【 優 秀 賞 】 第20 回 日本水大賞
守れ！ ふるさとのカスミサンショウウオ〜GISと環境DNAを用いた新規生息地の発見〜
岐阜県立岐阜高等学校自然科学部生物班
第1章

序論（Introduction）

里山里海域では人口の減少や耕作放棄地の増加、外来種の侵入や生物多様性の喪失が深刻な問題となっている。減少する生物多様性を保全するためには、より簡便で迅速な絶滅危惧種などの生息地の把握が求められる。本研究では、水域における新しい生物モニタリング手法として、近年注目されている環境DNAとGISを併用する調査方法を開発し、迅速且つ効率的に希少生物の新図1

規生息地を発見し、保護活動につなげていくことを目指GISした。また、博物館標本の調査や古い地形図などの情報テムである（図1）。本研究では、既知生息地3ヶ所（岐を利用し、GISを用いて、生息地の環境推移を解析した。

阜市、揖斐川町、海津市）の環境をGISソフト（QGIS

カスミサンショウウオ（Hynobius nebulosus ）は、

2.14）上で解析し、その分析結果を基に設定した岐阜

西日本の代表的な小型の止水産卵性サンショウウオで県生息地条件を満たす地域を検索することで新規生ある。繁殖期には、夜間に1対の卵嚢を水中の木の枝、息地を発見することを目指した。以下、手順を示す。

落ち葉などに産み付ける。卵から幼生の時期には水中で① 環 境 省 生 物 多 様 性 セ ンター の 岐 阜 県 植 生 図

生活し、変態上陸後は陸上で生活する。そのため、水域（vg _21a）の5つの植生（「水田」「、水田雑草群落」、と陸域に加えて、それらを繋ぐ水辺エコトーン（水陸移「休耕田」「、休耕田雑草群落」「、竹林」）を岐阜県の行帯）の全てが整った環境が必要な種である。非繁殖

地図上にGISを利用して出力した。

期は主に丘陵地や平野部を中心とした水田地帯などに② 生息地点の座標データを入力したExcelファイルを生息しており、夜行性のため日中は落ち葉やがれきの下、作成し、GIS上に表示、座標点を中心とした半径約腐葉土の中に潜んで生活しているので人目に触れる機500mの円を発生させた。

会は少なく、広範囲の捜索は多大な時間と労力を要す。
カスミサンショウウオの岐阜県内での生息は、
高木ら③ 作成した円内の5つの植生面積の割合を算出した（以下、植生割合）（図2）。

（1991）が報告し、分布域は岐阜県以西と広く認識されるようになった。岐阜県版レッドデータブックでは絶滅危惧Ⅰ類に指定されており、県内の生息地は2ヶ所のみであったが、専門家による30年間の調査の結果、2016年3月に3ヶ所目の生息地が発見された。このことにより、岐阜県内にはまだ知られていない潜在生息地がある可能性が示された。

第2章

研究材料と研究方法（Materials and Methods）（1）GIS
GISとは、地理情報を重ね合わせて分析できるシス濃色部：5つの植生
図2

網掛部：切り抜いた植生GISを用いた植生割合の算出④ 生 息地周辺の地形の様子を調査するため、同様に国土数値情報の標高傾斜度5次メッシュデータを出力した。

85

⑤ ② の円でメッシュを切り抜き、平均標高、平均傾斜補地（岐阜市3地点、関市1地点）で環境水及び堆積物度、平均傾斜方向を算出した。の環境DNA調査を行った。

先行研究（高橋ら、2014）から、岐阜県のカスミサン（3）標本の調査と地形図のGIS解析

ショウウオは鈴鹿山脈を南に迂回し、濃尾平野南西部過去の生息地で絶滅した理由を調べるため、岐阜県から分布を拡大したと考えられる。また、岐阜市、揖斐博物館の協力のもと、岐阜県内で捕獲されたカスミサ川町の両生息地は濃尾平野の外縁地域に存在していンショウウオの標本を捜索し、過去に生息していた地る。そこで、今回は岐阜県西部の濃尾平野外縁地域12点の特定を試みた。さらに、標本の産地と、1984年ま市町の地図上に半径約500mの円を規則的に発生さで生息が確認されていた海津市羽沢（以下、絶滅生息せ、岐阜県生 息 地 条件に該当する場所を植 生割合地）の生息当時と現在の地形図等を岐阜県図書館で捜±5％、±2％で検索した。さらに、地形条件として平均索した。その後、地形図をスキャニングし、専用のプラ標高、平均傾斜度、平均傾斜方向を追加検索して生息グイン（Georeferencer）を利用して地形図の画像デー候補地を特定した。

タに座標情報（GCP：Ground Control Point）を付（2）環境DNA与し、GISソフトで対象区画上に地物を作成後、本文中GISで絞り込んだ地点で採水し、環境DNA解析の第2章（1）①〜③と同様の方法で植生割合を求め、生結果を基に個体調査を展開することが新規生息地の息していたと考えられる年代と現在の植生割合（水田、迅速且つ効率的な発見につながると考えた。始めに岐竹林）を比較した。

阜市生息地で採水した水1Lを専用のガラスフィルター（4）系統解析で濾過し、Hynobius 属のmtDNA上の12S rRNAに2016年に発見された海津市の生息地、及び新規生共通のユニバーサルプライマー（富田、2016）を用い息地の個体のハプロタイプ解析を行い、岐阜県のカスてPCRを行い、電気泳動解析にてカスミサンショウウ

ミサンショウウオの遺伝的多様性を検証した。なお、成オの環境DNAが検出可能かどうかを検討した。なお、体、幼生の脱皮殻からDNAを抽出し、高橋ら（2014）検出は2系列で行った。ポジティブコントロール（PC）

が開発したカスミサンショウウオcy tbの特異的なプラとしてアクア・トトぎふのカスミサンショウウオの飼育イマー（CBL656、CBH1070、CBH759、CBL181）

水を、ネガティブコントロール（NC）として蒸留水を、を用いてPCRし、ダイターミネーター法で塩基配列の環境水と同じ手順で処理し、コンタミネーションが起特定を行った。また、上記にて配列解析を行った岐阜

こっていないことを確認する方法（高原ら、2016）を県内の2地点のカスミサンショウウオの塩基配列情報とった。生息が確認されている岐阜市生息地内の3地を加えて、MEGA6を用いてNJ法により分子系統樹を点と岐阜市有地（高橋ら、2014）内の2地点で2016年作成し、高橋らの考察を検証した。なお、系統解析に1月中旬から約1週間おきに採水し、環境DNAによる調は、岐阜高校にて解析した岐阜県4地点（岐阜市3個査の適正時期の特定を行った。さらに、調査地域には体、揖斐川町2個体、海津市2地点1個体ずつ）、三重県

Hynobius 属のサンショウウオが3種（カスミサンショ

2地 点（ 松 阪 市2個 体、津 市2個 体 ）、DDBJ（DNAウウオ、ヒダサンショウウオ（Hynobius kimurae ）、Data Bank of Japan）上の三重県1地点（津市1個コガタブチサンショウウオ（Hynobius yatsui ））生息体）、滋賀県2地点（彦根市1個体、甲賀市2個体）、東している可能性がある。これら3種のサンショウウオの山動植物園より提供して頂いた愛知県4地点（名古屋

脱皮殻からDNAを抽出し、12S rRNAとcytbの2座位

市3地点1個体ずつ、豊田市1個体）、長浜バイオ大学よについてPCR-R FLP法による簡便な種判別法を検討り提供して頂いた滋賀県2地点（米原市1個体、長浜市した。なお、cytbはカスミサンショウウオに特異的に開1個体）の塩基配列を利用した。

発されたプライマー（CBL181、CBH759

高橋ら、2014）を用いた。
海津市候補地の約500m円内の1地点で2016年10月に堆積物、2017年2月に環境水及び堆積物の環境

第3章 成 果・考察（Results and Discussion）（1）GIS

DNA調査を行い、2017年2、3月に生態調査を行った。

GISを用いた既知生息地3ヶ所（岐阜市、揖斐川町、2017年8月にGISで絞り込んだ残りの4ヶ所の生息候

海津市）周辺の環境解析の結果（表1）、植生割合は岐86阜市生息地と揖斐川町生息地では約27％、海津市生（2）環境DNA息地では約12％、標高は約40〜100m、傾斜度は約9

環境DNAについては、PC、岐阜市生息地の環境水〜11°、傾斜方向は南東方向であると算出された。植生ともに約300bpのDNAバンドを確認し、NCからはバ割合に2種類の傾向が見られたため、岐阜県生息地条ンドが検出されなかった（図4）。配列解析の結果、こ件を地域ごとに設定し、植生割合については岐阜市、れらのバンドはカスミサンショウウオの12S rR NA

揖斐川町を含む岐阜県西部地域では27.1±5％、海津（290bp）であった。

市を含む岐阜県南西部地域では11.9±5％とし、生息表2は採水した日付ごとに環境DNA中の12S rRNA候補地を検索した。検索の結果、340ヶ所生息候補地の電気泳動解析のバンドの濃淡を示している。6月17が得られた。さらに詳しく候補地を絞るため、植生割合

日は各地点で濃いバンドが検出されているが、これはを岐阜県西部地域では27.1±2％、岐阜県南西部地域

数日前の放流会（高橋ら、2014）により個体数が増加

では11.9±2％と設定した。地形条件については全てのしたためである。どの場所でも濃いバンドが検出された地域で標高100m以下、傾斜度7〜13°、傾斜方向は南3月上旬〜下旬が調査の最適期であることが判明した。

東と設定した。GIS解析の結果、生息候補地を岐阜市

各遺伝子の制限酵素地図から12S rR NAについてで3ヶ所、関市で1ヶ所、海津市で1ヶ所特定した（図3）。

はScaⅠ、cytbについてはMspⅠで種判別が可能であると特定した（図5）。PCR-R FLP解析の結果、ScaⅠ

表1で 処 理した12S rR NAは、カスミサン ショウウオ

既知生息地3ヶ所の解析結果

植生割合（％） 標高（m） 傾斜度（°） 傾斜方向
岐阜市

27.27

55.88

9.79

南東

揖斐川町

27.00

98.96

11.00

南東

海津市

11.90

41.68

9.30

南東

（290bp）では211bpと79bp、ヒダ サン ショウウオ（290bp）では212bpと78bpのバンドが確認され（図6）、MspⅠで処理したcy tbはカスミサンショウウオ（615bp）で450bpと165bpのバンドが見られた（図7）。これらの結果の組み合わせを利用して、本研究で検出したHynobius 属の環境DNAのバンドはカスミサンショウウオに由来するものであることが特定できた。
2016年10月、GISで特定した5ヶ所の候補地の1つである海津市候補地内で、堆積物を採取し、環境DNAの検出を試みた。その結果、岐阜市生息地と同様に約300bpのDNAバンドを確認した（図8）。環境水中より

白円：生息候補地 その他の円：植生割合を満たす円■：岐阜県西部地域 ■：岐阜県南西部地域
図3

岐阜県生息候補地

図4

も堆積物中の環境DNAは長期間にわたって検出できるといわれている（山中ら、2016）。2017年2月、同地

電気泳動像（岐阜市生息地）
表2

調査適正時期の解析

87

図9
図5

新規生息地

制限酵素切断地図

左：未処理

右：処理済

図6 Sca Ⅰ処理結果（12S rRNA）
図10

発見された卵嚢した地点と同じ地点に上陸前幼生を151匹放流した。
2017年8月に採取した環境水では岐阜市1地点、関市1地点で約300bpのDNAバンドを検出した（図11）
。
左：未処理

右：処理済

解析を2系統で行った

図7 Msp Ⅰ処理結果（cytb）（3）標本の調査と地形図のGIS解析
岐阜県博物館で標本調査を行った結果、1977年に各務原市、1988年に揖斐郡谷汲村（現揖斐川町）で捕獲された標本を発見した（図12、13）。
岐阜県図書館では各務原市、揖斐郡谷汲村、及び絶図8

電気泳動像（海津市候補地）

滅生息地（海津市羽沢）周辺の地形図などを捜索し、1909〜2016年の地形図、土地利用図を合計50枚発見した。このうち、標本捕獲の正確な場所が判明して点で調査を行い、採水した環境水より環境DNAの検出いる揖斐川町の標本産地と、絶滅生息地について、を試みたところ、約300bpのバンドが検出された（図はGISを用いた地形図の植生割合の比較を行った。標本未掲載）。これらの結果は、候補地にカスミサンショウ

産地では1983年と2016年、絶滅生息地では1977年ウオが生息する確かな証拠である。2017年3月、2月にと2016年の地形図（図14上）を用いて解析を行った

採水し環境DNAを検出した地点で個体調査を行った（標本が発見される以前の年代と最新のもの）。解析のところ、カスミサンショウウオの卵嚢1対を発見した（図結果、植生割合は標本産地では33.86％（1983年）か9、10）。図13中の点線部は卵嚢を示す。発見した卵嚢

ら26.04％（2016年）（揖斐川町の図は未掲載）、絶滅は、岐阜高校で継続して11年間行われている保護活動

生息地では16.80％（1977年）から8.04％（2016年）（高橋ら、2014）の一環として2017年6月23日に、保護に減少していた。また、同時期の航空写真（図14下）を88

図11

図12

各務原市標本図13

揖斐川町標本

電気泳動像（岐阜市候補地3地点、関市候補地1地点）

比較すると両地域とも水田が埋め立てられていることが分かった。今回の解析結果より、生息地周辺の水田は宅地化が進み、水路はU字溝になり、道路が舗装さ

左上：1977年の地形図
右上：2016年の地形図
左下：1964年の航空写真
右下：2009年の航空写真
円：絶滅生息地を中心とした半径約500mの検索対象
図14

海津市絶滅生息地周辺の地形図と航空写真れたことなどにより土壌中の含水量が低下し、湿地全第4章

体が乾燥したことが絶滅の原因だと考えられる。

本研究ではGISの候補地の絞り込みと環境DNA調（4）系統解析

結論（Conclusions）

査を併用した世界初の手法で、希少種であるカスミサン

配列解析の結果、2016年に発見された海津市のカショウウオの新規生息地をごく短期間で発見した。本

スミサンショウウオは岐阜市、揖斐川町とは異なるハプ手法は従来の生態調査の経済的、物理的な問題点へロタイプであることが分かった。また、解析した13個体の対処を備える革新的なものである。また、水環境に関は全て同じハプロタイプであった。さらに、今回発見し係する多くの生物に応用可能であり、幅広く活用ができた新規生息地のカスミサンショウウオを配列解析したると考えている。この成果は希少種の保護を志す人々に結果、2016年に発見された海津市生息地の個体と同大きな希望を与えるものとなった。しかし、新規生息地じ配列であった。両地点は直線距離で約4km離れていには卵嚢が1対しかなく、早急な保護活動の展開の必ることから、元々は同じ個体群であったものが生息域要性を感じた。また、山際にある産卵場の水路は、清掃の減少に伴い個体数を減らし、生息地が分断されたと活動の影響により、放流時には水たまりが消滅してい考えられる。本研究により、海津市個体群の遺伝的多た。そのため、今後、産卵場の整備だけではなく、非繁様性の低さが明らかとなった。

殖期に生息している森林や竹林とそれらをつなぐ水辺

海津市個体群の塩基配列を加えて東海地方のカスミエコトーンなど周辺環境の保全にも着手し、海津市やサンショウウオのcy tb（909bp）の系統樹を作成した

周辺住民の方々へ啓発活動を行い、地域一体型の保護結果（図15）、海津市個体群のハプロタイプは岐阜市や活動を進めていきたい。さらに、本研究の環境DNA調揖斐川町個体群と近縁だとわかった。逆に彦根市や米査は、岐阜市と関市にも潜在生息地が存在している可原市個体群とは遺伝的に離れていることから、海津市個能性を示した。また、標本調査から、岐阜県内にはかつ体群は三重県方面から侵入したと考えられる。この結て多くの場所でカスミサンショウウオが生息していた可果は、高橋ら（2014）の考察を確証に導くものとなった。

能性が示された。様々な人為的な影響により、生息に89

図15

分子系統樹

必要な水域、水辺エコトーン、陸域の荒廃や分断が起

2）環 境省生物多様性センター

こり、今日のような状況になってしまったと考えられる。

go.jp/webgis/sc-023.html

人知れず生息している希少生物を発見し、共生を図る

3）国 土 交 通 省 国 土 数 値 情 報http://gis.biodic.
http://nlftp.mlit.

ことが生物多様性の維持と保全につながると考える。

go.jp/ksj/gml/datalist/KsjTmplt-G04-d.html

また、本研究では、標本や地形図を用いて、過去と現4）高橋晃太郎ら（2014）守れ！ふるさとのカスミサン

在の生息地周辺の環境の変化とカスミサンショウウオ

ショウウオ 〜保護活動と遺伝的多様性の解析〜、との関わりについて考察した。自然史標本は再現する

2014日 本 ストックホ ルム青 少 年 水 大 賞【 優 秀ことのない、ある時点での自然現象を記録した‘もの’

賞】:102-108であって、新たな発見が見込まれる情報の塊である（斎5）富田勢（2016）環境DNA分析手法を用いたサンショ

藤、2013）。歴史的価値のある標本、生物の存在を示

ウウオ属の検出法の開発、神戸大学人間環境学科

す標本が多く眠っている可能性が本研究により示唆さ自然環境論コース卒業論文れた。また、GISを用いた地形図の解析より、過去の地

6）高原輝彦ら（2016）環境DNA分析の手法開発の現形図は植生の変遷を知るうえで価値があることが示さ状〜淡水域の研究事例を中心にして〜、日本生態学れた。今後、幅広い年代の地形図を用いて、カスミサン

会誌66（3）:583-599

ショウウオの生息環境の遷移をたどりたい。気象、人7）須 貝俊彦（2012）養老断層の断層活動に伴う断層間活動といった異なる要因をGISで総合的に解析する

崖麓扇状地の形成、2012年秋期学術大会日本地

ことで、カスミサンショウウオの個体群縮小や絶滅へ

理学会発表要旨集の原因を追究していきたい。今後、調査対象を拡大し、岐阜県内の希少生物の保護に役立て、地域の生物多様性の保全に貢献していきたい。

第5章

参考文献（References）

1）高木雅紀ら（1991）岐阜県止水性サンショウウオについて、爬虫両棲類学雑誌14（2）:91

908）山中裕樹ら（2016）環境DNA分析の野外調査への展開、66（3）:601-611
9）斎藤靖二（2013）自然史標本の意義について、日本古生物学会誌 化石93:131-135

岐阜県立岐阜高等学校自然科学部生物班