BioResource Now ! Vol.8 No.6

BioResource Now !
Issue Number 8June 2012

国内外のバイオリソースを巡る様々な問題や取り組みについて、毎月ホットな話題をこのニュースレターで紹介していきます。

金子 武人 ( 京都大学大学院医学研究科附属動物実験施設 )

ホット情報
No.40
じょうほう通信No.70
お薦め Book！
No.6

10 年ひと仕事−フリーズドライ精子保存法開発への道− P1 - 2 NewsLetter に掲載されているあらゆる内容の無断転
BLAST+ のインストール

P2「粘菌 −その驚くべき知性」

P2

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ホット情報〈NO.40〉

10 年ひと仕事−フリーズドライ精子保存法開発への道−
2001 年 8 月、私はハワイ・ホノルル
空港に降り立った。これが、フリーズドライ精子保存法開発の始まりである。柳町隆造博士率いるハワイ大学の研究グループは、1998 年にフリーズドライ精子からマウスを誕生させることに成功した。柳町グループの NIH プロジェクトに参画し、マウスフリーズドライ精子保存法をより効率の良いものにすることが私に与えられた課題であった。2 年間という短い期間の中で、絶対的な観光地である「ハワイ」の誘惑と闘いながら、フリーズドライに対する精子の耐性や作出効率向上に関する研究を行った。その甲斐もあって、
保 存 液 へ の 金 属 キ レ ー ト 剤 の 添 加、pH、保存温度、そして精子の成熟度がフリーズドライ後の精子の受精能に大きく影響することを明らかにすることができた。

液体窒素による凍結保存法が主流の中、なぜ「フリーズドライ」にこだわ る の か？そ れ は、こ の 技 術 が 携わっていたバイオリソース事業に大きなメリットがあると感じたからである。フリーズドライ精子保存法は、○ 特殊な凍結保護剤・保存液が不要（トリス -EDTA 保存液で保存可能）○ 液体窒素タンクや定期的な液体窒素の購入・補充が不要（冷蔵庫で保存可能）○ 設備・維持費の大幅なコストダウンが可能○ 保有サンプルの管理、バックアップが容易○ ドライシッパー・ドライアイス不要の常温国際輸送が可能（常温で3 ヶ月保存可能）である。このため私は、帰国後もバイオリソース事業を行いながら、フリーズドライ精子保存法の効率向上を目的とした研究を継続した。バイオリソース事業において、貴重な遺伝資源を安全に次世代に受け継ぐことは最重要課題である。そこで、マウスやラットでは、生体維持による感染症や遺伝的汚染のリスクを軽減するために、凍結精子・受精卵による系統保存が行われてきた。しかしながら、保存系統数の増加に伴う設備の増設、液体窒素使用量の増加、定期的な設備メンテナンス等によるランニングコストは決して安価とは言えない。

ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」
京都大学大学院医学研究科
附属動物実験施設 特定講師

金子 武人

今後も起こりうるであろう大災害においても、安全に遺伝資源を守ることのできる液体窒素不要の新しい遺伝資源長期保存法の実用化が、急務の課題であるとあらためて強く認識した瞬間であった。
そのような状況の中、フリーズドライ精子の長期保存が成功した。ラットで 5 年間、マウスで 3 年間、冷蔵庫（4℃）で保存したフリーズドライ精子から正常な繁殖能力を持つ子供が産まれたのである ( 写真 1)。どちらの精子もフリーズドライ直後の精子を用いた時と変わらない産子作出率が得られたことから、保存中の劣化や受精能の低下は認められなかった。この結果により、フリーズドライ精子保存法は実用化に大きく前進した。フリーズドライ精子長期保存法の実用化によって、これまでの液体窒素による凍結保存法よりも「安 全・簡 易・低 コ ス ト」の 遺 伝 資源保存・輸送が可能となるのである。
また、精子のみで遺伝子を次世代に伝えることができるトランスジェニック・コンジェニック系統の保存や、保存系統の簡易・安価なバックアップとしてフリーズドライ精子保存法は有効なツールになる。

また近年、安全面でも今後のバイオリソース事業において大きく考えさせられる事件が起きた。2011 年 3 月、東日本を襲った大震災である。この事件により、これまでフリーズドライ精子保存法の開発は、研究レベルであり実用化については将来的なものとしか考えていなかった私の思いは大きく変わった。震災では、長期停電により冷蔵庫・冷凍庫で保存されていた多くの研究用サンプルが失われた。液体窒素タンクは、供給システムが停止してもタンクが破損しない限り液体窒素の液面は維持されるため、震災直後の遺伝資源は守られた。しかしながら、1
日 5 〜 10 リットル気化する液体窒素は、生産工場被災による製造停止、道路の寸断による交通機能
1：フリーズドライ精子のアンプルと冷蔵庫（4℃）のマヒにより供給が途絶えたこと 写真
で 5 年間保存した精子から得られたラット（左）および3 年間保存した精子から得られたマウス（右）で危機的な状況に陥った。
次ページへ続く

BioResource Now ! Vol.8 No.6

今回の成果が得られるまでの道のりは 10 年を要した。まさに「10 年ひと仕事」である。フリーズドライ精子保存法は、野生動物の保護や優良家畜の保存においても応用できる可能性が高いことから、他の動物種での長期保存の成功を期待し、今後は精 子 の 常 温 長 期 保 存、受 精 卵 の フリーズドライ保存法の開発という新たな道を歩んでいきたい。■

現在までに受精卵のフリーズドライに成功した報告はない。近交系は受精卵で保存しなければならないので、全てのラット・マウス系統をフリーズドライで保存することはできないが、「精子＝フリーズドライ、受精卵＝液体窒素保存」とするだけでもコスト・安全面での貢献度は大きい。

BLAST+ のインストール
実行時間 (sec.)

2009 年、NCBI は従来の BLAST(Legacy BLAST)の改良版である BLAST+ をリリースしました。
長大なクエリ配列の分割や、Trace-back での部分検索の導入などが主な改善点とされ、これまで処理に時間のかかっていた大規模な検索も、短時間で実行できるようになりました。

先生のご発表論文

・PLoS One 7(4): e35043, 2012
・Cryobiology 64: 211-214 (2012)
関連記事のサイト

・http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/repro
duction/sperm̲freeze-drying̲jp.aspx

・http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/repro
duction/home̲jp.aspx

・http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news̲data/h/
h1/news6/2012/120410̲1.htm

じょうほう通信 [ 第 70 回 ] 10 分
BLAST+Legacy BLAST

クエリ配列長 kbases
図 1 は BLAST+ と Legacy BLAST とで、検索実行時間にどれほどの違いが生まれるのかを示し 図 1：BLAST+ と Legacy BLASTた図です。大腸菌の全ゲノム配列 (4.6Mbases) における tblastx 実行時間を デ ー タ ベ ー ス と し、そ の 任 意 の 箇 所 か ら 取 得 し た 5kbases、50kbases、500kbases の配列をクエリとして tblastx( フィルタオフ )を実行し、その処理時間を計測しました。※実行環境は、表 1 の通りです。

その結果、クエリ配列が長くなるほど BLAST+ と Legacy BLAST の実行時間の差が大きくなることがわかります。BLAST+ は Legacy BLAST
同様、ローカル環境にインストールして利用することが可能です。今回は、Linux での BLAST+ のインストールから、処理の実行までを紹介します。
表 1：マシンのスペック
CentOS 6.2 (32bit)OS
AMD Athlon(tm) 64 X2 Dual Core Processor 3800+(2.0GHz)
CPU
メモリ 2.0Gbyte
1Tbyte, SATA 3.0, 7200rpm
HDD$ blastn -version
blastn: 2.2.26+
Package: blast 2.2.26, build Feb 9 2012 16:01:19

データベースのフォーマット
① NCBI の BLAST ダウンロードページから、データベースのダウンロードページを開きます。(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/)② FASTA ディレクトリへアクセスし、目的のファイルを任意のディレクトリへダウンロードします。
③ 端末からコマンドを入力し ( 表 2-b 又は 2-c) 実行してください。
注）出力するデータベース名とハッシュインデックスの作成は必須ではありません。

④ 実行後、作成したデータベースの情報が端末に表示されれば、データベースのフォーマットは成功です。
BLAST の実行
① FASTA 形式のクエリを用意します。
② 端末からコマンドを入力し ( 表 2- d 又は 2-e) 処理を実行します。
③ 現在のディレクトリに結果のファイルが出力されていれば処理は成功です。
表 2 ：コマンド一覧
項番

目的a

PATH を通す

BLAST+ のインストール手順b

塩基配列 DB のフォーマット

① NCBI の BLAST のダウンロードページから、BLAST+ 最新版のダウンロードページ (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/)を開きます。
② 2012 年 6 月現在の最新版である ncbi-blast-2.2.26+-x64-linux.tar.gzを任意のディレクトリへダウンロードします。

cd

アミノ酸配列 DB のフォーマット
blastneblastp注）マシンの性能により時間のかかる場合があります。

③ gz ファイルをダブルクリックで解凍します。
④ 端末からコマンドを入力し（表 2-a）、BLAST の実行ファイルの格納されている bin までの PATH を通します。
⑤ 最後に、” blastn -version” と入力して実行してください。BLAST+のバージョンが表示されれば、イントールは成功です。（図 2）

お薦め Book！〈NO.6〉「粘菌 −その驚くべき知性」

中垣俊之著（PHP サイエンス・ワールド新書、2010 年）
著者はイグ・ノーベル賞を２度も受賞したことで有名な人。ちなみに、イグ・ノーベル賞は「人々を笑わせ、そして考えさせてくれる」研究に対して与えられるという。
本書では単細胞の真正粘菌が示す「優れた能力」が紹介されているが、その１つが 2008 年のイグノーベル賞を受賞した「粘菌の迷路解き」である。迷路の中に粘菌を入れ、迷路の入り口と出口に餌を置くと、粘菌は２つの餌を同時に食べようとして、入り口と出口をつなぐ最短の経路に沿って身体を伸ばす。つまり粘菌としては、餌は食べたいし身体は２つに分断したくないので、最短の管（原形質）でつないで身を１つに保つということらしい。
もう１つは、2010 年のイグノーベル賞に輝いた「関東圏の鉄道網を再現した粘菌」の話だ。寒天プレート上に描いた関東地方の地図の主要な都市に餌を置き、粘菌を東京の位置から出発させると、原形質流動によって広がり、餌に集まる。多数の餌を同時に食べようとするので、結果的に粘菌はネットワーク状の管を形成し、その形が現実の JR 路線図とよく一致したという。このとき、粘菌は管の総延長を短くすると同時に、管の一部が断線しても身体は２分されないように（連結保証性）、二重の最適化を行ったのだという。ここまでくると、たしかに粘菌は「驚くべき知性」をもっていると言えそうだ。(K.N.)

図 2：バージョン情報例

コマンド
export PATH=$PATH: 指定ディレクトリ
までの絶対パス
makeblastdb -in FASTAファイル -dbtype
nucl -out データベース -hash̲index
makeblastdb -in FASTAファイル -dbtype
prot -out データベース -hash̲index
blastn -db データベース -query クエリファイル-out 出力ファイル
blastp -db データベース -query クエリファイル-out 出力ファイル

大規模な検索であるほど性能を発揮する BLAST+ を、ぜひ使ってみてはいかがでしょうか。
（生物遺伝資源センター データベース事業部 松野 恭兵 ）Contact Address
連絡先 〒411-8540 静岡県三島市谷田 1111
国立遺伝学研究所 生物遺伝資源センターTEL 055-981-6885 ( 山崎 ) E-mail：brnews@shigen.info
Editor's Note
リソース保存技術の革新は、リソースセンターの運営に大きく貢献することはもちろんのこと、今後世界中の研究室に浸透することを考えるとその影響力は計り知れないですね。それにしても、新技術の発見から実用化まで 10 年間の金子先生の弛まないご努力に頭が下がります（Y.Y.)。

バイオリソース情報(NBRP) www.nbrp.jp/(SHIGEN) www.shigen.nig.ac.jp/indexja.htm(WGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/(JGR) www.shigen.nig.ac.jp/wgr/jgr/jgrUrlList.jsp

BioResource Now !
Issue Number 8 June 2012