電子顕微鏡解析
川端 猛
大阪大学 蛋白質研究所
寄附研究部門准教授

計算生命科学の基礎 IV
2017年10月25日(水) 17:00-18:30

今日の話題• 最近の電子顕微鏡をめぐる状況• 電子顕微鏡の仕組み• 単粒子解析• 単粒子解析の画像処理の例• 電顕の3Dマップからの原子モデルの構築法

最近の電子顕微鏡をめぐる状況

PDBデータの実験手法の内訳
実験手法 X-ray

NMR

エントリ数

120180

11998

1741

110

222

134251

比(%)

89.5%

8.9%

1.3%

0.08%

0.17%

100%

Electron
Microscopy

HybridOthersTotal

RCSB-PDB, 2017/10/18

2017年のノーベル化学賞
Developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination ofbimolecules in solution
溶液中の生体分子の高解像度の構造決定のための低温電子顕微鏡の技術の開発

Richard Henderson

Jacques Dubochet

Joachim Frank(1945-, MRC Laboratory of
Molecular Biology)(1942-, EMBL, Heidelberg)(1940-, Columbia university)

バクテリアの紫膜を用いたバクテリオロドプシンの二次元結晶の電子顕微鏡解析

クライオ電子顕微鏡の試料のための非晶質（アモルファス）氷の生成法を初めて確立

単粒子解析のための理論とプログラムの開発

PDBcode:1brd (1990)
ELECTRON CRYSTALLOGRAPHY (3.5 Å)

Nature 308, 32 - 36 (1984);

Frank,J., Shimkin,B., Dowse, H.
SPIDER—A modular software systemfor electron image processing.
Ultramicroscopy, 6,343-357, (1981)

Joachim Frank. Three-Dimensional Electron Microscopy Of Macromolecular Assemblies: Visualization Of Biological
Molecules In Their Native State Oxford University Press; 2nd版 (2006/2/2)

立体構造の決定法
Ｘ線結晶解析

原子モデルの構築
原子モデルの精密化

大量発現
精製
結晶化

X線回折強度の測定

３次元
電子密度マップ

ＮＭＲ（核磁気共鳴法）

原子モデルの構築
核磁気共鳴解析（NOE解析,帰属と距離拘束の抽出） 原子モデルの精密化

大量発現
精製
原子間
距離拘束

(1)多数分子の平均構造の観察（精製が重要。 大きな分子、複合体はより難しくなる）(2)発現・精製・結晶化のステップで、各タンパク質によって実験条件の調整が必須(3)実験データの収集・原子モデル構築の段階で計算機の支援が不可欠

電子顕微鏡（単粒子解析）
による立体構造データの取得

2D画像群
３次元再構成3D画像

原子モデル
原子モデリング

EMPIAR-10013

emd_5995.map

pdb3j7h.ent

402.2GB

150 MB

2.6 MB

EMDataBank
3DEMの密度マップを集めたデータベース

EMDBのデータをわかりやすくまとめたサーバ(PDBj, 鈴木)

ribosome

proteasome

GroEL/ES

5290個の EMDB のエントリ(2017/10/25) :Virus

EMPIAR (Electron Microscopy Public Image Archive)
https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/

EMDBに登録された3Dマップの元となった2D画像群を集めたデータベース

PDBの原子モデルの総量(33GB)の1４
1400倍に相当
EMDBの3Dマップの総量(516 GB)の91倍に相当2017/08/01現在
データエントリ数:87
全データサイズ： 47.2 TB
最大のエントリ：EMPIAR-10061 : 12.4 TB

EMDBの解像度

EMD-4116 2.2Å
EMD-2548 13Å

EMD-8751 4.4Å

EMD-1209 25Å

高解像度の電顕密度マップの出現
The revolution will not be crystallized. Nature 525, 172–174

2013年にUCSFのYifan Chengのグループが、3.4Åの解像度のLiao et al. (2013) Nature, 504,107.
膜タンパク質のマップを発表
TRPV1 (transient receptor potential channel)

Cao et al. (2013) Nature, 504,113.

主鎖構造だけでなく、側鎖の形状も低分子リガンド（カプサイシン）も見える?
⇒ Ｘ線結晶解析の密度マップと同様な手法でデノボの原子モデルが作成できる。
EMD-5776, 5778, 5779, PDB-3j5q,3j5r, 3j5p

E.Coli ribosome
EF-TU complex

Human g –secretase

2.9Å

3.4Å

EMD-2847, PDB-5afl
Fischer et al. (2015) Nature, 520,567.

EMD-3061, PDB-5a63
Bai et al. (2015) Nature, 525,212.

最近報告された構造
Liang, Y.L.,Khoshouei, M.,Radjainia, M.,Zhang,
Y.,Glukhova, A.,Tarrasch, J.,Thal, D.M.,Furness,
S.G.B.,Christopoulos, G.,Coudrat, T.,Danev,
R.,Baumeister, W.,Miller, L.J.,Christopoulos, A.,Kobilka,
B.K.,Wootten, D.,Skiniotis, G.,Sexton, P.M.

Ozorowski, G.,Pallesen, J.,de Val, N.,Lyumkis, D.,Cottrell,
C.A.,Torres, J.L.,Copps, J.,Stanfield, R.L.,Cupo, A.,Pugach,
P.,Moore, J.P.,Wilson, I.A.,Ward, A.B.

Open and closed structures reveal
Phase-plate cryo-EM structure of allostery and pliability in the HIV-1
a class B GPCR-G-protein complex. envelope spike.
Nature, 546:118-123, 2017
Nature, 547:360-363, 2017
Antibody
gp160
17b Fab

CD4

Antibody
17b Fab

gp160
gp160

gp160
EMDB-8623 (4.1 Å, 2003)(contour Level: 0.05) PDBcode: 5uz7

EMDB-8713 (3.7 Å, 2003)(contour : 0.07) PDBcode: 5vn3

Antibody
17b FabMap ChallengeとModel Challenge
http://challenges.emdatabank.org/

Map Challenge : ２次元画像群から、３次元密度マップを作成するコンテスト
Model Challenge : ３次元密度マップ
から原子モデルを作成するコンテスト※どちらも解像度がよい(<5Å)マップがターゲット
Deadline for submitting model is June 17, 2016 (21:00 UTC) => June 18 (6:00 JPN)

低温電子顕微鏡の仕組み

電子顕微鏡と光学顕微鏡
電子顕微鏡（透過型）

光学顕微鏡

電子銃

https://commons.wikimedia.org/
wiki/File:Scheme_TEM_en.svg

反射鏡

試料

試料ホルダー
対物レンズ

対物レンズ

中間レンズ
投射レンズ

接眼レンズ
画像録画装置

電子線を使用。経路は真空。磁界レンズを使用。蛍光スクリーンと銀塩写真フィルムか
直接電子検出器で像を検出

可視光線を使用。経路は空気中。
光学レンズを使用。
肉眼やCCDカメラで像を観察

走査型(SEM)と透過型(TEM)顕微鏡
走査型電子顕微鏡
Scanning electron microscopy

透過型電子顕微鏡
Transmission
電子銃
electron microscopy

電子銃

試料ホルダー
対物レンズ
中間レンズ
対物レンズ

投射レンズ

試料

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Schema_MEB_(en).svg
画像録画装置https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Scheme_TEM_en.svg
細く絞った電子線を試料に走査(scan)する。
試料からの二次電子の放出量を検出器で計測。 電子線を試料に照射し、透過した電子線の強弱などを像として検出。
試料の表面を観察する。

走査型(SEM)と透過型(TEM)顕微鏡
走査型(SEM)

透過型(TEM)
電子直接検出器
Gatan社K2-Summitを搭載

日本電子（株）社製
JSM-7900F 走査電子顕微鏡

日本電子（株）社製
JEM-2200FS

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:A_(H5N1)_virion,_a_type_of_bird_flu_virus_which_is_a_subtype_of_avian_i
nfluenza_A.jpg

Thermo Fischer (FEI)社製
Titan Krios G2

Beta-galactosidase (EMPIAR-10012)

クライオ電子顕微鏡の試料
電顕は試料を真空にさらすため、水分を含んだ生体試料はそのままでは計測できない。

ネガティブ染色法 (negative staining)：
酢酸ウラニル溶液を試料に加え、生体分子に重原子を付着させる方法
アモルファス氷で包埋する方法： 水を含んだ試料を急速に冷却させ、生体分子がアモルファ
ス状態の氷（非晶質氷）に埋まった状態にして観察する方法※氷の状態の水ではなく、急冷したアモルファス状態の水であることが重要。
氷は規則正しい結晶状態であるため、強く結晶回折して、生体分子を見えなくしてしまう。
クライオ電子顕微鏡 (Cryo Electron Microscopy)
アモルファス水で包埋した試料を、冷却した電子顕微鏡で観察する方法のこと
グリッド
直径3-5mmほどの銅板
多数の小さな穴
微小な穴のあいた
カーボン膜を貼って使用

グリッドの上に、生体分子試料をかけて、液体エタン＋液体ヘリウムで急速冷却して試料を作成する。
生体分子

アモルファス氷カーボン膜

2013年以降の電顕の高解像度化の要因
1. 直接電子検出器(Direct Electron Detector)の導入： これまでは電子を光に変えてCCDカメラで検出していた。DEDは電子を直接CMOSセンサーで検出する。

2. 動画撮影の導入： 毎秒数百枚のフレームを動画で撮影。動画から、電子線照射による試料のぶれを補正した静止画像を作成する。

3. 自動試料搬送装置(auto loader)などの自動データ取得機能： 無
人状態で長時間動作させることで大量のデータの取得が可能となった。

4. ボルタ位相板(Volta phase plate)の導入： カーボン膜を電子線の経路上に置くことで、高いコントラストを実現

5. 高性能な計算資源・ソフトウエアの改良： 大容量のハードディスク、メモリーの導入、クラスタマシンやGPUによる高い計算力。ベイズ推定など見通しのよい理論に基づいたソフトウエアの開発。

電顕による構造解析の特徴• 結晶化は不要。しかし試料の濃度などの調整は必須。
• 膜タンパク質でも適用可(detergent, nanodisc)• 比較的大きな分子に向いている(リボゾーム、GroEL)• 最近はGPCR, ヘモグロビンほどの大きさでも高解像度で観察可能 （ミオグロビンは不可らしい…）• 原則的に、標本中の分子が全て同じ形状をしていることを仮定• 近年のソフト(Relion)では、一つの標本から数個の形状を提案することも可能になってきている。
• 高解像度といっても3-4Åぐらい (?)• 低分子化合物が見える場合もある。しかし、結合部位はわかるが、精密なポーズは難しい？
• 抗体の結合部位を調べるのに有効？

単粒子解析

単粒子解析(single particle analysis)
包埋された
様々な向きの生体分子
2D画像の分類と平均化

３次元密度マップ

電顕像(micrograph)

分子像の切り出し(picking,boxing)

３次元再構成画像分類と平均化によるノイズ除去
原子モデル(PDB:3j7h)を5Åの解像度で格子幅7Åで32x32の画像に投影。SNR=0.5のノイズ。

5枚の平均10枚の平均

100枚の平均

原シグナル画像高次元再構成の問題
コンピュータ断層撮影

1D投影像から2D画像(断層像)を求める
カメラを被写体のまわりに回転させて撮影
投影方向は撮影時にわかっている

単粒子解析

2D投影像から3D画像を求める
多数の同一の分子が様々な方向で包埋
各粒子画像の投影方向を推定する必要

再構成のアルゴリズム
各投影画像の投影方向が既知の場合(1)実空間で行うアルゴリズム： 逆投影法
(2)周波数空間で行うアルゴリズム： フーリエ再構成法
観察投影像群

投影画像の投影方向が未知の場合
初期３D画像を導入。以下の(1)-(3)を繰り返す(1)3D画像から疑似投影像群 (2)各観察投影像に最も近いを作成
疑似投影像を選ぶ⇒ 投影方向の推定(3)推定投影方向を用いて3D画像を再構成。更新。

逆投影法：Back projectionpi (r (i ) ): i-番目の投影像

r ( i )  {x ( i ) , y ( i ) }: i-番目の投影像のXY局所座標bi (r (i ) , z (i ) )  pi (r (i ) )t ( z (i ) )   3 : i-番目の投影像の「逆投影体」

  1(”back projection body” )  21  D / 2  z  D / 2t ( z (i ) )  otherwise0: “top hat” function
ナイーブな逆投影法では、低周波成分が強調された
3D画像が再構成されてしまう。
N=> (r )  bi (r (i ) , z (i ) )投影画像に高周波成分を強調するフィルタをかけてから
i 1
逆投影をする: 再構成された3D画像



重み付き逆投影法 (weighted back projection)
フィルタ補正逆投映法 (filtered back projection) taken from Frank (2006), p 215

フーリエ再構成法 Fourier reconstruction
投影断面定理 Projection-slice theorem p( x)   f ( x, y )dy
F (k x , k y )    f ( x, y ) exp[2i( xk x  yk y )]dxdy

 

  f ( x, y )dy  exp[2ixk ]dx   p( x) exp[2ixk ]dx
f
(
x
,
y
)
exp[

2

ixk
]
dxdy

x
x
x
    

F (k x ,0)  

2D:







 p( x) exp[2ixk ]dx  F (k ,0)
x



x

taken from wiki

y軸に投影した1D投影像をフーリエ変換すると、 2Dの周波数空間でのky=0の直線になる。
3D: 





 p( x, y) exp[2i( xk  yk )]dxdy  F (k , k 0)

 

x

y

x

y,

Fourier transform of 2D projection is the
slice plane the Fourier 3D map.
Z軸に投影した2D投影像をフーリエ変換すると、 3Dの周波数空間kz=0の平面になる。

taken from Frank (2006), p 196

画像解析のソフトウエア
EMDBの統計情報 (EM navigatorによる）

プログラム

開発グループコメント

RELION

Sjor Scheres (MRC)

ベイズ推定(MAP EM)を採用。2D分類と3D構築。現
在の一流誌の論文の多くはこのソフトを使っている。

SPIDER

Joachim Frank(Columbia Univ.)

ノーベル賞受賞者が開発を続けているレガシーなソ
フトウエアパッケージ。

EMAN2

Steven Ludtke (Baylor
College of Medicine)

Relion出現前は、最もよく使われいたパッケージだったが、最近はRelionに圧倒されている。

Nikolaus Grigorieff

3D refinmentに特化したソフト。

FREALIGN(Howard Hughes Medical Institute)実際の画像解析の例
EMAN2のチュートリアルから

EMAN2 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Stephen Ludtke のグループ (Baylor College of Medicine, TX,US)で開発
C++.で書かれ、Pythonでラップ
多くのpythonのスクリプトが提供 : e2proc2d.py, e2proc3d.py, e2boxer.py, …
GUI付きのスクリプトもある (such as e2boxer.py, e2display.py, e2projectmanger.py…).
並列化は、 マルチスレッドとMPI による並列化計算が可能。 GPUには未対応 。
一連の作業を管理する
ウィザードタイプのGUIスクリプト
e2projectmanager.pyも提供されている。

使用する電顕画像データ• EMAN2のチュートリアルのデータから取得
http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Tutorials
・原論文 : Bartesaghi A, Matthies D, Banerjee S, Merk A, Subramaniam S Structureof β-galactosidase at 3.2-Å resolution obtained by cryo-electron microscopy,
PNAS.(2014) 111, 11709-11714; EMDB-5995; PDBcode:3j7h).
・原論文で用いた画像データはEMPIARデータベースからダウンロードできる。
EMPIAR-10012: micrographs (single image) 509 images in MRC format, 7420 x 7676.
Total file size :108.0 GB
EMPIAR-10013: micrographs (multiple image) 509 images in MRC format, 7420 x 7676 ,Frames per image 38, Total file size: 402.2GB・チュートリアルのデータは、練習用にデータを小さくしている。
動画は扱わない
509枚の画像 => 96枚の画像
画像の解像度 7420 x 7626 pixels => 3838 x 3710 pixels

96 images in HDF format: such as, BGal_000021.hdf, Bgal_000025.hdf, …,
Bgal_000496.hdf. Each HDF file has 54 MB, 3838 x 3710 pixels.
Total file size is 54MB x 96 = 5 GB.

低温電子顕微鏡の画像の例
BGal_000021.hdf
3838 x 3710 pixels.

最終的な３次元マップ(emd_5995, PDB:3j7h)

EMAN2の処理の手続き
Motion Correction (動画補正)

計算時間は４コアのデスクトップマシンによる(Dell Precision T1700, Xeon E3-1220 v3,3.10GHz,4 threads).
1. Prepare your project
2. Launch e2projectmanager.py
3. Import and estimate image defocus [1min]
4. Extracting/boxing particles from micrographs 粒子画像の抽出
5. CTF Correction 位相コントラスト伝達関数による補正[4min]
6. Building sets
7. Generating reference free class average [15min] 2D画像分類と平均画像
8. Eliminate bad particles
9. Select good class averages
10. Make initial models [1min] 初期密度3Dマップの生成
11. Building sets
12. 3D refinement 1 [12 min] 3Dマップの精密化 1
13. 3D refinement 2 [284 min = 4hour 44min] 3Dマップの精密化 1
14. Eliminate bad particles (optional)
15. Final refinement [673 min = 11hour 13min] 3Dマップの精密化 3

粒子画像の抽出 (picking, boxing)

手作業で1000個程度抽出してから、残りは自動抽出する方法が一般的。最終的には数万~数十万個の粒子を使用する。チュートリアルデータでは、抽出済みのboxファイルが提供

位相コントラスト伝達関数 (CTF) による補正
CTF mathematically describes how aberrations in a transmission electron microscope modify the image of a sample. This
sets the resolution of High-Resolution Transmission Electron Microscopy (HRTEM), also known as phase contrast TEM. By
considering the recorded image as a CTF-degraded true object, describing the CTF allows the true object to be reverseengineered. This is typically denoted CTF-correction, and is vital to obtain high resolution structures in 3D electron
microscopy, especially cryo-electron microscopy. Its equivalent in light-based optics, is the optical transfer function.

Frank (2006)f:defocus

A phase object and its
effect on an incoming The effect of spherical aberration
2
3
4
CTF: sin(2 (q))  sin(fq   / 2 Cs q ) plane wave.
Cs: spherical aberration constantCTF:wave length

今野(2003)

Wave number

True projection of GroEL(Ludtke and Chiu)

Same particle CTF andenvelop functions applied.

Example of CTF corrections
Before correction

After correction

Step 7. 2D画像の分類と平均像の作成(e2refine2d.py)
Input : all__ctf_flip_lp14.lst ( 5513 images with 56 x 56 pixels), Ncls :100

Example of “good” classes (class 0)
Included particles

Averaged image

Excluded particles

EMAN2の2D画像分類の算法(e2refine2d.py)
Iterative MSA (Multivariate Statistical Analysis) -based reference-free classification algorithm.
MSA and K-means for Rotational/translational invariant of 2D images
1. Initialize the iterative process by making some initial guesses at class-averages. These areinvariant-based, meaning even with MSA, this initial classification is not exceptionally good.
a. Generate rotational/translational invariants for each particle (input_fp)
b. Perform MSA on the invariants to define an orthogonal subspace representing the mostimportant differences among the classes (input_fp_basis) ( MSA may be PCA ?)c. Reproject the particles into the MSA subspace using --nbasis vectors (input_fp_basis_proj)
d. Classify the particles into --ncls classes using K-means (classmx_00)
e. Iterative class-averaging of the particles in each class to produce a set of initial averages(classes_init)

MSA and K-means for aligned 2D images

2. Align the current class-averages to each other, and sort them by similarity, keeping them
centered (allrefs_YY) (Note that YY starts with 01 and is incremented after each iteration)
3. Perform MSA on the (aligned) class-averages. Again, this represents largest differences, but
now performed on images, not invariants. (basis_YY)
4. Select a subset of --naliref averages to use as alignment references for this iteration (aliref_YY)
5. Align each particle to each of the reference averages from the last step. Keep the orientation
corresponding to the best-matching reference. (simmx_YY)
6. Project aligned particles using reference MSA vectors from basis_YY (input_YY_proj)
7. K-means classification of input_YY_proj (classmx_YY)
8. New iterative class-averages (classes_YY)
9. Loop back to step 2 until --iter loops are complete初期モデルの作成 (e2initialmodel.py)※D2の対称性の拘束を用いる.
4 つの代表画像から作成した場合8つの代表画像から作成した場合

56 x 56
56 x 56

56 x 56 x 56

56 x 56 x 56

3Dマップの精密化 1 (e2refine_easy.py)
Input : sets/all-bad1__ctf_flip_lp14.lst (5513 images with 56 x 56)
Initial 3D map is taken form the step 10 (initial model).
targetres : 18 Å
refined model1
Initial model
56 x 56 x 56

56 x 56 x 56

e2refine_easy.py
Includesre-classificationof 2D images.

3D マップの精密化2 (e2refine_easy.py)
Input : sets/all-bad1__ctf_flip_lp5.lst (5513 images with 128 x 128)
Initial 3D map is taken form the step 12 (3D refinement1).
targetres : 6 Å
refined model2
refined model1
56 x 56 x 56

128 x 128 x 128

最終精密化(e2refine_easy.py)

Input : sets/all-bad1__ctf_flip_fullres.lst (5513 images with 256 x 256)
Initial 3D map is taken form the step 13 (3D refinement2).
targetres : 4ÅFinal refinement
refined model2
256 x 256 x 256

FSC : Fourier Shell Correlation

128 x 128 x 128

Resolution: 4.1 Å

他のマップやX線構造との比較
Comparison with EMD-5995
Corr.Coeff. = 0.9175

Comparison with X-ray crystal structure (1dp0)
Corr.Coeff. = 0.7426(HOHs were removed.
Reso.For Sim.Map=4.0 Å)

RELION
MRCのSjor Scheres のグループが開発
2D分類と3D再構成のプログラムを提供。
動画補正、CTF補正などは、GUIから別のプ
ログラムを呼び出すことで対応。
2D分類と3D再構成では、ベイズ推定の枠組みを採用。最大事後確率推定(Maximum aposteriori estimation)のEMアルゴリズム。

3次元再構成では、周波数領域で行う。入力には、各2D画像を用い、２D平均画像は使わない。2D平均像は粒子抽出に用いる。
一つのサンプル(観察2D画像群)から、複数の3Dマップを推定することができる。
並列計算は、マルチコア(MPI), マルチスレッ
ドに加え、ver 2から、GPUにも対応。

クラスタマシンでなくてもGPU２枚付きの１台のデスクトップ機で現実的な時間で終了できる !

電顕の3D密度マップからの原子モデルの構築法

マップの解像度による形状特徴の違い
カプサイシンレセプターTRPV1の密度マップ[Cao et al., Nature, 504, 107(2013)]

解像度10Å（疑似データ）
ドメイン

解像度5Å （疑似データ）
２次構造（特にαへリックス)

解像度3.275Å(EMD-5778)

側鎖の一部（特にαへリックス)

密度マップから構築した原子モデル(PDB:3j5p)

モデリングの二つのアプローチ
高解像度の場合
低解像度の場合

デノボモデリングサブユニットの原子モデルを重ねる

マップだけで最初からモデリングする

x5

10～20Å

<4Å

低解像度

高解像度

解像度の目安

5Å以上

4Å以下

方針

サブユニットの原子モデル※を置く。それを変形・精密化

マップから原子モデルを構築。それを精密化

手作業で配置・モデリング

UCSF Chimera

COOT

自動で配置・モデリング

SITUS, IMP, gmfit

ROSETTA, PathWalker

変形・精密化MDFF (NAMD)

REFMAC,phenix_real_space_refine※ホモロジーモデリングによる予測構造もよく用いられる。

低解像度のモデリングの例
サブユニットの原子モデルを手作業で密度マップに重ねる

Clamp-loading complex
電顕による複合体の密度マップ
解像度:12Åx5Ｘ線結晶解析で解かれた
サブユニットの原子モデル

低解像度の密度マップ⇒

複合体の原子モデル

原子レベルの解像度のモデル

Miyata T, Suzuki H, Oyama T, Mayanagi K, Ishino Y, Morikawa K. (2005). Open clamp structure in theclamp-loading complex visualized by electron miscroscopic image analysis. PNAS, 102, 13795-13800.

Program SITUS
The popular software for docking of atomic models into 3D density map

http://situs.biomachina.org/

colores - Exhaustive One-At-A-Time
6D Search .colores is a rigid-body search
Points for
Points forSuperimposed tool, suitable for one-at-a-time fitting of
3D
denstiy
atomic model
structuresingle subunit structures, which are notnecessarily expected to account for theqdock : Representative 3D points
full map. The fitting procedure consists of 3 steps:
aregenerated using Vector Quantization.
(A) An exhaustive rigid body search on a discrete 6D
The superimposing problem becomes thelattice (B) an automatic ("black box") peak detection
based on the correlation scores on the lattice (C) the
matching between two groups of 3D points.

final off-lattice refinement of solutions to the nearest
maximum of the correlation).
53

ハイブリッド・モデリング
様々な部分的な実験情報を統合してモデリングを行うこと

ComplexSubunit1

Subunit2

Subunit3

いくつかの実験情報を満たすように最適化
マップへのフィット

反発

Subunits fit density map of the complex

repulsion among the subunits.

対称性

近接性

symmetric configuration of the subunits. Proximity (contact/interaction) of the subunits
obtained from the experiment (chemical crosslinking, mass spectroscopy..)IMP: Integrative Modeling Platform
Developed by Andrej Sali Lab

gmfit: fitting using Gaussian Mixture Model(GMM)
N

Mk

Atomic modelfor Subunit1

f C (r )   wii (r )f k (r )  wk  wk ,mk ,m (r )im

3D density map for Complex

GMM

GMM

EcmpfitCyclin-dependent
kinase2 (1finA)

EcmpfitErepuls

Atomic modelfor Subunit 2

Docking of the subunits
overlapping well with the complex

Etotal  Ecmpfit  Erepuls
GMM

Cyclin A(1finB)

GMM

Atomic model of Complex
K

Ecmpfit   ov( f k , f C )Overlap between two gdfs ov(A,B) can be obtained analytically.
ov( A , B )    A (r )B (r )dr 1(2 )3 / 2  A   B

1/ 2

 1

1
exp ( μ A  μB )T  A   B  ( μ A  μB )
 2


k

K

K

Erepuls    ov( f k , f k  )k k  k

Kawabata, Biophys.J.95,4643-4658 (2008)

Fitting Test: Botulinum Toxin (emd-2467)
Manually
Modelled by
the authors

Manually Modeled by the authors

Modelled by us

EMD-2467

Modeled by gmfit

Botulinum Neurotoxin
Resolution 30 Å. Ngauss=20.

Prediction with the Segmentation-Fitting initialization.
NI=1000, NS=100, 0.779089 Ngauss for complex = 20
Letet al, (2013), Structure of a. Structure of a Bimodular Botulinum Neurotoxin
Complex Provides Insights into Its Oral Toxity. PLOS PATHOGENS, Volume 9, Issue 10, Ngauss for subunit = 20

e1003690

2 subunits ( transformed
into GMM with Ngauss= 20)

Composed of 14 chains:
4ho4 x 1

M-PTC: BoNT x 1, NTN-HA x 1
HAcomplex: HA70 x 3, HA17 x 3, HA33 x 6

4ho7 x 3
M-PTC(3v0aAB)

HAcomplex(4ho4/4ho7)

Fitting Test: polyketide synthase (emd-5647)
Manuallymodelled by theauthors

Modelled by us

KS

KS

AT
AT

ACP

AT

AT

KR
KR

Emd_5647

Manually modeled by theauthors

Prediction with the Min-energy
of Symmetric SegmentationFitting initialization.
NI=1000, NS=100,CC=0.84.
Ngauss for complex = 20
Ngauss for subunit = 8

5th module from Pikromycin biosynthetic
pathway (PikAIII) withphosphopantetheinylated ACPResolution 9.2Å. Ngauss=20 or 40.

Dutta et al, (2014), Structure of a modular polyketide
synthase. Nature, 510, 512-517, 2014

ACP

KR
ACP
ACP

KR

Prediction with the Min-energy
of Symmetric SegmentationFitting initialization.
NI=1000, NS=100,CC=0.80.
Ngauss for complex = 40
Ngauss for subunit = 16

C2 symmetric restraintx2

KS domain
dimer(2hg4)

AT domain(2hg4)

x2

KR domain(2fr0)

x2
ACP
domain(2ju1)

7 subunits(each subunit istransformed into
GMM with
Ngauss=8 or 16)

gmfit のWEBサービス
Fitting assemblies can be obtained by gmfit
program by clicking the link “View fitting” in
the Omokage search page.

Map vs. map
EMDB 2190
EMDB 1883(RNA polymerase II)

Map vs. atomic model

If you googled by “gmfit”, you can find the“Pairwise gmfit” page.

EMDB 1095
PDB 4aas(GroEL)

Atomic model vs.
uploaduploadatomic model

uploaduploadPDB 3ifv
PDB 4k3l

You can input two emdb_id / pdb_id or
upload your own map / pdb files for the fitting.

(DNA clamps, dimer vs.
trimer)「Omokage検索」のサービス
As the query, EMDB_ID ,PDB_ID and SASBDB_ID
are available.

Query is EMDB-2190.

Omokage search
1-2 min

Users can upload their own
model or map file as query.

Human RNA polymerase II
Many maps and atomic modelsof RNA polymerase II are found.
Map vs Map
comparison
Map vs Atomcomparison

gmfit

gmfit
EMDB-2191 humanRNA polymerase II incomplex with B2 RNA

PDB-4a3i RNAPolymerase II
binary complex
with DNA

PDB-5c44 transcribing
RNA Polymerase II
complex

PDB-4bxx RNA
polymerase II complexes
with Bye1, a chromatinbinding PHF3 DIDO
homologue

PDB-4bbr RNA
EMDB-2192 human RNA
polymerase II-TFIIB polymerase II in complex
complexwith B2 81-131 RNA

PDB-1y1w
Complete RNAPolymerase II
elongation complex

PDB-2b8k 12subunit RNAPolymerase II

PDB-3k1f RNA
PDB-2r92 Elongation
PDB-4bxz RNA PDB-5c3e a transcribing RNAPolymerase II incomplex of RNA polymerase Polymerase II- Polymerase II complex reveals
complex with TFIIB II with artificial RdRP
Bye1 complex
a complete transcription bubble
scaffold

PDB-3h0g RNAPolymerase II from
Schizosaccharomyces
pombe

PDB-3j0k RNA
polymerase II within thehuman VP16-Mediatorpol II-TFIIF assembly

EMDB-2188 humanRNA polymerase II incomplex with scAlu
RNA

PDB-4a93 RNA
Polymerase II elongation
complex containing a
CPD Lesion

デノボモデリング:ROSETTAROSETTAを用いたモデリングの手続き

Ray Yu-Ruei Wang Mikhail Kudryashev Xueming Li
Edward H Egelman Marek Basler Yifan Cheng David
Baker Frank DiMaio. De novo protein structure
determination from near-atomic-resolution cryo-EM
maps, Nature Methods 12, 335–338 (2015)

密度マップを、ドメイン程度の小さい領域に切り出す(セグメン
テーション）が必須

デノボモデリング:PathWalker
アミノ酸に相当する点群を生成、それをできるだけタンパク質らしく鎖で結んでいく方法

密度マップを、ドメイン程度の小さい領域に切り出す(セグメンテーション）が必須
Muyuan Chena, c, Philip R. Baldwinb, c, Steven J. Ludtkec, Matthew L. Bakerc, De Novo modeling in cryo-EM density
maps with Pathwalking, J Str Biol, 196,289–298 (2016)

電顕による原子モデルを使うための注意点
1. 原子モデルの元となった密度マップを重ねて表示し、妥当なモデリングか確認する必要。（PDBに対応するEMDB IDが記載されている。表示はUCSF Chimeraを推奨。[tool]->[Volume Data]->[Volume Viewer]で簡単にしきい値を変えて表示できる。）

原子モデルのどの部分が、きちんと対応する密度があ
るか、また、原子モデルが置けていないマップの部分があるかなどが確認できる。

EMD-3061, PDB-5a63

2. X線結晶解析に比べて、一つのマップの部分において実質的な解像度が異なる場合がある。例えば、分子表面と分子の内側、膜貫通領域と可溶性領域で様相が異なることに注意。
3. 3~4Åの解像度のマップでは、おおまかなアミノ酸部位、結合部位などはわかるが、側鎖や結合分子の配座はそれほど正確ではないことに注意。