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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）＜平成 25 年度助成＞

ワサビ属植物のジェノタイピングにむけた次世代シーケンス技術を用いた DNAマーカー開発
山根京子（岐阜大学応用生物科学部植物遺伝育種学研究室）

背景および目的便にプライマー設計ができる手法が構築されており、本研究でも本技術を用いることとした。

ワサビは日本で栽培化された数少ない植物であり、日本が誇る重要な香辛野菜である。近年海外の需要も増え、医学、薬学、生化学などの分野でも注目されている。しかしワサビの自生地や在来種に関しての包括的な調査が行われたことはなく、遺伝学的な研究も皆無であった。山根は2005 年よりワサビ属植物の現地調査と植物収集を開始しこれまでに 150 地点を越える地点から個体を収集し、世界で唯一のワサビ属植物系統保存施設を運営している（図 1）。遺伝資源としてのワ図1

岐阜大学応用生物科学部植物遺伝育種学研究室において系統維持をしているワサビ属植物（2013 年撮影）。

材料および方法

サビを持続的に利用し保全することを目的として・葉緑体全ゲノム解読と葉緑体 SSR マーカー開発

地域系統間の遺伝的類縁関係等を調査している

供試植物材料は、静岡県農林技術研究所伊豆農が、品種判定や個体識別が可能な DNA マーカー

業研究センターわさび科および岐阜大学応用生物は未だ開発されていなかった。マーカーさえ開発

科学部植物遺伝育種学研究室において系統保存さできれば、品種改良や保全のためのジェノタイピれている標準系統「ふじだるま No . 3」を用いた。

ングが容易になり、ワサビ育種や保全策の策定な本系統の本葉から改変 CTAB 法を用い全 DNAをど、幅広い分野で応用が可能となる。そこ本研究抽出した。抽出した全 DNAを北海道システムサ

では、ワサビの遺伝資源としての基盤情報を整イエンス社に送付し、イルミナ社 TruSeq Nano備するために、次世代シークエンサーを用いて新DNA LT Sample Prep Kit の 標 準 プ ロ ト コ ル

規 DNA マーカーを構築することを目的とした。

（350bp Insert）に基づきライブラリーが調製され、DNA マーカーとしては、単一塩基配列の繰り返次世代シークエンサー（イルミナ社 Hiseq2500）にしを含む領域であるマイクロサテライト（=SSRよる塩基配列決定が行われた。

〔Simple Sequence Repeat〕）マーカー（例：・・・

明治大学農学部バイオインフォマティクス研究

AAAAAAAAAAAAA・・・）を作製する。マイ室准教授矢野健太郎氏および髙野知之氏により、クロサテライトは、その変異性の高さから、品種

Ray および Platanus でアセンブルが行われ、得ら判別や個体識別に利用されており、ワサビにおいれたコンティグ配列から、葉緑体ゲノムの全長配ても多方面での応用が期待できる。近年、次世列を決定した。

代シークエンス技術の発達により、より安価で簡得られたワサビの葉緑体全ゲノム配列とダイコ

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ワサビ属植物のジェノタイピングにむけた次世代シーケンス技術を用いた DNAマーカー開発

ンで既に全ゲノムが解読され情報公開されているる。ダイコンの葉緑体ゲノムと比較解析をした結配列（ Jeong et al., 2014 ）と比較解析を行った。

果、遺伝子の構成、向き、並びは一致していた。

全ゲノム情報から、A, T, C, G それぞれの繰り返し数ごとの分布を調べ、SSRの繰り返し数とゲノム中の数を明らかにした。最終的に、高い変異性が得られる可能性がある SSRを含む領域でのプライマー設計を行った。

・ジェノタイピングの確認
申請者により全国各地より収集・維持されているワサビおよび近縁野生種であるユリワサビを用いて、得られた SSR マーカーが本当にジェノタイピングできるマーカーであるのかどうかを確認した。
結果および考察・標準系統「ふじだるま No.3」の葉緑体全ゲノム解読

次世代シークエンサーを用いた、de novo ゲノムショットガンシークエンスにより、アセンブルの・ワサビ葉緑体ゲノムにおける SSR の分布
全ゲノム中、モノヌクレオタイド配列の繰り返し数と総数の一覧は次の通りである（表 1）。
表1

ワサビ葉緑体ゲノムにおけるモノヌクレオタイドの繰り返し数と総数

総数

繰り返し数
*ATCG456789101112131415161700004026
8402200000005738188542210252
49
1384020000000218
49
11112010000000

結 果、Ray で は、コ ン テ ィ グ 数 : 113,675、総 塩* ただし、A または T は８以上を、C または G は４以上をカウントした

基数 : 190,604,939、平均長 : 1,677 となり、Platanus

表 1 のとおり、モノヌクレオタイドの繰り返し

で は、コ ン テ ィ グ 数 : 2,671,540、総 塩 基 数 :数は、繰り返し数が少ないほどゲノム中の数が716,717,698、平均長 : 268 となった。予測ゲノム多くなることがわかった。これは、Yamane et al.

サイズは、アブラナ科の中でも大きいことが予想（2006）で得られたイネ科植物における結果と一さ れ、Platanus が 予 測 に 合 致 し て い る 可 能 性 が致する。また、A または TとC または G との間では、ある。また、ワサビの辛味成分の生成に関与す繰り返し数の分布が異なり、C または G の方が、るミロシナーゼ遺伝子とそのプロモーター配列

A または T に比べ、全体的に繰り返し数が少ないを含む 11752bp のコンティグも同定された。まことがわかった。

た、葉緑体ゲノムを含む大きなコンティグが得ら

マイクロサテライトや SSR においては、繰り返れ、その結果、葉緑体の全ゲノムが一つのコンし数が多いほど変異性が高いことが知られていティグで構成され、ダイコンの配列などを比較る。そのため、ゲノム中のモノヌクレオタイドの繰し、葉緑体全ゲノム配列が、世界にさきがけてり返し数が大きいものから順番に、マーカー候補解読できたことがわかった。ダイコンの全ゲノムとして検証した。このなかで、葉緑体の Inverted配列が 152860bp であるのに対して、ワサビはRepeat 領域に存在するモノヌクレオタイドの繰り153852bp であった。今回は、全 DNAを抽出し、返し配列は、マーカーとして除外している。これ

次世代シークエンサーで解読したこともあり、結は、本領域が非常に保存的でマーカーとしては不果的に細胞質ゲノムも含まれていたためにコピー的確であることが既に知られているためである。

数が多い葉緑体の解読につながったと考えられ

さらに、プライマーの設計は、できるだけ繰り返

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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

し数の多い SSR 座を含みながら、プライマー配列・新規開発 SSR マーカーの有用性の検証

は遺伝子のコード領域において設計できるように上記のうち、5 領域を用いて、山根によって集めした。これは、プライマーサイトでの突然変異のられた自生ワサビおよびユリワサビ系統と、静岡可能性を減らし、あらゆる日本のワサビ属植物に

県農林技術研究所伊豆農業研究センターわさび科

おいて増幅が可能なマーカーとして利用できるよが所有する栽培品種の計 40 系統の系統関係を明

表 2 の新規マーうにするためである。以上の結果、らかにしたのが図 2 である。

カーの開発に成功した。次に、本マーカーの有用性について検証する。

その結果、ごく一部の栽培品種を除き、ほとんどの栽培品種が同一の塩基配列を有していること

表2

ワサビの葉緑体ゲノムにおける SSR を含むマーカー一覧

モチーフ

遺伝子間領域フォワードプライマー

リバースプライマー

プライマー名
略称

A14
A14
A13
A11
A11
A11
A11
T16
T13
T13
T12
T11
T11

rbcL-accD
trnV- rps7
trnE-trnT
rps2-rpoC2
psaJ-rpl33
rps18-rpl20
rpl32-trnL
matK-trnK
psaA-ycf3
clpP-clpP
trnH-psbA
ycf6-psbM
trnP-psaJCGATAAATTAGATGGCCAAGCGCTCGAACTGATGACTTCCA
TCCTGAACCACTAGACGATGGATGACACCGAGCCCTTATTG
ATGGTTCGGTTCGTTAGCAG
TCGATTTATTAGTGAACAAGG
ATCACTTTCTACAGGTAATTCCGAGCCCCATCGAACTTTACGGACAACACATACAAAGAAAACGAACTAGCGGGTTGATGGAACGACGGGAATTGAACCTGGATATAGTAAGTCTCGCAGATGACAGGATTTGAACCCG

AGCTCGCCTCTGTATTCCAAACCGAGAAGAAAGGAGGCTCCGGATTTGAACCGATGACTT
GATTGGTTGAAAGGCCTGAATAGGGGTGTTATGCCGATTCTTATTTGCATCAAGCTTTCGTCTACCAATTTCACCATAGCCGGTAGAGTACTCGGCTTTT
CCTGGTAATTATATTGAAGCGTCGGAGGAGCAATTACCAAGCTATGCATGGTTCCTTGGT
TTGCATTTATTGCTACTGCA
AAGGGAAATGTTAATGCATC

K
I
L
M
N
E
H
O
A
P
Q
C
B

図2

ワサビ属４種における葉緑体 DNA5 領域の塩基配列多型に基づく NJ 系統樹。枝の上部は50%以上のブーツストラップ確率。都府県名が同じでも、種が同じ場合は全て集団が異なる。
尚、栽培品種は静岡県農業試験場より譲渡されたもの。ふじだるまは標準系統として、静岡県と岐阜大学が共同で系統維持を行っており、現在全ゲノム解読を行っている系統である。

ワサビ属植物のジェノタイピングにむけた次世代シーケンス技術を用いた DNAマーカー開発

41が明らかとなった。これは、山根によって聞き取の DNA 鑑定を行った。その結果、図 3 の通り、り調査や文献資料から推定された、品種の系譜と固有の配列を有していることがわかった。これは、矛盾がなかった。このことから、典型的な栽培品

地理的に近くに位置している、福井県大野地区や種は本配列を有しており、栽培品種かどうかの判今庄地区の自生ワサビと共有の派生形質を有して定が可能であることがわかった。さらに、栽培ワいたことにより判断した。

サビと自生のワサビやユリワサビは交雑している

上記の結果をふまえ、白山白峰地区における自可能性が山根により見出されており、今回の結果

生ワサビを栽培し、地域特産物化として販売するからも、遺伝的な類縁関係と地理的な関係の間にことを目指し、地元の生産者と協力しながら活動明瞭な関係がみられなかったことから、自生ワサを行っている。また、京都府南丹市の芦生地区にビの同定は困難であることがあらためて示されおいても、自生ワサビを探索し、DNA 鑑定の結た。しかしながら、系統数を 100 近くまで引き上果、二つの谷で自生ワサビらしき固有の配列を持げることで、地理的な関係が明らかとなることがつワサビを発見した。本地区でも、こうしたワサわかった。そこで、石川県白山白峰地区で古くかビをいずれは栽培し、地域特産物として売り出せ

ら在来ワサビとして認知されてきた、モチワサビるよう、地元の方々と協力して活動している。た図3

葉緑体 SSR 遺伝子座におけるワサビおよびユリワサビの塩基配列比較の一例。赤枠で囲った部分が白山白峰地区の自生ワサビ固有の配列を示す。福井県の大野地区や今庄地区の自生ワサビと共有の派生配列を有していたことから、本ワサビは自生ワサビといえるであろうと結論付けた。

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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

だ、芦生地区においてはシカの食害による被害がで至っている。今後は、次世代シークエンサーで深刻であり、山から植物がどんどん消えている。

解読した膨大なゲノム配列のなかから、さらに有ワサビも例にもれず、絶滅寸前となっていること用なマーカーを選抜し、品種改良や保全に役立つがわかった。見た目だけではわからないため、本マーカーを構築し、順次公開したいと考えている。

研究で開発した DNAマーカーが有効性を発揮し、自生ワサビの発見につながっている。現在具体的な保全計画が進行中で、今年中にシカよけの柵を設置し、保全活動を開始する予定である。

謝辞
本研究の遂行に際しまして、白山白峰地区の自生ワサビを提供して下さった松風産業 風一様に心以上のように、次世代シークエンサーを用いより御礼を申し上げます。また、終始サポートして、世界に先駆けてワサビの葉緑体全ゲノムを解て下さった、当研究室の小林恵子様に心より感謝読することができた。さらに本情報を用いて、進申し上げます。また、全国各地を調査した折にお化速度の速い SSRマーカーを開発することができ世話になりました、京都府南丹市芦生地区の皆様た。実際に本マーカーを用いることで自生ワサビをはじめとしました多くの方々に、この場をお借の DNA 鑑定に成功し、自生ワサビを地域ブランりして御礼を申し上げます。

ド化し、売り出すための保証データをつくること

本研究は平成 25 年度公益財団法人浦上食品・食ができた。京都府の芦生地区においては、保全文化振興財団の研究助成により資金提供を受け実計画を策定し、具体的な保全事業を実行するにま施されました。ここに厚く御礼を申し上げます。

Development of DNA markers for genotyping of wasabi using next-generation sequencing technologies

Development of DNA markers for genotyping of wasabi using
next-generation sequencing technologies
Kyoko Yamane
Faculty of Applied Biological Sciences, Plant Breeding and Genetics Laboratory
Gifu University[ Summary ]This report shows the development of new DNA markers for wasabi using nextgeneration sequencing technologies. Wasabi (Japanese horseradish: Eutrema japonicum(Sieb.) Maxim., syn. Wasabia japonica (Miq.) Matsum.) is a perennial herb that plays animportant role in traditional Japanese cuisine and culture. Although many research articles
focused the biochemical and pharmaceutical properties of wasabi, including its pungency,
or flavor, and its anti-carcinogenic or anti-inflammatory effects, there has been no genetic
study of wasabi. It remains poorly understood for the genetic diversity or the genetic
background of wasabi. In this study, using next-generation sequencing technologies,
search for DNA markers of wasabi was conducted. Consequently, whole-genome shotgun
sequencing successfully provided the whole chloroplast genome sequences of wasabi,“Fujidaruma”. The length of complete chloroplast genome in wasabi was 153852bp, andthe structure and order of chloroplast genes completely coincident with those of radish,Raphanus sativus. Based on these sequence data, new 13 SSR primer sets were constructed.
Phylogenetic analyses of the chloroplast 5 SSR regions of 40 Eutrema accessions in Japan
plus outgroup species, E. yunnanense, were used to generate neighbor joining (NJ) tree,
revealing that major cultivar of wasabi, E. japonicum, form a single clade clearly separated
from other Eutrema accessions. Accordingly, using these SSR markers, genotyping ofmajor cultivars and one of the landraces are successfully achieved. These data could help toidentify native grown wasabi and to launch the wasabi as a special local products.

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