コアシェルも全多孔性も徹底カバー
コアシェルも全多孔性も徹底カバー
C18から
C18からHILICからHILICまHILICまで
今さら聞けないカラムを上手今さら聞けないカラムを上手にを上手に使いこなすため使いこなすための基礎ための基礎とコツの基礎とコツ
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

全多孔性？コアシェル？

全多孔性からコアシェルに変えたけど・・・

段数が・・・
段数が・・・

保持が・・・
保持が・・・

流速上げると・・思っていたほど・・

全多孔性からコアシェルに変えたけど・・・
段数が・・・
段数が・・・
サンプル調整の溶媒負荷量
装置の容量保持が・・・
保持が・・・

サンプル調整の溶媒負荷量
C18カラム選択

流速上げると・・

検出器の取り込み時間
装置の容量思っていたほど・・

C18カラムはC18カラム
コアシェルと全多孔性の違い
圧力と粒子径の関連全多孔性粒子と何が違う？
コアシェル

全多孔性

素材

シリカ

特徴

アルカリ条件に弱い

粒度分布

狭い

広い

比表面積

狭い(150㎡/gほど)

広い(340㎡/gほど)

構造

ノンポーラスの核と多孔質層

多孔質

重量

重い

軽い

全多孔性シリカカラムで注意すべきこと
コアシェルシリカカラムで注意すべきこと

コアシェルシリカの電子顕微鏡写真
CP-SEM

粒子径: 2.6 μm
細孔径: 16 nm

粒子径: 2.6 μm
細孔径: 100 nm

粒子径: 3.4 μm
細孔径: 30 nm

コアシェルシリカ粒子を樹脂包埋し、Arイオンミリングにより断面加工し、導通処理のためOs(オスミウム)蒸着して観察しました。コア（フューズドシリカ）とその周りの多孔質層が確認できます。

市販されているコアシェル粒子
コア

粒子径1.3‐‐2 μm

2.4‐‐2.7μm

3.4 - 3.6 μm

4 - 5 μm

細孔径

9 - 10 nm

8 - 16 nm, 30 nm, 100 nm

20 - 40 nm

8 - 12 nm

多孔質層0.22 - 0.4 μm

0.3 - 0.5 μm

0.2 - 0.5 μm

0.?- 0.6 μm

比表面積 100 – 120 m2/g

90 – 150 m2/g,
25 – 40 m2/g

15 m2/g

90 m2/g

多孔質％58 - 77％27％

60%

58 – 78%全多孔性シリカとコアシェル型シリカ
2.6µ2.6µmと5µmの標準試料の保持比較
全多孔性シリカ
Sunniest C18, 5 μm

コアシェル型シリカ
SunShell C18, 2.6 μm

コアシェル型シリカ
SunShell C18, 5 μm

340 m2/g

150 m2/g

90 m2/g

比表面積

保持時間(tR)

保持指数(k)保持時間(tR)

保持指数(k)保持時間(tR)

保持指数(k)1) ウラシル

1.7001.3401.3002) カフェイン

1.90

0.12

1.460.091.410.083) フェノール

2.170.28

1.65

0.23

1.570.214) ブチルベンゼン

13.35

6.85

10.87

7.11

8.93

5.875) o-ターフェニル

19.19

10.29

15.49

10.56

12.76

8.826) アミルベンゼン

19.96

10.74

16.56

11.36

13.439.337) トリフェニレン

24.35

13.32

21.95

15.38

16.76

11.89

相対値アミルベンゼン

100%

100%

83%

106%

67%

87%

コアシェル型シリカ 5 μm
コア径：3.4 μm
シェル層厚：0.6 µm

移動相: Methanol/water(75:25)
温度: 40oC
カラム: 150 x 4.6 mm
流速: 1.0 mL/min

低流速時の理論段高さ
Column: SunShell C18 2.6 μm, 50 x 2.1 mm
totally porous 2 μm 50 x 2.1 mm
Mobile phase: Acetonitrile/water=(60/40)
Sample : Naphthalene

Plate height (μm)

201625℃ core shell 2.6 um

2倍以上の差1240℃ core shell 2.6 um
40℃ totally porous 2um

84

ほぼ同じ理論段高さ（段数）000.2

0.40.6

Flow rate (mL/min)

0.81カラム長さと理論段数
理論段数が約20,000段になるカラム長さと粒子径

全多孔性カラム

コアシェルカラム

粒子径長さ

圧力5 µm250 mm

低3 µm150 mm

中Sub 2 µm

100 mm

高2.6 µm

100 mm

中5 µm

150 mm低同じ理論段数でも、長さが短いカラムは分析時間が短縮可能

イソクラティック溶離例
Brand F C18, 5 μm 250 x 4.6 mm

HPLC

N(4)=19,313

3123
1054

SunShell C18, 2.6 μm 100 x 4.6 mm
4 5224N(4)=20,287

分析時間1/368101214Retention time/min

1618

20

154

2122

N(4)=20,287

305µm C18からの移行
C18からの移行

23

45Sample: 1 = Benzydamine
2 = Ketoprofen
3 = Naproxen
4 = Indomethacin
5 = Ibuprofen

6Retention time/min3UHPLC 1

N(4)=24,124

1.0 mL/min

254

31.8 mL/min

120142N(4)=22,424

53Retention time/min

5 μm, 250x4.6mmカラムに比べ分析時間1/6
4524Column:
Brand F C18, 5 μm 250 x 4.6 mm
SunShell C18, 2.6 μm 100 x 4.6 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphoric acid = 45/55
Flow rate: 1.0 mL/min,1.8 mL/min at the lowest chromatogram
Temperature: 25 ºC
Pressure: 9.5 MPa for Brand F C18 5 µm
13.4 MPa for SunShell C18 2.6 µm
Detection: UV@230 nm

6HPLC: Hitachi LaChrom ELITE（内径0.25mmの配管仕様）
UHPLC: Jasco X-LC

通常仕様とセミミクロ仕様のHPLC
通常仕様とセミミクロ仕様のHPLCの比較
HPLCの比較

Flow cell

Response Sampling Tubing ID

Normal 13 μL

0.1 sec

0.4 sec

0.25 mm

Semi-micro 3.2 μL 0.1 sec

0.4 sec

0.13 mm

Semi-micro 3.2 μL 0.05 sec

0.05 sec

0.13 mm

45000
40000
Acenaphthene

理論段数

35000

Toluene
Butylbenzene

30000
25000
20000

Semi-micro 0.05 sec

15000

Semi-micro 0.1 sec
10000

UracilNormal 0.1 sec

5000
005

ピーク幅/秒1015

Column: SunShell C18, 5 µm 250 x 4.6 mmMobile phase: CH3CN/H2O= 70/30
Flow rate: 1.0 mL/min,Temperature: 40 ºC
Pressure: 6.7 MPa
Detection: UV@250 nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Toluene
3 = Acenaphthene
4 = Butylbenzene
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE

配管の影響耐圧：130MPa
メタルフリー対応
SunShell C18 2.6 μm, 50 x 2.1 mm
321040.5

11.522.5

33.5

44.55 minConnecting tube
Injector→Column: Marvel X, 0.075 mm i.d., 350 mm length
Column→Flow cell of UV: Marvel X, 0.075 mm i.d., 150 mm length

Peak No.
12Efficiency3412
Tailing factor
3412
Peak width,h0.5 (min)34

Column: SunShell C18, 2.6 μm 50 x 2.1 mm
Mobile phase: Acetonitrile/water=60/40, Flow rate:0.30 mL/min
Temperature: RT, Detection: UV@250 nm, Injection volume: 0.4 μL
Sample: 1=Uracil, 2=Ethylbenzene, 3=Acenaphthene, 4=Butylbenzene

SUS
1107
6852
10976
10768
0.939
1.320
1.057
1.041
0.02010.0246
0.05130.0783

Marvel X
2614
10146
11907
11129
0.913
1.210
1.037
1.051
0.01240.01990.04930.0772粒子径の異なるコアシェルカラムの比較

汎用HPLCでも使用しやすい20MPa以下で使用可能な粒子径3.5µmを開発

全多孔性カラムとの比較
1218.0 MPa
312Column size: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Caffeine
3 = Phenol
4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl
6 = Amylbenzene
7 = Triphenylene
HPLC: Conventional HPLC instrument

CompanyA C18 Hybrid 3.5 μm(Totally porous hybrid silica)
754

N6=20,000
k6 =7.16

SunShell C18 3.5 μm(Core shell silica)
13.0 MPa

57N6=28,000
k6 =10.76431230(Tubing, 0.25 mm i.d.)Sunniest C18 3 μm(Totally porous silica)
515.7 MPa

5741015

N6=22,000
k6 =12.1

620

Retention time/min

2530

コアシェルカラム３大イメージ
全多孔性シリカカラムと比べてコアシェルカラムは圧力が低い
保持が小さい負荷量が少ない本当??
本当??

カラムの背圧
カラムの背圧は粒子径の2乗に反比例
HPLC

Brand F C18, 5 μm 250 x 4.6 mm

N(4)=19,313

3129.5 MPa
02468101214
Retention time/min

161820

SunShell C18, 2.6 μm 100 x 4.6 mm

0113.4 MPa

222224N(4)=20,287

315434554Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphoric acid = 45/55
Flow rate: 1.0 mL/min,Temperature: 25 ºC
Detection: UV@230 nm
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE（内径0.25mmの配管仕様）

2.6 μmでは5 μmの約3.7倍の圧になる
9.5MPa × 3.7 ×100/250 = 14.1MPa

6Retention time/min

粒子径に準じた背圧

単位圧力あたりの段数比較
PlatesPressure(MPa)

Plates/pressure

Sunniest C18-HT 2.0 μm

9,90016.7593

Brand A C18 1.9 μm

7,660

16.3470

Brand B C18 1.8 μm

10,10019.6515

Brand C C18 1.7 μm

11,14032.0348

SunShell C18 2.6 μm

9,600

9.7990Sunniest C18-HT 2.0 μm
Brand A C18 1.9 μm
Brand B C18 1.8 μm

2～３倍～３倍Brand C C18 1.7 μm
SunShell C18 2.6 μm
05,00010,0000102030

0300

600

900

Column: 50 x 2.1 mm C18, Mobile phase: Acetonitrile/water=(70/30), Temperature: 25 oC

全多孔性シリカカラムと比べるとコアシェルカラムは圧力が低い

圧力は粒子径通りの高さだが理論段数は高い
Sub2 µmでは使用できない長さのカラムを使用可能

標準試料の分離比較
Column:Company P C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (26.1 Mpa, 30,800 plate )Company
PC18264
Company T C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (22.7 Mpa, 31,600 plate)
26.1 MPa
113
Company W C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (18.5 Mpa, 23,300 plate)27
Company A C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (30.6 Mpa, 30,200 plate)51
k6=7.4Company
TC18
Company S C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (22.2 Mpa, 31,800 plate)
N6=31,600
6
3
422.7 MPa
SunShell C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (21.8 Mpa, 31,900 plate)
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
7
1 2 k6=7.75Company W C18 Flow rate: 1.0 mL/min
N6=23,300 46318.5 MPa
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine, 3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
7
1 2 k6=9.0
55 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene, 7 = Triphenylene
Company A C18
N6=30,200
7k6=5.4
5N6=30,800

30244676SunShell C1821.8 MPa 48

水素結合性30.6 MPa

52 k6=9.7
1 3 N6=31,800
2316456718202224

疎水性

立体選択性(Amylbenzene/Butylbenzen (Triphenylene/o-Terphenyl)e)0.481.54

1.200.35

1.56

1.50

Company W C180.38

1.59

1.32

Company A C180.42

1.57

1.25

Company S C180.44

1.60

1.31

SunShell C180.39

1.60

1.46

Company S C18 Company P C18
22.2 MPa
Company T C18

k6=10.4
N6=31,900

101214
16
Retention time/min(Caffeine/Phenol)

物性値
炭素含有量
Carbonloading (%)

細孔容積
比表面積
Specific surface Pore volume aarea a (m2/g)
(mL)

細孔径
Pore diameter a(nm)SunShell C18

7.3

1250.261

8.34

Company S C188.01330.278

8.20

Company A C188.5

1350.414

12.3

Company T C188.81300.273

8.39

Company W C18

7.3

1130.264

9.32

Company P C18

4.91020.237

9.25

a. C18充填剤を600℃で8時間焼成し，アルキル基を焼き飛ばした後のコアシェル粒子を測定しました。この測定値はオリジナルのコアシェル粒子の値より小さくなります。
*全ての測定はクロマニックテクノロジーズ社内で行いました。

アミトリプチリンの負荷量比較
Mobile phase: Acetonitrile/20mM phosphate buffer pH7.0=(60:40)
Column dimension: 150 x 4.6 mm, Flow rate: 1.0 mL/min, Temp.: 40oC

CH3N

CH3316000

1TF=1.18

24

SunShell C18(core shell)

14000
TF=1.42

Theoretical plate

12000
10000
8000
6000

100 times

SunShell C18
Company A C18Sunniest C18 3um
Company P C18
Company T C18
Compnay W C18
Company S C18

TF=2.43

TF=3.21

2000

T C18(core shell)
W C18(core shell)

TF=3.170.01

Sunniest
C18 3μm(fully porous)
P C18(core shell)

TF=1.25

4000

00.001A C18(core shell)

0.1

1

10

S C18(core shell)

TF=4.38

Sample weight/μg0

理論段数はピークの高さの4.4%のピーク幅を用いる5シグマ法を用いました。

4.4%

12

3

56
7
4Retention time/min

8910

Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol,
3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline

全多孔性シリカカラムと比べるとコアシェルカラムは保持が短い

保持時間は短いが保持指数はほぼ同じ
負荷量は少ないがその差は20%
コアシェルカラムは保持時間・負荷量共にメーカ間の差が大きい

負荷量が小さくなるということは・・
分取する場合・・・

コアシェルカラムの分取は・・・• できるだけ負荷量を取る• ピーク幅が広いことが多い• ピーク形状が悪い時もある• コストがかかる• 回収効率が20%程度さがる• コアシェルを使うメリットが少ない

分取においては全多孔性カラムのほうが向いているHILICカラムをいざ使用してみると・・・・
HILICカラムをいざ使用してみると・・・・• 考えていたものより・・・
保持が短い？保持しない保持時間の再現性が・・・
保持時間の再現性が・・・
理論段数が低い気が・・・

HILICはどうも使いづらいはどうも使いづらい

HILICの分離メカニズム
HILICの分離メカニズム
H2O

OOHO

Si
O

SiO

H2OO

O

O

O

SiOO
OSiSi

H2O OOSi

Mobile Phase

OHO

O

O

Si

Silica gel(HILIC)

12-

HO

O
O

H2O

O

O

Si

O

O

O

O

O

Si

O
O

O

O

Si
OOO

O
O

OH

OH

O

H2OO

Si

O

Si

O

HO

H2O
Si

OH
OH

H2O

H2O Si

O
Si

O

O

O

ODS silica
(RP)

21-

OH

H2O
Si

HO

Analyte

H2OO

H2O

O

Si

O

H2O

O

Si

Si

O

Hydrophilic
Partitioning

-

H2O

O
O
Si

O

Si

Si

O

O

Si

Analyte

H2O

O

Si

O

O

O

O

OH

Si

O
O

H2O

H2O O

Si
Si

Si

OH

Si

O
O

Si
O

O

Si

O

O

O

OO-

H2O

 HILICの特徴として･･･の特徴として･･･

 逆相系に用いる極性溶媒が使用可能である。
 固定相に形成された水和層との分配によって分離が起こると言われている。
 親水性が高い化合物ほど保持される特徴がある。

HILICを使用するうえでの注意点
HILICを使用するうえでの注意点• 保持が短い・保持がない場合
サンプル• 移動相もしくは水割合が低い溶媒で調整する



移動相• 有機溶媒の割合を増やす• 塩の濃度を上げる、塩の種類を変える• 理論段数が低い場合


サンプル• 負荷量を減らす

移動相• 流速を遅くする

逆相クロマトグラフィーと比べ、試料中の溶媒(水の影響を逆相クロマトグラフィーと比べ、試料中の溶媒 水)の影響を大きく受ける傾向がある
最適流速も逆相クロマトグラフィーより、低速になる傾向がある

いざ使用してみると・・・・

保持時間の再現性が・・・
保持時間の再現性が・・・

インジェクションによるベースラインの乱れ

UVで見てるけどそんなことはないけどで見てるけどそんなことはないけど水10μ10μL注入時のヒリックカラムのクロマトグラム
注入時のヒリックカラムのクロマトグラム
移動相：5mM酢酸アンモニウム/アセトニトリル(20:80)
検出：UV@220nm（青），RI (赤）水

水10µ0µL注入により固定相の状0µ 注入により固定相の状態が乱れている
固定相の平衡化完了

UVRI
6.6min05UVととRIのタイムラグのタイムラグ0.5分のタイムラグ 分

7.1min1015

TIME (min)UVでは観察できないベースライン
では観察できないベースラインの変化が起きている!!の変化が起きている20

いざ使用してみると・・・・カラム間の再現性が・・・

移動相の使用履歴の違いが原因

逆相ではそんなことなかったけど・・手順
acetonitrile : 20 mM ammonium acetate(pH6.8) =85:15
平衡化
プリン体分析
acetonitrile : 20 mM phosphate buffer (pH6.8) =85:15
平衡化acetonitrile : 20 mM ammonium acetate(pH6.8) =85:15
平衡化
プリン体分析

移動相の使用履歴の影響
移動相の使用履歴の影響
1212Column: SunShell Amide 2.6 mm : 150 x 4.6 mm,Mobile phase:acetonitrile : 20 mM ammonium acetate(pH6.8) =85:15
Flow rate: 0.8 mL/min Temperature: ambient
Detection: UV@250 nm
Sample:1. adenine, 2. hypoxanthine, 3. xanthine, 4. guanine

4リン酸緩衝液未使用
3430

1234567

リン酸緩衝液使用後8移動相の使用履歴によってはその影響が強く残り分離が変わることがあるまとめ コアシェルカラムは、特別圧力が低いわけではなく、近い性能を有する全多孔性シリカカラムと比較すると圧力は低い
 コアシェルカラムの保持は、同じ化学修飾をした全多孔性シリカカラムと比べ、保持時間は短くなるが保持指数は変わらない コアシェルカラムのサンプル負荷量は、全多孔性カラムと比較すると20%減少する
 コアシェルC18カラムも従来の全多孔性C18カラムと同様にメーカー間に保持や負荷量に差があり、その差は大きい。
 HILICモードで分析を行う場合、一般的な逆相モードより、サンプルの調整等、注意が必要な点が多い
 HILICモードで連続分析を行う場合、インジェクションによるベースラインの乱れを考慮する必要がある