紫 外 線 に よ る シ ワ ・ タ ル ミ 発 生 メ カ ニ ズ ム 研 究 の 23 年 間（1994~2017）の軌跡と到達点

はじめに加齢に伴い、顔面にはシワやタルミなどの形態変化が起きることはよく知られており、その主要な悪化要因に紫外線(UVA や UVB)による光老化の影響が報告され、この光老化は非露光部位で起こるような自然老化とは区別されている。シワの形成は病的変化ではないが、典型的な老徴の一つであり、特にいつまでも若い肌を保ちたいと願っている女性には深刻な皮膚変化と捉えられている。近年皮膚科施設や化粧品業界でシワの発症メカニズムとその予防および治療に関する研究が盛んに行われ、シワの原因の一端が明らかにされつつある。シワの発生にはコラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンなど真皮マトリック
ス成分の様々な変化が関わっていることが従来報告されているが、そのメカニズムの直接的な証明としては不完全なものであった。すなわち完成したシワ組織でのコラーゲン、エラスチン、グルコサミノグリカンなどの量的質的変化を捉えてはいるが、その変化がなぜ
シワ形成につながるのかに付いては充分な説明がなされていないのが現状であった。我々は従来の代表的メカニズムとしての、シワのエラストーシス〔変性エラスチンの蓄積〕由来説とは異なり、皮膚の弾力性を司る主要な成分であるエラスチン線維が紫外線によるエ
ラストーシス発現のはるか以前のシワ形成前及び初期に変性し、その弾力性を消失することがシワの発生に重要な要因であることを見出し、またこの変性は真皮線維芽細胞が産生分泌するエラスチン分解酵素、エラスターゼの働きによることを明らかとした。本報ではこのエラスチン/エラスターゼネットワークの紫外線誘導シワ形成メカニズムへの関与について、我々が行ってきた最近及び過去 23 年間の研究をまとめ濃縮して紹介する。

光老化によるシワ・タルミの形成機序
１．シワの発生部位と皮膚弾力性との関係
ヒトの顔面では額や目尻そして鼻唇溝など表情の動く部位にシワが多く発生するが、その程度は加齢に伴い増大することが知られておりシワやタルミの形成
は印象年齢を上げ、老徴の一つである。なかでも顔面の部位のうち目尻では最も早くシワの形成がみとめられ、その平均発生年齢は 35 歳である[1,2 a-8,o-40 ]。顔面各部位のうち目尻はまた加齢とともに（紫外線に暴露する回数も増加する）最も皮膚弾力性が低下する部位でもあり【図－１】、さらに三次元1

画像解析(3,4)により目じりのシワの幅と深さを正確に測定し、同じ皮膚部位の皮膚弾力性と比較してみると、シワの深さと皮膚の弾力性の低下には有意な高い相関が認められ【図－2】（a-1）、シワの発生の前段階として皮膚の弾力性の低下が生じることが推察されている。

図－１：皮膚各部位の年齢による弾力性の変化2図―２：シワの画像解析図

しわの深さと皮膚の弾力性

６０、７０代n = 36深い
1400

r=-0.563

1200

しわの
深さ

Depth (um)

1000
800
600
400
200
0
0.1

浅い

0.2

0.3

0.4

0.5

Ur/Uf

低い

皮膚弾力性

3

高い

図―３：顔面目じり同一部位でのシワの深さと皮膚弾力性の関係
また加齢に伴うシワスコアーの増加は同じ皮膚部位の弾力性の低下とよい相関を示す【図－５】。この皮膚弾力性の低下の原因の一つとして紫外線の寄与が大きいことが数多く報告されており、実験的にも動物モデルを用いた紫外線照射により皮膚弾力性が低下することにより、一過性のシワの固定が生じることが証明されている[a-4]。

1.0

r=-0.728

Skin elasticity

0.8

0.6

0.4

0.2
0

0

1

2

3

4

5

6

Wrinkle score
女性目尻の皮膚弾力性としわとの関係
皮膚弾力性が低下し、しわが深くなる

図―４：女性目じりの皮膚弾力性とシワスコア―の関連
すなわち、へアレスマウスの背部では紫外線を連続照射することによって皮膚の弾力性が低下し、正中線に対して横方向に、額の横ジワに類似した形状のシワが形成される【図－５】。これは動物が紫外線照射中に頻繁に座る姿勢をとり、この時には正中線に対して横方向に一過性のシワが生じるため、これが紫外線照射による皮膚弾力性の低下により、横方向にシワが固定化されるものと考えることができる。実際にマウス皮膚を正中線に平行になるように一過性の人工的な溝（縦ジワ）を瞬間接着剤で作製し、その直後に紫外線を照射しこれを繰り返すとマウス背部皮膚を固定していた方向と同様に縦ジワが形成され、紫外線照射を行わずに一時的に縦方向に固定したのみのマウスでは、固定した方向にシワは形成されない【図－５】。

4図－５：紫外線正常照射による横シワの形成と強制的縦シワ作成による縦シワの形成
これらの実験から、表情の動く部位では、表情の変化で起こる一過性のシワ（笑いジワなど）が形成されても皮膚のはりが保たれているときには元に戻りやす
いが、紫外線を慢性的に浴びることで皮膚の弾力性が低下すると一過性のシワが元に戻りにくくなり、これが永久的な“シワ”として固定されるものと考えられる【図－７】。

5図－７：一過性のシワ固定化の機序
２．シワの発生と弾力線維量およびコラーゲン線維量との関係
シワ発生の原因としては従来弾力線維症(Solar Elastosis)やコラーゲンの減少などが考えられているが、いずれも顔面の加齢皮膚での組織観察を基礎にしており、必ずしもシワが発生している直下の真皮の組織変化ではなく、光老化皮
膚真皮全般に認められる組織変化である。また紫外線の累積照射によりシワを形成させた後、その時の皮膚真皮の組織観察を行った所見であり、また図―８に示した矛盾などもあり、シワの発生と弾力線維量およびコラーゲン繊維量との関係を結論づけるためにはシワ形成の初期に生じ、より皮膚の弾力性の低下とシワ発生に直接的に結び付く組織変化を見る必要がある。

6

図―８：Solasr elastosis とシワ発生のドグマ
我々は UVB の累積照射を行い、シワ発生に至る過程を詳細に解析した。すなわ
ち UVB 照射後、８、１４，２０，２６週においてシワの形成の写真およびレプ
リカ、レプリカの画像解析によるシワ面積、皮膚弾力性（キュートメータ測定）、
弾性線維量（ルナ染色像の画像解析による）、また照射９，１７，２３，３６
週において皮膚中の弾性線維量およびコラーゲン量の変化を測定し、シワ発生
初期におけるこれらの因子の変化を解析した。ＵＶＢ累積照射８週目ですでに未照射皮膚に比べて明瞭なシワが形成され、シワのレプリカでもシワの形成がはっきりみとめられ（図―８）、レプリカの画像解析によるシワ％でも有意なシワ面積比の未照射と比べての増加が認められた（図―８）。また皮膚弾力性も８週目で未照射に比べての有意な減少がみられ、ルナ染色の画像解析から測定した弾性線維量に有意な増加はまだ認められなかった（図―９）。すべての因子は１４，２０，２６週に順に未照射との差が拡大し、弾性線維量も２６週で初めて未照射にくらべて有意な増加が認められた。さらに皮膚中の弾性線維
量およびコラーゲン量の変化の解析結果ではすでに明瞭なシワがおよび弾力性の低下か認められる照射９週目でも弾性線維量およびコラーゲン量には照射と未照射の間に差は認められず、明瞭な弾性繊維量の増加が認められるのは３６週目で、またコラーゲン量の明瞭な低下が認められるのは１７週目で（図―１０）、シワの発生や弾力性の低下に弾性線維やコラーゲン量は全く関与していないことが証明された。

7

図－８：Ａ：皮膚シワの形成とレプリカ像、Ｂ：シワの画像解析

図－９：Ａ：皮膚弾力性の変化、Ｂ：ルナ染色後の画像解析による弾性線維量8図－１０：皮膚真皮における弾性線維量とコラーゲン量のＵＶＢ累積照射による変化

図－１１：シワ形成皮膚真皮におけるエラスチカワンギーソン染色
同じ実験動物で紫外線でシワが誘導された皮膚のエラスチカワンギーソン染色でエラスチンを染色した組織染色像ではシワがない皮膚に比べて正常なエラス

9チン繊維がむしろ減少している（図―１１）。
すなわち皮膚弾力性の低下に伴うシワの発生にはエラスチンの量的変化ではな
くエラスチン線維の微細構造の変性変化が関与している可能性が示唆された。

３．皮膚の弾力性低下は真皮弾性線維の変性（湾曲化）による皮膚が紫外線を浴びて皮膚弾力性が低下するときに、真皮内部ではどのような変化が起きているのかを調べるため、我々は紫外線を連続照射したときの真皮弾性線維三次元形態の変化について観察を行った。ラット後ろ足を用いると、その足底皮膚をメルコックス樹脂を用いて灌流固定し、蟻酸にてコラーゲン等を消化することで、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いたラット足底皮膚における真皮弾性線維三次元構造の観察が可能となることを見出し [o-1]。この足底皮膚でも紫外線を照射することにより明瞭なシワが形成されることから【図－Ｘ
Ｘ】、そのシワ形成過程でのエラスチン繊維の三次元微細構造の変化を始めて観察することができた。すなわちこの方法では、ラットの腹部大動脈から樹脂を注入し後ろ足の血管を固定し、自然に近い状態で弾性線維の観察することが可能である（従ってこの方法は背部皮膚には応用できず、足底皮膚に限定される）。自然な弾性線維は直線状にゴムが張っている状態の組織で、皮膚の弾力性の維持はこの直線的な弾性線維の性状に依存している。若齢ラットの弾性線
維は高い直線性を保っているが、加齢に伴い湾曲化（直線性の低下）することが明らかになっている [o-2]。しかし若齢であっても最小紅斑量(1MED)以下の
紫外線を長期間浴びることにより真皮弾性線は湾曲化し、たわんだ状態となる【図－１２】。この湾曲化（直製性）の程度を、一枚の写真を９か所に分け、一本一本のエラスチン繊維をトレースすることにより、【図－１３】の如き計
算方法でエラスチン繊維の直線性をう

紫外線累積照射皮膚（シワの形成が認められる）

紫外線非照射皮膚10図―１２：紫外線(UVB)の累積照射の結果シワ形成が認められる皮膚真皮と未照射皮膚真皮のエラスチン線維の３次元形状

図－１３：エラスチン線維の直線性を定量方法評価した結果、累積した紫外線暴露により、エラスチン繊維の直線性がまず減
少し、その結果皮膚弾力性は低下し、その後にシワの形成およびシワの程度の増加が生じる【図－１４】ことが明らかとなった。このシワの形成が生じてい

図－１４：ラット足底皮膚へのＵＶＢ累積照射後の弾性線維の直線性と皮膚弾
力性とシワ強度の11経時変化
る皮膚組織の光学顕微鏡レベルでの組織染色像では、コラーゲンおよびエラス
チンの顕著な変化は認められず、solar elastosis 像もまったく認められない【図－１５，１６】[a-3]。また皮膚の炎症性変化や好中球の遊走も全く皆無であった。従って、皮膚は最小紅斑量の半分程度のエネルギーの紫外線を繰り返し浴
びることにより弾性線維の三次紫外線非照射足底皮膚

紫外線累積照射足底皮膚（シワの形成が認められる）

図－１７：シワ形成皮膚のＨ＆Ｅ染色像

紫外線非照射足底皮膚

紫外線累積照射足底皮膚（シワの形成が認められる）

図－１８：シワ形成皮膚のルナ染色像

元微細構造が変性し、皮膚弾力性が低下してシワが形成されるものと考えられ12る。従来シワの原因として考えられていた solar elastosis は紫外線によるシ
ワ形成の経時変化を注意深く観察した結果、シワ形成のかなり遅い段階で生じる現象で、シワの発生の初期段階には関与していないものと推察される。

一方紫外線(UVB)の高いエネルギー(5MED=850 mJ/cm2 in rat)での一回照射での実験では照射後１週間まででシワの形成は認められないが、３日後に強い紅斑
や７日後で落屑が認められ、皮膚弾力性はすべてのパラメーターで有意に減少した。(Kazue Tsukahara, Yoshinori Takema, Yukiko Yorimoto, Shigeru Moriwaki,
Tsutomu Fujimura and Genji Imokawa. Effects of single shot UVB irradiation
on skin elasticity and three-dimensional microstructure of elastic fibers
in rat ski. Photomedicine and Photobiology, 1999; 21: 77-79.)この実験でエラスチン繊維の３次元構造を調べたところ、コラーゲン繊維を消化するために使用するギ酸処理では通常はエラスチン繊維は消化されず残るが、UVB5MED 照
射後７日目の皮膚では、このギ酸処理でもエラスチン繊維は消化され、ギ酸処理を短くした際に残ったエラスチン繊維の湾曲化が照射皮膚で強く認められた。
この皮膚組織では主に単球からなる炎症性細胞の浸潤が顕著に認められた。
シワの形成とエラスチン繊維の三次元微細構造変性の関係は、レチノイン
酸塗布や炭酸ガスレーザー処理で、1MED 以下の UVB 累積照射で形成されたシワが消失する際に、湾曲化した弾性線維が直線性を取り戻し、低下した皮膚の弾力性が向上すること[a-14,15]などの我々の研究結果からも確認され、皮膚弾力性の低下には弾性線維三次元微細構造の変性が深く関わるものと考えられる。
すなわちこの皮膚弾力性低下に関与する重要な因子であるエラスチン線維の三次元構造が紫外線照射や自然老化により変性することがシワ形成の原因となっていることが我々の研究で初めて明らかとなった。この考え方は、従来の代表的なシワ形成メカニズムであるエラストーシス説（変性エラスチンの蓄積由来説）やコラゲナーゼの活性化にともなうコラーゲン繊維減少説とは全く異なるものである。
4. 弾性線維三次元微細構造の湾曲化のメカニズム
この弾性線維の湾曲化はどのようなメカニズムで起こっているのかを次に検討した。図―１９に示す如く、真皮線維芽細胞は真皮マトリックス蛋白であるコ
ラーゲンやエラスチンを産生するとともに真皮マトリックス蛋白を分解するコ
ラゲナーゼやエラスターゼも同時に産生し、真皮マトリックス蛋白量の制御を行っている。

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図－１９：真皮線維芽細胞のマトリックス蛋白の産生と代謝における役割
最も合理性の高いメカニズムは真皮でエラスチンを分解するエラスターゼ活性が亢進し、弾性線維が一部分で切られ、弾性線維が湾曲化（たわむ）している
可能性である。今までの紫外線によるシワ形成はすべて動物皮膚の最小紅斑量の半分ほどのＵＶＢエネルギーの累積照射で行っており、皮膚組織観察からも皮膚炎症が起きている兆候はないので、エラスターゼの産生細胞としては、マクロファージ(MMP-13)や好中球（好中球由来エラスターゼ：分泌型セリンプロ
テアーゼ）ではなく線維芽細胞と考えられ、またＵＶＢは表皮レベルまでしか到達できないことから、ＵＶＢ暴露した表皮ケラチノサイトから分泌されたサ
イトカインが基底膜を通過して真皮に侵入し、真皮線維芽細胞に働いてエラス
ターゼの発現が増強する可能性を考え、これを検証した。

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図－２０：紫外線暴露ヒト表皮細胞の培養上清を培養ヒト真皮フィブロブラス
トに添加した際に生じるエラスターゼ活性の変化
真皮線維芽細胞の産生するエラスターゼは分泌型ではなく膜結合型であり、線維芽細胞膜表面に発現することが知られているので、シワ形成皮膚で認められた弾性線維の変性が分解消化されて線維量が減少するのではなく、線維芽細胞
膜の周辺のみ分解切断され、通常は張っている弾性線維がたわんで湾曲化する現象とよく一致している。本検証実験の結果、ヒトケラチノサイトおよび HaCaT
細胞のＵＶＢ暴露(80mJ/cm2)後の培養上清の添加により、ヒト線維芽細胞のエラスターゼ活性は有意に増加し（図―２０）、ヒトケラチノサイトからＵＶＢ
暴露により分泌された液性因子が線維芽細胞に働いて、エラスターゼの発現を明瞭に増加させる可能性が明らかとなった。従って、この紫外線（ＵＶＢ）照射により表皮細胞分泌因子を介した真皮線維芽細胞の産生するエラスターゼ酵
素が弾性線維三次元微細構造の変性を誘導している可能性が示唆された。
実際に紫外線の照射により真皮中のエラスターゼ活性が上昇するかどうかを調べてみた結果、ラット足底およびヘアレスマウス背部皮膚に 1MED 以下の UVB を連続照射すると真皮中の弾性線維分解酵素エラスターゼ（線維芽細胞由来エラスターゼ）の活性は予想通り有意に上昇した【図－２１】 [a-14,15]。

15

図―２１：1MED 以下の UVB のヘアレスマスの背部皮膚への連続照射により生じたエラスターゼ活性の増加
エラスターゼ活性の上昇とエラスチン線維の変性さらには皮膚シワの発生の間の因果関係がよくわかる皮膚疾患としては Mid-Dermal Elastolysis（図―２２） [o-33]が知られている.本疾患は真皮でエラスチン線維の変性もしくは消失がエラスターゼの活性・亢進により引き起こされ、コラーゲンがまったく正常にもかかわらず、細かいシワが生じる皮膚病で。この真皮では好中球の浸潤が認められ、好中球由来のエラスターゼ活性が１０倍ほどに上昇しており、好中球エラスターゼはセリンプロテアーゼの分泌型エラスターゼであることから、周りのエラスチン繊維をすべて消化し、コラーゲンは正常に存在するにもかかわらず、エラスチン繊維が完全に消失している。すなわち皮膚炎症により浸潤する好中球由来のエラスターゼは分泌型のセリンプロテアーゼであるので、広範囲にわたってエラスチン繊維を分解し、エラスチン繊維が消失するものと考えられ、我々のターゲットである線維芽細胞由来のエラスターゼは膜結合型のメタロプロテアーゼで分泌はされず主に細胞膜上に発現して、線維芽細胞近傍のエラスチン繊維を切るのみで今回観察されたエラスチン繊維の量の変化は伴わないエラスチン繊維の湾曲に主に関与するものと推察される。

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図－２２：Mid-dermal elastolysis の皮膚写真と真皮電子顕微鏡写真および真皮におけるエラスターゼ活性
Fimiani M, Mazzatenta C, Alessandrini C, Paola M, Paola C, Andreassi L.
Mid-dermal elastolysis: an ultrastructural and biochemical study.
Arch Dermatol Res. 1995;287(2):152-7.

更年期障害モデル動物でのシワ形成パターンと真皮マトリックスプロテアーゼの関連
真皮エラスターゼ酵素の発現上昇がシワ形成に重要な役割を果たしていることが明確になってきたが、女性の更年期障害においては皮膚の弾力性が低下し、シワ形成が生じしやすく、この際に極端に減少する女性ホルモン（エストラジオール）の投与によって、これらの症状が改善するという研究報告（＃＃）に関連して、我々は更年期障害モデル動物である卵巣摘出ラットにおける皮膚弾
力性やシワ・ハリの程度および紫外線累積照射による影響を調べその際の真皮
エラスターゼ活性をタイプＩコラゲナーゼやタイプ IV コラゲナーゼとの比較してみた。卵巣摘出後数週後のラットの皮膚の形状を sham(同様に手術をするが卵巣は摘出しない)ラットと比較すると紫外線の照射なしでも、皮膚の弾力性は有意に減少し、弱いシワとタルミ形成が認められる（図３３－２８）。さらに紫17

外線 (UVB or UVA)の累積照射により卵巣摘出ラット皮膚ではシワ・タルミ形成が非摘出ラット皮膚に比べ有意に強く生じることが判明した。またこの際皮膚
真皮組織中の Type I や Type IV コラゲナーゼ活性の有意な増加は認められないのに対し、エラスターゼ活性のみが卵巣摘出ラット皮膚で、非摘出ラット皮膚に比べＵＶＢ累積照射なしでも有意な上昇を示し、さらにＵＶＢ累積照射によりさらなる有意な増加を示し、３種のマトリックスプロテアーゼのなかではエラスターゼ活性の亢進がシワ・タルミ形成の程度に最も相関性をもって観察され、エラスターゼの発現亢進とシワ・タルミ形成が強い因果関係を有していることが示された。

図－２３:卵巣摘出ラット皮膚

図―２４:各レプリカの形状
での皮膚表面形状

図－２５: タルミスコアーの図―２６: 卵巣摘出ラット皮膚での卵巣摘出ラットによる変化

皮膚ピンチテストの写真

18

図－２７:卵巣摘出ラット皮膚でのピンチテストの結果

図―２８: 卵巣摘出ラット皮膚での弾力パラメータの変化

図－２９: 卵巣摘出ラット皮膚の UVB 累積照射前後のメタロプロテアーゼ
活性の変化

これらの卵巣摘出ラット皮膚でみられた変化は女性ホルモンであるエストラ

19

ジオールが天然の抗酸化剤として皮膚における活性酸素種(ROS)の消去を行っており、紫外線照射により生じる ROS の産生を防いでいる可能性があり、ＲＯ
Ｓによる誘導される種々のサイトカインがフィブロブラストに働いて、エラス
ターゼ活性の亢進が生じている可能性を強く示唆している。

４．弾性線維分解酵素(エラスターゼ)阻害剤でシワが予防できる
以上より、紫外線により真皮で誘導されたエラスターゼ酵素活性の亢進が、弾力繊維の変性湾曲化を引き起こし、その結果弾力性が低下し、シワ形成に結びつくメカニズムの可能性を直接的に証明するために、真皮線維芽細胞エラスターゼ阻害剤を新しくデザインし、シワ予防効果の有無を検証した。すなわち実際の紫外線照射により真皮エラスターゼ活性が亢進し、弾性線維を分解・変性させ、その結果起こる皮膚弾力性低下によりシワが形成されるメカニズムを実証するために真皮線維芽細胞エラスターゼ酵素の特異的阻害剤を新しくデザイ
ンし、シワ予防効果の有無を検証した。
ここで真皮マトリックスプロテアーゼの阻害剤を用いて、動物皮膚でのシワ・タルミ形成への阻害効果を調べ、ある種のマトリックスプロテアーゼが特異的に関与することを証明する実験において、注意すべき点はその阻害剤の特異性を充分に調べておかないと、図―３０に示した如く、真皮マトリックスプロテ
アーゼの基質特異性は極めて低く、一種の真皮マトリックスプロテアーゼはエラスチンのみならずコラーゲンなどの複数のマトリックス蛋白の分解活性も持つ場合が多く認められ、例えばコラゲナーゼの阻害剤を用いて紫外線誘導のシ
ワ・タルミが改善されたとしても、その阻害剤は実はエラスターゼも阻害してしまう場合もあり、充分な証明にならないケースが多く認められることである。

20

図－３０：真皮で報告されているマトリックス分解酵素の種類と基質特性
線維芽細胞エラスターゼがシワ形成に重要な役割を持つ可能性が強くなってきたことから、線維芽細胞エラスターゼの特異的阻害剤を合成するための化合物
デザインを行うため、線維芽細胞エラスターゼと好中球エラスターゼの酵素阻
害性の解析を行った（図―３１）。この解析結果から線維芽細胞エラスターゼに強い阻害活性を示す Phosphoramidon を選択し、本阻害剤は糖構造がついているために経皮吸収性が弱いことから、この経皮吸収性を向上するため、脂溶性の フ ェ ニ チ ル 基 を 導 入 し 易 吸 収 性 で あ る 化 合 物
N-phenetyl-phosphonyl-leucyl-triptphan（NPLT）を合成した。ＮＰＬＴは好中球由来エラスターゼ、コラゲナーゼＩ，コラゲナーゼⅣにはまったく阻害活性を示さず、線維芽細胞エラスターゼを特異的に阻害することが明らかとなった（図―３２）。
へアレスマウス背部皮膚に１MED（マウス；65mJ/cm2,）以下の UVB 照射後に NPLT
を 1mM 濃度で塗布し、これを 18 週間続けることで、UVB 累積照射により形成されるシワ強度がコントロール (80%EtOH)と比較して有意に減少した（図―３２、
３３）。
またラット足底皮膚に UVB を 1MED (130mJ/cm2)以下のエネルギーで累積照射す
ると明瞭なシワが形成されるが、0.1～10mM NPTL の照射後塗布により,1mM 濃度から明瞭なシワ形成防止効果が観察された（図ー３４）。ここでＮＰＬＴはＵ
ＶＢ吸収能があるので、サンスクリーン効果を否定するため、10mM 濃度の典型的な UVB サンスクリーン剤である p-MCX を NPLT と同様に照射後に塗付したが、21

まったく抑制効果は認められず、NPLT のサンスクリーン効果によりシワ防止効
果が発揮されているわけではないことが証明された。
同時に皮膚の弾力性をキュウトメーターで測定した結果（図―３５）UVB 累積照射で低有意に低下するすべての弾性パラメーター値が 1mM NPLT の塗布から、有意に改善し 5-10mM 濃度では UVB 未照射コントロールと同様なレベルの弾力性を維持できたいた。
さらに電子顕微鏡観察では観察した真皮弾性線維の湾曲化が NPLT の塗付濃度に依存して抑制され１mM 濃度からは、UVB 未照射と同様な程度のエラスチン線維の直線性を示した（図―３６）。

図―３１：線維芽細胞エラスターゼと好中球エラスターゼの酵素活性阻害パターン22図－３２：新規化合物 NPLT の構造、マトリックス分解酵素活性への阻害効果お
よびＵＶＢ誘導シワ形成への効果、B: a:UVB 未照射コントロール、ｂ：ｃＵＶ
Ｂ累積照射、ｃ：ＵＶＢ＋ＮＰＬＴ（１０ｍＭ）塗付、ｄ：ＵＶＢ＋ＵＶＢサンスクリーン剤 p-MCX（１０ｍＭ）塗付

(1mM)
(1mM)

図－３３：NPLT 塗付による UVB 累積照射によるヘアレスマウス皮膚シワ形成へ
の阻害効果

23

ＵＶＢ照射6週後

図－３４：UVB 累積照射によるラット足底皮膚でのシワの形成と NPLT 照射後塗布による抑制効果

図―３５：UVB 累積照射によるラット足底皮膚での皮膚弾力性の低下と NPLT 照射後塗布によるその抑制効果

24図―３６：UVB 累積照射によるラット足底皮膚真皮でのエラスチン繊維の 3 次元構造の変性と NPLT 照射後塗布によるその防止効果

この線維芽細胞由来エラスターゼの阻害剤の塗付により生じたシワの防止効果、
皮膚弾力性の低下防止効果およびエラスチン繊維の３次元構造における直線性の低下防止効果それぞれ異なる NPLT 濃度に対してプロットして相互に比較すると、wrinkle%と skin elasticity(Ur)間では r=-0.935826 p=0.0019 の強い相関関係が、skin elasticity(Ur)とエラスチン繊維の直線性(Fiber Linearity)の間では、r=0.903038 ,p=0.0053 の強い相関関係が、さらに wrinkle%とエラス
チン繊維の直線性(Fiber Linearity)間では r=0.992271,p<0.0001 の強い相関関係が認められ、エラスチン繊維の直線性と皮膚弾力性とシワの強度がそれぞれ強い因果関係にあることが明らかとなり、従って、紫外線照射により上昇する
線維芽細胞由来エラスターゼ活性を阻害することで、弾性線維の変性（湾曲化）を防ぎ、皮膚弾力性が維持される結果、シワの予防が可能であることが明らか
となった。

25

図－３７:

26

これまでの研究により、真皮線維芽細胞由来エラスターゼのシワ・タルミ形成における重要な役割が明らかとなったが、この真皮線維芽細胞由来エラスター
ゼ酵素の分離精製が成功していないことより、本酵素のアミノ酸組成が明らかではなく、種々の酵素学的性質は以下に述べるごとくある程度判明していたが、その本体は不明であった。図―ＸＸに示すのは各種マトリックス分解酵素の種類とその膜結合性および基質特異性についてまとめたものである。
すなわち真皮線維芽細胞由来エラスターゼ酵素は分子量 94kDa の膜結合型のメ
タロプロテアーゼでその至適 pH は中性領域にあることが判明していた。本酵素の候補酵素としては 92-と 72-kDa typeIV collagenase(gelatinase)、
neutrophil elastase, metalloelastase, cathepsin G, proteinase 3 などが巣推察できるが、メタロプロテアーゼとしては中でも 92-と 72-kDa typeIV
collagenase(gelatinase)が唯一あてはまるが、分子量および膜結合性の点で一致しなかった。
我々は広範囲の調査から Neutral Endopeptidase(Neprilisin)が分子量、膜結合性メタロプロテアーゼの特性、さらには阻害性パターンから真皮線維芽細胞由来エラスターゼ酵素の最有力候補と考え、両酵素の同一性について解析した。
Neutral Endopeptidase は神経細胞系で発現している酵素で分解できる基質は図―ＸＸに示したごとく、エンケファリン、エンドセリン、サブスタンス P, ブラ
ジキンイン、ニューロテンシン、キニン、アンジオテンシン、インシュリンな
ど多岐にわたるがエラスチンを分解できるのかどうかは不明であった。

27

真皮線維芽細胞由来エラスターゼが Neutral Endopeptidase と同一な酵素であるがどうかを検証するため、培養ヒト真皮線維芽細胞 を固定後に Neutral
Endopeptidase の特異抗体で免疫染色を行った結果、Control IgG に比べ強い免疫染色像が得られ、培養ヒト真皮線維芽細胞に Neutral Endopeptidase が発現していることが確認された。培養ヒト真皮線維芽細胞に Neutral Endopeptidaseが発現していることをそのエラスターゼ活性と特異的阻害剤による阻害特性から解析するため培養ヒト真皮線維芽細胞のセルライセイトを用いてEndopeptidase の特異抗体で免疫沈降処理を行った後の遠心上清でのエラスターゼ活性は、Control IgG 処理では明瞭なエラスターゼ活性が認められたのに対し、ほとんど消失した。またこの Control IgG 処理上清で認められるエラスターゼ活性は NEP の特異的阻害剤である Thiorphan およびメタロプロテアーゼの特異的阻害剤である Phosphoramidone により強く抑制された。一方本免疫沈降
処理後の沈殿部では Control IgG 処理では弱いエラスターゼ活性が認められThiorphan で阻害効果は全く認められないのに対して、Endopeptidase の特異抗体処理では高いエラスターゼ活性が認められ、この活性は Thiorphan 処理で顕著に抑制された。以上の結果は培養ヒト真皮線維芽細胞に認められているエラ
スターゼ活性は Neutral Endopeptidase であり、ヒト真皮線維芽細胞由来のエラスターゼ酵素は Neutral Endopeptidase と同一の酵素であることを示唆して

28

いる。

また免疫沈降の上清を用いたウエスタンブロットでは control IgG 処理では NEP
蛋白は検出されるのに対し、NEP 抗体処理では、NEP 蛋白は検出されず、沈査に処理 1，2，3 回目まで NEP 蛋白が検出され、一方 control IgG 処理の沈査にはNEP 蛋白は検出される、NEP 活性で解析した免疫沈降実験の結果と一致した。

29

ヒトエラスチンへの分解活性を Remazol Brilliant Blue 結合不溶性ヒトエラスチ
ンを用いて、遊離する Remazol Brilliant Blue を 605nm でその吸収度を測定することによる解析した結果、NEP 抗体を用いた免疫沈降で control IgG 処理の上清では明瞭なヒトエラスチン分解活性が認められたのに対して、顕著なヒトエラ
スチン分解活性の減少が認められ、また control IgG 処理の上清に NEP 阻害剤のThiorphan または Phosphoramidone の添加によりヒトエラスチン分解活性の顕著な阻害がみとめられたことから、ヒトエラスチンの分解活性を用いた解析からも、ヒト線維芽細胞でエラスチン分解活性を示す酵素は NEP であることが証明された。
NEP cDNA 発現ベクターをＣＯＳ細胞にトランスフェクションし、細胞ライセイ
ト で の エ ラ ス タ ー ゼ 活 性 を
STANA(A) とglutaryl-Ala-Ala-Phe-4-methoxy-2-naphthylamine（Ｂ）を基質として使用して測定した結果、いずれの基質によっても明瞭なエラスターゼ活性が検出され、ヒト線維芽細胞で発現しているエラスターゼ活性は NEP であることが明瞭になった。

30

31

本エラスターゼ活性はヒト線維芽細胞の継代数に比例して活性が増加する傾向を示し、この活性増加は遺伝子発現の増加を伴わない蛋白量の増加によることが示されている。

32

またマウス皮膚内のエラスターゼ活性はマウスの加齢に伴い増加する傾向を示した。

33

ヒト線維芽細胞エラスターゼの本体が NEP/Neprilisin であることが明らかになっ た こ と から エラスターゼの酵素活性測定 ( 基質 STANA ）に加えて遺伝子(real-time RT-PCR with specific primer)及び蛋白解析(Western blotting with
anti-CD10/NEP)が可能となった。

したがって、ＵＶＢ照射によって、いかなるメカニズムで線維芽細胞のエラス
ターゼの活性が上昇するのかのメカニズムを細胞レベルで解析した。
まずＵＶＢは真皮深くまでは到達しないが、表皮直下の真皮上層には到達して直接線維芽細胞に影響する可能性はあるので、まず培養ヒト線維芽細胞に UVB

34

を直接照射した場合、エラスターゼ活性が亢進するかどうかを調べた。その結果直接的な線維芽細胞の UVB 暴露はむしろＮＥＰ蛋白発現およびエラスターゼ
活性を低下させることが判明し、この可能性は否定された。

図－ＸＸ：

つぎにＵＶＢに暴露された表皮細胞から種々の液性因子が遊離し、真皮の線維芽細胞まで到達して、ＮＥＰ発現を亢進する可能性を考え、図ＸＸに示したご
とく、ＵＶＢで暴露した培養表皮細胞の培養上清を培養ヒト線維芽細胞に添加した際に線維芽細胞内の collagenaseI(MMP-1), Collagen, Elastin および NEPの遺伝子発現がどのように変化するのかを調べた。その結果ＵＶＢの照射エネ
ルギーに依存して、ヒト線維芽細胞内でエラスチンやコラーゲンの遺伝子発現に目立った変化はなかったが、ＭＭＰ－１とＮＥＰの遺伝子発現は有意に増加することが明らかとなった。

35

以上の UVB 暴露ヒトケラチノサイトの培養上清をヒト線維芽細胞に添加した後に生じる線維芽細胞内の NEP, MMP-1, コラーゲン、エラスチンの遺伝子発現の変化への作用は皮膚に UVB を累積照射後 14 週後に皮膚真皮での相当する分子の遺伝子発現量の変化と類似していた。

次にＮＥＰの蛋白発現量を解析した結果、ＵＶＢ未照射の表皮細胞からも NEP

36

蛋白発現増強される因子がわずかに放出されており、ＵＶＢを 80mJ/cm2 照射後
４８－７２時間で有意な NEP 蛋白発現の増加が認められた。
ＵＶＢ暴露ケラチノサイトの培養上清を培養ヒト線維芽細胞へ添加することにより線維芽細胞内の NEP 発現が上昇する事実をさらにより in vivo に近い実験系で確認するため、セルインサートを用いた共存培養系を構築した。本実験モ
デルではセルインサートに培養したケラチノサイトに UVB を照射したのち、セルプレイトに培養した線維芽細胞と共存培養し、線維芽細胞内でのＮＥＰ発現が増加するかどうかを解析するものである。UVB80mJ/cm2 をセルインサートに培養した human primary keratinocytes に照射した後、セルプレイトに培養した線維芽細胞と共存培養を行うと、１８時間後から未照射コントロールと比べて徐々に NEP 遺伝子発現量が増加し、４８時間後には顕著な増加が認められた。

図－ＸＸ：

37

図－ＸＸ：NEP 蛋白の発現は共存培養 48-72 時間後で UVB 40J/cm2 以上で明瞭な増加が認められ,エラスターゼ活性も UVB 80-100 mJ/cm2 照射後の共存培養４８時間に有意な上昇が認められた。以上の結果から、紫外線暴露された表皮細胞から分泌された液性因子がセルインサートのメンブランを通過して線維芽細胞に作用し、NEP 発現が増加するメカニズムが明らかとなった。

38

39

次にＵＶＢ暴露ヒトケラチノサイトから分泌され、線維芽細胞に働いて NEP の発現を増加させる液性因子（サイトカイン）を同定するため、まずＵＶＢを
80mJ/cm2 照射後 40 時間までに培養上清に分泌されるサイトカインを調べた結果、最も顕著に増加するサイトカインは IL-8 と GM-CSF で, IL-6 と IL-1 は中程度の増加、TNFはわずかな増加を示した。

この中で真皮線維芽細胞に働いて NEP の発現を増加させる主要なサイトカインを調べるために、UVB 暴露ヒトケラチノサイトの培養上清中のサイトカイン分泌量（UVB dose で変化）と培養上清添加後のヒト繊維芽細胞中の NEP 遺伝子発現量を比較した。その結果 NEP 遺伝子発現と IL-8 量の相関係数は R2=0.1192,
GM-CSF とは R2=0.947, TNFa とは R2=0.8628, IL-1a とは R2=0.9492 となり中で40

も GM-CSF/IL-1/TNF分泌量との相関が高く、これらのサイトカインが主として NEP の発現増強に関与している可能性が高いことを示唆した。

さらにエラスターゼ活性を上昇させる原因サイトカインを同定する目的で UVB
暴露ヒトケラチノサイトの培養上清を培養ヒト線維芽細胞に添加する際にこれらの中和抗体を同時に添加し、上昇する NEP の発現増強がどのサイトカインの中和抗体で抑制されるかを調べた。

41

42

本実験をエラスターゼ活性から解析した結果を図―ＸＸに示した。ＵＶＢ暴露の HaCaT 細胞の培養上清を培養ヒト線維芽細胞を添加する際に、IL-1, GM-CSF,
TNF, IL-8, IL-6, non-specific IgG 中和抗体を同時に添加しＵＶＢ暴露培養
上清が示すエラスターゼの上昇は IL-1, GM-CSF の中和抗体に有意な抑制効果が認められ TNF, IL-8, IL-6, non-specific IgG の中和抗体では抑制効果は認められなかった。IL-1, GM-CSF の中和抗体の本抑制効果は human primary
keratinocytes を用いた同様な実験によっても確認された。

43

44

同様な中和抗体による実験を NEP 蛋白発現発現量を指標にして行った結果、エラスターゼ活性を指標にした実験と同様にＵＶＢ暴露の HaCaT 細胞の培養上清を培養ヒト線維芽細胞を添加する際に、IL-1, GM-CSF, TNF, IL-8, IL-6,
non-specific IgG 中和抗体を同時に添加しＵＶＢ暴露培養上清が示すＮＥＰ蛋
白の上昇は IL-1, GM-CSF の中和抗体に有意な抑制効果が認められ TNF, IL-8,
IL-6, non-specific IgG の中和抗体では抑制効果は認められなかった。

45

以上の中和抗体を用いる実験で IL-1, GM-CSF がＵＶＢ暴露表皮細胞から分泌され、真皮線維芽細胞に働いてエラスターゼの発現を増強させ、エラスチン繊
維の弾力性を低下させシワ形成に働く可能性が示唆されたが、さらに実際にこ46

れらのサイトカインがヒト線維芽細胞に作用してエラスターゼ活性が増加するかどうかを解析した結果、IL-1, GM-CSF, TNF, IL-8, IL-6 の中では IL-1,
GM-CSF のみがエラスターゼ活性を有意に上昇させるサイトカインであることが確認された。

47

48

49

in vivo に近い実験系で確認するため構築したセルインサート共存培養系を用いても、培養上清を用いた実験と同様に中和抗体の実験をおこない、エラスター
ゼ酵素(NEP)発現増強を引き起こすサイトカインの同定を行った。
セルインサートに培養したケラチノサイトに UVB を照射したのち、セルプレイ
トに培養した線維芽細胞と共存培養し７２時間後、線維芽細胞内での上昇する
Ｎ Ｅ Ｐ発 現 を どの サイ トカ イン の中 和 抗体 が 抑制 でき るか を解 析し た 。
UVB80mJ/cm2 をセルインサートに培養した HaCaT 細胞または human primary
keratinocytes に照射した後、セルプレイトに培養した線維芽細胞と共存培養を行い、同時に中和抗体を添加し４８時間後に線維芽細胞のエラスターゼ活性を測定した。その結果、培養上清を用いた実験と同様に HaCaT 細胞を用いた実験では anti-IL-1, anti-GM-CSF, anti-TNF, anti-IL-8, anti-IL-6 の中では
anti-IL-1, anti-GM-CSF のみがエラスターゼ活性を有意に増強させる中和抗体であることが確認された。また human primary keratinocytes を用いた同様の実験でも anti-IL-1, anti-GM-CSF 添加により有意にエラスターゼ活性の上昇が抑えられることが確認された。

50

以上の中和抗体を用いる実験で IL-1, GM-CSF がＵＶＢ暴露表皮細胞から分泌され、真皮線維芽細胞に働いてエラスターゼの発現を増強させ、エラスチン繊
維の弾力性を低下させシワ形成に働く可能性が示唆されたが、さらに実際にこれらのサイトカインがヒト線維芽細胞に作用してＮＥＰ遺伝子発現が増加するかどうかを解析した結果、IL-1, GM-CSF, TNF, IL-8, IL-6 の中では IL-1,
GM-CSF と TNFがエラスターゼ活性を有意に増強させるサイトカインであることが判明した。ここで TNFa 添加によるP 遺伝子発現が２４時間後に有意に増加
した結果は、今までの anti-TNFa を用いた実験結果と一致しないがこの理由は不明である。

51

さらに実際にこれらのサイトカインがヒト線維芽細胞に作用してＮＥＰ蛋白発
現が増加するかどうかを解析した結果、IL-1, GM-CSF, TNF, IL-8, IL-6 の中では IL-1, GM-CSF がＮＥＰ蛋白発現を有意に増強させるサイトカインであることが判明したが、ＮＥＰ遺伝子発現を増加させる作用が見られた TNFはＮＥＰ蛋白発現を逆に有意に低下させた。

52

＃In vivo シワ改善効果が確認されているケミカルのエラスターゼ酵素発現上
昇に結び付くパラクリン―サイトカインメカニズムの抑制機構
最後にこれまでに解明されたシワ形成パラクラインサイトカインメカニズムが正しいシワ形成メカニズムであることの確認のため、すでに In vivo シワ改善効果が確認されているケミカルであるアスタキサンチン（＃）とコエンザイム
Ｑ１０（＃）は、本パラクラインサイトカインメカニズムのどこかを抑制できているはずで、この点を確認することにより、我々の解明したメカニズムの検証を行った。

53

図－ＸＸ：

図－ＸＸ：

54

図－ＸＸ：
セルインサート共存培養系を用いて HaCaT 細胞にＵＶＢ80mJ/cm2 を照射し、セルカルチャープレイトに播種したヒト線維芽細胞とアスタキサンチンまたは
還元型コエンザイムＱ１０を添加後４８時間共存培養し、線維芽細胞内のエラ
スターゼ活性を測定した結果、紫外線照射により上昇したエラスターゼ活性はアスタキサンチンまたはコエンザイムＱ１０の存在下で有意に低下し、いずれもエラスターゼ活性の上昇を抑制する作用があることが確認された。このエラ
スターゼ発現抑制の可能な作用点は以下のごとく考えられる。
１）本ケミカルがＵＶＢ照射によるエラスターゼ誘導サイトカインである IL-1,または GM-CSF の産生分泌を抑制する。２）IL-1または GM-CSF が線維芽細胞に働いてエラスターゼ遺伝子発現増強を引き起こすシグナル伝達経路のどこかを抑制する。
３）NEP 遺伝子発現から蛋白発現を経て活性化するまでの経路を妨害する。４）エラスターゼ活性を直接阻害する。

55

図－ＸＸ：

56

図－ＸＸ：
そこでまず１）の可能性を検証するために HaCaT 細胞に UVB(80mJ/cm2)を照射し培養液中に分泌してくる IL-1または GM-CSF 量を ELISA 法にて定量した。
その結果ＡＸは 8 M では IL-1と GM-CSF の分泌を有意に抑制したのに対して還元型コエンザイムＱ１０は IL-1は  M で有意にその分泌を抑制したが
GM-CSF の分泌は M まで抑制効果は全く認められなかった。

57

図－ＸＸ：

58

図－ＸＸ：
次に２）の可能性を検証するために、培養線維芽細胞に IL-1(n)または
GM-CSF(10nM) を添加し７２時間培養後のエラスターゼ活性を測定した結果
IL-1のエラスターゼ活性増加作用に対してはX は全く抑制効果を示さないのに対して、還元型コエンザイムＱ１０は M で有意なエラスターゼ活性上昇に対する抑制効果を示した。また GM-CSF のエラスターゼ活性増加作用に対してもＡＸは全く抑制効果を示さないのに対して、還元型コエンザイムＱ１０は M
で有意なエラスターゼ活性上昇に対する抑制効果を示した。３）の可能性は解析が困 難で あり 、ま た４ ）の 可能 性は UVB 未照 射ま たは IL-1(n) 、
GM-CSF(10nM)の未添加の実験でエラスターゼ活性の有意な低下が認めらていな
いので、否定される。

59

以上の結果から、AX と還元型コエンザイム Q10 のシワ抑制メカニズムはAX はエラスターゼ酵素誘導サイトカインである IL-1と GM-CSF の産生分泌抑制
が、還元型コエンザイム Q10 は主として IL-1と GM-CSF による NEP 発現増強シグナルの抑制に基づく可能性が示唆される。

＃In vivo でのエラスターゼ酵素関与メカニズムの確証

以上の我々の研究からシワの発生メカニズムが皮膚の弾力性の低下に基づいて起きており、この皮膚弾力性は真皮弾性線維の三次元構造と密接に関わっていることが初めて明らかとなった。さらに真皮弾性線維の三次元構造の変性に関与している因子としては紫外線刺激により真皮線維芽細胞より産生されるエラ
スターゼ（NEP）が中心的な役割を果たしていることも明確となった【図－２６】。
この一連のメカニズムはエラスターゼ阻害剤の塗布により紫外線によるシワ形成が顕著に予防されたことからも証明された。

60

⚫

紫外線によるシワ形成メカニズムとショウキュウエキスの抗シワ効果

我々は既に、光老化の特徴であるシワの発生には皮膚の弾力性低下が基盤にあり、この皮膚弾力性は真皮弾性線維が張力を充分に発揮できる直線的な三次元構造が重要な役割を担うことを明らかとした。また、紫外線誘導の動物シワモ
デルで紫外線反復照射によりメタロプロテアーゼに属する線維芽細胞由来エラ
スターゼ酵素活性が真皮で顕著に増加すること、さらに線維芽細胞由来エラス
ターゼ酵素を阻害する剤を紫外線照射直後に反復塗布することで、真皮弾性線
維の湾曲化が防止され、皮膚弾力性が維持された結果、シワの形成が予防できることが判明し、真皮線維芽細胞由来のエラスターゼ酵素による弾性線維の三次元微細構造の損傷が皮膚弾力性の低下を引き起こし、シワが形成されるという、 従来の solar elastosis やコラーゲン減少理論とは異なる新しい“シワ形成メカニズム”を明らかにした。これらの新しい知見に基づき、真皮線維芽細胞由来エラスターゼ酵素への高い阻害活性を有する生薬エキスとしてショウ
キュウエキスを見出し、本エキスが紫外線誘導動物モデルで真皮弾性繊維の湾曲化を防止し、明瞭なシワ形成抑制効果を示すこと、さらにヒト顔面のシワ形成の予防改善にも有用な効果を有することが明らかとなった。すなわちシワ形
成メカニズムで重要な役割を果たしているエラスターゼ酵素の阻害剤が臨床的にも有効な抗シワ剤として使用可能であることが示唆された。
1. はじめに
近年、年代を問わず女性の素肌の美しさに対する意識が高まりつつある。加齢による顔面皮膚の変化には、シワやタルミなどの形状的変化と、シミや色素沈
着などの色彩的変化とが挙げられる。その中でもシワの発生は典型的な老化に伴う皮膚の外観的変化であり、メイクで簡単に隠すことも難しいことから女性にとって深刻な皮膚の悩みとして捉えられている。近年シワの発生の主な要因、また予防法や治療法に関して皮膚科施設などを中心にして数多くの研究がなされている。我々もシワの発生メカニズム解明やその予防法に取り組む中で、動物モデル実験によりシワの発生の初期段階では皮膚の弾力性が低下することが重要な誘導因子であり、皮膚の弾力性を司る主要な成分であるエラスチン線維の 3 次元微細構造が紫外線照射や自然老化により変性すること、またこの変性
は真皮線維芽細胞が産生分泌するエラスチン分解酵素、線維芽細胞由来エラス
ターゼ酵素の働きによることを明らかとした。この考え方は、従来の代表的なシワ形成メカニズムであるエラストーシス説（変性エラスチンの蓄積由来説）
やコラゲナーゼの活性化にともなうコラーゲン繊維減少説とは異なるものであ61

る。本稿では、近年我々が行ってきたこのエラスチン/エラスターゼネットワー
クの紫外線誘導シワ形成メカニズムへの関与について解説し、線維芽細胞エラ
スターゼ阻害効果を有する生薬エキスを動物シワモデルを用いてその効果を検証するとともに、ヒト眼瞼周囲部に塗布することにより抗シワ効果を確認した事例を紹介する。
5. エラスターゼ阻害剤による抗シワ効果
すなわち線維芽細胞由来エラスターゼ酵素の阻害活性をもち皮膚吸収性を有する物質は紫外線照射で引き起こされるシワ形成を防止することが明らかとなったが、NPLT そのものは安全性の観点からヒトに使用できないので、この物質を用いて抗シワ効果をヒトで実証することは実際上難しい。そこで、安全性が充分に高い約 400 種類の生薬エキスから線維芽細胞由来エラスターゼ酵素を阻害する生薬エキスを探索した結果、その中からショウキョウエキス (Zingiber
officinale (L.) Rose) 【図－２７】 に高い活性を見出した[o―３９]。この
ショウ
図－２７：

キョウエキスは、ショウガ科ショウガの根茎から抽出され多くの薬理作用が報告されているエキスであるが、皮膚に刺激をもたらす shogaol や gingerol が含まれている[o-29]。しかし、我々はそれらの精油成分を除いた水溶性成分に NPLTの有する阻害活性に類似した高い線維芽細胞由来エラスターゼ酵素の阻害活性があることを見出し【図－２８】、皮膚刺激のないエキスを抽出しヒトで使用することが可能になった。

62

図－２８：ショウキョウエキスのエラスターゼ阻害性
フィブロブラストエラスターゼ

好中球エラスターゼ

図－ＸＸ：
シワ改善剤は医薬部外品の主剤としてはまた登録されていないが、新規登録への要望は強いものがあり評価委員会が作られ評価に関するガイドラインが提出されている。
皮膚に人工的にシワを形成させることは、時間がかかりすぎて困難なことから、シワ改善剤のヒト評価は顔面にシワをすでに有する被験者を用いるのが通例である。顔面の特に目じり周辺のシワに限定して左右のシワへの比較試験もしくは 2 群に分けての同様に目尻周辺のシワへの効果を皮膚科専門医によるシワ強度の肉眼判定、さらにレプリカもしくは直接レリーフ取り込み装置でのシワの画像解析(2 次元および 3 次元）を行い、肉眼判定の際の最終有効性判定の参考にする場合が多い。また同時にシワ部位の皮膚弾力性をキューとメーターなどで評価し、皮膚弾力性への改善効果も示すことにより、シワ改善剤の効果の確認とすることができる。
⚫ シワ目視評価
使用した写真スケールは、以前我々の報告に従い作成し [a-8]、専門パネラ
ー1 名により評価を行った。目尻、下眼瞼のそれぞれの写真スケールを基に被験者のシワについて、以下に示す５段階の基準（0: シワがない、1:わずかにシワがある、2:シワがある、3:はっきりとシワがある、4:かなり深いシワがある）を用いて、スコア評価を行った。
図－３３：

63

１日２回、ハーフフェイスで１２ヶ月塗布
アウトドアータイプ男性(
アウトドアータイプ男性(２７－４９才、平均３７．６才)
２７－４９才、平均３７．６才)２０名

目尻

mean±SEM

1.8

しわスコアー

1.6

##

1.4

##

sample1.2**

1placebo

**

0.8
***

0.6

0

3

7
Time (month)12***,**, *：p<0.001, 0.01, 0.05 (vs sample 0 month)##, #：p<0.01, 0.05 (vs placebo 0 month)

図－ＸＸ：

しわ目視スコアの判定基準
0.しわがない
0.しわがない
2.わずかにしわがある
2.わずかにしわがある※しわの程度が上に示した判定基準の間の時は、中間のスコアを割り当てることとする。

4.しわがある
4.しわがある
6.はっきりしたしわがある
6.はっきりしたしわがある
8.かなり深いしわがある
8.かなり深いしわがある

フォトスケールの一例

Grade 1
Grade ２
Grade ３

Grade ５

Grade ４

図－３５：写真評価の実例
シワ接写写真撮影は、我々の以前の方法を用いて行った [a-8]。すなわち、被験者は座位にて軽く目を閉じた状態で行った。撮影にはミノルタα707si(Minolta, Tokyo, Japan)および Fujicolor super G Ace 100(富士フィル
ム)を使用し、顎を眼科用固定台に乗せ、カメラは三脚に固定して斜め 45 度方向に配置し、被写体との距離を一定にして左右両方向から撮影した。その後、シャッター速度 60, 絞り 22 で接写した。なお、使用した各フィルムの先頭に標準色見本を撮影し、同様になるように現像を行った。
5 段階の写真スケールを用いて専門パネラーがブラインドにてシワの目視評価を行った結果、目尻では、塗布前の値と比較して 12 ヶ月後では、プラセボ側では、シワスコアが有意に増加 (p<0.01) しており、ショウキョウ抽出液側では、

64

スコアが有意に減少(p<0.01)していた【図－３６】。一方、下眼瞼部位においても塗布前の値と比較して塗布から 12 ヶ月後では、プラセボ側はシワスコアの有 意 な 増 加 (p<0.05) が 認 め ら れ 、 シ ョ ウ キ ョ ウ 抽 出 液 側 で は 有 意 な 減 少(p<0.01)が認められた 【図－３７】。目尻部での処理前と一年後のシワスコア
ーの比較を行った結果【図－３８】サンプル無塗布部位でシワスコアーの平均は増加傾向にあるのに対し、サンプル塗付部位ではシワスコアーの有意な減少が認められている。サンプル塗布前と 12 ヶ月後の目周辺部位について代表的な接写写真を【図－３９】に示した。
１日２回、ハーフフェイスで１２ヶ月塗布
アウトドアータイプ男性(２７－４９才、平均３７．６才)２０名

下眼瞼

目尻
1.8

1.8

1.6

1.6

sample###wrinkle score

sample1.2

placebo

**

1

**

0.8
***

0.6

placebo

##

1.4

0

3

7

1.4

##

#

1.2
1
**

0.8
0.6

12

Time (month)

***

0

3

7
Time (month)***,**, *：p<0.001, 0.01, 0.05 (vs sample 0 month)***,**, *：p<0.001, 0.01, 0.05 (vs sample 0 month)##, #：p<0.01, 0.05 (vs placebo 0 month)##, #：p<0.01, 0.05 (vs placebo 0 month)

図－ＸＸ：

図―ＸＸ：

目尻
SampleVehicle4
p<0.01p<0.01

wrinkle score

wrinkle scoremean±SEM

mean±SEM

3

2

1

0

図－ＸＸ：

0M

12M

0M

Period (month)

12M

Period (month)

65

**

12

beforeafter

before

after

0M

12M

B: age-38

A: age-35

samplesampleplaceboplacebo

0M

12M

図－ＸＸ：

有効例（目尻）３０代目尻BEFORE

4０代目の下AFTER

有効例（目の下）

BEFORE

AFTER

図－ＸＸ：

66

ショウキョウエキスのシワ改善効果評価試験でのレプリカ評価の実例[b-5]
サンプル塗布前と 12 ヶ月後の目周辺部位について作成した代表的なレプリカの写真を【図－６４】に示した。これらのレプリカの画像解析を行った結果、
大じわでは、プラセボ側は塗布前と比較して 12 ヶ月後では有意な画像解析面積比(%)の増加(p<0.001)が認められた。一方、ショウキョウ抽出液側では、塗布前と比較して 12 ヶ月後では有意な減少(p<0.001)が認められた【図－６５】。
一方、小じわでは、プラセボ側は、塗布前と比較して 12 ヶ月後に有意な画像解析面積比(%)の増加(p<0.01)が認められたが、ショウキョウ抽出液側では 12 ヶ月後に有意な減少(p<0.001)が認められた 【図－６６】。また１２ヵ月後でのショウキョウ塗布群
塗布前

プラセボ塗布群
塗布前

12ヶ月後

12ヶ月後

42歳

38歳

38歳

37歳

眼瞼周囲部しわのレプリカ代表例

図―６５：目周辺部よりO１．８ｃｍ
大じわ
目周辺部位
小じわ

mean±SEM

3.5

10

###

3

##

placebo

2.5
***
***

fine wrinkle (%)

wrinkle (%)

sample

8
7

*

6
***

5

***

1.5

0

0

3

7
Time (month)mean±SEM

9

###

2

sampleplacebo3

12

7Time (month)***,*：p<0.001, 0.05 (vs sample 0 month)***,*：p<0.001, 0.05 (vs sample 0 month)###, ##：p<0.001, 0.01 (vs placebo 0 month)###, ##：p<0.001, 0.01 (vs placebo 0 month)

図－ＸＸ：

図―ＸＸ：

67

12

各被験者の顔面左右の試験開始前のレプリカ解析を比較した結果を【図―６７】にしめしたが、コントロール対側が有意なシワ面積％の増加を示しているのに対し、ショウキョウ抽出液側では有意なシワ面積％の減少を示し、ショウキョウ塗布によるシワの改善効果が示された。

図－ＸＸ：

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