コアシェル型充填カラムの固定相の展開とペプチド・タンパク質への応用
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

理論段数を上げるために・粒子径を小さくすることでカラム性能を上げることが可能(HETP≒2.2 x 粒子径)・カラム背圧は粒子径の2乗に反比例する(性能が高いカラムほど高圧)

粒子径

5 μm

3 μm

2 μm

2.6 μm

理論段高さ

11.0 μm

6.6 μm

4.4 μm

4.4 μm(HETP)

粒子径が小さいほど理論段高さは低くなる

コアシェル粒子では・・？

2

市販されているコアシェルカラム
SunShell（クロマニックテクノロジーズ） : C18, PFP, C8, Phenyl, RP-Aqua: C18, PFP, CN, PentaHILIC, RP-AmideHalo（AMT）: C18, PFP, AQ, PCCapcell Core（資生堂）: C18, PFP, C8, XB-C18, HILIC,Kinetex （フェノメネックス）
Kinetex Aeris（フェノメネックス）: C18, C8, C4 (タンパクペプチド分析用)
Ascentis Express（シグマアルドリッチ） : C18, F5(PFP), C8, OH5, RP-Amide: C18, C8, CN, Phenyl-Hexyl, SB-AQ
PoroShell（アジレントテクノロジ－）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, aQ, RP-MS
Accucore（サーモフィッシャー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, HILIC
Nuculeoshell（ナーゲル）: C18, PFP, C8, Amide, HILIC
Brownlee SPP（パーキンエルマー）

上記のメーカーより様々な固定相のコアシェルカラムが販売されてる。
( 固定相は抜粋)

コアシェルカラムはHPLCにおいて広く使用されるようになってきている
3市販されているコアシェルシリカ
核の径は1～3.2μm
多孔質シリカ層の厚さ0.2～0.6μm

・粒子径は1.7～5 μm
・細孔径は9～30 nm(3μm以下の粒子径では8～20 nm)

粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子はまだ販売されていない
粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子の開発を試みた
4

Desorption Dv (log d) (cc/g)

作成したコアシェルシリカの細孔分布0.90.8Core shell 30nm

0.70.6

Core shell 16nm

0.50.40.30.20.101

101001000

Pore Diameter (nm)5高分子分離用コアシェルカラム
作成した粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子を用いて以下のカラムを作成した
P/N
SunShell HFC18-30C46471
4.6 x 150 mm

PoreSurface
diameterarea

Carbonloading

C18EndSurface
capping
coverage

30 nm

40 m2/g

1.3%

1.2mmol/m2

Yes

SunShell C8-30
4.6 x 150 mm

C36471

30 nm

40 m2/g

1.2%

2.5mmol/m2

Yes

SunShell C4-30
4.6 x 150 mm

C26471

30 nm

40 m2/g

0.9%3mmol/m2

Yes

Particle diameter is 2.6 mm for all.

6

HFC18とは
Hexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

Sunniest
Bonding
Technology
Hexamethydichlorotrisiloxane+
Trimethylchlorosilane (TMS)
X
XX
SiSi

X

X

SiSiX（X: Cl, OCH3, OC2H5)

HFC18試薬の概略図

OOO

SiOSi

Si OOOSiSiOOOOOSiO OSiOOSiSiOSiOSi OSi
Si O OSiSi O
O OOOOSiHO OOSiSiSiSiOOSiOOOSiSiOOOOO
Si O

O O

O

シリカ表面への結合状態の概略図
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HFC18カラムのLC/MS移動相条件における耐酸性
Relative retention (%)

10095% line

8060
400.1% formic acid, pH2.670 ºC

2000200

400

600

Time (h)8001000

Durable test condition
Column : SunShell HFC18-162.6mm, 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1%
formic acid, pH2.6=40/60
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 70 ºC
Measurement condition
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

8ペプチドの分離
SunShell HFC18-16
Column:SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell HFC18-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C8-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C4-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell HFC18-30 Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 3 min 40 min
%B 5%
5%50%
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: Ambient
Detection: UV@210 nm,
SunShell C8-30
Sample: Tryptic digest of cytochrome C

SunShell C4-30

9タンパクの分離

SunShell
HFC18-30

SunShell
C8-30

SunShell
C4-30

Column: SunShell HFC18-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C8-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C4-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 4.6 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water, B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 min%B 20% 65%
Flow rate: 1.5 mL/min ,Temperature: Ambient
Detection: UV@210 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme,
3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin10選択性の異なるC18の比較

P/N

Pore
Surfacediameterarea

Carbonloading

C18EndSurface
capping
coverage

SunShell HFC18-16
CG6471
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

2.5%

1.2mmol/m2

Yes

SunShell C18-WP
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

5%2.5mmol/m2

Yes

CW6471

HFC18-WP は1対のシリル基によりC18を結合しますので，結合密度が低くなります。C18-WPに比べ約1/2です。
ペプチドやタンパク質はC18の結合密度により，分離が変化します。
11

結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC,
Sample: Tryptic digest of cytochrome C

Detection: UV@210 nm,

12結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC,Sample: Tryptic digest of myoglobin

Detection: UV@210 nm,

13SunShell C18-WPとRP-Aquaによるペプチドの分離
SunShell C18-WP

SunShell RP-Aqua

Column: SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell RP-Aqua, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: %B 0% – 100% in 35 min
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC, Detection: UV@210 nm,
Sample: Tryptic digest of myoglobin

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SunShell RP-Aquaによる核酸塩基の分離比較
Sunniest RP-AQUA
12Column:
Sunniest RP-AQUA 5 mm 150 x 4.6 mm
SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: Water
Flow rate: 1.0 mL/min for Sunniest
1.5 ml/min for SunShell
Temperature: 24ºCSample: 1 = Cytosine
2 = Uracil
3 = Thymidine
4 = Uridine
5 = Thymine

534

SunShell RP-AQUA
21345Plate(5)Resolution (4,5)

Sunniest

14,000

1.98

SunShell

30,0003.79

15SunShell RP-Aquaによる水溶性ビタミンの分離
SunShell RP-AQUA
1Column:
N(4)=30,800 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:N(3)=31,800
40mM Phosphate buffer pH6.8
43Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
2Sample: 1 = Nicotinic acid,
2 = Pyridoxal,
3 = Pyridoxine,
4 = Nicotinamide

16SunShell Al 微量アルミニウム測定専用カラム★13ppbアルミニウム標準品の測定例
オキシンを用いたキレート錯体として測定

213Column: SunShell Al 2.6mm, 4.6 x 30 mm
Mobile phase: 2-Propanol/buffer (pH7) = 30/70
Flow rate: 1.5 mL/min
Column Temperature: 25 oC
Pressure: 19.3 MPa
Fluorescence detection: EX= 370 nm, Em= 504 nm
Injection volume: 20 mL
Instrument: HPLC with 0.13 mm i.d. tubing from injector
to detector.
1: Oxine peak
2: 13ppb Aluminum standard solution
3: Blank (pure water)
Resolution of peak number 1 and 2: 2.00
This aluminum measurement is based on "Pharmaceutical Regulatory Science 35, 565-580 (2004)".

Time (min)

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まとめ
• 30 nm細孔を持つコアシェルシリカの合成に成功した。
• そのコアシェルシリカを用いて合成したカラムをペプチド、タンパクの分離に適用した。
• 結合密度の低いHFC18-16カラムにおいて，いくつかのペプチドで分離の改善が見られた。
• HFC18-16のLCMSでの使用を想定した耐酸試験において，1000時間以上の耐酸性能を確認できた。
• 今後コアシェルカラムは、多くの固定相が開発されていくと考えられる。

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