27PA-am062
多孔質層の厚さが異なる
コアシェル粒子のタンパク分離比較
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

市販されているコアシェルカラム
SunShell（クロマニックテクノロジーズ） : C18, PFP, C8, Phenyl, RP-Aqua: C18, PFP, CN, PentaHILIC, BioClass
Halo（AMT）: C18, PFP, AQ, PC, MP, WP
Capcell Core（資生堂）: C18, PFP, C8, XB-C18, HILIC,
Kinetex （フェノメネックス）
Kinetex Aeris（フェノメネックス）: C18, C8, C4 (タンパクペプチド分析用)
Ascentis Express（シグマアルドリッチ） : C18, F5(PFP), C8, OH5, RP-Amide: C4, C8, C18BioSehll（シグマアルドリッチ）: C18, C8, CN, Phenyl-Hexyl, SB-AQ
PoroShell（アジレントテクノロジ－）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, aQ, RP-MS
Accucore（サーモフィッシャー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, HILIC
Nuculeoshell（ナーゲル）: C18, PFP, C8, Amide, HILIC
Brownlee SPP（パーキンエルマー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, C18A, HILICBlue Shell（KNAUER）: C18, C18+, HILIC
Cortecs （Waters）: Biphenyl, ARC18
Raptor （Restek）
Ultracore (Ace): C18, Phenyl-Hexyl
SpeedCore (Fortis): C18, PFP, Diphenyl, HILIC
Coresep (Sielc): Mixmode
COSMOCORE (Nacarai):C18
Meteoric Core (YMC):C18, C8, C18Bio(固定相は抜粋)

コアシェルカラムは広く使用されるようになってきている

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市販されているコアシェルシリカ
核の径は1～3.2μm
多孔質シリカ層の厚さ0.2～0.6μm

・粒子径は1.3～5 μm
・細孔径は9～40 nm(3μm以下の粒子径では8～20 nm)

タンパク用のコアシェルシリカは0.2µ等の薄い多孔質層が主流

多孔質層の厚さが異なるコアシェルシリカのタンパク分離を比較した
3

多孔質相の厚さが異なるコアシェルシリカ
SunShell particle

Prototype particle

コア0.2 mm

0.5 mm
2.6 mm

3.4 mmParticle size: 2.6 μm
Thickness of porous layer: 0.5 μm
Specific surface area: 40 m2/gParticle size: 3.4 μm
Thickness of porous layer: 0.2 μm
Specific surface area: 15 m2/g4

作成したコアシェルシリカの細孔分布

5タンパクの分離
C18C18Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min%B20%
65%
oFlow : 0.5 mL/min , Temperature: 60 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin,
C8
5 = Ovalbumin
C8C4024SunShellHFC18-30C4681012SunShellC8-30

024681012SunShellC4-300246810126HFC18とはHexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

Sunniest
Bonding
Technology
Hexamethydichlorotrisiloxane+Trimethylchlorosilane (TMS)
XX
Sii
SXX
X
X

（X: Cl, OCH3, OC2H5)

HFC18試薬の概略図

SiSiO

O

O

SiO
Si

Si O O
O
Si
Si
O
OO

OO
Si
O O

SiOO

Si

SiO

SiO

Si O

Si
Si O O
Si
Si O
O O
O
OO

Si
HO O
OSi

Si
SiSiOOSiOOOSiSiOOOOO
Si O

O O

O

シリカ表面への結合状態の概略図
7HFC18カラムのLC/MS移動相条件における耐酸性

Relative retention (%)

10095% line

8060
400.1% formic acid, pH2.6
70 ºC

2000200400600

800

1000

Durable test condition
Column : SunShell HFC18-162.6mm, 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1%
formic acid, pH2.6=40/60
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 70 ºC
Measurement condition
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

Time (h)8グラジエントの違いによる分離の変化
195000Column:SunShell C8-30, 2.6 um (30 nm) 150 x 2.1 mm,Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min
%B20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin,
5 = Ovalbumin○145000

95000

45000

Time 0 min%B 20%

35min
65%

Time 0 min%B 20%

45min
65%

Time 0 min%B 20%

60min
65%

9-5000051015202530

354045多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較１Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 35 min
%B
20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

260oCでは、粒子径、多孔質相の厚さが異なってもピーク幅は同じ

31W0.5=2.5 sec
460 oC and 15 min gradient

5W0.5=2.5 sec

Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient

80 oCでも大きな違いはない

W0.5=4.2 sec
Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)
05

10

15

20

Retention time/min

Surface area works well for separation.

2510

多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較２Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 or 35 min
%B20%
65%
高速分離においては多孔質相が薄いほう
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,が分離が良好
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
0.5W =0.87 sec

2W0.5=0.93 sec
135480 oC and 5 min gradientPrototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient

W0.5=4.2 sec

Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)
05101520Retention time/min

Surface area works well for separation.

2511

多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較３Column:
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 150 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 150 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 60 min%B20% 65% ○Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

2 W0.5=6.0 sec

W0.5=8.0 sec

31

グラジエント時間が長い場合、粒子径の差以上のピーク幅の差が観察された45Sunshell C8-30, 3.4 μm
SunShellC8-30, 2.6 μm
03510152025303540454

分離は多孔質層が厚いほうが、良好

24262830

32343638401242まとめ• 多孔質層の厚さが異なるコアシェルシリカを比較した結果、タンパク分離において差が観察された。
• 特にグラジエント時間が長い分析では、多孔質層が厚い粒子での分離が良好であった。
• 溶出の速いグラジエント条件下においては、多孔質層が薄い粒子が有用であった。
• LC-MSを想定した耐酸試験において，HFC18カラムは1000時間以上の耐酸性能を確認できた。
• 今後コアシェルカラムは、多くの固定相が開発されていくと考えられる。

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