No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 1

発現・発現制御解析特集
今回は『発現・発現制御解析』を特集させていただきます。
発現・発現制御解析と申しましても、発現制御に関わるプロモーター活性の解析から、RT-PCR法
を用いる転写産物解析、更には翻訳産物の活性や局在を直接解析する解析など、多岐にわたります。
また、タンパク質のリン酸化等の翻訳後解析なども最近盛んに行われるようになりました。今回は、それら一連の研究をサポートする試薬を紹介させていただきます。

Products

本製品はすでに販売を中止しております。

®

Phos-tag biotin

新規なリン酸化タンパク質、リン酸化ペプチドの新しい検出用試薬です。
Phos-tag®は、広島大学・小池 透教授、株式会社ナード研究所、及びマナック株式会社により開発された、新しいコンセプトに基づいたリン酸化タンパク質検出用試薬です。亜鉛キレート性の化合物を用いることにより、高感度かつ特異的にリン酸化タンパ
ク質を検出することができます。本試薬は、ビオチンで修飾されていますので、ストレプトアビジンと組合せることにより様々な用途展開が可能です（図2）。ラジオアイソトープ（RI）の使用の必要はありません。

特長1 リン酸基に対して特異的な結合性を示します。
特長2 リン酸化アミノ酸の種類、および近傍のアミノ酸配列による影響を受ける
ことなく優れた結合性を示します。

特長3 PVDF膜上での検出や、SPRイメージング＊などの幅広い用途に適用することができます。

＊弊社SPR装置：MultiSPRinter®を用いたリン酸化タンパク質検出例は参考文献3をご参照ください。

図1．Phos-tag® biotin BTL-104、BTL-105の構造
リンカー長の異なる2種類のPhos-tag® biotinを準備しております。

図2．リン酸基の認識およびストレプト
アビジンを介した検出原理

1

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実施例

PVDF膜上でのリン酸化タンパク質の検出

Phos-tag®-化学発光検出法による、リン酸化プロテミクス
250 125 62.5 31.3 15.6 7.8

技術をご紹介します。一般的なウェスタンブロッティング法とほとんど同じ操作で、リン酸化を高感度に検出することができ

牛血清アルブミンます。ラジオアイソトープ（RI）を用いる必要がないため、一般

ヒト血清アルブミン

的な化学実験施設にて実施することができます。また、BSA

炭酸脱水素酵素等によるブロッキング操作も必要ありません。

0 （ng）

β-ガラクトシダーゼ

PVDF膜に様々なタンパク質をドットブロットし、Phos-

α-カゼインtag® BTL-104とHRP結合型ストレプトアビジンの複合体を脱リン酸化α-カゼイン

用いた発光検出結果を図3に示します。検出は、アマシャムバ
イオサイエンス社のECLシステムを用いて行いました。非リンβ-カゼイン

酸化タンパク質である牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、

脱リン酸化β-カゼイン

炭酸脱水酵素、及びβ-ガラクトシダーゼは全く検出されませ卵白アルブミンんでしたが、α-カゼイン、β-カゼイン、卵白アルブミン、及脱リン酸化卵白アルブミン

びペプシンなどのリン酸化タンパク質は数ngの量まで検出さペプシンれました（赤色）。また、リン酸化タンパク質をアルカリフォス

脱リン酸化ペプシン

ファターゼによって処理したものでは、化学発光シグナルが完全に消失しました。

図3．リン酸化タンパク質のドットブロット検出

図4に、EGF刺激前後のA431細胞の二次元電気泳動後のリ
ン酸化タンパク質をPVDF膜に転写し、同様に検出した例を示しました。EGF刺激によって検出されるスポットの数とそのEGF刺激前の細胞抽出液強度が増大していることが確認でます。特に緑の四角で囲んだ部分での変化が顕著でした。また、20kDa以下の低分子量領域の赤で囲んだスポットは刺激後にシグナルの強度が増し、青で囲んだスポットは、EGF刺激により出現しています。
（本実施例は、フォスタグコンソーシアムにおける研究成果であり、広島大学・木下 英司先生によりご提供いただきました）

EGF刺激後の細胞抽出液

図4．二次元電気泳動法を用いたリン酸化タンパク質の検出

参考文献

1）Kinoshita, E., Takahashi, M., Takeda, H., Shiro, M., Koike, T., Dalton Trans. 2004, 8, 1189-1193.
2）Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 749757.
3）Inamori, K., Kyo, M., Nishiya, Y., Inoue,Y., Sonoda, T., Kinoshita E., Koike, T., Katayama Y., Anal.

Chem. 2005, 77, 3979-3985.

保存温度

Code No.

価

Phos-tag ® biotin BTL-104

品 名 及 び 内 容

10mg

包

装

4℃

NABTL104¥70,000

Phos-tag ® biotin BTL-105

10mg

4℃

NABTL105¥70,000

Phos-tag ®は、小池 透先生の登録商標です。詳細につきましては、http://www.phos-tag.comをご参照ください。

2

格

No.83.qx 06.6.21 21:11 ページ 3

Products

EnzoLyte

TM

本製品はすでに販売を中止しております。

Caspase Assay Kits

蛍光測定系のCaspase assay kitの決定版です。様々なアッセイにご使用いただけます。
Anaspec社のCaspase活性測定キットはドラッグスクリーニングを考慮した設計になっており、簡便・確実にアポトーシス、およびカスパーゼの誘発・阻害物質のスクリーニングを行うことが可能です。

特長1 4種類の蛍光基質を用いたキットを使い分けることができます。
・被検物質が蛍光基を有する場合、波長を使い分けること
により、偽陽性・偽陰性を低減することができます。

特長2 アポトーシスの誘発。阻害物質ス
クリーニング実験に最適です。

図1．（Z-DEVD）2-Rh110を用いる
Caspase活性測定原理

・96well、もしくは384well plateで培養した細胞をそのままアッセイに用いることができます。

特長3 Caspase活性の促進・阻害剤のスクリーニングにも用いることができます。
・精製されたCaspaseもしくは細胞破砕液をアッセイに用いることもできます。
表1．各キットで使用されている蛍光色素と波長

Substrate

Excitation/Emission（nm）

Z-DEVD-AMC

354 / 442

Ac-DEVD-AFC

380 / 500

（Z-DEVD）2-Rh110

496 / 520

Z-DEVD-AnaRed

595 / 635

図2．Camtothecinの測定への干渉
それぞれの測定系に、Caspase-3のinducerであるCamtothecinを添加して、それぞれの波長で測定を行いました。この場合、Rh110とAnaRedTMの系で干渉（アッセイ阻害）が認められないことが分かりました。

品 名 及 び 内 容

包

装

価

格

保存温度

Code No.

危

EnzoLyteTM Homogeneous AMC Caspase 3/7 Assay Kit
・Caspase-3/7 substrate ・蛍光スタンダード
・Ac-DEVD-CHO（inhibitor） ・Assay Buffer（30ml）
・1M DTT（1ml） ・10×Lysis Buffer（20ml）

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

AS71118¥19,000

危

EnzoLyteTM AMC Caspase 7 Assay Kit *Fluorimetric*

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

AS71119¥39,000

危

EnzoLyteTM Homogeneous AFC Caspase 3/7 Assay Kit

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

AS71114¥39,000

危

EnzoLyteTM AFC Caspase 7 Assay Kit *Fluorimetric*

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

AS71115¥39,000

危

EnzoLyte

Homogeneous Rh110 Caspase 3/7 Assay Kit

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

AS71141¥39,000

危

EnzoLyteTM Rh110 Caspase 7 Assay Kit *Most Sensitive*

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

AS71142¥39,000（1250回（384well）） -20℃
Caspase 3/7 Assay Kit 500回（96well）

AS71122¥59,000

AS71123¥59,000

TM

危

EnzoLyte

危

EnzoLyteTM AnaRedTM Caspase 7 Assay Kit *Fluorimetric*

TM

Homogeneous AnaRed

TM

500回（96well）（1250回（384well）） -20℃

＊それぞれのキットはCaspase 3もしくは7に至適化されていますが、基質は同一のものを使用しておりクロスリアクションします。

品 名 及 び 内 容

危EnzoLyteTM AMC Caspase Profiling Kit *Fluorimetric*

危

EnzoLyteTM AMC Caspase Subtrate Sampler Kit *Fluorimetric*

包

装

保存温度

Code No.

価

96well plate×2-20℃

AS71120¥99,000

格

8×100回-20℃

AS71121¥79,000

危

EnzoLyte

AFC Caspase Profiling Kit *Fluorimetric*

96well plate×2-20℃

AS71116¥99,000

危

EnzoLyteTM AFC Caspase Subtrate Sampler Kit *Fluorimetric*

8×100回-20℃

AS71117¥79,000

TM＊ Profilingキットには、
Caspase-1, 2, 8, 3/7, 9, 6の基質が96well plateにプレコートされています。Samplerキットには、同じ基質がバイアルで供給されます。それぞれのキットは、
精製酵素もしくはライゼートを用いてアッセイすることができます。
危：本キットのパーツには、消防法における第4類第3石油類（等級Ⅲ）であるジメチルスルホキシドが含まれます。可燃性がありますので、ご注意ください。
※詳細に関しましては、http://www.anaspec.com/をご参照ください。

3

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Products

EnzoLyte

TM

本製品はすでに販売を中止しております。

HCV Protease Assay Kits

FRETを用いる高感度なHCV NS3/4A Protease活性測定キットです。
C型肝炎ウイルス（HCV）は、成熟化の段階でNS3/A4 proteaseによるviral nonstructural polyproteinの切断が必須であり、このプロテアーゼは創薬ターゲットとして注目されています。本キットは、FRET（fluorescence resonance energy
transfer:図1）を用いてNS3/A4 proteaseの活性を簡便かつ高感度に測定することができ、阻害剤のスクリーニング等に用いることができます。

特長1 3種類のキットから選択可能です。
・用途に従ってキットを選択することにより、効果的なアッセイが可能です（表1）。

特長2 阻害剤スクリーニングに最適です。
・別売のNS3/A4 proteaseを用いることにより、簡単にスクリーニング系を構築することができます。
表1．各キットの特長

EnzoLyteTM 490 HCV kit
TM

EnzoLyte

520 HCV kit

EnzoLyteTM 620 HCV kit

EDANS/DABCYL FRET peptideを用いる最もスタンダードかつ安価な測定キットです。
（図2）。
5-FAM/QXTTM 520 FRET peptideを用いることにより、490 kitに比べ約10倍の感度を達成しています
HiLyte FluorTM TR/QXTTM 610 FRET peptideを用いるため、被検化合物の蛍光干渉を最も受けにくいキットです。
520 kitと併用することにより、より正確な阻害プロファイルを作成することができます。

図1．EnzoLyteTM520 HCV KitのNS3/A4 protease活性測定原理

図2．EnzoLyteTM490キットと520キットの感度測定

品 名 及 び 内 容

包

装

保存温度

Code No.

価格

危

EnzoLyte

490 HCV protease Assay Kit *Fluorimetric*

500回（96well）（1250回（384well））-20℃

AS71126¥59,000

危

EnzoLyteTM 520 HCV protease Assay Kit *Fluorimetric*
・HCV NS3/4A protease substate ・蛍光スタンダード・DMSO ・2×Assay buffer ・Stop solution
・1M DTT ・Pep4AK（HCV NS3 protease cofactor）

100回（96well）（300回（384well））-20℃

AS71145¥59,000

危

EnzoLyteTM 620 HCV protease Assay Kit *Fluorimetric*

100回（96well）（300回（384well））-20℃

AS71146¥179,000

TM品 名 及 び 内 容

包

装

保存温度

Code No.

価格

Hepatitis C Virus NS3/4A protease, recombinant

5μg

-80℃

AS61017-5¥39,000

Hepatitis C Virus NS3/4A protease, recombinant

10μg

-80℃

AS61017-10¥60,000

Hepatitis C Virus NS3/4A protease mutant A156S, recombinant

5μg

-80℃

AS72022-5¥39,000

5μg-80℃

AS72023-5¥39,000

危

EnzoLyteTM 490 HIV protease Assay Kit *Fluorimetric*

500回（96well）（1250回（384well））-20℃

AS71127¥59,000

危

EnzoLyteTM 520 HIV protease Assay Kit *Fluorimetric*

100回（96well）（500回（384well））-20℃

AS71147¥59,000

危

EnzoLyteTM 620 HIV protease Assay Kit *Fluorimetric*

100回（96well）（250回（384well））-20℃

AS71148¥59,000

5μg-80℃

AS72028-5¥59,000

Hepatitis C Virus NS3/4A protease mutant A156T, recombinant

HIV protease, recombinant＊ EnzoLyteTM HIV Protease Assay Kitシリーズは、
Human immunodeficiency virus-1（HIV-1）のaspartic protease活性測定用のキットです。
ご注意ください。
危：本キットのパーツには、消防法における第4類第3石油類（等級Ⅲ）であるジメチルスルホキシドが含まれます。可燃性がありますので、※詳細に関しましては、http://www.anaspec.com/をご参照ください。

4

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 5

Products

本製品はすでに販売を中止しております。

ペルチェ式温度コントローラー

LittleGene

安価でコンパクトながら、多機能かつ正確で再現性の高い温度制御を実現します!
LittleGeneは、パーソナルユースに最適なペルチェ式温度コントローラーです。

特長1 超低価格：￥310,000

特長5 オイルフリーでの操作が可能
・ホットリッド機能が、大切なサンプルの蒸発を防ぎます。

特長2 コンパクト設計

・少量のサンプルでも安心してご使用いただけます。

・B5版ノートパソコンと同じ大きさです。

特長6 サンプルコントロールモード（液温推定制御）特長3 優れた温度制御・耐久性・高品質ペルチェ素子サーモモジュールを採用しているた・サンプルの液量に応じて、液温を推定し、温度制御する

め、高精度かつ迅速に温度コントロールを行ないます。

ことが可能です。
（設定液量範囲：10〜50μl）

特長4 さまざまな温度サイクルプログラムに対応

特長7 5連チューブが使用可能

・加熱・冷却速度を任意設定できます（0.1℃/sec〜）。

・0.2mlシングルチューブはもちろんのこと、0.2ml×5・サイクル毎の温度および保持時間の増減設定、プログラ

連チューブもご使用いただけます。また、8連チューブ

ムファイルの連結が可能です。

を切ってご使用いただくことも可能です。

主な仕様
処理検体数：

25検体（5×5）：0.2mlチューブ使用

温度調節範囲：4℃〜99℃

温度上昇速度：55℃〜95℃を約18秒

温度下降速度：

95℃〜55℃を約21秒

温度精度：≦±0.4℃

温度均一性：≦±0.4℃（55℃）
、≦±0.5℃（72℃）
、≦±0.8℃（95℃）

ホットリッド：105℃（OFF設定可能）

ディスプレイ：

20文字×2行（LCD）

最大サイクル回数：

99

1サイクルあたりの最大設定セグメント数：9
プログラムメモリー数：

99個

付属機能：

停電時のバックアップ機能

電源：

AC100V 50/60Hz

消費電力：

200W

外形寸法：

D285×W218×H178（mm）

重

3.2kg

量：

品 名 及 び 内 容

包ペルチェ式温度コントローラー

装

1台

LittleGene（本体）5Code No.
BFCTC-25A

価

格￥310,000

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 6

Products
Realtime Monitoring Fluorescent Quantitative Detection System

LineGene

本製品はすでに販売を中止しております。

核酸の増幅過程をリアルタイムモニタリング。コストパフォーマンスに自信あり。
本品は、核酸の増幅過程をリアルタイムにモニタリングする装置です。33フォーマットのパーソナルタイプで、再現性と精度の高いシ
ステムをご提供します。機器本体価格もさることながら、ランニングコストも安価です。
また、広範囲で未知試料を正確に定量したり、全ウェルを一度に解析するなど非常に高性能です。

特長1 優れたコストパフォーマンス

特長3 多様な系に対応・対応試薬は、SYBR® GreenⅠ、TaqMan® Probes（レポーター分・測定に専用チューブやキャピラリーは不要で、汎用0.2ml
PCR用チューブを使用できます。

子：FAM、クエンチャー分子：TAMRA）、Hybridization Probes、・非常に少ない反応ボリューム（10μl〜）で安定した結果

Molecular Beaconなど、多様な系に対応します。

を実現します。

励起波長：470nm

・試薬ランニングコストを低減※します。

検出波長：530nm 、640nm 、710nm※反応ボリューム10μlで…37円/チューブ（弊社キットSYBR®

特長4 ソフトウェア

Green Realtime PCR Master Mixを用いた場合）

・GUI環境によりセットアップは簡単です。

特長2 高感度オプティカルユニット

・増幅曲線のリアルタイム表示により、反応の進行状況が一目

・励起用光源は、発熱性が低く安定かつ長寿命のBlue LED

瞭然です。また、ランニング中にグラフのスケールを拡大しを採用しています。

反応初期の微小な蛍光をモニタリングすることも可能です。

・検出器は、検出限界が高く高速応答低ノイズのPMTを採用

・増幅の程度に合わせ、反応中にサイクルを追加、削除する

しています。

ことも可能です。

・この光学系により、蛍光シグナル信号を高感度かつ高速に・定量解析および融解曲線解析（SYBR® GreenⅠアプリケ

読み取り可能です。

性ーション）のどちらも可能です。

能■テンプレート濃度2倍差の検出
初期の鋳型濃度が2倍差のサンプルを、はっきりと区別して検出できます。
■ウェル間均一性
全ウェルにわたり同等の解析が可能です。

主な仕様■ダイナミックレンジ（図上・右）
広範囲かつ正確に未知試料を定量できます。
10コピー程度の低濃度での検出も可能です。

サンプル容量：0.2ml×33本
励起波長：

470nm

検出波長：

530nm

温度精度（設定温度）：≦±0.5℃（95℃）≦±0.3℃（72℃）≦±0.2℃（55℃）

640nm

710nm

温度均一性（設定温度）：

励起用光源： Blue LED≦±1.0℃（95℃）≦±0.5℃（72℃）≦±0.3℃（55℃）

蛍光検出器： フォトマルチプライヤーチューブ
（PMT）

電源：

100V

50/60Hz

最大消費電力： 1000W

温度制御範囲： 30℃〜99℃

外形寸法：

W514×D456×H292（mm）

温度変化率： 最大4℃/sec

重量：

23㎏

（2ステップ，45サイクルの反応=約90分）※製品の性能および仕様、
外観は改良のため予告なく変更することがある。

品 名 及 び 内 容

包Real Time Monitoring Fluorescent Quantitative Detection System

装1式

LineGene（本体 + ソフトウェア）

Code No.
BFFQD-33A

価

格¥1,890,000

Molecular Probes社の登録商標です。
※SYBR®は、※TaqMan®は、Roche Molecular Systems社の登録商標です。
※Hybridization ProbesはHoffman La Roche社の実施許諾が必要です。
品 名 及 び 内 容
Realtime PCR Master Mix（×2濃度）®

SYBR Green Realtime PCR Master Mix（×2濃度）

包

装＊

保存温度

Code No.

価

200回用（1ml×5本）
40回用（1ml×1本）-20℃

QPK-101
QPK-101T¥37,000¥10,000

200回用（1ml×5本）
40回用（1ml×1本）-20℃

QPK-201
QPK-201T¥37,000¥10,000＊：50μl反応系の場合の回数です。装置などによって推奨容量は異なります。

6

格No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 7

Technical Review

パーキンエルマー社ARVOTMMXを用いた
MultiReporter Assay System -Tripluc®- の解析例
東洋紡績（株）敦賀バイオ研究所

浅井 友実

はじめに
MultiReporter Assay System -Tripluc®-は、3色のルシフ
ェラーゼをレポーターとして用いる、遺伝子発現解析システムです。これら3種のルシフェラーゼ（SLG（緑）、SLO（橙）、SLR（赤））が、いずれもD-luciferinを基質とすることから、1ステップのアッセイで3つのレポーター活性の評価が可能な画期的なシステムです。

図2．パーキンエルマー社ARVOTMMX
510±30nmフィルター、595±30nmフィルター、
660±50nmフィルターの3枚の光学フィルターを装着。

これらのルシフェラーゼの活性測定は、細胞を溶解剤で溶解し、発光基質と混ぜて測定するin vitro計測（破壊系計測）や、培養液にD-luciferinを溶解し、細胞内に浸透するD-luciferinによっィルター、②595±30 nmフィルター、③660±50 nmフィて、細胞を生かしたまま計測する in vivo 計測（非破壊系計測）ルターを装着しました。
測定は、あらかじめ各ルシフェラーゼの発光について、全光によって行うことが可能です。
弊社では今まで、「MultiReporter Assay System -Tripluc®-（フィルター無挿入）に対する各フィルター透過光の割合を決定

Detection Reagents」（細胞溶解剤、基質溶液を含む）を用いしました（Tij：i=1,2,3（フィルター①、②、③）、j=g,o,r（ルるin vitro計測実験の測定にシングルチューブタイプのルミノメ

シフェラーゼSLG、SLO、SLR））。つづいて、各サンプルプレーター「カラフルックアナライザー 」をお奨めしてきました。

ートについて、3枚のフィルター（F1、F2、F3）を用いて測定を行

しかし、最近の検討により、市販のマルチウェル型のルミノメー

い、測定値からMicrosoft® Excelを用いて下式を計算し、各ル

ターを用いることが可能であることが分かりました。

シフェラーゼの発光量（G、O、R）を算出しました（特許出願中）。

TM

本稿では、「MultiReporter Assay System -Tripluc ®-（ ）（G

Detection Reagents」とパーキンエルマー社ARVOTMMXを用O

いたMultiReporter Assay System -Tripluc®-のプレートリー＝

R

ダーによる解析例をご紹介いたします。

T1g T1o T1r
T2g T2o T2r
T3g T3o T3r

-1

）（ ）
F1
F2
F3

1. 定量性の検討

方

白色不透明タイプの96ウェルプレートのcolumn A〜Hのそ法

れぞれに、各ルシフェラーゼを発現した細胞ライセートを表1

プレートリーダーを用いた in vitro計測のフローを図1に示しの要領で混合し、試料を調製しました。続いて、インジェクタ

ます。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを導入し、種々のーを用いて、各ウェルに「Detection Reagents」Assay

アッセイが行われた細胞のプレートから培地を除去後、溶解剤

Reagentを125μlずつ加え、3枚のフィルターの透過光を測

Lysis Solutionを加え、細胞を溶解します。続いて、基質溶液

定し、各ルシフェラーゼの活性を算出しました。

Assay Reagentを加え、プレートリーダーで測定します。

表1. 試料の調製

今回、プレートリーダーとして、インジェクター付のパーキン

Row No.

エルマー社ARVOTMMX（図2）を用い、Assay Reagentの分注は同機に装備されたインジェクターを使用しました。また、3枚の光学フィルターとして、ARVOTMMXには、①510±30 nmフ

1,2

3,4

5,6

7,8

9,10

11,12

SLG lysate（μl）

1

1

1

1

1

1

SLO lysate（μl）

24

19.2

14.4

9.6

4.8

0

SLR lysate（μl）

0

4.8

9.6

14.4

19.2

24

2. 解析例（AP1及びNFκBレスポンスエレメントの活性化の検討）
評価用コンストラクトとして、pSLO-test、pSLR-testの各ルシフェラーゼの上流にSV40プロモーターのコア領域を挿入し、そのさらに上流にAP1レスポンスエレメント（pSLOtestのみ）、及びNFκBレスポンスエレメント（pSLR-testのみ）を挿入したプラスミド（pSLO-AP1、pSLR-NFκB）を調製しました。
アッセイは、白色不透明タイプの96ウェルプレートに
HeLa S3細胞を4×104cells/wellずつ播種し、翌日、1ウェ
ルあたりpSLG-HSVtk SLG 0.03μg、pSLO-AP1 0.13
μg、pSLR-NFκB 0.04μgを混合し、トランスフェクショ

図1．in vitro 計測（プレートリーダー測定）

ン試薬LipofectamineTM2000（インビトロジェン社）を用い

7

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 8て無血清培地下でトランスフェクションを実施しました。24

2. 解析例（図4、5）

時間後に、0〜10ng/ml TNFα、0〜100nM PMAを含む培SLO、SLRルシフェラーゼ遺伝子にAP1レスポンスエレメ

地に置換し、4時間インキュベートしました（図4）。

ント、NFκBレスポンスエレメントを連結し、TNFα、PMA

イ ン キ ュ ベ ー ト 終 了 後 、 培 地 を 除 去 し 、「 D e t e c t i o nに対する応答性を検証しました。

Reagents」Lysis Solutionを25μl/well加え、軽く振とう

測定値よりSLG、SLO、SLRの相対光量を算出しました。

しながら20分間室温でインキュベートしました。続いて、イ

次に、内部標準としてトランスフェクションしたHSVtkプロ

ンジェクターを用いて、各ウェルに「Detection Reagents」

モーター下のSLGに対する相対活性としてSLO及びSLR値を

Assay Reagentを125μlずつ加え、3枚のフィルターの透図5にプロットしました。この結果、それぞれTNFαやPMA過光を測定し、各ルシフェラーゼの活性を算出しました。

に対し、濃度依存的なルシフェラーゼの発現活性を確認することができました。

結果及び考察1. 定量性の検討（図3）
3枚のフィルターの測定値より算出されたSLG、SLO、SLRの相対光量を図3にプロットしています。各ウェルに一定量を添加しているSLGについてはほぼ一定の値を、20%ずつ
添加量を変えたSLOやSLRについてはその増減に応じた値が
図4． 解析例で用いたアッセイ条件●のウェルにpSLG-HSVtk control、
pSLO-AP1、pSLR-NFκBを同量ト
ランスフェクションし、上記条件でインキュベートしました。

得られ、測定・算出の方法が適正であることが分かりました。
また、それらの値がプレート全体96サンプルにわたって安定していることから、96ウェルプレートを用いるハイスルー
プットアッセイが可能であることが示唆されました。
6.0

A

4.0E+04B

3.0E+04

C
D
E
F
G

14.0

A
B

8.0E+04C

6.0E+04D

4.0E+04

E

10.0
8.0
6.0
4.0

F

2.0

G

0.0

1

2.0E+04

12.0

1

2

3

4

5

6

7

8

発光強度（CPS）

1.0E+04

9

10

11 12

SLR

H

0.

0.0E+00

図5．AP1及びNFκBレスポンスエレメント活性化実験測定結果

A

8.0E+03B

6.0E+03C

4.0E+03
2.0E+03

D

本稿では、「MultiReporter Assay System -Tripluc®-」をプE

レートリーダーを用いて測定が可能であることをご紹介いたしま

F

した。

G
0.0E+00

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 12

0

SLO

1.0E+050.0H-

発光強度（CPS）

1.2E+05

11 12

10

10

10

9

1

8

-

7

10

6

1

5

0

4

10

3

1.0

0

2

2.0

0.

1

relative activity

0.0E+00

3.0

01

1.0E+044.0

0.

2.0E+04

5.0

00

SLG

relative activity

発光強度（CPS）

5.0E+04

H

詳細なパラメーターや実験条件にご関心のある方は是非弊社テ

図3．96ウェルプレートを用いた発光強度測定結果
A〜H及び1〜12は96ウェルプレートの行と列を示しています。

クニカルラインまでお問い合わせください。

装

保存温度

Code No.

価

プロモーター挿入用ベクター

品 名 及 び 内 容
pSLO-test

20μg

包

-20℃

MRV-102¥80,000

プロモーター挿入用ベクター

pSLR-test

20μg

-20℃

MRV-103¥80,000

HSVtkコントロールベクター

pSLG-HSVtk control

20μg

-20℃

MRV-301¥80,000

100回用
500回用
10,000回用-80℃

MRA-101
MRA-102
MRA-103¥30,000¥99,000¥1,350,000

MultiReporter Assay System -Tripluc®- in vitro アッセイ用試薬

Detection Reagents（Lysis Solution, Assay Reagent）

格※特許の関係上、ご購入の際には購入申込書への記入が必要です。企業の方のご購入に関しては、ライセンス契約が必要です。詳しくは弊社までお問い
合わせください。
※ベクターに関しては別途セット販売をしております。詳しくは、弊社までお問い合わせください。

8

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 9

ヒト初代細胞シリーズ

ヒト間葉系幹細胞 HMSC
再生研究の必須アイテムが登場。間葉系幹細胞増殖培地MF-medium®と供にご利用ください。
新鮮なヒト骨髄より分離された間葉系幹細胞（HMSC）です。細胞分化の研究や毒性、遺伝子導入、薬剤スクリーニングの研究などに利用できます。間葉系幹細胞増殖培地（MF-medium®）をご使用いただくことで、優れた増殖性を示します。

特長1 単一ドナー由来のヒト間葉系幹細胞です。
特長2 様々な用途で使用可能です。
特長3 MF-medium®を用いることで安定した培養が可能です。
一口メモ
間葉系幹細胞増殖培地MF-medium®は、間葉系細胞の増殖に適した低血清培地
です。通常、間葉系幹細胞増殖培地は10%程度の血清成分を含みますが、本培地は、成長因子やホルモンなどの添加量を調整することで低血清でありな
がら、10%血清含有DMEM培地よりも優れた増殖性を実現しています。また
最近、間葉系幹細胞 軟骨分化培地DF-C/骨分化培地DF-Bも販売を開始しました。合わせてお使いいただくことで、更に様々な応用実験が可能となります。

実施例1 ヒト間葉系幹細胞（HMSC）の増殖
・ヒト間葉系幹細胞（HMSC）をT-75フラスコに播種し、MF-medium®で培養しました。細胞は良好な増殖を示します。
培養3日目

培養6日目

図1．HMSCのMF-medium®中での増殖実施例2 MF-medium®と従来培地との増殖比較
・ヒト間葉系幹細胞（HMSC）T-75フラスコに2×105ずつ播種し、MF-medium®と10%FCS-DMEMで培養しました。培養3日目の観察結果を図2に示します。また、6日間培養後に細胞を回収し、細胞量を比較した結果を図3に示しました。MFmedium®は従来培地に比べHMSCの増殖に適していることが示唆されました。
MF-medium®（培養3日目）

10%FCS-DMEM（培養3日目）

図2．MF培地と従来培地でのHMSCの増殖性の比較

9

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 10

10%FCS-DMEM

MF-medium®

0

2

4

6

8

6

回収細胞数（×10 cell）
図3．培養条件によるHMSC細胞数の比較

実施例3 HMSCの脂肪分化誘導・HMSCを6穴プレートに1×105細胞/穴になるように播種しました。細胞がコンフルエントになったところで脂肪細胞分化培
地TADM（Code.TMTADM-250）に培地交換し、脂肪分化誘導を行いました。図4は2週間培養後の細胞形態を示します。
細胞内に脂肪滴が蓄積した脂肪分化細胞が観察できます。

価格を変更しております。
現在の情報は、お問い合わせいただきますようお願いいたします。

図4．HMSCの脂肪分化誘導

品 名 及 び 内 容

包ヒト間葉系幹細胞 HMSC
性能:第2継代細胞の凍結品
単一ドナー由来
細胞数:>5×105cells/Vial
用途:分化実験、再生実験などの研究

装1本>5×105cells/Vial

保存温度

Code No.

価

格

液体窒素

CA49205f¥97,000

保存温度

Code No.

価※HIV、HBV、HCV、マイコプラズマ、細菌、酵母、真菌陰性を確認しています。

品 名 及 び 内 容
®

包

装

格

間葉系幹細胞増殖培地MF-medium

500ml

4℃、-20℃

TMMFM-001¥35,000

脂肪細胞分化培地 TADM

250ml

4℃、-20℃

TMTADM-250¥20,000

間葉系幹細胞 軟骨分化培地 DF-C

250ml

4℃、-20℃

TMDFC-001¥65,000

間葉系幹細胞 軟骨分化培地 DF-C（TGF-β1,BMP-2なし）

250ml

4℃、-20℃

TMDFC-002¥40,000

間葉系幹細胞 骨分化培地 DF-B

250ml

4℃、-20℃

TMDFB-001¥50,000

間葉系幹細胞 骨分化培地 DF-B（TGF-β1なし）

250ml

4℃、-20℃

TMDFB-002¥25,000

250ml

4℃、-20℃

TMMFS-001¥28,000

1本

液体窒素

STSCI001¥70,000

初代細胞スターティング培地 MF-start
ヒト臍帯血由来単核細胞

TM10

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 11

糖ヌクレオチド糖転移酵素による糖鎖合成時の基質に最適な糖ヌクレオチドです。

CMP-NeuAc

GDP-Fuc

GDP-Man

本化合物を基質とする酵素：
Sialyltransferase

本化合物を基質とする酵素：
Fucosyltransferase

本化合物を基質とする酵素：
Mannosyltransferase

UDP-GalUDP-GalNAc

UDP-Glc

本化合物を基質とする酵素：
Galactosyltransferase

本化合物を基質とする酵素：
N-acetylgalactosaminyltransferase

本化合物を基質とする酵素：
Glucosyltransferase

UDP-GlcNAc

UDP-GlcUA

本化合物を基質とする酵素：
N-acetylglucosaminyltransferase

本化合物を基質とする酵素：
Glucuronosyltransferase

純度および水分含量

包 装

保存温度

Code No.

Cytidine 5'-monophospho-β-D- N-acetylneuraminic acid,disodium salt (CMP-NeuAc, 2Na) C20H29N4O16PNa2=658.4

品 名 及 び 内 容

純度（HPLC面積%）≧90.0%
吸収純度≧90.0%, 水分≦15.0%

25mg

-20℃

YM7215¥12,500

Guanosine 5'-diphospho-β-L-fucose, disodium salt
(GDP-Fuc, 2Na） C16H23N5O15P2Na2=633.3

純度（HPLC面積%）≧90.0%
吸収純度≧90.0%, 水分≦10.0%

25mg

-20℃

YM7229¥12,500

Guanosine 5'-diphospho-α-D-mannose, disodium salt
(GDP-Man, 2Na) C16H23N5O16P2Na2=649.3

純度（HPLC面積%）≧90.0%
吸収純度≧90.0%, 水分≦10.0%

100mg

-20℃

YM7210¥15,000

Uridine 5'-diphospho-α-D-galactose, disodium salt
(UDP-Gal, 2Na) C15H22N2O17P2Na2=610.3

純度（HPLC面積%）≧95.0%
吸収純度≧95.0%, 水分≦10.0%

100mg

-20℃

YM7213¥10,000

Uridine 5'-diphospho-α-D- N -acetylgalactosamine, disodium salt
(UDP-GalNAc, 2Na) C17H25N3O17P2Na2=651.3

純度（HPLC面積%）≧95.0%
吸収純度≧95.0%, 水分≦10.0%

25mg

-20℃

YM7958¥45,000

Uridine 5'-diphospho-α-D-glucose, disodium salt
(UDP-Glc, 2Na) C15H22N2O17P2Na2=610.3

純度（HPLC面積%）≧97.0%
吸収純度≧98.0%, 水分≦8.0%

100mg

冷蔵

YM7094¥5,000Uridine 5'-diphospho-α-D- N -acetylglucosamine, disodium salt
(UDP-GlcNAc, 2Na) C17H25N3O17P2Na2=651.3

純度（HPLC面積%）≧95.0%
吸収純度≧95.0%, 水分≦10.0%

100mg

-20℃

YM7191¥10,000

Uridine 5'-diphospho-α-D-glucuronate, trisodium salt
(UDP-GlcUA, 3Na) C15H19N2O18P2Na3=646.2

純度（HPLC面積%）≧95.0%
吸収純度≧95.0%, 水分≦12.0%

100mg

-20℃

YM7095¥7,50011価

格No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 12

本製品はすでに販売を中止しております。

機能性PEG（ポリエチレングリコール）試薬

様々な官能基を有するPEG試薬です。用途に応じ最適なPEG試薬を選択することができます。
PEGは親水性合成高分子であり、非特異的吸着・結合を抑制し、スペーサー効果を有すると報告されています。
生体不活性（Bioinert）
な物質であり、抗原となりません。Quanta Biodesign社のPEG試薬は数多くの論文で実績があります。

特長1 保護基を結合したPEGの使用で、選択的に反応を進めることができます。
特長2 蛋白質・抗体・酵素・薬剤の改質（PEGylation）に使用できます。
特長3 修飾時の凝集・沈殿防止に有効です。
・ペプチド合成用PEGを用いることで、ペプチド合成の際にPEGを途中に入れることができるため、凝集・沈殿しやすいペプチドの改質、スペーサーの付与に有効です。タンパク質のビオチン化・蛍光基の修飾による凝集・沈殿を軽減することができます。

特長4 表面改質・バイオチップなどの表面化学への応用可能です。
・特にMAL-dPEGTM-NHS試薬はSPR（表面プラズモン共鳴）チップへの応用に実績があります。

一口メモ
弊社表面プラズモン共鳴（SPR）イメージングシステ
ム：MultiSPRinter®を用いた解析において、アミノ基表面のチップにMAL-dPEG TM NHS
esterを用いてDNAを固定化することで、DNA-転写因子相互作用の解析が可能でした。
（参考文献）
Genes Cells . 2004, 9, 153164

装

保存温度

Code No.

4

100mg

-20℃

QB10181a¥47,000

8

100mg

-20℃

QB10184a¥47,000

2

100mg

-20℃

QB10266a¥30,000

4

100mg

-20℃

QB10214a¥40,000

8

100mg

-20℃

QB10274a¥45,000

12

100mg

-20℃

QB10284a¥40,000

24

100mg

-20℃

QB10314a¥50,000

2

1g

-20℃

QB10243c¥35,000

4

100mg

-20℃

QB10213a¥30,000

8

100mg

-20℃

QB10273a¥40,000

12

100mg

-20℃

QB10283a¥40,000

24

100mg

-20℃

QB10313a¥50,000

4

50mg

-20℃

QB10200a¥20,000

12

25mg

-20℃

QB10198a¥25,000

Biotin-dPEGTM-Cyanocobalamin

-

5mg

-20℃

QB10218a¥25,000

m-dPEG2TM acid

-

250mg

-20℃

QB10234a¥45,000

Bis-dPEGTM NHS ester

5

100mg

-20℃

QB10224a¥40,000

9

100mg

-20℃

QB10246a¥50,000

品 名 及 び 内 容
S-acetyl dPEGTM NHS ester

MAL-dPEGTM NHS ester

N-Fmoc-amido-dPEGTM-acid

NHS-dPEGTM-Biotin

PEG鎖長

包

価

ここで示した製品は一部であり、これらの他にさまざまな官能基を有するPEGを多数そろえています。詳しくは、以下のURLを参照下さい。
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/product̲feature/multisprinter/img/quanta.pdf、
またはhttp://www.quantabiodesign.com/

12格No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 13

本製品はすでに販売を中止しております。

Plasmid Purification Kits
簡便・簡単。韓国からやってきた新発想のスピンカラム式プラスミド抽出試薬です。

GENE ALLTM Plasmidシリーズは、スピンカラムを用いるプラスミド抽出試薬です。様々な工夫により、高いパフォーマンスを保ったまま、さらに操作がさらに簡素化されました。キットの選択は以下の表1を参照ください。

特長1 短時間で精製可能
・Plasmid Quickは、デブリスを除去するカラムとプラスミド吸着用カラムを重ねて使用することで（図2）、より短時間で精製が完了します。
・Plasmid SV Midiは、カラムを50mlチューブにセットし（図3）遠心することにより、より簡便に短時間で精製を終了させることができます。また、溶出ボリュームを0.6〜1mlに抑えることができ、溶出後のアルコール沈殿等は必要ありません。

特長2 高収率・高純度
・従来のスピンカラムキットと同等もしくは以上の収率・純度でプラスミドを得ることができます。
GENE ALLTM
方式

Plasmid Quick

Plasmid SV mini

Plasmid SV Midi

Spin

Spin/Vacuum

Spin/Vacuum

抽出時間<10min<23min<50minCulture volume
High copy plasmids
Low copy plasmids

〜3ml
〜3ml

〜5ml
〜10ml

〜50ml
〜100mlデブリスの除去

EasyClearTM

Centrifuge

EasyClearTM

平均収量

〜30μg

〜40μg

〜300μgプラスミドの用途

表1．キット選択の指標

シーケンス、PCR、制限酵素処理、 in vitro 転写、形質転換等＊Plasmid Quick及びSV miniのSpinカ
ラムの遠心は＞10,000xgもしくは10,000〜14,000rpm、SV MidiのSpinカラムの遠心は4,000〜5,000xg（スイングローター）で行います。
＊＊SV mini及びSV Midiは市販のVacuum
manifoldを用いるプロトコールにも対応
可能です。

！
除去
リス
ブ
デ
！
吸着 ！
！！
進行
同時

図2．Plasmid Quickカラムの構成

！
応！
ム対
ー
ュ
！
要！
、バキ
殿不
遠心
ル沈
ー
コ
アル

図3．Midiカラムの構成
市販の50mlチューブにフィットするように設計されております。
＊50mlチューブは添付されておりません。別途準備が必要です。

図1．各キットの操作フロー

13

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 14

実施例

GENE ALLTM Plasmid Quick を用いたプラスミド抽出例

様々なプラスミドを保有する大腸菌培養液2mlからGENE ALLTM Plasmid Quickを用いてプラスミド抽出を行いました。
まず、大腸菌を遠心分離した後、Buffer S1、Buffer S2により順次処理し、Buffer G3を添加した後、4〜5回転倒混和して、EasyClearTMに供しました。このユニットは図2に示すように、Filter column unitの上からセットすることができ、30〜60秒遠心することにより、デブリスは除去され、プラスミドはフィルターに吸着される仕組みになっています。遠心後、EasyClearTMを除去して、フィルターを洗浄液で洗浄し、溶出液を加えてプラスミドをマイクロチューブに溶出しました。
約10分間でプラスミド抽出ができました。図4は50μlで溶出したプラスミドの4μlを電気泳動したものです。すべて良好な収量で抽出することが可能でした。図5は、同様に抽出した様々プラスミドを抽出後、制限酵素処理し、電気泳動解析した結果を示しています。どれも良好なパターンを示しました。

M 1

M

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

Lane M : 1kb Ladder
Lane 1 : pUC18, host DH10B
Lane 2 : pUC18, host DH10B（ Eco RⅠ）
Lane 3 : pUC18, host DH10B（ Hin d Ⅲ）
Lane 4 : pUC18, host DH10B（ Sma Ⅰ）
Lane 5 : pQE30, host BL21
Lane 6 : pQE30, host BL21（Eco RⅠ）
Lane 7 : pQE30, host BL21（ Hin d Ⅲ）
Lane 8 : pQE30, host BL21（ Sma Ⅰ）
Lane 9 : pACYC184, host JM109
Lane 10 : pACYC184, host JM109（Eco RⅠ）
Lane 11 : pACYC184, host JM109（NcoⅠ）
Lane 12 : pACYC184, host JM109（Pvu Ⅱ）

Lane M: 1kb Ladder
Lane 1〜19 : pUC18, host DH5α
図4．Plasmid抽出結果

図5．プラスミドの制限酵素処理結果

品 名 及 び 内 容

包

TM

装

保存温度

Code No.

価格

危GENE ALL Plasmid SV mini
GENE ALLTM SV Column type Q, Collection tube, Buffer S1, Buffer S2,
Buffer S3, Buffer AW, Buffer PW, Buffer EB, RNase A

50回用
200回用

室温、-20℃ GB101150
GB101102¥9,000¥30,000

危

GENE ALLTM Plasmid Quick
GENE ALLTM SV Column type T, EasyClearTM filter column, Collection tube,
Buffer S1, Buffer S2, Buffer G3, Buffer AW, Buffer PW, Buffer EB, RNase A

50回用
200回用

室温、-20℃ GB101050
GB101002¥9,000¥30,000

危

GENE ALLTM Plasmid SV midi
GENE ALLTM SV Column type T, EasyClearTM filter column, Collection tube,
Buffer S1, Buffer S2, Buffer G3, Buffer AW, Buffer PW, Buffer EB, RNase A

26回用
50回用

室温、-20℃ GB101226
GB101250¥30,000¥50,000

保存温度

Code No.

危GENE ALLTM Gel SV

電気泳動ゲルからDNA断片（80bp〜10kb）の抽出（所要時間15分）

50回用
200回用

室温

GB102150
GB102102¥10,000¥36,000

危

GENE ALLTM PCR SV

PCR反応液、その他の酵素反応液からのDNA（100bp〜10kb）の抽出（所要時間6分）

50回用
200回用

室温

GB103150
GB103102¥9,500¥30,000

危

GENE ALLTM CleanUP SV

様々な酵素反応溶液からのDNA断片（40bp〜
10kb）の抽出（所要時間5分）

50回用
200回用

室温

GB113150
GB113102¥9,500¥30,000

品 名

用

途

包

装

価

格

危：本製品には、消防法：危険物第4類、アルコール類（等級Ⅱ）、労働安全衛生法：施行令、令別表第一、危険物四、引火性の物、令別表第九、名称等を通知すべき有害物、62号であるエタノールが含まれます。可燃性がございますので、お取扱いにはご注意ください。
※詳細に関しましては、http://www.generalbiosystem.com/english/index.htmlをご参照ください。

14

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 15

Realtime PCR
Master Mix

品名包装

Code No.

価格

Realtime PCR Master Mix 200回用（1ml×5本） QPK-101￥37,000
40回用（1ml×1本） QPK-101T ￥10,000
SYBR○ Green
200回用（1ml×5本） QPK-201￥37,000
Realtime PCR Master Mix
40回用（1ml×1本） QPK-201T ￥10,000
R

汎用性の高いリアルタイムPCR試薬です。様々な条件で能力を発揮します。
はじめ に
本試薬はrTaq polymeraseをベースとした高性能なリアルタイムPCR用マスターミックスです。プライマー以外の全ての組成を含む
2倍濃度の反応溶液で供給されます。TaqMan®アッセイ、プローブアッセイ、及びインターカレーターアッセイに対応する2種類のキットが準備されており、それぞれ以下のような特長があります。今号では、これらキットを用いて比較実験等を行った例を紹介いたします。

SYBR® Green

Realtime PCR Master Mix
用

途

対応機器

TaqMan®アッセイ
ハイブリダイゼーションプローブアッセイ

Realtime PCR Master Mix

インターカレーターアッセイ

・LineGene（BioFlux社、Code No.: BFFQD-33A）・LightCyclerTM（Roche Diagnostics社）
・ABI PRISM ® シリーズ（Applied Biosystems社）（⇒

本号ｐ.6をご参照ください）

など

TM

特

長

・BSAを含有しておりLightCycler 等のガラスキャピラリーシステムに対応します。
・パッシブリファレンスが添加されており、ABI PRISM ® シリーズなどに対応します。
・Taq polymeraseの中和抗体により、ホットスタートに対応します。
化学修飾によるホットスタートに比べ活性化の時間が短く、解析時間を短縮することができます。
・LineGeneを用いることにより、10μlでのアッセイが可能です。
・弊社逆転写酵素（ReverTra Ace® ）とRNase inhibitorの組み合わせにより 1ステップ RT-PCRが可能です。

方法

LineGeneを用いる標準的なインターカレーターアッセイのプロトコールを以下に示します。
DW

2.2 (μl)SYBR® Green Realtime PCR Mix

5Primer 1 (10pmole/μl)

0.4Primer 2 (10pmole/μl)

0.4

希釈逆転写反応溶液(cDNA溶液) or DNA溶液
Total

2
10

他社のキットは、それぞれの取扱い説明書に従い至適条件で行いました。サンプルとしては、30ngのヒトゲノムDNAを10倍ずつ段階希釈したものをサンプルとして、β-actin遺伝子をターゲットとしてPCRを行いました。〈ReverTra Ace®を用いて逆転写した溶液を直接用いる場合は、DWにて10倍に希釈したものを用います。〉
LineGeneを用いた1ステップRT-PCRは次のプロトコ〈RT希釈液の調製〉
DWールに従いました。サンプルはin vitro transcriptionに
28 (μl)より作成したG3PDH mRNAの希釈系列（105copyのRNase inhibitor (40U/μl)

45n希釈系列）を用いました。〈ダイマーの発生見られる場

ReverTra Ace® (100U/μl)

1

合、ReverTra Ace®の濃度を下げて検討します〉

Total

33

〈PCR反応溶液の調製〉
DW

2.2 (μl)SYBR® Green Realtime PCR Mix

5Primer 1 (10pmole/μl)

0.4Primer 2 (10pmole/μl)

0.4

RT希釈液

1

RNA溶液
Total

1
10

15

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 16

結果【増幅曲線】【融解曲線】TOYOBOTOYOBO

A社試薬

A社試薬立ち上がりの遅延

B社試薬

B社試薬

最終到達点のバラツキ

プライマーダイマーの成生図1．各社のRealtime PCR試薬を用いた増幅曲線および融解曲線比較（LineGene使用）

SYBR ® Greenを用いるインターカレーターア
ッセイでは、弊社の試薬を用いることにより、定量性の高い結果が得られることが分かりました。
プライマーダイマーの生成もありませんでした（図1）。
1ステップRT-PCRインターカレーターアッセ
イにおいても、いずれの濃度でも良好な増幅曲線を得ることができました（図2）。一方で、逆転写していないサンプルでは増幅しないことも確認しています。〈このアッセイ法では2ステップでの反応に比べプライマーダイマー成生等の非特異反応が発生することがあるため、予備検討をお薦めします〉

図2．1ステップRT-PCRインターカレーターアッセイ

このように、本試薬を用いることにより、再現性に優れた結果を簡便に得ることが可能です。是非一度お試しください。
品

名1stストランドcDNA合成キット

ReverTra Ace -α-®（逆転写酵素＋dNTPs他）
逆転写酵素

ReverTra Ace®
RNase Inhibitor
LineGene(本体＋ソフトウェア）

包

装

保存温度

Code No.

価

格

100回用

-20℃

FSK-101￥53,000

10,000U×1本
10,000U×5本-20℃

TRT-101
TRT-102￥15,000￥60,000

2,500×1本
2,500×5本-20℃

SIN-101
SIN-102￥9,000￥36,000

1式-20℃

BFFQD-33A￥1,890,000※リアルタイムPCR試薬は、F. Hoffman-La Roch Ltd.、Roche Molecular Systems Inc.並びにPerkin-Elmer Corporationとのライセンスに基づき販売されるものです。
※ LightCycler ®は、Idaho Technology Inc.並びにRoche Molecular Systems Inc.の商標です。
※ SYBR®は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。
※ TaqMan®は、The Perkin-Elmer Corporationの登録商標です。

16

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 17

Toxi-BlockerTM Transfection Supplementを用いたトランスフェクションの実施例のご紹介
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 増田 兼治

本製品はすでに販売を中止して
おります。

はじめ に
近年、リポソームをはじめ、様々な物質をキャリアーとした動物細胞への核酸のトランスフェクション法が開発され、広く使用されています。しかし、条件によっては、核酸の導入と同時に、細胞毒性も生じてし
まい、良い実験結果が得られない場合もあるようです。
弊社では、この問題を改善するため、Toxi-BlockerTM
Transfection Supplementを開発しました。ToxiBlockerTMは、核酸を動物細胞にトランスフェクション
する際に生ずる細胞毒性（Toxi）をブロック（Block）し、生存率を向上させる添加剤（Supplement）です。使用
方法は、トランスフェクション後に、Toxi-BlockerTMを添加するだけで、簡便です。
本稿では、Toxi-BlockerTMを用いて、Neuro 2a細胞（マウス神経芽細胞腫由来）、あるいは、COS-7細胞（アフリカミドリザル腎由来）へトランスフェクション
を実施した例をご紹介します。

方図1．Toxi-BlockerTMを用いた実験フロー法

結果及び考察1. β-gal染色による遺伝子導入の確認

1. β-gal染色による遺伝子導入の確認
トランスフェクション前日に、12ウェルプレートにNeuro

トランスフェクションの2日後、従来法（Toxi-BlockerTM未

5添 加 ） で は 強 い 細 胞 毒 性 が 現 れ て い ま し た。 一 方 、 T o x i -cells/well）。1.6μgのβ-gal発現プラスミドと4.0μlのBlockerTMを添加することで、従来法で見られた細胞毒性を大2a細胞、あるいは、COS-7細胞を播種しました（1.0×10
LipofectamineTM

2000 Reagent（Invitrogen社製）を用幅に低減し、生存率を向上させることが可能でした。また、本

いて、トランスフェクションを実施しました。トランスフェク

試薬を添加することにより、細胞の形態が正常に保たれること

ションの7時間後に、Toxi-BlockerTMを10μl添加しました。

も確認できました。

比較対照として、Toxi-BlockerTM未添加のウェルを用意しましβ-gal染色を実施し、遺伝子導入の有無を判断しました。

た。更に2日間培養後、β-gal Staining Kit（Invitrogen社製）

Toxi-BlockerTMを添加したウェルでも、遺伝子導入効率は従来を用いてβ-gal染色を実施しました（図2、3）。

法とほぼ同等との結果でした。

2. Toxi-BlockerTM添加タイミングの検討

2. Toxi-BlockerTM添加タイミングの検討

1.の条件で、GFP発現プラスミドを用いて、トランスフェク

トランスフェクションからToxi-BlockerTM添加までの時間がションを行いました。トランスフェクションの1、4、7、ある

短いと、細胞生存率の大幅な上昇が確認できましたが、遺伝子

いは、10時間後に、Toxi-Blocker TMを10μl添加しました。

導入効率が低下する傾向が認められました。一方、トランスフ

比較対照として、Toxi-BlockerTM未添加のウェルを用意しましェクションからToxi-BlockerTM添加までの時間が長いと、遺伝た。更に2日間培養後、Cell Count Reagent SF（ナカライ子導入効率はToxi-Blocker TM未添加での値とほぼ同等でした

社製）を用い、トランスフェクション未実施のウェルを基準とが、細胞毒性の低減効果はやや弱いとの結果でした。

して、細胞生存率を算出しました（図4、5）。また、フローサ

今回、紹介した2つの例では、トランスフェクションの7時

イトメーターを用いてGFP陽性細胞率を測定し、遺伝子導入効

間後にToxi-BlockerTMを添加することで、良好な結果を得るこ率を算出しました。

とができました。細胞およびトランスフェクション試薬によって、最適なToxi-BlockerTM添加のタイミングは異なりますので、
トランスフェクションの4〜10時間後を目安に最適化することをお薦めします。
トランスフェクション時の細胞毒性にお困りの研究者の皆様、是非一度本試薬をお試しください。

17

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 18

Toxi-BlockerTM添加

従来法

図2．β-gal染色結果（Neuro 2a細胞）

Toxi-BlockerTM添加

従来法

図3．β-gal染色結果（COS-7細胞）

（%）

100
80
60
40
20
0

生存率（%）
遺伝子導入効率（%）

未添加

1h

4h

7h

10h

トランスフェクション後、Toxi-BlockerTMを添加するまでの時間
図4．Neuro 2a細胞でのToxi-BlockerTM添加タイミングの検討結果

（%）

100
80
60
40
20
0

生存率（%）
遺伝子導入効率（%）

未添加

1h

4h

7h

10h

トランスフェクション後、Toxi-BlockerTMを添加するまでの時間
図5．COS-7細胞でのToxi-BlockerTM添加タイミングの検討結果

品名及び内容Toxi-Blocker

TM

Transfection Supplement

包装

1ml（12ウェルプレートで100ウェル分）

18

保存温度

Code No.

4℃

TFP-101

価

格¥22,000

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 19

精製プロテインキナーゼの活性評価
カルナバイオサイエンス株式会社 研究本部長

医学博士 石黒啓司

はじめ に質のピークとより低分子量にセリン・スレオニン残基をリン酸化

プロテインキナーゼ（以下、キナーゼ）は特定の基質タンパクするタンパク質のピークの少なくとも2種類のキナーゼ活性を有質にリン酸基を付加するリン酸基転移酵素（ホスホトランスフェ

する分画が認められました。昆虫細胞に発現させたHisタグ融合ラーゼ）です。キナーゼはチロシン残基をリン酸化するチロシン

EphB6自身にはキナーゼ活性はありませんので、これらのキナ

キナーゼ（以下、TK）とセリン残基とスレオニン残基をリン酸ーゼ活性は昆虫細胞が有するキナーゼであることが示唆されま化するセリン・スレオニンキナーゼ（以下、STK）に大別されます。その後の検討で、これらのキナーゼ活性はHisタグ融合

す。キナーゼはヒトゲノム遺伝子解析の結果を用いた解析からで

EphB6に結合せず、Ni-NTAカラムに結合することが明らかになは518個のキナーゼ遺伝子があると報告されており、Kinome1

りました。これらの昆虫細胞のキナーゼはNi-NTAカラムの精製と命名されています。STKファミリーはさらに、STE、CK1、条件を変えても容易にHisタグ融合タンパク質と分離できません

AGC、CMGC、CAMK、RGCおよびTKLに分類されます。また、でしたので、昆虫細胞で作られた多くのHisタグ融合タンパク質

TKファミリーは、受容体型と非受容体型に分類されます。受容

製品には普遍的に含まれているのではないかと考えました。そこ

体型のTKはリガンドが結合することで自己もしくは特定の基質

で、他社製品のHisタグ融合キナーゼタンパク質について、昆虫をリン酸化します。非受容体型TKとほとんどのSTKは細胞内に細胞のキナーゼ活性を測定してみました。PDGFRは御存知のよ

存在して、シグナル伝達分子として働いています。近年、キナー

うにPDGF受容体チロシンキナーゼで、セリン・スレオニン残基

ゼは創薬ターゲットとして多くの製薬企業やバイオ関連企業で注をリン酸化することは知られておりませんので、もしセリン・ス

目されており、bcl-abl阻害剤であるGleevecTM（慢性骨髄性白レオニンキナーゼ活性が認められれば、昆虫細胞のキナーゼの活血病）やEGFR阻害剤であるTarcevaTM（非小細胞肺癌、膵臓癌）、性を測定していることになります。結果は図1（a-d）に示してTM

またマルチプルキナーゼ阻害剤であるNexavar （進行性腎臓癌）

います。他社のHisタグ融合PDGFRは、セリン・スレオニンキ

やSutent TM（消化器間質腫瘍、進行性腎臓癌）などはすでに治ナーゼの基質を非常に強くリン酸化しました（d）。PDGFR以外

療薬として用いられています。

にもいくつかのHisタグ融合チロシンキナーゼについてセリン・

カルナバイオサイエンス株式会社（以下、カルナ社）では、スレオニンキナーゼ活性を測定しましたが、すべてのチロシンキ

206種類のヒトリンコンビナントタンパク質を製品化し、販売しナーゼがセリン・スレオニンキナーゼ活性を示し、昆虫細胞のキています（平成18年3月末現在）。市販されているキナーゼタン

ナーゼを含んでいることが分かりました。一方、図1に示したよ

パク質は一般に①ヒトもしくは動物細胞から抽出し、精製する、

うに、同様に昆虫細胞から作製したGSTタグ融合PDGFRは、セ②大腸菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等へ目的の発現遺伝子を導入しリン・スレオニンキナーゼの基質を全くリン酸化せず、少なくとてタンパク質を発現し、精製する、③無細胞系でタンパク質を発も昆虫細胞のセリン・スレオニンキナーゼが含まれていないこと

現し、精製することにより生産されています。これらのキナーゼが判明しました（b）。これとは反対に、いくつかのHisタグ融合

タンパク質を使用する際に考慮しなければならないのは、宿主由セリン・スレオニンキナーゼはチロシンキナーゼ活性を示しまし

来のキナーゼタンパク質の混在です。無細胞系や大腸菌でキナーた。この場合でも、GSTタグ融合セリン・スレオニンキナーゼ

ゼタンパク質を生産すれば問題ありませんが、昆虫細胞や哺乳類

はチロシンキナーゼ活性を示さず、少なくとも昆虫細胞のチロシ細胞から精製してくる場合、宿主から混入するキナーゼタンパク

ンキナーゼが含まれていないことが判明しました。以上のことよ

質を考慮する必要があります。

り、一般に市販されている昆虫細胞で作製したHisタグ融合タン
パク質にはチロシンキナーゼとセリン・スレオニンキナーゼの少昆虫細胞で作製したHisタグ融合EphB6に混在した昆虫細胞のキナーゼ

なくとも2種類の昆虫細胞のキナーゼが含まれている可能性が高いことが明らかになりました。

カルナ社ではキナーゼ製品の開発において次のような問題点を認識しています。KinomeのTKファミリーに分類されるヒト
EphB6はキナーゼ活性がないことが報告されています2。しかしながら、このEphB6をHisタグ融合タンパク質として昆虫細胞を用いて発現させ、Ni-NTAカラムを用いて精製すると、チロシン残基やセリン・スレオニン残基をリン酸化するキナーゼ活性を示します。精製したEphB6をSuperdex

200を用いてゲルろ過をすると、より高分子量にチロシン残基をリン酸化するタンパク

19

TK活性

STK活性

TK活性

STK活性

No.83.qx 06.5.29 19:22 ページ 20

図1．GSTタグ及びHisタグ融合PDGFRの活性測定における混在キナーゼ活性の評価
グルタチオンセファロースカラムを用いて精製したGSTタグ融合タンパク質とNi-NTAカラムを用いて精製したHisタグ融合
タンパク質を用いてチロシンキナーゼ活性とセリン・スレオニンキナーゼ活性の測定をした。（a）と（c）はELISA法、（b）と（d）はIMAP法で行なった。橙色はATP（−）を示し、青色はATP（＋）のキナーゼ活性測定の結果を示す。

結果及び考察ているものもありますが、含まれる昆虫細胞のキナーゼの活性のそれでは、昆虫細胞で作られた多くのHisタグ融合タンパク質

影響を受けないよう、プロファイリングを行っています。また、製品は、キナーゼの研究に使えないのでしょうか? 必ずしもそう

カルナ社のHisタグ融合キナーゼを購入された場合は、カルナ社

ではありません。昆虫細胞のキナーゼは、それぞれリン酸化しやの測定条件に準じて測定する限り、含まれる昆虫細胞のキナーゼ

すい基質があり、それらの基質を使わなければHisタグ融合キナの活性の影響を受けることはありませんが、他の基質を使用した

ーゼ自体の活性を測ることができます。また、Hisタグ融合タン

り、使用するHisタグ融合キナーゼ量を多く使用したりしてキナ

パク質製品に含まれる昆虫細胞のキナーゼの量は限られているたーゼ活性を測定すると影響がでることがあると思われます。

め、それらのキナーゼの影響がでない量を使う限り、目的のHis

カルナ社はこのようにして製造されたプロテインキナーゼを販

タグ融合キナーゼの活性を測ることができます。カルナ社はこれ売する一方、これらの酵素を用いて150種類を越えるプロテイ

らのHisタグ融合タンパク質製品に含まれる昆虫細胞のキナーゼ

ンキナーゼについて信頼性の高い化合物のプロファイリングサーの性質を詳しく調べることにより、それらの影響を受けない基質

ビスを提供しています*。

やキナーゼ測定条件を研究してきました。よって、カルナ社で行（*東洋紡では、受託事業の仲介は行っておりません、別途カルナバっているプロファイリングには、Hisタグ融合キナーゼを使用しイオサイエンス社（http://www.carnabio.com/）へお問い合わせ
ください）

参考文献

1）Manning G et al., Science, 298: 1912-34（2002）
2）Gurniak CB. and Berg LJ., Oncogene, 13: 777-786（1996）20

No.83_21.qx 06.7.1 18:31 ページ 1★ ★ ★ 3本お買い上げの方 25%OFF ! ★ ★ ★
※どの組み合わせでもかまいません（重複OK)※今回のキャンペーンは非営利研究機関の研究者の方を対象とさせていただきます。

本製品はすでに販売を中止しております。

期間：2006年6月19日〜9月29日（ご注文分）
カルナバイオサイエンス社プロテインキナーゼに新しい酵素が追加されました。

ついに200種類を越えました!!
カルナバイオサイエンス社のプロテインキナーゼは様々な用途に安心してお使いいただけます。UPLOAD81号、82号で紹介いたしました、QTL社の迅速プロテインキナーゼ活性測定キットQTL
LightSpeed®シリーズ等を用いる検討に最適です。

一口メモ

QTL LightSpeed® Assay Kitは「スーパークエンチング法」
を用いる化合物スクリーニングに最適なホモジニアスなプ
ロテインキナーゼ・ホスファターゼ活性測定キットです。
（参考文献）PNAS 101(43): 15295 (2004), BMC. Biotechnol., 5(1):16(2005)※

は新商品です

品
上記参照

名

包

装

5μg/vial

保存温度

Code No.

通常価格

-80℃

上記参照

上記参照（※お問い合わせください）21

実験のコツ、成功・失敗談募集！
！
皆様の日々の研究生活の中で、「こうやったら思いがけず実験がうまくいった」
とか、逆に「あの方法には魔物が潜んでいる」などといった、些細で論文などにはなりにくいけれども皆に伝えずには居られないような小ネタを、少なくとも一つはお持ちのはずです。
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気概のある研究者の皆様からのご投稿お待ちしております。

採用された方には漏れなく図書カード¥10,000分を進呈いたします。

募集要項■投稿方法：弊社ホームページ（URL：http://www.toyobo.co.jp/bio）からご投稿いただけます。
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友達へのメール感覚で、お気軽にご投稿ください。
※コツとしては、東洋紡製品のうまい使い方や、個人的な工夫などを中心に広くお待ちしております。
※失敗例に加えて、「どうやったらうまく行くの？」というような問いかけの記事も大歓迎。
※特許出願などが絡む可能性のある案件は、一度確認してからご投稿ください。

■賞

受付は終了
しております品：採用された方には漏れなく¥10,000分の図書券を進呈します。また、オープニング記念として、応募していただいた方の中から10名の方に図書カード¥5,000分を進呈いたします。

Reports〈掲載例〉

PCRプロダクトキャリーオーバー事件
匿名希望TKさん
数年前、ある種のウイルスの検出系を立ち上げていたころ、連日、すごい回数のPCR実験をこなしていました。するとその
うち、えらく検出率が上がる現象が観察され始めました。高感度化に成功したと勘違いした私は、臨床検体を用いる実験でも試してみました。すると、なんと自分の血清からもそのウイルスが検出されて、真っ青。もしかして、感染？その後の実験で、単なる水からも増幅されることが分かって一安心。毎日同じターゲットで実験していたせいで、PCRプロダクトがキャリーオ
ーバーしていたのでした。その後、私は調査のために、いろいろなところの水をサンプルとしてPCRを行い、PCRプロダクトの汚染マップなるものを作成しました。結果、もっとも汚染されていたのは、流し台。電気泳動後のバッファーをそこに棄てていたのが原因で、そこで洗浄したビンが汚染源でした。その後、電気泳動と試薬調製は別の部屋で行っています。皆さん、
電気泳動槽のバッファーは危険ですよ！

●本ページ掲載の試薬類は全て一般研究用の目的にのみ販売しており、医薬品、診断用医薬品、化粧品、食品用等には使用できませんので、十分ご注意ください。誤用による事故については、当社は一切の責任を負いません。
●本ページ掲載商品にには消費税は含まれておりません。実際のご購入価格については弊社代理店へお問い合わせください。
●本ページ中の略号：毒 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
劇 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
危 印は消防法に基づく危険物です。

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