20-04

First Strand cDNA Synthesis Kit

ReverTra Ace -α-®
(Code No. FSK-101)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD. Biotech support Department
OSAKA JAPANA3280K

― 目次 ―
[1]

はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(1)

[2]

RT-PCR 法の原理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(2)

[3]

キットに含まれているもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(3)

[4]

ご用意いただくもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(5)

[5]

プロトコール・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(6)

[6]

添付プライマーの説明・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(8)

[7]

RNAを取り扱う際の注意・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(9)

[8]

RT-PCR を行う際の注意・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(9)

[9]

トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(10)

[10]

関連商品・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

(12)

ご注意
本キットに含まれる試薬類はすべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬として決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。

FSK-101

[1] はじめに逆転写 (Reverse Transcription；RT) 反応を PCR (Polymerase Chain Reaction) と組み合わせた RT-PCR 法は、比較的簡便かつ迅速に、多数のサンプルからRNAの検出を行うことが可能な手法です。そのため、mRNA 発現の有無、発現量、長さの異常といった RNAの解析や cDNA クローニングの手段として近年広く一般的な方法として用いられるようになりました。
弊社では MMLV (Molony murine leukemia virus) 由来の逆転写酵素を遺伝子工学的手法を用いて改変し、長鎖の cDNA 合成を妨げる RNase H 活性を欠失させ、さらに cDNA合成能を大幅にアップさせた改良型酵素である ReverTra Ace® の開発に成功しました。本
製品は このReverTra Ace®の優れた cDNA 合成能を活かした、 First strand cDNA 合成キットです。

ReverTra Ace -α-®は、ReverTra Ace®を用いた First strand cDNA 合成キットです。RT用のプライマー、Positive Control を揃えているため、手軽に逆転写反応を行うことができます。お手持ちの各種DNAポリメラーゼによる PCR 反応のためのテンプレートの作製にもご利用いただけます。例えば、High fidelity PCR 用酵素、Long PCR 用酵素等と組み合わせることにより、より目的に応じた RT-PCR が可能です。

本製品には、以下の特長があります。
1. 高い cDNA 合成能
本製品で使用している ReverTra Ace®は cDNA 合成能を大幅にアップさせた改良型酵素です。14 kb 以上の cDNA 合成を確認しています。
2. 高い検出感度
ReverTra Ace -α-®は、逆転写反応液を全量持ち込んでも PCR 反応を阻害しないように至適化しているため、種々の DNA ポリメラーゼを用いて RT 反応と同一チューブ内でPCR 反応を行うことが可能です。

(1)

FSK-101[2] RT-PCR 法の原理
RT-PCR 法は、図1のように、鋳型 RNA から First Strand cDNA を合成する逆転写反応のステップと、この cDNA を鋳型として Second Strand cDNA を合成し、さらに目的の遺伝子断片を増幅する PCR のステップからなります。
RNA5’
ReverTra Ace-α-®

3’
3’ 5’ Primer
Reverse Transcriptase(Synthesis of First Strand cDNA)

Revertra Transcriptase
ReverTra Ace®

RTcDNA
3’5’
Synthesis of Second Strand cDNA

DNA Polymerase

PrimerPCR
Amplification

DNA Polymerase

図1 RT-PCR法の原理

FSK-101(2)

[3] キットに含まれているもの（-20℃保存）（100回用）100 μL

1ReverTra Ace®

25×RT Buffer(25 mM Mg 含有) 400 μL

3RNase Inhibitor(10 U/μL)

100 μL

4dNTP Mixture(各10 mM)

200 μL

5RNase Free H2O

6Oligo(dT)20(10 pmol/μL)

100 μL

7Random Primer(25 pmol/μL)

100 μL

8Control Primer F(10 pmol/μL)

50 μL

9Control Primer R(10 pmol/μL)

50 μL

10Positive Control RNA(105 copies/μL)

50 μL

1,200μL【各プライマーのシークエンス】
Oligo(dT)205'-(dT)20-3'
Random Primer5'-(dN)9-3'
Control Primer F (G3PDH)
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'(20 mer)

Control Primer R (G3PDH)
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(3)(20 mer)

FSK-101

【添付プライマー】
G3PDH遺伝子用の配列特異的コントロールプライマー（Control Primer F、R＊）では 0.45
kb の PCR 産物が得られます。このプライマーは、Human 由来の G3PDH 遺伝子のほか 、 Rat 、 Mouse 、 Swine 等 由 来 の も の に も ご 利 用 い た だ け ま す 。 G3PDH 遺 伝 子 は"Housekeeping Gene" であり、コントロール RNA のほか、大部分のトータル RNA に共通して適用できます。
このほか、Oligo(dT)20、Random Primerを添付しています。これらのプライマーの選定については後述の「添付プライマーの説明」（p. 9） をご参照ください。
＊

このプライマーセットを用いた場合、cDNAから得られる増幅産物と同じサイズの増幅産物がゲノムDNAより得られる場合があります。これはおそらくシュードジーンに由来するものと思われます。このため、RT-PCRを行う際には、DNase I処理したRNAを使用し、また、RT反応を行わないネガティブコントロールを取ることをおすすめします。

Primer F
559
mRNA11237
1110
Primer R

intronsize(bases)

1634

図290 129

90 92 193

104

Control Primer F、Rのロケーション【Positive Control RNA】
本キットはポジティブコントロール用RNAとして、Human G3PDH (Glyceraldehyde 3Phosphate Dehydrogenase) 遺伝子の in vitro 転写産物が添付されています（3'末端には22 mer の poly(A) tail が付加されています）（図3参照）。
G3PDH 遺伝子は、様々な哺乳類の組織で発現している "Housekeeping Gene" です。その mRNA 発現レベルは、一部のサイトカインや Tumor-promoting Phorbol Esters 等を含む誘導物質によっても影響を受けず、また、ほとんどの組織で一定していることが知られています。したがって、種々の組織から抽出したRNAサンプルをご利用いただく際に、最適なコントロールとしてご使用いただけます。

FSK-101(4)

hG3PDH RNA

Primer F

Poly(A) (22mers)
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Primer R

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Oligo(dT)20

0.45 kb
図3 ポジティブコントロールRNAと添付プライマー[4] ご用意いただくもの
RT-PCRを行う際には、本製品のほかに以下のものが必要となります。
1. 試薬・ミネラルオイル（必要に応じて）・電気泳動用ゲル・電気泳動用バッファー・DNAサイズマーカー
・滅菌蒸留水（PCR グレード）・PCR用試薬（DNA ポリメラーゼ）
2. 機器・器具
・サーマルサイクラー・ゲル電気泳動装置
・UVトランスイルミネーター及び撮影装置
・マイクロ遠心機
・PCR用チューブ(5)

FSK-101[5] プロトコール
1. 逆転写反応試薬使用量(11-X)μL

RNase Free H2O
5×RT Buffer

4μL

dNTP Mixture (各10 mM)

2μL

RNase Inhibitor (10 U/μL)

1μL

PrimerRandom Primer＊(25 pmol/μL)

Oligo(dT)20(10 pmol/μL)

配列特異的下流プライマー＊＊(10 pmol/μL)

いずれか1μL

RNA
Total RNA：1μg以下mRNA：10～100 ng

Positive Control RNA：105 copies(1μL)

いずれかXμL
1μL＊＊＊

ReverTra Ace®

20μL

Total Volume＊↓ （30℃、10 min.）↓ 42℃、20 min.
↓ 99℃、 5 min.
↓ 4℃、 5 min.
↓スピンダウン【注】＊Random Primer をご使用の場合は、十分にアニールできるように、30℃、10分間のプレインキュベートを行ってください。

＊＊

テンプレートとしてPositive Control RNAを用いる場合はControl Primer Rをご使用いただけます。

＊＊＊

逆転写酵素は反応後にcDNAに結合しているため、99℃、5分間の熱処理を行いますが、必要以上に添加すると熱処理が不十分となり、PCR反応を阻害することがありますので、ご注意ください。

FSK-101(6)2. PCR
基本的には、お手持ちの DNA ポリメラーゼの使用方法に従って下さい。以下に一般的な使用例を示します。
試薬使用量（1. 逆転写反応の）サンプル

20μL

滅菌蒸留水

67.5μL

10×PCR Buffer＊

10μL

配列特異的上流プライマー(10 pmol/μL)

1μL

配列特異的下流プライマー＊＊ (10 pmol/μL)

1μL

DNA ポリメラーゼ (5 U/μL)

0.5μL

Total Volume

100μL

↓PCR
（ターゲット長が1 kb程度の場合）
94℃

30 sec.

60℃

30 sec.

72℃（30サイクル）＊＊＊

1 min.

↓ サンプルの一部をとって、アガロースゲル電気泳動を行い、目的増幅断片の生成を確認する。
【注】＊Mg 別添の場合には、Mg も添加して下さい。

＊＊

配列特異的下流プライマーを逆転写反応に用いた場合は、プライマーの代わりに滅菌蒸留水 1μLを加えてください。

＊＊＊

使用する酵素によりますが、Taq ポリメラーゼの場合、ターゲット長が1 kbを超える際には、通常 1 min./1 kb を目安に伸長時間を延長してください。

(7)

FSK-101

[6] 添付プライマーの説明
逆転写反応のプライマー選択の際には、以下の選択基準を参考にしてください。
1. 配列特異的下流プライマー（Control Primer R）
一般には、鋳型 RNA と相補的な配列を持つプライマーを用いる場合、ターゲットのシークエンスがわかっている必要があります。

2. Oligo(dT)20
poly(A) tail を有する mRNA の逆転写反応にのみご使用いただけます。原核生物のRNA、真核生物の rRNA や tRNA 等には使用できません。
3. Random Primerpoly(A) tail の有無を問わず、一般的にご使用いただけます。Random Primer で逆転写反応を行った場合、いかなるペアの配列特異的なプライマーによっても PCR を行うことができます。
Random Primer で逆転写反応を行う際には、プライマーが十分アニールできるように30℃、10分間のプレインキュベートを行ってください。

FSK-101(8)

[7] RNA を取り扱う際の注意
1. RNase の混入をおさえる
RT-PCR法では、RNase の作用をおさえることが重要です。そのためには、使用器具および試薬類からの RNase の混入を防ぐとともに、純度の高い RNA サンプルを得ることが重要です。さらに、実験環境にご注意いただくとともに、唾液、汗等からの RNase の混入を防ぐため、マスク、手袋の着用をおすすめします。
2. 器具類について実験器具は可能な限り、ディスポーザブルタイプのプラスチック製品をオートクレーブ滅菌して使用して下さい。ガラス器具をご使用になる際には、乾熱滅菌するか、もしくは0.1%Diethylpyrocarbonate (DEPC) 溶液に37℃、12時間浸せきした後、オートクレーブ（121℃、30分間）をかけたものを使用します。

[8] RT-PCR を行う際の注意
本製品は鋳型として、Total RNA、tRNA、mRNA、rRNA に適用できるように設計されておりますが、いずれの場合でも目的の増幅産物を効率良く得るために純度の高いRNAサンプルをご使用になることをお薦めします。

(9)

FSK-101

[9] トラブルシューティング
1. 増幅バンドが確認できない、または、増幅効率が悪い。
原因
鋳型RNA対策
・純度が悪い・再調製する・鋳型量が少ない・PCRのサイクル数を増やす
・鋳型量を増やす

・劣化している・再調製する。
・使用頻度が高い場合は、あらかじめ少量ずつ分注しておく

・高次構造を有する

・RTにRandom Primerを使用する
・酵素以外を入れたRT反応液を65℃で5分間、氷上で5分間置いた後、RTを行う

プライマー

・Tm値が低い・アニーリング温度を下げる、またはプライマーを再設計する・配列が適切でない・poly (A) tail を持たないRNAをRTのテンプレートとする場合、Oligo(dT)20は使用できない
・配列が正しいことを確認する
・プライマー内、あるいはプライマー間に相補的な領域がないことを確認する
・PCRのプライマー2つが同一鎖にアニールしないことを確認する

PCR条件

・プライマー量が少ない

・1反応当り、10 pmol 以上使用する・アニーリング温度が高い

・PCR条件を検討する

・伸長時間が短い

・PCR条件を検討する

・サーマルサイクラーの作動が ・動作が正常であるかを確認する
適切でない
その他

・RNaseのコンタミ

・鋳型RNAを再調製する

・酵素の失活・コントロールRNAで確認する
・新しい酵素を使用する

FSK-101(10)2.非特異的なバンドが多い
原因
鋳型RNA

対策
・鋳型量が多すぎる・鋳型量を減らす

・ゲノムDNAのコンタミ

・DNase I 処理を行う
・逆転写反応を行っていないNegative
Control も同時にPCRを行う

プライマー

・配列が適切でない・ターゲット領域以外にもアニーリングしやすい領域がある→プライマーを再設計する・プライマー量が多すぎる・プライマー量を検討する

PCR条件

・アニーリング温度が低い

・アニーリング温度を上げる

その他

・サンプル間のコンタミネー ・チップをこまめに交換する
ション・フィルターチップを用いる(11)

FSK-101[10] 関連商品
●キット構成試薬の単品販売
品名

内容

Code No.

ReverTra Ace® ＜高効率逆転写酵素＞

10,000 U×1本

TRT-101

RNase Inhibitor, recombinant

2,500 U×1本

SIN-201（2,500 U×1本）×5

SIN-201X5

dNTPs Mixture（10 mM）

0.2 mLNTP-301

Oligo(dT)201 nmol

FSK-201

Random Primer (9 mer)

2.5 nmolFSK-301

100回用

NPK-201F

1個MGS-101

50回用

PCR-311F

200回用

FSQ-101●RNA抽出関連試薬
MagExtractorTM-RNA- ＜Total RNA抽出用試薬キット＞
Magical Trapper ＜磁性ビーズ分離用スタンド＞●他のRT-PCRキット
RT-PCR Quick Master Mix＜Tth DNA Pol.を使用したワンステップRT-PCRキット＞●リアルタイムPCR関連試薬
ReverTra Ace® qPCR RT Kit＜リアルタイムPCR用cDNA合成キット＞

1 mL×5本

Realtime PCR Master Mix＜リアルタイムPCR用マスターミックス(プローブ検出用）＞

SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

1 mL×5本＜リアルタイムPCR用マスターミックス(SYBR® Green I 検出用)＞

SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus＜リアルタイムPCR用マスターミックス(SYBR® Green I 検出用)＞

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix(500回用/20μL反応)
1 mL×5本(500回用/20μL反応)
1.67 mL×3本＜各種蛍光ﾌﾟﾛｰﾌﾞ・蛍光ﾌﾟﾗｲﾏｰ検出用リアルタイムPCR試薬＞

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix(500回用/20μL反応)
1.67 mL×3本＜SYBR® Green I検出用リアルタイムPCR試薬＞

FSK-101(500回用/20μL反応)(500回用/20μL反応)(12)

QPK-101

QPK-201

QPK-212

QPS-101

QPS-201

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