22-05

Emerald Luc
Luciferase Assay Reagent
Neo（Code No. ELA-301）

取扱説明書

TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA4735K

－目次－
[1]
[2]
[3]
[4]

はじめに …………………………………………………………………………
製品内容 ………………………………………………………………………
ご用意いただくもの ……………………………………………………………
哺乳類細胞におけるアッセイ方法 ……………………………………………
1. 試薬の準備 …………………………………………………………………
2. アッセイ方法 …………………………………………………………………
[5] トラブルシューティング……………………………………………………………
[6] 関連商品…………………………………………………………………………

23344467

ご注意
本製品は研究用試薬です。診断・臨床用試薬として決して使用しないでください。本製品の使用にあたっては、保護具の着用など実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。試薬が手や衣服に付着した場合や使用後は十分に水洗してください。万一目に入った場合は十分に水洗した後、医師の手当を受けてください。

1ELA-301

[1] はじめに本製品は、”Emerald Luc システム”の in vitro アッセイ用検出試薬 Emerald Luc Luciferase Assay
Reagent (Code : ELA-101)の組成を見直すことによって、発光シグナル及び細胞溶解性を向上させた発光試薬です。本試薬をご利用いただくことによって、より感度の高いリポーターアッセイが可能です。
リポーターアッセイは、ある遺伝子の転写制御配列（プロモーターなど）をリポーター遺伝子と連結し、細胞内で発現したリポーター酵素の活性を指標に遺伝子発現を評価する手法です。特にルシフェラーゼの発光を利用したシステムは感度が高く、活性測定が簡便なことから、広く用いられています。
“Emerald Luc システム”は、産業技術総合研究所・近江谷先生らのグループとの共同研究によって開発された Emerald Luc ルシフェラーゼを用いたリポーターアッセイシステムです（中島芳浩、近江谷克裕

バイオテクノロジージャーナル, 3-4, 230-232 (2006)、特許出願中）。Emerald Luc ルシフェラーゼは、ホタル由来ルシフェラーゼと同じ D-luciferin を発光基質としますが、ホタルルシフェラーゼより生細胞中で安定で、高いシグナルが観察されます（in cells アッセイ、非破壊計測）。一方で、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定する in vitro アッセイ（破壊計測）においても、ホタルルシフェラーゼと比べ発光持続性の高い検出が可能です。

被験配列

本製品

ELuc
ELuc(PEST)

細胞破壊系アッセイ（in vitroアッセイ）

ベクター：
pELuc-test
pELuc(PEST)

非破壊系アッセイ（in cellsアッセイ）

D-luciferin溶液
発光試薬細胞

ルミノメーター（インキュベーター機能つき）

ルミノメーター（プレートリーダー）
発光イメージングシステム

図 1. Emerald Luc システムの実験フロー

本製品には以下の特長があります。

特長 1 高い発光シグナル・高い発光持続性
本試薬は Emerald Luc ルシフェラーゼの in vitro アッセイ用に試薬組成を最適化しており、高い発光シグナルが得られます。さらに、本試薬による Emerald Luc ルシフェラーゼの発光は、ホタル由来ルシフェラーゼと比べ、高い持続性を示します。発光の減衰が少なく、HTS アッセイに最適です。

ELA-3012RLU

図 2. Emerald Luc の発光安定性、持続性
SV40 プロモーターに連結した ELuc (Emerald Luc)をHeLa S3 細胞にトランスフェクションし、細胞溶解後 10分後から発光を経時的に測定しました。グラフ縦軸が発光強度、横軸が試薬添加後経過時間を示します。

1.0E+06
8.0E+05
6.0E+05
4.0E+052.0E+05
0.0E+00
0204060min
本製品

従来品

特長 2 簡便な操作
本試薬は細胞を溶解する成分を含みますので、細胞溶解・発光反応を 1 つのステップで行えます。

[2] 製品内容
品名
Emerald Luc
Luciferase Assay Reagent
Neoサイズ（＊1）

Code No.

内容

保存温度

10mL×1 本

ELA-301

Luciferase Assay Reagent
10mL

-80℃

（＊1） 96 ウェルプレートでアッセイを行う場合、ELA-301 は 100 反応分に相当します。一回の測定で検出するサンプル数が少ない場合には、初回融解時に小分注して凍結保存することをお勧めします（弊社内の検討では 3 回までの凍結融解は品質上問題ないことを確認しております）。

細胞をあらかじめ溶解し、ライセートを用いて測定を行う場合には下記の試薬を別途ご購入ください。
品名
Emerald Luc Lysis Solution

サイズ
100mL×1 本

Code No.
ELA-201

内容Lysis Solution
100mL

保存温度-20℃[3] ご用意いただくもの・プロモーターなど被験配列を挿入した Emerald Luc プラスミド
Emerald Luc ベ ク タ ー （ pELuc-test （ Code No. ELV-101 ） ま た は pELuc(PEST)-test (Code No.
ELV-201)）は本製品には含まれません。別途ご購入ください。

・細胞、培地、トランスフェクション試薬など
・ルミノメーター及び適合する容器
プレートリーダーの場合は白色不透明プレートをご用意ください。
3ELA-301

[4]哺乳類細胞におけるアッセイ方法

1. 試薬の準備
・ ルシフェラーゼの活性は温度によって影響を受けますので、Luciferase Assay Reagent を十分に室温に戻してご使用ください。
・ Luciferase Assay Reagent は-80℃で保存し、融解は室温またはそれ以下で行ってください。水浴で溶解することをお勧めします。
・ 細胞も室温に戻した後、試薬を添加してください。

2. アッセイ方法（１） （96 ウェルまたは 384 ウェルプレートで）細胞培養後、そのまま測定を行う場合 (図 3)① Emerald Luc 遺伝子を導入した細胞を培養します。
細胞培養し、そのまま発光試薬を加えて測定するため、ルミノメーターでの測定に適合する白色不透明プレートで培養してください。

② 細胞をインキュベーターから取り出し、室温に戻します。
③ それぞれのウェルに細胞培養液と等量の Assay Reagent を添加します。
96 ウェルプレートでは、通常 100μL の細胞培養液に 100μL の Assay Reagent を添加します。384 ウェ
ルプレートでは、通常 30μL の細胞培養液に 30μL の Assay Reagent を添加します。

④ 10 分間室温でインキュベートして細胞を完全に溶解します。
この際、振とう機で軽く振とうすると反応液が均一になり、安定した計測が行えます。

⑤ ルミノメーターで測定します。

図 3. 96 または 384 ウェルプレートの検出

ELA-3014

(2) 細胞をあらかじめ溶解後、測定を行う場合 (図 4)
別売の Emerald Luc Lysis Solution （Code No. ELA-201）を使用します。
① Emerald Luc 遺伝子を導入した細胞を培養します。
② Emerald Luc Lysis Solution を室温に戻します。
③ 細胞培養液から培地を除去します。
④ PBS でリンスします。
⑤ 細胞が浸るのに十分量の Emerald Luc Lysis Solution を加えます。添加量は下記を参考に、他の測定など必要に応じて調整してください。

90mm ディッシュ
60mm ディッシュ
35mm ディッシュ
6 ウェルプレート

Emerald Luc Lysis Solution
添加量
3mL
1mL
500μL
500μL

12 ウェルプレート
24 ウェルプレート

200μL
100μL

容器

⑥ 細胞容器を軽く振とうし、室温で 5 分間放置します。
⑦ ライセート適当量を測定容器に移し、等量の Assay Reagent を加え測定します。

図 4. 細胞ライセートを用いる検出5ELA-301

[5] トラブルシューティング現象
シグナルが検出できない、または低い

定量性が悪い再現性がないELA-301

対応
・ もともと発現の低いプロモーターの可能性があります。
・ トランスフェクション試薬あるいは条件が不適当な可能性があります。試薬や条件を変えて実施してください。
・ プラスミドの純度が低い可能性があります。
Endotoxin の混入が少なくなるように再精製してください。
・ ルシフェラーゼが失活した可能性があります。ライセートを室温で長時間放置しないでください。
・ 試薬が劣化した可能性があります。新しい試薬で実施してください。
・ プラスミドのトランスフェクション効率など、実験条件にバラツキがある可能性があります。できるだけ均一になるように実験プロトコールを見直してください。
・ シグナルが低く、ノイズの影響を受けている可能性があります。シグナルが高くなるように実験条件を最適化してください。
・ Assay Reagent が室温に戻っていない可能性があります。Assay Reagent を室温に戻してください。
・ Assay Reagent が劣化した可能性があります。新しい試薬で実施してください。
・ 細胞の培養条件、処理条件など、実験条件にばらつきがある可能性があります。実験条件を確認してください。
・ ルミノメーターの不調の可能性があります。ルミノメーターの動作確認を実施してください。

6[6] 関連商品
●Emerald Luc ルシフェラーゼベクター
品名Emerald Luc プロモーター挿入用ベクター
pELuc-test
Emerald Luc-Short life タイプ-プロモーター挿入用ベクター
pELuc(PEST)-test●Emerald Luc 細胞溶解剤
Emerald Luc Lysis Solution

内容Code No.

20μg×1 本ELV-101

20μg×1 本ELV-201

100 mL×1 本

ELA-201

20μg×1 本

MRV-101

20μg×1 本

MRV-102

20μg×1 本

MRV-10320μg×1 本

MRV-201

20μg×1 本

MRV-202

20μg×1 本

MRV-20320μg×1 本

MRV-301

100 回用MRA-301●多色レポーターアッセイ
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

プロモーター挿入用ベクター pSLG-test
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

プロモーター挿入用ベクター pSLO-test
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

プロモーター挿入用ベクター pSLR-test
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SV40 コントロールベクター pSLG-SV40 control
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SV40 コントロールベクター pSLO-SV40 control
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SV40 コントロールベクター pSLR-SV40 control
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

HSVtk コントロールベクター pSLG-HSVtk control
MultiReporter Assay System -Tripluc®- In vitro アッセイ試薬Tripluc® Luciferase Assay Reagent

7ELA-301

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