C18では困難な親水性化合物分に最適なコアシェルカラム
：ヒリックから逆相までクロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

本日の内容• C28カラムの紹介
100%水系移動相で使用で来る理由
親水性化合物の分離への適用• Amideカラムの紹介
Amideカラムの特長
C28カラムとの比較

オクタコシル(C28)• 疎水性相互作用が主な相互作用• 水系の移動相での安定性が高い• 立体選択性が高い• 極性基導入型C18より、耐久性が高い

CH3H3CC18とC28の標準試料の分離
23Sunniest C18

1574

6

Retention time/min

Column: Sunniest C18, 5mm 150 x 4.6 mm
Sunniest RP-AQUA, 5m m 150 x 4.6 mm
Sunniest C18, 5mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa

Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene, (N=15,700)
5 = o-Terphenyl, (N=15,000)
6 = Amylbenzene, (N=15,300)
7 = Triphenylene, (N=14,500)

C18との比較1

1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: 97/3=CH3OH/H2O
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

2, 34C18

Detection: UV at 295nm
05101520retention time / min

25Sample: 1=δ-Tocopherol

30HOOSunrise C28 %C:18%

2=γ-Tocopherol

1C28HOO

3=β-Tocopherol

2HO43O

4=α-Tocopherol
HO05101520retention time / min

253035O

固定相容量は同じ

SunShell RP-Aqua の40 oCでの保持
核酸塩基の分離

25 ºC（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

53

Relative retention of thymine
(%)

40 ºC

2

140℃でのチミンの保持時間の変化

42

153
40

123Retention time/min

4Column: SunShell RP-Aqua, 2.6 μm 75 x 4.6 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25 ºC
Sample: 1 = Cytosine, 2 = Uracil, 3 = Thymidine,
4 = Uridine, 5 = Thymine

100908070605040302010012345Measurement number every stop flow
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，SunShell RP-Aquaほとんど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，94%以上の再現性を示しました。

酸性、塩基性条件下の耐久性
Relative plate number of thtmine
(%)

100

100

Relative retention (%)

9090808070706060505040

Sunniest RP-AQUA30

Other brand aqua type C1840Sunniest RP-AQUA

30

Other brand aqua type C182020020406080Time (h)Test conditions
Mobile phase: 0.5% TFA
Temperature: 60 ºC

1001201400100200300

400Time (h)Test conditions
Mobile phase:
20 mM phosphate buffer (pH 8.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

細孔からの移動相の抜け出し
内径0.5mmのガラス管

10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006気圧である

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である

内径が1mmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象
によりこの１気圧は簡単に発生する

毛細管現象
水とガラス管の場合 水とテフロン管の場合毛管現象の式:h=2g cosq /(rrg)g : 表面張力
r: 液体の密度（比重）

qgr

hr

hq

液体が管に濡れる場合
q < 90°液体が管に濡れない場合
q > 90°疎水性と撥水性
撥水性

水をはじく性質
θ水『液体と物質の表面との接触角が90度より 大きくその角度が大きいほど撥水性が強い』

疎水性

水と混ざりにくい性質

物質を水とn-オクタノールに溶解して水と混ぜ合わせ、平衡に達したときの双方での濃度の比、分配係数によって表される。分配係数はしばしば常用対数を用いてLogPと表される。

物質

撥水と疎水違う？同じ？

FFF
Trifluoromethane

Octadecane

OctaneOctacosane

接触角(θ)

120°

126°

140°

108°

分配係数(LogP)

0.64

9.18

5.1814.09水の溶解度 (㎎/L)

4090

0.006

0.66

8.84×10-10

分析化学 Vol.59 No. 3 , P193-205(2010)

疎水性(logP)が高いから撥水性(接触角)が高いわけではない

疎水性の高さ ≠ 撥水性の強さ

水溶性ビタミンの分離
SunShell RP-AQUA
1Column:
N(4)=30,800 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:N(3)=31,800
40mM Phosphate buffer pH6.843
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
2Sample: 1 = Nicotinic acid,
2 = Pyridoxal,
3 = Pyridoxine,
4 = Nicotinamide

アミノ酸の分離
Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM

01020

Retention time/min30アミノ酸のLC/MSm/z

100%

11880

AlaArg
Asn
Asp
Cys
Gln
Glu
Gly
His
Ile,Leu
LysMetPhe
ProSerThr
Trp
TyrVal
01020

Retention time/min

9060175
M =11740Structure of Valine
13320134
012250 65 78 88 102 114 130 140 155 166 181 203 216 231 247m/z
147
Mass spectrum of Valine14876156
132147150 Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
166 Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)
116B) 5mM HFBA in Acetonitorile/water(9/1)
106%B 0% to 20% in 20 min
120
Flow rate: 0.2mL/min
205 Temperature: 40 oC
182 Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM
118
W

有機酸の分離

Column: SunShell RP-AQUA 2.6 μm, 150 x 4.6 mm, Mobile phase: 0.025 M KH2PO4, pH2.5
Flow rate: 1.0 mL/min, Column pressure: 32 MPa for 1.5mL/min, Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210nm, Injection volume: 2 μL
Sample: 1 = Oxalic acid (60 ppm), 2 = Tartaric acid (500 ppm), 3 = Formic acid (1000 ppm),
4 = Malic acid (1000 ppm), 5 = Lactic acid (1000 ppm), 6 = Acetic acid (1000 ppm),
7 = Diglycolic acid (1000 ppm), 8 = Maleic acid (100 ppm), 9 = Citric acid (1000 ppm),
10 = Succinic acid (1000 ppm), 11 = Fumaric acid (10 ppm).

単糖の分離1234505

10Retention time (min)615
データ提供：東海大学 小玉修嗣先生

Column: SunShell RP-AQUA, 2.6um 100 x 4.6 mm
Mobile phase: 5 mM Phosphate and 25 mM tetraborate (pH 9.6)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 20 ºC
Detection: UV@220 nm
Sample: Monosacchraides derivatized with L-Tryptphan
1 D-Galactose, 2 L-Galactose, 3 D-Glucose 4, L-Mannose, 5 L-Glucose, 6 L-Mannose

HILICの分離メカニズム
H2O

O
O

Si
O

Si

O

OH
O
O

O
SiOH
Si

Si

H2O

O

O

O

Mobile Phase

H2O

O

O

O

O

Si

O
O

Si

Silica gel(HILIC)

12-HO
O

O

O
O

Si
O

Si

H2O

O

O

Si

O

O

H2O

Si
SiO

SiOHOOO

Si

OOO

OSiOO

OOOO

SiOOO

OHSiOOHOOH

H2O O

O

O

O

H2O O

Si

O

O

O

OH
OH

H2O

Si
O

ODS silica
(RP)

21-

OH

H2O
Si

HO

Si

H2O
Si

H2O

O

H2O
Si

Analyte

H2O

O

Si

O

Si

O

O

H2O

Si

O

HydrophilicPartitioning-

O
O
Si

O

Si

Si

O

Analyte

H2O

O

O

Si
O

OH

Si

O
O

H2O

O-

H2O

 HILICの特徴として･･･

 逆相系に用いる極性溶媒が使用可能である
 固定相に形成された水和層との分配によって分離が起こると言われている 親水性が高い化合物ほど保持される特徴がある

HILICを使用するうえでの注意点• 保持が短い・保持がない場合
サンプル• 移動相もしくは水割合が低い溶媒で調整する
移動相• 有機溶媒の割合を増やす• 塩の濃度を上げる、塩の種類を変える• 理論段数が低い場合
サンプル• 負荷量を減らす

移動相• 流速を遅くする

逆相クロマトグラフィと比べ、試料中の溶媒(水)の影響を大きく受ける傾向がある
最適流速も逆相クロマトグラフィより、低速になる傾向がある

HILICカラムに使用される官能器
 逆相カラムと違い・・・

 親水的な分配が主な分離機構だが二次相互作用も比較的強く働く
 二次的な相互作用を抑えることはほとんどされていない
 電荷を有する官能基が多い。
親水性相互作用
静電的相互作用
OO-S

両性イオン基イオン交換相互作用
陰イオン交換基

O

N+

陽イオン
交換基
OO

-

水素結合
ジオール基
OHSO
N

OH+CH3OH

アミド基

CH3N
O

二次相互作用の働き
疎水基 (主効果)

吸着性基(二次効果相互作用)

既存の分離剤
主効果(疎水基)

二次効果相互作用
制御型分離剤
主効果
(疎水基)

二次効果
(吸着等)第二主効果を持つ二足型分離剤
主効果
(疎水基)

制御された二次効果

第二の主効果HILICカラムを設計するうえで・・・
1. 基材自身の親水性が高い
 基材のみでもHILICで使用可能なシリカを選択 コアシェルを使用することで高分離が可能

2. 導入されている官能基の構造
 官能基が高い水和性を有し，高い密度で導入可能である
 静電的な相互作用が極力低い
 官能基の結合部位の疎水性が低いこと
RO
HN

アミド基を選択親水性の比較
分析条件：Mobile phase: Acetonitrile/ammonium acetate buffer (20 mM, pH = 4.76) = 90:10 [v/v]Linear velocity; 1.0 mm/s, UV detection wave length; 254 nm, Column oven temperature; 30 ℃

ColumnZIC-HILIC (5 mm)
ZIC-HILIC (3.5 mm)
Nucleodur HILIC (3 mm)
Amide-80 (5 mm)
XBridge Amide (3.5 mm)
PolySULFOETHYL (3 mm)
PolyHYDROXYETHYL (3 mm)
CYCLOBOND I (5 mm)
LiChrospher Diol (5 mm)
Chromolith Si
HALO HILIC (2.7 mm)
COSMOSIL HILIC (5 mm)
Sugar-D (5 mm)
NH2 -MS (5 mm)
SunShell HILIC-Amide (2.6 mm)

Uk (U)
2.11
2.10
2.20
3.30
2.55
1.58
3.92
0.70
1.50
0.31
0.64
1.60
1.58
2.44
2.93

A
Vk (A) k (V)1.55 2.32
1.51 2.28
2.33 3.40 ウリジン（U） アデノシン（A） ビダラビン（V）
3.80 4.90
2.81 3.64 ウリジンの保持から充填剤
1.15 1.39の親水性を評価
3.75 4.93
1.36 1.68
2.50 3.30
保持が大きいほど充填剤0.73 0.85の親水性が高い
1.59 1.87
2.20 3.00
1.88 2.72
2.13 2.90 同じHILICカラムであって3.55 4.84 も、親水性の違いが大きい

合成したSunShell HILIC－Amideは 他の官能基を導入したHILICカラムの中でも大きな親水性を有していた逆相カラムのように使い分ける必要がある

イオン交換性の比較
ZIC-HILIC (5 um)
ZIC-HILIC (3.5 um)
Nucleodur HILIC (3 um)
Amide-80 (5 um)
XBridge Amide (3.5 um)
PolySULFOETHYL (3 um)
PolyHYDROXYETHYL (3 um)
CYCLOBOND I (5 um)
LiChrospher Diol (5 um)
Chromolith Si
HALO HILIC (2.7 um)
COSMOSIL HILIC (5 um)
Sugar-D (5 um)
NH2-MS (5 um)

Uk( )
20 mM
2.11
2.10
2.20
3.30
2.55
1.58
3.92
0.70
1.50
0.31
0.64
1.60
1.58
2.44

SunShell HILIC-Amide (2.6 um)

2.93

ColumnSodium p-toluenesulfonate (SPTS)

Sk (S
0.69
0.56
1.13
0.89
0.74
0.25
0.87
3.32
0.95
0.06
0.20
1.28
3.00
2.01

0.33
0.27
0.51
0.270.29
0.160.22
4.73
0.63
0.19
0.310.80
1.900.82

Uk( )
20 mM
2.11
2.10
2.20
3.30
2.55
1.58
3.920.70
1.50
0.310.64
1.60
1.58
2.44

1.290.482.93)

a(SPTS/U)

aの値により充填剤のイオン交換性が評価できる値が小さいほどイオン交換性
Trimethylphenylammonium chloride (TMPAC)
が低い

TMPAC
k (TMPAC)a(TMPAC/U)

3.32
3.45
3.14
4.57
1.89
1.38
3.34
0.45
1.73
5.25
9.03
0.78
0.39
0.69

1.57
1.64
1.43
1.38
0.74
0.87
0.85
0.63
1.16
16.94
14.110.49
0.25
0.28

1.180.44

合成したSunShell HILIC－
Amideは aの値が低くアニオン、カチオン交換ともに小さいことが判明した

充填剤表面の比較
ColumnZIC-HILIC (5 um)
ZIC-HILIC (3.5 um)
Nucleodur HILIC (3 um)
Amide-80 (5 um)
Amide-80 (3 um)
XBridge Amide (3.5 um)
PolySULFOETHYL (3 um)
PolyHYDROXYETHYL (3 um)
CYCLOBOND I (5 um)
LiChrospher Diol (5 um)
Chromolith Si
HALO HILIC (2.7 um)
COSMOSIL HILIC (5 um)
Sugar-D (5 um)
NH2-MS (5 um)

Tbk (Tb)
0.36
0.34
0.52
1.06
1.43
0.71
0.23
0.750.440.570.31
0.64
0.49
0.31
0.43Tpk (Tp)
0.30
0.28
0.52
0.76
1.08
0.52
0.23
0.66
0.43
0.55
0.26
0.50
0.55
0.59
0.80

SunShell HILIC-Amide (2.6 um)

0.60

0.67α(Tb/Tp)
1.18
1.20
1.00
1.39
1.32
1.38
1.00
1.14
1.01
1.04
1.22
1.26
0.89
0.52
0.540.90

合成したSunShell HILIC－Amideは α = 0.9 であり、弱い塩基性を示した。

theophylline (Tp)theobromine (Tb)

α(Tb/Tp) > 1

酸性α(Tb/Tp) = 1

中性α(Tb/Tp) < 1

塩基性αの値によって充填剤表面の性質が評価される核酸塩基の分離
21435SunShell Amide

Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Acentice Express OH5 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
Acentice Express HILIC 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,Mobile phase: acetonitrile :20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm,
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

243

15

他社HILICカラム(ポリオール)
24135

他社HILICカラム(シリカ)合成甘味料の分離
Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :25 mM phosphate buffer (pH2.5) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 室温
Detection: UV@215 nm,

213

1. Aspartame

2. Saccharin,

3. Acesulfame K,

配糖体の分離

1Column:
SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :25 mM phosphate Ammonium (pH4.9) =8:2
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 室温
Detection: UV@215 nm,
Sample:1. Helicin, 2. Salicin, 3. Arbutin 4. Rutin

324

1. Helicin,

2. Salicin,

3. Arbutin

4. Rutinメラミンの分離

21

1. Cyanuric acid,

2. Melamine,

Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm,
Mobile phase: acetonitrile :5 mM phosphate Buffer (pH6.9) =75:25
Flow rate: 1.0 mL/min ,Temperature: 40 ℃
Detection: UV@220 nm,

HILICと逆相クロマトグラフィの比較
Column:SunShell Amide 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
SunShell RPAqua 2.6 mm : 100 x 4.6 mm
Mobile phase: acetonitrile :Amide : 20 mM ammonium acetate(pH4.7) =8:2
RPaqua : 20 mM phosphate buffer(pH7.0)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: UV@250 nm
Sample:1. tymine, 2. uracil, 3. uridine, 4. cytosine, 5. cytidine

21435SunShell Amide
5243SunShell RPAQUA
011234まとめ• C28カラムは、水系移動相のみでも保持時間が安定しており、極性化合物の分離に有用であった• 作成したSunShell HILIC-Amideは、他のHILICカラムと比較した場合、高い親水性を示し、イオン交換性も低かった• SunShell HILIC-Amideは、他社コアシェル型HILICカラムより長い保持を示した• C28カラムとAmideカラムを核酸塩基を用いて比較した場合、その溶出順は概ね逆となったクロマニックオープン10周年
特別キャンペーン
ホルダー

HEX 14mm

内径2mmから4.6mmの全ての固定相の逆相カラムで使用できます

配管

孔径2μm C18結合ガラスフィルター2μmフィルター
オシネジ・
PEEKフェラル

(逆相ガードカラムとしても使用可）

SunShell RP Guard Filter
SunShell RP Guard Filter
スターターキット(新オシネジ)(型番CBGAKN) 交換用C18フィルター5個（型番CBGAAC）＊CBGAKNは1/4インチのスパナ締めの配管になります

キャンペーン期間：2014年9月1日〜2015年4月30日
キャンペーン期間：2014年9月1日〜2015年4月30日＜＜ガードフィルター使用例＞＞
SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
ガードフィルターなし

使用前

tR(3)= 3.24 min
ガードフィルターあり
N(3) = 39,345

tR(3) = 3.26 min
N(3) = 38,940
ほとんど変化なし

012

345

使用後

ODSとの比較2

1 221Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:80/20=CH3CN/CHCl3
Flow rate: 1.0 mL/minConventional
C18 %C:18%

Temperature: 30 ºC
Detection: UV at 450nm
Sample: 1=a-Carotene

Sunrise C28 %C:18%

2=b-Carotene
05101520253035Retention time / min

固定相容量は2倍