Journal of Fisheries Technology, （8 2）, 81-88, 2016

水産技術，8（2）,81-88, 2016

原著論文

イメージサイトメトリーを用いた
有害赤潮原因渦鞭毛藻の死細胞検出技術の開発
＊1

外丸裕司

・木村

＊2

圭

＊3

・山口晴生

Enumeration of cell mortality in the harmful bloom-forming dinoflagellates
Karenia mikimotoi and Heterocapsa circularisquama using image cytometry
Yuji TOMARU, Kei KIMURA and Haruo YAMAGUCHIWe developed a new protocol for detecting and enumerating viable and dead cells of the potentiallyharmful, bloom-forming dinoflagellates, Karenia mikimotoi and Heterocapsa circularisquama. The method
employs image cytometry and SYTOX-green, which binds specifically to the nucleotides of dead cells andcan be used to simultaneously count the number of viable and dead cells of these dinoflagellates. In thisstudy, we evaluated increases in cell mortality due to salinity stress and virus infection in K. mikimotoi andH. circularisquama, respectively. In K. mikimotoi, a marked increase in cell death was observed when thesalinity was decreased rapidly from 30 to <18. Similarly, viral inoculation appeared to increase the numberof dead H. circularisquama cells in experimental cultures. It is considered that cell mortality in these algae
may have been induced by changes in a variety of physical, chemical and biological factors. Further studies
using this protocol would facilitate a deeper understanding of the processes affecting disintegration ofharmful algal blooms.
キーワード：イメージサイトメトリー，SYTOX-Green，死細胞，赤潮2015 年 9 月 10 日受付

2015 年 12 月 18 日受理

植物プランクトンの自然環境中における挙動を理解する。例えば生物学的要因として，競合生物のアレロパシー

るため，これまでの研究の多くがその増殖という観点で様物質による死滅（Yamasaki et al. 2007，Yamasaki et al.

進められてきた。その結果，赤潮原因種をはじめとする

2009），ウイルスによる感染死（Nagasaki et al. 1999），

多くの植物プランクトンの増殖と物理・化学・生物学的

原生生物やカビの寄生による死滅（Garces et al. 2013，

諸要因との関係が明らかになってきた。一方，現場環境

鏡味 2008），そして細菌による殺滅（今井 2000）などがにおける植物プランクトンの挙動を把握するためには，挙げられる。また，物理・化学的要因として，光不足やその増殖とともに消失過程を詳細に理解する必要があ

栄養塩の枯渇などのストレスも同様に，植物プランクト

る。この消失における代表的な例として動物プランクト

ンの死に影響を与えることが知られている（Berges et al.

ンによる捕食があげられるが，実際には植物プランクト

1998）。しかしながら，それらの死滅・殺滅因子が植物ンの死滅には多くの要因が関与することが示唆されていプランクトンの消失要因としてどの程度寄与しているか＊1

国立研究開発法人水産総合研究センター瀬戸内海区水産研究所〒739-0452

広島県廿日市市丸石2-17-5

	National Research Institute of Fisheries and Environment of Inland Sea, Fisheries Research Agency,
2-17-5 Maruishi, Hatsukaichi, Hiroshima 739-0452, JAPAN
tomaruy@affrc.go.jp＊2

佐賀大学低平地沿岸海域研究センター＊3

高知大学教育研究部自然科学系農学部門― 81 ―

のように調製した。対数増殖期にある H. circularisquama

は，定量的に検討されていない。
SYTOX-Green は核酸蛍光染色剤の一種であり，生きに予備培養していた HcDNAV01 株培養液を接種して 72ている細胞の膜は透過せず，生理活性を失った死細胞の時間培養し，ウイルス感染によって H. circularisquama

膜のみを透過する性質を持つ。このことから現在，医学・を溶藻させた。培養終了後，遠心処理（2,000rpm，10 分間，生理学等，様々な研究分野で本染色剤を用いた死細胞の4ºC）を行った H. circularisquama 溶藻液の上清を採取し，検出が行われている（Brussaard et al. 2001，Vardi et al.

さらに 0.8μm ヌクレポアフィルターで濾過した濾液を2012）。本染色剤を用いた死細胞検出はフローサイトメ

ウイルス懸濁液として用いた。

トリー（FCM）や顕微鏡で行うことが可能である。しイメージサイトメトリー（ICM） 実験には Tali® イメー

かしながら，このうち前者は高額な機械の導入が必要でジ サイトメーター（ライフテクノロジーズ）を用いた。

あり，なおかつ装置のオペレーティングが煩雑であるこ測定するサンプル 25μL を Tali 測定専用スライド（Tali®

とから，測定者に大きなコスト負担・労力を強いる。一Cellular Analysis Slide，ライフテクノロジーズ）に流し

方後者は，SYTOX-Green の蛍光検出が測定者の目視判込みし，細胞の数と大きさ，緑色蛍光ならびにクロロ

断に依存するため，個人差が出やすく，定量結果の客観

フィル自家蛍光（赤色蛍光）強度を測定した。解析イメー性が乏しいと指摘されている。

ジを図 1 に示す。測定条件として本機の標準セットアッ

近年，画像解析に基づいた細胞解析技術（イメージサ

プを用いた。励起に係る緑色ならびに赤色チャンネル用

イトメトリー，ICM）が発達している。本技術は顕微鏡

光源（LED）の波長は，それぞれ 458 ± 20nm ならびに観察による細胞の視覚化と蛍光情報の取得を同時に行う

530 ± 20nm であり，フィルターはそれぞれ 466/40 EX，ことが可能であり，FCM に対し比較的安価に導入でき

495 LP Di，525/50 EM ならびに 543/22 EX，580 LP Di，る機器である。操作においては FCM のようなトレーニ

585 LP EM である。スライドのスキャニングには 4 倍対

ングや顕微鏡観察のような技術の習得は必要とせず，ま物レンズ，ならびに 1.3 メガピクセルのカメラを用いた。

た目視観察による人為的ミスを排除でき，定量結果に客スキャニングで得られた細胞数，細胞の大きさ，各細胞

観性をもたせることができる。

の緑色ならびに赤色蛍光強度は，本機の標準ソフトウェ

本研究では，本邦で発生する有害赤潮の中でも特に被アで解析した。生細胞と死細胞の判定は ICM で得られ害の大きい魚貝類斃死原因渦鞭毛藻 Karenia mikimotoi，る情報の内，細胞サイズ，赤色蛍光強度ならびに緑色蛍

な ら び に 二 枚 貝 類 斃 死 原 因 渦 鞭 毛 藻 Heterocapsa

光強度によって判別した。すなわち，K. mikimotoi の場合，

circularisquama の死細胞を SYTOX-Green 染色と ICM に

細胞サイズが 16 ～ 36μm かつ赤色蛍光強度が 1500 以上

より検出・定量可能な手法の開発を目的とした。続いての細胞を生細胞とし，さらに赤色蛍光強度の有無にかか至適化した検出条件を用い，急激な塩分変動ならびにウ

わらず細胞サイズが規定値以内で緑色蛍光強度が 1500

イルス感染によって引き起こされる K. mikimotoi ならび以上ある細胞を死細胞とした。同様に H. circuralisquamaに H. circularisquama それぞれの死細胞発生を評価した。

の場合は，細胞の生死に関わるパラメーターとして，細胞サイズ，赤色蛍光強度ならびに緑色蛍光強度を，それ材料と方法

ぞれ 10 ～ 30μm，1500 以上ならびに 1500 以上とした。
いずれの場合も，ICM によってスキャンされた粒子が実験供試株

培養液には，SWM-3 改変海水培地（Chen

細胞サイズの範囲内であっても，緑色蛍光強度ならびにet al. 1969） に 2 nM の Na2SeO3 を 添 加 し た 培 地 を 用

赤色蛍光強度が 1500 未満の場合は細胞残渣または細胞い た（Imai et al. 1996）。 実 験 は 全 て 水 温 20ºC， 光以外の粒子として扱い，データから除外した。また上記

2

強 度 140μmol photons/m /s（12h：12h 明 暗 周 期 ） のにおいて，死細胞を規定する緑色蛍光強度は，予備実験

下 で 実 施 し た。K. mikimotoi Km6Y 無 菌 株 お よ び H.

の結果，SYTOX-Green 染色を施した生細胞の緑色蛍光

circularisquama HU9433 有 菌 株， い ず れ も 分 離 ク ロ ー

強度を明らかに超える値とした。赤色蛍光強度についてン株を用いた。バクテリアの存在有無は，SYBR-Goldは，残渣状の細胞が持つ赤色蛍光強度よりも，高い値と4（最終濃度：市販品に対し 1/10 濃度）で染色した培地

した。

中の懸濁物を 0.2 μm ヌクレポアフィルター（ワットマ

死細胞の SYTOX-Green 染色性ン）上に捕集し，蛍光顕微鏡（励起光：470 ～ 490nm；

胞の培養液にパラホルムアルデヒド／グルタルアルデヒ

蛍光：510 ～ 550nm; ダイクロイックミラー：505nm；

ド混合溶液（Kimura et al. 2012）を等量添加し，4ºC でBX50；オリンパス）で観察することで判定した（Kimura

一晩固定し，細胞タンパク質を変性させた。常温下で 3

and Tomaru 2014）。 そ の 結 果，K. mikimotoi 株 培 地 中

分間，3,000rpm（× 700g）の条件で遠心後，上清を取にはバクテリアの存在は確認されなかった。一方，H.

り除いた。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH ＝ 7.4）5

circularisquama 株の培地中にはバクテリアの存在が確認

mL を添加して細胞ペレットを再懸濁した後，5 分間常された。また，H. circularisquama 株に特異的に感染する

温で振盪（40rpm）することで PBS 洗浄を行った。同様

ウイルス HcDNAV01 株（Tarutani et al. 2001）は，以下の PBS 洗 浄 を 2 回 繰 り 返 し た 後，Triton-X を 1% 含 む― 82 ―

対数増殖後期にある細イメージサイトメトリーを用いた死細胞検出

図 1．イメージサイトメーターによる測定イメージ（実際の測定画面を編集）
	左上：同機による蛍光観察画像の一部（サンプル：2014 年 2 月 7 日，徳山湾，水深 4.4m，Karenia mikimotoi 2,760 cells/mL）
右上：細胞サイズヒストグラム
左下：細胞サイズゲートに入っている粒子が持つ緑色蛍光強度の分布
右下：細胞サイズゲートに入っている粒子が持つ赤色蛍光強度の分布
生細胞：細胞サイズゲート内にあり，赤色蛍光陽性かつ緑色蛍光陰性
死細胞：細胞サイズゲート内にあり，緑色蛍光陽性（赤色蛍光の有無は問わない）

PBS 溶液 5mL を添加し，常温で 10 分間振盪（40rpm）

うための画像取得は困難となる。ここで求められる要件した。その後，上記の PBS 洗浄をさらに 2 回繰り返し，

は，1）渦鞭毛藻の遊泳をグルタルアルデヒド（GA）で適量の PBS に再懸濁した固定細胞を試料とした。

止めつつ，2）GA 処理以前に生理活性を保持していた

死 細 胞 に 対 す る SYTOX-Green に よ る 染 色 時 間 を生細胞は SYTOX-Green により染色されず，3）GA 処理

決めるため，以下の実験を行った。固定試料に対し，以前から死んでいた細胞のみが特異的に染色されること

SYTOX-Green を最終濃度 0.5μM になるように添加し，である。これらの要件を満たす諸条件を以下のように検添加後 5，10，20，30，60 分後の全細胞の平均緑色蛍光討した。

強度を ICM で測定した。コントロールとして SYTOX-

対数増殖後期の培養細胞に SYTOX-Green を最終濃度

Green を添加していない固定細胞の緑色蛍光強度を測

0.5μM になるように添加し，常温暗所で 10 分間培養し定した。K. mikimotoi に関する実験は 3 回繰り返し，H.

た。SYTOX-Green 染色後の細胞に対し，最終濃度 0.1%

circuralisquama の場合は 1 回のみ実施した。

または 0.01% になるように GA を添加した。添加直後，藻類遊泳運動の固定と生細胞の SYTOX-Green 染色性へ

12，24，36，48，60 分後の全細胞の平均緑色蛍光強度の影響

ICM は顕微鏡による蛍光画像を基に，画像解を ICM で測定した。また蛍光強度 1500 以上を SYTOX-

析を行うシステムである。そのため，渦鞭毛藻のようにGreen 染色陽性とした場合の，全細胞集団に対する陽性

遊泳運動を活発に行っている細胞に対しては，解析を行細胞の割合を算出した。実験は 3 回繰り返した。

― 83 ―

本実験では，蛍光顕微鏡観察下での死細胞の計数を，研究で開発した手法を用いて計数した。計数は 2 回行

目視で迅速に行うことは現実的に不可能であった。そのい，それらの平均値を測定値とした。実験開始時の K.

ため，ICM の測定と併行した蛍光顕微鏡を用いた死細mikimotoi 細胞密度は約 12,000 ～ 24,000 cells/mL になる胞の計数は実施しなかった。

ように調整した。また塩分ショック後，培養 3 日目ま生 細 胞 へ の SYTOX-Green 添 加 の 影 響

SYTOX-Greenでの生細胞の密度変動から増殖速度（1 日当たりの分裂

染色の生細胞に対する有効性または無効性を評価する

回数）を算出した（Parsons et al. 1984）。対照区には塩ため，以下の実験を行った。対数増殖中の培養に対し，

分ショック区に添加した希釈用培地と等量の塩分 30 のSYTOX-Green を最終濃度 0.5μM になるように添加してSWM-3 海水培地を添加し，同様の操作を行った。実験

常温暗所に静置した。SYTOX-Green 添加直後，10，30

は全て 3 回繰り返し，実験結果を統計学的に評価した。

分後，1，2，3，6 時間後における全細胞の平均蛍光強H. circularisquama 培養へのウイルス接種による死細対 数 増 殖 中 の H. circularisquama に ウ

度を ICM で測定した。実験は 3 回繰り返した。

胞増加の検証ICM による生細胞数カウント

ICM による生細胞数カ

イ ル ス HcDNAV 懸 濁 液 を 2% 接 種 し， 上 記 と 同 様 のウントと血球計数盤によるそれとを比較するため，以下

SYTOX-Green 染色を施し，培養に占める死細胞の割合の実験を行った。対数増殖後期の K. mikimotoi 細胞をそを経時的に求めた。ウイルス懸濁液と同量の SWM-3 培のまま，もしくは塩分変化のない SWM-3 培地で希釈し，地を接種した試験区を対照区とした。実験は１本立てで生細胞数を倒立顕微鏡（Nikon, ECLIPSE Ti-U-Ph-2）下実施した。

でフックス - ローゼンタール血球計数盤を用いて計数した。そして同一サンプルについて，ICM による細胞数

結果と考察の自動カウントを行い，顕微鏡下計数と ICM 計数の値を比較した。H. circularisquama に関しては，下記に示

死細胞の SYTOX-Green 染色性すウイルス接種実験期間中に ICM 測定と同血球計数盤

固 定 細 胞 の 緑 色 蛍 光 強 度 は 1243 ± 10 で あ っ た が，による細胞計数を併行して実施し，両計数値の関係を評

SYTOX-Green 添加 5 分以降では約 10,000 になった（図染色前の K. mikimotoi

価した。顕微鏡観察による生細胞の判定は，遊泳時の細2）。染色時間 5 分以上において K. mikimotoi 細胞の平胞と同様な本来の形態を細胞が保ち，さらに葉緑体が観均緑色蛍光強度に有意差は認められなかった（One-way

察されることを基準とした。

ANOVA，p > 0.05）。H. circuralisquama 固定細胞も同様

低塩分ショックによる K. mikimotoi の死細胞検出

本に染色前の緑色蛍光強度は 978 であったが，その値は染論文で示した技術の実証例として，急激な塩分低下（塩色後 5 分で約 8800 にまで増加した。以上のことから，

分ショック）が K. mikimotoi の死滅に与える影響につい

死細胞に対する SYTOX-Green の染色時間は 5 分で十分て検討を行った。水温 20ºC の下，塩分 30 の SWM-3 海と判断されるが，より確実に死細胞を染色してカウント

水培地で培養していた対数増殖後期～定常期初期の K.

するためには，蛍光強度が確実に飽和する 10 分間以上

mikimotoi を，培地塩分 26 ～ 10 になるように SWM-3 蒸の染色が必要と判断された。

留水培地で塩分を希釈し，培養 1 時間後の死細胞を本

参考ではあるが，SYTOX-Green と同様に死細胞の膜

図 2．固定処理した赤潮原因藻類に対する SYTOX-Green の染色性
点線は蛍光強度 1500 を示す
Karenia mikimotoi（n=3，エラーバーは標準偏差）
Heterocapsa circularisquama（n=1）― 84 ―

イメージサイトメトリーを用いた死細胞検出を特異的に透過し，核酸染色が可能な SYTOX-Blue 染

意に増加した（Tukey-test，p<0.05）。そのため ICM で，色剤（ライフテクノロジーズ）についても同様な検討を活発な遊泳運動をしている K. mikimotoi 生細胞と死細胞行った。その結果，後者の染色剤も前者と同様に使用可を観察・検出する場合，SYTOX-Green による染色後，能であった（データ未発表）。

GA0.01% による固定処理を実施し，それから 12 分以内

固定処 理が生細 胞の SYTOX-Green 染色に及ぼす影響に測定を終えることが望ましいと思われた。

K. mikimotoi 細胞の動きを止めるための GA 添加処理が，H. circuralisquama の 場 合 も 同 様 に，GA の 添 加 に よSYTOX-Green 染色細胞数の増加に及ぼす影響を調べた

り，遊泳運動が直ちに停止した。そして ICM 測定では

ところ，GA 終濃度 0.1% ならびに 0.01%，いずれにお緑色蛍光強度が経時的に上昇し，死細胞の割合も GA

いても，固定時間が長くなるほど，細胞の平均緑色蛍

添加 12 分後には実験開始時と比べて明らかに増加した

光強度は増加した（図 3）。なお，K. mikimotoi 細胞の遊（Tukey-test，p < 0.05）（図 3）。これらのことを考慮する

泳運動は GA 処理を行った直後に停止することを，別と，H. circuralisquama の場合も，遊泳を停止させるた途，通常の顕微鏡観察で確認した。GA0.01% 処理の場

めに GA0.01% 処理を実施した後は，時間を置かず，速合，24 分後までは死と判定される細胞（蛍光値 1500 以

やかに ICM 測定を実施する必要がある。

上の細胞）が若干増加するものの，実験開始時のそれ

次 に， 対 数 増 殖 に あ る K. mikimotoi 培 養 細 胞 にと比べて差はなかった（One-way ANOVA，p>0.05）。一SYTOX-Green を添加し，6 時間後まで生細胞の染色の方，GA0.1% 処理では固定処理 12 分後以降，GA0.01%程度（緑色蛍光強度）を観察した（図 4）。その結果，処理でも 36 分後以降には実験開始時よりも死細胞が有実験開始から 3 時間の間，K. mikimotoi 生細胞の平均蛍

＊
＊

＊

＊

図 3．赤潮原因藻類の生細胞を固定処理した直後からの SYTOX-Green 染色性，ならびに培養中に占める SYTOX-Green 染色陽性判定細胞（緑色蛍光強度≧ 1500）の出現割合変化
点線は蛍光強度 1500 を示す
上段：細胞の平均緑色蛍光強度，下段：培養中に占める SYTOX-Green 染色陽性細胞
GA：グルタルアルデヒド（最終濃度）
	＊ p < 0.05（Tukey-test）：実験開始時と比較して有意に SYTOX-Green 染色陽性細胞の割合が増加
した最初の点n=3，エラーバーは標準偏差― 85 ―

光強度に明らかな差は認められなかった（Tukey-test，

度 0.5μM）。2）暗所で試料を 10 分～ 3 時間静置（染色）p > 0.05）。SYTOX-Green 添 加 6 時 間 後 の 細 胞 の 平 均

する。3）試料に対し GA 1% 溶液を 1% 量添加し（最終蛍光強度は，添加 3 時間目までのそれらよりも有意に

濃度 0.01%），直ちに十分撹拌する。4）速やかに ICM

増大することが認められた（Tukey-test，p < 0.05）。一

測定を実施し，12 分以内に計測を終了する。

方，H. circuralisquama の場合，染色 30 分後において実ICM による細胞数カウント

験開始時よりも有意な緑色蛍光強度の増大が認められめ た K. mikimotoi 細 胞 数 は， ほ ぼ 1：1（0.98） の 有 意

た（Tukey-test，p < 0.05）。ただしいずれの場合も，緑かつ密接な相関関係にあった（r2 = 0.929，p < 0.01，n =色蛍光強度の増大の程度は死細胞に判定される蛍光40）（図 5）。H. circuralisquama の場合も同様に両手法に強度 1500 よりも十分低かった。6 時間後における H.

よる計数値は有意な相関関係に（r2 = 0.980，p < 0.01，

circuralisquama 生細胞の緑色蛍光強度は，染色 3 時間以

n = 10）あった（図 5）ものの，計数値に 10% 程度のず顕微鏡ならびに ICM で求前のそれらの値よりも有意に高くなることが確認されたれが生じたため，今後のデータ蓄積がさらに必要と思わ（Tukey-test，p < 0.05）。以上の結果から，いずれの種にれた。本機で推奨されている最低細胞密度は試料 1 mL

おいても SYTOX-Green を添加した後は，10 分間以上染当たり 105 細胞である。それゆえ，測定誤差を抑えるた

色し，遅くとも 3 時間以内に測定を終えることが望まし

め，ICM による細胞数カウントは 1 つの試料に対していと思われた。

複数回行う必要がある。

上記の測定条件を総合すると，遊泳しているいずれの

低塩分ショックによる Karenia mikimotoi の死細胞検出

渦鞭毛藻類の場合も，遊泳運動を止めつつ生細胞と死細塩分の急激な低下が K. mikimotoi の死に与える影響を

胞をそれぞれ分けて計測するためには，次のような手評価した結果，塩分 30 から塩分 18 ～ 16 まで急激に低順が必要になると思われた。1）培養液に対し SYTOX-

下した場合，1 時間後には当該微細藻の総細胞数に対しGreen ストック溶液（50μM）を 1% 量添加する（最終濃て死細胞は平均で約 4% 発生し，さらに塩分 14 ならび

図 4．赤潮原因藻類の生細胞に対する SYTOX-Green の染色性＊ p < 0.05（Tukey-test）：それ以前の緑色蛍光強度と比較して有意に蛍光強度が増加した点
n = 3，エラーバーは標準偏差

図 5．イメージサイトメーター（ICM）ならびに血球計数盤による細胞計数値― 86 ―

イメージサイトメトリーを用いた死細胞検出に塩分 10 ではそれぞれ約 10%，約 50% の死細胞が発生

理・化学・生物学的要因，ならびにそれらの複合要因のした（図 6）。また塩分低下ショック後 3 日間の増殖速変動が K. mikimotoi の死亡に影響する過程を，室内実験

度は，塩分 16 以下で顕著に低下した（図 7）。

で検証することが可能であると思われた。

本種の 20ºC における増殖速度は，塩分 15 以下（塩分H. circularisquama 培養へのウイルス接種による死細一定条件）の培養条件で急激に低下する傾向にあること胞の増加が報告されている（山口 1994，山口・本城 1989）。また，

合は，ウイルス非接種区では 1.4% 以下であったのに実験期間中の総細胞数に対する死細胞の割

塩分 10 における K. mikimotoi の増殖は確認されていな

対し，ウイルス接種区では接種 2 日後から 4 日後に 13い。本実験で示された急激な塩分低下による死細胞の発～ 32%（2,140 ～ 4,717 cells/mL） に な っ た（ 図 8）。 そ生，ならびにその後の生細胞の増殖は，過去の知見に概の間，ウイルス接種区においては，水中のウイルス感

ね合致していると思われる。そのため本実験で構築した

染単位の緩やかな上昇が確認されたため（データ非表

K. mikimotoi の生死細胞カウントの手法は，培養実験に示），H. circularisquama の死細胞はウイルス接種区で高おいて有効な手法であると推察された。

頻度に発生していたものと推察された。HcDNAV の H.

K. mikimotoi は，様々な環境変動が起こる沿岸域に分

circularisquama に対する潜伏期間は 72 時間であること布している。本研究で構築した手法を用いることで，物が報告されている（Nagasaki et al. 2003）。このことを踏まえると，ウイルス接種区で検出された死細胞は，ウイルス感染した H. circularisquama 細胞がバーストする以前の状態であり，細胞の形態は維持されていたものの，ウイルス感染の進行により細胞膜の構造を維持可能な生理状態にはなかったと推察された。以上のことから，H.
circularisquama の生細胞と死細胞が混在する場合でも，
SYTOX-Green 染色と ICM により，両者を客観的に区別しながら定量的に検出可能なものと判断された。
今回の SYTOX-Green 染色に関わる諸条件の検討により，二種の赤潮原因渦鞭毛藻類について生細胞と死細胞が混在する条件でも，測定者の主観に依存せず客観的・定量的に両細胞を検出する手法の確立に成功した。本技術開発により，赤潮原因藻類の死滅に関わる各種要因の解析が効率化され，赤潮終息の予察技術開発に大きく貢献するものと期待される。さらに，本手法は細胞サイズ，

図 6．低 塩分ショック 30 分後の Karenia mikimotoi 培養中に占める SYTOX-Green 染色用生細胞（死細胞）の割合
	塩分 30 で培養中の K. mikimotoi 培養に対して蒸留水ベースの培地を添加し，塩分を 28 から 10 までの各段階に急激に低下させた。対照区には等量の塩分 30 の培地を添加した。
n = 3，エラーバーは標準偏差

赤色蛍光（クロロフィル自家蛍光量を反映）ならびに緑色蛍光（生死状態判別）データを同時かつ簡便に取得可
能なことから，各種パラメーターに基づいた餌料用微細藻や現場で高密度に発生している赤潮等，様々な場面における微細藻類の客観的状態診断技術の開発にも応用可能と思われる。

謝

辞本研究の一部は，平成 26 年度水産庁委託事業赤潮・
貧酸素水塊対策推進事業により行われた。海水採取に御協力いただいた，鬼塚剛博士に感謝いたします。

文

図 7．塩分ショック後 3 日間の Karenia mikimotoi の平均増殖速度
n = 3，エラーバーは標準偏差

献Berges JA, Falkowski PG (1998) Physiological stress and cell deathin marine phytoplankton: Induction of proteases in response tonitrogen or light limitation. Limnol. Oceanogr., 43, 129-135.
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図 8．ウイルス HcDNAV 接種後の，Heterocapsa circularisquama 培養中に占める生細胞と SYTOX-Green 染色陽性細胞（死細胞）密
度の変化
n=1

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