平成 30 年度第２回 EXTEND2016 化学物質の内分泌かく乱作用に関する検討会
19.03.28.

資料３－１

平成 30 年度第１段階試験管内試験(レポータージーン試験)の実施結果（中間報告）について(案)１．試験対象物質及び試験項目
平成 30 年度の第 1 段階試験管内試験（レポータージーン試験）の試験対象物質及び試験の対象となる作用モードを表 1-1 に示した。
表 1-1 試験対象物質及び作用モード
試験対象物質試験対象とした作用モード
エストロゲン

抗エストロゲン

アンドロゲン

抗アンドロゲンメフェナム酸

○

○

○

○

メラミン

○

○

○

○

2,4-ジクロロフェノール

○

○

○

○

○

○

ジブチルスズ

○

ピレン

○

○

フェニトロチオン○○

2,4-ジクロロフェノキシ酢酸
フェンチオン○○○

カルボフラン○○

アクリルアミド

○

○

フェノール

○

フルタミド

○

○

○

二硫化炭素

○

○

○

グリホサート○○○ニトロベンゼン○○○りん酸トリクレジル○

カルベンダジム○○

アクリロニトリル○○○

ジブロモクロロメタン

○

○

○

○

○

○
○

表 1-1 （つづき）
試験対象物質試験対象とした作用モード
エストロゲン

抗エストロゲン

アンドロゲン

抗アンドロゲン

ブタクロール○○○プロシミドン○

酢酸クロルマジノン

○

マンゼブ

○

○

マンネブ

○

○

○

ジメテート

○

○

○

フタル酸ジイソブチル

○
169

試験数注）

1922

ジブチルスズ：レポータージーン試験にはジブチルスズ二塩化物を用いた。

２．方法及び材料（1）ホルモン受容体の種類すべての作用モードに関して、受容体遺伝子及びレポーター遺伝子等の細胞導入効率の変動を標準化できる Dual-Luciferase Reporter Assay System を用いて一過性発現細胞系により試験を行った（図 2-1）。

図 2-1 レポータージーン試験の概要

2

（2）ホルモン受容体の種類
各作用モードの試験には、以下のホルモン受容体（生物種及びサブタイプ）を用いた。
エストロゲン作用：

メダカエストロゲン受容体α（ERα）

抗エストロゲン作用：

メダカエストロゲン受容体α（ERα）

アンドロゲン作用

メダカアンドロゲン受容体β（ARβ）

抗アンドロゲン作用：

メダカアンドロゲン受容体β（ARβ）（3）試薬及び試験濃度
試験には、 マンゼブ及びマンネブを除いて、純度 98％以上の試薬を供した。マンゼブ（又はマンコゼブ）及びマンネブについては、入手可能な範囲で最も純度が高い試薬（純度 91.0％及び 90.2％）を試験に供した。試験濃度は、試験対象物質の動物細胞に対する毒性及び培地への溶解性を考慮して決定した。
（4）陽性物質及びアンタゴニスト系試験での共添加濃度
各作用モードの試験では、試験が適切に実施されたことの確認及び試験対象物質の転写活性化能又は転写活性化阻害に対する相対的な強さを推定するために、試験対象物質での試験と並行して、以下の陽性対照物質による試験を実施した。
エストロゲン作用：

17βエストラジオール

抗エストロゲン作用：

4-ヒドロキシタモキシフェン

アンドロゲン作用：

11-ケトテストステロン

抗アンドロゲン作用：2-ヒドロキシフルタミド

アンタゴニスト系試験（抗エストロゲン作用及び抗アンドロゲン作用の試験）では、試験対象物質の阻害作用を確認するための共添加物質として、エストロゲン作用又はアンドロゲン作用試験での最大転写活性の 95％程度となる濃度を目安に陽性物質を添加した（17βエストラジオール（1×10-9 M）又は 11-ケトテストステロン（5×10-8 M））。
（5）試験手順及び条件
試験は、96 穴マイクロプレートを用いて、濃度あたり 3 又は 5 連（ウェル）で行った。試験では、専用の試薬を用いて一過的にベクターを導入した培養細胞を被験物質で暴露し、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの発光強度からホルモン受容体を介した作用による転写活性と内部コントロールの転写活性を定量化し、それらの比（発光強度比）を求めた。さらに、各試験濃度について、この発光強度比を助剤対照の発光強度比で除した転写活性化倍率を求めた。各作用での試験における条件の詳細を別添 1 に示した。
有意な反応が得られた試験対象物質については、追試験を実施して同様の結果が得られること（再現性）を確認した。

3（6）データ解析
アゴニスト系試験（エストロゲン作用、アンドロゲン作用の試験）では、試験濃度範囲において有意な転写活性化（転写活性化倍率の有意な上昇）が認められた試験対象物
質については、図 2-2 に示すように、その作用濃度として EC50 値又は PC10 値を算出した。また、アンタゴニスト系試験（抗エストロゲン作用、抗アンドロゲン作用の試験）では、試験濃度範囲において有意な転写活性阻害（転写活性化倍率の有意な低下）が認められた試験対象物質については、その作用濃度として IC50 値又は linIC30 値を算出した。
作用濃度が得られた場合には、それらを基に陽性対照物質の活性に対する比率（相対活性比）も算出した。

アゴニスト系試験
100%(最大転写活性)

8650%

420%

0-13-12-11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4EC5 010
転写活性化倍率

転写活性化倍率

108100%(陽性対照の最大転写活性)6420

転写活性の相対値-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

試験濃度(10E, M)

試験濃度(10E,M)

10%0%(助剤区転写活性)

P C 10アンタゴニスト系試験

転写活性化倍率80% 阻害（陽性対照の転写活性)

650%

42

転写活性化倍率

1010100% 阻害

0IC 5 0試験濃度(10E, M)（陽性対照の転写活性)630%

42100% 阻害

0（陰性対照の転写活性）PC-13-12-11-10-9 -8 -7 -6 -5 -40% 阻害

8（陰性対照の転写活性）PC -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4-13

転写活性阻害の相対値

試験濃度(10E,M)

l i n .IC30

転写活性阻害の相対値

図 2-2 アゴニスト系試験及びアンタゴニスト系試験における作用濃度の算出

4３．結果（１）メダカ ERα レポータージーン試験(エストロゲン作用）
エストロゲン作用を対象とした試験管内試験（メダカ ERα レポータージーン試験）の結果を表 3-1 及び図 3-1 に示した。
試験対象とした 19 物質のうち、2,4-ジクロロフェノール及びりん酸トリクレジルにおいて、試験濃度範囲で転写活性化倍率に有意な上昇がみられ、メダカ ERα に対する転写活性化作用（エストロゲン作用）を有することが示唆された。エストロゲン作用に関して、試験から得られた 2,4-ジクロロフェノールの PC10 は 1.8×10-5 M、りん酸トリクレジルのEC50 は 2.3×10-6 M、それらの陽性対照物質（17βエストラジオール）に対する相対活性比は 0.000067％及び 0.0029％であった。その他の 17 物質については、試験濃度範囲で転写活性化倍率に有意な上昇（メダカ ERαに対する転写活性化）は認めらなかった。
表 3-1 エストロゲン作用に関する試験管内試験の結果
試験対象物質エストロゲン作用EC50又はPC10相対活性比

メフェナム酸（得られなかった）

メラミン（得られなかった）

2,4-ジクロロフェノール

PC10 = 1.8×10-5 M

0.000067％

ピレン（得られなかった）

フェニトロチオン（得られなかった）

フェンチオン（得られなかった）

アクリルアミド（得られなかった）

フェノール（得られなかった）

フルタミド（得られなかった）

二硫化炭素（得られなかった）

グリホサート（得られなかった）

ニトロベンゼン（得られなかった）

りん酸トリクレジル

EC50 = 2.3×10-6 M

0.0029％カルベンダジム（得られなかった）

アクリロニトリル（得られなかった）

ジブロモクロロメタン（得られなかった）

酢酸クロルマジノン（得られなかった）

マンゼブ（得られなかった）

マンネブ（得られなかった）

17βエストラジオール

EC50 = 6.6×10-11 M
PC10 = 1.2×10-11 M

5

（2）メダカ ERα レポータージーン試験(抗エストロゲン作用）（実施中）（3）メダカ ARβレポータージーン試験(アンドロゲン作用）
アンドロゲン作用を対象とした試験管内試験（メダカ ARβレポータージーン試験）の結果を表 3-2 及び図 3-2 に示した。
試験対象とした 16 物質において、試験濃度範囲で転写活性化倍率に有意な上昇（メダカ ARβに対する転写活性化）は認められなかった。
表 3-2 アンドロゲン作用に関する試験管内試験の結果
試験対象物質アンドロゲン作用EC50又はPC10

相対活性比

メフェナム酸（得られなかった）

メラミン（得られなかった）

2,4-ジクロロフェノール（得られなかった）

ピレン（得られなかった）

カルボフラン（得られなかった）

フェノール（得られなかった）

フルタミド（得られなかった）

二硫化炭素（得られなかった）

グリホサート（得られなかった）

ニトロベンゼン（得られなかった）

りん酸トリクレジル（得られなかった）

アクリロニトリル（得られなかった）

ジブロモクロロメタン（得られなかった）

ブタクロール（得られなかった）

マンネブ（得られなかった）ジメテート（得られなかった）

11-ケトテストステロン

EC50 = 3.5×10 -9 M

（3）メダカ ARβレポータージーン試験(抗アンドロゲン作用）
アンドロゲン作用を対象とした試験管内試験（メダカ ARβレポータージーン試験）の結果を表 3-3 及び図 3-3 に示した。
試験対象とした 9 物質において、試験濃度範囲で 11-ケトテストステロン（陽性物質）
によるメダカ ARβ の転写活性化倍率に有意な低下（メダカ ARβ の転写活性に対する阻害作用）は認められなかった。
6

表 3-3 抗アンドロゲン作用に関する試験管内試験の結果
試験対象物質

抗アンドロゲン作用
IC50又はlinIC30

相対活性比

メフェナム酸（得られなかった）

メラミン（得られなかった）

2,4-ジクロロフェノール（得られなかった）

ピレン（得られなかった）

2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（得られなかった）

りん酸トリクレジル（得られなかった）

カルベンダジム（得られなかった）

ブタクロール（得られなかった）

ジメテート（得られなかった）

2-ヒドロキシフルタミド

IC50 = 4.9×10-7 M

7メフェナム酸

10010010075507550252500-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

2,4-ジクロロフェノール

試験濃度 (log M)

ピレン

フェニトロチオン

125

1251001001007550

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

75507550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

フェンチオン

試験濃度 (log M)

アクリルアミド

フェノール
1251001001007550

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

12575507550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

二硫化炭素

フルタミド

グリホサート125

1001001007550

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

12575507550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

りん酸トリクレジル

ニトロベンゼンカルベンダジム

125

125

100

100100

転写活性 (%)

125

7550

転写活性 (%)

転写活性 (%)

500

試験濃度 (log M)

転写活性 (%)

75

25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3転写活性 (%)

転写活性 (%)

125-25転写活性 (%)

メラミン

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

17βエストラジオール（陽性対照）12575507550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

図 3-1-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

メダカ ERα レポータージーン試験(エストロゲン作用）結果

8ジブロモクロロメタン

100

100

1007550

転写活性 (%)

125

75507550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

マンネブ

マンゼブ

2,4-ジクロロフェノール（追試験）

125

125

100

100

100

75
5025

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

酢酸クロルマジノン

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

アクリロニトリル
1257550257550
250

00-25-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

りん酸トリクレジル（追試験）

転写活性 (%)

1251007550250-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

図 3-1（つづき） メダカ ERαレポータージーン試験(エストロゲン作用）結果
メフェナム酸1001001007550

転写活性 (%)

1252575502575
50
25000-25-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

ピレン

2,4-ジクロロフェノールカルボフラン125125

1001001007550

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

メラミン

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

11-ケトテストステロン（陽性対照）
12575507550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

図 3-2-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

メダカ ARβ レポータージーン試験(アンドロゲン作用）結果
9フルタミド

1001001007550755050

2525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

ニトロベンゼングリホサートりん酸トリクレジル

125125100100100755025

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

7550257550
25000-25-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)

ジブロモクロロメタン

アクリロニトリル

ブタクロール125

125100100100

転写活性 (%)

1257550

転写活性 (%)

転写活性 (%)

75

25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3転写活性 (%)

転写活性 (%)

125-2575
50

7550252525000-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

100

100

転写活性 (%)

12550

試験濃度 (log M)

75
50

25

2500-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3

ジメテート

マンネブ
125

75

-25
-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

転写活性 (%)

二硫化炭素

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

フェノール
125-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3試験濃度 (log M)

図 3-2（つづき） メダカ ARβ レポータージーン試験(アンドロゲン作用）結果

10メフェナム酸

100

10012575
5075
5010075502525000-25-25-2525-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)(11KT共添加：5x10-8 M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)

試験濃度 (log M)

2,4-ジクロロフェノール

試験濃度 (log M)

ピレン

2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）

150

125

100125100755025

転写活性 (%)

125

転写活性 (%)

10075
50-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)(11KT共添加：5x10-8 M)

試験濃度 (log M)

5000-2575

25250-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)

試験濃度 (log M)

りん酸トリクレジル

試験濃度 (log M)

カルベンダジム

ブタクロール125125100100100

転写活性 (%)

125755025

転写活性 (%)

転写活性 (%)

転写活性 (%)

150

試験濃度 (log M)

転写活性 (%)

メラミン

125

転写活性 (%)

転写活性 (%)

2-ヒドロキシフルタミド（陽性対照）
125755025755025000-25-25-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)(11KT共添加：5x10-8 M)

試験濃度 (log M)

試験濃度 (log M)-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)

試験濃度 (log M)

ジメテート
125

転写活性 (%)

1007550250-25-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3(11KT共添加：5x10-8 M)

試験濃度 (log M)

図 3-3

メダカ ARβ レポータージーン試験(抗アンドロゲン作用）結果

11（別添 1）（1）

メダカ ERαレポータージーン試験（エストロゲン作用、抗エストロゲン作用）の条件
試験条件

エストロゲン作用試験（アゴニスト検出系）

抗エストロゲン作用試験（アンタゴニスト検出系）

試験容器

96穴マイクロプレート

動物細胞株

HEK293 （ヒト胎児腎由来細胞株）

試験培地

DMEM（2mM L-glutamine、10％FCS含有）

試験液量0.2 mL/well

細胞播種数

1.4×104 cells/well
medaka ERalpha/pcDNA

受容体発現ベクター
試験レポーターベクター

ERE-TK-Luc

コントロールレポーターベクター

pRL-TK-Rluc
37ºC、5 % CO2、40時間

培養環境及び時間連数

5連(well)/濃度

共添加陽性物質及び添加濃度
助剤及び最終濃度（2）－17βエストラジオール（1×10-9M）
DMSO 0.2 %DMSO 0.1 %メダカ ARβレポータージーン試験（アンドロゲン作用、抗アンドロゲン作用）の条
件
試験条件

アンドロゲン作用試験（アゴニスト検出系）

抗アンドロゲン作用試験（アンタゴニスト検出系）

試験容器

96穴マイクロプレート

動物細胞株

HepG2（ヒト肝腫瘍細胞株）

試験培地

DMEM（2mM L-glutamine、10％FCS含有）

試験液量0.2 mL/well

細胞播種数

1.4×104 cells/well
medaka ARbeta/pcDNA

受容体発現ベクター
試験レポーターベクター

ARE-MMTV-Luc

コントロールレポーターベクター

pRL-TK-Rluc
37℃、5％ CO2、40時間

培養環境及び時間連数
共添加陽性物質及び添加濃度
助剤及び最終濃度

5連(well)/濃度－DMSO 0.1％

1211-ケトテストステロン（5×10-8 M）
DMSO 0.2％