甲南大学

博士学位論文

線虫 C. elegans における神経系と腸が連関した
温度順化制御機構の解析

甲南大学大学院
自然科学研究科
本村

生命・機能科学専攻
晴佳

MOTOMURA Haruka
2024 年

3月

目次
要旨

p.1

略語一覧

p.3

1．序論

p.6

1.1 動物の温度耐性と生体調節
1.2 動物の温度応答における神経系の役割
1.3 神経細胞の生理機構
1.4 細胞内 Ca2+イメージングによる神経回路の解析
1.5 モデル生物

線虫 C. elegans

1.6 線虫 C. elegans の神経系
1.7 CREB の分子機構と神経系での機能
1.8 線虫 C. elegans の低温耐性と温度順化
1.9 線虫 C. elegans の脂肪の貯蔵と分解
1.10 線虫 C. elegans の脂肪の染色手法
1.11 本研究の目的

2．結果

p.27

2.1 転写因子 CREB は ASJ と RMG で機能し、温度順化を促進する
2.2 CREB は ASJ 感覚ニューロンの温度応答性に関わる
2.3 PVQ 介在ニューロンが ASJ から RMG への温度情報伝達を仲介する
2.4 PVQ 介在ニューロンは ASJ 温度受容ニューロンから温度情報伝達を受ける2.5 PVQ 介在ニューロンから RMG 介在ニューロンへの情報伝達はグルタ
ミン酸が機能する
2.6 神経ペプチド FLP-7 が腸の脂肪分解を介して温度順化を制御する
2.7 高温下で ATGL-1 が機能し、脂肪の分解を行う

3．考察

p.43

3.1 転写因子 CREB と温度順化の関係
3.2 温度順化を促進する全身周回性の神経回路
3.3 神経ペプチドを介した腸の脂肪分解経路と低温耐性の関係
3.4 その他の考察
3.5 C. elegans の低温死の解析における今後の展望

4．結語

p.53

5．材料・方法

p.55

6．謝辞

p.74

7．引用文献p.75

8. 図・表p.87

要旨
動物は生育環境の温度に合わせて生存戦略を取ることで、多様な環境の中で生存・繁殖を可能にしている。本研究では、線虫 Caenorhabditis elegans が飼育温度の変化によって頭部から尾部に跨る全身周回性の神経回路を駆動させ、腸の脂肪代謝を制御する温度順化機構を明らかにした。C. elegans は飼育
温度が変化すると新しい温度に慣れる「温度順化」を示す。例えば低温環境下でも生存可能な 15℃飼育個体を 25℃に移し 3 時間以上飼育すると、25℃に慣れて低温への耐性を失い、低温環境下で死滅するようになる。C. elegans の温度順化の制御において、転写因子 CREB（cAMP 応答配列結合タンパク質）が頭部に細胞体を持つ ASJ 温度受容ニューロンと RMG 介在ニューロンにおいて温度順化を制御することが明らかになった。ASJ 温度受容ニューロンと RMG 介在ニ
ューロンの間を繋ぐギャップ結合やシナプス接続は存在しないため、この 2 つのニューロンを仲介するニューロンの存在が考えられた。そこで ASJ 温度受容ニューロンと RMG 介在ニューロンの間の神経細胞のシナプス伝達を過活性化させた結果、尾部に細胞体を持つ PVQ 介在ニューロンが温度順化に関与している可能性が得られた。カルシウムイメージングと遺伝学的な解析により、PVQ 介
在ニューロンはグルタミン酸を介して ASJ 温度受容ニューロンと RMG 介在ニューロン間の温度情報伝達を仲介していることが示唆された。以上により、頭部の ASJ 温度受容ニューロン、尾部の PVQ 介在ニューロン、頭部の RMG 介在ニューロンと全身に渡って構成される神経回路が温度順化の制御に関与することが示唆された。次にこの神経回路の下流の解析を進めた結果、腸の脂肪代謝に関わる神経ペプチド FLP-7 の変異体とその受容体 NPR-22 の変異体で温度順化に1

遅れが見られることが分かった。神経ペプチド FLP-7 の下流で脂肪を分解することが報告されているトリグリセリドリパーゼ ATGL-1 は高温飼育時の方が発現量が増加した。中性脂肪を赤色に染める oil Red O で腸の脂肪量を定量化したところ、高温飼育時の方が腸の脂肪量が低下しており、トリグリセリドリパ
ーゼ ATGL-1 の増加と腸の脂肪量の低下が同じ温度域で起こっていることが明らかになった。つまり、C. elegans は全身を周回する神経回路と腸が連関し、腸の脂肪代謝を介して温度順化を制御する生体システムが明らかになった。

2

略語一覧
AFP

Antifreeze protein

AMPAα-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid

ATGL

Adipose triglyceride lipase

ATP

Adenosine triphosphate

C. elegans

Caenorhabditis elegans

CaM

Calmodulin

cAMP

Cyclic adenosine monophosphate

CBP

CREB-binding protein

cDNA

Complementary DNA

CeNGENC. elegans Neuronal Gene Expression Map & Network

CFP

Cyan fluorescent protein

cGMP

Cyclic guanosine monophosphate

CREB

cAMP Response Element-Binding protein

DEG/ENaC

Degenerin/epithelial Na+ channel

DNA

Deoxyribonucleic aciddNTPs

Deoxynucleotide triphosphates

FFA

Free fatty acids

FLP

FMRFamide (Phe-Met-Arg-Phe-amide)-related peptide

FRET

Fluorescence resonance energy transfer

GABA

γ-aminobutyric acidgfGain-of-function

GFP

Green fluorescent protein

HSL

Hormone-sensitive lipase
3

INS

InsulinInsP3R

Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor

KID

Kinase-inducible domain

LB

Luria-Bertani

LDs

Lipid droplets

LROs

Lysosome-related organelles

LTP

Long-term potentiation

MCU

Mitochondrial calcium uniporter

MICU

Mitochondrial calcium uptake

NeuroPAL

Neuronal polychromatic atlas of landmarks

NGM

Nematode growth medium

NLP

neuropeptide-like protein

NMDA

N-methyl-D-aspartate

OMM

Outer mitochondrial membrane

PCR

Polymerase chain reaction

PDE

Phosphodiesterase

PDK

Phosphoinositide-dependent kinase

PKA

Protein kinase A

PKC

Protein kinase C

POA

Preoptic area

PUFA

Polyunsaturated fatty acid

RNA

Ribonucleic acidRNAi

RNA interference

SERCA

Sarco-endoplasmic reticulum ATPase

4

SFA

Saturated fatty acid

SNARE

Soluble NSF attachment protein receptor

TG

Triglyceride

TRP

Transient receptor potential

TRPA

Transient receptor potential ankyrin

TRPCTransient receptor potential canonical

TRPM

Transient receptor potential melastatin

TRPVTransient receptor potential vanilloid

VDAC

Voltage dependent anion channel

XDH

Xanthine dehydrogenase

YC

Yellow cameleon

YFP

Yellow fluorescent protein

51. 序論1.1 動物の温度耐性と生体調節
動物は季節毎の環境変化に適切に対処することで生存している。特に冬は餌が乏しくなる上、低温から身を守らなければならない。越冬のために動物が取る戦略は種によって異なる。いわゆる「渡り鳥」の越冬戦略である餌のある温暖な地域への移動の他、シマリスやクマなどの一部の哺乳類は冬眠しエネルギーの消費量を抑えることで冬を越す(Alerstam and Backman, 2018;
Kawamichi, 1996; Thiel et al., 2022; Tsukamoto et al., 2019)。耐寒性を獲得し冬季も餌を摂取しながら冬を越す種もおり、寒さに対する備えは種によって様々である。
動物が低温によって受ける障害は多岐に渡る。哺乳類細胞においては、脂質の過酸化、細胞膜の機能低下による細胞内外のイオン恒常性の喪失、Ca2+流入に伴うホスホリパーゼ・プロテアーゼの活性化、細胞骨格の損傷などが挙げられる(Boutilier, 2001; Rubinsky, 2003)。これらを防ぐために、生物は耐寒機構を持つ。例えばニカメイガの越冬幼虫は、体液中にグリセロールを蓄積することにより凍結耐性を獲得する(Izumi et al., 2006)。-20℃下の越冬幼虫の脂肪体では、水は細胞内から細胞外に流出し、グリセロールは細胞外から細胞内に流入しており、凍結時に水チャネルタンパク質であるアクア
ポリンを介して細胞内の水と体液中のグリセロールを速やかに置換すること
で凍結障害を回避すると考えられている(Izumi et al., 2006)。他にも魚類
から植物に渡り保持されている不凍タンパク質（AFP）は、過冷却中に生じる単結晶氷に結合して成長を阻害する氷結晶結合機能と、細胞膜表面に結合して細胞内イオンの漏出と流入を抑制する細胞保護機能を持つ(Hirano et al.,6

2008)。魚類 AFP を加えた保存液では、4℃に暴露したヒト肝がん細胞株の生存率が上昇し(Hirano et al., 2008)、AFP を含んだ保存液を使用したラットの心臓は-1.3℃でも凍結しない(Amir et al., 2004)。線虫では担子菌由来のTisAFP8 を体壁筋に発現させると、−5℃経験後の生存率に顕著な増加が見られることが報告されている(Kuramochi et al., 2019)。近年、ヒトがん細胞において、低温によって誘導される細胞死が細胞内の鉄イオンに依存した細胞死様式であるフェロトーシスに近い性質を持つことが明らかにされている(Dixon et al., 2012; Hattori et al., 2017)。フェロトーシスでは、過酸化脂質と脂質ラジカル体が蓄積することにより、最終的に細胞形質膜が崩壊する(Dixon et al., 2012)。他にも、ヒトのミトコンドリアマトリックスへの Ca2+の輸送を正に制御する MICU1 の欠損は、ヒトがん細胞株の低温誘導性
細胞死を抑制するという報告もあり(Nakamura et al., 2021)、低温による細胞障害の回避には様々な分子機構が関与していると考えられる。

1.2 動物の温度応答における神経系の役割
動物は神経系に制御された体温調節機構を持つことで外界の温度変化に適応している。動物の体温調節機構は意識的な制御である行動性体温調節と意識的に制御できない自律性体温調節に分かれる(Morrison and Nakamura, 2019;
Nakamura, 2011; Terrien et al., 2011)。行動性体温調節として、群れを作って密集する、体を丸めて熱放散を防ぐ、日向ぼっこを行い日射により体を温めるなどの行動が挙げられる。ヒトの場合は、衣服の着用やエアコンを使用し行動性体温調節を行っている(Terrien et al., 2011)。自律性体温調節として、高温では気化熱として体熱を放散する蒸散性熱放散、室温付近では主に皮7膚の血管収縮により放散量を調節する非蒸散性熱放散、寒冷環境では骨格筋のふるえ、もしくは褐色脂肪組織による熱産生が行われる(Morrison andNakamura, 2019; Nakamura, 2011; Terrien et al., 2011)。これらの体温調節機構を実行するには温度を感知する受容器、受容器から送られてくる情報を処理する神経系、神経系に制御された効果器が必要となる。
ヒトを含む多くの哺乳類は表皮下の末梢神経に存在する非選択的陽イオンチ
ャネルである温度感受性 TRP（Transient receptor potential：TRP）チャネル
で温度を受容し、その情報はシグナルとして脳へと伝達される(Bandell etal., 2007; Caterina et al., 1997; Julius, 2013; Laing and Dhaka,2016)。TRP チャネルが活性化するとナトリウムイオンや Ca2+が細胞内に流入し、これにより電位依存性ナトリウムチャネルなどが開口されることで神経が発火すると考えられている。TRP チャネルはヒトでは 11 種類存在し、高温ではTRPV1、TRPV2、TRPM3、体温に近い暖かい温度では TRPV3、TRPV4、TRPM2、
TRPM4、TRPM5、低温では TRPM8、TRPA1、TRPC5 が活性化することでヒトは広い
温度域を感知できる(Bandell et al., 2007; Dhaka et al., 2006; Kashio
and Tominaga, 2022; Laing and Dhaka, 2016; Zimmermann et al., 2011)。
TRP チャネルの温度感受性は種によって異なることが報告されており、例えば両生類の TRPA1 の種による違いが知られている(Saito et al., 2022)。高温忌
避性が異なるリュウキュウカジカガエル、カジカガエル、ニホンアカガエルの3 種類から単離した高温センサーである TRPA1 が活性化する温度は、忌避温度が低いニホンアカガエルと忌避温度が高いリュウキュウカジカガエルで異なり、ニホンアカガエルの TRPA1 は高温で活性化するがリュウキュウカジカガエ
ルの TRPA1 は高温に応答しない。忌避温度がリュウキュウカジカガエルより低く、ニホンアカガエルより高いカジカガエルの TRPA1 の温度感受性は、他の 28種の間に位置していた(Saito et al., 2022)。他にも TRP チャネルの温度感受性の違いが温度に対する行動の変化に繋がる例として、コウテイペンギンの低温センサーである TRPM8 をマウスに導入すると低温忌避行動が弱くなるという報告もあり(Yang et al., 2020)、生物はそれぞれの生育環境に合った温度応
答性を進化の過程で獲得することで多様な温度環境での生存を可能にしていると考えられる。
哺乳類では、TRP チャネルで受容された温度情報は視床下部の視索前野(preoptic area：POA）で統合され、この部位から適切な信号を送られること
で自律性体温調節が行われている(Morrison and Nakamura, 2019)。POA による体温の恒常性の維持にはフィードバック制御とフィードフォワード制御が重要となる。フィードバック制御による体温調節とは、深部体温が適正な温度域から逸脱したことを感知し、至適温度に戻すような制御機構を指す。フィードフ
ォワード制御とは、感知した環境温度の変化を元に、深部体温が影響を受ける
前に体温調節を行う制御機構を指す(Kanosue et al., 2010; Morrison andNakamura, 2019)。フィードバックシグナルは内臓や筋肉、脊髄、脳の温度受容体から送られる。例えば深部体温が上昇すると熱産生や血管収縮が抑制される負のフィードバックが働き、適正な温度に戻す。フィードフォワードシグナ
ルは皮膚の温度受容体から送られ、例えば皮膚が冷たくなると熱産生や血管収縮を促進して体温の低下を防ぐ(Kanosue et al., 2010; Morrison andNakamura, 2019)。哺乳類の褐色脂肪組織の熱産生調節においては、興奮性のグルタミン酸作動性の入力と抑制性の GABA 作動性の入力のバランスにより制御されることが分かっている(Morrison and Nakamura, 2019)。

9

1.3 神経細胞の生理機構 (Kandel et al., 2014)
動物の環境情報の受容とそれに伴う行動の制御を司る神経細胞は、機能的に感覚ニューロン、介在ニューロン、運動ニューロンの 3 つに分類される。感覚ニューロンは末梢の受容器に主に存在し、環境中の様々な情報を受け取る。感覚ニューロンで受容された情報はそれと接続している介在ニューロンに伝達され、運動ニューロンを介して筋肉や分泌腺に指令が送られる。
動物の感覚受容から応答までを担うこれらの神経細胞は典型的に 4 つの部位から成り立っている。他のニューロンからの情報入力を受ける樹状突起、核や小胞体がある細胞体、他の神経細胞に電気シグナル（活動電位）を伝達する軸索、他の神経細胞へのシグナル伝達に特化したシナプス前終末である。軸索の根元の軸索初節から発生する活動電位の振幅は 100mV で維持され、毎秒 1〜
100m の速さで伝達される。活動電位がシナプス終末に伝わることで前シナプスから後シナプスへの情報伝達が行われる。
神経細胞のシグナルは細胞膜内外の電位差によって生み出される。静止状態の神経細胞は電位差を–65mV（静止膜電位）に維持しているが、膜電位の急速な＋40mV への上昇（活動電位）がシグナルとなって軸索を伝わっていく。細胞
膜内外の電位差を生み出すのは主に Na+と K+の不均衡な分布と、細胞膜の持つ選択的透過性である。細胞膜に存在する選択的透過性を持つイオンチャネルや
イオンポンプの機能により、細胞内では Na+の濃度は低く、K+の濃度は高く保たれているが、膜電位の変化により Na+がチャネルを通って細胞内に流れ込むよ
うになると細胞内の負の電荷が中和され、活動電位が発生する。軸索初節から活動電位が生じるのは、電位依存性 Na+チャネルが最も高い密度で存在するためである。電荷の分離が縮小し負の膜電位が減少することを脱分極と呼び、電荷の分離が増加し負の膜電位が増加することを過分極と呼ぶ。脱分極は細胞が10活動電位を発生する能力高める興奮性の変化であるのに対し、過分極は活動電位を発生する可能性を減らす抑制性の変化である。
シナプスには、電流を使用する高速な伝達経路である電気シナプスと、多様な化学物質を使用する化学シナプスがある。電気シナプスでは、前シナプスと後シナプスの接触する部位はギャップ結合とよばれ、前シナプスの電流の一部がギャップ結合を通って後シナプスに入る。これは前シナプスと後シナプスの間が約 4nm しか離れておらず、この狭い間隙はギャップ結合チャネルにより連結されているために起こる。一方化学シナプスのシナプス間隙は 20〜40nm の距離があるため、前シナプスが神経伝達物質を放出し、それを後シナプスが受容することで行われる。細胞体で形成されたシナプス小胞前駆体や神経ペプチ
ドなどを貯蔵する有芯小胞は、ATP 依存性の速い軸索輸送によって軸索終末まで輸送される。神経伝達物質として低分子量伝達物質と神経ペプチドの 2 種類
が主に使用されている。低分子量伝達物質はシナプス小胞(直径約 40nm)に貯蔵され、神経ペプチドは有芯小胞(直径約 70〜250nm)に貯蔵されている。有芯小胞は低分子量伝達物質も含む場合がある。シナプス前終末で活動電位が発生す
ると電位依存性 Ca2+チャネルが開き、細胞内の Ca2+濃度が上がることで生化学反応が誘発され、小胞膜に発現しているシナプトブレビン SNARE（v-SNARE の一種）が、標的膜に発現している 2 種類の t-SNARE（シンタキシンと SNAP25）と複合体を形成し、シナプス小胞とシナプス前膜が融合する。シナプス小胞が細胞膜と融合すると、シナプス間隙に神経伝達物質が放出される。
現在神経伝達物質として分かっているのは、アセチルコリン、生体アミン（ドパミン、ノルアドレナリン、セロトニンなど）、アミノ酸（グルタミン
酸、グリシン、GABA など）、アデノシン三リン酸(ATP)とその代謝産物などである。アミノ酸神経伝達物質の中でも興奮性のものと抑制性のものに分かれて

11

おり、グルタミン酸は興奮性シナプスの神経伝達物質である一方、グリシンとGABA は抑制性介在ニューロンで使用されている。

1.4 細胞内 Ca2+イメージングによる神経回路の解析
Ca2+シグナルはセカンドメッセンジャーとして生体内の多くの分子経路の制御に関与している。Ca2+は静止状態の細胞質で低く保たれているが、細胞外からの流入もしくは細胞内に貯蔵されていた Ca2+が放出されることで細胞質のCa2+濃度が上昇する(Berridge et al., 2000)。細胞外からの Ca2+の流入には、
電位依存性カルシウムチャネル、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、TRPC チャネルなどが関与し、細胞外への排出に
は細胞膜 Ca2+-ATP アーゼ（The plasma membrane Ca2+-ATPase：PMCA）と
Na+/Ca2+交換体（sodium-calcium exchanger：NCX）などが機能することが知られている(Berridge et al., 2000; Grienberger and Konnerth, 2012)。Ca2+は細胞内で小胞体、筋細胞では筋小胞体に蓄えられている。小胞体からの Ca2+放出にはイノシトール-1,4,5-三リン酸受容体（InsP3R）とリアノジン受容体が使用され、取り込みには筋小胞体カルシウム ATP アーゼ（sarco-endoplasmic
reticulum ATPase：SERCA）が機能する(Berridge et al., 2000)。小胞体の他にミトコンドリアも細胞内 Ca2+ストアとして機能している(Berridge et al.,2000)。Ca2+は、電位依存性アニオンチャネル（Voltage Dependent Anion
Channel：VDAC）を通ってミトコンドリア外膜（outer mitochondrial
membrane：OMM）に流入し、MCU（Mitochondrial Calcium Uniporter）と呼ばれるミトコンドリア内膜に存在するチャネルによりミトコンドリア内膜内部に入る。細胞内の Ca2+の制御おいて、小胞体とミトコンドリアは密接に機能して12いる。例えば小胞体の InsP3R は、細胞質シャペロンの Grp75 と OMM の VDAC1と複合体を形成することで、小胞体から InsP3R を介して放出された Ca2+をミトコンドリアへ送る(Rossi et al., 2019)。
Ca2+シグナルは心筋細胞の収縮や細胞周期の制御、細胞死に至るまで多くの細胞内プロセスに関わる(Berridge et al., 2000; Grienberger andKonnerth, 2012)。神経においては、シナプス前末端におけるシナプス小胞の分泌を誘導する他、CREB を介した核の遺伝子転写などの制御にも関わっており、in vivo での Ca2+濃度の変化の観察は生体システムの解析において非常に重要である(Berridge et al., 2000; Grienberger and Konnerth, 2012)。
細胞内 Ca2+イメージングとは、細胞内の Ca2+濃度の変化を可視化する技術のことである。Ca2+インディケーターとして紫外線で励起される Quin-2 が初めて生物実験に使用されて以来、異なる励起波長と、より感受性の高い Ca2+インディケーターの開発が進められてきた(Grienberger and Konnerth, 2012)。遺伝
子にコードされた Ca2+インディケーターのイエローカメレオン(Yellow
cameleon: YC)は、1997 年に開発された Ca2+インディケーターであり、蛍光タ
ンパク質 CFP と YFP のキメラタンパクである(Madisen et al., 2015;
Miyawaki et al., 1997; Nagai et al., 2004)。CFP と YFP の間はカルシウム
結合サイト(カルモジュリン(CaM)の一部)と CaM 結合タンパク質の一部(ミオシン軽鎖キナーゼ M13)で繋がっており、Ca2+がこの部位に結合するとカメレオンの立体構造が変化する。これにより CFP から YFP に蛍光共鳴エネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer: FRET)が起き、励起光照射下で発される CFP の藍色蛍光を YFP が吸収し、黄色の蛍光を発するようになる(Miyawaki et al., 1997; Nagai et al., 2004)。よってカメレオンの CFP と13

YFP の蛍光の比を取ることにより、細胞内の Ca2+濃度の変化を定量化することが可能となる。

1.5 モデル生物

線虫 C. elegans

Caenorhabditis elegans は土壌に生息する非寄生性の線虫の一種で、1974
年にシドニー・ブレナーによって見出されて以降、プログラム細胞死や RNAi干渉などの発見をもたらしたモデル動物である。体長は 1mm ほどで、全 959 個の細胞で構成される。体色が透明であることから、蛍光タンパク質を用いることで生体内（in vivo）の個々の細胞を可視化する解析が容易にできるという利点がある。神経ネットワークは 302 個の神経細胞で構成されており、全神経
細胞間の化学シナプス及びギャップ結合は電子顕微鏡を用いた切片解析から明らかにされている(White et al., 1986)。C. elegans は雌雄同体であるため、ホモ接合体としての系統維持が容易である。さらに、C. elegans の生まれてくる子孫のうち、0.1%の頻度で雄が出現する。この雄の個体は雌雄同体の個体と交配が可能であることから、C. elegans は遺伝学的解析にも適している(Brenner, 1974)。またゲノムサイズが約 100Mbp とモデル動物の中でも特に小さく、全ゲノム DNA 配列は 1998 年に決定されている(Consortium, 1998)。ゲ
ノム DNA に存在する全遺伝子の約 36%がヒトの遺伝子と類似した遺伝子である
ため、線虫で働く遺伝子をヒトの遺伝子と比較的容易に対応させて解析できる。

C. elegans の生育温度は約 13℃から 27℃であるが、生育温度によって繁殖力や成長速度が異なり、最も繁殖力が強い最適温度は約 18.2℃である(Begasse

et al., 2015; Gouvea et al., 2015)。C. elegans の成長段階は幼虫期の14

L1、L2、 L3、 L4 と成虫期に分けられる。L1 段階の幼虫を 15℃、20℃、25℃
で成長させた場合、卵を持ち始めた若い成虫(ヤングアダルト)になるまで 15℃
では約 89 時間、20℃は約 52 時間、25℃は約 41 時間必要となり、15℃で飼育した場合と 25℃で飼育した場合では成長速度が 2 倍ほど変わる(Gouvea etal., 2015)。

1.6 線虫 C. elegans の神経系
線虫 C. elegans の神経系は、1986 年に電子顕微鏡を用いた切片解析により
全神経細胞のネットワークが明らかにされて以来、発生から機能、遺伝子レベ
ルまで多面的に解析が進められてきた(Hobert, 2016; White et al., 1986)。

C. elegans の神経系は雌雄同体と雄で異なっている。雌雄同体は 302 個のニ
ューロンを持つ一方、雄は 385 個のニューロンからなる神経系を持つ。このう
ち雌雄同体では 8 個のニューロンが特異的であり、雄では 91 個のニューロンが特異的である(Cook et al., 2019)。

C. elegans の神経系では神経情報伝達物質として GABA、グルタミン酸、ア
セチルコリンや、アミン作動性の神経伝達物質であるドーパミン、セロトニ
ン、オクトパミン、チラミンと 200 以上の神経ペプチドを使用している(Hobert, 2016)。神経ペプチド遺伝子ファミリーはインスリン様ペプチド(INS) 、FMRF amide 様ペプチド（FLP）、神経ペプチド様タンパク質（NLP）の
３つの主要なファミリーに分類される(Frooninckx et al., 2012)。グルタミ
ン酸やアセチルコリンは透明なシナプス小胞に局在し、神経ペプチドや生体ア
ミン神経伝達物質は有芯小胞に局在する(Palamiuc et al., 2017)。

15

C. elegans の神経系ではアセチルコリンとグルタミン酸が最も用いられており、GABA やアミン作動性のニューロンは 10％ほどである(Hobert, 2016)。

C. elegans の神経系の解析は遺伝子を含む多階層レベルで進められていることから、データベースが豊富にあるという利点がある。2018 年には単一細胞
RNA シーケンシングによる全神経細胞の遺伝子発現プロファイルを作製する C.

elegans Neuronal Gene Expression Map & Network (CeNGEN)プロジェクトが行われた(Hammarlund et al., 2018; Taylor et al., 2021)。これにより、
Web アプリケーション上で各単一神経細胞で発現している遺伝子の種類と、その遺伝子発現の強度が容易に検索できる。
また C. elegans では全脳イメージングを行える系統が確立されている。近年、Eviatar Yemini らが 41 個のレポーター遺伝子を導入した NeuroPAL（aNeuronal Polychromatic Atlas of Landmarks）株を公表した。この神経多色地図系統では、蛍光タンパク質である mTagBFP2(青色)、CyOFP1(オレンジ色)、
mNeptune2.5(ピンク色)の蛍光をソフトウェアで擬似着色して組み合わせることにより全神経細胞が同定可能となる(Yemini et al., 2021)。さらに、このNeuroPAL 系統では、緑色蛍光タンパク質 GFP の緑色の波長域の蛍光タンパク質は使用されていないため、NeuroPAL 系統に、各自の興味のある遺伝子の制御配列の元で GFP を発現させることで、その遺伝子の発現神経細胞を 1 細胞のレベルで同定することができる。

1.7 CREB の分子機構と神経系での機能
cAMP 応答配列結合タンパク質（cAMP response element-binding protein：
CREB）は、N 末端にグルタミン残基が豊富な Q1 と呼ばれるドメインと、リン酸

16

化修飾を受けるキナーゼ誘導性ドメイン（kinase-inducible domain :KID）、Q2 ドメイン、C 末端に二量体の形成と DNA 結合を行う塩基性アミノ酸・ロイシンジッパー（bZIP）ドメインを持つ転写調節因子であり、CREB は特定の遺伝子のプロモーターDNA 配列に存在する CRE 配列（TGACGTCA）に結合す
る(Johannessen et al., 2004; Schumacher et al., 2000; Stati et al.,2021)。CREB は DNA の CRE 配列に結合しているがその状態では転写促進せず、その活性は cAMP 依存性プロテインキナーゼ A（PKA）や CaMKⅣなどのリン酸化酵素による CREB タンパク質のリン酸化によって制御されている。CREB がもつ
KID 領域内の 133 番目のセリン残基（Ser133）がリン酸化修飾を受けること
で、CREB はヒストンのアセチル化活性を持つ共活性化因子 CREB-binding
protein（CBP）と複合体を形成し、その CREB と CBP の複合体がヒストンアセ
チル化を行うことでクロマチン構造を変化させ転写を促進する(Greer andGreenberg, 2008; Lisman et al., 2018; Stati et al., 2021)。CBP はヒスト
ンアセチル化のみでなく RNA ポリメラーゼⅡをリクルートして転写を促進する(Greer and Greenberg, 2008)。
CREB はヒトから C. elegans まで保存されており、遺伝子の転写・翻訳によって新たなシナプスを形成することで動物の長期記憶の形成に関わることが報告されている。2001 年に Kandel らによりアメフラシ（Aplysia californica）の水管・エラ引き込み反射の連合学習には CREB が必要であることが示され(Kandel, 2001)、マウスで CREB を欠失させると、脳内の記憶を司る海馬のニ
ューロンにおけるシナプスの長期増強である LTP の誘導に欠陥が生じるが、CREB の構成的活性型（CREB-VP16）の発現により、LTP が増強するという報告もある(Greer and Greenberg, 2008)。CREB は転写促進によるシナプスの形成のほか、CREB を過剰発現させた神経細胞ではより多くの活動電位が生じるとい

17

う報告もあり、CREB が細胞の興奮性の増強に関与していると考えられる(Lisman et al., 2018)。
CREB が温度記憶に関与する例がモデル生物 C. elegans において報告されている。C. elegans は飼育温度と餌の有無をそれぞれ記憶し、それらを関連付けて学習することができる(Aoki and Mori, 2015; Mori et al., 2007; Ohta
and Kuhara, 2013)。この連合学習は行動レベルで観察することができる。一定の温度下で餌のある条件で飼育された C. elegans は、餌の無い温度勾配のある寒天上に置かれると過去に飼育されていた温度付近に移動するという温度走性を示す。この行動に関わる神経回路レベルでの情報処理として、まず頭部にある AFD 感覚ニューロンと AWC 感覚ニューロンが温度を受容し、その情報が下流の AIY 介在ニューロンと AIZ 介在ニューロンに伝達される。AIY 介在ニューロンと AIZ 介在ニューロンの情報は RIA 介在ニューロンで統合され、体壁筋を制御する運動ニューロンに信号が送られることで運動が制御される(Kuhara

et al., 2008; Mori and Ohshima, 1995; Mori et al., 2007; Nishida etal., 2011)。この温度走性の成立には温度受容ニューロンで機能する CREB が関与している(Nishida et al., 2011)。17℃で飼育された CREB 変異体は野生株と似た温度走性の表現型を示すが、20℃や 23℃で飼育された CREB 変異体は野生株に比べて低い温度に移動する異常を示した。この行動異常は AFD 感覚ニ
ューロンに CREB の野生型の cDNA を導入することで、野生株と同様の表現型を示すよう回復する(Nishida et al., 2011)。CREB 変異体では AFD 感覚ニューロ
ンの温度応答性が野生株と異なることが分かっている。具体的には、温度走性の表現型と同様に、17℃で飼育された CREB 変異体の AFD 感覚ニューロンでは
温度刺激時の Ca2+濃度の変化率は野生株と変わらないが、20℃もしくは 23℃で飼育された CREB 変異体の AFD 感覚ニューロンは野生株に比べて温度応答性が18低下しており、この温度刺激に対する感覚ニューロンの Ca2+濃度の変化の差異
が、CREB 変異体の温度走性に影響を与えていると考えられている。(Nishida

et al., 2011)。

1.8 線虫 C. elegans の低温耐性と温度順化

C. elegans の低温耐性は飼育温度に依存して変化する（図 1）。25℃で飼育された C. elegans は 0℃、1℃、2℃、4℃に暴露されるといずれの場合でも死滅するが、20℃で飼育された C. elegans は 0℃から 2℃に暴露された場合は死滅し、4℃では生存率が 80％以上となる。15℃で飼育された C. elegans は
2℃、4℃ではほぼ全ての個体が生存し、1℃では 60％、0℃では 20％ほど生存する(Ohta et al., 2014)。
多くの神経細胞でキネシンが欠損した unc-104 変異体、キューティクルの形成が異常になる rol-6 変異体、筋細胞に異常がでる unc-54 変異体など特定の組織に異常を持つ変異体のうち、unc-104 変異体で 20℃飼育の個体が低温暴露後に生存する低温耐性異常を示しており、さらに頭部のほぼすべての感覚神経に発現している OSM-6 の欠損変異体でも同様の異常が現れることから、C.

elegans の低温耐性には神経系からの情報伝達が重要であること明らかになっている(Ohta et al., 2014)。しかし、C. elegans の温度走性行動に関わる温度受容ニューロンである AFD 感覚ニューロンの発生に関わる OTX 型転写因子
TTX-1 の変異体と、同じく温度走性における温度受容ニューロンである AWC 感
覚ニューロンで温度情報伝達に関わる三量体 G タンパク質αサブユニット ODR3 の変異体は野生株と同じ低温耐性の表現型を示すことから、線虫 C. elegans

19

の低温耐性に関わる神経回路は温度走性行動に関わる神経回路とは別経路であると考えられている(Ohta et al., 2014)。
これまでに低温耐性や温度順化に関与する感覚ニューロンとして ASJ 感覚ニ
ューロン、ADL 感覚ニューロン、ASG 感覚ニューロンが見つかっている。ASJ 感
覚ニューロンにおける温度受容情報伝達の分子経路の仮説として、何らかの温度受容体が温度を受容した後に、これまでに同定されている三量体 G タンパク質 α サブユニット GPA-1、GPA-3、 GOA-1 がその情報を伝達し、グアニル酸シクラーゼである DAF-11 と ODR-1 を活性化し、ASJ 細胞内の環状 GMP の濃度を上昇させ、環状 GMP 依存性チャネル TAX-4/TAX-2 を開口させ、TAX-4/TAX-2 から
Ca2+が流入することで ASJ 感覚ニューロンを発火させること、また、環状 GMPを分解するホスホジエステラーゼ PDE-1 と PDE-2 がこの経路を抑制することが提唱されている(Ohnishi et al., 2018; Ohta et al., 2014; Takeishi etal., 2020; Ujisawa et al., 2016)。ASJ 感覚ニューロンは光受容ニューロンとしても知られている。ASJ 感覚ニューロンにおける温度情報伝達に関わる分子経路の構成分子は、ASJ 感覚ニューロンの光情報伝達経路の構成分子として既に同定されていた。このように ASJ 感覚ニューロンにおいて、温度情報伝達と光情報伝達の分子経路に共通点があるが、一方で、ASJ 感覚ニューロンの光受容体 LITE-1 の変異体では低温耐性は異常を示さないため、ASJ 感覚ニューロンにおいて未同定の温度受容体が存在し、それが光情報伝達経路と同様の分子経路を活性化し、ASJ 感覚ニューロン内の温度情報伝達を行っていると考えられる。
ASJ 感覚ニューロンは温度刺激によってインスリン様分子 DAF-28 と INS-6 を分泌し、腸のインスリン受容体 DAF-2 に受容される(Ohta et al., 2014; Ohta

et al., 2023)。DAF-2 は、PI3 キナーゼ AGE-1、PDK キナーゼ PDK-1、AKT キナ

20

ーゼ AKT-1, 2 を順次活性化し、FOXO 型転写因子 DAF-16 の核への移動を抑制することで遺伝子発現を変化させ、C. elegans の低温耐性に関与していると考えられている(Ohta et al., 2014; Ohta et al., 2023)。
インスリンの経路の他にも、精子が ASJ 感覚ニューロンの神経活動に影響を与え、低温耐性に関わるフィードバック機構も明らかになっている。ASJ 感覚
ニューロンからの情報伝達が腸の核ホルモン受容体 NHR-88 と NHR-114 で受容され、精子に存在する脱リン酸化酵素 GSP-4 が低温耐性に関与する(Sonoda etal., 2016)。
ADL 感覚ニューロンの温度感受性では、活性化を促進する 3 つの TRP チャネ
ルが関与する分子経路と、抑制する方向に機能する 2 つのカリウムチャネルが関与する経路のバランスによって温度刺激化の活性化が制御されていることが明らかになっている(Ohnishi et al., 2020; Okahata et al., 2019)。TRP チ
ャネル OSM-9 と OCR-2 は温度受容体として協調的に機能し、OCR-1 は ADL における OSM-9/OCR-2 の遺伝学的な負の制御因子として機能する(Okahata et al.,2019)。KCNQ 型カリウムチャネル KQT-2 は KQT-3 の制御因子として機能し、KQT-3 は ADL 感覚ニューロンの負の制御因子として働く可能性が示唆されている(Okahata et al., 2019)。
ADL 感覚ニューロンの温度応答性には、上流の URX 酸素受容ニューロンからの酸素情報伝達が影響する。URX 酸素受容ニューロンにおいて、酸素受容体として機能するグアニル酸シクラーゼ GCY-35 が酸素を受容すると、その酸素情報が URX とシナプスで接続している RMG 介在ニューロンに伝達され、RMG 介在ニューロンはギャップ結合によって、ADL 温度受容ニューロンの温度応答の感度を調節している。このように、ADL 温度受容ニューロンでは、酸素と温度の21シグナルが統合され、最終的には温度順化を調節している(Okahata et al.,2019; Takeishi et al., 2020)。
温度刺激によって ADL 温度受容ニューロンの細胞質内に Ca2+が流入することにより Ca2+依存性エンドリボヌクレアーゼ ENDU-2 が機能することが低温耐性に必要であることが明らかになっている(Ujisawa et al., 2018)。ENDU-2 は RNAを分解してリボソームの生合成を制御する核小体低分子 RNA（snoRNA）の生成を行っており、カスパーゼ CED-3 を介したアポトーシスシグナルを阻害することで低温耐性の制御に関わっている(Ujisawa et al., 2018)。endu-2 変異体では ADL 感覚ニューロンの温度刺激時の神経活動が低下しており、これは ADL におけるアポトーシスシグナルの過活性化に起因する可能性が考えられている(Ujisawa et al., 2018)。
ASG 感覚ニューロンでは、Degenerin/epithelial Na+ channel （DEG/ENaC）
タイプのメカノ受容体である DEG-1 が温度を受容していることが C. elegansのカルシウムイメージング解析と、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた 2電極電圧クランプ法による電気生理学的解析により明らかになっている(Takagaki et al., 2020)。ASG 感覚ニューロンで受容された温度情報は、キサ
ンチン脱水素酵素（XDH）の相同タンパク質である XDH-1 が機能する AIN 介在ニューロンと AVH 介在ニューロンに伝達され、低温耐性を制御する(Okahata

et al., 2022; Takagaki et al., 2020)。
以上のように、これまでに C. elegans の低温耐性や温度順化に関わる温度受容ニューロンと、その温度応答に関わる温度受容体や分子について解析が進められてきた。しかし、これらの温度受容ニューロンの下流の神経回路や低温耐性の獲得・喪失の原因は分かっていない。

22

1.9 線虫 C. elegans の脂肪の貯蔵と分解

C. elegans は摂取した脂肪酸を、グリセロール骨格に 3 分子の脂肪酸が結合したトリグリセリド（Triglyceride：TG）に変換して貯蔵する。その大部分は腸の脂肪滴（Lipid droplets：LDs）と呼ばれるリン脂質一重膜で構成された
50〜3000nm の細胞小器官で貯蔵され、一部はリソソーム関連オルガネラ（Lysosome-related organelles：LROs）で貯蔵される(An et al., 2023;
Srinivasan, 2015; Zhang et al., 2010)。腸の他には生殖巣、卵、皮下組織
が脂質染色で染色されることから、これらの組織にも脂肪が蓄えられていると考えられる(O'Rourke et al., 2009)。13C と 15N の安定同位体による標識とマ
ススペクトロメトリーを組み合わせた解析により、貯蔵されている脂質の2.4%、膜脂質の 4.7%が 1 時間ごとに入れ替わることが明らかにされている(Dancy et al., 2015; Perez and Watts, 2021)。

C. elegans の主なリパーゼは脂肪分解酵素トリグリセリドリパーゼ（Adipose triglyceride lipase：ATGL）とホルモン感受性リパーゼ（Hormone-sensitive lipase: HSL）である(An et al., 2023)。ATGL はヒトから C. elegans まで保存され、哺乳類細胞では LDs の表面に局在している(Smirnova et al., 2006)。ATGL は TG をジグリセリドと遊離脂肪酸（Freefatty acids：FFA）に分解する(Haemmerle et al., 2006)。絶食状態の C.

elegans では ATGL の発現量が増加し、再び餌が与えられると C18 脂肪酸デサチュラーゼ FAT-7 を誘導して脂肪レベルを回復する(Srinivasan, 2015)。
リパーゼの作用により TG から分離した FFA はミトコンドリアとペルオキシ
ソームで β 酸化経路によるエネルギーの生成に使用される。FFA のうち、短鎖、中鎖、長鎖脂肪酸はミトコンドリアでアセチル-CoA に変換され、超長鎖脂23

肪酸はペルオキシソームでアセチル-CoA に変換される(An et al., 2023;
Srinivasan, 2015)。
これまでに、C. elegans の低温環境（4℃）での長期の生存にホルモン感受性リパーゼ HOSL-1 を介した脂質分解経路が関与することが報告されているが(Liu et al., 2017)、C. elegans の温度順化に脂肪の代謝経路が関わっているのかは明らかにされていない。

1.10 線虫 C. elegans の脂肪の染色手法

C. elegans の脂肪の染色には Nile red、BODIPY や oil Red O などの色素が使用される。Nile red は in vitro や細胞株で使用すると疎水性環境で濃縮され、黄金色の蛍光を発する脂溶性色素である(O'Rourke et al., 2009)。Nile
red と BODIPY は、餌である大腸菌に混ぜることで生きた C. elegans の染色が可能となることから脂肪の蓄積の解析に用いられてきたが、これらの色素が主な脂肪の貯蔵機関ではなく、一部の脂肪を貯蔵している LROs を染色していると報告されている(O'Rourke et al., 2009)。C. elegans の腸には形態的・機能的に異なる顆粒が存在しており、Nile red で染色される酸性の LROs の他に、LROs と異なるマーカーで標識され、Nile red では染色されない中性の顆粒も存在する(O'Rourke et al., 2009)。C. elegans は餌が無い状態に置かれると貯蔵した TG を分解・代謝してエネルギーとするため、絶食の条件下ではTG 量が低下するが、Nile red のシグナルはむしろ増加する(O'Rourke et al.,2009)。LROs は、β 酸化経路によるエネルギーの生成のために中性脂肪滴から
ミトコンドリアやペルオキシソームへ脂肪を移動させる通過区画として機能している可能性が示唆されている(Srinivasan, 2015)。このことから、絶食の条

24

件下で Nile red のシグナルが増加しているのは、エネルギーの生成に脂肪を動員するために LROs へ脂肪の移行が進むためではないかと考えられる。

C. elegans の主な脂肪の貯蔵機関を染色する色素として LipidTOX neutrallipid green、LipidTOX neutral-lipid red、Sudan black、oil red O が検討された(O'Rourke et al., 2009)。LipidTOX neutral-lipid green、LipidTOX
neutral-lipid red は染色効率が悪く、C. elegans の外表面を覆うクチクラ層を透過処理した後でも 10%未満しか染まらず、これらの色素のシグナルは光退色に対して非常に敏感である(O'Rourke et al., 2009)。Sudan black を用いた染色では、エタノールによる洗浄段階の操作が最終的なシグナルに強く影響するため誤差が生じやすい(O'Rourke et al., 2009)。一方 oil Red O は C.

elegans の解剖学的構造を保存でき、サンプル間のばらつきも少なかった(O'Rourke et al., 2009)。oil Red O で染色して定量化した場合では、代謝変
異体とガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリーによる TG の生化学的測定の結果が相関しており、絶食条件においては Nile red で染めた場合とは異なりシグナルが低下した(O'Rourke et al., 2009)。そのため、oil Red Oを使用した染色法によって C. elegans の脂肪の定量化が行われている。

1.11 本研究の目的
これまで C. elegans の低温耐性や温度順化に関わる温度受容ニューロンとその分子機構の解析は進められてきたが、温度受容ニューロンの下流の神経回路や低温耐性の獲得・喪失の原因となる機構の解析は進められていなかった。
そのため、本研究では C. elegans の温度順化に焦点を当て、まず温度順化を制御する新規の分子の探索とその分子の機能細胞の同定を行い、温度順化の制

25

御に関わるニューロンを探索した。次にカルシウムイメージング法を用いて温度刺激時の神経活動を調べることにより、温度順化に関与する温度受容ニューロンとその下流のニューロンからなる神経回路の動態を測定した。その後、神経回路の下流で制御される組織として腸の脂肪代謝経路と温度順化の関係と、温度による脂肪量の差異について調べた。

26

2.結果
2.1 転写因子 CREB は ASJ と RMG で機能し、温度順化を促進する
これまでの研究から低温耐性や温度順化に関わる新規の温度受容ニューロン
や、温度受容ニューロン内での分子メカニズムの解析が進められてきたが、下流の情報伝達経路は不明の部分が多かった。そこで温度受容ニューロンの下流の経路の解明に向け、まず C. elegans の温度順化に関わる新たな分子の探索を行った。
転写因子 CREB は線虫から哺乳類まで保存され長期記憶の形成に関与する(Greer and Greenberg, 2008; Kandel, 2001)。CREB が C. elegans の温度順化に関わっているのか、温度シフトテストを用いて検証した。その結果、転写因子 CREB の変異体（crh-1 変異体）は、野生株 N2（Wild-type）に比べ新しい温度への順化が遅れることが分かった（図 2、3）(Motomura et al., 2022)。高温環境から低温環境への温度シフト （図 2；25℃→15℃→2℃）では、25℃飼
育後に 15℃を 3 時間経験した N2 の生存率が約 75％だったのに対し、crh-1 変
異体は 40％ほどに留まった。一方、低温環境から高温環境への温度シフト（図3；15℃→25℃→2℃）では、15℃で飼育された crh-1 変異体は 25℃への順化が遅れ、野生株に比べ生存率が増加した。特に 15℃飼育後に 25℃で 3 時間飼育した場合に N2 と crh-1 変異体の生存率の差は顕著であった（N2；約 5％、crh-

1 変異体；約 50％）（図 3）。このことから CREB は温度変化後 3 時間の間に作用し、温度順化を促進する可能性が考えられた。
次に crh-1 変異体の様々な組織に crh-1cDNA を導入し、野生型の crh-1 遺伝
子を発現させ、CREB が温度順化において C. elegans のどの組織で機能するのか同定した（図 4）(Motomura et al., 2022)。crh-1 変異体の温度順化異常は、unc-14 プロモーターを使用して crh-1cDNA を発現させた際に回復した（図274）。unc-14 プロモーターはほとんどの神経細胞で遺伝子を発現させることから、CREB がいずれかの神経細胞で機能することが示唆された。そこで、どの神経細胞が crh-1 変異体の温度順化異常の原因であるかをより詳細に調べるために、特定のニューロンで遺伝子発現を誘導することが既に報告されている様々なプロモーターDNA 配列を用いて、crh-1 変異体の特定のニューロンで野生型の crh-1 遺伝子を発現させる解析を行った。まず 302 個ある神経細胞のうち、64 個の神経細胞で発現誘導することが可能な 6 つのプロモーターDNA 配列(osm-6p, ncs-1p, ceh-10p, glr-1p, unc-8p, unc-86p) の下流に crh-1cDNAを融合したプラスミド DNA を作製し、それら 6 つの DNA コンストラクトを混合して、crh-1 変異体に導入した。その結果、crh-1 変異体の温度順化異常が野生株と同程度まで回復した（図 4）。しかし、41 個の神経細胞で発現誘導する
3 つのプロモーターDNA 配列(glr-1p, unc-8p, unc-86p)で crh-1 遺伝子を発現させたトランスジェニック系統は crh-1 変異体と同様の温度順化異常を示した（図 4）。次に、55 個の神経細胞で発現誘導する 5 つのプロモーターDNA 配列(trx-1p, ncs-1p, glr-1p, unc-8p, unc-86p)の下流に crh-1cDNA を融合した
プラスミド DNA を作製し、それら 5 つを混合して crh-1 変異体に導入した場合においても、crh-1 変異体の温度順化異常が野生株と同程度まで回復した（図4）。さらに、42 個の神経細胞で発現誘導する 4 つのプロモーターDNA 配列(trx-1p, glr-1p, unc-8p, unc-86p)を使用して作成したトランスジェニック
系統においても温度順化異常が部分的に回復したことから、ASJ 感覚ニューロ
ンが温度順化における CREB の機能細胞である可能性が考えられた（図 4）。ところが、crh-1 変異体の ASJ 感覚ニューロンのみに crh-1cDNA を導入しても（使用プロモーター：trx-1p)、温度シフトテストで生存率が高くなる異常は回復しなかった。この結果から、温度順化の成立には CREB が ASJ 感覚ニュー28

ロンで機能するだけでは十分でなく、他のニューロンにおける CREB の機能も必要である可能性が考えられた。
そこで、crh-1 変異体において ASJ 感覚ニューロンに加え ASJ 以外のニューロンでも同時に crh-1cDNA を導入した系統を作製した。具体的には、(1)ASJ とPVQ 介在ニューロン（使用プロモーター：trx-1p, glr-1p）、(2)ASJ と HSN 運
動ニューロン（使用プロモーター：trx-1p, unc-86p）、(3)ASJ と AIY 介在ニューロン（使用プロモーター：trx-1p, ceh-10p）、(4)ASJ と RMG 介在ニューロン（使用プロモーター：trx-1p, RMGp*）に crh-1cDNA を導入した crh-1 変
異体トランスジェニック系統を作製し、温度順化テスト後の生存率を測定した。その結果、(4)ASJ 感覚ニューロンと RMG 介在ニューロンで同時に crh-

1cDNA を導入した系統において、crh-1 変異体の温度順化異常が強く回復した（図 4）。なお、ASJ と PVQ 介在ニューロンに crh-1cDNA を導入した系統と、
ASJ と HSN 運動ニューロンに crh-1cDNA を導入した系統でも crh-1 変異体の温度順化異常が部分的に回復したが、これは使用したプロモーターの unc-86p とglr-1p が僅かに RMG 介在ニューロンでも発現誘導していることが最近報告されたため(Taylor et al., 2021)、その影響であったと考えられる。また、crh-1変異体の RMG 介在ニューロンでのみ crh-1cDNA を導入したトランスジェニック
系統では、crh-1 変異体が示す温度順化異常は回復しなかったことから、野生株において CREB は ASJ 感覚ニューロンと RMG 介在ニューロンで機能し、温度順化を促進すると考えられた(Motomura et al., 2022)。

2.2 CREB は ASJ 感覚ニューロンの温度応答性に関わる
野生株の ASJ 感覚ニューロンの温度応答性は C. elegans の飼育温度に依存して変化する(Ohta et al., 2014)。CREB の欠損が ASJ 感覚ニューロンの温度29応答性にどのような影響を与えるのか確認するために crh-1 変異体の ASJ 感覚
ニューロンに Ca2+の離脱と結合によって蛍光が変化する CFP と YFP のキメラタ
ンパク質であるイエローカメレオン YC3.60 を発現させ(Nagai et al.,2004)、温度刺激下の細胞体の Ca2+濃度の変化を可視化し、野生株と比較した（図 5-7）(Motomura et al., 2022)。ASJ 感覚ニューロンで発現誘導する trx-

1 プロモーター配列の下流に yc3.60 cDNA を融合したプラスミド DNA を作製し、野生株、シナプス接続に異常をもつシナプトブレビン snb-1 変異体と crh-

1 変異体に導入した。シナプトブレビンは、神経細胞間の情報伝達機構であるシナプス伝達において、前シナプスのシナプス小胞をシナプス終末に係留する分子として知られている。
飼育温度の違いにより温度刺激に対する ASJ 感覚ニューロンの温度応答性に違いがみられることが報告されていたため(Ohta et al., 2014)、特定の温度域のみで野生株と crh-1 変異体で ASJ 温度受容ニューロンの温度応答性に差がある可能性を考慮し、15℃飼育、20℃飼育、23℃飼育した個体を使用して、それぞれ飼育温度付近の温度刺激を与えた。Ca2+イメージングを行った結果、20℃または 23℃で飼育した野生株の ASJ 感覚ニューロンは Ca2+濃度の上昇が見られるが、crh-1 変異体では野生株に比べ有意に低下した（図 5-7）。シナプ
ス接続が低下している snb-1 変異体の ASJ 感覚ニューロンでは、Ca2+濃度変化
は野生株とほぼ同じであったことから（図 7）、crh-1 変異体の ASJ 感覚ニュ
ーロンの温度刺激時の神経活動の低下は他のニューロンからの影響ではないと考えられる。また 20℃で飼育された crh-1 変異体の Ca2+濃度変化の低下は、

crh-1 変異体の ASJ 感覚ニューロンに野生型 CREB を特異的に発現させることで回復した（図 6；crh-1;Ex[trx-1p::crh-1 cDNA]）。これらの結果から CREB は
ASJ 感覚ニューロンの温度応答性に関与することが示唆された。

30

ASJ 感覚ニューロンで発現誘導する trx-1 プロモーター配列の下流に snb-1
cDNA と蛍光タンパク質 VENUS を融合したプラスミド DNA（trx-1p::snb-

1::VENUS）を、crh-1 変異体に導入し、Z 軸方向の焦点面を変化させながら取得した画像を立体構築することによりシナプスの形態観察を行った。その結果、crh-1 変異体の ASJ 感覚ニューロンは SNB-1::VENUS の蛍光強度やシナプス間の距離に野生株との違いはないが、シナプスの総量が低下していることが分かった（図 8）(Motomura et al., 2022)。
以上の結果から、crh-1 変異体は野生株に比べ ASJ 感覚ニューロンの温度応
答性が低下しており、これにより ASJ 感覚ニューロンに接続している他の神経細胞への情報伝達も低下していると考えられる。これらの異常が CREB 変異体の温度順化の遅れに繋がる可能性が得られた。

2.3 PVQ 介在ニューロンが ASJ から RMG への温度情報伝達を仲介する

crh-1 変異体の回復実験から温度順化の促進に関わる神経細胞として ASJ 感
覚ニューロンと RMG 介在ニューロンが見つかったが、ASJ 感覚ニューロンとRMG 介在ニューロンはギャップ結合やシナプス結合で接続していないため（図9）(White et al., 1986)、この 2 つのニューロン間の情報伝達を仲介する神経細胞の存在が考えられた。
ASJ 感覚ニューロンから RMG 介在ニューロンへの最短の神経回路の経路は、
HSN 運動ニューロン、PVQ 介在ニューロン、ASK 感覚ニューロンのいずれかを介した経路である（図 9）(White et al., 1986)。そこで ASJ 感覚ニューロン、
PVQ 介在ニューロン、ASK 感覚ニューロン、そして HSN 運動ニューロンにプロテインキナーゼ C の構成的活性化型である PKCgf を導入し、人工的に神経ペプチドを介したシナプス伝達を過活性化した（図 10）(Motomura et al.,31

2022)。プロテインキナーゼ C は前シナプスの有芯小胞の放出を促進するため、その構成的活性化によりシナプス伝達を過活性化することができる(Sieburth et al., 2007)。HSN 運動ニューロン、PVQ 介在ニューロン、またはASK 感覚ニューロンで発現誘導するそれぞれのプロモーターの下流に ttx-

4(gf)cDNA 配列を繋いだプラスミドを作製し、野生株に遺伝子導入してトラン
スジェニック系統を作製した。
トランスジェニック系統を使用して温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）を行った結果、ASK 感覚ニューロン に PKCgf を導入した系統（N2; Ex[sra-7p:: ttx-4(gf)cDNA]）と HSN 運動ニューロンに PKCgf を導入した系統（N2;Ex[tph-1p:: ttx-4(gf)cDNA]）は、低温刺激後も野生株と同程度の生存率を示したが、ASJ 感覚ニューロンに PKCgf を導入した系統（N2; Ex[trx-1p:: ttx-

4(gf)cDNA]）と PVQ 介在ニューロンに PKCgf を導入した系統（N2; Ex[sra6p:: ttx-4(gf)cDNA]）は、野生株よりも低温刺激後の生存率が有意に増加した（図 10）。セロトニン作動性ニューロンである HSN 運動ニューロンのセロト
ニン合成に異常が起こる tph-1 変異体 とセロトニン受容体 mod-1 変異体も温度順化異常を示さなかったことから、HSN 運動ニューロンの神経情報伝達の異常は温度順化に影響しないと考えられた（図 11）(Motomura et al., 2022)。
次に、カルシウムイメージング法を用いて PVQ 介在ニューロンと RMG 介在ニューロンが温度情報伝達に関与しているか調べた。 野生株の生殖巣にイエロ
ーカメレオン（YC3.60）遺伝子の DNA をマイクロインジェクションで導入し、PVQ 介在ニューロンと RMG 介在ニューロンで YC3.60 が発現するトランスジェニ
ック系統を作製した。その系統の個体に温度刺激を与えながら、PVQ 介在ニューロンまたは RMG 介在ニューロンにおける Ca2+濃度の変化を計測した（図12）。その結果、23℃で飼育した C. elegans の PVQ 介在ニューロンと RMG 介

32

在ニューロンの細胞体では、温度変化に伴う Ca2+濃度の上昇が起こった。同じ条件において、ASJ 温度受容ニューロンでも温度変化に伴う Ca2+濃度の上昇が見られたことから（図 12）、ASJ 温度受容ニューロン、PVQ 介在ニューロン、
RMG 介在ニューロンは同じ温度域で活性化状態にあり、神経回路の接続地図を加味すると（図 9）、ASJ 温度受容ニューロンで受容された温度情報が、PVQ 介
在ニューロンを介して RMG 介在ニューロンに伝達される可能性が得られた(Motomura et al., 2022)。

2.4 PVQ 介在ニューロンは ASJ 温度受容ニューロンから温度情報伝達を受ける
前項より PVQ 介在ニューロンが温度順化に関わる温度情報伝達に関与していることが明らかになったものの、このニューロンの活性化が上流の感覚ニュー
ロンからの情報伝達に依存するのか、それとも PVQ 介在ニューロンに温度受容機構が存在しているのかは不明のままだった。そこで、温度刺激下の PVQ 介在ニューロンの神経活動が上流の感覚ニューロンに依存するのか調べるために、
シナプス接続に異常をもつシナプトブレビン snb-1 変異体の PVQ 介在ニューロ
ンでカルシウムイメージングを行った（図 13）(Motomura et al., 2022)。これまでに C. elegans の温度順化や低温耐性に関わる温度感受性を持つ感覚ニューロンとして ASJ 感覚ニューロン、ADL 感覚ニューロン、ASG 感覚ニューロンが報告されている。これらの感覚ニューロンはどれも PVQ 介在ニューロンの上流に位置している（図 9）。PVQ 介在ニューロンは ASJ 感覚ニューロンと相互にシナプス接続を持つ。ADL 感覚ニューロンとは AVJ 介在ニューロンを介して接続しており、ADL 感覚ニューロンと AVJ 介在ニューロン間、AVJ 介在ニューロンと PVQ 介在ニューロン間はともにシナプス接続である。ASG 感覚ニュー
ロンからは ASK 感覚ニューロンを介して接続している。ASG 感覚ニューロンと33

ASK 感覚ニューロンの間はシナプス接続だが、ASK 感覚ニューロンと PVQ 介在ニューロンはギャップ結合で接続している。よって、シナプス接続が低下した
PVQ 介在ニューロンは ASJ 感覚ニューロン、ADL 感覚ニューロン、ASG 感覚ニューロンからの温度情報伝達が低下していると考えられる。

snb-1 変異体の PVQ 介在ニューロンにイエローカメレオン（yc3.60）を導入したトランスジェニック系統（使用プロモーター：sra-6p）を作製し、カルシ
ウムイメージングを行った結果、温度刺激時の snb-1 変異体では、PVQ 介在ニ
ューロンの Ca2+濃度変化が野生株よりも減少することが分かった（図 13）(Motomura et al., 2022)。 snb-1 変異体の PVQ 介在ニューロンにおいて温度刺激下の神経活動が完全に低下しないのは、PVQ 介在ニューロン自身も僅かに温度応答している可能性と、PVQ 介在ニューロンにギャップ結合で接続している感覚ニューロンからの影響の可能性がある。しかし、snb-1 変異体におけるPVQ 介在ニューロンでは神経活動の顕著な低下が見られたことから、温度刺激下の PVQ 介在ニューロンの活性化には、上流の感覚ニューロンからのシナプスを介した温度情報伝達が重要であることが示唆された。
次に PVQ 介在ニューロンを活性化する上流の感覚ニューロンの同定を行った。これまでに ASJ 感覚ニューロン、ADL 感覚ニューロン、ASG 感覚ニューロ
ンの温度刺激時の Ca2+濃度変化が低下する変異体が報告されているため(Ohtaet al., 2014; Takagaki et al., 2020; Ujisawa et al., 2018)、これらの変異体を用いて温度刺激下の PVQ 介在ニューロンの Ca2+濃度の変化を計測した（図 14-16）(Motomura et al., 2022)。
環状 GMP 依存性チャネル TAX-4 を欠損した変異体では、ASJ 感覚ニューロンの温度応答性が著しく低下する(Ohta et al., 2014)。tax-4 変異体の PVQ 介在ニューロンにイエローカメレオンを導入したトランスジェニック系統（使用プ34ラスミド：npr-11p::ycx2.60）を作製し、カルシウムイメージングを行ったと
ころ、温度刺激下の tax-4 変異体の PVQ 介在ニューロンは野生株に比べ神経活動が低下していた（図 14）(Motomura et al., 2022)。さらに、tax-4 変異体における温度刺激時の PVQ 介在ニューロンの神経活動の低下は、野生型の tax-

4 遺伝子を tax-4 変異体の ASJ 感覚ニューロンで特異的に発現させたトランス
ジェニック系統で回復した（使用プロモーター：trx-1p）（図 14）(Motomura

et al., 2022)。これらの結果は、ASJ 感覚ニューロンからの温度情報シグナル
が PVQ 介在ニューロンを正に制御していることを示している。
温度感受性を持ち、低温耐性の制御に関わる ASG 感覚ニューロンの温度応答性が低下した変異体 deg-1 変異体の PVQ 介在ニューロンにイエローカメレオンを導入したトランスジェニック系統（使用プラスミド：sra-6p::ycx2.60）では、温度刺激時において PVQ 介在ニューロンに僅かな神経活動の上昇が見られたが、有意差のある神経活動の変化は起こらず、ASG 感覚ニューロンの温度応
答性の低下による PVQ 介在ニューロンへの影響は少ないと考えられた（図 15）(Motomura et al., 2022; Takagaki et al., 2020)。同じく温度順化に関与
し、温度感受性を持つ ADL 感覚ニューロンの温度応答性が低下する ocr-2 osm-

9; ocr-1 変異体の PVQ 介在ニューロンにイエローカメレオンを導入したトラン
スジェニック系統（使用プラスミド：sra-6p: yc3.60）の PVQ 介在ニューロン
では、温度刺激時に野生株と同様の Ca2+濃度の上昇が見られた（図 16）(Motomura et al., 2022; Ujisawa et al., 2018)。
以上の結果から、温度刺激下の PVQ 介在ニューロンは ASJ 感覚ニューロンからの温度情報伝達によって制御されていると考えられる(Motomura et al.,2022)。

35

2.5 PVQ 介在ニューロンから RMG 介在ニューロンへの情報伝達はグルタミン酸が機能する
ASJ 感覚ニューロンからの温度情報伝達が PVQ 介在ニューロンに伝達されていることが示唆されたため、次に、PVQ 介在ニューロンから RMG 介在ニューロンへの情報伝達を担う神経伝達物質の同定を行った。PVQ 介在ニューロンはグ
ルタミン酸作動性ニューロンであり、グルタミン酸をシナプス小胞に取り込む
小胞型グルタミン酸輸送体（VGLUT）をコードする eat-4 遺伝子を発現している。この eat-4 遺伝子に 614bp の欠損が起きている eat-4 変異体に関して、温度順化の表現型を測定した。15℃で飼育した eat-4 変異体を 25℃に 2 時間静置した後に 2℃に置くと（15℃→25℃→2℃）、eat-4 変異体は野生株に比べて生存率が高くなる異常を示すことが分かった（図 17）(Motomura et al.,2022)。eat-4 変異体の PVQ 介在ニューロンを含むニューロンに eat-4 の cDNAを導入したトランスジェニック系統と、トランスジェニックマーカーとなる遺伝子のみを導入した系統を作製し、温度順化テスト（15℃→25℃→2℃）を行った。マーカー遺伝子のみを導入した eat-4 変異体系統は、マーカー遺伝子を導入していない eat-4 変異体と同様に高い生存率を示す異常を示したが、eat-

4 変異体の PVQ 介在ニューロンに野生型の eat-4 cDNA を導入した系統では、野生株と同程度の生存率を示すようになった（図 17）(Motomura et al.,2022)。つまり、eat-4 変異体の温度順化異常は PVQ 介在ニューロンにおける

eat-4 遺伝子の機能欠損が原因である可能性が得られた。
そこで次に、PVQ 介在ニューロンで機能する EAT-4 が温度順化に関与することを確認するため、野生株の PVQ 介在ニューロンで特異的に eat-4 遺伝子をRNAi によってノックダウンした場合に温度順化異常が見られるかを調べた。野生株の PVQ 介在ニューロン特異的に eat-4 をノックダウンしたトランスジェニ

36

ック系統を作製し、温度順化テストを行ったところ、eat-4 変異体と同様の温度順化異常が見られた（図 18）(Motomura et al., 2022)。以上の結果から、PVQ 介在ニューロンで発現している小胞型グルタミン酸輸送体（VGLUT）である
EAT-4 が温度順化に関与していることが示唆された。VGLUT は、神経終末のシナプス部位に存在するシナプス小胞に神経伝達物質であるグルタミン酸を取り込む輸送体であり、一般的に VGLUT の変異体ではグルタミン酸がシナプスから放出されないため、グルタミン酸を介した神経伝達が欠損している。このことと今回の結果をふまえると、C. elegans の野生株の温度順化の成立において、PVQ 介在ニューロンのシナプスから神経伝達物質であるグルタミン酸が放出されることが温度順化に必要であると考えられる。
温度順化において PVQ 介在ニューロンの下流に位置する介在ニューロンとして RMG 介在ニューロンを同定した。そのため、PVQ 介在ニューロンから分泌されたグルタミン酸は、RMG 介在ニューロンに存在するグルタミン酸受容体で受容されることで、RMG 介在ニューロンの活性を変化させ、最終的に温度順化を引き起こしていると考えられる。そこで、温度順化において、PVQ 介在ニューロンから分泌されるグルタミン酸を受容する RMG 介在ニューロンのグルタミン酸受容体を同定するために、様々なグルタミン酸受容体の変異体を用いて温度順化テスト（15℃→25℃→2℃）を行った。その結果、AMPA 型グルタミン酸受容体である GLR-4 の変異体、NMDA 型グルタミン酸受容体である NMR-1 と NMR-2の変異体、グルタミン酸作動性クロライドチャネル(GLC)である AVR-14, 15 とGLC-1 の多重変異体(avr-14; avr-15 glc-1 と avr-14; glc-1)において、温度順化テスト後に生存率が上昇する異常が見られた（図 19）(Motomura et al.,2022)。なかでも GLR-4 は RMG 介在ニューロンで発現する AMPA 型グルタミン酸
受容体であったため、野生株の RMG 介在ニューロンでのみ glr-4 遺伝子と glr-37

5 遺伝子の両者を RNAi でダブルノックダウンしたトランスジェニック系統を作製し、温度順化テスト（15℃→25℃→2℃）を行った。その結果、glr-4 遺伝子と glr-5 遺伝子を同時にノックダウンした系統では、温度順化時の生存率が野生株より上昇することが分かった（図 20）(Motomura et al., 2022)。
次に、glr-4 遺伝子と glr-5 遺伝子をダブルノックダウンした RMG 介在ニューロンの温度応答性を、カメレオン YC3.60 を用いたカルシウムイメージングにより測定した。その結果、高温刺激下において、glr-4 遺伝子と glr-5 遺伝
子をダブルノックダウンした系統では野生株よりも細胞内 Ca2+濃度の変化が低下することが分かった（図 21）(Motomura et al., 2022)。野生株には劣るが、RMG 介在ニューロンの細胞内 Ca2+濃度の変化が完全に無くならず、温度に刺激に伴い上昇するのは、RMG 介在ニューロンが他の温度受容ニューロンと接続しているためだと考えられる。特に温度順化に関わることが分かっている
ADL 温度受容ニューロンと RMG 介在ニューロンはギャップ結合で直接接続している（図 9）(Okahata et al., 2019)。RMG 介在ニューロンが他の温度受容ニ
ューロンから温度情報伝達を受けたことにより、神経活動が上昇するものの、グルタミン酸受容体がダブルノックダウンされた影響で野生株の RMG 介在ニューロンと比べ神経活動が低下したと予想される。これらの結果から、RMG 介在ニューロンで発現しているグルタミン酸受容体 GLR-4 と GLR-5 は、温度順化の促進に関与していると考えられる。つまり、温度順化において、PVQ 介在ニューロンから分泌されるグルタミン酸は、RMG 介在ニューロンのグルタミン酸受容体 GLR-4 と GLR-5 で受容されていると考えられた。
PVQ 介在ニューロンはグルタミン酸を介した情報伝達経路の他にもギャップ結合で他のニューロンと接続している。PVQ 介在ニューロンのギャップ結合が温度順化に与える影響を調べるために、PVQ 介在ニューロンにおいてギャップ38

結合を形成するイネキシンを欠損した変異体で温度順化テスト（15℃→25℃→2℃）を行った。その結果、イネキシンである UNC-7、INX-9 と INX-19 の変異
体で温度順化異常が見られた（図 22A）(Motomura et al., 2022)。温度順化異常が見られたイネキシン変異体のうち、INX-9 と INX-19 は ASJ 感覚ニューロ
ン、PVQ 介在ニューロン、または RMG 介在ニューロンのいずれのニューロンでも発現していないが、UNC-7 は PVQ 介在ニューロンと RMG 介在ニューロンで発現している。イネキシンは通常、ヘテロもしくはホモ複合体を形成することで機能的なギャップ結合となる。PVQ 介在ニューロンには、イネキシン UNC-7 と複合体を形成する可能性のあるイネキシンである UNC-9 も発現している。そこ
で、野生株の PVQ 介在ニューロン特異的にイネキシンである UNC-7 と UNC-9 をRNAi でダブルノックダウンし、温度順化テスト（15℃→25℃→2℃）を行った
ところ、RNAi 系統では野生株より高い生存率を示した（図 22B）(Motomura etal., 2022)。この UNC-7 と UNC-9 のダブルノックダウン系統が示す温度順化テ
ストの生存率は野生株よりは高かったものの約 40％と、unc-7 変異体で同様のテストを行った際に比べて野生株の生存率との差が減少した（図 22A、B）(Motomura et al., 2022)。UNC-7 は PVQ 以外の多数のニューロンで発現しているため、unc-7 変異体が示す温度順化異常は主に PVQ 以外のニューロンにおけるギャップ結合の異常が原因であると考えられた。これらのことから、野生株の PVQ 介在ニューロンにおいて、ギャップ結合が温度順化に与える影響はシナプス接続よりも少ないと考えられる。

2.6 神経ペプチド FLP-7 が腸の脂肪分解を介して温度順化を制御する

C. elegans の低温耐性の獲得と喪失につながる生理的な原因は解明されていなかった。そのため温度情報伝達に関わる神経回路の下流で、どのような分子39

経路が機能し、低温刺激後に個体の死に至るのか調べた。脂肪の代謝が低温耐性と関係していることが示唆されており(Murray et al., 2007)、脂肪代謝に関わる分子と温度順化との関係に着目した。

C. elegans の脂肪代謝に関わる経路として、セロトニンシグナルの下流で脂肪分解酵素を介して腸の脂肪分解を制御する経路が報告されている。この経路ではセロトニンシグナルに応答して頭部の ASI 感覚ニューロンから神経ペプチド
FLP-7 が分泌され、それを腸にある神経ペプチド NPR-22 受容体が受け取ること
で腸の脂肪分解酵素 ATGL-1 を活性化する(Palamiuc et al., 2017)。これら脂肪代謝に関わる神経ペプチド FLP-7 とその受容体 NPR-22 の変異体を使い温度
シフトテスト（15℃→25℃→2℃）を行った結果、これら flp-7 変異体と npr-

22 変異体は野生株に比べ生存率が上昇する温度順化異常が見られた（図 23）(Motomura et al., 2022)。
次に温度順化に関わる神経ペプチド FLP-7 が、RMG 介在ニューロンで受容するグルタミン酸シグナル経路と同じ経路で機能するか調べた。野生株と flp-7
変異体、野生株の RMG 介在ニューロン特異的にグルタミン酸受容体 glr-4 と

glr-5 を RNAi でダブルノックダウンした系統、flp-7 変異体の RMG 介在ニューロン特異的にグルタミン酸受容体 glr-4 と glr-5 を RNAi でダブルノックダウ
ンした系統で温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）を行った（図 24）(Motomura et al., 2022)。その結果、flp-7 変異体と、野生株の RMG 介在ニューロン特異的に glr-4 と glr-5 をダブルノックダウンした系統、flp-7 変異体の RMG 介在ニューロン特異的に glr-4 と glr-5 をダブルノックダウンした系統
で生存率が上昇する異常が見られた（図 24）(Motomura et al., 2022)。FLP-7とグルタミン酸が別経路で機能していた場合、温度順化に関わる 2 つの経路が欠損した系統はより温度順化異常の表現型が強くなると考えられるため、これ

40

らの系統の生存率に有意な差はなかったことから、グルタミン酸が機能する
RMG 介在ニューロンと FLP-7 は同じ経路で機能していると考えられる。

2.7 高温下で ATGL-1 が機能し、脂肪の分解を行う
低温環境（4℃）で代謝に関わる経路としてホルモン感受性リパーゼ HOSL-1を介した脂肪分解経路が報告されているが、ATGL-1 はこの低温下での長期生存には関与していない(Liu et al., 2017)。しかし、hosl-1 は 4℃の環境下で発現量が増加することから(Liu et al., 2017)、ATGL-1 の発現量も温度の影響を受けて変動する可能性が考えられた。
そこで 15℃で飼育して成長させた個体と 25℃で飼育して成長させた個体の野
生株の腸の ATGL-1::GFP の蛍光強度を定量化し、環境温度依存的に ATGL-1 の発現量が変化するのか調べた。hjls67[atgl-1p::atgl-1::GFP+mec-7::RFP]の系統を用いて蛍光強度を定量化した結果、15℃飼育時に比べ 25℃飼育時の方がGFP の蛍光強度が強く、飼育温度依存的に ATGL-1 の発現量が増加していた（図25）(Motomura et al., 2022)。これにより、ATGL-1 による脂肪分解がより高い温度（25℃）で活性化されている可能性が得られた。
次に中性脂質を赤く染める oil red O で染色し、腸の脂肪量の定量化を行った。25℃で飼育し成長させた野生株と 15℃で飼育し成長させた野生株の脂肪量を比較したところ、25℃飼育時の野生株は 15℃飼育時の野生株より腸の脂肪量が低下していた（図 26）(Motomura et al., 2022)。この飼育温度依存的な腸の脂肪量の変化は、神経ペプチド flp-7 変異体や神経ペプチド受容体 npr-22
変異体では見られず、これは flp-7; npr-22 二重変異体も同様だった（図 26）(Motomura et al., 2022)。これらの結果から、FLP-7 と NPR-22 が関与する脂肪の代謝経路が高温飼育下での腸の脂肪分解に関与していると考えられた。

41

crh-1 変異体では 15℃飼育時と 25℃飼育時の腸の脂肪量に有意の差はなかったが、crh-1 変異体の ASJ 温度受容ニューロンと RMG 介在ニューロンで crh-1
cDNA を発現させると野生株と同様の表現型を示すようになった（図 27）(Motomura et al., 2022)。この crh-1 変異体に crh-1 cDNA を導入した後の表
現型の変化は、crh-1 変異体の ASJ 感覚ニューロンおよび RMG 介在ニューロン
で crh-1 遺伝子を発現させた際に温度順化の表現型が回復した結果と一致しており（図 4）(Motomura et al., 2022)、温度順化現象と飼育温度依存的な腸の脂肪量の減少は、どちらも ASJ 感覚ニューロンと RMG 介在ニューロンで機能する CREB で制御されていると考えられる。また、crh-1; flp-7 二重変異体でも、それぞれの変異体と同様に 15℃飼育時と 25℃飼育時の腸の脂肪量に有意の差がなかったことから、CREB と FLP-7 は同じ経路で機能し、腸の脂肪分解を促進していると考えられる（図 27）(Motomura et al., 2022)。
脂肪酸組成の差異が C. elegans の低温耐性に影響を与えるか確認するため、脂肪酸組成を気-液クロマトグラフィーにより計測した。様々な飼育温度条件(15℃、25℃、15℃→25℃（3hr）、25℃→15℃（3hr）)の crh-1 変異体と野生株 N2（wild-type）を調べたところ、15℃飼育から 25℃に 3 時間置いた crh-1
変異体[crh-1 (15℃→25℃(3hr))]は、同じ温度シフト条件の野生株[Wildtype (15℃→25℃(3hr))]に比べ飽和脂肪酸（Saturated fatty acid：SFA）の量が多く、一方で多価不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid：PUFA）の量が低下していた（図 28）(Motomura et al., 2022)。不飽和脂肪酸量が多い
方が低温下での細胞膜の流動性を保持できるはずであるが、crh-1 変異体では逆の結果となった。このことから、crh-1 変異体の低温耐性の保持は細胞膜の脂肪酸組成によるものではなく、腸の脂肪の総量が関わっていると考えられる。

42

3. 考察3.1 転写因子 CREB と温度順化の関係
温度順化異常を示す crh-1 変異体を使用して CREB の機能細胞の同定を進めた結果、ASJ 感覚ニューロンと RMG 介在ニューロンが温度順化の促進に関与することが明らかになった。CREB を欠損した変異体の ASJ 感覚ニューロンの温度応答性は野生株に比べて低下していることが分かった（図 4、6-7）(Motomura

et al., 2022)。
ASJ 感覚ニューロンは光受容ニューロンとしても知られており、ASJ 感覚ニューロン内の温度情報伝達経路は光情報伝達経路と同様の分子経路を活性化している(Ohta et al., 2014)。C. elegans は土壌中に生息しており、土壌中では光情報と温度情報を同時に処理する状況は少ないと考えられるが、光受容ニ
ューロンが温度受容も行い、C. elegans の温度順化に関与している理由を考察する。光情報と温度情報が結びつけられる理由として、日照時間の変化が挙げられる。環境中では日照時間という光情報と温度情報が密接に結びついている。実際にメダカやチャコウラナメクジでは光情報と温度情報に関連があると報告されている。メダカは水温の変化に応じて光感受性や色覚が異なることが明らかになっている。夏を模した長日・温暖な環境で飼育されたメダカは光に対して負の走性を持ち、婚姻色のバーチャルメダカに誘引されるが、冬を模した短日・低温で飼育したメダカはこれらに反応を示さない(Shimmura et al.,2017)。チャコウラナメクジでは短日条件で飼育した個体の方が長日条件より強い低温耐性を持つ(Udaka et al., 2008)。現在のところ C. elegans において光情報が低温耐性に影響を与えるかは分かっていないが、光受容機構と温度受容機構が互いに影響し合うメカニズムが種をこえて保存された結果、光受容43ニューロンである ASJ 感覚ニューロンが温度順化機構の制御にも使用されているのかもしれない。
次に転写因子 CREB を欠損した個体が温度順化に異常を示す理由を考察する。現在明らかになっている野生株と crh-1 変異体の違いは、15℃飼育時のASJ 感覚ニューロンのシナプスの体積の減少と温度刺激時の Ca2+濃度変化の減少である（図 6-7、8）(Motomura et al., 2022)。15℃飼育の時点でシナプスの形成が野生株と異なるうえ、温度刺激に対しての応答性が低下することにより 15℃から 25℃に移動させた際に下流に伝達される情報に差が生まれる。
CREB 変異体の RMG 介在ニューロンのカルシウムイメージングは実施していない
が、RMG 介在ニューロンでも ASJ 感覚ニューロンと同様にシナプスの形成と温度刺激時の興奮性の低下が起こっているとすると、温度情報の入力と統合が異常になり腸に送られるシグナルが本来必要なタイミングで送られなくなる、もしくは充分量のシグナル物質が分泌されず、腸内の代謝変化が温度環境と適合しないことによって低温耐性に異常がでるのではないかと考えられる。

3.2 温度順化を促進する全身周回性の神経回路
RMG 介在ニューロンと ASJ 感覚ニューロンの間に存在する複数あるニューロ
ンのうち、PVQ 介在ニューロンのシナプス伝達を人工的に過活性化した系統で温度順化異常が見られた。カルシウムイメージングの結果から、ASJ、PVQ、
RMG は同じ温度域で神経活動が見られることが明らかになった。シナプス接続が低下した snb-1 変異体、ASJ 感覚ニューロンの温度感受性が低下している

tax-4 変異体を使用したカルシウムメージングにより、温度刺激下の PVQ 介在ニューロンは ASJ 感覚ニューロンからの温度情報伝達に依存して活性化していることが分かった（図 10、12-14）(Motomura et al., 2022)。

44

頭部に細胞体を持つ ASJ 感覚ニューロンで受容され、同じく頭部に細胞体を持つ RMG 介在ニューロンに伝達される温度情報が一度、尾部を経由する理由を考察する。C. elegans は頭部にアンフィド（Amphid）と呼ばれる感覚神経が密集する部位を持つが、尾部にもファスミド（Phasmid）と呼ばれる神経細胞の密集部位を持つ。ファスミドはアンフィドに比べ小さいものの、ファスミドを構成するニューロンのうち PHA 感覚ニューロンと PHB 感覚ニューロンは化学受
容、PLM 感覚ニューロンはメカノ受容、PQR 感覚ニューロンは O2 受容、PHC 感
覚ニューロンは回避行動を誘導する有害な高温刺激の受容に関わることが報告されている(Cheung et al., 2005; Hilliard et al., 2002; Hobert, 2016;
Liu et al., 2012; Pirri and Alkema, 2012)。C. elegans は死の原因となり得る環境情報をこれらの感覚ニューロンで受容し、体の後方に危険が迫った場
合に忌避行動を行う。頭部で受容した情報が尾部ニューロンの神経活動にどのような影響を与えるのか不明だが、温度情報が一度 PVQ 介在ニューロンを経由するのは、頭部で受容した環境情報と尾部で受容した環境情報を統合すること
で、少ない神経細胞で周囲の環境に適切に対応するためである可能性が考えられる。
PVQ 介在ニューロンから RMG 介在ニューロンへの情報伝達はグルタミン酸が媒介することが、PVQ の小胞型グルタミン酸輸送体 EAT-4 をノックダウンした
系統と RMG のグルタミン酸受容体 GLR-4 と GLR-5 をノックダウンした系統で温度順化異常が見られたことから明らかにされているが（図 18、20）(Motomura

et al., 2022)、おそらくグルタミン酸の関与は PVQ 介在ニューロンから RMG
介在ニューロンの間だけには止まらないと予測される。様々なグルタミン酸受容体の変異体を用いた低温耐性テストの結果から、グルタミン酸受容体の種類によって低温刺激後の生存率が変化することが分かっている（図 19）45

(Motomura et al., 2022)。AMPA 型グルタミン酸受容体 GLR-4 と GLR-5 の変異体よりも NMDA 型グルタミン酸受容体 NMR-1 と NMR-2 の変異体の方がより高い
生存率の上昇を示した。これは、発現細胞の違いによる影響もあるだろうが、AMPA 型グルタミン酸受容体は陽イオンチャネルとして機能するが Ca2+に対しては非透過性であるのに対し、NMDA 型グルタミン酸受容体は Ca2+の透過性を持つことが原因であると考えている。一つの AMPA 型グルタミン酸受容体が欠損しても他の経路により脱分極が進めば NMDA 型グルタミン酸受容体を駆動できるが、NMDA 型グルタミン酸受容体を欠損した場合 Ca2+の急速な増加が十分にできなくなるため、より強い温度順化異常が示されたと考えられる。ASJ 感覚ニュ
ーロン、RMG 介在ニューロンで NMR-1 と NMR-2 の発現は報告されておらず、PVQ 介在ニューロンでは NMR-2 が僅かに発現している(Hammarlund et al.,2018; Taylor et al., 2021)。このことから、NMDA 型グルタミン酸受容体
NMR-1 と NMR-2 は ASJ、PVQ、RMG 以外のニューロンで機能し、温度順化に関わっている可能性が高い。
イオンチャネル型グルタミン酸受容体の変異体では生存率の上昇が見られた
一方、代謝型グルタミン酸受容体 MGL-1 は野生株よりも生存率が低下し、mgl-

2; mgl-1 の二重変異体でも野生株より僅かに低下していた。MGL-1 は神経環や咽頭神経系で発現して脂質貯蔵の正の制御に関与することが報告されており(Dillon et al., 2015; Jeong and Paik, 2017)、野生株より脂質の貯蔵が低下することによりこの様な表現型になった可能性がある。
クロライドチャネルの活性に関わる AVR-14 変異体では野生株と同様の生存率を示したが、AVR-14、AVR-15 と GLC-1 の三重変異体と AVR-14 と GLC-1 の二重変異体では生存率が上昇する温度順化異常を示した。グルタミン酸作動性クロライドチャネル GLC-1 は体壁筋や咽頭筋、頭部ニューロンで発現する(Ghosh46

et al., 2012)。AVR-14 は神経系で発現する(Dent et al., 2000)。クロライド
チャネルは細胞内に Cl−を取り込むことから細胞の発火の制御に重要であると考えられる。クロライドチャネルの変異体が、陽イオンチャネルである AMPA型グルタミン酸受容体や NMDA 型グルタミン酸受容体の変異体と似た表現型を示す理由はまだ分かっていない。

3.3 神経ペプチドを介した腸の脂肪分解経路と低温耐性の関係
温度順化テストの結果、脂肪の代謝に関わる神経ペプチド FLP-7 と神経ペプ
チド受容体 NPR-22 が温度順化に関わっており、FLP-7 はグルタミン酸が機能する RMG 介在ニューロンと同じ経路で機能していることが分かった。FLP-7 とNPR-22 の下流で機能する脂肪分解酵素 ATGL-1 は 15℃飼育時に比べ 25℃飼育時の方が多く発現しており、野生株の腸の脂肪量は 15℃飼育時に比べ 25℃飼育時の方が少なかった。FLP-7 変異体と NPR-22 変異体では飼育温度依存的な腸の脂肪量の変化が見られなくなったことから、ATGL-1 を制御する FLP-7 と NPR22 の経路は 25℃飼育で機能していると考えられる（図 23、25、26）(Motomura

et al., 2022)。
FLP-7 と NPR-22 は摂食と代謝に関わるシグナルであるセロトニンシグナルに応答することが報告されているが(Palamiuc et al., 2017)、セロトニンの合成を行うトリプトファン水酸化酵素 TPH-1 の変異体（tph-1 変異体）とセロト
ニン作動性クロライドチャネル MOD-1 の変異体（mod-1 変異体）は温度順化に異常を示さなかった（図 11）(Motomura et al., 2022)。このことから、温度順化に関わる神経ペプチド FLP-7 と神経ペプチド受容体 NPR-22 はセロトニン
シグナルで調節される経路とは別に、温度情報によってのみ駆動している可能性がある。摂食シグナルで駆動される経路が温度シグナルでも使用されるの47

は、C. elegans が温度と餌の情報を結びつけていることに由来するのかもしれない。C. elegans は餌があった温度を記憶し、その温度に向かう温度走性を示すことが報告されている(Aoki and Mori, 2015; Mori et al., 2007)。餌が豊富に望める環境を温度情報を元に検知しているのであれば、温度シグナルと摂食シグナルを統合することにより、脂肪を分解する量の調節を厳密に行えるのでないかと考えられる。C. elegans の成長速度は環境温度に依存する。15℃で飼育された C. elegans は卵から成虫になるまでに約 7 日を要するが、20℃で飼育された C. elegans は約 3 日で成虫になる。この約 2 倍の成長スピードを実現するために、高温ではエネルギーを使用する必要があり、貯蔵するよりも積極的な脂肪の分解が行われている可能性がある。よって温度シグナルと摂食シグナルの下流に共通した分子経路を持つことで、餌が豊富にあり、且つ生育に適した温度環境で脂肪の分解経路を活発に動かせるように調節している可能性が考えられる。

3.4 その他の考察
生物は環境状態の変化に生存できるように対応するにも関わらず、本研究では野生株は新たな環境に適応することにより低温で死滅し、変異体はむしろ生存する結果となった。C. elegans が自ら低温耐性を捨ててしまう理由として、子孫にエネルギーを投資することにより、個体の生存ではなく種として生存を図る戦略を取っている可能性がある。C. elegans は 15℃よりも 20℃や 25℃の温度環境で飼育された方が速く成長できることから、もし周辺環境が 15℃付近
から 20℃以上に変化した場合、新しい温度にすぐに慣れることができれば、慣れない系統よりも早く成長・繁殖できると考えている。温度順化経路が遅れる
系統は自然環境中で成長・繁殖に適した環境に偶然辿りつけたとしてもすぐに48

対応できず、その間に温度変化に直ぐに対応できる個体が繁殖してしまい、食糧などを確保できなくなるため、低温に強い状態を保持していたとしても自然環境では淘汰されてしまうのではないかと考えられる。

C. elegans が温度順化経路を持つもう一つの理由として、高温耐性の獲得が挙げられる。周辺の温度が 15℃から 20℃以上に上昇した場合、環境温度が急
激に 2℃まで低下する可能性より、そのまま上昇し続け、C. elegans の繁殖・生存に影響を及ぼす 25℃以上の高温環境となる可能性の方が高いと予想される。20℃で飼育した C. elegans を 25℃で 18 時間飼育すると熱ストレス（35℃）への耐性を向上させると報告されていることから(Treinin et al.,2003)、25℃への慣れが低温耐性の欠失を起こす反面、高温耐性の獲得に繋がり、熱ストレスによる死滅を回避できたと考えられる。
温度情報は生物の生殖系にも影響している。温度環境と生殖系の関係について、これまでに低温刺激後に腸の脂肪が生殖細胞に移動しない変異体では低温
刺激後の個体の死を防げることが報告されている(Gulyas and Powell,2022)。この論文では 2℃に 4 時間暴露された C. elegans 由来の卵は、低温刺激を受けなかった親の卵に比べ低温刺激（2℃、24 時間）後の孵化率が高くなるとも指摘されている(Gulyas and Powell, 2022)。温度環境の生殖系への影
響は低温環境のみでなく高温環境でも起こっている可能性があり、25℃で飼育された C. elegans 由来の卵は、15℃と 20℃で飼育された C. elegans 由来の卵に比べ高温刺激（29℃、24 時間）後の孵化率が高くなる(Gouvea et al.,2015)。これらの報告を踏まえると、C. elegans は環境変化に合わせて子孫にエネルギーを投資することが適応機構の一つとして存在している可能性がある。また C. elegans の腸は卵の卵黄を生成し、生殖細胞を育てる役割を持つ

49

ことから(Perez and Lehner, 2019)、この適応機構に腸に蓄積された脂肪が深く関わっている可能性がある。
今回示した温度順化を制御する脳腸連関モデルが他の動物にも共通している
可能性がある。哺乳類において、脳で処理された温度情報が腸に影響を与えているかは分かっていないが、脳と腸が互いに影響しあっている事例は報告されている。例えば、慢性的な腹痛や腹部の不快感等を特徴とする機能性疾患である過敏性腸症候群に、神経炎症による視床下部・下垂体・副腎皮質系（hypothalamic–pituitary–adrenal axis）とセロトニン作動性機能の調節不全が一部関与している可能性が報告されている(Ng et al., 2018)。他にもマウスにおいて腸内細菌叢の細菌細胞壁の断片であるムロペプチドが視床下部ニ
ューロンに感知されることで、摂食行動、営巣行動、体温調節に影響することが示されている(Gabanyi et al., 2022)。よって、哺乳類においても温度が神経伝達物質の分泌の変化に関与し、結果的に腸に影響を与える経路も見つかってくるかもしれない。

3.5 C. elegans の低温死の解析における今後の展望
低温死の原因の解析を進めるためには、まずどのタイミングで個体が死亡しているかを確認する必要がある。現在のところ、低温下(2℃)で死亡しているのか、それとも低温刺激後生育温度に戻された後に死亡するのかは分かってない。そこで、線虫 C. elegans の青色自家蛍光に着目した。
生体内には特定の波長を照射すると蛍光を発する物質が複数存在しており、
線虫 C. elegans は紫外域と青色域の 2 つの自家蛍光を示す。290 nm の励起光
(Ex290)を C. elegans に照射すると 330 nm の自家蛍光(Em330)を発し、340 nmの励起光(Ex340)を照射すると 430 nm の自家蛍光(Em430)を発する。Ex290/

50

Em330 の自家蛍光については、この蛍光波長と似た蛍光波長を持つ芳香族アミノ酸のトリプトファンの蛍光性に起因すると予想されている(Gerstbrein etal., 2005)。もう一つの蛍光波長である励起波長 Ex340/Em430 の自家蛍光については終末糖化産物（Advanced Glycation End-products：AGEs) であると報告されている(Gerstbrein et al., 2005; Komura et al., 2021)。この C.

elegans の青色自家蛍光は加齢とともに増加し、これは、青色自家蛍光を発す
る糖化された卵黄タンパク質ビテロゲニン(vitellogenin)が老化の過程で増加するためではないかと考えられている(Komura et al., 2021)。老化のバイオマーカーとして過酸化脂質や過酸化タンパク質により形成される色素のリポフ
スチンが知られているが、リポフスチンは紫外線域の励起光下で 540–640 nmの蛍光を発するため、加齢による青色蛍光の増加はリポフスチンの蓄積によるものではないと考えられている(Coburn et al., 2013; Komura et al.,2021)。
線虫 C. elegans の青色自家蛍光はバイオマーカーとしての有用性が報告されている。酸化ストレスの原因となる AGEs のバイオマーカーとしての利用可能性が示唆されているほか(Gerstbrein et al., 2005; Komura et al.,2021)、2013 年に Coburn らが、腸の青色自家蛍光が個体の死亡を示すバイオマ
ーカーとして利用できることを報告した。具体的には、C. elegans の青色自家
蛍光は、若い成虫では主に腸の顆粒（リソソーム関連オルガネラ）で観察できるが(Coburn et al., 2013; Gerstbrein et al., 2005)、C. elegans が致死の刺激を受けると腸の顆粒が壊れ、腸全体にアントラニル酸グルコシルエステル（Anthranilic Acid Glucosyl Esters）の青色の蛍光が増加する。老衰死する

C. elegans において、青色自家蛍光の増加は死亡する 2 時間前から起こりはじめ、死亡前に比べて 400%増加したのち、その後 6 時間のうちに減少していく51

(Coburn et al., 2013)。この青色自家蛍光の増加は老衰死においてだけでな
く、頭部付近への熱ストレスによる殺傷や、凍結融解、低 pH による殺傷でも起こったことから、腸の青色自家蛍光が C. elegans の死亡マーカーとして使用できると考えられている(Coburn et al., 2013)。

C. elegans の体内で死に向かう生理的機構が働き死に向かっているかどうかを確認する指標として、腸の周期的な Ca2+波に着目している。通常、健康な野
生株の C. elegans では尾部末端側の腸の細胞の Ca2+スパイクに誘発される Ca2+
波が起こっている(Peters et al., 2007)。しかし、死亡する前には腸の前方から後方に伝播する Ca2+波が流れ、ネクローシス経路を活性化させることで C.

elegans の死に繋がると報告されている(Coburn et al., 2013)。低温刺激後の個体の自家蛍光と Ca2+をイメージングすることで、どの時点で腸の破壊が進んでいるのかを確認することが可能になると考えており、低温に置かれた際に死亡するタイミングを同定し、その直前から C. elegans 個体の死が進んでいく
過程を詳細に観察する解析が可能であると考えられる。これにより個体の死を進める原因を特定し、最終的には動物個体の低温死を防ぐ分子生理機構の発見につながることを期待している。

52

4.結語
本研究から、温度変化を感知した線虫 C. elegans は全身を周回する神経回路を駆動し、最終的に腸の脂肪代謝経路を制御するという温度応答の｢神経回路・腸連関｣の生体システムが明らかになった（図 29）(Motomura et al.,2022)。これまで低温耐性や温度順化に関わる温度受容ニューロンとその分子機構の解析は進められてきたが、温度受容ニューロンの下流の神経回路や低温耐性の獲得・喪失の原因となる機構の解析は進められていなかった。今回の解析から、気温の変化を感じた神経系が腸内に蓄えられた脂肪を増減させている
ことがわかり、神経系と臓器の代謝経路を結びつけることができた。周囲の温度が 15℃から 25℃に変化すると、まず頭部に位置する ASJ 感覚ニューロンが温度情報として受容し、尾部に細胞体を持つ PVQ 介在ニューロンに情報が伝達される。次に PVQ 介在ニューロンはグルタミン酸を介して頭部に細胞体を持つ
RMG 介在ニューロンに情報を送る。RMG 介在ニューロンは、腸の代謝経路の制御に関わる神経ペプチドである FLP-7 の分泌を促す。FLP-7 は腸にある神経ペプチド受容体 NPR-22 で受容され、腸の脂肪分解酵素（トリグリセリドリパーゼ）である ATGL-1 を活性化させる。これにより 25℃で飼育されている間に脂肪の分解が進み、低温耐性の喪失につながる可能性が得られた（図 29）(Motomura et al., 2022)。今後この研究を発展させ、神経系が下流の臓器の制御を行う分子メカニズムをより詳細に解析することで、人工的な神経操作に
より個体全体の低温に対する表現型の制御が可能になるのではないかと考えている。脂肪と低温死の関係を探ることで低温による死を防ぐことができるような生体システムの発見も期待できる。C. elegans は分子レベルから個体レベル
までの生命現象を包括的に理解できる実験系であり、ヒトと共通の遺伝子を多く持っていることから、本研究で見つかってきた温度応答の神経回路・腸連関
53

システムに関して、他の動物においても解析が進展することで、今後、動物の温度応答メカニズムに新しい視点が加わる可能性が考えられる。

54

5.材料・方法
C. elegans の飼育法、培地や Buffer の組成等は THE NEMATODECAENORHABDITIS ELEGANS に従った(Wood and The Community of C. elegans
Researchers, 1988)。

試薬

購入元

製品番号

Oil red O

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN:1320-06-5

Na2HPO4・12H2O

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN:
10039-32-4

KCl

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN: 7447-40-7

NaCl

FUJIFILM Wako Pure

CAS RN: 7647-14-5

Chemical Corporation
Na2EGTANACALAI TESQUE, INC.

Cat#37346-05

spermidine-HCl

NACALAI TESQUE, INC.

CAS RN; 334-50-9

spermine

NACALAI TESQUE, INC.

CAS RN; 71-44-3

Na-PIPES

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN: 110003769-2

β-mercaptoethanol

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN: 60-24-2

paraformaldehyde

TAAB Laboratories

Cat#P001/1

TritonX

ICN Pharmaceuticals, Inc.

Cat#807426

KH2PO4

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN: 7778-77-0

isopropanol

FUJIFILM Wako Pure
Chemical Corporation

CAS RN: 67-63-0

55

使用した系統

提供元・出典元

系統名

N2 (Bristol)

CGC

N2

crh-1(tz2)
snb-1(md247)
eat-4(ky5) bc10

CGC

YT17

CGC

NM467

Ohnishi et al.,MT6308EMBO J, 2011

tax-4 (p678)

Komatsu et al.,Neuron, 1996

PR678

ocr-2 (ak47) osm-9 (ky10); ocr-1 (ak46)
deg-1 (u38)glr-4(tm3239)
glr-5(tm3506)
nmr-1(ak4)
nmr-2(ok3324)
mgl-1(tm1811)
mgl-2(tm355); mgl-1(tm1811)
avr-14(ad1305); avr-15(vu227) glc-1(pk54)
avr-14(ad1302); glc-1(pk54)
unc-7(e5)inx-2(ok376)
inx-7(ok2319)
inx-9(ok1502)
inx-19(ky634)
npr-22(tm8953)
npr-22(ok1598)
flp-7(ok2625)
npr-1(ad609)
tph-1(mg280)
mod-1(ok103)
npr-22(ok1598); flp-7(ok2625)

CGC

FG125

CGC

TU38

NBRP

tm3239NBRP

tm3506

CGC

VM487

CGC

VC2623

NBRP

tm1811CGC

DA2250CGC

DA1316CGC

DA1384

CGC

CB5

CGC

CX13325

CGC

RB1792CGC

CX12726CGC

CX6161

NBRP

tm8953CGC

RB1405CGC

RB1990

CGC

DA609

CGC

MT15434

CGC

MT9668(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR24156

crh-1(tz2); flp-7(ok2625)(Motomura, et

KHR242

al., PNAS,
2022)

hjls67[atgl-1p::atgl-1::GFP+mec-7::RFP]
crh-1(tz2);otaEx40[ges1p::NLS::GFP,AIYp::GFP] #10-6 (+injection
marker)crh-1(tz2);otaEx39[unc-14p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP] #10-3

CGC

VS20

(Motomura, etal., PNAS,KHR202(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR203crh-1(tz2); otaEx38[trx-1p::crh-1(wt),ges-1::NLS::GFP](Motomura, et

KHR2042022)

al., PNAS,
2022)

crh-1(tz2);otaEx44[osm-6p::ncs-1p::che10p::glr-1p::unc-8p::unc-86::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP] #5-12
crh-1(tz2);otaEx54[osm-6p::glr-1p::unc8p::unc-86p::crh-1cDNA,ges1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]
crh-1(tz2);otaEx46[interneuron(glr1p,unc-8p,unc-86p)::crh-1cDNA,ges1p::NLS::GFP,AIYp::GFP] #1-2
crh-1(tz2);otaEx55[interneuron(glr1p,unc-8p,unc-86p)::trx-1p::ncs-1p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]
crh-1(tz2);otaEx48[interneuron(glr1p,unc-8p,unc-86p)::trx-1p::ceh-10p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]
crh-1(tz2);otaEx47[interneuron(glr1p,unc-8p,unc-86p)::trx-1p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]
crh-1(tz2);otaEx49[glr-1p::trx-1p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]

57(Motomura, etal., PNAS,KHR2052022)(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR206(Motomura, et

KHR207al., PNAS,
2022)(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR208(Motomura, et

KHR209al., PNAS,
2022)(Motomura, etal., PNAS,KHR2102022)(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR211

crh-1(tz2);otaEx60[trx-1p::unc-86p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP](Motomura, et

crh-1(tz2);otaEx50[trx-1p::ceh-10p::crh1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP](Motomura, et

crh-1(tz2);otaEx61[trx-1p::AIYp::sra6p::crh-1cDNA,ges-1p::NLS::GFP,AIYp::GFP](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR214crh-1(tz2);otaEx63[ncs-1p::nCre,trx1p,flp-21p::LoxP::crh-1cDNA,ges1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]
crh-1(tz2);otaEx65[ncs-1p::nCre::UTR,flp21p::LoxP::crh-1cDNA::SL2::GFP,ges1p::NLS::GFP,AIYp::GFP]
WT; Ex[trx-1p::yc3.60, ges-1p::GFP](Motomura, et

KHR215snb-1(md247); Ex[trx-1p::yc3.60, ges1p::tagRFP]

KHR212

al., PNAS,
2022)
KHR213

al., PNAS,
2022)

al., PNAS,
2022)(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR216(Ohta, et al.,Nat Commun,
2014)

KHR243(Ohta, et al.,Nat Commun,

KHR2442014)

crh-1(tz2);Ex[trx-1p::yc3.60, ges1p::tagRFP,rol-6(gf)](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR217

crh-1(tz2);Ex[trx-1p::yc3.60, trx1p::crh-1cDNA, ges-1p::tagRFP, rol-6(gf)]N2; Ex[trx-1p::dsRedm, trx-1p::snb1::Venus, rol-6(gf)](Motomura, et

KHR218(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR260crh-1(tz2); Ex[trx-1p::dsRedm, trx1p::snb-1::Venus, rol-6(gf) ](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR262

WT;Ex[ges-1p::GFP, AIYp::GFP](Motomura, et

KHR219al., PNAS,
2022)

al., PNAS,
2022)

58

WT;Ex[sra-6p::ttx-4(gf), ges-1p::GFP,
AIYp::GFP] (PVQ etc.)(Motomura, et

KHR220al., PNAS,
2022)

WT;Ex[trx-1p::ttx-4(gf), ges-1p::GFP,
AIYp::GFP](ASJ)(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR221

WT;Ex[sra-7p::ttx-4(gf), ges-1p::GFP,
AIYp::GFP](ASK)(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR222

WT;Ex[tph-1p::ttx-4(gf), ges-1p::GFP,
AIYp::GFP](HSN etc.)(Motomura, et

KHR223

al., PNAS,
2022)

N2;ExFJI07[trx-1p::yc3.60, sra6p::yc3.60, rol-6(gf)](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR224

N2;ExMOT02[ncs1p::nCre,flp21p::LoxP::yc3.60,rol-6(gf)](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR225snb-1;ExFJI07[trx-1p::yc3.60, sra6p::yc3.60, rol-6(gf)](Motomura, etal., PNAS,KHR2262022)

N2;ExMOT33[npr-11p::ycx2.60, pRF4](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR227

tax-4;ExMOT33[npr-11p::ycx2.60, pRF4](Motomura, et

KHR228al., PNAS,
2022)

tax-4;ExMOT34[npr-11p::ycx2.60, trx1p::tax-4cDNA, pRF4](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR229N2;ExMOT20[sra-6p::ycx2.60, pRF4](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR230

deg-1; ExMOT20[sra-6p::ycx2.60, pRF4](Motomura, et

KHR231

al., PNAS,
2022)

59

deg-1; ExMOT27[sra-6p::ycx2.60, gcy21p::deg-1cDNA, pRF4](Motomura, et

KHR232

al., PNAS,
2022)

ocr-2(ak47)osm-9(ky10);ocr1(ak46);ExMOT05[sra-6p::yc3.60,trx1p::yc3.60, rol6(gf)]eat-4(ky5); otaEx80[ges-1p::NLS::GFP,
AIYp::GFP](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR233(Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR234eat-4(ky5); otaEx82[sra-6p::eat-4, ges1p::NLS::GFP, AIYp::GFP] (PVQ, ASH)

(Motomura, et

KHR235al., PNAS,
2022)

WT; otaEx142[PVQp::eat-4(RNAi), ges1p::NLS::GFP, AIYp::GFP](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR236

WT; otaEx118[RMGp::glr-4(RNAi),RMGp::glr-5(RNAi), ges-1p::NLS::GFP,
AIYp::GFP]
N2; ExMOT50[RMGp::glr-4(RNAi), RMGp::glr5(RNAi), RMGp::yc3.60](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR237(Motomura, etal., PNAS,KHR2382022)

WT; otaEx128[ASKp&PVQp::unc-7(RNAi),
ASKp&PVQp::unc-9(RNAi), ges-1p::NLS::GFP,
AIYp::GFP]
flp-7(ok2625); Ex118[RMGp::glr-4&glr5(RNAi), ges-1p::NLS::GFP, AIYp::GFP](Motomura, etal., PNAS,
2022)

KHR239(Motomura, et

KHR240al., PNAS,
2022)

顕微鏡
透過式実体顕微鏡 (Nikon SMZ800)
透過式実体蛍光顕微鏡（OLYMPUS: SZX12）使用したソフトウェア
MetaMorph ver. 7.8（Molecular Devices）
MetaVue software ver. 7.10（Molecular Devices）
60

MetaMorph ver. 7.10（Molecular Devices）

大腸菌
OP-50 株:C. elegans の餌として NGM プレートに塗布した。

6cm(3.5cm) Nematode Growth Medium (NGM) Plate (1000ml)
NaCl ··························· 3g
Agar (伊那寒天) ················ 20g
Peptone (Bacto) ················ 2.5g
H2O ····························· 975ml
以上をオートクレーブした後、以下を加えた。
Cholesterol (5mg/ml in EtOH)
1M CaCl2
1M MgSO4

1ml
1ml
1ml

1M Potassium Phosphate (pH6.0)25ml
これを直径 6cm のシャーレには 14ml ずつ、直径 3.5cm のシャーレには 6ml ず
つ分注し固めた。
Freezing Solution(2000ml)
NaCl ··························· 10.85g
KH2PO ··························· 49.8g
Na2HPO ·························· 46g
glycerol ······················· 300g
1M NaOH ························ 5.6ml
dH2O ···························· 2000ml mess up
以上をオートクレーブした後、以下の溶液を加えた。

61

1M MgSO4 ························ 1.3ml

M9 buffer(1000ml)
KH2PO4 ·························· 3g
Na2HPO4 ························· 6g
NaCl ··························· 5g
H2O ····························· 1000ml
以上をオートクレーブした後、以下の溶液を加えた。
1M MgSO4 ························ 1ml

カルシウムイメージング用 2%アガロースパッド(5ml)M9 buffer ······················ 5ml
agarose ······················· 0.1g
以上を溶かし、30ml ずつ 24×24 カバーガラスに滴下し、上から 24×24 カバー
ガラスをかぶせた。

マイクロインジェクション用 2％アガロースパッド(5ml)M9 buffer ······················ 5ml
agarose ······················· 0.1g
以上を湯煎で溶かし、パスツールピペットでカバーガラスに一滴のせ、その上から別のカバーガラスをかぶせた。カバーガラスを一枚外し、60℃で 1 時間乾熱滅菌した。

電気泳動用アガロースゲル(1%)
1×TAE ························· 100ml

62

agarose ························ 1g以上を電子レンジで溶かした後、エチジウムブロマイドを 10μℓ 加えて、ゲル用の型に流し、コームを挿してゲル化したものを使用した。

LB 液体培地 (200 ml)
dH2O ···························· 200ml
LB Broth Lennox（Becton Dickinson, USA)······························· 4 g
以上を混合し、オートクレーブで加熱滅菌した。

アンピシリン入り LB プレート（寒天培地）
dH2O ···························· 500ml
LB Broth Lennox（Becton Dickinson, USA)······························· 10 g
Agar (伊那寒天) ················ 10g
以上を混合しオートクレーブで加熱滅菌した後、撹拌しながら約 50℃に冷まし、以下の溶液を加えた。
Ampicillin（100 mg/ml) ········· 1000 μℓ
これを直径 9 cm のシャーレに約 12 ml ずつ分注し、固まるまで静置した。

マイクロインジェクションによるトランスジェニック系統の作製

C. elegans の生殖巣への遺伝子導入とトランスジェニック系統の作製は、過去の論文をもとに行った(Mello et al., 1991)。まず乾燥させたアガロースゲ
ルパッドの上にミネラルオイルを滴下し、アガロースゲルパッドに C. elegans

63

が接着する様に置いた。顕微鏡下で C. elegans の生殖巣に DNA 溶液を入れたガラス針を刺し、目的の染色体外遺伝子（5〜100 ng/μℓ）とマーカー遺伝子を導入した。マーカー遺伝子は腸で GFP が発現する pKDK66 ges-1p::nls::gfp(50 ng/μℓ）と AIY 介在ニューロンで GFP が発現する pAK62 AIYp::gfp（30ng/μℓ）、または回転する動きが観察される pRF4 rol-6(gf)（20-30 ng/μℓ）を使用した。生殖巣に DNA 溶液を注入した後、M9 バッファーを滴下して個体を浮かせ、ピッカーを用いて新しい NGM プレートに回収した(2 worms/plate）。
遺伝子を導入した C. elegans を 20℃で飼育した。F1 世代のうち、マーカー遺伝子により遺伝子導入されたを個体を選別し、1 個体ずつ新しい NGM プレートに移した。自家受精により次世代を産ませ、F2 世代でもマーカー遺伝子の伝播が確認できた個体をトランスジェニック系統とした。

プラスミド作製

crh-1 cDNA は pNYU15 sra-6p::crh-1 cDNA として入手し、eat-4 cDNA は森
博士のご厚意によりご提供頂いた。この研究では以下の神経細胞プロモーター
を用いた：unc-14p (1410 bp), trx-1p (1028 bp), osm-6p (2057 bp), ncs-

1p (3125 bp), ceh-10p (3457 bp), glr-1p (5323 bp), unc-8p (4218 bp),
unc-86p (3604 bp), sra-7p (4164 bp), and tph-1p (3155 bp)。これらのプロモーターは、各遺伝子のそれぞれの開始コドンの上流の DNA 配列を含んでいる。AIY プロモーター（844 bp）は以前以前の報告と同じ領域を使用した。
RMG 介在ニューロンの crh-1 cDNA と yc3.60 の発現には Cre-LoxP システムを用いた；pEM3 ncs-1p::nCre, および pEM1 flp-21p::LoxP::STOP::LoxP::npr-

1::SL2::GFP プラスミドは Bargmann 博士からご提供頂いた。pEM1 プラスミド64

中の ncs-1 cDNA を crh-1 cDNA または yc3.60 遺伝子で置換し、pOTA42 flp-

21p::LoxP::STOP::LoxP::crh-1cDNA::SL2::GFP、および pOTA125 flp21p::LoxP::yc3.60 を作製した。その後、pEM3 と pOTA42 を共に 20 ng/μℓでC. elegans の生殖巣にマイクロインジェクションを行った。
RMG 介在ニューロンで発現したものを除くレスキュープラスミドは、マーカー
pKDK66、ges-1p::NLS::GFP、pAK62、AIYp::GFP を用いて、8ng/μℓの濃度で注入した。PVQ のカルシウムイメージングは特定のプロモーター（sra-6 またはnpr-11 プロモーター）とイエローカメレオン（YC）遺伝子 yc3.60(Nagai etal., 2004)または ycx2.60(Madisen et al., 2015)と結合させて、pMOT19 sra6p::ycx2.60 および pMOT29 npr-11p::ycx2.60 を作製した。過去の論文に従い、ASJ のカルシウムイメージングには trx-1 プロモーターを用いた(Ohta etal., 2014)。

DNA 断片のライゲーション
使用するベクターDNA とインサート DNA を同じ制限酵素で処理した後、電気泳動によりライゲーションに使用する線状化ベクターとインサートをゲルから精製した。線状化ベクター:インサート=1:3 の割合で混ぜ合わせ、ベクターDNAとインサート DNA の合計量の 1/2 の量の Ligation high Ver. 2 (東洋紡、日本) を加えた。混合溶液を 15℃インキュベーターで 30 分間静置し、線状化ベ
クターとインサートを結合させた。

In-Fusion
線状化ベクターDNA は制限酵素処理もしくは PCR によって取得した。インサート DNA は、線状ベクターDNA の両側それぞれの末端配列に相同な 15 塩基を、

65

目的の DNA 断片を増幅するためのプライマーの 5'側にそれぞれ付加し、目的のDNA 断片を PCR で増幅した。線状化ベクター:インサート=50 ng：100-150 ngの割合で混ぜ合わせ、5 × In-Fusion HD Enzyme Premix (Takara Bio,
Japan) 2μℓ を加えた。DW で全量が 10μℓ になるようにメスアップし、50℃で
15 分間静置して線状化ベクターとインサートを結合させた。

エレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換
形質転換には大腸菌コンピテントセル DH10β（エレクトロポレーション用）を用いた。-80℃に保管してある DH10β を氷上で溶かした後、DH10β 溶液 20μℓ に対しプラスミド DNA もしくはライゲーション後の溶液を 2μℓ を混ぜた。
これを氷上で冷やしておいたキュベットに泡を立たせずに入れた。キュベットについた水分を拭き取り、MicroPulser（Bio-Rad, USA）のホルダーにキュベットを挿入し、「Pulse」と書かれたボタンを押した。200μℓ の LB 液体培地をキュベットにいれ、コンピテントセルを回収した。50μℓ〜200μℓをアンピシ
リン入り LB プレートに塗布して 37℃で一晩培養した。

ヒートショックによる大腸菌の形質転換
形質転換には大腸菌コンピテントセル DH10β（ヒートショック用）を用いた。-80℃に保管してある DH10β を氷上で溶かした後、コンピテントセル 50
μℓ に目的のプラスミド DNA の溶液を混ぜた。この溶液に 42℃で 45 秒間のヒートショックを与え、氷上に 2 分間静置した。その後、全量をアンピシリン入り LB プレートに塗布して 37℃で一晩培養した。

PCR 法

66

PCR 試薬および耐熱性 DNA ポリメーラーゼは KOD -Plus- Neo（東洋紡、日本）を用いた。10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo 5μℓ、2mM dNTPs 溶液
5μℓ、25mM MgSO4
スプライマー

3μℓ、10μM フォワードプライマー

1μℓ、10μM リバー

1μℓ、Plasmid DNA ~50ng/50μℓ、KOD -Plus- Neo

1μℓ をよく混合した後、滅菌水で全量 50μℓ になるように合わせた。温度プログラムは94℃ 2 分、98℃ 10 秒、使用するプライマーの Tm 値に合わせた温度で 30 秒、68℃ 1 kb/30 秒を 1 サイクルとし、これを 35 サイクル行った。サーマルサイ
クラーは LifeECO (Hangzhou Bioer Technology, China) もしくは Life Touch（Hangzhou Bioer Technology, China）を用いた。

温度順化テスト
温度順化テストは過去の論文を参考にして行った(Ohta et al., 2014;
Okahata et al., 2016; Okahata et al., 2019; Ujisawa et al., 2014b)。
直径 3.5cm のプラスチックプレートに 2%(w/v)の寒天を入れた NGM プレートに餌となる大腸菌 OP50 を塗布した。大腸菌の生えた NGM プレートの寒天上に 1個体以上の成虫（P0）を置き、15〜20 時間の各解析に使用する温度で飼育し、その後 P0 成虫を取り除いた。このプレートを温度順化テストに用いるアッセイプレートとした。P0 から生まれた F1 世代は卵から成虫になるまで、同じ飼育温度で成長させた。15℃の場合は、F1 を 5〜6 日間飼育し、25℃で飼育する場合は 60〜72 時間飼育した。
F1 が成体まで成長した後に、アッセイプレートを新しい温度環境に移して数時間飼育した。その後、プレートを氷上で 20 分間冷却し、2℃の冷蔵庫（CRB-41A、日立、日本）に移して 48 時間飼育した。48 時間後、アッセイプ

67レートを 15℃で 1 日静置した。その後、実体顕微鏡下で、生存している個体と死亡している個体を数えた。各アッセイは少なくとも 3 回実施した。

生体内カルシウムイメージング
生体内カルシウムイメージングは過去の論文を参考にして行った(Ujisawa

et al., 2014a)。実験に使用する C. elegans をスライドガラス上の 2％（w/v）アガーパッドに接着し、M9 バッファーを滴下した後にカバーガラスを被せ、マニキュアで封入した。カルシウムイメージングには、オリンパス IX81
または BX60 顕微鏡（オリンパス株式会社、日本）を使用し、サンプルをステージに取り付けられた ITO ガラスベースのサーモコントローラー（東海ヒット
株式会社、日本）上に置いて行った。
カルシウムインディケーターの蛍光画像の取得には、顕微鏡のカメラポートに直結させた Dual-view（Molecular Devices, USA）に取り付けた EM-CCD カメ
ラ EVOLVE512（Photometrics, USA）、または顕微鏡のカメラポートに直結させた CSU-W1 Sprit-view Model（横河電機、日本）に取り付けた EM-CCD カメラ
iXonUltra888（Andor, UK）、または顕微鏡のカメラポートに直結させた Wview（浜松ホトニクス、日本）に付けた ORCA fusion（Hamamatsu Photonics）
を用いて撮影した。画像は 30-300ms の露光時間で、1×1 ビニングまたは 4×4ビニングで撮影した。ガラスプレートの温度の測定には、サーモメーター（TP-OT-B14M、東海ヒット株式会社）を使用した。
各イメージング実験について、蛍光強度を取得し、MetaMorph ver. 7.10 画
像解析ソフトウェア（Molecular Devices）を用いて処理した。細胞内 Ca2+濃度の相対的な変化は、YC 蛍光比の変化として測定された。カルシウムインディケ
ーターYC3.60 および YCX2.60 を用いて Ca2+イメージングを実施した(Madisen68et al., 2015; Nagai et al., 2004)。YC 実験のバンドパスフィルターは、過去の論文に記載されているものを使用した(Ohta et al., 2014; Okahata etal., 2019; Takagaki et al., 2020)。

特定の神経細胞における RNA 干渉
特定の神経細胞における RNA 干渉は過去の論文を参考にして行った(Esposito et al., 2007)。RNAi 解析の標的遺伝子のセンスおよびアンチセン
ス塩基配列は、Ahringer の C. elegans RNAi クローンライブラリーの中に含まれる標的遺伝子クローンの DNA 配列の情報に従って、PCR 法を用いて DNA 断片を増幅した(Kamath and Ahringer, 2003)。センスおよびアンチセンス方向に
クローニングされた標的遺伝子の断片の上流に、細胞特異的プロモーターを融合させた。
RMG ニューロン特異的に標的遺伝子を RNAi するためには、RMG ニューロンでのみ遺伝子発現を誘導するプロモーターが必要であったが、単独の遺伝子プロモーターで RMG ニューロン特異的に発現誘導するものが存在しなかった。そのため、RMG ニューロンを含む複数のニューロンで発現誘導する 2 種類のプロモーターである ncs-1 プロモーターと avr-15 プロモーターを用いて、前者を用いて標的遺伝子の「センス」配列を発現させ、後者で標的遺伝子の「アンチセンス」配列を発現させた。C. elegans 体内では ncs-1 プロモーターと avr-15
プロモーターの発現が重複する RMG 介在ニューロンでのみ、標的遺伝子のセンス配列とアンチセンス配列が共存する状態ができるため、この方法を用いてRMG ニューロン特異的に標的遺伝子である glr-4 遺伝子と glr-5 遺伝子の RNAi
を行った。

69

PVQ ニューロン特異的に標的遺伝子(eat-4 遺伝子、unc-7 遺伝子、unc-9 遺伝子)の RNAi を行う解析においても同様に、PVQ ニューロン特異的に遺伝子発現を誘導させる単独のプロモーターは公表されていなかったため、PVQ ニューロンを含む複数のニューロンで発現誘導する 2 種類のプロモーターである sra-

6 プロモーターと npr-11 プロモーターを用いた。これらのプロモーターで発現が重複する PVQ ニューロンでのみ標的遺伝子のセンス配列とアンチセンス配列が共存する状態ができるため、この方法を用いて PVQ ニューロン特異的に標的遺伝子(eat-4 遺伝子、unc-7 遺伝子、unc-9 遺伝子)の RNAi を行った。標的遺伝子のセンスおよびアンチセンス断片を、ges-1p::NLS::GFP および AIYp::GFPなどのマーカー30ng/μℓと共に 20ng/μℓで C. elegans の生殖巣にマイクロイ
ンジェクションした。

Oil Red O 染色
Oil Red O 染色は過去の論文を参考にして行った(O'Rourke et al., 2009)。
一定の温度下で飼育し、成長段階を揃えた個体を使用した。成虫になって 1 日目の個体を集め、1×PBS (pH 7.4)で 3 回洗浄し、ガラス試験管に回収した。
その後、120μℓ の PBS と等量の 2％パラホルムアルデヒドを含む 2×MRWB バッ
ファー（160mM KCl、40mM NaCl、14mM Na2EGTA, 1mM spermidine-HCl, 0.4mM
spermine, 30mM Na-PIPES, pH7.4 および 0.2% b-mercaptoethanol）を加えて
1 時間穏やかに揺動し、バッファーを除去後、C. elegans を 1×PBS で洗浄した。脱水のため、1.0 mL の 60%イソプロパノールを加え、室温で 15 分間静置した。oil red O 原液（1% oil red O 含有イソプロパノール）を数日間平衡化
し、水で 60%に希釈して 1 時間揺動した後、0.22mm フィルターで濾過した。
脱水後の C. elegans が入った試験管から、60%イソプロパノールを除去し、70

oil red O 染色液 1mL を加え、C. elegans の入った溶液をローテーターで 30
分間もしくは一晩、回転させた。その後、oil red O 溶液を除去し、0.01%
Triton X-100 を含む 1×PBS 1.0 mL で C. elegans を 3 回洗浄した。最後に、

C. elegans をマウントし、カラーCCD カメラ(EOS kissX9, Canon)で明視野画像を取得した。

Oil Red O 染色個体の撮影条件
顕微鏡：SZX12

倍率

：90 倍

レンズ

：DF PLAPO 1.6X PF

コントラスト：最小
フィルター

：KB-4

閾値設定

：なし

露光時間

：1/5 (200ms)

ISO

：100

機種

：EOS KISS X9

撮影モード：Manual光源の電流値：-2A(ダイヤル：6 )Oil Red O の画像取得と定量化
すべての oil red O 染色個体の画像は、同一の設定と露光時間で取得した。
oil red O 蛍光は、画像解析ソフトウェアである MetaMorph ver.7.8(Molecular Devices) を用いて、RBG カラー画像から取得した。MetaMorph を用いてカラー画像から oil red O 蛍光を取得し、そのうち Red チャンネルの値

71

を最大値（255）から引いて反転させ、ネガティブコントロールとして oil red
O 染色を行わず他の操作は同様におこなったモック個体の反転値を差し引くことで定量化した。個体ごとの平均 oil red O 蛍光強度は、咽頭筋の直下から位置している腸の細胞のうち、2 対目と 3 対目の腸細胞の強度の合計として取得された。

ATGL-1::GFP 蛍光画像の定量化
ATGL-1::GFP 蛍光画像の定量化は過去の論文を参考にして行った(Palamiuc

et al., 2017)。蛍光画像は、MetaVue ソフトウェア ver. 7.10 (Molecular
Devices) を用いて、DOC-Cam Compact モノクロカメラ(Molecular Devices)を取り付けた Olympus IX81 倒立顕微鏡の 20×対物レンズ(UPlanSApo 20x,
Olympus)で撮影した。個体あたりの平均 ATGL-1::GFP 蛍光強度は、2 対目と 3対目の腸細胞の囲まれた領域内の強度の合計として取得した。

脂肪酸組成
発生段階を揃えたヤングアダルトの個体から脂質を抽出し、過去の論文を参考にメチル基転移させた(Murray et al., 2007)。脂肪酸メチルエステルは
気-液クロマトグラフィーで分析し、ピークの保持時間を標準物質と比較する
ことで定量した。脂肪酸組成は重量百分率で表示した。すべてのサンプルは独立して 3 回収集した。

統計解析
温度順化テストは、6 枚以上のプレートで少なくとも 3 回試行をそれぞれ別日に実施した。個々の実験データの値は、棒グラフ上にドットで示した。エラ72

ーバーは standard error of the mean（SEM）を示す。統計解析は、すべてのデータの分散は正規分布すると仮定し、パラメトリック検定である Dunnett’s
検定または Tukey-Kramer 検定、分散が等しくないと仮定した 2 標本による
Welch の t 検定を用いて行った。図中の（*）および（**）は、それぞれ P <0.05 および P < 0.01 を示す。これらの検定は、Mac 統計解析 ver. 3 (株式会社エスミ、日本)を使用した。

73

6.謝辞
はじめに、本研究を行うにあたり、適切な助言をしていただきました久原篤教授に深く感謝致します。ならびに、実験計画や実験操作の指導、実験結果に対する議論等、本研究を通して多大なアドバイスとご指導をして頂きました太
田茜 博士に心から感謝致します。oil Red O を使用した腸の脂肪量の定量化に尽力頂きました村上一寿氏、Cameleon 遺伝子を ASJ ニューロンと PVQ ニューロンに導入した系統を作製して頂きました藤井智子氏、カルシウムイメージングに用いる温度プログラムを作製して頂いた五百藏誠氏、カルシウムイメージン
グの実験操作やプラスミド作製等の実験操作の指導をしてくださった三浦徹氏、岡畑美咲 博士、高垣菜式 博士に感謝申し上げます。また、日本学術振興会特別研究員 DC に採用頂き、科研費提供による研究支援を頂きましたこと

厚く御礼申し上げます。さらに、学位論文の作成指導をして下さいました甲南
大学

久原篤

上田晴子

教授、日下部岳広准教授、檀上博史

教授、渡辺洋平

教授、岩月聡史

教授、本多大輔

教授、教授に心から感謝申し上げます。最後に、大学 4 年間及び大学院 5 年間、研究生活を支えて下さった家族と友人に深く感謝いたします。

74

7.引用文献
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868. 図・表15℃

2℃ (48h)

生存25℃

2℃ (48h)

死滅

図1 線虫C. elegans の低温耐性
線虫C. elegansは飼育温度によって低温耐性が変化する。15℃で飼育したC. elegansは2℃に暴露されても生存できるが、25℃で飼育したC. elegansは2℃の環境では生存できず死滅する。

87

温度順化シフト条件
25℃

卵

温度シフト

低温刺激

15℃ (0~8h)

2℃ (48h)

若い成虫**

生存率 (%)

100
75
50

*

n.s. n.s.

WT
crh-1

**

n.s.

25
0

0

1
2
5
3
8
15 ℃で飼育した時間 (h)

図2 野生株とcrh-1変異体の低温環境（15℃）シフト後の低温耐性
温度シフトテスト（25℃→15℃→2℃）後の野生株（WT）とcrh-1変異体の生存率。25℃飼育後15℃で3時間以上飼育すると、どちらの系
統も生存率が顕著に増加した。15℃で3時間飼育したcrh-1変異体では、野生株（WT）に比べ生存率が低い異常が見られた（アッセイ数≧6 、平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（n.s., P ≥0.05; *P < 0.05; **P < 0.01）。

88

温度順化シフト条件
温度シフト25℃ (0~18h) 2℃ (48h)15℃
卵生存率 (%)

100

若い成虫

n.s. **

WT
crh-1

**

75
50

**

25
0

低温刺激

0

1

3

n.s.

5

18
25 ℃で飼育した時間 (h)

図3 野生株とcrh-1変異体の高温環境（25℃）シフト後の低温耐性
温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の野生株（WT）とcrh-1変異体の生存率。15℃飼育後25℃で3時間以上飼育すると、どちらの系
統も生存率が顕著に低下した。25℃で3時間飼育したcrh-1変異体では、野生株（WT）に比べ生存率が高い異常が見られた（アッセイ数≧９ 、
平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（n.s., P ≥0.05; **P < 0.01）。

89

温度順化シフト条件
15℃

低温刺激

25℃ (3h)

2℃ (48h)

若い成虫

卵生存率 (%)

温度シフト(1) (2) (3)

**

100

n.s.

**

*

n.s.

**

**

**

**

**

(4)
n.s.

n.s.

**

n.s.

75
50
25
0

+
2)
tz er
(
1 k
h- ar
cr m
n
tio
ec
W

j
in

T

trx-1 trx-1 trx-1 trx-1
unc-14 trx-1 osm-6 osm-6
ncs-1
ncs-1 cehceh-10
10
glr-1
glr-1
glr-1 glr-1 unc-8 glr-1 glr-1
unc-8 unc-8 unc-8 unc- unc-8 unc-8 glr-1
uncunc- unc- 86
unc- unc86
86 86
86
86

trx-1 trx-1 trx-1
unc- ceh- AIYp
10
sra-6
86

ASJ
ASK

AIY AIY
PVQ PVQ PVQ PVQ PVQ PVQHSN HSN HSN HSN HSN
HSN
RMG

AIY

302

58

8

1

64

41

55

ASJ

46

ASJ ASJ ASJ

42

18

Promoters
RMGp*

Almost ASJ ASJ
ASK
all
AIY
PVQ
HSN
RMG

ASJ

trx-1

14

ASJ ASJ

RMGp*

ASJ

AIY
PVQ

Representative
neurons
RMG RMG

crh-1(tz2); Ex[ cell-specific promoters:: crh-1cDNA]

5

2

1

Number ofneurons
Genotype

図4 crh-1変異体の温度順化異常の回復実験
様々なプロモーターを使用してcrh-1変異体にcrh-1 cDNAを導入し、温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の温度順化異常が回復するか確認した。その結果、 crh-1 cDNAを crh-1変異体のASJ感覚ニューロンとRMG介在ニューロンに導入すると、野生株と同じ表現型を示すようになった（アッセイ数≧15、平均±標準誤差）。 RMGp* の表記はcrh-1 cDNAをCRE-LoxP system
を使用して導入したことを示している。統計処理はダネット検定を用いてマーカー系統とそれぞれの回復系統の生存率を比較した（n.s., P ≥ 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01）。

90

10
5
0

20 15oC

15oC

15oC飼育15
15

10
Ratio change (%)

15

crh-1 (+ASJ)
Ratio change (%)

Ratio change (%)

20

crh-1

WT

WT
snb-1

5
0

-5

-5

20oC
10oC
1

20oC

5
0
-5

10oC

501 (sec)

101

501 (sec)

図5 15℃飼育個体の温度刺激下のASJ感覚ニューロンのカルシウ
ムイメージング
15℃で飼育した野生株（WT）、 snb-1変異体、crh-1変異体、ASJ
特異的にcrh-1 cDNAを導入した回復系統（crh-1;Ex[trx-1p::crh-1
cDNA]）のASJ感覚ニューロンのカルシウムイメージングの結果。
温度刺激は約10℃-17℃。カルシウムインディケーターはYC3.60を用いた。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グ
ラフは411-421秒間の蛍光輝度比の平均値を示している。 15℃で飼育された個体は温度刺激に対しほとんど反応を示さなかった（個体数≧ 22 、平均±標準誤差）。

91

crh-1 (+ASJ)
20

15
10
5
0

20oC

20oC飼育15
15

10
Ratio change (%)

20oC

Ratio change (%)

Ratio change (%)

20

crh-1

WT

WT
snb-1

5
0
-5

-5
25oC

25oC

15oC

15oC

1

501

10

*

**

5
0
-5

501 (sec)

1

図6 20℃飼育個体の温度刺激下のASJ感覚ニューロンのカルシ
ウムイメージング
20℃で飼育した野生株（WT）、 snb-1変異体、crh-1変異体、ASJ特異的にcrh-1 cDNAを導入した回復系統（crh-1;Ex[trx1p::crh-1 cDNA]）のASJ感覚ニューロンのカルシウムイメージ
ングの結果。カルシウムインディケーターにはYC3.60を用いた。
温度刺激は約15℃-20℃。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グラフは510–520秒間の蛍光輝度比の平均値を示している。crh-1変異体のASJ は野生株（WT）に比べレ
シオ値（YFP/CFP）が低下したが、 ASJ特異的にcrh-1 cDNAを導入すると野生株（WT）と同程度までレシオ値が回復した（個体数≧ 22 、平均±標準誤差）。統計処理はテューキーの検定を用いた（*P < 0.05; **P < 0.01. ）。

92

5
0
-5

20 23oC

23oC飼育15
15

10

Ratio change (%)

10

crh-1 (+ASJ)
Ratio change (%)

Ratio change (%)

20 23oC
15

crh-1

WT

WT
snb-1

5
0
-5

30oC

30oC

20oC

20oC

1

501 (sec) 1

*

10
5
0
-5

501 (sec)

図7 23℃飼育個体の温度刺激下のASJ感覚ニューロンのカルシ
ウムイメージング
23℃で飼育した野生株（WT）、 snb-1変異体、crh-1変異体、ASJ特異的にcrh-1 cDNAを導入した回復系統（crh-1;Ex[trx1p::crh-1 cDNA]）のASJ感覚ニューロンのカルシウムイメージ
ングの結果。温度刺激は約20℃-25℃。カルシウムインディケー
ターにはYC3.60を用いた。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グラフは446-456 秒間の蛍光輝度比の平均値を示している。crh-1変異体のASJ は野生株（WT）に比べレ
シオ値（YFP/CFP）が低下した（個体数≧ 19 、平均±標準誤差）。統計処理はテューキーの検定を用いた（*P < 0.05 ）。

93

15℃ 飼育
ASJ感覚ニューロン

A

Total volume of synapses
per animal（µm³）

B

Wild typecrh-1(tz2)C

蛍光強度の比較D

シナプスの体積の合計

S2c_Relative Intensity_synapses

S2b_volume*of synapses

4000

n.s.

シナプスの距離n.s.of synapses
S2d_Distance
10

150

8

3000

6

100

2000
4
50

0

1000

wild-typeWild-type
N=9

crh-1
crh-1(tz2)
N=10（N= Number of animals）

0

2
0

Wild-typewild-type
N=98

crh-1(tz2)
crh-1
N=90

（N=Number of synapses）

wild-type（µm） Wild-type
N=89

crh-1
crh-1(tz2)
N=82（N=Number of intervals）

図8 crh-1変異体のASJ感覚ニューロンの形態的な解析(A) SNB-1::VENUS (Ex[trx-1p::daf-28::dsRedm, trx-1p::snb1::VENUS]) をASJ感覚ニューロンで発現させた野生型およびcrh-1変異体を共焦点顕微鏡で観察した。スケールバーは10μm。
(B)野生株およびcrh-1変異体のASJ感覚ニューロンにおけるシナプスの体積の合計を示している。(C)SNB-1::VENUS蛍光強度を示している。(D)シナプス間距離を示している。(個体数≧9、平均±標準誤差)B-Dの算出にはVolocityソフトウェアver.6.3を用いた(n.s., P ≥0.05; *P < 0.05）。

94

ASJ

ADL

ASG

AVJ
ASK
PVQ

HSN

RMG
シナプス接続ギャップ結合図9 ASJ感覚ニューロンからRMG介在ニューロンまでの神経回路の概略図
ASJ感覚ニューロンはRMG介在ニューロンと直接接続しておらず、他のニューロンを介している。三角形が感覚ニューロン、六角形が介在ニューロン、丸が運動ニューロンを表している。

95

15oC

生存率 (%)

100
100

25oC (2h)

2oC

**
**

80
80

60
60
40
40
20
20

00

aE 6p
x
:
N [tr :ttx N
2; xE -1 -4( 2;EpxgxN [sr ::tt f), [ge2; a- xg
7p -4 es s-1
E(gx[tp ::tt f) 1p p::
G
:
x ,
h
-1 -4 ge :GF(g s- FP P,p::tt f), 1p , A AIY
x- g:
I4( es :G Yp p::FG:gf) -1p P, :G
F
,g :
P
A
F
es :GF IYp P]( ]P-1 P:
p , A :G VQ::F
G IYp P )]F
P, ::G (AS
AF
IY P J)
p ](A
::
G S
F K)
P
](
H
S
N
)

2;

系統

p

.)

p
p )
p
1 tc
T rker） ra-6etc. rx-1 J) a-7 K) ph- N et AS sr AS
t HS
W a
s Q
(
m
(
(
V
P
（
(

Specific promoter::ttx-4(gf)cDNA

図10 PKC(gf)を導入した系統の温度シフト後の低温耐性野生株（WT）に活性型PKC(ttx-4gf)を様々なプロモーターで発
現させ、温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の低温耐性を確認した。 ASJ感覚ニューロンとPVQ介在ニューロンにPKC(gf)を導入した系統では温度順化異常が見られた（アッセイ
数≧18、平均±標準誤差）。統計処理はダネット検定を用いて野生株とPKC(gf)を導入したそれぞれの系統の生存率を比較した（**P < 0.01）。

96

15°C→25°C (18h)→2°C (48h)

60

80

n.s.

n.s.

20

60

Ww
ildild-ty-typpee
np np
r-1r-1
tp tph
h- -1
1
m m
od od
-1 -1

n.s.

n.s.

40
20
0

0

系統

n.s.

系統

W wildild -ty-ty pepennp prr-11
tptphh- 1
1
m mo
od d
-1-1

40

n.s.

生存率 (%)

生存率 (%)

15°C→25°C (3h)→2°C (48h)

図11 セロトニン作動性HSN運動ニューロンと温度順化の関係
野生株（Wild-type)とセロトニンの合成に必要なトリプトファン水
酸化酵素TPH-1とセロトニン作動性クロライドチャネルMOD-1の変異体を用いて温度順化テストを行なった。これらの変異体は野生株と同じ温度順化の表現型を示した（アッセイ数≧8、平均±標準誤差）。統計処理はダネット検定を用いた（ n.s., P ≥ 0.05 ）。

97

YFP/CFP
Ratio Change (%)

ASJ

30

RMG

PVQ

20
10
0

23oC
17oC

0

100
200 300 0
時間 (sec)

100

200 300
時間 (sec)

0100

200 300
時間 (sec)

図12 ASJ感覚ニューロン、PVQ介在ニューロン、 RMG介在
ニューロンのカルシウムイメージング
23℃で飼育した野生株（WT）に17℃→23℃→17℃の温度刺激を与えた際のASJ感覚ニューロン、PVQ介在ニューロン、 RMG
介在ニューロンのカルシウムイメージングを行った。どの細胞体でも温度変化伴ってレシオ値が変化していた。カルシウムイ
ンディケーターにはYC3.60を用いた。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値（個体数≧17、平均±標準誤差）。

98

WT

snb-1

Column data table

20
8080
10

Ratio Change (%)

Ratio Change (%)

30

0
-10

23oC
17oC
0

図13

100

200
時間 (sec)

300

**

6060
4040
2020
00
-20
-20
N2 snb-1

snb-1変異体のPVQ介在ニューロンのカルシウムイメージング

23℃で飼育した野生株（WT）とsnb-1変異体に17℃→23℃→17℃の温度刺激を与えた際のPVQ介在ニューロンのカルシウムイメージングの結果。 snb-1変異体のPVQでは野生株に比べレシオ値が低下していた。カルシウムインディケーターにはYC3.60を用いた。線グラフは
YFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値（個体数≧20、平均±標準誤差） 、棒グラフは103-107秒間の蛍光輝度比の平均値を示している。
統計処理はウェルチのt検定を用いた（**P < 0.01）。

99

tax-4tax-4;Ex[trx-1p::tax-4 cDNA]

30
20

n.s.

23oC
17oC
100

200
時間 (sec)

300

00
-20
-20
ta

N2

0

20
20

4
NA
]

-10

*

*

x-

0

40
40

cD

10

Ratio Change (%)

Ratio Change (%)

WT

[tr

x-

1p
::t

ax

-4

図14 tax-4変異体のPVQ介在ニューロンのカルシウムイメージ
ング

ta

x-

4;

Ex

23℃で飼育した野生株（WT）、tax-4変異体、 ASJ特異的にtax4 cDNAを導入したtax-4変異体（tax-4;Ex[trx-1p::tax-4 cDNA]）に17℃→23℃→17℃の温度刺激を与え、PVQ介在ニューロンのカルシウムイメージングを行った。 tax-4異体のPVQは野生株に比べレシオ値が顕著に低下するが、 ASJ特異的tax-4 cDNA を導入した系統では野生株と同程度のレシオ値の変化が見られた。
カルシウムインディケーターにはYCX2.60を用いた。線グラフ
はYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グラフは150–180秒間の蛍光輝度比の平均値を示している（個体数≧11、平均±標準誤差）。統計処理はテューキーの検定を用いた（ n.s., P ≥0.05 ; *P < 0.05）。

100

PVQ

n.s.

30

80
80

20

Ratio Change (%)

Ratio Change (%)

deg-1
WT
deg-1;Ex[gcy-21p::deg-1 cDNA]

10
0
-10
23oC

n.s.

60
60
40
40
20
20
00

17oC
100
200
時間 (sec)

300

-20
-20
de
N2
g-1
d
レス eg
キュ -1
ー

0

図15 deg-1変異体のPVQ介在ニューロンのカルシウムイメージング
23℃で飼育した野生株（WT）、deg-1変異体、 ASG特異的にdeg-1
cDNAを導入したdeg-1変異体（ deg-1;Ex[gcy-21p::deg-1 cDNA] ）に
17℃→23℃→17℃の温度刺激を与え、PVQ介在ニューロンのカルシ
ウムイメージングを行った。deg-1変異体のPVQは野生株に比べ有意差は出ないもののレシオ値が僅かに増加した。カルシウムインディ
ケーターにはYCX2.60を用いた。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グラフは99–103秒間の蛍光輝度比の平均値を示している（個体数≧18、平均±標準誤差）。統計処理はテューキーの検定を用いた（ n.s., P ≥ 0.05 ）。

101

WT
ocr-2 osm-9; ocr-1
PVQ
n.s.

100
100

20
Ratio Change (%)

10
0

-10
23oC

80
80
60
60
40
40
20
20
00

17oC
300

異

-9変

100
200
時間 (sec)

1o
cr2:o
sm

0

体

-20
-20
N2

Ratio Change (%)

30

oc
r-

図16 ocr-2 osm-9; ocr-1変異体のPVQ介在ニューロンのカルシ
ウムイメージング
23℃で飼育した野生株（WT）とocr-2 osm-9; ocr-1
変異体に17℃→23℃→17℃の温度刺激を与え、PVQ介在ニューロンのカルシウムイメージングを行った。 ocr-2 osm-9; ocr-1変異体のPVQのレシオ値は野生株と差がなかった。カルシウムイ
ンディケーターにはYC3.60を用いた。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グラフは103–107秒間の蛍光輝度比の平均値を示している（個体数≧18、平均±標準誤差）。統計
処理はウェルチのt検定を用いた（ n.s., P ≥ 0.05 ）。

102

15°C

25°C (2h)*100

生存率 (%)**

2°C (48h)

**

80
80

60
40
40
20

0

2

E
x8

;o
ta

5)

t-

ea

4(

ky

t-

ea

4(

ky

;o
ta

t-

5)

4(

ky

N

ea

W

ild

E
x8

5)

:
r)
p:
-4
e
6
t
k
ea
ra
ar
s
(m Ex A]x
; E t-4; cDN H)
4
tea t-4 , AS
ea
ea VQ
(P

e
p
y
t

2

00

図17 eat-4変異体の温度シフト後の低温耐性
温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後のeat-4変異体は野生株に比べ生存率が増加した。eat-4変異体のPVQにeat-4 cDNAを導入すると、野生株と同じ表現型を示すようになった（アッセイ数≧8、平均±標準誤差。統計処理はテューキーの検定を用いて生存率を比較した（*P < 0.05; **P < 0.01）。

103

15°C

25°C (2h)2°C (48h)

**

100
100

生存率 (%)

80
80
60
60
40
40
20
20
0
0

(R

N

A

pe

w
ild
-ty

PVQp::
eat-4(RNAi)

W
T;
E

x[

PV

Q
p:
:e

at

-4

no
RNAi

RNAi

WT

i)
]

WT

Genotype

図18 PVQ特異的eat-4 RNAi系統の温度シフト後の低温耐性
野生株のPVQ特異的にeat-4をノックダウンした系統は、温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後に野生株より高い生存率を示した（アッセイ数≧10、平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（**P < 0.01）。

104

15°C

生存率 (%)

100
100

**

25°C (5h)** **2°C (48h)

** **

50
50

0

w
gl il
r- d
4( ty
gl tm pe
r- 3
5( 23
tm 9
35 )
06
nm )
rnm 1
r
m m -2gl g-2 lav;m 1
rgl
14; a a -1
vr vrav -15 14
r- gl
14 c;g 1lc-1

e -4 lr-5 r-1 r-2 l-1 l-1 4-1 lc-1
p
c
1
r
l
y
l
g nm nm g g vr
g ;g
g
-t
m ;m a5
ild-1 r-14
2
r
W
l
g
av av
;
m
4
-1
r
av

図19 グルタミン酸受容体の変異体の温度シフト後の低温耐性
様々なグルタミン酸受容体変異体の温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の生存率を測定した（アッセイ数≧8、平均±標準誤差）。統計処理はダネット検定を用いて、野生株とそれぞれの変異体の生存率を比較した（**P < 0.01）。

105

25°C (3h)

15°C
100

2°C (48h)**

生存率 (%)

80
80

60
60
40
40
20
20
00

GenotypeRNAi

N2m 118_3lines

WTWT

no RMGp::glrRNAi 4(RNAi)RMGp::glr5(RNAi)

図20 RMG特異的glr-4、glr-5 RNAi系統の温度シフト後の低温耐性
野生株のRMG特異的にglr-4、glr-5をノックダウンした系統は、温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後に野生株より高い生存率を示した（アッセイ数≧9、平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（**P < 0.01）。

106

Wild-type (no RNAi)RMGp::glr-4(RNAi),RMGp::glr-5(RNAi)
RMG

20
10
0

-10
27°C
17°C

4040
2020
00
-20
-20

glr
-4

50 100 150 200 250 300
時間 (sec)

6060

Wi
ldtyp
,g
e
lr5R
NA
i

30

0

*

8080
Ratio Change (%)

Ratio Change (%)

40

図21 RMG特異的glr-4、glr-5 RNAi系統のRMG介在ニューロンのカルシウムイメージング
15℃で飼育した野生株（WT）とRMG特異的glr-4とglr-5をノッ
クダウンした系統に17℃→27℃→17℃の温度刺激を与え、RMG介在ニューロンのカルシウムイメージングを行った。
RMG特異的にglr-4とglr-5をノックダウンした系統では、高温刺激下で野生株よりレシオ値が低下した。カルシウムインディ
ケーターにはYC3.60を用いた。線グラフはYFP/CFPの蛍光輝度比（％）の平均値、棒グラフは142–146秒間の蛍光輝度比の平均値を示している（個体数≧18、平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（*P < 0.05）。

107

A

B

** **

60
40

2°C (48h)

**

80
80

80
80

60
60
40
40
20
20
00

WT

wi
ld
-ty

no RNAi PVQp::
unc-7(RNAi)
PVQp::
unc-9(RNAi)

R

Ex

X1

12

8

RNAi

WT

10

33 CB
B 25 5 u
17 in N
92 nx c-7 2C
X1 in 2(o (e7x)
k2
C 726 7(o 376
X6k)
16 inx 231 X
1 -9 9)in (o IV
x- k1
19 5
(k 02
y6 )
34
)I

Genotype

5-

e
9
9
7
2
typ nc-7 nx- nx- inx- x-1
i
i
d
u
in
il
W

+#

00

-7

20

C

25°C (3h)

100

pe

**

15°C

2°C (48h)#5

生存率 (%)

100
100

25°C (3h)

生存率 (%)

15°C

図22 イネキシン変異体の温度シフト後の低温耐性(A)様々なイネキシン変異体の温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の生存率を測定した（アッセイ数≧10、平均±標準誤差） 。統計処理はダネット検定を用いて、野生株とそれぞれのイネキシン変異体の生存率を比較した（**P <0.01）。
(B) 野生株のPVQ特異的にunc-7とunc-9をノックダウンした系統
では、温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の生存率が野生株より僅かに増加した（アッセイ数≧18、平均±標準誤差）。
統計処理はウェルチのt検定を用いた（**P < 0.01）。

108

15°C

100
100

25°C (3h)**2°C (48h)**

生存率 (%)

80
80
60
40
40
20
20

W
iW
l
flp d-iltdypty-7p(ok e enp2
r22 6f2l5p
(tm
)-7
8
np95
r-32)
2

00

図23 flp-7変異体とnpr-22変異体の温度シフト後の低温耐性
flp-7変異体とnpr-22変異体の温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）
後の生存率は野生株に比べ増加した（アッセイ数≧6、平均±標準誤差）。統計処理はダネット検定を用いて、野生株、flp-7変異体、npr22変異体のそれぞれの生存率を比較した（**P < 0.01）。

109

15°C

25°C (5h)

生存率 (%)

80
80

**

*

100
100

2°C (48h)

n.s.
n.s.

**

60
60
40
40
20
20

WT flp-7 WT flp-7

wi
Gp
ld
::g
-ty
M
lrpe
Gp
4&
::g
gl
lrr-5
flp
4&
(R
-7
gl
NA
r-5
i)]
(R
#4
NA
-4
i)]
#3
lin
es

00

no RNAiRNAi

RMGp::glr-4(RNAi)RMGp::glr-5(RNAi)M

図24 野生株とflp-7変異体でRMG特異的にglr-4、glr-5をノックダウンした系統の温度シフト後の低温耐性

[R

x1
18

;E

flp
-7

W
T;
E

x1
18

[R

野生株（WT）、flp-7変異体、野生株でRMG特異的にglr-4、glr-5
をノックダウンした系統（ WT; RMGp::glr-4(RNAi), RMGp::glr5(RNAi) ）、flp-7変異体でRMG特異的にglr-4、glr-5をノックダウンした系統（ flp-7 ; RMGp::glr-4(RNAi), RMGp::glr-5(RNAi) ）の温度シフトテスト（15℃→25℃→2℃）後の生存率を調べた。
WT; RMGp::glr-4(RNAi), RMGp::glr-5(RNAi) とflp-7 ; RMGp::glr4(RNAi), RMGp::glr-5(RNAi) の生存率に差は見られなかった（アッセイ数≧6、平均±標準誤差）。統計処理はテューキーの検定を用いてそれぞれの生存率を比較した（n.s., P ≥ 0.05; *P <0.05; **P < 0.01）。

110

25°C
300
300

**

250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
00

_2

_1

N2

N2

5℃

Wild-type
5℃[15°C飼育 Wild-type]

Fluorescence Intensity(% of wild-type 15 °C)[25°C飼育 Wild-type]

15°C

図25 飼育温度別のATGL-1の発現レベル
15℃飼育した個体と25℃飼育した個体のatgl-1::GFP の蛍光強度を測定した。縦軸は15℃飼育した野生株の平均を100％として算出している。 （個体数≧30、平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（**P < 0.01）。

111

**

350
350

[15°C飼育 Wild-type]

n.s.

n.s.
25°C

300
300

脂肪含量
(% of wild-type 15 °C)[25°C飼育 Wild-type]

n.s.

15°C

250

250
200
200
150
150

100
100
50
50

00

Wild-typeflp-7

npr-22 flp-7; npr-22

N2
_
N2 25
_ C
flp 15C
flp 7_2- 5
np 7_1 C
r-2 5Cflp npr 2_-2 25
flp 7;n 2_ C
-7 pr- 15C
;n 22
pr _
-2 2 52 C
cr _15hC
cr -1_
h- 25
1_ C
15
C

-20

図26 飼育温度別の腸の脂肪量の解析
15℃で飼育した場合と25℃で飼育した場合の野生株、flp-7 変異体、npr-22 変異体、 flp-7 変異体、 flp-7 ; npr-22 変異体の腸の脂肪量をoil Red Oで染色することにより定量化した（overnight
staining）。表で示している各個体の値は15℃で飼育した線虫の平均値を100％として算出した（個体数≧14、平均±標準誤差）。
統計処理はテューキーの検定を用いてそれぞれの生存率を比較した（n.s., P ≥ 0.05; **P < 0.01）。

112

15°C

25°C

脂肪含量
(% of wild-type 15 °C)

250

*

n.s.

n.s.

e
t- yp
ild

1
hr
c

-7
flp

n.s.

*

200
200
150

100
50
50

7
p, NA]J
lf pS[A -1cD
1;
x
h
E rh
cr
1; ::c
h p
cr MG
R

W
T
W (25
T ℃
cr (15 )h℃
cr -1 (
)
h- 25
1 ℃
cr
flp (15℃)
h-7
c 1)
cr rh- ;flp flp- (25
h
1 -7
7 ℃
cr -1;E ;flp #1 (15 )h- x- 71; OT 7 # -3 ℃)
Ex A 17 (2O 63 -3 5℃
TA #(63 27 15℃)
#2 -5 (
)
7- 25
5 ℃
(1 )
5℃
)

00

W

図27 飼育温度別のcrh-1変異体の腸の脂肪量の解析
15℃で飼育した場合と25℃で飼育した場合の野生株、crh-1変異体、flp-7 変異体、 crh-1; flp-7 変異体の腸の脂肪量をoil Red Oで染色することにより定量化した（30 min staining）。表で示している各個体の値は15℃で飼育した線虫の平均値を100％として算出した（個体数≧10、平均±標準誤差）。統計処理はテュー
キーの検定を用いてそれぞれの生存率を比較した（n.s., P ≥0.05; *P < 0.05 ）。

113

A

脂肪酸組成 (%)

25

crh-1 (15℃-cultivated)
crh-1 (25℃-cultivated)
crh-1 (15℃→ 25℃(3hr))
crh-1 (25℃→ 15℃(3hr))

Wild-type (15℃-cultivated)
Wild-type (25℃-cultivated)
Wild-type (15℃→ 25℃(3hr))
Wild-type (25℃→ 15℃(3hr))

20
15
10
5
0
14

B

:0

16

:0
1

1
6:

n-

7

17

:i s

o

17

:0
17

:1

n-

9
18

DM

A

脂肪酸組成 (%)

50

18

:0

18

:1

n-

9
18

:1

n-

7
18

:2

n-

6
18

:3

n-

6
18

:3

n-

3

20

:0

20

:1

n-

9
20

:3

n-

6
20

:4

n-

6
20

:4

n-

3
20

crh-1 (15℃)

30

Wild-type (15℃→
25℃(3h))crh-1 (15℃→
25℃(3h))20

Wild-type (25℃)

crh-1 (25℃)

10

Wild-type (25℃ →15℃(3h))crh-1 (25℃→
15℃(3h))

0

n-

3

**
Wild-type (15℃)

40

:5

**

SFA

*

MUFA

PUFA

図28 温度シフト時の野生株とcrh-1 変異体の脂肪酸組成の解析（A）15℃飼育、25℃飼育、15℃から25℃に移して3時間飼育、25℃から15℃に移して3時間飼育した時の野生株とcrh-1 変異体の脂肪酸の鎖長の解析。
（B）15℃飼育、25℃飼育、15℃から25℃に移して3時間飼育、25℃から15℃に移して3時間飼育した時の野生株とcrh-1 変異体の脂肪酸の飽和脂肪酸（SFA）、モノ不飽和脂肪酸（MUFA）、ポリ
不飽和脂肪酸（PUFA）の割合を示している（個体数≧3、平均±標準誤差）。統計処理はウェルチのt検定を用いた（*P < 0.05; **P <0.01）。

114

CREB

ASJ
温度刺激 (感覚ニューロン）
頭部

CREB

?

FLP-7

+

PVQ

(介在ニューロン)

ATGL-1 Intestine

尾部

NPR-22RMG

Glu(介在ニューロン)

図29 温度順化を促進する脳腸連関モデル
15℃から25℃への温度順化の場合、頭部のASJ感覚ニューロン
で温度刺激が受容され、尾部のPVQ介在ニューロンに伝達される。その後、PVQニューロンが頭部のRMG介在ニューロンにグ
ルタミン酸シグナルを介して伝達し、未同定のニューロンから神経ペプチドFLP-7の分泌が促される。FLP-7は、神経ペプチド
受容体NPR-22によって腸で受容され、トリグリセリドリパーゼ
ATGL-1の活性化を介して脂肪減少を誘導し、結果として低温耐性を低下させる。

115

表1
図4のプロモーターと対応する神経細胞
trx-1

osm-6, ncs-1, cehosm-6, glr-1,
10, glr-1, unc-8,
unc-8, unc-86
unc-86

trx-1, ncs-1, trx-1, ceh-10,
glr-1, unc-8,
glr-1, unc-8, glr-1, unc-8,
unc-86
unc-86
unc-86

trx-1, glr-1,
unc-8, unc-86

ADA

ADA

ADA

ADA

ADA

ADE

ADE

ADF

ADF

ADL
AFD

ADL
AFD

AIB

AIB

AIB

AIB

AIB

AIB

AIM
AIN

AIM
AIN

AIM
AIN

AIM
AIN

AIM
AIN

AIM
AIN

AIM

AIY

AIY

AIZ

AIZ

AIZ

AIZ

AIZ

AIZ

ASJ

trx-1, unc-86

trx-1, AIYp,
sra-6

trx-1, RMGp*

RMGp*

ADA

AFD
AIB
AIN
AIY

ALA
ALM

ALM

ALM

ALM

ALA
ALM

ALM

ALM

ALN

ALN

ALN

ALN

ALN

ALN

ALN

AQR
ASE

AQR
ASE

ASG

ASG

ASH
ASI
ASJ
ASK
AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ
AVK
AWA
AWB
AWC
BAG
BDU

ASH
ASI
ASJ
ASK
AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ

ASH

ASH

ASH

ASJ

ASJ

ASJ

ASJ

AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ
AVK
AWA
AWB
AWC
BAG
BDU

AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ

AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ

AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ

BDU

BDU

CEP

CEP

DA1-9
DB1-7
DD1-6

DA1-9
DB1-7
DD1-6

DA1-9
DB1-7
DD1-6

DA1-9
DB1-7
DD1-6

DA1-9
DB1-7
DD1-6

DA1-9
DB1-7
DD1-6

DVC
FLP
HSN

DVC
FLP
HSN

DVC
FLP
HSN

DVC
FLP
HSN

DVC
FLP
HSN

DVC
FLP
HSN

IL2

IL2

IL2

IL2

IL2

IL2

NSM
PDA
PDB
PDE
PHA
PHB
PLM
PVC
PVM
PVQ
RID
RIG
RIM

NSM
PDA
PDB
PDE
PHA
PHB
PLM
PVC
PVM
PVQ

NSM
PDA
PDB

NSM
PDA
PDB

NSM
PDA
PDB

NSM
PDA
PDB

PLM
PVC
PVM
PVQ

PHA
PHB
PLM
PVC
PVM
PVQ

PLM
PVC
PVM
PVQ

RIG
RIM

RIG
RIM

RIG
RIM

PLM
PVC
PVM
PVQ
RID
RIG
RIM

RIG
RIM

RIG
RIM

RIS

RIS

RIS

RIS

RIS

RIS

RIS

RMD

RMD

RMD

RMD

RMD

RMD

RMD

RME
RMG
SAB

RME

RME

RME

RME

RME

SAB

SAB

RME
RMG
SAB

SAB

SAB

SMD
URY
VA1-12

SMD
URY
VA1-12

SMD
URY
VA1-12

SMD
URY
VA1-12

SMD
URY
VA1-12

SMD
URY
VA1-12

VB1-11
VC1-6
VD1-13

VB1-11
VC1-6
VD1-13

VB1-11
VC1-6
VD1-13

VB1-11
VC1-6
VD1-13

VB1-11
VC1-6
VD1-13

VB1-11
VC1-6
VD1-13

AIY

ALA

ASE
ASG
ASH

AVA
AVB
AVD
AVE
AVG
AVJ

AWA
AWB
AWC
BDU

trx-1, ceh-10

ADF

AIY
AIZ

ADA

trx-1, glr-1

BDU

ASJ

ASJ

ASH
ASI
ASJ

ASJ

AVJ

BDU
CEP

CEP

DVC
FLP
HSN
IL2
NSM

PLM
PVC
PVQ

PVQ
RID

RME
RMG

116

SMD
URY

URY

RMG