放射光真空紫外円二色性分散計による生体分子の
構造解析
月向邦彦

広島大学大学院理学研究科 〒7398526 広島県東広島市鏡山 131
広島大学放射光科学研究センター 〒7398526 広島県東広島市鏡山 2313

松尾光一

広島大学大学院理学研究科〒7398526 広島県東広島市鏡山 131

要旨
広島大学放射光科学研究センター（HiSOR ）の BL15を放射光源とし，高真空下において水溶液中で140 nm まで測定可能な真空紫外円二色性（VUVCD）分散計を開発した。本分散計は，これまで市販の装置では不可能であった高エネ
ルギー遷移に基づく生体分子の構造解析を可能にする。本稿では，開発した VUVCD 分散計の概要と，各種アミノ酸，
糖類，タンパク質のスペクトル測定例を紹介し，生体分子構造解析への応用性について述べる。

.

確 保 し ， 精 力的 に VUVCD 装 置 の 開 発 に 取り 組 ん で い

はじめに
円偏光二色性（ Circular Dichroism: CD ）は，左右円偏

る3,4)。 2001 年 11 月には， Daresbary で VUVCD に関する光の吸収で差が生じる現象であり，キラル分子や光学活性

第 1 回国際ワークショップが開かれ，上記の各施設から物質の構造を敏感に反映する。そのため CD 分光法は，生代表者が集まり開発状況について情報交換が行われた5)。

体分子の構造解析において有力な方法として広く利用され現時点で，これら各国の装置はすべて窒素雰囲気中でしかている。この分光法は，分子量に制限がなく，微量な試料測定できず，短波長限界は170 nm 付近で止まっている。

で検出でき，液相固相気相状態でも測定可能で，温度

このような状況の中， 1997 年に広島大学放射光科学研や溶媒条件を変化できるなど，広範囲な実験条件に対応で究センター（ HSRC /HiSOR）が設置され，研究室に密着きる。特に生体分子の場合は，水溶液中の“生”の状態でし た 放 射 光 利 用 が 可 能 と な っ た6) （ http: // www.hsrc.

の構造が必要であり，CD 分光法は欠かせない構造解析法

hiroshima-u.ac.jp / index.html ）。この放射光源（ 0.7 GeV ）となっている1,2) 。しかし，通常光源を用いた市販の装置

は軟 X 線領域の研究には最適であり，我々はこのビーム

では，大気の光吸収や光学システムの問題のため，水溶液

ラ イ ン 15 を 用 い ， 日 本 分 光 株 式 会 社 の 協 力 を 得 て中で190 nm 以下の真空紫外（Vacuum-Ultraviolet: VUV ）VUVCD 分散計を開発してきた。光学系をすべて真空下領域の CD スペクトルを測定することは困難で，得られるに保持することにより，世界に先駆けて水溶液で 140 nm

情報に限界があった。 VUV 領域への拡張が可能になれまでの CD 測定に成功した7,8) 。本稿では，この装置の概ば，ヒドロキシル基やアセタール結合のような高エネル

略と，アミノ酸，糖類，タンパク質についてのスペクトル

ギー遷移に基づいたスペクトルが検出でき，生体分子の構測定結果を示し，本装置の生体分子構造解析への応用につ造についてより詳細かつ新規な情報を得ることができる。

いて紹介する。

このため，高輝度光源である放射光を用いた真空紫外円二色性分散計（以下 VUVCD と略す）の開発が強く望まれ.

てきた。このような VUVCD 装置の開発は， 1980 年代初

. 光学系

真空紫外円二色性分散計の開発

頭，アメリカの Brookhaven National Laboratory (BNL)

開発した VUVCD 装置の模式図を Fig. 1 に示す7,8)。すと Synchrotron Radiation Center (SRC），ドイツの Elec-

べての光学素子は，水や大気の光吸収を防ぐために，高真tron Stretcher Accelerator (ELSA) によって開始され，近空に保持された試料チェンバーと偏光変調チェンバー内に

年 で は ， イ ギ リ ス の Synchrotron

設置されている。 McPherson 直入射分光器で分光された

Radiation

Source(SRS），デンマークの Aarhus Storage Ring (ASTRID），

入射光は， MgF2 製のローションプリズム型直線偏光子

中国の Beijing Synchrotron Radiation Facility (BRSF) に（ polarizer: POL ）によって直交する主光と参照光に分離

よって開発され，現在，中国の University of Science andされる。その後，2 本の直線偏光は LiF 製の光弾性変調子

Technology (USTC），ドイツの Berlin Electron Storage（ photo-elastic modulator: PEM ）によって， 50 kHz の周Ring Company for Synchrotron Radiation (BESSY），ブラ

期で左右円偏光に変調される。主光は試料チェンバーに設ジルの Campinas National Synchrotron Light Laboratory

置された光学セルを通過後，光電子増倍管（ Main-PM ）(LNLS) で新しく建設中である。この中でも，特にイギリ～で検出される。参照光は主光の光軸に対して分離角5.1°スのグループは，CD 装置用として 3 本のビームラインをで検光子を通過後，別の光電子増倍管（ Ref-PM ）で5.4 °

118 ● May 2004 Vol.17 No.3
(C) 2004 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

生命科学特集 ■ 放射光真空紫外円二色性分散計による生体分子の構造解析

Figure 1. Block diagram of VUVCD spectrophotometer. Abbreviations: POL, polarizer; PEM, photo-elastic modulator; ANA, analyzer; MR, mirror; PM, photomultiplier; S, shutter; HV, high voltage supply; A, preampliˆer; GV, gate
valve.

検 出 さ れる 。 Main-PM で 検 出 さ れ た CD シグ ナ ル は ，Ref-PM で検出された参照光と lock-in-ampliˆer (LIA ) に
おいて同期整流され， CD 値としてモニターされる。また ， こ の 参 照 光 は PEM 駆 動 電 圧 の 調 整 に 使 用 さ れ ，PEM の熱などによるドリフトの自動補正を行うことにより位相変調を正確に制御している。このように，参照光を利用して LIA の安定性を向上させ，PEM を高精度に制御するシステムを光サーボリファレンス方式といい，CD 分散計で採用されているのは本装置のみである。また，放射光による試料の分解を防ぐため，測定中にのみ光を通過させる自動制御シャッターが取り付けられている。試料チェ
ンバーは偏光変調チェンバーとゲートバルブにより分離されており，偏光変調チェンバーを高真空下に保った状態で試料の交換が可能である。測定中のチェンバー内の真空度は10－4～10－5 Pa で維持されている。
. 光学試料セル
水溶液試料の CD スペクトルを 140 nm まで測定するた
 水溶液試料を高真空下で保持でき
めには，光学セルは，◯
 VUV 領域での水の吸収を最小限に抑えるためること，◯

Figure 2. Block diagram of the optical cell and its temperaturecontrol unit.

 セル窓の歪が小さくに光路長が短く可変であること，◯
 セル窓を洗VUV 領域において光の透過率が高いこと，◯
 広範囲
浄できるよう簡単に組み立て分解できること，◯

ル窓の洗浄も可能である。セルの温度は，ペルチェ素子をで温度が可変できること，などの条件を満たす必要があ

用いて可変できるようになっている。ペルチェ素子の冷却る。 Fig. 2 に我々の開発した光学セルと温度可変機構の剤として液体窒素が使われており，外部からフレキシブル

模式図示す9)。窓材として c 軸カットの MgF2 結晶を利用

チューブをとおしてセルホルダー内に注入される。ペルチすることにより，複屈折による影響を最小限に抑え，120

ェ素子と光学セルの MgF2 窓の間には銅製の熱伝導板がnm までの波長領域で 60 以上の透過率が確保されてい設置されており，熱伝導板に取り付けられた白金サーミス

る。光路長は，ドーナツ型の極薄テフロンスペーサーによ

ターの温度を検知することにより，温度コントローラーがり 1.3 ～ 50 mm の範囲で制御可能である。このセル窓は 3

ペルチェ素子の電圧を制御する仕組みになっている。

個の O-ring を使ってステンレスホルダーにセットされ，

. 性能評価

円筒形のスクリューにより全体を均一に固定することで，CD 測定では，楕円率の絶対値が正しく測定されている

セル窓に歪を与えることなく試料溶液を高真空下に保持でかが最も重要な問題である。 VUVCD 用の標準物質は知きる設計になっている。組み立て分解が容易にでき，セられていないので，ここでは通常の CD 標準試料であるカMay 2004 Vol.17 No.3 ● 119

Figure 3. VUVCD spectra of ammonium d-camphor-10-sulfonate
C. The solid line and open circles indicate theaqueous solution at 25°
spectra measured with the same sample solution using a VUVCD
spectrophotometer and a JASCO J720W spectropolarimeter,
respectively. The spectra were recorded with a 20-mm path length
MgF2 cell, a 1.0 mm slit, a 16-sec time constant, a 4-nm/min scan
speed, and 416 accumulations.

ンファースルフォン酸アンモニウムを用いて，開発した

VUVCD 分散計と光学セルの性能評価を行った。 Fig. 3に 300 ～ 140 nm での測定結果を示す。この物質は， 291

Figure 4. (a) VUVCD spectra of amino acids in aqueous solution
C. (a) L-alanine (, pH 6.2, concn. 10), D-alanine (,at 25°, pH 6.0, concn. 3), L-isoleupH 6.2, concn. 10), L-valine (cine (, pH 6.2, concn. 2.5), and L-leucine (, pH 6.3, con, pH 6.2, concn. 4), D-proline
cn. 1.5). (b) L-proline ((, pH 6.2, concn. 4), L-threonine (, pH 5.6, concn. 4),L-lysine (, pH 10.3, concn. 3), and L-serine (, pH 5.7,
concn. 3). The cells with 25- and 50-mm path length were used forthe measurements. All spectra are recorded under the same conditions as described for Figure 3. Circles indicate the spectra measured
by a JASCO J720W spectropolarimeter.

nm と 192 nm で 1 2 の CD 強度比を持つことが知られているが10) ，得られたスペクトルはこの条件を満たしてお（Lアラニン，D アラニン，Lバリン，Lロイシン，L イ

り，同一セルを用いて市販の CD 装置（JASCO J720W ）ソロイシン）の VUVCD スペクトルを示す。200 nm までで測定されたスペクトルとも190 nm まで一致している。

の波長領域において市販の装置（ JASCO J 720W ）で観

また，水のスペクトル（ベースライン）は測定波長領域に測されたスペクトルと一致している。 L および D 型のア

おいて± 2 mdeg と一定であることから，光学素子やセル

ラニンでそれぞれ正と負の対称な CD スペクトルが観測さ窓などの歪が小さく，用いた PEM が真空下で正しく作動

れ，光学異性体に対する理論的予測と一致している。ましていることが確認された。試料溶液の温度を直接測定す

た，各アミノ酸の VUVCD スペクトルは， 200 nm と 180

ることは困難であるが，セル窓の温度から，－ 30 ～ 70 °C

nm 付近に連続した 2 つの特徴的な正のピークを示しておの温度範囲で± 1°
C の精度で温度制御ができることを確認

り，それぞれ，カルボキシル基の n→pと p→p遷移に帰した。小間隙中の水はサブゼロ温度でも凍結しないため，

属される12,13)。これらのピークは，アラニン＜バリン＜ロ

光路長25 mm と50 mm の光学セルを使用した場合，それぞ

イシンと側鎖の疎水性が増すほど短波長側にシフトし，強れ－ 17 °C と－ 10 °C まで試料溶液を凍結することなしに冷度が増加している。また，側鎖のアルキル炭素数が同じに却することができる。このため，タンパク質の熱変性だけもかかわらず，b 炭素に不斉をもつイソロイシンはロイシ

でなく低温変性による構造の違いを解析することも可能でンよりも小さなモル楕円率を示している。このように，カある。このように，開発した VUVCD 分散計と光学セル

ルボキシル基の電子遷移は，明らかに側鎖の大きさや不斉を用いて，140 nm までの短波長領域で－30 ～70 °
C の温度に敏感であることがわかる。親水性アミノ酸（ L プロリ

範囲で水溶液の CD スペクトルを± 5の精度で測定する

ン， D プロリン， L リジン， L トレオニン， L セリン）

ことが可能になった8,9)。

の VUVCD スペクトルを Fig. 4b に示す。セリンとトレ
オニンは疎水性アミノ酸と同様， 200 nm と 180 nm 付近

.

生体分子構造解析への応用

. アミノ酸に 2 つの正のピークを示す。側鎖の b 炭素に不斉をもつ
トレオニンでは，やはり楕円率は小さく長波長側にシフト開発された VUVCD 分散計を用いて，各種アミノ酸水している。また， 170 nm 以下にいくつかのピークが観測

溶液（ pH 6 ， 25 °C ）の CD スペクトルを 260 ～ 140 nm のされ，ヒドロキシル基やアミノ基の関与が示唆される。側波長領域で測定した11)。Fig. 4a に 5 種の疎水性アミノ酸

鎖に正の荷電を有するリジンでは， 2 つのピークは 210

120 ● May 2004 Vol.17 No.3

生命科学特集 ■ 放射光真空紫外円二色性分散計による生体分子の構造解析

nm と 185 nm にレッドシフトしており，はっきりと分離が観測される。これらのスペクトルは，主として環状構造

して観測される。 L プロリンの VUVCD スペクトルは他中の酸素の吸収に起因するものと予想されるが15) ，そののアミノ酸と大きく異なり，213 nm に正， 194 nm と 166

理論的帰属は今後の研究を待たねばならない。 D グル

nm に 2 つの負のピークを示す。これは，明らかにプロリ

コースと D マンノースは C2 の OH 基の配向が異なるだ

ン側鎖の五員環構造によるものである。このように，アミけであるが， D グルコースでは D マンノースと比べ，モノ酸の VUVCD スペクトルは側鎖構造を敏感に反映して

ル楕円率が小さくブルーシフトしている。単糖類の C1 のおり，これまで不可能であった VUV 領域でのアミノ酸のOH 基は水溶液中で a-anomer と b-anomer の平衡状態にエネルギー遷移について有益な情報を得ることができる。

あり，C2 の OH 基が axial 配向では a-anomer が優位であ

現在，我々は分子軌道法を用いて，これらのスペクトルのることが NMR 測定により知られている16) 。 D マンノー

理論的帰属を行っている。

スの a-anomer 含有率は 65 で D グルコースの 38 より

. 糖類も多く， a-anomer は楕円率の増加とピークのレッドシフ

糖類のヒドロキシル基（OH）やアセタール結合（COC）

トを誘起すると推測される。同様な関係は， C5 にヒドロは，200 nm 以下の波長領域にのみ吸収を持つため，市販

キシメチル基を持たない Dリキソース（a-anomer，71）の装置では CD スペクトル測定が困難で，VUVCD 分散計と Dキシロース（a-anomer，37）でも観測される。

でのみ構造解析が可能となる。 Fig. 5a に 5 種の単糖類

グルコースと Dガラクトースの構造は，C4 の OH 基D（D グルコース，Dマンノース，D ガラクトース，Dキシ

が axial か equatorial かだけの違いであるが，正負の全く

ロース，D リキソース）の VUVCD スペクトルを示す14)。

異なったスペクトルを与える。D ガラクトースと D グル

Fig. 6 に示すように，これらの糖の構造は非常に類似しコースの a-anomer 含有率は，それぞれ38と32でそれているが，その VUVCD スペクトルは大きく異なる。 D 

ほど大きくは違わないが， C5 のヒドロキシメチル基のグルコースと D マンノースはそれぞれ 168 nm と 170 nm

ゴーシュゴーシュ（GG），ゴーシュトランス（GT），

付近に，D キシロースと D リキソースはそれぞれ167 nm

トランスゴーシュ（ TG ）の 3 つの立体構造は， C4 のと 172 nm 付近に正のピークを示す。 D ガラクトースでOH 基の配向の影響を大きく受けることが知られているは，対照的に 177 nm と 162 nm 付近に 2 つの負のピーク（ Fig. 7 参照）。 D グルコースでは C4 の OH が equatorial

Figure 5. (a) VUVCD spectra of saccharides in aqueous solution
C. (a) D-glucose (, concn. 10), D-mannose (, concn.
at 25°, concn. 5), D-xylose (, concn. 10),5), D-galactose (, concn. 3). (b) maltose (, concn. 8),and D-lyxose (, concn. 8), cellobiose (, concn. 8), gentioisomaltose (, concn. 8), and lactose (, concn. 3). Squares inbiose (dicate the 20-fold spectrum of maltose. A cell with a 50-mm path
length was used for the measurements from 200 to 180 nm, and nospacer was used below 180 nm. All spectra were recorded under thesame conditions as described for Figure 3. Circles indicate the spectra obtained with a 50-mm spacer using a JASCO J720W spectropolarimeter.

Figure 6.
rides.

Chemical structures of monosaccharides and disaccha-

May 2004 Vol.17 No.3 ● 121

Figure 7. Three possible staggered conformations (GG, GT, andTG) of the hydroxymethyl group at C5. The C4 hydroxyl is axial(a) for D-galactose and equatorial (e) for D-glucose. This is a view
looking down the bond from C5 to C6.

であるため，O6 との立体障害により TG 構造をとることができないが（GG GTTG＝55450），ガラクトー
ス で は OH 基 が axial で あ る た め TG 構 造 が 存 在 す る（GGGT TG ＝206020)17,18)。これらの構造の違い
が，D グルコースと D ガラクトースの VUVCD スペクト
ルに反映しているものと考えられる。このように，単糖類の VUVCD スペクトルには， C1 のアノマー型（ a および

b ）や C5 のヒドロキシメチル基のトランスやゴーシュ構
造が複雑に関与していると考えられる。
単糖類の 6 種類の配位（aGG, aGT, aTG, bGG, b

GT, bTG）は，水溶液中では平衡状態で存在するため，それぞれの CD スペクトルを単独に測定することは難しい。しかし，VUVCD スペクトルの deconvolution 解析により，それらの寄与を分離して評価することができる。

Figure 8. Deconvolution of the VUVCD spectra of D-glucose (a),D-mannose (b), and D-galactose (c) into the existing conformers a), a-GT (), b-GG (), b-GT (), a-TG (),
GG (). Black lines show the observed spectra, and circles
and b-TG (represent the spectra reconstituted from the spectrum for each conformer.

グルコース，Dマンノース，D
ガラクトースに対して，
D

6 種類の構造がそれぞれガウス分布の CD スペクトルを持つと仮定し，以下の式からそれらのスペクトルを求めた。

GG や GT 配位では，a-anomer が b-anomer より長波長側にシフトしており，エネルギー的に弱い遷移であることが[u]m, obs＝Xm, aGG[u]m, aGG＋Xm, aGT[u]m, aGT

わかる。

＋Xm, aTG[u]m, aTG＋Xm, bGG[u]m, bGG
＋Xm, bGT[u]m, bGT＋Xm, bTG[u]m, bTG[u]m＝[u0]×exp {－(l0－l)2/w 2}

二糖類の VUVCD スペクトルを Fig. 5b に示す14) 。ほ(1)

とんどのスペクトルで単糖類と同様，170 nm 付近に正の(2 )ピークが観測される。ラクトースにおいては 165 nm と

180 nm に 2 つの負のピークが観測され，構成糖の一つで
ここで，［u]m, obs は実測された単糖類 m（Dグルコース，

あるガラクトースの寄与が大きいものと考えられる。二糖

マンノース，Dガラクトース）のモル楕円率，Xm はそ
D

類の構造は Fig. 6 に示すように，構成単糖の違いだけでれぞれの単糖類中に含まれる 6 種類の配位（aGG, aGT,なく，グリコシド結合の配向（ a と b ）や部位（も 1,6 やaTG, bGG, bGT, bTG）の含有率である。［u]m は各1,4 ）によっても異なり， CD スペクトルにはこれらの影

構造のモル楕円率で，半値幅 w を持つ CD スペクトルの響が敏感に反映されている。 a1,6 結合からなるイソマル

ピーク波長 l0 でのモル楕円率［ u]0 を用いて，式(2)のよ

トースは，b 1,4 結合からなるマルトースに比べて大きなうに表される。Fig. 8 に deconvolution 解析の結果を示す。

楕円率を示すことから，1,6結合は1,4結合より楕円率を増グルコース，D マンノース，D ガラクトースいずれにD

加させる方向に寄与していることが示唆される。同様の結

お い て も， C5 の ヒ ド ロ キ シ メ チ ル 基 の GG と GT 構 造

果は， b 1,6 結合からなるゲンチオビオースと b 1,4 結合

は，それぞれ正および負の CD ピークを示している。こうからなるセロビオースのスペクトルの比較からも確認でき

して，D グルコースと D マンノースで観測された170 nm

る。また， a 結合であるイソマルトースやマルトースの付近の正の CD ピークには，GG 配位が大きく寄与していスペクトルを， b 結合からなるゲンチオビオースやセロることがわかる。さらに， D ガラクトースで観測されたビオースのスペクトルと比較することにより， b 結合に

165 nm と177 nm の負の CD ピークには，それぞれ GT と比べて a 結合は楕円率を増加させ，ピークをブルーシフ

bTG 配位が大きく寄与していることが示唆される。同じ

トさせる方向に寄与していることがわかる。さらに，マル

122 ● May 2004 Vol.17 No.3

生命科学特集 ■ 放射光真空紫外円二色性分散計による生体分子の構造解析

トースの 190 nm 付近の小さな負の CD ピークは，単糖類の VUVCD ス ペ ク ト ル の deconvolution 解 析 か ら b TG
配位に起因することが予想されるが，NMR 測定や理論計
算からもこの予測と一致する結果が得られている19,20)。
このように，糖類の VUVCD スペクトルには多くの構造因子が関わっており，その帰属は容易ではないが，これらの情報は VUV 領域への波長拡大によりはじめて明らかになったものであり，今後の糖類の CD の理論解析に重要な糸口を与えるものと考えられる。
. タンパク質
タンパク質の遠紫外 CD スペクトルには， a-helix や b-strand などの二次構造に関する情報が含まれており，二次構造含有率の予測や変性状態の解析に広く利用されている。Fig. 9 に X 線結晶構造の分かっている15 種類のタン
パク質の VUVCD スペクトルを示す21)。Fig. 9a は，ミオ
グロビン，ヘモグロビン，ヒト血清アルブミン，シトクロ
ム c などの a-helix だけからなるタンパク質（ a-protein ）のスペクトルで，これまで知られているように 222 nm 付
近と208 nm 付近に負，190 nm 付近に正の CD ピークが見られる。しかし，今回新たに 180 nm 付近に肩と 170 nm
付近に負のピークが観測され， 160 nm 以下にも正のピー
クの存在が予測される。また， a-helix の含有率が増すに
つれ CD 強度も大きくなる傾向が見られる。Fig. 9b は a-helix に富んだタンパク質の VUVCD スペクトルで，全体的に a-protein に類似したスペクトルが観測される。しかし，これらの中で， b-strand 構造を多く持つリボヌクレ
アーゼ A では，180 nm 付近で他のタンパク質と大きく異Figure 9. VUVCD spectra for 15 proteins in aqueous solution at 25°), hemoglobin (), HSA (), andC. (a) myoglobin (), a-lactalbumin (),; (b) peroxidase (cytochrome c (), ovalbumin (), and RNase A (); (c) conlysozyme (), b-lactoglobulin (), pepsin (), trypsinocanavalin A (), a-chymotrypsinogen (), and STI (). The spectra
gen (
were measured at protein concentrations of 0.21.0. All otherconditions were same as those described for Figure 5.

な る ス ペ ク ト ル が 観 測 さ れ た 。 Fig. 9c は 4 種 類 の b-

strand に富んだタンパク質（ b-strand-rich protein ）と 2
種類の b-strand だけからなるタンパク質（ b-protein ）の

ここで， X と Y はそれぞれ X 線結晶構造より求めた二次スペクトルで，200230, 170175, 160 nm 付近で負，185

構造含有率と CD から予測された二次構造含有率で，N は

200 と165 nm 付近に正の CD ピークが観測される。しか解析に用いたタンパク質の数である。d が小さく r が 1 にし， a-protein と比べて極めて多様なスペクトルを示すこ

近づくほど高い予測精度を表す。 a-helix と b-strand をそとがわかる。特に，無秩序構造（unordered structure）がれぞれ regular ( aR, bR ) と distorted ( aD, bD ) 構造に分離

40 以上ある大豆トリプシンインヒビターでは， 225 nm

し，turns と unordered 構造を含めた計 6 種類の二次構造付近に正の CD ピークが観測されている。

含有率の予測精度を Table 1 に示す。全体の予測精度を

このように，タンパク質の VUVCD スペクトルは二次示す d と r の値から，波長拡張とともに予測精度が向上

構造の特徴を敏感に反映しており，波長拡張によるタンパ

し，165 nm で最良であることがわかる。また，二次構造

ク質二次構造含有率の予測精度の向上が期待される。そこ

間で比べると， a-helix の予測精度は b-strand よりも高いで，二次構造解析プログラム SELCON322) の適用波長をことがわかる。次に， X 線結晶構造から得られた二次構

160 nm まで拡張し，今回測定された15種類のタンパク質

造含有率と，165 nm まで拡張した VUVCD スペクトルかを基底タンパク質として二次構造含有率の予測を行った。

ら得られた二次構造含有率を比較して Table 2 に示す。

予測精度の指標としては，以下の式で示される自乗平均偏ミオグロビンに代表されるように， a-protein の予測結果

差（RMS）（d）と Pearson 相関係数（r）を使用した。

は X 線結晶構造とよく一致することが分かる。 b-strand-rich protein であるトリプシノーゲンでは，a-helix の予測
2

1/ 2

d＝{∑(Xi－Yi) /N}(∑XYi i－∑X∑i Y i/N)
r＝
2
2
1/ 2
{∑Xi －(∑Xi) /N} ×{∑Y2i －(∑Yi)2/N}1/2

(3)
(4)

結果は X 線結晶構造と少し異なるが， b-strand に関しては高い精度で予測されている。このように， a-helix-richprotein と b-strand-rich protein で予測精度に差はあるが，
VUVCD による二次構造含有率の予測結果は全体的に X

May 2004 Vol.17 No.3 ● 123Table 1. Performance indices (d and r) of six types of secondary
structure determined from CD spectra in diŠerent wavelength
regionsa
Secondary
StructureaR

Wavelength region from 260 nm to
185 nm 180 nm 175 nm 170 nm 165 nm 160 nm

d
r

0.069
0.930

0.056
0.953

0.055
0.955

0.059
0.948

0.053
0.960

0.062
0.944

d
r

0.055
0.708

0.058
0.658

0.067
0.520

0.060
0.645

0.059
0.674

0.076
0.536

d
r

0.085
0.733

0.076
0.792

0.076
0.785

0.070
0.829

0.061
0.868

0.088
0.692

d
r

0.045
0.696

0.037
0.799

0.035
0.818

0.034
0.836

0.027
0.896

d
r

0.047
0.442

0.050
0.323

0.047
0.412

0.046
0.468

0.053
0.803

0.068
0.677

0.066
0.679

0.061
0.788

0.059
0.816

0.059
0.825

Table 3. Numbers of a-helix and b-strand segments determined by
X-ray analysis and CD spectra in the wavelength region from 260 to
165 nma-Helix

aD
bR
bD

Unordered
d
r
Total
d
r

Protein

X-ray

b-Strand

CD

X-ray

CD

Myoglobin

8

8.0

0

0

Hemoglobin
Human serum albumin

8
31

7.5
37.0

0
0

0
2.0

0.034
0.836

Cytochrome c
Peroxidase

5
17

5.0
16.0

0
2

3.0
7.0

0.041
0.650

0.052
0.602

a-Lactalbumin

9

5.0

3

2.0

0.066
0.674

0.064
0.698

0.078
0.628

Lysozyme
Ovalbumin

7
13

6.0
17.5

3
16

3.0
13.0

Ribonuclease A
b-Lactoglobulin

3
5

4.5
2.0

7
10

5.5
12.5

0.057
0.825

0.052
0.849

0.067
0.754

Pepsin

11

1.5

25

26.0

Trypsinogena-Chymotrypsinogen

3
6

5.5
4.5

13
14

13.0
17.0

Soybean trypsin inhibitor
Concanavalin A

1
3

3.5
6.5

15
16

14.0
10.5

Turn

a

線結晶構造に近いことが確認された。 distorted 構造の含有率 aD と bD には，それぞれ a-helix と b-strand の本数のaR, regular a-helix; aD, distorted a-helix; bR, regular b-strand;bD, distorted b-strand.

Table 2. Secondary-structure contents of 15 reference proteins determined by X-ray analysis and CD spectra in the wavelength region from
260 to 165 nm
Protein

aR

aD

bR

bD

Turn

UnordereddMyoglobin

X-ray
CD

54.9
60.2

20.9
20.5

0.0
1.5

0.0
－0.7

12.4
6.5

11.8
8.8

0.035

Hemoglobin

X-ray
CD

54.0
50.5

21.0
20.6

0.0
－1.4

0.0
－0.8

14.0
14.3

11.0
14.7

0.021

Human serum albumin

X-ray
CD

49.1
42.3

20.8
25.3

0.0
1.4

0.0
0.6

14.9
17.4

15.2
14.4

0.036

Cytochrome c

X-ray
CD

21.9
14.7

19.1
18.7

0.0
12.0

0.0
6.2

21.9
26.4

37.2
21.4

0.092

Peroxidase

X-ray
CD

29.2
23.4

20.8
20.5

0.7
3.4

1.3
4.8

25.6
25.8

22.4
22.1

0.030

a-Lactalbumin

X-ray
CD

19.5
26.8

24.4
16.4

1.6
5.4

4.9
3.0

23.6
21.1

26.0
27.4

0.069

Lysozyme

X-ray
CD

20.2
24.7

21.7
17.5

1.5
6.8

4.7
4.1

30.6
25.0

21.3
24.1

0.042

Ovalbumin

X-ray
CD

17.9
15.1

12.9
18.1

23.0
12.7

8.3
6.9

16.4
22.9

21.5
23.2

0.056

Ribonuclease A

X-ray
CD

11.3
12.2

9.7
14.7

21.7
14.1

11.3
8.7

21.8
20.6

24.2
28.9

0.044

b-Lactoglobulin

X-ray
CD

5.6
4.3

11.1
5.1

28.7
35.7

12.3
15.6

21.6
20.9

20.7
20.4

0.040

Pepsin

X-ray
CD

3.0
1.6

12.3
1.8

26.4
31.6

15.3
16.5

20.0
20.2

23.0
29.9

0.056

Trypsinogen

X-ray
CD

5.3
1.9

4.8
10.1

20.9
21.9

11.4
11.7

25.3
20.6

32.3
30.6

0.033

a-Chymotrypsinogen

X-rqy
CD

5.1
3.5

8.4
6.9

20.0
19.0

12.0
13.7

21.0
20.0

33.5
35.5

0.015

Soybean trypsin inhibitor

X-ray
CD

0.0
1.8

1.7
8.3

19.3
19.7

17.7
15.2

17.1
25.9

44.2
28.4

0.080

Concanavalin A

X-ray
CD

0.0
8.6

3.8
11.0

32.9
22.1

13.5
8.6

23.6
21.4

26.2
24.0

0.080

124 ● May 2004 Vol.17 No.3

生命科学特集 ■ 放射光真空紫外円二色性分散計による生体分子の構造解析

情報が含まれているため，aD と bD の値からこれらの本数を予測することができる23) 。その結果を X 線結晶構造と比較して Table 3 に示す。 a-helix の本数は， a-helix-rich

5)
6)
7)

protein を 中 心 に X 線 結 晶 構 造 と 近 い 値 が 得 ら れ ， bstrand も全体的に高い予測精度が得られている。このよ

8)

うに，CD スペクトルから二次構造の本数を予測すること
は，市販の CD 装置では困難であり，真空紫外領域まで

CD スペクトルを拡張することにより可能になる。さらに
基底タンパク質の数を増やし，より短波長までスペクトル
測定を拡張することにより，これらの予測精度はより改善されるものと期待される。
.

9)
10)
11)
12)
13)

おわりに
生物科学への放射光利用は，生体物質の構造解析や反応制御，生物の放射線障害や医学にいたる広範な分野で急速に広がりつつあり，その重要性は益々高まっている。特に， 構造 生物学 の分 野で は， X 線結 晶構 造解 析を はじめ，生体物質の構造解析に大きな威力を発揮している。生
体物質においては水中の生の状態での構造解析が必須であり，各国で競って CD 測定装置の開発が進められている。
幸い，本学に設置された放射光源は軟 X 線領域の研究に最適であり，その専用ラインを用いることにより，我々は水 溶 液 中 で 140 nm ま で CD ス ペ ク ト ル 測 定 が 可 能 な

VUVCD 分散計の開発に成功し，これまで未開拓であっ

14)
15)
16)
17)
18)
19)
20)
21)
22)

た高エネルギー遷移に基づいた生体物質やキラル分子のより詳細な構造解析を可能にした。十分なマシンタイムと研究室に密着した実験が可能で，生体物質の構造解析にとっては世界に類を見ない装置となっている。まだ， S / N 比

23)

B. A. Wallace: Synchr. Rad. News 15, 20 (2002).
谷口雅樹日本放射光学会誌 13, 246 (2000 )島田賢也
日本放射光学会誌 16, 213 (2003).
N. Ojima, K. Sakai, T. Fukazawa and K. Gekko: Chem. Lett.
832 (2000).
N. Ojima, K. Sakai, K. Matsuo, T. Matsui, T. Fukazawa, H.
Namatame, M. Taniguchi and K. Gekko: Chem. Lett. 522(2001).
K. Matsuo, K. Sakai, Y. Matsushima, T. Fukuyama and K.
Gekko: Anal. Sci. 19, 129 (2003).
T. Takakuwa, T. Konno and H. Meguro: Anal. Sci. 1, 215(1985).
K. Matsuo, Y. Matsushima, T. Fukuyama, S. Senba and K.
Gekko: Chem. Lett. 826 (2002).
T. Inagaki: Biopolymers 12, 1353 (1973).
P. A. Snyder, P. M. Vipond and W. C. Johnson, Jr.:
Biopolymers 12, 975 (1973).
K. Matsuo and K. Gekko: Carbohydr. Res. 339, 591 (2004).
I. Listowsky and S. Englard: J. Am. Chem. Soc. 30, 329(1968).
P. M. Collins and R. J. Ferrier: Monosaccharides (John
Wiley & Sons, New York, 1995) p41.
Y. Nishida, H. Hori, H. Ohrui and H. Megro: J. Carbohydr.
Chem. 7, 239 (1988).
R. U. Lemieux and J. T. Brewer: Adv. Chem. Ser. 117, 121(1973).
K. Gehring, P. G. Williams, J. G. Pelton, H. Morimoto and
D. E. Wemmer: Biochemistry 30, 5524 (1991).
K.-H. Ott and B. Meyer: Carbohydr. Res. 281, 11 (1996).
K. Matsuo, R. Yonehara and K. Gekko: J. Biochem. 135, 405(2004).
N. Sreerama and R. W. Woody: Anal. Biochem. 287, 252(2000).
N. Sreerama, S. Y. Venyaminov and R. W. Woody: Protein
Sci. 8, 370 (1999).

著者紹介の改良や吸収スペクトルの同時測定などいくつかの課題は

月向邦彦

残しているが，まもなく全国共同利用に供せられる予定で

広島大学大学院理学研究科

あり，今後，広い分野での応用が期待される。本装置が生E-mail: gekko＠sci.hiroshima-u.ac.jp

物科学の発展に貢献できれば望外の喜びである。

専門生物物理，生体高分子物理化学

謝辞
本研究は，広島大学放射光科学研究センターのスタッフ
をはじめ，共同研究者各氏の多大な貢献があって初めて可略歴

能となったものです。また，日本分光株式会社をはじめ内

1968年 3 月

広島大学大学院理学研究科修士課程修了

外の多くの方々のご指導と，科学研究費（ 12559007 ）お1968年 4 月

愛知教育大学助手

よび原子力研究所（黎明研究）の支援を得て行われまし1971年 6 月

名古屋大学農学部助手（理学博士取得）た。ここに深く感謝の意を表します。

1985年 4 月

名古屋大学農学部助教授

1995年 4 月

広島大学理学部教授

2000年 4 月

広島大学大学院理学研究科教授

参考文献
1)

G. D. Fasman: Circular dichroism and conformational analysis of biomolecules (Plenum Press, New York, 1996).
2) N. Berova, K. Nakanishi and R. W. Woody: Circular dichroism (Willy-VCH Press, New York, 2000).
3) B. A. Wallace: J. Synchrotron Rad. 7, 289 (2000).
4) D. T. Clarke, M. A. Bowler, B. D. Fell, J. V. Flaherty, A. F.
Grant, G. R. Jones, M. L. Martin-Fernandez, D. A. Shaw, B.
Todd, B. A. Wallace and E. Towns-Andrews: Synchr. Rad.
News 13, 21 (2000).

May 2004 Vol.17 No.3 ● 125松尾光一
広島大学大学院理学研究科
E-mail: pika＠hiroshima-u.ac.jp
専門CD 分光学，生物物理

略歴

1999年 3 月

広島大学理学部物性学科卒業

2004年 3 月

広島大学大学院理学研究科博士課程修了
博士（理学）

2004年 4 月

日本学術振興会特別研究員（PD）

Structure Analyses of Biomolecules using Synchrotron Radiation Circular
Dichroism Spectrophotometer
Kunihiko GEKKO

Koichi MATSUO

Graduate School of Science, Hiroshima University,131 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima 7398526, Japan
Hiroshima Synchrotron Radiation Center, Hiroshima University,
2313 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima 7398526, Japan
Graduate School of Science, Hiroshima University,131 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima 7398526, Japan

Abstract
We constructed the vacuum-ultraviolet circular dichroism (VUVCD) spectrophotometer, which is capable ofC, using ameasuring circular dichroism spectra to 140 nm for aqueous solutions at temperature from －30 to 70°
small-scale SR source at Hiroshima Synchrotron Radiation Center (HiSOR). This spectrophotometer was used forstructural analyses of amino acids, saccharides, and proteins in water. The obtained results demonstrate that asynchrotron radiation VUVCD spectroscopy provides more detailed and new information on the structures of
biomolecules, based on the high energy transitions of chromophores such as hydroxyl, acetal, and peptide groups.

126 ● May 2004 Vol.17 No.3