⽂献セミナー（1/31）回答
B4 野崎 多実⼦
セミナーは Imidazolidinone 形成によるタンパクの N 末修飾法とその応⽤について⾏いました。以下、セミナーでいただいた質問について回答いたします。
概要

Imidazolidinone 形成法 Q12PCA 法

TA4C 法Q2

応⽤ Q5
タンパクの細胞内への輸送 Q3ADC Q4

Q1. 各 Imidazolidinone 形成法の buffer 検討
実際にタンパク反応に⽤いている buffer 以外の buffer では反応性は⼤きく変化するのか。

・2PCA（論⽂中のタンパクとの反応には phosphate buffer を使⽤）

MacDonald JI, et al (2015). Nature chemical biology;11(5):326-331.

グルタチオン添加による収率の減少は、グルタチオンのチオールと 2PCA の間で⽣じる可逆的な相互作⽤によると考察されています。また、論⽂中に⾔及はありませんでしたが、Tris buffer に関しては⼀級アミンが存在することによる影響で収率が減少するのではないかと思います。
・TA4C（論⽂中のタンパクとの反応には MOPS を使⽤）タンパクと TA4C との反応の buffer 検討については詳細な記述がありませんでした。以下には、TA4C 合成（Dimroth転移）の additive 検討の情報を載せておきます。

Onoda, A., Inoue, N., Sumiyoshi, E., & Hayashi, T. (2020).. ChemBioChem,

Additive として sulfonate を含む化合物あるいは buffer を⽤いると Dimroth 転移の収率が向上することが⽰されており、buffer はタンパク反応前に除かなくても良いため 2 step タンパク修飾反応を容易にするとして MOPS が選ばれました。この 1 step ⽬で MOPS を使うこと、および 2PCA のタンパク反応において MOPS 中で⾼い収率が得られていることから、2 step ⽬のタンパク反応でも MOPS が使われることになったのではないかと考えています。

Q2. Dimroth 転移反応機構
Dimroth 転移の反応機構は以下の通りです。

※

ジアゾイミンの閉環（※）は、下の図のように、π電⼦共役系に直⾏する窒素原⼦の孤⽴電⼦対の流れ込みによるσ結合形成によるものです。

L'abbé, G. (1990). Bulletin des Sociétés Chimiques Belges, 99(4), 281-291.

Q3. RNaseA の N 末ポリマー修飾による細胞内導⼊について機能に影響を及ぼすことなく...なぜ？酵素活性点が N 末から遠いから？つまりこの場合はラッキーだった？

RNaseA の N 末ポリマー修飾が RNaseA の機能に影響を与えない理由としては、N 末のリジンは酵素活性に関与せず、酵素活性点からも離れていることが考えられます。
RNaseA の酵素活性点は His12, Lys41, His119 であり、タンパクの結晶構造で⾒ても N 末からは離れていることが分かります。

Leland, P. A., & Raines, R. T. (2001). Chemistry & Biology, 8(5), 405-413.

PDB : 5RSAQ4. Imidazolidinone 形成法の ADC への応⽤について

セミナーにおいて説明が不⼗分でしたが、紹介した論⽂では HER2 抗体の Fab と IgG のそれぞれについて
6-AM-2-PCA による N 末修飾を⾏なっています。それぞれの修飾に引き続いた実験としては以下が⾏われました。
＜Fab 修飾＞
In vitro 蛍光イメージング、LC-MS による修飾個数の計測、LC-MS/MS による結合箇所の確認、⽣細胞に対する抗体機能維持の確認（HER2 抗原発現細胞に対する assay）＜IgG 修飾＞
In vitro 蛍光イメージング、修飾による IgG の機能維持の確認（HER2 タンパクに対する KD 値の測定）
・DAR は算出されているのか

セミナーでお答えしたように、DAR は今回の論⽂では算出されていません。ただし、1 つの Fab に対していくつの 6-AM-2-PCA 修飾が⼊ったかについては MS を⽤いた解析が⾏われ、1 つ修飾が⼊った Fab が 43%(2)、2 つ修飾が⼊った Fab が 36%（(3) + (4):ヘミアミナール体）であることが分かっています。

hemiaminal

hemiaminal
Li, D. Z., Han, B. N., Wei, R., Yao, G. Y., Chen, Z., Liu, J., ... & Zhao, Q. (2018). MAbs, 10(5), 712719

Q5. Application についての他の N 末修飾法との⽐較

I

Application は、imidazolidinone formation 法と他の⽅法を⽐較している論⽂はないか？Imidazolidinone 形成法は他に⽐べて機能⾯でどのくらいメリットがあるのか？

Imidazolidinone 形成法と酸化的カップリングのそれぞれを⽤いて酵素の再利⽤を⾏なった論⽂があります。
この論⽂では、酵素の N 末端を Lithocholic acid(LA)で修飾し、LA と βCD の⾼い affinity を利⽤して βCD resin で酵素を回収した後、βCD を加えて競合させて resin から外すことで酵素の繰り返し使⽤を可能にしました。
タンパク N 末の LA 修飾には 2PCA を⽤いた
imidazolidinone 形成法と、o-aminophenole を⽤いた酸化的カップリング法を⽤いています。

Rosen, C. B.,(2016). ACIE, 55(30), 8585-8589.

＜Imidazolidinone 形成法＞

Imidazolidinone 形成法では LA-2PCA を合成し、βCD 存在下、タンパクと反応させて 71%収率で N 末修
飾タンパクを得ています。
（問題点）
・LA が⽔に溶けにくいため、LA-2PCA を溶解させるために 10% MeOH を加える必要があり、このMeOH の存在がタンパクの folding に影響を与える可能性がある。
・Imidazolidinone は⾼温下で加⽔分解を受けうる。
＜酸化的カップリング＞

酸化的カップリングではタンパクの触媒活性部位のシステインを DTNB(Ellmanʼs reagent)で保護し、βCD存在下、LA-o-aminophenole を加え K3Fe(CN)6 存在下で酸化し、68%収率で N 末修飾タンパクを得ます。
（Imidazolidinone 形成法に対する利点）
・βCD 過剰な条件で反応を⾏うため、LA-o-aminophenole は少量加えるだけでよく、MeOH を加えなくても溶解可能である。
・30 分以内で反応が可能である。
（問題点）
・N 末の Pro に対して特に効率よく反応が進⾏するため、タンパクの N 末に Pro を挿⼊するように改変を⾏う必要がある。
・Cys でカップリングが起こってしまうのを防ぐため、酵素活性部位の Cys を保護する必要がある。
以上のように、反応時間の観点、あるいは修飾化合物の物性によっては酸化カップリングがより有効なこともありますが、Pro 挿⼊や Cys 保護などの⼿間を考えると、簡便さや普遍性の⾯では Imidazolidinone 形成法がより優れていると⾔えると考えています。