トラブルシューティングガイド～金属配位性化合物・金属錯体をより安定に分析するためのポイント～(U230619A)

金属配位性化合物・金属錯体のHPLC分析

配位性化合物は、金属イオンと配位結合をすることで金属錯体を形成します。このような配位性化合物やその金属錯体は、合成品か天然由来かを問わず数多く存在しており、医薬品やヘルスケア商品、食品添加物、農薬、電子材料など非常に多岐にわたる分野で利用されています。
このような配位性化合物や金属錯体を分析する方法のひとつとして、HPLC法が古くから多用されています。しかしながら配位性化合物のHPLC分析においては、ピーク形状や定量性の不良、あるいは分析再現性が得られにくいといった問題が発生するケースがしばしば見うけられます。これらは、主に分析環境中からの金属イオンの混入が原因で生じます。
配位性化合物や金属錯体をHPLCで分析する場合には、通常の化合物を分析する場合とは違った特別の配慮が必要となります。ここでは、配位性化合物や金属錯体のHPLC分析において発生するトラブルの主な原因とその解決法について紹介します。

2配位性化合物・金属錯体のHPLC分析における問題の主な原因◼ カラム・充填剤に起因する不良

カラム・充填剤中の金属不純物が影響

カラムハードウェアの素材が影響◼ 装置に起因する不良

装置の汚れが影響

流路の金属製パーツが活性化していることが影響◼ サンプルに起因する不良

サンプルの調製方法や保管状況が影響

サンプルの安定性が影響

3

カラム･充填剤に起因する不良(1)
具体的なトラブル例
カラム・充填剤中の金属不純物による影響
充填剤中に残存している金属不純物と配位性化合物が相互作用することで、ピーク形状の不良や分析再現性不良が生じることがあります。金属不純物の多いカラムでは、配位性化合物が強く吸着してしまい溶出してこない場合もあります。
カラムハードウェアの素材による影響
金属配位性化合物がステンレス製のカラムハードウェア内面やフリットと相互作用してピーク形状が悪化する場合があります。

対処法－金属不純物の少ないカラムを使用する－酸を含む溶液の通液によりカラムの洗浄を行う－イナートな素材のハードウェアのカラムを使用する－移動相に5 mM程度のEDTA・2Naを添加する
4カラム・充填剤に起因する不良(2)
カラムの変更による改善
ヒノキチオールの分析: 新品カラムによる比較

YMC-Triart C18

21Tf(1)
1.27

Q090709D

2Tf(1)
4.15

ハイブリッド系C18
Brand I8

吸着大面積値再現性不良

1Q090120A

配位性の化合物は、充填剤に残存した金属不純物と相互作用することで、著しいピーク形状不良や分析再現性不良が生じることがあります。

2シリカ系C18
Brand A2Tf(1) 0.80

1

ピーク形状不良

Q090406C

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

: acetonitrile/0.1%H3PO4 (40/60): 40℃: UV at 254 nm

12.014.0min

21
EluentTemperature
Detection

10.0Hinokitiol
強配位性

金属不純物の残存が少ないカラムを選定することで対処が可能です。

⇒従来よりも金属不純物の少ないハイブリッド粒子を使用したYMC-Triart C18は強配位性の化合物でも新品状態から良好に分析可能です。

Methyl benzoate (I.S.)
5

カラム・充填剤に起因する不良(3)酸溶液の通液によるカラム洗浄
食品保存料の分析
1酸による洗浄後新品状態
mAU

mAU

Tf(3) 2.2

160

p-Hydroxyacetophenone(I.S.)

Tf(3) 1.1160

12酸溶液の通液による洗浄

80302120OH

1Sorbic acid

380

340O

2

ピークテイリング
120OHOOOO

OH

400Q080801P0481216minQ080804H0酸溶液の通液によるカラム洗浄手順
20 mM リン酸/アセトニトリル(50/50)溶液を10カラム体積分通液48ColumnEluent
Flow rate
TemperatureDetection

1216min

Dehydroacetic acid
配位性: シリカ系C18 150 X 4.6 mmI.D.
: 20 mM CH3COONa-CH3COOH (pH 4.4)/acetonitrile (80/20): 1.0 mL/min: 37℃: UV at 230 nm

リン酸など酸を含む溶液の通液により充填剤に残存する金属不純物を洗浄することで、配位性化合物のピーク形状を改善できる場合があります。カラムを使用しているうちに徐々に汚れが蓄積し、配位性化合物のピーク形状不良が生じたケースも、このような酸洗浄によって同様に改善できる場合があります。
6

カラム・充填剤に起因する不良(4)イナートな素材のハードウェアによる改善
Accura Triart

バイオイナート
コーティングカラムハードウェアの接液部をバイオイナートコーティング処理しており、ステンレスと配位性化合物の接触を回避
生体試料だけでなく低分子の配位性化合物の分析にも有効

Triart充填剤リン酸化ペプチドの分析
バイオイナートカラム
4.00

ステンレスカラム1

ピークテイリング
吸着 (T43pp検出せず)

4.00

relative intensity

relative intensity

33.00

ピーク形状良好
高感度

2.00

3.00
12.00
321.001.00

0.00: Triart C18 (1.9 μm, 12 nm)
100 X 2.1 mmI.D.
Eluent: A) water/formic acid (100/0.1)
B) acetonitrile/formic acid (100/0.1)
0.7-25%B (0-5 min), 25%B (5-6.6 min)Flow rate: 0.6 mL/min
Temperature : 60℃
Detection: ESI-MS
Injection: 2 µL (10 pmol/µL)
Sample: Massprep Phosphopeptide Enolase Standard (Waters)
System: Shimadzu Nexera XS inert
Shimadzu LCMS 2020
Column0.00
12345min12345minCourtesy of Shimadzu Europa GmbH1.

2.

T18p (m/z 407.2)

3.

T43pp (m/z 724.8)

T43p (m/z 684.8)

金属配位性化合物とステンレス製のカラムハードウェア内面やフリットの相互作用が懸念される場合は、イナートカラ
ムへ変更することでピーク形状、感度、定量性などが改善できる場合があります。
7

装置に起因する不良(1)
具体的なトラブル例

装置の汚染や流路の金属製パーツの活性化による影響
流路内部に蓄積した金属イオン性の汚れや、腐食等によって活性化した流路内の部位と、配位性化合物が相互作用することにより、ピーク形状不良が発生することがあります。

対処法－希硝酸溶液の通液により装置内の流路を洗浄する－EDTA等のキレート剤を含む溶液の通液により装置内の流路を洗浄する－装置をメタルフリー化する

8

装置に起因する不良(2)希硝酸溶液の通液による装置の洗浄
ヒノキチオールの分析
1

装置洗浄後

装置洗浄前
mAU

mAU

Tf(3) 0.98
ピーク形状不良2525Tf(3) 1.252020

希硝酸溶液による洗浄

151021050 Q100122A0 Q100122B
044812min

Hinokitiol
強配位性115502

Methyl benzoate (I.S.)
8

装置洗浄手順1. カラムを装置から外し、カラム部分に抵抗管を接続。なお、抵抗管出口は直接廃液へ流れるように接続。
2. 水⇒2 N硝酸(注)⇒水⇒IPAの順にそれぞれ15 mL程度ずつ通液。

12min: YMC-Triart C18 (5 mm, 12 nm)
150 X 3.0 mmI.D.
Eluent: acetonitrile/ 0.1% H3PO4 (40/60)
Flow rate: 0.43 mL/min
Temperature : 40℃
Detection: UV at 254 nm
Column

カラムに問題がない場合でも、装置配管の流路内部に蓄積した金属イオン性の汚れと配位性化合物が相互作用することによって、ピーク形状不良や分析再現性不良が発生することがあります。
2-6 N程度の硝酸溶液による装置の通液洗浄により、ピーク形状や分析再現性を改善できる可能性があります。
(注) 硝酸の取扱いには十分ご注意ください。

9

装置に起因する不良(3)含EDTA溶液の通液による装置の洗浄
シャンプー配合抗菌剤の分析
1

装置洗浄後

装置洗浄前
mAUmAU

N3=1450
ピーク割れ

225125202120

含EDTA
溶液による洗浄153105O

Hinokitiol

2315NOOH10H2NOH

Ciclopirox olamine

50HON3=3200

30Q100817E012NQ100818C

3456789min

0123456789min
H2N

装置洗浄手順1. カラムを装置から外し、カラム部分に抵抗管を接続。なお、抵抗管出口は直接廃液へ流れるように接続。
2. 水⇒1 mM EDTA・2Naを含む溶液[メタノール/水またはアセトニト
リル/水 (50/50)など] ⇒水⇒IPAの順にそれぞれ15 mL程度ずつ通液。

OOH
OH

Piroctone olamine: YMC-Triart C18 (5 mm, 12 nm)
50 X 2.0 mmI.D.
Eluent: methanol/water/HCOOH (65/35/0.1)
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature : 40℃
Detection: UV at 310 nm
Columnキレート形成能を有するEDTAを含む溶液による通液洗浄により、ピーク形状や分析再現性が改善するケースがあります。
10装置に起因する不良(4)装置のメタルフリー化による改善
ヌクレオチドの分析

通常システム＆ステンレスカラム

通常システム＆メタルフリーカラム

mAU

メタルフリー化システム＆メタルフリーカラム

mAU

mAU

* 1は溶出せず
83838326644222

1200
F170321B

00.5

14206F161226A

F170117B

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

min

00.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5min

00.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5min*メタルフリー化システム： サンプルループ、ニードルシート、インジェクタ-カラム配管にPEEKを使用

1. ATP

2. ADP

3. AMP

NH2
NO
HOP
OH

O
O

POHN

N

O
OPOO

NO

OHNHOPOHOH

OH

N

N

O

P

NO

OO

N
O

N

HOP

O

N
O

OH

OH

OH

OH

OH

: YMC-Triart C18 (3 mm, 12 nm)
50 X 2.1 mmI.D.
Eluent: 5 mM HCOONH4
Flow rate: 0.21 mL/min
Temperature : 25℃
Detection: UV at 265 nm
Injection: 1 mL (10 mg/mL)
Column

NH2

NH2

N

OH

カラムハードウェアとともに、装置のステンレス製配管や部品をメタルフリー化することでピーク形状が大幅に改善できる可能性があります。
11サンプルに起因する不良(1)
具体的なトラブル例(ケース1) サンプル保管中の変化
サンプル調製に使用した試薬中に含まれる金属イオンの影響により、またはサンプル保管に使用した容器などへの配位性化合物の吸着や容器から溶出した金属イオンと配位性化合物との相互作用(錯形成)により、ピーク形状不良や再現性不良が発生することがあります。
対処法－金属イオン性不純物の含有量が少ない容器･器具や試薬･溶媒を使用する。
－容器・器具から金属イオン性不純物を溶出させにくい試薬・溶媒でサンプルを調製する。
(ケース2) 金属錯体の分析中の安定性による影響
金属錯体の溶離液中での安定性が悪く、分析中に分解することでピーク形状不良が発生することがあります。
対処法－化合物が分析中安定に存在できる条件で分析を行う。
12

サンプルに起因する不良(2)サンプル保管中の変化(1)ヒノキチオールの分析

サンプル: 移動相である0.1%ギ酸/アセトニトリル (60/40)に溶解

mAU

ガラス製HPLC用
サンプルバイアル保管

褐色ガラス瓶保管

調製直後(PP製容器)
mAU

Tf 1.30

mAU

4040301

冷暗所
保管
2日後

220
101.
2.

12

Hinokitiol
Methyl benzoate: YMC-Triart C18 (5 mm, 12 nm)
150 X 3.0 mmI.D.
Eluent: acetonitrile/0.1%HCOOH (40/60)
Flow rate: 0.43 mL/min
Temperature : 40℃
Detection: UV at 254 nm
Injection: 4 mL
ColumnTf 1.4140302302012min

120

11010 HINOKI¥00607A38.D
0482220min

mAU

4030

100 HINOKI¥00603A24.D
048Tf -Tf -PP製バイアル保管

0 HINOKI¥00607A42.D
0481012min

0 HINOKI¥00607A44.D
04812min

保管前後のヒノキチオール溶液のUV吸収スペクトルAU
調製直後とは異なるスペクトル(=錯体由来の可能性)

21

調製直後
褐色ガラス瓶保管
ガラス製バイアル保管
PP製バイアル保管

0200250300

350400450波長(nm)特にガラス容器からは金属イオンが多く溶出する場合があります。サンプル保管の際、容器表面に存在する金属への配位性化合物の吸着、または容器から溶出した金属イオンとの相互作用により、HPLC分析時にピーク形状や再現性が悪化する場合があります。
13サンプルに起因する不良(3)サンプル保管中の変化(2)ヒノキチオールの分析

サンプル: 水/アセトニトリル (60/40)に溶解

mAU

mAU

Tf=1.27mAU

40

1220

冷暗所
保管
2日後

100 HINOKI¥00602A26.D
048121.
Hinokitiol
2.
Methyl benzoate

Tf=1.22

Tf=1.244030

ガラス製HPLC用
サンプルバイアル保管

褐色ガラス瓶保管

調製直後(PP製容器)

30

PP製バイアル保管
mAU

40

11302

Tf=1.2840

2202020

1010100 HINOKI¥00604A36.D048min12min

0 HINOKI¥00604A40.D048121302min

0 HINOKI¥00604A42.D
04812min

保管前後のヒノキチオール溶液のUV吸収スペクトル
AU

酸を含まない溶液でサンプル調2製した場合、いずれの容器でも調製直後と変わらずピーク形状は良好です。酸を含む溶液は、 1容器からの金属イオンの溶出を促進させやすいことが示唆され 0200ます。

いずれの容器でも2日間保管後も調製直後と全く同じスペクトル

250

300

350

調製直後
褐色ガラス瓶保管
ガラス製バイアル保管
PP製バイアル保管

400450波長(nm)

金属不純物の少ない容器、試薬や溶媒を使用し、容器から金属を溶出させやすい酸などを含まない溶液でサンプル調製することでピーク形状や再現性の不良を防ぐことができます。また、サンプルを用時調製することも有効です。
14

サンプルに起因する不良(4)金属錯体の分析中の安定性による影響
8-キノリノール錯体の分析

1ONZn（B) 5 mM 8-キノリノールを含む
リン酸緩衝液/メタノール溶離液(A) リン酸緩衝液/メタノール溶離液mAU30mAU100

移動相に8-キノリノールを添加

8012603(8-quinolinol)
Zn
AlCu200Q-COMP¥Q4120101.D – Q4120104.D

02468minBis(8-quinolinolato)
zinc

1225N
OO

N

20AlO

21540NON

Tris(8-quinolinolato)
aluminium

31035NOCu
O0Q100422A

024サンプル注入後に流路内で錯体の分解がおこると、(A)の例のようにピーク形状不良が発生するほか[Cu, Al]、完全に分解した場
合には、配位子である8-キノリノールのピークのみしか検出されないことがあります[Zn]。
分析中に錯体が安定に存在できるように移動相に8-キノリノールを添加することにより、良好に分析できるようになりました(B)。

68min

NBis(8-quinolinolato)
copper: YMC-Triart C18 (5 mm, 12 nm) 150 X 3.0 mmI.D.
: (A) 20 mM KH2PO4-K2HPO4(pH7.0)/methanol (35/65)(B) 20 mM KH2PO4-K2HPO4(pH7.0)/methanol (35/65)
containing 5 mM 8-quinolinol
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature : 40℃Detection: (A) UV at 254 nm(B) UV at 375 nm
ColumnEluent

錯体をHPLCで分析する場合には、分析中に錯体が安定に存在できる条件を選択することで、ピーク形状および再現性良好に分析することが可能になります。
15より安定に配位性化合物を分析するには◼ カラム・充填剤面での改善策
 製造工程由来の金属不純物の残存が少ないカラムを使用する。
 リン酸などの酸を含む溶液を通液してカラムの洗浄を行う。
カラム使用中に配位性化合物のピーク形状や再現性が悪化してきた場合にも有効な場合あり。
 イナートな素材のハードウェアのカラム （Accura Triart） を使用する。
◼ 装置面での改善策
 2-6 Nの硝酸やEDTAを含む溶液で装置の洗浄を実施する。
 移動相に接触する部品(特にサンプル注入部からカラムまで)をPEEK製などのメタルフリーなものに交換する。
◼ サンプル面での改善策
 微量金属分析用グレードなど金属イオンの含有量が少ない容器、溶媒や試薬を使用してサンプルを調製する。
⚫ 一般的なガラス製サンプル瓶は、金属イオンが溶出しやすい可能性があるため注意。
⚫ 微量金属分析用グレードの試薬等は、一般的にHPLCでの使用を保証していないので、有機系不純物の含有量には注意。
 サンプル調製の際、容器からの金属の溶出を促進させやすい酸などを含む溶液を使用しないことが望ましい。
 錯体を再現性よく分析するには、分析中に錯体が分解しないようにすることが必要。
錯体が安定に存在し得るpH設定や、場合によっては移動相への配位子の添加も有効。
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