私の研究

私の研究
低酸素応答性転写因子 HIF-1αに作用するがん分子標的治療薬の探索〜福島県土壌由来微生物を用いた創薬研究〜

金容必（きむ よんぴる）
いわき明星大学薬学部 教授

１．はじめにとする。創薬は膨大な時間と多くの人の英知と費いま、医療の場で用いられている薬のほとんど用を要する、リスクの大きな仕事である。新薬は、は、約60年前に世の中に存在していなかったと言ときには手術の必要をないものにするし、入院期われている。言いかえると、この60年余りの間に間を短くし、在宅で病気の多くをコントロールで今日の医療になくてはならない薬のほとんどが新きるようにするなど、医療の様相を一変させてき薬として登場してきたのである。

たのも事実である。現代における新薬開発は、医新薬がひとりで生まれてくることはまずなく、そこには砂漠の中からダイヤモンドを探すような療の進歩向上に欠くことのできないものになっている。

努力が必要である。新たに発見もしくは化合物とそこで、私たち研究室では現在日本の死亡原因して創製された物質を、病気の予防・治療や症状１位であるがんをターゲットとして福島県土壌由の改善に役立つ薬として医療の場に送り出すまで来微生物を用いて副作用の少ないがん分子標的薬の研究と開発の仕事を創薬と呼んでいる。人体のを目指し、創薬研究を行った。

仕組みや症状について新しい知識が得られると、病気の予防や治療についてのヒントや情報がいく

２．背景および目的つも生まれてくる。そこで天然物由来新薬候補物

乳がん、子宮頸がん、卵巣がんなど多くの悪性質の探索や化学合成が試されるが、それら候補化腫瘍において細胞への酸素供給はがんが生き延び合物が新薬になる確率は約10,000分の１であり、るために重要な因子のひとつであることが知ら化学実験から生物を用いた試験と治験（人での安れている。1992年に Semenza と Wang らによっ全性や有効性を確かめる試験）を経て新薬としてて初めて生体における酸素恒常性を司る因子と世の中に送るまでの歳月は９〜20年という長い期

して Hypoxia inducible facter-1α（HIF-1α、低間を必要とする。その間、沢山の開発費用も必要

酸素応答性転写因子）が報告され 1）、1995年に単

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私の研究離、精製されて以来、分子レベルの研究が加速的増殖にプラスの要因となっている。これらを可能に進み、がんの微小環境における HIF-1の機能がにしている因子は、低酸素条件下のがん細胞内で2）次々と明らかになってきた 。HIF-1はへリック活性化され、血管内皮増殖因子を制御することにスループへリックス構造を持つαサブユニット

よりがん細胞の増殖や転移を促進する作用をもつ（HIF-1α）とβサブユニット（HIF-1β）から構成HIF-1αである。従って、HIF-1α機能を制御すされるヘテロ二量体タンパク質である。HIF-1βる化合物は選択性の高く、かつ副作用の少ない新は恒常的に細胞内に存在しているタンパク質であしいタイプの抗がん剤になる可能性が高い。そこるのに対し、HIF-1αは正常組織において通常ので私たち研究室では、土壌由来糸状菌代謝産物を酸素濃度分圧下ではプロテアソームによる分解を用いて HIF-1αをがん分子標的としてスクリーニ受けるため、殆ど検出することができない。しかングを行った。

し、一旦細胞が低酸素に暴露されると HIF-1αの水酸化が阻害され安定化することで、HIF-1αの３．低酸素条件およびスクリーニング方法急速な蓄積を生じることが明らかとなっている。

スクリーニングにおいては、ヒト子宮頸がん

その後、細胞質に蓄積した HIF-1αは HIF-1βと（HeLa）細胞を糸状菌培養画分存在下で３時間前二量体を形成し核内標的遺伝子である Hypoxia処理し、さらに細胞を低酸素条件下（１%O 2 、responsive elements（HREs）に結合すること

94%N 2 、５%CO 2 ）で４時間培養後、細胞内ので血管新生因子である Vascular Endothelial

HIF-1α、βタンパク質レベルを Western blot 法

Growth Factor（VEGF）の産生を促す（図１）。

により検出した。また、ヒト乳がん細胞である

がん組織内はがん新生血管の構造異常や無秩序

MCF-7および T47D 細胞に対する活性成分の選な増殖などによって低酸素環境におかれているに択性については、低酸素下あるいは鉄キレート剤も関わらず、がん細胞は低酸素環境に適応し効率である deferoxamine（DFO）刺激で核内移行す的に増殖することができる。むしろ、低酸素環境

る HIF-1α、βタンパク質レベルを核抽出タンパ

は、がん細胞の悪性化、血管新生などのがん細胞ク質を作成して Western blot 法により検出した。

図１50

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がん細胞における HIF-1、VEGF と血管新生の関係

私の研究

４．スクリーニング結果、糸状菌の培養・精た。黄色粉末状物質として単離された３成分は製および構造解析

核磁気共鳴分光法（NMR）を初めとする各種機

土壌由来糸状菌の126培養画分でスクリーニン

器分析により IMU-0051-2-3-7は isochaetochromin

グを行った結果、最も強い HIF-1αタンパク質

B1、IMU-0051-2-3-9は isochaetochromin B2、の細胞内蓄積抑制を示した IMU-0051株のフラクIMU-0051-2-3-10は IMU-0051-2-3-9の新しい立体異ション２が選択された。糸状菌 IMU-0051株は福性体であることが明らかとなった（図３）。

島県いわき市三崎公園で採集した土壌より分離され、Pitt の分離法に従って菌学的性質を調べた結５．IMU-0051-2-3-7による HIF-1αタンパク果、Penicillium 属と同定された（図２）。本菌株

質の細胞内蓄積抑制効果をいわき産米を主成分とする生産培地で25日間静IMU-0051株から活性成分として単離された３置培養し、酢酸エチルを用いて抽出した後、得らつの化合物は、低酸素条件下で HeLa 細胞の細胞れた抽出画分をシリカゲルカラムクロマトグラ

質内に蓄積する HIF-1αタンパク質を濃度依存的フィーで分離して最終的にオクタデシルシリルに抑制した。そのうち活性の強かった IMU-0051-（ODS）カラムを用いる分取高速液体クロマトグ

2-3-7を用いて、３種類の細胞で低酸素下またはラフィ（HPLC）により３つの活性成分を単離しDFO 刺激による核内に移行する HIF-1αタンパ
ク質レベルを検討した。その結果、IMU-00512-3-7は、全ての細胞において低酸素下で核移行する HIF-1αタンパク質レベルを１から30μg/mlの範囲で濃度依存的に強く抑制したが、核内HIF-1βタンパク質レベルには殆ど影響を与えなかった。このようにして、IMU-0051-2-3-7の抑制作用が、HIF-1αタンパク質に選択的であることが明らかになった（図４）。一方、DFO 刺激により核移行した核内 HIF-1α、βタンパク質レベルに対しては、低酸素条件のように強い抑制活性は

図２ IMU-0051株の米培地による生産培養および顕微鏡写真見られなかった（データ未掲載）。以上の結果から、
IMU-0051-2-3-7は低酸素下の核内 HIF-1αタンパ

OHOH

2OHOHク質レベルに対して最も強い活性を示し、DFO2CH3CH3刺激により核移行した核内 HIF-1α、βタンパク質レベルに対する作用が弱いことから、がん治療

HO2CH3HO2CH3HO2CH3HO2CH3における選択的な治療薬として副作用の少ない抗CH3CH3OH OH
2
IMU-0051-2-3-7Isochaetochromin B1OHOH

2CH3HO2CH3HO2CH3OH OH
2
IMU-0051-2-3-9Isochaetochromin B2

CH3OH OH
2
IMU-0051-2-3-10
New compound

図３

IMU-0051-2-3-7、IMU-0051-2-3-9
および IMU-0051-2-3-10の構造がん薬のリード化合物になる可能性が示唆された。

６．IMU-0051-2-3-7における HIF-1αタンパ
ク質の細胞内蓄積抑制の作用機序
がん細胞が低酸素下で HIF-1αタンパク質を細胞内に蓄積するためには、p44/42MAP kinase 経路、PI3 kinase-Akt-mTOR 経路またはミトコンド

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図４図５

各種がん細胞の低酸素下による HIF-1αおよび HIF-1βの核移行に対するIMU-0051-2-3-7の作用
Normoxia：通常の酸素状態、Hypoxia：低酸素状態、HeLa：ヒト子宮頸がん細胞、
MCF-7および T47D：ヒト乳がん細胞

Hela 細胞の低酸素下における Akt および p44/42MAP kinase リン酸化に対する各種阻害薬の作用
Normoxia：通常の酸素状態、Hypoxia：低酸素状態
HeLa：ヒト子宮頸がん細胞、U0126（MEK-1阻害薬）、LY294002（PI3 kinase 阻害薬）、Rotenone（ミトコンドリア電子伝達系 Complex1阻害薬）、p-Akt：リン酸化された Akt バンド、
p-p44/42 MAPK：リン酸化された p44/42MAPK バンド

リアからの ROS（reactive oxygen species）などのを添加することにより低酸素下で３つの阻害薬

細胞内シグナル伝達経路が深く関わっている 3, 4）。

は HIF-1α、βタンパク質レベルに対しては強そこで、IMU-0051-2-3-7の抑制作用機序を明らか

い抑制活性を示し、DFO 刺激では U0126およびにすることを目的として３つの経路の阻害薬を

LY294002は弱い抑制活性を、rotenone は低酸素用いて作用機序の解析を行った。低酸素条件下

下および DFO 刺激共に強い抑制活性を示した

あるいは DFO 刺激で U0126（MEK-1阻害薬）、（データ未掲載）。以上のことから、IMU-0051-2-LY294002（PI3 kinase 阻害薬）
、または rotenone

3-7の HIF-1α、βの核内タンパク質レベルに対（ミトコンドリア電子伝達系 Complex１阻害薬）する抑制作用傾向は、U0126または LY294002の52

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抑制傾向と類似していることが示唆されたので、＜参考文献＞p44/42MAP kinase および Akt のリン酸化に対1） Gregg L. Semenza and Guang L. Wang.

する IMU-0051-2-3-7の効果について解析したとこ

A nuclear factor induced by hypoxia via deろ、両方共に抑制活性は認められなかった（図novo protein synthesis binds to the human５）。

erythropoietin gene enhancer at a site

以上の知見から、IMU-0051-2-3-7による低酸素下における HIF-1αタンパク質の細胞内蓄積抑required for transcriptional activation. Mol.

Cell. Biol. 12, 5447‑5454（1992）

制作用は、これまで知られている p44/42MAP

2） Gregg L. Semenza and Guang L. Wang.

kinase、Akt シグナル経路およびミトコンドリア

Purificationan dcharacterization of hypoxia-経路を介さないことが明らかとなり、新しい経路inducible factor 1. J. Biol. Chem. 1270, 1230‑1237の存在が強く示唆された。今後、これらの化合物（1995）の作用機序が解析できれば、新しい作用機序を持

3） Darren E. Richard, Edurne Berra, Emmanuel

つ副作用の少ない抗がん分子標的薬の開発に結び

Gothié, Danièle Roux and Jacques Pouysségur.

付く可能性が高いと思われる。

p44/42 mitogenactivated protein kinases
phosphorylate hypoxia-inducible factor 1（HIF-1）
and enhance the transcriptional activity of

７．最後に
本稿では、私たち研究室が行っているがんに対HIF-1. J. Biol. Chem. 274, 32631‑32637（1999）

する創薬研究について紹介しました。その他にも

4） Ning Gao, Liqin Shen, Zhuo Zhang, Stephen

微生物資源から薬剤耐性がん、炎症およびメラニ

S. Leonard, Hengjun He, Xue-Guang Zhang,

ン合成（皮膚がんや美白成分）に対する有効な生Xianglin Shi and Bing-Hua Jiang. Arsenite

物活性物質を探索することを柱として研究を行っ

induces HIF-1α and VEGF through PI3K, Aktています。近年の成果として、福島県土壌由来糸and reactive oxygen species in DU145 human状菌から新しいタイプの抗炎症薬（IRAK-4阻害

prostate carcinoma cells. Mol. Cell. Biochem. 255,剤）を世界で初めて発見し、イギリスの論文雑33‑45（2004）

5）

誌に発表をしました 。また、メラニン合成阻害5） Tadahiro Etoh, Yongpil Kim, Haruo Tanaka,剤も発見し、日本薬学会で研究発表したところ、

Masahiko Hayashi. Anti-inflammatory effect

2013年５月の化学工業日報に紹介され実用化が期

of berkeleyacetal C through the inhibition

待されています。私たちはこのような創薬研究がof interleukin-1receptor-associatedkinase-逸早く社会に役立てるよう、日々研究に邁進して4activity. Eur. J. Pharm. 698, 435‑443（2013）

います。

＜プロフィール＞
1968年生まれ。いわき明星大学 薬学部 教授。1991年韓国高麗大学卒業、2001年東北大学で薬学博士を取得。北里大学 北里生命科学研究所 研究員、アメリカ Mississippi 大学 薬学部 PD研究員、北里研究所 基礎研究所 研究員を経て2007年いわき明星大学薬学部へ。2013年から現職。専門は微生物代謝産物を用いた抗がん・抗炎症薬の創薬研究

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