Metagenome@Kin User Manual

Metagenome＠KIN
ユーザーマニュアル
Ver 2.3

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2016/4
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目

次

I.

概要

4

II.

インストール（Windows）

5

III.

ライセンスの取得

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IV.

解析の実行-Read への菌種の割り当て

11

V.

解析の実行-@KIN による菌叢解析

13

VI.

Pie Chart（円グラフ）表示画面説明

16

VII.

Sunburst graph（ドーナツグラフ）表示画面説明

17

VIII. 解析結果の出力

18

IX.

複数サンプルの棒グラフ表示

22

X.

クラスター解析結果の表示

23

XI.

２次元 PCA 解析結果の表示

24

XII.

３次元 PCA 解析結果の表示

25

XIII. 階層型クラスター解析結果の表示

26

XIV. 自己組織化マップ(SOM)解析結果の表示

27

XV.

多様性指数の算出

28

XVI. PCoA 主座標分析の実施

29

XVII. BLAST Database に登録されていない 16s 配列の頻度解析

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XVIII. RDP Classifier 結果ファイルを用いた解析

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XIX. 16SrRNA DataBase のアップデート方法

38

XX.

39

アンインストール方法

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I.

概要
Metagenome@KIN 16S rRNA 解析ツールは BLAST 結果ファイルを入力することで、次の結果を作成します。
✓

リジェクト情報（フィルタによりリジェクトされたリード名、およびフィルタされたリード数の情報）✓

円グラフ/ドーナツグラフ

✓

棒グラフ

✓

主成分分析（二次元）✓

主成分分析（三次元、アニメーション）✓

主成分分析（三次元、インタラクティブ）✓

階層的クラスタリング✓

自己組織化マップ✓

Alpha-diversity index✓

主座標分析(二次元)✓

主座標分析（三次元）

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I I . イ ン スト ール （W ind o w s ）インストール手順
弊社よりご連絡したダウンロードサイトより、ZIP 圧縮済み Metagenome@KINZIP ファイルを入手し解凍します。
解凍後作成された Metagenome@Kin フォルダ内のインストーラー ” metagenome@kin-2.3_setup.exe” をダブルクリックします。

解凍I accept the agreement をクリックします。

インストール先及びショートカットアイコン作成の有無を選択後 Install ボタンをクリックします。

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インストールが終了したら Finish ボタンをクリックします。

この時点ではまだアプリケーションの立ち上げは行いません。
R および R ライブラリのインストール
R と R ライブラリのインストールを行います。
ダウンロードした ZIP ファイルに含まれている下記の R インストーラーをダブルクリックし、表示される指示に従って初期設定のままインストールを実行します。R のインストール先は通常”C:\Program Files\R\R-3.1.0”となります。

R のインストール終了後、R の Library フォルダへ先にダウンロードした ZIP ファイルに含まれていた R-library
フォルダ内に記録された計 16 個のフォルダを移動します。

Drag & Drop

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Metagenome@Kin User ManualJava のインストール
Java のインストールを実行します。
ダウンロードした Metagenome@Kin ZIP ファイルに同梱されている Java インストーラーをダブルクリックし、表示の指示に従って初期設定のままインストールを実行します。

PATH の設定
Metagenome@KIN 上で R を実行するために、R の Library フォルダへのパスを設定します。
コントロールパネル->システム->システムの詳細設定をクリックします。”環境変数”をクリックし以下の画面を表示します。

ユーザー環境変数の”新規”をクリックし、”変数名”に PATH と入力します。
つぎに”変数値”に、インストールした R の x64 フォルダまでのフルパスを入力します。
例：C:\Program Files\R\R-3.1.0\bin\x64
さらに、セミコロンを入力した後に R ライブラリ rJava の jri フォルダ下部にある x64 フォルダまでのフルパスを入力します。
例：C:\Program Files\R\R-3.1.0\library\rJava\jri\x64
実際に変数値に入力される値の例：
C:\Program Files\R\R-3.1.0\bin\x64;C:\Program Files\R\R-3.1.0\library\rJava\jri\x64
続いて R Library フォルダへのパスを設定します。
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再度ユーザー環境変数の”新規”をクリックし、”変数名”に R_LIBS と入力します。
つぎに”変数値”に、インストールした R の Library フォルダまでのフルパスを入力します。
例：C:\Program Files\R\R-3.1.0\library

以上の設定が終われば OK をクリックして環境変数の設定を終了します。
デスクトップ上に作成された Metagenome@Kin ショートカットアイコンからアプリケーションを起動できます。

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I I I . ラ イ セ ンス の取 得
ＫＩＮには２週間のデモ期間が設けられています。この期間をすぎると KIN のライセンスが無効となり以下のようなメッセージが表示されます。
記載された URL ページを開き、ユーザー認証を行います。

ライセンス認証ページにて、
ユーザー名
所属機関名
メールアドレス
コンピュータの Physical address(=MAC address)＊を入力します
入力したメールアドレス宛てにライセンスファイルが World Fusion 社より送付されます。
届いたライセンスファイルを KIN のライセンスファイル選択画面で選ぶことでソフトウェアを使用可能になります。

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Metagenome@Kin User Manual＊Physical address(=MAC address)の入手方法
方法 1:KIN のライセンス認証画面下部にインストール PC の MAC address が表示されます。この数字をライセン
ス認証 Web ページの MAC address 入力欄にタイプします。

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方法 2:（Windows の場合）Command prompt を開き、”getmac”と入力することで MAC address が表示されます。

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I V. 解 析 の 実 行 -R ea d へ の菌 種 の割 り 当 て@KIN による解析に先だち、16s シーケンスリードへ対応する菌種を Homology Analysis tool により割り当てます。

・Homology Analysis tool の導入
弊社ダウンロードサイト: http://www.w-fusion.co.jp/J/sup/meta_kin_us.html

より入手し解凍します。このツールは Windows および MAC OS で動作します。Zip ファイルを解凍すると以下のファイルが生成されます。

Homology AnalysisTool_win_v2.jar が実行プログラムになります。

・BLAST の実行
1. homology_analysis_tool.jar をダブルクリックします
2. FASTA もしくは Fastq ファイルをドラッグアンドドロップで入力します(gz 圧縮ファイル可)。

3. 入力ファイルがペアエンド Fastq の場合、「Fastq-join to～」にチェックを入れることでペアエンドリードの結合が実施できます。イルミナ社製シーケンサから出力されるペアエンド
Fastq ファイル名の「_L001_R1.fastq および_L001_R2.fastq」にある R1 と R2 によりペアとなる Fastq ファイルを検出し、Fastq-join による結合を実施します。
4. 入力ファイルが Fastq ファイルの場合は”Fastq quality
Control”にチェックを入れ、・Cut off score=基準となる Phread score・Window size=平均クオリティ値を算出する bp 幅・Min seq length=要求する最低リード長を入力します。
5.Read のクラスター化を行う場合は”CD-HIT”にチェックを入れます。
入力ファイルが FASTA の場合はこの項目からパラメータを設定していきます。
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6.Blast の実行条件を入力します。
・Cut off value=Blast 実行時に要求する最低 E-value
・Max number of aligned sequences to keep:1 本のリードにいくつの Hit result を持つか、すなわち相同性の上位何件を結果として記録するか・Number of CPU=Blast に使用する CPU のコア数
7. 使用する BLAST database を選択します。
8. “Execute”ボタンをクリックします。

・BLAST 結果の取得
Blast の結果は実行時の日付と時刻をフォルダ名として記録されます(format YYYYMMDD-HHMMSS).

Blast 実行時に Read のクラスター化（CD-HIT の実行）を行っていた場合はファイル名に“_clstr.bln“を持つ Blast 結果
ファイルと“.bln“を持つファイルが両方
サンプルごとに作成されます。@KIN へは“_clstr.bln“を持つ Blast 結果を持ち込みます。
Blast 実行時に Read のクラスター化（CD-HIT の実行）を行っていなかった場合はファイル名に“.bln“を持つ Blast 結果ファイルのみがサンプルごとに作成されます。
* Fastq quality Control 実行時のパラメータの意味
リードの先頭付近の塩基はリードのクオリティ値が低いため先頭から 1 塩基ずつ塩基の QV を見ていき、指定(Cut off score)の値以上の QV が出現した地点から Window size 分の塩基の平均 QV 値を算出します。その後 1
塩基ずつ末端へ Window をずらしていき、毎回平均 QV 値を算出して Cut off score 以下になるまで続けます。
ユーザーが設定した Windows サイズの平均クオリティ値（ＱＶ）が指定の Cut off score 以下になったところで以降の塩基を除去します。
基準以下の塩基であった先頭部分の塩基は削除されます。
例＞
Window size=20, 最低リード長 120 クオリティ値カットオフ=7
リード塩基： AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
クオリティ値：21231357897898879799779872787938888891231↑
ここまでは QV が基準以下なのでカットManual_Version 2.3

平均値算出

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Metagenome@Kin User ManualV . 解 析 の 実 行 - @ K I N に よ る菌 叢 解 析. BLAST 結果データからの解析の実行
File メニューから”New Analysis using BLAST”を選択します、下記の解析開始メニューが表示されます。
Metagenome@Kin への入力データは 16s rRNA を
シーケンスしたリードデータ(Fasta)の Blast 結果です。
解析の実行前に、弊社より提供している
Homology analysis ツールにより Blast 結果ファイルを取得してください。

解析のプロジェクト名をプロジェクト名入力エリアに記入します（必須）。

プロジェクト名入力(必須)

Blast 結果カットオフパラメータ設定

Blast 結果フィルタ通過後の動作設定オプション
OTU を菌叢解析結果に含ませる場合にチェックを入れます。
PCoA 解析を実施する場合はチェックを入れます。
解析に使用する Database の選択欄

Blast 結果ファイル入力欄

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BLAST 結果にフィルタ条件を設定する場合チェックを入れた項目が有効になります。必須項目はありません。
「Reset Filter」ボタンをクリックすると初期値に戻ります。
identity(%)： 配列一致度の下限を指定

alignmentlength： アラインメント長の下限を指定

bitscore： 相同性がある局所配列の下限を塩基長の 2 倍で指定 mismatches： 一致しない塩基の許容数を指定
gapopenings： 塩基のギャップの許容数を指定

e-value： e-value の上限を指定

フィルタ条件を設定後、BLAST 結果ファイルを BLAST 結果ファイル入力エリアにドラッグ＆ドロップします。複数
ファイルを指定可能です。Submit をクリックすることで解析がスタートします。
Blast Results Database には Blast 実行時に使用したデータベースを指定します。このデータベースは KIN インス
トールフォルダ内の/rsrc/db フォルダ内の.mdb ファイルが表示されます。
解析が開始されると入力したプロジェクト名を親フォルダとするフォルダ内に、「Classification analysis」フォルダが作られ、その中に個々のサンプルが BLAST ファイル名をサンプル名として表示されます。解析は解析ログ表
示画面に「Complete 入力サンプル数 of 入力サンプル数」の表示が出れば終了です。

解析サンプル表示

解析ログ表示Blast 結果フィルタ通過後の動作設定オプション入力された Blast 結果に対して、設定したフィルターを通過できなかった場合の動作を指定できます。
*Include number of unclassified hits read:
チェックすることでフィルタ条件を通過できなかったリードの総数がメタゲノム解析結果中に” unclassified hit”として表示されます。
*Include number of no BLAST hits read:
Local Blast 実行時に設定された E-value カットオフ条件を通過できなかったリードには、Blast 結果ファイルにて
NO HIT と記載されます。チェックすることで NO HIT と記載されたリードの総数がメタゲノム解析結果中に”No
Blast hit”として表示されます。
*Assign “Not determined” if taxons of similar accepted hits read do not match
一つのリードに複数の異なった菌名(=同一 Taxon id)が同じ E-value を持っていた場合、いずれの菌を真にリードに割り当てることが正しいのか決定できないため、当該階層ではリードへ”Not determined”を割り振り、菌名を付与しません。
より上位の階層にて一つのリードに同じ菌名が割り振られた時点で菌名が付与されます。
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解析結果の表示
画面左の解析サンプル表示エリアにおいて、サンプル名をクリックすると解析結果が Pie chart/Sunbust
graph/spreadsheet で表示されます。
画面右上のプルダウンメニューから表示するグラフの形式と階層を切り替えることができます。

2,表示したいグラフと階層を選択
1,表示するサンプルを選択

解析結果の削除は、削除した Project のフォルダを選択後、メニューの Edit から”Delete Analysis”をクリックすることで Project 単位の解析データ削除が可能です。

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V I . P ie Cha r t （ 円 グラフ ） 表 示 画 面 説 明
Pie chart では Hit リード数の多い上位 20 件
までの菌名がグラフ下部に表示される

選択されている菌の名前と Hit リード数

表示するグラフの形式と階層

サンプル名をクリックすると表示する Piechart のサンプルを変更可能

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V I I . S unb ur s t gr a p h （ド ー ナ ツグ ラフ ） 表 示 画 面 説 明

ドーナツグラフは、中心から外側へ superkingdom・・・

マウスポインタを合わせると菌名と Hit したphylum・・・class・・・order・・・family・・・genus・・・

リード数が表示される

species・・・no rank の階層順で並んでいます

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Metagenome@Kin User ManualVIII.

解 析 結 果 の出 力

Spreadsheet の表示
サンプルごとの菌の出現頻度を見るには Spreadsheet が便利です。Spreadsheet は菌ごとの出現頻度（＝リード数）を階層ごとに表形式で表示します。“unclassified hit”は解析実行時に設定したフィルタ条件でのぞかれたリード数を表します
2,プルダウンメニュから Spreadsheet を選び表示する階層を選択

1,サンプルをクリックして Spreadsheet
で表示するサンプルを指定

解析データファイルの保存先
Metagenome@KIN の解析データは、File->Switch Workspace で表示されるデータ保存先フォルダにプロジェ
クト名のフォルダを自動的に作成し、その下部にサンプルの名前をフォルダ名として保存されます（データの保存先は変更可）。

＝プロジェクト名

サンプルごとのフォルダ内には、上位階層の解析項目におけるサンプルごとの＝サンプル名

解析結果が保存されています。
CSV ファイル: 解析項目のグラフ作成元データが記録されています＝解析項目名HTML ファイル:各解析項目のグラフが記録されています。グラフ画像の表示には FireFox が必要です。
02_hits_result フォルダの“accepted.csv”:メタゲノム解析に持ち込まれた個々のリードが何れの菌株に割り当てられたのか階層を通じて記録したデータが保存されています。
02_hits_result フォルダ内の“unclassified.csv”:解析実行時に設定したフィルタ条件に BLAST 結果のパラメータが達せず解析から除外されたリードが記録されています。
02_hits_result フォルダ内の“no_blast.csv”フォルダには Blast 実行時に設定した E-value に達せず Blast ＤＢ
上にリードのシーケンスに対応する菌株がないと判断されたリードが記録されています。
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解析データの出力
Pie chart・Sunburst graph 等のグラフ画像データは、出力したいグラフを表示後、メニューの File ->ExportActive Chart or Table を選択することで保存先フォルダを指定して出力できます。出力されるファイル形
式はグラフ画像の場合 HTML 形式で、表は CSV 形式となり FireFox およびエクセルにて開くことでデータを表示できます。
＊表示する菌数が多くなった場合、アプリケーション上で Pie chart や Sunburst graph が表示されないことがあります。そのような場合も File -> Export Active Chart or Table により HTML 形式で出力することでグラフの画像をブラウザ上で閲覧できます。Export された.html ファイルを開いてグラフ画像を表示するには FireFox をブラウザに用いる必要があります。

プロジェクトに含まれるデータをすべて Export するには File -> Export All Charts or Tables を選択します。
保存先のフォルダを指定するとプロジェクト内に含まれるすべてのサンプルのグラフ(html 形式)・表（CSV 形式）・
クラスタ解析結果画像ファイルが出力されます。

プロジェクトのフォルダ

Export All Charts or Tables で出力されるフォルダには個々のサンプル

以下の情報が含まれます。

----解析ログファイル----リード名と割り当てられた菌名の対応表----階層ごとの頻度解析結果（CSV 形式）----円グラフ画像および円グラフ作成元データ（CSV 形式）----ドーナツグラフ画像（html 形式）----同時に解析対象となった複数サンプルにおける菌の頻度情報----棒グラフ画像（html 形式）および棒グラフ作成元データ（CSV 形式）----2 次元 PCA 解析結果画像----3 次元 PCA 解析結果（自動コマ送り）----3 次元 PCA 解析結果（手動コマ送り）----階層型クラスタリング結果画像----SOM 解析結果画像---- Alpha Diversity---- PCoA 2D---- PCoA 3D
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Bar_chart フォルダの中身：

階層ごとの棒グラフ画像データ、画像の表示には FireFox が必要。

階層ごとの棒グラフ作成元データ（解析サンプルごとのリードに割り当てられた菌の頻度情報）

Pie_chart フォルダの中身：

階層ごとの円グラフ作成元データ（解析サンプルごとのリードに割り当てられた菌の頻度情報）

data_table フォルダの中身：
Blast にていずれの菌に何本のリードが Hit したのかを階層ごとにまとめた表

hits_result フォルダの中身：
Accepted_hits:リードがどの菌種に割り当てられたのかを階層ごとに一覧表示した表。
Query ID はリード名を表し、各階層における Taxon ID と菌名が示される。
No_blast_hit:BLAST 実行時に設定したフィルタ条件をクリアできなかったリード
Unclassified:メタゲノム解析実行時に設定した Blast 結果フィルタ条件をクリアできなかったリード

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解析結果の HTML 形式出力
File メニュー内の Create HTML Report を指定すると Workspace で表示されるデータ保存先フォルダの解析プロジェクト名フォルダ内に HTML ファイルが作成されます。
作成された index.html を開くことで解析結果を Metagenome@KIN を使わずに閲覧できます。

別 PC にて解析結果を閲覧する場合は、index.html のある場所からひとつ上のディレクトリに位置するプロジェク
ト名フォルダを移動して下さい。

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I X. 複 数 サ ン プルの 棒 グラフ 表 示
複数のサンプル（＝複数の BLAST 結果ファイル）を同時に解析した場合は、棒グラフで全サンプルの菌の構成を表示できます。
サンプル表示エリアにおいて「Statistical Analysis」の”default”をクリックし、ドロップダウンメニューにおいてBar chart と表示すべき階層を選択することで表示されます。
Statistical Analysis をクリックした状態でドロップダウンメニューをクリックすると、棒グラフや各種クラスター解
析結果を閲覧することができるようになります。

2,Bar chart と表示したい
階層を選択
サンプル表示エリア

1,Statistic Analysis の default
をクリック

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X . ク ラ スタ ー 解 析 結 果 の 表 示
複数のサンプルを解析した場合、Metagenome@KIN では以下 5 種類の解析が実行されます。
✓

PCA 2D： 主成分分析（二次元）✓

PCA 3D Animation： 主成分分析（三次元、アニメーション）✓

PCA 3D Interactive： 主成分分析（三次元、インタラクティブ）✓

Clustering： 階層的クラスタリング✓

SOM： 自己組織化マップ✓

PCoA：主座標分析

クラスター解析結果を閲覧するには、プロジェクトフォルダ内の「Statistical Analysis」フォルダ内の default アイ
コンを選択し、プルダウンメニューから表示したいクラスター解析結果を選択します。
クラスター解析は階層ごとに実施されるため、どの階層における結果を表示するかをプルダウンメニューから選択できます。

2,表示したいクラスタ解
析と階層を指定

1,Statistical Analysis の default を選択

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X I . ２ 次 元 P CA 解 析 結 果 の表 示
プルダウンメニューから 2D PCA を選択すると、主成分分析の二次元プロット
画像が菌の階層ごとに表示されます。％表示は PC1 と PC2 で表示されるプロット図の保持する情報量を示しています。
プルダウンメニューの階層を変更する
ことで表示する階層を変更でき、File メニューから使用できる Export 機能
により、表示している 2D PCA 解析のプ
ロット図は画像ファイルとして出力できます。

プルダウンメニューから PCA rotation info を選択することで、PCA 解析の第一主成分から第三主成分までの菌ごとの重み(rotation 情報)を表示できます。

各主成分にそってサンプルをプロットする段階で、何れの菌がサンプルのプロットパターンに影響を与えているのかを示しています。
Rotation 情報をしめすテーブルにて、正負の符号に関わらず絶対値の大きな菌が当該主成分上でサンプルを区分けする際の重みが大きい=サンプル間の存在量の差が大きいことを示します。

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X I I . ３ 次 元 P CA 解 析 結 果 の表 示
プルダウンメニューから 3D animated PCA を選択すると、主成分分析の三次元プロットアニメーションが菌の階層ごとに作成されます。

プルダウンメニュから 3D interactive PCA を選択すると主成分分析の三次元プロットが菌の階層ごとに表示されます
が、Metagenome@kin アプリケーション上では三次元プロット図が正常に表示されません。
ドラッグ＆ドロップによる表示角度の変更やマウスホイールによるサイズ変更は、表示している

開始点へ移動 コマ送り

再生・停止ボタン 終了点へ移動

3D interactive PCA の図をエクスポート機能により出力し Google Chrome ブラウザで開くことで可能になります。

自動再生

スピード

表示している図のエクスポート方法：
メニューのFile->Export Active Chart or table
により出力先フォルダを選択すると出力された.html ファイルを FireFox で開くことで可能になります。

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XIII.

階 層 型 ク ラ スタ ー 解 析 結 果 の表 示

プルダウンメニューから Hierarchical Clustering を選択することで階層型クラスタリングの結果が表示されます。
解析に用いたサンプルにおいて高い出現頻度を示す菌が赤色で表示され、頻度の少ない菌が黄色～白色で表示されます。
HeatMap の表示時に菌種の数が表示上限を超えている場合は”Exclude organisms whose～”にて階層型クラスタリングに持ち込む菌の数を減らすために、HIT リード数による下限の設定を行う必要があります。
菌種ごとに解析サンプルの中でもっとも HIT したリード数の多かった検体での HIT リード数が設定された下限値以下であった場合、その菌種は階層型クラスタリングから除外されます。

表示する階層や距離はプルダ
ウンメニューから選択できます26
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Metagenome@Kin User ManualXIV.

自 己 組 織 化 マッ プ ( SO M) 解 析 結 果 の表 示

プルダウンメニューから”SOM code info”もしくは”SOM map plot”を選択することで自己組織化マップの結果が表示されます。SOM のクラスタリング結果ファイルは、階層ごとに 2 つのクラスタリング画像ファイル（_code.png と_map.png）で構成されます。右の”SOM map plot”はサンプル名の記載されたサンプルクラスタリン
グの結果情報をあらわし、左の”SOM code info”は各階層（＝円）における菌の構成成分を表します。
SOM map plotにおいて同じ円の中にあるサンプルは菌の構成が似通っていることをあらわし、隣り合った円と円を構成するサンプル間でも類似性が存在することを示します。具体的にどのような菌を根拠に類似しているかを示す図がSOM code infoになります。
SOM Code info において、円内の弧の色は各菌の別をあわらし、弧の角度は同じです。パイの高さの差は、該当する円を構成するサンプルの菌の構成比に比例しています。このため、隣り合った円の中に存在するパ
イの色および大きさはほぼ類似します。SOM を形成する円内のパイは、サンプル間の分散の大きい上位 14 個の菌（＝サンプル間でばらつきが大きな菌）を選択して表示しています。

File メニューから使用できる Export 機能により、表示している SOM 解析結果画像を PNG 形式の画像ファイルとして出力できます。

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XV.多 様 性 指 数 の算 出
菌 叢 解 析 を実 行 す る と、 サ ン プ ル 内 で の 菌 層 の 多 様 性 を表 す S i m p s o n ’ s i n d e x と S h a n n o n
E n t r o p y が 算 出 さ れ ます 。
プ ル メニュ ー か ら A l p h a d i v e r s i t y を選 択 す る と表 示 さ れ ま す 。

S i m p s o n ’ s i n d e x ＝ 0 ～ 1 の 値 を とり 、 0 に 近 いほ ど 菌 叢 が 少 ない 菌 種 で 構 成 され て い る 。
0 の 場 合 1 種 類 の 菌 で 集 団 を構 成 し て いる こ と に な る 。

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X VI .

P Co A 主 座 標 分 析 の 実 施

U n i F r a c P C o A 解 析 を実 施 す る に は ” R u n P Co A ” の チ ェッ ク ボ ッ ク ス に チ ェ ッ ク を 入 れ 、 解 析 に 使
用 す る 距 離 と 系 統 樹 を選 択 し ます 。
P C o A 解 析 は B l a s t の 実 行 時 に 1 6 s Mi c r o b i a l D a t a b a s e を 選 択 し てい る 場 合 に の み 有 効 です 。

使 用 し た B l a s t デ ー タベ ー ス と同 じ 系 統 樹 を選 択 す る た め 、 1 6 s Mi c r o b i a l d a t a b a s e を使 用 し て
い た 場 合 は P Co A t r e e に て ” 1 6 S Mi c r o b i a l _ ～ ” を 選 択 し ます 。
P C o A 解 析 実 施 時 に 選 択 可 能 な 系 統 樹 は @ K I N イ ン スト ー ル フ ォ ル ダの r s r c フ ォ ル ダ- > g u i d e t r e e フ ォル ダ 内 に 置 か れ て い ます 。
C : \ M e t a g e n o m e @ K i n \ r s r c \g u i d e t r e e
B l a s t デ ー タ ベー ス を更 新 し た 場 合 は 、同 時 に 提 供 さ れ る g u i d e t r e e フ ァ イ ル を g u i d e t r e e フ ォ ル
ダ へ 移 動 し て おく 必 要 が あ り ます 。

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X VI I .

B L A ST D a ta b a s e に登 録 さ れ てい ない 16s 配 列 の頻 度 解 析

OTU 頻 度 解 析 の実 施
B l a s t D a t a b a s e に 登 録 さ れ て い ない 菌 が 検 体 中 に 存 在 し た 場 合 、 B l a s t 結 果 上 で は 非 常 に 低
い 相 同 性 か も し く は N o B l a s t h i t r e a d と し て 扱 わ れ ます 。
こ の よ う な R e a d に 対 して 類 似 配 列 をひ とつ の O T U 配 列 に ま と め てカ ウ ン ト し 、 @ K I N の 菌 叢 解 析結 果 に 表 示 す る こ とが で き ま す 。
1 、 O T U 出 力 機 能 を 備 え た 相 同 性 検 索 ツ ー ル で あ る Op e n R e f e r e n c e O T U Pi c k i n g T o o l に て
B l a s t に よ る R e a d へ の 菌 種 の 割 り 当 て を行 いま す 。
OTU 出 力 機 能 を有 効 にするには、”Open Reference”を有 効 にします。
“ C l o s e R e f e r e n c e ” を選 ん だ 場
合 は OTU は出 現 せず、Homology
analysis tool と同 様 に No blasth i t r e a d と し て扱 わ れ ます 。

W o r d s i ze は 括 弧 内 の 数 値 が 複
数 の R e a d を 1 本 に まと め る 際 の
相 同 性 基 準 を 示 し ます 。

Blast Database の登 録 配 列 に対 して、ここで指 定 した E-value
以 下 の相 同 性 しか示 せなかった
R e a d が No b l a s t h i t 扱 い と なり 、O T U 化 され ます 。

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2 、 B l a s t 解 析 結 果 か ら O T U を 含 む解 析 結 果 を 取 り 出 し ます 。
B l a s t が 終 了 す る と 、 日 付 の つ い た フ ォル ダ 内 に ” ～ _ O p e n R e f . b l n ” とい う 名 前 の つ い たフ ァ イ ル
が 検 体 数 分 だ け出 現 しま す 。
こ の _ Op e n R e f . b l n フ ァ イ ル を M e t a g e n o m e @ K I N へ 持 ち 込 み ま す 。

各 OTU の配列はこのファイルに記録されていますOTU を含む Blast 結果

検 体 ご と に ～ _ Op e n R e f . b l n フ ァ イ ル は 生 成 さ れ ま す が 、 B l a s t 結 果 フ ァ イ ル 中 に ” O T U # 数 字 ” で
表 示 さ れ る OT U 番 号 が 対 応 す る 配 列 は B l a s t 実 行 時 に 投 入 し た全 検 体 を通 じ て 同 じ です 。
” O T U # 数 字 ” で表 示 され る OT U 番 号 が 対 応 す る 配 列 は “ n o b l a s t h i t _ ～ _ c l s t r . f a s t a ” に 記 録 さ
れ て い ます 。

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3 、 B l a s t 解 析 結 果 を @ K I N に 投 入 し ます 。
O T U 配 列 を 含 ん だ B l a s t 結 果 を@ K I N に 投 入 し 、 菌 叢 解 析 に O T U 番 号 の 頻 度 情 報 を 表 示 す
る に は ” A s s i g n O p e n R e f e r e n c e O T U p i c k i n g ( o n l y S p e c i e s r a n k ) ” に チ ェッ ク を入 れ ま す 。
O T U 解 析 時 に は P Co A は 実 行 で き ませ ん 。

O T U を 含 ん だ解 析 結 果 は S p e c i e s r a n k に つ い て の み 出 力 さ れ ます 、 S p e c i e s r a n k 以 外 の 階
層 で は OT U を 含 ま ない通 常 の M e t a g e n o m e @ K I N に よ る 解 析 が 行 わ れ ま す 。

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Metagenome@Kin User Manual4、解 析 結 果 の閲 覧
O T U を 含 む解 析 結 果 が 作 成 され た 項 目 に は ( O T U ) と い う表 示 が つ きま す 。

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Blast フィルタ条件をパスしなかったリードのメタゲノム解析への反映
解析実行メニューの”Include number of …”にチェックを入れることで Blast 結果の相動性フィルタ条件を通過しなかったリードや、データベースに登録された菌が見つからなかったリードの数をメタゲノム解析に反映することができます。

“Include number of unclassified hits read (trapped read by BLAST filter)”にチェックを入れることで、KIN における解析実行時の Filter Conditions を通過できなかったリードが Unclassified taxon としてグラフやクラスタ
ー解析に出現するようになります。 “Include number of no BLAST hits read”にチェックを入れることで、BLAST 実行時のカットオフ条件により相動性をもつ菌が存在しなかったリードの数が No BLAST hit としてグラフやクラスタ解析に出現するようになります。
Unclassified taxon を解析に反映させた場合

No BLAST hit を解析に反映させた場合

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X VI I I . R D P Cla ss if i er 結 果 フ ァ イルを 用 い た 解 析RDP classifier により出力された結果ファイル(.txt)を KIN に読み込ませることで菌叢解析を実施できます。

⚫

RDP Classifier ツールの用意と実行

ＰＣ上で RDP Classifier を実行するツール(local_RDP_classifier.zip)を弊社ダウンロードサイト: http://www.w-fusion.co.jp/J/sup/meta_kin_us.html

より入手し解凍します。このツールは Windows および MAC OS で動作します。Zip ファイルを解凍すると以下のファイルが生成されます。

Homology AnalysisTool_win_v2.jar が実行プログラムになります。Fasta 形式の 16s シーケンスデータファイルをこのアイコンへドラッグアンドドロップすることで RDP Classifier が実行されます。実行時には 1 サンプルが一つのFasta ファイルになっている必要があり、複数の Fasta ファイルを同時に実行することも可能です。また、ペアエンドの Fastq ファイルであれば二つの Fastq ファイルをペアの重複部分で融合して一本の Read にすることもできます(Windows のみ)。
homology_analysis_tool.にて RDP Classifier を実行するには”RDP”を選択します。
RDP の実行時には入力ファイルとして Fastq ファイ
ルもしくは Fasta ファイルを使用できます。
Fastq ファイルを入力ファイルとしたときは“Fastq Quality Control”のチェックを有効にしてください。

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RDP の実行結果ファイルは、実行時の日付と時間をフォルダ名とするフォルダ内にテキストファイルとして記録されます (format YYYYMMDD-HHMMSS). Metagenome@KIN への入力は、KIN のメニューから“File” -> “NewAnalysis Using RDP…”と選択することで RDP 結果ファイルを入力する画面が開きます。

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RDP Classifier 実行結果ファイルからのメタゲノム解析

File メニューの New Analysis Using RDP をクリックすることで RDP classifier 実行結果ファイルのインポート画面が開くので、解析のプロジェクト名をプロジェクト名入力エリアに記入します（必須）。

2, Project 名を入力

1, New Analysis Using RDP を選択

3 Confidene のカットオフ値と適用する階層を指定

4 RDP classifier 実行結果ファイルをドラッグ＆ドロップ@kin での解析時には RDP classifier によるシーケンスリードに割り当てられた菌名の信頼性指標(=Confidence)によるカットオフが可能です。Confidence によるカットオフを適用する階層とカットオフ値を設定します。
16s rRNA を対象にした RDP classifier 実行結果には Genus から Domain までの階層情報しか含まれていないた
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め、Taxonomic rank で Species を選択するとエラーとなります。Genus を選択して下さい。
ITS1/2 を対象にした真菌の RDP classifier 解析結果には Species ランクの分類情報が含まれているため、Taxonomic rank で Species を選択することが可能です。
解析の実行時には RDP classifier 実行結果ファイルをファイル入力エリアにドラッグ＆ドロップします。
複数ファイルを指定可能で、Submit をクリックすることで解析がスタートします。
解析が開始されると入力したプロジェクト名を親フォルダとするフォルダ内に、「Classification analysis」フォルダが作られ、その中に個々のサンプルが RDP classifier 実行結果ファイル名をサンプル名として表示されます。解析は解析ログ表示画面に「Complete 入力サンプル数 of 入力サンプル数」の表示が出れば終了です。

@KIN での解析終了後、画面左の解析サンプル表示エリアにおいて、サンプル名をクリックすると解析結果が Pie
chart/Sunbust graph/spreadsheet で表示されます。
画面右上のプルダウンメニューから表示するグラフの形式と階層を切り替えることができます。
16s rRNA の RDP classifier の結果には Speciese 階層における分類結果は含まれません。
真菌の ITS 領域をシーケンスしたデータの RDP classifier 結果にはSpecies が含まれます。

複数のサンプルを解析に投じた場合は棒グラフ及び各種クラスター解析結果は Statistical analysis の default ア
イコンをクリックすることで表示されます。表示される結果の構成は Speciese 階層が含まれない点を除き Blast
解析結果ファイルからの実行結果と同じです。
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XIX.

1 6S r R N A D a ta B a se の ア ッ プ デート 方 法Metagenome@KIN には Blast 結果ファイルに対して菌名を付与するデータベースが含まれています。
World Fusion よりご案内している最新のデータベースファイル（mdb ファイル）のダウンロードサイトより、mdb フ
ァイルをダウンロードし、Metagenome@Kin インストールフォルダ内の/rsrc/db フォルダ内にコピーすることで解析実行時に Blast Results Database プルダウンメニューから選択できるようになります。

Metagenome@KIN のデータベースを更新する際に、BLAST 実行時に参照するデータベースも合わせて更新する必要があります。
World Fusion よりご案内している最新のデータベースファイル（mdb ファイル）のダウンロードサイトより、
Homology analysis tool 用の更新ファイルをダウンロードし、解凍後作成される”blastdb”フォルダを旧来の Local
BLAST プログラムが置かれているフォルダ内の”blastdb”フォルダと入れ替えます。
既知の機能制限＊ライセンス発行上の制限
Metagenome@KIN はインストール先 PC の Physical address(MAC address)に対応したライセンスファイルにより使用可能となります。Network device のない PC では Physical address を取得できないため、当ソフトウェアを使用することはできません。
＊3D interactive PCA 図の表示制限
Metagenome@KIN がグラフの描画に使用している JavaFX の仕様により、3D interactive PCA の結果を操作することはできません。
ドラッグ＆ドロップによる表示角度の変更やマウスホイールによるサイズ変更は、表示している 3D interactive
PCA の図をエクスポート機能により出力し、出力された html ファイルを Google chrome ブラウザで開くことで可能になります。

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X X . ア ン イ ンスト ール 方 法
Control panel の”プログラムと機能”から Metagenome@KIN を選択しアンインストールしてください。

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