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高効率リアルタイムPCR用マスターミックス「KOD SYBR® qPCRMix」を用いた次世代シーケンサー用ライブラリー定量の事例
東洋紡（株）

敦賀バイオ研究所 永友 寛一郎
はじめ に近年急速に普及している次世代シーケンサー（NGS）解析において、ライブラリーの正確な定量は、適正なリード数を得るために非常に重要です。そこで、アダプターを付加したライブラリーの定量方法としてリアルタイムPCRが用いられています。しかし、インサートの平均サイズが200bp以上であるため、市販のリアルタイムPCR試薬を使用することができないという難点がありました。
KOD SYBR® qPCR Mixは、KOD DNA polymerase（KOD）を使用したSYBR® GreenⅠ検出系によるリアルタイムPCR用マスターミックスです。3 →5 エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を除去したKOD exo（-）DNApolymeraseと最適化されたバッファー条件を組み合わせることで、KODの優れた合成能を最大限に発揮し、80%を超えるようなGCリッチなターゲットや長鎖ターゲット（〜2kb）の定量的な増幅においても安定したリアルタイムPCR測定が可能になっています。
今回は、本キットを用いて、illumina® 社シーケンサー解析用にライブラリーの定量を行った例をご紹介いたします。

方法（1）ライブラリー調製
RNA-seq解析用ライブラリー A-Dは、哺乳類細胞 total RNAからTruSeq® Standard mRNAサンプル調製キット（illumina®社）を用いて調製しました。
（2）ライブラリーの定量
サンプル：スタンダードDNA［PhiX Control Kit v3（illumina®社, インサート長平均375bp）を希釈調製したもの］及び（1）で調製したRNA-seq 解析用ライブラリー
プライマー配列：Primer ＃1：AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG AT（23bp）
Primer ＃2：CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA（21bp）【反応組成】【PCRサイクル】

DW

Xμl

KOD SYBR® qPCR Mix

10μl

10pmol/μl Primer ＃10.4μl

10pmol/μl Primer ＃20.4μl

50×ROX reference dye

0.04μlスタンダードDNAまたはライブラリー＊
total

95℃, 10 min.
↓（95℃, 10 sec. −60℃, 30 sec.）×40cycles↓MeltingYμl＊Data collectionは伸長ステップに設定しました。

20μl＊スタンダードDNAは20pMから0.1%Tween20で段階希釈して用いました。
ライブラリーはMultiNA（DNA/RNA分析用マイクロチップ電気泳動装置, 島津製作所）を用いて測定したDNA濃度を元に4pMに希釈調製してqPCRに用い、実際タグがついているものの濃度を測定しました。

【使用機器】Applied Biosystems® 7500 Fast

※比較のため、他のリアルタイムPCR試薬でも、取扱説明書推奨の条件にてリアルタイムPCRを実施し、比較を行いました。
なお、リアルタイムPCR機種により最適ROX量が変わる可能性があります。取扱説明書をご参照ください。

結果および考察（1）段階希釈したスタンダードDNAを用いた解析結果
A社リアルタイムPCR試薬（Taq使用）

KOD SYBR® qPCR Mix

B社NGSライブラリー定量試薬

増幅曲線解析

20pM

20pM
20pM

0.3125pM

0.3125pM

融解曲線解析

2014

10250.3125pM

No.102_'14.qx 14.8.7 14:11 ページ 6（2）RNA-seq 解析用ライブラリーを用いた解析結果
4pMに希釈したRNA-seq解析用ライブラリーA（平均長：約260bp）を用いて解析を行いました。

KOD SYBR® qPCR Mix

A社リアルタイムPCR試薬（Taq使用）

B社NGSライブラリー定量試薬

増幅曲線解析

融解曲線解析

（3）ライブラリー濃度 定量結果
ライブラリー濃度（nM）
A社リアルタイムPCR試薬（Taq使用）

KOD SYBR® qPCR Mix

B社NGSライブラリー定量試薬A

2,736629600

B

5,028548518

C1954451

D

2,174575579RNA-seq解析用ライブラリーを市販のスタンダードDNAを指標として定量を行ったところ、KOD SYBR® qPCR Mixでは、B社
ライブラリー定量試薬とほぼ同等の値を得ることができました。一方、A社リアルタイムPCR試薬では、ライブラリー濃度が一桁多く見積もられてしまいました。
ライブラリー定量では、通常のリアルタイムPCRのターゲット長（〜200bp）に比べて必要な増幅長が平均260bpと長いため、Taq
ポリメラーゼを使用したリアルタイムPCR試薬では、非特異的増幅や立ち上がりの遅れにより、正しく定量できないケースがあるようです。
（4）定量後のillumina®社シーケンサー解析結果【使用機器】illumina®社 MiSeq®
ライブラリーA

ライブラリーB

Read 1
Lane Tiles
138

Read 1
Dencity(K/mm2)Cluster PF(%)

Phas/Prephas Reads(%)(M)

1059+/-19

95.13+/-0.43

0.182 / 0.078

Dencity(K/mm2)Cluster PF(%)

Phas/Prephas Reads(%)(M)

1059+/-19

95.13+/-0.43

0.186 / 0.073

Lane Tiles

26.07

1

Read 2
Lane Tiles
13838

Dencity(K/mm2)Cluster PF(%)

Phas/Prephas Reads(%)(M)

1157+/-33

93.89+/-0.73

0.161 / 0.092

Dencity(K/mm2)Cluster PF(%)

Phas/Prephas Reads(%)(M)

1157+/-33

93.89+/-0.73

0.154 / 0.071

28.32

Read 2
Lane Tiles

26.07

13828.32®

KOD SYBR qPCR Mixを用いて見積もられた濃度をもとにライブラリー濃度が最適となるように希釈し、ライブラリーAとBにてシーケンス解 析を 実 施しました。そ の 結 果 、N G S 解 析で重 要となるD e n s i t y 、C l u s t e r P Fともに推 奨 範 囲 内（ 8 0 0 〜1300k/mm2, 80%以上）であり、適切にライブラリーを定量できたと考えられました。

まとめ®

本事例でお示ししたように、KOD SYBR qPCR Mixを使用することで、市販のNGSライブラリー定量試薬と同等の正確なライブラリーの定量が可能です。また、KOD SYBR® qPCR Mixは、コストパフォーマンスに優れ、GC含量が高いターゲットや長鎖ターゲットでも増幅可能であるため、ライブラリー定量以外にも様々な用途に応用可能であると考えられます。是非一度、KOD SYBR®
qPCR Mixをお試しください。
品名および内容
KOD SYBR® qPCR Mix
・KOD SYBR® qPCR Mix
・50×ROX reference dye

包装保存温度Code No.

価格

1ml×1本〔40回用〕-20℃QKD-201T¥9,8001.67ml×3本〔200回用〕-20℃

QKD-201¥32,000（1.67ml×3本）
×5〔1,000回用〕-20℃

QKD-201X5¥147,000※50×ROX reference dyeがマスターミックスとは、別添付されています。
※包装欄に記載の反応回数は、50μl反応時のものです。容量は、KOD SYBR® qPCR Mixのみ示しています。

＊SYBR およびApplied Biosystems は、Life Technologies Corporationの登録商標です。illumina, MiSeq およびTruSeq は、illumina, Inc.の登録商標です。

62014

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