Journal of Fisheries Technology，13（1），13 − 19，2020

水産技術，13（1），13 − 19，2020

技術報告

吸光分析法によるリシリコンブ抽出液中
マンニトールの新規定量法
田園大樹＊

Determination of mannitol in extracts from the kelp Saccharina japonica var. ochotensis
by a newly developed spectrophotometric analytical method
Daiki TAZONO

A new spectrophotometric method to determine mannitol was developed by combining a conventional method based on
generation of formaldehyde and its detection with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydorazone (MBTH). Determination ofmannitol in extracts from the kelp Saccharina japonica var. ochotensis was difficult with the conventional method becauseof non-specific colorations caused by contaminants. However, the newly developed MBTH method enabled determinationsof mannitol with reasonable levels of accuracy after pretreatments to remove contaminants using chloroform and cationicdeproteinization agents. Although the MBTH method showed relatively low precision for samples with low or highmannitol concentrations, it will be useful for analyses of natural samples such as seaweeds that usually include large
amounts of contaminants.
キーワード：マンニトール，リシリコンブ Saccharina japonica var. ochotensis
2020 年 2 月 6 日受付2020 年 10 月 30 日受理

マンニトールは，高親水性で炭素数 6 の鎖状多価アル

マンニトール含量は，藻体の季節的な生理状態，栄養状コールであり，細菌類や真菌類，海藻，高等植物等にお態を推察する上で重要な指標となる可能性がある。また，

いてエネルギー代謝や浸透圧調整，抗酸化作用等に関係

昆布だしらしい呈味は，グルタミン酸ナトリウムとマンしている（Jennings et al. 1998，Shen et al. 1999）。海藻

ニトール，塩化カリウムによって発現するとされているのうち褐藻類においては，炭酸同化の一次生成物がこの（上田 1997）。このように藻体中のマンニトール含量は，

マンニトールであることが知られており，好気呼吸基質

昆布類の呈味性の指標としても重要であり，リシリコンのほか貯蔵態同化産物としても機能することが知られてブをはじめとした海藻藻体中のマンニトールを一定の精いる（Yamaguchi et al. 1966，Yamaguchi et al. 1969，広度で定量する方法の重要性は高い。

瀬 1981）。褐藻類のツルアラメ Ecklonia stolonifera におい

マンニトールをはじめとした糖アルコールは，総糖質ては，藻体中のマンニトール含量に季節変動が生じるこ

定量法であるフェノール−硫酸法には陰性である。また，とが知られている（小田桐・加藤 2014）。また，リシリ還元性を示さないことから，還元糖の定量法である

コンブ Saccharina japonica var. ochotensis についても，藻Somgy-Nelson 法も適用できない。このため液体クロマト

体中のマンニトール含量が時期によって大きく変動する

グラフィーやガスクロマトグラフィーで定量されることことが分かっており（Kodama and Kawai 2019），藻体中が多いが，高額で大掛かりな設備が必要でこれらを活用＊

北海道立総合研究機構栽培水産試験場〒 051-0013

北海道室蘭市船見町 1 丁目 156-3

Mariculture Fisheries Reserach Institute, Hokkaido Research Organization, Funamicho1-156-3, Muroran, Hokkaido 051-0013, Japan
tazono-daiki@hro.or.jp– 13 –

できる状況は限られる。

分子のホルムアルデヒドが生じることを利用したものでLarsen（1978）は，Cameron et al.（1948）の方法に準ある。本法は，2 mg/mL，4 mg/mL のマンニトール水溶

じた方法として，マンニトールを含む粉末試料に硫酸酸液を用いて酸化反応時間を検討し，マンニトールが十分性下でメタ過ヨウ素酸カリウム（以下，KIO4 ）を作用に酸化される 10 分間のみ，KIO4 を作用させる。その後，

させ，ヨウ素滴定により定量する方法を見出している。

メタ亜ヒ酸により酸化反応を停止し，生じたホルムアル

本法は糖アルコールが，他の糖類に比べ KIO4 により急デヒドをクロモトロープ酸で呈色させ，波長 570 nm の速に酸化されることに基づいており，適切な反応時間を

吸 光 度 を 測 定 す る こ と で マ ン ニ ト ー ル を 定 量 す る。

取ることで，マンニトール以外の夾雑する糖類の影響をTibbling 法では，硫酸亜鉛と水酸化バリウムによる陽イ

少なくしている。Larsen（1978）の方法は，食品加工利オン系の除タンパク処理を，発色の前処理として行うこ用の分野を中心に利用されているが，固形試料としてととしている。また，Tibbling 法はヒト血清試料につい100mg 程度を必要とするため，試料がさらに微量の場合ては高い添加回収率を示すが，クロモトロープ酸の呈色には適用できない。また，滴定操作は十分に習熟した者

阻害物質である硝酸イオンや亜硝酸イオンが含まれる試が行わないと誤差が大きくなることから，簡便かつ汎用料には適用できない。一方，リシリコンブに代表される的に使える方法とは言い難い。

褐藻類の抽出液等，生体由来試料の多くには，これらのGreefe et al.（2003）は，細菌の Leuconostoc mesenteroides

無機窒素イオンが含まれている。実際にリシリコンブ抽

由来の mannitol 2−dehydrogenase（以下，MDH）を触媒

出液について Tibbling 法により分析すると，抽出液の濃とし，マンニトールがフルクトースに酸化される際に酸度に依存しない一様な赤色を示し，試料がさらに高濃度化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下，の場合は黄色を呈すことから（Data not shown），本法をNAD と略）が還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ

そのままリシリコンブ等の海藻試料の抽出液に適用するオチド（以下，NADH と略）に還元されることを利用しことはできない。

＋

た，高感度なヒト血清中マンニトールの定量法を示してTibbling 法におけるクロモトロープ酸の役割は，試液いる（以下，本法を MDH 法とする）。MDH 法は，容易中のホルムアルデヒドを呈色させ定量することである。

な操作と分光光度計による吸光度の測定のみでマンニ

このことから Tibbling 法と呈色妨害物質の影響が少ない

トールを定量できる方法である。現在市販されるマンニ

ホルムアルデヒドの検出法を組み合わせれば，海藻抽出トール定量キットは，本法にさらにプローブによる呈色液のような夾雑物が多い試料であっても，分光光度計等

を組み合わせたものがほとんどであり，血清や尿，細胞の分析機器で簡易かつ汎用的にマンニトールの分析が可

培地，生体組織からの抽出液等さまざまな試料に応用可能と考えられる。ホルムアルデヒドの定量法は Tibbling能とされる（Bio Vision 社 D−Mannitol Colorimetric Assay

法で用いられるクロモトロープ酸のほか，アセチルアセ

Kit，BioAssay Systems 社 EnzyChrome D−Mannitol Assay

トン法（Nash 1953），パラロザニリン法（Lyles et al. 1965）

Kit 他）。しかし，MDH 法で用いる L. mesenteroides 由来などの測定法が知られているが，感度および操作の煩雑の MDH は非常に高価であり，多検体を分析するには費さの点で，微量のホルムアルデヒドを簡単かつ迅速に分用が高額となる。このため，市販のキットは，小容量で析できる方法とは言い難い（大富ら 1975）。これに関連の反応，検出が可能なマイクロプレートリーダーの使用して大富ら（1975）は，Sawicki et al.（1961）によってが前提となっており，コストや設備の面から汎用的な分提案され，Hauser and Cummins（1964）によって操作

析方法とは言い難い。また，MDH はマンニトールだけの簡略化が行われた大気中のホルムアルデヒド定量法

でなく，フルクトースに対しても作用する基質選択性を有することから，25 mM のフルクトースの共存によりを応用し，3−methyl−2−benzothiazolinonehydorazone（以下，MBTH）を用いた水中の微量ホルムアルデヒド定量法を26 ％ の 誤 差 が 生 じ る と 推 定 さ れ て い る（Greefe et al.

考案している。

2003）。加えて，MDH 法は NAD が NADH に還元される

本報では，Tibbling 法と大富らの MBTH を用いたホル＋ことを利用するが，NAD＋は補酵素として生体中に普遍的に存在する物質であることから，各試料の NAD＋量のバックグラウンドを別途定量する必要があり，分析コス
トや夾雑物，操作性の面も含めると汎用的に使える方法とは言えない。
Tibbling（1968）は，ヒト血清中マンニトールの定量法として KIO4 による酸化とクロモトロープ酸による呈色 を 組 み 合 わ せ た 方 法 を 示 し て い る（ 以 下， 本 法 をTibbling 法と示す）。糖アルコールに KIO4 が作用するとギ酸とホルムアルデヒドが生成するが，Tibbling 法は，マンニトールに KIO4 が作用することで 4 分子のギ酸と 2

図 1． Tibbling（1968） の マ ン ニ ト ー ル 分 析 法（Tibbling 法 ），大 富 ら（1975） の ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 分 析 法， お よ び
MBTH 法の概念図
実線枠は Tibbling 法を，点線矢印は大富らの方法を，点線枠は本報での MBTH 法を示す

– 14 –

マンニトールの新規定量法

ムアルデヒド定量法を組み合わせ，水溶液中のマンニチューブに移し，DW10 mL を分注して 1 晩水溶性成分を

トールを一定以上の精度で定量する手法を開発した（以抽出した。翌日，抽出溶液の上清 7 mL をマクロピペッ

下，MBTH 法 と す る ）（ 図 1）。 ま た 精 度 検 証 の た め，

トにより別の 15 mL プラスチックチューブに移し，藻体

MBTH 法により分析したリシリコンブ抽出液のマンニが入っているチューブに再度 DW10 mL を分注してさらトール添加回収率試験，および繰り返し試験の結果につに 1 晩抽出した。翌日，再び抽出液 7 mL を再度マクロピ

いて示す。

ペットにより分取し，前日の抽出液と合わせて計 14 mLのリシリコンブ抽出液を得た（以下，抽出液と表記する

材料と方法

場合は本抽出液のことを示す）。
MBTH 法の分析操作

試薬

試料 400 μL を分注した 1.5 mL プ

ラスチックチューブにクロロホルム 1,000 μL を分注し，1．MBTH溶液

3−Metyl−2−benzothiazolinonehydrazone

ボルテックスミキサーで攪拌してクロロホルムに可溶のhydrochloride（ 東 京 化 成 工 業 ）0.1 g を 蒸 留 水（ 以 下，

夾雑物を除去した。分離した水層から 50 μL を分取し，DW）100 mL に溶解し，0.1％（w/v）に調製した。

あらかじめ硫酸亜鉛溶液 1,000 μL を分注した別の 2.0 mL

2．酸化試薬

無水塩化鉄（III）（関東化学）1.0 g を

プラスチックチューブに加えた。さらに水酸化バリウ

DW100 mL に溶解した後，アミド硫酸（富士フィルム和ム溶液 1,000 μL を加えた後，ボルテックスミキサーで

光純薬）1.6 g をさらに添加して溶解した。

攪 拌 し， 遠 心 分 離 機（TOMY 精 工 MRX−150） に よ り
11,800 × g，5 分間，室温で遠心分離して除タンパク処理

3．硫酸亜鉛溶液

硫酸亜鉛七水和物（純正化学）2.5gをした。

を DW100mL に溶解し，87mM に調製した。
4．水酸化バリウム溶液

水酸化バリウム八水和物（富除タンパク処理後の上清 300 μL（分光光度計等で使用

士 フ ィ ル ム 和 光 純 薬 ）2.6 g を DW100 mL に 溶 解 し，する総液量1,200 μLの場合の液量。マイクロプレートリー

83 mM に調製した。

ダーを使用する総液量200 μLの場合は50 μLとする。以下，

5．過ヨウ素酸溶液 0.5 M に DW で希釈した硫酸（富括弧内はマイクロプレートリーダー用分析操作の液量を士フィルム和光純薬）100 mL にメタ過ヨウ素酸カリウ

示す）を 1.5 mL プラスチックチューブに分注した。続いム（富士フィルム和光純薬）0.46 g を溶解し，20 mM にて過ヨウ素酸溶液 100 μL（17 μL）を加え，正確に 10 分調製した。

間計測してマンニトールを酸化処理した。10 分経過後，6．メタ亜ヒ酸溶液

メタ亜ヒ酸ナトリウム（Sigma

Aldrich）2.6 g を DW100 mL に溶解し，200 mM に調製した。

メタ亜ヒ酸溶液 100 μL（17 μL）を直ちに加え，酸化反応を完全に停止させるため 20 分程度静置した。

マンニトール（富士フィル

MBTH 溶液 500 μL（83 μL）を加え，さらに酸化試薬

ム和光純薬）0.5 g を DW100 mL に溶解した標準原液を適200 μL（33 μL）を加えボルテックスミキサーで攪拌し，

宜 DW で希釈して使用した。

そのまま 45 分静置して呈色させた。呈色後の試液の一7．マンニトール標準液

8．クロモトロープ酸試薬

クロモトロープ酸二ナト部を分取し，分光光度計，あるいはマイクロプレートリー

リウム二水和物（東京化成工業）1.1 g を DW100 mL に溶ダーにより試液全量の波長 628 nm における吸光度を測解し，10 M に希釈した硫酸 450 mL と混合した。調製直定した。
MBTH 法によるマンニトール標準液の分析

後は発色が鈍いことから使用する2日以上前に調製した。

MBTH 法その他，除タンパク処理に際し，非極性化合物を除去のマンニトール検出感度，検量線直線性を確認するためするために，クロロホルム（富士フィルム和光純薬）を

0.0 mg/mL，0.1 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL の 濃 度用いた。メタ亜ヒ酸ナトリウムは純度 90％以上，そのに DW で調製したマンニトール標準液を，MBTH 法によ他試薬は各社特級品を用いた。

り 呈 色 さ せ， 分 光 光 度 計（ 日 立 ハ イ テ ク ノ ロ ジ ー ズ

供試藻体

北海道礼文町において生産されている養殖U-3300）により波長 628 nm における吸光度を測定した。

用リシリコンブ S. japonica var. ochotensis の 1 年目藻体をTibbling法によるマンニトール標準液の分析 MBTH法用いた。試料は 2019 年 6 月，8 月，9 月にそれぞれ採集とTibbling法とを比較するため，0.0mg/mL，0.1 mg/mL，0.4 mg/mL，1.0 mg/mL のマンニトール濃度に調製したマした。
リシリコンブ抽出液の調製採集した藻体の中央部か

ンニトール標準液を Tibbling（1968）に従って測定した。

ら，φ 20 mm コルクボーラーにより円形の藻体片を切りすなわち，硫酸亜鉛溶液 1,000 μL を分注した 2.0 mL プラ

出した。この藻体片を自然乾燥させた後，さらに乾燥機

スチックチューブに標準液 20 μL を分注し，さらに水酸（EYLA WFO−501W）により 80°C で 1 晩乾燥させ，ミル化バリウム溶液 1,000 μL を加えた後，ボルテックスミキ

サー（イワタニ IMF−180）により粉砕した。実験に供しサーで攪拌し，遠心分離機により 11,800 × g で 5 分間，

た 3 ヶ月分，各月 5 本（合計 15 本）の粉砕藻体片の乾燥

室温で遠心分離した。

重 量 は 25.9 ± 12.8 mg（ 平 均 値 ± S.D.）， 最 小 8.7 〜 最 大

遠心分離後の上清 300 μL を，15 mL 蓋付き試験管に分51.8 mg で あ っ た。 粉 砕 藻 体 片 を 15 mL プ ラ ス チ ッ ク

注した。続いて過ヨウ素酸溶液 100 μL を加え，正確に 10– 15 –

分間計測してマンニトールを酸化処理した。10分経過後，メタ亜ヒ酸溶液 100 μL を直ちに加え，酸化反応を完全に停止させるため 20 分程度静置した。
続いてクロモトロープ酸試薬3 mLを加え，密栓した後，100°C に設定したウォーターバスで 30 分間加熱した。加
熱終了後，蓋をゆるめ，室温まで冷却した後，試液の一部を分取して分光光度計（日立ハイテクノロジーズ U−3300）で波長 570 nm における吸光度を測定した。
MBTH 法における吸光度の経時変化

MBTH 法における呈色時間，および呈色の経時的安定性を検討するため
吸光度の経時変化を確認した。マンニトール標準液を

図 2． MBTH 法および Tibbling 法により作成したマンニトール
標準液の検量線

0.1 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL の各濃度に調製し，MBTH 法のメタ亜ヒ酸溶液を加えるまでの分析操作を行った。MBTH 溶液，および酸化試薬を加えた後，直ちに試液の一部を分取して分光光度計（日立ハイテクノロ
ジーズ U−3300）により波長 628 nm における吸光度を 90分間記録した。
リシリコンブ抽出液におけるマンニトールの添加回収率試験

添加回収率試験は，夾雑物の存在下で試料に対する添加量が正確に分析されることで，その分析法の正確性を測る試験である。
各月に採集された藻体からの抽出液 50 μL を，96 穴マ

図 3． MBTH 法 に よ る マ ン ニ ト ー ル 標 準 液（0.5 mg/mL，0.25 mg/mL，0.1 mg/mL）における吸光度の経時変化

イクロプレートに分注し，DW および 0.1 mg/mL マンニ
トール標準液をそれぞれ加え，最終濃度がもとの抽出液

ロロホルム処理後の試料分取量が MBTH 法の方が 2.5 倍の 2 倍 希 釈 値（C0），2 倍 希 釈 値 ＋25 μg/mL（C1），2 倍多いが，Tibbling 法よりも切片の値が低く，0.1 mg/mL

希釈値＋50 μg/mL（C2）となるよう調製した。マイク

以上の濃度で MBTH 法の方が高い吸光度を示しており，

ロプレートリーダー（コロナ電気 SH1200）を用いた

検出感度は Tibbling 法よりも優れる（図 2）。

MBTH 法で，各試料の C0，C1，C2 および標準液希釈系

MBTH 法における吸光度の経時変化

マンニトール濃列を分析し，標準液希釈系列の吸光度から作成した検量

度 0.5 mg/mL では，20 分まで徐々に吸光度が上昇し，20線により C0，C1，C2 のマンニトール濃度を定量した。

分から 26 分の間に最も高い 0.468 に達した（図 3）。以降

C1 および C2 の値から C0 の値を減じ，それぞれ 25 おは緩やかに吸光度が減少し，45 分後には 0.442，60 分後

よび 50 で除してマンニトールの回収率 R1（C1 − C0）/25，には 0.415 となり，90 分後には 0.364 まで減少した（図 3）。

R2（C2 − C0）/50 を算出した。また，その変動係数（C.V）
リシリコンブ抽出液の繰り返し分析試験

マンニトール濃度 0.25 mg/mL では，30 分後に吸光度は 0.109，45 分後に 0.210，60 分後に 0.230 に達し，以降を算出した。
8月および，

はほぼ一定の吸光度を示した（図 3）。

9 月の試料 2 本分から得られた抽出液それぞれについて，

マンニトール濃度 0.1 mg/mL では，30 分後に吸光度はマイクロプレートリーダーを用いた MBTH 法により，同0.109，45 分後に 0.135，60 分後に 0.149 に達した。以降

一試料を7回分析した。併せて標準液希釈系列を分析し，も緩やかに吸光度は上昇し続け，90 分後には 0.169 に達

標準液希釈系列の吸光度から作成した検量線により試料した（図 3）。
リシリコンブ抽出液におけるマンニトールの添加回収のマンニトール濃度を定量した。各試料について平均値，

率試験

標準偏差および変動係数を算出した。

6 月 の 5 試 料 の 添 加 回 収 率 は R1 で 84.9 〜

125.7％，R2 では 84.9 〜 107.0％であった（表 1）。8 月の 5

結果

試 料 の 添 加 回 収 率 は R1 で 74.7 〜 112.1 ％，R2 で 91.7 〜
120.6％であった（表 1）。9 月の 5 試料の添加回収率は R1

MBTH 法と Tibbling 法によるマンニトール標準液の分析MBTH 法は，0.0 mg/mL から 0.5 mg/mL のマンニトー

で 95.1 〜 159.6％，R2 で 113.8 〜 124.0％であり，試料番
号 3 の R1 が全試料中最も誤差が大きくなった（表 1）。

ル濃度の間で Beer の法則に従って濃度依存的に吸光度

また 9 月の試料の R2 はすべて 10％以上高い値となったが上昇し，直線性の高い検量線が得られた（図 2）。決

（表 1）。6 月および 8 月の試料の変動係数はともに R1 で定 係 数 の 値 は Tibbling 法，MBTH 法 と も 0.9980，0.9985

約 14％，R2 で約 10％であった（表 1）。9 月の試料の変とほぼ同値となった（図 2）。検出感度については，ク

動係数は R2 で 3.4％であったが，R1 は 22.0％と値が高く– 16 –

マンニトールの新規定量法

表 1． リシリコンブ抽出液における添加回収率試験の結果
マンニトール濃度（μg/mL）
8月
C0
C1
C2
80.2
98.9
128.6
92.1
117.6
137.9
56.4
82.8
107.4
89.6
117.6
143.0
50.5
76.0
110.8

6月
試
料
番
号

試
料
番
号

C0
1.3
22.5
14.0
13.1
13.1

1
2
3
4
5

C1
32.7
52.2
35.2
43.7
41.2

C2
46.3
76.0
60.7
55.6
66.6

回収率
R1
（C1−C0）/25 R2（C2−C0）
/50
74.7％
96.8％
101.9％
91.7％
105.3％
101.9％
112.1％
107.0％
101.9％
120.6％
14.4％
10.7％

R1
（C1−C0）/25 R2（C2−C0）/50
125.7％
90.0％
118.9％
107.0％
84.9％
93.4％
122.3％
84.9％
112.1％
107.0％
14.5％
10.4％

1
2
3
4
5
C.V

9月
C0
222.8
170.2
206.7
148.1
90.4

C1
247.5
194.0
246.6
177.0
119.3

C2
284.0
227.1
268.7
209.3
149.8

R1
（C1−C0）/25 R2（C2−C0）/50
98.5％
122.3％
95.1％
113.8％
159.6％
124.0％
115.5％
122.3％
115.5％
118.9％
22.0％
3.4％

表 2． リシリコンブ抽出液における繰り返し試験の結果
繰り返し回数
8月
9月

1
2
1
2

1
43.2
83.8
198.9
141.8

2
43.2
75.2
198.0
141.8

3
41.4
82.1
191.9
139.2

マンニトール濃度（μg/mL）
4
5
6
7
47.5
44.0
43.2
45.8
70.8
82.1
76.9
78.6
200.6
198.9
193.7
190.2
141.8
144.4
141.8
141.8

なった（表 1）。

AVE
44.0
78.5
196.0
141.8

S.D
2.0
4.6
4.0
1.5

C.V
4.5％
5.8％
2.0％
1.1％

緩 や か に 吸 光 度 が 減 少 し た（ 図 3）。 ま た， 同 濃 度
8 月の試

0.1 mg/mL では 42 分で 0.131 に達し，以降も緩やかに吸料番号 1 を用いた，7 回の分析値は 41.4 〜 47.5 μg/mL で光度は上昇し続けており（図 3），経時的な呈色安定性

リシリコンブ抽出液における繰り返し試験あり，平均では 44.0 ± 2.0 μg/mL（平均値± S.D. 以下同様），には問題がある。大富ら（1975）は水中の微量ホルムア

変動係数は 4.5％であった（表 2）。また，試料番号 2 のルデヒドを MBTH により呈色させた場合，波長 628 nm

分 析 値 は 70.8 〜 83.8 μg/mL， 平 均 で は 78.5 ± 4.6 μg/mLにおける吸光度は 14 分後に最大に達し，以降 17 時間まとなり，変動係数は 5.8％であった（表 2）。

で一定であることを示している。このことからクロロホ

同 様 に，9 月 の 試 料 番 号 1 の 分 析 値 は 190.2 〜

ルム抽出，陽イオン系除タンパク，およびマンニトール

200.6 μg/mL，平均では 196.0 ± 4.0 μg/mL となり，変動係

酸化のいずれかの工程が影響し，MBTH の呈色安定性が数は 2.0％であった（表 2）。9 月の試料番号 2 の分析値は損なわれたと考えられる。このため，MBTH 法において139.2 〜 144.4 μg/mL，平均では 141.8 ± 1.5 μg/mL となり，は試料の反応時間に十分留意する必要があり，反応時間変動係数は 1.1％であった（表 2）。

に差が生じる場合などは，併せて標準液を分析するなどの対応が必要である。反応時間については，本報では検考察

量線直線性に問題が無かったため 45 分を採用したが，適切な反応時間については更なる検討が必要である。

マンニトール標準液を分析した結果，MBTH 法を用い添加回収率試験では，いずれの月の試料についてもた場合においても高い検量線直線性が得られた（図 2）。

10％以内の誤差で分析できている試料がある一方で，このことから，クロロホルムによる抽出処理，陽イオン

20％以上の誤差が生じている試料もあった（表 1）。特系の除タンパク処理，およびマンニトールの酸化工程はに 9 月の試料では R1 で 5 試料中 3 試料，R2 では 5 試料す

MBTH の検量線直線性には大きく影響しないと考えられ

べてで誤差が 10％以上となっている（表 1）。9 月の試料た。また検出感度については，除タンパク処理後の分取は 6，8 月の試料と比べるとマンニトール濃度が高くなっ量が異なるため一様に比較はできないが，Tibbling 法とており，試料中のマンニトール濃度が分析精度に影響し同等かそれ以上の感度を有しているとみられ，検量線直た可能性がある。マンニトール濃度が最も低い 6 月の試

線性と感度の観点からすると，MBTH 法はマンニトール料についても，R1 の誤差が 5 試料中 5 試料すべてで 10％の定量法として十分に機能すると考えられた。

以上となったが，一方で 6 月の試料の R2，8 月の試料のMBTH 法 に お け る 吸 光 度 は， マ ン ニ ト ー ル 濃 度

R2 では 5 試料中 4 試料で誤差が 10％以下であった（表 1）。

0.5 mg/mL では 20 分まで徐々に吸光度が上昇し，以降はこのことから，MBTH 法により精度よく分析できるマン– 17 –

ニトール濃度は 6 月の試料の C2 から 8 月の試料の C2 のる。また，除タンパク処理については，スピンカラムを濃度帯，すなわち 50 μg/mL から 150 μg/mL 付近と考えら用いた限外ろ過や，マンニトールは熱安定性が高いことれる。

からタンパク質の加熱変性による沈殿などを組み合わせ

繰り返し試験では，8 月の試料の変動係数は 4.5％，
5.8％，9 月の試料では 2.0％，1.1％であった（表 2）。9 月

ることで，MBTH 法がより有用な方法となる可能性がある。

の試料と 8 月の試料を比較すると，9 月の試料はいずれも マ ン ニ ト ー ル 濃 度 が 100 μg/mL 以 上 と な っ て お り，謝辞

100 μg/mL 以上の濃度帯で繰り返し分析の精度が安定す
本研究を進めるにあたり，実験に用いる養殖用リシリると示唆される。
MBTH 法は，MDH 法と比較しても，非酵素的反応でコンブの試料採集に協力してくださった宗谷地区水産技あることから基質選択性の影響を受けない点や，各試料

術普及指導所礼文支所の本前伸一支所長，野間田元主査，の NAD＋量のバックグラウンドを別途定量する必要がな

生産途中の養殖用リシリコンブを提供してくださった漁

い，等の点で優れる。また，Tibbling 法と比較しても，業者の大倉氏に深謝する。

MBTH 法の場合は加熱工程がなく，操作性の面で利点がある。一方，マンニトール以外の糖アルコールや，ジオー

文

献

ル構造を有する夾雑物が存在する場合には，これらの物質からもホルムアルデヒドが発生する可能性があり，分Cameron M, Ross A, Percival E (1948) Method for the routine estimation

析精度が低下する。

of mannitol, alginic acid, and combined fucose in seaweeds. J. Soc.

MBTH 法では，Tibbling 法同様，硫酸亜鉛水溶液，おChem. Ind., 67, 161−164.

よび水酸化バリウム水溶液による陽イオン系除タンパク

Greefe H, Gütschow B, Gehring H, Dibbelt L (2003) Sensitive and処理を採用した。除タンパク処理としては他に，トリク

specific photometric determination of mannitol in human serum.

ロロ酢酸（TCA）でタンパク質を沈殿させた後にジエチ

Clin. ChemLab Med., 41, 1049−1055.

ルエーテルで残存する TCA を抽出して除去する方法

Greenland AJ, Lewis DH (1984) Amines in barley leaves infected by（Huang et al. 2010，Greenland and Lewis 1984），メタノー

brown rust and their possible relevance to formation of ‘green

ルとクロロホルムで抽出する方法（Wessel and Flügge
1984）などが知られる。MBTH 法の除タンパク処理におislands’. New Phytol., 96, 283−291.
Hauser TR, Cummins RL (1964) Increasing sensitivity of 3−methyl−2−

いて TCA 処理，もしくはメタノール−クロロホルム抽

benzothiazolone hydrozone test for analysis of aliphatic aldehydes

出を行うと，ブランクでも MBTH が強く呈色し，呈色

in air. Anal. Chem., 36, 679−681.

安定性が大きく損なわれた（Data not shown）。この現象

広瀬弘幸（1981）藻類学総説 . 内田老鶴圃 , 東京 , pp. 147−180.

は TCA 処理において，水層に残存したジエチルエーテ

Huang G, Yang Q, Wang ZB (2010) Extraction and deproteinization of

ルを遠心エバポレーター，もしくは湯浴により除去して

mannan oligosaccharides. Z. Naturforsch., C: J. Biosci., 65, 387−も発生したことから，水層に不可逆的な反応が起こった390.

ことが推定される。このため MBTH 法における除タン

Jennings DB, Ehrenshaft M, Pharr DM, Williamson JD (1998) Roles for

パク処理は，陽イオン系除タンパク法を用いる必要があmannitol and mannitol dehydrogenase in active oxygen-mediatedる。また同様の理由で，除タンパク処理前に行うクロロ

plant defense. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15129−15133.

ホルム抽出についても，水層に一定の溶解性を示すジエ

Kodama H, Kawai T (2019) Monthly change of mannitol content in the

チルエーテルなどを用いることはできず，クロロホルム

kelp Saccharina japonica var. ochotensis from Wakkanai and Rebun,のように疎水性が極めて高く，水層に影響しない溶媒がNorthern Hokkaido, Sea of Japan. Algal Res., 12, 73−75.
Larsen B (1978) 17: Brown seaweeds: analysis of ash, fiber, iodine, and適する。

mannitol. In “Handbook of Phycological Methods” (ed. by Hellebust

本報における MBTH 法の分析操作では水酸化バリウ
ム八水和物，硫酸亜鉛七水和物，クロロホルム（いずれも医薬用外劇物），およびメタ亜ヒ酸ナトリウム（医薬J, Cragie J) Cambridge Univ. Press, London, pp. 181−188.
Lyles GR, Dowling FB, Blanchard VJ (1965) Quantitative determination

用外毒物）という極めて有害性の高い物質を採用しておof formaldehyde in the parts per hundred million concentration

り，実験者や環境に配慮した分析手法とは言えない。まlevel. J. Air. Poll. Count. Ass., 15, 106−108.

た，これらの廃液，沈殿物は専門業者に回収を依頼する

Nash T (1953) The colorimetric estimation of formaldehyde by means ofことになるため，廃液の処理コストという観点では問題

the Hantzsch reaction. Biochem. J., 55, 416−421.

点が残る。実験者に対する安全性や更なる低コスト化，

小田桐慎一郎・加藤陽治（2014）ツルアラメに含まれる糖質 , アミ

自然環境へ配慮の観点からも，これらの物質の代替は今

ノ酸およびポリフェノールの季節変化 . 日本食品化学工学会誌 ,後の課題となる。クロロホルム抽出の代替試薬としては，
ジクロロメタン，n−ヘキサンなどが候補として挙げられ

61, 268−277.
大富美智子・大野智子・赤堀貞利（1975）MBTH 法による水中の微– 18 –

マンニトールの新規定量法

Wessel DM, Flügge UI (1984) A method for the quantitative recovery of

量ホルムアルデヒドの定量法 . 工業用水 , 202, 21−24.
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protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.
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carbon from H14 CO3 − into sugar constituents by a brown alga,

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Eisenia bicyclis, during photosynthesis and its fate in the dark. Plant
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