家畜精子の受精制御分子の探索と利用
研究期間：1994～2023年

研究背景・目的
哺乳類の精子は，雌性生殖道内で受精に必要な変化（受精能獲得，鞭毛超活性化運動の発生および先体内容物の開口分泌反応[先体反応]）を行ったのちに卵子と出会い受精する。これらの変化は精子の受精制御分子により特異的に調節されている。また受精制御分子には動物種間差が存在するため，受精のメカニズムは動物種によって異なる。さらに家畜では受精制御分子の活性に比較的大きな個体差があり，これが雄性繁殖能力の個体差の原因となっている。私たちの研究室では，家畜（ウシおよびブタ）精子の受精メカニズムの解明を目的とし，家畜精子の受精制御分子を探索している。また発見された受精制御分子をマーカーとして利用する「精子機能の精密検査法」を開発することで，家畜の繁殖成績（人工授精の受胎率）の向上を目指している。

実験概要
 ウシおよびブタの精子を材料にし，細胞生物学的手法，生化学的手法，細胞免疫学的手法などを用いて，受精能獲得や鞭毛超活性化運動の発生制御に機能する分子を特定している。

 精子機能の精密検査法を開発するため，精子における受精制御分子の性状を個体毎に細胞免疫学的手法により観察し，その分子の性状と繁殖成績との相関関係を調べている。

図. 精子における受精制御分子の細胞免疫学的観察
抗受精制御分子抗体（赤, IZUMO1）/FITC標識レクチン（緑，精子先体）/DNA染色剤（青，精子核）で三重染色されたウシ精子の頭部結果と考察
受精制御分子の探索

家畜精子の鞭毛には部位特異的な環状アデノシン1リン酸（cAMP）シグナル伝達経路が存在し，受精能獲得および鞭毛超活性化運動の発生を制御していることを明らかにした。またウシ精子では頸部のプロテインホスファターゼがcAMPシグナル伝達経路の調節に重要な役割を果たすことを見いだした。

精子機能の精密検査法の開発

精巣上体での成熟とともに先体に配置されるチロシン

図. チロシンリン酸化型SPACA1タンパク質
抗リン酸化チロシン抗体（緑, pY）/抗SPACA1抗体（赤）で二重染色されたウシ精子の頭部リン酸化型 Sperm acrosome associated 1（SPACA1）タンパク質をマーカーとする精子機能の精密検査法をウシにおいて確立した。すなわち，この検査で不合格となったウシは低繁殖能力個体（凍結保存精子を用いた人工授精での成績が低い個体）と判別できた。また，卵子との受精に必須の鞭毛超活性化運動の制御機能を指標とする新規の精子活力検査法の開発に取り組んでいる。

図. 鞭毛超活性化したウシ精子の運動軌跡

神戸大学大学院 農学研究科 生殖生物学研究室
原山 洋 連絡先：harayama@kobe-u.ac.jp

発表論文
1. Miyamoto, N., Ohya, A., Duritahala, Sakase, M. and Harayama, H. Comparative characteristics
between calyculin A-induced and thimerosal-induced hyperactivation of cryopreserved bovine
spermatozoa. J Reprod Dev 69(3): 170-177, 2023.
2. Sai, S. and Harayama, H. Polyvinyl alcohol, but not bovine serum albumin, promotes the induction offull-type hyperactivation in boar cyclic AMP analog-treated spermatozoa. Anim Sci J 93: e13777, 2022.
3. Duritahala, Sakase, M. and Harayama, H. Involvement of Ca2+-ATPase in suppressing theappearance of bovine helically motile spermatozoa with intense force prior to cryopreservation.
J Reprod Dev 68(3): 181-189, 2022.
4. Wada, A. and Harayama, H. Calmodulin is involved in the occurrence of extracellular Ca2+dependent full-type hyperactivation in boar ejaculated spermatozoa incubated with cyclic AMP
analogs. Anim Sci J 92: e13552, 2021.
5. Saha, S.R., Sakase, M. and Harayama, H. Effects of digoxin on full-type hyperactivation in bovine
ejaculated spermatozoa with relatively lower survivability for incubation with stimulators of cAMPsignaling cascades. Theriogenology 154: 100-109, 2020.
6. Minami, K., Arai-Aso, M.M., Ogura-Kodama, Y., Yamada, A., Kishida, K., Sakase, M., Fukushima, M.
and Harayama, H. Characteristics of bull sperm acrosome associated 1 proteins. Anim Reprod Sci
218 (106479), 2020.
7. Arai, Y., Sakase, M., Fukushima, M. and Harayama, H. Identification of isoforms of calyculin Asensitive protein phosphatases which suppress full-type hyperactivation in bull ejaculatedspermatozoa. Theriogenology 129: 46-53, 2019.
8. Yamada, A., Sakase, M., Fukushima, M. and Harayama, H. Reconsideration of the evaluation criteria
for bull ejaculated sperm motility in the context of rotation. J Reprod Dev 64(5): 377-384, 2018.
9. Otsuka, N. and Harayama, H. Characterization of extracellular Ca2+-dependent full-type
hyperactivation in ejaculated boar spermatozoa preincubated with a cAMP analog. Mol Reprod
Dev 84(11): 1203-1217, 2017.
10. Arai, M.M., Minami, K., Ogura, Y., Otsuka N., Hama, S., Harayama, H., Sakase, M. and Fukushima,
M. Variation among individual bulls in the distribution of acrosomal tyrosine-phosphorylated
proteins in epididymal and ejaculated spermatozoa. Reprod Fertil Dev 29(7): 1297-1305, 2017.

総説・著書
1. 原山 洋，内藤邦彦．受精, 繁殖生物学 改訂版 (第2版), エデュワードプレス, pp. 228-237, 2020.
2. 原山 洋. 哺乳類の受精, 発生生物学, pp. 44-47, 培風館, 2019.
3. Harayama, H. Flagellar hyperactivation of bull and boar spermatozoa. Reprod Med Biol 17(4): 442-448,2018.
4. Harayama, H., Minami K., Kishida, K. and Noda, T. Protein biomarkers for male AI-subfertility inbovine spermatozoa. Reprod Med Biol 16(2): 89-98, 2017.

主な受賞歴
1. 原山 洋. 日本学術振興会（JSPS）平成28年度 特別研究員等審査会専門委員の表彰, 2017.
2. 原山 洋. 2012年度日本繁殖生物学会賞・学術賞, 2012.
3. Harayama, H. 2006 Lalor Foundation Award of American Society of Andrology, 2006.

共同研究先
兵庫県立農林水産技術総合センター，大阪公立大学獣医学部