植物のイオン輸送系の構造と機能に関する研究

魚住信之（名古屋大学 生物機能開発利用研究センター）
uozumi@agr.nagoya-u.ac.jp

植物細胞の恒常性維持と塩や浸透圧などの外界ストレスへの適応反応の中心的役割を担う K+チャネル・Na+トランスポーターの分子機構と生理的役割を解析するとともに、植物、動物や細菌の膜輸送体の新規機能解析系の構築と膜輸送体の生体膜への組み込み機構と原理、生物の種を越えた共通性の知見を見いだした。

植物の塩感受性に関与する Na+輸送体の発見
地球規模ですすむ耕地の砂漠化の要因は塩類の集積である。植物にとって Na+は必須栄養元素ではなく、植物は Na+に高い感受性(塩害)を示す。植物の疎水性の生体膜を横切って Na+が通る道があることは確認されていたがその実体は不明であった 1,2)。1994 年に小麦から Na+と K+の両イオンを輸送する新規の HKT 系トランスポーター遺伝子(HKT1)が単離された。大腸菌や酵母のこのホモログ輸送体は K+取込み系として機能していることから、植物の HKT1 も K+輸送体と思われていた。2000 年に私たちはシロイヌナズナから HKT1 ホモログ遺伝子(AtHKT1)を単離した。AtHKT1 の K+及び Na+輸送活性を調べたところ、意外なことに AtHKT1 は小麦 HKT1 のような K+輸送活性はなく、小麦 HKT1 よりも強い Na+輸送活性を検出した 3)。
AtHKT1 が植物においても Na+輸送体として機能していることが以下のように明らかとなった。
一般に Na＋は植物に毒性を示し植物の必須栄養元素ではない。AtHKT1 遺伝子はシロイヌナズナでは 1 コピーであることから遺伝子型と表現型が 1 対 1 に対応し AtHKT1 遺伝子の破壊株(ノックアウト株)の解析結果の解釈が比較的容易である。野生株が成育可能な高濃度の Na+添加培地において、AtHKT1 遺伝子破壊株の地上部(葉や茎)は塩害を受け培養経過とともに枯れた。このとき、地下部(根)の成長阻害は認められなかった。この破壊株の師管中の Na+濃度は野生株と比較して低いことが分かった。以上の実験結果から、AtHKT1 は地上部の師管に Na+を積み下ろす輸送体として機能し、本輸送体は植物の塩感受性(または塩耐性)に関わる輸送体であることが明らかとなった。他の研究者からも、AtHKT1 の変異が植物の塩害の抑制に働く Na+排出系 Na+/H+アンチポーターの調節因子の変異を緩和することが報告され、AtHKT1 が Na+の植物内循環に関与しているという私たちの結果が裏づけられた。植物の Na+吸収とNa+の循環系輸送体の実体は全く不明であったが、AtHKT1は Na+循環系の一部を担う輸送体として機能していることが明らかとなった。以上の結果は、HKT 系輸送体は細菌、酵母、植物において塩ストレスおよび浸透圧ストレスへの適応に重要な輸送体であることを示している。

野生株

AtHKT1遺伝子
突然変異株

図1 AtHKT1 トランスポーターの遺伝子を破壊した植物は、高塩濃度(NaCl 75mM)の培地では地上部が枯れる。AtHKT1 は植物の Na+輸送と塩感受性に関与するトランスポーターである。

イオン輸送体のトポロジーの決定とイオン選択性決定部位
イオン輸送体の機能やイオン選択性を探る上で、輸送体の膜貫通構造(トポロジー)とイオン選択性部位の決定は重要である。私たちは植物の K+輸送体が大腸菌の細胞膜(内膜)で正規のコンフォメーションを形成し機能発現することを見出した。さらに、大腸菌に発現して決定した膜蛋白質のトポロジーは、動物細胞の小胞体膜と動物培養細胞で決定した結果と一致した 4, 5)。このことは、大腸菌発現系は本輸送体にとどまらずその他の真核細胞由来の膜蛋白質の解析に応用可能な迅速かつ簡便な手法の一つであることを示している。大腸菌発現系は他のイオン輸送体解析に他の研究者によって利用されることとなった。また、真核細胞由来の膜蛋白質が原核細胞の生体膜で発現することは、原核細胞と真核細胞の垣根は従来から思われているよりも低いことを示唆している。
私たちは、植物に発現している 3 種類の K+輸送体である K+チャネル、HKT 系トランスポーター、KUP 系トランスポーターの膜貫通構造を決定する計画であり、前者２つを既に決定した。その結果、K+チャネルと HKT 系トランスポーターの構造は類似であることが以下の様に明らかとなった。HKT 輸送体のトポロジーに関して当時は、8 回膜貫通構造と10 回膜貫通構造の異なるモデルが２グループの研究者から提案されていた。
私たちは、大腸菌、in vitro、動物培養細胞の膜蛋白質発現系を用いて、AtHKT1 は 8 回の膜貫通構造を有することを明らかにした。
このHKT 系トランスポーターの構造はK+チャネルのイオン透過孔の構造であるMembrane-Pore-Membrane(MPM)モチーフが４回重複した秩序のある構造であることがわかった 6)。
決定した膜構造はイオン選択性残基の同定に有効な情報を与える。私たちは K+輸送活性のある小麦 HKT1 輸送体と K+輸送活性のないシロイヌナズナ AtHKT1 輸送体のイオン選択性に関与するアミノ酸を探った。小麦 HKT1 輸送体のイオン透過孔には特徴的な Gly が４つ存在するが、K+輸送活性のない AtHKT1 は最もＮ末端領域の Gly が Serに置換されている。この Ser を Gly に置換すると、K+輸送活性を示すようになった。先の結果に示したように K+チャネルと K+トランスポーターのイオン選択孔は、４つの MPM モチーフが会合した構造で形成されている。この１分子の MPM には K+の選択に必須の Gly が存在し、４つの MPM の Gly が四方から取り囲んで K+選択性透過孔を形成することが明らかとなった。このことは HKT 系
トランスポーターと K+チャネルはアミノ酸レベルの相同性は低いが、立体構造上は共通性が高く祖先が同じであることを示す。ポストゲノムシーク
エンス時代の課題の一つは蛋白質の構造と機能で

TaHKT1 76
AtHKT1 53
EcHKT1 80
OsHKT1 73
OsHKT2 73
ScTrk1 77
VaKtrB 55
Kv429

YIDMLFLSTSALTVS G LSDFDLFFTSVSAITVS S MSDLDLFFTSVSATTVS S MSYIDMLFLSTSALTLS S LIYIDMLFLSTSAMTVS G LSYIDTLFLAAGAVTQG G LN
ITDALFTATSAISVT G LG
IPDAFWWAVVTMTTV G YG

93709790909372446ある。この得られた結果は HKT 系輸送体と K+チャネルの骨格構造の進化的保存性を示している 7)。

ＣＮ

図 2 HKT 系トランスポーターの Na+/K+の選択に重要なアミノ酸。
第１番目の選択孔中のGly/SerがK+の選択性に関与することが分かった。

K+チャネルについてもイオン選択性に影響を与えるアミノ酸を解析した。K+チャネル(KAT1)の NH4+や Rb+の透過度が K+より 10 倍大きくなるアミノ酸変異を見いだし、イオン透過性には影響を与えないでイオン選択性を改変することが可能であることを示した。また、植物の K+チャネルは動物のそれと比較して Na+に対する K+の選択性が極めて高い。これは、植物において高濃度 Na+は、そのイオン毒性に加えて必須イオンの K+の取込み阻害を引き起こすため、動物の K+チャネルより厳密な Na+/K+選択性が植物の K+チャネルは備わっていると考えられている。植物の K+チャネルにはイオン選択孔付近によく保存されている Thr(K+チャネルの KAT1 では Thr256)があり、このアミノ酸は Na+の排斥に必須であることを明らかにした。近年の技術の進歩とともに蓄積されつつある X 線解析による立体構造の知見を利用することで、今後はさらに計画的なイオン輸送系の変更が可能と思われる 8)。

新規な膜貫通構造の形成機構
微生物・動物・植物の膜電位に応答してイオン選択孔が開閉する Na+、Ca2+、K+チャネルは基本的に同じ膜貫通構造(イオン透過孔、膜電位センサー)を形成している。イオン選択孔は２つの膜貫通セグメントの間に疎水性ループ構造が存在し、そのループがイオン選択を決定している。また、膜電位センサーは親水性膜貫通セグメントで形成されている。一般に、膜蛋白質の膜貫通セグメントは疎水性で、その疎水性を利用して生体膜に挿入される。
しかし、イオンチャネルには疎水性が高いにもかかわらず膜貫通構造を形成しないイオン透過孔や親水性膜貫通セグメントが存在するため、それらがどのようにして形成されるのかについて注目されていた。我々は、イオン選択孔と膜電位センサーの膜への挿入機構の解明を目的に、in vitro 翻訳系・膜挿入系(ウサギ網状赤血球溶血液・イヌの膵臓小胞体膜)を用いて、放線菌・動物・植物由来の K+チャネル(以上３種類)の膜貫通セグメントの生体膜への組込み過程を解析した。植物・動物・放線菌由来の区別なく K+チャネルのイオン選択孔の膜形成の結果は同様であった。疎水度の高いループは、膜貫通セグメントを形成する性質はなく、膜構造形成過程において一旦小胞体内腔に露出した後、最終的に膜に半分埋まった構造をとることが分かった 9)。膜電位センサーを形成する２つの膜貫通セグメントは、Ｎ末領域から順番に生体膜に挿入されるのではなく、２つの膜貫通セグメントが相互作用をして同時に生体膜に挿入されることが分かった。従来から知られている様式とは異なる、新規の膜貫通セグメントの膜形成様式の存在を示した 10, 11)。
膜停止機能

SA‑II型機能

S2(S6)
S1S3２つの膜貫通領域(S3‑S4)が同時に組み込まれる

S4(S5)
S1-S2 S5-S6

従来様式

S3-S4 新規様式

図３ 膜蛋白質の生体膜（小胞体膜）への挿入様式の解析。S4 のリボゾームにおける合成完了を待って、S3 は S4と相互作用して小胞膜に挿入されることを見出した。従来から知られている挿入過程とは異なる様式(S1‑S2 やS5‑S6)で、後ろの膜貫通部位が前の膜貫通部位の挿入を助ける新規に発見された組込様式である。

謝辞
本研究を共にすすめ、ご協力をいただいた大学院生、研究者および共同研究者に深く感謝いたします。本推薦にご尽力いただきました坂神洋次先生（名古屋大学教授）に感謝申し上げます。

引用文献
1) 水谷昭文、佐藤陽子、松田信行、加藤靖浩、魚住信之 (2003) カリウムイオン輸送系と生理的役割。細胞工学
別冊植物細胞工学シリーズ 秀潤社 18, 40-47
2) 佐藤陽子、水谷昭文、魚住信之 (2003) K+イオン輸送系の植物生長と塩感受性への役割。蛋白質核酸酵素増刊号 共立出版
3) Uozumi, N., Kim, E.J., Rubio, F., Yamaguchi, T., Muto, S., Tsuboi, A., Bakker, E.P., Nakamura, T., and Schroeder, J.I. (2000)
The Arabidopsis HKT1 gene homologue mediates inward Na+ currents in Xenopus oocytes and Na+ uptake in
Saccharomyces cerevisiae. Plant Physiol., 122, 1249-1259.
4) Uozumi, N., Nakamura, T., Schroeder, J. I. and Muto, S. (1998) Determination of transmembrane topology of an inward
rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana based on functional expression in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 95 9773-9778.
5) Uozumi, N., (2001) E. coli as an expression system for K+ transport systems from plants. Am. J. Physiol. 281, C733-C739.
6) Kato, Y., Sakaguchi, M., Mori. Y., Saito, K., Nakamura, T., Bakker, E. P., Sato, Y., Goshima, S., and Uozumi, N. (2001)
Evidence in support of a four transmembrane-pore-transmembrane topology model for the Arabidopsis thaliana Na+/K+translocating AtHKT1 protein, a member of the superfamily of K+ transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98, 6488-6493.
7) Maser, P., Hosoo, Y., Goshima, S., Horie, T., Eckelman B., Yamada, K., Yoshida, K., Bakker, E.P., Shinmyo, A., Oiki, S.,
Schroeder, J. I., and Uozumi, N. (2002) Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine potassium
selectivity in four-loop-per-subunit HKT transporters from plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 6428-6433.
8) Uozumi, N., Gassmann, W., Cao. Y., and Schroeder, J. I. (1995) Identification of strong modifications in cation selectivity in
an Arabidopsis inward rectifying potassium channel by mutation selection in yeast. J. Biol. Chem. 270. 24276-24281.
9) Umigai, N., Sato, Y., Mizutani, A., Utsumi, T., Sakaguchi, M., and Uozumi, N. (2003) Topogenesis of two transmembrane
type K+ channels, Kir 2.1 and KcsA. J. Biol. Chem., 278, 40373-40384.
10) Sato, Y., Sakaguchi, M., Goshima, S., Nakamura, T., and Uozumi, N. (2002) Integration of Shaker-type K+ channel, KAT1
into the endoplasmic reticulum membrane: Synergistic insertion of voltage sensing segments, S3-S4 and independent
insertion of pore-forming segments, S5-P-S6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 60-65.
11) Sato, Y., Sakaguchi, M., Goshima, S., Nakamura, T., and Uozumi, N. (2003) Molecular dissection of the contribution ofnegatively and positively charged residues in S2, S3, and S4 to the final membrane topology of the voltage sensor in the K+channel, KAT1. J. Biol. Chem., 278, 13227-13234.

Study on Structure and Function of Plant Ion Transport Proteins
Nobuyuki Uozumi (Bioscience and Biotechnology Center, Nagoya University)
uozumi@agr.nagoya-u.ac.jp