No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 16

No.96_'10.qx 10.11.1 19:28 ページ 1

高効率・高成功率PCR酵素

念
発売記 ーンペ
キャン

KOD FX Neo

f

40%of

難配列・Long PCR・
クルードサンプルにお薦め■期間：2010年10月20日〜2011年3月31日（ご注文分）

伸長性、及びクルードサンプルからの増幅効率が格段にアップしました。
KOD DNA polymerase＊は、優れた伸長性を有し、また比較的クル

KOD FX Neoード成分の阻害に強いといった特長を持っています。
「KOD FX」は、この酵素の特性を利用して開発された高成功率PCR酵素であり、難配列やクルードサンプルからの増幅などにおいてご好評いただいております。
しかし、従来のPCR酵素は、20〜30サイクル以降、増幅が持続しなくなる〈プラトー現象〉が生じるため、PCR機能が完全には発揮できてい

0

10
20

ないと考えられていました。KOD FX Neoは「KOD FX」の技術に、弊30社で新たに開発した「伸長エンハンサー」などの技術を応用することで、

40〈プラトー現象〉を抑え、長鎖ターゲット・難配列ターゲットの増幅やクル

図1．伸長エンハンサーの効果

ードサンプルからの増幅の効率をさらに向上させることに成功しました。
＊M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63：4504-4510（1997）

特長1 伸長性アップ
・ゲノムDNAを鋳型として最大40kbの増幅が可能
・30sec./kbの高速サイクルを実現（クルードサンプルでは1min./kbをお薦めしております）
・高GCターゲットなどの難配列の増幅に最適

実施例1 ヒトゲノムDNAを用いた増幅長の比較

実施例2 検出感度の比較従来困難であった、40kbの遺伝子の増幅が可能でした。

ヒトゲノムDNAを鋳型として検出感度の比較を行いましまた、従来品に比べ約半分の時間で増幅が完了しました。

M

1

2

3

（従来品）

M

1

2

3

の向上を認めました。

A社
Long PCR酵素

KOD FX

KOD FX Neo

た。その結果、KOD FX Neoは、従来品に比べ約一桁感度

M

1

2

KOD FX

KOD FX Neo

3

M

1

2

（従来品）

M

1

2

8.5kb

〈伸長時間〉

30sec./ kb

60sec./ kb≦30sec./ kb

M：λ/Hin d Ⅲ Marker
1： tPA 24kb
2： HBg 32kb
3： HBg 40kb

〈伸長時間〉

30sec./ kb

60sec./ kb

M： 1kb DNAラダー
1： 0.1ng
2： 0.01ng

Template：ヒトゲノムDNA 200ng/50μl

Template：ヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 8.5kb【サイクル条件】
KOD FX Neo

KOD FX【サイクル条件】

94℃, 2min.

94℃, 2min.

KOD FX Neo

KOD FX

98℃, 10sec.

98℃, 10sec.

94℃, 2min.

94℃, 2min.

74℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
72℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
70℃, 30sec./kb
98℃, 10sec.
68℃, 30sec./kb

2010

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

74℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
72℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
70℃, 60sec./kb
98℃, 10sec.
68℃, 60sec./kb

68℃, 7min.

68℃, 7min.

4℃, Hold

4℃, Hold

5 cycles98℃, 10sec.
68℃, 4.5min.

5 cycles5 cycles20 cycles

1

4℃, Hold

40 cycles

98℃, 10sec.
68℃, 9min.
4℃, Hold

40 cyclesNo.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 2

特長2 クルードサンプルからの増幅性能アップ
・植物ライセートやマウステールなどからの増幅効率を向上

・従来品同様、グラム陽性菌や酵母、カビなどからの直接PCRが・土壌成分や食品成分などのPCR阻害効果を低減

可能

実施例3 植物のライセートを用いた増幅実施例4 マウステールライセートを用いた増幅の比較

ワンステップ法で調製したタバコの葉のライセートをサンプ

アルカリ溶解法を用いて調製したマウステールライセー

ルとして検討を行いました。今回は、今までの検討で、35サイ

トをサンプルとして、3種類のマウス遺伝子の増幅をクルの条件ではあまり増幅の良くなかった2.2kb及び4.6kb

行いました。その結果、KOD FXとKOD FXのターゲットを増幅しました。その結果、KOD FX Neoを用いNeoでのみ全ターゲットについて良好な増幅ることで、明瞭な増幅を確認することができました。

が認められました。また、増幅効率はKOD FX

2.2kb
M

1

2

M

1

Neoの方が良好でした。

●前処理法（ワンステップ法）

4.6kb
2

1

2

M

4.6kb

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

マイクロ
チューブへ

葉（3mm角）精米（1粒）

2.2kb

A社
A社
クルードサンプル クルードサンプル
対応PCR酵素1 対応PCR酵素2

FX
KOD FX Neo KOD（従来品）

Buffer A 100μl添加し、Vortexにて良く攪拌

3

Buffer A: 100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA

M： 1kb DNAラダー
1： KOD FX（従来品）
2： KOD FX Neo

95℃・10 min.
Vortexにて良く攪拌

Template：
タバコ葉ライセート（ワンステップ法）
1μl
Target：rbcmtT）

5

98℃, 10sec.
68℃, 1min./kb【サイクル条件】

Template：マウステールライセート（アルカリ溶解法）0.5μl

68℃, 1min./kb

右：精米

98℃, 10sec.

30 cycles

マウステール（3mm程度）を96穴プレートに入れる↓ ←50mM NaOH 180μlを加え、蓋をしてVortexにて良く攪拌する↓ スピンダウン（軽く振って液を下に落とす程度でも問題ありません）↓ 95℃, 10min.インキュベート（サーマルサイクラーを使用）↓ ←1M Tris-HCl（pH 8.0）20μlを加え、蓋をしてVortexにて良く攪拌する↓ スピンダウン（軽く振って液を下に落とす程度でも問題ありません）
上清（テンプレート）⇒0.5〜2μlをPCR反応液50μlに添加

35 cycles

4℃, Hold※マウステール切片は、液に浸るようにカットしてください。 ※熱アルカリにご注意ください。
※処理後、マウステールは完全には溶解しません。マウステールの表面が溶ける程度です。
※本方法は、
1.5mlマイクロチューブなどを用いても可能です。

a p.7 User's Noteもご参照ください

実施例5 ジャム（食品）添加実験

実施例6 フミン酸添加実験

加工食品の一例として、ジャムの懸濁液をPCR反応液に添

フミン酸（humic acid）は、植物などの成分が腐植土や加してPCRの阻害の検討を行いました。果物には、多糖をは土壌などにおいて微生物などによって形成されるアルカリ

じめとするPCRを阻害する物質が含まれています。その結果、に可溶で、酸で沈殿する赤褐色ないし黒褐色を呈する、有機

KOD FX Neoが最も阻害に強いことが明らかとなりました。

物であり、PCRを阻害することが知られています。ここでは、

KOD FX

KOD FX Neo
M

94℃, 2min.

96ウェルPCRプレートを用いるマウステール処理法（アルカリ溶解法）【参考文献】
BioTechniques, 19：394（1995）

94℃, 2min.

M： 100 bp DNA ラダー, 1 kb DNA ラダー
1： Mouse TATA box binding protein（TBP）0.5 kb
2： Mouse transferrin receptor（Tfr）1.5 kb
3： Mouse membrane glycoprotein（Thy-1）2.6 kb

4℃, Hold

上清1 μlをPCR反応液に添加（植物組織は完全には溶解しません）
左：葉【サイクル条件】

4

1

2

（従来品）

3 4 M

1

2 3 4

例としてヒトゲノムDNAにフミン酸を混合し、PCRの阻害

A社クルードサンプル
B社
対応PCR酵素 Long PCR酵素
M 1 2 3 4 M 1 2 3 4に関する評価を行いました。その結果、KOD FX Neoが最もフミン酸の阻害に強い傾向があることが分かりました。
A社
B社クルードサンプル
Long PCR酵素
対応PCR酵素FX
KOD FX Neo KOD
（従来品）
M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3

1.3kb
3.6kb
M： 1kb DNA ラダー
1：ジャム上清0μl
2：ジャム上清2μl
3：ジャム上清4μl
4：ジャム上清6μl

添加PCR阻害物質：
イチゴジャム0.3gに100μlのTEバッファーを添加し遠心上清を添加【サイクル条件】

M： 1kb DNAラダー
1：フミン酸添加量＊ 0μl
2：フミン酸添加量＊ 2μl
3：フミン酸添加量＊ 4μl

94℃, 2min.
Template：10ng ヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 1.3kb

98℃, 10sec.
68℃, 1.5min.

30 cycles＊フミン酸：OD280＝1の溶液を使用

4℃, Hold

Template：10ngヒトゲノムDNA
Target：Human β-globin 3.6kb

2【サイクル条件】
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
68℃, 4min.

30 cycles

4℃, Hold2010

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 3

実施例7 コンポスト（堆肥）を用いたメタゲノム解析
コンポスト（堆肥）から、様々な方法を用いて粗抽出したDNA溶液（処理上清）をサンプルとして、原核生物共通プライマーを用いてKOD FX Neo【ターゲット】16s rDNA

M

【プライマー】
Fwd GTTTGATCCTGGCTCA
Rev TACCAGGGTATCTAATCC

1

2

3

rDNAの増幅を行いました。その結果、アルカリ溶解法とワンステップ
法で調製したサンプルを用いた検討において、一般的に広く行われて【サイクル条件】
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
55℃, 30sec.
68℃, 1min./kb
4℃, Hold

いるCTAB法と同程度の増幅を確認することができました（右図）。
続いて、KOD FX NeoのPCRプロダクトは末端が平滑化されているため、専用のTAクローニング試薬「TArget CloneTM -Plus-」を用いてクローニングし、シーケンス解析を行いました。その結果、解析した各96クローンにおいて、良好なシーケンス解析を行うことができました。また解析結果より、それぞれの粗抽出法によって得られた配列は、24〜26 cycles

1 アルカリ溶解法×24 cycles

ほぼ同様の傾向を示しました（アルカリ溶解法やワンステップ法は大2 ワンステップ法×24 cycles

変簡便な方法ですが、はじめて使用される場合は、検出される菌の傾3 CTAB法×26 cycles

向等について、従来の方法と比較などの事前検討をお薦めします）。

M： 100bp DNA ラダー
1： アルカリ溶解法
2：ワンステップ法
3： CTAB法（従来法）

また、アルカリ溶解法によって調製した上清を用いて、様々な増幅試薬を用いて、3種類の共通プライマーを用いてrDNAの増幅を行った
結果、KOD FX Neoが最も良好な結果を示すことが分かりました（下図）。

【ターゲット】16s rDNA
A社
A社
B社
クルードサンプル クルードサンプル クルードサンプル
対応PCR酵素1 対応PCR酵素2 対応PCR酵素

KOD FX Neo KOD FX
M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3

M

1

2

3 M

1

2

3

【プライマー】
1: Fwd ATTAGATACCCTDGTAGTCC
Rev TACCTTGTTACGACTT
2: Fwd AGGGTCATTGGAAACTGGG
Rev CGTGTTGTAGCCCAGGTCATA
3: Fwd GGCCTTCGGGTTGTAAACC
700bp
600bp
Rev CTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGC
550bp

M：100bp DNAラダー
1：原核生物由来rDNA（700 bp）
2：Bacillus sp.由来rDNA（600 bp）
3：High G/C グラム陽性菌由来rDNA（550 bp）

アルカリ溶解法
土壌100mg↓ ←50mM NaOH 180μl↓ Vortexにて良く攪拌↓ 95℃, 10min.インキュベート↓ ←1M Tris-HCl（pH8.0）20μl↓ Vortexにて良く攪拌↓ 遠心12,000rpm, 5min.
上清↓
滅菌水で10倍に希釈し、1μlをPCR反応液50μlに添加

品名および内容【サイクル条件】
94℃, 2min.
98℃, 10sec.
X℃, 30sec. Y cycles
68℃, 30sec.
1 X：50℃ Y：23 cycles
4℃, Hold2 X：60℃ Y：33 cycles
3 X：65℃ Y：33 cycles

ワンステップ法
土壌100 mg
↓ ←Buffer A＊ 100μl↓ Vortexにて良く攪拌↓ 95℃, 10 min.インキュベート↓ 遠心12,000rpm, 5min.
上清↓
滅菌水で10倍に希釈し、1μlをPCR反応液50μlに添加

CTAB法
下記論文に従って実施しました。
J. Zhou et al., DNA Recovery from Soils
of Diverse Composition. Appl. Environ.
Microbiol. 62：316-322（1996）＊Buffer A：100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA

包

装

保存温度

Code No.

価

格

-20℃

KFX-201￥35,000￥21,000-20℃

KFX-201X5￥140,000

対象外

キャンペーン価格

高効率・高成功率PCR酵素＊
200U×1本［200回用］
KOD FX Neo
KOD FX Neo（1.0U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX Neo＊（200U×1本）
×5［1,000回用］
2mM dNTP＊50μl反応を行ったときの反応回数で表示しています。
品

名

高効率TAクローニングキット（KOD用）

TArget Clone™ -Plus-

装

保存温度

Code No.

価

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

包格

KOD FX Neoによって増幅されたDNAの末端は平滑化されていますので、末端を制限酵素処理するか、平滑末端クローニングの手法を用いてクローニン
グを行う必要があります。また専用のTAクローニングキット「TArget CloneTM -Plus-（Code No. TAK-201）」を用いることで増幅産物に直接Aを付加し、そのまま容易にTAクローニングを行うことができます。

2010

3

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 4

ーン
キャンペ

高正確性PCRにお薦め

KOD -Plus- Neof40%off

高正確・高効率・高速PCR酵素■期間：2010年11月25日〜2011年3月31日（ご注文分）

サイクル後半での増幅の鈍化を改善。伸長時間短縮(30sec./kb)で理想的なクローニング用PCRを実現。
KOD DNA polymeraseは、強い3 →5 エキソヌクレアーゼ活性（校正KOD -Plus- Neo

増幅産物の量活性）を有し、正確にターゲット配列を増幅することができるため、クローニン
グ用のPCR酵素として好評いただいております。しかし、高正確性PCR酵素
は、20〜30サイクル以降、増幅が持続しなくなる〈プラトー現象〉が出やすいと言われています。KOD -Plus- Neoは、高正確性PCR酵素： KOD -Plus-0

シリーズの技術に、弊社で新たに開発した「伸長エンハンサー」を応用するこ

1020とでTaqの約80倍というKOD -Plus-シリーズの高い正確性を保持しつつ、

30
サイ
クル
数

〈プラトー現象〉を抑えることにより、微量な鋳型DNAからの増幅や長いター

40

ゲットの増幅効率を格段に向上させることに成功しました。

図1．伸長エンハンサーの効果

特長1 微量な鋳型DNAから正確・効率的な増幅が可能
・伸長エンハンサーを応用することによって、微量な鋳型DNAからでも高正確・高効

KO D - Pl us - Ne o

率に目的遺伝子を増幅することができる

KO D - P l u s - V e r . 2
KO D - P l u s KO D F X
Pfu DNA Po lymera se
A Long PCR
Taq DNA Po lyme ra s e

ようになりました。本酵素は高い正確性（Taqの約80倍）を示し、低コピー数の鋳型からも正確に目的遺伝子を増幅することができます。

0.0

図2．各酵素におけるPCRエラー率の比較

25.0

50.0

75.0

100.0

125.0

150.0

Mutation frequency（PCRエラー率）【KOD -Plus- Neoのサイクル条件】

サンプル：Total RNAから逆転写したcDNA（約50ng）

94℃, 2min.
KOD -Plus- Neo
M

1

2

3

4

5

6

A社 高正確性酵素
7

M

1

2

3

4

5

98℃, 10sec.

B社 高正確性酵素

6

7

M

1

2

3

4

5

6

7

68℃, 30sec./kb

40 cycles

20mer以上のプライマー（Tm値＞63℃）
においては、まず2ステップサイクルをお試しください。検討いらずで、簡単です。

M：1kb DNAラダー
1：Human brk Tyrosine kinase（1.6kb）
2：Human rac protein kinase-alpha（1.7kb）
3：Human 63kDa protein kinase（2.0kb）
4：Human c-syn protooncogene（2.2kb）
5：Human FER Tyrosine kinase（2.7kb）
6：Human cell adhesion kinase beta（3.2kb）
7：Human Jak2 kinase（3.6kb）

図3．様々なプロテインキナーゼ遺伝子の増幅（長いターゲットでより便利になりました）
特長2 増幅時間を短縮〈30sec./kb〉

特長3 幅広いターゲットの増幅

特長4

様々なプライマーで同一温度サイクル条件を実現

・従来品より伸長性が向上し、様々な長さのターゲットを・検討不要のサイクル条件を実現しました。20mer以上

増幅できます。ゲノムDNAで24kbまでの増幅を確認のプライマー（Tm値>63℃）＊においては、まずは2ステしています。

ップサイクルをお試しください。検討要らずで簡単です。
＊Tm値は最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いて計算した値を利用しています。

品名および内容

包

装

保存温度

Code No.

価格

キャンペーン価格-20℃

KOD-401￥30,000￥18,000-20℃

KOD-401X5￥120,000

対象外

高正確・高効率・高速PCR酵素＊
200U×1本［200回用］
KOD -Plus- Neo
KOD -Plus- Neo（1.0U/μl）
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo＊
25mM MgSO4（200U×1本）
×5［1,000回用］
2mM dNTP＊50μl反応を行ったときの反応回数で表示しています。

4

2010

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 5

KOD用高効率TAクローニングキット

TArget CloneTM -PlusKOD専用のTAクローニングキットです。10×A-attachment Mixの別売りもございます。
KOD -Plus- Neo（p.4）をはじめとする高正確性PCR酵素「KOD -Plus-シリーズ」、及びKOD FX Neo（p.1）をはじめとする高成功率PCR酵素「KOD FXシリーズ」などによって増幅されたDNA断片の末端は平滑化されており、通常の方法ではTAクローニング
することはできません。TArget CloneTM -Plus-はそのようなKOD系酵素で増幅されたPCR産物を直接用いて、高効率にTAクロー
ニングすることができます。
また、KOD PCR産物にdAを付加するための試薬パーツ「10×A-attachment Mix」の別売りもございます。この試薬を用いることにより、付属のpTA2ベクター以外の任意のTベクターへのクローニングが可能になります。

特長1 KODのPCR産物に対応
・平滑末端を生じるKODのPCR産物を直接用いてTAクローニングすることができます。

特長2 様々なベクターに対応可能
・別売りの10×A-attachment Mixを用いることにより、任意のTベクターを用いてTAクローニングを行うことが可能です。

KOD -Plus- Neo, KOD FX, KOD FX Neo
M＊＊ライゲーション試薬は、TAクローニング
効率の向上したLigation high Ver.2
をお薦めします。

図1．10×A-attachment Mixの反応原理

図2．任意のTベクターへのTAクローニングフロー■キャンペーン期間：2010年11月25日〜2011年3月31日（ご注文分）
格

キャンペーン価格

包装

保存温度

Code No.

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

対象外

25回用（25μl）-20℃

TAK-301￥12,000￥7,200

10×A-attachment Mix

品名および内容
高正確・高効率・高速PCR酵素

KOD -Plus- Neo
高効率・高成功率PCR酵素

KOD FX Neo
高効率ライゲーションキット

Ligation high Ver.2
高効率TAクローニングキット

TArget Clone™
高効率大腸菌コンピテントセル

Competent high DH5α
サブクローニング用コンピテントセル

Competent Quick DH5α

2010

価

品 名 お よ び 内 容
TArget CloneTM -Plus（pTA2 Vector, 2×Ligation Buffer, T4 DNA Ligase, 10×A-attachment Mix）

包装

Code No.

200U×1本-20℃

KOD-401￥30,000￥18,000

200U×1本-20℃

KFX-201￥35,000￥21,000

750μl×1本-20℃

LGK-201￥22,000￥13,200

10回用

-20℃

TAK-101￥12,000

対象外

0.1ml×10本

液体窒素

DNA-903￥17,000

対象外

0.1ml×20本-80℃

DNA-913￥29,000￥17,400

5

価格キャンペーン価格

保存温度

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 6

製品 KOD FX を用いた実施例

KOD FXを用いた麹菌 Aspergillus oryzaeの遺伝子破壊の確認
データご提供白鶴酒造株式会社 研究開発室

山下伸雄様※本実施例は、第61回 日本生物工学会大会（2009）にて発表されたものです。

麹菌の遺伝子破壊を行った際の確認は、従来、DNAの抽出を伴った煩雑なものであった。今回、KOD FXを用い、麹菌の分生胞子を溶液中で加熱しただけのサンプルを用いて増幅を行い遺伝子型の判定を行った。
実験方法

結

果
遺伝子破壊株を明瞭に判定でき、酵素活性

サ ン プ ル 麹菌の遺伝子破壊候補株の分生胞子が低下していたことから遺伝子の機能を特定サンプルの処理 ①胞子を微量かぎとりBuffer＊（50 μl）に懸濁できた。

＊Buffer：100 mM Tris-HCl（pH 9.5）, 1 M KCl, 10 mM EDTA

3
2
1
Ⅲ
in d 生株 壊株 壊株 壊株
λH 野 破 破 破②95℃10分 →Vortex →上清1μl / 50μl PCR反応液
遺 伝 子 名 推定酸性カルボキシペプチダーゼ（ACP）遺伝子
ターゲット長 3.6〜5.2 kb

5.2kb
3.6kb

破壊カセット
選択マーカーsC

ACP遺伝子

野生型

ORF

図2．麹菌を用いて行ったPCRの電気泳動結果

3.6kb

遺伝子破壊型

お客様からのコメント
sC

従来、麹菌等、糸状菌はコロニーPCRが困難

5.2kb

で、遺伝子破壊株を判定する際、ゲノムDNAを
カセットの外側のプライマー

抽出精製する必要があったが本製品を用いることで、その作業が不要となり、容易に多検体

図1．プライマーの位置と増幅産物のサイズのクローンの遺伝子型を調べることが可能になった。
反 応 液 組 成 滅菌水

10〈μl〉

2x PCR Buffer for KOD FX

252mM dNTPs

10 （final 0.4μM）

10pmol /μl Primer F

1.5（final 0.3μM）

10pmol /μl Primer R

1.5（final 0.3μM）

KOD FX（1.0U/μl）

1 （1U）

前処理サンプル溶液

1

Total

50 μl

サ イ ク ル 94℃,

2 min.

↓
98℃, 10 sec.
68℃,

5 min.

35 cycles

6

2010No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 7

製品 KOD FX を用いた実施例

KOD FXを用いた植物葉からの迅速DNA増幅
データご提供 京都大学大学院 農学研究科 地域環境科学専攻 生物環境科学講座 森林生化学分野

坂本正弘先生KOD FX実施例集に植物の前処理方法として記載されていた、95℃10分間の加熱によるワンステップ法では、目的とする
DNAの増幅が見られませんでした。そこで、ペッスルを用いて葉を破砕する少量多サンプルからのDNA簡易抽出法と、その抽出液を用いる高効率PCRの検討を実験の目的としました。
※ワンステップ法：Buffer A（下記参照）中で葉を95℃, 10min.処理した後、その上清をPCRのサンプルとする方法です。
（p.2ご参照）

実験方法
サ ン プ ル イネおよびタケ類の葉サンプルの処理 抽出液は実施例集に記載されていたBuffer Aと同じです。実施例集に記されていたように、植物の葉を約3mm角にハサミで切断し、マイクロチューブに入れ、これにBuffer Aを100μl加えました。ペッスルによってBufferが緑色になる程度まで葉を砕きました。その後、簡単にスピンダウンし、上清を1μl用いてPCR（50μl）を行いました。

葉サンプル（3mm角）

ペッスル
1μl
PCR

Buffer A：
100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA

スピンダウン

Buffer A

ペッスルを用いる葉サンプルの破砕

遺 伝 子 名 gibberellin 20-oxidase gene

サイクル 【3 Step cycle】
94℃,

ターゲット長 1686 bp

2 min.

98℃, 10 sec.
60℃, 30 sec.

反 応 液 組 成 滅菌水

10〈μl〉

68℃,

1 min.

2x PCR Buffer for KOD FX

25

68℃,

7 min.

2mM dNTPs

10 （final 0.4μM）

10pmol /μl Primer F

1.5（final 0.3μM）

10pmol /μl Primer R

1.5（final 0.3μM）

94℃,

KOD FX（1.0U/μl）

1 （1U）

98℃, 10 sec.

葉の破砕上清168℃,

1 min.

Total

50 μl

68℃,

7 min.

プライマー配列 Primer F: 5'-ATGCGGTGCAACTGCTACCC-3'
Primer R: 5'-TATACCTCCCGTTCGACAGC-3'※イネの遺伝子のDNA配列を基に作成

2010

7

35 cycles【2 Step cycle】
2 min.
35 cyclesNo.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 8

結

果
M

1

2

3

4

5

6

M

M

1

2

3

4

5

6

M

1686 bp
300 bp〈3 step cycle〉

M: DNA Ladder（Broad range）
1: イネ
2: モウソウチク
3: ハチク
4:トウチク5: シホウチク
6: メダケ〈2 step cycle〉

ペッスルで粉砕した方法では、いずれのサンプルにおいてもDNAの増幅が見られました。PCR反応を3ステップで行った場合（アニール温度60℃）と2ステップでおこなった場合を比較すると、2ステップでも増幅効率が若干落ちるもののDNAの増幅が見られました。
実施例集では葉緑体DNAからの増幅であり、コピー数が多いため加熱処理による方法でも増幅が可能であると思われましたが、ゲノムDNAからの増幅には適しませんでした。今回のペッスルによって粉砕した粗抽出液からは問題なくゲノムDNAからの増幅が行えました。また、実施例集にはプライマー長を長めに設定した方がよい、と記載されていましたが、今回は上述した20merのプライマー長でもPCR反応が問題なく行えました。

先生からのコメント
従来、PCR反応の鋳型に使用するDNAは、サンプルを液体窒素によって粉砕し、その後に抽出処理を行わねばならず、操作が煩雑で時間もかかりました。そのため、多数のサンプルを調製するにはかなりの労力を強いられましたが、今回のペッスルによる粉砕法では1サンプルに要するのは、ほんの数秒であり、サンプル数が多くても簡単にPCRできる利点があります。PCRを行う
だけであれば、今回の簡易抽出法によって得た抽出液を鋳型としてKOD FXによる反応で十分です。従来のDNAの抽出操作をすることを考えると時間と労力が大幅に節約できます。

今回のUSER'S NOTEにご紹介しました記事は「KOD FX」を用いたものですが、新商品「KOD FX Neo（p1）」にも充分応用できるものであると考えられます。
今後の、先生方の研究に広くお役立てください。

f

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ペー
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ウイン

対象品

高成功率PCR酵素■期間：2010年11月25日〜2011年3月31日（ご注文分）

KOD FX
包 装
200U ×1本

Code No.
KFX-101

価格
キャンペーン価格¥35,000¥21,000(200U ×1本) ×5

KFX-101X5¥140,000

対象外(200U ×1本) ×10

KFX-101X10¥260,000

対象外

8

KOD FXは、
マウステールライセート、植物ライ
セート、血液など様々なクルードサンプルから直接、高効率なPCRを行うことができます。
実施例は弊社ウェブサイト
（http：//www.
toyobo.co.jp/bio）KOD FXコーナーで公開しております。是非一度ご覧ください。

2010No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 9

免疫反応促進試薬Can Get Signal® immunostainを用いた免疫染色における固定法の検討
京都大学大学院 薬学研究科 生体情報制御学分野 高橋 千絵 先生
はじめ に
Rab11は、細胞表面からのエンドサイトーシスやその後のリサイクリングに重要な役割を果たす低分子量GTPaseであり、主としてリサイクリングエンドソームに局在します。しかしながら、蛍光免疫染色法に適した有用な抗体がなく、内在性Rab11の局在や、細胞内での機能を詳しく調べることが阻まれてきました。前回、本誌（vol.95 p11-12 Technical Reviewの項）において報告しまし
たように、免疫染色用「Can Get Signal ® immunostain」を用いることによって、従来法では検出が難しかったRab11のシグナルを検出することが可能になりました。
一方、exocyst複合体は、エキソサイトーシスにおける細胞内小胞の細胞膜への繋留（tethering）や融合（fusion）に関与することが知られており、構成サブユニットにsec15やExo70などがあります。sec15やExo70などの細胞内局在は、その機能から主に細胞膜近傍にあると考えられてきましたが、蛍光免疫染色法に適したexocystサブユニットに対する有用な抗体はなく、不明瞭でした。生化学的解析からはRab11とsec15の直接結合が報告されています。
今回私たちは、Exo70のシグナル検出に免疫染色用「Can Get Signal ® immunostain」が有用であることを確認しました。さらに、複数の固定法との組み合わせにも免疫染色用「 Can Get Signal ® immunostain」は有効であり、これにより、Rab11とExo70が核周辺とそこから伸びたチューブル様構造で共局在することを初めて見いだしました。

方

法

1. 細胞
カバーグラス上でHeLa細胞を培養し、48時間後固定しました。
（3.へ続く）2. Rab11のノックダウン（siRNA）
35×35 mmディッシュでHeLa細胞を培養し、24時間後にRab11aおよびRab11bに対するsiRNA、または、Exo70に対す
るsiRNAをトランスフェクションしました。その24時間後に細胞をカバーグラス上にまき直し、さらに48時間後（トランスフェクシ
ョンの72時間後）に細胞を固定しました。
（3.へ続く）3. 固定〈PFA固定〉培地を除き、37℃に温めた4%パラホルムアルデヒド溶液で10分間浸して固定しました。PBSで3回洗浄後、50 mM塩化ア
ンモニウム溶液で20分間クエンチンングし、PBSで3回洗浄し、0.1% TritonX-100/PBSで5分間処理した後、さらにPBS
で3回洗浄し、2% BSA/PBSで4℃一晩ブロッキングしました。
〈TCA固定〉培地を除き、氷冷した10%トリクロロ酢酸で15分間浸して直ちに固定しました。PBSで3回洗浄後、0.1% TritonX100/PBSで5分間処理した後、PBSで3回洗浄し、2% BSA/PBSで4℃一晩ブロッキングしました。
〈PFA固定＋TCA固定〉
PFA固定、クエンチングを行った後、氷冷した10%トリクロロ酢酸で15分間浸して固定しました。PBSで3回洗浄後、0.1%
TritonX-100/PBSで5分間処理した後、PBSで3回洗浄し、2% BSA/PBSで4℃一晩ブロッキングしました。
4. 1次抗体反応
1次抗体をCan Get Signal ® immunostain（Solution A） あるいはブロッキング液（2% BSA/PBS）で希釈（Rab11は200倍、Exo70は10倍）し、サンプルと4℃で一晩反応させました。反応後、PBSで3回洗浄しました。
〈1次抗体〉
抗Rab11モノクローナル抗体：マウス（BD Biosciences）
抗Exo70 モノクローナル抗体：ハイブリドーマ上清（Dr. Shu-Chan Hsu； Mount Sinai School of Medicine, New
Yorkより分与していただきました）

2010

9

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 10

5. 2次抗体反応
ブロッキング液で2次抗体を1,000倍希釈し、サンプルと室温で1時間反応させました。反応後、PBSで3回洗浄しました。
〈2次抗体〉
AlexaFluor ® 488標識抗マウスIgG抗体（Molecular Probes®）
AlexaFluor® 488標識抗マウスIgG2b抗体（Molecular Probes®）
AlexaFluor® 555標識抗マウスIgG2a抗体（Molecular Probes®）
6. 封入・観察
サンプルをFluorescent Mounting Medium（Dako）で封入し、蛍光顕微鏡観察をしました。顕微鏡はCarl Zeiss社製のAxiovert 200 MATを使用しました。

結果及び考察
図1は、細胞をPFA固定またはTCA

Rab11

固 定 し 、抗 R a b 1 1 抗 体 を 2 %BSA（従来法）

BSA/PBS（従来法）またはCan Get®

Can Get Signal immunostain Solution A

Signal ® immunostain Solution A
で希釈したときのRab11染色像をそれぞれ比較しています。PFA固定サンプ
ルでは、従来法でもCan Get Signal®

immunostain Solution Aを使用した

P
F
A
固
定

場合でもRab11のシグナルはほとんど検出できませんでした。TCA固定サン
プルでは、従来法ではほとんど検出できませんでしたが、Can Get Signal ®
immunostain Solution Aを使用する
ことにより、細胞質に散らばったエンド
ソーム様構造と核周辺およびそこから伸びたチューブル様構造のシグナルが顕著に認められました。また、このシグ

T
C
A
固
定

ナルはsiRNAを用いたRab11ノックダ
ウン細胞ではほぼ完全に消失しました（本誌vol.95 p11-12 Technical
図1．従来法とCan Get Signal ® immunostainを用いたときのRab11染色像の比較

Reviewの項参照）。
一方、同様な条件でのExo70の染色像を比較しました（図2）。PFA固定サ

Exo70

ンプルでは、従来法でほとんど検出でBSA（従来法）きなかったExo70のシグナルは、Can®

Can Get Signal immunostain Solution A

Get Signal ® immunostain Solution
Aの使用により、細胞質に散らばったエ
ンドソーム様構造と核周辺およびそこから伸びたチューブル様構造などが顕著に認められ、Rab11シグナルと酷似していました。このシグナルはsiRNA

P
F
A
固
定

を用いたExo70ノックダウン細胞ではほぼ完全に消失しました（ data notshown）。TCA固定サンプルでは、Can

Get

Signal ®

immunostain

Solution Aによりわずかなシグナルの増加が認められました。

T
C
A
固
定

図2．従来法とCan Get Signal ® immunostainを用いたときのExo70染色像の比較

10

2010

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 11

このように、Rab11とExo70ともにCan Get Signal ® immunostain

Exo70

Solution Aで劇的なシグナル増加を認めることができました。
しかしながら、両者の至適固定法が異なるため、同時に検出して共局在の有無を確かめることはできませんでした。そこで、PFA固定に引き続きTCA固定を行い、同時検出が可能かどうかを検討してみました。その結果、Rab11もExo70も顕拡大

著にシグナルを検出でき、両者が核周辺とそこから伸びたチューブル様構造

Rab11

で共局在することが確認できました
P
F
A
固
定
＋
T
C
A
固
定

（図3）
。

拡大

merge

拡大

図3．PFA固定＋TCA固定を行いCan Get Signal ® immunostainを用いたときのRab11とExo70の共局在の検出

以上の結果から、以下のことが明らかとなりました。
1）Can Get Signal ® immunostainは、従来法では難しかったRab11やExo70のシグナル検出を増強させ、それらの内在性
局在を明らかにすることができました。
2）Can Get Signal ® immunostainは、PFA固定にもTCA固定にも有効であることがわかりました。
3）PFA固定、TCA固定のように、抗体によって異なる固定法が有効な場合、PFA固定を行った後にTCA固定を施すことによって、両タンパク質のシグナルを同時に検出することが可能になりました。この場合も、Can Get Signal ® immunostainは有効であり、両固定法の利点を生かしながらシグナルを増強させることができました。

f

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30タ%
ペー
ーキャン

ウイン

対象品

免疫反応促進試薬■期間：2010年11月25日〜2011年3月31日（ご注文分）

Can Get Signal ® immunostain
内容
Solution A&B 各5ml×1本
Solution A
20ml×1本
Solution A （20ml ×1本）
×4
Solution B
20ml×1本
Solution B （20ml ×1本）
×4

Code No.
NKB-401
NKB-501
NKB-501x4
NKB-601
NKB-601x4

価格¥12,000¥30,000¥70,000¥30,000¥70,000※0.2％以下のノニオン系界面活性剤を含みます。

2010

11

キャンペーン価格¥8,400¥21,000
対象外¥21,000
対象外

Can Get Signal ® immunostainは、免疫組織・細胞染
色などの感度と特異性を改善する機能を有するバッファーです。
使用方法は、
現在希釈液に用いている希釈血清やブロ
ッキング溶液を本溶液に変更するだけです（Solution AとBは免疫反応の促進作用が異なり、両試薬ともに1次抗体および2次抗体にご使用いただけます）。
⇒詳しくはhttp：//www.toyobo.co.jp/bioをご覧ください。

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 12

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メールアドレスの登録はこちらから

https：//secure.toyobo.co.jp/bio01/html/cai/cai̲form.html

弊社ウェブページ
1 （www.toyobo.co.jp/bio）2

お問い合わせ・ご請求・
3 資料請求情報配信依頼4

CAI初代細胞ロット
情報配信依頼

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受付のメールが返信されます。

このメールをプリントアウトして保管しておいてください。ご発注の際の申込用紙になります。
東洋紡からCAI 製品情報の配信を開始いたします。
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情報例

Lot.＃

Donor Information
Age

Sex

Race

SourceF-abdominal

Year/Week Gesteron

Human Dermal
MicrovascularEndothelial Cells（CADMEC）adult

1941

47

2023

28

F

C

breast

2092

49

M

C

facial

2306

50

F

C

facial

2322

36

F

C

abdominal

2460

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CAI製品をご注文ください。その際上記の受付メールのプリントアウトを代理店様にお渡しください。
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（割引のご利用は1回のみとなります）

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入力いただきました個人情報につきましては、弊社で責任をもって管理し、お客様への情報提供のみに使用させていただきます。

12

2010

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 13●学会出展のご案内
下記の日程で、製品、パネル、資料の展示を行います。ブースには製品に詳しいスタッフがおりますので、ご質問などがございましたら、その場でお気軽にお尋ねください。BMB2010では、新製品のご紹介を兼ねた、楽しいイベントを企画しています。学会にお越しの際は是非、弊社ブースにお立ち寄りください。

日本動物実験代替法学会第23回大会
期間：2010年12月3日（金）〜12月5日（日）会場：北里大学薬学部1号館・コンベンションホール
日本分子生物学会・日本生化学会 合同大会（BMB2010）
期間：2010年12月7日（火）〜12月10日（金）会場：神戸国際展示場（神戸ポートアイランド）●実施例集のご案内
高成功率PCR酵素『KOD FX』、免疫反応促進試薬『Can Get Signal ®』を用いた実験例をまとめた、実施例
集をご用意しております。弊社ウェブサイト

のコーナーからご請求いただけます。ぜひご活用ください。

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弊社では、様々なお買い得情報、エッセイ、クイズなどを盛り込んだ、有用でお楽しみいただけるメールマガ
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弊社ウェブページ
1 （www.toyobo.co.jp/bio）

https：//secure.toyobo.co.jp/bio01/html/bionews/bionews̲form.html

2010

13

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 14

実験川柳特集 12
本コーナーは、弊社ウェブサイト（www.toyobo.co.jp/bio）「読者のコーナー」で最新の作品を確認いただけます。
そ【句評】それは悲しい事実ですね。問題が解決できたからなのか、れとも…。詮索したくなりますね。

●YANAGIさんのコメント：卒業後、研究室のホームページを見たら自分の研究していたテーマが消えていました。
（先輩談）【句評】 私もそれを感じたことがあります。特に夜にあの音を聞いていると意識が遠のきそうになったりします。酸素の供給よりも、
あの振動の心地よさが菌の生育に効いていたりして。とても美しい句なので採用させていただきました。
●シノさんのコメント：温浴で揺られる大腸菌は気持ちよさそう…
【句評】私も経験あります！ 逆に、ゲルを流し込んでいるときにすべてが固まってしまうパターンも悲しいですよ。だから最近、
プレキャ
ストゲルがもてはやされているのかも知れませんね。

●もこさんのコメント：すぐに使おうと作っておいたゲルが全く固まっていなくて、コームを抜いた瞬間に思わず呆然として自分が固まってしまう様子 。
【句評】なんとも生活臭のする川柳ですね。
しかも、リアルです。徹夜
はお肌にも悪いので、実験もほどほどに。でも、「クライマーズ
ハイ」ならぬ「実験ハイ」というのもありますよね。

●ぽんぽんさんのコメント：徹夜明けはドロドロです…

⇒弊社ウェブサイト（読者のコーナー＞ご投稿コーナー）からご投句いただけます。
ご投句はこちらから

弊社ウェブページ
1 （www.toyobo.co.jp/bio）

2

読者のコーナー3

ご投稿コーナー

http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/reader/contribute/index.html
採用になった方には、￥2,000の図書カードと認定証をご進呈いたします（詳しくはサイ
トをご覧ください）。奮って投句ください。

NOTICE TO PURCHASER :LIMITED LICENSE●PCR関連商品のラベルライセンスについての詳細は、弊社ウェブサイト
（www.toyobo.co.jp/bio）をご覧ください。

●本ページ掲載の試薬類は全て一般研究用の目的にのみ販売しており、医薬品、診断用医薬品、化粧品、食品用等には使用できませんので、十分ご注意ください。誤用による事故については、当社は一切の責任を負いません。
●本ページ掲載商品の価格（弊社希望価格）には消費税は含まれておりません。
実際のご購入価格については弊社代理店へお問い合わせください。
●本ページ中の略号：毒 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
劇 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
危 印は消防法に基づく危険物です。
組 印は「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（カタルヘナ法）に基づく組換え体または昆虫細胞組換え体で生産された蛋白質です。

14

2010

No.96_'10.qx 10.11.1 19:29 ページ 15

高効率・
高成功率PCR酵素

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10
20
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プレゼント
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バイオ・クロスワードパズル 〜元素編〜
1

5

a

7

4
2

ヨ
コ
の
カ
ギ

6

1. 窒素とリンと並んで植物の肥料に含まれる三大要素の一つです。
アルカリ金属に分類されます。英語で?
2. 甲状腺ホルモンに含まれるハロゲンの一種です。
3.エビやカニの血液の成分の一つであるヘモシアニンに含まれる金属です。
ちなみにヘモグロビンでは鉄がその役割を果たします。

bd4. 転写因子等の補因子としてしばしば用いられる金属です。DNAとの結合に関与します。
finger という独特の構造が良く知られています。

c

タ
テ
の
カ
ギ

5. 生体に重要な電解質のひとつで、ヒトではその大部分が細胞外液に分布している重要なアルカリ金属です。海の成分としても大量に含まれています。
英語で?
6. 毒性を示す常温で液体の金属です。体温計などに使われます。
7. DNAポリメラーゼ等の補因子として働くアルカリ土類金属です。PCRの時に加えますよね。ニガリの主成分の一つです。

3【以下の選択肢の中から選んでください】
LEAD ZINC IRON COPPER

寒い夜はやっぱり、熱燗と

a

b

c

d

CALCIUM

SODIUM

POTASSIUM

IODINE COBALTNATRIUM MERCURY

KARIUM

MAGNESIUM

MANGANESE

バイオクロスワードパズルの解答に加え、UPLOADのアンケート（下記クイズコーナーに記載）にご回答いただいた方から抽選で、5名様に2,000円分の図書カードをご進呈いたします。

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2

読者のコーナー3

クイズコーナー

http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/reader/quiz/index.html◆◆ 納期・注文に関するお問合せ ◆◆ライフサイエンス事業部（大阪）〒530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目2番8号
TEL.06-6348-3786 FAX.06-6348-3833
E-mail order̲lifescience@toyobo.jp

ライフサイエンス事業部（東京）〒141-8633

東京都品川区東五反田二丁目10番2号
東五反田スクエア
TEL.03-6422-4819 FAX.03-6422-4951
E-mail order̲lifescience@toyobo.jp◆◆ 製品内容・技術に関するお問合せ ◆◆テクニカルライン
TEL.06-6348-3888 FAX.06-6348-3833
開設時間：9：00〜12：00 13：00〜17：00（土・日・祝を除く）
E-mail tech̲osaka@toyobo.jp［URL] http：//www.toyobo.co.jp/bio
Ａ4443Ｋ/2010/11/20,000/1