血管新生に血管新生に対するビルベリー抽出物
するビルベリー抽出物の抽出物の作用（岐阜薬科大学、株式会社わかさ生活）
和漢医薬学会大会第23回、日本薬学会第126年会
C・ イムノブロッティング

眼内に異常血管が新生することによって引き起こされる「血管新生緑内障」、「加齢黄斑変性症」及び「糖尿病網膜症」などは失明につながる重篤な疾患である。したがって、異常血管の新生を抑制することは、これらの疾患の予防・治療において重要である。
本研究では、ビルベリー抽出物の血管新生に対する作用を明らかにするために、in vitroにおける管腔形成及び血管内皮細胞の増殖・遊走に対する作用を検討した。さらに、in vivoにおける網膜の異常血管新生に対する作用について、高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルを用いて検討した。

成長因子を除いたHUVECにVEGF及びビルベリー抽出物添加し、5分後にRIPA Bufferを加え、細胞を破壊し、細胞抽出物を回収した。
一次抗体として抗リン酸化PLCγ抗体、抗PLCγ抗体、抗リン酸化ERK1/2抗体、抗ERK1/2抗体（Cell Signaling）を用いた。
また、抗β-アクチン抗体（Sigma)を用いた。

・ 高酸素負荷マウス網膜血管新生（in vivo 評価方法）
生後７日後

生後１２日後生後1７日後Bilberry+V Bilberry

total PLCγβactin＃

9876543210C

全眼を摘出し固定した。
網膜に4つの割をいれ、スライドガラスに貼り付け異常血管の面積を計測した。

ビルベリー（Vaccinium myrtillus)

VpPLCγDensity( pPLCγ/total PLCγ)

目的

V

Bilberry+V Bilberry

C：Control, V：10 ng/ml VEGF-A#;p < 0.05 vs. Control (n=5-6)

図10. PLCγのリン酸化に対するビルベリー抽出物の作用• ブルーベリーの一種で主に北ヨーロッパ、北アメリカなどで自生している。樹高が15～40 cmと低く、耐寒性がある。4月から6月に開花する。

蛍光物質
FITC 20 mgを全身投与

通常大気（O２：21%）に戻し、ビルベリー抽出物300 ng（硝子体推定濃度30 µg/ml）を硝子体内に投与。

高酸素（O2：75%）を負荷する。

ビルベリー抽出物• 約150種類あると言われているブルーベリーの中でも最もアントシアニン含量が多く、25％含んでいる1）。また、15種類のアントシアニンを含む2）。
FITC• 近年、ビルベリーの抗酸化作用2)、コラーゲンの安定化作用、血小板の凝集抑制作用3)などの薬理作用が報告されている。

Bilberry extract

SalineArea of neovascular tufts(mm2/retina)

図5. in vivo 評価方法と実験スケジュール

結果
図1．ビルベリー （Vaccinium myrtillus）

1.4
1.2
1.00.8*0.60.40.20.0

SalineBilberry Extracts

n=9, *;p < 0.05 vs. Saline

図11. 高酸素負荷マウス網膜血管新生に対するビルベリー抽出物の作用

方法
VEGF-A• 血管管腔形成
ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC）と線維芽細胞を共培養した血管新生キット（クラボウ）を用いて測定した。予め全ての培地中に血管新生促進物質であるvascularendothelial growth factor-A （VEGF-A）を10 ng/mlになるように添加し、その培地へビルベリー抽出物をそれぞれ0.3、1.0、3.0、10及び30 µg/mlとなるように添加した。
９11日目

面積150100**
**

50**

**

0V0.3

13

1030 µg/ml

Length ( % of VEGF-A )７3 µg/ml

30 µg/ml

長さ150
100

**

50

VEGF-A及びビルベリー抽出物
含有

VEGF-A及びビルベリー抽出物
含有

培地交換
VEGF-A及びビルベリー抽出物
含有**

310**

V0.3

130 µg/ml

Bilberry extract + V

固定染色

図2．血管新生キットにおける培養スケジュール
11日目において形成された管腔中のCD31を染色し、血管新生定量ソフトウェアVer.2（クラボウ）を用いて、新生血管の面積、長さ、分岐点数及び枝数を計測した。

150

分岐点数

100**

50**

**

310**

0V0.3

130 µg/ml

Path ( % of VEGF-A )VEGF-A及びビルベリー抽出物
含有培地交換Joint ( % of VEGF-A )

培地交換

**

0

Bilberry extract + V
培地交換

結果のまとめBilberry extract + VEGF-A
Tube area ( % of VEGF-A )４

10.3 µg/ml

枝数150100**50****

310• ビルベリー抽出物（1 ～ 30 µg/ml）はVEGF依存性の血管管腔形成を有意に抑制した（図6）。
• ビルベリー抽出物（10～30 µg/ml）はVEGF依存性の血管内皮細胞の増殖及び遊走を有意に抑制した（図7, 8）。
• ビルベリー抽出物はVEGFによるリン酸化ERK1/2の亢進を有意に抑制した（図9）。一方、 VEGFによるリン酸化PLCγの亢進に対して明らかな作用は見られなかった（図10）。
• ビルベリー抽出物は硝子体内投与（300 ng:硝子体推定濃度30 µg/ml） により高酸素負荷マウス網膜の異常血管の新生を有意に抑制した（図11）。

**0V

0.3

1

Bilberry extract + V

30 µg/ml

Bilberry extract + V

ビルベリー抽出物の作用点

V:10 ng/ml VEGF-A, **:p < 0.01 vs. 10 ng/ml VEGF-A (n=3-6)

VEGFR2Pro liferation ( % o f co ntro l )図6. VEGF依存性血管管腔形成に対するビルベリー抽出物の作用• Tube area（面積）・・・管腔の面積• Length（長さ）・・・管腔の長さ• Joint（分岐点数）・・・管腔と管腔の交差した分岐点数• Path（枝数）・・・１本の管腔から派生した管腔の枝数

250*－6細胞播種

0150

PKC

**

100

Raf ・ Ras50

MEK

成長因子を除去した培地で培地交換

VEGF-A及びビルベリー抽出物添加

培地交換

0C

V 0.3 1

3 10 30 0.3 1

3 10 30 µg/ml

Akt/PKB

ERK1/2Bilberry

増殖遊走CCK-8添加3時間後
吸光度（492 nm）測定

まとめ##200**

150**
100500CV10330

Bilberry+V・ 細胞遊走30µg/mlBilberry

C:Control, V:10 ng/ml VEGF-A, ##;p < 0.01 vs. Control**:p < 0.01 vs. 10 ng/ml VEGF-A (n=5-6)

図8. VEGF依存性HUVEC遊走に対するビルベリー抽出物の作用

上部チャンバー

CBilberry+VV

８µm pore
下部チャンバー 遊走したHUVEC

図４. 細胞遊走試験のモデル
上部チャンバー：HUVEC（5.0×１０４cells）， 評価物質（ビルベリーエキス）
下部チャンバー：10 ng/ml VEGF， 評価物質（ビルベリーエキス）をそれぞれいれ、5%CO２，37℃にて４時間インキュベートした。
インキュベート後、PETメンブレンをメスで切り取り、ヘマトキシリンによって遊走したHUVECを染色した。

参考文献

pERK２
ERK１
ERK２
βactinDensity (pERK/totalERK)

Fibronectincoat

ビルベリー抽出物はin vitro血管管腔形成抑制作用及びin vivoマウス網膜における異常血管新生抑制作用を有することが明らかとなった。これらの作用はビルベリー抽出物の血管内皮細胞に対する増殖及び遊走抑制作用によることが示唆された。
さらに、ビルベリー抽出物の増殖抑制作用の機所の一部にERK1/2のリン酸化亢進抑制作用が関与していることが示唆された。
これらの結果から、ビルベリー抽出物は網膜の異常血管新生によって引き起こされる疾患（例えば、糖尿病網膜症など）に対する予防効果が期待される。

Bilberry

pERK１

10ng/ml VEGFと評価物質を含む培地

抑制

図１２． VEGFのシグナル経路とビルベリー抽出物の作用点

図3．細胞増殖試験スケジュール

PETメンブレン

Bilberry250

CCK-8添加HFN（ヒトフィブロネクチン）によりコーティングした８µm穴のセルカルチャーインサート（ベクトンディッキンソン）の上部チャンバーへ5.0×１０４cellsのHUVECを播種した。下層に遊走した細胞のみをヘマトキシリンにより染色を行い、その細胞を数え、測定した。

PIK３PIP３C:Control, V:10 ng/ml VEGF-A, ##;p < 0.01 vs. Control*:p < 0.05, **:p < 0.01 vs. 10 ng/ml VEGF-A (n=7-8)

96 時間

48Src

抑制なし

**

図7. VEGF依存性HUVEC増殖に対するビルベリー抽出物の作用
Cell Migration ( % of control )

－30

リン 酸化

PLC-γ

##

200

Bilberry＋V• 細胞増殖1ウェルあたり2×103 cellsのHUVECを96穴マイクロプレートに播種した。細胞増殖はCCK8（同仁：WST法）を添加し、3時間後に吸光度（492 nm）を測定することにより定量した。

VEGF#6543*

210C

V

Bilberry+V Bilberry

C:Control, V:10ng/ml VEGF (n=5-6).#;p <0.05, vs Control. *;p < 0.05, vs VEGF

図 9. ERK1/2のリン酸化に対するビルベリー抽出物の作用

1） Talavéra S, Felgines C, Texier O, Besson C, Lamaison JL,Rémésy C. Anthocyanins are efficiently absorbed from thestomach in anesthetized rats. J Nutr, 133:4178-4182, 2003.
2） Nakajima JI, Tanaka I, Seo S, Yamazaki M, and Saito K.
LC/PDA/ESI-MS Profiling and Radical Scavenging Activityof Anthocyanins in Various Berries. J Biomed Biotechnol,
5:241-247, 2004.
3） Morazzoni, P. & Magistretti, M. J. Activity of Myrtocyan®, ananthocyanoside complex from Vaccinium myrtillus (VMA),on platelet aggregation and adhesiveness. Fitoterapia
61:13-21, 1990.