［奥ら：単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発］［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS, 53（5），440〜445（2022）］▲

財団 Information
onn

報告書

令和２年度「日本薬局方の試験法等に関する研究」研究報告

単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発＊ 3
奥 輝明＊1，菊池 裕＊2, #A Novel Modified Monocyte Activation Test as an Alternative Method to the Pyrogen Test
Teruaki OKU ＊1 and Yutaka KIKUCHI ＊2, #1

ト試薬を用いたエンドトキシン試験法が 3）が日局 18

緒言

一般試験法に収載されている．エンドトキシンは発発熱性物質とは動物の体内で体温上昇を引き起こ熱中枢への直接作用の他に，単球や多形核白血球にす物質の総称である．第十八改正日本薬局方（日局作用しインターロイキン（IL）‑1β，IL‑6，インター1）

18）は一般試験法に発熱物質試験法 を収載しておフェロン（IFN）‑α，IFN‑β，TNF‑αなどの内因り，皮内，皮下及び筋肉内投与のみに用いるものを性発熱性物質を産生させることが知られている2）．

除いた注射剤が発熱性物質を含まず，微生物由来のカブトガニの凝固系を利用したリムルス試験には発熱性物質に汚染されていないことや，発熱反応を① ゲル形成がエンドトキシン濃度に依存すること惹起する溶出物が存在しないよう安全性評価や品質に基づいたゲル化法，② ゲル化する際に生じる濁管理に用いられている．発熱性物質試験法は，ウサ度変化を光学計にて測定する比濁法，及び③ エン

ギの静脈内に被検試料を投与し，直腸の体温上昇にドトキシンによるライセート試薬の活性化を発色合より発熱性物質の有無を判定する．本試験法では，成基質の切断にて検出する比色法があり，エンドトグラム陰性菌に由来する強力な発熱性物質のエンドキシン試験法に記載されている3）．比濁法とゲル化

トキシンのほか，グラム陽性菌のペプチドグリカン法 で は 0.25〜0.015 EU/mL， 比 色 法 で は 0.02〜や外毒素，ウイルス，病原性真菌といった多くの外0.0002 EU/mL のエンドトキシンが検出可能である．

来性発熱性物質の検出が可能である．一方で，試験エンドトキシン試験法は高感度に発熱性物質のエン動物を用いる試験であることから，ウサギの個体差ドトキシンを検出する有用な試験法であるが，他のが生じること，ヒトとは感受性・感度が異なること発熱性物質を検出できない．などが欠点として挙げられている．エンドトキシン

ウサギを用いた発熱性物質試験は，エンドトキシはグラム陰性菌の外膜構成成分であるリポ多糖ン以外の発熱性物質を検出可能だが，動物福祉など（Lipopolysaccharide，LPS）で，自然免疫を活性化の観点から，欧州評議会欧州医薬品医療品質部門する様々な生物活性を有しているが，特に強力な発（European Directorate for the quality of medicines，2）

熱性物質として知られている ．エンドトキシンのEDQM）は，今後 5 年間で欧州薬局方（Ph.Eur）の検出に特化した試験法として，原始生物であるカブ

59 か所に記載されているウサギ発熱性物質試験法

トガニの血液凝固系のリムルス反応によるライセー（Rabbit pyrogen test）を代替法に替える報道発表

＊1
＊2
＊3
#440

星薬科大学 東京都品川区荏原 2‑4‑41（〒 142‑8501）
Hoshi University, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2‑4‑41 Ebara, Shinagawa‑ku, Tokyo 142‑8501, Japan
千葉県立保健医療大学 千葉県千葉市美浜区若葉 2‑10‑1（〒 261‑0014）
Chiba Prefectural University of Health Sciences, 2‑10‑1 Wakaba, Mihama‑ku, Chiba, Chiba 261‑0014, Japan
本研究は一般財団法人医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団の令和 2 年度「日本薬局方の試験法等に関する研究」事業により行ったものである．
責任著者 Corresponding author

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 53 No. 5（2022）

本誌掲載記事の無断転載・翻訳を禁止します．また，無断複写・複製は著作権法上の例外を除き禁止されています．

［奥ら：単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発］（Press release）を 2021 年 7 月に発出した 4）．エンド

2.2 実験器具

トキシン試験法やウサギを用いた発熱性物質試験法

全てのガラス器具は乾熱処理（250°C，2 時間）し，の欠点を補った代替法として，欧州薬局方は単球活脱パイロジェン化したものを用いた．プラスチック性化試験法（Monocyte activation test，MAT）を器具は，エンドトキシンフリー又はパイロジェンフ

5）収載している ．ヒト全血を用いる MAT はエンドリーの製品を用いた．エンドトキシン試験用水にトキシン以外の発熱性物質を検出する手法として評は，日本薬局方注射用水を用いた．

6）

価されており ，Merck 社は 2010 年に発熱性物質の刺激で全血のヒト末梢血単核細胞（Peripheral

2.3 エンドトキシン

Blood Mononuclear Cells，PBMC）が産生する IL‑1エンドトキシン（ATCC 23501

βを測定する PyroDetect を上市している．同様に［O3:K2a,2b（L）:H2］由来 LPS）は，国立医薬品食品

ヒト単球系細胞株を用いた MAT の有用性も報告さ

衛生研究所医療機器部長蓜島由二博士から御供与いれ 7），2018 年 に ヒ ト 単 球 系 細 胞 株 Mono‑Mac‑6 がただいた．エンドトキシンの濃度は，日本薬局方エ産生する IL‑6 を測定する PyroMAT が Merck 社かンドトキシン標準品（JP‑RSE，ら上市された．現在は欧米でヒト PBMC やヒト単negative 由来；（一財）医薬品医療機器レギュラト

球系細胞株からなる複数の MAT 測定キットが入手

リーサイエンス財団）及び Endospecy ES‑50M Set

可能で，欧州薬局方に適合した発熱性物質試験の代（生化学工業株式会社）を用いて測定した．

O113:H10:K替法として利用されている．最近，MAT で測定した 11 種類の精製 LPS と 1 種類の Lipid A を測定した

2.4 細胞培養

エンドトキシン活性は，ライセート試薬を用いて測ヒト単球株である THP‑1 細胞は JCRB 細胞バン定した活性とよく相関していることが報告され

クより，Mono‑Mac‑6（MM6）細胞は DSMZ（ドイ8）た ．医薬品規制に関するガイドラインを調和するツ細胞バンク）より入手し，RPMI 1640 培地（10%観点からも，欧州薬局方に収載された MAT を検証

FCS，50 nM 2‑ME，PSA を含む）にて培養した．

し，国内で適用可能な代替法として研究する意義はまた，THP‑1 細胞を PMA（5 nM）にて 2 日間刺激高い．本研究では，MAT の有用性を評価し，医薬し た も の を dTHP‑1 細 胞，MM6 細 胞 を VtD3（10品，医療機器の品質管理や安全性評価に重要であるng/mL）にて 3 日間刺激したものを dMM6 細胞とし発熱性物質試験法やエンドトキシン試験法の欠点をた．

補い，高感度で迅速かつ簡便な新規試験法を開発することを目的とした．

2.5 Enzyme‑Linked Immuno Sorbent Assay（ELISA）

2ELISA は，BioLegend 社の ELISA キット（human

実験方法

TNF‑α及び IL‑6）を使用し，推奨プロトコールに
準 じ て 行 っ た．96 穴 プ レ ー ト に 各 細 胞（1 × 105

2.1 試薬RPMI 1640 培地，メルカプトエタノール（2‑ME），cells/well）を播種し，LPS（最終濃度 0.1〜10 EU/Phorbol 12‑myristate 13‑acetate，ペニシリン−スmL）を加え培養した（0〜24 時間）．その後上清を

トレプトマイシン−アムホテリシン B 懸濁液（x100回収し，培養液中に含まれる TNF‑α又は IL‑6 の溶液，PSA），ウシ血清アルブミン（BSA）は富士

濃度を ELISA 法により測定した．また，健常人新フ イ ル ム 和 光 純 薬 株 式 会 社 よ り 購 入 し た．1α,

鮮末梢血はヘパリン加血を回収後，RPMI 1640 培

25‑Dihydroxyvitamin D 3（VtD3），Tween 20 は地で 5 倍希釈して使用した．人体から取得された試Sigma‑Aldrich よ り 購 入 し た．SureBlue TMB料（健常人新鮮末梢血）は，星薬科大学研究倫理委

1‑component microwell peroxidase substrate は員会の承認を得て研究に用いた（研究倫理承認番

SeraCare Life Sciences より購入した．ウシ胎児血号：H26‑2）．

清（FCS）は Life Technologies より購入した．

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 5（2022）

No reproduction or translation of articles in this journal without permission. Moreover, copy
or reproduction without permission is prohibited except for exception under copyright laws.

441［奥ら：単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発］

2.6 ルシフェラーゼ試験
pNL3.2.NK‑κB‑RE ベクター（Promega）より，
NK‑κB 応 答 性 配 列 及 び 最 小 プ ロ モ ー タ ー 領 域，

4

結果

4.1 THP‑1 細胞及び MM6 細胞の LPS 刺激によNlucP を含む配列を切り出し，pLVSIN‑CMV‑purるサイトカイン産生

ベクター（タカラバイオ）より CMV プロモーター

THP‑1 細胞及び MM6 細胞の LPS 刺激（3 時間又及びマルチクローニングサイトを除いたベクターには 24 時間）によるサイトカイン産生量を ELISA 法組込んだ（pLVSIN‑ NK‑κB‑NL）．HEK293FT 細により測定した．最終濃度 10 EU/mL の LPS で刺激胞（Invitrogen）に，pLVSIN‑NK‑κB‑NL及びした場合，TNF‑αは，刺激 3 時間後の dMM6 細胞

ViraPower Lentiviral Packaging Mix（Thermoの培養上清から最も多く（約 450 pg/mL）検出されFisher Scientific）を導入し，培養上清から回収した

た（Fig. 1A）．MM6 細胞においても僅かに認められウイルス粒子をMM6 細胞に感染させた．細胞の選たが，THP‑1 細胞や dTHP‑1 細胞では検出されな

択には Puromycin（2.5μg/mL）を使用し，生存した

かった．また，刺激 24 時間後には，どの細胞にお細胞をMM6/NF‑κB‑NL 細胞とした．MM6/NF‑

い て も ほ と ん ど 検 出 で き な く な っ て い た． 次 に

κB‑NL 細胞は VtD3を含む培地で 3日間培養した

IL‑6 の ELISA の 結 果 を Fig. 1B に 示 し た． 刺 激 24

後，前述（2.5）と同様に LPSにて刺激を行った．そ時間後の dMM6 細胞の培養上清より，最も多く（約の後，Nano‑Glo Luciferase Assay System

5000 pg/mL）検出された．刺激 3 時間後の dMM6 細（Promega）にて測定を行った．測定には，マルチ胞及び刺激 24 時間後の MM6 細胞の培養上清より，

モードプレートリーダー（ARVO X2，PerkinElmer）

約 1000 pg/mL の IL‑6 が 検 出 さ れ た が，THP‑1 細を利用した．

胞や dTHP‑1 細胞ではほとんど検出されなかった．

34.2 dMM6 細胞の経時的なサイトカイン産生

利益相反

次に，dMM6 細胞を用いて，サイトカイン測定

本研究に関連して開示すべき利益相反関係にあるに適した LPS 刺激時間を調べるために，経時的（0，1，3，6，12，24 時間）に培養上清を回収し，同様企業等はない．に TNF‑α及び IL‑6 の産生量を測定した．LPS は，

B

A
LPS (10 EU/mL)

IL-6 (pg/mL)

TNF-Į SJP/LPS (10 EU/mL)

24 h

3h

Fig. 13h

24 h

LPS 刺激した各種細胞における TNF‑αと IL‑6 の産生

MM6 細胞，dMM6 細胞，THP‑1 細胞及び dTHP‑1 細胞を精製 LPS（■）とエンドトキシン試験用水（□）で刺激し，培地中に産生された TNF‑α（A）と IL‑6（B）を 3 時間後及び 24 時間後に採取して ELISA で測定した．横軸に各種培養細胞を，縦軸に産生量（pg/mL）を平均値±標準誤差で示した．

442

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 53 No. 5（2022）

本誌掲載記事の無断転載・翻訳を禁止します．また，無断複写・複製は著作権法上の例外を除き禁止されています．

［奥ら：単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発］

B

A
LPS (1 EU/mL)

IL-6 (pg/mL)

TNF-Į SJP/LPS (1 EU/mL)

Time (h)Fig. 2Time (h)LPS 刺激した dMM6 細胞の経時的な TNF‑α産生と IL‑6 の産生

dMM6 細胞を精製 LPS（■）で刺激し，培地中に産生された TNF‑α（A）と IL‑6（B）
を経時的に採取して ELISA で測定した．横軸に採取時間を，縦軸に産生量（pg/mL）を平均値±標準誤差で示した．

BALPS (0 ~ 10 EU/mL)

IL-6 (pg/mL)

TNF-Į SJP/LPS (0 ~ 10 EU/mL)- 101 0.1

dMM6- 101 0.1

Blood- 101 0.1

- 10dMM6

1 0.1

Blood

Fig. 3 LPS刺激したdMM6 細胞及び健常人新鮮末梢血のTNF‑α産生とIL‑6の産生
dMM6 細胞と健常人新鮮末梢血を各種濃度の精製 LPS（■）で刺激し，培地中に 3 時間後に産生された TNF‑α（A）と 24 時間後に産生された IL‑6（B）を採取して ELISA で測定した．横軸に精製 LPS の濃度を，縦軸に産生量（pg/mL）を平均値±標準誤差で示した．

最終濃度 1 EU/mL を用いた．その結果，TNF‑αα（3 時間）及び IL‑6（24 時間）の産生量を ELISAは刺激 3 時間後をピークとして，その後減少した法にて測定した．その結果，dMM6 細胞及び健常人（Fig. 2A）．一方，IL‑6 は，刺激 3 時間後から検出

新鮮末梢血は，LPS 濃度依存的に TNF‑α及び IL‑6され経時的に増加した（Fig. 2B）．の産生を誘導した（Fig. 3A，B）．また，dMM6 細胞のサイトカイン産生量は健常人新鮮末梢血に比較し4.3 dMM6 細胞とヒト新鮮末梢血の比較て高かった．

dMM6 細胞及び 5 倍稀釈健常人新鮮末梢血を用いて，LPS 刺激（0.1，1，10 EU/mL）における TNF‑

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 5（2022）

No reproduction or translation of articles in this journal without permission. Moreover, copy
or reproduction without permission is prohibited except for exception under copyright laws.

443［奥ら：単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発］

BA
LPS (1EU/mL)

Luciferase activity (count)

Luciferase activity (count)

LPS

Time (h)Fig. 4

LPS dose (EU/mL)

LPS 刺激した MM6/NF‑κB‑NL 細胞のルシフェラーゼアッセイ

A. MM6/NF‑κB‑NL 細胞を精製 LPS で刺激し，経時的に細胞を回収してルシフェラーゼアッセイを行なった．横軸に細胞を回収した時間を，縦軸にルシフェラーゼ活性を平均値±標準誤差で示した．B. MM6/NF‑κB‑NL 細胞を各種濃度の精製 LPS で刺激し，3 時間後に細胞を回収してルシフェラーゼ活性を測定した．横軸に精製 LPS の濃度を，縦軸にルシフェラーゼ活性を平均値±標準誤差で示した．

4.4 ルシフェラーゼアッセイによる LPS の検出間後が最大であった（Fig. 2）．活性型ビタミン D3

MM6/NF‑κB‑NL 細胞を VtD3 にて培養した後，で刺激した MM6 細胞の反応性は，5 倍希釈ヒト末LPS（1 EU/mL）にて刺激し，経時的に細胞を回収

梢 血（PyroDetect に 相 当 ） よ り 高 感 度 で あ り，してルシフェラーゼアッセイを行った．その結果，0.1 EU/mL の LPS を用いた場合でも IL‑6 を十分にLPS 刺激 3 時間後にルシフェラーゼ活性は最大値を測定することができた（Fig. 3）．これは，2018 年 12示し，その後消失した（Fig. 4A）．次に，本細胞の月に Merck 社より PyroDetect の改良法として発表

LPS の感受性について調べるために，LPS 濃度希釈された PyroMAT と同様の方法であり，その検出感系列を作製し刺激時間 3 時間に測定を行った．その度も同程度であることが示された．そこで本法を，結果，LPS 濃度 0.01 EU/mL まで検出でき，無刺激更に高感度で迅速・簡便・高感度へと改良するため

又は LPS 濃度 0.001 EU/mL の約 2 倍のルシフェラーに，MM6 細胞に NF‑κB 応答配列とその下流にトゼ活性であることが明らかになった（Fig. 4B）．

ゲオキヒオドシエビ（）由来のルシフェラーゼ遺伝子（NlucP）を配置した遺5伝子を導入した 9）．本細胞を用いたルシフェラーゼ

考察

アッセイより，LPS 刺激 3 時間後にルシフェラーゼ発熱性物質である LPS に起因する単球系白血病活性の最大値を認めた（Fig. 4A）．次に，LPS 濃度細胞株 THP‑1 細胞及び MM6 細胞のサイトカインの 検 出 限 界 を 調 べ た． そ の 結 果，0.01 EU/mL の（TNF‑α及び IL‑6）産生を測定したところ，MM6LPS が検出でることが明らかになった（Fig. 4B）．

細胞の反応性が良いことが分かった．また，活性型ウサギを用いた発熱性物質試験の正確性及び簡便

ビタミン D3 にてプレ刺激をすることで MM6 細胞性を改善すると共に，試験動物を最小限に減らすこの反応性が増大することが示された（Fig. 1）．LPSとが望まれており，代替法の開発が進められてい刺激により産生された TNF‑αは刺激後 3 時間で最る．本研究では，高感度で迅速かつ簡便な発熱性物大値を示し，その後は時間経過と共に減少した．分質試験の開発を試みた．発熱性物質への感受性や応泌された TNF‑αは培養液中で分解されていると考答パターンを考慮しヒト由来細胞を利用することをえられた．一方で，IL‑6 は培養液中に蓄積される前提としたが，ヒト末梢血を用いた測定には，血液と考えられ，サンプル回収の終点である刺激 24 時の供給源や安全性に配慮が必要であり，現実的には

444

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

Vol. 53 No. 5（2022）

本誌掲載記事の無断転載・翻訳を禁止します．また，無断複写・複製は著作権法上の例外を除き禁止されています．

［奥ら：単球活性化試験法による新規発熱性物質試験法の開発］困難であると考えられた．そこで本研究では，ヒト末梢血に代わる細胞の探索を行い MM6 細胞が有用であることを示した．更に，この MM6 細胞の応答性の解析にルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイ法を組み合わせることで，ELISA による測定

3）厚生労働省 . 4.01 エンドトキシン試験法 . 第十八改正日
本薬局方 . 2021. p.112‑115.
4）European Directorate for the quality of medicines.
Outcome of the 170th session of the European
Pharmacopoeia Commission, June 2021. https://www.
edqm.eu/sites/default/files/medias/fichiers/の必要がない，簡便で迅速な発熱性物質試験を考案

PressRelease / press‑release‑ph‑eur‑170th‑ph‑eur‑

した．本法は，測定の熟練度やプレート遠心機など

commission‑outcomes‑june̲2021.pdf.の設備が不要であること，刺激終了後に即時に結果が得られることなど多くの利点が挙げられた．また，PyroMAT で は，0.05 EU/mL の LPS を 検 出 限界としているのに対して，本法では，0.01 EU/mL

5）European Pharmacopoeia. 2.6.3. Monocyte activation
test. 2017, 9.2, p.4299‑4304.
6）Hasiwa, N.; Daneshian, M.; Bruegger, P.; Fennrich, S.;
Hochadel, A.; Hoffmann, S.; Rivera‑Mariani, F.E.;
Rockel, C.; Schindler, S.; Spreitzer, I.; Stoppelkamp, S.;の LPS を検出することができた．以上より，本研

Vysyaraju, K.; Hartung, T. Evidence for the detection

究では，高感度かつ迅速・簡便な新たな発熱性物質

of non‑endotoxin pyrogens by the whole blood

試験の代替法が提案できた．

monocyte activation test.

本研究では，発熱性物質のうち LPS に特化して解析を行ったが，本法はエンドトキシン試験とは異なり，ヒト単球系細胞を利用しているため，Toll 様受容体（TLR）などのパターン認識受容体を介して2013, 30, p.169‑208.

7）Nakagawa, Y.; Maeda, H.; Murai, T. Evaluation of the‑pyrogen test system based on proinflammatory

cytokine release from human monocytic cells;
comparison with a human whole blood culture test
system and with the rabbit pyrogen test.

様々な病原体関連分子を認識することが可能であ

2002, 9, p.588‑597.

り 10, 11），細菌のペプチドグリカンやウイルス核酸，8）Abate, W.; Sattar, A.A.; Liu, J.; Conway, M.E.; Jackson,真菌成分に対しても応答する．今後は LPS‑TLR4

S.K. Evaluation of recombinant factor C assay for the以外のシグナル伝達経路を介する炎症性物質に対す

detection of divergent lipopolysaccharide structural

る詳細な解析を行い，より優れた炎症性物質試験であることを示す必要がある．

species and comparison with Limulus amebocyte
lysate based assays and a human monocyte activityassay.

2017, 66, p.888‑897.

9）Hall, M.P.; Unch, J.; Binkowski, B.F.; Valley, M.P.; Butler,謝辞B.L.; Wood, M.G.; Otto, P.; Zimmerman, K.; Vidugiris, G.;

レポーターアッセイによる測定に御協力くださいました

Machleidt, T.; Robers, T.M.; Benink, H.A.; Eggers, C.T.;

星薬科大学衛生化学研究室長谷川晋也博士に深く感謝いた

Slater, M.R.; Meisenheimer, P.L.; Klaubert, D.H.; Fan, F.;

します．エンドトキシン（ATCC 23501［03 : K2a, 2b

Encell, L.P.; Wood, K.V. Engineered Luciferase（L）: H2］由来 LPS）を御供与くださいました国立医薬品食品Reporter from a Deep Sea Shrimp Utilizing a Novel

衛生研究所医療機器部長蓜島由二博士に深く感謝いたしま

Imidazopyrazinone Substrate.

す．

p.1848‑1857.

. 2012, 7,10）Kawasaki, T.; Kawai, T. Toll‑Like Receptor Signaling
文献Pathways.

1）厚生労働省 . 4.04 発熱性物質試験法 . 第十八改正日本薬局方 . 2021. p.121‑122.

2014, 5, 461. doi: 10.3389/

fimmu.2014.00461.
11）Takeuchi, O.; Akira, S. Pattern Recognition Receptors2）棚元憲一 . エンドトキシンと医薬品の品質管理 . 国立医and Inflammation,, 2010, 140, p.805‑820.

薬品食品衛生研究所報告 . 2008, 126, p.19‑33.

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 5（2022）

No reproduction or translation of articles in this journal without permission. Moreover, copy
or reproduction without permission is prohibited except for exception under copyright laws.

445