ヴァイロコントロール－病原菌をウイルスで病気にさせる－
研究期間：2007年～

研究背景・目的白紋羽病菌(Rosellina necatrix) は多年生作物に感染する土壌伝染性植物病原菌である。

従来の防除法では、一樹あたり１００リットル近くの
農薬を灌注するなど、労力・コスト・環境負荷の点で問題が多い。そこで、本菌を防除するために病原力低下効果を有する菌類ウイルスを利用したヴァイロコン
トロール（virocontrol）の開発が進められている。ト
ラップ法によるスクリーニングにより、土壌から有望なマイコウイルスを得ることに成功した。しかしながら、遺伝子型の異なる菌株間で対峙した場合、菌糸融
合が起こらず、細胞質不和合性反応によるプログラム
細胞死が誘導され、菌類ウイルスの伝搬が遮断されてしまう。任意菌株に対して菌類ウイルスを伝搬させる
ためには、この障壁を克服する必要がある。本研究では、細胞質不和合性機構を解明すると共に、菌類ウイルスを任意菌株へ導入するための技術開発を試みた。

罹病樹

白紋羽病菌

菌の病原力の低下因子の利用（菌類ウィルスの菌への感染）
治癒

罹病樹
病原力低下

ウィルス
菌糸
菌糸融合が重要①細胞質不和合性機構の解明
細胞観察を行い細胞質不和合性細胞死の特徴付けを行った

実験概要②菌類ウイルスの任意菌株への移行技術の開発
細胞質不和合性を打破し任意菌株へ菌類ウイルスが移行できる技術開発を行った①細胞質不和合性機構の解明

結果と考察

・菌糸が融合する前に細胞死が起こった。
・分泌性因子の認識により細胞死が引き起こされるものと考えられた。
・核の分解は起こらず、液胞の崩壊を端緒とするユニークな細胞死であった。

和合性反応

不和合性反応W779 vs. W370T1 (+ ZnCl2:0.75mM)②菌類ウイルスの任意菌株への移行技術の開発
前培養
R

受容菌
R

D

D

供与菌

セルロース膜菌類ウイルス保有阻害剤（87 種）移植

ウイルスゲノム（dsRNA）検出

W779 (GFP非発現)

W370T1 (GFP発現)

亜鉛化合物はPCDを緩和し
菌類ウイルスを伝搬した
神戸大学大学院 農学研究科 細胞機能構造学研究室
池田健一 連絡先：ikeken@phoenix.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Ikeda K, Inoue K, Nakamura H, Hamanaka T, Ohta T, Kitazawa H, Kida C, Kanematsu S, Park P (2011)
Genetic analysis of barrage line formation during mycelial incompatibility in Rosellinia necatrix. Fungal
Biology 115: 80-86.
2. Inoue K, Kanematsu S, Park P, Ikeda K (2011) Cytological analysis of mycelial incompatibility in Rosellinia
necatrix. Fungal Biology 115: 87-95.
3. Inoue K, Kanematsu S, Park P, Ikeda K (2011) Cytological analysis of mycelial incompatibility in
Helicobasidium mompa. FEMS Microbiology Letters 315: 94-100.
4. Inoue K, Ikeda K, Kanematsu S, Park P (2010) Ultrastructural analysis of mycelial incompatibility in
Rosellinia necatrix. Journal of Electron Microscopy Technology for Medicine and Biology 24: 83.
5. 池田健一、井上加奈子、木田千晶、上森喬大、兼松聡子、朴杓允 (2012) 病原菌をウイルスで病気にさせる生物防除法．土と微生物 66: 55-57.
6. Ikeda K, Inoue K, Kida C, Uwamori T, Sasaki A, Kanematsu S, Park P (2013) Potentiation of mycovirustransmission by zinc compounds via attenuation of heterogenic incompatibility in Rosellinia necatrix. Appliedand Environmental Microbiology 79: 3684-3691.
7. 池田健一 (2013) 病原菌をウイルスで病気にさせる生物防除法；ヴァイロコントロール．温古知新 50:
120-126.
8. 池田健一（2013）マイコウイルス伝搬の障壁となる細胞質不和合性機構とその克服．JATAFFジャーナル「特集 農作物生産におけるウイルスの有効利用」1: 9-13.
9. Uwamori T, Inoue K, Kida C, Morita Y, Park P, Nakayashiki H, Kanematsu S, Ikeda K (2015) Self- and nonself
recognition during hyphal interactions in Rosellinia necatrix. Journal of General Plant Pathology 81: 420-428.
10. Ohkita S, Lee Y, Nguyen Q, Ikeda K, Suzuki N, Nakayashiki H (2019) Three ourmia-like viruses and theirassociated RNAs in Pyricularia oryzae. Virology 534: 25-35.

学会発表
国際学会

８件

国内学会

２１件

特許
1. 朴杓允，池田健一，井上加奈子，兼松聡子： 細胞質不和合性阻害による糸状菌類へのウイルス導入方
法．特願2010-248960, 特願2011-181140（国内優先権主張出願）
2. 兼松聡子，八重樫元，池田健一，中屋敷均：新規白紋羽病菌およびその性質を利用した白紋羽病防除技
術．特願2016-026010

共同研究先
農研機構果樹研究所，

豊田合成株式会社，岡山大学，県立広島大学

研究費
１．生物系特定産業技術研究支援センター・イノベーション創出基礎的研究推進事業＜技術シーズ開発型＞「植物糸状菌病制御のためのヴァイロコントロール因子導入法の開発」（２００８～２０１２年）
２．農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業＜発展融合ステージ＞「ヴァイロコントロール因子の利用技術開発・果樹病害の治療・制御」（２０１３～２０１５年）
３．挑戦的研究（萌芽）「糸状菌における分生子を介した新たな菌類ウイルス伝搬様式」（２０１７～２０１８年）

電子顕微鏡技術の改良；固定法・樹脂切片特性・電子染色
研究期間：2007年～

研究背景・目的

実験概要

電子顕微鏡観察において良い画像を得るためには、観察対象となる試料の化学的特性と固定剤・樹脂・電子染色剤の化学特性との組み合わせを考慮する必要がある。本研究では、植物・糸状菌組織における観察法を検証した。
①固定法の検証
グルタルアルデヒドによる固定効果を向上させるための手法を検証した②各種組成樹脂を用いた切片の特性評価
各種組成で重合した樹脂より作製された切片の収縮性や試料との接着性などの特性評価を行った③酢酸ウラン代替染色剤の探索
核燃料物質として取扱規制の厳しい酢酸ウランに代わる電子染色剤の探索を試みた

結果と考察①固定法の検証；酸素バブリング法
グルタルアルデヒド固定中に酸素を供給することで固定効果が上昇した
酸素バブリング装置

通常処理区

酸素供給処理区

酸素要求性
ピリジニウム塩
による固定

樹脂

加温

非加温

a

b

c

d

e

f

g

h

i

切削方向

Quetol系樹脂はダイヤモン
ドナイフの切削圧に対して収縮しなかったが、Spurr’s
樹脂は収縮が大きく、観察
時に電子線を全体に照射して皺を開放した方が良い事を明らかとした。

Spurr’s Quetol-812 Araldite②各種組成樹脂を用いた切片の特性評価
植物試料は葉の表面がWaxで覆われていること
より、樹脂との剥離が頻繁に起こる。固定の過程
で過ヨウ素酸を処理することにより、樹脂との接着性が向上した。

無処理

過ヨウ素酸処理③酢酸ウラン代替染色剤の探索

タンパク質と電子染色剤の結合性
酢酸ウランに代わる電子染色剤として、酢酸ハフニウム、 を走査型電子顕微鏡反射電子観察
酢酸サマリウムを明らかとした。また、それぞれの試薬の モードで評価する系を確立した。
染色効果の違いより、結合特性が異なることが考えられた。
US
Pb
ウラン－鉛

ハフニウム－鉛

サマリウム－鉛
Sm

SmPb

U

UPb

神戸大学大学院 農学研究科 細胞機能構造学研究室
池田健一 連絡先：ikeken@phoenix.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Ikeda, K., Shimoi, S., Kitaoka, H., Morita, Y., Hyon, G.-S., Meguro, H., Inoue, K., and Park, P. (2010) The
occurrence of splits between plant surfaces and ambient epoxy resin is prevented by the oxidation of theepidermal cuticles with sodium perioxidate. Journal of Electron Microscopy Technology for Medicine andBiology 24: 19-24.
2. Ikeda, K., Inoue, K., Meguro, H., Shimoi, S., Kitaoka, H., Morita, Y., Hyon, G.-S., Kanematsu, S., and Park, P.
(2010) More than 0.2% water involved in unpolymerized Spurr’s resin mixture causes sectioning defects inultrathin sections of plant and fungal cells. Journal of Electron Microscopy Technology for Medicine andBiology 24: 35-39.
3. Ikeda, K., Inoue, K., Kanematsu, S., Horiuchi, Y., and Park, P. (2011) Enhanced Effects of nonisotopic
hafnium chloride in methanol as a substitute for uranyl acetate in TEM contrast of ultrastructure of fungal
and plant cells. Microscopy Research and Technique 74: 825-830.3.
4. Inoue, K., Morita, Y., Kanematsu, S., Park, P., and Ikeda, K. (2012) Comparative study of ultrathin section
shrinkage in various epoxy resin blocks: sectioning from Spurr’s block causes shrinkage in the longitudinal
direction. Journal of Electron Microscopy Technology for Medicine and Biology 26: 8-11.
5. Kaku, H., Inoue, K., Muranaka, Y., Park, P., Ikeda, K. (2015) Rapid contrast evaluation method based onaffinity beads and backscattered electron imaging for the screening of electron stains. Microscopy 64: 361368.

学会発表
1. Onoe, T., Horiuchi, Y., Inoue, K., Ikeda, K., and Park, P. (2009) A novel staining method for thin sections
and en bloc tissues of rat kidney fixed with glutaraldehyde and osmium tetroxide using methanolichafnium chloride. 6th International Symposium on Electron Microscopy in Medicine and Biology 2009
(Kobe University)
2. Shimoi, S., Ikeda, K., Kitaoka, H., Inoue, K., Hyon, G.-S., Hosogi, N., Kanematsu, S., and Park, P. (2009)
Treatment of periodic acid may enhance the attachment ability between specimen surfaces and theambient resin during ultrathin sectioning. 6th International Symposium on Electron Microscopy in Medicine
and Biology 2009 (Kobe University)
3. Horiuchi, Y., Onoe, T., Inoue, K., Ikeda, K., and Park, P. (2009) A novel staining method of methanolichafnium chloride (MHC) for uranyl acetate; staining effect of MHC for thin sections of bacteria, fungi,
human biopsies, rat tissues and plants. 6th International Symposium on Electron Microscopy in Medicine
and Biology 2009 (Kobe University)
4. 池田健一、井上加奈子、兼松聡子、朴杓允 (2011) 塩化サマリウムによるウラン代替染色法．医学生物学電子顕微鏡技術学会第27回学術講演会（四国大学交流プラザ、5月）p. 41.
5. 池田健一（2021）植物－微生物間相互作用解析における電子顕微鏡技術．第19回医学生物学電子顕微
鏡シンポジウム（招待講演）
国際学会

計

５件

国内学会

計

６件

受賞
医学生物学電子顕微鏡技術学会

奨励賞（２０１５年）

研究費
１．科学研究費 基盤研究Ｃ「感染応答タンパク質の高度保存のための酸素バブリング・アルデヒド新規
免疫電顕固定法」（２０１０～２０１２年）
２．科学研究費 基盤研究Ｃ「植物病理学のための酢酸ウランに代わるノンアイソトープ電子染色剤の新規開発」（２０１３～２０１５年）

pH降下型肥料を用いたレタスビックベイン病防除
研究期間：2014年～

レタスビックベイン病

研究背景・目的

レタスビックベイン病はウイルス病であるが、そのウイルスは媒介菌であるオルピディウム菌によって運ばれる。オルピディウム菌は低pH条件で根への感染力を失う
ことより、pH低下作用を有する肥料を用いた作付体系でレタス
ビックベイン病を防ぐことが可能であると考えた。本研究では、圃場におけるウイルス濃度の評価法の確立と低pH条件におけるオル
ピディウム菌の挙動を評価した。

実験概要

Mirafiori lettuce big-vein virus
オルピディウム菌（Olpidium virulentus）
休眠胞子

遊走子嚢

遊走子

①オルピディウム菌・ウイルス濃度の評価法

従来法より少量サンプルで解析できるように核酸抽出効率やプライマーの検討を行った②低pH条件におけるオルピディウム菌の挙動

低pH条件がオルピディウム菌の感染サイクルにどのように影響しているのか細胞学的解析を行った

結果と考察①オルピディウム菌・ウイルス濃度の評価法

土 0.5g

改善項目
１、土壌サンプル0.5 gにスケールダウン（細胞破砕機）
２、核酸抽出キットの改良
３、逆転写酵素の改良
４、プライマーの再設計

核酸抽出

ウイルス量

NucleoSpin RNA Clean-up(MACHEREY-NAGEL)

A(軽発病)

cDNA合成SYBR real time PCR

C(重発病)②低pH条件におけるオルピディウム菌の挙動

内部コントロールの利用

リン酸バッファー

根圏土壌

5

6

7

8

pH

上清
均一に混合

pH5.0 pH6.0pH7.0 pH8.0

６０分静置
遠心分離 100 xg 5 min

沈殿（100 xg）
低pH条件では上清画分で媒介菌が減少している

沈殿
Olpidium virulentus
特異的プライマーによるＰＣＲ

上清

核酸抽出
（ISOIL for Beads Beating）

低pH条件で遊走子放出が阻害される

神戸大学大学院 農学研究科 細胞機能構造学研究室
池田健一 連絡先：ikeken@phoenix.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Iwamoto, Y., Inoue, K., Nishiguchi, S., Matsuura, K., Aino, M., Nakayashiki, H., Ikeda, K. (2017) Acidic
soil conditions suppress zoospore release from zoosporangia in Olpidium virulentus. Journal of
General Plant Pathology 83: 240-243.
2. 岩本豊、井上海、池田健一、中屋敷均、田中正、佐藤博友、西口真嗣、松浦克成、中野伸一（2017）pH降下型肥料の施用がOlpidium virulentusの感染とレタスビックベイン病の発生に及ぼす影響．関西病虫害研究報告59: 51-53.

学会発表
1.池田健一、井上海、岩本豊、相野公孝、松浦克成、前川和正、中屋敷均、西口真嗣（2017）
Olpidium virulentusの遊走子放出に及ぼす土壌pHの影響．平成29年度日本植物病理学会大会、盛岡、
2017.4.26-28.
2.井上海、松浦克成、岩本豊、西口真嗣、池田健一、中屋敷均（2017）土壌からのミラフィオリレ
タスビックベインウイルスのqRT-PCR法による検出．平成29年度日本植物病理学会大会、盛岡、
2017.4.26-28.
3.池田健一、岩本豊、松浦克成、西口真嗣、中屋敷均（2019）Olpidium virulentusの休眠胞子におけるミラフィオリレタスビックベインウイルスの局在．平成３１年度日本植物病理学会大会、つくば2019.3.18-19.
4. 伊藤大貴、井上海、岩本豊、西口真嗣、中屋敷均、池田健一（2020）Mirafiori lettuce big vein
virusのLAMP法による検出．令和２年度日本植物病理学会関西部会
5. 池田健一、伊藤大貴、中屋敷均（2023）おとり植物を利用したMirafiori lettuce big-vein virus発病リスクのモニタリング．令和５年度日本植物病理学会関西部会

共同研究先
兵庫県農林水産技術研究所，ジェイカムアグリ

研究費
内閣府戦略的イノベーション創造プログラム（ＳＩＰ）＜次世代農林水産業創造技術＞「持続可能な農業千三のための新たな総合的植物保護技術の開発（レタスビックベイン病の発病を軽減し、加工業務用レタスに対応可能なpH降下型肥料の開発）」（２０１４～２０１８年）

植物病原糸状菌の宿主感染戦略の解明
研究期間：2007年～

植物病原菌は宿主葉に接着した後、侵入に重要な付着器を形成し、形態形成
付着器
植物細胞内へ侵入する。その過程において、細胞骨格系の変動を伴う形態変化や多様な遺伝子発現を伴い、胞子に蓄えられた糖や脂質などを生育に必要なエネルギーや侵入に必要な膨圧へと変換している。これら仕細胞壁
宿主侵入組みを解明することで、新たな病原菌防除戦略を見出すことが期待される。本研究でパピラ
は、宿主感染に重要な機構を明らかとし、病原菌種間の相違点などについて検討した。
研究背景・目的

結果と考察

①形態形成

植物
疎水面

いもち病菌は発芽した表面における物理的・化学的特性を感知し異なる発芽形態を示す。これら多様な形態変化を引き起こす仕組みはMAPキナーゼやcAMP-PKA
経路など多様なシグナル伝達経路が関与しており、下流の遺伝子発現では、ヒス接着性
トン修飾を改変する事でクロマチン構造を変化させていることを明らかとした。 ConA
さらに、いもち病菌は葉において付着器 WGA
付着器を形成するが、根においては菌足（Hyphopodium）を形成し、異なる遺伝 病原性
オートファジー
子制御が行われている。

②宿主侵入
宿主侵入を行うためには、細胞骨格系が付着器底部に集積することが重要であり、それはNADPH oxidase (Nox)が担っている。
胞子に蓄えられた糖や脂質などの貯蔵養分は各種代謝酵素によって分解・転送され、宿主侵入に重要な膨圧の生成や生育のためのエネルギーとして利用される。
貯蔵養分の代謝過程で、オートファジーが活性化されていることが明らかとなり、それに伴い、胞子内部の核が分解されてしまう。宿主感染時にはこのような大規模な代謝変動が起きていることが明らかとされている。

WT

感受性

ΔnoxA

ΔnoxB

発芽管

クチクラ
細胞壁

宿主接着

α-factor
親水面

Beef extract
Yeast extract

○
○
○
×
×
×

×
×
○
×
×
×

○
○
○
○
○
○

根面

？
weak
weak
hyphopodium○ (root)
×

いもち病菌におけるオートファジー誘導

１２時間

ナシ黒斑病菌におけるNoxBの病原性への関与

胞子

２４時間

液胞

胞子

胞子

発芽管
二重膜構造
（オートファゴソーム）

内容物は
分解された

ＰＭＳＦ処理（プロテアーゼ阻害剤）

いもち病菌の付着器における細胞骨格系のリング形成

ΔnoxAnoxB

アクチン局在セプチン局在神戸大学大学院 農学研究科 細胞機能構造学研究室
池田健一 連絡先：ikeken@phoenix.kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Park, P., and Ikeda, K. (2008): Ultrastructural analysis of responses of host and fungal cells during
plant infection. Journal of General Plant Pathology 74: 2-14.
2. Hyon, G.-S., Ikeda, K., Hosogi, N., Shinogi, T., and Park, P. (2010) Inhibitory effects of antioxidant
reagent in reactive oxygen species generation and penetration of appressoria of Alternaria alternata
Japanese pear pathotype. Phytopathology 100: 840-847.
3. Morita, Y., Hyon, G.-S., Hosogi, N., Miyata, N., Nakayashiki, H., Muranaka, Y., Inada, N., Park, P., andIkeda, K. (2013) Appressorium-localized NADPH oxidase B is essential for aggressiveness andpathogenicity in the host-specific toxin-producing fungus Alternaria alternata Japanese pear
pathotype. Molecular Plant Pathology 14: 365-378.
4. Pham, K. T. M., Inoue, Y., Vu B. V., Nguyen, H. H., Nakayashiki, T., Ikeda, K., Nakayashiki, H. (2015)
MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression
during infection-related morphogenesis. PLoS Genetics 11: e1005385.
5. 池田健一、井上加奈子、森田雄一、伊藤里紗、中本知里、植宏美、翠川陽大、藤原有紗、Talbot J
Nicholas、中屋敷均（2016）糸状菌病害の組織特異的感染戦略―いもち病菌の生い立ちを紐解く―．
植物感染生理談話会論文集「感染生理談話会の50年～古きを温ねて、新しきを知る～」 51: 83-94.
6. Ikeda, K., Park, P., Nakayashiki, H. (2019) Cell biology in phytopathogenic fungi during host
infection: commonalities and differences. Journal of General Plant Pathology 85: 163-173.
7. Xiang, Z., Okada, D., Asuke, S., Nakayashiki, H., Ikeda, K. (2022) Novel insights into host specificity
of Pyricularia oryzae and Pyricularia grisea in the infection of gramineous plant roots. Molecular
Plant Pathology 23: 1658-1670.
計

２６報

学会発表
国際学会

計

１７件

国内学会

計

５９件

受賞
Journal of General Plant Pathology誌論文賞「Novel aspects of hydrophobins in wheat isolate of
Magnaporthe oryzae: Mpg1, but not Mhp1, is essential for adhesion and pathogenicity」

共同研究先（エクセター大学、ネブラスカ大学）

研究費
１．科学研究費 基盤研究Ｂ（分担）「植物病害における病原性因子の役割に関する電子顕微鏡・
生化学解析」（２００６～２００８年）
２．科学研究費 若手研究Ａ（代表）「糸状菌の病原性発現過程におけるポラリソームと活性酸素生成複合体のダイナミクス」（２０１１～２０１３年）
３．ひょうご科学技術協会学術研究助成「植物病原糸状菌における膜局在性NADPHオキシダーゼ複合体構成因子の探索」（２０１９年）
４．科学研究費 基盤研究C（代表）「植物病原糸状菌における細胞周期の可視化と病原性に及ぼす影響評価」（２０２０～２０２２年）
５．科学研究費 基盤研究B（分担）「ジーンロスから紐解く植物病原菌の付着器侵入メカニズムと進化史（ ２０２３～２０２５年）」