2nd Choiceコアシェルカラム
長鎖アルキル基の実力(極性物質から異性体まで)
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

本日の内容• RP-AQUA (C28) カラムの紹介
100%水系移動相で使用で来る理由
親水性化合物の分離への適用• C30, C28カラムの紹介
C30カラムの特長
RP-AQUAカラムとの違い

長鎖アルキル基カラムのラインナップ• 親水性化合物向け長鎖アルキル基カラム
Sunniest RP-AQUA
SunAmor RP-AQUA
SunShell RP-AQUA• 疎水性化合物向け長鎖アルキル基カラム
Sunrise C28
SunShell C30

RP-AQUA(C28)カラム• 疎水性相互作用が主な相互作用• 水系の移動相での安定性が高い• 極性基導入型C18より、耐久性が高い• 親水性化合物の分離の使用可能

CH3

H3C

オクタコシル (C28)C18とRP-AQUAの標準試料の分離
23Sunniest C18

15746

Retention time/min

Column: Sunniest C18, 5µm 150 x 4.6 mm
Sunniest RP-AQUA, 5µ m 150 x 4.6 mm
Sunniest C18, 5µm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa

Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene, (N=15,700)
5 = o-Terphenyl, (N=15,000)
6 = Amylbenzene, (N=15,300)
7 = Triphenylene, (N=14,500)

SunShell RP-Aqua の40 oCでの保持核酸塩基の分離
1（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

53Relative retention of thymine
(%)

40 ºC

240℃でのチミンの保持時間の変化

425 ºC215340123Retention time/min

4Column: SunShell RP-Aqua, 2.6 μm 75 x 4.6 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25 ºC
Sample: 1 = Cytosine, 2 = Uracil, 3 = Thymidine,
4 = Uridine, 5 = Thymine

10090807060
50403020
10012345Measurement number every stop flow
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，SunShell RP-Aquaほとんど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，94%以上の再現性を示しました。

水溶性ビタミンの分離
SunShell RP-AQUA
1Column:
N(4)=30,800 SunShell RP-AQUA, 2.6 µm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:N(3)=31,800
40mM Phosphate buffer pH6.8
43Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
2Sample: 1 = Nicotinic acid,
2 = Pyridoxal,
3 = Pyridoxine,
4 = Nicotinamide

HILICと逆相クロマトグラフィーの比較
Column:SunShell Amide 2.6 µm : 100 x 4.6 mm
SunShell RPAqua 2.6 µm : 100 x 4.6 mm
Mobile phase: acetonitrile :Amide : 20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2RPaqua : 20 mM phosphate buffer(pH7.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

21435SunShell Amide5243

SunShell RPAQUA
011234細孔からの移動相の抜け出し
内径0.5mmのガラス管

10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006気圧である

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である

内径が1µmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象
によりこの１気圧は簡単に発生する

毛細管現象
水とガラス管の場合 水とテフロン管の場合毛管現象の式:h=2γ cosθ /(rρg)γ : 表面張力
ρ: 液体の密度（比重）

θgr
hrh

θ

液体が管に濡れる場合
θ < 90°液体が管に濡れない場合
θ > 90°疎水性と撥水性
撥水性

水をはじく性質
θ水『液体と物質の表面との接触角が90度より 大き
くその角度が大きいほど撥水性が強い』

疎水性

水と混ざりにくい性質

物質を水とn-オクタノールに溶解して水と混ぜ合わせ、平衡に達したときの双方での濃度の比、分配係数によって表される。分配係数はしばしば常用対数を用いてLogPと表される。

物質

撥水と疎水違う？同じ？

FFFTrifluoromethane

Octadecane

OctaneOctacosane

接触角(θ)

120°

126°

140°

108°

分配係数(LogP)

0.64

9.18

5.18

14.09

水の溶解度 (㎎/L)

4090

0.006

0.66

8.84×10-10

分析化学 Vol.59 No. 3 , P193-205(2010)

疎水性(logP)が高いから撥水性(接触角)が高いわけではない

疎水性の高さ ≠ 撥水性の強さ

酸性、塩基性条件下の耐久性
Relative plate number of thtmine(%)

100100Relative retention (%)

9090808070706060505040

Sunniest RP-AQUA30

Other brand aqua type C1840

Sunniest RP-AQUA30

Other brand aqua type C182020020406080

Time (h)Test conditions
Mobile phase: 0.5% TFA
Temperature: 60 ºC

1001201400100200300

400Time (h)Test conditions
Mobile phase:
20 mM phosphate buffer (pH 8.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

Relative plate of butylbenzene /%SunArmor RPAQUAの耐久性
Durable test condition
Column dimension: 50 x 2.1 mm
Mobile phase:
10mM Ammonium bicarbonate(pH 10)
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC

10080

SunArmor RPAQUA
60

4020001000

2000

3000

4000

5000

6000

Elution volume /mL

有機溶媒を用いないpH10の移動相でも高い
耐アルカリ性Measurement condition
Column dimension: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=70/30
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: acenaphtheneアミノ酸の分離
Column: Sunniest RP-AQUA 5µm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM

01020

Retention time/min30アミノ酸のLC/MS
m/z

100%11880

AlaArgAsn
AspCysGlnGlu
Gly
HisIle,Leu
LysMetPheProSerThrTrpTyrVal01020Retention time/min

9060
175
M =11740Structure of Valine
13320134012250 65 78 88 102 114 130 140 155 166 181 203 216 231 247m/z
147
Mass spectrum of Valine
14876156
132
147
150 Column: Sunniest RP-AQUA 5µm, 2.0x 150mm
166 Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)116B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)
106%B 0% to 20% in 20 min
120
Flow rate: 0.2mL/min
205 Temperature: 40 oC
182 Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM118W

有機酸の分離Column: SunShell RP-AQUA 2.6 µm, 150 x 4.6 mm, Mobile phase: 0.025 M KH2PO4, pH2.5
Flow rate: 1.0 mL/min, Column pressure: 32 MPa for 1.5mL/min, Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210nm, Injection volume: 2 µL
Sample: 1 = Oxalic acid (60 ppm), 2 = Tartaric acid (500 ppm), 3 = Formic acid (1000 ppm),
4 = Malic acid (1000 ppm), 5 = Lactic acid (1000 ppm), 6 = Acetic acid (1000 ppm),
7 = Diglycolic acid (1000 ppm), 8 = Maleic acid (100 ppm), 9 = Citric acid (1000 ppm),
10 = Succinic acid (1000 ppm), 11 = Fumaric acid (10 ppm).

単糖の分離123450510Retention time (min)615
データ提供：東海大学 小玉修嗣先生

Column: SunShell RP-AQUA, 2.6um 100 x 4.6 mm
Mobile phase: 5 mM Phosphate and 25 mM tetraborate (pH 9.6)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 20 ºC
Detection: UV@220 nm
Sample: Monosacchraides derivatized with L-Tryptphan
1 D-Galactose, 2 L-Galactose, 3 D-Glucose 4, L-Mannose, 5 L-Glucose, 6 L-Mannose• RP-AQUA (C28) カラムの紹介
100%水系移動相で使用で来る理由
親水性化合物の分離への適用• C30, C28カラムの紹介
RP-AQUAカラムとの違い
C30カラムの特長

C30 C28カラム• 疎水性相互作用が主な相互作用CH3• 疎水性の高い化合物分離に有用• 構造異性体分離に有用

H3C

トリアコンチル (C30)RP-AQUAとの違い
SunShell C30

SunShell
RP-AQUA

結合密度

1.9 µmol/m2

1.4 µmol/m2

エンド
キャッピングTMS

Sunniest エンド
キャップ

細孔径

12 nm

16 nm

pH範囲

2-82-8(2-10)

対象化合物

異性体
低極性化合物

極性化合物

大きな違いは官能基の結合密度

C30カラムの注意点
結合密度が高いほど異性体分離に優れる
CH3

結合密度が高すぎるとピークがテーリングする

H3C

トリアコンチル (C30)

結合密度が低いと分離が不十分になる

結合密度の影響
1Company A C30, 5 μm

234

非対称性

結合密度

細孔径

1.02

1.9 µmol/m2

13 nm

非対称性

結合密度

細孔径

1.633.7 µmol/m220 nm

非対称性

結合密度

細孔径

1.04

3.0 µmol/m213 nm

1Company B C30,5 µm

23412, 3Conventional C18, 5 µm
4051015202530

Retention time / min
Column dimension, 250 x 4.6 mm;
mobile phase, methanol/water = 97/3;
flow rate, 1.0 mL/min;temperature, 30 oC;
detection, UV295 nm;

sample,1 = δ-tocopherol, 2 = γ-tocopherol,
3 = β-tocopherol, 4 = α-tocopherol35

C18との比較1

1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: 97/3=CH3OH/H2O
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

2, 34C18Detection: UV at 295nm
05101520retention time / min

25Sample: 1=δ-Tocopherol

30HOOSunrise C28 %C:18%

2=γ-Tocopherol

1C28HOO

3=β-Tocopherol

2HO43O

4=α-Tocopherol
HO05101520
retention time / min

253035O

固定相容量は同じODSとの比較2
C181 221Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:80/20=CH3CN/CHCl3
Flow rate: 1.0 mL/min

Conventional
C18 %C:18%

C28

Temperature: 30 ºC
Detection: UV at 450nm
Sample: 1=α-CaroteneSunrise C28 %C:18%2=β-Carotene
05101520253035Retention time / min

固定相容量は2倍

ビタミンＥの分離比較

002468101214Column: SunShell C30, 2.6 µm 150 x 3.0 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O= 97/3 Flow rate: 0.43 mL/min, Temperature: 25 ºC, Pressure: 15.5 MPa

51015202530Column: Sunrise C28, 5 µm 250 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O= 97/3 Flow rate: 1 mL/min,Temperature: 25 ºC

35オレイン酸とエライジン酸の分離CH 31SunShell C18

αSeparation factor =1.083
Resolution

12Rs=2.863HOOleic acid
O01234562Retention time/min

H 3C

1SunShell C30

O2αElaidic acid

Separation factor =1.103
Resolution

Rs=3.340
01234Retention time/min
Mobile phase: Acetonitrile:water:formic acid=90:10:0.05
Flow rate: 1.0 mL / minTemperature: 40 oC
Detection: UV@215 nm
Sample: 1 = Oleic acid, 2 = Elaidic acid

5678OH

ビタミンＫ１異性体の分離比較
SunShell C30, 2.6 μm

T社 C30, 2.6 µm
35 oC

分離度Rs: 1.23

分離度Rs: 1.94

30 oC

分離度Rs: 2.88

25 oC

分離度Rs: 0.91

分離度Rs: 3.3320 oC

分離度Rs: 1.41

15 oC

分離度Rs: 1.78

trans

分離度Rs: 3.79
051015cis202502Column: SunShell C30, 2.6 µm 100 x 2.1 mm
T社 C30, 2.6 µm 100 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O= 96/4
Flow rate: 0.35 mL/min,

4transtrans

cis

cis
6810まとめ• 結合密度を低く調整したC28カラム、RP-AQUA
は、水系移動相のみでも保持時間が安定しており、極性化合物の分離に有用である。
• RP-AQUAカラムは、水系移動相用C18カラムと比較すると高い耐久性を有している• C30カラムは、低極性溶媒を移動相とするとODSとは異なった分離を示す。
• C30カラムは、C18カラムでは分離できない異性体分離を達成できる。
• 他社C30カラムと比べ、幅広い温度で異性体分離が達成可能である。