－農林水産省委託プロジェクト研究－

生産システム革新のための研究開発
優れたワクチン開発のための技術開発

平成２８年度

最終年度報告書

平成 29 年 3 月

国立研究開発法人
農業・食品産業技術総合研究機構

＜別紙様式３．平成２８年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題

研究年度

担当研究機関・研究室

２４ ２５ ２６ ２７ ２８

機関

研究室

農研機構・動衛研

病態研究領域・寒地

１．黄色ブドウ球菌性乳房炎
に対する粘膜免疫誘導型ワ
クチンの開発ワクチン抗原を探索（１）黄色ブドウ球菌用ワ

酪農衛生ユニット

クチン抗原の探索・精製とそれによる誘導される

抗オートインデューサー（AI）

特異免疫の解析法の確立

における病原因子の発現阻害確
農研機構・動衛研（２）クオラムセンシング

酪農衛生ユニットの阻害を利用した黄色ブ
ドウ球菌性乳房炎に対するワクチン手法の開発

粘膜免疫を効率よく誘導（３）乳房炎ワクチン用高するリポソームの最適化

北海学園大

工学部生命工学科

東北大学大学院

農学研究科応用生命科学専攻

機能リポソームの構築と乳腺組織でのワクチン効

ワクチン抗原のマウス乳果の検証房炎モデルを用いた検証（４）マウス乳房炎モデル

東北大学大学院を用いたワクチン効果の検証

病態研究領域・寒地

農学研究科応用生命科学専攻

ワクチン抗原特異的粘膜

酪農学園大学

獣医学群獣医学類

農研機構・動衛研

病態研究領域・寒地

免疫誘導の検証（５）ウシ乳房炎モデルお酪農衛生ユニット

よびフィールド牛群を用いたワクチン効果の検証

麻布大学獣医学部獣医学科

Ⅰ－２．実施体制
研究項目

担当研究機関・研究室
機関

研究担当者

研究室

研究開発責任者
１．黄色ブドウ球菌性乳房炎 農研機構・動衛研
に対する粘膜免疫誘導型ワ病態研究領域・寒地 ○林

智人

酪農衛生ユニット

クチンの開発（１）黄色ブドウ球菌用ワ 農研機構・動衛研
クチン抗原の探索・精製

病態研究領域・寒地 △林
酪農衛生ユニット智人（内田郁男）とそれによる誘導される

菊佳男

特異免疫の解析法の確立

秦英司
長澤裕哉

（２）クオラムセンシング 農研機構・動衛研

病態研究領域・寒地 △渡部 淳の阻害を利用した黄色ブ

酪農衛生ユニット

ドウ球菌性乳房炎に対す 北海学園大

工学部生命工学科

小山芳一

るワクチン手法の開発（３）乳房炎ワクチン用高 東北大学大学院

農学研究科応用生命 △麻生 久
科学専攻

機能リポソームの構築と野地智法

乳腺組織でのワクチン効
果の検証（４）マウス乳房炎モデル 酪農学園大学

農学研究科応用生命 △野地智法を用いたワクチン効果の

科学専攻

検証

獣医学群獣医学類

樋口豪紀
岩野英知

（５）ウシ乳房炎モデルお 農研機構・動衛研
よびフィールド牛群を用病態研究領域・寒地 △林

智人

酪農衛生ユニット

佳男

いたワクチン効果の検証

長澤裕哉
麻布大学獣

（注１）

菊

医学部獣医学科

河合一洋

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

小課題番号

研究期間

１００１

中課題名

小課題名

小課題責任者名・研究機関

平成２４～２８年度

優れたワクチンの開発のための技術開発

１、黄色ブドウ球菌性乳房炎に対する粘膜免疫誘導型ワクチンの開発林

智人・農研機構・動物衛生研究部門・病態研究領域・寒地酪農衛生ユニット

１）研究目的
搾乳牛の乳房炎は、乳量低下や乳質悪化による経済的な損失が極めて大きいことから、
原乳生産現場で最も防除が望まれている疾患である。平成21年度に日本獣医師会が獣医師•農家を対象として行った調査「畜産現場における新たな動物医薬品のニーズ調査（I）（乳牛関係部門）」でも、乳房炎は新たに動物医薬品等の開発・実用化が必要な病気等の第１位にあげられ、必要とする薬品としても乳房炎ワクチンが第１位にあげられている。細菌性乳房炎の原因菌の中でも特に黄色ブドウ球菌（SA）は、強感染性かつ難治性であることから早急な予防対策が望まれている。
しかし現在のところ国内動物製薬企業による乳房炎ワクチンの開発は１剤もない。一方、海外ではいくつか乳房炎ワクチン製剤が販売となっているが、そのいずれにおいても乳房炎予防の有効性が安定して認められる商品が少ないのも現状である。本課題では、
細菌感染防除に有効とされる分泌型IgA抗体の感染局所へ誘導させることが可能とされる新しいコンセプトの粘膜免疫の考え方を導入し、黄色ブドウ球菌（SA）に対する乳房炎ワクチン開発の可能性を検討する。研究期間の終了までに、経粘膜免疫誘導に適したワクチン抗原候補の検索•精製を行い、経粘膜免疫の効果的誘導の技術開発を試みる。
２）研究成果平成24年度
1. 全菌体成分全てを含む抗原は、２種の遺伝学的背景を示す菌株群 (Clonal Complex；CC)
97 型および CC705 型）からそれぞれ代表的な菌を株化し（CC97：1006 株ならびにCC705：1001 株）、LB 培地にて純培養を行い、ウシ鼻粘膜免疫を連続して行える量を確保した。またサブユニット抗原は、SA 性乳房炎が明確である乳汁をプローブとした
SA の DNA ライブラリースクリーニングを行い、今年度は鉄代謝に関連した一群の遺伝
子 Isd (iron regulated surface determinant) A、B および H をクローニングし、それぞれの遺伝子をタンパク発現ベクターである pGEX-6P-1 に挿入して大腸菌でタンパクを産生させ、親和性カラムにより個々のタンパクを精製した（図 1）。
また、SAが有する抗原を総体的に検出することを目的として、新しい抗体評価システ
ムBacteria plated ELISA（BacELISA）を開発した。これにより、血清中および乳汁中のSA抗原に対する分泌型IgA特異的抗体の定量解析が可能となった（図2）。
2. 乳房炎および正常の乳腺上皮細胞は、共にシクロフィリン A を発現していた。特に、乳房炎発症乳腺では乳腺上皮、乳汁および浸潤部位で強く染色され、乳汁中への分泌が確認された。一方、炎症の進行に伴い間質が肥大して乳腺胞が委縮した乳腺上皮では発現が弱かった。乳汁中シクロフィリン A は、正常乳においても微量検出されたが、乳房炎と診断された分房乳では大量に検出された（図 3）。さらに、乳汁中シクロフィリン A
は乳房炎マーカーの化学発光能（CL 能）と高い相関を示し、CL 能が低値で乳汁中シク
ロフィリン A が高い乳が確認された乳牛は、今後乳房炎を発症する予備軍である可能性が考えられた（図 4）。本研究により、リンパ球遊走因子シクロフィリン A は乳房炎初期において免疫細胞の動員などの炎症を誘導し、乳房炎早期診断マーカーとなり得る可能性が示唆され、ウシ乳房炎モデルおよびフィールド牛群を用いたワクチン効果検証への応用が可能出ることが判明した。
また、ワクチン用pH感受性膜融合ポリマーの検討に関しては、合成された多分岐型pH感
受性融合ポリマーの中で60分岐のポリマーが脂質膜との相互作用におけるpH応答性が最も高いことを確認した（表1、図5）。
3. 牛バルク乳由来 SA の 30 株の agr 型解析から既知の I〜IV 型の全型が得られたが、23株が I 型であった。反芻動物に特徴的であり、牛バルク乳から高率に分離される CC97
および CC705 の SA については、CC97 の全ておよび CC705 菌株の一部が I 型、CC705
菌株の一部が II 型であった（表 2）。AIP-1 および AIP-2 に対応するワクチン抗原を設計した（図 6）。
具体的データ

体細胞数

体細胞数（/ml）

図1、SA用ワクチン抗原の遺伝子組換えによるタンパク精製

乳汁中にSA感染があることを示す

総 Ig

IgA

図2、乳汁中のSA特異的抗体のBacELISA解析（総 Ig および IgA）

図3、乳汁中シクロフィリンAの

図4、乳汁中シクロフィリンAとCL能との相関

ウェスタンブロット解析
表1、新規pH感受性膜融合ポリマー

図5、多分岐型・直鎖型pH応答性ポリマー修飾リポソームのpH感受性能

表2．牛バルク乳由来SAのagr型および遺伝学的背景

MLST: multilocus sequence typing
CC: clonal co le

図6．SAのAIP-1およびAIP-2に対応する
抗原の設計
ラクトン構造に改変し構造安定性を高め、システインを付加しキャリアタンパク質との平成25年度1.
鉄/ヘム取り込み関連蛋白 Isd-A、-B、-H のサブユニット抗原に加えて、本年度はフィブリノゲン結合蛋白(ClfA)、ファイブロネクチン結合蛋白 (FnbP)の結合ドメイン
を組換え蛋白として作出した（図 1）。組み換え蛋白に対する乳汁中抗体についてウエスタンブロッティングにより解析したところ、IsdA、-B、-H 抗体は正常牛の乳汁においても検出され、ClfA 抗体は重症例からのみ検出された。しかし FnbP 抗体は検出されなかった（図 2）。
2.
全身免疫により、血漿中の抗 AIP-1 および-2 特異抗体価（IgG および A）を上げる
ことができたが、乳中の抗 AIP 抗体価の増加は僅かなものにとどまった（図 3）。
3.
生体膜への融合能について蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法を用いて解析した
結果、いずれのリポソームおいても、重合度の違う新規 pH 感受性膜融合ポリマー修飾によりエンドソーム膜との膜融合が認められた（図 4-A）。特に、EYPC/DOPE リ
ポソームは EYPC リポソームに比べいずれのポリマー修飾でも高い膜融合を示した。
また、MGlu-HPG60 を修飾した場合、EYPC リポソーム、EYPC/DOPE リポソームのいずれにおいても高い膜融合能を示す傾向が認められた（図 4-A）。さらに、ポリマー修飾 EYPC/DOPE リポソームの樹状細胞内分布を調べた結果、いずれのポリマ
ー修飾においても、ローダミンの蛍光と NBD の蛍光が樹状細胞内に観察され、リポソーム膜とエンドソーム膜との融合が確認された（図 4-B）。しかしながら、ポリマ
ー非修飾リポソームにおいては、ローダミンと NBD の蛍光が樹状細胞内に観察されなかった（図 4-B）。また SA 抗原封入リポソームの封入抗原の経時的安定性を確認したところ、3 週後で 17％、4 週後で約 30％の SA 抗原がリポソームから離脱することが分かった（表 1）。
精製カラム中に溶出バッファーを添加することにより、スブチリシンが活性化してC末
端にタグが無い組み換えウシCyPA蛋白を精製した。精製した組み換えウシCyPA蛋白
は、100 ng/mlに至適濃度が存在するリンパ球遊走能を有することが判明した（図5）。
作成したウシCyPAサンドウィッチELISAは、組み換えウシCyPA蛋白の1 ng/mlから
1 μ/mlまでの範囲で良好な検出性能を発揮できることが判明した（図6）。開発した
ELISAを用いて乳汁中のCyPAを定量することにより乳房炎発症初期段階の判定が可能となり、ウシ乳房炎モデルおよびフィールド牛群を用いたワクチン効果検証への応用が可能である。
4.
SA 死菌のワクチン抗原としての免役原性の評価行った（図 7）。SA 死菌の BALB/c
マウスへの腹腔投与によって、①SA に反応する IgM タイプの自然抗体が免疫前のマウスの血清中に既に存在していること、②SA 特異的 IgM 抗体の力価は、SA 死菌の免疫によって高まること、③SA 死菌の免疫によって、SA 特異的 IgG 抗体も新たに作り出されること、④SA 特異的 IgG 抗体の力価は、SA 特異的 IgM の抗体の力価と比較し低いこと、⑤SA 特異的 IgA 抗体の産生は、SA 死菌の腹腔投与では誘導されないこと、が明らかとなった。以上の結果から、SA 死菌はワクチン抗原としての免疫原性を有しているものの、IgM から IgG や IgA へのクラススイッチを促すためには、
SA 死菌投与によって誘導される免疫応答を効果的に増強させることが可能なアジュ
バントや、効果的なデリバリーシステムとの併用が必要不可欠であることが明らかとなった。
SAワクチンの効果判定において、SAに対するウシの基礎的な免疫応答能の評価が重要な指標と考えられる。本研究では、主要なサイトカインに着目しSAに対するウシ
末梢血単核球および好中球の応答性について評価した（図8）。その結果、SA生菌刺激によって単核球ではTNFα、IL17、IL18、IL2、IFNγ、TGFβ、IL4、IL10および
IL13のｍRNA発現量が増強し、IL1βおよびIL8の低下が確認された。好中球ではTNFα、
IL1β、IL8、IFNγおよびIL12のｍRNAの発現増強が確認された（図9）。両細胞ともSA死菌に対しサイトカインのｍRNAの発現増強は確認されなかった。これらの結果
はSAに対する生体の免疫応答の一端を示す結果であり、SAワクチン開発における基礎知見として重要であると考えられる。
乳房炎既往歴のない初産搾乳牛を用い、SA 株の生菌を乳房内に投与することにより慢性型乳房炎モデルの作出条件を確立したところ、25 CFU/分房の条件で慢性乳房炎の発症誘導が可能であるとこが分かった。また、乳房炎既往歴のない初産搾乳牛を用い、SA1006 株の死菌を鼻腔粘膜免疫することによる牛粘膜ワクチンモデル実験を試みた（図 10）。今回鼻腔粘膜に長時間ワクチン抗原を留めることを考え、粘稠性を確保するポリアクリル酸ナトリウムを SA1006 株死菌と混合した溶液により鼻腔粘膜
免疫したところ、乳汁中に SA 特異的 IgA 抗体が乳汁中に分泌されることが確認された（図 11）。現在 SA 特異的 IgA 抗体価の測定を継続しているが、充分に抗体価が上昇した時点において、慢性型乳房炎モデル作出条件において感染予防の実験を行う予定である。

5.

具体的データ1.

黄色ブドウ球菌用ワクチン抗原の探索•精製とそれによる誘導される特異免疫の解析

Marker

ClfA

FnBP

IsdA

IsdH

GST

PS（SA +）IsdA
IsdB

Marker法の確立
AB H C F M

389（SA +)AB HC F M

八紘46
ABH C F M

20min

75min

5sec

組み換え蛋白のSDS‐PAGE(12.5%)

図1 サブユニットワクチン
抗原候補分子A；IsdA
B；IsdB
H；IsdHC；ClfA
F；FnbP
M；分子量マーカー旭化成36983 （SA ‐） 275（初産後13週：SA‐）ABHCF M MABHC F
A B H GST

5sec

75min

乳清希釈倍率；1/200

HRP標識Protein G ( g/ml)
化学発光でシグナルを検出（時間はフィルムへの感光時間）

図2乳汁を用いたウエスタンブロッティング

10min

2. クオラムセンシングの阻害を利用した黄色ブドウ球菌性乳房炎に対するワクチン手法の開発

図3．AIP-1を免疫したマウスにおける血漿および乳中抗体
3. 乳房炎ワクチン用高機能リポソームの構築と乳腺組織でのワクチン効果の検証

図4 樹状細胞内におけるリポソームの融合

リ ポソ ーム安定性試験

表1

SA抗原封入リポソームの封入抗原の経時的安定性評価
Leakage of SA-antigen (%)
Liposomes

Day 0

Day 1

Day 5

Day 7

Day 14

Day 21

Day 28

Sup.

—

2.3

1.9

1.3

1.7

1.9

1.6

図5 組み換えウシシクロフィリンA(rbCyPA)の

図6ウシシクロフィリンAのELISA

活性確認：細胞遊走能
マウス乳房炎モデルを用いたワクチン効果の検証

3

3

IgM

2.5

IgG

2.5

Pre
1st
2nd

1.5

3rd

1

Pre
2

OD450

OD450

2

1st
2nd

1.5

3rd

1

4th
0.5

4th
0.5

0

0

8

9

3

10 11 12 13 14 15 16 17
血清希釈（Log2）89

10 11 12 13 14 15 16 17
血清希釈（Log2）

IgA

2.5

Pre
2

OD450

4.

1st

BALB/cマウス

2nd

1.5

免疫スケジュール

3rd

1

4th

サンプリング（血清）‐1

免疫（腹腔投与）0.5

黄色ブドウ球菌死菌（5x108CFU）

1

3

5

7
週

0

2

4

6

0

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17
血清希釈（Log2）

図7 黄色ブドウ球菌（SA）死菌のワクチン抗原としての免役原性の評価（マウス腹腔へのSA死菌投与によって誘導される血清中SA特異的免疫応答）

IL-8

*

2000

2

10

0.5

1

30

**

0
4

*
*

0

**

2

12

24

**
**

1.5

*
*

0

1

1

40

0.5

0.5

20

**

0

0

**
12

6

6

24

**
**
12

IL4

*
24

10

5

0
6

12

1.5

2000
0
30

6

1

4

0.5

2

0.005

0

0

0

1.5

6

0.006

1

4

0.004

10

0.5

2

0.002

12

24

6

12

24

200

100

0

0

10

60

*

4
2
0
3
2

40
5

50

1

20

0

24

12

0

24

0
6

12

0
6

24

6

12

24

IL1β

TNFα

12

24

6

12

IFNγ

24

**

**

**

12

図8-② SA刺激による単核球のmRNA発現量

24

30
20

50

20

500
*

*

0

0

0

15

5

6

4

10

0
3

6

40

2

30
20

3

6

10

10

0

0

0

0
3

6

3

6

図9 SA刺激による好中球のmRNA発現量

ウシ乳房炎モデルおよびフィールド牛群を用いたワクチン効果の検証

免疫：
ポリアクリル酸ナトリウムで粘稠性の黄色ブドウ球菌1006株
死菌（死菌：1010）含水溶液を作製し、鼻腔投与

図10

*

10
0

20

2

5

0

30

4

3
1

6

IL12

1000

**

40
20

IL8
100

40

60

0

0

0
6

200

100

6

0.01

20

0

12

300

400

0

*

0.015
**

**

100

IL13

IL10

IL6

4000

6

6

200

0

24

*

**
**

TGFβ

IL12
**

SA刺激による単核球のmRNA発現量

図8-①

6000

0

60

IFNγ
600

300

20

1000

0

***

1.5

6

5.

IL-2
400

* 10

0

S. aureus-stimulated
killed
live

IL-18

IL-17

1

S. aureus-stimulated
killed
live

20

IL-1β

S. aureus-stimulated
killedlive

S. aureus-stimulated
killedlive

TNF-α

SA死菌の鼻腔投与

36

（万/ml）

40
30
20

右前
右後
左前
左後

（CFU/ml）

1000
800
600
400

SA-IgA抗体濃度

黄色ブドウ球菌数
右前
右後
左前
左後

0.5
（O.D.=450nm）

体細胞数
50

10

200

0

0

-3 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 (w)
SA死菌投与▲ ▲▲▲-3 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 (w)
SA死菌投与▲ ▲
▲
▲

0.4
0.3

右前
右後
左前
左後

0.2
0.1
0

‐0.1

-3 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 (w)
SA死菌投与▲ ▲▲▲図11 乳汁中の体細胞数、SA 菌数、SA特異的 IgA 抗体価
平成26年度
1. 組み換え蛋白に対する乳汁中抗体についてウエスタンブロッティングにより解析した。IsdA、IsdB、IsdH は正常牛の牛においても検出され、ClfA 抗体は重症例から検出され、FnbP に対する抗体を有するものは検出できなかった。71 検体の牛乳汁中 IgA 抗体について調査した結果、抗 IdsA, IdsB, IdsH のいずれも場合も、SA 陽性牛の ELISA 値は SA
陰性のものに比較して有意に高くなった（P<0.05）。
2. 全身免疫により、血漿中の抗 AIP-1 および-2 特異抗体価（IgG および A）を上げることができた（図Ｘ）。アジュバントとして CTB を用いた経鼻粘膜免疫による抗 AIP-1 抗体価の測定結果については解析中である。抗 AIP-1 モノクローナル IgA 抗体（1 クローン）を得た。これはクオラムセンシング阻害に必要な抗 AIP-1 IgA 抗体価を評価するために利用できる。
3. 実験区の乳汁中体細胞数は黄色ブドウ球菌接種後 6 日以内に乳房炎発症の基準である 28.3
万個/ml 以上になったのに対して、対照区の乳汁中体細胞数は低い値で推移していた。また、実験区では黄色ブドウ球菌が検出されて細菌数が上昇し、乳房炎の発症が確認された。
実験区の乳汁中シクロフィリン A 濃度は乳房炎発症時に増加して高い値を継続したが、対照区では増加しなかった(図 1)。乳房炎発症前の分房別乳汁および合乳中シクロフィリン A
濃度の平均値はそれぞれ 97.5ng/ml および 63ng/ml であったのに対し、乳房炎発症後では988.5ng/ml および 623ng/ml となって 10 倍量に増加していた。合乳においても、乳房炎発症時にシクロフィリン A 濃度の上昇が確認された。また、体細胞数とシクロフィリン A
濃度の相関は、分房別乳で R2=0.76、合乳で R2=0.41 であり、共に強い相関が確認された(図2、図 3)。乳房炎発症乳の合乳汁中シクロフィリン A 濃度は 150ng/ml 以上であることが判明し、今後は例数を増加させることにより、乳房炎発症牛を検出できる乳汁中シクロフ
ィリン A 濃度の閾値を確立できることが判明した(図 4)。乳汁中のシクロフィリン A は、
乳腺上皮細胞が合成して乳汁へ分泌されるが、体細胞数と乳汁中シクロフィリン A 濃度には強い相関が認められることから、シクロフィリン A はその白血球遊走能により体細胞数を増加させて炎症を引き起し、乳房炎発症に関与している可能性があることが確認された。また、実験区では乳汁中シクロフィリン A 濃度が感染後も高い状態であったことから、乳房炎の慢性化を助長する要因の一つであることが示唆された。合乳中シクロフィリン A
濃度が感染前に比べて乳房炎発症後に 10 倍に上昇したことは、分房別乳測定に比較して簡便性が高くなると共に、測定経費の削減が可能となる。以上より、健常牛から乳房炎発症に移行する合乳中シクロフィリン A 濃度の閾値を明らかにすることにより、乳汁中シク
ロフィリン A 濃度測定によるワクチン効果判定と早期乳房炎診断が可能になることが判明した。
4. 黄色ブドウ球菌死菌とコレラ毒素を経鼻投与することで唾液、鼻洗浄液、膣洗浄液中に、経膣投与することで膣洗浄液中に、経肛門投与することで膣洗浄液および糞便中にコレラ

毒素特異的 IgA 抗体が誘導された。また、乳汁中のコレラ毒素特異的 IgA 抗体は、経口投与を除く、経鼻、経膣、経肛門の３つの投与方法によって確認され、３群間で有意な差は認められなかった。一方で、黄色ブドウ球菌特異的 IgA 抗体の力価は、どの試験区においても非常に低値であるか、検出限界以下であった。これらの結果は、経鼻投与が乳汁中にIgA 抗体産生を誘導するための優れた抗原投与方法であることを強く物語っていた。一方で、乳房炎ワクチンとして黄色ブドウ球菌の死菌を使用することは、抗原性に課題が残る
ことが明らかとなり、本プロジェクトで進めている乳房炎ワクチンの抗原デリバリーシス
テムの開発の重要性が改めて示唆された。
5. 乳腺に抗原特異的免疫を誘導する前感作抗原候補の乳汁中の抗体価を解析した。また鼻腔粘膜経路で SA 由来抗原を前感作した牛は、前感作なしの牛と比較し、SA 乳房内感染から短時間で SA 特異的 IgA 抗体を強く乳汁中に誘導できることを確認した。
具体的データ
1. 黄色ブドウ球菌用ワクチン抗原の探索•精製とそれによる誘導される特異免疫の解析法の確立

図1 鉄/ヘム取り込みシステムに関わるワクチン抗原候補のIsdA,IsdBおよびIsDH蛋白

ELISA値健康乳

ELISA値

SA(+)

SA（‐)

健康乳

SA（－）

SA（＋）

2.0

0.9

ELISA値

健康乳

SA（－）

SA（＋）

3.0

1.8

0.8

2.5

1.6

0.7

1.4

2.0

0.6
1.2

0.5
1.0

0.4
0.3

1.0

0.6

0.2

0.4

0.1

0.2

0.0

1.5

0.8

0.5

0.0

0.0

1

2

3

5

6

7
グループNo.

乳 中の抗IsdB IgA 抗体

中の抗IsdA IgA 抗体

汁

グループNo.

汁

汁

乳

4

グループNo.

乳 中の抗IsdH IgA 抗体

牛グループ1: 健康
グループ: 5 SA(+)，体細胞数 40＞
グループ2: SA (‐)，体細胞数 40万＞ グループ: 6 SA(+)，体細胞数 40‐200万
グループ3： SA (‐), 体細胞数40‐200万 グループ: 7 SA(+)，体細胞数 >200万
グループ4： SA (‐), 体細胞数 >200万図2 重症度の異なる乳房炎乳汁中における抗-IsdA、抗-IsdB、抗-IsdH IgA抗体価

2.

クオラムセンシングの阻害を利用した黄色ブドウ球菌性乳房炎に対するワクチン手法の開発

図3

AIP-1を全身免疫したマウスにおける血漿および乳中抗体c) 乳房炎ワクチン用高機能リポソームの構築と乳腺組織でのワクチン効果の検証

図4．黄色ブドウ球菌感染後の乳汁中
シクロフィリンA濃度

図？２．分房別乳汁中の体細胞数とシクロフィリンA濃度の相関マウス乳房炎モデルを用いたワクチン効果の検証

図？

ウシ乳房炎モデルおよびフィールド牛群を用いたワクチン効果の検証
牛
鼻腔粘膜からの前感作なしの球

溶

鼻粘膜を介したワクチネーション：
黄色ブドウ

菌死菌含水

液を、数回鼻腔から投与

1.40

球

乳

異
特

1.20
1.00
0.80

感染分房

0.60

非感染分房
弱い
抗体

0.40

生
産

汁

0.20
0.00
‐0.20
2d

牛

0d

1w

2w

3w

4w

鼻腔粘膜からの前感作ありの
球

1.00

0.60

感染分房
非感染分房

疫

0.40

強い
抗体

鼻
腔
鼻免
腔
鼻免
腔
免

生
産

0.80

疫

異
特

1.20

疫

汁

中の黄色ブドウ 菌
的IgA抗体価（OD=450nm）

1.40

乳

e)

ワクチン抗原の経鼻投与によって誘導される乳汁中IgA

中の黄色ブドウ 菌
的IgA抗体価（OD=450nm）

d)

0.20
0.00
‐0.20
0ｄ

11w

18w

20w

22w

0ｄ(23W)

1w

2w

3w

4w

5w

球

▲
黄色ブドウ 菌感染図？

乳汁中における黄色ブドウ球菌に対するIgA抗体価の推移（上：前感作なし下：前感作あり）

平成27年度1.
鉄/ヘム取り込み関連蛋白、IsdA, IsdB, IsdH に加えて、本年度は、ClfA (クランピン

グ因子結合蛋白)、FnBP(ファイブロネクチン結合蛋白)の結合ドメインを組み換え蛋白として作出した（図 1）。IsdA、IsdB、IsdH は正常牛および乳房炎罹患牛においても検出され（図 2）、組み換え蛋白に対する乳汁中抗体についてウエスタンブロッティン
グにより解析した。興味深いことに、ClfA や FnBP に対する抗体は乳房炎罹患牛の乳汁からは検出できないことが多かったが、ポリアクリル酸ナトリウムと SA 死菌あるいはナノゲルと SA 死菌との組合せで鼻腔前感作した牛では、SA 乳房感染後、ポリアクリル酸ナトリウムとの組合せにおいて ClfA が、ナノゲルとの組合せにおいて ClfA と FnBPに対する抗体価をそれぞれ上昇させる効果があることが示唆された（図 3）。
2.
リポソーム包埋 AIP-1 (10 μg) を径鼻免疫した場合は、SAS を用いて全身免疫した場合に比べ、IgA 抗体価で約 1/5、IgG 抗体価で約 1/18 程の上昇であった（図 4）。rTRAP
を SAS を用いて全身免疫して得た血漿中に IgA および IgG 抗体価の上昇を確認した（図5）。
乳房炎乳から分離した野外株SA03を用い、腹腔内投与によるマウス生存率を求め、SAの投与量と経過時間による生存率を比較検討した結果、SAが 107CFUより多くなると、マウスの生存率を劇的に減少させ、5×107CFU以上でマウスは致死となった（図6）。
菌数3×107CFU/100ulをマウス腹腔内に投与し、時間経過による生存率を調べたところ、投与後９時間から生存率が低下し、24時間で40％の生存率となった。以上から、SA03を用いたマウス腹腔内投与試験では、3×107CFU/100ulから5×107CFU/100ulの投与
量でワクチン効果試験を行うことが可能であると明らかとなった（図6）。
3. これまで行った実験牛 6 頭の乳汁中生菌数、黄色ブドウ球菌数、体細胞数およびシクロ
フィリン A 濃度をまとめたところ、感染乳房では全ての検査項目が黄色ブドウ球菌接種後 6 日以内に乳房炎発症の基準以上になったのに対して、非感染乳房対照区の乳汁中では低い値で推移していたことより、感染実験は成功していた（図 7）。乳汁中の体細胞数とシクロフィリン A 濃度との相関を比較したところ、ワクチンの無有に依らず高い相関が認められた（図 8）。しかしながら、乳汁中体細胞数 20 万個/ml 以上の乳汁
中シクロフィリン A 濃度は、ナノゲルワクチン感作群がワクチン無群に比較して低い傾向が認められた（図 9,10）。そこで、これまで実験に供した 6 頭の黄色ブドウ球菌
数、体細胞数およびシクロフィリン A 濃度を感染後 30 日間の平均値で比較した（図11,12）。ナノゲルワクチン感作群 2 頭の乳汁中シクロフィリン A 濃度の平均値は有意に低いことが判明し、乳汁中体細胞数の平均値でも 1 頭で最も低い値となった。ポリア
クリル酸ワクチン感作は 1 回の実験であるが、黄色ブドウ球菌数、体細胞数およびシク
ロフィリン A 濃度の平均値で最も高い値となった。乳汁中のシクロフィリン A は、乳腺上皮細胞が合成して乳汁へ分泌されるが、体細胞数と乳汁中シクロフィリン A 濃度には強い相関が認められることから、シクロフィリン A はその白血球遊走能により体細胞数を増加させて炎症を引き起し、乳房炎発症に関与している可能性があることが確認された。また、ナノゲルワクチン感作牛では、乳汁中体細胞数が高い乳汁であっても、乳汁中シクロフィリン A 濃度が低い値であったことより、炎症誘起に至る状態が緩和されていたと考えられた。以上より、健常牛から乳房炎発症に移行する合乳中シクロフ
ィリン A 濃度の閾値を明らかにすることにより、乳汁中シクロフィリン A 濃度測定によるワクチン効果判定と早期乳房炎診断が可能になることが判明した。
4.
ナノゲルを用いて黄色ブドウ球菌の死菌を被覆し、それをマウスに経鼻投与すること
で、乳汁中に黄色ブドウ球菌特異的 IgA 産生を誘導することが可能であった（図 13）。
黄色ブドウ球菌は抗原性が非常に低く、単独で経鼻投与しても、乳汁中に黄色ブドウ球
菌特異的 IgA 産生を誘導することは極めて難しいことから、本成果は、ナノゲルの優れた抗原デリバリー効果をウシでも実証できる可能性があることを意味する。興味深いことに、コレラ毒素をアジュバントとして併用した場合、黄色ブドウ球菌特異的 IgA
産生は誘導されなかった。このことは、コレラ毒素を併用することで鼻粘膜上皮細胞が損傷を受け、ナノゲルの抗原デリバリー効果が消失されたことを示唆していた。また、
黄色ブドウ球菌の死菌をナノゲルで被覆せずにコレラ毒素と共に経鼻投与した場合も、
黄色ブドウ球菌特異的 IｇA 産生は誘導されなかった。血清中の黄色ブドウ球菌特異的
IgG 産生も、乳汁中の IgA と同様の結果であった。また、コレラ毒素特異的血清中 IgG

および乳汁中 IgA は、ナノゲルの有無に関わらず、コレラ毒素をアジュバントとして用いた試験区で認められた。これらの結果は、ナノゲルを用いることで、アジュバント
非存在下でも黄色ブドウ球菌に対する免疫応答を誘導可能であることを意味していた。
5.
今年度までに実施した乳房炎歴のない初産牛の６頭の SA 死菌による鼻腔前感作あり（３頭）および前感作なし（３頭）の乳汁中に誘導される SA 特異的 IgA 抗体の実験結果をまとめた（図 14、図 15）。SA 死菌による前感作ありの３頭に関しては、１頭がポリアクリル酸ナトリウムと SA 死菌との組合せ、２頭がナノゲルと SA 死菌との組合せでの感作である。この実験の結果、乳汁中の SA 特異的 IgA 抗体価は、前感作ありの牛で感染後すみやかな抗体価の上昇が認められた。一方、前感作なしの牛では抗体価の強い上昇は見られなかった。この結果は、乳腺における SA 特異的な免疫学的メモリーの形成が局所のリンパ節等で形成されたか、あるいは鼻腔で形成された SA 特異的なメモリーB 細胞が粘膜帰巣経路により乳腺にホーミングしたことにより、感染後速やかな免疫反応が誘導された可能性が示唆された（図 15）。
これまでの前感作した牛３頭の中で、最もSA特異的IgA抗体価が高かったSA死菌＋ナノゲルで鼻腔前感作した牛の５週目の乳汁を用い、in vitroの細菌培養および乳腺上皮細胞の培養実験でSAの増殖抑制活性およびSAが持つ乳腺上皮細胞障害に対する抑制効果を解析した（図16）。その結果、SAにより前感作した牛の乳汁を培養培地に添加した場合、SAの増殖が抑制された（図17）。さらにその乳汁は、SAとの共培養による乳腺上皮細胞の死細胞数の増加を抑制することが示された（図18）。以上より、牛の鼻腔を介してSA死菌を前感作して得た乳汁のSAの増殖抑制活性およびSAに対する乳腺上皮細胞障害抑制活性が確認できた。
鼻腔を介した抗原の認識から乳腺において液性免疫が誘導されることは上記の実験において明らかに出来たが、抗原感作の出発点となる鼻腔でのSA死菌を取込む感作部位は未だ不明であった。そこでFITC標識SA死菌を牛の鼻孔から約15cmのカテーテルを用いて左の鼻腔へ投与し、1時間後に安楽殺して主要な粘膜上皮組織および頭部を中心としたリンパ節を回収し、回収したリンパ節中におけるSA死菌を取込んだ細胞の割合
をフローサイトメーターにより測定し、SA死菌が取込まれたリンパ節の解析をした（図19）。その結果、回収したリンパ節中におけるSA死菌陽性細胞の割合は、投与部位に近い口蓋扁桃や耳管扁桃、舌扁桃および従隔リンパ節で比較的高く、咽頭扁桃で最も高かった。一方、投与部位から遠位の腸間膜リンパ節や鼠径リンパ節ではSA死菌陽性細胞の割合は低かった。本実験の結果、咽頭扁桃が鼻腔からのSA死菌を最も取込む部位であることが示された。
牛の咽頭扁桃において、CD20（B細胞マーカー）陽性細胞が多数存在するリンパ濾胞が存在し、リンパ濾胞および上皮層とリンパ濾胞の間にIgA産生細胞が多数存在することが判明した（図20）。またIgAは、鼻腔粘膜および咽頭扁桃上皮細胞上にも局在していた（図20）。また、SA-FITCを鼻腔投与し、1時間後の咽頭扁桃におけるSA-FITC陽性
細胞が未投与の牛と比較して15.3%存在し、咽頭扁桃には、SA-FITC陽性細胞とCD45（白血球マーカー）、MHC class Ⅱ（抗原提示細胞マーカー）並びにCD11ｃ（樹状細胞マーカー）と共染色される細胞群が存在した（図21）。以上より、咽頭扁桃はSA-FITCに対する特異的免疫応答の場となっていることが示唆された。
鼻腔でのSA死菌の取込み部位の解析に併せて、鼻腔粘膜上皮におけるSA死菌を取込んだCytokeratin 18（CK18: M細胞マーカー）陽性細胞の有無を免疫染色法、さらに走査型電子顕微鏡を用いて、SA死菌を感作した組織から菌が取り込まれる超微細構造を画像から確認した。その結果、咽頭扁桃上皮層のSA陽性CK18細胞の解析でSA陽性細胞が存在することが判明した（図22）。さらに走査型電子顕微鏡により、咽頭扁桃上皮層にM細胞の特徴である繊毛を持たない細胞が存在することが確認された（図22）。これ
らの結果から、咽頭扁桃に存在するM細胞様細胞におけるSA死菌の取り込みが確認でき、この部位のM細胞様細胞が抗原感作の出発点となっている可能性が示唆された。

FnBP

Marker

ClfA

IsdA

IsdH

GST

IsdA
IsdB

現

Marker

具体的データ

GSTとの融合タンパクを大腸菌で発

(kDa)
97‐
66‐

プロテアーゼによりGSTと候補分子を分離45‐
候補分子をアフィニティー
クロマトグラフィーにより精製

29‐
20‐
14‐

IsdA, IsdB, IsdH：鉄/ヘム取り込
みシステムに関わる蛋白
ClfA:クランピング因子結合蛋白
FnBP:ファイブロネクチン結合蛋白

組み換え蛋白のSDS‐PAGE(12.5%)

図1 これまでに作製した黄色ブドウ球菌に対するワクチン抗原候補分子

ELISA

&

SA /)#ELISA &

SA(+)#

0.9##

2.0##

0.8##

1.8##

SA

ELISA &

SA

SA

2.5##

1.6##

0.7##

SA

3.0##

1.4##

0.6##

2.0##
1.2##

0.5##
1.0##

0.4##

1.0##

0.6##

0.2##

0.4##

0.1##

0.2##

0.0##

1.5##

0.8##

0.3##

0.5##

0.0##

0.0##

1###########2##########3###########4##########5##########6##########7#
No.

No.

No.

IsdA#IgA

IsdB#IgA##

IsdH#IgA#

図2 重症度の異なる乳房炎乳汁中における抗-IsdA、抗-IsdB、抗-IsdH IgA抗体価

無右前(SA)

ﾎﾟﾘｱｸﾘﾙ酸免
右後

ELISA値

1.0

1.0

0.8

0.8

0.6

0.6

0.6

0.4

0.4

0.4

0.2

0.2

0.2

0.0

0.0

0.8

0

5

ELISA値

1.2

5

10

15

20

25

30

35

2

1.0
0.8

0.8

0.6

0.6

0.6

0.4

0.4

0.4

0.2

0.2
5

10 15 20 25 30 35 40 45
感染後経過日数（日）0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0.2

0.0
0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

1.0

0.8

0.0

0

1.2

1.2
291

1.0

右後
左後

0.0
0

10 15 20 25 30 35 40 45

右前(SA)
左前(SA)

右後
1.2

1.0

ClfA

右前（SA）

ﾅﾉｹﾞﾙ免

1.2

1.2

FnBP

疫

疫

疫
免

0.0
0

5

10

15

20

25

感染後経過日数（日）3035

感染後経過日数（日）

図3 前感作をした牛の黄色ブドウ球菌感染後の乳汁中ClfAおよびFnbPに対するIgA抗体価

AIP1‐IgG

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

AIP1‐IgA

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

血漿

血漿

汁

day0 day7 day22 day36 day41 day41

汁

day0 day7 day22 day36 day41 day41
乳

乳

疫

用

疫

・ day 0, 14, 28 に 10 μg/head で径鼻免・ Sigma Adjuvant System を いた全身免 の1/5 (IgA抗体）〜1/18 (IgG抗体)の抗体価

図4 リポソーム包埋 AIP-1 を径鼻免疫したマウスの血漿中抗体価

疫

抗原： His タグを除去した組換えTRAP (rTRAP)
抗血漿： ３週間隔で rTRAP (5 μg/head) を Sigma Adjuvant System
で３回免 後１２日目の血漿Mouse an ‐TRAP an bodies (X 1,000 dilu on)
IgG

CBB

IgA

TRAP →

3,000 100
10 500
TRAP (ng/lane)50

図5 マウス抗TRAP抗体の検出

生

存

率

80

80

(%)

100

60

60

率

40

生

存

(％)

SA投与量を検討した。
100

40

20

20

0

0

5×10⁶ 1×10⁷ 2×10⁷ 3×10⁷ 5×10⁷ 5×10⁸

ddY系8‐10週齢雄マウスを

2

4

6

経過時間

9 12 18 24 36 48(時間)

いて、SAを腹腔内に投与し、48時間後まで

生

用

SA投与量 (CFU)率

生

投与量 3×107 CFU/100lによる 存 の時間経過

存を観察

図6 黄色ブドウ球菌腹腔内投与におけるマウスの生存率

図7 黄色ブドウ球菌接種後の乳中シクロフィリンＡの変動（まとめ）
接種後(30日目まで)

CyPA (ng/ml)

4
10000
10

3
10
1000

2
10100
y = 136.12x0.3219
r = 0.74 p <0.01

1010
100.1-1

11

10
1002
10003
10
10
10
体細胞数(万/ml)

10000410

体細胞数と乳中CyPA濃度に相関があった

図8 乳汁中シクロフェリン（CyPA）濃度と体細胞数との相関性

接種後(30日目まで)#284 （ポリアクリル酸ナトリウムワクチン）

#290
#295

#291 （ナノゲルワクチン）#300#296 （ナノゲルワクチン）

10000

10000

1000

1000

100

100

y = 141.04x0.3142
r = 0.70 p < 0.01

y = 129.5x0.3326
r = 0.77 p <0.01
10

0.1-1
10

11

10
1002
10003
10
10
10
体細胞数(万/ml)

10

0.1-1
10 10

100004

1

1

10
1002
10003
10
10
10
体細胞数(万/ml)

10000410ワクチン接種と非接種に関わらず体細胞数と乳中CyPA濃度に相関があった

図9 ワクチン接種による相関性の違い

接種後(30⽇
⽬まで
⽇⽬

)

#290

#291 （ナノゲルワクチン）#295#296 （ナノゲルワクチン）

#300
10000

10000

1000

1000

100

100

y = 184.5x0.2246
r = 0. 62p <0.01

y = 129.5x0.3326
r = 0.77 p <0.01
10

0.1-1
10

11

10
1002
10003
10
10
10
体細胞数(万/ml)

10

0.1-1
10 10

100004

11

10
1002
10003
10
10
10
体細胞数(万/ml)

10000410汁

ナノゲルワクチンを接種することにより乳中ＣｙＰＡ濃度の上昇が小さくなった。

図10 ワクチン接種による体細胞数とCyPAとの相関性の違い

図11 ワクチン接種によるＣｙＰＡ濃度の違い

図12 ワクチン接種によるＣｙＰＡ濃度の違い接種後平均

０

４

5

8 9 10 週

汁

産

交配
出

疫

生
産

球

用異
特

ナノゲルを乳房炎経鼻ワクチンのデリバリー
分子として いることで、乳 中の黄色ブドウ 菌
的IgAが増強される２

サンプリング母マウスへの免CT-specific IgA
SA-specific IgA

3

***

*

物

cC

鼻腔洗浄液

3

唾液
鼻腔洗浄液

母マウス
汁

汁

①ナノゲル+ A1006（5x108CF ） + コレラ毒素（5μg）：cCHP- A + C②ナノゲル+ A1006（5x108CF ）：cCHP- A③ A1006（5x108CF ） + コレラ毒素（5μg）： A + C④コントロール唾液(30日目まで)

胃内容 （乳 ）子マウス

乳
3

***

***

***

2

2

2

1

1

1

0

0

0

1 .5

1 .0

1 .5

**

**
1 .0

*

1 .0
0 .5

0 .5

0 .5

0 .0

A
-S
HP

0 .0

T
SA + CT ntr+ C HP Co
SA
cC

ol
H
cC

P

l
T
SA + CT ntro
+ C HPo
A
A
C
S
-S
cC

0 .0

l
T
SA + CT ntro
+ C HPo
A
A
C
S
-S
cC
HP
cC * p<0.05 ** p<0.01 *** p<0.001
Multiple comparison test (vs control)

図13 マウスにおいて黄色ブドウ球菌死菌とナノゲルの組合せは、乳汁中の黄色ブドウ球菌特異的IgA産生が増強される

溶

球

汁球

球

疫

黄色ブドウ 菌1006株死菌含水 液（ナノゲル or ポリアクリル酸ナトリウム含有）を作製し、鼻腔に隔週で免鼻腔へ黄色ブドウ 菌を複数回前感作

生
産

…

異球
特

乳 を採材後、黄色ブドウ 菌的IgA、
SCC、黄色ブドウ 菌数を評価

生

球

乳房内へ
黄色ブドウ 菌 菌感染

図14 牛における鼻腔前感作のプロトコール

ポリアクリル酸ナトリウム

前感作あり
1.2

前感作なし
1.2

No.284

1

1

0.8

0.8

0.6

0.6

0.4

0.4
0.2

0.2
0

0d

2w

4w

6w

8w

2w

4w

1.2

ナノゲル

1

No.296

1
0.8

0.6

0.6

0.4

0.4

2w

4w

6w

8w

2w

4w

0

1.2

No.291

4w

6w

8w

2w

4w

4w

6w

8w

2w

4w

4w

6w

8w

2w

4w

No.2900d2w

No.295

1

0.8

0.8

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2
0d

2w

4w

6w

8w

2w

4w

0

SA鼻腔粘膜感作
0d

2w

生

0

2w

0.2
0d

1.2
1

0d

1.2

0.2

ナノゲル

0

0.8

0

No.283

SA

菌乳房内感染図15 鼻腔前感作あり・なしにおける、乳汁中SA特異的IgA抗体価の変動

SA

異
特

的 IgA 抗体 （OD=450nm）

1.0

１

鼻腔感作
２

３

SA死菌
＋
ナノゲル

0.8

0.6
SA死菌
＋
ポリアクリル酸
ナトリウム

0.4
0.2
0

0d

1w 2w 3w 4w 5w
投与後の経過（週）6w

図16 ナノゲルおよびポリアクリル酸ナトリウムを用いた前感作段階での乳汁中SA特異的IgA抗体価の比較

図17 鼻腔からの前感作で得た乳汁のSA増殖抑制活性

100

a

a

a

a

a
b

80
60
40
c

c

20
0
SA

SA

Control

SA
*

SA

SA

75.53+%

56.46+%

Hoechst33342+/+PI

5.78+%

SA**

図18 鼻腔からの前感作で得た乳汁のSAの乳腺上皮細胞障害抑制活性

CD45

咽頭扁桃

鼠径リンパ節Counts

投与部位

FITC

気管

30
20

腸間膜リンパ節

胸腺

鼠径リンパ節

脾臓

縦隔扁桃

舌扁桃

SA-FITCを鼻腔投与した各リンパ節におけるSA-FITC陽性細胞の割合

IgA

Merge

咽頭扁桃

CD20

咽頭扁桃上皮

CD20 / IgA

図19

+
PBMCs

咽頭扁桃

0

耳管扁桃

10

口蓋扁桃

FITC-SA (%)

40

図20 咽頭扁桃におけるCD20およびIgA陽性細胞の局在

未投与
未投与
SA‐FITC

未投与

図21 咽頭扁桃における白血球、抗原提示細胞および樹状細胞のSA-FITC陽性細胞の割合

繊毛細胞なしCytokera n 18 / SA‐FITC

HE染色

走査型電子顕微鏡

繊毛細胞あり図22

SA-FITCを鼻腔投与した咽頭扁桃上皮細胞におけるSA-FITCの取り込み

平成28年度
1. IsdA, IsdB, IsdHに加えてClfA 、FnBPの組換え蛋白として作出し、これまでに５種の単離ワクチン候補抗原を作製した。IsdA、IsdB、IsdHの乳汁中抗体価は乳房炎の重症度に伴い高くなることがELISAで検出されたが、ClfAやFnBP抗体は乳房炎罹患牛でも検出が出来なかった。ポリアクリル酸ナトリウム＋SA死菌、あるいはナノゲル＋SA死菌

との組合せで鼻腔前感作した牛では、IsdA、IsdB、IsdHの乳汁中抗体価は早期にプラトーに達し、ClfA とFnBP に対する抗体価を上昇させることが可能であった（図１）。
2.
クオラムセンシングに関連する 2 種類の物質（AIP および TRAP）に対応する抗原を作製し、マウスを用いてそれらの抗原に対する効果的な全身免疫の方法を見出した。抗
AIP および TRAP 抗体価を評価する ELISA を開発した。抗 AIP 抗体は黄色ブドウ球菌の溶血毒素等の病原因子の発現を阻害することを示した。乳牛並びにマウスを用いた黄色ブドウ球菌の実験感染に対する感染防御試験に組換え TRAP を供した。
3.
今年度は、フィールド牛 6 頭の乳汁中シクロフィリン A 濃度を測定した。乳房炎を発症しなかった 3 頭の乳汁中体細胞数およびシクロフィリン A 濃度は変動も少なく、低い値であった。搾乳期間中に乳房炎を発症した 3 頭の乳汁中シクロフィリン A 濃度は、乳汁中体細胞数が異常値になる前もしくは同時期に高い値となることが確認された(図２)。乳汁中シクロフィリン A 濃度と乳汁中の体細胞数あるいは化学発光能との相関解析
では、健康牛の乳汁中シクロフィリン A 濃度は 500ng/ml 以下であったが、乳房炎発症
牛のシクロフィリン A 濃度は乳房炎を発症していない時期においても 500ng/ml 以上の高い値の乳汁が多く認められた(図３)。そこで、健康牛全サンプルの乳汁中シクロフィ
リン A 濃度平均と乳房炎を発症する前の乳汁中シクロフィリン A 濃度の平均を比較した
ところ、乳房炎発症牛では発症するまえから有意に高い値となっていることが判明した(図４)。よって、乳汁中シクロフィリン A 濃度の測定は、健康牛および乳房炎予備群を検出できることが確認された(図５)。本研究課題でこれまで行った実験牛 6 頭の乳汁中
生菌数、黄色ブドウ球菌数、体細胞数およびシクロフィリン A 濃度をまとめたところ、感染乳房では全ての検査項目が黄色ブドウ球菌接種後 6 日以内に乳房炎発症の基準以上になったのに対して、非感染乳房対照区の乳汁中では低い値で推移していたことより、感染実験は成功していた（図６）。そこで、これまで実験に供した 6 頭の黄色ブドウ球
菌数、体細胞数およびシクロフィリン A 濃度を感染後 30 日間の平均値で比較した（図７）。乳汁中の黄色ブドウ球菌数ではワクチン効果が認められなかった。ナノゲルワク
チン感作群 2 頭の乳汁中シクロフィリン A 濃度の平均値は無感作牛に比較して有意に低いことが判明し、乳汁中体細胞数が高い乳汁であっても、乳汁中シクロフィリン A 濃度が低い値であったことより、ナノゲルワクチンは炎症誘起に至る状態を緩和する効果が確認された。
4.
ナノゲル乳房炎ワクチンを開発する上で重要である、乳腺での IgA 産生を促す分子メカニズムを明らかにするための研究を、マウスモデルを用いて実施した。IgA 産生細胞の乳腺への細胞遊走には、乳腺上皮細胞が分泌するケモカインの一つである CCL28
が、また分泌された IgA の乳腺間質から乳腺房腔への放出には、同じく乳腺上皮細胞が合成する Polymeric Immunoglobulin Receptor（Poly-Ig Receptor）が重要な役割を果たしている。本研究では、CCL28 と Poly-Ig Receptor の乳腺上皮細胞での遺伝子発
現が、授乳刺激によって誘導されていること（乳腺での２つの遺伝子発現は、妊娠期には全く認められず、出産後授乳刺激が継続することで向上すること、さらには離乳後に速やかに消失すること）、また乳腺に存在する細菌とは無関係に促されること（授乳中の無菌マウスでも、それらの遺伝子発現に異常は認められないこと）を明らかにした。
これらの研究成果は、今後、IgA 誘導型の乳房炎粘膜ワクチンを開発する上で、その効果をさらに向上可能なアジュバント開発等に貢献可能な内容であった。
5.
今年度までに実施した乳房炎歴のない初産牛の６頭の SA 死菌による鼻腔前感作あり（３頭）および前感作なし（３頭）の乳汁中に誘導される SA 特異的 IgA 抗体、体細胞
数、SA 菌数、血清中白血球数および乳量低減割合の実験結果をまとめた（図、図）。
SA 死菌による前感作ありの３頭に関しては、１頭がポリアクリル酸ナトリウムと SA
死菌との組合せ、２頭がナノゲルと SA 死菌との組合せでの感作である。この実験の結
果、乳汁中の SA 特異的 IgA 抗体価は、前感作ありの牛で感染後すみやかな抗体価の上昇が認められた。一方、前感作なしの牛では抗体価の強い上昇は見られなかった。こ
の結果は、乳腺における SA 特異的な免疫学的メモリーの形成が局所のリンパ節等で形成されたか、あるいは鼻腔で形成された SA 特異的なメモリーB 細胞が粘膜帰巣経路により乳腺にホーミングしたことにより、感染後速やかな免疫反応が誘導された可能性が示唆された（図）。乳汁中の体細胞数の変動は、前感作ありの牛が感染後に体細胞数の増加を抑制していることを示した。このことは感染分房で産生誘導された SA 特異 IgA
抗体が SA 数の増加を抑制したことにより自然免疫の主役の好中球（体細胞の主）が低く抑えられたことを示唆している。実際に血清中白血球数の実験結果、SA 前感作により、感染初期（感染後 1 週間以内）における血清中白血球数の減少が抑制されることを確認した。このことは、SA の前感作により、全身性免疫の発動を抑制することが出来たことを示しており、SA 前感作による乳汁中体細胞数の減少は全身免疫に頼らず局所の粘膜免疫の発動が効果的に起こっていることを示唆している。乳汁中の黄色ブドウ球菌の変動は、前感作ありの牛が感染後に SA の増加を抑制していることを示している。
このことは感染分房で産生誘導された SA 特異 IgA 抗体の作用が SA 数の増加を抑制したことを示唆している。SA 性乳房炎による乳量低減割合は、SA 前感作により感染後 2週間から有意に低減の抑制が示された。さらに、これらの SA 感染モデル牛を感染後 4週間以降病理解剖し、乳房内の状況について組織形態学的解析による詳細な検討を行った。その結果、SA 前感作により、SA 凝集体の発現の消失や線維芽細胞の肥大化が抑制され、乳汁産生部位である乳腺上皮細胞の損傷を抑えることが明らかとなった。これ
らの結果、SA 前感作のメリットとして、乳房炎による乳量低減を低く抑えることが出来、乳牛の乳汁生産を高く維持できる、ということが示された。

具体的成果

図１

SA死菌を前感作したウシのSA感染後の乳汁中IsdHおよびClfAに対するIgA抗体価

図２

フィールド牛の乳中体細胞数とシクロフィリンＡ濃度の変動（↓は抗生剤治療）

図３

フィールド牛の乳中シクロフィリンＡ濃度と乳汁中の体細胞数あるいは化学発光能との
相関解析

図４

フィールド牛における乳房炎発症前の乳汁中の体細胞数あるいは化学発光能との乳中シクロフィリンＡ濃度

図５

フィールド牛における乳中シクロフィリンＡ濃度と乳房炎発症の関係

図６

黄色ブドウ球菌接種後の乳中シクロフィリンＡの変動（まとめ）図７

ナノゲルワクチン接種の有効性

図８

図９

乳腺でのIgA産生に関わる各種遺伝子発現

前感作あり・なしにおける乳汁中SA特異的IgA抗体価、体細胞数およびSA数の変動

図10

図11

前感作あり・なしにおける血清中白血球数および体細胞数の比較

SA前感作あり・なしにおける乳房炎による乳量低減の比較と乳腺組織の病理解析

３）成果活用における留意点

研究期間の成果を、今後フィールド牛群等を用いて実証研究に進める。
４）今後の課題1.
マウスあるいは牛を用い、これまでに精製した５種の単離抗原をカクテル化し、免疫実験あるいは感染実験に用いてワクチン抗原としての有効性を解析する。
2.
AIP あるいは TRAP の乳用牛に対する効果的な粘膜免疫手法を開発し、感染防御試
験につなげることが課題である。
3.
ナノゲルワクチン感作群の乳汁中シクロフィリン A 濃度の平均値は無感作牛に比較して有意に低いことが判明したことから、乳汁中体細胞数が高い乳汁であっても、乳汁中
シクロフィリン A 濃度が低い値であったことより、今後はフールド牛群を用いた実証試
験を行い、ナノゲルワクチンは炎症誘起に至る状態を緩和する効果を確認する。
4.
ナノゲル乳房炎ワクチンを開発する上で重要である、乳腺での IgA 産生を促す分子メカニズムを、マウスモデルを用いて実施し、IgA 産生細胞の乳腺への細胞遊走には、乳腺上皮細胞が分泌するケモカインの一つである CCL28 が、また分泌された IgA の乳腺 間 質 か ら 乳 腺 房 腔 へ の 放 出 に は 、 同 じ く 乳 腺 上 皮 細 胞 が 合 成 す る Polymeric
Immunoglobulin Receptor（Poly-Ig Receptor）が重要な役割を果たしていることを明らかにした。今後はフールド牛群を用いた実証試験を行い、牛でこのようなイベントが起こっているかを確認する。
5.
乳汁中の SA 特異 IgA 抗体の変動は、ワクチンありの牛が感染後に強い抗体の産生誘導があることを示している。このことは乳腺に免疫学的記憶がワクチンにより成立したことを示唆しているが、まだ記憶の機序にわからないことがあるので今後の課題でもある。また、SA 数の増加を抑制する作用機序にもわからないことが多いので今後の課題でもある。

＜別紙様式３．平成２８年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題

研究年度
２４ ２５ ２６ ２７ ２８担当研究機関・研究室
機関

研究室

動物衛生

ウイルス・疫学研究領域

研究部門

牛ウイルス・発病制御

１．新技術を用いたBVDワク
チン及び効果的な接種法の開発
主たる流行株の解析とウイルス（１）BVD野外流行株の解析と不活化抗原の作出

不活化法の検討ユニット
リポソームワクチンの作出と（２）リポソーム不活化ワク
チンの開発

動物衛生

ウイルス・疫学研究領域

研究部門

牛ウイルス・発病制御

大阪府立

ユニット

大学

農学部 獣医環境科学分野
獣医免疫学教室

筑波大学

医学医療系
生命医科学領域
環境微生物学

岩手大学

農学部

ける免疫誘導試験・攻撃試験

動物衛生

ウイルス・疫学研究領域

及び妊娠牛の感染陽性試験

研究部門

牛ウイルス・発病制御

マウスに対する免疫応答

BPIV3のリバース（３）牛パラインフルエンザ
3型（PIV3）を用いた遺伝
子組み換えウイルスワク
チンの開発

ジェネテイクス系の確立とハムスターに対する免疫応答

DNAワクチンの作出とマウ（４）DNAワクチンの構築

スにおける免疫応答

共同獣医学科

上記試作ワクチンの子牛にお（５）牛を用いた新型ワクチ
ンの効果検証ユニット

Ⅰ－２．実施体制
研究項目

担当研究機関・研究室
機関

研究担当者

研究室

研究開発責任者

動物衛生研究部門
疾病対策部◎國保健浩（～2016.3）◎吉原一浩（2016.４）

小課題責任者

動物衛生研究部門
発病制御ユニットウイルス・疫学
牛ウイルスユニット
研究領域○亀山健一郎（2014.3）○坪井孝益（2014.4～）

実行課題
動物衛生研究部門（１）BVD野外流行株の解 ウイルス・疫学 牛ウイルスユニット
発病制御ユニット
析と不活化抗原の作出
研究領域

△

坪井孝益
亀山健一郎

動物衛生研究部門 牛ウイルスユニット（２）リポソーム不活化ワ
ウイルス・疫学 発病制御ユニット
クチンの開発
研究領域

△

坪井孝益
亀山健一郎
渡耒 仁

△

竹内

大阪府立大学

農学部
獣医環境科学分野
獣医免疫学教室（３）牛パラインフルエン 筑波大学
ザ3型（PIV3）を用いた遺伝子組み換えウイルスワ
クチンの開発（４）DNAワクチンの構築 岩手大学

医学医療系
環境微生物学

農学部
共同獣医学科（５）牛を用いた新型ワク
動物衛生研究部門 牛ウイルスユニット
チンの効果検証
ウイルス・疫学 発病制御ユニット
研究領域

（注１）

薫

生命医科学領域△ 村上賢二

△

坪井孝益
亀山健一郎

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

小課題番号

*1002

研究期間

平成２４～２８年度

研究期間

平成２４～２８年度

中課題名

優れたワクチン開発のための技術開発

小課題名

新技術を用いたBVDワクチンおよび効果的な接種法の開発

小課題責任者名・研究機関

坪井孝益・農研機構

動物衛生研究部門

１）研究目的
牛ウイルス性下痢・粘膜病（BVD-MD）は国内の牛群に広く認められ、成牛での下痢や繁殖障害を主徴とした伝染疾病であるが、特に胎仔期の感染によって持続的にウイルスを排泄するとともにウイルス陽性の子牛を生産する持続感染牛（PI牛）となり、主要な感染源となって本病の拡大を招く。本病の予防には市販ワクチンが流通しているものの感染母牛から胎仔への感染阻止能が不十分であるため垂直感染によってPI牛が生産され続けることで結果的に重大な経済的損失をもたらす。垂直伝播を阻止し得る新たな機序による3種のワクチン開発に取り組む。
２）研究成果農研機構

動物衛生研究部門

野外分離株の系統樹解析
野外BVDウイルス分離分与株のE2領域による系統樹解析を行い、40株は1b型に属するBVDウイ
ルスと判別され、次に2a が29株、1aが21株、1cが13株と続き、E2領域に基づく4つの主要な遺伝子型を認めた。さらにこの系統樹解析に基づき攻撃試験用の1a型のNCP株の代表としてTochigi/1/1株が選定された他、1b型のCP株としてはG株等が選定された。
BVDVの増殖性と不活化法の検討
BVDVNose株の各種細胞の増殖性では回転培養法がMDBK細胞、MDBKSY細胞ともに有効であり、またBFM細胞はいずれ（回転・静置）の培養法も高い力価を示したが、細胞維持の点が問題であった。BVDVNo.12のMDBKSY細胞による回転培養による増殖性ではNose株とほぼ同様な増殖性を示したが、1b株のG1株では１a型の両ウイルス株よりも増殖性が劣る傾向を示し、1b型の－株ではさらに＋株よりも増殖性が劣る傾向を示した。次に不活化処理としてBVDVNose
株に対するホルマリン効果では、時間経過に合わせウイルス価の低下を確認し、また濃度別の各0.1％、0.05％、0.01％混和後の37℃及び4℃での培養を比較検討し、4℃で0.05％の処理がより本ウイルス不活化法として適するとした。
BVDVNose株のMDBKSY細胞における大量培養時の増殖性
上記の結果を踏まえ、MDBKSY細胞によるローラー瓶（RB）培養を行った。本RBにおける各ウ
イルス価でスムーズ表面RBでは力価で106.5-7.0/TCID50を認めたが、プリーツ表面RBは107.0-7.5、ガラス製RBは107.0-7.75の力価を示し、3種の中で毎回高力価が得られ、かつより扱いやすい手

法はプリーツ表面RBであった。大量培養後の各試料のホルマリン処理不活化ウイルス液に対して濃縮装置を使用した効率的なウイルス回収を行うとともに，スクロース密度勾配による精製後の総蛋白量の測定では、プリーツ表面RB、ガラス製RBにおいて約1000μg/ml以上の蛋白量が回収可能であること明確にした。
成牛(妊娠牛)における感染陽性試験
胎齢90日の抗体陰性妊娠牛において顕著な発熱を示さず、また流産も認めなかった。感染後約2ヶ月後の剖検では胎子を確認するとともに、母牛はウイルス感染から回復しウイルスが排除されたが、その胎盤及び胎子の全身に感染した事が示された
農研機構動物衛生研究部門・大阪府立大学
リポソーム封入不活化BVDVワクチン
マウスにおける免疫応答
マウスの試験では陽性対照の市販ワクチンでは4～8倍の抗体価、フロイントのアジュバントの混和の試作品では16～32倍の抗体価を示した。さらにリポソーム封入不活化ワクチンでは筋肉内接種において200μg接種マウスで128倍の抗体価を示した。
子牛における免疫応答、子牛1頭の筋肉内接種により、1回目は16倍、2回目256倍、3回目2048倍の抗体価が認められ、さらに追加1頭の免疫誘導でも同様に抗体価2000倍以上を示し、攻撃試験後の発熱や白血球減少が認めなかった。
筑波大学
BPIV3組換えワクチン
BPIV3のリバースジェネティクス系確立のためのウイルスゲノム解析
BN-CE 株および BN-1 株間のウイルス遺伝子の変異塩基箇所を調べたところ、3’リーダー領域（23 塩基目）、P 遺伝子領域（1942 塩基目）、F 遺伝子（5951 塩基目）および L 遺伝子（9822、13031 および 13550 塩基目）の計 6 塩基（翻訳領域 5 塩基、非翻訳領域 1 塩基）に置換が確認された。アミノ酸変異は F 蛋白質および L 蛋白質内で各 1 箇所の合計 2 箇所に存在すると推測された。
rBPV3の回収とＥ2蛋白質の発現確認
共培養上清をMDBK細胞に感染させ、感染3日後からCPEが観察された。さらに、野生(wt)rBPIV3由来の培養上清を用いてRT-PCRを行い、PCR産物はNheIで切断され、プラスミド由来のrBPIV3であることを確認した。同様にE2発現rBPIV3(E2-rBPIV3)由来の培養上清からは、
E2遺伝子特異的なRT-PCR産物の増幅を確認した。wt-rBPIV3、E2-rBPIV3の増殖曲線をそれぞれ測定したところ、最大1.0 x1011、6.3 x107 TCID50/mlに達した。間接蛍光抗体法により、
E2-rBPIV3感染48時間後にE2タンパク質の発現が確認された。完全長cDNAよりrBPIV3の作出に成功し、さらにrBPIV3完全長cDNA内に組み込んだE2タンパク質の発現を認めた。
ハムスターを用いたE2-rBPIV3感染実験。
膜内在性領域を除きBVDV E1タンパク質分泌用signal配列を付加したE2タンパク質遺伝子（E2 C+E1 signal）をBPIV3の完全長cDNAのN遺伝子とP遺伝子の間に組込み、BPIV3のリバー
スジェネティスク法により感染性ウイルスを回収した。E2タンパク質の発現をE2タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法（FA）及びウェスタンブロッティング（WB）
法により確認した。次にE2-rBPIV3-G感染MDBK細胞の細胞膜表面上のE2蛋白質をFA法により検出するとともにWB法でもE2蛋白質を確認した。当該組み換えPIV3のハムスターへの鼻腔内接種を行ったところ、1回免疫ではBVDVに対し4～16倍を示したが、2回免疫後には128～256
倍のBVDV抗体を確認した。またPIV3抗体価は1000倍以上を示した。（H27）

BN-CE株による組変えワクチンの作出
VSVの細胞外輸送シグナル、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインを付加したBVDV E2タンパク質を組込んだワクチン株（BN-CE株）由来の改良型BPIV3を構築した。追ってハムスターに対する免疫応答の有無を行う予定である。
岩手大学
DNAワクチン
試作DNAベクターの作出とマウスの免疫応答
DNAベクターを導入したCOS7細胞におけるE2蛋白の発現をanti-E2モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット解析したところ，delta C ワクチンを導入した細胞では、E2蛋白が細胞内で発現していることを確認した。シグナル配列を付加した３つのDNAベクター（E1、tPA、G）導入細胞では、それらの細胞におけるE2蛋白の発現量はdelta C導入細胞に比べて極めて高いこと，培養上清中にもE2蛋白が分泌されていることを確認した。DNAベクターで免疫したマウス血清中のBVDVに対する中和抗体の有無を調べたところ、E1とG免疫群では、全てのマウスで，delta C免疫群では6匹中5匹、tPA免疫群では4匹で抗体が検出され，E1とG免疫群の幾何平均抗体価±標準偏差（157.41±2.29と161.37±1.83）は、delta CおよびtPA
免疫群（2.64±1.46、10.8±1.49）に比べて有意に高かった。
マウスにおけるDNAベクターおよび不活化BVDV液との同時接種
DNAベクターと不活化ワクチンを同時に接種したところ、ベクター単体の接種以上に中和
抗体価の上昇が認められた。また、その中和抗体価は不活化BVDV液1/5量（100μL）においてもマウスにおける通常の不活化BVDV液の接種量（500 uL）の中和抗体価と比較し、GM値で10倍以上高かった。
マウスに対する用量依存性試験及びBVDV2型を発現するDNAベクター接種による免疫応答
100μｇから400μｇの容量に応じた抗体上昇が認められるが、800μｇと400μｇでの相異は少ないとなり、マウスにおいて400μｇがプラトーに達すると推察された。
子牛における免疫応答①子牛2頭にBVDV1a_Nose_E2△C-E1 DNAベクター400 ug/頭を大腿上部筋肉に接種後、3週間目に同量を追加接種（2回）したが、ともに抗体陰性を示した。
②子牛 2 頭に BVDV1a_Nose_E2△C-E1 DNA ベクター500 ug/頭を、１頭に同ベクター1mg/頭を 27G 針先 3 mm の 2 段針（トップ社）を用いて大腿上部皮内に 100 uL ずつ 5 カ所に接種し、さらに 2 週間隔にて計 3 回追加接種を行ったところ、500μｇの 1 頭は陰性となったが、もう 1 頭は 16 倍を示し、また 1mg では 32 倍を示した。
③抗体陰性子牛2頭において発熱等の臨床症状を認め、経時的検査で白血球減少症を示したが、2週間後の剖検では、各組織からのウイルス分離は陰性となった。一方それぞれのリンパ系組織（各種リンパ節や扁桃等）より遺伝子が多数検出された。
④不活化BVDV液を使用した子牛2頭の抗体上昇は1回目で認められず、2回目において16倍あるいは32倍の抗体価を確認した。一方不活化BVDV液とDNAベクター1mgとの混合接種では128倍となった。攻撃試験後の各組織からの遺伝子検出では抗体陰性牛と同様に各組織から多数のウイルス遺伝子が検出された。血清中のウイルス血症の確認では、陰性牛が明瞭な分画を示したが、上記の接種をした3頭は不鮮明となった。

３）成果活用における留意点
DNAワクチン
リポソームワクチン
通常のウイルス学に沿ったウイルス増殖、精製により作製したウイルス液を不活化させることで、原則どのようなウイルスでも細胞接種よる増殖が可能であれば、本手法によるワクチン開発が容易に可能となる。
本報告では筋肉内接種での手法をとったが、さらに眼結膜への接種でも効果が立証されれば、その2つの手法の組み合わせも可能となる他、その接種回数も2回で現市販ワクチン効果を超えうる中和価を示す可能性がある。
PIV3組換えワクチン
実験室経代株（BN-1 株）、ワクチン株（BN-CE 株）両方のリバースジェネティクス系を作ったので、牛パラインフルエンザワクチンの弱毒化機構の解析に使える可能性がある。
牛パラインフルエンザウイルス３型は培養細胞で非常に効率良く増えるので、組換えタンパ
ク質の大量調製に使える可能性がある。
本ウイルスは繊毛を有した呼吸器の上皮細胞に特異的に感染するので、ヒトに感染するウイ
ルスを含めた呼吸器感染ウイルスの感染機構の解析に使える可能性がある。
４）今後の課題
特徴を持ったBVDV新型ワクチンの試作品(プロトタイプ)の作出には全て成功し、それぞれの実
行課題で今後はリポソームワクチンでは筋注以外の眼結膜接種による研究があり、組換えBPIV3では子牛への接種試験が望まれ、さらにDNAワクチンではDNAベクターの抗体惹起力を増強させるためのアジュバントや投与法の研究や、細胞性免疫の研究もあるだろう。
次なる研究期間において直ちに実用化（製造販売）に至る成績にはなりえないと思われるが、その芽となる有効な成績あるいは他の研究分野に応用しうる成績も得られたと思われる。
その選定されたワクチンが成雌牛の子宮内に侵入したウイルスを排除しうるか否か？妊娠牛準備の前段階での検討が必要かと思われる。その結果を踏まえ、最終的には免疫誘導された多数の妊娠牛を準備し、攻撃ウイルス接種後の垂直感染阻止を認める研究(試験)が将来実施できることを望む。

＜別紙様式３．平成２８年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題
リポソームを用いた安全なPRRSウイルス用の経鼻多価ワクチンの開発

研究年度
２４ ２５ ２６ ２７ ２８組換えタンパク質の作製

担当研究機関・研究室
機関

研究室

国立研究開発法人 ウイルス・疫学研究
農業・食品産業技 領域
術総合研究機構
動物衛生研究部門

感染性cDNAク
ローンの作製国立研究開発法人 ウイルス・疫学研究
農業・食品産業技 領域
術総合研究機構
動物衛生研究部門

リポソームを用いた
経鼻多価ワクチンの開発

国立研究開発法人 ウイルス・疫学研究
農業・食品産業技 領域
術総合研究機構
動物衛生研究部門

Ⅰ－２．実施体制
担当研究機関・研究室

研究項目
研究開発責任者

機関

研究担当者

研究室

農研機構 動物衛 ウイルス・疫学研究 ◎
生研究部門
領域

高木道浩

リポソームを用いた安全なPRRSウイルス用の経鼻多価ワクチンの開発
１、抗原の作出
同上(1) 組換えタンパク質の
作製

同上

○

高木道浩
井関博

(2) 感染性cDNAクローン 同上
の作製

同上

○

高木道浩
井関博

２、リポソームを用いた経 同上
鼻多価ワクチンの開発

同上

○

高木道浩
井関博
川嶌健司
芝原友幸
渡来仁

大阪府立大学（注１）

病態研究領域
獣医免疫学教室

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

研究期間

平成２４～２８年度

小課題番号

研究期間

平成２４～２８年度

中課題名

小課題名

小課題責任者名・研究機関

優れたワクチンの開発のための技術開発
リポソームを用いた安全なPRRSウイルス用の経鼻多価ワクチンの開発
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構

動物衛

生研究部門・ウイルス・疫学研究領域・高木道浩

１）研究目的
豚繁殖･呼吸障害症候群(PRRS)は国内の農場に広く常在し、子豚の呼吸障害および母豚での流死産等を引き起こす伝染性疾病である。PRRSウイルスは北米型と欧州型の二つに大別されるが、同型のウイルス株間でも極めて多様な遺伝子変異が見られる。これまで
国内では主に北米型ウイルスの浸潤が知られていたが、最近、欧州型の侵入が明らかとなった。国内では弱毒生ワクチンが使用されているが、生ワクチンは免疫原性が高いものの病原性が復帰する可能性があり、欧州ではワクチン接種豚がワクチン類似株による
PRRSを発症した例が報告されている。また、ウイルスの多様性のため完全な防御効果は期待できない。PRRSの効果的な予防には遺伝的多様性に対応可能で、安全なワクチンの開発が必要であり、本課題においては、獲得免疫に加えて粘膜免疫の誘導が期待できる
リポソームを活用した、１）複数のウイルス株に由来する感染防御抗原を組合せた複合型サブユニット蛋白質ワクチン、２）リバースジェネティクス法を活用した人為的変異
導入ウイルスをワクチン株とする不活化遺伝子組換え型多価ワクチンの開発を目指す。
２）研究成果
国内における各クラスター北米型PRRSウイルスの分離株の病原性は感染初期に一過性の発熱が認められたものの顕著な臨床症状は見られないが、感染後の血清中ウイルス量に違いがあることが明らかとなった。バキュロウイルスを用いた北米型PRRSウイルス
組換えタンパク質の発現量は少なく、ワクチン抗原量に十分ではなかった。また、豚に対するリポソーム製剤のアジュバント効果について、抗原と封入したリポソーム製剤を筋肉内接種、あるいは1%ヒアルロン酸と混和したものを経鼻接種した場合、抗体産生が確認された。
３）成果活用における留意点
国内における各クラスター北米型PRRSウイルス感染実験では病原性が異なっているが、現場においては今回の得られた結果と比べて異なる可能性があることに留意する必要がある。農場においては、１）品種、２）飼育環境、３）その他の病原体、複合感染などにより病原性が変動することに留意する必要がある。
リポソーム製剤によるアジュバント効果は確認され、接種部位などには炎症反応など認められなかったが、さらにアジュバントとしての効果を検討する必要がある。
４）今後の課題
組換えタンパク質の発現が少量であったこと、抗原としてPRRSウイルスの多くの構造
タンパク質が関与していること、またPRRSウイルスは遺伝的多様であることから、これらに対応可能であると考えられるPRRSウイルス感染性cDNAクローンを作製し、上記問題に対応できるワクチン開発を引き続き実施する予定である。また、ワクチン効果を増強させるための粘膜免疫に有効なアジュバントを探索する必要がある。

＜別紙様式３．平成28年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題
１．効率的DDSの改良のための新規の高機能性ワクチン
キャリアーの開発)（１）新規pH感受性膜融合
ポリマーの開発（２）新規pH感受性膜融合
ポリマー修飾リポソームによる樹状細胞内への抗原デリバリーシステム（ワクチ
ンキャリアー）の確立（３）新規pH感受性膜融合
ポリマーを修飾したワクチ
ンキャリアーの最適化(4) 家畜（牛）における免疫誘導実験(5) 家畜（牛・豚）における免疫誘導実験

研究年度
２８

２９

３０

担当研究機関・研究室
３１

３２

pH感受
性膜融
合ポリ
マーの
開発

機関

研究室

大阪府立大学 生命環境科学研究科
工学研究科

大阪府立大学

リポソ
ーム型
ワクチ
ンキャ
リアー
の開発

リポソ
ーム型
ワクチ
ンキャ
リアー
の最適
化

生命環境科学研究科
工学研究科

大阪府立大学 生命環境科学研究科
工学研究科

大阪府立大学 生命環境科学研究科
工学研究科

牛を使
った免
疫応答
の解析

牛・豚
を使っ
た免疫
応答の
解析

大阪府立大学 生命環境科学研究科
工学研究科

Ⅰ－２．実施体制
研究項目
研究開発責任者（注１）

担当研究機関・研究室
機関

研究担当者

研究室

大阪府立大学大院 生命環境科学研究
科

◎渡耒仁

工学研究科

△河野健司

同

△弓場英司

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

小課題番号

2001

中課題名

研究期間

平成２４～２８年度

研究期間

平成２４～２８年度

優れたワクチンの開発のための技術開発

小課題名

次世代のワクチン開発に資する免疫活性化技術の研究開発

小課題責任者名・研究機関

渡耒 仁・大阪府立大学大学院生命環境科学研究科

１）研究目的
本研究では、免疫担当細胞への抗原搬送能に優れるリポソームにpH感受性膜融合能を持たせる
ことにより、抗原提示細胞内へのワクチン抗原の内在化を可能にし、家畜の感染症予防に効果的な免疫応答を効率良く誘導できる高機能性ワクチンキャリアーの開発を目的とする。
２）研究成果本研究の目的を達成するために、まず平成２４年度に様々な新規pH感受性膜融合ポリマーを開発した。平成２５年度には、前年度に開発した各新規pH感受性膜融合ポリマーの中から、ワクチンキャ
リアーとして最適なポリマー（MGlu-HPG60）を明らかにできた。平成２６年度においては、新規pH感受
性膜融合ポリマー修飾リポソームの経鼻免疫により、全身および粘膜局所に免疫応答を誘導出来る
ことを確認し、最適なアジュバントとしてα-GalCerを同定することによりリポソームを最適化した。平
成２７年度においては、牛に対して最適化リポソームワクチンの経乳頭免疫により、血清ならびに乳汁中に抗体産生が確認でき、牛に対するワクチンキャリアーとしての有用性を明らかにした。さらに平成２８年度においては、最適化リポソームワクチンの点眼免疫とリポソームワクチンの低コスト化が可能な陽性荷電脂質(DDAB)修飾リポソームの点眼あるいは経乳頭免疫により全身および粘膜局所に免疫応答の誘導が牛と豚で確認できた。これらの成果から、家畜の感染防御に有効な粘膜免疫応答
ならびに全身免疫応答を効果的に誘導できる新規の高機能性ワクチンキャリアーが開発でき、到達目標は達成できた。
３）成果活用における留意点
本研究課題によって得られた研究成果を普及・活用させるためには、動物衛生研究所や都道
府県の畜産試験場、農学系の他大学との共同研究や研究連携の強化を進め、牛、豚等の家畜を用いた感染防御試験の拡大を図り、その有効性を明らかにして行く。さらに得られた研究成果については論文や学会、雑誌等で広く発表することにより、リポソーム粘膜ワクチンの有用性を動物用医薬品企業にアピールし、企業との共同研究や連携に繋げる。このことにより、産業動物において重要な粘膜感染症に対する新規粘膜ワクチン開発へと発展させ、低コストのリポソーム粘膜ワクチンの実用化を目指す。
４）今後の課題
これまでの研究成果から、家畜に対して新規pH感受性膜融合ポリマー修飾リポソームのみならず陽性荷電脂質(DDAB)修飾リポソームのワクチンキャリアーとしての有用性が明らかとなった。これにより、家畜に対する最適な免疫応答の誘導のためのワクチンキャリアーの選択肢が広まるとともにリポソームワクチン製剤化のコスト低減に向けた取り組みがし易くなり、家畜の感染症予防に効果的な免疫応答を効率良く誘導できる高機能性ワクチンキャリアーの事業化が大きく前進する事が予想される。しかしながら、今後の課題として、多くの家畜を使った免疫誘導実験ならびに攻撃試験を実施し、ワクチンキャリアーとしての安全性ならびにその有用性を明らかにするなど、リポソームワクチンの事業化を加速せるためによりいっそうの取り組みが必要である。

＜別紙様式３．平成２８年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題

研究年度
24

25

26

担当研究機関・研究室
27

28

機関

研究室

(1) 家畜・家禽に使用できる
汎用性ワクチンベクタープラ
ットフォーム技術の開発

・ ウイルス及び細菌性病原体由来外来抗原の豚丹毒菌ベクターにおける発現解析

弱毒化ベクター候補株の作製、外来抗原の発現農研機構作製したベクターワクチ
ン候補株を利用しワクチ
ン効果を確認する。

・ 牛、豚、鶏など各動物種における免疫応答の解析及びワクチン効果の検証

農研機構

細菌・寄生虫研究領
域 細胞内寄生菌
ユニット

細菌・寄生虫研究領
域 細胞内寄生菌ユニット

Ⅰ－２．実施体制
研究項目

担当研究機関・研究室
機関(1) 家畜・家禽に使用できる 農研機構
汎用性ワクチンベクタープ
ラットフォーム技術の開発

研究担当者

研究室
細菌・寄生虫研究領
域 細胞内寄生菌ユニット◎△小川洋介△江口正浩△西川明芳

・ ウイルス及び細菌性病
原体由来外来抗原の豚丹毒菌ベクターにおける発現解析
・ 牛、豚、鶏など各動物種における免疫応答の解析及びワクチン効果の検証（注１）

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

小課題番号

2002

中課題名

小課題名

小課題責任者名・研究機関

研究期間

平成２４～２８年度

研究期間

平成２４～２８年度

優れたワクチンの開発のための技術開発
家畜・家禽に使用できる汎用性ワクチンベクタープラットフ
ォーム技術の開発
小川洋介・農研機構動物衛生研究所細菌・寄生虫研究領域

１）研究目的
豚丹毒菌を用い、複数の動物で利用できるワクチンベクタープラットフォーム技術の開発を行うため、ワクチンベクターとして利用できる安全で免疫誘導能に優れた弱毒株を遺伝学的理論に基づき構築する。また、多価ベクターワクチンを開発するには、ウイルスや細菌性の様々な病原体の多様な異種抗原を豚丹毒菌に効率よく発現させるための技術が必要となる。そこで、本研究では、豚丹毒菌における効率のよい異種抗原の発現技術を開発するとともに、牛、豚、鶏を用いて各動物種に適したワクチネーション免疫応答の解析、各種動物の感染症をモデルとした免疫誘導の効果の検証等、ワクチンベクターの実用化を目的とする応用研究を行う
２）研究成果これまで、豚丹毒菌に感受性が高い無菌豚に皮内接種しても豚に症状を起こすことがで
きず、さらに、経口投与することで、現行の生ワクチン株と同様に血中抗体価を上昇させることのできる、安全で免疫誘導能に優れたワクチンベクター候補株を作製することに成功した。また、この株へ組込み発現させるための外来抗原遺伝子として、豚浮腫病原因菌
大腸菌stx2e遺伝子、豚流行性下痢PEDウイルスS1遺伝子、鶏伝染性ファブリキウス嚢病
ウイルスVP2遺伝子、牛アカバネ病ウイルス中和抗原遺伝子のクローニングに成功した。
しかし、ワクチンベクター候補株への恒常的な発現は確認できていない。
３）成果活用における留意点
開発したワクチンベクター候補株は、現行の生ワクチンに比べて極めて安全であることが証明されており、今後は生ワクチンとしても利用できる。
４）今後の課題
異種微生物由来の外来抗原遺伝子をベクター株へ効率よく経常的に発現させるには、外来遺伝子のコドン頻度、発現プロモーターの選択、外来遺伝子と結合させるためのキャリアタ
ンパク質の選択が重要と考える。最適な組み合わせで実験を行う必要がある。

＜別紙様式３．平成28年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題

研究年度
２８ ２９ ３０ ３１ ３２

１．ヒストフィルス・ソム
ニ菌体表面蛋白質遺伝 誘導される抗体評価系の確立
子改変株を用いた牛呼生菌免疫による宿主免疫応答と吸器病に対する弱毒生
防御効果の評価
ワクチンの開発

担当研究機関・研究室
機関
農研機構

研究室
動物

衛生研究部門細菌・寄生虫研究
領域
病態研究領域

Ⅰ－２．実施体制
研究項目

担当研究機関・研究室
機関

研究担当者

研究室

○
１．ヒストフィルス・ソム 農研機構
細菌・寄生虫研究
ニ菌体表面蛋白質遺伝 動物衛生研究部門 領域 病原機能解子改変株を用いた牛呼析ユニット
吸器病に対する弱毒生ワクチンの開発
病態研究領域 病

星野尾歌織
上野勇一

木村久美子（2014.4～）
播谷亮（～2016.3）

理ユニット

（注１）

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

小課題番号

2003

研究期間

平成24～28年度

研究期間

平成24～28年度

中課題名

小課題名

小課題責任者名・研究機関

ヒストフィルス・ソムニ菌体表面蛋白質遺伝子改変株を用いた牛呼吸器病に対する弱毒生ワクチンの開発
星野尾歌織・農業・食品産業技術総合研究機構

動物衛生

研究部門

１）研究目的ウイルス・細菌等の混合感染により重篤化しやすい子牛の肺炎は、ひとたび発症すれば治癒しても完全な肺機能の回復は難しく、経済的損失が大きい。Histophilus somniはその原因細菌のひとつであり、現在予防には不活化ワクチンが使用されているが、皮下・筋肉内の投与経路による不活化ワクチンでは本菌の侵入門戸である粘膜面への抗体誘導は困難
なため、感染自体を防ぐことは難しい。本課題では、本菌の重要な病原因子である菌体表面蛋白質IbpAの機能領域DR1DR2を遺伝子改変により肺炎由来野生株2336株から欠失させて弱毒化したΔDR1DR2株について、経鼻投与による防御免疫の付与能を検証し、単回投与で粘膜免疫を誘導して感染自体を防御可能な弱毒生ワクチンの開発手法を確立することを目標とした。
２）研究成果牛にΔDR1DR2株の生菌懸濁液を鼻腔内に1回噴霧接種することでH.somniに対する特異抗体の誘導が可能であること、個体によっては気道内に生菌が数週間にわたり定着し、解剖時の扁桃からも生菌が分離されることが確認された。これにより、ΔDR1DR2株は牛において疾病を引き起こすことなく長期間にわたり免疫刺激を付与し得ることが明らかとなった。また、生菌免疫牛においては野生株攻撃後の臨床症状が対照群よりも軽微で、肺内での菌の排除も速やかな傾向にあった。これらのことから、H.somniのDR1DR2領域を遺伝子改変により欠失させることで、新たな弱毒生ワクチンの候補株が作出できる可能性が示唆された。
３）成果活用における留意点
本研究で用いた遺伝子改変株は輸入株2336を親株として作製されているため、ワクチンの実用化にあたっては、日本国内で分離された株を親株として改めて遺伝子改変株を作出する必要がある。親株の候補についてはゲノム解析等を行い、検討中である。
４）今後の課題
本研究において、実験感染による肺炎発症には宿主の胸腺重量も影響することが明らかとなっており、これを考慮しつつ統計学的な解析を行うのに十分な例数を確保するため、免疫防御試験を追加で実施中である。また、生菌免疫により誘導された抗体のH.somniに対する細胞毒性中和能等の解析による防御免疫付与能の評価を検討している。

＜別紙様式３．平成28年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題
１．DDS担体用人工ウイル
ス様粒子を用いた牛パピ
ローマワクチンの開発(1) 牛パピローマウイルス様中空粒子（BPV-VLP)の生産技術および精製技術の検討(2) 多価BPV-VLPの生産技術の確立(3) BPV遺伝子型特異的検出法の確立(4) BPVによる動物実験系の確立(5) 牛を用いたBPV-VLPの免疫誘導法および効果の検証(6) 牛を用いたBPV-VLPのワクチン効果の検証

研究年度
24

25

26

担当研究機関・研究室
27

28

機関
動物衛生研究所

研究室

Ⅰ－２．実施体制
研究項目
研究開発責任者

担当研究機関・研究室
機関
動物衛生研究所

研究担当者

研究室△前任者渡辺聡子(～
2016.3）後任者芝原友幸(2016.4～)
前任者畠間真一（～2015.3）
後任者菅野徹（2015.4～）（注１）

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

研究期間

平成24～28年度

小課題番号

研究期間

平成24～28年度

中課題名

小課題名

優れたワクチンの開発のための技術開発

次世代のワクチン開発に資する免疫活性化技術の研究開発

小課題責任者名・研究機関
１）研究目的
牛パピローマウイルス（BPV）の感染によって引き起こされる乳頭腫症は、全国的に高い頻度で発生し効率的な酪農経営の妨げとなっているが、現在のところ確立された予防法や治療法がな
い。BPVは現在14の遺伝子型に分類され、搾乳障害をひきおこす乳頭腫症の病変部からはBPV6が最も多く検出される。また、重篤な症状を引きおこすBPV9による被害も大きいことが知られており、対処方針の決定には遺伝子型の決定が重要である。
ウイルス様中空粒子(Virus Like Particle:VLP)はウイルス類似の外観や抗原性を有するが内部にウイルスゲノムを含まないため、最も安全なワクチンと考えられる。本研究ではバキュロウ
イルス発現系を用いてBPVのVLPを作製し、牛乳頭腫症ワクチンとしての効果を牛での感染実験を通じて実証することを目指す。
２）研究成果
① BPVの遺伝子型を簡便、迅速、特異的に判定できるLAMP法およびPCR-RFLP法を確立した。
（H24
～25）。
②

BPV6由来の乳頭腫病変乳剤を乳房に接種することにより、接種部位に上皮性乳頭腫の腫瘍を人為的に発生させることを可能とした（H25～H27）。
③

昆虫細胞株あるいは蚕の蛹にBPVのL1遺伝子を導入した組換えバキュロウイルスを接種することにより、細胞核内に野生型BPVとほぼ同じ大きさ、形を有するウイルス粒子(BPV-VLP)を生産させることができた。BPV-VLPはヘパリンカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのいずれでも精製が可能で、蛹を宿主とすることにより大量の（約0.5mg/頭）精製BPV-VLPを得ることができた（H24～H27）。
④

BPV6-VLPを接種することにより、牛にBPV特異抗体を誘導することができたが、BPV6-VLPの接種により乳頭腫症の発症予防効果の確認には至らなかった。
３）成果活用における留意点
外部資金等を活用して新薬開発に向けた当該VLPのワクチンのBPVに対する予防・治療効果の検討を行う。
４）今後の課題
BPV6-VLPの投与量、投与時期、アジュバントの添加等を検討し、BPV6-VLPのワクチン効果を再検討する必要がある。

＜別紙様式３．平成28年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
課

題

名

研究年度
24

25

26

27

28

研究内容

(1) PCV由来VLPの大量製造技
術の確立

PCV由来の組換え型VLPの生産、精製技術を確立する(2)PCVの遺伝子改変および遺伝子発現の技術

外来遺伝子を発現する組換えPCVを構築する技術を開発する(3) PCV由来VLPへの薬剤封入、付加、修飾技術の開発

哺乳動物細胞発現用コンストラクト（DNA）を組換え型VLPの内部、表面に効率的に導入する技術を開発する。

(4) PCV由来VLPの免疫賦与効
果の検証

DNA修飾した組換え型VLPを用いて、修飾
DNAがコードする外来抗原に対する免疫能を動物実験により評価する(5)PCV生ウイルスワクチンベ
クターの免疫賦与効果の検証

擬似PCVによる、PCVおよび外来抗原に対する免疫賦与効果を検証する

Ⅰ－２．実施体制
研究項目
研究開発責任者

担当研究機関・研究室
機関
動物衛生研究所

研究担当者

研究室
病態研究領域
病態研究領域◎前任者国保健浩（2014.4～2016.3）◎後任者新井鐘蔵(2016.4～)

ウイルス・疫学研究 △前任者鈴木孝子（2014.4
領域～2015.3）
病態研究領域△後任者新井鐘蔵(2015.4～2016.3）（注１）

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者には△を付すこと。

中課題番号

小課題番号

2005

研究期間

平成24～28年度

研究期間

平成24～28年度

中課題名

優れたワクチンの開発のための技術開発

小課題名

優れたワクチン開発のための抗原送達技術の開発

小課題責任者名・研究機関
１）研究目的粘膜組織への抗原の輸送は有効な細胞性免疫を誘導する上で重要であるが、Th1－Th2細胞間の拮抗などにより標的抗原に特異的な免疫能を付与することは困難である。特に産業動物においては「安全性」や「残留性」といった食品衛生上の要請も同時にクリアする必要があることか
ら、適切なワクチン接種技術を確立する必要がある。本課題では、呼吸器指向性にDNA輸送することが可能な担体を開発する。本年度は候補となる豚サーコウイルス（PCV）由来VLPの大量製造を目的としてPCV外殻タンパク質（ORF2）遺伝子発現系を確立する。
２）研究成果①

PCV1 ORF2遺伝子の発現系を構築し、リコンビナントの生産ならびに検出に成功した。
（H24）② 糖タンパク質の糖鎖形成に寄与するヨトウガの新規糖分解酵素（GlcNAcase 1）を同定し、生化学的特性の一部を明らかにした。（H25）③

Hisタグ融合型組換えPCV1 ORF2タンパク質を生産し、アフィニティークロマトグラフィー

による精製系を確立した。（H26）④精製したHisタグ融合型組換えPCV1 ORF2タンパク質を用いてPCV1様中空粒子を作製した

（H27）
⑤

Hisタグ融合型組換えPCV1 ORF2タンパク質上に付加されるN結合型糖鎖がRNA干渉による昆虫特異的糖分解酵素活性の抑制により変化することを明らかにした。また、当該酵素遺伝子を標的とするゲノム編集に利用するDNA切断酵素を昆虫細胞の核内で発現可能な発現ベクターを作製した。（H27）⑥DNA切断酵素発現ベクターの改良、標的遺伝子同定用のガイドRNA発現ベクターを構築ならびにDNA切断効率評価用のベクターを構築し、ゲノム編集を実施した。（H27）
３）成果活用における留意点

４）今後の課題目的とする糖鎖改変型の組換えPCV1 ORF2タンパク質を発現することが可能な昆虫細胞株を樹立する必要がある。

＜別紙様式３．平成２８年度の最終年度報告書＞
Ⅰ－１．年次計画
研究課題
２．次世代のワクチン開発に資する免疫活性化技術の研究開発（６）乳汁免疫の増強を目的とした免疫賦活化
技術の開発

研究年度
２４ ２５ ２６ ２７ ２８

妊娠マウスモデルによる
アジュバントの予備試験
乳腺組織へのIgA産生細胞移
行機構解明

豚流行性下痢ウイルスの乳汁免疫の基盤的知識の獲得

担当研究機関・研究室
機関

農研機構
動物衛生部門研究室

ウイルス・疫学研究
領域

Ⅰ－２．実施体制
研究項目

担当研究機関・研究室
機関

研究室

２．次世代のワクチン開発に資する免疫活性化技術の研究開発（６）乳汁免疫の増強を
農研機構 動物衛 ウイルス・疫学研究 ○目的とした免疫賦活化技術
生研究部門
領域
の開発

（注１）

研究担当者

宮﨑 綾子
鈴木 亨(～2017.3)
大橋 誠一(2017.4～)

研究開発責任者には◎、小課題責任者には○、実行課題責任者にはᇞを付すこと。

中課題番号

研究期間

平成２４～２８年度

小課題番号

研究期間

平成２４～２８年度

中課題名

優れたワクチンの開発のための技術開発

小課題名

乳汁免疫の増強を目的とした免疫賦活化技術の開発

小課題責任者名・研究機関

農研機構 動物衛生部門
宮﨑 綾子、大橋 誠一

ウイルス病研究領域

１）研究目的
哺乳豚における腸管感染症は発育遅延や飼料効率の低下を引き起こし、養豚経営に経済的損失を与える。その予防には、母子免疫、特にIgA抗体を含んだ乳汁を継続的に吸飲することによって成立する乳汁免疫が大きな役割を果たしている。乳汁中IgA抗体価を高めるには、応答性リンパ球群を効果的に母豚乳腺組織へ移行（ホーミング）させる必要がある。豚では腸管への免疫刺激により乳汁中へIgA産生を誘導できるとの報告があるものの、乳腺組織へのリンパ球移行機構の詳細が未解明であるために、効率的にリンパ球の移行を促進することができるワクチンアジュバントの開発が進んでおらず、哺乳豚における腸管感染症予防の障壁となっている。
そこで、本課題では、母豚乳腺組織へのリンパ球移行機構の解明を通じ、哺乳豚の腸管感染症予防に重要である乳汁免疫、特に乳汁へのIgA抗体産生を効果的に誘導できるワクチンア
ジュバントを開発することを目的とする。なお、平成25-26年の国内における豚流行性下痢（PED）の流行を受けてPEDワクチン改良への要望が高まったことから、平成26年度よりPED
ワクチン改良に必要な乳汁免疫の基盤的知識を得ることに目的を変更した。
２）研究成果（１）妊娠マウスモデルによるAll-trans retinoic acid（ATRA）の乳汁免疫アジュバントとしての有効性確認
前述の通り、豚では腸管免疫と乳汁免疫との関連が豚伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）の感染実験や野外症例から明らかにされている。そこで我々は、活性化したT細胞とB細胞の腸管移行に関与するCCR9等の細胞表面分子の発現に重要な役割を果たす、ATRAについて乳汁免疫アジュバントとしての有効性を妊娠マウスモデルにより検討した。
まず、雌マウス（BALB/c、4週齢）を一群6匹で4群に分け、試験群には1週間おきに3回オボアルブミン（OVA） 50 µgとATRA 150 µgを皮下接種した。3回目の接種から1週後に交配し、分娩予定日1週前に再度免疫を行った。対照群3群にはPBSとATRAの溶媒であるPEG400、PBSとATRA、またはOVAとPEG400をそれぞれ等量接種した。定期的に血液および乳汁を採取しTotal IgA量とOVA IgA抗体価を測定した。（動物実験計画書：承認番号
第12-060号）
その結果、試験群と対照群とで試験期間中の血清および分娩後7日目の乳汁中のTotal
IgA量ならびにOVA IgA抗体価に明確な差は認められなかったものの、試験群の分娩日乳

汁中OVA IgA抗体価が対照群と比較して高い傾向が認められた（図1）。これらの結果から、ATRAをアジュバントとすることにより、より効率的にIgAを乳汁中に誘導で
図1 妊娠期にATRAをアジュバントとしてOVAをきる可能性が示唆された。

⽪下接種したマウス（試験群、OVA+ATRA）
における分娩⽇の乳汁中OVA IgA抗体価。
PBS+PEG4000, PBS+ATRAおよび
OVA+PEG400は対照群。バーは平均値を⽰す。

（２）TGEV感染による乳汁へのIgA抗体誘導機構の解明
ATRAの妊娠マウスモデルにおける有効性確認と平行し、我々は妊娠豚へのTGEV実験感染により乳汁へのIgA抗体誘導機構の解明に取り組んだ。
まず、TGEV抗体陰性の未経産妊娠豚6頭を導入、2頭には分娩5週前に豚継代TGEV SH17
株 10 mlを経口投与、2頭には市販ワクチンを分娩5週および2週前に皮下接種、残る2頭には対照として細胞培養培地 10 mlを経口投与した。分娩日および分娩7日目の乳汁中中和抗体価を測定、分娩7日目に解剖し乳腺におけるIgAの分布を免疫組織化学染色により観察するとともに、乳腺より単核球を分離しTGEV IgA抗体産生細胞数を計測した。また、セルソー
ター（BD, FACSAriaII）により単離したIgA陽性細胞よりTotal RNAを抽出、RNAseqにより
TGEV接種豚と関連して発現が変化する遺伝子の特定を試みた（動物実験計画書：承認番号
第12-061号）。
TGEVを2頭に接種した結果、1頭（#83）では食欲不振が観察されたものの、1頭（#104）
では下痢や食欲不振等の臨床症状は観察されなった。ワクチン接種豚と対照豚では試験期間を通じて糞便でのウイルス遺伝子も検出されず、臨床症状も認められなかった。
分娩日および分娩7日目の乳汁中TGEV中和抗体を測定した結果を図2に示す。TGEV接種
豚2頭の分娩日の乳汁中抗体価はそれぞれ512倍と64倍であったが、分娩7日目には128倍と4倍と、1/4～1/16まで低下していた。抗体価は不顕性感染であった#104で低く、また低下率も大きい傾向が認められた。一方、ワクチン接種豚では分娩日の抗体価はそれぞれ1024倍とTGEV接種豚と比較して高かったものの、分娩7日後の乳汁中抗体価の低下はTGEV接種豚と比較して急速であり、分娩日と比較して1/64～1/128まで減少していた。なお、乳腺におけるTGEV IgA抗体産生細胞はウイルス接種豚でのみ検出された。分娩7日目の乳腺におけるIgA陽性細胞およびIgAの分布を観察した結果、IgA陽性細胞数に豚群間での大きな差異は認められなかったものの、TGEV接種豚でより広汎にIgAが分布する傾向が認められた（図3）。
これらの結果より、TGEV感染により分娩後のTGEV IgA抗体産生細胞の乳腺への局在が効率的に誘導されるとともに、分娩後の乳腺におけるIgA分泌が活発になる可能性が示唆された。このメカニズムを解明するために、乳腺よりIgA陽性細胞を単離し、mRNAの発現解析を実施する予定であったが、単離できたIgA陽性細胞数が少なかったために解析に十分なRNAが得られず、解析不可能であった。

図2 TGEV接種豚、TGEV
ワクチン接種豚および対照豚の分娩⽇および分娩7⽇⽬の乳汁におけるTGEV中和
抗体価

図3 TGEV接種豚、TGEV
ワクチン接種豚および対照豚の分娩7⽇⽬の乳腺におけるIgA陽性細胞とIgAの分布。IgAを緑⾊（FITC）、細胞核を⻘⾊
（DAPI）で染⾊している。

（３）PEDV感染による乳汁へのIgA抗体誘導機構の解明
当初、次に妊娠豚におけるATRAの乳汁免疫アジュバントとしての有効性について検討する予定であった。しかし、平成25-26年度の国内におけるPED流行をうけて、PEDワクチ
ンの効果向上に不可欠であるPEDV感染による乳汁へのIgA抗体誘導機構の解明へと計画を変更した。
まず、未経産妊娠豚6頭を導入、うち2頭には分娩前4週目に無菌豚継代PEDV
OKN-1/2013株10 mlを経口投与、2頭には分娩5週および2週前に市販生ワクチンを用法にしたがって筋肉内投与、残る2頭には対照として細胞培養培地のみを経口投与した。血液と分
娩後の乳汁を経時的に採取しPEDV 中和抗体価、IgGおよびIgA抗体価を測定した。また、経時的に乳腺組織を胸部および腰部乳房の2箇所より採取、免疫組織化学染色で乳腺におけるIgA陽性細胞数を1箇所につき4視野（計2箇所8視野）で計測するとともに、IgA陽性面積をImage Jソフトウェアを使用して計測した。また、乳腺組織よりRNAを抽出しIgA産生細胞の移行に関与する遺伝子4種（CCL25, CCR9, CCL28およびCCR10）についてmRNA定量による発現解析を行った。（動物実験計画書：承認番号

第14-014号）

その結果、PEDV接種豚では、血清中中和抗体価はワクチン接種豚と比較して高めに推移する傾向が認められたものの、血清中IgG抗体価の推移はワクチン接種豚とほぼ同様であった（図4）。一方、乳汁中の中和抗体とIgG抗体はPEDV接種豚において分娩7日目でもそれぞれ45倍と905倍と高く維持されていたものの、ワクチン接種豚ではどちらも検出限界以下まで低下していた。さらに、PEDV接種豚では接種後1週目より分娩後7日目まで検出可能であった血清中および乳汁中IgA抗体がワクチン接種豚では試験期間を通じて検出限界以下であった。
次に、乳腺におけるIgA陽性細胞数とIgA陽性面積の経時的変化について検討を行った
結果、PEDV接種豚において、接種後1週後（分娩3週間前）から分娩7日後にかけてIgA陽性
細胞数とIgA陽性面積が対照豚よりも高めに推移する傾向が認められた（分娩7日後のIgA陽性細胞数を除く）（図5）。一方、ワクチン接種豚では、1回目ワクチン接種3週後（分娩2週前）のIgA陽性細胞数とIgA陽性面積が対照豚よりも高い値を示したものの、それ以外では対照豚と同程度か下回る値であった（図5）。これらのことから、妊娠期のPEDV感染は分娩前でも乳腺へのIgA産生細胞の移行を促し、IgA分泌を効率的に誘導している可能性が示唆された。なお、我々が実施した妊娠豚へのPEDV接種試験では、腸管以外でのウイルス
増殖は確認されておらず、発症極期に解剖した場合でも乳腺および乳汁でウイルス遺伝子が検出されていないことから、PEDV接種豚ではPEDVの腸管感染による免疫刺激が乳腺へのIgA産生細胞の局在や効率的なIgA分泌を誘導したと考えられる。
最後に、乳腺へのリンパ球移行に関与する遺伝子として、主に小腸で発現し、小腸へのリンパ球移行へ関与すると考えられているCCL25およびそのリンパ球側受容体である
CCR9、ならびに主に鼻粘膜、唾液腺および大腸に発現するとともに分娩前後に発現が増加するCCL28とそのリンパ球側受容体であるCCR10の4遺伝子について乳腺におけるmRNA発現を経時的に解析した。
PEDV接種豚において、IgA抗体価とIgA陽性面積値の高かった分娩7日目においてCCL25のmRNA発現が対象豚と比較して1.8倍に増加していたものの、その他ではIgA抗体価、IgA陽性細胞数、そしてIgA陽性面積に関連して発現量が大きく変化する遺伝子が認められなかった。これらのことから、分娩後のCCL25の高発現が効率的なIgA分泌に寄与した可能性が示唆された一方、今回測定していない他の分子も分娩前のIgA産生細胞の移行やIgA分泌に関与している可能性が示唆された（図6）。

図4 PEDV接種豚またはワクチン接種豚の⾎清中および乳清中における中和抗体価
IgA抗体価およびIgG抗体価の推移。各群2頭の幾何平均値を⽰す。

図5 PEDV接種豚またはワクチン接種豚の乳腺におけるIgA陽性細胞およびIgA陽性⾯積の推移。各サンプリ
ング時に1頭の胸部および腰部の乳腺より計2検体を採取し、1検体につき4視野（計16視野/4検体/2頭/群）

を観察した平均値を⽰す。

図6 PEDV接種豚またはワクチン接種豚の乳腺におけるCCL25とCCL28、ならびにそれぞれの受容体であるCCR9とCCR10のmRNA相対発現量。対照豚群における内部標準遺伝⼦に対する各遺伝⼦の相対発現量を1として各検体における遺伝⼦発現量を相対値で求めた。結果は3種類の内部標準遺伝⼦（PPIA,
RPL4, YWHAZ）で得られた相対値の平均を⽰す。

３）成果活用における留意点
特になし
４）今後の課題
IgA産生細胞の乳腺移行にかかわる他の分子機構を今後明らかにする必要がある。

Ⅲ 研究成果一覧 【公表可】

課題番号 11105375
中課題名 優れたワクチンの開発のための技術開発

成果等の集計数
学術論文
課題
番号11105375

学会等発表（口頭またはポスター）

和文

欧文

国内

国際

7

18

49

12

出版
図書

国内特許権等

国際特許権等

PCT

出願

取得

出願

取得

出願

0

2

0

0

0

3

発表会
の主催 アウト
報道件 普及しう（シンポ リーチ活
数
る成果
動
ジウム・
セミナー
0

2

6

0

（１）学術論文
区分：①原著論文、②その他論文
整理番号

区分

タイトル
The cell wall component lipoteichoic acid of
Staphylococcus aureus induces chemokine gene
expression in bovine mammary epithelial cells.

1

①

2

②

3

①

4

①

著者

機関名

Yoshio KIKU, YuyaNAGASAWA,
Fuyuko TANABE,
Kazue
SUGAWARA,
Atsushi
WATANABE, Eiji
動衛研
HATA, Tomomi
OZAWA, Kei-ichi
NAKAJIMA,
Toshiro ARAI andTomohito
HAYASHI

総説 粘膜免疫機構に立脚した乳房炎粘膜ワクチン開
林智人
動衛研
発
Cyclophilin A is a new M cell marker of bovine
Hondo T, Someya
intestinal epithelium.
S, Nagasawa Y,
Terada S,
Watanabe H, Chen
東北大X, Watanabe K,
Ohwada S,
Kitazawa H, Rose
MT, Nochi T, Aso
H
黄色ブドウ球菌（SA）性乳房炎とSA排菌牛に対する粘岡本隆行、林智人 動衛研
膜免疫誘導治療法の検討究

掲載誌

掲載論文のDOI

発行 発行 巻 掲載
年
月 （号） ページ

J. Vet. Med. Sci.

2016

5

78(9)

1505
1510

産業動物臨床学会
誌

2016

11

7（3）

131139Cell Tissue Res.

2016

5

364

585
597

家畜診療

2016

10

63
（10）

607
615

Complete Genome Sequences of Bovine
Parainfluenza Virus Type 3 Strain BN-1 and Vaccine
Strain BN-CE.
5

②

6

①

7

①

8

①

9

①

10

②

11

②

12

①

13

①

14

①

15

①

16

①

Ohkura Tら

Efficiency of pH-sensitive fusogenic polymer-modified
Watarai S
liposomes as a vaccine carrier.
A liposome-based antigen delivery system using pHYuba Eら
sensitive fusogenic polymers for cancer
immunotherapy.
Infection of the upper respiratory tract of hamsters
by the bovine parainfluenza virus type 3 BN-1 strain Ohkura Tら
expressing enhanced green fluorescent protein.
Survey for detecting persistently infected cattle withbovine diarrhea in Japan.
Kameyama Kら

筑波大学

GenomeAnnouncement

2013

1

pii:e00
24712.doi:
10.112
1 (1) 8/gen
omeA.
00247
-12

大阪府立大学

Scientific World
Journal.

2013

2903234大阪府立大学

Biomaterials

2013

7

34
(12）

3042
3052

Virology

2015

1

476

134
140

J Vet.Med.Sci

2016

8

78
（8）

1329
－
1331

2014

2

63

1-5

2017

2

69

7-12

2014

158

6272

2014

2

141

筑波大学
動物衛生研究部
門

農研機構動物衛生
日本豚病研究会報
研究部門
農研機構動物衛生
日本豚病研究会報高木道浩
豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）の最新情報
研究部門
Application of pH-sensitive fusogenic polymerVeterinary
modified liposomes for development of mucosal
Immunology and
Watarai Sら
大阪府立大学
vaccines.
Immunopathologyy
Journal of
Evaluation of stearylamine-modified liposomes for the
Infectious
oral vaccine adjuvant.
Watarai S, Sasaki Y 大阪府立大学
Diseases andTherapy
Capsular polysaccharide of Erysipelothrix
施 芳、原田知享、rhusiopathiae, the causative agent of swine
小川洋介、小野農研機構動物衛Infection anderysipelas, and its modification with裕、亀山真由美、Immunity
生研究部門
phosphorylcholine.
宮本亨、江口正浩、下地善弘小川洋介、皆川Immunostimulatory effects of recombinantClinical and遊、施 芳、江口正 農研機構動物衛Erysipelothrix rhusiopathiae expressing porcine
Vaccine浩、宗田吉広、下 生研究部門
interleukin-18 in mice and pigs.
Immunology
地善弘
Collagen adhesin-nanoparticle interaction impairs
AS Devi, Yohsuke
adhesin's ligand binding mechanism.
Ogawa, Yoshihiro
農研機構動物衛Biochimca etShimoji, S
Biophysica Acta
生研究部門
Balakumar, Karthe
Ponnuraj
豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）の現状と最新の学
術的知見

高木道浩

2012

11

80

3993
4003

2012

9

19

1393
1398

2012

9

1820

819828

17

①

18

①

19

①

20

①

21

①

22

①

23

②

24

②

25

②

Characterization and identification of a novel
Shi Fang, Yohsuke
candidate vaccine protein through systematic analysis Ogawa , Akiyuki
of extracellular proteins of Erysipelothrix
Sano, Tomoyuki
農研機構動物衛rhusiopathiae.
Harada, Jiro Hirota,
Masahiro Eguchi, 生研究部門
Eiji Oishi, Yoshihiro
Shimoji
Erysipelothrix rhusiopathiae exploits cytokeratin 18- Tomoyuki Harada,
positive epithelial cells of porcine tonsillar crypts as Yohsuke Ogawa,an invasion gateway.
Masahiro Eguchi ,Shi Fang, Masumi 農研機構動物衛Sato, Kazuyuki
生研究部門
Uchida, Hiroyuki
Nakayama,
Yoshihiro Shimoji
Harada T, Ogawa
Phosphorylcholine and SpaA, a choline-binding
Y, Eguchi M, Shi F,
protein, are involved in the adherence of
農研機構動物衛
Sato M, Uchida K,
Erysipelothrix rhusiopathiae to porcine endothelial
生研究部門
cells, but this adherence is not mediated by the PAF Nakayama H,
Shimoji Y
receptor.
Development of a loop-mediated isothermal
Yamazaki Y, Oba E,
amplification assay for rapid and simple detection of Kashiwagi N,
農研機構動物衛
Erysipelothrix rhusiopathiae.
Sugita K, Shiiba K,
Baba Y, Shimoji Y, 生研究部門
Yamazaki W
Development of an SNP-based PCR assay for rapid
differentiation of a Japanese live vaccine strain fromfield isolates of Erysipelothrix rhusiopathiae.
Development of a novel PCR-RFLP assay for
improved detection and typing of bovine
papillomaviruses.

Infection and
Immunity

2013

12

81

4333
4340

Veterinary
Immunology and
Immunopathology

2013

6

153

260266

Veterinary
Microbiology

2014

5

172

216222

Letter in Applied
Microbiology

2014

4

58

362369

2015

7

117

1113

2015

6

218

2326

2014

7

15
(1)

2014

12

32

2014

10

51

Shiraiwa K, Ogawa
Journal ofY, Eguchi M,
農研機構動物衛
Microbiological
Hikono H,
生研究部門
Methods
Kusumoto M,
Shimoji Y
Kawauchi K,
農研機構動物衛J Virol
Takahashi C,
Methods.218:23-6
Ishihara R, Hatama 生研究部門
S
門平睦代、畠間真 農研機構動物衛 産業動物臨床医学
雑誌
一、岩佐光啓
生研究部門

北海道十勝地域における牛乳頭腫の有病率：と畜場での調査
食道の乳頭腫による牛の死亡事例と牛パピローマウ
畠間真一
イルス1型の関与
豚流行性下痢～概説と乳汁免疫について～
平成26年から流行を見せている豚流行性下痢症の概 宮崎綾子、鈴木況と対策、特に母豚免疫の重要性と効果的対策の詳 亨、大橋誠一
説農研機構動物衛
生研究部門

臨床獣医

農研機構動物衛 日本動物用医薬品
協会会報
生研究部門

2428
4043
3-15

（２）学会等発表（口頭またはポスター）
整理番号

タイトル

発表者名

機関名

1

Distribution of accessory gene regulator groups in
Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitic milk inJapan.

渡部淳、小山芳一、秦英司、
農研機構動物衛生研究部
内田郁夫、近山之雄、菊佳門、北海学園大学
男、林智人

2

Characteristics of mastitic mammary secretions from Holsteincows at 8-12 days before parturition

渡部淳、平井綱雄、秦英司

3

4
5

6

7

8

9
10
11

農研機構動物衛生研究部
門、（地独）道総研畜産試験

学会等名World Congress on
Controversies, Debates &Consensus in Veterinary
Medicine

発行 発行
年
月
2014

10

World Buiatrics Congress 2016 20167古川睦実、米山裕、秦英司、
岩野英知、樋口豪紀、安藤太助、佐藤美佳、林智人、菊佳
黄色ブドウ球菌のin vitroでの増殖阻害を可能にするウシポリク
東北大学、農研機構動物衛男、長澤裕哉、新實香奈枝、
東北畜産学会
ローナル抗体の作製
生研究部門、酪農学園大学
宇佐美克紀、佐々木志保、伊藤駿、渡邊康一、麻生久、野地智法
長澤裕哉、菊佳男、野地智
乳汁中に黄色ブドウ球菌特異的IgA抗体を誘導させる鼻腔を介し 法、 麻生久、田邉扶由子、 農研機構動物衛生研究部
第158回日本獣医学会
菅原和恵、石川義春、門田耕 門、東北大学
た抗原取り込み機序の解析
一、林智人
乳腺へ黄色ブドウ球菌特異的液性免疫を惹起させる鼻腔・扁桃
第20回日本乳房炎研究会・学
長澤裕哉、菊佳男、林智人 農研機構動物衛生研究部門
部を介した抗原取込み機序の解析
術集会
長澤裕哉、菊佳男、田邉扶由
ウシ咽頭扁桃は鼻腔投与した黄色ブドウ球菌に対する免疫応答 子、菅原和恵、石川義春、野 農研機構動物衛生研究部
第159回日本獣医学会
地智法、市居修、昆泰寛、麻 門、東北大学、北海道大学の場になる
生久、門田耕一、林智人
長澤裕哉、菊佳男、田邉扶由
ウシの咽頭扁桃は鼻腔から投与した黄色ブドウ球菌死菌に対す 子、菅原和恵、石川義春、市 農研機構動物衛生研究部
第21回日本乳房炎研究会・学
居修、昆泰寛、門田耕一、林 門、北海道大学
る免疫応答の場となる
術集会
智人
長澤裕哉、菊佳男、菅原和
黄色ブドウ球菌性乳房炎における乳汁中乳腺上皮細胞の割合 恵、田邉扶由子、石川義春、 農研機構動物衛生研究部
第6回家畜感染症学会
市居修、野地智法、麻生久、 門、東北大学、北海道大学
は乳腺組織の損傷を反映する
昆泰寛、門田耕一、林智人
World Congress on
長澤裕哉、菊佳男、小山芳Colonization of Staphylococcus aureus in the mucosal
農研機構動物衛生研究部
Controversies, Debates &一、野地智法、麻生久、林智
inflammatory area in the case of severe clinical bovine mastitis.
門、北海学園大学、東北大学 Consensus in Veterinary人
Medicine
ｐH応答性ポリグルシドール修飾リポソームによる抗腫瘍免疫の弓場英司ら
大阪府立大学
第61回高分子学会
誘導
The 44th International
pH-sensitive polymer-modified liposomes as an antigen delivery
Symposium on Macromoleculs,
弓場英司ら
大阪府立大学
system for cancer immunotherapy
IUPAC World Polymar
Congress

2016

9

2015

9

2015

10

2016

9

2016

10

2016

12

2016

7

2012

5

2012

6

12
13
14

抗腫瘍免疫誘導のためのｐH応答性ポリマー修飾リポソーム
Application of pH-sensitive fusogenic polymer-modified
liposomes for development of mucosal vaccine
ｐH応答性ポリマー修飾リポソームを用いた抗原デリバリーとがん免疫治療への応用

弓場英司ら

大阪府立大学

第28回日本DDC学会

2012

7

渡耒仁ら

大阪府立大学The 6th International
Veterinary vaccine and

2012

7

弓場英司ら

大阪府立大学

第21回日本組織適合性学会

2012

9

15

リポソームを応用した犬用経粘膜ワクチンの開発

清水遙介ら

大阪府立大学

第154回日本獣医学会

2012

9

16

効率的な抗腫瘍免疫誘導のためのｐH感受性ポリマー修飾リポ
弓場英司ら
ソームの設計大阪府立大学

第6１回高分子討論会

2012

9

17

鶏サルモネラ症に対する卵内接種リポソームワクチンの開発

大阪府立大学

平成24年度日本産業動物獣医
2012
学会

10

筑波大学

第60回日本ウイルス学会

2012

11

大阪府立大学2nd International Conference
on Biomaterials Science in

2013

3

筑波大学

15th International Negative
Strand Viruses Meeting, Spain

2013

6

18
19
20

渡耒仁ら

牛パラインフルエンザウイルス弱毒生ワクチンBN-CE株及び野大倉喬ら
外分離株BN-1株の遺伝子解析
pH-sensitive polymer-modified liposome based antigen
弓場英司ら
deversity system for cancer immunotherapy
Analysis of Complete Genome Sequences of Bovine
Parainfluenza Virus Type 3 BN-1 and Vaccine Strain BN-CE for 大倉喬ら
Reverse Genetics.

21

経粘膜リポソームワクチン用アジュバントの検討

原怜史ら

大阪府立大学

第156回日本獣医学会

2013

9

22

リポソームを応用した腫瘍ワクチンの開発

岡崎誠治ら

大阪府立大学

第156回日本獣医学会

2013

9

大阪府立大学

第156回日本獣医学会

2013

9

筑波大学

第61回ウイルス学会学術集会

2013

11

農研機構動物衛生研究部門 第61回ウイルス学会学術集会

2013

11

23
24

pH感受性リポソームを応用した犬用経鼻ワクチンによる免疫誘清水遙介ら
導牛感染症に対する新規ワクチンベクターとしての組換え牛パライ
大倉喬ら
ンフルエンザ3型ウイルス作製の試み
坪井孝益ら

25

牛ウイルス性下痢ウイルス1b型の子牛における病原性26

国内で分離された牛ウイルス性下痢ウイルスの遺伝子型の推移 亀山健一郎ら

27

Transition of bovine viral diarrhea virus subgenotypes in Japan.

亀山健一郎ら28

リポソームを応用した犬用歯周病粘膜ワクチンの開発

清水遙介ら

大阪府立大学

第157回日本獣医学会

2014

9

29

リポソームを応用した経皮ワクチンの開発

三上幸恵ら

大阪府立大学

第157回日本獣医学会

2014

9

30

リポソームを応用した腫瘍ワクチンによる免疫誘導の解析

岡崎誠治ら

大阪府立大学

第157回日本獣医学会

2014

9

31

牛ウイルス性下痢・粘膜病に対するDNAワクチンの構築

内藤郁慶ら

岩手大学

第157回日本獣医学会

2014

9

32
33

牛ウイルス性下痢・粘膜病－その多様な病態と持続感染牛の重坪井孝益
大性－牛ウイルス性下痢ウイルス1b型が1a型不活化ワクチン接種子牛
坪井孝益らに及ぼす影響平成25年度獣医学術学会年次
2014
大会
The 3rd Thailand-Japan Joint
農研機構動物衛生研究部門
2014
Conference on Animal Health
農研機構動物衛生研究部門

第42回東北家畜衛生協議会検
2014
討会 秋田
第62回日本ウイルス学会学術
農研機構動物衛生研究部門
2014
集会 横浜
農研機構動物衛生研究部門

3
7

10
11

34

牛パラインフルエンザウイルス３型BN-1株のハムスターにおけるトロピズム

竹内薫ら

筑波大学

35

Development of liposomal intraocular vaccine for canine
periodontitis.

清水遙介ら

大阪府立大学36

Application of pH-sensitive fusogenic polymer-modified
liposomes for development of cancer vaccines.

岡崎誠治ら

大阪府立大学

37

Cell tropism and pathogenicity of bovine parainfluenza type 3

竹内薫ら

筑波大学

38
39
40
41
42
43
44

陽性荷電脂質修飾リポソーム粘膜ワクチンの免疫誘導効果の伊東彩ら
解析
新規pH感受性ポリマー修飾リポソームワクチンの免疫誘導効果
今岡侑輝ら
の解析
リポソームを応用した犬用歯周病粘膜ワクチンの開発：感染防
清水遙介ら
御能の評価
リポソームを応用した腫瘍ワクチンによる治療効果の解析

岡崎誠治ら

マンノース修飾リポソームを応用した制御性T細胞の誘導を可能
藤原典子らにするワクチンの開発
膜タンパク質を欠損する牛パラインフルエンザウイルス3型の性
高田麻里奈ら状腫瘍細胞を抗原とした腫瘍ワクチン（自家腫瘍ワクチン）による
樋口裕梨ら
免疫応答の解析

第62回日本ウイルス学会学術集会 横浜
The 4th Kobe International
Conference on the Care for All
Creatures -ICAC KOBE
The 4th Kobe International
Conference on the Care for All
Creatures -ICAC KOBE
Robert Lamb Symposium(Northwestern University,
Evanston, IL, USA

2014

11

2015

7

2015

7

2015

7

大阪府立大学

第158回日本獣医学会

2015

9

大阪府立大学

第158回日本獣医学会

2015

9

大阪府立大学

第158回日本獣医学会

2015

9

大阪府立大学

第158回日本獣医学会

2015

9

大阪府立大学

第158回日本獣医学会

2015

9

筑波大学

第63回日本ウイルス学会学術
集会

2015

11

大阪府立大学

第159回日本獣医学会

2016

9

45

生殖系の感染症に対する経膣リポソームワクチンの開発

田邊会理ら

大阪府立大学

第159回日本獣医学会

2016

9

46

リポソームを応用した自家腫瘍ワクチンによる治療効果の解析

岡崎誠治ら

大阪府立大学

第159回日本獣医学会

2016

9

47

リポソームを応用したI型インターフェロン誘導法の開発

松本佳奈子ら

大阪府立大学

第159回日本獣医学会

2016

9

48

欠損型牛パラインフルエンザウイルス3型の相互補完的回収方法の検討

高田麻里奈ら筑波大学

第64回日本ウイルス学会学術集会(札幌）

2016

10

49

Pathogenicity of porcine reproductive and respiratory syndrome
高木道浩
viruses isolated in Japan.

3rd the Thailand-Japan Joint
農研機構動物衛生研究部門 Conference on Animal Health
2014

2014

7

50

国内で分離された北米型PRRSウイルス株の病原性

高木道浩

農研機構動物衛生研究部門

第157回日本獣医学会学術集
会

2014

9

51

腫瘍細胞を抗原とした腫瘍ワクチン（自家腫瘍ワクチン）による免疫応答の解析樋口裕梨、岡崎誠治、岩崎忠、弓場英司、河野健司、渡 大阪府立大学
耒仁

第159回日本獣医学会

2016

9

52

生殖系の感染症に対する経膣リポソームワクチンの開発

田邊会理、岩崎忠、渡耒仁

第159回日本獣医学会

2016

9

大阪府立大学

53
54
55
56

57

58
59
60
61

リポソームを応用した自家腫瘍ワクチンによる治療効果の解析

岡崎誠治、岩崎忠、弓場英司、河野健司、渡来仁

大阪府立大学

第159回日本獣医学会

2016

リポソーム型点眼ワクチン/経乳頭ワクチン〜家畜（牛）における動物用ワクチンーバイオ医薬品
渡耒仁
大阪府立大学2016
免疫誘導〜
研究会 2016年シンポジウム
渡耒仁、塔娜、弓場英司、河ウシ乳房炎に対する乳頭接種型新規リポソームワクチンの開平成28年度日本産業動物獣医大阪府立大学2016
野健司、小岩政照
発：経乳頭免疫による免疫応答の解析
学会（近畿）
牛呼吸器病由来Pasteurella multocida におけるｐｆｈB1 、ｐｆｈB2
星野尾歌織
農研機構動物衛生研究部門 第87回日本細菌学会総会
2014
遺伝子の保有および発現状況の解析
Shinichi Hatama, Michiko
Sakakibara, Ryoko Ishihara,
Epidemiology, clinical characteristics and prevention measures
9th International Congress of
Satoko Watanabe, Koichi
動物衛生研究所
2012
for bovine papillomavirus type 9 induced papillomatosis.
Veterinary Virology
Kadota, Yukino Tamamura,
Ikuo Uchida
第157回日本獣医学会学術集
北海道十勝地域における牛乳頭腫の有病率：と畜場での調査 門平睦代、畠間真一ら
動物衛生研究所
2014
会
バキュロウイルス発現系による牛パピローマウイルス様粒子の 渡辺聡子、畠間真一、飯塚哲
第158回日本獣医学会学術集
動物衛生研究所
2015
作製也、芝原友幸、菅野徹
会
組換えバキュロウイルスによる牛パピローマウイルス主要外殻タ 渡辺聡子、畠間真一、芝原友第38回日本分子生物学会・第動物衛生研究所
2015
ンパクL1遺伝子の発現とウイルス様粒子の作製
幸、菅野徹
88回日本生化学会合同大会
ハスモンヨトウ（Spodoptera frugiperda）由来の新規ヘキソサミニ
国保健浩、Hoang Vu Dang
動物衛生研究所
第35回日本分子生物学会
2012
ダーゼ遺伝子の単離

9
9
10
3

9

9
9
12
11

（３）出版図書区分：①出版著書、②雑誌（学術論文に記載したものを除く、重複記載をしない。）、③年報、④広報誌、⑤その他
整理番号

著書名（タイトル）

区分

乳房炎

著者名

1

①

動物微生物学・動物感染症学

林智人

2

①

牛病学（第三版） （牛乳頭腫症）

明石博臣、江口正志、神尾次
彦、加茂前秀夫、酒井豊、芳賀猛、眞鍋昇／編

3①

動物用ワクチンとバイオ医薬品―新たな潮流―

國保健浩

機関名

出版社

全国動物保険看護系大学協会カリインター
キュラム検討委員 ズー出版
会編

発行 発行
年
月
2016

3

近代出版 201310

動物用ワクチン-バ
文永堂出
イオ医薬品研究会
版
編

2017

7

（４）国内特許権等
区分：①育成者権、②特許権、③実用新案権、④意匠権、⑤回路配置利用権
整理番号

区分

1

②

2

②

特許権等の名称

発明者

権利者（出願人等）

アカバネウイルスに対して中和活性を有す 小川洋介、下地善
農研機構
る抗体を誘導するペプチド
弘、江口正浩
ＣＤＰ−グリセロールグリセロフォスフォトラン 下地善弘、小川洋
スフェラーゼ遺伝子欠損豚丹毒菌とその利 介、白岩和真、江 農研機構
用
口正浩

機関名

出願番号

出願年月日

取得年月
日

農研機構

特願2014-032120
2014/2/21（特6373601）

2018/7/28

農研機構

特願2015-169017
2015/8/28（特6342860）

2018/5/25（５）国際特許権等
区分：①育成者権、②特許権、③実用新案権、④意匠権、⑤回路配置利用権
整理番号

特許権等の名称

区分

発明者

権利者
（出願人等）

機関名

機関名

掲載紙・放送社名
等

出願番号

出願年月日

取得年月
日

該当無し
（６）報道等
区分：①プレスリリース、②新聞記事、③テレビ放映、④その他
整理番号

記事等の名称

区分

掲載
年月日

備 考

該当無し
（７）普及に移しうる成果
区分：①普及に移されたもの・製品化して普及できるもの、②普及のめどがたったもの、製品化して普及のめどがたったもの、③主要成果として外部評価を受けたもの
普及（製品化）
成果の名称
機関名
主な利用場面
普及状況
整理番号
区分
年月
1

②、③ 安全で効果の高い豚丹毒生ワクチン候補株 農研機構

2015

1

動物医薬品の製造

2②、③

豚丹毒菌生ワクチン株と野生株とを識別できるPCR法の開発

20151

家畜保健衛生所等における家畜伝染病の病性鑑定、食肉検査

農研機構

出願国

（８）発表会の主催（シンポジウム・セミナー等）の状況
発表会の名称

整理番号

機関名

開催場所

年月日

1

第2回乳房炎サマーキャンプ

2

第8回動物用ワクチン・バイオ医薬品研究会シンポジ
ウム

大学乳房炎教育懇 宮城県大崎市
2016/8/22
談会
川渡公民館
動物用ワクチン・バ
日本大学獣医学部 2016/9/8
イオ医薬品研究会

3

第 40 回大動物臨床研究会シンポジウム

大動物臨床研究会 酪農学園大学

4

5

6

2016/11/5

動物用ワクチン-バイオ医薬品研究会2012年シンポジ 生物科学安全研究 岩手県盛岡市
2012/9/14
岩手大学
ウム所
大阪府大阪市
大阪国際交流セン2013/2/10
平成24年度日本獣医師会年次大会シンポジウム
日本獣医師会ター
シェラトン都ホテル
大阪
動物用ワクチン-バイオ医薬品研究会2016年シンポジ 生物科学安全研究 神奈川県藤沢市
ウム
所
日本大学

2016/9/8

参加者
数

備 考

60
100

H28年度日本獣医学会学術集会開催期間の関連シンポジ
ウムとして開催

160
60

鶏サルモネラ症に対するリポソーム点眼ワクチン（渡耒）

60

68

新しい動物用ワクチンの開発に向けて（國保）リポソーム型点眼ワクチン/経乳頭ワクチン～家畜おける免疫誘導～（渡耒）牛ウイルス性下痢・粘膜病におけるDNAワクチンの開発（村上）（９）アウトリーチ活動の状況
区分：①一般市民向けのシンポジウム・講演会及び公開講座・サイエンスカフェ等、②展示会及びフェアへの出展・大学及び研究所等の一般公開への参画、 ③その他（子供向け出前授業等）
整理番号

アウトリーチ活動

区分
該当無し

機関名

開催場所

年月日

参加者
数

主な参加者

備 考