No.88.qx 07.10.10 14:52 ページ 10特集

Flexible KOD DNA polymerase

PCR実験の悩み、KOD FXが解決いたします。

KOD FX

KOD FXは、KOD DNA polymeraseをベースに開発された高性能PCR試薬です。優れた「増幅成功率」、「増幅効率」、「伸長性」を示し、幅広いPCRにおいて確実な結果を期待できます。

大好評販売中PCRの新境地へ！
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ットがかったターゲ
なえ
増はで他社酵素
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い ただいて お6名の先生方の実施例を掲載しております。

正確性PCRがう
まくいかずに困っている︒︵幅広いPCRで力を発揮︶︵ロ伸ン長グ性性能︶★★★★

高正確性PCRをしたい︵収 増量 幅︶ 効率

増幅成
功率

サＧンＣ
プリルッチ増幅末端

伸長時
間スホ
タッート
ト（/kb）KOD FX （Taqの約１１倍） ★★★★★

★★★★★★

★★★★★★

★★★★★★

平滑末端

１min.

○

KOD DNA
Polymerase

★★

★★

★★

★★★★

平滑末端

３０sec.

ー

★★★★

★★★★

★★★

★★★★

平滑末端

１min.

○

★★★★

★★★★

★★★★

★★★★

平滑末端

１min.

○

★★★★★

★★★★★

★★★★

★★★

A付加あり

１min.

ー

★★★★★

★★★★★

★★★★★

★★★

A付加あり

１min.

○

★★★★★

★★★★★

★★★★

★★★★

A付加あり

３０sec.

ーKOD -PlusKOD -PlusVer.2
Blend Taq®

高効率でBlend Taq®
汎用PCRを-Plusしたい
KOD Dash®

★★★★★
（Taqの約５０倍）★★★★★★
（Taqの約８０倍）★★★★★★
（Taqの約８０倍）★★
（Taqの約３倍）★★
（Taqの約３倍）★★
（Taqの約３倍）

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特集

Reliability

高い成功率

KOD FXでは、他社GC rich対応PCR試薬が増幅できないターゲットでも増幅できます。

GC richターゲットの増幅
ヒトTGF-β 2.3kb

ヒト IGF2R遺伝子［NM̲000876］8.9kb（GC含量約70%）

M1 1234567 M2（GC含量約90%の領域を含む）

M1 1234567 M2

M1：1kb DNA ラダー
1 ：KOD FX
2 ：KOD -Plus3 ：KOD -Plus-+5% DMSO
4 ：A社汎用PCR酵素（Taqベース）
5 ：B社高正確性酵素
6 ：C社高正確性酵素
7 ：Taq DNA Pol.
M2：λ／Hin dⅢ digest
鋳型：ヒトゲノムDNA 10ng／50μl 反応系

M1：1kb DNA ラダー
1 ：KOD FX
2 ：A社汎用PCR酵素（Taqベース）
3 ：D社Long PCR酵素（Taqベース）
4 ：E社GCrich対応高正確性酵素
5 ：F社GCrich対応Long PCR酵素Ⅰ
6 ：G社GCrich対応Long PCR酵素Ⅱ
7 ：H社高効率Long PCR酵素
M2：λ／Hin dⅢ digest
鋳型：ヒトcDNA（HeLa Total RNA 50ng相当）／50μl 反応系

様々な先生方からKOD FXを使った実施例（実施例は弊社ウェブサイト：www.
c-mos遺伝子の増幅（変異導入のためのPCR）
1BMP-2遺伝子の増幅
M

21

M

2

遺伝子名

プロトオンコジーンc-mos

遺伝子名

サンプル

Plasmid DNA 5ng

サンプル

ターゲット長ターゲット長約4.5kb

プライマー条件 32mer, 0.2μM（final）

Mouse genome BAC clone DNA 0.1μg
約2kb（GC-rich領域含む）

プライマー条件 20mer, 1μM（final）

サイクル

サイクル

KOD FX
95℃ 3min,（95℃ 30sec., 55℃ 1min., 72℃ 4min.）×20
72℃ 7min
A社高正確性酵素

KOD FX（98℃ 10sec., 68℃ 2min.）×35cycles
A社Long PCR酵素（94℃ 1min., 60℃ 30sec., 72℃ 2min.）×35

推奨条件

データご提供東京工業大学大学院
生命理工学研究科
生命情報専攻立花和則先生1：KOD FX
2：A社高正確性酵素

Mouse BMP-2

データご提供鳥取大学医学部
生命科学科 分子生物学
安永茉由先生、佐藤建三先生

M：λ／Eco T14I DNA Markers
1：KOD FX
2：A社Long PCR酵素

先生からのコメント
これまで何回も失敗していたPCRが一度でうまく行った。ちなみに、A社の酵素で増幅した約2kbのバンドは、シーケンスの結果、別の遺伝子だった。

先生からのコメント
得られたコロ ニ ー 数 は 、KOD FXの方が圧倒的に多かった。

マウスゲノムDNAを用いたPGK neo遺伝子の検出
M

1234

M

Chick GAD67プロモーター領域のクローン化
12345

M

67

1, 2：A社Long PCR酵素
3, 4：KOD FX
1, 3： 遺伝子型（＋）の遺伝子
改変マウスゲノム
2, 4： 遺伝子型（−）の遺伝子
改変マウスゲノム（NC）
M：φX174／Hin cⅡ＋
λ／Hin dⅢ DNA Markers

遺伝子名PGK neoサンプル

Mouse genomic DNA 5〜10ng

ターゲット長1.5kb

プライマー条件 30mer, 0.4μM（final）
サイクル
KOD FX

94℃ 2min.,（98℃ 10sec., 68℃ 90sec.）×30

A社Long PCR酵素 94℃ 2min.,（94℃ 30sec., 60℃ 2min.）×30
72℃ 2min.

1：A社高正確性酵素
2：B社Long PCR酵素
3：C社Long PCR酵素
4：D社Long PCR酵素
5：E社Long PCR酵素
6, 7：KOD FX
M：1kb Ladder Markers（上から10kb, 8kb, 6kb）

遺伝子名
データご提供東京大学大学院医学系研究科細胞分子薬理学教室（飯野研究室）金丸和典先生先生からのコメント
既存の製品では比較的困難な検出が、KOD FXでは明瞭に検出できて驚いた。
さらに 、非 特 異 的 増 幅 がKOD FXでは消失した。

サンプル
ターゲット長Chick GAD67プロモーター領域Chick kidney genomic DNA 0.1μg6273bp

プライマー条件
F primer：T CA G G T T G G T G T T CT CT CA CT G
22mer
R primer：T C A G C G C G G G T T G A A A G G A A G C
22mer
サイクル
KOD FX （98℃ 10sec., 68℃ 7min.）×35
KOD FX以外 推奨条件

データご提供京都大学医学部神経生物学講座（第一生理学教室）
石井孝広先生先生からのコメント
全く増えなかったのが増えた。クローン化後、配列が合っていることも確認した。

No.88.qx 07.10.10 14:56 ページ 12

特集

Amplification Efficiency

抜群の増幅効率

KOD FXでは、少ない鋳型量からでも優れた増幅効率を示します。

KOD FXM

1234

A社
汎用酵素（Taqベース）

KOD -PlusVer.2
M

1234M

1234B社
高正確性
酵素M

123Ｃ社
高正確性
酵素4M

123Taq DNA pol.
4M

1234M
M：1kb DNA ラダー
1：鋳型量 0.1ng
2：1ng
3：10ng4：100ng

鋳型：ヒトゲノムDNA 0.1ng〜100ng／50μl 反応系

PCRサイクル条件： 94℃

2min.

98℃

10sec.

68℃

3min.

ターゲット：β-globin 2.8kb

30 cyclesをお寄せいただきました。

基 本 条 件

toyobo.co.jp/bioでも公開しています）
Human転写因子（HNF3b, C/EBPβ, FTFおよびHNF6）
cDNAとmiR-17, 18, 19, 20, 92領域genomic DNAの増幅
M 1 2 3 4 5

M 1 2 3 4 5

M 1 2 3 4 5＊他社酵素については、製品添付のプロトコールに従い30サイクルにて実施しました。

M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5（1）反応液組成
2×PCR buffer for KOD FX 25μl
2mM dNTPs
10 μl
10pmol／μl Primer F
1.5μl
10pmol／μl Primer R
1.5μl
Genomic DNA〜200ngPlasmid DNA〜50ng
cDNA〜200ng（RNA相当）
KOD FX（1.0U／μl）
1μl
DW
up to 50μl

2ステップサイクル
94℃ 2min.
98℃ 10sec.
68℃ 1min.／kb

HNF3b
サンプルサイクル

C/EBPβFTF

HNF6

HNF3b, C／EBPβ, FTF, HNF6：
ヒト肝癌由来細胞株HuH7由来cDNA（0.1μg Total RNA相当）
miR-17〜92：
ヒト肝癌由来細胞株HuH7由来Ｇｅｎｏｍｉｃ DNA 0.2μg
KOD FX

94℃ 2min.,（98℃ 10sec., 55℃ 30sec., 68℃ 2min.）×40cycles

他社酵素

推奨条件

miR-17〜92

1：KOD FX
2：A社高正確性酵素
3：B社高正確性酵素
4：B社高正確性酵素（GC buffer ＋ 3% DMSO）
5：B社高正確性酵素（GC buffer ＋ 6% DMSO）
M：500base Ruler

遺伝子名、ターゲット長、及びプライマー配列¡HNF3b（ターゲット長：1.4kb）
プライマー 5'AC TCGAATT CCAGTATGCTGGGA G CG G TG A A G A 3
5'AAGGGGTA CCAGAGTTAGC CGG G CCTG A A 3 '¡C／EBPβ（ターゲット長：1.0kb）
プライマー 5'ATTAGAATT C GTTCATGC AACGCCTG G TG G CC 3 '5'CGCGGGTA CCGCGCTAGC AGTGG CCG G A G G A 3 '¡FTF（ターゲット長：1.6kb）
プライマー 5'C TATGAA TTC AC TAAGAATGTCTTCTA A TTC 3 '5'ATTC GATATCTTTAAAGC AAGTTTTTA A 3 '¡HNF6（ターゲット長：1.4kb）
プライマー 5'TCGCGAATTC CAC GATGAAC GCG CA G CTG A CCA T 3 '5'CTTTGGT AC CGAGGTTTTAGTTTG TG G TTCT 3 '¡ miR-17, 18, 19, 20, 92領域（ターゲット長：1.1kb）
プライマー 5'GGTTAC TAGTTGTTAGAGTTTGAG G TG TTA 3 '5'TATGAC TAGTCATATCGCAATAC TTA A CA G 3（赤字はhomologous sequenceを示します）

25〜40cycles

ステップダウンサイクル
94℃ 2min.
98℃ 10sec.
74℃ 1min.／kb
98℃ 10sec.
72℃ 1min.／kb
98℃ 10sec.
70℃ 1min.／kb
98℃ 10sec.
68℃ 1min.／kb
68℃ 7min.

5 cycles5 cycles5 cycles15〜25cycles

Q1:プライマー設計などに関して何かコツはありますか?
A1: 10kbを超える長いターゲットの増
データご提供
金沢大学がん研究所
細胞情報調節
黒木和之先生先生からのコメント
容易に各種クローンを入手でき驚きました。

幅には、通常より長め(27mer以上）にPrimerを設計して特異性を上げると共に、アニーリング（及び伸長反応）を比較的高い温度に設定することで、より良い結果を得ることができます。特に、ステップダウンサイ
クルでの増幅が有効です。また、少なくともカートリッジ精製した精製度の高いプライマーを用いることによって、非特異バンドを減らすことが可能です。

No.88.qx 07.10.10 14:56 ページ 13特集

優れた伸長性（増幅可能鎖長） Long Target Capability
KOD FXでは、λDNAを鋳型に40kb、ヒトゲノムDNAを鋳型に24kb、cDNAを鋳型に13.5kbの増幅が可能です。

M1 1

2

Long Targetの増幅

M：1kb Ladder Markers
1：KOD FX
2：A社Long PCR用酵素
3：A社高正確性酵素

Template:逆転写反応液（cDNA）
M1 1

2

植物発現プロモーターに連結させた
植物ウイルスcDNA増幅

33 M2
鋳型：逆転写反応液（ヒトcDNA）
Human total RNA100ng相当／50μl 反応系
M1：1kb DNA ラダー
1 ：Polymeraseε6.8kb
2 ：Insulin-like growth factor 2 receptor 8.9kb
3 ：Dystrophin 13.5kb
M2：λ／Hin dⅢ digest

遺伝子名

発現プロモーター＋植物ウイルスcDNA

サンプル

プラスミドDNA 0.2μg

ターゲット長11kb

プライマー条件 21 mer（GC=21%）サイクル
KOD FX 94℃ 2.5min.,（94℃ 15sec., 57℃ 15sec., 68℃ 7min.）×25
A社Long PCR酵素、高正確性酵素
94℃ 2.5min.,（94℃ 15sec., 57℃ 15sec., 72℃ 7min.）×25

データご提供日本大学生物資源科学部
植物病理学研究室
井村喜之先生先生からのコメント
KOD FXは、A社のLong PCR
酵素と比較して増幅効率がはるかに優れていた。また、A社
高正確性酵素ではどの条件でも増幅することができなかった。さらに、KOD FXは50μｌの系に対して1Uの使用で充分な結果が得られた。

Q2: PCR増幅時の正確性はどのくらいですか?
A2: Taq DNA polymeraseの約11倍です。KOD FXのPCRエラーによるミス塩基の取り込み頻度（エラー率）は、実際にシーケンシングにて解析した144,535塩基中、わずか19塩基でした。このエラー率は、他社Long PCR用酵素の約10倍優れている値でした。実際に、KOD FXで増幅した13.5kbのヒトジストロフィン（DMD）遺伝子をベクターにクローニングしたところ、5クローン中1クローンの割合でPCRエラーのないクローンを取得することができました。
PCRエラー率＜PCRエラー率の測定方法＞
各酵素にてヒトゲノムDNAを鋳型にβ-globin領域2.4kbの増幅を行い、PCR産物をTAクローニング後、96クローンをピックしてシーケンシングを行い、配列の確認を行いました。

KOD -PlusKOD FX
Pfu DNA Polymerase
A社Long PCR用試薬
Taq DNA Polymerase※KOD -Plus- Ver.2の正確性はKOD -Plus- とほぼ同等です。

020401006080
Mutation Frequency（×10-5）140160

保存温度

Code No.

価200U×1本［200回用*］-20℃

KFX-101￥35,000（200U×1本）
×5［1,000回用*］-20℃

KFX-101X5￥140,000

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs

120

包高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

装*50μl反応を行った時の反応回数を表示しています。
※KOD FXで増幅されたDNA断片は平滑化されているため、通常のTAクローニングはできません。TArget Clone™ -Plus-をお使いください。

ライフサイエンス事業部（大阪）〒530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目2番8号
TEL.06-6348-3786 FAX.06-6348-3833
E-mail order̲lifescience@toyobo.jp

ライフサイエンス事業部（東京）〒103-8530 東京都中央区日本橋小網町17番9号
TEL.03-3660-4819 FAX.03-3660-4951
E-mail order̲lifescience@toyobo.jp

Toyoboテクニカルライン
TEL.06-6348-3888（9：00〜12：00 13：00〜17：00（土・日・祝を除く））
FAX.06-6348-3833
E-mail tech̲osaka@toyobo.jp

Toyobo Web Site
［ http：//www.toyobo.co.jp/bio ]格