Journal of Fisheries Technology, （7 2）, 85-88, 2015

短水産技術，7（2）, 85-88, 2015

報

トラフグ凍結精子の家庭用冷蔵庫での二次保存
細谷将＊・水野直樹＊・城夕香＊・藤田真志＊・鈴木譲＊・菊池潔＊

Secondary preservation of cryopreserved torafugu (Takifugu rubripes)
sperm in a conventional refrigerator
Sho HOSOYA, Naoki MIZUNO, Yuka JO, Masashi FUJITA,Yuzuru SUZUKI and Kiyoshi KIKUCHI
Transfer of cryopreserved torafugu (Takifugu rubripes) sperm for commercial use has been established.
Because of difficulties in rigorous ovulation control for this species, secondary preservation of thecryopreserved sperm might be required after delivery to hatcheries that are not equipped with deep freezers
or liquid nitrogen tanks until the ﬁsh spawn. In this study, we tested the ability to keep cryopreserved sperm
in a conventional freezer and fridge. Sperm directly transferred from a liquid nitrogen tank to the freezer
became motionless within a day and fertilization ability within nine hours, whereas those thawed and kept
in the fridge maintained motility over four days and could produce larvae even 72 hours after secondarypreservation.
キーワード：トラフグ，凍結精子保存，二次保存
2014 年 6 月 9 日受付

2015 年 1 月 8 日受理

ゲノム情報を活用した育種研究の重要性がますます広トラフグを始め，多くの魚種では水温や日長の管理，く認識されつつあるが，その成果が水産分野でも実用化

ホルモン処理などによる排卵誘導を行っても厳密に産卵され始めた。その代表例はリンホシスチス病耐性を持つ日を決定することは容易ではない。したがって，凍結精

ヒラメ系統であり，このヒラメ種苗はすでに市場におい子を生産現場に持ち込んでも，その日に卵が得られずにて大きなシェアを獲得している（Ozaki et al. 2012，Fuji授精できない事態も起こり得る。そうならないためには，et al. 2007）。今後は，多くの養殖魚種において優良系統搬入した凍結精子の二次保存法について検討しておく必が次々と生まれ，その種苗の流通が拡大すると予想され要があると考えられた。

る。さらには，畜産業界で行われているように（畜産技本研究では，天然のトラフグ（Takifugu rubripes）を術協会 2004），凍結精子を利用した優良品種の流通が一用いて，液体窒素容器や超低温冷蔵庫などがない生産現般的になる可能性も高い。先駆的な例としては，岐阜県場でも可能な方法として，家庭用冷蔵庫の冷凍室および河川環境研究所が県内の鮎養殖業者に対して子持ち鮎生冷蔵室での二次保存を検討した。最初に実験 1 では，冷産支援として行っている全雌化精液の販売があげられ凍室内での保存を試み，精子の能力を評価するために人る。また，東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産工授精させて孵化率を求めた。次に実験 2 では，冷蔵室実験所（以下，東大水産実験所）で作出された「超雄ト内での 3 日間の保存を試みた孵化実験を行った。実験 3ラフグ」（菊池ら 2013，Matsunaga et al. 2014）の凍結精

では，冷蔵室内で 3 日以上保存した精子の運動活性を評子の提供も 2013 年から始まっている。

価した。

＊

東京大学大学院農学生命科学研究科附属水産実験所〒 431-0214

静岡県浜松市西区舞阪町弁天島 2971-4Fisheries Laboratory, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, University of Tokyo, 2971-4 Bentenjima, Maisaka, Nishiku,Hamamatsu 431-0214, Japanahosoya@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp― 85 ―

材料と方法日の午後 3 時に凍結精子を上述の方法で解凍した後，ストローのままポリ袋に入れて家庭用冷蔵庫の冷蔵室に保実験 1：冷凍室での二次保存 2013 年 4 月 26 日に敦賀存した。5 月 10 日に採卵できたので，午後 3 時にこの港にて購入した天然トラフグを東大水産実験所まで陸送

解凍精子を用いて乾導法で人工授精し，100 粒の卵からして実験に供した。すでに排精していた 3 尾の雄（個体上述の方法で孵化率を求めた。

A，B，C）から 4 月 29 日に精子を採取し，ストロー法（Kamada et al. 2008）で凍結精子を作製し，液体窒素で実験 3：冷蔵庫で 3 日以上保存した精子の運動能保存した。精子の保存液には，ジメチルスルホキシド

1，2 とは異なるオス個体（G，H，I）から採精して凍結（Dimethyl sulfoxide（DMSO），Wako）と非働化済みウシ精子を作製し，精子の運動能を記録した。液体窒素から胎 児 血 清（Fetal bovine serum（FBS），Gibco 社 ） を 1:9出した凍結精子を 20ºC の水で解凍した後，家庭用冷蔵実験の割合で混合して用いた。精子に 9 倍量の保存液を添加庫内に保存した。冷凍庫に移してから 76，100，124 時し，穏和な転倒混和を 30 回行って希釈した。精子に活間にあたる精子の運動能を精子運動比と運動時間から評性があることを確認したうえで，0.5 mL サイズのスト価し，冷蔵庫での保存時間との関係について検討した。

ロー精液管（富士平工業株式会社）に充填し，ストロー

また，対照区として，液体窒素容器から出して解凍したパウダー（富士平工業株式会社）で封をした。ストロー直後の精子についても運動能を評価した。

は液体窒素の液面で 1 分間冷却した後に液体窒素に沈運動能の評価は顕微鏡下で 400 倍の倍率で行った。スめ，液体窒素容器（XT-20，Taylor Wharton，米国）で保ライドグラ上に 9μL の海水を取り，解凍した精子を 0.3存した。

μL 滴下し，素早く混合することで活性を賦与した。顕この凍結精子を用いて，冷凍室（-24ºC 程度）で 2 日

微鏡は Leica 社製の光学顕微鏡（DM5000B）を用い，鏡間の保存を試みた。雌個体の成熟過程をカニュレーショ

筒にデジタルカメラ（DFC490）をつないでパソコンモンで確認し，成熟の進行具合から産卵日を 5 月 2 日と予ニターに映し，それを Sony 社製ハンディカム（HDR-想した。4 月 30 日の 9 時，15 時，5 月 1 日の 9 時，15 時，SR12）で録画して精子の運動を観察した。運動精子比5 月 2 日の 3 時に，各個体の凍結精子をストロー 3 本ずは太田ら（1995）の方法により，６段階に区分して判定

つ液体窒素容器から出して，ポリ袋に入れて冷凍室に保した。すなわち，活性を賦与してから 10 秒後に前進運存した。後述の媒精操作を行ったのは，5 月 2 日の 12

動する精子の割合が 75% 以上の場合を「5+」，50–74%時であったため，冷凍室での保存時間は，それぞれ 51，を「4+」，25–49% を「3+」，24% 以 下 を「2+」， 極 め て45，27，21，9 時間となった。

少数の場合を「1+」，すべて動かない場合を「0」とした。

凍結精子の解凍は，各個体あたりストロー 3 本ずつを冷凍室から取り出し，20ºC の水をはったバットにスト

また，精子を滴下した直後から活性を持つ精子が視界内でおよそ 5% になるまでの時間を運動時間とした。

ローのまま浮かべて行った。人工授精に先立って，解凍後の活性を顕微鏡下で確認したところ，9 時間保存した結

果

精子には活性が認められたが，21 時間保存した精子は，その場で痙攣したように首をふる精子はいたものの，前実験 1：冷凍室での二次保存進運動する精子はなかった。保存時間が 27 時間以上の化率だったのに対し，冷凍庫で二次保存した場合，9 時対照区では 5 割程度の孵精子はどの個体でも活性がなかった。これらの結果を受間保存区では平均 4–14% と著しく低下しており，21 時

け，9 時間保存した精子と 21 時間保存した精子，およ間保存区では孵化仔魚を得られず，孵化率は 0% であっび対照区として，液体窒素から出してそのまま 20ºC のた（図 1）。各個体の平均値を用いて，保存時間の影響水で解凍した精子を用いて人工授精を行った。各ストを Kruskal-Wallis test（n = 3，α = 0.05）で評価した。そのローから 18μL の精子をとり，それぞれ直径 9cm の滅菌結果，冷凍庫での保存時間の延長とともに孵化率の有意済みプラスチックシャーレ中で 1.0 g の卵と混ぜ，乾導な低下が認められた（P = 0.024）。

法で人工授精させた。授精には 20ºC の濾過海水を用いた。5 時間後に卵 100 粒ずつを 300mL の海水を入れた

実験 2：冷蔵室での二次保存

500mL のサンプル瓶に保存し，海水を毎日交換しながでストローのまま冷蔵保存した場合，対照区と同程度のら孵化まで飼育した。

孵化仔魚が得られた（図 2）。個体 D の精子を用いた 72

凍結精子を解凍したうえ

時 間 保 存 区 の み 14% 程 度 と 孵 化 率 が 低 か っ た が，
実験 2：冷蔵室での二次保存 2014 年 4 月 28 日に敦賀

Kruskal-Wallis test（n = 3，P = 0.177）では対照区との間港にて購入した天然トラフグを東大水産実験所まで陸送に有意差は確認されなかった。

して実験に供した。すでに排精していた 3 尾の雄個体（D，E，F）から 5 月 6 日に精子を採取し，上述の方法で液実験 3：冷蔵室で 3 日以上保存した精子の運動能体窒素中に凍結保存した。5 月 7 日の午後 3 時と 5 月 9後にストローのまま冷蔵保存した精子の運動時間は保存― 86 ―解凍

トラフグ凍結精子の冷蔵保存

図 1．トラフグ精子の冷凍室での保存時間と媒精後の孵化率（平均値±標準偏差）．A，B，C は個体の識別記号

図 3．解凍精子の冷蔵室での保存時間と賦活後の精子運動時間（平均値±標準偏差）．G，H，I は個体の識別記号

考察

トラフグの凍結精子を家庭用冷蔵庫の冷凍室に保存した場合，１日以内に活性を失い，孵化率も 9 時間以内に著しく低下した（図 1）。このことから，本種では冷凍室での二次保存は不可能あることが分かった。本実験で二次保存が不可能であったメカニズムは不明であるが，冷凍室内の温度（-24ºC）が動物細胞内で氷結晶が生成される -8ºC から -21ºC の温度帯（朝比奈 1980）に近かったことが影響していると考えられる。したがって，これよりももっと低い温度を保つ冷凍庫であれば二次保存が可能かもしれない。一方，解凍後に冷蔵保存した場合，
図 2．トラフグ精子の冷蔵室での保存時間と媒精後の孵化率（平均値±標準偏差）．D，E，F は個体の識別記号

3 日経過しても対照群と同程度の孵化仔魚を得られた（図 2）。このことから，トラフグの凍結精子は，搬入後，家庭用冷蔵庫の冷蔵室に二次保存することが可能であるとことが示された。本研究では冷蔵室での 4 日以上の二時間の経過とともに減少の傾向にあったものの（図 3），次保存は試せなかったが，実験 3 で精子の運動能は 4 日

対 照 区 と 有 意 差 は な か っ た（Kruskal-Wallis test，P =目まで大きな変化がなく，5 日経過した場合に若干の劣0.157）。また，精子運動比は，100 時間では「5+」が多かっ化傾向が認められたことから（図 3，表 1），冷蔵室で二たが，124 時間では「4+」が増えており，全体として運次保存の可能期間は 3–4 日程度と予想された。ただし，動能の低下が認められた（表 1）。

個体 D 由来の精子では 3 日目に孵化率の低下が認められた。この結果から，この個体の精子は他の個体の精子

表 1．個体 G，H，I から得た凍結精子の冷蔵室での保存時間と賦活後の精子運動比が「5+」「4+」だった回数（n=3）― 87 ―

より質的に劣っていたことが示唆され，凍結前の精子の引用文献

質によって保存可能期間が異なることも予想された。今後，凍結前の精子の運動能などから二次保存の可能時間を予測するモデル式などの開発が求められる。
以上のことから，トラフグの凍結精子は家庭用冷蔵庫で二次保存が可能であることが示された。生産現場に液体窒素容器や超低温冷凍庫など専用の道具が必ずしも必要ではないことは，凍結精子の使用を容易にする。また，凍結精子を搬入した日に卵が得られない，あるいは得られても過熟などで状態が思わしくなかった場合，近日中に産卵が予定されている雌に使用できるなど計画に柔軟性が持てる。さらに，解凍精子を冷蔵発送できるため，輸送方法の選択肢も増える。育種研究の成果が蓄積されるにつれて，養殖業において凍結精子の流通は一般的になると予想される。今後，他魚種においても凍結精子の二次保存方法を含め，凍結精子の使用について利便性を増すような技術の開発が望まれる。

謝

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35，31–37.