アミノナフトチアゾールジオン誘導体の抗菌活性原口 珠実1、林 紗希2、畠中 芳郎3、永尾 寿浩3、田中 重光3、吉井 未貴3、高田 慎也4、原 史子4、萩森政頼4、吉田 都1,2

1武庫川女子大学 女性活躍総合研究所

23大阪産業技術研究所 森之宮センター4武庫川女子大学 薬学部 臨床製剤学研究室武庫川女子大学 薬学部 薬品分析学研究室これまでに我々は、Aminonaphtho[2,3-d]thiazole-4,9-dioneを基本骨格とした誘導体を合成し、黄色ブドウ球菌、MRSA、表皮ブドウ球菌に対するMIC測定により、これらに抗菌活性があることを見出している。本研究では、これまでに合成した化合物の中で最も強い抗菌活性を示した2-(piperazin-1-yl)naphtho[2,3-d]thiazole-4,9-dione (PNT) の抗菌メカニズムを検討するために、①PNTの菌体への取り込み評価、②PNTによる菌の形態変化の評価、③PNTによるDNAジャイレース阻害評価を行った。蛍光顕微鏡を用いたPNTの菌体内への取り込み評価では、黄色ブドウ球菌、MRSA、表皮ブドウ球菌いずれの菌に対しても、PNT添加後30分、60分ともに菌体の蛍光が観察された。TEMを用いた菌の形態評価では、PNT添加30分後には菌の内部が空洞化していることが観察された。さらにDNAジャイレース阻害評価では、既存の抗菌薬ノルフロキサシンと同等のDNAジャイレース阻害効果を示した。
以上より、PNTは菌に添加30分後には菌体に取り込まれ、菌体内を浸食し、DNAジャイレースを阻害することにより抗菌活性を示すことが考えられた。
キーワード：抗菌活性、蛍光、TEM、DNAジャイレースはじめに見出している。本研究では、合成した化合物の中S. epidermidis（表皮ブドウ球菌）はヒトの皮で 特 に 抗 菌 活 性 が 高 か っ た 2-(piperazin-1-膚表面に最も多く存在する菌種であり、侵襲的医yl)naphtho[2,3-d]thiazole-4,9-dione (PNT) に療行為が常時行われている病院での院内感染の原着目し、その抗菌メカニズムを追究することを目因となりやすい 。S. aureus（黄色ブドウ球菌）的とした。

1)2)は、化膿性疾患、食中毒の原因となりやすい 。抗菌薬の使用ではその耐性菌の出現が問題となって1.

いる。MRSAは黄色ブドウ球菌が本来保有していなPNTの菌体への取り込み評価1.1. 方法い新しいペニシリン結合蛋白を獲得したメチシリPNTが励起により蛍光発光することを確認してン（ペニシリン）耐性菌だが、ペニシリン以外の多いるため、PNTの菌体への取り込み評価に蛍光顕微くの抗菌薬にも耐性を示す多剤耐性菌とも言われ鏡BZ-X810 (KEYENCE) を用いた。菌種は、黄色ブている 。このような多剤耐性菌の出現は、これまドウ球菌 S. aureus (NBRC 12732）、メチシリン耐でに開発された抗菌薬の消耗を加速してしまうこ性黄色ブドウ球菌 MRSA (JCM16555)、表皮ブドウとになり、新しい抗菌薬の開発が急務となる。

球菌 S. epidermidis (NBRC 100911)の3種を使用3)我 々 は こ れ ま で に Aminonaphtho[2,3-した。培地はMueller-Hinton broth pH7 (Bectond]thiazole-4,9-dioneを基本骨格とした誘導体をDickinson TM, USA) を使用した。96wellプレート合成し、S. epidermidis、S. aureus、MRSAに対すに、各菌液1.0×108 CFU/mLを112 μLずつ播種しるMIC測定により、これらに抗菌活性があることをた後、PNTのDMSO溶液 (0.26 mg/mL) を8 μLずつ27添加した。この96wellプレートを37℃で保温し、ど確認できなかったが、菌体内の空洞化が観察さ30分、60分、120分後にサンプル採取し、遠沈れた。

（15,000 g×15 min）後のペレットを生理食塩水100μLに懸濁して蛍光顕微鏡観察用試料とした（励起波長/蛍光波長：480/500 nm）。菌細胞に取り込まれたPNTの蛍光発光を定量的に評価するため、Image Jを用いて蛍光顕微鏡撮影画像中の細胞数をカウントし、細胞発光率（％）を算出した。細胞発光率は、励起により緑色に蛍光発光した細胞図１数を、励起なしで撮影した画像中の全細胞数で除した値×100とした。

PNTによる菌の形態変化3．PNTによるDNAジャイレース阻害評価1.2. 結果3.1.

いずれの菌種でも、PNT添加30分後には菌細胞の発方法DNA ジ ャ イ レ ー ス 阻 害 評 価 に は 、 S. aureus光が観察された。細胞発光率は、黄色ブドウ球菌gyraseではPNT添加30分後：59%、60分後：70%、MRSAではDNAsupercoilingassaykitplus(ProFoldin)を使用した。既存のDNAジャイレースPNT添加30分後：72%、60分後：80%、表皮ブドウ球阻害薬であるノルフロキサシンを比較対照として菌ではPNT添加30分後：85%、60分後：88%であった。

使用し、ノルフロキサシンまたはPNTを添加した反細胞発光率は、表皮ブドウ球菌、MRSA、黄色ブドウ応溶液20μLを37℃、90分保温後、超純水100μLと球菌の順で菌細胞へ取り込まれやすいことが考え蛍光染色試薬 (H19 dye) 25 μLを添加し室温でられた。

15分静置した後、Multimode Plate Reader Nivo2．PNTによる菌の形態変化の評価(PerkinElmer)で蛍光検出した（励起波長/発光波2.1. 方法長：480/530 nm）。

透過型電子顕微鏡法（Transmission Electron3.2.

Misroscopy: TEM）により、PNT添加後の各菌の断結果PNTは、ノルフロキサシンと同等のDNAジャイレ面を観察した。使用した菌種、培地は1.と同様でース阻害作用を示した。DNAジャイレース50%阻害あ る 。1.0× 108 CFU/mLの 各 菌液 45μ Lに 、 0.4濃度（IC50）は、ノルフロキサシンでは94.1μg/mL、mg/1.5 mLのPNTを9μL添加し、37℃で30分培養しPNTでは111.3 μg/mLであった。

た。グルタルアルデヒドを最終濃度2.5%となるように添加し、遠心分離後の沈殿物に3%低融点寒天まとめ溶液を添加し、冷却固化後、1 mm角のキューブにPNTは菌に添加30分後には菌体に取り込まれ、菌し、4%四酸化オスミニウム溶液を添加し1時間かけ体内を浸食し、DNAジャイレースを阻害することにて固定した。精製水で洗浄後、エタノールで洗浄より抗菌活性を示すことが考えられた。

し（35%→50%→70%→90%→95%→100%）×3回、エポキシ樹脂（Questol 651 Mix）溶液に置き換え、5℃1)で2週間、60℃で24時間かけて硬化し、ウルトラミクロトームで超薄切片（厚み100 nm）を調製した。

2)Meshで回収した超薄切片を2%ウラニル酢酸塩水溶液に浸透20分後、精製水で洗浄、レイノールズ鉛染色液に浸透5分後、透過型電子顕微鏡JEM-2100で3)観察した。
2.2. 結果
PNT添加により、菌体の細胞表面の損傷はほとん

28

Severn,M.M.,Horswill,A.R.:Staphylococcusepidermidis and its dual lifestyle in skin health andinfection. Nat. Rev. Micro-biol. Feb;21(2), 97-111.2023.
Proctor R.A., Kriegeskorte, A., Kahl B.C., Becker K.
et al., Staphylococcus aureus Small Colony Variants(SCVs): a road map for the metabolic pathways involvedin persistent infections. Front Cell Infect Microbiol.
4, 99, 2014.
Jaradat Z.W., Ababneh Q.O., Sha'aban S.T., AlkofahiA.A.et al., Methicillin Resistant Staphylococcus aureus
andpublicfomites:areview.
Pathog GlobHealth.Dec;114(8), 426-450, 2020.