C18 カラム基礎講座
コアシェル、全多孔性どう使うのが効果的？
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 佐藤誠 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

全多孔性？コアシェル？

官能基は・・・

予算は・・・

粒子径は・・・

高速化するには分取も・・・

分離を変えるには・・
疎水性相互作用

相互作用の異なるカラムに交換する

アルキル基
親水性相互作用
イオン交換相互作用
陰イオン
交換基
π-π相互作用
フェニル基

N+

陽イオン
交換基
OO

-

水素結合
ジオール基
OHSO

アミド基
OH

CH3

カラム充填剤基材

CH3NO

分離を変化させる
移動相を交換カラムを交換相互作用の強さ
働き方

メーカーやロットの違いで・・・
同じC18カラムなのに分離が変わることがある

二次的な相互作用が変わるから相互作用カラムの性能を決める要因

化学修飾
コーティング→ 耐久性
官能基の結合→ 選択性
エンドキャッピング→ 不活性化
化学修飾 → 分離に大きく影響

カラムの性能を決める要因2

基材の選択
素材の選択
微粒子化
基材の形状

→ 耐久性・選択性→ 高理論段数化→ 高速化・高理論段数化

基材の選択 → 理論段数に大きく影響

全多孔性粒子と何が違う？
コアシェル

全多孔性

素材

シリカ

特徴

アルカリ条件に弱い

粒度分布

狭い

広い

比表面積

狭い(150㎡/gほど)

広い(340㎡/gほど)

構造

ノンポーラスの核と多孔質層多孔質

重量

重い

軽い

全多孔性シリカカラムで注意すべきこと
コアシェルシリカカラムで注意すべきこと

市販されているコアシェル粒子
コア

粒子径1.3‐2 µm

2.4‐2.7µm

3.4 - 3.6 µm

4 - 5 µm

細孔径

9 - 10 nm

8 - 16 nm, 30 nm, 100 nm

20 - 40 nm

8 - 12 nm

多孔質層0.22 - 0.4 µm0.3 - 0.5 µm

0.2 - 0.5 µm

0.?- 0.6 µm

比表面積 100 – 120 m2/g

90 – 150 m2/g,
25 – 40 m2/g

15 m2/g

90 m2/g

多孔質％58 - 77％27％

60%

58 – 78%二種類のコアシェル構造のシリカ粒子

モノレイヤー（単層）多孔質構造

マルチレイヤー（多層）多孔質層構造

全多孔性とコアシェルの理論段高さの比較
18
16

Fully porous 5 um

Plate Height, um

14

Fully porous 3 um

12

Fully proous 1.8 um

10Core Shell 2.6 um

8Fully porous 2.6 um

6Column: C18, 50 x 4.6 mm
Mobile phase:
Acetonitrile/water=(60/40)
Temperature: 25 oC
Sample : Naphthalene

4200510Mobile Phase Velocity, mm/sec15◇ 全多孔性シリカカラムと比べるとコアシェルカラムは圧力が低い◇ 全多孔性シリカカラムと比べるとコアシェルカラムは保持が小さい
コアシェルカラムは負荷量が少ないカラムの背圧
カラムの背圧は粒子径の2乗に反比例
Brand F C18, 5 µm 250 x 4.6 mm

HPLCN(4)=19,313

3129.5 MPa
02468101214Retention time/min

161820

SunShell C18, 2.6 µm 100 x 4.6 mm

0113.4 MPa

222224N(4)=20,287

315434554Mobile phase:
CH3CN/20mM Phosphoric acid = 45/55
Flow rate: 1.0 mL/min,Temperature: 25 ºC
Detection: UV@230 nm
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE（内径0.25mmの配管仕様）

2.6 µmでは5 µmの約3.7倍の圧になる
9.5MPa × 3.7 ×100/250 = 14.1MPa

6Retention time/min

粒子径に準じた背圧

単位圧力あたりの段数比較
PlatesPressure(MPa)

Plates/pressure

Sunniest C18-HT 2.0 µm

9,90016.7593

Brand A C18 1.9 µm

7,660

16.3470

Brand B C18 1.8 µm

10,10019.6515

Brand C C18 1.7 µm

11,14032.0348

SunShell C18 2.6 µm

9,600

9.7990Sunniest C18-HT 2.0 µm
Brand A C18 1.9 µmBrand B C18 1.8 µm
Brand C C18 1.7 µm

2～３倍SunShell C18 2.6 µm
05,00010,00001020300300600900Column: 50 x 2.1 mm C18, Mobile phase: Acetonitrile/water=(70/30), Temperature: 25 oC

全多孔性シリカカラムと比べるとコアシェルカラムは圧力が低い

圧力は粒子径通りの高さだが理論段数は高い

全多孔性シリカとコアシェル型シリカ
2.6µmと5µmの標準試料の保持比較
全多孔性シリカ
Sunniest C18, 5 µm

コアシェル型シリカ
SunShell C18, 2.6 µm

コアシェル型シリカ
SunShell C18, 5 µm

340 m2/g

150 m2/g

90 m2/g

比表面積

保持時間(tR)

保持指数(k)保持時間(tR)

保持指数(k)保持時間(tR)

保持指数(k)1) ウラシル

1.70

01.3401.3002) カフェイン

1.90

0.12

1.460.09

1.410.083) フェノール

2.17

0.28

1.650.23

1.570.214) ブチルベンゼン

13.35

6.85

10.87

7.11

8.93

5.875) o-ターフェニル

19.19

10.29

15.49

10.56

12.768.826) アミルベンゼン

19.96

10.74

16.56

11.36

13.439.337) トリフェニレン

24.35

13.32

21.95

15.38

16.76

11.89

相対値アミルベンゼン

100%

100%

83%

106%

67%

87%

コアシェル型シリカ 5 µm
コア径：3.4 µm
シェル層厚：0.6 µm

移動相: Methanol/water(75:25)
温度: 40oC
カラム: 150 x 4.6 mm
流速: 1.0 mL/min

標準試料の分離比較
Column:Company P C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (26.1 Mpa, 30,800 plate )Company P C18
264
Company T C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (22.7 Mpa, 31,600 plate)
26.1 MPa
113
Company W C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (18.5 Mpa, 23,300 plate)27
Company A C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (30.6 Mpa, 30,200 plate)51k6=7.4Company T C18
Company S C18, 2.7 μm 150 x 4.6 mm (22.2 Mpa, 31,800 plate)
N6=31,600
63422.7 MPa
SunShell C18, 2.6 μm 150 x 4.6 mm (21.8 Mpa, 31,900 plate)
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
7
1 2 k6=7.75
Company W C18 Flow rate: 1.0 mL/min
N6=23,300 46318.5 MPa
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine, 3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
7
1 2 k6=9.0
5
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene, 7 = Triphenylene
Company A C18
N6=30,200
7k6=5.4
5N6=30,800

30244676

SunShell C1821.8 MPa 48

水素結合性30.6 MPa

52 k6=9.7
1 3 N6=31,800
2316456718202224

疎水性

立体選択性(Amylbenzene/Butylbenzen (Triphenylene/o-Terphenyl)
e)

0.48

1.54

1.20

0.35

1.56

1.50

Company W C18

0.38

1.59

1.32

Company A C18

0.42

1.57

1.25

Company S C18

0.44

1.60

1.31

SunShell C18

0.39

1.60

1.46

Company S C18 Company P C18
22.2 MPa
Company T C18

k6=10.4
N6=31,900101214
16Retention time/min(Caffeine/Phenol)アミトリプチリンの負荷量比較
Mobile phase: Acetonitrile/20mM phosphate buffer pH7.0=(60:40)
Column dimension: 150 x 4.6 mm, Flow rate: 1.0 mL/min, Temp.: 40oC

CH3N
CH3316000

1

TF=1.18

24

SunShell C18(core shell)

14000
TF=1.42

Theoretical plate

12000
10000
8000
6000

100 times

SunShell C18
Company A C18
Sunniest C18 3um
Company P C18
Company T C18
Compnay W C18
Company S C18

TF=2.43

TF=3.21

2000

T C18(core shell)
W C18(core shell)

TF=3.170.01

Sunniest
C18 3μm(fully porous)
P C18(core shell)

TF=1.25

4000

00.001A C18(core shell)

0.1

1

10

S C18(core shell)

TF=4.38

Sample weight/μg0

理論段数はピークの高さの4.4%のピーク幅を用いる5シグマ法を用いました。

4.4%

1235674Retention time/min

8910Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol,
3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline

物性値
炭素含有量Carbonloading (%)

細孔容積
比表面積
Specific surface Pore volume aarea a (m2/g)(mL)

細孔径Pore diameter a(nm)SunShell C18

7.3

1250.261

8.34

Company S C18

8.0

1330.278

8.20

Company A C18

8.5

1350.414

12.3

Company T C18

8.8

1300.273

8.39

Company W C18

7.3

1130.264

9.32

Company P C18

4.91020.237

9.25

a. C18充填剤を600℃で8時間焼成し，アルキル基を焼き飛ばした後のコアシェル粒子を測定しました。この測定値はオリジナルのコアシェル粒子の値より小さくなります。
*全ての測定はクロマニックテクノロジーズ社内で行いました。

全多孔性シリカカラムと比べるとコアシェルカラムは保持が短い

保持時間は短いが保持指数はほぼ同じ
負荷量は少ないがその差は20%
コアシェルカラムは保持時間・負荷量共にメーカ間の差が大きい

負荷量が小さくなるということは・・
分取する場合・・・

コアシェルカラムの分取は・・・• できるだけ負荷量を取る• ピーク幅が広いことが多い• ピーク形状が悪い時もある• コストがかかる• 回収効率が20%程度さがる• コアシェルを使うメリットが少ない

分取においては全多孔性カラムのほうが向いているコアシェル粒子の多様性
コアシェル

全多孔性

素材

シリカ

ポリマー、シリカ

粒子径1.3 ～ 5 µm

1.5 ～ 10 µm

細孔径

8 ～ 100 nm

0 ～ 100 nm

比表面積15 ～ 150 ㎡/g～ 400 ㎡/g

多孔質層

0.2 ～ 0.6 µm-重量重い

軽い

多孔質層の厚さを変えることでより適した粒子を選択可能に多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較
Column: SunShell C8-30, 2.6 µm (30 nm, 0.5 µm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30HT, 3.4 µm (30 nm, 0.2 µm layer) 100 x 2.1 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 or 35 min
%B
20%
65%
高速分離においては多孔質相が薄いほう
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,が分離が良好
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
W0.5=0.87 sec

2W0.5=0.93 sec
135480 oC and 5 min gradient
SunShell C8-30HT 3.4 µm (0.2 µm)
SunShell C8-30 2.6 µm (0.5 µm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient
W0.5=4.2 sec
SunShell C8-30HT 3.4 µm (0.2 µm)
SunShell C8-30 2.6 µm (0.5 µm)
051015Retention time/min

Surface area works well for separation.

2025

多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較２Column:
SunShell C8-30, 2.6 µm (30 nm, 0.5 µm layer) 150 x 2.1 mm, Sunshell C8-30HT, 3.4 µm (30 nm, 0.2 µm layer) 150 x 2.1 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 60 min%B
20% 65%○
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

2 W0.5=6.0 sec

W0.5=8.0 sec

31

グラジエント時間が長い場合、粒子径の差以上のピーク幅の差が観察された45Sunshell C8-30HT, 3.4 µmSunShellC8-30, 2.6 µm
0351015202530354054

分離は多孔質層が厚いほうが、良好

24262830323436384042

高分子用カラムColumn: SunShell C4-100, 2.6 µm (100 nm, 0.5 µm layer) 100 x 2.1 mm,Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.085 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min
30 min%B 30%
45%
Flow rate: 0.4 mL/min , Temperature: 80 C
Detection: UV@215 nm,
Sample: IgG purified by Protein G column○024681012Retention time/min

14161820

微粒子化のメリット，デメリット• HPLC，UHPLC両方で使用可能• 時短，理論段数の両立が難しい場合がある• UHPLCでのみ使用可能• 圧力が高圧に• 高速化，高理論段数化が可能• 短いカラムで分離可能に流速による理論段数変化
35000

30000

理論段数

25000

流速が上がるにしたがって理論段数も上がるはず…

20000

15000

10000
Totally porous hybrid C18
Totally porous monodisperse C18

5000

SunShell C18
00.1

0.2

0.3

0.4

流速 mL/min
Column: 100 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Temperature: 40 ºC
Sample: Acenaphthene,

0.5

0.60.7

摩擦熱の発生

カラム末端の表面温度/℃

通液開始

9分後

40カラム：コアシェル, 2.6 μm 150 x 4.6mm
移動相：メタノール
流速：5 mL/min
カラム圧：70 MPa
室温：23℃

35302520151005
通液時間/分1015

流速による理論段数変化
35000

30000

理論段数25000

20000

摩擦熱による段数低下

15000

10000
Totally porous hybrid C18
5000

Totally porous monodisperse C18
SunShell C18

00.1

0.2

0.3

0.4

流速 mL/min
Column: 100 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Temperature: 40 ºC
Sample: Acenaphthene,

0.5

0.60.7

粒子の熱伝導性O
H2 O
O H2SiSiCOCOCSiSiCO
H2H2O H2O H2 OSiCCSiOCSiSiC
H2 O
H2OO

コアシェルシリカはコアが存在し，全多孔性シリカより熱伝導性が良く，摩擦熱の影響を受けにくいため， より高い流速領域まで段数は上昇 すると推測される。

全多孔性ハイブリッドシリカは，シリカ骨格に炭素鎖が入っているため，熱伝導性が悪く， カラム内の温度分布が均一でないため， 通常の全多孔性シリカより，低流速で摩擦熱が 原因となる段数低下が起こったと推測される。

*Fabrice Gritti, Georges Guiochon, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 5069.
A part of abstract
This unexpected result is accounted for by the three times
smaller heat conductivity of the BEH bed (BEH 0.25
W/m/K) than that of the Kinetex bed (Kinetex 0.75W/m/K).

コアシェルシリカの熱伝導性はハイブッリドシリカの3倍

カラムを上手に使うには・・
理論段数が高いカラムを使うにあたって・・・・
ピークの溶出は早く、高理論段数化カラム内拡散が小さい得られるクロマトグラムのピークボリウムが小さい

物質移動速度が速い

装置のチョットした容量が結果に影響することに通常仕様とセミミクロ仕様のHPLCの比較

Flow cell

Response Sampling Tubing ID

Normal 13 μL

0.1 sec

0.4 sec

0.25 mm

Semi-micro 3.2 μL 0.1 sec

0.4 sec

0.13 mm

Semi-micro 3.2 μL 0.05 sec

0.05 sec

0.13 mm

45000
40000
Acenaphthene

理論段数

35000

Toluene
Butylbenzene

30000
25000
20000

Semi-micro 0.05 sec

15000

Semi-micro 0.1 sec

10000

UracilNormal 0.1 sec

5000
005

ピーク幅/秒

1015Column: SunShell C18, 5 µm 250 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/H2O= 70/30
Flow rate: 1.0 mL/min,Temperature: 40 ºC
Pressure: 6.7 MPa
Detection: UV@250 nm
Sample: 1 = Uracil
2 = Toluene
3 = Acenaphthene
4 = Butylbenzene
HPLC: Hitachi LaChrom ELITE

まとめ
コアシェルカラムは、特別圧力が低いわけではなく、近い性能を有する全多孔性シリカカラムと比較すると圧力は低い
コアシェルカラムの保持は、同じ化学修飾をした全多孔性シリカカラムと比較すると、保持時間は短くなるが保持指数は変わらない
コアシェルカラムのサンプル負荷量は、全多孔性カラムと比較すると20%減少する
コアシェルC18カラムも従来の全多孔性C18カラムと同様にメーカー間，ブランド間に保持や負荷量に差があり、その差は大きい。
2µm以下の粒子において、摩擦熱によると考えられる段数低下はハイブリッドシリカが顕著であった。