吸光度計による微細藻類の培養密度推定法

水産技術，9（1），27 － 31，2017

Journal of Fisheries Technology，9（1），27 － 31，2017

短報

吸光光度計を利用した餌料用微細藻培養密度の簡易推定法
川崎琢真・清水洋平・多田匡秀＊Simple method for density measurement of cultured algae applying an absorption
spectrometer
Takuma KAWASAKI, Yohei SHIMIZU and Masahide TADA
In the fisheries industry, microalgae are used as aquaculture feed for larval fish and crustaceans and as culture
water additives. Methods that use tools such as a counting chamber require a considerable amount of time todetermine the density of microalgae as aquaculture feed. The present study thus aimed to develop a method ofcell density estimation using a simple absorption spectrometer in six species of microalgae. The absorbanceof microalgal cultures showed clear peaks near 430 to 470nm and 680nm, and there’s a significant correlation
between the algal density and the absorbance at 470nm. No differences were observed between the counting
chamber and the absorption spectrometer in cultures of four of the six species, suggesting that the cell density
can be effectively estimated using an absorption spectrometer.
キーワード：微細藻類，餌料，密度推定，吸光光度法
2015 年 9 月 2 日受付，2016 年 11 月 14 日受理
微細藻類は，貝類や甲殻類などの無脊椎動物の初期餌

奥村 2000，加藤ら 2004，杉山ら 2013）および Utermohl

料，魚類の飼育水添加剤および餌料生物用の餌として利法（Hasle1978，勢村 1995，原口・谷口 2003）などが，用されている。特に，二枚貝の種苗生産現場において餌機器による計測法としてクロロフィル計を用いる方法

料となる微細藻類の確保は必須であり，生産現場で培養（山崎・疋田 2013）およびコールターカウンターを用いするか，市販の濃縮品を購入して利用するのが一般的でる方法（石川・磯和 2012）などが報告されている。こある。国内で餌料として用いられる微細藻類は約 20 種

れらの方法の中で，目視による計数法は大量の種苗生産程度（岡内 2014）とされており，対象種や育成段階毎時には手間がかかること，計数に用いられる機器は一般に適した種類を用いる必要がある。に高額で限られた機関でしか利用できないことが課題で水産分野で用いられている微細藻類のうち，汎用的なある。

株は国立研究開発法人水産総合研究センターで保存さ吸光光度法は，溶液中の溶解物又は懸濁物の定量法とれ，種苗生産機関に配布されている（岡内 2011）。餌料して，研究分野で広く利用されている。対象とする試料用微細藻類のうち，Chaetoceros 属や Nannochloropsis 属

は化合物の他，生体物質にも有効であり，核酸，イムノの一部は濃縮品が市販されているが，その他の微細藻類

グロブリン，細胞数および大腸菌数などの汎用的な測定を用いる場合には保存株から拡大培養して用いるのが一対象については，機器毎に自動濃度計算が可能なソフトウェアを内蔵する機器も増えて来ている。西澤・千原

般的である。
二枚貝の種苗生産において，餌料として用いる微細藻（1979）は、藻体懸濁液について吸光度と藻体濃度の関類の量は，飼育水 1mL 当たりの細胞数を基準として計係から検量線を作成することで定量が可能であると提案量される場合が多い。培養した微細藻類の密度の決定は，しているが、これまで種苗生産の現場で餌料として用い目視による計数法として血球計算盤を用いる方法（中島・る培養微細藻類の濃度管理に利用された例は示されてい＊

地方独立行政法人北海道立総合研究機構栽培水産試験場〒 051-0013

北海道室蘭市舟見町 156 番 3 号

Mariculture Fisheries Research Institute, Hokkaido Reserch Organization, Hunami 156-3, Muroran, Hokkaido 051-0013, Japan
kawasaki-takuma@hro.or.jp― 27 ―

ない。

吸光度計での細胞密度推定の有効性を検証するため，そこで本研究では，水産分野で培養して利用される微3 種類の異なる容器（A，B，C）で培養した 6 種各 3 本

細藻類 6 種を対象に，小型の吸光度計を用いて細胞密度の微細藻類培養液を用い，血球計算盤を用いる方法およを簡易に推定する方法の開発を試みた。

び吸光度計の測定値を標準曲線に当てはめる方法でそれぞれの細胞密度を求めた 2 つの異なる方法により得られ材料と方法た細胞密度の平均値を t 検定により比較した。
本研究において使用した回帰分析および t 検定はすべ試験に用いた微細藻類は，国立研究開発法人水産総合て Statcel3 ソフトウェア（柳井 2013）を用いて解析した。

研究センター増養殖研究所および瀬戸内海区水産研究所
より元株の配布を受けたものを拡大培養して使用した（表 1）。培養液は全ての種で共通とし，120℃で 20 分の結果

高圧蒸気滅菌を施した濾過海水 1L に対し，市販培養液異なる 6 種の微細藻類培養液を用いて 400 ～ 900nm（KW21 第一製網）1mL，50g/L メタケイ酸ナトリウム水（5nm 間隔）での吸光度を測定した結果，すべての種で溶液 1mL の割合で添加した。微細藻類の元株を添加し430 ～ 470nm 付近と 680nm 付近に顕著な吸光度のピーた培養液を容量 1 リットルの培養袋（エニーロック 3 号ク が 見 ら れ た。 こ の う ち， 珪 藻 類 で あ る Chaetoceros

セット BC-AL03SET 株式会社バイオメディカルサイエ

neogracile と Phaeodactylum tricoruntum は 440nm 付 近 でンス）とエアレーションを用いて 20℃で通気培養した。のピークが 680nm 付近のピークに比べ高かった。その培養した微細藻類は，対数増殖期に達した段階で培養を他 4 種では，430 ～ 470nm 付近と 680nm 付近のピーク停止し，各試験に供した。の高さは同程度であった。

本試験で対象とする 6 種の微細藻類の吸光特性を調べ

微細藻類 6 種の培養液の細胞密度と 470nm での吸光るため，各種微細藻類の培養液 2mL を光路長 10mm の度の関係から散布図を描いた結果，すべての株で細胞ディスポーザブルセル（ディスポセル 2711 ケニス株式

密度と吸光度の間に有意な正の相関が見られた（図 1）。

会社）に入れ，紫外・可視分光光度計（DU730 ベック

また，線形近似により得た近似式は，全ての種で R のマンコールター株式会社）で 400 ～ 900nm の範囲の吸値が 0.96 以上であった。簡易吸光度計の検出範囲であ光度を 5nm 毎に測定した。

る吸光度 0.05 ～ 1.50 の範囲において検出可能な細胞密2培養微細藻類の密度と吸光度の関係を調べる為，6 種度を標準曲線の式から求めた結果，C. neogracile ではおの微細藻類を各種 3 又は 4 本の培養袋で培養を行った。

よそ 40 万～ 750 万細胞 /mL，P. tricoruntum ではおよそ微細藻類培養液を，トーマ血球計算盤（03-101-1 エルマ

20 万 ～ 880 万 細 胞 /mL，Pavlova lutheri で は お よ そ 30販売株式会社）を用いて生物顕微鏡（Nikon Eclipse 80i）

万～ 710 万細胞 /mL，Isochrysis sp.（Tahiti）ではおよそ下で培養袋毎に 6 回計数して平均値を求めた。続いて，

30 万～ 1000 万細胞 /mL，Tetraselmis tetrathele ではおよ

計数済みの微細藻類培養液を未使用の滅菌培養液で 1/2

そ 4 万 ～ 220 万 細 胞 /mL，Nannochloropsis oculata で は希釈を繰り返しながら，単波長吸光度計（吸光度計 B

およそ 80 万～ 2200 万細胞 /mL 程度の範囲と推定された。

ABS-B470 株式会社共立理化学研究所）で 470nm の吸血球計算盤と吸光度計により細胞密度を求めて平均値光度を測定した。測定容器は光路長 20mm の専用カップを比較したところ，C. neogracile，P. lutheri，T. tetrathele（WAK-CC10 株式会社共立理化学研究所）を用いた。次および N. oculata では 2 つの方法で求めた細胞密度の平に，微細藻類の細胞密度と吸光度計により測定した吸光均値に有意な差は見られなかった。P. tricoruntum では度から散布図を描画し，近似式を計算して標準曲線とし3 本の培養液の内 2 本で，血球計算盤に比べ吸光度計でた。また，細胞密度と吸光度の関係を回帰分析により解求めた細胞密度が有意に高い値を示した。I. sp.（Tahiti）

析した。さらに，得られた標準曲線を用いて，簡易吸光では 3 本の培養液のうち 2 本で血球計算盤に比べ吸光度度計の検出範囲で推定できる細胞密度の範囲を求めた。

計で求めた細胞密度が有意に低い値を示した。また，全ての株において血球計算盤に比べ吸光度計で推定した場合の方が結果のばらつきが小さくなる傾向が見られた

表 1．試験に用いた微細藻類の種類と株名

グループ（図 2）。

種名

株名

珪藻類

Chaetoceros neogracile

NRIA-0023

珪藻類

Phaeodactylum tricoruntum

NRIA-0065

ハプト藻類Pavlova lutheri

NRIA-0080

ハプト藻類

本研究において，微細藻類 6 種の 400 ～ 900nm におIsochrysis sp.（Tahiti）

NRIA-0076

ブラシノ藻類

ける吸光特性を調べた結果，種共通で 430 ～ 470nm 付

Tetraselmis tetrathele

NRIA-0090

真正眼点藻類近と 680nm 付近に顕著な吸光度のピークが見られた。

Nannochloropsis oculata

NRIA-0098

すべての光合成植物が持つクロロフィル a の吸収極大波

考― 28 ―

察

③吸光度計による微細藻類の培養密度推定法

123456810m）
L116 ／
1 0個

9細胞数（

712131415161718吸光度
図 1．微細藻類 6 種の細胞密度と吸光度の関係
点線は 95% 信頼区間を示す

19679nm付近（植木ら
2 0 長は1430nm
6 c m 付近とカラー指定 な し 2010）であり，用微細藻類培養液中の細胞密度を吸光度測定により推定

本研究で見られた 680nm 付近の吸光度のピークはクロできる可能性が示された。試験に用いた 6 種の微細藻類

カロテノイドには多くの種類が存在し，珪藻およびハプ

oculata では，吸光度計と血球計算盤で同等の結果が得

2 1 ロフィル
図 1a．
微細藻類 6 種の細胞密度と吸光度 の 関neogracile，P.
係由来と推察された。また，光合成生物が持つのうち，C.
lutheri，T. tetrathele, および N.
2 2 ト藻ではフコキサンチン（吸収極大波長
点 線 は 9 5 % 信 頼 区449nm）
間 を，真正示すられた。P. tricoruntum では，血球計算盤に比べ吸光度計

眼点藻類ではビオラキサンチン（吸収極大波長 441nm）を用いた場合に細胞密度が高く，I. sp.（Tahiti）では逆が主成分と報告されている（高市 2009）。本研究で見らに吸光度計による推定値が低くなる傾向が見られた。これた 430 ～ 470nm 付近のピークは種を問わずなだらか

れら 2 種で推定が困難な原因の 1 つとして，培養液中にであったことから，複数種のカロテノイドおよび前述の生じた微細藻類のフロックが計数または吸光度計の結果

2 5 クロロフィル a の吸光特性が混在した状態での吸光スペに影響を及ぼしたと考えられるが、違いが生じた理由はクトルである可能性が高い。本研究で用いた 470nm の不明である。さらに，本試験で用いた 6 種の微細藻類で吸光度は，微細藻類の持つクロロフィル a およびカロテ12は，測定可能な細胞密度の範囲が大きく異なることが明2324

ノイド類の吸光度をターゲットとした測定を実施したと考えられる。

らかとなった。この原因を本研究で明らかとすることはできないが，細胞の小さな N. oculata が最も高密度まで

本研究で調べた細胞密度と吸光度との関係から，餌料推定でき，それに比べ細胞の大きな P. tricoruntum では― 29 ―

③1234568912m）
L116 ／
1 0個

10細胞数（7131415161718192021

図 2．血球計算盤（白）と吸光度（灰）から算出した細胞密度の比較
A から C は各株を異なる容器で培養した培養液を示す。白色のバーは血球計算盤で求めた細胞密度（N ＝ 6）を，灰色のバー＊は吸光度計で求めた細胞密度（N ＝ 3）を示す。バーの上部の縦棒は標準偏差を表す。 及び＊＊は有意差があることを＊＊＊示す（ ウェルチ t 検定（p ＜ 0.05）， スチューデント t 検定（p ＜ 0.01））

16cm

カラー指定なし

図 2． 血 球 計 算 盤 （ 白 ） と 吸 光 度 （ 灰 ） か ら 算 出 し た 細 胞 密 度 の 比 較推定できる密度が低かったことから，細胞の大きさや含内 2014）。本研究で用いたのは対数増殖期の培養液であ2 2まれる色素量が関係していると推察される。
A か ら C は 各 株 を 異 な る 容 器 で 培 養り，定常期や死滅期の培養細胞や濃縮細胞およびそれらし た 培 養 液 を 示 す 。白 色 の バ ー は 血
本研究により試みた単波長吸光度計による細胞密度のの日周性など様々な条件の培養液の密度推定には，別途有効性の確認が必要である。
2 3推定方法は，一度標準曲線を描いて各吸光度から細胞密球 計 算 盤 で 求 め た 細 胞 密 度 （ N=6） を，灰 色 の バ ー は 吸 光 度 計 で 求 め た度の変換表を作成しておけば，血球計算盤で測定する方以上の結果より，餌料用微細藻類の培養液の細胞密枚貝等の浮遊幼生飼育試験において，自家培養した微細および N. oculata の 4 種の微細藻類においては簡易吸光

2 4法に比べ，手早く密度を決定することが可能である。二細 胞 密 度 （ N = 3 ） を 示 す 。 バ ー の 上 度の管理において，C.
部の縦棒は標準偏差を表す 。 *tetrathele及び
neogracile，P.
lutheri，T.
2 5藻類を給餌する場合などには，給餌条件を揃えるために**は 有 意 差 が あ る こ と を 示 す （ *ウ ェル チ ｔ 検 定 （ p<0.05） ,**ス チ ュ ー
度計を用いた迅速な計測ができる可能性が示された。こ培養液中の細胞密度の計数が必要となる場合がある。この方法は，自家培養を要する餌料用微細藻類の密度測定のように頻繁に計数が必要となる場面において，吸光度13作業を大幅に軽量化できる可能性がある。また本方法に計による細胞密度推定は作業の軽量化に非常に有効な手用いた簡易吸光度計は小型・安価で乾電池で利用できる段となりうる。一方，微細藻類の培養では，増殖段階ことから，種苗生産現場等への普及も容易な機器である。

毎に細胞の様相が変化することが報告されている（岡ただし，本研究で用いている標準曲線は普遍的なもので― 30 ―

吸光度計による微細藻類の培養密度推定法は無いと考えられるため，利用機関毎に標準化の実施と

5） 中島幹二・奥村裕弥（2000）人工光利用による餌料用微小定期的な精度確認が必要である。

藻類 Pavlova lutheri の培養器大型化に関する考察．照明学
会誌，84（8A），502-506．

謝辞6） 西澤一俊・千原光雄（1979）藻類研究法．共立出版，東京，278-280p.

本研究を遂行するに当たり，微細藻類を配布していた

7） 岡内正典（2011）餌料となる微細藻類の培養を簡単に！．

だいた国立研究開発法人水産総合研究センター増養殖研
究所の岡内正典氏および瀬戸内海区水産研究所の兼松正

養殖，611，50-53．
8） 岡内正典（2014）餌料用微細藻類の高増殖株作出とその培衛氏にお礼申し上げる。また，本研究におけるデータ分
析に関し，包括的な助言を頂いた北海道立総合研究機構

養法および利用．日本水産学会誌，80（3），323-326．
9） 勢村均（1995）イタヤガイ成貝における餌料プランクト

栽培水産試験場の石田良太郎氏，城幹昌氏に深く感謝す

ンの種および濃度と濾水速度，消化率，同化速度との関係．

る。

日本水産学会誌，61（5），673-678．
10）杉山勇作・上野幹憲・Cyril Glenn Perez SATUITO・山下憲司・

引用文献

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同時添加が植物プランクトン群集の増殖と種組成に及ぼす

紅藻スサビノリの光合成色素と葉緑体微細構造における栄2） 原口浩一・谷口

養欠乏応答．日本水産学会誌，76，375-382．

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潔（2012）白色発光ダイオード（LED）

13）山 崎 康 裕・ 疋 田 拓 也（2013） 珪 藻 類 キ ー ト セ ロ ス

を用いた餌料用微細藻類の培養．水産技術，4（2），51-

Chaetoceros neogracile の培養液を用いた餌料用微細藻類パ55．

ブロバ Pavlova lutheri の増殖改善．日本水産学会誌，79，3） 石川卓・磯和4） 加藤元一・岡内正典・中神秀一（2004）珪藻類キートセロ
ス属 2 種の濃縮技術の開発と濃縮細胞の再生．水産増殖，875-877．
14）柳井久江（2013）4step エクセル統計．オーエムエス出版，

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