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トピックス〔ビタミン 96 巻

トピックス

シロイヌナズナに発現させたリコンビナントヒト内因子の有用性
Usefulness of recombinant human intrinsic factor expressed in the plant
Arabidopsis thaliana

ヒトにおけるビタミン B12（以下，VB12）の吸収およの安定性が高いことなどがある．シロイヌナズナに発び取り込みの概略は以下の通りである．食物中の VB12

現させた rhIF とヒト胃液中の IF との同一性を調べると，は多くの場合タンパク質と結合して存在している．ヒ

両者とも SDS-PAGE 上で 50 kDa にタンパク質のバンド

トが食物を摂取すると，VB12 は上部消化管で胃酸と酵を示す，結合特性に関しては，両者とも哺乳動物にお素の作用によってタンパク質から遊離し，唾液腺からいて VB12 としての生理活性があるコバラミンと強く結分泌されるハプトコリン（haptocorrin，以下，HC）と結合するが，活性がないコビンアミドとは親和性が低かっ合する．HC-VB12 は十二指腸で膵液中の酵素によってた，IF に特異的なリセプターである CUBN との結合性消化され，遊離した VB12 は次に胃の壁細胞から分泌では，両者とも結合の K＋（nM−1・s−1）および K−（s−1）

さ れ た 内 因 子（intrinsic factor， 以 下，IF）と 結 合 し てがいずれも 10−4 オーダーの近似した値を示し CUBNIF-VB12 複合体（ホロ IF）を形成する．この複合体は腸との解離定数（Kd）も両者の間で近似していた，など

管を下降し，回腸の腸細胞を横切って体内に移行する．

の結果から，シロイヌナズナを使って発現した rhIF は

IF-VB12 複合体はエンドサイトシスによって取り込ま

ヒト胃液中の IF と性質や機能が一致していると考え

れ る が， 移 行 は 膜 貫 通 タ ン パ ク 質 ア ム ニ オ ン レ ス

られた．遺伝子組み換え体シロイヌナズナを栽培し，（CUBAM）に結合した IF-VB12 受容体（キュビリン，以その種子を採取して次代を生育させることを繰り返せ

下 CUBN）の介助による．続いて IF はリソソームのタば極めて大量の rhIF を得ることが可能なので，rhIF を

ンパク質消化酵素によって分解され，VB12 は遊離の形，

IF と同一のものとして扱うことができれば利用範囲は

あるいはトランスコバラミン（transcobalamin，以下，

大きく広がると考えられる．Fedosov らの rhIF 産生のTC）に結合した形で血液中に放出される．VB12 を必要

成功 2）以降，それを実用的に利用するためにどのようとする細胞はホロ TC 受容体，すなわち CD320 を発現な研究がおこなわれているのか，そしてシロイヌナズ

している．取り込まれた TC-VB12 の TC はリソソーム

ナ産生 rhIF の特長をどのように活用してきたのかを以酵素によって分解され，遊離した VB12 は細胞に利用

下に紹介する．

される．このように IF は食物中の VB12 を吸収するために重要な役割を担っているが，その IF の性質・性状や作用機序はまだ完全には解明されていない．IF がヒトの胃液 1L（≒ 1 kg）中にわずか 3 mg 程度しか含ま
1）

rhIF は IF に替わって経口投与した VB12 吸収を助ける
冒頭に述べたように，胃から分泌される IF は消化れていない微量成分 であることが研究進展の大きな管で食物中の VB12 を吸収するために大きな役割を果障害となっている．

たしている．したがって，rhIF が IF と同じように腸管以前著者らは，Fedosov ら 2）がこの微量成分であるにおける VB12 吸収を助けるかどうかは臨床上大きな

ヒトの IF 遺伝子を高等植物であるシロイヌナズナ問題であるが，これを知るためには VB12 吸収試験を（Arabidopsis thaliana）に組み込んでリコンビナントヒ

行って rhIF の効果を調べればよい．VB12 吸収試験にト IF（以下，rhIF）を発現させることに成功したことをは従来 Schilling test が広く採用されてきた．この試験

この欄で紹介した 3）．シロイヌナズナに rhIF を発現さ

法は放射性 57Co・VB12 あるいは 57Co・VB12＋IF を経口せるメリットとして，①必要経費が大変少ないこと，②投与し，57Co・VB12 を単独投与した場合に吸収されず，大量に得られること，③得られる rhIF が VB12 を結合しIF を加えたときに 57Co・VB12 が吸収されるなら VB12ていない遊離型（アポ IF）であること，④得られた rhIF

吸収過程の欠陥は IF の分泌に異常があると判定する

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トピックス

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方法である．この試験法は感度が良いが放射性の 57Coてしまう．また，IF を結合タンパク質として使用したで標識した VB12 を使用するので近年実施することが場合でも，それに TC や HC が混入していると真の値よ困難になりつつあるため，これに代わる試験法が求めり高い値が示される 8）．一方，植物由来の Fedosov らられ，血清中で VB12 を結合・輸送する TC が注目されの rhIF には TC や HC が混入することがないので正確た．血液中で VB12 を結合している TC（ホロ TC）の濃な測定値が得られる．rhIF が得られる以前に使用して度が，近い過去に経口投与された VB12 の吸収量を反映いた VB12 結合タンパク質は動物由来であるため，抽することが示されたので 4）-6），これを VB12 吸収の指標

出した VB12 結合タンパク質の一部分は内在性の VB127）で既に飽和されていることが多いので，測定感度を低はこの方法で rhIF の効果を試験した．VB12 による治療下させる．VB12 要求性の代謝経路がない植物は体内にを受けたことがなかった明白な VB12 欠乏患者に VB12

VB12 を持っていないため Fedosov らの rhIF には VB12

単独を与えた場合，ホロ TC 濃度の上昇幅はごく僅か

飽和 IF が含まれていない．これらのことから結合タだったが，VB12 と rhIF を同時に与えると上昇幅が 3

ンパク質への競合的結合を利用する VB12 測定法には倍に増大した．VB12 含有量が少ない食餌を摂取してきFedosov らの rhIF が理論的に最適であると考えられる．

た被検者，あるいは消化能力の低下などが VB12 欠乏

そこで彼らは rhIF を使用して，VB12 が正しく測定でとして利用するようになってきたのである．Hvas らの理由である被検者では，VB12 を単独で与えただけできることを確認する実験を行った．すなわち，競合的

血清中ホロ TC 濃度が大きく上昇した．先天的 CUBN

結合を利用して VB12 を測定するタイプの Axos-Shield

欠損症のように吸収機能に障害がある被検者では VB12

キットを使用し，測定キットを使用して VB12 を測定

単独，および VB12 と rhIF 同時投与のいずれの場合にした結果と，キット中に VB12 結合タンパク質としておいても血中ホロ TC 濃度上昇はみられなかった．以含まれているブタ IF を磁気ビーズ（Dynabeads）に連結

上述べたように VB12 吸収過程において rhIF が IF と同した rhIF で置き換えた場合に得られた結果を比較する

様に生理活性を示すことが認められた．この試験法で実験を行った．その結果，検量線は VB12 濃度が 0 –は Schilling test に比べて大量の IF を必要とすることが160 pmol/L の範囲をカバーできた．ヒト血清と VB12欠点であるが，その問題は rhIF が大量に得られること

標準液を試料として用い VB12 測定結果を比較すると，キットの方法で得られた VB12 測定結果を x，nhIF で置により解決できた．注目に値することは，彼らが rhIF
標品として使用したのは遺伝子組み替え処理をしたシ

き換えた場合の測定結果を y として，ヒト血清（n＝ロイヌナズナの葉の乾燥物そのものであることで，そ71）で は y＝1.05 x＋2.8 pmol/L（ 相 関 係 数 r＝0.98），
VB12 標 準 液（n＝25）で は y＝0.99 x＋1.7 pmol/ L（r＝の乾燥物中の IF 活性は 18 か月間貯蔵しても減少しな
ヌナズナが悪性貧血の治療へ応用されることが期待さ

0.99），ヒト血清と VB12 標準液の両方合わせると y＝
1.04 x＋2.2 pmol/ L（r＝0.98）と い う 結 果 が 得 ら れ た．

れる．

さらに，検量線の範囲内での測定内変動は VB12 の低

かったという．今後 rhIF を含む遺伝子組み換えシロイ

VB12 測定の際に rhIF を VB12 結合タンパク質として利用する〜高濃度範囲で 3 〜 8％であり，本来の測定法キット
について報告されている 10％以下という値と同等だった．このように VB12 結合タンパク質を rhIF で置き替

臨床医学において VB12 を測定する際にもっとも普えて測定した結果は本来のキットで測定した場合と同通に使われる方法は，特異的な結合タンパク質を用い一と見なされたので，rhIF は競合的結合を利用するて，試料中の VB12 と標識した純正の VB12 が競合的にVB12 測定法に使用する結合タンパク質として適してい

結合タンパク質と結合することを利用する．VB12 を特ると結論できるとしている．

異的に結合するタンパク質は①胃液や胃粘膜中の IF，②血清中の TC，③唾液などに含まれる HC であるが，IF 抗体の測定

これら利用する場合いくつかの問題を伴う．そのひと始めにヒトの VB12 吸収における IF 抗体の関与につつはこれらのタンパク質を精製することが難しいこと

いて概説する．VB12 欠乏をきたす代表的疾患の一つでである．ヒト IF はヒトにおいて生理的活性があるコ

ある悪性貧血に至る原因は VB12 供給不足の他に VB12

バラミンのみを特異的に結合するが，ヒト TC と HC

吸収不全がある．吸収不全の原因はいくつもあるがそはコバラミン以外の多くの類似体にも結合してしまの一つに悪性貧血患者の血清や胃液にかなり高頻度にう．したがって VB12 測定の際，結合タンパクとして検出される IF 抗体による吸収阻害がある．IF 抗体は 2

TC や HC を使用すると，測定結果が不正な高値を示し

種類存在し，Ⅰ型（阻止抗体）は IF の VB12 結合部位を

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トピックス

〔ビタミン 96 巻

ブロックすることで VB12 吸収を阻害する．Ⅱ型（結合な役割を果たしているが，これまで IF を CUBN 標的抗体）は IF-VB12 複合体に結合して IF の形態を変化さ指向の「運び屋」として体系的に利用することを検討すせるので，複合体が回腸のリセプターに結合できなくる研究は行われてこなかった．薬物を運ぶために VB12なり，結局 VB12 吸収を阻害する．そのため IF 抗体のの吸収・取り込み経路を長期間にわたって利用するこ検出は悪性貧血の確定診断に重要である．従来は被検とは，増殖している細胞における VB12 取り込みを障

57

血清添加時と非添加時に IF に結合される Co・VB12

害することになるのではないかという懸念があったた

量の差からⅠ型抗体の量を測定した．IF に結合しためである．しかし，CUBN はホロ IF に対するたった

57

57

Co-VB12 と遊離型 Co-VB12 との分別には，透析法，一つの既知の受容体で，胃腸管の回腸以外に見いださ活性炭素末吸着法，ゲルろ過法などが用いられた．Ⅱ

れているのは腎臓，内耳および卵黄嚢のみであり，IF型抗体の検出は，IF-57Co・VB12 複合体に被検血清を加は VB12 の細胞取り込みにおいて体系的に役目を演じ

え，抗体分子が結合することにより生ずる分子サイズている訳ではない．さらに，VB12 を結合している IFなどの変化を電気泳動法，免疫拡散法，免疫電気泳動を使用することにより理論的には VB12 の吸収・取り法，ゲルろ過法，免疫共沈法などにより調べた．これ込みを障害することは起こらない．

らの実験手技は煩雑で時間を要するばかりでなく，近このように IF はターゲティングを目指す研究にとっ

年は放射性アイソトープに対する規制が厳しくなってて明るい展望を提供しているように見えることから，きたため実施しにくい．そこで Nexø ら 10）は Fedosov

Workinger ら 11）は PET を利用した in vivo 画像化と生体らの作成した rhIF を利用して ELISA 法で IF 抗体を測内分布研究に植物由来の rhIF を利用することを試み定する方法を開発した．ELISA 法においてはプレート（1）30-50 mg という大量た．この研究を行うためには，

上のウェルに固定する捕捉試薬として抗体を用いる場の IF が入手可能であること，（2）その IF がアポ型，す合が多いが，Nexø ら 10）は rhIF をプレート上のウェル

なわち，事前に結合している VB12 を持たない型で，に固定し，そこへ IF 抗体を含む検液を加え，rhIF に

希望の VB12 複合体を結合できることが必要である．

IF 抗体を結合させた．この方法では，VB12 を結合してWorkinger ら 11）は以上の条件を満たす IF は植物シロイ

い な い rhIF を 使 え ば Ⅰ 型 抗 体 を，VB12 で 飽 和 し た

ヌナズナにヒト遺伝子を組み込んで発現される rhIF 2）

rhIF-VB12 を使えばⅡ型抗体を測定することができる．

であると考えた．植物は VB12 を生理的に利用しないⅠ型抗体を測定しようとする時，捕捉試薬として VB12

ため，植物中ではアポ IF だけが生産され，ホロ IF かを結合していない IF，すなわちアポ IF が必要である

ら VB12 を除去する手順が不要である．反対に，動物がシロイヌナズナに発現させた rhIF は全てアポ IF な

由来の IF の場合には体内に普遍的に存在する VB12 とので真に好都合である．99 検体のヒト血清中の IF 抗

結合してホロ型を形成していることが多いので，タン体 を rhIF を 使 っ て 測 定 し た と こ ろ， 市 販 の 測 定 法

パク質変性等の手段を用いて結合している VB12 を除（Diagnostic Products Corporation）を使って得られた結去しなければならないが，その際に VB12 の解離が完果と一致し，健康なドナーからの血清では一例を除い

全か，IF の再生が完全か，回収率が良いか，などの問て全て抗体陰性の結果が得られた．VB12 濃度グループ

題を伴う．

別 IF 抗体陽性率は，血清 VB12 レベル＜100 pmol/L の前項までに紹介した rhIF 活用法において，rhIF はヒグループでは 67％，100-150 pmol/L のグループでは

ト胃液中の IF に代わりうるという結果が得られた．

17 ％，151-200 pmol/L の グ ル ー プ で は 6 ％， そ し て

し か し rhIF 分 子 中 の 糖 質 を GC/MS で 分 析 す る と，
Į（1–3）-フコース，キシロース，マンノースおよび n-＞200 pmol/L のグループでは 1％だった．このように
ELISA 法で IF 抗体を測定する場合 rhIF は適切な捕捉

アセチルグルコサミンが 0.17：0.18：1.0：0.24 の比率

試薬であると言える．

で含まれていたが 11），ヒト胃液中の IF にマンノース

標的細胞や器官へのターゲティングの 1/2 量含まれていることが報告されているガラク
トース 1）が rhIF には検出されなかった．糖タンパク質

疾病の診断や治療のため体内の特定の細胞や器官をに存在する糖鎖は受容体認識と関係していると考えら

高精度で画像化するとともに，そこへ薬物を送達するれているので，IF と rhIF の間に糖鎖の違いがあるのでための「運び屋」の研究が盛んに行われていて，本稿冒あれば取りこまれる器官が異なる可能性が大きい．こ頭に記した VB12 の吸収・取り込み経路をこの分野にれらの知見をもとに Workinger ら 11）は rhIF を血液中に利用できるのではないかと考えられてきた．胃腸管に投与した場合，その受容体は消化管中における CUBN

おいて，IF は CUBN を経由する VB12 吸収過程で重要ではなく，マンノース受容体 CD206 が有力であると

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トピックス

考えた．CD206 はフコース，マンノースおよび n-アセ

VB12 を充分に摂取していたマウスの間に差異はみられ

チルグルコサミンを認識し，体内では肝臓の上皮細胞なかった．この結果のように，内在性の VB12 レベル

およびマクロファージに見いだされる受容体である．

によって 89Zr・VB12 の肝臓による取り込みが影響され彼らは rhIF が CD206 によって取り込まれることを確ないことから，注射された rhIF は食餌性 VB12 が IF 介

認するため，CUBN 陰性で CD206 陽性の J774．A1 マ

在のメカニズムで吸収され，細胞に取りこまれる際にクロファージ細胞による取り込みをフローサイトメト依存する TC 介在の取り込みメカニズムとは全く別のリーで調べたところ，VB12 単体は取り込まれず，rhIF-

経 路 で 取 り 込 ま れ る こ と が 分 か っ た． こ の こ と は

VB12 は 37 ℃で取り込まれ，4 ℃で取り込まれなかった．

VB12- 薬物複合体の「運び屋」として rhIF が利用できる

さらに，マンノースの重合体であるマンナンを rhIF-ということを強く示唆している．
rhIF-89Zr・VB12 を 注 射 し た 後，ex vivo（in vitro）でVB12 より先に系に添加すると rhIF-VB12 の取り込みが減少したので，rhIF の取込み現象がマンノース介助性

89のプロセスであることが確認された．

まれており，PET 画像で得られた結果を裏付けていた．

Zr・VB12 の分布を調べた結果，肝臓に特に多く取りこ

次に血液中に注射した rhIF がどの臓器を標的とする

以上のように肝臓による rhIF の取り込みに関する検かを PET 画像で調べるため放射性 89Zirconium・VB12

討の結果，rhIF は必要な薬物を肝臓に送達する「運び（89Zr・VB12）をプローブとして使用した 12）．Zr・VB12屋」として利用できる可能性は大きい．それが充分可と IF の結合を調べると，Kd は 1.57 nM だったが，こ能かどうかは，VB12 に結合した薬物をどの程度容易に，の値は VB12 の代表的な形であるシアノコバラミンに確実に肝臓に置いてくるか，そしてどの細胞がそれをおける 1.36 nM と類似していたので，VB12 の IF との取り込むかということを明らかにする必要があるが，結合特性に Zr の結合は変化を与えなかったと判断し，それらに関する研究は彼らの実験室で進行中であると

PET による画像化を行った．胸腺除去雌性ヌードマウ

いう 11）．

89

スに IF- Zr・VB12 を尾静脈から注射後 PET 画像を撮っ
89

遺伝子組み換え技術を用いてシロイヌナズナに産生たところ， Zr・VB12 は肝臓において著しい取り込みさせた rhIF は，動物由来の IF と変わらないことが明らを示した．この時，体内の VB12 レベルが注射した IF-

かになったことで，今後検査や測定が容易になることに89貢献すると思われる．また，薬物を結合させた VB12 を

Zr・VB12 の体内分布に影響を及ぼすかどうかを調べたが，PET 撮像以前に 21 日間 VB12 欠乏食で飼育し，

IF に載せて肝臓に薬物を送達する手段として活用する

体内や血液中の VB12 レベルが低下しているマウスと，ことに関しては今後のさらなる発展が期待される．

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図1

シロイヌナズナに発現させたリコンビナントヒト内因子の活用法と特長-；recombinant human intrinsic factor（rhIF）

370〔ビタミン 96 巻

トピックス

Key words :human intrinsic factor expressed in plants, hugeamount of human intrinsic factor, VB12-free
intrinsic factor, intrinsic factor free of haptocorrin
or transcobalamin

1043-1049
5）von Castel-Roberts KM, Morkbak AL, Nexø E, Edgemon CA,
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1

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山田

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