九州シンクロトロン光研究センター
県有ビームライン利用報告書
課 題 番 号 ： 1305052F

Ｂ Ｌ 番 号 ： BL-07（様式第 5 号）

南極産好冷細菌由来グルコキナーゼの高分解能Ｘ線結晶解析
High resolution X-ray crystallographic analysisof glucosekinase from Antarctic

Pseudoalteromonas sp. AS-131

本島 浩之、渡邉 啓一
Hiroyuki Motoshima, Keiichi Watanabe

佐賀大学
Saga University※１※２

先 端 創 生 利 用（ 長 期 タ イ プ 、長 期 ト ラ イ ア ル ユ ー ス ）課 題 は 、実 施 課 題 名 の 末 尾 に 期 を 表 す（ Ⅰ ）、（ Ⅱ ）、（ Ⅲ ） を 追 記 し て 下 さ い 。
利 用 情 報 の 開 示 が 必 要 な 課 題 は 、本 利 用 報 告 書 と は 別 に 利 用 年 度 終 了 後 二 年 以 内 に 研 究 成 果 公
開 ｛ 論 文 （ 査 読 付 ） の 発 表 又 は 研 究 セ ン タ ー の 研 究 成 果 公 報 で 公 表 ｝ が 必 要 で す 。 (ト ラ イ アルユースを除く)

１．概要（注：結論を含めて下さい）
南 極 産 好 冷 細 菌 由 来 グ ル コ キ ナ ー ゼ の グ ル コ ー ス 及 び ATPア ナ ロ グ を 含 む 条 件 で の 共 結晶 を 作 成 し た 。複 合 体 結 晶 の 回 折 実 験 の 結 果 、得 ら れ た 回 折 デ ー タ が 3.0 Å と 低 分 解 能 、か つ R-merge が 悪 く デ ー タ 取 集 に は 適 さ な い 結 晶 で あ っ た め 、構 造 解 析 を 行 う こ と が できなかった。
（ English ）We have created a co-crystal of conditions, including the ATP analog and glucose
complex of glucokinase from Antarctic Pseudoalteromonas sp. AS-131. Results
diffraction experiments of complex crystals, because collection preparative data
R-merge poor diffraction data were obtained at low resolution at 3.0 Å , these data
could not be carried out structural analysis.

２．背景と目的
低温環境で生育する生物の保有する酵素は低温に適応している酵素（低温適応酵素）であると考えられている。低温適応酵素とは温度低下による化学反応速度低下を、酵素の構造の動き（ゆらぎ）を大きくすることによって、低温での活性低下を防いでおり、それゆえ熱安定性が低いものが多いといわれている。今回用いる南極産好冷細菌由来グルコキナーゼ（PsGk）はこれまでの研究により、中温菌である大腸菌 K-12 株由来グルコキナーゼ（EcGk）と比較して熱安定性が 20℃高く、活性の温度依存では至適温度が 5℃低く、至適温度以下では約 6 倍活性が高いことがわかっている。この特徴はこれまでの低温適応酵素では見られない熱安定性の高い低温適応酵素であることがわかった。また、基質であるグルコースと ATP に対する親和性を調べた実験から、南極産好冷細菌由来グルコキナーゼ（PsGk）は大腸菌 K-12 株由来グルコキナーゼ（EcGk）と比較して、グルコースの場合、あまり違いは見られなかったが、ATP の場合、親和性の低下が見られた。ATP 結合部位はヒト由来グルコキナーゼの X 線結晶構造からわかっており、南極産好冷細菌由来グルコキナーゼ（PsGk）はその領域の近傍に 5 残基の挿入が見られた。

３．実験内容（試料、実験方法、解析方法の説明）
大腸菌で発現した好冷細菌由来グルコキナーゼを用いた。このグクコキナーゼは1 mM グルコース、1 mM ATPアナログ(PNP) を含む蛋白質溶液に沈殿溶液

0.2 M Trimethylamine N-oxide

dihydrate、0.1 M Tris pH 8.5、25% w/v PEGMME 2000の条件にから生じた結晶を用いた。

用いる試料は単結晶のタンパク質の結晶で、放射線照射による劣化を防ぐため、窒素噴きつけによる低温測定（100 Ｋ）を行う。測定は単結晶Ｘ線回折実験。測定条件は波長1Å前後、試料温度 100K、 2θ角度範囲 0°、振り角 1°、カメラ長 100 mm で行った。
Summary of data collection statistics------------------------------------------------------------Spacegroup
Unit cell dimensions

P4132
168.1990.00

168.19168.19

90.00

90.00

Mosaicity

0.78

Resolution range

23.32 - 3.05

Total number of reflections

353835

Number of unique reflections

16069(3.15 - 3.05)

Average redundancy

22.02(21.98)% completeness99.8(99.2)

Rmerge0.766(0.939)

Rmeas

0.784

(0.961)

RmeasA (I+,I- reflns kept apart) 0.787
Reduced ChiSquared
Output <I/sigI>(0.962)0.99

3.7(0.82)(2.6)------------------------------------------------------------Note: Values in () are for the last resolution shell.

４．実験結果と考察
今回は基質を含まない結晶とは結晶系が異なっていため、基質アナログが結合している可能が高かったが、得られた回折データが3.0 Åと低分解能、かつR-merge が悪くデータ取集には適さない結晶であっため、構造解析を行うことができなかった。

５．今後の課題
現段階では基質や基質アナログを含んだ複合体結晶を得ることができていないので、結晶が条件と基質アナログの変更および検討を行い、複合体結晶の調整を行う必要がある。

６．参考文献

２０１３年度

修士論文（湧川）

２０１１年度
２０１０年度

修士論文
修士論文

（織田）
（中山）

２００９年度

修士論文（小川）

７．論文発表・特許（注：本課題に関連するこれまでの代表的な成果）

８．キーワード（注：試料及び実験方法を特定する用語を２～３）
好冷細菌、グルコキナーゼ、ATP アナログ

９．研究成果公開について（注：※２に記載した研究成果の公開について①と②のうち該当しない方を消して下さい。また、論文（査読付）発表と研究センターへの報告、または研究成果公報への原稿提出時期を記入して下さい（2012 年度実施課題は 2014 年度末が期限となります。）② 研究成果公報の原稿提出（提出時期：２０１６年（提出時期：２０１６年 ３月）