No.87.qx 07.7.3 15:43 ページ 5『KOD FX』を用いたlong PCRにおけるPrimerの精製グレード及び鎖長の影響
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 杉山 明生
はじめ にM1 1『KOD FX』は、KOD DNA polymeraseをベースに開発された高性能PCR

23 45 M2
鋳型：ヒトゲノムDNA
50ng／50μl 反応系（1〜3）200ng／50μl 反応系（4,5）

試薬です。増幅効率、増幅成功率、および伸長性において高い性能を示すことが確認されています。よって、この酵素を使用することにより、今までどの酵素を用いても増幅が困難であったようなターゲットの増幅に成功する可能性が高まり

M1：1kb DNA ラダー
1 ：β-globin 1.3kb
2 ：β-globin 3.6kb
3 ：β-globin 8.5kb
4 ：β-globin 17.5kb
5 ：tPA
24.0kb
M2：λ／Hin dⅢ digestました。例えば、GC richターゲットや全血を直接用いたPCRなどにおいても力を発揮することが確かめられています。
K O D D N A P o l y m e r a s e は 、優 れ た 正 確 性 に 加 え て 、P f u D N A
polymeraseの10倍以上のProcessivity（合成持続能力）を有し、long PCRができる素地をもともと備えていました。東洋紡では、このKODの特性を最大限に引き出すべく、改めて酵素、buffer、サイクル条件の検討を行い、優れた伸図1．KOD FXを用いたlong PCR長性を引き出すことに成功しました。図1のように、KOD FXでは、ヒトゲノムDNAを鋳型としたlong PCRにおいて、24kb程度のターゲット一口メモまでの増幅が可能であることが確かめられています。
今回は、このKOD FXの特長の一つである優れた伸長性を十KOD FXで増幅されたDNA断片の末端は平滑化されており、通常のTAクローニングはできません。TAクローニングを行うには、専用の試薬「TArget CloneTM-Plus-（Code No.:TAK-201）」が必要となります。ちなみに、
KOD FXの正確性はTaq DNA polymeraseの約11倍程度です［KOD -Plus-（Code No.:KOD-201）の正確性はTaq DNA polymeraseの約80倍です］。

分に引き出せるように、比較的困難とされる10kb以上のターゲットの増幅におけるPrimerの精製グレード及び鎖長の影響について検討を行いましたのでご紹介いたします。

方法

KOD FXを用いたPCRは、下記の反応組成にて、比較的増幅が難しいとされるヒトゲノムβ-globin領域の17.5kbをターゲットとして検討を行いました。また、PCRサイクルは、KOD FXの標準推奨（2）サイクル条件条件である2ステップと、long PCR用に推奨しているステップダウ2ステップ

ステップダウンンの2通りにて行いました。本検討にて使用したPrimerの配列等を、

94℃, 2min.

94℃，2min.

表1に記載しました。

98℃, 10sec.
68℃, 18min

30 cycles（1）反応液組成
25 μl

2mM dNTPs

10 μl

10pmoles／μl Primer F

1.5 μl10pmoles／μl Primer R

1.5 μlHuman Genomic DNA（50ng/μl）

1 μl

KOD FX（1.0U/μl）

1 μl

Autoclaved, distilled waterup to 50 μlPrimer名AB

hGB17.5F
hGB17.5R

123456789101112hGB17.5F40
hGB17.5F38
hGB17.5F36
hGB17.5F34
hGB17.5F32hGB17.5F30hGB17.5F28hGB17.5F26
hGB17.5F24hGB17.5F22hGB17.5F20hGB17.5F1872℃，18min
98℃，10sec.
70℃，18min.
98℃，10sec.
68℃，18min.

5 cycles5 cycles5 cycles20 cycles

68℃，7min.
PrimerSize

Primer配列

（mer）

GC％

Tm（℃）

精製グレードTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA

353549%
46%

77.5
76.9

脱塩、カートリッジ、HPLC
脱塩、カートリッジ、HPLCGACTTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCCTTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTTGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCGCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCACCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCCTGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCGCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTGTGATTATGACTATCCCACAGTCTGATTATGACTATCCCACAGTCATTATGACTATCCCACAGTCTATGACTATCCCACAGTC

403836343230
2826
24
22
20
1848%
47%
47%
50%
47%
47%
46%
42%
42%
41%
40%
44%

78.8
78.0
77.7
75.9
72.3
69.9
67.4
64.0
61.6
57.9
52.7
49.7

カートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジカートリッジ

表1．使用Primer一覧

8774℃，18min
98℃，10sec.

2×PCR buffer for KOD FX

No.

98℃，10sec.

5

No.87.qx 07.7.3 15:46 ページ 6結果及び考察（1）long PCRにおけるPrimer精製グレードの影響

2ステップ

脱塩、カートリッジ精製、及びHPLC精製の3通りの方

1法にて精製したPrimer（ 表1のA及びB）を用いてPCRステップダウン

231M

23を行い、Primerの精製グレードの違いによるPCRパフォーマンスを比較評価しました。その結果（図2）、脱塩グレードでは、2ステップ、ステップダウンのいずれのサイクル条件においても、目的バンド以外にスメアが出や17.5kbすい傾向にあることが分かりました。一方、カートリッジ精製とHPLC精製グレードでは、両者で大きな差はなく、ステップダウンのサイクル条件では目的バンドのみの明
1 ：脱塩
2 ：カートリッジ精製
3 ：HPLC精製
M2：λ／Hin dⅢ digest

瞭な増幅を得ることができました 。この結果から、長いターゲットを増幅する場合、カートリッジ精製以上のグレードのプライマーを用いる方がより良い結果が得られる

図2．long PCRにおけるPrimer精製グレードの影響ことが分かりました。
（2）long PCRにおけるPrimer長の影響

次に、long PCRにおけるPrimer長の影響を見るため、40merから18merまで2base刻みで長さを変化させたPrimerを調製（表1のNo．
1〜12、精製は、いずれもカートリッジ精製グレード）し、PCRを行いました。その結果（図3）、2ステップのサイクル条件では、40〜24merでターゲットの増幅が認められ、同時に出現したエキストラバンドはPrimer長が長い程少ない傾向にあることが分かりました。一方、ステップダウンのサイクル条件では、40〜28merでターゲットの増幅が得られ、エキストラバンドはPrimer長に関わらず出現しませんでした。この結果から、long PCRでは、通常より長めにPrimerを設計し特異性を上げると共に、アニーリング（及び伸長反応）を比較的高い温度に設定することでより良い結果が得られることが分かりました。

2ステップ
M

1234567

ステップダウン
8910 1112M

12345678910 111217.5kb

F側Primer（Primer長）
1： hBG17.5F40（40mer）
2： hBG17.5F38（38mer）
3： hBG17.5F36（36mer）
4： hBG17.5F34（34mer）
5： hBG17.5F32（32mer）
6： hBG17.5F30（30mer）

7： hBG17.5F28（28mer）
8： hBG17.5F26（26mer）
9： hBG17.5F24（24mer）
10： hBG17.5F22（22mer）
11： hBG17.5F20（20mer）
12： hBG17.5F18（18mer）

R側Primerは、1〜12共通で、
hBG17.5R（35mer）を使用。
M：λ／Hin dⅢ digest

図3．long PCRにおけるPrimer長の影響

まとめ
KOD FXを用いるlong PCRのコツをまとめますと、（1）カートリッジもしくはHPLC精製グレードのプライマーを用いる、（2）プライマーは長めに設計し、アニーリング温度を高めに設定する、（3）必要に応じてステップダウンPCRを行う、ということになります。KOD FXは今回ご紹介したlong PCR以外にも幅広いPCRにおいて高いパフォーマンスを示すことが分かっています。別のPCR酵素で増幅に行き詰った時には、是非一度お試しください。
品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U／μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs

包装保存温度

Code No.

価-20℃

KFX-101￥35,000

装保存温度

Code No.

価

10回用-20℃

TAK-201￥16,000

200U×1本（200回*）

格＊50μl反応を行った時の使用回数を表示しています。

品名および内容
高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

包6格87