第2回バイオ医薬展2018

基礎から解説コアシェルカラム
多孔質の厚さで変わるタンパク分析(クロマニックテクノロジーズ)
長江 徳和，塚本 友康，佐藤 誠
1

コアシェルシリカの歴史
1967・1968年に基本特許は出願されている。

(1) J.J. Kirkland, F.A. Truszkowski, C.H. Dilks, and G.S. Engel, J. Chromatogr.,
A 890, 3–13 (2000).
(2) J.J. Kirkland, T.J. Langlois, and J.J. DeStefano, Am. Lab. 39, 18–21 (2007).

2007年に微小粒子の製造法の特許が出願された。
2

コアシェルカラム
Manufacturer

Brand

Porous layer
Particle size
Pore diameter Surface area
thickness(μm)(nm)(m2/g)(µm)

Bonded phase1

Advanced
Chromatography
Technologies

UltraCore

2.5, 5

C18, Phenyl-hexyl

2

Advanced Mterials
Technologies

HALO

2.0, 2.7,
3.4,4.6

120, 135, 15,0.2, 0.4, 0.5,
9, 16, 40, 100
90
0.6

C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP, Cyano, RP-Amide, HILIC,
Pentahydroxy-HILIC, C4, Glycan

3

AkzuNobel

Kromasil ClassicShell/
EternityShell

2.5

0.5

110

C18, C8

4Agilent Technologies

PoroShell

1.9, 2.7, 4, 5 0.25, 0.5

12, 30130

C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP, SB-Aq, Cysno, HILIC

5

Chrom4

Isosceles

2.6, 4.6

9.5, 16

140, 90

C18, AQ, C8，C3, Phenyl-hexyl, PFP, Amide(HILIC)

6

ChromaNik
Technologies

SunShell

2.0, 2.6, 3.4, 0.2, 0.4, 0.5, 9, 12, 16, 30,
4.6
0.6
100

7

Dr Maisch

PeproShell

2.6

8

Fortis Technologies

SpeedCore

2.6, 3.5, 5

0.4

8, 16, 30

140

C18, C18-Amide, C18-PFP, Diphenyl, PFP, HILIC C8, C4

9GL Sciences

InertCore

2.4

0.3

9

100

C18

10

Knauer

BlueShell

2.6, 4.5

0.5

8

130

C18, C8

11

Merck (supelco)

Ascentis Express/
BioShell

2.0, 2.7, 3.4, 0.2, 0.4, 0.5,
9, 16, 40,50.6120, 135, 80,
15, 90C18, C8, C4, RP-Amide Phenyl-Hexyl, Biphenyl, Cyano, PFP,
Pentahydroxy-HILIC

12

Macherey-Nagel

NucleoShell

2.7

0.5

9

130

C18,Phenyl-Hexyl, PFP, HILIC

13

Nacalai Tesque

CosmoCore

2.6

0.5

9

150

C18, Cholestrol, Pentabromobenzyl

14

Perkin Elmer

Brownlee SPP

2.7

0.5

9, 16

15

Phenomenex

Kinetex/ Aeris

1.3, 1.7, 2.6, 0.2, 0.23,
3.6, 50.35, 0.67

16RestekRaptor

2.7

9

150

C18, Biphenyl, PFP, HILIC

17

Sepax Technologies

Opalshell

2.6

0.5

9

150

C18

18

Osaka Soda

2.7

0.5

9, 16, 30

150

C18, AQ, Adamantyl , Phosphocholine, PFP

19

SCAS

Capcell Core
Sumipax ODS Z-Shel
Sumichiral OA-Shell P1

2.6

0.5

9, 30

150, 40

C18, Poly(diphenylacetylene) derivative

20

SIELC Technologies

21

Thermo Scientific

Accucore

2.6, 4130

Mixed mode: RP + cation exchange, aRP + anion exchnge, HILIC+ ion exchange
C18, C8, AQ, henyl-Hexyl, Phenyl, C30, PFP

22

WatersCortecs

1.6, 2.7

0.26

9

100

C18, C8, Phenyl-Hexyl, HILIC

23

Welch

Boltimate

2.7

0.5

9

120

C18, Phenyl-Hexyl, PFP, HILIC

24

YMC

Meteoric Core

2.7

0.5

8, 16

150, 90

C18, C8

Coresep

9.5

0.5, 0.6130150, 90, 40,15, C18, RP-AQUA, C8, PFP, Pnenyl-Hexyl, 2-Etheylpyridine, HILIC22
Amide, C30, Hexafunctional C18, C4
C18

2.7

10, 20C18, C8, Phnyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, HILIC
200

9
8, 15

C18, C8, Phenyl-hexyl, PFP, Biphenyl, HILIC, C4

3

コアシェル粒子（クロマニックテクノロジーズ）
2.6 μm

多孔質層（シリカゲル層）
核（ノンポーラスシリカ）

0.5 μm
1.6 μm

5 μm for routine
0.6 μm

細孔径 9 nm,Core

2.6 μm16 nm,
30 nm,
100 nm

3.4 μmCore

4.6 μm

3.4 μm for protein

細孔径 9 nm

0.2 μm2 μm
0.4 μm
3.0 μm
3.4 μm

Core

細孔径

30 nm

1.2 μm
2 μm

Core

細孔径

9 nm
4

コアシェルシリカの電子顕微鏡写真
CP-SEM

粒子径: 2.6 μm
細孔径: 16 nm

粒子径: 2.6 μm
細孔径: 100 nm

粒子径: 3.4 μm
細孔径: 30 nm

コアシェルシリカ粒子を樹脂包埋し、Arイオンミリングにより断面加工し、導通処理のためOs(オスミ5ウム)蒸着して観察しました。コア（フューズドシリカ）とその周りの多孔質層が確認できます。

コアシェル構造なぜ高理論段数か？
Van Deemterの式

6

コアシェルと全多孔性充填剤の比較
拡散幅
Ca. 2.0 µm
sampleコアシェル型

拡散幅
試料成分が充填
剤内に入った後拡散して広がる2.0 µmsample

全多孔性

2.0 µm
1.6 µm
2.6 µm理論段高さのA項は粒子径ではなく，拡散の幅に関係している？
7

全多孔性とコアシェルの理論段高さの比較
18
16

Fully porous 5 um

Plate Height, μm

14

Fully porous 3 um

12

Fully proous 1.8 um

10Core Shell 2.6 um

8Fully porous 2.6 um

6Column: C18, 50 x 4.6 mm
Mobile phase:
Acetonitrile/water=(60/40)
Temperature: 25 oC
Sample : Naphthalene

4
2
0
0

5

10

15

Mobile Phase Velocity, mm/sec
8

Sub2 µmカラムとコアシェル型カラムとの圧力比較
45
Sunniest C18-HT 2.0 um
Brand A C18 1.9 um
Brand B C18 1.8 um
Brand C C18 1.7 um
Brand D C18 2.6 um
SunShell C18 2.6 um

40

Pressure, MPa

35
30
25
20
15

Column dimension: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: Acetonitrile/water=(70/30)
Temperature: 25 oC

10
5
0
0

0.5

1

1.5

Flow rate, mL/min9コアシェルC18の標準試料の分離例
UHPLC使用
1

3

サブ2µm（1.8µm）と同じ段数

2

0

4

2

1

Column: SunShell C18, 2.6 µm 100 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.3 mL/min
サブ2µm（1.8µm）のPressure: 12.5 MPa
半分以下の圧力
Temperature: 25 ºC

段数(3)=21,300

4

6

Sample: 1 = Uracil
2 = Toluene
3 = Acenaphthene
4 = BUtylbenzene

8Retention time/min

2

Plates(3)=38,000
3Retention time/min

4

Column: SunShell C18, 2.6 µm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=70/30
Flow rate: 1.0 mL/min
Pressure: 11.5 MPa
Temperature: 25 ºC

10単位圧力あたりの段数比較
PlatesPressure(MPa)

Plates/pressure

Sunniest C18-HT 2.0 µm

9,900

16.7

593

Brand A C18 1.9 µm

7,660

16.3

470

Brand B C18 1.8 µm

10,10019.6

515

Brand C C18 1.7 µm

11,14032.0

348SunShell C18 2.6 µm

9,600

9.7

990

Sunniest C18-HT 2.0 µm
Brand A C18 1.9 µm
Brand B C18 1.8 µm
Brand C C18 1.7 µm

2～３倍SunShell C18 2.6 µm
0

5,000

10,000

0

10

20

30

0

300

600

Column: 50 x 2.1 mm C18, Mobile phase: Acetonitrile/water=(70/30), Temperature: 25 oC

900

11

通常仕様とセミミクロ仕様のHPLCの比較

Flow cell

Response Sampling Tubing ID

Normal 13 μL

0.1 sec

0.4 sec

0.25 mm

Semi-micro 3.2 μL 0.1 sec

0.4 sec

0.13 mm

Semi-micro 3.2 μL 0.05 sec

0.05 sec

0.13 mm

45000

Column: SunShell C18, 5 μm 250 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O= 70/30
Flow rate: 1.0 mL/min,
Temperature: 40 ºC
Pressure: 6.7 MPa
Detection: UV@250 nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Toluene
3 = Acenaphthene
4 = Butylbenzene

40000
Acenaphthene

理論段数

35000

Toluene

Butylbenzene

30000
25000
20000

Semi-micro 0.05 sec
Semi-micro 0.1 sec
Normal 0.1 sec

15000
10000

Uracil

5000
0
0

5

ピーク幅/秒10

15

HPLC: Hitachi LaChrom ELITE

12イソクラティック溶離例 5μm C18からの移行
Brand F C18, 5 μm 250 x 4.6 mm

HPLC

N(4)=19,313

3

1
2

3
1

SunShell C18, 2.6 μm 100 x 4.6 mm
4 5

2

0

2

4

N(4)=20,287

分析時間1/3

6

8

10
12
14
Retention time/min

16

18

20

1

5

4

2

1

22

N(4)=20,287

3

0

5

4

2

3

4

5

Sample: 1 = Benzydamine
2 = Ketoprofen
3 = Naproxen
4 = Indomethacin
5 = Ibuprofen

6

Retention time/min

3

UHPLC 1

N(4)=24,124

1.0 mL/min

2

5

4

3

1.8 mL/min

1
2

0

1

4

2

24

Column:Brand F C18, 5 μm 250 x 4.6 mm
SunShell C18, 2.6 μm 100 x 4.6 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphoric acid = 45/55
Flow rate: 1.0 mL/min,
1.8 mL/min at the lowest chromatogram
Temperature: 25 ºC
Pressure: 9.5 MPa for Brand F C18 5 μm
13.4 MPa for SunShell C18 2.6 μm
Detection: UV@230 nm

N(4)=22,424

HPLC: Hitachi LaChrom ELITE（内径0.25mmの配管仕様）
UHPLC: Jasco X-LC

5

3

Retention time/min

5µm, 250x4.6mmカラムに比べ分析時間1/6
4

5

6

13

なぜコアシェルカラムが選ばれるか？
1. 高理論段数，ハイスループット（高速分析）の全多孔性サブ2μm
カラムの需要が，この10年あまり大幅に伸びてきている。
2. コアシェル粒子は全多孔性粒子に比べ理論段数（性能）が50%アップする。
3. 言い換えれば，全多孔性の1.8μmの充填剤と同じ理論段数がコアシェルでは2.6μmの充填剤で達成される。
4. カラム圧を比較すると，粒子径の2乗には比例するため，コアシェルでは2.6μmの充填剤は全多孔性の1.8μmの充填剤の半分のカラム圧である。
5. UHPLCは高耐圧仕様であるが，低い圧での操作は装置のメンテ
ナンスを大幅に軽減できる。
6. サブ2μmカラムのユーザーもUHPLC装置に優しい（故障回数を低減できる） 2.6μmのコアシェルカラムに移行する例が多くなってきた。
14高分子分離用コアシェルカラム
（タンパク質用）
P/N

ParticleCore
size
diameterThickness of
porouslayer

Porediameter

Surfacearea

Carbonloading

Surfacecoverage

Endcapping

SunShell C4-100
C66961 2.6 μm
2.1 x 100 mm

1.6 μm

0.5 μm

100 nm

22 m2/g

0.6%3µmol/m2

Yes

SunShell C4-30
2.1 x 100 mm

C26961 2.6 μm

1.6 μm

0.5 μm

30 nm

40 m2/g

0.9%3µmol/m2

Yes

SunShell C8-100
C76961 2.6 μm
2.1 x 100 mm

1.6 μm

0.5 μm

100 nm

22 m2/g

0.9%2.5µmol/m2

Yes

SunShell C8-30
2.1 x 100 mm

C36961 2.6 μm

1.6 μm

0.5 μm

30 nm

40 m2/g

1.2%2.5µmol/m2

Yes

SunShell C8-30HT
C56961 3.4 μm
2.1 x 100 mm

3.0 μm

0.2 μm30 nm

15 m2/g

0.5%

2.5µmol/m2

Yes

15

コアシェル粒子の細孔分布
Desorption Dv (log d) (cc/g)

0.9Core shell 2.6um, 16nm

0.8Core shell 2.6um, 30nm

0.7Core shell 3.4um, 30nm

0.6Core shell 2.6um, 100nm

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

1

10

100

1000

Pore Diameter (nm)16タンパク質分離 温度の影響
Column:SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 min%B 20% 65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C or 60 C
Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: Jasco X-LC○

25oC
150 mm L

○

60 C
○

80 C
○

0

2

4

6

8

Retention time/min

10

12

17

タンパク質の分離

クラジエント時間の影響

390000Column:SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min%B 20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin,
5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: Jasco X-LC

340000○290000240000190000140000Time 0 min%B 20%

15min
65%

90000

Time 0 min%B 20%

25min
65%

40000

Time 0 min%B 20%

35min
65%-1000005

1015
Retention time/min

18標準タンパク質の分離(5min)
Column:SunShell C4-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C4-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30HT, 3.4 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min%B 20% 65%
Flow rate: 0.5 mL/min ,Temperature: 80 oC
Detection: UV@215 nm,
Injection volume: 0.5 μL
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: HITACIHI Chromaster

タンパク質分離には多孔質層が薄い方が有利だと言われるが，細孔径1000Å(100nm)の場合には多孔質層は0.5 μmでも問題ない。

ピーク幅(W0.5, min)
多孔質層
Cytochrome C
Lysozyme
BSA
Myoglobin
Ovalbumin

C4-1000.5 μm
0.047
0.045
0.079
0.048
0.109

C4-30
0.5 μm
0.057
0.056
0.122
0.066
0.133

C8-1000.5 μm
0.047
0.046
0.077
0.047
0.109

C8-30
0.5 μm
0.057
0.056
0.100
0.063
0.119

C8-30HT0.2 μm
0.046
0.046
0.075
0.045
0.109

試料濃度
0.025%
0.025%
0.050%
0.025%
0.025%

19

標準タンパク質の分離(60min)
Column:SunShell C4-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C4-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30HT, 3.4 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 60、 min%B 20% 65%
Flow rate: 0.5 mL/min ,Temperature: 80 oC
Detection: UV@215 nm,
Injection volume: 1.0 μL
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: HITACIHI Chromaster
Retention time / min

ピーク幅(W0.5, min)

多孔質層が薄い場合には試料負荷量が小さくなり，注入量を考慮しなければ
ならない。

多孔質層
Cytochrome C
Lysozyme
BSA
Myoglobin
Ovalbumin

C4-1000.5 μm
0.167
0.164
0.308
0.197
0.391

C4-30
0.5 μm
0.177
0.180
0.410
0.221
0.889

C8-1000.5 μm
0.160
0.153
0.276
0.180
0.247

C8-30
0.5 μm
0.155
0.166
0.514
0.199
0.428

C8-30HT C8-30HT 0.5uL 試料濃度
0.2 μm
0.2 μm0.212
0.144
0.050%
0.196
0.145
0.050%
0.422
0.330
0.100%
0.238
0.176
0.050%
0.184
0.176
0.050%

20

タンパク質の精密分離
Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 or 150 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 or 60 min%B 20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 oC , Detection: UV@215 nm
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

タンパク質の精製時界面活性剤を用いることがある。

BSA

Retention time/min

Ovalbumin
界面活性剤がタンパク質に結合していると

21

界面活性剤の分離 Triton X-100
Column: SunShell C18, 2.6 µm 150 x 3.0 mm i.d.
Mobile phase: Tetrahydrofuran:Acetonitrile:Water = 20:20:60
Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 25 oC
Detection: UV@275nm
Sample: 1= Triton X-100

0

5

10

15

20

25

30

Retention time/min

22

細胞培養によって得られた精製抗体（IgG）の分離
Column dimension: 100 x 2.1 mm i.d.
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.085)
30-45%B (0-30 min)Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC
Detection UV at 215 nm
Injection 5 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）
Not eluted

Totally porous C4, 300 ÅCore shell C8, 300 Å
この移動相条件の場合，C8
カラムではIgGは溶出しない

Core shell C4, 300 Å
SunShell C4-100, 1000 Å

Retention time/min

23

精製抗体（IgG）のサイズ排除分離
SunSec Diol30

Column: SunSec Diol30, 4 μm 300 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase:
0.1M Phosphate buffer + 0.2 M NaCl (pH6.8)
Flow rate: 0.35 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 2 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

2

4

6

8

10

12

14

Retention time/min24

2-プロパノールを移動相に添加したIｇGの分離
Column dimension: 100 x 2.1 mm i.d.
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/2-propanol/TFA (80/20/0.085)
15%B (0-0.5 min) and 15-50%B (0.5-50 min)Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC
Detection UV at 215 nm
Injection 5 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

2-プロパノールはC8カラム
でもIgGを溶出させるが，分離は悪くなる。

Core shell C8, 1000 Å

SunShell C4-100, 1000 Å

0

5

10
Retention time/min

15

20

25

25

ナノカラムによる細胞培養によって得られた精製抗体(IgG)の分離

Core shell C4, 300 Å
100 x 2.1 mm i.d.

Column dimension: 100 x 2.1 mm i.d.
100 x 0.15 mm i.d. (nano-clolumn)
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.085)
30-45%B (0-30 min) (0-15min）
Flow rate: 0.4 mL/min, 0.004 mL/min (nano-column)
Temperature: 80 ºC
Detection: UV at 215 nm
Injection: 5 µL, 0.1 µL (nano-column)
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

SunShell C4-100, 1000 Å
100 x 2.1 mm i.d.
SunShell C4-100, 1000 Å
100 x 0.15 mm i.d.

Retention time/min

26

Figure 1. Crystal structure of human IgG[1] with the x and y lengths.
27

細孔径100nmの コアシェルシリカ

Figure 2A. SEM image of a 2.7 μm superficially porous 1000Å particle. 2B. FIB image of a1000Å SPP showing the 1.7 μm core with 0.5 μm shell.

★直径0.1μmのシリカ一次粒子から多孔質層が形成されている。
★粒子径0.1μmのノンポーラス充填剤と同等な分離ができ，カラム圧は2.7μm粒子相当になる。
★したがって，粒子径0.1μmのカラムに比べ，2.7μmのカラムは 1/700の背圧になる。
28

細孔分布

Figure 4. Pore size distributions of 1.7 μm 300Å FPPs and 2.7 μm 1000Å SPPs.

29

Trastuzumabの試料負荷量とクロマトグラム

1.7倍の差トラスツズマブ（分子標的薬）
商品名（製造・販売会社）:ハーセプチン（中外製薬）
30

Trastuzumabの相互作用する表面
FPP: 70 m2/g，21 m2 (0.3g) in a 150 x 2.1 mm column
SPP: 22 m2/g，13 m2 (0.6g) in a 150 x 2.1 mm column, SPPはFPP比べ充填剤の比重が約2倍

FPP: 21 m2 x 30%= 6.3 m2/column

表面積の割合：30%
表面積の割合：80%

1.7倍

SPP: 13 m2 x 80%= 10.4 m2/column

400Å以上の細孔内でのみ相互作用

31

まとめ
コアシェル構造により全多孔性に比べ段数が50%アップする。
コアシェル粒子は表面に多孔質層が存在し，この層が0.5 μm以下であり，拡散の遅い高分子の移動
距離が全多孔性粒子よりも短く，短時間で平衡化される。
モノクロナール抗体のような分子量が15万を超える試料は，100nmの細孔径が有利に働く。
32

33