研究フロンティア（平成年度奨励賞受賞論文）

胎生期卵巣における NR5A1/Ad4BP/SF1 の転写抑制はNotch シグナルを介した卵巣発生の最適化に必要である
野村 莉紗，鹿島田 健一
東京医科歯科大学発生発達病態学

緒とを示唆するが，詳細については明らかでない．

言Nr5a1（Nuclear receptor family 5 group A member 1）

目

的は，Ad4bp（adrenal 4―binding protein）あるいは Sf ―1（steroidogenic factor―1）とも呼ばれ，当初はステロイド）

胎生期 XX 性腺に異所性に Nr5a1 を強制発現させたマ産生酵素発現に必要な転写因子として同定された ．さウスを作成し，胎生期 XX 性腺おける Nr5a1 の発現抑制

らにその後 Nr5a1 は性腺においてその発生から精巣のの意義を明らかにする．

体細胞であるセルトリ細胞，ライディッヒ細胞分化まで多くの役割を果たすことが明らかとなった ― ）．性腺発生

方法

および精巣分化に必須の転写因子であることから，NR5A1 はヒトでは ，XY DSD の主要な原因遺伝子のつ）

Nr5a1 強制発現マウスの作成には，胎生期の XY 性腺，XX 性腺支持細胞に同レベルで発現する Wt1（Wilms Tu-として知られる ．
性腺における Nr5a1 の発現は，雌雄差が明らかでな

mor 1）のプロモーター領域を含む

kb の BAC クロー）

い原始性腺では発現レベルに差はないが，性決定以降，ンを用いた ．導入にあたり，Nr5a1 は IRES 配列を介精巣では亢進し卵巣では低下する ）．従来，この卵巣でして Egfp（Enhanced green fluorescent protein）を連結の発現の低下は主には promoter や enhancer の活性のさせ，内因性 Nr5a1と区別できるようにした．その結低下によるもので，胎生期卵巣発生において高いレベル

果，XX 性腺において Nr5a1の発現レベルが異なるでの Nr5a1 が不要であるためであると考えられていた．

イン（TgA および TgS）の強制発現マウスを作成した

近年われわれは，胎生期卵巣における Nr5a1 の発現抑（図制の意義について興味深いの発現がより強く XY 性腺と同程度を示した（図 B, C）．

つの知見を得た．一つ目はラA）．TgS は TgA に比べ，XX 性腺における Nr5a1

卵巣特異的な転写因子であるFOXL（Forkhead box L ）が胎生期 Nr5a1 の発現を抑制していること ），二つ目は結果ある特定のミスセンス変異（R W）をもつ NR5A1 は，XX DSD の原因となり，その病態として R W をもNR A は精巣決定因子ではない．

つ NR5A1 は胎生期に NR0B1（Nuclear receptor family．dpc の性腺において EGFP 陽性の NR A 陽性細0 group B member 1）などの卵巣発生に必須の分子に胞を認め，導入した Nr5a1 が発現していることを確認

よる抑制的な機構から免れることが示唆されたことであした（図る ）．

た．性腺は免疫染色で SOX （Sry-type HMG box― ）このことは，卵巣の正常な発生において，Nr5a1 はあC）
．Tg―A, Tg―S とも内外性器は雌性型であっの発現を認めず，セルトリ細胞の分化を認めなかった

る一定以下の発現レベルまで抑制される必要があるこ（図）．これらは，NR5A1 の強制発現のみでは Sry 不と，XX 性腺において異所性に発現した場合，精巣決定在下では単独で精巣誘導できないことを示した．

遺伝子である Sry（Sex- determining region Y ）不在下
でも単独で性腺分化を精巣に誘導できる可能性があるこ
連絡先：鹿島田健一，東京医科歯科大学発生発達病態学〒 ―東京都文京区湯島 ― ―TEL ： ――
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E-mail：kkashimada.ped@tmd.ac.jp18

日本生殖内分泌学会雑誌（2019）24 : 18-23

Tg XX マウスは sub fertile である．
胎生期卵巣においては卵巣発生に必須な Notch

signal を抑制する．
卵巣の形態学的解析では，両 Tg マウスにおいて，Pに multi oocyte follicle（MOF）の形成（図A），P

胎生期卵巣における NR5A1/Ad4BP/SF1 の転写抑制は Notch シグナルを介した卵巣発生の最適化に必要である

（A）

（B）

（C）

図

トランスジェニックマウスの作成（A）トランスジェニック作成に用いたベクターおよびその方法．IRES 配列を介して Nr a ， Egfp をもつフラグメントを Wt の BAC クローンに導入した（PBWt ―Nr a /EGFP）．ゲノムへの組み込みには PiggyBac Transposon Vector System を用い効率化を図った．
（B）XX マウスにおける Nr a の発現量から ラインを選択，樹立した．TgA ラインは，野生型 XX マウスに比べ Nr a の発現がわずかに上昇しており，TgS ラインは XY 野生型マウスとほぼ同等に上昇していた．P の性腺における qRT―PCR 解析．Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ．
（C）蛍光免疫染色による TgS, TgA XX 性腺の解析．EGFP と NR A は同一の細胞に発現している．

図

NR A は精巣決定因子ではない．
P における卵巣の免疫染色．TgA XX，TgS XX ともに卵胞形成を認め（B, C, F, G），SOXの発現を認めなかった（F, G）．太い点線：性腺の辺縁，点線：卵胞と卵子，または精索の辺縁．Scale Bar＝ µm

研究フロンティア19野村莉紗

他に成熟卵胞（type ― ）の有意な減少を認め（図B），る卵巣機能不全の原因となることが知られている ）．本

卵胞の形成・成熟の障害を認めた．これは，より早期の研究結果は，NR A は機能喪失だけではなく，発現抑type ― の卵胞におけるアポトーシスの増加が原因であ制が解除することによっても同様に早発閉経と同様の臨C）．また TgS では早期より妊孕床像を示すことが示された．このことは卵巣発生におい性に障害を認め，TgA マウスでは産仔数が生後 週こて NR5A1/Nr5a1 の発現はある一定の至適発現レベルにると考えられた（図ろ（出産を―回経験した後）より妊孕性が野生型と調節される必要があることを示唆する．

比較し有意に低下し，早発閉経の表現型を示した（図 D）．

近年，NR A は性腺における糖代謝やコレステロー

これらの表現型は既報の Notch2, Jag1 knock out マウルの代謝においても重要な役割を果たすことが見出され）スと類似していたことから ，Notch シグナル分子の発た ， ）．NR A はステロイド産生酵素の発現に必須な転現を解析したところ，TgA において Notch2, 3の発現が写因子として発見されたが，こうした制御はいずれも生有意に減少していた（ ．dpc）（図体の内分泌代謝系において定量性を伴うことが要求されE）．

る．今回のわれわれの結果は，Nr5a1 が精巣分化，卵巣胎 生 期 XX 性 腺 に お け る 過 剰

は Notch signalを抑制し，卵巣の正常発生を阻害する．
これらの表現型が実際に Notch シグナルの減弱によ

分化，それぞれの stage において，その機能の一部は Nr5a1―Notch のような定量的な制御に支えられている可能性を示すものである．

るものであることを確認するため，rescue 実験を行なっ

今 日 ま で の 性 分 化，性 腺 発 生 の 研 究 は，Sry―Sox9,

た．具体的にはハムスターのモノクローナル抗体を用いWnt4―Foxl2 といった精巣卵巣の分化を司る molecularて作成した Notch agonist（HMN ― ）を胎生期（ ．，switch とその拮抗的な役割を中心に形成されてきた．

．， ．dpc）に 妊 娠 親 マ ウ ス に 投 与 し 解 析 し た ）今後はこうした Nr a ―Notch シグナルといった定量的A）．その結果，MOF の形成，成熟卵胞数の減少な連続性のある制御を，性スペクトラムの形成として捉が有意に改善し，アポトーシス陽性卵胞の数も減少した

え，精巣卵巣それぞれの性腺発生の機構を解明していく

B, C, D）
．このことより TgA マウスの卵巣でのことが性分化，性腺発生の多様性や可塑性を解明する手（図（図表現型が体制期の Notch シグナルの低下によることをがかりになる可能性があると考えられる．

明らかとした．また，卵巣の発生に重要な Wnt4，の発（なお本研究は，Journal of Cell Science（現が，TgA で低下し（P ），Notchした（図agonist 投与で回復F）．これらは XX 性腺では Notch が Wnt4の発現を制御していると考えられた．Foxl2 では有意な変化を認めなかった（図考E）．

察

上記の結果から NR A は Sry 不在下では精巣発生を単独で誘導することはできず精巣決定因子ではないと考えられた．
一方，胎生期 XX 性腺において NR A は Notch signalを介した卵巣の発生の最適化に必要であると考えられた．Notch signal は隣接する細胞間シグナル伝達系のつで，さまざまな組織の発生に重要な役割を示すが，卵巣においては生殖細胞と支持細胞間のシグナル伝達を担い，卵胞成熟に必須であることが知られている ）， ）．NR
A と Notch signal の拮抗的な関係は，過去には精巣のステロイド産生細胞である Leydig 細胞分化においても知られており，本研究の結果はこれらの制御機構が卵巣においても保たれていることを示した．
以前より NR A の機能喪失は，早発閉経を始めとす

20日本生殖内分泌学会雑誌Vol.24 2019掲載された））に胎生期卵巣における NR5A1/Ad4BP/SF1 の転写抑制は Notch シグナルを介した卵巣発生の最適化に必要である

（A）

（B）

（C）

（D）

（E）

図

卵巣の組織学的検討（A）TgA，TgS とも Multi oocyte follicle（MOF）の形成を認めた．P ，Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ．
（B）TgA，TgS とも成熟卵胞数（type ― ）が有意に低下していた．P ，Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ．
（C）Type ， の卵胞において Cleaved Capase 陽性の卵胞数が有意に上昇していた．P ，Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ．
（D）Mating の回数と合計の産仔数の推移．同じ 匹の XY 野生型と掛け合わせ続け，累積産仔数を評価したところ，TgSマウスの妊孕性はほぼ廃絶していた．TgA は 回目の Mating のころより有意に妊孕性の低下を認めた．n＝（E）TgA マウスにおいて， Notch ， の mRNA の発現が有意に低下していた． ．dpc Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ．

研究フロンティア

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野村莉紗

他（A）（C）（B）（D）（E）（F）

図（A）Notch agonist を用いたレスキュー実験．XX 野生型の卵子に XY TgA または XY 野生型の精子を IVF し ICR マウスに偽妊娠させ， ．，．， ．dpc に Notch agonist 抗体（HMN ― ）又はコントロールのハムスター IgG 抗体（Ham―Ab）を腹腔内投与し出生後の卵胞形成の表現型を評価した．
（B）HMN ― 投与により TgA の MOF 数が減少した．P ，Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ．
（C）HMN ― 投与で成熟卵胞（type ― ）の減少が回復した P ，Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ．
（D）Cleaved Caspase 陽性の卵胞数が HMN ― 投与により有意に減少した．P ，Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ．
（E，F） Wnt は TgA マウスで発現が減少しており，それは HMN ― により回復した． Foxl では有意な差を認めなかった．Mean±SEM，
n＝ ，＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ．

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.24 2019

胎生期卵巣における NR5A1/Ad4BP/SF1 の転写抑制は Notch シグナルを介した卵巣発生の最適化に必要である

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