静電気学会誌，41, 1（2017）57-62

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

誘電回転法による動物細胞の識別と活性評価
桜庭 一樹 ，古澤 尚也 ，脇坂 嘉一 ，箱田 優
＊

＊

＊＊

＊, 1

（2016年9月29日受付；2016年12月16日受理）

Animal Cell Identification and Active Evaluation Using
Electrorotation Method＊＊

Kazuki SAKURABA , Naoya FURUSAWA ,＊＊＊, 1
Yoshikazu WAKIZAKA and Masaru HAKODA（Received September 29, 2016; Accepted December 16, 2016）
We investigated the identification and activity evaluation of animal cells by dielectrophoresis（ DEP）
. The imaginary part ofClausius-Mossotti function Im［K（ω ）］of five kinds of animal cells was measured using electro-rotation（ EROT）, which is a
type of DEP. As a result, it was revealed that Im［K（ω ）］was different in the kind of cells. In addition, the cells were exposedto three kinds of stress, and the correlation of Im［K（ω ）］and the activity of the cells was shown. Furthermore, Im［K（ω ）］was analyzed using Single-Shell model. We showed that this EROT device is effective as an activity evaluation device andenables identification of the cells.

1．はじめにや MACS は高精度な分析が可能である反面，蛍光色素及近年，医療の分野において細胞培養は高い安全性が要

び磁気チップを分析対象物に注入しなければならず，分求され，細胞の分離分析技術は非常に重要な役割を担っ析対象物への影響が懸念されている．一方で，電場を利ている．細胞や生体高分子などの計測や分離には主に光，用した分析は細胞の電気的特性のみを利用するため，細磁場，および電場が用いられた技術が使われている ．光胞への非侵襲的な分析が可能である．著者らは，誘電泳を利用した技術には，レーザーと蛍光標識を用いて細胞の動現象を利用した誘電泳動浮揚法を用いて，細胞の同定

選択的な分離を可能とするセルソーターがあり，磁場を利および活性の評価を行い，細胞の特性を Clasuius-Mossotti

用したものには，MACS が挙げられる．電場を利用する現関数の実部 Re［K（ω ）］で整理した象として電気泳動や誘電泳動，誘電回転法があり，遺伝動を利用した分離装置を考案し，異種細胞の分離や生死子導入などに用いられている．誘電泳動は，不均一電場中細胞の分離の有効性を明らかにしている

1）において，電場により分極した粒子が，電場の勾配によって強電場側あるいは弱電場側へ泳動する現象である．

．さらに，誘電泳

2-6）

．

7-14）

本研究では誘電泳動の 1 つである，誘電回転法を利用
し細胞の分析を行い，細胞の特性を Clasuius-Mossotti 関

誘電回転法は，回転している不均一電場中にある分極数の虚部 Im［K（ω ）］で整理した．その際，より精度の高した粒子が，電場に引きずられるように回転する現象でい分析を行うために本装置の最適分析条件を検討した．

ある．これらの方法は，粒子が持つ電荷を利用する電気

その後，分析対象の細胞を 3-2H3 細胞，MEF 細胞，iPS

泳動と異なり，粒子の分極によるため，電気的に中性な細胞，MDCK 細胞，HeLa 細胞の 5 種類とし各細胞の誘対象物まで適用することができる．また，セルソーター

電特性を測定した．また，3-2H3 細胞に培養日数を増やした場合のストレス，強電場に長時間さらした電場スト

キーワード：誘電泳動，誘電回転法，シングルシェルモデル
＊群馬大学大学院理工学府環境創生部門（〒376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1）
Department of Environmental Engineering Science,
Graduate School of Science and Technology, Gunma
University, 1-5-1, Tenjin-cho, Kiryu-shi, Gunma, 376-8515,
Japan＊＊
株式会社 AFI テクノロジー（〒602-0841 京都市上京区梶井町 448-5）
AFI Technology Co. Ltd., 448-5, Kajii-cho Kamigyo-ku,
Kyoto, 602-0841, Japan1
hakoda@gunma-u.ac.jp

レス，培養温度を上昇させた温度ストレスの 3 種類を加えて誘電特性の変化を測定し，増殖活性と誘電特性の相関について検討した．

2．理論
誘電回転法は 4 つの電極間で回転する回転電場を利用し，粒子を回転させる．回転電場に置かれた粒子は，粒子表面に回転トルクが生じることで回転を開始する．この回転トルクГ（ω ）は粒子径 r，周囲媒質の誘電率 ε m，
電場強度 E 及び，粒子と周囲媒質の誘電率に関する複静電気学会誌 第41巻 第 1 号（2017）58

素関数 Clasuius-Mossotti 関数の虚部 Im［K
（ω ）
］で
（1）式
のように表される ．
15）（1）
粒子の回転速度 Ω は，粒子の表面摩擦抵抗 R が回転
トルクとつり合うことで定常状態となる．表面摩擦抵抗
Rは（3）式のようになる．
（2）式，回転速度 Ω は（2）（3）

η m は周囲媒質の粘度である．
（1）
式中の Im［K（ω ）］なお，は細胞の誘電特性を表す因子であるため，
（1）
（3）
- 式を使
い Im［K（ω ）］について整理したのが
（4）
式である

．

16, 17）（4）

3．実験方法と手順
3.1 各細胞の培養
本実験では浮遊性細胞のマウスハイブリドーマ 3-2H3

図 1 装置図（ a ）および四重電極形状（ b ）Fig.1 Schematic diagram of experimental apparatus（ a ）andquadruple electrode shape（ b ）．

3.3 回転速度測定とIm［K（ω ）］の算出

細胞，足場付着性細胞のヒト子宮頸癌細胞 HeLa 細胞，

Im［K
（ω ）
］を算出するため，細胞の回転速度を測定しマウス線維芽細胞 MEF 細胞，マウス iPS 細胞，イヌ腎

た．細胞の回転速度は周波数に依存するため，周波数を臓細胞 MDCK 細胞を用いた．培地には DMEM（ Sigma

1 kHz から 1 MHz まで変化させて検討した．各周波数で，D6429）500 ml を基本とし，10％FBS（ GIBCO BRL ），硫

回転速度はおおよそ 10 個のデータの平均値とした．回

酸ストレプトマイシン（明治製菓）100 mg/ml（力価）とペ転の計測は，1 回転を 3～20 sec 程度で測定した．回転ニシリン G カリウム（萬有製薬）100 U/ml からなる抗生物

速度の速い場合は動画の再生速度を落とすことで測定誤質を 5 ％添加した混合培地を使用した．また，マウス iPS

差を抑え，計測した．なお，細胞懸濁には浸透圧とジュ

細 胞 に 関 し て は 分 化 抑 制 剤 と し て，NEAAS（Sigma

ール熱の発生を抑える条件で調整した 8.5 wt% スクロー

M7145） 5 ml，モノチオグリセロール（ Wako 195-15791）

ス + 0.3 wt% グルコース溶液を使用した．

0.5 ml，LIF（ Wako 199-16051）0.5 ml を上記培地へ更に加

3.4 各ストレス付加方法及び生存率，比増殖速度測定

えた．各種細胞はコンフルエントになるまで 37 ℃，5.0％

細胞へのストレスと誘電特性 Im［K（ω ）］の関係を検討CO2 下のインキュベータ（ ESPEC BNA-111）で培養した．

するため，3-2H3 細胞をサンプル細胞として，培養日数，

3.2 装置形状と電圧印加

電場印加，温度付与の 3 種類のストレスを加えた．培養

図 1 に本実験の装置概略図と四重電極の拡大図を示

日数は，通常 2 日間でコンフルエントになる細胞を 2，3，

す．本実験はファンクションジェネレーター（33220A,

4，5 日間と培養した．電場ストレスは 1.0×10 cells/ml

Agilent ）で電気信号を出力し，フェーズシフター（ AFIに濃度調製した細胞懸濁液を，強電場発生装置に注入しテクノロジー製）を介して四重電極に電圧を印加する．

電場強度を 6.6，13.3，20.0，26.7 kVp-p/m とし，各条件

フェーズシフターは，ファンクションジェネレーターかともに 30 分間電圧を印加した．強電場発生装置は図 2

ら受け取った電気信号の位相を変化させる．位相の変化に示す．強電場装置は厚さ 1 mm のチタン板を電極としした電圧が四重電極に伝わるため，強電場領域が電極間た．電極の横を厚さ 5 mm のアクリル板，周囲を厚さ 1を回転する．これによって回転電場が形成される．電極

mm のアクリル板で覆った．電極間距離 3 mm の空間に間に配置した粒子は回転電場の影響を受け回転する．こ細胞懸濁液を注入した．なお強電場発生装置は，ジューの回転の様子を顕微鏡（ MT5310L, MEIJI TECHNO Co. ）ル熱の発生を防ぐために周囲を氷水で浸し温度の上昇をで観察し，PC（ Compaq 6000 Pro SF, 日本 HP ）に動画と抑えた．温度ストレスはインキュベータの温度を 39，して保存した．

41，43，45 ℃に昇温し 2 時間静置培養した．各ストレ6誘電回転法による動物細胞の識別と活性評価（桜庭 一樹ら）

59

中心部分に限定した．解析値は 4 つの電極の中心線が交差する点を中心とし，中心から上下左右 50 µm まで 10µm 毎に算出した結果を平均化した．

4.2 分析条件の最適化
本装置は細胞分析装置であるため，より高精度な分析
結果を得るために，電極間距離と印加電圧を変化させ最適実験条件を検討した．サンプル細胞には 3-2H3 細胞を使用した．電極間距離を 200 µm，電極幅 50 µm と電極間距離 300 µm，電極幅 75 µm の 2 条件で検討し，その結果を図 4 に示した．図 （4 a）より電極間距離が短くな
図 2 強電場発生装置
Fig.2 Schematic diagram of strong electric field generator.

ることで細胞の回転速度が増加した．一方，図 （
4 b）の
Im［K
（ω ）
］のグラフでは電極間距離に依存せず同じ値を取った．この結果は，電場強度の 2 乗 E と回転速度が2

ス付加後，細胞数計測の際には，トリパンブルー染色を比例関係にあるためと考察した．
（4）式において回転速用いて生細胞と死細胞をカウントし，その割合から生存

度 Ω と電場強度 E の関係より，電極間距離の短縮で増率を算出した．培養日数ストレスの細胞は播種濃度と培加した分は，互いの増加分で相殺されるため Im［K（ω ）］養後の細胞濃度，経過日数から比増殖速度を算出した．

が同じ値になったと考えられる．また，細胞のカウント

電場，温度ストレスはストレス付加後の細胞を 2 日間培は手動で計測するため，回転速度の増加に伴い標準誤差

養し，播種濃度と培養後の細胞濃度から比増殖速度を算が大きくなった．加えて，電極間距離の短縮は測定範囲出した ．

の減少にも繋がるため電極間距離は 200 µm よりも 300

18）24．実験結果及び考察
4.1 電場解析
誘電回転法では Im［K（ω ）］の算出の際に電極間の電場強度が必要となる．そこで，四重電極間の電場強度は
COMSOL MULTIPHYSICS（ Ver.4.2）を使用して解析した．
解析結果を図 3 に示した．なお，図 3 の電極形状は電極
幅が 75 µm，電極間距離が 300 µm である．電場強度の平均値算出にあたり電極付近は強電場領域が回転するため，平均を算出しても偏差が大きくなる．よって，細胞の測定には電場の時間変化による影響が少ない電極間の図 3 電場解析
Fig.3 Electric field analysis.

図 4 （ a ）回転速度，（ b ）Im［K（ω ）］に及ぼす電極間距離の影響
Fig.4 Effect of the distance between the electrodes（ a ）rotation］．
speed，（ b ）Im［K（ω ）静電気学会誌 第41巻 第 1 号（2017）60µm が適切である．さらに電圧を変えた場合に関しても，電圧を大きくすることで電場強度は増加し回転速度も増加した．この結果，電極間距離と同様標準偏差が大きくなったため，本装置では電極間距離 300 µm，印加電圧
5 Vp-p が最適条件である．

4.3 細胞種毎の誘電特性測 定した 細 胞は 3-2H3 細 胞，iPS 細 胞，MDCK 細 胞，HeLa 細胞，MEF 細胞の 5 種類であり，その結果を図 5に示す．図より Im［K（ω ）］の最大値を取る周波数や，最大値の大きさが細胞種によって異なることが分かった．
Im［K
（ω ）
］
は細胞の導電率や誘電率に依存している．細胞の導電率は細胞質の組成に，誘電率は細胞膜の絶縁効
果に依存すると考えられる．よって，細胞質の組成と細胞膜の状態が細胞種によって異なるために Im［K（ω ）］も異なったと考察した．

図 5 各細胞種の誘電特性
Fig.5 Dielectric properties of each cell type.

］の最大値を取る周波数や上記の結果より，Im［K（ω ）最大値の大きさ利用することで特定の細胞を同定することが可能であると示唆された．また，HeLa 細胞と MEF
細胞の Im［K（ω ）］が類似しているが，この 2 種類に関しては粒子径の違いが明らかに異なることから判別は可能である．

4.4 ストレス付加による誘電特性の変化
3-2H3 細胞をサンプルとして，細胞の誘電特性に及ぼす各ストレスの影響を検討し，その結果を図 6 に示す．

図 6 各ストレスによる Im［K（ω ）］の変化（ a ）培養日数（ b ）電場ストレス （ c ）温度ストレス］by each stress.
Fig.6 Change of Im［K（ω ）（ a ）Cultured day（ b ）Electric field stress（ c ）Temperature stress

培養日数を増やした場合は，培養 3 日目に Im［K（ω ）］は急激に低下し，その後も低下した．電場によるストレスが低下した．温度によるストレスは 41℃，2 時間培養でを加えた場合は，Im［K（ω ）］のピークが 6.6 kVp-p/m で

Im［K
（ω ）
］のピークが低周波数にシフトし，温度の上昇

高周波側にシフトし，電場強度の増加に伴いピークの値に伴ってピークの値が低下した．ストレスの付加方法が

誘電回転法による動物細胞の識別と活性評価（桜庭 一樹ら）
表 1 Single-Shell model による各ストレス（ a ）培養日数（ b ）電場ストレス（ c ）温度ストレス
Table1 Each stress by Single-Shell model.
（ a ）Cultured day（ b ）Electric field stress（ c ）Temperature stress（a）61

パク質の熱変性に依る所が大きいと考えられる．一般にタンパク質は，50℃以上で変性を起こし，高温になるほ
ど短時間で変性を起こす．
一方で 50℃に満たない温度でも長時間培養すれば，変性を起こす．このことからタンパク質が変性したこと

Culturedday

Cytoplasm
relative
permittivity［-］

Cytoplasm
electric
conductivity［ S/m ］

Cell
membrane
capacitance2［ F/m ］

2day

100

3.15 × 10

1.50 × 10

3day

150

3.68 × 10

1.05 × 10120

2.88 × 10

8.46 × 10

組成を解析することで，それぞれのストレスが細胞の部

1102.28 × 10

8.36 × 10

位に及ぼす影響を検証することができた．

4day
5day

-1
-3

-3
-3

-3
-3
-4

-4

で，細胞内の誘電率，電気伝導度が変化したと考えられる．
上記結果から，3 種のストレスで Im［K
（ω ）
］の変化に
違いが生じた．また，Single-Shell model を使い細胞内の4.5 誘電特性と増殖活性の関係

（b）
Added
electricfield［ kVp-p/m ］

Cytoplasm
relative
permittivity［-］

Cytoplasm
electric
conductivity［ S/m ］

Cell
membrane
capacitance2［ F/m ］

Non stress100

3.15 × 10

1.50 × 10

6.6

180

1.90 × 10

9.00 × 10

26.7

190

4.00 × 10

5.98 × 10

Temperaturestress［℃-2h ］

Cytoplasm
relative
permittivity［-］

Cytoplasm
electric
conductivity［ S/m ］

Cell
membrane
capacitance2［ F/m ］

Non stress100

3.15 × 10

1.50 × 1041295

1.68 × 10

2.61 × 1043300

1.30 × 10

2.61 × 10299

8.76 × 10

2.55 × 10

-1
-2

-3

-3
-4
-4

ストレスを付加することで細胞の増殖活性に起因する生存率，比増殖速度と誘電特性 Im［K（ω ）］の関係を検討 し た． 図 7 は， 図 6 で 使 用 し た 各 ス ト レ ス 実 験 50
kHz 時の Im［K
（ω ）
］と生存率
（a）
，比増殖速度（b）の関係を示す．図 7 より細胞の生存率と比増殖速度は，Im［K（ω ）］の低下に伴って低下した．また，ストレスの種類

（c）

45

-1
-2

-2
-3

-3
-3
-3

-3

異なることで Im［K（ω ）］の推移に違いが生じた．この違いが何に起因するものかを調べるため，細胞を細胞膜と細胞質のみで考えた解析モデル Single-Shell model を使い，計算した結果を表 1 に示す ．なお，Single-Shell
6）

model でのフィッティングカーブの値と実験結果との誤差は 1～15％程度である．培養日数の影響は他に比べ細胞質の電気伝導度が培養 3 日目で急激な低下を引き起こした．コンフルエントに達した後の培養は，代謝による乳酸の蓄積等によって培地の pH を変化させ培養環境を悪化させる．培地が酸性側に傾くことで，細胞膜がダメージを受け Im［K（ω ）］が低下したと考えられる ．次に，
19）

電場ストレスの影響は他のストレス付加方法に比べて，細胞膜キャパシタンスが最も低下した．これは電場によって細胞膜が薄くなり，やがて膜破壊を起こすことに関係していると考えられる ．温度ストレスの影響は他の
1）

二つのストレスに比べ細胞質比誘電率の上昇が大きく，
また細胞膜キャパシタンスが唯一増加した．これはタン

図 7 誘電特性と増殖活性の関係（ a ）生存率 （ b ）比増殖速度
Fig.7 Relationship of dielectric properties and growth activity.
（ a ）Survival ratio（ b ）Specific growth rate

静電気学会誌 第41巻 第 1 号（2017）62に依らず，Im［K（ω ）］と生存率，比増殖速度の関係は，

Analysis of electrical property of the animal cell using

一本の近似曲線で引くことができた．これは Im［K（ω ）］dielectrophoresis levitation. Key Engineering Materials, 534が細胞の増殖活性と相関があることを証明しており，本（2013）93

装置は細胞の活性評価も行うことができると示唆され

7） Y. Wakizaka, M. Hakoda, N. Shiragami: Effect of Electrode

た．一方，近似曲線から外れた温度ストレスの結果は，Geometry on Dielectrophoretic Separation of Cells. Biochem.

タンパク質が変性することで細胞内の増殖が低下した可Eng. J., 20［1］（2004）13

能性がある．その結果，通常の細胞の組成から著しく外れてしまったと考えられる ．
19）8） Y. Wakizaka, M. Hakoda, N. Shiragami: Numerical Simulationof Electrode Geometry and Its Arrangement ofDielectrophoretic Filter for Separation of Cells. J. Chem. Eng.

5．結言Japan, 37［7］（2004）908

誘電泳動現象の 1 つである誘電回転法を用いた動物細9） 箱田優，脇坂嘉一，三井信一，北島信義：生死細胞分胞の Im［K（ω ）］の測定の結果，以下の結論を得た．

離のための誘電泳動フィルターの開発．静電気学会誌，（1）5 つの細胞種で Im［K（ω ）］の最大値の大きさ，最大

29［1］（2005）8

値をとる周波数が異なることが明らかとなった．こ10）箱田

優，十枝内元子，脇坂嘉一：細孔絶縁膜付き誘電の結果と粒子径の違いを利用することで細胞種の同泳動デバイスによる細胞の連続分離．静電気学会誌，30定が可能である．

［3］（2005）140（2）細胞にストレス（培養日数，電場，温度）を付加す

11） Y. Hirota, M. Hakoda, K. Wakizaka: Separation characteristic

るとその付加方法で Im［K（ω ）］の低下推移に相違of animal cells using a dielectrophoretic filter. Bioprocess andが生じた．この違いを，解析モデルを用い数値化す

Biosystem Eng., 33（2010）607

ることで細胞内の変化を解析することができた．
（3）ストレス付加による細胞の生存率と比増殖速度の低下が Im［K（ω ）］の低下と相関関係にあることを立証した．これにより細胞の Im［K（ω ）］による活性評
価が可能であると示唆された．

12）M. Hakoda, Y. Wakizaka, Y. Hirota, N. Kitajima: Separation of
viable cells and nonviable cells using dielectrophoretic filter.
Biotechnology Progress, 26［4］（2010）1062
13）M . H a k o d a , T. O t a k i : A n a l y t i c a l C h a r a c t e r i s t i c o f
Chromatography Device Using Dielectrophoresis
Phenomenon. Key Engineering Materials, 497（2012）87

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3） 廣田祐輔，箱田Development of particle packed bed type chromatography（2013）88
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誘電泳動浮揚法による誘電特性の関係．静電気学会誌，

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34（2010）8

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4） Y. Hirota, M. Hakoda: Relationship between Dielectric17）Y. Huang: Membrane dielectric responses of humancharacteristic by DEP Levitation and Differentiation Activity

T-lymphocytes following mitogenic stimulation. Biochimi

for Stem Cells. Key Engineering Materials, 459（2011）84

Biophysica Acta, 1417（1999）51

5） M. Hakoda, Y. Hirota: Correlation between Dielectric Property
by Dielectrophoretic Levitation and Growth Activity of Cells
Exposed to Electric Field, Bioprocess. Biosyst. Eng. 36（2013）1219
6） O. Kobayashi, Y. Umezawa, S. Kanai and M. Hakoda:18）小林

猛 , 本多裕之：生物化学工学，p.52，東京化学同人（2002）19）山本英樹：Wnt シグナル伝達経路の活性制御と発がんとの関連．生化学 80（2008）1079