No.101_'13.qx 13.10.15 14:47 ページ 7

高効率リアルタイムPCR用マスターミックス

KOD SYBR® qPCR Mix
GCリッチ等の難配列の増幅に最適。今まで設計したプライマーを使用可能。
KOD SYBR® qPCR Mixは、KOD DNA polymerase（KOD）を使用したSYBR® GreenⅠ検出系によるリアルタイムPCR用マスターミックスです。3 →5 エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を除去したKOD exo（−）DNA polymeraseと最適化されたバッファー条件を組み合わせることで、KODの『優れた合成能』や『クルード成分の阻害を受けにくい』という性質を最大限に発揮し、安定したリアルタイムPCR解析が可能になりました。

特長1 長鎖ターゲットの増幅が可能（〜2kb）
KOD DNA Polymeraseの特長を活かして長鎖ターゲット増幅での定量性に優れます。プライマーの選択幅が格段に広がり、2kbまでのターゲットであれば、多くの場合今まで設計したプライマーをそのまま用いることも可能です。

M1

2

KOD SYBR® qPCR Mix

3

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（弊社従来品：Taq使用）

増幅曲線解析

104 103 102101100コピー

1.9kb

同一のプライマーを使用

融解曲線解析
電気泳動解析

1： KOD FX Neo
2： KOD FX
3： KOD -Plus- Ver.2

鋳型：ヒトゲノムDNA
ターゲット：TGFβ（1918bp）

図1．長鎖ターゲットに対するリアルタイムPCR（ABI StepOnePlusTM使用）
KOD FXシリーズやKOD-Plus-シリーズで増幅可能なプライマーを用い、約2kbのターゲットの増幅を実施しました。その結果、Taq DNA polymeraseを用いる従来品では増幅困難な約2kbのターゲットでも本製品では定量的な増幅が認められました。

また、2kbまでの様々なターゲット長を選択できるため、幅広い融解曲線解析が可能です。プライマーダイマーの発生領域（短鎖領域）を外して増幅領域を選べるため、エンドポイントアッセイを用いる多型解析、マルチプレックスPCR解析などに有利です。

特長2 GCリッチターゲットに対応
KOD DNA polymeraseを使用することで、Taq DNA polymeraseを用いる従来品では困難であったGC含量が70%を超えるようなターゲットにおいても、定量的な増幅が認められます。
IGF2R（GC含量：83％、鋳型：ヒトcDNA）

KOD SYBR® qPCR Mix

Ａ社製リアルタイムPCR試薬（GC70％以上対応）

5-1希釈

5-1希釈

5-1希釈
5-5希釈

5-5希釈

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（弊社従来品）

5-5希釈

図2．GCリッチなターゲットに対するリアルタイムPCR（ABI StepOnePlusTM使用）
GC含量が70％を超えるターゲットに対し、各リアルタイムPCR試薬による反応性の比較を行いました。鋳型には、弊社の高性能逆転写反応用試薬「ReverTra Ace® qPCR RT kit（CodeNo. FSQ-101）」により合成したHeLa細胞total RNA由来のcDNAを用い、cDNAの5倍希釈（5段階）について、反応を実施しました。その結果、弊社従来品では、増幅困難であったGCリッチなターゲットに対しても、定量的な増幅が認められました。また、反応特異性が高く、プライマーダイマーが生じにくいため、低コピーまでの幅広い定量可能域を得ることができました。

2013

7

No.101_'13.qx 13.10.15 14:48 ページ 8

特長3 クルードサンプルを用いる解析が可能
クルード成分による阻害を受けにくいため、血液やマウステール、植物ライセート等を用いるアッセイが可能です。長鎖増幅やTail配列を付加したプライマーを用いる増幅によるジェノタイピング解析等に応用することができます。

マウステールライセートを用いるジェノタイピング例
アルカリ溶解法
100bp/予測Tm値：79℃
マウステール（約3mm）

Wild type（WT）

マイクロチューブへ

WT用 primer
共通 primer

12

CreER knock-in（KI）

CreER
Cre用 primer

50mM NaOH 180μl添加

341bp/予測Tm値：84℃

Vortexにて良く攪拌

3KI/KI

95℃・10min.
1M Tris-HCl（pH8.0） 20μl添加

WT/WT

Vortexにて良く攪拌
遠心（12,000rpm, 10min.）4※本実験で使用したトランスジェニックマウスのマウステールは、東京大学 分子細胞生物学研究所 情報伝達研究分野
平林祐介先生よりご供与いただきました。

WT/KI20μl反応系に上清0.5〜2μlを添加（マウステールは完全には溶解しません）
6065707580859095

Temperature（℃）

5

図3．融解曲線解析を用いるワンチューブマウスジェノタイピング（ABI 7500使用）
マウステールアルカリ熱抽出液を用い、ワンチューブでジェノタイピング解析を実施しました。WT特異的増幅産物とknock-in特異的増幅産物の増幅長を変えることで、計算上、増幅産物のTm値に差異が生じるように設計しました。WT特異的プライマーは、CreER knock-inに対しては、増幅長が長いため、伸長時間を30秒と短くすることで増幅できないようにしています。また、ヘテロ検出におけるピーク比のバランスをとるために、WT特異的プライマー：knock-in特異的プライマー=1:3として検出の結果、すべてのタイプで増幅が認められジェノタイピングを実施することができました。

特長4 高い特異性
プライマーダイマーなどの非特異的反応を抑えることで、低コピー域までの幅広い定量を可能とします。また、弊社リアルタイ
ムPCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace® qPCR RTシリーズ」を併用することで安定した検出が得られます。

特長5 様々な機器に対応ブロックタイプの機器（Fast Modeにも対応）のほか、ガラスキャピラリーを用いる高速サイクラーにも対応しています。また、
50×ROX reference dyeが別添付されているため、パッシブリファレンスを必要とする機器においても、各機器に適したROX濃度でご使用頂けます。
保存温度

Code No.

価

1ml×1本〔40回用〕

包-20℃

QKD-201T¥9,8001.67ml×3本〔200回用〕-20℃

QKD-201¥32,000（1.67ml×3本）
×5〔1,000回用〕-20℃QKD-201X5¥147,000

品名および内容
KOD SYBR® qPCR Mix
・KOD SYBR® qPCR Mix
・50×ROX reference dye

装格※50×ROX reference dyeがマスターミックスとは、別添付されています。
※包装欄に記載の反応回数は、50μl反応時のものです。容量は、KOD SYBR® qPCR Mixのみ示しています。
※SYBR®は、Molecular Probes Inc.の登録商標です。

装保存温度

Code No.

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

200回用

-20℃

FSQ-101¥38,000

リアルタイムPCR用cDNA合成キット
完全プレミックスタイプ

200回用

-20℃

FSQ-201¥38,000

200回用

-20℃

FSQ-301¥40,000

品包名価格

リアルタイムPCR用cDNA合成キット

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
リアルタイムPCR用cDNA合成キット
完全プレミックスタイプ（ゲノムDNA除去試薬付き）

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover※包装欄に記載の反応回数は、10μl反応時のものです。

82013