課題番号：２４指００１
研究課題名：生体膜脂質生合成メカニズム解明と脂質バイオマーカーの探索
主任研究者名 ：清水孝雄
分担研究者名 ：キーワード ：生体膜リン脂質、リゾリン脂質アシル転移酵素、生理活性脂質、脂質バイオマーカー、生体膜認識
研究成果：
生体膜リン脂質生合成メカニズムを代表的なホスファチジルコリン（PC）生合成酵素を中心に調べた。
現在知られている酵素リゾホスファチジルコリンアシル転移酵素（LPCAT）1,2,3 と４、さらに前駆体リン脂質であるホスファチジン酸（PA）生合成酵素リゾホスファチジン酸アシル転移酵素（LPAAT）1,2,と 3 の寄与を解析した。その結果、脂肪酸組成によってリン脂質に組み込まれる（アシル化）ステップが異なる事がわかった。なかでも呼吸に必須な肺サーファクタント脂質であるジパルミトイルPC(DPPC)の生合成には LPCAT1 の寄与が大きい事も証明できた。次に、LPCAT1-KO マウスを作成したところ、肺サーファクタント脂質の質の低下（DPPC の低下）を観察した。また、急性肺障害に高い感受性を持っており、正常な生体内リン脂質脂肪酸組成の重要性を示唆した。
（Harayama et al. Cell Metab.
2014）
強力な生理活性リン脂質である血小板活性化因子（platelet-activating factor, PAF）の生合成酵素
LPCAT2 の活性調節メカニズムの一端を解明した。これまで、LPCAT2 はマクロファージにおいて GPCR刺激後秒単位で、細菌内毒素刺激分単位や時間単位で活性が上昇する事がわかっていた。後者の調節は Ser34 のリン酸化と発現誘導であった。今回、前者の秒単位の活性化も Ser34 のリン酸化であることがわかった。しかし、キナーゼは異なり PKCa と予測できた。（Morimoto et al. J. Biol. Chem. 2014）
また、LPCAT2 の阻害剤スクリーニングも１７万化合物から行った。TSI-01 という化合物が LPCAT2 に対して特異性を見せた。（Tarui et al.J. Lipid Res. 2014）
脳の脂肪酸にはドコサヘキサエン酸（DHA）が多い。今回、DHA をリン脂質に組み込むアシル転移酵素を想定し、LPAAT4 と名付けた。脳における DHA の役割の解明や疾患治療への発展を期待できる。（Etoet al. BBRC 2014）肺サーファクタント脂質輸送に関わる可能性の高いタンパク質 Sec14-like3 を同定した。脂質膜のパッキングの隙間（lipid packing defect）に結合する事を示した。今後、どのような脂質を運べるのか、どう制御されているか、などの解析が重要になる。（Hishikawa et al. FASEB J. 2013）
上記の一部の内容も含めたレビューも報告している。(Hishikawa et al. J. Lipid Res. 2014)

Subject No.

：２４指００１Title：Analysis of cellular membrane phospholipid biosynthesis and screening of lipid

biomarkers
Researchers ：Takao Shimizu
Key word：Cellular membrane phospholipid, Eicosanoid, Lipid biomarkerAbstract：

Phosphatidylcholine (PC) is biosynthesized from lyso-PC (LPC) by LPC acyltransferase (LPCAT).
Until now, four kinds of LPCAT were identified; LPCAT1, LPCAT2, LPCAT3, and LPCAT4. Phosphatidicacid (PA) is a precursor phospholipid of PC, and three PA biosynthetic enzymes from lyso-PA(LPA) were also identified; LPAAT1, LPAAT2, and LPAAT3. We reported here that biosynthesis ofmost PC species were regulated by LPCATs or LPAATs. Especially, dipalmitoyl-PC (DPPC) was mainly
biosynthesized by LPCAT1. We also showed that LPCAT1-KO mice had the high sensitivity for acutelung injury.（Harayama et al. Cell Metab. 2014）
Platelet-activating factor (PAF) is a potent lipid mediator. In response to extracellular
stimuli,PAF is biosynthesized by lyso-PAF acetyltransferase, LPCAT2. We identified that theacute LPCAT2 activation is regulated its phosphorylation at Ser34. LPCAT2 may be phosphorylated
in the Ca/Protein kinase C  pathway.（Morimoto et al. J. Biol. Chem. 2014）.We also screened
LPCAT2 specific inhibitor from 170,000 compounds and identified TSI-01 as a candidate of species
for PAF related diseases.（Tarui et al.J. Lipid Res. 2014）
Brain is abundant in docosahexiaenoic acid (DHA).In this study, we identified a novel
LPAAT,LPAAT4 with preference for DHA-CoA. LPAAT mRNA was mainly detected in the brain. Thisfindings will contribute to study on the role of DHA in the brain（Eto et al. BBRC 2014）
We identified a candidate gene, Sec14-like 3 associated with transport of pulmonary surfactant
lipid. Sec14-like 3 was mainly expressed in the lung, and recognized lipid packing defect. We
speculated that Sec14-like 3 may transport target lipids to intraalveolar space by the binding
to the lipid packing defect.（Hishikawa et al. FASEB J. 2013）
We summarized the recent phospholipid studies in the review. (Hishikawa et al. J. Lipid Res.
2014)

Researchers には、分担研究者を記載する。

Morimoto et al. J. Biol. Chem. 2014

LPCAT2阻害剤スクリーニング
酵素アッセイ (Microsomal fraction)
High-Throughput Screening (HTS)
1. 主活性を蛍光測定
LC-MS/MS を用いた活性測定
2. LPCAT2のPAF生合成活性（主活性）3. LPCAT1の活性（酵素特異性）
4. 濃度依存性試験（酵素および基質特異性）
5. 0.4% BSAアッセイ（主活性）6. 種差アッセイ
細胞アッセイ (RAW267.4-mLPCAT2 cells)
7.細胞毒性試験
8.培養細胞PAF測定
PAF生合成酵素阻害剤の同定

174,131
↓
1,794
↓
617
↓
32
↓
24
↓
13
↓
10
↓
TSI-01
Tarui et al. J. Lipid Res. 2014

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２４指００１
研究課題名： 生体膜脂質生合成メカニズム解明と脂質バイオマーカーの探索
主任研究者名：清水孝雄

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Taketomi Y,
Ueno N,
Kojima T, Sato
H, Murase R,
Yamamoto K,
Tanaka S,
Sakanaka M,
Nakamura M,
Nishito Y,
Kawana M,
Kambe N,
Ikeda K,
Taguchi R,
Nakamizo S,
Mast cell maturation is driven via a group
Kabashima K,
III phospholipase A2-prostaglandin D2Nat Immunol
Gelb MH, Arita
DP1 receptor paracrine axis.
M, Yokomizo T,
Nakamura M,
Watanabe K,Hirai H,Nakamura M,
Okayama Y, RaC, Aritake K,
Urade Y,
Morimoto K,
Sugimoto Y,
Shimizu T,
Narumiya S,
Hara S,
Murakami M.

142013

Yoshikawa, K.,
Kita, Y.,
Furukawa, A.,
Excitotoxicity-induced immediate surge in
Kawamura, N.,
hippocampal prostanoid production has
Hasegawalatent effects that promote chronicFatty Acids.
Ishii, S., Chiba,
progressive neuronal death.
Y., Takei, S.,
Prostaglandins Leukot. Essent.
Maruyama, K.,
Shimizu, T.,
Shimada, A.

882013436

2013

Alkylglycerol monooxygenase as apotential modulator for PAF synthesis inmacrophages.

Tokuoka M, S.,
Biochem Biophys
Kita, Y.,Res Commun.
Shindou, H.,
Shimizu, T.

研究発表及び特許取得報告について

Hashimotodani, Y., OhnoAcute inhibition of diacylglycerol lipase
Shosaku, T.,
blocks endocannabinoid-mediatedTanimura, A.,retrograde synaptic suppression: evidence Kita, Y., Sano, J. Physiol.
for on-demand biosynthesis of 2Y., Shimizu, T.,arachidonoylglycerol.
Marzo,Vincenzo
Di, and Kano,M.

591

2013

Identification of Sec14-like 3 as a novel
lipid-packing sensor in the lung.

Hishikawa, D.,
Shindou, H.,
Harayama, T.,
FASEB J.
Ogasawara, R.,
Suwabe, A. andShimizu, T.

27

2013

TDAG8 activation inhibits osteoclastic
bone resorption.

Hikiji, H.,
Endo, D.,
Horie, K.,
Harayama, T.,
Akahoshi, N.,
Igarashi, H.,
Kihara, Y.,
Yanagida, K.,
Takeda, J.,
Koji, T.,
Shimizu, T.,
and Ishii, S.

FASEB J.

28

2013

Antiobese function of platelet-activating
factor: increased adiposity in plateletactivating factor receptor-deficient micewith age.

Sugatani, J.,
Sadamitsu, S.,
Yamaguchi, M.,
Yamazaki, Y.,
Higa, R.,
Hattori, Y.,
FASEB J.
Uchida, T.,
Ikari, A.,
Sugiyama, W.,
Watanabe, T.,
Ishii, S., Miwa,M., Shimizu, T.

28

2013

443

2013

55

2014

A Novel Lysophosphatidic Acid
Acyltransferase Enzyme (LPAAT4) with a Eto, M.,
Biochem Biophys
Possible Role for Incorporating
Shindou, H.,
Res Commun.
Docosahexaenoic Acid into Brain
and Shimizu, T.
Glycerophospholipids.
Hishikawa, D.,
Diversity and function of membrane
Hashidate, T.,glycerophospholipids generated by theJ. Lipid Res.
Shimizu, T.,remodeling pathway in mammalian cells. and Shindou,H.

研究発表及び特許取得報告についてInterplay between CXCR2 and BLT1
facilitates neutrophil infiltration andresultant keratinocyte activation in amurine model of imiquimod-inducedpsoriasis

Sumida, H.,
Yanagida, K.,
Kita, Y., Abe,J.,
Matsushima,J. Immunol.
K., Nakamura,M., Ishii, S.,
Sato, S., andShimizu, T.

192

2014

12-Hydroxyhpetadecatrienoic acidpromotes epidermal wound healing byaccelerating keratinocyte migration via
BLT2 receptor.

Liu, M., Saeki,K., Matsunobu,T., Okuno, T.,
Koga, T.,
Sugimoto, Y.,
Yokoyama, C., J. Exp. Med.
Nakamizo, S.,
Kabashima, K.,
Narumiya, S.,
Shimizu, T.,and
Yokomizo, T.

in press

2014

Rapid Production of Platelet-activating
Factor Is Induced by Protein Kinase Cαmediated Phosphorylation of
Lysophosphatidylcholine Acyltransferase
2.

Morimoto, R.,
Shindou, H.,
Tarui, M., andShimizu, T.

in press

2014

Lysophospholipid acyltransferases
mediate phosphatidylcholine
diversification to achieve the physicalproperties required in vivo.

Harayama, T.,
Eto, M.,
Shindou, H.,
Kita, Y.,
Otsubo, E.,
Cell metab.
Hishikawa, D.,
Ishii, S.,
Sakimura, K.,
Mishina, M.,
and Shimizu, T.

in press

2014

Selective inhibitors of a PAF biosynthetic
enzyme lysophosphatidylcholine
acyltransferase 2.

Tarui, M.,
Shindou, H.,
Kumagai, K.,
Morimoto, R.,
Harayama, T.,
Hashidate, T., J. Lipid Res.
Kojima, H.,
Okabe, T.,
Nagano, T.,
Nagase, T., andShimizu, T.

in press

2014

垂井愛、進藤英雄、森本亮、衛藤
血小板活性化因子(PAF)生合成酵素(LPCATs)
分子呼吸器病、先樹、原山武士、長阻害剤の検討
端医学社
瀬隆英、清水孝雄

172013

グリセロリン脂質リモデリング2482014

進藤英雄

J. Biol. Chem.

医学のあゆみ研究発表及び特許取得報告について

学会発表
タイトル

発表者

学会名場所

年月

衛藤樹、進藤英「脂肪細胞分化におけるリン脂質リモデリング酵 雄、原山武士、柳ホテル松島大観
日本脂質生化学会
2013年6月
素（リゾリン脂質アシル基転移酵素）の解析」
田圭介、清水孝荘、日本、松島雄High-speed monitoring method foreicosanoids and related compounds using
liquid chromatography / mass
spectrometry

Masaki
Yamada,Yoshihiro Kita,
SuzumiTokuoka,Takahiro
Kohira, Takao
Shimizu

61st ASMS
Conference onMass
Spectrometry

米国 ミネアポリスコンベン
2013年6月
ションセンターA very fast triple quadrupole mass
spectrometer as a tool for SRM-based
phospholipidomics

Yoshihiro Kita,
SuzumiM.Tokuoka,
Masaki
Yamada,and
Takao Shimizu

61st ASMS
Conference onMass
Spectrometry

米国 ミネアポリ
スコンベンション 2013年6月
センター

Glycerophospholipid metabolism andbiological functions

清水孝雄

2013 FASEB
SummerResearch
Conference
ヒルトンニセコビ
Lysophospholipid レッジ 北海道ニ 2013年8月
セコ村 日本
and Other
RelatedMediators – FromBench to Clinic

Monoacylglycerol lipase mediates
lipopolysaccharide-induced fever in mice

Yoshihiro Kita,
Asami
Tanimura,
Maya
Yamazaki,KenjiSakimura,
Masanobu
Kano, Takao
Shimizu

FASEB ScienceResearchConferencesヒルトンニセコ(Lysophospholipid ビレッジ（北海 2013年8月
and other Related 道ニセコ町
Mediators - From
Bench to Clinic)

リゾリン脂質アシル転移酵素による生体膜リン脂質多様性形成

進藤英雄、清水孝雄

第86回日本生化学 パシフィコ横浜、
2013年9月会シンポジウム
神奈川県

Yoshimitsu
Bioactive lipid in
Nakanishi,
Cancer,Analysis of human leukotriene B4 type I
KeisukeInflammation,
receptor phosphorylationsites by Phos-tag Yanagida,
and Related
SDS-PAGE
Takao Shimizu, Diseases, 13thMotonaoInternational
Nakamura
Conference

Sheraton
Puerto Rico,
San Juan,
Puerto Rico

2013年11月

研究発表及び特許取得報告について

Lipid mediators: enzymes and receptors

3th International
Conference on
Bioactive Lipids
Shimizu Takao in Cancer,Inflammation,and RelatedDiseases

Sheraton
Puerto Rico,
San Juan,Puerto Rico

2013年11月

Megumi Tarui,
Hideo Shindou,
Ryo Morimoto, 13th
Miki Eto,
International
Takeshi,
Conference on
Discovery of a selective inhibitor for theHarayama,
Bioactive Lipids
PAF biosynthetic enzyme
Kazuoin Cancer,
lysophosphatidylcholine acyltransferase 2
Kumagai,
Inflammation,
Tetsuo Nagano, and Related
TakahideDiseases
Nagase, Takao
Shimizu

Sheraton
Puerto Rico
2013年11月
Hotel , Puerto
Rico, San Juan

13thInternational
Ryo Morimoto,Conference on
Acceleration of platelet-activating factor
Hideo Shindou,
Bioactive Lipids
biosynthesis by phosphorylated
Megumi Tarui,in Cancer,
lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 and Takao
Inflammation,
Shimizuand RelatedDiseases

Sheraton
Puerto Rico
2013年11月
Hotel , Puerto
Rico, San Juan

日本肺サーファクタ
ント・界面医学会
東京医科大学、2013年11月
第49回学術研究会 東京都新宿区
特別講演

肺サーファクタントのリン脂質と呼吸機能

進藤英雄

イミキモド誘発マウス乾癬様皮疹における好中球浸潤の機序と役割の解明

住田隼一、柳田圭介、北芳博、阿部淳、松島綱治、 第41回日本臨床免 海峡メッセ下関、
2013年11月
下関市、日本中村元直、石井 疫学会総会
聡、佐藤伸一、清水孝雄

Sec14L3 a novel protein recognizing
liposome curvature and packing defect清水孝雄

LIPID MAPS
Annual Meeting
Scripps
2014:Lipidmics
Seaside Forum
Impact on Cell
2014年5月
UCSD、La
Biology,
Jolla CA, USA
Inflammation andMetabolic Disease

研究発表及び特許取得報告について

Yoshihiro Kita,
Kenji Yoshida,
Suzumi M.
Tokuoka,
Monoacylglycerol lipase mediates fever via Fumie
hypothalamic prostaglandin E2 production Hamano, Kenji
Sakimura,
Masanobu
Kano,Takao
Shimizu

LIPID MAPS
Annual Meeting
Scripps
2014:Lipidmics
Seaside Forum
Impact on Cell
2014年5月
UCSD、La
Biology,
Jolla CA, USA
Inflammation andMetabolic Disease

Development of glycerophospholipid
profiling methods using ternary gradientliquid chromatography/high-speed triple
quadrupole mass spectrometry

LIPID MAPS
SuzumiAnnual Meeting
Tokuoka,Scripps
2014:Lipidmics
Yoshihiro Kita,
Seaside Forum
Impact on Cell
2014年5月
MasakiUCSD、La
Biology,
Yamada, Takao
Jolla CA, USA
Inflammation andShimizu
Metabolic Disease

Deficiency of monoacylglycerol lipase
attenuates diet-induced obesity in an
endocannabinoid system-independentmanner

Kenji Yoshida,
Yoshihiro Kita,
SuzumiTokuoka, Kenji
Sakimura,
Masanobu
Kano, Takao
Shimizu

LIPID MAPS
Annual Meeting
Scripps
2014:Lipidmics
Seaside Forum
Impact on Cell
2014年5月
UCSD、La
Biology,
Jolla CA, USA
Inflammation andMetabolic Disease

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称発表者

発表先場所年月日)記載のこと。
登録番号

該当無し

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国