静電気学会誌，44, 1（2020）8-13

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

高電界パルス殺菌におけるパルス波形に関する考察
宮﨑 大貴 ，豊満 陽希 ，片野 景一郎 ，主計 俊哉 ，勝木 淳
＊, 1

＊

＊

＊

＊＊

（2019年9月12日受付 ; 2019年11月29日受理）

Experimental and Analytical Considerations of Pulse Waveformfor Efficient Sterilization Using Pulsed Electric Field
＊, 1

＊

＊

Daiki MIYAZAKI , Haruki TOYOMITSU , Kei-ichiro KATANO ,＊＊＊Shunya KAZUE and Sunao KATSUKI（Received September 12, 2019; Accepted November 29, 2019）
Pulsed electric field（ PEF ）is one of the non-thermal physical bactericidal agents that are unlikely to denature ingredients infresh liquid foods. This paper discusses the optimum pulse waveform experimentally and analytically for efficient PEF
7sterilization. Enterobacter aerogenes in carboxymethyl cellulose solution（10 /ml ）was continuously subjected to various kindsof PEFs（ field strength: 30-50 kV/cm, pulse duration: 100-600 ns ）before the exposure to the mild thermal energy at thetemperature of 55℃. The minimum pulse durations for the field strengths of 30 and 50 kV/cm for 6-log order bacterial reduction
were approximately 600 and 400 ns, respectively. PEFs with a longer pulse duration and a moderate field strength tends to killbacteria more efficiently than more intense and shorter ones, in the experimental range. The pore expansion process based on thethermal energy associated with the pulse waveform was discussed using the quasi-steady state calculation of the electric fieldaround the pore. The pulse waveform determines the history of the energy dissipation in the pore, of which the diameter
influences the transmembrane electric field around the pore. The calculation suggests that longer pulses enlarge the membranepore, whereas faster buildup fields are likely to increase the number of the pores.

1．はじめに

温物理殺菌法

国連食糧農業機関（ FAO ）と世界保健機関（ WHO ）

原理的に細胞膜を有する対象のみを選択的に傷害し，タの合同機関である食品規格（ CODEX ）委員会で発表さンパク質などの食品成分への直接的な影響はほとんどなれた国際的な食品衛生管理基準である HACCP（ Hazard

い． PEF 処理によるタンパク質凝集が数例報告されてAnalysis and Critical Control Point ） は，流通する全てのいるが加工食品に対して十分な殺菌を義務付けている．その手に起因するものである．PEF 法は連続処理を可能とし，法として大容量処理かつ確実な殺菌が可能であることか

処理部が小さいので現行の食品製造ラインに容易に付設

ら加熱殺菌が主流となっている．しかし，生鮮食品，特できるなど , 製造現場とのマッチングが良い．

1）に，牛乳，豆乳や液卵に代表されるタンパク質を主成分

2-4）のうち高電界パルス（ PEF ）殺菌法は，，いずれもジュール熱による過度な液温上昇

5, 6）

1967 年 Sale と Hamilton の実験以降，数多くの PEF 殺とする食品は栄養素や風味成分が熱によって劣化する．

菌の研究が行われてきた

このため，予てから低温殺菌技術が求められている．低界分布や温度分布，電界に対する菌の向きや媒体の性質．PEF 法では，電極間の電7-9）といった物理因子のほか，細胞周期や膜の状態などの生キーワード：高電界パルス，液体低温殺菌，パルス波形，
膜小孔，準静電界解析＊
熊本大学大学院自然科学教育部情報電気工学専攻（〒860-8555 熊本県熊本市中央区黒髪 2丁目39番地1号）
Department of Computer Science and ElectricalEngineering, Graduate School of Science and Technology,
Kumamoto University, 2-39-1, Kurokami, Chuo-ku,
Kumamoto-shi, Kumamoto 860-8555, Japan＊＊
熊本大学パルスパワー科学研究所（〒860-8555 熊本県熊本市中央区黒髪 2丁目39番地1号）
Institute of Pulsed Power Science, Kumamoto University,
2-39-1, Kurokami, Chuo-ku, Kumamoto-shi, Kumamoto
860-8555, Japan1d.miyazaki@st.cs.kumamoto-u.ac.jp
DOI：https://doi.org/10.34342/iesj.2020.44.1.8

物的因子が膜損傷の程度や損傷に対する応答に影響す
る．PEF は菌膜を傷害するが，菌の一部は回復して活動を再開する．この生き残った菌を損傷菌といい，こ10, 11）

れが PEF 法の殺菌効果を弱める原因の 1 つである．PEFの殺菌作用を高めるために，天然由来の抗菌物質を添加したり，温熱を併用するなど工夫されている．著者

12, 13）

らも液状全卵の殺菌を想定し，50 kV/cm の PEF とタン
パク質が変性しない 55℃の温熱処理を組み合わせて，カルボキシメチルセルロース水溶液中のエンテロバクター菌の 7 桁殺菌に成功している．

14-16）

製造現場で求められる毎時 1 トンを超える大流量処理
では，PEF 処理中の冷却がほとんど効かないので，ジュ高電界パルス殺菌におけるパルス波形に関する考察（宮﨑 大貴ら）

9

ール発熱による液温上昇が深刻になる．液温上昇抑制のレス管を通って一旦加温器で温度 T1（ = 50℃）に昇温されためには PEF への投入電気エネルギーを小さくするこ

た後，PEF 処理部において所定条件の PEF を受ける．本研とに尽きる．前出の PEF と他の処理との組み合わせは，

究では，出口温度が入口温度と等しくなるように冷却パワ

電極から液体に供給されるエネルギーを減じるための方ーを調整した．その後菌液は，55℃の保温器を 150 秒間で策である．一方で，殺菌効果を高めるためのパルス波形

通過し，ペリスタポンプで排出後に採取される．PEF 処理

やパルス幅に関する議論も数々行われてきた．電界部を通過する間に菌液に与える平均パルス回数を 5回とし強度を一定としてパルス幅のみを変化させた場合，パルた．液温を冷媒で一定に保つために，パルス電源の繰返しス幅が長いほど殺菌効果は大きくなるが，エネルギー効

周波数を 1 pps，流速を 10 ml/min とした．菌液が PEF 処理率でみると 600～1000 ns で極大になるようである ．た部を通過する時間，系全体を通過する時間，および 1回のだ，殺菌とパルス波形との関連性を述べた研究の多くは

試験時間はそれぞれ 5 秒，3分 30 秒，
および 5分以内である．

17, 18）17）

現象論に終始し，理論的な議論は見られない．本論文では，

2.3 パルス電源

PEF と温熱を組み合わせた殺菌法において殺菌効果を最パルス電源は，高電圧シリコンケーブルで作った空芯大にするパルス波形の特徴について，殺菌実験と数値計

インダクタ L（260 nH ）と高電圧キャパシタ C（2.6 nF，算とを併せて議論する．パルス波形として台形を前提とFHV-9AJ, TDK ）を 1組として梯子状に n 段結線したブル

する．PEF の操作可能な因子は電界強度とパルス幅であームライン型パルス形成回路（ BPFN ），およびこれを充り，付随する因子として電界の立上り速度にも着目する．

電する直流電源から成る

まず殺菌実験において，パルス幅を 100～600 ns，電界強ンス Z および出力電圧のパルス幅 dt は次式で表される．

度を 30～50 kV/cm の範囲で変化させ，これら PEF 因子と殺菌強度との関連を調べた．また，菌を単層の誘電体膜からなる薄膜球体とする物理モデルを用いて細胞膜上に形成された小孔に対する外部電界の役割を考えた上で，殺菌のための最適な PEF の波形について考察する．

Z=2
dt = 2n．出力端からみたインピーダ

14-16）

L⁄C

（1）

LC

（2）

Z は 20 Ω 固定である．dt は n によって容易に変更できる．
本実験では n を 2，4，6，8 および 11 とし，dt（ FWHM ）はそれぞれ 100，200，300，400 および 600 ns となる．BPFN

2．殺菌実験
2.1 菌および菌液
本研究は液状全卵の殺菌を想定し，それを模した条件で実験した．卵の加工食品でしばしば食中毒の原因となるサルモネラ菌と同科であり低浸襲性のエンテロバクター菌（ Enterobacter aerogenes，ATCC 13048, グラム陰性）を用いた．35℃で 24 時間培養した菌を一旦 10 ml の生
理食塩水に懸濁する．精製水にカルボキシメチルセルロ
ースナトリウム 1.5％と食塩 0.25％を溶解し，導電率（6.7
mS/cm ）と粘度（15.5 mPa・s ）を液状全卵と同等に調整する．このカルボキシメチルセルロース（ CMC ）水図 1 高電界パルス殺菌実験システム
Fig.1 Experimental setup for PEF sterilization.

溶液 500 ml をオートクレーブ（120℃×30 分）し，これに菌を混釈して菌濃度 10 個 /ml 菌液とした．
7

2.2 1回通過連続流式殺菌システム
本装置は，菌液を連続的に流しながら 1 回のみ通過させて処理するシステムである．PEF 処理部は，間隔14-16）

4 mm の並行平板ステンレス電極（SUS316）からなり，液体冷媒で冷却可能である．PEF 処理部の入口と出口の流路内に蛍光式光ファイバー温度計のファイバーセンサを挿入
して液温を監視した．系全体を 2 気圧加圧し，出口のペリ
スタポンプによって流速を調整した．加圧ステンレス容器に入った濃度 10 個 /ml の菌液は，外径 1/4 インチのステン
7

図 2 PEF 印加部における電圧波形
Fig.2 Voltage waveforms applied to the PEF treatment cell.

静電気学会誌 第44巻 第 1 号（2020）

10の短絡スイッチにはロータリーギャップスイッチを用いた．PEF 処理部の電極間電圧を高電圧プローブ（ P6015a，
Tektonix ），電流をピアソンコイル（ Model 101, Pearson ）を用いて測定した．Fig. 2 に PEF 処理部に菌液を流しながら印加した 20 kV のパルス電圧波形を示す．電極間は 53
pF の静電容量を含むが 20 Ω の抵抗性負荷とみなしてよい．

2.4 殺菌強度評価
コロニーカウント法を用いて殺菌強度を評価した．まず採取した菌液を生理食塩水で希釈する．処理条件から予想される菌数に応じて 1/10 希釈を数回繰り返す．コ
ントロールとして未殺菌処理の菌液を同様に 1/10 およ5

び 1/10 となるように希釈した．これらを 200 µl ずつ標
6

準 寒 天 培 地 に 塗 抹 し， イ ン キ ュ ベ ー タ（ ICL300b,
Yamato ）で 37℃，24 時間培養した後，寒天上のコロニ

図 3 エンテロバクター菌に対する様々なパルス幅および電界強度の PEF 処理の殺菌強度（平均印加パルス数 : 5）
Fig.3 Bactericidal effect Log（ N/N0）of variety kinds of PEFs interms of field strength and pulse duration for Enterobactor
aerogenes（ number of pulses during the PEF treatment : 5）．

ーを目視で計数した．PEF 処理した生菌数 N とコント

電界を用いても 400 ns 以上のパルス幅が必要である．40

ロールの生菌数 N0 の比の対数 Log（ N/N0）を殺菌強度

kV/cm および 30 kV/cm に対して 6 桁殺菌を可能にする最とした．各条件の試行回数は 3 回である．

小パルス幅は近似曲線よりそれぞれ約 500 ns，600 ns であ

2.5 菌膜損傷の評価

る．6 桁殺菌するために必要な単位質量あたりの電気エPEF 処理した菌の膜損傷を確認するために，基質膜のネルギー，すなわちエネルギー効率を比較すると，30

物質透過性を示唆する蛍光試薬ヨウ化プロピジウム

kV/cm@600 ns，40 kV/cm@500 ns，50 kV/cm@400 ns に

（ PI ）を用いて蛍光観察した．PI は正常な脂質膜に対して

対してそれぞれ 18 kJ/kg，27 kJ/kg，33 kJ/kg であり，30

不透過であるが，一旦細胞内に入ると DNA にインターカ

kV/cm@600 ns の場合が最もエネルギー効率が高い．

レートして 488 nm の励起光で赤色蛍光を発する．PI は，

実用的な大流量処理を考えると，電極間隔を大きくす

分子量 668 Da，大きさ 1 nm 程度であり，基質膜に直径数るために電界は小さいほど良く，パルス電源への厳しい

nm の小孔ができれば菌内部に入り込む．このため，蛍光要求を考えるとなおさらである．より良いエネルギー効を発する細胞は基質膜が損傷しているとみなされる ．こ率で殺菌するために，電界強度を大きくすべきか，ある

こでは，PEF 印加直後の菌液に PI を添加するため，2.2 節

いはパルス幅を長くすべきか，という視点で，次章で菌で述べたシステムではなく，汎用エレクトロポレーションを単純化した物理モデルを用いて考察する．このほかパ用キュベットを用いて PEF を印加した．PI を滴下してピルス幅とエネルギー効率の関係については次の 2 点にもペッティングした後，暗所で 30 分間静置した．その後ガ注意したい．1 点目は，膜充電に関わるものである．詳

ラス底のディッシュに移して，顕微鏡（ DMi8, Leica ）の

しくは次章で述べるが，菌に対する膜充電の時定数は位相差モードおよび蛍光モードで観察した．

50 ns 程度なので，パルス幅が短いほどパルス全体に対19）する膜充電にかかる時間の割合が大きくなる．すなわち，

3．殺菌実験結果

全パルスに対して膜に強電界がかかる時間の割合が小さ

Fig. 3 は，初菌濃度 10 個 /ml の菌液を，電界強度とパル

くなる．2 点目は，パルス波形の不完全性に関するもの

ス幅について様々な条件で殺菌処理した結果である．縦軸である．パルス幅が短いほど全パルスに対して電界が大は殺菌強度（コントロール菌液に対する処理菌液中の生菌

きい時間の割合が小さくなる．このため，菌が強い電界数の比の対数）であり，エラーバーは標準偏差を示す．破

を受ける時間はパルス幅（半値全幅）よりも短い．

7

線は最小二乗法を用いて指数関数で近似した曲線である．

Fig. 4 は，30 kV/cm，600 ns の PEF を 5 回印加した直パルス幅が同一であれば電界強度が大きいほど殺菌強度後に蛍光試薬 PI を加えた菌液の位相差顕微鏡像と同じが大きい．電界強度を一定とするとパルス幅が長いほど殺視野の蛍光像である．視野のすべての菌において，強弱

菌強度が大きく，パルス幅に関して指数関数的に生菌数がはあるものの，赤色蛍光が見られ，PEF によって菌膜が減少している．Fig. 3 に見られる電界強度，パルス幅と殺損傷していることがわかる．次章では，PEF によって小菌効果の相関は，従前の多くの研究孔が形成されることを前提に，継続する外部電界が小孔と同様である．殺17, 18）

菌率 6 桁を超える強い殺菌のためには 50 kV/cm の大きいにどのように作用するかという視点で議論する．

高電界パルス殺菌におけるパルス波形に関する考察（宮﨑 大貴ら）

11

図 4 PEF（30 kV/cm, 600 ns, 5 回）を印加したエンテロバク
ター菌の明視野像と PI 蛍光像
Fig.4 Bright field and PI fluorescent images of Enterobactor
aerogenes exposed to five of 30 kV/cm, 600 ns PEFs.

4．考察
電界下で細胞膜に小孔が形成される過程については，膜を構成する分子の分子動力学的解析の試みが多くなさ
れ ，明らかになりつつある．ここでは，小孔形成後も20）

外部電界がかかり続ける状況において，小孔の様態変化
における外部電界の役割を考える．まず，導電性液体中に浮かんだ厚さ 10 nm の非導電性膜でできた直径 1 µmの薄膜球を考える．内部も導電性液体で満たされている．
これに外部から立上り時間 50 ns，振幅 40 kV/cm のステップ電界を印加する．この状況における準定常電界を
CST Studio Suite（ダッソー・システムズ）を用いて計算した．Fig. 5 は PEF 印加開始から 300 ns 経過後の電界方向に沿った薄膜球中心軸上の電界強度分布である．球の図 5 外部電界（40 kV/cm ）下の細胞の中心軸上の電界分布．
球中心を基準とした．下は高電位側の膜近傍の拡大．
Fig.5 Potential profile along the center axis of the spherical cell inthe direction of the external field of 40 kV/cm. The upper isthe whole view and the lower is the magnified view aroundthe membrane at the high potential side.

中心を電位基準とした．液状全卵中に単独で存在する細菌を想定し，計算に用いた膜や内外の液体の物性値は文献 14 から引用し，一定とした．Fig. 5 下段は高電位側の膜近傍を拡大したものである．外部電界は膜の外側に正電荷を集積させて電位を上昇させ，内側ではその逆が起こる．このため膜横断電界が増幅される．Fig. 6 は，振幅 30, 40 および 50 kV/cm のステップ電界を印加したときの膜電界の立上りからの経時変化である．膜近傍に正負の電荷が集積する時間 τ［ s ］は，細胞半径 α［ m ］，
膜の静電容量 Cm［ F/m ］と細胞質および外液の導電率2σp，σ［S/m ］を用いて次のように表される ．
s21）

τ =（σp + σs） αCm-1（3）

本研究において τ は約 50 ns である．外部電界の立上

図 6 30，40 および 50 kV/cm のステップ状の外部電界に対する細胞膜の電界強度の時間変化（パルスの立上がり
時間は 50 ns ）Fig.6 Temporal variation of the electric field strength at the cell
membrane for different external fields of 30, 40 and 50 kV/
cm.

がりに対して膜電界の上昇が遅れていることがわかる．

孔に流れ込む電気エネルギーによって小孔内温度が上昇

仮に膜の破壊電界を 2 MV/cm とすれば，外部電界の大し，脂質膜を押し広げるという仮説のもとで議論を進める．

きさによって膜破壊の時刻が数 10 ns 程度異なる．

Fig. 7 は，小孔の直径を 5，10 および 20 nm とした場合の次に，高電位側の細胞膜に小孔が存在する場合の小孔

小孔周辺の電流密度分布である．Fig. 8 は，小孔が存在す

近傍の電界分布に着目して解析する．ここでは，小孔内る場合の小孔中心軸上の膜を横断する電位分布を，小孔は均質であり，小孔内における熱伝導，イオンの拡散やがない場合と比べたものである．小孔形成によって勾配

液と脂質膜の流体的な相互作用は考えないことにし，小が緩和されるものの，依然として大きい勾配が維持されて

12

静電気学会誌 第44巻 第 1 号（2020）

図 7 PEF（40 kV/cm ）の外部電界印加時の高電位側の膜の小孔周辺の電流密度分布
Fig.7 Current density distribution around the membrane pore at the high potential side for different pore
diameters. External electric field is 40 kV/cm.

図 8 外部電界（40 kV/cm ）印加時の小孔周辺の電位分布（パラメータは小孔直径 D ）Fig.8 Potential profiles along the membrane pores for different
pore diameters under the external electric field of 40 kV/cm.

図 10 単一小孔が存在する膜に外部電界（40 kV/cm ）を印加した場合の小孔周辺の膜横断電界（パラメータは小孔直径 D ）Fig.10 Transmembrane electric field around the membrane pore
under the external electric field of 40 kV/cm for different
pore diameters.

を外部電界で与えることが必要であり，小孔を拡大しう
る十分な電界強度を持続するパルス波形が好ましいといえる．Gintautas 等は，電界強度やパルス幅と細胞に形成される小孔の大きさの関連について，大きさの異なる分子の膜透過性を用いて調べており ，ここで行った解析
18）の解釈は彼らの実験と矛盾しない．また，Fig. 3 に示した殺菌実験のほか，PEF 殺菌におけるパルス幅の意義を議論した Frey 等の報告
図 9 一定外部電界下で膨張する膜小孔内の電力密度推移（パ
ラメータは外部電界強度 E ）Fig.9 Power density in the membrane pore as a function of pore
diameter for different external electric fields.

とも合致する．

17）

ここまでは単一の小孔についての議論であったが，実際は多数の小孔が形成されうる．Fig. 10 は，膜に 1 つの小孔が存在する場合の小孔周辺の膜横断電界と小孔からの距離の関係を示す．直径 5 nm の小孔から 30 nm 離れたいることがわかる．これによって小孔に電流が流れ込ん地点において膜横断電界は小孔がない場合の 95％以上にで急激に温度が上昇し，リン脂質を押し広げる圧力とな維持されている．この大きい電界は別の独立した小孔のる．一方で，Fig. 9 にみられるように，一定の外部電界下形成に寄与する．PEF によって小孔が形成され，時間経では小孔の拡大とともに電力密度が小さくなるので，小過とともに小孔が拡大すると，同時に電界が緩和される

孔拡大が飽和する．要するに，外部電界から小孔に供給範囲が拡大する．このことは，電界の立上りが高速なほされる電力密度の履歴によって小孔の大きさが決まる．

ど（あるいは，同じ立ち上がり時間であっても振幅が大きしたがって，殺菌のためには，膜小孔が物理的にも生物いほど），小孔が密に存在する可能性を示唆する．ただし，的にも回復できないほど拡大するような電力密度の履歴

電流が分散されるので個々の小孔を拡大させる圧力は抑高電界パルス殺菌におけるパルス波形に関する考察（宮﨑 大貴ら）
制される．Fig. 3 において，電界強度が大きい場合よりもパルス幅が長いほうが殺菌のエネルギー効率が高いのは，小孔の数が多いことよりも直径が大きいことの方が菌にとって致命傷になりやすいことを示唆する．Kotnik 等は，脂質膜に形成された小孔が脂質分子の熱運動によって閉じる過程を分子動力学シミュレーションを用いて議論しており，小孔径が大きほど膜の回復により長い時間を要し，20
nm 程度を超えると縮小しなくなることを示している ．
20）

Fig. 3 のパルス幅 100 ns と 150 ns の場合に大きい電界でも殺菌効果が小さかったのは，小孔が拡大するための時間が十分でないことに加えて，電界の立上がりが高速なために却って小孔拡大が抑制されていることもありうる．

5．結言
高電界パルス殺菌において，エネルギー効率を最大化するパルス波形について，電界強度とパルス幅を変数とした殺菌実験と，小孔を有する細胞の物理モデルを用いた数値解析によって考察した．概して，パルス幅が短いほど十分な殺菌効果を得るための電界強度を大きくしなければならない．パルス幅が短く電界が大きい条件とパルス幅が長く電界が小さい条件を比較すると，後者のエ
ネルギー効率が良いことがわかった．また，膜小孔形成
後の小孔膨張圧力が小孔内のエネルギー密度に依存するという仮説をもとに，外部電界下における小孔を有する膜について電界計算を行い，直径や数で表される小孔の様態の経時変化が外部電界の履歴，すなわちパルス波形に依存する可能性を示した．
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