肥満・糖尿病予防を目的とした香辛料成分によるアディポサイトカインの分泌・発現制御に関する研究

63〈平成16年度〉

肥満・糖尿病予防を目的とした香辛料成分によるアディポサイトカインの分泌・発現制御に関する研究
津田孝

範（同志社大学研究開発推進機構）

1. は じ め にDNAマイクロアレイにより解析することを試み，肥満・糖尿病予防を標的とした新たな機能性食品

平成15年国民健康・栄養調査によると，30歳から60歳の男性の３割以上が肥満者（BMIが25以上）の創製へ貢献することを目的とした。
2. 実 験 方 法

であると報告されている。肥満の原因は遺伝因子の他に環境因子である過食，高脂肪食，運動不足〔実験材料〕が大きく関与している。肥満は，これを基盤とし試料としては，紫バジルや赤シソなどに含まれて糖尿病，動脈硬化症などの生活習慣病を発症さているアントシアニン（シアニジン３−グルコシせる。近年の研究成果から脂肪組織は，種々のアド；C3G，シアニジン；Cy，デルフィニジン３−

ディポサイトカイン（脂肪細胞から分泌される生ルチノシド；D3R，デルフィニジン；Del），ショ理活性物質）を分泌する最も重要な内分泌臓器でウガの辛味成分である６−ジンゲロール（図１）あり，その機能制御で肥満あるいは糖尿病を制御を始めとして市販されている香辛料成分についてできることが明らかにされつつある１）。アディポ

検討した。

サイトカインの中でアディポネクチンは，脂肪細胞特異的に発現している重要なアディポサイトカ〔アディポネクチンの発現低下を抑制する食品
因子検索の評価系〕

インである。血漿中には高濃度で存在（５−10マウス脂肪細胞株3T3−L1は定法に従い培養，μg/mL）し，肥満，インスリン抵抗性と負の相関成熟脂肪細胞へ分化誘導したものを用いた。アデを示す。その機能としては，脂肪酸酸化やインスィポネクチンは炎症性サイトカインであるTNFリン感受性の増強，抗動脈硬化作用などが明らか

αにより遺伝子発現が低下することが知られていにされている。現在その遺伝子発現，分泌の上昇る。そこでアディポネクチンの発現低下を抑制す作用を有する食品因子が注目されている。最近のる食品因子検索の評価系として3T3−L1へ各種食研究成果から，肥満は脂肪組織の慢性炎症状態で品因子を投与して１時間後にTNFαを投与（最終あり，TNFαを始めとする炎症性サイトカインに濃度10ng/mL）し，15時間後に細胞を回収，総よるアディポサイトカインの異常がインスリン感RNAを得た。得られた総RNAよりcDNAを作成

受性の低下を始めとするメタボリックシンドロー
ムの発症に関わることが明らかにされている。このような背景の中で本研究では，食品因子として香辛料に注目し，アディポサイトカインの発現，分泌に関わる香辛料成分を検討してその作用を

図１６−ジンゲロールの化学構造

浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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し，アディポネクチンの遺伝子発現量をリアルタール値を用いてノーマリゼーションを行った後，イムPCR法により定量，比較した。

アフィメトリクス社のアルゴリズム，発現強度か〔DNAマイクロアレイを用いたヒト初代培養

らシグナルのうまく検出できなかったものや発現成熟脂肪細胞における香辛料成分による遺伝強度の低い遺伝子を削除して信頼できると思われ子発現変動の網羅的解析〕

る4538遺伝子を抽出した。以下の解析はすべてこ市販品のヒト皮下脂肪組織より分離した前駆脂肪細胞を培養して，コンフルエントになったとこれを元にして行った。
3. 結果と考察

ろで，定法に従い，分化用培地で３日間維持して分化誘導した後，成熟脂肪細胞維持培地へ交換，10日目でアディポネクチンの発現低下を抑制する

3. 1 アディポネクチンの発現低下を抑制する
食品因子の検索

食品因子検索の結果，抑制効果の明らかになった

最近の研究成果から，肥満と脂肪組織におけるシアニジン（Cy）を投与した（最終濃度；100μM）炎症の関係が注目されている。これまでに脂肪組（図２）。なお，実験はn＝３として，24時間後に織でのTNFαの発現の上昇とインスリン抵抗性細胞を回収，総RNAを得た。

がリンクすることは知られていた。最近，肥満マ得られたトータルRNAはアフィメトリクス社

ウスの脂肪組織において，単球走化性因子としての プ ロ ト コ ー ル に 従 い，１本 鎖cDNA，２本 鎖

知 ら れ る ケ モ カ イ ンmonocyte chemoattractant

cDNAを経てcRNAを合成した。なおDNAマイク

protein-1（MCP-1）のmRNAレベルが上昇するこロ ア レ イ と し て は，ア フ ィ メ ト リ ク ス 社 のと，脂肪細胞においても，MCP-1はインスリン依

human genome focus arrayを用いた。このDNA

存性のグルコースの取り込みを抑制し，インスリマイクロアレイ（以下アフィメトリクス社の商品

ン抵抗性に関与するという可能性が示唆され

名 に 従 い ジ ー ン チ ッ プ と 表 記）は，humanた２）。その後，肥満マウスの脂肪組織へのマクロ

genome U133setよりアノテーション既知の8793

ファージの浸潤と脂肪組織由来の炎症性サイトカ遺伝子を搭載したチップであり，プロトコールにインの発現が，このような炎症細胞に由来するこ従い，発色・検出を行った。得られた発現強度のとが明らかにされた３，４）。

結果は，すべてを信頼できるデータとして採用で肥満と脂肪組織における炎症を整理すると，次きないためクオリティコントロールを行った。のようになる。すなわち，肥満による脂肪細胞のそこで，市販の解析ソフト（GeneSpring，シリ肥大化→脂肪細胞あるいは前駆脂肪細胞からコンジェネティクス社）を用いて，まずコントロ

MCP-1をはじめとする炎症に関連するケモカインが分泌→脂肪組織への単球遊走，マクロファージへの分化→マクロファージはさらに炎症性サイトカイン（TNFαなど）の放出，炎症惹起，ケモカイン（MCP-1）分泌刺激→脂肪組織へさらに炎症細胞をリクルート，サイトカイン，ケモカイン分泌→アディポサイトカイン発現の異常→インスリン感受性低下などのメタボリックシンドローム

図２ アントシアニン（Cy）の化学構造に関連する異常へ，という図式が考えられる。

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図３ TNFαにより誘導されるアディポネクチンの遺伝子発現量低下に対する６−ジンゲロールの抑制作用

つまり，肥満＝脂肪組織の慢性炎症状態であり，これがアディポサイトカインの異常をきたし，その結果メタボリックシンドロームを引き起こす。従って最上流の肥満（内臓脂肪蓄積）の抑制はもちろんであるが，肥満によるアディポサイトカインの発現・分泌異常の正常化は脂肪細胞の機能を維持しメタボリックシンドロームを治療，予防する重要な標的の一つと考えられる。
そこでマウス脂肪細胞株3T3−L1を用いて，TNFαの投与によるアディポネクチンの遺伝子発現低下を抑制する香辛料成分を検索した。数十種類の試料を検討した結果，ショウガ中の辛味成分である６−ジンゲロールに抑制効果を見出した（図３）。さらに検討を進めたところ，これまでに著者が高脂肪食による肥満，高血糖に対する抑図４

TNFαにより誘導されるアディポネクチンの遺伝子発現量低下に対するアントシアニンの抑制作用制作用を明らかにしているアントシアニン類に同様の活性を見出した（図４）。アントシアニンは配て，ヒト成熟脂肪細胞へ投与した時の遺伝子発現糖体よりもアグリコンにより強い活性が認められ変動の網羅的解析を行い検討した。

たので，これまでにも研究実績のあるCyについ3. 2 DNAマイクロアレイによる解析

浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）66
表１

ヒト脂肪細胞においてCy投与により遺伝子発現量が上昇するアディポサイトカイン，脂質及びエネルギー代謝関連遺伝子

遺伝子 no.

相対発現量1U94592
NM̲004797
NM̲002666
NM̲004364
NM̲005195
S69189NM̲001928
NM̲001909

2.24
1.82
1.80
1.75
1.69
1.68
1.67
1.52

遺伝子名
uncoupling protein 2（UCP2）
adipose most abundant gene transcript 1（Adiponectin）
perilipin
CCAAT/enhancer binding protein（C/EBP）, alpha
CCAAT/enhancer binding protein（C/EBP）, deltaacyl-CoA oxidase 1（ACOX1）
D component of complement（adipsin）
cathepsin D（lysosomal aspartyl protease）

1; コントロールの発現量を1.0とした時の各処理群での相対発現量表２

ヒト脂肪細胞においてCy投与により遺伝子発現量が低下するアディポサイトカイン

遺伝子 no.

相対発現量1AL574210

0.388

NM̲000600

0.56

遺伝子名
serine（or cysteine）proteinase inhibitor, clade E（nexin, plasminogen activator inhibitor type 1）, member 1（PAI-1）
interleukin-6（IL-6）

1; コントロールの発現量を1.0とした時の各処理群での相対発現量（１） Cyにより変動した遺伝子数て重要であり，すでに我々によりアントシアニンコントロールとの発現強度の比較を行い，Cyの高脂肪食負荷による抗肥満，血糖上昇抑制作用

投与により遺伝子発現量が1.5倍以上に上昇，あるやラット脂肪細胞での作用を報告している９，10）。

いは低下した遺伝子を検討したところ，上昇する

CyはTNFα誘導によるアディポネクチンの遺伝ものとして158遺伝子，逆に低下するものは215遺子発現低下を抑制するだけでなく，単独で投与し伝子が認められた。また1.8倍以上に上昇，あるいても発現を上昇させることが明らかになった。

は低下した遺伝子としては，上昇するものとして他のアディポサイトカインの発現に対する作用40遺伝子，逆に低下するものは72遺伝子が認めらとしては，興味深いことにプラスミノーゲンアクれた。

ティベーターインヒビター１（PAI−1）とインタ（２） Cy投与によるアディポサイトカインのーロイキン−６（IL−6）がCyの投与により低下遺伝子発現に対する影響することが明らかになった（表２）。PAI−1は，次にCyのヒト成熟脂肪細胞への作用について，血管内皮細胞から産生されるが，脂肪細胞からもアディポサイトカインと脂質代謝，エネルギー代産生されるアディポサイトカインの一つであり，謝などに関連すると考えられる遺伝子群に注目

血栓をとかす線溶能の活性化を阻害，動脈硬化のし，1.5倍以上上昇した遺伝子，逆に低下した遺伝進展に関わるとしてその制御と脂肪細胞からの分子を抽出した（表１，２）。その結果Cyの投与によ泌の役割が重要視されており，肥満，糖尿病態でり，アディポネクチンの発現上昇が観察された。の血中濃度の上昇が知られている10）。またIL−6

アディポネクチンは，脂肪細胞特異的に発現しては炎症性サイトカインの一つであるが，やはり脂おり，肥満や糖尿病で低下し，そのエネルギー消肪細胞からも産生され，インスリン抵抗性に関係費促進やインスリン抵抗性の改善作用を有する重し，PAI−1の上昇にも関与することが報告され要なアディポサイトカインの一つであり，その発て お り，肥 満，糖 尿 病 と の 関 連 か 知 ら れ て い

現，分泌上昇作用を有する食品因子が注目されてる11，12）。これらの結果から，Cyの新たな作用として，いる５〜８）。アントシアニン（Cy）はその候補としPAI−1やIL−6の遺伝子発現の制御が示された。

肥満・糖尿病予防を目的とした香辛料成分によるアディポサイトカインの分泌・発現制御に関する研究（３） 脂質代謝，エネルギー代謝関連遺伝子の発現に対する影響
脂質代謝，エネルギー代謝などとの関連が考え

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成分の新たな機能を示唆するものとして今後の検討が重要である。
4. お わ り にられる遺伝子群について検討したところ，脱共役タンパク質２（UCP2），アシルCoAオキシダーゼ

香辛料成分の脂肪細胞機能の制御を目指してア１（ACOX1），ペリリピン（PLN）遺伝子の発現ディポネクチンの発現低下を抑制する香辛料成分上昇を認めた（表１）。UCP2は主として脂肪細胞の検索を行ない，ショウガ辛味成分である６−ジに発現しており，ミトコンドリア内膜に存在し，ンゲロールやアントシアニンに活性を見出した。

ATPとして合成されるエネルギーを熱として外アントシアニン（Cy）については，作用機構の解界へ放出することから細胞内エネルギー消費分子明を目指して脂肪細胞へCyを投与した時の遺伝としてしられているが，脂肪組織に発現している子発現をDNAマイクロアレイにより解析するこ

UCP2がどの程度エネルギー消費分子として作用とを試み，脂肪細胞機能の制御（アディポサイトしているかどうかは議論が分かれている。一方

カインの発現制御）を標的とした新たな機能性食ACOX1は脂肪酸燃焼に関わる酵素であるが，品の創製へ貢献することを目的とした。

UCP2，ACOX1の上昇はアントシアニンによるエ

その結果，Cyのヒト成熟脂肪細胞への投与にネルギー代謝，脂質代謝の亢進作用のひとつとしより，アディポネクチンの発現上昇が観察されたて考えられる。一方PLNは，脂肪滴に局在するタので，ジーンチップの結果の確認のために，リアンパク質で脂肪滴の蓄積と分解の制御に関連する

ルタイムPCR法によるアディポネクチンの遺伝子が，この結果はCyによる発現上昇を介した脂肪発現量の定量を行ったところ，ジーンチップと同滴への影響の可能性を示唆するものと考えられる様の有意な上昇が認められた。またアディポサイ

が，詳細については今後の検討が必要である。

トカイン遺伝子発現に対する新たな作用として（４） リアルタイムPCR法による遺伝子発現量

PAI−1やIL−6の発現低下作用を見出した。同様の検討に脂質代謝あるいはエネルギー代謝に関連するとジーンチップでCy投与群に変動が認められた考えられる遺伝子群について検討したところ，

アディポサイトカイン（アディポネクチン，PAI

UCP2，ACOX1，PLNの上昇を認め，これらにつ−1，IL−6）と脂質代謝，エネルギー代謝関連遺いてもリアルタイムPCRによる発現定量により有伝子（UCP2，ACOX1，PLN）についてリアルタ意な上昇が確認できた。

イムPCR法による発現定量を行って確認，比較し以上により香辛料成分の生理機能としてアディた。いずれもCy投与群において有意な上昇を認

ポサイトカインの発現変動への作用を見出すととめており，ジーンチップの結果を裏付けることがもに，脂質代謝に関連した遺伝子発現変動についできた（図５）。ても新たな知見を得ることができた。そしてこれ

以上の結果，Cyの投与によりアディポサイトらの変動がその生理機能に関わることが示唆されカイン，脂質代謝，エネルギー代謝に関連した遺た。今後は種による差，内臓脂肪組織由来の細胞伝子発現に変動が認められ，これらの変動がそのと皮下脂肪組織由来の細胞の相違，個体レベルで生理機能に関わることが示唆された。特にアディの結果を含め，さらに検討を有するが，本研究助

ポサイトカインに対する作用については，香辛料成により，香辛料成分の有効利用に関する研究の浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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図５ リアルタイムPCR法による遺伝子発現量の定量 * P＜0.05

進展とDNAマイクロアレイをツールとした食品機能研究の一端を担うことができたものと考えて100, 7265-7270（2003）.
３） Weisberg, S. P., McCann, D., Desai, M., Rosenbaum, M.,Leibel, R. L., Ferrante, Jr, A. W. いる。

. 112, 1796-1808（2003）.
４） Xu, H., Barnes, G. T., Yang, Q., Tan, G., Yang, D., Chou,

謝辞

本研究を遂行するにあたり，貴重な研究助成を賜りました財団法人浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者各位に心より感謝いたします。

C. J., Sole, J , Nichols, A., Ross, J. S., Tartaglia, L. A., Chen, H.
. 112, 1821-1830（2003）.

５） Maeda, K., Okubo, K., Shimomura, I., Funahashi, T.,Matsuzawa, Y., Matsubara, K. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 221: 16286-16289,（1996）.
６） Arita, Y., Kihara, S., Ouchi, N., Takahashi, M., Maeda, K.,

文献１） Shimomura, I., Funahashi, T., Takahashi, M., Maeda, K.,
Kotani, K., Nakamura, T., Yamashita, S., Miura, M., Fukuda,Y., Takemura, K., Tokunaga, K., Matsuzawa, Y. Nat. Med. 2:800-803,（1996）.
２） Sartipy, P., Loskutoff, D. J.  
 ,Miyagawa, J., Hotta, K., Shimomura, I., Nakamura, T.,Miyaoka, K., Kuriyama, H., Nishida, M., Yamashita, S.,Okubo, K., Matsubara, K., Muraguchi, M., Ohmoto, Y.,
Funahashi, T., Matsuzawa, Y. Biochem. Biophys. Res.
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７） Yamauchi, T., Kamon, J., Waki, H., Terauchi, Y., Kubota,

肥満・糖尿病予防を目的とした香辛料成分によるアディポサイトカインの分泌・発現制御に関する研究

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS Vol.14（2006）

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Studies for regulation of adipocytokine gene expression and secretion by thecomponents of spices
Takanori Tsuda（Office for Research Initiatives and Development, Doshisha University）

Adipocyte dysfunction is strongly associated with the development of obesity and insulin
resistance. It is accepted that the regulation of adipocytokine secretion or the adipocyte
specific gene expression is one of the most important targets for the prevention of obesity andamelioration of insulin sensitivity. Adiponectin is one of the most important adipocytokines,
and is specifically and highly expressed in adipocytes. The plasma adiponectin concentrationand mRNA expression level are decreased in the obese and insulin resistant state. In thisstudy, we evaluated the inhibitory activity of reduction of adiponectin expression by thecomponents of spices. 6-Gingerol and anthocyanins（cyanidin; Cy）had the significant activity
in vitro using 3T3-L1 adipocytes. Based on these results, we examined the gene expression
profile in human adipocytes treated with Cy. The human adipocytes were treated with 100
μM Cy or vehicle for 24h. The total RNA from the adipocytes was isolated and carried out
GeneChip microarray analysis. Based on the gene expression profile, we demonstrated thesignificant changes of adipocytokine expression（up-regulation of adiponectin and downregulation of plasminogen activator inhibitor-1 and interleukin-6）. The lipid metabolism
related genes（uncoupling protein2, acylCoA oxidase1 and perilipin）also significantly inducedby the treatment of adipocytes with Cy. These data have provided a new aspect ofphysiological functionality of spices related with regulation of obesity and diabetes that meritfurther investigation.