酸化ストレス
酸化ストレス誘発網膜神経節細胞死
ストレス誘発網膜神経節細胞死に誘発網膜神経節細胞死に対するビルベリーエキスの保護作用するビルベリーエキスの保護作用（岐阜薬科大学、株式会社わかさ生活）

緑内障

0.3 µg/ml VMA80

1.0 µg/ml VMA60

3.0 µg/ml VMA

4010 µg/ml VMA

2000

エステラーゼ分解
エステラーゼ分解

468SIN-1

100

0.3 µM Cyanidin

80

1.0 µM Cyanidin

60

3.0 µM Cyanidin

40

10 µM Cyanidin

2030 µM Cyanidin

0102CM-H2DCF（蛍光：蛍光：緑）

Reactive
OxygenSpecies

1201201001008060
40**

200

NMDA (5 nmol/eye)及びVMAをマウス硝子体へ投与し、その7日後に眼球を摘出した。その後、固定・薄切した切片をHematoxylin及びEosin染色 により染色した。視神経乳頭より、約350 µm離れた箇所を撮影し、GCL（神経節細胞層）中の細胞数及びIPL（内網上層）の厚さを測定した。
GCL

Total Intensity(% of SIN-1)

Total Intensity(% of SIN-1)

CM-H2DCF（無色）＋Diacetate

2120

Reaction time (min)6．
．NMDA誘発網膜障害
誘発網膜障害モデル）
誘発網膜障害モデル （in vivo）

0.3

1.03.0VMASIN-1

100

SIN-180

0.3 µM Delphinidin60

1.0 µM Delphinidin

40

3.0 µM Delphinidin

2010 µM Delphinidin

030 µM Delphinidin02468IPL810**
**

40**

200.3 1.0 3.0 10Cyanidin
SIN-130 µM

120

SIN-1

1000.3 µM Malvidin80

1.0 µM Malvidin60

3.0 µM Malvidin
10 µM Malvidin

4030 µM Malvidin

2030 µM Trolox

00102468Reaction time (min)1201206600120

4

Reaction time (min)80

10 µg/ml

Reaction time (min)Total Intensity(% of SIN-1)

緑内障とは視神経乳頭、視野の特徴的変化の少なくともひとつを有し、通常、眼圧を十分に下降させることにより視神経障害の改善あるいは進行を阻止し得る眼の機能的構造的異常を特徴とする疾患である。

SIN-1

100

Radical production(％ of SIN-1 at 10 min)

＊ラジカル量
ラジカル量の測定原理＊
測定原理＊
CM-H2DCFDA（無色）Radical production(％ of SIN-1 at 10 min)

網膜神経節細胞死は緑内障等の後眼部疾患の原因のひとつであり、その発症機序の一部に酸化ストレスの関与が指摘されている1)。我々は、網膜神経節細胞株を用いて酸化ストレスを誘導する活性酸素種(ONOO-)に対するビルベリーエ
キス及び含有成分であるアントシアニジン（シアニジン、デルフィニジン、マルビジン）の作用について検討した。

120

Radical production(％ of SIN-1 at 10 min)

目的

Radical production(％ of SIN-1 at 10 min)

日本薬学会第128年会
年会
日本薬学会第10100

10080
*80

60**

60

**

4040**

20**

200

内顆粒層
外網状層

00.3 1.0 3.0 10Delphinidin
SIN-1

0.330 µM

1.03.0 10Malvidin
SIN-13030 µM
Trolox

図３. SIN-1（ONOO-）誘発RGC-5細胞内ラジカル上昇に対するVMA、シアニジン、デルフィニジン及びマルビジンの作用

外顆粒層*:p < 0.05, **:p < 0.01 vs. 0.5 mM SIN-1 (n=5-6)

マウス硝子体内投与

網膜色素上皮

VMAVehicle

Control

10100µg/eye

Eyeballs wereenucleated
Histologicalanalysis

ビルベリー（Vaccinium myrtillus)

0 Day

ブルーベリーの一種で主に北ヨーロッパ、北アメリカなどで自生している。樹高が15～40 cmと低く、耐寒性がある。4月から6月に開花する。約150種類あると言われているブルーベリーの中でも最もアントシ
アニン含量が多く、その抽出エキスはVMA (Vaccinium myrtillus
anthocyanoside）と呼ばれ36%、15種類のアントシアニンを含む。

7．
．TUNEL染色
染色

近年、血管新生抑制作用2)、血管保護作用3)などの薬理作用が報告されている。

NMDA (5 nmol/eye)、VMA及びnNOSの阻害剤であるL-NAMEをマウス硝子体へ投与し、その24時間後に眼球を摘出した。その後、固定・薄切した切片をTUNEL染色により、アポトーシス細胞を染色した。

7 Day
25 µm
Cell number in GCL (cell/mm2)

45.0

*

40.0

140.0

IPL thickness (µm)

正常視野
緑内障視野
正常視野と緑内障視野NMDA

マウス網膜切片像

Injection ofNMDA and VMA(administration of vitreous)

120.0

*

100.0

##

80.0
60.0
40.0
20.0

35.0

##

30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.00.0Control

Vehicle10010

ビルベリー （Vaccinium myrtillus）

Controlµg/eye

Vehicle100 µg/eye

NMDANMDA

図４. NMDA誘発網膜障害モデルに対するVMAの作用

結果

材料と方法

10VMAVMA##:p < 0.01 vs. Control, *:p < 0.05 vs. Vehicle (n=6-11)

NMDA
Control

１．化合物
VMAは株式会社
株式会社わかさシアニジン、デルフィニ
株式会社わかさ生活
わかさ生活（生活（京都）京都）から、シアニジン
シアニジン デルフィニ
ジン及びマルビジン
マルビジンはExtrasynthese社(Genay Cedex, France) よジン
マルビジン
OCH3り入手した。 OHOH

11
10

12
15

9OH

13

HOMalvidin① Delphinidin 3-O-galactopyranoside, ② Delphinidin 3-O-glucopyranoside,③ Cyanidin 3-O-galactopyranoside, ④ Delphinidin 3-O-arabinopyranoside,⑤ Cyanidin 3-O-glucopyranoside,⑥ Petunidin 3-O-galactopyranoside,⑦ Cyanidin 3-O-arabinopyranoside, ⑧ Petunidin 3-O-glucopyranoside,⑨ Paeonidin 3-O-galactopyranoside, ⑩ Petunidin 3-O-arabinopyranoside,⑪ Paeonidin 3-O-glucopyranoside,⑫ Malvidin 3-O-glucopyranoside,⑬ Paeonidin 3-O-arabinopyranoside, ⑭ Malvidin 3-O-galactopyranoside,⑮ Malvidin 3-O-arabinopyranoside2．
．HPLC分析
分析
VMAはは1 mg/mlとなるようギとなるようギ酸となるようギ酸へ溶解した
溶解した。
した。
溶出は／minでで行った。
溶出はreverse-phase C18 カラムを用カラムを用い、 1 ml／った。
UV-visible detectorによりにより 520 nmにてにて測定にて測定を測定を行った。
った。
Solution（A））液 10%ギギ酸（B））液 ギ 酸、アセトニトリル、アセトニトリル、メタノール、メタノール、水(10／／22.5／／22.5／／40 (vol/vol))The gradient
0分時分時・・・（A））液、10%（（B））液分時・・・90%（・・・40分時分時・・・（A））液、35%（（B））液分時・・・ 65%（－1 023 hour

Medium replace(10%FBS→1%FBS）
and addition of drugs

WST-8 assay
Oxidative-stress

Cell viability (% of Control)

RGC-5を1000 cell/wellの密度で96well plateへ播種し、24時間培養を行った。その後、培地を1％FBS-D-MEMへ置換し、各濃度のVMAまたはアグリコン（シアニジン、デルフィニジン及びマルビジン）を添加し、37℃にてインキュベートした。その1時間後、ONOO-を産生するSIN-1をそれぞれ終濃度0.5ｍMとなるよう添加した。その23時間後、生細胞をWST-8法（同仁）により定量した。

120**

10080

##60402000.3

100*80##60
402003 101Cyanidin
0.5 mM SIN-10.3

10 µg/ml

120
100*80

1 hourMeasurement ofradical in RGC-5

60

Medium replace(10%FBS→1%FBS）
and addition of drugs

Addition of
CM-H2DCFDA

VMA(100 µg/eye)NMDA

L-NAME(100 µg/eye)40
2000.3 1 3 10 30 10 30 µM
Delphinidin
0.5 mM SIN-1

10 µM

・VMA (10 µg/ml)、シアニジン(10 µM) 、デルフィニジン(30 µM) 、及びマルビジン(10 µM)はSIN-1誘発RGC-5細胞死を有意に抑制した (図２) 。
・マウス脳ホモジネートの脂質過酸化をVMA、シアニジン、デルフィニジン及びマルビジンは濃度依存的に抑制した(表1) 。
・VMA(10 µg/ml)、シアニジン(3.0-30 µM)、デルフィニジン(10-30 µM)及びマルビジン(10-30 µM)はSIN-1誘発細胞内ラジカル上昇を有意に抑制した(図３) 。
・VMA(100 µg/eye) はNMDA誘発網膜障害モデルマウスに対して内網状層厚の菲薄化及び網膜神経節細胞数の減少を有意に抑制した (図４) 。
・ VMA(100 µg/eye) 及びL-NAME(100 µg/eye)はNMDA誘発網膜障害モデル
マウスに対してTUNEL陽性の細胞数の増加を有意に抑制した(図５)。

100VMAの作用点

*80
##60

Ca2+NMDA40

NMDA 受容体200

Ca2+2+0.3 1 3 10 3Malvidin
0.5 mM SIN-1

10µM

Ca2+ Ca2+ Ca
Ca2+O2・VMAnNOSL-Arg##;p < 0.01 vs. Control *:p < 0.05, **:p < 0.01 vs. 0.5 mM SIN-1 (n=6)

ONOO-NO

脂質過酸化

Cell Death

図7. NMDA誘発網膜障害モデルに対するVMAの作用点

Treatment
VMA

IC50 (95% confidence limits)
1.0 µg/ml(0.8―1.4)

Cyanidin

0.7 µM(0.4―1.0)

Delphinidin

1.9 µM(1.4―2.4)

Malvidin

8.3 µM(5.7―20.2)

n=3-4
RGC-5 cells were seededat a density 1000cell/well(in 10% FBS D-MEM)**120

表１．脂質過酸化に対するVMA、シアニジン、デルフィニジン及びマルビジンの作用

RGC-5を1000 cell/wellの密度で96well plateへ播種し、24時間培養を行った。その後、培地を1％FBS-D-MEMへ置換し、各濃度のVMAまたはアグリコン（シアニジン、デルフィニジン及びマルビジン）を添加し、1時間、37℃にてインキュベートした。その1時間後、終濃度10µMとなるようCM-H2DCFDAを添加した。15分間、 37℃にてインキュベートした後、同じ培地に交換をした。その後、SIN-1を終濃度0.5 mM加え、10分間の経時的なラジカル変化を励起波長488nm、蛍光波長525 nmにて測定し、10分間の総ラジカル量を算出した。

01.0 3.0 10120

図２. SIN-1（ONOO-）誘発RGC-5細胞死に対するVMA、シアニジン、デルフィニジン及びマルビジンの作用

5．
．細胞内ラジカル
細胞内ラジカル測定
ラジカル測定Control**

結果のまとめVMA
0.5 mM SIN-1

4．
．マウス脳脂質過酸化マウス脳脂質過酸化マウス摘出脳ホモジネートに被検薬を加え、37℃30分間脂質過酸化反応させた。その後、直ちに35%HCｌO4を添加し、反応を停止させた。2800 rpm、10分間遠心し、その上清にチオバルビツール酸（TBA）溶液を添加し、100℃、15分間反応させることにより発色させ、TBA反応産物（TBARS）を吸光度計(532 nm)により計測した。結果は、各被検薬に対するTBARSの50%抑制率（IC50）として算出した。

####:p < 0.01 vs. Control, **;p < 0.01 vs. Vehicle (n=10-11)

Cell viability (% of Control)

3．
．RGC-5増殖試験
増殖試験

454035302520151050

図５. NMDA誘発TUNEL陽性細胞の増加に対するVMAの作用

図1. VMAのHPLC分析

Cell viability (% of Control)

Delphinidin

シアニジン、デルフィニジン及びマルビジンの構造式－24

TUNEL-positive cells in GCL (mm)86

OCH3OHHOCyanidin

50 µm

7O+OHOH
HO

RGC-5 cells were seeded
at a density 1000 cell/well(in 10% FBS D-MEM)

L-NAME (100 µg/eye)

514

HOO+

3 4

Cell viability (% of Control)

HOO+－24

VMA (100 µg/eye)

2OH

OHOH
HOVehicle

１

まとめVMA及びその含有成分であるアントシアニジンは、酸化ストレス（ONOO-）誘導RGC-5細胞死を有意に抑制した。また、
VMAはin vivo NMDA誘発網膜障害を有意に抑制した。
これらの保護作用には、アントシアニジンの抗酸化作用が関与していることが示唆された。

参考文献
1)Bonne, C., Muller, A., Villain, M., Free radicals in retinal ischemia.
Gen Pharmacol 30:3:275-280, 1998.
2)N. Matsunaga, Y. Chikaraishi, M. Shimazawa, S.Yokota and H. Hara.
Vaccinium myrtillus (Bilberry) extracts reduce angiogenesis in vitro and in vivo .
eCAM (published online on October 27, 20doi:10.1093/ecam/nem151)
3) Morazzoni, P. & Magistretti, M. J. Activity of Myrtocyan®, ananthocyanoside complex from Vaccinium myrtillus (VMA), on platelet aggregation
and adhesiveness. Fitoterapia 61:13-21, 1990.