分離選択の大幅な改善：高温･有機溶媒が有する知られざる能力㈱ クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和

1

高耐熱性POST-X2 C18の開発• 近年，2µm以下の微小粒子径充填剤を充填した超高速HPLCカラムが市販されはじめている• 微粒子化は高性能化の有効な手段ではあるが，装置側のリスクが大きく，また，汎用HPLCではその能力を十分に引き出すことはできない• 高温下で使用することができれば拡散係数を大きくでき，高分解能を得ることができるが，一般的なシリカ系逆相固定相は50ºC以上での長期使用は不可能である• クロマニックテクノロジーズは，シリカ系逆相固定相の耐熱性向上を目的として，有機シリケートグラフトによる基材シリカゲルの改質を行い，60°Cで十分に使用可能なC18カラムであるPost-X2 C18を開発した
2

酸性/アルカリ性下でのシリカゲルの分解
R

R
Si

H3C

O

CH3CH3Si

Rin AcidR
Si

H3C

CH3CH3SiRR
Si

OOO

O

Si

Si

Si

Si

O

OO

O

O

O

O

H3C+H

CH3CH3Si

H
H

OOSi

O

O官能基の切断

OO

Si
O

OO

Oin Alkaline
基材の切断
H3C

CH3CH3Si
OO

R

H3C

Si

OH

OSi
O

R-Si
O

O

CH3CH3 R
Si
H

Si

O

O

O

Si
O

O

O

H3C

R

O

R

O
Si

Si
O

CH3CH3Si

O

O

O

R

H

Si

O

O
Si

O

HOO

3耐熱性シラン化合物
GC用固定相に用いられている
CH3CH3O

CH3O

O

Si

nR1Si
CH3OnSiO

R2m

Poly[dimethylsiloxane]

Poly[alkylsiloxane]/[dimethylsiloxane](OV-1, SE30…)(phenyl:OV-5, OV-17, cyano/phenyl:V-225, OV-1701…)
CH3O

CH3CH3SiSi

CH3CH3R1OnSiO

R2m

R=

C3H6CN

Silarylene (silphenylene) type
アルキル・アルキレン基の導入で耐熱性・化学的安定性が向上する?!
4

有機シリケートグラフト型固定相（Post-X2 C18)の推定構造
疎水性官能基(C18)

炭素含有量:15%

TMS

R1R1OSiOSi

R2R2CH 2CH 2SiO

SiOOSiOSiOSi

R2R2OSiOnSi

CH 2O

CH 2CH 2O
CH 2SiOOSiSiO

R2R2OO3 ∼ 4層OOSiSiOSiOOSiOR1R1OOSiSiOOOOOSiOOCH 2R1R1OCH 2SiTMSOO

シリカの物性値
比表面積：340m2/g，細孔容積：1.0mL/g，細孔径：12nm
580ºC-pH 3.0における理論段数と保持時間の変化
120

相対理論段数（ ）相 対 保 持 時 間 （ ）/ %1008060Conditions
Post-X2 C18, 5μm 150 mm x 4.6 mm i.d..

40

Mobile phase: ACN/ 50 mM acetic acid pH3.0=40:60
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 80 oC

2000100200300
通液時間 / hour

400500650ºC-pH 10における理論段数の変化
120

相対理論段数（）/ %1008060Conditions
Post-X2 C18, 5μm40150 mm x 4.6 mm i.d..

Mobile phase: ACN/ 50 mM TEA + HCl pH10.0=40:60
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 50 oC

2000100200300
通液時間 / hour

4005007カラム温度を上げるとどうなるか？
★溶質の拡散係数が上がる★吸脱着速度が速くなる★移動相の粘度が下がる
三環系抗うつ剤のような比較的分子量の大きく拡散係数の低い試料は
NH

N

CH3ノルトリプチリン

CH3CH3アミトリプチリン

理論段数が上昇，更に対称性も向上
高粘度有機溶媒も10MPa以下の低圧で使用可能になる

溶出順序が逆転することもあり，分離が改善

8

各温度における線流速と理論段高との関係
102倍

H/dp

8642020

4060

80

100

udp/Dm,25F.D.Antina and C. Horvath, J. Chromatogr., 436， 1-15 (1988)。

9温度と粘度および拡散係数との関係
η = α exp(β/T)η25TDm = Dm,25・ η298
η:粘度，T:絶対温度， D：拡散係数10温度と分析時間の関係
カラム圧，段数を一定となる条件
1.0tR/ tR,250.8

0.6

0.40.2

50

100

150

200

Temperature (°C)
F.D.Antia and C. Horvath, J. Chromatogr., 436， 1-15 (1988)。

11カラム温度による理論段数と対称性の変化
260

2

アミトリプチリン/メタノール

240

相対理論段数 (%)

1200

対称性

1.5220トルエン/メタノール
アミトリプチリン/1,4-ジオキサン

1800.5160

トルエン/1,4-ジオキサン

1400

アミトリプチリン/メタノール

120-0.5100

アミトリプチリン/1,4ジオキサン

80-11520253035 40 45
温度（℃）

50556065

カラム： Post-X2 C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：メタノール/2０mM リン酸緩衝液pH7.5 (80:20)
1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液ｐH7.5 (65:35)
流速：1.0 mL/min

12

60 ºCと20 ºCでのクロマトグラム
メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(80:20)

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(65:35)

552

160 ºC

N=10300
As=1.21

N=8700As=1.1942

143135230244520 ºC

12

N=5700As=1.51

68101214
Retention time / min40123

N=4700As=1.62345678Retention time / min

カラム: Post-X2 C18, 5μm, 4.6 x150 mm.
カラム温度: 60 ºC, 20 ºC 検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロプラノロール, 3=トルエン, 4=ノルトリプチリン, 5=アミトリプチリン 13

高粘性溶媒による選択性の変化
82% メタノール

η=0.6, 3.7 MPa
δ=12.9, δd=6.2 775234Peak 5246

1. ウラシル
2. カフェイン
3. フェノール
4. ブチルベンゼン
5. o-ターフェニル
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ
7. トリフェニレン
810Retention time / min

カラム: Post-X2 C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.

η=1.54, 6.5 MPa
δ=9.8, δd=7.856610Peak768% 1,4-ジオキサン

10423246568

10Retention time / min14

高粘性溶媒の使用－選択性のコントロールⅠ
77523164752
1 34602446723
178

10602465

58% 2-プロパノール
1η=2.338.0 MPa
2
δ=10.2
δd= 7.2

54570% エタノール
η=1.2
6.1 MPa
δ=11.2
δd= 6.8

6,723121 382% メタノール
η=0.6
3.7 MPa
δ=12.9
δd= 6.2

54 646874% アセトニトリル
η=0.37
2.3 MPa
δ=11.8δd= 6.5
67% 1,4-ジオキサン
η=1.546.5 MPa
δ= 9.8δd=7.849% THF
η=0.55
5.5 MPa
δ= 9.1δd=7.61015

選択性のコントロールⅡ
263

メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(81:19)

5142631エタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(66:34)

542
163

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(63:37)

540

12

34567Retention time / min

カラム: Post-X2 C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,6=アミトリプチリン

16pHによる保持の変化
2,56pH3.0

pHの上昇に伴い，
13

プロピルパラベン保持減少
4ノルトリプチリン，アミトリプチリンの保持増加

2 3pH7.06514236pH10.0 1

540123456789Retention time / min10

カラム: Post-X2 C18, 5μm, 4.6 x 150mm
移動相: メタノール/20mMリン酸緩衝液. (80:20)
カラム温度: 40 ºC
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン
17温度，pHの効果
2pH10.0,pHを上げる

40 ºC

635140246

N=8500As=1.25
N=6800As=1.40825 N=5500
402428Retention time / min

pH＜温度

N=8300As=1.3063

N=10800
As=1.1551

As=1.696

ピーク形状への効果

pH7.0,60 ºC

63

移動相: メタノール/20mMリン酸緩衝液. (80:20)
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン

12

温度を上げるpH7.0,40 ºC
110

カラム: Post-X2 C18, 5mm, 4.6 x 150mm

N=8500As=1.30

4101202468101218

まとめ• カラム温度を60°Cに設定するだけで，理論段数が上がり，対称性が向上する• さらに，高粘度有機溶媒をカラム圧力を気にすることなく使用でき，選択性を大きく変化させることが可能となる• つまり一本のカラムで性能向上させ，しかも選択性を大きく変え，最適な分離条件を簡単に導き出せる19