原著論文

診療と新薬 2023; 60: 309-321

B16 メラノーマにおけるメラニン産生に及ぼす緑色 LED 光の影響

診療と新薬 Web横田友美 1）／東平正志 1）／山中一範 1）／松田明子 2）● 概要
目的：緑色 LED 光によるメラニン産生に及ぼす影響について検討し，メラニン産生抑制に効果的な照射条件を見出すことを目的とした。
方法：マウス黒色腫細胞株 B16 メラノーマ細胞に緑色 LED 光を照射し，細胞生存率およびメラニン生成率を測定することで，メラニン産生抑制に対する効果を評価した。
結果：385 nm の UV-LED 光源を用いて B16 メラノーマ細胞に照射したところ，メラニン量は増加した。また，B16 メラノーマに 505 および 525 nm の緑色 LED 光を照射したところ，メラニ
ン産生量は減少した。さらにこの傾向は 505 nm の緑色 LED 光の方が顕著であり，本実験条件下においては出力が高いほどより減少することがわかった。

Ⅰ．は じ め に

膚の色素沈着を制御する上で重要である 2）。これまでその方法について多くの研究がなされており，美皮膚組織は身体最大の臓器であり，微生物や化学

容医療上だけでなく，一般家庭でも化粧品・医薬物質などの外的因子の侵入から身体を守る役割を品，サプリメント，家庭用美顔器などで対応するも担っている。さらに，外界との境界にある皮膚，特のが発売されている。

に顔面などの皮膚は常に紫外線に曝されており，皮一方，可視光線は生体侵襲性が小さく，医療分野

膚組織中の生体色素の一つであるメラニンが，そのや美容皮膚分野では生体に対する可視光線の影響に

光化学的特性により皮膚を紫外線による傷害からついてさまざまな研究がされている 3）。特に青色，守っている。

赤色については皮膚の修復，老化防止などの効果がメラニンは皮膚が紫外線に曝されることで生成さ報告されている 4）5）。しかしメラニン産生に及ぼすれるフェノール類化合物が高分子化した色素の総称

可視光線の影響に関する研究はほとんどない。本研

で，黒色のユーメラニンと黄色のフェオメラニンの究では新たなメラニン産生抑制法として主に緑色の2 種類が存在する。メラニンの産生は，表皮の基底

可視光線がメラニン産生に及ぼす影響を，B16 メラ層付近に存在するメラノサイトの細胞内小器官であ

ノーマ細胞を用いて検討した。

1）るメラノソームで行われる 。メラニンは皮膚を紫外線から防御する働きがあるが，メラニン産生が異Ⅱ．実験

常に亢進することで皮膚への色素沈着がしばしばシ

緑色 LED 光のメラニン産生抑制への影響の有無

ミや肝斑となって美容上の問題を引き起こす。したに関して確認するため，2 つの実験を実施した。実がって，効果的にメラニン産生を抑制することは皮験①として，B16 メラノーマ細胞単体でのメラニン

1）ヤーマン株式会社／Tomomi YOKOTA，Higashihira MASASHI，Kazunori YAMANAKA; YA-MAN LTD.
2）SENSHIN CLINIC／Matsuda AKIKO; SENSHIN CLINIC

38 （310）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

電動ファン

水フィルタ
LED 光源図1

LED 光照射装置

産生能，メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）の

表 1 細胞培養用試薬

添加の有無によるメラニン産生能への影響を検討しDMEM 培地（Gibcol 1885-084）
ウシ胎児血清 FBS〔Sigma 173012（Lot.BCCC3916）〕
ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）（Gibcol 5140-122）
トリプシン/EDTA（Gibco 10010-23）
トリパンブルー溶液（Wako 207-17081）

たのち，緑色 LED 光を照射して B16 メラノーマ細胞の細胞生存率とメラニン産生能を評価した。実験②として，緑色 LED 光の出力を複数設定し，メラ
ニン産生抑制効果のある照射出力を評価した。なお，実験①および②は，それぞれ桐蔭横浜大学および株式会社きれいテストラボにて実施された。
Ⅱ.1

実 験 ①

Ⅱ.1.1 方法

動化した FBS を 50 mL と P/S を 5 mL とを添加した 500 mL の DMEM 培 地， な ら び に PBS（ − ）を，事前に 37℃の温浴で温めた。培養容器内の古Ⅱ.1.1.1 供試細胞い培地を取り除き，PBS（−）を細胞に直接当たら

B16 メラノーマ 4A5 は，文部科学省 / 国立研究ないように添加し，細胞表面を良く洗浄した。この開発法人日本医療研究開発機構（AMED）ナショナ

作業を 2 回繰り返した。トリプシン /EDTA を細胞

ル バ イ オ リ ソ ー ス プ ロ ジ ェ ク ト を 介 し て， 理 研に当たらないように添加し，3 分間，37℃でイン

BRC から提供されたものを用いた。本実験①の内キュベーションした。顕微鏡下で細胞が剥がれ，球容につき，以降に示す細胞はこれを指すものとす状に浮遊していることを確認し，剥がれていない細る。

胞がある場合は，培養フラスコ底面をタッピングしⅡ.1.1.2

LED 光照射装置て剥がした。培地を添加してトリプシンの作用を阻

図 1 に LED 光照射装置を示す。40 × 40 × 30 cm

害し，15 mL の遠沈管に移し，1000 rpm で 5 分間の容器を用いて暗所を設けた。容器の中央にヤーマ

遠心分離した。上清を取り除き，細胞ペレットをン株式会社から提供された波長 505 および 525 nm

タッピングし，PBS（−）を添加して細胞を十分にの緑色 LED（ウシオ電機製）を搭載した照射装置

分 散 さ せ， 同 様 に 1000 rpm で 5 分 間 遠 心 分離しを設置した。また，波長 385 nm の UV-LED（ウシた。この操作を 2 回繰り返した。遠心分離中に，分

オ電機製）を搭載した照射装置も同じ容器内に設置注した細胞懸濁液をトリパンブルー染色し，血球計して利用した。

算盤を用いて全細胞数および死細胞数を測定し，細Ⅱ.1.1.3 細胞培養および継代胞生存率を算出した。遠心分離後，上清を取り除

表 1 に示す試薬を用いて細胞培養を行った。非き，所定の濃度になるように培地を添加し，細胞懸診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

図2

LED 光照射装置

表2

LED 光照射条件

条件

LED

1
2
3
4
5
6

未処理（クリーンベンチ内 3 分静置）
505 nm505 nm505 nm505 nm505 nm39 （311）照射出力（mW/cm2） 照射時間（min）
0.5
1.0
4.0
7.0
11.5
0.5

3
3
3
3
3

濁液を得た。所定量の培地を分注した新しい培養容

標準溶液を用いて 405 nm の吸光度を測定し，検量器に細胞懸濁液を添加した。添加後，容器をゆすっ線を作成した。測定には 0.1 mL 用ミクロセルホルて，細胞を均一にし，37℃，5％ CO 2 下で培養しダを備えた紫外可視分光光度計（V-550，日本分光

た。

社製）を利用し，光路幅 4 mm のプラスチックセル

Ⅱ.1.1.4 緑色 LED 光および紫外線光照射を用いた。また，対照には 10 wt％ DMSO 含有 26 穴のウェルプレートに，DMEM 培地で調製しmol/L 水酸化ナトリウム水溶液を用いた。同様に，

4

4た 1 × 10 および 2 × 10 Cells/mL の細胞懸濁液 2

細胞溶解液の吸光度を測定し，検量線を用いてメラmL を 分 注 し，37 ℃，5 ％ CO 2 下 で 3 日 間 培 養 し

ニン濃度を定量した。

た。培養後，培地を抜き取り，100 nM のα-MSH

Ⅱ.1.1.6 細胞タンパク濃度の定量を含むフェノールレッド不含 DMEM 培地 2 mL を細胞溶解液中の細胞に由来するタンパク濃度（細添加後，505 および 525 nm の緑色 LED 光を所定時

胞タンパク濃度）は，Bio-Rad 社製の RCDC プロテ間照射した。照射は，1 日 1 回，都合 3 日間行い，

インアッセイキットⅡを用いた。また，標準物質と1 日間培養した。培養後，細胞を PBS（−）1 mL

してウシ血清アルブミン フラクション V（Rockland

で洗浄し，10 wt％ジメチルスルホキシド（DMSO）

Immunochemicals 社製）を用いて検量線を作成し，を含む 2 mol/L の水酸化ナトリウム水溶液 0.5 mL

対照には蒸留水を用いた。

添加し，メラニンおよび細胞を溶解した。溶解後，Ⅱ.1.1.7 細胞生存数の測定

細胞溶解液をガラス製ネジ付き試験管に分注した。

培養後，Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液（同別 に， 緑 色 LED 光 に 代 わ り，385 nm の UV-LED

仁化学社製，CK04）を 0.2 mL（培地の 1/10 量）

光を 1，3 および 5 分間照射して 3 日間培養した系

添加し，2 時間培養後，蒸留水で 10 倍に希釈して，列も作製した。なお，細胞初期濃度やα-MSH 濃度

450 nm の吸光度を測定して細胞生存数を算出した。

はプレテストにより決定した。

Ⅱ.2

実 験 ②

Ⅱ.1.1.5 メラニン濃度の定量

Ⅱ.2.1 方10 wt％ DMSO を含む 2 mol/L 水酸化ナトリウムⅡ.2.1.1 供試細胞

水溶液で調製したメラニン（MP Biomedicals 社製）

法

B16 メラノーマ 4A5 は，理研 BRC から提供され40 （312）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

0.8
505 nm505 nm0 min
30 min60 min0.04

Protein concentration（mg/mL）

Concentration of melanin per protein（mg/mg）

0.05

0.03

0.02

0.01

0

1 × 104

0.6

0.4

0.2

0

2 × 104

Inicial cell concentration（Cells/mL）

525 nm

525 nm0 min
30 min60 min0.04

Protein concentration（mg/mL）

Concentration of melanin per protein（mg/mg）

2 × 104

0.8

0.03

0.02

0.01

1 × 104

0.6

0.2

0

2 × 104

図 3 緑色 LED 光照射に伴うメラニン産生量505 および 525 nmLED 光の照射エネルギー（400 〜 700 nm）

0 min
30 min60 min0.4

Inicial cell concentration（Cells/mL）

表3

1 × 104

Initial cell concentration（Cells/mL）

0.05

0

0 min
30 min60 min1 × 104

2 × 104

Initial cell concentration（Cells/mL）

図4

緑色 LED 光照射に伴う細胞タンパク量

抗 真 菌 剤（Antibiotic-Antimycotic 100X，Cat No.

LED

照射エネルギー（ J/cm2）

照射時間（min）

15240-062，Invitrogen，USA） を 含 む Dulbecco s

505 nm

22.6
45.2

28.3
56.6

Modified Eagle Medium（DMEM，Cat No.10566-

525 nm

22.3
44.6

30
60

016，Gibco，USA）を用いた。100 nM α-Melanocyte
stimulating hormone（α-MSH，Cat No. M4135，
Sigma-Aldrich,USA）および 100 μM テオフィリン（Cat No. T1633，Sigma-Aldrich，USA）を含む 10％
FBS 含有 DMEM を調製したもの。

たものを用いた。本実験②の内容につき，以降に示

Ⅱ.2.1.2

す 細 胞 と い う 言 葉 は こ れ を 指 す も の と す る。

図 2 に LED 光照射装置を示す。ヤーマン株式会

Ⅱ.2.1.3 〜 5 に記載のとおりの細胞と細胞培養を行社から提供された波長 505 nm の緑色 LED（ウシオい，培地は以下のものを使用した。

電機製）を搭載した照射装置を使用した。表 2 に10.0％（v/v）Fetal Bovine Serum（FBS，Cat
No. SH30071.03，Hyclone，UK）および 1.0％（v/v）

LED 光照射装置

照射条件を示す。

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

Ⅱ.2.1.3 細胞培養および継代

0.5

60 mm dish（Cat No. 353002，Falcon，USA）に505 nm

3.0 × 10 5 cells/dish の密度で細胞を播種し，CO 2 イ
培養した。
Ⅱ.2.1.4

緑色 LED 光照射

培 地 を 除 去 し，Phosphate buﬀer saline〔PBS（−），Cat No. 198601，Nissui，Japan〕で洗浄後，8 mL のハンクス平衡塩溶液（＋）
〔HBSS（＋），

0.4
Absorbance at 450 nm

ンキュベータ内（CO 2 濃度 5％，37℃）で 24 時間

41 （313）0 min
30 min60 min

0.3

0.2

0.1

Cat No. 084-08965，Wako，japan〕に交換後，照射条件に従って照射機器を適用した。さらに HBSS

0（＋）を除去し，3 mL の試験培地に交換して 72 時
間培養した。

1 × 104

2 × 104

Initial cell concentration（Cells/mL）

Ⅱ.2.1.5 メラニン濃度，細胞タンパク濃度，

0.5

細胞生存率の定量

525 nm培 養 後 に PBS で 洗 浄 後，alamarBlue（Cat No.
て 10 倍希釈した alamarBlue 溶液を細胞に 2 mL 処
理し，CO 2 インキュベータにて 37℃，2 時間培養し た。alamarBlue 溶 液 を 回 収 し て 96 穴 プ レ ー ト（Cat No. 9017，costar，USA）に 200μL 入 れ， マ

0.4
Absorbance at 450 nm

DAL1100，Invitrogen，USA） を 無 血 清 DMEM に

0 min
30 min60 min0.3

0.2

イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー（SPARK Ⓡ 10M，

0.1

TECAN，Switzerland）を 用 い 570 nm お よ び 600
nm の吸光度（OD570，OD600）を測定した。ブラ

0

1 × 104

ンクとして alamarBlue 溶液を用いた。60 mmdish

2 × 104

Initial cell concentration（Cells/mL）から alamarBlue 溶液を除去し，PBS（−）で洗浄後にメラニンを可溶化するため，10％ DMSO を含

図5

緑色 LED 光照射に伴う細胞生存数

有する 1M 水酸化ナトリウム水溶液を 1 mL 加え，
85℃下で 10 分間インキュベートした。メラニン溶
解液を 96 穴プレートに 100μL 入れ，マイクロプ

Ⅲ.1

レートリーダーを用い 405 nm の吸光度（OD405）

Ⅲ.1.1を測定した。対照の OD570-600 を 100％として，

実 験 ①
緑色 LED 光照射によるメラニン産生量
および細胞タンパク量

LED 光照射適用群の細胞生存率を算出した。また，

505 および 525 nm の緑色 LED 光の照射時間を対照の OD405 を 100％として，メラニン生成率を30 および 60 分間照射した際の細胞タンパク量あた

算 出 し た。 さ ら に， 対 照，LED 光 照 射 適 用 群 のりのメラニン量（メラニン濃度を細胞タンパク濃度

OD405 と alamarBlue に て 測 定 し た OD570-600 でで除した値）を図 3 に示す。525 nm と 505 nm は照除した値を細胞あたりのメラニン生成率として算出

射エネルギー量が等しくなるように 505 nm の照射した。有意差検定は対照と LED 光照射適用群を対

時間を表 3 のように制御した。いずれの LED 光に応のない t 検定で有意差検定を実施した。検定はいおいてもメラニン産生量は LED 光の照射時間の増ずれも両側で有意水準を 5％未満とした。

加に伴い明らかに低下した。また，その傾向は 525

Ⅲ．結果

まず実験①の結果について述べる。

nm より 505 nm の LED 光の方が顕著であった。図
4 は，LED 光照射後の細胞タンパク量の変化を示
す（n ＝ 3）。LED 光照射に伴い細胞タンパク量はConcentration of melanin per protein（mg/mg）

42 （314）

診療と新薬・第 60 巻

0.05

第 5 号（2023 年 5 月）

A

B

C

D

写真中の A 〜 D は
本図 A 〜 D の系に
相当する

0.04

D
0.03

C

B
0.02

0.01

0

A

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Protein concentration（mg/mL）

図 6 LED 光未照射の細胞タンパク量と細胞タンパク量あたりのメラニン産生量との相関（左）とメラニン産生状態の顕微鏡観察（右）（倍率：2 倍）

Concentration of melanin per protein（mg/mg）

Protein concentration（mg/mL）

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

5 × 103

1 × 104

2 × 104

4 × 104

Initial cell concentration（Cells/mL）

図 7 細胞タンパク量に対する細胞初期濃度の影響

0.04

0.03

0.02

0.01

0

5 × 103

1 × 104

2 × 104

4 × 104

Initial cell concentration（Cells/mL）

図8

細胞タンパク量あたりのメラニン量に対する細胞初期
濃度の影響減少し，その傾向は 505 nm の LED 光照射にて顕果は，図 4 に示す細胞タンパク量の結果と一致す著であった。細胞タンパク量の減少は，LED 光照

る。したがって，緑色 LED 光照射に伴い，細胞生射によって，細胞死あるいは細胞増殖抑制が生じた存数は減少すると伴に，産生される細胞タンパク量ためと考えられる。CCK-8 を用いた，LED 光照射

あたりのメラニン量も減少することがわかった。

時の細胞生存数の変化を図 5 に示す。縦軸は 450

Ⅲ.1.2 細胞濃度とメラニン産生量との相関

nm の吸光度を示し，吸光度が大きいほど細胞生存細胞濃度と細胞タンパク量あたりのメラニン産生数が大きいことを意味する。いずれの LED 光照射量との相関について検証した（図 6）。図 7 に細胞においても細胞生存数は LED 光の照射時間の増加

タンパク量，図 8 に細胞タンパク質あたりのメラに伴い減少した。さらに，細胞生存数の減少は，ニン産生量，図 9 にその顕微鏡観察結果を示す。

505 nm の LED 光の方が顕著であった。これらの結細胞タンパク量あたりのメラニン産生量が細胞初期

診療と新薬・第 60 巻

43 （315）

第 5 号（2023 年 5 月）

0.5 × 10 4 Cells/mL

1 × 10 4 Cells/mL

2 × 10 4 Cells/mL

4 × 10 4 Cells/mL

図 9 細胞初期濃度に対するメラニン産生状態（倍率：2 倍）

濃度の増加に伴い増加する傾向が観察された。細胞ていることが示唆された。これにより LED 光照射によって B16 メラノーマの壊死あるいは増殖抑制
によって細胞数が減少し，細胞濃度が低下したため，メラニン産生が抑制されたものと考えられる。
Ⅲ.1.3 紫外線照射による細胞生存率およびメラニン産生量
紫外線照射により，メラニン産生が促進することは明らかであるが，用いる細胞や照射条件などの検討も含め，385 nm の UV-LED 光照射を行った培養

0.02

Concentration of melanin per protein（mg/mg）

数（細胞濃度）の増加に伴いメラニン産生が促進し

0 min
1 min
3 min
5 min

0.015

0.01

0.005

0

における細胞タンパク量あたりのメラニン量と顕微鏡観察結果を図 10，図 11 に示す。紫外線によって

1 × 104

2 × 104

Inicial cell concentration（Cells/mL）

細胞タンパク量あたりのメラニン量は増加することが示された。同条件で測定した細胞タンパク量変化

図 10 UV-LED 光照射に伴うメラニン産生量

および CCK-8 による細胞生存数の変化を図 12，図13 に示す。これらの結果から，細胞タンパク量は385 nm の UV-LED 光照射に伴い減少し，細胞生存Ⅲ.2

数も減少することがわかった。この結果は，緑色

Ⅲ.2.1

LED 光 照 射 の 場 合 と は 異 な る。 す な わ ち，UV-

実 験 ②
緑色 LED 光照射によるメラニン産生量
および細胞タンパク量

LED 光照射によって細胞生存数は減少するものの，結果を表 4 に示しグラフにしたものを図 14 〜図B16 メラノーマにおけるメラニン産生促進物質等の16 に示す。B16 メラノーマ細胞に緑色 LED 光（505

産生が亢進したため，メラニン産生量が増加したとnm）を照射した際に，いずれの出力においてもメ考えられる。

ラニン生成率は対照と比較して有意に低い値を示

次に実験②の結果について述べる。

し，メラニン生成抑制を認めた。なかでも最も出力の高い 11.5 mw/cm2 適用においては，細胞あたりのメラニン生成率についても対照と比較して有意に

44 （316）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

1 × 10 4 Cells/mL
0 min

1 × 10 4 Cells/mL
1 min

1 × 10 4 Cells/mL
3 min

1 × 10 4 Cells/mL
5 min

2 × 10 4 Cells/mL
0 min

2 × 10 4 Cells/mL
1 min

2 × 10 4 Cells/mL
3 min

2 × 10 4 Cells/mL
5 min

図 11 UV-LED 光照射に伴うメラニン産生状態（倍率：2 倍）

低い値を示し，本条件の中では最も出力の高いもの
がよりメラニン生成能の抑制傾向がみられた。
Ⅳ．考察

実験②では 505 nm の緑色 LED 光の出力を変えてメラニン産生量を測定したところ，細胞生存率は減少しなかったが，メラニン産生量は減少した。
これにより本実験条件下において，細胞あたりの本試験では緑色 LED の有用性を探るために B16

メラニン産生量との明確な関係性は明らかにならな

メラノーマ細胞におけるメラニン産生に及ぼす可視

かったが，505 nm の緑色 LED 光の照射により B16

光線緑色 LED 光および紫外線 UV-LED 光の影響にメラノーマ細胞におけるメラニン産生が抑制される

ついて検討した。

ことが示された。

実験①では B16 メラノーマ細胞に 505 および 525

メラニンとはフェノール類物質の酵素的酸化にnm の緑色 LED 光を照射したところ，メラノーマ

よって形成される高分子化合物の色素で，主にヒト細胞の細胞数が減少し，メラニン産生量も減少しではフェオメラニンとユーメラニンが存在する。黄た。さらに，この傾向は 505 nm の緑色 LED 光の色のフェオメラニンと黒色のユーメラニンが混ざり方が顕著であった。385 nm の UV-LED 光では細胞合 い， 肉 眼 的 に 観 察 さ れ る 色 素 と し て 認 識 さ れ

生存数は減少するがメラニン産生は促進した。

る 6）。本来は，紫外線から肌を守るための肌の反応診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

Concentration of protein（mg/mL）

1

45 （317）

0.4
0 min
1 min
3 min
5 min

0.3
Abs at 450 nm

0.8

0 min
1 min
3 min
5 min

0.6

0.4

0.2

0.1
0.2

0

1 × 104

0

2 × 104

1 × 104

Inicial cell concentration（Cells/mL）

Initial cell concentration（Cells/mL）

図 12 UV-LED 光照射に伴う細胞タンパク量

表4

mean

s.d.

P

─
100.0
99.3
97.8
96.8
97.8
95.7

─
1.8
1.4
1.3
1.0
2.0
0.9

─
1.000
0.479
0.040
0.004
0.069
0.000

100.0
97.1
97.8
97.2
98.5
91.6

1.9
2.5
1.8
2.3
3.2
2.3

1.000
0.048
0.069
0.042
0.332
0.000

100.0
97.8
100.0
100.4
100.7
95.8

1.9
3.0
2.1
2.9
3.1
2.7

1.000
0.157
0.987
0.758
0.643
0.010

105
100
95
90
85

m2

m2

図 14 細胞生存率

50
5

nm

11
.

5

7.
0

m

m

w

w

/c

/c

m2
50
5

nm

4.
0
50
5

nm

nm

1.
0

m

w

/c

m2
m

w

w

/c

/c

m2

80

m

11.5 mw/cm2

P

50
5

505 nms.d.

0.
5

7.0 mw/cm2

mean

照

505 nmP

対

4.0 mw/cm2

細胞あたりのメラニン生成率（％）

s.d.

nm

505 nm

メラニン生成率（％）

mean

50
5

1.0 mw/cm2

細胞生存率（％）

細胞生存率（％）

505 nm

図 13 UV-LED 光照射に伴う細胞生存数

細胞生存率，メラニン生成率，細胞あたりのメラニン生成率

条件

ブランク
対照
505 nm 0.5 mw/cm2

2 × 10446 （318）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

メラニン生成率（％）

105
100
95
90
85

2

2

11

7.

.5

0

m
w
/c
m

m
w
/c
m

2

nm

nm

50

5

50

5

nm

4.

0

m
w
/c
m

2

m
w
/c
m
5
50

50

50

5

5

nm

nm

1.

0.

0

5

対

m
w
/c
m

照

2

80

図 15 メラニン生成率

細胞あたりのメラニン生成率（％）

105
100
95
90
85

m2

m2
11
.5

7.
0

m

m

w

w

/c

/c

m2

50
5

nm

nm
50
5

nm

4.
0

m

w

/c

m2
/c
50
5

50
5

50
5

nm

nm

0.
5

1.
0

m

m

w

w

/c

対

照

m2

80

図 16 細胞あたりのメラニン生成率

であるが，メラニンの生成はシミ，そばかすなどの酸化されインドール化合物に変化し，それらが互い色素沈着につながり，白く美しい肌を好む日本人のに結合することで黒色のユーメラニンが合成され価値観に反し，美容上の課題となっている。

る。また，システインが共存すると，ドーパキノン

メラニンの産生は，表皮の基底フェノール層付近

はシステインと結合して 5-S-システイニルドーパに存在するメラノサイトの細胞内小器官であるメラに変化し，これが重合して黄色のフェオメラニンがノソームで行われる（図 17）。メラノソーム内で合成される 2）
（図 18）。

は，出発物質 L-チロシンが銅含有酵素であるチロ

紫外線照射時にはケラチノサイトからメラニン産

シナーゼによって酸化されて L-ドーパとなり，ドー生を促進する様々なサイトカインやホルモンが分泌パキノンへと代謝される。さらに，ドーパキノンがさ れ， そ の 中 で も 幹 細 胞 因 子 SCF（Stem cell

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）

47 （319）

L-チロシン

神経堤細胞

メラニン
表皮 キャップ

遊走

OH
H2N
COOH
チロシナーゼ真皮
L-ドーパ

メラノブラストOH

角化細胞へのメラノソームの移行

分化

H2N
COOH OH
チロシナーゼメラノサイト核分裂

メラノソーム
Golgi
装置

ドーパキノン
O

StageⅠ

H2N

Ⅱ
Ⅲ

核

COOH

O

Ⅳ

システイン

成熟メラノサイト
ドーパクロム

図 17

メラニンの形成過程

1）

システイニルドーパ

TPR-2
インドール誘導体
TPR-1

factor）7），α-メ ラ ノ サ イ ト 刺 激 ホ ル モ ン（αmelanocyte stimulating hormone α-MSH）8），エンド

ユーメラニン

フェオメラニン

図 18 メラニンの生合成 1）

9）

セ リ ン（endothelin） ， プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン（prostaglandin）は重要な役割を果たす 10）。これら
は，メラノサイトの増殖やそのアポトーシスの抑

バ ー の 亢 進， メ ラ ノ ソ ー ム の 上 方 へ の ト ラ ン ス

制，メラノサイトの樹状突起の伸長促進などに働ファーが高まりメラニンが排出されやすくなるなど

き，メラニン産生を促進する。

が報告されている 2）13）。すなわち，シミ抑制に対しなかでもメラノサイト刺激ホルモンであるて非侵襲的，非切除的方法であると期待されていα-MSH はメラノサイトのメラノコルチン 1 受容体

る 14）15）。また，他方，LED 照射におけるシミ抑制も（melanocortin 1 receptor）を介しメラノサイトの増UVR（ultraviolet rays）照射と比較して，DNA 損

殖 や メ ラ ニ ン 生 成 を 亢 進 す る こ と が 知 ら れて い傷や細胞アポトーシスの増加などを伴わずにメラニ。本試験ではプレ試験としてメラニン生成にンの生成を刺激できるという報告 16） がある。これ欠かせないα-MSH の有効量を確認し，100 nm 濃

は，UVR を照射すると一重項酸素を生成し，生体度が適していると結果を得た。これは既存試験にお分子に酸化的損傷を引き起こすため，DNA 損傷やる

11）12）

11）

ける結果にも一致し ，本試験での緑色 LED 光の細胞アポトーシスが生じそれが原因となってメラニ

メラニン生成抑制を検討した試験におけるα-MSH

ンの色素沈着が起こるが，赤，青，緑などの LED

濃度が適していたことも示唆している。

を照射したときは DNA 損傷や細胞アポトーシスの

メラニンの生成を抑制するために使用される美白増加を伴わず皮膚保護のためのメラニン産生に寄与

有効成分の作用機序ではアルブチンやコウジ酸などするため，色素沈着を抑制するということである。

のメラニンの生成を促進するチロシナーゼを抑制す

また，DNA 損傷や細胞アポトーシスの増加を伴わる 作 用 や， サ リ チ ル 酸 や AMP2Na に 代 表 さ れ る

ないという点は，実験②にて照射の出力に比例してターンオーバーを活性化して色素を放出する作用な細胞生存率が減少しなかったことでも確認できた。

2）

どがある 。IPL（インテンスパルスライト）によ

しかし実験①では UVR 照射時より少ないものの細るシミ抑制の作用機序は光線照射により表皮ケラチ

胞生存率が減少していることから，緑色 LED は酸

ノサイトの破壊，基底細胞からの表皮ターンオー

化的損傷を完全に防御するものではなく，あくまで

48 （320）

診療と新薬・第 60 巻

第 5 号（2023 年 5 月）も抑制するものであることを示唆している。

Ⅴ．総

また細胞死だけではメラニン産生量の減少は説明括できないため，緑色 LED の照射によりメラニンのB16 メラノーマ細胞に 505 および 525 nm の緑色産生を抑制するなんらかの機序が働いていることがLED 光を照射したところ，照射に伴いメラニン産推察される。詳細にはいまだ解明されていないが，生量が減少した。385 nm の UV-LED 光を照射する

IPL による表皮ケラチノサイトの破壊，表皮ターンとメラニン産生量が増加していることから，紫外線オーバーの亢進，メラノソームの上方へのトランスにより増加するメラニン産生量は緑色 LED 光（とファーの促進などが LED 照射においても起こって

くに 505 nm）の可視光線を照射することによりメ15）

ラニン産生量を抑制することが示された。

いることが推察される 。
LED の波長の違いについては，LED は青色（450

参 考 文 献nm）から赤色（700 nm）までの波長の違いで人皮膚細胞における影響が異なることが多く報告 15） されている。赤色（633 nm）では日光角化症患者の方への光線力学療法や，紫斑紅斑の治療にも用いられ 17） ている。黄色（590 nm）では光老化皮膚色素沈着，紅斑，しわの改善に用いられ

18）19），また青色（470 nm）ではマウス B16 メラノーマ細胞においてメラニン合成を抑制したが，メラニンの脱色を生じ
4）

1）清水

宏：あたらしい皮膚科学 第 3 版．pp. 10-12，中山書店，東京，2018．
2）田中浩：美白製品とその作用．日本香粧品学会誌

2019；43：39-43．
3）森脇真一，櫟原維華：美容皮膚科領域の新しい医療機
器 と し て の LED（ 発 光 ダ イ オ ー ド ） の 可 能 性．
Aesthetic Dermatology 2009; 19: 39-44.
4）Ohara M，Kobayashi M，Fujiwara H，et al: Blue lightinhibits melanin synthesis in B16 melanoma 4A5 cells

なかったという報告 がある。また，モルモットのand skin pigmentation induced by ultraviolet B in

背 に UVB 光 と 青 色 LED 光 を 照 射 し た 際 に 青 色

guinea-pigs. Photodermatol Photoimmunol

LED 光がメラニンの生成を抑制するという報告 5）

Photomed 2004; 20: 86-92.

や，青色光（450 nm）が B16F10 メラノーマ細胞の増殖を阻害し，S 期細胞の割合を減少させるとい
う報告

20）

もある。

同様に本試験で用いた緑色 LED 光についても，
緑色 LED 光（532 nm）が B16F10 メラノーマ細胞の細胞生存率を 30％引き起こし，平均腫瘍サイズ

5）Ohara M，Kawashima Y，Katoh O，et al: Blue lightinhibits the growth of B16 melanoma cells. Jpn J Cancer
Res 2002; 93: 551-558.
6）伊藤祥輔，柴原茂樹，錦織千佳子 監修：色素細胞 第 2
版─基礎から臨床へ─．第 11 章，慶應義塾大学出版会，東京，2015．
7）Imokawa G，Kobayasi T，Miyagishi M: Intracellularsignaling mechanisms leading to synergistic effects of（TAS）を 20％減少させ，メラノーマの増殖を防ぐ

endothelin-1 and stem cell factor on proliferation of

ことが報告 21）されている。このように LED の光のcultured human melanocytes. Cross-talk via trans-

色（波長）においても作用機序が異なり，今回同じ

activation of the tyrosine kinase c-kit receptor. J Biol

緑色 LED 光であっても試験①で 505 nm と 525 nmで比較したところ，505 nm でより効果があるといChem 2000; 275: 33321-8.
8）Kadekaro AL，Kavanagh R，Kanto H，et al: α-Melanocortin and Endothelin-1 activate antiapototic

う結果が得られた。いままであまり緑色 LED 光に

pathways and reduce DNA damage in human

おけるメラニン産生抑制は研究されてこなかった

melanocytes. Cancer Res 2005; 65: 4292-9.

が，本試験において 505 〜 525 nm の緑色 LED 光にもメラニン産生抑制がみられたことは今後肌の光老化対策における光治療の幅を広げたといえるだろう。しかし細胞あたりのメラニン生成率と照射出力や波長との明確な相関性は今回の試験では認められなかったことからも，今後さらなる照射出力や波長の違いによるメラニン生成抑制能への影響を検討することが課題として残された。

9）Imokawa G，Miyagishi M，Yada Y: Endothelin-1 as a
new melanogen: Coordinated expression of its gene andthe tyrosinase gene in UVB-exposed human epidermis. J
Invest Dermatol 1995; 105: 32-7.
10）赤坂英二郎，中野創，神可代，他：紫外線防御機

構におけるメラノサイト，ケラチノサイトのエンドセ
リ ン-1 / 幹 細 胞 因 子 を 介 し た 相 互 作 用． 弘 前 医 学
2011；62：138-43．
11）Abdel-Malek Z，Swope VB，Suzuki I，et al: Mitogenic
and melanogenic stimulation of normal humanmelanocytes by melanotropic peptides. Proc Natl Acad

診療と新薬・第 60 巻

Sci U S A 1995; 92: 1789-93.

第 5 号（2023 年 5 月）

49 （321）17）Trelles MA，Allones I: Red Light-emitting diode (LED)12）S u z u k i I ， C o n e R D ， I m S ， e t a l : B i n d i n g o ftherapy accelerates wound healing post-blepharoplasty

melanotropic hormones to the melanocortin receptor

and periocular laser ablative resurfacing. J Cosmet

MC1R on human melanocytes stimulates proliferation

Laser Ther 2006; 8: 39-42.

and melanogenesis. Endocrinology 1996; 137: 1627-33.

18）Weiss RA，McDaniel DH，Geronemus RG，et al:13）Yamashita T，Negishi K，Hariya T，et al: Intense

Clinical trial of a novel non-thermal LED array forpulsed light therapy for superficial pigmented lesions

reversal of photoaging: clinical，histologic，and surface

evaluated by reﬂectance-mode confocal microscopy andproﬁlometric results. Lasers Surg Med 2005; 36: 85-91.

optical coherence tomography. J Invest Dermatol 2006;19）Weiss RA，McDaniel DH，Geronemus RG，et al:

126: 2281-6.
14）S a d i c k N S ， W e i s s R ， K i l m e r S ， e t a l :Photorejuvenation with intense pulsed light: results of amulti-center study. J Drugs Dermatol 2004; 3: 41-9.

Clinical experience with light-emitting diode (LED)photomodulation. Dermatol Surg 2005; 31(9 Pt 2): 1199205.
20）Sparsa A，Faucher K，Sol V，et al: Blue Light is15）森脇真一，小谷麻由美，櫟原維華，他：ヒト皮膚 3 次

Phototoxic for B16F10 Murine Melanoma and Bovine

元 モ デ ル を 用 い た 赤 色， 青 色 LED（Light emitting

Endothelial Cell Lines by Direct Cytocidal Effect.

diode） の 色 素 沈 着 抑 制 効 果 の 検 討．Aesthetic

Anticancer Res 2010; 30: 143-147.

Dermatolgy 2010；20：288-94．

21）Haussmann PB，Pavani C，Marcolongo-Pereira C，et

16）Moreiras H，O'Connor C，Bell M，et al: Visible light

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and human skin pigmentation: The importance of skinmelanoma tumor size. J Photochem Photobiol 2022;

phototype. Exp Dermatol 2021; 30: 1324-31.

9:100092.