利用成果報告書
1 課題番号

H27-007

2 報告者

鈴木 洋史

3 利用区分

成果公開有償利用

4 利用課題名

複数の主要適合遺伝子複合体対立遺伝子に対して使用可能なT細胞受容体ファージライブラリの作製

5 使用装置名

BIACORE 分子間相互作用解析装置

6 利用期間平成 27 年

国立大学法人東京大学医学部附属病院薬剤部研究室

5月25日 〜 平成28年

3月31日

【序論】
ファージディスプレイ法を用いたT細胞受容体（TCR）ライブラリ作製に向け、その鋳型の選定を目的に、特定の遺伝型の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に対してTCRを表面に発現したM13ファージ（TCR-ファージ）を数種作製し、いずれのTCRファージが胸腺教育過程を経た適切な結合能（Kd 100μM）を持つかを評価しようとした。そこで、BIACORE T-100を使用させていただき、MHCを固相化した流路に対しTCR-ファージを流した際の流路上の質量変化を測定することで、その結合能の評価を試みた。
【方法・結果】
まず、結合能を有することが既知であるhuman MHC A*02:01とhuman TCR 868の組合せを用いてMHC固相化条件の検討とMHC-TCR相互作用を検出するコントロール実験を行った。human TCR 868とファージの外殻タンパク質g3pの融合タンパク質の発現系を構築し、調整法上の上限となる濃度（40nM）でTCR-ファージを調整した。このファージ溶液を用いた際、MHCの分子量（~57kDa）とTCR-ファージの分子量（16.3MDa）、想定する解離定数（Kd 100μM）を考慮して、MHCの固相化量と検出されるシグナルの関係を計算したところ、この条件下において固相化量を1,000RUとすることで、~109RUという測定に十分なシグナルが検出されると考えられた（式）。そこで、double Hisタグの付加されたMHC組換えタンパク質をNi-NTA chip上へ流すことで、キレート形成によりMHCの固相化を行い、1,300RUという固相化量にて安定して達成できる条件を決定した。また、対照群としてMHCの構成分子であるβ2-microglobulin（β2m）を設定し、double Hisタグ付加組換えタンパク質を作製し、その分子量（~14kDa）を考慮したうえで適切な量（~370RU）を固相化できる条件を決定した。この固相化流路に対してTCR-ファージを流したところ、MHC固相化条件とβ2m固相化条件において同等のシグナルが観測された（表）。また、Niを除いたNTA流路に対して同TCR-ファージを流したところ、タンパク質非固相化かつNi非存在条件においてはシグナルが大きく減弱した（表）。さらに、別日の検討にて、タンパク質を固相化せずNiを添加した条件において、MHC固相化条件、β2m固相化条件と同程度のシグナルが検出されることを確認した。
【まとめ・考察】
結果から、TCR-ファージがNi依存的にchip表面に結合していることが想定された。また、今回使用したM13ファージ粒子はその全長が800nmである一方、BIACOREの検出原理ではchipから300nmまでの範囲の質量変化しか検出できない。このため、
M13ファージの使用が不適切であったことも、MHC-TCR特異的な相互作用の検出がなされなかった原因として考えられた。
以上、BIACORE T-100を用いた実験は行われたが、その結果、実験系の再考が必要と考えられたため、現在検討中である。
利用成果・実績 【序論】
7の概要
ファージディスプレイ法を用いたT細胞受容体（TCR）ライブラリ作製に向け、その鋳型の選定を目的に、特定の遺伝型の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に対してTCRを表面に発現したM13ファージ（TCR-ファージ）を数種作製し、いずれのTCRファージが胸腺教育過程を経た適切な結合能（Kd 100μM）を持つかを評価しようとした。そこで、BIACORE T-100を使用させていただき、MHCを固相化した流路に対しTCR-ファージを流した際の流路上の質量変化を測定することで、その結合能の評価を試みた。
【方法・結果】
まず、結合能を有することが既知であるhuman MHC A*02:01とhuman TCR 868の組合せを用いてMHC固相化条件の検討とMHC-TCR相互作用を検出するコントロール実験を行った。human TCR 868とファージの外殻タンパク質g3pの融合タンパク質の発現系を構築し、調整法上の上限となる濃度（40nM）でTCR-ファージを調整した。このファージ溶液を用いた際、MHCの分子量（~57kDa）とTCR-ファージの分子量（16.3MDa）、想定する解離定数（Kd 100μM）を考慮して、MHCの固相化量と検出されるシグナルの関係を計算したところ、この条件下において固相化量を1,000RUとすることで、~109RUという測定に十分なシグナルが検出されると考えられた（式）。そこで、double Hisタグの付加されたMHC組換えタンパク質をNi-NTA chip上へ流すことで、キレート形成によりMHCの固相化を行い、1,300RUという固相化量にて安定して達成できる条件を決定した。また、対照群としてMHCの構成分子であるβ2-microglobulin（β2m）を設定し、double Hisタグ付加組換えタンパク質を作製し、その分子量（~14kDa）を考慮したうえで適切な量（~370RU）を固相化できる条件を決定した。この固相化流路に対してTCR-ファージを流したところ、MHC固相化条件とβ2m固相化条件において同等のシグナルが観測された（表）。また、Niを除いたNTA流路に対して同TCR-ファージを流したところ、タンパク質非固相化かつNi非存在条件においてはシグナルが大きく減弱した（表）。さらに、別日の検討にて、タンパク質を固相化せずNiを添加した条件において、MHC固相化条件、β2m固相化条件と同程度のシグナルが検出されることを確認した。
【まとめ・考察】
結果から、TCR-ファージがNi依存的にchip表面に結合していることが想定された。また、今回使用したM13ファージ粒子はその全長が800nmである一方、BIACOREの検出原理ではchipから300nmまでの範囲の質量変化しか検出できない。このため、
M13ファージの使用が不適切であったことも、MHC-TCR特異的な相互作用の検出がなされなかった原因として考えられた。
以上、BIACORE T-100を用いた実験は行われたが、その結果、実験系の再考が必要と考えられたため、現在検討中である。
（次ページに原文を掲載）
8

社会・経済への波及効果

9 学会等における口頭・ポスター発表

該当無し

10 学会誌・雑誌等における論文掲載

該当無し

東京大学大学院薬学系研究科
ワンストップ創薬共用ファシリティセンター

【序論】
ファージディスプレイ法を用いた T 細胞受容体（TCR）ライブラリ作製に向け、その鋳型の選定を目的に、特定の遺伝型の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に対して TCR を表面に発現した M13 ファージ（TCR-ファージ）を数種作製し、いずれの TCR-ファージが胸腺教育過程を経た適切な結合能（Kd 100µM）を持つかを評価しようとした。そこで、BIACORE
T-100 を使用させていただき、MHC を固相化した流路に対し TCR-ファージを流した際の流路上の質量変化を測定することで、その結合能の評価を試みた。
【方法・結果】
まず、結合能を有することが既知である human MHC A*02:01 と human TCR 868 の組合せを用いて MHC 固相化条件の検討と MHC-TCR 相互作用を検出するコントロール実験を行った。
human TCR 868 とファージの外殻タンパク質 g3p の融合タンパク質の発現系を構築し、調整法上の上限となる濃度（40nM）で TCR-ファージを調整した。このファージ溶液を用いた際、MHC の分子量（~57kDa）と TCR-ファージの分子量（16.3MDa）、想定する解離定数（Kd 100µM）を考慮して、MHC の固相化量と検出されるシグナルの関係を計算したところ、この条件下において固相化量を 1,000RU とすることで、 TCR-ファージ MHC TCR-ファージ結合部位TCR-ファージ結合量~109RU という測定に十分なシグナルが検出されると考えられた（式）。そこで、double
His タグの付加された MHC 組換えタンパク

固相化量

分子量濃度16.3𝑀𝐷𝑎
40𝑛𝑀
𝑅 = 1000𝑅𝑈 ××1×= 109𝑅𝑈
60𝑘𝐷𝑎
100𝜇𝑀
MHC分子量 想定解離定数式：MHC固相化量とTCR-ファージ結合量の関係

質を Ni-NTA chip 上へ流すことで、キレート形成により MHC の固相化を行い、1,300RU という固相化量にて安定して達成できる条件を決定した。また、対照群として MHC の構成分子である β2-microglobulin（β2m）を設定し、double His タグ付加組換えタンパク質を作製し、その分子量（~14kDa）を考慮したうえで適切な量（~370RU）を固相化できる条件を決定した。この固相化流路に対して TCR-ファージを流したところ、MHC 固相化条件と β2m 固相化条件において同等のシグナルが観測された（表）。また、Ni を除いた NTA 流路に対して同 TCR-ファージを流したところ、タンパク質非固相化かつ Ni 非存在条件においてはシグナルが大きく減弱した（表）。さらに、別日の検討

表：コントロール実験の結果

にて、タンパク質を固相化せず Ni を添加した条件

流流路路

固相化量量(RU)TCR-ファージ
結合量量(RU)

において、MHC 固相化条件、β2m 固相化条件と同A*02:01
β2mNTA1310377-25330945程度のシグナルが検出されることを確認した。
【まとめ・考察】

結果から、TCR-ファージが Ni 依存的に chip 表面に結合していることが想定された。また、今回使用した M13 ファージ粒子はその全長が 800nm である一方、BIACORE の検出原理では chip から 300nm までの範囲の質量変化しか検出できない。このため、M13 ファージの使用が不適切であったことも、MHC-TCR 特異的な相互作用の検出がなされなかった原因として考えられた。以上、BIACORE T-100 を用いた実験は行われたが、その結果、実験系の再考が必要と考えられたため、現在検討中である。