【日本SJWP大賞】 第18回 日本水大賞
複合的水質監視装置の開発とナミウズムシの生態
山口県立山口高等学校

化学・生物部

Ⅰ．はじめに泳を阻害する物質が存在する可能性があると判定する

水の安全性を検査する方法の中で、生物検定としてシステムを構築した。

は、数日間の藻類の増殖から判断する方法やミジンコ

無脊椎動物への代替種については、きれいな水のの遊泳阻害を目視で判断する方法1）、或いは、メダカを指標生物であるナミウズムシ（Dugesia japonica ）を選用いた水質の連続監視2） などがある。ミジンコや藻類定した。ナミウズムシを入れた容器に試験水を流入さを用いた試験は人手に頼ることが多く、費用や労力をせ、ナミウズムシの生存に影響を及ぼす物質が含まれ要する。また、メダカを用いる方法については、動物実ている場合は衰弱して押し流される構造とし、ナミウズ

験 の 適 切 な 施 行 の 国 際 原 則 で あ る3R s

ムシの有無によって水質を判定するシステムとした。ま3）（Replacement、Reduction、Refinement）に則してた、ナミウズムシは再生能力が高く、虫体を二等分する考えると、脊椎動物である魚類から無脊椎動物へ変更ように切断した場合、それぞれの断片は失われた部分することが望ましいと思われた。

を再生して二匹になる。予め虫体を二等分し、脳が無い

これらの課題を解決すれば、水の安全性試験を実施することが容易になり、人々の健康な生活を維持し尾部側の断片を水質監視に用いることで、ナミウズムシに与える苦痛を軽減するよう配慮した。

たり水環境を保全したりすることに役立てることがでこれらのオオカナダモの細胞質流動、オオミジンコきる。そこで、藻類やミジンコを用いる検査についてはの遊泳、ナミウズムシ尾部断片の有無を監視するシス

コンピューターで自動監視できるシステムに変更するこ

テムを組合せ、複合的水質監視装置を構築した。とで労力の削減を図り、メダカを用いる検査について

1

脊椎動物を用いない生物検定を行い、コンピューは無脊椎動物への代替について検討した。

Ⅱ．複合的水質監視装置の開発

研究の目的

ターで監視することで労力やランニングコストを低減できる水質監視装置を開発することを目的とした。

オオカナダモ（ Egeria densa ）の細胞に含まれる葉緑体は細胞の中を流れるように運動し、これを細胞質2流動（原形質流動）という。細胞質流動は、死細胞では（1）オオカナダモ（ Egeria densa ）見られない4）。このことから、コンピューターを利用し材料
萩市の阿武川下流域で採取し、大形のガラス水槽て細胞質流動を自動監視すれば、植物細胞に致死的で、室温・恒明条件にて栽培した。

な影響を与える物質の有無をモニタリングすることが（2）オオミジンコ（ Daphnia magna ）できると考えた。藻類の増殖試験とは感度が異なるもNBRPから分譲していただいた。カルキ抜き（テトラのの、オオカナダモの細胞質流動をコンピューターを社、コントラコロライン）で脱塩素した水道水を水槽に利用して監視することで、労力の削減を図った。

注ぎ、20℃に設定したインキュベーター内で、明暗サイ

ミジンコの遊泳阻害試験については、光に集まる性

クル14:10（照明2270lux）で飼育した。緑藻（セネデ5）質（正の光走性）を利用した。試験水を流入させる水スムス属やアナベナ属）を1日1回、飼育水が薄く緑色槽にオオミジンコを入れ、この水槽の一端にオオミジを呈する濃度で与えた。

ンコを誘引する照明を設置した。照明周辺をUSBカメ（3）ナミウズムシ（Dugesia japonica ）ラによって監視し、オオミジンコが遊泳していれば安行動の実験には京都大学 井上 武 先生から分譲し全な水であり、オオミジンコが遊泳していなければ遊ていただいた株を、毒性試験には山口市糸米川で採集91した個体群を用いた。人工海水（（株）ジャパンバイオケミカル）を0.05g/Lの濃度で溶解させた飼育水（水深1.0〜1.5cm）にナミウズムシを入れ、20℃に設定したインキュベーター内で恒暗条件にて飼育した。ニワト
リのレバーを3日に1回与え、その3時間後に新しい飼育水を入れた容器に移した。
3 オオカナダモの細胞質流動の監視

図２

水温と流動速度（1）観察方法
連続して細胞質流動を観察する装置（図1）を作製し、10cm離 れ た 部 分 の 光 量 子束密度 が50μmol/m2/2に 調 整 し たLEDを 顕 微 鏡（ ニ コ ンD224211EL）に取り付けて観察した。各細胞の中で四隅にある4個の葉緑体の速度の平均値を一つの細胞の

図３ 光の色と流動グラフの中の値は中央値、バーは最大・最小値、アルファベットは有意差を示す（P＜0.05）

ため、光源としては、葉緑体が運動し続ける白色の方が適していた。

図１

細胞質流動の観察速度とし、各群で約100個の細胞を計測した。
（2）結果

図４

葉緑体の凝集① 5℃〜25℃の水温では、温度が高いほど流速が速まる傾向があり、各温度間には5％水準で有意4 オオミジンコの遊泳阻害の監視な差が検出された（Steel-Dwass法）（図2）。

（1）観察方法と結果②細 胞質流動の速度は、照射する光の色によってミネラルウォーターを入れた小型水槽（図5）にミジ変化した。青色の光が最も速く、次いで白色、赤ンコ1匹を入れて20℃に保った。光量子計（apogee、色、黄色の順となった（図3）。各群間には、5％水

MQ-200）を用いて一定の光量子束密度（50μmol/準で有意な差が検出された（Steel-Dwass法）。

m2/s）に調整したLED（青色、緑色、黄色、赤色、白（3）考察色）を小型水槽の端に密着させて光源とした。小型水水温については、5〜25℃まで流動が見られたため、槽を0（暗端）〜7（光源側）の8区間に分け、オオミジこれらの温度範囲において監視が可能であると推察さンコの位置を2分後に記録した。なお、1匹のミジンコれる（図2）。細胞質流動には青色の光が有効であったに対して10回行った平均値を求め、30匹（仔15匹・成（図3）。しかし、青色を照射した場合、長時間経過する体15匹）のデータを分析した。結果は図6に示した。と葉緑体が細胞の縁に集合して停止した（図4）。その92

（2）結果と考察
28時間まではほとんど運動しないことから、機能的な情報処理機構は存在しないと推察した。この時期の断片を生物検定に用いた場合は、苦痛を与えないと思
図５

光走性の実験方法

われた（図8）。

（2）考察
オオミジンコは緑色の光源に引き寄せられる傾向があった（図6）。光源に近い部分を遊泳するオオミジンコをモニタリングすることで、自由に活動させつつ、遊泳阻害の状態を確認することが可能となった（図7）
。

図８

6

切断後の時間と尾部断片の運動

n=15

毒性試験

（1）方法
オオミジンコの急性遊泳阻害試験であるOECDテス
図６ 光走性（親仔）グラフ中の数字は中央値、バーは最小値、n=30トガイドライン202に準拠して行った。
（2）結果
CuSO4に対 するオオカナダモのLC50は0.64〜1.28mg/Lで、銅イオン換算では0.5mg/L以下であった。細胞質流動が停止する濃度が、水道水の基準値8）（1.0mg/L）以下であることから、水質監視に使用できることが分かった。サルコシル（界面活性剤）に対してはナミウズムシが敏感であった。生物種により毒性物

図７

ミジンコ監視部質への耐性に違いがあることが確認できた（図9）。

5 ナミウズムシの尾部断片の監視
ナミウズムシは高い再生能力を有しており、体を切断した場合、2週間程度で元の状態にまで再生する。脳の機能的な再生は5日目に急速に起こり6）、刺激に反応する機構は4日目までの尾側断片には整っていない7）。
そのため、切断後4日目までであれば、生物検定に用いる尾部断片に対して痛みや苦痛を与える可能性は低いと考えられた。ナミウズムシ切断後の尾部の行動について調べ、苦痛を与えない期間を推定した。
（1）方法
頭部と尾部に2分するようにカミソリ刃を用いて切断し た。水 温 を20 ℃ に 保 ち、LEDラ イト（GEX社
AUROR A、照 度50lux）で 照 明し な が ら、カメラ（SONY HDR-AS15）を用いて60秒間隔でインターバル撮影を行った。撮影した画像を連続して比較し、ナミ図9

薬品の種類とLC50（半数致死濃度）
数値は中央値、区間はLC50値

ウズムシ断片の動きを確認した。

937

水質監視の開発と製作

物である11）と考えられてきたが、野外に生息する個体

上記の実験や観察の結果を活用し、水質監視装置をの中には体色が緑色のナミウズムシもいるため、藻類製作した。開発したシステムは、オオカナダモ監視部、などの植物を捕食している可能性も考えられた。そこ

オオミジンコ監視部、ナミウズムシ監視部、および、そで、ナミウズムシの食性について明らかにするために、れらの判断出力を統合してグラフィカルに提示するフ

山口市内を流れる糸米川において、ナミウズムシや水ロントエンド部によって構成した。最初の3つはC言語

生生物の生物量について調べた。と画像処理ライブラリOpenCVで実装し、最後のフロ

1

調査方法

ントエンド部はJavaで実装した。これらのプログラム

山口県糸米川で、上流からA、B、Cの3地点を設定

は計算装置ASUS X200M 上で並列実行される。

し、月に一度コドラート法にて水生生物を採集した（図水質の判定は、3種の監視部で、それぞれ異なる画像

11）。コドラート枠（30cm×30cm）を川底に設置し、処理の手法を用いている。ここでは、オオミジンコ監視その範囲内の水生生物をシャベルを用いて砂利ごと採部の処理について記載する。

集して、砂利を除いて水生生物を集めた。採集した生オオミジンコを撮影した画像を用いて毒性物質の影物はガラス製のビンに入れて持ち帰り、生物種や個体響を検出する手法9）は開発されているが、既存の技術は小さなセルに入れた止水中の個体に対するモニタリングである。私たちが開発した装置では、自由遊泳させたミジンコを光に集めて監視している点が、既存のものとは異なっている。まず、USBカメラ（Logicool HD

図11

調査地（左からA地点、B地点、C地点）

図12

トビケラ類とナミウズムシの個体数

Webcam C310）でミジンコを撮影し、画像を取り込む。なお、起動時には、画像を撮影し、重み付き平均を更新することを繰り返して、平均画像を作成する10）。
USBカメラから取り込んだ画像と作成した平均画像の差分を作成し、二値化をする。閾値処理のち、画像を平滑化し、別の閾値で二値化する。そして、ノイズを取り除くために、画像に収縮処理をかけて、探索窓の中にある輪郭を抽出する。輪郭の面積と円形度の基準でオオミジンコの成体を識別する。その後、探索窓の中にオオミジンコの成体がいなくなれば、オオミジンコの遊泳が阻害されたとみなし、警報を発する（図10）。

図10

3種の生物検定を用いた複合的水質監視装置

Ⅲ．ナミウズムシの生態
ナミウズムシを水質監視の生物検定に用いる場合、食物連鎖の中でどこに位置しているかを把握することは重要である。これまで、ナミウズムシは動物食性動94

数を記録した。個体の同定は『日本淡水生物学』（上野2）四国総合研究所.“メダカdeモニタ”,益三.（株）北隆館.1973）を参考にした。

（参照2016/04/24）

2

結果と考察

http://www.co.jp/service/environment/

調査期間：2015年3月〜9月

seibutumonita.htm

C地点では、6月に環境の急変が起こり、それまでに

3）日本動物実験代替法学会.

生物量の大半を占めていたトビケラ類が激減し、代わhttp://www.asas.or.jp/jsaae/,（参照 2015-

りにカゲロウ類が急増した。一方、ナミウズムシは7月09-26）

以降ほとんど見られなくなった。このことから、C地点

4）“細胞の運動と細胞骨格”
. ニューステージ新生のナミウズムシはトビケラ類を主に捕食していた可能物図表. 浜島 書店 編 集部. 浜島 書店, p.48,性が考えられた。そこで、それぞれの地点において、ト2011

ビケラとナミウズムシの個体数の変動を示した（図5）U .C.Storz, R. J. Paul, “Photota x is in12）。このグラフから、トビケラの個体数の増減に伴っwater fleas（Daphnia magna）is differentlyてナミウズムシの個体数が増減している可能性が推察

influenced by visible and U V light”. J

された。今後、トビケラ類とナミウズムシとの関係を中Comp Physiol. A183:709-717,1998

心に調査を続けていく方針である。

Ⅳ．今後の展望
今回開発した水質監視装置の実用化に向けて、システムの改良を進め、実際に継続運転をしながら信頼性

6）Takeshi Inoue, et al.“Morphological andFunctional Recovery of the Planarian
Photosensing System dur ing HeadR e g e n e r a t i o n”. Z o o l o g i c a l S c i e n c e
21:275-283, 2004

を高めたい。また、有害物質の成分や濃度を推定でき

7）Takeshi Inoue, et al. “Planarian shows

るよう、検定に用いる生物種の選定や毒性試験のデー

decision-making behavior in response toタを蓄積したい。

multiple stimuli by integ rative bra inⅤ．謝辞

function”.Zoological Letters , 1-7, 20158）厚 生労 働 省,水質基 準 項目と基 準 値,2015年,

細胞質流動については首都大学東京の門田明雄先

http://w w w.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/

生、オオミジンコに関する実験方法や飼育、毒性試験

kenkou/suido/kijun/kijunchi.html（ 参照の方法などについては国立環境研究所の鑪迫典久先

2016/04/24）

生、ナミウズムシに関する実験方法やデータの解析な

9）K ei TA NIGUCHI, Kazuhiro SASA andどについては京都大学の井上武先生、画像解析のソフ

Katsumi TAK AYAMA Development of a

トウェアの改善方法については山口大学の水上嘉樹先

rea l-t i me i ma ge a na ly sis sy stem for

生、実験計画については山口大学の堀学先生から御指toxicity testing using Daphnia magna.福井導を賜りました。なお、研究費はJST「中高生の科学部工業高等専門学校活動振興プログラム」による支援を受けています。また、

第46号, 2012

オオミジンコは国立環境研究所水環境実験施設で継10）永 田雅人.実践

代飼育されている系統を、ナミウズムシは京都大学で飼育されている系統を分譲していただきました。皆様のご支援に心から感謝申し上げます。

Ⅵ．引用文献1）O ECDにおける生態影響試験法及びGLP基準.
環 境 省p.1-16, （ 参 照2016/04/24） http://w w w.e n v. g o.j p /c h e m i / s e i t a i - k e n t o /h13/02/01.pdf

研究紀要

自然科学・工学

OpenCV 2.4 映像処理＆解析.第一版、カットシステム,201311）“プラナリアの摂食行動の解析”
.下山せいら.つくば生物ジャーナルVol.10 January,2011

山口県立高等学校
３年

化学・生物部濵田 尚輝
松本久也

原田要95