Press Release
⽂部科学記者会、科学記者会、⼤阪科学・⼤学記者クラブ 同時発表

2024 年 8 ⽉ 7 ⽇
横浜⼤

市
阪⽴⼤⼤学
学

ワニはどうして⻑時間⽔に潜れるのか？
〜クライオ電⼦顕微鏡によってワニのヘモグロビンのもつ特徴的なアロステリック制御のしくみを解明〜
横浜市⽴⼤学⼤学院⽣命医科学研究科 ⾼橋捷也さん（博⼠後期課程 3 年）、ジェレミー・
テイム教授、⻄澤知宏教授、李勇燦助教らの研究グループは、Aarhus ⼤学（デンマーク）
Angela Fago 教授、Nebraska ⼤学 Jay Storz 教授、⼤阪⼤学蛋⽩質研究所 栗栖源嗣教授、川本晃⼤助教らとの国際共同研究により、ワニのヘモグロビンの⽴体構造とそのアロステリック制御＊1 に関わる重炭酸イオンとの結合様式を、クライオ電⼦顕微鏡単粒⼦解析＊2 により明らかにしました。
本研究成果は、科学誌「Nature Communications」に掲載されました（2024 年 8 ⽉ 2 ⽇）。

研究成果のポイント

クライオ電⼦顕微鏡を⽤いて、ワニのヘモグロビンの⽴体構造とそのアロステリック制御に関わる重炭酸イオンの結合様式を解明しました。

重炭酸イオンの結合に重要な、ワニのヘモグロビンにおけるアミノ酸置換を特定しました。

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ヘモグロビンのような普遍的な分⼦が、⽣物の進化にともなって、どのように進化してきたのか、その関連性の理解に寄与することが期待されます。

研究背景
ヘモグロビンは⾎液中で酸素運搬の役割を担うタンパク質であり、全ての脊椎動物において共通の機能を果たします。ヘモグロビンはαサブユニットとβサブユニットがそれぞれ 2 つずつ会合した 4 量体構造をとります。各サブユニットはヘムと呼ばれる⾚⾊に⾒える鉄イオン錯体をもっており、酸素が 1 分⼦結合することができます。酸素がヘムに結合すると、ヘモグロビン 4 量体は R (Relaxed) 型という「開いた」構造をとり、⼀⽅で、酸素が外れると T (Tense) 型という「閉じた」構造をとることが知られています。これらの構造の変化は、ほとんどの脊椎動物において、有機リン酸の作⽤によってアロステリックに制御されます。⼀⽅、脊椎動物で唯⼀ワニは、有機リン酸の作⽤を受けることなく、重炭酸イオン (HCO3−) の作⽤を受けることが 40 年以上前に報告されました。この重炭酸イオンの作⽤のおかげで、ワニは⻑時間潜⽔しても酸素を供給することができるため、それを活⽤した狩りを⾏うことが可能です。このワニに特有な重炭酸イオンの作⽤を明らかにするために、
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ワニのヘモグロビンの⽴体構造の分⼦レベルでの解析が必要でしたが、ワニのヘモグロビンは良質な結晶が得られておらず、いまだに X 線結晶構造解析による構造決定に成功していません。そこで今回、研究グループはクライオ電⼦顕微鏡単粒⼦解析法を⽤いることで、ワニのヘモグロビンの構造決定を⽬指しました。
研究内容
研究グループは、North Texas ⼤学にて⽣態学の実験⽬的で飼育されているワニ (Alligatormississippiensis) から採取された⾎液からヘモグロビンを精製して、クライオ電⼦顕微鏡による構造解析を⾏いました。それにより、酸素が結合した状態、⼀酸化炭素 (CO) が結合した状態（図 1a）、および酸素が解離した状態（デオキシ状態）（図 1b）の 3 種類の状態の⽴体構造を明らかにすることに成功しました。デオキシ状態のヘモグロビン試料は、⼤阪⼤学栗栖研究室に設置された嫌気チャンバー内の低酸素環境下で調製しました。

図 1 a) ⼀酸化炭素 (CO) が結合した状態の R 型構造をとったワニのヘモグロビンの電顕マップ。b) デオ
キシ状態の T 型構造をとったワニのヘモグロビンの電顕マップ。α1 サブユニットをピンク⾊、β1 サブユニットを⽔⾊、α2 サブユニットを⻩緑⾊、β2 サブユニットをオレンジ⾊、ヘムを⻩⾊で表⽰している。

・重炭酸イオンとの結合様式
2.2 オングストローム（Å、1Åは 100 億分の 1 メートル）の⾼分解能で決定した、T 型構造をとったデオキシ状態のワニのヘモグロビンの⽴体構造から、ヘモグロビン 4 量体のαサブユニット、βサブユニットの界⾯に合計 2 分⼦の重炭酸イオンが結合することが明らかになりました（図 2a）。その結合部位は、他の脊椎動物のヘモグロビンにおける有機リン酸の結合部位とは異なっており、ワニのヘモグロビンが独⾃に獲得したものであることがわかりました。重炭酸イオンは合計 8 つのアミノ酸によって認識されており（図 2b、c）、ヒトを含む他の動物のヘモグロビンと⽐較すると、ワニでは特に 2 つのアミノ酸置換（βサブユニットの 38 番⽬のスレオニン＊3 と、41 番⽬のフェニルアラニン＊4）が重炭酸イオンによる作⽤を獲得するために重要であることが明らかになりました（図 2d）。
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図 2 a) 重炭酸イオン（⻩⾊）が結合した T 型構造のワニのヘモグロビンの⽴体構造。b) 重炭酸イオンの電顕マップの密度。c) 重炭酸イオンと T 型構造のワニのヘモグロビンのβ1 サブユニット（⽔⾊）との結合様式。d) ワニのヘモグロビン（⽔⾊）とヒトのヘモグロビン（オレンジ⾊）における重炭酸イオン結合部位の⽐較。

今後の展開
この研究の起源は、実に 40 年以上前にさかのぼります。1977 年に初めてワニのヘモグロビンの重炭酸イオン作⽤が報告されて以降、イギリス分⼦⽣物学研究所の Max Perutz 博⼠や⻑井潔博⼠らによって、その仕組みが議論されてきましたが、⽴体構造は⻑い間明らかになっていませんでした。本研究は、これらの⻑い研究の末に実を結んだ成果であると⾔えます。
本研究により、ワニが進化の過程で独⾃に獲得した重炭酸イオン作⽤の仕組みが明らかになったことで、脊椎動物のヘモグロビン分⼦進化における新たな知⾒を提供できる可能性が期待されます。また、今後、鎌状⾚⾎球症等で⼼肺機能の弱い患者に対する遺伝⼦治療や輸⾎⽤⼈⼯⾎液といった医療への応⽤も期待されます。
本論⽂の責任著者であるテイム教授（横浜市⽴⼤学⼤学院⽣命医科学研究科）をはじめ、複数の研究者の指導者でもあった故⻑井博⼠に特別の感謝を⽰したいと思います。
研究費
本研究は、⽂部科学省科学研究費助成事業（JP23H02439, JP24H02264［⻄澤］）、JST 次世
代研究者挑戦的研究プログラム（JPMJSP2179［⾼橋］）、AMED 研究事業（JP23ama121001）の⽀援を受けて⾏われました。
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論⽂情報
論⽂タイトル：The unique allosteric property of crocodilian haemoglobin elucidated by cryoEM.
著者：Takahashi K, Lee Y, Fago A, Bautista NM, Storz JF, Kawamoto A, Kurisu G, Nishizawa T*,
Tame JRH. * (*correspondence)
掲載雑誌：Nature Communications
DOI： 10.1038/s41467-024-49947-x

⽤語説明＊1 アロステリック制御：ヘモグロビンの⼀つのサブユニットに酸素が結合すると、連鎖的に 4 量体の他のサブユニットにも構造変化が伝わり、酸素に対する親和性が向上する仕組み。この仕組みによって、ヘモグロビンにおける酸素結合・解離は協同的に起こることが知られている。

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2 クライオ電⼦顕微鏡単粒⼦解析 : クライオ電⼦顕微鏡と呼ばれる装置を⽤いて、約180℃の低温環境下でタンパク質などの試料に電⼦線を照射して撮影し、得られた粒⼦像から三次元構造情報を再構成して、分⼦の⽴体構造を解析する⼿法。

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3 スレオニン（ヒトではリジン） : 20 種類ある天然アミノ酸のうち、スレオニン、リジンはいずれも親⽔的ではあるが、スレオニンに対してリジンは側鎖が⻑く、先端にアミド基に由来する正電荷をもつ。ワニのヘモグロビンでは、リジンの正電荷が重炭酸イオンの負電荷とイオン結合を形成する。

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4 フェニルアラニン（ヒトではチロシン） : 20 種類ある天然アミノ酸のうち、チロシンとフェニルアラニンはいずれもベンゼン環構造を側鎖にもつが、チロシンは側鎖の先端に⽔酸基が付加されている。ワニのヘモグロビンでは、チロシンの⽔酸基が重炭酸イオンと⽔素結合を形成する。

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