イチゴ萎黄病菌など分子マーカーによる Fusarium oxysporum の分化型・レースの診断法

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イチゴ萎黄病菌など分子マーカーによる
Fusarium oxysporum の分化型・レースの診断法
岐阜大学生命科学総合研究支援センターゲノム研究分野

須

賀

晴

久

原菌かにかかわらずすべて防除するというのでは，作業は じ め に

量 や コ ス ト が か か り 過 ぎ る こ と に な る。そ こ で F.

Fusarium oxysporum は世界中の土壌に生息し，100 種

oxysporum について，迅速簡易に病原菌（分化型やレー以上の植物に萎凋，つる割れ，根腐れ等の病害を引き起ス）を診断するための方法が求められている。ここではこす重要な病原菌である。しかし，種という単位ではな

F. oxysporum において分化型・レース特異的な PCR 用

く菌株という単位で見ると病気を起こす植物は基本的にプライマーの開発に利用されている inter-retrotranspo-

1 種ないし数種に限られている。つまり，個々の菌株に

son amplified polymorphism（IRAP）―PCR お よ び そ れは宿主植物種に対する特異性があり，例えばトマトの病を利用したイチゴ萎黄病菌の簡易診断法の開発，これま原菌株は，トマト以外のイチゴなどに病気を起こすことでに開発された F. oxysporum の分化型・レース診断用分はなく，逆にイチゴの病原菌株は，イチゴ以外のトマト

子マーカーを紹介する。

などに病気を起こすことはない。そこで，F. oxysporum

Iは宿主植物種への特異性に基づいて，例えばトマトの病

IRAP―PCR とは原菌は forma specialis（f. sp.）lycopersici，イチゴの病原

IRAP―PCR とは，ゲノム上のトランスポゾン関連配列

菌は f. sp. fragariae のように種内が分化型（f. sp.）に細間を PCR で増幅させる方法のことで，主に増幅 DNA

分化されている。また分化型によってはさらに個々の菌の多型を検出する目的に利用されている。通常トランス

株に植物品種への特異性が見られるものもあり，そのよ

ポゾンそのものを PCR で増幅するのであれば，1 ペア（2うな分化型はさらにレースとして細分化されている。植種類）のプライマーを内向きになるように用意する。こ物栽培現場では植物体や土壌等から F. oxysporum がよくれに対し IRAP―PCR では，あえて外向きのプライマー分離されるが，病原菌の特定にあたっては特に注意を要を使用して PCR を行う。外向きのプライマーで PCR をする。というのも F. oxysporum は植物病原菌ばかりでは実施すると，理論上，プライマーはゲノム DNA にアニ

なく，病気を起こさない，つまり非病原菌もあり，極端ーリングして新しい DNA 鎖を合成するが，近傍に反対な場合，病斑部から分離されたものでも必ずしも病原菌

向きにアニーリングするもう 1 種類のプライマーがないとは限らないからである。非病原性 F. oxysporum は病害

限り，指数関数的な DNA の増幅が起こらない。ここでの発生の有無にかかわらず，栽培現場で頻繁に分離され言う近傍とは PCR による増幅が可能なサイズ（距離）るが，病原菌とは形態的な見分けがつかないため，病原のことである。一般の Taq DNA ポリメラーゼの場合，菌と混同されやすい。分離された F. oxysporum が病原菌

PCR で 増 幅 で き る DNA は，数 千 bp で あ り，特 殊 なかどうかを判定するには，実際に分離菌を植物に接種しLong PCR 用のポリメラーゼを利用する場合でも 10 Kbpて病気を起こさせてみなければならない。接種試験には程度とされている。一般にゲノム上でこのような近距離

設備，知識，技術が必要なうえ，植物を栽培するためのにトランスポゾン関連配列が位置することは多くないた

期間，さらに接種して発病するまでの期間も必要で，通め，外向きのプライマーを用いた PCR ではあまり DNA

常はかなりの時間が必要となる。先に述べたように非病の増幅を期待できない。しかし，F. oxysporum の場合，原性の F. oxysporum は植物栽培現場には普遍的に存在す

これまでにゲノムから様々な種類のトランスポゾン関連

るため，F. oxysporum が分離された場合に病原菌か非病配列が多数検出されており，ゲノム全体の 5％にも達す

Diagnostic Methods of Forma Specialis Including f. sp. fragariae
and Race of Fusarium oxysporum Based on Molecular Markers.
By Haruhisa SUGAにより DNA が増幅し，その増幅パターンに種内多型もる と さ れ て い る。実 際 に F. oxysporum で は IRAP―PCR（キーワード：同定，宿主特異性，分子診断，土壌伝染性植物病
原菌，検出）

認められている。したがって，そのような増幅 DNA 中に分化型やレースに特異的なものが見つかれば，それらを診断用の分子マーカーにすることができる。本来，分化型やレースの診断ではそれらを決定している遺伝子を― 45 ―

46

植

物

防

疫

第 70 巻

診断の標的にするのが理想ではあるが，f.sp. lycopersici

第 1 号 （2016 年）

IRAP―PCR は，F. oxysporum f. sp. lactucae レース 1 診断を除いて F.oxysporum ではそのような遺伝子がわかって用分子マーカーの開発において初めて利用された

おらず，また PCR でそのような遺伝子が検出されたと（PASQUALI et al., 2007）。一方で，トランスポゾンのゲノしても必ずしもその遺伝子が機能しているとは限らな

ム内転移の性質を考慮すれば，IRAP―PCR をもとに開発い。こ の よ う な こ と か ら，こ れ ま で 開 発 さ れ た

された分子マーカーは安定しない可能性も考えられる

F.oxysporum の分化型・レース診断用分子マーカーはが，転移の頻度はよくわかっておらず，結局のところマ

IRAP―PCR を含めて RAPD など，基本的には診断したーカーとして安定性は実際に使ってみなければわからな

い分化型・レースの菌株と，それ以外の菌株との間で違い。また，トランスポゾンには移動タイプだけでなく，いを見いだして分子マーカー化したものである。したが増幅タイプもある。増幅タイプのトランスポゾンは，ゲって，分化型・レース診断用分子マーカーの開発においノム内で増加はしても，移動してなくなることはないたては，比較株間でそのような違いを見いだせるかが成功め，そのような配列に設計されたプライマーはマーカーのカギとなる。F.oxysporum と別の菌種を識別するためとしてより安定しているかもしれない。また，移動タイの分子マーカーに比べ，F.oxysporum 内のある分化型とプのトランスポゾンでも移動の際に特有の塩基配列を残非病原性菌（あるいは別の分化型），あるいは同一分化

すものや，既に移動機能を失っているものもあり，その型内の異なるレースを識別できるような分子マーカーをような塩基配列に設計されたプライマーも安定している開発するには，遺伝的に近縁なゲノム上において識別しかもしれない。以下には IRAP―PCR を利用してイチゴ

たい株間に共通した違いを見いだすことが必要で，開発

萎黄病菌 F. oxysporum f. sp. fragariae 診断用分子マーカがより難しくなる。IRAP―PCR はそのような状況下におー を 開 発 し た 際 の 例 を 挙 げ る が（SUGA et al., 2013），

いて違いを見いだすうえで大きな利点を有している。そIRAP―PCR はこの分化型の分子マーカーの開発に限られれは，F.oxysporum から検出されているトランスポゾン

た技術ではない。他の様々な F. oxysporum の分化型ある

関連配列は種類数が多いことから，違いを見いだす際にいはレースについても，比較のための病原性，分離地，

試す外向きのプライマーの数を多くできるためである。

分離年，分離源等の多様性が確保された菌株を多数用意

例えばゲノム上で近距離に Skippy と呼ばれるトランス

できれば，IRAP―PCR で診断用分子マーカーを開発でき

ポゾンが隣り合っている場合，Skippy の外向きプライマ

る可能性がある。

ーの PCR で Skippy 間のゲノム領域が増幅することにな

IIるが，近距離であっても Skippy と，Skippy 以外のトラ
ンスポゾンが隣り合っている場合は DNA が増幅されな

f. sp.
分子マーカーの開発

診断用

いことになる。そこで例えば Skippy とそれとは別のト開発にあたってはまず，イチゴへの接種試験で病気をランスポゾンとして Hornet1 が隣り合っている場合を想起こすことを確認した F. oxysporum f. sp. fragariae を 33

定して，Skippy の外向きのプライマーと Hornet1 の外向菌株（複数地域，複数年に分離された菌株），イチゴかきのプライマーでも PCR を実施してみる。さらにプラら分離されたもののイチゴへの接種試験で病気は起こさ

イマーを変えて Hornet1 以外の様々なトランスポゾン関なかった F. oxysporum を 6 菌株（複数地域，複数年に分連配列についても同様に PCR を実施して DNA の増幅

離されたもので，ここではこれらの菌株を非病原性 F.

を試みる。隣接するトランスポゾン関連配列の方向につ

oxysporum とした）および f. sp. fragariae 以外の五つのいても，両方とも同じ方向と逆方向の場合それぞれを想分化型各 1 株づつを用意した。分離地の多様性確保の観定することになるため，PCR で DNA の増幅を試みるプ

点からは国内だけでなく外国分離菌株も使用するのが理ライマーの組合せはさらに増える。F.oxysporum からは想であるが，入手が困難だったためここでは国内分離株

少なくとも 26 ファミリーに属する様々なトランスポゾのみを使用した。最初は，f. sp. fragariae がどのようなン関連配列が検出されており，試験できるプライマーのトランスポゾン関連配列を持つのかを調べるため，通常組合せも膨大になるため，増幅 DNA の中から分化型・の，つまり内向きプライマーを用いた PCR により 7 種

レースに特異的なものを探し出せる可能性が高まってい類のトランスポゾン関連配列の検出を試みた。その結る。そ れ ま で に も F.oxysporum f. sp. albedinis や f. sp.

果，5 種類トランスポゾン関連配列が f. sp. fragariae 33

chrisanthemi, f. sp. dianthi のレース診断用の分子マーカ

菌株すべてで検出された。同様に f. sp. fragariae 以外のーの開発にトランスポゾン関連配列が利用されてきたが五つの分化型の株でもほとんどの種類のトランスポゾン，外向きのプライマーを使用する（LIEVENS et al., 2008）

関連配列が検出されたが，非病原性 F. oxysporum の株で― 46 ―

イチゴ萎黄病菌など分子マーカーによる Fusarium oxysporum の分化型・レースの診断法

47は検出されたトランスポゾン関連配列の種類数が少なかマルチプレックス PCR 溶液った。次に f. sp. fragariae 全株で検出された 5 種類のト

5X GoTaq Buffer

ランスポゾン関連配列の両端に外向きのプライマーを設

2.5 mM

dNTP

20μM

FofraF プライマー

1μl

20μM

FofraR プライマー

1μl

10μM

PFO2 プライマー

1μl

10μM

PFO3 プライマー

1μl

5U/μl

GoTaq polymerase

0.5μl

計し，f. sp. fragariae の 1 菌株，f. sp. fragariae 以外の五つの分化型各 1 菌株，非病原性 F. oxysporum の 1 菌株を用いて IRAP―PCR を行った。理論上のプライマーの組
合せは 60 通りあったが，23 通り試験したところで Han

2μl
0.8μl

と Skippy に設定した外向きプライマーで f. sp. fragariae

Mag Extractor 抽出ゲノム DNAの菌株のみに 268 bp の増幅 DNA が検出された。さらに

H2O

残りの f. sp. fragariae 32 菌株と非病原性 F. oxysporum 5

Total

2μl
0.7μl
10μl

菌株を用いて同様の IRAP―PCR を行ったところ，この268 bp の DNA の増幅が f. sp. fragariae に特異的である
こ と が 確 認 さ れ た。た だ し，PCR の 条 件 を 整 え て もIRAP―PCR に使用していたプライマーペアでは 268 bp
以外のサイズの増幅 DNA も認められていたため，増幅した 268 bp の DNA の塩基配列を決定して内側に新たな温度変化
サーマルサイクラーにはバイオラッド iCycler を使用
94℃

2分

↓
30 サイクル
94℃

1分

プ ラ イ マ ー FoFraF（設 計 当 初 の 名 前 は HS430）：5ʼ―

63℃

1分

CAGACTGGGGTGCTTAAAGTT―3ʼ と FofraR（設計当初

72℃

1分

の名前は HS432）：5ʼ―AACCGCTAGGGTCGTAACAAA―3ʼ
を設計した。このプライマーペアを使用することで余分な DNA の増幅がなくなり，F. oxysporum f. sp. fragariae
のみに 239 bp のみの DNA が増幅するようになった。ただし，上記のようにこのプライマーペアは F. oxysporum
内の比較によって開発されたものであることから，厳密には診断対象の菌株が F. oxysporum に限られることにな
る。そ こ で，EDEL et al.（2000）に よ り 開 発 さ れ た F.
oxysporum 特 異 的 PCR 用 プ ラ イ マ ー（PFO2 : 5ʼ―C C C A G G G T A T T A C A C G G T―3 ʼ と P F O 3 : 5 ʼ―
CGGGGGATAAAGGCGG―3ʼ で 70 bp が増幅する）とこ

A

B

C

（bp）
500
400
300

239 bp200
100のプライマーペアを合わせたマルチプレックス PCR に70 bp

することで，診断対象株が必ずしも F. oxysporum に限定
されないようにした。図―1 に示す条件でマルチプレッ
クス PCR を実施し，70 bp と 239 bp の両方の DNA が増幅した場合には F. oxysporum f. sp. fragariae，一方 70 bpのみの増幅が見られた場合には非病原性 F. oxysporum お
よ び い ず れ の 増 幅 も 見 ら れ な か っ た 場 合 に は F.
oxysporum 以外の菌種と判定する。ただし，FoFraF とFoFraR のプライマーペアによる PCR においては F. fujikuroi や F. graminearum からの DNA 増幅は見られてお図− 1 マ ル チ プ レ ッ ク ス PCR に よ る F. oxysporum f. sp.
fragariae の診断
FofraF, FofraR, PFO2, PFO3 プライマーによるマルチ
プレックス PCR の条件（上）とマルチプレックス
PCR の産物を 2.5％アガロースゲル電気泳動に供試した際に見られる増幅 DNA バンドのイラスト（下）．
各 レ ー ン の 上 部 点 線 は 試 料 の 電 気 泳 動 開 始 位 置．
FofraF と FofraR プライマーペアで 239 bp, PFO2 とPFO3 プライマーペアで 70 bp の DNA が増幅する．
A : F. oxysporum f. sp. fragariae, B：非病原性あるいは
f. sp. fragariae 以 外 の 分 化 型 の F. oxysporum, C : F.
oxysporum 以外の菌種．

ら ず（SUGA et al., 2013），ま た，開 発 の 経 緯 か ら し て，
このプライマーペアだけの PCR 診断に F. oxysporum 以
外の Fusarium 属菌種の菌株が用いられた場合でも，判定用 DNA と同様サイズの DNA が非特異的反応で増幅して誤った診断をしてしまうという危険性は低いと思わについては，新たにイチゴ栽培環境から分離した 157 株

れる。開発したマルチプレックス PCR の診断の正確性の Fusarium 菌株を用いて調べた。マルチプレックス― 47 ―

48

植

物

防

疫

第 70 巻

PCR で は，79 菌 株 が F. oxysporum f. sp. fragariae, 58 菌

第 1 号 （2016 年）の菌株が SIX1, SIX2, SIX3, SIX5 を有し，逆に f. sp. radi-株が非病原性 F. oxysporum, 20 菌株が F. oxysporum 以外

cis―lycopersici を含む他の分化型や非病原性 F.oxysporumの菌種と判定された。実際にそれらの株をそれぞれイチにはそれらがないことが明らかにされている（LIEVENS et

ゴ に 接 種 し た と こ ろ，マ ル チ プ レ ッ ク ス PCR で F.

al., 2009 ; van der DOES et al., 2008）。したがって，SIX1，

oxysporum f. sp. fragariae と判定された 79 菌株中の 73 菌

あるいはさらに SIX2, SIX3, SIX5 を増幅する PCR で f.

株が萎黄病を起こし，非病原性 F. oxysporum あるいは F.

sp. lycopersici の同定が可能である。さらに F.oxysporum f.

oxysporum 以外の菌種と判定された菌株はいずれも病気

sp. lycopersici では品種特異性（抵抗性遺伝子）に基づいを 起 こ さ な か っ た。マ ル チ プ レ ッ ク ス PCR で F.

て レ ー ス 1 〜 3 が 知 ら れ て い る が，レ ー ス 1 の み がoxysporum f. sp. fragariae と判定されながらイチゴへの接SIX4（AVR1）を有すること，および SIX3（AVR2）は種で病気を起こさなかった 6 菌株は再度の接種試験を行レース 2 とレース 3 の株間で 3 種類の一塩基置換が存在ってみたが，病気は起こさなかった。これらについてはすることに基づいて，レース診断用の PCR プライマー

F. oxysporum f. sp. fragariae でありながら培養中に病原性。筆者の知る限が開発されている（LIEVENS et al., 2009）を失ったもの，あるいはマルチプレックス PCR の偽陽り F.oxysporum では f. sp. lycopersici 以外に分化型の決定性 で 本 来 の 非 病 原 性 の F. oxysporum を 誤 っ て f. sp.

にかかわる遺伝子が解明された例はなく，先に述べたよfragariae と判定したものと予想されるが，不一致の原

うにこれまで F.oxysporum で報告されたきた分化型・レ因はわかっていない。

ース診断用分子マーカーはいずれも目的の分化型あるいFoFraF と FoFraR のプライマーペアが分離菌株の診はレースとそれ以外の F.oxysporum などとの比較に基づ

断だけではなく，土壌からの F. oxysporum f. sp. fragariae

いて開発されたものである。2010 年以前に開発されたの検出に利用できないかを調べるため，土壌に 102 〜

F.oxysporum の分化型・レース診断用分子マーカーにつ

105/g となるように F. oxysporum f. sp. fragariae の分生胞

い て は LIEVENS et al.（2008），お よ び SAIKIA and KADOO

子を添加し，そこから DNA を抽出して PCR を行って（2010）にまとめられている。その後開発されたものあみた。ここでは DNA の抽出前にフザリウム選択培地

るいはそれらに記載されていないものとしては，ZHANG（FoG2 液体培地；NISHIMURA, 2007）を加えて 4 日間 25℃

et al.（2005）のプライマーより特異性が高められた f.

で前培養した場合についても調べてみたところ，前培養

sp. niveum（L IN et al., 2010），f. sp. cubense（L IN et al.,なしの場合は 103/g 以上，前培養ありの場合は 102/g 以

2009 ; D ITA et al., 2010），f. sp. chr ysanthemi（L I et al.,上で診断用 DNA の増幅が確認された。検出限界は土壌

，f.
2010）
，f. sp. melonis レ ー ス 2（LUONGO et al., 2012）の種類や菌株の状態等にもよると予想されるが，本プラ

sp. ricini（REDDY et al., 2012），f. sp. cepae のタマネギ分

イマーペアは土壌から直接 F. oxysporum f. sp. fragariae

離株（SASAKI et al., 2015）診断用の PCR プライマーがあを検出することにも利用が可能で，前培養することでそる。さらに，f. sp. lycopersici については TaqMan probeの感度が上がると考えられる。

を使用した定量 PCR 法も開発されている（INAMI et al.,

III その他の分化型・レース診断用分子マーカー

2010）。

お わ り にF.oxysporum においては分化型を決定している遺伝子がほとんどわかっていない中，唯一 f. sp. lycopersici だけ

IRAP―PCR に基づく分子マーカーは，トランスポゾン

は分化型の決定にかかわる遺伝子が解明されている。

関連配列間を標的としていることから安定性について不F.oxysporum f. sp. lycopersici ではトマトへの菌が感染時

安がないわけではないが，正確性や安定性の評価にはに木部で分泌される（secreted in xylem : SIX）タンパク

様々な地域，場面で実際の利用例を蓄積させることが必

質群が調べられ，①それらの遺伝子（SIX）が第 14 染

要 と 思 わ れ る。一 方，筆 者 ら が f. sp. fragariae 診 断 用

色体に座上していること（MA et al., 2010）（ただし，こPCR プライマーを開発する過程で F. oxysporum から様々

こで全ゲノムシーケンスに用いられた 4278 菌株はレーなトランスポゾン関連配列を検出してみた結果，分化型

ス 2 で，SIX4（AVR1）を欠いていた），② SIX1（AVR3），にかかわりなく非病原菌より病原菌のほうで多くのトラ

SIX3（AVR2），SIX4（AVR1）がレースを決定する非病

ンスポゾン関連配列が検出される傾向が見られた（SUGA

原力（avirulence；AVR）遺伝子であること（HOUTERMAN

et al. 2013）。F. oxysporum f. sp. lycopersici で は SIX が 座

et al., 2008 ; 2009 ; REP et al., 2004），③ F.oxysporum f. sp.

上する染色体にトランスポゾン関連配列が多いことが報

lycopersici は分子系統的に複数の起源であってもすべて告されており（MA et al., 2010），F. oxysporum における― 48 ―

イチゴ萎黄病菌など分子マーカーによる Fusarium oxysporum の分化型・レースの診断法

49

病原性とトランスポゾンには何らかの関係があることが号 21023）「イチゴ健全種苗生産のための病害検査プロ

予想されている。筆者らが f. sp. fragariae 診断用に開発

グラムの構築」により得られた成果を含む。ここに記ししたマーカー領域の塩基配列について相同性検索をしててお礼申し上げる。

み た と こ ろ，今 年 GenBank に 登 録 さ れ た f. sp.
lycopersici IPO1530/B1 株（GenBank Accession No.
KP213325.1）に 82％（166/203 bp）の相同性が見られ，その相同性領域は SIX4（AVR1）遺伝子からわずかに 46
Kbp しか離れていないことが判明した。したがって，
IRAP―PCR に基づいて開発した分子マーカーは病原菌の迅 速 診 断 と し て の 価 値 の み な ら ず，さ ら に f. sp.
lycopersici 以外の F. oxysporum の宿主特異性決定機構を解明するための手掛かりになる可能性も秘めている。
謝辞 本文には，岐阜大学生命科学総合研究支援センター 須賀研究室学生諸氏および技術補佐員，岐阜大学
応用生物科学部 清水研究室，岐阜大学流域圏科学研究センター

景山研究室，奈良県農業研究開発センター

平山喜彦氏，栃木県農業環境指導センター 森島正二氏，
千葉県農林総合研究センター 鈴木健氏，ほか多くの関係者の協力により得られた内容および，農林水産省新
たな農林水産政策を推進する実用技術開発事業（課題番

引

用

文

献

1）DITA, M.A. et al.（2010）: Plant Pathol 59 : 348 〜 357.
2）EDEL, V. et al.（2000）: Mycol Res 104 : 518 〜 526.
3）HOUTERMAN, P.M. et al.（2008）: PLoS Pathog 4 : e1000061.
4）
et al.（2009）: Plant J 58 : 970 〜 978.
5）INAMI, K. et al.（2010）: J Gen Plant Pathol 76 : 116 〜 121.
6）LI, Y. et al.（2010）: Journal of Plant Pathology 92 : 525 〜 530.
7）LIEVENS, B. et al（2008）: Pest Manag Sci 64 : 781 〜 788.
et al.（2009）: FEMS Microbiol Lett 300 : 201 〜 215.
8）9）LIN, Y.H. et al（2009）: Eur J Plant Pathol 123 : 353 〜 365.
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10）11）LUONGO, L. et al.（2012）: Journal of Plant Pathology 94 : 193 〜
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12）MA, L.J. et al.（2010）: Nature 464 : 367 〜 373.
13）NISHIMURA, N.（2007）: J Gen Plant Pathol 73 : 342 〜 348.
14）PASQUALI, M. et al.（2007）: Phytopathology 97 : 987 〜 996.
15）REP, M. et al.（2004）: Mol Microbiol 53 : 1373 〜 1383.
16）REDDY, J.M. et al.（2012）: Eur J Plant Pathol 134 : 713 〜 719.
17）S A I K I A , R. and N. K A D O O（2010）: Molecular Identification of
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18）SASAKI, K. et al.（2015）: J Gen Plant Pathol 81 : 232 〜 236.
19）SUGA, H. et al.（2013）: Plant Dis 97 : 619 〜 625.
20）van der DOES, H.C. et al.（2008）: Environ Microbiol 10 : 1475 〜
1485.
21）ZHANG, Z. et al.（2005）: FEMS Microbiol Lett 249 : 39 〜 47.

新しく登録された農薬（27.11.1 〜 11.30）
掲載は，種類名，登録番号：商品名（製造者又は輸入者）登録年月日，有効成分：含有量，対象作物：対象病害虫：使用時期等。ただし，除草剤・植物成長調整剤については，適用作物，適用雑草等を記載。

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レタス：オオタバコガ，ハスモンヨトウ，ヨトウムシ，ナモ
グリバエ，アブラムシ類：収穫前日まで
ピーマン：オオタバコガ，アザミウマ類，アブラムシ類，コナジラミ類：収穫前日まで（73 ページに続く）― 49 ―