Prebiotic phosphorylation andtrimetaphosphate chemistry2015.1.31 (Sat)
Takumi Matsueda (B4)1

Contents
1. Introduction
2. Prebiotic phosphorylation
3. Application of TMP
4. Summary2

Phosphate compound in life

1. introduction

Phosphate plays many important roles in life

“molecular unit of currency”

other roles: phospholipid, phosphorylation by kinase ...
3

1. introduction

Phosphoester drugs
Nucleotide type anti-viral, anti-cancer drugs、ゾメ
あるが、る薬C. Dumontet, et. al., Nature Reviews, 2013, 12, 447-464
4

1. introduction

What is prebiotic chemistry?

To disclose how to construct the building block of living organisms
from inorganic compounds in primitive earth condition is “prebiotic chemistry”
prebiotic chemistry of DNA
primordial atmospheremethaneammonia

purine baseribosesimple structure
condensed monomer
building blocks

nucleotideDNA5

Today’s topic

1. introduction

How to form nucleotide in prebiotic condition

Application of trimetaphosphate to anti-cancer prodrugs, IP3 synthesis61. Introduction
2. Prebiotic phosphorylation
3. Application of TMP
4. Summary

7

Phosphate in primitive earth

2. Prebiotic phosphorylation

Apatite seems to be first phosphate rock form in primitive earth

apatite(a kind of igneous rock)
Ca5(PO4)3X2 (X= OH, halogen)estimeted the total volume of P
14-40*1020 g (max: 0.05-0.1 M)

E. J. Griffith, et. al., Origins of life, 1977, 8, 71-85

8

2. Prebiotic phosphorylation

Orthophosphate phosphorylation

First, phosphorylation was thought to proceed with CN species

carbodiimide

CN species are good condensing reagents, but easy to hydrolyze
L. E. Orgel, R. Lohrmann, Science, 1968, 161, 64-66
9

Activation by urea

2. Prebiotic phosphorylation

Orgel thought urea is the condensing reagent in dry condition

The role of ... urea : activate phosphateammonium chloride : inhibition of carbamate formation with alcohol
R. Lohrmanm, L. E. Orgel, Science, 1971, 171, 490-494
10Activation by urea

2. Prebiotic phosphorylation(base)

R. Lohrmanm, L. E. Orgel, Science, 1971, 171, 490-494
11Urea in desert condition

2. Prebiotic phosphorylation

L. E. Orgel, et. al., Nature, 1972, 237, 162-164122. Prebiotic phosphorylation

AMP from condensed phosphate

Adenosine phosphorylation from condensed cyclo phosphate(Adenosine:0.1 M, P reagent: 1 M)

pyrophosphate case ... no reaction
basic condition (graham’s salt case) ... 2’,3’-AMP yield increased

AMP yield was very low, but it was found that condensed
cyclo phosphate worked as phosphorylation reagent
A.Shwartz, C. Ponnamperuma, Nature, 1968, 218, 443
13

TMP phosphorylation

2. Prebiotic phosphorylation

2’ and 3’ selective phosphorylation without protecting groups

53%

TMP phosphorylation : room tempurature, non condensing reagent, 2’, 3’ selective
R. Saffhill, J. Org. Chem., 1970, 35, 9, 2881-2883
14

Glyceric acid phosphorylation

2. Prebiotic phosphorylation

TMP produced cyclophosphate and pyrophosphateafter 24 h ... 2-P 21%, 3-P 17%

Vera Kolb, L. E. Orgel, Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 1996, 26, 7-13

15

Prebiotic nucleotide formation

2. Prebiotic phosphorylation

One-pot synthesis of adenosine from D-ribose, adenine, and TMP

pH 7

TMP : D-ribose : adenine = 1.5 : 1 : 1.2
concentration of ribose = 1.85*10-4 M (0.37mmol in 2L water)

2:335-40 d, yield 43%(no 5’-AMP, ATP)G. Micheletti, et. al., Chem Comm, 2011, 47, 3640-3642
16

2. Prebiotic phosphorylation

The merit of TMP

In prebiotic condition, why TMP is better reagent than orthophosphate?
MeritTMP

orthophosphate

Solubility

good solubility even in thepresence of Ca, Mg cation

low solubility, apatiteformation with Ca cation

Mild condition

room tempreture

more than 65 oC

Condensing
reagent

nothingurea

Trimetaphosphate is potentially prebiotic reagent
and has some merits than orthophosphate !
17

1. Introduction
2. Prebiotic phosphorylation3. Application of TMP
4. Summary

18

Amino acid type prodrug

3. Application of TMP

Amino acid prodrug synthesis of fluorouridine-monophosphate (FUdR-MP)

anti-cancer
effective synthesis is needed

E. J. McIntee, et. al., Med. Res. Rev, 2000, 20, 417-451
19

P ester formation

3. Application of TMP

DCC and phosphite used route need some more steps than Penta-P case
DCC condensation

J. Wagner, et. al., J. Med. Chem., 1996, 39, 4569-4575

Phosphite route

Y. Zhao, et.al, Synlett , 2004, 14, 2600-2602
20

Penta-covalent P

3. Application of TMP

Penta-covalent P intermediate will produce P-amino acid ester
Zhao Yufen’s group idea

Y. Zhao, et. al., Eur. J. Org. Chem, 2011, 3220-3228
21

Peptide bond with TMP

3. Application of TMP

TMP as condensing reagent in basic condition

less than 0.1% tripeptide, not found tetrapeptide

Polypeptide formation in acidic condition

possible to form polypeptide
Y. Yamagata, et. al., Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 1988, 18, 165-178
22

Peptide bond with TMP

3. Application of TMP

Condensation of (gly)2 proceeds in weak acidic condition(gly)2 formation
gly: 0.5 M, TMP: 0.5 M, 38 oC(gly)4 formation(gly)2: 0.5 M, TMP: 0.5 M, 38 oC

Y. Yamagata, et. al., Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 1988, 18, 165-178
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N-Phosphoryl amino acids

3. Application of TMP

amino acid and TMP give N-phosphoryl aminoacid (or dipeptide)

Y. Zhao, et. al., Eur. J. Org. Chem, 2009, 3026-3035
24

Nucleophilic attack on NPAAs

3. Application of TMP

Alchoxide and phosphate attack on P position of penta P intermediate

5a and 6a are also observed(each yield ... unknown)

Y. Zhao, et. al., Eur. J. Org. Chem, 2009, 3026-3035
25

3. Application of TMP

NPAAs synthesis
Increase the NPAAs yield, substrate scope

10-40 h, 35-45 oC, 60-91%
R = side chain of Gly, Ala, Leu, Val, Ser, Thr, Glu, Phe, Trp, Met, Pro, Arg, Homo-Ser(=CH2CH2OH)(Asn, Gln... instable in alkali)
R

GA

L

V

S

T

E

FW

M

P

R

HS

Time(h)

1624

2030

15

16

20

35

40

15

10

18

10Temp(oC)

454540

40

35

35

3540

45

35

35

40

35

pH

11.4

11.3

11.2

11.2

10.711.8

11.3

10.8

11.0

10.8

12.0

11.3

11.0

yield(%)

60

6384869075

91648988608070

Y. Zhao, et. al., Green, Chem, 2009, 11, 569-573

26

1. Introduction
2. Prebiotic phosphorylation
3. Application of TMP
4. Summary27

4. Summary

Summary

Trimetaphosphate is important phpsphorylation reagent in prebiotic chemistry
Produced from magmatic condition
High solubility in waterNeedless of condensing reagent
Mild condition

Easy synthesis of phosphorodiamidite prodrug
from penta-coordinate phosphorus28

Q&A29•ハイドロコートンにおけるリン酸の役割
ステロイド骨格単体では水溶性が足りないため、体内のエステラーゼによる加水分解を受けるような官能基としてリン酸基が入っています。こちらに関してはリン酸が反応点に直接関係する要素ではなく、あくまで水溶性向上という目的で導入されているようです。
•核酸アナログ以外のリン酸構造を持つ骨格の有無についてC-P結合を有する例になってしまいますが、こちらに示すゾメドロン酸一水和物（商品名:ゾメタ）はビスホスホネート骨格を有する薬物で、骨の表面と強く結合することによって破骨細胞による骨吸収を阻害する効果を持っており、骨粗鬆症などの骨に異常をきたす病気の治療薬として売り出されています。

ゾメタ（ノバルティス）
30•プレバイオティクスにおいて砂漠条件を適用している理由
今回は特に水中でということで水溶媒中のリン酸化について重きを置いて説明しましたが、自発的反応は必ずしも水中である必要はなく例えばリン鉱石の表面上でリン酸ソースがある条件でやるなどの状況を想定して様々な手法が取られています。砂漠条件もその一例であり、今回については尿素が縮合剤たりうる例というのを示したかったのでこちらの例を適用しました。補足ですが、ドライな条件では溶媒無しで反応剤（固体）を反応させているようです。
•結局トリメタリン酸が最も優れたリン酸化剤なのかプレバイオティクスでない条件ではなんとでもやりようがあるのでプレバイオティクスでの話になりますが、あくまで自分自身はそうだと結論づけています。ただし、研究分野としてトリメタリン酸がリン酸化剤であるという共通認識は特にあるわけではなく、現在でもオルトリン酸を用いたプレバイオ
ティクなリン酸化の研究は行われています。
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•Graham’s salt の生成機構
縮合リン酸の実験ではオルトリン酸を650℃で加熱することで得られているようです。一方でYamagataら(Nature,1991,352,516-519)はリン酸鉱石火山条件での縮合リン酸生成をさせた結果、昇華性を持つ五酸化二リンの加水分解物のみが得られていたため原始地球に存在していたかは不明のままです。
•トリメタリン酸とリニアトリリン酸の違い

トリメタリン酸のアニオン性の低さによりアルコールに対する求電子力に差が出ているのではないかと思われます。アニオン性が高いリニアトリリン酸
は電子豊富なため求核攻撃を受けにくのではないかと予想しています。

32•5位でリン酸化が起こらない理由
一番多かった質問がこれでした。これについては気になって調べてはみたのですが、選択性に言及している報告例が見られず正確な機構については不明なままです。すいません。特に文献を見たという訳ではないのですが、塩基のない糖類の場合だと五員環と六員環のタイプが平衡して存在していて、一級アルコールの5’位が環形成に使われているためリン酸が入りにくいとかはあるのかもしれないかなと考えてはみました。塩基が入っている場合はこれが適用できないためこの説明では不十分であるとは思いますが…
•3’位と5’位でリン酸基転移は起こらないのか
p16(Chem Comm 2011年の例)では3’位のみリン酸化した生成物と5’位のみでリン酸化した生成物が2%以下で得られているのが確認されました。このことから、3’位5’位を結ぶサイクリックなリン酸中間体が生じたと思われるため、リン酸転移は起こりうるだろうと考えられます。

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•1960-1970年代のリン酸化における収率計算について14Cのような放射性同位体を用いて実験をしてから、反応終了後は標準サンプルと照らし合わせつつワットマンペーパーを用いた電気泳動で分離します。
収率は放射線測定を行い検出回数で収率を求めていました。
•選択性などはともかくリン酸が入ればいいという場合に使うべき試薬は何か
一般にリン酸つけたいとなった時に使われるのはPOCl3だと思います。この場合はピリジンを溶媒量使うことが多いです。あるいはO-Ar基を脱離基とした求核置換的なものや、p20に示したようなホスファイトを用いた後に酸化する方法があります。

34•Dr. ZhaoらはどうしてNPAAsを用いたリン酸エステル合成の報告をだしていないか考えられる可能性としては、環状中間体がすぐに加溶媒分解してしまい、開いたNPAAsが平衡で有利になってしまうというケースです。最終的には一級アルコールが水に勝たなくてはいけないため、水溶液中でやるというのは厳しそうな印象を受けました。
•トリメタリン酸を用いたペプチド結合の持つ応用の余地について
ポリペプチド形成において酸性条件に付せば重合は確かに起こりますが、どうしても反応時間の長さが問題になってくるような気がします。また、同じアミノ酸同士の縮合ならともかく混合されている溶液中で行おうとした場合選択性をだすのが難しいような印象を受けたので、あまり現実的でないような気はします。

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