［加藤：円偏光二色性測定法に関する研究］［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS, 53（1），53〜57（2022）］▲

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報告書

令和 2 年度「日本薬局方の試験法等に関する研究」研究報告

円偏光二色性測定法に関する研究＊ 2
加藤 くみ子＊1

Study on Circular Dichroism Spectroscopy
Kumiko SAKAI-KATO ＊1

Summary
Circular dichroism spectroscopy is a method for analysis of the structure of optically active substances. It is also used
for determination of the secondary structure of peptides, proteins, and nucleotides. In this study, the effect of solvent on thesecondary structure of magainin II was examined. Furthermore, the suitability of the reference substances supplied by themanufacturer for verification of the performance of the apparatus was examined.
Key words
Circular dichroism, Optically active substances, Peptide1

本研究では，ペプチドを用いた円偏光二色性測定

緒言法に与える溶媒の影響を調べた．また，筆者らは，円偏光二色性 circular dichroism は光学活性な化

円偏光二色性測定法の標準化研究として，海外薬局合物の光の吸収波長領域において，左右円偏光の吸方の試験法を参考に，機器性能の確認手法の研究を収度合いが異なる現象を呼ぶ．鏡像異性体の円偏光行い，有害試薬を用いない方法等に関する知見を得

二色性スペクトルは鏡像関係になるので，鏡像異性ている2）．本研究では，機器性能に用いられる試薬体の立体配置の識別が可能である．したがって，医について更に情報を取得した．

薬品開発において，光学活性物質の構造解析等に用いられる1）．更にペプチド，タンパク質，オリゴヌ
クレオチドではその高次構造解析に円偏光二色性測定法が用いられている1）．ペプチドやタンパク質は2ペプチドの二次構造解析における溶媒の影響

光学活性なアミノ酸が発色団となるペプチド結合に

円偏光二色性測定法はペプチドの二次構造解析により連なっているため，それらの高次構造の違いが汎用される．そこで，モデルペプチドとして，アフ円偏光二色性スペクトルに影響を与える．一方，核リカツメガエルより単離された抗菌性ペプチドであ酸も，その構成単位が，発色団である塩基と不斉中る magainin II を用いて，溶媒が二次構造解析へ与心を有する糖との結合によるため，円偏光二色性がえる影響を調べた．また，タンパク質二次構造解析観察され，らせん構造等の解析に利用可能である．

プログラムを用い，二次構造中のα‑ ヘリックス含＊1＊2

北里大学薬学部 東京都港区白金 5‑9‑1（〒 108‑8641）
School of Pharmacy, Kitasato Universtiy, 5‑9‑1 Shirokane, Minato‑ku, Tokyo 108‑8641, Japan
本研究は一般財団法人医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団の令和 2 年度 ｢日本薬局方の試験法等に関する研究｣ 事業により行ったものである．

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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53［加藤：円偏光二色性測定法に関する研究］

量の推定を行った．

2.2 magainin II の円偏光二色性スペクトルに及ぼす溶媒の影響
magainin II の 抗 菌 作 用 は， 両 親 媒 性 のα‑ ヘ

2.1 溶媒の円偏光二色性スペクトル
円偏光二色性スペクトルの測定に使用する溶媒リックス構造が寄与していることが知られていは，試料の測定波長領域に吸収がなく十分に透明でる3）．そこで，様々な溶媒中での magainin II のα‑あるものを選択しなければならない．そこで，複数ヘリックス含量を調査した．α‑ ヘリックス含量のの溶媒について溶媒自身の円偏光二色性スペクトル

推定には，日本分光タンパク質二次構造解析プログを測定した．Fig. 1 に水，10 mM リン酸緩衝液（pHラム JWSSE‑513 を用いた 4）．

，アセトニト7.0），メタノール，エタノール（99.5）

magainin II の測定データをモル楕円率に換算し，リル，2,2,2 ‑ トリフルオロエタノール，及びクロロスペクトル表示した結果が Fig. 2 である．Fig. 2 にホルムの円偏光二色性スペクトルを示す．クロロホ示す通り，溶媒により magainin II の構造が大きく

ル ム 以 外 は，190‑300 nm で 平 坦 な ス ペ ク ト ル と変化することが分かった．Table 1 に示すように，なった．クロロホルムのスペクトルより，クロロホプログラム解析により推定されたα‑ ヘリックス含ルムにペプチドを溶解することで 230 nm 以下の波量は，水系溶媒中より，有機溶媒中のほうが大き長領域ではノイズが大きくペプチドの測定が難しい

く，Fig. 1 で もα‑ ヘ リ ッ ク ス 構 造 に 観 察 さ れ る

ことが示されたため，magainin II の円偏光二色性

208，222 nm 付近の負の極大ピークが観察された．

スペクトル測定では，クロロホルム以外の溶媒を用

これは過去の報告とも一致している3）．2,2,2‑ トリいることとした．

フルオロエタノールは二次構造の安定化に寄与する溶媒として，円偏光二色性の研究で汎用されてい100-10190210230250270290-200190

21023025027029030

10 mM phosphate buffer (pH7.0)

202010100190

210230250270290-2030190-30

acetonitrile

0-10190210230

250

270

290

30ethanol(99.5)

10100210230

250

270290CD (mdeg)

20190

Wavelength (nm)-30

20-20-30

0-10-20
Wavelength (nm)

-30

-10

10

2,2,2-trifluoroethanol

0-10190

210

230

250

270

290

-20
Wavelength (nm)-30

Wavelength (nm)Fig. 1 種々の溶媒の円偏光二色性スペクトル54

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

210230250-20Wavelength (nm)-30

CD (mdeg)

CD (mdeg)30

CD (mdeg)

10-10chloroform

20-20
Wavelength (nm)-30-1030

methanol

20CD (mdeg)

CD (mdeg)

30water20

CD (mdeg)30Vol. 53 No. 1（2022）

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Wavelength (nm)

270

290

［加藤：円偏光二色性測定法に関する研究］-5000 190

210

230

mol elip (degʀcm2/dmol)-15000

25000

250

270

290

5000
-5000 190

5000
230

250

270

290

-15000

5000
230

250

270

290

mol elip (degʀcm2/dmol)

mol elip (degʀcm2/dmol)

Ethanol(99.5)
ethanol

210

270

290

5000
-5000 190

210230

250

270

290

25000

Wavelengthʤnmʥ

acetonitrile

15000
5000
-5000 190

210

230

250

270

290

-15000

Wavelengthʤnmʥ

15000-5000 190

250

15000

-15000

Wavelengthʤnmʥ

25000

230

50 vol% 2,2,2-trifluoroethanol

25000

Wavelengthʤnmʥ

10 mM phosphate buffer (pH7.0)

210

210-15000

Wavelength (nm)15000

-5000 190

mol elip (degʀcm2/dmol)

5000

15000

mol elip (degʀcm2/dmol)

mol elip (degʀcm2/dmol)

15000

methanol25000

mol elip (degʀcm2/dmol)

water

25000

25000

2,2,2-trifluoroethanol

15000
5000
-5000 190

210

230

250

270

290-15000-15000

Wavelengthʤnmʥ

Wavelengthʤnmʥ

Fig. 2 種々の溶媒に溶解した magainin Ⅱの円偏光二色性スペクトル

Table 1 種々の溶媒中における magainin Ⅱのヘリックス含量（%）
溶媒α‑ ヘリックス含量（%）

水0リン酸緩衝液

2.1エタノール（99.5）

7.5

メタノール

12.2

アセトニトリル

28.8

2,2,2‑ トリフルオロエタノール

33.5

50 vol% 2,2,2‑ トリフルオロエタノール

22.8

る5）．特に，水系溶媒との混合溶媒は，生体膜を模ム7）を用いて推測した報告値 26% と類似していた3）．

した溶媒としてしばしば利用される6）．そこで 50以上の結果より，測定溶媒によりペプチドの二次

vol% 2,2,2 ‑ トリフルオロエタノールを用いて円偏構造が大きく変わる事例もあるため，二次構造解析

光二色性スペクトルを取得しα‑ ヘリックス含量をの際に溶媒の選択，測定条件の記載に留意する必要推定したところ，含量は 23％であった．この値は，がある．

40 vol% 2,2,2‑ ト リ フ ル オ ロ エ タ ノ ー ル 中 の［測定条件］

magainin II のα‑ ヘ リ ッ ク ス 含 量 を，Provencher

試薬：0.1 mg/mL magaininⅡ（Bachem AG）

らにより開発された統計学的コンピュータプログラ

エタノール（99.5） （ナカライテスク株式会社）

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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55［加藤：円偏光二色性測定法に関する研究］

メタノール （ナカライテスク株式会社）

185 nm か ら 340 nm ま で 測 定 す る と き，アセトニトリル （関東化学株式会社）

290.5 nm におけるΔεは＋ 2.2 〜 ＋ 2.5 である．

2,2,2‑ トリフルオロエタノール （富士フイルム和光

192.5 nm におけるΔεは− 4.3 〜 − 5 である．

純薬株式会社）［CD 測定条件］

日本分光株式会社製の円二色性分光光度計の説明

円二色性分散計（JASCO J‑720 日本分光株式会社）

書には，機器付属の試薬（CD 測定用 ‑ しょうのセル：二つ口セル（Φ 22 × 1 mm）

う ‑10‑ ス ル ホ ン 酸 ア ン モ ニ ウ ム［CD 測定の測定条件］‑Camphor‑10‑sulfonate 片 山 化 学 工 業 株 式 会 社

感度：Standard製）を用いて「円偏光二色性の正確さ」に相当する

データ取り込み間隔：0.2 nm

校正法が記載されているが，「変調の直線性」につい走査モード Continuousては示されていない．一般試験法案「3.2 変調の直走査速度：100 nm/min

線性」には， ‑ カンファスルホン酸アンモニウムをレスポンス：1s用いた事例が記載されているため，同じ化合物であバンド幅：1 nm

る上記の CD 測定用 ‑ しょうのう ‑10‑ スルホン酸積算回数： 10 回アンモニウムが，「変調の直線性」へ使用可能か調べ

Ammonium

た．
Fig. 3 に得られた円偏光二色性スペクトルを示

3 装置性能の確認に用いる試薬

す．290.5 nm におけるモル円二色性Δεは 2.37（3 回装置性能の確認は，欧州薬局方に収載の一般試験の平均），192.5 nm におけるΔεは ‑5.0（3 回の平均）

8）であり，いずれも判定基準「290.5 nm におけるΔεは法及び検証研究2）を参考とした試験法案が，以下
1）＋2.2 〜 ＋2.5である．192.5 nmにおけるΔεは−4.3の内容で意見公募のために公開された ．

〜 − 5 である．」に適合していた．
したがって，測定機器に付属の上記試薬で「変調3.1 円偏光二色性の正確さΔεが既知である物質，例えばイソアンドロの直線性」の確認を行うことも可能であると考えら

ステロン， ‑ カンファスルホン酸アンモニウ

れる．

ムなどを用いて校正する（機器メーカーの推奨［測定条件］品を用いてもよい）．イソアンドロステロンを

試薬：CD 測定用 ‑ しょうのう ‑10‑ スルホン酸アン用いる場合は，イソアンドロステロン 10.0 mg

モニウムを正確に量り，エタノール（99.5）に溶かし，正（片山化学工業株式会社製）

確に 10 mL とする．層長 10 mm のセルを用い［CD 測定条件］て，調製した溶液の円偏光二色性スペクトルを

円二色性分散計（JASCO J‑720 日本分光株式会社）

280 nm から 360 nm まで測定するとき，304 nm

セル：セル：二つ口セル（Φ 22 × 1 mm）

Ammonium‑Camphor‑10‑sulfonate

3.2 変調の直線性Δεが既知である物質，例えば ‑ カンファス
ルホン酸アンモニウムなどを用いて校正する（機器メーカーの推奨品を用いてもよい）． ‑カンファスルホン酸アンモニウムを用いる場合
は， ‑ カ ン フ ァ ス ル ホ ン 酸 ア ン モ ニ ウ ムMol.CD ((mol/L)-1࣭cm-1)

におけるΔεは＋ 3.3 である．
3210-1 185-2-3-4-5-66.0 mg を 正 確 に 量 り， 水 に 溶 か し， 正 確 に10 mL とする．層長 1 mm のセルを用いて，調製した溶液の円偏光二色性スペクトルを

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医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

200215230245260275290305320335

Wavelength (nm)Fig.3 CD 測定用 ‑しょうのう ‑10‑ スルホン酸アンモニ
ウムを用いた変調の直線性確認のための円偏光二色性スペクトル

Vol. 53 No. 1（2022）

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［加藤：円偏光二色性測定法に関する研究］［CD 測定の測定条件］

standards‑development/jp/pub‑comments/jp/0195.

感度：Standard

html, （accessed 2021‑10‑16）,（日本薬局方フォーラム ,2021, 30（3）, p.291‑292. に掲載）．

データ取り込み間隔：0.1 nm

2）Sakai‑Kato, K.; Yoshida, K.; Ohgita, T.; Takechi‑Haraya,

走査モード ContinuousY.; Demizu, Y.; Saito, H. Refining calibration procedures

走査速度：100 nm/minof circular dichroism spectrometer to improve

レスポンス：1 susability,. 2019, 35, p.1275‑1278.

バンド幅：1 nm

3）Chen, H.‑C.; Brown, J.H.; Morell, J. L. Huang C.M.

積算回数 3 回

Synthetic magainin analogues with improved
antimicrobial activity.

. 1988, 236, p.462‑466.

4）ReedJ.; Reed, T. A. Effect of trifluoroethanol on protein

4 まとめ

secondary structure: an nmR and CD study using asynthetic actin peptide.

本研究では，円偏光二色性測定のための技術情報. 1997, 254,

p.36‑40.

を提供するために，ペプチド測定における溶媒の影

5）Sonnichsen, F. D.; Eyk, J.E.van,; Hodges, R.S.; Sykes,響，及び機器性能の確認に用いられる試薬について

B.D. Effect of trifluoroethanol on protein secondary

報告した．低分子化合物，高分子化合物に加え，中structure: an nmR and CD study using a synthetic

分子化合物である核酸やペプチドを有効成分とする医薬品の開発が増加している．その特性解析に円偏光二色性測定法は有用であり，今後，円偏光二色性測定法の更なる活用が期待される．

actin peptide.

. 1992, 31, p.8790‑8798.

6）Matsuzaki, K. Magainins as paradigm for the mode ofaction of pore forming polypeptides.
1998, 1376, p.391‑400.
7）Provencher, S.W.: Contin（Version 2）users manual.
Technical Report EMBL‑DA07. Computer Physics
Communications Program Library. Queenʼs University

文 献1）日本薬局方収載原案に関するご意見の募集について（令和 3 年 9 月分 その 1）, 2.28 円偏光二色性測定法 , 医薬品of Belfast, 1984.
8）2.2.41 Circular Dichroism, European Pharmacopoeia.

医療機器総合機構 https://www.pmda.go.jp/rs‑std‑jp/Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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