ChromaNik

新技術・新製品セミナー

C18,C8で保持や分離は何が決めて？
前代未聞のカラムの知識①

疎水性の高い固定相は保持が大きい？

②

濡れている，濡れていない(non-wetting)？

おまけ，エンドフィッティングの差異『こんなことがあるのか！』（クロマニックテクノロジーズ）
長江 徳和
1

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疎水性Methane (C1)

Octane (C8)Octadecane(C18)

Triacontane(C30)

分配係数(LogP)

1.09

5.18

9.18

14.09

水への溶解度 (mg/L)

22.6

0.66

0.006

8.84×10-10

疎水性(LogP)はn-オクタノールと水への分配比率により定義される
C30は最も疎水性が高いが，これは水への溶解度が低いことが大きく影響する.
化合物の保持予測として用いられる化合物は，一般的にLogPが1から6の間のものである.
2

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C18固定相の保持
1C18, 2.3 μmol/m2,%C=17%

Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=(98:2)

2

Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ºC

4811216 min

C18, 1.2 μmol/m2,%C=11%

Detection: UV @450nm
Sample: 1= Tocopherol
2= Tocopherol acetate2481216 min

固定相の体積（結合密度）が半分になると保持もおおよそ半分になる.
3

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逆相固定相の選択性および保持O
H3CO

CH3OHNN
N

CH3N

CH3CH3

固定相

炭素含有量

C3018%C1818%

C811%

C14.5%

Phenyl8%

Cyano7%

水素結合性

疎水性

疎水性

立体選択性

α(カフェイン/フェノール）α(アミルベンゼン/ブチルベンゼン）

アミルベンゼンの保持係数α(o-ターフェニル/トリフェニレン）

0.50

1.72

18.90.34

1.68

19.7

0.29

1.55

0.51
0.69
0.48

9.4

1.432.3

1.38

2.5

1.160.4

1.73
1.440.89
0.990.87
1.97★固定相：シリカ基材の細孔径，12nm，一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水=70/30，温度：30℃

C8固定相はC18固定相に比べ固定相体積（炭素含有量）は約半分であり，アミルベンゼンの保持も同様に約半分である.
4ChromaNik

固定相の体積（結合密度）が半分になると保持もおおよそ半分になる.

C8固定相(%C=11%)はC18固定相（1.2 μmol/m2,%C=11%）とC8固定相はC18固定相に比べ体積は半分であり，アミルベンゼンの保持も半分である.

体積（炭素含有）も，保持も同じである.

5ChromaNik

保持係数(k)と分配比（Kd)SD x VS
Sk==M
MD x VMSD
Kd =MD

S: 固定相中の溶質の存在量
M：移動相中の溶質の存在量
SD：固定相中の溶質の分配濃度
MD: 移動相中の要旨値の分配濃度
VS：固定相の体積（容積）VM：移動相の容積

C8固定相(%C=11%)とC18固定相（1.2 μmol/m2, %C=11%）は固定相体積(VS)が同じで保持係数(k)も同じであるので，分配比（Kd)も同じ値になる.
6

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固定相の体積が2倍異なるC18固定相の保持係数(k)と分配比（Kd)
固定相

炭素含有量

結合密度

固定相体積

移動相体積

C18 (A)17%

2.3 μmol/m2

0.4 mL

1.6 mLC18 (B)11%

1.2 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mL
4.6x150mmカラムを使用

C18（A, B)は同じ固定相なので，分配比（Kd)は同じだと仮定する.
C18 (A) の場合

C18 (B) の場合

kAkB

0.4ｘ 0.25

0.25 Kdｘ 0.13

0.13 Kd

1.60.23
1.77

C18(A)はC18(B)の約2倍の保持係数になる.
7

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固定相の体積が異なる場合＜＜同じ固定相では分配濃度比が同じと仮定する（固定相/移動相=1）＞＞

例えばC18(%C=18%)
移動相への分配量(0.5)

移動相と固定相への分配濃度比は同じであるため，分配量の比(k)は体積比となる。

移動相

k=0.5/0.5=1

固定相

固定相への分配量(0.5)

固定相の体積が半分のC18（％C=9%)
移動相への分配量(0.75)

k=0.25/0.75=0.33
固定相への分配量(0.25)
8ChromaNik

固定相の体積が同じC18とC8固定相の保持係数(k)と分配比（Kd)
固定相

炭素含有量

結合密度

固定相体積

移動相体積

C18 (A)17%

2.3 μmol/m2

0.4 mL

1.6 mLC18 (B)11%

1.2 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mL

C811%

2.4 μmol/m2

0.23 mL

1.77 mL
4.6x150mmカラムを使用

C18とC8固定相分配比（Kd)はKdC18, KdC8
C18 (B) の場合

C8 の場合kC18
kC80.23ｘ 0.130.13 KdC18ｘ 0.130.13 KdC8

1.770.23
1.77

C18(B)とC8の保持係数は同じであるため， KdC18とKdC8も同じである.
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逆相固定相の選択性および保持OH3COCH3OHNNNCH3NCH3CH3

固定相

炭素含有量

C3018%C1818%

C811%

C14.5%

Phenyl8%

Cyano7%

水素結合性

疎水性

疎水性

立体選択性

α(カフェイン/フェノール）α(アミルベンゼン/ブチルベンゼン）

アミルベンゼンの保持係数α(o-ターフェニル/トリフェニレン）

0.50

1.72

18.9

0.34

1.68

19.7

0.29

1.55

0.51
0.69
0.48

9.4

1.43

2.3

1.38

2.5

1.16

0.4

1.73
1.44
0.89
0.99
0.87
1.97

★固定相：一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水=70/30，温度：30℃

・炭素一個の差（アミルベンゼンとブチルベンゼンの分離係数）はアルキル鎖長と相関があるように見える.
・しかし保持時間が大きく異なる分離での比較である.
10ChromaNik

炭素一個の差の分離係数
C30C18C8アルキル鎖長が長いほど分離係数（α）は大きい.

しかし

C1
保持時間を一緒にすると炭素が一個異なる成分（トルエン，エチルベンゼン）の分離係数（α）は同じである.

カラムサイズ：4.6×150㎜
移動相：メタノール/水、有機溶媒濃度は図中に表示
流 速：1.0 mL/min，温度：30℃，
試 料：1=メチルパラベン，2=エチルパラベン，3=ベンゼン，4=トルエン，5=ナフタレン，6=エチルベンゼン

保持が同じ場合の炭素一個の差の成分の分離係数を固定相の疎水性と定義すれば，アルキル鎖長の差は疎水性に関係しない.11

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メタノール・水移動相におけるアミルベンゼンとフェノールの保持◆標準試料の分離例
2 3454521345Sunniest C18 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.38716253032Sunniest C8 %C:10%

1520Retention time/min

32Sunniest C8 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.41716102153Sunniest C30 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.40

6Sunniest C18 %C:16%

3107Sunniest C30 %C:16%

12◆ピリジンとフェノールの分離

35Column: Sunniest C18, C30, C8, 5µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine, 3 = Phenol,
4 = Butylbenzene, 5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene, 7 = Triphenylene

C30固定相もC18固定相お同じ炭素含有量であれば保持は同じである.

0246Retention time/min

8Column: Sunniest C18, C30, C8, 5µm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil, 2 = Pyridine, 3 = Phenol

フェノールはどの固定相でも保持はほぼ同じである. これはフェノールが固定相表面でのみ相互作用するため，実際に作用する固定相の体積が同じになるためである.12

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試料とC18固定相の相互作用場：メタノール

メタノール・水移動相

C18

C8

アミルベンゼンはオクタデカンに可溶
OH

フェノールはオクタデカンに難溶
13ChromaNik

まとめ
1. C30, C18およびC8の固定相自身の疎水性は大きく異なる.
2. しかし固定相と移動相に分配する溶質から論じた場合，この溶質の分配(濃度)比はどの固定相でもほぼ同じである.
3. つまり，固定相体積と固定相への溶質の分配量（分配濃度が同じであるため）はほぼ比例し，保持も同様に比例する.
4. 保持係数(k)は固定相と移動相の分配(濃度)比(Kd)で決まるわけではなく，分配濃度に固定相・移動相の体積・容積を乗じた固定相中と移動相中に存在する溶質の量により決まる.
5. もちろんアルキル鎖長の違いにより，選択性は異なる.
6. フェノールのような極性の高い成分は固定相の表面とのみ相互作用する
ため，固定相の体積は関係なくなり，表面積が保持係数に関わってくる.

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逆相アルキル基は立ち上がっている，寝込んでいる？
濡れている，濡れていない(non-wetting)？
逆相HPLCにおける水または緩衝液のみの移動相を用いた分析の問題点

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水移動相ではODSカラムの保持が減少する
特にポンプを停止した後は大きく減少
条件
カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
流速: 1.0 mL/min
１時間通液停止後再度通液し測定

温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

保持時間：5.40minから0.41minに減少

再現性がない16

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アルキル基の寝込みによる説明
1999年，アルキル基の寝込みによる保持減少の記述
Mobile phase: Acetonitrile/water =10/90

固定相は移動相で濡れている。
アルキル基は立ち上がっている.
水でカラムを洗浄すると，アルキル基は寝込んでしまう.
これをBondedphase collapseと表現している.
再び移動相を流しても寝込みのため，保持は小さくなっている.
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現在の移動相の細孔からの抜け出しによる説明
2013年，アルキル基の寝込みによるDewettingの結果，移動相は抜け出る
水移動相ではアルキル基は寝込んでしまい，Phase collapseがおこる。Phasecollapse状態になると移動相と濡れなくなり，移動相は細孔から抜け出す.

RONALD E. MAJORS, LCGC North America, Jul 1, 2013

アルキル基は立ち上がっており，固定相は移動相で濡れている.移動相は細孔から抜け出さない.

Dewetting とは１）アルキル基が立ち上がっている
状態がWetting２）アルキル基が寝込んだ状態になるとnon-wetting１の状態から２の状態に変化する事をDewettingと表現している！or？
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Dewettingとは？

http://www.mynewsdesk.com/uk/northumbria-university/pressreleases/its-delightful-its-dynamic-its-dewetting-1582445

Dewetting とは接触角が大きくなること！！
細孔から液体が抜けることではない！！
実は移動相を換えない限り，逆相固定相表面と移動相の接触角は変化しない！！
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他社のDewettingの説明
実は固定相表面は移動相で濡れていない。
毛管作用で抜け出そうとする圧力以上の圧がかかっているので，細孔に留まっているだけである。
Dewetting
Phenomenon

毛管作用で抜け出そうとする圧力以下の圧まで下がると，細孔から抜け出る。
これは毛管現象である。

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毛管現象とは（岩波 理化学辞典 第5版）

液体中に細い管（毛細管）を立てると、管内において液面が管外よりも上がりまたは下がる現象。液体分子間の凝集力と液体と管壁の間の付着力との大小関係により，液体が管を濡らす（付着力が大きい）ときは液面は上昇し、濡らさないときは下降する。管の内外の液面の高さの差をh、管の半径をr、液体の密度をρ、液体の表面張力をγ、接触角をθ、重力加速度をgとすれば、h=2γcosθ/rρgとなる。
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毛管現象
Capillarity, Capillary phenomenon
水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合

毛管現象の式:h=2γ cosθ /(rρg)γ : 表面張力
ρ: 液体の密度(比重)θgrhrhθ

液体が管に濡れる場合
θ < 90°液体が管に濡れない場合
θ > 90°22

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毛管現象
内径0.5mmのガラス管10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006気圧である。内径が1μmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。
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水100%移動相条件下で保持が減少する理由
カラム内のC18充塡剤粒子

移動相：水充填剤に圧力がかかっている場合ポンプを停止し充填剤に圧力がからなくなると細孔内に移動相が浸透している状態

細孔内から移動相が抜け出た状態

Permeating

Expelling
Depermeating
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疑問その５ C18表面と30%メタノールは濡れるか？
上から見た場合それぞれの溶液にC18充填剤を混ぜ、超音波の振動を加えながら撹拌混合した.
・70%メタノールでは超音波の振動を加えなくても完全にC18充填剤が分散する. 分散後沈降し始める.

横から見た場合（濡れるため，細孔内に溶液が入り込み分散する）

・50%メタノールでは一部分散している.
（超音波振動を加えない場合は全く分散しない）（濡れないため，細孔内に溶液は入り込めない）

・30%メタノールでは全く分散していない.
（濡れないため，細孔内に溶液は入り込めない）
メタノール/水(30:70)(50:50)(70:30)T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

発表者の回答：メタノール濃度が50%以下の溶液はC18表面に濡れないため、細孔内に入り込めない. しかし，圧力をかける，また100%メタノールで濡れている状態から溶液を切り替えた場合には30%メタノールでも細孔内に入り込み，その後大気圧にしても細孔から抜け出すことはない.
濡れ性は固定相の寝込み(Phase collapse)で決まるのではなく，移動相（溶液）により決まる.
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疑問その６ 大気圧が低ければC18カラムから移動相は抜け出すか？
カラム: C18 250x4.6mm
模擬大気圧: 0.01MPa
カラム温度: 40 ℃

＊真空ポンプでカラム内の圧力を大気圧以下にし、20分間放置＊充填剤細孔から移動相が抜けた場合にはカラムの重量が変化＊70%以上のメタノールをカラムに通液した場合は0.01MPaでも充填剤細孔からの移動相溶液の抜け出しはほとんど認められず，50%以下では移動相溶液は抜け出している.
＊70%以上のメタノールではC18充填剤が濡れるため，毛管作用により細孔内へ入り込む力が働き，充填剤細孔から溶液は抜け出ないが、50%以下では濡れないため，抜け出そうとする.

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)0-0.05

発表者の回答：毛管作用とは，濡れる（接触角が90度未満）場合には毛細管内に入り込む力が働き，逆に濡れない（接触角が90度より大きい）場合には毛細管から抜け出す力が働くことである.
メタノール濃度50％以下の濃度ではC18充填剤の細孔内から移動相を抜き出す力が働く. その力が0.01MPaより大きいため左図に示されているようにカラムから移動相溶液が抜け出す.
通常10％以上のメタノール濃度の移動相を用いれば，保持の減少は起こらない. これはC18充填剤細孔内から移動相溶液を抜け出させる圧力が大気圧（1気圧）より低いためである.

-0.1
-0.15
-0.2
-0.25
-0.3
-0.35
-0.4
-0.45
-0.5
02040

60

80100

メタノール/水移動相のメタノール濃度(%)
N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU Vol. 59, No. 3, 193 (2010).

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ChromaNik疑問その８ Dewetting は起こっているのか？
C18固定相，メタノール：水(70:30)移動相

固定相は移動相で濡れている
Wetting 保持の変化はない

C18固定相，メタノール：水(50:50)移動相
C18固定相，メタノール：水(30:70)移動相

固定相は移動相で濡れていない
Non-wetting 保持の変化はない

C18固定相，水移動相

固定相は移動相で濡れていない
Non-wetting 保持は変化する

発表者の回答：固定相が濡れている（Wetting）と濡れていない(Non-wetting)は，固定相の状態が変わると言うよりも，移動相溶液が異なることにより，濡れている状態と濡れていない状態になることである. メタ
ノール：水(70:30)移動相溶液はC18固定相に濡れるが，メタノール：水(30:70)移動相溶液や水はC18固定相に濡れない. したがって，Wetting 状態からNon-wetting 状態への変化は溶液の組成比の変化で起こっており，C18固定相の状態が変化しWetting 状態からNon-wetting状態に変わっているのではない.
移動相溶液の組成の変化でWetting からNon-wetting なることをDewetting と言うのであればDewetting は起こっている. しかし通常は溶液組成を変えることにより，濡れ性が変化することをあえてDewetting と言わないと思われる. また固定相の状態の変化で，初めは水に濡れており，試料は保持するが，その後時間の経過とともに水には濡れなくなり，試料の保持が減少するのであれば，Dewetting は起こっている. しかし実際には後者のような現象は起こっていない.
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まとめ
逆相固定相に移動相溶媒が濡れない場合，毛管作用で移動相溶媒は充填剤細孔から抜け出す力が働く.
その力（圧力）が大気圧より大きい場合に細孔内から移動相溶媒は抜け出る.
Dewetting の意味の定義をしかりと定める必要があると思われる。Wetting とNon-wetting状態は確認できるが，移動相溶液が変わらなければ， Wetting からNon-wetting状態への変化は起こらない.
水移動相を用いた場合の逆相カラムのさまざまな現象については下記の総合論文に詳しく記載されている.

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エンドフィッティングの違い
A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

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A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

ChromaNik

A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

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IDEX社IsoBarと同じ接続のカラム

SunShell, Halo, PoroShell,
Ascentis Express, Perkin Elmer SPP,
Kinetex, CosmoCore, ClassicShell,
MeteoricCore, UltraCore, OpalShell,
Capcell Core

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