全ての逆相カラムで水移動相を用いて保持の再現性を出すノウハウ
ChromaNik（株）クロマニックテクノロジーズ
長江徳和
1

逆相カラムの水100%移動相
条件での問題点
ChromaNik

・保持の減少・再現性の低下（・カラム寿命の低下）
2従来のアルキル基の寝込みによる説明の元となったと思われる論文
ChromaNik

1979年
アルキル基の寝込みに関する論文
C18の寝込みについて記述されている
3

ChromaNik

4

ChromaNik

5

保持の減少の本当の原因は？

ChromaNik

細孔からの移動相の抜け出し

6

ODSカラムの保持挙動（水100%）
ChromaNik

条件
カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
１時間通液停止後再度通液し測定

流速: 1.0 mL/min
温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America October 2002.

保持時間：5.40minから0.41minに減少

再現性がない7

ポンプ停止後のカラムの状態
ChromaNik

初期 試料は保持している。
カラムポンプインジェクター

ポンプを止め圧力が0になったら、すぐにカラムIN側に密栓をする。
カラム
ポンプ

インジェクター

カラムOUT側から移動相が出てくる。(0.59mL)
その後送液開始すると保持はすでに短くなっている。
8

水100%移動相条件下で保持が減少する理由
カラム内のODS粒子

移動相：水ChromaNik

充填剤に圧力がかかっている場合ポンプを停止し充填剤に圧力がからなくなると細孔内に移動相が満たされている状態

細孔内から移動相が抜け出た状態

細孔内から移動相が抜けた後、16MPa以上の圧力をかけないと戻らない。
細孔内に移動相を戻すためには有機溶媒を70%以上含む移動相に置換しなくてはならない。
9細孔から移動相を抜け出させるためにどんな力が作用しているか？
ChromaNik

毛管作用10毛管現象とは（岩波 理化学辞典 第5版）
ChromaNik

液体中に細い管（毛細管）を立てると、管内において液面が管外よりも上がりまたは下がる現象。液体分子間の凝集力と液体と管壁の間の付着力との大小関係により，液体が管を濡らす（付着力が大きい）ときは液面は上昇し、濡らさないときは下降する。管の内外の液面の高さの差をh、管の半径をr、液体の密度をρ、液体の表面張力をγ、接触角をθ、重力加速度をgとすれば、h=2γcosθ/rρgとなる。
11

毛管現象
Capillarity, Capillary phenomenon
ChromaNik

水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合

毛管現象の式:h=2γ cosθ /(rρg)γ : 表面張力
ρ: 液体の密度（比重）θgrhrhθ

液体が管に濡れる場合
θ < 90°液体が管に濡れない場合
θ > 90°12毛管現象
内径0.5mmのガラス管
ChromaNik

10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。この場合に作用してる圧力は0.006気圧である。内径が1μmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。
13

ポンプを停止すると保持が減少
ChromaNik

条件
カラム：ODS 4.6 x 150 mm
移動相：水カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
１時間通液停止後再度通液し測定

流速: 1.0 mL/min
温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America October 2002.

カラム出口以降の背圧を毛管現象で作用する圧以上に上げると保持はどうなるか？
14バックプレッシャーの影響
ChromaNik

カラム：ODS (細孔径10.3nm)

100

相対保持時間（％）

4.6 x 150 mm
粒子径：5 um80

ヒステリシスカラムのみにかかる圧力：6 MPa
移動相：水60

ポンプを停止せず
バックプレッシャーを下げた場合

40

ポンプ停止後パックプレッシャーを上げた場合

20

00

5

10

15

202530

バックプレッシャー(MPa）T. Enami and N. Nagae, American Laboratory October 2004.

流速：1.0 mL/min
温度：40℃
試料：2-プロパノール＊カラムの後に内径0.13mmの配管を0.2から3m接続し、カラムのout側に圧力がかかった状態で測定
35 ＊ポンプ停止前の保持を100%とし、ポンプ停止後再通液時の保持の割合を縦軸としました。
15カラム内充填剤の細孔内の状態
Column: ODS(10) 5 um 150 x 4.6mm, Mobile phase: Water,
Flow rate: 1.0mL/min, Temperature:40℃
ChromaNik
カラム入口の圧力
100① 8.5 MPa

2.5 MPa80② 17 MPa

11 MPa60③ 22 MPa

16 MPa

④ 36MPa

30 MPa

⑤ 11MPa

5 MPa⑤
相対保持時間（％）

カラムで口の圧力④③40

ポンプを停止せず
バックプレッシャーを下げた場合

20

ポンプ停止後パックプレッシャーを上げた場合

②

①005

10

1520

253035

細孔内に移動相が入り込んでいる状態

バックプレッシャー(MPa）

細孔内から移動相が抜け出た状態
T. Enami and N. Nagae, American Laboratory October 2004.

16水100%移動相条件でも再現性のでるHPLC装置
ChromaNik

ポンプ２4.6mmカラム
ポンプ１ インジェクター

背圧用0.13mm配管
1 mL/min – 5 MPa （ポンプ１のみ）
6 mL/min – 30 MPa（ポンプ１＋２）

背圧用ポンプの流速を調整し、カラムout側の背圧を制御する。
特許公開2004-198136

17有機溶媒を使用した水100%移動相条件でも再現性のでる方法
ChromaNik

4.6mmカラムポンプ

インジェクター

背圧用0.13mm配管
1 mL/min – 5 MPa

毎日分析終了後もしくは分析開始前に70%以上有機溶媒を含む移動相を5分間流すこと。5MPaの背圧をかけながら水移動相を送液し，分析開始する。分析中はポンプを停止しない。
18

濡れる（wetting）とはChromaNik『液体と物質の表面との接触角が90度より小さい状態である』『液体と物質の表面との接触角が90度より大きい場合は濡れてない状態である』

θ液体物質θ

『蓮の葉の上に水滴が存在する，この場合蓮の葉は水に濡れているか？』
細孔内でもODS表面に水は濡れない（接触角は90度以上）

19

ODS表面は細孔内でも濡れない！
ChromaNik
Water

Silica

ODS充填剤上の水

Pressure

10nm

Wetting

Dewetting

Permeating

Expelling orDepermeating

浸透この表現の方が的を射ているのでは？

追い出し
20

ODS表面と移動相（水）が濡れていなくても保持するのか？
ChromaNik
ODSカラム、水移動相、40℃
試料：亜硝酸ナトリウム、核酸塩基5種

ODSカラム内をクロロホルムに置換後70℃で24時間乾燥し、カラム温度40℃で水移動相を流す。
＊充填剤細孔内には空気が入っている。
＊保持しない。
＊細孔内には全く水が入っていない。

T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

＊乾燥操作を行っているので、固定相のアルキル基と有機溶媒は溶媒和していない。（アルキル基は寝込んでいるCollapse
していると考えられる。）
21

ODS表面と移動相（水）が濡れていなくても保持するのか？
ChromaNik
ODSカラム、水移動相、40℃
試料：亜硝酸ナトリウム、核酸塩基5種

全く保持のない状態からポンプ停止しないでカラム出口以降に背圧を23MPa加えると、保持し６本のピークに分離する。
背圧を加えただけであるので細孔内に移動相が入っており、固定相の状態は変化していないはずである。細孔内の空気の体積は0.5%以下になり通液中に移動相に溶け込むと考えられる。

T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

22

ODS表面と移動相（水）が濡れていなくても保持するのか？
ChromaNik
ODSカラム、水移動相、40℃
試料：亜硝酸ナトリウム、核酸塩基5種

ポンプを60分間停止後、再度移動相を通液する。
＊ポンプ停止時に細孔から移動相が70%以上抜け出す。
＊背圧をかけないで，再度通液しても細孔内へ移動相は戻らない。
＊保持は小さくなった。

T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

23

ODS表面と移動相（水）が濡れていなくても保持するのか？
ChromaNik
ODSカラム、水移動相、40℃
試料：亜硝酸ナトリウム、核酸塩基5種

T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

通液しながらカラム出口以降の背圧を再度23MPa加えると、前回と同様に保持が増し６本のピークに分離する。全く同じ分離であり、背圧を加えることにより再現性のある分離が達成される。

ODS表面は有機溶媒で濡れた状態の履歴が無くても水移動相で分離可能、アルキル基が寝込んでいても分離に関係しない。

24

固定相と移動相は濡れていなくても相互作用はあるのか？
ChromaNik

段理論から分離のメカニズムを説明
する場合

カラム
カラムの輪切り１つが１段１段は分液ロート１個の分配に相当します。
ヘキサンと水は濡れないが溶質は両溶媒間を移動し、ある比率に分配される。

ヘキサン（固定相）

したがって固定相と移動相も同様にお互いは濡れなくても溶質の分配は起こる。

水（移動相）
25

ODS表面と30%メタノールは濡れるか？
ChromaNik

それぞれの溶液にODS充填剤を混ぜ、超音波の振動を加えながら撹拌混合した。
・70%メタノールでは超音波の振動を加えなくても完全にODS充填剤が分散する。
分散後沈降し始める。
・50%メタノールでは一部分散している。
（超音波振動を加えない場合は全く分散しない）

・30%メタノールでは全く分散していない。

メタノール/水(30:70)(50:50)(70:30)T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

メタノール濃度が50%以下の溶液はODS
表面に濡れないため、細孔内に入り込めない。しかし、圧力をかける、また100%メタノールで濡れている状態から溶液を切り替えた場合には30%メタノールでも細孔内に入り込み、その後大気圧にしても細孔から抜け出すことはない。
26

乾燥ODSとメタノールで濡れたODSを用いた場合の亜硝酸ナトリウム・ウラシルの溶出時間(t0)の比較
ChromaNik
カラム: ODS(10), 20 μm - 150x 4.6 mm

100
相対溶出時間 (%)

移動相: メタノール/水=(10:90),
80(30:70), (50:50), (70:30), (90:10)60

流速: 0.2 mL/min

40

カラムout側の圧力: 0 MPa

カラムin側の圧力: 0.1 MPa
温度: 40 ℃

20

試料: 亜硝酸ナトリウム（10%メタノール）

0020

4060

移動相中のメタノール濃度(%)

80100

ウラシル（30%メタノール以上）＊保持しない溶質として使用
T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.

一度100%メタノールをカラムに通液し、ODS充填剤をメタノールで濡らした後、それぞれの移動相を置換し測定したt0（亜硝酸ナトリウム・ウラシルの溶出時間）を100%とし、乾燥ODSカラムに直接それぞれの移動相を通液し測定したt0の相対値を移動相中のメタノール濃度に対してプロットした。

＊相対溶出時間が100%未満の場合は細孔内全てに移動相が入り込んでいないことを意味している。
27

大気圧が１気圧以下であるならばChromaNik＊真空ポンプでカラム内の圧力を大気圧以下にし、20分間放置＊充填剤細孔から移動相が抜けた場合にはカラムの重量が変化
28

ODS充填剤中の10%メタノール溶媒の状態
ChromaNik

カラム: ODS, 5 μm - 250x4.6mm

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)0-0.05

カラム内溶媒: メタノール/水=(10:90)-0.1

カラム温度: 40 ℃

-0.15

放置時間：20分間-0.2＊10%メタノールをカラムに通液した場
合はポンプ停止後でも保持の変化は認められず、充填剤細孔から溶媒が抜けることはない。

-0.25-0.3-0.35-0.4-0.45
-0.5
00.02

0.04

0.06

0.080.1＊模擬的に大気圧を１気圧以下にした
場合、0.05MPa未満ではカラムの重量が減り、充填剤細孔内から溶媒が抜け出ている。

気圧（MPa)29

ODS充填剤中の0.01MPaでの溶媒の状態
ChromaNik

カラム: ODS, 5 μm - 250x4.6mm

カラムから抜け出た溶媒の重量(g)0-0.05模擬大気圧: 0.01MPa-0.1

カラム温度: 40 ℃

-0.15

放置時間: 20分間

-0.2

＊70%以上のメタノールをカラムに通液した場合は0.01MPaでも充填剤細孔からの溶媒の抜け出しはほとんど認められず、50%以下では溶媒の抜け出している。

-0.25-0.3-0.35-0.4-0.45-0.5020406080100

メタノール/水移動相のメタノール濃度(%)＊70%以上のメタノールではODS充填剤が濡れるため、毛管作用により細孔内へ入り込む力が働き、充填剤細孔から溶媒は抜けでないが、50%以下では濡れないため、抜けようとする。
30なぜ30%メタノールはODSに濡れないのにポンプを停止しても細孔から抜け出ないのか？
ChromaNik

Column: ODS (20μm) 150x4.6mm

Mobile phase: water

Mobile phase: methanol/water(30:70)1001008080

Relative retention (%)

Relative retention (%)

Column: ODS (5μm) 150x4.6mm

Very bighysteresis

60

before stoppingflow
40

after stopping
flow

60

Mobile phaseexists in the pore
40Mobile phasedoesn't exists inthe pore20200.01MPa

乾燥ODS005101520253035

Back pressure (MPa)00
Back pressure (MPa)

ポンプ停止

大気圧は30%メタノールを細孔内に押し留めておくのに十分な圧力である

31

ChromaNik

32

ChromaNik

33

まとめChromaNik

毛管作用によりODS細孔内からの水の抜け出しが説明でき、ODSに濡れない溶媒は細孔から抜け出ようとする力が働く 乾燥した溶媒和していないODSでも水移動相が細孔内に存在すれば分配が起こり分離できる カラム出口以降の背圧を制御することにより保持の再現性が上がる34

【参考文献】
ChromaNik

1) N. Nagae and T. Enami, BUNSEKI KAGAKU, 49 (2000) 887.
2) T. Enami and N. Nagae, Chromatography, 22 (2001) 33.
3) N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America October 2002.
4) N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America June 2003.
5) N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC Europe Volume 16 Number 7
July 2003.
6) T. Enami and N. Nagae, American Laboratory October 2004.
7) 特許公開2004-198136
8) T. Enami and N. Nagae, BUNSEKI KAGAKU, 53 (2004) 1309.
35