令和元年度

佐賀県工業技術センター研究報告書

地域資源を活用した機能性食品および素材開発（第 1 報）
－抽出溶媒の違いがレンコンポリフェノール精製物の特性に及ぼす影響－
食品工業部
鶴田裕美 岩元彬 柘植圭介
レンコンポリフェノールを機能性食品や化粧品原料として実用化するために，これまで抽出に使用していた含水アセトン（AWA）を安全性の高い抽出溶媒に変更する必要がある．本報では，AWA の代替溶媒として 50％エタノール，水，酢酸水を使用し，抽出・精製したポリフェノールの特性について調べた．収率，ポリフェノール量および抗酸化活性を測定した結果，50％エ
タノール抽出・精製物の収量は AWA の約 6 割であったが，ポリフェノール量および抗酸化活性は AWA 抽出・精製物と同等であり，代替溶媒として問題がないことを確認した．また，得られた精製物の抗菌性を評価したところ，頭皮のフケ症に関与する表皮ブドウ球菌に対して強い抗菌性が認められ，ヘアケア商品への利用展開の可能性が示唆された．

１．はじめに
佐賀県では，「中小企業による地域産業資源を活用した事業活動の促進に関する法律（平成 19 年施行）」に基づき，県内の中小企業の方々が広く活用し得る地域
産業資源を 295 件指定している（令和元年度）1)．具体的には，農林水産物で「みかん」や「佐賀のり」，鉱工．また，レンコンのポリフェノールは，可食部に比べて，皮や節などの未利用部位に多く存在することも認めている（図 2）7）．
最近では，レンコンのポリフェノールが皮膚のしわやたるみの原因となるマトリクスメタロプロテアーゼ
産生抑制作用や炎症性サイトカイン産生抑制作用を有業品またはその生産技術で「伊万里・有田焼」や「諸富
家具・建具」，観光資源で「吉野ヶ里遺跡」や「有明海」などが指定されている．中小企業者は，指定された地
域産業資源を活用した新たな事業計画を作成し，国の認定を受けることで，様々な支援策を利用することができる．これまでに，本県では，95 件の農林水産物がすることを見出し，食品のみならず化粧品原料としての有用性についても明らかにした 8）．また，レンコンのポリフェノールは，含水アセトンで抽出効率が高いことが分かっているが，食品原料や化粧品原料の製造においては，アセトンの使用は好ましくない．以前の研究で，含水アセトンの代替溶媒として 50％エタノール

地域資源として指定されており，「米」や「麦」などの農産物で事業化された例はあるものの，その採択数は多いとは言えない状況である．そこで，本研究では，地域資源として指定されている農林水産物や今後，指定を目指す農林水産物の機能性を明らかにすることで，農林水産物の付加価値向上やブランド化を促進し，生が有効であることを報告したが，得られた粗抽出物や精製したポリフェノールの詳細な特性については明らかにしていなかった 9）．

2- 6)

R
OH

産者や中小企業事業者の事業活動を支援することを目的とする．
レンコンは，本県の地域資源に指定されている農産物の一つであり，その生産量は全国 2 位，九州 1 位を誇る（平成 30 年度）．我々は，これまでに，未利用な規格外品のレンコンを新たな機能性食品素材として利用することを目的に研究を行なってきた．そのなかで，レンコンに含まれるポリフェノールは，主にカテキン
およびガロカテキンを構成成分としたプロアントシア
ニジン（PA）であり（図 1），肥満モデルマウスにおける脂肪肝改善効果や線虫の寿命延長効果を認めている

O

HO

OH
R

OH
OH

OH

O

HO

OH
R

OH

R=H ,

－ 27 －

OH

OH
O

HO

catechin/ epicatechin
R=OH,
gallocatechin/epigallocatechin

n

OH
OH

OH

図 1 レンコンポリフェノールの推定構造

令和元年度

佐賀県工業技術センター研究報告書

mg カテキン当量/ 100g 新鮮重量

2000

可食部

皮

節

1750
1500
1250
1000
750
500
250
0

金澄8号

在来種

図 2 レンコンの総ポリフェノール量（部位別）

図 3 乾燥前のレンコン皮

そこで，今回は，アセトン以外の安全性の高い溶媒を用いて抽出・精製したレンコンポリフェノールの抗酸化性や分子量の違いについて報告する．さらに，今後のスキンケア商品等の開発を考慮し，50％エタノー

精製物は，上記の方法で得られた各粗抽出物を水で再溶解し，疎水性吸着樹脂 Diaion HP-20 に吸着させた．
水で洗浄後，90％エタノールで溶出させ，濃縮乾固物
を精製物とした．Dimethyl sulfoxide（DMSO）に溶解し，ル粗抽出物から精製したレンコンポリフェノールの皮膚常在菌や汚染指標菌に対する抗菌性を評価した結果についても併せて報告する．
２．実験方法2.1 試薬類

各種分析に供した．
2.4 総ポリフェノール(TP)量の測定
TP 量の測定は Folin-Ciocalteu 法 10)を一部改良して行った．すなわち，96 穴マイクロプレートに 10 μL の試料溶液を加え，10 倍希釈したフォーリン・チオカルト
試薬 75 μL を加えて攪拌し，室温で 5 分間静置した．

実験に使用する試薬類について，Trolox は BIOMOL
Research Labs. Inc.（USA）製，Fluorescein, sodium salt はSigma-Aldrich Inc.（USA）製，2-Morpholinoethanesulfonicacid（MES）は株式会社同仁化学研究所（熊本）製，Diaion
HP-20 は三菱ケミカル株式会社（東京）製，ポリスチレ
ン標準品は昭和電工株式会社（東京）製，Mueller Hinton

さらに，2％炭酸ナトリウム溶液 75 μL を加え，攪拌し，室温で 15 分間静置後，750 nm の吸光度をマイクロプ
レートリーダー（Molecular Devices，Spectra Max M5）を用いて測定した．標準物質にカテキンを用いて検量線を作成し，試料のポリフェノール量をカテキン当量として換算した．

Broth は Becton, Dickinson and Company（USA）製，GAM
変法ブイヨンは日水製薬株式会社（東京）製，Nutrient
Broth No.1 は Sigma-Aldrich Inc.（USA）製，その他の試薬は富士フィルム和光純薬株式会社（大阪）製を用いた．
2.2 試料調製

2.5 プロアントシアニジン（PA）量の測定
PA 量の測定は，バニリン－塩酸法 11) を用いて行った．すなわち，試料溶液 0.5 mL に 4% バニリン－メタ
ノール溶液 3 mL を加え，撹拌した．さらに，塩酸 1.5
mL を添加し，撹拌後，室温で 15 分間静置し，紫外可視分光光度計（島津製作所，UV-3600）を用いて波長 500

県内の食品工場からレンコンの皮（図 3）を回収し，露点制御型熱風乾燥機（木原製作所，SM10S-EH-DPC）を用いて 70℃・20 時間乾燥させた．ハンマークラッシ
ャー（メッシュ孔径 0.3 mm）で粉砕し，試料とした．
2.3 粗抽出物および精製物の調製AWA（アセトン/水/酢酸＝70：29.5：0.5），50％エタnm の吸光度を測定した．標準物質にカテキンを用いて検量線を作成し，試料の PA 量をカテキン当量として換算した．
2.6 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）ラジカル
消去活性の測定
DPPH ラジカル消去活性を須田らの方法 12)を用いて

ノール，水，1％酢酸水の 4 種を抽出溶媒として使用した．試料 2ｇを遠沈管に精秤し，各抽出溶媒 20 mL を添加した．常温で 2 時間攪拌抽出し，遠心分離後の上清を回収した．この操作をさらに 1 回繰り返し，得られた減圧濃縮乾固物を粗抽出物とした．

測定し，抗酸化能の評価を行った．すなわち，96 穴マ
イクロプレートに 200 mM MES 緩衝液（pH 6.0）50 μL，
適宜希釈した試料溶液 50 μL を加え，攪拌した．エタ
ノールに溶解した 200 μM DPPH 溶液を 100 μL 加え，
室温で 20 分間反応後，520 nm の吸光度をマイクロプ－ 28 －

令和元年度

レートリーダー（Molecular Devices，Spectra Max M5）を用いて測定した．標準物質には，Trolox を用いて検量線を作成し，DPPH の退色率から試料の抗酸化能をTrolox 当量として換算した．
2.7 親水性活性酸素吸収能(H-ORAC)の測定

表 1 H-ORAC 測定条件

H-ORAC は，国立研究開発法人農業・食品産業技術
総合研究機構食品総合研究所の H-ORAC 分析法標準作
業手順書 13)に従い，蛍光マイクロプレートリーダー（TECAN，Infinite 200 PRO）を用いて測定した．試料
溶液および標準物質の Trolox は，リン酸緩衝液で適宜希釈した．96 穴マイクロプレートにブランク（リン酸

表 2 のとおりである．標準物質には，ポリスチレン 5種（分子量：19,500，9,590，4,730，1,920，580）を用い，重量平均分子量（Mw），数平均分子量（Mn）およびピークトップ分子量（Mp）を求めた．
2.9 抗菌性評価試験
抗菌性試験は，細井らの方法 14)を一部改良し，96 穴
マイクロプレートを用いて行った．供試菌は，独立行
政法人製品評価技術基盤機構から 9 株を購入し，その詳細と使用培地および培養条件は表 3 に示したとおりである．試料 150 g より 50％エタノールで抽出後に精製したレンコンポリフェノール精製物は，DMSO で溶
解後，0.2 μm 滅菌フィルターでろ過し，被験物質とした．マイクロプレートに培地 180 μL，終濃度が 1,600
ppm～25 ppm になるように 7 段階に希釈した被験物質
10 μL を添加した．供試菌液は，滅菌生理食塩水で初期菌数が 103～104 cfu/ｍL になるように希釈し，10 μL を接種した．培養終了後，600 nm または 660 nm の吸光度をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices，Spectra Max M5）を用いて測定した．対照に比べて吸光度の増加率が 50％以下の濃度を 50％生育阻害濃度（IC50），増加率が 10％以下の濃度を最小生育阻止濃度（MIC）と判定した．
また，IC50 および MIC 判定後のプレートから 5 μL

項目

条件

励起波長
蛍光波長

485 nm
535 nm

測定間隔

2分

測定時間

90 分

測定回数

46 回

恒温器

37℃
表 2 SEC 分析条件

項目

緩衝液）
，試料溶液，標準物質 35 μL を分注し，各ウェ
ルに 100.7 nM Fluoresein sodium salt 溶液 115 μL を加えた．
10 分間のプレインキュベーション後，31.7 mM 2,2’
-azobis (2-amidinopropane) hydrochloride 50 μL を加え，撹
拌後，蛍光強度を測定した．H-ORAC 値は，蛍光強度の減衰曲線下面積を算出し，検量線から Trolox 相当量として表した．蛍光マイクロプレートリーダーにおける測定条件は表 1 のとおりである．
2.8 サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）による分子量測定
精製物は，移動相で 0.5 mg/mL に溶解後，0.2 μm メ
ンブレンフィルターでろ過した．SEC の分析条件は，

佐賀県工業技術センター研究報告書

装置
移動相
流量
カラム
カラム温度
検出
試料注入量

条件
島津 LC-AT，RID-20A
50 mM LiBr 含む DMF
0.4 mL / 分
TSKgel Super AW3000，TOSHO（6.0×150 mm，4 µm）
40℃
示差屈折
20 µL

を採取し，200 μL の培地を分注したマイクロプレートに移した．培養終了後，600 nm または 660 nm の吸光度を測定し，対照に比べて吸光度の上昇が認められな
かった濃度を最小殺菌濃度（MBC）と判定した．
３．結果および考察
3.1 レンコン粗抽出物の収率，ポリフェノール量および抗酸化活性
各抽出溶媒で得られた粗抽出物の収率，ポリフェノール量および抗酸化活性を測定した結果を表 4 に示す．
粗抽出物の試料に対する収率は，1％酢酸水で最も多く，AWA で最も少なかったが大差ではなかった．TP 量お
よび PA 量は、いずれも AWA で最も高く，次いで 50％
エタノール，1％酢酸水，水の順であり，既報 9）と同様の結果が得られた．
抗酸化活性は，DPPPH ラジカル消去活性および HORAC 値ともに AWA で最も高く，次いで 50％エタノールで高かった．粗抽出物では，ポリフェノール量と抗酸化活性に正の相関が認められた．
3.2 レンコンポリフェノール精製物の収率，ポリフェ
ノール量および抗酸化活性
各粗抽出物から得た精製物の収率，ポリフェノール
量および抗酸化活性を測定した結果を表 5 に示す．各
精製物の試料に対する収率は，AWA で最も高く，次いで 50％エタノール，1％酢酸水，水の順であった．粗抽
出物に対する割合も AWA が最も高く，水で最も低値－ 29 －

令和元年度

佐賀県工業技術センター研究報告書

表 3 供試菌および培養条件
菌種

和名

菌株

分離源

使用培地

培養条件

1

Escherichia coli

大腸菌

NBRC3972

糞便

Mueller Hinton Broth

37℃・24hr・好気

2Staphylococcus aureus

黄色ブドウ球菌

NBRC13276

ヒトの病変

Mueller Hinton Broth

37℃・24hr・好気

3

Pseudomonas aeruginosa

緑膿菌

NBRC13275

外耳感染

Mueller Hinton Broth

37℃・24hr・好気

4Candida albicans

カンジダ菌

NBRC1594

気管支真菌症患者

NB Broth No.1

25℃・48hr・好気

5Staphylococcus epidermidis

表皮ブドウ球菌

NBRC100911

30 代女性の鼻腔

Mueller Hinton Broth

37℃・24hr・好気

6

Staphylococcus epidermidis

表皮ブドウ球菌

NBRC113846

鼻

Mueller Hinton Broth

37℃・24hr・好気

7

Cutibacterium acnes

アクネ菌

NBRC107605

顔のニキビ

GAM 変法ブイヨン

37℃・72hr・嫌気

8

Cutibacterium acnes

アクネ菌

NBRC113819

40 代男性の頬GAM 変法ブイヨン

37℃・72hr・嫌気

9

Cutibacterium acnes

アクネ菌

NBRC113869

30 代女性の鼻腔

GAM 変法ブイヨン

37℃・72hr・嫌気

表 4 レンコン粗抽出物の収率、ポリフェノール量および抗酸化活性
収率

TP 量

PA 量

DPPH 消去活性H-ORAC 値（%）（mg / g CAE）

（mg / g CAE）（µmol /g TE）（µmol /g TE）

AWA

21.7

174

173

1,237

1,372

50％エタノール

23.7

116

107

886

1,040

水

25.0

71

51

436

589

1％酢酸水

26.9

73

59

479

596

溶出溶媒

(CAE：カテキン当量，TE：Trolox 当量)

表 5 レンコンポリフェノール精製物の収率、ポリフェノール量および抗酸化活性
溶出溶媒

収率
（%）

粗抽出物比
（%）

TP 量

PA 量

DPPH 消去活性H-ORAC 値（mg / g CAE）

（mg / g CAE）（µmol /g TE）（µmol /g TE）

AWA

4.6

21.0

755

741

5,707

5,490

50％エタノール

2.7

11.5

764

718

5,773

7,477

水

1.3

5.3

665

547

4,877

8,160

1％酢酸水

1.6

5.8

737

658

5,436

7,654

(CAE：カテキン当量，TE：Trolox 当量)を示した．50％エタノール精製物の収量は，AWA の約6 割であり，精製物の収率には，抽出溶媒の種類が大きく影響することが示された．
各精製物の TP 量は，50％エタノールで最も高く，次いで AWA，1％酢酸水，水の順であった．PA 量は，AWA3.3 精製物の分子量
各精製物の分子量を SEC で測定した結果を表 6 に示
す．Mw および Mp は，AWA で最も大きく，次いで 50％
エタノール，水，1％酢酸水の順であった．Mn は，AWAで最も大きく，次いで 50％エタノール， 1％酢酸水，で最も高く，次いで 50％エタノール，1％酢酸水，水の順であった．水抽出で得られた精製物は，他の溶媒に比べて顕著に低いことが認められた．
DPPH ラジカル消去活性は，TP 量と PA 量がそれぞれ正の相関（r = 0.993，r = 0.983）を示し，水以外の抽出溶媒で高い値が認められた．一方，H-ORAC 値は，水の順であった．レンコン PA の構成成分であるカテキンの分子量が 290，ガロカテキンの分子量が 306 であることより，AWA 精製物の平均重合度は 14～15 量
体，50％エタノールおよび水は 8～9 量体，1％酢酸水
は 7～8 量体程度であることが推定された．また，上述
3.2 の H-ORAC 値と Mn が強い負の相関（r =‐0.984）

DPPH ラジカル消去活性の結果と相反して水抽出で最も高い値を示し，AWA 抽出で著しく低かった．

を示していることより，レンコン PA の H-ORAC の強さに分子サイズが関与している可能性が示唆された．

－ 30 －

令和元年度ニキビの原因菌であるアクネ菌 3 種については，
NBRC107605 株の IC50 が 400 ppm であったが，NBRC113819 株では800 ppm，
NBRC113869 株では1,600
ppm と差が大きかった．MIC は，いずれも 1,600 ppm
または 1,600 ppm 以上であり，強い抗菌性はなかった．

表 6 レンコンポリフェノール精製物の分子量
抽出溶媒

Mw

Mn

Mp

AWA

4,401

1,455

4,142

50%エタノール

2,683

1,107

2,655

水

2,576

970

2,125

1％酢酸水

2,344

986

2,089

佐賀県工業技術センター研究報告書

しかし，アクネ菌のレンコンポリフェノールに対する感受性は，菌株によって大きく異なる可能性が認められたため，今後はニキビ患者から分離した菌株を用いて評価する予定である．

（Mw：重量平均分子量，Mn：数平均分子量，Mp：ピークト
ップ分子量）

４．おわりに

3.4 50％エタノール抽出物から精製したレンコンポリ
フェノールの抗菌性評価

レンコンポリフェノールを機能性食品および化粧品
素材として利用するためには，これまで抽出溶媒として使用してきた含水アセトンを安全性の高い抽出溶媒に変更する必要があった．本研究では，以前の研究でAWA の代替溶媒として有用性が認められていた 50％
エタノールの粗抽出物および精製物の収率や特性につ50％エタノール抽出物から得た精製物の抗菌性を評価した結果を表 7 に示す．今回の抗菌性試験に用いた大腸菌，黄色ブドウ球菌，緑膿菌およびカンジダ菌は，
日本薬局方や JIS 規格の抗菌試験等に多用される菌株であり，自然界で汚染しやすい指標菌として用いた．
表皮ブドウ球菌とアクネ菌は，皮膚の常在菌であり，頭皮のフケ症やニキビとの関与が報告されている．
大腸菌では，IC50 が 1,600 ppm と強い抗菌性は認められなかった．黄色ブドウ球菌，緑膿菌およびカンジ
ダ菌については，いずれも MIC が 800 ppm であり，食品成分としては，比較的低濃度で抗菌性が認められた．
2 種の表皮ブドウ球菌では，いずれも MIC が 200 ppm，
MBC が 400 ppm と強い抗菌性が認められた．また，健常者とフケ症の頭皮の細菌叢を解析した結果，健常者の頭皮に比べ，フケ症の頭皮では，表皮ブドウ球菌が多く存在することが報告されており，レンコンのポリフェノールはヘアケア商品としての利用が期待できる可能性が示された 15)．

いて評価し，AWA，水，酢酸水を使用した場合と比較した．その結果，50％エタノール精製物は，収率ではやや劣るものの，TP 量および抗酸化活性において AWAと同等であり，水や酢酸水よりも有用性が高いことが確認された．また，精製物の分子量は，抽出溶媒の種類で異なり，AWA は他の溶媒に比べて高分子域の PA まで抽出できるが，H-ORAC 値は PA の分子量が大きくなるにつれて低下する傾向が認められた．
50％エタノール精製物の汚染指標菌および皮膚常在菌に対する抗菌性を評価したところ，汚染指標菌では，
黄色ブドウ球菌，緑膿菌およびカンジダ菌に効果が認められた．ニキビの原因となるアクネ菌については，
今回用いた菌株で強い抗菌性は見られなかった．フケ

表 7 レンコンポリフェノール精製物（50％エタノール抽出）の抗菌性評価

1
2

菌種

菌株

初期菌数
（cfu/mL）

IC50
(ppm)

MIC
(ppm)

MBC
(ppm)

Escherichia coli

NBRC3972

4.5×104

1,600

1,600

>1,600

NBRC13276

4.6×103

200

800

800

400

800

800

Staphylococcus aureus

3

Pseudomonas aeruginosa

NBRC13275

8.2×104

4

Candida albicans

NBRC1594

5.8×103

200

800

>1600

NBRC100911

5.6×103

25

200

400

NBRC113846

3.1×104

100

200

400

400

1,600

>1,60056Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus epidermidis

7

Cutibacterium acnes

NBRC107605

1.6×104

8

Cutibacterium acnes

NBRC113819

2.9×103

800

1,600

>1,600

NBRC113869

1.6×104

1,600>1,600>1,6009

Cutibacterium acnes(IC50：50％生育阻害濃度，MIC：最小生育阻止濃度，MBC：最小殺菌濃度)－ 31 －

令和元年度

佐賀県工業技術センター研究報告書

症と関連性の高い表皮ブドウ球菌については，強い抗菌性を示したため，今後，ヘアケア商品等への利用を検討していく予定である．
なお，本研究を実施するにあたって使用したマイクロプレートリーダーおよび紫外可視分光光度計は，電７）鶴田裕美，吉村臣史，澤田和敬，柘植圭介：佐賀県
工業技術センター研究報告書，24, 45-49 (2015)８) 山内良子，岩元彬，吉村裕美，柘植圭介：国内特許
第 6667773 号：炎症性サイトカイン産生抑制用の組成物（2020.2.28）

源立地地域対策交付金で導入した．
参考文献
１）佐賀県庁 HP：https://www.pref.saga.lg.jp/kiji00327303/index.html
２）鶴田裕美，柘植圭介，吉村臣史，小金丸和義，柳田

９) 鶴田裕美，柘植圭介，吉村臣史：佐賀県工業技術センター研究報告書，20, 51-55 (2011)10）Sun T, Tang J, Powers J. R.: Effect of pectolytic enzyme
preparations on the phenolic composition andantioxidant activity of asparagus juice. J. Agric. Food
Chem., 53 (1), 42-48 (2005).

晃良，永尾晃治：佐賀県工業技術センター研究報
告書，16, 51-53 (2007)３）鶴田裕美，柘植圭介，吉村臣史，小金丸和義，柳田晃良，永尾晃治：佐賀県工業技術センター研究報
告書，18, 41-47 (2009)４）Tsuruta Y, Nagao K, Shirouchi B, Nomura S, Tsuge K,11）Sun JS, Tsuanga YH, Chen IJ, Huang WC, Hang YS, Lu
FJ.: An ultra-weak chemiluminescence study onoxidative stress in rabbits following acute thermal injury.
Burns, 24, 225-231 (2000).
12）須田郁夫，食品機能研究法，光琳，218-220 (2000)
13）渡辺純，沖智之，竹林純，H-ORAC 分析法標準作

Koganemaru K, Yanagita T. : Effects of Lotus root (theedible rhizome of Nelumbo nucifera) on thedeveolopment of non-alcoholic fatty liver disease inobese diabetic db/db mice. Biosci Biotechnol Biochem.
76 (3), 462-466 (2012)５）Tsuruta Y, Nagao K, Kai S, Tsuge K, Yoshimura T,

業手順書，国立研究開発法人農業・食品産業技術
総合研究機構食品総合研究所(2013).
14）細井永次，鳴嶋善聡：抗菌剤の簡易評価法の開発，
埼玉県産業技術総合センター研究報告，第 8 巻（2010）15）Clavaud C, Jourdain R, Bar-Hen A, Tichit M, Bouchier

Koganemaru K, Yanagita T. : Polyphenolic extract oflotus root (edible rhizome of Nelumbo nucifera)
alleviates hepatic steatosis in obese diabetic db/db mice.
Lipids Health Dis. 10, 202 (2011)６）鶴田裕美，吉村臣史，澤田和敬：佐賀県工業技術センター研究報告書，23, 57-62 (2014)

C, Pouradier F, El Rawadi C, Guillot J, MénardSzczebara F, Breton L, Latgé JP, Mouyna I.: Dandruff Is
associated with disequilibrium in the proportion of the
major bacterial and fungal populations colonizing thescalp. PLoS One, 8 (3), e58203 (2013).

－ 32 －