エンドトキシン計Sievers Eclipseを使用したライセート試薬の保存評価
Application Note
目的
ライセート試薬をマイクロチューブに入れて－20℃で2週間保存して、エンドトキシン計 SieversEclipseで測定した際の性能を評価しました。この検証で評価したマイクロチューブは、ThermoScientific†スクリューキャップマイクロチューブ（カタログ番号：3488PK、2.0mL）です。エンド
トキシン計Sievers Eclipseでは、1回のアッセイに必要なライセート試薬は1mLだけです。ただし、市販のライセート試薬の容量は1mL以上の試薬調製水 (LRW) で再溶解されます。このアプリケー
ションノートでは、1度に1回のアッセイ（マイクロプレート 1枚）のみを行う場合でも、1本のライセート試薬をすべて使うためのデータとガイダンスを提供します。

背景
エンドトキシン計 Sievers Eclipseは、カイネティック比色法により検量線と反応干渉因子（PPC）を含む最大21個のサンプルを分析できます。Sievers Eclipseのマイクロプレートには、あらかじめエンドトキシン一次標準品 (USP-RSE) とPPCが充填されており、わずか1mL のライセート試薬で、各アッセイで最大 5 点（50～0.005 EU/mL）の検量線を検証できます。
ライセート試薬（Endochrome-K‡とChromo LAL§）のメーカーの使用説明書（IFU）によると、ライセート試薬は再溶解後は－20℃で2週間冷凍保存できます。今回、Sievers Eclipseで使用するライセート試薬を一度溶解して、2本のThermo Scientificスクリューキャップマイクロチューブに 1mLずつ入れて－20℃で保存できることを評価しました。

実験計画
評価では、Thermo Scientificスクリューキャップマイクロチューブ（カタログ番号：3488PK、2.0 mL) を使用しました。ライセート試薬はAssociates of Cape Cod（ACC）製のChromo-LAL試薬（ロット：337082）とCharles River Laboratories（CRL）製のEndchrome-K 試薬（ロット：N4253E）の性能を3つの保存期間（0日目、7日目、14日目）で評価しました。各保存期間において、3枚のマイクロプレートを使って、 5 点検量線（50 ～ 0.005 EU/mL）とサンプル21検体（サンプルとして試薬調製水（LRW）を使用）を評価しました。
0 日目：使用説明書（IFU）に従ってEndochrome-KとChromo-LALを4本ずつのバイアルに調製しました。各試薬のバイアル1本ずつを0日目の評価に使用しました。残りの 6本のバイアルの試薬を1.1mLずつ12本のThermo Scientificマイクロチューブに分注してラベルを貼りました。試薬を分注した12本のマイクロチューブを－20℃で保管しました。0日目のテストは、各試薬（Endochrome-KとChromo-LAL）においてSievers Eclipseマイクロプレートを3枚ずつ使用し、5 点検量線（50 ～0.005 EU/mL）とサンプル21検体（サンプルとして試薬調製水（LRW）を使用）を評価しました。
0日目の検量線とLRWサンプルの結果については、付録Aを参照してください。

†Trademark of Thermo Fisher Scientific Inc.
‡Trademark of Charles River Laboratories, Inc.
§Trademark of Associates of Cape Cod, Inc.

300 00376 Rev. B

エンドトキシン計Sievers Eclipseを使用したライセート試薬の保存評価

7日目：－20℃で凍結した各ライセート試薬を使って6つのアッセイを行いました。6本の試薬を冷凍庫から取り出し、解凍して室温に戻しました。残りの6本の試薬は引き続き－20℃で保存しました。次に、7日目の試薬を使ってEclipseで測定しました。検量線の結果と7日目のサンプルの結果については、付録Bを参照してください。
14日目：－20℃で凍結した各ライセート試薬を使って6つのアッセイを行いました。6本の試薬を冷凍庫から取り出し、解凍して室温に戻しました。次に、14日目の試薬を使ってEclipseで測定しました。14日目の検量線とサンプルの結果については、付録Cを参照してください。
この検証の合格基準は以下の通りです。
• 直線性：|r| 値：0.980以上• 反応干渉因子試験(PPC)：50 ～ 200 %• 各標準品・サンプルの PPC回収率の変動係数：20%以下• ネガティブコントロールのオンセットタイム：0.005 EU/mLより遅い

まとめと推奨事項
すべての保存期間（0日目、7日目、14日目）の完了時に、両方のライセート試薬（Chromo-LALとEndochrome-K）についてエンドトキシンの測定結果を調べ、凍結/解凍後のThermo Scientific
スクリューキャップマイクロチューブ（カタログ番号 3488PK、2.0 mL）で同等の結果が得られるかどうかを評価しました。14日目のEndochrome-Kのプレート2の1つのウェルで単一の流体障害が検出されたため、この結果は棄却されました。この流体障害はエラーであり、保存条件やライセート試薬の安定性とは関係ありません。
ここに示したデータは、Sievers Eclipseで使用する際、調製してすぐに使用したライセート試薬と－20℃で最大 14日間凍結保存したライセート試薬の同等性を示しています。これらの結果から、IFUに記載されている通りに、Thermo Scientificマイクロチューブを使用して各試薬を1回だけ凍結/解凍しても測定性能に影響がないことが示されました。Thermo Scientificスクリューキャップ
マイクロチューブ（カタログ番号：3488PK、2.0 mL）は、試薬を－20℃で最長 2 週間保存してもエンドトキシンアッセイに影響しないことが証明されています。したがって、Sieversチームは、ライセート試薬の保管、廃棄量の削減のためにこのチューブを使用することを推奨しています。この検証のすべてのデータはリクエストに応じて入手可能です

300 00376 Rev. B

エンドトキシン計Sievers Eclipseを使用したライセート試薬の保存評価

付録A：0日目の検量線とサンプル結果
エンドトキシン計 Sievers Eclipseは、アッセイごとに 3～ 5 点の検量線を評価できます。この評価では、測定範囲全体を把握するために、各時点で5 点の検量線を使用しました。検量線とサンプルの0日目の結果を以下に示します。
表1. 0日目：Chromo-LAL ロット: 337082

検量線

プレート

R値

オンセットタイムCV（％）

ネガティブコントロール
0.005 EU /mL未満

合否11.000

1.0～4.9％

合格

適合21.0000.8～6.7％

合格

適合30.9992.3～5.9％

合格

適合表2. 0日目：Endochrome-K ロット: N4253E 検量線
プレート

R値

オンセットタイムCV（％）

ネガティブコントロール
0.005 EU /mL未満

合否10.9990.4～8.9％

合格

適合20.9992.7～5.3％

合格

適合30.997

1.8～5.9％

合格

適合表3. 0日目：Chromo-LAL ロット: 337082

サンプルプレート

セグメント

PPC
回収率（％）

PPC
オンセット
タイム（％）

PPC回収率（％）：
50～200％以内？

CV（％）：
20％未満？

1

1～2191.1～127.9％

0.0～5.7％

適合

適合

2

1～2174.0～122.1％

0.4～7.6％

適合

適合

3

1～2175.1～110.2％

0.0～6.6％適合

適合表4. 0日目：Endochrome-K ロット: N4253E サンプルプレート

セグメント

PPC
回収率（％）

PPC
オンセット
タイム（％）

PPC回収率（％）：
50～200％以内？

CV（％）：
20％未満？

1

1～2183.2～107.5％

0.4～9.0％

適合

適合

2

1～2193.0～160.3％

0.0～4.0％

適合

適合

3

1～2160.7～109.5％

0.0～6.6％適合

適合

300 00376 Rev. B

エンドトキシン計Sievers Eclipseを使用したライセート試薬の保存評価

付録B：7日目の検量線とサンプル結果
表1. 7日目：Chromo-LAL ロット: 337082

検量線

プレート

R値

オンセットタイムCV（％）

ネガティブコントロール
0.005 EU /mL未満

合否10.998

0.6～7.2％

合格

適合20.9991.9～11.9％

合格

適合30.9990.9～8.4％

合格

適合表2. 7日目：Endochrome-K ロット: N4253E 検量線
プレート

R値

オンセットタイムCV（％）

ネガティブコントロール
0.005 EU /mL未満

合否10.999

1.6～5.7％

合格

適合20.999

1.2～3.2％

合格

適合

31.0000.0～7.9％

合格

適合表3. 7日目：Chromo-LAL ロット: 337082

サンプル

プレート

セグメント

PPC
回収率（％）

PPC
オンセットタイム（％）

PPC回収率（％）：
50～200％以内？

CV（％）：
20％未満？

11～21

70.3～138.6％

0.0～11.7％

適合

適合

2

1～2182.7～176.6％

0.0～11.3％

適合

適合

3

1～2167.2～141.8％

0.5～16.3％

適合

適合表4. 7日目：Endochrome-K ロット: N4253E サンプル
プレート

セグメント

PPC
回収率（％）

PPC
オンセット
タイム（％）

PPC回収率（％）：
50～200％以内？

CV（％）：
20％未満？

1

1～2176.5～117.1％

0.0～9.6％

適合

適合

2

1～2166.5～123.9％

0.0～12.4％

適合

適合

3

1～2193.1～125.2％

0.0～5.7％適合

適合

300 00376 Rev. B

エンドトキシン計Sievers Eclipseを使用したライセート試薬の保存評価

付録C：14日目の検量線とサンプル結果
表1. 14日目：Chromo-LAL ロット: 337082

検量線

プレート

R値

オンセットタイムCV（％）

ネガティブコントロール
0.005 EU /mL未満

合否10.999

1.2～4.6％

合格

適合

20.9992.2～7.6％

合格

適合

31.0002.8～6.5％

合格

適合表2. 14日目：Endochrome-K ロット: N4253E

検量線

プレート

R値

オンセットタイムCV（％）

ネガティブコントロール
0.005 EU /mL未満

合否

1

1.000

1.7～3.1％

合格

適合

2

1.000

1.1～2.5％

合格

適合

3

1.000

1.1～4.9％

合格

適合表3. 14日目：Chromo-LAL ロット: 337082

サンプル

プレート

セグメント

PPC
回収率（％）

PPC
オンセット
タイム（％）

PPC回収率（％）：
50～200％以内？

CV（％）：
20％未満？

1

1～21

83.3～179.3％

0.0～9.4％

適合

適合

2

1～21

89.2～147.4％

0.4～8.8％

適合

適合

3

1～21

78.9～137.0％

0.5～14.0％

適合

適合表4. 14日目：Endochrome-K ロット: N4253E

サンプルプレート

セグメント

PPC
回収率（％）

PPC
オンセット
タイム（％）

PPC回収率（％）：
50～200％以内？

CV（％）：
20％未満？

1

1～21

94.9～107.8％

0.0～3.5％

適合

適合

2

1～21

82.5～109.5％

0.0～4.7％

適合

適合

3

1～21

93.3～104.6％

0.7～4.1％適合

適合

300 00376 Rev. B

エンドトキシン計Sievers Eclipseを使用したライセート試薬の保存評価

使用した分析装置とアクセサリー
エンドトキシン計 Sievers Eclipse シリアルナンバー：1811-0006
エンドトキシン計 Sievers Eclipse シリアルナンバー：1911-0025
試薬調製水：Associates of Cape Cod（ACC） ロット：AG29752122Eclipseマイクロプレート：ロットナンバー：IJ122336
Charles River Laboratories (CRL) Endochrome-K LAL 試薬 ロット：N4253E
Associates of Cape Cod (ACC) Chromo-LAL 試薬 ロット：337082（翻訳：セントラル科学株式会社）

300 00376 Rev. B