極性化合物の分離に！
HILIC，C18-SACの基礎と上手な使い方！
一般のC18では分離が難しい極性化合物に適した
HILICとSilanol Activity Controlled C18の活用法について説明いたします2007/8/30 15:10-15:35

A-4会場

於：アパホテル&リゾート 東京ベイ幕張 ホール㈱クロマニックテクノロジーズ

ChromaNik Technologies Inc. TEL: 06-6581-0885 http://chromanik.co.jp

First Choice (測定対象：極性化合物
測定対象：極性化合物))

極性化合物分析のための カラム[ Second Choice ] 移動相

 C18 (ODS), 5µ5µm, 150 x 4.6 mm i.d.
i.d.
 モノファンクション型，フルエンドキャッピング

分離ができない！
さぁ困った！次の手は？

 各メーカーの技術資料から類似化合物の条件検索

5%溶解し易い組成
溶解し易い組成 H2O/CH3OH溶解度試験：析出点より
OH溶解度試験：析出点より5%
 グラジエントができれば有機溶媒 20%⇒20%⇒80%，80%，20min
 イオン性化合物の場合は 25mMリン酸緩衝液を添加
25mMリン酸緩衝液を添加
 酸：p酸：pH4.5 (KH2PO4)，塩基：p，塩基：pH6.8 (KH2PO4/Na2PO4=1/1)

 試料
 移動相で溶解あるいは移動相で希釈
 0.45µ0.45µmのメンブランフィルタでろ過後，のメンブランフィルタでろ過後，5∼10µ10µL注入とりあえず，分析をしてみたけど…

分離の改善の概念

 分離ができな～い
分離ができな～い!!

Rs = 分離度が足らない カラムに保持されない

Rs =

1
k
N ⋅ (α − 1) ⋅4
1+ k

N：理論段数，α：分離係数 [α=k2/k1]，k：保持指数 [k=(Tr-T0)/T0]

 検出ができな～い
検出ができな～い!!

5

5

4

α=1.3

Rs

3

k =5

α=1.3

4

k =2
k =5
k =2

3

3

2

α=1.2

2
α=1.2

 共存成分が重なっている
 検出器に応答しない (ここでは省略)
ここでは省略)

1

1

0

0
0

粒子径，移動相流速を変えてみると…

5000-1
N / TP column

10000

k =5

4

Rs

Ö 分離の改善5Rs

 共存成分と重なっている

1
α −1 kN⋅⋅4
α 1+ kk =2

2

N =5000

N =5000

1
0

0

5

10
k

15

20

1.0

1.1

1.2
α

1.3

1.4

有機溶媒濃度を変えてみると…
有機溶媒濃度を変えてみると…
k = 1.79

3 µm
理論段数

5 µm

Ethanol δ=11.2，H2O δ=21

3 µm

δ：Hildebrandの溶解パラメータ

有機溶媒比率を下げると保持は大きくなる！

80% Ethanol/H2O
δ=13.16(選択性が変化することもある)

5 µm

k = 3.93

10 µm
70% Ethanol/H2O
δ=14.14

最高の理論段数が出る

最適流速がある！
流速

粒子径を小さくすると理論段数は高くなる！

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

移動相溶媒の種類を変えてみると…
移動相溶媒の種類を変えてみると…
63% 2-Propanol
δ=14.20
δd= 6.87

ピリジンのピーク形状
Column A
Column B

δ：Hildebrandの溶解パラメータ
δd：分散力・ロンドン力の相互作用
δo：双極子配向力の相互作用

Propanolδ =10.2
δd= 7.2, δo= 2.5

有機溶媒種を変えると選択性が変化する！

Column C
Column D

80% Methanol
δ=14.52
δd= 6.22
Methanolδ =12.9
δd= 6.2, δo= 5

溶出時間

エンドキャッピングが悪いと塩基性化合物がテーリングする！

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

(残存シラノールに吸着してテーリングするとされています)10

エンドキャッピングの効果？
②

Second Choice

１

a)
１

3

d 保持の小さい成分の分離の改善

１0

シラノール基の活性コントロール

5

②

10
Retention time / min

O

O

H

Silanol Activity
Controlled
Technology

H

O

O

Si

Si

3

疎水基

Isolated Silanol

2
1

シロキサン
結合に変換

高吸着性
シラノール

B) シラノール活性調節C18
シラノール活性調節C18O

1

Vicinal Silanol

O

H

H

O

O

2

H

H

O

O

O

O

Si

Si

Si

Si

Si

O

O

O

Si

Si

OH

20

3

H
O
Si

N

3=フェノール

4

H

Si

O

Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase:
50/50=CH3CN/20 mM PBS pH4.5
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = uracil,
2 = propranolol
5
3 = nortriptyline
4 = amitriptyline
5 = toluene

4

疎水基

15

N
H

②=ピリジン

ODS化後？？？処理
シラノール有りA) エンドキャッピングC18
エンドキャッピングC18

H
Si

HN
O

塩基性化合物の選択性の比較

OSi

カラム: C18化シリカゲル
C%=14.8%
移動相: 30% CH3OH/H2O
流 速: 1.0 mL/min
温 度: 40 ºC
試 料: 1=ウラシル

ODS化のみシラノール有りc)

ZIC®-HILIC HPLC Column

O

②

b)

ChromaNik Sunrise C18C18-SAC

O

フルエンド
キャッピング3c 逆相モードのままで選択性を大幅改善

Si

3

5

Si

Si

Geminal Silanol

ODS化直後

活性調節後

0

5

10

15

20

Retention time / min2

シラノール活性の調節技術の効果
シラノール活性の調節技術の効果
 ChromaNikでは，吸着活性の高いシラノールをChromaNikでは，吸着活性の高いシラノールを選択的に低減させ，有効なシラノールのみを残存させる技術を開発しました この技術の導入により高密度エンドキャッピング
が可能となり，塩基性化合物のピーク形状を大幅に改善させることができました －Sunrise C18
 また，活性調節後の高水和性シラノールをエンド
キャッピングすることなく，固定相中に残存させたことにより，水素結合性
たことにより，水素結合性/イオン性
イオン性相互作用がプラスされた今までにない逆相分離モードを創出
プラスされた今までにない逆相分離モードを創出することができました－Sunrise C18
C18-SAC

イオン交換クロマトグラフィにおける保持
イオン交換クロマトグラフィにおける保持

ChromaNik Sunrise C18-SAC
 高純度シリカゲルにオクタデシルシランを結合後，シラノール活性調節処理を行い，エンドキャッピ
ング処理を行わずにシラノールを残存させました
ング処理を行わずにシラノールを残存させました，比表面積：340m
340m2/g，
 細孔径：12nm
細孔径：12nm，比表面積：/g，炭素量：
炭素量：14%
 シラノール基に基づく相互作用 (水素結合/
水素結合/イオン

交換等)
交換等) が加味されて分離が行われます 酸性条件下ではイオン交換相互作用が強く働きますので，緩衝液/すので，緩衝液/塩濃度で分離の調節が可能です

評価用化合物の化学構造と酸解離指数

 カラムと溶離液の種類が決定されると，カラムと溶離液の種類が決定されると，log k (保持

CH3

指数の
指数の対数)
対数) とlog [A[A] (溶離剤イオン濃度の対数)
溶離剤イオン濃度の対数)間に直線関係があり，その傾きは，－間に直線関係があり，その傾きは，－zA/zBです

log k = −

CH3

HN
O

zB
z
V
1
log[ A] + B log[ A] + log r +log K ABzAzA
Vm z A

N
H

O

O

NH

CH3

OH

1. uracil
pKa 9.45

2. toluene－

A：溶離剤イオン，B
溶離剤イオン，B：測定イオン，：測定イオン， k：Bの保持指数，
ZA, ZB：各イオンの電荷，Vr, Vm ：カラム内の樹脂体積と移動相体積 ，：各イオンの電荷，
B
 K A ：選択係数

3. propranolol
pKa 9.42



CH3



1

2

3

5

4

200mM
3

5

4

100mM
2

1

3

5

4

50mM
2

1

3

4

Column: Sunrise C18-SAC
5µm, 4.6x150 mm
Mobile phase: 70/30=CH3CN/acetate buffer (pH4.1)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 °C
Sample:1 = uracil
2 = toluene
3 = propranolol
4 = nortriptyline
5 5 = amitriptyline

25mM
1

緩衝液濃度と保持指数との関係
log k = −

10mM

1.4

14,0001.2

412,000N (amitriptyline)

1.0

10,0000.8

amitriptyline

8,000

0.6

nortriptyline

6,000

0.4

Toluene

4

5

4,000

propranolol

2,000

0.0

0
0.5

2

zB
z
V
1
log[ A] + B log[ A] + log r +log K ABzAzA
Vm z A

0.2

2
3

0

5. amitriptyline
pKa 9.4

6

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Retention time / min

N (アミトリプチリン) / TP/150mm

24. Nortriptyline
pKa 9.7

log [保持指数]

1

CH3

CH3

※上式は広濃度域で成立しないとされます
が，実用使用実用使用濃濃上式は広濃度域で成立しないとされますが，
度範囲は
成立します
します
範囲は1桁以内です
桁以内ですので直線関係はので直線関係は成立異なる緩衝液濃度でのクロマトグラム

NH

N

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

log [緩衝液濃度 / mM]

3

異なる緩衝液pHにおける分離異なる緩衝液pHにおける分離
2

1

2

3

4

1

23

4

1

2

pH3.46pH4.08

2

1

4
4

25
amitriptyline20

イオン交換能の増加
シラノールの解離増加

15nortriptyline

水素結合性？

10

propranolol

5

Toluene2

3

pH6.790

53

pH5.901

5

3

pH4.97

Column: Sunrise C18-SAC
5µm, 4.6x150mm
Mobile phase: 70/30=CH3CN/100mM acetate buffer
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 °C
Sample:1 = uracil
2 = toluene
5
3 = propranolol
4 = nortriptyline
5 = amitriptyline
5

45

3

Capacity factor k

1
pH2.65

緩衝液pHと保持指数との関係
緩衝液pHと保持指数との関係

5

0

5

4
10
15
20
25
Retention time / min

2

3

1

6

7

8

核酸塩基類の分離例

Column size: 4.6x150 mm, 5µm
Mobile phase:
10/90=CH3CN/20mM H3PO4
Flow rate: 1.0 mL/min
Sample: 1 = 8-quinolinol (oxine)
2 = caffeine

25Buffer pH

8-キノリノール/
キノリノール/カフェインの分離例
A) Sunrise C18

4

30

1

HN
O

N

Column: Sunrise C18-SAC,
5 µm, 4.6 x 150 mm
Mobile phase: 20 mM KH2PO4 pH4.5
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC
Sample: 1 = cytosine, 2 = uracil,
3 = thymidine, 4 = thymine

2
HN

NH2
O

O

N
H

4

B) Sunrise C18C18-SAC
OH

1

H

H3C
H
HO

2

O

3

O

N
O

CH3

HN
OH
H

N

N
H

O

NH2

＊

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

0

Retention time / min

極性/…
極性/親水性化合物だけを保持できたら親水性化合物だけを保持できたら…
 逆相モードと溶出順序が逆転できたら…
逆相モードと溶出順序が逆転できたら…

！
 C18に保持し難い親水性化合物の分離が可能に
C18に保持し難い親水性化合物の分離が可能に！
性能が劣化ががなくなる！
 疎水性化合物の疎水性化合物の残存による残存による性能が劣化なくなる！
 それも，単純な分配モードで分離ができたら…
それも，単純な分配モードで分離ができたら…
 水－有機溶媒系で親水性化合物の分離が可能に！
水－有機溶媒系で親水性化合物の分離が可能に！

強酸//強塩基を使用しないでよい！
 イオン抑制のために
イオン抑制のために強酸塩基を使用しないでよい！
のでLC
LC--MSと結合可能に！
 イオンペア剤を使用しない
イオンペア剤を使用しないのでMSと結合可能に！
 イオン交換のような煩雑な緩衝液調整から開放される！
イオン交換のような煩雑な緩衝液調整から開放される！

5

10
Retention time / min15

親水性相互作用クロマトグラフィー
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography : HILIC
HILIC

対象成分/親水性固定相間の親水性相互作用に基づいて分離されます HILICモードでは，親水性の高い化合物ほど強く保持されます 多くの場合，溶出順序は逆相モード
RPLCとは逆になります強く保持 逆相型カラムでは保持され難く，
ボイドボリューム近くに溶出する成分の分離にHILICは最適です
HILICとHILICとRPLCによるペプチドの分離
RPLCによるペプチドの分離
 安定した水和特性を持ち，保水性の Mobile phase:(HILIC) 60:40 = CH CN/10 mM AcONH (pH 7)(RPLC) 5:95 = CH CN/10 mM AcONH (pH 7)
高い充填剤が必要となります
Sample: 1 = Phe-Gly-Gly-Phe, 2 = Leu-Gly-Gly,


3

3

4

4

3 = Gly-Gly-Gly

4

ZIC®-HILIC/HILIC/pHILICの官能基構造
HILICの官能基構造
CH3
CH2

N CH2 CH2 CH2

SO3

スルホベタイン型官能基

CH3

両性イオン “荷電しかも中性”
荷電しかも中性”
・安定で強い水和相を相を形成形成
安定で強い水和・静電的相互作用が低い

塩基性ペプチドの保持
Column：Column： ZIC®-HILIC,HILIC, bare silica column, 100 × 4.6 mm i.d.
i.d.
Mobile phase: 40 % acetonitrile in CH3COONH4 (50 mM, pH 6.5)
Sample: bradykinin (pI 12)

分子内塩
を形成

S

陽イオン交換
相互作用が
加味される

N

★ Chaotropic order
Anion: TCA−>ClO4−>NO3−>Cl−>acetate−>F−> SO42−
Cation: Ca2+>Mg2+>Li+>Na+, K+>NH4+> (CH3)4N+

HILICにおける溶媒強度
HILICにおける溶媒強度

Column:Column: ZIC®-pHILIC,HILIC, 100 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase:
phase: (left) 75:25 = acetonitrile/CH
acetonitrile/CH3COONH4 (17 mM, pH 6.8)
(right) 75:25 = acetonitrile/NH4HCO3 (17 mM, pH 9.6)
Sample: 1 = gentisic acid, 2 = protocatechuic acid,
acid, 3 = isophthalic acid6
5
Retention factor k

芳香族有機酸の分離例

HILICにおける溶媒強度
HILICにおける溶媒強度

acetonitrile

42
1

methanol

05060

イオン化を高めると保持も分離も改善

THF < acetone< acetonitrile < IPA< ethanol < water

CH3CN
のほうが
強く保持

3

2

70

80

90

100

Concentration of organic solvent / %Column; ZIC®-HILIC 150 x 4.6 mm
Mobile phase: 10 mM formic acid
Legend;(circles)circles) cytosine(triangles) adenine

核酸塩基の分離例
Column: ZIC®-HILIC 150 x 2.1 mm, 5 µm
Eluent: 80% acetonitrile/20% 25 mM CH3COOH, 2.5 mM CH3COONH4
Flow rate: 0.1 mL/min, Detection: UV at 254 nm
Sample: 1 = thymine, 2 = uracil, 3 = adenine, 4 = guanine, 5 = cytosine

1

2
1

3

3

極性化合物のための Second Choiceカラム First Choice はフルエンドキャップ型C18
フルエンドキャップ型C18カラム
 First Trial Conditionでの分離結果を見て，分離を改善
Conditionでの分離結果を見て，分離を改善 まず，ChromaNik
まず，ChromaNik Sunrise C18でトライして下さい
C18でトライして下さい！

 Second Choice c 選択性の異なる固定相の使用
選択性の異なる固定相の使用の改善
 水素結合性/
水素結合性/イオン性相互作用による分離
イオン性相互作用による分離の 特に塩基性薬物の分離改善には － Sunrise C18C18-SAC !!

 Second Choice d HILICモードの使用
HILICモードの使用 C18に保持され難い高極性化合物の分離を改善
C18に保持され難い高極性化合物の分離を改善
 極性化合物の分離改善には － ZIC®-HILIC column !!

5