23-09

RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit(Code No. RMD-201, RMD-201T)

取扱説明書
TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPAN

―目次―
[1]
[2]
[3]
[4]

[5]
[6]
[7]
[8]

はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品内容・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
製品のほかに用意するもの・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
使用方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
1. 細胞溶解または RNA 希釈・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
2. 熱変性反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
3．ゲノム除去反応・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
4．cDNA 合成および増幅反応(RT-RamDA®反応)・・・・・・・・・・・
実施例・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
トラブルシューティング・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
関連製品・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

233447789101112―ご注意―
本キットに含まれる試薬は、すべて研究用試薬です。診断・臨床用試薬としては決して使用しないでください。本キットの使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。
※RT-RamDA®、RamDA-seq®は、国立研究開発法人理化学研究所の登録商標です。
RMD-2011

[1] はじめに

RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit はシングルセルや微量の RNA から cDNA を調製することが可能です。本キットで調製した cDNA はリアルタイム PCR の鋳型として使用することができ、高感度に遺伝子発現解析を行うことができます。
本キットでは Reverse Transcription with Random Displacement
Amplification(RT-RamDA®) 法参考文献(1)を採用しています。RT-RamDA®法は逆転写酵
素の鎖置換活性を利用した新規 cDNA 増幅方法であり、poly(A) RNA だけでなく、non-poly(A)由来の cDNA の高感度な検出が可能です。このため RT-RamDA®法では従来技術に比べ検出遺伝子が多いことが特長です。

図 1. 本キットのワークフロー◆本キットの特長◆
1. シングルセルや微量 RNA から cDNA 調製可能
1～100 細胞 または 10pg~1ng total RNA
2. RNA 全長をカバーした解析が可能
10kb 以上のターゲット RNA の全長をリードでカバーできる cDNA を調製可能
3. 様々なリアルタイム PCR 試薬に使用可能
様々なリアルタイム PCR 試薬と組み合わせて使用可能です。SYBR® Green I,
TaqMan® アッセイ両方に対応しています。
弊社 THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101,QPS-201)、KOD SYBR® qPCR
Mix(Code: QKD-201)等 を使用することができます。

2RMD-201

[2] 製品内容
本キットには、以下の試薬が含まれております。試薬は-20℃で保存してください。
RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit (Code:RMD-201,RMD-201T)
試薬名

保存①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water⑤RT-RamDA® Buffer⑥RT-RamDA® Enzyme Mix⑦RT-RamDA® Primer Mix⑧gDNA Remover

-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃

容量容量(RMD-201)(RMD-201T)

480μL
108μL
22μL
960μL
240μL
54μL
54μL
54μL

[3] 製品のほかに用意するもの
本キットのほかに、以下の機器・試薬類をご用意ください。
・ サーマルサイクラーまたはインキュベーター
ご使用にあたっては各装置の取扱説明書に従ってください。
・ リアルタイム PCR 装置及びリアルタイム PCR 用試薬
ご使用にあたっては各装置、試薬の取扱説明書に従ってください。

RMD-201

3120μL
27μL
6μL
240μL
60μL
14μL
14μL
14μL

[4] 使用方法
本キットは細胞または精製済みの total RNA を使用することができます。FACS を用いて細胞を取得する場合はセクション 1．A、FACS 以外の方法にて細胞を取得する場
合はセクション 1．B、精製済みの total RNA を使用する場合はセクション 1．C から始めてください。その後、セクション 2．熱変性反応ステップに進んでください。

サンプル
細胞FACS
FACS 以外
精製 RNA

細胞溶解 / RNA 希釈セクション 1．A
セクション 1．B
セクション 1．C

熱変性反応～
セクション 2．

１．細胞溶解または RNA 希釈 （Cell lysis or RNA dilution）
A. FACS を用いて細胞取得を行う場合(1) 細胞溶解に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に必要量より余分量をみて調製してください。
細胞溶解液の調製
1 反応(μL)
20.450.050.5
3①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free waterTotal※余分量を 10%とした場合

20 反応(μL)※ 100 反応(μL)※
44220
9.949.5
1.1
5.5115566330(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに細胞溶解液を 1well あたり 3μL 分注します。
分注は氷上にて行い、分注後すぐに qPCR 用シールや熱圧着式シールにてシーリングを行ってください。
(3) ソーティングまでプレートを氷上または 4℃にて保管を行い、ご使用の FACS の取扱説明書や推奨するパラメーターに従い、細胞ソーティングを実施してください。
(4) ソーティング後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(5) その後、すみやかに次のステップに進むか、－80℃にてサンプルを保管してください。

4RMD-201

B. FACS 以外で細胞取得を行う場合
マニュアルピッキングなどで細胞取得を行う場合は細胞サンプルの液量は 0.5μL 以下にしてください。
(1) 細胞溶解に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に予め以下の試薬を調製し、その後細胞サンプルを添加してください。
細胞サンプルの液量が 0.5μL 未満の場合は細胞溶解液の調製時に水の添加量を調整してください。
細胞溶解液の調製
1 反応(μL)①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor
細胞サンプル④Nuclease free waterTotal

20.45
0.05~0.5X3例) 細胞サンプルの液量が 0.5μL の場合
20 反応(μL) ※①Lysis Buffer
44②Lysis Enhancer
9.9③RNase Inhibitor
1.1Total55※余分量を 10%とした場合100 反応(μL) ※22049.55.5275(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに細胞溶解液を 1well あたり 2.5μL 分注します。
分注は氷上にて行い、分注後すぐにシーリングを行い、遠心してください。
(3) 細胞サンプルの添加までプレートを氷上または 4℃にて保管を行い、細胞取得機器のマニュアルに従い、細胞サンプルの添加を行ってください。
(4) 細胞サンプルの添加後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(5) その後、すみやかに次のステップに進むか、－80℃にてサンプルを保管してください。

RMD-2015

C. 精製済みの total RNA を使用する場合(1) RNA 溶液の 90%が RNA 希釈液になるように希釈してください。以下を参考に RNA希釈液を必要量チューブに作製してください。
RNA 希釈液の調製①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor④Nuclease free water
Total

100 反応(μL)
220
49.55.555
330RNA 希釈例)
1ng Input を行う場合(μL)
10ng/μL total RNA
1RNA 希釈液
29Total30
希釈した 333pg/μL total RNA 溶液 3μL を使用してください。
10pg Input を行う場合(μL)
333pg/μL total RNA
1RNA 希釈液
99Total100
希釈した 3.3pg/μL total RNA 溶液 3μL を使用してください。

(2) 96well プレートまたは 8 連チューブに希釈した RNA 溶液を 1well あたり 3μL 分注します。
(3) 分注後、シーリングを行い、遠心を行ってください。
(4) その後、すみやかに次のステップに進むか、－80℃にてサンプルを保管してください。

6RMD-201

2．熱変性反応 （Denature）(1) サンプルプレートやチューブを 4℃にて遠心を行い、以下の温度でインキュベートしてください。
凍結サンプルを使用する場合は熱変性反応前に 4℃にて融解し、遠心した後に熱変性反応に進んでください。
熱変性反応
StepDenature

Temperature
74℃
4℃

Time
1.5min.
hold

3．ゲノム除去反応 （Digestion of genomic DNA）
(1) ゲノム除去反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
＊ERCC RNA 等コントロール RNA を使用する場合は④Nuclease free water の添加量を調整してください。
ゲノム除去反応液の調製
1 反応(μL)
0.30.45
2.25
3⑤RT-RamDA® Buffer⑧gDNA Remover④Nuclease free water＊Total※余分量を 10%とした場合

20 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※6.6339.949.549.5247.566330(2) 熱変性反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブにゲノム反応液を 1wellあたり 3μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
ゲノム除去反応
Step
Genomic DNA digestion

Temperature
30℃
4℃

Time
5min.
hold

(3) ゲノム反応後、すみやかに次のステップに進んでください。

RMD-201

7

4．cDNA 合成および増幅反応（RT-RamDA®反応）(1) RT-RamDA®反応に必要な試薬をチューブに作製します。以下を参考に調製してください。
＊NSR Primer を使用する場合は⑦RT-RamDA® Primer Mix の代わりに 1st NSR

Primer Mix for human または 1st NSR Primer Mix for mouse を使用してください。
RT-RamDA®反応液⑤RT-RamDA® Buffer⑥RT-RamDA® Enzyme Mix⑦RT-RamDA® Primer Mix＊
④Nuclease free waterTotal※余分量を 10%とした場合

1 反応(μL)
1.50.450.450.6
320 反応(μL) ※ 100 反応(μL) ※331659.949.5
9.949.5
13.26666330(2) ゲノム除去反応を行った 96well プレートまたは 8 連チューブに RT-RamDA®反応
液を 1well あたり 3μL 添加し、遠心後、以下の温度でインキュベートしてください。
RT-RamDA®反応
StepPriming 1
Priming 2
Reverse transcription
and amplification
Inactivation

Temperature
25℃
30℃
37℃
50℃
98℃
4℃

Time
10min.
10min.
30min.
5min.
5min.
hold

(3) RT-RamDA®反応後、すみやかに次のステップに進むか、－20℃～－30℃にて保管してください。
(4) リアルタイム PCR 実施の際は、鋳型として反応液に直接または希釈して添加してください。
RT-RamDA®反応液(9μL)の 1/10~1/25（0.9～0.36μL）を鋳型量としてください。多量の添加は PCR の反応効率を低下させ、正確な定量ができないことがあります。

8RMD-201

例）1/25 量を鋳型量とする場合(μL)
9RT-RamDA®反応液
Nuclease free water
41
Total
50
希釈した反応液 2μL をリアルタイム PCR の鋳型として使用してください。

[5] 実施例
1. 従来の逆転写反応との cDNA 量比較＜方法＞
NIH3T3 細胞から抽出した Total RNA 10pg を用いて RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit (Code:RMD-201)と従来の逆転写反応試薬である ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA
Remover(Code: FSQ-３01)を用いて、cDNA 合成を行いました。その後、それぞれの cDNA を鋳型にTHUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)を用いて 7 種類の House Keeping Gene についてリアルタイム PCR 解析を行い比較しました。Ct 値から算出される RT-RamDA® cDNA
Synthesis Kit の cDNA 量を従来の逆転写反応の cDNA で割った際の数値を増幅率として算出しまし
た。

＜結果＞

従来の逆転写反応試薬を使用した際の cDNA 量に対して RT-RamDA® cDNA Synthesis Kit では約 10 倍程度の cDNA を得ることが可能です。

RMD-2019[6] トラブルシューティング現象

原因

リアルタイム PCR でシ RNA が分解しているグナルが出ない、あるいは遅れて検出される

対策
・RNA が分解していないか確認してください。
・チップやチューブなどに RNase がコンタミしていないか確認してください。
・細胞溶解や RNA 希釈のステップは氷上にて行ってください。

RNA の量が少なすぎ 本製品では、およそ 10pg から 1ng までの RNA を用る、あるいは多すぎる いた場合に逆転写増幅反応が可能であることを確認していますが、RNA の種類や品質によっては、反応可能な RNA 量は変動する可能性があります。鋳
型 RNA の添加量を増減させてください。
反応温度が不適切

逆転写反応液の添加量が多すぎる

反応条件の変更は、プライマーのアニーリング効率、酵素活性、逆転写反応後の酵素失活など広範囲に影響します。反応温度は必ず本説明書に記載の条件に従って実施してください。
添加量が多すぎる場合、PCR 反応が阻害される可能性があります。逆転写反応液のリアルタイム PCR反応液への添加量は、PCR 反応液の液量の 10%以下にしてください。

10RMD-201

[7] 関連製品
内容96 回用*

Code No.
RMD-101

24 回用*

RMD-101T

1,152 回用*

RMD-301

NSR Primer Set for human

96 回用*

NSR-101

NSR Primer Set for mouse

96 回用*

NSR-102

内容Code No.

500 回用/20μL 反応

NLQ-101

品名
次世代シーケンサー解析用 cDNA 調製キット

GenNext® RamDA-seq® Single CellKit
RamDA Cell Lysis Kit*96 ウェルプレートの１ウェルでの使用回数になります。

品名
イルミナ社次世代シーケンサー用ライブラリー定量キット

GenNext® NGS Library
Quantification Kit
リアルタイム PCR 用試薬

Code No.
内容1mL×1 本
QPS-101T(100 回用/20μL 反応)
1.67ml×3 本
QPS-101(500 回用/20μL 反応)(1.67ml×3 本)×5
QPS-101X5(500 回用/20μL 反応)×5
1mL×1 本QKD-201T(100 回用/20μL 反応)
1.67ml×3 本
QKD-201(500 回用/20μL 反応)(1.67ml×3 本)×5
QKD-201X5(500 回用/20μL 反応)×5
1mL×1 本QPS-201T(100 回用/20μL 反応)
1.67ml×3 本
QPS-201(500 回用/20μL 反応)(1.67ml×3 本)×5
QPS-201X5(500 回用/20μL 反応)×5

品名

各種蛍光プローブ・蛍光プライマー検出用リアルタイム
PCR 試薬THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

高効率 SYBR® Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬

KOD SYBR® qPCR Mix

高効率 SYBR® Green I 検出系用リアルタイム PCR 試薬

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

RMD-20111

[8] 参考文献(1)Hayashi .T et al.Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing
and enhancer RNAs. Nature Communications. 9：619（2018)より詳細な情報は、弊社ウェブサイトをご覧ください
https://lifescience.toyobo.co.jp/

12RMD-201

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (東京)〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目１７番１０号 住友商事京橋ビル
TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp－製品の内容・技術に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
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