ヒト網膜毛細血管細胞に対するビルベリーエキスの作用～岐阜薬科大学薬効解析学研究室 ・ 株式会社わかさ生活～（日本薬学会 第133回年会 学会発表）

背景および目的

網膜網膜剥離（破け出血）

後期に白内障も進行する。

新生血管硝子体で破け出血細胞
ヒト網膜毛細血管内皮細胞 ：HRMECs（Human retinal microvascular endothelialcells： HRMECs）＜糖尿病合併症が起こる割合＞
・糖尿病網膜症・・・30～60％
・糖尿病黄斑症・・・10～20％
・糖尿病血管新生緑内障・・・3～5％
・糖尿病白内障・・・20～60％ ※※白内障も後期に起こる。

④③⑥⑦⑪⑩

これまでの関連研究

VEGF
10 nM添加HRMECsコンフルエント

写真撮影（4か所）→遊走細胞数
カウント →評価⑮5. ウェスタンブロット解析
OCH3OH

HOO+

HOO+

OH

Malvidin

Delphinidin（シアニジン）◆HRMECs
培地交換
細胞播種
2％FBS
54×10 cell/well CB (－)
12ウェルプレート

HOHOCyanidin

細胞回収

PBS洗浄

37℃インキュベート

OCH3OHHO

スタベーション

O+OHOH

5 min

2d培養OHOH

1d0 (day)（マルビジン）（デルフィニジン）

被検試料
添加

VEGF
10 nM添加Western blot analysis
分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ （ERK）

アントシアニジンの構造式

実験結果
VEGF誘発HRMECs 増殖に対するビルベリーとアントシアニジンの増殖抑制作用
Proliferation (% of control)

ビルベリーエキス
180160140120100806040200

アントシアニジン （デルフィニジン、 シアニジン、 マルビジン）

##

*

C

180160140120100806040200

##
**

**

180160140120100806040200##*180160
140120100806040200

##**

CCV
13CV
13131030
Cyanidin (μM)
Delphinidin (μM)
Bilberry (μg/ml)
VEGF
VEGF
VEGF
Data shown are mean ± S.E.M (n=6), ##; p<0.01 v.s. control, *; p<0.05, **; p<0.01 v.s. Vehicle, C; control, V; vehicle.

VV**

13Malvidin (μM)
VEGF

VEGF誘発HRMECs 遊走に対するビルベリーとアントシアニジンの遊走抑制作用

Control

350

B-ext. 10μg/ml

Vehicleアントシアニジン （デルフィニジン、 シアニジン、 マルビジン）
Cell migration (% of control)

Cell migration (% of control)

ビルベリーエキス② VEGF誘発管腔形成に対するビルベリーエキスの抑制作用

37℃インキュベート⑫⑬（VEGF添加前）

Vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2010,7(1):47-56. ）

被検試料
添加

◆HRMECs
培地交換
細胞播種
2％FBS
20×105 cell/well CB (－)
12ウェルプレート○アントシアニジン① VEGF誘発 ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial
Cells : HUVEC）増殖試験に対するビルベリーエキスの抑制作用

VME inhibited proliferation of HUVECs induced by VEGF-A. HUVECs were cultured in 96-well plates
at a density of 2000 cells per well, then incubated for a total of 96 h at 37°C in 5% CO2. HUVECs weresupplemented with or without VEGF-A (10 ng/ml) plus various concentrations of test drugs, andmeasurements were made by WST-8 assay. Data are shown as mean_SEM (n=5–8). C: Control. *, P<0.05;**, P<0.01 versus VEGF-A (Dunnett’s multiple-comparison test). ***, P<0.01 versus Control (Student’s ttest). （参考元： Matsunaga, N., et al. Vaccinium myrtillus (Bilberry) Extracts Reduce Angiogenesis In Vitro and In

スタベーション

写真画像から
遊走細胞数をカウント

細胞かきとり跡⑨

ビルベリー（Vaccinium myrtillus)

ビルベリー果実（フィンランドにて撮影）

培養

⑧OH

ビルベリー

3d2d⑭HO

一般的なブルーベリー

1d0 (day)⑤OH＜効果＞
 視覚機能改善作用
 眼精疲労改善作用
 血小板凝固抑制作用
 毛細血管保護作用
 血管拡張作用

VEGF
10 nM添加12 ウェルプレート

毛様体、虹彩にまで新生血管が伸びる＝血管新生緑内障

ブルーベリーの一種で主に北ヨーロッパ、北アメリカなどで自生している。
約150種類あると言われているブルーベリーの中でもアントシアニン含量が多く、その抽出エキスはVMA (Vaccinium myrtillus anthocyanoside）と呼ばれ、36%、15種類のアントシアニンを含んでいる。VMAはサプリメント利用がなされている。

37℃インキュベート

4. VEGF誘発HRMECs遊走試験

① Delphinidin 3-O-galactopyranoside,② Delphinidin 3-O-glucopyranoside,③ Cyanidin 3-O-galactopyranoside, ④ Delphinidin 3-O-alabinopyranoside,⑤ Cyanidin 3-O-glucopyranoside,⑥ Petunidin 3-O-galactopyranoside,⑦ Cyanidin 3-O-alabinopyranoside, ⑧ Petunidin 3-O-glucopyranoside,⑨ Peonidin 3-O-galactopyranoside, ⑩ Petunidin 3-O-alabinopyranoside,⑪ Peonidin 3-O-glucopyranoside,⑫ Malvidin 3-O-glucopyranoside,⑬ Peonidin 3-O-alabinopyranoside, ⑭ Malvidin 3-O-galactopyranoside,⑮ Malvidin 3-O-alabinopyranoside

②被検試料
添加

CCK-8による細胞数の測定

マイクロプレートリーダーによる吸光度の測定○ビルベリーエキス
本試験で用いたビルベリーエキス（VMA，わかさ生活）についてHPLC分析にて以下に示すアントシアニン組成であることを確認した。

①スタベーション◆HRMECs培地交換
細胞播種
10％FBSCB (－)
2000 cell/well
96ウェルプレート

2. 被検試料

糖尿病で血流が低下すると、栄養を届けるために異常な新生血管がつくられる。しかし脆弱なために簡単に破れ、出血を引き起こす。結果、視機能が低下する。新生血管が硝子体や毛様体にまで延びると、網膜剥離や緑内障の原因になる。

3d2d培養培養条件
・CSC-medium, 10%FBS,2% Culture Boostar (CB)

HRMECs1d0 (day)

Proliferation (% of control)＜糖尿病網膜症の病態＞

3. VEGF誘発HRMECs増殖試験

Proliferation (% of control)

糖尿病網膜症

1. 培養細胞Proliferation (% of control)

糖尿病網膜症や加齢性黄斑変性症、または未熟児網膜症において、血管新生の形成と硝子体内での出血、および網膜毛細血管の透過性亢進による浮腫発生は、疾患初期の視力低下を招く原因として問題視されている。
これらに対し、治療法としてはレーザー治療、硝子体手術、血管新生や血管透過性亢進の原因因子で知られている血管内皮細胞増殖因子（vascularendothelial growth factor：VEGF）抑制剤の眼内注射などが存在するが、長期的には浮腫の再発や治療に伴う合併症などの問題点も挙げられている。
我々は、これまでにヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein
endothelial cells：HUVECs）に対するビルベリー(Vaccinium myrtillus L.)エキスの血管新生阻害作用を見いだしてきた。そこで本研究では、新たにヒト網膜毛細血管内皮細胞培養系（human retinal microvascular endothelialcells: HRMEC）を用いたin vitro試験において、血管新生に対するビルベリーエキスおよび主要なアントシアニジンの予防作用を検討した。

実験方法##300**

250

**

200
150
10050250##200**

*

***

150
1005000C

V1030CVBilberry (μg/ml)

310310Delphinidin (μM) Cyanidin (μM)

310Malvidin (μM)

VEGF

VEGF
Data shown are mean ± S.E.M (n=6), ##; p<0.01 v.s. control, *; p<0.05, **; p<0.01 v.s. Vehicle, C; control, V; vehicle.

ウェスタンブロット解析
ビルベリーエキス
VEGF
BilberryC
p-ERK 1/2

V10 301030

p-ERK/total-ERK
ratio to control

6t-ERK 1/2##54***

32
10β-actin

CV

1030

1030

Bilberry extract (μg/ml)
VEGF
Data shown are mean ± S.E.M (n=6), ##; p<0.01 v.s. control, *; p<0.05, **; p<0.01 v.s. Vehicle, C; control, V; vehicle.

結語
VME inhibited tube formation induced by VEGF-A. Representative photographs of tube formation (A).
Scale bar=100 mm. HUVECs were co-cultured with human fibroblasts, as described in Methods section, andincubated for 11 days with or without the indicated concentrations of VME, with the concomitant addition ofVEGF-A (10 ng ml_1). Tube formation was observed in five randomly chosen fields, and tube area (B),length (C), joints (D) and paths (E) were measured using an Angiogenesis Image Analyzer. Data are shownas mean_SEM (n=3–6). C: Control. *, P<0.05; **, P<0.01 versus VEGF-A (Dunnett’s multiple-comparisontest). ***, P<0.01 versus Control (Student’s t-test).
（参考元： Matsunaga, N., et al. Vaccinium myrtillus (Bilberry) Extracts Reduce Angiogenesis In Vitro and In Vivo. EvidBased Complement Alternat Med. 2010,7(1):47-56. ）◆ビルベリーエキスおよびアントシアニジン（Delphinidin、Cyanidin、Malvidin）は、VEGFにより誘発されるHRMECsの細胞増殖を抑制した。
◆ビルベリーエキスおよびアントシアニジンはVEGFにより誘発される細胞遊走を抑制した。
◆ビルベリーエキスは、VEGFによるERKのリン酸化を抑制した。
ビルベリーおよびビルベリーに含まれるアントシアニジンは、VEGFにより誘発される血管新生を抑制する作用を有することから、糖尿病網膜症の病態悪化を軽減する可能性が示唆された。