「高い光安定性と pH 感受性を有する蛍光プローブを用いた生体内破骨細胞活性の二光子ライブイメージング」

目

次

表紙の図（第23回学術集会ベストイメージング賞受賞）「高い光安定性とpH感受性を有する蛍光プローブを用いた生体内破骨細胞活性の二光子ライブイメージング」.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 前田拓樹・小和田俊行・ 菊地和也 .. . . 表2
日本バイオイメージング学会公開講座のご案内... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .    1第24回日本バイオイメージング学会学術集会のお知らせ.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .    2論

文「イネの生殖器官発達におけるオートファジーの新たな役割」. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 来須孝光・花俣 繁・小谷野智子・朽津和幸 .. . .    7特集「顕微鏡で測る」（２）「ルシフェラーゼを用いた細胞レベルの遺伝子発現動態解析」. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 今井章裕・村田 隆・長谷部光泰 .. . . 12
「光退色後蛍光回復法（FRAP）を用いたタンパク質動態解析の.
実際と２光子励起法の利用」. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 村田 隆 .. . . 17
「蛍光寿命や近赤外光を応用したイメージング技術」. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 三輪佳宏・田中順子・千田直子・黒山喬允・逆井智貴・
濱田理人・百武篤也・新井達郎・高橋

智 .. . . 22

投稿規定と協賛学会のお知らせ.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

前田 拓樹 1)、小和田 俊行 2)、菊地 和也 1, 2)
1)

大阪大 ･ 院 ･ 工、2) 大阪大 ･ 免疫学フロンティア研究センター

破骨細胞による骨吸収は、骨組織の成長や修復の際に、骨密度や形状を調節するために必要不可欠な生体機能である。その一方で、過剰な骨吸収は、骨粗しょう症や関節リウマチといった骨疾患を引き起こす。そのため、骨疾患に対する新薬開発や治療法を確立する上で、生体内における破骨細胞動態を解析可能な蛍光イメージング技術の開発が求められている。そこで我々は、活性化破骨細胞が骨表面上に酸性領域を形成することに着目し、①低 pH 環境下で蛍光がON になる蛍光スイッチ機能と、②骨表面への選択的送達能を有する蛍光プロー
ブを開発した。プローブを皮下注射によりマウスに投与し、骨組織を二光子励起顕微鏡により観察したところ、一部の破骨細胞直下からプローブ由来の蛍光シグナルが観察された。これは、開発したプローブが活性化破骨細胞により形成された酸性領域を選択的に可視化可能であることを示している。このように、
本研究では、機能性蛍光プローブと二光子励起顕微鏡を組み合わせることよって、破骨細胞動態を詳細に解析可能であることを明らかにした。
（左上）pH 感受性蛍光プローブによる破骨細胞
活性検出の概念。破骨細胞の酸性領域でのみプローブ蛍光が ON となり、骨吸収を選択的に可視化可能となる。
（右上）pH 感受性と骨選択的送達能を有するプ
ローブ構造。BODIPY 色素を母骨格に持ち、光誘起電子移動による pH 感受性機能を有す。骨に対する親和性の高いビスホスホネート構造を導入し、生体中の骨組織に対する選択的送達能を付与した。
（下）マウス頭頂骨の二光子励起顕微鏡による蛍光イメージング像。赤色：破骨細胞、青色：
骨 組 織、 緑 色： プ ロ ー ブ。Kowada, T. et al. J.
Am. Chem. Soc. 2011, 133, 17772 より一部改変して掲載。Scale bar: 40 mm

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

第 24 回日本バイオイメージング学会学術集会「公開講座」並びに「学術講演会」のお知らせ
第 24 回日本バイオイメージング学会学術集会・大会長
朽津 和幸 (東京理科大学 理工学部 応用生物科学科 教授)
下記の通り「第 24 回日本バイオイメージング学会学術集会」を開催いたします。多くの方々にご参加頂きたくご案内申し上げます。
「全身・全脳透明化の先に見えるもの―生命の「時間」の理解に向けて―」と題した特別講演を東京大学/理化学研究所の上田泰己先生にお願いしています。また今回は特に、ジャズミュージシャンとしても高名な坂田明氏を始めとする多彩なゲストをお迎えして、会員の皆様にもお楽しみいただけるような公開講座を企画しております。学術集会はもちろんのこと、公開講座にも、学生さんや一般の方などお誘い合わせの上、奮ってご参加いただけますよう、お待ちしております。
プログラム等の詳細につきましては下記学術集会 Web ページをご覧ください。
学術集会 Web ページ

URL: http://www.rs.tus.ac.jp/ambs15/index.html

学術集会 Facebook ページ

URL: https://www.facebook.com/ambs15

会期：平成 27 (2015) 年 9 月 26 日（土）～ 9 月 28 日（月）◆公開講座：

9 月 26 日（土）12:00 ～ 17:10（懇談会～18:30）◆学術講演会：

9 月 27 日（日）9:00 ～ 17:50（懇親会～20:00）
9 月 28 日（月）9:00 ～ 17:20

会場：東京理科大学葛飾キャンパス図書館大ホール（〒125-8585 東京都葛飾区新宿 6-3-1 地下鉄千代田線直通 JR 金町駅徒歩 8 分）
（会場案内 http://www.tus.ac.jp/info/access/katcamp.html）
主催：日本バイオイメージング学会
共催：東京理科大学 研究推進機構 総合研究院 イメージングフロンティア研究部門
協賛学会：決定し次第ホームページに掲載しますので、ご参照ください。
◎各種締切り期日◆講演受付・締切〇演題申込み・締切

平成 27 年 7 月 27 日（月）〇抄録(和文または英文)原稿・締切

平成 27 年 7 月 27 日（月）◆学術集会参加登録・締切

平成 27 年 8 月 21 日（金）◆懇親会参加登録・締切

平成 27 年 8 月 21 日（金）◎各種申し込みの流れ
１．一般講演者
演題申込み・抄録提出（同時）→参加登録、懇親会参加登録→参加費・懇親会費振込
２．参加のみの場合
参加登録、懇親会参加登録→参加費・懇親会費振込－2－Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング◎演題募集
一般講演（ポスターサマリー講演＋ポスター発表）の演題を募集します。代表して発表する著者は本学会の会員に限ります。入会がお済みでない方は、学会のホームページで入会申込書を入手し、手続きしてください。学会ホームページ：http://www0.nih.go.jp/niid/bioimaging/
一般講演の申込手順は次の通りです。締切日を厳守して下さい。
◆申込方法
大会ホームページ（http://www.rs.tus.ac.jp/ambs15/index.html）より抄録のテンプレート(和文または英文のどちらか一方)をダウンロードし、抄録を作成してください。作成した抄録は、参加申込書と同時に ambs15@rs.tus.ac.jp 宛に電子メールにて提出をお願いします。ポスターサマリー用パワー
ポイントファイルも、事務局 ambs15@rs.tus.ac.jp 宛に電子メールで送付してください。
※トピカルセッションについて
今回の学術集会では、学際的な議論をこれまで以上に活発に行うことを目指して、通常のポス
タープレゼンテーション(サマリー講演あり)に加えて、ポスター演題の中から実行委員会が選定した題目について、異分野の研究者に対して背景等を長目にわかりやすく御講演いただく「トピカルセッション」を設けます。ご協力のほどよろしくお願いします。
平成 27 年 7 月 27 日（月）◆演題申込み・抄録(和文または英文)提出：◆ポスターサマリー用パワーポイントファイル提出：(スライド 3 枚以内、ファイルサイズ 20 MB 以内)

平成 27 年 9 月 11 日（金）◎事前参加登録
演題を出される方も参加のみの方も、いずれも事前参加登録をお済ませください。締切りは平成 27 年
8 月 21 日（金）です。懇親会の参加登録も平成 27 年 8 月 21 日（金）までにお済ませください。参加
登録は大会ホームページより参加申し込み用のエクセルファイルをダウンロードし、記入後にambs15@rs.tus.ac.jp あてにお送りください。
◎参加費、懇親会費と支払い方法
事前参加登録頂きましたら、参加費と懇親会費の合計（懇親会に出席されない方は参加費のみ）を下記口座に平成 27 年 8 月 31 日（月）までにご入金ください。領収書は、学術集会受付にてネームカードと共にお渡しします。
◆参加費：〇公開講座：無料〇学術集会：
一般（会員・協賛学会員※：5,000 円、非会員：8,000 円）
学生（学部学生無料、会員大学院生 1,000 円、非会員大学院生 3,000 円）※※学生の方は当日受付にて学生証をご提示ください。
協賛学会は決定し次第ホームページに掲載しますのでご参照ください。
〇懇親会費：一般 5,000 円 ／ 学生：2,000 円〇振込先：振込および振替手数料は、ご負担いただきたくお願い申し上げます。
）
銀行・支店名：みずほ銀行(0001)・金町(カナマチ)支店（店番号 242）
口座番号：
普通預金 2271611
口座名称：
第 24 回日本バイオイメージング学会学術集会－3－Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング◎公開講座「私たちのくらしとバイオイメージング～見えるからわかるバイオの世界～」
http://www.rs.tus.ac.jp/ambs15/os.html
http://www.rs.tus.ac.jp/ambs15/poster/150926.pdf (ポスター･ダウンロード)
日時：2015 年 9 月 26 日(土)12:00-18:30

会場：東京理科大学葛飾校舎図書館大ホール及びホワイエ(125-8585 東京都葛飾区新宿 6-3-1)
12:00-13:00(ホワイエで、実験を体験できます)

バイオイメージング体験◆バイオイメージング実験「自分の DNA を見てみよう！」◆3D バイオイメージング体験

他◆特別展示：
イラストがいざなう科学の入り口

イラストレーター/神戸大学

ウチダヒロコ◆協賛展示：〇バイオメディアアート展示
Metaphorest (早稲田大学先進理工学部･教授 岩崎 秀雄 他)〇サイエンスコミュニケーション展示
文部科学省科学研究費 新学術領域研究「植物細胞壁の情報処理システム」〇バイオイメージング映像上映
13:00-13:10

グレンデル 他

１．はじめに
国立医薬品衛生研究所･所長 川西 徹

13:10-13:40

２．「あきらめない雌しべ：秘められた花の力を映像で解き明かす」
名古屋大学大学院理学研究科･教授 東山 哲也

13:40-14:10

３．「見えないものを見る：画像処理によるバイオイメージングの展開」
理化学研究所光量子工学研究領域･チームリーダー 横田 秀夫

14:10-14:50

休憩 (バイオイメージング実験体験、展示見学 等)

14:50-15:20

４．「イラストがいざなう科学の入り口」
イラストレーター/神戸大学 ウチダ ヒロコ

15:20-15:50

５．「生物発光が拓く未来の生活」
大阪大学産業科学研究所･教授 永井 健治

15:50-16:00

休憩

16:00-17:00

６．「いのちが透けて見えるミジンコから思うこと」
ジャズミュージシャン/広島大学客員教授

17:00-17:10

坂田 明

７．おわりに東京理科大学理工学部･教授 朽津 和幸

17:10-18:30

懇談会（講演者への質問、進路相談など）（軽食や飲物を準備する予定です。
）－4－

ホワイエにてVol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング◎学術講演会プログラム (予定; 実施スケジュールは変更の可能性があります。)
9 月 27 日（日）
9:00

開会式

9:10-11:10

若手企画シンポジウム「NO DIVISION, NO LIFE」

11:10-12:40 ポスターサマリー講演１
12:40-13:40 休憩
13:40-14:40 ポスター討論１
14:40-16:40 シンポジウム 「第 2 の生体の窓」
16:50-17:50 特別講演 「全身・全脳透明化の先に見えるもの―生命の「時間」の理解に向けて―」
東京大学大学院医学系研究科・教授/理化学研究所 上田 泰己
18:00-20:00 懇親会
9 月 28 日（月）9:00-11:00

トピカルセッション(講演)11:00-12:30 ポスターサマリー講演 2
12:30-13:30 休憩
13:30-14:30 ポスター討論 2 ; ベストイメージング賞投票締切
14:30-16:30 シンポジウム「感染症を見る」

16:40-17:10 奨励賞受賞講演
17:10-17:20 閉会式(ベストイメージング賞授賞式)☆若手(2012 年度･2013 年度奨励賞受賞者)企画シンポジウム「NO DIVISION, NO LIFE.～動物と植物の細胞分裂イメージング最前線～」
オーガナイザー：岡部弘基（東京大・院・薬）, 桧垣匠（東京大・院・新領域）
細胞分裂は動植物を問わず生命の発生・維持にとって始原的意義を持つ基本的な生命現象である。本シンポジウムでは、動物分野と植物分野から２名ずつ、イメージング技術を駆使する細胞分裂研究者が最新の研究成果を紹介する。全演題終了後に、簡単な総合討論の時間を設け、細胞分裂における動植物の多様性・共通性に関する知識の整理と議論を行う予定である。特に、今後どのよ
うなバイオイメージング技術が、分子（遺伝子）レベルでは大きく異なると考えられる動植物の細胞分裂の共通項を見出し、細胞分裂という生命の根源的現象を深く理解することができるか、議論を深めたい。
清光 智美（名古屋大学 大学院理学研究科）
板橋 岳志（早稲田大学 理工学術院）
村田 隆（基礎生物学研究所 生物進化研究部門）
笹部 美知子（弘前大学 農学生命科学部）☆シンポジウム「第 2 の生体の窓～21 世紀のバイオイメージングの窓～」
オーガナイザー：曽我 公平（東京理科大）、竹内 司（島津製作所）、
横田 秀夫（理化学研究所）、岸本 英博（琉球大）－5－

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バイオイメージング

1000 nm を超える近赤外波長域は「第 2 の生体の窓 Second Biological Window(SBW)」として近年世界的に話題を呼んでいる。これにはこの波長域におけるカメラなどの光学デバイスや蛍光材料などのアイテムを包括するシステムの発達が密接に関係する。このシンポジウムでは、世界に先行して日本で発達しつつある SBW におけるイメージングにフォーカスし、日本がこの波長域において世界をリードする地位を獲得することをめざし、SBW におけるバイオイメージングの現状と課題について議論する。
１．SBW イメージングの現状と課題：曽我 公平(東京理科大)２．SBW におけるスペクトルイメージング：演者未定（住友電工）
３．カーボンナノチューブの SBW における蛍光：岡崎 俊也(産総研)
４．SBW におけるアニマルイメージングシステム：竹内 司(島津製作所)、
渡邉 重明(住商ファーマ)
５．SBW の医療応用：金子 和弘(国立がん研究センター東病院)☆シンポジウム「感染症を見る」
オーガナイザー：鈴木 和男（帝京大）、加藤 有介（徳島大）
最近世界に脅威をもたらしているエボラ熱、インフルエンザなど感染症は、我々の免疫系・生体防御機能をくぐりぬけ、パンデミックとなったり重症化したりする。そして、感染微生物は、薬剤耐性を獲得してますます生体防御に対抗して感染拡大を示すため、その防御機能と薬剤耐性の機構解明が重要である。そうした感染症に対する機構解析には、分子・細胞レベルでの新しいイメージング手法が不可欠で、その最新アプローチを紹介する。
１．オーバービュー：鈴木 和男（帝京大）
２．生体と微生物のせめぎ合いのはざまを見る：Thomus Leto (NIIAD-NIH, USA)
３．インフルエンザの薬剤耐性を見る：鈴木 和男（帝京大）、加藤 有介（徳島大）４．クライオ蛍光顕微鏡で見る数ケルビンの世界：藤芳 曉（東工大・院理工）５．一般演題から関連演題を１件選択
６．まとめ：加藤 有介（徳島大）◎本学術集会についての問い合わせ先第 24 回日本バイオイメージング学会学術集会事務局
E-mail： ambs15@rs.tus.ac.jp（できるだけ電子メールでの連絡をお願い申し上げます。
）
URL: http://www.rs.tus.ac.jp/ambs15/index.html◆大会長：朽津 和幸〒278-8510 千葉県野田市山崎 2641 東京理科大学理工学部応用生物科学科
TEL: 04-7122-9404; FAX: 04-7123-9767◆副大会長：曽我 公平〒125-8585

東京都葛飾区新宿 6-3-1

東京理科大学基礎工学部材料工学科

TEL: 03-5876-1419; FAX: 03-3609-3866－6－

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バイオイメージング

イネの生殖器官発達におけるオートファジーの新たな役割
来 須 孝 光 1, 2 * , † 、 花 俣 繁 1 、 小 谷 野 智 子 1 、 朽 津 和 幸 1 *1 東 京 理 科 大 学 ･理 工 学 部 ･応 用 生 物 科 学 科 、 2 東 京 工 科 大 学 ･応 用 生 物 学 部*E-mail: kurusutkmt@stf.teu.ac.jp; kuchitsu@rs.noda.tus.ac.jp

要旨
オートファジーは、細胞質中に内膜系（オートファゴソーム）が生成され、液胞やリソソームと融合することにより、細胞成
分が分解される自食作用であり、多くの真核生物の発生･分化や代謝の制御において重要な役割を果たす。一方、モデル双子葉植物シロイヌナズナのオートファジー欠損変異体は正常な生活環を示すと報告されており、植物の発生におけるオートファジーの役割は未解明な部分が多かった。我々は、単子葉植物イネにおいて、オートファジー可視化実験系を構築すると共に、オートフ
ァジー欠損変異株を複数同定した。変異体ホモ個体では、種子がほぼ全く稔らず、交雑検定の結果、雄性不稔形質を示した。変
異株では、花粉が未成熟で発芽能も著しく低下していた。電子顕微鏡イメージング等により、花粉形成過程の葯の各組織のオー
トファジー動態を解析した結果、花粉への栄養や表面構造の材料供給組織を構成する葯の最内層のタペート細胞において、減数分裂期後にオートファジーが誘導されることを発見した。オートファジー欠損変異株では、タペート組織においてオートファジーが観察されず、同時に lipid body の分解が、野生型と比べて顕著に遅延していた。イネの雄性生殖器官の発生過程におけるオー
トファジーの生理学的役割について考察する。

はじめに真核生物に保存され、共通の機能を果たしている[7]。中でも、オートファジーは、真核生物に普遍的な細胞内の分解機構

ATG8 はオートファゴソームのマーカーとして、動物や微生であり、生体内の栄養のリサイクルに大きく寄与している。そ物だけでなく、植物においても有用であり、緑色蛍光タンパクの実行に関与する ATG （Autophagy-related） 遺伝子群は、真質（GFP）やその改変タンパク質と ATG8 との融合タンパク質

核生物に広く保存されている[1]。一方、酵母、線虫、ショウジを発現させることにより、オートファジー動態の解析が進め

ョウバエやマウス等の多様な生物において、オートファジー

られて来た[8-10]。細胞内の分子動態の観察に適したタバコ培が発生・変態や分化において、栄養供給を含めて重要な役割を

養細胞 BY-2 を用いて、オートファジーフラックスの簡便な定果たすことが知られている[2, 3]。しかし、モデル植物シロイ量解析系が構築されている[9, 10]。

ヌナズナの対応する遺伝子の変異体は、正常に胚発生、発芽、植物の液胞内は、液胞膜に局在する V 型 H+-ATPase、H+輸子葉の発達、根の伸長、花芽形成、種子生産を遂行でき、正常送性 pyrophosphatase の 2 種のプロトンポンプの働きにより酸な生活環を示すことが知られている。従って、植物の生殖、発性に保たれている。GFP-AtATG8a を発現させたシロイヌナズ

生過程におけるオートファジーの生理的役割は殆ど解っていナの根に、液胞膜 H+-ATPase 阻害剤 concanamycin A（ConcA）

ない[4]。唯一の例外として、Atatg6 変異体が不稔形質を示すを処理すると、液胞内 pH が上昇し、その結果 GFP 蛍光を伴[5]が、ATG6 は PI3K 複合体の一部であり、他の PI3K 変異体

う小胞構造体（オートファジックボディ） が蓄積する[8]。

も、同様の不稔形質を示すことから[6]、シロイヌナズナにお我々は，GFP-AtATG8a を発現させた形質転換イネを作出し、いては、オートファジー欠損が不稔の直接の原因ではないと

オートファゴソームの可視化実験系の構築を試みた[11]。ショ想定される。

糖欠乏培地にイネ培養細胞を移し、栄養欠乏によるオートフ
ァジーを誘導すると共に、ConcA を処理し、共焦点レーザー
顕微鏡により、液胞内 GFP 蛍光を継時的に測定した。その結イネ培養細胞におけるオートファジー可視化系の確立
オートファジーの実行に関与する ATG 遺伝子群は、
多くの果、ConcA 処理により、液胞内の蛍光強度が時間依存的に増大し、GFP-ATG8 の液胞内への蓄積が確認された（図 1 下図†

2014 年度日本バイオイメージング学会奨励賞受賞者（Starvation + ConcA））。
－7－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

一方、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、ショ糖欠乏時の細胞内構造体の変化を解析した。ショ糖欠乏によりオートフ
ァジーが誘導された細胞では、特徴的な膜構造を持つオート
ファゴソーム及び、液胞内においてオートファジックボディ（細胞質成分であるミトコンドリアや色素体を含む構造体）
が観察された（図 2）。これらの結果は、イネにおいて、オー
トファジーによりミトコンドリアや葉緑体が液胞に運ばれ、分解されることを示唆している。

図 2．透過型電子顕微鏡（TEM）を用いたイネ培養細胞におけるオートファジー動態の観察。液胞内（V）において、細胞質成分を含むオートファジックボディ（AB）が観察された。

イネオートファジー欠損変異体の同定と表現型の解析
ATG7 は、オートファゴソームの形成に必須であり、ATG5ATG12 結合体の形成において、E1 様酵素として働く[12]。
イネおいては，単一遺伝子としてゲノム上に存在しており、根や葉、そして生殖器官である穂、葯、雌しべ、種子等の、あらゆる組織で発現が見られる[11, 12]。
我々は、イネのレトロトランスポゾン Tos17 挿入変異系統
35,000 ラインを探索し、第 1 エキソンに Tos17 が挿入された
Osatg7 変異株（Osatg7-1）を同定した[11]。GFP-AtATG8a を用いたオートファジー動態のイメージング解析、TEM 解析、イ
ムノブロット法による ATG5-ATG12 結合体の生化学的解析等の結果、Osatg7 変異株では、オートファジーが完全に欠損していることが判明した[11]。
次に、オートファジー欠損が、イネの生長及び発生に与える影響を調べるために、Osatg7 変異株の表現型を、生活環を通して解析した。栄養生長期においては、野性型と Osatg7 変異
株の間で大きな差は見られなかった。一方、生殖生長期に移行
図 1．GFP-ATG8 を用いたイネ培養細胞におけるオートファ

すると、野性型に比べて Osatg7 変異株では、出穂及び開花のジーの可視化。通常生育条件では GFP-ATG8 は細胞質と核に遅延が観察されると共に、重篤な不稔形質を示し、変異体ホモ

局在する（Control）。細胞をショ糖欠乏培地に移すと同時に個体では、種子がほぼ全く稔らなかった（図 3） [11]。この結ConcA を処理すると、液胞内（V）に GFP 蛍光が蓄積した果は、オートファジーが、イネの生殖生長過程において重要な（Starvation + ConcA）。Bars = 20 μm

役割を担う可能性を示唆している。

－8－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング
成熟期の花粉を花粉発芽培地に散布し、花粉の発芽率を定量解析した。その結果、野性型の花粉の発芽率は 60 %程度だったのに対して、Osatg7 変異株の花粉は、ほぼ全く発芽しなかった[11]。こうした解析結果から、Osatg7 変異株の花粉は未成熟であり、Osatg7 変異株においては、花粉成熟の過程に異常が生じていることが示唆された。
次に、花粉異常が配偶子由来なのか、親である配偶体由来なのかを調べるために、遺伝子型がヘテロである Osatg7 変異株と野性型の交配実験を行った。野性型の雌しべに、遺伝子型がヘテロの Osatg7 変異株花粉を受粉させたところ、次世代における遺伝子型の比は、
野性型とヘテロが 1 対 1 であった [11]。
この結果は、配偶子の遺伝子型が Osatg7 欠損になっても、花粉成熟に影響を与えないことを示唆している。つまり、Osatg7
変異株の花粉異常は、配偶子である花粉自体のオートファジ

図 3．イネのオートファジー欠損変異体の乾燥穂の形態。オーー能欠損が原因ではなく、配偶体からのデンプンや脂質等の、トファジー欠損変異体のイネのホモ接合型（Osatg7-1）は重物質・栄養供給異常に起因する可能性が高いことを示唆する。

篤な不稔形質を示した。写真は稔実期においても種子を形成
せず、こうべを垂れていない様子を示している。Bar = 2 cm

タペート組織におけるオートファジーとプログラム細胞死
葯は 4 つの層から構成されており、その最内層はタペート

イネオートファジー欠損変異体は雄性不稔形質を示す層と呼ばれる。花粉発達の間、タペート細胞が花粉成熟に必要

Osatg7 変異株における不稔形質の原因を探る第一歩として、な物質の供給を担うと考えられている[14]。植物の花粉発生初

交雑検定を行った。Osatg7 変異株の雌しべに、野性型の花粉期において、葯内の花粉母細胞から減数分裂により、将来の花を受粉させたときには、種子が得られたのに対し、野生型の雌粉である小胞子が生じる。1 つの花粉母細胞から減数分裂で生しべに、変異株の花粉を受粉させたときには、稔実種子は得らじた 4 つの小胞子をまとめて花粉四分子と呼ぶ[14]。花粉成熟れなかった[11]。これらの結果は、Osatg7 変異株の不稔形質は、期に移行すると、プログラム細胞死（PCD）による、タペート

雄性（♂）側の異常に起因することを示唆している。実際、成細胞の分解が観察される。タペートの分解は高度に制御され熟期の雌しべは、野性型株と Osatg7 変異株との間で、形態的ており、細胞質の縮み、細胞壁からの分離、染色体凝縮、小胞差異は観察されなかった。また、この表現型は、Osatg9 変異体 （ER） の肥大といった PCD に見られる特徴が観察される株でも同様に観察された[11]ことから、イネのオートファジー[15]。

欠損が、不稔の直接原因である可能性が強く示唆された。

オートファジーがタペート細胞の分解・代謝に関与していイネのオートファジー変異株が雄性不稔であることから、る可能性を検証するため、花粉の成熟ステージを追って、タペ

雄性側の配偶子である花粉について解析を進めた。まず、野性ート細胞内を電子顕微鏡により観察した。その結果、野性型の型及び Osatg7 変異株の成熟葯内の花粉を観察した結果、野性一核期のタペート細胞において、オートファゴソーム様構造型に比べ変異株の葯内には、未成熟な花粉が多く見られた。成体が多数観察された。Osatg7 変異株のタペート細胞内では、熟花粉では、デンプンや lipid body （脂質顆粒/脂肪滴）が花粉

そのような構造体は観察されなかった。さらに、野性型の一核内に蓄積しており[13]、花粉成熟度の一つの指標として用いら期のタペート細胞内において液胞内に lipid body が取り込まれれる。そこで、野性型及び Osatg7 変異株花粉のデンプンや脂たものが多数観察された[11]。lipid body は花粉表面の外殻形

質顆粒蓄積を解析したところ、野性型株に比べ、変異株では蓄成の材料として重要である[14]。これらの結果はオートファジ

積量が大幅に減少していた。

ーが一核期のタペート細胞内で誘導され、タペート細胞内の次に、受精過程に必須な、花粉管の発芽及び伸長を解析した。

脂質等の代謝・分解に関与している可能性を示唆する。

－9－Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

花粉形成の過程で、タペート層は PCD により消失するが、能性が考えられる。

Osatg7 変異株では、成熟葯においてもタペート層の一部が残存していた[11]。タペート細胞に誘導されるオートファジーは、

考察とまとめPCD にも関与する可能性が示唆される。近年、動物において

Osatg7 変異株等のイネのオートファジー欠損株は不稔形質

オートファジーが関与するさまざまな PCD（オートファジーを示す[11, 24]。一方、Atatg7 変異株等、シロイヌナズナのオー様細胞死）が報告されている[16-19]。

トファジー欠損株は、正常な生長と発生を示す[25]。この相違

正常な花粉成熟には、タペート細胞の PCD が適切な時期にの原因として、イネとシロイヌナズナの花粉形成過程におけ誘導されることが必要である。例えば ms1 変異体は、タペー

るタペート層の分解様式の相違が考えられる。どちらも最終

トの分解が遅れ、PCD による分解ではなく、ネクローシス様的にタペート細胞が PCD により消失することは同じだが、イの分解に移行してしまうことが報告されている[20]。さらに、

ネでは四分子期から徐々にタペート層が分解され、薄くなり、イネの変異体 tapetal degeneration retardation （Ostdr） は、タ

最終的に消失するのに対して、シロイヌナズナのタペート細

ペートの分解、PCD が著しく遅延し、結果として花粉に異常

胞は、一度肥大し、花粉成熟の最終段階においてはじけ、そのが生じる [21, 22]。タペートの PCD のタイミングを決定する

内容物が花粉表面に付着する[14]。

機構は、四分子期から開始していると考えられている[23]。

シロイヌナズナの花粉成熟にオートファジーが必須でない

Osatg7 変異株におけるタペート層の分解不全は、オートフとしても、タペート細胞においてオートファジーの誘導が起ァジーという分解機構の欠損により、花粉の成熟に比べて、タきている可能性はあり得る。実際、トマト等、複数の植物種のペート細胞の分解が遅れたことを反映しているとも考えられ

タペート細胞内において、オートファゴソーム様構造体が存る。一方、花粉の成熟には、タペート細胞分解の適切な時間的在する可能性を示唆する知見もある[26, 27]。オートファジー制御を必要とすることから、この分解の遅延が、花粉の未成熟によるタペート細胞分解という機構は、イネ以外の植物種でにつながった可能性も考えられる。

も広く保存されている可能性も考えられる。

さらに、Osatg7 変異株では、葯からの花粉放出過程である、

タペート細胞におけるオートファジー動態のイメージング

裂開能も低下していた[11]。葯の裂開には、植物ホルモンだけ

解析は、植物の生殖機構の解明と共に、穀物の種子形成等の応でなく、葯内の乾燥レベルも重要である。Osatg7 変異株では、用面からも重要な課題である[28]。筆者らは現在、タペート細葯のタペート層が残存しており、この残存したタペート層が、胞内のオートファジーや lipid body 等のオルガネラの動態を解葯内の乾燥の妨げとなり、結果として、葯の不裂開を引き起こ

析するための新たなイメージング技術の開発を進めている。

している可能性も考えられる。
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Tsukamoto S, Kuma A, Murakami M, Kishi C, Yamamoto A,
Mizushima

変異株では、トリアシルグリセロール（TAG）が減少していたある [13]。この結果は、前述の lipid body の TEM 解析結果とMizushima N, Yoshimori T, Ohsumi Y (2011) The role of Atg

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バイオイメージング

特集「顕微鏡で測る」（2）
ルシフェラーゼを用いた細胞レベルの遺伝子発現動態解析今井 章裕 1*、村田 隆 1,2、長谷部 光泰 1,2
1 自然科学研究機構･基礎生物学研究所･生物進化研究部門、2 総合研究大学院大学･生命科学研究科*E-mail: aimai@nibb.ac.jp

要旨
多細胞生物の発生や環境応答の過程では、遺伝子発現が細胞ごとに異なる動態を示すことがある。遺伝子発現の動態を詳細に知るためには、生体内でレポータータンパク質を発現させ、そのシグナルの時空間変化を調べる必要がある。これまでの遺伝子発現の動態解析では、シグナルが強く、かつ多色イメージングが可能である蛍光タンパク質が、レポータータンパク質として主に用いられてきた。しかしながら、蛍光の検出には励起光の照射が必須であるため、それが引き起こす細胞へのダメージや自家蛍光の発生といった問題に常に注意しなくてはならない。一方で、ルシフェラーゼを用いた発光イメージングは、励起光を使用しないためこれらの問題を回避できる反面、シグナルが微弱で検出が困難であるという問題があった。近年、発光検出器の感度の向上に伴い、このルシフェラーゼの短所は克服されてきている。本稿では、発光イメージングの近年の進歩を概説し、筆者らが開発した細胞レベル発光イメージング系を紹介する。

はじめにと比較した際の利点について述べる。また、筆者らが行っホタルなどの発光生物は、自ら光を生成するしくみをもち、生存戦略のひとつとして「発光」を利用している。こている細胞レベル発光イメージング系を用いた遺伝子発現解析の例を紹介する。

の「発光」は、ルシフェリンを基質としたルシフェラーゼ
による酵素反応の結果、化学エネルギーが光エネルギーへ

ルシフェラーゼによる発光反応と変換することで生ずる[1]。ルシフェラーゼ遺伝子は、細ルシフェラーゼは発光反応を触媒する酵素の総称であ菌・昆虫・海産無脊椎動物といった様々な生物からこれまり、その立体構造や、反応基質、反応様式は生物種によっ

でに単離・同定されており、注目する遺伝子のプロモータて大きく異なることが多い[1]。これまで同定されたルシー配列と融合させ、生体内に導入することで、遺伝子発現

フェラーゼの中で最もその反応機構がよく調べられていの変動を推測するレポーターとして用いられてきた。発光るのはホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼであり、は、ルミノメーターによって検出されることが多いが、ルレポータータンパク質として多くの研究で使用されていミノメーターは溶液試料中の発光量を測定する機器である。ホタルルシフェラーゼは、ATP およびマグネシウムイるため、「どこで発光しているか」という空間情報を得る

オンの存在下で、ホタルルシフェリンの酸化を触媒し、そことができない。空間情報を得るためには、ルシフェラーの結果生じる励起状態のオキシルルシフェリンが基底状

ゼは発光が微弱であるため検出が困難であった。しかし、態へ戻る際に、黄緑色（最大発光波長 562 nm）の光を生じ近年の検出カメラの感度の向上によって、発光シグナルをる （図１）。ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラ

画像として取得することが可能になり、これによってルシーゼは、カルシウムイオンの結合によって活性化され、基フェラーゼは遺伝子発現の時空間変化を解析するツール質であるセレンテラジン（ウミシイタケルシフェリン）のとして、さまざまな分野において選択されるようになって酸化を触媒する。放出される光は青緑色（最大発光波長きている。

480 nm）である。発光細菌（Vibrio harveyi）ルシフェラー

本稿ではルシフェラーゼをレポータータンパク質としゼは、細菌における遺伝子発現の検出に用いられ、還元型て用いた発光イメージング系の概要と、蛍光イメージング

フラビンモノヌクレオチドの酸化反応を触媒し、結果とし－12－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージングて青緑色の光（最大発光波長 490 nm）が生じる。

について述べる。
蛍光タンパク質の検出には、生体試料に励起光を照射する必要がある。励起光は蛍光タンパク質以外の生体物質にも吸収され、自家蛍光が発生する。蛍光タンパク質のシグ
ナル値が低い場合には、この自家蛍光は不規則な背景光として無視できない割合となり、シグナル値の信頼性が低下する。一方、励起光を必要としない発光イメージングでは、自家蛍光が発生しないことから、背景光を極めて低いレベ

図１ 蛍光タンパク質発現細胞とルシフェラーゼ発現細胞の発光様式の違い。ここではホタルルシフェラーゼの触媒反応例を示す。

ルに抑えることができる。したがって、蛍光イメージングに比べ、シグナル値の信頼度が高く、定量性に優れると期待される。

発光イメージングに用いる検出装置
発光イメージングでは、シグナルを検出する機器としてまた、励起光は、熱や活性酸素の発生、DNA 損傷など

電子増倍型 CCD （Electron Multiplying –CCD: EM-CCD）を引き起こし、生体にダメージを与える。発光イメージン

カメラが用いられる。EM-CCD カメラは、通常の CCD カ

グでは、励起光によるダメージがないため、生体試料の長メラと異なり、受光部で発生した電荷をデジタル信号に変期的な経時観察をより低い侵襲性で行うことができる。

換する前に、高電圧をかけて電荷を増幅させることができ

レポーターシグナルを安定に検出できることも発光イる[2]。EM-CCD カメラの登場により、発光シグナルを検メージングの利点と考えられる。励起光照射は蛍光タンパ

出する感度が飛躍的に上昇し、解析できる対象が広がった。

ク質特有の退色現象を引き起こすが、発光イメージングに発光検出装置は、「暗箱一体型」と、「顕微鏡—カメラ独

おいては、この問題を回避し、長時間かつ安定的なシグナ

立型」に分けられる。「暗箱一体型」は、カメラ、レンズ

ルの検出が可能である。ただし、基質の減少によるシグナ

が遮光性の高い暗箱に内蔵されており、暗箱内部の生きたルの低下には注意が必要であり、この点については後の項

ままの小動物、植物、寒天培地上の微生物などからの発光で詳しく述べる。

を検出することができる。
「顕微鏡—カメラ独立型」は、EM-

ルシフェラーゼによる発光シグナルは、プロモーター活

CCD カメラを顕微鏡に接続する形式で構成される。その性の経時変動に対し、より高い時間的正確度で応答すると場合には、顕微鏡本体を暗幕で覆い、入念に遮光する必要期待される。蛍光タンパク質は、翻訳後すぐにはレポータがある。蛍光顕微鏡の使用に求められる暗条件とは異なり、ータンパク質として機能せず、アミノ酸残基間の環化・酸

わずかな光の漏れがノイズとして映り込んでしまうため、化反応によって起きる発色団の形成が必要である。蛍光タ可能であるならば暗室内に顕微鏡システム一式を設置す

ンパク質種によるが、シグナルとプロモーター活性の間に、るのが望ましい。「顕微鏡—カメラ独立型」は、「暗箱一体

長ければ数時間の時間的ずれが生じることもある [3]。ル型」と異なり、顕微鏡システムの構成や解析ソフトウェア

シフェラーゼの機能に発色団の形成は必要なく、翻訳後すが自由に選べることに加え、照明や温度制御など観察時にぐに機能することができる分、シグナル検出開始に至る時

おける試料の培養条件に柔軟に対応できるというメリッ

間が短くなると期待される。また、ルシフェラーゼの方が、トがある。

概してタンパク質寿命が短い傾向にある。たとえば、野生型ホタルルシフェラーゼの半減期が約 2 時間であるのに対し、野生型 GFP は約 26 時間である[4][5]。このため、野発光イメージングの利点
遺伝子の発現動態を調べる目的で生体イメージングを

生型ホタルルシフェラーゼの方が野生型 GFP に比べ、プ行う場合には、レポータータンパク質の選択肢として、蛍ロモーター活性の減衰に対してより時間的なずれが少な

光タンパク質とルシフェラーゼが挙げられる。どちらも観く応答できると考えられる。ただし、発色団形成時間およ

察目的によって得手／不得手な側面がある。この項では、

びタンパク質寿命に関しては、近年多数の改良型蛍光タン

蛍光イメージングと比べた際の、発光イメージングの利点

パク質が開発されており、蛍光タンパク質の時間的正確度－13－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージングに関する短所は補われつつある[6]。

より明るいシグナルの観察を可能にする画期的な方法である。

ルシフェラーゼの改良
前項で、蛍光イメージングに対する発光イメージングの発光イメージングを行う際の留意点

利点を述べたが、発光イメージングにもいくつかの改善すべき点がある。

この項では、実際に発光イメージングを行う場合に特に注意を要する点について述べる。

遺伝子の発現解析を行う際、複数遺伝子の発現変動パタ

第一の注意点は、基質の投与法である。観察対象が培養ーンを同時に比較する実験や、遺伝子発現量の標準化が必

細胞や植物体の場合は、基質の培地への添加や噴射投与、要な場合がある。生体イメージングにおいてこれらを行う

あるいはマウスなどの小動物の場合には、静脈／腹腔内注には、複数種のレポーターを用いた多色アッセイを用いる

射による投与が一般的であるが、基質が解析対象の組織や必要がある。これは、異なる蛍光波長を発する蛍光タンパ

細胞に到達しているかを、恒常的発現を示す遺伝子プロモ

ク質あるいは蛍光色素を用いて、波長フィルタによってーターを利用して確認する必要がある。

各々のシグナルを分離し、異なるレポーターのシグナルを第二の注意点は、基質の安定性である。ウミシイタケル

独立に検出する手法である。かつてのルシフェラーゼを用シフェラーゼを用いる場合、基質であるセレンテラジンはいた研究では、いずれのルシフェラーゼ種でも最大発光波

培地中で非常に不安定であることが多い[9]。 長時間にお長が青緑色付近に近接していたため多色アッセイが難し

よぶ生体イメージングでは、基質の追加投与を検討するか、かった。しかし、現在では赤色や橙色発光型のルシフェラ

保護基を付加することによって安定化させたセレンテラーゼが単離および開発されており、同一の試料において複ジンを用いる必要がある[10]。

数種のルシフェラーゼの発光シグナルを独立に測定することが可能になってきた。

細胞レベル発光イメージングの実際

発光イメージングのもう一つの問題点はシグナルが微

この項では、ルシフェラーゼを用いた遺伝子発現動態解弱なことである。短時間に変動する遺伝子発現を観察する

析の例として、筆者らが開発した細胞レベル発光イメージ

場合には、露光時間を長くすることができない。そこで、ング系について述べる。

シグナル強度の乏しさを、ルシフェラーゼと蛍光タンパク

筆者らは、コケ植物のヒメツリガネゴケ（Physcomitrella

質の融合タンパク質を作ることによって改善する方法がpatens）を研究材料にして、分化体細胞の幹細胞化の分子考案された[7][8]。これは生物発光共鳴エネルギー移動

メカニズムの解明を目指している。ヒメツリガネゴケの葉（BRET）の原理に基づいており、発光基質が光を放出すを切断し、培地中で生育させると、切断箇所に面した葉細るエネルギーを、近傍の蛍光タンパク質に転移させる。す胞が幹細胞へと変化する[11]。幹細胞への運命転換が起こ

ると、蛍光タンパク質の光エネルギー変換効率がより高いったことは、先端成長と細胞分裂が起こることで判別でき、場合に、発光量が増えることになる。励起光を使わずに、

切断後 24 時間から 36 時間のあいだに観察される（図２）。

図２ ヒメツリガネゴケの幹細胞誘導系。葉の切断によって、切り口の葉細胞が幹細胞化する。幹細胞は、先端成長をしながら細胞分裂を繰り返す。
写真は切断後0、32、40時間目（h）の葉。矢印は幹細胞を指す。写真中のスケールバーは100 µm （囲い枠の中は20 µm）を示す。

－14－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

この幹細胞化は、光を完全に遮断した暗条件下では誘導さ発光検出装置は「顕微鏡—カメラ独立型」を採用し、倒立

れず、光シグナルが必要であることが分かっている。

顕微鏡や EM-CCD カメラなどから構成される顕微鏡解析

筆者らの研究室では、これまでに複数の幹細胞化を制御

システム一式を、温度制御可能な暗室内に設置した。次に、する遺伝子を同定してきた。それらは幹細胞化過程におい幹細胞誘導には光が必要であるが、一方で発光検出時にはて、自己フィードバック制御を含む遺伝子ネットワークを完全な暗条件である必要がある。この障害を乗り越えるた

形成すると考えられている。各々の遺伝子の制御関係を明め、「顕微鏡—カメラ独立型」システムの利点を活かし、別らかにするために、野生型と変異体間における遺伝子発現

途 LED 照明装置とプログラムタイマーを導入し、明暗サの比較解析を行う必要があるが、それには発現変化量を正

イクルを作り出した（図３A）。ホタルルシフェリンは、葉確にモニターできる高い定量性をもった解析系が適してに接する寒天培地にあらかじめ添加した。解析対象遺伝子いる。また、幹細胞化までの 24〜36 時間という比較的短のプロモーター配列とホタルルシフェラーゼ遺伝子の融時間に変動する遺伝子発現を、時間的なずれを少なくして合遺伝子を導入した安定形質転換体を作成し観察試料と検出する必要がある。さらに、幹細胞と非幹細胞は隣り合した。

っているため、それらを区分して独立に遺伝子発現を測定

実際の例として、ルシフェラーゼを用いて行った、幹細

したい。 そこで筆者らは、ヒメツリガネゴケの幹細胞誘胞化を促進する RNA 結合タンパク質遺伝子のプロモータ

導系において、「高い定量性」かつ「高い時間的正確度」

ー活性の解析画像を示す（図３B）。本プロモーターレポー

で、「細胞ごと」に遺伝子発現量を測定する系の確立を目

ターラインの切断した葉の各細胞から、発光反応に由来す

指し、細胞レベル発光イメージング系を独自に開発した。

るシグナルが検出された。このように、背景光と明確に区

図３ 幹細胞化を促進するRNA結合タンパク質遺伝子のプロモーター活性レポーターラインを用いた、幹細胞誘導時における発光強度の推移の定量
解析。
（A）発光シグナルの検出スケジュール。30分間の暗期にEM-CCDカメラによる発光シグナルの検出を行う。
（B）葉切断後0、8、16、32時
間目（h）のプロモーター活性（疑似カラー）と 明視野の重ねあわせ画像。1回の撮影あたりの露光時間は2分間で行った。写真中のスケールバーは
100 µmを示す。
（C）葉切断後32時間目までの幹細胞（左）および非幹細胞（右）の発光強度の推移。それぞれのプロットは細胞ごとの発光強度の変化を示す。

－15－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

別できる発光シグナルが検出されれば、画像解析ソフトウ

Yampolsky IV, Merzlyak EM, Shkoporov AN, Sander I,

ェアを用いて、発光強度の時間推移を細胞ごとに区分化しLukyanov KA, Chudakov DM (2006) Structural basis forて定量解析することができる。図３C は、画像中の全細胞

the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein.

を「幹細胞」と「非幹細胞」にグループ分けし、発光強度

EMBO Rep. 7: 1006-1012.

の時間推移を細胞ごとにプロットしたグラフである。これ

4.

Ignowski JM, Schaffer DV (2004) Kinetic analysis andを見ると、個々の細胞における本遺伝子のプロモーター活

modeling of firefly luciferase as a quantitative reporter gene性の動態は、特に「非幹細胞」グループ内において多様で

in live mammalian cells. Biotechnol. Bioeng. 86: 827-834.

あり、それらは決して同一のアイデンティティーをもった

5.

細胞集団ではないことが分かる。

Corish P, Tyler-Smith C (1999) Attenuation of green
fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein

同一の培養条件で生育させ、外見上は同じ状態にある細胞の集団であっても、細胞ごとのばらつきや遺伝子発現のEng. 12: 1035-1040.
6.

ゆらぎが観察される [12]。それらを計測するには、遺伝子発現の変化を“同一の細胞”で追跡する必要があり、それ

永井健治 (2007) 生細胞蛍光イメージング第 8 章 改
変型蛍光タンパク質の利用 共立出版

7.

Hoshino H, Nakajima Y, Ohmiya Y (2007) Luciferase-YFPはシングルセルトランスクリプトームのような一点のみ

fusion tag with enhanced emission for single-cellの解析系では困難である。細胞レベル発光イメージング系

luminescence imaging. Nat. Methods 4: 637-639.

は、幹細胞化過程における遺伝子発現の微細なゆらぎや細8.

Saito K, Chang YF, Horikawa K, Hatsugai N, Higuchi Y,

胞間のばらつきを検出し、細胞ごとの発現動態を比較する

Hashida M, Yoshida Y, Matsuda T, Arai Y, Nagai T (2012)のに適した解析系である。

Luminescent proteins for high-speed single-cell and wholebody imaging. Nat. Commun. 3: 1262.

おわりに

9.

Close DM, Xu T, Sayler GS, Ripp S (2011) In vivo

本稿で述べたように、発光イメージングには多くの利点

bioluminescent imaging (BLI): Noninvasive visualization

があり、これまで見えなかった生命現象を発見し、新たなand interrogation of biological processes in living animals.

研究展開を導く可能性を含むツールである。今後、新しい

Sensors 11: 180-206.

技術開発とともに、より幅広い解析対象において活用が進

10. Hawkins E, Unch J, Murphy N, Vidugiriene J, Scurria M,

むことが期待できる。

Klaubert DH, Wood KV (2005) Measuring Renillaluciferase luminescence in living cells. Promega Notes 90:

謝辞

10-14.

原稿に有益なコメントをいただいた森下美生、越水静両

11. Ishikawa M, Murata T, Sato Y, Nishiyama T, Hiwatashi Y,

氏に感謝する。本稿で述べた研究結果は、日本学術振興会

Imai A, Kimura M, Sugimoto N, Akita A, Oguri Y,「頭脳循環を加速する若手研究者戦略的海外派遣プログラFriedman WE, Hasebe M, Kubo M (2011) Physcomitrellaム」における、Philip N. Benfey 教授（デューク大学、米国）

cyclin-dependent kinase A links cell cycle reactivation toとの共同研究による成果を含む。

other cellular changes during reprogramming of leaf cells.
Plant Cell 23: 2924-2938.

引用文献
1.

2.

12. Elowitz MB, Levine AJ, Siggia ED, Swain PS (2002)

今井一洋, 近江谷克裕 (2006) バイオ・ケミルミネセ

Stochastic gene expression in a single cell. Science 297:

ンス ハンドブック 丸善株式会社

1183-1186.

最上秀夫 (2006) 染色・バイオイメージング実験ハンドブック第 8 章, 高感度 CCD カメラとイメージイン
テンシファイアー 羊土社

3.

Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG,－16－（2014 年 7 月 19 日受付; 2014 年 7 月 25 日受理）

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

光退色後蛍光回復法（FRAP）を用いたタンパク質動態解析の実際と２光子励起法の利用
村田 隆 1,2*
1 基礎生物学研究所･生物進化研究部門、2 総合研究大学院大学･生命科学研究科･基礎生物学専攻* E-mail: tkmurata@nibb.ac.jp

はじめに

では実際に FRAP を行う場合の注意点、蛍光標識タンパク

細胞内のタンパク質はその機能に応じて特定の場所に質の量が細胞内で変動する場合の内部標準の利用、対象と局在する。定常状態の細胞では、タンパク質は一定の場所

する構造体が立体的な時の２光子励起法の利用についてに留まって動かないように見える。しかしながら、一見す議論する。

ると動かないように見えるタンパク質も常に結合と解離を繰り返している場合が多い。結合と解離は、タンパク質

FRAP の基本原理の交換に働き、タンパク質が局在変化をする時の原動力とFRAP では、解析対象のタンパク質と蛍光タンパク質となると考えられる。これらの動態を解析することは、細胞の融合タンパク質を細胞内に発現させる[1]。化学的に蛍の構造と機能をタンパク質レベルで理解する上で重要と光標識したタンパク質を細胞内に導入する方法もある[2]。

思われる。

次に、細胞内の特定部位に局在した融合タンパク質に強い細胞内のタンパク質動態を可視化するには幾つかの方光を当てて蛍光を退色させる。もしも退色した融合タンパ法がある。光退色後蛍光回復法（FRAP）は比較的遅いタ

ク質が他の領域にある退色していないタンパク質と交換

ンパク質の動きを解析するのに適した方法である。この方するなら、退色領域の蛍光は回復するはずである（図 1）。

法では、共焦点顕微鏡で細胞内の注目する領域の部分照射

この回復時間を解析することによりタンパク質動態を知を行って蛍光分子を光退色させ、その後の回復速度を解析ることができる。現在市販されているポイントスキャン式

する。FRAP の他にも、光っていない蛍光タンパク質を光の共焦点顕微鏡は、スキャンパターンをコンピューターで活性化するフォトアクティベーション法、１つの蛍光タン制御するため、視野中の狭い領域に励起光をパターン照射

パク質の動きを直接検出する１分子観察法も有用な方法

することは容易である。

である。また、着目する焦点領域の蛍光変動を解析する蛍光相関分光法（FCS）も細胞内蛍光分子の動態を解析する方法である。
蛍光相関分光法が溶液中で早く拡散する分子を対象にするのに対し、FRAP など他の方法は、対象とするタンパ
ク質が細胞内の構造上に結合し、移動や交換反応が数百ミ
リ秒から数十分程度の間に起こる現象を解析する方法である。これらは顕微鏡の画像取得を伴う方法であるため、
画像取得時間より速く動く分子の動態を捉えることはできない。FRAP の場合は、画像取得・解析を１次元の線に限定するなどの方法で高速化が可能だが、この場合でも、蛍光分子の光退色に必要な光量の光が解析領域に照射されるより速く動く分子の動態を解析するのは不可能である。逆に、FCS は着目する焦点領域中に出入りする分子数の変動を解析するため、動きの遅い分子は解析が難しい。

図１

光退色後蛍光回復法（FRAP）の原理。細胞内の特定の領域に局在するタンパク質を蛍光標識し（図では緑色で示す）、一部の領域を光退色させる（中央）。退色
領域と周囲の間で蛍光分子の交換が起こる場合、退色領域への蛍光分子の侵入が起こり（下）、時間とともに蛍光は回復する（右）。

そのため、研究目的に応じて使い分けられている[1]。本稿－17－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

FRAP は、対象とするタンパク質が方向性を持って移動する場合にも有力な解析手段となる。もしも対象とするタンパク質が方向性を持って移動するなら、退色によって生じた暗い領域はタンパク質の移動とともに動くはずである（図２）。蛍光回復速度の解析による交換速度の定量化の他に、タンパク質の移動方向についての情報が得られる
ことが FRAP の利点である。

図３

蛍光回復曲線の一例。退色領域の蛍光輝度を

縦軸、時間を横軸にプロットした。t1/2 は自由に移動する蛍光分子の半分が交換した時間で、タンパク質
移動速度の指標になる。一方、時間が経っても輝度が回復しない割合は移動しないタンパク質の存在比
図２

退色した蛍光標識タンパク質が退色領域外のタン率の指標となる。

パク質と交換する場合、蛍光は時間とともに回復するが、標識したタンパク質が一定方向（この場合は右）に場合、退色後の一定時間後の回復率を求め、棒グラフで表移動する場合、退色した領域は時間とともに移動する。

示することが多い。一定時間後の回復率を求める場合、回復曲線のどの時点で回復率を求めるか、回復曲線を参照して決める必要がある。回復が定常状態になった時点で回復

蛍光回復曲線の解釈
FRAP は、蛍光タンパク質を融合させた対象タンパク質を発現する細胞と共焦点顕微鏡があればできる方法なの率を求めれば動かない成分の割合、回復初期なら交換速度を反映した数値になる。

で、１分子解析や FCS など他の方法に比べて手軽に行える。その一方で、実験結果の解釈には注意する必要がある。

退色範囲、画像取得条件の設定
実際に退色実験を行う場合、細胞内のどの領域をどの程退色後の蛍光回復曲線の一例を図３に示す。この例では、退色後、蛍光は急速に回復し、最終的には定常状態に達す度の広さで退色させるか決める必要がある。退色領域は解るが、初期値までは回復しない。この場合、対象とするタ

析する蛍光分子が局在する領域に比べて充分に狭いこと

ンパク質には細胞内の他の分子と交換するものの他に、対が望ましい。もしも退色領域が広いと、細胞内の全蛍光分

象領域にとどまり交換しないものが存在すると解釈でき子に対して無視できない量の蛍光タンパク質が退色してる[1]。これらの構成成分の交換速度と割合は、計算によりしまい、見かけ上交換しない分子が増えた回復曲線になる

求めることが可能である。また、より複雑な３成分以上の（図４）。退色領域で退色した分子の量を計算に組み込ん系であっても、カーブフィッティングは可能と 考えられだ解析も行われているが[3]、実際に照射領域のどの範囲るが、その場合は結果の解釈をより慎重に行うべきと思わが退色したかを厳密に決定することは難しい（後述、図５れる。

参照）。また、図２下のように蛍光分子が方向性を持って分子生物学においては、野生型と突然変異体でタンパク質の交換速度を比較する実験がよく行われる。このような移動するなど、退色した分子が自由拡散と異なる挙動をする場合には正しく計算できない。

－18－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング
的解析は難しい。しかしながら、タンパク質の総量を見積
もる内部標準マーカーを用いることにより、交換率を見積もることは可能である。測定対象のタンパク質に２色の異なる蛍光タンパク質を融合させた融合タンパク質を設計し、２色の融合タンパク質を同時に発現させる。このようにして作成した２色発現細胞を用い、１色のみを退色させ、もう１色は内部標準として用いる。内部標準との比率を計算することにより、タンパク質の総量が変動する条件下での動態を見積もることができる[5, 6]。

図４

退色領域が広すぎる場合に予想される回復曲

２光子励起法との組み合わせ線。退色した蛍光分子どうしの交換により、退色領

先述のように、FRAP による光退色の範囲は対象物に対域が充分に狭い場合（左）に比べて、動かない蛍光して充分に狭いことが望ましい。しかしながら、解析対象

分子の画分が見かけ上増える。

が立体的な場合、退色範囲を限定することは難しい。共焦FRAP において回復曲線を高時間分解能で得るために点顕微鏡の励起光は対物レンズから円錐状に照射されては、短い時間間隔で対象の画像を取得しなければならない。

焦点を結ぶため、非焦点面では励起光が広範囲に照射され短時間で多数の蛍光タンパク質画像を取得する時に問題る。光子密度は焦点面ほど高くないものの、非焦点面におになるのが、蛍光タンパク質の光退色である。多くの解析

いても退色は起こる（図５）。そのため、狭い範囲に励起

では、退色領域以外の輝度を計測し、その輝度減少をもと

光をパターン照射した場合でも、無視できない量の蛍光タに退色を補正することが行われている。画像解析プログラ

ンパク質が退色することは起こりえる。このような場合、ム ImageJ のプラグイン（FRAP Analysis）[4]にも組み込ま

２光子励起法を用いて退色させることが有効である[7, 8]。

れているが、退色の起こるような画像取得条件では光障害のリスクもあるため、可能な限り退色の起こらない画像取得条件を設定することが望ましい。対象とする細胞構造の識別が可能な程度に解像度を下げることによって、画像取得時の照射光量を下げ、退色を軽減することは可能である。
１枚の美しい画像を撮影する条件と、光回復の定量に用いるデータを取得する条件は異なることに留意する必要が
図５ある。

１光子励起における退色領域の立体的広がりの概念図。退色領域は焦点面から上下に立体的に広がる。実際の退色領域は蛍光分子の退色しやすさやレー

タンパク質の量が変動する場合の解析
上記のように退色条件と画像取得条件に注意しても、回復曲線の解析が困難な場合がある。対象とする構造物上の蛍光融合タンパク質の総量が変動する場合である。FRAP

ザ強度、対物レンズの開口数等の条件によって異なる。右図中の矢印は非焦点面で退色した蛍光分子の焦点面への流入を示す。

による定量解析は、基本的には対象領域におけるタンパク質の交換反応が平衡状態であることを前提としている。蛍光融合タンパク質の量が変動している場合、本来は蛍光が100%回復する条件であっても、見かけの回復率は 100%に届かなかったり、逆に 100%を越えた回復になったりする。

２光子励起現象は、１つの蛍光分子に２つの光子が同時に吸収された時に起こる現象である。たとえば、488 nm で励起される緑色蛍光タンパク質（GFP）の場合、約２倍の波長である 950 nm の光子２個によっても励起できる[9]。
２つの光子が１つの蛍光分子に同時に吸収される確率は

このような場合、単純に回復曲線を計測するだけでは定量－19－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

光強度の２乗に比例するため、２光子励起は顕微鏡の焦点起で退色させ、その後の回復を測定した。微小管の絶対量付近のみで起こり、非焦点面で起こる確率は実質上ゼロでの増減を見積もるため、GFP チューブリンを内部標準としある。そのため、２光子励起法を用いれば、蛍光タンパクて用いた。

質を焦点面でのみ退色させ、非焦点面では退色させないこ

TagRFP は赤色の蛍光タンパク質だが、他の多くの赤色蛍とが可能である。最新の２光子顕微鏡では共焦点顕微鏡観

光タンパク質同様、約 700-800 nm の遠赤色光によっても察と２光子励起を電動制御で素早く切り替えることが可

２光子励起が起こる。さらに、赤色蛍光タンパク質の中で、能なため、共焦点顕微鏡観察で退色前の画像を撮影し、２

この短波長側の２光子励起の励起効率が高いことが報告

光子励起で焦点面のみを退色させ、ただちに共焦点顕微鏡

されている[12]。一方、GFP は約 1000 nm より短い広い波観察で画像取得することが可能になった。

長範囲で２光子励起されるが、700-800 nm での励起効率

２光子励起を用いれば焦点面のみを退色させることがは低い[12]。そこで、760 nm の励起光を用いてレーザ出力可能だが、２光子励起特有の注意点もある。第一に、励起を調整することにより、GFP はほとんど退色しないがされる分子の量が励起光量の増加に対して非線形で上昇

TagRFP は退色する条件を得た。この条件で TagRFP チュ

するため、焦点面に励起光を当てすぎないように注意する

ーブリンを退色させ、その後の回復を定量解析した。隔膜必要がある。もしも励起光が強すぎると、試料の破壊につ形成体の形状は時間とともに変わるため、退色領域の長時ながる危険性がある。第二は励起波長の設定である。２光子励起は１光子励起に比べて広い波長範囲の蛍光色素を単一の波長で励起することができる[10]。しかしながら、このことは、単一波長の励起光で非特異的にさまざまな吸収波長の蛍光タンパク質が退色されてしまう可能性を意味する。内部標準を用いた多色標識の解析では、単一の蛍光タンパク質のみを退色させることが望ましいため、多重標識試料の２光子励起 FRAP は、退色に用いる波長を慎重に選ぶ必要がある。

植物の微小管動態解析における内部標準の利用と２光子
FRAP
一般に、動物の培養細胞はガラス表面に平たく伸展するものが多いが、植物の細胞は液体培地中で懸濁され、細胞は円筒状など厚みを持った形状になる。厚みを持った細胞の場合、非焦点面の退色についてより注意する必要がある。
著者らはタバコ培養細胞の細胞質分裂における微小管動態の解析に２光子励起 FRAP を利用した[11]。植物細胞の細胞質分裂においては、隔膜形成体と呼ばれる分裂装置が形成され、この中で細胞板が作られる。隔膜形成体は微小管を多く含む構造だが、その微小管動態には謎が多かった。
隔膜形成体は細胞質分裂の進行とともに拡大し、局所的な微小管の増加と減少が起こる動的な構造体である。著者らは隔膜形成体の微小管動態を解析するため、TagRFP チュ
ーブリンと GFP チューブリンを同時に発現するタバコ培養細胞を作成した。次に TagRFP チューブリンを２光子励
－20－

図６

タバコ培養細胞の隔膜形成体における２光子

FRAP の解析例。文献 11 より改変。GFP チューブリ
ンと TagRFP チューブリンで２重標識した隔膜形成
体の TagRFP を退色させ、その後の輝度変化を追跡した。GFP と TagRFP の輝度値を標準化し、差分を演算して差分画像を得た（上右）。差分画像を用いて退色域（Region i）と隣接する領域（Region ii,
Region iii）の輝度値を計測した。退色した TagRFPの輝度は時間とともに回復するが、測定時間内では完
全には回復しないことがわかる。

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

間観察は難しかったが、交換の遅い微小管と早い微小管が4.

ImageJ plugin FRAP Analysis:

共存していることを示唆する結果を得た（図６）。この結

http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:ana

果は微小管重合阻害剤処理による観察や GFP チューブリ

lysis:frap_analysis:start

ン低発現株の解析による蛍光チューブリン分子の移動の5.

Zicha D, Dobbie IM, Holt MR, Monypenny J,

観察結果と一致していた。このように、２光子励起によるSoong DYH, Gray C, Dunn GA (2003) Rapid actin

FRAP はタンパク質動態の解析に適した方法と考えられ

transport during cell protrusion. Science 300: 142-

る。

145.
6.

Smith M B, Kiuchi T, Watanabe N, Vavylonis D(2013) Distributed actin turnover in the

おわりにlamellipodium and FRAP kinetics. Biophys. J. 104:

本稿においては FRAP の基礎知識と立体的な試料にお247-257.

ける問題点を解説し、その解決法として２光子励起とFRAP を組み合わせた方法を紹介した。２光子励起を用い

7.

Brown EB, Wu ES, Webb WW (1999)

た退色法は立体的な組織や細胞を解析する場合は有力なMeasurement of molecular diffusion in solution by

方法と考えられるが、常に光障害のリスクがある。PA-GFP

multiphoton fluorescence photobleaching recovery.

などの光活性化タンパク質や、Dendra2 などの光変換タン

Biophys. J. 77: 2837-2849.

パク質を利用することが可能なら、蛍光タンパク質を退色

8.

Waharte F, Brown CM, Coscoy S, Coudrier E,

させる方法に比べて励起光を弱くすることが可能と思わ

Amblard F (2005) A two-photon FRAP analysis of

れるが、２光子吸収現象を用いた光変換タンパク質の変換

the cytoskeleton dynamics in the microvilli ofはほとんど例がない。今後の条件検討と、２光子吸収によintestinal cells. Biophys. J. 88: 1467-1478.
9.

る変換に適した光変換タンパク質の開発が待たれる。

Zipfel WR, Williams RM, Webb WW (2003)
Nonlinear magic: multiphoton microscopy in thebiosciences. Nat. Biotech. 21: 1369-1377.

謝辞
本稿の執筆にあたりご助言いただいた野中茂紀博士（基10. Xu C, Zipfel W, Shear JB, Williams RM, Webb WW

礎生物学研究所）に感謝いたします。本総説で紹介した２(1996) Multiphoton fluorescence excitation: new

光子 FRAP の解析は、植物科学最先端研究拠点ネットワー

spectral windows for biological nonlinear

クの支援を受け、名古屋大学にて行われました。研究支援

microscopy. Proc Natl Acad Sci USA 93: 10763-に感謝いたします。

10768.
11. Murata T, Sano T, Sasabe M, Nonaka S,

引用文献

Higashiyama T, Hasezawa S, Machida Y, Hasebe

1.

Lippincott-Schwartz J, Snapp E, Kenworthy A

M (2013) Mechanism of microtubule array(2001) Studying protein dynamics in living cells.

expansion in the cytokinetic phragmoplast. Nat.

Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 444-456.

Commun. 4: 1967.

2.

3.

Wang YL (1985) Exchange of actin subunits at the

12. Drobizhev M, Makarov NS, Tillo SE, Hughes TE,

leading edge of living fibroblasts: possible role of

Rebane A (2011) Two-photon absorption properties

treadmilling. J. Cell Biol. 101: 597-602.

of fluorescent proteins. Nat. Methods 8: 393-399.

Mueller F, Wach P, McNally JG (2008) Evidence(2015 年 4 月 29 日受付; 2015 年 5 月 7 日受理)

for a common mode of transcription factor
interaction with chromatin as revealed by
improved quantitative fluorescence recovery after
photobleaching. Biophys. J. 94: 3323-3339.
－21－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

蛍光寿命や近赤外光を応用したイメージング技術
三輪 佳宏 1*、田中 順子 1、千田 直子 2、黒山 喬允 3、逆井 智貴 3、濱田 理人 1、百武 篤也 4、新井 達郎 4、高橋 智 1
1 筑波大学･医学医療系、2 株式会社日立製作所･研究開発、3 筑波大学大学院･人間総合科学研究科、 4 筑波大学･化学系* E-mail: ymiwa@md.tsukuba.ac.jp

要旨
定量的な蛍光イメージングに向けて、様々な新しい計測の可能性について研究が進められている。その中で本稿では２つの取り組みを紹介する。これまでに数々の報告例がある分子内 FRET プローブに対して、２分子間のタンパク質間相互作用を FRET で検出したい場合には、蛍光寿命計測によるドナー蛍光の蛍光寿命短縮を計測することが有効な手段となる。
この計測の精度を高めるために、我々は長蛍光寿命の蛍光色素である Tsukuba Green の応用を進めている。もう一つの新しい技術として、哺乳動物組織での吸収が少なく、深部イメージングに適している近赤外蛍光を用いるイメージング手法がある。この技術が進展することで、マウス体内の非侵襲３次元イメージングが可能になると期待される。

はじめにを受けとるアクセプターの蛍光強度が増加するため、比が生命科学研究における蛍光計測の重要性については、も変化するからである。一方、ドナーとアクセプターの蛍光はや言及の必要すらないと思われる。しかし、可視域の蛍タンパク質を別々のタンパク質に独立して融合させ、２種光強度を計測する以外にも、蛍光寿命を計測したり、近赤類の融合タンパク質の間での結合を検出する２分子間外光の性質を利用したイメージングなどの手法も存在しFRET を蛍光強度比で計測することは困難である。細胞内ている。これらを実用化することができれば、蛍光計測ののあらゆる局所において、ドナーの融合タンパク質とアク可能性を一層拡大し、光をとおして生命を見ることで明らセプターの融合タンパク質の存在比を一定にすることはかにできる範囲が広がると期待される。そこで本稿では、困難なので、蛍光強度比は最初から一定にはならないから

蛍光寿命計測と近赤外蛍光の２つについて、我々の取り組である。だが、細胞への刺激によって、ダイナミックに細みと、今後の可能性について紹介する。

胞内局在が変化するタンパク質は多く、異なる局在変化をするタンパク質どうしの出会いを捉えるには、どうしても蛍光寿命計測の応用

別々のポリペプチドとして独立に細胞内に存在させた上蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によるタンパク質間で、FRET を観察する技術が必要となる。このような場合相互作用の検出方法は、非常に強力な解析手法であり、カに用いられるのが蛍光寿命というパラメーターである。蛍ルモジュリンと M13 のカルシウム依存性の結合を利用し光寿命はそれぞれの蛍光物質に固有の値であるが、同時にた細胞内カルシウムの検出を初めとして、様々な成功例が環境の影響も受ける。FRET がおこると、そのドナー蛍光報告されている[1, 2]。これらのうちの多くの蛍光プローの蛍光寿命は、FRET の効率に応じて短縮する。この短縮

ブは、分子内 FRET すなわち、ドナーとアクセプターとなを検出することができれば、ドナーとアクセプターの蛍光

る２種類の蛍光タンパク質を一つながりのポリペプチド

タンパク質がどのような存在比であろうとも、すなわち蛍として融合させたものが用いられている。こうすることで、光強度比がどれだけバラついていようとも、２分子間細胞内のあらゆる局所において、ドナーとアクセプターのFRET の計測が可能となる[3, 4]。

蛍光タンパク質の存在比を一定にすることができること

では、そもそも蛍光寿命とはどのくらいの値で、どうすから、蛍光強度比を捉えることで FRET 効率の変化を算出

れば検出できるのだろうか。通常の緑の蛍光色素では 2〜することが可能となる。FRET が起こっている場所では、

4 ns（ナノ秒）程度の値を示すものが多い。また、FRET

エネルギーを失うドナーの蛍光強度が減弱し、エネルギー

効率すなわち、ドナー蛍光色素が吸収したエネルギーのう－22－Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

ちアクセプターに移動するエネルギーの割合を E、ドナー

どうしであれば、それぞれの融合遺伝子をデザインして細色素の本来の蛍光寿命をτD、FRET 時の蛍光寿命をτDA

胞に発現させればよいが、TG は有機系の色素であるため、とすると

E=1-τDA /τD の式で表される。ということは、

なんとかしてタンパク質に結合させなければならない。特例えば 20%の FRET 効率であれば蛍光寿命が 2.0 ns から

定のタンパク質に共有結合で特定の分子を安定に結合で1.6 ns に短縮し、これを測定しようとすれば、サブナノ秒

きる確立されたツールとして、HaloTag[7]、SNAP[8]、のオーダーが正確に計測できる手法や特別な装置が必要

CLIP[9]をはじめとする技術が開発されてきている。これとなる。一般にこの計測は、蛍光寿命イメージング顕微鏡

らはいずれも、細胞に発現させた標的タンパク質に対して、（FLIM）を用いて行われる。FLIM では、細胞内の局所に後から添加した蛍光色素を共有結合で安定にラベルする

おける FRET も検出できる反面、細胞間でのバラつきを検ことが可能である。そこで我々は、これらのうち HaloTag

討するために多数の細胞のデータを取得して統計的に処のシステムを採用し、HaloTag タンパク質を発現するヒト

理したいような場合には、データの取得に多くの時間がか

HEp-2 細胞に HaloTagTG リガンドを添加することでラベ

かり大変である。そこで我々はこれまでに、三井造船株式

ルできることを確認した（図２A）。ただし、フローサイ

会社との共同研究で、蛍光寿命計測できる時間分解フロー

トメーターでの計測では、細胞内に存在する自家蛍光由来

サイトメーターFlicyme をセットアップしてきた[5]。このの極めて短い蛍光寿命成分も平均値に加味されるため、実方法であれば、多数の細胞のデータを容易に取得できるが、際には 10 ns よりも短い 5.0 ns 程度の計測値になってしま

一方で細胞内の局所でしか FRET が起こっていない場合う。それでも、一般的な蛍光色素よりは蛍光寿命が長いが、でも、細胞全体の平均的な蛍光寿命の値を得ることとなる。

自家蛍光成分を補正する方法については、今後の重要な検したがって、変化率はさらに小さくなることが予想され、討課題である。

いっそう高い精度での蛍光寿命計測が要求されてしまう。
では、より正確に蛍光寿命の短縮を計測するにはどのよ
うな解決策があるだろうか。そこで我々は幸いにも、緑の蛍光色素でありながら、蛍光寿命が長い新規蛍光色素を得ることに成功し Tsukuba Green（TG）と名付けた[6]。図１に TG と N-メチル体の構造を示す。

図１ Tsukuba Green（左）と N-メチル体（右）の構造

TG そのものも 4.9 ns と比較的長い蛍光寿命を示すが、Nメチル体になると 9.5 ns という非常に長い蛍光寿命を示

図２. HaloTag Tsukuba Green リガンドを用いて標識したす。これを FRET のドナーとして用いると、上記のよう細胞での Tsukuba Green の蛍光寿命測定結果。（A）に FRET 効率が 20%の場合、9.5 ns から 7.6 ns への約 2 ns

HaloTag タンパク質を単独で発現。
（B）Kusabira Orangeの短縮を捉えることとなり、2.0 ns から 1.6 ns への 0.4 nsと HaloTag タンパク質の融合タンパク質を発現。（C）の短縮をとらえなくはならない場合にくらべて、かなり計

Kusabira Orange と Runx2 の融合タンパク質、および測が楽になる。しかし TG を用いて FRET プローブをデザ

CBF1 と HaloTag タンパク質の融合タンパク質の両方をインしようとする場合、一つ問題がある。蛍光タンパク質

同時に発現。

－23－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

次に、HaloTag タンパク質を蛍光タンパク質の Kusabira
Orange（KO）と融合させて、分子内 FRET を起こす状態にして計測してみると、3.9 ns まで短縮することがわかった（図２B）。さらに、１対１で結合することが知られている転写因子の Runx2-CBFβのペアのそれぞれに KO とHaloTag タ ン パ ク 質 を 融 合 し て 、 KO-Runx2 お よ び
CBFβ-HaloTag をデザインし、これらを簡便に多重遺伝子導入ができるエピゾーマルベクターの EBV-based ベクタ
ー[10]をもちいて同時に細胞内に発現させた状態にして蛍光寿命を計測した（図２C）。すると、KO と HaloTag を直接融合させた場合と同様に蛍光寿命の短縮が起こっており、２分子間 FRET を検出できていることが示唆された。
以上のように、もともとの蛍光寿命が長い TG をドナーに用いることで、1 ns 以上の短縮として FRET を捉えるこ図３. マウス新生仔腹部で皮膚越しに母乳自家蛍光検出とができた。一般的な蛍光タンパク質を用いた以前の計測
では[5]、非常に FRET 効率を高めた分子内 FRET のプロー

生後２日目の新生仔では皮膚が非常に薄いため、どちらのブでも 2.0 ns→1.3 ns であり、これをさらに分子間 FRET

蛍光も皮膚越しに容易に検出できる。ただし近赤外光はよにすると計測が困難であった。このことから、長蛍光寿命

り深部の光も検出されるため、ボケた画像になる。ところであることの有利さがわかる。しかしながら、もともとのがそれから１週間が経過して生後８日目になると、皮膚のTG の蛍光寿命が本来の寿命の半分程度としてしか捉えら厚みはわずかにコンマ数ミリしか厚くなっていないが、それないままでは、性能を十分に発揮できているとはいいがの厚みでオレンジの光はかなり遮断されてしまうのに対たい。今後、時間分解フローサイトメーターでの計測法そして、近赤外光はまったく問題なく透過して検出される。

のものについても詳細な検討を加えて、自家蛍光の影響をこの図からも、近赤外光と可視光の透過度が圧倒的に違う補正する方法を確立する必要がある。

ことが容易に理解していただけると思う。
近赤外光は、身体の断面の直径が1～2 cmのマウスであれば、体内を貫通して３次元にイメージングできると考え

近赤外蛍光を応用した非侵襲イメージング
もう一つ、これから発展と応用が期待される技術に近赤られている。ただし哺乳動物の組織には、吸収の他にも散外光を使ったin vivoイメージングがある。哺乳動物の体は乱の問題がある。このため光が深くまで入るといっても、不透明であり可視光は透過できないが、これは全ての細胞

１点から入射したレーザー光ですら、散乱によりまさに濃中に存在するヘムによって、650 nm以下の波長の光が強く度勾配を作るかのように体内全体に広がってしまう。した吸収されてしまうことが原因である。ところが、650 nm

がって、空気中や水中のように光の直進性に基づいて２次を超える近赤外の波長の光はこの吸収が小さいため、体内元の画像から蛍光体の位置を特定することは難しい。そこに深く浸透できることが知られている。650 nm〜900 nm

で、多数のデータに基づいてコンピュータに計算をさせ、の光は、生体の光学的窓（optical window）とよばれ、哺その結果として蛍光体の位置を割り出す特殊な撮影技術

乳動物の体内に深く浸透することができる[11]。図３にマが必要となってくる。この目的のために、パーキンエルマ

ウス新生仔の腹部で非侵襲に腸内の母乳の自家蛍光を撮

ー社のIVIS SpectrumやVMTなどの装置が市販されている。

影した例を示す。母乳中には様々な波長成分の自家蛍光が我々が用いているIVIS Spectrumの場合には、マウスの下部含まれているため、オレンジの波長も近赤外の波長も蛍光の１点から絞り込んだ励起ビームを入射して、体の上部にを発している。

抜けて来る蛍光情報をカメラで取得する。次に励起ビームの入射位置を次々と変更しながら、様々に変化する蛍光パ－24－Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

ターンを取得し、それらをもとに体の吸収・散乱の光学係あった。動物に普段食べさせている飼料中には、通常アル数に基づいてコンピュータで計算し、蛍光体の位置を３次

ファルファが混ぜてあるが、植物成分中にはビリベルジン

元的に割り出すことでイメージングする。

とよく似たテトラピロール環をもつ近赤外蛍光物質であでは次に、近赤外で使える蛍光プローブにはどのようなるクロロフィルが大量に含まれている。これではエサの強ものがあるのか。臨床で肝機能の検査のために用いるイン

烈な蛍光ばかりが検出されてしまい、目的の蛍光イメージ

ドシアニングリーン（ICG）など、有機化合物の色素には、ングが実施できない。また、アルファルファを抜いた飼料

励起も蛍光も近赤外の条件をみたすものが存在する。しかも市販されてはいるが、実際に計測してみると、かなりのしながら、様々な生命科学の現象を捉えるには、GFPの発近赤外蛍光を発していた。そこで我々は、オリエンタル酵

見によって蛍光イメージングが普及したように、遺伝子と母工業株式会社の協力を得て、まず第１段階として、ICG

して導入・発現させることができ、トランスジェニックマ

の検出を可能にする波長域（Ex: 780, Em: 820）の自家蛍光

ウスやノックインマウスで使える蛍光タンパク質プローを低減したiVid#1を、次いで、iRFPの検出も邪魔をしない

ブが必要である。従来のGFPの仲間の蛍光タンパク質も、ように、iRFPの波長域（Ex: 675, Em: 720）での自家蛍光長波長化を狙った開発がずいぶん展開されたが、基本的にまで低減させたiVid#2を開発してきた[15]。 これを使うと長波長になるためには発色団のπ電子の共役領域が広が

iRFPも十分に３次元イメージングすることができ、マウスる必要があり、平面構造が大きくなることが必要である。

体内の深部まで検出することが可能になった。iRFPを発現

しかし、蛍光タンパク質の基本構造として、11本のβシーさせた細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定しチューブ

トが筒状になっているβcan構造は共通しているために、に詰めたものと、ICGを固化したチューブを同時に生きた

その内腔のサイズにはある程度限界があり、蛍光最大強度

マウスの腹腔内に留置し、X線CTおよびIVIS Spectrumで解波長は650 nmまで達してはいるものの、600 nmより長波長析した例を示す（図４）。

の光で励起できるものは、なかなか出てこなかった。そこで、下村脩先生と同時にノーベル賞を受賞したTsienのグループでは、まったく別のタンパク質を元に人工的により長波長の蛍光タンパク質を開発し報告した[12]。バクテリ
オフィトクロムはヘムの代謝物であるビリベルジンを取り込む性質をもつ色素タンパク質であるが[13]、これに変異を導入し、哺乳動物の細胞中に存在するビリベルジンを発色団として取り込むことで、近赤外の励起と蛍光を満たす蛍光タンパク質IFP1.4が開発された。しかし、ただタン
パク質を発現させただけでは十分な成熟が起こらず、蛍光は弱いものであったため、in vivoイメージングに利用するにはかなり困難であった。ところが、2011年になって、
Verkhushaのグループから大幅に改良されたiRFPが報告された[14]。iRFPは、ビリベルジンに対するアフィニティー
が圧倒的に高いため、そのまま細胞に発現させただけでも細胞内のビリベルジン濃度で十分に成熟が可能で強い近赤外蛍光を発する。このiRFPを用いれば、感覚的には従来のGFP様蛍光タンパク質の場合と同じ実験手法で発現・イメージング実験が可能になった。
生きたマウス体内の近赤外蛍光イメージングを実施する際に、どうしても解決しておかなければならない問題が

図４. iVid#2で飼育したマウス体内のiRFP発現細胞と固化
ICGチューブの非侵襲３次元イメージング－25－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

X線CT画像（図４A）から、うつぶせのマウスの腹腔内のiRFP の発現について、図５に示すように、全血球で近赤

腹側に２本のチューブが存在していることが確認できる。

外蛍光が検出され（図５B）、他のほとんどの臓器でも強このように非常に深い部位に蛍光体が存在していても、上い蛍光が検出された。また１年にわたって飼育を継続した

述したような手法でIVIS Spectrumを用いて多数のデータが、特徴的な異常はいまのところ見いだされていない。こを取得し、これらに基づいて計算をすると、蛍光体の３次のことから、iRFP の発現そのものが何らかの異常を引き元的な位置が算出されてくる（図４B）。ICGを固化したチ起こす可能性は低く、一般的な体内イメージングに利用で

ューブはiRFPの波長域にも蛍光を持つため、この図では両きるものと考えている。

方のチューブが描出されている。しかもiVid#2であれば、近赤外蛍光撮影を邪魔していないことがわかる。

今後、この iRFP トランスジェニックマウスをドナーとしてさまざまな移植実験により体内イメージングに応用

iRFP を大量に細胞に発現させた場合に、上述したようできると考えている。例えば、骨髄移植の系であれば、血に、ヘムの代謝物であるビリベルジンが iRFP にトラップ

球のみが近赤外に光っているマウスを作出できるので、炎されて大量に細胞内に蓄積した状態になるが、これがヘム症を初め、様々な疾患の病態を検出できる可能性がある。

の代謝そのものに影響したり、それ以外にも何らかの細胞

また、通常は iRFP を発現しないが、cre による組換えが起毒性を示したり、マウスのいずれかの臓器で機能不全を起こるとプロモーター配列と iRFP 遺伝子が連結される iRFP

こさないかどうかは、今後の応用の上で非常に重要である。

flox マウスを樹立すれば、特定の細胞・組織依存的に cre

そこで我々は、iRFPを全身で発現するトランスジェニックを発現するマウスと交配させることで、体内の狙った臓器

マウスを樹立し、長期間の飼育を行い、発現そのものの維でだけ iRFP を発現させて、生きたままでまったく非侵襲

持とマウスの健康状態をモニターした[16]。

に、かつ継続的に長期観察することが実現できると期待される。これは様々な疾患の発症や病態の進行をライブ観察
することを可能にし、創薬や治療法開発のためのモデル系として大きな貢献が可能だと考えている。
もちろん単純に、従来型の蛍光タンパク質のどの波長とも重ならずにさらに組み合わせできるマルチカラー化ツールとしても、非常に強力である。Verkhusha の研究室からは、すでに iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713(最初に開発されたもの) 、iRFP720 の５色の iRFP 変異体を開発したことが報告されており[17]、これらを従来型の蛍光タンパク質と組み合わせると、いっきに組み合わせ可能な
蛍光タンパク質の種類が増えることになる。例えば、スペ
クトル撮影を行って unmix 機能を使えば、10 色以上の組
み合わせも可能になると期待される。近赤外蛍光検出を狙った装置も続々と開発・販売されており、今後は安価なものもかなり出回ってくると期待される。また、これらの近赤外蛍光タンパク質は、蛍光を検出するのみでなく、パルスレーザーを色素に照射した際に発生する超音波をとらえてイメージングする光音響イメージングのプローブとしての可能性も高い。これを通常の超音波画像と組み合わ

図５. iRFPトランスジェニックマウスの近赤外蛍光検出

せたイメージングは、臓器との位置関係をより詳細に解析(A)新生仔の全身像(B)白血球細胞のFACS解析

でき、強力な解析手段になると期待される。非侵襲イメー
ジング技術は、現在世界的に非常に扱いが厳しくなってい－26－

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング

る実験動物愛護の観点からも重要である。今後、多くの研究者の参入を期待したい。

Biotechnol. 21: 86-89.
9.

Gautier A, Juillerat A, Heinis C, Correa Jr, IR,
Kindermann M, Beaufils F, Johnsson K (2008) An

謝辞

engineered protein tag for multiprotein labeling in living

本研究を遂行するにあたり、文部科学省科学研究費補助金

cells. Chem. Biol. 15: 128-136.

（25113702、26102712、26221004、15H04281）による助10. Tanaka J, Miwa Y, Miyoshi K, Ueno A, Inoue H (1999)

成を受けました。ここに感謝の意を記します。

Contruction of Epstein-Barr Virus-based expression vector
containing mini-oriP. Biochem. Biophys. Res. Commun.

引用文献
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－27－

（2015 年 5 月 7 日受付; 2015 年 5 月 19 日受理）

Vol.24 No.1 (2015)

バイオイメージング「バイオイメージング」投稿のお誘い
和文誌「バイオイメージング」は、全文がインターネット上で公開され、多くの方にお読みいただいています。シンポジウム等に基づく特集記事も歓迎致します。下記の要領で、投稿をお待ちしています。
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ング学会に帰属することを前提とする。
２．他の雑誌・書籍等にすでに掲載された内容を含む原稿や、他の雑誌等に投稿中の原稿は、原著論文として投稿 できない。総説、解説等において、図・表・文章など出版済みの内容を転載する場合は、投稿前に著作権所持者の許可を取ること。これらの規定に反した場合、また、データの捏造や他の著作物からの盗用など、科学的ないし社会的倫理に反する行為が判明した場合には、編集委員会は掲
載決定後あるいは掲載後においてもその原稿の掲載取り消しを行うことができる。
３．投稿原稿の体裁は次のとおりとする。
(1) テキストは原則として MS-Word 形式のファイルとする。
(2) 原稿の最初に、表題、著者氏名、所属先、電子メールアドレスを記載する。
(3) A4 版で 6 ページ以内を標準とする。原則として和文フォントは MS 明朝、英文は Times New Roman
または Times。余白：上下 25 mm、左右 20 mm、タイトル･著者氏名･所属･要旨は全段、本文は 2 段
組として、40 行/ページ、行送り 17.5pt。タイトルは 12 ポイント、執筆者氏名･所属･本文は 9 ポイ
ント。図表等は、必要に応じて 2 段組にせず、全段で掲載することも可能。図･写真･表･図の説明
文は、ファイル本文中の希望箇所に挿入する。
４．投稿にあたっては、投稿原稿のファイル(MS-Word 形式と pdf 形式の双方; 図、写真の元データファ
イル(300 dpi 以上の解像度)を含む)を日本バイオイメージング学会「バイオイメージング」編集長宛に、電子データとして送付する。
５．校正は、著者の責任において行う。
６．著者の希望によりカラー印刷する場合の別途費用は、著者負担とする。別刷を 50 部単位で購入することができる。
原稿投稿先：「バイオイメージング」編集委員長 朽津 和幸〒278-8510 千葉県野田市山崎 2641 東京理科大学理工学部応用生物科学科
E-mail: kuchitsu@rs.noda.tus.ac.jp; FAX: 04-7123-9767
日本バイオイメージング学会が協賛する学会の御案内
2015 年 11 月 24-27 日

The 2nd East-Asia Microscopy Conference (EAMC-2)

http://www.eamc2.org/
The Himeji Chamber of Commerce and Industry (HCCI), Himeji, Hyogo, JAPAN
Abstract due: July 31, 2015; Author notification of acceptance: September 1, 2015
Early registration: September 30, 2015
Contact: E-mail: eamc2@microscopy.or.jp; phone: +81(3)5389-6640; fax: +81(3)3368-2822－28－「バイオイメージング」への皆様の御投稿をお待ちしております。
「バイオイ
メージング」のホームページも是非御活用下さい。
現在、第 24 回日本バイオイメージング学会公開講座 ･ 学術集会の準備が進められています。今回は、2013 年にできたばかりの東京理科大学葛飾キャンパスのコンサートホールが会場です。公開講座も、会員の皆様方にお楽しみいただ
けるよう、さまざまな展示や実験を含む多彩なプログラムを準備しています。
バイオイメージングをテーマにした、年に一度の異分野交流の機会をお楽しみいただければ幸いです。学術集会ホームページの他に、学術集会 Facebook ペー
ジ (https://www.facebook.com/ambs15) を通じた情報発信も進めて行く予定ですので、皆様の「いいね！」をよろしくお願いします。
本誌の校了直前に、本学会名誉会員の奥山 典生 先生の訃報を受けました。
謹んで御冥福をお祈り申し上げます。
（K.K.）

池水信二（熊本大学大学院生命科学研究部）
菊地和也（大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻）○朽津和幸（東京理科大学理工学部応用生物科学科）
洲崎悦子（就実大学薬学部）
曽我公平（東京理科大学基礎工学部材料工学科）
桧垣 匠（東京大学大学院新領域創成科学研究科先端生命科学専攻）
古野忠秀（愛知学院大学薬学部）（○：編集委員長）

2015 年 6 月 24 日発行
発行所：日本バイオイメージング学会〒113-0033 東京都文京区本郷 7-3-1
東京大学大学院薬学系研究科生体分析化学教室内
電話: 03-5841-4760; FAX 03-5802-3339
E-mail: bioimage@nih.go.jp
URL: http;//www0.nih.go.jp/niid/bioimaging/