Agilent AdvanceBio
Gly-X N-グリカンサンプル前処理とInstantPC キット

シンプルなワークフローによる高速 FLD/MS グリカン分析

簡素化と標準化による生産性向上

N-結合型グリカンの位置と構造は、治療用タンパク質の薬理学で重要な役割を果たし、免疫原性や薬物動態、薬力学に影響を与える可能性があります。

Agilent AdvanceBio Gly-X (旧 ProZyme) は、 溶 液 内 ワークフロ ー を 簡 素 化する 次世代 の N-グリカン 前処理 プラットフォームです。Agilent InstantPC (旧ProZyme) 色素や、真空プレートの効率的なクリーンアップステップと組み合わせて、余分な標識色素や変性剤を除去することで、UHPLC や LC/MS 用のサンプルの前処理が通常 60 分以内に完了します。

生産性向上を実現する要素– UHPLC や LC/MS 用サンプルを 1 時間以内に前処理

糖鎖分析を加速する
トータルソリューション

– 高い UHPLC-FLD および MS シグナルのための InstantPC 色素に ProZyme の製品とサービスが加 わ– 5 分間の PNGase F 消化により、N-グリカンを偏りなく遊離– 室温で安定するシンプルな 96 ウェルクリーンアッププレート– 高速・高分解能分析に対応– 柔軟なサンプルスループットをサポートし、無駄がないモジュール形式

アジレントのバイオ医薬品向 け 製品群

りました。今後は、糖鎖分析のあらゆるステップをサポートする機器および消耗品をすべてアジレントからご購入いただ

けます。サンプル前処理から始まり、確かな分析結果を得るまでの包括的 なグリカン分析ワークフローをアジレントが実現します。これにより、お客様の求め

糖タンパク質 40 μg
変性 3 分間

N-グリカナーゼ消化 5 分間

グリカンの遊離

InstantPC ラベリング 1 分間

ラベル化グリカン

96 ウェルクリーンアッププレート
UHPLC、MS/MS

データ解析

る信頼性と再現性に優 れた結果を容易に得られるようになります。

詳しくはこちら:www.agilent.com/chem/jp

脱グリコシル化

AdvanceBio Gly-X 技術

Gly-X N-グリカンの遊離とラベリングは 96 ウェルプレートの単独自の変性剤により N-グリカン部位の一ウェルで実行されます。
曝露が増進され、酵素による迅速な切断が実現し、5 分で N-グリカナーゼ (PNGase F) による Gly-X 脱グリコシル化が可能になります。

Gyl-X は、高温条件下 (50 ℃) でも、偏りなく PNGase F の活性を保ちます。
Gly-X 変性試薬は室温で安定し、特別な取り扱いはなく必要、MS にも適しています。
Gly-X では、大半のタンパク質の溶液内での酵素脱グリコシル化が、1 ウェルにつき 40 μg まで、5分以内に完了します (図 1)。

エタネルセプトA

グリコシル化

脱グリコシル化

2000

Fc 領域および TNF-α

Fc 領域および TNF-α■ 未処理の糖タンパク質

FU

1500

1000

■ Gly-X PNGase F 消化マーカー

500

PNGase F051528466395150240kDa
セツキシマブB
5000

脱グリコシル化重鎖
グリコシル化重鎖

FU

4000

3000

■ 未処理の糖タンパク質■ Gly-X PNGase F 消化軽鎖1000

PNGase F2000

マーカー051528466395150240

kDa
図 1: Agilent AdvanceBio Gly-X の酵素による脱グリコシル化の効率。エタネルセプト (A) は、N-結合型グリコシル化部位を IgG1 Fc 領域に 1 つ、TNF-α コンポーネントに2 つ含みます。セツキシマブ (B) には、2 つの重鎖 N-グリコシル化部位 (Fc 領域に 1 つと Fab 領域に 1 つ) あります。Gly-X による脱グリコシル化では、ターゲットピークのリテンションタイムが、Agilent Bioanalyzer で検出されたとおりにシフトします。

2ラベリングON-グリカンの InstantPC ラベリング

ONO

Gly-X では、バッファ成分と変性剤が InstantPC 色素との互換N性を持つため、PNGase F 消化の直後に、1 分間のラベリングス

OONHOテップが可能です。InstantPC 色素 (図 2) は、新しい N-グリカ

3 級アミンンインスタント標識色素の 1 つであり、MS と HILIC/FLD の感

プロカイン

Glycan-NH2度を大幅に高めます。

O

プロカインの活性化された形態である InstantPC は、PNGase

F 消化 により遊離されたグリコシルアミンとの 安定した 尿素結合 を形成し、 ポジティブモードで高 い MS シグナルを生成する
3 級アミンを含 みます。InstantPC は、モノアイソトピック質量261.14773 Da を還元末端に追加します。

グリカンONOO+NNHNHOHO

図 2: 新しいグリカン標識色素、Agilent InstantPC の構造

Agilent InstantPC とその他のグリカン標識色素の比較

グリカン分析でよく使われている標識色素は十分にイオン化されないため、低アバンダンスのグリカンの検出には、通常、蛍光分析を使わざるを得ません。InstantPC は、テストされたグリカン標識色素の中で LC/FLD シグナルが最も強くなっています (図 3A)。

次に蛍光分析に適した標識色素はプロカインアミドですが、その前処理で行われる還元的アミノ化ワークフローにはさらに長い時間がかかります。LC の高い FLD シグナルに加え、InstantPC には、ポジティブモードで高い MS シグナルを生成する 3 級アミンが含まれます (図 3B)。

AG0F の 抽出 MS ピーク面積

3.0E+5
2.5E+52.0E+5
1.5E+5
1.0E+55.0E+4MS

3.0E+5
2.5E+52.0E+5
1.5E+5
1.0E+55.0E+4ミアロプ

Bカイン

2Aド

素色識標社
他

stantPB
2A

アン
イカロプ他社

標識

ミ色

ド素CtP
anstInC00InG0F の FLR ピーク面積B

蛍光分光分析

図 3: FLD (A) と MS (B) のレスポンスの比較。メーカーの指示に従って、同量の糖タンパク質サンプルから得られたグリカンに、Agilent InstantPC、他社標識色素、プロカインアミド、2-AB でラベル化し、UHPLC で測定しました。グラフの棒は、G0F N-グリカン種のピーク面積を表します。

3

クリーンアップAgilent InstantPC ラベル化 N-グリカンのクリーンアップ

Agilent AdvanceBio Gly-X のワークフローには、ラベル化グリカンから遊離色素と変性剤を除去するクリーンアップステップが含まれます。サンプルがロードされる 96 ウェルクリーンアッププ

レートは、ラベル化グリカンを取り込んでから、溶出溶媒の極性を変更して遊離できるために最適化されています。

一般的な真空ろ過マニホールドは、以下のすべてのステップで使用されます。

1.サンプルのロード

2.ロード/洗浄溶液を使った洗浄 (2x)3.160 mM ギ酸アンモニウム/10% アセトニトリル溶液による溶出

Gly-X クリーンアップでは、ラベル化グリカンの 95 % 超が保持されます (データの記載なし)。シアル酸付加されたグリカン種は、

図 4 のように保持されます。このクリーンアップでは、遊離標識

シアル酸付加された N-グリカンのエタネルセプト %色素だけでなく、ラベル化グリカンの変性剤も除去されます。

95.4%

6050.348.0

50403020100

クリーンアップなし

クリーンアップあり

図 4: Agilent AdvanceBio Gly-X のクリーンアップ。Gly-X と Agilent InstantPC

キットで前処理したグリカンについて、シアル酸付加されたエタネルセプト N-グリカンの相対 % 面積を、最終的なクリーンアップステップがある場合と、ない場合に分けて計算しました。

4分析

Agilent InstantPC ラベル化 N-グリカンのHILIC/FLD プロファイル

図 5 は、60 分メソッドで分離したエタネルセプト N-グリカンをルを図 5 に示します。溶出順序は、2-AB など、他のグリカン標超が除去されるため、遊離色素のピークは最小限に抑えられま示しています。Gly-X クリーンアップにより、遊離色素の 99.97%

エタネルセプト InstantPC N-グリカンの HILIC 溶出プロファイ

す。Gly-X で前処理したサンプルから得られた相対 % ピーク面積識色素に類似しています。グリカンプロファイルの複雑さに応じデータは、高い再現性を示しています (表 1)。て、さまざまな長さの HILIC メソッドを使用できます。

5000
4600

G2FS14200
G0F

3800
3400

G2S1

EU

3000
G1F[6]

2600
2200

G2FS21800
Man51400

G2F
G1F[3]

1000
600
2000151617

G1FS12223
Minutes

24

G1[6]
G1[3]

G014

G2S2G21819202125262728293031

図 5: Gly-X と InstantPC キットを用いたエタネルセプト InstantPC-ラベル化 N-グリカンの HILIC/FLD プロファイル。60 分間のグラジエント。

表 1. エタネルセプト N- グリカン全ピーク面積に対し、面積が 2 % を超えるピークと、その面積 CV (n=8)
グリカン% 面積% 面積CV

グリカン

% 面積% 面積
CVG0F-N

19.8

2.1

G1F[3]

4.1

0.9

G0

4.7

1.5

G2F

13.7

2.5

G0F

9.4

1.5

G2FS1[3] 4.8

0.3

Man5

4.8

2.4

G2FS1[6] 20.3

0.9

G1[6]

2.5

2.4

G2FS2

2.2

G1F[6]

4.5

1.0

10.75

仕様

Agilent AdvanceBio Gly-X およびタンパク質のロード量

1 ～ 40* μg

InstantPC

製品情報
説明

AdvanceBio Gly-X および InstantPC キット(96-ct)

部品番号

GX96-IPC

脱グリコシル化の効率

大半のタンパク質で完了

AdvanceBio Gly-X および InstantPC キット(24-ct)*

GX24-IPC

標識色素

InstantPCFLD および MS 検出に対して最適

AdvanceBio Gly-X および InstantPC

脱グリコシル化およびラベリングモジュールセット

GX96-201PC>95%脱グリコシル化およびラベリングモジュールセット

GX24-201PC

AdvanceBio Gly-X InstantPC ラベリングモジュール(96-ct)

GX96-101

残留変性試薬グリカンの回収

遊離色素の除去

LC-MS (Q-TOF) で検出せず>99%

シアル酸付加された種の確保>95%(ウェル間および日間)CV 5 %未満(96-ct)AdvanceBio Gly-X および InstantPC(24-ct)精度

主なグリカンのピーク面積

AdvanceBio Gly-X InstantPC ラベリングモジュール(24-ct)

GX24-101

総ワークフロー時間

42 分 (16 サンプル)、99 分 (96 サンプル)

Gly-X InstantPC クリーンアップモジュール (96-ct)

GX96-102(試薬の前処理を含む)

オートサンプラでのサンプルの最長 6 日間

サンプルの長期安定性

Gly-X Eluent、-20 ° C で最高 30 日間

安定性

キットの構成(穿孔後はこの限りではありません)

分析 1 回あたり 1 ～ 96 個のサンプルの前処理に十分な量の試薬

クリーンアッププレートは再利用可能、室温で保管可能*グリコシル化の程度によっては、40 μg を超える糖タンパク質を使用できます。

6AssayMAP PA50 Protein-A アフィニティ精製キット (96-ct)

G5524-60010 KIT* GX24-IPC には、96-ct のクリーンアッププレートが含まれます。クリーンアップ

プレートは室温で保存し、GX24-201PC のリフィルを注文してください。

製品情報InstantPC ラベル化個別

部品番号

InstantPC ラベル化 N-グリカンライブラリ

部品番号

G0-N

GKPC-401

グリカンライブラリ

GKPC-005

G0

GKPC-301

G0F-N

GKPC-402

G0F

GKPC-302

G1

GKPC-317

G1F

GKPC-316

G2

GKPC-304

G2F

GKPC-305

G1F + 1aGal

GKPC-403

G2F + 1aGal

GKPC-404

G2F + 2aGal

GKPC-318

G1S1 (α2,3)GKPC-329

グリカン標準G1S1 (α2,6)G1FS1 (α2,3)G1S1 (α2,6)G2S1 (α2,3)G2S1 (α2,6)G2FS1 (α2,3)G2FS1 (α2,6)G2S2 (α2,3)G2S2 (α2,6)G2FS2 (α2,3)AdvanceBio ヒト IgG N-結合型

グルコースホモポリマー

CHO mAb N-結合型グリカンライブラリ

CHO mAb N-結合型グリカンライブラリ +CHO mAb 糖タンパク質α(2-3) シアル化 3 本鎖糖鎖ライブラリα(2-6) シアル化 3 本鎖ライブラリα(2-3) シアル化 4 本鎖糖鎖ライブラリα(2-6) シアル化 4 本鎖糖鎖ライブラリ

GKPC-503
GKPC-020
GKPC-020-P
GKPC-233
GKPC-263
GKPC-234
GKPC-264

GKPC-319
GKPC-330
GKPC-320
GKPC-321
GKPC-311
GKPC-325
GKPC-315
GKPC-322
GKPC-312
GKPC-323

G2FS2 (α2,6)GKPC-313

Man5

GKPC-103

Man6

GKPC-104

Man7

GKPC-105

Man8

GKPC-106Man9

GKPC-1077

ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2019
Printed in Japan, June 07, 20195994-0918JAJP