T‑G256

.
L
:
:
I
:
:
.

Eコ

室
闇

最終報

セルロースの 2‑ヒドロキシ工チル及びメチルエーテルのほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

試験番号:丁目 G255

試 験 期 間 :2017年 1月 1
1 日‑2017年 3月 27日

試験実施施設株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

干1
56・0042 東京都世田谷区羽根木 1
・3
・1
1

試験委託者
厚生労働省

底薬・生活衛生局

医薬品審査管理課〒 100‑8916 東京都千代田区霞が関 1・2・2

株式会社ボゾリサーチセンター〒 151‑0065 東 京 都 渋 谷 区 大 山 町 36‑7

T‑G256

1.

GLP陳述書試験番号

T G256

試験表題

セルロースの 2‑ヒドロキシェチル及びメチルエーテルの岨

ほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

本試験は以下の GLP基準を遵守して実施したものです。
「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準 j(平成 23年 3月 31 日、薬食発 0331第 8号、平成 23.03・29製 局 第 6号、
環保企発第 110331010号)

試験責任者
株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所研究部

2

T-G256

2.

目次

1.

GLP 陳述書 ................................................................................................... 2

2.

目次 .............................................................................................................. 33.

試験実施概要 ................................................................................................ 7
3.1

試験番号 ............................................................................................... 7

3.2

試験表題 ............................................................................................... 7

3.3

試験目的 ............................................................................................... 7

3.4

試験委託者 ........................................................................................... 7

3.5

試験受託者 ........................................................................................... 7

3.6

試験実施施設 ........................................................................................ 7

3.7

試験日程 ............................................................................................... 7

3.8

試験責任者 ........................................................................................... 7

3.9

試験担当者 ........................................................................................... 8

3.10

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと ............................................ 83.11

試資料保存 ........................................................................................... 8

3.12

試験責任者の記名・押印及びその日付 ................................................... 8

4.

要約 .............................................................................................................. 95.

緒言 ............................................................................................................ 106.

試験材料及び方法 ........................................................................................ 116.1

被験物質及び溶媒 ............................................................................... 11

6.1.1

被験物質 ...................................................................................... 11

6.1.2

溶媒 ............................................................................................. 116.1.3

溶媒の選択理由 ............................................................................ 12

6.1.4

調製方法 ...................................................................................... 12

6.1.4.1

細胞増殖抑制試験 ................................................................ 12

6.1.4.2

染色体異常試験 ................................................................... 12

6.1.5

調製頻度 ...................................................................................... 12

6.1.6

被験液の安定性 ............................................................................ 126.2

対照物質 ............................................................................................. 126.2.1

陰性対照 ...................................................................................... 12

6.2.2

陽性対照 ...................................................................................... 126.3

使用細胞株 ......................................................................................... 136.3.1

細胞株 .......................................................................................... 136.3.2

細胞の選択理由 ............................................................................ 146.3.3

培養条件 ...................................................................................... 14

6.4

S9 mix 及び培養液の調製 .................................................................... 143

T-G256
6.4.1

S9 mix ......................................................................................... 146.4.2

培養液 .......................................................................................... 15

6.5

7.

試験方法 1 ) .......................................................................................... 15

6.5.1

識別方法 ...................................................................................... 15

6.5.2

用量の設定 ................................................................................... 166.5.3

細胞増殖抑制試験 ......................................................................... 166.5.4

染色体異常試験 ............................................................................ 176.5.5

数値の取扱い................................................................................ 186.5.6

標本の観察 ................................................................................... 196.5.7

染色体異常の分類 ......................................................................... 19

6.5.8

結果の判定 ................................................................................... 20

6.5.9

統計解析 ...................................................................................... 20

6.5.10

判定基準 ...................................................................................... 20

試験結果 ..................................................................................................... 21
7.1

細胞増殖抑制試験 ............................................................................... 217.2

染色体異常試験................................................................................... 21

7.3

試験成立基準 ...................................................................................... 21

8.

考察 ............................................................................................................ 229.

参考文献 ..................................................................................................... 23

添付資料
Attached Data 1

Background Data in the Testing Facility ......................... 24

図Fig. 1Results of the Chromosomal aberration test in cultured
Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl
2-hydroxyethyl cellulose [Short-term treatment: –S9mix] ............................................................................. 25

Fig. 2

Results of the Chromosomal aberration test in cultured
Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl
2-hydroxyethyl cellulose [Short-term treatment: +S9mix] ............................................................................. 26

Fig. 3Results of the Chromosomal aberration test in cultured
Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl
2-hydroxyethyl cellulose [Continuous treatment: 24hr] .... 27

表
Table 1Chromosomal aberration in cultured Chinese hamster4

T-G256(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl
cellulose [Short-term treatment: −S9 mix] ....................... 28
Table 2Chromosomal aberration in cultured Chinese hamster(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl
cellulose [Short-term treatment: +S9 mix] ....................... 29

Table 3Chromosomal aberration in cultured Chinese hamster(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl
cellulose [Continuous treatment: 24hr] ........................... 30

付表Appendix 1

Results of the cell-growth inhibition test in cultured
Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl
2-hydroxyethyl cellulose ................................................ 31

Appendix 2-1

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in
cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose [Short-term treatment:−S9 mix] ....................................................................... 32

Appendix 2-2

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in
cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose [Short-term treatment:+S9 mix] ....................................................................... 33

Appendix 2-3

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in
cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose [Continuous treatment:
24hr] ............................................................................ 34

Appendix 3-1

Results of observation in the Chromosomal aberration
test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwithMethyl2-hydroxyethyl

cellulose[Short-term

treatment: −S9 mix] ....................................................... 35
Appendix 3-2

Results of observation in the Chromosomal aberration
test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwithMethyl2-hydroxyethyl

cellulose[Short-term

treatment: +S9 mix] ....................................................... 36
Appendix 3-3

Results of observation in the Chromosomal aberration
test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwithMethyl2-hydroxyethyl

cellulose[Continuous

treatment: 24hr] ............................................................ 37
Appendix 4

Cell concentration and population doubling in the5

T-G256
cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl
cellulose ....................................................................... 38
Appendix 5

Cell concentration and population doubling in thechromosomal aberration test in cultured Chinese hamster(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl
cellulose ....................................................................... 39

信頼性保証書 .................................................................................................... 40

6

T-G2563.

試験実施概要3.1

試験番号T-G2563.2

試験表題

セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルのほ乳類培養細胞を用いる
染色体異常試験3.3

試験目的

ほ乳類の培養細胞（CHL/IU 細胞株）を用いて、セルロースの 2-ヒドロキシエチル
及びメチルエーテルの染色体異常誘発能を確認することを目的とした。

3.4

試験委託者

厚生労働省

医薬・生活衛生局〒100-8916

3.5

医薬品審査管理課

東京都千代田区霞が関 1-2-2

試験受託者

株式会社ボゾリサーチセンター〒151-0065

3.6

東京都渋谷区大山町 36-7

試験実施施設株式会社ボゾリサーチセンター〒156-0042

東京都世田谷区羽根木 1-3-11

株式会社ボゾリサーチセンター〒412-0039

3.7

3.8

東京研究所
御殿場研究所

静岡県御殿場市かまど 1284

試験日程
試験開始日

：

2017 年1 月 11 日

被験物質受領日：2016 年 11 月 17 日

実験開始日

：

2017 年1 月 13 日

実験終了日：

2017 年2 月 14 日

試験終了日：

2017 年3 月 27 日

試験責任者

株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

7

研究部

TG256
聞

3.9

試験担当者

被験物質保存責任者:
化学分析責任者
試験担当者

3.10

予見することができなかった諒験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったことはなかった。

3
.
1
1

試資料保存

試験計画書原本、記録文書、生デー夕、被験物質の一部、染色体標本及lJ報告書類(最終報告書の原本を含む)は株式会社ボゾリサーチセンター御殿場研究所の資料保

0年 間 保 存 す る 。 期 間 終 了 後 の 保 存 に つ い て は 、 厚 生 労
存施設に最終報告書提出後 1

働省

医薬・生活衛生局

医薬品審査管理課化学物質安全対策室と株式会社ボゾリ

サーチセンタ一間で協議し、その処置を決定する。

3.12

試験責任者の記名・押印及びその日付

株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所研究部

8

T-G256

4.

要約
セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルの染色体異常誘発能の有無を検討するため、チャイニーズ・ハムスター肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた
染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の用量を設定するため、2000 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2で希釈した計 8 用量を設定し、細胞増殖抑制試験を行った。その結果、すべての処理
法で 50%を超える細胞増殖抑制作用は認められず、50%細胞増殖抑制濃度（概略値）
は算出されなかった。以上の結果より、すべての処理法で 2000 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2 で希釈した 3 用量を設定し、染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の結果、染色体構造異常の一つの指標であるギャップを含まない染色体異常を有する細胞の出現率（TA 値）及び倍数体（poly 値）の出現率は、いずれの処理法においても、陰性対照群と比較して統計的に有意な増加は認められず、陰性対照群の施設内背景データの 95%確率分布の範囲内であったため、陰性と判定した。
なお、すべての処理法において、陰性対照群では染色体構造異常を有する細胞及び倍数体の出現頻度は背景データの 95%確率分布の範囲内にあった。これに対して、陽性対照群では、陰性対照群と比較すると、染色体構造異常において統計学的に有意な増加が認められた。したがって、試験は適切に実施されたと考えられた。
以上の結果から、セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルは本試験条
件下において、染色体構造異常及び染色体数的異常を誘発しないと結論した。

9

T-G2565.

緒言
セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルの安全性評価の一環として、ほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験を実施したので、その成績を報告する。
なお、遵守した基準及び準拠した毒性試験ガイドラインなどは以下の通りである。
1)

•

GLP
「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準」（平成 23 年 3 月 31 日、薬食発 0331 第 8 号、平成 23･03･29 製局第 6 号、
環保企発第 110331010 号）

2)•

毒性試験ガイドライン「新規化学物質等に係る試験の方法についての一部改正について」（平成 27 年 12 月 21 日：薬食発 1221 第 1 号、20151209 製局第 1 号、環保企発
第 1512211 号）•「OECD Guidelines for Testing of Chemicals 473」
（OECD 理事会：2016 年 7 月 29 日）

10

T-G2566.

試験材料及び方法

6.1
6.1.1

被験物質及び溶媒
被験物質

製造者

：

名称

：

セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテル

別名：

Methyl 2-hydroxyethyl cellulose

CAS 番号：

9032-42-2

官報公示整理番号：(8)-187（化審法）

構造式又は示性式

：

分子式

：

C34H66O24

分子量

：

858.9

形状

：

粉末

色

：

白色

ロット番号

：

MKBV8724V

純度：

不明（水分 2.2%）

保存方法

：

冷所（実測値：4.5 ~ 6.0 °C、2016 年 11 月 17 日 ~ 2017年 2 月 20 日）、密栓、乾燥

保存場所

：

東京研究所

被験物質保存室

安定性：

株式会社ボゾリサーチセンター

御殿場研究所で、実験終了後に安定性を測定し、安定であったことを確認した。
取扱い上の注意：

作業場の換気を十分に行い、マスク、保護眼鏡、保護手袋等の適切な保護具を着用し、直接の接触を防ぐ。
取り扱い後は、手、顔等を良く洗い、うがいをする。

残余品の処理：使用後の残量は、試験終了後に全て廃棄した。

名称

：

注射用水

規格

：

日本薬局方

ロット番号

：

6F79N

製造元

：

㈱大塚製薬工場

保存方法

：

室温

6.1.2

溶媒

11

T-G256
保存場所

6.1.3

：

東京研究所

培養細胞試験室

溶媒の選択理由

溶媒検討の結果、水に 20.0 mg/mL で懸濁、DMSO 及びアセトンに不溶であったた
め、懸濁溶媒として注射用水を選択した。

6.1.4
6.1.4.1

調製方法
細胞増殖抑制試験

被験物質 0.2000 g を 10 mL メスフラスコに秤取した。溶媒を添加し、懸濁した後に、メスアップして最高濃度の 20.0 mg/mL 懸濁液（プレートに 0.500 mL 添加した際の最終濃度：2000 μg/mL）を調製した。次いで、20.0 mg/mL 被験液を公比 2（各濃度の被験液 5 mL：溶媒 5 mL）で順次 7 段階希釈し、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、
0.313 及び 0.156 mg/mL の 8 濃度段階の被験液を調製した。

6.1.4.2

染色体異常試験

被験物質 0.4000 g を 20 mL メスフラスコに秤取した。溶媒を添加し、懸濁した後に、メスアップして最高濃度の 20.0 mg/mL 懸濁液（プレートに 0.500 mL 添加した際の最終濃度：2000 μg/mL）を調製した。次いで、20.0 mg/mL 被験液を公比 2（各濃度の被験液 10 mL：溶媒 10 mL）で順次 2 段階希釈し、10.0 及び 5.00 mg/mL の 3 濃
度段階の被験液を調製した。

6.1.5

調製頻度

用時に調製した。

6.1.6

被験液の安定性

被験物質に溶媒を添加した際に、発泡、発熱、吸熱、着色等の変化の有無を肉眼的及び触知にて観察し、被験液が安定であったことを確認した。

6.2
6.2.1

対照物質
陰性対照

溶媒として用いる注射用水を陰性対照とした。

6.2.2
1)

陽性対照

非代謝活性化系

マイトマイシン C（MMC）
ロット番号

：

578AEI

製造元：

協和発酵キリン株式会社

力価：

2 mg（力価）/瓶12

T-G256

2)

保存方法

：

室温、遮光

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

代謝活性化系

シクロフォスファミド（CP）

3)

ロット番号

：

CTN3690

製造元：

和光純薬工業株式会社

純度：

生化学用（97.0%以上）

保存方法

：

冷蔵、遮光

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

冷蔵庫

調製方法
調製は全て用時に行った。

(1) MMCMMC の 2 mg 充填バイアルに生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、
ロット番号：K6F99）を 2 mL 加えて溶解した（1 mg/mL）。次に、この溶液を公比 20 で順次 2 段階希釈（溶液 0.250 mL：生理食塩液 4.750 mL）し、0.050
及び 0.0025 mg/mL の溶液を調製した（短時間処理法の非代謝活性化では培養液
4.850 mL に 0.0025 mg/mL 溶液を 0.150 mL 加えた。連続処理法では培養液 4.900
mL に 0.0025 mg/mL 溶液を 0.100 mL 加えた。この時の最終濃度は、それぞれ
0.075 µg/mL 及び 0.050 µg/mL）。
(2) CP
CP 0.0140 g を γ 線滅菌済プラスチック遠沈管（50 mL）に秤取した。これに生
理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、ロット番号：K6F99）を 20 mL
加えて溶解し、0.70 mg/mL 溶液を調製した（培養液 4.900 mL に 0.100 mL を加えた。この時の最終濃度は 14 μg/mL）。
4)陽性対照物質の選択理由

毒性試験ガイドライン（前述 5. 2)）に使用が推奨されているため。

6.3
6.3.1

使用細胞株
細胞株

チャイニーズ・ハムスターの肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた。独立行政法
人医薬基盤研究所 JCRB 細胞バンクから 2014 年 4 月 2 日に入手し、凍結保存した細胞について定期的に細胞の性状検査を実施して、性状が適正であること（培養形態、細胞倍加時間 15~20 時間以内、染色体数の平均が 25 本、マイコプラズマ等の汚染がない）が確認されたものを 30 継代以内で試験に使用した。使用時の細胞継代数は細胞増殖抑制試験で 25 継代、染色体異常試験で 4 継代であった。

13

T-G2566.3.2

細胞の選択理由

毒性試験ガイドライン（前述 5. 2)）に使用が推奨されているため。

6.3.3

培養条件

炭酸ガス培養装置を用い、CO 2 濃度 5%、温度 37°C、高湿度条件下で培養した。継代は 1~4 日ごとに行った。

6.4
6.4.1

S9 mix 及び培養液の調製
S9 mix

S9 及 び 補 酵 素 （ S9 ／ コ フ ァ ク タ ー C セ ッ ト 、 ロ ッ ト 番 号 ： C160902061 及 び
C161118091）を混合し、S9 mix を調製した。調製は用時に行った。
1)

S9
名称

：

S9

製造元

：

オリエンタル酵母工業株式会社

ロット番号

：

16090206、16111809

製造日：2016 年 9 月 2 日（ロット番号：16090206）
2016 年 11 月 18 日（ロット番号：16111809）

種・系統

：

ラット•SD 系

週齢・性：

7 週齢・雄誘導物質：

フェノバルビタール(PB)及び 5,6-ベンゾフラボン(BF)

投与方法

：

腹腔内投与

投与期間及び投与量：

PB4 日間連続投与 30+60+60+60(mg/kg 体重)PB 投与 3 日目 BF 投与 80(mg/kg 体重)

使用期限

：

2017 年 3 月 1 日（ロット番号：16090206）
2017 年 5 月 17 日（ロット番号：16111809）

2)

保存方法

：

冷凍(–70°C 以下)

保存場所

：

東京研究所

名称

：

コファクターC

製造元：

オリエンタル酵母工業株式会社

ロット番号

：

C16083106、C16111609

製造日：2016 年 8 月 31 日（ロット番号：C16083106）

培養細胞試験室

超低温フリーザ

補酵素2016 年 11 月 16 日（ロット番号：C16111609）
保存方法：

冷凍(–70°C 以下)

使用期限

：

2017 年 2 月 28 日（ロット番号：C16083106）
2017 年 5 月 15 日（ロット番号：C16111609）

保存場所

：

東京研究所

14

培養細胞試験室

超低温フリーザT-G256
3)

S9 mix の組成(1 mL 中)水：

0.7 mLS9：

0.3 mL

MgCl 2：5 µmol/mL

KCl：

33 µmol/mL

グルコース-6-リン酸：

5 µmol/mL

酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP)：

4 µmol/mL

HEPES 緩衝液(pH7.2)
：

6.4.2

4 µmol/mL

培養液

Minimum Essential Medium (MEM)(GIBCO TM 、Cat.No.11095)に非働化（56°C、30分）した牛血清(bovine serum、BS)を 10 v/v%添加した培養液(BS-MEM)を用いた。
調製後の培養液は冷蔵保存した。
1)

2)

牛血清
ロット番号

：

1671327、1641353

製造元：

Life Technologies Corporation

保存方法

：

冷凍（−20°C 以下）

保存場所

：

東京研究所

培養細胞試験室

冷凍庫

Minimum Essential Medium（MEM）
ロット番号

：

1810988、1790847

製造元：

Life Technologies Corporation

保存方法

：

冷蔵

保存場所

：

東京研究所

6.5

培養細胞試験室

冷蔵庫

試験方法 1)

試験は以下に示したステージの順に実施した
1. 細胞増殖抑制試験

短時間処理法2. 染色体異常試験

連続処理法
短時間処理法
連続処理法

6.5.1

代謝活性化
非代謝活性化
24 時間処理
代謝活性化
非代謝活性化
24 時間処理

識別方法

以下のように定めた記号又は数字を記したラベルを、シャーレ及びスライドグラス

15

T-G256に貼付して識別を行った。
対象

内容

記号又は数字+−24NC
高濃度から 1、2、3･･･n の枝番号
PC
1、2、3

シャーレ

短時間処理法 代謝活性化
短時間処理法 非代謝活性化
連続処理法 24 時間処理
陰性対照群
被験液処理群
陽性対照群
同一処理群内での識別
染色体標本

6.5.2
1)

試験番号とコンピュータが無作為に割り振った「01」~「99」までの 2 桁の番号
及びスライドの枚数を表す枝番号

盲検法によってランダムにコード化した処理内容

用量の設定

細胞増殖抑制試験

最高用量を「新規化学物質等に係る試験の方法についての一部改正について」で定められた 2000 μg/mL とし、以下公比 2 で希釈した 1000、500、250、125、62.5、31.3
及び 15.6 μg/mL の計 8 用量を設定した。また、これに陰性対照群を設けた。
2)

染色体異常試験

最高用量を 2000 μg/mL とし、以下公比 2 で希釈した 1000 及び 500 μg/mL の計 3用量を設定した。これに陰性対照群及び陽性対照群を設けた。

6.5.3

細胞増殖抑制試験

染色体異常試験の用量を設定するための予備試験として実施した。なお、以下の試
験操作のうち、無菌性を必要とする場合は、無菌環境下において、滅菌済の器具を用いて、無菌操作によって実施した。
1)

短時間処理法の代謝活性化と非代謝活性化、連続処理法の 24 時間処理のそれぞれに、陰性対照群及び被験物質処理群を設けた。シャーレ（プレート）はプラス
チックプレート（直径 60 mm）を用い、各群 1 枚とした。また、相対細胞集団倍加数（Relative Cell Population Doubling Number、RPD）を算出するための処理開始時細胞数測定用にプレートを 1 枚設けた。

2)

プレート当たり 2×10 4 個の細胞（培養液 5.0 mL）を播種した。

3)

培養 3 日後、倒立位相差顕微鏡下で細胞に異常がないことを確認後、下表に従い、培養液の除去及び処理を行い、処理開始時細胞数測定用のプレート 1 枚については、以下の方法に従い細胞濃度を測定し、処理開始時の細胞濃度とした。

16

T-G256

培養液除去量S9 mix 添加量
溶媒・被験液添加量

短時間処理法
非代謝活性化
代謝活性化
0.500 mL
1.333 mL
0.833 mL
0.500 mL

連続処理法
0.500 mL

0.500 mL

0.500 mL

(1) 当該プレートの培養液を廃棄し、Phosphate-Buffered Saline (–)（PBS (–)）を適量加えプレートを洗浄した。
(2) PBS(–) を 廃 棄 し 、 0.25% ト リ プ シ ン 溶 液 （ Trypsin 0.25% 、 Life Technologies
Corporation）を 1 mL 加え、約 5 分間静置した。
(3) ピペッティングで細胞を剥離・分散させた後、プレートに新しい 10%BS-MEM
培養液を 1 mL 添加し、血球計算盤を用いて細胞濃度を測定した。血球計算盤の計数値は、8 区画の平均値の小数点第 1 位を四捨五入したものを細胞集団倍加数（Population Doubling Number、PD）の計算に用いた。
4)

被験物質処理後、倒立位相差顕微鏡下で析出の有無を観察し、肉眼で培養液の色調を確認した。確認後、短時間処理法では 6 時間、連続処理法では 24 時間培養した。

5)6 時間培養後、短時間処理法については、4)同様に析出の有無を確認するとともに、倒立位相差顕微鏡下で細胞の状態を確認した。次いで、牛血清を約 2%となるよう添加した生理食塩液で細胞を洗浄し、新しい培養液 5.0 mL を加え、更に18 時間培養した。

6)

培養終了後、倒立位相差顕微鏡下で析出の有無及び細胞の状態を確認した（短時間処理法の培養終了時の結果は、参考データとした）。

7)

次いで、3)の方法に従い、各プレートの細胞濃度を測定し、終了時の細胞濃度とした。

8)得られた細胞濃度から、式 1 及び 2 に従い、陰性対照群を 100%とした各群の細胞数の RPD*を算出した。
PD = [log (処理（培養）終了時の細胞数 ÷ 処理開始時の細胞数)] ÷ log 2〔式 1〕

RPD (%)=（被験物質処理群における PD）（陰性対照群における PD）

×100
〔式 2〕

9)

細胞増殖抑制率（=100-RPD）*を算出し、50%を挟む 2 点の直線式から、50%細胞増殖抑制濃度（概略値）を算出した。
*計算値が 0 以下の場合は 0 として扱った。

6.5.4

染色体異常試験

以下の試験操作のうち、無菌性を必要とする場合は、無菌環境下において、滅菌済の器具を用いて、無菌操作によって実施した。
17

T-G2561)

短時間処理法の代謝活性化と非代謝活性化、連続処理法の 24 時間処理のそれぞれに、陰性対照群、被験物質処理群及び陽性対照群を設けた。シャーレ（プレート）はプラスチックプレート（直径 60 mm）を用い、各群 3 枚（枝番号-1、2 及び 3）とした。また、RPD を算出するための処理開始時細胞数測定用にプレート
を 1 枚設けた。

2)

プレート当たり 2×10 4 個の細胞（培養液 5.0 mL）を播種した。

3)

培養 3 日後に、倒立位相差顕微鏡下で細胞に異常がないことを確認後、下表に従い、培養液の除去及び処理を行い、開始時測定用のプレート 1 枚については、細胞増殖抑制試験に準じて、処理開始時の細胞濃度とした。

培養液除去量

短時間処理法
非代謝活性化
代謝活性化
0.500 mL
1.333 mL
(0.150 mL) *(0.933 mL) *0.833 mL

連続処理法
0.500 mL
(0.100 mL) *S9 mix 添加量
溶媒・被験液・0.500 mL
0.500 mL
0.500 mL
陽性対照物質液(MMC: 0.150 mL) *(CP: 0.100 mL) *(MMC: 0.100 mL) *添加量*：（ ）内は、陽性対照群の培養液除去量及び陽性対照物質液添加量を示す。

4)

被験物質処理後、倒立位相差顕微鏡下で析出の有無及び肉眼で培養液の色を確認し、短時間処理法では 6 時間、連続処理法では 24 時間培養した。

5)6 時間培養後、短時間処理法については倒立相差顕微鏡下で被験物質の析出及び細胞の状態を確認した。次いで、約 2%となるよう牛血清を添加した生理食塩液
で細胞を洗浄し、新しい培養液 5.0 mL を加え、更に 18 時間培養した。

6)

各群 2 枚のプレート（枝番号-1 及び-2）について、染色体観察用標本作製のため培養終了の約 2 時間前にコルセミド（デメコルシン溶液、10 μg/mL）を 0.1 mL
加えた。

7)

培養終了後、プレートの培養液を遠沈管に移し（連続処理法の被験物質処理群については培養液を廃棄し、新しい培養液 5.0 mL を遠沈管に添加した。）、0.25%
トリプシン溶液（Trypsin 0.25%、Life Technologies Corporation）で細胞を剥がし、回収・遠心分離した。次いで、遠心分離によって集めた細胞を 0.075M 塩化
カリウム溶液で約 15 分間低張処理し、メチルアルコール：酢酸＝3：1 液で固定した。固定した細胞をスライドガラス 1 枚につき 2 箇所に滴下した。染色体標本
はプレート当たり 2 枚作製した。細胞滴下後、約 1 日以上空気乾燥し、2%ギム
ザ液で約 15 分間染色して染色体標本を作製した。

8)

残る各群 1 枚のプレート（枝番号-3）は、倒立位相差顕微鏡下で析出の有無及び細胞の状態を確認した（短時間処理法の培養終了時の結果は、参考データとした）。
その後、細胞増殖抑制試験に準じて細胞濃度を測定し、RPD を算出した。

6.5.5

数値の取扱いRPD 算出には表示値を用い、下記の桁数に従って計算した。

18

T-G2561)

細胞濃度については、血球計算盤における 8 区画の計数値の平均値の小数点第 1
位を四捨五入し、整数で表示した（単位：計数値の平均値 × 10 4 cells/mL）。

2)

PD については、1) の表示値を用いて計算し、小数点第 3 位を四捨五入し、小数点第 2 位まで表示した。

3)

RPD（百分率）については、2) の表示値を用いて計算し、小数点第 1 位を四捨五入し整数として表示した。

6.5.6

標本の観察

顕微鏡下でプレート当たり 150 細胞（各濃度当たり 300 細胞）の染色体が良く展開した分裂中期像を観察し、構造異常の種類と異常を持つ細胞の数を記録した。同時に倍数体の出現数も記録した。染色体標本の観察はすべてブラインド化して行った。

6.5.7

染色体異常の分類

染色体異常は構造異常と数的異常に大別し、構造異常は更に以下のように定義・分
類した。
1)

構造異常
染色体異常の種類は以下のように定義し分類した。
ギャップ(g)：

染 色 分 体 型 (ctg) 及 び 染 色 体 型 (csg)を 含 む ギ ャ ッ プ とは染色体又は染色分体の同軸上に断片があるもの（非染色部分が染色分体の同軸上にある）であって、その長さが染色分体の幅以下で明瞭な非染色部位が認められるもの。

染色分体型切断(ctb)：

断片が染色分体の同軸上からはずれているもの及び非染色部位が染色分体の同軸上にあっても、その長さが染色分体の幅以上に離れているもの。

染色分体型交換(cte)：

四放射状交換など。

染色体型切断(csb) ：断片が染色体の同軸上からはずれており動原体が認められないもの及び非染色部位が染色体の同軸上にあっても、その長さが染色分体の幅以上に離れているもの。

2)

染色体型交換(cse) ：二動原体染色体、環状染色体など。

その他(other)

断片化(frg)など。

：

数的異常
染色体数が、その細胞が本来持っている固有の数（二倍体）と異なり、倍化した
場合を数的異常と定義した。
倍数性：

polyploidy（核内倍加体：endoreduplication を含む）

19

T-G256

6.5.8

結果の判定

判定に際しては、染色体の構造並びに数的異常を持つ細胞の出現数によって判定した。構造異常の総出現数は、ギャップを含む場合（TAG）と含まない場合（TA）とに分け、総合判定は後者を用い、統計解析を実施し、判定基準に従って判定した。

6.5.9

統計解析

異常の出現頻度に対する有意性の判定は、陰性対照群と被験物質処理群間で構造異常及び数的異常について Fisher の直接確率計算法 2 ) （有意水準：片側 5%）並びにCochran Armitage の傾向検定 3 ) （有意水準：片側 5%）を、陰性対照群と陽性対照群間で構造異常について Fisher の直接確率計算法 2 ) （有意水準：片側 5%）を行った。

6.5.10

判定基準

結果の判定は、下記の基準に従い、生物学的関連性を考慮して判定した。
1)

陽性
Fisher の直接確率計算法及び Cochran Armitage の傾向検定においてともに有意差が認められ、異常の出現頻度が陰性対照群の背景データ管理値の 95%確率分布
外の場合。

2)

陰性
Fisher の直接確率計算法及び Cochran Armitage の傾向検定においてともに有意差が認められず、異常の出現頻度が陰性対照群の背景データ管理値の 95%確率分
布内の場合。

20

T-G256

7.

試験結果

7.1

細胞増殖抑制試験

結果を Appendix 1、Appendix 2-1~2-3、Appendix 4 に示した。
被験液添加に伴う析出の有無及び培養液の色調変化は、すべての処理法のすべての用量で析出が認められ、色調変化は認められなかった。細胞毒性の指標である RPD を測定した結果、すべての処理法で 50%を超える細胞増殖抑制作用は認められず、50%
細胞増殖抑制濃度（概略値）は算出されなかった。

7.2

染色体異常試験結果を Fig.1~3、Table 1~3、Appendix 3-1~3-3、Appendix 5 に示した。
被験液添加に伴う析出の有無及び培養液の色調変化は、すべての処理法のすべての用量で析出が認められ、色調変化は認められなかった。
構造異常の出現率（TA）は、短時間処理法の非代謝活性化では 2000、1000 及び 500
μg/mL で 0.7、0.7 及び 0.7%であった。短時間処理法の代謝活性化では 2000、1000
及び 500 μg/mL で 0.7、0.3 及び 0.7%であった。連続処理法では 2000、1000 及び 500
μg/mL で 0.3、0.7 及び 0.3%であった。
数的異常（倍数体、Poly）の出現率は、短時間処理法の非代謝活性化では 2000、1000
及び 500 μg/mL で 0.7、0.7 及び 0%であった。短時間処理法の代謝活性化では 2000、
1000 及び 500 μg/mL で 0.3、0 及び 1.0%であった。連続処理法では 2000、1000 及び500 μg/mL で 0.7、0.7 及び 1.0%であった。

7.3

試験成立基準以下の基準を満たしたため、試験は適切に実施されたと判断した。

•••

観察可能な 3 用量以上にて、評価された。
陰性対照群では異常の出現率は背景データの 95%確率分布の範囲内にあった。
陽性対照群では、陰性対照群と比較すると、染色体構造異常において統計的に有意な増加が認められた。

•

試験環境に特に問題は認められなかった。

21

T-G2568.

考察
セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルの染色体異常誘発能の有無を検討するため、チャイニーズ・ハムスター肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた
染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の結果、染色体構造異常の一つの指標であるギャップを含まない染色体異常を有する細胞の出現率（TA 値）及び倍数体（poly 値）の出現率は、いずれの処理法においても、陰性対照群と比較して統計的に有意な増加は認められず、陰性対照群の施設内背景データの 95%確率分布の範囲内であったため、陰性と判定した。
なお、すべての処理法において、陰性対照群では染色体構造異常を有する細胞及び倍数体の出現頻度は背景データの 95%確率分布の範囲内にあった。これに対して、陽性対照群では、陰性対照群と比較すると、染色体構造異常において統計学的に有意な増加が認められた。したがって、試験は適切に実施されたと考えられた。
また、本被験物質は Ames 試験で陽性 4 ) と報告されている。
以上の結果から、セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルは本試験条
件下において、染色体構造異常及び染色体数的異常を誘発しないと結論した。

22

T-G256

9.

参考文献

1)

祖父尼俊雄監修（1999）：<改訂>染色体異常試験データ集、pp. 15-20、エル・
アイ・シー 、東京

2)

Siegel S, Castellan NJ. Jr. Nonparametric statistics for the behavioral sciences. 2nd
ed. New York: McGraw-Hill; 1988.

3)

Agresti A, Categorical Data Analysis. New Jersey: Wiley InterScience; 2002

4)(2017)：セルロースの 2-ヒドロキシエチル及びメチルエーテルの細菌を用いる復帰突然変異試験（試験番号：T-2265）、株式会社ボゾリサーチセンター

23

T-G256
Attached Data 1

Background Data in the Testing Facility
Cumulative background data of chromosome aberration tests in cultured Chinese hamster cells (line
CHL/IU), carried out under the same study conditions at BoZo Research Center Inc.
Period for NC : April-2015-February-2017
Treatment
S9 mix+Cells
observed

Poly
(%)

TA
(%)

S9 mix

6-18( 5700)Mean
S.D.

( 21.3)0.6
0.4( 24.7)
0.6
0.3

+
(CP)

UCL
LCL*
( 5700)
Mean
S.D.

1.4
0.0
( 18.7)
0.5
0.4

1.2
0.0
( 30.0)
0.8
0.4

UCL
LCL*

1.3
0.0

1.6
0.0

( 5700)
Mean
S.D.
UCL
LCL*

( 20.7)
0.5
0.4
1.3
0.0

( 26.7)
0.7
0.3
1.3
0.1

( 300)( 0.7)( 0.7)

Mean
S.D.
UCL
LCL*

0.3
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!

0.3#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!

6-18( n=19)

NC

-

24-0
( n=19)-TreatmentTime( n=19)-Period for PC : April-2015-February-2017

48-0( n=1)

Time

6-18( n=19)
(MMC)

PC

6-18

( n=19)
(MMC)

24-0

( n=19)
(MMC)

48-0

( n=1)

Cells
observed

Poly
(%)

TA
(%)

( 5700)Mean
S.D.

( 1.3)
0.0
0.2( 2126.7)
56.0
12.1

UCL
LCL*
( 5700)
Mean
S.D.

0.4
0.0
( 2.7)
0.1
0.1

79.7
32.3
( 1084.0)
28.5
4.9

UCL
LCL*

0.3
0.0

38.1
18.9

( 5700)
Mean
S.D.
UCL
LCL*

( 8.7)
0.2
0.4
1.0
0.0

( 1192.7)
31.4
6.5
44.1
18.7

( 300)( 0.0)( 130.0)

Mean
S.D.
UCL
LCL*

0.0
65.0
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!
#DIV/0!
( ):number of observed.

Negative control (NC) : water for injection, isotonic sodium chloride solution, dimethylsulfoxide, 0.5w/v% sodium carboxymethyl
cellulose solution, acetone or culture medium
Positive control (PC) : CP ; Cyclophosphamide, 14 μg/mL
MMC ; Mitomycin C, 0.075 μg/mL (used for the short-term treatment)
MMC ; Mitomycin C, 0.050 μg/mL (used for the continuous treatment)
S9 mix : + ; with metabolic activation - ; without metabolic activation
Time : treatment hours - hours of incubation without test article
Poly : polyploide cells
TA : total number of cells with aberrations excluding gaps
n : the number of studies
Mean : average of structural aberration and numerical aberration in cumulative studies
S.D. : standard deviation of structural aberration and numerical aberration in cumulative studies
UCL : 95% control limits(upper control limit)
LCL : 95% control limits(lower control limit)* : The value was regarded as 0%, when value was 0 and below.

24

T-G256
110

100

Cell-growth ratio
TA value
Poly value

100

90

90

80

80

Cell-growth ratio(%)

70

60

60
50

50
40

40
30

30

20

20

10

10

0

0
-10

-10

NC

500

1000

2000

PC

Concentration of test article(μg/mL)

Fig. 1Results of the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : -S9 mix]
NC : Negative control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.075 μg/mL)
Cell-growth ratio was shown as the RPD.

25

TA or Poly value(%)

70

T-G256
Cell-growth ratio

110

100

TA value
Poly value

100

90

90

80
70

70

60

60
50

50
40

40
30

30

20

20
10

10

0

0

-10

-10

NC

500

1000

2000

PC

Concentration of test article(μg/mL)

Fig. 2
Results of the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : +S9 mix]
NC : Negative control (water for injection)
PC : Positive control (cyclophosphamide : 14 μg/mL)
Cell-growth ratio was shown as the RPD.

26

TA or Poly value(%)

Cell-growth ratio(%)

80

T-G256
Cell-growth ratio

110

100

TA value
Poly value

100

90

90

80

80

Cell-growth ratio(%)

70

60

60
50

50
40

40
30

30

20

20
10

10

0

0

-10

-10

NC

500

1000

2000

PC

Concentration of test article(μg/mL)

Fig. 3Results of the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose[Continuous treatment : 24hr]
NC : Negative control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.050 μg/mL)
Cell-growth ratio was shown as the RPD.

27

TA or Poly value(%)

70

T-G256
Chromosomal aberration in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment:-S9 mix]
Number of cells with numerical chromosomal
Conc. of
Number of cells with structural chromosomal aberration (%)
Time S9
RPD
aberration (%)
test article
trend
Cells
trend
Cells Polyploid(h) mix(%)TA(%)
g
TAG(%)
other Total (%)
other
ctb
cte
cse
csb
(μg/mL)test
observed
testobserved
cells
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
2
0
2
100
NC
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
2
0
2
300
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
300
4(1.3)
0(0.0)
4(1.3)
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
0
0
0
72
500
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
0
0
0
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
N.S.
N.S.
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
1
0
1
72
6-18
1000
150
1
1
0
0
0
2
0
2
150
1
0
1
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
72
2000
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
300
2(0.7)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
150
12
24
0
0
0
34
0
34
150
0
0
0
72
PC
150
9
38
0
0
0
47
0
47
150
0
0
0
300
21(7.0) 62(20.7) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 81(27.0)* 0(0.0) 81(27.0)
3000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
g: chromatid or chromosome gap, ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange,other: including fragmentation
TA: total number of cells with aberration excluding gap, TAG: total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (water for injection)
PC: Positive control (mitomycin C, 0.075 μg/mL)*:Fisher's exact test, p<0.05 N.S.:not significant
RPD: relative population doubling RPD (%) showed PD of test article treatment group against the one of negative control.
Table 1

28

T-G256
Chromosomal aberration in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment:+S9 mix]
Number of cells with numerical chromosomal
Conc. of
Number of cells with structural chromosomal aberration (%)
Time S9
RPD
aberration (%)
test article
trend
trend
Cells
Cells Polyploid(h) mix(%)
other Total (%)
g
TAG(%)
csb
ctb
cte
cse
other
TA(%)
(μg/mL)test
test
observed
cells
observed
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
100
NC
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
2
0
2
300
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
300
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
100
500
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
2
0
2
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
N.S.
N.S.
6-18
+
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
0
0
0
91
1000
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
0
0
0
300
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
300
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
0
0
0
88
2000
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
150
4
92
0
0
0
96
0
96
150
0
0
0
36
PC
150
10
101
0
0
0
106
0
106
150
0
0
0
300
14(4.7) 193(64.3) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 202(67.3)* 0(0.0) 202(67.3)
3000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
g: chromatid or chromosome gap, ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange,other: including fragmentation
TA: total number of cells with aberration excluding gap, TAG: total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (water for injection)
PC: Positive control (cyclophosphamide, 14 μg/mL)*:Fisher's exact test, p<0.05 N.S.:not significant
RPD: relative population doubling RPD (%) showed PD of test article treatment group against the one of negative control.
Table 229

T-G256
Chromosomal aberration in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Continuous treatment:24hr]
Number of cells with numerical chromosomal
Conc. of
Number of cells with structural chromosomal aberration (%)
Time S9
RPD
aberration (%)
test article
trend
Cells
trend
Cells Polyploid(h) mix
(%)
ctb
cte
csb
cse
TA(%)
g
TAG(%)
other Total (%)
other(μg/mL)cells
test
observed
testobserved
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
100
NC
150
0
1
0
0
0
1
0
1
150
2
0
2
300
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
2
0
2
103
500
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
1
0
1
300
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
300
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
N.S.
N.S.
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
1
0
1
100
24-0
1000
150
1
1
0
0
0
2
0
2
150
1
0
1
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
300
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
150
1
0
0
0
0
1
0
1
150
0
0
0
85
2000
150
0
0
0
0
0
0
0
0
150
2
0
2
300
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
300
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
150
11
31
0
0
0
42
0
42
150
0
0
0
67
PC
150
9
39
0
0
0
48
0
48
150
0
0
0
300
20(6.7) 70(23.3) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 90(30.0)* 0(0.0) 90(30.0)
3000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
g: chromatid or chromosome gap, ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange,other: including fragmentation
TA: total number of cells with aberration excluding gap, TAG: total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (water for injection)
PC: Positive control (mitomycin C, 0.050 μg/mL)*:Fisher's exact test, p<0.05 N.S.:not significant
RPD: relative population doubling RPD (%) showed PD of test article treatment group against the one of negative control.
Table 330

T-G256-S9 mix

120+S9 mix
24hr

110
100
90

Cell-growth ratio(%)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
NC

15.6

31.3

62.5

125

250

500

1000

2000

Concentration of test article(μg/mL)

Appendix 1
Results of the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated with Methyl
2-hydroxyethyl cellulose
NC : Negative Control (water for injection)
Cell-growth ratio was shown as the RPD.

31

T-G256

Appendix 2-1

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : -S9 mix]

-

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)

RPDa)
(%)

Cell-growth inhibition testc)
CellObservation
growthf)
Precipitates/Crystals
inhibition Condition of Color of
d)
e)
cells
medium1)
2)
ratio(%)b)
0-0 (NC)

100

15.6

107

0

-

-

-

-

31.3

91

9

-

-

-

-

62.5

105

0

-

-

+

+

125

94

6

-

-

+

+

250

100

0

-

-

+

+

500

107

0

-

-

+

+

1000

105

0

-

-

+

+

2000

110

0

-

-

+

+

Concentration of 50% cell-growth inhibition : above

2000

μg/mL

NC : Negative Control (water for injection)a) The plate in the negative control group was regarded as a 100% growth.
b) Cell-growth inhibition ratio was shown as 100 - RPD. The value was regarded as 0%, when value was 0 and fewerc) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after additionof the test suspensions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test suspensions and2)
at the end of treatment.
d) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
e) - : No changes of colorf) - : Absence of precipitates+ : Presence of precipitates floating in the medium.
All calculations were carried out using Excel 201032

T-G256

Appendix 2-2

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : +S9 mix]

+

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)

RPDa)
(%)

Cell-growth inhibition testc)
CellObservation
growthPrecipitates/Crystalsf)
inhibition Condition of Color ofd)e)mediumcells
1)
2)
ratio(%)b)
0-0 (NC)

100

15.6

101

0

-

-

-

-

31.3

97

3

-

-

-

-

62.5

108

0

-

-

+

+

125

101

0

-

-

+

+

250

100

0

-

-

+

+

500

106

0

-

-

+

+

1000

104

0

-

-

+

+

2000

97

3

-

-

+

+

Concentration of 50% cell-growth inhibition : above

2000

μg/mL

NC : Negative Control (water for injection)a) The plate in the negative control group was regarded as a 100% growth.
b) Cell-growth inhibition ratio was shown as 100 - RPD. The value was regarded as 0%, when value was 0 and fewerc) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after additionof the test suspensions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test suspensions and2)
at the end of treatment.
d) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
e) - : No changes of colorf) - : Absence of precipitates+ : Presence of precipitates floating in the medium.
All calculations were carried out using Excel 201033

T-G256

Appendix 2-3

Cell-growth ratio in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treated withMethyl 2-hydroxyethyl cellulose[Continuous treatment : 24hr]

-

24-0

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)

RPDa)
(%)

Cell-growth inhibition test
CellObservationc)
growthf)
Precipitates/Crystals
inhibition Condition of Color of
d)
e)
cells
medium1)
2)
ratio(%)b)
0-0 (NC)

100

15.6

91

9

-

-

-

-

31.3

88

12

-

-

-

-

63

100

0

-

-

+

+

125

93

7

-

-

+

+

250

98

2

-

-

+

+

500

91

9

-

-

+

+

1000

96

4

-

-

+

+

2000

93

7

-

-

+

+

Concentration of 50% cell-growth inhibition : above

2000

μg/mL

NC : Negative Control (water for injection)a) The plate in the negative control group was regarded as a 100% growth.
b) Cell-growth inhibition ratio was shown as 100 - RPD. The value was regarded as 0%, when value was 0 and fewerc) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after additionof the test suspensions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test suspensions and2)
at the end of treatment.
d) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
e) - : No changes of colorf) - : Absence of precipitates+ : Presence of precipitates floating in the medium.
All calculations were carried out using Excel 201034

T-G256

Appendix 3-1

Results of observation in the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : -S9 mix]

-

6-18

Test article

Chromosome aberration test
Study type Treatment andObservationa)S9 time Concentration
Condition of cellsb) Color of mediumc)(μg/mL)mix (hr)Precipitates/Crystalsd)1)2)0 (NC)

-

-

-

-

500

-

-

+

+

1000

-

-

+

+

2000

-

-

+

+

-

-

-

-

PC

NC : Negative control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.075 μg/mL)a) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after addition of
the test suspensions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test suspensions and 2)atthe end of treatment.
b) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
c) - : No changes of colord) - : Absence of precipitates+ : Presence of precipitates floating in the medium.

35

T-G256

Appendix 3-2

Results of observation in the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : +S9 mix]

+

6-18

Test article

Chromosome aberration testa)Study type Treatment andObservation
S9 time Concentration
Condition of cellsb) Color of mediumc)(μg/mL)mix (hr)d)

Precipitates/Crystals
1)
2)

0 (NC)

-

-

-

-

500

-

-

+

+

1000

-

-

+

+

2000

-

-

+

+

-

-

-

-

PC

NC : Negative control (water for injection)
PC : Positive control (cyclophosphamide : 14 μg/mL)a) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after addition of
the test suspensions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test suspensions and 2)atthe end of treatment.
b) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
c) - : No changes of colord) - : Absence of precipitates+ : Presence of precipitates floating in the medium.

36

T-G256

Appendix 3-3

Results of observation in the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster (CHL/IU) cells treatedwith Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Continuous treatment : 24hr]

-

24-0

Test article

Chromosome aberration test
Study type Treatment andObservationa)S9 time Concentration
Condition of cellsb) Color of mediumc)(μg/mL)mix (hr)Precipitates/Crystalsd)1)2)0 (NC)

-

-

-

-

500

-

-

+

+

1000

-

-

+

+

2000

-

-

+

+

-

-

-

-

PC

NC : Negative control (water for injection)
PC : Positive control (mitomycin C : 0.050 μg/mL)a) Condition of cells was observed at the end of treatment. Color of medium was observed immediately after addition of
the test suspensions. Precipitates/crystals were observed 1)immediately after addition of the test suspensions and 2)atthe end of treatment.
b) - : Most of the cells were attached to the surface of plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
c) - : No changes of colord) - : Absence of precipitates+ : Presence of precipitates floating in the medium.

37

T-G256

Appendix 4

Cell concentration and population doubling in the cell-growth inhibition test in cultured Chinese hamster(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : -S9 mix]

-

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)
0 (NC)
15.6
31.3
62.5
125
250
500
1000
2000

Cell counts a)(×104 cells/mL)

Cell counts(×104 cells/mL)

b)

PD

18

43
46
40
45
41
43
46
45
47

1.26
1.35
1.15
1.32
1.19
1.26
1.35
1.32
1.38

[Short-term treatment : +S9 mix]

+

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)
0 (NC)
15.6
31.3
62.5
125
250
500
1000
2000

a)

b)

Cell counts(×104 cells/mL)

Cell counts(×104 cells/mL)

PD

18

48
49
47
52
49
48
51
50
47

1.42
1.44
1.38
1.53
1.44
1.42
1.50
1.47
1.38

[Continuous treatment : 24hr]

-

24-0

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)
0 (NC)
15.6
31.3
62.5
125
250
500
1000
2000

a)

b)

Cell counts(×104 cells/mL)

Cell counts(×104 cells/mL)

PD

18

47
43
42
47
44
46
43
45
44

1.38
1.26
1.22
1.38
1.29
1.35
1.26
1.32
1.29

NC : Negative Control (water for injection)
The number of cells on the plate of each dose was measured using the hemocytometer (8 areas) at the time of starta)and end b) for treatment. Cell counts were displayed as the mean of measured values.
PD : Population Doubling was determined as;[log (cell counts at the time of end / cell counts at the time of start treatment)] / log 2
All calculations were carried out using Excel 201038

T-G256

Appendix 5

Cell concentration and population doubling in the chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster(CHL/IU) cells treated with Methyl 2-hydroxyethyl cellulose[Short-term treatment : -S9 mix]
Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)Cell counts a)(×104 cells/mL)

Cell counts b)(×104 cells/mL)

PD

39

1.38

30

1.00

30

1.00

30

1.00

30

1.00

Cell counts b)(×104 cells/mL)

PD

0 (NC)

39

1.38

500

39

1.38

36

1.26

35

1.22

21

0.49

Cell counts b)(×104 cells/mL)

PD

0 (NC)

38

1.34

500

39

1.38

38

1.34

33

1.14

28

0.90

-

6-18

Test article

0 (NC)
500
15

1000
2000
PC

[Short-term treatment : +S9 mix]

+

6-18

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)Cell counts a)(×104 cells/mL)

15

1000
2000
PC

[Continuous treatment : 24hr]

-

24-0

Test article

Study type Treatment andS9 time Concentration(μg/mL)mix (hr)Cell counts a)(×104 cells/mL)

1000

15

2000
PC

NC : Negative control (water for injection)
The number of cells on the plate of each dose was measured using the hemocytometer (8 areas) at the time of starta) andb)
end for treatment. Cell counts were displayed as the mean of measured values.
PD : Population Doubling was determined as;[log (cell counts at the time of end / cell counts at the time of start treatment)] / log 2
All calculations were carried out using Excel 201039

T‑G256

信頼性保証書 (
1
/
2
)
試験番号

T‑G256

試験表題

セ ル ロ ー ス の 2・ヒドロキシエチル及びメチルエーテ
ノレのほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験

本試験は以下に示す基準を遵守して実施されたことを保証致します。
「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準 j(平成 23年 3月 31 日、薬食発 0331第 8号 、 平 成 23 ・03 ・29製 局 第 6号、環保 企 発 第 110331010号)
なお、調査は下記の通り実施致しました。
タ
ン
日セ
ワ/'チ

立日

之)旧 J

j

月ザ肘

tf

︑ぷハ証
年︑ポ隅

/冶言

つ/宅頂

μ 榔{

試験における調査
項

目

担当者

調

査

試験責任者及び運営管理者への
報告日

日

試験計画書

2017年

l月 1
1日

2017年

l月 1
1日

細胞播穏

2017年

l月 27日2017年

i月 27日調製・保存(被験物質・陽性対

2017年

l月 30日2017年

l月 30日染色体標本作製(固定)

2017年

l月 3
1日

2017年

l月 3
1日

染色体標本作製(染色)

2017年

2月

l日

2017年

2月

染色体標木観察

2017年

2月 1
0日

2017年

2月 1
0日

被験物質の安定性

2017年

2月 2
1日

2017年

2月 2
1日

生データ

2017年

3月

7日

2017年

3月

8日

2017年

3月

9日

2017年

3月

8日

2017年

3月

9日

改善確認、

2017年

3月

9日

2017年

3月

9日

最終報告書

2017年

3月 27日2017年

3月 27日照物質)、被験物質の処理

最終報告書草案

図・表・付表40l日

T‑G256

信頼性保証書 (
2
/
2
)
施設調査

項

自

担当者

調

培養細胞の性状検査

41

査部門責任者及び運営管理者への
報告日

日

2016年

8月

5日

2016年

8月

8日

2016年

8月

9日

2016年

8月 12 日2016年

8月 18 日2016年 ， 8月 22 日