静電気学会誌，43, 2（2019）78-83

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

大気圧低温プラズマ照射処理を行った
生理食塩水が低酸素脳症モデルラットに与える影響
松田 清香 ，細井戸 健人，小林 千尋，森＊, 1

晃（2018年9月13日受付；2019年2月18日受理）

Influence of Physiological Saline Solution Subjected to Atmospheric Pressure Low
Temperature Plasma Irradiation on Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model Rats＊, 1

Sayaka MATSUDA , Kento HOSOIDO, Chihiro KOBAYASHI and Akira MORI
（Received September 13, 2018; Accepted February 18, 2019）
Atmospheric-pressure plasmas are currently applied in clinical settings such as burn hearing, in many cases, without any
explanation for its mechanism. In preceding studies, it has been reported that the atmospheric pressure plasma generates
angiogenesis of the damaged region. The purpose of our study is whether the atmospheric-pressure plasmas is effective toHypoxic Ischemic Encephalopathy（ HIE）
. Plasma irradiated physiological saline was used as a method of treatment of HIE.
Administration of the plasma irradiated physiological saline improved the part where damage was received by HIE. This effectmay be caused by nitrogen oxide of the physiological saline by plasma irradiation.

1．はじめに認された ．
16）

原子や分子が陽イオンと電子に電離した状態であるプ

具体的な疾患治療の先行研究としては，Drexel 大学よ

ラズマは，エネルギーの極大性・高い活性などの様々なり，プラズマをヒトの皮膚に照射することで難治性皮膚性質を持つことが知られている．近年，大気圧低温プラ病の治癒傾向が報告されている ．また，低温プラズマ
17）

ズマ（気体の温度が室温に近い大気圧プラズマ）の医療の照射によりマウスの腫瘍の増殖を遅らせ，延命効果を応用を目指し研究が行われている ．大気圧低温プラズ

もたらすようながん治療分野の成果も報告されている ．

マは医療分野において材料改質や医療器具の滅菌の他，

本 研 究 で は， 低 酸 素 脳 症（ HIE: Hypoxic Ischemic

生体の組織や細胞などに対して用いることで疾患や創傷

Encephalopathy ） を 対 象 疾 患 と し て 検 討 を 実 施 す る．

部位に対する治療への応用が期待されている

HIE は，有効な治療方法が確立されておらず，効果的な

1）

．

2-7）

プラズマによる治癒効果は，プラズマの性質が関与し18）

治療法の発見が必要とされている疾患である．HIE に対

8-12）．しかし，プラズマによるして大気圧低温プラズマを投与することで HIE の要因

生体の治癒機序については未だ不明な点が多く，明確なとなる脳内の虚血・低酸素状態が改善されれば，脳機能根拠が得られていないのが現状である．

の保持・回復が期待できる．

ていると考えられている

我々の研究グループでは，プラズマによる治癒機序を解

本稿では HIE モデルラットに対して，プラズマ照射処

明する手段として，大気圧低温プラズマを実験動物や細胞理を行った生理食塩水を用いた．プラズマ照射処理を行に照射した実験結果から情報を集めている．大気圧低温プった生理食塩水を投与したことによる HIE への影響とラズマを用いた先行研究より複数の作用が判明した ．ラプラズマ照射を行った生理食塩水に対する検討を通してットに作製した熱傷に対してプラズマ照射した実験では生体，特に HIE に対するプラズマの影響因子の推定を血管新生を伴う熱傷治癒促進作用が確認された．ま行う．なお，生体への投与方法として先行研究にて検証

た，ラットに対してプラズマ吸入した実験では動脈血酸された吸入と，本稿にて提唱する血管内への投与でプラ素飽和度（ SpO2）の増加作用及び血行動態の変化が確

ズマの吸収の過程は同一とはいえない．しかしながら，

13）

14, 15）肺もしくは表皮細胞からプラズマによる産生物が血管内キーワード：大気圧プラズマ，プラズマ医療，低酸素脳症＊
東京都市大学大学院工学研究科生体医工学専攻（〒158-8557 東京都世田谷区玉堤 1-28-1）
Graduate School of Engineering, Major in Biomedical
Engineering, Tokyo City University, 1-28-1 Tamazutsumi,
Setagaya-ku, Tokyo 158-8557, Japan1
g1781424@tcu.ac.jpに吸収される場合と，プラズマによる産生物が血管などに直接導入される場合は，どちらもプラズマによって産生した物質が血管内に含まれる点では類似する箇所があるといえる．つまり，プラズマが持つ何らかの作用には吸入と血管内への投与とで類似する箇所と大きく異なる箇所が両立していると考えられる．

大気圧低温プラズマ照射処理を行った生理食塩水が低酸素脳症モデルラットに与える影響（松田 清香ら）

79（25）

本稿では，初めに HIE について述べ，次に HIE モデルラットの作製方法について述べる．その後プラズマ照射処理の方法及び HIE モデルラットへの投与方法と結果を述べる．
最後にプラズマ照射生理食塩水を用いた実験とその結果を示し，プラズマが HIE に与える影響について考察を行う．

2．HIEとは
HIE は，心停止，窒息などにより脳の血流停止・低下が起き脳で低酸素状態や虚血状態などが継続した結果起図 1 低酸素負荷環境
Fig.1 Schematic diagram of low oxygen load.

こる脳疾患の 1 つである．
新生児期に意識障害や呼吸障害がみられる状態は新生し気温 37℃，酸素濃度 8％，窒素濃度 92％の低酸素環境

児脳症と総称される．新生児脳症は 1,000 人の出生に対下に，2 時間曝露させた．酸素および窒素濃度の調整にし 1～6 人程度で発生する．新生児脳症を発生した場合，は小動物実験用酸素コントローラ（ Oxygen controller，

50～80％は HIE に分類される．脳が低酸素状態，もProOx M110，BioSpherix ）を用いた．本装置は，低酸素

しくは虚血状態に陥った場合，神経細胞や周囲の血管など環境を作製する際は窒素を供給することで濃度調整を行うが障害される．HIE の治療方法としては対症療法しか存在装置であるため窒素ガスボンベと組み合わせて使用した．

しておらず，積極的な治療方法は現状存在しない．また，以上の HIE モデルラット作製処置を行ったラットを本

19, 20）有効な対症療法の一つである脳低温療法は重症の HIE に

稿では HIE モデルラットと呼称する．

効果が少ないことや治療可能な時間が短いことなどの欠点

3.2 生理食塩水への大気圧低温プラズマ照射処理方法も確認されており，より効果的な治療法の発見が必要とさプラズマは，以下に示す方法で発生させた．発生装置れている．このような病態を持つ HIE はプラズマによる生は， 矩 形 波 発 振 器（ Pulse Generator，WAVE FACTORY

体への好ましい影響として挙げられる血管拡張や血管新1941，株式会社エヌエフ回路設計ブロック）・電圧増幅

生の促進，SpO2 の増加が良好に働く可能性が高いと考え器（ HVPS: High Voltage Power Supply，HAVA4321，株式られる．また，HIE の改善が見られた場合にプラズマが実会 社 エ ヌ エ フ 回 路 設 計 ブ ロ ッ ク ）・ ガ ス 流 量 調 節 器

際の生体組織や組織内を通る血管に対しても効果を有す（ MFC: Mass Flow Controller，FCST1005FC-4F2-F1L-H，コ

ることが確認できるため適切な対象疾患であるといえる．

フロック株式会社）を用いた．プラズマの発生時には，次章より HIE モデルラットに対する具体的な検討方法

He ガスを流入させることで He ガスボンベからプラズマ発生部に至る流路内を He ガスで満たした．大気圧低温プラを述べる．

ズマの発生部には，プラズマ発生部の内径が 8 mm，先端3．HIEモデルラットに対する大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の投与

部の内径が 1 mm のガラスキャピラリーを用いた．ガラス
キャピラリー内部には直径 1 mm の円柱形状のタングステ

HIE モデルラットにプラズマ照射生理食塩水の投与実

ン電極を導入し，ガラスキャピラリー外部には筒状のタン験の方法および結果，考察を示す．本稿に記載の動物実

グステン製の接地電極を設置した同軸構造である．電極に

験は本学倫理委員会の承認の下，適切な被験動物の取りパルス幅 100 μs の正負両極パルス電圧を印加させること扱いに留意して行われたものである．

でプラズマを発生させた．本研究で用いる装置は，タング

3.1 HIEモデルラットの作製方法

ステン電極－接地電極間でのみプラズマを放電し生成した実験に使用する HIE モデルラットの作製を行った．本

活性種を，ガラスキャピラリー先端から吹き流す機構であ処置には，1 週齢の新生児ラット（ wistar，SPF ）を使用

る．Fig.2 に大 気圧低温プラズマ発 生装置の概念図を，した．ラットのような齧歯類は低酸素環境に強いため低Table 1 に大気圧低温プラズマの発生条件を示す．

酸素負荷を虚血負荷と共に行った ．
21）

塩化ナトリウム量 4.5 g/500 mL，電解質濃度 Na ，Cl+-

まず，ラットが動かないようにセボフレン（セボフル

各 154 mEq/L，pH4.5～8.0 の生理食塩水（大塚生食注，ラン）を用いて全身麻酔を行った．虚血負荷は左総頸動

大塚製薬株式会社）をプラスチック製の容器（15 W×

脈を 2 回結紮することによって行った．低酸素負荷は，

10 D×20H mm ）に対し 1.6 mL 注入した．また，容器中

低酸素環境に曝露させることで行った．低酸素環境は，の気相に対する外気の流入などの影響を防ぐため容器にFig.1 に示すように保育器を用いた装置に，ラットを収容

対しプラスチックパラフィンフィルム（パラフィルム，

80（26）

静電気学会誌 第43巻 第 2 号（2019）

図 3 脳浮腫
Fig.3 Left brain edema.
図 2 プラズマ発生装置の概念図
Fig.2 Model of atmospheric pressure plasma irradiation to normal
saline.
表 1 大気圧低温プラズマの発生条件
Table 1 Set value of plasma generator.
Gas

Flow

VoltageHe

1（ L/min ）8（ kVp-p ）Frequency

Waveform

Treatment time5（ kHz ）square300（ sec ）Chicago，Pechiney Plastic Packaging Company ）を用いて蓋をした．プラスチックパラフィンフィルムの蓋に対し

図 4 脳萎縮Fig.4 Left brain hemisphere atrophy.

3.4 大気圧低温プラズマ照射生理食塩水のHIEモデルラットへの投与結果てガラスキャピラリーの先端のみが入る穴をあけるよう

前章記載の条件で投与を行った HIE モデルラットに対に刺入した．ガラスキャピラリーの先端は液面より 5して投与 21 日後，病理解剖にて HIE 病態の評価を実施

mm 上方に位置しプラズマの副生成物である活性種を吹した．HIE 発症によって，脳の外見に変化が生じることき付けた．本手法によって処理を行った生理食塩水を本が先行研究より明らかである．よって，脳の外見的変化

稿では大気圧低温プラズマ照射生理食塩水と呼称する．

を確認するために脳摘出を行った．

なお，類似の研究報告として殺菌・がん治療などの効果

ラットに腹腔投与による全身麻酔を行った．細胞・組を目的とした PAM（ Plasma activate medium, 大阪大学，

織の自己腐敗を防ぎ，生きている時の状態に近いまま安名古屋大学）が報告されている．しかし，本研究とは母定化させることを目的に固定を行った．固定法は，10％ガスが異なる点，プラズマ発生条件が異なる点，対象お中性ホルマリン液を使用し灌流法を用いた．

よび対象疾患が異なる点で大きく異なる ．特に対象疾
22）

固定した脳の摘出を行った．先行研究よりモデルラッ

患に着目すると，本研究のように HIE を対象としプラトの HIE 病態として脳浮腫および脳萎縮が確認されてズマによる治療効果を検討する報告は確認されておらいる．Fig.3 に脳浮腫，Fig.4 に脳萎縮を示す．本研究にず，本研究の独自性といえる．

おいて作製されるモデルラットは左総頸動脈を結紮する

3.3 大気圧低温プラズマ照射生理食塩水のHIEモデルラットへの投与方法

ことによる負荷を行っていることから，左脳にのみ病態が確認されることが明らかになっている．そのため対象臓器である脳に近く血管系への吸収が期待される

Fig.3 に示す脳浮腫では，左脳の脳実質が水分に置換し，脳室内投与が HIE モデルラットを生存させた状態で行欠損していることがわかる．Fig.3 の図中に円で囲ったえる投与方法であるためこれを実施した．脳室とは側脳部分は脳実質が水分に置換され，透明化し背景が透けて室・第三脳室・第四脳室のことをいう．脳室液は脳室内いる．また，Fig.4 に示す脳萎縮では，右脳に比べ左脳を循環しており各脳室への投与の差はないと考えられが小さく萎縮していることがわかる．Fig.4 図中に示しる．以下に投与方法を簡潔に示す．

た矢印の長さの左右差からも左脳が右脳と比較し小さ

モデルラット作製処置の直後に 0.05 mL のプラズマ照い．本研究では，CT（ LCT-200，日立アロカメディカル

射生理食塩水を側脳室に投与した．投与は 27 G の注射株式会社）を用いることで左右半球の面積比や左右半球針を用いて頭皮の上から頭蓋を貫き行った．

の直径比を計測することで定量的に判断している．モデ大気圧低温プラズマ照射処理を行った生理食塩水が低酸素脳症モデルラットに与える影響（松田 清香ら）

81（27）

表 2 病理解剖結果
Table 2 Pathological autopsy result.
Brain hemisphere
Atrophy

Edema

Control（ n=6）

0％

100％

Plasma（ n=6）

33.3％

66.7％

ルラット作製処置を行った個体と未処置の個体の左右半球を計測，比較するとモデルラット作製処置を行った個体（ n=10）は 5％～10％の差，未処置の個体（ n=10）は0％～3％の差が左右半球で確認されている．そのため，
本研究では単純 CT を用いて計測を行い左右半球で 5％

図 5 窒素酸化物および過酸化水素の濃度
Fig.5 Content of nitrogen oxide and hydrogen peroxide.
図中のエラーバーは各回 n=4 のデータ区間を示す．

以上差がある場合を脳萎縮としている．Fig.3，4 より脳浮腫は脳萎縮と比較して脳の実質が水分に置換し，欠損の通りの方法で行った．作製した大気圧低温プラズマ照

していることから重度の病態であると考えられる．

射生理食塩水に対し，パックテストおよびデジタルパッ

Table 2 に大気圧低温プラズマ照射生理食塩水を投与

クテスト（共立理化学研究所）を用いて含有されているした投与群と He のみ照射した生理食塩水を投与したコ

亜硝酸イオンと硝酸イオン，過酸化水素の量を測定した．

ントロール群の病理解剖結果の比較を示す．

なお，最も有効性が見込まれる一酸化窒素は不安定な物

Table 2 よりコントロール群では重度の病態である脳浮腫質であり本稿記載の方法では測定できないため，今回はを示す個体のみが確認されたが，投与群ではより軽度の病それに準ずる窒素酸化物を測定した．プラズマ照射によ態である脳萎縮を示す個体が存在することがわかる．つまる生理食塩水中の窒素酸化物および過酸化水素の濃度をり，大気圧低温プラズマ照射生理食塩水を投与することにFig.5 に示す．なお，照射以前の各物質の含有量は，窒

よって HIE の症状が軽減する可能性が示された．

素化合物は検出不能，H2O2 は 0.10 mg/l であった．

また，投与した結果，投与を行った両群とも全ての個

Fig.5 より本稿の実験系を用いて，プラズマを照射す

体が病理解剖を実施する投与後 21 日間まで生存した．

ることによる窒素酸化物および過酸化水素の産生とプラ

3.5 プラズマ照射生理食塩水に対する検討

ズマ照射によって産生された化合物が生理食塩水に溶解

前項よりプラズマ照射生理食塩水を HIE モデルラットする量が得られた．

に投与することで HIE の症状が軽減された可能性があ

結果として，過酸化水素量はヒトおよびラットの血中るという結果が得られた．本章では本稿のプラズマ照射

含有量の下限値と同様であり，血中への投与によって大処理の方法を用いた際のプラズマ照射生理食塩水の特性

きな影響を及ぼす量とはいえず，血中の過酸化水素分解を調査するため行った実験の方法及び結果，考察を示す．

作用によって処理可能なレベルと考えられる ．

3.5.1 大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の含有物
調査実験

23）

また，プラズマ照射による pH の変化についてコンパク
ト型水質計（ LAQUAtwin-pH-11B,HORIBA ）を用いて測プラズマ照射によって生成する物質として窒素酸化物定を実施した．プラズマ照射以前の pH が 6.5 であったの（ Nitrogen Oxides ）が挙げられる．窒素酸化物は，二酸に対し，プラズマ照射後の pH は 6.7 であった．これはプラ化窒素に代表される強い酸化作用による細胞毒性に由来

ズマ照射によって生じた物質によって pH が変化したもの

する生体への悪影響が知られている．しかしながら窒素と考えられる．なお，上記の pH の変化は使用した生理食

酸化物の一種である一酸化窒素においては生体内での生塩水の保証 pH 範囲内であり，かつ照射前後で性質の変化

理機能に関与していることが明らかであり，特に血管拡がないことから個体への影響は限りなく低いと考えられる．

張作用が知られている．これらの物質がプラズマ照射生

3.5.2 プラズマ照射生理食塩水による血球細胞毒性

理食塩水中に確認できることは明らかであるが，その含の調査

有量を調査することで HIE に好影響を与えた因子に窒

前項より大気圧低温プラズマ照射生理食塩水に含まれ素酸化物が含まれるか否かを検討する．また，プラズマる窒素酸化物量を確認した．今回の検討においてプラズの照射によって産生される主要な化合物である過酸化水

マ照射生理食塩水は血中に直接投与されており，細胞お素についても測定を実施し，含有の有無を検討する．

よび生体への悪影響が無いとは断言できない．

大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の作製は前章記載

そこで大気圧低温プラズマ照射生理食塩水とラットの82（28）

静電気学会誌 第43巻 第 2 号（2019）

図 6 混合後の血球数の変化
Fig.6 Changes in the Blood cell count after mixing.
図中のエラーバーは各回 n=3 のデータ区間を示す．

血液を混和させ血球細胞が特異に損傷されるかの調査実

理食塩水を脳室内投与することによって「低酸素脳症の験を実施した．

要因となる現象の緩和」もしくは「低酸素脳症によって

3.2 節に示す方法で大気圧低温プラズマ照射生理食塩

損傷した部位の改善」が起きたものと考えられる．

水を作製した．また，ラットから採取した血液に血液凝「低酸素脳症の要因となる現象の緩和」として挙げら固を防ぐためのヘパリン添加生理食塩水を加えたラット

れる効果は大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の投与にの血液サンプルを作製した．その後，大気圧低温プラズ

よって血管拡張作用が生じ，血流が回復することが仮説

マ照射生理食塩水とラットの血液サンプルを 1：1 の割の 1 つとして挙げられる．この仮説の場合，影響因子は合で混和した．作製した混和物から一定時間経過毎に微

一酸化窒素であると考えられる．実際に大気圧低温プラ

量を抜き出し，顕微鏡を用いて血球を計数した．コント

ズマ照射生理食塩水中には一酸化窒素の半減体である硝ロール群として同様の手順で He 照射生理食塩水を混和

酸イオンおよび亜硝酸イオンの存在が確認されている．

したものを使用した．作製した混和物は赤血球の安定保

しかしながら一酸化窒素は液体に溶けにくく，また不安

存温度である 2～6℃に保って保管し，混和から 2 時間定で半減期が短い物質であることが知られている．これ

経過まで観察を行った．顕微鏡で計数した結果を Fig.6

らを踏まえると必ずしも一酸化窒素が効果の主な影響因に示す．なお図中のエラーバーは各回，計数位置を 3 回子では無い可能性も示唆される．

変更し測定したもののデータ区間のばらつきを指したも「低酸素脳症によって損傷した部位の改善」として挙げのである．また，時間経過による減少量を示すために計られる効果は大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の投与に数した細胞から算出される平均含有血球量では無く，測よって複数の化学物質が脳室内液および脳血管内に生じた定開始時の血球量で正規化した値を用いた．

ことが刺激となり，何らかの内因性作用の興奮を引き起こ

Fig.6 より，大気圧低温プラズマ照射生理食塩水を混すことで細胞の修復が促されたことが仮説として挙げられ和したことによる明らかな細胞の減少を確認することはる．この仮説の場合，大気圧低温プラズマ照射によって生できなかった．つまり，大気圧低温プラズマ照射生理食理食塩水中に生じる物質の経時的な解析とそれが血球や生塩水を混和することによって明らかな血球細胞への毒性

体内環境に及ぼす影響をより精緻に検証する必要があり，はないものと考えられる．従って，プラズマ照射生理食

本研究の結果のみで推定することは困難であるといえる．

塩水の脳室内投与によって赤血球に対する悪影響は存在せず，何らかのプラズマ照射による影響が HIE に対し，

4．おわりにポジティブな効果を示したと考えられる．

本研究は，大気圧低温プラズマ照射生理食塩水を用い3.5.3 大気圧低温プラズマ照射生理食塩水がHIEに与える影響因子の推定
以上より大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の投与に1．HIE モデルラットへの脳室内投与による影響
2．大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の窒素酸化物量
3．大気圧低温プラズマ照射生理食塩水の細胞毒性よる HIE の症状軽減効果と大気圧低温プラズマ照射生理を検討したものであり，その結果，以下の事柄を明らか

食塩水の生体への影響の一端を確認することができた．

にした．

上記の結果を基にすると，大気圧低温プラズマ照射生（1）HIE モデルラットに対する大気圧低温プラズマ照射

大気圧低温プラズマ照射処理を行った生理食塩水が低酸素脳症モデルラットに与える影響（松田 清香ら）
生理食塩水の脳室内投与により，HIE 症状が軽減される．
（2）大気圧低温プラズマ照射生理食塩水中に硝酸イオン・
亜硝酸イオンなどの窒素酸化物が産生されている．
（3）大気圧低温プラズマ照射生理食塩水は明らかな血球
細胞毒性は無く，（1）に示す現象は窒素酸化物によって引き起こされる血管拡張などのプラズマ照射による影響の可能性が示唆された．
これらの効果が発現するメカニズムについては不明である．しかしながら，大気圧プラズマにより生じたイオンやラジカルが空気中の分子や生理食塩水の分子へ衝突する
ことにより，その刺激によって化学反応や物質の合成が促され，それによって産生されたなんらかの因子が細胞増殖の活性化や血管拡張や血流の増加などに関与する内因性
一酸化窒素合成酵素の産生を促しているという説が考えられる．これは，単純に一酸化窒素をバブリングさせた生理食塩水を投与することとは異なり，複雑なバランスで生
理食塩水に変化が生じている可能性を示すものである．
今後は，プラズマを照射することによってどのような作用が生じているのかを調査し，HIE に確認された症状軽減のメカニズムを明らかにしていくことを目標とする．
これらのことが明らかになれば，これまでの消極的な対症療法のみであった HIE の療法とは一線を画する新しい
積極的治療法を生み出すことも可能になるだろう．
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