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浦上財団研究報告書

Vol.30（2023）＜令和元年度助成＞

機能性多糖類フコイダンを豊富に含む新規モズク株作出に必須となる新技術の開発

西辻光希（沖縄科学技術大学院大学 マリンゲノミックスユニット）

Introduction

特定し、海藻では世界初となる交雑育種に必須となる新技術を開発する。

日本に流通する褐藻モズクの 90％以上は沖縄で養殖されるオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus ）Material and methodsであり、年間 50 億円規模の産業である。モズクには多数の生理活性が報告されている硫酸多糖フコイ

ゲノム比較解析ダンが豊富に含まれており、その需要は増加し続けオキナワモズク S 株のゲノム情報（遺伝子モデルている。より豊富にフコイダンを含むモズク品種のver2）およびシオミドロのゲノム情報は web サイト

作出が切望されているが、海藻類において交雑育種からダウンロードした（Table 1）。Blast ソフトウェは成功していない。オキナワモズクの交雑を行うにア（ver. 2.7.1）を使用し、オキナワモズクの雌雄特は、雌雄盤状体を単離する必要があるが、形態から異的遺伝子を探索した。

判別することができないため実現していない（Figure1A ～ D）
。そのため、オキナワモズクの 2N および雌雄盤状体を正確に区別する手法の開発が喫緊の課題となっている。
褐藻類のゲノム解読は、その重要性にかかわらず、わずか 9 例に止まっている。動植物では 1 万種近くがゲノム解読されていることを鑑みても、その少なさが際立っている 1)。褐藻が持つ多糖が障害となり、ゲノム解読を困難にしているためである。そんな中、
私はこれまでに褐藻のゲノム解読を 5 例報告し、既に単離されている特徴的なオキナワモズク 4 株（S、K、O、C 株）は同一種ではなく、亜種であることを。また近縁種シオミ
報告してきた 2, 3, 4)（Figure 1E）
ドロ（Ectocarpus siliculosus ）では雌雄特異的遺伝子が既に同定されている 5)。
本研究では、シオミドロ雌雄特異的遺伝子の情報をもとに、オキナワモズクでの雌雄遺伝子の候補を特定する。それらに対する遺伝マーカーを設計し有用性を確認することにより、オキナワモズク盤状体の 2N および雌雄判別に利用できる遺伝マーカーを

Figure 1 （A）オキナワモズクの生活環。（B）2N、（C）雄、（D）雌の各盤状体。形態から見分けることは不可能である。スケールバー：
100 µm （E）これまで私がゲノム解読した褐藻 5 例。オキナワモズ
ク 4 株は同一種ではなく亜種であることが明らかになっている。

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機能性多糖類フコイダンを豊富に含む新規モズク株作出に必須となる新技術の開発

Table 1

ゲノム情報や解析に用いた web サイトの URL

オキナワモズクゲノム

https://marinegenomics.oist.jp/okinawa_mozuku_s_v2/viewer/download?project_id=67

シオミドロゲノムhttps://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/EctsiV2

NCBI Primer-BLAST

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

Results

オキナワモズク盤状体
オキナワモズクの 2N、雄、雌の各盤状体は沖縄県
水産海洋技術センターで単離されたものを使用した。

雌雄特異的遺伝子の候補の特定と遺伝マーカーの設計
オキナワモズクとシオミドロのゲノム比較解析のプライマー（遺伝マーカー）の設計
オキナワモズクにおいて雌雄特異的と考えられる

結果、12,999 個のオキナワモズク遺伝子のうち、遺伝子のうち、33 の遺伝子について特異的なプラ

雌雄特異的と考えられる遺伝子 269 個が見つかっイマー（遺伝マーカー）を NCBI Primer-Blast（Tableた。269 個の候補遺伝子のうち、16 遺伝子に対し、1）を用いて設計した。

33 の特異的なプライマー（遺伝マーカーの候補）を設計することができた。

ゲノム PCR
1.5 ml チューブに 2N、N オス、N メスの盤状体 1カケと滅菌水 70 µl を加えた。それを 95 度で 5 分遺伝マーカーの決定とオキナワモズクの雌雄判別加熱処理した。処理液 1 µl を用いて TaKaRa Gflex

設計した 33 の遺伝マーカー候補を用いてゲノム

PCR mix のプロトコル通りに PCR した。PCR 産物を

PCR を行ったところ、雄遺伝子 5 つ、雌遺伝子 4 つ

1％アガロースゲルで DNA ラダー（プロメガ 1 kb

について特異的なバンド（PCR 産物）が検出された

DNA ラダー）と共に 30 分電気泳動し、ゲルを撮影（Table 2, Figure 2）。また 2N 盤状体を用いたものした。

では、9 つの遺伝マーカー由来の PCR 産物が確認できた。

Table 2

作成した遺伝マーカーの配列

Gene ID

Fw primer

Rv primer

PCR 産物

雌雄g11150

ACACCCTTGTAATCGGGATGACCACTACATTTTCACCGC

453bp

オスg11151

CGCAGGCCATTTCGGTTTAGGCTACACGCTCTTCTGGAGG

524bp

オスg12375

GGTCGTGAAAGTACTTGAGG

TTCATGAGCAAAGGATCGT

975bp

オスg12376

CTGGAGTTGGGAGACACGAG

CCGAACCCATGAACGGATGA

762bp

オスg12381

AGGTGAACGCACGAAGGAAACGGAAGGACATGGTACACCG

911bp

オスg13772

TGCACCGTTGAGAGAGTTGT

TTTCGGTCAAGGAGTCCACC

359bp

メスg19792

GACGTGCTGATGACTCACGAGTTACGGTTAGCACGAGGGT

476bp

メスg19793

AAGCGGGGTTTCCAGAGATG

GTTTTTGTTCTGGGGCCGTC

717bp

メスg20120GGTAATGCGAATGTGCGACCAAGATGGGTATGCTCGGACG

769bp

メス

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浦上財団研究報告書

Vol.30（2023）

Figure 2 ゲノム PCR 産物の検出（A）2N、（B）雄、（C）雌の各盤状体を用いた結果。それぞれ雌雄特異的なバンドが検出された。
2N 盤状体は雄雌遺伝子の両方を持つことも改めて示された。

さらに簡便に盤状体の 2N、雄、雌を判別するために、一度に複数の遺伝マーカーを用いたゲノムPCR を行った。その結果、盤状体が 2N の時はバンドが 2 本、雄もしくは雌の時は、検出箇所が異なるバンドが 1 本それぞれ検出することができた（Figure3）。これらの結果は、検査対象の盤状体が 2N か雄か雌かを、1 回のゲノム PCR で確認することができるようになったことを意味している。

Discussions
269 個の雌雄特異的遺伝子の候補
オキナワモズク 12,999 遺伝子のうち、雌雄特異的と考えられる遺伝子が 269 個と多数見つかってきた。これは近縁種シオミドロの 34 個と比較してもFigure 3 複数の遺伝マーカーを用いたゲノム PCR 産物の検出
2N 盤状体を用いた時は 2 本、雌雄盤状体の時は異なる長さのバンドが1 本それぞれ検出された。

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とても多い。これは本来雌雄特異的ではない遺伝子け合わせ、より高品質なコンブが得られることも期が多数含まれているためだと考えられる。雄／雌盤待できる。

状体の RNA-seq を行い、遺伝子発現解析をすることにより正確に雌雄特異的遺伝子が絞り込めるはずで次に開発すべき技術と今後の課題ある。しかしながら今回遺伝マーカーを作成した雄本研究の成果により、雌雄判別が可能になった。

5 つ、雌 4 つの遺伝子を利用すればオキナワモズク

しかしながらモズクを含む褐藻類で交雑育種を行うの雌雄判別は問題なく可能である（Figure 2, 3）。

ためにはもう 1 つ別の技術、株判別する遺伝マー

そのため、候補遺伝子が他にも多数あるが、本研究カーが必要になる。株判別を行わずに同じ株をかけ結果の優位性に変わりはない。

合わせてしまうと、遺伝的に新しいものは得られない。新たな品種を生み出すためには、異なる株を交複数の遺伝マーカーを組み合わせ簡便な雌雄雑させる必要がある。株判別マーカーを開発するに判別方法の確立は、株ごとのゲノム情報が必須となる。オキナワモ

本研究では雄 5 つ、雌 4 つの遺伝子に対する遺伝

ズクの場合、先行研究により特徴が異なる 4 株のゲマーカーの作成に成功した。遺伝マーカーを組み合ノム解読が完了している。さらに高温耐性株などもわせ、より少ない回数での雌雄判別を実現できた。

既に単離・株化されており、ゲノム解読中である。

これは研究者以外でもより簡単に判別が行えること

これらの情報を用いることにより、株判別マーカーを意味する。例えばモズク養殖に注力している沖縄の開発は十分実現可能であり、早期に実現すべきの県水産海洋技術センターをはじめとする各都道府県課題でもある。

が管轄する水産課や水産庁の職員でも利用可能である。また遺伝マーカーを用いた判別は安価な装置 3Conclusionsつ（合計 30 万円程度）があれば実施可能である。
そのため、どのような企業でもこの遺伝マーカーを本研究の成果により、オキナワモズク盤状体の雌用いた雌雄判別が可能であり、誰でもオキナワモズ雄を判別することができるようになった。さらなる

クの新品種作出に取り組むことが可能になったとい

技術開発が必要になるものの、海藻類初となる交雑うことも意味する。つまり本研究に得られた成果は、育種が現実味を帯びてきている。モズク類で新たな世界初の海藻類交雑育種による品種改良を現実的に交雑品種が作成できれば、その影響はコンブ、ワカ可能にするものである。

メ、ヒジキなどの他の褐藻にもおよぶことが予見される。

モズク類以外の海藻類への波及効果

近年の地球温暖化の影響により、日本の海藻類は本研究での遺伝マーカーの設計には近縁種シオミ瀕死の状況にある。長崎県五島列島や和歌山県串本

ドロの情報を利用した。これはモズクの遺伝マーでは魚の住処となる海藻類が激減し、その代わりにカーがシオミドロにも利用できる可能性が高いこと

造礁サンゴが増殖しているとの報道が多数なされてを意味する。シオミドロは微細な非食用褐藻であるいる。本研究の成果を用いて地球温暖化に対応できため産業利用されることはない。しかしながら他のる海藻品種を作出することができれば、そのような褐藻類、例えばコンブ、ワカメ、ヒジキなどには、問題にも対応できる。ひいては本研究の成果は、国モズク遺伝マーカーが利用可能であると考えられ連が提唱する SDGs（持続可能な開発目標）の「13.

る。コンブでは品種登録されてはいないものの、複気候変動に具体的な対策を」「14. 海の豊かさを守ろ数の品種があるとされている。そのため、本研究でう」に貢献できる可能性を多分に秘めている。

得られた遺伝マーカーを用いて異なる品種同士をか44

浦上財団研究報告書

Acknowledgement
本研究で用いたオキナワモズクは共同研究先でもある沖縄県水産海洋技術センターより提供されました。この場を借りてお礼申し上げます。
ならびに本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼を申し上げます。

Vol.30（2023）

R ef er enc e1) 西辻光希，未開拓な大型海藻ゲノムの現状とこれから，藻類 ，67 巻，2 号，81-87 ページ，2019 年
2) Nishitsuji et al ., A draft genome of the brown alga,
Cladosiphon okamuranus , S-strain: a platform forfuture studies of 'mozuku' biology., DNA research ,Vol. 23, Issue 6, pp. 561–570, 2016 年
3) Nishitsuji et al ., Draft genome of the brown alga,
Nemacystus decipiens , Onna-1 strain: Fusion ofgenes involved in the sulfated fucan biosynthesis
pathway., Scientific Reports , Vol. 9, Article number:4607, 2019 年
4) Nishitsuji et al ., Comparative genomics of fourstrains of the edible brown alga, Cladosiphon
okamuranus , BMC Genomics , Vol. 21, Article
number: 422, 2020 年
5) Alexandre Cormier et al ., Re-annotation, improved
large-scale assembly and establishment of acatalogue of noncoding loci for the genome of themodel brown alga Ectocarpus , New Phytologist ,Apr;214 (1) :219-232 2017 年

Development of new essential tools for breeding new Okinawa mozuku strainsthat contain more of the functional polysaccharide fucoidan

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Development of new essential tools for breeding new Okinawa mozuku
strains that contain more of the functional polysaccharide fucoidan
Koki NISHITSUJI
Marine genomics unit, Okinawa Institute of Science and Technology
Cladosiphon okamuranus , Okinawa mozuku in Japanese, is one of the edible
brown seaweeds, with an annual yield of 22k tons, worth 5 billion JPY per year
in Japan. More than 90% of Japanese mozuku production is from Okinawa, 95%of which is cultivated. C . okamuranus contains more fucoidan, which is abioactive polysaccharide, than other brown algae. The life cycle of C .
okamuranus is complicated, and it has self-cloning life cycles in both the
haploid (N, male and female) and diploid (2N). The diploid seeds (germlings)
can give rise to editable sporophytes. Establishing a new mozuku strain that
contains more fucoidan is required. However, important tools for distinguishing
diploid, haploid-male, and haploid-female germlings are missing for the crossbreeding of C . okamuranus . In this study, we developed a new technology toaddress that issue. A comparative analysis between C . okamuranus and therelated species, Ectocarpus siliculosus revealed that more than 200 putative
male/female genes were found in the C . okamuranus genome, and specificprimers could be designed for five male and four female genes. PCR results
using these primers showed that we could distinguish diploid, male, or female
germlings. These results suggest that the crossbreeding of C . okamuranus will
be realized, and that a fucoidan-rich mozuku strain will be bred in the nearfuture.