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C18はC8より疎水性が高いので、C18はC8より保持が大きい？

新技術説明会これを聞けばカラム分離の疑問は解ける!?
メーカーが謳う逆相カラム最新定説:
C18基は立ってる?寝てる?保持の長さは何で決まる?
①

C18はC8より疎水性が高いので、C18はC8より保持が大きい？

②

Dewettingと表現することがある。これは正しい表現なのか？

③

アルキル基は立ち上がっているか？

④

新規エンドキャッピング

ぶんせき技術紹介

疎水性Methane (C1)

Octane (C8)Octadecane(C18)

Triacontane(C30)

分配係数(LogP)

1.09

5.18

9.18

14.09

水への溶解度 (mg/L)

22.6

0.66

0.006

8.84×10-10

疎水性(LogP)はn-オクタノールと水への分配比率により定義される（クロマニックテクノロジーズ）
長江 徳和

C30は最も疎水性が高いが，これは水への溶解度が低いことが大きく影響する.

1

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化合物の保持予測として用いられる化合物は，一般的にLogPが1から6の間のものである.
2
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逆相固定相の選択性および保持

C18固定相の保持

O
H3C

1

O

C18, 2.3 μmol/m2,%C=17%

8

1

12

C18, 1.2 μmol/m2,%C=11%

CH3
CH3

水素結合性

疎水性

疎水性

立体選択性

α(カフェイン/フェノール）α(アミルベンゼン/ブチルベンゼン）

アミルベンゼンの保持係数α(o-ターフェニル/トリフェニレン）

炭素含有量

C30

18%

C18

18%

0.34

Detection: UV @450nm

C8

11%

0.29

Sample: 1= Tocopherol

C1

4.5%

Phenyl

8%

Cyano

7%

Flow rate: 1.0 mL/min

16 minN

固定相Mobile phase:

Temperature: 30 ºC
4

OH

N

CH3

Column size: 4.6x150 mm

CH3OH/H2O=(98:2)
2

CH3
N

N

2= Tocopherol acetate

2

0.50

0.51
0.69
0.48

1.72

18.9

1.68

19.7

1.55

9.4

1.43

2.3

1.38

2.5

1.16

0.4

1.73
1.44
0.89
0.99
0.87
1.97

★固定相：シリカ基材の細孔径，12nm，一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水=70/30，温度：30℃

4

8

12

16 minC8固定相はC18固定相に比べ固定相体積（炭素含有量）は約半分であり，アミルベンゼンの保持も同様に約半分である.

固定相の体積（結合密度）が半分になると保持もおおよそ半分になる.
3

4

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保持係数(k)と分配比（Kd)
固定相の体積（結合密度）が半分になると保持もおおよそ半分になる.

SD x VSSk==
MD x VM
M
SD
Kd =
MD

C8固定相(%C=11%)はC18固定相（1.2 μmol/m2,%C=11%）と

S: 固定相中の溶質の存在量
M：移動相中の溶質の存在量
SD：固定相中の溶質の分配濃度
MD: 移動相中の要旨値の分配濃度
VS：固定相の体積（容積）VM：移動相の容積

体積（炭素含有）も，保持も同じである.

C8固定相はC18固定相に比べ体積は半分であり，アミルベン
ゼンの保持も半分である.

5

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C8固定相(%C=11%)とC18固定相（1.2 μmol/m2, %C=11%）は固定相体積(VS)が同じで保持係数(k)も同じであるので，分配比（Kd)も同じ値になる.
6
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固定相の体積が異なる場合

固定相の体積が2倍異なるC18固定相の保持係数(k)と分配比（Kd)
固定相

炭素含有量

結合密度

固定相体積

移動相体積

C18 (A)17%

2.3 μmol/m2

0.4 mL

1.6 mL11%

1.2 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mL

C18 (B)

例えばC18(%C=18%)
移動相への分配量(0.5)

C18 (B) の場合

kB

0.4

k=0.5/0.5=1固定相

k固定相への分配量(0.5)

C18（A, B)は同じ固定相なので，分配比（Kd)は同じだと仮定する. Kd

kA

移動相と固定相への分配濃度比は同じであるため，分配量の比(k)は体積比となる。

移動相

4.6x150mmカラムを使用

C18 (A) の場合＜＜同じ固定相では分配濃度比が同じと仮定する（固定相/移動相=1）＞＞

ｘ 0.250.25 Kd

ｘ 0.130.13 Kd

固定相の体積が半分のC18（％C=9%)

1.6
0.23

移動相への分配量(0.75)

1.77

k=0.25/0.75=0.33
固定相への分配量(0.25)

C18(A)はC18(B)の約2倍の保持係数になる.
788ChromaNik

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固定相の体積が同じC18とC8固定相の保持係数(k)と分配比（Kd)

逆相固定相の選択性および保持
O
H3C

O

固定相

炭素含有量

結合密度

固定相体積

移動相体積

C18 (A)17%

2.3 μmol/m2

0.4 mL

1.6 mLC18 (B)11%

1.2 μmol/m2

0.23 mLC811%

2.4 μmol/m2

0.23 mL

C18とC8固定相分配比（Kd)はKdC18, KdC8
C18 (B) の場合

C8 の場合

kC18
kC8

OH

CH3

水素結合性

疎水性

疎水性

立体選択性

α(カフェイン/フェノール）α(アミルベンゼン/ブチルベンゼン）

アミルベンゼンの保持係数α(o-ターフェニル/トリフェニレン）炭素含有量1.77 mL

C30

18%

1.77 mL

C18

18%

0.34

4.6x150mmカラムを使用

C8

11%

0.29

C1

4.5%

Phenyl

8%

Cyano

7%

ｘ 0.13

CH3

N

固定相

1.77
0.23

N
CH3

Kd
0.23

CH3
N

N

0.13 KdC18

0.50

0.51
0.69
0.48

1.72

18.9

1.68

19.7

1.55

9.4

1.43

2.3

1.38

2.5

1.16

0.4

1.73
1.44
0.89
0.99
0.87
1.97

★固定相：一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水=70/30，温度：30℃

ｘ 0.131.77

0.13 KdC8

C18(B)とC8の保持係数は同じであるため， KdC18とKdC8も同じである.

・炭素一個の差（アミルベンゼンとブチルベンゼンの分離係数）はアルキル鎖長と相関があるように見える.
・しかし保持時間が大きく異なる分離での比較である.

9

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炭素一個の差の分離係数

アルキル鎖長が長いほど分離係数（α）は大きい.

しかし

C30

1. C30, C18およびC8の固定相自身の疎水性は大きく異なる.

C18

2. しかし固定相と移動相に分配する溶質から論じた場合，この溶質の分配(濃度)比はどの固定相でもほぼ同じである.

C8

3. つまり，固定相体積と固定相への溶質の分配量（分配濃度が同じである
ため）はほぼ比例し，保持も同様に比例する.

C1
保持時間を一緒にすると炭素が一個異なる成分（トルエン，エチルベンゼン）の分離係数（α）は同じである.

まとめ

4. 保持係数(k)は固定相と移動相の分配(濃度)比(Kd)で決まるわけではなく，分配濃度に固定相・移動相の体積・容積を乗じた固定相中と移動相中に存在する溶質の量により決まる.
5. もちろんアルキル鎖長の違いにより，選択性は異なる.

カラムサイズ：4.6×150㎜
移動相：メタノール/水、有機溶媒濃度は図中に表示
流 速：1.0 mL/min，温度：30℃，
試 料：1=メチルパラベン，2=エチルパラベン，
3=ベンゼン，4=トルエン，5=ナフタレン，6=エチルベンゼン

保持が同じ場合の炭素一個の差の成分の分離係数を固定相の疎水性と定義すれば，アルキル鎖長の差は疎水性に関係しない.11

6. フェノールのような極性の高い成分は固定相の表面とのみ相互作用する
ため，固定相の体積は関係なくなり，表面積が保持係数に関わってくる.

12

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逆相アルキル基は水移動相ではODSカラムの保持が減少する
特にポンプを停止した後は大きく減少

立ち上がっている，寝込んでいる？

条件

濡れている，濡れていない(non-wetting)？

カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa

逆相HPLCにおける水または緩衝液のみの移動相を

流速: 1.0 mL/min
１時間通液停止後再度通液し測定用いた分析の問題点

温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

保持時間：5.40minから0.41minに減少

ぶんせき技術紹介

再現性がない13

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14

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アルキル基の寝込みによる説明の元となったと思われる論文

アルキル基の寝込みによる説明
1999年，アルキル基の寝込みによる保持減少の記述
Mobile phase: Acetonitrile/water =10/90

1979年
アルキル基の寝込みに関する論文
C18の寝込みについて記述されている

Wetting

Wetting

Dewettingと言われていた

Non-wetting

Non-wetting

1980年 有機溶媒を含まない水系移動相を用いた場合の保持の減少をアルキル基の寝込みと主張した論文

15

固定相は移動相で濡れている。
アルキル基は立ち上がっている.
水でカラムを洗浄す
ると，アルキル基は寝込んでしまう.
これをBondedphase collapseと表現している.
再び移動相を流しても寝込みのため，保持は小さくなっている.
16

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現在の移動相の細孔からの抜け出しによる説明

Dewettingとは？

2013年，アルキル基の寝込みによるDewettingの結果，移動相は抜け出る
RONALD E. MAJORS, LCGC North America, Jul 1, 2013

水移動相ではアルキル基は寝込んでしまい，Phase collapseがおこる。Phase
collapse状態になると移動相と濡れなくなり，移動相は細孔から抜け出す.

アルキル基は立ち上がって
おり，固定相は移動相で濡れている.移動相は細孔から抜け出さない.

Dewetting とは１）アルキル基が立ち上がっている
状態がWetting２）アルキル基が寝込んだ状態になるとnon-wetting１の状態から２の状態に変化する事をDewettingと表現している！or？

http://www.mynewsdesk.com/uk/northumbria-university/pressreleases/its-delightful-its-dynamic-its-dewetting-1582445

Dewetting とは接触角が大きくなること！！
細孔から液体が抜けることではない！！
実は移動相を換えない限り，逆相固定相表面と移動相の接触角は変化しない！！

17

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他社のDewettingの説明

毛管現象とは（岩波 理化学辞典 第5版）

実は固定相表面は移動相で濡れていない。
毛管作用で抜け出そうとする圧力以上の圧がかかっているので，細孔に留まっているだけである。
Dewetting
Phenomenon

毛管作用で抜け出そうとする圧力以下の圧まで下がると，細孔から抜け出る。
これは毛管現象である。

19

液体中に細い管（毛細管）を立てると、管内において液面が管外よりも上がりまたは下がる現象。液体分子間の凝集力と液体と管壁の間の付着力との大小関係により，液体が管を濡らす（付着力が大きい）ときは液面は上昇し、濡らさないときは下降する。管の内外の液面の高さの差をh、管の半径をr、液体の密度をρ、液体の表面張力をγ、接触角をθ、重力加速度をgとすれば、h=2γcosθ/rρgとなる。
20

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毛管現象

毛管現象
Capillarity, Capillary phenomenon
水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合

毛管現象の式:h=2γ cosθ /(rρg)γ : 表面張力
ρ: 液体の密度(比重)内径0.5 mmのガラス管

θ
g
r
h
r

h

10 nm

θ

液体が管に濡れる場合
θ < 90°液体が管に濡れない場合
θ > 90°21

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内径0.5 mmのガラス管内で赤インクは6 cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006
気圧である。内径が1 μmでは30 m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。
22

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水100%移動相条件下で保持が減少する理由
カラム内のC18充塡剤粒子
充填剤に圧力がかかっている場合

移動相：水

疑問その１ C18表面と30%メタノールは濡れるか？
上から見た場合それぞれの溶液にC18充填剤を混ぜ、超音波の振動を加えながら撹拌混合した.

ポンプを停止し充填剤に圧力がからなくなると・70%メタノールでは超音波の振動を加えなくても完全にC18充填剤が分散する. 分散後沈降し始める.

横から見た場合（濡れるため，細孔内に溶液が入り込み分散する）

・50%メタノールでは一部分散している.
（超音波振動を加えない場合は全く分散しない）（濡れないため，細孔内に溶液は入り込めない）

・30%メタノールでは全く分散していない.
（濡れないため，細孔内に溶液は入り込めない）

細孔内に移動相が浸透している状態

Permeating

細孔内から移動相が抜け出た状態

メタノール/水(30:70)Expelling
Depermeating(50:50)(70:30)T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

発表者の回答：メタノール濃度が50%以下の溶液はC18表面に濡れないため、細孔内に入り込めない. しかし，圧力をかける，また100%メタノールで濡れている状態から溶液を切り替えた場合には30%メタノールでも細孔内に入り込み，その後大気圧にしても細孔から抜け出すことはない.
濡れ性は固定相の寝込み(Phase collapse)で決まるのではなく，移動相（溶液）により決まる.
23

24

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疑問その２ 大気圧が低ければC18カラムから移動相は抜け出すか？
カラム: C18 250x4.6mm
模擬大気圧: 0.01MPa
カラム温度: 40 ℃

＊真空ポンプでカラム内の圧力を大気圧以下にし、20分間放置＊充填剤細孔から移動相が抜けた場合にはカラムの重量が変化＊70%以上のメタノールをカラムに通液した場合は0.01MPaでも充填剤細孔からの移動相溶液の抜け
出しはほとんど認められず，50%以下では移動相溶
液は抜け出している.
＊70%以上のメタノールではC18充填剤が濡れるため，毛管作用により細孔内へ入り込む力が働き，充填剤細孔から溶液は抜け出ないが、50%以下では濡れないため，抜け出そうとする.

疑問その3 C18表面と移動相（水）が濡れていなくても保持するのか？
C18カラム内をクロロホルムに置換後70℃で24時間乾燥し、カラム温度40℃で水移動相を流す。

C18カラムout側に23MPaの抵抗を付け水移動相を流す。

発表者の回答：乾燥操作を行っているので、固定相のアルキル基と有機溶媒は溶媒和していない。（アルキル基は寝込んでいるCollapseしていると考えられる。）充填剤細孔内には移動相は入り込むことなく試料は保持も分離もされない。
カラムout側に，毛管作用で働く圧力を超える23MPaの背圧を加えると，水移動相は充填剤細孔内に入り込み，試料は保持し，分離される。

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)

0
-0.05
-0.1
-0.15
-0.2
-0.25
-0.3
-0.35
-0.4
-0.45
-0.5
0

20

40

60

80

100

メタノール/水移動相のメタノール濃度(%)

毛管作用とは，濡れる（接触角が90度未満）場合には毛細管内に入り込む力が働き，逆に濡れない（接触角が90度より大きい）場合には毛細管から抜け出す力が働くことである.
メタノール濃度50％以下の濃度ではC18充填剤の細孔内から移動相を抜き出す力が働く. その力が0.01MPaより大きいため
左図に示されているようにカラムから移動相溶液が抜け出す.
通常10％以上のメタノール濃度の移動相を用いれば，保持の減少は起こらない. これはC18充填剤細孔内から移動相溶液を抜け出させる圧力が大気圧（1気圧）より低いためである.

一端送液ポンプを停止し，1時間放置後カラムout側の抵抗を外し，水移動相を流す。

C18カラムout側に再度23MPaの抵抗を付け水移動相を流す。

C18カラム、水移動相、40℃
試料：亜硝酸ナトリウム、核酸塩基5種
T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

送液ポンプを停止し，充填剤周りの圧を大気圧まで下げると，毛管作用により水移動相は充填剤細孔内から抜け出す。カラムout側の背圧をかけない状態で再通液すると保持は減少し，分離は悪くなっている。
再度23MPaの背圧を加えると，水移動相は再び充填
剤細孔内に入り込み，試料は保持し，分離される。
左図の全ての分離で，水移動相はC18固定相に濡れていない。固定相と移動相は濡れれなくても，ある界面で接していれば溶質は分配し，保持し分離できる。

25

N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU Vol. 59, No. 3, 193 (2010).

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まとめ 逆相固定相に移動相溶媒が濡れない場合，毛管作用で移動相溶媒は充填剤細孔から抜け出す力が働く.
 その力（圧力）が大気圧より大きい場合に細孔内から移動相溶媒は抜け出る.
 Dewetting の意味の定義をしかりと定める必要があると思われる。Wetting とNon-wetting状態は確認できるが，移動相溶液が変わらなければ， Wetting から
Non-wetting状態への変化は起こらない.
 水移動相を用いた場合の逆相カラムのさまざまな現象については下記の総合論
文に詳しく記載されている.

逆相固定相のアルキル基：寝込んで（絡み合って）いるのか（Ligand Collapse)
または立ち上がっているのか？

一般的にはアルキル基は立ち上がっていると考えられている？
しかし視点を変えると違った見方ができる27

28

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C18表面上での溶媒和の概略図

有機溶媒中でのオクタデカンの状態

メタノール

アセトニトリル

オクタデシル基は寝込
み，表面に少量のメタ
ノールが溶媒和している.

メタノールと同様に，オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している.

テトラヒドロフラン

メタノールにオクタデカン（C18H38)は混ざらない.
（溶けない）

テトラヒドロフラン（THF)にオクタデカン（C18H38)は溶ける.

メタノールとの接触面積が最低になるようなコンフォメーションをとると考えられる.

オクタデシル基は立ち上がっており，全体にテトラヒドロフランは溶媒和している.

ほとんど（80%以上）固まった状態であると推測される

29

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30

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最新のC18固定相のシミュレーション

53% by volume

Figure 1: Left: Snapshots from simulations indifferent solvents, C18 chains (gray), and alkane
and alcohol solutes (large spheres with green,
red, and white indicating CHx, hydroxyl oxygen,and hydrogen, respectively). Middle and right:
Density profiles of C18chains, methanol, water,
and acetonitrile for pure water (W), puremethanol (M), pure acetonitrile (A), and solvent
mixtures given as mole percent. T = 323 K,
grafting density of 2.9 µmol/m2. Adapted, in part,from references 4 and 14.

60% by volume
82% by volume

移動相中の有機溶媒の固定相への溶媒和の測定
有機溶媒の保持係数から移動相と固定相の分配量を計算

87% by volume

有機溶媒の固定相への分配量を溶媒和量と仮定
LCGC North America
630 Volume 31 Number 8 August 201332

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アセトニトリル・水移動相を用いたｔ０（亜硝酸ナトリウ
ム）とアセトニトリル（ベイカントピーク）のクロマトグラム

アルコール類の分離

カラム：C18 4.6x150mmt

Acetonitrile/water=(20:80) 0 (Sodium nitrite)2

カラム：ODS 250 x 4.6 mm
移動相：水
流速: 1.0 mL/min
温度： 40 C
検出：RI
試料: 1. メタノール
2. エタノール
3. アセトニトリル
4. 1-プロパノール
5. 2-プロパノール

5
4
1
3

流速：0.5 mL/min

温度：40℃

System volume0.291 min

Acetonitrile/water=(10:90)
Acetonitrile/water=(5:95)

ts (Vacant peak of acetonitrile)

Acetonitrile/water=(2:98)
Acetonitrile/water=(1:99)

0

4
5
6
7
8
TIIME (min)アセトニトリルは保持しており，固定相中に分配する. この分配量を溶媒和量とする.

逆相ＬＣの移動相で用いられる有機溶媒も保持し，分離できる.

1

2

3

33

34

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アセトニトリル・水移動相を用いた場合の保持時間，保持および固定相へのアセトニトリルの分配量
k = (ts-t0) / (t0-system volume)

k=S/M S=kxM

カラム：ODS 4.6 x 150 mm，
カラム中の充填剤は約1.5 gであり，この充填剤の約0.3 g(0.35 mL)がC18固定相に相当する.
6
0.8
0.101 mL

アセトニトリルの保持時間

5

C1, C18およびC30固定相 へのアセトニトリルの分配量（溶媒和量）
0.16

カラム内固定相中の有機溶媒量(mL)

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C1 (TMS)

カラム: C1 (TMS, %C: 5%)

C18

0.12

C18 (%C: 16%)C30

C30 (%C: 16%)

0.08

4.6x150mm
0.04

アルキル鎖長が長くなっても溶媒和量は大差ない.

0

0.7

0

5

10

15

20

25

有機溶媒濃度(%)

40.5

亜硝酸ナトリウムの溶出時間

30.4
0.059 mL2

アセトニトリルの保持係数（ｋ） 0.3

0.033 mL

保持係数（ｋ）

時間（分）

0.6

C1, C18およびC30固定相の状態

0.2
1

固定相へのアセトニトリルの分配量

0.017 mL
0.011 mL

0
0%

0.1
0

5%

10%

15%

移動相中のアセトニトリル濃度(%)

20%35

固定相表面上に溶媒和するため，アルキル鎖長が異なっていてもアセトニトリルの溶媒和量はほとんど同じである. またラマンスペクトルを用いてアセトニトリルの溶媒和量を測定した
36
報告もあるが，同様にC1, C8, C18固定相への溶媒和量は同じであると結論づけている.

ChromaNik

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C18固定相への分配量（溶媒和量）

C18表面上での溶媒和の概略図

カラム：C18，（一部C30)

0.2
テトラヒドロフラン THF(C30)

4.6x150mm

メタノール

アセトニトリル

テトラヒドロフラン

オクタデシル基は寝込み，表面に少量のメタノールが溶媒和している.

オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している.

オクタデシル基は立
ち上がっており，全体にテトラヒドロフラ
ンは溶媒和している.

カラム内固定相中の溶媒量(mL)

テトラヒドロフラン THF

１）4.6x150mmカラムにC18充填
剤は約1.5g入っている.

アセトニトリル

0.15

エタノール

２）C18の炭素含有量16%C30の炭素含有量16%

メタノール

0.1

カラム内のオクタデシル基の容量は約0.35mLと計算される.

0.05

有機溶媒濃度20%でメタノール
は約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している.

0
0

5

10

15

20

有機溶媒濃度(%)

37

ChromaNik

38

ChromaNikto（ウラシル）の溶出時間の比較

有機溶媒によるt0の変化
7
5
1 3
2

50% THF

カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.

6 7
74% アセトニトリル
5682% メタノール

アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるよ
うに有機溶媒と水との混合比を決定

7
4 6

45

123
2
1 3

移動相：

カラム: C18, 5µm, 4.6 x 150 mm

4(mL)

有機溶媒の疎水性(Log P)

82%メタノール

1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール，4. ブチルベンゼン, 5. o-ターフェニル，-0.77

70%エタノール

6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ，7. トリフェニレン-0.31

58% 2-プロパノール

ウラシルｔ０の溶出量

１）溶媒和した有機溶媒とアルキル基の両方が固定相として働く.
２）溶媒和量の多い場合にｔ０は小さくなる.
３）THFはメタンノールに比べ，0.25mL（=1.89-1.64）多くアルキル基に溶媒和していることになる.
4

6

1.64mL1.89mL
1.80mL

カラム: C18, 5µm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm. 試料: 1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール
アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるように有機溶媒と水との混合比を決定

74%アセトニトリル-0.34

67%ジオキサン-0.42

50% THF

0.46
1

Retention time/min
39

40

ChromaNik

ChromaNik

メタノールとテトラヒドロフラン（THF)の差

C18固定相への分配量（溶媒和量）
0.55

カラム内固定相中の溶媒量(mL)

0.54.6x150mm

テトラヒドロフラン THF

0.45

THF(C30)

１）4.6x150mmカラムにC18充填
剤は約1.5g入っている.

アセトニトリル

0.4

エタノール

0.35

メタノール

カラム：C18, C30, C8

テトラヒドロフラン THF(C30)

２）C18の炭素含有量16%

THF(C18)

C30の炭素含有量16%

メタノール

カラム内のアルキル基の容量は約0.35mLと計算される.

0.3
THF(C8)

0.25

THF

0.15
0.1
0.05
0
0

20

40

60

80

100

5

3

6

4
7

1 2

Sunniest C18 %C:16%

53

82%メタノールの溶媒和量を0.06mLと仮定すると，ウラシルの溶出量から74%アセトニトリ
ルと50%THFの溶媒和量はそれぞれ0.15mLと0.31mLとなる.

4

1

2

Sunniest C8 %C：10%

5
3
4
5

6

Peak 5

10
15
Retention time/min

41

ChromaNik

670有機溶媒濃度(%)

Sunniest C30 ％C:16%

71 2

有機溶媒濃度20%でメタノール
は約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している.

0.2

Column: Sunniest C30, C18, C8, 5µm
4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
THF/H2O=50/50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

20

Peak7
42

25

ChromaNik

C30,C18,C8固定相の状態
C30 %C 16%

C18 %C 16%

炭素含有量の同じC30とC18はメタノール・水移
動相条件では保持はほぼ同じ

CH3OH/H2O=75/25

C8 %C 10%
1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=(97:3)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

2, 3
4

C18

Detection: UV@295nm

C30：メタノール
0

C18

5

10

15
20
retention time / min

25

30

Sample: 1=δ-Tocopherol
HO
O

：THF

Sunrise C30 %C:18%

2=γ-Tocopherol

1

THF/H2O=50/50

C30

HO
O

C8

3=β-Tocopherol

2

HO

4

3

O

4=α-Tocopherol
HO

0

43

5

10
15
20
retention time / min

25

30

35

O

固定相容量は同じ
44

ChromaNik

ChromaNik

メタノール・水移動相におけるアミルベンゼンとフェノールの保持

炭素含有量の同じC30とC18でもアセトニトリル・ク
ロロホルム移動相条件では保持は変わる◆標準試料の分離例

C18
1 2

1

2

Column size: 4.6x250 mm◆ピリジンとフェノールの分離

2 3
1

Sunniest C30 %C:16%

2

Sunniest C18 %C:16%

4

5

7

3

Sunniest C30 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.40

6

2

1

Mobile phase:
3

CH3CN/CHCl3=(80:20)

4Detection: UV @450nm

Conventional
C18 %C:18%

1

Sample:
CH3
H

H3 C

CH3 H

H

CH3

H

H

H

CH3

CH3

H

H

H

CH3

H

H

H

H H 3C

CH
H3

5

10

15

20

25

30

35

H 3C

CH 3 H

H

H

CH 3

H

H

CH3

H
H3 C

H

CH 3

CH 3

H

H

H

H

CH 3

H

H

H H 3C

4

5

6

10

25

30

CH 3

H
H 3C

Retention time / min

固定相容量は約2倍
45

ChromaNik

3

2

Sunniest C8 %C:10%

15
20
Retention time/min

32Sunniest C8 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.41

7

1

35

Column: Sunniest C18, C30, C8, 5µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

2=β-Carotene
0301=α-Carotene
Sunrise C30 %C:18%

5

2

C30

1

6

Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ºC

Sunniest C18 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.38

7

5

1

0

2

4
6
Retention time/min

8

Column: Sunniest C18, C30, C8, 5µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Pyridine
3 = Phenol

C8はC18とC30に比べ，アミルベンゼンの保持は半分であるが，フェノールの保持はほぼ同じである.
46

ChromaNik

層の厚い固定相（C30)と層の薄い固定相（C18)の比較

試料とC18固定相の相互作用場
メタノール・水移動相：メタノールC18

ノンポーラスシリカにポリメリックC30とモノメリックC18を結合
NP-C30, %C：0.23%

C8

アミルベンゼンはオクタデカンに可溶

炭素含有量は約1/4で層の厚みも約1/4
OH

NP-C18, %C：0.06%
フェノールはオクタデカンに難溶
4748

ChromaNik

ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
タンパク質の分離
NP-C184.6x30mm

Sample: 1 = Ribonuclease,
2 = Insulin,
3 = Cytochrom C,
4 = Lysozyme,
5 = Myoglobin,
6 = Carbonic anhydraseA) 0.1%TFA,
B) CH3CN
グラジエント溶離

NP-C30とNP-C18の比較
多環芳香族炭化水素の分離
タンパク質

NP-C304.6x30mm

NP-C18

NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 20%-100%, 5 min
No. 11

グラジエント溶離

タンパク質

No. 1

Retention time/min

Retention time/min

Retention time/min

多環芳香族炭化水素は極性が低いため，アルキル基全体と相互作用し，
NP-C30は固定相が厚く，NP-C18に比べ溶質の固定相内への出入りに時間がかかるため，ピークがブロードになると考えられる.

タンパク質は固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す.
49

ChromaNik

ChromaNik

まとめ

NP-C30とNP-C18の比較
ナギのメタノール抽出成分の分離
4.6x30mm50

NP-C18・水移動相を用いた場合には逆相アルキル基は寝込んでしまうと言われていたが，メタノール移動相でもアルキ
ル基はほとんど寝込んでいると推察される.

NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 0%-30%, 5 min

・THF・水移動相ではアルキル基はTHFの溶媒和により立ち上がるようになり，寝込んでいると推察されるメタノー
ル・水移動相とは異なる分離が可能である.

グラジエント溶離Retention time/min

Retention time/min

ナギの極性成分も固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す.
51

・試料の疎水性・極性の度合いにより，固定相の作用場が異なり，極性の高い試料の保持はアルキル鎖に大きく影響されない.
52

ChromaNik

ChromaNik

Sunniest (SunShell) Bonding Technology

ユニークなエンドキャッピング

Trifunctional silyl-reagent,Sunniest (SunShell) Bonding
Technology(Octadecyltrichlorosilane)Difunctional silyl-endcapping reagent(Hexamethyldichlorotrisiloxane)

熱処理によりシラノール基をシロキサン結合に変換

Second silyl-endcapping reagent(above + Trimethylchrolosilane(TMS))
High reaction temperature for endcapping

ぶんせき技術紹介
53

ChromaNik

54

ChromaNik

Silanol Activity Control

Bonding state on silica

Typical no endcapping C18

Sunrise C18-SAC

Silanol Activity
ControlTechnology

Final TMS
吸着性の高いシラノール基Heat

シロキサン結合
に変換

HO
Si
O
Si
Si
O

Si

Si
Si
O

O
Si

O

Si
O

O

O

O

O
O

O

Si

Si

O
O

O

Si
Si

O

HO

O

O

Si

Si

O

Si

Si

O

O

O

Si

O

Si
Si

Si
Si O
Si O
O O

Si

O

O

O

O

Si

O

O

O

Si

O O

O
Si

Si

O OH
O
Si
O
O
Si
Si
Si
O O
O O O
O
O
Si O
O Si O
Si
O
O

O
Si
O

O
O

O

55

O H

有機溶媒と水からなる移動相中では疎水基（C18)の影響で水和しにくいシラノール基

O H

疎水基（C18)の影響が少なく，十分水和できるシラノール基
56

ChromaNik

ChromaNik

残存シラノール基の割合

疎水性の比較

★シリカ表面上のシラノール基量は 8 〜 9 μmol/m2

Conventional end-capping★C18結合後2/3のシラノール基は残っている.
C18の結合密度〜3 μmol/m2

C18

C18

C18

C18

C18

End-capping layer★C18およびエンドキャッピング（TMSなど）後1980年代 1/2

Both Sunniest end-capping and Silanol Activity Control

1990年代 2/5

C18

C18

C18

C18

More
Hydrophobic

C18

End-capping layer

2000年代 1/3 のシラノール基は残っている.
1/3の残存シラノール基の影響はエンドキャッピング剤
によりほぼ封鎖される.

シラノール基が少ない分，固定相全体としての疎水性は上がる

57

ChromaNik

58

ChromaNik

炭素含有量と保持時間

保持と炭素含有量との関係(2種類の異なる反応温度)
エンドキャッピングの反応温度: X oC (200 oC 以上)

シリカ基材:コアシェル(150m2/g)
Retention Carbon loading Specific surface area b
factor(%)(m2/g)

エンドキャッピングの
反応温度

X oC

(X-40) oC

C18結合後の炭素含有量

7.0%

7.0%

SunShell C18, 2.6 μm

10.4

7.3

125

Ascentis Express C18, 2.7 μm

9.7

8.0

133

PoroShell C18 EC, 2.7 μm

9.0

8.5

135

Cortecs C18, 2.7 μm

7.7

7.3

113

Accucore C18, 2.7 μm

7.4

8.8

130

Kinetex C18, 2.6 μm

5.4

4.9

102

エンドキャッピング後の
炭素含有量

7.3%

7.7%

(熱によりC18が一部切断)(熱によるC18の切断はない)

Silanol Activity Control

Yes（シロキサン結合変換）

No

塩基性化合物のテーリング度合い

良好

良好（X oCと同じ）

Retention factor (k)

10.4

9.5
o

X C
(X-40) oC

10% down

0

2

4

6

8

10

12

14

Retention time/min

16

a.
b.

18

20

22

Retention factor of amylbenzene,Mobile phase; methanol:water=75:25, 40 oC,
Measured using C18 materials sintered at 600 degree Celsius for 8 hours.

Both Sunniest end-capping and Silanol Activity Control

24

59

60

ChromaNik

ChromaNik

残存シラノール基の影響

酸性条件での耐久性

アミトリプチリンのピーク形状
1 2

4

3

SunShell C18

TF=1.20
TF=1.89

4

0

1

2

3

4

5

6

C C18 EC4

TF=2.61 4

A C18

TF=2.73

B C18

4

TF=3.12

E C18

4

D C18

TF=3.24
7

8

Durable test condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/1.0% TFA, pH1=10/90
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC

9

10

CH3
N
CH3

Retention time/min

Mobile phase: Acetonitrile/10mM ammonium acetate pH6.8=(40:60)
Column dimension: 150 x 4.6 mm, Flow rate: 1.0 mL/min, Temp.: 40oC
Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol, 3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline

1% TFA
80 ℃

Amitriptyline

Measurement condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

62

61

ChromaNik

ChromaNik

Bleeding test using LC/MS

アルカリ性条件での耐久性＋Q1: 5.997 min to 7.999 min of Sample

Durable test condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Sodium borate/
10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 50 ºC

TIC of ＋Q1

Measurement condition
Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=70/30
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

他社C18

Column size: 50 x 2.1 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 1min 5min 7min
%B: 5% 5% 100% 100%
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization:
Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

SunSell C18
63

64

ChromaNik

ChromaNik

エンドフィッティングの違い

新規エンドキャッピングタンデムTMS化 新製品
Novel end-capping method

詳しくはProposed nameProminert, SunBright, ArmorShell,
C18, RP-AQUA C8 Biphenyl, Phenyl, etc.

https://bunseki.jsac.jp/wp-content/uploads/2022/02/p071.pdf

A 社 接続部The ultimate end-capping method at the present

パーカータイプ 接続部

ぶんせき技術紹介（単位：mm）【New concept】

従来よりも更に蜜なエンドキャッピング
が可能となり，耐久性が大幅に向上
使用ｐH範囲：1-12
65

ChromaNik

上記カラムのみテーパー角度は36度で，他の全てのカラムは40度です．

66

ChromaNik

詳しくは

詳しくは

https://bunseki.jsac.jp/wp-content/uploads/2022/02/p071.pdf

https://bunseki.jsac.jp/wp-content/uploads/2022/02/p071.pdf
A社カラムにパーカタイプ配管を接続した場合A 社 接続部

パーカータイプ 接続部

A 社 接続部

パーカータイプカラムにA社接続用の配管を接続した場合
パーカータイプ 接続部（単位：mm）（単位：mm）

10.4

36°

36°

40°

36°

40°

それぞれの接続に金属フェラルと1/16”チューブで接続した状態
67

40°

A社カラム接続はテーパー角度が小さいた
め、フェラルの後部で締まり，デッドボリュー
ムはできない.

40°

36°

パーカータイプカラム接続はフェラル先端で締まり、チューブ先端に隙間ができ、ピーク
が広がる.

68

ChromaNik

ChromaNik

トラブルフリー配管 MarvelX, MarvelXACT

IDEX社IsoBarと同じ接続のカラム

A
配管先端

MarvelXACT
誰でも同じ一定のトルクで締め付けが出来る

MarvelXB

SunShell, Halo, PoroShell,
Ascentis Express, Perkin Elmer SPP,
Kinetex, CosmoCore, ClassicShell,
MeteoricCore, UltraCore, OpalShell,
Capcell CoreC

69

ChromaNik

フェラルを用いない接続，チューブ先端で密着
ChromaNik

3.5 µmカラムの比較：保持係数・カラム圧・理論段数

新発売 3.5 μmコアシェルC18

1
2

W company C18 Hybrid 3.5 μm（全多孔性ハイブリッドシリカ）
18.0 MPa

3

1

7

5

4

N6=20,000
k6 =7.1

6

2

SunShell C18 3.5 μm
13.0 MPa
3

0

5

4

5

N6=28,000
k6 =9.2

7

Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
3 = Phenol
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
HPLC: 汎用コンベンショナル装置（内径 0.25 mm の配管を使用）

6

10

15

20

25

Retention time/min

他社ハイブリッドC18に比べSunShell C18は

保持係数は1.3倍・カラム圧は30%減・理論段数は40%増
71

ChromaNik

ChromaNik

シン商品

Biphenyl 新製品 SunShell, Prominert, Sunniest

タンデムTMS化

2.6 μm★ 汎用HPLC でも問題なく使用できるほどの低カラム圧★ 通常の1.4倍の高理論段数 28,000段/15cm★ 新規エンドキャッピングによる高耐久性
推奨pH範囲：1 ~ 12 (C18), 1 ~ 10 (Biphenyl)




5 μm

三官能性シリル化試薬使用

Biphenylの特徴


3.5 μmビフェニル基の二つのベンゼン環は約45度ねじれており，ビフェニル基は単独のフェニル基とは異なる分離挙動を示す。
有機溶媒を含まない水系移動相を用いても，保持の変化がなく，保持時間の再現性の高い分離が達成される。
カフェインのような極性化合物の保持が大きくなる。
他社Biphenylはほとんど一官能性シリル化試薬を用いているが、弊社Biphenyl
は耐酸性の高い三官能性シリル化試薬を使用している。

O
O Si
O

メチル馬尿酸の異性体の分離比較
Column: SunShell C18 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell C30 2.6 μm 150 x 2.1 mm
SunShell Phenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
SunShell Biphenyl 2.6 μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:
Organic solvent/25 mM phosphate buffer pH3.0
Flow rate: 1.0 mL/min, 0.2 mL/min for only C30
Temperature: 40 oC
Detection: UV@230 nm
Sample: o-, m-, p-Methylhippuric acid

Novel end-capping method
The ultimate end-capping method at the present

ortho

meta
OH

NH

O

OH

NH

OH

NH

O

O

O
H 3C

CH3

【New concept】

para

O

O

CH3

73

74

ChromaNik

ChromaNik

SunShellの物性値
結合相

コアシェルシリカ

SunShell C18
SunShell C18
SunShell C18
SunShell C18
SunShell Biphenyl

粒子径 コア径(μm)(μm)

細孔径 比表面(nm) 積(m2/g)

2.0 μm
2.6 μm
3.5 μm
4.6 μm
2.6 μm

9 nm
9 nm
9 nm
9 nm
9 nm

1.2 μm
1.6 μm
2.3 μm
3.4 μm
1.6 μm

120 m2/g
150 m2/g
150 m2/g
90 m2/g
150 m2/g

炭素含有
量(%)

固定相

USP Code

エンドキャッピング

6.5%
7%
7%
5.5%
5%

C18
C18
C18
C18
Biphenyl

L1
L1
L1
L1
L11

Sunniest endcapping
Sunniest endcapping
Sunniest endcapping
Sunniest endcapping
Sunniest endcapping

使用
使用
最高圧 pH範囲
100 MPa 1.5 - 1060 MPa60 MPa50 MPa60 MPa1.5 - 10
1.5 - 10
1.5 - 10
1.5 - 9

SunShell, Prominert, Sunniestの価格例

SunShell C18, 3.5 µm
Prominert C18, 3.5 µm
SunShell Biphenyl,
2.6 µmProminert Biphenyl,
3.5 µm

内径(mm)
⻑さ(mm)

型 番

50
100
150
250
50
100
150
250
30
50
75
100
150
50
100
150
250

CB9941
CB9961
CB9971-----PB9941
PB9961
PB9971-----C86931
C86941
C86951
C86961
C86971
P89941
P89961
P89971------

50
100
150
250

E83241
E83261
E83271
E83281

内径(mm)

Sunniest Biphenyl,
5 µm

2.1

価 格

型 番

¥50,000¥55,000¥62,000-----¥55,000¥60,000¥67,000-----¥67,000¥69,000¥75,000¥84,000¥89,000¥65,000¥72,000¥79,000-----------CB9361
CB9371
CB9381-----PB9361
PB9371
PB9381
C86331
C86341
C86351
C86361
C86371-----P89361
P89371
P89381¥60,000¥65,000¥67,000¥70,000

E83341
E83361
E83371
E83381

2.0

3.0

価 格

型 番

-----¥55,000¥62,000¥80,000-----¥60,000¥67,000¥87,000¥67,000¥69,000¥75,000¥84,000¥89,000-----¥72,000¥79,000¥95,000-----CB9461
CB9471
CB9481-----PB9461
PB9471
PB9481
C86431
C86441
C86451
C86461
C86471-----P89461
P89471
P89481¥60,000¥65,000¥67,000¥70,000

E83441
E83461
E83471
E83481

3.0

4.6

価 格

-----¥55,000¥62,000¥80,000-----¥60,000¥67,000¥87,000¥67,000¥69,000¥75,000¥84,000¥89,000-----¥72,000¥79,000¥95,000

USP L Code

L1
Bentencho station

株式会社 クロマニックテクノロジーズ
552-0001 大阪府大阪市港区波除6-3-1
TEL: 06-6581-0885 FAX: 06-6581-0890
E-mail: info@chromanik.co.jp
URL: http://chromanik.co.jp

L11

4.6

¥60,000¥65,000¥67,000¥70,000

75

76

ChromaNik

ChromaNik

Comparison of particle size 2.6 µm, 3.5 µm and 5 µm
2

8 MPa

3

7

5
4

1 2

Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
N6=20,000
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
7
3 = Phenol
N6=28,000
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7
7 = Triphenylene
HPLC:
Hitachi LaChrom ELITE
N6=32,000(Tubing, 0.25 mm i.d.)

SunShell C18 5 µm

1

6SunShell C18 3.5 µm
5313 MPa

4

6

2
1

0

SunShell C18 2.6 µm
422 MPa
3

2

4

6

8

10

12

5
6

14

16

18

20

22

24

Retention time/min

通常のHPLC装置を用いても、粒子径3.5 μmコアシェルカラムであれば段数も高く背圧も低い.
77

78