人工制限酵素等を用いた突然変異育種法（独）農業生物資源研究所
農業生物先端ゲノム研究センター
ゲノム機能改変研究ユニット/
横浜市立大学・木原生物学研究所
土岐 精一

突然変異育種
放射線等によって人為的に誘発した突然変異を品種改良に利用
主にガンマ線を変異原として国内で200品種以上を作出
草丈が低く、耐倒伏性に優れたイネ 「レイメイ」
突然変異育種による国内での実用品種第１号（1959年）
黒斑病抵抗性の「ゴールド二十世紀」（1981年）・作物のゲノム情報が塩基配列レベルで明らかにされる様になってきた。
・１～数塩基の多型が、農業上有用な形質を作物に付与する場合も多い。

・比較ゲノム・タンパク質工学の進展により、有用なタンパク質をデザインすることが可能になってきた。

脱粒性を決める配列

日本晴 ATTTCA
カサラス ATTGCA

ゲノム上の標的とする遺伝子に狙いを定め、塩基配列レベルで改変する技術が必要とされている。

人工制限酵素：Zinc-Finger Nucleases (ZFNs)

1モチーフが3塩基を認識→18塩基を認識して切断する制限酵素
6塩基認識の制限酵素→平均すると約４千bpの断片に切断
18塩基認識の制限酵素→平均すると約7億bpに一回切断→ゲノム上の標的遺伝子のみを切断できる標的遺伝子特異的に変異を導入する２つの方法
標的遺伝子の切断②遺伝子ターゲッティング（標的組換え）（お手本を使った変異の導入）①標的変異
ＤＮＡ末端の非相同末端結合

5’

ＤＮＡ末端修復

3’
GT vector

＊
＊
＊

欠失
挿入

塩基置換

**

標的遺伝子の切断部位に欠失・挿入・塩基置換が導入できる
特願2010 遺伝的に改造された植物細胞の製造方法(生物研）

＊
＊
＊

3’
5’

細胞外よりお手本となるＤＮＡを導入
ＤＮＡの相同組換えを利用した修復

＊
＊
＊
＊

標的遺伝子の任意の場所に欠失・挿入・塩基置換・モチーフ交換が誘導できる
特願2010 遺伝的に改変された細胞を製造する方法（生物研・京大）

標的遺伝子特異的に変異を導入する２つの方法
標的遺伝子の切断②標的組換え（ジーンターゲッティング）
お手本を使うDNA修復①標的変異
お手本を使わないDNA修復

欠失

非相同末端結合(NHEJ)

5’3’＊

3’5’＊
＊

相同組換え(HR)挿入塩基置換＊＊

切断部位に欠失・挿入・塩基置換が導入できる

＊
＊
＊

＊
＊
＊
＊

遺伝子の望むべき部位に欠失・挿入・塩基置換・モチーフ交換が誘導できる

標的遺伝子をZFNsで切断し変異を導入することに初めて成功

PNAS 2010
ABI4

人工ヌクレアーゼ(ZFNs)を用いた計画的な変異の導入

変異細胞が生殖系列に入る

変異細胞が出現

人工ヌクレアーゼ遺伝子の発現を誘導
人工ヌクレアーゼ
遺伝子を導入した植物体
変異植物体の獲得

野生型

1.5µM
ABA

ABA非感受性突然変異体(abi4 )

人工ヌクレアーゼで作った変異体標的遺伝子により大きな欠失を導入出来ないだろうか？

1. 標的遺伝子の特異的切断

切断

ABI4ゲノム遺伝子配列

2. DNA末端の保護

野生型植物（Ku80存在下）でZFN切断を行った場合

Ku80
Ku70
Ku80欠損植物を用いてZFN切断を行った場合

Ku70/80の欠損植物体にZFNを処理することにより、切断部位により大きな欠損を誘導できる
特願：遺伝的に改変された植物細胞の製造方法

新規人工制限酵素TALENは植物の病気の研究から生まれた
112/1334

LTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG

核移行シグナル

転写活性化
ドメイン

NADC

DNA結合ドメイン
HD NI NG HD NN HD HD NI HD NG NI HD HD NN NG
5’-C A T C G C C A C T A C C G T-3’
標的DNA配列

植物病原細菌

AD

植物細胞

細胞質
AD
核移行シグナル

病原菌感染を促進する遺伝子群の転写誘導
AD遺伝子

核病気

TALENsによるイネWaxy遺伝子座の切断

CCTTAAGTCCTTATAAGCACATL5GCTCCTTAAGTCCTTATAAGCACATL4CCTTAAGTCCTTATAAGCACATATL3GCTCCTTAAGTCCTTATAAGCACATATL2CCTTATAAGCACATATL1ACTGCTCCTTAAGTCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACAATTTTTTGACGAGGAATTCAGGAATATTCGTGTATACCGTAACATTATATATACAAACTCAAAATCGCTGTTAAAAATACAAACTCAAAATCGCTACAAACTCAAAATCGCTGTATACAAACTCAAAATCGCTATACAAACTCAAAATCGCTG

Waxy locus

R1R2R3R4Experimental scheme for TALEN-mediated mutagenesis in rice

Callus induction(3 - 4 weeks)
SeedG418 selection(2 - 4 weeks)

Agrobacterium
infection

Detection of TALENmediated mutation
by CelI assay

Clonal propagation of theindependent G418r calli

TALEN overexpression vector
TALEN-mediatedmutant callus

ZmUbi TALEN-L TALEN-R T
2ACells processingmutation

Regeneration

Isolation of TALENmediated mutant
T0 plants

Detection of TALENmediated mutation
by CelI assay

Mutant T0 plant

T0 plants
Wild-type TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA
12-2, 8 TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACAA
TCCTTATAAGCACATATGGCAT----ATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA
12-414-8, 10, 11TCCTTATAAGCACATATGGCATT---ATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA
15-40 TCCTTATAAGCACATATGGCATT-----ATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA
15-43 TCCTTATAAGCACATATGG------------------TCCTTTTTAGCGACA

T1 plants
Wt : Het : Hom
TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA
12-2 TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 3 : 5 : 4A
12-4 TCCTTATAAGCACATATGGCAT----ATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 6 : 7 : 412-8 TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 4 : 10 : 4A
14-8 TCCTTATAAGCACATATGGCATT---ATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 2 : 8 : 514-10 TCCTTATAAGCACATATGGCATT---ATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 1 : 10 : 514-11 TCCTTATAAGCACATATGGCATT---ATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 4 : 5 : 315-40 TCCTTATAAGCACATATGGCATT-----ATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 4 : 4 : 315-43 TCCTTATAAGCACATATGG------------------TCCTTTTTAGCGACA 6 : 4 : 4植物体で検出された変異が、次世代へ安定的に伝達される再分化後は新たな変異が生じない？
TALENsによる標的の切断はカルスで生じやすい？

Callus induction(1-2 weeks)
Seed

Genotyping

TALEN transgenic T1 seed
ZmUbi TALEN-L TALEN-R T
2A

Mutation
HomoHetero
Wild-type

Detection of TALENmediated mutation
by CelI assay
Clonal propagation

標的変異の頻度はイネlig4変異体において向上する解析した 突然変異
クローン数 クローン数

突然変異
率 (%)

実験1
コシヒカリ(+/+)

16

16.3

lig4 (-/-)

23

1043.5

コシヒカリ(+/+)

26

27.7

lig4 (-/-)

17529.4

実験2

イネにおいては・・・
NHEJ関連因子の欠損で、TALENs誘導性の変異頻度も塩基欠損の大きさも上昇

Lig4 917G x Wx TALEN A1/B2-2
Wt TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 4/16
TCCTTATAAGCACATAT-------------ATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 12/16
Lig4 917G x Wx TALEN A1/B2-4
Wt TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 8/14
TCCTTATAAGCACATATGGCATTGT-----------TTGAGTTTTAGCGACA 3/14
TCCTTATA-----------------------TATGTTTGAGTTTTAGCGACA 2/14
TCCTTATAAGCACATATG-----------------TTTGAGTTTTAGCGACA 1/14
Lig4 917G x Wx TALEN A1/B2-16Wt TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 10/16
TCCTTATAAGCACATAT-------------ATATTTTTGAGTTTTAGCGACA 1/16
TCCTTATAAGCACATATGGCATTGT-----------------TTTAGCGACA 1/16
TCCTTATAAGCACATATG-----------------TTTGAGTTTTAGCGACA 1/16
TCCTTATAAGCACATAT---------------ATGTTTGAGTTTTAGCGACA 1/16----------------------136 bp------------------------ 1/16
TCCTTATAAGCACATAT-------------ATATGTTTGAGTTTTAGCGACA 1/16

Zinc finger nucleases (ZFNs)

Zinc finger motif（DNA binding domain）

FokI
5’-CCCCGCCGCCGCCACcgtaGGAGGAGGAGCCAAC-3’
3’-GGGGCGGCGGCGGTGgcatCCTCCTCCTCGGTTG-5’

TALENs

NI→A; NG→T; NN→G; HD→C
112/1334

LTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG

FokI5’-TCCTTATAAGCACATATGGCATTGTAATATATATGTTTGAGTTTTAGCGA-3’
3’-AGGAATATTCGTGTATACCGTAACATTATATATACAAACTCAAAATCGCT-5’

CRISPR-Cas9
Guide RNA

5’-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCNNN
N
3’-NNNNNNN
NNNNNNN-5’Cas9
5’-NNNNNNN N
N NNNNNNN-3’N
N
GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG
PAM

ZFNsやTALENをRNAやタンパク質の形で植物細胞に導入することは簡単ではない

細胞質

TALENの遺伝子

核TALENの認識配列

標的変異技術は育種にどう貢献するか①農業上重要な遺伝子の同定や、機能解析を促進させる。

②農業上不要な遺伝子を計画的に壊せる。また切断部位に変異を導入しアミノ酸置換を起こせる。
③２種類の人工ヌクレアーゼを利用することにより、染色体上の不要な部分を取り除いたり、転座を起こさせることが可能である。

標的変異（今後の研究）・人工制限酵素遺伝子をどうやって取り除くか
次世代で分離させる トランスポゾンの利用
・人工制限酵素遺伝子を染色体上に導入せず、一過的に発現させ変異を導入する。
・人工制限酵素をRNAやタンパク質の形で植物細胞内に導入し変異を導入する。
・人工制限酵素タンパク質を細菌やウイルスに作らせ感染によって植物細胞に導入し、変異を導入する。
・核酸・タンパク質ではない人工制限酵素の開発

標的変異技術の活用

標的変異技術の活用

・フライドポテトにしてもアクリルアミドを作らないジャガイモの育成

・ソラニンを作らないジャガイモの育成

標的遺伝子特異的に変異を導入する２つの方法
標的遺伝子の切断②標的組換え（ジーンターゲッティング）
お手本を使うDNA修復①標的変異
お手本を使わないDNA修復

欠失

非相同末端結合(NHEJ)

5’3’

＊

3’5’

＊
＊

相同組換え(HR)
挿入

塩基置換
＊
＊

切断部位に欠失・挿入・塩基置換が導入できる

＊
＊
＊

＊
＊
＊
＊

遺伝子の望むべき部位に欠失・挿入・塩基置換・モチーフ交換が誘導できる

脱粒性

イネ栽培化の鍵となった脱粒性抑制遺伝子を発見（農林水産研究成果10大トピックス Konishi et al. 2006
Science)

開花期調節

Hd16

Hori et al. (2013) Plant J.

標的組換え（ジーンターゲティング：GT）とは・DNAの塩基配列の相同性を利用して、遺伝子を組換えることを「相同組換え」と言う。
・「相同組換え」を利用して、染色体上の遺伝子を細胞外から導入した遺伝子と置き換える事を「標的組換え」と呼ぶ。

標的組換え技術により染色体上の特定の遺伝子に変異を導入したり、破壊する事ができる。

標的遺伝子特異的に変異を導入する２つの方法
標的遺伝子の切断①標的変異お手本を使わないDNA修復

欠失

非相同末端結合(NHEJ)②標的組換え（ジーンターゲッティング）
お手本を使うDNA修復
5’3’

＊

3’5’

＊
＊

相同組換え(HR)
挿入

塩基置換
＊
＊

切断部位に欠失・挿入・塩基置換が導入できる

＊
＊
＊

＊
＊
＊
＊

遺伝子の望むべき部位に欠失・挿入・塩基置換・モチーフ交換が誘導できる

アセト乳酸合成酵素(Acetolactate synthase:ALS)
分岐鎖アミノ酸(バリン、ロイシン、イソロイシン BCAA)の合成に関与
ビスピリバックNa塩（BS、クミアイ化学)
Pyruvate

2-Ketobutyrate
Acetolactatesynthase(ALS)

Pyruvate

2-Aceto-2hydroxybutyrate

2-Acetolactate

NADPH

Pyruvate

Ketoacid
reductoisomerase(KARI)

NADPH

2,3-Dihydroxy-3isovalerate

2,3-Dihydroxy-3methylvalerate

バリン

イソロイシンロイシン

ビスピリバックNa塩（BS、クミアイ化学)

標的組換えによる除草剤耐性イネの作出（培養系で見出された変異の植物体への計画的な導入）
除草剤耐性イネ培養細胞の選抜（再分化しない）

変異部位の同定
Trp

ALS

Leu

ALS 遺伝子座

SerIle

相同組換えを利用したGT

LB
ベクター

W548L S627I

L

S

葉緑体移行シグナル

野生型遺伝子座A

L

S

変異が導入された
遺伝子座

A

L

S

RB

BS耐性個体の選抜
A

L

S

Positive control vector

GT vectorLSジーンターゲッティング植物体の次世代の解析
シークエンスの確認
LB

BS感受性検定

L S
A L S

RB

RB配列なしイネゲノム欠失なし

LB配列なしイネゲノム欠失なし
W548L

S627I

Segregate out
GT hetero
GT homo・BS耐性：感受性=3:1
・W548L, S627I変異は連鎖し、変異の有無 とBS耐性/感受性は対応しているジーンターゲッティングによって2つの点変異を導入したイネはBS剤に対して高度の耐性を示す

WT

Hetero

Homo
BS未処理

WT

HeteroBS 1 kg/ha

Homo

WT

Homo

BS 1 kg/ha

ALSの酵素活性の阻害（％）

高レベルの除草剤耐性を付与するには野生型のALS酵素を発現させないことが重要である

100

ヘテロ型

野生型

Hetero
OE

80
6040

過剰発現体

200

Homo

WT

10-9

10-8 10-7 10-6
BSの濃度 (M)

10-5

ホモ型

10-4

BS感受性ALS複合体のみ

BS耐性、感受性
ALS複合体混在

BS耐性ALS
複合体のみ

ベクター由来のＤＮＡ断片が導入されていないのか？
CGH (Comparative Genomic Hybridization) array
Gene targeting vectorの全配列をスポットしたアレイを作製し、異なる蛍光色素でラベリングした野生型とターゲッティング個体のgenomic DNAをhybridizeさせる。

変異体にのみ挿入されている配列があればシグナル比が変化

T-DNA (イネゲノム 8kb)

Δ5’ ALS

Binary vector

WT (Cy3)

GT (Cy5)ベクター由来のＤＮＡの挿入は検出されなかった
WTにGTベクターを添加 (Cy5)WT (Cy5)

WT (Cy3)

GT (Cy5)

WT (Cy3)

WT (Cy3)次世代シークエンサーによる解析

C58 Genomic DNA(linear 2Mb)

T-DNA (Rice genome 8kb)

Binary vector(pPZP2028 7kb)
pAtC58(542kb)
C58 genomic DNA(circular 2.8Mb)

Agrobacterium

Vir genes

Ti plasmid(pTiBo542からT-DNAを除いたもの 244kb)

ベクター、アグロバクテリウム由来の塩基配列は検出されなかった。
自然突然変異と同等の変異体と看做せるか？

点変異の導入でお米のトリプトファン含量を増やす（タンパク質工学的知見の活用）

Shikimate

Chorismate
GTAS
prephenate anthranilate
Phe, Tyr

Feedback
repression

S126F / L530D=Trp 非感受性＋酵素活性の向上

Trp

Anthranilate Syntase（ＡＳ）はトリプトファンによってフィードバック制御を受ける。

WT
Tozawa et al. 2007

AS 遺伝子座

S126F

L530D

完熟種子の遊離トリプトファン含量は原系統の約２３０倍

6000

完熟種子中の遊離トリプトファン含量 (nmol/gDW)
4255±855

5000
4000

60
40200

日本晴

野生型

GT

S126F/L530D

野生型Y367A

GT
特願：相同組換えを利用したイネアントラニル酸合成酵素の改変

２塩基の置換で代謝は変わる
cytidine

Galacturonic acidcystine
GSSG

UMP

cytosine

gluconic acidshikimate

Cysadenosine

adenineAMP

guanosine

guanineallantoin

quinatecoumaric acidTyrthiamine

tryptamine

serotonin

pyridoxamine

GSH

glycerate
pyridoxamine5P

Gly

OASA2

G3P

Ser

anthranilate
betainePhecholineAlapyruvate

Trp

Leu
Nicotinate-nucleotide

mevalonate

HMG-CoA

IAA

Deamino-NADVal
Nicotinate

Nicotin amide

NADGABA

trigonellineAsnpipecolinate

Asp

LysGlnGlu

5oxoProornitine

ProGT/NT > 10
10 > GT/NT > 55 > GT/NT > 1.5

Met

Homo serThrIle

pantothenate

Hisβ-Ala

理研 斉藤先生との共同研究

CitrullinehydroPro

0.2 > GT/NT > 0.1

Arg

Putrescine

Agmatine

0.67 > GT/NT > 0.2

Spermidine

No differenceor Not detected

Saika et al. (2012) Metabolites

高等真核生物では標的組換え(GT)頻度は極めて低い（１）外来DNAのランダム挿入は非相同末端結合(NHEJ)経路によって起こる。

鋳型DNAの導入（2）標的組換え(GT)は鋳型DNAをお手本にした相同組み換え(HR)経路によって起こる。

ランダム挿入(NHEJ)

核染色体
DNA

細胞質

標的組換え
(HR)

(3)高等真核細胞ではランダム挿入 >> 標的組換え遺伝子が導入された細胞の1/1,000 ～1/100,000が標的組換え

標的組換えが起きた細胞を効率的に選抜することや、相同組み換え頻度を向上させることが必要ポジティブ・ネガティブ選抜により、標的組換えを起こした細胞を濃縮できる

ベクターの導入

相同組換え

x

標的遺伝子座x

生育
標的組換え
細胞生育阻害ポジティブ選抜
マーカー遺伝子

ランダムな遺伝子導入

ネガティブ選抜
マーカー遺伝子寺田、飯田イネWaxy遺伝子の破壊による餅イネの作成

日本晴

GT(T1)

13.2 Kb

1 Kb
EcoRV

EcoRV

Wild-type locus
RBVector

EcoRV

anti-nptII

EcoRV

nptII

GT locus

LB

anti-nptII
7.4 Kb

9.6 Kb
EcoRV

EcoRV

EcoRV

nptII

EcoRV

必要無くなったマーカー遺伝子をどうやって回収するか？

ネガティブ選抜
マーカー遺伝子

ポジティブ選抜
マーカー遺伝子

導入したい変異

相同組換え

標的組換えが生じた細胞の選抜

マーカー
遺伝子の綺麗な除去
希望する変異のみの導入

標的遺伝子＊トランスポゾンの利用や相同組換えの利用による足跡を残さないマーカー遺伝子の除去技術の開発が期待されている

昆虫のトランスポゾンpiggyBacを用いたマーカー除去システム
動物のトランスポゾンが植物で動くことを発見！

Luciferase
遺伝子の発現
転移前

Wt Cont

転移後転移酵素発現
5-FCなし5-FCあり8.2 Kb

AscI

9.4

L

piggyBac

6.6

転移
AscI

4.4

3.9 KbLUC

GTTAA

piggyBac

TTAAC

転移
GTG GTG GCC CCT GTT AAC GAG GAC TAT ATCV
VAP
V
N
E
DY
I

PacI

PacI

UC

ステップ1

標的遺伝子座GT ベクター

ネガティブ

標的遺伝子

標的

ポジティブ

遺伝子

ネガティブ点変異

piggyBac

ポジティブ・ネガティブ選抜による標的組換え細胞の選抜

標的

ステップ2

ポジティブ

転移酵素の発現

遺伝子

マーカー遺伝子の除去
ポジティブ点変異の導入された標的遺伝子座

標的遺伝子

標的遺伝子に必要な変異のみを導入する技術ができた

WT

OsALS
3.4 Kb

3.0 Kb

W548L S627I

ネガティブポジティブ

ネガティブ

ポジティブ

GT

ポジティブ

転移酵素の発現

マーカー除去

OsALS

除去サイト
GCTGACg
L T

HpaI
GTTAACg
L T

W548L変異CAATGG
Q W

MfeI
CAATTG
Q L

S627I変異cCAAGTG
P S

MfeI
cCAATTG
P I

標的組換え技術は育種にどう貢献するか

本手法を用いることにより、標的とする遺伝子の任意の塩基配列を正確に改変できる。
①異種の植物・微生物・動物で見出された有用変異を対象とする作物に直接的に導入できる。
②タンパク質工学的手法により見出された有用変異を対象とする作物に直接的に導入できる。
③将来的には、減数分裂期の組換え制御も可能。

標的組換え（今後の研究）・あらゆる植物に適応可能な標的組換え細胞・植物の選抜法の開発
・人工制限酵素と鋳型DNAをどうやって細胞に効率的に導入するか・人工制限酵素の発現と鋳型DNAの導入タイミングをどうやって合わせるか・相同組み換えの頻度を人工制限酵素の利用以外でどのように向上させるか→化学物質による制御

標的組換えの活用（比較ゲノムの知見の利用）
浜ダイコン（耐塩性）C
浜ダイコンのＸ遺伝子の００番目の塩基がCであることにより耐塩性が増す

キャベツ

A→C
キャベツにもＸ遺伝子は存在し、その塩基配列は浜ダイコンとほぼ同じである。

標的組換えによりキャベツのＸ遺伝子の００番目のＡをＣに置換する。

標的組換えを活用すれば、栄養繁殖性の植物の育種を効率的に行うことができる
AB例) 病気に強いが収量は少ない例) 病気に弱いが収量は多い
罹病性

Ｘ遺伝子

耐病性
Ｘ遺伝子

品種Aにおいて見出されている耐病性に関わる1塩基多型を、標的組換えにより品種Bに導入する

突然変異育種
ガンマ線
突然変異剤

標的変異

標的遺伝子を人工制限酵素で切断

標的組換え

標的遺伝子を人工制限酵素で切断
お手本DNAを利用して標的遺伝子を改変望ましくない変異望ましい
変異
望ましくない変異

標的遺伝子に変異を導入（主に遺伝子を破壊）

正確な
標的遺伝子の改変

遺伝子導入

外来遺伝子を染色体上に挿入

内在性の相同な遺伝子が存在しても+外来遺伝子が足される比較ゲノムタンパク質工学

ゲノム機能改変技術

有用遺伝子・ゲノムをデザイン

ゲノム改変技術を利用した分子育種（有用形質の計画的な導入）