THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix

QPX-201, QPX-201T【THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix トラブルシューティング】
現象
高濃度サンプルの反応で直線性が乱れる

原因
対策
サンプル DNA へのSYBR® Green I は全ての二本鎖 DNA に結合し、SYBR® Green I の結合 蛍光を発する性質を持つため、サンプルに高濃度によるベースラインの上 の二本鎖 DNA が含まれる場合、ベースラインが昇上昇し、正確な Ct 値を算出できなくなることがあります。サンプル濃度を下げて反応を行ってください。
サンプル溶液中の不純 サンプルの純度が低い場合、不純物によって物による反応阻害
PCR が阻害されることがあります。また、リアルタ
イム PCR 用に設計されていない逆転写反応用試
薬により合成した cDNA をご使用の場合、逆転写反応液に含まれる物質によって、反応が阻害されることがあります。サンプル濃度を下げて反応を行うか、サンプルの精製を行ってください。また、逆転写反応にはリアルタイム PCR 用に設計された試薬を用いてください。
低濃度サンプルの反 標的 DNA のコピー数が 反応液中に標的 DNA が数コピーから数十コピー応で直線性が乱れる 少なすぎるしか含まれない場合、確率的にコピー数のばらつきが大きくなり、直線性が乱れやすくなります。サンプル濃度を上げて反応を行ってください。
DNA の反応チューブへ 用いたサンプルの DNA 量が少ない場合、またはの吸着サンプルを希釈して長時間放置した場合、DNA が反応チューブへ吸着するなどの原因で実質的な鋳型量が減少することがあります。サンプル濃度を上げて反応を行ってください。また、サンプルを希釈して反応を行う場合は、希釈は反応直前に行ってください。
プライマーダイマーの同 標的 DNA の増幅と、プライマーダイマーの増幅と時発生が同時に発生し、標的配列のみの増幅曲線が検出できなくなることがあります。融解曲線分析によって複数のピークが確認される場合は、反応条件の再検討を行い、プライマーダイマーの発生を回避してください。
希釈系列サンプルの 非特異反応との競合
プライマーの特異性が十分でない場合、標的以外増幅曲線の間隔が揃の増幅反応が同時発生し、標的配列のみの増幅わない曲線が検出できなくなることがあります。融解曲線
分析によって複数のピークが確認される場合は、反応条件の再検討を行い、非特異反応の発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更を検討してください。

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THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix

現象
原因
PCR 効率が 80%を下 反応条件の不適合回る(slope < -3.95)

QPX-201, QPX-201T

対策
標的配列によっては、標準の反応条件で十分なPCR 効率が得られない場合があります。[4] 使用
方法 (2) PCR サイクル条件設定に従って、PCR反応条件の再検討を行ってください。
プライマーの Tm が通常 Tm が低いプライマーを用いた場合、標準のサイクよりも低い(60°C 以下) ル条件では十分にアニーリングが行われないことがあります。伸長温度を下げるか(p.8、*4 参照)、3ステップ PCR(p.12 参照)をお試しください。
プライマーの劣化
プライマーの劣化により、PCR 効率が大きく低下することがあります。プライマーの原液からの再希釈、またはプライマーの再合成を行ってください。
PCR 効率算出時に、直 直線から外れた Ct 値を PCR 効率算出に利用した線から外れた Ct 値を含 場合、算出値の誤差が増大します。直線から外れめた
た Ct 値を算出対象から外し、再計算を行ってください。
PCR 効率が 110%を PCR 効率算出時に、直 直線から外れた Ct 値を PCR 効率算出に利用した上回る
線から外れた Ct 値を含 場合、算出値の誤差が増大します。直線から外れ(slope > -3.1)
めたた Ct 値を算出対象から外し、再計算を行ってください。
再現性が良くないサンプルの純度が低い サンプルの純度が低いと、PCR への阻害が発生し、再現性が低下することがあります。サンプル濃度を下げて反応を行うか、サンプルの精製を行ってください。
希釈後、長時間放置し 濃度が薄い DNA 溶液は、容器への吸着によってたサンプルを使用実効濃度が低下することがあります。原液から再希釈を行ってください。また、希釈系列による標準サンプルは、希釈後の保存は避け、毎回反応時に原液から都度作製してください。
鋳型に精製プラスミド
精製プラスミド DNA 溶液や PCR 増幅産物を鋳型
DNA や PCR 増幅産物 として使用する場合、全 DNA 量に対する標的配を使用
列のコピー数が極めて高くなるため、反応液への添加量は少なくする必要があります。その際、溶液中の DNA 濃度が極めて低くなることで、DNA が容器への吸着などによって失われやすくなり、特に低濃度域の直線性や再現性が大きく低下する原因となります。希釈の際には、反応と関与しない核酸(Yeast RNA など)を希釈液に混合することで、低濃度域の直線性が改善される場合があります。
プライマーの品質差同一の配列を持つプライマーでも、合成時毎に品質差が発生することがあります。新規に合成を行った際は、従来用いていたものと比較実験を行って、品質差の確認を行ってください。

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QPX-201, QPX-201T

現象
no-template control(NTC)で増幅が見られる

原因
対策
プライマーダイマーの発 融解曲線分析において、no-template control のピ
生ークが標的配列よりも低温側に存在する場合は、プライマーダイマーの発生が疑われます。プライマーダイマーは、プライマー配列のほか、プライマーの品質によっても発生程度が異なります。まず[4]使用方法 (2) PCR サイクル条件設定に従って、PCR 反応条件の再検討を行い、改善が見られない場合には、プライマーの再設計や再合成を検討してください。また、再合成の際は、精製グレードを HPLC 以上にしてください。
コンタミネーションの発 融解曲線分析において、no-template control のピ
生ークが標的配列とほぼ同じ位置に存在する場合は、反応系へのコンタミネーションが疑われます。
再試時も再現する場合には、試薬類や滅菌水へのコンタミネーションが発生している可能性がありますので、試薬類や滅菌水の更新を行ってください。
増幅曲線の蛍光シグ 蛍光測定時間が短い
一部の機器では、PCR の伸長時間が短すぎる場ナルが弱い、または合、蛍光測定が十分に完了しない場合がありま
増幅曲線の形状がギす。増幅曲線のがたつきが目立つ場合には、伸長ザギザになる時間を長め(30～60 秒)に設定することで、改善される場合があります。
反応液量が少ない
機器の標準条件よりも少ない液量で反応を行った
場合、蛍光測定値の誤差が増大する傾向があります。液量を増やして反応を行ってください。
融解曲線分析で複数 非特異反応の発生
プライマーの特異性が十分でない場合、標的以外のピークが見られるの増幅反応が同時発生し、純粋な標的配列のみの増幅曲線が検出できなくなることがあります。反
応条件の再検討を行い、非特異反応の発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更を検討してください。
プライマーダイマーの発 標的 DNA の増幅と、プライマーダイマーの増幅と生が同時に発生することがあります。反応条件の再検討を行い、プライマーダイマーの発生を回避してください。改善されない場合は、プライマー配列の変更や、精製グレードを上げた再合成を検討してください。

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