
Clα
ω
町u
1
汀rrent刊
け(%)
SA NA cytot
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司∞
O.
∞
O.
∞
0.
250.
0) O.
∞1.0 )

nunununununu

nunununununu

0 0 0 1判・・・1 1 2 0 0 2 0001mAot‑‑h‑‑‑‑au︑︐︐︐司︐pumccdQU

CnunU2inunu'i

nunununuoo︑司nu‑‑tAnunuti

・nUAUnunU・tinununununu

Solvent1)0MPA
0.
23MPA
0.
45
MPA
0.
90
CPA
0.
00
5

∞
6・(18)∞
6・(18)∞
6・(18) 2∞
6 (18) 2∞
18) 26 (∞6・(18) 2∞
6‑(18) 2∞
6・(18) 2∞6圃(18) 2∞
6・(18) 2∞222+++++Non‑treatment
1Solvent)0MPA0.
2345MPA0.
MPA0.
90CPA0.
005hUNo.ofstructuralaberrations
Concen‑ S9 Timeof No.ofaxposurecells
Group rtIon mlX e(h) analyse
dgap ctbc(mg/mL)
te0.
0)
0.
5)
1.0 )
0.
0)

1 ( 0.5) 1 ( 0.
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0 ) 41*(20.
5)

O.

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0
96.
5
96.
590.
50.
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O.

0.
131.∞*∞O.
∞O.

Abbrev
iations，gap:chromatidgapandchromosomegap，ctb:chromatidb
reak，cte:chromatidexchange，cs
b:chromosomeb
reak，
cse:
chromosomeexchange(dicentri
candring)，mul:multipleaberrations，TAG:totalno.
ofcellswi出 aberrations，TA :totalno.
SA:structuralaberration，NA:numer
icalaberration，CPA:cyclophosphamide.
ofcellsw
ithaberr
ationsexceptgap，t..
2)Morethann
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r
ation
si
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lwerescoredぉ 10.3)Others，sucha
sattenuationand1)Dist
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ellswereanalysedineachp民 mgroup.5)Cochran.Arm
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tp<O.01.6)Cel
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Monocellater™. *:Sign
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