2022.11. 22 on Zoom

PF-UA タンパク質結晶構造解析ユーザーグループ

第7回タンパク質結晶構造解析中級者向け講習会

構造⽣物学者が知るべき
Colabfold活⽤⽅法（イントロダクション）
伏信進⽮
東京⼤学 ⼤学院農学⽣命科学研究科
A picture of “AlphaFold2” imagined by Midjourneyタンパク質の⽴体構造予測に関する報道
MITテクノロジーレビュー vol. 7 2022.6.15

朝⽇新聞朝刊 教育・科学⾯ 2022.7.29

フォールディング問題は解決した?
※ただしイケメンに限る
PDBに実験構造あり構造予測可能だったもの
AlphaFold2で予測可能に(⾼信頼度)
AlphaFold2で予測可能に(低信頼度)

Thornton et al., Nat. Med., 2021

もともと単独で構造をとらない天然変性タンパク質(intrincically disordered protein, IDP)の構造予測は難しい

Callaway, Nature, 2022

2021年7⽉の前と後「新規構造はロマンです」
ホモロジーモデリング(SWISS-MODEL)では嘘くさい構造しか得られなかった良質な結晶構造が得られる
R/Rfree = 0.176/0.224
SeMet法により「位相決定」
構造が「解ける」(2021年6⽉)

Cα RMSD = 1.77 Å

分⼦置換では位相が決定できない（類似構造のseq. id < 20%)結晶ができてX線の反射データも得られる！（分解能 2.0 Å!）

2021年7⽉
AlphaFold2登場
予測構造がほとんど同じ！

Cα RMSD = 0.47 Å構造解析の⼤変さ これまでとこれからX線結晶構造解析を例にしてここが圧倒的に簡単になった！
サンプル調製結晶化

X線データ測定

位相決定

モデル構築

複合体決定

重原⼦(MIR)
SeMet, S-SAD
MR (分⼦置換)

分⼦置換には類似構造が必要だった
解きたい構造鋳型構造(PDB)

以前の予測構造?

AlphaFold2で(少なくとも部分的には)良質な鋳型構造が⼿に⼊る時代に分⼦置換の鋳型「本物」の結晶構造

結晶学的
精密化相同性 > 30%は必要

分⼦置換には使えない

結晶化に向けたコンストラクト作成にも⼤いに役に⽴つ
どこで切ればよいか⼀⽬瞭然
Ordered/disorderedの予測も、極めて正確

既存のdisorder予測
サーバーを凌駕

Perrakis & Sixma, EMBO Rep., 2021

Akdel et al., NSMB, 2022

https://www.itmedia.co.jp/news/articles/2107/20/news136.html

Crystal Structure of Protein X
Dimer structure(biological assembly)

16 molecules in the asymmetric unit

R/Rfree = 20.9/27.7%
⾼めの分解能 (2.2 Å)のX線反射
データセットを2014年に取って以来、ずっと位相が解けずにいた(SeMetなど全て失敗)

様々な⼿法で予測構造を作り、分⼦置換(molecularreplacement, MR)を、繰り返
すが全て失敗2021年7⽉ AlphaFold2の予測構造であっさりMRが解ける

Predicted and crystal structures of Protein X
Crystal structure (green) vsRaptorX (white): MR failed

Cα RMSD = 1.724 ÅTemplate sequence id. < 20%(BLASTでヒットしないレベル)
Thanks to Dr. Moriwaki

Crystal structure (green) vs
AlphaFold2 (pink): MR successful

Cα RMSD = 0.410 ÅAlphaFold2は動くタン
パク質をどう予測するのか？
“The current version of AlphaFold gives you the structure that it
believes is the most likely one to appear in PDB”
"AlphaFoldの現在のバージョンは、PDBに現れる可能性が最も⾼いと思われる構造を教えてくれる”

John Jumper (DeepMind), 2021
Mullard, Nat. Rev., 2021

ドメインが⼤きく動く場合 (糖キナーゼその1)
Bifidobacterium longum N-acetylhexosamine 1-kinase
Open

結晶構造: +ADP (4WH3)

Close

結晶構造: +GlcNAc (4OCJ)

ClosedAF2予測構造
Closed構造を予測

ドメインが⼤きく動く場合 (糖キナーゼその2)
Sulfolobus tokodaii Hexokinase
Open

結晶構造: Apo (2E2N)

Close

Open

結晶構造: Complex (2E2Q)

AF2予測構造

今度はOpen構造を予測

タンパク質全体が動く場合 (P450 その1)P450norOpen

結晶構造: Apo (1CL6)

Heme

Close

Open

結晶構造: Complex (1XQD)

NADH

AF2予測構造

Open構造を予測
ヘムのポケットには何も⼊っていない

タンパク質全体が動く場合 (P450 その2)
CYP105P1

Xtal (apo-open)
AF2
Xtal (complex-closed)

⽩：Apo結晶構造 (3E5J)
緑：Complex結晶構造 (3ABA)
シアン：AF2予測構造
Open/closeの中間を予測することもある？

HemeFilipin

AlphaFold2の予測構造はリガンド結合予測に使えるか？

糖質結合ドメインの例
実験構造を鋳型に⽤いれば⾼い精度でリガンド複合体が予測できるが予測したタンパク質構造はそれに劣る
緑：リガンドフリー構造 (3ACF)
⻩：リガンド結合構造 (3ACH)

緑：リガンドフリー構造 (3ACF)
マゼンタ：AF2予測構造
GlnArg橙：リガンドフリー構造にautomated dockingしたリガンド

ピンク：AF2予測構造にautomated dockingしたリガンド

ポケットの予測には使える

pLDDTが低いとポケットが⼤きくなりがち

pLDDT > 90ならポケットの位置推定は実験構造と遜⾊ない

Akdel et al., NSMB, 2022

タンパク質-タンパク質相互作⽤の予測
複数のタンパク質配列をリンカーでつないで投げると相互作⽤予測に使えることを発⾒
2021.7.19 森脇由隆 先⽣（東⼤農）➔ 多量体構造予測機能を追加したAlphaFoldMultimer論文が発表 (2021.10.4)➔ AlphaFold ver. 2.1.0（11月3日）のアップ
デートで多量体構造予測機能が一般利用可能に。

Evans et al., bioRxiv, 2021-2022

https://doi.org/10.1101/2021.10.04.463034

⼆量体を正しく予測できない例
ColabFold: AlphaFold2 using MMseqs2に同じ配列を”:”(コロン)でつないで投げるだけ
SGSLQQVTDFGDNPTNVGMYIYVPNNLASNPGIVVAIHYCTGTGPGYYGDSPYATLSEQYGFIVIYPSSPYSGGCWDVSSQATLTHNGGGNSNSIANMVTWTISKYGADSSKVFVTGSSSGAMMTNVMAATYPELFAAATVYSGVSAGCFYSNTNQVDGWNSTCAQGDVITTPEHWASIAEAMYSGYSGSRPRMQIYHGSIDTTLYPQNYYETCKQWAGVFGYDYSAPEKTEANTPQTNYETTIWGDSLQGIFATGVGHTVPIHGDKDMEWFGFA:SGSLQQVTDFGDNPTNVGMYIYVPNNLASNPGIVVAIHYCTGTGPGYYGDSPYATLSEQYGFIVIYPSSPYSGGCWDVSSQATLTHNGGGNSNSIANMVTWTISKYGADSSKVFVTGSSSGAMMTNVMAATYPELFAAATVYSGVSAGCFYSNTNQVDGWNSTCAQGDVITTPEHWASIAEAMYSGYSGSRPRMQIYHGSIDTTLYPQNYYETCKQWAGVFGYDYSAPEKTEANTPQTNYETTIWGDSLQGIFATGVGHTVPIHGDKDMEWFGFA

Rank_1

5X6S

Rank_2

Rank_3

Rank_4
Rank_5

AF2をオリゴマー予測に使⽤するモノマーなのにホモダイマーと予測されてしまった例

古いドッキングツールよりはマシ
GRAMM(2002)
で正確に予測できた

AF2予測正解(3TDT)

1

3

4

AF2で正確に予測できた

5

No. of recyclesを増やせば正解を出すこともある

短くリニアな天然変性領域がタンパク質にフィットするところは予測できる場合が多い

位置は正しいが逆向き複数の天然変性タンパク質の複合体も予測できるコラーゲンの３重ヘリックスはだめ

Akdel et al., NSMB, 2022

“なんたらフォールド”の登場
List of Predictors
2022.11.22現在

MSA-based(Multiple Sequence Alignment)•••••

AlphaFold2
ColabFold
FastFold
HelixFold
MEGA-Fold••••

OpenFold
RoseTTAFold
Uni-Fold
Uni-Fold-jax

A collection of *fold* tools

https://github.com/biolists/folding_tools

pLM-based(protein Language Model)
••
•
••
•

ESM-Fold
EMBER3D
HelixFold-single
IgFoldOmegaFoldRGN2Other• EquiFold
ディフュージョンモデル
（抗体⽤）

結晶構造
ColabFold (AF2+ MMseqs2)
Cα RMSD = 0.373 Å
OmegaFold ColabCα RMSD = 0.405 Å

圧倒的に速い構造サンプリングへの応⽤
ヒトAcyl-coenzyme A synthetase ACSM2Aの例
アデニル化コンフォメーション(橙)予測構造サンプリング(⿊)

モーフィング(⿊)

チオエステル化
コンフォメーション(緑)

ほとんど緑と同じだが、ちらっと橙(open)に近いコンフォメーションが⾒える

Molecular Dynamicsなどを使った計算⼿法と相補的に使える？
https://qiita.com/Ag_smith/items/fca48002fbdcb15145c0

構造サンプリングで糖キナーゼのコ
ンフォメーション変化も予測できるBy ⼩野⽥先⽣

ColabFoldを⽤いた⽅法
notebook=https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/b
eta/AlphaFold2_advanced_beta.ipynb
sequence=MTESNEDLFGIASHFALEGAVTGIEPYGDGHINTTYLVTTDGPRYILQQMNTSIFPDTVNLMRNVELVTSTLKAQGKETLDIVPTTSGATWAEIDGGAWRVYKFIEHTVSYNLVPNPDVFREAGSAFGDFQNFLSEFDASQLTETIAHFHDTPHRFEDFKA
ALAADKLGRAAACQPEIDFYLSHADQYAVVMD
GLRDGSIPLRVTHNDTKLNNILMDATTGKARAIIDLDTIMPGSMLFDFGDSIRFGASTALEDEKDLSKVHFSTELFRAYTEGFVGELRGSITAREAELLPFSGNLLTMECGMRFLADYLEGDIYFATKYPEHNLVRTRTQIKLVQEMEQKASETRAIVADIMEAAR
msa_method=mmseqs2
homooligomer=1
pair_mode=unpaired
cov=0
qid=0
max_msa=512:1024
subsample_msa=True
num_relax=0
use_turbo=True
use_ptm=True
rank_by=pLDDT
num_models=5
num_samples=8
num_ensemble=1
max_recycles=3
is_training=False
use_templates=False

Bifidobacterium longum N-acetylhexosamine 1-kinase
デフォルトのAF2ではclosed構造を予測
Open 結晶構造 4WH3
Closed 結晶構造 4OCJPDBへの予測構造の掲載開始
Computed Structure Models (CSM)がデフォルトで検索結果に表⽰されるようになった (~2022.8.31)

その後、わずか１週間でデフォルトがOFFになる

実験構造はどうなる？
“実験的に決定された⽣体⾼分⼦の⽴体構造は、分解能が3.5 Å以上であれば、AlphaFold2の予測構造よりも信頼できるため、可能であれば実験構造を参照すべきである”"... experimentally-determined MX structures (3.5 Å resolution or better)are more reliable than AlphaFold2 computed structure models andshould be used preferentially whenever possible."

Shao et al. bioRxiv, 2022.05.17
https://doi.org/10.1101/2022.05.17.492280

クライオ電顕構造解析への応⽤
AR9 nvRNAP proteins
Nuclear Pore Complex

30種類、1000以上のタンパク質からなる巨⼤複合体
点線部分は予測構造のおかげでモデリング可能になった
Callaway, Nature, 2022

Krysthatofvych et al., Proteins, 2021

ただし予測構造は電顕構造と違うところもある
AR9 nvRNAP proteins

Krysthatofvych et al., Proteins, 2021

構造を破壊する変異には鈍感
病気に関するミスセンス変異
１アミノ酸置換がタンパク質の凝集、ミスフォールディング、機能喪失につながることがある
Ubiquitin-associateddomain (UBA)

Breast Canter C-Terminal(BRCT)L198Aで変性タンパク質になる

A1708Eは乳がんに関連不安定化してプロテアーゼで分解されやすくなる

Myosin VIMyUb domain

R1117Aでアダプタータンパク質との相互作⽤を失い構造が不安定になる
変異でpLDDTが少し上がる(WT: 89 -> R1117A: 90)

Buel & Walters, NSMB, 2022

タンパク質の不安定化を予測する構造としては有⽤タンパク質への変異が引き起こすΔΔGの予測値と実験値の⽐較

RosettaによるΔΔGの予測
ヒトのスフィンゴ糖脂質デルタ(4)デサチュラーゼ(DEGS1)と疾患変異タンパク質不安定化

↑不安定化
以外の要因

実験構造を使った場合とAF2構造(pLDDT > 90)に差がない
Akdel et al., NSMB, 2022

現時点での限界と今後の課題• ドッキングの鋳型として（ドラッグデザイン等）
Ø 実験構造ほど正確ではないが「違うもの」がヒットする• 構造を破壊するミスセンス変異の予測Ø 分⼦進化にもとづいた変異の配列がDBにないため難しい？
Ø フォールド/アンフォールドの予測をするためにはタンパク質の物理学から学習する必要がある• 複数のコンフォメーションの予測
Ø 現時点では難しい
Ø 細胞内の他のタンパク質との相互作⽤にも依る• 複合体構造Ø 今後改善するはず• 何と結合するかの予測は難しい
Ø 低分⼦化合物の種類は無数にあるラジオしかなかったときにはニュース原稿を読むだけだったのが、TVが出現するとニュース番組も⼤きく変わったような変化(by AlQuaraishi)
Callaway, Nature, 2022

とてもためになる読み物

https://doi.org/10.11234/jsbibr.2022.3