クローニング実験ハンドブック−保存版−★ライゲーションの基本から
ディレクショナルクローニングまで★
（2021年4月修正版）

目次

クローニング実験（操作の流れ）・ In-Fusionクローニング
・ TAクローニング・ 制限酵素／ライゲーション

cDNA合成核酸精製
アガロースゲル電気泳動

本ハンドブックでは、
In-Fusionクローニング法、TAクローニング法および制限酵素／ライゲー
ション法 の 解 説に加え、クローニングの 前 後に必 要な各 種 実 験 操 作（ D N A 精 製 、c D N A
合成、PCR など）の概要を紹介しています。
クローニングを初めて行う方から経 験されている方まで、多くの 研 究 者 の 皆 様に役 立つ『クローニング実験ハンドブック』を、
どうぞご活用ください。

クローニング方法について
目的のDNA（ターゲット配列）
を任意のベクターに組み換える操作をクローニングといいます。
ここでは、よく使われるクローニング法のうち、In-Fusionクローニング法、TAクローニング法、制限酵素／ライゲー
ション法を紹介します。それぞれの特長をおさえて、実験目的に応じた最適な方法を選んでください。
（実験操作の詳細は3ページ以降をご覧ください。）

In-Fusionクローニング法

おすすめ▶実験操作の詳細は3ページへ

DNA断片同士の末端15塩基の相同配列を融合させることでクローニングを行います。
使用する任意のベクターの末端配列を利用してクローニングを行うため、あらゆるベクターが使用でき、余分な配列が一切付加されず、しかもディレクショナルクローニングを行うことができる優れた手法です。
PCRクローニングを行えば、制限酵素も不要です。

✓ どんなベクターのどんな位置にもディレクショナルクローニングが可能✓ 短鎖から長鎖（50 bp〜15 kb）
まで効率よくクローニングが可能✓ 一挙に複数DNA断片を挿入するマルチクローニングが可能✓ In-Fusion反応はわずか15分で完了

TAクローニング法▶実験操作の詳細は5ページへ

Taq DNAポリメラーゼなどをベースとするPCR酵素を用いて得られた増幅産物のほとんどは、その3ʼ末端にデオ
キシアデノシン（dA）が一塩基付加されています。
TAクローニングでは、3ʼ末端にデオキシチミジン（dT）
を一塩基付加したTベクターを使用し、PCR増幅産物のdA一塩基突出部分と相補的となることを利用して簡便にクローニングを行います。
（インサートDNAの5ʼ末端のリン酸化は不要です。）
ライゲーション試薬とTベクターのセット

Mighty TA-cloning Kit

平滑末端を持つPCR産物のTAクローニングにMighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR※ PrimeSTAR DNA Polymeraseなどα型DNAポリメラーゼによる増幅産物のほとんどは、酵素自身がもつ強力な3ʼ→5ʼ
exonuclease活性により平滑末端となっているので、その増幅産物の末端にdAを付加したのちTAクローニングを行います。
（PCR酵素の種類と末端形状については6ページをご覧ください。）

鎖長が5 kb以上のPCR産物には平滑末端クローニングをお勧めします

Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)

制限酵素／ライゲーション法▶実験操作の詳細は7ページへ

制限酵素でベクタープラスミドとインサートDNAをそれぞれ切断した後、DNAリガーゼやライゲーション試薬を用いて連結させる方法です。遺伝子組換え実験の基本操作として長年利用されています。
ライゲーション効率の高さがクローニングの成功の鍵です。

−1−

Ligation MixをDNA溶液と混合するだけでライゲーション反応が可能（突出末端、平滑末端）。高いライゲーション効率を実現

DNA Ligation Kit <Mighty Mix>

10 kbを超える長鎖DNAのクローニングに

TaKaRa DNA Ligation Kit LONG

| クローニング実験ハンドブック

●クローニング方法別、操作の流れ ●In-Fusionクローニング

TAクローニング

PCR増幅

制限酵素／ライゲーション

PCR増幅

増幅確認

増幅確認

1日目

In-Fusion反応

2日目

1日目

増幅産物精製

ライゲーション

制限酵素消化・精製

形質転換

ベクター脱リン酸化

2日目

目的クローン取得

・ 少ない操作ステップ

増幅確認

1日目

増幅産物精製

形質転換
目的クローン取得

PCR増幅

ライゲーション

2日目

形質転換・ 実験時間を約1〜2日短縮

In-Fusionクローニング法は簡便でスピーディーな手法です！

3日目

目的クローン取得※上記は標準的な実験操作での比較です。場合により、操作ステップや実験時間は増減する場合があります。

■ 最適なクローニング法を選びましょう
In-Fusionクローニング

TAクローニング
A 3ʼ

3ʼ A

インサート

インサート

ベクター

T

制限酵素／ライゲーション
HI

T

Tベクター

インサート

d III

線状化
ベクター

成功率の高いクローニングがしたい
複数断片を一度にクローニングしたい

ディレクショナル
クローニングがしたい
制限酵素サイトがない、もしくは合わない好きなベクターの好きな位置に入れたい

制限酵素を使わずにクローニングしたい
クローニングにかかる時間を短縮したい
長鎖のインサートを挿入したい
とにかくコスト重視でクローニングがしたい■ クローニング関連製品 ガイドブック

逆転写酵素
PrimeScriptシリーズ

クローニング
コンパクトガイド

In-Fusionクローニングガイド

核酸抽出・精製カタログ＜製品一覧＞

・MACHEREY-NAGEL

PrimeScript™シリーズ

決定版！

特長・用途

より高品質の完全長cDNA合成に

リアルタイムRT-PCR用
逆転写キットPrimeScript™
Reverse Transcriptase

PrimeScript™ II
Reverse Transcriptase

PrimeScript™ RT reagent
Kit（Perfect Real Time）

・PrimeScript RTaseのディスプレー
スメント伸長活性により、
バックグ
ラウンドの低いcDNA合成が可能

・アクセサリータンパク質の添加により、さらに非特異的伸長を抑えてバックグラウンドのきわめて低い
cDNA合成を実現

cDNA合成のスタンダード

・高い伸長性・強固な高次構造RNAにも対応

・長鎖RNAからの完全長cDNA合成に最適

・リアルタイムRT-PCRに最適化した
逆転写キット・反応時間は15分

PCR

核酸調製
核酸精製

発現系の選択PCR からタンパク質精製まで、
タカラバイオは皆様のクローニングをトータルにサポートします。
クローニングに役立つ製品情報が満載です。
あなたのそばにいつもこの 1 冊を！

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★★

★★

★★★

★★

伸長性
（増幅実績）〜13.5 kb

〜13.5 kb

-

反応温度

42℃

42℃

37℃

42℃
（37℃）
での反応で鋳型RNAのダメージを最小限に抑えながら、PrimeScript RTaseのディスプレース
メント伸長活性により、高次構造RNAや長鎖RNAに対してもバックグラウンドの低いcDNA合成が可能

形質転換・
インサートチェック

-

掲載ページ

p. 1〜230〜60分

7D.D5D7DT+RW6WDUW9HUVLRQ（基本の 3&5）
7D.D5D7DT ™シリーズ

p. 5〜6※各酵素はRNaseH活性を持たず、mRNAからのcDNA合成を阻害しません。

マルチプレックス PCR 用
バイサルファイト処理済'1$ 用

0LJKW\$PSIRU&DUG'\H 入りプレミックス試薬〒103-8232 東京都中央区日本橋2丁目15-10
TEL.03-3271-8553 FAX.03-3271-7282〒525-0058 滋賀県草津市野路東七丁目2番62号
TEL.077-565-6969 FAX.077-565-6995
製品に関する技術的なお問い合わせ(PHUDOG$PS3&50DVWHU0L[
6DSSKLUH$PS)DVW3&50DVWHU0L[¥101,000

RR001B¥97,000

RR001C¥248,000

RR01AM¥30,000

1,000 U（AM×4）

RR01BM¥97,000

3,000 U（AM×12）

RR01CM¥248,000

125 U

RR042A¥29,000

500 U（A×4）

RR042B¥92,000

125 U

RR002A¥27,500

500 U（A×4）

RR002B¥88,000

125 U

RR02AG¥27,500

500 U（AG×4）

RR02BG¥88,000

250 U

R007A

¥29,000

R007B¥92,000

R001A¥27,500

R001B¥88,000

R001C¥220,000

R001AM¥27,500

R001BM¥88,000

1,000 U（A×4）

250 U

R001CM¥220,000

100回

R300A

¥10,500

400回（A×4）

R300B¥33,500

100回

R090A

100回

RR062A¥34,000

400回（A×4）

RR062B¥109,000

250 U

R110A

¥32,000

R110B¥96,000

R071A¥31,500

1,000 U（A×4）
250 U
1,000 U（A×4）

R071B¥16,000

R072A¥40,000

800回（A×4）

R072B¥136,500

40回

R073A

¥21,000

160回（A×4）

R073B¥68,000

200回

R074A

¥52,500

160回

RR320A

¥6,700160回

RR300A¥17,000

800回（A×5）

RR300B¥63,000

160回

RR350A¥17,000

800回（A×5）

RR350B¥63,000䖵 㟁ẼὋື⏝䝞䝑䝣䜯䞊䠄TBEᇬTAE䠅䖵 䛭䛾௚䝞䝑䝣䜯䞊䠄Tris䚸TE䠅䕺᰾㓟㟁ẼὋື⏝䜰䜺䝻䞊䝇䖵 䝇䝍䞁䝎䞊䝗䜰䜺䝻䞊䝇 䞉䞉䞉 AgaroseᇷTAKARAᇸ䝅䝸䞊䝈

Ὃື⏝䝀䝹
䛾స〇

䖵 㧗ᶵ⬟䜰䜺䝻䞊䝇 䞉䞉䞉 PrimeGel™ Agarose䝅䝸䞊䝈䕺 DNAศᏊ㔞䝬䞊䜹䞊㐺ษ䛺䝃䜲䝈䛾
ศᏊ㔞䝬䞊䜹䞊
䜢㑅ᢥ䖵 DNA Ladder 䠖 Ready-to-use䝍䜲䝥䠋Loading Bufferูῧ௜䝍䜲䝥䖵 DNA Digested Marker䕺㟁ẼὋື⿦⨨Mupid䛷㟁ẼὋື䖵 Mupid®䝅䝸䞊䝈䕺᰾㓟ᰁⰍヨ⸆ SYBR® Green 䝅䝸䞊䝈¥101,000

200回

タカラバイオテクニカルサポートライン䝀䝹䜢ᰁⰍ䛧䛶
┠ⓗ䛾䝞䞁䝗䜢᳨ฟ䖵 SYBR® Green I 䠄஧ᮏ㙐DNA⏝䠅䖵 SYBR® Green II 䠄୍ᮏ㙐DNA䚸RNA⏝䠅䕺䜰䜺䝻䞊䝇䝀䝹䛛䜙䛾᰾㓟ᢳฟ䞉⢭〇䝀䝹䛛䜙
DNA᩿∦䜢ᅇ཰䖵 NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up䠘䝁䝻䝙䞊PCR䛷䛾䜲䞁䝃䞊䝖䝏䜵䝑䜽౛䠚

TEL.077-543-6116 FAX.077-543-1977
東京支店
関西支店

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TaKaRa テクニカルサポートライン
製品の技術的なご質問に専門の係がお応えします。

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䕺䝞䝑䝣䜯䞊䠄䝟䜴䝎䞊䝍䜲䝥䠅Ὃື⏝䝞䝑䝣䜯䞊
䛾ㄪ〇・本カタログで紹介した製品はすべて研究用として販売しております。
ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
・ライセンス情報については弊社ウェブサイトにてご確認ください。
・本カタログに記載された社名および製品名は、
特に記載がなくても各社の商標または登録商標です。
・本カタログ記載の価格は 2014 年 6 月 30 日現在の希望小売価格です。
価格に消費税は含まれておりません。

ウェブサイト

http://www.takara-bio.co.jp䛂䝞䝑䝣䜯䞊ㄪ〇䛃䛛䜙䛂DNA᩿∦ᅇ཰䛃䜎䛷䚸᰾㓟㟁ẼὋື䛾඲䛶䛾䝇䝔䝑䝥䜢䝖䞊䝍䝹䝃䝫䞊䝖¥30,000

1,000 U（250 U×4）

3,000 U（AM×12）

7D.D5D(SL7DT+6
（IRUELVXOILWHWUHDWHG'1$）¥31,500

RR006B
RR001A

2016ᖺ6᭶ᨵゞ¥31,500¥101,000

RR006A

3,000 U（B×3）

3,000 U（B×3）

0XOWLSOH[3&5$VVD\.LW9HU 1HZ¥37,000¥31,500

R010B

᰾㓟㟁ẼὋື 㛵㐃〇ရ䜺䜲䝗¥24,000¥101,000

R010A

1,000 U（AM×4）

0LJKW\$PS*HQRW\SLQJ.LW(PHUDOG$PS0$;3&50DVWHU0L[

関西支店

核酸電気泳動
関連製品ガイド¥105,000

R045B


7D.D5D7DT（0JIUHH%XIIHU）

0LJKW\$PS'1$3RO\PHUDVH9HU

R050B
R045A

250 U

プラスミド精製

タンパク質精製

R050A

250 U

1,000 U（250 U×4）0LJKW\$PSIRU))3(

15分
サンプル品ご提供中

p. 3〜4

7D.D5D/$7DT ZLWK*&%XIIHU

パワフルな 3&5
クルードサンプルに

東京支店
30〜60分

7D.D5D/$7DT ¥101,000

R091A

400回（A×4）

7D.D5D7DT

7D.D5D7DT+6/RZ'1$ 1HZ

クローニング

2015-2016★★

反応阻害要因への耐性

サンプル品

7D.D5D/$7DT +RW6WDUW9HUVLRQ¥31,500

R060B

100回
250 U

250 U

7D.D5D([7DT (0JIUHH%XIIHU)

2014-2015

価格（税別）

R060A

250 U

1,000 U（A×4）
1,000 U（A×4）

制限酵素ハンドブック（基本の 3&5）
7D.D5D/$7DT  シリーズ

製品コード

100回
1,000 U（A×4）

250 U

7D.D5D([7DT 

7D.D5D7DT+63HUIHFW0L[ 1HZ

高品質cDNA
合成

反応時間（基本の 3&5）
7D.D5D([7DT  シリーズ

容量
250 U
1,000 U（A×4）

7NV*IOH['1$3RO\PHUDVH/RZ'1$ 1HZ

3ULPH67$50D['1$3RO\PHUDVH
3ULPH67$5+6'1$3RO\PHUDVH

マッハライ・ナーゲル 核酸抽出・精製

製品名

7NV*IOH['1$3RO\PHUDVH

3ULPH67$5*;/'1$3RO\PHUDVH
高正確性 3&5 酵素
3ULPH67$5 シリーズ

2%4'P\[OGU)WKFG

クローニング

高い成功率！
様々な場面に 7NV*IOH[7D.D5D([7DT +RW6WDUW9HUVLRQ

コンパクトガイド
逆転写酵素
・キット
の特長

制限酵素ハンドブック 2014-2015

PCR Enzymes Guide

本ガイドでご紹介した製品のうち、主要なものを一覧にまとめています。
製品名

核酸抽出・精製2015-2016

ワンランク上の逆転写酵素

制限酵素ハンドブック

TEL 03-3271-8553
TEL 077-565-6969

TEL 077-543-6116

Website䝀䝹䠖 Agarose L03 䛂TAKARA䛃䠄䝀䝹⃰ᗘ ᧭᧡䠅䝬䞊䜹䞊䠖 DL5,000 DNA Marker
PCR㓝⣲䠖 EmeraldAmp MAX PCR Master Mix

FAX 03-3271-7282
FAX 077-565-6995

FAX 077-543-1977

http://www.takara-bio.co.jp

 年  月作成 .

| クローニング実験ハンドブック−2−

In-Fusion クローニング

ClontechのIn-Fusion酵素を用いてDNA断片同士の末端15塩基の相同配列を融合させることでクローニングを行います。使用する任意のベクターの末端配列を利用してクローニングを行うため、あらゆるベクターが使用でき、余分な配列が一切付加されず、しかもディレクショナルクローニングを行うことができる優れた手法です。

原理と特長●インサートの種類、クローニング部位、ベクターを選ばずディレクショナルにクローニング●短鎖から長鎖（50 bp〜15 kb）
まで効率よくクローニング可能●１回の反応で、複数DNA断片の同時クローニングも可能● In-Fusion反応はわずか15分で完了
5 × In-Fusion HD Enzyme & dH2O
①

PCR
線状化
ベクター

②

②制限酵素処理またはインバースPCRにより線状化ベクターを用意し、①のPCR産物※とIn-Fusion酵素を混合する。
※非特異的な増幅がある場合にはスピンカラム精製を、シングル
バンドの場合はCloning Enhancer処理を行って使用してください。

③
目的クローン

操作方法の概要③ 50℃15分のIn-Fusion反応によりシームレスかつディレクショナルに
クローニングが完了（プロトコールの詳細については必ず取扱説明書を確認してください。）

１．
線状化ベクターおよびインサートDNAの調製①使用するベクターとクローニング部位を決定し、制限酵素処理または
インバースPCRによりベクターを線状化する。
…線状化ベクター溶液［A］↓②インサートDNAのPCR増幅のためのIn-Fusion Primerを設計する。
Forward Primer
5ʼ- NNNNNNNNNNNNNNN
ベクター末端が 5ʼ- NNNNNNNNNNN…
5ʼ突出の場合 3ʼ-… NNNNNNNNNNNNNNN
Forward Primer
5ʼ- NNNNNNNNNNNNNNN
ベクター末端が 5ʼ- NNNNNNNNNNNNNNN…
平滑の場合 3ʼ-… NNNNNNNNNNNNNNN
Forward Primer
5ʼ- NNNNNNNNNNNNNNN

インサートDNAを増幅するための特異的な配列を追加
NNNNNNNNNNNNNNN …-3ʼ
NNNNNNNNNNN …-5ʼ
NNNNNNNNNNNNNNN -5ʼ
Reverse Primer↓③インサートDNAをPCR増幅する。
（PrimeSTAR® Max DNA Polymeraseを用いた場合）
PrimeSTAR Max Premix（2×）
Forward Primer
Reverse Primer
Template
滅菌精製水
98℃ 10 sec.
55℃ 5 sec. または15 sec.
72℃ 5 sec./kb

25 μl
0.2〜0.3 μM
0.2〜0.3 μM< 200 ng
up to 50 μl

30〜35 cycles

NNNNNNNNNNNNNNN …-3ʼ
NNNNNNNNNNNNNNN …-5ʼ
NNNNNNNNNNNNNNN -5ʼ
Reverse Primer

ベクター末端が 5ʼ- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN -3ʼ
…
…
3ʼ突出の場合 3ʼ-… NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN …-5ʼ
NNNNNNNNNNNNNNN -5ʼ
Reverse Primer
上述の塩基を15塩基の相同配列として数えます。

In-Fusion酵素は、各DNA断片の末端15塩基の相同配列を認識してこれを融合させます。このため目的インサートをPCR増幅する場合には、使用する線状化ベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的
プライマーの5ʼ末端に付加することがポイントです。上図のように線状化
ベクターの末端形状に合わせて、In-Fusion Primerを設計してください。
なお、In-Fusion Cloning反応は増幅産物のA-overhangの有無による影響を受けないため、PCR増幅産物のA-overhangを考慮する必要はありません。
In-Fusion Primerの設計にはオンラインツールの使用が便利です⇒⇒−3−①In-Fusion酵素は、DNA断片の末端15塩基の相同配列を融合するため、ベクター上のクローニングしたい位置の両側15塩基とそれぞれ相補的な配列を付加したプライマーで目的遺伝子をPCR増幅する。

| クローニング実験ハンドブック！ 便利なオンラインツール
In-Fusionクローニング用のプライマー設計ツール、実験例紹介、
各種ガイド、学習ツールなど、役立つ情報を多数掲載しています。

https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/primer-design-and-other-tools

2.アガロースゲル電気泳動でPCR増幅産物を確認①電気泳動の結果に応じて、以下のようにインサートDNAを処理する。
●増幅産物に非特異的な増幅が認められた場合：
目的バンドのみを切り出し、NucleoSpin ® Gel and PCR
Clean-upを用いてスピンカラム精製を行う。
●増幅産物がシングルバンドの場合はCloning Enhancer
処理を推奨 ：
PCR反応液Cloning Enhancer

5 μl
2μ
ｌ

4.大腸菌への形質転換
Stellar™ Competent Cells（製品コード 636763）
やHST08
Premium Competent Cells（製品コード 9128）など、形質転換効率が
1×108 cfu/μgプラスミ
ドDNA以上のコンピテントセルの使用を推奨します。

5.インサートチェックPCR、培養、プラスミド精製
インサートチェックPCRは5ページを、
プラスミド精製は10ページを参照！ 複数DNA断片のマルチクローニング

37℃ 15分→80℃ 15分↓②インサートDNA溶液［B］とする。

Fragment 1

3. In-Fusion Cloning反応
5 × In-Fusion HD Enzyme Premix
線状化ベクター［A］
精製済／CE処理済みPCR断片［B］
滅菌精製水

Fragment 2

形質転換コロニー数
正しい形質転換体の割合

Fragment 3

線状化ベクター

2 μl
x μl
y μl
up to 10 μl

50℃、15分反応→氷上静置

415
7/10

目的クローン

In-Fusion Cloningならマルチクローニングも効率よく行うことができます。各1 kbのDNA断片をIn-Fusion® HD Cloning Kitを用いてクローニングし、コロニーPCRによりインサートを確認したところ、10クローン中7クローンで正しい挿入が確認できました。

【関連製品リスト】 10回包装（EcoDry™タイプは8回包装）キット付属品

終売

製品名

製品コード

価格（税別）

In-Fusion® HD Cloning Kit ※639648￥23,000

―

―

―

―

In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer ※639633￥25,000

●

―

―

―

In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin® ※639639￥26,000

―

●

―

―

In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Kit ※639689￥24,000

―

―

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―

In-Fusion® HD Cloning Plus ※638909￥50,000

―

●

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●

In-Fusion® HD Cloning Plus CE ※638916￥48,000

●

―

●

●

CloningEnhancer

Stellar
精製用カラム Competent
NucleoSpin
Cell

CloneAmp
HiFi PCR
Premix

すでにタカラバイオの高正確性PCR
酵素「PrimeSTAR
シリーズ」
をお使いの
方はこちらがおススメです。

初めてI n - F u s i o n
キットを使 用される方、特にオールイン
ワンキッ
トをご要望の方はこちらをどうぞ！

※プレミックス済み液体タイプのIn-Fusion HDには、上記のほか、50回包装と100回包装があります。
※In-Fusion HD EcoDry Cloning Kitは、凍結乾燥タイプ（室温、デシケーター内保存可能）のIn-Fusion HDキットです。マイクロチューブに分注済みのため直ちに使用することができます。24回タイプ（8連チューブ×3本）、96回タイプ（96ウェルプレート）もあります。

〈In-Fusion® HD添付製品〉

Cloning Enhancer
PCR産物がシングルバンドの場合に増幅産物をそのままIn-Fusion
反応に用いるための前処理試薬。この処理により、PCRに使用したプライマーや鋳型プラスミド、dNTPの影響を受けず、In-Fusion酵素が最大のパフォーマンスを示すことができる。

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
PCR産物が複数バンドの場合にゲル精製を行うスピンカラム

Stellar™ Competent Cells
高い形質転換能を持つコンピテントセル。長鎖プラスミドDNAの形質
転 換においても高い効 率が得られ、同 様の遺 伝 子 型を持つ他のコンピテントセルと比較してコロニー形成速度が速い。pUC系プラスミド
での形質転換の際には、
β-ガラクトシダーゼのα-相補性を利用し、X-Gal添加による組換え体の青／白選別を行うことができる。

CloneAmp™ HiFi PCR Premix
正確性が極めて高いPCR酵素。In-Fusionクローニングにおいて、インサートDNAの増幅やPCRによるベクターの線状化に最適である。
本製品は、In-Fusion® HD Cloning Plusシリーズに添付されている。

| クローニング実験ハンドブック−4−TAクローニング

DNA PolymeraseなどのPCR酵素による増幅産物は、その3ʼ末端にデオキシアデノシン（dA）が一塩基付加されています。TAクローニングでは、3ʼ末端にデオキシチミジン（dT）
を一塩基付加したTベクターを使用し、PCR増幅産物のdA一塩基突出部分と相補的となることを利用して簡便にクローニングを行います。
（インサートDNAの5ʼ 末端のリン酸化は不要です。）

操作方法の概要
１．
インサートDNAの準備（目的DNA断片の調製）①PCRによる増幅（®

使用の場合）

10 ×
Buﬀer（Mg2+ plus） 5 μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）
4 μl （各 200 μM）
Forward Primer
0.2〜1 μM （ﬁnal conc.）
Reverse Primer
0.2〜1 μM （ﬁnal conc.）
鋳型DNA＜ 500 ng1.25 U
滅菌精製水
up to 50 μl（軽くタッピングして混合）
98℃ 10 sec.
55℃ 30 sec.
72℃ 1 min./kb

30 cycles★PrimeSTAR ®などα型のPCR酵素では、3ʼ末端にdAが付加しないので注意が必要（次ページ参照）。
↓②アガロースゲル電気泳動により、想定される大きさの目的のDNA断片が増幅していることを確認する。
↓③NucleoSpin ® Gel and PCR Clean-up 等を用いて、PCR反応液から残存するプライマーや塩基を除いてDNAを精製する（10ページを参照）。
↓④回収した溶液をインサートDNA溶液とする。
★②で目的以外のDNA断片も観察された場合には、アガロースゲルから目的
DNA断片のバンドを切り出して、NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up
等を用いて精製する必要がある。

２．
Tベクターとのライゲーション
Mighty TA-cloning Kit使用の場合①新しいチューブに以下を用意する。
滅菌精製水
pMD20-T Vector
PCR産物（インサートDNA溶液）

3 μl
1 μl（50 ng）
1 μl↓②Ligation Mighty Mixを5 μl加え、穏やかに混合↓③16℃で30分間インキュベートする。

３．
形質転換

HST08 Premium Competent Cells使用の場合①HST08コンピテントセル100 μlを使用直前に氷上で融解して穏やかに混和後、14 ml 丸底チューブに移す（ボルテックス不可）。
↓②ライゲーション反応後の溶液10 μlを加え、氷中30分間放置↓③42℃で 45秒間インキュベート後、氷中1〜2分間放置↓④あらかじめ37℃に保温したSOC培地を最終1 mlになるように加える。
↓⑤37℃で1時間振とう（160〜225 rpm）↓
⑥LB選択プレート（LB＋Amp＋X-Gal）に適当量まき、37℃で一晩静置↓⑦青／白判定で白コロニーを候補とする。
★
JM109を使用する場合はアンピシリン、X-Gal、IPTGを含むLB
プレートに塗布する。37℃で一晩培養し、青／白判定で白コロニーを候補とする。

4．
インサートチェックPCR

EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix使用の場合①新しいチューブに以下を用意する。
EmeraldAmp MAX PCR Master Mix（2×Premix）
25 μl
Forward Primer
0.2 μM（ﬁnal conc.）
Reverse Primer
0.2 μM（ﬁnal conc.）
滅菌精製水
up to 50 μl↓②プレート上のコロニーをチップの先でごく少量掻き取り、上記のPCR反応液に懸濁して増幅する。
98℃ 10 sec.
60℃ 30 sec.
72℃ 1 min./kb

30 cycles↓③PCR反応液を一部アガロースゲル電気泳動に供し、インサートを確認する。

５．
培養、プラスミド精製①目的のプラスミドを持つことを確認したコロニーを取り、LB＋Amp培地
2 mlに加えて一晩振とう培養する。
↓②NucleoSpin® Plasmid EasyPure 等を用いてプラスミドDNAを精製する。
（精製手順は10ページ参照）★精製したプラスミドDNAの構造を、制限酵素処理・アガロースゲル電気泳動により確認すると良い。

−5−| クローニング実験ハンドブック

！ PCR酵素の種類と末端形状
PCR用DNAポリメラーゼは大きく2つのタイプに分けられます。
DNA PolymeraseをはじめとするPol I型（family A）
酵素と、 DNA
Polymeraseに代表されるα型（family B）
酵素です。

用試薬「Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR ® 」
をご用意しています。本キットには平滑末端をもつPCR増幅産物の3ʼ末端にdAを付加するためのA-overhang mixtureが添付されており、簡便な操作でTAクローニングが可能です。

Pol I 型DNAポリメラーゼおよびPol I 型をベースとする改良型PCR
®
酵素
（
など）
の増幅産物のほとんどは、
その3ʼ末端にデオキシアデノシン（dA）が一塩基付加されています。これを利用してPCR産物をそのままTAクローニングに使用可能です。

PCR酵素のタイプ

Pol I 型
（family A）

α型（family B）

増幅産物の3ʼ末端の形状

dAが付加される（TAクローニング可）

平滑末端

®

一方、
α型DNAポリメラーゼによる増幅産物のほとんどは、酵素自身がもつ強力な3ʼ→5ʼexonuclease活性により平滑末端となっており、そのままではTAクローニングに使用できません。平滑末端のPCR産物をTA
クローニングに用いる場合には、3ʼ末端にdAを付加する必要があります。

®

™
MightyAmp™シリーズ
EmeraldAmp® MAX
SapphireAmp®
SpeedSTAR™

酵素名

タカラバイオでは、通常のTAクローニング用試薬「Mighty TA-cloning
Kit」
に加え、
α型DNAポリメラーゼによる増幅産物専用のTAクローニング！ Tベクターについて
TA-cloning Kitの他にも、2種類のTベクター、T-Vector pMD20およびT-Vector pMD19（Simple）
を販売しています。いずれも形質転換体の
青／白選択が可能です。
T-Vector pMD19（Simple）
ではpUC19に由来するマルチクローニング
サイト上のすべての制限酵素サイトが除去されているため、クローニング後にインサート部分の制限酵素サイトを利用する場合に便利です。

PrimeSTAR® シリーズ
Tks Gﬂex™

PrimeSTAR®シリーズなどα型ポリメラーゼで増幅した平滑末端のPCR産物
をリン酸化して平滑末端クローニングを行う場合にも、Mighty Cloning
Reagent Set（Blunt End）
をご利用ください。
OriZ！ 5 kb以上のPCR産物のクローニング

T-Vector pMD20（2,736 bp）

長鎖のPCR産物（5 kb以上）の場合、TAクローニング効率が低下する
ため、平滑末端クローニングをお勧めします。末端平滑化およびリン酸化のための簡便な前処理用試薬を含むMighty Cloning Reagent Set（Blunt End）
（ 製品コード 6027）の使用が便利です。

T

T

Multicloning site

Ampr

【関連製品リスト】
容量

製品コード

価格（税別）

20回

6028¥22,000

Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR

20回

6019

¥33,000

T-Vector pMD20

1 μg

3270

¥10,500

T-Vector pMD19（Simple）

1 μg

3271

¥10,500

Mighty Cloning Reagent Set（Blunt End）

20回

6027

¥30,000

HST08 Premium Competent Cells

1 Set（100 μl × 10）

9128¥23,100

JM109 Competent Cells

1 Set（100 μl × 10）

9052¥21,000

DH5α Competent Cells

1 Set（100 μl × 10）

9057¥21,000

インサートチェックPCR

EmeraldAmp MAX PCR Master Mix

160回

RR320A¥7,000

DNAクリーンアップ

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up ※10回

740609.10¥5,300プラスミド精製

NucleoSpin® Plasmid EasyPure ※10回

740727.10¥4,200

Agarose L03「TAKARA」

100 g

5003

¥18,000

500 μl
（100回）

3422A¥20,000

100 μg3403¥9,000

製品名
Mighty TA-cloning Kit
TAクローニングキッ
トおよびTベクター

平滑末端クローニングキット®

形質転換用コンピテントセル

電気泳動

®

®

100 bp DNA Ladder（Dye Plus）
λ-d III digest★各PCR酵素については、
タカラバイオウェブサイトでご確認ください。

※マッハライ・ナーゲル社の製品です。

| クローニング実験ハンドブック−6−制限酵素／ライゲーションによるクローニング

制限酵素でベクタープラスミドとインサートDNAをそれぞれ切断した後、DNAリガーゼやライゲーション試薬を用いて連結させる方法です。遺伝子組換え実験の基本操作として長年利用されています。
↓③制限酵素反応により両端を切断（必要に応じてスケールアップ）

操作方法の概要
１．
インサートDNAの準備（目的のDNA断片の調製）（a）制限酵素での切り出し

あらかじめ目的DNA断片の制限酵素切断箇所を確認し、次に使用する
ベクタープラスミドのクローニングサイトに合わせて、切り出しに使用する制限酵素を選定する。
★Takara Cut-Site Navigator（次ページ）
が便利です。

制限酵素

d lllとH Iでのdouble digestionの例①反応液を調製する。
基質DNA
d lll
HI
10 × K Buﬀer
滅菌精製水（≦ 1 μg）
1 μl
1 μl
2 μl
up to 20 μl（軽くタッピングして混合）↓②37℃で1時間 反応↓③反応液の半分（10 μl程度）にLoading Buﬀerを加えてアガロースゲル
電気泳動を行い、切断を確認する。
↓④目的DNA断片のバンドを含むゲルを切り出す。
★DNAの損傷を抑えるため、UV照射は短時間で行う。
↓⑤NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up 等を用いて、ゲルからDNAを精製（ゲル抽出操作手順は10ページを参照）↓⑥ インサートDNA溶液［A］とする。

（b）PCRによる増幅↓④37℃で1時間 反応↓⑤NucleoSpin ® Gel and PCR Clean-up 等を用いて、ゲルからDNAを精製（10ページを参照）↓⑥回収した溶液をインサートDNA溶液［A］とする。

2．
ベクタープラスミドの準備①目的のベクタープラスミド（環状）のクローニングサイトを制限酵素で切断【ベクターの線状化】
ベクタープラスミドDNA （≦ 1 μg）
d lll
1 μl
HI
1 μl
10 × K Buﬀer
2 μl
滅菌精製水
up to 20 μl（軽くタッピングして混合）↓②37℃、1時間 反応↓③NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up 等を用いて、反応液からDNAを
精製（10ページを参照）↓④回収した溶液をプラスミドDNA溶液［B］とする。

ベクターとの連結に使用する制限酵素切断部位を5ʼ側に付加 ※した
プライマーを用いて、インサートDNAのPCR増幅を行う。
※制限酵素切断部位＋さらに5ʼ側に3塩基以上を付加！ の線 状 化を行う場 合は、線 状 化したベクターのセルフライ

Tks Gﬂex™ DNA Polymeraseを使用した例

脱リン酸化処理（セルフライゲーションの防止）①PCR
2 × Gﬂex PCR Buﬀer（Mg2+, dNTP plus）
25 μl
Forward Primer
0.2 〜0.3 μM（ﬁnal conc.）
Reverse Primer
0.2 〜0.3 μM（ﬁnal conc.）
鋳型DNA＜500 ng
Tks Gﬂex DNA Polymerase
1.25 U
滅菌精製水
up to 50 μl（軽くタッピングして混合）
94℃ 1 min.
↓
98℃ 10 sec.
60℃ 15 sec.
68℃ 30 sec./kb

30 cycles↓②PCR産物の精製
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up 等を用いて増幅産物を精製する（10ページを参照）。

−7−

上記精製済みPCR産物≦ 2 μl
d lll
1 μl
HI
1 μl
10 × K Buﬀer
2 μl
滅菌精製水
up to 20 μl（軽くタッピングして混合）| クローニング実験ハンドブック

1種類の制限酵素でインサートDNAの調製、ベクタープラスミド

ゲーションを防止するため、下記の脱リン酸化処理を行う。

制限酵素処理済みベクタープラスミド
1〜20 pmol
Alkaline Phosphatase（BAP）
0.3〜0.6 U
10 × BAP Buﬀer
5 μl
滅菌精製水
up to 50 μl（軽くタッピングして混合）↓
37〜65℃で30分間反応↓
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25：24：1）
抽出（2回）↓
クロロホルム／イソアミルアルコール（24：1）
抽出（1回）↓
エタノール沈殿↓TE Buﬀer（20 μl以下）に溶解し、プラスミドDNA溶液［B］とする。
★5'-突出末端の脱リン酸化はCIAP（Calf Intestinal Alkaline
Phosphatase）
による処理でも十分ですが、平滑末端や3ʼ-突出末端の脱リン酸化にはBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）の使用を推奨します。

3．インサートDNAと線状化プラスミドのライゲーション

！ よくある質問

DNA Ligation Kit〈Mighty Mix〉使用の場合
インサートDNA溶液［A］
プラスミドDNA溶液［B］
Ligation Mix
滅菌精製水

25〜250 fmol
50 ng
（25 fmol）
7.5 μlup to 15 μl↓
16℃、30分反応（または25℃、5分反応）

4．
形質転換

HST08 Premium Competent Cells使用の場合①HST08コンピテントセル100 μlを使用直前に氷上で融解して穏やかに混和後、14 ml丸底チューブに移す（ボルテックス不可）。
↓②ライゲーション反応後の溶液10 μlを加え、氷中30分間放置↓③42℃で 45秒間インキュベート後、氷中1〜2分間放置↓④あらかじめ37℃に保温したSOC培地を最終1 mlになるように加える。
↓⑤37℃で1時間振とう（160〜225 rpm）↓
⑥LB選択プレートに適当量まき、37℃で一晩静置

５．
インサートチェックPCR
６．
培養、プラスミド精製【 Q1 】
ライゲーションが起こりにくく、形質転換効率が悪いときに注意する点は？
【A1】
・ライゲーション反応時間を延長してください。
・DNA溶液の塩濃度が高いとライゲーション効率が低下します。
特にエタノール沈澱時の酢酸アンモニウム塩は阻害作用を示します
ので、エタノール沈澱の際には塩が残らないよう、丁寧に洗浄操作を行ってください。
・DNA抽出キットを使用した場合、抽出液のエタノール沈澱を行いバッファー交換することで、ライゲーション効率が改善することがあります。
・突出末端のライゲーションの場合、DNA溶液（ベクター+インサートDNA）を60〜65℃で2〜3分加温後、急冷してからLigation Kitの各試薬を加え反応を行って下さい。
ライゲーションに有効な突出末端が確保され、形質転換効率が改善されることがあります。
以上の操作で改善されない場合はDNAの再精製を推奨します。
【Q2】長鎖のクローニングで気をつける点は？
【A2】長鎖になるほどライゲーション効率が低下する傾向があります。
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG（製品コード 6024）
は長鎖DNAのライゲーションに最適化してあり、10 kb以上のライゲーションを行う場合に威力を発揮します。
また、インサートDNAを含めたプラスミドの全サイズが大きい場合（特に10 kbを超える場合）は大腸菌への導入効率が低くなり、大腸菌内でのプラスミドの安定性も低下することがあるため、欠失したクローンになる確率が高くなります。大きなサイズのDNAを効率よく形質転換できる
HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）の使用をお勧めします。

インサートチェックPCRは5ページを、
プラスミド精製は10ページを参照

タカラバイオウェブサイト上の制限酵素認識配列検索ツール！ Takara Cut‐Site Navigator
DNA配列を読み込んで条件を設定すると、切断サイトを一覧や模式図、配列の詳細で表示できます。

【関連製品リスト】
製品名

容量

製品コード

価格（税別）

d lll

10,000 U

1060A¥7,000HI

10,000 U

1010A¥7,000

50 U

2120A

¥11,500

1,000 U

2250A

¥11,500

Tks Gﬂex™ DNA Polymerase

250 U

R060A

¥32,000

DNA Ligation Kit〈Mighty Mix〉

1 Kit

6023

¥27,000

TaKaRa DNA Ligation Kit LONG

1 Kit

6024

¥27,000

HST08 Premium Competent Cells

1 Set（100 μl × 10）

9128¥23,100

JM109 Competent Cells

1 Set（100 μl × 10）

9052¥21,000

DNAクリーンアップ

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up ※10回

740609.10¥5,300プラスミド精製

NucleoSpin Plasmid EasyPure ※10回

740727.10¥4,200

Agarose L03「TAKARA」

100 g

5003

¥18,000

500 μl
（100回）

3407A¥20,000

100 μg3403¥9,000

制限酵素、
脱リン酸化

Alkaline Phosphatase（

C75）

Alkaline Phosphatase（Calf intestine）
PCR

ライゲーション、
形質転換

電気泳動

®

100 bp DNA Ladderλ-d III digest※マッハライ・ナーゲル社の製品です。

| クローニング実験ハンドブック−8−逆転写酵素＆cDNA合成

単離精製されたRNAから、RT-PCRやLibrary作製を行う場合、
まず逆転写酵素（Reverse Transcriptate: RTase）
でcDNA化する必要があります。
ここでは、PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kitを用いてcDNA合成を行うための一般的なプロトコールを紹介します。

現在、研究用試薬として汎用されている逆転写酵素には、avian myeloblastosis virus（ AMV）由来と、moloney murine leukemia virus（ M-MLV）
由来の2種類があります。従来、
mRNA高次構造の影響を回避する手段として熱安定性が高いAMV RTaseが使用されていましたが、
近年、
M-MLV由来の改良型逆転写酵素（PrimeScript™シリーズなど）の性能が向上したため、こちらが主流になりつつあります。
なお、逆転写酵素を用いたcDNA合成では、RNA上に反応開始位置となるプライマーをアニ−ルさせますが、
このプライマーには使用目的の違いから、以下の3種類が用いられます。
１. オリゴdTプライマー：mRNAのpolyA tailにアニールさせ、3'側からcDNAを合成します。
２. ランダムプライマー（通常、6塩基から9塩基程度）：mRNA、rRNA等すべてのRNAからcDNAを合成します。
３. 既知の配列特異的なプライマー：特定のcDNAのみを合成します。

操作方法の概要
1st strand cDNA合成
PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kit
使用の場合！ cDNA合成の阻害要因を克服
cDNA合成の阻害要因①マイクロチューブ内に以下の鋳型RNA/Primer混合液を調製する。
Oligo dT Primer（50 μM）
1 μl（or Random 6mers（50 μM）
1 μl ）（or Gene Speciﬁc Primer
2 pmol ）dNTP mixture（10 mM each）
1 μl
鋳型RNA
total RNA : ≦5 μg（or polyA RNA : ≦1 μg ）RNase free dH2O
up to 10 μl↓②65℃で5分間保温した後、氷上で急冷する。
↓③以下の反応液を加え、全量を20 μlにする。
上記鋳型RNA/Primer Mixture
5 × PrimeScript II Buﬀer
RNase Inhibitor（40 U/μl）
PrimeScript II RTase（200 U/μl）
RNase free dH2O

RNAの高次構造
RTase

RNAの分解RTaseの非特異的結合

ミスプライミング伸長

伸長阻害

10 μl
4 μl
0.5 μl1 μlup to 20 μl↓④軽く撹拌する。
↓⑤以下の条件で反応する。

ミスプライミング伸長

cDNA合成を行う際には、RNAの高次構造や分解、RTase自身のＲＮＡへの非特異的な結合、氷上放置による伸長阻害などがしばしば問題となります。
PrimeScript™ II RTaseは、
もともと優れた性能を持つ逆転写酵素
PrimeScript™と独自のアクセサリータンパク質の添加により、これらの阻害要因を克服しました。

PrimeScript™
RTaseþ 高次構造をとるRNAに強いþ 42℃反応でRNAのダメージを抑制＋（ 30℃ 10 min.） ※Random 6mersを用いた場合に必要
42℃ 30〜60 min.

アクセサリータンパク質↓⑥95℃で5分間保温した後、氷上で冷却する。

þ RTase自身のRNAへの非特異的結合を抑制
þ 氷上放置による伸長阻害を抑制【関連製品リスト】
製品名
最高品質の1st strand
cDNAの合成に推奨
高正確性PCR酵素と組み合わせたRT-PCRキット

−9−

容量

製品コード

価格（税別）

PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kit

50回

6210A

¥37,000

PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit

50回

R023A

￥52,000

PrimeScript™ II High Fidelity One Step RT-PCR Kit

50回

R026A

￥52,000| クローニング実験ハンドブック

PCR反応後のプライマー除去、アガロースゲルからのDNA回収、プラスミドDNA精製など、クローニングの様々な場面で迅速・簡便かつ高純度に核酸精製を行うために
スピンカラムタイプの核酸精製キットを使用します。
ここでは、シリカメンブレンスピンカラムを使用したDNAの精製方法を紹介します。

核酸の精製
操作方法の概要
プラスミドDNAの精製

アガロースゲルからDNAを精製

NucleoSpin Plasmid EasyPure使用の場合

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up使用の場合①大腸菌培養液（高コピープラスミド：2〜10 ml）
を遠心分離（12,000 × g、30秒）
し、上清を捨ててペレットを得る。
↓②A1バッファー
（＋RNase A）
150 μlを加え、Vortexで菌体を懸濁する。
↓③A2バッファー250 μlを加え、5回ほど転倒混和後、2分静置する。
【溶菌】↓④A3バッファー350 μlを加え、液体の色が青色から完全に無色に変わる
まで転倒混和する。青色が残っていないことを確認し、遠心分離（12,000 × g、3分）を行う。
↓⑤上清をNucleoSpin® Plasmid EasyPureカラムに移して遠心（1,000〜2,000 × g、30秒）
する。
【結合】
↓
⑥AQバッファー
（+EtOH）
450 μlを加えて、遠心（12,000 × g、1分）する。
【洗浄／乾燥】↓⑦AEバッファー50 μlをカラムに加えて室温で1分置く。
↓⑧遠心（12,000 × g、1分）
によりプラスミド溶液を回収する。
【溶出】①ゲル100 mgにNTIバッファー200 μlを加え、50℃10分インキュベート
してゲルを溶解する。
↓②NucleoSpin®カラムに溶液を移して遠心（11,000 × g、30秒）
する。
【結合】
↓
③NT3バッファー（＋EtOH）700 μlを加えて遠心（11,000 × g、30秒）
する。
【洗浄】
↓
④カラムのメンブレンを乾燥（11,000 × g、1分）
する。
↓⑤NEバッファー（15〜30 μl）
をカラムに加えて室温で１分静置後、
遠心（11,000 × g、1分）
する。
【溶出】

®

アガロースゲル

結合

溶出

洗浄、乾燥

★NucleoSpin® Gel and PCR Clean-upは、同じバッファーを用いてPCR
産物のクリーンアップにも使用可能です。
PCR反応液100 μl（必要に応じて滅菌精製水を加え100 μlとする）に
NTIバッファー200 μlを加えて混合し、上記の②以降のステップを行って
ください。
溶菌

結合

洗浄／乾燥

溶出

！ チェックポイント
陰イオン交換クロマトグラフィー（NucleoBond シリーズ）®

核酸は、低pH条件下でプラスにチャージしたイオン交換基に結合するが、高pH・高塩濃度条件にするとイオン交換基から解離する。これにより、核酸を高純度に精製することができる。
（→トランスフェクショングレードのプラスミドDNA精製など）

シリカメンブレンスピンカラム（NucleoSpin®シリーズ）
高濃度のカオトロピック塩を含むBinding Buﬀerと混合した核酸は、水和水が奪われた状態となりシリカメンブレンに結合するが、低塩濃度のElution
Buﬀerを加えると核酸は再び水和水を獲得し、シリカメンブレンから解離
して溶出される。
シリカメンブレンの使用により、簡便かつ低コストでDNA精製を行うことができる。

【関連製品リスト】

下記リストの製品は、マッハライ・ナーゲル社の製品です。
製品名
NucleoSpin® Plasmid

プラスミドDNAミニプレップ

製品コード

価格（税別）

50回

740588.50¥10,700

250回

740588.250¥50,000

50回

740727.50¥10,500

250回

740727.250¥36,700®

NucleoBond Xtra Midi

10回

740410.10¥14,500

NucleoBond® Xtra Midi EF

１0回

740420.10¥21,900

NucleoSpin® Plasmid EasyPure
トランスフェクショングレードのプラスミド
DNA精製（EFはエンドトキシンフリー）

容量

PCR産物のクリーンアップとゲル抽出の両方に使用可能

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up

細胞・組織などからのtotal RNA精製

NucleoSpin RNA®

50回

740609.50¥13,500

250回

740609.250¥50,000

50回

740955.50¥34,500| クローニング実験ハンドブック −10−

クローニング実験において、DNAの検出、定量は欠くことのできない操作です。その中でもアガロースゲル電気泳動によるDNA
検出は日常的におこなわれる手法です。ここではアガロースゲル作製を中心に紹介します。

アガロースゲル電気泳動
操作方法の概要１．
アガロースゲルの作製（1%ゲル、150 ml作製の場合）①アガロース粉末を1.5 g量り取る。
②適切な大きさの容器中＊1で、室温または冷却したバッファー＊2 150 mlを攪袢しながらアガロース粉末を加える。
（容器全体の重量を量って記録しておく。）③ラップで覆った後蒸気抜きの穴を開け、電子レンジにセットし加熱する。
時々とめて攪袢し、完全に溶解する＊3。
④加熱終了後電子レンジから出し、静かに攪袢して均一にし泡を取り除く。
（必要に応じて再び重量を量り、温めた蒸留水を加えて蒸発した水分を補う。）⑤溶液を室温に置いて50〜60℃まで冷却し、コームをセットしたゲルトレイに流し入れる。ピペットチップなどで泡を取り除き、冷やし固める。
⑥適量のバッファーを重層後コームを外し、泳動槽に移す。
（すぐに使用しない場合は、バッファーを満たした容器に入れ冷暗所保存する。）

２．
電気泳動サンプルの準備

泳動サンプル溶液に1/10量の10 × Loading Buﬀerを加えてよく混合する。DNA分子量マーカーも同様に準備する。
ゲルのウェルにサンプル溶液をアプライする。

３．
電気泳動

＊1 三角フラスコでもよいが、溶液の2〜5倍容量のビーカーを使うことで突沸を防止できる。3%以上の高濃度ゲルを調製するときは、さらに大きな容器を使うことをお勧めする。
＊2 3%以上の高濃度ゲルを調製する際アガロース粒子がバッファーに分散しにくい場合があるが、あらかじめバッファーを氷上で10分間ほど
冷却しておくと分散しやすくなる。
＊3 電子レンジで加熱する際は、容器全体が過熱し激しく沸騰することがあるので充分に注意が必要である。また、火傷を防ぐためにholderや断熱性手袋を使用することが望ましい。

〈アガロースの種類と濃度の選択〉
分離範囲

推奨アガロース

ゲル濃度500 bp未満

PrimeGel™ Agarose PCR-Sieve など

500〜5,000 bp

Agarose L03、PrimeGel™ Agarose LE 1-20Kなど

5,000 bp以上

PrimeGel™ Agarose GOLD 3-40K

3%
1%
0.5%

〈DNA分子量マーカーの泳動図〉①

泳動装置（パワーサプライ）のスイッチを入れて電気泳動を開始する。電流の向きに注意する（泳動上流側に陰極、下流側に陽極をセットする）。適度に分離した時点でスイッチを切る。

４．
ゲルの染色

③λ ‒
T14 I digest（1% PrimeGel Agarose LE 1-20K GAT）

ー600

②1 kb DNA Ladder（1% Agarose L03）

ー5
ー4
ー3

ー200
ー150

ー2

ー100

ー1

ー1,882
ー1,489
ー925
ー421

（kb）

ー50

ー19,329
ー7,743
ー6,223
ー4,254
ー3,472
ー2,690ー10ー300

泳動後のゲルをエチジウムブロマイド（EtBr）、SYBR® Green Iなどの染色液
に浸す。

③

②

ー1,500ー1,000①50 bp DNA Ladder（3% PrimeGel Agarose PCR-Sieve）

ー74
（bp）

（bp）

【関連製品リスト】
概要

容量

製品コード

価格（税別）

1 kb以上の核酸の分離に

100 g

5003

¥18,000

1 kb以上の核酸の分離・回収に（高品質タイプ）

100 g

5801A

￥34,000

PCR増幅産物など1 kb以下の核酸の分離に

100 g

5810A

￥48,000

1包

T9131￥18,900

10包

製品名
Agarose L03「TAKARA」

アガロース PrimeGel™ Agarose LE 1-20K GAT
各種PrimeGel™ Agarose PCR-Sieve
バッファー
パウダー

Tris-Acetate-EDTA Buﬀer（TAE）50 × Powder, pH8.3

1包を蒸留水に溶解して1 Lの50 × TAEを作製

Tris-Borate-EDTA Buﬀer（TBE）Powder, pH8.3

1包を蒸留水に溶解して1 LのTBEを作製

T9121￥10,500

分子量マーカー

100 bp DNA Ladder（Dye Plus）

100〜1,500 bpの11本のバンド

3422A
500 μ
（100回）
l￥20,000

1 kb DNA Ladder（Dye Plus）

1〜10 kbの10本のバンド

3426A
500 μ
（100回）
l￥14,000

Mupid®-2plus ※スタンダードモデル

一式

M-2P

￥40,760

Mupid -exU ※高機能モデル

一式

EXU-1￥56,950

Mupid -One ※CE（ヨーロッパ電気安全規格）
に準拠

一式

O1-01

¥62,000

電気泳動
装置

®
®

※ミューピッド社の製品です。
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2024年7月修正N