476

日呼吸誌

2（4），2013●ファイザーフェローシップ報告

肺胞マクロファージにおけるプロテアーゼおよびアンチプロテアーゼの発現と慢性閉塞性肺疾患との関係
石井

健男

要 旨：
【 背 景 】 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ は， 慢 性 閉 塞 性 肺 疾 患（chronic obstructive pulmonary disease：
COPD）の病態において，matrix metalloproteinases（MMPs）や cathepsins といったプロテアーゼの発現を介して重要な役割を果たしていると考えられている．肺胞マクロファージは同時に，MMPs の阻害因子である tissue inhibitors of metalloproteinases（TIMPs）および cathepsins の阻害因子である cystatin C も発現している．これらプロテアーゼおよびアンチプロテアーゼのバランスの悪化が，肺気腫の原因となっている可能性がある．
【目的】肺胞マクロファージにおける MMPs，cathepsins およびその阻害因子の発現量とその遺伝子型との関連，また発現量と COPD の表現型との関連について検討する．【方法】末梢肺に限局した肺腫瘍患者 109 人について，外科切除時に得られた肺標本の正常な部分を選び気管支肺洗浄を行い，肺胞マクロファージを採取した．この肺胞マクロファージを用い，quantitative real-time PCR により
MMPs，cathepsins，TIMPs および cystatin C の発現量を調べた．これら遺伝子のベースラインでの発現量とその遺伝子型の関連について調べた．遺伝子発現量と，肺機能検査および computed tomography（CT）-scanの結果との関連についても検討を行った．
【結果】肺胞マクロファージにおける cystatin C のベースライン
での発現量は FEV1％ predicted と正の相関にあり，MMP12 のベースライン発現量は FEV1％ predicted
および DLco/VA% predicted と負の相関にあった．cystatin C および MMP1 の遺伝子型は，それぞれの遺伝子のベースライン発現量と優位に相関していた．【結語】MMP12 の肺胞マクロファージにおける発現が
COPD と関連することが確認され，また cystatin C と COPD との関連が新たに見いだされた．

緒ゼ・アンチプロテアーゼ仮説とオキシダント・アンチオ

言キシダント仮説が存在する．また，肺胞マクロファージ，

慢 性 閉 塞 性 肺 疾 患（chronic obstructive pulmonary

主に CD8＋の T リンパ球，および好中球がその病態におdisease：COPD）は，可逆性が完全にはみられない慢

いて鍵となる役割を果たしていると考えられている1）．

性 気 道 閉 塞 に よ っ て 特 徴 づ け ら れ る 疾 患 で あ る1）．

ゆえに，肺胞マクロファージから分泌されるプロテアー

COPD は世界の慢性疾患のなかで罹患率および死亡率

ゼおよびアンチプロテアーゼが COPD の病態に重要でともに高い疾患であり，2020 年には全世界における死あると考えられる．

2）

亡原因の第 3 位に位置するであろうと推定されている ．

matrix metalloproteinases（MMPs）はコラーゲンお

COPD の最も重要なリスクファクターは喫煙であるが，よびエラスチンを分解する酵素のファミリーを形成して慢性の重度の喫煙者のうち 10〜20％のみが COPD を発おり，炎症に伴う組織の再形成や修復に大きな役割を果症する3）．また，COPD の家族集積性はその遺伝的な因たしている5）．MMP1（interstitial collagenase），MMP9子を示唆している4）．ゆえに，喫煙による気道障害への（gelatinase B）， お よ び MMP12（human macrophage

感受性の相違が存在し，この喫煙感受性がα1 antitryp-elastase）は肺胞マクロファージにより生成され，動物

sin（A1-AT）以外の遺伝因子と関連していると考えらおよび人間に関する複数の研究にて，気道炎症および肺れる3）．

気腫の形成においてこれらの MMPs が重要であると報COPDの病態については2大仮説，
すなわちプロテアー

告されている6）．
cathepsin L と S は肺胞マクロファージにより生成さ〒113‑8603 東京都文京区千駄木 1‑1‑5
日本医科大学呼吸器内科（E-mail: tishii@nms.ac.jp）

れる lysosomal cysteine proteases であり6），やはりエラ
スチンの分解を介して COPD に関与している可能性がある7）．しかしながら，COPD の病態における役割はこ肺胞マクロファージ由来プロテアーゼと COPD の関係

れまでのところ不明である．

477

理食塩液が注入されたのちに BAL 液が回収された．回

肺胞マクロファージは MMPs の阻害因子である tis-

収を助けるために組織は穏やかにマッサージされた．

sue inhibitors of metalloproteinases（TIMPs） や，ca-

BAL は 1 検体について 6〜7 回行われて 240〜480 ml がthepsin L や S を阻害する作用のある cystatin C も生成

回 収 され， 無 菌的な プラ スチ ック 瓶に 集め られ た．

する．肺気腫はプロテアーゼ・アンチプロテアーゼバラ

BAL は debris や粘液を除去すべく無菌ガーゼにてろ過

ンスが崩れるために生じると考えられることから，これされ，遠心された（250×g，10 min）
．細胞の生存率は

ら阻害因子の発現量も病態を考えるうえで重要と思われtrypan blue exclusion にて調べ，
常に 90％以上であった．

る．

細胞の分画を調べるため，Shandon® II cytocentrifuge

当研究において，我々は COPD および肺気腫の重症度を呼吸機能検査および CT-scan にて評価し，この重を用い室温で 1 時間空気乾燥させ Cytospin® preparations を行った．

症度と肺胞マクロファージにおけるプロテアーゼ

3．肺胞マクロファージの分離（MMP1，9，12，cathepsin L と S）およびアンチプロ

肺胞マクロファージは Ficoll-Hypaque® density cen-テアーゼ（TIMP1，2，3，および cystatin C）の発現量

trifugation にて分離された9）．細胞は RPMI 1640（Invit-との関連を検討した．同時に，発現量とその遺伝子型とrogen，Carlsbad，CA，USA）にて 2 度洗浄され，106の関連も検討した．

肺胞マクロファージ/ml の濃度で RPMI 1640 に再浮遊

方法

1．母 集 団された．
4．RNA 抽出および cDNA 合成
Total RNA は， 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら RNeasy®

2001 年 7 月 か ら 2004 年 11 月 に Vancouver General

Mini Kit（Qiagen GmbH，Hilden，Germany）を用いてHospital に て ス テ ー ジ I ま た は II の 末 梢 の 小 型 腫 瘍

抽出され，さらにゲノム DNA を除去 RNase-free DNase（＜3 cm）で肺切除を行った 109 人（白人 87 人，アジ

（Qiagen）にて処理された．RNA 量は Quant-iT™ Ribo-

ア人 17 人，不明 5 人）を対象とした．平均年齢は 67±

Green® RNA reagent（Molecular Probes，Inc.，Eu-

10 歳であり，49 名（45％）が男性であった．喫煙歴にgene，OR，USA）
により測定された．0.5〜1 μg の RNA

ついては current smokers が 43 名（39％），former smok-

について，200 U SuperScript® RNase H-Reverse Tran-ers が 59 人（54％）であり，
pack years は 46±25 であっscriptase（Invitrogen），40 U RNaseOUT® Recombi-

た．
術前の呼吸機能テスト（pulmonary function tests：
PFT）は ATS のガイドラインに基づき，forced expira-nant Ribonuclease Inhibitor（Invitrogen），および 0.5 μg
Oligo（dT）Primer（Invitrogen）を用いて逆転写反応を行い，20 μl の cDNA 溶液が得られた．

tory volume in one second（FEV1），forced vital capac-

5．定量的 real-time PCR

ity（FVC）， お よ び single breath diﬀusing capacity

RNA の発現の定量については，肺胞マクロファージに（DLCO）/the alveolar volume（VA）について行われた8）．

おける MMP1，MMP9，MMP12，cathepsin L，cathep-

CT-scan は対象者のうち 75 名について施行された．平sin S，TIMP1，TIMP2，TIMP3，お よび cystatin C の

均 値 は FEV1％ predicted 83，FVC％ predicted 92，

発現量について，TaqMan® システムにより ABI Prism®

FEV1/FVC 70％，および DLco/VA％ predicted 75％で7900HT Sequence Detection System（Applied Biosys-

あった．
A1-AT の遺伝子型は MM，MZ，ZZ，genotype はそ
れぞれ 97％，3％，および 0％であった．

tems，Foster City，CA，USA）を用いて 384 well platesにて行った．プライマーおよびプローブのセットは Applied Biosystems よ り 購 入 し た（Hs00272002̲m1，

当研究は University of British Columbia/Providence

Hs00233958̲m1，Hs00234579̲m1，Hs00159178̲m1，

Health Care および Vancouver Hospital and Health Sci-

Hs00266474̲m1，Hs00175403̲m1，Hs00171558̲m1，

ences Research Ethics Boards によって認可されたもの

Hs00234278̲m1，Hs00165949̲m1，Hs00264679̲m1）．

である．すべての対象者は書面となったインフォーム
ド・コンセントを受けている．

すべての PCR は，2 ng mRNA 相当の cDNA，0.5 μlの TaqMan Gene Expression Assay（20×）（プライマー

2．気管支肺胞洗浄

およびプローブが含まれている），5 μl の TaqMan 2×切除肺または肺葉について手術後 1 時間以内に無菌的Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用に気管支肺胞洗浄（bronchoalveolar lavage：BAL）がいて，最終容量が 10 μl となるようにした．サイクルの行われた．Foley catheter（14 gauge）が腫瘍を含まな条件は，95℃ for 10 min でい肺区画または肺葉への気道に挿入され，60 ml の冷生性化し，そのあと増幅および定量のサイクルを反復してDNA polymerase を活

日呼吸誌

478

Table 1
Gene
MMP1
MMP9

MMP12
Cathepsin L

Cathepsin S
TIMP2

TIMP3
Cystatin C

2（4），2013

Characteristics of SNPs and CA repeats in this study

Name of the SNP

Accession number for SNPs or repeats

SNP location from TSS（bp）

MMP1̲-1607
MMP1̲-822
MMP9̲-2997
MMP9̲-1812
MMP9̲-1562
MMP9̲CA repeat
MMP12̲-124
CTSL̲-7231
CTSL̲-1656
CTSL̲157
CTSS̲-12674
CTSS̲-958
TIMP2̲-2803
TIMP2̲3040
TIMP2̲54154
TIMP3̲-4083
TIMP3̲-1295
CST3̲7141

rs1799750
rs498186
rs4810482
rs3918241
rs3918242
D20S838
rs2276109
rs3128507
rs3118869
rs2274611
rs10888394
rs1136774
rs4789932
rs7212662
rs2277698
rs1962223
rs9619311
rs6036478

−1607
−822
−2997
−1812
−1562
between −130 and −90
−124
−7231
−1656
157
−12674
−958
−2803
3040
54154
−4083
−1295
7141

TSS, transcription start site.

行った（95℃ for 15 s，60℃ for 60 s with a single ﬂuo-

rithm にて選択した．ハプロタイプブロックの定義はrescence measurement）．各サンプルについて 3 回の計

Gabriel ら15）の報告に従い，tag SNPs は LD threshold を測を行った．

r2 ≥ 0.8 および minor allele frequency ≥ 0.10 として選択

threshold cycle は SDS 2.1 software（Applied Biosys-

した．MMP1 および MMP12 については適切なハプロtems）を用いて決定した．Muller ら の方法に従い，タイプブロックを見いだすことができなかったため，プ遺伝子発現量は calibrator sample（当研究の対象ではな

ロモーター領域が存在すると考えられる転写開始位置か

10）い，肺胞マクロファージからの cDNA サンプル）によら 2,000 塩基上流までの領域について HapMap data かり標準化され，同時に reference gene である guanine

ら SNPs を， す な わ ち MMP1 に つ い て rs498186 を，

nucleotide binding protein, beta polypeptide 2-like 1

MMP12 について rs2276109 を選択した．

（GNB2L1）（COPD の疾患重度にかかわらず肺胞マクロTIMP1 については上記の方法で適切な遺伝子多型をファージの中で最も量的に安定して発現されていると選択できなかったため，10 人の対象についてプロモー

我々が報告11））の発現量により，標準化されている．

ター領域と転写制御因子を含むとされるイントロン 1 を

6．genotyping

含む転写開始場所から−1783 bp より＋857 bp までにつ

1）SNP など遺伝子多型の選択

いて，シークエンシングを行った16）〜18）．しかしながら，論文などによる既報告に基づき，あるいは HapMap

minor allele frequency ≥ 0.10 である SNPs を見いだすこ（http://www.hapmap.org/）においてプロモーター領域とはできなかった．

を含むハプロタイプブロックを調べそのブロックに含ま

2）genotypingれる遺伝子多型［single nucleotide polymorphism（SNP）など］を，MMPs，cathepsins，TIMPs，および cystatin
C について選択した（Table 1）．
まず，COPD と関連があるとされた SNP を選択した．

ゲ ノ ム DNA は 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら DNeasy
Blood ＆ Tissue Kit を用いて抽出した．
上述の SNPs のうち 15 個と A1-AT Z allele19）については 5́ to 3́ exonuclease TaqMan assays（Applied Bio-

す な わ ち，MMP1 の rs1799750，MMP9 の D20S838 お

20）にて，ABI TaqMan Assays-on-Demand（Tasystems）

よ び rs3918242，MMP12 の rs2276109， お よ び TIMP2

ble 1）をプライマーおよびプローブとして用いて遺伝の rs2277698 である．

12）〜14）

他 の す べ て の SNPs は HapMap の デ ー タ を も と に子型を決定した．
MMP1 の rs1799750 および MMP9 の rs3918242 の遺

Haploview 3.2 software（http://www.broad.mit.edu/

伝子型については，以前の報告に準拠して restriction

mpg/haploview）（Copyright© 2003‑2005 Whitehead In-

fragment length polymorphism を行った12）21）．rs1799750

stitute for Biomedical Research）を用いて tagging algo-の PCR プライマーは forward：5́-TGACTTTTAAAA-

肺胞マクロファージ由来プロテアーゼと COPD の関係

CATAGTCTATGTTCA-3́ お よ び reverse：5́-TCTT-

479

erate emphysema を−855 Hounsﬁeld units をカットオ

GGATTGATTTGAGATAAGTCATAGC-3́ で あ る．

フ 値 と し， ま た severe emphysema に つ い て は−950

PCR 産物を制限酵素

Hounsﬁeld units をカットオフ値とした21）．定量的解析

I（New England BioLabs Inc.，

Beverly，MA）にて分解し電気泳動を行い，homozy-は 45 人の対象について行われた．

gous 2G/2G alleles は 269 bp，一方 homozygous 1G/1G

8．統計解析

alleles は 241 と 28 bp の バ ン ド が み ら れ，heterozy-

Hardy-Weinberg equilibrium については，R-genetics

gotes はこれらのバンドの組み合わせとなった（269，

package（http://cran.r-project.org: authors of the．rs3918242 に つ い て は sense primer：
241，28 bp）

package are Gregory Warnes and Friedrich Leisch）を

5́-GCCTGGCACATAGTAGGCCC お よ び antisense

用いて計算した．他のすべての統計処理は SPSS soft-

primer：5́-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC を用い，アware version 13.0（SAS Institute Inc.，Cary，NC，

ニーリング温度を 60℃として PCR を行った．435 bp のUSA）を用いて行われた．結果は mean［standard de-

PCR 産物について 5 U の制限酵素

viation（SD）］にて示した．直線回帰解析は，mRNA

I（New England

BioLabs Inc.）にて処理し電気泳動した．homozygous C

expression と PFT あるいは定量的 CT-scan データとのの遺伝子型（CC）では 435 bp のバンドのみみられ，相関について調べるうえで用いられた．直線回帰は遺伝

homozygous T 遺 伝 子 型（TT） で は 188 bp と 247 bp

子型と mRNA expression の相関，また遺伝子型と PFTの 2 本のバンド，heterozygous の遺伝子型（CT）ではあるいは定量的 CT-scan データとの相関を調べるため

これらすべてのバンドがみられた．

に も 用 い ら れ， こ の 際 遺 伝 子 型 に つ い て は additive

MMP9 遺伝子における CA repeats の数の決定は Ge-

model を用い，p-value は Wald test statistic に基づいて

neScan 解 析 を 用 い て 行 っ た． ラ ベ ル し て い な い for-

計算された．半定量的肺気腫スコアと gene expression

ward primer：5́-GAGGTGGTGTAAGCCCTTTCT-

levels あるいは遺伝子型の相関については ordinal re-

CATGC お よ び TAMRA で 蛍 光 ラ ベ ル し た primer：gression を用いた．年齢，
性別，人種および喫煙歴（pack5́-ATGGTGAGGGCAGAGGTGTCTGACT，0.5 Uyear）にて補正を行った．

DNA polymerase（Qiagen）を用いてアニーリング温度

各対象のハプロタイプは PHASE version 2.027）28）を用62℃とし 35 サイクルの PCR を行った．その後 PCR 産

いて推定を行った．ハプロタイプと他の因子の相関につ物 は internal standard（GeneScan-400 ROX，Applied

いての直線回帰解析は，Hapassoc program for the R

Biosystems） と 混 合 し て， ア レ ル は ABI PRISM 377

package を用いて行った．ハプロタイプと mRNA ex-

slab-gel sequencer（Applied Biosystems） に て 分 離，pression，PFT または定量的 CT-scan データとの相関

Genotyper 3.7 software（Applied Biosystems）にてアは直線回帰にて評価した．confounding および adjust-

レルの決定を行った．CA repeats を含んでいる DNA

ment variables としては年齢，性別，人種，および喫煙

standards は直接シークエンシングにてリピート数を決歴（pack years）を用いた．

定し positive controls として各実験に用いた．アレルはp＜0.05 を有意とした．多重解析となることから，

short（16 CA repeats 以 下 ） お よ び long（17 CA re-

Bonferroni correction を 行 っ た．Bonferroni-corrected12）と定義した．
peats 以上）

p-values を適時表示した．当研究デザインのパワーにつ

template なしのコントロールと遺伝子型のわかっていては PASS 2005（Hintze J. NCSS and PASS. Number

いるコントロールは，すべてのアッセイにて用いられた．

Cruncher Statistical Systems. 2004; Utah: Kaysville.

7．CT-scan morphometry
半定量的肺気腫スコアは，2 人の独立した読影者にて75 の対象について決められた．読影者は肺気腫を 6 段
階にスコア化した（0：no emphysema，5：＞75％ emphysema） ．肺実質の定量的解析は以前報告されてい22）

www.ncss.com）を用いて評価した．

結果

1．プロテアーゼおよびアンチプロテアーゼの遺伝子
発現と COPD 形質との関連る方法を用いて行われた23）24）．肺実質は胸壁および大血

プロテアーゼ（MMPs と cathepsins）およびアンチ管から contour-following algorithm にて分離および分画

プロテアーゼ（TIMPs と cystatin C）の mRNA 発現量化された．肺容量はすべてのスライスにおける voxel のと COPD 形質，すなわち呼吸機能検査と CT-scan デー

数を合計して voxel の容量で乗じ合計を計算した．肺のタの関連について解析を行った．呼吸機能検査としては

CT 濃度（g/ml）は各 voxel の X-ray の減衰度から推定

FEV1％ predicted，carbon monoxide diﬀusing capacity

された25）26）．肺の重量および空気の容量は，肺の容量と（DLco）/alveolar volume（VA）％ predicted， お よ び

濃度の測定値から計算された23）24）．肺気腫は mild/mod-

residual volume（RV）/total lung capacity（TLC）につ

480

日呼吸誌

2（4），2013

A

B

Fig. 1 Relationship between MMP12 mRNA expression level in alveolar macrophages and FEV1％ predicted（A）and DLco/VA％ predicted（B）without any adjustment in a whole population. Regression lines are also
shown. The expression level of MMP12 showed a significant inverse association with all of these PFT data.

いて，それぞれ慢性気道閉塞，diﬀusion capacity および

DLco/VA％ predicted と の 相 関 は Bonferroni correc-

air trapping または hyperinﬂation を評価するために解tion 後も有意であった（データなし）．

析することとした．CT-scan データは半定量肺気腫スコ

肺胞マクロファージにおける cystatin C のベースライ

アおよび 2 種類（肺気腫の存在，および重度の肺気腫のン 発 現 量 は FEV1％ predicted（Fig. 2A） お よ び RV/

存在について）の定量的な肺気腫評価を行った24）29）．

TLC％（Fig. 2B）と有意な正の相関を示した．Bonfer-

肺胞マクロファージにおける MMP12 のベースライン
発 現 量 は FEV1％ predicted お よ び DLco/VA％ predicted と の 有 意 な 負 の 相 関 を 示 し（Fig. 1A，B），

roni correction 後は，白人においてのみ有意であった（データなし）．

肺胞マクロファージ由来プロテアーゼと COPD の関係

481

A

B

Fig. 2 Relationship between cystatin C mRNA expression level in alveolar macrophages and FEV1％ predicted（A）and RV/TLC ％（B）without any adjustment in a whole population. Regression lines are also shown. The
expression level of cystatin C showed a significant positive association with all of these PFT data.

2．プロテアーゼとアンチプロテアーゼの遺伝子型おHardy-Weinberg equilibriumから期待されるものとなっ

よびハプロタイプと，その発現量またはその変化ているかどうかについて検討した．最大多数である白人との関連の母集団においてすべての遺伝子多型は Hardy-Wein-

次に，これらの遺伝子の多型が遺伝子発現量を変化させ，ひいては喫煙者の COPD 感受性を変化させるかどうかについて検討を行った．

berg equilibrium にあった（データなし）．
MMP1 mRNA のベースライン発現量は MMP1̲-1607の 1G アレルの数の増加と正の相関を示した（Fig. 3A）．

まず，肺癌患者からサンプルを集めたことを含め se-

この相関はハプロタイプ解析でも示された．LPS また

lection bias の可能性を調べるため，遺伝子型の頻度がは TNF による MMP1 の発現量変化もこのアレルとの

482

日呼吸誌

2（4），2013

A

B

Fig. 3 Some genotypes affected their gene expression levels in alveolar macrophages.（A）MMP1
mRNA basal expression was positively associated with increasing number of 1G alleles of
MMP1̲-1607.（B）Cystatin C mRNA basal expression was positively associated with increasing
number of C alleles of CST3̲7141.

関連がみられ，これらの関連はハプロタイプ解析でも示CST3̲7141 の C アレルの数の増加と正に相関しておりされた．

（Fig. 3B） 肺 胞 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る cystatin C

cystatin C mRNA の ベ ー ス ラ イ ン 発 現 量 は，mRNA のベースライン発現量は FEV1％ predicted とCST3̲7141 の C アレルの増加と正の相関を示した（Fig.

有 意 な 正 の 相 関 を 示 し て い た こ と か ら（Fig. 2A），

3B）．TNF-α に よ る cystatin C の 発 現 量 の 変 化 も

CST3̲7141 の C アレルの数の増加が FEV1％ predicted

CST3̲7141 の C アレルの増加と正の相関を示した ．

と関連していることが期待された．しかしながら，これ3．プロテアーゼおよびアンチプロテアーゼの遺伝子

らのアレルと FEV1％ predicted の直接的な関係は，母型およびハプロタイプと COPD 形質との関連

集団全体においても白人のみにおいてもみられなかっcystatin C mRNA の ベ ー ス ラ イ ン の 発 現 量 はた．

肺胞マクロファージ由来プロテアーゼと COPD の関係

考483

MMP12 の増加は細胞外器質の分解を直接的にあるい

察は TNF の活性化を介して進めると考えられることか

当研究において，肺胞マクロファージにおける cys-ら34），MMP12 の発現量の変化は FEV1％ predicted だtatin C のベースライン発現量が FEV1％ predicted と正けでなく DLco/VA% predicted とも相関したと考えらの相関を示し，また MMP12 のベースライン発現量がれる．

FEV1％ predicted および DLco/VA predicted と負の相

cystatin C 発現量の増加は，エラスチンの分解能を有関を示した．cystatin C および MMP1 の遺伝子型はそするcathepsin LおよびSの活性を減少させると考えられ，のベースライン発現量と相関を示した．

ゆえに，細胞外器質の安定および肺気腫の病態進行の阻

喫煙および他の空気中の刺激物質は肺胞マクロファー

害につながると想定される．cystatin C の発現量と PFT

ジ を 刺 激 し て MMPs お よ び cathepsins の 産 生 を 促

データとの相関は白人集団のみにてより強いものであっす30）〜32）．MMP1 はコラーゲンを分解し，また MMP9，たことから，cystatin C は白人における COPD の病態

12，cathepsin L および S はエラスチンを分解する ．

にて重要な役割を果たす可能性がある．cystatin C の発

33）

コラーゲンとエラスチンの分解は，肺気腫および気道の現量は FEV1％ predicted および RV/TLC ％と相関しリモデリングに導く．さらに，MMP12 は TNF-αの活ていたが DLco/VA との相関はみられなかった．よって，性化を介して好中球をも刺激し，活性化された好中球は

cystatin C は肺気腫よりも気道のリモデリングに関与しMMP9，neurtrophil elastase および cathepsin G の産生ている可能性がある．

によりエラスチンの分解および肺気腫を導きうると考え

当研究の遺伝子発現量とそのほかの因子の相関の解析られる ．tissue inhibitor of metalloproteinases およびにおいては，いくつかの問題点も存在する．PASS 2005

cystatin C はアンチプロテアーゼとして働き，肺気腫のsoftware を用いて推定すると，109 人の対象を用いて遺進行を防ぐ可能性がある ．

伝子発現量と COPD 形質の間の相関をみる場合，相関

34）

35）

COPD の病態においてプロテアーゼおよびアンチプ

が 0.3 以上の場合のみ 80％の検出力が得られる．RV/

ロテアーゼが役割を果たしているとする報告は，多く存

TLC および DLco/VA％ predicted および CT-scan デー

在する．気道閉塞を伴う喫煙者は，COPD でない喫煙タについてはより対象数が少ないことから，遺伝子発現者 や 非 喫 煙 者 と 比 較 し て 肺 に お け る MMP1 お よ びと COPD 形質の相関の検出力はより弱いと考えられる．

MMP9 の発現が多いとされ36），MMP12 についても同様

さらに，母集団の 58.7％は GOLD 0 と重症の肺気腫は少の報告がみられる ．MMP1，9 および 12 の遺伝子多型

ないことから，CT-scan による肺気腫の計測が困難となと，COPD あるいはその関連形質との間に相関がみらり，遺伝子発現と CT-scan データとの相関を検出でき37）れるとする報告が複数あげられている．ヒト

12）14）38）〜40）

なかった原因の一つとなった可能性がある．

MMP1 を過剰発現するトランスジェニックマウスは，遺伝子発現における遺伝子多型の役割についても多くヒトの肺気腫と同様の形態上の変化がその肺にみられの報告がみられる．卵巣癌の癌組織における MMP1 のた41）．MMP12 ノックアウトマウスは喫煙曝露しても肺発現は，MMP1̲-1607 において 2G アレルを有している気腫を形成せず ，喫煙刺激による肺傷害に MMP12 の場合に，より高いとする報告がみられる48）．transfection

存在が重要であることが示唆された．TIMPs と COPD

による実験で，またDNA-protein interaction assaysにて，病態の相関についても，TIMP2 の＋853 G/A SNP のア

MMP9̲-1562 において T アレルを有する場合に，より42）

レル頻度が日本人において COPD と関連していると報高いプロモーター活性が MMP9 にて得られるとする報

告されており13），その遺伝子型頻度がエジプト人におい告もある49）．MMP12̲-124 の A アレルは AP1 の結合をて COPD と 関 与 し て い る と も 報 告 さ れ て い る43）．

強 め MMP12 の プ ロ モ ー タ ー 活 性 を 上 げ る こ と がMMP9/TIMP1 比率は慢性気管支炎にて気道閉塞と相関にて観察されている50）．cystatin C の主なハプロタ

しているとの報告もある44）．気腫肺における MMP を介イプである−82G/−5G/＋4A が血清 cystatin C 濃度とした細胞外器質の分解および組織のリモデリングにおい

関連し，その homozygous にて血清濃度が最高と報告て MT1-MMP/MMP2/TIMP2 が重要な役割を果たしてされている51）．cathepsin L，S および TIMPs についているとされる45）．TIMP3 ノックアウトマウスは進行性

遺伝子多型と発現量との相関に関する報告はみられなの気腫の拡大とコラーゲンの分解がみられた ．sub-

い．

46）

clinical な肺気腫患者の気管支肺胞洗浄液において ca-

当研究において，MMP1 mRNA のベースライン発現

thepsin L および cystatin C の濃度が上昇していたとの量は MMP1̲-1607 の 1G アレルの増加と正の相関を示し報告もあるが47），これらの遺伝子の多型と COPD とのた．この結果は他の組織における報告と正反対のもので関係についての報告はみられない．

ある48）．よって，1G アレルと MMP1 発現量について本

484

日呼吸誌

2（4），2013

研究にて観察された結果は，肺胞マクロファージに特異者についての同様の研究を進めており，本研究での結果的なものである可能性がある．ハプロタイプ G−519-C−340を確認できるものと考えている．

がより強いプロモーター活性を持つという報告が近年な本研究にて，我々は MMP12 が COPD における気道

され また MMP1 のプロモーター領域は HapMap デー

閉塞に寄与することを確認した．また，cystatin C の発

52）

タによるハプロタイプブロックをプロモーター領域に有現量と COPD 形質の相関を新たに見いだし，このアン

さないことから，MMP1 のプロモーター制御について

チプロテアーゼが cathepsins による障害から肺を防御はより多くの SNP を用いた検討が必要であると考えらしていることを示唆した．cystatin C は発現量と遺伝子れる．

型に有意な相関がみられたことから，同遺伝子について

MMP12̲-124 は MMP12 のベースラインでの発現量おの SNP も COPD 形質に影響を及ぼす可能性があり as-

よび発現の変化と相関しておらず，COPD 形質とも相

sociation studiesにおける候補SNPとなると考えられる．

関していなかった．MMP12 のベースラインでの発現量

MMP とその阻害因子だけでなく cathepsins とその阻害は COPD 形質と有意に相関していたことから，その発因子についても，COPD の病態における役割について，

現および mRNA の安定性を制御する遺伝子領域を特定

より大きな母集団を用いての検討が必要と考えられる．

することは重要であり，MMP12̲-124 を含むハプロタイ
プブロック（プロモーター領域を含んでいた）の上流および下流にわたり検索の必要があると思われる．

※本論文に記述した内容を含む拡大研究結果について，European Respiratory Journal にて掲載予定である．

肺胞マクロファージにおけるcystatin C mRNAのベー

引用文献

スライン発現量は，CST3̲7141 の C アレルの増加と正の相関を示した．プロモーターおよびエクソン 1 における cystatin C のハプロタイプが cystatin C の血清濃度と関連していることが報告されており51），このハプロタ
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の既報告のプロモーターハプロタイプにより制御されている可能性がある．CST3̲7141 の C homozygotes が最も高い FEV1.0％ predicted を有していたが，この結果
は統計学的には有意でなかった．
当研究において，遺伝子多型とそのほかの因子の相関の 解 析 にお い て も，いくつかの問題点も存在 する．
PASS 2005 software を用いた推定より，遺伝子多型と遺伝子発現量との相関の検出力は，遺伝子型におけるサ
ンプルサイズ，遺伝子発現量におけるグループ内の SDのため，ほとんどの SNP について低いと考えられた．
遺伝子型と COPD 形質との相関についても，検出力にばらつきがみられ，80％を下回ることが多かった．ゆえに，遺伝子型と発現量あるいは COPD 形質との相関を検出するために，より大きな母集団を用いる必要があると考えられた．
さらに，肺癌患者からの肺胞マクロファージを用いたことから，母集団についてバイアスがかかっている可能性がある．母集団中の白人集団について Hardy-Weinberg equilibrium がなりたっていることはすべての SNPについて確認したが，いくつかの SNP が COPD 同様肺癌集団に偏っている可能性がある．MMP の多型と肺癌との相関を認める報告もみられる21）．この疑問を解消するため，我々は現在肺癌患者でない喫煙者および既喫煙

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