日本薬学会第133年会

新技術セミナー2.6μmコアシェルカラム初のタン
パク質分離用30nmカラムAmplus
クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和、塚本 友康
Norikazu Nagae, Tomoyasu Tsukamoto
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

1コアシェル型シリカの歴史(1) J.J. Kirkland, F.A. Truszkowski, C.H. Dilks, and G.S. Engel, J.
Chromatogr., A 890, 3–13 (2000).
(2) J.J. Kirkland, T.J. Langlois, and J.J. DeStefano, Am. Lab. 39, 18–21 (2007).
2

コアシェル充填剤とはSuperficially porous particle

コア（核）の周りに多孔質層が存在

粒子径によりカラム圧は決まり，粒子径の２乗に反比例してカラム圧は高くなる
同じ粒子径の全多孔性の粒子に比べ，コアシェル粒子は多孔質層が薄いため，溶質の拡散距離が短くなり，速く平衡化するため，段数が高くなる
つまり，コアシェルは3mm粒子の圧力と同等であるにもかかわらず，サブ2mmの性能を発揮する
3

二種類のコアシェル構造のシリカ粒子

モノレイヤー（単層）多孔質構造

マルチレイヤー（多層）多孔質層構造

4

A社コアシェル粒子の粒度分布
Coulter counter

Volume (%)

D90/D10=1.12

Particle size (mm)5Amplusシリカのコアシェル構造の概略図
0.5 mm

0.5 mm

2.6 mmコア2.6 mm

コア1.6 mm

多孔性シリカ部

多孔性シリカ部
モノレイヤー（単層）多孔質構造
粒子径：2.6 mm，コア径：1.6 mm，多孔質層の厚さ：0.5 mm
細孔容積：0.30 mL/g，比表面積：90, 40 m2/g，細孔径：16 nm, 30 nm,
多孔性シリカの体積の割合：77%6全多孔性とコアシェル型の理論段高さの比較
1816Fully porous 5 um

Plate Height, um

14

Fully porous 3 um

12Fully proous 1.8 um

10Core Shell 2.6 um

8Fully porous 2.6 um

6Column: C18, 50 x 4.6 mm
Mobile phase:
Acetonitrile/water=(60/40)
Temperature: 25 oC
Sample : Naphthalene

4200510Mobile Phase Velocity, mm/sec
715

Sub2mmカラムとコアシェル型カラムとの圧力比較
45Sunniest C18-HT 2.0 um
Brand A C18 1.9 um
Brand B C18 1.8 um
Brand C C18 1.7 um
Brand D C18 2.6 umAmplus C18-162.6
SunShell
C18 2.6umum

40Pressure, MPa

3530252015Column dimension: 50 x 2.1 mm
Mobile phase: Acetonitrile/water=(70/30)
Temperature: 25 oC

105000.5

1Flow rate, mL/min
81.5

全多孔性シリカ粒子と何が違う，何が一緒？
核を内包している(フューズドシリカ)
多孔質シリカ構造は異なる(コアが有るか無いか)
素材はシリカであり、全多孔性、コアシェルとも共通

化学的特徴は全多孔性シリカと同じ
9コアシェル構造なぜいいの？
Van Deemterの式

10Desorption Dv (log d) (cc/g)

コアシェルシリカの細孔分布0.90.8Core shell 30nm

0.70.6Core shell 16nm

0.50.40.30.20.101

10100

Pore Diameter (nm)111000高分子分離用コアシェルカラム
Particlesize

Porediameter

Surfacearea

Carbonloading

C18 Surface
coverageEndcapping

SunShell C18-WP

2.6 μm

16 nm

90 m2/g

5%2.5 mmol/m2

Yes

SunShell HFC18-16

2.6 μm

16 nm

90 m2/g

2.5%1.2 mmol/m2

Yes

SunShell HFC18-30

2.6 μm

30 nm

40 m2/g

1.3%1.2 mmol/m2

Yes

Amplus C18-16

2.6 μm

16 nm

90 m2/g

2.5%1.2 mmol/m2

Yes

Aumplus C18-30

2.6 μm

30 nm

40 m2/g

1.3%1.2 mmol/m2

YesAmplus C8-30

2.6 μm

30 nm

40 m2/g

1.2%2.5 mmol/m2

Yes

Amplus C4-30

2.6 μm

30 nm

40 m2/g

0.9%

3 mmol/m2

Yes

カラムサイズ：内径2.1mm,30mm,4.6mm，長さ50mm,100mm,150mm
12HFC18とはHexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

Sunniest
Bonding
Technology
Hexamethydichlorotrisiloxane+Trimethylchlorosilane (TMS)
X
X

X
Si

SiX

X

Si
SiX

（X: Cl, OCH3, OC2H5)OO

HFC18試薬の概略図

O

SiO
Si

Si O
OO
SiSiOOOOOSiO OSiOOSiSiOSiO

Si O

SiSi O OSiSi O
O OOOOSiHO OOSiSiSiSiOOSiOOOSiSiOOOOOSi O

O OO

シリカ表面への結合状態の概略図
13

HFC18の耐酸性
LC/MS用の移動相条件

Relative retention (%)

10095% line

8060400.1% formic acid, pH2.670 ºC

2000200

400

600

Time (h)

800

1000

Durable test condition
Column : SunShell HFC18-162.6mm, 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1%
formic acid, pH2.6=40/60
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 70 ºC
Measurement condition
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/minTemperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

14結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC,Sample: Tryptic digest of myoglobin
15Detection: UV@210 nm,

結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WPColumn: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC,
Sample: Tryptic digest of cytochrome C 16

Detection: UV@210 nm,

標準タンパク質の分離

Amplus C8-30
Column:Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 150 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 20 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.35 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.01 μg/μL each protein,Sample:1. Angiotensin I
2. Ribonuclease A
3. Cytochrome C
4. Lysozyme
5. Transferrin
6. Bovine Serum Albumin
7. Myoglobin
8. Carbonic Anhydrase

17

Ribonuclease A/Bの分離
Amplus C18-30
Column:Amplus C18-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 20 min%B 22% 70.5%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Ribonuclease B
2. Ribonuclease A18

Ribonuclease A/Bの分離
Amplus C8-30 MS検出
Column:Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% Formic acid in waterB) 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 10 min%B 17.5% 17.5%
Isocratic separation
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 60 oC
Detection: MS,Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Ribonuclease B
2. Ribonuclease A

19

Lipaseの分離 Amplus C8-30 MS検出
Column:Amplus C8-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% Formic acid in waterB) 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 10 min%B 15% 60%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 60 oC
Detection: MS,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Lipase Impurity
2. Lipase

20

BSA 消化物の分離 Amplus C18-16Column:
Amplus C18-16, 2.6 mm (16 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 1 min 21 min%B 10% 10% 40%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,
Sample:1. Bovine Serum Albumin Digest

21

Alpha Casein消化物の分離
Amplus C18-16Column:
Amplus C18-16, 2.6 mm (16 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 10 min 14 min%B 10% 36.4% 36.4%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,Sample:
1. Alpha Casein Digest

22

まとめAmplus (SunShell)は30nmの平均細孔径を持つ初めてのコアシェル充填剤
HFC18固定相は最高で6本の共有結合でシリカ表面に結合できるため，耐酸性が高くなり，LC/MSで多用される0.1％ギ酸の移動相で1000時間以上の耐久性が示された
HFC18は結合密度が通常の半分であり，ペプチド等の分離選択性が変わる

23

Amplus の価格
2.1

内径(mm)

Amplus C18-16

Amplus C18-30

Amplus C8-30

Amplus C4-30

3.04.6

長さ(mm)型 番価 格型 番価 格型 番

価 格50

A16941¥66,000

A16341¥66,000

A16441¥66,000

100

A16961¥79,000

A16361¥79,000

A16461¥79,000

150

A16971¥84,000

A16371¥84,000

A16471¥84,000

50

A46941¥66,000

A46341¥66,000

A46441¥66,000

100

A46961¥79,000

A46361¥79,000

A46461¥79,000

150

A46971¥84,000

A46371¥84,000

A46471¥84,000

50

A36941¥66,000

A36341¥66,000

A36441¥66,000

100

A36961¥79,000

A36361¥79,000

A36461¥79,000

150

A36971¥84,000

A36371¥84,000

A36471¥84,000

50

A26941¥66,000

A26341¥66,000

A26441¥66,000

100

A26961¥79,000

A26361¥79,000

A26461¥79,000

150

A26971¥84,000

A26371¥84,000

A26471¥84,000

24