静電気学会誌，42, 2（2018）90-95

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

がん治療を目的とした高周波バーストパルスががん細胞へ与える影響の調査
佐藤 浩美 ，安 啓太 ，南谷 靖史 ，大西 伸明 ，
＊＊
＊＊
＊＊
＊＊
藤原 裕介 ，松林 恭平 ，宮川 大輝 ，勝木 淳
＊

＊

＊, 1

＊＊

（2017年9月11日受付；2018年1月22日受理）

Investigation of Effect on Cancer Cell by High Frequency Burst Pulse forCancer Treatment
＊

＊

＊, 1

Hiromi SATO , Keita YASU , Yasushi MINAMITANI ,＊＊＊＊＊＊Nobuaki OHNISHI , Yusuke FUJIWARA , Kyohei MATSUBAYASHI ,＊＊＊＊Daiki MIYAKAWA and Sunao KATSUKI（Received September 11, 2017; Accepted January 22, 2018）
Recently, it has been shown that cancer is able to be treated by the nanosecond pulsed high electric field. We have studied thecancer treatment applying electric field by electromagnetic wave. In this study, we have investigated effect on cancer cell by ahigh frequency and high intensity burst pulse. The burst pulse has advantage of high efficiency for emission of theelectromagnetic wave. In this paper, it has been shown that there is possibility that the burst pulse more causes apoptosis to
HeLa-S3 cancer cell than the single pulse. DNA fragmentation by apoptosis has been observed at applying 200 shots of the burst
pulse train with 5 pulses of the frequency of 130 MHz with the electric field strength of 50 kV/cm. However, it hasn't been
observed at applying the single pulse of same condition.

1．はじめに感などの副作用を伴い，人体に対する負担が大きいため問

現在，日本人の死因第 1位を占めているのはがんであり，題となっている．そこで，副作用が軽い可能性があるがん

1）

全体の約 30％を占めている ．人間の身体を構成する数

治療としてパルスパワーを用いることが注目されている ．

十兆の細胞は日々分裂，増殖，アポトーシス（異常をきた

パルスパワーを用いたがん治療法では細胞に印加するした細胞が自己の所属する生体を守るために起こす自殺

電界の周波数が重要な要素である．高等生物を成す真核現象）を繰り返している．ところが，遺伝子に突然変異

細胞は，細胞膜で覆われた細胞質中に核があり，核は核が生じると身体が必要としていない場合でも細胞分裂を質が核膜で覆われている．そして，核質中に DNA がある

起こして増殖したり，死滅すべき細胞が死滅しなくなった構造となっている．細胞膜と核膜は電気抵抗が大きく，りする（アポトーシス機能の喪失）．このようにして生じ細胞質と核質は電解質であるため，真核細胞全体を簡単た過剰な細胞のうち，生命を脅かすものをがんと呼ぶ ．

な電気等価回路で表すと，細胞膜と核膜は誘電体，細胞

現在，がんの治療方法として外科治療，化学療法，放射質と核質は導体としての性質を持ち，図 1 のようにそれぞ

線療法が行われているが，脱毛，食欲不振，嘔吐，疲労れコンデンサ，抵抗とみなせる ．したがって，細胞に交2）キーワード：がん治療，高周波，バーストパルス，アポ
トーシス，HeLa-S3＊
山形大学（〒992-8510 山形県米沢市城南 4-3-16）
Graduate school of Science and Engineering, Yamagata
University, 4-3-16, Jonan, Yonezawa-shi, Yamagata,992-8150, Japan＊＊
熊本大学（〒860-8555 熊本県熊本市黒髪 2-39-1）
Graduate school of Science and Technology, Kumamoto
University, 2-39-1, Kurokami, Kumamoto-shi, Kumamoto,
860-8555, Japan1
minami@yz.yamagata-u.ac.jp

3）4）

流電圧を印加したとき，細胞の各部分にかかる電圧の大きさは周波数によって異なることになる．我々が動物細胞と同様の真核細胞である酵母細胞に対して図 1 のような

図 1 細胞の等価回路
Fig.1 The electric equivalent circuit of a cell.

がん治療を目的とした高周波バーストパルスががん細胞へ与える影響の調査（佐藤 浩美ら）

91（35）

図 2 細胞等価回路の周波数特性例
Fig.2 The example of the frequency characteristic of the electricequivalent circuit of a cell.

図 3 磁気スイッチ型非線形伝送線路バーストパルス発生装置
Fig.3 The burst pulse generator with magnetic switch typenonlinear transmission line.

等価回路をあてはめ，細胞各部分の周波数特性を計算しの LC 段数分連続した振動を持つパルス，すなわちバーた例を図 2 に示す ．パルスパワーを用いた技術では，時ストパルスを出力することが可能である．NLTL を用い

間幅が数ナノ程度の，数百 MHz の周波数成分を持つ極短た高周波バーストパルス発生装置の回路は，NLTL 本体

パルス電界を細胞に印加することも可能なので，細胞質，と負荷，負荷へ電圧を印加するギャップスイッチ，およ

核質に直接電界を作用させることができ，これにより細胞

び NLTL の昇圧充電回路から成っている．通常のパルスにアポトーシスを誘発できていると考えられている．最近

形成線路は各コンデンサによる周期が短い出力パルスがの研究により，がん細胞にナノ秒のパルスパワーによって重なり合って方形波を形成する回路であるが，磁気スイ

数十 kV/cm 程度の高電界を印加することで，アポトーシ

ッチ型 NLTL は強磁性体の持つ飽和特性を利用し，各コ

スを引き起こすことができることが明らかになっている ．

ンデンサで生成された振動パルスを独立した状態で連続

5）6）

このような高周波高電界を患部に印加するには針電極出力することを可能にしている．

を身体に直接さす方法があるが，臓器など複雑な部位へ

本実験では細胞内部の細胞質，核質にバーストパルスの電界供給は難しい．そこで，複数の集束アンテナを身

電界を作用させた場合の影響を調べたい．図 2 に示す交体の周囲に置き，患部に電界を集束し，重ね合わせるこ

流電界印加時の細胞各部の電界強度の周波数依存性の結とで高電界をかける方法が提案されている ．我々の研果より，100 MHz 以上になると細胞質および核質に印加究室でもこの方法での電界印加を研究している ．

される電圧がほぼ最大となる ．加えて，細胞膜にかか

7）

8）

11）

この方法では，電磁波の放射効率を考えると供給波形

る電圧が 10 分の 1 以下になり，ほぼ細胞内部に電圧がは方形波や減衰波ではなく，単一周波数の複数の振動パかかるようになる．したがって，100 MHz 以上のバース

ルスが連続するバーストパルスを供給する方が望まし

トパルスを印加すると細胞内部に多くの電圧が印加されい．また，バーストパルスにすることにより細胞に与えた場合の影響がわかる．そこで，本実験では 130 MHz

るエネルギーも増し，効果的と考えられる．しかし，10の周波数のバーストパルスに対する影響を調べた．比較

kV/cm を超えるような高電界の高周波バーストパルスでするバーストパルスの振動の数は，現在の実験装置で出の実験は行われていない ．

せる最大数である 5，および最小の 1 に設定した．

9）

そこで，我々は数十 kV/cm の高電界の高周波バース

図 4 に本実験で印加したバーストパルス波形とその周波トパルスの有効性を確認するため，実際に人の子宮頸が数スペクトルを示す．図 4（ a ）は，130 MHz の周波数でん細胞である HeLa-S3 細胞へバーストパルスの振動の数

1段の LC 段を組み，1周期分のパルスを出力した場合のを変えて印加し，HeLa 細胞へのアポトーシス誘導の影

出力電圧波形で，
図 4（ b ）にその周波数スペクトルを示す．

響を調査した結果について報告する．

図 4（ c ）は，130 MHz の周波数で 5 段の LC 段を組み，5周期分のパルスを出力した場合の出力電圧波形で，
図（4 d）

2．実験装置および実験方法にその周波数スペクトルを示す． LC 段の充電電圧は 34

2.1 実験装置

kV である．バーストパルスの出力電圧の測定には高電圧

図 3 に実験装置の概略を示す．バーストパルスの発生

プローブ（ Tektronix, P6015: 1000:1）を使用した．この回は 磁 気 ス イ ッ チ 型 非 線 形 伝 送 線 路（ NLTL：Nonlinear

路の出力波形は，図 4 からわかるように振動波形にオフセ

transmission line ）により行っている ．この装置は線路

ット電圧が加わったような 1-cosω t の形となっている．

10）

92（36）

静電気学会誌 第42巻 第 2 号（2018）
表 1 印加条件
Table1 The applied condition to the cancer cell.
Electric field intensity［ kV/cm ］

50

100

The number of applying pulses［ shots ］

200

500

1

3

1, 5

1, 5

The pulse repetition rate［ pps ］
The oscillation number of the burst pulse

細胞死の観測は PI 染色法を用いて行った．PI 染色液には -Cellstain- PI solution（同仁化学研究所，P378）を用いた．PI 染色法の原理及び測定手順を次に記す．PI は
分子量 668.39 の比較的大きな蛍光色素であり，通常では細胞内に入ることはない．しかし，細胞膜に PI が通過できるほどの穴（ナノポア）が出来ると細胞内に入り核を赤く染める．染色された細胞は細胞膜に欠陥ができ
図 4 バーストパルス発生装置の出力電圧波形及びその周波数スペクトル
Fig.4 The output voltage waveform and its frequency spectrafrom the burst pulse generator.

ているため死細胞であると判断できる．
PI での測定手順は次のとおりである．印加後，キュベットから細胞懸濁液をすべて取り出し，培地で 10 倍希釈する（1.0× 10 cells/mL ）．次に 96 well マイクロプレート
5

2.2 実験方法に 100 μL ずつ播種する（1.0× 10 cells ）．播種したもの細胞へのパルス電界の印加には，図 3 に示すエレクトは 0 時間で測定するものはすぐに，12 時間後に測定する

ロポレーション用電極付き容器（キュベット）を用いた．

ものは 12 時間インキュベートした後，PI を最終濃度 14電極間隔は 1 mm で，試料の容量は 100 μL である．電μg/mL になるように添加し，インキュベータ内で 20 分イ

極間の試料のインピーダンスは使用した培地の導電率でンキュベートする．最後に蛍光顕微鏡下で 516 nm の短波

決まり 10 Ω である．

長レーザーで励起し，露光時間 1 秒で蛍光像を取得する．

実験ではヒト子宮頸がんの亜種である HeLa-S3（ ATCC,

実験は，パルス電界を印加直後の 0 時間後と，印加しCCL-2.2：住商ファーマインターナショナル）を供試細胞て 12 時間後の細胞の様子を観測した．これは，電界がとした ．供試細胞は，培地に MEMα（和光純薬工業：

細胞膜に直接作用することで細胞膜に絶縁破壊を起こし

135-15175）＋ 10 ％ FBS（ ウ シ 胎 児 血 清，Fetal Bovineて穴が開く場合は，電界印加直後に PI 染色液が細胞にSerum ）（ Sigma-Aldrich：172012-500ML）＋ 1 ％ Penicillin/

入り込むが，アポトーシスによる細胞死のようなシグナ

Streptomycin（和光純薬工業：168-23191）を使用し，37℃，

ル伝達を介して細胞の生存率が低下する場合には，パルCO2 5 ％（残りは空気）の環境下のインキュベータ（培養器）

ス電界を細胞へ印加してから数時間経過した後に細胞膜内で 48～72時間培養したものを使用した．パルス印加時が劣化して穴が開き PI 染色液が入り込むからである ．

の細胞濃度は 1.0× 10 cells/mL とし，1 mm 間隔電極付き

アポトーシス誘導の有無の確認には TUNEL 法を用いキュベット内の全細胞数は 1.0× 10 cells とした．また，パた．TUNEL 試薬にはフローサイトメトリーアポトーシ

ルス電界印加時における培地にも上記の培地を使用した．

ス検出キット FlowTACS （コスモバイオ，4817-60-K ）

実験は，最初にアポトーシス誘導を確認するバーストを用いた．TUNEL 法とは，細胞がアポトーシスを起こ

パルスの電界強度と印加回数を決定するため，電界印加す過程で断片化する DNA に分子プローブを反応させ，時の細胞死の割合を観測した．印加した電界は，電界強染色を行う方法である．つまり，アポトーシスが起きて度 50 kV/cm で印加回数 200 shots と，電界強度 100 kV/

いるかどうかが，染色しているかどうかで分かる方法で

cm で 印 加 回 数 500 shots の 2 つ で あ る． 電 界 強 度 100

ある．測定はフローサイトメータを用いて行った．

12）

6

5

13）

TM

kV/cm は，用いた 1 mm キュベット内で，目視により放TUNEL 法での測定手順は以下のとおりである．パル

電が起こらない範囲として設定した．印加条件をまとめ

ス電界印加後 PI 実験と同様の手順で処理を行い，0 時間

たものを表 1 に示す．その後，この 2 点よりアポトーシのものはすぐに，12 時間後のものは 12 時間培養後に，ス誘導を確認するための電界強度，印加回数を決定し，シャーレ内の培地をマイクロチューブへ移し，そのシャアポトーシスの誘導の有無を確認した．

ーレにリン酸緩衝生理食塩水（ PBS ）を 500 μL 入れ，

がん治療を目的とした高周波バーストパルスががん細胞へ与える影響の調査（佐藤 浩美ら）

93（37）

それもまたマイクロチューブに移す．また先ほどのシャーレに 1 mM のエチレンジアミン四酢酸（ EDTA ）を
200 μL 入れ，1 分後 EDTA をさらにマイクロチューブに移す．マイクロチューブの懸濁液をシャーレに戻し，ピペッティング（ピペット内に懸濁液を出し入れすること
でかき混ぜること）で細胞をはがす．
次に，マイクロチューブにピペッティングした懸濁液を入れ，2000 G，25℃で 3 分間遠心にかける．その後上清を抜き，4％パラホルムアルデヒドを 500 μL 入れ，再度ピ
ペッティングする．パラホルムアルデヒドを入れたことで固定された細胞を 2000 G，25℃で 3 分遠心し上清を抜き，マイクロチューブに PBS を 1 mL 加えて 2000 G，25℃で 3分遠心する．遠心後上清を抜き，膜透過性試薬（ Cytonin ）を 100 μL 加えて細胞膜を融解させる．その後 10 分ごとにタッピングしながら 60 分間，37℃でインキュベートする．
その後，2000 G，25℃で 3 分遠心して TACS ヌクレアーゼなどのキット同封の酵素を投薬し，1 時間インキュベートする．そして，インキュベート後フルオレセイン
イソチオシアネート（ FITC ）による染色を 40 分，常温暗室で行う．この溶液をフローサイトメータ（ FACS
Calibur , AS ONE ）で測定する．
TM

3．HeLa細胞への印加実験結果
3.1 印加強度の違いによる細胞死の観測
図 5 にパルス電界を印加した場合の細胞の PI 蛍光染
色写真の例を示す．電界強度 50 kV/cm，印加回数 200
shots の条件の図 5（ a ），（ b ）では印加後 12 時間，電界

図 5 PI 蛍光染色による細胞死の様子（× 10 倍）
Fig.5 The appearance of the cell death by PI fluorescent stain.（×10 magnified ）強度 100 kV/cm，印加回数 500 shots の条件の図 （
5 c）
（
，d）
では印加後すぐに測定したものを示している．図 5（ c ），パルス電界を細胞へ印加した場合の細胞死の割合を算出（ d ）では印加直後に，ほとんどの細胞が PI 染色されてしたものを図 6 に示す．図にはパルス電界を印加しない

しまっていることがわかる．つまり，電界強度 100 kV/以外は同様の操作を行ったネガティブコントロールの割

cm で印加回数 500 shots の印加強度では，印加直後にパ合も表している．図において，100 kV/cm，500 shots の条

ルス電界によってほとんどの細胞が死んでいることを示件にはエラーバーがないが，これはこの実験がアポトーしている．この結果の確認のため，生細胞数測定試薬（同

シス誘導を確認するバーストパルスの電界強度と印加回

仁化学研究所：Cell Counting Kit-8）でも測定を行ったが数を決定することが目的だったため，どのくらいの値を生細胞は確認されなかった．この結果より電界強度 100

示すかがわかればよく，エラーバーが必要ではなかった

kV/cm で印加回数 500 shots の印加強度では，12 時間後ので，本実験自体を 1回しか実施していないためである．

にシグナル伝達で染色される細胞はほとんど残っていな

ただし，100 kV/cm，500 shots の結果はアポトーシス誘導

いと考えられたので 12 時間後の PI 測定は省略した ．

の確認に適さなかったので 1回しか測定していないが，一方，電界強度 50 kV/cm で印加回数 200 shots の条件

電界強度 50 kV/cm，印加回数 200 shots の条件およびネの測定では，印加直後の顕微鏡観察では様子に変化のあ

ガティブコントロールは，後のアポトーシス誘導の有無

る細胞は少なかったので，細胞内シグナル伝達により細の確認時に PI 染色を確認したデータも図 6 に入れたため胞死が増える 12 時間後に PI 染色を行い，死んでいる細複数のデータ（3 回）がありエラーバーが記載されている．

5）胞を確認した．
図 5 で示したような PI 染色の写真データを基にして，図より，50 kV/cm，200 shots での細胞死の割合は，振動の数 1 のバーストパルスでは 2.69％とコントロールと

94（38）

静電気学会誌 第42巻 第 2 号（2018）

図 6 振動の数 1 と 5 のバーストパルスを印加時の細胞の死
亡率
Fig.6 The ratios of the cell death applying the burst pulses with 1
oscillation and 5 oscillations.

図 7 コントロールにおける各蛍光強度での細胞数
Fig.7 The number of the cell at each fluorescence intensity forcontrols.

差がなく細胞に影響を与えていないことがわかる．振動の数 5 のバーストパルスでは 30.5％と約 3 分の 1 の細胞が細胞死した．一方，100 kV/cm，500 shots では振動の数
1 及び 5 でそれぞれ 80.6％，89.5％と，細胞死の割合が高くなった．この印加強度では，電界印加直後に細胞のほ
とんどに細胞膜破壊による細胞死を与えてしまっている
ことがわかる．したがって，
電界印加時に起こる細胞膜（コンデンサとみなせる）への電荷蓄積により細胞膜に絶縁

図 8 各蛍光強度における細胞数（電界強度 50 kV/cm, 130
MHz のパルス電界を 200 shots 印加した直後）
Fig.8 The number of the cell at each fluorescence intensity.（0 hour
after applying pulses of 130 MHz, 50 kV/cm, 200 shots ）破壊が発生し，ネクローシス（壊死）による細胞死であると推測される ．これは，130 MHz では相対的に細胞強度の位置から図 7（ b ）のような蛍光強度の位置に移動

内部に比べて細胞膜へかかる電圧は低下するが，印加しするため，蛍光強度が数十以下の低いところの細胞数がた電界強度が 100 kV/cm では大きすぎたため，細胞膜へ少なくなり，数十以上の高いところの細胞数が多くなる．

印加された電圧が細胞膜を絶縁破壊するのに十分な程大図 8（ a ）に，印加後 0 h のバーストパルスの振動の

きかったことを示している．この場合，アポトーシスに

数 1 の条件下における蛍光強度と細胞数の関係を示す．

進む前に細胞死が起こるため，アポトーシスによる細胞図 8（ a ）は図 7（ a ）のネガティブコントロールと同様死は観測されない ．一方，我々の文献 5）の結果より，に，蛍光強度が数十以上の高いところの細胞数は少なく，細胞が十数パーセント死ぬ条件であればアポトーシス誘

数十以下の低いところの細胞数が多いためアポトーシス

導が確認できることがわかっている．したがって，アポを起こしていない．

14）

5）

トーシス誘導の有無の確認は電界強度の大きさを半分に一方，図 8（ b ）には，印加後 0 h のバーストパルス

した 50 kV/cm，200 shots の印加条件にて行うこととした．

の振動の数を 5 とした条件下における蛍光強度と細胞数

3.2 アポトーシス誘導の有無の確認の関係を示す．図 8（ b ）では，蛍光強度が数十以上の

図 7 に TUNEL 法により観測したコントロールにおける細胞数が増え，蛍光強度が数十以下の細胞と同等の数と各蛍光強度での細胞数を示す．図 7（ a ）には，パルス電なっている．振動の数が 5 のバーストパルスを印加する

界を印加していない場合の細胞の蛍光強度と細胞数の関と，パルス電界印加直後からアポトーシスを起こした細係の測定結果であるネガティブコントロールを示す．パル胞が存在することが観測された．

ス電界を印加していない場合は多くの細胞が細胞死を起図 9 に，図 8 のフローサイトメトリーの結果を DNA の

こしていないため蛍光色素は発光せず，蛍光強度が数十断片化の割合で数値化したものを示す．断片化の閾値は以上の高いところの細胞数は少なく，数十以下の低いと

図 7（ a ），（ b ）の細胞数を規格化して比べ，線の交わっころの細胞数が多い．図 7（ b ）には，直接 DNA 鎖を切た蛍光強度，37 とした．バーストパルスの振動の数 1 でる試薬（ TACS-Nuclease，TANEL 試薬に同梱）により強は DNA が断片化した細胞の割合はネガティブコントロー

制的にすべての細胞に DNA の断片化を起こしたポジティ

ルと同じでありアポトーシスは誘導されていないことが示

ブコントロールを示す．パルス電界印加によりアポトーシ

される．一方，バーストパルスの振動の数 5 の方は約半スを起こした細胞は，蛍光色素と反応し図 7（ a ）の蛍光分の細胞が DNA の断片化を起こしており，パルス電界印

がん治療を目的とした高周波バーストパルスががん細胞へ与える影響の調査（佐藤 浩美ら）

95（39）

参考文献

図 9 50 kV/cm で 130 MHz のパルス電界を 200 shots 印加し0 h 後の DNA 断片化の割合
Fig.9 The ratio of DNA fragmentation applying pulse electricfield with 130 MHz.（0h after applying pulses of 50 kV/cm,
200 shots ）加直後からアポトーシスが誘導されていることがわかる．
バーストパルスの振動の数 1 と 5 の比較では，加えたエネルギー値に振動の数分の 5 倍の差があるため当初の狙い通り DNA の断片化，すなわちアポトーシス誘導に差異が生じたと考えられる．130 MHz，50 kV/cm，200
shots の条件ではアポトーシス誘導の閾値はバーストパ
ルスの振動の数 1 から 5 の間にあることが示された．
以上のことから，細胞に印加するパルスをバーストパ
ルスにして振動の数を増やすとアポトーシスを起こすことが容易になることが示された．今後この間の振動の数を調べ，アポトーシスを誘導できる閾値の振動の数を明らかにする．さらに，バーストパルスに優位性があるかを明らかにするため，バーストパルスの振動の数 1 のパ
ルス電界の繰り返し周波数と印加ショット数を 5 倍にして，同じ時間内にバーストパルスの振動の数 5 のパルス
電界と同じエネルギーを細胞に加えたとき，アポトーシ
ス誘導に差異があるか調べる．

4．おわりに
周波数 130 MHz のバーストのパルス電界を HeLa 細胞
へ印加し，その影響を調べた．電界強度 50 kV/cm のバーストパルスの振動の数 1 のパルス電界ではアポトーシ
スを起こせなかったが，バーストパルスの振動の数 5 の
パルス電界を印加した場合は印加直後から DNA の断片化が見られたことから，アポトーシスが効率よく起きる
こ と が 確 認 さ れ た． 電 界 強 度 100 kV， 印 加 回 数 500
shots の条件においては，印加直後に細胞がほとんど死亡していることから，アポトーシスではなく細胞膜の破壊によるネクローシスによって細胞死したと考えられる．以上より，今後はこの間の印加条件を詳しく調べる
ことで，がん細胞にアポトーシスを引き起こす印加条件を明らかにすることが出来ると考えられる．
本研究の一部は科学研究費補助金（基盤研究（ C ）26420220）の助成により行われた．

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