Journal of Fisheries Technology, 6（2）, 161︲167, 2014

水産技術，6（2）, 161︲167, 2014

原著論文

海水試料の毒量分析による
麻痺性貝毒モニタリング手法の開発と検証
及川寛＊1･山本圭吾＊2・長井敏＊3

Analysis of Paralytic Shellfish Toxin Content in the Water Column as
an Alternative Method of Monitoring Alexandrium tamarense
Hiroshi OIKAWA, Keigo YAMAMOTO and Satoshi NAGAI
Several species of dinoflagellate produce paralytic shellfish toxin (PST), the accumulation of which inbivalves is a serious problem to public health and the fisheries and aquaculture of bivalves. The causative
substances are saxitoxin and its analogues. The direct measurement of these substances in seawater samples
was studied as an alternative method for the monitoring of the causative dinoflagellate Alexandrium tamarense by microscopic observation. Toxin profiles in 23 strains of A. tamarense isolated from Osaka Bay
were analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), and the major toxin in these strains
was C2 (N21-sulfocarbamoyl gonyautoxin-3). The S/N (signal to noise ratio) of the C2 peak in HPLC analysis was over the quantitative level (S/N>10) when the cell density of A. tamarense in the sample was >100
cells/mL. Since the prefectural government has called for attention to PST in bivalves when the cell densityof A. tamarense exceeds 5 cells/mL, the volume of the sample should be reduced to 1/20 to detect C2 by
HPLC for monitoring purposes. In spring 2012, seawater samples were continuously collected at two monitoring sites in Osaka Bay, and the toxin contents and cell density of A. tamarense were analyzed. The toxin
contents by direct measurement had good correlations (St. 12: r=0.834; St. 19: r=0.817) with the cell density. These results indicate the possibility of the direct measurement of PST as an alternative method of monitoring.
2013 年 7 月 12 日受付，2013 年 10 月 29 日受理
麻痺性貝毒の原因成分はサキシトキシンとその類縁体とした二枚貝の毒化が報告されているが，毒化した二枚成分である。海洋環境では 10 種以上の渦鞭毛藻が麻痺貝の採捕や流通を防ぐために，生産者ならびに都道府県

性貝毒成分を生産する種として知られている 1-4）。これの関係機関は二枚貝を対象とした検査を行い 9），可食部らの渦鞭毛藻が出現した海域ではフィルターフィーダーが規制基準値となる 4 MU/g を超えた場合に採捕や出荷である二枚貝などが貝毒成分を蓄積し，それをヒトが食を自粛する措置がとられる 10,11）。このように，二枚貝のべた場合に麻痺性貝毒による食中毒が起こる可能性があ

毒化は食品衛生上の大きな問題であるとともに漁業生産る。 国 内 で は Alexandrium tamarense5）, A. catenella6）, A.

上も大きな障害であり，2012 年には 11 の道・県で採捕tamiyavanichii , Gymnodinium catenatum の 4 種を原因藻や出荷の自粛措置がとられた＊。生産現場では二枚貝の

7）

＊1

8）

独立行政法人水産総合研究センター

瀬戸内海区水産研究所〒 739-0452 広島県廿日市市丸石 2-17-5
National Research Institute of Fisheries and Environment of Inland Sea, FRA, 2-17-5 Maruishi, Hatsukaichi, Hiroshima 739-0452, Japanoikawah@fra.affrc.go.jp＊2

地方独立行政法人＊3

独立行政法人水産総合研究センター 中央水産研究所

大阪府立環境農林水産総合研究所水産技術センター― 161 ―

毒化を調べるほかにも，水産関係機関を中心に二枚貝のmL を遠心分離（600 g, 3 min）して A. tamarense 藻体を毒化予察を目的として原因となる渦鞭毛藻のモニタリン回収した。回収した藻体は 0.2 mol/L の酢酸で 2 倍希釈。毒化予察は，毒化した貝類を流通（w/v）したのちに 2 分間の超音波破砕を行い，遠心式のさせてしまう危険性をより小さくすることや，計画的な限外ろ過フィルター（Ultrafree, UFC30GV00, Millipore）

出荷のための有益な情報となる。現在，原因藻のモニタでクリーンアップして後述の高速液体クロマトグラフィ

リングは顕微鏡観察による計数が一般的であり，この方ー（HPLC）分析に供した。なお，遠心分離前の培養液法は顕微鏡以外に特別な設備は必要なく簡便な方法であ中の細胞数から遠心分離後の遠心上清中に認められた細る。しかし，主要な原因藻である Alexandrium 属は形態

胞数を差し引いて分析試料中の細胞数を求め，細胞あた的に類似したものが多く，国内でも有毒種，無毒種の両りの毒量算出に用いた。

グを行っている

11,12）

方が出現する 13-15）。また，国内ではこれまで毒化の原因となっていないが，有毒とされる種が散見されることが海水試料処理方法の検討あり 16），これらを顕微鏡観察により判別するには相当発生に注意を喚起する A. tamarense の細胞密度は 5 cells/

大阪湾で行政が麻痺性貝毒のな技術や知識・経験を必要とする。そのため，限られた

mL であり，この密度の海水試料で主要な麻痺性貝毒成

人材で必要十分な数の観測定点を網羅することが困難な分が測定できるように海水試料の濃縮方法を検討した。

場合がある。このように原因藻の顕微鏡観察によるモニ検討には，大阪湾で分離した培養株のうち，細胞当たり

タリングは安価で簡便に行うことができる手法である一の毒量が少なく比較的増殖がよい OSK-6 株を用いた。

方，配置できる人数や観察者の技術・経験によってそのまず，海水試料の濃縮に用いるプランクトンネットの目

情報量や精度が左右される可能性がある。また，麻痺性合いについて，A. tamarense の細胞密度が 1,000 cells/mL

貝毒のリスクの根源は原因藻が生産する毒成分であり，となるように海水試料を調製し，この海水試料 1 L をろ

その毒成分の種類や量は原因種や同じ種でも株によって過濃縮したときにネットを通過した細胞の数を調べて使。すなわち，原因藻の計用する目合いを判断した。なお，ネットの目合いは 10,

数結果はそのようなリスクの違いを正確に反映したもの

15, 20, 30 μm の 4 種とし，ろ過には，現場での使用を異なることが知られている

2,17）

ではない。

考慮し，直径 10cm，長さ 5cm の塩ビ管にプランクトン

そこで，本報告では原因藻を含む海水の麻痺性貝毒量ネットを貼り付けた簡易のろ過器を使用した。

を直接測定してその毒量をモニタリング指標とすること

次 に，A. tamarense（OSK-6 株 ） の 細 胞 密 度 が 5, 50,を目指し，顕微鏡観察によるモニタリングで二枚貝の毒100, 200, 400, 600, 800, 1000 cells/mL となるように海水試化に注意を喚起する細胞密度（大阪湾，5 cells/mL）以

料を調製し，この海水試料を後述の HPLC 分析に供し下の海水でも麻痺性貝毒成分量を測定できる手法を検討て主要な PSP 成分について定量下限となる細胞密度をした。さらに，検討した測定方法により，近年麻痺性貝求めた。そして，その結果から 5 cells/mL の海水の毒成毒の被害が頻発する大阪湾 18）で採取した海水試料の毒分測定に必要な濃縮倍率を判断した。このときの海水試量を測定し，顕微鏡観察で求めた原因藻の計数値と比較

料も 0.2 mol/L の濃度の酢酸で 2 倍希釈（v/v）し，2 分することにより本手法の貝毒予察指標としての可能性を間の超音波破砕を行い，限外ろ過フィルター（Ultrafree,

検証した。

UFC30GV00, Millipore）でクリーンアップして分析に供した。なお，定量下限は対象成分の S/N 比により判断

材料と方法
A. tamarense の毒成分組成

し，その値が 10 以上の場合を定量可能とした 19）。
本報告において対象海域

現場海水の毒量と原因藻密度の比較

大阪湾（図 1）にとした大阪湾で出現する麻痺性貝毒原因藻 A. tamarense

おいて 2 定点（St. 12 および St. 19）をもうけ，麻痺性の主要な毒成分を明らかにするため，大阪湾から本種を貝毒の発生時期である 2012 年 2 月～ 5 月に原則として分離培養して毒成分組成を調べた。大阪湾で 2011 年 4

週 1 回採水し，海水試料中の麻痺性貝毒量の分析と原因

月 5 日に採取した海水から A. tamarense を１細胞ずつ改藻の顕微鏡観察による計数を行い結果を比較した。海水変 f/2 培地を満たした浮遊細胞培養用 24 穴プレートに試料を宮村ら 20）の方法に従って内径 35mm，長さ 10 m

分離し，温度 15℃，光量子束密度を 100 μmol/m2/s，明のプラスチック製ホースを垂直に沈めて柱状に採水し，暗条件を D:L=8h:16h としたグロースチャンバー内で培全量をポリバケツで受けたのち 2 L をプラスチックボト

養した。そのうち増殖が確認出来た株は，最終的に 50ルに入れて広島県内の所属する研究所に送付した。海水mL の培地を入れた 100 mL 容のガラス製フラスコまで

試料は採取翌日の午前中に受け取り，本報告で検討した培養サイズを大きくして 2 週間培養し，その培養液 12方法により 1 L を 5-10 mL に濃縮処理した。濃縮処理後*

農林水産省消費・安全局畜水産安全管理課事務連絡（平成 24 年 12 月 20 日，No. 25）貝毒発生に伴う出荷自主規制措置及び解除について．

― 162 ―

Oshima21）が報告したポストカラム蛍光化法により行い，分析用標準品は農林水産省消費安全局から配布された
g o n y a u t o x i n 1 （ G T X 1 ）， G T X 2 ， G T X 3 ， G T X 4 ，d e c a r b a m o y l G T X 2 （ d c G T X 2 ）， d c G T X 3 ， N 2 1 sulfocarbamoyl gonyautoxin 2（C1），N21-sulfocarbamoyl
gonyautoxin 3（C2），neosaxitoxin（neoSTX）と，水産総合研究センター中央水産研究所渡邊龍一博士より分与い
ただいた GTX5，GTX6，当所にて製造し広島大学浅川准教授に定量していただいた saxitoxin（STX）の計 12成分を用いた。HPLC 分析装置は Hitachi 製の L-7250 オ
ートサンプラー，L-7100 送液ポンプ，L-7300 反応槽（65℃），L-7480 蛍 光 検 出 器（ 励 起 波 長 330 nm, 蛍 光 波 長
390 nm）を使用し，分析用カラムは Inertsil C8-3（GL サイエンス , 4.6 mm id × 150 mm）を用いた。

結

図 1．大阪湾における現場海水試料の採水地点

果

A. tamarense の毒成分組成

大阪湾から分離した 23 株の試料は他の分析と同様に 0.2 mol/L の酢酸で 2 倍希釈

で は， 標 準 品 と し て 用 い た 12 成 分 の う ち GTX1，（w/v）し，超音波破砕後に限外ろ過フィルターでクリー

GTX3，GTX4，GTX5，C1，C2，neoSTX，STX，

ンアップして分析に供した。また，これとは別に，海水

dcGTX3 の 9 成分が検出された（図 2）。このなかで第一

100 mL を 15 μm のプランクトンネットを用いて 10 mLの主要な成分である C2 の組成比は 28.5-79.6 mol% の範

前後に濃縮し，そのうち 1 mL を倒立顕微鏡により検鏡

囲に，第二の主要な成分である GTX4 の組成比は 7.4-

して A. tamarense の細胞数を計数した。検鏡は 1 試料に44.8 mol% の範囲に分布し，この上位 2 成分を株ごとにつき 3 回行い，平均値をその試料の細胞密度とした。

合計（C2 + GTX4）した割合は 69.0-97.5 mol% となった。
この合計値を単純に平均した値は 85.4 mol% となり，全HPLC に よ る 麻 痺 性 貝 毒 成 分 の 分 析

HPLC 分 析 は

毒成分の 8 割以上をこの 2 成分で占めるという結果であ

図 2．大阪湾から分離した Alexandrium tamarense の麻痺性貝毒成分組成― 163 ―

っ た。 ま た， 細 胞 あ た り の 毒 量 は 12.2 fmol/cell か らから，濃縮処理には 15 μm の目合いのプランクトンネ

129.9 fmol/ cell まで株ごとに大きく異なっていた。

ットが適当と判断した。

海水試料処理方法の検討に OSK-6 株を添加した海水試料の HPLC 分析を行い，次に，海水の濃縮倍率を検討するため各種の細胞密度
大阪湾の A. tamarense は C2

および GTX4 の 2 成分が主要成分であることから，A.

C2 および GTX4 の 2 成分について S/N 比を求めた（表tamarense の細胞密度が 5 cells/mL あるいはそれ以下で2）。S/N 比とはベースラインノイズに対するピーク高さ

この 2 成分を検出するための海水処理方法を検討した。

の比であり，一般的に定量下限は S/N>10 とされる 19）。

まず，培養した A. tamarense（OSK-6 株）を添加した

したがって，C2 では細胞密度が 100 cells/mL で S/N は

海水試料を用いてろ過試験を行い使用する目合いを検討

10 を超えており，5 cells/mL の細胞密度を想定すると，した。各目合いにおいてネットを通過した A. tamarense

20 倍の濃縮で C2 は定量できると考えられた。一方，組藻体の割合を表 1 に示したが，30 μm ではほとんど全成比の低い GTX4 は 1000 cells/mL で S/N が定量下限にてが，20 μm の目合いでは 7 割ほどがネットを通過し近い 9.5 であった。このことから，5 cells/mL の細胞密度てしまうことがわかった。一方，15 μm の目合いではの試料で GTX4 を定量するには 200 倍以上の濃縮が必通過する割合は 5% 程度であり，10 μm では 1% ほどし要と考えられた。

か通過しなかった。このうち 10 μm の目合いは，ろ過に時間がかかるうえ現場海水では目合いが小いため珪藻

現場海水の毒量と原因藻密度の比較などにより目詰まりが生じて高倍率に濃縮できないこと

手法により，大阪湾の 2 定点において柱状採水した海水

ここまで検討した試料の毒量値を分析するとともに，A. tamarense の出現
表 1．各種目合いのプランクトンネットを通過した Alexandriumtamarense 培養株細胞の割合

細胞を検鏡により計数して細胞密度を求め，両者の結果＊

平均値±標準偏差（n=3）

表 2．各種細胞密度に Alexandrium tamarense 培養株＊ を添加した海水試料の HPLC 分析における麻痺性貝毒成分 C2 お
よび GTX4 の S/N 比＊

使 用 株（OSK-6）の 毒 量 は C2 が 10 fmol/cell，GTX4 が 3.4
fmol/cell＊＊
ピーク不検出a,b
2 回の分析の平均値

図 3．大阪湾の St. 12 (a) および St. 19 (b) で採取した海水試料の Alexandrium tamarense 細胞密度（●）と測定した毒量値（△）の推移― 164 ―

nmol/L であり，細胞密度の最大値がわずかに小さい St.
19 のほうが高い毒量値を示した。

考察

麻痺性貝毒の原因物質は，A. tamarense など特定の渦鞭毛藻類が産生する毒成分であり 1-4），毒成分量のデー
タはリスクの多寡を直接反映するものである。また，経験が必要とされる微細藻類の形態による判別と異なり，毒成分のピークを確認することで容易にかつ確実に有毒種の出現を判断できる。これまでに海水試料中に微量に存在する毒成分量を測定する手法として大島 22）が報告した方法がよく知られる。この方法は，海水試料を活性炭カラムに通して貝毒成分を吸着させた後，蒸留水により洗浄して脱塩し，さらに酢酸とエタノールを含む溶媒で溶出した毒成分を減圧濃縮して毒量を測定する。宮村ら 20）は同手法により測定した海水懸濁物中の毒量と二枚貝毒化との対応を調べて予察指標としての有効性を示した。しかし，この手法は試料処理や分析に時間がかかることから，顕微鏡観察に代わる選択肢にはなっていな
いのが現状である。そのため，本報告ではまず海水試料中の毒成分量を簡易な濃縮処理だけで直接測定する手法を検討した。その結果，目合い 15 μm のプランクトン
ネットにより 20 倍に濃縮した試料の分析により，大阪
湾で注意喚起が必要とされる A. tamarense の細胞密度（5cells/mL）において主要な貝毒成分である C2 の定量が可能（S/N>10）であることがわかった。また，C2 の次に組成比が高かった GTX4 の場合は，200 倍以上の濃縮で定量が可能であると考えられた。なお，本報告において使用した HPLC 装置は購入後 15 年が経過したもので，
図 4．大阪湾の St. 12 (a) および St. 19 (b) で採取した海水試料における毒量値と Alexandrium tamarense 細胞密度の相関

近年開発が進む高感度な液体クロマトグラフィー装
置 23,24）ではないが，このような一般的に普及している
HPLC 装置で検出感度は十分であった。
次に，実際に大阪湾定点で採取した現場試料を分析しを比較した（図 3）。海水試料は例年麻痺性貝毒が発生てこの手法の検証を行った。試料採取を行った 2012 年

す る 春 季 を 中 心 に 4 ヶ 月 に わ た り 採 取 し た が，A.

は A. tamarense の出現密度は最大でも 1 cells/mL 程度と

tamarense の 最 高 細 胞 密 度 は St. 12 で 4 月 23 日 の 1.0

低かったが，濃縮倍率を高めることでこのような低密度

cells/mL，St. 19 で 5 月 7 日の 0.77 cells/mL であり，2 定の A. tamarense の出現時にも組成比の高い C2 成分を検点とも大阪湾で麻痺性貝毒の注意喚起となる 5 cells/mL

出することができ，毒量値と A. tamarense の細胞密度にを上回ることはなかった。今回の一連の毒量分析のため

良い相関を得た。今回は，二枚貝が毒化するような高いの試料は，5 cells/mL 以下でも毒成分を検出できるよう細胞密度の海水試料について分析できなかったが，そのに 1 L の海水試料を 5-10 mL（100-200 倍）に濃縮したたような試料ではより多くの毒成分が検出されるため，よめ A. tamarense は低密度であったが最も組成比が高いとり精度の高いデータとなることが期待できる。これらの思われる C2 を検出することができた。検出した麻痺性ことから，本手法は原因藻の計数によるモニタリングを貝毒成分はこの C2 のみであったが，毒量のピークと細代替できる可能性を持つと考える。また，2 つの定点の胞密度のピークはほぼ一致した。また，毒量値と細胞密毒量値を比較すると，細胞密度の小さい St. 19 のほうが度について回帰分析した結果を図 4 に示したが，相関係

毒量値は高い値を示した。この原因としては，今回大阪

数は St. 12 と St. 19 ではそれぞれ 0.834 と 0.817 であり，湾で分離した 23 株の A. tamarense でも細胞当たり毒量ともに良い相関を示した。一方，2 つの定点の毒量の最は株間で 10 倍を超える差があったことから，St. 12 と大値を比較すると，St. 12 は 0.087 nmol/L，St. 19 は 0.21

St. 19 では異なる毒含量の集団となっていた可能性が考― 165 ―

えられる。このようなリスクの違いは出現細胞数のデー

文

献タからは直接読み取ることができないが，毒量値を分析した場合には把握することが可能であり本手法の利点を示した結果と言える。
一方で，顕微鏡観察による計数と比べると毒量分析そのものにはいまだ時間がかかるのは否めない。麻痺性貝
毒成分は 20 種以上の成分が知られており，大島の方
法 21）による HPLC 分析はそれら多成分の分離に優れる
が，すべての成分を分析するには 3 種類の溶離液を使い分けて，それぞれ 20 分前後の分析時間が必要である。
大阪湾の A. tamarense は C2 と GTX4 が主要な毒成分であるが，両者の分析には異なる溶離液による 2 回の分析が必要であり 40 分程度を要する。そのため，現時点でも微細藻類の形態判別に習熟している場合には顕微鏡観察が迅速・簡便な手法である。しかしながら，HPLC 分
析では多検体を自動で連続分析することが可能であり，多くの試料を一度に分析する場合に自動化の恩恵は大きい。したがって，出荷自粛を行う海域や期間をきめ細かく設定するために多くの定点からのデータを得ることが必要な場合などは本手法の導入にもメリットがあると考える。また，ハイスループットな超高速液体クロマトグ
ラフィー 23）や液体クロマトグラフィー / 質量分析 24），同時に多検体の分析が可能な ELISA 法による麻痺性貝毒の分析 25,26）が利用可能であれば，分析時間そのものの短縮が期待できる。
本報告では，海水中の麻痺性貝毒量を貝毒予察の指標として利用するための検討を行い，簡易な濃縮処理で原因藻のモニタリングに必要とされるものと同等な感度で麻痺性貝毒成分量を測定することが可能であることを示した。また，現場で採取した海水においても毒量と原因
プランクトンの出現密度には良い相関が認められた。しかし，分析そのものに要する時間の短縮や，原因藻の出現密度が低く検証することができなかった二枚貝の毒性との相関性についてなど，今後取り組むべき課題も残されている。海水中の毒量を指標とする方法は，原因藻の種類や海域によらない汎用性の高い手法となる可能性があり，これらの問題を解決して実用できる技術にしていきたいと考えている。

謝辞

麻痺性貝毒分析に使用した標準品のうち，サキシトキ
シン標準品の定量にご協力いただいた広島大学生物圏科
学研究科浅川学准教授に感謝する。また，サキシトキ

シン以外の貝毒標準品は，農林水産省消費安全局海洋生物毒安全対策事業ならびに中央水産研究所渡邊龍一研究
員からご提供いただいた。ここに深謝する。なお，本研
究の一部は農林水産技術会議委託プロジェクト研究「海洋微生物解析による沿岸漁業被害の予測・抑制技術の開発」の一部として行われた。

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