Scientific and Educational Reports of the Facultyof Science and Technology, Kochi University
Vol. 3 (2020), No. 1

疫病菌 Phytophthora infestans の２種類のタウロシアミンキナーゼの酵素特性
鳥海秀人・鈴木知彦〒780-8520 高知市曙町 2­5̶1
高知大学理工学部比較生化学研究室
Enzymatic properties of two taurocyamine kinases from Phytophthora infestans
Hideto Torinoumi and Tomohiko Suzuki

Laboratory of Comparative Biochemistry, Faculty of Science and Technology, Kochi
University, Kochi 780-8520 Japan
Key Words ; guanidino kinase, phosphagen kinase, Phytophthora infestans, two-domain enzyme, taurocyamine kinase, cooperativity.
要旨
フォスファゲンキナーゼ（PK）は，ATP のリン酸基をグアニジノ化合物に転移し，高エネルギー化合物のフォスファゲンを合成する反応を可逆的に触媒する酵素群の総称であり，エネルギー代謝において重要な役割を果たしている．タウロシアミンキナーゼ（TK）もその一つであり，環形動物，扁形動物，そして単細胞生物などのそれぞれ一部に分布している．
単細胞生物である疫病菌 Phytophthora infestans（以下，P.infestans）はトマトやジャガイモ等に寄生し，農作物大きな被害を及ぼす．P.infestans には，2 種類の PK（1 ドメイン型及び 2 ドメイン型酵素）が存在しており，両者ともタウロシアミンに対して基質特異性を示すことが示された（それぞれ TK1 および TK2）
．疫病菌が感染する植物細胞は TK を発現していないことから， TK 酵素の機能解明とその阻害剤の開発は，新たな疫病菌対策に繋がる可能性がある．
本研究では先ず P.infestans TK1 及び TK2 それぞれに対して詳細な活性測定を行い，完全な酵素パラメータ
Tau

Tau

（４種類の解離定数：Ka , Kia , Ka

ATP

, Kia

ンに対する親和性を表すパラメータ Ka

Tau

ATP

，及び触媒定数 kcat）を決定した．その結果，酵素とタウロシアミ

は TK1 で 0.34 mM ，TK2 で 0.77 mM となり，TK1 の基質親和性が TK2 より２倍高かった．一方，ATP に対する親和性 Ka-１ATPはそれぞれ 0.55 mM，0.85 mM であった．また-１

両者の触媒定数（kcat）は TK1 で 98 s ，TK2 で 189 s であり，TK２が活性ドメインを二つ含むことを考慮すれば，ドメインあたりの触媒定数はほぼ同等であることが分かる．また両者の触媒効率（kcat/Ka
-2

-１

-2

ATP

Tau

/Kia ）は-１

TK1 で 117 mM ・s ，TK2 で 100 mM ・s と計算され，ドメインあたりの触媒効率では TK1 が２倍以上優る．
次に，P.infestans ２ドメイン型 TK2 のドメイン 1（TK2-D1）とドメイン 2（TK2-D2）を切り離し，それぞれのリコンビナント酵素を作成したが，ドメイン１は発現量が極めて低く酵素活性の測定には至らなかった．一方，ドメイン２では，KaTauが 1.01 mM ，Ka

Received: March 13, 2020
Reviewed by anonymous referee(s), and accepted: March 17, 2020
Published: April 9, 2020

ATPが 4.46 mM と決定され，この値を２ドメイン型酵素 TK2

1

と比較すると特に ATP に対する親和性が５倍低下していた．また，TK2-D2 の触媒定数と触媒効率はそれぞれ
-１

-2

-１

5.1 s 及び 2.5 mM ・s であり， TK2 のそれぞれ 37 分の１及び 40 分の 1 に低下していた．このことから，両ドメイン間に相互作用が存在し，それが触媒効率を高めている，すなわち２ドメイン型 TK に協同性が存在する可能性が示唆される．また，単離された TK2-D2 酵素は安定性が低く，4℃で保存しても 12 時間後にはその活性が 69％に低下しており，ドメイン２単独では構造的に不安定であることが予想される．
これまでに報告されている様々な２ドメイン型 PK 酵素，及び単離されたドメインの触媒定数から総合的に判断すると，ヨロイイソギンチャク Anthopleura japonica の２ドメイン型 AK においてのみ，ドメイン間に明白
その構造基盤としては，な相互作用が存在し，その結果 kcat を増大させる強い協同性が生じていると結論される．
両ドメインの接触部位に存在する Arg122（ドメイン１）と Asp408（ドメイン２）間のイオン結合が関与している可能性がある．

Abstract

Phosphagen kinases are enzymes that catalyze the reversible transfer of the gamma phosphoryl
group of ATP to naturally occurring guanidino compounds, yielding ADP and a phosphorylated
guanidine referred to as a phosphagen. The PK reaction has a key role in temporal and spatial ATP
buffering systems in cells to maintain effective energy flow. Taurocyanine kinase (TK) is one of thePKs, and is distributed in some species of annelids, flatworms, and unicellular organisms.

Phytophthora infestans (hereinafter referred to as P. infestans), a unicellular organism, infests
tomatoes and potatoes and causes great damage to crops. P. infestans contains two types of PKs(one-domain and two-domain enzymes: TK1 and TK2, respectively), both of which show substratespecificity for taurocyanine. Since plant cells do not express TK usually, elucidation of the functionof the TK enzyme and development of its inhibitors may lead to new measures against the disease.
In this study, we first measured the enzyme activity of P. infestans TK1 and TK2, and determined
Tau

Tau

the complete parameters (four dissociation constants: Ka , Kia , Ka

ATP

, Kia

ATP

, and the catalytic constantTaukcat). The Ka , showing the affinity for the enzyme and taurocyamine in the presence of ATP, was0.34 mM for TK1 and 0.77 mM for TK2. On the other hand, the Ka

ATP, was 0.55 mM and 0.85 mM,-1-1

respectively. The catalytic constants (kcat) were calculated to be 98 s for TK1 and 189 s for TK2.
Considering that TK2 contains two active domains, the catalytic constants per domain are almost thesame. In addition, the catalytic efficiency (kcat/Ka
100 mM

-2

-1

· s

ATP

Tau

-2

-1

/Kia ) is estimated to be 117 mM · s for TK1 andfor TK2, suggesting that the catalytic efficiency of the former (per domain) is

approximateky twice that of TK2.
Next, domain 1 and 2 of P. infestans 2-domain enzyme, TK2-D1 and TK2-D2, respectively, wereseparated and the recombinant enzymes were expressed. The expression level of TK2-D1 wasextremely low and the enzyme activity was not measured. On the other hand, the Ka

Tau

and KaATPof

TK2-D2 was determined to be 1.01 mM and 4.46 mM, respectively. Compared with the native twodomain TK2, the affinity for ATP was reduced by 5 times. The catalytic constant and catalytic

2efficiency of TK2-D2 were remarkably reduced: 5.1 s-1 and 2.5 mM-2 · s-1, respectively, which were
1/37 and 1/40 that of two-domain TK2, respectively. This suggests that there exists cooperativity,
which enhances the catalytic efficiency, between the two domains. Moreover, the isolated TK2-D2
was structurally unstable, and its activity was decreased largely after 12 hours storage at 4 C.
Comparison of the catalytic constants from the various two-domain PK enzymes suggested that a
clear cooperativity between the domains was found only in the two-domain AK of the sea anemone

Anthopleura japonica. In this case, one of the key residues responsible for the cooperativity might
be the ionic bond between Arg122 (domain 1) and Asp408 (domain 2).

序論
フォスファゲンキナーゼ（PK）は，ATP のリン酸基をグアニジノ化合物に転移し，高エネルギー化合物のフォスファゲンを合成する反応を可逆的に触媒する酵素群の総称であり，特に ATP の需要が高い細胞のエネルギ
ー代謝において重要な働きをしている（Morrison, 1973 ; Ellington, 2001）．PK は，使用する基質の違いにより，アルギニンキナーゼ（AK），クレアチンキナーゼ，ロンブリシンキナーゼ，タウロシアミンキナーゼ（TK），
グリコシアミンキナーゼ，ハイポタウロシアミンキナーゼ，サラセミンキナーゼ，オフェリンキナーゼ等に分類される（van Thoai, 1968; Watts,1971; Suzuki et al., 1997b; Ellington & Suzuki，2006）．
単細胞生物である疫病菌 Phytophthora infestans （以下，P. infestans）には２種類のタウロシアミンキナーゼ（分子量 40 kDa のペプチド鎖からなる通常型 TK1 と，その倍の分子量 80 kDa を持つ 2 ドメイン型 TK2）が存在する
（Uda et al., 2013）．
これらの TK のグアニジノ基質の認識に関わる GS 領域のアミノ酸配列（Suzuki
et al., 1997b）は，環形動物の TK のものとは大きく異なっており（Uda et al.,2013；Tanaka et al., 2011），
両酵素はタウロシアミンに対する基質特異性を独立に獲得したことが分子系統樹の解析から分かっている．
疫病菌 P. infestans は人間の生活に身近なトマトやジャガイモ等の農作物に寄生し大きな被害を及ぼすことから，その対策は喫緊の課題とされている．疫病菌が感染する植物は TK を発現していないことから， 疫病菌の TK 酵素の機能解明とその阻害剤の開発は，新たな疫病菌対策に繋がる可能性が高い．
本研究では，P. infestans TK1，TK2 の詳細な酵素活性測定を行い，完全な酵素活性パラメーターを決定した．次に，２ドメイン型 TK2 のドメイン間相互作用や酵素機能の協同性を調べる目的から，二つのドメインを分離して，それぞれの遺伝子を発現用ベクターに組み込んだ．ドメイン１については発現が極めて弱く酵素パラ
メータの決定には至らなかったが，ドメイン２については決定することができた．また，これまでの２ドメイン型 PK 酵素のデータを総括し，その協同性発現に必要な分子的基盤を考察した．

材料と方法
TK1 および TK2 のクローンは，すでに発現用プラスミド pET-30b の NdeI / EcoRI サイトに組み込まれているものを用いた（Uda et al., 2013）． TK2 のドメイン１とドメイン２の分割は TK2 クローンを鋳型にPCR により行った．両ドメインとも 5ʼ側に NdeI サイトを，3ʼ側に His-tag と EcoRI サイトを付加するよう設計した．増幅には KOD+ Neo DNA Polymerase を用いた．両ドメインをクローン化した後，塩基配列にエラーが起こっていないことを確かめた．

3

これらの発現プラスミドを用いて大腸菌 BL-21 をトランスフォームし， 0.5 mM IPTG 存在下，16-25℃，
24-48 時間振盪培養してリコンビナント酵素を発現させた．発現大腸菌は超音波により細胞を破砕し，His-tagを付加したリコンビナント酵素は，Ni-NTA resin を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した（Uda et al., 2013）．酵素濃度は ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）を使い，アミノ酸組成（6 x His-tag を含む）から推定される値（280 nm の吸光度が 0.954 の時に 1 mg/ml）を用いて決定した．
PK の正反応（フォスファゲン合成方向）は，二基質高速平衡ランダムオーダー反応速度論によって説明される（Morrison and James, 1965）．TK の酵素活性測定は，25 C において，その反応にピルビン酸キナーゼ，
乳酸脱水素酵素の反応をリンクさせ，最終的に NADH が NAD+に変化する反応を 340 nm で追跡して決定した（Morrison and James, 1965）．この反応の初速度（v）は，２種類の基質濃度（ATP 及びタウロシアミン）と５種類の酵素パラメータにより以下の式で表される．

𝑣=

𝑉%&'
*&.
𝐾&)*+ ∙ 𝐾-&[𝑇𝑎𝑢][𝐴𝑇𝑃]

𝐾&)*+
𝐾&*&.
+ [𝐴𝑇𝑃]+ [𝑇𝑎𝑢]
+1

*&.
)*+
𝐾-&
/𝐾&*&. = 𝐾-&/𝐾&)*+

𝑉%&' = 𝑘:&; [𝐸= ]ここで，Ka はもう一方の基質の存在下における当該基質の解離定数，Kia はもう一方の基質の非存在下における
当該基質の解離定数，kcat は Vmax から計算される触媒定数である．また，E0 は反応に用いた酵素濃度である．二基質速度論における上記５種類のパラメータ（４種類の解離定数：KaTau, KiaTau, KaATP, KiaATP 及び kcat）を求めるた
めに，TK1 においては 64 通りの異なる基質濃度（それぞれの基質濃度で独立に３回測定：総測定点 192）
，TK2
においては 72 通りの異なる基質濃度（それぞれの基質濃度で独立に３回測定：総測定点 216）
，TK2-D2 においては 48 通りの異なる基質濃度（それぞれの基質濃度で独立に２回測定：総測定点 96）において酵素反応を測定し（Figure 1-3）
，それぞれの初速度から SigmaPlot12 または Dr. R. Viola によって書かれた Enzyme
kinetics Programs, ver.2.0 を用いて，５種類のパラメータを算出した．尚，ここで算出した kcat は，一分子あたりの触媒定数であり，一分子に活性部位が２箇所存在する２ドメイン型酵素の場合，kcat はそれぞれのドメイ
ンの値の和として見積もられる．

結果
P. infestans TK1 酵素は，大腸菌クローンを 0.5 mM IPTG 存在下，20℃ で 24 時間発現誘導をした結果，可溶性分画に大量に発現することができた．一方，P. infestans TK2 酵素は，前者に比べて発現量が少なかっ
たが，0.5 mM IPTG 存在下，25℃ で 24 時間発現誘導をすることで活性測定には十分な量のリコンビナント
酵素を得ることができた．

P. infestans TK2 のドメイン１部分（TK2-D1）は，0.5 mM IPTG 存在下，16-25℃ で 48 時間発現誘導したが，発現量が極めて少なく酵素活性の測定には至らなかった．ドメイン２部分（TK2-D2）は，0.5 mM IPTG

4

存在下，16℃ で 48 時間発現誘導し，酵素活性の測定には十分な量のリコンビナント酵素を得ることができた（Fig. 1）．

g

75 kDa,ss

50 kDa*. 37 kDa
W6M

25 kDa

M

1

2

(

3

)

4

*

5

,



(

)

*

,

P. infestans TK2 のドメイン２部分の発現と精製（SDS-PAGE）. M：マーカータンパク質，１：不溶性分画，２：
可溶性分画，３：アフィニティーカラム未吸着部分，４：50 mM イミダゾール溶出分画，５：100 mM イミダゾール溶出分
画．酵素活性測定は分画５のリコンビナント酵素を用いて行われた．
Fig.1

(

k)

アフィニティクロマトグラフィーにより精製された TK2-D2 リコンビナント酵素の活性を，グアニジノ化合
YUPMd[ Qk, Y

YUPMd[ Q

物 L-アルギニン，クレアチン，グリコシアミン，タウロシアミンを用いて決定したところ，P. infestans TK1Y

YUPMd[ Qyl

及び TK2 と同様に（Uda et al., 2013），タウロシアミンにのみ有意な活性を示した．

P. infestans TK1 及び TK2 の野生型２種類のリコンビナント酵素を用いて，詳細な酵素活性測定を行い（Fig.
2），二基質酵素反応の完全なパラメーターを決定した（Table 1）．その結果，酵素と基質タウロシアミンの親和性を表す KaTau は TK1 で 0.34 mM ，TK2 で 0.77 mM と決定され，前者の基質親和性が後者より２倍高か(-hn kった．一方，ATP に対する親和性 KaATP はそれぞれ 0.55 mM，0.85 mM であり，大きくは変わらなかった．また両者の触媒定数（kcat）は TK1 で 98 s-１ ，TK2 で 189 s-１であり，TK２が活性ドメインを二つ含むことを考慮すれば，ドメインあたりの触媒定数はほぼ同等であることが分かる．一方，両者の触媒効率（kcat/Ka
-2

-１

-2

ATP

Tau

/Kia ）-１

は TK1 で 117 mM ・s ，TK2 で 100 mM ・s と計算され，ドメインあたりの触媒効率では TK1 が２倍以上高かった．
Table 1 Kinetic parameters of TKs from P. infestans and P. sojae
SourceEnzymePhytophthora
infestans

TK1

Reference
This work

Vmax

Ka

Kia

Ka

Kia

ATP

kcat

[μmoles/min*mg ]

[mM]

Tau

[mM]

Tau

[mM]

ATP

[mM]

[1/s]

kcat/KaATP/KiaTau

Kia/Ka,[mM -2s- ]146.72 ± 5.40

0.34 ± 0.03

1.51 ± 0.31

0.55 ± 0.09

2.43 ± 0.36

97.80 ± 3.60

4.4

117

TK2

141.74 ± 4.15

0.77 ± 0.07

2.36 ± 0.33

0.85 ± 0.089

2.60 ± 0.37

188.9 ± 5.53

3

100

TK2-D2

7.61 ± 1.61

1.01 ± 0.56

0.67 ± 0.30

4.46 ± 1.49

3.00 ± 2.11

5.07 ± 1.05

0.6

2.5

141.15 ± 4.5

0.52 ± 0.03

0.1 ± 0.02

1.8 ± 0.1

0.35 ± 0.1

94.1 ± 3.0

0.2

522

*.
Phytophthora sojae

TK1

Palmer et al. (2013)

W6M
次に，TK2 のドメイン 1（TK2-D1）とドメイン 2（TK2-D2）を切り離し，それぞれのリコンビナント酵

(

)

*

,

5

8US% )*

F=j6)

E6E

B397

-

.

素を作成したが，ドメイン１は発現量が極めて低く酵素活性の測定ができなかった．一方，ドメイン２（TK2D2）では，KaTauが 1.01 mM ，Ka

ATP

が 4.46 mM と決定され，２ドメイン型 TK2 と比較するとドメイン分割

により ATP に対する親和性が５倍低下した（Table 1）．また，TK2-D2 の触媒定数と触媒効率はそれぞれ 5.1
s-１及び 2.5 mM-2・s-１であり， TK2 のそれぞれ 37 分の１及び 40 分の 1 に低下していた．さらに，ドメイン２のリコンビナント酵素は安定性が低く， 4℃で 5 時間後には活性が 87％に，10 時間後には 75％に，12 時
間後には 69％に低下した．さらに，酵素溶液の希釈によっても活性の低下が見られた．このようにドメイン２
単独では構造的に不安定であることが予想される．

考察
P. infestans TK1 と P. sojae TK1 と酵素パラメータの比較
前報において我々は P. infestans TK1 と TK2 の予備的な酵素パラメータを報告し，この酵素がタウロシアミンに対して高い基質特異性を持つことを示した（Uda et al., 2013）．また，P. infestans の細胞内に実際に基
質タウロシアミンが存在することも示した．この研究では，P. infestans TK1 と TK2 の完全な酵素パラメータを決定した（Table 1）．
一方，Palmeret al. (2013)は，近縁種 P. sojae TK1 の酵素活性パラメーターを報告している．両種の TK1
酵素のアミノ酸一致率は 94％と高く，また，既知のタウロシアミン結合部位や ATP 結合部位に関わるアミノ酸も両種で全て保存されている．Table1 に酵素パラメータの比較を示した．５種類の酵素パラメータ（４種類の解離定数：KaTau, KiaTau, KaATP, KiaATP 及び Vmax (または kcat)）のうち，KaTau, KaATP 及び Vmax（kcat）については，両者は比較的良く似た値を取っていたが，KiaTau と KiaATP については 7-23 倍の違いが見られた．
二基質反応酵素である PK においては，基質の解離定数の比 Kia/Ka が基質結合時の相乗効果の指標となることが知られている．通常この値は 1 以上であることが多いが，これは一方の基質が酵素に結合している状態では，もう一方の基質が酵素により相乗的に結合することを示している（Jacobs and Kuby, 1980）．これはまた，基質の結合時と非結合時において酵素の立体構造が変化することも示唆する．PK 酵素は N 末及び C 末の二つの内部ドメイン構造を持ち，前者は主にグアニジノ基質，後者は ATP の結合に関与している．おそらく
Kia/Ka が示す基質結合に関する相乗効果は，両内部ドメインの相互作用を表していると思われる．
今回の研究では P. infestans TK1 の Kia/Ka 値は 4.4 ，TK2 では 3.0 であった．この結果から両酵素とも基質結合に対する相乗効果は存在すると結論される．しかし，P. sojae TK1 においては，1 をかなり下回る Kia/Ka
値（0.2）が報告されており，Palmer et al.（2013）はこれが卵菌類 TK の特徴ではないかと述べている．しかし P. infestans TK1 では Kia/Ka =4.4 と決定されたことを踏まえると，両者の違いは，パラメータ算出手法の違いに由来する可能性が指摘される．すなわち，Palmer らは等温滴定熱量測定（Isothermal Titration
Calorimeter）によって，基質と酵素の結合時に発生する僅かな熱量の変化の計測から解離定数を算出しているのに対して，本研究では多くの PK 反応で用いられている手法，すなわち TK が触媒する反応によって生じるタ
ウロシアミンリン酸を NADH の減少に共役させて 340 nm で追跡する方法によって測定している．

6

Michaelis-Menten
120

A (TK1)

Rate (µmol/min/mg)

100

80

60

40

20

0
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Tau (mM)
Vmax = 146.7
Ka = 0.3434
Kb = 0.5502
alpha = 4.4


120


B = 0.1429
B = 0.2381
B = 0.4762
B = 0.9524
B = 1.4286
B = 2.8571
B = 3.3333
B = 4.7619

Michaelis-Menten

B (TK2)Rate (µmol/min/mg)

100

80

8US% ( 60 F=i

UOTMQ U

3FB

Q
y

n k

t

40

n
l




Q

4k
3FB

l

p
(

*

FMN Q%

20




0
0



1

2

3

4

Vmax = 141.7
Ka = 0.779
Kb = 0.8572
alpha = 3.


3.5


B = 0.119
B = 0.2381
B = 0.4762
B = 0.9524
B = 1.4286
B = 1.9048
B = 2.8571
B = 3.3333
B = 4.7619

Michaelis-Menten

C (TK2-D2)

3.0

Rate (µmol/min/mg)

5

Tau (mM)

2.5

8US% (/

F=j

2.0

UOTMQ U

3FB

Q

Q

4k

y

t
1.5

n k
n

l

3FB

l

p
(

*

FMN Q%

1.0

0.5

0.0
0

1

2

3

Tau (mM)

4

5

Vmax = 7.6
B = 0.4762
Fig.2 P. infestans TK1（A），TK2（B）およびTK2-D2（C）のタウロシアミンに対する酵素活性．
これらのデータをKa = 0.9987
B = 0.9524
Kb=
4.4
用い，SigmaPlot12 を使って酵素パラメータを決定した．（A）８種類のミカエリス・メンテン型グラフのATP 濃度は，上B = 1.4286
alpha = 0.6838
B = 1.9048
から，4.76，3.33，2.86，1.43，0.952，0.476，0.238，0.143 mM，（B）ATP
濃度は，上から，4.76，3.33，2.86，
B = 3.3333
B = 3.8095
1.90，1.43，0.952，0.476，0.238，0.119 mM，（C）ATP 濃度は，上から，3.81，3.33，
1.90，1.43，0.952，0.476



mM．




7

２ドメイン型 PK 酵素のドメイン間に協同性は存在するか？

通常，PK 酵素は 40kDa のサブユニットからなり，単量体または二量体を形成している．ところが，Steinet al. (1990) は，マンソン住血吸虫 Schistosoma mansoni に基質特異性が不明の 74 kDa のポリペプチド鎖をコードする PK 遺伝子が存在することを初めて示し，これが二つの活性部位を持つことを明らかにした．後にこの酵素は，タウロシアミンに対して活性を示すことが示され TK とされたが（Awama et al., 2008），S.

mansoni の生体内に実際に基質タウロシアミンが存在するかどうかは不明である．次いで，北海道教育大学のSoga and Yazawa は 1996 年の日本動物学会において，二枚貝 Pseudocardium sachalinensis の閉殻筋にポリペプチド鎖の分子量が 80 kDa のアルギニンキナーゼ（AK）が存在することを発表した．その後，この酵
素の cDNA 由来のアミノ酸配列が報告され，この酵素が通常の AK 遺伝子が重複融合し，完全な活性部位を２箇所もつ２ドメイン型 AK 酵素であることが判明した（Suzuki et al., 1998）．驚くべきことに，二枚貝においては２ドメイン型 AK が極めて広く分布していることが分かっている（Suzuki et al., 2002; Uda et al., 2008）．
一方，ヨロイイソギンチャク Anthopleura japonica においても２ドメイン型 AK 酵素が直接単離され，そのcDNA 由来のアミノ酸配列が決定された（Suzuki et al., 1997a）．吾妻のグループは，肺吸虫 Paragonimus

westermani に２ドメイン型 TK 酵素が存在することを示した（Jarilla et al., 2009）．また最近，繊毛虫
Tetrahymena pyriformis においても通常の単量体 AK（40 kDa）に加えて，２ドメイン型 AK が存在することが示された（Okazaki et al., 2015）．このように，２ドメイン型 PK 酵素は，進化の段階で独立に何度も生じており，２つのドメイン間の相互作用や酵素機能の協同性などは非常に興味ある問題を提示している．
２ドメイン型 PK 酵素のドメイン間相互作用と協同性に関する酵素反応速度論からのアプローチには三通りの手法があり，[A]それぞれのドメインを分離し野生型２ドメイン型酵素の酵素活性と比較する方法，[B]２ドメイ
ン型酵素の一方のドメインに致命的なアミノ酸変異を導入し，そのドメインの活性がほぼ消失していると仮定して野生型２ドメイン型酵素の活性と比較する方法，そして[C]２ドメイン型酵素のドメイン間に数アミノ酸の挿入を加え強制的にドメイン間の相互作用の程度を減じる方法である．
[A]の手法では，２ドメイン型酵素の kcat（または完全な酵素パラメータ算出によって算出される触媒効率

kcat/KaATP/KiaTau or Arg，簡易的には kcat/KiaTau or Arg）を，分離された各ドメインの総和と比較し，２ドメイン型酵素の方が有意に大きければドメイン間に相互作用が存在すると推定される．ただし，分離されたドメインの立体構造
が２ドメイン型酵素の中に置かれている状態と大きくは変わらないと仮定している．またこの方法では，分離されたドメインの可溶性や発現量に問題が生じて活性測定できない場合がある．今回の研究でも P. infestans２ドメイン型 TK のドメイン１については十分な発現量が得られず，また過去に行った研究においても，シジミ

Corbicula japonica２ドメイン型 AK のドメイン１は発現するものの不溶化して活性測定ができなかった．[A]の方法で完全な酵素パラメータが算出されており比較しうるデータが揃っているのは，ヨロイイソギンチャク A.

japonica（Tada and Suzuki, 2010）, 肺吸虫 P. westermani（Jarilla et al., 2009）, テトラヒメナ T. pyriformis
D1

D2

2-Domain（Okazaki et al., 2011）についてである（Table 2 [A]）．それぞれの(kcat +kcat ) / kcat

値は，T. pyriformis

AK：0.91，A. japonica AK：0.38，P. westermani TK：1.07 と計算された．従って，１よりも有意に低い値（0.38）を示している A. japonica AK２ドメイン型酵素においては，２つのドメイン間に相互作用が存在し，活性発現に正の協同性が生じている可能性がある．尚，触媒効率 kcat/KaATP/KiaTau or Arg を用いた比較からもこの結論は変わらない．

8

9

Tetrahymena pyriformis

Anthopleura japonica

ProtistCnidaria

Cnidaria[C]

Anthopleura japonica

Calyptogena kaikoi

Bivalvia

arginineargininearginine

Corbicula japonica

Bivalvia

argininetaurocyamine

Anthopleura japonica

taurocyamine

arginineargininetaurocyamine

Specificity for
guanidine

Trematode Schistosoma mansoni

Cnidaria[B]

Trematode Paragonimus westermani

Phytophthora infestans

Oomycete[A]

Source2-domain AK (D1-KKKKKK-D2)

native 2-domain AK (6 x His)

Tada and Suzuki (2010)503 ± 24.3

0.18 ± 0.02

0.28 ± 0.05

1.06 ± 0.08

2-domain AK (Y68A in D2) (MBP)

0.912 ± 0.031
0.828 ± 0.029

Uda et al. (2008)

3.61 ± 0.19

2-domain AK (Y68A in D1) (MBP)

native 2-domain AK (MBP)

2-domain AK (Y68A both in D1 and D2) (MBP)

0.379 ± 0.026

2-domain AK (Y68A in D2) (MBP)

0.341 ± 0.026
0.283 ± 0.011

Uda et al. (2008)

2-domain AK (Y68A in D1) (MBP)

native 2-domain AK (MBP)

0.21 ± 0.02

2-domain TK (C268S in D2)

0.26 ± 0.02
0.36 ± 0.02

Meceron et al. (2015)

2-domain TK (C268S in D1)

native 2-domain TK

0.18 ± 0.02

2-domainAK (Y68G in D2)

0.28 ± 0.05

0.51 ± 0.04

0.75 ± 0.07

0.57 ± 0.10

0.66 ± 0.07

0.29 ± 0.05

0.28 ± 0.05

0.76 ± 0.11

0.23 ± 0.06

0.35 ± 0.08

1.01 ± 0.56

0.77 ± 0.07

0.42 ± 0.04

503 ± 24.3

Arg or Tau

[mM]

Ka

2-domain AK (Y68G in D1)

Tada and Suzuki (2010)21.43 ± 1.75

TK-D2 (MBP)

native 2-domain AK (6 x His)

40.31 ± 2.51

60.01 ± 3.01

TK-D1 (MBP)

Jarilla et al. (2009)234 ± 10.1

AK-D2 (6 x His)

native 2-domain TK (MBP)

150 ± 6.60

503 ± 24.3

AK-D1 (6 x His)

native 2-domain AK (6 x His)

48.8 ± 1.88

47.5 ± 1.86

7.61 ± 1.61

141.7 ± 4.15

AK2-D2 (6 x His)

Tada and Suzuki (2010)

Vmax[μmoles/min*mg ]38.0 ± 1.47

Okazaki et al. (2015)

This work

ReferenceAK2-D1 (6 x His)

native 2-domain AK2 (6 x His)

TK2-D2 (6 x His)

native 2-domain TK2 (6 x His)

Enzyme (tag)Arg or Tau

0.23 ± 0.05

0.30 ± 0.08

0.23 ± 0.05

0.14 ± 0.04

0.30 ± 0.08

1.49 ± 0.29

4.22 ± 1.12

1.95 ± 0.43

0.34 ± 0.07

0.26 ± 0.88

0.30 ± 0.08

1.62 ± 0.20

0.29 ± 0.08

0.60 ± 0.14

0.67 ± 0.30

2.36 ± 0.33

[mM]

Kia

ATP

0.78 ± 0.05

1.52 ± 0.16

0.78 ± 0.05

1.62 ± 0.11

1.52 ± 0.16

1.43 ± 0.36

0.66 ± 0.11

0.98 ± 0.16

1.27 ± 0.11

2.93 ± 0.24

1.52 ± 0.16

0.97 ± 0.99

1.03 ± 0.09

0.73 ± 0.07

4.46 ± 1.49

0.85 ± 0.08

[mM]

Ka

ATP

1.02 ± 0.24

1.61 ± 0.55

1.02 ± 0.24

0.55 ± 0.16

1.61 ± 0.55

4.03 ± 0.76

3.58 ± 0.27

3.37 ± 0.70

0.66 ± 0.14

2.66 ± 0.75

1.61 ± 0.55

2.06 ± 0.39

1.29 ± 0.59

1.27 ± 0.48

3.00 ± 2.11

2.60 ± 0.37

[mM]

Kia

Table 2 Kinetic parameters of native two-domain PK, its isolated subunit and mutants (incorporated fatal amino acid replacement into the native enzyme)kcat

123 ± 2678 ± 33

5.62 ± 0.04*

22.2 ± 0.4*

45.8 ± 1.6*

8.00 ± 0.34*

55.2 ± 2.0*

84.2 ± 0.6*

174.8 ± 8.6*

36 ± 161 ± 187 ± 2123 ± 289 ± 3678 ± 33

11.56 ± 0.45

24.16 ± 1.54

33.44 ± 1.01

157 ±7104 ± 5678 ± 33

32.5 ± 1.25

25.4 ± 0.98

63.4 ± 2.25

5.07 ± 1.05

188 ± 5.53

[1/s]

1.28

1.07

1.28

0.33

1.07

2.92

5.63

3.42

0.52

0.9

1.07

2.1

1.2

1.7

0.6

3

Kia/Ka

5.32*

16.8*

50.4*

2.22*

145.8*

298*

514*

171.4

172.2

334.3

[mM-1s- ]kcat/KArg or Tau

252

1487

686

392

1487

5.4

8.7

17.5

364

137

1487

21

85

145

2.5

100

[mM-2s- ]

18

61

80

111

31

107

38

91

[%]

kcat/Ka ATP/Kia Arg or Tau kcat(D1+D2) / kcat(2D)[B]の手法では，A. japonica（Tada and Suzuki, 2010），マンソン住血吸虫 S. mansoni（Merceron et al.,2015）
，シジミ Corbicula japonica（Uda et al., 2008），カイコウシロウリガイ Calyptogena kaikoi（Uda
et al., 2008）で比較しうるデータが提示されている（Table 2 [B]）．それぞれの(kcatD1 +kcatD2) / kcat2-Domain 値は，A. japonica AK：0.31，S. mansoni TK：1.11， C. japonica AK：0.80，C. kaikoi AK：0.61 と計算された．
この場合も，１よりも有意に低い値（0.31）を示している A. japonica２ドメイン型 AK 酵素においては，２つのドメイン間に相互作用が存在し，活性発現に正の協同性が生じていると推定される．尚，簡易的な触媒効率

kcat/KaTau or Arg を用いた比較からもこの結論は変わらない．C. japonica AK の結果からは，両方のドメインに致命的なアミノ酸変異を導入しても（基質結合に関わる保存性の極めて高い Tyr を Ala に変異させた）５％程度の kcat が残っていた（Table 2 [B]）．
[C]の手法は A. japonica でのみ行われているが（Tada and Suzuki, 2010），ドメイン間に Lys を６残基挿入することで kcat6K intert/kcat2-Domain 値は 0.18 となり，A. japonica２ドメイン型酵素では，協同性により強い kcat の増加が見られる結果を裏付ける結果となった．
以上の結果から，A. japonica２ドメイン型 AK では，ドメイン間相互作用に由来する強い kcat の上昇（協同性）
が存在することは確実であると思われる．
今回研究に用いた P. infestans ２ドメイン型 TK は，吸虫 S. mansoni や P. westermani の TK とは遺伝子の起源が明確に異なる（Uda et al., 2013）．この TK が協同性を示すかどうかは，ドメイン１のリコンビナント酵素の発現が極めて弱かったために明確な結論は導き出せなかったが．しかし，P. infestans ２ドメイン型
TK の kcat（188 s-1）が単離したドメイン２の kcat（5.07 s-1）より極めて大きいことから，この酵素も強い協同性を示す可能性はある．

２ドメイン型 PK が協同性を示す構造的基盤

2 ドメイン型の PK 酵素の立体構造は，S. mansoni TK（Merceron et al., 2015）と A. japonica AK（Wanget al., 2015）について決定されている．Wang らの報告によれば，A. japonica AK の２つのドメインは長いαヘリックスにより接続された L 字型の非対称構造を取っている．加えて，2 つのドメインは互いに直接接触し，水素結合と疎水性相互作用を通じて L 字型ドメイン配置を安定化させている．一方，このドメイン間の相互作用
は S. mansoni TK においては明確に述べられていない．ドメイン間の接触は協同性の発現には必須であるので，私たちは A. japonica AK の接触面に存在する結合の中で一対のイオン結合を形成するアミノ酸残基，ドメイン
１の Arg122 及びドメイン２の Asp408 に注目した．
Table 3 A key ion-pair formed between the two domains of A. japonica 2-domain AK, and the coresponding residues in other two-domain PKs
Sources

EnzymeReference

Residue 122 (Domain 1)

Residue 408 (Domain 2)

A. japonica

AKSuzuki et al.(1997a), Wang et al. (2015)

Arg

Asp

C. kaikoi

AK

Uda et al. (2008)

Asn

Gln

T. pyriformis

AK

Okazaki et al. (2015)

Asp

Gln

S. mansoni

TK

Merceron et al. (2015)

Asn

His

P. westermani

TK

Jarilla et al. (2009)

Asp

His

P. infestans

TK

Uda et al. (2013)

Glu

Met

他の２ドメイン型 PK 酵素における，これらの残基に相当するアミノ酸を Table 3 に示した．Table 3 から明10

らかなように，Arg-Asp イオンペアは S. mansoni や T. pyriformis の２ドメイン型酵素では保存されておらず，P. westermani２ドメイン型 TK でイオン結合が可能な組み合わせ（Asp-His；His の pKa 以下の pH でのみ結合が可能）があるのみである．Table 2 から強い協同性を示す酵素は A. japonica ２ドメイン型 AK のみであること，また S. mansoni や T. pyriformis の２ドメイン型酵素では協同性を欠き各ドメインが単独で働いていることを考慮すると（Merceron et al., 2015; Okazaki et al., 2015），この Arg-Asp イオンペアが協同性の発現に強く関わっている可能性がある．今後，Arg122 及び Asp408 のアミノ酸変異体作成を通じて，協同性の発現機序が明らかになると思われる．
この研究で用いた P. infestans ２ドメイン型 TK については，今回の予備的な研究から協同性を示す可能性が示唆されているので，今後，立体構造の解明が進みドメイン間の接触領域が明確になることを期待したい．

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