Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

第 23 回日本バイオイメージング学会学術集会「公開講座」並びに「学術講演会」のお知らせ
第 23 回日本バイオイメージング学会学術集会・大会長

菊地和也

第 23 回日本バイオイメージング学会学術集会を開催いたします。多くの方々にご参加頂きたくご案内申し上げます。プログラム等の詳細につきましては学術集会 URL：http://www-molpro.mls.eng.osaka-u.ac.jp/bioimage2014/
をご覧ください。
会期：平成 26 年 9 月 4 日（木）～9 月 6 日（土）◆公開講座：9 月 6 日（土）13:00～17:00◆学術講演会：9 月 4 日（木）13:30 ～9 月 6 日（土）12:00
会場：大阪大学銀杏会館（大阪府吹田市山田丘 2-2）（http://www.office.med.osaka-u.ac.jp/icho/icho-jp.html を参照）
協賛学会（五十音順）
応用物理学会

化学工学会

可視化情報学会

日本医学物理学会

日本化学会

日本細胞生物学会

日本磁気共鳴医学会

日本神経科学学会

日本神経化学会

日本生物物理学会

日本生理学会

日本組織細胞化学会

日本蛋白質科学会

日本超音波医学会

日本農芸化学会

日本物理学会

日本分光学会

日本分子イメージング学会

日本分析化学会

日本免疫学会

日本薬学会

日本レーザー医学会◎重要事項の締切り期日、等◆講演受付締切り期日○演題申込み・締切り

平成 26 年 6 月 30 日（月）○日本語、英語抄録原稿・締切り

平成 26 年 6 月 30 日（月）◆参加登録・締切り

平成 26 年 7 月 30 日（水）◆懇親会参加登録･締切り

平成 26 年 7 月 30 日（水）★一般口演（ポスター発表）の演題を募集しています。代表して発表する著者は本学会の会員に限ります。入会がお済みでない方は、学会のホームページで入会申込書を入手し、手続きをしてください。
一般口演の申込手順は次のようになっています。締切り日を厳守して下さい。
○演題申込み・日本語抄録および英語抄録提出（6 月 30 日（月））○申込方法：
大会ホームページ（http://www-molpro.mls.eng.osaka-u.ac.jp/bioimage2014/）より日本語抄録および英語抄録のテンプレートをダウンロードし、抄録を作成してください。作成した抄録は、参加申込書と同時に事務局宛にメールにて提出をお願いします。
－1－Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング◎事前参加登録
演題を出される方も、参加のみの方も事前参加登録を済ませてください。締切りは 7 月 30 日（水）です。
◎懇親会の参加登録も 7 月 30 日（水）までに済ませてください。
◎参加費、懇親会費と支払い方法
事前参加登録頂きましたら、参加費と懇親会費の合計（懇親会に出席されない方は参加費のみ）を下記口座に
平成 26 年 8 月 14 日（木）までにご入金ください。領収書は、学術集会受付にてネームカードと共にお渡しします。
参加費：公開講座（無料）
学術集会：一般（会員・協賛学会員：6,000 円、非会員：8,000 円）
懇親会費：

5,000 円一般

学生（3,000 円）

学生：2,000 円

振込および振替手数料は、ご負担いただきたくお願い申し上げます。
①郵便振替の場合
口座記号番号：14010－54506921
口座名称：

第 23 回日本バイオイメージング学会学術集会②銀行振込の場合銀行・支店名：三菱東京 UFJ 銀行・千里中央支店（店番号 240）

口座番号：0292414

口座名称：

第 23 回日本バイオイメージング学会学術集会◎公開講座プログラム
日時：9 月 6 日（土）13:00～17:00（受付 12：00～13：00）
会場：大阪大学銀杏会館（大阪府吹田市山田丘 2-2）「融合研究が拓くバイオイメージング～物理学・化学の生命科学研究への新展開～」

13:00～15:00
1. 「はじめに」
川西徹（国立医薬品食品衛生研究所）
2. 「植物の重力受容メカニズムに迫る」
森田美代（名古屋大学大学院生命農学研究科）
3. 「細胞機能を分子スパイで探る」
新井由之（大阪大学産業科学研究所）
4. 「細胞エネルギーを可視化する」
今村博臣（京都大学白眉センター）
5. 「植物の細胞内ダイナミクス」
上田晴子（京都大学大学院理学研究科）
15:15～16:45
6. 「細胞の細部構造をありのままに調べるラマン顕微鏡」
小関泰之（東京大学大学院工学系研究科）
7. 「神経細胞の興奮を可視化する」
筒井秀和（北陸先端科学技術大学院大学マテリアルサイエンス研究科）－2－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

8. 「ナノダイヤモンドで細胞機能を視る・操作する」
原田慶恵（京都大学物質－細胞統合システム拠点）
9. 「おわりに」
菊地和也（大阪大学大学院工学研究科）

17:00～18:00

懇談会◎学術講演会プログラム
日時：9 月 4 日（木）13:30 ～ 9 月 6 日（土）12:00
会場：大阪大学銀杏会館（大阪府吹田市山田丘 2-2）

9 月 4 日（木）
13:30

開会

13:40～15:40

シンポジウム 1「生命・イメージング・データベース」

オーガナイザー：木原裕（姫路日ノ本短期大学）、小島正樹（東京薬科大学生命科学部）
1-1.「生命とは何か（仮）」金子邦彦（東京大学大学院総合文化研究科）

1-2.「ダイナミック・イメージング（仮）」1-3.「構造生命科学の世界展開」

若槻壮市（スタンフォード大学医学部）

1-4.「イメージングのデータベース（仮）」15:50～17:30

澤井哲（東京大学大学院総合文化研究科）

京田耕司（理化学研究所生命システムセンター）

シンポジウム 2「20 年後に見えているもの」

オーガナイザー：樋口ゆり子（京都大学大学院薬学研究科）
2-1.「細胞の個性を創る、探す、使う」

合田圭介（東京大学大学院理学系研究科）

2-2.「脳活動のモデル化と知覚体験の可視化：現在と未来」
2-3.「Ｘ線光学はどこまで進むか？」

西本伸志（情報通信研究機構）

玉作賢治（理化学研究所）

2-4.「超高速分光の未来～アト秒・ゼプタ秒とイメージング～」
新倉弘倫（早稲田大学理工学術院先進理工学部）

9 月 5 日（金）9:30～11:30

シンポジウム 3「脱ラベル化イメージング」

オーガナイザー：藤田克昌（大阪大学大学院工学研究科）
3-1.「ラベルフリーイメージングの医療応用」
高松哲郎（京都府立医科大学大学院医学研究科）
3-2.「非標識光学イメージングで細胞状態を観る」
市村垂生、渡邉朋信（理化学研究所生命システム研究センター）
3-3.「吸収増幅顕微鏡による細胞個性計測」
新井由之、永井健治（大阪大学産業科学研究所）－3－Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
3-4.「Multimodal Raman and phase imaging for maximal information retrieval from cellular targets」
Nicholas I Smith（大阪大学免疫学フロンティア研究センター）

3-5. 「 Digital Holographic Microscopy: Applications in Coherent Superresolution and Monitoring of Neuronal
Dynamics」

Nicolas Pavillon（大阪大学免疫学フロンティア研究センター）

13:00～14:40

ポスター討論（前半：奇数、後半：偶数）

14:55～15:45

特別講演 1

三浦正幸（東京大学大学院薬学系研究科）

15:55～16:45

特別講演 2

難波啓一（大阪大学大学院生命機能研究科）

16:55～17:25

奨励賞受賞講演17:35～17:50

ベストイメージング賞授賞式

18:00～19:30

懇親会

9 月 6 日（土）9:30～11:10

シンポジウム 4「おもろいイメージング」

オーガナイザー：渡邉朋信（理化学研究所生命システム研究センター）
4-1.「光音響（仮）」石原美弥（防衛医科大学校医用工学講座）

4-2.「補償光学（仮）」早野裕（国立天文台ハワイ観測所）

4-3.「ホログラフィック顕微鏡（仮）」4-4.「MRI による温度計測（仮）」11:20～11:50

11:50

田原樹（関西大学システム理工学部）

森勇樹（大阪大学免疫学フロンティア研究センター）

総会

閉会

◆理事会

：9 月 4 日（木）17:30～19:30◆評議員会：9 月 5 日（金）11:30～13:00◆総：9 月 6 日（土）11:20～11:50

会◎本学術集会についての問い合わせ先大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻物質生命工学コース
ケミカルバイオロジー領域内第 23 回日本バイオイメージング学会学術集会事務局
大会長

菊地和也

〒565-0871

大阪府吹田市山田丘 2-1

総合研究棟５階

TEL: 06-6879-7924, FAX：06-6879-7875
E-mail：bioimage2014@mls.eng.osaka-u.ac.jp
URL：http://www-molpro.mls.eng.osaka-u.ac.jp/bioimage2014/－4－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

第 22 回日本バイオイメージング学会学術集会報告
船津高志 1, 2

1 第 22 回日本バイオイメージング学会学術集会大会長; 2 東京大学大学院薬学系研究科* E-mail: funatsu@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

本学会の第 22 回学術集会が、2013 年 9 月 14 日～16 日

ポジウムでは、様々な超解像顕微鏡法が原理から解説されに、東京大学薬学部講堂にて行われました。以下に、集会

たほか、画像処理による高解像化も紹介され、参加者の興のご報告をしたいと思います。

味を惹きつけました。シンポジウムを挟んで、ポスター討

まず、9 月 14 日には、高校生や一般の方を対象とした論が行われました。43 題のポスターがエントランスホー

公開講座を開催しました。開催案内を協賛学会のホームペルに掲示され、15 日は、そのうちの 21 件について討論がージでお知らせしたほか、ポスターをスーパーサイエンス

行われました。その後、日本バイオイメージング学会奨励

ハイスクールに指定されている高等学校、東京都内の高等賞受賞者による講演が行われました。本年度は、桧垣匠博

学校に郵送しました。その結果、当日は 163 名の参加者が士（東京大学）が奨励賞を受賞されました。引き続き、浜あり、薬学部講堂がほぼ満席になりました。参加者の内訳

地格先生（京都大学）による特別講演が行われました。生は、大学や病院関係者が約 80 名、企業や一般人が約 70きた組織にプローブを入れて狙った受容体などを特異的

名、高校生・引率の教師が 16 名、さらに中学生が 1 名でに標識する技術が紹介されました。

した。

16 日も、引き続き学術講演会を行う予定でしたが台風

バイオイメージングの分野で最先端の研究を展開され18 号が会場付近を通過し、暴風警報が発令されたため中ている政池知子（東京理科大）、古寺哲幸（金沢大学）、神止としました。ポスターや講演の準備をしていただいた皆谷真子（東京大学）、喜多村和郎（東京大学）、樋口ゆり子

様、遠慮はるばる東京までお越しいただいていた方、当日（京都大学）、小野正博（京都大学）先生に講演をしてい悪天候にもかかわらず会場までいらしてくださった方、誠

ただきました。生体分子、組織内の細胞、個体内の分子プに申し訳ありませんでした。

ローブのイメージングに加えて、蛍光イメージングや

なお、16 日は、シンポジウムが 2 件「医薬品をイメー

SPECT(単一光子放射断層撮影)のためのプローブ開発が紹ジングする介されました。講演会終了後は、東京大学大学院薬学系研「生命・イメージング・データベース」、ポスター討論 22

究科生体分析化学教室の見学会を行いました。１分子蛍光件、三浦正幸先生（東京大学）による特別講演が予定され顕微鏡によるキネシン分子の運動観察や光ピンセットがていました。これらの発表を楽しみにしておりましたが、実演されました。約 60 名の方が見学会に参加されました。

中止になりましたことを、たいへん残念に思います。参加

見学会と並行して、講師の先生方を囲んで軽食をとりなが者の皆様に被害がでなかったことを願うばかりです。

－革新的医薬品創出のための基盤技術－」、ら懇談しました。中学生が講師の先生に熱心に質問していなお、本学術講演会は、19 の関連学会の協賛を得て開た姿が印象に残りました。なお、公開講座は科学研究費補催しました。また、公益財団法人サントリー生命科学財団

助金（研究成果公開促進費）の援助を得て行いました。記をはじめ、25 の協賛企業のご援助をいただきました。記して感謝します。

して感謝申し上げます。明年の第 23 回日本バイオイメー

続いて、9 月 15 日、16 日には学術講演会を開催しましジング学会学術集会は、大阪大学において菊地和也大会長

た。180 名の参加者があり、薬学部講堂が満席になりましのもとで開催されます。皆さんの参加をお待ちしています。

た。15 日は、シンポジウムが 2 件「ラマン・イメージン
グの最前線」、「超解像顕微鏡の現状と課題」が行われました。非線形ラマン分光法により画像の取得が飛躍的に高速化されたことが印象的でした。また、超解像顕微鏡のシン－5－Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

植物の孔辺細胞をモデルとした蛍光タンパク質の統計的局在解析
桧垣 匠*
東京大・院・新領域創成科学* E-mail: higaki@k.u-tokyo.ac.jp

はじめにくとも生物学的に重要な意味を持つ局在性を見逃してい蛍光イメージングによるタンパク質の細胞内局在解析

る可能性には注意を払うべきであろうと思われる。もちろは、その機能推定や相互作用因子の探索のための基本的なん、このような細胞内局在に対する定量的な考え方は細胞研究手段である。タンパク質の細胞内局在を網羅的に決定

分化状態、外部環境刺激、遺伝子変異に応じたタンパク質

し、データベースとして公開する試みはおよそ 10 年以上の局在変化を厳密に議論する上においては必要不可欠と前より積極的に進められており [1]、近年の蛍光標識や顕なる。蛍光タンパク質の細胞内局在をイメージング技術に

微鏡撮影のハイスループット化はその潮流をますます加よって定量的に評価する方法としてまず考えられるのは、速させている。このような網羅的な細胞内局在情報は各種細胞内構造内における蛍光輝度を測定することであ

localizome とも呼ばれ、他のオミクス情報との統合への期る。実際、外部環境刺激に応じて細胞質と細胞核を行き来

待も高まっている [2]。その一方で、細胞内局在の表現方

する転写因子の動態は、細胞質と細胞核における蛍光輝度法に関しては、例えば「ゴルジ体」や「細胞核、細胞質」

比を測定することで定量的に評価できる [3]。しかし、通のように、蛍光画像の定性的な目視判断により同定した細常の蛍光顕微鏡画像ではあらゆる細胞内構造の形状や配胞内構造の名前を挙げる従来通りの方法に留まることが置の情報を同時に得ることはほぼ不可能である。そのため、多い。しかしながら、本来、タンパク質の細胞内局在とは

蛍光タンパク質の細胞内局在を定量的に表現するために、各細胞内構造の中に存在するタンパク質分子の割合のこ

細胞内構造の領域を切り分けて蛍光輝度を測定する手段とであり、細胞内構造の名前を示すだけの端的な記述はあは現実的ではない。

くまでも近似的な表現に過ぎない。すなわち、細胞内局在

この問題を克服するために、私たちは多数の蛍光顕微鏡

が「小胞体、ゴルジ体」とされているタンパク質群であっ画 像 か ら 細 胞 内 局 在 確 率 マ ッ ピ ン グ （ intracellularても、タンパク質の種類ごとに両者への局在の程度は異な

localization probabilistic mapping）と呼ばれる手法によってる場合があり、その差異あるいは類似性を細胞内構造名だ

蛍光タンパク質の細部内局在を統計的に可視化し、これらけで表現することには限界がある。理論的には、タンパクをクラスタリング解析する方法を提案してきた [4, 5]。本質の細胞内局在の類似性は数値として定量的に評価する

稿では、植物の孔辺細胞をモデル細胞として各種細胞内構ことができるはずである（図 1）。もちろん、細胞内構造

造の蛍光マーカータンパク質群の細胞内局在を定量評価

名として近似された局在情報だけでも、私たちは十分に研した研究について概説する。

究目的を達成できる場合も多いが、局在の程度としては低植物の孔辺細胞
まず、本研究の材料である植物の孔辺細胞について説明

図 1. どうすれば細胞内局在を定量的に評価できるだろうか？

--------------------------------------------------------------------------

図 2. 気孔開閉の模式図*2013 年度日本バイオイメージング学会奨励賞受賞者－6－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

したい。植物の葉や茎の表面には微細な孔が無数に存在し内局在確率マッピングにうってつけの材料と言える。

ており、これは気孔と呼ばれている。気孔は二酸化炭素（光合成の基質）をはじめとする生理機能に関わるガス代謝の蛍光マーカー画像の網羅的取得調節を担っており、植物の生存にとって必要不可欠な器官

細胞内局在確率マッピングのためには、各々の蛍光マーである。葉内における二酸化炭素分圧は大気環境に比べてカーについて複数の画像を得る必要がある。そこで、モデ十分に低いため、気孔が開くと二酸化炭素は拡散によってル植物のシロイヌナズナを材料とし、植物細胞における代葉内へ取り込まれ、光合成反応が進む。これと同時に、葉表的な細胞内構造の蛍光マーカータンパク質を発現する

内の水蒸気は気孔を通って大気へ放出される。この現象は20 種類の形質転換株について、それぞれ 100 細胞の孔辺蒸散と呼ばれており、根から新たな水分を吸い上げる原動

細胞の連続光学切片画像を、高速撮影に向くスピニングデ

力になっていると考えられている。しかし、気孔が開き過ィスク式共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮影した [4]。取ぎれば植物は水分不足に陥ってしまい、最終的には萎れて得した顕微鏡画像の一部はデータベース（LIPS database）

枯れてしまう。このため、気孔の開閉は光強度や水環境なとして纏め、当研究室のホームページで公開している

どの変化に応じて厳密に制御される。植物は外部環境変化

（図 3）
。本デ
（http://hasezawa.ib.k.u-tokyo.ac.jp/lips/）に応じた気孔の開閉機能を獲得することで、陸上の厳しい

ータベースでは、(1) 明視野画像および蛍光画像（原画像）、

環境変化に対処してきたと考えられる。この気孔の開閉機(2) ボリュームレンダリング法による三次元再構築蛍光

能は、気孔を形成する一対の孔辺細胞の膨圧運動により実画像（GIF アニメーション、ウェブ上での閲覧を前提と現されている。孔辺細胞の細胞壁の厚さは均一ではなく、している）、(3) 後述する細胞形状を画一化した標準蛍光

気孔に面した側が肥厚して伸展しにくくなっているため

画像、(4) 気孔開度や細胞長軸の長さなどの形態計測情報、に、孔辺細胞が膨張すると弓型に変形して気孔が開く。逆を無償で公開している。特に、三次元再構築蛍光画像は細に孔辺細胞が収縮すると気孔は閉じる（図 2）。孔辺細胞

胞内構造の立体的な分布や形状を視覚的に把握することの膨圧運動の機構に関しては盛んに研究が進められておができるため、教育にも活用して頂ければ幸いである [7]。

り、私たちのグループもオルガネラや細胞骨格系などの細なお、今回の解析に供した各種蛍光マーカータンパク質発胞内構造の寄与に着目して解析を進めている [4, 6]。私た

現株について、野生株と比較して孔辺細胞の形状、細胞極

ちは蛍光タンパク質の細胞内局在解析のモデル系として性、気孔開閉能に顕著な差が無いことを確認している [4]。

も孔辺細胞は有用な材料だと考えている。まず、孔辺細胞本研究では連続光学切片像から最大輝度投影像を得るこは葉の表面に位置しており、顕微鏡観察のためのサンプルとにより、二次元的な細胞内局在の定量評価に取り組んだ。

作成が容易である。また、成熟した孔辺細胞は大きさや形状が比較的均質であるとともに、気孔に対して近位側-遠細胞内局在確率マップ: 複数の蛍光画像の平均化

位側で明確な細胞極性があり、オルガネラや細胞骨格系の孔辺細胞は比較的形状が均一な細胞とは言え、当然なが偏在も認められる。このような特徴から、孔辺細胞は細胞

らその大きさや形状にはばらつきがあり、そのままでは細図 3. 顕微鏡画像データベース LIPS

図 4. 細胞内局在確率マッピングのための画像処理－7－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
胞内局在確率マップを得ることは難しい。そこで、すべてマップを図 5 に示す。

の孔辺細胞を平均的な形状へ画一化するための画像処理が必要となる。本研究では、まず明視野画像を用いて解析

平均輝度の細胞内分布に基づくクラスタリング解析

対象とした全 2000 細胞の孔辺細胞に対して外接矩形を手

クラスタリングはデータ間の類似度に基づいてデータ動で設定し、長辺および短辺の平均値を求めた。すべての群を整理する分析手法のひとつであり、生命科学分野にお蛍光画像に対して設定した外接矩形を平均サイズになる

いては遺伝子配列や遺伝子発現パターンの解析などによように画像変形するとともに、細胞ごとの明るさのバラつく用いられる。私たちは顕微鏡画像の解析においてもクラきを軽減するため、蛍光輝度を標準化した（図 4a）。このスタリングが有用であることを示してきた [6]。ここでは、

ように、細胞サイズと輝度を標準化した画像群の一部は細胞内局在確率マップの類似性を評価するため、各画素にLIPS データベースにて公開している（LIPS dataset III;

おける輝度に基づくクラスタリングを行った。なお、元のhttp://hasezawa.ib.k.u-tokyo.ac.jp/lips/images.html ）。

細胞内局在確率マップは 304×119 画素であったが、次元

この標準化蛍光画像の平均を各蛍光マーカーについて得縮約のために 70×27 画素へ画像を縮尺した後に、全 1890

た（図 4b）。さらに、細胞長軸方向に関してはオルガネラ

画素の輝度を測定した [4]。20 種類の蛍光マーカータンパの偏在など明確な細胞極性は認められなかったことから、

ク質について、自己組織化マップによるクラスタリング結細胞端部から細胞中央部にかけて対称的に加算平均像を

果を図６に示す。類似したデータは自己組織化マップ上に得て（図 4c）、最終的な細胞内局在確率マップとした [4, 5]。

おいて近くに位置する。解析の結果、例えば図６の左下に各々の蛍光マーカータンパク質に関する細胞内局在確率

位置する微小管マーカーである GFP-tubulin と微小管プラ
ス端マーカーである GFP-EB1 のように、細胞内局在の類
似性に応じてクラスターを形成していることが確認でき、本手法の妥当性が示唆された。また、GFP-mTn は植物のアクチン繊維マーカーとして知られているものの、アクチン繊維に加えて細胞核においても局在が認められる。一方、
GFP-ABD2 も同様に植物のアクチン繊維マーカーであるが、GFP-mTn のような細胞核でのシグナルはほとんど認められない [6, 8]。両者は自己組織化マップ上で近くに位置しており、アクチン繊維局在という共通性が見てとれる

図 5. 各種蛍光タンパク質の輝度平均に基づく細胞内局在確率

一方で、興味深いことに、小胞体マーカーである GFP-ER
は GFP-ABD2 よりも GFP-mTn の近くに位置していた（図６、青矢印）。この結果は、小胞体はアクチン繊維と共に細胞表層に局在するだけでなく、核膜とも繋がっているた

図 7. patrol1 変異による GFP-AHA1 の小胞状構造の内在化

図 6. 輝度平均に基づく細胞内局在確率クラスタリング－8－Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

めに細胞核にも局在が認められる GFP-mTn との類似性が細胞内局在確率マップでは両者はよく類似しており（図 5、高くなったと解釈できる。このように、本手法は事前の知GFP-AHA1, GFP-AHA1 in patrol1 mutant）、自己組織化マッ識にとらわれずに細胞内局在を再確認する上でも有益とプ上でも近くに位置していた（図 6、左上）。この結果は、思われる。

GFP-AHA1 の小胞の出現位置に偏りがなく、輝度平均に基づく方法では patrol1 変異による GFP-AHA1 の局在変化を

複数画像の標準偏差による GFP-AHA1 小胞状構造の検出

検出できていないことを示している。そこで、GFP-AHA1

シロイヌナズナのプロトンポンプの一種である AHA1の小胞化を細胞内局在確率マップにより検出するため、小は主に細胞膜に局在し、気孔開口に必須な細胞膜の過分極

胞状構造が出現した場合の細胞膜近傍における輝度の不を引き起こす。私たちは動物のシナプス小胞の融合に必要

均一性に着目し、複数細胞の輝度の平均ではなく標準偏差な MUNC-13 の植物のホモログである PATROL1 の欠損変による検討を試みた。標準偏差による細胞内局在確率マッ

異体において、GFP-AHA1 が小胞状構造として内在化する

プを図 8 に示す。一見して、ペルオキシソームやエンドソことを報告しており、PATROL1 は少なくとも孔辺細胞にーム、ゴルジ体といった小胞状のオルガネラの構造が強調

おいて AHA1 を細胞膜に局在化させる機能を持つと考えされているのが見てとれる（図 8）。輝度に基づくクラスている [9, 10]。野生株背景および patrol1 変異体背景におタリングを実施したところ、輝度平均に基づくクラスタリ

ける個々の孔辺細胞での GFP-AHA1 局在の見た目の差異

ングと同様に、主な細胞内局在が共通の蛍光マーカーは近は顕著であるにもかかわらず（図 7）、輝度平均に基づく

くに位置することが確認された。その一方で、輝度平均の場合とは異なり、patrol1 変異体背景における GFP-AHA1
局在は、野生株背景における GFP-AHA1 および細胞膜マーカーである GFP-PIP2a（野生株背景）に対して離れて位置した（図９、青矢印）。この結果は、標準偏差の導入によって patrol1 変異による GFP-AHA1 の小胞化を検出できたことを示している。このように、どのような特徴量を利用するかによってクラスタリング結果は大きく変わり得るため、研究目的に応じた適切な統計量の設定が必要となる。

図 8. 各種蛍光タンパク質の標準偏差に基づく細胞内局在確率

おわりに
本稿では、私たちが蛍光タンパク質の細胞内局在を定量的に評価するために取り組んだシロイヌナズナの孔辺細胞をモデルとした細胞内局在確率マッピングと画像クラスタリングに関する研究を紹介した。ここでは焦点面に対して垂直方向に投影した二次元画像に対する解析について述べたが、同様の解析を三次元画像に応用することも可能である。本研究手法は、解析対象とする細胞の形状が均一な方が望ましいという制限があるものの、条件さえ整えば、蛍光タンパク質の細胞内局在を議論する上で有用な方法と考えている。また、本稿で紹介した解析例では気孔の開度については考慮せずにあらゆる開き具合の孔辺細胞を解析対象としたが、私たちは開口時および閉鎖時それぞ

図 9. 輝度の標準偏差に基づく細胞内局在確率クラスタリング

れの輝度平均に基づく細胞内局在確率マップの差分から、－9－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
気孔開閉に伴う小胞体の移動という新奇の細胞内動態を3.

Pelet S, Dechant R, Lee SS, van Drogen F, Peter M (2012)

見出している [4]。この小胞体の移動は複数の蛍光顕微鏡

An integrated image analysis platform to quantify signal

画像による統計的解析だけでなく、白色光照射による気孔transduction in single cells. Integrative Biology 4:

開口、および孔辺細胞に隣接した表皮細胞のレーザーアブ

1274-1282.

レーションによる強制的な気孔開口においても起こるこ

4.

Higaki T, Kutsuna N, Hosokawa Y, Akita K, Ebine K,とを経時的な観察により確認できた [4]。このように本手

Ueda T, Kondo N, Hasezawa S (2012) Statistical organelle法は新たな細胞生物学的なイベントを発見する上でもそdissection of Arabidopsis guard cells using image databaseの威力を発揮すると考えられる。

LIPS. Scientific Reports 2: 405.

細胞生物学分野において、蛍光タンパク質の局在や細胞

5.

Higaki T, Kutsuna N, & Hasezawa S (2012) Probabilistic

内構造の分布を表現する場合、印象的な美しい顕微鏡画像

mapping and image clustering for quantitative assessment

を一枚だけ示すことも多い。研究者渾身の顕微鏡画像は有of fluorescent protein localizations in Arabidopsis guard

無も言わせぬ説得力があるが、たまたま撮影することのでcells. Protocol Exchange doi: 10.1038/protex.2012.013.

きた「奇跡の一枚」をあたかも全ての細胞で起きているか

6.

Higaki T, Kutsuna N, Sano T, Kondo N, Hasezawa Sのように思わせてしまう危険性を持つことも否定できな(2010) Quantification and cluster analysis of actin

い。こういった顕微鏡画像データのバイアスを検証するにcytoskeletal structures in plant cells: role of actin bundling

は、やはり顕微鏡撮影の実験を複数細胞で繰り返し、多量

inの画像を統計的に解析する他に手だてはないと思われる。

Arabidopsis guard cells. The Plant Journal 61: 156-165.

最近では顕微鏡撮影装置や画像処理技術の発展に伴って、

7.

stomatal

movement

duringdiurnalcyclesin

Higaki T, Kutsuna N, Hasezawa S (2013) LIPS database

ハイコンテントアナリシスと称される多量の画像取得おwith LIPService: a microscopic image database of

よび画像解析のプラットホームも身近な存在になりつつ

intracellular structures in Arabidopsis guard cells. BMCある。これまで研究者の主観に基づく定性的な判断に留ま

Plant Biology 13: 81.

っていた細胞内局在が、客観的かつ定量的に決定されるよ8.

Higaki T, Sano T, Hasezawa S (2007) Actin microfilament

うになる時代が着実に近づいているのではないかと期待

dynamics and actin side-binding proteins in plants.

している。

Current Opininon in Plant Biology 10: 549-556.
9.

Hashimoto-Sugimoto M, Higaki T, Yaeno T, Nagami A,
Irie M, Fujimi M, Miyamoto M, Akita K, Negi J, Shirasu

謝辞
共同研究者である東京大学新領域創成科学研究科・馳澤K, Hasezawa S, Iba K (2013) A Munc13-like protein in

盛一郎教授、朽名夏麿助教、秋田佳恵さんに心より感謝いArabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is

たします。また、本研究は科学研究費助成事業（若手研究essential for stomatal responses. Nature Communications(A)、課題番号 25711017）の助成を受けました。ここに謝4: 2215.
10. Higaki, T, Hashimoto-Sugimoto M, Akita K, Iba K,

意を示します。

Hasezawa, S (2013) Dynamics and environmental
引用文献

responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells.

1.

Plant & Cell Physiology 55: 773-780.

Huh WK, Falvo JV, Gerke LC, Carroll AS, Howson RW,
Weissman JS, O'Shea EK (2003) Global analysis ofprotein localization in budding yeast. Nature 425:686-691.

2.

Joyce AR, Palsson BØ (2006) The model organism as asystem: integrating 'omics' data sets. Nature Reviews
Molecular Cell Biology 7: 198-210.
－10－(2013 年 12 月 20 日受付、2014 年 1 月 10 日受理)

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

特集「顕微鏡で測る」
測定装置としての顕微鏡を用いた生物機能の解析
村田 隆 1*、稲田 のりこ 2、朽津 和幸 3
1 基生研･生物進化；2 奈良先端大･バイオ・植物グローバル；3 東京理科大･理工･応用生物科学* E-mail: tkmurata@nibb.ac.jp

顕微鏡は、物体の微細な構造を拡大して観察する装置、は、本号及び次号において、顕微鏡を使った測定解析の実

つまり形を見る道具である。生物学において、顕微鏡の開際や、新しい手法の開発の現状について、特集を組むこと

発は、生物の基本単位である細胞の発見と細胞生物学の発にした。

展につながる非常に重要なものであった。その後も顕微鏡

本号では、稲田ら（奈良先端大）が、一般に蛍光の定技術の進化により、裸眼では見ることのできない生物の微量に用いられる蛍光強度ではなく、蛍光寿命をパラメータ細構造が次々と明らかになり、更に写真やデジタル画像のーとして、細胞内温度を定量解析する新技術について紹介

撮影装置というデータ記録技術の確立は、生物機能の理解する。また、北村（北海道大）は、蛍光相関分光法と FRETに大きな貢献を果たしてきた。

（蛍光共鳴エネルギー移動）の定量的解析により、タンパ

一方、生物機能を理解するためには、構造の観察のよ

ク質凝集体の分解と毒性の機構について明らかにした例

うな形態の定性的な解析のみならず、細胞内の環境やそのについて紹介する。朽津・花俣ら（東京理科大）は、蛍光

構成要素の動態などの機能的情報を定量的に解析するこの pH 依存性が異なる 2 種の蛍光タンパク質を直列につなとが必要である。従来は、細胞の機能を理解する上で欠かいだプローブを使って、細胞質から酸性コンパートメント

すことのできない遺伝子発現やタンパク質量の変化など（液胞）へのオートファジー（細胞内自食作用)の動態をの量的情報は、破砕した細胞抽出液を用いた分子生物学

定量的かつ簡便に解析した例を紹介する。

的・生化学的手法により解析することが一般的であった。

次号では、今井ら（基生研）が、発光を用いた一細胞

しかしながら、こうした手法では、生きている組織中のレベルでの遺伝子発現の定量化の試みについて、村田（基個々の細胞の振る舞いを知ることは難しい。

生研）は、光退色法を用いて細胞骨格の動態を定量した例

近年、蛍光タンパク質や他の化学プローブの発達によを紹介する。三輪（筑波大）は新規蛍光色素を用いた蛍光

り、細胞内のタンパク質動態についての量的情報、更には寿命計測やマウス非侵襲イメージングについて紹介する

pH などの細胞内環境について様々な情報が得られるよう予定である。

になった。また画像撮影技術の進歩により、顕微鏡の写真

本特集の企画は、2014 年 3 月 20 日に日本植物生理学

撮影装置は、銀塩フィルムから、半導体や真空管を用いた会第 55 回年会のシンポジウム「顕微鏡で測る－測定装置

CCD（電荷結合素子）、CMOS（相補型金属酸化膜半導体）、としての顕微鏡を用いた生物機能の解析」をきっかけとし

PMT（光電子増倍管）などの定量性に優れた受光素子に置て始まった。広範な分野の読者に研究の現状と展望を解説

き換えられ、顕微鏡下の各々の構造から来る光を定量できすることを目指した本特集が、学際的な連携研究の呼び水るようになった。これらの技術進歩は、生きている生物内となり、今後の生命科学の発展に少しでも寄与することがや細胞内の微小空間の様々な情報を測定し、定量的なデー

できれば幸いである。
（2014 年 5 月 27 日投稿;

タを得ることを可能にした。
空間･時間分解能の高い定量測定装置としての顕微鏡は、今後の生命科学研究に欠かすことができないツールとなることが予想される。このような状況を踏まえ、本誌で－11－

2014 年 5 月 29 日受理）

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

特集「顕微鏡で測る」
蛍光相関分光法と FRET を用いた細胞内タンパク質品質管理機構の解析北村朗

北海道大・院・先端生命科学* E-mail: akita@sci.hokudai.ac.jp
要旨
細胞が恒常性を維持するために、タンパク質は合成と分解、輸送などの点で調節を受けている。このようにして保たれた細胞恒常性を「タンパク質恒常性」という。タンパク質恒常性の破たんは神経変性疾患などの病因となると考えられている。筆者らは、蛍光相関分光法、FRET 法、光活性化型蛍光タンパク質などを用いることで、神経変性疾患の一つである筋萎縮性側索硬化症 (ALS)の原因因子である SOD1 タンパク質凝集体形成と除去の機構を明らかにした。さらに、これらの蛍光イメージング法で得られた結果と、古典的な生化学解析の結果を比較または統合的に解釈することで、より詳細な機構の解明を行った結果についてまとめて紹介する。

細胞内タンパク質の誕生と死―タンパク質の品質管理―

しく折り畳み機能的なタンパク質へとまとめあげるフォ細胞が恒常性を維持するためには、数々の分子がそれぞールディング過程が必要である [1]。そしてミスフォール

れの機能を維持することが重要である。タンパク質はこのディングしてしまったタンパク質（不良品）は分解して壊ような細胞恒常性を維持するために重要な生体分子であす必要がある。これらの過程をまとめて、細胞内におけるる。それでは、生命の基本単位である細胞の恒常性を維持「タンパク質の品質管理機構」と呼ばれている [2]。このするために、タンパク質にどのようなことが求められるのような品質管理機構と共に細胞内外への輸送環境など生であろうか。それは、「量」と「質」であると解釈するこ命プロセスが維持されている状態を「タンパク質恒常性とが出来る。タンパク質の「量」と「質」を維持するため（Protein homeostasis/Proteostasis）」という[3, 4]。

にはどのようにすればよいか。それは工場における製品生産を思い浮かべるとわかりやすい。工場で生産される製品

細胞内タンパク質凝集体の細胞毒性

は、需要に応じた供給量と品質を維持する必要がある。こ細胞内では翻訳されたポリペプチド鎖を機能的なタンのような維持機構は「工場製品の品質管理」と言われる。

パク質へとフォールディングする際に介在するのは「分子細胞内におけるタンパク質の生産過程では、遺伝子からのシャペロン」である。この分子シャペロンはタンパク質恒

転写、リボソームにおける翻訳、そしてポリペプチドを正常性を維持するために重要な一つ目の砦である [1]。次に、細胞内のタンパク質分解システムには、主要な二つの経路が知られている。ひとつはユビキチン－プロテアソーム経路、もうひとつはオートファジー－リソソーム経路である[5, 6]。前者のユビキチン－プロテアソーム経路は、不要になったタンパク質に多量体化ユビキチンタンパク質で標識をする。この標識を「ポリユビキチン化」という。ポリユビキチン化されたタンパク質は、プロテアソームに送られ、タンパク質はポリペプチドの状態へと解きほぐされながら、針の穴に糸を通すようにプロテアソームの中へ送り込まれアミノ酸へと分解される。後者のオートファジー

図 1. 細胞内タンパク質の品質管理機構－リソソーム経路は、タンパク質のみならずオルガネラな－12－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

ども含めて不要となった対象を脂質の二重膜で隔離し、リでつくりだした微小な検出領域に蛍光分子が出入りする

ソソームと融合させて分解するシステムである。これらのことにより生ずる蛍光ゆらぎを測定し、その自己相関関数

タンパク質分解経路が正しく働かなくなると、ミスフォーを計算することで、蛍光分子の大きさと、検出領域内の平ルドしたタンパク質が増加する。増加したミスフォールド

均分子数を解析する手法である。測定された蛍光強度の平タンパク質が効率よく除去されない場合は凝集する [6]。

均値を、検出領域内の平均分子数で割ると、単一粒子あた

この凝集状態には数～十量体程度の「オリゴマー」から、りの平均蛍光強度 (Counts per molecule; CPM) が求められ

数 μm 程度という光学顕微鏡で容易に観察できるほどのる。この CPM 値の増大は凝集体解析において重要な情報

大きさに至り、「封入体」と呼ばれるものもある。こういをもたらしてくれる。細胞抽出液などの場合、蛍光分子でった凝集体は、他の正しくフォールディングしたタンパク標識されたタンパク質が、自己会合して凝集体を形成して質に結合してその機能を失わせることで、細胞にとって毒いるのか、あるいは内在性のタンパク質と結合して分子量となりうることが示唆されている [7, 8]。このようなタンが大きく計測されているのかという問題点が出てくる。

パク質凝集体が原因であると考えられている病気として、CPM 値はこの問題に対し、自己会合している分子種が存

神経変性疾患、白内障、アミロイドーシスなどが知られて在することの直接的な証拠となる。著者らの研究では、神いる。神経変性疾患では、細胞内外にタンパク質が集積し経変性疾患のひとつである筋萎縮性側索硬化症 (ALS)のた「封入体」が病理学的によく高頻度で観察されることが原因因子である ALS 関連変異型 SOD1 タンパク質に黄色

多く、さらに、「封入体」には、ユビキチン化されたタン

蛍光タンパク質 (YFP)を融合し、機械的に破砕した細胞抽

パク質が豊富に含まれることから、細胞内タンパク質分解

出液の可溶性画分で凝集形成解析を行った [15]。この結系の破たんによるミスフォールドタンパク質の増加が「封果、プロテアソーム活性の阻害時、拡散係数より 1 MDa

入体」形成の重要な契機となっていると考えられていると推定される SOD1 分子種が出現した。さらに、CPM 値[7, 9]。目の水晶体でクリスタリンタンパク質が変性し凝の増加が見られた。一方、野生型 SOD1-YFP では変化は

集すると白く濁り光を通しにくくなるため、これが白内障見られなかった。次に、同様に調整した細胞抽出液に対し、の原因となることが知られている [10]。また、細胞外の抗 YFP 抗体による免疫沈降を行った後、抗ユビキチン抗タンパク質が構造変化を起こし、βシート構造に富んだ不体でウェスタンブロットを行ったところ、プロテアソーム

溶性のアミロイドという繊維状構造を形成すると、アミロ活性低下に伴い、ALS 変異型 SOD1-YFP はポリユビキチ

イドが体内の臓器などに沈着し、機能不全を引き起こすと、ン化された分子種が増えていることを確認した。これらのアミロイドーシスと呼ばれる [11]。どの病気においても結果は、可溶性画分中に SOD1-YFP の凝集オリゴマーと、タンパク質のフォールディング状態が変化することが共

ユビキチン化された SOD1-YFP が混在していることを示通項である。また、凝集したタンパク質の分子量はさまざ唆している。

まな大きさを持っているが、なかでも数量体～数十量体程

蛍光相関分光法は、分子量が一サンプルあたりの解析に度の可溶性オリゴマーが強い細胞毒性を獲得すると考え必要なサンプル量が数十マイクロリットルですみ、さらに、られている。

測定時間が数分程度であることから、多くのサンプル数を解析する上できわめて有用なツールであると考えられる。
蛍光相関分光法のもう一つ重要な利点は、生細胞内での凝集体の大きさを測る―蛍光相関分光法―
それでは、タンパク質凝集体の大きさを測るためにはど測定が可能なところである。上述の ALS 関連変異型

古典的には、ゲル濾過

SOD1-YFP を発現する生細胞のプロテアソーム活性を阻法やショ糖密度勾配超遠心分画などの生化学的手法が使害し、蛍光相関分光法測定を行ったところ、有意な拡散係われていた。ただし、これらの実験系は準備から検出まで数の低下と CPM 値の上昇が計測された [15]。このことは、に長い時間を要する。そこで、著者らは、蛍光相関分光法

生細胞内においても変異型 SOD1-YFP の凝集オリゴマー(Fluorescence correlation spectroscopy; FCS)を利用することが形成されていることを示唆している。ただし、生細胞内にした [12-14]。蛍光相関分光法は共焦点レーザー顕微鏡

においては、さまざまな生理的相互作用が存在することはのようにすれば良いであろうか？

－13－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
予想できる。そのため、測定された拡散係数の解釈は慎重

また、筆者の属する研究室では、FCCS 法を用いることに行わなければならない。著者らのグループが行った別ので、生細胞内における解離定数 (Kd)を求める系を確立し研 究 で は 、 も や も や 病 リ ス ク 因 子 で あ り 、 ATPases

た [19]。FCCS 法では、蛍光相関分光法同様に、各蛍光分

Associated with diverse cellular Activities (AAA+)ファミリー

子の平均分子数と、相互作用している分子の割合が求めらに属する Mysterin/RNF213 タンパク質の生細胞内におけるれる。よって、濃度に変換することで解離定数の算出が可オリゴマー化を蛍光相関分光法で解析した [16]。ここで能である。

は、生細胞内で測定された拡散係数を元に、Stokes-Einstein

ただし、FCCS 法は相互作用相手が既知でなければ適応関係式による球状分子として仮定したときの分子量を算が困難な手法である。相互作用相手を見つけ出すためには、出した。その結果、AAA+ファミリータンパク質の性質か

免疫沈降－マススペクトロスコピー (IP-MS)法などのよらは六量体を形成すると考えられていた Mysterin が、細うなプロテオーム解析の技術と組み合わせることが肝要

胞質で拡散する成分のうち約半分が単量体として存在すであると考えられる。著者らは一つの検討として、ALSることが明らかとなった。CPM 値は単量体 GFP と比較し関連 TDP43 タンパク質に着目した。この TDP43 タンパクて増加しなかったことも、この単量体説を支持する結果と質が切断されて生じるカルボキシル末端断片なった。

(TDP43CTF) は、全長よりもより凝集しやすい。そこで、
この TDP43CTF に結合するタンパク質を、IP-MS 法により調べたところ、分子シャペロンである Hsp70 が同定された。そこで、GFP-TDP43CTF と Hsp70-RFP を共発現した細胞抽出液を FCCS 法で解析したところ、相互作用が検出された（未発表データ）。この結果は、分子間相互作用解析に FCCS 法が利用できることを示している。
従来型共焦点顕微鏡の光学系を元にした FCCS 法の典型的な問題点としては、10 μM 以上の高濃度域における解

図２. 蛍光相関分光法で得られる測定値の解釈

析が難しいことが挙げられる。より高濃度での測定を可能にするためには、検出領域の体積を減らすことが一つの解凝集体と相互作用するタンパク質を調べる―蛍光相互相決法である。そのために、超解像蛍光顕微鏡技術の一つで

関分光法―

あ る STED (Stimulated emission depletion) 顕 微 鏡 と 、

蛍光相関分光法の有用性は前項で概説したが、一つ大き

FCS/FCCS との組み合わせが検討されている [20]。また、な欠点が存在する。それは、相互作用する異種の相手が不今回紹介したものは二色 FCCS 法であり、二種類の分子間明な点である。この問題点を解決するための方法として、相互作用のみを解析する手法であったが、四色 FCCS 法も蛍光相互相関分光法(Fluorescence cross-correlation

spectroscopy; FCCS)がある [17]。相互作用相手を異なる色の蛍光色素でラベルし、二色蛍光シグナル間の同時性を検出することで、相互作用の強弱を調べることができる。
著者らのグループは、細胞間でタンパク質の形質が遺伝する酵母プリオンと分子シャペロンとの相互作用について、FCCS 法を用いて検出することに成功した [18]。FCCS
法も蛍光相関分光法同様、数十マイクロリットル程度の溶液量で済み、短時間で測定が可能なことから、免疫沈降－
ウェスタンブロット法などの結合実験と比較して簡便に解析ができると思われる。

図３．ドナー･アクセプター間の立体配座が FRET に及ぼす影
響の模式図

－14－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

報告されている [21]。これは、六通りの分子間相互作用

計測された。蛍光相関分光法を用いた解析結果から、分子を同一時空間的に測定することが可能であることから、今量 1 MDa 程度のオリゴマーはこのときすでに形成してい後の生物学応用が期待される。

たので、この FRET は、SOD1 タンパク質のオリゴマー化による構造変化を捉えているものと思われる。続いて、プ
ロテアソーム活性阻害を 16 時間行うと、中心体近傍にア凝集体の構造を調べる―FRET 法―
これまで述べてきた蛍光相関分光またはその発展系でグリソーム様の封入体構造が出現した。このアグリソームある蛍光相互相関分光法は、分子の動きと数に着目するた様封入体構造中における FRET 効率は平均 38%であった。

めの方法であったが、凝集体を知るためには、凝集体に含以上のことは、プロテアソーム活性阻害時、まず細胞質でまれる分子構造を解析する必要がある。このような構造に形成されたオリゴマーが、次に中心体近傍のアグリソーム

対してアプローチするための手法として、蛍光共鳴エネル様封入体へと運ばれて、分子間の立体配座がより FRET がギ ー 移 動 (Förster/Fluorescence resonance energy transfer;

起こりやすいものに変化していることが示唆された。さらFRET) 法がある。FRET は、おおよそ 10 nm 以内に近接し、に興味深いことに、アクセプターを cp173mVenus から、エネルギーが移動しやすい相対的配座にある二つの蛍光

通常型の mVenus へ置換した SOD1-G85R-mVenus へ変更す分子間で起こる物理現象である。理論的には、蛍光分子間

ると、アグリソーム様封入体における FRET 効率は平均距離の近接は FRET を起こす必要条件にしか過ぎないこ

10%へと大きく減少した。円順列変異は蛍光タンパク質発とを理解しておかねばならないであろう。FRET を細胞な色団の向きを変化させることから、アグリソーム様封入体

どでイメージング計測するための手法については、文献に含まれる変異型 SOD1 は、ランダムな立体配座で分子間22 と文献 23 に詳しいが、ここでは最も重要な点のみを書が会合して凝集しているのではなく、規則的な形で会合しき記しておきたい。それは、「FRET 効率」と「FRET インていることが示唆された。このように、アクセプターの向デックス」の違いである。前者の「FRET 効率」とは、励きを変更して FRET 測定を行い、比較することで、凝集タ起状態にあるドナー分子のうち、アクセプター分子にエネ

ンパク質の立体配座に関する情報を抽出することができルギーを受け渡す分子の割合を示し、アクセプターを褪色る。

させたときのドナー蛍光強度変化（アクセプターフォトブ
リーチング法）や、ドナーの蛍光寿命測定から求められる。

変異型 SOD1 を含む細胞内封入体のプロテアソーム活性

後者の「FRET インデックス」は、ドナー･アクセプター

依存的ダイナミクスと細胞毒性の蛍光強度比を算出することで、FRET シグナルを強調す

細胞内タンパク質の品質管理においてタンパク質分解る方法であり、計測装置によって値は変化する。分子間が重要な経路であることは述べてきた。では、このタンパ

FRET を利用する場合、より定量的である「FRET 効率」

ク質の分解を可視化解析するためにはどのようなアプロを計測するのが良いと思われる。そこで筆者らは、プロテーチが可能であろうか。先述の変異型 SOD1-G85R-YFP タ

アソーム活性阻害時、ALS 関連変異をもつ SOD1 タンパ

ンパク質を、プロテアソーム活性阻害によりアグリソーム

ク質が形成する凝集体内部における分子間立体配座につ形成させ、続いてプロテアソーム阻害剤を培地中から洗いいて解析するために、シアン色蛍光タンパク質で単一成分流した後、蛍光タイムラプスイメージングを行った [15]。

の 蛍 光 寿 命 を 示 す mTFP1 を 融 合 し た 変 異 型 SOD1

細胞内に形成されたアグリソーム様封入体は、半減期９時(SOD1-G85R-mTFP1)と 173 番目の残基で円順列変異を施間で消失した。このとき、プロテアソームで分解されるデした mVenus を融合した SOD1-G85R-cp173mVenus を共発

グロンタグと融合した GFP-CL1 タンパク質を発現させた

現させた細胞に対し蛍光寿命イメージング法により解析

細胞で、プロテアソーム活性の回復をモニターしたところ、を行った [15]。その結果、まず、プロテアソーム活性を阻害剤の除去後すみやかにプロテアソーム活性が回復し阻害しないとき、FRET は観察されなかった。次に、プロていることが示された。このことは、封入体に含まれた凝テアソーム活性阻害を開始してから 8 時間後、封入体構造

集タンパク質であっても、ときほぐされてプロテアソームが見られない細胞質において、 FRET 効率は平均 24%とで分解されることを示している。

－15－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
次 に 、 光 活 性 化型 GFP で ある PAGFP を 融 合したなかでも、蛍光相関分光法と FRET の手法は有用であり、SOD1-G85R-PAGFP を使って、プロテアソーム活性阻害時

さまざまな機構の解明に利用できるものであると思われと活性回復時におけるアグリソーム様封入体と細胞質にる。なかでも、神経変性疾患は細胞内タンパク質恒常性の存在する分子集団同士の交換速度を測定した。この結果、破たんにより引き起こされると考えられているが、タンパ

プロテアソーム活性回復時に交換速度が速くなっている

ク質のどのような構造変化や多量体化形成が具体的に細ことがわかった [15]。これは、プロテアソームの活性が胞毒性を獲得するのかについて、未解明な部分が多い。生回復すると、アグリソーム様封入体に集積した凝集タンパ

細胞内におけるタンパク質の状態を明らかにするために、ク質を分解するために再び細胞質へ送り出されることを

蛍光イメージングの手法は直接的かつ有用なアプローチ

意味すると解釈される。

であると考えられる。今後、新たな蛍光プローブの開発やさらに、封入体に含まれない、細胞質集団のSOD1-G85R-PAGFP を活性化した後、細胞の蛍光強度を観計測手法の確立により、病気の原因となる分子基盤を明らかにしていきたい。

察するという細胞質内パルスチェイスイメージングを行ったところ、プロテアソーム活性阻害時よりも阻害してい引用文献

ない時のほうが蛍光強度は速く減衰することがわかった。

1.

Hartl FU, Bracher A, Hayer-Hartl M (2011) Molecular

上述のパルスチェイスイメージング法を用いることで、局

chaperones in protein folding and proteostasis. Nature

在依存的なタンパク質分解速度を生細胞内で定量化する

475: 324-332.
2.

ことが可能になる。

of protein quality control. Cell 157: 52-64.

さらに、先項で述べた FRET 計測を、プロテアソーム活
性回復時に行った。結果は、プロテアソーム活性回復 10

Wolff S, Weissman JS, Dillin A (2014) Differential scales

3.

Balch WE, Morimoto RI, Dillin A, Kelly JW (2008)

時間後の時点でアグリソーム様封入体における FRET 効

Adapting proteostasis for disease intervention. Science

率が平均 14%まで低下した。このことから、封入体に取り

319: 916-919.

込まれた凝集タンパク質がときほぐされるとともに、封入

4.

Lindquist SL, Kelly JW (2011) Chemical and biological

体内部でもゆっくりと配座を変化させている可能性が考

approaches for adapting proteostasis to ameliorate protein

えられる。これらの知見から、封入体構造が静的な構造でmisfolding and aggregation diseases: progress andはなく、細胞内のタンパク質分解活性の阻害や回復ととも

prognosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 3:に、その性質をダイナミックに変化させることで、細胞にa004507.

おけるストレス回避やタンパク質品質管理を行っている

5.

Klionsky DJ, Schulman BA (2014) Dynamic regulation ofと予想される。このように、蛍光イメージングの手法を用

macroautophagy by distinctive ubiquitin-like proteins.

いることにより、タンパク質封入体の新たな特徴が明らか

Nature Structural and Molecular Biology 21: 336-345.
6.

になってきている。

protein aggregation. Trends in Cell Biology 10: 524-530.

さらに驚くべきことに、変異型 SOD1 を発現する細胞は、
プロテアソーム活性阻害時より活性回復時のときに細胞

Kopito RR (2000) Aggresomes, inclusion bodies and

7.

Morimoto RI (2008) Proteotoxic stress and inducible

死が増えることが明らかになった [15]。このことは、プ

chaperone networks in neurodegenerative disease andロテアソーム活性回復時に生じる凝集性オリゴマーが細aging. Genes and Development 22: 1427-1438.

胞にとってより強い毒性を持つのかもしれない。また、プ8.

Calamini B and Morimoto RI (2012) Protein homeostasis

ロテアソーム活性の変動が繰り返されると、細胞毒性がよas a therapeutic target for diseases of protein conformation.

り増加し、ALS を発症しやすくなるのかもしれない。

Current Topics in Medicinal Chemistry 12: 2623-2640.
9.

以上で述べてきたように、細胞内タンパク質恒常性を維持するメカニズムを明らかにする上で、蛍光イメージング、－16－

Ilieva H, Polymenidou M, Cleveland DW (2009) Non-cellautonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS
and beyond. Journal of Cell Biology 187: 761-772.

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

10. Moreau KL, King JA (2012) Protein misfolding and20. Eggeling C, Ringemann C, Medda R, Schwarzmann G,

aggregation in cataract disease and prospects for

Sandhoff K, Polyakova S, Belov VN, Hein B, vonprevention. Trends in Molecular Medicine 18: 273-282.

Middendorff C, Schönle A, Hell SW (2009) Direct

11. Radford SE, Weissman JS (2012) Special issue: theobservation of the nanoscale dynamics of membrane lipids

molecular and cellular mechanisms of amyloidosis.

in a living cell. Nature 457: 1159-1162.
21. Shcherbakova DM, Hink MA, Joosen L, Gadella TW,

Journal of Molecular Biology 421: 139-141.
12. Rigler R, Mets U, Widengren J, Kask P (1993)

Verkhusha VV (2012) An orange fluorescent protein with

Fluorescence correlation spectroscopy with high counta large Stokes shift for single-excitation multicolor FCCS

rate and low background: analysis of translational

and FRET imaging. Journal of the American Chemical

diffusion. European Biophysics Journal 22: 169–175.

Society 134: 7913-7923.

13. Lippincott-Schwartz J, Snapp E, Kenworthy A (2001)

22. 平岡泰、原口徳子、木村宏編 (2007) 生細胞蛍光イメ

Studying protein dynamics in living cells. Nature Reviews
Molecular and Cell Biology 2: 444-456.

ージング 共立出版
23. 宮脇敦史 (2010) 蛍光イメージング革命 秀潤社

14. Kitamura A, Kubota H, Pack CG, Matsumoto G, Hirayama
S, Takahashi Y, Kimura H, Kinjo M, Morimoto RI, Nagata
K (2006) Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine
toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell
Biology 8: 1163-1170.
15. Kitamura A, Inada N, Kubota H, Matsumoto G, Kinjo M,
Morimoto RI, Nagata K (2014) Dysregulation of theproteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant
SOD1. Genes to Cells 19: 209-224.
16. Morito D, Nishikawa K, Hoseki J, Kitamura A, Kotani Y,
Kiso K, Kinjo M, Fujiyoshi Y, Nagata K (2014)
Moyamoya disease-associated protein mysterin/RNF213
is a novel AAA+ ATPase, which dynamically changes its
oligomeric state. Scientific Reports 4: 4442.
17. Bacia K, Kim SA, Schwille P (2006) Fluorescencecross-correlation spectroscopy in living cells. Nature
Methods 3: 83-89.
18. Ohta S, Kawai-Noma S, Kitamura A, Pack CG, Kinjo M,
Taguchi H (2013) The interaction of Hsp104 with yeast
prion Sup35 as analyzed by fluorescence cross-correlation
spectroscopy. Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 442: 28-32.
19. Tiwari M, Mikuni S, Muto H, Kinjo M. (2013)
Determination of dissociation constant of the NFκB
p50/p65 heterodimer using fluorescence cross-correlation
spectroscopy in the living cell. Biochemical andBiophysical Research Communications 436: 430-435.
－17－(2014 年 5 月 3 日受付; 2014 年 5 月 26 日受理)

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

特集「顕微鏡で測る」
細胞の温度を測る
稲田のりこ 1*、林晃之 1、福田七穂 1、内山聖一 2
1 奈良先端大・バイオ・植物グローバル; 2 東京大・院・薬* E-mail: norikoi@bs.naist.jp

要旨
生物にとって、温度は最も重要な物理量である。生物の基本単位である細胞温度を計測することにより、細胞の状態について様々な情報を得ることができると考えられる。私たちは、新規の蛍光温度プローブと蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて、細胞内の局所的温度変化を正確に定量化し、温度分布を可視化する手法を、世界に先駆けて開発することに成功した。本稿では、私たちが開発した細胞内温度計測の手法と、それによって得られた結果について紹介する。また、蛍光温度プローブの改良に向けた取組みについても紹介する。

はじめにその手法により初めて明らかになった細胞内の温度分布

はじめに読者の皆さんに質問をしたい。細胞の中の温度はについて紹介する。また最後に、細胞内温度計測法のさら何度だと思いますか？

なる改良に向けて私たちが取り組んできたプロジェクト

恐らく、細胞内温度の研究を始めた当初の私たちがそうについても紹介したい。

であったように、大多数の方は「細胞の中の温度が何度であるか？」という問題について考えたことはないのではな

蛍光温度プローブ

いだろうか。少考の後、動物組織、細胞を扱う研究者の方筆者らが用いた蛍光温度プローブは、温度感受性高分子となら、「恒温動物である哺乳類なら 37℃前後」、植物分野

環境応答性蛍光団とを組み合わせたものである。温度感受の研究者なら「外気温と同じ」と答えるのではないかと思性ユニット NNPAM は、低温では NNPAM ユニットと溶媒う。しかし本当にそうなのだろうか？組織や細胞種、細胞の水分子との間で形成される水素結合により伸張した構の状態によって違いはないだろうか？細胞内部には様々造を取るものの、水溶液の温度が上昇すると水素結合が切な役割を担う細胞小器官があるが、それら細胞小器官の温度はすべて同じなのだろうか？
この問に答えるため、顕微鏡を使って細胞温度を測る技術の開発が、近年盛んに進められている[1-4]。顕微鏡は、光学顕微鏡なら最高で 200 nm、電子顕微鏡なら 2 nm という非常に高い空間分解能を有しており、細胞のような非常に小さい物質を対象とする解析には欠かすことができな
いツールである。筆者らは、そのような細胞内温度計測技

加熱術の発展に先駆けて、2012 年に細胞内の温度分布を高い冷却精度で計測し可視化する手法を報告し、更にそれを用いて細胞内部に温度差があること、細胞小器官ごとに温度が異なることを明らかにした[5-7]。

弱蛍光

強蛍光

本稿では、新規の蛍光温度プローブと蛍光寿命イメージ
ング顕微鏡（Fluorescence Lifetime Imaging Microscope、FLIM）を用いた細胞内温度計測法の詳細について説明し、図 1. ポリマー状蛍光温度プローブ FPT の化学式（上）と機能原理（下）。

－18－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

断され、NNPAM 内の疎水性相互作用により丸まった構造能を持ち、細胞内の温度分布を計測しうるプローブであるに変化する。一方蛍光性ユニット DBD-AA は、疎水性環ことが示された。

境で強い蛍光を発するという特徴を持っている。温度変化による NNPAM ユニットの構造変化を DBD-AA ユニット

蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）

が感知し、水溶液の温度上昇を蛍光強度の上昇として検出

FPT を COS7 細胞に導入し培地の温度を上昇させたときにするというのがこの蛍光温度プローブの原理である（図まず気づいたのが、細胞核での顕著な蛍光強度の上昇であ１）。

る。上述のように FPT の蛍光強度は温度の上昇とともに

内山らはこの原理に基づく蛍光温度プローブの開発に取組み、2003 年には水溶液中で機能する蛍光性高分子を上昇する。では細胞核の温度は細胞質よりも高いのだろう
か？

報告している[8]。更に 2009 年には、基本構造にイオン性

環境変化に応答して蛍光特性が変化する蛍光物質を用ユニットを導入することにより、細胞の中のような高イオ

いて定量的な解析を行う場合、蛍光強度は最も一般的に使ン環境でも沈殿することなく機能するナノゲル状蛍光温

われるパラメーターである。しかしながら蛍光強度は、励度プローブを開発し、生きている細胞の温度計測に成功し起光の強さ、検出器の感度などの画像取得条件、および、ている[9]。このナノゲル状の蛍光温度プローブは、培地

蛍光物質の濃度に大きく依存して変化する。特に、細胞内温度を 30℃以上に上げると細胞内でプローブ同士が集ま部における蛍光物質の局所的な濃度変化は大きな問題にってドット状の塊となる。この高温で塊になるという性質なりうる。FPT によって得られた結果についても、何らかのため、このプローブを用いた細胞内温度計測では細胞内の理由により細胞核に FPT が蓄積し、蛍光強度が高くな

部の温度分布を計測することが困難であり、蛍光顕微鏡とっている可能性が考えられた。

CCD カメラを用いて細胞全体の蛍光輝度を測定することによって細胞１個あたりの温度変化を計測した[9]。

この可能性を検証するために筆者らが用いたのが、蛍光物質の濃度への依存性が低いパラメーターとして知られ上述の蛍光温度プローブは、温度分解能が 27〜33℃のる蛍光寿命を計測する方法である。蛍光寿命とは、蛍光物間で 0.29〜0.50℃と非常に高いものであったが、上記の理質が励起されてから蛍光を発して基底状態に戻るまでに由から測定できる範囲、つまり空間分解能が細胞 1 個の単励起状態にとどまっている時間の長さであり、例えばフル位（50 μm 程度）に限られていた。より空間分解能を上げ、オレセインは 4 ナノ秒、オワンクラゲ由来の蛍光タンパク

細胞の中の温度分布をも計測できるようにと開発された

質 GFP は 3 ナノ秒程度の蛍光寿命値を示す。蛍光寿命値のが、2012 年に報告したポリマー状の蛍光温度プローブ

はその蛍光物質がおかれている環境に依存して変化する（Fluorescent Polymeric Thermometer、FPT）である（図１）。

ことから、蛍光寿命を可視化する FLIM 解析を行なうこと

これは、2009 年に報告されたナノゲル状蛍光温度プロー

により、微小空間の環境変化を捉えることができる。FLIM

ブと同じ基本構造を直鎖状にしたものであり、プローブ自8

Average fluorescence
lifetime / ns

体のサイズは、収縮時でナノゲル状のものが 51.2 nm に対し、FPT は 8.9 nm とずっと小さい。ナノゲル状蛍光温度
プローブと同様、温度特異的な応答性を示し、pH、イオ
ン濃度、タンパク質濃度など、細胞内で変化する可能性がある温度以外の要因には影響されない[5]。
FPT をマイクロインジェクションによりアフリカミド

7
6
5
4
28 30 32 34 36 38 40
Temperature / °C

リザル腎臓由来の培養細胞 COS7 に導入したところ、細胞核を含む細胞全体に蛍光が分布することが確認された。更に培地温度を 30℃以上に上げてもドット状の塊になるこ

図 2. 動物培養細胞抽出液における FPT の蛍光寿命と温度のとなく一様に分布していたことから、FPT は高い空間分解相関を示すグラフ。

－19－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
は、機器が高額であり、またその解析法が蛍光強度の計測

ギーが熱に変換されて放出され、細胞の温度が上昇するこなど従来の顕微鏡画像定量法とは大きく異なることから、とが知られている[11]。FPT を導入した細胞を脱共役剤で一般に広く利用されるには至っていないが、蛍光物質の濃処理したところ、30 分後にはミトコンドリア周辺で顕著度や画像取得条件の変化に影響を受けにくく、顕微鏡を用に蛍光寿命が長くなっている様子が観察されたことから、いた解析法としては非常に定量性が高い手法であると言ミトコンドリア周辺で見られた発熱が、確かにミトコンドえる。

リアの機能に由来するものであることが明らかになった。

動物培養細胞の抽出液を用いて温度依存的な FPT の蛍
光寿命変化を調べた結果、温度上昇に伴って蛍光寿命値が長くなることが確かめられた（図 2）。この蛍光寿命値の延長は、水素結合を形成していない蛍光団 DBD ユニットの割合が増加することに由来している[10]。このグラフから求められた FPT の温度分解能は 29〜39℃の間で 0.18〜
0.58℃であった。以下の解析では、このグラフを検量線として細胞内温度分布を計測した。

細胞内温度分布の解析

10 μm

FPT と FLIM による細胞内温度イメージング解析の結果、大多数の細胞において細胞核における FPT の蛍光寿命が蛍光寿命[ns]

長くなっていることが確認され（図 3）、確かに細胞核の温度は細胞質と比較して高いこと、またこの温度差は 1℃
近くにも達することが明らかになった。この結果は、細胞内で 1℃近くの温度差があるということを明らかにした図 3. COS7 細胞に導入した FPT の FLIM 像。低い温度を青、高い温度を赤の擬似カラーで示す。矢頭は中心体を示す。

初めての報告である。また、この細胞質と細胞核との温度

ここで、本稿の最初で提示した質問「細胞の温度は何度

差は細胞周期に依存して変化し、G1 期では細胞核と細胞なのか？」に立ち戻ってみたい。筆者らの研究は細胞内部

質との温度差が比較的大きいのに対し、S/G2 期では温度の温度差の数値化にとどまっており、実は細胞の絶対温度差が殆どなくなることがわかった[5]。

を数値化して示すには至っていない。検量線を元に数値化

多数の細胞について解析している途中で私たちは、細胞することは可能であるが、本当に細胞の温度がその値なの

核の横に高温のドット状構造が存在することに気がついかを検証する他の手段がないためである。しかしながら、た（図 3、矢頭）。免疫抗体染色の結果この高温構造が中最初の問に派生する「細胞内部の温度は均一なのか？」と心体であることが確かめられ、中心体付近の温度は細胞質

いう質問には、「細胞小器官ごとに温度は異なる」というの他の部分と比較して平均 0.8℃高いことが明らかになっ答えを与えることができた。更に細胞機能が細胞温度と密た[5]。

接に結びついていることを示し、様々な細胞機能を明らか

ミトコンドリアは細胞における発熱器官として知られて い る 。 ミ ト コ ン ド リ ア 染 色 剤 で あ る MitoTrackerにする手法として細胞温度の計測が今後大きな役割を果たす可能性を示すことができたと考えている。

DeepRed で染色し高倍率で観察した結果、ミトコンドリア
周辺で FPT の蛍光寿命が長くなっていることがわかった

新しい蛍光温度プローブの開発[5]。このミトコンドリア周辺での発熱が、ミトコンドリ

2012 年 の 論 文 で 使 用 し た FPT は 、 現 在 Diffusive

アの機能に由来するものであることを調べるため、ミトコ

thermoprobe と い う 商 品 名 で 市 販 さ れ て お り

ンドリアの脱共役剤である FCCP 処理を行った。FCCP で(http://www.funakoshi.co.jp/contents/7538)、細胞内温度に興細胞を処理すると、ATP 合成に使用される筈だったエネル

味を持つ研究者なら誰でも使用できるようになっている。

－20－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

しかし、この細胞内温度イメージング法を生命科学研究にいる。また、動物培養細胞以外の細胞種—特に筆頭著者のおけるより一般的な手法にするためには、まだいくつかの本来の専門である植物細胞への応用技術についても現在課題が残されていると考えている。

確立を進めており、これらの技術開発が、温度という観点課題の一つが細胞内への導入法である。FPT を細胞内に導入するにはマイクロインジェクション法が必要であるから細胞機能を探る研究発展のきっかけとなることと期待している。

が、プローブに細胞膜透過性があればより簡便に実験ができる。この点を改良するために開発されたのが、イオン性おわりにユニットをカチオン性の APTMA ユニットに変換した

最初に記載した通り、細胞内温度計測に関する技術開発はFPT である。細胞壁の存在とサイズの小ささからマイクロ現在非常に盛んに進められている。昨年だけでも、ナノダ

インジェクションによる導入が難しい材料である酵母細イヤモンド粒子を用いた細胞内温度上昇の計測[14]、サル胞を対象として作られたものであり、プローブと酵母細胞

モネラ菌の温度感受性ペプチドを GFP に結合させることを共培養して 20 分以内には速やかに細胞内に取り込まれによって GFP の温度依存的蛍光強度変化を増大させた蛍

る[12]。また酵母と同様に、動物培養細胞へも導入される

光温度計[15]、ラマン顕微鏡による細胞内温度計測[16]、ことが示されている[12]。

光音響顕微鏡を用いた細胞内温度計測[17]などの例が報もう一つの課題が、蛍光温度プローブの褪色耐性の改良

告されている。今後、著者らの開発した細胞内温度計と他である。FLIM の中でも、筆者らが用いている単一光子計の温度計を組み合わせて使用することにより、測定精度の測法は、蛍光強度の弱い試料でも測定が可能であると一般

検証や絶対温度の定量解析など、技術面での改良が期待さに言われている。しかしながら筆者らの経験では、蛍光強れる。また細胞内温度計の多様化により、温度という観点

度が弱くいわゆる S/N 比の低い試料では、蛍光寿命測定にからの解析がより一般的になることが期待される。著者らおけるノイズの影響が強くなり、蛍光寿命値が実際よりもの研究成果と本稿が、多くの研究者が細胞内温度と細胞機長く算出されるなど、正確な測定が難しくなる。一方、能との関係に興味を持つきっかけとなることを願ってい

FLIM のための画像取得には時間がかかる。温度イメージる。

ングでは 1 分かけて 1 枚の FLIM 像を取得するため、2012
年に報告した蛍光温度プローブは 1 回の FLIM 像取得でか

謝辞なりの褪色が観察されており、同じ試料の FLIM 像を経時本研究の遂行に当たり、JST 研究成果展開事業（先端計測

的に何回も取得するということが困難であった。温度プロ

分析技術・機器開発プログラム）、文部科学省特別教育研ーブの褪色耐性を向上させるために、蛍光ユニットの究経費

DBD-AA を DBThD-AA に変換した蛍光温度プローブを作

トップ教育推進プログラム、公益財団法人三菱財団による成し、褪色耐性を 10 倍向上させることに成功した[13]。

助成を受けました。ここに感謝の意を記します。

植物科学研究教育推進事業・植物科学グローバル

この改良により、今後、薬剤処理による経時的な細胞内温度変化を解析するというような実験も可能になると考え

引用文献

ている。

1.

Palacio F, Carlos LD (2012) Thermometry at the

更に現在、この二つの改良点を組み合わせた蛍光温度プ

nanoscale. Nanoscale 4: 4799-4829.

ローブを動物培養細胞に適用し、簡便に細胞内温度分布をイメージングするためのプロトコールの確立を進めてい

2.

Jaque

D,

VetroneF(2012)

Luminescencenanothermometry. Nanoscale 4: 4301-4326.

る（林・稲田、未発表）。この新規蛍光温度プローブでも、細胞核と細胞質との温度差やミトコンドリア周辺の発熱

Brites CD, Lima PP, Silva NJ, Millan A, Amaral VS,

3.

Inada N, Uchiyama S (2013) Methods and benefits ofが観察されること（林・稲田、未発表）を確認しており、

imaging the temperature distribution inside living cells.

さらにこのプロトコールが様々な動物培養細胞に応用可Imaging in Medicine 5: 303-305.

能であること（福田・林・稲田、未発表）を明らかにして

4.

－21－

Wang XD, Walfbeis OS, Meier RJ (2013) LuminescentVol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

5.

probes and sensors for temperature. Chemical Society

Inada

Reviews 42: 7834-7869.

Environment-sensitive fluorophores with benzothiadiazole

Okabe K, Inada N, Gota C, Harada Y, Funatsu T,

andUchiyama S (2012) Intracellular temperature mapping

components of a fluorescent polymeric thermometer.

with

Chemistry – A European Journal 18: 9552-9563.

afluorescentfluorescence

6.

polymericlifetime

imaging

thermometer
microscopy.

Naturebenzoselenadiazole

TobitastructuresS

as(2012)

candidate

14. Kucsko G, Maurer PC, Yao NY, Kubo M, Noh HJ, Lo PK,

内山聖一、岡部弘基、稲田のりこ（2012）蛍光寿命測in a living cell. Nature 500: 54-58.

光化学 43:

15. Kiyonaka S, Kajimoto T, Sakaguchi R, Shinmi D,

24-27.

Omatsu-Kanbe M, Matsuura H, Imamura H, Yoshizaki T,

稲田のりこ、岡部弘基、林晃之、内山聖一（2013）新Hamachi I, Morii T, Mori Y (2013) Genetically encoded

規蛍光プローブと蛍光寿命イメージング顕微鏡を用

fluorescentthermosensors

visualize

subcellular

thermoregulation in living cells. Nature Methods 10:

Plant Morphology

25: 55-60.

1232-1238.

Uchiyama S, Matsumura Y, de Silva AP, Iwai K (2003)

16. Chiu YF, Huang CK, Shigeto S (2013) In vivo probing of

Fluorescent molecular thermometers based on polymers

the temperature responses of intracellular biomolecules inshowing

temperature-induced

yeastlabeled

with

phase

polarity-responsive

transitions

andbenzoflurazans.

Analytical Chemistry 75: 5926-5935.
9.

T,Park H, Lukin MD (2013) Nanometre-scale thermometry

いた細胞内温度計測イメージング

8.

Yoshihara

Communications 3: 705.

定による細胞内温度分布イメージング

7.

and

N,

cells

by

label-freeRamanmicroscopy.

ChemBioChem 14: 1001-1005.
17. Gao L, Zhang C, Li C, Wang LV (2013) Intracellular

Gota C, Okabe K, Funatsu T, Harada Y, Uchiyama S

temperature(2009) Hydrophilic fluorescent nanogel thermometer forphotoacoustic thermometry. Applied Physics Letters 102:

intracellular thermometry. Journal of the American

193705.

10. Gota C, Uchiyama S, Yoshihara T, Tobita T, Ohwada T(2008) Temperature-dependent fluorescence lifetime of apolymericthermometer,poly(N-isopropylacrylamide), labeled by polarity andhydrogenbondingsensitive

4-sulfamoyl-7-aminobenzofurazan. Journal of Physical
Chemistry B 112: 2829-2836.
11. Heytler PG, Prichard WW (1962) A new class of
uncoupling agents- carbonyl cyanide phenylhydrazones.
Biochemical and Biophysical Research Communications
7: 272-275.
12. Tsuji T, Yoshida S, Yoshida A, Uchiyama S (2013)
Cationic fluorescent polymeric thermometers with theability to enter yeast and mammalian cells for practicalintracellulartemperature

measurements.

withfluorescence-assisted(2014 年 5 月 5 日受付; 2014 年 5 月 23 日受理)

Chemical Society 131: 2766-2767.

fluorescent

mapping

Analytical

Chemistry 85: 9815-9823.
13. Uchiyama S, Kimura K, Gota C, Okabe K, Kawamoto K,－22－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング

特集「顕微鏡で測る」
植物のオートファジー動態の簡便な定量解析
花 俣 繁 1、 来 須 孝 光 1,2*、 朽 津 和 幸 1**
1

東 京 理 科 大 ･理 工 ･応 用 生 物 科 学 ; 2 東 京 工 科 大 ･応 用 生 物

E-mail: *kurusutkmt@stf.teu.ac.jp; **kuchitsu@rs.noda.tus.ac.jp

要旨
細胞内の大規模分解系であるオートファジー（細胞内自食作用）は、植物を含む真核生物の様々な高次生命機能に関与する。
一方、細胞の 90%以上を液胞が占める植物細胞においては、細胞内での動的なオートファゴソームの形成、そして液胞への分解産物の運搬というオートファジーの一連の動態（オートファジーフラックス）を簡便に観察することは難しく、植物のオートファジーフラックスの定量的なモニタリング技術の開発は重要な課題であった。我々は、オートファゴソームマーカーとして知られる ATG8 タンパク質のタバコホモログ（NtATG8a）と、性質の異なる 2 種類の蛍光タンパク質（mRFP1, YFP）を利用することにより、植物のオートファジーフラックスを非破壊的、且つ簡便に定量的に検出する方法を開発した。本稿では、YFP-NtATG8aの挙動を基に、新規に構築したオートファジープローブの特徴や、オートファジーの動態（フラックス）を定量的に評価する手法について述べる。

植物培養細胞におけるオートファジーマーカータンパク質の動態
細胞内の大規模分解系であるオートファジー（細胞内自食作用）の実行に関与する ATG（Autophagy-related）遺伝子群は、多くの真核生物に保存され、共通の機能を果たしている[1, 2]。
中でも、ATG8 はオートファゴソームマーカーとして、植物を含む真核生物に普遍的に有用であり、これまでに、モデル植物であるシロイヌナズナ、イネや、細胞内の分子動態の観察に適したタバコ培養細胞 BY-2 において、緑色蛍光タンパク質（GFP）
やその改変タンパク質と ATG8 群との融合タンパク質を用いることで、植物のオートファジー動態について解析が図 1. オートファゴソームのマーカータンパク質

進められて来た[1, 3-7]。
YFP-NtATG8 群（NtATG8a, b, c,d）を発現させたタバコ培養細胞において、栄養源が豊富な条件下では YFP のシグナルは
主に細胞質と核質において検出されるが、窒素やショ糖およ（YFP-NtATG8a）を発現させたタバコ培養細胞 BY-2。細胞をショ糖欠乏条件下で培養すると、細胞質において輝度の高い顆粒状の構造体が形成される。Bar = 20 μm

びリン酸欠乏条件下で培養すると、細胞質中に YFP-NtATG8sの局在化する構造体が増加する（図 1）。これらの構造体の形成過程は、蛍光顕微鏡を用いたリアルタイムイメージングに

YFP-NtATG8a による点状構造体（オートファゴソーム）数の変化
タバコ BY-2 細胞をショ糖欠乏条件下で培養し、共焦点レーより捉えることができ、YFP-NtATG8a の局在化するカップ状構造体はリング状構造体へと成熟し、形成したオートファゴ
ソームは最終的に液胞と融合し、消失する[5]。

ザー顕微鏡により観察すると、細胞質においてオートファゴ
ソーム数の増加が観察される[3, 5]。しかし、この増加は、ショ糖欠乏条件での培養 2 時間後にはほぼ一定に達し、その後－23－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
はほとんど変化しない（図 2）。このことは、オートファゴソ

トファジーフラックスを反映するかどうかを調べた。ショ糖

ームの数は、オートファジー活性化状態の判断を可能にする欠乏培地に細胞を移し、ConcA を処理し、共焦点レーザー顕

ものの、オートファジー活性の定量的な指標としては向いて微鏡により、液胞内 YFP 蛍光強度を継時的に測定した。そのいないことを示している。

結果、ConcA を処理することで、液胞内の YFP 蛍光強度が時間依存的に増大し（図 4A、Control）、その増大はショ糖欠乏により加速した（図 4B、Starvation）。これらの結果は、細胞質から液胞内への NtATG8a タンパク質の移動を追跡する
ことは、オートファジーフラックスをモニターするために有用な指標となる可能性を意味する。

図 2. ショ糖欠乏処理により誘導されるオートファゴソーム
の数の変化。オートファゴソームの数は、細胞をショ糖欠乏状態においてから数時間後に一定に達し、その後は大きく変化しない。

細胞内の YFP-NtATG8a の蛍光強度の変化
オートファジー誘導に伴い、ATG8 は液胞へと運ばれ、分解される。そこで、オートファジー誘導による細胞質と核質の
YFP 蛍光強度の変化を観察すると同時に、YFP-NtATG8a タン
パク質量をウエスタンブロット法により調べた。その結果、
通常生育条件下では、細胞内の YFP 蛍光強度とタンパク質の量に大きな変化は見られなかったが、ショ糖飢餓条件下では、細胞内の YFP 蛍光強度とタンパク質量が、時間依存的に減少した（図 3Starvation）[3]。これらの結果は、オートファジー
誘導に伴うオートファゴソーム数の増加が、見かけ上平衡に達した後も、YFP-NtATG8a は細胞質から液胞へと運搬され続けていることを示唆している。

液胞内の YFP-NtATG8a の蛍光強度の変化
植物の液胞内は液胞膜に存在する H+-ATPase の働きにより、酸性に保たれている。GFP-AtATG8a を発現させたシロイ+

図 3. オートファジー誘導時の YFP の蛍光強度とマーカー

ヌナズナの根の細胞に、液胞膜 H -ATPase 阻害剤の一つであタンパク質量の減少。(A-B)細胞をショ糖欠乏条件下で培養する

るコンカナマイシン A（ConcA）を処理すると、液胞内 pH がと、細胞質および核質の YFP 蛍光強度が時間依存的に減少した。Bar

上昇し、その結果として、GFP 蛍光を伴う小胞構造体（オー= 50 μm。(C)オートファジー誘導時におけるオートファゴソームマ

トファジックボディ）が蓄積する[1, 3-4]。

ーカータンパク質量の経時的な変化。YFP-NtATG8a タンパク質の量

そこで我々は、YFP-NtATG8a の液胞内への運搬に伴う、液胞内の YFP 蛍光強度変化に着目し、蛍光強度の増大が、オー

は、BY-2 細胞をショ糖欠乏状態に移した後に、時間依存的に減少し
た。

－24－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
pH インジケーターとして、しばしば用いられている[9-11]。
一方で、サンゴの一種（Discosoma）に由来する DsRed およびその変異体シリーズ（mRFP1 等）はプロトン感受性が低い。
そのため、低 pH においても消光しないことが知られており、GFP や YFP と DsRed 等をタンデムに連結した融合タンパク質を用いて、生体内での pH 変化観察に利用されている[9-11]。
そこで、mRFP1 と YFP および NtATG8a をタンデムに連結した融合タンパク質(mRFP1-YFP-NtATG8a)を設計した（図 5）。
大腸菌を用いて mRFP1-YFP-NtATG8a タンパク質を発現させ、蛍光分光光度計を用いて、溶菌液の mRFP1 と YFP の蛍光強度を測定したところ、mRFP1 蛍光強度は pH7.0–5.4 の間で殆ど変化しなかったが、YFP 蛍光強度は pH 依存的に減少し、細胞内での生理的な使用範囲において有用となる可能性が高いことが示された [3]。

図 5. pH センサーを付加したオートファジープローブの構造。オートファジープローブは、pH センサー部分(mRFP1-YFP)とオートファジーのマーカー部分(NtATG8a)から構成されている。
+

図 4. 液胞膜 H -ATPase 阻害剤の処理により起こる液胞内の YFP 蛍光強度の変化。(A)細胞を ConcA 存在下で培養すると、タバコ培養細胞におけるプローブの細胞内動態

液胞内にオートファジックボディが蓄積するとともに、YFP 蛍光強度が増大した。(B)液胞内の YFP 蛍光強度の増大はショ糖欠乏条件下において、加速した。

HA

タ グ を 付 加 し た 上 記 プ ロ ー ブ（HA-mRFP1-YFP-NtATG8a）を発現させたタバコ BY-2 株を作出し、オートファジー誘導時の細胞内動態について解析した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、通常生育条件下の細胞オートファジー特異的プローブの構築を観察したところ、YFP 蛍光は、YFP-NtATG8a 発現細胞と我々は上記の指標を、定量評価出来れば、植物細胞のオートファジーフラックスを細胞レベルで、解析出来ると考えた。
しかしながら、これらを定量的に観察・評価するためには、
煩雑な操作と、ConcA 処理による、細胞への影響を考慮する必要が生じる。

同様に、主に細胞質と核質において強く検出された。一方、
mRFP1 蛍光は、細胞質と核質で強く、液胞において弱く検出された（図 6A Control）。次に、オートファジーを誘導し、細胞を観察した結果、細胞質と核質の mRFP1 と YFP 両方の蛍光強度が減少し、液胞内において mRFP1 蛍光のみが強くそこで、これらの問題を解決するために、植物細胞の細胞質と液胞内の pH の違いに着目した。植物細胞の細胞質は弱ア
ルカリ性（pH 約 7.2）であるが、酸性コンパートメントである液胞内の pH は約 5.5 である[8]。
蛍光タンパク質の発色団は、プロトンの有無により波長特性が変化し、酸性 pH で蛍光が弱検出された（図 6A Starvation）。これらの結果は、細胞質と核質の mRFP1 と YFP 蛍光強度の減少、および液胞内のmRFP1 蛍光強度の増大の追跡が、オートファジーフラックス
をモニターするための優れた指標となることを示唆している（図 6B）。

まることが知られている。オワンクラゲ(Aequorea victoria)の改
変 GFP タンパク質のうち、YFP はとりわけ pH 感受性が高く、－25－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージングを用いて継時的に観察した。その結果、通常生育条件下では、細胞全体の YFP 蛍光強度と RFP 蛍光強度は大きく変化しなかった（図 7A）。一方、ショ糖飢餓条件下では、細胞全体の RFP
蛍光強度は大きく変化しなかったものの、YFP 蛍光強度が時間の経過とともに減少した。結果として、細胞懸濁液の
RFP/YFP の蛍光強度の Ratio はオートファジーの実行に伴い、
時間依存的に増大した（図 7B）。
これらの結果は、(1) RFP/YFP の Ratio 変化がオートファジ
ー経路に特異的に変化すること、(2) Ratio の増大は、オートファジーフラックス検出における、良い指標となること、(3) 細胞懸濁液の蛍光強度を測定するだけで、オートファジーフラ
ックスを、極めて簡便に検出可能であることを示している。

図 6. タバコ培養細胞 BY-2 におけるオートファジー誘導時のプローブタンパク質の細胞内動態の in vivo イメージング。(A-B)HA-mRFP1-YFP-NtATG8a タンパク質を恒常的に発現させた形質転換 BY-2 細胞において、ショ糖が豊富な条件下では
mRFP1 と YFP の両蛍光は主に核と細胞質において検出された。
ショ糖欠乏によりオートファジーを誘導すると YFP 蛍光強度が減
少し、一方で mRFP1 の蛍光が液胞で強く検出された。

細胞懸濁液の蛍光強度変化によるオートファジー評価系の確立
上述のように、オートファジー誘導時において、細胞質と核質の RFP と YFP の蛍光強度の減少が観察された。一方、

図 7. 細胞懸濁液の蛍光強度の変化を指標としたオートフ

YFP 蛍光は液胞内ではほとんど検出されなかったのに対して、

ァ ジ ー フ ラ ッ ク ス の 定 量 的 モ ニ タ リ ン グ 。 (A)RFP 蛍光は液胞内においても観察された。これらの結果は、

HA-mRFP1-YFP-NtATG8a を発現させたタバコ BY-2 細胞をショ糖

オートファジー誘導に伴い、プローブの局在が変化し、YFP欠乏状態におくと、オートファジーの誘導に伴い、細胞懸濁液の蛍光強度は減少するが、RFP 蛍光強度は大きく影響を受けな

YFP 蛍光強度が減少するが、RFP 蛍光強度はほとんど変化しない。

いことを意味しており、細胞全体の RFP と YFP の蛍光強度の(B)オートファジーの誘導に伴い、細胞懸濁液の mRFP1/YFP の変化が、オートファジーフラックスを簡便にモニターするた

Ratio が時間依存的に増大した。

めの有用な指標である可能性が示唆された。
そこで、細胞全体の RFP と YFP の蛍光強度を、蛍光顕微鏡－26－

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング
starvation. Plant Physiology111: 1233-1241.

おわりに
本稿では、タバコ培養細胞 BY-2 における ATG8 タンパク質

7.

Kurusu T, Koyano T, Hanamata S, Kubo T, Noguchi Y, Yagi C,の動態に着目し、蛍光特性の異なる 2 種類の蛍光タンパク質

Nagata N, Yamamoto T, Ohnishi T, Okazaki Y, Kitahata N,を融合することで、
BY-2 細胞のオートファジーフラックスを、Ando D, Ishikawa M, Wada S, Miyao A, Hirochika H,

非破壊的かつ定量的にモニタリングする方法を解説した。

Shimada S, Makino A, Saito K, Ishida H, Kinoshita T, KurataN,

本手法は、植物細胞内のオートファジー動態変化だけでな

Kuchitsu

K(2014)OsATG7

isrequiredfor

く、様々な刺激に対するオートファジーの定量的解析や、オ

autophagy-dependent lipid metabolism in rice post-meiotic

ートファジー制御化合物のハイスループットスクリーニング

anther development. Autophagy10: 878-888.

に有効と期待される。併せて同定される抑制剤に関しても、

8.

Kuchitsu K, Yazaki Y, Sakano K, Shibuya N (1997) Transient

作用点を検証することで、未解明な部分が多い、植物のオー

cytoplasmic pH change and ion fluxes through the plasma

トファジー実行過程や制御機構を解明する上でも、有用であ

membrane in suspension-cultured rice cells triggered byると想定される。

N-acetylchitooligosaccharideelicitor. Plant&Cell
Physiology 38: 1012-1018.
9.

謝辞

Gjetting S K, Ytting CK, Schulz A, Fuglsang AT (2012) LiveYFP-NtATG8a コンストラクトは、松岡健博士（九州大学農imaging of intra-and extracellular pH in plants using pHusion,

学部）、mRFP1-AtATG8a コンストラクトは、吉本光希博士（フa novel genetically encoded biosensor. Journalof Experimental

ランス国立農学研究所）から分与された。花俣は、文部科学

Botany 63: 3207-3218.

省支援事業「植物科学グローバルトップ教育推進プログラム」

10.

Kimura S, Noda T, Yoshimori T (2007) Dissection of the
autophagosome maturation process by a novel reporter protein,に参加した。ここに感謝致します。

tandem fluorescent-tagged LC3.Autophagy 3: 452-460.
11.

引用文献
1.

2.

Yoshimoto K (2012) Beginning to understand autophagy, an

NBR1 is a selective autophagy substrate and a functional

intracellular self-degradation system in plants. Plant &Cellhybrid of the mammalian autophagic adapters NBR1 andPhysiology 53: 1355-1365.

p62/SQSTM1. Autophagy 7: 993-1010.

Mizushima N, Komatsu M (2011) Autophagy: renovation ofcells and tissues. Cell 147: 728-741.

3.

Hanamata S, Kurusu T, Okada M, Suda A, Kawamura K,
Tsukada E, Kuchitsu K (2013) In vivo imaging andquantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2
cells. Plant Signalingand Behavor 8: e22510.

4.

Yoshimoto K, Hanaoka H, Sato S, Kato T, Tabata S, Noda T,
Ohsumi Y (2004) Processing of ATG8s, ubiquitin-like proteins,
and their deconjugation by ATG4s are essential for plant
autophagy. The Plant Cell 16: 2967-2983.

5.

ToyookaK, Moriyasu Y, Goto Y, Takeuchi M, Fukuda H,
Matsuoka K (2006) Protein aggregates are transported tovacuoles by a macroautophagic mechanism in nutrient-starved
plant cells. Autophagy 2: 96-106.

6.

Svenning S, Lamark T, Krause K, Johansen T (2011) Plant

Moriyasu Y, Ohsumi Y (1996) Autophagy in tobacco
suspension-cultured

cells

in

responsetosucrose－27－(2014 年 5 月 26 日受付; 2014 年 5 月 29 日受理)

Vol.23 No.1 (2014)

バイオイメージング「バイオイメージング」投稿要領
タイトル(明朝体 12 ポイント)
著者名１1*、著者名２21

所属（略称）１; 2 所属（略称）２* E-mail: 責任著者のメールアドレス

本文 9 ポイント○○○○○○○○○○○○○○○○○○

所に挿入し、8 ポイント、原則として和文フォントは MS

１．本誌は、日本バイオイメージング学会の高い学際性にゴシック、英文は Arial を用いる。

基づき、バイオイメージング及び関連領域に関する、広範

４．投稿にあたっては、投稿原稿のファイル（MS-Word

な専門分野の研究者や学生が理解しやすい和文の原著論

形式と pdf 形式の双方; 図、写真の元データファイル(300

文、総説、解説等を掲載する。また、会員が所属する研究

dpi 以上の解像度)を含む）を日本バイオイメージング学会

室や研究機関の紹介記事等を掲載する。論文等は、編集委「バイオイメージング」編集長宛に、電子データとして送員と当該分野の専門家が審査を行い、編集委員会が採否を付する。

決定する。本誌に掲載された著作物の著作権は、日本バイ

５．校正は、著者の責任において行う。

オイメージング学会に帰属することを前提とする。

６．著者の希望によりカラー印刷する場合の別途費用は、

２．他の雑誌・書籍等にすでに掲載された内容を含む原稿著者負担とする。 別刷を 50 部単位で購入することがでや、他の雑誌等に投稿中の原稿は、原著論文として投稿できる。

きない。総説、解説等において、図・表・文章など出版済
みの内容を転載する場合は、投稿前に著作権所持者の許可を取ること。これらの規定に反した場合、また、データの捏造や他の著作物からの盗用など、科学的ないし社会的倫図 1. バイオイメージング Bioimages

理に反する行為が判明した場合には、編集委員会は掲載決
定後あるいは掲載後においてもその原稿の掲載取り消しを行うことができる。

引用文献

３．投稿原稿の体裁は次のとおりとする。 (1) テキスト

1.

Murakami T, Ono M, Ishikawa H (1993) Confocal

は、原則として MS-Word 形式のファイルとする。

interference reflection microscopy of cultured cells.

(2) 原稿の最初に、表題、著者氏名、所属先、電子メール

Bioimages 1: 1-8.
2.

アドレスを記載する。また原則として要旨を付ける。

Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC(3) A4 版で 6 ページ以内を標準とする。原則として和文フ(1994) Green fluorescent protein as a marker for geneォントは MS 明朝、英文は Times New Roman または Times

expression. Science 263: 802-805.

を用いる。
余白は上下 25 mm、左右 20 mm、タイトル･著者氏名･所属･要旨は全段、本文は 2 段組として、40 行/ページ、行
送り 17.5 pt とする。タイトルは 12 ポイント、執筆者氏名･所属･本文は 9 ポイントを用いる。図表等は、必要に応じて 2 段組にせず、全段で掲載することも可能。
(4) 図･写真･表･図の説明文は、ファイル本文中の希望箇－28－