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高効率・高成功率PCR酵素｢KOD FX Neo」を用いたマウス爪からの直接PCR事例
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 小林 哲大
はじめ に
KOD DNA polymerase*は、優れた伸長性を有し、クルード成分の阻害を受けにくいという特長を有しています。KOD FXは、この特性を利用して開発

KOD FX Neo

された高成功率PCR酵素であり、難配列やクルードサンプルからの増幅などの用途でご好評いただいています。
しかし、KOD FXをはじめ従来のPCR酵素は20〜30サイクル以降、増幅が持続しなくなる〈プラトー現象〉が生じ、PCR機能が完全には発揮できないことがありました。｢KOD FX Neo｣は、KOD FXの技術に、弊社で新たに開発した「伸長エンハンサー」などの技術を応用することで、〈プラトー現象〉を抑え、0102030

微量サンプルや長鎖・難配列ターゲット、クルードサンプルなどからの増幅効率40をさらに向上させることに成功しました。
今回は、微量かつクルードなサンプルの実施例としてマウスの爪からの直接PCRを実施しました。マウスのジェノタイピングでは通常、血液や尾を使用しますが、マウスを傷つけてしまうという欠点がありました。爪を用いることでマウ

図1．伸長エンハンサーの効果＊M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63：4504-4510（1997）

スを傷つけることなくジェノタイピングが可能になります。その方法および結果を紹介いたします。

方法（1）マウス爪の採取
マウス爪は以下のように一指から採取しました。
（爪の大きさはごく微量で十分です。目安としては鉤爪（かぎづめ）の先端を切り取る程度です。）①マウスの足を固定する②爪切りなどを用いて爪を切断③PCRチューブに切断した爪、反応液を添加し、PCRへ（2）PCR
ターゲット: Mouse TBP

反応液組成
PCR grade water

11 μl

Primer #1: CAGTTGCTACTGCCTGCTGTTGTT2×PCR Buffer for KOD FX Neo

25 μl

Primer #2: GCTAGGATTAAAGACGTGCCACCA

2mM dNTPs

10 μl

10pmol/μl Primer #1

1.5μl

10pmol/μl Primer #2

1.5μl

KOD FX Neo

1 μl

Total reaction volume

ターゲット: Mouse Tfrc
Primer #1: TGTGGAGGGTCAACGTGGTAGTT
Primer #2: GTGACATTCTCAGGTGGCAGCTT
ターゲット: Mouse Thy-1
Primer #1: CCACAGAATCCAAGTCGGAACTCTTG

50 μl

Primer #2: GTAGCAGTGGTGGTATTATACATGGTG【サイクル条件】
94℃, 2min.
比較のため他社クルードサンプル対応PCR酵素でも、取扱説明書推奨の条件

98℃, 10sec.
68℃, 4min./kb4℃, Hold35 cycles

にてPCRを実施し、比較を行いました。この際、サイクルはKOD FX Neoと同じく35サイクルで行いました。

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結果および考察M

123

A社クルードサンプル対応PCR酵素

KOD FXNeo

KOD FX
M

123M

123

B社クルードサンプル対応
PCR酵素
M

123M

M： 200 bp DNAラダー
1： Mouse TATA box binding protein (TBP) 0.5 kb
2： Mouse transferrin receptor (Tfrc) 1.5 kb
3： Mouse membrane glycoprotein (Thy-1) 2.6 kb

PCR産物を、2%アガロースゲルに5μlアプライして解析を行いました。その結果、KOD FX、KOD FX Neoでのみ増幅が確認できました。なお、KOD FXとKOD FX Neoを比較すると、KOD FX Neoを用いた方が増幅量が多い結果となりました。爪に含まれるDNAは微量とされています。KOD FX Neoを用いれば、このような微量テンプレートからでも十分増幅が可能でした。

まとめ爪などの微量サンプルからの精製はロスが生じやすく高度な精製技術を必要とします。今回紹介したマウス爪からの直接PCRは微量サンプルから簡便かつ迅速に目的遺伝子を増幅することが可能です。
マウスのジェノタイピングの際は、是非、本方法をお試しください。
また、ヒトの爪を用いた検討においても良好な結果を得ています。同様にお試しください。

KOD FX Neoではマウステールの直接PCRも可能です。この際もPCRに持ち込む量はごく微量で実施してください。
M

KOD FX
Neo

A社クルードサンプル B社クルードサンプル
対応PCR酵素
対応PCR酵素

1M23123M

123

M50μl反応で← この程度の大きさで十分です

マウステール1mm

直接電気泳動解析PCRKOD FX Neo＊マウステールなど動物組織を直接増幅した場合、PCR産物がアガロースゲル電気泳動のウェルに残ることがあります。泳動する際は、PCR産物 50μlに対し、20 mg/ml Proteinase K 10μlを添加してから泳動することをお薦めします。

M： 200 bp DNAラダー
1： Mouse TATA box binding protein (TBP) 0.5 kb
2： Mouse transferrin receptor (Tfrc) 1.5 kb
3： Mouse membrane glycoprotein (Thy-1) 2.6 kb■キャンペーン期間：〜2012年3月30日（ご注文分）まで
品名および内容包装

高効率・高成功率PCR酵素＊

200U×1本［200回用］
KOD FX Neo＊KOD FX Neo（1.0U/μl）（200U×1本）
×5［1,000回用］
2×PCR Buffer for KOD FX Neo＊（200U×1本）
×10［2,000回用］
2mM dNTP

保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格-20℃

KFX-201￥35,000￥21,000-20℃

KFX-201X5￥140,000

対象外

-20℃

KFX-201X10￥260,000

対象外＊50μl反応を行ったときの反応回数で表示しています。

品名

高効率TAクローニングキット（KOD用）

TArget Clone™ -Plus-

装

保存温度

Code No.

10回用

-20℃

TAK-201

包価格￥16,000

KOD FX Neoによって増幅されたDNAの末端は平滑化されていますので、末端を制限酵素処理するか、平滑末端クローニングの手法を用いてクローニングを行う必要があります。また専用のTAクローニングキット「TArget CloneTM -Plus-（Code No. TAK-201）」を用いることで増幅産物に直接Aを付加し、そのまま容易にTAクローニングを行うことができます。

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