26 動物抗菌会報 24（2002）

カンピロバクターの薬剤感受性試験法の現状
高橋敏雄
農林水産省動物医薬品検査所 （〒１８５８- ５１１ 国分寺市戸倉１１- ５１- ）既に米国では，カンピロバクターが食中毒原因菌１．はじめにの第一位となっている。
また，最近ではフルオロキノロンに対して耐性抗菌性物質が，畜産分野でも利用されるようにを示すカンピロバクターが，ヒトの症例や畜産食なって約半世紀が過ぎようとしている。動物用抗品などから分離されるとの文献報告が散見され菌性物質は，主として細菌感染症の治療や成長促る。2000 年 10 月，米国 FDA は，家禽用経口投与進などを目的として広く畜産に利用された結果，型フルオロキノロン剤の承認取り消し通知を発出

畜産の安定経営や安全な畜産物の安定供給に多大した。その背景にはヒトのカンピロバクター食中な貢献をしてきた。反面，動物に対して各種の抗毒の感染源は畜産食品，特に家禽肉であり，畜産菌性物質を使用することが広く普及するに伴い，分野で獲得されたフルオロキノロン耐性のカンピ

食用動物における耐性菌の出現という新たな問題

ロバクターに汚染された食品をヒトが摂取するこが提起された。そこでは特に，食用動物に抗菌性と，あるいはそれに接触することが，ヒトの健康物質を使うことにより薬剤耐性菌が選択され，新において脅威となった点が挙げられている。いずたに出現した耐性菌もしくは耐性遺伝子が食物連れにせよ，この裏付けとなっているものが，分離鎖を介して人へ伝播し，人の細菌感染症の治療を菌株の薬剤感受性試験データを中心とした疫学情困難にするという潜在的な危険性に対して焦点が報とリスク分析の結果であったことは明白な事実当てられてきた。今回のテーマである薬剤感受性である。

試験は，抗菌性物質に対する細菌の感受性の程度

現在，耐性菌問題に対する獣医領域の主要な対を調べるための検査法で，耐性菌を検出するため応策は人の医療分野と同様であり，国際的な共通の最も基本的な方法であり，この耐性菌問題の根認識となっている「慎重使用の原則」の遵守であ幹に係わる事項であるとも考えられる。

る。すなわち，抗菌性物質の使用の現場においてカンピロバクター（主に Campylobacter jejuni）は，原因菌の薬剤感受性試験データや添付文書なは，家禽などの食肉を原因食品としたヒトの下痢どの有用な基本情報（抗菌スペクトル，薬物動態症（食中毒）の原因菌として国際的に注目されてなど）に基づく慎重な薬剤選択が益々重要であいる。本菌は食品媒介性病原菌のひとつであり，る。

感染源としての保菌動物の関与などを考えると，本稿においては，その抗菌剤選択の基礎となる公衆衛生上ならびに家畜衛生上も極めて重要な細in vitro 薬剤感受性試験法の一般論をブレークポ菌である。ここ数年来，本菌は国内の細菌性食中イントの考え方も含めて概説するとともに，これ毒事件での原因菌としては，サルモネラや腸炎ビまで国際的に議論の多いカンピロバクターの薬剤ブリオとともに常に上位に位置し，原因菌別の食感受性試験法の現況について紹介したい。

中毒事件数でみると全体の約 25％を占めている。
26

高橋敏雄／カンピロバクターの薬剤感受性試験法の現状／24（2002） 27

２．薬剤感受性試験法の種類
現行の薬剤感受性試験法は，大きく拡散法と希３．NCCLS の役割
NCCLS の薬剤感受性試験法小委員会では希釈釈法とに分けられる〔4〕。

法と拡散法の標準法を制定しており，現在では１）ディスク拡散法

NCCLS 法が薬剤感受性試験法の最も標準的な国

ディスク拡散法は，わが国において臨床検査室際法として認知されてきている。NCCLS は規制におけるルーチンの薬剤感受性試験法としては最力をもたない任意団体であるが，その標準法が広も普及した方法であり，一濃度法，三濃度法およ範に受容されてきた背景には，広く意見を求めコび濃度勾配ディスク法の三種類がある。一定量のンセンサスを得るための組織活動がある。1968

薬剤を含んだディスクを予め被検菌を接種した寒年に設立されて以来，全米を中心に臨床検査室，天培地の上に置いて培養すると，薬剤は次第に寒臨床検査業者，医薬品製造メーカー，政府機関関天培地中を拡散し，ディスクを中心に一定の濃度

係者，微生物学者および医師などの参加を得て，勾配をつくる。その結果，被検菌の感受性の度合独特の意見合意のプロセスを経て最終的な標準法

いに応じてディスク周囲に発育阻止帯が形成さまたは指針を提起している。

れ，その阻止円の広さで感受性の程度を調べるもNCCLS における意見合意のプロセスは，標準のである。一般に，本法には，)国際法である米化すべきプロジェクトの決定に始まり，意見合意

国臨床検査標準化委員会（National Committee forの各段階における文書の刊行，臨床検査の現場かLaboratory Standards：NCCLS）法，*国内法でらのコメントへの対応，文書の改訂，最終合意のある一濃度ディスク法（昭和），三濃度ディスク法得られた段階での文書の刊行及び施行後の見直し（栄研）および，+濃度勾配ディスク法（Ｅテスまで，ひとつの標準法の提起までに 5 〜 6 年の検ト）などが知られている。理論的には，出現した討期間を費やしてきている。NCCLS 文書には，阻止円の直径から最小発育阻止濃度（minimum意 見 合 意 の 段 階 に 応 じ て，proposed（提 案），inhibitory concentration：MIC）の近似値を推定す

tentative（暫定案）および approved（承認条項）

ることは可能であるが，基本的にはブレークポイの三段階が設定されている。

ントを中心に感受性か耐性かを定性的に判定するものであると考えるべきである。

４．ブレークポイントの意義

２）希釈法
本法は，薬剤を寒天培地で希釈する寒天平板希

ブレークポイントとは，薬剤感受性試験で得ら釈法と液体培地で希釈する液体培地希釈法に大別れた抗菌性物質の MIC 値を臨床効果などとの関される。希釈法は拡散法に比べるとコストの面で連性をもたせ，抗菌剤選択の際のより有効な指標やや高くつくが，MIC を具体的に知ることができとなるように設定されたものである。一般にブるため，病原微生物に対する抗菌力の詳細な比較

レークポイントは，細菌学的ブレークポイントとをする際に有用性の高い方法である。また，液体臨床的ブレークポイントに大別される。前者は，培地希釈法としては，半自動化された微量液体希我々がこれまで実施してきている耐性菌調査のよ釈法が主流となっており，必要に応じて最小殺菌

うな全国レベルの調査において得られた薬剤の濃度（minimum bactericidal concentration：MBC）

MIC 値の分布が二峰性を示した場合に，両ピーについても測定することは可能である。希釈法にクの谷間の値をもって設定され，疫学調査におけついては，日本化学療法学会と NCCLS がそれぞる耐性菌の検出などの目的での応用価値が極めてれ標準法を提唱しているが、現在では NCCLS 法高い。一方，臨床的ブレークポイントとは，薬物が国内外ともに広く普及しつつある。

動態指標（最高血中濃度，血中半減期，組織移行性，抗菌作用の特性など）および実際の臨床試験

28 動物抗菌会報 24（2002）

データに基づき，臨床的有効性の境界点として主衛生分野と家畜衛生分野の種々な機関においてはに理論的に設定された MIC 値である。細菌学的ディスク法，寒天平板希釈法および微量液体希釈

ブレークポイントが，菌種−薬剤別に設定される法など，その手法は多種多様であり，全く統一化のに対し，臨床的ブレークポイントは，基準値をが図られてこなかった。1999 年以降，国内で実菌種別ではなく，人の感染症別（呼吸器感染症，施している家畜由来細菌の薬剤耐性モニタリング敗血症および尿路感染症）に設定されている〔2〕。

調査（JVARM）においては，試行的に一濃度ディいずれにせよ，日本化学療法学会が独自に提案しスク拡散法（推定 MIC 値の算出）と寒天平板希釈ているこの臨床的ブレークポイントは，全て人の法を併用してきた。各供試薬剤の MIC 値を指標と医療上のブレークポイントである。残念ながら，した場合，両法間には必ずしも高い相関性は認め

現在のところ獣医学領域においては，この種のブられなかった。

レークポイントの設定は行われていない。一方，

しかし，幸いにもつい最近 NCCLS はカンピロ

NCCLS が菌種別に提案しているブレークポイン

バ ク タ ー に つ い て は 唯 一，寒 天 平 板 希 釈 法 をト（感受性 S −中間Ｉ−耐性Ｒの判定基準値）の「approved standard」として，その標準的試験法設定は，日本化学療法学会のそれに比べて臨床的を明示した 〔1〕。そこで以下に，NCCLS によりな 意 味 合 い が 弱 い と 考 え ら れ る。最 近 で は，提唱された試験方法の概略を紹介する。

NCCLS の提唱する標準試験法とそのブレークポ

１）供試材料イントが国際的にも広く採用され始められている。

)感受性測定用培地：5％羊脱線維素血液加ミューラーヒントン寒天培地*菌浮遊用液：ミューラーヒントンブロース，

５．カンピロバクターにおける薬剤感受性試験法の現状と問題点

滅菌精製水または生理食塩液+薬剤原液の希釈用液：滅菌精製水またはリン酸塩緩衝液

カンピロバクターは，耐性菌調査における対象,供試薬剤：後述菌種であるサルモネラ，腸球菌および大腸菌とは２）薬剤の調製明確にその発育条件が異なる。この培養気相条件)薬剤の入手や感受性測定用培地の種類などがカンピロバク
ターの薬剤感受性試験における重要な変動要因のひとつとなっている。すなわち，本菌は微好気性菌であるというその細菌学的特性から，一般細菌常用標準品またはその同等品を入手して供試する。
*薬剤（標準品粉末）の保存方法の試験方法をそのまま適用できない本質的な問題

薬剤は，吸湿防止のためにデシケーター中で– 20℃ 以下で保存する。使用に際しては，点がある。本菌の薬剤感受性試験法については，常温に戻してから秤量する。吸湿牲のものもNCCLS や日本化学療法学会なども標準的な方法あるので，秤量は相対湿度 45％以下の条件下をこれまで明示してこなかった。そのため，前述で行う。のようにカンピロバクターは耐性菌問題において+薬剤の溶解

現在，最も注目される細菌であるにも係わらず，水溶性の薬剤は原則として，滅菌精製水を世界各国の耐性菌モニタリング調査実施機関では用いて溶解する。水に不溶性ないし難溶性の様々な試験法が独自に考案・応用されてきたのが薬剤については，必要に応じてエタノールや現状である。例えば，主要なモニタリングシステ水酸化ナトリウム溶液などの溶媒を用いて，ムである米国の NARMS では主に微量液体希釈法

できるだけ少量に溶解した後，精製水で希釈を，デンマークの DANMAP ではディスク法と寒して薬剤原液を調製する。薬剤原液は，いず天平板希釈法をそれぞれ採用している。この状況

れも通常，5,120μg/ml 又はμg（力価）/ml のは，日本国内においても同様であり，医療・公衆濃度に調製する。

高橋敏雄／カンピロバクターの薬剤感受性試験法の現状／24（2002） 29

殆どの薬剤原液は、ポリエチレンまたはポリプロピレン製の滅菌びんに入れて，– 70 ℃

*薬剤含有感受性測定用培地の調製
ミューラーヒントン寒天培地を溶解，滅菌以下の保存条件で，約 6 ヶ月間は使用可能でして 48 〜 50℃ に保持する。使用時に 5％のある。ただし，一度溶解したものは全てその割合で羊脱線維素血液を添加し，感受性測定日のうちに使用しなければならない。

用培地とする。直径 90mm サイズのシャーレ,薬剤濃度の調整法を使用する場合には，前項で調製した薬剤の供試薬剤を秤量後，規定の溶媒で溶解する

各希釈液 2ml を入れ，これに培地 18 ml を加が，予め下記の計算式に基づき必要溶媒量をえて薬剤と十分混合した後に固化させる。最計算しておく。

終的な寒天培地の厚さは，3 〜 4mm にしな

溶媒量計算式；ければならない。同時に，薬剤無添加の対照溶媒量（ml）＝薬剤の力価（μg/ml）×秤量（mg）

平板も作成する。室温で固化させた寒天培地
は，使用前に，約 30 分間程度ふ卵器内で寒÷原液の濃度（μg/ml）
３）MIC 測定法の実際天表面を乾燥させ，表面に水滴が付いていな)薬剤の希釈いことを確認する。

表 1 に示した具体的な方法に従い，5,120μg/mlを薬剤原液とした 2 倍段階希釈列を作成する。

+接種用菌液の調製
5％羊脱線維素血液加ミューラーヒントン
寒天平板培地で 37℃ 48 時間又は 42℃ 24 時

表１

寒天平板希釈法に用いる抗菌薬の希釈調製法

マスター液希釈培養した被検菌株のコロニーをミューラーヒ

濃度（μg/ml）
A液
B液
C液
D液
E液

5,120
1,280160
202.5

間，微好気下（10％CO2，５％O2，85％N2）でントンブロース，精製水または生理食塩液に処方直接浮遊させる。その菌液は約 1 〜 4 × 108
CFU/ml（McFarland 標準液 No. 0.5 に相当）とA 液 1 容＋蒸留水 3 容
B 液 1 容＋蒸留水 7 容C 液 1 容＋蒸留水 7 容
D 液 1 容＋蒸留水 7 容なるように濃度調整後，さらに 10 倍希釈して接種用菌液とする。なお，濃度調整した菌液は，調製後 30 分以内に使用しなければな

抗菌薬の溶液段階

マスター液（μg/ml）

容量（ml）＋蒸留水（ml）

中間濃度（μg/ml）

寒天での 1：10 希釈での最終的な濃度（μg/ml）

log2

123A 液（5,120）
A 液（5,120）
A 液（5,120）

―
1
1―
13

5,120
2,560
1,280

512256128

987456B 液（1,280）
B 液（1,280）
B 液（1,280）

1
11137640320160643216654789

C 液（ 160）
C 液（ 160）
C 液（ 160）

111137804020842321101112D 液（D 液（D 液（20）20）20）

1111371052.5

10.50.250–1–213E 液（2.5）

111.250.125–330 動物抗菌会報 24（2002）

らない。
,接種用菌液の平板への接種

染症用治療薬として汎用性が高い。従って，鶏肉などの摂取によるフルオロキノロン耐性カンピロ

前項で調製した接種用菌液を，ミクロプラバクターのヒトの健康や医療に及ぼす影響に関すンター（直径 3mm の金属製のピン）などにるリスク評価は，フルオロキノロン剤が鶏大腸菌とり，これを静かに薬剤含有平板もしくは対症とマイコプラズマ感染症の治療薬として認可さ照平板にスポットする。接種の順番は最初にれている日本国内においても急務の課題となって対照平板へ接種し，次いで各薬剤ごとに最もきている。リスク分析に資するデータの中心とな低濃度の薬剤を含む平板培地から接種を開始

るものは，やはり各分野での耐性菌調査成績であし，次第に高濃度の培地に接種していく。雑り，その適正なリスク評価の実施を促していく上菌の混入がないことを確かめるために，少なで，基本となるものが本稿のテーマである薬剤感

くとも最初と最後に対照平板に接種する。平

受性試験手法の統一であると理解している。

板表面の菌液が乾いた後，シャーレを反転

国内での動物由来株のフルオロキノロン耐性にし，35 〜 37℃ 微好気下（10％CO2，５％O2，関する過去の調査成績は，極めて少なく，その出85％N2）で培養し，判定を行う。

現頻度の推移を厳密に比較・考察することは困難-エンドポイントの決定であるが，一部の地域・年次限定的な成績によれ

原則，接種菌の薬剤含有培地での発育が対ば，フルオロキノロン耐性の出現率は，ヒト由来照培地のそれに比べて 80％以上減少してい株，食肉由来株および動物由来株ともに，増加する薬剤の最低濃度をエンドポイントと判定る傾向が窺える。獣医領域でも最初の承認時であし，その値を MIC とする。単一のコロニーる 1991 年以降，経口投与型を中心にフルオロキまたは軽微な発育は無視し，発育阻止とみなノロン剤の消費量が増加傾向を示し，その多くがす。

鶏に用いられている現状などが，その原因のひと.精度管理つであると推察されるが，現実には種々な要因が薬剤感受性試験法の精密性と正確性を確保する目的で，Campylobacter jejuni ATCC 33560

複雑かつ多元的に絡み合っており，その背景を直接的に特定することはできない。

（本菌種の基準株）を精度管理用菌株に定め，今後とも国内においては，カンピロバクターのシプロフロキサシン，ナリジクス酸，エリス

フルオロキノロン耐性に関しては，)全国レベル

ロマイシン，テトラサイクリン，ドキシサイ

での畜産分野における各種細菌の抗菌剤感受性動

クリン，ゲンタマイシンおよびメロペネムの向を監視し，その試験成績を集積・解析するとと本菌株に対する精度管理限界値（MIC 値範

もに，*家畜由来耐性株とヒト由来耐性株との関囲）を試験成立要件として規定している。更連性について，分子疫学手法を駆使して遺伝学的に詳細な精度管理の手法については，参考文に解析していくことや，+動物由来耐性株のヒト献を参照されたい。

医療に及ぼす影響に関するリスク分析を関係機関の協力・連携の下で実施することが必要である。

６．おわりにこれまで，一連のリスク分析の妨げとなった原因のひとつが各国における薬剤感受性試験手法の諸外国での最近の報告と同様に，国内において不統一性であるとも考えられる。永年の懸案事項

も 1999 年度以降の全国調査により健康な家畜家であったカンピロバクターの国際標準法が今回，禽の糞便から分離されたカンピロバクターについNCCLS により初めて提案されたことを契機に，て抗菌剤感受性を測定した結果，フルオロキノロJVARM も含めた国内の各関係機関を手始めに世ン耐性株が分離株全体の 20％前後に確認された界各国のモニタリング手法が統一され，カンピロ〔3〕。広域な抗菌スペクトルをもつフルオロキノバクターの薬剤耐性に関する調査研究が確実に進ロン剤は，一般的に食中毒も含めたヒトの腸管感展し，我々関係者の大命題でもある「動物から人高橋敏雄／カンピロバクターの薬剤感受性試験法の現状／24（2002） 31

への薬剤耐性の伝播に関する適正なリスク評価の℃ 微好気下（10％ CO2，５％ O2，85％ N2）で行う実施」に少しでも近づけることを期待したい。

ことなどが挙げられる。標準法の提唱を契機に，国内の各関係機関をはじめ，世界各国のモニタリ

要約

ング手法が統一され，カンピロバクターの薬剤耐性に関する調査研究が各関係機関の連携の下で確

カンピロバクターは，微好気性菌である特性か実に進展していくことを期待したい。

ら，一般細菌の試験方法をそのまま適用できないという本質的な問題点を抱えている。そのため，参考文献

本菌は耐性菌問題において現在，最も注目されている細菌のひとつであるにも係わらず，世界各国

１）National Committee for Clinical Laboratory Standards:の耐性菌モニタリング調査の実施機関では様々なPerformance Standards for Antimicrobial Disk

試験法が独自に応用されてきたのが現状であっand Dilution Susceptibility Tests for Bacteria

た。一連のリスク分析の妨げとなった原因のひと

Isolated from Animals. Second edition, Approved

つが，各国における薬剤感受性試験手法の不統一

Standard. NCCLS document Replaces M31-A2,性であると言えるかもしれない。幸いにも，永年vol. 22, no.6. NCCLS, Villanova. (2002)の懸案であったカンピロバクターの国際標準法が２）日本化学療法学会抗菌薬感受性測定法検討委員

今年，NCCLS により初めて提案された。本法は会：委員会報告，呼吸器感染症および敗血症にお寒天平板希釈法であり，その特徴としては)感受けるブレークポイント．42，905-914．
（1994）

性測定用培地は５％羊脱線維素血液加ミューラー

３）高橋敏雄，守岡綾子，石原加奈子ら：国内におけヒントン寒天培地を使用すること，*接種用菌液る家畜由来耐性菌について．動物抗菌会報，23，は平板上の菌コロニーをミューラーヒントンブ
ロースなどに浮遊させて 1 〜 4 × 10８CFU/ml となるように菌数を調整し，さらに通常 10 希釈したものを使用すること，+接種後の培養は 35 〜 37

9-16．
（2001）
４）山口恵三：抗菌薬感受性測定法．日本臨床，52，350-354．
（1994）

32 動物抗菌会報 24（2002）

Present Situation on Drug Sensitivity Test of Campylobacter
Toshio TAKAHASHINational Veterinary Assay Laboratory, 1-15-1, Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511, Japan
There are some of essential issues that the protocols of drug sensitivity test of general bacteria could not beapplied easily to those of Camplyobacter such as microaerophile. Although Campylobacter is recognized to be one of
the most noteworthy bacteria in the process of recent discussion on the antimicrobial resistance, the various
methods have been adopted individually in antimicrobial resistance monitoring program around the world. It is
possible that a lack of unity of the protocols in each country is a cause to prevent accomplishment of a serial risk
analysis. Fortunately, the international standard method of drug sensitivity test of Campylobacter remaining unsettled
has been proposed by NCCLS in this year. The characteristics of present agar dilution method are as follows; )using Muller-Hinton agar supplemented with 5% defibrinated sheep blood as the medium for the sensitivity
determination, * using a bacterial suspension which is directly taken from colonies on the blood agar, adjusted toapproximately 1 〜 4 × 108 CFU per ml and diluted generally to 10 times as inoculum to the medium, + Incubating
the agar plate at 35 to 37 ℃ under microaerophilic condition (10％CO2, 5％O2, 85％N2).
Taking the opportunity of NCCLS proposal of the standard method, we hope that the research on antimicrobialresistance of Campylobacter based on the monitoring tool harmonized among foreign countries as well as thedomestic laboratories would be certainly advanced in cooperation with the related organization.

討論（座長：五十君靜信 国立薬食研，阪野哲也 全農家畜衛研）

質問（阪野哲也：全農家衛研）

答（高橋敏雄：動薬検）ディスク法は定性に適してはいる反面，定量的使カンピロバクターだけでなく，大腸菌などにおい用には未だ不適とのことですが，カンピロバクターても，ディスク法は必ずしも定量的な方法であると以外の大腸菌などにおいては如何でしょうか。

はいえないと思います。