ChromaNik Technical Note: No. S1011 (2021)

逆相液体クロマトグラフィーの基礎講座 S1011

コアシェル構造の優位性：
どうしてコアシェル粒子は理論段数が高くなるのか？

株式会社クロマニックテクノロジーズ
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長江徳和

はじめに1969 年に J.J.Kirkland1)らが開発した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は分離分析の手法としては最も広く世界中に普及した。発表当時に使用されていたカラムには，直径 30 µm から 40 µm のガラスビーズなどの表面に0.5 µm 程度の厚みの多孔質層が存在する粒子が充塡されていた。これは当時 Pellicular（ペリキュラー）型充塡剤1)2)と呼ばれていた。実はこの充塡剤が現在 superficially porous particle（表面多孔性粒子，コアシェル粒子）と呼ばれている充塡剤の元祖である。その後 HPLC カラムに用いる充塡剤の開発は精力的に行われ，様々な官能基を結合した固定相の開発に加え，充塡剤基材もペリキュラー型充塡剤から粒子径 10 µm の破砕形全多孔性のシリカへ移行した。さらに高性能化が進められると，球形の全多孔性シリカが開発され，粒子径も 10 µm から，1980 年代には5 µm が主流になり，1990 年代には 3 µm も多用されるようになった。理論段数は粒子径に反比例して上がるため，粒子の 10 µm から 3 µm への微細化により 3 倍以上の理論段数の向上が達成された。21 世紀に入ると HPLC 装置の高性能化（高耐圧化）に伴い，2.5 µm からサブ 2 µm へと更なる微粒子化が進み，ハイスループット分析が可能となった。充塡剤の高性能化は全多孔性粒子の微細化だけでなく，1990 年代以降ノンポーラス粒子，全多孔性シリカ骨格内に炭素あるいは炭素鎖を組み込んだハイブリッド型粒子，および µm オーダーのスルーポアーと nm オーダーのメソポアーを持つ共連続体をカラムとして用いるモノリス型カラムも提案されてきた。さらに 2000 年にはタンパク質などの生体高分子分離用に厚さ 0.25 µm の多孔質層，直径 4.5 µm の核（ノンポーラスシリカ）を持つ粒子径 5 µm の表面多孔性充塡剤 3)が発表された。これは初期のペリキュラー型充塡剤の核が 30 µm から 4.5 µm に小さくなったものである。その後 2007 年に核の直径が 1.7 µm で多孔質層が 0.5 µm のコアシェル充塡剤が発表 4)5)され，コアシェル充塡剤・カラムの性能の高さが認知され，広く普及し始めた。数年後には多くの HPLC カラムメーカーがコアシェルカラム市場に参入し，1.3 µm から５µm の粒子径のコアシェルカラムが入手可能となった。本稿ではコアシェル型充塡剤の高性能化について述べる。

２市販コアシェルカラムの現状

コアシェルカラムは前述のように 2000 年にタンパク質用に粒子径 5 µm のものが開発されたが，市場的には大きく広まることがなかった。しかし 2007 年に粒子径 2.7 µm のコアシェル充塡剤が開発された後，各社から同様なカラムが市販 6)され，2021 年現在は少なくとも 33 社のコアシェルカラムが利用できる様になった。表 1 に現在市販されているコアシェルカラムを示す。粒子径は 1.3 µm から 5 µm，細孔径は 8 nm から 100 nm，さらに固定相は逆相系を中心に，ヒリックや，ミックスモード系など，幅広い選択肢がある。Bell らは新製品として発表されたクロ-1-

１

市販されているコアシェルカラム

マトグラフィーカラムなどの報告をしている 7)-10)。それによると逆相カラム・ヒリックカラムを合わせた合計では，ポリマー，全多孔性シリカおよびコアシェルシリカなどすべてのカラムに占めるコアシェルカラムの比率
は，2015 年では 13/31，2016 年では 12/27，2017 年では 9/24，2018 年では 11/27，2020 年では 7/11 であり，この 6 年では市場に出てくるカラム全体のほぼ 40%がコアシェルカラムであった。また生体高分子用の逆相カラムに限定すると，2015 年では 6/14，2016 年では 5/6，2017 年では 4/6，2018 年では 1/2 であり，コアシェルカラムの割合が非常に高い。これは近年需要が大きくなっている抗体医薬品などの分析には，全多孔性充塡剤よりもコアシェル充塡剤に優位性があることに起因していると推察される。

図１-2-

細孔径 100 nm のコアシェルシリカ

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コアシェル粒子の構造
コアシェル粒子は中心部の核（Core）と外側の多孔質層（Shell）の２つの異なるシリカから構成される。クロマ

ニックテクノロジーズ社のコアシェルシリカである粒子径 2.6 µm で細孔径 100 nm の SunShell 粒子の電子顕微鏡
写真を図１に示す。これはコアシェルシリカ粒子を樹脂包埋し，Ar イオンミリングにより断面加工し，導通処理のため Os（オスミウム）蒸着処理を施しており，ほぼ粒子の真ん中で輪切りにした状態になっている。中心部の核と表面の多孔質層が明確に映っている。粒子サイズは図１に示しているように核の直径は 1.6 µm で，多孔質層の厚さは 0.5 µm で粒子径は 2.6 µm となっている。この電子顕微鏡写真で分かるように多孔質層はシリカの微粒子（一次粒子）が集まってできており，粒子間の隙間が細孔になる。このコアシェルシリカの平均細孔径は 100 nm であり，多孔質層を形成しているシリカの一次粒子の直径も約 100 nm であり，ほぼ同じ大きさである。低分離
分離用の充塡剤の細孔径は 10 nm 前後であり，この

図１

サイズの細孔は金属をシリカ表面に蒸着すること

細孔径 100 nm のコアシェルシリカで，細孔が埋まってしまい，電子顕微鏡写真で細孔を観察することは難しくなる。図２に粒子径 2.6 µmで細孔径 16 nm の SunShell 粒子の電子顕微鏡写真を示すが，細孔が小さいため，多くの孔が金属蒸着でつぶれてしまっている。表 1 に示されている様に市販されているコアシェルカラムの充塡剤の細孔径は低分子用の 8 nm から 12 nm，高分子（タンパク図２質等）用の 30 nm，100 nm まで幅広く利用できる。

４

細孔径 16 nm のコアシェルシリカ

コアシェル型充塡剤の性能評価

4・1

Van Deemter Plot

全多孔性 C18 の 5 µm，3 µm，1.8 µm およびコアシェル型 C18（SunShell C18）の理論段高さと移動相線流速の関係（Van Deemter Plot）を図 3 に示す。Van Deemter の式は以下の様に表される。

H, dp，u および Dm はそれぞれ理論段高さ，粒子径，移動相の線流速およびアナライトの移動相中の拡散係数である。A 項は多流路拡散・渦巻き拡散（エディー拡散），B 項はカラム軸方向への拡散，C 項は物質移動の項であり，特に C 項は固定相－移動相での物質移動，粒子内での拡散による物質移動に依存する。Van Deemter の式に示される様に，A 項は粒子径に比例し，C 項は粒子径の二乗に比例する。
また移動相の線流速に対し A 項は無関係でゼロ次関数であり，B 項は反比例し，C 項は比例する。線流速が小さい場合にはＢ項が理論段高さに大きく寄与

図３-3-

理論段高さと移動相線流速の関係し，逆に線流速が大きい場合にはＣ項が大きく寄与する。Van Deemter の式はこのように粒子径が小さくなるほど理論段高さは低くなり，カラム長を理論段高さで除した値の理論段数は高くなることを表している。図３に示されている様に，全多孔性の C18 充塡剤では粒子径が小さいほど理論段高さは低くなった。しかしながらコアシェル型
C18 の理論段高さは，粒子径が 2.6 µm でありながら，1.8 µm の全多孔性 C18 とほぼ同じであった。粒子径のみが異なり他の物性が同じ全多孔性 C18 は A 項・B 項・C 項の定数 A・B・C は同値であると考えられるが，コアシェ
ル型 C18 ではこの定数の値が異なっていると考えられる。図 3 の Van Deemter プロットを比較すると，2.6 µm のコアシェル型 C18 は Van Deemter の式の定数 A・B・C 全てが小さくなると考えられ，以下に A・B・C 項について考察する。

4・2

Van Deemter の式の A 項

A 項は多流路拡散・渦巻き拡散（エディー拡散）の項であり，カラム内の粒子間隙が狭いほど，カラム内の粒子間での多流路拡散・渦巻き拡散が小さくなり，その結果 A 項の値が小さくなる。A 項は粒子径（dp）に比例しており，粒子径が 2 倍になれば，粒子間隙も 2 倍になり，A 項も 2 倍になる。図 4 には全多孔性シリカとコアシェルシリカの粒度分布を示す。粒度分布の評価の方法として，粒子の小さい方から 10%の粒子径(D10)と 90%の粒子径(D90)の比を用いた。全多孔性シリカは中位の粒子径(D50)が 1.8 µm で，D90/D10 が 1.50 の場合の粒子分布であり，一般的な HPLC/UHPLC 用シリカ充塡剤の平均図４的な粒度分布である。一方，コアシェルシリカは粒子径粒度分布

全多孔性シリカとコアシェルシリカの(D50)が 2.6 µm で，D90/D10 が 1.10 であり，粒度分布

図５

多流路拡散・渦巻き拡散（エディー拡散）の模式-4-が狭いことが特徴である。図 5 には多流路拡散・渦巻き拡散（エディー拡散）の模式図を示す。カラム内の充塡剤の充塡状態と移動相が流れる流路を示している。粒度分布の広い一般的な全多孔性シリカは粒子間空隙率が 35%か
ら 40%であるのに対し，粒度分布の狭いコアシェルシリカは粒子間空隙率が 30%から 35%程度であり，コアシェルシリカの方が粒子間空隙は小さくなり，多流路拡散・渦巻き拡散が小さくなる。その結果 Van Deemter の式の A 項が小さくなる。粒度分布は中心部に核が存在するコアシェル構造とは関係がなく，全多孔性シリカでも，コアシェルシリカと同程度の粒度分布のものができれば，Ａ項は小さくできる。

4・3

Van Deemter の式の B 項

B 項はカラム軸方向への拡散であり，アナライトの移動相中の拡散係数(Dm)に比例し，移動相の線流速に反比例する。移動相の線流速が低いほど，カラム内にアナライトが留まっている時間が長くなり，拡散は時間の長い分大きくなる。また，B 項は充塡剤の粒子径には依存しない。図 6 にカラム軸方向へのアナライトの拡散の模式図を示す。図１の電子顕微鏡写真で分かるように多孔性シリカは無孔性のシリカがランダム結合しその隙間が細孔となっているため，全多孔性シリカの細孔は粒子を貫通している。また細孔容積は充塡剤の体積の 50%以上であり， 粒子の 50%以上が貫通孔となっている。全多孔性シリカは細孔が貫通しているため，アナライトは充塡剤シリカを通り抜けることができる。一方コアシェルシリカは粒子の中心部に無効性のシリカの核（コア）があり，アナライトはこのシリカコアを通り抜けることができない。またこのシリカコアはカラムの断面に対し，約 30%の面積に相当する
ため，アナライトのカラム軸方向への拡散も 30%程度抑制されると考えられる。つまり，全多孔性シリカに比べ，コアシェルシリカは B 項の定数の B 値が約 70%になっていると推察される。

図 6 カラム軸方向へのアナライトの拡散の模式図
4・4

Van Deemter の式の C 項

C 項は物質移動の項であり，粒子径の二乗に比例し，移動相の線流速に比例する。粒子径の二乗に比例とは，2 倍の粒子径の差が C 項では 4 倍の差となり，粒子径が最も大きく関与する項である。C 項の固定相－移動相での-5-

物質移動は粒子細孔内での拡散による物質移動に比べ理論段高さに与える影響が小さいため，粒子細孔内での拡散による物質移動が C 項を決める大きな要因となる。移動相は粒子間の隙間では流れているが，粒子の細孔内ではアナライトも含め，ほぼ拡散（ブラウン運動）によって移動してる。アナライトは充塡剤の細孔に入り込み，細孔内でランダムに拡散移動し，細孔から出て，粒子間隙で流れている移動相と共に次の充塡剤に移動する。この場合充塡剤の粒子径が大きい程，アナライトは充塡剤細孔に入ってから出てくるまでに時間がかかるため，移動相の流れと共に移動するアナライトとの移動速度の差が生じ，ピークは広がる。図７に充塡剤細孔内でのアナライトの移動距離とピーク幅の関係についての模式図を示す。全多孔性シリカとコアシェルシリカを比較すると，コアシェルシリカは中心部に無孔性のシリカが存在し，図１の電子顕微鏡写真で分かるように，多孔質部が充塡剤の外側に層を形成している。従って，コアシェルシリカは同じ粒子径の全多孔性シリカに比べ，充塡剤細孔内に入って，出てくるまでの，移動距離が短くなり，時間も短くなる。つまり，コアシェルシリカは多孔質部が層として存在するため，全多孔性シリカに比べ，アナライトの図7

細孔内での移動時間が短くなり，C 項が小さくなる。

距離とピーク幅の関係

4・5充塡剤細孔内でのアナライトの移動

コアシェルカラムの理論段数向上率

今まで述べてきたようにコアシェルカラムは全多孔性充塡剤充塡カラムに比べ，Van Deemterの式の A 項，Ｂ項および C 項の全部の項で値が小さくなることにより理論段高さが低くなり，理論段数が大きくなる。長江ら 11)は粒子径 2.7 µm のコアシェル型 C18 と全多孔性 C18 充塡剤の比較
を Van Deemter Plot を用いて，A 項，B 項および C 項に分解し，それぞれ独立した関係式として比較した。図 8 にはこの Van Deemter Plot を示す。移動相の線流速が 5 mm/sec の時の全多孔性C18 充塡剤に対するコアシェル型 C18 充塡剤のA 項，B 項および C 項それぞれ独立した項の減少率を計算すると，それぞれ 15%，5%および 14%となった。すべての項を合わせた理論段高さの減少率はそれぞれの項の減少率を加えた 33%とな

図８-6-

粒子径 2.7 μm の C18 充填剤の Van Deemter Plotる。理論段高さとしては 67%となり，理論段数の上昇率に換算すると 149%となる。同じ粒子径での比較ではコアシェル型 C18 は全多孔性 C18 よりも 49%理論段数が上昇することを示している。

５コアシェルカラムの分離例

図 9 にはコアシェルカラムである SunShell C18 2.6 µm, 250 X 4.6ｍｍi.d. を用いた標準試料のクロマトグラムとそれぞれのピークの理論段数を示す。この分離条件では 45 MPa のカラム背圧がかかっており，装置流路の容積を小さくし，カラム以外の容積による段数の低下を極力抑えた UHPLC を用いた。二番目のトルエンピークは 69,000段以上の理論段数が得られている。粒子径 3 µm の全多孔性の C18 カラムでは 40,000 段前後の理論段数が得られるが，粒子径の差を考慮してもコアシェル型 C18 カラムは約 50%高い理論段数が得られている。各ピークの理論段数を比較すると溶出の早いピークほど高い値になっている。これは Van Deemter の式の B 項のカラム軸方向の拡散により説明でき，遅く溶出するピークほどカラム内に留まっている時間が長く，カラム軸方向の拡散が大きくなってピーク幅が広くなったためである。

図９

コアシェル型 C18 カラムによる標準試料の分離

測定条件：カラム，SunShell C18 2.6 μm, 250 X 4.6ｍｍi.d.；移動相，アセトニトリル/水=60/40；流量，1.8 mL/min；
カラム温度，25℃；検出；UV250 nm; ピーク，1=ウラシル，2=トルエン，3=アセナフテン，4=ブチルベンゼン，
UHPLC 装置，Jasco X-LC．

６

まとめ

本稿ではコアシェルカラムの理論段数向上を Van Deemter の式を用いて解説した。全多孔性充塡剤ではカラムの理論段数向上は粒子の微細化により達成されてきた。理論段数は粒子径に反比例し増加するが，カラム背圧は粒子径の二乗に反比例し上昇する。また微粒子化に伴い，理論段数の極大値はより移動相線流速の高い方にずれる。
これらを考慮すると，微粒子化に共ない，圧力は粒子径の三乗に反比例し上昇することになる。コアシェルカラムの登場は，微粒子化だけに頼らない高性能化をもたらした画期的な技術であると言える。

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文

献

1) J. J. Kirkland: J. Chromatogr. Sci., 7, 7 (1969).
2) C. Horvath, B. A. Preiss, S. R. Lipsky: Anal. Chem., 39, 1422 (1967).
3) J. J. Kirkland, F. A. Truszkowski, C. H. Dilks Jr., G. S. Engel: J. Chromatogr. A, 890, 3 (2000).
4) J. J. Kirkland, T. J. Langlois, J. J. DeStefano: Am. Lab., 39, 18 (2007).
5) J. J. DeStefano, T. J. Langlois, J. J. Kirkland: J. Chromatogr. Sci., 46, 254 (2008).
6) E. M. Borges, M. A. Rostagno, M. A. A. Meireles: RSC Adv., 4, 22875 (2014).
7) D. S. Bell: LCGC NORTH AMERICA, 34, 9, 242 (2016).
8) D. S. Bell: LCGC Europe, 30, 4, 196 (2017).
9) D. S. Bell: LCGC NORTH AMERICA, 36, 4, 234 (2018).
10) D. S. Bell: LCGC NORTH AMERICA, 38, 4, 211 (2020).
11) N. Nagae, T. Tsukamoto: HPLC2014, P-470 (2014).
〈http://chromanik.co.jp/technical/pdf/hplc2014_poster2.pdf〉（2021 年 4 月 28 日，最終確認）．

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