50植物

防疫第 70 巻

第 1 号 （2016 年）

PCR によるイチゴ萎黄病菌検出技術の生産現場での活用
奈良県農業研究開発センター

はじめ平

山喜彦

ター大和野菜研究センターにおいて原原親苗育成し，2に年目に奈良県農協が管理するイチゴ優良親苗増殖圃場にイチゴ萎黄病は，Fusarium oxysporum f. sp. fragariae

おいて原親苗を育成する。さらに 3 年目に各地域の親苗によって引き起こされる土壌病害である。現在栽培され増殖圃場において親苗を増殖し，約 3 万本の親苗を生産ているイチゴ主要品種の多くが本病に対して罹病性であ者へ供給している。親苗の供給体制が整備された当初

り，全国的に発生が多くなっている。本病の典型的な症は，原原親苗を対象に Fo 選択培地を用いた培養法によ状は，新葉の小葉 3 枚のうち 1 枚または 2 枚が黄化してる萎黄病検定が実施されてきた（口絵②）。検定部位で小さくなり奇形葉となる（口絵① a）。病徴が進行する

あるイチゴクラウンの表皮をカッターで削ぎ取り，70％と苗全体が著しくわい化し，枯死に至る。また，発病苗

エタノールと 5％次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌後，のクラウンを輪切りにすると，導管の黒変あるいは褐変

Fo 選択培地である Fo―G2 培地（西村，2008）で培養する。

が見られる（口絵① b）。しかし，葉の奇形や黄化は，コロニーが出現した場合には陽性とみなし，陽性となっ養分欠乏や過剰，薬害等の生理障害でも発生し，クラウた苗と親苗が同じ苗はすべて廃棄してきた。しかし，こンの褐変は炭疽病や疫病等の病害でも見られる。そのたの方法では非病原性フザリウム菌が検出された場合にもめ，生産現場からの診断依頼に対して判断に迷うことが陽性と判定され，多くの苗が廃棄される。このような無多い。また，Fusarium oxysporum（以下，Fo）には，作駄を省くために，2012 年から選択培地で検出後に，出物によって病原性が異なる分化型や，非病原性菌が多く現したコロニーから DNA を抽出し，萎黄病菌検出用プ存在しており，これらの菌と萎黄病菌は形態が同じで識ライマーによる PCR を実施している。DNA 抽出には別することができない。そのため，本病を特定するにはPrepMan Ultra Reagent（Life Technologies）を使用して分離菌をイチゴに接種し，病原性を確認する必要があいるが，コロニーからの抽出のため他の簡易な方法でもり，非常に多くの手間と日数がかかる作業となる。この可能である。

ような中，萎黄病菌と他の Fo を識別できるプライマー

Fo 選択培地で試料を培養すると，高濃度の次亜塩素による PCR 検出技術が開発された（SUGA et al., 2013）。

酸ナトリウムでの表面殺菌にもかかわらず，毎年多くの迅速な対応が迫られる生産現場において，本技術は非常非病原性フザリウム菌が検出される。2013 〜 15 年の検に有効な診断法となっている。奈良県では，①原原種苗定では，平均 19.5％の試料において非病原性フザリウムの保菌検定，②普及指導員からの苗診断依頼，さらに，菌が検出されており（表―1），PCR 検定導入前にはこれ③土壌消毒の要否を判定するための圃場診断等に本検出らの試料苗が廃棄されていたことになる。
検定時には試料採取時の圃場への病原菌の持ち込みに技術を活用しているので，それら事例を紹介する。
なお，本病害の検出技術についてはイチゴ萎黄病感染も気をつけている。具体的には，試料採取は日々栽培管苗の検査マニュアルとして成果普及技術集にまとめられ理を行っている担当者が行い，その後の培養や PCR はている（千葉県農林総合研究センター，2012）。技術的表− 1 原原親苗の萎黄病検定におけるフザリウム菌の検出な詳細についてはそちらを参照されたい。

フザリウム菌のI 原原親苗の保菌検定

年度

萎黄病菌検出数

検定数
検出数 （分離率（％）） （分離率（％））

奈良県では県育成品種を中心にイチゴ親苗供給体制が整備されている。まず 1 年目に奈良県農業研究開発セン
Utilization of PCR Detection of Fusarium oxysporum f. sp. fragariae
Causing Strawberry Wilt.
By Yoshihiko HIRAYAMA（キーワード：イチゴ萎黄病，PCR，検出）

2013

66

19（28.9）

0（0）

2014

65

3（ 4.6）

0（0）

2015

56

14（25.0）

0（0）

平均

58.7

12.0

（19.5）

0（0）

分離率は検定数に対する割合．

― 50 ―

PCR によるイチゴ萎黄病菌検出技術の生産現場での活用別の担当者が行っている。病害検定はあくまでも確認す51

実際には，コロニーと培養土から DNA を抽出し，検るものであり，このような人の出入りの制限とともに，定を実施する場合があるが，1 週間程度で生産者に診断

培養土の蒸気消毒の実施や空中採苗方式による苗増殖等結果を返すことが可能となり，迅速で無駄のない防除対の栽培管理や防除対策にも力を入れている。

策へとつながっている。また，様々な症状の苗を診断し，その結果との照合を繰り返していくうちに，萎黄病とそII 生産苗の診断依頼への対応の他の原因によるものとを見分ける目も養われてくる。

普及指導員や農協の営農指導員からは，生産者が管理III 圃しているイチゴ苗の診断依頼がある。経験豊富な普及指場

診

断導員からの依頼は，萎黄病とも生理障害とも判断がつか圃場診断は，まだ実施事例が少ない。主に厳密な管理ないものが多く，現在では PCR 診断が欠かせないものが必要な親苗増殖圃場や，毎年本病の発生が多く対策にとなっている。持ち込まれた苗は症状の程度によって，苦慮している圃場等に限られている。

検定部位や DNA 抽出法を使い分けて診断している。具

土壌伝染性の萎黄病は，汚染土壌や被害残さが伝染源になる。近年，イチゴの育苗方式は，臭化メチル代替技

体的な症状ごとの対応を以下に記す。
一つ目は著しく葉が奇形になっている苗である。この術として広まった隔離育苗が主流となっている。しかような場合には，導管が褐変していることが多く，前述し，萎黄病の発生は期待するほど減少していないのが現の原原親苗の検定と同じように，クラウンから選択培地状である。多発圃場では，発病を繰り返す事例が多いこを用い た 培 養 法 で 菌 を分離し，その後コロニーからとから，育苗施設内に残された汚染残さや通路等の土壌DNA を抽出し，PCR を行う。この方法は，どちらかとが汚染源として考えられた。

いうと萎黄病菌であることを確かめるために実施していここでは，親苗生産圃場の育苗ハウス内の土壌から本菌を検出し，その汚染状況を調査した事例を紹介する。

る場合が多い。
次に，葉は奇形しているが，その症状が軽く，生理障

土壌診断はベンチアップした隔離育苗を実施しているハ害と見分けがつかないような苗である。このような苗はウスで行い，ハウスの出入り口や通路から土壌を採取し導管褐変が見られないことが多く，クラウンからの分離た。それぞれの採取土壌 10 ml を 50 ml 遠沈管に入れ，が難しいため，ポット苗の根と培養土の混合試料を採取

Fo―G2 液体培地を 2 ml 添加し，4 日間培養した。その後，し（口絵③），DNA 抽出を行っている。採取した試料

培養した土壌を滅菌蒸留水で懸濁し，その懸濁液から10 ml を 50 ml 遠沈管に入れ，寒天を除いた Fo―G2 液体DNA を抽出した。DNA 抽出は土壌からも安定して検出培地を 2 ml 添加し，25℃で 4 日間静置培養する（口絵④）。

が可能な塩化ベンジル法で行い，その後，MgExtractor

培養には時間がかかるが，試料の破砕作業を省略し，し―plant genome kit―を用いて抽出液を精製した。20 検体

かも検出感度を高めることができる利点がある。このとき検出限界は菌密度 102 個/g レベルであり，無培養に表− 2 親苗生産圃場からのイチゴ萎黄病菌の検出比べて約 10 倍の検出感度になる（平山ら，2010）。培養採取場所

後，滅 菌 蒸 留 水 で 懸 濁 し，そ の 懸 濁 液 の 沈 殿 物 か ら

調査圃場DNA を抽出する。DNA 抽出には植物体からの本菌の検入口

通路 1

通路 2

発病の有無

出結果が良好であった MagExtractor―plant genome kit―

A＋−−無（東洋紡）を使用している。イチゴ育苗でよく使用されB−−−

無ているピートモス，バーミキュライト，パーライトの混C＋−＋無D

−＋＋無E

−−＋有

養土からの検出には，塩化ベンジル法（KAGEYAMA et al.,F＋＋＋無2003）に よ り DNA を 抽 出 し，そ の 後 の 精 製 用 に

G−＋＋無MagExtractor―plant genome kit―を用いている。この診H＋−＋無断法では，試料に根の一部と培養土だけを用いるため苗I−−−無合培養土では，本 DNA 抽出キットでの検出が可能である。しかし，灰色低地土や真砂土等では検出が不安定になることを確認しており，このような土壌を混合した培の傷みが少なく，陰性の場合には検定苗をその後も利用できる利点がある。

＋：萎黄病菌が検出，−：萎黄病菌が非検出．
有：発病を確認，無：発病なし．

― 51 ―

52

植物

防第 70 巻疫

第 1 号 （2016 年）

表− 3 各用途別のイチゴ萎黄病菌の検出法
DNA 抽出活用場面

採取部位

原原親苗の検定

クラウン

Fo―G2 培地

PrepMan Ultra Reagent

コロニー PCR

クラウン

Fo―G2 培地

PrepMan Ultra Reagent

導管褐変がある場合，コロニー PCRMgEx

導菅褐変がない場合

診断依頼への対応
土壌診断

前培養

培養土と根 Fo―G2 液体培地の添加
Fo―G2 液体培地の添加

土壌備考

塩化ベンジル法＋ MgExMgEx : MgExtractor―plant genome kit―．

処理するのに DNA 抽出から精製まで 2 時間程度の時間な採取部位や DNA 抽出法等が明らかとなっている（表が必要である。

―3）。

検定の結果，9 圃場中 7 圃場の通路と入り口付近のい

近年，各都道府県の病害虫防除所や研究機関ではサー

ずれかの土壌から本菌が検出され，高頻度で汚染されてマルサイクラー等の必要機器が整備され，PCR は植物いることが明らかになった（表―2）。また，調査した圃

病害の診断に欠かせない技術となっている。また一昔前場のうち，発病が確認されたのは 1 圃場のみであった。に比べれば，PCR に必要な試薬類などの消耗品が格段

このことから，ハウス内の通路が汚染されていても必ずに安価になり，数多くの検体にも対応できるようになっしも発病するものではないが，管理作業や土壌が風で舞た。今後は，病害診断だけでなく，これまで未解決であうことによって，間接的に本菌がイチゴに感染し，発病った感染源の特定や発生生態の解明のために PCR をどする可能性があると考えられた。このような結果を踏まのように応用していくかが重要になると考える。

えて，特に親苗増殖圃場では，クレゾールによる長靴の最後に，本成果は農林水産省の新たな農林水産政策を消毒，育苗施設の太陽熱消毒を実施することを徹底する推進する実用技術開発事業「イチゴ健全種苗生産のための病害検査プログラムの構築（課題番号 21023）」の中で，ように指導している。

おわり

千葉県農林総合研究センター鈴木に健氏，岐阜大学生命科学総合研究支援センター須賀晴久博士，岐阜大学流域

今回紹介した萎黄病菌検出技術は，当初イチゴ親苗の圏科学研究センター景山幸二博士等多くの方々との共同保菌検定を目的に開発された。近年，各県で育成された研究によって得られた成果である。なお，本事業ではイブランド品種が他県でも栽培されるようになり，親苗やチゴ萎黄病菌のほか，炭疽病と疫病の検出技術も開発

生産苗の移動が頻繁になっている。このことから広域的し，前述の成果普及技術資料にまとめている。興味のあな病害発生リスクが高まっていると言える。このようなる方は是非活用していただきたい。
引背景から，苗の病害検定を実施し，無病苗を販売あるいは譲渡することが重要であり，今回紹介した原原親苗のPCR 検定は基本となるものと考えられる。さらに，土壌から安定して検出できる DNA 抽出法が確立され，萎黄病菌検出用プライマーが現地圃場の土壌から検出した場合にも特異性を持つことが明らかにされた。これにより，生産者圃場の育苗苗の診断や土壌汚染状況調査も可用

文献1）千葉県農林総合研究センター（2012）: 平成 23 年度成果普及技術資料「イチゴ炭疽病・萎黄病・疫病感染苗検査マニュアル」：26 pp．
（https://www.pref.chiba.lg.jp/lab-nourin/nourin/
koukaishiryou/manual.html）
2）平山喜彦ら（2010）: 日植病報 76 : 160（講要）．
3）KAGEYAMA, K. et al.（2003）: J. Gen. Plant Pathol. 69 : 153 〜 160.
4）西村範夫（2008）: 植物防疫 62 : 162 〜 167．
5）SUGA, H. et al.（2013）: Plant Dis. 97 : 619 〜 625.

能となった。現在では，それぞれの目的に応じて，最適― 52 ―