FLUGAS V2Automatic Influenza Genome Assembly and subtyping

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Automatic Influenza Genome Assembly and subtyping

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D E S I G N

C U S T O M I Z A T I O N

Chapterウインドウ項目 【画面構成】

・初期画面

プログラムの実行は、FluGAS.exe プログラム本体、もしくはショートカット をダブルクリ
ックして開始します。

※初回起動時はライセンスと Guppy プログラムの設定を行うダイアログが表示されます。

A D M I N I S T R A T I V E

U S E RG U I D E

・画面項目（左側メニュー）【Analyses】
解析を始める画面を表示します【Results】
解析結果を表示する画面を表示します【Reference A】
ウイルスのリファレンス配列を更新する画面を表示します【Reference B】
亜型決定ウイルスのリファレンス配列を更新する画面を表示します

・画面項目（下部ログメッセージ）

アプリケーションで行われている内容を表示します。実行中のタスクやエラーログなどが表示されます。

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U S E RG U I D E

・解析画面

【Select Sequencer】
解析に利用するデータを出力したシーケンサを選択します【Select Use Parameters】
解析時に利用するパラメータを選択します
初期状態は［default］が選択されています。右にある［edit］ボタンをクリックすると選択されているシーケンサに対して設定できる画面へ遷移します【Select Data】
解析を行うデータを格納している［フォルダ］、もしくは［ファイル］を、枠内へドラッグ・アンド・ドロップします［Select Folder(s)］や［Select File(s)］をクリックすることでも選択が可能です4

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U S E R

ChapterG U I D E



解析を行う 【MiSeq シーケンサ】

Illumina MiSeq シーケンサから出力された Fastq（または gz 圧縮された Fastq）ファイルを解析します。

・[Select Sequencer]設定の［MiSeq data］チェックボタンをクリックしますクリック※ [MiSeq data]と[Minion data]は排他です。混合サンプルの解析には対応していません

・[Select Use Parameters]設定で利用するパラメータセットを選択します

プルダウン 選択※ 解析時のパラメータを選択します。FluGAS は解析実行前にパラメータを全て設定する必要があります。解析時に使用する詳細なパラメータを変更するには横の【edit】ボタンをクリックしパラメータ画面にて編集を行います。

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U S E RG U I D E

・[Select Use Parameters]設定で解析対象を選択します※ 解析対象の A 型/B 型ウイルスを選択します。デフォルトは両者とも解析対象になっています。解析対象が A 型のみ、もしくは B 型のみの場合は、［FluA］もしくは［FluB］を選択することにより解析時間が短く設定できます。

※［edit］ボタンをクリックすることにより、MiSeq シーケンサデータにより解析するさいに利用するマッピングツール（Bowtie2 ）や、ホモロジー検索（Blast）実行時のパラメータを設定できます。
詳細は［パラメータ設定］の項目を参照してください。

・[Select Data]設定のテキストボックス内へ Fastq ファイルをドラッグ＆ドロップします

ファイルを選択してドラッグ・アンド・ドロップ

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※ MiSeq のデータは、拡張子が「fastq」または「fastq.gz」の拡張子ファイルが指定可能です。上記以外のファイルを指定するとエラーとなります。

または［Select File(s)］ボタンをクリックすることにより、ファイル選択ウインドウから、解析を行う[Fastq ファイル]を選択（複数サンプル可）もできます。

リンクをクリック
Fastq 選択ウインドウ

ファイルを選択（複数可）
開くボタンで決定※ MiSeq シーケンサのデータを解析する場合、フォルダの選択はできません。

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U S E RG U I D E

・[Analysis]ボタンをクリックし保存場所を指定します。

クリック

解析データの指定を行ったのちに[Next]ボタンをクリックすると、解析ファイルの保存場所を指定するウインドウが表示されます。

保存するフォルダを選択すると解析が実行されます。

クリック※ 日本語やスペースを含むフォルダを指定しないでください。外部ツールでエラーとなる場合があります。

実行中は下部ログメッセージに実行中のコマンドが表示されます。

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解析を行う 【MinION シーケンサ】
Nanopore MinION シーケンサから出力された Fast5 または Fastq ファイルを解析します・[Select Sequencer]設定の［MinION data］ボタンをクリックしますクリック※ [MiSeq data]と[Minion data]は排他です。混合サンプルの解析には対応していません

MinION Fast5 から解析する場合、フォルダの指定が可能です。
指定するフォルダ・ファイルが 1 ランのデータの場合 [is 1-sample]をチェックします。

チェックが入っている場合、[Select Data]に指定したフォルダもしくはファイルを全てが 1 ランのサンプルとして、
1 解析分のデータとして利用され、Barcode に基づくサンプル分割が行われます
チェックを外すと、指定された 1 ファイルもしくは 1 フォルダを別々のサンプルとして解析します。
MinION Fast5 から解析する場合、バーコード分割を行います。バーコード分割は PC にインストールされた Guppy のプログ
ラムを使用します。

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U S E RG U I D E

対象をバーコード分割する場合は、[barcode separate]をチェックします。

チェックが入っている場合、[Select Data]に指定した対象を Basecall したのちにバーコード分割を行います。
チェックを外すと、指定された 1 ファイルもしくは 1 フォルダを別々のサンプルとして解析します。

[barcode separate]にチェックが入っている場合、次画面で各バーコードに対応したサンプル名が指定可能です。
※詳細はバーコード分割画面を参照してください。

・[Select Use Parameters]設定で利用するパラメータセットを選択します

プルダウン 選択※ 解析時のパラメータを選択します。FluGAS は解析実行前にパラメータを全て設定する必要があります。解析時に使用する詳細なパラメータを変更するには横の【edit】ボタンをクリックしパラメータ画面にて編集を行います。
Fast5 から Fastq へ変換するコンバートツール、マッピングツールや、ホモロジー検索（Blast）実行時のパラメータを設定できます。（詳細は Parameters の項目を参照してください）・[Select Use Parameters]設定で解析対象を選択します※ 解析対象の A 型/B 型ウイルスを選択します。デフォルトは両者とも解析対象になっています。解析対象が A 型のみ、もしくは B 型のみの場合は、［FluA］もしくは［FluB］を選択することにより解析時間が短く設定できます。

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U S E RG U I D E

※ 解析対象の 分節対象を選択します。デフォルトは全ての分節が解析対象になっています。解析対象の分節を指定することで解析時間が短く設定できます。

※［edit］ボタンをクリックすることにより、MinION シーケンサデータにより解析するさいに利用するマッピングツール（minimap2）や、ホモロジー検索（Blast）実行時のパラメータを設定できます。
詳細は［パラメータ設定］の項目を参照してください。

・[Select Data]設定のテキストボックス内へ、[Fast5 フォルダ]［Fastq ファイル］をドラ
ッグ・アンド・ドロップします

フォルダ・ファイルを選択してドラッグ・アンド・ドロップ

11A D M I N I S T R A T I V E

U S E RG U I D E

MinION シーケンサで指定できるデータは以下の内容です※

Fast5 ファイル (※１)※

Fast5 が保存されているフォルダ※

付属のコンバートツールで Fastq へ変換後の Fastq ファイル

※1 Nanopre 社が提供している変換・マッピングツール「Guppy」が必須です
2020.01 時点 Guppy 3.4.4 で検証を行っています・[Analysis]ボタンをクリックし保存場所を指定します。

クリック

解析対象が Fastq ファイルの場合、解析ファイルの保存場所を指定します。

クリック

保存するフォルダを選択します。

※ 日本語やスペースを含むフォルダを指定しないでください。外部ツールでエラーとなる場合があります。

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U S E RG U I D E指定されたデータが MinION（fast5）データの場合、ベースコールとバーコード分割を行います。対象のデータに対応するコンフィグの選択と、サンプル名を指定します。
ポップアップウインドウが表示されますMinION（Fast5 形式）データを指定し[barcode separate]にチェックが入っていた場合、guppy_barcoder プログラムによりバーコード分割を行います。バーコードに対応するサン
プル名[name]を指定します。

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U S E RG U I D E

Barcode に対応するサンプル名を入力します

バーコードの名前はエクセルからも指定することができます。

クリック

ウインドウ右上にある、[TemplateExcel]ボタンを押下し、エクセルファイルの保存場所を指定します。テーブル表示されている内容と同じ表が取得できます。

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C 列に各バーコードに対応するサンプル名を記述して保存します

ダウンロードしたエクセルファイルを編集します。C 列にサンプル名を入力して保存します。バーコード数はデフォルトで 24 件です。
※B 列にはバーコードの一意名となっているので編集しないでください。

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U S E RG U I D E

・エクセルファイルを、テーブル表示内にドラッグ＆ドロップすると、内容が反映されます。

barcode01～barcode04 までに対応するサンプル名を入力

編集・保存したエクセルファイルを barcode テーブルへドラッグ＆ドロップ

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U S E RG U I D E

エクセルファイルに入力した「Name」だ
け更新されますエクセルファイルに入力した[Name]がテーブル表示に反映されます。
※上記の例では「barcode01」～「barcode04」の[Name]を変更（sample1～sample4）して保存したエクセル
ファイルをドラッグ＆ドロップした結果です。

barcode はデフォルトで 01～24 まで登録されています。25 以上のバーコードをご利用の場
合は、エクセルファイル内で B 列の「barcode24」以下に、「barcode25」を増やし[Name]を指定してから保存したエクセルファイルをドラッグ＆ドロップしてください。増加した分のバーコードが反映されます。

クリック

バーコードに対応するサンプル名を指定したのちに、[Next]ボタンを押下すると保存場所を指定するウインドウが表示されます。

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U S E RG U I D E

保存するフォルダを選択すると解析が実行されます。
実行中は下部ログメッセージに実行中のコマンドが表示されます。
※ファイルの保存場所を指定する際に、日本語名（全角）・スペースを含むフォルダを指定しないでください。外部ツー
ル実行時に正常動作しない場合があります。

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U S E R

ChapterG U I D E

パラメータ設定を行う 【MiSeq シーケンサ】

Illumina MiSeq シーケンサから出力されたデータを解析する際に利用するツールの設定を行います。
[Select Sequencer] 項目で「MiSeq data」を選択したのち、［Select Use Parameters］
項目で「edit」ボタンをクリックします。

１．選択

２．クリック19

A D M I N I S T R A T I V E

U S E RG U I D E

・パラメータ設定 項目 【MiSeq】【Parameter Name】（必須）
下部で設定したパラメータ項目にたいして名前を付けて保存します。
指定したパラメータを利用する場合は必須です。以前に同じパラメータ名がある場合は上書きされます。
【Analysis target is top3】
解析を行うさいにマッピング、Blast 結果の対象を上位 3 件にします（デフォルト）
チェックを外すとマッピング、Blast 結果の上位 1 件のみを対象とします20

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【Mapping Parameter】
MiSeq データのマッピングを行う【bowtie2】実行時に指定するパラメータを設定します。
【use number of threads 】
マッピングを行うさいに利用する CPU スレッドを指定します。
【Bowtie2 Parameter edit?】（非推奨）
Bowtie2 実行しに指定するパラメータを編集する場合にチェックボックスをオンにしてパラメータ値を変更します。（既存のパラメータセットは、A 型インフルエンザ・ウイルス MiSeq シーケンスデータを前提としパラメータをセットしています）

詳細は以下のサイトにある内容を参照してください。
http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml【Sampling read count】
Fastq から 解析に利用するリード数を設定します。（Illumina シーケンサから出力されるリード数
が過多の場合、解析に時間がかかるほか、利用 PC によってはメモリが足りない時があります。このパラメータにより解析を行うリード数を制限することにより解析時間の短縮、PC のメモリ不足などに対応します）【use FastQC 】【FastQC】
Fastq から Phread score の高い塩基のみを取得する Quality control の設定を行います。
【use FastQC 】
MiSeq データを利用する場合に、QC チェックを行う場合にチェックします。
【MinPhreadScore 】
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U S E RG U I D E

QC に使用する Phread score のカットオフを設定します【Window Size 】
QC 時に使用する Window 幅を塩基数で設定します【Min Length】
解析に持ち込む Read の最小塩基⾧を指定します。QC での Read Trimming 後の Read ⾧がこの値以下の Readは破棄されます。

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U S E RG U I D E

・パラメータ設定項目 【MinION】【Parameter Name】（必須）
下部で設定したパラメータ項目にたいして名前を付けて保存します。
指定したパラメータを利用する場合は必須です。以前に同じパラメータ名がある場合は上書きされます。
【Analysis target is top3】
解析を行うさいにマッピング、Blast 結果の対象を上位 3 件にします（デフォルト）
チェックを外すとマッピング、Blast 結果の上位 1 件のみを対象とします23

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U S E RG U I D E

【Convert tool Select】
MinION シーケンサから出力された Fast5 形式のファイルを Fasta 形式へ変換させるツールを選択します。入力ファイルが Fastq/Fasta 形式の場合、この項目は無視されます。
現バージョンは Guppy のみ利用可能です（以前のバージョンで選択可能だったツールは、廃止となりました）。

【Guppy】
Fast5 から Fasta へ変換する際にナノポア社が提供している［Guppy］を利用します。
※［Guppy］を利用する場合は、事前にナノポア社のダウンロードページより Windows 版インストールファイルを保存し実行します。
[select]ボタンから Guppy の「bin」フォルダを指定してください。デフォルトのインストールさきは C:\Program

Files\OxfordNanopore\ont-guppy-cpu\bin となります。

・パラメータ設定 項目 【共通】【CNS Create consensus】
コンセンサス配列 作成時のパラメータを設定します。
【CNS Min Coverage 】
指定されたカバレッジ以下の領域は下記のパラメータ【1st mapping Less than Min Coverage】、【final mappingLess than Min Coverage】 に従います

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U S E RG U I D E

【Homo Frequency】
指定されたアレル頻度を超えた塩基がコンセンサス配列に反映されます【Variant Min Frequency】
指定されたアレル頻度以上の変異をコンセンサス配列へ反映されます【Ins/Del Min Frequency】
指定されたアレル頻度以上の変異（Ins / Del）がコンセンサス配列に反映されます【1st Mapping Less than Min Coverage】
1st Mapping 結果から作成される一時コンセンサス配列に対して、上記で指定された【CNS Min Coverage】の閾値を満たさなかったコンセンサス塩基に空白文字（None）、もしくは N を指定します【1st Mapping Less than Min Coverage】
最終コンセンサス配列作成の Mapping 結果から、上記で指定された【CNS Min Coverage】の閾値を満たさなかったコ
ンセンサス塩基に空白文字（None）、もしくは Nを指定します【Consensus include ‘N’ cutoff】
コンセンサス配列 として採用する閾値を設定します。
【Ratio of Include （%） 】
作成されたコンセンサス配列に、指定された数値（％）以上の N が含まれていた場合、当該コンセンサス配列を破棄します25

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U S E RG U I D E

【Blast result cutoff】
BLAST 実行時に指定するパラメータを設定します。
【Blast E-value 】
Blast 結果から Subtype 決定に使用する Subject を取得する際の E-value の下限を設定します【Blast Max-target 】
Subtype 決定に使用する Blast 結果の Subject 数を設定します
指定された数の Subject がすべて同じ Subtype を示している場合検体の Subtype が決定されます【Select consensus Blast target】
コンセンサス配列を作成するための 2nd-mapping リファレンスを決定する BLAST 結果の基準を設定します。
【Blast Top result Select. 】
Top Hit を選択する Blast 結果の項目を選択します。デフォルトは Length です。
※ Length の場合 BLAST の閾値を超えた結果の中から塩基配列数が最大のエントリーとなります【Blast cutoff value Select.】
Blast 結果の閾値を指定します。
（上述の Blast Top result Select.項目と一緒に利用します）

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U S E RG U I D E

【Cancel】 【Commit】ボタン
パラメータ設定画面の値を保存するかを決定します。
【Cancel】
上記の設定項目・数値を破棄して、解析画面へ戻ります【Commit】
上記の設定項目・数値を保存し、解析画面へ戻ります27

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U S E R

ChapterG U I D E

解析結果を参照する 【Sample Result】

解析結果を参照します。

画面項目（左側メニュー）［Result］をクリックすると解析結果画面へ遷移します。

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U S E RG U I D E

・解析結果画面 項目【解析結果 リスト】
解析を行った日付（Date）と 解析実行時に指定したフォルダまたはファイルの代表名がリストされます。
リスト上部の［Date］［Name］をクリックすると、リスト部分がクリック対象の昇順・降順となります。
デフォルトは日付（降順）です。
【date:From/To 】
リスト下部にあるカレンダーオブジェクトにより、解析日の絞り込みができます。カレンダーアイコンをクリックし月日を指定します。カレンダーオブジェクトで選択した日付により解析結果リストが変更されます。

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【Hide/Delete】
解析結果リストに表示されるサンプルに対して一時的に非表示、または削除が可能です。解析結果リストの当該サンプ
ル名を右クリックするメニューを表示させ、［Hide］/［Delete］を選択します。
・［Hide］ 一時的に解析結果リストより当該サンプルを非表示にします・［Delete］管理しているサンプルの情報を削除します（削除されたデータは戻りません）【Sample Result】
解析結果リスト行を選択（クリック）すると、選択された解析結果が表示されます。
【Sample 】
解析実行時に入力したフォルダ/ファイル名をもとに解析結果の名前が付けられます。（MinION データの場合 barcodeを利用したデータとなるため入力したフォルダ名に barcode が付与された名前になります）【Name 】
解析実行時に入力したフォルダ/ファイル名をもとに解析結果の名前が付けられます。
［name］テキストボックスに任意の文字列を入力後、テキストボックス右にある［commit］ボタンをクリックすることによりデフォルトのフォルダ・ファイル名ではなく、ユーザが分かりやすい名前を付与する事ができます。
［commit］ボタンにより更新が正常に行われると、［解析結果リスト］にも反映されます。
【Type】
解析結果のインフルエンザ型・亜型 が表示されます。
解析できなかったサンプルの方は「＃」に置き換わります。
【ExecDate】
解析を行った日時の詳細を表示します。

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U S E RG U I D E

【Sample Detail】
解析結果 塩基配列に関する情報を表示します。
リスト行を選択（クリック）すると、選択された解析結果が表示されます。

【InfluA1～InfluB3】タブ
解析を行う A 型、B 型のそれぞれスコア順 Top3（デフォルト）までの情報を表示します。（設定項目で Top1 のみの解析を行う場合、InfluA1、InfluB1 のみ有効になります）
選択されたタブの塩基情報が下部に表示されます。
インフルエンザ A 型で最良スコア＝ InfluA1
インフルエンザ B 型で最良スコア＝InfluB1※スコアは以下の方法により算出されます
MinION:Cover Ratio x Cover average 数値が高い順
MiSeq: Cover Ratio ＞ Cover average ＞ Length の数値が高い順※
Cover Ratio = リファレンス カバー率
Cover average ＝平均カバレッジ
Length = コンセンサス配列の塩基⾧【Segment】
解析は亜型別にそれぞれに行われます。亜型ごとの塩基情報を表示します。
【CoverRatio】
解析結果のコンセンサス配列と、元となった参照配列に対してのカバー率が表示されます。
（コンセンサス配列⾧ / 参照配列⾧）31

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【Cover avg】
解析結果のコンセンサス配列と、元となった参照配列に対しての平均 Depth が表示されます。
（コンセンサスを形成するリード総塩基数 / 参照配列⾧）【CDS】
解析結果のコンセンサス配列の転写領域の範囲が表示されます。
（転写領域の判定は、Appendx: コンセンサス配列の CDS に関して を参照）
【Create Consensus】
解析結果のコンセンサス配列が表示されます。解析時の設定により、各閾値（CoverRatio、Cover Avg、N-率 ）を下回った場合は表示されません。

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・GSAID 提出エクセルの作成【Create Excel】
解析結果を表示している右下部にある［Create Excel］ボタンをクリックすると、上記に詳細表示されている塩基情報を反映したエクセルを作成します。

エクセルの保存場所とファイル名を指定します。

33

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複数サンプルを対象に GISAID 提出エクセルを作成する場合、［解析結果リスト］で複数選択（Shift+クリック）したのち、［Create Excel］ボタンをクリックします。

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U S E R

ChapterG U I D E



参照配列を更新する 【Reference update】

解析に利用する参照配列を更新します。

画面項目（左側メニュー）［MappingRef］［TypingRef］をクリックするとリファレンス配列の更新を行う画面を表示します。

［MappingRef］インフルエンザの参照配列（マッピング、BLAST のリファレンス配列）［TypingRef］インフルエンザ亜型決定参照配列
A 型 NA、HA 型を決定する参照配列
B 型 Yamagata/Victoria を決定する参照配列

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・インフルエンザ リファレンス配列の更新【NCBI reference】
解析に用いるリファレンス配列を作成するため、NCBI の FTP サイトから「influenza.fna.gz」ファイル
をダウンロードします。※ インターネット接続が必要です
更新が実行されると、自動的にファイルがダウンロードされます。ファイルに登録されている FASTA 形式のヘッダ情報から、インフルエンザ A / B 型の亜型（ha/mp/na/np/ns/pa/pb1/pb2）の 8 分節に分割され保存されます。

【User reference fasta】
解析に用いるリファレンス配列にユーザが保持している配列を利用したい際、ここに Fasta ファイルを設定することで上記の NCBI Influenza 配列とともに各分節に分割され保存されます。
適用する FASTA ファイルの配列名は分節の判断できる文字列「（HA）などカッコで囲まれた分節」、型が判定できる
文字列「（H３N2）など」の亜型が判別できる文字列が必要です。
章末の※ GISAID から取得した参照配列を加えて解析する方法 を参照してください36

A D M I N I S T R A T I V E

U S E RG U I D E

【Parameter】
リファレンス配列を更新する際に利用するパラメータを指定します。
【Influ-A】【Influ-B】タブ
それぞれの A 型／B 型インフルエンザ、各分節の塩基⾧を指定します。
【Min Len】 （テキストボックス 数値）
対象 Fasta 形式の塩基数のうち指定された数値以上の塩基数を持つエントリーがリファレンス配列の対象となります【Max Len】 （テキストボックス 数値）
対象 Fasta 形式の塩基数のうち指定された数値以下の塩基数を持つエントリーがリファレンス配列の対象となります【5’ start】 （テキストボックス 【AGCT】）
Fasta 形式の塩基が指定された塩基から始まるエントリーがリファレンス配列の対象となります【3’ end】 （テキストボックス 【AGCT】）
Fasta 形式の塩基が指定された塩基で終わるエントリーがリファレンス配列の対象となります【inc ‘N’】（テキストボックス 数値）
リファレンス配列候補となっている塩基配列の‘N’の許容個数をしていします。指定された数値以内の’N’塩基がある配列がリファレンス配列となります。
空白の場合リファレンス配列の作成時に無視されます（’N’が幾つでも採用されます）。
【Min CDS】 （テキストボックス 数値）
対象 Fasta 形式の塩基のうち指定された数値以上の CDS ⾧を持つエントリーがリファレンス配列の対象となります（CDS は NCBI 登録ではなく、FluGAS で仮想的に取得した領域を対象としています）【Max CDS】 （テキストボックス 数値）
対象 Fasta 形式塩基のうち指定された数値以下の CDS ⾧を持つエントリーがリファレンス配列の対象となります（CDS は NCBI 登録ではなく、FluGAS で仮想的に取得した領域を対象としています）【CD-HIT】（テキストボックス 数値（1 以下））
数値（Float）が入っている場合解析フローの最初に行うマッピング対象を作成するさいに利用する「CD-HIT」のパラメータを設定します。デフォルト値は 0.9（90％）です。

※ 1st-Mapping
FluGAS 解析フローの最初に行うマッピングは、NCBI には同じ塩基配列が異なるエントリーとして登録されているため
参照配列全体から相同性の高い配列を除いたリファレンス配列が対象となります。
相同性の高い配列から代表配列を得る際に CD-HIT（https://cd-hit.org/）を利用しています。

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※ GISAID から取得した参照配列を加えて解析する方法
GISAID の公開しているインフルエンザゲノム配列を NCBI のインフルエンザゲノム参照配列とともに利用することができます。 GISAID から配列を取得する際に、配列名に A 型・B 型の別と分節名が配列名中に入るようにして Fasta ファイルをダウンロードします。
（例）>A/Chicken/Anhui/39/2004_|_A_/_H5N1_(NP)_@2004_(Month_and_day_unknown)>A/Pennsylvania/17/2012_|_A_/_H3N2_(MP)_@2012-08-23>A/North_Carolina/29/2014_|_A_/_H3N2_(PB1)_@2014-11-08※ CDS の取得に関して
FluGAS リファレンス配列の中から極端に短い（Deletion の多い）配列や極端に⾧い（Insertion の多い）配列を除く事を目的とします。0 を指定した場合、CDS 領域⾧に関しての Filter は OFF になります。
CDS 領域は以下の正規表現を用いて取得した仮想的な塩基配列元に閾値に照らし合わせ判定を行います。
（NP/MP は 1 つの領域に 2 つの転写領域をもつため異なる方法を用います）
・NP/MP 文節 以外@"(atg(?:\S{3})*?(?:tag|taa|tga))"
・NP/MP 文節@"(atg(?:\S{3})*?(?:tag|taa|tga)[\S](?:\S{3})*?(?:tag|taa|tga))"38

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U S E R

ChapterG U I D E

ライセンスの登録 【License】

FluGAS はインストール後 2 週間をデモ期間として利用いただけます。
デモ期間を過ぎると、ライセンスエラーとなり起動時にダイアログが表示されます［ライセンス エラーダイアログ］「いいえ」を選択すると、アプリケーションが終了します。
「はい」を選択すると、インフォメーションウインドウが表示されます。

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表示されている英数字（12 桁）をお知らせください「ライセンスファイル」を取得済みの場合は、［select］ボタンからライセンスファイルを選択し、［accept license］ボ
タンをクリックします。
「ライセンスファイル」を申請する際は、「your address 」 部分に書いてある文字列を弊社にお送りください。
［open contact page］から弊社のお問い合わせ画面、もしくは以下のメールアドレスよりご連絡ください。
URL:https://www.w-fusion.co.jp/J/contactus.php
メールアドレス:techsupport@w-fusion.co.jp

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【Appendx】

コンセンサス配列へ反映される SNP と挿入・欠失のルール
コンセンサス配列へ反映される SNP と挿入・欠失のルール
CNS MIN COVERAGE で設定したカバレッジを越えた領域からコンセンサス配列が出力されます。この領域にある変異をコンセンサス配列に反映するルール
は下記です。 CNS MIN Variant Frequency で設定された頻度を超えた変異がコンセンサスに反映されます。
CNS MIN Variant Frequency 以上で CNS MIN Homozygous Frequency 以下の SNP が複数ある場合は IUPAC 表記のルールにのっとった混
合塩基がコンセンサスに反映されます。
SNP がひとつしかなく、頻度が CNS MIN Variant Frequency 以上で CNS MIN Homozygous Frequency 以下の場合はマッピングリード中の参照
配列の塩基が CNS MIN Variant Frequency 以上で CNS MIN Homozygous Frequency 以下であれば参照配列塩基と SNP の IUPAC 表記となります。
複数の SNP のうちひとつでも CNS MIN Homozygous Frequency を超えた SNP があれば、その SNP の塩基がコンセンサスに反映されます。
複数の CNS MIN Homozygous Frequency を越えた SNP が存在した場合は頻度のもっとも高い変異が反映されます。
挿入・欠失がコンセンサス配列に反映されるには必ず CNS MIN Homozygous Frequency を超えていることが条件です。
CNS MIN Variant Frequency を超えただけでは挿入・欠失はコンセンサス配列に反映されません。

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バーコードとサンプル名
入力データの個数と、[is 1-run] 、[barcode separate]のチェックボックスによって、バーコードに対応する表示名が変化します。
・「is 1-run」 チェックボックスが ON、「barcode separate」チェックボックスが ON の場合
複数データ（fast5 ファイル、fast5 を含むフォルダ）を指定した際、ベースコール後の Fastq ファイルをマージしてバーコード分割を行うため入力されたファ
イルは 1fastq として扱われます。
このため、バーコード分割を行った場合でもサンプル数はバーコード分割後の数と同じになるため「barcode01」～ が一意名になります。
「is 1-run」 チェックボックスが OFF、「barcode separate」チェックが ON の場合
単一のデータを指定した場合、上記同様にベースコール後の入力データが 1fastq となるため、「barcode01」～ が一意名になります。
複数のデータが指定された場合、各データに対してバーコード分割が行われるため、各データのフルパス⁺Barcode 番号になります。

name list 個数
uniq

1

uniqs

n

singlebarcode24

multin x barcode24

is-1runbarcoden=1

request

TRUE

TRUE

TRUE

single

TRUE

TRUE

FALSE

single

TRUE

FALSE

TRUE

uniq

TRUE

FALSE

FALSE

uniq

FALSE

TRUE

TRUE

single

FALSE

TRUE

FALSE

multi

FALSE

FALSE

TRUE

uniq

FALSE

FALSE

FALSE

uniqs

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コンセンサス配列の作成に関して
FluGAS は以下の要項によって各亜型に対してコンセンサス配列を作成します。
Step1:1st-MappingSample 配列 ｘ リファレンス配列
Step2:mapping -> Pileup コマンド -> コンセンサス配列作成
マッピング結果 sam ファイルから、SNP/insert/delete を反映させた 1st コンセンサス配列作成
Step3:1st-Blast
1st コンセンサス配列 ｘ リファレンス配列
BLAST 結果から上位 3 件を 次項 2nd-Mapping リファレンス配列とする
Step4:2ndMappingSample 配列 ｘ 1st-Blast リファレンス配列【mapping -> Pileup コマンド -> コンセンサス配列】
マッピング結果 sam ファイルから、SNP/insert/delete を反映させた 2nd コンセンサス配列作成【2nd-Blast】
2nd コンセンサス配列 ｘ リファレンス配列※ Step1:1-sample 分の Fastq ファイルと、A/B 型の 8 分節（計 16 分節）のリファレンス配列に対してマッピングを行います。
デフォルトのマッピング対象は「SelectedReference」フォルダにあるリファレンス配列です。パラメータ設定画面の[Mapping tool Select]項目にある【1stMapping is selected reference】のチェックを外した場合、[reference]フォルダ内にあるリファレンス配列が対象となります。

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亜型判定に関して
FluGAS は以下の要項によってウイルスの亜型判定を行います。
・

TypeA 亜型
最終コンセンサス配列を、亜型判定用のリファレンス配列に対して BLAST を実行します。
・ HA-コンセンサス ｘ HA-リファレンス
・ NA-コンセンサス ｘ NA リファレンス
コンセンサス配列は、最大 3 本作成され、それぞれの BLAST の結果が同じ亜型（数値）でない場合は判定できずとなり【＃】になります。
同一コンセンサスの BLAST 結果が、すべて同じ亜型である場合に限り亜型（数値）が決定されます。
※ このため、コンセンサス配列が作成された状態でも、未判定【＃】になることがあります。

表示される A 型の亜型判定は最もスコアの良いコンセンサス配列の決定値となります。閾値を満たすコンセンサス配列の亜型判定結果は、すべての亜型判定を表示します。

当該サンプルの推定亜型

コンセンサス配列の亜型判定結果 この例の場合
HA は閾値を超えたコンセンサス配列は 1 本のみで HA12
NA は閾値を超えたコンセンサス配列が 2 本作成されたが 2 本
とも NA5 という判定

・TypeB 亜型
最終コンセンサス配列を、亜型判定用のリファレンス配列に対して BLAST を実行します。
・ HA-コンセンサス ｘ Yamagata -リファレンス
・ HA-コンセンサス ｘ Victoria-リファレンス
それぞれの BLAST 結果を比較し、スコアの高いリファレンスに対応する型が当該サンプルの型として表示されます。
HA コンセンサス配列は最大 3 本作成され、それぞれ型判定が行われ多数決により Yamagata もしくは Victoria 型として表示されます。

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コンセンサス配列の CDS に関して
FluGAS は以下の要項によってコンセンサス配列の CDS を検出します。
１．ncbi リファレンス配列の gi 番号からインターネット経由で Genbank 情報を取得
２．Genbank 情報から CDS 情報を取得（cds-start 位置）
３．ATG から始まるコンセンサス配列に対して、以下の正規表現で取得された最短の塩基配列をコンセンサス CDS として登録
４．Result 画面 Sample Detail で表示 (※CDS 領域が取得できない場合は ー が表示される)

・コンセンサス CDS を検索する正規表現
最終コンセンサス配列を、Genbank cds-start 位置からの sub-consensus を作成し、開始コドン（ATG）から始まるコンセンサス配列として以下の正規表
現により CDS の終了位置を検出します。

・NP/MP 以外@"(^atg(?:\S{3})*?(?:tag|taa|tga))"
・NP/MP@"(^atg(?:\S{3})*?(?:tag|taa|tga)[\S](?:\S{3})*?(?:tag|taa|tga))"45

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最終マッピング状況の確認に関して
 コンセンサス配列が正常に作成されたサンプルに対して、サブタイプをクリックすると MappingViewer と、CDS 翻訳領域のアライメントを表示します。
 MappingViewer は Tablet(https://ics.hutton.ac.uk/tablet/) が起動します。
 アライメントは Alignview(http://www.ormbunkar.se/aliview/)が起動します

Tablet で表示


起動初期にはアライメントが表示されていません。

Contig(リファレンス ID)をクリックするとマッピング状態が表示されます。

※複数 Contig がある場合 Read 欄の数値の有るものを選択します。

Read が 0 の Contig を選択した場合マッピング領域が無いためエラー表示となります。

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AliVew で表示
初期状態は上にリファレンスアミノ酸配列（NCBI から取得した Genbank tranceration 情報）
下段がコンセンサス配列の CDS 領域から翻訳したアミノ酸配列※File 下のアイコンをクリックすると変化の在った部分のみ表示されます47

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このソフトウエア（FluGAS）は国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生部門と共同研究成果をもとに株式会社ワールドフュージョンが開発・販売をしています。

内容についてのお問い合わせ先:
株式会社ワールドフュージョン技術営業部
東京都中央区日本橋蛎殻町 1 丁目 38 番１２号
油商会館ビル２F
Tel:03-3662-0521 Fax:03-3662-0522

Mail:techsupport@w-fusion.co.jp
URL:https://www.w-fusion.co.jp

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