意外と知らないカラムの話～C18の分離を変えるシラノール～
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 佐藤誠 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

シラノールとエンドキャップ

エンドキャッピング

塩基性化合物のピーク形状の改善

ピンポイントなエンドキャッピング

表面を覆うようなエンドキャッピング
手法

TMS化、マルチステージタイプ、ポリメリックエンドキャッピング
高温気相エンドキャッピング
Sunniest エンドキャッピング
シラノールアクティビティコントロール

Sunniestエンドキャッピングの効果
Sunniest C18

43

12

Sunniest RP-AQUA

N(4) =12,400
TF(4) =1.10

4

3

1Column size: 4.6 x 150 mm
Particle size: 5 µm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 =60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC or 22 ºCSample: 1 = Uracil
CH
2 = Propranolol
ONHCH

N(4) =12,500
TF(4) =1.04

233Sunniest C84312OHN(4) =12,000
TF(4) =1.09

3 = Nortriptyline
NHCH34N(4) =10,000
TF(4) =1.14

3
1 2

124

3N(4) =4,000
TF(4) =4.33

B社C18
320

4 = Amitriptyline

A社C182

1Sunniest PhE

464

8101214

Retention time/min

1618

CH3NCH3N(4) =4,300
TF(4) =5.24

202224標準試料の分離比較
Column:Company P C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (26.1 Mpa, 30,800 plate )Company
PC18264
Company T C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (22.7 Mpa, 31,600 plate)
26.1 MPa
113
Company W C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (18.5 Mpa, 23,300 plate)27
Company A C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (30.6 Mpa, 30,200 plate)51
k6=7.4Company
TC18
Company S C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (22.2 Mpa, 31,800 plate)
N6=31,600
6
3
422.7 MPa
SunShell C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (21.8 Mpa, 31,900 plate)
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
7
1 2 k6=7.75Company W C18 Flow rate: 1.0 mL/min
N6=23,300 46318.5 MPa
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine, 3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
7
1 2 k6=9.05
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene, 7 = Triphenylene
Company A C18
N6=30,200
7k6=5.4
N6=30,800

530244676SunShell C1821.8 MPa 48

水素結合性30.6 MPa

52 k6=9.7
1 3 N6=31,800
2316456718202224

疎水性

立体選択性(Amylbenzene/Butylbenzen (Triphenylene/o-Terphenyl)e)0.481.54

1.200.35

1.56

1.50

Company W C18

0.38

1.59

1.32

Company A C18

0.42

1.57

1.25

Company S C180.44

1.60

1.31

SunShell C18

0.39

1.60

1.46

Company S C18 Company P C18
22.2 MPa
Company T C18

k6=10.4
N6=31,900

101214
16
Retention time/min(Caffeine/Phenol)

同じ官能基で差がでるのは？
疎水基 (主効果)

吸着性基(二次効果相互作用)

既存の分離剤
主効果(疎水基)

二次効果相互作用
制御型分離剤
主効果
(疎水基)

二次効果
(吸着等)

第二主効果を持つ
二足型分離剤
主効果
(疎水基)

制御された
二次効果

第二の主効果シラノール
カラム、分離にとっては良くないシラノール基の相互作用
1. 吸着
2. イオン交換
3. 水素結合

Si-OH
Si-OSi-OH

１）吸着・順相クロマトグラフィーで用いられる未修飾シリカ中のシラノール基
２）シリカ系逆相充填剤の残存シラノール基

シラノール基のイオン交換性!?

塩基性化合物のテーリング
高吸着性
シラノール

シラノールのイオン交換性

CH3

HSi

イオン交換クロマトグラフィにおいてすべての塩基性物質がテーリングするわけではない

C18カラム充塡剤上に、塩基性物質をテーリングさせる要因があるのでは

O

H

O

O

H O

O

Si

Si

Si

Si

C18基近くの疎水場に存在するシラノール基が水和しようとし塩基性物質を強く引き付けるのでは？

シラノールアクティビティコントロール
Sunrise C18-SAC

高吸着性
シラノール
CH3

H
Si

O

O

O

H O

SiSi

Si

H
O
Si

Silanol
ActivityControl
Technology

シロキサン
結合に変換
CH3SiOO

Si

Si

HOO
Si

シラノールの活性コントロール

シリカは結晶構造ではなくアモルファス

条件次第では原子を動かすことができるSiシラノール基による分離の変化■ ピリジンの溶出順とピーク形状の比較
Column size: 4.6 X 150mm
Mobile phase: CH3OH/H2O = 30:70
Sample: 1 = Uracil, ② = Pyridine, 3 = PhenolA) Sunrise C18(Endcapped)②3１3B) 他社 C18(Non-endcapped)

１②3C) Sunrise C18-SAC 3②

シラノール基の影響でピリジンが移動するがテーリング無し

１0

シラノール基の影響でピリジンが移動するがテーリング

51015Retention time / min20

塩基性化合物の選択性の比較
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH3.0 or pH4.5 = 50:50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil
HNA) Sunrise C18
4pH4.52315OB) Sunrise C18-SAC
1pH4.52NHO

2 = Propranolol
4CH3O

33 = Nortriptyline

NHCH3OH

54 = Amitriptyline

0246810Retention time / min

121416NHN

5 = Toluene

CH3CH3CH3CH3

水素結合性TMS化C18
Sunrise C18 2（キサンチン類の分離）

3

1= テオブロミン 2= テオフィリン

41OO

CH3N

HNO

エンドキャッピングなしC18
Sunrise C18-SAC
24O

345678NH

N

CH33= カフェイン
H3C2HNN

3O1ONHNCH310H3C91011CH3NNNNHCH3Time (min)カラムサイズ：4.6 x 150 mm
移動相：メタノール/20mMリン酸二水素カリウム pH4.5 (30:70)
流 速：1.0 mL/min
温 度：40 ºC

4= フェノールOHイオン交換シラノール基含有カラムによる塩濃度の影響
カラム：エンドキャッピングなしC18,Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm
移動相：
アセトニトリル/ 酢酸アンモニウム pH 4.1 (70:30)
流速：1.0 mL/min
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，
4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

123200 mM
1542
3100 mM
150 mM

N=12,000

N=12,500

2531544

N=13,000

225 mM345

N=13,500

塩濃度を上げると保持が小さくなる，つまりイオン交換が働いている

1210 mM

3024681012 14 16 18
保持時間(min)54

N=12,00020222426

イオン交換423151235

エンドキャプC18との保持比較

カラム：TMS化C18, Sunrise C18
4.6 x 150 mm
アセトニトリル/エンドキャップなし
C18, Sunrise C18-SAC
20mMリン酸緩衝液pH3.0 (50:50)
4.6 x 150 mm
流速：1.0 mL/min
4
温度：40 ºC
試料：1=ウラシル，2=プロプラノロール，アセトニトリル/
3=ノルトリプチリン，
20mMリン酸緩衝液pH4.5 (50:50)
4=アミトリプチリン，5=トルエン

15

アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH6.0 (80:20)

05101520

432253035

保持時間(min)

4045

50556065

実際の使用例
同じメーカの最新カラムに変更後分離が変わる

カラムの製造終了••••

シラノール基の残存量の違い
基材シリカの違い
C18 試薬の違い
エンドキャッピング方法・試薬の違い

製造終了となる
カラムの多くは・・・

CH3CH3H
Si

O

OO

H O

SiSi

SiH
OSi

過去数十年前に作られたメソッドはシラノール基の相互作用を自然と利用していた可能性がある

SiO

O

Si

Si

H

O

O
Si

Si

シラノール基の相互作用を活かせるカラムが有効

弊社の技術サニエスト結合（エンドキャッピング）技術
Hexamethyloctadecyltetrasilane (C18 reagent A)の合成

Final TMS

シリカ表面に結合
HO

トルエン中で還流

SiO
SiSiOSiOSiO O SiOSiO
O OHOSiO
OOO
SiOSiOSiSiSiHO OO OSiOO OO OOSiOSiOSiOOSi
O Si O O Si O Si OSiO Si O OOSiOOOOOOOOSiOOOSiOSiOO

Si O Si
SiOOOSiSi OO O

SiSiSi標準試料の分離比較
Column:Company P C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (26.1 Mpa, 30,800 plate )CompanyP
C18
264
Company T C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (22.7 Mpa, 31,600 plate)
26.1 MPa
113
Company W C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (18.5 Mpa, 23,300 plate)27
Company A C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (30.6 Mpa, 30,200 plate)
51k6=7.4Company
TC18
Company S C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (22.2 Mpa, 31,800 plate)
N6=31,600
63422.7 MPa
SunShell C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (21.8 Mpa, 31,900 plate)
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
7
1 2 k6=7.75
Company W C18 Flow rate: 1.0 mL/min
N6=23,300 4
6318.5 MPa
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine, 3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
7
1 2 k6=9.055 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene, 7 = Triphenylene
Company A C18
N6=30,200
7k6=5.4
N6=30,800

530244676

SunShell C1821.8 MPa 48

水素結合性30.6 MPa

52 k6=9.7
1 3 N6=31,800
2316456718202224

疎水性

立体選択性(Amylbenzene/Butylbenzen (Triphenylene/o-Terphenyl)
e)

0.48

1.54

1.20

0.35

1.56

1.50

Company W C18

0.38

1.59

1.32

Company A C18

0.42

1.57

1.25

Company S C18

0.44

1.60

1.31

SunShell C18

0.39

1.60

1.46

Company S C18 Company P C18
22.2 MPa
Company T C18

k6=10.4N6=31,900

10121416Retention time/min(Caffeine/Phenol)

物性値
炭素含有量Carbonloading (%)

細孔容積
比表面積
Specific surface Pore volume aarea a (m2/g)
(mL)

細孔径
Pore diameter a(nm)SunShell C18

7.3

1250.261

8.34

Company S C18

8.0

1330.278

8.20

Company A C18

8.5

1350.414

12.3

Company T C18

8.8

1300.273

8.39

Company W C18

7.3

1130.264

9.32

Company P C18

4.91020.237

9.25

a. C18充填剤を600℃で8時間焼成し，アルキル基を焼き飛ばした後のコアシェル粒子を測定しました。この測定値はオリジナルのコアシェル粒子の値より小さくなります。
*全ての測定はクロマニックテクノロジーズ社内で行いました。

シリカ表面の疎水性
既存のエンドキャッピング
Stationary phase
C18C18C18C18C18End-capping layer

低疎水性Sunniest エンドキャッピング
Stationary phase
C18C18C18C18End-capping layer

C18高保持の比較
炭素含有量：7.3％

024681012

炭素含有量：6.9％024681012

炭素含有量は少ないがシラノール基減少の影響により保持が増加

まとめ• アモルファスであるシリカゲルは一定条件下においてシラノール基を、シロキサン結合に変えることが可能であった• シラノール基を効果的に残すことで一般的なエンドキャッピングを施したC18カラムとは異なった分離が可能であった• エンドキャッピングと同時にシロキサン結合変換により作成されたC18カラムは、一般的なエンドキャッピングで作成されたC18カラムより保持が増大した。