コアシェル型充填カラムの固定相の展開とその使用例
クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和、塚本 友康
Norikazu Nagae, Tomoyasu
Tsukamoto
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp
1シェルコア型シリカの歴史(1) J.J. Kirkland, F.A. Truszkowski, C.H. Dilks, and G.S. Engel, J.
Chromatogr., A 890, 3–13 (2000).
(2) J.J. Kirkland, T.J. Langlois, and J.J. DeStefano, Am. Lab. 39,
18–21 (2007).

2

二種類のコアシェル構造のシリカ粒子

モノレイヤー（単層）多孔質構造

マルチレイヤー（多層）多孔質層構造

SunShellシリカのコアシェル構造の概略図
0.5 mm

0.5 mm

2.6 mm

2.6 mmコア

コア1.6 mm

多孔性シリカ部多孔性シリカ部
粒子径：2.6 mm，コア径：1.6 mm，多孔質層の厚さ：0.5 mm
細孔容積：0.30 mL/g，比表面積：150 m2/g，細孔径：9 nm
多孔性シリカの体積の割合：77%

4コアシェル型充填剤SunShell
コアシェルシリカ
粒子径 細孔径 比表面積 炭素含有量(nm)(m2/g)(%)(mm)
SunShell
C18SunShell
C8SunShell
PFP
SunShell
PhE
SunShell
RP-Aqua
SunShell
C18-WP

結合相
結合相2.69150

7C182.69150

4.5C82.69150

4.5

Pentafluorophenyl

2.69150

4

Phenylethyl2.61690

4C282.61690

5C18使用最高圧
60 MPa or
8,570 psi
60 MPa or
8,570 psi
60 MPa or
8,570 psi
60 MPa or
8,570 psi
60 MPa or
8,570 psi
60 MPa or
8,570 psi

使用pH
範囲
1.5 - 10
1.5 - 92-82-82 – 8a)
1.5 - 10a) SunShell RP-Aquaカラムは水移動相で使用できるため、有機溶媒を含まない緩衝液での使用pH範囲を示す。

標準試料の分離比較
1243
15243
12,32,31

SunShell PhE (phenyethyl)Hydrogen Hydrophobicity
Steric(Amylbenzene/bonding
selectivity

SunShell PFP

62457

SunShell C867230SunShell RP-Aqua

2Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine,
3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

73
1765654SunShell C18-WP (16nm)

674

1755SunShell C184
468

1061214

16

Retention time/min

1820

2224

(Caffeine/Phenol)

Butylbenzene)(Triphenylene/o-Terphenyl)

C18-WP

0.40

1.55

1.35

RP-Aqua

0.52

1.52

1.30

PhE

1.00

1.38

0.93

PFP

1.00

1.31

2.38

C80.32

1.46

1.08C180.39

1.60

1.46

オキシンとカフェインの保持比較
21SunShell C18-WP (16nm)Column dimension: 150 x 4.6 mm

Mobile phase: CH3CN/20mM H3PO4=10/90
2Flow rate: 1.0 mL/min
SunShell RP-Aqua Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 8-Quinolinol (Oxine)
2
2 = Caffeine
SunShell PhE (phenyethyl)1121SunShell PFP
21SunShell C821012SunShell C1834Retention time/min

5678910

SunShell RP-Aqua の40 oCでの保持
核酸塩基の分離

25 ºC

123421（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

5チミンの相対保持時間(%)

40 ºC

40℃でのチミンの保持時間の変化

5340123Retention time/min

4Column: SunShell RP-Aqua, 2.6 mm 75 x 4.6 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25 ºC
Sample: 1 = Cytosine, 2 = Uracil, 3 = Thymidine,
4 = Uridine, 5 = Thymine

1009080706050403020100Initial

1234

ポンプ停止ごとの保持時間測定回数
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，SunShell RP-Aquaほとんど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，94%以上の再現性を示しました。

SunShell C18-WPとRP-Aquaによるペプチドの分離
SunShell C18-WP

SunSehll RP-Aqua

Column: SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm,
SunShell RP-Aqua, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: %B 0% – 100% in 35 min
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC, Detection: UV@210 nm,
Sample: Tryptic digest of myoglobin

SunShell C18-WPとRP-Aquaによるタンパク質の分離
2421SunShell C18-WP

313444SunShell RP-Aqua

Column: SunShell C18-WP, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell RP-Aqua, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: %B 0% – 100% in 35 min
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@210 nm
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = Myoglobin, 4 - Ovalbuminキサンチン類の分離比較
3SunShell
1C18Water
241SunShellPFPSunShellPFPSunShell
PFP0132Water

412123432434Retention time/min

20mM
phosphatebuffer pH750mM
phosphatebuffer pH75SunShell C18, PFP 2.6 mm 150 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/water or buffer=30/70
Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Theobromine
2 = Theophyline
3 = Caffeine
4 = Phenol

SunShell PFPはC18に比べ極性の高いカフェインを強く保持します。また塩濃度の調節で分離を変えることができますキシレンの異性体の分離
3SunShell C18

213SunShell PFPSunShell C18, PFP 2.6 mm 150 x 2.1 mmMobile phase:
CH3OH/water=75:25 for SunShell C18
CH3OH/water=60:40 for SunShell PFP
Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = o-Xylene
2 = m-Xylene
3 = p-Xylene

210

123Retention time/min

45

SunShell PFPは異性体の分離についてもC18と異なる分離パターンを示します。

クロゾールの異性体の分離
1,2SunShell C18

3123
SunShell PFP

Column:SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell PFP, 2.7 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC
Sample:1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

C18カラムではp-クレゾールとm-クレゾールは分離不可能ですが、PFP は分離可能です。

水溶性ビタミンの分離
SunShell RP-AQUA
1Column:
N(4)=30,800 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase:N(3)=31,800
40mM Phosphate buffer pH6.8
43Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
2Sample:1 = Nicotinic acid,
2 = Pyridoxal,
3 = Pyridoxine,
4 = Nicotinamide

核酸塩基の分離比較
Sunniest RP-AQUA
12Column:
Sunniest RP-AQUA 5 mm 150 x 4.6 mm
SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: Water
Flow rate: 1.0 mL/min for Sunniest
1.5 ml/min for SunShell
Temperature: 24ºCSample: 1 = Cytosine
2 = Uracil
3 = Thymidine
4 = Uridine
5 = Thymine

534SunShell RP-AQUA
21345Plate(5)Resolution (4,5)

Sunniest

14,000

1.98

SunShell

30,0003.79

ヌクレオチドの分離の分離
2 SunShell RP-AQUA
1N(2)=37,900
Column:N(4)=30,000 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
4Mobile phase:
320mM Phosphate buffer pH6.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCDetection: UV@250nm
Sample: 1 = 5’-GDP,
2 = 5’-ATP,
3 = 5’-ADP,
4 = 5’-AMP

高速分離例
724835100.20.460.6

Retention time/min

0.8

1Column: SunShell C18 2.6 mm, 30 x 3.0 mm.
Mobile phase: A) Wtaer, B) Acetonitrile; Gradient(Acetonitorile %), 0.00 min - 35%, 0.40 min 100%, 0.80 min - 100%, 0.85 min - 35%, 1cycle;
1.8min, (High-pressure gradient).
Flow rate: 1.0 mL/min.
Temperature: 40 ºC.
Injection Volume: 1 µL.
Wavelength: 200 - 500nm, CH-9, 215 - 500nm(Max Abs.).
Sample: Mixture of ultraviolet absorbers,
1 = 2,2’,4,4’-Tetrahydroxybenzophenone,
2 = Ethyl p-aminobenzoate,
3 = 2, 4-Dihydroxybenzophenone,
4 = 2,2’-Dihydroxy-4-methoxybenzophenone,
5 = 2,2’-Dihydroxy-4,4’-dimethoxybenzophenone,
6 = 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone,
7 = 2-(2’-Hydroxy-5’-metylphenyl) benzotriazole,
8 = 4-tert-Butylphenyl salicylate.
Courtesy of Jasco.

SunShell RP ガードフィルター（C18結合カートリッジフィルター）Tubing0.13mmID,60mm
lengthHolder

BeforeAfter
Cartridge
filterbondedwith C18☆均一な細孔径を持つモノリス型ガラスフィルター（直径4mm,厚さ4mm）にC18を結合☆夾雑物の捕捉によるカラム圧の上昇防止やC1８結合相による吸着物の除去など、種々の逆相カラムのガードカラムとして利用可能☆カートリッジ式で交換が容易☆ホルダーを含めローデッドボリューム仕様（2.1x50mmカラムで5%の段数低下、4.6x150mmカラムで1%の段数低下）☆内径2.1mm～4.6mmカラムに使用可能☆SunShell RP Guard Filterの圧力損失は１ｍL/minで約0.1MPa、またGuard Filter 本体の耐圧は60MPa☆SunShell以外の逆相カラムにも汎用的に使用可能☆アミトリプチリンのような塩基性化合物もテーリングのないシャープなピーク形状

SunShell RP Guard Filterの性能評価
SunShell C18, 2.6 mm 50 x 2.1 mm
Without Guard Filter

SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
Without Guard Filter

Mobile phase:
CH3CN/H2O=60/40 for 2.1 mm
CH3CN/H2O=70/30 for 4.6 mm
Flow rate:
0.3 mL/min for 2.1 mm
1.8 mL/min for 4.6 mm
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250nm
tR(3) = 2.57 min Sample: 1 = Uracil
With Guard Filter
N(3) = 8,786
2 = Toluene
5% の段数低下
3 = Acenaphthene
4 = ButylbenzenetR(3)= 2.46 min
N(3) = 9,239

With Guard Filter

0123Retention time/min

4501tR(3)= 3.24 min
N(3) = 39,345tR(3) = 3.26 min
N(3) = 38,940
ほとんど変化なし

23Retention time/min45

まとめ
コアシェル型SunShellカラムはC18, C8, PFP, PhE,C18-WPおよびRP-Aquaの六種類の固定相が利用可能
全多孔性充填剤と同様にコアシェル型充填剤も固定相を換えるこることにより異なった選択性が得られる
PFP固定相は極性化合物の相対保持が大きいことや異性体の分離がC18より優れていることが示された
サブ2mm粒子と同等な高速分離がコアシェル型
SunShellカラムでも達成された
C18結合型ガードフィルターはガードカラムとしても使用でき、高性能なカラムでも段数低下は最低限であった
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