常識を超えた新規C18充填剤・すべてのピークをシャープに！:
2μmカラムへの挑戦
クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和
Norikazu Nagae
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp
分析展2010新技術説明会9月3日

1

【緒言】
カークランドによりHPLCが発明されて以来40年近く経過するが，この間充填剤は日々改良が進められてきた。
 表面多孔性（ペリキュラー）充填剤から全多孔性に，さらに近年再び粒子径を3μm以下にした表面多孔性へと，シリカ系充填基材も変化している。
 またシリカ系逆相充填剤はシラノール基の影響を防ぐため，
様々なエンドキャッピング技法が開発されてきた。
 演者らは従来のエンドキャッピング方法の概念を変え，エンドキャッピング試薬をあらかじめオクタデシルシリル化
試薬に結合させたシリル化試薬を開発した。
 アミトリプチリンのピーク形状を比較することにより，この試薬で調製した充填剤の残存シラノール基の評価を行った。


分析展2010新技術説明会9月3日

2

新規C18試薬A（HMODTS) 特許出願中
ヘキサメチルオクタデシルテトラシラン

Step 2

Step 1

toluene＋ H2O＋
80℃，4h

MeO

Si

OMe
OMe

HO

Si

OMe
OMe

HO

Me
Cl

MeMe MeMe Me
Si

O

Si

O

Si

Cl

toluene30℃，2h

Si

OMe
OMe

Me
Cl

分析展2010新技術説明会9月3日

MeMe
Si

O

MeMe
Si

O

Me
Si

O

Si

OMe
OMe

3

推定されるシリカ表面での結合状態（Sunniest C18 HMODTS）

Final TMS

HO
Si
O
Si

Si

O

Si

Si
Si
O

O

Si
O

O

Si

Si O

Si

O O

O
O

O

O

O

O

Si

Si
O

O

Si

O

Si
O

O
O
Si

O

Si
O

O

O

Si

Si O

O

Si

O

O

Si

O
Si
Si
HO

O

O

Si
O

Si
O

O

Si

O O

Si

O
Si

O OH
O
Si
O
O
Si
Si
Si
O O
O O O
O
O
Si O
O Si O
Si
O
O

分析展2010新技術説明会9月3日

O
Si
O

O
O

4

Sunniest C18 HMODTS充填剤の物性用いたシリカゲル: 12nm, 340 m2/g, 5 μm
C18試薬結合後の炭素含有量：16.1%
最終エンドキャッピング後の炭素含有量：16.3%

分析展2010新技術説明会9月3日

5アミトリプチリンのピーク比較Ⅰ
メタノール CH3OH, pH7.5, 40 ºC
Sunniest C18 （HMODTS)
1

４３

N(4)=11,000
TF(4)=1.06

2Sunniest RP-AQUA
1

４

３
2

N(4)=10,500
TF(4)=1.07

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Propranolol
CH
3

O

NH

CH3

OH

1

４

A社C18
3

2

1

N(4)=8,950
TF(4)=1.76
４

B社C18
３

2

N(4)=10,000
TF(4)=1.50

3 = Nortriptyline
NH
CH3

4 = Amitriptyline
CH3
N
CH3

0

2

4

6

8

10

Retention time/min

12

14

16

分析展2010新技術説明会9月3日

6アミトリプチリンのピーク比較Ⅱ
メタノール CH3OH, pH6.0, 22 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
1

４

N(4)=9,000
TF(4)=1.08

３
2

４

Sunniest RP-AQUA
1

N(4)=8,000
TF(4)=1.10

３
2

1

A社C18

４

N(4)=3,900
TF(4)=2.92

3

2
1

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0=80/20
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 22 ºC
Sample: 1 = Uracil
CH
O
NH
CH
2 = Propranolol

B社C18 ３

N(4)=5,800
TF(4)=2.86

４

2

3

3

OH

3 = Nortriptyline
NH
CH3

4 = Amitriptyline
CH3
N
CH3

0

2

4

6

8

10

12

14

Retention time/min

分析展2010新技術説明会9月3日

7アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-A
アセトニトリル CH3CN, pH7.0, 40 ºC
Sunniest C18 (HMODTS)
４1

３

N(4)=14,000
TF(4)=1.16

2Sunniest RP-AQUA
1

４

３
2

1

A社C18
3

2
1

N(4)=13,800
TF(4)=1.24

４

3

3

OH

3 = Nortriptyline

N(4)=4,000
TF(4)=4.33

B社C18
３

2

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
CH
2 = Propranolol
O
NH
CH

４

NH
CH3

N(4)=4,300
TF(4)=5.24

4 = Amitriptyline
CH3
N
CH3

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

Retention time/min

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8アミトリプチリンのピーク比較Ⅲ-B
ColumnTF

N

ColumnTF

N

Sunniest C18(HMODTS)

1.04 12,500

Japanese company C1 C18

2.14

8,700

Sunniest RP-AQUA

1.12 12,800

P1

1.09

9,500

D1

5.19

M1

2.01 11,200

D2

2.19 14,200

Japanese company D1 C18

1.30 12,000

AT

3.25

5,300

Japanese company D2 C18

2.92

8,000

S1

1.74

8,300

Japanese company D3 C18

2.70

6,100

W1

1.97 10,600

Japanese company E1 C18

1.56 11,400

WS2

1.59 10,100

Japanese company F1 C18

3.44

W3

1.33 10,000

Japanese company G1 C18

1.71 10,000

Japanese company G2 C18

2.15 11,500

Japanese company A1 C18 3.07

3,300

8,500

6,700

Japanese company A2 C18 2.52

9,200Japanese company H1 C18

11.1

2,100

Japanese company B1 C18 2.23

50

Japanese company I1 C18

3.77

7,400

A1

3.28

5,900

Japanese company B2 C18 2.01 10,900
Japanese company B3 C18 7,75

Column size: 150 X 4.6 mm
Particle size: 5 μm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphatebuffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

CH3
N
CH3

3,600

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9耐久性の評価

耐酸性加速試験

耐久性試験条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/1.0% TFA,pH1=10/90
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 80 ºC

保持時間測定条件
Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Ethylbenzene
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10耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C18はpH10，50℃の条件で700時間の耐久性
耐久性試験条件
Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC
理論段数測定条件
Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

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11耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C8はpH9.2，40℃の条件で600時間の耐久性
耐久性試験条件
Column: Sunniest C8, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC
理論段数測定条件
Column: Sunniest C8, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

分析展2010新技術説明会9月3日

12リン酸緩衝液によるpH選択性
2
3
1

pH2.3
6

5

4
3

pH7

1
42

6

5

3,5
4

0

pH10

2

5

1

6

10

15
20
Retention time/min

Column: Sunniest C18 HMODTS, 5 μm,
4.6 x 150 mm
Mobile phase:
A1) 20mM Phosphoric acid pH2.3
A2) 20mM Phosphate buffer pH7
A3) 20mM Phosphate buffer pH10
B) Acetonitrile
Time (min)030%B (%)
2
26
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: 1= Thiamine HCl Vitamin B1
2 = Nicotinamide
3 = Nicotinic acid
4 = Pyridoxine HCl Vitamin B6
5 = Folic acid25
630
= Riboflavin Vitamin B2

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13移動相の異なる条件でのアミトリプチリンの
ピーク比較
A

4
1

N(4) =11,000
TF(4) =1.03 Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:A) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5 = 80/20
B) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0 = 80/20
C) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 = 60/40
4N(4) =9,000 D) CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8 = 40/60
TF(4) =1.06 Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC for A, C and D, 22 ºC for B
Sample: 1 = Uracil,
2 = Propranolol,
4 N(4) =12,500
3 = Nortriptyline,
4 = Amitriptyline,
TF(4) =1.04
5 = Toluene

3
2

B

3

1
2

C

1

2

3
5

D

0

1

2

2

3

4

4

6

N(4) =12,100
TF(4) =1.09

8
10
Retention time (min)

12

5
14

16

18

分析展2010新技術説明会9月3日

2014他社との比較
N=12,200
TF=1.30
1

N=12,100
TF=1.21

N=12,000
TF=1.28

Sunniest C18 HMODTS
Sunniest RP-AQUA
N=5,100
TF=2.4

Sunniest C8

Column size: 4.6x150 mm
Particle size: 5μm
Mobile phase: CH3CN/10mM
Ammonium acetate
pH6.8=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

N=8,500
TF=2.6

E社 C18N=5,500
TF=2.1F社 C18N=8,100
TF=2.0

G社 C18

CH3NCH3

H社 C18
0

2

4

6

8

10

12

14

Retention time/min

分析展2010新技術説明会9月3日

15カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）
Column size: 2.0x150 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: Corona CAD

F社 C18

B社 C18Sunniest C18 HMODTS

Retention time/min

分析展2010新技術説明会9月3日

16

MSを用いたブリードの比較

Company B C18

Sunniest C18 HMODTS

Column size: 150 x 2.0 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization: Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

分析展2010新技術説明会9月3日

17

0.1% ギ酸移動相での平衡化
問題点
・イオン強度の低い酸性条件（LC/MS用の移動相）において，一般のC18固定相は塩基性化合物の保持時間は数時間かけて，徐々に減少し，安定するまでに時間がかかる
・C18固定相内に微量に残存しているシラノール基は，C18アルキル基の疎水場の中に存在するため，シラノール基が平衡状態になるまでに数時間から十数時間かかる また試料過負荷時に分配比の移動相へのずれが大きく，ピーク形状は直角三角形に近い形状になり，早く溶出するようになる

解決方法
・固定相内部に存在するシラノール基を極力減らすことにより，シラノール基そのものの影響を排除する

Sunniest C18・粒子表面のイオン化を高め，疎水場の中にシラノール基が存在していても，シラノール基の周りのイオン化表面により，シラノール基の状態の平衡化を速くさせる充填剤も提案されている
分析展2010新技術説明会9月3日

18Problems in acidic, low-ionic strength condition
from poster (P-631) by Waters at HPLC 2010

Two of the performance issues for highpurity silica and hybrid supports thatare most evident in acidic, low-ionicstrength mobile phases, are poor peak
shape1 for analytical mass loads ofbasic analytes, and slow equilibration
for basic analytes when materials are
exposed to alternating high and low pH
mobile phases.2 (Figure 1)
It was hypothesized that the absenceof a controlling surface charge at low
pH on high purity supports was thecause of the unexpected column
performance.
For high purity hybrid and silica-based
reversed phase materials, the surface
charge of the particle is near zero atabout pH 3. Near this pH, even smallchanges in surface charge have alarge impact on the peak shape andretention of ionized compounds.
1. McCalley, D. V. J. Chromatogr. A 2005, 1075, 57.
2. (a) Gilroy, J. J.; Dolan, J. W.; Snyder, L. R. J. Chromatogr. A 2003, 1000, 757. (b) Marchand, D.H., Williams, L.A., Dolan, J.W., L.R. Snyder, L.R. J.
Chromatog. A, 2003, 1015, 53.

分析展2010新技術説明会9月3日

19

0.1%ギ酸酸性条件での塩基性化合物の保持の安定性
Sunniest C18, 5μm

Condition
Column size: 4.6x 150 mm
Mobile phase: Acetonitrile/0.1%
formic acid (30:70)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: Amitriptyline (0.27mg/mL)
Injection Volume:0.2 μL

tR=4.25 min

InitialAfter 12 hours

tR=4.24 min

After elution of pH 10 tR=4.29 min
mobile phase
After 12 hours

tR=4.25 min

CH3NConventional C18, 5μm

CH3InitialAfter 12 hours

tR=5.24 min

After elution of pH 10 mobile phase
After 12 hours

tR=7.67 min

tR=6.59 min

After 2 hours

tR=6.16 min

tR=5.15 min20

0.1%ギ酸酸性条件でのアミトリプチリンの負荷量
Sunniest C18,5μm
N=8,752

4

5 min

6

Condition
Column size: 4.6x 150 mm
Mobile phase: Acetonitrile/0.1%
formic acid (30:70)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: Amitriptyline (0.27mg/mL)
Injection Volume:0.2, 1, 2, 4 and 8 μL

N=8,423

Conventional C18,
5μm
4

8 μL
4 μL
2 μL
1 μL
0.2 μL

CH3
N
CH3

5 min

6

イオン強度の低い酸性条件ではアミトリプチリンの様な塩基性化合物は0.5μg程度の注入であれば十分な段数が得られます. 過負荷になった状態では，残存シラノール基の影響がほとんどないSunniest C18は一般C18に比べテーリングも少なく，ピークがシャープになります.
21
分析展2010新技術説明会9月3日

2μm粒子精密分級による狭い粒度分布
コールターカンウンター方式による粒度分布
D10:1.67 μm
D50: 2.09 μm
D90: 2.65 μm
D90/D10=1.59

D10:1.75 μm
D50: 2.01 μm
D90: 2.31 μm
D90/D10=1.32

細かい粒子が少ないため
約20%カラム圧低下(μm)

分析展2010新技術説明会9月3日

2 μmシリカゲ
ルでは驚異的な値
22

カラム耐圧一般の5, 3μmと同じ物性の2μmシリカ
カラム長さ30mmから50mmでの耐圧は50MPa程度
55MPaの充填圧では2.1x50mmには約100mg充填される
4%分凹みやすい

Sunniest C18-HT 2μmは，骨格の太い高耐圧シリカゲルを採用
耐圧は70MPa以上になる

カラム圧20%上昇

75MPaの充填圧では2.1x50mmには約104mg充填される
分析展2010新技術説明会9月3日

23

カラム圧（MPa）

有機溶媒と水移動相を用いたカラム圧

他社2μmカラムと同等

有機溶媒濃（%）
Column: Sunniest C18, 2μm （Prototype) 50 x 2.0 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O, CH3CN/H2O
Flow rate: 0.5 mL/min
Temperature: 40 ºC
分析展2010新技術説明会9月3日

24

2 μmカラムの理論段数比較
2.1 x 30 mm
N(3)= 5,375

Mobile phase: CH3CN/H2O = 60/40
Flow rate: 0.6 mL/min for 2.1 x 30 mm
and 2.1 x 50 mm
1.0 mL/min for 3.0 x 50 mm

2.1 x 50 mm
N(3)= 9,294

0.4 mL/min for 2.1 x 75 mm
and 2.1 x 100 mm

3.0 x 50 mm
N(3)= 9,303

Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: 1=Uracil,
2=Toluene,

2.1 x 75 mm
N(3)= 14,021

3=Acenaphthene,
4=Butylbenzene

2.1 x 100 mm
N(3)= 19,802

分析展2010新技術説明会9月3日

25

2 μm充填剤も同様な表面処理
A メタノール/20mMリン酸緩衝液 pH7.5 =(80:20)
1

2

N(4) =8,068
TF(4) =1.13

3

4

4

N(4) =7,670
TF(4) =1.50
Ｆ社 C18B アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH7.0 =(60:40)
12

理論段数の比較N(4) =7,529
TF(4) =1.19

3

4
4

N(4) =3,068
TF(4) =4.26
Ｆ社 C18
1.00

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.00

2.0

テーリングファクターの比較

Retention time (min)Column: Sunniest C18 HMODTS, 2 μm 2.0 x 50 mm, Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 = Amitriptyline,
分析展2010新技術説明会9月3日

26

ハイスループット化
解熱鎮痛剤の分離 Analgesics
Sunniest C18 5 μm, 150 x 4.6 mm i.d.
12N(4)=80,000 plate/m
3

4

Mobile phase:
CH3CN/0.1% Formic acid = 20/80
Flow rate: 1.0 mL/min for 150 x 4.6 mm i.d.,
0.6 mL/min for 50 x 2.0 mm i.d.
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@230 nm
1

NH

CH3
O

Acetaminophen

HO

CH3

ハイスループット化

2

N(4)=162,000 plate/m

3

Sunniest C18 2 μm, 50 x 2.0 mm i.d.
0

1

2

3

4

5

6

7

N

O

8

9

10

12

O

N

CH3

O

OH

Antipyrine

Aspirin

O
CH3

4

H2N
H3C

O

O

Ethenzamide

Retention time (min)

分析展2010新技術説明会9月3日

27

カラム本体内面の表面粗さ
表面粗さを表すパラメータ
Ra: 中心線平均粗さ
中心線

Rz: 十点平均粗さ（断面曲線から基準長さだけを抜き取った部分において、最高から5番目までの山頂の標高の平均値と、最深から5番目までの谷底の標高の平均値との差の値）

RaRｚ

表面粗さを示す概略図

A社

B社

C社

D社

E社

クロマニックテクノロジーズRa

0.34 μm

0.32 μm

0.37 μm

0.03 μm0.20 μm

0.01 μm

Rz

1.88 μm

1.62 μm

1.91 μm0.19 μm0.90 μm0.10 μm

分析展2010新技術説明会9月3日

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★Sunniest C18-HT 2 μmの価格※ 上表以外のサイズに関しても製造可能です。詳細は㈱クロマニックテクノロジーズまでお問合せ下さい。上記価格に消費税は含まれておりません。

発売記念キャンペーンセール
期間：2010年4月1日～2011年3月31日

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分析展2010新技術説明会9月3日

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【まとめ】Sunniest C18, RP-AUQA
エンドキャッピング試薬として用いられるヘキサメチル
トリシロキサンをODSに結合させた新規C18試薬（HMODTS)を開発した
 HMODTSの官能基はシリカ表面の様々な位置のシラノー
ル基と結合可能 残存シラノール基を非常に少なくすることが可能，その結果耐久性が向上 - pH10使用可能
 移動相中の有機溶媒や緩衝液などの制限を受けることなく，塩基性化合物のテーリグを少なくできた CSH技術を用いなくても酸性低イオン強度条件下で塩基性化合物の分離を改善させることができた
 2μm粒子を用いることにより高速分析が達成された


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