J. Inst. Electrostat. Jpn.

静電気学会誌，34, 1 (2010) 2-7

小型アルゴンプラズマジェットによる殺菌効果の検証
柴 原 大 輝*, 安 田 八 郎*, 藤 井 直 斗**，栗 田 弘 史*，
高 島 和 則*，水 野彰*,1（2009 年 8 月 3 日受付；2009 年 11 月 10 日受理）

Sterilization of Escherichia coli by Small Size Argon Plasma Jet
Daiki SHIBAHARA,* Hachiro YASUDA,* Naoto FUJII,** Hirofumi KURITA,*Kazunori TAKASHIMA* and Akira MIZUNO*,1(Received August, 3 2009; Accepted November, 10 2009)

Non-thermal atmospheric pressure plasmas have recently been applied in biomedical field. Plasma jet show aconsiderable promise for medical application where surfaces are exposed to plasma in a non-contact and site-specificmanner at nearly the same temperature as the ambient gas. We have characterized a device of argon plasma jet of
relatively small dimensions using smoke wire methods and optical emission spectrometry. Efficacy ofdecontamination by the plasma for the wet state of Escherichia coli cells was investigated with several culturingconditions such as surface of an agar plate, inside the soft agar layer and in the water solution. Denaturation of theproteins inside the cell was also demonstrated. These results suggest that reactive species are produced from thesewater and they kill the bacterial cells.
1.

た発光分光計測を行った．また，寒天培地表面および液中環はじめに近年，プラズマや放電を利用した新しい殺菌・医療技術の開発・実用化が検討されている．その中でも大気圧低温プラズマ境下における大腸菌の殺菌効果の検証およびタンパク質変性効果の検証を行った．に大きな注目が集まっており，放電機構と応用に関する研究が盛んに進められている 1)．大気圧プラズマの 1 つとして，プラズ2.

マジェットが挙げられる．プラズマジェットは被照射物に対して

図 1 に，本実験の実験構成図を示す．Ar ガス流量は流量計

熱負荷をかけずに，化学的に活性なラジカルによるプラズマプにて 2.0 L/min に調整し，小型プラズマジェット発生装置に流ロセスを行うことが可能である．任意の対象物表面に非接触で入させた．電源にはパルス電源（電子制御国際 実験機 9 号）曝露できることから，身体表面の疾患治療や血液凝固の促進を用い，発光分光計測，寒天培地表面における殺菌および2）

実験装置および実験方法．また，プラGFP 蛍光減衰効果実験では印加電圧 6.4 kV0-p，周波数 4

ズマジェットは局所的なプラズマプロセスを可能としているためkHz とし，液中殺菌では印加電圧 5.0 kV0-p，周波数 4 kHz としなどの医療分野への応用研究が注目されている
3)

虫歯治療 や 96 穴プレートを用いた多検体並列処理への適用
4)が期待されている ．

た．
図 2 に小型プラズマジェット発生装置概略図を示す．北野ら

本研究では，アルゴンガス（以下 Ar ガス）を媒体とする，小の方法 5)を参考にし，接地電極を 2 本にする等の一部改変を型プラズマジェット発生装置を作製し，その特性理解のためス加えた．石英ガラス管（外径 4 mm，内径 2 mm）の内部にアルミモークワイヤー法による Ar ガス流れの可視化，分光器を用いテープを貼り付け高電圧印加電極とした．また，その石英ガラス管に対して，外壁にアルミテープを接地電極として設置した

キーワード：アルゴンプラズマジェット，プラズマ，スモークワイヤー法，殺菌効果，大腸菌* 豊橋技術科学大学エコロジー工学系（441-8580 豊橋市天伯町雲雀ヶ丘 1-1）
Department of Ecological Engineering, Toyohashi
University of Technology, 1-1, Hibarigaoka, Tenpaku-ku,
Toyohashi 441-8580, Japan** 象印マホービン株式会社（530-8511 大阪府大阪市北区天満 1-20-5）
Zojirushi Coporation, 1-20-5 Temma, Kita-ku, Osaka
530-8511, Japan,
1

mizuno@eco.tut.ac.jp

石英ガラス管 2 本を斜めに配置した．石英ガラス管内部にはAr ガスが流入し，装置先端からプラズマジェットが発生する構造となっている．図 3 にプラズマジェット発生時における観察写真を示す．
2.1

スモークワイヤー法による Ar 流れの可視化

シャーレおよび 96 穴プレートにおいて，プラズマジェット発生装置より放たれるガス流の挙動を調べるためにスモークワイヤー法にて Ar 流れの可視化を行った．
プラズマジェット発生装置先端部から 3 mm の位置にφ0.1 mm のタングステン線を設置し，トレーサーには流動パ

小型アルゴンプラズマジェットによる殺菌効果の検証（柴原大輝ら）

3ラフィンを用いた．このとき，プラズマジェット発生装置

2.2のメインノズル両脇に配置した石英ガラス管は，メインノプラズマジェット発生装置先端部と分光計測用光ファイズルより放たれるガス流に影響を及ぼさないと考え取り外バーヘッド(USB4000P Ocean Optics)の間 20 mm の位置に 5した．タングステン線への電圧印加用電源として直流電源

mm 厚の石英ガラスを設置し，照射下部から垂直に採光しを使用，印加電圧 12 V，電流 1.4 A として放電無し Ar ガスて発光分光計測を行った．

発光分光計測流れを可視化した．また，撮影には，高速度カメラ

2.3(PHOTORON FASTCAM-X1280PCI) を用いて毎秒 250 フ

本実験では，クラゲ緑色蛍光タンパク質（GFP）を産生する

小型プラズマジェット殺菌効果の検証

組み換え体大腸菌（E. coli MV1184 pGLO）を殺菌検体としレームで撮影を行った．

た．L(+)-アラビノースを含む培地で培養すると GFP の発現が誘導され，細胞内に GFP が蓄積する．プラズマジェットを曝露
Ar gas input

Ar

Oscilloscope

FlowMeter

した場合におけるメンブレンフィルタ（ADVANTEC CelluloseAcetate,ポアサイズ 0.45 μm，φ90 mm (以下フィルタ）)上での範囲別殺菌効果の検証，大腸菌を Soft agar に混合させた場合における培地中深度別殺菌効果の検証，96 穴プレート内に菌Ar Gas

液を滴下した場合における殺菌効果の検証を行った．それぞれ全 3 回の実験を行い，平均グラフを算出した．
Pulse PowerSupply

2.3.1

フィルタ表面における殺菌効果

減圧濾過法にて，約 3,000 cell の大腸菌をフィルタ上に捕集

Plasma Jet Generator

図 1 実験構成図

し，アンピシリンおよび L(+)-アラビノースが添加された LB 寒天

Fig. 1 Schematic of the experimental set-up.

培地上に設置した．設置されたフィルタ中央上部 20 mm の位置にプラズマジェット発生装置を設置し，プラズマジェットを曝Ar gas input
Seal tape

露した．曝露時間は 0，15，45，135，405，1,215 s とした．曝露Aluminum Tape

Quartz Glass Tube
（O.D.4mm，I.D.2mm）

後，37℃に設定されたインキュベーター内にて 24 時間培養後，生菌数の測定および観察を行った．フィルタを中心地点より半径 5 mm の同心円で区分し，中心領域を①，最外領域を⑤とする①-⑤の領域における生菌数の測定および単位面積当りm70m

Silicone Rubberの生菌数の算出を行った．
2.3.2

培地深度別殺菌効果

アラビノースを添加し 45℃にしておいた溶解 Soft agar 培地
10°に約 10,000 CFU/mL となるよう大腸菌を混合させ，アンピシリン

図 2 プラズマジェット発生装置概略図

および L(+)-アラビノースが添加された LB 寒天培地上に厚さをFig. 2 Schematic of the plasma jet generator.

1-5 mm まで 1 mm ごとに変えて重層した．Soft agar 培地中央
上部 20 mm の位置にプラズマジェット発生装置を設置し，プラズマジェットを曝露した．曝露時間は 0，2，4，6 min とした．曝露後，37℃に設定されたインキュベーター内にて 24 時間培養後，Soft agar 中心地点より半径 1 mm の領域および半径 2.530ｍｍmm の領域において単位面積当りの生菌数の測定および観察を行った．
2.3.3

96 穴プレートを用いた液中殺菌効果
8

1.5×10 CFU/mL に調整した大腸菌を 96 穴プレートの 1 ウェル内に 70 μL（菌液深さは約 2 mm）および 150 μL（菌液深さは約 4 mm）滴下し，液面上部 20 mm の位置にプラズマジェット発生装置先端を設置し，プラズマジェットを曝露した．曝露時
図 3 放電観察写真

間は 70 μL では 0,2，4，6，7，8，10 min とし，150 μL では 2-20Fig. 3 Photographs of the plasma jet.

min までの 2 min 間隔とした．また，周囲への影響を調べるため

4静電気学会誌

第 34 巻プラズマジェット照射に隣接する 1 ウェル内に同様の菌液を

第 1 号（2010）(a)

70 μL および 150 μL 滴下した．曝露後，pH の測定，菌の回Tungsten Wire(φ0.1mm)

3mm

収および希釈を行い，コンラージ棒にて LB 寒天培地上に塗布した．塗布された培地を 37℃に設定されたインキュベー
ター内にて 24 時間培養後，生菌数の測定を行った．
2.4

フィルタ表面におけるGFP蛍光減衰効果

減圧濾過法にて，約 1.0×109 cell の大腸菌をフィルタ上に捕集し，アンピシリンおよび L(+)-アラビノースが添加された LB
寒天培地上に設置した．設置されたフィルタ中央上部 20 mmの位置にプラズマジェット発生装置を設置し，プラズマジェットを曝露した．曝露時間は 5-20 min までの 5 min 間隔とした．曝露後，紫外線励起波長 254 nm を照射し観察を行った．

3.1

実験結果および考察

Tungsten Wire
(φ0.1mm)

3mm

3.

(b)

スモークワイヤー法による Ar 流れの可視化

スモークワイヤー法による放電無し Ar ガス流れの可視化を行った．図 4 に容器別の Ar ガス流れの様子を示す．
図 4(a)は 50 mm シャーレにおける Ar ガス流れである．プラズマジェット装置先端から放たれた Ar ガスがシャーレに衝突し，シャーレ底面全体に広がりをみせているのが分かる．また，
図 4(b)は 96 穴プレートにおける Ar ガス流れである．プラズマジェット装置先端から放たれた Ar ガスが 1 ウェルにのみ流入しており隣接する穴にはほとんど流入しないことが分かった．
以上の結果から，シャーレおよび 96 穴プレートにおいて，

図 4 Ar ガス流れの可視化写真プラズマジェットの有効範囲を推測することができた．
3.2(a） 50 mm シャーレ，(b) 96 穴プレート

発光分光計測Fig. 4 Visualization of the argon gas flow.

分光器によるプラズマジェットの発光分光計測を行った．

(a）50 mm Petri dish，(b) 96-well plate.

DNA の紫外線吸収による損傷として高い殺菌効果が認めら観測される．また，活性酸素種のうち最も強力な酸化力をもつ，OH ラジカルが発生すると，309 nm 付近にスペクトルが観測される 6）．図 5 に本実験で用いたプラズマジェットの発光スペクトルを示す．
図 5 は波長 200-850 nm での発光スペクトルである．そのIntensity [a.u.]

れている UV-C region は 200-280 nm においてスペクトルが8000
7000
6000
5000
4000
3000
200010000

結果 UV-C region ではピークが観測されず，短波長域でスAr

Ar

Ar
Ar

Ar

200300ペクトルが観測できたのは UV-A region(315-400 nm)のみであった．この結果から，本実験で作製したプラズマジェット

Ar

400

500
600
Wave length [nm]700800

図 5 発光分光計測結果
Fig. 5 Emmision Spectrum of the plasma jet.

では紫外線による殺菌効果は期待できないと考えられる．また，観測されたピークの波長は，それぞれ 381，406，697，751，764，772 nm であった．波長データベース 7，8)を引用し，

3.3

小型プラズマジェットの殺菌効果

これらの波長を特定した結果全ての波長においてアルゴンを3.3.1

フィルタ表面における殺菌効果観測することができたが，OH ラジカルのスペクトルを観測する菌を捕集したフィルタ上にプラズマジェットを曝露した場合にことはできなかった．このことから，OH ラジカルなどの活性種はおける殺菌効果の検証を行った．図 6 にプラズマジェット曝露

培地上もしくは液中にプラズマジェットを照射した際に，それら

時間 0，135，1,215 s の観察写真，図 7 に単位面積当たりの範に含まれる水分子から生成されるのではないかと考えられる．

囲別生存曲線を示す．

5

小型アルゴンプラズマジェットによる殺菌効果の検証（柴原大輝ら）

スの流れに伴い，曝露が培地上全体に広がり活性種を生成40mm

すると考えられる．更に液層で生成された活性種が拡散することにより殺菌効果を放射状に伸展させていると考えられる．
3.3.2

培地深度別殺菌効果

上層寒天培地中に固定された菌へのプラズマジェットの影響を調べた．Soft agar 培地に混合し重層させた培
地上にプラズマジェットを曝露した場合における殺菌効果の検証を行った．図 8 にプラズマジェット曝露時間
6 min での Soft agar 培地厚さ 1，3，5 mm の観察写真，
図 9 に Soft agar 培地厚さ別単位面積当たりにおける生存曲線を示す．
図 8 の結果から，Soft agar 培地の厚さに関らず曝露部を中心として殺菌効果が確認された．
図 9(a)は半径 1 mm 領域での生存曲線である．Soft agar
培地厚さ 5 mm において，曝露時間 6 min にて 92%の殺菌
図6率となった．また，Fig. 9(b)は半径 2.5 mm 領域での生存曲フィルタ上範囲別殺菌観察写真

上：コントロール，左：放電時間 135 s，右：1,215 s.

線である．Soft agar 培地厚さ 5 mm において，曝露時間 6Fig. 6min にて 89%の殺菌率であった．

Photographs of Petri dishes showing the effects ofthe plasma jet on E. coli cells.

これらの結果より，Soft agar 培地の厚さを増やしても曝露Top Petri dish is control, bottom Petri dishes were treated for部中心においてはほぼ同様の殺菌効果が得られたことから，

135 s (left) and 1,215 s (right).

プラズマジェットの殺菌能力は浸透性を持つことが確認された．その殺菌要因としてはプラズマジェットを培地表面に曝60CFU/cm2露した際に生成される活性種が培地内に浸透することによる①②③④⑤504030

ものであると考えられる．

40mm

201000200

400

600
time[s]80010001200

図 7 フィルタ上範囲別生存曲線
Fig. 7 Survival curves of E.coli according to the range on
membrane filter which exposed the plasma jet.
図 6，7 より，プラズマジェットの曝露時間経過に伴い，曝露部分を中心とし，放射状に殺菌が伸展することが分かった．
また，殺菌効果は曝露部分に近づくにつれ上昇し，曝露部分（中心領域①）の領域においては，放電曝露開始 405 s にて 100%の殺菌率となった．
プラズマジェットにおける殺菌のメカニズムとして，曝露部

図 8 培地厚さ別殺菌観察写真(放電時間：6 min)
上：厚さ 1 mm，左：3 mm，右：5 mm.

中心における荷電粒子の菌体への衝突による物理的破壊

Fig. 8 Photographs of Petri dishes showing the effects of the

および培地上の水分を吸収したフィルタへ，プラズマジェット

plasma jet on E. coli cells.

を曝露することによって生成した活性種による化学的破壊がTop agar medium of Petri dish is 1 mm in thickness, bottom agar行われていると考えられる．また，Ar ガスがフィルタ表面に衝

medium of Petri dishes are 3 mm in thickness (left) and 5 mm in

突し，フィルタ表面全体に広がりをみせていることから，Ar ガ

thickness (right).

6第 34 巻

静電気学会誌

CFU/cm2(a)450400350300250200150100500

第 1 号（2010）

40mm

Thickness 1mm
Thickness 2mm
Thickness 3mm
Thickness 4mm
Thickness 5mm

02time[min]46CFU/cm2(b)400350300
250200150100500Thickness 1mm
Thickness 2mm
Thickness 3mm
Thickness 4mm
Thickness 5mm

図 11 フィルタ上 GFP 蛍光減衰観察写真
0246time[min]上：コントロール，左：放電時間 10 min，右：20 min.
Fig. 11 Photographs of Petri dishes showing the effects of the

図 9 培地厚さ別生存曲線

plasma jet on GFP.

(a) 半径 1 mm 領域，(b) 半径 2.5 mm 領域.

Top Petri dishes are controls, bottom Petri dishes were treatedFig. 9 Survival curves of E.coli according to the thickness

for 10 min (left) and 20 min (right).

of the agar medium which exposed the plasma jet.
(a） 1 mm in radius area，(b) 2.5 mm in radius area.

3.3.3

96 穴プレートを用いた液中殺菌結果

プラズマジェット曝露後の 1 ウェル内の菌液および，隣接(a)する 1 ウェル内の菌液を回収し，生菌数の測定を行った．図CFU

1.E+1010 に菌液 volume 別の生存曲線を示す．

1.E+08

図 10(a)は菌液 70 μL での 1 ウェル内生存曲線である．1

1.E+06

ウェル内において 8 min の曝露にて 4 桁の殺菌を確認した．

1.E+04

殺菌要因としては，液中での活性種の生成による化学的破exposed sample
next well sample

1.E+02壊が考えられる．pH 測定の結果は放電時間 8 min 以降 pH

1.E+000246time[min]810

いても生菌数に変化はみられなかった．

(b)

CFU/mL

5 以下となっていた．また，隣の 1 ウェル内では 10 min にお図 10(b)は菌液 150 μL での 1 ウェル内生存曲線である．

1.E+10

菌液 volume を増やした場合，16 min の曝露にて 4 桁の殺1.E+08

菌を確認した．また，pH 測定の結果は 16 min 以降 pH 5 以

1.E+06下となっていた．

1.E+04以上の結果からプラズマジェットを液中に曝露することで，exposed sample
next well sample

1.E+02生成された活性種により殺菌が行われたと考えられる．しか1.E+00
0510time[min]1520し，菌液 volume を増やすことで深さが増し殺菌効果は弱くなると考えられる．また，菌液の pH が低下していることから，溶存 NOx が増加していると考えられる．菌液 70 μL でのプラズ

図 10 96 穴プレート 1 ウェル内生存曲線

マジェット曝露において，直接曝露を行った 1 ウェル内では(a) 菌液 70 μL，(b) 菌液 150 μL.

殺菌効果が得られ，隣の 1 ウェル内では殺菌効果が得られFig. 10 Survival curves of E. coli in one hole of 96-well plate

なかったことおよびプラズマジェットでの 96 穴プレートにおいwhich exposed the plasma jet.て，Ar ガスが 1 ウェルにのみ流入しており隣接する穴にはほ(a）70 μL sample，(b) 150 μL sample.

とんど流入しないことから，周囲のウェルに影響を与えること

小型アルゴンプラズマジェットによる殺菌効果の検証（柴原大輝ら）
なく，殺菌評価を行えることが示唆された．
3.4

フィルタ表面における GFP 蛍光減衰結果

伴い曝露が広がり放射状に殺菌効果が伸展していく．
(4) 厚さ別殺菌効果において，プラズマジェットの曝露部中我々は，誘電体バリア放電による殺菌において，菌体内心では荷電粒子や活性種が浸透性を持つと考えられGFP（緑色蛍光物質）の変性と菌の死滅との間に密接な相関9)が見られることを示した ．

7る．
(5) 液中および培地中において，液層で発生した活性種やそこで，GFP 産生菌を捕集したフィルタ上にプラズマジェッ硝酸イオン等が拡散していると考えられる．

トを曝露した場合における GFP 蛍光の減衰効果の検証を行(6) 小型プラズマジェットでの 96 穴プレートにおいて隣接すった．図 11 にプラズマジェット曝露時間 0，10，20 min の観察る穴に影響を与えることなく，1 つのウェル内のみを殺菌

写真を示す．

できる．

図 11 の結果から，プラズマジェット曝露部分におい(7) プラズマジェットはタンパク質の変性にも影響を与える要て時間経過に伴い GFP 蛍光の減衰が生じていることが素を持っていることが示された．

わかった．この主な要因として，プラズマジェット曝露により生成された活性種が菌に含まれるタンパク質を酸化および変性させていると考えられる．
4.

まとめ

小型プラズマジェットにより，Arガス流れの可視化，発光分
光計測，フィルタ上範囲別殺菌，培地厚さ別殺菌，96 穴プ
レート 1 ウェル内液中殺菌，フィルタ上GFP蛍光減衰実験を行った．これらの結果より，以下のことが示唆された．
(1) 発光分光測定結果より，本実験で作製したプラズマジェットでは紫外線による殺菌効果は期待できない．
(2) プラズマジェットは空気中においては OH ラジカルなどの活性種をほとんど生成していない．しかしプラズマジェットを培地上および液中に照射させた際には活性種を生成すると考えられる．
(3) 範囲別殺菌効果は中心部が最も強く，Ar ガスの流れに

参考文献
M. Laroussi: Plasma Process. Polym., 2 (2005) 391
G. Fridman, G. Friedman, A. Gutsol, A. B. Shekhter, V. N.
Vasilets and A. Fridman: Plasma Process. Polym., 5 (2008)503
3) B. Liu, D. Drake and E. Stoffels: IEEE Trans. Plasma Sci.,
34 (2006)1317
4) M. Laroussi, C. Tendero, X. Lu, S Alla, W.L.Hynes：
1)
2)

Plasma Process. Polym., 3 (2006) 470
5)

北野勝久，浜口智志，青木裕紀：プラズマ生成装置およびプラズマ生成方法，国際公開番号 WO2008/072390 A1

6)

佐藤圭輔, 安岡康一, 石井彰三：IEEJ Trans. FM, 128,
6 (2008) 401

7)

G.R. Harrison： “M.I.T Wavelength Tables”, p.xxii-xxxiv,
MIT Press, Cambridge (1969)
8) R.K. Winge, V.A. Fassel, V.J. Peterson and M.A. Floyd:“Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry,
An Atlas of Spectral, information”, p.28, Elsevier SciencePublication, Maryland Heights (1985)
9) H.Yasuda, M. Hashimoto, Md. M. Rahman K. Takashimaand A. Mizuno: Plasma Process. Polym., 5 (2008) 615