博士論文

Ca2+/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼ活性化キナーゼの
特異的阻害剤の開発と阻害メカニズムに関する研究

2022 年 3 月
大塚 里美

岡山大学大学院
ヘルスシステム統合科学研究科

1

目次
1. 第１章 序論
1.1 細胞内カルシウム情報伝達機構

4

1.2 Calmodulin の構造と機能

4

1.3 Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素 (CaM kinase, CaMK)

5

1.4 CaM kinase kinase (CaMKK)の構造と生理的役割

5

1.5 CaMKK 経路の調節異常と疾患の関連11

1.6 タンパク質リン酸化酵素阻害剤

13

1.7 タンパク質リン酸化酵素阻害剤の結合様式による分類

14

1.8 CaMKK 阻害剤 STO-609

16

1.9 本研究の目的

18

2. 第２章2.1 要約20

2.2 緒言21

2.3 実験材料と方法

22

2.4 結果26

2.5 考察34

3. 第３章3.1 要約39

3.2 緒言40

3.3 実験材料と方法

42

3.4 結果46

3.5 考察55

4. 第４章4.1 要約59

4.2 緒言60

4.3 実験材料と方法

61

4.4 結果652

4.5 考察72

5. 総括と今後の展望

75

6. 謝辞

77

7. 発表論文

788. 参考文献793

1. 序論1.1 細胞内カルシウム情報伝達機構
我々真核生物の細胞内においては、カルシウムイオンをセカンドメッセンジャーとした多様な細胞内情報伝達機構によって、筋収縮から記憶・学習などの高次中枢神経機能、免疫応
答、細胞増殖に至る、非常に多くの生体機能が調節されている。細胞外のカルシウムイオン
濃度は数 mM と高濃度であるのに対し、定常状態の細胞内カルシウムイオン濃度は 100 nM
以下と 20,000 倍程度低く保たれている[1]。また、細胞内小器官である小胞体(ER)やミト
コンドリアにもカルシウムイオンが高濃度で貯蓄されており、細胞内カルシウムストアとしての役割を担っている[2]。定常状態の細胞は刺激に応じて細胞外および細胞内ストアからカルシウムチャンネルや IP3 受容体を介して細胞内にカルシウムイオンを流入させ、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を引き起こす。細胞内にはカルシウムイオンと特異的に結合する多くのカルシウム受容タンパク質が存在し、これらカルシウム受容タンパク質はカ
ルシウムイオンとの結合により構造変化を引き起こし、細胞内におけるカルシウム濃度上昇の変化を細胞内における生化学的、生物物理学的反応に繋げる[3]。Protein kinase C などのいくつかのタンパク質群はカルシウムイオンと結合することで直接機能が制御される一方、その他のカルシウム結合タンパク質は、分子間相互作用を介してカルシウム信号を細胞機能の変化に結び付ける仲介分子として機能する。

1.2 Calmodulin の構造と機能
Calmodulin (CaM)は 148 アミノ酸残基から成る分子量約 16.7 kDa のカルシウム結合タン
パク質であり、カルシウム濃度を感知して様々なタンパク質に情報を伝える仲介分子としての機能を担っている。CaM は Histone や Actin、Ubiquitin と同様、遺伝的に最も保存されたタンパク質の一つとして知られており、すべての真核生物において普遍的に発現している。特に脳におけるカルシウムシグナル伝達においては CaM による仲介反応が大きな役割を担っており、神経細胞における軸索および樹状突起の伸展制御やシナプス可塑性などに関与することが報告されている[4-6]。
CaM は N 末端側と C 末端側にそれぞれ２つずつ、合計４つの特異的カルシウム結合構造である EF-hand motif を持っており、１分子の CaM に対して４分子のカルシウムイオンが結合する。カルシウムイオンが結合していない状態の CaM (apo-CaM)は N 末端ドメインの２つの EF-hand のヘリックスが閉ざされている一方で、C 末端ドメインは部分的に疎水性部位が露出した”semiopen”の構造になっている。CaM にカルシウムイオンが結合すると4

ヘリックス間の角度が大幅に変化し、CaM の２つのドメインがより「開いた」コンホメー
ションが形成される。この構造変化によりメチオニンに富んだ疎水性領域が露出することで、標的タンパク質との相互作用における親和性を変化させる[7]。

1.3 Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素 (CaM kinase, CaMK)
タンパク質リン酸化酵素(プロテインキナーゼ)は真核生物における多くのシグナル伝達に関与しており、真核生物遺伝子の最大のファミリーの 1 つである[8]。タンパク質リン酸化
酵素は基質タンパク質のリン酸化を介して活性を変化させることで、代謝、転写、細胞周期の進行、アポトーシス、分化など、様々な細胞内プロセスを制御している[9]。多数の CaM
標的タンパク質のなかでも Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素 (CaM kinase,
CaMK)は最もその機能解明が進んでいる一連の酵素群の 1 つであり、CaM kinase 活性に関する最初の報告は脳のシナプトソーム膜におけるカルシウム依存的なリン酸化に CaM が必要であるという 1970 年代後半の発見にまで遡る[10]。CaMK は Ca2+/CaM 複合体の結合によってアロステリックに活性化され、基質タンパク質の特定の Ser/Thr 残基をリン酸化し、これにより基質分子の機能変化を引き起こすことで転写、細胞死、細胞骨格再構成、記憶や学習などの生体機能を調節する。CaMK は基質特異性の高い“dedicated CaM kinases”と幅広い基質分子をリン酸化できる“multifunctional CaM kinases”に分類され、それぞれ前者には myosin light chain kinase (MLCK)や eEF2 kinase (別名 CaM kinase III)、および後者にはCaM kinase I (CaMKI)、CaM kinase II (CaMKII)や CaM kinase IV (CaMKIV)などの異なる遺伝子にコードされるリン酸化酵素が含まれる[11]。中でも CaMKI および CaMKIV は
Ca2+/CaM 複合体の結合による調節のみならず、上流キナーゼ(CaM kinase kinase: CaMKK)による活性化ループのリン酸化により活性化され、これにより酵素触媒能力は 10～30 倍上昇する[12, 13]。CaMKI/IV の上流キナーゼである CaMKK 自身も Ca2+/CaM 複合体の結合によって活性化される Ca2+/CaM 依存性のタンパク質リン酸化酵素であり、CaMKK から
CaMKI/IV のリン酸化を介した一連のカルシウムシグナル伝達は CaMK カスケードと呼ばれている。

1.4 CaM kinase kinase (CaMKK)の構造と生理的役割
CaMKK は 1993 年にラット脳抽出液中に含まれる CaMKIV の活性化因子として、その存在が初めて報告された[14]。CaMKK には異なる遺伝子にコードされた CaMKKαとCaMKKβの二種類のアイソフォームが存在し、CaMKKα/βは N 末端領域の触媒領域
5

(CaMKKα: 126-434, CaMKKβ: 162-470)と、それに続く Ca2+/CaM 結合領域を含む調節領域 (CaMKKα: 438-463, CaMKKβ: 474-499)から構成されている。CaMKK の触媒領域
内には RP ドメインと呼ばれる Arg/Pro に富んだ特徴的な領域 (CaMKKα: 167-189,
CaMKKβ: 203-225)が存在しており、基質の認識に関与していると考えられている。
CaMKKαとβは触媒領域から調節領域に至るまで約 70%の相同性を示し、CaMKI および
CaMKIV をリン酸化依存的に活性化するという機能も重複している[15, 16]。一方、両アイ
ソフォームの活性調節機構や基質の選択性においては部分的に異なることが明らかとなっている。CaMKKα/βともに Ca2+/CaM 依存性の酵素であり、細胞内の Ca2+濃度が低いときには自身の自己阻害領域により酵素活性は不活性に保たれている[17]。細胞内の Ca2+濃度が上昇すると、Ca2+/CaM 複合体が調節領域に存在する CaM 結合領域に結合することで自己阻害を解除し、リン酸化酵素活性を発現する。一方、CaMKKβは触媒領域の N 末端付
近に N 末端調節領域と呼ばれる CaMKKαには存在しない領域を有しており(CaMKKβ:129-151)、この領域が自己阻害領域の触媒領域への相互作用を妨げることで、自発活性の発現を引き起こすことが報告されている。このため組み換え大腸菌によって発現・精製した
CaMKKβは Ca2+/CaM 複合体が結合していない条件下でも最大活性の 70-80%程度の自発活性を示す一方で、動物細胞においては N 末端調節領域の Ser/Thr 残基がリン酸化を受けることで Ca2+/CaM 依存性を示すことが報告されている[18, 19]。また、
CaMKKβは CaMKI
および CaMKIV のリン酸化依存的活性化に加えて、AMP 活性化キナーゼ (AMP-activatedprotein kinase, AMPK)のリン酸化依存的活性化能力を有することが報告されている[2022]。CaMKKα/βは全身に発現しているが、特に中枢神経系に豊富に存在する。中枢神経において、CaMKKαは脳全体の神経細胞に広く発現しており特に大脳皮質や顔面神経核に豊富に存在しているのに対し、CaMKKβの発現は比較的局所的であり、特に小脳顆粒層に豊富に存在している[23]。このような CaMKK の中枢神経系への局在と一致して、CaMKKは中枢神経機能への関与が多く報告されており、CaMKKα遺伝子欠損マウスではオスのみ
で文脈的恐怖記憶が損なわれており[24]、CaMKKβ遺伝子欠損マウスでは空間記憶が損な
われ、海馬 CA1 シナプスにおける後期の長期増強(LTP)も消失することが報告されている[25]。以下に CaMKK からのリン酸化によって活性化される主要な基質キナーゼの構造と活性化メカニズム、および生理的役割について個別に記述する。

6

Figure 1

CaMKK の構造と活性調節機構(A) rat CaMKKα の構造と活性調節機構を示した。数字はアミノ酸番号を示す。CaMKKα は触媒領域(catalytic domain,
アミノ酸 126-434)と、自己阻害領域 (autoinhibitory domain: AID)・CaM 結合領域 (CaM binding domain: CBD)を含
む調節領域(アミノ酸 438-463)から構成される。触媒領域中には CaMKK に特徴的な RP ドメイン (arginine/prolinerich domain, アミノ酸 167-189)が含まれる。CaMKKα は Ca2+/CaM 非結合時においては自己阻害領域が触媒領域に結合した不活性型の構造をとっており、CaM 結合領域に Ca2+/CaM 複合体が結合することで触媒領域が露出した活性型の構造に変化する。(B) rat CaMKKβ の構造と活性調節機構を示した。CaMKKβ は CaMKKα と同様に触媒領域(アミノ酸 162-470)と調節領域(アミノ酸 474-499)を含み、さらに CaMKKβ に固有の領域として N 末端調節領域(アミノ酸129-151)を持つ。CaMKKβ は N 末端調節領域が調節領域と触媒領域の結合を阻害することで自発活性を持ち、N 末端
調節領域がリン酸化されると CaMKKβ は自発活性を失い Ca2+ /CaM 依存型酵素に変換される。

7

CaM kinase I (CaMKI)
CaMKI は分子量約 42~53 kDa の単量体リン酸化酵素であり、哺乳類の CaMKI ファミリーは４つの異なる遺伝子にコードされた CaMKIα、β、γ、δ の 4 つのアイソフォームから構成されている[26-28]。CaMKI も他の CaM kinase と同様、N 末端側の触媒領域と C 末端
側の調節領域から構成されており、調節領域内に存在する CaM 結合部位への Ca2+/CaM 複合体の結合によって調節領域の自己阻害が解除される。さらに、CaMKI の活性化には
Ca2+/CaM 複合体の結合に加えて上流キナーゼ (CaMKKα/β)による活性化ループの Thr
残基のリン酸化が必要であり、このリン酸化によって CaMKI は最大活性を示す。CaMKKにより活性化された CaMKI は、ミオシン II 調節軽鎖(MRLC)の Ser19 のリン酸化を誘導
し、アクチンフィラメントの再編成を引き起こすことが報告されている[29]。また、海馬ニューロンにおいて、CaMKI はグアニンヌクレオチド交換因子(EGF) βPIX の Ser516 のリン酸化を介して、スパインとシナプスの活動依存性成熟を促進することが示されている[30]。

Figure 2

CaMKI の活性調節機構

CaMKI は触媒領域 (catalytic domain)と、自己阻害領域 (autoinhibitory domain: AID)・CaM 結合領域 (CaM binding
domain: CBD)を含む調節領域から構成される。CaMKI は Ca2+/CaM 非結合時においては自己阻害領域が触媒領域に結合した不活性型の構造をとっており、CaM 結合領域に Ca2+/CaM 複合体が結合することで触媒領域が露出する。さらに触媒領域中の活性化ループに含まれる Thr 残基が上流キナーゼ(CaMKK)によってリン酸化されることで、触媒領域がアロステリックに活性化され活性型酵素となる。

CaM kinase IV (CaMKIV)
CaMKIV は分子量約 65 kDa の Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素であり、単一の遺伝子にコードされた二つのアイソフォーム (CaMKIVα, CaMKIVβ)が存在する[31]。
CaMKIV は他の CaM kinase と同様に触媒領域と調節領域から構成されており、活性化には調節領域への Ca2+/CaM の結合が必要である。CaMKI と同様、CaMKIV の活性化には多段8階の過程が必要であり、まず Ca2+/CaM 複合体が CaM 結合領域へ結合することで触媒領域が露出し、その後 CaMKK から CaMKIV 活性化ループの Thr196 がリン酸化される。さらに、
CaMKI とは異なり CaMKIV は自身の Ser/Thr に富んだ N 末端領域を自己リン酸化し、この自己リン酸化によって CaMKIV は最大活性型に変換されるだけでなく、Ca2+/CaM に非依存的な酵素活性を示すようになる。CaMKIV は主に核に局在しており[32]、CREB(cAMP response element binding protein)、SRF (serum response factor)、HDAC4 (histone
deacetylase 4)などの転写因子を Ca2+依存的にリン酸化することで転写調節に関与する[3335]。なかでも CREB は最もよく研究の進んでいる CaMKIV の標的分子であり、CaMKIVによる CREB (Ser133)のリン酸化依存的な活性化に伴う遺伝子発現によって、長期記憶の形成に関与することが明らかとなっている[36, 37]。

Figure 3

CaMKIV の活性調節機構

CaMKIV は触媒領域 (catalytic domain)と、自己阻害領域 (autoinhibitory domain: AID)・CaM 結合領域(CaM binding
domain: CBD)を含む調節領域から構成される。CaMKIV は Ca2+/CaM 非結合時においては自己阻害領域が触媒領域に結合した不活性型の構造をとっており、CaM 結合領域に Ca2+/CaM 複合体が結合することで触媒領域が露出する。さらに触媒領域中の活性化ループに含まれる Thr 残基が上流キナーゼ(CaMKK)によってリン酸化されることで、触媒領域がアロステリックに活性化され活性型酵素となる。活性化された CaMKIV は、自身の N 末端領域をリン酸化し、Ca2+/CaM に依存しない活性(自発活性)を獲得する。

9

AMP-activated protein kinase (AMPK)
AMP-activated protein kinase (AMPK)は細胞内における AMP/ATP および ADP/ATP 比を感知する重要な代謝センサー分子であり、触媒サブユニット(α-subunit)と２つの調節サ
ブユニット(β-subunit, γ-subunit)から構成されるヘテロ三量体として存在している。
AMPK は細胞内エネルギー(ATP)レベルの低下、すなわち AMP レベルの増加によって活性化され、下流基質分子のリン酸化を介して ATP を生成する異化経路を活性化すると同時に、同化経路や ATP を消費するプロセスを不活性化することで、エネルギーの恒常性を維持する。AMPK の活性化には AMPKαサブユニットの活性化ループに位置する Thr172 のリン酸化が必要であり、AMP は AMPKγサブユニットに結合することで①上流キナーゼによる Thr172 リン酸化の促進、②脱リン酸化酵素による Thr172 脱リン酸化の阻害、③触媒活性のアロステリック活性化の３つのメカニズムを介して AMPK を活性化しており、これらは ATP の結合と競合している。最近、前者２つのメカニズムにおいては ADP によっても引き起こされることが報告されている[38]。αサブユニットの Thr172 をリン酸化し
AMPK を活性化する上流キナーゼとしては liver kinase B1 (LKB1)[39-41]と CaMKKβが報告されており[20-22]、LKB1 はほぼ全ての組織における AMPK の主な活性化キナーゼであるのに対し、CaMKKβは特に神経細胞や T 細胞における AMPK の活性化に関与することが報告されている[42, 43]。AMPK は真核生物のエネルギー代謝において重要な調節因子であることから、肥満およびⅡ型糖尿病治療における主要な標的分子である。例えば、II 型
糖尿病治療薬として広く用いられているメトホルミンは、AMPK の活性化を介して血糖降下作用を引き起こしていると考えられている[44-46]。さらに、AMPK を介した細胞内エネ
ルギーレベル調節の機能不全はがんとの関連も報告されている。最も一般的な肺がんである非小細胞肺がん(NSCLC)において、30-40%が AMPK の活性化キナーゼである LKB1 に変異を持つことが報告されており[47]、LKB1/AMPK 経路の不活性化が異常な細胞増殖を引き起すと考えられている[48]。また、肝細胞がん(HCC)では LKB1 発現量の低下、および活性化 AMPK の低下と予後不良との相関が報告されている[49, 50]。AMPK の不活性化に伴うこれら疾患とは対照的に、CaMKKβ/AMPK 経路の過剰な活性化もがん細胞増殖に関与することが報告されており、これらについては後述する。

10

Figure 4

AMPK の調節機構と生理的役割

AMPK は触媒サブユニット (α-subunit)と調節サブユニット (β, γ-subunit)から構成される三量体として存在する。
AMPK は α-subunit の活性化ループに位置する Thr172 が上流キナーゼ (CaMKKβ, LKB1)によってリン酸化されることで活性化状態になる。細胞内のエネルギーレベルが低下すると AMP が γ-subunit に結合し、触媒領域のアロステリ
ック活性化、Thr172 リン酸化促進および保護を介して AMPK が活性化される。活性化した AMPK は様々な基質分子のリン酸化を介して同化反応を抑制し、異化反応を促進することで細胞内のエネルギー恒常性を維持している。

1.5 CaMKK 経路の調節異常と疾患の関連
CaMKK は Ca2+/CaM シグナル伝達経路において上流に位置する重要なリン酸化酵素であり、CaMKI や CaMKIV、AMPK のリン酸化依存的な活性化を介して神経発生や遺伝子発現、エネルギー代謝といった多岐にわたる生理機能の調節に関与している。そのため、
CaMKK の調節異常、すなわちこれら下流リン酸化酵素を介した細胞内情報伝達異常は精神疾患やがんといった様々な疾患との関連が報告されている。ゲノムワイド解析により、
CaMKKβ遺伝子を含む染色体 12q24.31 の領域が、不安、双極性障害、統合失調症の病因に関与している感受性遺伝子座として特定されており、CaMKKβ遺伝子におけるエキソンの一塩基多型（rs3817190）は T85S 変異を引き起こし、自発活性調節に影響を与えることで不安神経症と双極性障害に関与することが明らかとなっている[51]。また、CaMKKβ遺伝子のイントロン 17 における一塩基多型(rs1063843)が、統合失調症患者において CaMKK
βの発現低下に関与することも報告されている[52]。CaMKKβ発現量の低下によって引き起こされる疾患とは対照的に、CaMKK の過剰な活性化も疾患の原因となることが明らかとなっており、
特に CaMKK の過剰な活性化とがん細胞増殖との関連が多く報告されている。
肝細胞がんにおいては CaMKKβの発現量と肝がん患者の生存率に負の相関があり、
11

CaMKKβ/CaMKIV の経路を介した mammalian target of rapamycin (mTOR)/ribosomal
protein S6 kinase, 70 kDa (S6K)の調節が肝がん細胞の増殖に関与することが示されている[53]。また、CaMKKβからのリン酸化によって活性化される AMPK は生体内における重要な代謝調節分子であることから、前立腺がんにおいてはアンドロゲン刺激に伴う CaMKK
βの発現上昇が CaMKKβ/AMPK リン酸化カスケードの異常活性化を引き起こし、がん細胞増殖を促進することが報告されている[54, 55]。さらに最近の研究で、発現上昇した
CaMKKβにより活性化された AMPK が、ULK1 (unc-51 like autophagy activating kinase 1)をリン酸化依存的に活性化し、mTOR に依存しないオートファジーを引き起こすことで、前立腺がん細胞の増殖に寄与していることが示された[56]。また、CaMKKβ/AMPK 経路
はアノイキス抵抗性への関与も報告されており、LKB1 が欠損した肺がん細胞において、細胞接着の喪失が glutamate dehydrogenase 1 (GDH1)の発現上昇を引き起こし、GDH1 によって産生されるα-ketoglutarate (α-KG)が CaMKKβと AMPK の結合を促進することによりアノイキス抵抗性を上昇させ、転移を促進することが示されている[57]。

12Figure 5

CaMKK を介した細胞内シグナル伝達

CaMKK は Ca2+/CaM 複合体の結合により活性化されると、CaMKI、CaMKIV、AMPK をリン酸化依存的に活性化する。活性化されたこれら基質キナーゼは、さらに下流の分子をリン酸化することでシグナルを伝達し、神経発生や遺伝
子発現、代謝調節といった多岐にわたる生理機能を調節する。

1.6 タンパク質リン酸化酵素阻害剤
前述の CaMKI や CaMKIV、AMPK などを含む多くのタンパク質はリン酸化による調節を受け、その機能を変化させることでシグナル伝達の調節因子として様々な生理機能を制御している。そのため、タンパク質リン酸化反応を触媒するタンパク質リン酸化酵素(キナーゼ)は細胞内の情報伝達において中心的な役割を担っている。細胞内におけるキナーゼの役
割を明らかにするための手法として、対象キナーゼの機能喪失型のアプローチがよく活用されており、ノックアウトやノックダウンのような遺伝子工学的手法や、阻害剤といった薬理学的手法が一般的に用いられている。特に、対象キナーゼの薬理学的な阻害は簡易的に、任意のタイミングで特定のキナーゼ活性を抑制できることから、キナーゼの生理機能解析においてキナーゼの選択的阻害剤は非常に有用なツールである。また、正常な細胞内においてタンパク質のリン酸化を介したシグナル伝達は厳密に調節されており、キナーゼの異常な活性化はシグナルバランスの崩壊を引き起こし、がんなどの重篤な疾患の原因となるため、キナーゼ阻害剤はキナーゼの異常活性化を原因とする疾患の治療薬としても応用されている。医薬品として利用されているキナーゼ阻害剤の最も有名な例として、慢性骨髄性白血病治療薬であるイマチニブ(商品名: グリベック)が挙げられる。慢性骨髄性白血病は９番と２２番染色体の相互転座によって生じるフィラデルフィア(Ph)遺伝子から産生される
Bcr-Abl 融合チロシンキナーゼが恒常的に活性を示すことで引き起こされる疾患であり、イマチニブは Abl キナーゼ活性を抑制することで異常な白血病細胞の増殖を抑制する[58]。
また、自己免疫疾患である関節リウマチの治療薬としてもキナーゼ阻害剤が用いられてお13

り、トファシチニブ(ゼルヤンツ)、バリシチニブ(オルミエント)などの様々なヤヌスキナー
ゼ(JAK)阻害剤が臨床応用されている。ヤヌスキナーゼは典型的なチロシンキナーゼであり、サイトカインが受容体に結合すると、受容体、および転写因子である STAT のリン酸化を介して免疫反応の制御に関与している[59]。JAK 阻害剤は JAK/STAT 経路の阻害を介してリウマチに対して薬効を示す。さらに、リウマチと同じく自己免疫疾患であるアトピー性皮膚炎においても JAK 阻害剤は薬効を示し、2020 年に JAK 阻害薬バリシチニブ(オルミエン
ト)がアトピー性皮膚炎の治療薬として追加承認された。加えて同年、デルゴシチニブ(コレクチム)もアトピー性皮膚炎の外用 JAK 阻害剤として承認されている。

1.7 タンパク質リン酸化酵素阻害剤の結合様式による分類
典型的なキナーゼの触媒領域は 1 本のαへリックス(αC）と 5 本のβストランド(β1-β5)から構成される N 末端ローブと、主に α へリックスから構成される C 末端ローブで形成されており、両ローブ間は 1 本のループ構造から成るヒンジ領域が繋いでいる。この２つのローブ間の溝が ATP 結合部位となっており、ほとんどのキナーゼ阻害剤は ATP 結合ポケットに結合する。また、C 末端ローブには「活性化ループ (A-loop)」と呼ばれる、リン酸化されることで大きく構造を変化し活性発現に重要な役割を果たすループが存在しており、活性化ループはキナーゼ間で保存された DFG モチーフ (Asp-Phe-Gly)から始まり、
APE モチーフ (Asp-Pro-Glu)までと定義されている。DFG モチーフのアスパラギン酸はマ
グネシウムイオンを介して ATP の結合に関与しており、リン酸化を受ける基質分子の水酸
基、DFG モチーフ、ATP の相対位置は全てのキナーゼで保存されている[60]。
キナーゼ阻害剤はその結合様式により Type-I から Type-V と共有結合型の合計 6 種類に分類される[61]。Type-I 阻害剤はキナーゼの ATP 結合ポケットに直接相互作用し、活性化ループがリン酸化されて”DFG-in”コンホメーションにあるキナーゼの活性化構造に結合する。
Type-I 阻害剤は古くから研究されており最も報告例の多いタイプの阻害剤であるが、ATP
結合ポケットは全てのキナーゼ間で高い類似性を持つことから、標的以外のキナーゼにも相互作用する可能性がある。しかし、ATP 結合ポケットの奥と外縁部についてはキナーゼ
間で差異があり、標的キナーゼに特徴的な構造をうまく利用することができれば、高い選択性を獲得することが可能である。Type-I 阻害剤の医薬品の例としては、上皮成長因子受容体(EGFR)のチロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブ(イレッサ)などが挙げられる[62,63]。Type-II 阻害剤は ATP 結合ポケットに加えて、キナーゼの自己阻害構造の１つである”DFG-out”構造に結合するタイプの阻害剤である。このコンホメーションでは DFG モチ
14

ーフのアスパラギン酸とフェニルアラニンが反転しており、フェニルアラニンによって占有されていた疎水性の空間が露出することで、ATP 結合部位に隣接した部位に新たな疎水性のポケットが出現する。この疎水性のポケットを形成するアミノ酸残基は ATP 結合ポケットと比較して多様性が高いことから、Type-II 阻害剤は Type-I 阻害剤と比較して標的キナーゼへの高い選択性が得られやすい。代表的な Type-II 阻害剤の例としては前述のAbelson tyrosine kinase (Abl)阻害剤であるイマチニブが挙げられ、慢性骨髄性白血病治療薬として使用されている[64]。Type-III 阻害剤は Type-II 阻害剤の DFG-out 領域のようなATP 結合ポケット近傍の領域にのみ結合するタイプの阻害剤である。Type-III 阻害剤の例
としては MAPK/ERK kinase 1 (MEK1)および 2 (MEK2)の阻害剤である CI-1040 が挙げられ、DFG-out 領域に結合することでキナーゼを不活性型の構造に固定する[65]。Type-IV 阻
害剤はアロステリック阻害剤であり、ATP 結合ポケットから離れたアロステリック部位に結合することでキナーゼを不活性構造に変化させる。Type-V 阻害剤は二基質性の阻害剤であり、例としては ATP 拮抗薬と共有結合したキナーゼ基質のペプチドアナログが挙げられる。このタイプの阻害剤は高い選択性が期待できる一方、分子量が大きくなるため溶解性、膜透過性などが課題となる。共有結合型の阻害剤は、キナーゼの活性部位に共有結合することでキナーゼ活性を不可逆に阻害する。ほとんどの共有結合型阻害剤はキナーゼ活性部位の求核性システインと結合する。共有結合型阻害剤の例としてはネラチニブ(HIK-272)が挙げられ、ネラチニブは EGFR キナーゼの ATP 結合部位に位置するシステイン残基に共有結合することで酵素活性を阻害する[66]。

15Figure 6

典型的なキナーゼの触媒領域の構造

Protein kinase A (PKA)の触媒領域の構造をリボンモデルで示した。キナーゼの触媒領域は N 末端ローブ(青)と C 末端
ローブ(黄)から構成されており、両ローブ間を１本のループ構造から成るヒンジ領域(緑)がつないでいる。N 末端ロー
ブと C 末端ローブ間の溝が ATP 結合部位になっている。C 末端ローブには活性化ループ (A-loop, 赤)と呼ばれる領域が存在し、この領域がリン酸化を受けることにより触媒領域がアロステリックに活性化される。(PDB: 4hpu より作図)

1.8 CaMKK 阻害剤 STO-609
私たちの研究グループは、
2002 年に CaMKK 阻害剤である STO-609 (7H-benzimidazo［2,1a］benz［de］-isoquinoline-7-one-3-carboxylic acid)を開発した[67]。STO-609 は ATP と競合的に CaMKK を阻害する ATP 拮抗薬であり(Type-I 阻害剤)、CaMKKαと比較して
CaMKKβに対し 5-10 倍高い選択性を示す (CaMKKα: Ki=80 ng/ml, CaMKKβ Ki=15
ng/ml)。このような STO-609 の CaMKK アイソフォームに対する選択性の違いは、CaMKKの触媒領域に存在する 1 アミノ酸残基（Leu233: rat CaMKKα, Val269: rat CaMKKβ）の違いによる立体障害の差によって生じていると推定されており、STO-609 の CaMKKβVal269Leu 変異体に対する阻害活性は、野生型と比較して約８倍低下する[68]。CaMKKβ/STO-609 複合体の X 線結晶構造解析によって、CaMKKβ Val270 (rat CaMKKβ Val269)と STO-609 間で水素結合を形成することが明らかとなっていることからも、この１アミノ酸残基のアイソフォーム間の違いが STO-609 の CaMKK アイソフォーム選択性に影響を与えることが強く示唆されている。
STO-609 は細胞膜透過性を持ち、生きた細胞内における CaMKK の阻害が可能であるため、現在までに世界中で STO-609 を用いた CaMKK シグナルの生理機能解明に関する研究が数多く報告されてきた。例えば、神経細胞を STO-609 で処理することによって神経突起の成長、および成長円錐の運動性が抑制されることが報告されており、この表現型の変化は
STO-609 抵抗性 CaMKK 変異体または恒常活性型 CaMKI の遺伝子導入により救済されることから、CaMKK/CaMKI 経路の神経発達における生理的役割が明らかとなった[69]。また最近の研究では、回腸平滑筋および膀胱平滑筋において、Ca2+誘発性の脱感作が STO-609
処理によって抑制されることが報告されており、平滑筋収縮の相性応答調節におけるCaMKK の寄与が示唆された[70]。さらに、前述の CaMKK の過剰な活性化を原因とする疾患においては、STO-609 による CaMKK の薬理学的阻害が病態を改善させることが示されており、がん細胞 (前立腺がん細胞: C4-2B, 肝がん細胞: PHM1)をマウスに移植したゼノ
グラフトモデルにおいて、STO-609 の投与が腫瘍の成長を抑制することが報告されている
16

[53] [54]。
このように STO-609 は、CaMKK を介したシグナル伝達の生理機能解明における簡便かつ有用なツールであり、加えて CaMKK の調節異常に起因する疾患治療薬への応用も期待される。一方、STO-609 は ATP 拮抗薬であることから、CaMKK 以外のキナーゼに対しても阻害活性を示す可能性がある。実際に STO-609 はカゼインキナーゼ 2 (CK2)や Pim3 キナーゼ(PIM3)などに対しても阻害効果を示すことが報告されており[71]、STO-609 の薬理学的な効果については十分な検討と評価が必要である。

Figure 7

CaMKKβ-STO-609 複合体の共結晶構造(A) CaMKKβ の構造をリボンモデルで示した。青は N 末端ローブ、黄色は C 末端ローブ、緑はヒンジ領域、赤は活性化ループを示す。STO-609 を球体モデルで示した。緑は炭素原子、青は窒素原子、赤は酸素原子を示す。STO-609
は N 末端ローブと C 末端ローブの間の ATP 結合部位に結合している。(PDB: 2zv2 より作図) (B) STO-609 とCaMKKβ の相互作用アミノ酸残基を示した。緑と水色は炭素原子、青は窒素原子、赤は酸素原子を示す。水分子は赤色の球体で示した。水素結合は点線で示した。CaMKKβ と STO-609 の相互作用のほとんどは疎水性相互作用である(L171, V179, A192, V249, F267, G273, P274, L319, A330)。さらに STO-609 は CaMKKβ の E236、V270、D330 と水素結合する。V270 は CaMKKα では Leu(L233)になっており、STO-609 の CaMKK アイソフォーム選択性に関与すると考えられている。(PDB: 2zv2 より作図)17

1.9 本研究の目的
CaMKKα/βは細胞内カルシウムシグナル経路において上流に位置する重要なリン酸化酵素であり、特に CaMKKβの調節異常と疾患との関連が多く報告されている。CaMKKβの調節異常がなぜ疾患の原因となるかを明らかにするためには、まず CaMKKβの正常な調節メカニズムの詳細を解明する必要がある。CaMKKαと CaMKKβ間で調節メカニズムや機能は一部重複している一方で、CaMKKβは N 末端調節領域とそれに伴う自発活性を持ち、この領域は CaMKKαには存在しない。CaMKKβは N 末端調節領域のリン酸化により
Ca2+/CaM 依存性酵素に変換されることが報告されているが、実際の細胞レベルの自発活性の調節メカニズムについては不明な点が多い。そこで、本研究では細胞レベルでの N 末端
調節領域のリン酸化調節機構の解明を目的として研究を行った。
また、CaMKK の生理機能解明において CaMKK の選択的阻害剤は非常に便利なツールであり、これまで CaMKK 阻害剤として STO-609 が広く用いられてきた。さらに、CaMKK
阻害剤は CaMKK の異常活性化を原因とする疾患の治療薬としても期待できる一方で、
STO-609 の酵素選択性などの問題も残されている。そこで、STO-609 に代わる新たな阻害剤の開発を目的として研究を行った。

18

2. 第 2 章

cAMP シグナル経路による
Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase βの調節

192.1 要約
Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素活性化キナーゼ (CaMKK)は CaM キナーゼ 1(CaMKI)、CaM キナーゼ 4 (CaMKIV)、5’-AMP 活性化タンパク質リン酸化酵素 (AMPK)
をリン酸化依存的に活性化することで、神経発生や遺伝子発現、代謝応答など多岐にわたる
生理応答に関与する重要なリン酸化酵素である。CaMKK は Ca2+/CaM 依存性のキナーゼであるが、CaMKK のアイソフォームである CaMKKβは Ca2+/CaM に依存しない酵素活性(自発活性)を持つ。最近、所属する研究グループは CaMKKβの下流基質分子である AMPK
が CaMKKβの Thr144 をフィードバックリン酸化し、CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性の酵素に変換することを明らかにした。しかし、細胞内および in vivo における CaMKKβ(Thr144)のリン酸化調節については明らかとなっていない。そこで本研究では細胞内における CaMKK (Thr144)リン酸化調節経路の探索を行い、cAMP を上昇させる刺激(イソプロ
テレノール、フォルスコリン)によって CaMKK (Thr144)のリン酸化が速やかに上昇することを見出した。このリン酸化は Protein kinase A (PKA)阻害剤である H-89 で細胞を処理することによりほぼ完全に消失したことから、cAMP/PKA シグナル経路によって CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が調節を受けていることが明らかとなった。さらに in vitro において、精製 PKA 触媒サブユニットは精製 CaMKKβの Thr144 をリン酸化した。この結果より、
PKA は CaMKKβを直接リン酸化することが確認できた。さらに、PKA からのリン酸化の有無による CaMKKβ酵素活性の Ca2+/CaM 依存性を検討した結果、CaMKKβは PKA からのリン酸化によって Ca2+/CaM 存在下における酵素活性(最大活性)は変化せずに、
Ca2+/CaM 非存在下における酵素活性(自発活性)のみが低下した。この結果より、PKA はCaMKKβ (Thr144)をリン酸化することにより、CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性の酵素に変換することが明らかとなった。CaMKKβ (Thr144)のリン酸化はマウス小脳抽出液を用いた免疫沈降によっても検出されたことから、CaMKKβ (Thr144)は生理的にリン酸化されており、in vivo においても CaMKKβの自発活性調節に関与している可能性が示唆された。以上の結果から、cAMP/PKA 経路による CaMKKβ の細胞内リン酸化調節の存在が明らかとなり、cAMP 経路が CaMKKβ の Ca2+制御を支えている可能性が示唆された。

20

2.2 緒言
Ca2+/CaM 依 存 性タンパ ク質リ ン酸化 酵素活性 化キナ ーゼ (CaMKK) は、 CaMKI とCaMKIV の活性化ループに位置する Thr 残基 (CaMKIα: The177, CaMKIV: Thr196)をリン酸化し活性化するキナーゼとして最初に発見された[72, 73]。CaMKK は Caenorhabditis

elegans や Aspergillus nidulans を含む下等真核生物においても発現しており[13, 15, 16, 74,75]、哺乳類における CaMKK は、CaMKKαと CaMKKβの二つのアイソフォームから構成されている。CaMKKβは CaMKI、CaMKIV に加えて、5’AMP 活性化キナーゼ(AMPK)
αサブユニットの Thr172 のリン酸化を介して AMPK を活性化し、脂肪肝やがん細胞の成長といった病態生理学的応答や代謝応答に関与することが報告されている[20-22, 42, 54,
57, 76, 77]。CaMKK は Ca2+/CaM 依存性のキナーゼであり、他の CaM キナーゼと同様に分子内の自己阻害機構によって酵素活性が調節され、調節領域への Ca2+/CaM 複合体の結合によって活性化される[17, 78]。さらに CaMKK は Ca2+/CaM 複合体による活性調節のみ
ならず、自己リン酸化[79]や複数のキナーゼによる分子間リン酸化によっても調節されており、例えば CaMKKαは cAMP 依存性タンパク質リン酸化酵素(PKA)からのリン酸化によって負に調節される[80-82]。また、厳密な Ca2+/CaM 依存性を示す CaMKKαとは異なり、
CaMKKβは触媒領域の N 末端付近に N 末端調節領域と呼ばれる CaMKKαには存在しない領域を有しており (CaMKKβ: 129-151)、この領域が自己阻害領域の触媒領域への相互作用を妨げることで、Ca2+/CaM 結合に依存しない活性(自発活性)の発現を引き起こすことが報告されている[83]。一方で、細胞内における CaMKKβを介したシグナル伝達経路の活性化には細胞内 Ca2+濃度の上昇が必要であり、最近の研究でサイクリン依存性タンパク質
キナーゼ 5 (CDK5)とグリコーゲン合成酵素キナーゼ 3 (GSK3)によるヒト CaMKKβの N
末端調節領域の Ser129、Ser133、Ser137 残基のリン酸化が、CaMKKβの自発活性を低下させることが明らかとなった[18]。さらに、同領域における Thr144 の AMPK によるフィードバックリン酸化も CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性の酵素に変換することが最近明らかになり[19]、N 末端調節領域におけるリン酸化調節が CaMKK シグナル経路の Ca2+依存的な活性化に必要不可欠であると考えられる。しかし、細胞内における CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が、どのようなシグナル経路によって調節されているのかは未だ明らかとなっていない。そこで、本研究では培養細胞内における CaMKKβ(Thr144)リン酸化調節経路の探索を行い、cAMP/PKA シグナル経路による CaMKKβ(Thr144)のリン酸化調節を明らかにした。cAMP/PKA 経路による CaMKKβのリン酸化は CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性酵素に変換したことから、in vivo においても cAMP/PKA シグナル経路が CaMKKβの自発活性21調節に関与しているのかもしれない。

2.3 実験材料と方法
実験材料
タンパク質
ラット CaMKKβ(野生型, T144A 変異体)は大腸菌(E. coli) BL21 Star (DE3)を用いて発現させ、グルタチオンセファロースと Q セファロースを用いて精製した。Calmodulin (CaM)
は大腸菌(E. coli) BL21 (DE3)を用いて発現させ、フェニルセファロースを用いて精製を行った後、透析により EGTA を除去した。GST-CaMKI 1-293 K49E は大腸菌(E. coli) JM109を用いて発現させ、グルタチオンセファロースにより精製を行った後、透析によりグルタチ
オンを除去した。His-AMPK は大腸菌(E. coli) BL21-CodonPlus (DE3)を用いて発現させ、Ni-セファロースによる精製を行ったあと、透析によりイミダゾールを除去した。ウシ心臓組織より精製された PKA 触媒サブユニットは渡邊 泰男教授(昭和薬科大学)から分与された標品を使用した。

抗体
抗リン酸化 CaMKI Thr177 抗体(clone 9H8)、抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体 (clone
A04)、抗 CaMKKβ抗体は以前作製されたものを用いた[19, 23, 84]。抗リン酸化 AMPK
Thr172 抗体(2535)は Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から購入したものを用いた。
HRP 融合抗マウス IgG 抗体、HRP 融合抗ラビット IgG 抗体は GE Healthcare Life Sciences
から購入したものを用いた。

その他
Compound C (Dorsomorphin)は東京化成工業株式会社(東京, 日本)から購入したものを用いた。フォルスコリンは和光純薬(大阪, 日本)から購入したものを用いた。H-89 は Cayman
Chemical (Michigan, USA)から購入したものを用いた。その他の試薬は一般的な市販品を
用いた。

22

PKA, AMPK による CaMKKβのリン酸化 (in vitro)
活性化 AMPK の調整
精製 His-AMPK (100 µg)と精製 CaMKKβ(10 µg)、50 mM HEPES-NaOH pH7.5、10 mM
Mg(Ac)2、1 mM DTT、2 mM CaCl2、6 µM CaM、1 mM ATP を含む反応液(1 ml)を作製し、30℃、1 時間の反応を行った。その後、Ni-セファロースクロマトグラフィーによって、
CaMKKβおよび ATP を除去した。

PKA および活性化 AMPK による CaMKKβのリン酸化
50 mM HEPES-NaOH(pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、2 mM EGTA、100 μM
ATP、酵素として精製 PKA 触媒サブユニットもしくは活性化 AMPK(3-330 ng)、リン酸化
基質として精製 CaMKKβ(1 µg)を含む反応液(20 µl)を、30℃の条件下でリン酸化反応を行った。反応の開始は ATP の添加により行った。反応の停止は等量の SDS-PAGE sample
buffer もしくは 20 倍量の dilution buffer (50 mM HEPES pH 7.5, 2 mg/ml bovine serum
albumin (BSA), 10% ethylene glycol, 2 mM EDTA)の添加により行い、その後ウエスタンブ
ロット法による解析、または CaMKKβ酵素活性測定を行った。

CaMKKβ酵素活性測定 (in vitro)
50 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、100 μM ATP、2 mM
CaCl2、6 µM CaM、酵素として CaMKKβ(2.5 ng)、リン酸化基質として GST-CaMKI 1293 K49E(10 µg)を含む反応液(20 µl)を 30℃で 5 分間リン酸化反応を行った。反応の開始は ATP の添加により行った。反応後、反応液(4 µl)をニトロセルロース膜(Bio-Rad
Laboratories, Inc. Hercules, CA)に滴下した。その後、5%スキムミルク (TTBS)で一時間ブ
ロッキングを行い、抗リン酸化 CaMKI (Thr177)抗体を用いてリン酸化された CaMKI を検出した。リン酸化シグナル強度の定量化は Quantity One® software (ver. 4.6.5, Bio-Rad
Laboratories, Inc.)を用いて行った。

LC-MS/MS による CaMKKβリン酸化部位の同定
上述のリン酸化反応の手順に従い、組み換え CaMKKβ(1 µg)を精製 PKA 触媒サブユニッ
ト(0.1 µg/20 µl)により 30℃で 10 分間リン酸化した。リン酸化反応溶液は SDS-PAGE によ23

り分離を行った後、CaMKKβのバンドを切り出してプロテアーゼによるゲル内消化を行い、LC-MS/MS 分析を行った (LCMS-IT-TOF)。

細胞培養と遺伝子導入
細胞培養
HeLa 細胞と COS-7 細胞は、10 %ウシ胎児血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)「ニッスイ」を用いて 37℃, 5 % CO2 条件下で培養した。

遺伝子導入と細胞の回収
HeLa 細胞を 2.0 x 105 cells/well になるように 6 well dish に播種し、一晩の培養後に 2 µg
CaMKKβ (pME-CaMKKβ)発現プラスミド、および 1 µg PKA 触媒サブユニット(pMEPKAc)発現プラスミド(PKA 共発現時)と 6 µg polyethylenimine “MAX”の複合体溶液を滴下することで遺伝子導入した。8 時間後に培地交換を行い、遺伝子導入から 44 時間後に細胞を回収した。

細胞の刺激
フォルスコリン、イソプロテレノールによる細胞刺激
CaMKKβを一過性発現させた HeLa 細胞を、フォルスコリン(終濃度 10 µM)またはイソプ
ロテレノール(終濃度 10 µM)を含む培地(DMEM)で培地交換を行い、細胞を刺激した。その後、培地を除去し PBS で洗浄後、100 µl の 1x SDS-Sample buffer を加えて細胞を回収した。その後超音波破砕を行った後に 100℃で 10 分間加熱し、14,000 rpm で 10 分間遠心分離を行った後、上清(10 µl)をウエスタンブロッティング法にて解析した。

H-89 による処理
HeLa 細胞に CaMKKβを上記の方法で一過性発現させ、フォルスコリンまたはイソプロテ
レノール刺激の 1 時間前に、H-89 (終濃度 50 µM)を含む培地で培地交換を行うことで H89 処理を行った。その後の細胞の刺激、回収、およびリン酸化 CaMKKβの検出は上述の手順に準じて行った。

24

抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体による免疫沈降
上述の PKA による CaMKKβのリン酸化の手順に準じて、精製 CaMKKβ (2 µg/ 40 µl)を精製 PKA 触媒サブユニット(0.1 µg/40 µl)によって 30℃、10 分間リン酸化反応を行った。
その後、IP buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH.7.5, 1 mM EDTA, 0.1 µM okadaicacid)で二種類の CaMKKβ濃度 (438 ng/ml, 219 ng/ml)に希釈した。また、マウス小脳(３個)を 3 ml の IP buffer に破砕し、15000 rpm で 15 分間遠心分離を行った後、上清を回収した。希釈した精製 CaMKKβもしくは小脳抽出液(1 ml)を 25 µl の protein G-sepharose (GEHealthcare)でプレクリア後、normal mouse IgG (1 µg)もしくは抗リン酸化 CaMKKβThr144 抗体(1 µg)を加え、4℃で 12 時間振盪した。その後、25 µl の protein G-sepharose
を反応溶液に加え、一晩振盪した。IP buffer によって５回洗浄した後、SDS-PAGE sample
buffer を加え、100 度で 10 分間加熱して溶出し、ウエスタンブロッティングを行った。

25

2.4 結果
cAMP/PKA シグナル経路によって CaMKKβ(Thr144)がリン酸化される
CaMKKβ(Thr144)は CaMKKβの下流基質分子である AMPK によってフィードバックリ
ン酸化されることで Ca2+/CaM 依存性を獲得することが先行研究により明らかとなっている[19]。そこで、細胞内において CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が如何なるシグナル経路によりリン酸化調節を受けているのかを明らかにするため、HeLa 細胞において様々な細胞刺激を行い、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体を用いたウエスタンブロッティングによるリン酸化解析を行った。今回、内因性の CaMKKβは発現量が少なく検出が困難であったた
め、ラット CaMKKβを一過性発現させた HeLa 細胞を用いてリン酸化解析を行った。その結果、βアドレナリン受容体のアゴニストであるイソプロテレノールで HeLa 細胞を刺激することにより、CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が速やかに上昇することを見出した。このリン酸化は刺激後 5 分を最大として減少していた(Fig. 1A)。イソプロテレノール刺激により上昇した CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が cAMP/PKA 経路を介しているのかを検証するため、HeLa 細胞を PKA 阻害剤である H-89 で処理し、イソプロテレノール刺激を行った。その結果、H-89 処理により、イソプロテレノール刺激依存的に上昇した CaMKKβ(Thr144)のリン酸化がほぼ完全に消失した(Fig. 1B)。さらに、アデニル酸シクラーゼ活性化剤であるフォルスコリンにより同様の細胞刺激実験を行った結果、フォルスコリンによっても CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が速やかに上昇し、このリン酸化は H-89 による PKA
阻害によって完全に抑制された(Fig. 1C, D)。これらの結果から、HeLa 細胞内において
CaMKKβ(Thr144)が cAMP/PKA 経路によりリン酸化されることが明らかとなった。

26

Figure 1

HeLa 細胞において、cAMP 経路は CaMKKβ (Thr144)のリン酸化を調節する(A)(C) CaMKKβ を一過性発現させた細胞を 10 µM イソプロテレノール(A)もしくは 10 µM フォルスコリン(C)で 160 分間刺激した。その後、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体(挿入図上)および抗 CaMKKβ 抗体(挿入図下)を用いたウエスタンブロッティングを行った。CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベルはイソプロテレノール刺激後 5 分(A)、もしくはフォルスコリン刺激後 60 分(C)を 100%としたパーセンテージで示した。実験は duplicate で行った。(B)(D)CaMKKβ を一過性発現させた HeLa 細胞を 50 µM H-89(+H-89)もしくは DMSO(-)で 1 時間処理し、その後 10 µM
イソプロテレノールで 5 分間(C)、もしくは 10 µM フォルスコリンで 60 分間(D)刺激を行った。その後、抗リン酸化
CaMKKβ(Thr144)抗体(挿入図上)および抗 CaMKKβ 抗体(挿入図下)を用いたウエスタンブロッティングを行った。
CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベルは H-89 未処理の刺激した細胞を 100%としたパーセンテージで算出した。(B)および(D)のグラフは triplicate の平均値と標準偏差を示した。統計的な有意差は H-89 未処理の細胞と比較し、*p<0.005、**p<0.001 で示した。

27

PKA は CaMKKβ(Thr144)を直接リン酸化する
次に CaMKKβ(Thr144)が PKA により直接リン酸化されることを確認するため、COS-7 細胞に CaMKKβと PKA 触媒サブユニットを共発現させ、抗リン酸化 CaMKK(Thr144)抗体を用いたウエスタンブロッティングによりリン酸化解析を行った。その結果、CaMKKβのみを一過性発現させた COS-7 細胞においては CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベルが非常に低かったのに対して、PKA を共発現させることで CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベル
は大きく上昇した(Fig. 2A)。さらに、精製 PKA 触媒サブユニットを用いて、試験管内において CaMKKβのリン酸化を行ない、CaMKKβ(Thr144)のリン酸化をウエスタンブロッテ
ィングによりリン酸化を検出した結果、反応時間に依存して CaMKKβ(Thr144)のリン酸化上昇が確認された(Fig. 2B)。以上の結果は、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体を用いた部位特異的リン酸化の検出であったため、次に LC-MS/MS を用いて PKA による CaMKK
βのリン酸化部位の網羅解析を行った。その結果、PKA により CaMKKβの Thr144 を含む
３アミノ酸残基(Thr144, Ser494, Ser510)がリン酸化されることが明らかとなり(Fig. 2C,
D)、
これらのリン酸化部位は AMPK による CaMKKβのリン酸化部位と一致していた[19]。
これらの結果より、CaMKKβ(Thr144)は PKA により直接リン酸化されることが示された。

28

Figure 2

COS-7 細胞および in vitro における PKA による CaMKKβ (Thr144)のリン酸化(A) mock(-)もしくは rat CaMKKβ、PKA 触媒サブユニット(PKAc)発現プラスミドを一過性発現させた COS-7 細胞の抽出液を、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体 (挿入図上)および抗 CaMKKβ 抗体 (挿入図下)によってウエスタンブ
ロッティングを行った。実験は triplicate で行った。(B) 精製 CaMKKβ (1 µg)を Mg-ATP 存在下で精製 PKAc (0.1µg)によって図に示した時間でリン酸化反応を行ったあと、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体 (挿入図上)および抗CaMKKβ 抗体(挿入図下)によるウエスタンブロッティングを行った (CaMKKβ 62.5 ng)。CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベルはリン酸化 60 分におけるリン酸化シグナル強度を 100%としたパーセンテージで示した。実験は duplicateで行った。(C) (D) 精製 PKAc によって 10 分間リン酸化した精製 CaMKKβ を SDS-PAGE で分離し、プロテアーゼを用いて消化した後、LC-MS / MS 分析を行った。 特定された rat CaMKKβ の PKAc によるリン酸化部位の模式図を示した(Thr144, Ser494, Ser510)。黒丸中の P はリン酸化を示す。N は N 末端調節領域 (アミノ酸残基 129-151)、RPは Arg-Pro リッチドメイン、Catalytic は触媒領域 (アミノ酸残基 162-470)、AID/CBD は Ca2+/CaM 結合領域を含む
自己抑制ドメイン (アミノ酸残基 474-499)を示す。Thr144(上図)、Ser494(中央図)、および Ser510(下図)のリン酸化
は、それぞれアミノ酸残基 142-148、494-503、508-522 を含むペプチドの単一荷電イオンの LC-MS / MS によって分析された。

AMPK を介した CaMKKβ Thr144 のリン酸化
以上の実験結果より(Fig. 1, 2)、cAMP/PKA 経路を介した CaMKKβ(Thr144)のリン酸化調節の存在が明らかとなり、このリン酸化部位(Thr144)は AMPK によるリン酸化部位としても報告されている[19]。CaMKKβを過剰発現させた HeLa 細胞において、内因性 AMPKは自発活性型 CaMKKβからのリン酸化によって恒常的に活性化されていると考えられることから、CaMKKβを一過性発現させた HeLa 細胞において、未刺激条件下での CaMKKβ(Thr144)のリン酸化に AMPK が関与しているのかを検討した。Fig. 1A で示した通り、
CaMKKβの Thr144 は未刺激状態でもわずかにリン酸化されている。CaMKKβを一過性発現させた HeLa 細胞を、AMPK の阻害剤である Compound C で処理し、CaMKKβ(Thr144)の未刺激状態でのリン酸化をウエスタンブロッティングにより検出した結果、Compound C 処理により CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が抑制された(Fig. 3A)。この結果
から、未刺激状態においても CaMKKβ(Thr144)は AMPK によってリン酸化されており、
AMPK によるリン酸化はイソプロテレノール刺激によって引き起こされる CaMKKβ(Thr144)のリン酸化上昇と比較して弱いことが示された (Fig. 1A)。次に、CaMKKβ(Thr144)に対する PKA と AMPK のリン酸化能力を比較するため、試験管内において、PKAまたは活性化 AMPK を用いて CaMKKβ(Thr144)のリン酸化を行った。その結果、PKA は
活性化 AMPK と比較して CaMKKβ(Thr144)のリン酸化能力が高いことが明らかとなり(Fig. 3B)、この結果は未刺激条件下とイソプロテレノール刺激条件下における CaMKKβ29

(Thr144)リン酸化の観察結果と一致していた(Fig. 1A, C と Fig. 3A)。

Figure 3

HeLa 細胞および in vitro における AMPK による CaMKKβ (Thr144)のリン酸化(A) Rat CaMKKβ 発現プラスミドを一過性発現させた HeLa 細胞を 10 µM の Compound C (+)もしくは DMSO (-)で20 分間処理した。その後、細胞抽出液を抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体(挿入図上)および抗 CaMKKβ 抗体(挿入図下)によってウエスタンブロッティングを行った。Compound C 処理を行っていない細胞のリン酸化
CaMKKβ(Thr144)の平均を 100%としたパーセンテージで算出し、triplicate の平均値と標準偏差を示した。統計的な有意差は Compound C 未処理の細胞と比較し、*p<0.05 で示した。(B) 精製 rat CaMKKβ (1 µg)を図に示した濃度の精製 PKAc (●)、もしくは活性化 AMPK(○)で Mg-ATP 存在下、30℃で 60 分間リン酸化反応を行った。その後、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、リン酸化 CaMKKβ(Thr144)の定量化を行った。CaMKKβ(Thr144)リン酸化レベルは 409 nM PKA 条件下のリン酸化レベルを 100%としてパーセンテージで示した。実験は duplicate で行った。

Thr144 のリン酸化は CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性酵素に変換する
自発活性型の CaMKKβは、AMPK により Thr144 がリン酸化されることで Ca2+/CaM 依
存性の酵素に変換されることが報告されている[19]。そのため、次に PKA による CaMKK
βのリン酸化が CaMKKβの酵素活性に及ぼす影響について検討した。まず、精製 PKA 触媒サブユニットによって CaMKKβをリン酸化し、その後 GST-CaMKI 1-293 K49E (kinasedead 変異体)をリン酸化基質として、EGTA 条件下における CaMKKβの酵素活性(自発活性)を測定した。その結果、PKA からのリン酸化反応時間に依存して CaMKKβの自発活性が低下しており、この低下の程度は Fig. 2B で示した PKA による CaMKKβ(Thr144)のリ
ン酸化上昇とほぼ一致していた(Fig. 4A)。さらに、PKA により CaMKKβが十分にリン酸30

化された反応時間(60 分)条件下において、Ca2+/CaM 存在下および EGTA 存在下におけるCaMKKβのリン酸化酵素活性を測定した。その結果、Ca2+/CaM 存在下における CaMKK
β活性(最大活性) は PKA からのリン酸化の有無によって変化せず、EGTA 条件下における CaMKKβ活性(自発活性)のみが PKA からのリン酸化によって減少した(Fig. 4B)。さらに、この PKA からのリン酸化による CaMKKβの自発活性の低下は、CaMKKβ Thr144Ala
変異体においては起こらなかった(Fig. 4C)ことから、PKA は AMPK と同様に、CaMKKβの Thr144 をリン酸化することで、CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性の酵素に変換するリン酸化機能調節が明らかとなった。

Figure 4

CaMKKβは PKA からのリン酸化によって Ca2+/CaM 依存型の酵素に変換される(A) 精製 CaMKKβを精製 PKAc 存在下(黒丸)もしくは非存在下(白丸)で、図に示した反応時間でリン酸化反応を行った。その後、GST-CaMKI 1-293 K49E を基質として CaMKKβ (2.5 ng)の自発活性を EGTA 条件下で測定した。CaMKKβ活性 (GST-CaMKI 1-293 K49E Thr177 のリン酸化)は、PKA によるリン酸化を行っていない CaMKKβ自発活性の平均値を 100%としたパーセンテージで示した。
実験は duplicate で行った。
(B) 精製 CaMKKβ を精製 PKA 存在下(+PKA)
もしくは非存在下(-PKA)で 60 分間リン酸化した。反応を停止させた後、 GST-CaMKI 1-293KE を基質として、
Ca2+/CaM 存在下 (最大活性, +, 白棒)もしくは非存在下(自発活性, -, 黒棒)における CaMKKβ の酵素活性を測定した。
CaMKKβ 活性は PKA 非存在下における CaMKKβ の最大活性の平均値を 100%としたパーセンテージで算出し、31

triplicate の平均値と標準偏差を図に示した。統計的な有意差は PKA 非存在下における CaMKKβ の最大活性と比較し、**P<0.001 で示した。有意差がない場合は n.s. (not significant)で示した。PKA 存在下、および非存在下においてリン酸化した CaMKKβ は、抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体によってウエスタンブロッティングを行った(挿入図) (C) 精製 CaMKKβ 野生型、もしくは Thr144Ala 変異体を精製 PKAc 存在下 (+, 黒棒)もしくは非存在下 (-, 白棒)で 60 分間
リン酸化し、反応を停止させた後、GST-CaMKI 1-293KE を基質として、Ca2+/CaM 非存在下における CaMKKβ の酵
素活性(自発活性)を測定した。CaMKKβ 活性は PKA によってリン酸化していない CaMKKβ の自発活性の平均値を100%としたパーセンテージで算出し、triplicate の平均値と標準偏差を図に示した。統計的な有意差は PKA 非存在下における CaMKKβ の自発活性と比較し、**p<0.001 で示した。有意差がない場合は n.s. (not significant)で示した。

CaMKKβ Thr144 は生理的にリン酸化されている
CaMKKβ(Thr144)が生理的な条件下においてもリン酸化されることを確認するために、
CaMKKβが豊富に発現しているマウス小脳を用いて、リン酸化 CaMKKβ(Thr144)の検出を試みた[23]。まず抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体を用いたマウス小脳抽出液のウエス
タンブロッティングを試みたが、リン酸化 CaMKKβ(Thr144)は検出できなかった。そこで、抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体による免疫沈降を行い、リン酸化 CaMKKβ(Thr144)の濃縮を行った。リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体の免疫沈降における特異性を確かめるため、精製 PKA 触媒サブユニットによってリン酸化した CaMKKβ、および未処理の CaMKKβを二種類の濃度 (438 ng/ml, 219 ng/ml)において、抗リン酸化 CaMKK
Thr144 抗体を用いた免疫沈降を行った。ウエスタンブロッティングの結果、PKA によってリン酸化された CaMKKβのみが、抗 CaMKKβ抗体と抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体の両方で検出された。この結果より、抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体は、リン酸化
CaMKKβ(Thr144)のみを選択的に濃縮、免疫沈降できることが確認できた。そこで、次にこの抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体を用いて、マウス小脳抽出液からの免疫沈降を行った。ウエスタンブロッティングの結果、抗 CaMKK 抗体と抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体の両方で CaMKKβのバンドが検出され、normal IgG では検出されなかったことから、
CaMKKβ(Thr144)のリン酸化は、マウスの小脳においても生理的に起こることが確認された。

32

Figure 5

マウス小脳における CaMKKβ (Thr144)のリン酸化(A) 抗リン酸化 CaMKKβ(Thr144)抗体によるリン酸化 CaMKKβ の免疫沈降。精製 rat CaMKKβ (2 µg)を精製
PKAc (100 ng)存在下(+)もしくは非存在下(-)で 60 分間リン酸化した。IP buffer で希釈したリン酸化サンプル(438 もしくは 219 ng/ml CaMKKβ)を 1 µg の抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体と混和した後、protein G sepharose と混和した。セファロースを洗浄した後、免疫沈降サンプル(IP)と input サンプル(input) (20 ng CaMKKβ: 左図, 10 ng
CaMKKβ: 右図)を抗リン酸化 CaMKKβ 抗体(上図)もしくは抗 CaMKKβ 抗体(下図)を用いたウエスタンブロッティ
ングを行った。(B) マウス小脳における CaMKKβ(Thr144)のリン酸化。マウス小脳の免疫沈降は 1 µg の抗リン酸化
CaMKKβ Thr144 抗体 (α-pThr144 Ab)または normal mouse IgG (Normal IgG)を用いて、実験材料と方法の項に示した方法で行った。免疫沈降されたサンプルは抗リン酸化 CaMKKβ Thr144 抗体(左図)または抗 CaMKK 抗体(右図)を用いたウエスタンブロッティングを行った。

33

2.5 考察CaMKK を介したリン酸化カスケードは、がん細胞増殖といった病態生理学的な経路や神経および代謝シグナル伝達など、多岐にわたる生理応答において重要な役割を担う[11, 85]。
CaMKK/CaMKI や CaMKK/CaMKIV といった CaMK カスケードは、上流酵素 (CaMKK)と下流酵素 (CaMKI, CaMKIV)の両方が Ca2+/CaM による活性調節を受けることにより、厳密に Ca2+シグナル伝達が制御されている[72]。CaMKKβは N 末端調節領域(アミノ酸残基 129-151)と呼ばれる CaMKKαには存在しない領域を有しており、この領域が Ca2+/CaM
非結合時における自己抑制を阻害することにより、Ca2+/CaM に依存しない活性(自発活性)を示す。最近の研究により、N 末端調節領域における複数のアミノ酸残基(ヒト CaMKKβ:Ser129, Ser133, Ser137)の CDK5 と GSK3 によるリン酸化や、Thr144 の AMPK によるリン酸化によって CaMKKβの自発活性が低下し、Ca2+/CaM 依存性の酵素に変換されることが明らかとなっている[18, 19]。しかし、細胞内および in vivo における CaMKKβ(Thr144)のリン酸化調節については明らかとなっていない。
本研究においては、動物細胞をイソプロテレノール、もしくはフォルスコリンで刺激することにより、cAMP/PKA シグナル経路を活性化させることで、CaMKKβ(Thr144)のリン酸化が顕著に誘引されることを明らかにした。このリン酸化は PKA 触媒サブユニットの共発
現によっても上昇した。また、未刺激状態における CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベルは非常に低く、AMPK 阻害剤 (compound C)処理によってほぼ完全に消失したことから、未刺激の細胞内においては AMPK が CaMKKβ(Thr144)のリン酸化に関与していると考えられる。また、Fig. 1A において、イソプロテレノール刺激によって上昇した CaMKKβ(Thr144)のリン酸化レベルは、5 分を最大として以降は徐々に減少しており、この結果は
CaMKKβ(Thr144)が脱リン酸化によって動的に調節されていることを示唆している。さらに、in vitro においても CaMKKβ(Thr144)は PKA によってリン酸化され、CaMKKβの最大活性は変化せずに自発活性のみが低下した。したがって、PKA は CaMKKβ(Thr144)を
直接リン酸化することで、CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性酵素に変換することが明らかとなった。この結果は、CaMKKβ(Thr144)のリン酸化模倣型変異体(Thr144Glu 変異体)が完全に Ca2+/CaM に依存的な活性を示すという以前の研究結果と一致している[19]。一方、これらの結果とは対照的に、Psenakova らは PKA によるリン酸化がヒト CaMKKβ(93-517)
活性を低下させることを報告しており、非リン酸化ヒト CaMKKβ(93-517)と比較して
CaMK1D (kinase dead 変異体)を基質とした場合には約 50%、AMPKα2 (kinase dead 変異体)を基質とした場合には約 30%、酵素活性を抑制することが報告されている[86]。このよ34

うな結果の不一致は、本研究における PKA による CaMKKβのリン酸化時間(30℃で 60 分)
が Psenakova らの行ったリン酸化時間(30℃で 3 時間、その後 4℃で一晩)と比較して短い、
もしくは CaMKKβ変異体(93-517)は野生型 CaMKKβと比較して PKA によるリン酸化の感受性が高い可能性があるなどの理由によるものと考えられる。興味深いことに、CaMKKβ(Thr144)と相同なアミノ酸残基である CaMKKα(Thr108)も PKA によってリン酸化されることが報告されており、この CaMKKα(Thr108)のリン酸化は CaMKKβ(Thr144)のリン酸化とは対照的に、CaMKKαの Ca2+/CaM に依存した酵素活性(最大活性)を低下させる[80, 81]。さらに、PKA によってリン酸化された CaMKKα(Thr108)は 14-3-3 タンパク質との結合により酵素活性が抑制される[82]一方、リン酸化 CaMKKβ(Thr144)は 14-3-3γの結合によって酵素活性が抑制されないことが報告されている[86]。したがって、細胞内における CaMKKα/βアイソフォームは、cAMP/PKA シグナル経路により異なる調節を受けていることが予想される。また、PKA による CaMKKβのリン酸化部位を LC-MS/MS によって同定した結果、Thr144 に加えて Ser494 と Ser510 が検出された(Fig. 2C, D)。ヒトCaMKKβ(Ser100)は PKA によってリン酸化されることが報告されているが[86]、ラット
CaMKKβ(Ser99)の PKA によるリン酸化は検出されなかった。これらの種間では、リン酸化されるアミノ酸部位を 0 とした-3 位に位置するアミノ酸残基が異なっており (ラット:
GKMS99LQ, ヒト: RKLS100LQ)、この P-3 位のアミノ酸残基が PKA による基質認識に重要であるため[87]、ラット CaMKKβ(Ser99)は PKA によってリン酸化されなかったと考えられる。また、先行研究により CaMKKβ(Ser494)は AMPK によってもリン酸化されることが明らかとなっており、Ser494Ala 変異体は野生型と同様に AMPK からのリン酸化によって自発活性が低下することから、AMPK からのリン酸化による CaMKKβ自発活性の調節には関与しないことが示されている[19]。一方で、CaMKKβ(Ser494)と相同な CaMKKα(Ser458)も PKA によってリン酸化されることが報告されており、このリン酸化アミノ酸残基は Ca2+/CaM 結合領域内に位置しているため、リン酸化 CaMKKα(Ser458)は Ca2+/CaMの結合能力が減少することが示されている[80]。CaMKKβ(Ser494)も同様に Ca2+/CaM 結
合部位に位置しているが、PKA による CaMKKβ(Ser494)のリン酸化は CaMKKβのCa2+/CaM 依存的な活性に影響を与えなかった(Fig. 4B)。本研究では 6 µM の CaM 条件下
において CaMKKβの酵素活性を測定しており、この CaM 濃度は脳、精巣、肺、副腎、前立腺など様々な哺乳動物組織の可溶性画分における濃度に相当する[88]。一方、以前の研究では約 30 nM のビオチン化 CaM を用いた CaM オーバーレイ法によって CaMKKαのCa2+/CaM 結合能力を検討しており、本研究の CaMKKβ酵素活性測定における CaM 濃度35

(6 µM)と比較して非常に低濃度である。そのため、 CaMKKβ(Ser494)のリン酸化もCa2+/CaM 結合能力を低下させる可能性はあるが、高濃度の CaM 条件下においては顕著な影響を与えないのかもしれない。また、Death -associated Protein Kinase (DAPK)を介した
ヒト CaMKKβの Ser511 (ラット CaMKKβ: Ser510)のリン酸化は、Ca2+/CaM によって活性化された CaMKKβの自己リン酸化を約 40%阻害することが報告されている[89]。しかし、本研究においては PKA からのリン酸化による CaMKKβの Ca2+/CaM 条件下における酵素活性に有意な変化はなかった(Fig. 4B)。したがって、Ser510 のリン酸化は CaMKKβの自己リン酸化にのみ影響を及ぼし、他の基質分子へのリン酸化には影響を与えないのかもしれない。これらの結果より、PKA による CaMKKβ Ser494 と Ser510 のリン酸化は、
CaMKKβの自発活性低下に関与していないと考えられる。

以上の結果をまとめると、PKA による CaMKKβ(Thr144)のリン酸化は、AMPK によるリン酸化と同様に CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性の酵素に変換することが明らかとなった。
この CaMKKβ(Thr144)のリン酸化はマウス小脳抽出液からの免疫沈降によっても検出されたことから、生理的条件下においてもリン酸化されていることが確認された。この結果より、他のキナーゼによるリン酸化の可能性は否定できないが、AMPK や PKA が脳内における CaMKKβ(Thr144)のリン酸化に関与している可能性が示唆された。本研究の結果は、HeLa 細胞や小脳において、cAMP/PKA シグナル経路が Thr144 のリン酸化を介して
CaMKKβの自発活性調節に関与している可能性を示している。しかし、 in vivo におけるCaMKKβ(Thr144)のリン酸化キナーゼの特定にはさらなる研究が必要である。さらに、本研究と以前の研究の結果をまとめると、CaMKKβ N 末端調節領域 (アミノ酸残基 129151)の複数のキナーゼ (CDK5/GSK3[18], AMPK[19], PKA)によるリン酸化は CaMKKβを Ca2+/CaM 依存性酵素に変換し、このリン酸化調節が細胞内 Ca2+濃度上昇によって引き起こされる CaMKKβを介したシグナル伝達カスケードの調節に必要なのかもしれない(Fig. 6)。

36

Figure 6

CaMKKβ の Ca2+/CaM 経路と cAMP/PKA 経路によるクロストーク調節

CaM の分子構造はタンパク質データバンク(PDB)から入手した(1PU5)。GPCR は G タンパク質共役受容体を示す。
α/β/γ は G タンパク質共役受容体 α/β/γ サブユニットを示す。CaMKI は Ca2+/CaM-dependent protein kinase Iを示す。CaMKIV は Ca2+/CaM-dependent protein kinase IV を示す。AMPK は 5’AMP-activated protein kinase を示す。CREB は cAMP response element binding protein を示す。ACC は acetyl-CoA carboxylase を示す。T は Thr 残基を示す。黒丸中の P はリン酸化を示す。

37

3. 第 3 章

STO-609 をリード化合物とした
新規 Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase 阻害剤
TIM-063 の開発

38

3.1 要約
Ca2+/Calmodulin (CaM)依存性タンパク質リン酸化酵素活性化キナーゼ (CaMKK)は、細胞内カルシウムシグナル伝達経路において上流に位置する調節リン酸化酵素である。CaMKK
は Ca2+/CaM 複合体によって活性化される下流の基質分子である Ca2+/CaM 依存性タンパ
ク質リン酸化酵素 I (CaMKI)、CaMKIV や 5’AMP 依存性タンパク質リン酸化酵素(AMPK)
をリン酸化依存的に活性化し、神経発生や遺伝子発現、代謝調節といった様々な生理機能を制御する。また前立腺がんや肝がんなど、ある種のがん細胞においては CaMKKβ の過剰発現とがん細胞の増殖などの病態との関連も報告されている。そのため CaMKK の選択的阻害剤の開発は、CaMKK を介したシグナル伝達経路の生理機能解明への貢献のみならず、
これら疾患の治療薬としての応用も期待される。本研究では、現在まで CaMKK 阻害剤として広く用いられてきた STO-609 をリード化合物として、新規 pan-CaMKK 阻害剤 TIM063 (2-hydroxy-3-nitro-7H-benzo[de]benzo[4,5]imidazo[2,1-a]isoquinolin-7-one) と、不活性類似体 TIM-062 の開発を行った。In vitro において、CaMKKβに対し 5-10 倍高い阻害活性を示す STO-609 とは異なり、TIM-063 は CaMKKαと CaMKKβに対して同等の阻害活性を示した (CaMKKα: IC50=0.63 µM, CaMKKβ: IC50=0.96 µM)。興味深いことに、
TIM-063 と比較してニトロ基を欠いた TIM-062 および水酸基を欠いた TIM-064 は、TIM063 と非常に類似した構造を持つにも関わらず CaMKKαと CaMKKβに対して阻害活性を示さず、ニトロ基と水酸基の両方が CaMKK の阻害に必要であった。また、反応速度論解析
より、TIM-063 は STO-609 と同様に ATP 拮抗薬であることが明らかとなった。さらに、TIM-063 は HeLa 細胞においてイオノマイシン刺激によって誘発された CaMKK 基質分子
(CaMKI, CaMKIV, AMPK)のリン酸化を阻害剤濃度依存的に低下させた(IC50~0.3 µM)。
CaMKK を一過性発現させた COS-7 細胞においても同様にイオノマイシン刺激による
CaMKIV のリン酸化を阻害したことから、TIM-063 は細胞膜透過性を持ち、細胞内 CaMKKを阻害できることが確認された。一方で、不活性類似体である TIM-062 は細胞内においても CaMKK に対し阻害活性を示さなかった。これらの結果から、新規 CaMKK 阻害剤 TIM063 と不活性類似体 TIM-062 は CaMKK シグナル伝達機構の生理機能解明のために有用であり、STO-609 をリード化合物とする新たな CaMKK 阻害薬創製の可能性が示唆された。

39

3.2 緒言
Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素活性化キナーゼ(CaMKK)は Ca2+/CaM 依存性のタンパク質リン酸化酵素であり、他の CaMK と同様に分子内の自己阻害機構によって酵素活性が調節され、調節領域への Ca2+/CaM 複合体の結合により活性化される[17, 90]。また、
2 章において cAMP/PKA シグナル経路からの CaMKKβ(Thr144)のリン酸化によって
CaMKKβの自発活性が調節されることを明らかにした。CaMKK は CaMKI と CaMKIV の活性化ループに位置する Thr 残基(CaMKIα: The177, CaMKIV: Thr196)をリン酸化し活性化するキナーゼとして最初に発見され[11, 72, 91, 92]、その後 NG108 細胞、HEK293 細胞、
LNCaP 細胞、OVCAR-3 細胞など、様々な細胞株において PKA/Akt をリン酸化し活性化
することも報告されている[93-96]。さらに、CaMKKβは 5’AMP 活性化キナーゼ(AMPK)
触媒サブユニット(α subunit)の活性化ループにおける Thr 残基(Thr172)をリン酸化し活性化することで、細胞のエネルギー代謝調節において重要な役割を担うことも報告された[20-22]。CaMKK は上述の基質キナーゼのリン酸化を介して、神経活動[4, 6, 24, 25, 30, 36,
69, 97, 98]や代謝応答[42, 85, 99]だけでなく、がん細胞の成長[53, 96]や増殖[100]といった病理応答においても重要な役割を担っている。CaMKK への Ca2+/CaM の結合、および他のシグナル経路からのリン酸化を介した活性調節は正常な細胞内において厳密に制御されており、このバランスが崩壊することは疾患の原因となりうる。特に CaMKKβ/AMPK 経路の活性化は、代謝調節に関連する肝疾患[77]だけでなく、前立腺がん[54]や肺がん[57]のようながん細胞増殖にも関与することが報告されている。そのため、CaMKKβはこれら疾患の有望な分子標的となる可能性がある。
所属する研究室では、２００２年に最初の CaMKK 阻害剤 STO-609 (7H-benzimidazo[2,1a]benz[de]isoquinoline-7-one-3-carboxylic acid) が 開 発 さ れ [67] 、 CaMKK/CaMKI 、CaMKK/CaMKIV、CaMKK/AMPK や CaMKK/PKB(Akt)経路を介した様々な Ca2+依存的生理応答における CaMKK 活性の関与を実証するために広く用いられてきた[4, 20-22, 36,
69, 101-105]。In vivo における STO-609 の投与は前立腺がん[54]、肝がん[53]、非アルコ
ール性脂肪肝[77]における病態を改善させることが報告されており、最近、免疫応答性マウ
スにおいて乳腺腫瘍の成長を抑制することも示された[106]。さらに、以前の研究から STO609 による CaMKK2(β)の阻害は満腹感の制御に関与することが報告されており[42]、この効果は最近開発された経口投与可能な CaMKK 阻害剤 Compound 4t においても確認された[107]。STO-609 は他のキナーゼ阻害剤と同様に細胞膜透過性を持ち、CaMKK 触媒領域の ATP 結合部位に ATP と競合的に結合することで CaMKK を阻害する ATP 拮抗薬であ40

る[67]。しかし、全てのキナーゼは ATP を基質として利用しているため、ATP 結合部位付近の構造は全てのキナーゼ間で非常に類似している。そのため、ATP 結合部位を標的とした STO-609 は、ATP 結合部位の構造類似性を有する多くのタンパク質リン酸化酵素に対しても阻害効果を示す可能性がある。実際に、STO-609 はカゼインキナーゼ 2 (CK2)や
AMPK、MAPK 相互作用キナーゼ 1 などのキナーゼに対しても、CaMKKβと比較して 10倍程度低いが阻害活性を示すことが報告されている[71]。このように、STO-609 は CaMKKに対して完全に選択的ではないが、CaMKK の STO-609 耐性変異体が開発されているため、細胞内 CaMKK の生理機能の評価において STO-609 は依然として有用である[68, 69, 108]。
しかし、STO-609 は CaMKKβに対し CaMKKαよりも高い阻害活性を示すため[67, 68,71]、CaMKKαに特異的な生理機能の解明に用いることは困難である。そのため、CaMKK
アイソフォームの生理学的な役割を調べるためには、STO-609 とは異なる CaMKK 阻害剤を開発する必要がある。現在まで STO-609 の改良を目的とした STO-609 誘導体の構造活性相関は行われていなかったため、本研究では様々な STO-609 誘導体を合成し、CaMKK阻害剤としての有用性の検討を行った。その結果、 in vitro および培養細胞内において、
CaMKKα/βの両アイソフォームに対して同等の阻害活性を示す新規 CaMKK 阻害剤 TIM063 と、その不活性類似体として TIM-062 を見出した。

41

3.3 実験材料と方法
実験材料
タンパク質
CaMKKαおよび CaMKKβは大腸菌(E. coli) BL21 Star (DE3)を用いて発現し、グルタチオ
ンセファロースと Q セファロースを用いて精製した。Calmodulin (CaM)は大腸菌(E. coli)
BL21(DE3)を用いて発現し、フェニルセファロースを用いて精製を行ったあと、透析を行った。GST-CaMKI 1-293 K49E、GST-CaMKKα 126-434、GST-CaMKKβ 162-470 は大腸菌(E. coli) JM109 (GST-CaMKI 1-293 K49E)もしくは BL21 Star (DE3) (GST-CaMKKα126-434, GST-CaMKKβ 162-470)を用いて発現させ、グルタチオンセファロースによって精製を行った後、透析を行った。GST-CaMKI と GST-CaMKIV は大腸菌(E. coli) JM109 を用いて発現し、グルタチオンセファロースと CaM セファロースを用いて精製を行った。精製した GST-CaMKI および GST-CaMKIV にプレシジョンプロテアーゼ(10 unit, Amersham
Biosciences)を加え、5℃で 12 時間反応させた。その後、切断された GST をグルタチオン
セファロースにより除去することで CaMKI および CaMKIV を作製した。ウシ心臓組織より精製した PKA 触媒サブユニットは渡邊 泰男教授(昭和薬科大学)から分与された標品を使用した。CaMKII はラット前脳から精製した標品を使用した[67]。

抗体
抗リン酸化 AMPK (pThr172)抗体(2535)および抗 AMPK 抗体(2532)は Cell Signaling
Technology (Danvers, MA)から購入したものを用いた。抗リン酸化 CaMKI (pThr177)抗体(clone 9H8)および抗リン酸化 CaMKIV (pThr196)抗体(clone 8D4)は以前に作製されたものを用いた[84]。抗 HA 抗体(12CA5)は Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN)から購入したものを用いた。HRP 融合抗マウス IgG 抗体、HRP 融合抗ラビット IgG 抗体は GE
Healthcare Life Sciences から購入したものを用いた。

その他
STO-609 誘導体は岡山大学 大学院教育学研究科 石川彰彦研究室で合成した化合物を使用した。STO-609 は Tocris Bioscience (Ellsville, MO)から購入したものを用いた。
その他の試薬は一般的な市販品を用いた。

42

活性化 CaMKI および CaMKIV の作製
精製 CaMKI もしくは CaMKIV (100 µg/ml)と精製 CaMKKα(3 µg/ml)をリン酸化反応液(50 mM HEPES-NaOH pH7.5, 10 mM Mg(Ac)2, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 10 µM CaM, 200µM ATP)中で 1 時間反応させ、CaMK のリン酸化を行った。反応の開始は ATP の添加によって行い、反応の停止は 20 倍量の冷やした停止液 (50 mM HEPES-NaOH pH7.5, 2
mg/ml BSA, 10% エチレングリコール, 2 mM EDTA)の添加によって行った。

酵素阻害活性測定(in vitro)
CaMKKαおよび CaMKKβ50 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、100 μM [γ-32P]ATP、
2 mM CaCl2、6 µM CaM、酵素として CaMKKα(3 ng)もしくは CaMKKβ(30 ng)、基質として GST-CaMKI 1-293 K49E (12.5 µg)を含む反応液(25 µl)を 30℃で 10 分間反応させ、リン酸化を行った。反応の開始は[γ-32P]ATP の添加によって行った。反応後、反応液 20 µl
を P81 phosphocellulose paper (Whatman)に滴下し、75 mM リン酸緩衝液で洗浄を行った(10 min×6 回)。リン酸化基質 (GST-CaMKI 1-293KE)への 32P 取り込み量の検出は液体シ
ンチレーションカウンターを用いて行った。阻害剤は反応溶液の 5 vol % (1.25 µl)になるよ
うに加え、DMSO(溶媒)のみを加えたサンプルを陰性対照とした。

CaMKKαおよび CaMKKβの自己リン酸化
50 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、100 μM [γ-32P]ATP、
2 mM CaCl2 および 6 µM CaM (CaMKKα用反応液)もしくは 2 mM EGTA (CaMKKβ用反応液)、酵素として CaMKKαもしくは CaMKKβ (1 µg)を含む反応液(20 µl)を 30℃で 120
分間混和し、リン酸化反応を行った。反応の開始は[γ-32P]ATP の添加によって行った。酵
素反応後、4x SDS-PAGE Sample buffer を 5 µl 加えて反応を停止させ、SDS-PAGE を行っ
たあと、X 線フィルムを用いて CaMKK の自己リン酸化を検出した。検出した自己リン酸化の定量化は ImageJ を用いて行った。阻害剤は反応溶液の 5 vol % (1 µl)になるように加え、DMSO(溶媒)のみを加えたサンプルを陰性対照とした。

43

その他リン酸化酵素
50 mM HEPES-NaOH pH 7.5、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、100 μM [γ-32P]ATP、酵
素、40 µM のリン酸化基質ペプチドを含む反応液(25 µl)を 30℃で 10 分間反応させ、リン酸化を行った。反応の開始は[γ-32P]ATP の添加によって行った。反応後、反応液 20 µl を
P81 phosphocellulose paper (Whatman)に滴下し、75 mM リン酸緩衝液で洗浄を行った(10min×6 回)。基質ペプチドへの 32P 取り込み量の検出は液体シンチレーションカウンターを用いて行った。阻害剤は反応溶液の 5 vol % (1.25 µl)になるように加え、DMSO(溶媒)のみを加えたサンプルを陰性対照とした。使用した酵素と基質ペプチドを以下の表に示す。

Table 1

使用した酵素と基質ペプチド
Protein kinase

Substrate

Activated CaMKI (2 ng)

Syntide-2

CaMKII (10 ng)

Syntide-2

Activated CaMKIV (6.3 ng)

Syntide-2

PKA (125 ng)

Kemptamide

酵素阻害活性測定(in cells)
細胞の培養
HeLa 細胞と COS-7 細胞は、10 %ウシ胎児血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)「ニッスイ」を用いて 37℃, 5 % CO2 条件下で培養を行った。

阻害剤の細胞内 CaMKK 阻害活性測定
内在性 CaMKK 阻害活性測定(CaMKI, CaMKIV 一過性発現細胞)
HeLa 細胞を 1.5 x 105 cells/well になるように 6 well dish に播種し、24 時間後に 1 µg HAラット CaMKIα (pME-HA-CaMKIα)もしくは 0.25 µg HA-ラット CaMKIV (pME-HACaMKIV)発現プラスミドと 6 µg polyethylenimine “MAX”の複合体溶液を滴下して、遺伝子導入を行った。8 時間後に培地交換を行い、プラスミドの添加から 42 時間後に阻害剤もし
くは DMSO を含む無血清培地(0.5 % DMSO)で培地交換を行った。6 時間後、1 µM イオ
ノマイシンと阻害剤、もしくは DMSO を含む無血清培地(0.6 % DMSO)で培地交換を行い、細胞のイオノマイシン刺激を行った。5 分間のイオノマイシン刺激の後、培地を捨て、10044

µl の SDS-PAGE sample buffer を加えて細胞を回収した。回収したサンプルを 100℃で 10分間加熱した後、超音波破砕を行った。その後 14000 rpm で 10 分間遠心分離を行い、上清を回収した。その後、上清に含まれるリン酸化 CaMKI およびリン酸化 CaMKIV を抗リン酸化 CaMKI 抗体(pThr177)もしくは抗リン酸化 CaMKIV 抗体(pThr196)を用いたウエスタ
ンブロット法により検出することで、阻害剤の細胞内 CaMKK 阻害活性を検討した。また、内部標準として抗 HA 抗体を用いた。

(内在性 AMPK)HeLa 細胞を 1.5 x 105 cells/well になるように 6 well dish に播種し、48 時間後に 6 時間の阻害剤処理を行った。その後 5 分間のイオノマイシン刺激を行い、細胞を回収した。回収したサンプルの処理は上記と同様の手順で行った。サンプルに含まれるリン酸化 AMPK は抗リ
ン酸化 AMPK 抗体 (pThr172)を用いたウエスタンブロット法により検出した。また、内部標準として抗 AMPK 抗体を用いた。

一過性発現 CaMKKα/β阻害活性測定
COS-7 細胞を 1.5 x 105 cells/well になるように 6 well dish に播種し、24 時間後に 1 µg HAmouse CaMKIV (pME-HA-CaMKIV)と FLAG-rat CaMKK (pcDNA3-FLAG-CaMKKα)もしくは rat CaMKKβ (pME-CaMKKβ)発現プラスミドと 6 µg polyethylenimine “MAX”の複合体溶液を滴下した。細胞の阻害剤処理およびイオノマイシン刺激、サンプルの処理は上記と同様の手順で行った。サンプルに含まれるリン酸化 CaMKIV は抗リン酸化 CaMKIV 抗体(pThr196)を用いたウエスタンブロット法により検出した。また、内部標準として抗 HA抗体を用いた。

その他
タンパク質濃度の測定はウシ血清アルブミンを基準に Bradford 法 (Bio-Rad)を用いて測定した。

45

3.4 結果
STO-609 誘導体の CaMKK 阻害活性測定スクリーニング
新規 CaMKK 阻害剤を開発するため、様々な置換基を持つ STO-609 誘導体を合成し(岡山大学 大学院教育学研究科 石川彰彦研究室にて合成) (Fig. 1A)、試験管内における CaMKKαおよび CaMKKβに対する阻害活性のスクリーニングを行った。阻害剤濃度 10 mg/ml(27-35 µM)の条件下で CaMKKαおよび CaMKKβに対する STO-609 誘導体の阻害活性を測定した結果、TIM-063 が CaMKKαと CaMKKβの両方に対して約 90%の高い阻害活性を示した(Fig. 1B)。興味深いことに、TIM-063 と比較してニトロ基(R2)を欠く TIM-062 お
よび水酸基(R1)を欠く TIM-064 は、TIM-063 と非常に類似した構造を持つにもかかわらず、CaMKKαと CaMKKβの両方に対して阻害活性を示さなかった。このような不活性構
造類似体は TIM-063 と off-target 分子が重複している可能性があり、TIM-063 の不活性アナログとして利用できる可能性がある。そのため新規 CaMKK 阻害剤候補化合物 TIM-063と不活性類似体 TIM-062 および TIM-064 に着目し、その性質と有用性のさらなる検討を
行った。

46

Figure 1

STO-609 誘導体の構造と CaMKK 阻害活性(A) STO-609 と誘導体の構造式。(B) CaMKKα (白棒)および CaMKKβ (黒棒)に対する STO-609 誘導体の酵素阻害活性測定。Ca2+/CaM、100 μM [γ-32P]ATP を含む溶液中で、GST-CaMKI 1–293 Lys49Glu(kinase-dead 変異体)を基質として 30℃で 10 分リン酸化反応を行った(実験材料と方法の項を参照)。STO-609 もしくは STO-609 誘導体は反応溶
液体積の 5%量になるように添加し、終濃度を 10 µg/ml とした (STO-609, 27 μM; TIM-055, 30 μM; TIM-056, 30 μM;
TIM-057, 28 μM; TIM-058, 28 μM; TIM-059, 28 μM; TIM-060, 30 μM; TIM-061, 30 μM; TIM-062, 35 μM; TIM-063,
30 μM; TIM-064, 32 μM)。CaMKK の酵素活性は溶媒(DMSO)のみを添加した場合の平均値を 100%として算出した。
実験は Triplicate で行い、平均値を棒グラフとして示し、標準偏差はエラーバーで示した。

TIM-063 の CaMKKα/β活性阻害能力の評価
TIM-063 の詳細な CaMKK 阻害能力およびアイソフォーム選択性を明らかにするため、
CaMKK 阻害活性の阻害剤濃度依存性を検討した。阻害剤濃度 0.1-10 µg/ml の条件下で
CaMKKαおよび CaMKKβに対する阻害活性を測定した結果、CaMKKβに対して選択性を示す STO-609 とは異なり、TIM-063 は CaMKKαと CaMKKβの両方に対して同等の阻害活性を示した (IC50 値：CaMKKα=0.63 µM, IC50 値：CaMKKβ=0.96 µM) (Fig. 2A)。一方、不活性類似体である TIM-062 および TIM-064 は、測定した全ての阻害剤濃度において、CaMKKα/βに対して顕著な阻害活性を示さなかった。
次に、TIM-063 が酵素に直接作用していることを確認するため、CaMKKα/βの自己リン酸化に対する阻害活性の測定を行った。CaMKKβ は Ca2+/CaM に非依存的な自己リン酸化が起こることが報告されているため[79]、Ca2+/CaM 非存在下における CaMKKβ の自己リン酸化に対する TIM-063 の阻害活性を測定した。その結果、TIM-063 は CaMKKβ自己
47リン酸化に対して、CaMKI をリン酸化基質とした際と同程度の阻害活性を示した (IC50 値：
0.66 µM)(Fig. 2B, 右図)。さらに、TIM-063 は Ca2+/CaM 存在下における CaMKKα の自己リン酸化に対しても阻害効果を示した(Fig. 2B, 左図)。TIM-063 は CaMKKα/β の自己リン酸化に対して阻害活性を示したことから、基質拮抗薬ではないことが明らかとなった。
また、TIM-063 は Ca2+/CaM の有無に関わらず CaMKK 阻害活性を示したことから、CaM
拮抗薬ではないことも確認された。不活性類似体である TIM-062 および TIM-064 は、
CaMKI を基質とした際と同様に、CaMKKα/β の自己リン酸化に対して顕著な阻害活性を示さなかった(Fig. 2C)。

48

Figure 2

TIM-063 および TIM-063 類似体の CaMKK 活性への効果(A) CaMKKα (左)および CaMKKβ (右)に対する TIM-063 および TIM-063 類似体の酵素阻害活性測定。Ca2+/CaM、
100 μM [γ-32P]ATP を含む溶液中で、GST-CaMKI 1–293 Lys49Glu (kinase-dead 変異体)を基質として 30℃で 10 分リン酸化反応を行った(実験材料と方法の項を参照)。STO-609(〇)、TIM-062(▲)、TIM-063(●)、TIM-064(◆)は、図中に示した終濃度で、反応溶液体積の 5%量添加した。 CaMKK の酵素活性は溶媒(DMSO)のみを添加した場合の平均値を 100%として算出した。実験は Triplicate で行い、標準偏差はエラーバーで示した。(B) CaMKKα 自己リン酸化(左)および CaMKKβ 自己リン酸化(右)に対する TIM-063 の阻害効果。 100 μM [γ-32P]ATP、Ca2+/CaM (CaMKKα)も
しくは EGTA (CaMKKβ)を含む溶液中で 30℃、120 分間のリン酸化反応を行った。 TIM-063(●) は、図中に示した
終濃度で、反応溶液体積の 5%量添加した。 CaMKK の酵素活性は溶媒(DMSO)のみを添加した場合の平均値を 100%として算出した。実験は duplicate で行った。(C) CaMKKα 自己リン酸化(左)および CaMKKβ 自己リン酸化(右)に対す
る TIM-062 および TIM-064 の効果。 100 μM [γ-32P]ATP、Ca2+/CaM (CaMKKα)もしくは EGTA (CaMKKβ)を含む
溶液中で 30℃、120 分間のリン酸化反応を行った。 TIM-062 および TIM-064 は、終濃度を 10 µg/ml として、反応溶
液体積の 5%量添加した。 CaMKK の酵素活性は溶媒(DMSO)のみを添加した場合の平均値を 100%として算出した。
実験は triplicate で行い、平均値を棒グラフとして示し、標準偏差はエラーバーで示した。統計的な有意差は DMSO のみを添加した際の CaMKK の自己リン酸化を基準として、*p<0.05 で示した。有意差がない場合は n.s. (notsignificant)で示した。

TIM-063 および構造類似体の酵素選択性の検討
TIM-063 のリン酸化酵素選択性を評価するため、様々なリン酸化酵素に対する阻害活性を測定し、IC50 値を算出した(Table. 2)。活性型 CaMKI、CaMKII、活性型 CaMKIV、PKA に対する阻害活性を測定した結果、TIM-063 は CaMKII に対し CaMKK と比較して 20 倍程
度弱い阻害活性を示したが(IC50 値：14 µM)、その他のリン酸化酵素に対しては顕著な阻害活性を示さなかった(IC50＞10 µg/ml)。不活性類縁体である TIM-062, 064 は、測定した全てのタンパク質リン酸化酵素に対して不活性であった(IC50＞10 µg/ml)。これらの結果より、
TIM-063 は CaMKK に対して比較的高い選択性を示すことが確認できた。

49

Table 2

TIM-063 および不活性類似体(TIM-062, TIM-064)の酵素選択性
IC50 value (% inhibition at 10 µg/mL)

Protein kinases

TIM-062

TIM-063

TIM-064

CaMKKα> 29 µM (18 ± 3 %)0.63 µM> 27 µM (4 ± 3 %)CaMKKβ> 29 µM (15 ± 5 %)0.96 µM> 27 µM (1 ± 4 %)CaM kinase I> 29 µM (22 ± 12 %)> 26 µM (32 ± 6 %)> 27 µM (9 ± 4 %)CaM kinase II> 29 µM (14 ± 12 %)14 µM> 27 µM (26 ± 8 %)CaM kinase IV> 29 µM (ND) a> 26 µM (8 ± 6 %)> 27 µM (ND)

PKAb

> 29 µM (17 ± 5 %)> 26 µM (24 ± 2 %)> 27 µM (29 ± 9 %)aND, not detected; bPKA, cAMP-dependent protein kinase

10 µg/mL compounds (TIM-062: 29 µM, TIM-063: 26 µM, TIM-064: 32 µM)

TIM-063 の作用メカニズムの解明(作用部位の検討)
CaMKK は ATP 結合部位を含む触媒領域と、Ca2+/CaM 結合部位と自己阻害領域を含む調節領域から構成されている。TIM-063 の作用領域を明らかにするため、CaMKKα およびCaMKKβ の調節領域を除いた触媒領域のみの変異体 (GST-CaMKKα 126-434, GSTCaMKKβ 162-470)に対する TIM-063 の阻害活性を測定した。その結果、TIM-063 は触媒領域のみの変異体に対しても野生型 CaMKK と同様に阻害活性を示し、TIM-063 は CaMKKの触媒領域に直接作用していることが明らかとなった(Fig. 3A)。

(酵素反応速度論的解析)
さらに詳細な作用メカニズムを明らかにするため、25-200 µM の ATP 濃度条件下におけるTIM-063 の阻害活性を測定し、Lineweaver-Burk plot を作成した。その結果、TIM-063 によって反応の最大速度(Vmax)は変化せず、ATP との親和性のみが低下(ミカエリス定数 Kmが上昇)したことから、TIM-063 は ATP 拮抗薬であることが明らかとなった(Fig. 3B)。

50

Figure 3

TIM-063 は ATP 拮抗薬である(A) CaMKKα WT (左, ●)、CaMKKα 触媒領域変異体 (GST-CaMKKα 126-434, 左, 〇)、CaMKKβ WT (右, ●) 、
CaMKKβ 触媒領域変異体 (GST-CaMKKβ 162-470, 右, 〇)に対する TIM-063 の酵素阻害効果。 100 μM [γ32P]ATP、 Ca2+/CaM (WT)もしくは EGTA(触媒領域変異体)を含む溶液中で、GST-CaMKI 1–293 Lys49Glu (kinase-dead 変異体)を基質として 30℃で 10 分リン酸化反応を行った(実験材料と方法の項を参照)。 TIM-063 は、図中に示した終濃度で、反応溶液体積の 5%量添加した。 CaMKK 活性は溶媒(DMSO)のみを添加した場合の平均値を 100%として算出した。実験は duplicate で行った。(B) TIM-063 存在下(●)もしくは非存在下(DMSO, 〇)において、25-200
μM [γ-32P]ATP、 Ca2+/CaM を含む溶液中で、GST-CaMKI 1–293 Lys49Glu (kinase-dead 変異体)を基質として 30℃
で 10 分リン酸化反応を行った(実験材料と方法の項を参照)。TIM-063 もしくは DMSO は反応溶液体積の 5%量添加した。実験は duplicate で行い、反応速度と ATP 濃度に対する逆対数プロット(Lineweaver–Burk プロット)で示した。

51

TIM-063 および不活性類似体の細胞内 CaMKK 阻害活性の検討(HeLa 細胞内因性 CaMKK 阻害活性測定)
上記の実験結果から、試験管内における TIM-063 の CaMKK 阻害能力および作用メカニズ
ムが明らかとなった。次に動物細胞内における TIM-063 の CaMKK 阻害活性の検討を行った。CaMKK のリン酸化基質として HA-CaMKIαを一過性発現させた HeLa 細胞を TIM063、または不活性類似体とともに一定時間（６時間）培養し、その後イオノマイシン刺激を行うことで細胞内の CaMKK を活性化させた。CaMKI のリン酸化レベルを抗リン酸化抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した結果、TIM-063 の濃度に依存した
CaMKI(Thr177)のリン酸化レベルの低下が確認された(IC50=0.3 µM)。一方、不活性類縁体である TIM-062 によるリン酸化レベルは最大濃度（35 µM）においても、変化が見られなかった。TIM-064 は細胞毒性を示し off-target 効果が示唆されたため、細胞における実験からは除外した。同様の実験を HA-CaMKIV を一過性発現させた HeLa 細胞、および内在性の AMPK においても行った結果、CaMKI と同様のリン酸化阻害効果の結果が得られた。
これらより、TIM-063 は細胞膜透過性を持ち、細胞内の内在性 CaMKK 活性を阻害できる
こと、および TIM-062 は細胞内においても CaMKK 活性を阻害しないことが示された(Fig.
4)。

52

Figure 4

CaMKK 基質分子のイオノマイシン誘導リン酸化に対する TIM-063 の効果

6 穴プレートで培養した HeLa 細胞(A)、HA-CaMKIα 一過性発現 HeLa 細胞(B)、HA-CaMKIV 一過性発現 HeLa 細胞(C)を図に示した濃度の TIM-063 もしくは TIM-062 を含む無血清培地で 6 時間処理した後、1 µM のイオノマイシン(iono)、もしくは DMSO(-)で 5 分間細胞を刺激した。その後、SDS-PAGE sample buffer を加えて細胞を回収し(実験
材料と方法の項を参照)、回収したサンプルを抗リン酸化 AMPK(Thr172)抗体(A)、抗リン酸化 CaMKIα (Thr177)抗体(B)、抗リン酸化 CaMKIV (Thr196)抗体(C)を用いたウエスタンブロッティングを行った。内部標準として抗 AMPK
抗体もしくは抗 HA 抗体を用いた。検出されたバンド強度を数値化し、阻害剤非存在下におけるイオノマイシン刺激細胞におけるリン酸化レベルの平均値を基準とした割合をグラフで示した。実験は duplicate で行った。

(COS-7 細胞一過性発現 CaMKKα/β 阻害活性測定)
細胞の TIM-063 処理による CaMKK 下流基質分子のリン酸化レベルの低下が本当に
CaMKK の阻害によるものかを確かめるため、CaMKKα もしくは CaMKKβ を一過性発現させた COS-7 細胞を用いて同様の実験を行った。このとき、基質分子として HA-CaMKIVも共発現させた。その結果、CaMKKα を一過性発現した細胞において TIM-063 の濃度依存的に CaMKIV のリン酸化レベルが低下し、TIM-062 によっては変化しなかった。
さらに、
CaMKKβ を一過性発現させた細胞においても同様の結果が得られた。これらの結果から、TIM-063 が細胞内 CaMKKα および CaMKKβ の両酵素活性を阻害していることが確認できた(Fig. 5)。

53

Figure 5

CaMKK 一過性 COS-7 細胞における TIM-063 の CaMKK 阻害効果

HA-CaMKIV のみを一過性発現させた COS-7 細胞、および HA-CaMKIV と FLAG-CaMKKα (A)または CaMKKβ (B)を一過性発現させた COS-7 細胞を、図に示した濃度の TIM-063 もしくは TIM-062 を含む無血清培地で 6 時間処理した後、5 分間イオノマイシン刺激(1 µM)を行った。回収したサンプルを抗リン酸化 CaMKIV (Thr196)抗体を用いたウ
エスタンブロッティングを行った。内部標準として抗 HA 抗体を用いた。検出されたバンド強度を数値化し、阻害剤非存在下における CaMKK 過剰発現細胞におけるリン酸化レベルの平均値を基準とした割合をグラフで示した。実験はduplicate で行った。

54

3.5 考察本研究では様々な STO-609 誘導体を合成し、
CaMKK 活性阻害スクリーニングの結果より、その中から新規 CaMKK 阻害剤として TIM-063 を発見した。
CaMKKαと比較して CaMKK
βに 5-10 倍程度高い選択性を示す STO-609 とは異なり(Fig. 2A)、TIM-063 は CaMKKαと CaMKKβ両方に同等の阻害活性を示す pan-CaMKK 阻害剤であった (IC50=0.63-0.96µM, Fig. 1, 2)。STO-609 と同様に TIM-063 は CaMKK に直接作用することで阻害しており、酵素反応速度解析から ATP 拮抗薬であることが明らかとなった(Fig. 3B)。さらに、TIM-063 は HeLa 細胞内において、イオノマイシンによって誘引される CaMKK 基質分子のリン酸化 (AMPK: Thr172, CaMKIα: Thr177, CaMKIV: Thr196)を抑制したことから、膜透過性を有し内因性 CaMKK を阻害していることが確認できた(Fig. 4)。同様に、CaMKKαもしくは CaMKKβを一過性発現させた COS-7 細胞においても TIM-063 によって
CaMKIV のリン酸化が抑制されることが確認できたが、内因性 CaMKK (Fig. 4)と比較して、過剰発現させた CaMKK(Fig. 5)の阻害にはより高濃度の TIM-063 が必要であった。これは、CaMKK を過剰発現させた細胞内においては、高濃度の CaMKK が存在することにより、阻害剤が効きにくいためと考えられる。
置換基を変化させた STO-609 誘導体の CaMKK 阻害活性のスクリーニングにおいて、R2 位に STO-609 (-COOH)や TIM-063 (-NO2)と比較して大きな置換基を持つ TIM-055(NHCH2CH2OH)も CaMKKβに対して弱い阻害活性を示しており、さらに大きな置換基を持つ誘導体 (TIM-057, TIM-059, TIM-060)では CaMKK 阻害活性が完全に失われていた。
STO-609 と CaMKKβ複合体の共結晶構造により、STO-609 のカルボキシル基(R2 位)付近の ATP 結合ポケットには空いた空間がわずかに残っており(PDB: 2zv2)、STO-609 のカルボキシル基の酸素原子は、この空間に入り込んだ水分子を介して CaMKKβ Glu236 と水素結合を形成する[109](序論 Fig. 7B)。そのため、R2 位にカルボキシル基より大きな置換基を持つ TIM-055 も CaMKKβに対する阻害活性をわずかに示し、さらに大きな置換基を持つ誘導体 (TIM-057, TIM-059, TIM-060)では立体障害により阻害活性が完全に失われたと考えられる。また、R3 位に大きな置換基を持つ誘導体 (TIM-056, TIM-058, TIM-061)は全て
CaMKK に対する阻害活性を示さなかった。R3 位付近には CaMKK の Phe (CaMKKα:Phe230, CaMKKβ: Phe267)が位置しており、フェニル基が ATP 結合ポケット内部の空間を占めている (PDB: CaMKKα 6cd6, CaMKKβ 2zv2)(Fig. 6)。そのため、この位置に大きな置換基をもつ誘導体は CaMKK に対する阻害活性を示さなかったと考えられる。興味深いことに、CaMKKβに対して選択性を示す STO-609 とは異なり、TIM-063 は CaMKK
55

αと CaMKKβに対して同等の阻害活性を示した。これまでの研究により、STO-609 のCaMKKβに対する選択性の違いは、CaMKK 触媒領域のヒンジ領域に存在する 1 アミノ酸
残基（Leu233: CaMKKα, Val270: CaMKKβ）の違いによる立体障害の差によって生じていることが推定されている[68]。しかし、Val270 は今回変更した置換基から遠く離れた位置にあり、それにも関わらず TIM-063 では CaMKK アイソフォームに対する選択性が変化した。CaMKKαと CaMKKβの ATP 結合ポケット付近のアミノ酸配置は非常に類似しており、両アイソフォーム間での違いは前述の Val270 を含むヒンジ領域の 4 アミノ酸残基(CAMKKα Asp231 と CaMKKβ Glu268, CaMKKα Leu233 と CaMKKβ Val270,
CaMKKα Arg234 と CaMKKβ Asn271, CaMKKα Lys235 と CaMKKβ Gln272)と Ploop と呼ばれる領域の１アミノ酸残基 (CaMKKα Ala138 と CaMKKβ Ser175)のみである[110]。ヒンジ領域は今回変更した置換基から遠く離れている一方で(序論 Fig. 7A)、Ploop は R1 位付近に位置していることから(Fig. 6)、TIM-063 R1 位の水酸基が P-loop と新たな相互作用を形成することで CaMKK アイソフォーム間での選択性に変化が生じた可能性がある。もしくは R2 位がカルボキシル基(STO-609)からニトロ基(TIM-063)に変化したことにより、阻害剤と結合した際の CaMKK にコンホメーションの変化が生じ、アイソフォーム間での選択性に差異が生じたのかもしれない。このような知見は、今後 CaMKK のア
イソフォーム間で選択性を示す阻害剤の開発において重要な手がかりになると考えられる。
さらに興味深いことに、TIM-063 と比較してニトロ基を欠く TIM-062、および水酸基を欠く TIM-064 は、TIM-063 と非常に類似した構造を持つにもかかわらず、CaMKKα/β に対し不活性であった(IC50＞10 µg/ml)。STO-609 と CaMKKβの共結晶構造解析により、STO-609 のカルボキシル基が CaMKKβ の Glu236 及び Asp330 と水素結合を形成することが明らかとなっていることから、STO-609 のカルボキシル基に対応する TIM-063 のニトロ基も同様に CaMKK と水素結合を形成していることが予測される。しかしニトロ基のみでは CaMKK 阻害活性を示さず(TIM-064)、ニトロ基と水酸基の両方が必要であることから、①水酸基が共鳴効果によってニトロ基に電子を押し出し、ニトロ基酸素原子の電子密度が高まることで CaMKK とより強い水素結合を形成している、または②水酸基そのものが CaMKK と新たな水素結合を形成し、より強く CaMKK と結合していると考えられる。
このような不活性類似体は TIM-063 と off-target 分子が重複している可能性があるため、

in vivo において TIM-063 を使用する際に TIM-062 を陰性対照として用いることで、TIM063 によって得られた効果が CaMKK の阻害によるものかを評価できる可能性が期待される。
56

以上より、本研究において STO-609 誘導体をリード化合物として、新規 pan-CaMKK 阻害剤 TIM-063 を見出した。TIM-063 は ATP と競合的に CaMKK を阻害する ATP 拮抗薬であり、細胞内 CaMKK においても酵素阻害効果を示すことから、膜透過性を有することが確認できた。また、TIM-063 と比較して非常に類似した構造を持つ不活性類似体 TIM-062
は、試験管内および細胞内の両方において、CaMKK に対し阻害活性を示さなかった。これらの結果より、STO-609 をリード化合物とする新たな CaMKK 阻害薬創製の可能性が示唆された。

Figure 6

CaMKKβ-STO-609 複合体の共結晶構造

CaMKKβの構造をリボンモデルで示した。Phe267 を赤で示しており、ATP 結合ポケット内部の R3 位付近の空間を占めている。P-loop を青で示しており、R1 位の近傍に位置している。STO-609 をスティックモデルで示した。緑は炭素原子、青は窒素原子、赤は酸素原子を示す。 (PDB: 2zv2 より作図)

57

4. 第 4 章

TIM-063 と Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase の構造変化依存的な可逆的相互作用584.1 要約
Ca2+/CaM 依存性タンパク質リン酸化酵素活性化キナーゼ(CaMKK)は Ca2+/CaM 複合体の結 合 に よ り 活 性 化 さ れ る リ ン 酸 化 酵 素 で あ り 、 CaMKI 、 CaMKIV、 protein kinase B(PKB)/Akt、5’AMP 依存性キナーゼ(AMPK)をリン酸化依存的に活性化することで、細胞内における多様なシグナル伝達経路の調節に関与している。３章において、新規 CaMKK 阻
害 剤 TIM-063 (2-hydroxy-3-nitro-7H-benzo[de]benzo[4,5]imidazo[2,1-a]isoquinolin-7one)を開発し、TIM-063 が ATP 拮抗薬であることを明らかにした。しかし、CaMKK は
Ca2+/CaM 複合体の結合によって酵素活性が調節されており、不活性状態の CaMKK は酵
素活性を示さないため、CaMKK の活性化状態と TIM-063 の結合/解離の関連は明らかとなっていない。そこで本章では、TIM-063 をセファロースに固定化した TIM-063 結合セファ
ロース担体(TIM-127 セファロース)を作製し、酵素-阻害剤複合体の結合/解離動態の解明を試みた。まず、作製した TIM-127 セファロースの Ca2+/CaM 条件下における CaMKK 結合能力を精製 GST-CaMKKαを用いて検討した結果、GST-CaMKKαは TIM-127 セファ
ロースに結合し、遊離 TIM-063 の濃度依存的にセファロースから解離・溶出されることが確認できた。さらに、CaMKKαおよび CaMKKβを一過性発現させた COS-7 細胞抽出液、およびマウス脳抽出液において、セファロースに CaMKK が選択的に結合し、TIM-063 に
よって溶出されることも確認できた。そこで、作製した TIM-127 セファロースを用いて、精製 GST-CaMKKαの活性化状態に依存した TIM-063 の結合を検討した結果、TIM-063
は Ca2+/CaM 存在下、すなわち活性化状態の CaMKKαとのみ結合できることが明らかとなった。一方で、調節領域(アミノ酸残基 438-463)を除いた CaMKKα触媒領域変異体(アミノ酸残基 126-434)は Ca2+/CaM 条件下と EGTA 条件下の両方で TIM-127 セファロースとの結合が確認されたことから、不活性状態の CaMKKαでは調節領域によって TIM-063 の触媒領域への結合が阻害されていることが示唆された。このことは、Ca2+/CaM 条件下において TIM-127 セファロースに結合させた活性型 CaMKKαは、EGTA によって完全にセファロースから解離したことにより裏付けられた。これらの結果より、TIM-063 と CaMKK
αの結合は CaMKKαの構造変化に依存して可逆的であることが示された。以上の結果より、おそらく TIM-063 は細胞内 Ca2+濃度が低い未刺激状態においては CaMKK と結合しておらず、細胞が刺激を受け細胞内 Ca2+濃度が上昇したときのみ CaMKK と結合していると考えられる。さらに、TIM-063 と CaMKK の結合は CaMKK の構造変化に伴い可逆的であり、細胞内 Ca2+濃度が低下し CaMKKαが不活性構造に変化する際に CaMKKαの触媒領域から排除されることが示唆された。
59

4.2 緒言
Ca2+/Calmodulin (CaM)依存性プロテインキナーゼ活性化キナーゼ(CaMKK)は、ATP 結合部位を含む触媒領域 (CaMKKα: 126-434, CaMKKβ: 162-470)と Ca2+/CaM 結合領域を含む調節領域 (CaMKKα: 438-463, CaMKKβ: 474-499)から構成される Ca2+/CaM 依存性のタンパク質リン酸化酵素である。CaMKKαの調節領域ペプチド (CaMKKα 438-463)はCa2+/CaM 存在下において恒常的活性型 CaMKKα (CaMKKα 84-434)の酵素活性を ATPと競合的に阻害することが報告されており[17]、CaMKK の調節領域は自身の触媒領域に結合することで酵素活性を抑制していると考えられている。3 章において、新規 CaMKK 阻害剤 TIM-063 を開発し、TIM-063 が CaMKK の触媒領域に直接作用し、ATP と競合的に
CaMKK を阻害する ATP 拮抗薬であることを見出した[111]。TIM-063 は CaMKK の酵素活性に対し阻害効果を示すことから、少なくとも活性化 CaMKK の ATP 結合部位に結合していると考えられる。しかし CaMKK は Ca2+/CaM 依存性酵素であるため、実際の細胞内では細胞内カルシウムイオン濃度に依存した酵素の構造変化が引き起こされ、CaMKK の酵
素活性が調節されている[17, 90]。細胞内における阻害剤のふるまいを理解する上で、
CaMKK の構造変化に依存した阻害剤の結合/解離の動態を明らかにすることは重要であると考えられる。しかし、不活性化構造の CaMKK は酵素活性を示さず、阻害剤による酵素阻
害活性を測定することは不可能であるため、不活性化構造の CaMKK に対する阻害剤の結合状態は明らかとなっていない。また、活性化構造の CaMKK に結合した阻害剤が、CaMKKが不活性化状態に戻る際に解離するのか、結合を維持するのか、CaMKK-阻害剤相互作用の結合/解離の動態も酵素阻害活性から明らかにすることは困難である。そこで本章では、
kinobeads 技術[112]に基づいて新規 CaMKK 阻害剤 TIM-063 をセファロースに固定化した TIM-063 結合セファロース(TIM-127 セファロース)を作製し、Ca2+/CaM 存在下および非存在下における CaMKK-TIM-063 の結合/解離動態の解明を試みた。

60

4.3 実験材料と方法
実験材料
タンパク質
CaMKKαおよび CaMKKβは大腸菌(E. coli) BL21 Star(DE3)を用いて発現し、カルモデュ
リンセファロースと Q セファロースを用いて精製を行った。
Calmodulin (CaM)は大腸菌(E.
coli) BL21 (DE3)を用いて発現させ、フェニルセファロースを用いて精製を行った後、透析にて EGTA を除去した。GST-CaMKI 1-293 K49E、GST-CaMKKα、GST-CaMKKα 126434 は大腸菌(E. coli) JM109 (GST-CaMKI 1-293 K49E, GST-CaMKKα)もしくは BL21
Star (DE3) (GST-CaMKKα 126-434)を用いて発現し、グルタチオンセファロースによって精製を行った後、透析によりグルタチオンを除去した。

抗体
抗リン酸化 CaMKI (pThr177)抗体 (clone 9H8) は以前に作製されたものを用いた[84]。抗CaMKKα抗体、および抗 CaMKKβ抗体は北里大学医学部 阪上洋行教授より分与されたマ
ウスモノクローナル抗体を使用した。抗 GST 抗体(27457701V)は GE Healthcare Life Sciences
から購入したものを用いた。HRP 融合抗マウス IgG 抗体は GE Healthcare Life Sciences から購入したものを用いた。HRP 融合抗ゴート IgG 抗体は SouthernBiotech から購入したものを用いた。

その他
TIM-063 および TIM-127 は岡山大学 大学院教育学研究科 石川彰彦研究室で合成したものを使用した。その他の試薬は一般的な市販品を用いた。

Dot blot 法による CaMKKαおよび CaMKKβの酵素活性測定
50 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)、10 mM Mg(Ac)2、1 mM DTT、100 μM ATP、2 mM
CaCl2、6 µM CaM、酵素として CaMKKαもしくは CaMKKβ(5 ng)、リン酸化基質としてGST-CaMKI 1-293 K49E (10 µg)を含む反応液(20 µl)を 30℃で 5 分間混和し、リン酸化反応を行った。酵素反応の開始は ATP の添加によって行った。反応後、反応液(4 µl)をニトロ
セルロース膜(Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA)に滴下した。その後、5%スキムミル
61

クで一時間ブロッキングを行い、抗リン酸化 CaMKI (Thr177)抗体を用いてリン酸化された
CaMKI を検出した。リン酸化シグナル強度の定量化は ImageJ ソフトウェアを用いて行った。

TIM-127 セファロースの作製
2 mM TIM-127 溶液(溶媒：イソプロパノール) 1 ml を 1ml NHS 活性化セファロース(GEHealthcare Life Sciences)と混ぜ合わせ、塩基としてトリエチルアミン 15 µl を加えて室温で 60 時間反応させた(カップリング反応)。次に、アミノエタノール 50 µl を加え、室温で 6時間反応させることで、未反応の NHS 活性基のブロッキングを行った。カップリング反応
およびブロッキング反応は遮光した状態で行った。その後、10 ml の DMSO で 5 回、10 mlのエタノールで３回セファロースを洗浄した。また、阻害剤を結合させず、ブロッキングのみを行ったセファロースも作製し、以降の実験の陰性対照として使用した(コントロールセ
ファロース)。作製したセファロースは 50%スラリー/エタノールの状態で、4℃にて遮光保存した。

CaMKK/TIM-063 複合体の結合実験
CaMKK 一過性発現 COS-7 細胞抽出液を用いた CaMKK/TIM-063 結合実験
(COS-7 細胞抽出液の調整)
COS-7 細胞は、10 %ウシ胎児血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)「ニッス
イ」を用いて培養した(37℃, 5 % CO2)。50%コンフルエントに培養した COS-7 細胞に 10µg His6-CaMKKα (pME-His6-CaMKKα)もしくは CaMKKβ (pME-CaMKKβ)発現プラ
スミドと 30 µg polyethylenimine “MAX”の複合体溶液を滴下して遺伝子導入を行った。8 時
間後に培地交換を行い、遺伝子導入から 48 時間後に 300 µl の抽出溶液(20 mM Tris-HCl(pH7.5), 150 mM NaCl, 0.05% tween20, 1% プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤 カ ク テ ル （ Nacalai
Tesque）)で細胞を回収し、氷上で超音波破砕した。その後 14,000 rpm で 10 分間遠心分離を行い、上清を回収した。

(結合実験)
10 µl の TIM-127 セファロース、もしくはコントロールセファロースと、2 mM CaCl2 と 6µM CaM を添加した COS-7 細胞抽出液(140 µl)を混ぜ合わせ、室温で 30 分間混和した。そ62

の後、2 mM CaCl2 を含む溶液 A (20 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween
20, 500 µl)でセファロース担体の洗浄を行った(10 分間, 3 回)。洗浄後、20 µl の溶出溶液(100 µM TIM-063, 2 mM CaCl2 を含む溶液 A)によって、セファロースに結合したタンパク
質を溶出させた。セファロースとの結合前サンプル(input, 2.5 µl)および溶出サンプル(8 µl)を、抗 CaMKKα抗体、もしくは抗 CaMKKβ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、セファロースに結合・溶出した CaMKKαおよび CaMKKβの検出を行った。また、セファロースとの結合前サンプル(input, 1.3 µl)および溶出サンプル(4 µl)を SDS-PAGE により分離し、銀染色を行った。

マウス大脳抽出液を用いた CaMKK/TIM-063 結合実験
(マウス大脳抽出液の調整)
マウス大脳(1 個)を 2 ml の抽出溶液(20 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 2% プロテアーゼ阻害剤カクテル)に加え、氷上で破砕した。その後 14000 rpm で 10 分間遠心分離を行い、上清（マウス大脳抽出液）を得た。

(結合実験)
100 µl の TIM-127 セファロース、もしくはコントロールセファロースを、2 mM CaCl2 と 6µM CaM を添加したマウス大脳抽出液 (5 mg/ml, 450 µl) と混ぜ合わせ、４℃で 45 分間結合させた。その後、2 mM の CaCl2 を含む溶液 A (20 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl,
0.05% Tween 20) 1 ml で 10 分間、3 回セファロースの洗浄を行った。洗浄後、450 µl の溶出溶液 (100 µM TIM-063, 2 mM CaCl2 を含む溶液 A)によって、セファロースに結合した
CaMKK を溶出させた。その後、溶出サンプルを 30 kDa カット濃縮スピンカラムによって50 µl まで濃縮した。セファロースとの結合前の大脳抽出液(input)、結合後の大脳抽出液(unbound)、および溶出サンプルをそれぞれ 4.1 µl 用いて、抗 CaMKKα抗体または抗CaMKKβ抗体によるウエスタンブロッティングを行い、セファロースに結合・溶出した
CaMKK の検出を行った。

CaMKK/TIM-063 結合の Ca2+/CaM 依存性の検討
10 µl の TIM-127 セファロース、もしくはコントロールセファロースを、0.7 µM GSTCaMKKαと GST-CaMKIα(陰性対照)を含む溶液 A (20 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM
NaCl, 0.05% Tween 20)と混和し、Ca2+/CaM 存在下(2 mM CaCl2, 6 µM CaM)もしくは非63

存在下(2 mM EGTA)、室温で 30 分間結合させた。その後、2 mM CaCl2 もしくは 2 mM
EGTA を含む溶液 A (500 µl)でセファロース担体の洗浄を行った(10 分間, 3 回)。洗浄後、20 µl の溶出溶液(100 µM TIM-063, 2 mM CaCl2 もしくは EGTA を含む溶液 A)によって、セファロースに結合したキナーゼを溶出させた。セファロースとの結合前サンプル(input,
2.5 µl)および溶出サンプル(8 µl)を、抗 GST 抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、セファロースに結合・溶出した GST-CaMKKαおよび GST-CaMKIαの検出を行った。

CaMKK/TIM-063 複合体の解離実験
100 µl の TIM127 セファロースを充填したカラムに 0.7 µM GST-CaMKKαと Ca2+/CaM(2 mM CaCl2, 6 µM CaM)を含む溶液 A (20 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 0.05%
Tween 20)を供し、GST-CaMKKαをセファロースに結合させた(室温)。その後、低温室(4℃)で 2 mM CaCl2 を含む溶液 A (5 ml)をカラムに加え、セファロースの洗浄を行った。3
回洗浄を行った後、2 mM の EGTA を含む溶液 A をカラムに加え、溶出フラクションを回収した(Fr. 1: 50 µl, Fr. 2-7: 100 µl)。EGTA による溶出の後、セファロースに残った GSTCaMKKαを溶出させるため、室温で 100 µM TIM-063 を含む溶液 A(200 µl)をカラムに加えて溶出を行った。セファロースとの結合前サンプル(input, 2.5 µl)および溶出フラクショ
ン(8 µl)を、抗 GST 抗体を用いたウエスタンブロッティングを行い、TIM-127 セファロー
ス担体から解離した GST-CaMKKαの検出を行った。

その他
タンパク質濃度の測定はウシ血清アルブミンを基準に Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad)を用いて測定した。

64

4.4 結果
TIM-063 結合セファロース (TIM-127 セファロース)の作製
TIM-063 をセファロース担体(NHS 活性化セファロース)とカップリングさせるため、まずは TIM-063 へのアミノ基の導入を試みた。TIM-063 のリード化合物である STO-609 とCaMKKβとの X 線共結晶構造を参考にして[109]、CaMKK の ATP 結合部位の外側に位置することが予測される部位の先端にアミノ基を有する親水性のリンカーを導入した(TIM127, Fig. 1A)。導入したリンカー部分が CaMKK との結合に影響を与えないことを確認する
ため、TIM-127 の CaMKKα/βに対する酵素阻害活性を測定し、TIM-063 との CaMKK 活性阻害効果の比較を行った。GST-CaMKIαの不活性変異体(GST-CaMKIα 1-293 K49E)
をリン酸化基質として CaMKKα/βに対する酵素阻害活性を測定した結果、TIM-127 はTIM-063 と同様に CaMKK に対する阻害活性を示した(Fig. 1B)。この結果より、導入したリンカー部分は CaMKK との結合に影響を与えないことが確認できたため、TIM-127 とNHS 活性化セファロースとのカップリングを行うことで、TIM-063 結合セファロース(TIM-127 セファロース)を作製した。また、TIM-127 を結合させず NHS 活性基のブロッキングのみを行ったコントロールセファロース担体も作製し、以降の実験において陰性対照として用いた。

65

Figure 1

TIM-127 の構造と CaMKK 阻害能力

(A) TIM-063 と TIM-127 の構造式。(B) CaMKKα (左図)および CaMKKβ (右図)に対する TIM-063(〇)および TIM2+

127(●)の酵素阻害活性測定。Ca /CaM、Mg-ATP を含む溶液中で、GST-CaMKI 1–293 Lys49Glu (kinase-dead 変異体)を基質として 30℃で 5 分リン酸化反応を行った(実験材料と方法の項を参照)。TIM-063 および TIM-127 は図に示
した終濃度で、反応溶液体積の 5%量になるように添加した。実験は duplicate で行い、CaMKK の酵素活性は溶媒(DMSO)のみを添加した場合の平均値を 100%として算出した。

CaMKK/TIM-063 相互作用分析
TIM-127 セファロースを用いた CaMKK と TIM-063 の直接的相互作用分析法の概要を Fig.
2A に示す。
TIM-127 セファロースとキナーゼを含む溶液 (組み換えキナーゼ、細胞抽出液、組織抽出液)を Ca2+/CaM 存在下、または非存在下において混和した後、セファロースを洗浄した。その後 TIM-063 を含む溶液をセファロースに加え、TIM-127 セファロースに結合したキナーゼを競合的に解離・溶出させた。
最初に、Ca2+/CaM 存在下において TIM-127 セファロースに結合させた組み換え GSTCaMKKαが、遊離の TIM-063 (0.01-100 µM)によって溶出されることを検証した(Fig. 2B)。
0.01-100 µM の TIM-063 溶液による溶出を行った結果、TIM-063 の濃度に依存して GSTCaMKKαが溶出されることが確認できた。以降の実験では、最も溶出量の多かった 100 µM
TIM-063 の条件で TIM-127 セファロース担体からの解離・溶出を行った。

66

Figure 2

TIM-063 結合セファロースを用いた TIM-063-CaMKK 相互作用測定法(A) TIM-063-CaMKK 直接相互作用測定法の手順。TIM-063 結合セファロース(TIM-127 セファロース)を組み換えキナーゼもしくは細胞・組織抽出液を Ca2+/CaM もしくは EGTA 条件下で混和した。その後セファロースを十分に洗浄した後に、TIM-063 溶液をセファロースに加え、セファロースに結合したキナーゼを TIM-063 と競合的に溶出した。
溶出サンプルはウエスタンブロッティングによって検出した。 (B) 溶出条件の検討。 大腸菌より発現・精製した
GST-CaMKKα を、Ca2+/CaM 条件下で TIM-127 セファロースと混和し、CaCl2 を含む溶液で洗浄した(実験材料と方法の項を参照)。その後 0.01-100 µM の TIM-063 を含む溶液をセファロースに加えて溶出を行い、溶出サンプルに含まれる GST-CaMKKα を抗 GST 抗体を用いたウエスタンブロッティングによって検出した。分子量マーカーは図の左側に示した。＊は GST-CaMKKα を示す。

CaMKK アイソフォームと TIM-063 の選択的相互作用
次に、ラット CaMKKαおよび CaMKKβを一過性発現させた COS-7 細胞抽出液(Fig. 3A)およびマウス脳抽出液(Fig. 3B)を用いて、TIM-127 セファロースの CaMKK 結合能と結合選択性の検討を行った。His6-CaMKKαもしくは CaMKKβを一過性発現させた COS-7 細胞抽出液を Ca2+/CaM 存在下で TIM-127 セファロース、もしくはコントロールセファロー
ス(C)と混和し、Ca2+を含む洗浄液でセファロースを洗浄した。その後、100 µM の TIM063 による溶出を行い、SDS-PAGE による分離を行った後、銀染色(Fig. 3A, 下図)および
67

抗 CaMKKα抗体もしくは抗 CaMKKβ抗体を用いたウエスタンブロッティング(Fig. 3A,
上図)により、TIM-127 セファロース担体に結合・溶出された CaMKK アイソフォームを検出した。その結果、CaMKKαと CaMKKβの両方が TIM-063 によって TIM-127 セファロースより溶出されており、一方コントロールセファロースからの酵素の溶出は検出されなかった。銀染色において、CaMKK アイソフォームと思われるバンド(約 75 kDa)以外には
ほとんどバンドは見られないことから、TIM-063 は選択的に CaMKK アイソフォームと結合していると考えられる。CaMKK アイソフォーム以外のバンドとしては、約 30 kDa に薄い結合タンパク質のバンドが検出されており、これは TIM-063 の off-target 分子であると考えられる。さらに、内因性 CaMKK も TIM-127 セファロースに結合し TIM-063 により溶出されるのかを調べるため、CaMKKα/β両アイソフォームが豊富に発現しているマウ
ス大脳抽出液[23]を用いて Ca2+/CaM 条件下でセファロースとの結合実験を行った。2.25
mg のタンパク質を含むマウス大脳抽出液と TIM-127 セファロース、もしくはコントロー
ルセファロース担体を混和することで抽出液に含まれる CaMKK をセファロースに結合させた後、Ca2+を含む洗浄液で十分にセファロースを洗浄し、100 µM の遊離 TIM-063 によって、結合した CaMKK の溶出を行った。そして、CaMKKαおよび CaMKKβのセファロ
ースへの結合・溶出を、それぞれ抗 CaMKKα抗体および抗 CaMKKβ抗体を用いたウエス
タンブロッティングによって確認した(Fig. 3B)。その結果、TIM-127 セファロースには
CaMKKα/βがほぼ完全にセファロースに結合しており、TIM-063 によって競合的に溶出された。一方、コントロールセファロース担体においては CaMKKα/βの結合・溶出は見られなかった。これらの結果より、内因性 CaMKKα/βも TIM-127 セファロースの TIM063 部分に酵素-阻害剤の相互作用により結合しており、遊離の TIM-063 により競合的に置換することで解離・溶出されることが確認できた。

68

Figure 3

TIM-063 と CaMKKα、CaMKKβ の選択的結合(A) His6-CaMKKα もしくは CaMKKβ を一過性発現させた COS-7 細胞の抽出液を、Fig. 2A に示した手順で TIM-127
セファロースとの結合実験を行った。細胞抽出液は Ca2+/CaM 存在下、TIM-127 セファロース(TIM-127-S)もしくはコントロールセファロース(C)と混和した。CaCl2 を含む洗浄液で洗浄を行った後、100 µM の TIM-063 を含む溶出液を加えて溶出を行った。溶出サンプルは SDS-PAGE によって分離した後、抗 CaMKKα 抗体(上, 左図)および抗CaMKKβ 抗体(上, 右図)を用いたウエスタンブロッティング、および銀染色(下図)を行った。細胞抽出液(input)も同時にウエスタンブロッティング、および銀染色を行った。分子量マーカーは図の左側に示した。＊は CaMKK アイソフォームを示す。矢印は約 30 kDa の TIM-063 結合分子を示す。 (B) マウス小脳抽出液と TIM-063 の結合実験。2.25 mgのタンパク質を含むマウス小脳抽出液を Ca2+/CaM 存在下、TIM-127 セファロース(TIM-127-S)もしくはコントロー
ルセファロース(C)と混和した。 CaCl2 を含む洗浄液で洗浄を行った後、100 µM の TIM-063 を含む溶出液で溶出を行った。溶出サンプル(+TIM-063)に含まれる CaMKK は、抗 CaMKKα 抗体(上)および抗 CaMKKβ 抗体(下)を用いたウ
エスタンブロッティングによって検出した。マウス小脳抽出液(Input)およびセファロースとの結合後の上清(Unbound)も同時にウエスタンブロッティングを行った。分子量マーカーは図の左側に示した。＊は CaMKK アイソフ
ォームを示す。

TIM-063-CaMKKα結合の Ca2+/CaM 依存性
CaMKK は自身の調節領域によって触媒領域が阻害された不活性型構造と、Ca2+/CaM 複合体の結合によって自己阻害が解除された活性型構造の２つのコンホメーションが存在する。
TIM-063 は活性型構造の CaMKK に対して阻害活性を示す一方で、不活性型構造の CaMKK
69

に対する TIM-063 の相互作用は明らかとなっていない。そこで、作製した TIM-127 セフ
ァロース担体を用いて TIM-063-CaMKK 結合の Ca2+/CaM 依存性を検討した。大腸菌により発現・精製した GST-CaMKKαと、陰性対照として TIM-063 によって酵素活性が阻害されない GST-CaMKIαを含むキナーゼ溶液を Ca2+/CaM 条件下、および Ca2+キレート剤である EGTA 条件下において TIM-127 セファロース、もしくはコントロールセファロースと混和した。セファロースを十分に洗浄した後、セファロースに結合したキナーゼを TIM063 によって競合的に解離・溶出した。溶出されたキナーゼを抗 GST 抗体によるウエスタ
ンブロッティングによって検出した結果、GST-CaMKKαは Ca2+/CaM 条件下のみで TIM127 セファロースとの結合・溶出が確認された(Fig. 4A)。一方、TIM-063 によって阻害されない GST-CaMKIαは Ca2+/CaM 条件下、EGTA 条件下ともにセファロースとの結合・溶出が検出されず、TIM-127 セファロースは酵素への阻害能力に依存して CaMKKαと選択的に結合していることが確認できた。これらの結果より、TIM-063-CaMKK の結合はCa2+/CaM 複合体の結合に伴う CaMKK の構造変化に依存しており、活性型の CaMKK のみが TIM-063 と結合できることが示唆された。
不活性型構造の CaMKKαにおいて、触媒領域 (アミノ酸残基 126-434)は調節領域 (アミノ酸残基 438-463)によって阻害されることから[17]、不活性構造の CaMKK においては、調節領域が TIM-063 の触媒領域への結合を阻害していると考えられる。この仮説を検証するため、CaMKKαの触媒領域変異体 (GST-CaMKKα 126-434)を大腸菌により発現・精製
し、同様の結合実験を行った(Fig. 4B)。その結果、予測された通り CaMKKα触媒領域変異
体は Ca2+/CaM 条件下のみならず EGTA 条件下においても TIM-127 セファロースへの結合・溶出が確認され、CaMKKαの調節領域が TIM-063 の触媒領域への結合を妨げている
ことが示された(Fig. 4B)。

TIM-063 と CaMKK の可逆的相互作用
上記の結果より、TIM-063 は活性型構造の CaMKKαに対してのみ結合できることが示された。CaMKK は細胞内 Ca2+濃度変化に伴う Ca2+/CaM 複合体の結合・解離によって可逆的に構造変化を引き起こし、酵素活性を調節している。次に、活性型 CaMKK に結合した
TIM-063 が、CaMKK が不活性化状態に変化する際に解離するのか、または結合を保つのかについて検討した。Ca2+/CaM 存在下で活性化状態の GST-CaMKKαを TIM-127 セファ
ロースに結合させ、十分に洗浄を行った後に、EGTA を含む溶出液を加えることでセファ
ロースに結合した活性型 CaMKKαを不活性型構造に変化させた。その後、セファロースに70

残った CaMKKαを完全に溶出させるため、これまでと同様に遊離の TIM-063 による溶出を行った。セファロースから溶出された GST-CaMKKαを、抗 GST 抗体を用いたウエスタ
ンブロッティングによって検出した結果、EGTA によって全ての CaMKKαがセファロー
スから溶出されており、遊離の TIM-063 による溶出画分では CaMKKαは検出されなかった。この結果より、活性型構造の CaMKKαに結合した TIM-063 は、CaMKKαが不活性型構造に変化する際に CaMKKαから解離しており、CaMKKαと TIM-063 の結合は、CaMKK
αの構造変化に依存して可逆的であることが明らかとなった(Fig. 4C)。

Figure 4

TIM-063/CaMKK 複合体の Ca2+/CaM 依存的な結合特性(A) GST-CaMKKα(上)と GST-CaMKIα(下)を Ca2+/CaM 条件下(+)または EGTA 条件下(-)で、TIM-127 セファロー
ス(TIM-127-S)、もしくはコントロールセファロース(C)と混和した。CaCl2 もしくは EGTA を含む洗浄液で十分にセファロースを洗浄した後、100 µM の TIM-063 を含む溶出液を加え溶出を行った。その後、溶出サンプルに含まれるキナーゼを抗 GST 抗体を用いたウエスタンブロッティングによって検出した。分子量マーカーは図の左側に示した。
(B) GST-CaMKKα WT (上)と GST-CaMKKα 126-434 (下)を Ca2+/CaM 条件下(+)または EGTA 条件下(-)で、TIM127 セファロース(TIM-127-S)、もしくはコントロールセファロース(C)と混和した。CaCl2 もしくは EGTA を含む洗浄液で十分にセファロースを洗浄した後、100 µM の TIM-063 を含む溶出液を加え溶出を行った。その後、溶出サン
プルに含まれるキナーゼを抗 GST 抗体を用いたウエスタンブロッティングによって検出した。分子量マーカーは図の左側に示した。 (C) GST-CaMKKα を Ca2+/CaM 存在下で TIM-127 セファロースと混和し、その後 CaCl2 を含む洗浄
液で洗浄を行った。洗浄後、2 mM の EGTA を含む溶液を加えて溶出を行った後に(EGTA Elution)、100 µM の TIM063 による溶出を行った(+TIM-063)。溶出サンプルに含まれる GST-CaMKKα は抗 GST 抗体を用いたウエスタンブ
ロッティングによって検出した。＊は GST-CaMKKα を示す。分子量マーカーは図の左側に示した。

71

4.5 考察
3 章において、新規 CaMKK 阻害剤として TIM-063 を開発し、酵素反応速度論的な解析に
より TIM-063 が ATP 競合薬として作用することを見出した。一方、不活性化構造の CaMKK
は酵素活性を示さず阻害剤による酵素活性阻害の測定が不可能なため、不活性化状態の
CaMKK に対する TIM-063 の相互作用の解析は困難である。また CaMKK-TIM-063 の結合解離状態についても酵素活性測定からの検証も困難である。そこで本研究では、kinobeads
技術[112]に基づいて CaMKK 阻害剤 TIM-063 をセファロースに結合させた TIM-063 結合
セファロース(TIM-127 セファロース)を作製し、CaMKKα/TIM-063 複合体のより直接的な相互作用動態の解明を試みた(Fig. 2A)。 Kinobeads 法では非特異的キナーゼ阻害剤をセ
ファロースに固定化しているのに対して、本研究では TIM-063 をセファロースに固定化し、標的キナーゼ(CaMKK)との相互作用解析に応用した。作製した TIM-127 セファロース担
体は酵素を過剰発現させた培養細胞およびマウス組織抽出液において、標的キナーゼ(CaMKK)と効率的かつ選択的に結合することが確認された(Fig. 3)。また、TIM-127 セフ
ァロースの TIM-063 部位に結合した CaMKK は遊離の TIM-063 の添加により競合的に解離し、セファロースから溶出されることが確認された(Fig. 2B)。これらの結果より、TIM127 セファロースは CaMKKαとの非特異的な結合ではなく、酵素-阻害剤の相互作用を介して結合していると考えられる。
CaMKKαは Ca2+/CaM 複合体の結合により構造変化を引き起こし活性化するキナーゼのため[17]、CaMKKαと TIM-063 の結合は Ca2+/CaM 依存的な CaMKKαの活性化状態の影響を受ける可能性がある。そこで、TIM-063 と CaMKKαの結合における Ca2+/CaM 依存性を検討した結果、Ca2+/CaM 条件下でのみ TIM-127 セファロースへの結合が確認された。この結果より、TIM-063 は活性型構造の CaMKKα とのみ結合できることが明らかとなった(Fig. 4A)。また、CaMKKα の調節領域を取り除いた触媒領域変異体(GST-CaMKKα126-434)は、Ca2+/CaM 非存在下においても TIM-063 結合セファロースと結合した(Fig.
4B)。これらの結果から、不活性型 CaMKKα において、調節領域が TIM-063 の触媒領域への結合を妨げていることが示された。CaMKK の調節領域は反応速度論的な解析によってATP と競合的に触媒活性を抑制することが報告されており[17]、３章において TIM-063 は
CaMKK 調節領域と同様、ATP と競合的に CaMKK 活性を阻害することが明らかになっている[111]。本研究により得られた、CaMKK の調節領域が TIM-063 の触媒領域への結合を妨げる結果は、これまでの酵素速度論解析の結果を裏付けている。さらに、Ca2+/CaM 存在下においてセファロースに結合させた活性化状態の CaMKKαは、EGTA によって不活性72

化状態に戻る際にセファロースから解離することから、TIM-063 と CaMKKαの結合はCa2+/CaM 依存的な CaMKKαの構造変化に伴って可逆的であることが示された(Fig. 4C)。
これらの結果より、細胞内において、細胞内 Ca2+濃度が低い状態では TIM-063 は CaMKKと結合しておらず、細胞が刺激を受け細胞内 Ca2+濃度が上昇したときのみ CaMKK と結合していることが予想される。さらに、TIM-063 と CaMKKαの結合は細胞内の Ca2+濃度変化と、それに伴う CaMKKαの構造変化に対して可逆的であり、CaM と解離した CaMKKαの調節領域が触媒領域と相互作用する際に、触媒領域に結合していた TIM-063 が排除されることが示唆された(Fig. 5)。TIM-063 は STO-609 をリード化合物として得られた阻害剤であり、STO-609 および TIM-063 は共に ATP 拮抗薬であるため[67, 111]、STO-609 のCaMKK への相互作用動態も TIM-063 と類似していることが予測される。キナーゼの ATP
結合部位はキナーゼ間で非常に類似した構造を持つため、ATP 拮抗薬は標的キナーゼへの高選択性を得ることが難しい。しかし、キナーゼの調節メカニズムにはキナーゼ間で多様性があるため、標的キナーゼに特徴的な調節メカニズムを利用できれば、阻害剤の選択性を大きく向上させられる可能性がある。本研究によって得られた CaMKK の Ca2+/CaM 依存的な構造変化に伴う ATP 拮抗薬(TIM-063)の結合・解離動態における知見は、今後より高選択性を有する阻害剤の開発において重要なヒントになるであろう。
また、作製した TIM-127 セファロースは TIM-063 の標的分子である CaMKK と選択的に結合し、遊離の阻害剤によって競合的に溶出されることから(Fig. 3)、阻害剤セファロースによる阻害剤-相互作用分子の直接的相互作用分析法と質量分析によるタンパク質同定法を組み合わせることで、様々な細胞・組織抽出液から阻害剤の off-target 分子の網羅的同定が可能であることが期待される。実際に約 30 kDa の位置に COS-7 細胞抽出液中の off-target
分子とみられるバンドが確認されている(Fig. 3A)。CaMKK 阻害剤の off-target 分子の網羅的同定は、CaMKK 生理機能のより正確な薬理学的解析に重要であると考えられる。

73

Figure 5

CaMKK と TIM-063 の結合モデル

細胞内の Ca2+濃度が低いとき、CaMKK は自身の調節領域 (アミノ酸残基 438-463)が触媒領域 (アミノ酸残基 126434)と強固に結合した不活性型の構造をとっており、TIM-063 は CaMKK の触媒領域に結合することができない。細胞が刺激を受け細胞内の Ca2+濃度が上昇すると、Ca2+/CaM 複合体は CaMKK の調節領域に結合することで CaMKKの自己抑制を解除し、CaMKK は触媒領域が露出した活性型の構造に変化する。この構造変化により TIM-063 は
CaMKK の触媒領域に結合できるようになり、活性型 CaMKK の酵素活性を抑制する。細胞内の Ca2+濃度が低下すると CaMKK は不活性型の構造に変化し、これに伴い TIM-063 は CaMKK の触媒領域から解離する。図中の数字は rat
CaMKKα のアミノ酸残基を示している。CaM および apoCaM の構造はタンパク質構造データバンク (1UP5, 1CFD)から入手した。

74

5. 総括および今後の展望
Ca2+/Calmodulin (CaM)依存性タンパク質リン酸化酵素活性化キナーゼ(CaMKK)は細胞内カルシウムシグナル経路において上流に位置する重要なリン酸化酵素であり、下流基質
分子のリン酸化を介して神経発生や遺伝子発現、代謝調節など多岐にわたる生理機能を調節する。CaMKK の調節異常は双極性障害、統合失調症などの精神疾患や、前立腺がん、肝がんなどのがん細胞増殖に関与することが報告されている。本論文においては、細胞内における CaMKK の調節機構に関する研究、および CaMKK の過剰活性化を原因とする疾患の治療薬開発を目的とした新規 CaMKK 阻害剤の開発と相互作用解析を行った。
２章では、cAMP/PKA 経路による CaMKKβ(Thr144)の細胞内リン酸化調節を明らかにし、CaMKKβ(Thr144)が PKA によって直接リン酸化されることで Ca2+/CaM 依存性酵素に変換されることを見出した。生体内における CaMKKβの自発活性の意義についての詳細は未だ明らかとなっていないが、CaMKKβ自発活性の調節不全を引き起こす変異は、不安神経症や双極性障害に関与することが報告されていることから、CaMKKβを介した生理機
能調節において何らかの意味を持つことが予測される。本研究によって明らかとなった
cAMP/PKA 経路による CaMKKβ(Thr144)のリン酸化調節における知見は、今後 CaMKK
β自発活性調節の意義や、疾患への関与の解明に貢献できることが期待される。
３章では、CaMKK 阻害剤 STO-609 をリード化合物として、新規 pan-CaMKK 阻害剤
TIM-063 を見出した。STO-609 は CaMKKαと比較して CaMKKβに対して選択性を示す
ため、細胞内における CaMKKαの生理機能解明に用いることが困難であったが、本研究において CaMKKαとβの両方に対して同等の阻害活性を示す TIM-063 の開発に成功した。
TIM-063 は動物細胞内の CaMKK に対しても阻害活性を示し、膜透過性を有することが確認できたことから、CaMKK の生理機能解析および CaMKK の異常活性化を原因とする疾患の治療薬としての有用性が示唆された。さらに、TIM-063 の不活性類似体として TIM062 も見出し、TIM-063 の陰性対照として用いることで、CaMKK シグナル経路のより正確な薬理学的解析に貢献できることが期待される。また、ATP 結合ポケット内部の置換基を変更した今回の STO-609 誘導体からは、CaMKKαにのみ選択性を示す阻害剤は得られなかったが、CaMKKα/β両アイソフォームに対し同等の阻害効果が得られた TIM-063 をリード化合物として、さらに ATP ポケット外部の置換基を変化させることで、CaMKKαに対し選択性を示す阻害剤が得られるかもしれない。
4 章では、TIM-063 をセファロースに固定化した TIM-063 結合セファロース(TIM-127
セファロース)を作製し、用いることで、TIM-063-CaMKKα複合体の Ca2+/CaM 依存的な75

構造変化に伴う可逆的な結合/解離動態を明らかにした。TIM-063 は ATP 拮抗薬であるが、標的キナーゼに特徴的な調節メカニズムを利用できれば、阻害剤の選択性を大きく向上させられる可能性がある。本研究によって得られた知見は、今後より高選択性を有する阻害剤の開発において重要な手がかりとなることが期待される。また、TIM-127 セファロースはTIM-063 の標的分子である CaMKKαおよび CaMKKβと選択的に結合することから、質量分析によるタンパク質同定法と組み合わせることで、TIM-063 の off-target 分子の網羅的同定が可能になることが期待される。さらに、本手法は他の薬物においても、セファロー
スに固定化させることができれば応用が可能であると考えられる。疾患の新たな治療薬を開発し実用化に移す際、新規薬剤の安全性や薬物動態の解明に多くの時間と費用が必要になる。薬物の標的分子以外への相互作用(副作用)と新規な薬効とは表裏の関係にあるため、
off-target 分子の網羅的同定技術の開発は既存薬の再開発(Drug repositioning)につながることが期待される。

76

6. 謝辞はじめに、本研究を遂行するにあたり終始温かいご指導や本論文の副査のみならず、研究以外のサポートをしていただきました岡山大学 大学院ヘルスシステム統合科学研究科 細胞機能設計学研究室 徳光 浩 教授には厚く御礼申し上げます。本論文の主査の労を賜った
岡山大学 大学院ヘルスシステム統合科学研究科 生体分子工学研究室 大槻 高史 教授ならびに、副査の労を賜った岡山大学 大学院ヘルスシステム統合科学研究科 １分子生物化学研究室 井出 徹 教授には本論文の完遂にあたり、様々なご協力とご指導をいただきましたことを心より感謝申し上げます。
研究面ならびに研究面以外のサポートと日ごろから多くの助言とご指導を頂いた、岡山大学 大学院ヘルスシステム統合科学研究科 細胞機能設計学研究室 金山 直樹 准教授、曲正樹 助教、波多野 直哉 特任講師には心より感謝申し上げます。また、本論文の完遂にあたり様々なご支援とご協力を頂いた、平田 裕子 技術職員に深く感謝申し上げます。また多くのご協力とサポートをしていただいた細胞機能設計学研究室の皆様の助けにより本論文を完遂できましたことを、心より感謝申し上げます。
また、新規化合物設計の相談や合成をお引き受けいただきました、岡山大学 大学院教育学研究科 有機化学研究室 石川 彰彦 教授、ならびに石川研究室の皆様に心より感謝申し上げます。
最後に、長きにわたり学生生活の支援ならびに本研究の完遂に集中させていただいた家族に心から感謝いたします。

77

7. 発表論文(筆頭著者論文)
1) Takabatake S*, Ohtsuka S*, Sugawara T, Hatano N, Kanayama N, Magari M, Sakagami H, andTokumitsu H, Regulation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase β

bycAMP signaling. Biochim Biophys Acta Gen Subj, 2019. 1863(4): p. 672-680 (equal
contribution*)

2) Ohtsuka S, Ozeki Y, Fujiwara M, Miyagawa T, Kanayama N, Magari M, Hatano N, Suizu F,
Ishikawa T, and Tokumitsu H, Development and characterization of novel molecular probes

for Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase derived from STO-609. Biochemistry,
2020. 59(17): p. 1701-1710.

3) Ohtsuka S, Okumura T, Τabuchi Y, Miyagawa T, Kanayama N, Magari M, Hatano N,
Sakagami H, Suizu F, Ishikawa T, and Tokumitsu H, Conformation-dependent reversible

interaction of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase with an inhibitor, TIM-063.
Biochemistry, 2022 in press.

(共著者論文)1) Takabatake S, Fukumoto Y, Ohtsuka S, Kanayama N, Magari M, Sakagami H, Hatano N, andTokumitsu H, Phosphorylation and dephosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent

protein kinase kinaseβ at Thr144 in HeLa cells, Biochem Biophys Res Commun, 2020. 525:
p. 251-257.

2) Doi S, Fujioka N, Ohtsuka S, Kondo R, Yamamoto M, Denda M, Magari M, Kanayama N,
Hatano N, Morishita R, Hasegawa T, and Tokumitsu H, Regulation of the tubulin

polymerization-promoting protein by Ca2+/S100 proteins. Cell Calcium, 2021. 96: p. 102404.

3) Fukumoto Y, Harada Y, Ohtsuka S, Kanayama N, Magari M, Hatano N, Sakagami H, andTokumitsu H, Oligomerization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase. Biochem
Biophys Res Commun, 2022. 587: p. 160-165.

78

8. 参考文献
1.

Clapham, D.E., Calcium signaling. Cell, 2007. 131(6): p. 1047-58.

2.

Clapham, D.E., Calcium signaling. Cell, 1995. 80(2): p. 259-68.

3.

Carafoli, E. and J. Krebs, Why Calcium? How Calcium Became the Best Communicator. J
Biol Chem, 2016. 291(40): p. 20849-20857.

4.

Wayman, G.A., et al., Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase

I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron, 2006. 50(6):p. 897-909.
5.

Glazewski, S., et al., Requirement for α-CaMKII in experience-dependent plasticity ofthe barrel cortex. Science, 1996. 272(5260): p. 421-3.
6.

Ageta-Ishihara, N., et al., Control of cortical axon elongation by a GABA-driven

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase cascade. J Neurosci, 2009. 29(43): p. 137209.
7.

Chin, D. and A.R. Means, Calmodulin: a prototypical calcium sensor. Trends Cell Biol,
2000. 10(8): p. 322-8.

8.

Venter, J.C., et al., The sequence of the human genome. Science, 2001. 291(5507): p.
1304-51.

9.

Manning, G., et al., The protein kinase complement of the human genome. Science, 2002.
298(5600): p. 1912-34.

10.

Schulman, H. and P. Greengard, Ca2+-dependent protein phosphorylation system inmembranes from various tissues, and its activation by "calcium-dependent regulator".
Proc Natl Acad Sci U S A, 1978. 75(11): p. 5432-6.
11.

Takemoto-Kimura, S., et al., Calmodulin kinases: essential regulators in health and disease.
J Neurochem, 2017. 141(6): p. 808-818.

12.

Tokumitsu, H., et al., Activation mechanisms for Ca2+/calmodulin-dependent protein

kinase IV. Identification of a brain CaM-kinase IV kinase. J Biol Chem, 1994. 269(46): p.
28640-7.
13.

Tokumitsu, H., H. Enslen, and T.R. Soderling, Characterization of a Ca2+/calmodulin-

dependent

proteinkinasecascade.

Molecular

cloningandexpressionofcalcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase. J Biol Chem, 1995. 270(33): p.
19320-4.
14.

Okuno, S. and H. Fujisawa, Requirement of Brain Extract for the Activity of Brain

Calmodulin - Dependent Protein Kinase IV Expressed in Escherichia Coli. Journal of
Biochemistry, 1993. 114(2): p. 167-170.
15.

Kitani, T., S. Okuno, and H. Fujisawa, Molecular cloning of Ca2+/calmodulin-dependent79

protein kinase kinase β. J Biochem, 1997. 122(1): p. 243-50.
16.

Anderson, K.A., et al., Components of a calmodulin-dependent protein kinase cascade.

Molecular

cloning,functional

characterizationandcellular

localizationofCa2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase β. J Biol Chem, 1998. 273(48): p.
31880-9.
17.

Tokumitsu, H., et al., Regulatory mechanism of Ca2+/calmodulin-dependent protein

kinase kinase. J Biol Chem, 2000. 275(26): p. 20090-5.
18.

Green, M.F., et al., Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase β is regulated bymultisite phosphorylation. J Biol Chem, 2011. 286(32): p. 28066-79.
19.

Nakanishi, A., et al., AMP-activated protein kinase-mediated feedback phosphorylation

controls the Ca2+/calmodulin (CaM) dependence of Ca2+/CaM-dependent protein kinasekinase β. J Biol Chem, 2017. 292(48): p. 19804-19813.
20.

Woods, A., et al., Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase β acts upstream of

AMP-activated protein kinase in mammalian cells. Cell Metab, 2005. 2(1): p. 21-33.
21.

Hawley, S.A., et al., Calmodulin-dependent protein kinase kinase β is an alternative

upstream kinase for AMP-activated protein kinase. Cell Metab, 2005. 2(1): p. 9-19.
22.

Hurley, R.L., et al., The Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinases are AMP-

activated protein kinase kinases. J Biol Chem, 2005. 280(32): p. 29060-6.
23.

Sakagami, H., et al., Distinct immunohistochemical localization of two isoforms of

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinases in the adult rat brain. Eur J Neurosci,
2000. 12(1): p. 89-99.
24.

Mizuno, K., et al., Ca2+/calmodulin kinase kinase α is dispensable for brain development

but is required for distinct memories in male, though not in female, mice. Mol Cell Biol,
2006. 26(23): p. 9094-104.
25.

Peters, M., et al., Loss of Ca2+/calmodulin kinase kinase β affects the formation of some,

but not all, types of hippocampus-dependent long-term memory. J Neurosci, 2003.
23(30): p. 9752-60.
26.

Nairn, A.C. and P. Greengard, Purification and characterization of Ca2+/calmodulin-

dependent protein kinase I from bovine brain. J Biol Chem, 1987. 262(15): p. 7273-81.
27.

Yokokura, H., et al., Isolation and comparison of rat cDNAs encoding Ca2+/calmodulin-

dependent protein kinase I isoforms. Biochim Biophys Acta, 1997. 1338(1): p. 8-12.
28.

Takemoto-Kimura, S., et al., Molecular cloning and characterization of CLICK-III/CaMKIγ, a novel membrane-anchored neuronal Ca2+/calmodulin-dependent protein
kinase (CaMK). J Biol Chem, 2003. 278(20): p. 18597-605.
29.

Suizu, F., et al., Characterization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I as amyosin II regulatory light chain kinase in vitro and in vivo. Biochem J, 2002. 367(Pt 2): p.

80

335-45.
30.

Saneyoshi, T., et al., Activity-dependent synaptogenesis: regulation by a CaM-kinasekinase/CaM-kinase I/βPIX signaling complex. Neuron, 2008. 57(1): p. 94-107.
31.

Sun, Z., et al., Organization and analysis of the complete rat calmodulin-dependent

protein kinase IV gene. J Biol Chem, 1995. 270(49): p. 29507-14.
32.

Nakamura, Y., et al., An immunohistochemical study of Ca2+/calmodulin-dependent

protein kinase IV in the rat central nervous system: light and electron microscopic
observations. Neuroscience, 1995. 68(1): p. 181-94.
33.

Enslen, H., et al., Characterization of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV. Rolein transcriptional regulation. J Biol Chem, 1994. 269(22): p. 15520-7.
34.

Miranti, C.K., et al., Calcium activates serum response factor-dependent transcription bya Ras- and Elk-1-independent mechanism that involves a Ca2+/calmodulin-dependent
kinase. Mol Cell Biol, 1995. 15(7): p. 3672-84.
35.

Miska, E.A., et al., Differential localization of HDAC4 orchestrates muscle differentiation.
Nucleic Acids Res, 2001. 29(16): p. 3439-47.

36.

Bito, H., K. Deisseroth, and R.W. Tsien, CREB phosphorylation and dephosphorylation:a Ca2+- and stimulus duration-dependent switch for hippocampal gene expression. Cell,
1996. 87(7): p. 1203-14.
37.

Silva, A.J., et al., CREB and memory. Annu Rev Neurosci, 1998. 21: p. 127-48.

38.

Gowans, G.J. and D.G. Hardie, AMPK: a cellular energy sensor primarily regulated by

AMP. Biochem Soc Trans, 2014. 42(1): p. 71-5.
39.

Hawley, S.A., et al., Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRAD α/β andMO25 α/β are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade. J Biol,
2003. 2(4): p. 28.
40.

Woods, A., et al., LKB1 is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinasecascade. Curr Biol, 2003. 13(22): p. 2004-8.
41.

Shaw, R.J., et al., The tumor suppressor LKB1 kinase directly activates AMP-activatedkinase and regulates apoptosis in response to energy stress. Proc Natl Acad Sci U S A,
2004. 101(10): p. 3329-35.
42.

Anderson, K.A., et al., Hypothalamic CaMKK2 contributes to the regulation of energybalance. Cell Metab, 2008. 7(5): p. 377-88.
43.

Tamás, P., et al., Regulation of the energy sensor AMP-activated protein kinase by antigen

receptor and Ca2+ in T lymphocytes. J Exp Med, 2006. 203(7): p. 1665-70.
44.

Shaw, R.J., et al., The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic

effects of metformin. Science, 2005. 310(5754): p. 1642-6.
45.

Zhou, G., et al., Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action.

81

J Clin Invest, 2001. 108(8): p. 1167-74.
46.

Duca, F.A., et al., Metformin activates a duodenal Ampk-dependent pathway to lower

hepatic glucose production in rats. Nat Med, 2015. 21(5): p. 506-11.
47.

Ding, L., et al., Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature,
2008. 455(7216): p. 1069-75.

48.

Carretero, J., et al., Dysfunctional AMPK activity, signalling through mTOR and survival

in response to energetic stress in LKB1-deficient lung cancer. Oncogene, 2007. 26(11):p. 1616-25.
49.

Huang, Y.H., et al., Decreased expression of LKB1 correlates with poor prognosis in

hepatocellular carcinoma patients undergoing hepatectomy. Asian Pac J Cancer Prev,
2013. 14(3): p. 1985-8.
50.

Zheng, L., et al., Prognostic significance of AMPK activation and therapeutic effects of

metformin in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res, 2013. 19(19): p. 5372-80.
51.

Scott, J.W., et al., Autophosphorylation of CaMKK2 generates autonomous activity that is

disrupted by a T85S mutation linked to anxiety and bipolar disorder. Sci Rep, 2015. 5: p.
14436.
52.

Luo, X.J., et al., Convergent lines of evidence support CAMKK2 as a schizophrenia

susceptibility gene. Mol Psychiatry, 2014. 19(7): p. 774-83.
53.

Lin, F., et al., The CaMKK2/CaMKIV relay is an essential regulator of hepatic cancer.
Hepatology, 2015. 62(2): p. 505-20.

54.

Massie, C.E., et al., The androgen receptor fuels prostate cancer by regulating central

metabolism and biosynthesis. EMBO J, 2011. 30(13): p. 2719-33.
55.

Frigo, D.E., et al., CaM kinase kinase β-mediated activation of the growth regulatory

kinase AMPK is required for androgen-dependent migration of prostate cancer cells.
Cancer Res, 2011. 71(2): p. 528-37.
56.

Lin, C., et al., Inhibition of CAMKK2 impairs autophagy and castration-resistant prostatecancer via suppression of AMPK-ULK1 signaling. Oncogene, 2021. 40(9): p. 1690-1705.
57.

Jin, L., et al., The PLAG1-GDH1 Axis Promotes Anoikis Resistance and Tumor

Metastasis through CamKK2-AMPK Signaling in LKB1-Deficient Lung Cancer. Mol Cell,2018. 69(1): p. 87-99 e7.
58.

Braun, T.P., C.A. Eide, and B.J. Druker, Response and Resistance to BCR-ABL1-

Targeted Therapies. Cancer Cell, 2020. 37(4): p. 530-542.
59.

Tanaka, Y., K. Maeshima, and K. Yamaoka, In vitro and in vivo analysis of a JAK inhibitorin rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 2012. 71 Suppl 2: p. i70-4.
60.

木下, 誉., キナーゼを標的とした構造生物学および創薬の現状. 日本結晶学会誌, 2017.
59(4): p. 174-181.

82

61.

Gavrin, L.K. and E. Saiah, Approaches to discover non-ATP site kinase inhibitors.
MedChemComm, 2013. 4(1): p. 41-51.

62.

Wakeling, A.E., et al., ZD1839 (Iressa): an orally active inhibitor of epidermal growth

factor signaling with potential for cancer therapy. Cancer research, 2002. 62(20): p. 57495754.
63.

Yun, C.H., et al., Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor

complexes: mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.
Cancer Cell, 2007. 11(3): p. 217-27.
64.

Schindler, T., et al., Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine

kinase. Science, 2000. 289(5486): p. 1938-42.
65.

Ohren, J.F., et al., Structures of human MAP kinase kinase 1 (MEK1) and MEK2 describe

novel noncompetitive kinase inhibition. Nat Struct Mol Biol, 2004. 11(12): p. 1192-7.
66.

Rabindran, S.K., et al., Antitumor activity of HKI-272, an orally active, irreversible

inhibitor of the HER-2 tyrosine kinase. Cancer Res, 2004. 64(11): p. 3958-65.
67.

Tokumitsu, H., et al., STO-609, a specific inhibitor of the Ca2+/calmodulin-dependent

protein kinase kinase. J Biol Chem, 2002. 277(18): p. 15813-8.
68.

Tokumitsu, H., et al., A single amino acid difference between α and β Ca2+/calmodulin-

dependent protein kinase kinase dictates sensitivity to the specific inhibitor, STO-609. J
Biol Chem, 2003. 278(13): p. 10908-13.
69.

Wayman, G.A., et al., Regulation of axonal extension and growth cone motility bycalmodulin-dependent protein kinase I. J Neurosci, 2004. 24(15): p. 3786-94.
70.

Kitazawa, T., et al., A temporal Ca2+ desensitization of myosin light chain kinase in phasicsmooth muscles induced by CaMKKβ/PP2A pathways. Am J Physiol Cell Physiol, 2021.
321(3): p. C549-c558.
71.

Bain, J., et al., The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update. Biochem J,
2007. 408(3): p. 297-315.

72.

Soderling, T.R. and J.T. Stull, Structure and regulation of calcium/calmodulin-dependent

protein kinases. Chem Rev, 2001. 101(8): p. 2341-52.
73.

Means, A.R., The Year in Basic Science: calmodulin kinase cascades. Mol Endocrinol,
2008. 22(12): p. 2759-65.

74.

Kimura, Y., et al., A CaMK cascade activates CRE-mediated transcription in neurons of

Caenorhabditis elegans. EMBO Rep, 2002. 3(10): p. 962-6.
75.

Joseph, J.D. and A.R. Means, Identification and characterization of two Ca 2+/CaM-

dependent protein kinases required for normal nuclear division in Aspergillus nidulans. J
Biol Chem, 2000. 275(49): p. 38230-8.
76.

Ghislat, G., et al., Withdrawal of essential amino acids increases autophagy by a pathway

83

involving Ca2+/calmodulin-dependent kinase kinase-β (CaMKK-β). J Biol Chem, 2012.
287(46): p. 38625-36.
77.

York, B., et al., Pharmacological inhibition of CaMKK2 with the selective antagonist STO-

609 regresses NAFLD. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 11793.
78.

Tokumitsu, H. and T.R. Soderling, Requirements for calcium and calmodulin in thecalmodulin kinase activation cascade. J Biol Chem, 1996. 271(10): p. 5617-22.
79.

Tokumitsu, H., et al., Generation of autonomous activity of Ca2+/calmodulin-dependent

protein kinase kinase β by autophosphorylation. Biochemistry, 2011. 50(38): p. 8193201.
80.

Wayman, G.A., H. Tokumitsu, and T.R. Soderling, Inhibitory cross-talk by cAMP kinaseon the calmodulin-dependent protein kinase cascade. J Biol Chem, 1997. 272(26): p.
16073-6.
81.

Matsushita, M. and A.C. Nairn, Inhibition of the Ca2+/calmodulin-dependent protein

kinase I cascade by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem, 1999. 274(15): p.
10086-93.
82.

Davare, M.A., et al., Inhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinaseby protein 14-3-3. J Biol Chem, 2004. 279(50): p. 52191-9.
83.

Tokumitsu, H., et al., Differential regulatory mechanism of Ca2+/calmodulin-dependent

protein kinase kinase isoforms. Biochemistry, 2001. 40(46): p. 13925-32.
84.

Tokumitsu, H., et al., Mechanism of the generation of autonomous activity of

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV. J Biol Chem, 2004. 279(39): p. 40296-302.
85.

Marcelo, K.L., A.R. Means, and B. York, The Ca2+/Calmodulin/CaMKK2 Axis: Nature's

Metabolic CaMshaft. Trends Endocrinol Metab, 2016. 27(10): p. 706-718.
86.

Psenakova, K., et al., 14-3-3 protein directly interacts with the kinase domain of

calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase (CaMKK2). Biochim Biophys Acta
Gen Subj, 2018. 1862(7): p. 1612-1625.
87.

Knighton, D.R., et al., Structure of a peptide inhibitor bound to the catalytic subunit ofcyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Science, 1991. 253(5018): p.
414-20.
88.

Kakiuchi, S., et al., Quantitative determinations of calmodulin in the supernatant andparticulate fractions of mammalian tissues. J Biochem, 1982. 92(4): p. 1041-8.
89.

Schumacher, A.M., et al., A calmodulin-regulated protein kinase linked to neuron survival

is a substrate for the calmodulin-regulated death-associated protein kinase. Biochemistry,
2004. 43(25): p. 8116-24.
90.

Osawa, M., et al., A novel target recognition revealed by calmodulin in complex with Ca2+-

calmodulin-dependent kinase kinase. Nat Struct Biol, 1999. 6(9): p. 819-24.

84

91.

Hook, S.S. and A.R. Means, Ca2+/CaM-dependent kinases: from activation to function.
Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2001. 41: p. 471-505.

92.

Wayman, G.A., et al., Calmodulin-kinases: modulators of neuronal development andplasticity. Neuron, 2008. 59(6): p. 914-31.
93.

Yano, S., H. Tokumitsu, and T.R. Soderling, Calcium promotes cell survival through CaM-

K kinase activation of the protein-kinase-B pathway. Nature, 1998. 396(6711): p. 584-7.
94.

Chen, B.C., et al., Inhibition of interleukin-1β -induced NF-kappa B activation by

calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase occurs through Akt activation
associated with interleukin-1 receptor-associated kinase phosphorylation and uncouplingof MyD88. J Biol Chem, 2002. 277(27): p. 24169-79.
95.

Schmitt, J.M., et al., CaM kinase control of AKT and LNCaP cell survival. J Cell Biochem,2012. 113(5): p. 1514-26.

96.

Gocher, A.M., et al., Akt activation by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase

2 (CaMKK2) in ovarian cancer cells. J Biol Chem, 2017. 292(34): p. 14188-14204.
97.

Nakamuta, S., et al., Local application of neurotrophins specifies axons through inositol

1,4,5-trisphosphate, calcium, and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases. Sci Signal,
2011. 4(199): p. ra76.
98.

Horigane, S., et al., Facilitation of axon outgrowth via a Wnt5a-CaMKK-CaMKIαpathway during neuronal polarization. Mol Brain, 2016. 9(1): p. 8.
99.

Anderson, K.A., et al., Deletion of CaMKK2 from the liver lowers blood glucose andimproves whole-body glucose tolerance in the mouse. Mol Endocrinol, 2012. 26(2): p.
281-91.
100.

Karacosta, L.G., et al., A regulatory feedback loop between Ca2+/calmodulin-dependent

protein kinase kinase 2 (CaMKK2) and the androgen receptor in prostate cancer
progression. J Biol Chem, 2012. 287(29): p. 24832-43.
101.

Fortin, D.A., et al., Long-term potentiation-dependent spine enlargement requires

synaptic Ca2+-permeable AMPA receptors recruited by CaM-kinase I. J Neurosci, 2010.
30(35): p. 11565-75.
102.

Tinsley, C.J., et al., A role for the CAMKK pathway in visual object recognition memory.
Hippocampus, 2012. 22(3): p. 466-76.

103.

Sato, K., et al., Regulation of osteoclast differentiation and function by the CaMK-CREB

pathway. Nat Med, 2006. 12(12): p. 1410-6.
104.

Park, D., et al., Activation of CaMKIV by soluble amyloid-β1-42 impedes trafficking of

axonal vesicles and impairs activity-dependent synaptogenesis. Sci Signal, 2017. 10(487).
105.

Hawley, S.A., et al., Use of cells expressing γ subunit variants to identify diverse

mechanisms of AMPK activation. Cell Metab, 2010. 11(6): p. 554-65.

85

106.

Racioppi, L., et al., CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive

microenvironment in breast cancer. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 2450.
107.

Price, D.J., et al., An orally available, brain-penetrant CAMKK2 inhibitor reduces foodintake in rodent model. Bioorg Med Chem Lett, 2018. 28(10): p. 1958-1963.
108.

Fujiwara, Y., et al., Analysis of Distinct Roles of CaMKK Isoforms Using STO-609-

Resistant Mutants in Living Cells. Biochemistry, 2015. 54(25): p. 3969-77.
109.

Kukimoto-Niino, M., et al., Crystal structure of the Ca2+/calmodulin-dependent protein

kinase kinase in complex with the inhibitor STO-609. J Biol Chem, 2011. 286(25): p.
22570-9.
110.

Santiago, A.D.S., et al., Structural Analysis of Inhibitor Binding to CAMKK1 Identifies

Features Necessary for Design of Specific Inhibitors. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 14800.
111.

Ohtsuka, S., et al., Development and Characterization of Novel Molecular Probes for

Ca2+/Calmodulin-Dependent

Protein

KinaseKinase,Derivedfrom

STO-609.

Biochemistry, 2020. 59(17): p. 1701-1710.
112.

Bantscheff, M., et al., Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action ofclinical ABL kinase inhibitors. Nat Biotechnol, 2007. 25(9): p. 1035-44.

86