1000Å細孔を持つコアシェル粒子のタンパクを用いた分離評価
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 佐藤誠 長江徳和
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http://chromanik.co.jp

適切な細孔径を選ぶのは・・・

高分子に小さいポアサイズ

低分子に大きいポアサイズ

活用できる表面積が狭くなる

粒子の持つ表面積が狭い

適切な細孔径を選ぶことで分離に必要な面積を確保できる2

粒子の細孔径
細孔径

0 nm(ノンポーラス)

8 - 12 nm

16 - 20 nm

20 - 100 nm

比表面積極小

大

小

保持

極小

大きい

小さい

試料

タンパク

低分子化合物

ペプチドなど高分子(タンパクなど)

分子量の大きいタンパクなどの高分離向けのカラムは細孔径が30 nmでC4やC8が主流

試料の分子量に対し細孔径が小さすぎるものを選ぶとテーリングや保持が短くなることがある
ノンポーラスの充填剤は、試料負荷量が小さすぎるため実用的ではない

1000Å細孔を持つコアシェル粒子のタンパクを用いた分離評価を行った

3

コアシェルシリカの電子顕微鏡写真
CP-SEM

粒子径: 2.6 μm
細孔径: 16 nm

粒子径: 2.6 μm
細孔径: 100 nm

粒子径: 3.4 μm
細孔径: 30 nm

コアシェルシリカ粒子を樹脂包埋し、Arイオンミリングにより断面加工し、導通処理のためOs(オスミウム)蒸着して観察しました。コア（フューズドシリカ）とその周りの多孔質層が確認できます。

4コアシェル粒子の細孔分布

Desorption Dv (log d) (cc/g)

0.90.8Core shell 2.6um, 16nm

0.7Core shell 2.6um, 30nm
Core shell 3.4um, 30nm

0.6Core shell 2.6um, 100nm

0.5
0.4
0.3
0.20.10110100

1000

Pore Diameter (nm)5

標準タンパク質の分離(60min)
Column:SunShell C4-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C4-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30HT, 3.4 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 60 min%B 20% 65%
Flow rate: 0.5 mL/min ,Temperature: 80 oC
Detection: UV@215 nm,
Injection volume: 1.0 μL
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: HITACIHI Chromaster
Retention time / min

ピーク幅(W0.5, min)C4-100多孔質層が薄い場合には0.5 μm
試料負荷量が小さくなり， 多孔質層
Cytochrome C 0.167
注入量を考慮しなければLysozyme
0.164
BSA
0.308
ならない。
Myoglobin
Ovalbumin

0.197
0.391

C4-30

C8-100C8-30 C8-30HT

0.5 μm
0.177
0.180
0.410
0.221
0.889

0.5 μm
0.160
0.153
0.276
0.180
0.247

0.5 μm
0.155
0.166
0.514
0.199
0.428

0.2 μm
0.212
0.196
0.422
0.238
0.184

C8-30HT
0.5uL
0.2 μm
0.144
0.145
0.330
0.176
0.176

試料濃度
0.050%
0.050%
0.100%
0.050%
0.050%

6

標準タンパク質の分離(5min)
Column:SunShell C4-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C4-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30HT, 3.4 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min%B 20% 65%Flow rate: 0.5 mL/min ,Temperature: 80 oC
Detection: UV@215 nm,
Injection volume: 0.5 μL
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: HITACIHI Chromaster

タンパク質分離には多孔質層が薄い方が有利だと言われるが，細孔径1000Å(100nm)の場合には多孔質層は0.5 μmでも問題ない。

ピーク幅(W0.5, min)
多孔質層
Cytochrome C
Lysozyme
BSA
Myoglobin
Ovalbumin

C4-1000.5 μm
0.047
0.045
0.079
0.048
0.109

C4-30
0.5 μm
0.057
0.056
0.122
0.066
0.133

C8-1000.5 μm0.047
0.046
0.077
0.047
0.109

C8-30
0.5 μm
0.057
0.056
0.100
0.063
0.119

C8-30HT 試料濃度
0.2 μm
0.046
0.025%
0.046
0.025%
0.075
0.050%
0.045
0.025%
0.109
0.025%

7

ナノカラムによる細胞培養によって得られた精製抗体(IgG)の分離

Core shell C4, 300 Å
100 x 2.1 mm i.d.

Column dimension: 100 x 2.1 mm i.d.
100 x 0.15 mm i.d. (nanoclolumn)
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.085)
30-45%B (0-30 min) (0-15min）
Flow rate: 0.4 mL/min, 0.004 mL/min (nano-column)
Temperature: 80 ºC
Detection:
UV at 215 nm
Injection: 5 µL, 0.1 µL (nano-column)
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

SunShell C4-100, 1000
Å 100 x 2.1 mm i.d.
SunShell C4-100, 1000
Å 100 x 0.15 mm i.d.

Retention time/min

8

精製抗体（IgG）のサイズ排除分離
SunSecDiol30246810Column: SunSec Diol30, 4 μm 300 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase:
0.1M Phosphate buffer + 0.2 M NaCl (pH6.8)
Flow rate: 0.35 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection UV at 220 nmInjection 2 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

1214

Retention time/min

92-プロパノールを移動相に添加したIｇGの分離
Column dimension: 100 x 2.1 mm i.d.
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/2-propanol/TFA (20/80/0.085)
15%B (0-0.5 min) and 15-50%B (0.5-50 min)Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC
Detection UV at 215 nm
Injection 5 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

2-プロパノールはC8カラム
でもIgGを溶出させるが，分離は悪くなる。

Core shell C8, 1000 ÅSunShell C4-100, 1000 Å0510152025Retention time/min

10IgG standardのクロマトグラム
Column dimension: 100 x 2.1 mm i.d.
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.085)
35-45%B (0-45 min)Flow rate: 0.4 mL/min, Temperature: 80 ºC
Detection:UV at 215 nm
Injection: 5 µL
Sample: Intact mAb Mass Check Standard (Waters)

02468101214Retention time/min

11IgG standardのクロマトグラム2Column: SunSec Diol30, 4 μm 300 x 4.6 mm i.d.× 2Mobile phase:0.1M Phosphate buffer + 0.2 M NaCl (pH6.8)
Flow rate: 0.1 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 2 µL
Sample : Intact mAb Mass Check Standard (waters)(Waters)

0102030405060708090

100Retention time/min12まとめ• 100 nm細孔を持つコアシェルシリカカラムはC4、C8ともに30 nm細孔のコアシェルカラム より、たんぱく質標準品において良好な分離を示した。
• グラジエント時間の長さに関わらず、100 nm細孔のコアシェル粒子カラムはタンパク標準品において良好な分離を示した• 精製抗体(IgG)サンプルを用いた場合、30 nm細孔を有するC4コアシェルカラムは、30 nm細孔の全多孔性C4カラムより、良好な分離を示した。さらに100 nm細孔を有する、C4コアシェルカラムは最も良い分離を示した• 100 nm細孔を持つコアシェル粒子は高分子分析において有用であることが示唆された。
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