日本薬学会年会新技術セミナー

ハイブリッド型に並ぶ耐アルカリ性:Sunniest / SunShell C18の紹介

クロマニック テクノロジーズ○長江 徳和Norikazu NagaeEmail:info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

1

【緒言】
シリカ系逆相充填剤はシラノール基の影響を防ぐため，様々なエンドキャッピング技法が開発されてきた。
演者らは従来のエンドキャッピング方法の概念を変え，エンドキャッピング試薬をあらかじめオクタデシルシリル化試薬に結合させたシリル化試薬を開発した。
5mmおよび2mmの全多孔性シリカおよび2.6mmのコアー
シェル型シリカに新規試薬を結合し，評価した。
アミトリプチリンのピーク形状を比較することにより，この試薬で調製した充填剤の残存シラノール基の評価を行った。
アルカリ性条件での耐久性をハイブリッド型C18と比較した。
2

Sunniest C18 およびSunShell C18固定相の推定されるシリカ表面での結合状態

Final TMS
シリカ表面に結合HOSiOSiSi OMeClMeMe
SiO

MeMe
SiOMeSiO

SiOMeOMe

新規C18試薬
ヘキサメチルオクタデシルテトラシラン（HMODTS)SiOSi
O O SiOSiOSiSiO
Si OOOO OOSiSiSi
SiO OHOSiSi
Si OOOOOSi
SiO SiOSiSiSiOO
HO OOO
Si
OO O
O OO
SiOSi
O
Si
OOSi
Si
Si
Si O
Si
O O
O Si O O O
OOSiOOOOOOOO
SiOOO3HMODTS結合に用いたシリカ基材
全多孔性シリカ (Sunniest C18)1) 細孔径: 12nm, 比表面積: 340 m2/g, 粒子径: 5 mm2) 細孔径: 10nm, 比表面積: 340 m2/g, 粒子径: 2 mm3) 炭素含有量： 16%
コアシェル型シリカ (SunShell C18)1)細孔径: 9nm, 比表面積: 150 m2/g, 粒子径: 2.6 mm2) 炭素含有量： 7%4アミトリプチリンのピーク比較Ⅰ
N(4) =11,000 4
TF(4) =1.03

A

4

1

N(4)=10,000
TF(4)=1.50

32Brand E C18

31B

N(4) =9,000
TF(4) =1.06

44

2N(4)=5,800
TF(4)=2.86

Column: Sunniest C18(HMODTS), 5 mm 150 x 4.6 mm
Re: Brand E C18, 5 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:A) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5 = 80/20B) CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0 = 80/20C) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0 = 60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC for A, C and D, 22 ºC for B
Sample: 1 = Uracil,CH
2 = Propranolol,
3ONH

CH3OH

Brand E C18

3 = Nortriptyline,
1C

2

NH

3
N(4) =12,500
TF(4) =1.04
4

4

N(4)=4,300
TF(4)=5.24

4 = Amitriptyline,

CH3CH3N

CH3

Brand E C18

TF: USP tailing factor

通常のC18：C移動相でアミトリプチリン(4)はひどくテーリング

5アミトリプチリンのピーク比較Ⅱ-A
アセトニトリル CH3CN, pH7.0, 40 ºC
A Sunniest C18 (HMODTS), 5 mm
143TF(4)=1.04

2BSunniest C18-HT(HMODTS), 2 mm
1 234TF(4)=1.28

Column size: 150 x 4.6 mm for A, D and E
100 x 2.1 mm for B and C
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min for A, D, and E
0.4 mL/min for B and C
Temperature: 40 ºC
CHSample: 1 = Uracil
ONHCH
2 = Propranolol
OH
33C18(HMODTS), 2.6 mm core shell typeC SunShell
34TF(4)=1.38

1 2DE

3 = Nortriptyline

NH4 = Amitriptyline

CH3CH3

Brand D C18, 2.6 mm core shell type11324

TF(4)=2.24

NCH3

Brand E C18, 5 mm
2３4

TF(4)=5.24

TF: USP tailing factor

6アミトリプチリンのピーク比較Ⅱ-B
ColumnTF

N

ColumnTF

N

Sunniest C18(HMODTS)

1.04 12,500

Japanese company C1 C18

2.148,700

Sunniest RP-AQUA

1.24 13,800

P1

1.09

9,500

D1

5.19

M1

2.01 11,200

D2

2.19 14,200

Japanese company D1 C18

1.30 12,000

AT

3.25

5,300

Japanese company D2 C18

2.928,000

S1

1.74

8,300

Japanese company D3 C18

2.706,100W11.97 10,600

Japanese company E1 C18

1.56 10,400

WS21.59 10,100

Japanese company F1 C183.44W31.33 10,000

Japanese company G1 C181.71 10,000

3,3006,700

Japanese company A1 C18 3.078,500

Japanese company G2 C182.15 11,500

Japanese company A2 C18 2.52

9,200Japanese company H1 C1811.12,100

Japanese company B1 C18 2.2350

Japanese company I1 C183.777,400

A13.285,900

Japanese company B2 C18 2.01 10,900
Japanese company B3 C18 7,75

Column size: 150 X 4.6 mm
Particle size: 5 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphatebuffer pH7.0=60/40
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: Amitriptyline

CH3NCH33,6007耐久性の評価

アルカリ性試験

Sunniest C18(HMODTS)はpH10，50℃の条件で700時間の耐久性
ブチルベンゼンの相対理論段数(%)

120

耐久性試験条件
Column: Sunniest C18 HMODTS, 5mm
150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Sodium
borate /10mM NaOH=30/21/49 (pH10)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 50 ºC

100806040

Sunniest C18
2000200

400600通液時間（ｈ）

800

理論段数測定条件
Column: Sunniest C18 HMODTS, 5mm
150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

8Azithromycinの純度評価

USP 32 Protocol Related Substances Test
カラム C18 4.6x250mm
移動相：A)50リン酸緩衝液pH8.95
B)アセトニトリル/メタノール（25/75)
90分のクラジエント溶離
流速：1.0 mL/mi n
カラム温度：60℃

pH9のアルカリ性でしかもカラム温度60℃
非常に過酷な条件
他社ハイブリッドカラムXB-C18

30回測定でカラム劣化
大差なし

Sunniest C18（通常のシリカ）

25回測定でカラム劣化
9Azithromycin
Related Substances test
Indian Pharmacopeia Column Recommended Waters X-Bridge
250X4.6, 5 um
Column used Sunshell Column 100X4.6, 2.6 um
M.Phase A: 0.18 % anhydrous Na2HPO4 pH 8.9M.Phase B :25 volumes MeOH and 75 volumes AcN .
Gradient table, Flow rate and relevant method details given in slide
Number 11Temperature 60 Deg C.
Sample concentration 8000 ppm
Injection volume used 50 ul for 250X 4.6, 5 um X-Bridge C18 column
Injection volume used 20 ul for 100X 4.6, 5 um Sunshell C18 column
UV 210 nm
System suitability requirements: RRT between Azihtromycin Principal
peak and 3-deoxyazithromycin shall be about 1.33
10Azithromycin Related Substances Test
Reference Indian Pharmacopeia 2010 pg 857-858
52504.6150

2.6100
4.6
1.92
2011Azithromycin
Related Substances test Chromatograms
0.30

Solvent Blank chromatogram

0.30

AUAU

-0.04
0.00

-0.04
0.00

0.30

min

20.00

sample chromatogram (Injection 50)

min

20.00

Sample chromatogram (Injection 92)

AUAU

-0.04
0.00

0.30

Sample chromatogram (Injection 2)

min

20.00

-0.04
0.00

min

20.00

12

カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）
Column size: 150 x 2.0mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/minTemperature: 40 ºC
Detection: Corona CAD

F社 C18

B社 C18Sunniest C18 HMODTS

Retention time/min

13MSを用いたブリードの比較
5.E+08

Column size: 150 x 2.0 mm
Mobile phase:A) 0.1% acetic acidB) CH3CN
Gradient:
Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 40 ºC
MS： ABI API-4000
Ionization: Turboionspray (cation)
Measurement mode:
Q1 Scan m/z 100-1000

5.E+084.E+08Company B C18

Intensity (cps)

4.E+083.E+083.E+082.E+082.E+081.E+08Sunniest C18 HMODTS5.E+07

0.E+0005101520Time (min)14SunShell
コアシェル構造の概略図
2.6 mm

0.5 mm

2.6 mmコア

コア1.6 mm

多孔性シリカ部

多孔性シリカ部
粒子径：2.6 mm，コア径：1.6 mm，多孔質層の厚さ：0.5 mm
細孔容積：0.34 mL/g，比表面積：150 m2/g，細孔径：9 nm
多孔性シリカの体積の割合：77%15全多孔性とコアシェル型の理論段高さの比較
1816Fully porous 5 um

Plate Height, um

14

Fully porous 3 um

12

Fully proous 2 um

10Core Shell 2.6 um

86Column: 50 x 4.6 mm C18Mobile phase:
Acetonitrile/water=(60/40)
Temperature: 25 oC
Sample : Naphthalene

4200510Mobile Phase Velocity, mm/sec

1516ハイスループットSub2mmカラムとコアシェル型カラムとの圧力比較
45Sunniest C18-HT 2.0 um

40

Brand A C19 1.9 um

Pressure, MPa

35

Brand B C18 1.8 um
Brand C C18 1.7 um

30

Brand D C18 2.6 um

25

SunShell 2.6 um

20
15Column: 50 x 2.1 mm C18Mobile phase:
Acetonitrile/water=(70/30)
Temperature: 25 oC

105000.5

1Flow rate, mL/min

1.517単位圧力あたりの段数比較
PlatesPressure(MPa)

Plates/pressure

Sunniest C18 –HT 2.0 mm

9,90016.7593Brand A C18 1.9 mm

7,660

16.3470

Brand B C18 1.8 mm

10,10019.6515

Brand C C18 1.7 mm

11,14032.0348

SunShell C18 2.6 mm

9,2009.7948

Sunniest C18 –HT 2.0 mm
Brand A C18 1.9 mm
Brand B C18 1.8 mm
Brand C C18 1.7 mm
SunShell C18 2.6 mm
05,00010,00001020300300

600

900

Column: 50 x 2.1 mm C18, Mobile phase: Acetonitrile/water=(70/30), Temperature: 25 oC

18

高速分離例
72483156Column: SunShell C18 2.6 mm, 30 x 3.0 mm.
Mobile phase: A) Wtaer, B) Acetonitrile; Gradient(Acetonitorile %), 0.00 min - 35%, 0.40 min 100%, 0.80 min - 100%, 0.85 min - 35%, 1cycle;
1.8min, (High-pressure gradient).
Flow rate: 1.0 mL/min.
Temperature: 40 ºC.
Injection Volume: 1 µL.
Wavelength: 200 - 500nm, CH-9, 215 - 500nm(Max Abs.).
Sample: Mixture of ultraviolet absorbers,
1 = 2,2’,4,4’-Tetrahydroxybenzophenone,
2 = Ethyl p-aminobenzoate,
3 = 2, 4-Dihydroxybenzophenone,
4 = 2,2’-Dihydroxy-4-methoxybenzophenone,
5 = 2,2’-Dihydroxy-4,4’dimethoxybenzophenone,
6 = 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone,
7 = 2-(2’-Hydroxy-5’-metylphenyl) benzotriazole,
8 = 4-tert-Butylphenyl salicylate.
19Courtesy of Jasco.

イソクラチック溶離例
Brand F C18, 5 mm 250 x 4.6 mm

HPLC

N(4)=19,313

3123104 524

N(4)=20,287

分析時間1/368101214Retention time/min1618200542122

N(4)=20,287

3154SunShell C18, 2.6 mm 100 x 4.6 mm

25mm C18からの移行

23456Retention time/min

UHPLC 131.8 mL/min201425431N(4)=24,124

1.0 mL/min

2N(4)=22,424

24Column:
Brand F C18, 5 mm 250 x 4.6 mm
SunShell C18, 2.6 mm 100 x 4.6 mm
Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphoric acid = 45/55
Flow rate: 1.0 mL/min,
1.8 mL/min at the lowest chromatogram
Temperature: 25 ºC
Pressure: 9.5 MPa for Brand F C18 5 mm
13.4 MPa for SunShell C18 2.6 mm
Detection: UV@230 nm
Sample: 1 = Benzydamine
2 = Ketoprofen
3 = Naproxen
4 = Indomethacin
5 = Ibuprofen
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE（内径0.25mmの配管仕様）
UHPLC: Jasco X-LC

53Retention time/min

5mm, 250x4.6mmカラムに比べ分析時間1/6
45620

グラジエント溶離例

5mm C18からの移行
Column:Brand G C18, 5 mm 150 x 4.6 mm
SunShell C18, 2.6 mm 75 x 4.6 mm
Mobile phase:A) 0.1% Phosphoric acidB) CH3CN
Gradient program for Brand G C18
Time%B0 min
2%

15 min25%

20 min25%

7.5 min25%

10 min25%for SunShell C18
Time%B0 min
2%

Flow rate: 1.0 mL/min,
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: Oolong tea
1 = Gallocatechin, 2 = Epigallocatechin,
3 = Catechin, 4 = Caffeine, 5 = Epicatechin,
6 = Epigallocatechin gallate, 7 =Gallocatechin gallate, 8 = Epicatechingallate, 9 = Catechin gallate
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE（内径0.25mmの配管仕様）
UHPLC: Jasco X-LC
21

クレゾールの異性体の分離
1,2SunShell C18

3123
SunShell PFP

Column:SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell PFP, 2.7 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºCSample:
1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

C18カラムではp-クレゾールとm-クレゾールは分離不可能です
が、PFP は分離可能です。

22

SunShell RP ガードフィルター（C18結合カートリッジフィルター）Tubing0.13mmID,60mm
lengthHolder

BeforeAfter
Cartridge
filterbondedwith C18☆均一な細孔径を持つモノリス型ガラスフィルター（直径4mm,厚さ4mm）にC18を結合☆夾雑物の捕捉によるカラム圧の上昇防止やC1８結合相による吸着物の除去など、種々の逆相カラムのガードカラムとして利用可能☆カートリッジ式で交換が容易☆ホルダーを含めローデッドボリューム仕様（2.1x50mmカラムで5%の段数低下、4.6x150mmカラムで1%の段数低下）☆内径2.1mm～4.6mmカラムに使用可能☆SunShell RP Guard Filterの圧力損失は１ｍL/minで約0.1MPa、またGuard Filter 本体の耐圧は60MPa☆SunShell以外の逆相カラムにも汎用的に使用可能☆アミトリプチリンのような塩基性化合物もテーリングのないシャープなピーク形状
23

【まとめ】
シリカ表面の様々な位置のシラノール基と結合可能な新規
C18試薬（HMODTS)を開発した
残存シラノール基を非常に少なくすることができ，その結果耐久性が向上 - pH10使用可能・ハイブリッド型と同等な耐久性2.6mmのコアシェル型粒子を用いることによりサブ2mmカラムの半分の圧力で，同等な段数が得られた
コアシェル型C18は，超高圧LC装置が不要で，汎用HPLC装置でサブ2mmと同等な高速分離が達成可能である
さらにコアシェル型C18は分析時間が短縮されるため、アルカリ性移動相条件下での分析数が大幅に増やすことが可能
24