Scientific and Educational Reports of the Facultyof Science and Technology, Kochi University
Vol. 2 (2019), No. 3

環形動物グアニジノキナーゼの多様性．多毛類 Capitella sp.の細胞質型タウロシアミンキナーゼの遺伝子合成と完全な酵素パラメータ

Diversity in Annelid Guanidino Kinases. DNA Synthesis and Complete Kinetic Parameters ofCytoplasmic Taurocyamine Kinase from the Polychaete Capitella sp.
八木華奈子・鈴木知彦

Kanako Yagi and Tomohiko Suzuki〒780-8520 高知市曙町 2­5­1
高知大学理工学部比較生化学研究室

Laboratory of Comparative Biochemistry, Faculty of Science and Technology, Kochi University,
Kochi 780-8520 Japan

Key Words; guanidino kinase, phosphagen kinase, Capitella sp., enzyme activity, taurocyamine

kinase.
要約
多毛類 Capitella sp. は全ゲノムが解読されており，その情報から少なくとも２種類（細胞質型とミトコンドリア型）のグアニジノキナーゼが存在していることが分かっている．その酵素活性は同定されていないが，アミノ酸配列からはロ
ンブリシンキナーゼ（LK）の可能性が指摘された．今回の研究では，Capitella のリコンビナント細胞質型酵素を用いて，その活性を明確にすることを目的にした．先ず，そのアミノ酸配列に基づき 28 本の DNA オリゴマーを設計し，オーバーラップ・エクステンション PCR 法により遺伝子を全合成した．次に，この遺伝子をプラスミドに組み込み，大腸菌内でリコンビナント酵素を発現させた．酵素は His-tag を用いて精製した．利用できる４種類のグアニジノ基質（クレアチン，
アルギニン，グリコシアミン，タウロシアミン）を用いて酵素活性測定を行ったところ，タウロシアミンについてのみ強い活性を示した．次に，異なる 64 点の基質濃度において酵素活性を測定し，完全な酵素パラメータ（４種類の解離定数：
Tau
Tau
ATP
ATP
Ka , Kia , Ka , Kia ，及び kcat）を計算した．ATP 存在下の酵素と基質タウロシアミンの親和性を示すパラメータ

Tau

（Ka

）は 1.06

0.125 mM であると決定され, この値は環形動物の他のタウロシアミンキナーゼ（TK）酵素の値（0.881-4.01 ｍM）と同等であり，Capitella 酵素は主活性として TK 活性を持つことが分かった．また，タウロシアミ
Tauンに対して副活性を示す Eisenia LK では，その Ka は 15.3 mM であり，Capitella 酵素（1.06 mM）よりも 10 倍以
上親和性が低い．このことも，Capitella 酵素が LK ではなく TK であることの傍証となる．今回の結果から，Capitella
細胞質型酵素は，アミノ酸配列から予想されていたロンブリシンキナーゼではなく，タウロシアミンキナーゼであると結論される．

Abstract
The genomic data suggest that two types of guanidino kinases, cytoplasmic form and mitochondrial form, arepresent in the polychaete Capitella sp. The derived amino acid sequences of the enzymes have a similarity withthose of lombricine kinases, although the enzyme activity has not been determined. The purpose of this work is

Received: January 23, 2019
Reviewed by anonymous referee(s), and accepted: January 26, 2019
Published: March 27, 20191

to identify the substrate specificity of the Capitella cytoplasmic enzyme. In this report, we synthesized the DNA
of Capitella cytoplasmic enzyme with overlap extension PCR, and the recombinant enzyme was expressed in E.

coli. The purified enzyme showed activity only for taurocyamine among the four guanidino substrates, creatine,
arginine, glycocyamine and taurocyamine examined. Based on the measurements under 64 different substrate
Tau

Tau

ATP

ATP

concentrations, full kinetic parameters (4 dissociation constants：Ka , Kia , Ka , Kia ，and the catalytic
Tau

constant: kcat）for the Capitella TK enzyme were determined. The Ka

value, representing the affinity for thesubstrate taurocyamine in the presence of ATP, was determined to be 1.06

0.125 mM, which is comparable

to those (0.881-4.01 mM) of other annelid TKs from Arenicola and Riftia. On the other hand, Eisenia LK shows
Tau

activity not only for the main substrate lombricine, but also taurocyamine. However, the Ka
reported to be 15.31

of Eisenia LK is0.75 mM, indicating that Eisenia LK has 10-fold or more weaker affinity than Capitella

enzyme. Thus, the Capitella enzyme is concluded to be taurocyamine kinase (TK), but not lombricine kinase (LK)
as suggested from its amino acid sequence.

序論
グアニジドキナーゼ（フォスファゲンキナーゼ）は，ATP のリン酸基をグアニジド化合物に転移させ，ADP とリン酸化された高エネルギーグアニジド化合物（フォスファゲン）を生成する反応を可逆的に触媒する酵素である．この酵素群は，
ATP 需要の多い組織や細胞で強く発現しており，細胞内の ATP 濃度を一定に保つ役割を果たしている [Watts, 1971]．
グアニジノキナーゼは，使用する基質の違いにより，アルギニンキナーゼ（AK），クレアチンキナーゼ（CK），ロンブリ
シンキナーゼ（LK），タウロシアミンキナーゼ（TK），グリコシアミンキナーゼ（GK），ハイポタウロシアミンキナーゼ（HTK），サラセミンキナーゼ（ThaK），オフェリンキナーゼ（OK）等に分類される [Van Thoai, 1968; Watts,1971;
Suzuki et al., 1997; Ellington & Suzuki，2006 and 2007]．これらの酵素の分布には大きな特徴があり，脊椎動物ではCK，節足動物や軟体動物では AK などほとんどの分類群が単一もしくは少数の種類の酵素を含むのに対して[Uda et al.,2006]，環形動物及びそれに近縁な動物群には上記８種類の酵素が全て含まれている．すなわち，環形動物の系統においてグアニジノキナーゼ遺伝子が著しく多様化しているのである．環形動物内でもグアニジノキナーゼの特徴的な分布が見られる．多毛類においては上記酵素のうち６種類（AK, CK, TK, GK, ThaK, OK）が分布し[Van Thoai, 1968; Watts,1971;
Uda & Suzuki, 2007; Suzuki & Furukohri, 1994; Uda et al., 2005a]，貧毛類では LK のみ [Suzuki et al., 1997;
Doumen, 2012]，一方，ヒル類ではグアニジノキナーゼの報告はない．環形動物に近縁なユムシ類では LK [Ellington &Bush, 2002]，ホシムシ類では HTK [Uda et al., 2005b]の分布が見られる．
多毛類の一種 Capitella sp. は，しばしば環境汚染を示す指標性の生物として扱われており[菊池, 1979]，そのゲノム配列も判明している．我々は以前の研究で，Capitella ゲノム配列から２種類のグアニジノキナーゼを抽出し，アミノ酸配列の系統樹上の位置から，それらが LK である可能性を指摘した[Tanaka et al., 2007]．この研究では，Capitella 細胞質型
リコンビナント酵素を発現させて，実際にその基質特異性を決定することを目的とする．

材料と方法
Capitella 細胞質型グアニジノキナーゼのアミノ酸配列データを基に，Web 上のプログラム(DNAWorks v3)を用いて

2

28 本のオリゴマーを設計した．尚，オリゴマー1 には NdeI 配列が，オリゴマー28 には 6 x His 配列と EcoRI 配列を付加した．設計したオリゴマー（各 50 µM）を 1 µL づつ混合し，各オリゴマー濃度が 625 nM になるようなオリゴマー混合液(Template)を作製した．
+

上記の Template を 1 µL 用い，10x KOD Neo Buffer：2.5 µL，2 mM dNTP：2.5 µL，25mM MgSO4 ：1 µL，+

DMSO：1.25 µL，水：15.75 µL，KOD Neo DNA Polymerase：0.5 µL を加えて First PCR を行った．PCR の条件+は前報と同じである[土居ら，2018]． First PCR 産物 1 µL を Template として，10x KOD Neo Buffer：2.5 µL，2 mM
dNTP：2.5 µL，25mM MgSO4 ：1 µL，DMSO：1.25 µL，Primer-1：1 µL，Primer-28：1 µL，水：13.75 µL，+

KOD Neo DNA Polymerase：0.5 µL を加えて Second PCR を行った．
次に， Second PCR 産物（1,100 bp）の３ʼ末端に dA を付加し，pGEM-T easy ベクターに組み込んだ．塩基配列を確認した後，インサート DNA を切り出し，発現用プラスミド pET-30b の NdeI / EcoRI サイトに組み換えた．

Capitella リコンビナント酵素を，1 mM IPTG 存在下，18℃，
このプラスミドで，大腸菌 BL-21 をトランスフォームし，
24 時間発現させた．発現大腸菌は超音波により細胞を破砕し，可溶性の His-tag リコンビナント酵素は，Ni-NTA resinを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した．
グアニジノキナーゼの酵素活性測定は，25 C において，反応にピルビン酸キナーゼ，乳酸脱水素酵素の反応をリンクさ+せ，最終的に NADH が NAD に変化する反応に置き換えて，340 nm で追跡した[Morrison & James, 1965]．

結果と考察
366 アミノ酸から構成されている Capitella 細胞質型グアニジノキナーゼのアミノ酸配列は，Tanaka et al. (2007)に記してある．Overlap extension PCR により，この酵素の DNA（約 1,100 bp）を合成した．First PCR 及び Second PCRの結果を Figure１に示した．1,100 bp の DNA を抽出して３ʼ末端に dA 付加を行なった後，pGEM にクローニングし，
適切な塩基配列を持つクローンを選び出した．さらに，インサート DNA を pET ベクターの NdeI / HindIII サイトに組み込んだ．再度，この DNA 配列に変異が起こっていないことを確認した．

1,650 bp1,000 bp

M
Figure 112Overlap extension PCR の結果． M: Marker DNA, 1：First PCR,

2：Second PCR．矢印は 1100 pb の DNA を示す．

pET ベクターに組み込んだ細胞質型グアニジノキナーゼ（C 末に His-tag を付加）遺伝子を大腸菌 BL21 株中で発現さ3せた．リコンビナント酵素は，1.0 mM IPTG，18℃で 24 時間の条件下で可溶性酵素が最も多く得られ，酵素は His-tagを用いたアフィニティカラムで精製した．精製のそれぞれの段階の SDS-PAGE を Figure 2 に示す．レーン５の酵素を，酵素活性測定に用いた．

50 kDa37 kDa

M

1

2

3

4

5

6

Figure 2 Capitella 細胞質型グアニジノキナーゼの精製過程の SDS-PAGE. 1：可溶性画分，2：不溶性画分，3：20 mM Imidazole

溶出分画，4：50 mM Imidazole 溶出分画，5：100 mM Imidazole 溶出分画（使用した酵素），６：150 mM Imidazole 溶出分画．矢印は分子量 42 kDa を示す．

精製されたリコンビナント酵素は，確認した４種類の基質（クレアチン，アルギニン，グリコシアミン，タウロシアミ
ン：最終濃度は 4.76 mM）のうち，タウロシアミンにおいてのみ酵素活性を示し，それ以外に対しては全く活性を示さなかった．従って，暫定的に，Capitella 細胞質型グアニジノキナーゼはタウロシアミンキナーゼ（TK）と判断した．
グアニジノキナーゼの正反応（フォスファゲン合成方向）は，二基質高速平衡ランダムオーダー反応速度論によって説明される[Morrison & James, 1965]．この反応の初速度（v）は，２種類の基質濃度（ATP 及びグアニジノ基質（ここでは Taurocyamine））と５種類の酵素パラメータにより以下の式で表される．

𝑣=

𝑉%&'
*&.
𝐾&)*+ ∙ 𝐾-&[𝑇𝑎𝑢][𝐴𝑇𝑃]

+

𝐾&)*+
𝐾 *&.
+ & +1[𝐴𝑇𝑃] [𝑇𝑎𝑢])*+*&.
𝐾&*&. ∙ 𝐾-&= 𝐾&)*+ ∙ 𝐾-&

𝑉%&' = 𝑘9&: [𝐸< ]ここで，Ka はもう一方の基質の存在下における当該基質の解離定数，Kia はもう一方の基質の非存在下における当該基質の解離定数，kcat は Vmax から計算される触媒定数である．E0 は反応に用いた酵素濃度である．二基質速度論における上
Tau

Tau

ATP

ATP

記５種類のパラメータ（４種類の解離定数：Ka , Kia , Ka , Kia ，及び kcat）を求めるために，６４通りの異なる
基質濃度において酵素反応を測定し（Figure 3），それぞれの初速度から SigmaPlot12 を用いて，５種類のパラメータを算出した．この実験は３回繰り返し，それぞれの実験からパラメータ（Exp.1，Exp.2，Exp.3 in Table 1）を計算した．

4

得られたパラメータ間には，２倍程度の差異が見られた．この報告では，最も誤差の少ない酵素パラメータセット（Exp.2
in Table 1）を採用した．

Figure 3 Capitella 細胞質型グアニジノキナーゼのタウロシアミンに対する酵素活性．64 点の異なる基質濃度において酵素活性を測定した（Exp.2）．８種類のミカエリス・メンテン型酵素グラフの ATP 濃度は，上から，4.76，2.38，1.19，0.714，0.595，0.476，
0.357，0.238 mM である．酵素パラメータは SigmaPlot12 を使って算出した．

Table 1 に，今回の研究で決定した多毛類 Capitella 細胞質型 TK の酵素パラメータと，すでに報告されている多毛類

Arenicola TK と MiTK（細胞質型とミトコンドリア型），深海チューブワーム Riftia MiTK（ミトコンドリア型），及び貧毛類 Eisenia LK の基質タウロシアミンに対する酵素パラメータを比較した．尚，リコンビナント酵素の精製のために，

Capitella TK では His-tag を，それ以外の酵素では MBP(マルトース結合タンパク質)-tag を使用している．
Tau
先ず ATP 存在下におけるタウロシアミンに対する親和性（Ka ）を比較すると，Capitella TK では 1.06 mM（Exp.2

in Table 1）であり，この値は同じ多毛類の Arenicola MiTK（0.881 ｍM）と同等とみなすことができる．また，Arenicola
細胞質型 TK や Riftia MiTK の値は，タウロシアミンに対してより低い親和性（それぞれ 4.01 ｍM 及び 2.12 mM）を示していることから，Capitella 酵素は明瞭にタウロシアミンキナーゼ（TK）であると結論できる．
また，タウロシアミンに対して副活性を示す Eisenia LK では，その KaTau は 15.3 mM であり，Capitella 酵素（1.06 mM）
よりも 10 倍以上親和性が低い（Table 1）．このことも，Capitella 酵素が TK であることの傍証となる．

5

Table 1 タウロシアミンに対して活性を示すグアニジノキナーゼの酵素パラメータの比較．MiTK：ミトコンドリア型TK．それ以外の酵素は細胞質型．
Enzyme Tag

kcat (1/s)

KaTau (mM)

KiaTau (mM)

KaATP (mM)

KiaATP (mM)

Kia/KaKaTau/KaATP

Exp.1

6xHis

1.23 ± 0.026

0.64 ± 0.058

7.93 ± 1.37

0.23 ± 0.034

2.84 ± 0.31

12.39

2.78

Exp.2

6xHis

2.57 ± 0.093

1.06 ± 0.125

5.83 ± 1.02

0.57 ± 0.085

3.16 ± 0.44

5.50

1.86

Exp.3

6xHis

1.34 ± 0.062

1.06 ± 0.169

9.31 ± 3.32

0.27 ± 0.085

2.38 ± 0.45

8.78

3.93

Riftia pachyptila MiTKUda et al. (2005c)

MBP

2.12 ± 0.459

Arenicola brasiliensis TK

Uda et al. (2005c)

MBP

4.01 ± 0.418

Arenicola brasiliensis MiTK

Tanaka et al. (2011)

MBP

0.881 ± 0.085

Eisenia foetida LK

Tanaka et al.2004

MBP

81.79 ± 7.97

0.29 ± 0.056

1.67 ± 0.33

5.34

52.79

Sources

Polychaete

Oligochete

Reference

Capitella sp. TK

This work

7.28 ± 0.45

15.31 ± 0.75

高速平衡ランダム機構の二基質酵素反応における Kia/Ka 値は，一方の基質の結合によって他方の基質結合が影響される度合い（基質結合の相乗効果）を表す．グアニジノキナーゼにおいては，通常，この値は 1 より大きく，最初の基質の結合が他方の基質結合を促進することを示している．Capitella TK 酵素においては，この値は 5.50（Exp.2 in Table 1）
であり，強い相乗効果が推測される．
以前の研究で私たちは，アミノ酸配列の系統樹上で Capitella 酵素が Arenicola TK や Riftia TK のクラスターではなくEisenia LK などが含まれるクラスターに含まれていたことを根拠に，この酵素はロンブリシンキナーゼ（LK）の可能性が高いと論じた[Tanaka et al., 2007]．また，グアニジノキナーゼの基質認識には，GS 領域と 95 位のグアニジノ基質認
識アミノ酸が重要であることがわかっているが[Suzuki et al., 1997; Tanaka & Suzuki, 2004]，今回，Capitella 酵素の
アミノ酸配列を詳細に検討した結果，GS 領域及び 95 位のアミノ酸は LK 型（それぞれ，5 残基欠損型及び Lys）であった．しかしながら，今回の研究で明らかになったように，Capitella 酵素は，他の TK 酵素と同様なタウロシアミンに対す
Tau

る強い親和性（Ka= 1.06 mM）を持っている（Table 1）．Capitella 酵素については，現時点で，基質ロンブリシンの入手が難しいためにその Ka 測定に至っていない．しかし，Eisenia LK の主基質ロンブリシン及び副基質タウロシアミ
ンの Ka 値（それぞれ，5.33 mM 及び 15.31 mM）[Tanaka et al., 2004]から判断すると，Capitella 酵素が，タウロ
シアミン（1.06 mM）を超える強い親和性をロンブリシンに対して示す可能性は限りなく低い．

Capitella 酵素のアミノ酸配列が LK に最も類似しているのに，主活性はタウロシアミンであろうことはおそらく確実である．これは，LK と TK 間のグアニジノ基質認識がごくわずかなアミノ酸残基の置換によって変換しうることを示唆している．また，TK 酵素は，環形動物以外でも原生生物[Uda et al., 2013; Palmer et al., 2013]や扁形動物[Jarilla et al.,2009]において独立に出現していることを考慮すると，グアニジノキナーゼ酵素群においては，タウロシアミンに対する基質特異性の獲得ルートが多様であると思われる．

謝辞
この研究の一部は，日本学術振興会科学研究費補助金の助成（基盤（C）15K07151）により行われた．

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