C18とは違う分離を！
2本目にするならどのカラム？
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

C18カラムでは分離できない

異性体 親水性化合物
構造等の類縁物質

カラムを変える

移動相を変える標準試料の分離例（全多孔性）
1 2Sunrise C30

34235Sunniest C187642 3Sunniest RP-AQUA

751452113467

水素結合性Sunniest C86(Caffeine/Phenol)

7 52,37651Column: SunriseC30,Sunniest C18, RP-AQUA, 5C8, PhE, PFP,PFP&C18
5 µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene,

Sunniest PhE

46
12,37

5Sunniest PFP

4 6
1Sunniest PFP＆C18

2,3
40

510

615

5７2025Retention time/min

30

3540

疎水性

立体選択性

(Amylbenzene/ (Triphenylene/Butylbenzene) o-Terphenyl)

C30

0.51

1.59

1.52

C18

0.43

1.56

1.37

RP-QUA

0.49

1.56

1.37

C80.33

1.43

1.23

PhE

1.00

1.34

0.92

PFP1.00

1.29

2.51

PFP&C18

1.00

1.432.66

C30 C28カラム• 疎水性相互作用が主な相互作用
結合密度が高い場合
CH3• 疎水性の高い化合物分離に有用• 構造異性体分離に有用
結合密度が低い場合 (RP-AQUA)
H3C

トリアコンチル (C30)• 水系の移動相での安定性が高い• 極性基導入型C18より、耐久性が高い• 親水性化合物の分離の使用可能

RP-AQUAとの違い
SunShell C30

SunShellRP-AQUA

結合密度1.9 μmol/m2

1.4 μmol/m2

エンド
キャッピングTMS

Sunniest エンド
キャップ

細孔径

12 nm

16 nm

pH範囲

2-82-8(2-10)

対象化合物

異性体
低極性化合物

極性化合物

大きな違いは官能基の結合密度

SunShell RP-Aqua の40 oCでの保持
核酸塩基の分離

25 ºC（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

53Relative retention of thymine
(%)

40 ºC

2140℃でのチミンの保持時間の変化

4215340123Retention time/min

4Column: SunShell RP-Aqua, 2.6 μm 75 x 4.6 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25 ºC
Sample: 1 = Cytosine, 2 = Uracil, 3 = Thymidine,
4 = Uridine, 5 = Thymine

100908070605040302010012345Measurement number every stop flow
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。
毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，SunShell RP-Aquaほとん
ど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，94%以上の再現性を示しました。

HILICと逆相クロマトグラフィーの比較
2

1435

SunShell AmideColumn:
SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
SunShell RPAqua 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
Mobile phase: acetonitrile :Amide : 20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2
RPaqua : 20 mM phosphate buffer(pH7.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

5243SunShell RPAQUA
0112Retention time/min34

有機酸の分離

Column: SunShell RP-AQUA 2.6 μm, 150 x 4.6 mm, Mobile phase: 0.025 M KH2PO4, pH2.5
Flow rate: 1.0 mL/min, Column pressure: 32 MPa for 1.5mL/min, Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210nm, Injection volume: 2 μL
Sample: 1 = Oxalic acid (60 ppm), 2 = Tartaric acid (500 ppm), 3 = Formic acid (1000 ppm),
4 = Malic acid (1000 ppm), 5 = Lactic acid (1000 ppm), 6 = Acetic acid (1000 ppm),
7 = Diglycolic acid (1000 ppm), 8 = Maleic acid (100 ppm), 9 = Citric acid (1000 ppm),
10 = Succinic acid (1000 ppm), 11 = Fumaric acid (10 ppm).

アミノ酸の分離
Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM

01020Retention time/min30アミノ酸のLC/MSm/z

100%11880

Ala
Arg
Asn
Asp
CysGlnGlu
Gly
His
Ile,Leu
LysMetPheProSerThr
TrpTyrVal01020Retention time/min

9060
175
M =11740Structure of Valine
13320134012250 65 78 88 102 114 130 140 155 166 181 203 216 231 247m/z
147
Mass spectrum of Valine
14876156
132
147
150 Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
166 Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)116B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)
106%B 0% to 20% in 20 min
120
Flow rate: 0.2mL/min
205 Temperature: 40 oC
182 Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM118W

C30カラムの注意点
結合密度が高いほど異性体分離に優れる
CH3

結合密度が高すぎるとピークがテーリングするH3C

トリアコンチル (C30)

結合密度が低いと分離が不十分になる

結合密度の影響
1Company A C30, 5 μm

234

非対称性

結合密度

細孔径

1.02

1.9 μmol/m213 nm

非対称性

結合密度

細孔径

1.63

3.7 μmol/m220 nm

非対称性

結合密度

細孔径

1.04

3.0 μmol/m213 nm

1Company B C30,5 μm

23412, 3Conventional C18, 5 μm
4051015202530

Retention time / min
Column dimension, 250 x 4.6 mm;
mobile phase, methanol/water = 97/3;
flow rate, 1.0 mL/min;temperature, 30 oC;
detection, UV295 nm;

sample,1 = δ-tocopherol, 2 = γ-tocopherol,
3 = β-tocopherol, 4 = α-tocopherol35ビタミンＫ１異性体の分離比較
T社 C30, 2.6 μm

SunShell C30, 2.6 μm
35 oC

分離度Rs: 1.23

分離度Rs: 1.94

30 oC

分離度Rs: 2.88

25 oC

分離度Rs: 0.91

分離度Rs: 3.33

20 oC

分離度Rs: 1.41

15 oC

分離度Rs: 1.78

trans

分離度Rs: 3.79
051015

cis2025030

2Retention time/min

4transtranscis

cis
6

Retention time/min

Column: SunShell C30, 2.6 μm 100 x 2.1 mm
T社 C30, 2.6 μm 100 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O= 96/4
Flow rate: 0.35 mL/min,810ビタミンＥの分離比較

02468101214

Retention time/min

Column: SunShell C30, 2.6 mm 150 x 3.0 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O= 97/3 Flow rate: 0.43 mL/min, Temperature: 25 ºC, Pressure: 15.5 MPa

051015202530

Retention time/min

Column: Sunrise C28, 5 mm 250 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O= 97/3 Flow rate: 1 mL/min,Temperature: 25 ºC35

ペンタフルオロフェニル（PFP)FFFFFH3C• 疎水性相互作用• 水素結合性• 双極子相互作用• π-π相互作用• 静電的相互作用• 極性化合物の保持が可能• 立体選択性に優れている• ハロゲン化合物の分離に有効標準試料の分離

1524312,3SunShell RP-Aqua

75SunShell PFP

64176

Hydrogen Hydrophobicity
Stericbonding (Amylbenzene/ selectivity

72SunShell C18246810(Caffeine/Phenol)

Butylbenzene)(Triphenylene/o-Terphenyl)

RP-Aqua

0.52

1.52

1.30

PFP

1.00

1.31

2.38

C18

0.39

1.60

1.46

546

30Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine,
3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

121416

Retention time/min

18202224

クレゾール異性体の分離
1,2SunShell C183123
SunShell PFP

Column:SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell PFP, 2.7 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC
Sample: 1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

C18カラムではp-クレゾールとm-クレゾールは分離不可能
PFP は分離可能

C18とPFPによる塩基性化合物の保持比較
2,3,4Column: SunShell C18, PFP, 2.6μm 150 x 4.6 mm

SunShell C18Mobile phase: CH3CN/10mM Phosphate buffer pH7.0 = 80/２0
Flow rate: 1.8 mL/min
Temperature: 25 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 =Amitriptyline

11SunShell PFP
234

PFP＆C18

CH3FFFFF• 疎水性相互作用• 水素結合性• 双極子相互作用• π-π相互作用• 静電的相互作用• 立体選択性に優れている• PFPカラムと比べると疎水性相互作用が強い

H3C

標準試料の分離例（コアシェル）
17243
15243
15765, 72,3641 2,34

1656Column dimension: 150 x 4.6 mm
SunShell C18-WP (16nm)Mobile phase: CH OH/H O=75/25
32Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
SunShell RP-AQUA
Sample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine,(16nm)
3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
SunShell Phenyl
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene,(9nm)
7 = Triphenylene

7SunShell PFP (9nm)

54 63
14SunShell C8 (9nm)637

SunShell C183546(9nm)
51015

Retention time/min

2025

疎水性

立体選択性

(Caffeine/ (Amylbenzene/ (Triphenylene/Phenol)
Butylbenzene) o-Terphenyl)

77520水素結合性SunShell PFP＆C18 (9nm)

21 2

75C18-WP

0.40

1.55

1.35

RP-AQUA

0.52

1.52

1.30

Phenyl

1.00

1.48

1.01

PFP

1.00

1.31

2.38

PFP&C18

1.64

1.41

2.77

C80.32

1.46

1.08

C18 30

0.39

1.60

1.46

標準試料の分離例（全多孔性）
1 2

Sunrise C30

342

35Sunniest C18

35Sunniest RP-AQUA

152

134

7

Sunniest C8

水素結合性6(Caffeine/Phenol)

7 52,3764

17642765

1Column: SunriseC30,
Sunniest C18, RP-AQUA, 5C8, PhE, PFP,PFP&C185 µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene,

Sunniest PhE

46
152,34
1

72,3Sunniest PFP＆C18
40Sunniest PFP

6510

615

5７20

25

Retention time/min

30

3540

疎水性

立体選択性(Amylbenzene/ (Triphenylene/Butylbenzene) o-Terphenyl)

C30

0.51

1.59

1.52

C180.43

1.56

1.37

RP-QUA0.491.56

1.37

C80.33

1.43

1.23

PhE

1.00

1.34

0.92

PFP

1.00

1.29

2.51

PFP&C18

1.00

1.43

2.66

耐久性比較
120%

Test conditions
Column: PFP&C18 5um 2.1x150 mm
PFP 5um 2.1x150 mm
Mobil phase: CH3OH/20mM PB pH7.0=70/30
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC

相対理論段数

100%
80%
60%

Measurement condition
Column: PFP&C18 5um 2.1x150 mm
PFP 5um 2.1x150 mm
Mobil phase: Acetonitrile/water=70/30
Acetonitrile/water=60/40
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Acenaphthene

40%20%0%
0100200300

400500600

通液時間/h

一般的なPFPカラムの3倍の耐久性を実現

iHILIC-Fusion column by HILICON
 SeQuent社でZIC-HILIC充填剤の合成を担当していたWen JiangさんがHILICON社をUMEÅで2014年に設立
 両性イオンとアミドの長所を取り入れた
 HILIC-Fusion を開発
Wen Jiang

HILICカラムを設計するうえで・・
1. 基材自身の親水性が高い
 基材のみでもHILICで使用可能なシリカを選択 コアシェルを使用することで高分離が可能

2. 導入されている官能基の構造
 官能基が高い水和性を有し，高い密度で導入可能である
 静電的な相互作用が極力低い
 官能基の結合部位の疎水性が低いこと

24水10μL注入時のヒリックカラムのクロマトグラム

移動相：5mM酢酸アンモニウム/アセトニトリル(20:8
検出：UV@220nm（青），RI (赤）水

水10mL注入により固定相の状態が乱れている
固定相の平衡化完了

UVRI
6.6min05

UVとRIのタイムラグ0.5分

7.1min10TIME (min)1520安定な水和層形成のためのイオンとは
ホフマイスターシリーズ (Hofmeister series リオトロピック系列と同意) とは、水を構造化させる能力の順にイオンを配列したものである。（水和を安定させるイオン）
アニオンではSO4(2-)＞HPO4(2-)＞CH3COO(-)～citrate(3-)＞tartrate(2-)＞HCO3(-)＞CrO4(2-）＞Cl(-)＞NO3(-)＞ClO3(-)
カチオンでは(CH3)4N+>NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+

アミノ酸のHILIC–ESI-MS
標準品

ダイエットサプリ

LC–MS System: Agilent 1100er LC system andThermo Fisher LTQ™ equipped with a HESI
source, operated in positive ionization mode foranalysis of standards. For the dietary supplement,
an Orbitrap™ Exactive classic equipped with aHESI source and operated in positive ionization
mode.
Column: 150 × 2.1 mm, 3.5-μm iHILICFusion(+)
Gradient Elution: A) acetonitrile–water–1 M
ammonium acetate, pH 5.75 (90:5:5); B) water–acetonitrile–1 M ammonium acetate, pH 5.75
(90:5:5); 0–0.5 min (90:10) A–B; 0.5 to 25 min,gradient elution from (90:10) A–B to (60:40) A–B.
Flow Rate: 0.3 mL/min
Column Temperature: 40 °C
Injection Volume: 5 μL
Amino Acids: Arginine, asparagine, aspartic acid,glutamic acid, glutamine, hydroxyl-proline,isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline,tryptophan, tyrosine, and valine. 50 μM of eachamino acid was dissolved in water–acetonitrile(25:75) solution.

リン脂質のiHILIC-Fusionカラムによる分離
LC–MS system: Thermo Scientifi c Ultimate 3000
HPLC system coupled to a Q Exactive™ Plus Hybrid
Quadrupole-Orbitrap™ mass spectrometer, which isequipped with a HESI II source and operated innegative ionization mode (ESI-).
Column: 150 × 2.1 mm, 3.5 μm 100 Å iHILIC®Fusion.
Eluent:A) ammonium acetate solution (35 mM, pH 5.75) andacetonitrile (95:5, v/v);
B) acetonitrile.
Gradient elution: 0–0.5 min, 97% B; 0.5–26.5 min,from 97% to 75% B; 27–33 min, 60% B; 35–45 min 97%B.
Flow rate: 0.3 mL/min
Column temperature: 40 °C
Injection volume: 10 μL