Scientific and Educational Reports of the Facultyof Science and Technology, Kochi University
Vol. 5 (2022), No. 3

アカサンゴのアルギニンキナーゼ（AK1）の好冷特性と日本産宝石サンゴの分岐年代の推定安藤凌 1，山新晃弘 1，加納義貴 1，宇田幸司 1，岩崎望 2，鈴木知彦 1
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高知大学理工学部生物科学科比較生化学研究室

立正大学地球環境科学部環境システム学科環境生態学研究室

Keywords: 宝石サンゴ，アカサンゴ（ Corallium japonicum），シロサンゴ（Pleurocorallium konojoi），モモイロサンゴ（Pleuroorallium

elatius），アルギニンキナーゼ（arginine kinase），分岐年代

Psychrophilic nature of arginine kinase 1 (AK1) from Corallium japonicum, and estimation of
the divergence time of the three Japanese precious corals by UPGMA method
R. Andou1, A. Yamashin1, Y. Kanou1, K. Uda1, N. Iwasaki2 and T. Suzuki1
1Laboratory of Comparative Biochemistry, Faculty of Science and Technology, Kochi University, Kochi 780-0056, Japan
2Faculty of Geo-environment Science, Rissho University, Kumagaya 360-0194, Japan

要約
日本近海の水深 80～300 m に分布する刺胞動物の宝石サンゴ，アカサンゴ，シロサンゴ，モモイロサンゴの RNA
シークエンスの結果により，全ての種は２種類のアルギニンキナーゼ遺伝子（AK1, AK2）を発現していることが明らかになった．AK1 は L-アルギニンに対して強い活性を示したが，一方，AK2 は入手可能なグアニジノ基質のいずれに対しても有意な活性を示さなかった．AK1 においては，結晶構造が判明している Limulus AK のアルギニン結合に関わる
7 つのアミノ酸残基が正確に保存されていた．一方 AK2 においては，基質アルギニン結合部位の中でも特に重要性が高く厳密に保存されている 2 つのアミノ酸残基，75 位の Tyr と 241 位の Glu が，それぞれ His と Gly に置換されていた．興味深いことに，このユニークな２箇所のアミノ酸置換は，刺胞動物 Nematostella や軟体動物 Clione の AK においても見出された．Nematostella AK は微弱な AK 活性を残存しているが， 241 位の Gly を正常型の Glu に変異させても AK 活性の増強は見られなかった．これらのことから，このユニークな置換を持つ AK2 は未知のグアニジノ基質に対して活性を示す可能性が示唆された．
今回の研究では，アカサンゴ AK1 の酵素活性を広い温度範囲において測定し，この酵素が好冷特性を持つかどうかを確かめることを主たる目的とした．その結果，AK1 反応の活性化エネルギー (Ea) は 27.5 kJ/mol と決定され，また，好冷性酵素判別パラメータ，Δ(ΔH o‡)p-m 及び Δ(TΔS o‡)p-m， はそれぞれ，- 23.1，- 24.8 kJ/mol と計算された．
これらの値は，アカサンゴ AK1 が好冷性酵素であることを強く示唆している．
AK1 および AK2 のアミノ酸配列に基づき，日本産三種類の宝石サンゴの分岐年代を UPGMA 法によって推定した．
刺胞動物と環形動物の分岐を５億 2500 万年前と仮定すると，AK1 のアミノ酸配列からは，アカサンゴは 510 万年前にシロサンゴ，モモイロサンゴのグループから分岐したと推定された．シロサンゴとモモイロサンゴの分岐は 340 万年前と計算された．また，AK2 配列からは，前者の分岐は，990 万年前と計算され．AK1 の分子進化速度とはおよそ２倍の違いが見られた．一方，シロサンゴとモモイロサンゴの分岐は AK1 とほぼ同様の値（330 万年前）であった．

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Abstract
RNA sequencing results for the three Japanese precious corals, Corallium japonicum, Pleurocorallium konojoi andPleurocorallium elatius, distributed at depths of 80 to 300 m in the waters near Japan, indicated that all species
express two types of arginine kinase genes (AK1, AK2). Corallium japonicus AK1 showed strong activity for Larginine, while AK2 showed no significant activity for any of the available guanidine substrates. In the AK1
sequences, seven amino acid residues associated with the substrate arginine binding, deduced from the crystal
structure of Limulus AK, were conserved. On the other hand, in the AK2 sequences, two amino acid residues, Tyr at
position 75 and Glu at position 241, that are strictly conserved in normal AKs, were replaced by His and Gly,
respectively. Interestingly, these two unique substitutions were also found in the AKs of the cnidarian Nematostella
and the mollusk Clione. It has been shown that Nematostella AK has a very weak AK activity, and that the
replacement of Gly241 by normal Glu gave no enhancement of the AK activity. These results suggest that AK2 withthe unique substitutions may have an activity for an unknown guanidino substrate.
The purpose of this study is to measure the enzyme activity of Corallium japonicum AK1 over a wide temperature
range and to determine whether this enzyme has psychrophilic nature or not. The activation energy (Ea) of the AK1
reaction was determined to be 27.5 kJ / mol, and the discrimination parameter for psychrophilic enzymes, D (DH0‡)

DS0‡) p-m, was calculated to be -23.1 and -24.8 kJ / mol, respectively. These values suggest that Corallium

p-m and D(Tjaponicum AK1 is a psychrophilic enzyme.
The divergence times of the three Japanese precious corals were estimated from the amino acid sequences of AK1
and AK2 using the UPGMA method, assuming the divergence time of cnidarians and annelids to be 525 million years
ago (Mya). In use of AK1 sequences, the divergence time of Corallium japonicum and the other two corals(Pleurocorallium konojoi and Pleurocorallium elatius) was estimated to be 5.1 Mya, and that of the latter two was
3.4 Mya. On the other hand, in use of AK2 sequences, the divergence time of Corallium japonicum and the other two
was 9.9 Mya, and that of P. konojoi and P. elatius was 3.3 Mya.

1. 序論
AK を含むフォスファゲンキナーゼ (PK) は，ATP の高エネルギーリン酸基をグアニジノ基質に転移させ，高エネルギ
ーリン酸化合物であるフォスファゲンを生成する一群のリン酸基転移酵素である．フォスファゲンは ATP を大量に消費する筋肉繊維等で貯蔵され，ATP の再生時に速やかにリン酸基の供給源となる [1-5]．
温度依存性の観点から，酵素はその活性を有する温度帯ごとに「好熱性 (thermophilic)」，「中温性 (mesophilic)」，「好冷性 (psychrophilic)」に分類される [6-9]．通常の酵素の多くは中温性酵素であり，好熱性酵素としては PCR に用いられる Taq DNA ポリメラーゼがよく知られている．好冷性酵素は，寒冷地や深海などに生息するバクテリアに含まれることが多く，リパーゼなどにおいては工学的な応用と利用が盛んである [10]．
アルギニンキナーゼ（AK）は，主に無脊椎動物に含まれる PK の一種であり，ロブスターAK は中温性酵素として知られる[11]．最近，低温条件下でも基質アルギニンと高い親和性を示し，かつ効率的に酵素反応を触媒する好冷性酵素として，深海生物シロウリガイの 2 ドメイン型 AK [12]や，ミナミヌマエビの AK1 が報告された [13]．このような好冷性酵
素は，中温性酵素に比べて活性部位の構造が柔軟であることが分かっている [14-19]．
宝石サンゴは刺胞動物に属し，日本産のものとしてはアカサンゴ: Corallium japonicum，シロサンゴ: Pleurocorallium

konojoi，モモイロサンゴ: Pleurocorallium elatius がよく知られている．日本の珊瑚漁は，明治以降高知県で始まり，その後，長崎，鹿児島，小笠原などに漁場が広がり，珊瑚加工品は海外向けに輸出されて外貨の獲得に寄与してきた [20]．
上記３種類の日本産宝石サンゴについては RNA シークエンスが行われており，それらは２種類の AK 遺伝子，AK1 と2

AK2 を発現していることが明らかになっている（宇田，未発表）．本研究ではアカサンゴの AK1 及び AK2 のリコンビナ
ント酵素を発現・精製し，それらの酵素活性を測定した．その結果，AK1 は L-アルギニンについて強い酵素活性を示した
ものの，AK2 については L-アルギニンに活性を示さないばかりかクレアチン，グリコシアミン，タウロシアミンについても酵素活性を示さなかった．アカサンゴ AK1 について様々な温度条件で反応を行い，反応の活性化エネルギーや遷移状態の熱力学パラメーターを算出した．得られたパラメーターを，これまでに報告されている好冷性酵素や中温性酵素と比較したところ，AK1 は好冷性型であることが分かった．アカサンゴは水深 80〜300 m の比較的低温な環境に生息する宝石
サンゴの一種であるので，この性質はアカサンゴの低温環境への適合戦略の一つとして捉えることができる．
加えてこの研究においては，日本産宝石サンゴの AK1 と AK2 のアミノ酸配列を用いて作成した系統樹からそれらの分
岐年代について考察した．その結果，アカサンゴは，シロサンゴ及びモモイロサンゴのグループと 510-990 万年前に分岐し，シロサンゴとモモイロサンゴの分岐は 330-340 万年前であると推定された．

2. 材料と方法
2-1 日本産宝石サンゴ（アカサンゴ，シロサンゴ，モモイロサンゴ）の RNA シークエンス

それぞれの total RNA は RNeasy Total RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) を用いて精製し，DNase (DNAfree, Ambion, Austin, TX)で処理した. RNA シークエンスのための paired-end cDNA library は total RNA を用いて作成し，Illumina HiSeq2500 system による解析を外注した．尚，方法の詳細は宇田によって別途報告予定である．

2-2 アカサンゴ AK1 及び AK2 遺伝子のクローニング

アカサンゴの cDNA プールを用いて，AK1 及び AK2 遺伝子を PCR 増幅した．増幅産物は，pGEM T-easy ベクターの Nde I/Hind III サイトに組み込んだ．配列の 5'側には 6 x His タグを付加した．増副産物は，その塩基配列を確認した
のちに，発現ベクターpET30 に組み換えた．

2-3 リコンビナント酵素の発現

リコンビナント酵素は，1mM IPTG の存在下で，15℃，48 時間，発現誘導した．可溶化した酵素は，アフィニティク
ロマトグラフィーによって精製した．精製された酵素の濃度は，ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)によって推定した．

2-4 酵素活性の測定

酵素活性は，AK 反応（正反応）で生じる ADP を，Pyruvate kinase 及び Lactate Dehydrogenase を用いて連続的に変換し，最終的に NADH から NAD+への変化を 340 nm で追跡することで測定した [21-22]．

2-5 活性化エネルギー及び遷移状態の熱力学パラメータの決定
ARG

AK 反応の活性化エネルギーは，アレーニウスの式: ln [kcat] = - Ea/RT + c，により求めた.

遷移状態の熱力学的パラメータは以下の関係式より求めた．

ΔH o‡ = Ea ‒ RT,
ΔG o‡ = RT (ln[kBT/h]-ln[kcat])及び

ΔS o‡ = (ΔH o‡ - ΔG o‡)/T,
ここで R は気体定数 (8.3145 JK-1•mol-1), kB はボルツマン定数 (1.3807 ´ 10-23 JK-1), h はプランク定数 (6.6261 ´
10-34 Js), T は絶対温度である.

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3. 結果と考察
3-1

アカサンゴ AK1 と AK2 のアミノ酸配列の比較と日本産宝石サンゴの分子系統

アカサンゴ AK1 のアミノ酸配列は，地中海産ベニサンゴ：Corallium rubrum の AK 配列と同一であることはすでに報告した[23]．
Fig.１は日本産宝石サンゴ３種の AK1 及び AK2 のアミノ酸配列のアラインメントである．Fig.１に示したように，アカサンゴ AK1 のアミノ酸配列は，モモイロサンゴ及びシロサンゴの AK1 と，それぞれ 4 箇所及び 2 箇所異なっていた．
モモイロサンゴとシロサンゴの AK1 間には，2 箇所の違いがある．
一方，アカサンゴ AK２のアミノ酸配列は，モモイロサンゴ及びシロサンゴの AK２と，それぞれ 7 箇所及び 5 箇所異なっていた．モモイロサンゴとシロサンゴの AK２間では，2 箇所の違いが見られた．
これまで，AK の機能に関わるアミノ酸としては，Limulus AK の X 線結晶解析等により，基質アルギニンの結合に関わる残基，基質 ATP（ADP）の結合に関わる残基，基質結合時の安定化に必要なイオンペア，グアニジノ基質の識別に関わる残基などが判明している [24-27]．
日本産宝石サンゴ３種の AK1 においては，基質アルギニン結合に関わる 7 つのアミノ酸残基は正確に保存されていた（Fig.１の赤丸で示した残基）．一方 AK2 においては，7 つのアミノ酸残基の中でも特に重要度の高い 2 つのアミノ酸残基，75 位の Tyr 及び 241 位の Glu が，それぞれ His と Gly に置換されていた（Fig. 1 の緑の網掛け）．Tyr75 及び Glu241の側鎖は，いずれも基質アルギニンと直接水素結合して基質結合構造を安定化させており，これらの残基はほとんどの AK
酵素において保存されている．このユニークな２箇所の置換（Y75H，E241G）は，後述するように刺胞動物 Nematostellaや軟体動物 Clione の AK においても見出されている．
一方，ATP（ADP）の結合に関わる 5 箇所のアルギニン残基は，AK1，AK2 の全ての配列で保存されていた（Fig. 1 の薄い青の菱形）．また，グアニジノ基質の識別に関わる残基（Fig.１の 96 位の緑の五角形）も，一般的な AK 配列のアミノ酸 Tyr で保存されていた．
基質結合時の安定化に必要なイオンペアは，
AK1 においては一般的な AK で見られる Asp69Arg209 であったが，AK2 においては少数の AK で見られる Asp69-Lys209 型であった（Fig. 1 の黒の三角形）．
AK1 および AK2 のアミノ酸配列に基づき，日本産三種類の宝石サンゴの分岐年代を，MEGAX 中の UPGMA 法によって推定した（Fig.２）．澄江（チェンジャン）動物群の発見に基づき刺胞動物と環形動物の分岐を５億 2500 万年前と仮定すると [28]，AK1 のアミノ酸配列からは，アカサンゴは 510 万年前にシロサンゴとモモイロサンゴのグループと分岐したと推定された．シロサンゴとモモイロサンゴの分岐は 340 万年前と計算された．一方，AK2 からは，それぞれ 990 万年前，330 万年前と計算された．AK1 と AK2 では，見かけ上，分子進化速度におよそ２倍の違いが見られるが，これは今回の推定が少数のアミノ酸置換数から導出されたための誤差か，或いは，AK1 と AK2 がオーソログ遺伝子ではないことに由来するものと思われる．アミノ酸配列の代わりに塩基配列を用いると配列間の見かけの置換数は増えるものの，刺胞動物と環形動物の５億 2500 万年前の分岐年代をもとに近縁な宝石サンゴの分岐年代を推定する際には，より大きな誤差を生じる可能性が高い．

3-2 アカサンゴ AK1 と AK2 の酵素活性

今回の研究では，AK1，AK2 で，それぞれ，1.15 mg/ml，0.36 mg/ml の濃度のリコンビナント酵素を精製することができた．この濃度は，酵素活性を測定するには十分である．また，SDS-PAGE の結果は，酵素が十分に精製されていることを示していた．

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    _     _     _     _     _     _     _     _     _     _     _     _$.&RUDOOLXPMDSRQLFXP UHG ( ' 4 / 5 , , 6 04 1 * $ ' , * $ 9 ) ( 5 / 6 5 $ $ 1 + , ( 6 9 $ .         ) 6 + ' ( + / * < , 7 6 & 3 6 1 / *$.3OHXURFRUDOOLXPHODWLXV SLQN  ( ' 4 / 5 , , 6 0 4 1 * $ ' , * $ 9 ) ( 5 / 6 5 $ $ 1 + , ( 6 9 $ .         ) 6 + ' ( + / * < , 7 6 & 3 6 1 / *$.3OHXURFRUDOOLXPNRQRMRL ZKLWH  ( ' 4 / 5 , , 6 0 4 1 * $ ' , * $ 9 ) ( 5 / 6 5 $ $ 1 + , ( 6 9 $ .         ) 6 + ' ( + / * < , 7 6 & 3 6 1 / *$.&RUDOOLXPMDSRQLFXP UHG * ' + / 5 , , 6 0 5 0 * $ ' 9 . * 9 ) ( / / 6 . * $ . 9 , ( ' * 9 . . $ 7 * . . ( $ ) 00 + 3 . ) * $ , 7 & & 3 6 1 / *$.3OHXURFRUDOOLXPHODWLXV SLQN  * ' + / 5 , , 6 0 5 0 * $ ' 9 . * 9 ) ( / / 6 5 * $ . 9 , ( ' * 9 . . $ 7 * . . ( $ ) 00 + 3 . ) * $ , 7 & & 3 6 1 / *$.3OHXURFRUDOOLXPNRQRMRL ZKLWH * ' + / 5 , , 6 0 5 0 * $ ' 9 . * 9 ) ( / / 6 5 * $ . 9 , ( ' * 9 . . $ 7 * . . ( $ ) 00 + 3 . ) * $ , 7 & & 3 6 1 / *



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









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7$/ 5$ 6 9+ , ./ 3 ./ 6 $5.   '( ) 4$ , $'. ) <94 , 5* , +*( + 6 ( 6 9**9<' , 6 1.55 /*5 6
7$ / 5$ 6 9+ , . / 3 . / 6 $5.   '( ) 4$ 7$'. ) <94 , 5* , +*( + 6 ( 6 9**9<' , 6 1.55 / *5 6
7$ / 5$ 6 9+ , . / 3 . / 6 $5.   '( ) 4$ , $'. ) <94 , 5* , +*( + 6 ( 6 9**9<' , 6 1.55 / *5 6
7 * 0 5 * 6 9 + , . , 3 . / , . $:* ) . . , ' ( ( & 5 . 5 4 & 4 $ 5 * 6 6 * ( + 6 ( 9 9 ' 5 9 *  , 6 1:5 5 , * / $7 * 0 5 * 6 9 + , . , 3 . / , . $:* ) . . , ' ( ( & 5 . 5 4 & 4 $ 5 * 6 6 * ( + 6 ( 9 9 ' 5 9 *  , 6 1:5 5 , * / $7 *0 5 * 6 9 + , . , 3 . / , . $:* ) . . , ' ( ( & 5 . 5 4 & 4 $ 5 * 6 6 * ( + 6 ( 9 9 ' 5 9 *  , 6 1:5 5 , * / $


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


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
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






Amino acid sequence alignment of AK1 and AK2 from three Japanese precious corals．

The AK1

sequence is shaded in pink and the AK2 is in light blue. Amino acids conserved in each of the AK1 or AK2 sequences
are boxed. The crystal structure of Limulus AK suggested involvements of seven amino acids in arginine binding (redcircles), of five amino acids in ATP binding (light blue diamonds), of ion pairs required for stabilization in substratebounded structure (black triangles) and of a residue involved in guanidino substrate recognition (green pentagon).
Two unique amino acid mutations at positions 75 and 241 of AK2 are shaded in green.

55 種のグアニジノ基質（L-アルギニン，D-アルギニン，クレアチン，グリコシアミン，タウロシアミン）を使用し，25 ℃
における活性を確認しところ，アカサンゴ AK1 は L-アルギニンに対してのみ，252

0.42 [µmoles/min*mg protein]の強い酵素活性を示した。
一方，アカサンゴ AK2 は，15 ℃及び 25 ℃において，上記５種類のグアニジノ基質に対する活性を示さなかった．前
述したように，AK2 は 7 残基の基質結合部位のうちの２箇所にユニークな変異があり（Y75H 及び E241G），これが AK
活性を示さない主たる理由と推定される．ところで，アカサンゴと同じ刺胞動物に属する Nematostella においても，同様のユニークなアミノ酸置換（Y75H 及び E241G）を持つ AK 酵素が発現している．この酵素には微弱な AK 活性が残存しているが [29]，241 位の Gly を正常型の Glu に変異させても（G241E）その活性が増強されることはなく，むしろ活性は約 50％減少している（未発表データ）．
現在，我々は軟体動物クリオネ: Clione limacina の AK について研究を進めている．クリオネは氷温中で生活し，２種類の AK，AK1 と AK2 を発現している．そして，その AK1 はアカサンゴの AK1 と同様に，L-アルギニンについて強い活性を示し，一方，AK2 については既存のグアニジノ基質に対して活性を持たない可能性が示唆されている．加えて，ク
リオネ AK2 のアミノ酸配列は，前述した AK の基質結合部位で保存性の特に高い Tyr75 及び Glu241（Fig.１）が，アカ
サンゴ AK2 と同様に His 及び Gly で置き換わっていた．刺胞動物であるアカサンゴと軟体動物であるクリオネは進化的に大きな隔たりがあるが，両者でこれらのユニークなアミノ酸置換が出現していることは驚きである．ここで，Nematostella の微弱な AK 活性が G241E 変異体においても増強されることはなくむしろ半減したことを考え合わせると，アカサンゴ，Nematostella 及びクリオネの AK2 は，アルギニンに対して主たる基質特異性を示す酵素ではなく，未知のグアニジノ基質に対して反応する酵素に進化している可能性が示唆される．

525 million years ago
elatius
AK1-Corallium elatius(pink)(pink)
58 AK1-Pleurocollarium

100

Cnidaria

AK1-Pleurocollarium
konojoi(white)
AK1-Corallium konojoi(white)88

AK1-Collarium japonicum(red) (red)AK1-Paracorallium
japonicum
AK-Myzostoma
AK-Myzostomacirriferum
cirriferum

Annelida

AK2-Collarium
japonicum(red) (red)AK2-Paracorallium
japonicum
AK2-Pleurocollarium
elatius
AK2-Corallium
elatius(pink)(pink)

100
91

Fig. 2

AK2-Pleurocollarium
konojoi(white)AK2-Corallium konojoi(white)Estimation of the divergence time of the three Japanese precious corals by the UPGMA method. Using99

the amino acid sequences in Fig. 1 and that of Myzostoma, a basal member of annelids [30], a phylogenetic tree was100

constructed by the UPGMA method. As an outer group, creatine kinase (CKs) sequences were used. Assuming thedivergence time between Myzostoma and the Corallium japonicum AK1 to be 525 million years ago (Mya) (branch
length in Fig.2: 0.42525), we estimated the branching time of each AK sequences from each branch lengths. The
number at the branching point is the bootstrap value. The branch length and estimated divergence time of each88

sequence are as follows: Corallium japonicum AK1 (0.00414: 510 Mya), Pleurocorallium konojoi andPleurocorallium elatius AK1 (0.00275: 340 Mya), Corallium japonicum AK2 (0.00804: 990 Mya), Pleurocorallium
100

konojoi and Pleurocorallium elatius AK2 (0.00267: 330 Mya).
100

6

0.50

0.40

0.30

0.20

0.10

0.00

0.00336

0.003400.003440.00348

1/T

Fig. 3Arrhenius plot for the AK1 reaction of Corallium japonicum. The enzyme reaction of Corallium

japonicum AK1 was measured in the presence of 4.76 mM ATP under five different temperatures of 15, 17.5, 20,
22.5 and 25° C, and the kcatARG value of each reaction was obtained. Then, the activation energy (Ea) was obtained
from the slope of the straight line.
3-3 アカサンゴ AK1 反応の活性化エネルギーと遷移状態の熱力学的パラメータ

アカサンゴ AK1 の酵素反応を，15，17.5，20，22.5，25 ℃の５種類の温度条件で測定した．反応は 4.76 mM ATP
存在下，L-アルギニンの濃度を 8 段階に変えて基質アルギニンに対する kcat ARG 及び Km ARG を求めた（Table 1）．4.76 mM
ATP の存在下で， ATP の酵素に対する飽和度は 92-93%と推定され，温度依存的に大きく変化していなかった．この数
値は，各温度における KaATP の値として Neocaridina AK2 の値 [13]を用い，以下の式を用いることで計算した．

酵素の ATP 飽和度 = [ATP]/([ATP]+KaATP)

アカサンゴの kcat ARG 及び Km ARG の値は温度の上昇とともに増加し，比較した他の AK と同様であった．一方，酵素の触
媒効率の目安となる kcat ARG/Km ARG 値は，アカサンゴ AK1 では温度の上昇とともに低下していった．この傾向は，好冷性酵素である Neocaridina AK1 のものと似ていた（Table 1 を参照）．

Table 1 Kinetic parameters of AK reaction at different temperatures
SourceReference

Corallium japonicum AK1

This work

Neocaridina denticulate AK1

Suzuki and Kanou [13](Psychrophilic)

Neocaridina denticulate AK2(Mesophilic)

Suzuki and Kanou [13]Temperaturekcat [1/s]

KmARG [mM]kcat/KmARG

1572± 0.87

0.072

±

0.008

1000

17.5

87

± 2.26

0.099

±

0.018

879

20

92

± 1.43

0.132

±

0.012

697

22.5

94

± 2.33

0.148

±

0.020

635

25

112

± 2.77

0.234

±

0.024

479

15

170

± 3.66

0.166

±

0.036

1024

17.5

183

± 6.15

0.179

±

0.060

1022

20

244

± 8.02

0.302

±

0.061

808

25

272

± 7.16

0.439

±

0.053

620
824

15

108

± 7.41

0.131

±

0.077

17.5

134

± 7.66

0.196

±

0.070

684

20

174

± 3.15

0.165

±

0.021

1055

22.5

196

± 23.28

0.290

±

0.161

676

25

217

± 12.58

0.344

±

0.084

631

7

次に，kcat ARG の値を使ってアレーニウスプロットを作成し（Fig.３），その傾きから活性化エネルギー（Ea）を求めた（Table
2）．アカサンゴ AK1 反応の活性化エネルギー（Ea = 27.5 kJ/mol）は，中温性酵素として知られる Neocaridina AK2 及びロブスターAK の値，それぞれ 50.6，54.4 kJ/mol よりも著しく低く，好冷性酵素として知られる Neocaridina AK1
や Calyptogena 2 ドメイン AK のものに近かった（それぞれ 35.8，21.2 kJ/mol）．Ea の低下は，低温環境下で効率的に酵素反応を触媒するために必要な特徴とされる[14-19]．

Table 2 Activation energy (E a) and thermodynamic parameters for the transition state of AK reactions.

Sources

Method for
determination of
kcat value

ReferenceE a (kJ/mol)

D H o ‡ (kJ/mol) D G o ‡ (kJ/mol) D S o ‡ (J/mol/K)

D (D H o ‡)p-m (kJ/mol) D (T D S o ‡)p-m (kJ/mol)Type

Collarium japonicum AK1

2

This work

27.5

25

61.3

-121.9

-23.1

-24.8

psychrophilic

Calyptogena two-domain AK

1

Suzuki et al. [12]

21.2

18.8

69.4

-170

-29.3

-39.2

psychrophilic

Neocaridina AK1

1

Kanou and Suzuki [13]

35.8

33.3

59.1

-86.6

-18.7

-18.4

psychrophilic

Neocaridina AK2

1

Kanou and Suzuki [13]

50.6

48.1

59.6

-38.6

0.0

0.0

mesophilic

Lobster AK

3

Travers et al. [11]

54.4

52

61

-25

3.9

4.1

mesophilic

1 Based on the k cat of the complete two-substrate kinetic parameters
2 Based on the observed k cat in the presence of 4.76 mM ATP
3 Based on the observed k cat in the presence of 10 mM arginine and 5 mM ATP.

アカサンゴ AK1 反応の Ea を用いて，熱力学パラメーターを算出した（ΔH o‡= 25.0 kJ/mol，ΔG o‡= 61.3 kJ/mol，

ΔS o‡= -121.9 J/mol/K）（Table 2）．これらの値を用いて，Lonhienne et al. [17]によって提案されている好冷性酵素の判別パラメータ， Δ(ΔH o‡)p-m 及び Δ(TΔS o‡)p-m を算出した．ここで，p は判定される酵素の熱力学的パラメータの値，m は中温性酵素の値を示す．これらの値が大きく負の値を取る場合は低温性酵素と判断される．アカサンゴ AK1 のそれぞれの値は，- 23.1，- 24.8 kJ/mol と計算され，この結果を中温性や好冷性酵素のものと比較すると（Table 2），
アカサンゴ AK1 は好冷性酵素であると結論される．

結論
日本産宝石サンゴ，アカサンゴ，シロサンゴ，モモイロサンゴは，２種類のアルギニンキナーゼ遺伝子（AK1, AK2）を発現している．このうち AK1 は L-アルギニンに対して強い活性を示した．AK1 反応の活性化エネルギー，及び好冷性
酵素判別パラメータ，Δ(ΔH o‡)p-m 及び Δ(TΔS o‡)p-m，は，アカサンゴ AK1 が好冷性酵素であることを強く示唆している．一方，アカサンゴ AK2 はいずれのグアニジノ基質に対しても有意な活性を示さなかった．この理由は，酵素の基質アルギニン結合部位として機能する重要度が高い 2 つのアミノ酸残基，75 位の Tyr と 241 位の Glu が，それぞれ His とGly に変異しているためと推定した．しかし，このユニークな２箇所のアミノ酸置換を持つ AK が，刺胞動物 Nematostellaや軟体動物 Clione の AK においても見いだされたことから，これらが未知のグアニジノ基質に対して活性を示す可能性を指摘した．AK1 および AK2 のアミノ酸配列に基づき，日本産三種類の宝石サンゴの分岐年代を UPGMA 法によって推定した．刺胞動物と環形動物の分岐を５億 2500 万年前と仮定し，アミノ酸配列からは，アカサンゴは 510-990 万年前にシロサンゴ，モモイロサンゴのグループから分岐したと推定された．シロサンゴとモモイロサンゴの分岐は 330-340 万年前と計算された．

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10