第 71回（ 2019年）

日本生物工学会大会
トピックス 集会期2019 年（令和元年）9 月 16 日（月・祝）～ 18 日（水）

会

場

岡山大学

津島キャンパス

公益社団法人 日本生物工学会

第 71回（ 2019年）

日本生物工学会大会
トピックス 集会期2019 年（令和元年）9 月 16 日（月・祝）～ 18 日（水）

会

場

岡山大学

津島キャンパス

公益社団法人 日本生物工学会� �� ����������� �������

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 回日本生物工学会大会
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第 71
トピックス集 目次
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＜トピックス要旨 （一般講演番号 / 一般講演タイトル / 講演者 / 所属）＞��� �� ����� �� ����� �� ���� �� ����� �� ����� �� ���【遺伝子工学】������� �� ��� �� �
p. 6
1Gp18 G 会場（D25） 第 1 日�����
17:18······················································································CRISPR-Cas9�システムによるオーランチオキトリウム属の生産脂質の改質������������� ��������� ��������

○北堀 智希 1，渡邉 研志 1，青井 真人 1，畑 浩介 1，高橋 宏和 1，岡村 好子 1，松山 恵介 2，黛 新造 3，秋 庸裕 1�c��-������������� ������ �����������������
（1 広島大院・統合生命科学，2 長瀬産業，3 出光興産）
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p. 8
2Aa10 A 会場（A36） 第 2 日 11:00······················································································
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極微小組織切片からの単一細胞レベルトランスクリプトーム解析

�○松永 浩子 1，髙橋 清文 1，山崎 美輝 2,3，有川 浩司 1，細川 正人 4，竹山 春子 1,2,3,4
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（1 早大ナノライフ創新研，
早大院先進理工，産総研 CBBD-OIL，4 早大理工総研）

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p. 10
3Ba080��ER�M�G����M��
B 会場（A37）���u��������pz��������p�
第 3 日 10:36······················································································
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Saccharomyces cerevisiae
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の高温ストレス適応機構
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2������2EV磯崎 日奈子 1，山崎 真澄 1，澤田 俊 1，工藤 大喜 1，Devanadera Allan2，���������2�������������������������������������
2
Irene，Nayve Jr. Fidel Rey P.2，○杉山 峰崇 1
Grace Pait Ivy2，Pajares�������j�����pu����pua����2�����
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1
2（ 阪大院・工， フィリピン大ロスバニョス校・国立分子生物学バイオテクノロジー研究所）
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��j���k�a�【酵素学，酵素工学・タンパク質工学／抗体工学】
�1Ap09 A 会場（A36） 第 1 日 15:18······················································································ p. 12
�����クライオ電子顕微鏡によるロイシン脱水素酵素の高分解能構造を用いた耐熱化機構の解明
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1
2○山口 浩輝 ，亀川 亜希子 ，中田 國夫 1，柏木 立己 1，水越 利巳 1，藤吉 好則 2，谷 一寿 3�����������������������
1
2 ��������������pz�u 3�7��0�27 �（ 味の素バイオ・ファイン研，
東京医科歯科大・高等研究院・セスプル， 三重大・院医）
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p. 14
2Ap17
A 会場（A36） 第 2 日 17:06······················································································
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�����p�������pz���j�����aProteusvulgaris 由来 l- アミノ酸デアミナーゼの機能解析とアンモニア生産への応用
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○宮澤 沙哉佳，梅澤 覚，木野 邦器
������ �7��0 �������������������� ���������� ��������� �（早大院・先進理工・応化）
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p. 16
2Bp09
B 会場（A37） 第 2 日 15:18······················································································
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パラゴムノキの天然ゴム生合成マシナリを構成するタンパク質の機能解析�������������������
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山口 真琴 1，小島 幸治 1，廣森 美樹 1，石井 智樹 1，和氣 駿之 1，山下 哲 2，戸澤 譲 3，������������������������
山口 晴彦 4G�����
，井之上��������������������
ゆき乃 4，伏原 和久 4，中山 亨 1，○高橋 征司 1
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（ 東北大院・工， 金沢大院・自科，3 埼玉大院・理工，4 住友ゴム工業（株））
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p. 18
2Jp07
J 会場（E23） 第 2 日 14:54······················································································
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自己ユビキチン化能を有する人工 RING ﬁnger����p�����j�������pu��
の作製法
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○宮本 和英，中谷 有沙，齋藤 一樹
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（姫路獨協大・薬）�������������
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3Cp01 C 会場（B21） 第 3 日 13:30······················································································ p. 20
天然構造特異的認識モノクローナル抗体の作製とその評価○磯﨑 勇志，湊元 幹太，冨田 昌弘（三重大院・工）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】

2Ca03 C 会場（B21） 第 2 日 9:24······················································································· p. 22「アミノ酸機能工学」による大腸菌へのストレス耐性の付与○磯貝 章太，高木 博史（奈良先端大・バイオ）2Fa07 F 会場（D23） 第 2 日 10:12······················································································ p. 24
クローン病自然発症モデル SAMP1/YitFc マウスの病状進行に伴う腸内細菌叢および糞便メタボライトの変動○小松 陽介 1,2，清水 由宇 1，山野 めぐみ 1，中村 公則 1,3，綾部 時芳 1,3，相沢 智康 1,3,4（1 北大院・生命科学，2 森永乳業，3 北大院・先端生命，4 北大・国際連携研究教育局）

2Ja11

J 会場（E23） 第 2 日 11:12······················································································ p. 26
糸状菌 Talaromyces cellulolyticus による抗体等バイオ医薬品製造技術の開発○深田 寛朗 1，十倉 充範 2，臼田 佳弘 1
（ 味の素バイオ・ファイン研，2 味の素研究開発企画部）
1【醸造学，醸造工学／食品科学，食品工学】

2Ha02 H 会場（D32） 第 2 日 9:12······················································································· p. 28
麹由来グリコシルセラミドの腸内細菌への作用解析○永留 真優 1，阪本 真由子 1，宮川 幸 1，北島 悠花 1，中村 強 2，中山 二郎 3，北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農，2 福岡女子大，3 九大院・農）2Hp13 H 会場（D32） 第 2 日 16:18······················································································ p. 30
協会系酵母と近縁な広島 6 号酵母の特性解析及びその活用○山﨑 梨沙 1,2,3，五島 徹也 2，大場 健司 3，大土井 律之 3，赤尾 健 1,2（ 酒総研，2 広島大院・統合生命科学，3 広島総合技術研・食品工業技術セ）
1

3Fa01 F 会場（D23） 第 3 日 9:00······················································································· p. 32
清涼飲料水中に添加した殺菌乳酸菌体の菌株判別 RNA-MLSA 法の開発
○青山 冬樹（アサヒ飲料・技術研）

3Ha01 H 会場（D32） 第 3 日 9:00······················································································· p. 34
Aspergillus luchuensis におけるフェノール酸脱炭酸酵素遺伝子破壊による 4-VG 生成への影響○眞榮田 麻友美 1,2，本底 麻綸 2，渡嘉敷 建孝 3，後藤 正利 1,4，水谷 治 1,2，上地 敬子 2，平良 東紀 1,2（1 鹿児島大院・連農，2 琉球大・農，3 石川種麹店，4 佐賀大・農）3� �� ����������� �������

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【環境工学，廃水処理技術／バイオマス，資源，エネルギー工学】
p. 36
1Bp02 B 会場（A37） 第 1 日 13:42······················································································
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海洋性クラミドモナス油脂高蓄積変異株における油脂・カロテノイド増産メカニズムの解明

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豊 3，張 嘉修
，蓮沼
誠久 1,2，近藤（1 神戸大・先端バイオ工，2 神戸大院・科技イノベ，3 量研高崎・放射線生物応用，4 国立成功大・化工，5 神戸大院・工）
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p. 38
1Bp12 B 会場（A37） 第 1 日�����
15:54······················································································
有用油脂生産藻の特性分析と環境ストレス耐性評価������������� ���������� ��������
11
�○高木 明香莉 ，佐々木 美月 ，佐々木 大作 2，朝山 宗彦 1
（ 茨城大院・農，2 Biox 化学工業）

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4��EM���EOM��M��V�M�E���EG����
p. 40
3Aa02 A 会場（A36） 第 3 日 9:12·······················································································

セルロース系エタノール生産のための発酵阻害物質耐性馴養変異体における責任遺伝子変異の同定

�○藤森 一浩 1，小林 洋介 1,2，佐原 健彦 1，扇谷 悟 1，鎌形 洋一 12��������������������0��ER�M�G����M��
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（1 産総研・生物プロセス，
Biomaterial in Tokyo）

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p. 42
3Jp04 0��ER�M�G����M��
J 会場（E23） ���u��������pz��������p�
第 3 日 14:06······················································································
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好気的硫黄代謝細菌を活用した重金属除去pua�������
2������2EV- ���������������� 0��ER�M�G����M�� ����○黒田 真史 1，小林 慎 1，高山 一也 2，池 道彦 1���������2�������������������������������������
（1 阪大院・工，2 日東電工（株））
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【生物化学工学／バイオプロセス】
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1Dp08
D 会場（B32） 第 1 日 15:06······················································································ p. 44
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ＣＦＤ解析と生物反応モデル式を組み合わせた商業スケールバイオリアクターにおける��������� 0��ER�M�G����M���V����7��0 �
物質生産シミュレーション技術の開発�� �������G�GG�V� �����R�V �� 2EV- ������

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○沖野 祥平，渡邉 実，種田 大介��������������pz�u �7��0�27 ���������������0��ER�M�G����M����（日揮）
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1Hp12
H 会場（D32） 第 1 日 15:54······················································································ p. 46
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�����p�������pz���j�����aEﬃcient
production of itaconic acid using a psychrophile-based
simplebiocatalyst
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Gonglinfeng
Luo, Takahisa Tajima, Junichi Kato������○�7��0�������������������� ���������� ��������� �（Grad. Sch. Integr. Sci. Life, Hiroshima Univ.）�pua���������������p������������xzkuj�����������
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p. 48
3Da08
D 会場（B32） 第 3 日 10:36······················································································
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模擬微小重力環境が腸内有用細菌の諸特性に及ぼす影響の解析と利用�������������������
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○増田 亜理沙，青柳 秀紀
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（筑波大院・生命環境）�����������������������j������������������������
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�����0 � G����� ������ ��� ���� �7��0�� 2������2EV- ��� 0��ER�M�G����M�� ����【植物細胞工学，組織培養，育種工学】
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1Ep09
E 会場（
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� D12） 第 1 日 15:18······················································································ p. 50
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機械学習を用いた植物 mRNA 切断に関わる特徴の選抜�������������
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��0 ���p�○上野 大心，山崎 将太朗，出村拓，加藤 晃（奈良先端大・バイオ）4

【生体医用工学】

3Ga01 G 会場（D25） 第 3 日 9:00······················································································· p. 52
ビタミンナノエマルションの角膜細胞浸透性を利用した新規点眼薬の開発○高木 昌宏 1，三宅 深雪 2，栗岡 昌利 3，辻野 義雄 1,4，下川 直史 1
（ 北陸先端大・マテリアル， ライオン・先進解析科学研，3 ライオン・薬品研，4 岡山理大・経営）
1

2

3Ga03 G 会場（D25） 第 3 日 9:24······················································································· p. 54
共培養マイクロデバイスを搭載した微小電極アレイチップによる iPS 由来運動神経・
骨格筋細胞評価プロセスの開発○古谷 太樹 1，清水 一憲 1，伊藤 卓治 2，岡田 洋平 2，本多 裕之 1,3（1 名大院・工，2 愛知医大・神経内科，3 名大・予防早期医療創成セ）【生体情報工学，バイオインフォマティクス】

3Ia01

I 会場（D34） 第 3 日 9:00······················································································· p. 56
基質酵素反応予測のための機械学習に基づく予測モデルの構築方法の探索と評価○渡邉 直暉 1，村田 昌浩 2，荻野 千秋 1，近藤 昭彦 3，荒木 通啓 2,3（1 神戸大院・工，2 京大院・医，3 神戸大院・科技イノベ）【バイオセンシング，分析化学】

2Fp01 F 会場（D23） 第 2 日 13:30······················································································ p. 58
がん診断のための高感度で前処理不用なインタクトエクソソームセンシング
森 貴翔，清水 拓，片山 航，源 和晃，高野 恵里，砂山 博文，北山 雄己哉，○竹内 俊文（神戸大院・工）【生合成，天然物化学】

3Ea06 E 会場（D12） 第 3 日 10:00······················································································ p. 60
ポリグルタミン酸生合成における新規エピメリ化反応○佐藤 将太 1，重松 真由子 1，加藤 陽菜多 1，小笠原 泰志 2，大利 徹 2（1 北大院・総合化学，2 北大院・工）【ペプチド工学】

2Ip11

I 会場（D34） 第 2 日 15:42······················································································ p. 62
爆発性芳香族化合物の簡便・迅速な検出に向けた TNT 認識ペプチド修飾量子ドットの作製○児美川 拓実 1，Tamang Abiral2，田中 祐圭 1，Critchley Kevin2，Evans Stephen2，大河内 美奈 1
（1 東工大・物質理工，2 Sch. Phys. Astron.，Univ. Leeds）

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参考文献
1)


T. Yoda, etal.: 
Sci.Reports, 7,4325(2017)
  

2)


X. Xu, etal
. : eLife
!
7,e37551(2018) 9



第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集Saccharomyces cerevisiae SPY3 の高温ストレス適応機構
磯崎

日奈子 1・山崎

真澄 1・澤田俊 1・工藤大喜 1・Allan Devanadera2・

Ivy Grace Pait2・Irene Pajares2・Fidel Rey P. Nayve Jr.2・杉山
1

峰崇 1＊

大阪大学大学院工学研究科，2 フィリピン大学ロスバニョス校・BIOTECH〒565-0871

吹田市山田丘 2-1

大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻生物工学コース
Tel: 06-6879-4577

E-mail: sugi2@bio.eng.osaka-u.ac.jp

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は，その優れたエタノール耐性やエタノール生産能力からバイオエタノールの生産に利用されている．しかし，近年の地球温暖化問題などから，高温ストレス耐性能力の強化が求められている．そこで本研究では，高温ストレス耐性向上に重要となる知見を得るために，自然界から単離された S. cerevisiae の中で 42℃という我々が知る限り最も高い高温ストレス耐性を示す野生酵母 SPY3 が持つ優れた高温ストレス適応機構を解析した．その結果，
SPY3 は高温ストレス条件下でも優れたエタノール生産性を示し，ROS 除去関連遺伝子群の高発現による細胞内 ROS レベルの低減や幾つかの転写活性化因子の高発現により，優れた高温ストレス耐性を獲得していることを見出した．本研究の成果は，熱帯地域でのバイオエタノール生産のコスト削減や生産性の安定化に貢献すると期待される．

1. はじめに
近年の様々な環境・エネルギー問題から，持続可能な循環型社会の構築が求められており，その取り組みの一つとして，バイオマス由来のエタノールを従来の石油燃料の代替として利用することが進められている．
バイオエタノールの発酵生産宿主としては，その優れたエタノール耐性やエタノール生産能力から，出芽酵母 S. cerevisiae が利用されている．バイオマスが豊富な熱帯地域でバイオエタノール生産が主に行われているが，昨今の異常気象により，タイなどでは発酵熱も加わり発酵温度が S. cerevisiae の至適温度である30℃を容易に超え，増殖や発酵が著しく低下する 40℃以上になることもある．そのため，冷却設備や冷却コストが必要となるが，優れた高温ストレス耐性を示す
出芽酵母が開発できれば生産コストの効率化が進む．
また，食料資源と競合しないリグノセルロースからの効率的なエタノール生産方法の一つとして並行複発酵
プロセスが考案されているが，糖化酵素の至適温度(45～50℃)と S. cerevisiae の至適発酵温度 (30℃前後)にはギャップがある．しかし，高温耐性酵母が利用できれば，このギャップを縮めることができ，糖化酵素の使用量や冷却コストを削減することも可能となる．

10

S. cerevisiae SPY3 はフィリピンで単離された野生酵母であり，その特徴として，自然界から単離された
S. cerevisiae の中で 42℃という我々が知る限り最も高い高温ストレス耐性を示す．さらに，細胞回収が容易となる凝集性も併せ持つ．しかし，その優れた高温
ストレス適応機構は全く明らかとなっていない．そこで本研究では，SPY3 の高温ストレス適応機構を解析し，
高温ストレス耐性向上に重要となる知見を得ることにした．そのため，SPY3 において特徴的な発現を示す遺伝子や高温ストレス条件下で増大することが知られている細胞内 ROS レベルおよび遺伝子発現変化に寄与す
る転写活性化因子について解析した．加えて，高温ス
トレス条件下でのエタノール生産性についても解析を行った．

2. 結果と考察(1)SPY3 における抗酸化遺伝子群の発現と ROS レベル
S. cerevisiae 研究室株 BY4743 をコントロールとしたマイクロアレイおよびリアルタイム PCR 解析の結果，
SPY3 では高温条件下において抗酸化遺伝子群の発現量が 3 倍以上上昇していることが分かった(図 1)．
BY4743 の細胞内 ROS レベルは高温ストレスにより増大

(3)SPY3 のエタノール生産能力
これまでに，優れた高温耐性と高エタノール生産性を併せ持つ S. cerevisiae TJ14 が開発されており，バイオエタノールの実生産候補株として検討されている
1-3)．そこで，TJ14 をコントロールとして高温条件下で
SPY3 のエタノール生産能力を解析した（図 3）．その結果，SPY3 は TJ14 よりも優れた生育速度，グルコース
消費速度およびエタノール生産性を示し，高温条件下にもかかわらず収率 95%以上でエタノールを生産した．







結果，SFP1 を過剰発現させると，SPY3 の高温耐性がさらに向上した．このことから，SPY3 において高発現している SFP1 遺伝子は優れた高温耐性を獲得するために特に重要な働きをしていることが明らかとなった．





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               ����������(����図 1. 40℃での抗酸化遺伝子群の発現量 

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したが，SPY3 では細胞内 ROS レベルの増大が低く抑えられていた (図 2)．これらの結果より，SPY3 で強く発現している抗酸化遺伝子群が高温ストレス条件下で増大する ROS の蓄積を抑え，これが優れた高温耐性の獲得に寄与していることが明らかとなった．

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図 3. 41.5℃での SPY3 と TJ14 の発酵試験

3. 今後の展望

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







図 2. 40℃での細胞内 ROS レベル(2)高温耐性獲得に寄与する転写活性化因子の探索
マイクロアレイ解析から明らかとなった SPY3 において高発現している 419 遺伝子のうち，60%以上を直接あるいは間接的に転写活性化しうる転写活性化因子として Ace2，Sfp1，Gcn4，Yap1，Msn2 を見出した．これ
らの転写活性化因子遺伝子の高温条件下における発現量を解析したところ，BY4743 と比べて SPY3 では発現量が上昇しており，特に，ACE2，SFP1，GCN4 では 3 倍以上高く発現していた．これら 3 つの遺伝子を破壊し，それらの高温耐性を解析したところ，3 つの破壊株は全て高温感受性を示した．このことから，Ace2，Sfp1，
Gcn4 は SPY3 の優れた高温耐性の獲得に重要な役割を果たしていることが明らかとなった．次に，SFP1 の過剰発現株を構築して，その高温耐性を解析した．その以上のことから，SPY3 はバイオエタノール生産において優れた宿主プラットフォームとなりうることが明らかとなった．Ace2，Sfp1，Gcn4 はそれぞれ，細胞の分離，リボソームの生合成，アミノ酸の生合成に関与する．本研究から，これらの細胞内プロセスが酵母の
高温ストレス適応能力の向上に重要となることが明らかとなったことから，それらの機能を詳細に解析し，得られた高温ストレス適応機構の知見を応用すれば，熱帯地域での発酵生産や並行複発酵を用いた発酵生産の効率化に貢献すると期待される．

参考文献
1) Moukamnerd, C. et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 88,
87 (2010).
2) Benjaphokee, S. et al.: NewBiotechnol., 29, 379 (2012).
3) Shahsavarani, H. et al.: J. Biosci. Bioeng., 115, 20 (2013).

11

第  回日本生物工学会大会 トピックス集

クライオ電子顕微鏡によるロイシン脱水素酵素の
高分解能構造を用いた耐熱化機構の解明
山口浩輝  、亀川亜希子 、中田國夫 、柏木立己 、水越利巳 、
藤吉好則 、谷一寿 

味の素株式会社 東京医科歯科大・高等研究院・セスプル 三重大・院医〒神奈川県川崎市川崎区鈴木町  味の素株式会社バイオ・ファイン研究所
7HO)D[
(PDLOKLURNLB\DPDJXFKL#DMLQRPRWRFRP

ロイシン脱水素酵素 /'+(& は分岐鎖アミノ酸の脱アミノ化を触媒する、1$'依存型の酸化還元酵素である。*HREDFLOOXVVWHDURWKHUPRSKLOXV 由来の /'+ *VW/'+ は耐熱性が高いため、分岐鎖アミノ酸の定量や生産に有用であることが知られていた。しかしながら、*VW/'+ の立体構造は決定されておらず、その耐熱性機構や補酵素認識機構は不明であった。そこで、我々はクライオ
電子顕微鏡 &U\R(0 を用いて、*VW/'+ アポ体および 1$'複合体の立体構造を原子分解能でそれぞれ決定し、これらの分子機構を考察したので報告する  。．はじめに
アミノ酸分析は生理学や栄養学等の広範な分野において必要不可欠な技術であり、液体クロマトグラフィ
ー装置や質量分析計などの大型機器が広く使用されてきた。これらの方法は、網羅的に複数種のアミノ酸を高い精度と正確性で一度に分析できる一方で、高額な装置や高い専門性を必要とするため、技術の汎用化には課題があった。我々は、この課題を解決するため、アミノ酸代謝酵素を用いて特定のアミノ酸を安価かつ簡便に測定可能である「酵素法」に着目して研究開発を進めている。測定用酵素の実用化に向けては酵素の耐熱性が開発の鍵となるため、分子レベルでの耐熱化機構の理解が欠かせない。本発表では分岐鎖アミノ酸
測定用酵素を一例として我々の取り組みを紹介する。
分岐鎖アミノ酸の測定には、1$'依存型酸化還元酵
素の  種であるロイシン脱水素酵素 /'+ が広く用いられている。特に *HREDFLOOXVVWHDURWKHUPRSKLOXV
由来 /'+ *VW/'+ は耐熱性が高く測定用酵素として極めて有用であるが、立体構造は決定されておらず、その耐熱性機構は不明であった。そこで我々はクライオ
電子顕微鏡 &U\R(0 を用いた単粒子解析法による耐熱性機構の解明を目的として研究を開始した。更に、;
線結晶構造解析では解析困難であった 1$'複合体の原子レベルの立体構造を決定することに成功したので報告する  。12方法 
 &U\R(0 データ測定と画像解析
*VW/'+ アポ体と 1$'＋複合体のデータ収集をクライ
オ電子顕微鏡 -(06)) -(2/ 社  を用いて加速電圧 N9倍率  で行った。
 *VW/'+ 変異体評価
*VW/'+ 変異体および、& 末端欠損体を調製し、℃
で  分間処理した際の残存活性を評価した。

結果と考察
 *VW/'+ の全体構造
*VW/'+ のアポ体および 1$'＋複合体を分解能 Åおよび Åで構造決定した 3'%,'$&)$&+ （図 ）。
図 *VW/'+ の  次元平均像と密度マップ
D  次元平均像、 EF 各密度マップ、 G アポ体、
黒 と 1$'複合体 白 プロトマーの重ね合わせ 1$'認識機構
 *VW/'+ は  量体を形成しており、各プロトマーのド
メイン ,, に 1$'が  分子ずつ相互作用していた 図G 。同じファミリーに属するグルタミン酸酸化酵素では 1$'の結合による協同的な構造変化が起こることが知られているが  、当初の予想に反して *VW/'+ は 1$'の結合による大きなコンフォメーション変化は観察されなかった。
*VW/'+ と の配列同一性を示す /\VLQLEDFLOOXVVSKDHULFXV 由来 /'+ /VS/'+ の 1$'複合体構造が、既に ; 線結晶構造解析で決定されているが、1$'のソーキングが結晶に悪影響となることが報告されており、データベースへの登録はされていない  。著者らは、
非対称単位中に存在する  分子中の $ 鎖のみに 1$'の電子密度が見られたとしている。そこで、 *VW/'+ の
1$'複合体と /VS/'+ アポ体の $ 鎖、% 鎖を重ね合わせ
ると、% 鎖は結晶中でドメイン ,, が 1$'の方向へ折れ曲がることで触媒部位の空間が狭くなっていた 図  。
このことから、/VS/'+ の $ 鎖と &U\R(0 による *VW/'+
は 1$' が結合できる溶液中に近い構造である一方、/VS/'+ の % 鎖は結晶中のパッキングの影響で 1$'が結合しにくい構造であることが示唆された。


図 *VW/'+ と /VS/'+ の各分子間の構造比較
左 *VW/'+ 白色 と /VS/'+$ 鎖 灰色 の重ね合わせ
右 *VW/'+ 白色 と /VS/'+% 鎖 黒色 の重ね合わせ 1$' の結合によって  量体形成に関わるドメイン ,の温度因子が低下し、1$'結合モチーフのドメイン ,,では温度因子の上昇とディスオーダーが起こっていた。1$'のニコチンアミド部位は 6HU と水素結合を形成しており $VQ6HU が 1$'の方向へ移動していた 図  。この変化によって残基番号  のディスオーダーおよびドメイン ,, の  残基 残基番号 の主鎖の構造変化が起こっていた。これに従い、隣接分子のドメイン , に存在する $UJ 側鎖周辺の空隙が拡張し、$UJ は構造変化が可能となり、近傍の残基と新たな相互作用を獲得していた。従って、
1$'の結合によりドメイン ,, の運動性が高くなる一方でドメイン , の運動性が低下することが示唆された。



図 1$' 結合による *VW/'+ の構造変化
黒、濃灰色：アポ体 $ 鎖、* 鎖、白、淡灰色：1$'複合体 $ 鎖、* 鎖  *VW/'+ の耐熱性機構
 興味深いことに、6SRURVDUFLQDSV\FKURSKLOD 由来/'+ 6SV/'+ は *VW/'+ と の配列同一性を示す一方で耐熱性が約 ℃低い  。配列比較の結果から差が見られた *VW/'+ のアミノ酸残基を 6SV/'+ の対応するア
ミノ酸残基に変異させたところ、$OD 及び 7\U 変
異体は熱処理後の相対活性がそれぞれ約 と大きく低下した *VW/'+ 野生型は約   。これらの残基はいずれも分子界面で分子間相互作用を形成しており、*VW/'+ 全体の安定化に寄与していることが示唆された。更に、*VW/'+ は /VS/'+ や 6SV/'+ と比較して &末端が  残基 $UJ$UJ 長く、周辺の残基との相互作用が観察されたため、これらを  残基ずつ欠損させたところ、徐々に耐熱性が低くなる現象が観察された  。以上のことより、*VW/'+ の高い耐熱性には $OD、
7\U および & 末端領域が重要であることが強く示唆された。

今後の展望
 *VW/'+ の解析から得られた知見を他のアミノ酸分析用酵素や産業用酵素の開発に応用するとともに、広
範な分野でアミノ酸分析用酵素を実用化していく。

参考文献
1)
Yamaguchi, H. etal.:Struct. Biol.,205,
 <DPDJXFKL+
HWDO
J.
-6WUXFW%LRO
11-21(2019) 2)al.: Baker,%DNHUP.
3J.
-et
HWDO
Structure
6WUXFWXUH,3,
693-705
(1995) 
3)
  Fujiyoshi,)XML\RVKL Y.
< etHW alDO.:
 Ultramicroscopy
8OWUDPLFURVFRS\, 38,
241-251(1991)
 
4)  Borgnia,%RUJQLD M.
0 J.
- etHW alDO.: Mol.
0RO Pharmacol.
3KDUPDFRO, 89,645-651(2016) 
5)
Zhao, Y.HWDO
et al.:
Mol. Catal. B Enzym. 83,
 =KDR< J.
-0RO&DWDO%(Q]\P
65-72(2012)  13

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集Proteus vulgaris 由来 L-アミノ酸デアミナーゼの機能解析とアンモニア生産への応用
宮澤 沙哉佳・梅澤 覚・木野 邦器*
早稲田大学大学院〒169-8555

先進理工学研究科

東京都新宿区大久保 3-4-1
Tel: 03-5286-3211

応用化学専攻早稲田大学大学院先進理工学研究科
Fax: 03-3232-3889

E-mail: kkino@waseda.jp
L-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)は、多様な L-アミノ酸を基質としてa-ケト酸およびアンモニアを生成する酵素である。Proteus 属細菌の LAAD は膜結合型酵素であり、芳香族および脂肪族アミノ酸に作用する type1、塩基性アミノ酸に作用する type2 の基質特異性の異なる二種類が報告されている。P. vulgaris 由来 LAAD では type1 の機能は明らかとなっていない。そこで我々は、ゲノム情報から pvLAAD の type1 を初めて見出し、大腸菌で発現させた組換え酵素の機能解析を行い、type2との基質特異性の違いを明らかにした。広範な基質特異性を示す LAAD は、産業上有用な生理活性を有するa-ケト酸だけでなく、水素エネルギーのキャリアとして近年注目を集めているアンモニアを効率的に生産可能であり、食品廃棄物などのバイオマス資源に対して LAAD を利用するアンモニ
アの環境調和型生産プロセスの構築は、持続可能な社会の実現に貢献すると考える。

１．はじめにアンモニアは年間約 2 億 ton にも及ぶ量が生産され、食料生産に必須な肥料をはじめ、幅広い用途で用いられる。常温常圧に近い条件で液化可能であることから、輸送に優れるだけでなく、カーボンフリーであるため、近年では持続可能な社会の実現に向けた水素キャリア
としての利用が期待されており、さらなる需要拡大が見込まれている。アンモニアは、100 年以上にわたり
ハーバー・ボッシュ法により生産されているが、高温高圧条件を必要とし、大量のエネルギー消費を伴うため、大規模プラントに対応する合成法にとどまっている。水素キャリアとしてのアンモニア合成には、小規模分散型のプラントが求められることから、環境負荷の低い、新たな合成法の開発が期待されている。そこ
で我々は、タンパク質を含む食品廃棄物等のバイオマ
ス資源に由来するアミノ酸からアンモニアを生産可能
な L-アミノ酸デアミナーゼを利用する化石資源に依存しないアンモニア生産プロセスの開発に着目した。
Proteus 属細菌が有する膜結合型 LAAD は、FAD を補酵素として、L-アミノ酸のアミノ基を酸化的に脱離してa-ケト酸およびアンモニアを生成する反応を触媒する。LAAD は幅広い L-アミノ酸に対して活性を有し、

14

芳香族および脂肪族アミノ酸に対して高い活性を示す
type1、塩基性アミノ酸に対して高い活性を示す type2の存在が報告されている 1)。しかし、P. vulgaris 由来
LAAD では type2 のみ詳細な検討が行われているが、type1 の機能は明らかとなっていなかった 1)。そこで、本研究では pvLAAD type1 を新たに取得し、当該酵素を大腸菌の膜結合型組換え酵素として発現させ、その機能解析とアンモニア生産への応用可能性を検証した。

+ H2O + O2
L-amino acid

12

pvLAAD10+ NH3+H2O2

Glya-keto acid

Ile

Phe
図 1. pvLAAD による L-アミノ酸の脱アミノ化反応
Trp

２．方法

Cys
Lys

His
既報 の pvLAAD type2 をクエリーとして、P. vulgaris
IAM12003 株のゲノム配列に対する BLAST 検索から
Glu
type1 を見出した。同ゲノムを鋳型として目的遺伝子をThr
取得後 pET-21a(+)ベクターに連結し、当該プラスミド
Glnを大腸菌 Rosetta2(DE3)に導入して、組換え大腸菌を作 12製した。pvLAAD は大腸菌でも機能する膜結合シグナ
2)

10

30

ル配列を含むため、IPTG による遺伝子誘導発現により膜結合型酵素として発現させ、当該組換え大腸菌の菌体を用いて各種 L-アミノ酸を基質とした脱アミノ化反応を行った。L-アミノ酸は HPLC を用いた OPA 法、生成物であるa-ケト酸は 2,4-ジニトロフェニルヒドラジンを用いた呈色法、アンモニアはa-ケトグルタル酸とグルタミン酸脱水素酵素を利用した F-キット(株式会社 J.K.インターナショナル)を用いて行った。

concentration/mM

25

8

6

12
10

12

108

86

type1

type2

2

0 12

12
10

108

86

64

2 10

64

Gly

42

20

4 8

02
Ala
Gly
Val
Ile
Leu
Phe
Tyr
Trp
Met
Cys
Pro
Lys
Arg
His
Asp
Glu
Ser
Thr
Asn
Gln
6

6

24

8 4

42
20
02
24
a-keto acid/mM

46

68

810

10
12

type2
type1
10 2 12 0
2

46

68

810

10
12

5

0

2

4
time/h68

４．今後の展望
本研究では、ゲノム情報を駆使して pvLAAD type1
を初めて見出し、当該酵素を発現させた大腸菌を用いて、既報の LAAD では網羅できなかった L-アミノ酸の脱アミノ化に成功した。LAAD に加えて、現在までに見出されているアミノ酸生産及び脱アミノ化プロセス
を組み合わせることで、食品廃棄物等の多様なバイオマス資源を利用するアンモニアおよびa-ケト酸の生産プロセスが構築可能である。とくに、アンモニアは次世代のエネルギー源である水素のキャリアとして注目を集めており、本技術をハーバー・ボッシュ法に代わる環境調和型プロセスとして構築することができれば、持続可能な社会の実現に大いに寄与するものと考える。

12

12

10

図 3. pvLAAD type1 発現大腸菌を用いたa-ケト酸
およびアンモニア生産

まず、L-Ile を基質とした反応における pvLAAD type1の至適反応条件を検討した結果、25 ˚C、pH 9.0 において最も高い活性を示し、1 hr の反応で 10 mM の L-Ile
をほぼ完全に脱アミノ化した。続いて、pvLAAD type1
および type2 をそれぞれ発現させた組換え大腸菌を用いて、上記至適反応条件下における 20 種類の L-アミノ酸に対する基質特異性を評価した。基質 10 mM に対する活性を比較した結果、pvLAAD type1 は、type2 では脱アミノ化反応がほとんど進行しない L-Val や L-Ileなどの脂肪族アミノ酸、L-Tyr や L-Trp などの芳香族アミノ酸に対して高い活性を示すことが明らかとなり、他の Proteus 属細菌で報告されている二種類の LAADの基質特異性の特徴を示した (図 2)。
12

a -keto acidammonia
L -Ile150３．結果と考察Ala AlaGly Gly
Val ValIle
Ile
Leu Leu
Phe PheTyr Tyr
Trp Trp
Met MetCys Cys
Pro ProLys LysArg Arg
His HisAsp Asp
Glu Glu
Ser SerThr ThrAsn AsnGln 4 Gln

20

4

6

8

10

12

図 2. pvLAAD の type1 および type2 の L-アミノ酸にIle
対する基質特異性比較
Phe

8

6

Trp
この結果を受け、
pvLAAD type1 の脂肪族アミノ酸にCys
対して高活性である特徴を活かし、
L-Ile を基質としてLys
a-ケト酸およびアンモニア生産を検討した。25 mM の
L-Ile に対して、pvLAAD
type1 発現大腸菌を用いた脱His
アミノ化反応を行った結果、図3 に示すように、8 hr
Glu
で 25 mMThrの L-Ile をほぼ 100%のモル変換収率でa-ケト酸とアンモニアに変換した。
Gln

4

2
0 12 2 10
a-keto acid/mM

4 8

6 6

8 4

10 2 12 02
a-keto acid/mM

図 4. 環境調和循環型のアンモニア及びa-ケト酸
生産プロセスとその概念図

参考文献
J.-Oh Baek, et al., J. Basic Microbiol., 51, 129-135, (2011).

1)

E. Takahashi, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63,2)2244-2247, (1999).
4

6

8

10

12

15

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集パラゴムノキの天然ゴム生合成マシナリを構成するタンパク質の機能解析
山口 真琴 1, 小島 幸治 1，廣森 美樹 1，石井 智樹 1，和氣 駿之 1, 山下 哲 2, 戸澤 譲 3,
山口 晴彦 4, 井之上 ゆき乃 4, 伏原 和久 4, 中山 亨 1,高橋 征司 1＊
1

東北大学大学院工学研究科， 2 金沢大学大学院自然科学研究科， 3 埼玉大学大学院理工学研究科，
4
住友ゴム工業株式会社〒980-8579

仙台市青葉区荒巻字青葉 6-6-11-505
Tel: 022-795-7272

東北大学大学院工学研究科

Fax: 022-795-7271

E-mail: takahashis@tohoku.ac.jp

パラゴムノキの天然ゴム（NR）は，タイヤ生産をはじめとするゴム工業に不可欠な天然材料である．NR 生産能力の向上や代替生物における NR 生産系構築のためには，その生合成機構の解明が必要となるが，長らく謎のままであった．我々は，NR の主骨格生合成酵素である cis 型プレニルト
ランスフェラーゼ（cPT）を同定するとともに，その活性を上昇させる相互作用タンパク質も同定した．また，それらをゴム粒子上で再構成させる系を開発することで，in vitro において NR 生合成を再現することに成功した．今回我々は，それらの相互作用タンパク質の cPT への寄与を解析し，活性上昇に重要なドメインを明らかにした．

1. はじめに
現在，伝統的に産業利用されていた天然有機材料の
大半は石油化学製品に置き換わっている．一方，パラ
ゴムノキのラテックス由来の天然ゴム（NR）に関して
は，そのユニークな材料特性を完全に代替可能な化学
ポリマーの開発に至っていないことから，タイヤ製造をはじめとする現代のゴム工業においても不可欠な天然材料である．近年の世界規模のモータリゼーションの進展で NR の需要が一層高まるなか，NR 高生産品
種の分子育種や，代替生物による NR 生産系の開発が強く望まれている．そのためには NR 生合成機構の解明が必須となるが，長年にわたり未解明の点が非常に多かった．そこで我々は，NR 生合成酵素の解明に取り組んできた．
NR の主骨格は cis-1,4-ポリイソプレンであり，その生合成は，cis 型プレニルトランスフェラーゼ（cPT）
により触媒される．ラテックス内において NR は，ゴム粒子（RP）と呼ばれる脂質一重膜構造のオルガネラ
内に蓄積している．これまでに我々は，パラゴムノキのラテックス特異的な cPT である HRT1 を単離してい

16

図 1.

天然ゴム生合成マシナリのモデル

る 1)．また，我々は無細胞タンパク質発現系を利用した RP 膜上へのタンパク質導入法を開発した．この系
で RP に導入された HRT１は NR 合成活性を示すことを見出し，in vitro で NR 合成を再現することに初めて成功した 2)．さらに，HRT1 と相互作用する RP 膜タ
ンパク質 HRBP を同定し，さらに，HRBP が別の RP
膜タンパク質である REF とも相互作用することを明らかにした．REF と HRBP の共発現は HRT1 の活性を上昇させたため，この三者複合体を核とする NR 生
合成マシナリが提唱された（図 1）．本研究では，NR
生合成における HRBP や REF の機能解析を行った．

2. 結果と考察(1) HRBP の HRT１ 相 互 作 用 ド メ イ ン の 探 索
HRBP は，真核生物で広く保存されている NgBR フ
ァミリーに属するタンパク質であり，N 末端側の推定
膜貫通と，C 末端側の cPT 様ドメインとで構成される(図 2)が，それ単独で cPT 活性は示さない．原核生物
由来 cPT はホモダイマー構造をとるのに対し，一般的な真核生物由来 cPT はホモダイマー構造をとる根拠が明確に見出されていない．そのため，NgBR ファミ
リーの cPT 様ドメインが cPT と相互作用することでヘテロダイマーとして存在していると考えられていた．
一方，REF は RP 膜結合タンパク質であるため，HRBPの N 末端側の膜貫通ドメインと相互作用することが予想された．そこで，スプリットユビキチンシステムによる酵母ツーハイブリッドアッセイ（Y2H）によりHRT１に対する HRBP の相互作用ドメインを探索した．その結果，予想に反し，HRBP の膜貫通ドメイン
近傍のごく限られた領域が HRT１との相互作用ドメ
インであり，REF との相互作用ドメインもその近傍であることがわかった(図 3)．Y2H の結果を検証するため，ベンサミアナタバコの表皮細胞内における蛍光タ
ンパク質再構成法による相互作用解析を行なった．その結果，やはり HRBP の N 末端側のみで HRT１と相互作用可能であり，その相互作用部位は，HRBP 全長の場合と同様に，ゴルジ体であることがわかった．

図２. NgBR ファミリーのドメイン構造(2) HRBP の N 末 端 ド メ イ ン に よ る HRT１ の 活 性 化
RP 上における HRT1-HRBP-REF の三者複合体形成には HRBP の N 末端側ドメインだけで十分であることがわかったが，HRT１の活性増強に cPT 様ドメインが寄与するかを検証するため，無細胞タンパク質発現系で，パラゴムノキのラテックスより調製した RP 上に各種タンパク質を導入した．精製した RP の NR 合
成活性を，モノマー基質である 14C-イソペンテニル二リン酸（IPP）の反応生成物（NR）への取り込みによ

図３. Y２H による相互作用解析
1: –，2: HRBP 全長，3: HRBP の N 末端ドメイン，
4: HRBP の cPT 様ドメインり評価した．その結果，HRBP および REF の共発現による HRT１の活性化には，HRBP の N 末端側ドメ
インだけで十分であり，有意な cPT 様ドメインの寄与は検出されなかった．
(3) NR 合 成 以 外 に 寄 与 す る cPT と の 相 互 作 用パラゴムノキには，HRT1 を含め 5 種の cPT が存在する．ラテックスで発現していない cPT は，一般的な真核生物と同様，小胞体膜における糖担体脂質である
ドリコールの生合成に寄与していると考えられる．それらの cPT と HRBP の相互作用を解析した結果，パ
ラゴムノキの全ての cPT が HRBP と相互作用した．
また，NR 生合成に寄与しない cPT でもやはり HRBPの N 末端側ドメインと相互作用した．
これらの結果から，cPT-HRBP 複合体はパラゴムノ
キの全組織で機能しているが，ラテックス内においては，HRBP を介して REF と相互作用することで複合体が RP 膜上において安定化され，その結果として，
cPT が NR を生合成できる様になったと考えられる．

3. 今後の展望
本研究では，NR 生合成マシナリを構成するタンパ
ク質複合体の結合様式と，HRBP の NR 合成活性化に重要なドメインが明らかとなった．今後，HRT1 の
HRBP との相互作用ドメインを解明することで，活性化の分子機構に迫ることができる．大腸菌で発現させた HRT1 は酵素活性を示さないことから，活性化には真核細胞に含まれる何らかの因子が必要であることが示唆されていた．今回の研究をもとに HRT1 の活性発現機構が解明されることで，幅広い代替生物によるNR 生合成が可能となると期待できる．

文
参 考 文 献献
1)

2)Asawatreratanakul,
K.,
Zhang,
Y.W.,
Wititsuwannakul, D., Wititsuwannakul, R., Takahashi,S., Rattanapittayaporn, A. and Koyama, T., Eur. J.
Biochem., 270, 4671-4680 (2003).
Yamashita, S., Yamaguchi, H., Waki, T., Aoki, Y.,
Mizuno, M., Yanbe, F., Ishii, T., Funaki, A., Tozawa,Y., Miyagi-Inoue, Y., eLife, 5, e19022 (2016).

17

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集自己ユビキチン化能を有する人工 RING finger の作製法

宮本

和英＊・中谷有沙・齋藤一樹

姫路獨協大学薬学部〒670-8524

姫路市上大野 7-2-1

Tel: 079-223-6873

Fax: 079-223-6873

E-mail: miyamoto@himeji-du.ac.jp

生体内のユビキチン化反応は、不要なタンパク質の分解などの機能を担い、健康を維持するために重要である。最近、ユビキチン結合酵素(E2)活性が、白血病や乳がんなどの多くのがんに関与していることが報告された。しかし、血液・組織中の E2 活性を測定すれば新たながん診断の指標となりうることは広く認識されながらも、ユビキチン化が複雑なカスケード反応であるという理由から、これまで E2 活性を検出するのは困難とされてきた。本研究では、人工 RING finger (ARF)を作製し、これを活用した簡便な E2 活性の検出システムの開発を検討した。E2 活性の多寡から、プロ
テアソーム阻害剤などの抗がん剤が治療前に有効かどうかを判定する新たなツールを提案する。

１．はじめに

２．実験方法と結果

生体内では、構造異常などが原因で不要となったタ
ンパク質を分解・管理する品質管理機能であるユビキ
チンプロテアソームシステムが存在する。このシステ
ムでは、ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)およびユビキチンリガーゼ(E3)の 3 つの酵素が関与している。ユビキチンが E1 から E2 に転移し、そして E3 を介して標的タンパク質に付加される。この反応が繰り返されることで複数のユビキチンが標的タ
ンパク質に付加される。付加された複数のユビキチンを目印に、標的タンパク質の分解が行われる。このユビキチン化は、細胞の機能維持に重要な働きをしている他、白血病、乳がんなどの疾患に関わることが報告されており、これら疾患に罹患すると E2 酵素の発現量が変化する。しかし、血液・組織中の E2 活性を測定す
れば新たながんの指標となりうることは広く認識されながらも、ユビキチン化が複雑なカスケード反応であるという理由から、これまで E2 活性を定量的に計測するのは困難とされてきた。本研究では、人工 RING
finger (ARF)を活用して、ヒト急性前骨髄球性白血病細胞における E2 活性を捉える新たな手法を検討した。

18

図１. 人工 RING finger(ARF)の作製法

白 血 病 の 発 症 に 関 与 す る Seven in absentia
homologue（SIAH）1 タンパク質は、その N 末端に RING
フィンガードメイン(RING)を有する E3 である(図１)。
RING は、Active Site(5 残基：PKLTC)を通して、特異的に E2 と結合する。その PKLTC 配列をアミノ酸レベル
で取り出し、それを 38 残基の亜鉛結合ペプチドを土台にして移植することでキメラ分子を設計した 1-4)。このようにして設計した ARF が、自己ユビキチン化能を獲得できるように、土台にはリジンリッチな配列を選択

図３. ヒト急性前骨髄球性白血病細胞における E2 活性の検出した。オリジナルの SIAH1 は 564 残基からなるが、ARF

ヒト急性前骨髄性白血病株(NB4)に抗がん剤であるは 1/10 以下にまで分子サイズダウンされた。この分子プロテアソーム阻害薬（ボルテゾミブ）を添加して、サイズであれば、ARF をペプチド自動合成機で化学合

そのがん細胞の細胞死を誘導する実験を行った。NB4成することが可能で、粉末状態で保存し易い。また、細胞の細胞死によって、E2―ユビキチン複合体が細胞抗体のように試薬間でのロット差が生じにくく取り扱

外に逸脱され、その結果、その複合体が培養上清中でいが容易であり、予期せぬ分解・修飾を受けにくいと検出される。その上清サンプルに ARF を添加して、生いった優れた点がある。

理活性反応測定装置 (AMIS-101)を用いて、リアルタイムに E2 活性を高感度に検出できた 6)。本法は、抗体検
出とは全く異なる情報を我々に与えてくれており、これまでに捉えることが困難であった E2 活性の検出を初めて可能にする手法である。

３．今後の展望
ARF の E2 活性検出システムは、ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害薬の抗がん剤が治療前に有効かどうかを判定するための治療前診断用のツールとして期待している。今後は、各種がん細胞や担癌動物を使った実証実験を通して ARF を活用する E2 活性の検出シ
図２. (A)オリジナルのユビキチン化反応と(B)ARF による自己ユビキチン化反応
標的タンパク質（基質）を用いず、11 種類の E2 のユビキチン化実験から、ARF は特異的に E2 を認識し、ステムの有効性を示していきたい。

参考文献
1)

自己ユビキチン化能を有していることが分かった。また、ARF の E2 特異性は、オリジナルの SIAH1 タンパク1151-1156 (2019).
2)

質と類似しており、移植した Active Site(5 残基：
PKLTC)が機能していることが確認できた。オリジナル

3)

Miyamoto, K et al., Protein Science, 27,

4)

Miyamoto, K et al., Protein Science, 27,

987-992(2018).

ARF を用いることで、ARF 自身が基質としての役割を担うことができるので、簡単なユビキチン化反応が構築

1354-1363(2018) [Review]
5)

Miyamoto, K et al., Protein Science, 27,

6)

Miyamoto, K et al., Methods in Molecular Biology,

できた(図２)。この ARF の反応を用いることで、簡便に E2 活性（E2 から ARF へのユビキチン転移活性）を検出・測定することができるようになった 4,5)。

Miyamoto, K et al., Protein Science, 28, 448-453(2019).

のユビキチン化反応は、複雑な複合体を形成しながらユビキチンを基質に付加する。しかし、今回作製した

Miyamoto, K et al., Protein Science, 28,

1704-1709(2018).
1867, 75–87(2018).

19

第 71 回日本生物工学会大会 トピックス集

天然構造特異的認識モノクローナル抗体の作製とその評価
磯﨑

勇志・湊元

幹太・冨田

三重大学大学院〒514-8507

昌弘*

工学研究科

三重県津市栗真町屋町 1577

Tel: 059-231-9428

Fax: 059-231-9430

E-mail: tomita@chem.mie-u.ac.jp

生体内で機能しているタンパク質のすべては、立体構造を有している。そのため、モノクローナ
ル抗体を分子標的治療薬やがんマーカーとして使用する場合、その立体構造を認識することが極めて重要である。しかし、立体構造を認識するモノクローナル抗体を作製することは容易ではない。
そこで、本研究では『立体構造特異的ターゲティング (SST) 法』を用いて、立体構造認識モノク
ローナル抗体を作製し、その評価を行った。その結果、作製されたモノクローナル抗体は目的タン
パク質の立体構造を特異的に認識する可能性が示された。この新技術を利用することで、革新的な分子標的治療薬への応用が期待できる。
分子標的治療薬への応用が期待できる。

1. はじめに
近年、モノクローナル抗体は幅広い分野で利用されており、特に、分子標的治療薬 (抗体医薬) への期待は年々高まっている。モノクローナル抗体の特徴として、高い特異性と親和性が知られている。しかし、モノクローナル抗体の多くは、目的タンパク質の一次配列を認識している。生体内で機能しているタンパク質のすべては、立体構造を有しており、モノクローナル
抗体を分子標的治療薬として応用する際には、その立体構造を認識することが大変重要である。しかし、立体構造を認識するモノクローナル抗体の作製法は、未だ、確立されていない。
そこで、本研究では立体構造認識モノクローナル抗体を高効率に作製する新規技術を開発した (図 1) 1-3)。
新規ハイブリドーマテクノロジーである『立体構造特異的ターゲティング
異 的ターゲテ ィ ン グ (Stereospecific targeting :SST) 法』の最大のポイントは、DNA 免疫によって獲得した感作 B 細胞を目的抗原発現ミエローマ細胞を用いて選択するところにある。
本研究では、創薬ターゲットとして注目されている
GPCR (G タンパク質共役受容体) に対する立体構造認
識モノクローナル抗体の作製を目指した。GPCR の一つ
で あ る huCRHR1 ( ヒ ト corticotropin-releasing
hormone receptor 1) をモデルタンパク質として研究を進めた。CRHR1 はうつ病やパニック障害等の疾患に関与していることが報告されている 4,5)。

20
２

2. 方法
(1) 立体構造認識モノクローナル抗体の作製
huCRHR1 の遺伝子を含む組換えプラスミド DNA をマ
ウスに複数回投与した。最終免疫として huCRHR1 発現
CHO-K1 細胞を用いた。免疫されたマウスから脾臓を無菌的に取り出し、感作 B 細胞を含む脾臓懸濁液を調製した。感作 B 細胞を huCRHR1 発現ミエローマ細胞を用いて選択し、B 細胞-ミエローマ細胞複合体を形成した。
両細胞を電気パルスを用いて選択的に融合を行い、目的の立体構造認識モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。作製されたハイブリドーマは限界希釈法
によってクローン化を行った後、クローン化ハイブリ
ドーマによって産生される目的抗体をプロテイン A カ
ラムを用いて精製した。

(2) 立体構造認識モノクローナル抗体の評価(2)作立体構造認識モノクローナル抗体の評価製されたモノクローナル抗体の評価は、作製されたモノクローナル抗体の評価は、
Cell-ELISA
法によって行った。さらに、アイソタイプ
Cell-ELISA 法によって行った。さらに、アイソタイプ
およびサブクラスは
ELISA 法に基づき評価した。得らおよびサブクラスは ELISA 法に基づき評価した。得られたモノクローナル抗体が目的タンパク質の立体構造れたモノクローナル抗体が目的タンパク質の立体構造を認識するかどうかを huCRHR1 発現 CHO-K1 細胞を用いを認識するかどうかを
huCRHR1 発現 CHO-K1 細胞を用いた免疫蛍光染色法およびウェスタンブロッティング法
た免疫蛍光染色法およびウェスタンブロッティング法
によって検討した。
によって検討した。

せたウェスタンブロッティング法に基づき解析したとが示された。一方、huCRHR1 発現 CHO-K1 細胞を変性させたウェスタンブロッティング法に基づき解析したところ、特異的な結合を確認することができなかった
せたウェスタンブロッティング法に基づき解析したところ、特異的な結合を確認することができなかった(図3) 。このことから、作製抗体は、huCRHR1 の立体
ころ、特異的な結合を確認することができなかった(図
構造を特異的に認識する可能性が示唆された。
(図 3)3) 。このことから、作製抗体は、huCRHR1。このことから、作製抗体は、huCRHR1 の立体の立体構造を特異的に認識する可能性が示唆された。
構造を特異的に認識する可能性が示唆された。

3. 結果・考察
3. 結果・考察(1) 立体構造認識モノクローナル抗体の作製(1)
SST立体構造認識モノクローナル抗体の作製法に基づき、融合実験を行ったところ、多くのSST 法に基づき、融合実験を行ったところ、多くのハイブリドーマを獲得することに成功した。ハイブリ
ハイブリドーマを獲得することに成功した。ハイブリ
ドーマ上清中の抗体価を Cell-ELISA 法によって評価
ドーマ上清中の抗体価を法によって評価したところ、huCRHR1 発現Cell-ELISA
CHO-K1 細胞に対する特異的したところ、
huCRHR1
発現
CHO-K1細胞に対する特異的結合が確認できた。そこで、限界希釈法を用いてクロ結合が確認できた。そこで、限界希釈法を用いてクローン化を行い、3 種類のハイブリドーマ
ー ン 化 を 行 い 、 3 の確立に成功した。
種類のハイブリドーマ(C7-G1,C7-H6,C7-H10)
ハイブリド(C7-G1,C7-H6,C7-H10)の確立に成功した。
ハイブリド
ーマ上清中のモノクローナル抗体をプロテイン A カラーマ上清中のモノクローナル抗体をプロテイン A カラ
ムを用いて精製を行い、精製モノクローナル抗体を得
ムを用いて精製を行い、精製モノクローナル抗体を得た。
た。
精製されたモノクローナル抗体の抗体価を精 製 さ れによって評価したところ、huCRHR1たモノクローナル抗体の抗体価をCell-ELISA
発現
Cell-ELISAによって評価したところ、huCRHR1
発現
CHO-K1 細胞に対して、特異的に結合することが示され
CHO-K1 細胞に対して、特異的に結合することが示された。さらに、精製モノクローナル抗体はIgG タイプのた。さらに、精製モノクローナル抗体はIgG タイプの抗体で、サブクラスはIgG2a タイプの抗体であること
抗体で、サブクラスは
IgG2aタイプの抗体であることが明らかになった (図 2) 。
が明らかになった (図 2) 。

4. 今後の展望
4.
今後の展望
4.本研究において、SST
今後の展望
法に基づき、目的タンパク質本研究において、SSTの立体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の本研究において、SST 法に基づき、目的タンパク質法に基づき、目的タンパク質の立体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の獲得に成功した。SST
法は細胞膜表面上にあるすべての立体構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の獲得に成功した。SSTのタンパク質をターゲットにでき、それらに対する立獲得に成功した。SST 法は細胞膜表面上にあるすべて
法は細胞膜表面上にあるすべてのタンパク質をターゲットにでき、それらに対する立体構造認識モノクローナル抗体の作製を可能とする革のタンパク質をターゲットにでき、それらに対する立体構造認識モノクローナル抗体の作製を可能とする革新的な方法である。この新規法は分子標的治療薬への体構造認識モノクローナル抗体の作製を可能とする革新的な方法である。この新規法は分子標的治療薬への新たなアプローチとして期待できる。
新的な方法である。この新規法は分子標的治療薬への新たなアプローチとして期待できる。
新たなアプローチとして期待できる。

参考文献
参考文献
参考文献


1)


2)

0.+5#  #/& 46.050  ..6/05*'3#18   
0.+5# , 
Tomita,M.#/&
and46.050
Tsumoto,K...6/05*'3#18: Immunotherapy
3
46.050 '5 #-   30&6%5+0/ 0( .0/0%-0/#-(3),
371 (2011)
46.050
 '5#- 30&6%5+0/
0( .0/0%-0/#-
6-563'0(/+.#-'--4#/6#-0(#/5+$0&+'4/
Tsumoto, K.
et al.
:25.6 Productionof#/5+$0&+'4/6-563'0(/+.#-'--4#/6#-0(#4+%
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monoclonal
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Specialized
Applications
(7th
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
(2)立体構造認識モノクローナル抗体の評価(2)立体構造認識モノクローナル抗体の評価
精製モノクローナル抗体の更なる評価のために、
精製モノクローナル抗体の更なる評価のために、
huCRHR1
発現 CHO-K1 細胞を用いた免疫蛍光染色および
huCRHR1
発現 CHO-K1 細胞を用いた免疫蛍光染色およびウェスタンブロッティング法を行い、立体構造特異性
ウェスタンブロッティング法を行い、立体構造特異性を検証した。その結果、精製モノクローナル抗体はを検証した。その結果、精製モノクローナル抗体は
huCRHR1
発現 CHO-1 細胞表面に特異的に結合すること
huCRHR1
発現 CHO-1 細胞表面に特異的に結合することが示された。一方、huCRHR1
発現 CHO-K1 細胞を変性さが示された。一方、huCRHR1 発現 CHO-K1 細胞を変性さ


3)
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
4)
5)

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Blackwell, Hoboken,
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Supplementary46.050
'5 #- ..6/05*'3#18   
102– 113) (2016).
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0-'630$+0-    !#/)"0)'34
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
(2019) '5#-0)'34
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Wang, X. et al.: Mol. Neurobiol.,48 (3), 544(2013)
Rogers, J. et al.: Mol. Psychiatry., 18 (6) 700(2013)

３21

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集「アミノ酸機能工学」による大腸菌へのストレス耐性の付与

磯貝

章太・高木

博史*

奈良先端科学技術大学院学 先端科学研究科 バイオサイエンス領域〒630-0192

奈良県生駒市高山町 8916-5
Tel: 0743-72-5420

奈良先端科学技術大学院大学先端科学研究科
Fax: 0743-72-5429

E-mail: hiro@bs.naist.jp

大腸菌は、最も研究の進んだモデル生物であり、様々な物質生産の宿主となっている。一方で、ストレス耐性の付与により、生産性向上を達成した報告例は少ない。我々は、グルタミン酸・リジ
ン・プロリンといった機能性アミノ酸が、大腸菌にストレス耐性を付与することを見出し、「アミノ酸機能工学」と名付けた育種手法により、高温ストレスや酸ストレスに耐性を有する大腸菌を取得した。さらに、各アミノ酸の代謝改変株を用いて、機能性アミノ酸によるストレス耐性付与機構の解明を進めている。

1. はじめに大腸菌は最も研究の進んだモデル生物の一つであり、生育環境下で受ける高温や酸といったストレスに対する応答・適応・耐性機構に関する知見は豊富にある。
一方で、実際の有用物質生産株にストレス耐性を付与することで、生産性を改善した報告例はほとんどない。
我々の研究室では、プロリンおよびアルギニン・リ
ジン・グルタミン酸といった荷電アミノ酸が酵母に冷凍ストレス耐性を付与すること 1)、特にプロリンは、種々のストレスで上昇する細胞内の活性酸素種レベルを低下させること 2)などを多数報告している。また、
プロリンやアルギニンについては、それぞれタンパク質のフォールディング促進効果、凝集抑制作用が知られている。リジンやグルタミン酸もタンパク質表面の荷電アミノ酸と相互作用することにより、タンパク質の変性を防ぐ効果が期待できる。これらのアミノ酸は、細胞内でも同様の効果を発揮し、細胞にストレス耐性を付与すると考えられる。そこで、これらの機能性アミノ酸（プロリン・アルギニン・リジン・グルタミン酸）を高生産させることで細胞にストレス耐性を付与
し、有用物質の生産性を向上させる育種手法を「アミノ酸機能工学」と命名した（図 1）3)。現在、「アミノ酸機能工学」を大腸菌に適用し、優れたストレス耐性を備えた大腸菌の育種、および機能性アミノ酸がストレス耐性を付与するメカニズムの解明を進めている。

22

図 1 「アミノ酸機能工学」による大腸菌へのストレス耐性の付与

2. 結果と考察(1) 機能性アミノ酸によるストレス耐性の付与
はじめに、大腸菌野生型株の生育が抑制される、
43 ℃（高温ストレス）もしくは pH5（酸ストレス）の条件において、機能性アミノ酸（グルタミン酸・リ
ジン・プロリン）を含む最少培地で培養し、生育に及ぼす影響を検証した。その結果、高温ストレス条件で培養した場合には、グルタミン酸・リジン・プロリンの添加により、また酸ストレス条件で培養した場合には、グルタミン酸・リジンの添加により大腸菌の生育がそれぞれ改善した（図 2）。一方、アラニンを添加した場合には、いずれの条件においても生育の改善は認められなかった。これらの結果から、機能性アミノ酸が大腸菌にストレス耐性を付与する可能性が示された。

酵素（LysC および ProB）の高機能型変異体を発現させた代謝改変株を作製し、高温および酸ストレス耐性を検証した。その結果、これらの代謝改変株は変異株が生育可能な高温ストレス条件では生育することができず、現在、培養温度の条件検討を進めている。一方、酸ストレス条件では、培養初期の生育が改善し、培養期間を短縮できる可能性が見出された（図 3B）。

図 2 機能性アミノ酸の添加によるストレス耐性の付与（A：高温ストレス、B：酸ストレス）(2) リジン・プロリン高生産株のスクリーニング
機能性アミノ酸の添加によりストレス条件下における大腸菌の生育が改善したことから、次に機能性アミノ酸を高生産する突然変異株のスクリーニングを試みた。その結果、野生型株の 9 倍以上のリジンを菌体内に蓄積する変異株、および野生型株の 4-7 倍のプロリンを蓄積する変異株をそれぞれ取得した。これらの変異株について、遺伝子変異の同定を試みたところ、プ
ロリン高生産株については、プロリン生合成の鍵酵素
ProB の遺伝子にアミノ酸置換を伴う変異が導入されており、ProB がプロリンによるフィードバック阻害非感受性になったことがプロリン高生産の要因と考えられる。一方、リジン高生産株については、リジン生合
成の鍵酵素（LysC または DapA）の遺伝子に変異が導入されておらず、現在全ゲノム解析を進めている。
(3) リジン・プロリン高生産株のストレス耐性
取得したリジン・プロリン高生産株について、高温
ストレスおよび酸ストレス耐性を検証した。その結果、高温条件で培養した際にリジン高生産株では顕著に生育が改善した（図 3A）。一方、pH5 の条件では僅かに生育が改善しただけにとどまった。この結果から、リジンの高生産が大腸菌に高温ストレス耐性を付与する可能性が示された。
(4) リジン・プロリン代謝改変株のストレス耐性
リジンやプロリンによるストレス耐性付与機構を明らかにするために、リジンおよびプロリン生合成の鍵

図 3 機能性アミノ酸の高生産によるストレス耐性の付与（A：高温ストレス、B：酸ストレス）3. 今後の展望
本研究では、機能性アミノ酸（グルタミン酸・リジ
ン・プロリン）により、大腸菌に高温・酸ストレス耐性が付与されることを見出した。現在、機能性アミノ酸の高生産株や代謝改変株を用いて、細胞にストレス耐性が付与される機構の解析を進めている。本研究で得られた基盤的成果に基づき、機能性アミノ酸の高生産または培地への添加により、有用物質を生産する微生物にストレス耐性を付与することで、生産コストの削減やエネルギー消費の低減などの波及効果が期待される（本研究は、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）の委託業務で行われた）。

文
参考文献献1) Takagi, H. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 47,
405-411 (1997).
2) Takagi, H. et al., Yeast, 33, 355-63 (2016).
3) Takagi, H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 83,
1449-1462 (2019).

23

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集クローン病自然発症モデル  ")0% マウスの病状進行に伴う腸内細菌叢および糞便メタボライトの変動
小松 陽介 1,2・清水 由宇 1・山野 めぐみ 1・中村 公則 1,3・綾部 時芳 1,3・相沢 智康 1,3,4*
1

北海道大学 大学院生命科学院、2 森永乳業株式会社 健康栄養科学研究所、

3

北海道大学 大学院先端生命科学研究院、4 北海道大学 国際連携研究教育局〒060-0810

札幌市北区北 10 条西 8 丁目

Tel/Fax: 011-706-3806
E-mail: aizawa@sci.hokudai.ac.jp

クローン病は、患者数が世界的に増加し続けている腸管の慢性炎症性疾患であり、その原因は未だ不明である。クローン病の診断は、慢性炎症に起因する血性下痢や内視鏡所見等により決定される。クローン病の病態推移を、炎症所見が顕在化しない段階から追うことは困難であり、ヒトクローン病を模した動物モデルを用いた研究には大きな意義がある。本研究は、非侵襲検体である糞便の NMR メタボロームを用いることにより、早期診断が可能となり得る知見を提供する。
1.はじめにクローン病は、回腸を中心として消化管のあらゆる部位に非連続性の炎症病変を生じる原因不明の難病であり、その発症と症状の悪化には、遺伝的要因や環境的要因に加え、免疫応答異常が関連することが報告されてきた 1)。さらに、クローン病患者の腸内において、細菌叢の破綻（ディスバイオーシス）が生じ、宿主に対して不都合な免疫応答を生じさせることが知られている。このような腸内細菌のディスバイオーシスに付随して、細菌に由来するメタボライトが変動し、クローン病の増悪や合併症の発現に関連している可能性が考えられる。しかしながら、クローン病の進行に伴い、糞便中メタボライトがどのような経時的変動を示すかについてはほとんど知られていない。もし、クローン病の病状の悪化に伴い、特徴的な変動を示すメタボラ
イトが特定されれば、病状を予測し得るバイオマーカ
ーとして有用であるかも知れない。本研究の目的は、クローン病自然発症モデルを用いて、クローン病の病状の悪化に伴って変化する、腸内細菌およびそのメタ
ボライトの推移を調べることである。
2.方法

クローン病の自然発症モデルとして SAMP/YitFc マ
ウスを、対照群として ICR マウスを使用し、経時的に

24

回腸組織および糞便を採取した。回腸組織については、
ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行い、炎症の進行を確認した。糞便については、次世代 DNA シーケ
ンサーを用いた腸内細菌叢解析および核磁気共鳴分光法（NMR）を用いたメタボローム解析を実施した。
3.結果と考察(1)週齢経過に伴うクローン病類似回腸組織所見の増悪SAMP/YitFc マウスの回腸切片に対し、HE 染色を行ったところ、4 週齢では組織所見上の異常は限定的であったが、週齢の増加とともに炎症が進行し、絨毛構造の破綻と筋層の肥厚、粘膜固有層への炎症性細胞の浸潤が見られた【図 1】。

【図 1】回腸組織の HE 染色像(2)病態進行に伴う腸内細菌叢の変化
SAMP1/YitFc マウスの腸内細菌叢は、週齢が進むに

つれ、 Firmicutes 門の減少と Bacteroidetes 門の増加が進行し、15 週齢において最も顕著であった【図 2】。
このことから、クローン病の病状の進行に、不可逆的な菌叢変動が関わっている可能性が考えられる。

【図 2】腸内細菌叢（門レベル）の変化(3)各週齢における糞便中メタボライトのプロファイ
リングと病態進行に伴う経時的な濃度変化
SAMP1/YitFc マウスと対照群のマウスの糞便中メタ
ボライトに由来する NMR スペクトルに対し、部分的最小二乗回帰分析（OPLS-DA）を行ったところ、各週齢において、群毎にクラスターが形成され、明確な分離が確認できた【図 3A】。続いて、両マウス群の群間差に寄与した NMR スペクトルについて、Chenomx データベースと照合し、代謝物を同定した。さらに、同定した代謝物のうち、12 の化合物に対し、定量解析を行い、経時的な濃度変化を示した【図 3B】（一部）。

群と比較して有意に低かった。酪酸は、クローン病患者の便中で減少することが報告されており 2)、本研究の結果と一致している。さらに、我々の菌叢解析の結果、SAMP1/YitFc マウスにおいて、週齢を重ねるにつれ 、 酪 酸 産 生 菌 で あ る F.prausnitzii を 含 む
Ruminococcaceae の減少が確認された。クローン病の発症・進行に伴い、酪酸産生菌が相対的に減少したことにより、糞便中酪酸が低下したと推察される。その一方で、15 週齢において、糞便中の酪酸濃度は上昇した。過去に、酪酸の吸収を担うモノカルボン酸輸送体の消化管内の発現量が、炎症性腸疾患の動物モデルにおいて低下することが報告されている 3)。このことを考慮すると、15 週齢における糞便中の酪酸の増加は、これら輸送体を介した吸収が阻害されたことにより、糞便中に酪酸が滞留した結果であるかも知れない。
SAMP1/YitFc マウスの糞便中タウリン濃度は、週齢に関わらず比較的高い濃度を示した。潰瘍性大腸炎の患者で報告されているように 4)、タウリンの脱抱合を担う腸内細菌が相対的に増加したことにより、糞便中の遊離タウリンが増加した可能性がある。また、クローン病の発症や病状悪化には、酸化ストレスが影響していることが報告されている 5)。タウリンは抗酸化作用を有することから、病態形成において重要な役割を果たしている可能性が考えられる。
4.今後の展望

本研究において我々は、クローン病自然発症モデルである SAMP1/YitFc マウスを用いて、クローン病の病態進行に伴い、メタボライトが劇的に変動すること、これらの変動には、部分的に腸内細菌の変動が影響する可能性を示した。クローン病の病状進行に伴う、腸管組織の悪化に至る前の段階において、これらの糞便
中メタボライトを、病状を予測し得るバイオマーカーとして活用し、早期診断が可能となれば、患者の QOLの改善に貢献できるかも知れない。

【図 3】糞便メタボローム解析(A) OPLS-DA、(B)メタボライトの濃度変化（一部）
我々の HE 染色の結果、4 週齢のマウスの組織所見上の異常はまだ限定的であったが、糞便中のメタボライ
トはすでに劇的に変動しており、組織所見上にて症状の顕在化が起こる前に、糞便中メタボライトの変化が起きていることが推察された。さらに、定量解析の結果、SAMP1/YitFc マウスの酪酸の糞便中濃度は、対照

参考文献
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26

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ª|SmP\qşėRC§º[ÂOÆëč©
シングすることを目指し、ゴルジ体で働く内在性プロª|©s¬[Gm .H[,< の利用を検討した。
`ÌŖqķƓRWD
セシングプロテアーゼである
,< はa /\V$UJ
=98. の` & 末を切断するが、/\V$UJİqÊġSmMC=98. `®ń.H[の上流ƦË_jlV`ÊġÒŒaïÔRCŔŎŧ_jXZÊ
配列によりその切断効率は変化し、生物種によって切 
D³`ŲŐƇ
ġÒŒ`ƆHƘƚƦËaĺE[Gm 断効率の良い認識配列は様々である。他の糸状菌[`źĵqÛŽ_ 、9DO$OD;[[;[[/\V$UJ
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での結果を参考にƚƦË¥u¥¦¬q &%+
 と
\ +6$
# の間に挿入しプロセ`Ʈ_ĘÅR©
識配列ライブラリーを
ª|ÒŒqƕÀRWDV`źĵCƎĞ`ÊġÒŒ`シング効率を評価した。その結果、複数の切断効率のƸHƦËqƐÈSP\_ĎÐRC 末に余分な配列のİ_»É^ƦË`高い配列を見出すことに成功し、1^H +6$
# を高い分泌量を維持したまま生産することにqƸHÉŁƩqŻĖRWeeŔŕSmP\_
ないĎÐRWDP`jI_ &%+ を融合タンパク質として利qƉàª{Ɯ\RZÌ
成功した。
このように
ŖRC
ƐÈRW
,<
ƘƚƦËqĘÅSmŝœųè
«
用し、見出した .H[ 認識配列を挿入する発現系 図 ・ŝœųBqţŪRWD
発現系③を確立した。












è 発現カセット模式図ŝœz ļĆè図©s¬`ĚŶ
プロテアーゼの探索$*,33;363=:0*;9 はプロテアーゼ活性が非常に低a©s¬ŃčMƵĄ_¹
7FHOOXORO\WLFXVHP\MŏƬ[GmMC# の分泌発現検討の結果、`ÉŁŝœķƓ`źĵCいことが特長であるが、+6$ÉŁQnW +6$
# が菌体外でわずかに分解されているこMƇºð[pTL_ÉƒQnZHmP
分泌された\MħkL_^XWDVP[P`Éƒ_Ư¯RZHmとが明らかになった。そこでこの分解に関与している©s¬qĚŶSmP\\RWD£¬r¬¡
プロテアーゼを探索することとした。ジャーファーメª¬íƶĩ` 51$VHT"9,7 によるトランスクリプトーム_jm¥ª{¦¬
ンター培養時のƒĴqøĤRCŝœƩ`ƸH©s¬_YHZľ
解析を実施し、発現量の高いプロテアーゼについて欠ĝRCĊknWľĝĶ`íƶ®ň\ +6$
# 標品を混合しĻäqŇàR
損し、得られた欠損株の培養上清と?[  日間静置した。その結果、
ĦƮƴżRWDV`źĵC\VF%=9* 欠損株においľĝĶ_KH
℃でZÉƒŎ`ªMŅòRWP\Lk <VF%
'9* を主要なq±Ə^て分解物のバンドが消失したことから
©s¬\RZá÷RW 。構築したDĹŮRW +6$
# 分泌生
ÉŁŔ
プロテアーゼとして同定したŕƇLk \VF%=9* 欠損株を構築したところ、
ľĝĶqĹŮRW\PoCÉƒŎ`ª
産菌から分解物のバンMŅòRÉƒMđÍQnmP\qţƘRWD
ドが消失し分解が抑制されることを確認した。
£¬r¬¡ª¬_jm
# ÉŁŔŕíƶジャーファーメンターによる +6$
分泌生産培養ĹŮRW +6$
# 発現カセットを、よりセルラーゼ生産ŝœz qCjl §¥¬Ŕŕ
構築したƂMâ®RWù± .
  株ĶJQD
.5) 変異、糖消費速度向ïŜCűŅƛƟąâ
能が向上した宿主®ũōïŜ 由来のŘĳ` \VF%=9* 欠損株に導入し、ジャーフ
ľĝĶ_ýÅRC£¬
上突然変異
r¬¡ª¬_jmwíƶqøĤRWD
ァーメンターによるフェッドバッチ培養を実施した。

V`źĵC 時間でĩƮ[ J/ . の分泌生産量を示した。
`ÉŁŔŕƩqŤRWD
その結果、ĹŮRWŝœų`ēºb`ƣŖ
構築した発現系の抗体への適用ĹŮRWŝœųqŖHC
ēº`ÉŁŝœqķƓRWD
構築した発現系を用い、抗体の分泌発現を検討した。
¥¬ª>Cs¦¤トラスツズマブ
ハーセプチン®)、アダリブマブ
ヒュ¥>Cニボルマブ
§y¬>`ŝœĶqĹŮRWD
ミラ®)、
オプジーボ®)の発現株を構築した。
¥~íƶ®ňq 3URWHLQ$!86:,05 精製したところ、図ŰƍRW\PoCè 
フラスコ培養上清を_ŤSjI_ƨƫ\ƞƫ`ªqķÈ[NW  。
Dに示すように重鎖と軽鎖のバンドを検出できた!86:,05 精製した簡易精製品を用い、各抗原への結ŰƍRWůĨŰƍäqŖHCßēÚb`ź
3URWHLQ$àŃčq (/,6$# で確認したところ標品とほぼ同等の結[ţƘRW\PoĻä\cdáŬ`ź
合活性をàŃčMƘgknWDまた、
eWCトラスツズマブ¥¬
合活性が認められた。
ハーセプ
ª>_YHZaCvƊ°ö÷čƖƷqøĤRC
チン®)については、マウス血中安定性試験を実施し、Ļä\áŬ`Ɗ°ØŉĮqŤSP\qţƘRWD
標品と同等の血中半減期を示すことを確認した。












è 各種抗体医薬品の発現結果
ßŧēºÖƈä`ŝœźĵ図

²ĉ`þĭ今後の展望
ıŢŨ_jlCŲŐƇ 7FHOOXORO\WLFXV$*,33;363=:0*;9 Mēº^
本研究により、糸状菌が抗体な]`uyÖƈä`ÃnWÉŁŝœų\^mÝƂčq
どのバイオ医薬品の優れた分泌発現系となる可能性を$\HIåĻ[ª{ƜÜƔŝœ
ŤRWD7$/$0$;$&70
示した。
という商標でタンパク質受託発現サ¬qƭóRZKlCĥ_êÆð`¶ĸLkŝœķ
ービスを開始しており、既に国内外の企業から発現検ƓqÜƔRZHmDıŝœų[ŔŕRWēº`Qk^
討を受託している。本発現系で生産した抗体のさらなmƗŷ^ŏčƒĴiƑÍüČƖƷqƋHCuyÖƈる詳細な特性解析や規制対応試験を行い、バイオ医薬
äŔŕų\RZ`ƭŝqěơRZHODeWCıŝœ
品生産系としての開発を推進していく。また、本発現ų[aűƫM´ÑQn^H\HIŏƬMƐÈQnYY
系では糖鎖が付加されないという特長が見出されつつGlC³`ŝœų_üSmÃ¸čqţŪRZHOD
あり、他の発現系に対する優位性を確立していく。

ÛŽğő
参考文献
 
!
特許第"*&":2  !"特許第/7+2
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新たな知見は麹の、そして日本の発酵食品全般の新たōŶdƠcFYU]ēěcňƏƚÍ³ŮcđZa®÷
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参考文献

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29

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集協会系酵母と近縁な広島 6 号酵母の特性解析及びその活用
山﨑

梨沙 1,2,3・五島
1

徹也 1・大場健司 3・大土井律之 3・赤尾健*1,2

酒総研，2 広島大院・統合生命科学,3 広島総合技術研・食品工業技術セ〒739-0046 広島県東広島市鏡山３丁目７− １独立行政法人酒類総合研究所
Tel: 082-420-0800

Fax: 082-420-0802

E-mail: akao_t@nrib.go.jp

大正期に広島の酒蔵から分離された広島 6 号酵母（H6）は，現在主流の協会系酵母とは遺伝的に非常に近縁ながら，協会系酵母が持たない胞子形成能を持つ稀有な菌株である．協会系酵母の高発酵性の原因とされている機能欠失変異 rim15 5055insA 及び msn4 C1540T の配列を調べたところ，msn4 C1540Tのみを有していた．2 つの変異の片方のみを有する菌株として初めての例である．H6 と協会系酵母との交配株を作成すると，多数の胞子を形成し，四胞子分離が可能となるため，協会系酵母の胞子形成不全を H6 の遺伝子が相補していることが示唆される．この特性と既存の菌株を生かし，遺伝子組換え技術や変異処理に頼らない新規菌株の育種や遺伝解析に活用することが可能である．

1.はじめに

2.材料・方法

広島県では古くから，温暖な気候に適した独自の清酒酵母が分離・選抜され，清酒醸造に用いられている．
最古の分離株として，大正 15 年に県内酒造会社の醪から分離された広島 6 号（H6）酵母がある 1)．昭和 2 年
より頒布をされていたとの記録があるが，現在は使用されていない．以降は日本醸造協会より頒布されている協会 7 号酵母（K7）を代表とする優れた特性を持った協会系酵母が広まり，主流となっている．

清酒小仕込み試験は総米 100g，1 段仕込み，品温は 15℃
一定で 20 日間発酵させた．胞子形成は酢酸カリウム培
地でおこなった．系統樹の作成は Futagami et al.4)の方法及び全ゲノム解析結果を用いて NJ 法により行った．

3.結果と考察(1)醸造特性

一方，協会系酵母における胞子形成は胞子形成能が非常に低く，ごくまれに形成した胞子についても発芽しないことが知られている 2)．協会系酵母の育種に関しては，突然変異誘発後の薬剤耐性による醸造特性の改変が多く行われているが，2 倍体(2n)である清酒酵
母への劣性変異体の取得が難しいことや，変異処理によって染色体の別の箇所に変異が入ることによる醸造特性の変化が起こることが懸念される．また，ランダ
ムスポア法を用いた 1 倍体(n)取得による交配育種も行われているが 3)，前述のとおり胞子形成の低さから，新規の清酒酵母開発には大きな障害となっている．
本研究では，H6 の遺伝的背景の調査や協会系酵母との特性比較を行い，清酒醸造に使えるように改良する
ことや，本菌株の持つ特性を生かす方法について検討を重ねている．

30

清酒小仕込み試験を行ったところ，協会系酵母と比較してやや緩慢な発酵経過を取ったが，清酒醸造に十分に使用できる発酵力を有していた．カプロン酸エチル
や酢酸イソアミルなどのエステル生成は協会系酵母と比較して低く，穏やかな香りであった．興味深いことに，清酒の貯蔵劣化臭である老香の主要成分である
DMTS の既知前駆体(DMTS-P1)の生成が少なく，製成酒の DMTS 生成ポテンシャル(DMTS-pp)も低いという特徴が見られた．
(2)胞子形成能
H6 の胞子形成能を調べたところ，高い頻度での胞子形成が観察された．加えて，マイクロマニュピレーター
で胞子を分離すると四分子の発芽が観察された．このことから，H6 は協会系酵母とは異なり，減数分裂時の組換えが正常で染色体分配が正しく行われていることが示唆された（図 1）．

ついても調べたところ，胞子形成頻度は破壊株で大きく低下したが，胞子発芽率に関しては親株と同程度であった．
(5)4-VG 生成について
フェノール化合物である 4-ビニルグアイアコール(4-VG)は燻製様の香りで，清酒中に含まれるとオフフ
レーバーとして指摘を受ける．もろみ中のフェルラ酸
が酵母によって変換されることで生成するが，協会系
酵母は 4-VG の生成能を失っていることが報告されている 7)．そこで,4-VG 生成に関与する遺伝子 PAD1,FDC1に関してもシーケンスで確認を行った．H6 の FDC1 はK7 と同様に 1 塩基置換によるナンセンス変異が入っており，4-VG を生成しないことが確認された．
(6)H6 と協会酵母の交配株の作成と解析
図1

広島 6 号酵母の胞子形成(3)S.cerevisiae の中での系統関係
5 遺伝子（ZAP1,THI7,PXL1,YRR1,GLG1）による系統樹を作成したところ，協会系酵母（K7 や K11 など）と同じ枝に位置した(図 2)．全ゲノム解析結果を用いた系
統樹では，協会系酵母とごく近縁であったが，少し離れて位置した．

H6 より分離した 1 倍体と K7 の 1 倍体の交配株を作成した．交配の確認は RIM15 の SNP 箇所で確認した．取得した交配株の胞子形成能の調査及び清酒小仕込み試験を行った．交配株は多数の胞子を形成し，四胞子分離も可能であったため，協会系酵母の胞子形成不全を
H6 の遺伝子が相補していることが示唆された．また，醸造特性に関しては，K7 と同程度の発酵性の株が得られた．DMTS-P1 については高い値を示したが，DMTS-pp
は K7 と比較して有意に低いという興味深い特徴を示した．交配株は両親株の良い特徴を引き継いだ株であるといえる．

4.今後の展望H6 より分離した 1 倍体は，研究で使用される実験室酵
母のように各染色体が 1 本ずつであることから 1 倍体を用いた育種や遺伝解析に応用が可能である．現在，
広島 6 号を活用して高エステル生成やリンゴ酸高生成，尿素非生産性など様々な特性をもった清酒酵母 1 倍体
ライブラリを作製中である．
図25 遺伝子で作成した系統樹(4)高発酵原因遺伝子について
協会系酵母は Msn2/4 や Rim15 などストレス応答に関与する因子の機能が欠損することによりエタノールへのストレス耐性が低下し，それに伴って高アルコール発酵能を獲得している 5)，6)．協会系酵母の高発酵性の原因とされる機能欠失変異 rim15 5055insA 及び msn4 C1540T のH6 における配列を調べたところ，msn4 C1540T のみを有していた．H6 の RIM15 破壊株を作成して，清酒小仕込み試験を行ったところ，RIM15 欠損による発酵性や製成酒成分への影響は見られなかった．また，胞子形成に

参考文献
1) 鼓 尚夫，改訂清酒酵母の研究，p.258 (1980)
2) Nakazawa N. et al, J.Ferment.Bioeng., 73，
265-270 (1992)3) 藤原朋子ら, 醸協, 112,641-654 (2017)
4) Futagami T.et al, Yeast, 34, 407-415 2017)5) Watanabe D.et al, Appl.Environ.Microbiol.,
77,934-941 (2011)
6) Watanabe D. et al, Appl.Environ.Microbiol.,
78,4008-4016 (2012)7) Mukai N. et al, J.Biosci.Bioeng.,
118,50-55 (2014)31

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集清涼飲料水中に添加した殺菌乳酸菌体の菌株判別 RNA-MLSA 法の開発
青山冬樹

アサヒ飲料(株)技術研究所〒302-0106

茨城県守谷市緑 1-1-21

Tel: 0297-46-9904

Fax: 0297-46-1533

E-mail: fuyuki.aoyama@asahiinryo.co.jp

機能性表示食品制度を利用した食品で特定の菌株を機能性成分として使用した場合，第 3 者機関で当該の菌株の定性・定量試験が実施可能な必要がある．生きた乳酸菌であれば特異的検出培地とPCR 等により比較的容易に定量・定性が可能であることが多いが，加熱殺菌工程を経る清涼飲料水
では生菌を単離できず，菌株判別を行うことは極めて難しい. また清涼飲料水中で賞味期限中まで保存されることで飲料中の菌体の DNA は分解が進むため，従来一般的に使用されるタイピング手法
を用いて菌株を同定することはできなかった.そこで 2-4 個のハウスキーピング遺伝子の RNA の 100– 200 nt 程度を増幅・解析するプライマーを開発し，結合した配列を用いて系統樹解析を行うことで，清涼飲料水中の L.amylovorus，L.gasseri の死菌体の菌株判別が可能となった．

はじめに
機能性表示食品で特定の菌株を機能性成分として使用した場合，当該の菌株の定性，定量試験が必要となる．しかし清涼飲料水中では食品衛生法上必要な加熱
殺菌により乳酸菌体の核酸は分解し，また賞味期限まで長期に特定の pH 条件（主には pH4.0 未満）にさらされ，核酸はさらに分解する．そのため清涼飲料水中の死菌体には，主に生菌の核酸を対象とした RAPD-PCR，
rep-PCR，RiboPrinter，PFGE などでの手法ではタイピ
ング解析ができなかった．そこで RNA を対象とした
MLSA 法による定性試験法の検討を実施した．

賞味期限を考慮して保存したサンプルを作成した．
プライマー
文献記載のプライマー1) 及び，新たに設計した L.
amylovorus CP1563 株判別，および L. gasseri CP2305
株判別 MLSA 用のプライマーを使用した．
DNA 抽出及び RNA 抽出
培養菌体，乾燥菌末及び各菌添加の製品液より DNA
及び RNA を抽出した．生菌及び乾燥菌末からのDNA/RNA 抽出には NucleoSpin® RNA 及び NucleoSpin®
RNA/DNA Buffer Set を用いて，製品液からの RNA 抽
出には製品液 10ml をサンプルとして 8000rpm で集菌後に NucleoSpin® RNA Plus を用いた．

実験方法
使用菌株・サンプル

Lactobacillus amylovorus CP1563 株
Lactobacillus gasseri CP2305 株
培養菌体，培養後加熱殺菌しフリーズドライにて粉末化した原料用の乾燥菌末を菌体サンプルとした．また，乾燥菌末を添加して製造した「カラダカルピス」
及び「届く強さの乳酸菌」の製品液をそれぞれの菌体を添加した実製品の試験溶液とした．また実製品液の32

PCR 及び RT-PCR 及び遺伝子解析抽出した DNA 溶液，RNA 溶液をテンプレートとして各種プライマーにて MLSA によるタイピングを実施した．
PCR(Ready-To-Go PCR Beads)，RT-PCR（PrimeScript One
Step RT-PCR(ver. 2.0)）は反応液量を 25 µl とし，鋳型溶液量は 2 µl としたが，核酸濃度が低いサンプ
ルは最大 8 µl とした．PCR 反応条件は STEP1: 95℃2 分，
STEP 2: 95℃30 秒，STEP 3: 55℃30 秒，STEP 4:72℃
30 秒，STEP2-4 を計 40cycle とし C1000 Touch Thermal

Cycler を使用した．RT-PCR では試薬プロトコルに従った逆転写のステップを追加した．

結果と考察
DNA 及び RNA 抽出結果
各種サンプルからの DNA および RNA 抽出の結果を表 1に示す．乾燥菌末からは DNA を得ることが出来たが，飲料製品液の菌体からは DNA を得ることが出来なかった．しかし一方で RNA は全サンプルから回収することが出来た．
表 1. 各サンプルの DNA, RNA 抽出結果
菌種・菌株

サンプル

DNA（ng/ml）

L.amylovorus

乾燥菌末
飲料製品液(10ml)
乾燥菌末
飲料製品液(10ml)

384.2
検出できず
46.1
検出できず

CP1563

L.gasseri
CP2305

製品， Lane 2，6:製造直後 3，7:25℃9 ヶ月保存品 4，
8: 25℃12 ヶ月保存品)
系統樹解析
増幅された gyrB，pyrG の他に lepA，gyrA 遺伝子の一部の塩基配列を決定し，L.amylovorus 属の各菌株で4 種の遺伝子配列を連結した配列を作成して近隣結合法にて系統樹解析を行った．12 ヵ月保存した飲料製品の解析配列が L.amylovorus CP1563 株の配列と一致し，その他の菌株と異なる配列であることが分かり，当該菌株が CP1563 株と同定できた．また解析したすべての菌株をタイピングにより判別できた．

RNA（ng/ml）
108.5
73.7
198.5
59.9

RT-PCR 試験結果 1
乾燥菌末・飲料製品液より抽出した RNA を鋳型としRamachandran らの研究 1)のプライマーで RT-PCR を実施した結果，乾燥菌末由来の RNA では目的の増幅産物(約 600 bp)を得ることが出来たが，飲料製品液由来のRNA では目的の増幅産物を得ることが出来なかった．

図 3．L.amylovorus 各菌株の gyrB，pyrG，lepA，gyrA
遺伝子の一部を結合し NJ 法で作成した系統樹

結論
図 1．L. amylovorus CP1563 株原料菌末及び飲料製品液抽出 RNA の RT-PCR 結果， Lane 1 - 6:原料菌末，
7 - 12：飲料製品液（Lane 1，7: fusA，2，8:gyrA， 3，
9:gyrB，4,10:lepA，5，11:pyrG，6，12:recA)
RT-PCR 試験結果 2
飲料の賞味期限を想定し保存条件(9，12M)の異なる
飲料製品液より抽出した RNA を鋳型にして，本研究で設計したプライマーで RT-PCR を行った結果，100 – 125
bp 程度の目的サイズの増幅産物を得ることが出来た．

清涼飲料水中に添加した死菌体は殺菌や保存の影響
により DNA を対象とした解析はできなかった．一方 RNA
も同様に分解が進んでおり，600 nt 程度以上の増幅・解析することはできなかった．しかし 100 - 200 nt
程度のサイズの RNA をターゲットとすることで保存 12か月後のサンプルでも MLSA 解析が可能であり，清涼飲料水中の死菌体の菌株同定が初めて可能となった．
今回の RNA を用いた分析法においては初期の DNA，
RNA 量や加熱時，保存時の分解性，飲料製品中の有機酸の種類や pH など数多くの因子が影響しており，さらなる検討の必要性が示唆される．また本手法は定性のみの手法であり，今後は定性定量を合わせた特定死菌体の定量手法の開発が望まれる．

参考文献
図 2．L. amylovorus CP1563 原料菌末及び飲料製品
液抽出 RNA の RT-PCR 結果，Lane 1 - 4:gyrB，5 - 8：
pyrG，Lane 1，5: 原料菌末，Lane 2 - 4，6 - 8:飲料

1) Ramachandran，P.，Lacher，D. W.，Pfeiler，E. A.，
Elkins，C. A.: Appl. Environ. Microbiol.，79，7220-7228 (2013).

33

第
第
71回日本生物工学会大会
回日本生物工学会大会 トピックス集
トピックス集$VSHUJLOOXVOXFKXHQVLVのフェノール酸脱炭酸酵素遺伝子破壊><1=3588@>8@/4@1:>5>
DBCH
生成への影響 による 9*
DGH," FE

KIJML

1，2
1，4
1，2
眞榮田 麻友美
麻友美，
・本底 麻綸
麻綸2・渡嘉敷
・渡嘉敷 建孝建孝3・後藤・後藤 正利
正利，
・水谷 治
治，
・
眞榮田
・本底
・水谷
・
1，2*
上地 敬子
敬子2・平良・平良 東紀
東紀，
上地


1

鹿児島大学大学院連合農学研究科，
鹿児島大学大学院連合農学研究科，2琉球大学農学部，
琉球大学農学部，3有限会社石川種麹店，有限会社石川種麹店，4佐賀大学農学部
佐賀大学農学部
*〒903-0213
沖縄県中頭郡西原町千原
1 琉球大学農学部
琉球大学農学部〒沖縄県中頭郡西原町千原
Tel: 098-895-8802
Fax: 098-895-8802
7HO)D[
E-mail: tokey@agr.u-ryukyu.ac.jp(PDLOWRNH\#DJUXU\XN\XDFMS
泡盛古酒の特徴香バニリンは，原料米中のフェルラ酸（FA）が醸造中にビニルグアヤコール
4-ビニルグアヤコール
 泡盛古酒の特徴香バニリンは，原料米中のフェルラ酸（)$）が醸造中に（4-VG）へ変換され，貯蔵中に非酵素的酸化によって生成される。醸造中の)$FAの脱炭酸反応は蒸の脱炭酸反応は蒸（9*）へ変換され，貯蔵中に非酵素的酸化によって生成される。醸造中の留時の熱や酸，もしくは酵母や乳酸菌等の代謝によって変換されることが示唆されている。一方，
留時の熱や酸，もしくは酵母や乳酸菌等の代謝によって変換されることが示唆されている。一方，Aspergillus luchuensisのゲノム上には細菌類やのゲノム上には細菌類や&DQGLGD
Candida属由来フェノール酸脱炭酸酵素（3$'）
属由来フェノール酸脱炭酸酵素（PAD）$VSHUJLOOXVOXFKXHQVLVと相同性を有する配列が存在する。
これまでに，A.OXFKXHQVLVluchuensis由来フェノール酸脱炭酸酵素
由来フェノール酸脱炭酸酵素（AlPAD）と相同性を有する配列が存在する。
これまでに，$（$O3$'）
が)$FAからから9*
4-VGへの変換（)$'への変換（FAD活性）を触媒すること，$O3$'活性）を触媒すること，AlPADが製麹中に発現・機能していること
が製麹中に発現・機能していることがを明らかにしている。本研究では，AlPADのの9*4-VG生成への寄与を明確にするために生成への寄与を明確にするためにDOSDG
alpad破壊株を
破壊株をを明らかにしている。本研究では，$O3$'
作製し，静止菌体反応によるFAD
活性および醸造中の4-VG
生成量を野生株と比較した。
その結果，作製し，静止菌体反応による )$' 活性および醸造中の 9* 生成量を野生株と比較した。その結果，静止菌体反応において野生株では経時的に9*4-VG生成量が増大したが，生成量が増大したが，
alpad破壊株ではほとんど検破壊株ではほとんど検
静止菌体反応において野生株では経時的にDOSDG出されなかった。野生株で仕込んだモロミの蒸留液中の9*4-VG量は，製麹
量は，製麹
42時間以降時間以降
66時間まで時間まで出されなかった。野生株で仕込んだモロミの蒸留液中のalpad破壊株の
破壊株の9*4-VG量はほとんど変化しなかった。製麹時間
量はほとんど変化しなかった。製麹時間
42時間以
時間以
著しく上昇したのに対し，DOSDG
著しく上昇したのに対し，降の麹を用いた泡盛醸造において，4-VG生成における生成における$O3$'
AlPADの寄与率は約の寄与率は約－
8－9割と算出された。
割と算出された。
降の麹を用いた泡盛醸造において，9*
これらの結果から，泡盛醸造中の9*4-VG生成は
生成は$O3$'
AlPADが主要因であることが明らかとなった。
が主要因であることが明らかとなった。
これらの結果から，泡盛醸造中の

1.
はじめに はじめに 泡盛古酒の特徴香として知られているバニリンは，泡盛古酒の特徴香として知られているバニリンは，醸造中に原料米中のフェルラ酸（FA）の脱炭酸反応に
醸造中に原料米中のフェルラ酸（)$）の脱炭酸反応により生成されたより生成された ビニルグアヤコール（9*）から，4-ビニルグアヤコール（4-VG）から，貯蔵中に非酵素的酸化によって生成されることが知ら
貯蔵中に非酵素的酸化によって生成されることが知られている（図。醸造中のれている（図）1）。醸造中の)$
FAの脱炭酸反応は蒸留時
の脱炭酸反応は蒸留時
醸造中

貯蔵中

米の細胞壁多糖
Xyl

Xyl

熱・酸

Xyl

フェルラ酸
HO
Ara エステ ラーゼ
O

O 酵母由来㻼㻭㻰㻝・㻲㻰㻯
CH2

乳酸菌由来㻼㻭㻰

O

CHO

黒麹菌由来㻭㼘㻼㻭㻰
OMe
OMe
OH

OMe

OMe

OH

OH

フェルラ酸
㻔㻲㻭㻕

㻠㻙ビニルグアヤコール㻔㻌㻠㻙㼂㻳㻌㻕

OH

バニリン

図泡盛古酒の特徴香であるバニリンの生成過程
1. 泡盛古酒の特徴香であるバニリンの生成過程
図




34



の熱と酸
の熱と酸 1)，もしくは酵母や乳酸菌等の代謝によって，もしくは酵母や乳酸菌等の代謝によって
変換
換さ
され
れる
るこ
こと
とが示
が 示唆
唆さ
され
れて
ている
い る。
Saccharomyces
変。 6DFFKDURP\FHV
FHUHYLVLDH
cerevisiae ではでは SKHQ\ODFU\OLFDFLGGHFDUER[\ODVH
phenylacrylic acid decarboxylase（PAD1）とIHUXOLFDFLGGHFDUER[\ODVH（)'&）のferulic acid decarboxylase（FDC1）の2（3$'）とつの酵素が共同してつの酵素が共同して)$FAからから9*
4-VGを生成することが報を生成することが報2)
告されている 。一方で，。一方で，$VSHUJLOOXVOXFKXHQVLVAspergillus luchuensisのの告されている
ゲノム上には，ゲノム上には，6FHUHYLVLDH
S. cerevisiaeののSDG
pad1およびおよび IGF
fdc1 とと相同性を有する遺伝子と，これとは全く相同性の無い
相同性を有する遺伝子と，これとは全く相同性の無い
細菌
菌類
類お
およ
よび
び &DQGLGD
Candida 属
属のの SKHQROLF
phenolic DFLG
acid
細decarboxylase（PAD）と相同性を有するSDG
pad遺伝子が遺伝子がGHFDUER[\ODVH（3$'）と相同性を有する存在する。存在する。
A. luchuensisPXW
mut.
これまで我々の研究において，$OXFKXHQVLV これまで我々の研究において，kawachii のの SDG
pad1 破壊株が親株と同様の破壊株が親株と同様の )$FA からから 9*4-VG
NDZDFKLLへの変換能（FAD 活性）を有する事を確認している。
活性）を有する事を確認している。
への変換能（)$'また，
A. luchuensisYDU
var. DZDPRUL
awamori,6+
ISH1 株の株の SDG
pad 遺
遺また，$OXFKXHQVLV伝子（DOSDG
alpad）を大腸菌で発現させた）を大腸菌で発現させた $O3$'
AlPAD が十分なが十分な
伝子（
FAD 活性を示す事，ウエスタンブロッティングにより活性を示す事，ウエスタンブロッティングにより
)$'

㻟㻡

㻠㻜

㻟㻜

70
70

0

0

70
㻢㻤 60
㻠㻢 㻡㻢 㻢㻤AlPAD
製麹時間 （㼔） AlPAD

㻟㻡

㻠㻜

㻠㻢

㻡㻢

㻢㻤

1 Unit は 40 ℃で1分間あたり1 μmolの4-VGを生産する酵素量
1 Unit は 40 ℃で1分間あたり1 μmolの4-VGを生産する酵素量
AlPAD

図製麹時間の異なる麹の無細胞抽出液の)$'酵素活性
1 Unit は 40 ℃で1分間あたり1 μmolの4-VGを生産する酵素量
図製麹時間の異なる麹の無細胞抽出液の2. 製麹時間の異なる麹の無細胞抽出液のFAD酵素活性酵素活性図)$'とウエスタンブロッティングで検出した
$O3$'
量の相関
図
製麹時間の異なる麹の無細胞抽出液の)$' 酵素活性とウエスタンブロッティングで検出した$O3$'
AlPAD量の相関
量の相関とウエスタンブロッティングで検出したとウエスタンブロッティングで検出した $O3$' 量の相関
本研究では，
泡盛醸造における
$O3$'
の
9*
生成へ
本研究では，
泡盛醸造における$O3$'
AlPADのの9*4-VG生成へ
生成へ
 本研究では，泡盛醸造における 本研究では，泡盛醸造における$O3$' の 9* 生成への寄与を明確にするために
DOSDG
破壊株を作成し，静の寄与を明確にするために
alpad
破壊株を作成し，静の寄与を明確にするために
DOSDG 破壊株を作成し，静の寄与を明確にするために
DOSDG 破壊株を作成し，静止菌体反応による)$'活性および醸造中の9*
生成量
止菌体反応による
FAD
活性および醸造中の4-VG生成量
生成量
止菌体反応による)$'活性および醸造中の9*
止菌体反応による )$' 活性および醸造中の9* 生成量を野生株と比較した。
を野生株と比較した。
を野生株と比較した。
を野生株と比較した。


方法および結果
2. 方法および結果
方法および結果方法および結果

著しく低く，一定であった（図4B）。
著しく低く，一定であった（図
。
$
%%）

$

%

○野生株の㻲㻭

○野生株の㻲㻭
●㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株の㻲㻭
0.14 $●
㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株の㻲㻭

0.14 △野生株の㻠㻙㼂㻳
○野生株の㻲㻭
△野生株の㻠㻙㼂㻳●㼍㼘㼜㼍㼐
破壊株の㻲㻭
破壊株の㻠㻙㼂㻳
0.12 ▲㼍㼘㼜㼍㼐
破壊株の㻠㻙㼂㻳
0.120.14▲㼍㼘㼜㼍㼐△野生株の㻠㻙㼂㻳
0.12 ▲㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株の㻠㻙㼂㻳
0.1
0.1
0.080.1
0.08
0.08
0.06
0.06
0.06
0.04
0.04
0.04
0.02
0.020.0200 030 40 50 60 70
30 3040 405050 6060 70
70
製麴時間
（㼔）
製麴時間（㼔）（㼔）
製麴時間㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕

60
60

0 製麹時間 （㼔）製麹時間 （㼔）50
㻟㻡30 㻠㻜 40㻠㻢 㻡㻢㻲㻭または㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕㻲㻭または㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕

50
50

40

㻲㻭または㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕

㻟㻜
㻟㻜

0.2
40

AlPAD量（カウント㼤㻝㻜㻞）

30
30

㻞）㻞
AlPAD量（カウント㼤㻝㻜AlPAD量（カウント㼤㻝㻜）0Units/µg of GlcNAc

Units/µg
Units/µgofofGlcNAc
GlcNAc 
定量した麹中の
$O3$'
量と
)$'
酵素活性に相関がある
アレイを検出器とした +3/&
+3/& を用いて定量した。
定量した麹中の量とアレイを検出器とした
定量した麹中の$O3$'
AlPAD
量と)$'
FAD酵素活性に相関がある
酵素活性に相関がある
ミ及び蒸留液中のFA およびを用いて定量した。
4-VG はフォトダイオード

事（図）を示した
その結果，モロミにおいては，野生株では製麹時間
 3)。 事（図
アレイを検出器とした その結果，モロミにおいては，野生株では製麹時間
事（図）を示した
2）を示した 。
。
HPLC を用いて定量した。
に伴い)$ 濃度は低下し，9*濃度は低下し，9*濃度は上昇した。DOSDG
DOSDG
定量した麹中の $O3$' 量と )$' 酵素活性に相関がある に伴いアレイを検出器とした+3/& を用いて定量した。
)$濃度は上昇した。
その結果，モロミにおいては，野生株では製麹時間
0.8
15
破壊株では製麹時間に伴い)$濃度は若干上昇し，
9*
0.8 ）を示した
15○㻲㻭㻰活性  。事（図
その結果，モロミにおいては，野生株では製麹時間
破壊株では製麹時間に伴い)$ 濃度は若干上昇し，
9*○㻲㻭㻰活性に伴い FA 濃度は低下し，4-VG
濃度は上昇した。alpad●㻭㼘㻼㻭㻰量
0.6 ●㻭㼘㻼㻭㻰量
濃度は一定で，野生株と比較して著しく低くかった
（図
に伴い
)$
濃度は低下し，9*濃度は上昇した。
DOSDG
0.6
濃度は一定で，野生株と比較して著しく低くかった（図
10
破壊株では製麹時間に伴いFA 濃度は若干上昇し，
4-VG
10
0.8
15
破壊株では製麹時間に伴い)$濃度は若干上昇し，
9*
$）
。蒸留液の
9*
濃度は，野生株では製麹時間に伴○㻲㻭㻰活性0.4
$）。蒸留液の 9*
濃度は，野生株では製麹時間に伴0.4
濃度は一定で，野生株と比較して著しく低くかった（図●㻭㼘㻼㻭㻰量
0.6
濃度は一定で，野生株と比較して著しく低くかった（図
5
い著しく増加し，
DOSDG 破壊株では野生株と比較して破壊株では野生株と比較して105
い著しく増加し，
DOSDG
0.2
4A）
。蒸留液の
4-VG
濃度は，野生株では製麹時間に伴
0.2$）。蒸留液の 9* 濃度は，野生株では製麹時間に伴
0.4
著しく低く，一定であった（図%）。
著しく低く，一定であった（図%）。
い著しく増加し，
破壊株では野生株と比較して005
い著しく増加し，alpad
DOSDG 破壊株では野生株と比較して
○野生株
%
0.14
0.14 ○野生株●㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株●㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株
0.12
0.14 ○野生株
0.12●㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株
0.12
0.1
0.1
0.1
0.08
0.08
0.08
0.06
0.06
0.06
0.04
0.04
0.04
0.02
0.02
0.02
0
0
0
30 40 50 60 70
30 40
40 50
50 6060 7070
30製麴時間 （㼔）製麴時間
製麴時間（㼔）
（㼔）

0.4
0.4
0.2
0.2

㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕㻠㻙㼂㻳濃度㻔㼙㻹㻕図
野生株または
DOSDG
破壊株を用いた麹で仕込んだモ
図

野生株またはDOSDG破壊株を用いた麹で仕込んだモ破壊株を用いた麹で仕込んだモ図
4.野生株または野生株またはalpad
破壊株を用いた麹で仕込んだモ
図
DOSDG


DOSDG
破壊株の作製ロミ（$）および蒸留液（%）中における
)$
及び
9*


DOSDG
破壊株の作製ロミ（$）および蒸留液（%）中における
及び
9*
量量
量
(1)
alpad破壊株の作製
破壊株の作製ロミ（A）および蒸留液（B）中における)$
FA
及び
4-VG
量
 DOSDG
ロミ（$）および蒸留液（%）中における
)$
及び
9*

DOSDG
破壊株の作製は泡盛実用菌株
,6+
株を親株と


DOSDG
破壊株の作製は泡盛実用菌株
,6+
株を親株と
alpad破壊株の作製は泡盛実用菌株
破壊株の作製は泡盛実用菌株,6+
ISH1株を親株と株を親株と DOSDG
してアグロバクテリウム法で行った。
 これらの結果を基に，
9* 生成における生成における$O3$'の寄してアグロバクテリウム法で行った。
これらの結果を基に，
9*
$O3$'
の寄
してアグロバクテリウム法で行った。
これらの結果を基に，4-VG生成における
AlPADの寄してアグロバクテリウム法で行った。
 これらの結果を基に，
9*生成における
$O3$'
の寄
＊
＊

与率
を算出すると，製麹時間
－
時間のモロミで
＊

与率
－
時間のモロミで＊ を算出すると，製麹時間与率を算出すると，製麹時間
42－66
時間のモロミで
与率を算出すると，製麹時間
－ 時間のモロミで 静止菌体反応による )$' 活性測定
は約－，蒸留液では約 －であった。
静止菌体反応による
)$'
活性測定
は約
－，蒸留液では約－であった。
(2)
静止菌体反応による)$'
FAD活性測定
活性測定
は約81－92%，蒸留液では約88－94%であった。
 静止菌体反応によるは約－，蒸留液では約－であった。
 P0)$ を含む最少培地で培養した菌体を十分に＊寄与率  ＝ 野生株 9* 量－破壊株 ×野生株
P0)$を含む最少培地で培養した菌体を十分に
＊寄与率
＝ 野生株
野生株 9*9*量－破壊株 ×野生株
×野生株
0.5 mM洗浄し，静止菌体反応に用いた。P0)$
FA を含む最少培地で培養した菌体を十分にを含む最少培地で培養した菌体を十分に＊寄与率(%)＝(野生株
4VG量－破壊株 P0)$
 ＝水溶液に菌 ＊寄与率
量－破壊株)×100/野生株
洗浄し，静止菌体反応に用いた。P0)$
水溶液に菌洗浄し，静止菌体反応に用いた。4mM FA 水溶液に菌水溶液に菌洗浄し，静止菌体反応に用いた。P0)$
体を浸し，反応時間毎の 9* 量を定量した。
その結果，今後の展望

体を浸し，反応時間毎の
9*量を定量した。
その結果，体を浸し，反応時間毎の4-VG量を定量した。
その結果，野生株では反応時間に伴い
9* が著しく増加したが，体を浸し，反応時間毎の 9* 量を定量した。
その結果，
今後の展望
3. 今後の展望
野生株では反応時間に伴い
9*が著しく増加したが，DOSDG 破壊株ではほとんど検出されなかった図  。 今後の展望
本研究において，泡盛醸造中の)$ から 9* への変
野生株では反応時間に伴い
4-VGが著しく増加したが，が著しく増加したが，野生株では反応時間に伴い
9*
DOSDG
破壊株ではほとんど検出されなかった
図 3)。
。
本研究において，泡盛醸造中の
)$
から
9*
への変
換は $O3$' が主要因であることが明らかとなった。今1
alpad破壊株ではほとんど検出されなかった破壊株ではほとんど検出されなかった(図本研究において，泡盛醸造中のFAからから9*
4-VGへの変
への変
DOSDG
図
。
○野生株
 本研究において，泡盛醸造中の
)$
●
㼍㼘㼜㼍㼐
破壊株
後は，製麹時間に伴い$O3$'
量が増大するメカニズム
換は$O3$'が主要因であることが明らかとなった。今
1
換は
AlPAD
が主要因であることが明らかとなった。今
0.8
換は $O3$' が主要因であることが明らかとなった。今
○野生株
1
○野生株
について解析する予定である。
●㼍㼘㼜㼍㼐 破壊株
後は，製麹時間に伴い$O3$'
量が増大するメカニズム
後は，製麹時間に伴い
AlPAD量が増大するメカニズム
量が増大するメカニズム
破壊株
後は，製麹時間に伴い$O3$'
0.8 ●㼍㼘㼜㼍㼐
0.6

0.8
について解析する予定である。
について解析する予定である。
について解析する予定である。
0.6
0.4
0.6
 謝辞
0.2
0 本研究の一部は日本学術振興会特別研究員奨励費
謝辞
謝辞
謝辞
（-）の助成を受けたものである。
0

10

20

30

40

本研究の一部は日本学術振興会特別研究員奨励費
本研究の一部は日本学術振興会特別研究員奨励費
 本研究の一部は日本学術振興会特別研究員奨励費

反応時間 （㼔）（-）の助成を受けたものである。
0（19J10823）の助成を受けたものである。
（-）の助成を受けたものである。
0
0
10
20
30 DOSDG
40 破壊株の比較  参考文献
図 静止菌体反応における野生株と
0
10
20
30
40

反応時間 （㼔） 
 .RVHNL7,WR<)XUXVH6,WR. ,ZDQR
反応時間 （㼔）

参考文献
参考文献
 野生株および DOSDG 破壊株を用いた醸造試験
.-)HUPHQW%LRHQJ    図

静止菌体反応における野生株とDOSDG破壊株の比較
参考文献
図
3.静止菌体反応における野生株と静止菌体反応における野生株とDOSDG
alpad破壊株の比較
破壊株の比較図インディカ精白米を用いて野生株またはDOSDG
破壊
 0XNDL10DVDNL.)XMLL7.DZDPXNDL0
.RVHNL
7
,WR
<
)XUXVH
6,WR
,WR
.
,ZDQR
&;>175 *$?;-<
!@=@>1) 6
$?;
&
.
$A.:;
& %
 
7
,WR
)XUXVH,ZDQR
株で製麹を行い，一定時間毎にサンプリングを行った。  .RVHNL,HIXML+-%LRVFL%LRHQJ
  

野生株および
DOSDG
破壊株を用いた醸造試験
.-)HUPHQW%LRHQJ

野生株およびalpad
破壊株を用いた醸造試験(3)!1=91:?
5;1:3
 野生株および
DOSDG
破壊株を用いた醸造試験
.-)HUPHQW%LRHQJ

次に，製麹時間の異なる麹で仕込んだモロミを  週間 
インディカ精白米を用いて野生株またはDOSDG
破壊
0XNDL10DVDNL.)XMLL7.DZDPXNDL0
インディカ精白米を用いて野生株またはalpad破壊破壊 インディカ精白米を用いて野生株またはDOSDG
発酵させた。発酵後，簡易蒸留器を用いて蒸留液中の'@7.5('.>.75&!@655*&.A.9@7.5'$12@65
0XNDL10DVDNL.)XMLL7.DZDPXNDL0
 0DHGD07RNDVKLNL07RNDVKLNL08HFKL
株で製麹を行い，一定時間毎にサンプリングを行った。
,HIXML+-%LRVFL%LRHQJ
株で製麹を行い，一定時間毎にサンプリングを行った。
#%,WR
5;>/5
5;1:3

株で製麹を行い，一定時間毎にサンプリングを行った。
アルコール濃度が ZZ になるまで蒸留した。モロ ,HIXML+-%LRVFL%LRHQJ 
.
6
7DLUD
7
-%LRVFL%LRHQJ  次に，製麹時間の異なる麹で仕込んだモロミを

週間


ミ及び蒸留液中の
)$
および
9*
はフォトダイオード
次に，製麹時間の異なる麹で仕込んだモロミを
2週間
'.10.
'
*;7.>4575'*;7.>4575
'+1/45
& $?;
次に，製麹時間の異なる麹で仕込んだモロミを  週間
 

発酵させた。発酵後，簡易蒸留器を用いて蒸留液中の

0DHGD07RNDVKLNL07RNDVKLNL08HFKL
発酵させた。発酵後，簡易蒸留器を用いて蒸留液中の
 *.5=. * % 5;>/5 5;1:3  
発酵させた。発酵後，簡易蒸留器を用いて蒸留液中の )
0DHGD07RNDVKLNL07RNDVKLNL08HFKL
アルコール濃度がZZ になるまで蒸留した。
になるまで蒸留した。モロモロアルコール濃度が
10%(w/w)になるまで蒸留した。
モロ
アルコール濃度がZZ
ミ及び蒸留液中の
)$
および
9*
はフォトダイオード
ミ及び蒸留液中の )$ および 9* はフォトダイオード.,WR6
6 7DLUD
7DLUD7
7-
-%LRVFL%LRVFL%LRHQJ
%LRHQJ 

.,WR  


35š  ÕĔĠŋņõé¬ä¬ }swƤķĴăswıűƭŵśáŐĨ[HMhıűp~màŌpx\ƀĕÀŷĄ ðóęö ¯ŷÂ¢  äƛƊ úÔ²  ŶĲƅ ƏŷĖü  ŗĆäé¶ŠmoõéŕŜy{Ư ŗĆäéäéƢŘéĈŻm vŕŜŘƯƜçŘéĈŻŕŜƞőīĩƭôƜçĂōŕŜćƯ Ùşą¿äéÃéõéŘƯ ŗĆäéäéƢõéŕŜŘD

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KOR1

5 μm

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Lipid

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Lipid content (%)



35













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XÎĪ@ÝÛ\ŞŤĽJĥĹRhÝƬ  Ĕœ©ơW
Eg@Ěğ\ÐĜŊàÀJƪŴWETSA

50
JSC4
45

KOR1
40

35

30

25

20

15

10

5

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Cultivation time (days)× !#% [HMhıűÐĜŊ\ċřƮųp~ mWEh~m\ÐĜŊd !#%WƪŴ[àÀPVHg@ & \ěä~mÐĜŊJ 71 1) W E T S \ [ î P @ !#% ]71 1) WETS× AıűÐĜŊXÎĪ@!#% \~mÐĜŊ\àÀ]ŞŤĽJĥĹRhÝƬ  Ĕœ©ơWEg@Ěğ\ÐĜŊàÀJƪŴWETSA

3.5
JSC4

3
KOR1

2.5

2


1.5

1

0.5


0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Cultivation time (days)×  !#% [HMh~mÐĜŊ\ċř!#% \łįÃņÐĜŊ]ĕĚÑğ[ĂQVĿPL
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30
25
20

JSC4
KOR1

15
10
5
0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Cultivation time (days)×  !#% [HMhłįÃņÐĜŊ\ċř
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čt&'$\ĎčkÉMVźjiSAÇŬĐň9&  /=+6 &-3 %/:  
!+=9* /=+6 39=/-2896 390>/6< 



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

37

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集有用油脂生産藻の特性分析と環境ストレス耐性評価
Useful lipid production and stress resistance of a novel green alga髙木

明香莉 1・佐々木1

美月 1・佐々木大作 2・朝山宗彦 1＊

茨城大学大学院, 農学研究科〒300-0393
2茨城県稲敷郡阿見町中央 3-21-1

BioX 化学工業株式会社〒730-0847

広島県広島市中区舟入南 6-1-6

E-mail: munehiko.asayama.777@vc.ibaraki.ac.jp

パラクロレラ BX1.5 株は, 屋外大規模培養が可能な新奇天然緑藻であり, 細胞内に C16 飽和脂肪酸と C18 不飽和脂肪酸を主成分とする中性脂肪(トリアシルグリセロール, TAG)を高蓄積する. 加えて, 様々なストレス耐性を持つばかりでなく, 培養条件に依存して細胞内に脂質ならびに細胞外に新規多糖も高生産できる. 現在, 本株の特性を活かしたバイオリファイナリー(藻によるモノづくり)に取り組んでおり, 一部商品化に成功している.

20.1/
微細藻類は, 高い増殖力および光合成能を有することが知られている. 加えて, 安価な培地で培養することが可能で, 場所や季節などにも制限されないことから“モノづくり”に適している. 微細藻類の中でも特に緑藻(green algae)は, 油脂や多糖, 色素などの有用物質を効率良く生産できることから, 持続可能なバイ
オマスを提供する資源(resource)として, 医薬・食品・燃料等の産業分野で注目されている. しかし, 実用化のためには藻の大規模培養技術の確立, 有用物質の効率的な誘導・蓄積培養条件の最適化, 安価な抽出・加工技術の開発などが必要である. 本研究で用いる緑藻 Parachlorella sp. BX1.5 は, 茨城大学と BioX
化学工業社が共同研究で単離・純化に成功したパラク
ロレラ属の新種(あるいは亜種)であり, 細胞内に有用な中性脂肪(TAG), 細胞外に多糖を共生産することが明らかとなった有望株である(図 1). 今回は, BX1.5
細胞内の TAG 蓄積に及ぼす培養条件の検討ならびに脂質組成の分析を行った. さらに, 屋外大規模培養に有効な細胞の環境ストレス耐性試験をベンチスケールで実施し, その結果を評価した. 現在, BX1.5 株を利用したバイオリファイナリーを展開中で, 一部商品化に成功した例についても紹介する.

38

図 1. 油と多糖を共生産する新種藻 BX1.5

2．解析データおよび方法
BX1.5 株を 2%炭酸ガス充満式インキュベーター内
で BG111), 窒素欠乏 BG11− N, および リン欠乏 BG11
− P 培地を用いた栄養条件下で培養し, 光学顕微鏡により細胞形態を観察した. 次に, 細胞から全脂質を抽出し, 蓄積成分を TLC(Thin-Layer Chromatography)で確認した後, メチルエステル化させた脂質化合物(FAMEs)を FID (Flame Ionization Detector)分析して,脂質の組成と生産量を測定した. また, 各培養条件下での培地 pH 変化や細胞内クロロフィル a 量を測定した.
さらに, 十分に生育させた本株細胞を強酸・強アルカ
リ, 高温度, 乾燥, 高浸透圧など 8 条件のストレス下に一定時間晒した後, BG11 寒天培地にスポットし, 生育を観察した.

3．結果と考察(1) 油蓄積に有効な培養条件
本株を BG11− N/− P 培地で培養した場合, C16 飽和
脂肪酸(C16：0, 燃料向き)ならびに C18 不飽和脂肪酸（C18:2, C18:3, 食用油向き）を主成分とする TAG が効率良く蓄積されていた. しかし, この培養条件ではバイオマスそのものが低減することから, 2%炭酸ガス
供給下 BG11 培地で培養することの方が, 相対的に TAG生産に有効であることが明らかとなった. 乾燥重量あたりに占める FAMEs 組成を緑藻(BX1.5, パラクロレラPC2), クロレラ CH2), クラミドモナス CY3), ナンノクロ
ロプシス NC4))間で比較しても, BX1.5 脂質はω3/ω6
油の含量が他種に比べ, 豊富なことが示された.

図 3. 環境ストレス耐性と屋外培養
BX1.5 株は, 屋外大量培養が可能であり, かつ細胞内に食用油, 細胞外に多糖を同時に高生産できる, 緑藻として報告された最初の例である. このように, BX1.5
株は細胞の内外でそれぞれ脂質と多糖を拮抗することなく生産することができるため,“細胞まるごと”利用した新しい藻バイオリファイナリーへの使い道が期待される. 現在, BX1.5 株を利用した様々な商品化を試みており,「熟成黒にんにく」や「藻こんにゃく」などは一部販売までに至っている(図 4). 今後は, 細胞外多糖の成分・機能分析をはじめ, 脂質と多糖の生産メカニズムの解明により, パラクロレラ BX1.5 株による“モノづくり”の一層の発展につなげたい.

図 2. 緑藻脂質の組成比較(2) 環境ストレスへの耐性
BX1.5 細胞を一定の環境ストレス条件下に晒したところ, 酸またはアルカリ(pH 2, 11), 高温度(50～70℃),
紫外線(UV)照射, 乾燥(熱, 凍結乾燥)などに対して耐性を示した(図 3, 挿入部分). この耐性は, BG11− N/− P 培地由来細胞間で一部異なるパターンを示したことから, 培地 pH に加え, 細胞内の脂質やクロロフィル
a 蓄積量などの差も, ストレス耐性へ影響している可能性が示された. 現在, この優れた耐性能を活かした10 トン規模での屋外培養を行っている(図 3).

図 4. BX1.5 藻バイオリファイナリーの可能性

4．今後の展望

参考文献

現在, 我が国における微細藻類の活用としては, ス
ピルリナの青色素蛋白質（フィコシアニン)の食品添加剤, クロレラやユーグレナのサプリメントなどが代表例として挙げられる. 遺伝子組換藻を利用したバイオ
燃料増産も試みられており魅力的ではあるが, まだまだコスト的に課題が多い. 今回紹介したパラクロレラ

!''"* &)%-,$&#    
!-+%&*#!&()&+( %&#          *&*#(&%*#%*!        (+ +'%!*#!&* %&#'   39

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集セルロース系エタノール生産のための発酵阻害物質耐性
馴養変異体における責任遺伝子変異の同定
藤森 一浩 1,*、小林 洋介 1,2、佐原 健彦 1、扇谷 悟 1、鎌形 洋一 1
1

産業技術総合研究所・生物プロセス研究部門，2 Biomaterial in Tokyo〒305-0688 つくば市東 1-1-1
Tel: 029-849-1228
Fax: 029-861-6226
E-mail: k-fujimori@aist.go.jp

セルロース系エタノール生産において、原料に含まれるあるいは糖化反応によって生成される発酵阻害物質によってエタノール発酵が著しく阻害されることが実用化の一つの障壁となっている。
我々は、これまでの研究において、発酵阻害物質を含まないグルコース・キシロース培地において、エタノール変換効率 95%という非常に高い性能を示す出芽酵母株 IR-2 B16 株を構築した。ところが、サトウキビバガスを原料とする同時糖化併行複発酵（SSCF）プロセスでは、キシロースはおろかグルコースですらほとんど資化できず、本来の性能を発揮できなかった。そこで、この B16 株を親株として上記の SSCF 条件下で発酵試験を行い、生き残った菌を単離するという馴化培養を繰り返す
ことにより、発酵阻害物質耐性を獲得した複数の独立した変異体株の分離に成功した。本研究では、
次世代シーケンサーを用いた比較ゲノム解析によって、阻害物質耐性をもたらす責任遺伝子変異候
補を探索した。その結果、すべての変異体に共通して変異が存在する遺伝子として RGT1 を見出した。

1. はじめに

2. 解析データおよび方法

農林水産業・都市廃棄物を原料とするセルロース系
エタノール生産の技術的な課題として、(1)植物細胞壁に含まれるセルロースやヘミセルロースをグルコース
やキシロース等の単糖へ分離するための技術、(2)有機酸を含む複数の炭素源が同時に存在する環境下で、効率よく短時間にエタノールに変換する生産菌の開発という大きく 2 点を挙げることができる。(1)については、
キシロース代謝向上をもたらす変異の同定 1)、現時点
で最も優れた性能を持つキシロースイソメラーゼの同定とさらなる活性向上をもたらす有用変異の同定 2)、
ペントースリン酸経路の最適化 3),4)を行い、これらを集約することで実用生産株を構築してきた。しかし、(2)については、合理的な遺伝子・代謝改変では十分な阻害物質耐性を獲得することはできていなかった。
そこで、本研究では、発酵阻害物質耐性を持たない
IR-2 B16 を親株として SSCF プロセスによる発酵試験（馴養）を行い、馴養後のスラリーから発酵阻害物質
耐性を獲得した変異体をクローン化することを繰り返した。これらの全ゲノム解析を行うことにより、阻害物質耐性をもたらす責任遺伝子変異の同定を試みた。

阻害物質耐性変異体株 IFS シリーズのうち、表 1 に示す変異体株を解析対象として選定した。IFS1-4 及び数字で示されたクローンはサルベージされた馴養変異体を示しており、B16 は親株を示している。太枠で囲まれた 10 株よりゲノム DNA を調製し、IonProton(Thermo Fisher Scientific)により全ゲノム解析を行った。得られたシーケンスデータを IR-2idA30(MATa)
ゲノム塩基配列 5)をリファレンスとしてマッピングを行い、通常条件にて variation call を行うことによって、すべての変異を抽出した。親株及びそれぞれの変異体の系統関係（図 1）から、各株の持つ変異が論理的に真となる変異を 1、偽となる変異を 0 とする Binarycode（表 1）を作成し、遺伝的背景を用いた論理的ア
ルゴリズム法 1)を用いてすべての株において論理的に真となる変異があるかどうか検索を行った。

40

3. 結果と考察

図 1 に示した各スレッドは、それぞれ独立した馴養
実験系統を示している。最大 4 回の馴養（阻害物質を図 1. 馴養により得られた変異体の系統関係

表 1. 責任遺伝子変異であることが論理的に真となる組み合わせを示した Binary code

含む実バイオマスを用いた発酵試験）を行った。阻害物質耐性を示した株から派生した子孫株は、繰り返し発酵試験を行ってもすべて阻害物質耐性を示したことから、阻害物質耐性をもたらす変異は、最初の馴養の間に導入されたと考えられた。
解析の結果、すべての変異体に共通して変異を有する遺伝子として RGT1 が見出された（表 2）。各変異体
系統は独立した馴養実験により導入されているため、
RGT1 に導入された変異はそれぞれ実験系統ごとに異なっていたが、クローン 10 のみ一塩基欠損によるフレームシフト、それ以外はすべてストップコドンへのアミノ酸置換（non-sense 変異）になっていたことから、
RGT1 の機能欠損が阻害物質耐性獲得の原因であると推察された。 RGT1 は外界のグルコース濃度に応じてHXT と呼ばれる一連の糖輸送体の発現制御を行う転写因子としてよく知られたものである。B16 株は、発酵阻害物質の存在下ではカタボライト制御に何らかの異常が発生し、糖の利用が制限されていたと考えられる。
RGT1 の機能欠損は、カタボライト抑制の解除をもたらし、その結果、グルコースとキシロースの同時利用を可能にし、発酵阻害物質存在下においても効率良くエ
タノール発酵が進んだと考えられる。
4. 今後の展望

我々は、これまで同様の方法を用いてキシロース代
謝向上変異体（HEX/SXM 変異）5)やキシリトール代謝向表 2. 変異体に共通して変異のある遺伝子

上変異体 6)の責任遺伝子変異を同定してきた。本研究で 用 い た 変 異 体 IFS は 、 パ ー ト ナ ー 企 業 で あ る
Biomaterial in Tokyo において、廃菌床を原料としたセルロース系エタノール生産においても優れた発酵性能を示すことが示されている。しかし、さらなる株の改良には、RGT1 欠損変異を B16 に導入した新たな親株を作りなおし、RGT1 欠損が阻害物質耐性をもたらすことを確認する必要があるだろう。また、何故、RGT1 の変異が阻害物質耐性を示したのか？という分子メカニ
ズムについては未解明のままであり、今後、解明に向けてさらなる詳細な研究が必要である。発酵阻害物質
濃度は、バイオマス種、前処理法、酵素などの条件によって異なるが、IR-2 C シリーズは、想定される発酵条件下で、各種バイオマスから発酵阻害物質に阻害されることなくエタノール生産が可能である。我々の開発してきた株や技術が、セルロース系エタノールの商業生産に適用されることで、持続可能な社会の実現に貢献することができれば幸いである。
謝辞
本研究は、バイオマスエネルギー技術研究開発/バイオ燃料製造の有用要素技術開発事業/有用微生物を用いた発酵生産技術の研究開発/C5C6 糖同時発酵微生物の開発 (NEDO)において行った。
参考文献
 :    :"  
 (,.(! (6$/ ,2)7(/,26(&+     2%$9$5+,# (6$/ 83    2%$9$5+, #  (6 $/    1' ,&42%,2/  ,26(&+     7-,024,   (6 $/  ,&42%,2/  (5  11271&( (  
!$1,! (6$/  ,25&, ,2(1*   41

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集好気的硫黄代謝細菌を活用した重金属除去
真史 1＊・小林黒田1

慎 1・高山一也 2・池道彦 1

大阪大学大学院工学研究科，2 日東電工株式会社〒565-0871

大阪府吹田市山田丘 2-1
Tel: 06-6879-7673

大阪大学大学院工学研究科 M3-507
Fax: 06-6879-7675

E-mail: kuroda@see.eng.osaka-u.ac.jp

廃水等に含まれる有害性の高い重金属類を生物学的に硫化物に変換し，沈殿・除去するプロセスの創成を目指し，好気条件下で重金属硫化物を形成する細菌の集積と単離を試みた．兵庫県生野鉱山付近から採取した土壌を，銅，カドミウム，亜鉛と，硫黄源としてチオ硫酸を含む培地に加え，好気条件下で繰り返し集積培養をすることで，これら金属を安定して除去する細菌群集の集積に成功した．ここから単離した細菌 Lysinibacillus sp. HM1 は，48 時間で銅，カドミウム，亜鉛をそれぞれ 100%，99.9%，86.4%除去し，有望な好気的硫黄代謝・重金属除去細菌であると考えられた．

１．はじめに重金属類は，様々な産業に利用される一方で，そのほとんどが高い毒性を有するため，世界各地で重金属による深刻な水環境汚染が発生している．硫化物法は
硫化ナトリウム等の硫化剤を添加することで排水から重金属を除去する技術であり，除去効率が高い反面，運転中に毒性・腐食性の高い硫化水素が発生するため，
実処理への適用例は少ない．本研究では，細菌の好気的硫黄代謝を用いることで，硫化水素を発生させることなく重金属を硫化物として沈殿・除去できる新規プ
ロセスの創成を目指し，重金属除去活性の高い新規硫
黄代謝細菌の集積と単離を試みた．

２．方法
2-1. 重金属除去細菌群集の集積培養及び重金属除去
能の評価
6 mM のチオ硫酸ナトリウム，各 1 mM の塩化銅(II)，
塩化亜鉛(II)，塩化カドミウム(II)，およびキレート剤として 6 mM のニトリロ三酢酸を含む TSB 培地（以下，重金属培地）20 mL に兵庫県生野鉱山付近から採取した土壌 1 g-wet を添加し，50 mL 容バイアル中で好気的に培養した（28℃，120rpm）．得られた培養液 200 μ
L を 5 日おきに同組成の新たな培地に植え継ぐ操作を繰り返し，高濃度の硫黄と重金属を含む環境に適応した細菌を集積した．培養系の pH を安定させるため，緩42

衝剤として 11～17 バッチ目には 100 mM のリン酸
（pH7.0）を，18 バッチ目以降は 100 mM の 2-モルホリ
ノエタンスルホン酸（MES；pH 6.0）を添加した．各バッチ前後に採取した試料に含まれる Cu，Zn，Cd 濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析により分析した．
2-2. 集積系を構成する細菌群集の解析
16S rRNA 遺伝子の V4 領域を標的としたアンプリコ
ンシーケンス解析により，28 バッチ目に得られた集積系に含まれる細菌群集を解析した．
2-3. 細菌の単離と重金属除去能力の評価
1.5%(w/v)の寒天により固化した重金属培地を用いて，集積系に含まれる主要な細菌を単離した．単離した各細菌について，100 mM の MES を含む重金属培地を用いて好気条件下で 48 時間の回転振盪培養（28℃，120rpm)を行い，重金属除去能力を評価した．また，重金属除去試験後の細胞を，透過型電子顕微鏡-エネルギー
分散型 X 線回折（TEM-EDX）により観察し，形成された沈殿物の形態観察と元素組成分析を行った．

３．結果および考察
3-1. 重金属除去細菌群集の集積
集積過程の重金属除去率の推移を図１に示す．集積
培養開始直後から 4 バッチ目まで，集積系は高い重金
属除去率を示したが，5 バッチ目以降は除去率が悪化した．これは，培養中の pH 変動が硫化物形成反応に影




pH7.0
pH7.0

培地pH
培地pH
緩衝剤
緩衝剤

なし
なし

100
100

pH6.0
pH6.0

リン酸
リン酸
MES
(100
mM)
MES
(100
mM)
(100
mM)
(100
mM)

除去率 (%)

8080

)

%
60
(ｦ 60
4040

2020

CuCu
ZnZn
CdCd

00
1 1 3 3 5 5 7 7 9 9111113131515171720202222242426 2628 28

バッチ数
バッチ数

図
図．集積培養における重金属除去率の推移
1．集積培養における重金属除去率の推移

いては，硫黄と同族の元素で代謝経路が類似すると推おり 1)，また，Stenotrophomonas 属細菌においては Cd
測されるセレンやテルルを還元するものが報告されての存在化で硫化カドミウムを形成するものや 2)，様々おり  ，また，6WHQRWURSKRPRQDV 属細菌においては &G
な重金属に対して吸着機能を有するものが報告されての存在化で硫化カドミウムを形成するものや，様々いる 3)．これらを踏まえると，集積系に含まれていたな重金属に対して吸着機能を有するものが報告されてこれらの細菌は，硫黄源であるチオ硫酸の還元によるいる ．これらを踏まえると，集積系に含まれていた
重金属硫化物の形成，及び細菌への吸着機能等により，これらの細菌は，硫黄源であるチオ硫酸の還元による重金属除去に寄与しているものと推測された．
重金属硫化物の形成，及び細菌への吸着機能等により，重金属除去に寄与しているものと推測された．
 3-3. 集積系から単離した細菌による重金属除去
集積系より単離された Lysinibacillus sp. HM1，
集積系から単離した細菌による重金属除去
Stenotrophomonas
sp./\VLQLEDFLOOXV
HM2，Ochrobactrum
sp. HM3，
集積系より単離された
VS+0，
Paenibacillus
sp.
HM4
の
4
株について重金属除去能
6WHQRWURSKRPRQDVVS+0，2FKUREDFWUXP VS+0，
力を評価したところ，94%以上の Cu 除3DHQLEDFLOOXVVS+0 のいずれの菌株も
 株について重金属除去能去率を示したが，HM2，HM3，HM4
3 株は Cd
力を評価したところ，いずれの菌株も の以上の&X除去率が除去率を示したが，+0，+0，+0
の  株は &G 除去率が15.7～48.9%，Zn 除去率が 13.5～41.3%に留まった．
一～，=Q 除去率が一 86.4%
方，HM1 株は
Cu，Cd，Zn～に留まった．
をそれぞれ 100%，99.9%，
方，除去し，最も高い重金属除去能力を示した．重金属除+0 株は &X，&G，=Q をそれぞれ ，，
除去し，最も高い重金属除去能力を示した．重金属除去試験後の HM1 株の細胞を TEM-EDX により分析したと去試験後の+0 株の細胞を 7(0('; により分析したと からころ，細胞の表面または内部に，S・Cu・Zn・Cd
ころ，細胞の表面または内部に，6・&X・=Q・&G
から成る直径数 nm の多数の粒子が形成されていることが成る直径数
QPの多数の粒子が形成されていることが明らかになり（図 2），これにより細胞とともに重金属
明らかになり（図 ），これにより細胞とともに重金属が沈殿除去されているものと考えられた．
が沈殿除去されているものと考えられた．


４．結論
４．結論
本研究では，環境土壌から，好気条件下でチオ硫酸

本研究では，環境土壌から，好気条件下でチオ硫酸を利用することで重金属を除去する集積系の構築に成を利用することで重金属を除去する集積系の構築に成500 nm
功した．
また，集積系から単離した
Lysinibacillus
功した．
また，集積系から単離した/\VLQLEDFLOOXVVS sp.
500 nmHM1は，他の単離した菌株と比較して最も高い重金属+0
は，他の単離した菌株と比較して最も高い重金属
図 2．Lysinibacillus sp. HM1 細胞表面／内部に形成除去能を示し，集積系による重金属除去において主要除去能を示し，集積系による重金属除去において主要された重金属硫化物ナノ粒子
図．/\VLQLEDFLOOXVVS+0 細胞表面／内部に形成な役割を果たしているものと考えられた．本研究によな役割を果たしているものと考えられた．本研究によされた重金属硫化物ナノ粒子
り得られた好気的硫黄代謝細菌による処理は，重金属響したためと考えられたため，緩衝剤を用いて pH の変 り得られた好気的硫黄代謝細菌による処理は，重金属響したためと考えられたため，緩衝剤を用いて S+ の変除去技術の新たなオプションとなり得ると期待される．

動を緩和した．11～17 バッチ目にリン酸（pH7.0）を 除去技術の新たなオプションとなり得ると期待される．
動を緩和した．～ バッチ目にリン酸（S+）を添加したところ除去率をやや不安定になったが，18 バ 
添加したところ除去率をやや不安定になったが， バ
参考文献
ッチ目以降 MES（pH6.0）を添加して集積を継続したと 参考文献
ッチ目以降 0(6（S+）を添加して集積を継続したと
:DQJHWDO(QYLURQ6FL3ROOXW5HV,QW 
 #.("3!")#/!")#.("*3#.&")/3
ころ，25 バッチ目以降は比較的高い重金属除去率が維ころ， バッチ目以降は比較的高い重金属除去率が維
.4*0/.%*/,,32'1.2    
持され，Cu および Cd 除去率は最大で 100%，Zn 除去率
持され，&X および &G 除去率は最大で ，=Q 除去率 3DJHVHWDO
3/R621(H    
は最大で71.4%を示した．
は最大で を示した．
 :LHU]EDHWDO
3RO-&KHP7HFKQRO
#('1/1'/.0/&3*.'#00*'0

'3,*.#.&%)/3#+ / ' 
3-2. 集積系を構成する細菌集積系を構成する細菌 
安定した重金属除去が達成された 28
バッチ目の集安定した重金属除去が達成された
バッチ目の集謝辞*'05$#/,)'-'%)./,     
積系に含まれる細菌群集を解析したところ，集積系は積系に含まれる細菌群集を解析したところ，集積系は7(0('; 分析は，大阪大学超高圧電子顕微鏡センタLysinibacillus
属
（
48.3%
）
，
Stenotrophomonas
属/\VLQLEDFLOOXV 属 （  ）， 6WHQRWURSKRPRQDV 属ーにおける「文部科学省ナノテクノロジープラットフ
謝辞（29.3%），2FKUREDFWUXP
Ochrobactrum属（）属（13.9%），Paenibacillus ォーム事業微細構造解析プラットフォーム（），，3DHQLEDFLOOXV（大阪大学
TEM-EDX 分析は，大阪大学超高圧電子顕微鏡センタ属（）およびその他（）の278OTUから構成され属（5.4%）およびその他（3.1%）のから構成され ナノテクノロジー設備供用拠点）」の支援を受けて実施
ーにおける「文部科学省ナノテクノロジープラットフ
る非常に単純化したものであり，高度に集積されている非常に単純化したものであり，高度に集積されてい されました．
ォーム事業 微細構造解析プラットフォーム」の支援をることが明らかになった．
/\VLQLEDFLOOXV
属細菌におることが明らかになった．
Lysinibacillus
属細菌においては，硫黄と同族の元素で代謝経路が類似すると推測されるセレンやテルルを還元するものが報告されて受けて実施されました．

43

第  回日本生物工学会大会 トピックス集

ＣＦＤ解析と生物反応モデル式を組み合わせた商業スケールバイオ
リアクターにおける物質生産シミュレーション技術の開発
沖野 祥平＊ ・渡邉 実・種田 大介
日揮株式会社 プロセステクノロジー本部〒茨城県東茨城郡大洗町成田町 日揮技術研究所
7HO)D[
(PDLORNLQRVKRKHL#MJFFRP&)' &RPSXWDWLRQDO)OXLG'\QDPLFV）解析に微生物反応式を組込み、商業スケールリアクターでのエタノール
生産のシミュレーションを行った。シミュレーションの結果、リアクター内には温度分布が発生し、その分布は時間毎に変化することが推察された。また、リアクター内を均一と仮定した場合と比較して、シミュレーション
結果ではエタノール最終濃度、収率が低下することが示された。さらに、リアクター内の温度分布とその変化を実験室スケールで再現したスケールダウンシミュレータにて発酵試験を行い、その有効性を検証した。

はじめに㻌
有用物質生産を目指した微生物の開発は、実験室ス
ケールのフラスコやジャーファーメンターを用い、充分な振盪や攪拌によって、反応器内の温度、S+、基質濃度、生産物濃度などの微生物の生育や生産性に影響する因子を均一にした条件にて行われる。一方で、バイオエタノールなどの商業バイオプラントにおいては、
数十～数百立米スケールの大規模なリアクターが用いられるが、この様な大規模リアクター内において温度、S+、基質濃度、生産物濃度などの環境因子を常に均一に維持することは難しい。その結果、実験室スケールで得られた微生物にとっての最適条件が大規模リアク
ターでは再現されず、微生物の性能が発揮されないケースが発生し、その性能が目的生産物の生産性や生産濃度であった場合には経済性に大きく影響する。もし、スケールアップの前段階において大規模リアクターにおける生産性を予測できれば、経済性低下リスクを把握できるとともに、スケールアップに適した微生物の改良やプロセス面からの対策を前もって講ずることが可能となる。
リアクター内や配管内の種々濃度や温度分布などをシミュレーションする技術として、&)' 解析手法がある。本手法では、多数の格子を用いて反応槽を表現し、各格子点における速度、圧力、温度、濃度などの値を計算し、反応槽内の流動状態、各種濃度を予測するこ

44とができる。&)' 解析は、バイオリアクターのシミュ
レーションにも応用されており、リアクター形状や攪拌方法が影響を及ぼすリアクター内の各種濃度分布のシミュレーションや、
生物反応式を &)' 解析に組込み、生物反応速度も反映したシミュレーションも行われている。
本研究においては、
実用的観点から重要となる、
大規模 数百立米 、
各濃度が経時変化する非定常状態、発酵終了までの長時間反応をシミュレーショ
ンすることを目的に、生物反応式を組込んだ &)' 解析を行った。さらに、解析結果を実験室スケールに再現したスケールダウンシミュレータをデザインし、その有効性の検証を目的として、本装置を用いた発酵試験を行った。

方法㻌
酵母を用いたバイオエタノール生産の商業プラントをモデルとした。発酵槽のサイズは P 高さ P、槽内径 P とし、槽内温度の維持のため、外部循
環ポンプと熱交換器を含む外部循環ラインを設けた。
運転条件として、仕込みは P、ポンプ循環速度を
PK とし、リアクター内部平均発酵液温度が º&となるように、熱交換後の流入液の温度を算出、設定した。&)' 解析では、基本的な方程式として、質量、運動量、エネルギーの保存式とともに、質量分率の輸送方程式を取り扱った。微生物反応速度については、



250

実線均一モデル 対照
破線&)'解析

200

Glucose150

Ethanol

100

50

0

Cell

0

12

24

36

48

Time (h)Temperature (ºC)

0hって、&)' 解析では最終濃度が低下したと考えられる。
さらにこの &)' 解析で得られたリアクター内温度分
布とその時間変化を、 つの温度の異なるリアクターを連結し、時間によってそれぞれの容量を変えることで再現したスケールダウンシミュレータを構築して培養試験を行った。その結果、グルコース消費、エタノール生成、および菌体増殖ともに、&)' 解析と同様な結果が得られ、スケールダウンシミュレータが実規模装置を模擬できる可能性が示された。
以上より、&)' 解析に微生物反応速度を組込んだシ
ミュレーション手法が、スケールアップ時の微生物、およびプロセスの問題点抽出への活用が期待できる結果が得られた。今後は、仕込み時の菌体の添加方法や基質流加などの実際の運転に即した解析が必要となる。

Concentration (g/l)

酵母を用いた温度依存のエタノールの反応速度式を用いた  。温度依存のパラメータは、エタノール生産実用酵母を用いた º&～º& の発酵試験の結果より 次式を構築し、他のパラメータについては発酵試験結
果とフィッティングして決定した。また、発酵熱については、基質、生成物、細胞の熱収支式を用いた。各時間の各成分濃度と発酵熱の変化速度は、それぞれ&)' 解析の質量分率輸送方程式およびエネルギー保存
式中の生成項として与えた。また、発酵槽内の各種濃度および温度を均一と仮定した均一モデルを &)' 解析
結果の対照として、微生物反応速度式と熱収支式を数値的に解くことで計算した。また &)' 解析結果を検証するために、&)' 解析で示されたリアクター内の温度
分布時間変化を実験室スケールに模擬したスケールダ
ウンシミュレータを組立てて培養試験を行った。

結果と考察㻌
 &)' 解析で得られたリアクター内の温度分布変化データを ' にて図１に示した。培養開始時から槽内の温度分布が現れはじめ、～ 時間においては、中心部分に温度の高い箇所が発生することが示された。また、グルコース、エタノール、菌体濃度のシミュレーショ
ン結果を図  に示す。実線で示した均一モデルと比較
して &)' 解析の結果では、グルコース消費速度は高い
ものの、最終エタノール濃度が約 JO 低くなることが示された。今回使用した菌株は、温度が高い条件において基質当たりのエタノール収率が低下する傾向であることをパラメータ決定の際の発酵試験において認めており、リアクター内高温度箇所の存在の影響によ

2h

5 hr

10 hr

  図 基質、生成物、菌体濃度の経時変化謝辞
本研究は国立研究開発法人新エネルギー・産業技術
総合開発機構 1('2 の委託研究として実施した。

参考文献
 GH$QGUDGH55 HWDO$SSO%LRFKHP%LRWHFKQRO
137-140、753-763
(2007).
 



15 hr

25 hr

35 hr

45 hr

図 発酵槽内の温度分布の時間変化

45

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集ªª­§­©²·´µ³¨¸§·­³²³ª­·¥§³²­§¥§­¨¸¶­²«¥´¶»§¬µ³´¬­°©¦¥¶©¨¶­±´°©¦­³§¥·¥°»¶·ñIiåïìí|am#ÐÚÝáèäï}ÑNTQRò羅1

宮臨風 1・田島誉久 2・加藤純一 2＊

広島大学大学院先端物質科学研究科，2 広島大学大学院統合生命科学研究科〒739-8530

東広島市鏡山 1-3-1

Tel: 082-424-7871

Fax: 082-424-7047

E-mail: jun@hiroshima-u.ac.jp

低温菌シンプル酵素触媒とは物質変換酵素を発現させた低温菌を中温で熱処理・反応することにより，宿主の代謝による副産物を抑制するとともに基質の膜透過性を向上させることが可能となり，高収率で効率的な物質変換が実現できる酵素触媒である．本研究では，クエン酸をイタコン酸に変換する酵素を発現させて熱処理条件等を検討することにより，簡便で効率的な物質変換触媒を構築した．

１．はじめにシンプル酵素触媒とはなるべく簡便な操作でシンプルに効率的な物質変換を行うことを目的とする酵素触媒である．従来の微生物触媒は生育と並行して物質変換を行うために，宿主由来の代謝酵素により生成される代謝産物が副産物となるため，収率が低いことが大きな問題となっていた．近年では代謝工学的に最適な
代謝フラックスとなるようなゲノム改変がなされることで効率的な物質変換が可能となることもあるが，改変にかかる手間や時間は大きく，そもそも生育に必須な代謝を完全に削除することは困難である．
そこで，熱処理により宿主の代謝と物質変換系を切り分けることが可能となればもっと簡便に効率的な物
質変換触媒を構築できるというコンセプトで研究が進められている．特に当研究室では低温菌を宿主とすることで低い熱処理温度で効率的な触媒を構築できることを想定して検討を行ってきた．宿主を低温菌とすることで宿主の代謝酵素の熱失活を低温で行えること，変換酵素に利用できる酵素を動物や植物などを含む幅広い生物を由来にできることで，多様な物質変換系を構築することが可能な点が挙げられる．これまでに増殖阻害を引き起こす 3-プロピオンヒドロキシアルデ
ヒド 1)や宿主代謝系と競合して生成されるアスパラギ

46ン酸 2)などポリマー原料となる化学品の高収率変換を行った．固定化することにより持続的な変換も可能であり，工業的な利用も期待される．また，補酵素再生
系と共役させることも可能であり，熱処理により宿主が死細胞となることから増殖基質の生成であっても消費することなく効率的に変換することが可能であった
3)．

図 1 シンプル酵素触媒 中温の熱処理で宿主の代謝酵素を失活した効率的な物質変換を行う，基質の膜透過性を向上させた高速変換が可能となる，煩雑な酵素の精製を必要としない，多種多様な中温性の酵素を利用して自由に変換系を設計できる，生育阻害のある物質の生成にも利用できる，など様々なメリットを有する．

本研究では，このような様々なメリットを有するシンプル酵素触媒をイタコン酸の変換に活用することにした．イタコン酸は炭素数 5 の有用化学品であり，生物的には糸状菌による変換がなされてきた．しかし，

変換酵素がミトコンドリアと細胞質に分断して存在す
ることや代謝酵素と競合する変換であることから変換プロセスの改変がなされてきた．そこでシンプル酵素
触媒を用いることにより酵素を精製することなく簡便に物質変換プロセスを構築することを目的とした．

２．方法
広宿主域プラスミド pHA12 を用いてクエン酸をイタ
コン酸に変換するための 2 種類の酵素（大腸菌由来のアコニターゼ AcnB，糸状菌由来の cis-アコニット酸脱炭酸酵素 CAD）遺伝子をそれぞれ取得し，tac プロモー
ター下に挿入して発現プラスミドを構築した．これを接合により低温菌 Shewanella 属細菌に導入した．18℃で培養した低温菌株を回収し，中温で熱処理後にクエン酸を添加して反応を行った．80℃ですべての酵素反応を失活させた反応液中の有機酸量を HPLC にて定量した．

３．結果と考察
当該酵素を発現するプラスミドを低温菌に導入して物質変換を行った．220 mM（42 g/L）のクエン酸を高収率でイタコン酸に変換することが示された（図 2）．

また，膜透過性の向上について検討を行うために同一の発現プラスミドを大腸菌に導入して変換反応を比較した．その結果，大腸菌株に比べて Shewanella 属細菌では生産性が高く，熱処理によりさらに向上することが示された．したがって，低温菌を宿主に利用し、熱処理することで変換酵素の基質へのアクセスが向上
し，高い生産性を示すことが明らかとなった（図 3）．

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47

第 71 回日本生物工学会大会 トピックス集

模擬微小重力環境が腸内有用細菌の諸特性に及ぼす影響の解析と利用
増田 亜理沙 1・青柳 秀紀 1, 2＊
1

筑波大学大学院 生命環境科学研究科 生物資源科学専攻
2
筑波大学 生命環境系〒305-8572 茨城県つくば市天王台 1-1-1
Tel: 029-853-7212、 Fax: 029-853-4605
E-mail: aoyagi.hideki.ge@.u.tsukuba.ac.jp

従来の微生物培養法で培養化できる微生物は、自然界に存在する全微生物の 1％程度であることが示唆され、新たな培養法が求められている。そこで我々は、模擬微小重力（low-shear and modeled
microgravity: LSMMG）培養に着目し、LSMMG 培養が種々の腸内有用細菌の生理活性に及ぼす影響の解析をおこなった。種々の腸内有用細菌 (乳酸菌やビフィズス菌) を対象に、検討した結果、LSMMG 条件で顕著な増殖促進や耐酸性の向上が認められる菌株が存在することが明らかとなった。
今回検討した菌株の中で、特に、Bifidobacterium breve は顕著な耐酸性の向上が認められ、凍結保存後の菌体も優れた耐酸性が認められた。本研究は、LSMMG 条件を適切に活用することで、耐酸性に優れた有用プロバイオティクスを取得できることを示したはじめての報告である。

1. はじめに

2. 材料と方法

従来法で培養可能な微生物は、自然界に存在する全微生物の 1％程度であることが示唆され、社会的ニーズとして新たな培養法が求められている。この現状を踏まえ、我々は、模擬微小重力（LSMMG）培養に着目した。LSMMG 条件は通常重力 (NG) 条件と比べて、約 100 分の 1 の重力を示すと共に、剪断力が低く、物質が均一に混合、分散する等の特徴がある。これまで、
LSMMG 条件が腸内有用細菌の生理活性に及ぼす影響はほとんど検討されていなかった。我々は、腸内有用細菌 (乳酸菌やビフィズス菌) を LSMMG 培養し、
種 々 検 討 し た 結 果 、 (A) LSMMG 培 養 に よ り
Lactobacillus acidophilus JCM1028 の耐酸性が向上す
る、(B) LSMMG 条件で L. acidophilus の耐酸性試験をおこなうと、NG 条件よりも高い生存率を示す、新規な現象を見出した 1)。

使用菌株と培地

本研究では、種々の乳酸菌やビフィズス菌を対象に、この現象の普遍性の有無を解析するとともに、この現象を耐酸性プロバイオティクスの取得に活用できるのではないかと考え、種々検討をおこなった。

48

4 種 類 の 乳 酸 菌 (L. acidophilus, L. gasseri, L.
delbruekii subsp. bulgaricus, L. casei) とビフィズス菌(Bifidobacterium breve) を実験に用いた。乳酸菌の培養に は MRS 培 地 、 ビ フ ィ ズ ス 菌 の 培 養 に はBifidobacterium 培地を使用した。

模擬微小重力培養と胃酸耐性試験
High Aspect-ratio Rotating Vessel (HARV) bioreactor[Synthecon] を用いて LSMMG 培養をおこなった。比較のため、垂直に軸をとり HARV を回転させ通常重力(NG) 培養をおこなった (37℃、乳酸菌は 12 h, ビフィ
ズス菌は 24 h 培養をおこなった) 。胃酸耐性試験は、
LSMMG や NG 培養で得られた菌体を集菌し、適宜、調製後、人工胃液 (pH 2.5) を作用させた (NG またはLSMMG 条件、37℃、60 min) 。任意の寒天平板培地を用いて生菌数から、生存率を算出した (図１) 。

図１ 乳酸菌とビフィズス菌の胃酸耐性試験の概要図.

3. 結果と考察（I） 乳酸菌やビフィズス菌の胃酸耐性の比較
HARV bioreactor を用いて、前述の 5 菌株を NG あ
るいは LSMMG 培養した後、NG あるいは LSMMG 条
件 で 胃 酸 耐 性 試 験 を お こ な っ た ( 図 １ ) 。 L.
acidophilus の場合と同様に (a) B. breve は LSMMG 培
養により耐酸性が向上し、(b) L. gasseri、L. casei および B. breve は LSMMG 条件で胃酸耐性試験をおこなうと、NG 条件よりも高い生存率を示した (図２) 。
以上の結果から、今回検討した 5 菌株では、LSMMG
培養や LSMMG 条件に対する影響は菌株により異なることが分かった (図２) 。

(Ⅱ) 高い胃酸耐性能を有する B. breve の取得
今回検討した菌株の中で、特に、B. breve は、LSMMG
培養することで NG 培養した場合と比べて、顕著な耐酸性の向上が見られた。そこで、LSMMG 培養した
B. breve を酸耐性試験後、寒天平板培地に播種し、生成したコロニーを取得 (図１ LN’, LL’) 、培養し、種々検討をおこなった。その結果、取得する前の菌体の生存率 (図１ LN, LL) と比較すると、LN’と LL’の方が高い生存率を示した (B. breve の耐酸性は、凍結保存した後も保持された) 。また、胃酸処理の時間
を 120 min に延長した場合や人工胃液の pH 条件を 2.0にした場合も、いずれも高い生存率が認められた。

4. 今後の展望
本研究は、LSMMG 培養や LSMMG 条件下での耐酸性試験を耐酸性プロバイオティクスの取得に利用したはじめての研究である。獲得した耐酸性に優れた菌株
は凍結保存ができ、今後、プロバイオティクスとして利用できる可能性が示唆された。現在、他の菌株や耐酸性以外の特性について検討中である。

5. 参考文献
図２ 種々の条件における乳酸菌やビフィズス菌の胃酸耐性能の比較 (NN, NL, LN, LL は図１参照).

1） 長谷川ら：第 70 回 日本生物工学会大会講演要旨
集, p. 267 (2018).

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49

第  回日本生物工学会大会 トピックス集

機械学習を用いた植物 mRNA 切断に関わる特徴の選抜
上野大心・山崎将太朗・出村拓・加藤晃*
奈良先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科〒630-0101 奈良県生駒市高山町 8916-5
Tel: 0743-72-5463

Fax: 0743-72-5469

E-mail: kou@bs.naist.jp

外来遺伝子を細胞内で発現させる上で、mRNA の安定性は重要である。この安定性を制御する機構の一つとして、mRNA の分解機構が挙げられる。一般的に導入遺伝子を発現させる際は、コンス
トラクトの両末端配列が共通のため、特に mRNA の内部配列の切断に依存する分解機構が大きく関与するが、その詳細な知見は不明であった。我々は、mRNA の切断部位を網羅的に検出できる
Truncated RNA end sequencing (TREseq) 法をシロイヌナズナにおいて確立した。この手法を用いて解析を行ったところ、切断部位周辺には G 塩基の割合が高い傾向が認められた。加えて、それらの遺伝子内における分布に着目すると 3 塩基単位の周期性など、翻訳過程の関与が示唆された。これらの結果は、mRNA 切断には複数の要因（特徴）が関与する事を示唆している。そこで本解析では、
機械学習 (random forest classifier) を用いて、mRNA 切断に関わる重要な特徴の選抜、及び評価を行った。

1. はじめに 植物バイオテクノロジーにおいて、有用遺伝子を細胞内に導入し、植物自身の機能改良（耐病性、各種ス
トレス耐性、多収性の付与など）、植物機能を利用した環境浄化、植物機能を利用した有用物質生産（生分解性プラスティック、植物性油脂、医療用タンパク質など）が行われている。導入された遺伝子 (DNA) は、転写、翻訳過程を経て、タンパク質となる。この転写、翻訳過程に加え、mRNA の蓄積量は最終的なタンパク質量を決定 する重 要な要因 の一つと 考えら れる。
mRNA 蓄積量の決定には、mRNA の分解機構が関わるが、その機構はポリ A 短縮、キャップ除去に依存する
分解、もしくはエンドヌクレアーゼによる内部配列の切断に起因する分解に大別できる [1]。一般的に導入遺伝子を発現させる際は、両末端配列が共通のコンストラクトを使 用する ため、導 入遺伝子 によっ て蓄積
mRNA 量が異なる要因には特に mRNA の内部配列の切断に依存する分解機構が大きく関与する（図 1）。しかし、動植物、酵母を含め、この分解機構に関する詳細な知見は不明であった。

50



 そこで、我々は mRNA の切断部位を網羅的に同定できる Truncated RNA end sequencing (TREseq) 法をシロ
イヌナズナにおいて確立し、解析を行った[2]。その結果、切断部位周辺には G リッチな傾向が見られた。加
えて、遺伝子内における切断部位の分布に着目すると、

図 1. mRNA の内部配列の切断に依存する分解機構
CDS 内における 3 塩基単位の周期性など、翻訳過程の関与が示唆された[2]。これらの結果は、mRNA の切断には複数の要因（特徴）が関与することを示唆している。
先行研究において、個別遺伝子を対象とした際に、

mRNA の切断にはリボソームの停滞位置が強く関与することが酵母において報告されているが[3]、植物においては詳細な解析は行われていない。そこで、本研究では、mRNA の切断に関わる複数の要因（RNA の特徴）を想定し、機械学習 (random forest classifier) を用いてその切断に関わる重要な特徴の選抜、評価を行った。

2. 解析データおよび方法(1) 解析データの取得
 先行研究より、網羅的な切断部位に関する情報を取得した[2]。また、mRNA の切断には翻訳過程が関与することが示唆されたため、TREseq と同条件である培養
3 日目 T87 培養細胞を用いて、mRNA 上のリボソーム
位置情報を測定できるリボソームフットプリント法を行い、取得した情報を以下のモデルの構築に使用した。

3. 結果と考察 モデルの精度を見ると F 値が 0.78 となり、大部分を予測できていることが示された（図 3）。各特徴の重要度をモデルから抽出すると、mRNA の切断部位の決定には、リボソームの停滞位置ではなく、切断部位周辺の配列が重要であることが示された。リボソームの停滞位置が mRNA 切断に重要であることが報告されている一方で、その切断部位は、リボソームの近傍ではなく、幅広い領域において生じていることが酵母において報告されている [4]。これらの結果は、翻訳過程はmRNA の切断に関与はするが、どこでその切断が生じるかなど、mRNA 切断位置の決定には大きな影響を与えないことを示唆している。

(2) 機械学習
 数理モデルの構築には Python のライブラリである、
scikit-learn の random forest classifier を使用した。モデルとしては、mRNA 上の任意の位置が与えられた際に、その部位を切断、非切断に分類（予測）するモデルを作成した（図 2）。このモデルには、切断部位周辺の塩基比率、リボソームの位置、RNA 配列全体の A、U、G、C 含量など数百の特徴を加えた。まず、全データ（切断、非切断部位）をトレーニング、テストデータに分割後、トレーニングデータを用いてモデルを作成した。その際、Out-Of-Bag (OOB) error rate を基にハイパーパラメーターを設定した。モデルの精度に関して
は、テストデータを使用し、分類モデルの精度の指標値である F 値を基に評価した。また、コントロール(Con) として、ランダムに値を出した際の F 値も算出
した。

図 3.

モデルの精度、および各特徴の重要度の評価

4. 今後の展望 今回の結果から、mRNA の切断には、その周辺の配列的特徴が重要である傾向が示された。今後は、切断されやすい配列をレポーター遺伝子に挿入後、塩基置
換実験を行い、実際にどのような配列が mRNA の切断に関与するかを、in vivo において検証する。
 これらの解析により、mRNA 切断に関与する配列が明らかとなれば、それらの配列を導入する遺伝子から取り除くなど、より安定的な導入外来遺伝子の発現に貢献すると考えられる。

参考文献[1] Parker, R.: Genetics, 191, 671-702 (2012)[2] Ueno, D. et al.: J. Biosci. Bioeng., 125, 723-728 (2018)
図 2.

Random forest を用いた分類モデル[3] Doma, M. K., and Parker, R.: Nature, 440, 561-564(2006)[4] Simms, C. L. et al.: Mol., Cell, 68, 361-373 (2017)51Ƈ  ðĵĿŪţđā½ÿ½ ǐªy§¤ª`ƬƞƎƛœƽĢsÒŬOUĳƪşźƢ`ǋųǙľ ķĄ «¯Ă Ŗǒ «ńĎ ķÒ «ƺǈ ƗǏ «±Đ ŷâ  ÚǎËƆÿ«¦u§D¥w{ª«ËǀƭŁƂāž¥w{ª«Ƣìž  Ďčũÿ«Ɛï ŽĐŹƜƖēĶá  ÚǎËƆƂāħƤÿāǍÿā ¦u§wyª"+1  ǝ ǝ  ';  ǝ ǝ   2'.18'0',./'.78')/5ªǣ
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Ô`ÁŬaňA^ěĤüÙsęJƷMQM\IżnqZFpI% &? l  `ÁŬaƒë[EWU@  ƌy§¤ªŚŕ[a?ƞƝƶÑĀ`ę
JĨJ\ #$ `ßƓsƫřO?­Ĵ? ƌy§¤ª[a?ƞƝƶÑĀ`ęJĨJ\æĹ_?#$`ÏÈ_çGƞ`ęJƻhl?ĉƛsěĥQpyª
ww^ěĤüÙIƫřNqUòǟ@Nn_?
¥ŊÇŇƿsĽQp #$ [a? ƌ`yª
wv^ěĤüÙa¥sƷş_ÖƾNqU@ $ y§¤ª`ƞƽǂĩØIµÙÔ`ƃǖ?¥Ňƿ`ĽŠ_mWZŰ^o? ƌ`ùå_?yªw¬_moƞƽǂIƷMpàƜĢIƁíò Ƭƞ°ŵƎƛŅêƹ`y§¤ªƑƳ«Ƙć(1)EOPO 系の VA ナノエマルションは、
人工細胞膜(GUV)において膜の引き込みを誘引し、ラフトモデルの存在で、内部に小胞を形成した。
(2)ヒト角膜上皮細胞に対し、EOPO 系ナノエマルショ
ンは細胞内部に小胞を形成し、効率的に細胞核周辺に集積した。
(3)ナノエマルションによる細胞への取り込み効率は、界面活性剤の種類により異なり、エンドサイトーシスを誘引する場合に促進される。

ÞƘıŦ

された。
ò２ǡEOPO ƌ_mp¹đƎƛƞ`ěĤüÙ(a)y§¤ª?(b)EOPO `h?(c)ŊĘò

13  2 0
"-,.('  %- ") )%+ #'   "*"$" !%- ") &/,&%*%--  

53

第 71
 回日本生物工学会大会
回日本生物工学会大会 トピックス集
トピックス集共培養マイクロデバイスを搭載した微小電極アレイチップによる
共培養マイクロデバイスを搭載した微小電極アレイチップによる
L36
由来運動神経・骨格筋細胞評価プロセスの開発! 由来運動神経・骨格筋細胞評価プロセスの開発
1,3＊
古谷 太樹 1・清水
・清水 一憲 1・伊藤・伊藤 卓治 2・岡田
古谷
・岡田 洋平 2・本多・本多 裕之 ＊

1名古屋大学工学研究科生命分子工学専攻，2 愛知医科大学医学部内科学講座（神経内科），，3名古屋大学予防早期医療創成センター
名古屋大学予防早期医療創成センター
〒464-8603
名古屋市千種区不老町 名古屋大学工学研究科
名古屋大学工学研究科〒名古屋市千種区不老町
Tel: 052-789-3215
Fax: 052-789-3214
7HO)D[

(PDLOKRQGD#FKHPELRQDJR\DXDFMS
E-mail: honda@chembio.nagoya-u.ac.jp


vitro でヒ
本研究では、神経筋疾患の発症機構解明や創薬スクリーニングへの応用を目指し、 in
LQYLWUR
ト L36
iPS 細胞から分化させた運動神経細胞と骨格筋細胞間の活動電位伝播を評価するための共培養プ
ロセスを構築した。微小電極アレイ（0($）チップ上に共培養マイクロデバイスを搭載することで、ロセスを構築した。微小電極アレイ（MEA）チップ上に共培養マイクロデバイスを搭載することで、運動神経の細胞体と軸索、骨格筋の細胞体の位置を制御した。培養表面処理条件の検討を行った結果、ヒト L36
iPS 細胞由来の運動神経細胞と骨格筋細胞を長期間共培養することが可能になり、活動電位伝播の計測に成功した。
位伝播の計測に成功した。


1.背景
背景
人が体を動かすとき、脳からの指令は電気信号として運動神経を伝わり、運動神経から神経伝達物質が骨格筋へと放出され、骨格筋は電気活動によって収縮する。この運動神経と骨格筋の電気活動に異常が生じる疾患を神経筋疾患と呼び、発症機構は未解明で根本的な治療薬や治療法もない。ヒト iPS
L36 細胞由来の運動神
経細胞と骨格筋細胞を用いて、運動神経に支配された
in YLWUR
vitro で再構築することで、神経筋疾患の骨格筋を LQ
発症機構の解明につながると大きく期待されている。
発症機構の解明につながると大きく期待されている。
微小電極アレイ(MEA)チップは、
微小電極アレイ0($ チップは、多数の微小電極がアレイ状に配置された細胞培養機材であり、その表面で培養した細胞の活動電位を簡便に測定することができる。これまでに神経細胞や心筋細胞の活動電位計測に汎用されてきたが、運動神経と骨格筋細胞の活動電位伝播の計測は数例しかなく、さらに我々が知る限り、
より実用的な評価系としてヒト iPS
L36 細胞由来の両細胞の活動電位伝播の計測に用いた例はない。
の活動電位伝播の計測に用いた例はない。
運動神経細胞と骨格筋細胞のように活動電位を発す
る異なる複数の種類の細胞を 0($
MEA チップ上で共培養する場合、電極上で細胞が重なる可能性があり、測定された活動電位がどちらの細胞由来であるかを判断できないことが問題である。以前我々は運動神経細胞と骨格筋細胞の共培養マイクロデバイスを開発した 1)。デ
バイスは、二つの細胞培養チャンバーとそれらをつな

54



ぐ軸索だけが通ることができるマイクロ流路をもつ。
このデバイスを用いると神経筋接合部を形成した運動神経細胞と骨格筋細胞のそれぞれの細胞体を分離した状態で共培養することが可能である。
状態で共培養することが可能である。
を改良し、本研究では、共培養マイクロデバイス 1)
0($
チップに搭載することで、ヒト
L36細胞由来の運MEA
iPS
動神経細胞と骨格筋細胞を区画化共培養し、それらの細胞間の活動電位伝播を測定することを目指した 図
細胞間の活動電位伝播を測定することを目指した(図 。0($ チップの培養表面処理条件を検討した結果、1)。MEA
長期間共培養することが可能になり、活動電位伝播の計測に成功した。
計測に成功した。


研究概要図
図 1 研究概要図


2.材料と方法
材料と方法
MEA チップとして、アルファメッドサイエンティフ
0($
MED64 プローブを使用した。フォト
ィック株式会社の 0('
リソグラフィ技術によって作製したマイクロデバイス
MEA チップに搭載した。ヒト L36
iPS 細胞 %
201B7 株とヒ
を 0($

と骨格
iPS 細胞 %
409B2 株をそれぞれ運動神経細胞 2)
ト L36
3)

筋細胞 に分化誘導し、共培養を行った。共培養 7 日
目に、グルタミン酸を添加して運動神経細胞を特異的に刺激し、続けてナトリウムチャネル阻害剤であるテ
トロドトキシンを添加して活動電位伝播の計測を行った。活動電位の測定・解析には MED64
0(' システム専用ソ
フトウェア 0RELXVを利用した。
Mobius を利用した。


3.結果と考察結果と考察(1)表面処理条件の検討
 表面処理条件の検討
従来の方法でコーティングを行い、iPS 細胞由来の従来の方法でコーティングを行い、L36
MEA チップ上で培養したところ、培養 4骨格筋細胞を 0($
日目には細胞が剥離した。骨格筋細胞への分化誘導には約 7 日必要なため、骨格筋細胞を長期間培養するための表面処理条件を検討した。シラン処理の有無、親水化処理の有無、マトリゲルコーティングの時間などを検討し、最もよい細胞接着を示す条件を見出した。
実際に培養を行ったところ、分化培養 7 日に加えて共培養 3 日目まで、少なくとも合計 10 日間の間、骨格筋細胞を剥離させることなく培養することに成功した。
細胞を剥離させることなく培養することに成功した。
(2)化合物添加による活動電位変化の観察
 化合物添加による活動電位変化の観察
MEA チップに搭載し、(1)で見出した条件
デバイスを 0($
 で見出した条件
で、表面処理を施し、iPS 由来の運動神経細胞と骨格で、表面処理を施し、L36
筋細胞を共培養した。共培養 7 日目に MEA0($ チップを装置に設置し、活動電位測定を行った。運動神経細胞を培養した側にグルタミン酸を添加したところ、骨格筋細胞の活動電位の発生頻度が増加した。グルタミン酸の添加量を増加させることでその頻度がさらに増加した。テトロドトキシンを添加することでこの活動電位が抑制される様子が観察された(図が抑制される様子が観察された
図 2)。この結果は、。この結果は、グルタミン酸の添加によって運動神経細胞が刺激され、神経筋接合部を介してこの刺激が骨格筋細胞へと伝えられていることを示唆しており、運動神経細胞から骨格筋細胞への活動電位伝播の測定に成功したと考えら
れる。
れる。




図 2 活動電位の測定
活動電位の測定
①添加なし、②グルタミン酸
100 µM、③グルタミン酸①添加なし、②グルタミン酸
µ0、③グルタミン酸µ0、④テトロドトキシンQ0
500µM、④テトロドトキシン 250 nM


4.今後の展望今後の展望 我々は、マイクロデバイスを MEA
0($ チップに搭載することで、ヒト iPS
L36 細胞由来の運動神経細胞と骨格筋細胞の培養区画を分けて共培養を行い、運動神経細胞から骨格筋細胞への活動電位伝播を測定することに成功した。
した。
 現在、遺伝子工学を用いて、光を用いて細胞に刺激を加えることができるオプトジェネティクス技術や蛍光タンパク質によるカルシウムイメージング技術の構築を並行して進めている。今回開発した共培養プロセスと組み合わせることで、運動神経細胞と骨格筋細胞の接合を詳細に解析することが可能になると期待され
る。
る。
L36
今後は、上述の技術を用いて、健常者と患者の iPS細胞から分化誘導した運動神経細胞と骨格筋細胞を共培養し、神経筋疾患の発症機構解明を目指す。また神経筋疾患の治療薬となりうる化合物のスクリーニングへの応用も検討を進めていく。
への応用も検討を進めていく。


謝辞
謝辞
本研究の一部は JSPS
-636 科研費基盤研究 B%(18H01796)+
の助成で実施した。
の助成で実施した。


参考文献
参考文献
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

55 

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集基質酵素反応予測のための機械学習に基づく予測モデルの構築方法の探索と評価
渡邉直暉 1・村田1

昌浩 2・荻野

千秋 1・近藤昭彦 3・荒木通啓 2,3*神戸大学大学院 工学研究科，2 京都大学大学院 医学研究科,
3
神戸大学大学院 科学技術イノベーション研究科〒657-8501

神戸市灘区六甲台町 1-1

Tel: 078-803-6193

神戸大学工学研究科

Fax: 078-803-6193

E-mail: ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

近年分子生物学データベースには、ゲノムシーケンス技術の発展により”Un-annotated”な遺伝子配列が爆発的に増加しているため、アノテーションを計算的手法により早急に決定する必要がある。さらにこのような配列の中には、代謝工学において重要な酵素配列が含まれていることが推測されそれらを新たに発見することは非常に重要である。本研究ではこのような酵素の発見や既存の代謝経路の拡張のため酵素配列の反応予測を近年注目されている機械学習を用いて 2 通りの方法で行った。まず酵素のアミノ酸配列を用いて Enzyme Commission (EC) number の予測モデルを構築した。次に酵素配列に基質・生成物の化学構造情報を加えて EC 予測と同時に酵素の反応予測が可能なモデルを構築した。予測精度を評価したところ、前者のモデルでは予測精度は低い結果となったが後者においては機械学習の種類に限らず予測精度が大幅に向上し高い精度となった。このことか
らこの方法は、基質酵素反応予測に非常に有効的であることが示唆された。

1. はじめに酵素は生化学反応を触媒するタンパク質で代謝工学
において非常に重要な物質である。これらの中には、ある特定の基質と反応する現在でも発見されていない
酵素・新たな基質と反応し、新たな有用な生成物を合成できる特定の酵素・全く未知の反応を触媒する酵素が存在する可能性がある。酵素は Enzyme Commission(EC) number によって触媒する反応ごとに階層的に分類されている。
これらの酵素の配列情報は様々な分子生物学データ
ベースに登録されており、特にタンパク質配列データ
ベースの Swiss-Prot1)には約 25 万もの酵素配列情報が登録されている。近年では次世代シーケンサーにより、遺伝子の配列情報が爆発的に増加していくに従い“Un-annotated”な配列も増加し続け、さらに潜在的にその中には重要な酵素配列が存在する可能性がある。
これらの背景から、計算的手法を用いて酵素の反応予測のため、主に酵素のアミノ酸配列のみを用いる方
法や基質や生成物の化学構造を用いる方法等を用いて取り組まれている。本研究では代謝工学において重要

56

な酵素を新たに発見し、既存の代謝経路を拡張させる
ため機械学習を用いた酵素配列の反応予測を行った。

2. データセットと方法(1)使用データセット
まず学習用データセットとして BRENDA2)・KEGG3)に登録されている酵素反応情報を取得し、33263 組の基質酵素-生成物(SEP)・25320 組の基質‐酵素(SE)・2882
個の酵素(E)のデータセットを作成した。その際、酵素のアミノ酸配列情報は Swiss-Prot、基質・生成物の化
学構造情報は Pubchem4)から取得した。次にそれぞれの予測モデル評価のため Escherichia coli K-12 の酵素と代謝産物情報を上記と同様に取得した。
(2)特徴抽出と機械学習による予測モデル構築
PROFEAT5)を用いて酵素のアミノ酸配列を 1437 次元、
DRAGON6)を用いて基質・生成物の化学構造情報を 1387
次元のベクトルとして表現し、E-, SE-, SEP-vectorを作成した。それぞれのベクトルとそれに対応する酵
素反応の EC number から複数の機械学習を用いて EC
予測可能な E-model、それと同時に詳細な酵素反応を

予測可能な SE-, SEP-model を構築した(図 1)。

た。さらに RF を用いた次元削減ありのモデル内では削減の影響をほぼ受けていないことから厳密に特徴抽出
方法を選ぶ必要がないため他の機械学習よりも優れていることが推察される。

図 1. 本研究における酵素反応予測の概略図

3. 結果と考察(1)予測精度の評価
E. coli K-12 の酵素を用いて E-, SE-, SEP-modelの予測精度を求めた(図 2)。機械学習の種類によらず
E-model の予測精度が最も低く、基質・生成物の化学構造の情報量の増加に従い精度の向上が見られた。このことから、酵素のアミノ酸配列情報に基質・生成物の化学構造情報を加える方法は精度の向上や予測範囲
を EC 予測から拡張した酵素の反応予測に非常に有効的であることが示唆された。また 1 つの酵素で複数の反応を触媒しているものについても全ての機械学習において半数近く正しく予測した。
さらに RF の SEP-model の予測精度が最も高くなった。
RF はアンサンブル学習や特徴量選択の最適化を行いながら学習を行うため、過学習が他の機械学習を用いたモデルよりも起きにくかったことが考えられる。

表 1. 次元削減した SEP-model の予測精度(F score)
略: raw;元の SEP-vector, C; 基質・生成物の次元,
E;酵素の次元, del;次元削減, 番号;記述子のタイプ

4. 今後の展望
本研究により酵素のアミノ酸配列情報に基質・生成物の化学構造情報を加える方法は酵素反応の予測に非常に有効的であることが示唆された。しかし予測モデ
ルの精度評価のために他の生物種による更なる試験が必要である。また特徴抽出の改良や学習用データのバ
リエーションの増加させることによりモデルの過学習を防ぎ精度を向上させることが可能である。

謝辞
本研究で用いた学習データを提供してくださった三
井情報の小川哲平氏に感謝いたします。本研究は新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）による、植物等のスマートセルを利用した高機能品生産技術の開発（スマートセルプロジェクト）の支援により行われ
ました。

参考文献
図 2. E. coli K-12 テストの予測精度 (AUC)(2)酵素反応予測の重要因子の探索
ベクトル内のどの次元が予測に重要な因子かを確認するため、特定の次元を削減して 6 種類の SEP-modelを構築し、同様に E. coli K-12 テストを行った(表 1)。
化合物の情報の次元を削減するにつれ予測精度の減少
量が増加したことから酵素の配列情報よりも反応予測に重要であることが示唆される。これは E-model の予測精度が最も低い結果と一致する。また機械学習の種
類により予測精度の変化が異なっているため全般的に反応予測に重要な因子は存在していないことが分かっ *'!/+2040/3024+5.5%-'+%%+&3'3     -$%6','4$-5%-'+%%+&3'3     
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$%%'33'&5/'   57

第 71 回日本生物工学会大会 トピックス集

がん診断のための高感度で前処理不用なインタクトエクソソームセンシング
森貴翔, 清水

拓, 片山
北山

航, 源

和晃,高野

雄己哉, ○竹内恵里, 砂山博文,

俊文＊

神戸大学大学院工学研究科〒657-8501

神戸市灘区六甲台町 1-1
Tel: 078-803-6158

神戸大学大学院工学研究科

Fax: 078-803-6158

E-mail: takeuchi@gold.kobe-u.ac.jp

最近、がん細胞から放出されるエクソソームが、がんの悪性化や転移に深く関わっていることが明らかとなり、このがん細胞由来エクソソームを追跡することで、がんの早期発見をする試みが、新たながん検出法としての期待感から注目を集めている。本研究では、抗体と人工高分子材料を巧みに融合し、煩雑な前処理をすることなしに、体液中のがん細胞由来のエクソソームを正常エクソ
ソームと識別することに成功した。エクソソームの高感度測定を自動化した「エクソソーム自動分
析計」も併せて開発し、迅速、簡単に体液検査を行うことが可能となり、エクソソームをバイオマーカーにしたがんの早期発見のための新しい方法論として期待される。

１．背景
細胞外小胞エクソソームは、さまざまな細胞から放出される脂質二重膜を有する 100 ナノメートル程度の小胞である。最近、がん細胞から放出されるエクソソームが、がんの悪性化や転移に深く関わっていることが明らかとなり[1,2]、このがん細胞由来エクソソームを追跡することで、がんの早期発見をする試みが、新
たながん検出法として注目を集めている。
現状のエクソソーム分析法は、超遠心やアフィニテ
ィー分離などを併用して行われるため、手順が煩雑で、簡便で迅速とは言えない。煩雑な前処理をすることなしに、体液中のがん細胞由来のエクソソームを正常エ
クソソームと識別することができれば、簡単な体液検
査でがんの早期発見が可能となる。現状行われている
正診率の低い「各種がん診断法」、例えば乳がんに対するマンモグラフィ検査や各種がんに対する血中がんマーカータンパク質検査などに代わる新たながんの検査法として期待される。また、患者の大きな負担となる
直接組織を採取する「組織生検」前の事前検査として行えば、組織生検の件数も減少し、医師、患者ともにその負担は軽減される。
我々は、これまで分子インプリンティングによるプラスチック抗体（分子インプリントポリマー：MIP）

58

に関する一連の研究を行ってきており[3, 4]、その過程で、従来にはない画期的なナノ空間特異的な後天的修飾法、ポストインプリンティング修飾法（PIM）を開発した[5-10]。PIM を用いることにより、MIP の分子認識に加え、その認識情報を読み出し可能なシグナル（例えば蛍光変化）に変換してアウトプットできる多機能 MIP の実現が可能となった。エクソソームそのものを鋳型にして、天然の抗体と組み合わせたハイブリッド多機能 MIP の開発にも成功している[11]。
本研究では、エクソソームと同等のサイズを有する鋳型シリカナノ粒子をエクソソームの代替として用いて、エクソソーム結合空間を構築し、PIM により、その空間内のみにエクソソーム膜タンパク質を認識する
抗体と蛍光レポーター分子を配置することに成功した。
このエクソソーム蛍光センシングチップを用いて、がん細胞由来のインタクトエクソソームを検出可能か検討したところ、超遠心などの前処理をすることなしに
正常エクソソームと識別可能であることが分かったのでその詳細を報告する。

２．材料と方法
金スパッタガラス基板を amino-EG6-undecanthiolhydrochloride および 2-(2-bromoisobutyryloxy)undecyl
thiol の EtOH 溶液に 25℃で一晩浸漬し、基板上に自己組織化単分子膜 (mixed SAM)を形成した。次に、ジスルフィドを介してメタクリロイル化されたシリカナ
ノ粒子をこの基板上に固定化した。表面開始原子移動
ラジカル重合(ATRP)によって基板上にポリマー薄膜を合成した。モノマーとして 2-metacryloyloxyethyl
phosphorylcholine (MPC)を用い、40℃、3 時間重合を行った。Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP-HCl)にてジスルフィド結合を還元し、0.5 wt%
SDS を含む酢酸バッファー (pH4.0)中で一晩静置して、ポリマー薄膜からシリカ粒子を切り出した。形成された空孔に残存する遊離のチオール基に蛍光レポー
ター分子を導入し Protein G を介して抗体を固定化し、エクソソ－ムセンシングチップ(図 1)を得た。

３．結果と考察
このエクソソーム自動分析装置を用いて、がん患者の体液試料中のエクソソームを測定したところ、検出限界は 10-16 M オーダーであることが明らかとなり、前処置の必要がなくワンチップ 10 分以内での高速エクソソーム超高感度検出が可能なことが分かった。がん患者のエクソソームの表面膜タンパク質プロファイ
ルは健常人とは明らかに異なり、がん由来エクソソー
ムががん検知のバイオマーカーとして機能することが示唆された。

４．今後の展望
がんの早期発見のためには、がんに罹患する前のがん検診が重要であるが、現状では検診の煩わしさから、その受診率が極めて低くなっている。本研究で開発したエクソソーム自動分析計を用いることで、体液中のエクソソームを容易に分析可能となり、今後、大規模に臨床試料を収集してエクソソーム分析を行い、がん由来エクソソームの分析が、がん診断に確かに有用であることが実証されれば、その簡便性から、がん検診
受診率の向上に貢献することはもちろん、がん診断、治療効果、がんの転移予測、治療後の予後管理などにも適用可能で、本法は、国民の健康に大きく貢献することが期待される。

謝辞
図 1．エクソソームセンシングチップ
エクソソームの測定は、3D アームをもつ自動分注
ロボットに検出系として蛍光顕微鏡部分を搭載した特注のインタクトエクソソーム自動分析装置(図 2)にて行った。

図 2．エクソソーム自動分析計

本研究は JSPS 科研費 19H00845 および神戸医療産業都市推進機構の助成により行われた。

参考文献[1]. Valadi, H. et al., Nat. Cell Biol. 2007, 9, 654-659[2]. Hoshino, A. et al., Nature 2015, 527, 329-335.
[3]. Takeuchi, T. et al., Chromatography 2016, 37, 43-64(open access).
[4]. Takeuchi, T., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56,
7088-7092.
[5]. Takeuchi, T., Sunayama, H. Chem. Commun. 2018, 54,
6243-6251 (Feature article).
[6]. Takeuchi, T., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53,
12765-12770.
[7]. Sunayama, H., et al. J. Mater. Chem. B 2016, 4,
7138-7145.
[8]. Horikawa, R., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55,
13023-13027.
[9]. Morishige, T., et al. ChemNanoMat 2019, 5, 224-229.
[10]. Matsumoto, H., et al. Sci. Technol. Adv. Mater. 2019,20, 305-312.
[11]. Mori, K. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58,
1612-1615.

59

第 71 回日本生物工学会大会 トピックス集

ポリグルタミン酸生合成における新規エピメリ化反応
佐藤

将太 1・重松1

真由子 1・加藤陽菜多 1・小笠原泰志 2・大利徹 2＊

北海道大学 大学院総合化学院，2 北海道大学 大学院工学研究院〒060-8628

札幌市北区北 13 条西 8 丁目
Tel: 011-706-7815

北海道大学 大学院工学研究院

Fax: 011-706-7118

E-mail: dairi@eng.hokudai.ac.jp

γ-ポリグルタミン酸 (PGA) は、納豆菌等が生産し納豆の糸の成分として知られる D,L-グルタミン酸 (Glu) の混合ポリマーである。これまでに 3 つの酵素 PgsBCA の生合成への関与が示されているが、いずれも膜酵素であり in vitro での反応解析がほとんどなされておらず、詳細は未解明である。
納豆菌はグルタミン酸ラセマーゼを有し、D-Glu を生合成できることから、これまで D,L-Glu の両者の重合反応により混合ポリマーが生合成されると考えられてきた。しかし、最近当研究室で見出したペプチド系天然物 MS-271 の生合成に関与する新規ペプチドエピメラーゼ (MslH) が PgsA と高い相同性を有することから、PGA の生合成においてもペプチド鎖上の L-Glu 残基のエピメリ化反応によって D-Glu 残基が導入される可能性が示唆された。そこで本研究では、グルタミン酸ラセマ
ーゼ欠損大腸菌で pgsBCA を異種宿主生産し、安定同位体標識した D-、L-Glu の投与実験により PGAの生合成にエピメリ化反応が関与することを実証した。
1. はじめに

最近ラッソペプチド天然物 MS-271 の生合成に関わる
新規ペプチドエピメラーゼ（MslH）を見出しており、

γ-ポリグルタミン酸 (PGA) は、 D,L-グルタミン酸

これが PgsA と高い相同性を示したことから、PGA の(Glu) がイソペプチド結合でつながった混合ポリマー

生合成では、L-Glu が伸長鎖に取り込まれてからペプであり、主に納豆菌 (Bacillus subtilis var. natto) 等のチド上のエピメリ化 (立体反転反応) により D-Glu とBacillus 属細菌によって生産され、納豆の糸の成分となる可能性が示唆された (図 1C)［1］。そこで本研究して日本人になじみ深い (図 1A)。また、安全かつ高では安定同位体の取込み実験でその検証を行った。

い保水性や生分解性の特徴を有することから食品や化粧品の添加物、水質改善剤など様々な用途で利用されている。PGA の生合成に関しては、これまで生産菌が共通に持つ 3 つの遺伝子 (pgsBCA) の関与が示されている。このうち PgsB は ATP 依存のアミド結合形成
酵素と相同性があり、Glu 重合の中心反応を担うことが示されているが、PgsA および PgsC は既知の酵素との相同性を有さず、また PgsBCA は何れも膜酵素であることから、in vitro での解析が殆どなされておらず
生合成機構の詳細は未解明である。前述のように PGA
は D-Glu を含むが、D-Glu は微生物の細胞壁のペプチ
ドグリカンの成分として必須であり、Bacillus 属細菌
もグルタミン酸ラセマーゼにより D-Glu を生合成できる。このため、PGA は D,L-Glu の両者の重合反応により生合成されると考えられてきた。しかし、筆者らは60

図 1. PGA の構造 (A)、PGA 生合成遺伝子 (B)、および予想されるエピメリ化反応 (C)2. 結果と考察

り込みは見られなかったのに対し、標識 L-Glu を用いた場合には D,L-Glu 残基ともに重水素の取り込みが確

PGA 生合成におけるエピメリ化反応の関与は、同認された。この結果から PGA の D-Glu 残基の由来は

位体標識実験で PGA 中の D-Glu 残基の由来が D-Glu、

L-Glu であり、PGA の生合成にペプチド上のエピメリ

L-Glu のいずれかを解析すれば検証可能である。仮説

化反応が関与することが明らかになった［2］。

が正しい場合、L-Glu の取込みが期待される。しかし、納豆菌はグルタミン酸ラセマーゼを有しているため、
D,L-Glu の標識体を区別できない。そこで、グルタミ

ン酸ラセマーゼの欠損に起因する D-Glu 要求性大腸菌(WM335) で PGA 生産系を構築し、投与実験を行った。
はじめに WM335 を宿主に用いた PGA の異種生産を確認するため、Bacillus megaterium 由来の pgsBCA
遺伝子を WM335 に導入、形質転換体を培養後、既知の方法で PGA を精製した。PGA の生産は 1H-NMR とアミノ酸分析で確認した。続いて PGA を Bacillus
subtilis 168 が持つ２つの PGA 分解酵素 (YoqZ とGGT) で Glu モ ノ マ ー へ と 加 水 分 解 後 、 L-FDAA

図 3. PGA の生合成

(2,4-dinitro-5-fluorophenyl-L-alaninamide) でキラル誘導体化、LC-MS 分析し、PGA が D/L 比 20/80 の Gluで構成されていることを確認した（図 2A）。

これまで PgsA は N 末に膜貫通領域を持ち細胞膜の外側に局在することが示されていた。本結果を踏まえ

次に PGA 中の D-Glu 残基の由来を確認するため、た PGA の推定生合成機構を図 3 に示す。すなわち、

重水素標識した Glu (D-または L-[4,4-2H2]Glu) を投与

L-Glu が PgsBCA 複合体に取り込まれることで鎖伸長して PGA を生産させた後、Glu 残基への重水素の取込

反応が起こった後、PgsA が PGA を細胞外側に輸送、みを LC-MS で分析した。その結果、標識 D-Glu を投

その際に一定の割合でエピメリ化を触媒し D-Glu 残基

与した場合には D-,L-Glu 残基のいずれにも重水素の取を導入すると考えられる。
3. 今後の展望
本研究ではグルタミン酸ラセマーゼ欠損大腸菌と安同位体標識した D,L-Glu を用いて PGA の生合成にペプ
チド上のエピメリ化反応が関与することを示した。今後は、遺伝子の交換実験によりエピメリ化を担う酵素
同定、D,L-Glu 比の制御機構の解明し、生合成工学による PGA 生産への応用に発展させていくことを目指したい。
本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業 新学
術領域研究 (生合成リデザイン) 16H06452、基盤研究
18H03937 および 18K05449、旭硝子財団の助成を受けて実施されました。

図 2. キラル誘導体化 Glu の LC-MS 分析結果
左 か ら MS ク ロ マ ト グ ラ ム (ESI negative, m/z[1]. Feng, Z., Ogasawara, Y., Nomura, S., and Dairi, T.

399±1.5)、L-FDAA-L-Glu の MS、L-FDAA-D-Glu の MS

ChemBioChem, 19, 2045–2048 (2018).

(A) 非標識、(B) D-[4,4-2H2]Glu 投与 (1 g/L)、[2]. Ogasawara, Y., Shigematsu, M., Sato, S., Kato, H.,(C) L-[4,4- H2]Glu 投与 (1 g/L)

and Dairi, T. Org. Lett., 21, 3972–3975 (2019).

261

第 71 回日本生物工学会大会

トピックス集爆発性芳香族化合物の簡便・迅速な検出に向けた
TNT 認識ペプチド修飾量子ドットの作製児美川

拓実 1・Abiral Tamang2・田中1

祐圭 1・Kevin Critchley2・Stephen Evans2・大河内美奈*1

東京工業大学物質理工学院，2 University of Leeds, School of Physics and Astronomy〒152-8552

目黒区大岡山 2-12-1

東京工業大学物質理工学院

Tel: 03-5734-2116
E-mail: okochi.m.aa@m.titech.ac.jp

代表的なニトロ芳香族化合物である 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)を対象として、TNT 認識ペプ
チドを表面に修飾した量子ドットを用いることで、迅速・簡便かつ選択的な検出を実現した。ペプチドは抗 TNT 抗体の相補性決定領域から取得し、合成した量子ドットに修飾した。本技術は、蛍光分光光度計や UV ランプを用いた肉眼での観察により、1 分以内での迅速な検出が可能であることが特徴であり、簡便な爆発物検出法の開発につながると期待される。

１．はじめに
昨今のテロ事件の増加を受けて、空港等での爆発物検出の重要性が再認識されている。さらに、地雷の探索や河川や土壌におけるコンタミネーションのモニタリングなど、爆発性および人体・環境に対する毒性を有するニトロ芳香族化合物のオンサイト検出の需要も高まっている。
当研究室ではこれまでに、代表的な爆発性化合物であり、軍事用途において使用されている化合物である
2,4,6-trinitrotoluene（TNT）を対象に、TNT 認識ペ
プチドをセンサチップに固定化した表面プラズモン共鳴（SPR）センサを用いたオンサイト高感度検出技術の開発を行ってきた。SPR は装置の小型化が可能で、高感度検出を達成できるものの、装置が高価である、校正・検出に時間を要する、実験操作が煩雑であるなどの課題も存在した。
本研究ではナノ粒子が発する蛍光の減衰による、簡便かつ迅速な TNT の検出の実現を目指し、蛍光を発す
るナノ粒子として量子ドットに着目した。量子ドット
は、液晶やバイオイメージングへの応用が注目されているナノ材料であり、非常に安定した強い蛍光を示すことで知られている。そこで、TNT 認識ペプチドを表面に修飾した CdTe/CdS コアシェル型量子ドットを作製し、量子ドット溶液中に TNT 溶液を滴下した際の量
子ドットの蛍光の消光により検出を試みた。また、類似の化合物に対する選択性試験を行うことで、TNT 特
異的な検出が可能であることを確認した。

62

２．実験・結果(1)TNT 認識ペプチドの探索
TNT 認識ペプチドは、抗 TNT 抗体の相補性決定領域(CDRs) の 配 列 か ら 取 得 し た 。 Keyhole limpet
hemocyanin (KLH) タンパク質の表面に TNT 類似物質を修飾した TNP-KLH を用いて作製したハイブリドーマ細胞から、RT-PCR により cDNA を取得し、抗 TNT 抗体およびその CDRs の配列を決定した。
その後、抗体のもつ 6 つの CDR 配列のうち、最も強
く TNT に結合する配列を選抜するため、メンブレン上に各ペプチドをスポット合成するペプチドアレイ技術
を用いて結合性を評価した。測定には、TNP-KLH、抗KLH 抗体、蛍光標識二次抗体を用いた ELISA 法を使用した。その結果、重鎖 CDR3 配列のペプチドの TNT への結合性を確認した（図 1）。得られた CDR3 配列をリガ
ンドとしてセンサチップに固定化し、SPR を用いて結合力を測定したところ、解離定数は 1.3 μM となった。
続いて、重鎖 CDR3 配列を前後からトランケーションした配列をペプチドアレイ技術によって合成し、同様のTNT 結合試験を行った。最終的に、12 残基からなる TNT
認識ペプチド (ARGYSSFIYWFF) を取得した 1)。
(2)量子ドットの合成・ペプチドによる機能化
CdTe/CdS 量子ドットは、カドミウムイオン溶液に水
素化テルルガスを注入して種結晶を生成させた後、還流することで結晶成長させることでコアを形成させ、チオ尿素を添加することで表面にシェルを付加した。
合成した量子ドットは、平均粒径 3.5 nm 程度で、550 nm

付近の蛍光を発し、量子効率は 11%程度であった。また、表面に CdS シェルを持つため、ジスルフィド結合を介した表面へのシステイン付加ペプチドの修飾が容易であるという特徴をもつ。C 末端側にシステインを付加した TNT 認識ペプチドを量子ドット溶液と混合し修飾を行った (図 2a)。また、ゼータ電位および動的
光散乱(DLS)からペプチドの固定化を確認した(図 2b)。

みという非常に簡便な方法での検出が実現した。
TNT 滴下後の蛍光強度の経時変化を評価したところ、蛍光変化は 1 分以内に起こることが確認された。さらに、類似化合物である、2,4-Dinitrotoluene (DNT) お
よび Toluene との結合性試験の結果、DNT およびToluene に対する消光はほとんど見られなかったが、DNT および Toluene と TNT との混合サンプルに対しては、TNT と同様の消光を示したことから、TNT に対する
選択的な応答であることが確認された(図 3c)。

図 1 a 抗体から TNT 認識ペプチドの取得 b ペプチドアレイを用いた TNT 結合性評価

図 3 a 量子ドットによる蛍光検出の概略 b TNT 濃度に応答した量子ドットの蛍光の消光 c 類似化合物 (DNT,
Toluene)に対する選択性試験
３．考察
TNT 認識ペプチドの TNT への選択的な結合は、芳香族アミノ酸 (Y、F、W) と TNT の芳香環とのπ電子相互作用および、塩基性アミノ酸 (R) のアミノ基と TNTのニトロ基の静電的相互作用によるものと推察される。
量子ドットを用いた TNT 検出原理として、TNT が量子ドット表面のペプチドに結合することによるエネル
ギー移動であると考えられる。

図 2 a 量子ドットに対するペプチド修飾。b ペプチド
修飾前後の粒径変化 c ゼータ電位変化(3)ペプチド修飾量子ドットによる TNT 検出
TNT 溶液を 100 nM の TNT 認識ペプチド修飾量子ドット溶液中に滴下し、量子ドットの蛍光強度の変化を測定した。蛍光分光光度計による測定から、滴下した TNTに濃度に応じて量子ドットの蛍光が減衰することが示された(図 3b)。この際の検出限界は 1 μM (228 ppb) 程度であると計算された。また、UV ランプを用いても、感度は劣るものの、肉眼で量子ドットの蛍光の減衰が確認できた。本手法では、溶液中に TNT を滴下するの

４．今後の展望
本研究では、TNT 認識ペプチドを修飾した量子ドットによる TNT の蛍光検出が実現した。この手法は、オンサイトにおいて非常に簡便かつ迅速に TNT を検出できる技術として応用が期待される。今後は、夾雑物存在下での安定した検出が可能であるか、また作製したナノ材料の保存安定性など、実用化に向けた課題を検討する予定である。
５. 参考文献
1) Okochi M, et al.: ACS Comb. Sci., 19, 625-632 (2017)63皆様の分析をサポートする

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http://www.bizen-c.co.jp

第 71 回日本生物工学会大会講演トピックス集
2019 年 8 月 9 日発行
発行所

公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
大阪大学工学部内
TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp

編

第 71 回日本生物工学会大会実行委員会

集