質量分析インフォマティクスの基礎
有田正規（国立遺伝学研究所）

アウトライン質量分析とは1.


極めて物理化学的なチャレンジ化合物の同定法

2.

化合物の検出と同定
 メタボロミクス


マススペクトルを理解する3.
フラグメンテーション

スペクトルからの構造推定

4.

推定手法
 データリソースドーピング検査
 ドーピング検査＝ 禁止薬物リストのチェック
対象薬物は数百種。 尿検査で判断。
 過去の尿サンプルも検査、過去に遡ってメダルを剥奪• ロンドン五輪は一日400サンプル、6千以上を8年保存• リオ五輪では5千以上を検査，10年保存（多くのロシア選手が出場不可）
でも、どうやって？
極めて微量，かつ検査時間も限られる

朝日新聞より質量分析
質量分析計からの出力をマススペクトルという。
試料をイオン化して磁場内を飛ばし、その移動度から質量を割り出す。

酢酸 CH3COOH のスペクトル

図はwww.chem-station.comより

強度

質量質量を測定する原理
JJ トムソン卿のアイデア (1912):
等電荷なら，同じ電磁場の中を通ると同じ斥力(フレミング左手の法則)
その移動度は，質量に比例する

https://www.youtube.com/watch?v=EzvQzImBuq8
イオン化手法の違い
EI ... electron impact (ionization)
ESI ... electro-spray ionization
MALDI ... matrix assisted laser desorption
ionization

質量を測定する手法の違い
Q ... 四重極TOF ... 飛行時間型
FT ... フーリエ変換型

測定試料
QMS, TOF-MS, FTICR-MS

イオン源

分析器

EI, ESI, MALDI

イオン検出器
質量分析計 (mass spectrometer)

物質のイオン化
質量分析計の内部は基本的に真空 イオン化は単分子反応
 観測値はフラグメントイオン
 しかも精密質量がわかる

EI, CI 電子, 化学イオン化
電子や化合物と衝突
ESI
エレクトロスプレー
溶液噴射による(ソフトイオン化）

ビデオによる学習教材
Fundamentals of MS by Waters(7 YouTube videos, 2018)https://www.youtube.com/
watch?v=9AWBAI-Owzk
Mass Spectrometry(Royal Society of Chemistry 2008)https://www.youtube.com/
watch?v=J-wao0O0_qM

クロマトグラフィーによる違い
 ガスクロマトグラフィーMS

揮発性物質、誘導体化、EI
 装置によるバイアスは少ない 複数回測定し、共通して計測されるピークはおよそ500 そのうち同定できる代謝物は50から300ほど 液体クロマトグラフィーMS

様々なカラム、ESI カラムや測定法によって結果は変わる
 比較は難しく、計測されるピークはだいたい1000～2000
 そのうち同定できる代謝物は50から300ほど
 脂質の場合、構造の正確さはあまり問えない


精密質量
 炭素


12.0000, 水素 1.0078, 酸素 15.9949 …

同位体を考慮した平均質量（炭素なら12.0107）ではなく、モノアイソトピック質量を測定することに注意 整数質量 (unit mass) なら同じでも…

酢酸 CH3COOH
 尿素 CH4N2O
 ケイ素 SiO2


60.021160.032359.9667

 いまの質量分析計は小数点以下3~4桁までわかる< 5 ppm でも候補は多い

同位体 (isotope) 12C

12.0000
98.93%
 13C
13.00341.07%
 12.0000 x 0.9893 + 13.0034 x 0.0107 = 12.0107
 元素周期表に載っているのはこの値
 例：

エタン CH3-CH3 質量は 12 x 2 + 1 x 6 = 30
ただし、 2/100 の確率で 311/10000 の確率で 32
炭素数に比例して1違いの質量ピーク

1: 0.02 : 0.001

30 31 32

様々な同位体
https://www.nist.gov/pml/atomic-weights-andisotopic-compositionsrelative-atomic-masses
最新のNIST表では，元素の平均質量は区間であらわされる。

Glucosinolate アブラナ科に含まれる代謝物群
 辛子やわさびのピリッとする成分

C10H16KNO9S2
 このイオン C10H16NO9S2－ の測定は
 右の例は、シニグリン

質量ピーク
358.03 (マイナスイオン）
13Cの同位体ピーク 359.03 (1x10 %)34Sの同位体ピーク
360.03 (2x4%)

sinigrinアダクトイオン 正イオンを作るもの

プロトンナトリウム
カリウム
アンモニア
アセトニトリル
メタノール

 負イオンを作るもの

ヒドリド M-H
M+H M+1.0073
M-2H
M+2H M/2+1.0073
2M-H
2M+H 2M+1.0073
M-H2O-H
M+Na M+22.9892
M+K
M+38.9632
M+NH4 M+18.0338
M+ASN+H
M+42.0338

塩素臭素
ギ酸
酢酸

M+ClM+Br
M+HCOO
M+CH3COO

M+CH3OH+H
M+33.0335

その組み合わせなど

その組み合わせなど

M-1.0073
M/2-1.0073
2M-1.0073
M-19.0184
M+34.9694
M+78.9189
M+44.9982
M+59.0139

代謝物の同定 (identification) とは クロマトグラムで、ピークが出てくる時間を検証

純品を測っておく マススペクトルが純品と一致するか検証

EI-MSの場合はライブラリが存在
ESI-MSのライブラリは純品を測っておく

つまり、保有する純品の総数がそのまま検出力スペクトルの例（わかりやすい）
Mass: 75.06688
CH2NH2

H2O

COO

Parent ion
C2H5O2N

スペクトルの例（難しい）Mass: 291.150
CN+2TMS…174

Si(CH3)3 …73

2TMS…147

CHNH2+3TMS…248-CH3…276

メタボロミクスの手法
 質量分析計またはNMR
1.

質量分析計 (MS)
各種クロマトグラフィーと組み合わせて利用し、測定できる化合物数は数百。

2.

NMR
通常は分取した化合物の構造決定に用いるが、計測は混合物でも可能。
測定できる化合物は数十。

国際メタボロミクス学会のガイドライン
安易に 「同定した」 (identify) とは書けない
Level 0Identified

同定した

NMRにより、立体化学まで一致

Level 1

Identified

同定した同一機器で測定した標準物質と保持時間・スペクトル・同位体分布など、少なくとも2つ以上の結果が一致

Level 2Putatively
annotated

推定した

質量スペクトルやその他の物理化学的特徴から構造が確定

Level 3Putatively
characterized(class)Unknown

クラス推定した 構造は確定できないがスペクトル等が類似

Level 4

未知

代謝物の存在は明らかだが構造や種類がわからない

同定の難しさ 既知の天然物構造は20万を超えるが、生物界における分布はほとんど不明
誰も正解を知らない 検証できないので論文は著者の一存による表記
 研究室間でのデータ比較が不可能

機器が違えば結果も違う。生データはサイズが大きく、交換すら不可能（次世代シーケンサの結果に似る）
 代謝物名の統合すらできないのが現状

M Arita “What can metabolomics learn from genomics and proteomics?” Curr
Opin Biotech 2009 20:610-5

二次代謝物といわれる化合物たち
Polyketides

Terpenoids

from acetyl C2 units

from isoprene C5 units terpenes
 steroids
 carotenoids

 macrolides
 aromatics

Phenolics

Alkaloidsfrom phenylalaninefrom amino acids

 flavonoids

 amino acid + others

 polyphenols

代謝物の特徴も様々 分子量100-1000 amu 極性highly apolarlipids
fatty acids
waxesterpenes

carotenoids
chlorophylls
steroids
flavonoids

phenolics
alcohols

amino acids
organic acids
aminesnucleosides
alkaloids

 volatility, solubility
 pKa (acid dissociation constant) Ka = [A-][H+]/[HA]highly polar
sugarsphosphates
metalssalts

代謝物の量は様々(NIST の血漿標準
SRM 1950の測定）

Burla et al. 2018 J Lipid
Res.

リソース
化合物のデータベース

1.


ACS SciFinder ($57000/year)
研究者が利用できる無償のデータベース
PubChem (NIH), ChemSpider (RSC), HMDB (Canada) …

スペクトルのデータベース

2.


NIST Libraryが有名 (40万円程度)
名前はわからなくても観測されるピークのDB
MassBank (Japan), GNPS (UC San Diego), RIKEN Prime など比較を可能にするプロトコルやデータのリポジトリ

3.




NIH MetabolomicsWorkbench
EBI MetaboLights
DDBJ MetaboBank （10月にスタート）

休憩スペクトルからの構造推定

Tsugawa et al. 2015
Nat Methods

アデノシンのフラグメンテーション
adenosine[M+1]+
251.1

C10H14N5O4

178.1

C10H11N4O4268.1

C7H8N5O

121.0

C6H5N2O

133.1

109.0

C5H9O4C5H5N2O 136.1
C5H6N5C5H7O3

119.0

C4H7O494.0

92.0

C4H4N3C4H2N3103.0

C4H7O374.1

C2H8N385.0

C4H5O267.0
82.0

115.0

C3H3N287.0

73.0

75.0

C3H4N3C3H5O2C3H7O2C4H7O259.0

C3H7O
57.065.0

C3H5O

C3HN265.0

C4H5O71.0

C3H3O261.0

C2H5O245.0

C2H5O

C3H3O55.0

41.0
43.0

C2H3O

C3H5

C3H3 39.0よく観測されるイオン（特徴ピーク）
adenosine[M+1]+251.1

C10H14N5O4178.1

268.1

121.0
133.1
109.0

115.0

C5H5N2O 136.1
C5H6N5119.0

C4H7O494.0

92.0

103.0

74.1

85.0
C4H5O2

characteristic fingerprints
67.082.0

様々な測定条件でも安定して出る
フラグメントが存在。
57.065.0
これを予測できれば良い。
C3H5O73.0C3H5O275.087.0

59.0
C3H7O65.071.0

C3H3O261.045.0

C2H5O

C3H3O55.041.043.0
C2H3O

C3H539.0構造推定の基本
 基本は「組成式」 の正しい予測（深層学習，知識ベース，カーネル法）

 組成式の推定には，正確な質量測定が最重要
 正確な組成式を得るための手法

サンプル数を増やして化合物分布の知識を援用
 安定同位体比を変化させてマーキング
構造推定のバイオインフォマティクス
目的： マススペクトルから構造を予測したい
学習対象： 特徴ピークと，構造の相関 Network similarity (GNPS)
 LDA
 Kernel Method
 Rule-based(MS2LDA)(CSI:FingerID)(MS-FINDER)

gnps.ucsd.edu
ms2lda.org
csi-fingerid.org
prime.psc.riken.jp

GNPS Molecular Networking

bioRxiv “Human volatilome”
doi: https://doi.org/10.1101/2020.01.13.905091

LDA: topic modelling Latent Dirichlet allocation (lda) は自然言語のトピックを推定するための手法 （文書：構造，単語：特徴ピーク）

https://haripo.com/articles/2016/LDA-for-Pokemon-analysis/

フラグメントからの Kernel 法 (SVM)
Boecker研
化合物を部分構造（フィンガープリント）の集合と捉え，個々のビットを持つかどうかをカーネル法で推定する。

水素リアレンジメント則
安定イオンを生成するため，溶媒から水素を取得する。
その個数は，元素によって異なる。

Tsugawa et al.
2016
Anal ChemExample (negative)
位置 b で開裂するとき，O-S結合のS側ルールは2通り。
-2H のとき： H2SO3 -2H-H のとき： H2SO3 - H

Example (negative)

位置 b で開裂するとき，C-N結合のC側ルールは -2Hすなわち -3H のイオンが生じる
位置 c で開裂するとき，O-P結合のP側ルールは -Hすなわち OH を失って更に -H なので -5H になるマイニングの流れ
メタボロミクス

平均化、ベースライン検出

アライメント、ピーク検出

2.






相関解析

ベースコール、品質検査

アセンブル、遺伝子推定2.


コンティグ作成、アノテート

機能検索、同定

3.

手作業で物質同定

多変量，ネットワーク解析

4.



クロマトグラムの比較ライブラリ検索、同定

3.

出力データ処理1.



手作業でパスウェイ同定

統計，ネットワーク解析4.


システム生物学

時間と共にボトルネックは後ろに移動

出力データ処理

1.

ゲノミクス

展望
 化合物の同定がボトルネック
 論文も false positive は多い 特徴ピークの情報が揃えば、スペクトルからの構造推定が飛躍的に向上
化合物カテゴリー毎にスペクトルを予測
 リソースをリポジトリに蓄積
 ESIスペクトルにも特徴ピークは存在

理論的にライブラリを構築する知識が重要メタボロミクスのリソース
http://wiki.metabolomicssociety.org/