ホルムアルデヒド固定酵素の発現制御機構と触媒機能の応用機能開発
京都大学大学院 農学研究科 応用生命科学専攻 由里本 博也
1. はじめにホルムアルデヒド（HCHO）は、メタンやメタノール、メチルアミンなどの C1 化合物を利用する微生物（メチロトローフ）の代謝経路において、エネルギーを得るための酸化経路と細胞構成成分合成のための資化経路の分岐点に位置する重要な化合物である。HCHO は強い生物毒性を示す化合物であるため、全ての生物は何らかの HCHO 解毒機構を持っている。その一つにメチロトローフ細菌がもつ HCHO 固定経路であるリブロースモノリン酸経路（RuMP 経路）がある。本経路では遊離の HCHO とリブロース 5-リン酸とがアルドール縮合して 3-ヘキシュロース 6-リン酸が生成し、これが異性化されてフルクトース 6-リン酸になる（図１）。この２段階の反応は、3-ヘキシュロース-6-リン酸シンターゼ（HPS）と 6-ホスホ-3-ヘキシュロイソメラーゼ（PHI）によって触媒される。HPS と PHI の遺伝子はメチロトローフ細菌だけでなく、非メチロトローフ細菌やアーキアにも広く存在する。本シンポジウムでは、我々がこれまHC*HO
C*H2OHC*H2OH
COCH2OH
HOCH
HOCH
COCO
HCOH
HCOH
HCOH
HPS HCOH PHI HCOH
HCOH
CH2O-P
CH2O-P
CH2O-P
Ribulose 5-P

でに行ってきた RuMP 経路の生理機能や HPS, PHI の遺伝子構D-arabino-3-Hexulose 6-P

Fructose 6-P

図 1. HPS と PHI造や発現制御機構、触媒機能に関する研究結果と、そこから得られた基盤的知見を利用した応用機能開発について紹介する。
2. HPS, PHI の遺伝子構造と発現制御機構
メチロトローフ細菌では、HPS と PHI の遺伝子（hps■ メチロトローフ細菌：Bacillus brevis S1および phi）はクラスターを形成しており、通性メチロトhps
グルコース6デヒドロゲナーゼ

ローフ細菌である Mycobacterium gastri や Bacillus
両遺伝子はポリシストロニックなオペロンとbrevis では、RuMP オペロン

■ 非メチロトローフ細菌：Bacillus subtilis

hxlR

して HCHO に応答して発現する（図２）。非メチロトロhps

phi

DNA-結合タンパク

ーフ性の枯草菌 Bacillus subtilis でも、通性メチロトロー
フ細菌と同様なオペロンとしてコードされており、培地に

phi

RuMP オペロン■ アーキア：Pyrococcus spp., Thermococcus spp.

添加した HCHO によって両遺伝子が誘導発現する。細菌

hps

phi

図 2. hps と phi の遺伝子配座の hps/phi オペロンのHCHO依存的な転写活性化の分子本オペロン上流のHCHO機構は全く分かっていなかったが、枯草菌のhps/phi オペロン上流に存在するHxlRが、応答領域に結合する新規 DNA 結合性転写活性化因子であることを明らかにした。しかしながら、in vitro でのオペロン上流配列への HxlR 結合は、HCHO の有無によって影響されなかったことから、本オペロンの HCHOによる転写活性化には HxlR 以外の別の因子が関与することが示唆され、現在枯草菌の遺伝子破壊株ライブラリーやトランスポゾン変異を用いて、新規遺伝子を探索している。
3. アーキアの HPS/PHI の生理機能
超好熱性アーキア Pyrococcus horikoshii や Thermococcus kodakaraensis では、HPS と PHI はひとつの読み枠にコードされる二機能性酵素となっている（図２）。アーキアの HPS, PHI に関する知見は皆無であったが、我々はこれらの二機能性酵素を大腸菌内で発現させ、相当する酵素活性を持つことを明らかにした。またその生理機能に関して、ゲノム解析の結果からペントースリン酸経路を欠いたアーキアの一群に HPS と PHI が存在することに着目した。ペントースリン酸経路が不完

GAP

全なアーキアでは、核酸合成の前駆体となるリボ

F6P
TK

Aromaticamino acids

S7P

E4P

ース 5-リン酸の供給経路が不明であったが、遺伝子破壊が可能な T. kodakaraensis で当該遺伝子RPEを破壊してその生育特性を調べることにより、

RPI

R5P

TAGAP

F6P

Nucleotides

リン酸の供給に必須であることを酵素化学的・遺伝学的に実証した（図 3）。これはアーキアの糖代路が C1 化合物代謝以外に重要な生理的機能を持

TK

Ru5P

HPS/PHI の HCHO 固定の逆反応がペントース謝に明確な新知見を与えただけでなく、RuMP 経

Xu5P

HPS

Hu6P

PHI

HCHO

図 3. T. kodakaraensis におけるペントースリン酸合成経つことを示した最初の例であり、同一酵素が細菌とアーキアでは正逆異なる方向の反応にその生理的意義をもつことを初めて明らかにした。
4. 常温で機能する HPS-PHI 人工融合酵素の創製と利用

P. horikoshii の HPS-PHI 融合酵素について、HPS 部分、PHI 部分、HPS-PHI 融合酵素をそれぞれ大腸菌で発現させて活性を比較したところ、HPS-PHI 融合酵素は HPS と PHI を混合した酵素系に比べてサブユニット換算で約 50 倍の活性を示した。P. horikoshii 由来の酵素は常温では機能しないので、常温付近での活性型融合酵素を創製するため、メチロトローフ細菌 M. gastri 由来の HPS と PHI を人工的に融合させた二機能性酵素を大腸菌で発現させた。人工融合酵素では触媒効率が向上しており、大腸菌発現株では HCHO 耐性が向上した。
HPS と PHI を異種生物に導入する際、融合酵素であれば 1 段階の形質転換で導入できる上に、本融合酵素はHCHO 耐性による形質転換マーカーとしての利用などが期待される。
一方、メチロトローフ細菌の HCHO 資化経路には RuMP 経路以外にセリン経路がある。HPS, PHI をセリン経路を持つメチロトローフ細菌に導入することにより、メタノール資化能の向上が期待できる。そこで、
HPS-PHI 人工融合酵素をセリン経路で HCHO を資化するメチロトローフ細菌 Methylobacterium extorquens
AM1 株に導入した。
野生株およびセリン経路上の酵素遺伝子の破壊株にHPS-PHI 融合酵素を導入したところ、破壊株に導入した株はメタノール培地で生育し、導入した HPS-PHI によりセリン経路が代替できることがわかった。さらに野生株に導入した場合ではメタノール資化能が向上することがわかった。M. extorquens AM1 株はメタノールからの PHB（ポリヒドロキシ酪酸）生産などにも使用される菌株であることから、HPS-PHI 融合酵素導入により、高収率化が可能になると考えられる。
5. おわりに
HCHO は「シックハウス症候群」の主要な原因物質とされており、室内空気中や環境中の HCHO を検出、除去する技術開発が求められている。我々は細菌の HPS, PHI を植物に導入し、空気中の HCHO を吸収・除去できる組換え植物の創製にも成功しており、現在 HPS-PHI 融合酵素の導入を行っている。また枯草菌遺伝子のHCHO 応答領域の支配下に蛍光タンパク質を発現することによって、環境中の HCHO を検出できるセンサー細胞の開発も行っている。以上のように、HPS, PHI の触媒機能だけでなく、HCHO に応答する遺伝子発現制御機構を利用した応用開発を進めている。またこれらの研究を通して、循環型資源としても注目されている C1 化合物の有効利用技術開発への展開も期待できる。