Scientific and Educational Reports of the Facultyof Science and Technology, Kochi University
Vol. 5 (2022), No. 2

フォスファゲンキナーゼの GS 領域のアミノ酸欠損と酵素活性発現の関連
市成秀一，鈴木知彦
高知大学理工学部生物科学科比較生化学研究室
要約
フォスファゲンキナーゼ（PK）ファミリーに属するクレアチンキナーゼ（CK）やアルギニンキナーゼ（AK）は基質特異性が高く，それぞれ基質クレアチンやアルギニンにのみ酵素活性を示す．ところが，環形動物に存在するロンブリシンキ
ナーゼ（LK）は，主基質ロンブリシンだけでなく，タウロシアミン，アルギニン，グリコシアミンに対しても酵素活性を示す．
このように，LK の基質認識システムは CK や AK と比べると著しく弛緩している，言い換えれば LK には様々なグアニ
ジノ基質に対応する「可塑性」がある．GS（guanidino specificity）領域は PK のグアニジノ基質の認識に関与しており，
PK の種類ごとに GS 領域内に特徴的なアミノ酸残基の欠損を示す：グリコシアミンキナーゼ（GK）は欠損なし，CK は１
残基欠損，AK，LK，タウロシアミンキナーゼ（TK），ハイポタウロシアミンキナーゼ（HTK），オフェリンキナーゼ（OK）は５残基欠損を持つ．
本研究では，シマミミズ LK，タマシキゴカイ TK，オウムガイ AK，ゼブラフィッシュ CK，スジホシムシモドキ HTK を材料に用い，それらの GS 領域に Ala 残基を複数パターン挿入した変異体を作成した．CK，AK，HTK の GS 領域に Alaを１残基挿入すると（1A 変異体），その主活性（触媒効率：kcat/Km）は野生型の 0.8％以下に劇的に低下した．これは，AK，CK，HTK では，GS 領域上での基質認識が最適化され，それぞれの酵素の基質特異性が決定されていることを示唆している．一方，LK-1A 変異体では，主基質ロンブリシンに対して，野生型の 23%の活性が残存していた．加えて，
Ala の挿入数を 4 残基まで増加させても，その活性は LK-1A と大差なかった．また，興味深いことに，LK-1A から LK7A までの 7 種類の変異体は，副基質タウロシアミンに対して野生型と同程度の活性を維持していた．
Keywords: GS 領域（GS region），フォスファゲンキナーゼ（phosphagen kinase: PK），アルギニンキナーゼ（arginine
kinase: AK），グリコシアミンキナーゼ（glycocyamine kinase: GK），クレアチンキナーゼ（creatine kinase: CK），タウロシ
アミンキナーゼ（taurocyamine kinase: TK），ハイポタウロシアミンキナーゼ（hypotaurocyamine kinase: HTK），ロンブリ
シンキナーゼ（lombricine kinase: LK），オフェリンキナーゼ（opheline kinase: OK）

Relationship between the amino acid deletion in the GS region of phosphagen kinase
and expression of its enzyme activity
Shuichi Ichinari and Tomohiko Suzuki
Laboratory of Biochemistry, Department of Biological Sciences, Faculty of Science andTechnology, Kochi University, Kochi 780-8520 Japan
Abstract
Creatine kinase (CK) and arginine kinase (AK), which belong to the phosphagen kinase (PK) family, havea high substrate specificity and show enzymatic activity only for the substrate creatine and arginine,1

respectively. However, lombricine kinase (LK) present in annelids exhibits enzymatic activity not only on
the main substrate lombricine but also on taurocyamine, arginine, and glycocyamine. Thus, the substrate
recognition system on the GS region of LK appears to be remarkably relaxed, compared to the cases of CK,
AK and HTK with high specificity. In other words, the GS region has a "plasticity" corresponding to various
guanidino substrates. The GS region in PK enzyme is involved in guanidino substrate recognition, andeach enzyme has a characteristic amino acid deletion: glycocyamine kinase (GK) has no deletion, CK has
one deletion, and AK, LK, taurocyamine kinase (TK), hypotaurocyamine kinase (HTK), opheline kinase(OK) are deficient in 5 residues.
In order to make clear the role of GS-region, we inserted Ala residues into the GS-regions of LK from

Eisenia foetida, TK Arenicola marina, AK from Natilus pompilius, CK from Danio rerio, and HTK from
Siphonosoma cumanense. When one Ala residue was inserted into the GS region of CK, AK and HTK, its
activity (catalytic efficiency: kcat / Km) was dramatically reduced to less than 1% of that of the wild type.
This shows that the GS region plays a crucial role in substrate recognition in the three enzymes, and that
the GS region is optimized for the recognition of the main substrate in each enzyme. We prepared LK
mutants with one to seven Ala residues insertion in GS region. The results show that irrespective of
number of inserted Ala residues, the activity of the mutants was retained in about 20% of the wild-type forthe substrate lombricine. Interestingly, the activities of the mutants were comparable to that of the wildtype for the substrate taurocyamine.

1. 序論
2＋

フォスファゲンキナーゼ（PK）は，Mg 存在下において ATP の高エネルギーリン酸基をグアニジノ化合物に転移する
反応を可逆的に触媒する酵素群であり，ATP を消費する細胞等において重要な役割を果たしている[1-3]．
グアニジノ化合物には，アルギニン，グリコシアミン，クレアチン、タウロシアミン，ハイポタウロシアミン，ロンブリシン，
オフェリン等があり，それぞれのグアニジノ基質ごとに反応を触媒する酵素，アルギニンキナーゼ（AK），グリコシアミ
ンキナーゼ（GK），クレアチンキナーゼ（CK），タウロシアミンキナーゼ（TK），ハイポタウロシアミンキナーゼ（HTK），ロンブリシンキナーゼ（LK），オフェリンキナーゼ（OK）が存在する[4-5]．脊椎動物には CK のみが存在するが，無脊椎動物では CK に加えて，AK，GK，TK，HTK，LK，OK など少なくとも 6 種の PK が存在している[6]．

Fig.1 Alignment of amino acid sequences around the GS region of PK enzymes (GK, CK, MiTK, TK, AK,HTK and LK). The 84th residue shaded in yellow is the amino acid involved in the identification of theguanidino substrate [11, 20]. Although not included in this alignment, the GS region of the OK sequence
has a 5-amino acid deletion, as well as those of LK and TK.

2

GS（guanidino specificity）領域は PK のグアニジノ基質の認識に関与しており，PK の種類ごとに GS 領域内に一定のアミノ酸欠損がある[7, 8]．すなわち，分子量の大きなグアニジノ基質を利用する酵素（AK，TK，HTK，LK，OK）は欠損数が５と最も大きく，CK の欠損数は１，最も小さい基質を利用する GK の欠損数は０である（Fig.1 を参照）．GS 領域
は，カブトガニ（Limulus polyphemus）AK やシビレエイ（Torpedo california）CK の結晶構造から[9, 10]，グアニジノ基質
結合に関わる flexible loop 上に存在していることが後に判明した．
LK は環形動物やその近縁の動物にのみ存在しており，シマミミズ（Eisenia foetida）LK は主基質ロンブリシンだけでなく，タウロシアミン，アルギニン，グリコシアミンにも酵素活性を示す[11,12]．環形動物の TK においても，多様なグアニジノ基質に対する活性が報告されている[13]．このように，環形動物の LK や TK には，CK や AK には見られない基
質特異性の著しい弛緩が見られる．
本研究では，AK，CK，HTK，TK，LK の GS 領域内に Ala 残基を挿入した変異体を作成した．そして，その酵素活性を追うことで，GS 領域のアミノ酸欠損数が基質認識にどのような影響を与えるかを探った．尚，本論文中でのアミノ酸
番号はシマミミズ LK のものを採用した．
2. 材料と方法
2-1 各種変異体の作製
全ての変異酵素は，pMAL ベクターにクローニングされていたそれぞれの野生型を鋳型に，KOD+DNA polymeraseを用いた Inverse PCR 法によって作製した．増幅された PCR 産物は DpnI 消化し，T4 DNA polymerase を用いた DNA
末端の平滑化，及び T4 polynucleotide kinase を用いたリン酸化を行った．回収した DNA 溶液に等量の Ligation high
( TOYOBO ) を加え，16℃で 90 min 静置してセルフライゲーション反応を行った．その反応液を用いて，コンピタントセ
ル DH5αをトランスフォームし，アンピシリンを含む LB agar 上で 37℃，16 h 静置培養した．変異導入プラスミドは Cycle
Sequencing 反応後，ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems )を用いた配列解析により配列の確認を行った．
2-2 リコンビナントタンパク質の発現誘導と精製
各種の野生型酵素及び変異酵素は，Maltose Binding Protein (MBP) との融合タンパク質として大腸菌 TB-1 中で発現させた．可溶化したリコンビナントタンパク質は Amylose Resin ( New England Biolabs ) を用いた Batch 法で精製した．Column Buffer，Elution Buffer は Amylose Resin の説明書に従い作製した．酵素の精製度は SDS-PAGE により確認した．タンパク質濃度は，280nm での吸光度が 0.77 のときに 1 mg protein/ml であるとして推定し，MBP（42.5
kDa）の分を差し引いて計算した．
2-3 酵素活性測定
精製酵素の活性測定は，ピルビン酸キナーゼとラクテートデヒドロキナーゼを用いた共役反応系で行った[4, 14]．この測定法では，最終的に NADH が NAD＋に変化するときの 340nm 吸光度の変化を追跡する．尚，全ての測定は 25℃で行った．
3. 結果と考察
3-1 GS 領域内 Ala 付加変異酵素の発現と酵素活性測定
本研究ではオウムガイ（Natilus pompilius）AK，ゼブラフィッシュ（Danio rerio）CK，スジホシムシモドキ（Siphonosoma

cumanense）HTK，シマミミズ（Eisenia foetida）LK，タマシキゴカイ（Arenicola marina）TK の変異酵素を作製した．各リコ
ンビナント酵素は，可溶化する可能性が高いマルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質として大腸菌内で発現させ，Amylose Resin を用いたアフィニティクロマトグラフィーで精製した．結果的に，全ての変異タンパク質は 1mM IPTG，25℃，20 h の発現条件で可溶化した．変異体は，GS 領域の欠損部位（Fig.1 を参照）に Ala を 1 残基挿入
した場合には 1A，2 残基挿入した場合には 2A，3 残基挿入した場合には 3A のように表記した．

3

4

野生型および変異体の酵素活性は，AK，CK，HTK については，それぞれの主基質であるアルギニン，クレアチン，
タウロシアミン（基質ハイポタウロシアミンが入手不能であるためタウロシアミンで代用）に対して，LK 及び TK に関してはロンブリシン，タウロシアミン，グリコシアミンに対して測定した．本実験で用いたロンブリシンは，シーボルトミミズ（Pheretima sieboldi）またはユムシ（Urechis unicinctus）の生体から直接イオン交換クロマトグラフィーによって精製したものであり [15-17]，その他の基質に対しては市販のものを用いた．
また，変異体の活性が低く，酵素パラメータの算出が困難な場合には，9.52 mM グアニジノ基質及び 4.76 mM ATP
存在下での反応速度（V： mol Pi / (min x mg of protein)) を測定し，その kcat 値を算出した．
3-2 GS 領域内 Ala 付加変異体の酵素活性(1) AK，CK，HTK 変異体
上記３種類の 1A 付加変異酵素の主基質に対する活性（触媒効率：kcat/Km）は，野生型の 1％以下に激減した（Fig.2，Table 1）．また，データは示していないが，変異体は他の基質に対しても活性を示さなかった．これは，AK，CK，
HTK では GS 領域上での基質認識が最適化され，それぞれの酵素の基質特異性が維持されていることを示唆している．尚，HTK はアミノ酸配列が AK に近く，AK 遺伝子から進化した酵素であることが分かっている[18]．

Fig.2 Comparison of enzyme activity (catalytic efficiency: kcat/Km) of wild-type and 1A mutant of Nautilus
AK, Siphonosoma HTK and Danio CK. (A) Activity of AK wild-type and mutant for the substrate arginine(n.d., not determined), (B) Activity of HTK wild-type and mutant for the substrate taurocyamine, (C)Activity of CK wild-type and mutant for the substrate creatine.

(2) LK 変異体
主基質であるロンブリシンに対して，LK-1A 変異体の活性（kcat/Km）は野生型の 23.7％に低下した（Fig.3(A)，Table 2）．さらに，LK-2A，-3A，-4A 変異体の活性も野生型の 20％程度の活性を維持しており，GS 領域内への Ala４5

残基までの挿入の影響は一定であり限定的であった．このように，LK の GS 領域への Ala 挿入変異体は，GS 領域に
1 アミノ酸残基挿入によりその活性が著しく低下した AK，HTK，CK（Fig. 2）とは全く異なる挙動を示した．
ロンブリシンは現在判明している PK の基質としては最も質量の大きい分子であるので，前述した基質分子の大きさと GS 領域のアミノ酸欠損数の関連性から判断すると，GS 領域の伸長（Ala の挿入）はその活性を大きく低下させると予想された．ところが実際は，LK-1A から-4A の変異体は野生型の 2 割程度の活性を維持しており，LK の場合には，GS 領域のみでは基質認識が最適化されていないと推定できる．
一方，基質タウロシアミンに対しては，興味深いことに，LK-1A から LA-7A までの７種類の変異体の全てが野生型と同程度の活性を維持していた（Fig.3(B), Table 2）．これは，LK の GS 領域以外にタウロシアミンの認識に関わる部位が存在することを示唆している．実際に，タウロシアミンを基質として用いる TK 酵素は，これまでに少なくとも独立に３回，原生生物（GS 領域のアミノ酸欠損数 5），扁形動物（欠損数 6），環形動物（欠損数 5）で生じている[19]．一方，基質グリコシアミンに対しては，LK
変異体は野生型より僅かに高い活性を示した（Table2）．
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Lombricine
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Fig.3 Comparison of enzyme activity (catalytic efficiency: kcat/Km) of wild-type and mutants of Eisenia
LK and Arenicola TK and MiTK. (A) Activity of LK wild-type and mutants for the substrate lombricine,(B) Activity of LK wild-type and mutants for the substrate taurocyamine, (C) Activity of TK and MiTK
wild-type and mutants for the substrate taurocyamine.

6(3) TK 変異体
タマシキゴカイには 2 種類の TK（細胞質型及びミトコンドリア型）が存在し，細胞質型 TK（TK）の GS 領域のアミノ酸欠損数は５で LK と同じであるが，ミトコンドリア型 TK（MiTK）の欠損数は CK と同じ１である（Fig. 1）．MiTK の欠損数１
は，この遺伝子がミトコンドリア型 CK（MiCK）から進化したことを示す証拠でもある[19]．TK のアミノ酸配列は LK との高い一致率を示し（TK-LK 間で 70％，MiTK-LK 間で 60％），また，TK はロンブリシンに対しても活性を示すことから[12]，両者の基質認識機構は相互に類似している可能性がある．そこで，TK においても GS 領域内の Ala 付加変異体を作成した．
TK-1A 変異体は構造が不安定で失活が非常に早く，正確な酵素活性パラメータを決定することはできなかった．しかし，この変異体の反応速度は，少なくとも kcat = 2.13 (1/s)以上と見積もられ（Table 2），野生型（8.24）の 25%に相当した．この割合を LK-1A のもの（54%）と比較すると，TK-1A における Ala 挿入の影響は LK-1 に近く，劇的な活性低下をもたらした AK-1A，HTK-1A, CK-1A とは明らかに異なる．
一方，MiTK の 1A 及び 2A 変異体の活性（kcat/Km）は，野生型のそれぞれ 11%及び 31%に減少した．この減少率も，
LK 変異体のものに近い．
また，MiCK 遺伝子由来である MiTK は，野生型及び変異体においてグリコシアミンに対してもある程度の活性を示す（Table 2）．これは，CK や MiCK は基質特異性の高い酵素であるものの，その野生型がグリコシアミンに対しては僅
かな活性を示すことに由来している[21]．
結論
今回のデータは，LK や TK の GS 領域周辺の基質認識機構が AK や CK に比べると著しく弛緩している，言い換え
れば LK や TK の GS 領域には様々なグアニジノ基質に対応する「可塑性」があることを示すものである．これは，環形動物内で 4 種の PK 酵素（GK，TK，LK，OK）が独自に進化・多様化した結果 [6]，基質特異性の完成度が低い LK や
TK 等の酵素が生じたことを想起させるものである．
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