逆相固定相どうなっているの？
これを知れば見方・使い方が変わる
ChromaNik

長江 徳和㈱ クロマニック テクノロジーズ
TEL: 06-6581-0885

FAX: 06-6581-0８９０

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http://chromanik.co.jp
日本薬科機器協会ラークショップ2013

1

ChromaNik

A)水の多い移動相を用いた場合の保持の変化と逆相充填剤の状態
B)通常の移動相中での逆相固定相のアルキル基の状態は？
また分離場として働く固定相とは？

2

通常の逆相カラムの水100%
移動相条件での保持の減少
ChromaNik

原因は: アルキル基の寝込み
Phase collapse
Ligand collapse
多くの論文で発表されていた
3

ChromaNik

アルキル基の寝込みによる説明の元となったと思われる論文

1979年
アルキル基の寝込みに関する論文
C18の寝込みについて記述されている
4

ChromaNik

5

ChromaNik

従来のアルキル基の寝込みによる説明
1999年アルキル基の寝込みによる保持減少の記述のある報文

6ChromaNik

HPLCカラムメーカーのよるアルキル基の絡み合い説ポリメリックＯＤＳはリガンド密度が高く，耐酸性はあるものの，リガンドの絡み合いや寝込み（collapse)によって，水１００％系では保持の急激な低下（可逆的）が生じるとされています。これは 多官能ＯＤＳ=ポリメリックＯＤＳという誤解によるものです。
Imtakt websiteより（http://www.imtakt.com/jp/Products/Unison/Ucollapse.htm）
7

ChromaNik

HPLCカラムメーカーのよるアルキ
ル基の寝込み説と撥水説

Sigma Aldrich website より（http://www.sigmaaldrich.com/japan/analytical-chromatography/hplc/ascentis.html）
8

保持の減少の本当の原因は？

ChromaNik

細孔からの移動相の抜け出し

9

ChromaNik

ODSカラムの保持挙動（水100%）条件
カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
１時間通液停止後再度通液し測定

流速: 1.0 mL/min
温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America October 2002.

保持時間：5.40minから0.41minに減少

再現性がない10

ChromaNik

ポンプ停止後のカラムの状態
初期 試料は保持している。
カラム
ポンプ

インジェクター

ポンプを止め圧力が0になったら、すぐにカラムIN側に密栓をする。
カラム
ポンプ

インジェクター

カラムOUT側から移動相が出てくる。(0.59mL)
その後送液開始すると保持はすでに短くなっている。
11

ChromaNik

水100%移動相条件下で保持が減少する理由
カラム内のODS粒子

移動相：水充填剤に圧力がかかっている場合

ポンプを停止し充填剤に圧力がからなくなると細孔内に移動相が満たされている状態

細孔内から移動相が抜け出た状態

細孔内から移動相が抜けた後、16MPa以上の圧力をかけないと戻らない。
細孔内に移動相を戻すためには有機溶媒を70%以上含む移動相に置換しなくてはならない。
12

細孔から移動相を抜け出させるためにどんな力が作用しているか？
ChromaNik

毛管作用
13ChromaNik

毛管現象とは（岩波 理化学辞典 第5版）

液体中に細い管（毛細管）を立てると、管内において液面が管外よりも上がりまたは下がる現象。液体分子間の凝集力と液体と管壁の間の付着力との大小関係により，液体が管を濡らす（付着力が大きい）ときは液面は上昇し、濡らさないときは下降する。管の内外の液面の高さの差をh、管の半径をr、液体の密度をρ、液体の表面張力をγ、接触角をθ、重力加速度をgとすれば、h=2γcosθ/rρgとなる。
14

ChromaNik

毛管現象
Capillarity, Capillary phenomenon
水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合

毛管現象の式:h=2g cosq /(rrg): 表面張力: 液体の密度（比重）

q
g
r

h
r

h

q

液体が管に濡れる場合
q < 90°液体が管に濡れない場合
q > 90°15ChromaNik

毛管現象
内径0.5mmのガラス管

10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006気圧である。内径が1mmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

カラムを大気圧状態にして、移動相を逆相充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。

16

ChromaNik

アルキル鎖長と細孔径の影響%

ポンプ停止1時間後の保持比較

C1
C30

C18

C8

ChromaNik

バックプレッシャーの影響
カラム：C18 (10.3nm)

相対保持時間（％）

100

4.6 x 150 mm
粒子径：5 mm80

ヒステリシスカラムのみにかかる圧力：6 MPa
移動相：水

60

40

20

ポンプを停止せず
バックプレッシャーを下げた場合

流速：1.0 mL/min

ポンプ停止後パック
プレッシャーを上げた場合

試料：2-プロパノール

0
0

5

10

15

20

25

30

バックプレッシャー(MPa）T. Enami and N. Nagae, American Laboratory October 2004.

温度：40℃＊カラムの後に内径0.13mmの配管を0.2から3m接続し、カラムのout側に圧力がかかった状態で測定
35 ＊ポンプ停止前の保持を100%とし、ポンプ停止後再通液時の保持の割合を縦軸としました。

ChromaNik

カラム内充填剤の細孔内の状態
Column: C18 (10) 5 mm 150 x 4.6mm, Mobile phase: Water,
Flow rate: 1.0mL/min, Temperature:40℃
カラム入口の圧力
100① 8.5 MPa

2.5 MPa80② 17 MPa

11 MPa60③ 22 MPa

16 MPa

④ 36MPa

30 MPa

⑤ 11MPa

5 MPa⑤
相対保持時間（％）

カラムで口の圧力④③

40

ポンプを停止せず
バックプレッシャーを
下げた場合

20

ポンプ停止後パック
プレッシャーを上げ
た場合

②

①

細孔内に移動相が入り込んでいる状態
0
0

5

10

15

20

25

バックプレッシャー(MPa）3035

細孔内から移動相が抜け出た状態
T. Enami and N. Nagae, American Laboratory October 2004.

ChromaNik

バックプレッシャーの影響
16MPaで細孔径内に水
カラム：ODS(10.3nm)
4.6 x 150 mmが入りことから
粒子径：5 um

相対保持時間（％）

100

80

ヒステリシスカラムのみにかかる圧力：6 MPa
移動相：水C18表面と水との接触
ポンプを停止せず
流速：1.0 mL/min
バックプレッシャーを角を計算すると下げた場合
温度：40℃

6040

ポンプ停止後パック
プレッシャーを上げた場合

20

試料：2-プロパノール＊カラムの後に内径0.13mmの配管を0.2から3m接続し、カラムのout側に圧力がかかった状態で測定

１２６度となる

0
0

5

10

15

20

25

30

バックプレッシャー(MPa）T. Enami and N. Nagae, American Laboratory October 2004.

35 ＊ポンプ停止前の保持を100%とし、ポンプ停止後再通液時の保持の割合を縦軸としました。

ChromaNik

アルキル鎖長と細孔径の影響
ポンプ停止1時間後の保持比較%

毛管現象の式:h=2g cosq /(rrg)

126度

C1
C30

108度

C18

C8

140度

ChromaNik

水100%移動相で安定な保持を得る
ためには
逆相充填剤は水に濡れない－接触角は90度以上
毛管作用によって抜け出そうとする圧力が大気圧（0.1MPa)以下であればよい
細孔径が10nmの充填剤の場合

C8 :水との接触角は140度→→大気圧以上→→移動相抜ける
C18 :水との接触角は126度→→大気圧以上→→移動相抜ける
C30 :水との接触角は108度→→大気圧以下→→移動相抜けない

ChromaNik

C18表面と30%メタノールは濡れるか？
それぞれの溶液にC18充填剤を混ぜ、超音波の振動を加えながら撹拌混合した。
・70%メタノールでは超音波の振動を加えなくても完全にC18充填剤が分散する。分
散後沈降し始める。
・50%メタノールでは一部分散している。
（超音波振動を加えない場合は全く分散しない）

・30%メタノールでは全く分散していない。

メタノール/水(30:70)(50:50)(70:30)T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

メタノール濃度が50%以下の溶液はC18
表面に濡れないため、細孔内に入り込めない。しかし、圧力をかける、また100%メ
タノールで濡れている状態から溶液を切り替えた場合には30%メタノールでも細孔内に入り込み、その後大気圧にしても細孔から抜け出すことはない。
23

ChromaNik

大気圧が１気圧以下であるならば＊真空ポンプでカラム内の圧力を大気圧以下にし、20分間放置＊充填剤細孔から移動相が抜けた場合にはカラムの重量が変化
24

ChromaNik

ODS充填剤中の10%メタノール溶媒の状態

カラム: C18, 5 mm - 250x4.6mm

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)

0
-0.05

カラム内溶媒: メタノール/水=(10:90)-0.1

カラム温度: 40 ℃

-0.15

放置時間：20分間-0.2＊10%メタノールをカラムに通液した場
合はポンプ停止後でも保持の変化は認められず、充填剤細孔から溶媒が抜けることはない。

-0.25
-0.3
-0.35
-0.4
-0.45
-0.5
0

0.02

0.04

0.06

気圧（MPa)0.08

0.1＊模擬的に大気圧を１気圧以下にした
場合、0.05MPa未満ではカラムの重量が減り、充填剤細孔内から溶媒が抜け出ている。

ChromaNik

C18充填剤中の0.01MPaでの溶媒の状態
カラム: C18, 5 mm - 250x4.6mm

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)

0
-0.05

模擬大気圧: 0.01MPa-0.1

カラム温度: 40 ℃

-0.15

放置時間: 20分間

-0.2

＊70%以上のメタノールをカラムに通液した場合は0.01MPaでも充填剤細孔からの溶媒の抜け出しはほとんど認められず、50%以下では溶媒の抜け出し
ている。

-0.25
-0.3
-0.35

C18表面と移動相の接触角が90°以上

-0.4
-0.45
-0.5
0

20

40

60

80

100

メタノール/水移動相のメタノール濃度(%)＊70%以上のメタノールではODS充填剤が濡れるため、毛管作用により細孔内へ入り込む力が働き、充填剤細孔か
ら溶媒は抜けでないが、50%以下では濡れないため、抜けようとする。
26

逆相固定相のアルキル基：寝込んで（絡み合って）いるのか（Ligand Collapse)
または立ち上がっているのか？
ChromaNik

一般的にはアルキル基は立ち上がっていると考えられている？
しかし視点を変えると違った見方ができる
27

ChromaNik

有機溶媒中でのオクタデカンの状態
メタノールにオクタデカン（C18H38)は混ざらない（溶けない）

テトラヒドロフラン（THF)にオクタデカン（C18H38)は溶ける

メタノールとの接触面積が最低になるようなコンフォメーションをとると考えられる

28

ChromaNik

C18表面上での溶媒和の概略図
メタノール

アセトニトリル

オクタデシル基は寝込
み，表面に少量のメタ
ノールが溶媒和している

メタノールと同様に，オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和しているテトラヒドロフラン

オクタデシル基は立ち上がっており，全体にテトラヒドロフランは溶媒和しているほとんど（95%以上）固まった状態であると推測される
29

ChromaNik

ラマンスペクトルによる溶媒和量の測定
Adsorption Mechanism in RPLC. Effect of the Nature of the Organic Modifier
Fabrice Gritti, and Georges Guiochon, Anal. Chem., 2005, 77 (13), 4257-4272

30

ChromaNik

Molecular Dynamics Simulations of Alkylsilane Stationary-Phase Orderand Disorder. 1. Effects of Surface Coverage and Bonding Chemistry
Katrice A. Lippa, Lane C. Sander, and Raymond D. Mountain
Anal. Chem., 2005, 77 (24), 7852-7861

第15回LCテクノプラザ2010

31

ChromaNik

Molecular Dynamics Simulations of Alkylsilane Stationary-Phase Orderand Disorder. 1. Effects of Surface Coverage and Bonding Chemistry
Katrice A. Lippa, Lane C. Sander, and Raymond D. Mountain
Anal. Chem., 2005, 77 (24), 7852-7861

32

ChromaNik

移動相中の有機溶媒の固定相への溶媒和の測定
有機溶媒の保持係数から移動相と固定相の分配量を計算
有機溶媒の固定相への分配量を溶媒和量と仮定
33

ChromaNik

アルコール類の分離
2

カラム：ODS 250 x 4.6 mm
移動相：水
流速: 1.0 mL/min
温度： 40 C
検出：RI
試料: 1. メタノール
2. エタノール
3. アセトニトリル
4. 1-プロパノール
5. 2-プロパノール

5
4
1
3

逆相ＬＣの移動相で用いられる有機溶媒も保持し，分離できる34

ChromaNik

アセトニトリル・水移動相を用いたｔ０（亜硝酸ナトリウ
ム）とアセトニトリル（ベイカントピーク）のクロマトグラム
Acetonitrile/water=(20:80)

t0 (Sodium nitrite) カラム：C18 4.6x150mm
流速：0.5 mL/min

温度：40℃

Systemvolume0.291 min Acetonitrile/water=(10:90)

Acetonitrile/water=(5:95)

ts (Vacant peak of acetonitrile)

Acetonitrile/water=(2:98)
Acetonitrile/water=(1:99)

0

1

2

3

4
TIIME (min)

5

6

7

8

アセトニトリルは保持しており，固定相中に分配する。この分配量を35
溶媒和量とする

ChromaNik

アセトニトリル・水移動相を用いた場合の保持時間，保持および固定相へのアセトニトリルの分配量
k = (ts-t0) / (t0-system volume)

k=S/M

S=kxM

カラム：ODS 4.6x150mm，カラム中の充填剤は約1.5gであり，この充填剤の約0.3g(0.35mL)がC18固定相に相当する
6
0.8
0.101mL

アセトニトリルの保持時間

5

0.7

4

0.5

亜硝酸ナトリウムの溶出時間

30.4
0.059mL

2

0.033mL1

アセトニトリルの保持（ｋ）

0.2

0.017mL 固定相へのアセトニトリルの分配量
0.011mL

0
0%

0.3

保持（ｋ）

時間（分）

0.6

5%

10%

15%

0.1
0
20%

移動相中のアセトニトリル濃度(%)
36

ChromaNik

C1, C18およびC28固定相 へのアセトニトリルの分配量（溶媒和量）

カラム内固定相中の有機溶媒量(mL)

0.16

TMS (C1)
C18
C28

0.12

カラム: TMS (C1, %C: 5%)
C18 (%C: 16%)
C28 (%C: 16%)
4.6x150mm

0.08

アルキル鎖長が長くなっても溶媒和量は大差ない

0.04

0
0

5

10

15

20

25

有機溶媒濃度(%)
37

ChromaNik

C1, C18およびC28固定相の状態
移動相：CH3CN/H2O

C28

C18

: Acetonitrile

C1 (TMS)

疎水性表面上に溶媒和するため，アルキル鎖長が異なっていてもアセトニトリ
ルの溶媒和量はほとんど同じである。
またラマンスペクトルを用いてアセトニトリルの溶媒和量を測定した報告もある
が，同様にC1, C8, C18固定相への溶媒和量は同じであると結論づけている。
38

ChromaNik

C18固定相への分配量（溶媒和量）
カラム：C18，（一部C28)

0.2
テトラヒドロフラン THF(C28)

4.6x150mm

カラム内固定相中の溶媒量(mL)

テトラヒドロフラン THF

１）4.6x150mmカラムにC18充
填剤は約1.5g入っている

アセトニトリル

0.15

エタノール

２）C18の炭素含有量16%
C28の炭素含有量16%

メタノール

0.1

カラム内のオクタデシル基の容量は約0.35mLと計算される

0.05

有機溶媒濃度20%でメタノール
は約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している。

0
0

5

10

15

有機溶媒濃度(%)

20
39

ChromaNik

C18表面上での溶媒和の概略図
メタノール

アセトニトリル

テトラヒドロフラン

オクタデシル基は寝込み，表面に少量のメタノールが溶媒和している

オクタデシル基は寝込んでおり，表面にアセトニトリルが溶媒和している

オクタデシル基は立
ち上がっており，全体にテトラヒドロフラ
ンは溶媒和している40

ChromaNik

アセトニトリル・水移動相を用いた場合の保持時間，保持および固定相へのアセトニトリルの分配量
60.8
0.101mL

アセトニトリルの保持時間

5

0.7

4

0.5

亜硝酸ナトリウムの溶出時間

30.4
0.059mL

2

0.033mL1

アセトニトリルの保持（ｋ）

0.2

0.017mL 固定相へのアセトニトリルの分配量
0.011mL

0
0%

0.3

保持（ｋ）

時間（分）

0.6

5%

10%

15%

0.1
0
20%

移動相中のアセトニトリル濃度(%)

亜硝酸ナトリウムの溶出時間（t0）の減少量と固定相へのアセトニトリルの分配量の増加量が一致する

41

ChromaNik

有機溶媒によるt0の変化
7
5

1 3
2

0

2

6

50% THF

カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.

6 7
74% アセトニトリル
5682% メタノール

アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるよ
うに有機溶媒と水との混合比を決定

4 6

4
4

カラム: C18, 5mm, 4.6 x 150 mm

7

45

123
2
1 3

移動相：

(mL)

8

10

ウラシルｔ０の溶出量

1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール，4. ブチルベンゼン, 5. o-ターフェニル，
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ，7. トリフェニレン

１）溶媒和した有機溶媒とアルキル基の両方が固定相として働く。
２）溶媒和量の多い場合にｔ０は小さくなる

0

３）THFはメタンノールに比べ，0.25mL（=1.89-1.64）多くアルキル基に溶媒和し46ていることになる

2

1.64mL
1.80mL1.89mL42

42

ChromaNik

C18固定相への分配量（溶媒和量）
0.55
0.5
カラム内固定相中の溶媒量(mL)

カラム：C18，C28, C8

テトラヒドロフラン THF(C28)
テトラヒドロフラン THF

0.45

4.6x150mm
THF(C28)

アセトニトリル

0.4

エタノール

0.35

THF(C18)

メタノール

0.3
THF(C8)１）4.6x150mmカラムにC18充
填剤は約1.5g入っている
２）C18の炭素含有量16%
C28の炭素含有量16%
カラム内のアルキル基の容量は約0.35mLと計算される

0.25
0.2

有機溶媒濃度20%でメタノール
は約0.04mL，アセトニトリルは約0.1mL，テトラヒドロフランは約0.15mL溶媒和している。

0.15
0.1
0.05
0
0

20

40

60

有機溶媒濃度(%)

80

100

82%メタノールの溶媒和量を0.06mLと仮定すると，ウラシ
ルの溶出量から74%アセトニト
リルと50%THFの溶媒和量はそれぞれ0.15mLと0.31mLとなる43

ChromaNikto（ウラシル）の溶出時間の比較
カラム: C18, 5mm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm. 試料: 1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール
アミルベンゼンの溶出量が約8mLになるように有機溶媒と水との混合比を決定

有機溶媒の疎水性(Log P)

82%メタノール-0.77

70%エタノール-0.31

58% 2-プロパノール
74%アセトニトリル

067%ジオキサン

-0.34
-0.42

50% THF

0.46
1

2

Retention time/min

酢酸エチル: 0.73
3クロロホルム: 1.97
44

ChromaNik

メタノールとテトラヒドロフラン（THF)の差
メタノール

2 3
1

Sunniest C28 ％C:16%

2

Sunniest C18 ％C:16%

1

2
1

4

3

6

7

5

4

3

4

5

6

7

5

0

7

5

Sunniest C8 ％C:10%

6

10

THF

15
20
Retention time/min

30

5

3

6

4
7

1 2

Sunniest C18 %C:16%

5

3

4
1

6

7

2

Sunniest C8 %C：10%

5
3
4

0

35

Sunniest C28 ％C:16%

7

1 2

25

Column: Sunniest C28, C18, C8, 5mm
4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=75/25
THF/H2O=50/50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

5

6

10
15
Retention time/min

Peak 5
20

25

Peak7
45

ChromaNik

C28,C18,C8固定相の状態
C28%C 16%

C18 %C 16%

CH3OH/H2O=75/25

C8 %C 10%

C28

：メタノールC18：THF

THF/H2O=50/50
C846

ChromaNik

移動相有機溶媒の選択性
5=o-terphenylと7=triphenyleneの溶出順序
7

7
5

2
3
1

6

4
7
5

2
1 3

4

0

2

4

4

6

8

7

23
1

7

10

6

0

2

4

6

5

58% 2-プロパノール
1=2.3
3
8.0 MPa2=10.2
d= 7.254

570% エタノール=1.2
6.1 MPa=11.2
d= 6.8

6

6,7
23
1

2
1 3

82% メタノール=0.6
3.7 MPa=12.9
d= 6.2

5

4 6

4

6

8

74% アセトニトリル=0.37
2.3 MPa=11.8
d= 6.567% 1,4-ジオキサン=1.54O
6.5 MPa
= 9.8
O
d=7.8
49% THF=0.55
5.5 MPa
= 9.1
d=7.6
10

O

47

ChromaNik

炭素含有量の同じC28とC18はメタノール・
水移動相条件では保持は同じ
1

Conventional C18%C:18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=(97:3)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC

2, 3
4

C18

Detection: UV@295nm
0

5

10

15
20
retention time / min

Sunrise
C28 %C:18%

25

30

Sample: 1=δ-Tocopherol
HOO

2=γ-Tocopherol

1

C28

HO
O

3=β-Tocopherol

2

HO

4

3

O

4=α-Tocopherol
HO

0

5

10
15
20
retention time / min

25

30

35

O

固定相容量は同じ
48

ChromaNik

炭素含有量の同じC28とC18でもアセトニトリル・
クロロホルム移動相条件では保持は変わる
C18
1 2

1

2
Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:
CH3CN/CHCl3=(80:20)
Flow rate: 1.0 mL/min

Conventional
C18 %C:18%

C28

Temperature: 30 ºC
Detection: UV @450nm
Sample: 1=a-Carotene

Sunrise C28 %C:18%

2=b-Carotene
0

5

10

15

20

25

30

35

Retention time / min

固定相容量は2倍49ChromaNik

メタノール・水移動相におけるアミルベ
ンゼンとフェノールの保持◆標準試料の分離例
2 3
1

Sunniest C28 %C:16%

2

Sunniest C18 %C:16%

4

3

1

5

1

5
3

4

5

6

10

2

1

Sunniest C18 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.38

7

5

1

6

Sunniest C8 %C:10%

25

30

1

35

Column: Sunniest C18, C28, C8, 5mm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene,
5 = o-Terphenyl,
6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

0

2

3

2

Sunniest C8 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.41

7

15
20
Retention time/min

3Sunniest C28 分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.40

7

6

4

2

0

◆ピリジンとフェノールの分離

3

2

4
6
Retention time/min

8

Column: Sunniest C18, C28, C8, 5mm 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Pyridine
3 = Phenol

C8はC18とC28に比べ，アミルベンゼンの保持は半分であるが，フェノールの保持はほぼ同じである。
50

ChromaNik

試料とC18固定相の相互作用場
メタノール・水移動相：メタノール

C18

C8

アミルベンゼンはオクタデカンに可溶
OH

フェノールはオクタデカンに難溶
51

ChromaNik

層の厚い固定相（C30)と層の薄い固定相（C18)の比較
ノンポーラスシリカにポリメリックC30とモノメリックC18を結合
NP-C30, %C：0.23%

炭素含有量は約1/4で層の厚みも約1/4
NP-C18, %C：0.06%

52ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
タンパク質の分離
4.6x30mm

NP-C18A) 0.1%TFA,
B) CH3CN
グラジエント溶離

Sample: 1 = Ribonuclease,
2 = Insulin,
3 = Cytochrom C,
4 = Lysozyme,
5 = Myoglobin,
6 = Carbonic anhydrase

タンパク質

NP-C30タンパク質

Retention time/min

タンパク質は固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す
53

ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
多環芳香族炭化水素の分離
4.6x30mm

NP-C18

NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 20%-100%,
5 min

No. 11

グラジエント溶離
No. 1

Retention time/min

Retention time/min

多環芳香族炭化水素は極性が低いため，アルキル基全体と相互作用し，
NP-C30は固定相が厚く，NP-C18に比べ溶質の固定相内への出入りに時間がかかるため，ピークがブロードになると考えられる
54

ChromaNik

NP-C30とNP-C18の比較
ナギのメタノール抽出成分の分離
4.6x30mm

NP-C18

NP-C30A) H2OB) CH3OH%B: 0%-30%,
5 min
グラジエント溶離Retention time/min

Retention time/min

ナギの極性成分も固定相表面のみと相互作用していると考えられる
C18とC30はほぼ同じ分離を示す
第15回LCテクノプラザ2010

55

ChromaNik

水素結合性の比較 キサンチン類の分離
Sunrise C18

メタノール・水(30:70)

3
2

1

4
2

Sunrise C18-SAC

1=TheobromineOα(3/4)=0.50
3

4

2.84倍

α(3/4)=1.42

1

4

2
1

N

N

1

3

2

4

2,3

3=Caffeine

0

2

O

2.88倍Column:

THF・水(30:70)
4

2
1

H3C

α(3/4)=0.46

1
3

4

6
8
10
Retention time/min

OCH3

アセトニトリル・水(30:70)

α(3/4)=0.16

H3C

N

O

3

α(3/4)=0.0664α(3/4)=0.081

12

14

O

CH3

HN
O

2=Theophylline

N

N

N

CH3

4=Phenol

CH3
N

N

H
N

N

OH

N

CH3

Sunrise C18, End-capped （%C:15)
Sunrise C18-SAC, Not end-capped(%C:14%)5mm, 4.6x150 mm
Mobile phase:
CH3OH/H2O=30/70
1.22倍
CH3CN/H2O=30/70
THF/H2O=30/70
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

カフェインは水素結合性が高く，シラノール基の存在により保持が大きくなるが，THFを用いるとシラノール基の影響が少なくなる
56

ChromaNik

水素結合性の比較 固定相の状態
THF・水

メタノール・水

カフェイン

O
H3C

O

CH3
N

N

N

N
CH3

O
H3C

O

CH3

カフェイン

N

N

N

N
CH3

OH

OH

OH

OH

THF・水移動相を用いた場合には，極性の高いTHFが固定相内に存在することにより，溶質に対するシラノール基の影響を弱ませる。
57

ChromaNik

まとめ・水移動相と用いた場合には逆相アルキル基は寝込んでしまうと言われていたが，メタノール移動相でもアルキル基はほとんど寝込んでいると推察される。
・水移動相での逆相カラムの保持の減少はアルキル基の寝込
みや絡み合いではなく，毛管作用による充填剤細孔内からの移動相の抜け出しである。
・THF・水移動相ではアルキル基はTHFの溶媒和により立ち上がるようになり，寝込んでいると推察されるメタノール・水移動
相とは異なる分離が可能である。
58