ChromaNik

新技術説明会

ここでしか聞けないカラムの初耳学（真実）：同じカラムで保持が違うその理由～C18、C8、C30はどう違う～①

C18はC8より疎水性が高いので、C18はC8より保持が大きい？

②

Dewettingと表現することがある。これは正しい表現なのか？

③

アルキル基は立ち上がっているか？

④

新規エンドキャッピング

（クロマニックテクノロジーズ）
長江 徳和

1

ChromaNik

疎水性Methane (C1)

Octane (C8)Octadecane(C18)

Triacontane(C30)

分配係数(LogP)

1.09

5.18

9.18

14.09

水への溶解度 (mg/L)

22.6

0.66

0.006

8.84×10-10

疎水性(LogP)はn-オクタノールと水への分配比率により定義される
C30は最も疎水性が高いが，これは水への溶解度が低いことが大きく影響する.
化合物の保持予測として用いられる化合物は，一般的にLogPが1から6の間のものである.
2

ChromaNik

C18固定相の保持
1

C18, 2.3 μmol/m2,%C=17%

Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=(98:2)

2

Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ºC

4

8

1

12

16 minC18, 1.2 μmol/m2,%C=11%

Detection: UV @450nm
Sample: 1= Tocopherol
2= Tocopherol acetate

2

4

8

12

16 min固定相の体積（結合密度）が半分になると保持もおおよそ半分になる.
3

ChromaNik

逆相固定相の選択性および保持
O
H3C

O

CH3

OH

N

N
N

CH3

N

CH3

CH3

水素結合性

疎水性

疎水性

立体選択性

α(カフェイン/フェノール）α(アミルベンゼン/ブチルベンゼン）

アミルベンゼンの保持係数α(o-ターフェニル/トリフェニレン）

固定相

炭素含有量

C30

18%

C18

18%

0.34

C8

11%

0.29

C1

4.5%

Phenyl

8%

Cyano

7%

0.50

0.51
0.69
0.48

1.72

18.9

1.68

19.7
9.4

1.55
1.43

2.3

1.38

2.5

1.16

0.4

1.73
1.44
0.89
0.99
0.87
1.97

★固定相：シリカ基材の細孔径，12nm，一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水=70/30，温度：30℃

C8固定相はC18固定相に比べ固定相体積（炭素含有量）は約半分であり，アミルベンゼンの保持も同様に約半分である.
4

ChromaNik

固定相の体積（結合密度）が半分になると保持もおおよそ半分になる.

C8固定相(%C=11%)はC18固定相（1.2 μmol/m2,%C=11%）と

C8固定相はC18固定相に比べ体積は半分であり，アミルベン
ゼンの保持も半分である.

体積（炭素含有）も，保持も同じである.

5

ChromaNik

保持係数(k)と分配比（Kd)SD x VSSk==
M
MD x VM
SD
Kd =MD

S: 固定相中の溶質の存在量
M：移動相中の溶質の存在量
SD：固定相中の溶質の分配濃度
MD: 移動相中の要旨値の分配濃度
VS：固定相の体積（容積）VM：移動相の容積

C8固定相(%C=11%)とC18固定相（1.2 μmol/m2, %C=11%）は固定相体積(VS)が同じで保持係数(k)も同じであるので，分配比（Kd)も同じ値になる.
6

ChromaNik

固定相の体積が2倍異なるC18固定相の保持係数(k)と分配比（Kd)
固定相

炭素含有量

結合密度

固定相体積

移動相体積

C18 (A)17%

2.3 μmol/m2

0.4 mL

1.6 mLC18 (B)11%

1.2 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mL
4.6x150mmカラムを使用

C18（A, B)は同じ固定相なので，分配比（Kd)は同じだと仮定する.
C18 (A) の場合

C18 (B) の場合

kA
kB

0.4

ｘ 0.250.25 Kd

ｘ 0.130.13 Kd

1.6
0.23
1.77

C18(A)はC18(B)の約2倍の保持係数になる.
7

ChromaNik

固定相の体積が異なる場合＜＜同じ固定相では分配濃度比が同じと仮定する（固定相/移動相=1）＞＞

例えばC18(%C=18%)
移動相への分配量(0.5)

移動相と固定相への分配濃度比は同じであるため，分配量の比(k)は体積比となる。

移動相
固定相

k=0.5/0.5=1
固定相への分配量(0.5)

固定相の体積が半分のC18（％C=9%)
移動相への分配量(0.75)

k=0.25/0.75=0.33
固定相への分配量(0.25)88ChromaNik

固定相の体積が同じC18とC8固定相の保持係数(k)と分配比（Kd)
固定相

炭素含有量

結合密度

固定相体積

移動相体積

C18 (A)17%

2.3 μmol/m2

0.4 mL

1.6 mLC18 (B)11%

1.2 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mLC811%

2.4 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mL
4.6x150mmカラムを使用

C18とC8固定相分配比（Kd)はKdC18, KdC8
C18 (B) の場合

C8 の場合

kC18
kC8

0.23

ｘ 0.130.13 KdC18

ｘ 0.130.13 KdC8

1.77
0.23
1.77

C18(B)とC8の保持係数は同じであるため， KdC18とKdC8も同じである.
9

ChromaNik

逆相固定相の選択性および保持
O
H3C

O

CH3
OH

N

N
N

CH3

N

CH3

CH3

水素結合性

固定相

炭素含有量

C30

18%

C18

18%

0.34

C8

11%

0.29

C1

4.5%

Phenyl

8%

Cyano

7%

α(カフェイン/フェノール）

疎水性

疎水性

立体選択性

α(アミルベンゼン/ブチルベンゼン）

アミルベンゼンの保持係数α(o-ターフェニル/トリフェニレン）

0.50

0.51
0.69
0.48

1.72

18.9

1.68

19.7

1.55

9.4

1.43

2.3

1.38

2.5

1.16

0.4

1.73
1.44
0.89
0.99
0.87
1.97

★固定相：一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水=70/30，温度：30℃

・炭素一個の差（アミルベンゼンとブチルベンゼンの分離係数）はアルキル鎖長と相関があるように見える.
・しかし保持時間が大きく異なる分離での比較である.
10

ChromaNik

炭素一個の差の分離係数
C30
C18
C8
アルキル鎖長が長いほど分離係数（α）は大きい.

しかし

C1
保持時間を一緒にすると炭素が一個異なる成分（トルエン，エチルベンゼン）の分離係数（α）は同じである.

カラムサイズ：4.6×150㎜
移動相：メタノール/水、有機溶媒濃度は図中に表示
流 速：1.0 mL/min，温度：30℃，
試 料：1=メチルパラベン，2=エチルパラベン，
3=ベンゼン，4=トルエン，5=ナフタレン，6=エチルベンゼン

保持が同じ場合の炭素一個の差の成分の分離係数を固定相の疎水性と定義すれば，アルキル鎖長の差は疎水性に関係しない.11

ChromaNik

まとめ
1. C30, C18およびC8の固定相自身の疎水性は大きく異なる.
2. しかし固定相と移動相に分配する溶質から論じた場合，この溶質の分配(濃度)比はどの固定相でもほぼ同じである.
3. つまり，固定相体積と固定相への溶質の分配量（分配濃度が同じである
ため）はほぼ比例し，保持も同様に比例する.
4. 保持係数(k)は固定相と移動相の分配(濃度)比(Kd)で決まるわけではなく，分配濃度に固定相・移動相の体積・容積を乗じた固定相中と移動相中に存在する溶質の量により決まる.
5. もちろんアルキル鎖長の違いにより，選択性は異なる.
6. フェノールのような極性の高い成分は固定相の表面とのみ相互作用する
ため，固定相の体積は関係なくなり，表面積が保持係数に関わってくる.

12

ChromaNik

逆相アルキル基は立ち上がっている，寝込んでいる？
濡れている，濡れていない(non-wetting)？
逆相HPLCにおける水または緩衝液のみの移動相を用いた分析の問題点

13ChromaNik

水移動相ではODSカラムの保持が減少する
特にポンプを停止した後は大きく減少
条件
カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
流速: 1.0 mL/min
１時間通液停止後再度通液し測定

温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

保持時間：5.40minから0.41minに減少

再現性がない14

ChromaNik

アルキル基の寝込みによる説明の元となったと思われる論文

1979年
アルキル基の寝込みに関する論文
C18の寝込みについて記述されている

1980年 有機溶媒を含まない水系移動相を用いた場合の保持の減少をアルキル基の寝込みと主張した論文

15

ChromaNik

アルキル基の寝込みによる説明
1999年，アルキル基の寝込みによる保持減少の記述
Mobile phase: Acetonitrile/water =10/90

固定相は移動相で濡れている。
アルキル基は立ち上がっている.
水でカラムを洗浄す
ると，アルキル基は寝込んでしまう.
これをBondedphase collapseと表現している.
再び移動相を流しても寝込みのため，保持は小さくなっている.
16

ChromaNik

現在の移動相の細孔からの抜け出しによる説明
2013年，アルキル基の寝込みによるDewettingの結果，移動相は抜け出る
RONALD E. MAJORS, LCGC North America, Jul 1, 2013

水移動相ではアルキル基は寝込んでしまい，Phase collapseがおこる。Phase
collapse状態になると移動相と濡れなくなり，移動相は細孔から抜け出す.

アルキル基は立ち上がって
おり，固定相は移動相で濡れている.移動相は細孔から抜け出さない.

Dewetting とは１）アルキル基が立ち上がっている
状態がWetting２）アルキル基が寝込んだ状態になるとnon-wetting１の状態から２の状態に変化する事をDewettingと表現している！or？
17ChromaNik

Dewettingとは？

http://www.mynewsdesk.com/uk/northumbria-university/pressreleases/its-delightful-its-dynamic-its-dewetting-1582445

Dewetting とは接触角が大きくなること！！
細孔から液体が抜けることではない！！
実は移動相を換えない限り，逆相固定相表面と移動相の接触角は変化しない！！
18

ChromaNik

他社のDewettingの説明
実は固定相表面は移動相で濡れていない。
毛管作用で抜け出そうとする圧力以上の圧がかかっているので，細孔に留まっているだけである。
Dewetting
Phenomenon

毛管作用で抜け出そうとする圧力以下の圧まで下がると，細孔から抜け出る。
これは毛管現象である。

19

ChromaNik

毛管現象とは（岩波 理化学辞典 第5版）

液体中に細い管（毛細管）を立てると、管内において液面が管外よりも上がりまたは下がる現象。液体分子間の凝集力と液体と管壁の間の付着力との大小関係により，液体が管を濡らす（付着力が大きい）ときは液面は上昇し、濡らさないときは下降する。管の内外の液面の高さの差をh、管の半径をr、液体の密度をρ、液体の表面張力をγ、接触角をθ、重力加速度をgとすれば、h=2γcosθ/rρgとなる。
20

ChromaNik

毛管現象
Capillarity, Capillary phenomenon
水とガラス管の場合

毛管現象の式:h=2γ cosθ /(rρg)γ : 表面張力
ρ: 液体の密度(比重)

水とテフロン管の場合

θ
g
r
h

r

h

θ

液体が管に濡れる場合
θ < 90°液体が管に濡れない場合
θ > 90°21

ChromaNik

毛管現象
内径0.5 mmのガラス管

10 nm

内径0.5 mmのガラス管内で赤インクは6 cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006
気圧である。内径が1 μmでは30 m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。
22

ChromaNik

水100%移動相条件下で保持が減少する理由
カラム内のC18充塡剤粒子

移動相：水充填剤に圧力がかかっている場合

ポンプを停止し充填剤に圧力がからなくなると細孔内に移動相が浸透している状態

細孔内から移動相が抜け出た状態

Permeating

Expelling
Depermeating
23

ChromaNik

疑問その５ C18表面と30%メタノールは濡れるか？
上から見た場合それぞれの溶液にC18充填剤を混ぜ、超音波の振動を加えながら撹拌混合した.
・70%メタノールでは超音波の振動を加えなくても完全にC18充填剤が分散する. 分散後沈降し始める.

横から見た場合（濡れるため，細孔内に溶液が入り込み分散する）

・50%メタノールでは一部分散している.
（超音波振動を加えない場合は全く分散しない）（濡れないため，細孔内に溶液は入り込めない）

・30%メタノールでは全く分散していない.
（濡れないため，細孔内に溶液は入り込めない）
メタノール/水(30:70)(50:50)(70:30)T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

発表者の回答：メタノール濃度が50%以下の溶液はC18表面に濡れないため、細孔内に入り込めない. しかし，圧力をかける，また100%メタノールで濡れている状態から溶液を切り替えた場合には30%メタノールでも細孔内に入り込み，その後大気圧にしても細孔から抜け出すことはない.
濡れ性は固定相の寝込み(Phase collapse)で決まるのではなく，移動相（溶液）により決まる.
24

ChromaNik

疑問その６ 大気圧が低ければC18カラムから移動相は抜け出すか？
カラム: C18 250x4.6mm
模擬大気圧: 0.01MPa
カラム温度: 40 ℃

＊真空ポンプでカラム内の圧力を大気圧以下にし、20分間放置＊充填剤細孔から移動相が抜けた場合にはカラムの重量が変化＊70%以上のメタノールをカラムに通液した場合は0.01MPaでも充填剤細孔からの移動相溶液の抜け
出しはほとんど認められず，50%以下では移動相溶
液は抜け出している.
＊70%以上のメタノールではC18充填剤が濡れるため，毛管作用により細孔内へ入り込む力が働き，充填剤細孔から溶液は抜け出ないが、50%以下では濡れないため，抜け出そうとする.

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)

0
-0.05

発表者の回答：毛管作用とは，濡れる（接触角が90度未満）場合には毛細管内に入り込む力が働き，逆に濡れない（接触角が90度より大きい）場合には毛細管から抜け出す力が働くことである.
メタノール濃度50％以下の濃度ではC18充填剤の細孔内から移動
相を抜き出す力が働く. その力が0.01MPaより大きいため左図に示されているようにカラムから移動相溶液が抜け出す.
通常10％以上のメタノール濃度の移動相を用いれば，保持の減少は起こらない. これはC18充填剤細孔内から移動相溶液を抜け出させる圧力が大気圧（1気圧）より低いためである.

-0.1
-0.15
-0.2
-0.25
-0.3
-0.35
-0.4
-0.45
-0.5
0

20

40

60

80

100

メタノール/水移動相のメタノール濃度(%)
N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU Vol. 59, No. 3, 193 (2010).

25

ChromaNik

疑問その８ Dewetting は起こっているのか？
C18固定相，メタノール：水(70:30)移動相

固定相は移動相で濡れている
Wetting 保持の変化はない

C18固定相，メタノール：水(50:50)移動相
C18固定相，メタノール：水(30:70)移動相

固定相は移動相で濡れていない
Non-wetting 保持の変化はない

C18固定相，水移動相

固定相は移動相で濡れていない
Non-wetting 保持は変化する

発表者の回答：固定相が濡れている（Wetting）と濡れていない(Non-wetting)は，固定相の状態が変わると言うよりも，移動相溶液が異なることにより，濡れている状態と濡れていない状態になることである. メタ
ノール：水(70:30)移動相溶液はC18固定相に濡れるが，メタノール：水(30:70)移動相溶液や水はC18固定
相に濡れない. したがって，Wetting 状態からNon-wetting 状態への変化は溶液の組成比の変化で起こっており，C18固定相の状態が変化しWetting 状態からNon-wetting状態に変わっているのではない.
移動相溶液の組成の変化でWetting からNon-wetting なることをDewetting と言うのであればDewetting は起こっている. しかし通常は溶液組成を変えることにより，濡れ性が変化することをあえてDewetting と言わないと思われる. また固定相の状態の変化で，初めは水に濡れており，試料は保持するが，その後時間の経過とともに水には濡れなくなり，試料の保持が減少するのであれば，Dewetting は起こっている. しかし実際には後者のような現象は起こっていない.
26

ChromaNik

まとめ 逆相固定相に移動相溶媒が濡れない場合，毛管作用で移動相溶媒は充填剤細孔から抜け出す力が働く.
 その力（圧力）が大気圧より大きい場合に細孔内から移動相溶媒は抜け出る.
 Dewetting の意味の定義をしかりと定める必要があると思われる。Wetting とNon-wetting状態は確認できるが，移動相溶液が変わらなければ， Wetting から
Non-wetting状態への変化は起こらない.
 水移動相を用いた場合の逆相カラムのさまざまな現象については下記の総合論
文に詳しく記載されている.

27

ChromaNik

逆相固定相のアルキル基：寝込んで（絡み合って）いるのか（Ligand Collapse)
または立ち上がっているのか？

一般的にはアルキル基は立ち上がっていると考えられている？
しかし視点を変えると違った見方ができる
28

ChromaNik

有機溶媒中でのオクタデカンの状態
メタノールにオクタデカン（C18H38)は混ざらない.
（溶けない）

テトラヒドロフラン（THF)にオクタデカン（C18H38)は溶ける.

メタノールとの接触面積が最低になるようなコンフォメーションをとると考えられる.

29

ChromaNik

C18表面上での溶媒和の概略図
メタノール

アセトニトリル

オクタデシル基は寝込
み，表面に少量のメタ
ノールが溶媒和している.

メタノールと同様に，オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している.

テトラヒドロフラン

オクタデシル基は立ち上がっており，全体にテトラヒドロフランは溶媒和している.

ほとんど（80%以上）固まった状態であると推測される

30

ChromaNik

最新のC18固定相のシミュレーション

53% by volume

Figure 1: Left: Snapshots from simulations indifferent solvents, C18 chains (gray), and alkane
and alcohol solutes (large spheres with green,
red, and white indicating CHx, hydroxyl oxygen,and hydrogen, respectively). Middle and right:
Density profiles of C18chains, methanol, water,
and acetonitrile for pure water (W), puremethanol (M), pure acetonitrile (A), and solvent
mixtures given as mole percent. T = 323 K,
grafting density of 2.9 µmol/m2. Adapted, in part,from references 4 and 14.

60% by volume
82% by volume

87% by volume

LCGC North America
630 Volume 31 Number 8 August 2013

ChromaNik

移動相中の有機溶媒の固定相への溶媒和の測定
有機溶媒の保持係数から移動相と固定相の分配量を計算
有機溶媒の固定相への分配量を溶媒和量と仮定
32

ChromaNik

アルコール類の分離
2

カラム：ODS 250 x 4.6 mm
移動相：水
流速: 1.0 mL/min
温度： 40 C
検出：RI
試料: 1. メタノール
2. エタノール
3. アセトニトリル
4. 1-プロパノール
5. 2-プロパノール

5
4
1
3

逆相ＬＣの移動相で用いられる有機溶媒も保持し，分離できる.
33

ChromaNik

アセトニトリル・水移動相を用いたｔ０（亜硝酸ナトリウ
ム）とアセトニトリル（ベイカントピーク）のクロマトグラムtAcetonitrile/water=(20:80) 0 (Sodium nitrite)

カラム：C18 4.6x150mm
流速：0.5 mL/min

温度：40℃

System volume0.291 min

Acetonitrile/water=(10:90)
Acetonitrile/water=(5:95)
Acetonitrile/water=(2:98)

ts (Vacant peak of acetonitrile)

Acetonitrile/water=(1:99)

0

1

2

3

4
5
6
7
8
TIIME (min)アセトニトリルは保持しており，固定相中に分配する. この分配量を溶媒和量とする.
34

ChromaNik

アセトニトリル・水移動相を用いた場合の保持時間，保持および固定相へのアセトニトリルの分配量
k = (ts-t0) / (t0-system volume)

k=S/M S=kxM

カラム：ODS 4.6 x 150 mm，
カラム中の充填剤は約1.5 gであり，この充填剤の約0.3 g(0.35 mL)がC18固定相に相当する.
0.8
6
0.101 mL

アセトニトリルの保持時間

5

0.7

4

0.5

亜硝酸ナトリウムの溶出時間

30.4
0.059 mL2

アセトニトリルの保持係数（ｋ） 0.3

0.033 mL

保持係数（ｋ）

時間（分）

0.6

0.2
1

固定相へのアセトニトリルの分配量

0.017 mL
0.011 mL

0
0%

0.1
0

5%

10%

15%

移動相中のアセトニトリル濃度(%)

20%35

ChromaNik

C1, C18およびC30固定相 へのアセトニトリルの分配量（溶媒和量）
カラム内固定相中の有機溶媒量(mL)

0.16

C1 (TMS)

カラム: C1 (TMS, %C: 5%)

C18

0.12

C18 (%C: 16%)C30

C30 (%C: 16%)

0.08

4.6x150mm
0.04

アルキル鎖長が長くなっても溶媒和量は大差ない.

0
0

5

10

15

20

25

有機溶媒濃度(%)

C1, C18およびC30固定相の状態

固定相表面上に溶媒和するため，アルキル鎖長が異なっていてもアセトニトリルの溶媒和量はほとんど同じである. またラマンスペクトルを用いてアセトニトリルの溶媒和量を測定した
36
報告もあるが，同様にC1, C8, C18固定相への溶媒和量は同じであると結論づけている.

ChromaNik

C18固定相への分配量（溶媒和量）
カラム：C18，（一部C30)

0.2
テトラヒドロフラン THF(C30)

4.6x150mm

カラム内固定相中の溶媒量(mL)

テトラヒドロフラン THF

１）4.6x150mmカラムにC18充填
剤は約1.5g入っている.

アセトニトリル

0.15

エタノール

２）C18の炭素含有量16%C30の炭素含有量16%

メタノール

0.1

カラム内のオクタデシル基の容量は約0.35mLと計算される.

0.05

有機溶媒濃度20%でメタノール
は約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している.

0
0

5

10

15

有機溶媒濃度(%)

20
37ChromaNik

C18表面上での溶媒和の概略図
メタノール

アセトニトリル

テトラヒドロフラン

オクタデシル基は寝込み，表面に少量のメタノールが溶媒和している.

オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している.

オクタデシル基は立
ち上がっており，全体にテトラヒドロフラ
ンは溶媒和している.
38

ChromaNik

有機溶媒によるt0の変化
7
5
1 3
2

カラム: C18, 5µm, 4.6 x 150 mm

50% THF

カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.

6 7
74% アセトニトリル
5682% メタノール

アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるよ
うに有機溶媒と水との混合比を決定

7
4 6

45

123
2
1 3

移動相：

4
(mL)

1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール，4. ブチルベンゼン, 5. o-ターフェニル，
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ，7. トリフェニレン

ウラシルｔ０の溶出量

１）溶媒和した有機溶媒とアルキル基の両方が固定相として働く.
２）溶媒和量の多い場合にｔ０は小さくなる.
３）THFはメタンノールに比べ，0.25mL（=1.89-1.64）多くアルキル基に溶媒和していることになる.
4

6

1.64mL1.89mL
1.80mL39

ChromaNikto（ウラシル）の溶出時間の比較
カラム: C18, 5µm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm. 試料: 1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール
アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるように有機溶媒と水との混合比を決定

有機溶媒の疎水性(Log P)

82%メタノール-0.77

70%エタノール-0.31

58% 2-プロパノール
74%アセトニトリル-0.34

67%ジオキサン
50% THF

-0.42
0.46
1

Retention time/min
40

ChromaNik

C18固定相への分配量（溶媒和量）
0.55

カラム：C18, C30, C8

テトラヒドロフラン THF(C30)

カラム内固定相中の溶媒量(mL)

0.54.6x150mm

テトラヒドロフラン THF

0.45

THF(C30)

１）4.6x150mmカラムにC18充填
剤は約1.5g入っている.

アセトニトリル

0.4

エタノール

0.35

２）C18の炭素含有量16%

THF(C18)

C30の炭素含有量16%

メタノール

カラム内のアルキル基の容量は約0.35mLと計算される.

0.3
THF(C8)0.25

有機溶媒濃度20%でメタノール
は約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している.

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

20

40

60

有機溶媒濃度(%)

80

100

82%メタノールの溶媒和量を0.06mLと仮定すると，ウラシルの溶出量から74%アセトニトリ
ルと50%THFの溶媒和量はそれぞれ0.15mLと0.31mLとなる.
41

ChromaNik

メタノールとテトラヒドロフラン（THF)の差
メタノール

THF
Sunniest C30 ％C:16%

7

1 2

5

3

6

4
7

1 2

Sunniest C18 %C:16%

5

3

4

1

6

7

2

Sunniest C8 %C：10%

5
3
4

0

Column: Sunniest C30, C18, C8, 5µm
4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
THF/H2O=50/50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

5

6

10
15
Retention time/min

Peak 5
20

25

Peak7
42

ChromaNik

C30,C18,C8固定相の状態
C30 %C 16%

C18 %C 16%

CH3OH/H2O=75/25

C8 %C 10%

C30

：メタノールC18：THF

THF/H2O=50/50
C843

ChromaNik

炭素含有量の同じC30とC18はメタノール・水移
動相条件では保持はほぼ同じ
1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=(97:3)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

2, 3
4

C18

Detection: UV@295nm
0

5

10

15
20
retention time / min

25

30

Sample: 1=δ-Tocopherol
HOO

Sunrise C30 %C:18%

2=γ-Tocopherol

1

C30

HO
O

3=β-Tocopherol

2

HO

4

3

O

4=α-Tocopherol
HO

0

5

10
15
20
retention time / min

25

30

35

O

固定相容量は同じ
44

ChromaNik

炭素含有量の同じC30とC18でもアセトニトリル・ク
ロロホルム移動相条件では保持は変わる
C18
1 2

1

2

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:
CH3CN/CHCl3=(80:20)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ºC

C30

Detection: UV @450nm

Conventional
C18 %C:18%

Sample:1=α-Carotene
CH3
H

Sunrise C30 %C:18%

H3C

CH 3

H

H

CH 3

H

H

H

CH3

CH3

H

H

H

CH 3

H

H

H

H H3C

CH 3

H
H3C

2=β-Carotene
CH3
H

0

5

10

15

20

25

30

35

H 3C

CH H
3

H

H

CH3

H

H

H

CH3

CH 3

H

H

H

H

CH 3

H

H

H

H 3C

CH 3

H
H 3C

Retention time / min

固定相容量は約2倍
45ChromaNik

メタノール・水移動相におけるアミルベンゼンとフェノールの保持◆標準試料の分離例
2 3

4

2

5

4

5

2
3

4

5

6

10

2

1

1

6

2

Sunniest C8 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.41

7

25

30

3

2

Sunniest C8 %C:10%

15
20
Retention time/min

3Sunniest C18 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.38

7

5

3

Sunniest C30 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.40

6Sunniest C18 %C:16%

3
1

0

7

Sunniest C30 %C:16%

11◆ピリジンとフェノールの分離

1

35

Column: Sunniest C18, C30, C8, 5µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

0

2

4
6
Retention time/min

8

Column: Sunniest C18, C30, C8, 5µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Pyridine
3 = Phenol

C8はC18とC30に比べ，アミルベンゼンの保持は半分であるが，フェノールの保持はほぼ同じである.
46

ChromaNik

試料とC18固定相の相互作用場
メタノール・水移動相：メタノール

C18

C8

アミルベンゼンはオクタデカンに可溶
OH

フェノールはオクタデカンに難溶
47

ChromaNik

層の厚い固定相（C30)と層の薄い固定相（C18)の比較
ノンポーラスシリカにポリメリックC30とモノメリックC18を結合
NP-C30, %C：0.23%

炭素含有量は約1/4で層の厚みも約1/4
NP-C18, %C：0.06%

48

ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
タンパク質の分離
4.6x30mm

NP-C18A) 0.1%TFA,
B) CH3CN
グラジエント溶離

Sample: 1 = Ribonuclease,
2 = Insulin,
3 = Cytochrom C,
4 = Lysozyme,
5 = Myoglobin,
6 = Carbonic anhydrase

NP-C30

タンパク質

タンパク質

Retention time/min

タンパク質は固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す.
49

ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
多環芳香族炭化水素の分離
4.6x30mm

NP-C18

NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 20%-100%, 5 min
No. 11

グラジエント溶離

No. 1

Retention time/min

Retention time/min

多環芳香族炭化水素は極性が低いため，アルキル基全体と相互作用し，
NP-C30は固定相が厚く，NP-C18に比べ溶質の固定相内への出入りに時間がかかるため，ピークがブロードになると考えられる.
50

ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
ナギのメタノール抽出成分の分離
4.6x30mm

NP-C18

NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 0%-30%, 5 min
グラジエント溶離Retention time/min

Retention time/min

ナギの極性成分も固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す.
51

ChromaNik

まとめ・水移動相を用いた場合には逆相アルキル基は寝込んでしまうと言われていたが，メタノール移動相でもアルキ
ル基はほとんど寝込んでいると推察される.
・THF・水移動相ではアルキル基はTHFの溶媒和により立ち上がるようになり，寝込んでいると推察されるメタノー
ル・水移動相とは異なる分離が可能である.
・試料の疎水性・極性の度合いにより，固定相の作用場が異なり，極性の高い試料の保持はアルキル鎖に大きく影響されない.
52

ChromaNik

1. エンドキャッピング技術・最新の手法

Sunniest (SunShell) Bonding
Technology
熱処理によりシラノール基をシロキサン結合に変換

53

ChromaNik

Sunniest (SunShell) Bonding Technology
Trifunctional silyl-reagent,(Octadecyltrichlorosilane)Difunctional silyl-endcapping reagent(Hexamethyldichlorotrisiloxane)
Second silyl-endcapping reagent(above + Trimethylchrolosilane(TMS))
High reaction temperature for endcapping54

ChromaNik

Bonding state on silica

Final TMS

HO
Si
O
Si

O

Si

Si

Si
Si
O
Si

O

O

Si O

Si

O

O

O
O

Si

O
O

O

Si
Si

O

O

O

Si

O

HO

O

O

Si

Si

O

O

O O

O
Si

Si
O

O OH
O
O
O
Si
Si
Si
O O
O O O
O
O
Si O
O Si O
Si
O
O
Si

Si

O

Si

Si

O

Si

Si O

O

Si

O

Si
Si

O O

O
Si

O

O

O

O

O

Si

Si
O

O
O

O

55

ChromaNik

Silanol Activity Control
Typical no endcapping C18

Sunrise C18-SAC

Silanol Activity
ControlTechnology
吸着性の高いシラノール基Heat

シロキサン結合に変換

O H

有機溶媒と水からなる移動相中では疎水基（C18)の影響で水和しにくいシラノール基

O H

疎水基（C18)の影響が少なく，十分水和できるシラノール基
56

ChromaNik

残存シラノール基の割合
シリカ表面上のシラノール基量は 8 〜 9 μmol/m2
C18結合後2/3のシラノール基は残っている.
C18の結合密度〜3 μmol/m2
C18およびエンドキャッピング（TMSなど）後1980年代 1/2
1990年代 2/5
2000年代 1/3 のシラノール基は残っている.
1/3の残存シラノール基の影響はエンドキャッピング剤
によりほぼ封鎖される.
57

ChromaNik

疎水性の比較
Conventional end-capping
C18

C18

C18

C18

C18

End-capping layer

Both Sunniest end-capping and Silanol Activity Control
C18

C18

C18

End-capping layer

C18

C18

More
Hydrophobic

58

ChromaNik

炭素含有量と保持時間(2種類の異なる反応温度)
エンドキャッピングの反応温度: X oC (200 oC 以上)

シリカ基材:コアシェル(150m2/g)

エンドキャッピングの
反応温度

X oC

(X-40) oC

C18結合後の炭素含有量

7.0%

7.0%

エンドキャッピング後の
炭素含有量

7.3%

7.7%

(熱によりC18が一部切断)(熱によるC18の切断はない)

Silanol Activity Control

Yes（シロキサン結合変換）

No

塩基性化合物のテーリング度合い

良好

良好（X oCと同じ）

Retention factor (k)

10.4

9.5
X oC
(X-40) oC

10% down

0

2

4

6

8

10

12

14

Retention time/min

16

18

20

22

24

59

ChromaNik

保持と炭素含有量との関係
Retention Carbon loading Specific surface area b
factor(%)(m2/g)SunShell C18, 2.6 μm

10.4

7.3

125

Ascentis Express C18, 2.7 μm

9.7

8.0

133

PoroShell C18 EC, 2.7 μm

9.0

8.5

135

Cortecs C18, 2.7 μm

7.7

7.3

113

Accucore C18, 2.7 μm

7.4

8.8

130

Kinetex C18, 2.6 μm

5.4

4.9

102

a.
b.

Retention factor of amylbenzene,Mobile phase; methanol:water=75:25, 40 oC,
Measured using C18 materials sintered at 600 degree Celsius for 8 hours.

Both Sunniest end-capping and Silanol Activity Control
60

ChromaNik

Comparison of amitriptyline peak
4
1 2

3

SunShell C18

TF=1.20
TF=1.894

TF=2.61 4

Kinetex C18

TF=2.73

Accucore C18

4

1

2

3

4

5

6

Cortecs C18

TF=3.124

TF=3.24
0

PoroShell C18 EC

4

7

8

Ascentis Express C18
9

10

Retention time/min

Mobile phase: Acetonitrile/10mM ammonium acetate pH6.8=(40:60)
Column dimension: 150 x 4.6 mm, Flow rate: 1.0 mL/min, Temp.: 40oC
Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol, 3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline

CH3
N
CH3

Amitriptyline

61

ChromaNik

酸性条件での耐久性
Relative retention/%100▲

Durable test condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/1.0% TFA,
pH1=10/90
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC

▲

80
60

SunShell C18
Ascentis EXpress C18 100

40

Accucore C18
Kinetex C18

20

Poroshell C18 EC

0
0

20

40

60

Time/h

80

100

120

Measurement condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

62ChromaNik

アルカリ性条件での耐久性
Relative plate of butylbenzene /%

100
80
60
SunShell C18

Durable test condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Sodium borate/
10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 50 ºC

Ascntis Express C18

40

Kinetex C18
Accucore C18

20

Poroshell C18 EC001,000 2,000 3,000 4,000 5,000 6,000

Measurement condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=70/30
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

Elution volume/mL
63

ChromaNik

Bleeding test using LC/MS＋Q1: 5.997 min to 7.999 min of Sample

TIC of ＋Q1

他社C18

Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 1min 5min 7min
%B: 5% 5% 100% 100%
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization:
Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

SunSell C18
64

ChromaNik

エンドフィッティングの違い
A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

上記カラムのみテーパー角度は36度で，他の全てのカラムは40度です．

65

ChromaNik

A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

36°

それぞれの接続に金属フェラルと1/16”
チューブで接続した状態

40°

66

ChromaNik

A社カラムにパーカタイプ配管を接続した場合A 社 接続部

パーカータイプカラムにA社接続用の配管を接続した場合

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

36°

A社カラム接続はテーパー角度が小さ
いため、フェラルの後部で締まり，デッド
ボリュームはできません.

40°

パーカータイプカラム接続はフェラル先端で締まり、チューブ先端に隙間ができ、ピークが広がる.
67

ChromaNik

IDEX社IsoBarと同じ接続のカラム

SunShell, Halo, PoroShell,
Ascentis Express, Perkin Elmer SPP,
Kinetex, CosmoCore, ClassicShell,
MeteoricCore, UltraCore, OpalShell,
Capcell Core
68

ChromaNik

新発売 3.5 μmコアシェルC18

69

ChromaNik

Comparison of particle size 2.6 µm, 3.5 µm and 5 µm
2

8 MPa

3

7

5
4

1 2

Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
N6=20,000
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
7
3 = Phenol
N6=28,000
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7
7 = Triphenylene
N6=32,000 HPLC: Hitachi LaChrom ELITE(Tubing, 0.25 mm i.d.)

SunShell C18 5 µm

1

6SunShell C18 3.5 µm

313 MPa

5

4

6

2
1

0

SunShell C18 2.6 µm
422 MPa
3

2

4

6

8

10

12

5
6

14

16

18

20

22

24

Retention time/min

通常のHPLC装置を用いても、粒子径3.5 μmコアシェルカラムであれば段数も高く背圧も低い.
70

ChromaNik

Comparison of totally and superficially porous particle
1
2

A company C18 Hybrid 3.5 μm（全多孔性ハイブリッドシリカ）
18.0 MPa

3

7

5

4

Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
3 = Phenol
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
HPLC: 汎用コンベンショナル装置

N6=20,000
k6 =7.1

6

1
2

SunShell C18 3.5 μm（コアシェルシリカ）
13.0 MPa754N6=28,000
k6 =10.7631（内径 0.25 mm の配管を使用）
2

Sunniest C18 3 μm
（全多孔性シリカ）
3015.7 MPa

5

7
5
4

10

N6=22,000
k6 =12.1

6

15

20

25

Retention time/min

30

ChromaNik

Biphenyl 新製品

三官能性シリル化試薬使用
O
O Si
O

Biphenylの特徴

ビフェニル基の二つのベンゼン環は約45度ねじれており，ビフェニル基は単独のフェニル基とは異なる分離挙動を示す。
有機溶媒を含まない水系移動相を用いても，保持の変化がなく，保持時間の再現性の高い分離が達成される。
カフェインのような極性化合物の保持が大きくなる。
他社Biphenylはほとんど一官能性シリル化試薬を用いているが、弊社Biphenyl
は耐酸性の高い三官能性シリル化試薬を使用している。

メチル馬尿酸の異性体の分離比較
Column: SunShell C18 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell C30 2.6 μm 150 x 2.1 mm
SunShell Phenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell Biphenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:
Organic solvent/25 mM phosphate buffer pH3.0
Flow rate: 1.0 mL/min, 0.2 mL/min for only C30
Temperature: 40 oC
Detection: UV@230 nm
Sample: o-, m-, p-Methylhippuric acid
ortho

meta

O

O

OH

NH

O
OH

NH

OH

NH

O

O

O
CH 3

para
H 3C

CH3

72

ChromaNik

SunShellの物性値
結合相

コアシェルシリカ
炭素含有
量(%)

固定相

USP L line

エンドキャッピング

使用
最高圧

120 m2/g

6.5%

C18

L1

Sunniest endcapping

100 MPa 1.5 - 10

9 nm

150 m2/g

7%

C18

L1

Sunniest endcapping

60 MPa1.5 - 10

3.5 μm 2.3 μm

9 nm

150 m2/g

7%

C18

L1

Sunniest endcapping

60 MPa1.5 - 10

SunShell C18

4.6 μm 3.4 μm

9 nm

90 m2/g

5.5%

C18

L1

Sunniest endcapping

50 MPa1.5 - 10

SunShell Biphenyl

2.6 μm 1.6 μm

9 nm

150 m2/g

5%Biphenyl

L11

Sunniest endcapping

60 MPa1.5 - 9粒子径 コア径(μm)(μm)

細孔径 比表面(nm) 積(m2/g)

SunShell C18

2.0 μm 1.2 μm

9 nm

SunShell C18

2.6 μm 1.6 μm

SunShell C18

使用
pH範囲

SunShellの価格例
内径(mm)

1.0

2.1

3.0

4.6

USP category

長さ(mm)
50
100
150
30
50
75
100
150
250

型 番
--------------------CB6141-----CB6161
CB6171------価 格--------------------¥66,000-----¥79,000¥84,000------型 番
CB1941
CB1961
CB1971
CB6931
CB6941
CB6951
CB6961
CB6971------

価 格¥80,000¥85,000¥93,000¥65,000¥66,000¥71,000¥79,000¥84,000------

型 番---------------CB6331
CB6341
CB6351
CB6361
CB6371
CB6381価 格---------------¥65,000¥66,000¥71,000¥79,000¥84,000¥110,000型 番---------------CB6431
CB6441
CB6451
CB6461
CB6471
CB6481価 格---------------¥65,000¥66,000¥71,000¥79,000¥84,000¥110,000

SunShell C18, 3.5 µm

50
100
150
250

------------------------------------------

CB9941
CB9961
CB9971------¥50,000¥55,000¥62,000-----------CB9361
CB9371
CB9381-----¥55,000¥62,000¥80,000-----CB9461
CB9471
CB9481-----¥55,000¥62,000¥80,000

SunShell C18, 5 µm

150
250

---------------------------------------

CB3371
CB3381¥58,800¥77,000

CB3471
CB3481¥58,800¥77,000

SunShell Biphenyl,
2.6 µm

30
50
75
100
150

----------------------------------------------------

C86931
C86941
C86951
C86961
C86971¥67,000¥69,000¥75,000¥84,000¥89,000

C86331
C86341
C86351
C86361
C86371¥67,000¥69,000¥75,000¥84,000¥89,000

C86431
C86441
C86451
C86461
C86471¥67,000¥69,000¥75,000¥84,000¥89,000

SunShell C18, 2 µm

SunShell C18, 2.6 µm

L1

L11

73

ChromaNik

74

ChromaNik

Bentencho station

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552-0001 大阪府大阪市港区波除6-3-1
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