水100%移動相でも使える
次世代逆相カラム：
耐久性アップ・ピーク対称性アップ
ChromaNik㈱ クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp
Jaima2009 新技術説明会9月4日

1

通常の逆相カラムの水100%
移動相条件での問題点
ChromaNik

・保持の減少・再現性の低下
・カラム寿命の低下（どのpHでも有機溶媒を含まない移動相が最も劣化が早い）

Jaima2009 新技術説明会9月4日

2ChromaNik

従来のアルキル基の寝込みによる説明の元となったと思われる論文

1979年アルキル基の寝込みに関する論文
C18の寝込みについて記述されている
Jaima2009 新技術説明会9月4日

3ChromaNik

Jaima2009 新技術説明会9月4日

4ChromaNik

Jaima2009 新技術説明会9月4日

5ChromaNik

従来のアルキル基の寝込みによる説明
1999年アルキル基の寝込みによる保持減少の記述のある報文

Jaima2009 新技術説明会9月4日

6保持の減少の本当の原因は？

ChromaNik

細孔からの移動相の抜け出し

Jaima2009 新技術説明会9月4日

7ChromaNik

ODSカラムの保持挙動（水100%）条件
カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
１時間通液停止後再度通液し測定

流速: 1.0 mL/min
温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America October 2002.

保持時間：5.40minから0.41minに減少
Jaima2009 新技術説明会9月4日

再現性がない8ChromaNik

ポンプ停止後のカラムの状態
初期 試料は保持している。
カラムポンプインジェクター

ポンプを止め圧力が0になったら、すぐにカラムIN側に密栓をする。
カラムポンプインジェクター

カラムOUT側から移動相が出てくる。(0.59mL)
その後送液開始すると保持はすでに短くなっている。
Jaima2009 新技術説明会9月4日

9ChromaNik

水100%移動相条件下で保持が減少する理由
カラム内のODS粒子

移動相：水充填剤に圧力がかかっている場合ポンプを停止し充填剤に圧力がからなくなると細孔内に移動相が満たされている状態

細孔内から移動相が抜け出た状態

細孔内から移動相が抜けた後、16MPa以上の圧力をかけないと戻らない。
細孔内に移動相を戻すためには有機溶媒を70%以上含む移動相に置換しなくてはならない。
Jaima2009 新技術説明会9月4日

10細孔から移動相を抜け出させるためにどんな力が作用しているか？
ChromaNik

毛管作用
Jaima2009 新技術説明会9月4日

11ChromaNik

毛管現象とは（岩波 理化学辞典 第5版）

液体中に細い管（毛細管）を立てると、管内において液面が管外よりも上がりまたは下がる現象。液体分子間の凝集力と液体と管壁の間の付着力との大小関係により，液体が管を濡らす（付着力が大きい）ときは液面は上昇し、濡らさないときは下降する。管の内外の液面の高さの差をh、管の半径をr、液体の密度をρ、液体の表面張力をγ、接触角をθ、重力加速度をgとすれば、h=2γcosθ/rρgとなる。
Jaima2009 新技術説明会9月4日

12ChromaNik

毛管現象
Capillarity, Capillary phenomenon
水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合

毛管現象の式:h=2γ cosθ /(rρg)γ : 表面張力
ρ: 液体の密度（比重）θgrhrhθ

液体が管に濡れる場合
θ < 90°

Jaima2009 新技術説明会9月4日

液体が管に濡れない場合
θ > 90°13

ChromaNik

毛管現象
内径0.5mmのガラス管10nm

内径0.5mmのガラス管内でカラムを大気圧状態にして、移動赤インクは6cm上昇する。こ相を充填剤の細孔から抜け出さの場合に作用してる圧力はせるために必要な圧力は１気圧0.006気圧である。内径がである。充填剤の細孔の大きさを1μmでは30m上昇し、3気圧考慮すると毛管現象によりこの１の圧力が作用していること気圧は簡単に発生する。
Jaima2009
新技術説明会9月4日
14になる。

ChromaNik

濡れる（wetting）とは『液体と物質の表面との接触角が90度より小さい状態である』『液体と物質の表面との接触角が90度より大きい場合は濡れてない状態である』

θ液体物質

θ

『蓮の葉の上に水滴が存在する，この場合蓮の葉は水に濡れているか？』
細孔内でもODS表面に水は濡れない（接触角は90度以上）
Jaima2009 新技術説明会9月4日

15ChromaNik

水100%移動相で安定な保持を得るためには
逆相充填剤は水に濡れない－接触角は90度以上
毛管作用によって抜け出そうとする圧力が大気圧（0.1MPa)以下であればよい
C8 :水との接触角は137度→→大気圧以上→→移動相抜ける
C18 :水との接触角は126度→→大気圧以上→→移動相抜ける
C28 :水との接触角は105度→→大気圧以下→→移動相抜けない
Jaima2009 新技術説明会9月4日

16逆相固定相のアルキル基：
寝込んでいるのか（Ligand Collapse)
または立ち上がっているのか？
ChromaNik

一般的にはアルキル基は立ち上がっていると考えられている
しかし視点を変えると違った見方ができる

Jaima2009 新技術説明会9月4日

17ChromaNik

有機溶媒中でのオクタデカンの状態
メタノールにオクタデカン（C18H38)は溶けない

テトラヒドロフラン（THF)にオクタデカン（C18H38)は溶ける

メタノールとの接触面積が最低になるようなコンフォメーションをとると考えられる

Jaima2009 新技術説明会9月4日

18ChromaNik

C18表面上での溶媒和の概略図
メタノール

アセトニトリル

テトラヒドロフラン

オクタデシル基は寝込
み，表面に少量のメタノールが溶媒和している

メタノールと同様に，オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している

オクタデシル基は立ち上がっており，全体にテトラヒドロフランは溶媒和している

Jaima2009 新技術説明会9月4日

19ChromaNik

水100％移動相で使用可能C18★水との接触角を90度に近づけている•C18の結合密度を下げる•極性の高いエンドキャッピング
•C18に極性基を埋め込む•アルキル鎖長を長くする

Sunniest RP-AQUA→→

充填剤表面の疎水性が下がり，耐久性が落ちる
充填剤表面の疎水性は同じで，耐久性が落ちない

オクタコシル基結合（C28)
Jaima2009 新技術説明会9月4日

20ChromaNik

耐酸性加速試験 0.5%TFA, pH1.3
アミルベンゼンの相対保持係数 (%)

耐久性試験条件
100Column: Sunniest RP-AQUA,5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: 0.5% TFA
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 60 ºC

90807060

他社C18, AQ type

5040

保持時間測定条件

Sunniest RP-AQUA

3020020406080

通液時間 (h)100120140

Column: Sunniest RP-AQUA,5μm 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Amylbenzene

Jaima2009 新技術説明会9月4日

21ChromaNik

耐アルカリ性試験 緩衝液のみpH8
耐久性試験条件
チミンの相対理論段数(%)

100Column: Sunniest RP-AQUA, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: 20mM Phosphate buffer pH8.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

90807060

理論段数測定条件

5040

Sunniest RP-AQUA

30
200100200300
通液時間 (h)400

Column: Sunniest RP-AQUA, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Thymine

Jaima2009 新技術説明会9月4日

22ChromaNik

核酸塩基の分離と再現性

25 ºC

253

1

40℃でのチミンの保持時間の変化（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

45234024681012Retention time/min

14

チ ミン の 相 対 保 持 時 間 (%)

40 ºC 110090807060504030201001Column: Sunniest RP-AQUA, 5μm
4.6x150 mm
Mobile phase: 10mM Phosphatebuffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25ºC
Sample: 1 = Cytosine 2 = Uracil
3 = Thymidine 4 = Uridine
5 = Thymine

2345

ポンプ停止毎の保持時間測定回数

緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，Sunniest RP-AQUAはほとんど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，97%以上の再現性を示しました。
Jaima2009 新技術説明会9月3日

23ChromaNik

緩衝液のみの移動相での分離例◆ヌクレオチド◆水溶性ビタミン13423215
N=19,800

401234567891011121314

Retention time/minColumn: Sunniest RP-AQUA, 5μm 4.6x150 mm
Mobile phase: 40mM Phosphate buffer pH6.8
Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Nicotinic acid，2 = Pyridoxal，3 =Pyridoxine，4 = Nicotinamide

01234567891011121314

Retention time/min
Column: Sunniest RP-AQUA, 3μm 4.6x150 mm
Mobile phase: 20mM Phosphate buffer pH6.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 5’-GDP, 2 = 5’-GMP,
3 = 5’-ATP, 4 = 5’-ADP, 5 = 5’-AMP

Jaima2009 新技術説明会9月3日

24ChromaNik

カテキンおよびうまみ成分の分離
Column: Sunniest RP-AQUA 5 μm,
250 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase: A) H2O/H3PO4 (99.9:0.1)
B) CH3CN
Time (min) 0 20 60%B (%) 00 50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210 nm
Injection volume: 10 μL
Sample: Oolong tea
1 = (-)-Epigallocatechin
2 = (+)-Catechin
3 = (-)-Epigallocatechin gallate
4 = (-)-Epicatechin
5 = (-)-Epicatechin gallate

カフェイン
グアニル酸

シュウ酸
テアニン

31420510152025303540
Retention time (min）54550

Jaima2009 新技術説明会9月3日

5525ChromaNik

水溶性ビタミンの分離例 Ⅱ
1320mM Phosphate buffer
pH7.042502468610 12 14 16 18
Retention time (min)2022243120mM Ammonium acetate
4256024681012 14 16 18
Retention time (min)202224Column: Sunniest RP-AQUA 5 μm,150 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase:A) 20mM Ammonium acetateB) Acetonitrile/ A solution (20:80)
Time (min)05 2025%B (%)
00 100 100
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: 1= Nicotinic acid
2 = Pyridoxine HCl Vitamin B6
3 = Nicotinamide
4 = Thiamine HCl Vitamin B1
5 = Folic acid
6 = Riboflavin Vitamin B2

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Jaima2009 新技術説明会9月3日

26ChromaNik

まとめ逆相カラムは水移動相が細孔から抜け出すため，保持時間が減少する
この細孔内からの水移動相の抜け出しは毛管作用により起こる
他社C18 AQ typeは疎水性を下げているので，耐久性が劣る
オクタコサン基結合Sunniest RP-AQUAは，アルキル基が長いため，水移動相でも保持の再現性が得られる
Sunniest RP-AQUAは疎水性を下げていないため，耐久性を犠牲にしていない

Jaima2009 新技術説明会9月4日

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