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No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 1

発売 ン
ー
ャ
キ ンペ

f

30%of

リアルタイムPCR用cDNA合成キット

ReverTra Ace® qPCR RT Kit■期間：2007年7月17日〜2007年9月28日（ご注文分）
一部のリアルタイムPCR用マスターミックスも30%OFFキャンペーン対象です。

リアルタイムPCR用のcDNA合成に最適化された逆転写キットの登場です。
ReverTra Ace® qPCR RT Kitは、
リアルタイムPCR用鋳型cDNA作製に最適な、簡便かつ高効率な逆転写反応キットです。本キッ
トは、弊社高性能逆転写酵素『ReverTra Ace®』を使用しているため反応効率に優れます。また、
リアルタイムPCRのターゲットとな
るcDNAを網羅的かつ効率的に合成できるように反応組成が最適化されています。本キットでは、これらの改良により、約15分の反応
で十分なcDNAを得ることが可能です。さらに、キット構成も簡素化されており、より簡便に作業を進めることができます。

特長1 抜群のcDNA合成効率
・ReverTra Ace® qPCR RT Kitは、高性能逆転写酵素『ReverTra Ace®』を使用し、またリアルタイムPCR用のcDNA合成に最適化された反応バッファーと、最適な混合比を持つプライマーミックスを採用することにより、幅広い
ターゲットに対して条件検討を行うことなく網羅的に高効率な逆転写反応を行うことが可能となりました。

特長2 短時間・簡便なプロトコール
・ReverTra Ace® qPCR RT Kitは、わずか15分の逆転写反応で、幅広いターゲットに対して効率的に逆転写反応を行うことができます。また、
リアルタイムPCRにおいて反応阻害の要因となる残存鋳型RNAの除去においても、追加的なRNase H処理を必要としません（特許出願中）。

特長3 リアルタイムPCR試薬との適合性向上
リアルタイムPCRの反応系への逆転写反応液の持込の影響を最小限に抑えるよう改良さ・ReverTra Ace® qPCR RT Kitは、れており、最大20%（V/V）を反応液に添加した場合でも優れた直線性を示します。よって、低発現mRNAの検出にも最適です。

実施例1 他社品とのcDNA合成量比較
HeLa細胞由来のtotal RNA 100ngを鋳型として、各社キットをそれぞれの推奨条件に従って使用し、逆転写反応を行いました。続いて、
リアルタイムPCRの反応液（弊社SYBR® Green Realtime PCR Master Mix使用）に上記逆転写反応液をそれぞれ1%（V/V）で添加し、リアルタイムPCRによるβ-ActinとPolymerase εのcDNA量の定量を行いました。その結果、本キットを用いることで、両ターゲットにおいて最も高い収量が得られることが示されました。

ReverTra Ace® 弊社従来品
qPCR RT Kit （Randomプライマー）
15min.
10min.
20min.

弊社従来品

A社キット

B社キット

20min.

15min.

10min.
30min.

図1．cDNA合成量比較
図下の数値は、逆転写反応の温度と時間を示します。

87

C社キット

D社キット

（Oligo（dT）プライマー）

1

15min.

10min.
2hr.

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 2

実施例2 RNase H処理の有無による検出感度比較
ReverTra Ace® qPCR RT KitとRNase H別添タイプのB
社cDNA合成キットを使用し、それぞれ推奨プロトコルに従って逆転写反応を実施しました（B社キットはRNase H処理あり/なしの両方を実施）。実施例1と同様の方法を用いてβ-Actinの増幅を比較した結果、B社キットではRNase H処理をしなかった場合では、検出感度の大幅な低下が認められましたが、ReverTra Ace ® qPCR RT Kitによる反応では、追加的な
RNase H処理なしでも高い検出感度を示しました。ここには示しませんが、本キットを用いた場合は、RNase H処理した場合も感度は同等でした。
〈本キットはRNase H処理の工程を含みません〉
図2．RNase H処理の有無による検出感度比較

実施例3 鋳型RNA量の添加量に対する合成効率の検討
ReverTra Ace® qPCR RT Kitの反応系（10μl）に対して、
HeLa細胞由来のtotal RNAを0.5μg−0.5pgの範囲でそれぞれ添加し、実施例2と同様の方法を用いてcDNA合成量の比較を行いました。その後、反応液を鋳型としてβ-Actin遺伝子の増幅を行った結果、検討を行った全範囲において鋳型RNA
量とcDNA収量は高い相関を示し、鋳型RNAの多寡に関わらず安定して高いcDNA合成効率を維持していることが示されました。このことは、ターゲット濃度の異なるサンプル間においても逆転写効率の変化が極めて少ないことを示唆しており、定図3．鋳型RNA量の添加量に対する合成効率の検討

量結果の誤差を最小限に抑えることができると期待されます。

品 名 お よ び 内 容

包

装

保存温度

Code No.

価-20℃

FSQ-101¥38,000

格

キャンペーン価格®

ReverTra Ace qPCR RT Kit
5×RT Buffer
Enzyme Mix
Primer Mix
Nuclease-free Water

品 名 お よ び 内 容
リアルタイムPCR用マスターミックス（各種プローブアッセイ用）

Realtime PCR Master Mix

200回用（10μl反応）

包

装

＊

保存温度

40回用（1ml× 1本）
200回用（1ml× 5本）-20℃

1000回用（1ml×25本）
リアルタイムPCR用マスターミックス（SYBR® Greenアッセイ用）®

SYBR Green Realtime PCR Master Mix

40回用（1ml× 1本）®

SYBR Green Realtime PCR Master Mix -Plus-

価格

キャンペーン価格

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QPK-101¥37,000¥25,900

QPK-101X5¥170,000-

QPK-201T¥10,000-¥37,000¥25,900

QPK-201X5¥170,000-

40回用（1ml× 1本）

QPK-211T¥10,000-

200回用（1ml× 5本）

QPK-211¥37,000¥25,900¥170,000-

200回用（1ml× 5本）-20℃

1000回用（1ml×25本）
特異性・再現性が向上したリアルタイムPCR用マスターミックス（SYBR® Greenアッセイ用）

Code No.

¥26,600

1000回用（1ml×25本）-20℃

QPK-201

QPK-211X5＊1反応を50μlにて行う時の使用回数です。

287

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 3

本製品はすでに販売を中止しております。

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特長2 8連チューブ対応・サイクル毎の温度および保持時間の増減設定、プログラム
ファイルの連結が可能です。

・0.2mlシングルチューブはもちろんのこと、0.2ml×8連
チューブもご使用いただけます。
（8×3＝24フォーマット）

特長6 サンプルコントロールモード（液温推定制御）・従来のLittleGene（5×5＝25フォーマット）も別途販売
しております。

・ブロックの温度ではなく、サンプルの液量に応じて、液温を特長3 コンパクト設計

推定し、温度制御することが可能です。
（設定液量範囲：10〜50μl）

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・軽量（3.2kg）。

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24検体（8×3）：0.2mlチューブ使用

温度調節範囲：4℃〜99℃

温度上昇速度：55℃〜95℃を約18秒

温度下降速度：

95℃〜55℃を約21秒

温度精度：≦±0.4℃

温度均一性：≦±0.4℃（55℃）
、≦±0.5℃（72℃）
、≦±0.8℃（95℃）

ホットリッド：105℃（OFF設定可能）

ディスプレイ：

20文字×2行（LCD）

最大サイクル回数：

99

1サイクルあたりの最大設定セグメント数：9
プログラムメモリー数：

99個

付属機能：

停電時のバックアップ機能

電源：

AC100V 50/60Hz

消費電力：

品

名

ペルチェ式温度コントローラー

LittleGene2
ペルチェ式温度コントローラー

LittleGene

87

200W

外形寸法：

D285×W218×H178（mm）

重

3.2kg

量：

包

フォーマット装

Code No.

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1台

BFCTC-24H￥310,000

5×5（0.2mlチューブ）

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BFCTC-25A￥310,0003

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 4

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487

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 5『KOD FX』を用いたlong PCRにおけるPrimerの精製グレード及び鎖長の影響
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 杉山 明生
はじめ に

M1 1

『KOD FX』は、KOD DNA polymeraseをベースに開発された高性能PCR

2

3 4

5 M2
鋳型：ヒトゲノムDNA
50ng／50μl 反応系（1〜3）200ng／50μl 反応系（4,5）

試薬です。増幅効率、増幅成功率、および伸長性において高い性能を示すことが確認されています。よって、この酵素を使用することにより、今までどの酵素を用いても増幅が困難であったようなターゲットの増幅に成功する可能性が高まり

M1：1kb DNA ラダー
1 ：β-globin 1.3kb
2 ：β-globin 3.6kb
3 ：β-globin 8.5kb
4 ：β-globin 17.5kb
5 ：tPA
24.0kb
M2：λ／Hin dⅢ digest

ました。例えば、GC richターゲットや全血を直接用いたPCRなどにおいても力を発揮することが確かめられています。
K O D D N A P o l y m e r a s e は 、優 れ た 正 確 性 に 加 え て 、P f u D N A
polymeraseの10倍以上のProcessivity（合成持続能力）を有し、long PCRができる素地をもともと備えていました。東洋紡では、このKODの特性を最大限に引き出すべく、改めて酵素、buffer、サイクル条件の検討を行い、優れた伸図1．KOD FXを用いたlong PCR

長性を引き出すことに成功しました。図1のように、KOD FXでは、ヒトゲノム
DNAを鋳型としたlong PCRにおいて、24kb程度のターゲット

一口メモまでの増幅が可能であることが確かめられています。
今回は、このKOD FXの特長の一つである優れた伸長性を十KOD FXで増幅されたDNA断片の末端は平滑化されており、通常のTAクロー
ニングはできません。TAクローニングを行うには、専用の試薬「TArget CloneTM-Plus-（Code No.:TAK-201）」が必要となります。ちなみに、
KOD FXの正確性
はTaq DNA polymeraseの約11倍程度です［KOD -Plus-（Code No.:
KOD-201）の正確性はTaq DNA polymeraseの約80倍です］。

分に引き出せるように、比較的困難とされる10kb以上のターゲ
ットの増幅におけるPrimerの精製グレード及び鎖長の影響について検討を行いましたのでご紹介いたします。

方法

KOD FXを用いたPCRは、下記の反応組成にて、比較的増幅が難しいとされるヒトゲノムβ-globin領域の17.5kbをターゲットとして検討を行いました。また、PCRサイクルは、KOD FXの標準推奨（2）サイクル条件

条件である2ステップと、long PCR用に推奨しているステップダウ

2ステップ

ステップダウンンの2通りにて行いました。本検討にて使用したPrimerの配列等を、

94℃, 2min.

94℃，2min.

表1に記載しました。

98℃, 10sec.
68℃, 18min

30 cycles（1）反応液組成
25 μl

2mM dNTPs

10 μl

10pmoles／μl Primer F

1.5 μl10pmoles／μl Primer R

1.5 μlHuman Genomic DNA（50ng/μl）

1 μl

KOD FX（1.0U/μl）

1 μl

Autoclaved, distilled water

up to 50 μl

Primer名

A
B

hGB17.5F
hGB17.5R

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

hGB17.5F40
hGB17.5F38
hGB17.5F36
hGB17.5F34
hGB17.5F32
hGB17.5F30
hGB17.5F28
hGB17.5F26
hGB17.5F24
hGB17.5F22
hGB17.5F20
hGB17.5F18

72℃，18min
98℃，10sec.
70℃，18min.
98℃，10sec.
68℃，18min.

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

68℃，7min.
PrimerSize

Primer配列

（mer）

GC％

Tm
（℃）

精製グレードTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA

35
35

49%
46%

77.5
76.9

脱塩、カートリッジ、HPLC
脱塩、カートリッジ、HPLCGACTTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCCTTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTGATTATGACTATCCCACAGTCATTATGACTATCCCACAGTCTATGACTATCCCACAGTC

40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18

48%
47%
47%
50%
47%
47%
46%
42%
42%
41%
40%
44%

78.8
78.0
77.7
75.9
72.3
69.9
67.4
64.0
61.6
57.9
52.7
49.7

カートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジ

表1．使用Primer一覧

87

74℃，18min
98℃，10sec.

2×PCR buffer for KOD FX

No.

98℃，10sec.

5

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 6

結果及び考察（1）long PCRにおけるPrimer精製グレードの影響

2ステップ

脱塩、カートリッジ精製、及びHPLC精製の3通りの方

1法にて精製したPrimer（ 表1のA及びB）を用いてPCR

ステップダウン

2

3

1

M

2

3

を行い、Primerの精製グレードの違いによるPCRパフォーマンスを比較評価しました。その結果（図2）、脱塩
グレードでは、2ステップ、ステップダウンのいずれのサイクル条件においても、目的バンド以外にスメアが出や

17.5kb

すい傾向にあることが分かりました。一方、カートリッジ
精製とHPLC精製グレードでは、両者で大きな差はなく、ステップダウンのサイクル条件では目的バンドのみの明
1 ：脱塩
2 ：カートリッジ精製
3 ：HPLC精製
M2：λ／Hin dⅢ digest

瞭な増幅を得ることができました 。この結果から、長いターゲットを増幅する場合、カートリッジ精製以上のグレードのプライマーを用いる方がより良い結果が得られる

図2．long PCRにおけるPrimer精製グレードの影響ことが分かりました。
（2）long PCRにおけるPrimer長の影響

次に、long PCRにおけるPrimer長の影響を見るため、40merから18merまで2base刻みで長さを変化させたPrimerを調製（表1のNo．
1〜12、精製は、いずれもカートリッジ精製グレード）し、PCRを行いました。その結果（図3）、2ステップのサイクル条件では、40〜
24merでターゲットの増幅が認められ、同時に出現したエキストラバンドはPrimer長が長い程少ない傾向にあることが分かりました。一方、ステップダウンのサイクル条件では、40〜28merでターゲットの増幅が得られ、エキストラバンドはPrimer長に関わらず出現しませんでした。この結果から、long PCRでは、通常より長めにPrimerを設計し特異性を上げると共に、アニーリング（及び伸長反応）を比較的高い温度に設定することでより良い結果が得られることが分かりました。

2ステップ
M

1

2

3

4

5

6

7

ステップダウン
8

9

10 11

12

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

12

17.5kb

F側Primer（Primer長）
1： hBG17.5F40（40mer）
2： hBG17.5F38（38mer）
3： hBG17.5F36（36mer）
4： hBG17.5F34（34mer）
5： hBG17.5F32（32mer）
6： hBG17.5F30（30mer）

7： hBG17.5F28（28mer）
8： hBG17.5F26（26mer）
9： hBG17.5F24（24mer）
10： hBG17.5F22（22mer）
11： hBG17.5F20（20mer）
12： hBG17.5F18（18mer）

R側Primerは、1〜12共通で、
hBG17.5R（35mer）
を使用。
M：λ／Hin dⅢ digest

図3．long PCRにおけるPrimer長の影響

まとめ
KOD FXを用いるlong PCRのコツをまとめますと、（1）カートリッジもしくはHPLC精製グレードのプライマーを用いる、（2）プライマーは長めに設計し、アニーリング温度を高めに設定する、（3）必要に応じてステップダウンPCRを行う、ということになります。KOD FXは今回ご紹介したlong PCR以外にも幅広いPCRにおいて高いパフォーマンスを示すことが分かっています。別のPCR酵素で増幅に行き詰った時には、是非一度お試しください。
品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U／μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs

包

装

保存温度

Code No.

価-20℃

KFX-101￥35,000

装保存温度

Code No.

価

10回用

-20℃

TAK-201￥16,000

200U×1本（200回*）

格＊50μl反応を行った時の使用回数を表示しています。

品名および内容
高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

包

6

格

87

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 7

高発光・長持続性ルシフェラーゼアッセイシステム：Emerald
Lucシステムを用いた転写因子NFκBの活性化の解析
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 浅井 友実
はじめ にEmerald Lucシステムは、ブラジル産ヒカリコメツキムシ由来のルシフェラーゼを採用したリポーターアッ
セイシステムです。ホタルルシフェラーゼを用いるシステムに比べ、in vitro、in vivo、いずれのアッセイにおいても安定した高いシグナルを得ることができます（図2、図3）。化合物探索におけるHTS（in vitroアッセイ）や、生細胞における発現の時間変動解析（in vivoアッセイ）などに有用です。
転写因子NFκBは、炎症性サイトカインTNF-αをはじめ様々な刺激によって活性化され、免疫反応や炎症反応などに関与する種々の遺伝子の発現を制御していることが知られています。活性化の詳細に関しては、細胞質のNFκB/IκBが、刺激を受けることにより解離し、NFκBが核内へ移行し、様々な遺伝子の発現をオンするメカニズムが提唱されています（図4）。本稿では、本システムを用いたNFκB活性化における阻害剤アッセイ、およびin vivoイメージングへの応用についてご紹介いたします。

図1．Assay reagent外観

発光強度比較
強発光

相対発光安定性比較

安定発光
1液アッセイが可能

図3．Emerald Lucシステムアッセイフロー①Emerald Luc Luciferase Assay Reagent②Emerald Luc Lysis Solution

図2．発光強度、および発光安定性の比較

NFκBリポーターベクターの構築
方法

転写因子NFκBの活性化をモニターするリポーターとして、HSVtk
promoter配列の上流にNFκBの結合配列を付加したコンストラクトを作製しました。具体的には、被検配列挿入用ベクターpELuc（PEST）-test（Code No.ELV-201）を用いて、Emerald Luc（ELuc）遺伝子の上流にHSVtkプロモーターを、さらにその上流にNFκB結合配列（5 -CGGA
AAGTCCA-3（1）、6コピー）を挿入することによって、（ NFκB）
6 -tkELuc（PEST）を構築しました（図4）。
また、対照実験用として、同様にAP1結合配列（5 -ATGAGTCAA-3（1）、6コピー）をHSVtkプロモーターの上流に挿入した（AP1）6-tk図4．（NFκB）6-tk-ELuc（PEST）コンストラクトとTNFα刺激
による転写の活性化

ELuc（PEST）を構築しました。

877

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 8

一口メモ
Emerald Lucシステムのプロモーター挿入用ベクターとしてpELuc-test、pELuc（ PEST）-testを販売しております。
Emerald Luc（ELuc）
は細胞内で非常に安定なルシフェラーゼです。ELuc（PEST）
はルシフェラーゼの細胞内寿命を短くするために、ルシフェラーゼのC末端にPEST配列と呼ばれるタンパク質分解促進配列を付加しています。シグナル強度の高い検出を行うにはpELuc-testを、
時計遺伝子のリズム解析などの動的な変動の検出にはpELuc（PEST）-testのご利用をお薦めします。詳細はUpload vol.85 p1,2または弊社ウェブサイトをご覧ください。
＊Emerald Luc遺伝子について、特許出願中。

NFκBリポーターを用いたin vitroアッセイ（TNFα刺激による活性化と阻害剤による阻害実験）
Ammonium Pyrrolidinedithiocarbamate（APDC）は、TNFα、LPS、PMA、酸化ストレスなどによって誘導されるNFκB活性化を選択的に阻害し、他の転写因子AP-1、SP-1、Oct-1の活性化は阻害しないことが知られています。
ここでは、NFκBの活性化におけるAPDCの阻害活性を、96ウェルプレートを用いるin vitroアッセイ系を用いて測定しました。また対照として、同様にAP-1活性化に対する影響を評価しました。

方法

9 6 ウェ ル 白 色 不 透 明 プ レ ート に H e L a 細 胞 を 播 種 し 、LipofectamineTM 2000を用いて、（NFκB）6-tk-ELuc（PEST）、および（AP1）6-tk-ELuc（PEST）プラスミドをそれぞれトランスフェクションしました（24時間）。培地はDMEM/10%FCSを使用しました。
NFκB活性化に対するTNFα濃度依存性を調べた実験では、（NF
κB）6-tk-ELuc（PEST）をトランスフェクションしたHeLa細胞に、0.001、0.01、0.1、1、10ng/ml TNFαを加え、6時間インキュベートした後、測定を行いました。
APDCによる阻害実験では、（NFκB）6-tk-ELuc（PEST）または
図5．NFκB活性化のTNFα濃度依存性（AP1）6-tk-ELuc（PEST）をトランスフェクションしたHeLa細胞に0.5mM、1mMのAPDCを加え、1.5時間インキュベートし、続いて、1ng/ml TNFαまたは0.1μM PMAを加え、さらに6時間イン
キュベートした後、測定を行いました。
ルシフェラーゼアッセイは、培地が入ったままの状態で、細胞に培
地と等量のEmerald Luc Luciferase Assay Reagent（CodeNo. ELA-101）を加え、振とう機で軽く振とうしながら10分間イン
キュベートし、プレートリーダーARVOMX（パーキンエルマー社）で発光を測定しました。

結果及び考察図5は、（ NFκB）6-tk-ELuc（PEST）を導入したHeLa細胞を各TNFα濃度で刺激し、発現したルシフェラーゼの活性を測定したものです。各条件n=2で実施し、平均値と測定値のバラツキをプロットしています。この結果から、NFκBの活性化が、TNFα濃度依存的に増大する様子を確認できました。
図6は、NFκBもしくはAP1結合配列を有するそれぞれのプラス
ミドを導入したHeLa細胞をそれぞれ各濃度のAPDCで前処理し、続いて、未処理（-）、TNFα、PMAで刺激した後、発光強度を測定した結果です。結果、NFκBはTNFα、PMAのいずれの刺激によっても活性化され、APDC添加によって阻害されました。一方、AP1の活性化はPMA刺激に対してのみ認められ、APDC処理による阻害は認められませんでした。
この結果、APDCの阻害はNFκBに特異的なものであることが確
図6．NFκB AP1活性化におけるAPDCの効果

認でき、従来報告されている薬剤の効果をEmerald Lucシステムを用いたリポーターアッセイにおいても再現することができました。

887No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 9

NFκBリポーターを用いたin vivoアッセイ（TNFα刺激のリアルタイム計測、シングルセルイメージング）
ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞をルシフェリンを含む培地で培養することによりルシフェリンが細胞へ浸透し、発光を生じます。invivoアッセイにおける、
リアルタイム測定では、
この発光を光電子増倍管が組み込まれた測定装置で連続モニターします。
また、細胞を対象とした発光イメージング解析では、個々の細胞の動態を検出することが可能です。この技術を利用することによって、個々の細胞の遺伝子発現を経時的にモニターでき、さらに、遺伝子発現の細胞間での同期、細胞間の相互作用や情報伝達などの解析が可能とな
ります。
ここでは、
リアルタイム計測と発光イメージングの事例をご紹介いたします。

方法

結果及び考察35mmディッシュにHeLa細胞を播種し、Lipofectamine

図7に①の計測による経時変化、図8に②のモニターによる3

TM

時間おきの細胞の発光像を示します。

2000を用いて、（ NFκB）6-tk-ELuc（PEST）プラスミドをトラン
スフェクションしました。翌日、10ng/ml TNFα、0.5mM D-

この結果、TNFα添加によるNFκBの活性化の様子は、細胞

luciferinを添加して、下記2つの連続モニターを実施しました。培

集団で評価した場合も個々の細胞レベルで評価した場合にも同様

地はDMEM/10% FCSを使用しました。

に、TNFα添加9時間前後まで活性化が進み、その後減衰していくことが確認できました。

①細胞培養機能搭載ルミノメーターKronos（アトー社）
3分ごとに10秒間の積算測定を20時間実施②発光イメージングシステムLV200（オリンパス社）
露光：2分間、インターバル：10分間、倍率：20倍で、20時間実施図8．NFκB活性化の細胞イメージング
TNFα添加後の経過時間毎の細胞の発光像。
個々の輝点がNFκBが活性化した細胞を示します（オリンパス社提供）。

図7．NFκB活性化のリアルタイム計測
TNFα添加後の経過時間毎の発光強度の推移を示します。

まとめ
Emerald Lucシステムでは、in vitroからin vivoまで多様なアッセイが可能です。in vitroアッセイ系については、Upload vol. 86 p.3に「AP1応答及び阻害剤効果の検出」例をご紹介しておりますので、あわせてご覧ください〈弊社ウェブサイト（www.toyobo.co.jp/bio）にてご覧いただけます〉。
品

名

包

保存温度

Code No.

10ml
100ml

-80℃

ELA-101
ELA-102￥14,000￥78,000

Emerald Luc Lysis Solution**

100ml

-20℃

ELA-201￥8,000D-luciferin（カリウム塩）

20mg
100mg

-20℃

MRL-101
MRL-102￥24,000￥92,000

10μg

-20℃

ELV-101￥35,000

10μg

-20℃

ELV-201￥35,000

Emerald Lucシステム破壊系発光試薬

Emerald Luc Luciferase Assay Reagent*

装Emerald Lucシステム細胞溶解剤

Emerald Lucプロモーター挿入用ベクター

pELuc-test***Emerald Luc-Short lifeタイプ-プロモーター挿入用ベクター

pELuc（PEST）-test***価格＊96ウェルプレートの場合、Emerald Luc Luciferase Assay Reagent 10mlは100反応、100mlは1,000反応に相当します。
＊＊Emerald Luc Lysis Solutionは希釈の必要がなく、そのままご使用いただけます。
＊＊＊ヒカリコメツキムシ由来ルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターは、弊社にて特許出願した技術です。当ベクター（Emerald Luc Vector
Code No.;ELV-101,ELV-201）の使用において、弊社の検出用試薬（Emerald Luc Luciferase Assay Reagent Code No.;
ELA-101, ELA-102, ELA-201, D-Luciferin Code No.; MRL-101, MRL-102）を用いる場合は、営利・非営利団体に関らず、ライセンス契約は必要ございません。営利団体で弊社の検出用試薬を用いない場合は、ライセンス契約が必要となります。製品にライセンスポ
リシーが添付されておりますので、開封前に必ずご確認ください。ご不明な点は弊社までお問い合わせください。

2007年9月28日までにご注文いただいた方でご希望の方に、プロモーター挿入用ベクターを無償サービスいたします。申し込み方法等の詳細に関しましては、弊社webサイト（www.toyobo.co.jp/bio）のキャンペーンコーナーをご覧ください。

879

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 10

No.87.qx 07.7.5 15:17 ページ 11

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 12

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 13

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 14

高効率ライゲーション試薬：Ligation high Ver.2を用いたライゲーション反応の条件検討
東洋紡績（株）

ライフサイエンス事業部 黒板 敏弘
はじめ にLigation high Ver.2は、長くご利用いたいただいておりますLigation high(Code No.:LGK-101)を、更に使いやすく改良した高効率な1液タイプのライゲーション試薬です。特に、TAクローニング効率が飛躍的に向上しています（図１）。また、-20℃保存で凍結しないため、フリーザーから取り出してそのままご使用いただけるようになりました。本試薬は、様々な末端を有するDNA断片の連結反応に幅広く用いることができます。

120
100
80
60
40
20
0
図2．−20℃保存での試薬の状態
従来品（緑）、本製品（青）本製品は−20℃保存で凍結しません。

図1．TAクローニング効率の比較（16℃、30min反応）

本稿では、Ligation high Ver.2の基本性能に関する実施例に加え、通常ではあまり検討されることのない、平滑末端、およびTAクローニ
ングにおけるインサートの挿入方向についての検討例をご紹介いたします。

方（1）インサートDNAの調製

法（3）ライゲーション反応

TAクローニング用のDNA断片は、λDNAの約0.5kbの領域を上記の方法で調製したベクター（50ng）とDNA断片をモル比

Taq DNA polymeraseを用いて増幅して調製しました。平滑末で1:3となるように混合し（7.5μl）とし、その溶液に等量（7.5μl）

端クローニング用のDNA断片は、同じプライマーを使用し、高のLigation high Ver.2を加え、様々な温度、時間でライゲーシ

正確性PCR酵素KOD -Plus-*にて増幅して調製しました（リン酸ョン反応を行いました。その後、反応液10μlをCompetent

化プライマー使用）。突出末端クローニング用のDNA断片は、両high DH5α（Code No.:DNA-903）100μlに添加し、常法に端にHin dIIIサイトを有するようにλDNAの約0.5kbの領域を増従って形質転換を行いました。続けてその一部をLB/Ampプレ

幅した後、両末端を Hin dIIIで切断し、調製しました。すべてのートにプレーティングし、翌日、白コロニー（インサートあり）と、青DNA断片は、最後にMagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-

コロニー（インサートなし）をカウントしました。インサートの方向（Code No.:NPK-601）を用いて精製した後に、DNA量を定量の確認は、ベクター上とインサート上に設計したプライマーを用し、使用しました。

いるコロニーダイレクトPCR法を用いて行いました（各20クロー＊KOD -Plus-で増幅されたDNA断片の末端は平滑化されています。

ンを解析）。
プライマーのリン酸化、ベクターの脱リン酸化、およびインサー（2）ベクターの調製
平滑末端クローニング用のベクターは、pUC19をHin cIIで切トの方向性の確認はUPLOAD Vol. 86のプロトコールコーナー

断した後に、E.coli Alkaline Phophatase（BAP-111）にて脱「 平滑末端クローニング」をご覧ください〈 弊社ウェブサイト

リン酸化し、使用しました。突出末端クローニング用のベクターは（www.toyobo.co.jp/bio）にてご覧いただけます〉。

pUC19をHin dIIIで切断した後、同様に脱リン酸化して使用しました。脱リン酸処理後、ベクターは（1）と同様の方法で精製して用いました。TAベクターは市販のものを使用しました。

1487

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 15

結果及び考察（1）反応時間とクローニング効率
12016℃反応における、各種DNA断片のクローニング効率を末端形状別に比較しました。その結果、突出末端ライゲーションでは約5分

100

相対白コロニー数

でほぼライゲーション反応が完了していることが分かりました。また、
平滑末端、およびTAクローニングにおいても30分間で約70〜80%の反応が完了することが分かりました（図3）。
平滑末端、およびTAクローニングにおいては、1時間を越えて2時間まで徐々に効率が増加することも分かっており、クローニング効率が低い場合は、反応時間を2時間まで延ばすことにより、さらに効率

80
突出末端

60

平滑末端
40

TA

20

を向上させることが可能であると思われました。

0
0

20

40

60

反応時間（分）（2）反応温度とインサートの方向

図3．反応時間と反応性
様々な末端のDNA断片の16℃での反応時間とライゲーション効率。
各反応の60分後の白コロニー数を100として表示。

以下に、反応温度とクローニング効率（図4）、反応温度とインサートの方向性（図5）に関する実験結果を示します。

100

平滑末端

80

正方向挿入率（％）

相対白コロニー数

100

TA
60
40
20
0

平滑末端

80

TA
60
40
20
0

４℃

４℃

16℃

22℃ （室温）

反応温度

16℃

22℃ （室温）

反応温度

図4．反応温度とクローニング効率
16℃での白コロニー数を100として表示。

図5．反応温度とインサートの方向

まず、反応効率に関しては、本試薬のプロトコールで推奨している16℃が最も良い結果となりました。ただし、4℃や22℃（室温）でも実験を進めるのに支障のない数のコロニーを得ることができました。インサートの方向に関しては、温度によって異なる傾向が認められました。また、平滑末端とTAクローニングにおいて弱いながら方向性に関して相関が見られました。挿入方向の偏りは広く知られれている現象であり、
これは末端付近のDNAの立体構造や末端の塩基配列によっても変わってくるようです。今回の検討では、反応温度によってクローニングされるインサートの方向が変化することが分かりました。このことは、あまりにインサートの方向が一方に偏ってしまった場合、挿入の配向性を変化させる対策のヒントとなるのではないかと考えられました。

おわりに
Ligation high Ver.2は、従来の一液系のライゲーション試薬と同等以上の効率を有し、さらに使い勝手も考慮した設計になっています。
是非一度お試しください。

品

名

包

Ligation high Ver.2

装*

保存温度

Code No.

価-20℃

LGK-201¥22,000

750μl×1本

格＊1反応に7.5μl使用する場合、100回用としてご使用いただけます。

高効率コンピテントセル
品

名

包

装＊

保

存

Code No.

価

格

Competent high JM109

0.1ml×10本

液体窒素

DNA-900¥17,000

Competent high DH5α

0.1ml×10本

液体窒素

DNA-903¥17,000＊SOC培地1ml×10本、Positive Control Plasmid 50μl×1本を含みます。

8715

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 16

ーン
キャンペ

部位特異的変異導入キット

KOD -Plus- Mutagenesis Kit

f

30%of

■期間：2007年8月6日〜2007年9月28日（ご注文分）

KOD -Plus- を用いたInverse PCR法に基づく部位特異的変異導入キットです。
幅広い変異導入が可能です。
本製品は、KOD -Plus-の高い正確性を活かした、Inverse PCR法に基づく部位特異的変異導入キットです。Inverse PCR法では、プラスミドを鋳型として、逆向きに設定したプライマーを用いてPCRを行い、プラスミ
ド全周の増幅を行います。その際、導入したい変異や挿入配列を付加したプライマーを用いることにより、様々な変異を導入することができます。
本製品には、形質転換までに必要な全ての試薬および詳細なプロトコー
ルが含まれています。

一口メモ
KOD -Plus-は、
KOD DNA polymeraseに、
常温で活性を抑える2種類の抗体を加えたホットスタート対応型高正確性PCR用酵素です。Taq DNA polymeraseの約80倍の正確性（fidelity）
を示し、正確性を必要とするPCRに最適です。

キット外観

特長1 幅広い変異導入に対応
・Inverse PCR法の採用により、数bpの置換、挿入、欠失のみでなく、数10bpの挿入（Tagの導入）や数100bpの欠失等にも対
応 可 能です。また、特 定 部 位 のアミノ酸を 2 0 種 類 のアミノ酸に置 換するなどの ア ミ ノ 酸 点 変 更 ラ イ ブ ラ リ ー の 作 製（Saturation Mutagenesis）も可能です。

特長2 確実な変異導入
・最大95％の変異導入効率が得られます。また、KOD -Plus-の採用、およびPCRサイクル数を最小限に設定するなど条件の最適化により、PCRエラーによる2nd-site mutation（目的とする変異以外の変異）が入る可能性を最小限にしています。最長約11kbのプラスミドで変異導入を確認済みです。

特長3 簡単プロトコール＊・本製品では、PCR産物のSelf-ligationを、KinaseとLigaseを同時に反応させて行います。従って、PCR Primerのリン酸化は不要です。また、形質転換まで3ステップの簡単なプロトコールとなっています。
＊特許出願中品 名 お よ び 内 容
KOD -Plus- Mutagenesis Kit
KOD -Plus10×Buffer for iPCR
2mM dNTPs
DpnⅠ
T4 Polynucleotide Kinase
Ligation highControl Plasmid
Control Primer #1
Control Primer #2

包

装

保存温度

Code No.

価

格

20回用

-20℃

SMK-101¥38,000

キャンペーン価格¥26,600

本誌p.17〜p.19「PROTOCOL CORNER」にプロトコールや実験のコツをご紹介しています。

1687

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 17

KOD -Plus- Mutagenesis Kitを用いる
部位特異的変異導入
知っているようで、少し自信がない。本コーナーでは、そのようなプロトコールを詳しく解説いたします。

はじめ に

最後に、③直鎖状プラスミドであるPCR産物をSelf-ligationする

部位特異的変異導入法（Site-Directed Mutagenesis）は、タことにより環状化し、大腸菌の形質転換に供します。

ンパク質の機能改変のみならず、タンパク質へのタグやストップコド

本稿で紹介する方法では、①→②→③の各ステップ間でDNAのンの挿入、プロモーターやシスエレメントの解析など、様々な解析に精製は行いません。とすると、②のステップで断片化された鋳型

必須の手法となっています。その方法としては、古典的なKunkel法

Plasmidが、③のSelf-ligation反応時にPlasmidに挿入されてしをはじめ、近年では、PCR法を応用した様々な方法が開発されていまうのではないか、と心配される方もおられるかと思います。
しかし、ます。プロトコールコーナー第2回目の今回は、Inverse PCR

弊社の検討では、断片が挿入された経験はありません。これは、2（iPCR）法に基づく部位特異的変異導入法について、部位特異的変piece ligationよりもSelf-ligationの方が圧倒的に反応効率が良異導入キット「KOD -Plus- Mutagenesis Kit（Code No.:SMK-

いことによるものと考えられます。

101）」を中心に、プロトコールおよびコツをご紹介します。

それでは、実際のプロトコールの詳細をご紹介します。

今回、ご紹介するステップを図1に示しました。まず、①Plasmid

方DNAを鋳型に、変異を導入したプライマーを用いてInverse PCRを行います。欠失変異体を取得したい場合には、その欠失させたい法

1．
プライマー設計領域の外側にプライマーを設計します。次に、②PCR産物に制限酵
素DpnIを加え、鋳型Plasmidを消化します（ Dpn I は、メチル化サ
イトを認識し、一般的な大腸菌株から調製したプラスミドはメチル化されており、Dpn Iにより切断を受けます）。

図2．プライマー設計方法

分子生物学実験では、様々な変異導入実験を行いますが、大きく（1）置換、（2）欠失、（3）挿入に分けることができます。
（1）（3）の変異導入に共通したプライマー設計に関する注意点・コツは以下のとおりです。
（2）については、変異を導入したプライマーを設計する必要はありません。

1・変異導入部位は、プライマーの5 端、あるいは5 端付近に設計します。
・3 端側には鋳型DNAと相補性のある領域が少なくとも20塩基以上（望ましくは25bp程度）になるようにします。

2・プライマーが50塩基を超えるような場合は、精製度の高い
プライマーを用います。
（プライマーが長くなるほど、5 端の欠落した不完全なプライマーの混入が増える傾向にあります）
以下に、それぞれの場合に分けて説明いたします。

3

（1）置換
1 〜 6 塩 基 程 度 の 置 換 が 最 も よく行 わ れ ま す 。ま た 、InversePCR法を採用している本キットでは、ミックス塩基を導入することで、アミノ酸点変異ライブラリーの作製なども可能です。図3は、アミノ酸点変異ライブラリーを作製したプライ
マーの例を示しています。
図1．Inverse PCRによる部位特異的変異導入フロー

87

17

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 18の2点です。Taq polymeraseでは、3 端に主にAがついた突出末端となるため、図1の③のステップでSelf-ligationされません。
よって、本キットには、高正確性PCR酵素「KOD -Plus-」が採用
されています。
なお、本プロトコールでは、③ のSelf-ligation反応時に、PCR e リン酸化 / ライゲーション

Kinaseによるリン酸化を同時に行いますので、プライマーを予めリン酸化しておくことは不要です。以下に実験操作を示します。
（1）各 P C Rプライマ ー の 濃 度 を 1 0 p m o l e s /μl に、鋳 型
Plasmid DNAの濃度を50ng/μlに調整します。

図3．アミノ酸点変異ライブラリー作製例（2）PCR用チューブに以下のように反応液を調製します。

NNNは完全に5 末端に設定する必要はなく、5 端付近に設定すれば問題ありません。また、5 末端付近に設定した方が、ライ

滅菌蒸留水
10×Buffer for iPCR
2mM dNTPs
プライマー1（10pmoles/μl）
プライマー2（10pmoles/μl）
鋳型Plasmid DNA（50ng/μl）
KOD -PlusTotal Volume

ゲーションされる末端の配列が統一されるため、クローン間でのライゲーション効率を統一することができます。
（2）欠失
欠失の導入はInverse PCRの利点を最大に生かせる変異導入の一つです。プライマー設計は、欠失させたい領域を増幅しないようにプライマーを設計するだけです（図2）。プライマー

35（μl）
5
5
1.5
1.5
1
1
50μl

中に変異を導入する必要はありません。よって、広い領域に渡る欠失変異体を作製することが可能です。

（3）以下の反応サイクルにてPCRを実施します。

（3）挿入
94℃
98℃
68℃
4℃ Hold

挿入は、短いタグ配列などを導入する場合に行います。挿入
も、Inverse PCR法を採用している本キットでは容易に行うことができます。以下に、His-tag配列の挿入に用いたプライマ

2min
10sec
Xmin＊1

Y（4〜10）サイクル＊2

ーの例をお示しします。
＊1

増幅するサイズ（kb）
を基に、1min./kbを目安に設定します。例
えば、5kbのPlasmidの全周を増幅したい場合には、5min．
に設定します。
＊2 増幅するサイズ（kb）
を基に、1サイクル/kbを目安に設定します。
但し、最終的に得られるコロニー数は、用いるコンピテントセルの形質転換効率等によっても変動しますので、実験に余裕がある
場合には、反応液を2分割し、二通りのサイクル数にて実施します（例えば、5サイクルと10サイクル）。

PCR e リン酸化 / ライゲーション

予備実験を行う場合は、PCRを10〜20サイクルにて実施し、ア
図4．His-tag配列挿入例

ガロースゲル電気泳動にてエキストラバンドが発生しないPCR

ここでは、片方のプライマーのみにタグ配列を設計しましたが、挿入配列が長い場合などPCR効率の低下が予想される場合
は、挿入配列を2分割して両方のプライマーに設計することも条件の検討を行います。条件を見出せたら、PCR反応組成はそのままで、サイクル数を下げて増幅を行います。
3．
Dpn Iによる鋳型Plasmidの消化可能です。

次に、メチル化されているDNAを特異的に分解する制限酵素

Dpn Iを作用させて鋳型Plasmid DNAを消化します。Dpn Iの反応には一般的に、本来TA bufferが用いられますが、添付され2．
Inverse PCRているKOD -Plus-の反応Buffer中でも十分に本来の活性を発

ここでのポイントは、KOD -Plus-のようなProofreading（校揮します。一般的に用いられるJM109やDH5αなどの大腸菌で正）活性を有する高正確性のPCR酵素を用いることです。この理調製したPlasmid鋳型はメチル化を受けていますので、Dpn Iの由は、分解を受け消去できます。以下に実験操作を示します。

・目的の変異箇所以外に変異が入るのを防ぐ。

（1）以下のように、PCR反応の終了したチューブに、Dpn Iを加・PCR産物の端がBlunt End（平滑末端）となるため

え、反応させます。

Self-ligationが可能となる。

1887

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 19

るLigation試薬：Ligation highには、Ligaseの他にrATP等もPCRの終了した反応液
Dpn I（10U/μl）
Total Volume↓
37℃、1h反応（全量50μl）
2μl
52μl

含まれており、Kinaseは十分に働くことができます。手順は以下のとおりです。
（1）新しいPCR用チューブに以下の順番で反応液を調製し、反応させます。

（2）（オプション）Dpn I処理後の反応液5μlをアガロースゲル

Dpn I処理済みPCR産物
滅菌蒸留水
Ligation highT4 Polynucleotide Kinase（5U/μl）
Total Volume 15μl↓
16℃、1h反応

電気泳動に供し、PCR増幅産物の確認を行います。但し、サ
イクル数が少ない（5サイクル程度以下の）場合には、バンドが確認できない場合があります。その場合であっても、ほとんどの場合、変異体は得られます。そのまま、次のステップに進んでください。

2（μl）
7
5
1
15μl

4．
PCR産物のSelf-ligation
最後に、T4 Polynucleotide KinaseとLigaseを同時に作用（2）反応液の一部（〜10μl）を大腸菌の形質転換に供します。

させてPCR産物を自己環状化させます。キットに添付されていおわりにここでご紹介したInverse PCR法に基づく部位特異的変異導入法には、以下の特長があります。
①数bpの置換、挿入、欠失のみでなく、数10bpの挿入（Tagの導入）や数100bpの欠失等、幅広い変異導入に対応できる。
②特定部位のアミノ酸を20種類のアミノ酸に置換するなどのアミノ配点変異ライブラリーの作製（Saturation Mutagenesis）
も可能。
また、本キットには、コントロールプラスミドとプライマーが添付されており、初めての方でも確実に変異導入実験を行うことができるようになっています。是非一度お試しください。

品 名 お よ び 内 容
KOD -Plus- Mutagenesis Kit
・KOD -Plus・10×Buffer for iPCR
・2mM dNTPs
・Dpn I・T4 Polynucleotide Kinase
・Ligation high・Control Plasmid・Control Primer #1
・Control Primer #2

装

保存温度

Code No.

価

20回用

-20℃

SMK-101¥38,000

包格

キャンペーン価格¥26,600

キャンペーン期間中 30%OFFにてご提供いたします。 キャンペーン期間：2007年8月6日〜2007年9月28日［ご注文分］

過去に紹介した記事で、今号に関連のある記事をピックアップしてご紹介するコーナーです。

『KOD FX』（本誌p.5・6掲載）

ことが確かめられています。よって、研究室のフリーザーに常備しておくと便利
なPCR試薬なのかも知れません。KOD FXの正確性はTaq DNA polymerase

本誌で紹介いたしましたKOD FXは、高い成功率、抜群の増幅効率、優れたの約11倍であり、ベストとは言わないまでも、クローニング実験などにも用い

伸長性、および正確性を兼ね備えた新しいPCR試薬です。

ることができます。

弊社では、今までKODシリーズとして、KOD -Plus-、KOD -Plus- Ver.2、

ちなみに、クローニングに本当に向いているPCR試薬は、KOD -Plus-とKOD Dash®などを販売して参りました。すべてKODという名前を冠しますが、

KOD -Plus- Ver.2です。両方ともにTaq DNA polymeraseの約80倍の正それぞれ特性が異なっており、実験の種類によって使い分ける必要があります。

確性を示します（KOD -Plus- Ver.2の方がPCR成功率に優れています）。

このあたりの使い分けにつきましては、弊社ウェブサイト（www.toyobo.

また、KOD FX、KOD -Plus-、およびKOD -Plus- Ver.2で増幅された

co.jp/bio）「PCRコーナー」に詳しくまとめていますので、是非一度ご覧くださ

DNA断片の末端は平滑化されているため、通常の方法ではTAクローニングすい 。この ペ ージ から は 各 ポリメラ ー ゼ や 試 薬 、キット などへ のリンクがることができません。よって、弊社ではそのような場合に、PCR産物を直接用い張ってあります。また、それぞれの詳細ページは様々な実施例にもリンクしていてTAクローニングできる試薬として「TArget CloneTM -Plus-」を発売していますので便利です。

ます。この試薬も、弊社ウェブサイトの「PCRコーナー」でご紹介していますの

さて、このKOD FXですが、弊社のPCR酵素の中でも抜群に成功率が高い

87

で、是非一度チェックしてみてください。

19

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 20

Flash NewsNew Cytokines/
Antibodies＜輸送・保存：-20℃＞
品

名Human PEDF, Recombinant
Murine IL-5, Recombinant

ヒト/動物正常細胞

Cell Applications, Incでは、ヒトおよび様々な動本製品はすでに包装
Code No.
価 格
販売を中止して
20μg
PT13013¥39,000
おります。
25μg
PT21515¥39,000

Human HVEM-Fｃ, Recombinant 100μg

PT31027¥39,000

Rat IL-5, Recombinant

10μg

PT40005¥39,000

Human CTGF, polyclonal, Rabbit 50μg

PT500P252¥39,000

価格を変更しております。
現在の情報は、お問い合わせいただきますようお願いいたします。

物由来の正常細胞を販売しております。

〈抗体〉
ヒト外毛根鞘細胞（HORC）

Human CTGF, polyclonal, Rabbit-Biotin 25μg PT500P252Bt ¥39,000
Human Vaspin, polyclonal, Rabbit 50μg

PT500P256¥39,000

Human PAI-1, polyclonal, Rabbit 50μg

PT500P260¥39,000＜輸送：-80℃、-20℃／保存：液体窒素、-20℃＞

Human PAI-1, polyclonal, Rabbit-Biotin 25μg PT500P260Bt ¥39,000

品

名

内容

ヒト外毛根鞘細胞(HORSC) : adult※詳しくは、http://www.peprotech.com/をご覧ください。

ヒト腕頭動脈内皮細胞(HBcAEC) : adult

SNAP-tagTM 融合用Gateway ®

ヒト頚動脈内皮細胞(HCtAEC) : adult

ベクター

ヒト腕頭動脈平滑筋細胞(HBcASMC) : adult

SNAP-tag™は、約20kDaの酵
ヒト頚動脈平滑筋細胞(HCtASMC) : adult

素タグで あり、ベ ン ジル グア ニン(BG)基を有する人工基質と共有結ヒト神経幹細胞(HNSC): fetal合を形成する性質を有します。様々な人工基質を用いることで、細胞をネコ軟骨細胞(FC)用いた蛍光イメージング、蛍光タン
TM

SNAP-tag と蛍光基質との特異的結合

この度、Gateway® 対応のSNAP-tag™融合タンパク
SNAP-tag™融羅的に解析するよ
うな用途で力を発
揮します。

品

名

包装

本製品はすでに販売を中止しております。
Code No.

価

格

6μg

CVPL218 ¥95,000

SNAP-express pSEMS-Gateway®SNAP26m Mammalian Expression Kit

6μg

CVPL219 ¥95,000

凍結細胞 1vial

CA60605a¥126,000

Total Kit 1kit

CA606K05a¥161,000

凍結細胞 1vial

CA301205a¥110,000

Total Kit 1kit

CA3012K05a ¥140,000

凍結細胞 1vial

CA301405a

Total Kit 1kit

CA3014K05a ¥140,000

凍結細胞 1vial

CA351205a

Total Kit 1kit

CA3512K05a ¥138,000

凍結細胞 1vial

CA351405a

Total Kit 1kit

CA3514K05a ¥138,000¥110,000¥105,000¥105,000

凍結細胞 1vial CAHS82020f ¥142,000
Total Kit 1kit CAHS820K20f ¥160,000
CAF40205¥105,000¥138,000

凍結細胞 1vial

CAF40605¥105,000

Total Kit 1kit

CAF406K05¥138,000

凍結細胞 1vial

CAF49205¥100,000

ラット間葉系幹細胞(RMSC) 凍結細胞 1vial

CAR49205¥80,000

5合タンパク質を網SNAP-express pSEMS-SNAP26mGateway® Mammalian Expression Kit

価格

CAF402K05

ネコ間葉系幹細胞(FMSC)

質 発 現 用 ベ クタ ー が 発 売 さ れ まし た 。本 ベ クタ ー は

Code No.

凍結細胞 1vial

ネコ骨芽細胞(FOb)

固定化などを行うことができます。

包装

Total Kit 1kit

パク質の作製、およびタンパク質の＜輸送・保存：-20℃＞

ラット間葉系幹細胞（RMSC）※詳しくは、http://www.covalys.com/をご覧ください。
※それぞれにはコントロール発現用のpSEMS1-H2B-26m（5μg）
〈核
移行コントロール〉が添付されます。
※Gateway®テクノロジーに関する特許はInvitrogen社が保有しています。
本製品に関するラベルライセンスはhttp://www.covalys.com/をご参照ください。

20※1vialには、5×10 cells含まれます〔ヒト神経幹細胞（HNSC）は、2×106cellsです〕。
※Total Kitには、凍結細胞の他に、増殖培地、サブカルチャー試薬セット(A)(Code No.CAO90K)が含まれます〔ヒト神経幹細胞（HNSC）Total
Kitは凍結細胞と増殖培地のみを含みます〕。
※ネコ間葉系幹細胞（FMSC）、ラット間葉系細胞（RMSC）は、Total Kitの販売はございませんので、別売りの間葉系幹細胞増殖培地 MF-medium(Code No.TMMFM-001 ￥35,000)、サブカルチャー試薬セット(B)(Code No.TMTSC-K ￥10,000)をお使いください。
※サブカルチャーセットは以下の構成から成ります。
¡サブカルチャー試薬セット(A)ハンクス平衡緩衝塩溶液（HBSS）100ml
トリプシン-EDTA溶液
100ml
トリプシン中和液
100ml¡サブカルチャー試薬セット(B)
PBS
100ml
トリプシン-EDTA溶液
30ml
トリプシン中和液
30ml※詳しくはhttp://www.cellapplications.com/をご覧ください。

87No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 21

お客様とのコミュニケーションのコーナーです。

「手抜きプレーティング」

匿名希望

ぽんぽんさん

通常、プレーティングしたプレートは37℃でover nightですが、週末休みたい私は、金曜のトランスフォーメーション後、月曜日の朝までプレートを実験台の引出しに隠して（笑）います(＠室温)。温度が不安定？な時は室温にした保冷箱様の登場。
キムタオルで巻いて中にIN。プレートのふたはパラフィルムで軽く巻いておいても良いですね。特殊なコンストラクトでなければ、問題なくコロニーが生えます。コロニーが小さいかしらという時は、2-3時間37℃にそっと入って戴きます。
（ちなみに、
カラーセレクションの場合は、まじめに行ってください！）

E．
coliの試験管培養も1hr程振った後、週末は私同様目につかない所＠室温で休んでいただいて、月曜日に37℃で2-3hr
程振ってプレップ。心持ち薄めですがプラスミドはきちんと取れます（3mLまで。大量培養はまじめにしましょう）。敢えてコツと言えば、抗生剤を濃い目に入れるということ（通常量の1．
5倍程度。普通に振るときでもAmpだと8hr、Kmでも10hrも振ればO．
K）。抗生剤を入れたLB培地を室温に置いている人がわりといるのですが、個人的に駄目だと思っています。どう考
えても活性が落ちているのではないかと思うのでラボの慣例に従わずLB培地は一人で4℃に入れている私なのでした。

火水木金土日月編集部からのコメント：必ずうまくいく実験
は、
なるべく工夫して効率化したいものですね。土日を有意義に過ごせて、かつ月曜
日の午前中から臨戦状態に入れるという意味で大変良い方法のように思います。

実験川柳特集 3【句評】 MIAって、 missing in action （行方不明兵）のことなんですね。折角のサンプルが透析中になくなるってむなしいですよね。

【句評】メーカーとしては大変ありがたい一句です。皆様、WB解析にはCan Get Signal ®をお使いくださいませ。川柳としても大変よくできていると思います。

【句評】OHさん、
またまたご投句ありがとうございました。ノーベル賞級の研究はこのような事例を突き詰めて得られることも多いと聞きます。あきらめずに実験を続けてみては如何でしょうか？
●OH さんのコメント：
期待＆予想していた結果は右上がりだったのですが、結果は右下がり。
誤差はないので疑いようがなく、残念。

【句評】確かに。私の学生時代にもチップ洗浄当番なるものが存在しました。再生チップでタンパク質定量試薬を吸い込むと、その段階で着色したりして。懐かしいです。

【句評】追い詰められている時の「コンパチ」サイトって魅力ですよね。
後で後悔することも多いですが…。
●あっちゃん さんのコメント：
切断末端がcompatibleな制限酵素（Xba IとNhe I）
どうしでつないだために、悲しい思いをしました。

⇒弊社ウェブサイト（読者のコーナー＞ご投稿コーナー）からご投稿、ご投句いただけます。
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/reader/contribute/index.html
採用になった方には、図書カードをご進呈いたします。詳細は上記ウェブサイトをご覧ください。

8721

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 22●KOD FX 30％OFFキャンペーン 〜2007年8月31日（ご注文分）
高い成功率、抜群の増幅効率、優れた伸長性、および正確性を兼ね備えた新しいタイプのPCR●ヒト IGF2R遺伝子［NM̲000876］8.9kb（GC含量約90％の領域を含む）
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2

3

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酵素です。PCR実験の悩み、KOD FXが解決いM1：1kb DNA ラダー
1 ：KOD FX
2 ：A社汎用酵素（Taqベース）
3 ：B社Long PCR酵素（Taqベース）
4 ：C社GCrich対応高正確性酵素
5 ：D社GCrich対応Long PCR酵素Ⅰ
6 ：D社GCrich対応Long PCR酵素Ⅱ
M2：λ／Hin dⅢ digest

たします。詳しく
は本誌P5・6をご参照ください。

鋳型：ヒトcDNA（HeLa Total RNA 50ng相当）／50μl 反応系

品

名

KOD FX包装＊

200U×1本（200回用）

保存温度

Code No.

-20℃

KFX-101

価格

キャンペーン価格¥35,000¥24,500＊50μl反応を行った時の反応回数を表示しています。

●Emerald Luc Luciferase Assay Reagent
発売キャンペーン 〜2007年9月28日（ご注文分）
Emerald Lucはブラジル産ヒカリコメツキムシに由来するルシフェラーゼを採用した
高感度なルシフェラーゼアッセイシステムです。この度、in vitroアッセイ用の試薬を発売しました。キャンペーン期間中アッセイ試薬をお買い上げいただいた方にプロモーター配列挿入用プラスミドをご進呈いたします。詳細は、本誌P7〜9、および弊社ウェブサイト（www.toyobo.co.jp/bio）をご参照ください。

●お問い合わせ先のメールアドレスが変更になりました。
納期・注文に関するお問い合わせ order̲lifescience@bio.toyobo.co.jp ⇒ order̲lifescience@toyobo.jp
テクニカルライン techosk@bio.toyobo.co.jp ⇒ tech̲osaka@toyobo.jp

NOTICE TO PURCHASER :LIMITED LICENSE●PCR関連商品のラベルライセンスについての詳細は、弊社ウェブサイト
（www.toyobo.co.jp/bio）［PCR関連コーナー］をご覧ください。

●本ページ掲載の試薬類は全て一般研究用の目的にのみ販売しており、医薬品、診断用医薬品、化粧品、食品用等には使用できませんので、十分ご注意ください。誤用による事故については、当社は一切の責任を負いません。
●本ページ掲載商品にには消費税は含まれておりません。実際のご購入価格については弊社代理店へお問い合わせください。
●本ページ中の略号：毒 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外毒物です。
劇 印は毒物および劇物取締法に基づく医薬用外劇物です。
危 印は消防法に基づく危険物です。

2287

No.87.qx 07.7.5 15:18 ページ 23

新しいRT（逆転写）キットの登場です！
！ 新発売！

30％OFF 期間：2007年7月17日〜9月28日（ご注文分）

リアルタイム PCR用cDNA合成キット

本誌p1-2、p10-13に
詳細記事がございます。

HeLa細胞由来のtotal RNA
100ngを鋳型として逆転写
反 応を 行 な い 、β- A c t i nとPolymerase εの量をリアル
タイムPCR法を用いて定量
し比較しました。
図下の数値は、各社推奨の逆転写反応条件を示します。

¡抜群のcDNA合成効率！
！
！
¡短時間・簡便なプロトコールを採用！
！
¡リアルタイムPCR試薬との適合性がアップ！

ReverTra Ace® 弊社従来品
弊社従来品
qPCR RT Kit （Randomプライマー） （Oligo（dT）プライマー）
15min.
10min.
20min.
20min.

A社キット

B社キット

15min.

C社キット

10min.
30min.

15min.

9

7

13

1. 1.のタテのカギと対になる言葉。
2. 「栄養価」のことを

ヨ
コ
の
カ
ギ

6
11
2

10min.
2hr.

cDNA合成量比較
プレゼント
付き

バイオ・クロスワードパズル
1a

D社キット

controlは製造業の最重要課題です。

valueといいます。

3. 車を調整したり、ラジオの周波数を合わせることを意味する動詞です。
4. 有糸分裂促進因子（剤）。レクチンなどにもこの活性があります。
5. （選挙・投票によって）〜を選ぶ、という意味の動詞です。
6. ヘモグロビンとの親和性が酸素の200倍以上も強く、中毒の原因となる分子です。分子式で。

12d1. 「量」のことを英語で？
7. 「競売」のことを英語で？ 最近、
インターネットで盛んです。

5

10

タ
テ
の
カ
ギ

c

8

3

b

8. 「上の」という意味のある接頭語。最近、○○○geneticsの研究が盛んですね。
ちなみに、○○○geneticsとは、DNA配列の変化に依存しない遺伝子発現の変化が、細胞世代を超えて継承される現象を研究する学問です。それに伴って、DNAメチル化の研究などが近年盛んに行われるようになりました。
9. 原子番号53番。甲状腺ホルモンにも含まれる元素です。
10. 意匠文字、商標などを表わす単語です。
11. 阻害定数。酵素阻害剤の阻害の程度を表わす定数です。

412. 「卵母細胞」。母音二つで始まるめずらしい単語です。
13. 「tear」の過去分詞です。過去系は「tore」。高校時代に活用を暗記したような・
・

赤マスに入る文字は？

ab

ご応募はこちらから※ご応募期間 2007年8月6日〜2007年9月28日

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バイオクロスワードパズルの解答に加え、UPLOADのアンケート（下記クイズコーナーに記載）にご回答いただいた方から抽選で、10名様に2,000円分の図書カードをご進呈いたします。

弊社ウェブページ
1 （www.toyobo.co.jp/bio）

2

読者のコーナー3

クイズコーナー

http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/reader/quiz/index.html◆◆ 納期・注文に関するお問合せ ◆◆ライフサイエンス事業部（大阪）〒530-8230 大阪市北区堂島浜二丁目2番8号
TEL.06-6348-3786 FAX.06-6348-3833
E-mail order̲lifescience@toyobo.jp

ライフサイエンス事業部（東京）〒103-8530 東京都中央区日本橋小網町17番9号
TEL.03-3660-4819 FAX.03-3660-4951
E-mail order̲lifescience@toyobo.jp◆◆ 製品内容・技術に関するお問合せ ◆◆テクニカルライン
TEL.06-6348-3888 FAX.06-6348-3833
開設時間：9：00〜12：00 13：00〜17：00（土・日・祝を除く）
E-mail tech̲osaka@toyobo.jp［URL] http：//www.toyobo.co.jp/bio

A3743K/2007/8/19,000/1