カーボン固相抽出の革命－
Carbon X 登場！and ヒリックSPE・ZIC‐HILICの活用法
クロマニックテクノロジーズ
長江徳和
info@chromanik.co.jp
1

新規カーボン積層型シリカSPE基材
Carbon coated on porous silica(COS)2

目標とするCOS の特性••
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

ユニークな選択性
表面積が高い取り扱いが簡単
再現性のある回収率 (Batch‐to‐batch, cartridge‐to‐cartridge)
回収率が高い機械的安定性が高い
溶液流れが安定充填剤への浸透性が高い
微粒子が存在しない
適した細孔径を採用
溶出物がない粒度分布がせまい
3

COS 特長と利点
特長
機械的安定性，微粒子がない，新規な応用が可能，通液性がよい
利点
フリットを通過する微粒を除去しているので，サンプリングのやり直しが少ない
強溶媒洗浄カートリッジ，分取用素材による新しい応用例
カートリッジ間の再現性が高い
他製品の弱点
回収液の濁りの原因になる微粒子が粒子の充填する操作中に発生する
機械的強度の低さから適用できない応用例がある

4市販されているカーボンの比較
Product

Material TypePrice ($)/gram

CLSCOS

Carbon on Silica

5SPE gradesilica~70~150

ENVI-18 (ODS) (1)ODS bonded Silica

2.084560475

Not selective for polar
analytes

ENVI-Carb Plus (1)Spherical carbon molecularsieves

15177-400

15-301149

Small pore size; lowapparent surface area.

ENVI-Carb (1)Graphitized carbon black

537-125

SampliQ (2)Graphitized carbon black

537-125

Carboprep (3)Graphitized carbon black

12HyperSep (4)Porous graphitic carbon

100™

Particle Pore Size
Surface
Size (µm)(Å)
Area (m2/g)

30

Disadvantage

Nonporous
Nonporous
Nonporous

100

Nonporous, fragile.

100

Nonporous, fragile.

90

Nonporous, fragile.

250

100

Too expensive for
disposable cartridge.

5カーボン原料の比較

Carbon coatedsilica

6逆相としての特性（メチレン1個と保持の関係）
ODS and Carbon Are Both Reverse Phase
1.5ODS

Nitroalkanes

1COS

logk’ 0.5
0-0.5234567# of methylene (CH2) group* Mao, Y, Thesis, 20007

保持比較（ODS & COS）
1.00
Carbonlog(k’/k’benzene)

0.50
ODS

0.00
12345678

Solute #-0.50
12345

N-benzyl formamide
benzylalcohol
phenol3-phenyl propanol
p-chlorophenol

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22678910acetopheonone
benzonitrile
nitrobenzene
methyl benzoate
anisole1112131415

benzenep-nitrobenzyl chloride
p-nitrotoluene
benzophenone
toluene1617181920

bromobenzene
21
naphthalene
22
ethylbenzene
p-xylenep-dichlorobenzene

propylbenzene
n-butylbenzene*Jackson, P.T, Schure, M.R., Weber, T.P., Carr, P.W., Anal. Chem. 1997, 69, 416.
8

COS 異性体の選択性

p-Xylene

Ethylbenzene

Relative retention
ODS1.0COS1.69

応用例 Selected Applications• 農薬，殺虫剤，除草剤(acidic, hydrophilic, etc.)• Color Sorbents (Chlorophyll)
• 有機酸
• 異性体
• スルホン酸塩• 疎水性医薬品• PCBs10

pH3以下でのカーボン表面の概略図

11

pH3以上でのカーボン表面の概略図

12

COS の規格• Base Material: Silica• Particle Size: 38‐125 micron• Particle Shape: Irregular• Estimated Mean Pore Diameter: ~90 A• Estimated Specific Surface Area: ~100 m2/g
• % Carbon Loading: 1213機械的強度COS

Envi-Carb Carbon
AfterBefore

摩擦後も粒つぶされた粒子
子は壊れていない
操作：
2枚のカラス板に粒子を挟み，ガラス板を滑らす
倍率: 20x14

農薬の SPE の例
Step 1. 農薬のロードと溶出• Packing: Cartridges packed with 0.7g of Carbon onsilica• SPE Condition: 5mL 4:1 CH2Cl2:ACN, then 2mL ACN,
then 10mL 2% acetic acid in H2O.
• Sample Application: 1mL Bromacil (in 10% MeOH inH CCH
H2O). Pirimicarb (1 mL)
N33O
H3C
H3C

CH3O
N

CH3ONHBr

CH3O
N

NN

CH3CH
• Wash/Dry: No change• Elution: Pass 2 mL ACN, then 2‐ 2 mL of 4:1
CH2Cl2.:ACN. Collect all eluent in same vessel.
Evaporate to dryness and reconstitute with 80/20
H2O/ACN.
315

農薬の SPE の例
Step 2: HPLCによる農薬の分離• Column‐ Zorbax Eclipse XDB‐ C‐18 4.6 X 50mm,5µm• Mobile Phase A: 10/90 ACN/H2O with 0.1%
Formic Acid
• Mobile Phase B: 90/10 ACN/H2O with 0.1%
Formic Acid
• 25µl injection• Detector: 290nm• Column temp: 35°C
Time (min)0.2
32.0
35.040.041.0%A80
600080%B204010010020Time (min)055.567%A95
20209595%B
58080
5516COS カートリッジによるBromacilと Pirmicarb の回収率
Batch

Pirimicarb
standard

Bromacil

Batch

Pirimicarb
standard

Cart#

Averagerecovery% RSD

AveragerecoveryS9‐1981295

3Bromacil% RSD

Cart #

Averagerecovery% RSD

Averagerecovery

%RSD

97

1

S10‐1104

1102

19999

298

12

100

0100

1102

10093

296

1

398

199

1103

100

495

197

1499

1100

1103

101

595

197

1593

197

1101

104

S10‐191190

1S11‐192

299

199107296294

1292

1102

199111

397

296

1390

1100

1100112

498

398

0

491

1102

1100112

596

2101

1591

0101

1105

110

Cartridges: 0.9 g of COS, 3 separate batches
Recovery: N=5 replicates; 50 ug/mL Bromacil; 20ug/mL Pirmicarb

Relative
recovery %17

COSによるBromacilの相対回収率の比較
CH3O
N

3.5

CH3NH

3OBr

CH3

Area Ratio

2.5
2

Measured

1.5Standard

10.5
00

12

3

Concentration Ratio
18

COS バッチ間の特性• % Carbon = 12% +/‐ 1% (N=10)• Bromacil 回収率 = 95.7% +/‐ 4% (N =10)
• Pirimicarb 回収率 = 94% +/‐ 4% (N =10)
batchbatch

19

COS のフローテスト
COSAveCartridge Time(min) % RSD
110:47
1%
2
10:29
1%
3
10:37
1%
410:17
510:45Envi-Carb
Ave
Time(min) % RSD
10:03
4%
8:18
4%
4:46
1%

1. N= 3 for each cartridge
Flow test:
Measure time to pass 4mL of eluent 4:1 CH2Cl2/ACN through a 3 mL cartridge20試料負荷量と破過重量• 3 mL カートリッジを用い，300μg/mLまで回収率の直線性が得られた• 3 mL カートリッジでの破過重量は3 mgであった

21

ZIC‐HILIC SPE の特長

22

ヒリックの条件
O

ヒリックで分離できる化合物••

LogP値が小さいかマイナス
親水性，イオン性またはイオン化する化合物

OHNHHHO+NNO

HHOO PHOOH

O
SO-O

23

ヒリックにおける溶媒強度

Water > Methanol > Ethanol > Propanol > Acetonitrile
Acetonitrile > Acetone

溶媒極性減少Decreased Solvent Polarity

溶出力減少
Decreased Elution Power

保持力増加
Increased Retention Capacity24選択性が重要!
•

分離能は選択性が大きく関与

分離モードを変えると選択性は大きく変化
25

思い出してください!

逆相分離での試料調整は水の組成比の高い溶媒で行われることが多い!

Adjust injection volume!
or optimise sample prep!
26

固相抽出の選択性
逆相固相抽出試料は水で希釈されSPEに注入される
有機溶媒で溶出させる
ZIC®‐HILIC カラムで試料は濃縮できる
ZIC®‐HILIC 固相抽出
試料はアセトニトリルで希釈されSPEに注入される
水または緩衝液で溶出させる
逆相カラムで試料は濃縮できる27

®
ZIC ‐HILIC SPE の応用例
プラズマのマトリックス中の測定物質を妨害する成分を除去

抽出方法:
 アセトニトリルでプラズマを沈殿させる(1.5 mL to 0.1 mL)

 遠心分離後上澄みをロード®

 ZIC -HILIC SPE 1 mL 100 mg
プレコンディション：アセトニトリル(2 mL)

amoxicillin アセトニトリルで洗浄後乾燥
 水で溶出 (400 µL)
分離条件:
(A) Acetonitrile (ACN) precipitated blank plasma(B) ZIC®-HILIC extracted ACN precipitated spiked plasma(C) ZIC®-HILIC extracted ACN precipitated blank plasma

Reversed phase column (Aquasil) at a flow rate of
1.0 mL/min, with isocratic 93% phosphte buffer(pH 2.5, 0.1 M), 7% ACN. Injectionof 85 µL, UVdetection at 230 nm*N. Lindegårdh et al., Therapeutic Drug Monitoring, in press.

Lindegardh et al., Therapeutic Drug Monitoring, 27(2005) 503-508

28

96‐ウェルプレートの利用
ペラミビルは米バイオクライストファーマ社(BioCryst Pharmaceuticals)によって開発された、抗インフルエンザ薬です。
ウィルスのノイラミニダーゼを阻害することで、インフルエンザウィルスの体内増殖・拡散を抑えます

96-well ZIC®-HILIC clean-up & RPLC separation
provide rapid, sensitive and selective results.
Extraction procedure optimized to minimize
presence of phospholipids in SPE eluate.
Validated method to support analysis of drug
after intravenous administration.
Lindegardh et al., J. Chromatogr. A, 1215 (2008) 145-151

29

保持に与えるイオンの影響
Name

Ammonium
FormateAmmonium
AcetateAmmonium
Phosphate

Sodium
Phosphate

Triethylamine
Phosphate

Hydrazine

26.00

27.87

44.94

37.39

> 60

Methyl hydrazine

20.02

21.53

33.03

29.42

46.75

1,1-Dimethylhydrazine

18.05

19.27

27.39

25.01

32.91

1,2-Dimethylhydrazine

14.96

16.27

22.23

20.85

29.18

H2N NH2CH3HN
NH2H3C

CH3N
NH2

保持時間
緩衝液中のアニオン: ギ酸 <酢酸 <<リン酸
緩衝液中のカチオン: Na+ < NH4+ < TEA+
ホスマイスターシリーズ（Hofmeister series）
30

2010年9月以降新価格（値下げ）
ZIC®-HILIC SPE Cartridges
注文番号

充填剤量カートリッジ

カートリッジ

数量

価

格[mg]

タイプ

容量 [mL][本/箱][¥][¥]

新価格

ZIC®-HILIC シリンジ型固相抽出カートリッジ
2942-010SQ

25シリンジ型

1100

74,00063,5002942-030SQ

100シリンジ型

1100

93,00075,8002942-031SQ

100シリンジ型

3100

93,00088,0002942-041SQ

200シリンジ型

3100

110,000

88,0002942-051SQ

500

シリンジ型

3100

180,000

134,000

2942-052SQ500シリンジ型

62553,000

49,8002942-062SQ

1000

シリンジ型

62574,000

63,5002942-132SQ

100

96 well-plate

2170,000

60,400＊上記価格に消費税は含まれて下りません

31