福田惠温41

吉備国際大学研究紀要（医療・自然科学系）
第29号，41−49，2019

トレハロースの開発とその応用福田惠温Development and Application of Trehalose
Shigeharu FUKUDA
Abstract
The bacterium Arthrobacter sp. Q36, isolated from soil, showed an ability to produce
trehalose from maltooligosaccharides and starch. Two novel enzymes, malto-oligosyltrehalose
synthase（MTSase, EC 5.4.99.15）and malto-oligosyltrehalose trehalohydrolase（MTHase,EC 3.2.1.141）were isolated and the production mechanism of trehalose was cleared.
By the simultaneous reaction of these two enzymes, isoamylase and cyclomaltodextrin
glucanotransferase on starch, the yield of trehalose reached to more than 85%. Trehaloseshows many excellent properties to improve food quality. The hydration function oftrehalose is applied to prevent food damage due to moisture and freezing. This sugar has
an inhibitory effect on starch retrogradation and protein denaturation. Experiments using
an ovariectomized mouse model of osteoporosis suggested that ingesting trehalose might beeffective in preventing osteoporosis. In addition to their application to foods, trehalose is a
useful ingredient for cosmetic and pharmaceutical products.
Key words：trehalose, glycosyltransferase, glass transition temperature
キーワード：トレハロース，糖転移酵素，ガラス転移温度

１．はじめに

２．トレハロースとは筆者は株式会社・林原において40数年にわたり，

砂 漠 の 植 物（ マ リ カ タ ヒ バ ） が 乾 季 を じ っ と

微生物酵素の検索，新規糖質の開発研究に従事して耐える時 １），あるいはネムリユスリカの幼虫が水きた。ここでは画期的な製法と評価されたトレハの な い 環 境 に な る と 体 内 に ト レ ハ ロ ー ス を合成ロースの新規製法の開発経緯，およびトレハロース

し， ガ ラ ス 状 態 で 乾 燥 か ら 組 織 を 保 護 し て い るの食品物性に及ぼす機能とその食品分野への応用に（Cryptobiosis ／無代謝状態）と言われている ２）。

ついて紹介したい。

また寒冷環境で大腸菌や酵母はトレハロースを合成

吉備国際大学農学部〒656-0484 兵庫県南あわじ市志知佐礼尾370-1
Kibi International University370-1, Shichi-sareo Minami-awaji, Hyogo, Japan (656-0484)

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トレハロースの開発とその応用することにより低温ストレスに対する防御機構を備学的に不可能である」，さらに，「反応性に富む還元えていることが分かっている３）。

基どうしが結合したトレハロースの結合エネルギートレハロース（α-D-Glucopyranosyl-1, 1-α-D-は高く，α-1, 4 結合からなるデンプンのような低glucopyranoside: α, α-Trehalose）はグルコースエネルギー結合物から生成するはずがない，熱力学の還元基どうしがα, α-1, 1 結合した非還元性二糖的にも不可能である」と考えられていた。事実，同であり，細菌・酵母などの微生物，キノコ・海草・じく還元末端どうしが結合したスクロースの結合エ昆虫などの動植物に広く存在する天然糖質の一つでネルギーは，α-1, 4 結合に比べてかなり高いことある（図１）。

が分かっていた。
しかし我々は微生物のもつ無限の可能性に期待し，土壌微生物よりα, α-1, 1 結合を生成する酵素の検索を行った。その結果，Arthrobacter属の菌体
内にα-1, 4-グルカンからトレハロースを生じる反応系を見出した４）。詳細に調べたところ，α-1, 4-

図１

トレハロースの化学構造グルカンから反応中間体を経てトレハロースが生成していることが分かった。中間体はα-1, 4-グルカンの還元末端側がトレハロースに変換されたマルト

また，タンパク質の安定化や凍結・乾燥からの細オリゴシルトレハロースであった。すなわち，ト胞保護作用など，極めて魅力的な性質を有する糖質レハロースの生成は，還元末端のα-1, 4 結合グルであることから，食品・化粧品・医薬品への用途がコース残基をα, α-1, 1 結合に変換するマルトオリ期待されていた。しかし1992年当時，トレハロー

ゴシルトレハロース生成酵素／MTSase（（1→4）-

スは酵母から抽出・精製されていたため，価格がα -D-glucan 1- α -D-glucosylmutase; malto-

１kg当たり数万円と極めて高く，有用性は認識さ

oligosyltrehalose synthase: EC 5. 4. 99. 15）と，生れながらも実際にはなかなか使うことができなかっ成したマルトオリゴシルトレハロースのトレハロー

た。微生物による発酵法や酵素を用いた製法も検討

ス部分のα-1, 4 結合を特異的に加水分解するトレされていたが，生成率，コストの面で実用化されて

ハ ロ ー ス 遊 離 酵 素 ／MTHase（4-α-D-｛（1→4）-

いなかった。

３．トレハロース生成酵素の開発
同じグルコースから構成されており，大量にしかも安価なデンプンを原料にトレハロースを製造することができれば，低価格のトレハロースが供給可能となる。それは我々糖質研究者の夢でもあった。しかし当時「デンプンからトレハロースを作ることはできない」と言われていた。その理由として，「α1, 4 結合をα, α-1, 1 結合に繋ぎ変えるのは立体化

図２MTSase，MTHaseによるトレハロースの生成機構

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α -D-glucano｝
trehalose trehalohydrolase; malto-性部位近傍がα, α‐1, 1 糖転移活性発現に特有な構

oligosyltrehalose trehalohydrolase; EC 3. 2. 1. 141）

造を示していると考えられた７）。一方，MTHaseにの共同反応によることが分かった（図２）。

ついてはFeeseらが報告しており，やはり特異的なMTSaseはグルコース鎖長が３以上のマルトオリ構造をしていることが分かっている８）。

ゴ糖に作用し，対応するマルトオリゴシルトレハロースを生成する。本酵素はスクロースからイソマルチュロースを生成するイソマルチュロース合４．トレハロースの製法検討

成酵素（EC 5. 4. 99. 11）と同様の分子内転移反応

我 々 は 上 記 酵 素 系 以 外 に， 分 子 内 転 移 反 応を触媒することから，Mutaseに分類された。一方，によりマルトースを直接トレハロースに変換

MTHaseはα-1, 4 グルコシド結合を加水分解し，す る ト レ ハ ロ ー ス 生 成 酵 素（maltose α‐D‐

生成物がα-アノマーであることからα-アミラーゼ

glucosyltransferase; trehalose synthase; EC 5. 4. 99.の一種と考えられるが，マルトオリゴ糖やアミロー

16）もPimelobacter属やThermus属の細菌中に見出スなどのα-グルカンにはほとんど作用せず，マルしている９）。いずれも新規酵素として認定され，新トオリゴシルトレハロースに特異的に作用する酵素

しいEC番号が付与された。

である。

トレハロースの製法を検討するにあたり，いくつ前記２つの酵素によるトレハロース生成系

かの方法が考えられた（図３）。前記トレハロースは，Arthrobacter属 以 外 に 古 細 菌 の 一 種 で あ る生成酵素やトレハロースホスホリラーゼを用いる系

Sulfolobus属や，Brevibacterium属，Micrococcus属，では，いったん高純度のマルトースを製造する必要

Rizobium属など広く細菌類に存在することが分かがあり，さらにこれらの酵素によるトレハロースへり，細菌における一つのトレハロース合成系と考えの変換は平衡反応であるため，トレハロースの生成られる４）。Arthrobacter sp. Q36株由来酵素５），およ率が60%程度とあまり高くないなどの理由により検びSulfolobus acidocaldarius ATCC33909由 来 耐 熱討を断念した。

性酵素遺伝子６） をクローニングし塩基配列を解析

一方，MTSase，MTHaseを用いた反応系は転移した結果，MTSase（tre Y），MTHase（tre Z）と反応と加水分解反応の繰り返しであり，デンプンかイソアミラーゼ遺伝子（tre X）が染色体上で近接らのトレハロース生成率が極めて高いことから，こして存在していることがわかった。しかもこれら遺伝子は終始コドンを含む４塩基が重複しており，トレハロースオペロンを形成していると考えられた。
アミノ酸配列について類縁酵素との相同性を比較すると，MTSase，MTHaseともにトレハロース関連酵素よりむしろ，α‐アミラーゼファミリーに類似していることが分かった。この知見をもとに，α‐アミラーゼファミリーに共通に保存されている触媒残基相当アミノ酸を部位特異的変異処理すると，活性が消失することを確認した。
MTSaseの立体構造は小林らが解析しており，活図３

デンプンからのトレハロース製造法

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トレハロースの開発とその応用

表１

トレハロース生産酵素の性質

glucanotransferase; EC 2. 4. 1. 19）の不均化反応を利用して低分子オリゴ糖を高分子化させ，再度基質として利用できるようにした。また，反応終期にわずかに残るグルコシルトレハロースをグルコアミラーゼによりトレハロースとグルコースに分解した。以上のような種々酵素の組み合わせにより，デンプンからトレハロースを85%以上含む反応液を得ることができた（図３）。この反応液はほとんどがの酵素系を採用することにした。用いる酵素としてトレハロースとグルコースであり，しかもトレハはSulfolobus属 由 来MTSase，MTHaseが 耐 熱 性 に

ロースは結晶化が容易なため，高収率で高純度結晶優れ，糖化反応には有利であるが，微生物の生育やトレハロース（98%以上）を回収し製品化すること

酵素生産性が低いなど培養上の問題点，さらにはトができた10）。１kg当たり約300円と，従来の100分のレハロースの収率がやや低いなど工業的な生産には１の価格で1994年に上市された。

適していなかった。
Arthrobacter Q36株は酵素生産能が高く，当初トレハロースの生産に用いていたが10），糖化温度が45℃と低く，トレハロース生成率は高いものの工業製

５． トレハロースの食品物性における機能，および食品への応用

造用酵素としてはやや不安定であった。その後単表２に示したようにトレハロースは非還元性であ離したArthrobacter S34株由来酵素はQ36株と比べり，熱，酸に対して安定なため加熱工程による分解・て糖化温度が10℃高く，しかも至適pHが低いため着色（メイラード反応）がほとんどない。従って他同時に作用させるイソアミラーゼとの相性も良く，の食品成分の変性への影響も極めて少ない。また２生産性はQ36株の10倍以上と考えられた（表１）11）。

含水結晶は湿度に対しても安定であることから，水本菌株をNTG変異処理による育種，培養条件の検が存在する環境に対し補完的に働き，食品の水分活討により，両酵素の生産量を数千倍に高めることが性を低下させて保湿性を高める作用，保存・日持ちできた。

向上，冷凍・冷蔵による離水防止作用を示す。また，さらにデンプンからトレハロースを効率よく生産するために種々の検討が加えられた。用いるデンプン種は安価なトウモロコシやタピオカ由来のデンプンが適していた。デンプンの高温液化に耐熱性α‐アミラーゼを，またデンプンの分岐構造を加水分解する目的でイソアミラーゼを併用した。さらに反応の後期に基質となりにくいオリゴ糖が蓄積するため，サイクロデキストリングルカノトラン ス フ ェ ラ ー ゼ ／CGTase（（1→4）-α-D-glucan:（1 → 4）
- α -D-glucan 4- α -D-［
（1 → 4）- α -Dglucano］-transferase（cyclizing）; cyclodextrin

表２

トレハロースの物理化学的性質

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表３

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トレハロースの機能と食品用途

図４

各種糖質のデンプン老化抑制効果

トレハロースは単糖や他の二糖類（スクロース，マルトース）と比較して高いガラス転移温度を示すことが特徴である。
食品のおいしさを表すパラメーターとして，テクスチュアー・食感といった食品物性，味・香りの影響，おいしさの持続，賞味期限の延長効果などが挙げられる。我々はトレハロースの発売開始以来，20年にわたってトレハロースの物性，応用開発や種々生理機能について調べてきた。そのなかで食品への応用に関しての機能性を見い出し，表３に各機能とその図５

トレハロースのデンプン老化抑制効果

食品への応用例を示した。基本的にはトレハロースに特徴的な物理化学的性質，すなわち水和力の高さ，結晶性，高いガラス転移温度，氷結晶成長抑制効果に起因している。以下，主な応用例について述べる。

図５Cに示したように，トレハロースを使用することにより餅の柔らかさを保つ効果が高くなり，品質（1）デンプン老化抑制効果

保持期間の延長にも有効である。

デンプンを含む食品は低温に保存，あるいは保存

老化はデンプンの直鎖構造であるアミロース部分

時間とともにデンプンの老化により硬化，パサつき中の水分子が抜け，アミロースどうしが水素結合になど品質の劣化が起こる。図４に示したようにトレより会合することによって起こる。トレハロースは

ハロースはスクロース，マルトースなどの二糖，そデンプン鎖中に分散している水分子と入れ代わるこの他オリゴ糖のなかでデンプン老化抑制効果が特にとにより，アミロース間の水素結合生成を阻害し，高いことが分かっている。トレハロースは和菓子をデンプンの老化を抑えるのではないかと考えられて中心にパン，麺類などデンプンを含む食品の柔らかいる。

さを保つ目的に最も広く利用されている12）。また，炊飯時に２%程度のトレハロースを添加しておくと，低温時における米の硬化が抑えられ，チルド流通のおにぎり，米飯の凍結にも用いることができる。

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トレハロースの開発とその応用（2）タンパク質変性抑制効果
タンパク質は加熱により変性し，凝固・硬化する。
トレハロースはタンパク変性を抑制する効果を有しており，卵を加熱処理する際にトレハロースを添加しておくと，ふっくらとしたスクランブルエッグを調製することができる。鶏肉のから揚げや牛豚挽き肉を用いたハンバーグも同様に固くなりすぎないな
ど，各種タンパク質性食品の熱変性抑制効果を発揮する。

図７

トレハロースの氷結晶成長抑制効果

スクロース，ソルビトール，マルトースにもタンパク質変性抑制効果が認められているが，トレハロースが最も強い抑制効果を示す（図６）。
結時の組織の電子顕微鏡写真では，トレハロースを含むプリンで氷結晶の成長が抑制され，組織の破壊が抑えられていることが分かる。
トレハロースは水和力が強いため，タンパク質分子の周囲に形成されている安定な水分子の層にすみやかに入り込み，水分子と入れ換わると考えられる。
従って，凍結してもタンパク質分子周囲の氷結晶の
図６

種々糖質のタンパク質変性防止効果

成長がトレハロース分子の存在により抑えられるた
め13，14），タンパク質本来の構造が保護され，解凍しても離水が起こりにくいと推測されている。

（3）保水性トレハロースは水分子との相互作用が比較的強（5）矯味・矯臭作用，風味改善効果

く，保水性を保つ効果を示す。食品の水分を安定的

糖質は甘味料としてだけでなく，えぐみ，苦味をに保ち，保存による離水や乾燥を抑えることが可能

抑えたり，不快な臭いを抑えたりする目的で料理にであり，できたてのフレッシュ感やしっとり感を保使われている。一般に糖質は味の改善や臭いの抑制つことができる。水分を多く含むゼリー，ムース，作用を有しているが，トレハロースも矯味・矯臭効

スポンジケーキやホイップクリームなどに応用され果を示す。とくに豆乳や青汁，疎水性アミノ酸（バている。

リン，ロイシン，イソロイシンなど）の苦みを抑制することが分かっており，飲料の呈味改善目的で使（4）冷凍時の組織保護（氷結晶成長抑制）効果
豆腐やプリンなどタンパク質を多く含む食品を凍結すると氷結晶の成長により組織が破壊され，「す」が形成される。その後解凍すると，離水により元の形を保持できなくなる。図７−Bに示したプリン凍われている。苦みの抑制，塩味の増強効果は官能試
験のみならず，味覚センサーを用いても同様の結果が得られている。

福田（6）結晶化，ガラス化の応用

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ンプン老化と同様の現象が起こる。エカトリアル水

かつお節はもともと柔らかい魚肉であるが，いっ酸基の多い糖ほど水のクラスター構造にはまりやす

たんかつお節に加工した後はいつまでもその形状やいと考えられており，トレハロースの水酸基は全て硬さが変わらず保持される。ガラス化状態の特徴をエカトリアルであることから水和特性の強い糖であ示す典型例であるが，キャンディ，スナック菓子，ることが分かる（図８）15，16）。

クッキー，ビスケットなどいずれもガラス化を応用

一方，トレハロースのガラス化転移温度はマルした食品である。これらの食品を製造する際にはガトースやスクロースより高い。これはトレハロースラス化転移温度が高い物質を用いたほうが，より安がその周囲の水分子を強く構造化していることを意定的に品質を保つことができる。トレハロースのガ味する。このようにトレハロースの水和作用はそのラス化転移温度は一般的に利用されている糖質のな分子構造からも支持されている。

かでは最も高く（表２），クッキーやスナック菓子

水分含量が多い環境では水和数の多さ，すなわちのクリスピー感（サクサク感）を保持したり，キャ食品中の水分をトレハロースが拘束することによりンディの吸湿抑制などに効果的である。このように，柔らかさの保持に繋がっている。一方，水分が低い

トレハロースを用いて効率よくガラス化することに環境ではスクロースなどと比べて安定なガラス状態より，高温・冷凍・乾燥・多湿などの環境ストレスを形成しやすいため，固さを保持する機能が高いのへの耐性が付与され，食感が保たれる。

ではないかと考えられる。

６．トレハロースの化学構造と物理的特性

７．トレハロースの生理機能

これまで述べてきたようにトレハロースは物性面

井上らはチューリップ花茎をトレハロースで処において種々の機能を発揮することが分かってい理すると花弁の老化離脱が４日遅れ，花弁の老化る。これはトレハロースのもつ強い水和作用による抑制に有効であることを見出した17）。トレハロー

水の構造化にあると考えられている。種々食品成分

スは細胞伸長には影響しないが，花弁のイオン漏分子周辺の水が構造化することにより界面のエント出を抑制し，組織の代謝活性を維持する機能を有ロピーが低下する。それに伴い食品の構造はパッキしていることが示された。またWinglerらは，シング密度を増大させ，水との接触面積を減らしてデロイヌナズナの発芽過程にトレハロースを添加すると根，子葉の成長が抑制されることを見出した。これはトレハロースによりApL3（ADP-Glucose18）Pyrophosphorylase）遺伝子の発現が誘導され，発芽時の成長よりむしろデンプン合成を促している結果であると考えられる。このことは植物界においても，トレハロースが種々の生理機能を発揮する可能性を示している。
組織安定化作用を化粧品，医薬品に応用する試みがなされている。ヒト皮膚線維芽細胞を水分がほと
図８

糖の水和力・e-OH基数と水和数

んど存在しない乾燥環境で培養すると，トレハロー

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トレハロースの開発とその応用スが存在する場合，スクロース，マルトースに比べルにおいて，トレハロースの経口投与により大腿骨て細胞生存率が最も高く，またその効果は濃度依存の骨密度減少が抑制されることを示した。トレハ的であった19）。すなわち，トレハロースは乾燥によ

ロースの摂取によりIL-6などの炎症性サイトカインる細胞の生体膜破壊を防ぐ効果を示すことが確認さの産生が抑えられ，その結果として破骨細胞の誘導れた。松本らも同様にヒト角膜細胞を用いて，マルが抑制されたのではないかと考えられる23）。

トースや市販点眼薬よりトレハロースの方が，乾燥さらに，貫名らは遺伝性疾患であるハンチントンからの細胞保護作用が強いことを報告している20）。

病の動物モデルにおいて，疾患に特徴的な大脳萎縮，Croweらは，エンドサイトーシスにより血小板に運動機能低下がトレハロースの飲水投与により改善

トレハロースを取り込ませ，凍結乾燥させることにされることを見出した24）。トレハロースの経口投与成功した。そして２年間の保存期間を経た後でも，により神経疾患の改善が数多く報告されている25）。

90 %の血小板を回収することができた21）。
一方，和田らは臨床臓器移植に用いられている臓器保存液（Euro Collins液）の改良を検討した。グ

またKaplonらは，ヒトが12週間にわたりトレハロースを経口摂取することにより心血管疾患の発症リスクが低下することを報告している26）。

ルコースをトレハロースに置き換えることにより肺これら種々疾患に対するトレハロースの作用機構機能の維持に有効であることを見出し，ET-Kyotoはまだ明らかではないが，トレハロースがオート（extracellular-type trehalose-containing Kyoto）液ファジーを促進することと関連している可能性があを開発した。この保存液はすでにヒトの肺移植に用る27）。

いられている22）。
また，新井らは卵巣を摘出した骨粗しょう症モデ

トレハロースのもつ生理機能に関しては，別の機会に整理して報告したい。

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