組織微小環境における空間的シングルセル解析の最新技術

co-detection by indexing (CODEX) 技術を用いた高度な(～60）多重免疫蛍光染色による”切片を用いたシングルセル解析”

バイオストリーム株式会社

細野直哉

本日の内容• 空間的シングルセル解析の重要性• CODEX技術の原理とワークフロー• CODEX技術をベースにしたPhenoCyclerシステムの特徴• 空間的シングルセルデータ解析• 空間的シングルセル解析例• 空間的マルチオミックス解析に向けて

空間的シングルセル解析の重要性
組織は個々の細胞の相互作用で成り立っており、サイトメトリーやscRNAseqに代表される細胞サスペンションの解析ではその情報が失われてしまう。
がんや様々な組織の微小環境の解析には空間情報（位置情報）を保持した切片でのシングルセル解析が重要。

しかし、現状の数マーカー免疫染色では、微小環境に存在する個々の細胞のセルタイプやその状態を把握することはできない。
細胞表面マーカーや機能マーカーも含め包括的に解析できる高度な（～100）多重免疫染色の解析システムが必要。

Spatial Omics is Hot, Rapidly emerged field
Spatial Whole Transcriptome解析は微小環境解析の有力なディスカバリーツー
ルとして普及しつつあるが、解像度と検出力が問題（55um) 。高解像度で検出力の高いSpatial single cell Proteomicsでのvalidationやデータ統合によるマルチオミックス解析がトレンドになりつつある。
Spatial Whole Transcriptome自体の高解像度化も進みつつある。

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CODEX is the leading Spatial Phenotyping solution for
Global Cell Atlas Efforts
Global program to create
cell atlas

Top tier institute participation

Nearly 100 datasets contributed to public domain
Over 50 publications

co-detection by indexing (CODEX)の原理とワークフロー
フィルターセット
凍結切片FFPE• 抗体にリンクしているDNAバーコードと蛍光プローブのハイブリによりタンパク質を検出• ハイブリと変性（室温）を繰り返し、3色の蛍光をサイクルで検出することで高度な多重染色を実現（3色X20サイクルで60ターゲットなど。35サイクル以上安定）• 切片の再ランも可能• バックグラウンド減算で自家蛍光の影響を最小化（PhotoBleachingで自家蛍光を実験的に減少させるプロトコールも公開）• 抗体はバーコード付きでready-to-useの108種類とカスタムコンジュゲーションが可能（400種類以上のバリデート済み抗体）

PhenoCycler抗体リスト（バーコードコンジュゲート済み-108）
ヒトFFPE用
Anti-Hu ATM(AKYP0122)-BX083
Anti-Hu ER(AKYP0105)-BX084
Anti-Hu b-Catenin1(AKYP0068)-BX020 Anti-Hu FOXP3(AKYP0102)-BX031
Anti-Hu Bcl-2(AKYP0120)-BX085
Anti-Hu GATA3(AKYP0116)-BX049
Anti-Hu Beta-actin(AKYP0072)-BX010 Anti-Hu Granzyme B(AKYP0086)-BX041

Anti-Hu Caveolin(AKYP0115)-BX086 Anti-Hu Histone H3 Pho(AKYP0060)-BX030
Anti-Hu CD3e(AKYP0062)-BX045
Anti-Hu HLA-A(AKYP0078)-BX004
Anti-Hu CD4(AKYP0048)-BX003
Anti-Hu HLA-DR(AKYP0063)-BX033
Anti-Hu CD8(AKYP0028)-BX026
Anti-Hu HLA-E(AKYP0096)-BX034
Anti-Hu CD11c(AKYP0051)-BX024
Anti-Hu ICOS(AKYP0090)-BX054
Anti-Hu CD14(AKYP0079)-BX037
Anti-Hu IDO1(AKYP0084)-BX027
Anti-Hu CD20(AKYP0049)-BX007
Anti-Hu IFNG(AKYP0093)-BX020
Anti-Hu CD21(AKYP0061)-BX032
Anti-Hu iNOS(AKYP0104)-BX023
Anti-Hu CD31(AKYP0047)-BX001
Anti-Hu Keratin 8/18(AKYP0112)-BX081
Anti-Hu CD34(AKYP0088)-BX025
Anti-Hu Keratin 14(AKYP0064)-BX002
Anti-Hu CD38(AKYP0110)-BX089
Anti-Hu/Mu Ki67(AKYP0052)-BX047
Anti-Hu CD39(AKYP0107)-BX099
Anti-Hu LAG3(AKYP0089)-BX055
Anti-Hu CD40(AKYP0095)-BX010
Anti-Hu LIF(AKYP0065)-BX006
Anti-Hu CD44(AKYP0073)-BX005
Anti-Hu Mac2/Galectin-3(AKYP0067)-BX035
Anti-Hu CD45(AKYP0074)-BX021
Anti-Hu MPO(AKYP0113)-BX098
Anti-Hu CD45RO(AKYP0059)-BX017 Anti-Hu Pan-Cytokeratin(AKYP0053)-BX019
Anti-Hu CD66(AKYP0080)-BX016
Anti-Hu PCNA(AKYP0085)-BX036
Anti-Hu CD68(AKYP0050)-BX015
Anti-Hu PD-1(AKYP0070)-BX046
Anti-Hu CD79a(AKYP0109)-BX090
Anti-Hu PD-L1(AKYP0103)-BX043
Anti-Hu CD107a(AKYP0004)-BX006
Anti-Hu Podoplanin(AKYP0007)-BX023
Anti-Hu CD141(AKYP0124)-BX087
Anti-Hu SMA(AKYP0081)-BX013
Anti-Hu CD163(AKYP0114)-BX069
Anti-Hu TFAM(AKYP0066)-BX029
Anti-Hu Collagen IV(AKYP0083)-BX042 Anti-Hu TIGIT(AKYP0092)-BX002
Anti-Hu E-cadherin(AKYP0057)-BX014 Anti-Hu TP63(AKYP0111)-BX093
Anti-Hu EpCAM(AKYP0119)-BX091
Anti-Hu Vimentin(AKYP0082)-BX022
Anti-Hu VISTA(AKYP0094)-BX040

ヒトFF用Anti-Hu CD2(AKYP0009)-BX002
Anti-Hu CD3(AKYP0027)-BX015
Anti-Hu CD4(AKYP0034)-BX021
Anti-Hu CD8(AKYP0012)-BX004

Anti-Hu CD11c(AKYP0042)-BX027
Anti-Hu CD19(AKYP0010)-BX003
Anti-Hu CD21(AKYP0022)-BX013
Anti-Hu CD31(AKYP0029)-BX032
Anti-Hu CD34(AKYP0056)-BX035
Anti-Hu CD38(AKYP0020)-BX007
Anti-Hu CD45(AKYP0008)-BX001
Anti-Hu CD45RO(AKYP0059)-BX017
Anti-Hu/Mu CD49f(AKYP0018)-BX033
Anti-Hu CD69(AKYP0058)-BX041
Anti-Hu CD90(AKYP0054)-BX022
Anti-Hu CD104(AKYP0019)-BX005
Anti-Hu CD138(AKYP0021)-BX010
Anti-Hu CD278(AKYP0031)-BX017
Anti-Hu HLA-DR(AKYP0017)-BX026
Anti-Hu/Mu Ki67(AKYP0052)-BX047
Anti-Hu Pan-Cytokeratin(AKYP0053)-BX019
Anti-Hu PD-1(AKYP0026)-BX014
Anti-Hu Podoplanin(AKYP0007)-BX023

マウスFF用Anti-Mu CD3(AKYP0035)-BX021
Anti-Mu CD4(AKYP0041)-BX026
Anti-Mu CD5(AKYP0016)-BX017
Anti-Mu CD8a(AKYP0044)-BX029

Anti-Mu CD11b(AKYP0040)-BX025
Anti-Mu CD11c(AKYP0045)-BX030
Anti-Mu CD19(AKYP0033)-BX020
Anti-Mu CD21/35(AKYP0037)-BX023
Anti-Mu CD24(AKYP0036)-BX022
Anti-Mu CD31(AKYP0002)-BX002
Anti-Mu CD38(AKYP0032)-BX019
Anti-Hu/Mu CD44(AKYP0003)-BX005
Anti-Mu CD45(AKYP0005)-BX007
Anti-Mu CD45R/B220(AKYP0014)-BX010
Anti-Hu/Mu CD49f(AKYP0018)-BX033
Anti-Hu/Mu CD49f(AKYP0018)-BX033
Anti-Mu CD71(AKYP0043)-BX027
Anti-Mu CD90.2(AKYP0001)-BX001
Anti-Mu CD169(AKYP0015)-BX015
Anti-Mu IgD(AKYP0030)-BX016
Anti-Mu IgM(AKYP0025)-BX013
Anti-Hu/Mu Ki67(AKYP0052)-BX047
Anti-Mu Ly6g(AKYP0039)-BX024
Anti-Mu MHC II(AKYP0006)-BX014
Anti-Mu TCRb(AKYP0011)-BX003
Anti-Mu Ter119(AKYP0013)-BX004

カスタムでのコンジュゲートも可能。カスタムコンジュゲートで確認されているものも含めると～400種類(HubMAPなどのプロジェクトで確認された抗体リストも順次アップデートされている）

カスタムコンジュゲート
免染で実績のある抗体を使用する。
抗体は50ugを使用
原則としてPBSに懸濁された精製抗体を使用する
BSA、ゼラチン等のキャリア―タ
ンパク質、グリセロールなどが含まれるものは使用しない抗体を部分的に還元してHeavy
chainにDNAバーコードをコンジュゲート

CODEX技術を利用したAkoya PhenoCycler-システム
PhenoCycler-Fusion (PCF)システム

PhenoCycler-Open (PCO)システム•

凍結切片、FFPE切片を用いて～60種類のタンパク質をシングルセルの解像度でイメージング(解像度は0.5um/0.37um/0.33um)•

Akoya Fusionシステム、キーエンスBZX-700/800シリーズ,
またはZEISS Axio Oberver7と組み合わせて使用•

切片の厚みは5-10umでPCFでは高速でスライドガラスの全面スキャンが可能。PCOはカバーガラスで領域ベース。
(PCF-18x34mm/PCO-15mmx15mm)•

無償の解析ツールQupath/CytoMapが利用可能。
イメージデータから個々の細胞をセグメント化し、次元削減、クラスタリング解析や細胞間距離を指標にした細胞間相互作用、CellularNeiborhood解析 が可能。

•PCFはTSAを用いたイメージングが可能
PCOでは通常の顕微鏡として利用する際に切り替えが容易

Human Tonsil (24plex) 12.2mm x8.9mm, >1M cells空間的シングルセル解析の流れ
1次解析(QuPathなど）
イメージデータの取得

２次解析(CytoMAPなど）
細胞レベルの解析
次元削減（UMAPなど)

解析領域の指定
フェノタイプマッピング
Cell Segmentation

Cell Classification / Clustering
ー教師あり機械学習ベースの分類
ー教師無しクラスタリング

細胞間相互作用の解析
Cellular Neighborhood（CN)レベルの解析
CNの検出
CNの領域へのマッピング
CN間相互作用の解析

核シグナルによる細胞のセグメンテーション
Watershed Algorism

StarDist Algorism （HubMap）(https://github.com/stardist/stardist)

DAPI Image

Intensity Profile
極大値の探索と領域拡張

距離、近隣シグナル
ベースで細胞の境界を推定

Cells Outline

事前学習されたモデルを利用した深層学習で各ピクセ
ルのシグナル、バックグラ
ウンドを判別し核の境界をポリゴンで予測距離、近隣シグナルベースで細胞の境界を推定

QuPath (無償のツール）による細胞のセグメンテーションと分類
Cell Segmentation (QuPath original & StarDist)DAPIを利用したクラスタリング

Cell Classification(教師付き機械学習でトレーニングされた分類子でテストデータの予測を行う）

Commercial

核、細胞質、細胞膜のマーカーなどマルチパラメータ―を利用した
Cell Segmentation & Cell Classificationの解析ツール
Akoya Informソフトウェア＆PhenoptrReport

Public open source

Indicalabs HALOソフトウェア
VISIOPHARMソフトウェア

論文ではDeepCell、Cellposeのクオリティスコアが高くなっている

空間的シングルセル解析の流れ
1次解析(QuPathなど）
イメージデータの取得

２次解析 (CytoMAPなど）
細胞レベルの解析
次元削減（UMAPなど)

解析領域の指定
フェノタイプマッピング
Cell Segmentation

Cell Classification / Clustering
ー教師あり機械学習ベースの分類
ー教師無しクラスタリング

細胞間相互作用の解析
Cellular Neighborhood（CN)レベルの解析
CNの検出CNの領域へのマッピング
CN間相互作用の解析

細胞レベルの解析（無償の解析ツールCytoMAP)
フェノタイプマッピング
tSNE/UMAP(次元削減）

教師なしクラスタリング

細胞間相互作用の解析

アノテーション（マニュアル）Cellular Neighborhood解析（CytoMAP）
https://www.akoyabio.com/webinar/codex-with-seurat-a-high-dimensional-approach-to-unlocking-spatial-insights/

Cellular Neighborhood解析

Cellular Neighborhood Interaction

解析可能なツール
Neighborhood Coordination
CytoMAP,VisioPharm

MAV, QuPathの使い方はYoutubeにて公開しております。
https://www.youtube.com/channel/UCKgB6yUz-cVef-l-3U4siNQ/videos

使用例1：Cellular Neighborhood解析
組織マイクロアレイを用いた効率的な大腸がんの微小環境の解析

関連論文

Cell. 2020 Oct 29;183(3):838.

• PhenoCyclerシステムの原理、方法を詳述• 組織マイクロアレイとの組み合わせでハイスループット解析を実現• 2枚のカバースリップに140組織スポット（0.6mm)をマウントし、大腸がん35検体（17 CLR vs 18 Dll)を解析。
• 56タンパク質を同時に解析して28のセルタイプを同定し、シングルセルレベルの細胞間相互作用を解析。
• 細胞間相互作用だけでなく領域としての特徴づけを行い（CN: CellularNeighborhood) 、領域間の相互作用解析により予後に関連する微小環境の特徴を同定。

New Biomarkers are Needed to Better Predict Patient Response

Conventional Biomarkers Fail to Predict Outcomes in Lymphoma

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Context Matters: Spatial Neighborhoods Predict Response
Discovery Uncovers Predictive Potential of Spatial Neighborhoods
CITN-10 Phase II Clinical Trial (Cutaneous T-Cell Lymphoma)• 56-plex IO Panel

38% response• Multiple spatial neighborhoods

CN10 = Treg
enriched
CN5 = Tumor &dendritic cells

CN8 frequency

25% no-response

CN10 frequency

differentiate responders vs.
non-responders!

CN5 frequency

Spatial Neighborhood
Map Responder

Anti-PD-1
therapy

CN8 = Tumor &CD4+ T cells

Source: Philips, et al. Immune Cell Topography Predicts Response to PD-1 Blockade in Cutaneous T Cell Lymphoma Nat Commun. 2021 Nov 18;12(1):6726. PMID 34795254 doi:
10.1038/s41467-021-26974-6 This publication copyright is governed by a CC BY 4.0 License

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Spatial Neighborhoods in Today’s Literature
Rapid Adoption of SNs as Potential Biomarkers Across the Biomedical Literature

Aaron Mayer, Derek Holman, Utkarsh Tandon, Salil Bhate, Sunil Bodapati, GrahamBarlow, Jeff Chang, Sarah Black, Erica Crenshaw, Brigid Boland, Sarah Streett, WilliamSandborn, John Chang, Sanjiv Gambhir, Garry Nolan, Christian Schürch, Stephan
Rogalla22

使用例２:セルタイプの同定によるSpatial Transcriptomeデータのバリデーション

Single-cell resolution is the key!
PhenoCycler image

Other systems••

組織の連続性がなく、シングルセルデータではないデータの49％が失われている（Visium)

PhenoCyclerによるValidationが有用••25検体の浸潤性膀胱がんのsnRNAseqで、ネオアジュバンント化学療法を伴う/伴わない術後の予後マーカー（予後不良）として、および癌免チェック
ポイント阻害剤の予後マーカ（予後良好）としてCDH12を同定
Validationの過程で初めにVisiumを使用し、CDH12が強く発現しているエリアに、疲弊CD8陽性T細胞マーカーであるPDCD1, LAG3, HAVCR2などの発現を確認•

最終的にPhenCyclerでシングルセルレベルでのCDH12陽性腫瘍細胞と疲弊CD8陽性T細胞の共在（細胞間相互作用）を確認•

CNを利用した相互作用解析

•

マウスの急性腎臓損傷モデルで空間的トランスクリプトーム解析を実施（Visium)•

セルタイプ情報をVisiumの各スポットにマップするするためにscRNAseq, snRNAseqのデータセットを使用••

Visiumのスポットサイズが55umとシングルセルサイズではなく、メジャーなセルタイプが各スポットにアサインされやすい傾向を観察
最終的にCODEXでセルタイプの分布と頻度を確認しているPhenoCyclerシステムの空間的シングルセルトランスクリプトーム解析への応用
Merger of CITE-Seq and PhenoCycler data
CITE-Seq produces multiplexed PROTEIN and mRNA expression data
CITE-Seq workflow

123456PROTEIN

1 2 3 4 5 6mRNA
123456

1 2 3 4 5 6

PhenoCycler (CODEX) results are multiplexed PROTEIN expression data
マウスの脾臓の凍結切片の解析データ

Cell. 2 018 Aug 9;174(4):968-981.e15. doi: 10.1016

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使用例３：空間的シングルセルトランスクリプトーム解析への応用
CITE-Seq データと PhenoCycler データの統合

Science Advances 05 Mar 2021:
Vol. 7, no. 10, eabc5464
DOI: 10.1126/sciadv.abc5464• マウスの脾臓サンプルで33の細胞表面タンパク質をターゲットとしてCITEseqを実施（7097細胞）。
• 33の表面タンパク質データを相関解析ベースにした独自のアルゴリズム（STvEA)でCITE-seqのデータをPhenoCyclerのデータ（Cell. 2018)にマッピング。
• 73％のPhenoCyclerデータ（57819細胞）にマッピングされ、トランスクリプトームをベースにした空間的シングルセル解析が可能に。
• 解析ツールSTvEAがGitHubに公開されており、利用可能。
• Original Citation:
https://advances.sciencemag.org/content/7/10/eabc5464
共通するタンパク質のデータで相関解析→
mRNAデータを組織切片データにマッピングして空間的シングルセルトランスクリプトーム解析に応用

Human Biomolecular Atlas Program (HuBMAP)関連
Highly Multiplexed Immunofluorescence of the Human Kidney using CODEX•

PhenoCycler (CODEX)で新鮮凍結に使用できる23の腎臓組織マーカーパネルを構築•

カスタムコンジュゲート抗体が機能し、柔軟性を評価•

Imaging Mass cytometryに比べて広い領域（mm2) のイメージングが可能である点を評価•

多様な微小環境のシングルセルレベルの解析に利用可能である
ことが確認された

今後の展開① >100Plexのタンパク質検出の実現 (今年中の予定)
Industry’s First 103-plex Whole-Slide Dataset

今後の展開② 12plex RNAScopeの実現 (今年中の予定)

RNAscope Hiplex v230

今後の展開③ 独自開発の100plex RNA検出、タンパク質とRNAの同時検出の実現（来年前半の予定)
100plex RNA検出同一組織でのマルチオミックス
100plex RNA & 100plexタンパク質

同一組織切片での100plex マルチオミックス

https://www.akoyabio.com/PhenoCycler-Fusion-System/multiomics-grant/

CODEX技術を用いた空間的シングルセル解析

まとめ• CODEX技術を利用して～60種類のタンパク質を標的にシングルセルの解像度での多重蛍光免疫染色が可能で、以下のアプリケーション
で主に使用されている①微小環境におけるシングルセルレベルでの細胞間相互作用、領域間相互作用の解析②セルタイプの存在を証明する目的でSatial TranscriptomeデータのValidationに使用③scRNAseq (CITE-seq)とのデータ統合による空間的シングルセルトランスクリプトーム解析• セルセグメンテーションおよびセルタイピングの精度向上が研究テーマの一つになっており、核をベースにした手法から、細胞質、細胞膜のマーカーも含め、かつAIを利用して細胞境界の予測、セルタイピングを行う手法の開発がすすめられている。
• 技術的にはスライドガラスの全面スキャンが可能になっており、5スライド/週で解析が可能• 100plexのタンパク質またはRNAの検出が可能になるとともに（今年度）、RNAとタンパク質の同時検出も可能になる予定（来年度）• レセプターリガンド解析や細胞内局在の解析に耐えうる解像度の実現が今後の課題

お問い合わせ先 ： バイオストリーム株式会社〒105-0021
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Email: info@biostream.co.jp
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