原著論文

診療と新薬 2020; 57: 74-79

β- アミロイド投与マウスの認知機能障害に対する診療と新薬 Web

メマンチン塩酸塩 OD 錠「明治」の薬効確認試験大山昌代 1）／蓮沼恵子 1）／小林洋之 2）／村澤寛泰 2）／パブラック晶子 2）／今西泰一郎 1）／三浦有紀 1）● 要旨
メマンチン塩酸塩 OD 錠「明治」（以下，試験製剤と略す）は，メマリーⓇ OD 錠（以下，標準製剤と略す）の有効成分を同量含有する同一剤型の後発医薬品であり，Meiji Seika ファルマ株式会社が製造販売承認を取得した錠剤である。今回，β-アミロイドのコアフラグメント（Aβ）（25-35）が誘発するマウスの認知機能障害に対する試験製剤の効果について Y 迷路試験と受動回避試験により検討した。標準製剤を陽性対照とした。
Aβ（25-35）の脳室内投与により，Y 迷路試験で自発的交替行動率は有意な減少を示し，また受動回避試験において保持潜時が有意に短縮したことから，Aβ（25-35）投与により認知機能障害が誘発されたことが確認できた。試験製剤及び標準製剤それぞれ 2.5 及び 5 mg/kg の 1 日 1 回，11 日間反復経口投与は，用量依存的に Aβ（25-35）が誘発する認知機能障害を改善し，両製剤ともに 5 mg/kg で有意に改善した。
以上のように，試験製剤は標準製剤と同様に Aβ（25-35）が誘発するマウスの認知機能障害を改善した。

キーワード：メマンチン塩酸塩，グルタミン酸，Aβ（25-35）誘発認知機能障害モデル，Y 迷路試験，受動回避試験，後発医薬品

1．は じ め に
メマンチン塩酸塩 OD 錠「明治」（以下，試験製ハイマー型認知症治療薬である 1）。
アルツハイマー型認知症は，認知機能障害を中核とする進行性の神経変性疾患であり，病理学的特徴Ⓡ剤と略す）は，メマリー OD 錠（以下，標準製剤として β- アミロイド（以下，Aβ）の凝集・蓄積と略す）の有効成分メマンチン塩酸塩を同量含有すによる老人斑，神経原線維変化，神経細胞死が認める同一剤型の後発医薬品であり，Meiji Seika ファられる。臨床症状の特徴としては，認知機能障害にルマ株式会社が製造販売承認を取得した錠剤であ加えて意欲や感情の障害，妄想，幻覚，徘徊，興奮る。などの行動・心理症状を呈することが多いことが知メマンチン塩酸塩はグルタミン酸受容体サブタイられている 2）。アルツハイマー型認知症の原因の一プの一つである，N -methyl-D-aspartate（NMDA）

つ と し て， グ ル タ ミ ン 酸 神 経 の 機 能 異 常 に よ る受容体拮抗を作用機序とする中等度及び高度アルツ

NMDA 受容体の過剰な活性化が考えられており，メマンチンは生理的なグルタミン酸神経伝達には影

1）Meiji Seika ファルマ株式会社
2）株式会社日本バイオリサーチセンター

響せず，NMDA 受容体拮抗作用により過剰なグルタミン酸による神経細胞毒性や記憶・学習障害を抑診療と新薬・第 57 巻

第 2 号（2020 年 2 月）

制することが示されている 3）。

11 （75）

A

そこで本研究では，試験製剤の認知機能障害に対Bする改善効果について，Aβ のコアフラグメントである Aβ（25-35）の脳室内投与が誘発するマウスの認知10機能障害モデルを用いて，Y 迷路試験と受動回避試
験により標準製剤を陽性対照として検討した。な12

お，Aβ（25-35）を脳室内投与したマウスは，短期間で神経細胞変性や認知機能障害を示すことから，簡便なアルツハイマー型認知機能障害モデルとして知ら39.5
4.5
A cross sectionof armCれている。

A，B，C の 3 つのアーム（長さ 39.5 cm，床幅 4.5 cm，壁の高さ 12 cm）がそれぞれ 120°に分岐した，プラスチック製の装置。

2．材料及び実験方法
2．
1（unit：cm）

図１

使用動物

Y 迷路試験装置の模式図

５週齢（受入時）の雄性マウス（ddY 系，日本エスエルシー株式会社）を，5 日間の検疫期間と，そ水（株式会社大塚製薬工場）で 2 mM に調整し，の後 6 日間の馴化飼育を経て実験に使用した。マウ

37℃設定の定温保管庫に 4 日間インキュベーショ

スは，オートクレーブ処理した床敷（ペパークリー

ンした。偽手術群には注射用水を用いた。

ン，日本エスエルシー株式会社）を入れたプラス

2．
3 実験方法

チック製ケージ（W：310×D：360×H：175 mm）

2．3．1 Aβ（25-35）溶液の注入を用いて 1 ケージ 10 匹まで，群分け後は 1 ケージ

マウスはペントバルビタールナトリウム（東京化あたり 3 〜 5 匹までの群飼育とした。管理温度：成工業株式会社）40 mg/kg を腹腔内投与（投与液20 〜 26℃，管理湿度：40 〜 70％，明暗各 12 時間

量：10 mL/kg）し麻酔した。頭皮にレボブピバカ（照明：午前 6 時〜午後 6 時）
，換気回数：12 回 /イン塩酸塩（ポプスカインⓇ 0.25％注，丸石製薬株

時（フィルターを通した新鮮空気）に維持した環境式会社）を皮下投与（0.1 mL）した。マウスの頭下 で 飼 育 し た。 飼 育 期 間 中， 水 道 水 と 固 型 飼 料

頂部の毛を刈り，頭部を脳定位固定装置に固定後，（MF，オリエンタル酵母工業株式会社）を自由摂

頭皮をヨードチンキで消毒後に切開して皮下組織を取させた。

取り除いた。歯科用ドリルを用いて bregma より側実験群として，偽手術，Aβ（25-35）投与＋溶媒（溶方 1 mm（右側），後方 0.2 mm の頭蓋骨にステンレ媒対照），Aβ（25-35）投与＋試験製剤 2.5 mg/kg 及び 5

ス製パイプ刺入用の穴を開け，骨表面から 2.5 mmmg/kg，Aβ（25-35）投与＋標準製剤 2.5 mg/kg 及び 5の深さまで外径 0.5 mm のシリコンチューブ及びマmg/kg の計 6 群を設定した。なお，各群の例数はイクロシリンジに接続されたステンレス製パイプを12 匹とした。

垂直に刺入した。脳室内に Aβ（25-35）溶液（偽手術群2．
2は注射用水）の 6 nmol/3μL をマイクロシリンジポ

使用薬剤と薬剤の調製

メ マ ン チ ン 塩 酸 塩 OD 錠 20 mg「 明 治 」（MeijiⓇンプで 3 分間かけて注入した。注入後は，ステンレ

Seika ファルマ株式会社）並びにメマリー OD 錠

ス製パイプを挿入したまま 3 分間静置し，ステンレ20 mg（第一三共株式会社）を使用した。両製剤

ス製パイプをゆっくりと抜去した。頭蓋穴を非吸収は，それぞれ磨砕後，0.5 w/v％メチルセルロース

性骨髄止血剤（ネストップⓇ，アルフレッサファー（メトローズⓇ SM-100，信越化学工業株式会社）でマ株式会社）で塞ぎ，頭皮を縫合した後，飼育ケー懸濁し，逐次希釈してそれぞれメマンチン塩酸塩とジに戻した。なお，Aβ（25-35）溶液の注入は，試験製して 0.25 mg/mL，0.5 mg/mL の濃度の懸濁液とし剤又は標準製剤の 3 日目の投与前に行った。て調製した。試験製剤並びに標準製剤は 10 mL/kg

2．3．2Y 迷路試験（自発的交替行動試験）の容量で 1 日 1 回 11 日間反復経口投与した。β-試験には，3 つのアーム（長さ 39.5 cm，床幅 4.5Amyloid（25-35）（PolyPeptide Laboratories） は 注 射 用cm，壁の高さ 12 cm）がそれぞれ 120°に分岐して

12 （76）

診療と新薬・第 57 巻第２号（2020 年２月）

いるプラスチック製の Y 字型迷路（有限会社ユニ2．4コム）を用いた（図１）。装置の床面の照度は 10

本試験は，Meiji Seika ファルマ株式会社横浜研〜 40 lx に調節した。マウスを Y 字型迷路のいずれ

究所動物実験管理委員会及び株式会社日本バイオリかのアームに置き，8 分間迷路内を自由に探索させサーチセンター羽島研究所実験動物委員会で審査・た。マウスが測定時間内に移動したアームの順番を承認された方法に従い，株式会社日本バイオリサー記録し，アームに移動した回数を数えた。なお，測チセンター羽島研究所で実施した。

動物倫理

定は試験製剤又は標準製剤の 9 日目の投与 1 時間

2．5 統計解析方法後に行った。

Y 迷路試験（総エントリー数，自発的交替行動自発的交替行動率は，マウスが測定時間内に移動数，自発的交替行動率）及び受動回避試験（獲得潜したアームの回数を総エントリー数，その中で連続し時及び保持潜時）について各群の平均値及び標準誤て異なる 3 つのアームを選択した組み合わせの数を差を算出した。両試験において，偽手術群と Aβ（25-35）

自発的交替行動数とし，以下の式を用いて算出した。

投与群（溶媒対照群）及び試験製剤と標準製剤の同自発的交替行動率（％）＝［自発的交替行動数 /（総エントリー数− 2）］×100

用量群間の比較には分散比の F 検定により等分散であることを確認し Student s t-検定を用いた。溶媒対照群に対する標準製剤群又は試験製剤群の比較〔計算例〕には Bartlett 検定による分散の均一性の検定を行い

Y 字型迷路の各アームを A，B，C とし，マウス等分散であることを確認し Dunnett 型多重比較検が ACBABACBAB の順で移動した場合，自発的交定（Dunnett 検定）を用いた。いずれも，有意水準

替行動数は ACB，CBA，BAC，ACB，CBA の 5 回は 5％とした。なお，有意差検定には，市販の統計となり，これを総エントリー数 10 回から 2 を引い

プ ロ グ ラ ム（SAS シ ス テ ム；SAS Institute Japanた 8 で割った値に 100 を掛けた数値 62.5 が自発株式会社あるいは EXSUS；株式会社 CAC クロア）

的交替行動率となる。

を使用した。

自発的交替行動率（％）＝［ 5 /（10 − 2）］×100 ＝ 62.5

2．
3．
3

受動回避試験

3．結果

Y 迷路試験の自発的交替行動率の結果を図２に示試験には，中央がスライド式ドアで仕切られた明した。自発的交替行動率について，偽手術群では室（W：100×D：100×H：300 mm）と床のグリッ69.7±7.5％であったのに対し，Aβ（25-35）投与群（溶ドを通して電気刺激を流すことができる暗室（W：媒対照群）では 59.9±7.7％と偽手術群に対して有240×D：245×H：300 mm）から成る step through意 な 減 少 が 認 め ら れ（p ＝ 0.006，Student s t-検型受動的回避反応装置（明暗箱：自社製，SHOCK定），Aβ（25-35）投与により認知機能障害が誘発されてSCRAMBLER：有限会社ユニコム）を用いた。

いることが確認できた。試験製剤 2.5 mg/kg 群及び獲得試行（投与 10 日）は，試験製剤又は標準製

5 mg/kg 群の自発的交替行動率はそれぞれ 64.5±

剤投与 1 時間後に行った。マウスを明室に入れて4.8％及び 68.4±5.2％と用量依存的に自発的交替行

10 秒後にスライド式ドアを静かに開け，マウスが動率は増加し，5 mg/kg 群では溶媒対照群と比較し暗室に入るまでの時間（獲得潜時）を測定した。マて有意な増加が認められた（p ＝ 0.003，Dunnett

ウスが暗室に入ると同時にスライド式ドアを閉め電検 定 ）。 標 準 製 剤 で も 同 様 に 2.5 mg/kg 群 及 び 5気刺激（0.2 mA，2 sec，スクランブル方式）を負mg/kg 群でそれぞれ 66.6±9.5％及び 72.3±8.3％荷し，その後マウスをホームケージへ戻した。保持と用量依存的に自発的交替行動率は増加し，5 mg/試行は 24 時間後（投与 11 日）に行い，電気刺激kg 群では溶媒対照群と比較して有意な増加が認めは負荷せず，マウスが暗室に入るまでの時間（保持られた（p ＝ 0.002，Dunnett 検定）。試験製剤と標潜時）を測定した。明室で 300 秒経過した場合は準製剤の同用量間に有意な差はみられなかった（2.5

その時点で終了し，300 秒を保持潜時とした。

mg/kg；p ＝ 0.504，5 mg/kg；p ＝ 0.172，Student s t検定）
。なお，総エントリー数及び自発的交替行動

診療と新薬・第 57 巻

第 2 号（2020 年 2 月）

13 （77）100

自発的交替行動率（％）

90p＝0.00670

p＝0.002＄＄

p＝0.003＃＃80＊＊60
50403020100溶媒
偽手術

溶媒2.55メマンチン塩酸塩
OD 錠「明治」

2.55（mg/kg p.o.）Ⓡ

メマリー OD 錠（25-35）i.c.v.
Aβ各群の自発的交替行動率の平均値及び標準誤差を示した。
＊ ＊；vs 偽手術群 by Student s t-検定＃＃，＄＄；vs 溶媒対照群 by Dunnett 型多重比較検定
n＝12

図２ マウス Aβ（25-35）誘発認知機能障害モデルの Y 迷路課題に及ぼすメマンチン塩酸
塩 OD 錠「明治」の影響

300
p＝0.040＃＃250

p＝0.041＄＄保持潜時（秒）

200p＝0.001＊＊

150
100500
溶媒偽手術

溶媒2.55メマンチン塩酸塩
OD 錠「明治」

2.55（mg/kg p.o.）

メマリーⓇOD 錠

Aβ（25-35）i.c.v.

各群の保持潜時の平均値及び標準誤差を示した。
＊ ＊；vs 偽手術群 by Student s t-検定＃＃，＄＄；vs 溶媒対照群 by Dunnett 型多重比較検定
n＝12

図３ マウス Aβ（25-35）誘発認知機能障害モデルの受動回避試験に及ぼすメマンチン塩酸塩 OD 錠「明治」の影響

14 （78）

診療と新薬・第 57 巻

数については各群間に有意な差はなかった（データ示さず）。

第２号（2020 年２月）

して汎用されている 4）。
Aβ は脳内のグルタミン酸がその産生に関与して受動回避試験の保持潜時の結果を図３に示した。

いるだけでなく，Aβ がシナプスにおけるグルタミ偽手術群の保持潜時は 246.0±23.5 秒であったのにン酸遊離に影響することが報告されている。アルツ

対し，Aβ（25-35）投与群（溶媒対照群）では 126.5±

ハイマー型認知症では Aβ がグルタミン酸神経の異16.3 秒と偽手術群に対して有意な減少が認められ常な活性化を誘発し，シナプスの可塑性が障害さ（p ＝ 0.001，Student s t-検定），Aβ（25-35）投与によりれ，神経細胞死や認知機能障害を起こすと考えられ認知機能障害が誘発されていることが確認できた。ている 5）。メマンチンは NMDA 受容体に作用する試験製剤 2.5 mg/kg 群及び 5 mg/kg 群の保持潜時ことでグルタミン酸神経伝達を抑制し，シナプスのはそれぞれ 184.5±16.3 秒及び 205.1±25.4 秒と用可塑性の回復や認知機能障害を改善すると考えられ量依存的に延長し，5 mg/kg 群では溶媒対照群と比ている 6）。Aβ を脳内に投与したラットやマウスで

較 し て 有 意 な 延 長 が 認 め ら れ た（p ＝ 0.040，は神経細胞死や認知機能障害が認められることが知Dunnett 検定）。同様に標準製剤でも 2.5 mg/kg 群られており，メマンチンはそれらを改善することが及 び 5 mg/kg 群 で そ れ ぞ れ 183.3±25.5 秒 及 び

報告されている 7）。

203.0±24.7 秒と用量依存的に反応潜時は延長し，本試験では，Aβ（25-35）が誘発するマウスの認知機

5 mg/kg 群では溶媒対照群と比較して有意な延長が能障害モデルを用いて Y 迷路試験と受動回避試験認められた（p ＝ 0.041，Dunnett 検定）。試験製剤に及ぼす試験製剤の影響を，標準製剤を陽性対照と標準製剤の同用量間に有意な差はみられなかったとして検討した。その結果，試験製剤及び標準製（2.5 mg/kg；p ＝ 0.974，5 mg/kg；p ＝ 0.953，剤は同様に Y 迷路課題と受動回避試験で認められStudent s t-検定）。なお，各群の獲得潜時には有意た Aβ（25-35）投与によるマウスの認知機能障害を改善な差はなかった（データ示さず）。

したことから，試験製剤は標準製剤と同様の作用を4．考察有することが明らかとなった。また，試験製剤と標準製剤はいずれも Y 迷路試験における総エントリー

メマンチン塩酸塩 OD 錠「明治」は先発医薬品で数と受動回避試験における獲得潜時には影響しなある中等度及び高度アルツハイマー型認知症治療薬

かったことから，今回の試験で用いた両製剤の投与Ⓡ

メマリー OD 錠の後発医薬品である。後発医薬品

量はマウスの活動性に影響しないと考えられた。

は，「後発品の生物学的同等性試験ガイドライン」

ヒトでのメマンチンの血漿中有効濃度は 1μM と報に従い製剤評価（溶出試験及びヒトでの生物学的同告されている 7）。マウスにメマンチン塩酸塩を単回経等性試験）を実施し，先発医薬品と同等であること

口投与した場合の Cmax は，1 mg/kg で 0.477μM，が認められ，製造販売承認された医薬品である。本

10 mg/kg で 7.60μM で 8），投与量依存的に血漿中試験ではマウスの Aβ（25-35）誘発認知機能障害モデル濃度が上昇していることから，今回の投与用量としを用いて，試験製剤の認知機能への影響について検てヒト血漿中有効濃度 1μM を上回ると推定される討した。

2.5 mg/kg に加え，さらにその 2 倍量の 5 mg/kg をAβ はアルツハイマー型認知症の原因物質の一つと設定した。本試験では臨床で用いられる製剤をマウして知られており，Aβ が脳内に凝集・蓄積することスの Aβ（25-35）誘発認知機能障害モデルマウスに経口により神経細胞が変性・脱落し，脳の働きを低下さ投与し，両剤とも認知機能障害改善作用を有するこせることで認知機能障害などの症状が発現すると考とが示された。

えられている。今回の動物モデルに用いた Aβ（25-35）

認知機能の評価に加え，安全性評価として試験製は，Aβ のコアフラグメントであり，Aβ と同様に剤及び標準製剤のラットを用いた単回経口投与試験

凝集能や神経毒性の特性を備えている。Aβ（25-35）をを実施した。両製剤はメマンチン塩酸塩の臨床にお脳室内投与したマウスは，投与後短期間で神経細胞（約 0.3 mg/kg；ヒトの体重ける 1 日最大用量 20 mg 1）

変性と認知機能障害を示すことから，簡便なアルツ

60 kg として換算）の 100 倍量に相当する 30 mg/kg

ハイマー型認知機能障害に対する薬効評価モデルとを投与量に設定して，6 週齢の SD 系雄性ラット（1診療と新薬・第 57 巻群 3 匹）にそれぞれ単回経口投与し，一般状態観察，体重測定および剖検を行った。その結果，投与直後から投与 30 分後までに自発運動の低下が両製剤群で散見されたが，投与 1 時間後には異常は認められず，一過性の発現であった。体重は両製剤群と第 2 号（2020 年 2 月）

15 （79）ビューフォーム．2018 年 6 月改訂（第 15 版）
2）日本神経学会（監修），「認知症疾患診療ガイドライン」
作 成 委 員 会（ 編 集 ）． 認 知 症 疾 患 診 療 ガ イ ド ラ イ ン
2017．医学書院，2017.
3）中村祐．メマンチン．日本生物学的精神医学会誌

2011; 22: 227-35.

も溶媒を投与した対照群と同様に推移し，有意な差4）Klementiev B, Novikova T, Novitskaya V, et al. Aは認められなかった。投与 7 日後の剖検でも変化はneural cell adhesion molecule-derived peptide reduces

認められなかった 9）。

neuropathological signs and cognitive impairment
induced by Aβ25-35. Neuroscience 2007; 145: 209-24.

以上，メマンチン塩酸塩 OD 錠「明治」の認知機

5）Revett TJ, Baker GB, Jhamandas J, et al. Glutamate

能障害に及ぼす影響について，先発医薬品である

system, amyloidβpeptides and tau protein: functionalⓇ

メマリー OD 錠を陽性対照として，Aβ（25-35）が誘発するマウスのモデルを用いて Y 迷路試験と受動回避試験により検討した。その結果，メマンチン

interrelationships and relevance to Alzheimer disease
pathology. J Psychiatry Neurosci 2013; 38: 6-23.
6）D a n y s z W , P a r s o n s C G , M o b i u s H J , e t a l .
Neuroprotective and symptomatological action of

塩酸塩 OD 錠「明治」はメマリーⓇ OD 錠と同様に

memantine relevant for Alzheimer's disease ─ a uniﬁed

Aβ（25-35）が誘発するマウスにおける認知機能障害を

glutamatergic hypothesis on the mechanism of action.

改善させることが確認できた。

Neurotox Res 2000; 2: 85-97.
7）Rammes G, Danysz W, Parsons CG. Pharmacodynamics

5．利 益 相 反
本試験は，Meiji Seika ファルマ株式会社が起案し，試験計画書作成，試験実施と統計解析を株式会社日本バイオリサーチセンターへ委託し実施した。なお，大山昌代，蓮沼恵子，今西泰一郎，三浦有紀は，Meiji Seika ファルマ株式会社の社員であり，小林洋之，村澤寛泰，パブラック晶子は，株式会社日本バイオリサーチセンターの社員である。

of memantine: an update. Curr Neuropharmacol 2008; 6:
55-78.
8）Beconi MG, Howland D, Park L, et al. Pharmacokinetics
of memantine in rats and mice. PLoS Curr 2011; 3:
RRN1291.
9）Meiji Seika ファルマ株式会社．メマンチン「明治」の雄性ラットを用いた単回投与毒性試験に関する資料（社内資料）．2020.

6．参 考 文 献（公開日：2020 年 2 月 18 日）
1）メマリーⓇ 錠・OD 錠・ドライシロップ．医薬品インタ