22 動物抗菌会報 23（2001）

魚類病原細菌 Lactococcus garvieae より分離された
薬剤耐性プラスミドの構造解析
廣野育生

青木

東京水産大学資源育成学科遺伝生化学講座

宙（〒１０８８- ４７７ 東京都港区港南４５- ７- ）を解析し，さらに，R プラスミドがコードする薬はじめに剤耐性遺伝子の起源を考察することを目的とした。

材料と方法

Lactococcus garvieae はグラム陽性球菌で，ブリのレンサ球菌症の原因菌である 1）。本菌による感染症は 1974 年に九州および四国のブリ養殖場でL. garvieae の R プラスミドの構造
L. garvieae EH8632 株より伝達性 R プラスミド

突発的に発生し，今日もなお全国各地の養殖場で頻発し，養殖業者に多大な経済的被害を与えていDNA を抽出精製した。伝達性 R プラスミドを制る。本菌感染症の治療には主としてマクロライド

限酵素 Sau3A1，EcoRI および HindIII で消化し，系抗生物質やリンコマイシンおよびオキシテトラ

それぞれの DNA 断片をベクタープラスミドにクサイクリンが使用されて来た。1980 年代前半まローン化し，塩基配列を決定した。決定した塩基2）では本菌の薬剤耐性株は見られなかったが ，配列は GenBank に登録されている塩基配列ある

1980 年代中頃より多剤耐性株が出現するように

いはタンパク質配列に対しての相同性検索を

3）

BLAST プログラムにより行った。

なった 。これら薬剤耐性株は，マクロライド系抗生物質あるいはリンコマイシンに中等度の耐性結を示すタイプ，マクロライド系抗生物質，リンコ果マイシン，テトラサイクリンに高度耐性を示すタ
イプおよびマクロライド系抗生物質，リンコマイ

伝達性 R プラスミド pSY8632 は制限酵素によるシン，クロラムフェニコールに高度耐性を示す 3

消化断片の比較解析により約 30kb の大きさでつのタイプに分類された 4）。これらの多剤耐性株あった。pSY8632 がコードしているマクロライドの内，高度耐性を示す株は伝達性の R プラスミド

耐性遺伝子はブドウ球菌由来のマクロライド耐性によるものであった 3）。また，1987 年から 1988 年

遺 伝 子（ermB）と 最 も 相 同 性 が 高 か っ た。まに分離された L. garvieae 370 株のうち約 15％はマた，pSY8632 がコードしているテトラサイクリンクロライド耐性を示し，同時にテトラサイクリン耐性遺伝子は Lactococcus lactis 由来のテトラサイ耐性あるいはクロラムフェニコール耐性を示しクリン耐性遺伝子 （tetS）と最も高い相同性を示た。1999 年から 2000 年に分離された 41 株のうちした。マクロライド耐性遺伝子とテトラサイクリ

約 30％の株はマクロライド耐性とテトラサイクン耐性遺伝子は約 1kb 離れて存在していた（図リン耐性を示した。

１）。両遺伝子間には Enterococcus faecalis のプラ

そこで，本研究ではマクロライド系抗生物質，スミドにコードされている機能不明なタンパク質と相同な配列が 2 個存在した（図１）。

リンコマイシン，テトラサイクリンに高度耐性を示す株より検出された伝達性 R プラスミドの構造22

廣野育生ほか／Lactococus garvieae の薬剤耐性プラスミド／23（2001） 23

図１

L. garvieae の伝達性 R プラスミド pSY8632 上のテトラサイクリン耐性遺伝子（tetS）とエリスロマイシン耐性遺伝子（ermB）の物理的地図

表１

L. garvieae の伝達性 R プラスミド pSY8632 上に存在した既知遺伝子のホモロジー

菌種およびプラスミド，トランスポゾン

遺伝子

Streptococcus pyogenes plasmid pDB101

ORF-alpha, ORF-gamma, ORF-eta,ORF-delta, ORF-zeta, cops
RepS
ORF-3, ORF-5, ORF-6
TrsK
ORF-14
Resolvase

Streptococcus pyogenes plasmid pDB101
Streptococcus sp. plasmid pIP501
Lactococcus lactis plasmid pMRC01
Enterococcus faecalis Tn916
Enterococcus faecalis plasmid pAM-beta-1

エリスロマイシン耐性遺伝子とテトラサイクリ相同性を示す配列は見られなかった。このことかン耐性遺伝子が連座している領域の端には IS 様ら，今回解析したプラスミドの起源はグラム陽性の配列が存在した。このことは，これら薬剤耐性の球菌由来のものであると考えられた。

遺伝子がトランスポゾンとして R プラスミド，染最後に，本菌感染症に対するワクチンが開発さ色体内あるいは細菌間で動いている可能性が示唆れ，養殖場で使用されるようになったにも関わらされた。しかし，今回解析したようにエリスロマず，薬剤耐性菌感染症が発生していることから，

イシン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子

今後も本菌の薬剤耐性機構の解明ならびに疫学的が連座して存在している R プラスミドの報告はなな調査を行なう必要があると思われた。

く，本菌内で新たに構築された遺伝子群である可能性も示唆された。PCR による薬剤耐性遺伝子

要約検出の結果，1999 年および 2000 年に分離された
薬剤耐性菌は伝達性 R プラスミド pSY8632 と同じLactococcus garvieae の 伝 達 性 R プ ラ ス ミ ド

マクロライド耐性遺伝子およびテトラサイクリン

pSY8632 は制限酵素による消化断片解析により約耐性遺伝子をコードしていることが明らかとなっ30kb の大きさであることがわかった。pSY8632

た。このことから，1980 年代後半から 2000 年ま上にコードされていたマクロライド耐性遺伝子はでの長期間に渡り，同一あるいは類似の構造の伝ブドウ球菌由来のマクロライド耐性遺伝子

達性 R プラスミドが存在し続けている可能性が示（ermB）と最も相同性が高く，テトラサイクリンされた。

耐性遺伝子は Lactococcus lactis 由来のテトラサイ

伝達性 R プラスミド pSY8632 がコードしているクリン耐性遺伝子（tetS）と最も高い相同性を示

薬剤耐性遺伝子領域以外の領域には，L. lactis あした。マクロライド耐性遺伝子とテトラサイクリ

るいは Streptococcus pyogenes 由来のプラスミドにン 耐 性 遺 伝 子 は 約 1kb 離 れ て 存 在 し て い た。

コードされている遺伝子と高い相同性を示す配列

pSY8632 上にコードされていた薬剤耐性遺伝子領が多数見られた（表１）。しかし，グラム陰性桿域以外は，L. lactis あるいは Streptococcus pyogenes

菌由来の R プラスミドあるいはゲノム配列と高い由来のプラスミドにコードされている遺伝子と高24 動物抗菌会報 23（2001）

い相同性を示す配列が多数見られた。このことか

文

献ら，今回解析したプラスミドの起源はグラム陽性細菌のものであると考えられ，今後，薬剤耐性プ

１．Kitao,T.：Fish Pathology 17, 17-26 (1982)

ラスミドの起源を研究する上で重要な情報になる

２．Aoki,T., Takeshita, S., and Kitao, T.：Bull. Jap.と思われた。

Soc. Sci. Fish 49, 1673-1677(1983)
３．Aoki,T., Takami,K., and Kitao,T.：Dis. Aquat.
Organ. 8, 171-177(1990)
４．Aoki T., Takami,K., and Kitao,T.： Proceedings ofthe Second Asian Fishries Forum, 697-699(1990)

Characterization of Structure and Genes of R Plasmid from Fish-Pathogenic Lactococcus garvieae
Ikuo HIRONO and Takashi AOKILaboratory of Genetics and Biochemistry, Tokyo University of Fisheries,
Konan 4-5-7, Minato-ku, Tokyo 108-8477, Japan
We characterized the structure and genes of R plasmid pSY8632 detected in fish-pathogenic Lactococcus garvieae.
This R plasmid encoded with resistance to erythromycin and tetracycline. The erythromycin resistance gene wasmost identical to ermE gene originated from Staphylococcus aureus. The tetracycline resistance gene was mostidentical to Lactococcus lactis tetS gene. We also found several genes which were homologue genes of R plasmids ofL. lactis or Streptococcus pyogenes. These results suggest that the origin of R plasmid pSY8632 is some of R plasmidfrom Gram-positive bacteria.

討論（座長：畑井喜司雄，日獣畜大）

質問（岡野圭介，藤沢薬品）
ハマチはオールイン，オールアウトの飼育形態である。エコサイクルをつなげるものは何でしょうか。
答（廣野育生，東京水産大）よく分からないのが事実です。しかし，耐性遺伝子やそれらをコードするＲプラスミドの構造が年により異なることがあるのも事実です。今後，さらに研究が必要かと思われます。
質問（片岡康，日獣畜大）EM，TC 耐性遺伝子が Tn 由来であることから，ハマチ由来の他の細菌への耐性の転移はみられませんか。
答（廣野育生，東京水産大）ハマチ由来の他の細菌への耐性遺伝子の転移はみられません。