原著

日本受精着床学会雑誌 32（2）
：1–4，
2015

当院における免疫細胞子宮腔内注入法の有効性の検討
The Effect of Intrauterine Administration of Autologous Peripheral Blood Mononuclear
Cells before Embryo Transfer
岸千春
小島瞳
安澤 圭昭

上地栄里奈
池澤 有加
田中 雄大

池崎 公彦
浅利 真司

田村 俊男
長崎 貴幸

藤井亜希子
笹森弥真人

Chiharu Kishi, Erina Uechi, Kimihiko Ikezaki, Toshio Tamura, Akiko Fujii, Hitomi Kojima,
Yuka Ikezawa, Shinji Asari, Takayuki Nagasaki, Yamato Sasamori, Yoshiaki Anzawa, Yudai Tanaka
Medical Park Shonan, 1-24-7 Shonandai, Fujisawa, Kanagawa 252-0804, Japan
要旨：生殖補助医療の技術は日々進歩し続けており，昨今の体外受精の成績はめざましい。しかしながら，良好胚が得られるにもかかわらず，移植を何度試みても妊娠に至らない反復不成功症例が存在し，こうした症例は「着床障害」と呼ばれている。着床に関して免疫細胞の関与が示唆されており，免疫細胞を用いた着床率向上の試みが報告されている。今回われわれは，融解胚移植前の自己免疫細胞子宮腔内注入が着床率向上に有効かどうか検討した。2013 年
1 月 1 日から 2014 年 3 月 31 日まで単一融解胚盤胞移植を行った 436 症例 646 周期を対象とし，融解胚移植 2 日前にフィコール液を用いて遠心分離した自己免疫細胞を子宮腔内に注入した免疫細胞注入群 259 周期と免疫細胞注入を行わなかった非注入群 387 周期について検討を行った。全体の臨床妊娠率は免疫細胞注入群で 40.2％（104/259），
非注入群で 45.2％（175/387）であり，2 群間に有意差はみられなかったものの免疫細胞注入群がやや低い傾向にあった。40 歳以上の臨床妊娠率の比較では，平均胚移植施行回数が免疫細胞注入群で有意に多く，臨床妊娠率は免疫細胞注入群が 25.6％（22/86），非注入群が 30.3％（37/122）と有意差は見られなかったものの免疫細胞注入群がやや低い傾向にあった。また過去融解胚移植回数 2 回以上の臨床妊娠率は，免疫細胞注入群が 33.7％（28/83），非注入群が38.8％（31/80）であり有意差は見られなかった。免疫細胞注入群は非注入群と比較して臨床成績は有意な改善は見られず，自己免疫細胞子宮腔内注入の有効性は見出だせなかった。
キーワード：融解胚移植，着床障害，免疫細胞ABSTRACT: It was reported that intrauterine administration of autologous peripheral blood mononuclear cells(PBMC) is associated with embryo implantation. Intrauterine administration of PBMC has been reported to improve
the pregnancy rate of patients with repeated failures of IVF-ET. In this study, we examined the effect of intrauterine
administration of PBMC. The subjects of this study were 646 cycles of 436 patients who received frozen-thawed
embryo transfer at our facility. The PBMCs were isolated from each patient and administered into the uterine
cavity. Embryo transfer was performed within three days of the administration of PBMC. The clinical pregnancy
rates in PBMC treated group and non-treated groups were 40.2% (104/259) and 45.2% (175/387), respectively. The
difference was not statistically significant between the two groups. For patients over the age of 40, the pregnancy
rate of each group was 25.6% (22/86), and 30.3% (37/122), respectively. Once again, the difference was notstatistically significant. Intrauterine administration of PBMC did not improve the pregnancy rate of patients withrepeated IVF failures.
Key words: frozen-thawed embryo transfer, implantation failure, PBMC

緒 論
体外受精において，治療の成否を最も大きく左右する
受付日：2014 年 11 月 10 日／受理日：2014 年 11 月 18 日
メディカルパーク湘南：〒 252-0804 神奈川県藤沢市湘南台1-24-7TEL: 0466-41-0331 FAX: 0466-41-0332
e-mail: labo_shonan_ivf@yahoo.co.jpのは移植胚の質であろう。しかし良好胚盤胞を移植しても妊娠に至らない反復不成功症例も少なからず存在する。
こうした着床障害の原因の一つとして，移植胚自体の着床能以外にも，子宮内膜側の着床能に原因がある可能性が推測される。子宮内膜が胚を受容する機序には種々の

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当院における自己免疫細胞子宮腔内注入の有効性の検討

サイトカインが関与しており，エンドクラインを介した授受によって着床に適した環境が整えられる。こうした機序に免疫細胞が深く関与していることが，様々な研究から推測されている。例えば妊娠マウスの脾臓細胞を偽妊娠マウスに投与することで直接子宮内膜の変化に作用し，本来胚が着床しない時期でも胚の着床を促進することが報告されている 1)。また非妊娠マウスの免疫細胞で2．凍結融解胚移植施行
凍結融解胚移植は自然周期もしくはホルモン補充周期によって行った。移植 5 日前に，子宮内膜が 7 mm 以下である場合には移植キャンセルとした。凍結胚盤胞はThawing Kit（北里バイオファルマ，Japan）を用いて融解し 3 ～ 4 時間の回復培養の後に，胚移植を行った。移植には全例 ET カテーテル（北里メディカル，Japan）を用いた。

も子宮内膜の変化と胚の着床を誘導するとの報告もある2)。妊娠女性の免疫細胞によって，マウス胚とヒト絨毛細胞癌由来の BeWo 細胞の浸潤が亢進することが確認された 3)。 非妊娠女性の免疫細胞に hCG を添加することにより胚の浸潤作用が増強されることもわかっており，免疫細胞と胚の着床には密接な関わりがあることが示唆されている 4)。
こうした報告を受けて着床不全の治療法として新しく考案された方法が，免疫細胞を用いた着床率向上の試みである 5)。患者自身の血液から単離した免疫細胞を子宮腔内へ注入する方法で，体外受精反復不成功症例に対し

3．免疫細胞抽出方法
免疫細胞抽出の方法は徐らの方法に従った 6)。融解胚移植 2 日前に患者より採血した 8 ml の血液検体を等量の生理食塩水で希釈し，Lymphoprep ™（コスモ・バイオ株Japan）上に重層して800 g，20分の遠心分離を行っ式会社，た。得られた免疫細胞を 500 g，10 分遠心処理し，0.3 ml
生理食塩水を用いて調整し，サフィード ® ネラトンカテー
テル（テルモ株式会社，Japan）を用いて子宮腔内に注入した。免疫細胞の子宮腔内注入は融解胚移植の 1 ～ 3 日前に行った。

てこの治療法を採用したところ臨床妊娠率が向上したという報告が近年見られる 5–7)。
本研究では，前述の報告に基づき，融解胚盤胞移植を行った患者に対して，免疫細胞子宮腔内注入が有効であ

4．統計学的処理
統計学的処理には、Student t 検定およびカイ二乗検定を用いた。P ＜ 0.05 を以て有意な差として判定した。

るか検討した。

結 果
対象と方法

患者背景の比較検討では，胚移植時年齢，移植胚数，2013 年 1 月 1 日から 2014 年 3 月 31 日の間に，単一融胚移植時内膜厚では，免疫細胞注入群と，非注入群の 2解胚盤胞移植を行った症例のうち，436 症例 646 周期を群間には有意な差はみられなかった。過去胚移植施行回対象とした。本検討は当院の倫理委員会の承認を得て数は免疫細胞注入群が有意に多かった（表 1）。

行った。融解胚移植 2 日前にフィコール液を用いて遠心

免疫細胞注入群および非注入群の全体の成績は，化学分離した自己免疫細胞を子宮腔内に注入した免疫細胞妊娠率がそれぞれ 49.8％（129/259）対 56.0％（217/387），

注入群 259 周期と免疫細胞注入を行わなかった非注入群

臨床妊娠率が 40.2％（104/259）対 45.2％（175/387），着387周期について比較検討した。免疫細胞注入はインフォー

床率が 35.5 ％（92/259）対 40.3 ％（156/387），流産率が23.1％（24/104）対 20.6％（36/175）であった。いずれも有意差は見られなかった（図 1）。
して行った。
患者年齢を 40 歳以上の症例のみで検討した。免疫細1．胚盤胞凍結
胞注入群と非注入群それぞれの成績は，化学妊娠率が39.5％（34/86）対 46.7％（57/122），臨床妊娠率が 25.6％
調節卵巣刺激によって採卵された卵に対して Universal
IVF medium（オリジオ・ジャパン株式会社，Japan）を用 （22/86）対 30.3％（37/122），着床率が 18.6％（16/86）対25.4％（31/122），流産率が 27.3％（6/22）対 27.0％（10/37）
い 6.0 ％ CO2，5.0 ％ O2，89.0 ％ N2 の条件下で 3 ～ 4 時間
conventional IVF または ICSI を施行した。 であった。いずれの群も有意な差は見られなかった（図 2）。の前培養を行い，翌日，正常受精が確認された胚は Global（Life Global,過去に融解胚移植を 2 回以上施行し，妊娠に至っていUSA）にて培養を継続し，day5 もしくは day6 に Gardnerない反復不成功例だけを対象に比較検討した。免疫細分類にて 3BB 以上の良好胚盤胞を Vitrification Kit（北里胞注入群，非注入群それぞれの成績は，化学妊娠率が43.4％（36/86）対 48.8％（39/80），臨床妊娠率が 33.7％
バイオファルマ，Japan）を用いて凍結保存した。
（28/83）対 38.8％（31/80），着床率が 32.5％（27/83）対
ムドコンセントを行い患者より同意の得られた症例に対岸 千春，他

表1

全体の成績

対象症例数

非注入群

リンパ球注入群303

212

対象周期数259387

平均年齢

37.0 ± 4.2

37.4 ± 4.2

平均胚移植回数 *1.8 ± 1.8

2.2 ± 2.0

平均融解胚移植回数 *0.8 ± 1.2

1.2 ± 1.4

平均移植時内膜厚 *9.8 ± 2.1

10.2 ± 2.5

化学妊娠率

56.0％
（217/387）49.8％（129/259）

臨床妊娠率

45.2％
（175/387）40.2％（104/259）

着床率

40.3％
（156/387）

35.5％（92/259）

流産率

20.6％
（36/175）

23.1％（24/104）

図1

全体の成績

*: P ＜ 0.05．

31.2％（25/80），流産率が 17.8％（5/28）対 29.0％（9/31）
であり，有意な差は見られなかった（図 3）。

考 察
げっ歯類やヒトでは implantation window と呼ばれる子宮内膜が胚を受容できる限られた期間が存在する 8)。こ

図2の期間の着床の成立には，子宮内膜に作用する種々の因40 歳以上の症例での成績子が関与している。エストロゲンとプロゲステロンは子宮内膜上皮に作用して種々のサイトカインを誘導し，胚が着床する環境を整える。こうしたステロイドホルモンによるエンドクライン機構以外に，着床が成立するには胚と子宮内膜のシグナル伝達による cross talk が必要であると考えられている 7)。その他にも，胚を受容する機序として，胚の存在下では子宮内膜のケモカイン・接着分子・レプチン・アポトーシスの調節が変化し，着床に適した環境に変化していることも報告されている 9)。さらに免疫細胞もこのエンドクラインシステムに部分的に関与している。緒論に記した通り，免疫細胞は胚の存在を認識して機能を変え，子宮内膜の分化や胚の浸潤に対して促進的な役割を果たすことがマウスを用いた研究で明らかになっている 2–4)。こうした理論に基づいて，反復不成功症例に対する妊娠率向上を目的とした免疫細胞子宮腔内注入を行った報告がいくつかある。
徐ら 6) の報告では，新鮮胚移植周期において免疫細胞子宮腔内注入を行った症例と注入しなかった症例につい図3過去融解胚移植回数 2 回以上の症例での成績

3

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当院における自己免疫細胞子宮腔内注入の有効性の検討て臨床成績の比較検討を行ったところ，体外受精反復不していない。この点が治療成績の改善に繋がらなかった

成功症例において免疫細胞注入群が非注入群より妊娠率可能性はある。しかし，徐ら 6) は新鮮胚移植周期において，が有意に高かった。また 40 歳以上の症例では，既往回数

Okitsu ら 7) は融解胚移植周期において，hCG 添加を行わず良好な成績を得ている。今後，プロトコールを修正した上で，反復不成功症例に対しての治療法として子宮腔内免疫細胞注入を採用すべきか慎重に検討する必要があると考えている。

が免疫細胞注入群の方が有意に多いにもかかわらず免疫細胞注入群で妊娠率が高い傾向にあり，胚移植前の免疫細胞子宮腔内注入は体外受精反復不成功症例に対して有効性が示唆されたと報告している。

Yoshioka ら 5) は hCG 処理後 2 日間培養して活性化させた患者自己免疫細胞と注入当日採取した免疫細胞を合わせて子宮腔内へ注入する方法を用い，反復不成功症例の臨床妊娠率が改善したことを報告している。注入群と非注入群の臨床妊娠率は 41.2％対 11.1％，着床率は 23.4％対 4.1％，出生率は 35.3％対 5.5％となり，注入群で有意に高かった。
Okitsu ら 7) の報告では融解胚移植周期に子宮腔内免疫細胞注入を行うことで，体外受精反復不成功症例に対して臨床妊娠率が向上したと報告している。全体での成績では注入群と非注入群の妊娠率は 21.6％対 21.7％，着床率は 21.1％対 21.8％と有意な差はないが，反復不成功症例においては，妊娠率は 42.1 ％対 16.7 ％，着床率は25.0％対 9.4％とが注入群が有意に高くなったと報告している。
藤原ら 10) はこの治療法が有効であった要因として 4 つの機序を考察している。まず免疫細胞によって子宮内膜上皮の分化が促進する可能性，第二にカテーテル挿入と免疫細胞注入による子宮内膜上皮に対する物理的刺激が炎症反応を起こし，着床に関与している可能性，第三に免疫細胞から分泌されたプロテアーゼよって胚接着分子が分解される可能性，そして最後に注入された免疫細胞が子宮内膜上皮を通って子宮内膜へ移動し胚の接着と浸潤に作用する可能性である。
しかし，今回のわれわれの検討では，免疫細胞注入群と非注入群とで，その臨床成績は同等となり，子宮腔内免疫細胞注入の有効性は見出すことができなかった。対象を 40 歳以上の高齢症例および体外受精反復不成功症例に限定した比較検討でも，着床障害の改善に有効性を見出すことができなかった。
Yoshioka ら 5) の報告では，hCG 添加により免疫細胞の活性化を行っている。hCG による活性化の必要性を裏付ける報告として，in vitro で妊娠マウスの免疫細胞を子宮内膜細胞に添加すると子宮内膜への分化が見られるという報告がある 4)。また，hCG によって活性化された免疫細胞は，絨毛癌の cell line として知られる BeWo 細胞と子宮内膜の in vitro での接着を促進するとの報告もある 3)。
今回のわれわれのプロトコールでは hCG や血清を添加

文 献1) Takabatake, K., Fujiwara, H., Goto, Y., Nakayama, T., Higuchi, T.,
Fujita, J., Maeda, M., Mori, T.: Splenocytes in early pregnancy
promote embryo implantation by regulating endometrial
differentiation in mice. Hum. Reprod., 12: 2102–2107, 1997.
2) Fujita, K., Nakayama, T., Takabatake, K., Higuchi, T., Fujita, J.,
Maeda, M., Fujiwara, H., Mori, T.: Administration of thymocytes
derived from non-pregnant mice induces an endometrial receptive
stage and leukaemia inhibitory factor expression in the uterus.
Hum. Reprod., 13: 2888–2894, 1998.
3) Kosaka, K., Fujiwara, H., Tatsumi, K., Yoshioka, S., Higuchi,T., Sato, Y., Nakayama, T., Fujii, S.: Human peritheral blood
monoclear cells enhance cell-cell interaction between humanendometrial epithelial cells and BeWo-cell spheroids. Hum.
Reprod., 18: 19–25, 2003.
4) Nakayama, T., Fujiwara, H., Maeda, M., Inoue, T., Yoshioka,S., Mori, T., Fujii, S.: Human peripheral bold mononuclear cells(PBMC) in early pregnancy promote embryo invasion in vitro:
HCG enhances the effects of PBMC. Hum. Reprod., 17: 207–212, 2002.
5) Yoshioka, S., Fujiwara, H., Nakayama, T., Kosaka, K., Mori, T.,Fujii, S.: Intrauterine administration of autologous peripheral
blood mononuclear cells promotes implantation rates in patientswith repeated failure of IVF-embryo transfer. Hum. Reprod., 21:3290–3294, 2006.

6) 徐東舜・清須知栄子：胚移植前の自己免疫細胞子宮内注入の有効性について．受精着床誌，26: 198–201, 2009.
7) Okitsu, O., Kiyokawa, M., Oda, T., Miyake, K., Sato, Y.,Fujiwara, H.: Intrauterine administration of autologous peripheral
blood monoclear cells increases clinical pregnancy rate infrozen/thawed embryo transfer cycle of patients with repeatedimplantation failure. J. Reprod. Immunol., 92: 82–87, 2011.
8) 森 崇 英：Implantation window を 考 慮 し た 胚 移 植． 森 崇
英・久保晴海・岡村均編，図説 ART マニュアル 改訂第 2 版，
pp.191–195，永井書店，2006.
9) Simón, C., Dominuez, F., Remohí, J., Pellicer, A.: Embryo effects
in human impantation: embryonic regulation of endometrial
molecules in human implantation. Ann. N. Y. Acad. Sci., 943:
1–16, 2001.
10) 藤原 浩：免疫細胞を用いた着床率向上の試み．日産婦誌，
60: 399–402, 2008.