ペプチド分離の最適化ノウハウ
プチド分離の最適化ノウハウ

分離困難なペプチドの分離最適化事例

ペプチド・タンパク質の分離最適化における主要ファクター
カラム

官能基・細孔径の組み合わせ⇒ ターゲットのペプチド・タンパク質の分子量や疎水性に合わせて選択
一般的に分子量が大きいほど、疎水性が低く、細孔径の大きいカラムが適する

移動相

0.1% TFA/acetonitrileのグラジエント溶出がファーストチョイス⇒ イオン性に差がある混合物の場合、TFAの濃度や酸の種類、pH値の変更も有効⇒ acetonitrileのグラジエント条件の最適化
分子量の大きいタンパク質では溶出力の高い2-propanolの添加も効果的

温度

選択性変化やピーク形状の改善に有効だが、カラム耐久性面で制約がある（TFAを添加した強酸性条件下での加温は 官能基脱離を促進する）（TFAを添加した強酸性条件下での加温は、官能基脱離を促進する）

高耐久性カラムTriartにより、最適化ツールとしての温度の活用範囲が拡大
2

高性能＆高耐久性を兼ね備えた
YMC-Triart C18
YMC-Triart C18 の主な仕様
基材

有機シリカハイブリッド

官能基
官能C18

粒子径

1.9 m，3 m，5 m

細孔径12 nm

炭素含有量約20%

エンドキャッピングあり

使用pHレンジ

1-12

使用温度上限70℃ forf pH
H11-77 50℃ for
f pHH77-1212((トリファンクショナル結合)結 )YMC-Triartの優れた耐久性% of initial rettention time120%

pH 1 (1% TFA),TFA) 70℃のような厳しい条件でも卓越した耐久性

100%

YMC-Triart C1880%

Silica based C18
Hybrid-silica based C1860%40%

acetonitrile/water/TFA(10/90/1, pH 1), 70℃で保管、20時間ごとにカラム性能評価

20%
0%02040Time (hr)6080100カラム性能試験

Column: 5 µm, 50 X 2.0 mmI.D.

Eluent: acetonitrile/water (60/40)
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature : 37ºCSample: butyl benzoate

3

Triart C18による抗菌ペプチドの分離最適化例 (1)１アミノ酸配列違い
分析対象物


-Defensin-1 : A CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC
MW 3,442

-Defensin-2 :MW 3,371

-Defensin-3 : D CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC
MW 3,486

CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC＊ Total 30残基のうちN末端のアミノ酸のみ異なる or 少ない4

Triart C18による抗菌ペプチドの分離最適化例 (2)カラム温度の比較
70℃

40℃1. -Defensin-1
2. -Defensin-2
3. -Defensin-3

mAUmAU
4040

1, 2, 3303020201010¥201112060000018.D_F111206A001Column
EluentFlow rate
Detection

2: YMC-Triart C18 (1.9 m, 12 nm),
: 50 X 2.0 mmI.D.
: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.1)
25-45%B ((0-5 min)): 0.4 mL/min: 220 nmmin

1, 32¥201112060000021.D_F111206E

0012min70℃において選択性の変化により、70℃において選択性の変化によりpeak1,3とpeak2が分離

その他の条件を最適化

5Triart C18による抗菌ペプチドの分離最適化例 (3)酸の濃度・種類およびグラジエントの検討（at 70℃）
0.1% TFA

Column: YMC-Triart C18 (1.9 m, 12 nm), 50 X 2.0 mmI.D.

Eluent: A) 酸含有水溶液

1. -Defensin-1
2. -Defensin-2
3 -Defensin-33.
 Defensin 3B) 酸含有アセトニトリル溶液

mAU

1, 3

(0.1 % HCOOHのB液は0.08%)

60

240

Flow rate: 0.4 mL/min

Detection: 220 nm

Temperature : 70℃

200酸の濃度 種類
酸の濃度・種類¥201204260000035.D_F120426B

0246

1 2 3

Rs (1, 2) = 1.26
Rs (2, 3) = 1.1046min

TFA濃度の変更、さらにギ酸への変更により
分離選択性が大きく改善

0.01% TFA
mAU

アセトニトリルのグラジエント勾配

6040

勾配を緩やかにすることで分離度が向上

200¥201204260000045.D_F120426D

020.1% HCOOH

min

15-35 %B (0-10 min)15-30%B (0-10 min)slope : 2
2.0%B/min
0%B/minslope : 1
1.5%B/min
5%B/min
mAU

mAU
60

1260

Rs (1, 2) = 1.44
Rs (2, 3) = 2.25

3

14040

2020
¥201204260000023.D¥F120426C

0026minRs (1, 2) = 1.50
Rs (2, 3) = 2.49

3¥201204260000055.D_F120426F

0420246min6Triart C18による抗菌ペプチドの分離最適化例 (4)2-propanolの添加
acetonitrile

15-30%B (0-10 min)slope : 1.5%B/min

mAU60

1 240

3Rs (1, 2) = 1.50
R (2Rs(2, 3) = 2
2.494920¥201204260000055.D_F120426F

00123422-propanol/acetonitrile
l/i il (50/50)

minslope : 1.5%B/minmAU

Column60
40

1 2

Rs (1, 2) = 1.86
Rs (2, 3) = 2.47

3Eluent

1: A) 0.1% formic acid in waterB) 0.08% formic acid in organic solvent¥201205010002503.D_F120501D0: YMC-Triart C18 (1.9 m, 12 nm)
50 X 2.0 mmI.D.

200

1. -Defensin-1
2 -Defensin-22.
 Defensin 2
3. -Defensin-3

10-25%B
1025%B (0(0-1010 min)234Flow rate

: 0.4 mL/min

Detection: 220 nmTemperature: 70℃min

有機溶媒をアセトニトリルから2-プロパノール/アセトニトリル混液に変更&グラジエント勾配を最適化
同等の分析時間でpeak1および2の分離度が向上
7

Triart C18による抗菌ペプチドの分離最適化例 (5)
まとめYMC-Triart C18 (1.9 m, 12 nm), 50 X 2.0 mmI.D.
ファーストチョイスの条件
mAU

1. -Defensin-1
2 -Defensin-2
2.
D fi 23. -Defensin-3

ブロードなピーク、不分離

40

1, 2, 330

Eluent20

Flow rate
Temperature
Detection

10¥201112060000018.D_F111206A

001min2

分離条件最適化・カラム温度の変更
・移動相の酸 有機溶媒の変更
・移動相の酸、有機溶媒の変更
・グラジエント勾配の変更

最適化条件

分離良好

mAU
60

1 2Eluent: A) water/formic acid (100/0.1)
B) 2-propanol/acetonitrile/formic acid(50/50/0.08)
10-25%B (0-10 min)Flow rate: 0.4 mL/min

340200¥201205010002503.D_F120501D

0: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.1)
25 45%B (025-45%B(0-55 min)i ): 0.4 mL/min: 40℃: 220 nm

1234min

Temperature: 70℃Detection: 220 nm8

ペプチド・タンパク質の逆相HPLC分析における分離最適化のポイント
 酸の濃度および種類酸の濃度および種類による選択性変化を利用して分離を改善
特に、目的のペプチド・タンパク質のイオン性に差がある場合に有効 有機溶媒の濃度および種類分子量や疎水性の大きいタンパク質では、より溶出力の高い有機溶媒の使用が保持やピーク形状の改善に効果的 カラム温度
カラム温度の変更は選択性変化と共に、ピーク形状の変化をもたらすため分離の大幅な改善が期待できる
特に、分子量が1万以上のタンパク質において、高温分析が非常に効果的

高耐久性カラムYMC Triart C18 は、高温条件でも耐久性に優れ、高耐久性カラムYMC-Triart
は 高温条件でも耐久性に優れペプチド・タンパク質の分離にも有効
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