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浦上財団研究報告書

Vol.30（2023）＜令和 3 年度助成＞

腸内環境の改変と腸管ウイルス感染制御
金井祐太（大阪大学 微生物病研究所 ウイルス免疫分野）

下部消化管に感染する腸管ウイルス（ロタウイル

近交系マウス（Balb/c、3 週齢、オス）に 2 週間経ス、レオウイルス、コロナウイルス、カリシウイル

口 投 与 し、 ロ タ ウ イ ル ス を 経 口 感 染 し た と こ ろ、ス等）は、胃や腸管腔内での pH の変化や多量に存

Penicillin 投与マウスにおいて顕著なロタウイルス感在する消化酵素に耐性を持ち、ロタウイルスのよう染抑制が認められた（図 1A）。そこでベータラクタに宿主の消化酵素によりウイルスタンパク質が切断

ム系抗生物質（Penicillin、Ampicillin、Cefmetazole、されることで感染性を得るウイルスも存在するなMeropenem）を経口投与したマウスにロタウイルス

ど、腸管環境に適応して進化してきたと考えられる。

感染を試みたところ、いずれの抗生物質投与マウスまたウイルス種ごとに好適な感染組織（小腸上部、においても顕著なロタウイルス感染抑制が認められ小腸下部、盲腸、大腸など）の特異性や、感染感受た（図 1B）。上述の実験（図 1A）において一部の性を示す年齢層が異なることから、腸管ウイルス種

Kanamycin 投与マウスにおいてウイルス感染抑制がごとの好適な腸管環境が異なることが考えられる。

見られたため、次にアミノグリコシド系抗生物質

腸管腔内には 1,000 種超の腸内細菌が生息しており、（Kanamycin、Neomycin、Gentamicin、Streptomycin）特定の腸内細菌がウイルスの感染性の促進もしくはを試験に供した。これらの抗生物質を 2 週間経口投抑制に関与していることが近年明らかになってい与したマウスにロタウイルス感染を行ったところ、る。腸内細菌の代謝物（胆汁酸、短鎖脂肪酸、トリGentamicin および Streptomycin 投与マウスで顕著プトファン代謝物等）は腸管上皮細胞により吸収さなロタウイルス感染抑制が認められた（図 1C）。これ、生体の恒常性維持に重要な機能を果たしている。

れらの抗生物質を用いた実験から特定の腸内細菌がまた腸管における細胞分化速度は他の組織に比べ極ロタウイルスの感染感受性に関与していることが示めて速く、幹細胞からは常に腸管上皮細胞が分化し唆された。確認のために無菌マウス（Balb/c、3 週数日で全ての腸管上皮細胞が置き換わり、腸内環境齢、オス）にロタウイルス感染を試みたところ、通が変化することで腸管上皮細胞の遺伝子発現が変動

常飼育マウスと比較しロタウイルス感染量が顕著にすることが知られている。このような、別組織とは低下した（図 1D）。さらに無菌マウスに通常飼育マ全く異なる環境を「正常環境」として適応した腸管ウスの糞便懸濁液を経口投与し、2 週間飼育するこウイルスの感染性は腸管環境の変化に応じて変動すとで腸内細菌叢を再構築したマウスにおいてはロタることが知られている。

ウイルス感染量が通常飼育マウスと同程度に回復しそこで本研究課題では、腸内環境の変動とウイル
ス感染の関連を調べるために、作用機序の異なる抗たことから、腸内細菌叢がロタウイルス感染に重要であることが確認された。

生物質［Penicillin（ベータラクタム）、Kanamycin

次に抗生物質を用いない腸内環境の改変法として（アミノグリコシド）、Doxycycline（テトラサイクリン）、特殊配合飼料を用いたマウス感染実験を行った。通Erythromycin（マクロライド）、Sulfamethoxazole

常 飼 料 と し て CE-2（ 日 本 ク レ ア 株 式 会 社 ）、AIN-（サルファ剤）、Lomefloxacin（ニューキノロン）］を76A（TestDiet、米国）、高脂肪飼料として Quick fat

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腸内環境の改変と腸管ウイルス感染制御

図 1 腸内細菌叢改変マウスにおけるロタウイルス感染性の変化
A-C. 各種抗生物質を 2 週間飲水投与したマウス（Balb/c、3 週齢）にロタウイルスを経口感染し、72 時間後の腸管内におけるロタウイルス量を測定した。D. 通常飼育マウス（Balb/c、3 週齢）、無菌マウス（Balb/c、3 週齢）および無菌マウスに通常飼育マウスの糞便懸濁液を経口投与し腸内細菌叢を再構築したマウスにロタウイルス経口感染を試みた。感染 72 時間後の腸管内におけるロタウイルス量を測定した。

（日本クレア株式会社）、58Y1（TestDiet）、高コレ感染実験を試みたところ、AIN-76A、58R6、およびステロール飼料として 58R6（TestDiet）を用意した

58Y1 で飼育したマウスにおいて顕著なロタウイル（表 1）。近交系マウス（Balb/c、3 週齢、オス）をス感染抑制が認められた（図 2）。これらの結果からそれぞれの飼料で 2 週間飼育した後、ロタウイルス腸内環境が変動することでロタウイルス感染性が変

表1

マウスの飼育に使用した飼料の栄養組成

Protein(%)

Fat(%)

Cholesterol(ppm)

Fiber(%)

Carbohydrate(%)

CE-2 (CLEA)

25.1

4.51

5.05

Quick fat (CLEA)

24.1

133.9AIN-76A (TestDiet)

1850566.4

58R6 (TestDiet)

20.2

20.1

12537

5.645.2

58Y1 (TestDiet)

23.1

34.9

301

6.5

25.9

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Vol.30（2023）ていることが考えられた。
次に抗生物質や特殊配合飼料で飼育したマウスにおけるウイルス感染抑制のメカニズムを探索するため、腸管内容物によるウイルス粒子の感染性への直接の影響を調べた。ロタウイルス粒子の表面にはスパイク状の VP4 タンパク質が並ぶ。細胞内で合成された新規ロタウイルス粒子は細胞外へ放出された後、 宿 主 由 来 の ト リ プ シ ン に よ り VP4 が VP8 とVP5 に切断され感染性を獲得する（図 3A）。そこで培養細胞で増幅したロタウイルス粒子とマウス腸管
図 2 特殊配合飼料で飼育したマウスにおけるロタウイルス感染能の変化
通常飼料（CE-2、AIN-76A）、高脂肪飼料（Quick fat、58Y1）、高コレステロール飼料（58R6）で 2 週間飼育したマウスにロタウイルス感染を行い、感染 72 時間後の腸管内ウイルス量を測定した。

内容物を混合し、ウイルス感染性の増減を調べた。

化したことが示唆された。また通常飼料として用意3B）。そこに通常飼育マウス、Penicillin 投与マウス

した AIN-76A で飼育したマウスでウイルス感染が激もしくは AIN-76A で飼育したマウスの腸管内容物を減したことから、試料中の単純な脂肪やコレステ混合し、感染性ウイルス量を定量したところ、いずロール量のような直接の要因ではなく、腸内細菌やれのマウス由来の腸管内容物処理においても同程度その代謝物を含む二次的な腸内環境の変化が関連しにロタウイルス感染性の上昇が認められた（図 3C）。

まず培養細胞でトリプシンを添加せずにウイルスを感染し、非感染性のウイルス粒子を用意した（図図 3 腸管内容物によるロタウイルス感染性への影響
A. トリプシンによりロタウイルス粒子表面の VP4 が切断されることで感染能を獲得する。B. 培養液中にトリプシンを加えることで感染性のロタウイルスが得られる。C-D. マウス腸管内容物の (C) 非感染性ウイルス粒子および (D) 感染性ウイルス粒子への影響。
Control : 通常飼育マウス、Penicillin : ペニシリン投与マウス、AIN-76A : AIN-76A 飼料で飼育したマウス。

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このことは腸管内容物に含まれるトリプシンによりの感染性が低下する訳ではないことが示唆された。

ロタウイルスが感染性を獲得したことを意味する

次に腸内細菌叢の変化とウイルス感染の関連を明が、ロタウイルス感染抑制を示したトリプシンやらかにするために、様々な抗生物質を投与したマウAIN-76A 飼料で飼育したマウスでもウイルス活性化

スの糞便内腸内細菌叢をメタゲノム解析により測定能には差がないことが明らかとなった。次にトリプした。図 1A で使用した 7 種の抗生物質をそれぞれシンを添加した培養細胞でウイルスを増幅し、感染2 週間飲水投与したマウスにおいてそれぞれの抗生性のロタウイルス粒子を用意した。そこにマウス腸物質に固有の細菌叢の変化が認められた（図 4）。

管内容物を混合し、感染性ウイルス量を定量したと特にロタウイルス感染抑制が認められた Penicillin

ころ、通常飼育マウス、Penicillin 投与マウスおよび投 与 マ ウ ス に お い て は Allobaculum 属 細 菌 やAIN-76A 飼育マウス由来の腸管内容物との混合におDesulfovibrionaceae 科細菌など、通常飼育ではほいていずれも感染性が同程度に上昇した（図 3D）。

ぼ認められない細菌叢の増加が見られた。

感染性ウイルス量の増加は、感染性ウイルス粒子と腸管内で分解された食事由来成分は腸内細菌によして用意したサンプルに残余した非感染性ウイルス

り二次代謝され、代謝物質の一部は腸管上皮細胞よ粒子が、腸管内容物に含まれる過剰のトリプシンにり吸収される。細菌種により代謝物質の質・量が異より活性化されたためと考えられた。これらの結果なるため、腸内細菌叢の変化により腸管内代謝物質から、Penicillin 投与や AIN-76A 飼料により変化しの構成が異なり、宿主への生理的影響にも変化が生た腸管内容物の直接の作用によりロタウイルス粒子じることが予想される。そこで抗生物質投与マウス

図 4 様々な抗生物質によるマウス糞便内腸内細菌叢への影響
各種抗生物質を 2 週間飲水投与したマウスの糞便内細菌叢のメタゲノム解析を行った。各マウス個体における割合が 5％を超える候補細菌種を表示した。

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Vol.30（2023）

における腸管内容物の代謝物質を調べ、ウイルス感染に関連する候補物質の推定を行った。ロタウイル
ス抑制効果を示した Penicillin（1 g/L）を 2 週間飲水投与したマウス（Balb/c、3 週齢、オス）と通常
飼 育 し た マ ウ ス の 盲 腸 内 容 物 の 代 謝 物 質 を CETOFMS および LC-TOFMS 法により測定した（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社による受託解析）。合計 426 の候補化合物が検出され、多くの化合物が Penicillin 投与マウスで顕著な増加もしくは減少が認められた（図 5）。
これらの結果から、Penicillin 投与マウスにおいて腸内細菌叢と代謝物質の構成が通常飼育マウスと比較し大きく変化していることが明らかとなった。一方、ウイルス粒子と腸管内容物との混合実験（図 3）から、腸内細菌叢と代謝物質が変化した腸管内容物
中でもウイルス感染能の減少が認められなかったた
め、次にウイルス感染の標的である腸管上皮細胞の変化について調べた。ロタウイルス感染抑制が認められた Penicillin 投与マウスおよび高コレステロー
ル飼料飼育マウスの腸管上皮細胞の RNA トランスク

図5

マウス腸管内代謝物・候補化合物の階層的クラスタリング解析（HCA）結果
横軸はサンプル名、縦軸はピークを示す。ピークに対して HCA を実施し、ピーク間の距離は図中の樹形図で表している。緑が濃いほど平均よりも小さいことを示し、赤が濃いほど平均よりも大きいことを示す。

リプトーム解析を行ったところ、770 の遺伝子において通常飼育マウスと比較し、Penicillin・高コレステロール飼料の一方もしくは両方において顕著な遺伝子発現の増加もしくは減少が認められた（図 6）。
この遺伝子群の中には免疫関連遺伝子や、ロタウイルスの感染受容体である糖鎖の転移酵素など、ウイルス感染との関連が容易に想像されるものも含まれていたが、多くの遺伝に関してはロタウイルス感染抑制との関連は未知であった。今後、個々の遺伝子について培養細胞を用いて候補遺伝子の過剰発現、ノックダウン・ノックアウトの手法によりウイルス感染との関連を調べる予定である。
謝

辞本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼を申し上げます。

図 6 マウス腸管上皮細胞におけるトランスクリプトーム解析
通常飼育マウスと比較し、ペニシリン投与マウスもしくは高コレステロー
ル飼料飼育マウスで差が見られた 770 遺伝子発現量のヒートマップを示した。

Control of enteric viral infections by modification of the intestinal environment

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Control of enteric viral infections by modificationof the intestinal environment
Yuta KANAI
Department of Virology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University
Rotavirus is a leading cause of severe acute g astroenterit is in infants
and children younger than 5 years. In this study, we altered the intestinal
environment of inbred mice (Balb/c) via administration of antibiotics
and custom diets, and invest ig ated the result ing infect ivity of rotavirus.
Rotavirus infectivity was reduced in mice that were administered betalactam antibiotics (penicillin, ampicillin, cefmetazole, and meropenem) andaminoglycoside antibiotics (gentamicin, streptomycin). However, administrationof kanamycin, neomycin (aminoglycoside), doxycycline (tetracycline),erythromycin (macrolide), sulfamethoxazole (sulfonamide), and lomefloxacin(new quinolone) did not affect rotavirus infections in mice. Further, rotavirus
infections were reduced in mice raised not only on a high-cholesterol andhigh-fat diet, but also on AIN-76A, a conventional diet used mainly in theUnited States. A metagenomic analysis of fecal bacteria revealed a significant
alteration of intestinal microbiota in penicillin-treated mice. In particular,
bacteria of the genus Allobaculum and families Desulfovibrionaceae andPeptostreptococcaceae , which are hardly detectable in conventional mice,increased significantly. Further, the metabolite compositions in penicillintreated mice were also changed. Finally, we investigated the RNA transcriptome
in intestinal epithelial cells, and found that the expressions of 770 genes wereincreased or decreased in penicillin-treated mice and/or high-cholesterol dietfed mice. Based on these results, it was hypothesized that the administrationof antibiotics or diet induced alterations in intestinal flora, followed by alteredmetabolite composition. Changes in metabolite composition might induce
altered gene expressions in intestinal epithelial cells, resulting in an increased
resistance to rotavirus infection.