Tiss. Cult. Res. Commun. 27: 139–147 (2008)© 2008 Japanese Tissue Culture Association

日本におけるヒト ES、iPS 細胞研究標準化：その１

古江−楠田 美保
独・医薬基盤研究所・生物資源研究部門・細胞資源研究室
京都大学再生医科学研究所・附属幹細胞医学研究センター・細胞プロセシング

要旨

１９９８年にヒト胚性幹（ES）細胞が樹立され、発生過程におけるメカニズムの解明や再生医療応用などの目的で、国際的にはさかんに研究が進められている。
一方、日本においては種々の問題から、多くの研究者がヒト ES 細胞を使用して研究を進められているという現状ではない。２００７年にヒト人工多能性幹（iPS）細胞が開発され、日本においてもにわかにヒト幹細胞の培養に携わる研究者が増加してきた。ヒト iPS 細胞は、ヒト ES 細胞様の形質を有しており、ES 細胞用のプロトコールのほとんどを iPS 細胞に応用することが可能である。
この総説では、ヒト ES についての基本的な培養について紹介する。

キーワード： ヒト ES 細胞、ヒト iPS 細胞、フィーダー細胞

序

おいては2004年に中辻らのグループにより2，3） ヒ

文ト ES 細胞株が樹立されたが、種々の問題から多く1）

1998年 Thomson らにより 、ヒト ES 細胞が樹の研究者がヒト ES 細胞を使用して研究を進めてい立されて10年の月日が過ぎようとしている。当時、るという現状ではない。2006年に山中らのグルーThomson 教授からヒト ES 細胞の供与をうけた多プにより、マウス人工多能性幹（iPS）細胞の開発

くの研究者がその培養ができず、たびたびが発表された4）。多くの研究者達はヒト iPS 細胞のThomson 教授に再送を求めるため、ジャクソン研

開発までにはまだまだ時間がかかるだろうと予想究所でヒト ES 細胞のトレーニングが始まったと聞していた。しかし、その予想を大きく裏切って、く。この話は、ヒト ES 細胞の培養が従来の細胞培

2007年にヒト iPS 細胞の作成が発表された5）。その養とはかなり異なっていることを意味するのでは後は次々と世界中から新しいヒト iPS 細胞作成のないだろうか。現在、ヒトES 細胞は、国際的には報告されている6–9）。日本国内においても、各研究

発生過程におけるメカニズムの解明や再生医療研室で新規の iPS 細胞の作製が行われ、当 JCRB 細究などにさかんに使用されている。一方、日本に

胞バンク（厚生労働省研究資源事業）に新規のヒト iPS 細胞が寄託されて、現在、分譲の準備を行っ連絡者：古江−楠田美保ている。ヒト ES 細胞は株間の差が大きいことが知独立行政法人 医薬基盤研究所 生物資源研究部門 細胞資源研究室〒567–0085 茨木市彩都あさぎ1–6–8
TEL：072–641–9811 内線（3210）、FAX：072–641–9851
E-mail: mkfurue@nibio.go.jp

られている。一つの研究室で樹立された細胞であっても、株間によって増殖速度や分化傾向も異なり10）、また、継代方法を変える必要がある場合

139

古江−楠田美保

も多い。英国シェフィール大学 Andrews 教授がマイシンあるいは g 線照射処理済みの MEF が供給

リーダーとして推進している International human

されている（表 1 ）。各自で初代培養を行って MEF

ES cell initiatives（ISCI）プロジェクトでは、日本を作成すると安価なように思えるが、ES 細胞の未を含めた世界11カ国の研究者らが共同で60株近く分化性を維持できるかどうかなどのチェックを含のヒト ES 細胞株の特徴を比較し、ヒト ES 細胞研

めると、ロット管理にかなり手間がかかる。MEF

11，
12）

究の標準化が進められている。ヒト iPS 細胞はではなく、樹立された STO 細胞株を使用する場合

ヒト ES 細胞様の特徴を有しており、同じ細胞株かもある14）。STO 細胞（ATCC, CRL-1503）は、Dr.

ら作製された iPS 細胞であっても、クローン間のAlan Bernstein により分離された SIM マウス線維差が認められる。ES 細胞を用いた培養プロトコー

芽細胞のチオグアニンおよびウアバイン抵抗性亜ルのほとんどを iPS 細胞に応用することが可能で系で、奇形癌腫（EC）やマウス ES 細胞のフィーある。ヒト ES 細胞研究が一般的でなかった日本にダーとして用いられている。STO 細胞は容易に細おいてヒト iPS 細胞を用いた研究を行うためには、胞を増やすことが可能であり、ほぼ MEF と同様に

ヒト ES 細胞を基準とした標準化研究を行う必要が問題なく培養できる場合もあるが、ES 細胞との相あるだろう。まず、ヒトES、iPS 細胞ついて論文性の問題があったり、4 日間以上の培養には耐えに記載されないような内容も含めて基礎的な培養られないなど、難しい点もある。しかし、相性よ

方法について紹介する。

く培養できる場合には、取り扱いが簡単で安価である。ネオマイシン抵抗性（neor）発現ベクター
および LIF 発現ベクターを安定的に組み込んだ

１．フィーダー細胞

STO 細胞（SNL 細胞、あるいは SNL 76/7 STO 細ES 細胞を未分化状態に保持するために、一般的

胞、ECACC 07032801）は、山中らのグループににはマウス胎児由来初代培養線維芽細胞（mouse

よるヒト iPS 細胞培養に使用されている。また、embryonic fibroblast: MEF）がフィーダー細胞とし動物由来細胞を使用せず、ヒト化培養条件を目指13）て用いられている 。線維芽細胞といっても純粋して様々なヒト組織由来細胞が試みられていな線維芽細胞ではなく、実際には多くの細胞が混る15，16）。

ざっている。マウスの系統は、各種細胞の樹立者が使用したものを使うのが望ましい。MEF はマイ

２．培

トマイシン C あるいは g 線照射により有糸分裂を不活性化して使用する。最近は、各社からマイト

養液Thomson らにより樹立された当時は Dulbecco’s

表１ JCRB において使用しているフィーダー細胞の種類
細 胞 名
Primary mouse embryo fibroblast
Strain CF-1
Hygro Resistant Strain C57/BL6ICR
STO 細胞SNL 76/7 STO 細胞処

理

マイトマイシン処理済
マイトマイシン処理済
マイトマイシン処理済* のあるものは、当バンクで使用可能であることを確認済み。

140

入手先

カタログ番号

細胞数 /25 cm2

ミリポア
ミリポア
リプロセル
ATCC
ECACC

PMEF-CF*PMEF-HL*RCHEFC003*
CRL-1503
07032801

2.4 ¥ 1052 ¥ 105
2 ¥ 105

日本におけるヒト ES、iPS 細胞研究標準化

modified Eagle’s medium、あるいは DMEM と F12る。幹細胞は、弱酸性には強いがアルカリ性にはを 1：1 に混合した DM/F12、と20％牛血清が使用弱いので、注意が必要である18）。

されていた13）。しかし、血清成分にはヒト ES 細胞の分化因子も含まれていることから改良され、近３．細 胞 分 散 法

年は、線維芽細胞増殖因子（FGF-2）と KnockOut

ヒト ES、iPS 細胞の培養において細胞分散法がSerum Replacement™（KSR, Invitrogen）と KnockOut
17）

DMEM（Invitrogen）が使用されている 。DM/

もっとも難しいと言えるだろう。シングルセルにF12、あるいは KnockOut DM/F12（Invitrogen）もしてしまうと、ほとんどの細胞がアポトーシスに基礎培地として使用されている（表 1 ）。KSR は、より生存できないため、コロニーを50〜100個ぐら

serum-free とされているが、動物由来成分を含み、いの細胞集団にして継代を行う1，19）。継代時の細胞ロット差があるためにロットチェックが必要とな

分散は、機械的方法と酵素による方法に大別される。また、解凍して 2 週間以上たったものは品質る13）。酵素による方法は、均一に細胞分散でき、簡が保証されていない。HEPES を含まない培地を使便である。一方、分散方法によっては分化しなく用することが多い。HEPES はもともと一般的な培なる、あるいは、染色体異常となるなど、細胞分養細胞に対して毒性があり、ロット差も多いこと

散方法による様々な現象がヒト ES 細胞研究者の間が知られている。一方、HEPES を使用しない場合

では知られている。特に、酵素処理によってシン

には緩衝作用が弱くなり、pH の変化も大きくな

グルセルが多くでてしまうような操作により、染

表２
最

終

濃

度

80% Knockout DMEM*
（あるいは DMEM/F12）
20% GIBCO Knockout SR
1% non-essential amino acid soltuion
1 mM L-glutamine
0.1 mM b-mercaptoethanol
4 mg/ml human bFGF**

ヒト ES 用培地25, 26)
ス

ト

ッ

ク

GIBCO 番号10829-018(Sigma D6421)

100 x MEM non-essential amino acid soltuion
0.146 g in 10 ml PBS
14.3 M b-mercaptoethanol
2 mg/ml in PBS with 0.1% BSA

10828-028
11140-035
21-51-016
Sigma M-7154
13256-029【手順】
1．L-glutamine / b-mercaptoethanol 液の作成
10 ml の CMF-PBS に、0.146 g の L-glutamine を 15 ml チューブに入れる。
7 ml の b-mercaptoethanol を入れてよく混ぜる。
2．フィルターユニットに、以下を入れる。
Knockout DMEM
160 mlGIBCO Knockout SR
40 ml
2 ml
L-glutamine / b-mercaptoethanol 液
100 x non-essential amino acid solution
2 mlhuman bFGF
400 ml3．フィルターする。
4．4 °Cにて保存し、1 週間以内に使用する。
*：JCRB 細胞バンクでは HEPES を含まない GIBCO11965、11765 を混ぜて使用している。
**：研究室によって使用濃度は少しずつ異なっているので、実際に培養を開始する際には、その細胞に添付されているプロトコールを参照のこと。

141

古江−楠田美保

表３．JCRB におけるヒト ES、iPS 細胞の継代の手順
手
2

準

備

継

代

培
地
交
換

漓

順

時

間

滷

25 cm フラスコ に0.1%ゼラチン溶液を 2 ml ずつ入れる 。
37°Cインキュベーターに静置。
MEF 用培地を作成澆。
ゼラチン液を吸引。PBS にて洗浄。
各フラスコに MEF 用培地を 4 ml ずつ入れる。
15 ml チューブに MEF 培地を 9 ml 入れる。
N2 に入れたまま MEF をクリーンベンチ近くに持ってくる。
バイアルの蓋をクリーンベンチ内で開けてバイアルの N2 を抜く。
37°Cウォーターバスに入れて溶解。半分以上凍った状態でクリーンベンチ内へ移動する。MEF 培地でピペッ
ティングしながら溶解。MEF 浮遊液を 15 ml チューブに入れる。
1000 rpm 遠心
新しい MEF 用培地に MEF を浮遊させる。
MEF 細胞浮遊液を 1 ml ずつ各フラスコに入れる。
MEF を CO2 インキュベーターに入れて、培養。
MEF 用培地からES用培地（FGF-2 なし）に交換し、培養潺。
ヒト ES、iPS 細胞を培養しているフラスコの培地を吸引。
1 unit/ml Dispase潸（Roche/ 解凍後 3 日以内に使用）を 1 ml 入れる。
37°C・CO2 インキュベーターに入れてインキュベーション。
Dispase を吸引。
hES 培地 10 ml を入れて、10 ml ピペットをつけたピペットエイド（強にする）で培地を吹きかけるようにしてコロニーをはがす（できるだけ回数を少なくする。2 回程度のピペッティングでコロニーがはがれないよ
うな場合は、セルスクレーパーを使用してコロニーをはがす）。
顕微鏡でコロニーの分散状態を確認する。
15 ml チューブに細胞浮遊液を入れて、300 rpm にて遠心（大きいコロニーのみを回収する）。
新しい hES 培地を入れて細胞浮遊液とする（ピペッティングはしない）。
MEF の培地を吸引。
各フラスコに細胞浮遊液を入れる（Slit の割合は株による）顕微鏡でコロニーの分散状態を確認。
CO2 インキュベーターに入れて培養。
接着率が悪い株の場合、翌日の培地交換は行わない場合もある
培地交換に必要な hES 培地をチューブに分取し、FGF-2 を入れる。
37°Cウォーターバスで培地を温める。
細胞の状態を顕微鏡でチェック。
温めた培地をクリーンベンチに持ってくる。
フラスコの培地を吸引。
温めた培地を入れる。
細胞の状態をチェック潯。
CO2 インキュベーターに入れて、培養。
基本的に毎日培地交換を行う潛。

30 minできるだけ短い時間で行う。
2 min

24 h
24 h

3~10 min澁

2 min

24 h
(24 h)5 min

漓 メーカーによって細胞の生着率や継代時のディスパーゼの処理時間なども変わってくる。当バンクではコーニングを使用している。
滷 成育医療センター樹立 iPS 細胞は、C57/BL6 マウスの MEF を使用して樹立されている。市販のものでは、Hygro Resistant Strain C57/
BL6（ミリポア）が使用可能であることを確認している。MEF バイアル 1 本を30枚の 25 cm2 フラスコに播種している。ただし、ロット差があるため、新しいロットの際には、密度を変えて播種してチェックする必要がある。
澆 high glucose, L-gluthaminem、15%牛胎児血清（ES グレード）含有 DMEM
潺 MEF は播種してから24時間後では十分に広がっていないため、2 日後以降に使用する方が望ましい。継代する前に、事前にヒト ES用培地に交換をしておき、MEF をヒト ES 培地になじませておくとよい。
潸 Dispase の活性は解凍後 3 日以後は急激に低下する。細胞分散の処理時間を一定にするためには、用事解凍して使用するのが望ましい。また、提示されている酵素活性が同様であっても、会社によって微妙にその活性は異なる。当セルバンクでは Roch・Dispase 1
unit/ml で使用できることは確認している。
澁 Dispase に対する感受性は株によって異なる。新しいロットのディスパーゼあるいは新しい細胞株の場合には、まず、3 分37°Cで処理して顕微鏡でコロニーの状態を確認する。ES、iPS 細胞のコロニーのエッジが光って、少しだけ丸くカールしていたら、すぐにディスパーゼを除く。コロニーが巻きあがるようにカールしている場合には処理時間が長すぎる。その場合、簡単に揺らしただけでコロ
ニーがはがれてしまう可能性があるため、ディスパーゼは吸引せずに、培地を加えて遠心してディスパーゼを除く。2 〜 3 回培地で洗った方が生着率が良い。
澀 培地の調整でよく間違えるのが 2-ME の濃度である。2-ME の濃度が高い場合、培地交換してすぐに細胞が死んでいく。
潯 平日は毎日培地交換を行うが、週末は土曜日か日曜日のどちらか 1 回のみにしている。ただし、その場合、コンフルエントでない状
態にしておく必要がある。

142

日本におけるヒト ES、iPS 細胞研究標準化

色体異常が誘導されると報告されている20，21）。操

ニーを選択する際に使用できる。しかし、EDTA

作者による差も大きく、今後改良がもっとも必要に対する感受性は細胞株によって異なり、シング

な事項であると考えられる。

ルセルになる細胞株もあり、すべての細胞株に使

漓

機

械

用できるわけではない。

的潺

機械的、いわゆる mechanical による継代方法1）

トリプシン／EDTA

が、染色体変異が少なく、分化能や未分化性の維ヒト ES 細胞はトリプシンに弱く、0.05％ trypsin

持がもっとも良いと、ヒト ES 細胞研究者の間では/ 1 mM EDTA を使用する。通常の継代に使用され信じられている。顕微鏡下で、形のよいコロニーている細胞株もあるが、FACS による解析の際にを探し、まず、その周りのフィーダーを先の細い

シングルセルにするために使用されることが多い。

プラスチックパスツールで除き、コロニーを50〜潸 トリプシン／コラゲナーゼ（CTK）

100程度の細胞集団になるようにプラスチックパス
ツールで小さく刻んでからピックアップし、新し

日本国内では末盛ら3）により開発された［Ca2+］

い MEF の上に播種する。この手法は熟練と時間をで活性を弱めたトリプシンとコラゲナーゼとの混3）要し、また、大容量での培養は難しい 。最近、イ

合液 CTK が使用されていることが多い。処理時間

ンビトロジェンから専用のスクレーパー（StemPro

も短く簡便であるが、均一で適度な大きさのコロ

EZPassage）が発売された。時間と熟練は要さずにニーにするためには若干の熟練を要する。

継代できるがコストは高くなる。
滷澁

コラゲナーゼディスパーゼ合同酒精が自然界より分離選択したバチルス属

13）とセルスクレーパーをの菌株の培養液より精製したプロテアーゼで、ト用いる方法が一般的に使用されている。培地を除リプシンやコラゲナーゼより穏やかに細胞を分散

き、0.1％コラゲナーゼ IV を 1 ml 加えて37°Cのイできる。Thomson らによる樹立時には、機械的方

ンキュベーターに入れて約10分程度処理する。時法かディスパーゼが用いられている。当セルバン

間は酵素活性によるが、時々、顕微鏡下で観察し、クにおいては、現在、iPS 細胞の継代にはディスフィーダーとコロニーの間に間隙ができる程度にパーゼを使用している。

0.1％コラゲナーゼ IV

なったら、コラゲナーゼを吸引し、新しい培地を澀 アキュターゼTM

2 〜 3 ml 加えてからセルスクレーパーで細胞をはがす。培地をさらに 7 ml 程度加えてフィーダーとミリポアから販売されているプロテアーゼ、ココロニーを引き離すように、ピペッティングを数

ラーゲン分解酵素による細胞剥離剤とされている回行う。シェフィールド大学では、コラゲナーゼ

が組成は明らかにされていない。ヒト ES 細胞は通とガラスビーズを使用している。

常シングルセルとなると増殖できないが、この分澆散液を使用した場合には、シングルセルにしてもEDTA細胞が増殖できる。クローナルアッセイなどの場

0.1〜0.2％ EDTA で処理すると、適度な大きさ合に使用されている。

にコロニーが分散され、未分化なコロニーだけが回収できる。分化した細胞集団から未分化なコロ

143

古江−楠田潯 ROCK インヒビター

美保

漓

形

態

細胞分散液ではないが、シングルセルにした際細胞質がほとんどなく、丸い核を持った細胞が22）

コンパクトに集合したコロニーを形成し、細胞間により報告された。遺伝子導入後のクローニング。
境が明瞭でない特徴的な様相を呈する17）（図１）のアポトーシスを阻害する薬剤として、笹井らなど、シングルセルにする必要がある際に使用さ

滷

れている。

アルカリフォスファターゼ活性の同定

未分化なマウス、サル、ヒトの ES 細胞は、組織
非特異的アルカリフォスファターゼ活性を示すこ

４．未分化性の同定法についてとが知られている。その機能については、明らか未分化なヒト ES 細胞に発現するマーカー分子やとなっていない。

表面抗原などが報告されているが、未分化性を同澆定する決定的なマーカー分子は見つかってない。
現状では、形態からの判断がもっとも確実である

FACS による細胞表面抗原の同定

ヒト Embryonal carcinoma（EC）に発現する糖脂と言われている。

質である stage specific embryonic antigen（SSEA）-3、

図１：
A〜C：hES khES-1 京都大学再生医科学研究所 により分配されたヒト ES 細胞 khES-1。
D〜F：hiPS 201B7；物質―細胞統合システム拠点 iPS 細胞研究センター／再生医科学研究所・山中伸弥教授から共同研究契約により提供されたヒト iPS 細胞 201B7 clone。
G〜I： hiPS Dotcom; 国立成育医療センター生殖医療研究部梅澤明弘部長より寄託されたヒト iPS 細胞 dotcom
clone。

144

日本におけるヒト ES、iPS 細胞研究標準化

SSEA-4、糖タンパクである Tra-1-60、Tra-1-81 がの一助となることを願う。

23）

広く使用されている 。SSEA-1 は、マウスにおいては未分化な ES 細胞において発現するが、ヒトに謝

おいては、分化した ES 細胞において発現する。

辞

SSEA-4 は、未分化なヒト ES 細胞にもヒト ES、iPS 細胞の培養に関与している独・医発現するが、赤血球にも発現する。一般的には、

薬基盤研のすべての皆様に感謝します。なお、ヒ

SSEA-1 と、SSEA-3 あるいは SSEA-4 が調べられ

ト ES、iPS 細胞に関する本研究は、厚生労働省科ている。しかし、SSEA-3 が発現しているからと学研究費補助金によりサポートされています。

SSEA-3,

いって SSEA-4 が発現しているとは限らないため、これらの抗体をセットで解析することが望ましい。

文潺 RT-PCR による遺伝子発現の解析

献1）Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S.,
Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S. andJones, J. M.: Embryonic stem cell lines derived fromhuman blastocysts. Science, 282, 1145–1147,
1998.
2）Suemori, H.: [Establishment of human embryonicstem cell lines and their therapeutic application].
Rinsho Byori, 52, 254–258, 2004.
3）Suemori, H., Yasuchika, K., Hasegawa, K., Fujioka,T., Tsuneyoshi, N. and Nakatsuji, N.: Efficient establishment of human embryonic stem cell lines andlong-term maintenance with stable karyotype by
enzymatic bulk passage. Biochem Biophys Res
Commun, 345, 926–932, 2006.
4） Takahashi, K. and Yamanaka, S.: Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic andadult fibroblast cultures by defined factors. Cell,
126, 663–676, 2006.
5）Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M.,
Ichisaka, T., Tomoda, K. and Yamanaka, S.: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 131, 861–872, 2007.
6）Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., AntosiewiczBourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir,
G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, II and Thomson,
J. A.: Induced pluripotent stem cell lines derived fromhuman somatic cells. Science, 318, 1917–1920,
2007.
7）Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A.,
Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W. and
Daley, G. Q.: Reprogramming of human somatic
cells to pluripotency with defined factors. Nature,451, 141–146, 2008.
8） Huangfu, D., Osafune, K., Maehr, R., Guo, W.,
Eijkelenboom, A., Chen, S., Muhlestein, W. andMelton, D. A.: Induction of pluripotent stem cells from

現在、多くの転写因子が未分化性維持に機能していることが報告されている。なかでも、OCT3/
4、NANOG、SOX2 はマウスならびにヒト ES 細胞の未分化マーカー遺伝子として認識されている24）。
そ の ほ か に 、 REX-1、 TGDF、 FGF-4、 LIN28、
LEFTB なども未分化なヒト ES 細胞に発現することが報告されている。ヒト ES 細胞研究 Initiative
project による世界で樹立された59株のヒト ES 細胞における遺伝子発現解析の結果が報告されているので12）、参照されたい。

５．培 養 の 実 際
ヒトES、iPS 細胞は、継代ごとに、あるいは、操作者により細胞の状態が異なってしまうことはよく見られ、大変扱いが難しい。操作者の腕が問われる細胞である。油断をすると、ほとんどの細胞が分化してしまう。実験をする上でも、毎回同じ結果を得ることが難しいため、指導する研究者は間違いが起きないよう十分に監督する必要があるだろう。株によって相当に特徴が異なるため、あまり扱いにくいようであれば、株を変えることをお勧めする。以上、簡単ではあるが、ヒト ES、iPS
細胞の培養方法についての概要をまとめてみた。
本総説が、多くの研究者によるより良い成果産出145

古江−楠田primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2.
Nat Biotechnol, 2008.
9） Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., Niakan, K. K.,
Weisenthal, L. M., Mitsumoto, H., Chung, W., Croft,
G. F., Saphier, G., Leibel, R., Goland, R., Wichterle,
H., Henderson, C. E. and Eggan, K.: Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS
can be differentiated into motor neurons. Science,
321, 1218–1221, 2008.
10）Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R.
J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien,
K. R. and Melton, D. A.: Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem
cell lines. Nat Biotechnol, 26, 313–315, 2008.
11）Andrews, P. W., Benvenisty, N., McKay, R., Pera,
M. F., Rossant, J., Semb, H. and Stacey, G. N.: The
International Stem Cell Initiative: toward benchmarks
for human embryonic stem cell research. Nat
Biotechnol, 23, 795–797, 2005.
12）Adewumi, O., Aflatoonian, B., Ahrlund-Richter, L.,
Amit, M., Andrews, P. W., Beighton, G., Bello, P. A.,
Benvenisty, N., Berry, L. S., Bevan, S., Blum, B.,
Brooking, J., Chen, K. G., Choo, A. B., Churchill, G.
A., Corbel, M., Damjanov, I., Draper, J. S., Dvorak,P., Emanuelsson, K., Fleck, R. A., Ford, A., Gertow,
K., Gertsenstein, M., Gokhale, P. J., Hamilton, R. S.,
Hampl, A., Healy, L. E., Hovatta, O., Hyllner, J.,
Imreh, M. P., Itskovitz-Eldor, J., Jackson, J., Johnson,
J. L., Jones, M., Kee, K., King, B. L., Knowles, B. B.,
Lako, M., Lebrin, F., Mallon, B. S., Manning, D.,
Mayshar, Y., McKay, R. D., Michalska, A. E., Mikkola,M., Mileikovsky, M., Minger, S. L., Moore, H. D.,
Mummery, C. L., Nagy, A., Nakatsuji, N., O’Brien C,
M., Oh, S. K., Olsson, C., Otonkoski, T., Park, K. Y.,
Passier, R., Patel, H., Patel, M., Pedersen, R., Pera,
M. F., Piekarczyk, M. S., Pera, R. A., Reubinoff, B. E.,
Robins, A. J., Rossant, J., Rugg-Gunn, P., Schulz, T.
C., Semb, H., Sherrer, E. S., Siemen, H., Stacey, G.
N., Stojkovic, M., Suemori, H., Szatkiewicz, J.,
Turetsky, T., Tuuri, T., van den Brink, S., Vintersten,K., Vuoristo, S., Ward, D., Weaver, T. A., Young, L. A.
and Zhang, W.: Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell
Initiative. Nat Biotechnol, 2007.
13）Hoffman, L. M. and Carpenter, M. K.: Characterization and culture of human embryonic stem cells.
Nat Biotechnol, 23, 699–708, 2005.
14）Park, S. P., Lee, Y. J., Lee, K. S., Ah Shin, H., Cho,
H. Y., Chung, K. S., Kim, E. Y. and Lim, J. H.: Establishment of human embryonic stem cell lines from frozen-thawed blastocysts using STO cell feeder layers.
Hum Reprod, 19, 676–684, 2004.

美保15）Skottman, H. and Hovatta, O.: Culture conditions
for human embryonic stem cells. Reproduction,
132, 691–698, 2006.
16）Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R.
S. and McKay, R. D.: Toward xeno-free culture ofhuman embryonic stem cells. Int J Biochem Cell
Biol, 38, 1063–1075, 2006.
17）Draper, J. S., Moore, H. D., Ruban, L. N., Gokhale,
P. J. and Andrews, P. W.: Culture and characterization of human embryonic stem cells. Stem Cells
Dev, 13, 325–336, 2004.
18） Ludwig, T. E., Levenstein, M. E., Jones, J. M.,
Berggren, W. T., Mitchen, E. R., Frane, J. L.,
Crandall, L. J., Daigh, C. A., Conard, K. R.,
Piekarczyk, M. S., Llanas, R. A. and Thomson, J. A.:
Derivation of human embryonic stem cells in definedconditions. Nat Biotechnol, 24, 185–187, 2006.
19） Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y.,
Trounson, A. and Bongso, A.: Embryonic stem celllines from human blastocysts: somatic differentiationin vitro. Nat Biotechnol, 18, 399–404, 2000.
20）Draper, J. S., Smith, K., Gokhale, P., Moore, H. D.,
Maltby, E., Johnson, J., Meisner, L., Zwaka, T. P.,
Thomson, J. A. and Andrews, P. W.: Recurrent gainof chromosomes 17q and 12 in cultured humanembryonic stem cells. Nat Biotechnol, 22, 53–54,
2004.
21）Brimble, S. N., Zeng, X., Weiler, D. A., Luo, Y., Liu,Y., Lyons, I. G., Freed, W. J., Robins, A. J., Rao, M. S.
and Schulz, T. C.: Karyotypic stability, genotyping,differentiation, feeder-free maintenance, and gene
expression sampling in three human embryonic stem
cell lines derived prior to August 9, 2001. StemCells Dev, 13, 585–597, 2004.
22）Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama,A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B.,
Nishikawa, S., Nishikawa, S., Muguruma, K. andSasai, Y.: A ROCK inhibitor permits survival of
dissociated human embryonic stem cells. Nat
Biotechnol, 25, 681–686, 2007.
23） Henderson, J. K., Draper, J. S., Baillie, H. S.,
Fishel, S., Thomson, J. A., Moore, H. and Andrews, P.
W.: Preimplantation human embryos and embryonicstem cells show comparable expression of stagespecific embryonic antigens. Stem Cells, 20, 329–
337, 2002.
24）Boyer, L. A., Lee, T. I., Cole, M. F., Johnstone, S.
E., Levine, S. S., Zucker, J. P., Guenther, M. G.,
Kumar, R. M., Murray, H. L., Jenner, R. G., Gifford, D.
K., Melton, D. A., Jaenisch, R. and Young, R. A.:
Core transcriptional regulatory circuitry in humanembryonic stem cells. Cell, 122, 947–956, 2005.

146日本におけるヒト ES、iPS 細胞研究標準化

Dev Biol, 227, 271–278, 2000.
26）Sheffield, T. U. o.: Center for Stem Cell Biology
Training Course in Human Embryonic Stem Cell
Culture 2007 Protocol Handbook. 2007.
(Accepted 21 January 2009)25）Amit, M., Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., Chiu,
C. P., Harris, C. P., Waknitz, M. A., Itskovitz-Eldor, J.
and Thomson, J. A.: Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture.

Standardization of human embryonic stem（ES）cell and induced pulripoent stem（iPS）cell
research in Japan

Miho Kusuda Furue
Japanese Collection of Research Bioresources（JCRB）Cell Bank, National Institute of Biomedical Innovation, Osaka
567–0085, Japan, Laboratory of Cell Processing, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Kyoto 606–
8507, Japan

Abstract

In 1998, human embryonic stem（ES）cells have been established. Since then, the human ES
cells have been used as a tool for understanding the mechanisms in human development andregeneration application research in the world. However, in Japan, not so many searchers haveused human ES cells. It is caused from several issues. In 2007, human induced pluripotent
stem（iPS）cells have been developed. The situation in Japanese stem cell research havebeen changing. As the characteristics of Human iPS cells are quite similar to those of human
ES cells, researcher can use the protocols of human ES cells for iPS cell research. In thisreview, I have summarized the culture and characteristics of human ES and iPS cells.

Key Words:

human ES cells, human iPS cells, feeder cells

147