Catalytic Activities of Complexes between Heme and
G-Quadruplex Nucleic Acids
Yasuhiko Yamamoto1*, Atsuya Momotake1,2
1 Department of Chemistry, University of Tsukuba

1-1-1, Tennoudai, Tsukuba, 305-8571, Japan
2 Tsukuba Research Center for Energy Materials Science (TREMS), University of Tsukuba

1-1-1, Tennoudai, Tsukuba 305-8571, Japan
yamamoto@chem.tsukuba.ac.jp
Heme is perhaps the most ubiquitous and abundantcofactor found in nature. Despite such ubiquitous
occurrence of heme in nature, no functional role invivo has yet been attributed to heme incorporated into
nucleic acids. The RNA world hypothesis has
provided a strong stimulus for exploring new catalytic
properties of RNAs. Iron tetrapyrrole complexes suchas heme are thought to be key compounds in the
postulated RNA world, and hence the incorporation ofheme into DNAs as well as RNAs is expected tocontribute to such a study. In fact, heme-boundnucleic acids have been shown to exhibit at least twoof the known catalytic functions of contemporary
heme enzymes, i.e., peroxidase and peroxygenase
activities. Hence, these heme-bound nucleic acids
could be regarded as prototypes for redox-catalyzing
ribozymes in the primordial RNA world.
Keyword: Catalytic activity, G-quadruplex DNA, Heme, NMR, Water molecule
Yasuhiko Yamamoto received his Ph. D. from University of California, Davis, in 1986.
He became an assistant professor at Tokyo Institute of Technology in 1986, and thenan associate professor at University of Tsukuba in 1993. He was promoted to aprofessor of University of Tsukuba in 1999. He retired from this university and becamea professor emeritus.

Atsuya Momotake is an associate professor at the Department of Chemistry, Universityof Tsukuba, Japan. He received his Ph.D. degree in 1999 at Chiba University. He
worked at MCP Hahnemann University (USA) as a postdoctoral research fellow. Thenhe moved to the University of Tsukuba and was promoted to an assistant professor in2005 and to an associate professor in 2020. His current major research interest is todevelop functional bio-related materials.

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ヘムとグアニン四重鎖の複合体の触媒作用山本泰彦１・百武篤也 1,2
１

筑波大学数理物質系化学域・ 2 筑波大学エネルギー物質科学研究センター（TREMS）

１．はじめにヘム(Figure 1A)は、鉄原子とポルフィリンの錯体であり、赤血球に含まれる血色素タンパク質
ヘモグロビンなどのヘムタンパク質の補欠分子族として生物界に遍在している。さらに、最近の研究から、遺伝子の発現制御など、ヘムの多様な生理機能が次々に明らかになっており、生体内におけるヘムの役割に注目が集まっている[1,2]。これまで、私共はヘムタンパク質の機能と構造の相関関係を研究し、ヘムの機能がタンパク質との相互作用を通して調節される分子機構を解明してきた[3-5]。一連のヘムタンパク質が示
す多様な機能がヘムとタンパク質の相互作用によって生み出されることを考えると、タンパク質
以外の生体高分子でもヘムを組込めば新しい機能が創出できるのではと思ったことが、本稿で紹介する私共の研究のきっかけであった。
まず、生体高分子の中で、私共は核酸に着目した。RNA にはリボザイムとして知られる触媒作用を示す分子が存在することから[6]、RNAだけでなく DNA にもヘムを組込むことができれば、核酸との相互作用を通してヘムの機能が調節できると考えたからである。ただし、DNA の立体構造として有名な二重らせん構造の核酸には、ヘムは結合しない。ヘムのアニオン性側鎖
が、核酸主鎖のリン酸イオンと静電的に反発するからである。そこで、私共は、ヘムを組込む核酸として、グアニン四重鎖[7]（四重鎖と言っても、実際には四重鎖らせん構造）に着目した。グアニン四重鎖の分子内部で形成される G カルテット(Figure 1B)は、ヘムのポルフィリン環との π-π ス
タッキング相互作用に適していると考えたからである(後述)。ところで、グアニン四重鎖は、真核生物の染色体末端のテロメアと呼ばれる領域に存在することが知られている[8, 9]。テロメアは、細胞の老化やガン化などに関連していると考えられている[10]。ヒトのテロメアでは、チミン(T)、ア デ ニ ン (A) お よ び グ ア ニ ン (G) か ら な る
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Figure 1.
Molecular structures ofheme(Fe3+) (A) and G-quartet formed
through a cyclic and coplanar association offour guanine bases through Hoogsteenhydrogen bonds (B).

d(TTAGGG)（DNA 鎖の 5’末端から 3’末端の方向に TTAGGG の順に 6 つの塩基がつながった塩基配列(Figures 2A & A’)、“d”は DNA 鎖を表し、RNA 鎖の場合は“r”を付す）を基本単位とする塩基配列が何度も繰り返されている。テロメアのように G が豊富な領域は、四重鎖を形成する傾向が強いことが示されており、バイオインフォ
マティクス(Bioinformatics)からは、ヒトゲノムには四重鎖が形成可能な領域は数十万ヶ所は存在することが示唆されている[11]。したがって、グア
ニン四重鎖も、生物界に遍在していると言える。
私共は、いずれも生物界に遍在するヘムとグ
アニン四重鎖の相互作用の研究は、生物科学だけでなく物質科学においても新たな分野の開
拓につながる可能性があると期待している。現生生物への進化の前に、原始地球上で、RNAからなる自己複製系が存在していたとする“RNA ワールド”仮説[12]が正しいとすると、ヘムの先祖と言える錯体が RNA のグアニン四重鎖(四重鎖 RNA)に組込まれて RNA ワールドを支える触媒分子として作用していた可能性があると私共は考えている。約 37 億年前の生命誕生の痕跡として知られるストロマトライトはシアノバ
クテリアの化石であると考えられていることから、当時からクロロフィル類似化合物が光合成に利59

用されていた可能性がある。ポルフィリンは、ア
セチレン、アンモニア、ホルムアルデヒドのような、宇宙に普遍的に存在し、原始地球上で存在していたと考えられている簡単な分子からも合成されることが実証されている[13]。したがって、無生物的に合成されたポルフィリンに、地表付近に豊富に存在する鉄原子が組込まれたヘムの先祖と言える錯体が当時から存在していた可能性がある。ヘムの先祖と言える錯体が RNA ワー
ルドの出現に一翼を担っていたかどうかを検証する研究は、生物科学の重要な研究課題である生命の起源を解明するための鍵となると考えられる。本稿では、ヘムとグアニン四重鎖の相互作用の研究が拓く物質科学として、ヘムと四重鎖 DNA の複合体が示す触媒作用の研究を紹介する。
２．ヘムとグアニン四重鎖ヘムを構成するポルフィリンは、側鎖としてメ
チル基 4 つに加えて、ビニル基とプロピオン酸
基がそれぞれ 2 つ結合しているプロトポルフィリ
ン IX である(Figure 1A)。側鎖として結合する置換基の種類と数で名称がプロトポルフィリンと決
まり、ローマ数字 IX は置換基の結合位置を表している。ポルフィリンは、18π 電子系の複素芳香族化合物であり、可視領域に強い吸収を示すなど、特徴的な分光学的性質をもつ。さらに、鉄原子が組込まれたヘムの電子的および磁気的性
質は、鉄原子の酸化状態、スピン状態、配位状態に依存する。特に、鉄イオンが不対電子をもつ常磁性ヘムで 1H NMR スペクトルを測定すれば、観測されるシグナルの常磁性シフトの解析を通して、ヘムの電子構造が解明できると共に、ヘム近傍の構造化学的環境に関する情報を原子レベルで得ることができる[14]。
四重鎖 DNA は、文字通り DNA 鎖 4 本により形成される。そして、四重鎖 DNA の内部では、グアニン塩基(G) 4 つが同一平面内で水素結合
により環状に連結した G カルテットと呼ばれる特徴的な構造が形成されている[7] (Figure 1B)。G
カルテットの平面性と大きさはいずれも、ヘムのポルフィリン環との π-π スタッキング相互作用に適している。実際、三価の鉄イオンをもつヘム(ヘム(Fe3+))は、四重鎖 DNA の 3’末端 G カル
テットに対して、親和性約 10-6 M-1 で結合する(Figure 2C) [15, 16]。核酸に対するヘムの結合
は、ポルフィリン環と G カルテットの π-π スタッキング相互作用によってもたらされることを考慮す
ると、ヘムは四重鎖 DNA [15, 16]および四重鎖
RNA[17]に特異的に結合する錯体であると言える。
四重鎖 DNA の内部では、複数の G カルテッ
ト同士が π-π スタッキング相互作用により積層している(Figure 2B)。そして、積層する G カルテッ
トのまわりの 4 本の DNA 鎖がどのように配向す
るかによって、平行型、逆平行型[18]、(3+1)ハ
イブリッド型[19]などいくつかのフォールディングが可能である(Figure 3)。四重鎖 DNA の安定性
は、積層する G カルテットの枚数に依存する。
例えば、4 本の DNA 鎖がすべて同一方向に配Figure 2. Structures of hexanucleotide d(TTAGGG) (A and A’), G-quadruplex DNA [d(TTAGGG)]4(6mer) (B), and a heme-DNAzyme formed between heme and 6mer (C), and oxidation reaction of
Amplex red catalyzed by the heme-DNAzyme (D).
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列する平行型四重鎖 DNA の立体構造の安定性を反映する変性温度は、Figure 3A に示す積層 G カルテットが 2 枚の四重鎖 DNA では室温以下であり、3 枚の四重鎖 DNA では約 55 ℃、
4 枚では約 85 ℃、5 枚ではさらに高温になる。
し た がっ て 、生体内で 通常存在す る四重鎖
DNA では積層 G カルテットが 3 枚であるのは、その安定性が生体内での利用に適しているためと考えることができる。G カルテットの π-π スタ
ッキングで、隣接する G カルテットの間にはカリウムイオンなど一価カチオンが存在し、近接す
る 8 つのグアニンのカルボニル酸素原子間の電子的反発を低減している。したがって、一価カチオンが存在しなければ、G カルテットひいては四重鎖 DNA は形成しない。
私共が主に研究対象とするのは、平行型四重鎖 DNA である。塩基配列 d(TTAGGG)が 4 分子で生じる平行型四重鎖 DNA [d(TTAGGG)]4(Figure 2B) (以降、6mer と略記)などの分子構造
はらせん軸に関して四回回転対称であるので、NMR による解析に好都合である[15, 20-33]。上
述の通り、ヘムが π-π スタッキング相互作用によFigure 3. Schematic illustration of parallel Gquadruplex DNAs, [d(TTAGnT)]4 (n = 2, 3, 4,or 5) (A), [d(TAGGGTTAGGGT)]2 [18] (B), andd(TAGGGTGGGTTGGGTGIG) (C), an antiparallel one, [d(TAGGGTTAGGGT)]2 [18] (D),and (3+1) hybrid one, d(GGGTTAGGGTTAG
GG)/d(TTAGGG) [19] (E). The bases of T6,
T7, and A8 in (B) and (D), those of T6, T10,
T11, and T15 in (C) , and those of T4, T5, A6,
T10, T11, and A12 of the long fragment in (D)are omitted for clarity.
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り結合するのは、平行型四重鎖 DNA の 3’末端
G カルテットであり、5’末端ではない。その理由は、次の通りに考えることができる。G カルテットの構造で、塩基部分だけを考えると、表側と裏側の区別はできないが、デオキシリボース環の配向も含めて考えると、表側と裏側に違いがあることが分かる(Figure 4)。平行型四重鎖 DNAの場合、4 つのリボース環の電子豊富な酸素原子(Figure 4A)はすべて 5’末端側に向く(Figures
4B & C)ため、それらの静電ポテンシャル(Figure
4D)がヘム側鎖のプロピオン酸基の負電荷などと静電的に反発する。この反発を避けるため、ヘムは反対側の 3’末端側に結合すると考えられる。実際、3’末端側と 5’末端側それぞれに当
該酸素原子が 2 つ存在する逆平行型四重鎖DNA(Figure 3D)にはヘムは結合しない[32]。なお、ヘムの分子構造はポルフィリン環の 5 位と15 位の炭素原子を通る軸に関して擬 2 回回転

Figure 4. Molecular structure of deoxyribose(A), conformation of trinucleotide d(GGG) in aparallel G-quadruplex (B), and molecular
structure and an electrostatic potential map ofG-quartet, together with the deoxyribose
moieties, in a parallel G-quadruplex DNA (Cand D). In (A), (B), and (C), electron-rich ringoxygen atoms (Orings) are indicated bymagenta circles. In (B), Orings are on the 5’terminal side of the G-quartet plane. Due tothe orderly arrangement of electron-rich Orings,
with respect to the G-quartet plane, in aparallel G-quadruplex DNA, the electrostatic
potential of the 5’-terminal surface is highly
negative, as indicated in red (D).

61

対称であるので(Figure 1A)、ヘムは G カルテッ
トに対して“表と裏”の 2 通りの配向で結合する[27, 33]。
３．ヘムと四重鎖 DNA の複合体の触媒作用
D. Sen (Simon Fraser Univ. (カナダ))らは、
DNA のランダムな塩基配列のライブラリを利用してヘム(Fe3+)に特異的に結合するアプタマー(Aptamer)を選び出すことに成功すると共に、DNA アプタマーとヘム(Fe3+)の複合体はヘムタ
ンパク質類似の分光学的性質およびペルオキ
シダーゼ類似の酸化触媒作用を示すことを明らかにした[34-43]。D. Sen らのこの発見により、ヘムタンパク質においてヘムの機能がタンパク質との相互作用を通して調節されるように、四重鎖DNA との相互作用によってもヘムの機能を調節することができることが実証され、ヘムと DNAの複合体を触媒(ヘム DNA 酵素)として応用する研究分野が開拓された。四重鎖 DNA は安定性が高く、80 ℃以上の高温および有機溶媒との混合水溶液中でも利用可能[43]である上に、DNA 鑑定などで知られている通り、DNA の合成は簡便であることから、ヘム DNA 酵素は実用化の観点からも画期的な触媒であると言える。
まず、私共は、6mer がヘム(Fe3+)の酸化触媒活性に与える影響を計測した(Figure 2C)。なお、
酸化触媒活性の計測は、Amplex red (10-acetyl3,7-dihydroxyphenoxazine)を基質として用いて行った(Figure 2D) [44, 45]。Amplex red の酸化
反 応 で 生 成 す る Resorufin(7-hydroxyphenoxazin-3-one)は波長約 570 nm に吸収を示すことを利用して Resorufin 濃度を決定した。そして、基質の酸化反応により生じる Resorufin の濃度の経時変化(Figure 5)を一次関数でフィッティングして得られた初速度(R0)を指標として、酸化触媒活性を評価した。ヘム(Fe3+)単独でもAmplex red の酸化反応は進むが、6mer の添加により R0 は約 6 倍に増大することが示され(Figure 5)、6mer への結合によりヘム(Fe3+)の酸化触媒活性が増大することが確認できた[44]。
４．ヘム DNA 酵素のヘムに軸配位子として結合する水分子
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Figure 5. Time-evolution of 570-nm
absorbance due to Resorufin produced fromthe oxidation of Amplex Red by heme(Fe3+) in
the absence (○) and presence of 1 equivalent[d(TTAGGG)]4 (6mer) (●) in 300 mM KCl and
50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.80,
at 25 ºC. The initial slope (R0) of the plots forheme(Fe3+) was increased by a factor of ~6 inthe presence of 6mer.

ヘムタンパク質が示す多様な機能は、ヘムの電子構造およびヘム近傍の構造化学的環境により発現する。特に、ヘム鉄に結合する軸配位子の電子的性質は、ヘムの反応性に大きな影響を及ぼす。ヘム DNA 酵素(Figure 6A)のヘム
鉄には特異な物理化学的性質をもつ水分子(H2O)が軸配位子として結合しており(Figure 6B)、
この水分子がヘム(Fe3+)の酸化触媒活性を増大している[33]。したがって、ヘムの触媒活性の変化は、四重鎖 DNA への結合のみによって生じる訳ではなく、G カルテットとヘムの間に存在し、ヘム鉄に結合する軸配位子により誘起されるのである[46]。
ヘム DNA 酵素のヘム(Fe3+)は、軸配位子として H2O が 2 分子結合した六配位高スピン状態(S = 5/2)である(Figure 6C 左)。軸配位子として結合する 2 つの H2O で、ヘムと G カルテットの疎水性接触界面に孤立する方を軸配位子 H2O(AxH2O)、ヘム平面を挟んで AxH2O の反対側に存在する方を外部配位子 H2O (ExH2O)と呼んで区別する。ヘム DNA 酵素の AxH2O は、ヘモグ
ロビンやペルオキシダーゼなどにおける軸配位
子ヒスチジン(軸配位子 His)に相当する役割を果たしている（後述）。AxH2O は疎水性空間に孤立することに加えて、酸素原子がヘム(Fe3+)に配位すると共に、水素原子 2 つは近接する G カル
テットのカルボニル酸素原子と水素結合を形成
62

していると考えられる。AxH2O は sp2 混成軌道よりも sp3 混成軌道によりヘム鉄に配位することが、ヘム(Fe2+)モデル化合物における計算化学により示された[27]。つまり、ヘム(Fe2+)と AxH2O の配位結合は、Fe2+の 3dz2 軌道への H2O の σ 供与により形成する。さらに、AxH2O の分極は通常のFigure 7. 600 MHz 1H NMR spectra of aheme(Fe3+)-6mer complex in the presence of
10 equivalent KCN in 90% H2O/10% D2O (A)or 100% D2O (B), 200 mM KCl, and 100 mM
potassium phosphate buffer, pH 6.85, at
25 °C. Portions, ~55-~95 ppm, of the spectraof (A) and (B) are expanded in (A’) and (B’),
respectively. Since the time scale of the ligand
exchange reaction between ExH2O and CN−(see Figure 6C) is slower than the NMR timescale, signals due to both the H2O adduct with
S = 5/2 and CN− one with S = 1/2 areseparately observed. Signals at ~88 ppm in(A’), indicated by a red circle, are assignable
to AxH2O protons of the CN− adduct.
Figure 6. Schematic illustration of aheme(Fe3+)-6mer complex (A) and heme
coordination structure in a cyanide ion (CN−)
adduct of the complex (B). In (B), axial H2O(AxH2O) located in the hydrophobic interface
between G6 G-quartet and heme iscoordinated to heme(Fe3+) and also forms
hydrogen bonds with carbonyl oxygen atomsof the G-quartet. Only the porphyrin moiety ofheme and four guanine bases of G-quartet are
illustrated. Exchange reaction of external H2O(ExH2O) of the H2O adduct with CN− to form theCN− adduct (C) and ionization of ExH2O (D). In(D), L represents AxH2O. The equilibrium
constant of the reaction is usually represented
as “pKa” in analogy with the ionization
equilibrium of an acid. The pKa can be used asa measure for assessment of electron densityof the heme Fe atom (ρFe) because the value
decreases with decreasing ρFe as a result of adecrease in the H+ affinity of ExOH−. In
addition, apart from the ionization states ofheme propionic side chains, heme(Fe3+) with−
ExH2O and ExOH are cationic and neutral,
respectively, and hence the latter is thought tobe stabilized over the former in thehydrophobic heme environment, resulting in adecrease in the pKa with decreasing polarity of
the local heme environment.
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水分子 H2O より約 16 %大きいことが計算によって示され、水酸化物イオン(OH−)の電子状態に近いことが示された。また、H2O の分極は、ヘム(Fe2+)への配位により約 3 %、Ｇカルテットのグア
ニン塩基のカルボニル酸素原子との 2 つの水素結合の形成により約 9 %、それぞれ増大することが示され、これらがそれぞれ単独で作用するよりも同時に作用する方が H2O の分極の増大の程度が大きい、すなわち、AxH2O の分極の増大
は、ヘム(Fe2+)への配位と、カルボニル酸素原子への水素結合の相乗効果によることが示された。
このような AxH2O の特異な電子状態は、ヘムのポルフィリン環とＧカルテットの 2 つの π 平面に囲まれた疎水性環境により生み出されていると言える。AxH2O のダイナミクスも特徴的である。
AxH2O は、ヘムおよびＧカルテットの両方に関して、ヘム鉄との配位結合のまわりに回転している[27]。また、AxH2O の水素交換は、著しく遅く、タイムスケールは≪20 s−1 である[33]。このように、
AxH2O 分子は、フラーレン C60、C70 のケージに内包された H2O [47-49]などのように物理的に周囲から隔離されていないにも関わらず、水素交換が著しく遅いユニークな孤立 H2O と見なすこと63

ができ、さらなる物理化学的性質の解明が期待される。
ヘム DNA 酵素における AxH2O の検出は、1H
NMR により行った[33]。鉄三価高スピン状態(S= 5/2)のヘム(Fe3+)と 6mer の複合体にシアン化物イオン(CN−)を添加すると、AxH2O が保持された状態で、ExH2O が CN−に置換された鉄三価低ス ピ ン 状 態 (S = 1/2) の CN− 付 加 物 が生 じ る(Figures 6B & C)。このように、ヘム DNA 酵素では、AxH2O に比べて、ExH2O の置換は起こりやすい。例えば、ヘム(Fe3+)をもつヘム DNA 酵素に
イミダゾール(Im)を添加すれば、ExH2O が Im に置換された鉄三価低スピン状態(S = 1/2)の Im
付加物が生成する[25]。また、一酸化炭素(CO)を吹き込んでヘム DNA 酵素のヘム鉄(Fe3+)を亜
ジチオン酸ナトリウム Na2S2O4 で還元すると、鉄
二価低スピン状態(S = 0)の CO 付加物が生成す
る[24, 26, 27]。
ヘム(Fe3+)をもつヘム DNA 酵素に CN−が添加された場合、ExH2O と CN−の配位子交換反応(Figure 6C)のタイムスケールは NMR のタイムスケールよりも遅いため、1H NMR スペクトルには
高スピン(S = 5/2)と低スピン(S = 1/2)それぞれの状態に対応する 2 組のシグナルが混在して観測される[33] (Figure 7)。そして、CN−付加物の 1H
NMR スペクトルで、約 88 ppm に常磁性シフトして観測されるシグナル(ほぼ等しい強度の 2 つのシグナルが重なっており、35 ℃以上でそれらは分離して観測される)は、25 ℃での線幅が約2000 Hz であることからヘム(Fe3+)の近傍に存在するプロトンに由来することが明らかであると共に(Figure 7A’)、溶媒を重水 D2O に置換することによりシグナルは消失することから(Figure 7B’)、
AxH2O のプロトンに由来すると帰属された[33]。
CN−付加物の 1H NMR スペクトルには、ヘム
DNA 酵素における AxH2O とヘムの電子的相互作用が反映された[33] (Figure 8)。CN−付加物のヘム側鎖メチルプロトン(CH3)シグナルには、
AxH2O の水素(H)が重水素(D)に置換(H/D 置換)
されて生じる H2O、HDO および D2O それぞれの状態を反映する同位体シフトが観測された。
この同位体シフトは、H/D 置換が AxH2O の電子的性質に与える影響がヘム鉄からヘムのポルフ
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ィリン環の π 電子系を介し、最終的には超共役により CH3 水素原子の 1s 軌道に非局在化する
不対電子密度に影響を与えることを示している。
また、AxHDO に対応する CH3 シグナルが観測されたことから、AxH2O は単独で存在することも実証された。なお、観測された同位体シフトは約0.03 ppm と小さいことから、ヘムの電子構造に著しく敏感な常磁性シフトしたシグナルでなけ
れば、AxH2O とヘムのこのようなユニークな電子的相互作用の検出は不可能であると言える。さら に 、 い ず れ の CH3 シ グ ナ ル で も 、 AxH2O,
AxHDO, AxD2O それぞれの状態に対応するシグナルのシフト値の大小関係は、AxH2O < AxHDO

Figure 8. 600 MHz 1H NMR spectra, 13.7−19.2
ppm, of the CN− adduct of the heme(Fe3+)-6mercomplex in 200 mM KCl and 100 mM potassium
phosphate buffer, pH 6.94−7.18, with various
solvent D2O(%): 10% (A), 50% (B), and ∼100%(C), at 25 ºC. The chemical shift ranges,
15.0−15.8 ppm, of traces (A)−(C) are expanded
in traces (A′)−(C′). Three resolved peaks
associated with AxH2O, AxHDO, and AxD2O,
illustrated in the inset, were observed for eachof the heme methyl proton signals. The
doubling of heme methyl proton signals is dueto the formation of two isomers possessing
heme orientations differing by 180° rotation
about the pseudo-C2 axis, with respect to theinteracting G-quartet. The structure of heme isalso illustrated in the inset.

64Figure 9. Catalytic cycle of a heme-DNAzyme. The catalytic cycle starts from the reaction of theferric resting state (A) with hydrogen peroxide (H2O2) to form a ferric hydroperoxide intermediate
named as compound 0 (B and C) and then a reactive oxoiron(IV) porphyrin π-cation radical species
known as compound I (D) is produced. Compound I induces the first single-electron oxidation of a
substrate (R) to form an oxoiron(IV) porphyrin species know as compound II (E), which returns to
the ferric resting state (A) by the second single-electron oxidation of the substrate (R). In (B) and(C), B represents the base to promote the compound I formation, i.e., adenine base in the hemeDNAzyme (see text).

< AxD2O であることから、ヘム鉄への電子供与の程度は AxD2O の場合が最も大きいことがわかる。
５． ヘム DNA 酵素の酸化触媒サイクル
ヘム DNA 酵素の酸化触媒サイクルの解明には、酸化反応活性種の特定が必要である。私共は 、 ヘ ム DNA 酵 素 の 触 媒 サ イ ク ル で 、Compound I と呼ばれる高い反応性をもつ反応中間体である、オキソ鉄四価ポルフィリン π カチ
オンラジカル錯体が生成することを明らかにした[50]。ヘム(Fe3+)をもつヘム DNA 酵素の電子ス
ピン共鳴(ESR)スペクトルでは、典型的な六配位
高スピン状態(S = 5/2)のヘム(Fe3+)を反映するシグナルが g 値約 2 および約 6 に観測され、過酸化水素 H2O2 を添加すると g = 2.00 に Compound
I に由来するシグナルが検出された。
ヘ ム DNA 酵 素 の 酸 化 触 媒 サ イ ク ル でCompound I が生成するという知見に基づいて、
ヘム DNA 酵素の触媒サイクルは本質的にペルオキシダーゼと同じであることが示された[50](Figure 9)。まず、Resting state(A)の ExH2O がH2O2 に置換され Compound 0(B)が生じ、ヘム鉄に結合した H2O2 の水素原子の引き抜き(B からC)および Fe3+ から配位子への電子移動に伴う
H2O の放出(C から D)により Compound I(D)が生成する。そして、Compound I(D)から Restingstate(A)が再生される過程で、Compound II（E）
を経由して基質(R) 2 分子が酸化される。この反応機構で、AxH2O は弱いながらもヘム鉄に電子を供与することにより、ヘム鉄に結合した H2O2の O-O 結合のヘテロリシスを促進し、その結果として、Compound I の生成が促進されると考えられる。
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)では、ヒスチジン(His170)が軸配位子としてヘム鉄に結合し、ヘム平面を挟んで His170 の反対側のヘム鉄近傍には His42 およびアルギニン(Arg)38が存在する[51] (Figure 10)。HRP における軸配
位子 His170 は、アスパラギン酸(Asp)247 の側鎖との水素結合を通した部分的な脱プロトン化によってイミダゾレートに近い状態にあるため、ヘム鉄への電子供与性が強く、Compound I 生成の促進に役立っている。また、His42 およびArg38 は、一般酸塩基触媒作用によりヘム鉄に結合した H2O2 の O-O 結合のヘテロリシスを促進する[52]。したがって、上述した通り、ヘム
DNA 酵素における AxH2O は、Compound I 生成において、HRP の His170 同様の電子的役割を果たしていると考えられる。そして、ヘム DNA 酵
素のヘム近傍にアデニンの塩基が存在すれば、
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その一般塩基触媒作用により、触媒活性は増大する（後述）。
６．ヘム DNA 酵素の酸化触媒活性に影響を与える因子
私共は、ヘム DNA 酵素の酸化触媒活性に影響を与える因子として、ヘム鉄の電子密度(ρFe)とヘム近傍の構造化学的環境に着目し、それぞれが触媒活性に与える影響を解析すると共に、両者の触媒活性に対する影響における相乗効
果の有無を解析した[45]。まず、ρFe は、ヘム
(Proto)に加えて化学修飾ヘム 3,8-DMD および
2,8-DPF を利用して変化させた(Figures 11A, A’& A”)（以降、本節では Proto、3,8-DMD および
2,8-DPF をひとまとめにしてヘムと呼ぶ）。これらのヘムの分子構造の違いは、ポルフィリン環に結合する 2 つの側鎖のみであり、Proto はビニル基、3,8-DMD はメチル基、2,8-DPF はトリフルオ
ロメチル基(CF3)をもつ。したがって、電子供与基のメチル基をもつ 3,8-DMD の ρFe は、他の 2
種のヘムより大きいと考えられる。Proto の ρFe は、
ポルフィリン環の π 電子系に対するビニル基の配向に依存するが、ヘム DNA 酵素において G
カルテットに π-π スタッキングする Proto では、ポルフィリン環とビニル基の 2 つの π 電子系は同一平面になるので、3,8-DMD よりも小さいと考えられる。さらに、電子求引性が強い CF3 をもつ
2,8-DPF の ρFe は Proto よりも小さいと考えられる。
したがって、ρFe の大小関係は 2,8-DPF < Proto <3,8-DMD であると予想される[3, 4]。私共は、ヘの電離反応の平衡定数(pKa)を指標として ρFe を評価した[45] (Figure 6D)。ヘム(Fe3+)と 6mer の複合体の場合、2,8-DPF(Fe3+)、Proto(Fe3+)、3,8DMD(Fe3+)それぞれの pKa は、9.20 ± 0.02、8.91± 0.04、8.30 ± 0.05 と決定され、ρFe の大小関係が予想通りであることが確認できた。
ヘム DNA 酵素におけるヘム近傍の構造化学的環境の評価にも、pKa を指標として使うことがで き る [43] 。 6mer の 場 合 と 同 様 に 、[d(TTAGGGT)]4 (6mer/T) 、 [d(TTAGGGA)]4(6mer/A)いずれに対しても、ヘムは 3’末端 G カ
ルテットの 3’末端側に特異的にスタッキングして複合体を形成する。つまり、ヘムは、6mer/T では G6 と T7 の塩基の間、6mer/A では G6 と A7の塩基の間に結合する(Figures 11B, C & D)。
3,8-DMD(Fe3+)と 6mer、6mer/T、6mer/A それぞれの複合体の pKa は、それぞれ 9.20 ± 0.02、9.39 ± 0.01、9.93 ± 0.02 であり、6mer/T の複合体の pKa が 6mer の複合体よりも小さい理由としては、前者ではヘムが G6 G カルテットと T7 塩基の間の疎水性空間に存在することが考えられ

Figure 10. Schematic representation of theactive site of horseradish peroxidase (HRP)
involving in the “push-pull” mechanism [51].

ム DNA 酵素のヘム鉄(Fe3+)に結合する ExH2O
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Figure 11. Molecular structures of heme(Fe3+)(Proto) (A), 3,8-dimethyldeutero-porphyrinatoiron(III) (3,8-DMD(Fe3+)) (A’), and 13,17-bis(2carboxylatoethyl)-3,7,12,18-tetramethyl-2,8bis(trifluoromethyl)-porphyrinatoiron(III) (2,8DPF(Fe3+)) (A”), and schematic representation of complexes between heme and parallel
G-quadruplex DNAs [d(TTAGGG)]4 (6mer),[d(TTAGGGT)]4 (6mer/T), and [d(TTAGGGA)]4 (6mer/A), i.e., heme-6mer (B), heme6mer/T (C), and heme-6mer/A complexes (D),respectively.

66

る。そして、6mer/A の複合体の pKa がさらに小さい理由は、ヘムが G6 G カルテットと A7 塩基の間の疎水性空間に存在することに加えて、
ExH2O が A7 塩基と水素結合を形成することが考えられる。
私共は、Figure 11 に示すヘムと四重鎖 DNA
それぞれ 3 種の組合せで調製できる複合体 9種について、pKa と酸化触媒活性の関係を解析した[45] (Figure 12)。まず、複合体を形成する四重鎖 DNA が同じであれば、触媒活性の大小関
係は 2,8-DPF < Proto < 3,8-DMD であること、つまり ρFe の大小関係と同一であることが示された。
ペルオキシダーゼでは軸配位子からヘム鉄への電子供与が Compound I 生成の促進に寄与していることを考慮すると、複合体では ρFe が大
きい程触媒活性が大きいという結果は予想通りであると言える。また、いずれのヘムでも、触媒活性の大小関係は 6mer/T の複合体 < 6mer の複合体 < 6mer/A の複合体であった。6mer/T の複合体の触媒活性が 6mer の複合体よりも小さい理由としては、T7 塩基の立体障害によりヘムへの基質の接近が妨げられることが考えられる。
また、6mer/A の複合体の触媒活性が大きいのは、A7 塩基が一般塩基触媒として作用し、Compound I の生成を促進するからであると考えることができる。最後に、同一四重鎖 DNA でヘムが異なる複合体 3 種についての pKa に対する酸化反応の初速度のプロットは右上がりの直性に載り、その直線の傾きは四重鎖 DNA には依存しないことが明らかになった。この結果は、ρFeの変化を通した電子的影響とヘム近傍の構造
化学的環境は、それぞれ独立して複合体の酸化触媒活性の調節に作用することを示している。
したがって、ヘム DNA 酵素では、ペルオキシダーゼにおいて“Push-Pull”機構[53, 54]として知られる軸配位子からヘム鉄への“Push”機構とヘム近傍の一般酸塩基触媒作用による“Pull”機構の相乗効果による Compound I 生成の促進は観測されなかった。
７．結語
本稿では、ヘムと四重鎖 DNA の複合体の立体構造と酸化触媒作用の分子機構について紹Acc. Mater. Surf. Res. 2023, Vol.8 No.2, 58-69.

Figure 12. Plots of the initial slope (R0), as ameasure for the peroxidase activity, against
the pKas, as a measure for the ρFe, (pKa-R0
plots) of the heme(Fe3+)-6mer, heme(Fe3+)6mer/T, and heme(Fe3+)-6mer/A complexes;
3,8-DMD (●), Proto (○), and 2,8-DPF (■) [45].
The similarity in the slope for the pKa-R0 plots
among the three systems indicated that the“push mechanism” in the heme(Fe3+)-DNA
complex is independent of the local heme
environment.

介した。現生生物に存在するペルオキシダーゼの酸化触媒サイクルと本質的に同一の反応機
構がヘムと四重鎖 DNA の複合体で実現されていることが明らかとなったことから、ヘム DNA 酵
素も、ヘムタンパク質のような高い触媒活性を示す可能性が示された。今後、ヘム DNA 酵素におけるヘム近傍の構造化学的環境のさらなる多様化が実現できれば、ヘム DNA 酵素は思いもかけない触媒活性や機能を示すことが期待できると共に、原始地球上で無生物的に合成されたヘムのような錯体が生命誕生の一翼を担っていた可能性を検証することもできると考えられる。
また、ヘムは遺伝情報の伝達においても重要な役割を担っていることが明らかになりつつあることから、私共の研究により解明されたヘムと核酸の特異的な結合は、遺伝子の発現制御におけるヘムの役割のさらなる理解にも有用であると考えられる。さらに、G カルテットには、ヘムだけでなく、環状テトラピロール類の分子骨格をもつポルフィリンやフタロシアニンなども特異的に結合することが明らかになっていることから、がんの治療法 とし て期待 さ れ て い る光線力学療法（PDT）の光増感剤として有用な四重鎖 DNA を67

標的とする環状テトラピロール類の分子設計にも本研究が役立つこと示されている[55, 56]。ヘムとグアニン四重鎖の相互作用の研究が拓く生
物科学と物質科学の今後の発展に期待したい。
８．謝辞
本稿で紹介した研究成果は、筑波大学生物
無機化学研究室のスタッフと学生、根矢三郎千葉大学名誉教授、鈴木秋弘長岡工業高等専門学校教授、筑波大学の小島隆彦教授および小谷正弘博士をはじめとする多くの共同研究者の方々の長年にわたる日々の努力の賜物であります。ここに心よりの謝意を表したいと思います。
また、長年にわたって研究をサポートいただいた文部科学省および日本学術振興会に感謝い
たします。
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