かび由来アスパルティックプロテアーゼを用いた
色素タンパク質の脱色 研究期間：2012年～現在に至る
研究背景・目的【目的】【研究背景】

本研究では、色相の変化に関わるアスパルティッ
クプロテアーゼの働きを調べるとともにこの酵素を他分野でも利用するためにその能力を評価しています。

日本の伝統食品であるかつお節には、大きく分けて荒節と枯節という2種類の製品が存在します。原
料のかつおをおろし、熱水で煮たかつお肉を煙で燻した（焙乾）だけのものを荒節と呼び、荒節をアス
ペルギルス属のかつお節かびを使って発酵させたものを枯節と呼びます。かび付けの技法は、冷蔵や冷凍技術がなかった江戸時代に確立された保存法です
が、輸送技術が進歩した今でも続けられています。
それはかび付けの効用であり、①水分含量の低下（雑菌が生えにくい）、②脂質の分解（あぶら焼けの防止）、③旨味の向上、④まろやかな香味、⑤色相の変化などが挙げられます。

実験概要

A408 nm

0.20
0.15
0.10
0.05
0
0

0.1

ETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG

ヘムタンパク質は、PepAにより限定分解を受けて、ヘム（赤色）が遊離する。その後、酸化還元酵素系によって，ヘム⇒ビリベ
ルジン⇒ビリルビン（黄色）へと代謝される。⇒脱色につながる。

かび付け(荒節) 工程

PepA_A_awamori
PepA_A_niger1
PepA_A_niger3
PepA_A_phoenicis1
PepA_A_phoenicis2
PepA_A_fumigatus1
PepA_A_oryzae1
PepA_A_oryzae2
PepA_P_chrysogenum(枯節)20~24%

14~15%

水分含量の低下

香味の付与( O-メチル化)

脂肪の分解(リパーゼ)

色相の変化（PepA）

かび付けの
役割・意義

【PepAの大量調製】
P. pastorisに
よる大量発
現の検討

pro-mature, 1.13 kb

培養条件の検討

20 40 60 80 100
M 1

遺伝子ク
ローニン
グと解析

反応時間

【PepAによる限定分解】

焙乾

pepA

ミオグロビン+酵素

MGLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHP

煮熟

精製

ミオグロビンのみ

結果と考察

A. glaucus
A. repens【PepAの精製・特性解析】【脱色因子の検索】

色素タンパク質の分解・脱色がアスパルティックプロテアーゼ（PepA）によるものであり、脱色活性を追いかけました。

鰹節（枯節）の製造工程

2

3

4 5

6

7

8

9 10 11簡便な精製法の検討

PepA_A_fumigatus3
PepA_A_niger2
PepA_A_oryzae3
PepA_B_cinerea
PepA_A_nidulans
PepA_P_janthinellum
PepA_MK82【PepAの活用】【PepAの性質】
PepAは、中性領域まで安定で、室温でも約一か月活性を維持しました。また、界面活性剤や漂白剤に対しても安定でした。

Blood fromchickenControl (-Enz.)+Recombinant
protease【鰹肉の脱色】
PepAを用いてミオグロビン溶
液と鰹節片が脱色されるか調べると、確かに脱色が見られた。
C

S

C

S

血液を滴下した布（左）は、洗濯洗剤のみではシミが残ってしまうが（中央）、PepAと組み合わせると洗い上がりがよくな
ります（右）。

神戸大学大学院 農学研究科 微生物資源化学研究室
竹中 慎治 連絡先：stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

発表論文
1.

Lim L, Senba H, Kimura Y, Yokota S, Doi M, Yoshida K, and Takenaka S. Influences of N-linked
glycosylation on the biochemical properties of aspartic protease from Aspergillus glaucus MA0196.
Process Biochem. 79:74-80 (2019). doi: 10.1016/j.procbio.2018.12.017

2.

Takenaka S, Lim L, Fukami T, Yokota S, Doi M. Isolation and characterization of an aspartic proteaseable to hydrolyze and decolorize heme proteins from Aspergillus glaucus. J Sci Food Agric. 2018 Sep 6.
doi: 10.1002/jsfa.9339.

3.

Takenaka S, Umeda M, Senba H, Koyama D, Tanaka K, Yoshida KI, Doi M. Heterologous expression
and characterisation of the Aspergillus aspartic protease involved in the hydrolysis and decolorisationof red-pigmented proteins. J Sci Food Agric. 97(1):95-101 (2017). doi: 10.1002/jsfa.7688.

4.

Aoki K, Matsubara S, Umeda M, Tachibanac S, Doi M, Takenaka S. Aspartic protease from Aspergillus(Eurotium) repens strain MK82 is involved in the hydrolysis and decolourisation of dried bonito(Katsuobushi). J Sci Food Agric. 93(6):1349-1355 (2013). doi: 10.1002/jsfa.5896.

学会発表
1.

○林理希、土居幹治、竹中慎治ら．Aspergillus glaucus MA0196由来ハイマンノース型アスパル
ティックプロテアーゼの分泌生産と酵素特性の解析 （生命科学系学会合同年次大会、2017年12月）

2.

○林理希、竹中慎治、横田仁子、土居幹治ら．Aspergillus glaucus MA0196におけるアスパルティッ
クプロテアーゼの生産特性と酵素の性質 （日本生化学会 近畿支部例会、2017年）

3.

○竹中慎治、土居幹治ら．かつお節のかび付けに使用される Aspergillus 属糸状菌由来アスパル
ティックプロテアーゼの特性解析 （日本生物工学会本大会、2015年）

4.

○仙波弘雅、小山大、土居幹治、吉田健一、竹中慎治．ハイマンノース型糖鎖を有するAspergillus
glaucus MA0196由来アスパルティックプロテアーゼの特性解析 （日本生物工学会、2014年9月、北海道）

5.

○中川 知里、吉田 健一、小山 大、土居 幹治、青木 健次、竹中 慎治．かつお節のかび付けに使用されるAspergillus glaucus MA0196由来アスパルティックプロテアーゼの精製と特性解析（2011年3月、京都）

6.

○梅田 麻代、吉田 健一、小山 大、土居 幹治、青木 健次、竹中 慎治．かつお節のかび付けに使用されるAspergillus repens MK82由来アスパルティックプロテアーゼの精製と特性解析（2011年3月、京
都）

特許
1.

ピキア酵母を用いた遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼの製造方法（特開201760421）

2.

脱色用プロテアーゼおよびその用途（特開2009-219483）

共同研究先
1.

マルトモ株式会社

微生物酵素を用いた卵殻膜の加水分解と可溶性
ペプチド・タンパク質の抽出研究期間：2008～現在に至る化を図りながら、可溶性ペプチドやタンパク質の生
理活性とその構造の解明に取り組んでいます。

研究背景・目的【研究背景】
鶏卵は、栄養価の高い機能性食品で、年間約260万トン消費されています。よって、加工工程で生じる非可食部である卵殻部の有効活用も求められています。卵殻部の構成成分である卵殻膜は、古来より生理活性があることはわかっていましたが、いまだに焼却廃棄されています。食品・化粧品・サプリメ
ントなどの分野での活用を考えれば前処理（可溶化）が必要となりますが、化学的処理よりも温和な条件で行うことが環境にも優しいと言えます。

卵殻膜はタマゴの殻の内側にある薄い生体膜であり、その主成分はタンパク質で、二層の網目状構造をしています。微生物が卵内部への侵入・汚染を防ぐ役割を果たしているため難分解
性です。

卵殻膜部分

【目的】
本研究では、卵殻膜を効率よく分解できる微生物
由来エラスターゼを検索し、卵殻膜分解条件の最適

M. Baláž, Acta Biomaterialia, 10: 38273843 (2014)より【卵殻膜分解酵素の特性解析】

実験概要【卵殻膜分解微生物の検索】【卵殻膜の分解と分画】
卵殻膜分解

酵素精製

ゲルろ過

酵素など
ろ過

遺伝子クローニング

1.2

I

II III IV V

1.0

UV280

自然界またはデータベース
から検索

0.8
0.6
0.4

分解活性評価LasB_ME4
LasB_PST01
LasB_indica
AVP_AeG1
AhpB_AG2
Hap_3083

AYWDGTAMLFGDGATMFYPLVSLDVAAHEVSHGFTEQNSGLIYRGQSGGMNEAFSDMAGE 172
AYWDGTAMLFGDGATMFYPLVSLDVAAHEVSHGFTEQNSGLIYRGQSGGMNEAFSDMAGE 172
AFWDGESMTFGDGARTFYPLVALDVVAHEVSHGFTEQNSNLQYYGQSGGMNEAFSDMAGE 172
AFWDGSQMTFGDGATTFHPLVSLDVAAHEVSHGFTEQNSGLIYSGQSGGINEAFSDMAGE 170
AFWDGSQIDFGDGATTFYPLVSLDVAAHEVSHGFTEQNSGLVYSGQSGGINEAFSDMAGE 170
AFWDGRAMTFGDGYTRFYPLVDINVSAHEVSHGFTEQNSGLVYRDMSGGINEAFSDIAGE 178*:*** : **** *:*** ::* *************.* * . ***:******:***

LasB_ME4
LasB_PST01
LasB_indica
AVP_AeG1
AhpB_AG2
Hap_3083

AAEFYMRGKNDFLIGYDIKKGSGALRYMDQPSRDGRSIDNASQYYNGIDVHHSSGVYNRA 232
AAEFYMRGKNDFLIGYDIKKGSGALRYMDQPSRDGRSIDNASQYYNGIDVHHSSGVYNRA 232
TAEYYMKGHNDWKVGFDITKGTGALRYMDDPTKDGRSIGHAADYRSGMNVHYSSGVYNKA 232
AAEFYMKGSNDWLVGAQIFKGNGSLRYFEDPTRDGRSIGHAADYREGMDVHHSSGVYNRA 230
AAENYMKGSNDWLVGAQIFKGNEPLRYFEDPTRDGSSIGHASDYYDGIDVHHSSGVYNRA 230
AAEYFMRGNVDWIVGADIFKSSGGLRYFDQPSRDGRSIDHASQYYSGIDVHHSSGVFNRA 238:** :*:* *: :* :* *.. ***:::*::** **.:*::* .*::**:****:*:*

LasB_ME4
LasB_PST01
LasB_indica
AVP_AeG1
AhpB_AG2
Hap_3083

FYLLANSPGWDTRKAFEVFVDANRYYWTATSNYNSGACGVIRSAQNRNYSAADVTRAFST 292
FYLLANSPGWDTRKAFEVFVDANRYYWTATSNYNSGACGVIRSAQNRNYSAADVTRAFST 292
FYLLANTAGWDTRKAFEVFLDANRFYWTETSSFDRGACGVIQSSQNRGYGTSAVVQAFRQ 292
FYLLATSSGWNTRKAFEVFLLANRLYWGANTNYQQGACGVSRATADLGYNQADVARAFQT 290
FYLLANTSGWNTRKAFEVFVLANRLYWGANTTYDQGACGWTKAATDLGYSLTDVAAAFTT 290
FYLLANKSGWNVRKGFEVFAVANQLYWTPNSTFDQGGCGVVKAAQDLNYNTADVVAAFNT 298*****...**:.**.**** **: ** .:.:: *.** ::: : .*. : *. **

0.2
0
20
60
40
80
Fraction No. (5 ml/tube)

0100

生理活性試験

【分画した生理活性ペプチドの生理活性試験】

結果と考察

100

70 0

10
20
30
Eggshell membrane (mg/ml)
10(反応時間)(酵素添加量)

8

2

6
4

1

2
0

0.2

0.4

0.6

0.8

Purified enzyme (U)

1 0

4

8

0
12

16

Time (h)

20

24

80
60
40
20

0
-20

0

5

10
15
Time (min)

卵殻膜を分解できる研究室オリジナルの酵素を用い、最適化条件
では、コントロールと比較して10倍以上の可溶性ペプチド・タンパ
ク質を抽出できるようになりました。また、分画サンプルは美白効
果につながると期待されるチロシナーゼ阻害活性やラジカル物質消去作用が見られました。

21

0
100

20

ABTS radical
scavenging
activity (%)

0
40
60
50
Temperature (ºC)

3

Protein (mg/ml)

Peptide (mM)

2Peptide (mM)

Protein (mg/ml)

6
4

30

40
20

8

1

0

mV

10

(卵殻膜添加量)

2

0

0h
2h
6h
15 h

60

3

(最適温度)(最適条件)

80

Remaining
diphenolase
activity (%)

【卵殻膜分解の最適化】

32

21 32

80

(チロシナーゼ
阻害活性)(ABTS radical
消去活性)

60
40

58
68

20
0
0

20
60
40
80
Fraction No. (5 ml/tube)

100

神戸大学大学院 農学研究科 微生物資源化学研究室
竹中 慎治 連絡先：stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Takenaka S, Yokoyama M, Kimura Y, Yamashita Y, and Ashida H. Characterization of an organicsolvent-stable elastase from Pseudomonas indica and its potential use in eggshell membranehydrolysis. Process Biochem. 85:156-163 (2019). https://doi.org/10.1016/j.procbio.2019.06.021
2. Takenaka S, Hano S, Cheng M, Yoshida K, Aoki K. Organic solvent-tolerant elastase efficiently
hydrolyzes insoluble, cross-linked, protein fiber of eggshell membranes. Biotechnol Lett.
34(5):949-55 (2012). doi: 10.1007/s10529-012-0861-3.
3. Cheng M, Takenaka S, Aoki S, Murakami S, Aoki K. Purification and characterization of an
eggshell membrane decomposing protease from Pseudomonas aeruginosa strain ME-4. J Biosci
Bioeng. 107(4):373-378 (2009). doi: 10.1016/j.jbiosc.2008.12.010.

学会発表
1. 横山 萌、○竹中 慎治、吉岡 泰淳、山下 陽子、芦田 均．卵殻膜分解活性を示す微生物由来エラ
スターゼの検索と特性解析 （日本農芸化学会本大会、2018年3月、名古屋）
2. ○横山 萌、吉岡 康淳、山下 陽子、芦田 均、竹中 慎治．微生物由来エラスターゼを用いた卵殻膜の可溶化と生理活性ペプチドの調製 （2017年度生命科学系学会合同年次大会、神戸）
3. ○竹中 慎治、大坂 宇津実、山下 陽子、芦田 均．卵殻膜分解酵素の異種発現と同酵素を用いた卵殻膜からの生理活性ペプチドの取得 （日本農芸化学会本大会、2016年3月、北海道）
4. ○芦田 均、田中 裕基、山下 陽子、竹中 慎治．卵殻膜由来ペプチドによるによるグルコース取り込み促進効果について （日本食品科学工学会、2015）

共同研究先
1. 当学部 生物機能開発化学（山下先生）/ 動物資源利用化学（白井・福田先生）
2. 旗影会 特別研究助成等により研究を実施中

環境・発酵食品中の微生物菌叢解析
研究期間：2010～現在に至る

研究背景・目的【研究背景】
環境や発酵食品中の微生物菌叢の変遷について理解するためには、単離培養できる微生物とできないものすべてを含めて解析する必要があります。近年の遺伝子解析技術の進歩によりrRNA遺伝子やITS領域をターゲットとして「RFLP 法、SSCP 法、DGGE法等」や「全ゲノム解析」による菌叢解析が行われています。

培養できない微生物が多い！

【目的】
農薬を分解する微生物群集および伝統発酵食品の発酵熟成に関わる糸状菌の変遷について明らかにすることを目的としました。

PepA_A_nidulans
PepA_A_fumigatus1
PepA_P_janthinellum
PepA_A_awamori
PepA_A_niger3
PepA_A_niger1
PepA_A_phoenicis2
PepA_A_phoenicis1
PepA_A_repens MK82

0.1

難培養微生物でも一斉に解析ができる。

PepA_B_cinerea
PepA_A_oryzae3
PepA_A_niger2
PepA_A_fumigtus2
PepA_P_chrysogenum
PepA_A_glaucus MA0196
PepA_A_oryzae2
PepA_A_oryzae1【研究例２】

実験概要

だしの素のひとつであるかつお節は「かび付け」と呼ばれる発酵・熟成工程を経て製造される。

【研究例１】
4-アミノピリジンは鳥類に対する忌避剤として利用されています。環境中における微生物分解は複数の微生物が関わって無機化されていることがわかりましたが、keyとなる微生物は単離培養できませんでした。⇒菌叢解析で明らかにすることにしました。

煮熟
焙乾

かび付け

(荒節) 工程
かび付け

日乾

(枯節)
払落し

4回繰り返す複数の近縁種の鰹節かびが、リパーゼ、プロテ
アーゼ、O-メチル化酵素などを生産することでうま味や香味の付与に寄与していると言われているが、どのようなかびかはあまりわかっていませんでした。
⇒鰹節かびの変遷を明らかにする。

17.5％

19.6％

18.0％

16.2％

粗脂肪

4.1％

2.6％

5.8％

5.7％

5% M

カビ菌液

水分

1番
2番
3番
4番

結果と考察
M

100

構成比 (%)806035%(a) A. amstelodami

40(c) A. chevalieri(p) A. pseudoglaucus

20(r) A. ruber(s) A. sydowii

0

菌叢解析から単離培養できなかった
Hyphomicrobium属細菌を検出できました。この菌は、4-アミノピリジンが存在すると徐々に存在比が増大し、代謝分解の初発ステップで働いていることがわかりました。

枯節1番

枯節2番

枯節3番

枯節4番

(o) Others

鰹節の発酵には、かび付けを繰り返す毎に、好乾性のAspergillus属糸状菌（5種）が構成比を変えながら働いていることがわかりました。

神戸大学大学院 農学研究科 微生物資源化学研究室
竹中 慎治 連絡先：stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Takenaka S, Ogawa C, Uemura M, Umeki T, Kimura Y, Yokota S, Doi M. Identification andcharacterization of extracellular enzymes secreted by Aspergillus spp. involved in lipolysis andlipid-antioxidation during katsuobushi fermentation and ripening. Int J Food Microbiol.
353:109299 (2021). https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109299
2. Takenaka S, Nomura R, Minegishi A, Yoshida K, Enrichment and characterization of a bacterial
culture that can degrade 4-aminopyridine. BMC Microbiol. 13:62 (2013).

学会発表
1. ○竹中 慎治、中林麗奈、小川千晶、横田仁子、土居幹治．鰹節（枯節）製造のかび付け発酵工程における好乾性糸状菌の菌叢解析（日本農芸化学会本大会、2019年3
月、東京）

特許
1. 鰹節カビの種の検出方法（特開2020-110091）

共同研究先
1. マルトモ株式会社

微生物酵素の耐塩性機構の解明
研究期間：2003～現在に至るします。また、オリジナルの酵素と変異酵素との耐塩性を比較することで普遍的なメカニズムの考察を目的としています。

研究背景・目的【研究背景】
タンパク質や糖質を多く含む食品の加工において、もとめる風味やうま味を付与することや、腐敗や食物汚染を防ぐために、塩を加えることがあります。
しかし、加工に関わる既存の酵素の中には塩に対して不安定なものもあり、幅広い塩濃度で安定で高活性な耐塩性タイプの酵素の取得が求められています。
また、近年取り組まれているバイオマスの分解にも耐塩性タイプの加水分解酵素は、コストの面で有利
です。

塩に対して
不安定な酵素

好塩性酵素

機能改変して能力アップを図る

塩依存型
であり、塩がないと不安定耐塩性酵素【目的】
本研究では、酵素タンパク質の配列データを収集しながら、配列比較により耐塩性に関わるアミノ酸残基を推定し、酵素の機能改変（耐塩性化）を目指
酵素精製
耐塩性評価

実験概要

塩蔵発酵食品からの検索

アミノ酸置換による多重変異酵素の作製

配列比較
耐塩性に関わる
アミノ酸残基の推定
Apr_No_16
Apr_FP133
Carlsberg
Subtilisin_DY

AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQD 60
AQSVPYGVSQIKAPALHSQGFTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQD 60
AQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGE-AYNTD 59
AQTVPYGIPLIKADKVQAQGYKGANVKVGIIDTGIAASHTDLKVVGGASFVSGE-SYNTD 59** ********* * **** © ** ** ** * **** * **Apr_No_16
Apr_FP133
Carlsberg
Subtilisin_DY

GSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMD 120
NNSHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMD 120
GNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGTYSGIVSGIEWATTNGMD 119
GNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPNVSLYAIKVLNSSGSGTYSAIVSGIEWATQNGLD 119©******* *** **** ** **** ****** ** * ***** * *Apr_No_16
Apr_FP133
Carlsberg
Subtilisin_DY

VINMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAV 180
VINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGGSSTVGYPGKYPSVIAVGAV 180
VINMSLGGPSGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAV 179
VINMSLGGPSGSTALKQAVDKAYASGIVVVAAAGNSGSSGSQNTIGYPAKYDSVIAVGAV 179********* ** * * ** ** ** ***** * *** *** ** * ******

Apr_No_16
Apr_FP133
Carlsberg
Subtilisin_DY

NSSNQRASFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPT 240
NSSNQRASFSSVGSELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGAYNGTSMASPHVAGAAALILSKHPN 240
DSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTSTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPN 239
DSNKNRASFSSVGAELEVMAPGVSVYSTYPSNTYTSLNGTSMASPHVAGAAALILSKYPT 239******* * ** ******* *****©** ************* *Apr_No_16
Apr_FP133
Carlsberg
Subtilisin_DY

WTNAQVRDRLESTATYLGSSFYYGKGLINVQAAAQ 275
WTNTQVRSSLENTTTKLGDAFYYGKGLINVQAAAQ 275
LSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ 274
LSASQVRNRLSSTATNLGDSFYYGKGLINVEAAAQ 274*** * * * ** ********** ****

・変異酵素発現株の取得
・酵素の機能（耐塩性）の評価データベースからの検索

推定高次構造モデル
での機能推定

結果と考察
実験例: 麹菌由来γ-グルタミルトランスペプチダーゼの耐塩性化
120 a.a.

ASAOggtA
AOggtA
100 a.a.

Relative activity (%)

100

ASggtA80

醤油・味噌醸
造における塩濃度領域6040

醤油・味噌醸造では、麹菌由来の加水分解酵素群が大豆タンパ
20
ク質に作用し、遊離アミノ酸がこれら調味食品のうま味やこくを0高める。グルタミナーゼは、グルタミンを加水分解してうま味を
0
5
10
15
20
呈するグルタミン酸へと変換することから、同醸造における鍵酵
NaCl (%)
素であるが、高塩濃度下では活性が極端に低下する。本研究では、
麹菌由来酵素（□）、オリジナル糸状
我々オリジナルの糸状菌由来グルタミナーゼと配列比較し、作製
菌由来酵素（〇）、キメラ酵素（●）
したキメラ酵素が、耐塩性に優れることを明らかにした。

神戸大学大学院 農学研究科 微生物資源化学研究室
竹中 慎治 連絡先：stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

発表論文
1.

Senba H, Nishikawa A, Kimura Y, Tanaka S, Matsumoto J, Doi M, Takenaka S. Improvement in salttolerance of Aspergillus oryzae γ-glutamyl transpeptidase via protein chimerization with Aspergillus
sydowii homolog. Enzym Microb Technol. 167:110240 (2023).
https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2023.110240

2.

Nishikawa A, Senba H, Kimura Y, Yokota S, Doi M, Takenaka S. Isolation and characterization of a salttolerant γ-glutamyl transpeptidase from xerophilic Aspergillus sydowii. 3 Biotech. 12:253 (2022).
https://doi.org/10.1007/s13205-022-03259-3

3.

Takenaka S, Takada A, Kimura Y, Watanabe M, Kuntiya A. Improvement of the halotolerance of a
Bacillus serine protease by protein surface engineering. J. Basic Microbiol. 62:174-184 (2022).

4.

Takenaka S, Yoshinami J, Kuntiya A, Techapun C, Leksawasdi N, Seesuriyachan P, Chaiyaso T,
Watanabe M, Tanaka K, Yoshida KI. Characterization and mutation analysis of a halotolerant serine
protease from a new isolate of Bacillus subtilis. Biotechnol Lett. 40(1):189-196 (2018).

5.

Takenaka S, Miyatake A, Tanaka K, Kuntiya A, Techapun C, Leksawasdi N, Seesuriyachan P, Chaiyaso T,
Watanabe M, Yoshida K. Characterization of the native form and the carboxy-terminally truncatedhalotolerant form of α-amylases from Bacillus subtilis strain FP-133. J Basic Microbiol. 55(6):780-789(2015).

6.

Takenaka S, Yoshida N, Yoshida K, Murakami S, Aoki K. Molecular cloning and sequence analysis of
two distinct halotolerant extracellular proteases from Bacillus subtilis FP-133. Biosci Biotechnol
Biochem. 75(1):148-151 (2011).

7.

Setyorini E, Kim YJ, Takenaka S, Murakami S, Aoki K. Purification and characterization of a halotolerant
intracellular protease from Bacillus subtilis strain FP-133. J Basic Microbiol. 46(4):294-304 (2006).

8.

Setyorini E, Takenaka S, Murakami S, Aoki K. Purification and characterization of two novel
halotolerant extracellular proteases from Bacillus subtilis strain FP-133. Biosci Biotechnol Biochem.
70(2):433-440 (2006).

学会発表
1.

S. Takenaka, A. Takada et al., Characterization and mutation analysis of a halotolerant serine proteasefrom Bacillus subtilis isolated from Thai traditional fermented shrimp paste. The final joint seminar ofcore to core program advanced research networks. (2018. Dec., Yamaguchi)

2.

竹中慎治, 吉浪淳, 髙田愛莉ら タイの塩蔵発酵食品から分離したBacillus属細菌の生産する耐塩性プ
ロテアーゼの遺伝子クローニングと特性解析 日本農芸化学会関西・中四国・西日本支部合同大阪大会 (2017年9月、大阪）

3.

竹中慎治, 吉浪淳ら タイの塩蔵発酵食品から分離した Bacillus 属細菌の生産する耐塩性プロテアー
ゼの特性解析 日本生物工学会大会（2017年9月、東京）

4.

S. Takenaka. Bacterial Enzymes with special characteristics for biotechnological applications. IC-STAR2015 (The 1st International Conference on Science, Technology and Interdisciplinary Research ) (2015
年9月、インドネシア・ジャワ）

5.

S. Takenaka. Characterization of the native form and the carboxy-terminally truncated halotolerant
form of alpha-amylases from Bacillus subtilis FP-133. The 6th international conference on
fermentation technology for value added agricultural products（2015年7月、タイ・コンケ
ン）

共同研究先
1.

マルトモ株式会社

2.

チェンマイ大学アグロインダストリー学部（タイ国）

好乾性糸状菌による鰹節だしがらの発酵
研究期間：2021～現在に至る
微生物発酵による加水分解処理を検討し、加水分解に関わるペプチダーゼの同定と発酵物の生理活性評
価を行うこととした。

研究背景・目的【研究背景】
2013年に「和食とその文化」がユネスコの無形文化遺産に登録され、和食の基本である“だし”も世界的に知られるようになった。これに伴い、鰹節等調
整品は、国内消費・輸出量も増加傾向にある(農林水産省 輸出・国際関連情報より)。鰹節からだしをとった後に生じる食品残渣“だしがら”のリサイクルとして、堆肥や家畜飼料への転換が挙げられるが、競合する食品廃棄物は多い。よって、SDGsの達成に寄与できる新たな高度利用法の開発も望まれている。

【目的】“だしがら”は、タンパク質を主成分とする残渣であることから、本研究ではプロテアーゼ高生産なっ
好乾性糸状菌Aspergillus sydowii MA0196を用いた

実験概要

堆肥
削り節

破砕
鰹節等調整品
つゆ、だし、
食品加工残渣
たれ…
“だしがら”
は、タンパク質が主成分

A. sydowii MA0196

可溶性画分

ペプチダーゼの精製（酸性/中性条件）

MA0196株を鰹節だしがら固体
培地で培養後、緩衝液にて培養物
から菌体外酵素を抽出後、緩衝液(pH 5.0および7.5)にて透析し、粗酵素液とした。また、可溶性画分の抽出は、かつおだしの調製法にならい、蒸留水にて熱水抽出した。

ゲルろ過クロマトグラフィー

・タンパク質同定
LC-MS/MS-Mascot解析
・鰹節由来可溶性タンパク質
加水分解

・アミノ酸組成分析
・味覚評価
・生理活性評価・物理化学的性質

結果と考察
かつお
だし

＜高度利用＞
遊離アミノ酸/ペプ
チドを含有する発酵物の調製

ファインケミカル化タンパク質源鰹節だしがら

粗酵素液

飼料

ミオシン重鎖尾部の加水分解に特化した
セリンプロテアーゼ

鰹節/削り節

だしがら
鰹節カビ
の移植

NH2-

だしがら発酵物
加水分解酵素/旨味アミノ酸/生理活性ペプチド含有

エキソ型ペプチダーゼ-COOH 群による分解

アミノ酸および生ペプチドの遊離

だしがらに含まれるミオシンタンパク質に対し、エンド型およびエキソ型ペプチダーゼが協働して作用し、発酵物には遊離アミノ酸およびペプチドが含まれていた。発酵物の可溶性画分に呈味性の向上を確認すると
ともに、フリーラジカル消去活性、抗酸化活性、アンジオテンシン変換酵素阻害活性だけでなく、乳酸菌の増殖促進効果を見出した。発酵物は、醸造調味料や健康食品用タンパク質素材としての展開が期待できます。

神戸大学大学院 農学研究科 微生物資源化学研究室
竹中 慎治 連絡先：stakenaka@people.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Takenaka S, Kato M, Oribe Y, Kimura Y, Tanaka S, Matsumoto J, Doi M. Exploring the potential of
katsuobushi grounds as a source of bioactive peptides through fermentation with Aspergillus
sydowii. Proc Biochem. 130:534-544 (2023). https://doi.org/10.1016/j.procbio.2023.05.017
2. Senba H, Nishikawa A, Kimura Y, Tanaka S, Matsumoto J, Doi M, Takenaka S. Improvement insalt-tolerance of Aspergillus oryzae γ-glutamyl transpeptidase via protein chimerization withAspergillus sydowii homolog. Enzym Microb Technol. 167:110240 (2023).
https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2023.110240
3. Takenaka S, Ogawa C, Uemura M, Umeki T, Kimura Y, Yokota S, Doi M. Identification andcharacterization of extracellular enzymes secreted by Aspergillus spp. involved in lipolysis andlipid-antioxidation during katsuobushi fermentation and ripening. Int J Food Microbiol.
353:109299 (2021). https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109299
4. Takenaka S, Nakabayashi R, Ogawa C, Kimura Y, Yokota S, Doi M. Characterization of surface
Aspergillus community involved in traditional fermentation and ripening of katsuobushi. Int Food
Microbiol. 327:108654 (2020). https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108654

学会発表
1. 竹中慎治, 加藤将城, 織部恭宏、木村行宏、田中伸一、松本淳一、土居幹治. Aspergillus sydowii
による鰹節だしがらの発酵と可溶性画分の特性解析. 日本生物工学会 (2023年9月、名古屋）＜
大会トピックスとして選出＞

共同研究先
1. マルトモ株式会社

特許（本研究に関連する特許）
1. 発酵食品組成物の製造方法（仮題）として出願準備中