九州シンクロトロン光研究センター
県有ビームライン利用報告書
Ｂ Ｌ 番 号 ： BL07

課 題 番 号 ： 1704023T（様式第 5 号）
広角 X 線散乱を用いた脂質分子の微小な構造の差異が膜の格子欠陥形成に及ぼす影響
Wide angle x-ray diffraction reveals influence of lipid structures on the membrane defects.
著 者 ･共 著 者 氏 名
木下 祥尚・千歳 傑・田中 かおる

Masanao Kinoshita, Takeshi Chitose, Kaoru Tanaka
著 者 ･共 著 者 所 属
九州大学理学研究院 化学部門

Department of Chemistry, Faculty of Science, Kyusyu-University
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先 端 創 生 利 用（ 長 期 タ イ プ ）課 題 は 、 実 施 課 題 名 の 末 尾 に 期 を 表 す（ Ⅰ ）、（ Ⅱ ）、（ Ⅲ ）を 追 記してください。
利 用 情 報 の 公 開 が 必 要 な 課 題 は 、本 利 用 報 告 書 と は 別 に 利 用 年 度 終 了 後 2 年 以 内 に 研 究 成 果 公
開｛ 論 文（ 査 読 付 ）の 発 表 又 は 研 究 セ ン タ ー の 研 究 成 果 公 報 で 公 表 ｝が 必 要 で す (ト ラ イ ア ル
利 用 を 除 く )。
実験に参加された機関を全てご記載ください。
共 著 者 に は 実 験 参 加 者 を ご 記 載 く だ さ い （ 各 実 験 参 加 機 関 よ り 1 人 以 上 ）。

１．概要（注：結論を含めて下さい）
本 研 究 で は 、 生 体 内 に 存 在 す る わ ず か に 化 学 構 造 の 異 な る 脂 質 分 子 、 ceramide (Cer)と そ の ジ ヒ ド ロ 体 dihydroceramide (DHCer)が 、 脂 質 膜 の 格 子 欠 陥 形 成 に 及 ぼ す 影 響 に つい て 、 広 角 X 線 散 乱 を 用 い て 調 べ た 。 そ の 結 果 、 Cer に 比 べ 、 炭 素 鎖 に 二 重 結 合 の な い
DHCer を 混 合 す る こ と で 、結 晶 性 が 高 く 格 子 欠 陥 の 少 な い 脂 質 膜 が 形 成 す る こ と を 示 唆
する結果を得た。
（ English ）We investigated the influence of structural difference on the formation of the membrane
defects using ceramide (Cer) and dihydro -ceramide (DHCer). Our wide angle x -ray diffraction(WAXD) measurements revealed that incorporation of DHCer into sphingomyelin (SM)membranes forms less membrane defects than Cer mixtures. This results indicate that theformation of membrane defects depends on the small structural difference of lipid molecules.

２．背景と目的
主としてリン脂質とタンパク質で形成される細胞膜の最も重要な役割は、細胞内部と外界との間での物質の交換であり、これは生命を維持するために不可欠である。この交換には、イオンチャネルなどの他に、細胞膜に存在する格子欠陥の関与が示唆されている(図 1)。そのため、格子欠陥形成の機序は、細胞膜の機能やそれにかかわる病理を議論するための重要な情報である[1]。しかし、これはあくまで推測であり、脂質の分子構造と格子欠陥の相関について、直接的な知見は得られていない。
３．実験内容（試料、実験方法、解析方法の説明）
本研究では、わずかに化学構造の異なる脂質、ceramideとそのジヒドロ体(DHCer)が、脂質膜の格子欠陥形成に及ぼす影響について、広角X線散乱を用いて調べた(図2)。波長は1Åに設定し、カメラ長(Lc=257 mm)はシリコンを用いてキャリブレーションした(図3)。試料はガラスキャピラリに封入し、温度

図 1. 脂質膜中に形成される格子欠陥の描像。構造の異なる脂質が近接すると、その部位で充填構造に不整合が生じるので、膜に亀裂(格子欠陥)が生じやすくなる。

制御は窒素ガスを用いた。また散乱の検出は冷却CCDカメラを用いて行った(図3)。得られたデバイ・シェラーリングはFit 2Dを用いて、一次元化した。

図3.ビームラインの設定と各種パラメータ。

図2. 本研究で用いた試料。赤矢印はセラミドとそのジヒドロ体の構造の差異を示している。

４．実験結果と考察
図 4 に示したのは、sphingomyelin (SM)に対し cermide (Cer)、および、わずかに構造の異なるdihydro-ceramide (DHCer)を加えた混合脂質膜の昇温過程熱測定(DSC)サーモグラムである。それぞれ、
67.0°C (ΔH=35 kJ/mol)と 70.0°C (ΔH=34 kJ/mol)付近に、脂質炭化水素鎖の融解に起因する、単一の転移ピークが生じている。SM に少量の Cer を加えると、膜内で Cer-poor と Cer-rich 領域の相分離が生じることが知られている。一方、図 4 の組成では、いずれの混合膜でも、ほぼ単一の転移ピークが表れていることから、すべての膜領域が Cer-rich 相に転移していることがわかる。図 5 に示したのは、
SM/Cer および SM/DHCer 混合膜の 25℃における広角 X 線散乱プロファイルである。それぞれ、2.41nm-1 と 2.38 nm-1 に、脂質炭化水素鎖の充填構造に対応する散乱ピークが生じており、このことは前者の方が、脂質が密に充填していることを示している。次に、散乱ピークの半値幅をもとに、それぞれの脂質膜に生じる格子欠陥の量を比較した。その結果、前者の半値幅は 0.06 nm-1 であるのに対し、後者の半値幅は 0.04 nm-1 となった。この結果は、SM/Cer 混合膜に比べ、SM/DHCer の方が、より結晶性が高く、格子欠陥の少ない膜を形成していることを示唆している。このように、今回の実験では、わずかな分子構造の差異(二重結合の有無)により、膜に生じる格子欠陥の量が制御されることを示唆する結果を得た。

図4. (a) SM/Cer混合膜と(b)SM/DHCer混合膜の昇温過程熱測定サーモグラム

図5. (a) SM/Cer混合膜と(b)SM/DHCer混合膜の25℃における1次元化した広角X線散乱プ
ロファイル。

５．今後の課題
本課題はトライアル利用のため、とりわけ二重結合の有無が脂質膜の格子欠陥形成に及ぼす影響に注目した。今後は、二重結合の存在部位と格子欠陥の相関など、より広範囲な情報を取得することで、構造-物性相関の機序を明らかにする。

６．参考文献[1] Nitsch et al., Evidence for a membrane defect in Alzheimer disease brain.1992. Proc. Natl. Acad USA.
1992. 89, 1671-1675.
７．論文発表・特許（注：本課題に関連するこれまでの代表的な成果）[1]Masanao Kinoshita et al., Kinetics for the subgel phase formation in DPPC/DOPC mixed bilayers. Chem.
Phys. Lipids 2010. 163, 712-719.
[2]Masanao Kinoshita et al., Characterization of the ordered phase formed by sphingomyelin analogues andcholesterol binary mixtures. 2013. Biophysics 9, 37-49.
[3]Masanao Kinoshita et al., Raft-based sphingomyelin interactions revealed by new fluorescentsphingomyelin analogs. J. Cell Biol. 2017,[4]Jun Ando and Masanao Kinoshita et al., Sphingomyelin distribution in lipid rafts of artificial monolayer
membranes visualized by Raman microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. 112, 2558-4563.
[5]Masanao Kinoshita and Satoru Kato. Intermolecular interaction of phosphatidylinositol with raft molecules
sphingomyelin and cholesterol. Biophysics 2008. 4, 1-9.
[6]Masanao Kinoshita et al., Kinetics for the subgel phase formation in DPPC/DOPC mixed bilayers. Chem.
Phys. Lipids 2010. 163, 712-719.
[7]Masanao Kinoshita et al., NaCl-dependent formation of the highly crystalline phase in sufficiently hydrated
dimyristoylphosphatidylglycerol bilayers. Chem. Phys. Lipids 2009. 161, 1-10.
[8]Masanao Kinoshita et al., Effect of bilayer morphology on the subgel phase formation. Chem. Phys. Lipids
2007. 151, 30-40.
[9]Masanao Kinoshita and Satoru Kato. Time-curse of the ordered phase formation in lipid bilayers caused bysphingomyelin hydrolysis. Photon Factory Activity Reports 2012, #29 Part B, p343.
[10]Masanao Kinoshita and Satoru Kato. Cyclodextrin-induced modulation of phase behavior of thedipalmitoylphosphatidylcholin/cholesterol mixed liposome. Photon Factory Activity Reports 2012, #27 Part B,
p230.
８．キーワード（注：試料及び実験方法を特定する用語を２～３）
脂質膜、格子欠陥、広角 X 線散乱
９．研究成果公開について（注：※２に記載した研究成果の公開について①と②のうち該当しない方を消してください。また、論文（査読付）発表と研究センターへの報告、または研究成果公報への原稿提出時期を記入してください（2017 年度実施課題は 2019 年度末が期限となります）。
長期タイプ課題は、ご利用の最終期の利用報告書にご記入ください。