温泉科学（J. Hot Spring Sci.），60，434‑444（2011）

原著

温泉施設に分布するの侵入経路の解明に関する研究加藤尚之1），大野 章2），齋藤宏治1），山口惠三2)（平成 23 年 1 月 23 日受付，平成 23 年 2 月 21 日受理）

Study on Elucidation of Invasion Pathway ofin Hot Spring Facilities
Naoyuki KATO1）, Akira OHNO2）, Koji SAITO1） and Keizo YAMAGUCHI2)

Abstract
It is not clear about the route thatcomes in the recycling-type
supply system of hot spring water. Although there is no clear evidence, we speculate thatthe dust with amoeba cysts phagocyted
cells derived from soil may be a major
contributor, and the dust directly, or by attaching to human body, may enter in the bathtub.
It is very important on the prevention of the disease outbreak for us to elucidate howcome in the recycling-type supply system of hot spring water.
We studied in this article the genetic identity between
strains isolated
from soil around hot spring facility and the strains from bathtub water of the facility in
Shizuoka, Niigata, Kagoshima and Kanagawa prefectures.
was detectedfrom bathtub water samples in 10 of 11 hot spring facilities. Thirteen soil samples from 11
facilities were also examined, and only 5 strains ofwere isolated from 3 soil
samples around 2 facilities. Serogroup of 2 strains of these isolates were coincident with theisolates from the matching hot spring water. The similarity of strains from both sources
was examined by using a random ampliﬁed polymorphic DNA (RAPD) analysis protocol. As
the result, the identity was not recognized at least in two facilities.
Key words : Hot spring water,, Soil, Polymerase chain reaction,
Serogroup, Random ampliﬁed polymorphic DNA (RAPD)

要

旨

温泉循環システムへのレジオネラ ニューモフィラ（
1)434）の侵入経路

東邦大学医学部化学研究室，2）東邦大学医学部微生物・感染症学講座，〒143‑8540 東京都大田区大森西 5‑21‑16．1）Departments of Chemistry and 2）Microbiology & Infectious Disease, Faculty of Medicine,
Toho University, 5‑21‑16 Omori-nishi, Ota-ku, Tokyo 143‑8540, Japan.

第 60 巻（2011）

温泉施設に分布するの侵入経路の解明に関する研究は明確になっていないが，一般的には土壌からレジオネラ属菌を内包するアメーバシストを含む埃が，直接あるいは人の体に付着して浴槽に入ると考えられている．レジオネラ属菌がどのようにして温泉循環システムに侵入するか，その径路を明らかにすることは，レジオネラ症の集団発生の予防にとって重要である．
本論文において，著者らは静岡県，新潟県，鹿児島県，神奈川県の各温泉施設周辺の土壌から分離されたと温泉施設浴槽水から分離された同一血清群の株について遺伝的同一性を検討した．
は 11 温泉施設の浴槽水の中で 10 施設から検出された．
また 11 温泉施設周辺の土壌 13 試料の中でが検出されたのは，2 施設周辺の土壌 3 試料から 5 株であった．その 2 施設の周辺土壌から分離された 2 株のについて血清群が温泉の浴槽水と一致した．これらについて random ampliﬁed polymorphic
DNA analysis（RAPD 法）を用いて株の同一性を調べた．結果は今回の 2 施設については少なくとも周辺土壌由来と温泉水由来の同一血清群株での遺伝的同一性を確認できなかった．
キーワード：温泉水，レジオネラ ニューモフィラ，土壌，PCR 法，血清群，RAPD 法

1． は じ め に1976 年米国のフィラデルフィアで行われた在郷軍人大会で，その参加者と他の宿泊客および通行人を含む 221 名に原因不明の集団肺炎が発症し 34 名が死亡するという事件が発生した．その後の調査で，患者がクーリングタワーの飛沫中の病原菌を吸引し発症したことが明らかとなった（Brenner

1979）．それ以降レジオネラ肺炎の感染症例は世界中から報告されるようになり，

特に診断技術の進歩に伴い感染症例数は増加している．また外国での感染例のほとんどが，クーリ
ングタワー，給湯施設，加湿器，渦流浴などの人工環境水が感染源となっていることから，本菌が水系環境に広く分布していることが浮き彫りにされている．
一方，我が国におけるレジオネラ肺炎の感染症例は，斎藤ら（1981）の報告が最初であった．最
近では温泉におけるレジオネラ属菌のヒトへの感染が散発し，社会問題となっている（高橋ら，1995；中館ら，1999）．その原因の一つに，最近の温泉ブームで一日当たりの入浴客が急増し，そのニーズに応えるため，入浴施設の大型化が進んでいることが挙げられる．大型施設では，大量にお湯が必要となり，それに伴い必然的に源泉の湯量が不足することから，循環による方式を採らざるを得ないのが現状である．循環式ろ過装置では，ろ過器のろ材がアメーバなどの原生動物の繁殖の場となり，そのようなところにレジオネラ属菌が入り込むと，レジオネラ属菌の宿主であるアメーバ内でレジオネラ属菌が増殖し，循環湯と共に浴槽内に侵入する．では何故レジオネラ属菌が温泉浴槽および露天風呂に侵入するのか．これまでレジオネラ属菌は，土壌，河川水，湖沼水などの自然環境中に生息し，それが土埃などにより浴槽内に侵入すると考えられている．また入浴客自身が浴槽に持ち込むとも考えられている．しかし，いずれに関しても詳細は明らかになっていない．
これら侵入経路を解明することは，レジオネラ属菌からの温泉の保護およびレジオネラ感染症の予防対策を立てる上でも重要であると考えられる．そこで今回，温泉での感染が報告されているに着目し，温泉水およびその周辺土壌から検出されたが，遺伝学的に同一株由来であるか否かを明らかにするために，温泉水およびその周辺土壌を採取して検討を行った．

2． 実験材料および方法
2．1

試

料

試料は 2002 年 7〜12 月に静岡県（A〜H），新潟県（I），鹿児島県（J），神奈川県（K）の各温435

加藤尚之，大野章，齋藤宏治，山口惠三

温泉科学

Table 1 Chemical character of the hot spring waters tested.
Sampling pointspH

Tw (ºC)Type of hot spring

A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K

8.31
8.78
8.46
7.71
8.10
8.39
9.31
8.77
7.43
7.84
7.32

40.3
40.1
39.1
45.7
40.0
42.4
40.7
39.3
40.8
41.1
41.8

Na-SO4・Cl
Na-SO4
Ca・Na-SO4
Na・Mg-Cl
Na・Mg-Cl
Ca・Na-SO4
Na-HCO3・CO3・SO4
Ca・Na-SO4
Na・Ca-SO4
Na-ClNa-Cl・SO4

泉源泉（Table 1），浴槽水，露天風呂を採取した．またそれらの温泉施設周辺（温泉採水地を中心として半径約 300 m 以内）で表面より深さ 15 cm 以内の土壌を採取した．
2．2

レジオネラ属菌の検出および同定

2．2．1

土壌からの検出

土壌試料 50 g に対し，滅菌蒸留水 250 mL を加え激しく攪拌を行った．撹拌後，滅菌済みキャップ付き試験管に上清 1 mL を取り，等量の 0.2 M KCl‑HCl 緩衝液（pH 2.2）を加え攪拌し，15 分間静置後，buﬀered charcoal yeast extractα（BCYEα）培地にサプリメントとして modiﬁed wadowsky
yee（MWY）supplement（OXIOD 社製）と Pimaricin（SIGMA 社製）を 0.1 mL 添加した培地全面にコンラージ棒で塗抹し，35℃で 5〜6 日間培養を行った．これを direct（0time）法とした．
一方，enrichment 法では土壌試料を 35℃で 9 週間インキュベーションを行った．その間，1 週
間毎に上清 1 mL を滅菌済みキャップ付き試験管に取り，等量の 0.2 M KCl‑HCl 緩衝液（pH 2.2）を加え攪拌し，15 分間静置後，以下同様に培地に塗抹し 35℃で 5〜6 日間培養した．どちらの方法
とも，培養後レジオネラ属菌を疑う集落を白金耳で釣菌し，レジオネラ属菌であることを確認する
ために，BCYEα培地および Muller-Hinton 培地にそれぞれ塗抹し，前者のみ発育した菌をレジオ
ネラ属菌とした（Koide

2001）．その後，Polymerase Chain Reaction（PCR）法により菌種の同定を行い，については，さらに免疫血清凝集反応（デンカ生研）で血清群（serogroup, SG）の同定を行った．
2.2.2

温泉水からの検出

温泉水 200 mL を滅菌チューブに取り，4℃，9,000 回転で 15 分間，遠心分離（Avanti HP 20
Beckman Coulter）を行った．遠心後，上清を捨て 1 mL に濃縮した．等量の 0.2 M KCl‑HCl 緩衝液（pH 2.2）を加え攪拌し，20 分間静置後，WYOα培地（栄研化学）に 0.1 mL 滴下し，コンラー
ジ棒で培地全面に塗抹した．35℃で 5〜6 日間培養後，レジオネラ属菌を疑う集落を白金耳で釣菌し，レジオネラ属菌であることを確認するために，BCYEα培地と Muller-Hinton 培地にそれぞれ塗抹し，前者のみ発育した菌をレジオネラ属菌とした．その後，PCR 法により菌種の同定を行い，については，さらに免疫血清凝集反応で血清群の同定を行った．

436

第 60 巻（2011）
2.2.3

温泉施設に分布するの侵入経路の解明に関する研究

菌種の同定

1） 免疫血清凝集反応
温泉水および土壌から培地上にコロニーを形成したレジオネラ属菌を釣菌し，滅菌生理食塩水に懸濁させたのち，スライドガラスの上に 3 µL を分取した．そこに血清群を同定する試薬（デンカ
生研）2 滴加え混合し，1 分以内に凝集が観察された試料を陽性とした．
2） DNA の抽出
温泉水および土壌から培地上にコロニーを形成したレジオネラ属菌を釣菌し，滅菌生理食塩水に懸濁させ，滅菌マイクロチューブに移し，12,000 回転で 5 分間遠心を行った．この操作を 3 回繰り返した後，滅菌生理食塩水で 107〜109 個 L−1 に調製し，Sepa Gene（三光純薬）を用い本菌の DNAを抽出した．
ⅰ） PCR 法
PCR 法の反応系は，DNA テンプレート 5 µL, dNTP（Takara Co. Ltd.）5 µL, 10×PCR buﬀer（Takara Co. Ltd.）5 µL, DNA taq（Takara Co. Ltd.）0.5 µL, レジオネラ属に特有なプライマー：
LEG 448A（5ʼ-GAGGGTTGATAGGTTAAGAGC）および LEG 854B（5ʼ-CGGTCAACTTATCGCGTTTGCT）各 0.5 µL, 滅菌済み Milli Q 33.5 µL を加え計 50 µL とし，GeneAmp PCR system 2400
（Perkin Elmer）にかけた．反応条件は，95℃ 5 分間の変性反応をし，95℃ 30 秒，61℃ 59 秒，74℃
59 秒を 40 サイクル後，74℃ 7 分の延長反応を行った．1.2% アガロース・ゲル（岩井化学薬品）を用いて電気泳動し，ethidium bromide に 20 分間浸し，紫外線照射でバンドの位置を確認した（山本，1998）．さらに，に特有なプライマー：Lmip L920（5ʼ-GCTACAGACAAGGAT-AAGTTG）および Lmip R1548（5ʼ-GTTTTGTATGACTTTAATTCA）を用いて同様に行った．
反応条件は 95℃ 5 分間の変性反応をし，95℃ 30 秒，55℃ 30 秒，72℃ 30 秒を 25 サイクル後，
72℃ 7 分の延長反応を行った（Mahbubani1990）．

ⅱ） Random ampliﬁed polymorphic DNA（RAPD）法
検出されたの中で，血清群まで一致したものに対し，RAPD 法を行った．反応−1系は，あらかじめ 15 µg mLにあわせた DNA テンプレート 33.5 µL, dNTP 5 µL, 10×PCR buﬀer

5 mL, DNA taq 0.25 µL, プライマーとして 15 mer（5ʼ-GTGGTGGTGGTGGTG）1 µL, 滅菌済み Milli
Q 5.25 µL を加え計 50 µL とし，GeneAmp PCR system 2400（Perkin Elmer）にかけた．反応条件
は，95℃ 5 分間の変性反応をし，95℃ 30 秒，35℃ 30 秒，72℃ 30 秒を 30 サイクル後，72℃で 7分の延長反応を行った．また再度確認するために，あらかじめ 15 µg mL−1 にあわせた DNA テン
プレート 14.5 µL, dNTP 5 µL, 10×PCR buﬀer 5 µL, DNA taq 0.5 µL, プライマーとして AP8（5ʼTTGCTGGCCTAGTTAAACGTA），AP9（5ʼ-ATGCGTAACCGTAACGTGCTGACT）各 1 µL, 滅
菌済み Milli Q 23 µL を加え合計 50 µL とし，GeneAmp PCR system 2400（Perkin Elmer）にかけた（Molmeret2001 ; Zeybek

2008）．反応条件は，94℃ 5 分間の変性反応をし，94℃ 1 分，30℃ 2 分，72℃ 1 分を 40 サイクル後，72℃で 3 分の延長反応を行った．どちらとも
2% のアガロース・ゲル（NuSieve 3 : 1, BMA）を用い電気泳動し，ethidium bromide に 20 分間
浸し，紫外線照射でバンドの位置を確認した．

3． 結
3．1

果

温泉周辺土壌

A〜K の 11 温泉施設周辺の土壌 13 試料（B および D 温泉施設周辺の土壌は各 2 試料ずつ採取，E
温泉施設周辺の土壌は採取していない），中 9 試料（69.2%）から 13 株のレジオネラ属菌（437

加藤尚之，大野章，齋藤宏治，山口惠三）を検出し，そのうち

温泉科学

は D-1，2 および J 温泉施設周辺土壌からのみ 5 株検出された．従って，今回の調査から，以外のレジオネラ属菌が多く分布していることが明らかになった．またレジオネラ属菌はインキュベーション時間の経過に伴い多くの菌株が検出された（Table 2）．
3．2

土壌から検出された菌株の PCR

土壌から検出された菌株がレジオネラ属菌で，尚かつであることを確認するた

めに PCR の測定を行なった（Fig 1，加藤，2004）．lane 1 は F 温泉施設周辺土壌で培養を初めてから 3 週間目に検出された菌株，lane 2 は D 温泉施設周辺土壌 D-1 で培養を初めてから 3 週間目に検出された菌株，lane 3，4 は D 温泉施設周辺土壌 D-2 で培養を初めてから 3 週間目に検出された菌株，lane 5，6 は D 温泉施設周辺土壌 D-2 で培養を始めてから 4 週間目に検出された菌株をそれぞれ白金耳で釣菌した．レジオネラ属菌の特異的なバンドは 430 bp のところに産生する．左側の lane 1〜6 ではいずれもコントロールの lane 7 と同じ 430 bp の位置にバンドが観察されることから，これらはレジオネラ属菌であることが分かった．またに特異的なバンドは

650 bp のところに産生する．右側の lane 2，5，6，はコントロールの lane 7 と同じ 650 bp の位置にバンドが観察されることから，これらの菌株はであることが分かった．また右側の lane 1，3，4 の菌株は 650 bp のところにバンドが産生されていないことから，以外のレジオネラ属菌であることが分かった．観察されたについて免疫血清

凝集反応を行ったところ，lane 2 では SG2 に凝集し，lane 5，6 は SG7 に凝集した．
3．3

温泉水中および周辺の土壌中から検出された L. pneumophila

A〜K の 11 温泉の中で A を除く 10 温泉（90.9%）からレジオネラ属菌が検出された（Table 3）．
検出された菌種は全てであった．血清群を見ると７箇所の室内浴槽から

SG1，SG2，SG3，SG5 および SG6 が検出された．なお，Table 3 に示した D 温泉浴槽水
中のSG5 は 2001 年の調査で検出された菌株を採用した．露天風呂からは，I 温泉

を除く 5 箇所からが検出された．それらの血清群は SG1，SG4，SG5 および SG10であった I 温泉では露天風呂の温泉水からレジオネラ属菌は検出されなかったが，露天風呂の岩肌に付着した ぬめり を採取し，レジオネラ属菌の検出を試みた．その結果，アメーバと共に
SG1 および SG6 が検出された（Table 3）．また I 温泉では浴槽から検出されたレジオネラ属菌の血清群とぬめりと露天風呂で検出された
3．4から検出された血清群が異なっていた．J および K 温泉でも浴槽の血清群が異なっていたことは興味深いことであった．

温泉の浴槽水およびその施設周辺土壌から検出された菌株の PCR

D 温泉の浴槽水から検出された菌株とその施設周辺土壌 D-1 で培養を始めてから 7 週間目に検出された菌株をそれぞれ２菌株ずつ白金耳で釣菌し PCR を行った．その結果，いずれの菌株も430 bp の位置にバンドが産生していることからレジオネラ属菌であることが分かった．さらにに特異的である 650 bp の位置にバンドが産出していることから，D 温泉の浴槽水およびその施設周辺土壌 D-1 から検出したレジオネラ属菌はいずれもであった．今回 PCR を行なった菌株は免疫血清凝集反応の結果いずれも SG5 に凝集したことから，D 温泉の浴槽水およびその施設周辺土壌 D-1 から検出されたの血清群が SG5 で一致している

ことが分かった．Table 2 より，D 温泉施設周辺から採取した土壌 D-1 では，培養を初めてから 9
週間目までに検出された438の血清群は SG2，SG5，SG7 であった．また J 温泉の露

2 weeks
1.0×101
ND
ND
ND
4.3×102
ND
ND
1.0×103
ND―
ND
ND
3.2×102
ND
ND
3.0×101ND
ND

1 week
1.0×101
ND
ND
ND
ND
ND
ND
3.0×101
ND―
ND
ND
2.0×101
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
2.0×101
ND―
4.2×102
ND
9.1×102
ND
ND
7.0×101
ND
ND

ND
ND
ND
ND
1.0×101

3 weeks
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
5.0×101―
1.17×103
ND
1.45×103
ND
3.0×101NT
ND
ND

4 weeks

ND : Not Detected, NT : Not Tested, spp. : species, SG : Serogroup, CFU : Colony Forming Unit

spp.
spp.
SG5

spp.
spp.
spp.

ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
―
ND
2.0×101
ND
ND
ND
ND
ND
ND

0 timeND
ND
ND
7.0×101―
ND
ND
2.9×102
ND
ND
3.0×101
ND
NT

ND
ND
ND
ND
8.0×101

5 weeks

ND
ND
NT
ND
ND
NT
NT
―
ND
ND
1.3×102
ND
ND
2.0×101
4.0×101
ND

ND
1.0×101

6 weeks

2.0×101
ND
ND
1.8×102
―
NT
NT
NT
ND
ND
3.0×101
9.0×101
ND

NT
NT
NT
NT
1.0×101

7 weeks

Number of organisms (CFU/m ) after incubation

ND
ND
2.0×101
5.0×101
1.0×101
ND
ND
―
ND
ND
7.0×101
ND
ND
1.0×101
6.0×101NT

ND
1.0×101

8 weeks

isolated from the soil around the hot springs after incubation.

ND
ND
ND
1.0×101
ND
ND
6.0×101―
ND
ND
1.0×102
ND
ND
ND
5.0×101
ND

ND
1.6×102

9 weeks

温泉施設に分布する

K

E
F
G
H
I-1
I-2
J

D-2

spp.
spp.

A
B-1
B-2
C
D-1

SG2
SG5
SG7
spp.
SG7

isolatedSpecies and number ofSampling point

Table 2

第 60 巻（2011）の侵入経路の解明に関する研究439加藤尚之，大野章，齋藤宏治，山口惠三

温泉科学Fig. 1 PCR proﬁles of colonies suspected of the genus
from soil samples (Kato, 2004)
Lane 1 to 6 : The PCR profiles for-suspected colonies cultured from the soil
samples around F and D hot spring facility. Lane-1 ; sample F (facility F), lane-2 ; sample D-1(facility D), lane-3, 4, 5, 6 ; sample D-2 (facility D). The colonies in lane 1-4 and in lane 5, 6
grew in 3 weeks and 4 weeks after incubation, respectively. Lane 7 : control strain ;Suzuki.
Left side (1-6) : PCR proﬁles for the genus; The 430 bp amplicon speciﬁc to thegenus
was detected in all samples.
Right side (1-6) : PCR profiles for; The 650 bp amplicon specific towas detected only in lane 2, 5 and 6.
Molecular size markers (X 174 Hinc II digest) are given at the lanes M in base pairs.

Table 3 Serogroups ofisolated from hot springwaters and soil around the hot springs.
Sampling points
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K

Hot spring waters
Inside bathOpen air bath

ND
ND
SG3
SG5*
SG6
―
SG2
―
SG3, SG5
SG3
SG1

―
SG5
―
―
―
SG4
ND
SG1
SG1**, SG6**
SG5, SG10
SG4, SG5

Soils
ND
ND
ND
SG2, SG5, SG7
―
ND
ND
ND
ND
SG5
ND

SG : Serogroups, * previous data, ** slime, ND : Not Detected

天風呂およびその施設周辺土壌から検出されたの血清群は，露天風呂では SG5，

SG10 であり，その施設周辺土壌では SG5 であったことから，J 温泉の露天風呂およびその施設周辺土壌から検出されたは SG5 が一致していた（データは示していない）．なお，

今回および前回の調査の中で，温泉水とその施設周辺土壌から検出された
440

の血清

第 60 巻（2011）

温泉施設に分布するの侵入経路の解明に関する研究群が一致したサンプルは，D および J 温泉だけであった．
3．5

血清群が一致した L. pneumophila の RAPD

D 温泉の浴槽水およびその施設周辺土壌 D-1 より分離し，血清群が一致した
SG5 株の RAPD の結果を Fig. 2 に示した．その結果，D 温泉の浴槽水から検出された
SG5 の lane 1〜10 のバンドパターンは全て一致していた．またその施設周辺土壌 D-1 から検出された

SG5 の lane 11，12 のバンドパターンも一致していた．しかし，lane 1〜

10 と lane 11，12 のバンドパターンは異なっていることから遺伝学的な一致はみられなかった．
従って，D 温泉の浴槽水およびその周辺土壌 D-1 から検出された

SG5 株の起源は異なっていることが示唆された．またこの結果は J 温泉の露天風呂およびその周辺土壌から検出された

SG5 株でも同様であった（データは示していない）
．

4． 考

察

本邦の温泉でのレジオネラ属菌に関する報告は，例えば藪内ら（1994）は，40 温泉中 17 温泉（42.5%）からレジオネラ属菌を検出し，その内 16 温泉がであったと報告している．本研究でも，11 温泉の中でレジオネラ属菌が検出された 10 温泉（90.9%）の全てがであったことから，自然環境中と同様に，温泉でもことが示唆された．これまでの報告から温泉におけるが広く蔓延しているの血清群は，SG3，4，5 が多く検出されている．しかし，本研究では試料数が少ないこともあるが，SG1〜6，10 まで検出されており，このような傾向は見られなかった．今回の調査で，I 温泉の残留塩素濃度が 2.0 ppm 以上であるにもかかわらず，露天風呂の温泉表面水と接触している岩肌に付着している ぬめり からが検出された．レジオネラ属菌は微細藻類の代謝産物を栄養源として利用する

こと，原生動物（アメーバ）の食胞内に取り込まれ，その中で増殖することが知られている（八木Fig. 2 Comparison of genotype by RAPD analysis between
SG5 isolates from
D hot spring water and surrounding soil.
Lanes 1-10,
SG5 isolates from D hot spring water ; lanes 11, 12,
SG5 isolates from surrounding soil. Molecular size markers (X 174 Hinc IIdigest) are given at the lanes M in base pairs.

441加藤尚之，大野章，齋藤宏治，山口惠三

田・遠藤，1998）．今回採取したぬめり出されたことから，

温泉科学からレジオネラ属菌の宿主であるアメーバが同時に検を取り込んだアメーバがシスト化（環境の悪化によってそれに耐えられる体に変化した状態，ただし増殖できない）し（藪内，1997），何らかによって露天風呂に入り込み， ぬめり の中でアメーバが再活性化して脱嚢することでも増殖して，アメーバを食い破って出てきているものと考えられた．この事から，この様な状況で一度に多くの浴客が露天風呂に入りそれにより残留塩素濃度が著しく低下した場合には，レジオネラ感染を引き起こす原因になりうることが示唆された．
これまで土壌からのレジオネラ属菌の検出に関するデータは少ない．例えば，伊藤（1983）はモ
ルモット腹腔内注入法を用い，長崎県と大分県で採取した土壌 28 試料中，5 試料（17.9%）から検出した．中浜（1983）はこの方法を応用し，岡山県で採取した土壌 7 試料中，1 試料（14.3%）か
ら検出している．また，古畑ら（2002）は日本各地の土壌にを添加し，37℃で 4 週間

培養後，1,362 試料中，86 試料（6.3%）から検出した．検出された菌種の 80.2% がであったと報告している．一方，宮本ら（2000）の報告では土壌からレジオネラ属菌は全く検出されなかった．Koide（2001）は市販の腐葉土 24 試料中，22 試料からレジオネラ属菌を検出した．石野ら（2008）は温泉源泉周辺土壌 33 試料を採取し，レジオネラ属菌の有無を直接培養法および増菌培養法を用いて調査した．その結果，レジオネラ属菌は直接培養法では 3 試料（9.1%）から検出した．増菌培養法ではレジオネラ属菌が 13 試料（39.4%）から検出され，このうち 9 試料
（69.2%）がであったと報告している．これらの調査は温泉源泉周辺土壌のみであり，温泉浴槽からのレジオネラ属菌との関係については調べていない．
今回調査を行った温泉施設周辺土壌では 13 試料中 9 試料（69.2%）から 13 株のレジオネラ属菌が検出された．しかし，土壌からはは検出された菌種の 38.5% であったことから，温泉施設周辺
以外のレジオネラ属菌が多く検出されていた．これら検出源でのレジオネラ属菌の菌種の違いに関する原因は不明である．direct（0time）法では，G からのみレジオネ
ラ属菌が検出された．また enrichment 法で検出されたの中で，D-1 からは SG2，

SG5，SG7，D-2 からは SG7，そして J からは SG5 が検出された．このことから，土壌中のレジオ
ネラ属菌はアメーバに取り込まれた状態で，アメーバがシスト化するのに伴い，レジオネラ属菌もその中で VNC（Viable but Noncultuable：生きてはいるが培養能力を持たない）の状態（Michael
1997 ; Ohno

2003；加藤，2004）でいるか，レジオネラ属菌が単独で VNC の状態で土壌中に生息しているものと考えられた．いずれの状態にせよ，enrichment 法でレジオネラ属菌が検出されたことから，土壌を滅菌水に入れ適温でインキュベーションすることによりレジオネラ属菌が復活し培養能を持ったことが示唆された．また direct 法で検出されにくい事として，低 pH 処
理法を用いてもレジオネラ属菌の培養を阻害する細菌類は完全に死滅せず，選択培地上に多数生育することから，培養能力を持っているレジオネラ属菌も生育を阻害されている可能性があることが示唆された．
本研究の主たる目的である侵入経路を明らかにする実験では，温泉水およびその施設周辺土壌から検出されたレジオネラ属菌の中でであることを PCR 法により確認した．さらに血清群が一致した試料は，D 温泉の浴槽水およびその施設周辺土壌 D-1 と J 温泉の露天風呂およびその施設周辺土壌の 2 箇所だけであり，いずれもSG5 であった．次に遺伝学的同定法の一つである RAPD 法を用いて，それぞれの温泉水およびその施設周辺土壌から検出された同じ SG5 のが遺伝学的に一致するか否か確認実験を行ったが遺伝学的な一致は見られなかった．従って，D 温泉水およびその施設周辺土壌と J 温泉水およびその施設周辺土壌から
検出された
442

の起源はそれぞれ異なることが示唆された．

第 60 巻（2011）

温泉施設に分布するの侵入経路の解明に関する研究

5． 結

論

今回，温泉におけるレジオネラ属菌の侵入経路を解明するために，温泉水およびその施設周辺土
壌からを検出し，さらにそれらの血清群が一致した試料を 2 箇所同定し，これらについて遺伝学的に同一のであるか否か RAPD 法を用いて確認実験を行った．その結果，遺伝学的な一致は見られなかった．従って，本研究では侵入経路を特定するまでには至らなかった．しかし，今回の調査で十分な塩素殺菌を行っているにも関わらず，温泉中のぬめり

からアメーバおよびレジオネラ属菌が検出された事は，殺菌している温泉であってもレジオネラ属
菌に感染する可能性がある事が示唆された．従って，浴槽および露天風呂での衛生管理を十分に行うことが重要である事が分かった．今後温泉へのレジオネラ属菌の侵入経路を明らかにするためには，土壌からだけでなく，湯客の体に付着して浴槽内に侵入することなども考慮する必要があると考えられた．
謝辞本研究に要した費用の一部は，文部科学省科学研究費（基盤研究（Ｃ）（2）課題番号：13680634

研究代表者 加藤尚之）を当てた．記して謝意を表します．
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