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リアルタイムPCR用細胞溶解&cDNA合成キット（培養細胞用）

念発売記 ーンペンャキTMSuperPrep Cell Lysis & RT Kit 40%offfor qPCR
■期間：2013年10月9日〜2014年3月20日（ご注文分）

培養細胞から簡便・短時間にリアルタイムPCR用の鋳型cDNAの調製が可能です。
SuperPrepTM Cell Lysis & RT Kit for qPCR（Code：SCQ-101）は、リアルタイムPCRよる遺伝子発現解析のための細胞溶解試薬（Lysis Reagents）と逆転写反応試薬（RT Reagents）からなるキットです。本製品をご使用いただくことで、96ウェルプレートなどで培養した細胞から、逆転写反応の鋳型として利用可能なRNAを含む細胞ライセートを簡便に調製することができます。
さらに、本キットに含まれる逆転写反応試薬は、この細胞ライセートからのRT反応に最適化されています。本キットにより、簡便、迅速に培養細胞からリアルタイムPCR用の鋳型cDNAの合成が可能であり、ハイスループットアッセイに適しています。

SuperPrepTM Cell Lysis Kit for qPCR（Code：SCQ-201）は、細胞溶解試薬（Lysis Reagents）の別売品です。1-step
リアルタイムRT-PCRによる簡易アッセイのための細胞ライセートの調製にご使用いただけます。

Cell Lysis（7min.＊1）

Revers Transcription（25min.＊1）

qPCR＊2【Lysis Reagents】

培養細胞

2-step リアルタイムRT-PCR

高精度測定

・Lysis Solution
・Stop Solution
・gDNA Remover
・RNase Inhibitor

PBS洗浄
Lysis Solution
添加5min.、室温ライセートを
RT Master Mixと混合
37℃、15min. → 50℃、5min. → 98℃、5min.

Stop Solution
添加2min.、室温

cDNAをリアルタイムPCR試薬と混合〈リアルタイムPCR試薬例〉
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix（Code: QPS-101）
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（Code: QPS-201）※Lysis Reagents の別売り品として、SuperPrepTM
Cell Lysis Kit for qPCR（Code No. SCQ-201）をご準備しております。

【RT Reagents】
・5×RT Master Mix
・5×RT Master Mix
no-RT control ＊・Nuclease free Water

簡易測定

1-step リアルタイムRT-PCR＊2＊1

SuperPrepTM
Cell Lysis Kit for qPCR
(Code No. SCQ-201)

SuperPrepTM
Cell Lysis & RT Kit for qPCR
(Code No. SCQ-101)

作業時間を含まない時間を表示しています。
＊2 リアルタイムPCR試薬は本キットには含まれません。
別途ご用意ください。

SuperPrepTM Cell Lysis & RT Kit for qPCR（Code No. SCQ-101）
上の2種類の試薬セットを含みます。
＊逆転写酵素を含まないマスターミックスです。コントロールとして使用します。

図1．操作フロー特長1 RNA精製不要
・細胞をPBS（−）で洗浄後、Lysis Solutio n（ gDNA
Remover添加）を細胞に添加、懸濁し、室温で5分間インキ

本製品

ュベートすることによって、細胞溶解とゲノムDNAの分解を同時に行います。反応停止はStop Solutionを添加してA社品処理するのみで、熱処理は必要ありません。

B社品

細胞溶解
RT反応
従来フロー

・逆転写反応は、細胞ライセート（希釈不要）を加え、20分間0インキュベートします。

3060

90120

所要時間
（min.）
図2．cDNA合成までの所要時間
従来フローの細胞溶解時間はRNA抽出作業時間を示します。

2013

1

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特長2 ライセートから高品質なcDNAを合成
最適化されたバッファー組成により、RNase等の細胞成分によるRNAの分解を効果的に抑えます（調製したRNAは氷上で2時間安定です）。また、DNaseⅠ処理後にcDNA合成を行うことから、ゲノムDNAのコンタミの少ない高品質なcDNAを合成することができます。逆転写試薬は弊社の高効率逆転写酵素「ReverTra Ace®」をもとに最適化されたマスターミックス※となっており、簡便・高効率にcDNA合成を行うことができます。合成したcDNAは長期保存可能です。
本試薬は、幅広い種類の細胞を用いるアッセイに使用可能です。下表の代表的な細胞について適用できることを確認しています。
※マスターミックスにはランダムプライマーとOligo dTプライマーが最適比率で混合されています。
表1. 本製品の適用確認済み細胞

細胞名

接着／浮遊種細胞

由来

1A431

接着

H. sapiens

epidermoid carcinoma cell line

上皮様細胞がん2C2C12接着

M. musculus

myoblast cell line

筋芽細胞

3Caco-2接着

H. sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大腸がん4CHO-K1

接着

C. griseus

ovary cell line

卵巣

5COLO205

浮遊

H. sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大腸がん

6DLD-1接着

H. sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大腸がん

7HCT-15

接着

H. sapiens

colon adenocarcinoma cell line

大腸がん

8HDF

接着

H. sapiens

primary foreskin fibroblasts (primary cell)

皮膚線維芽細胞9HEK293

接着

H. sapiens

embryonic kidney cell line

胎児腎10HeLa S3接着

H. sapiens

cervix carcinoma cell line

子宮頸がん

11HepG2

接着

H. sapiens

hepatocellular carcinoma cell line

肝がん

12Jurkat浮遊

H. sapiensT lymphocyte cell line

白血病T細胞13K562浮遊

H. sapiens

myelogenous leukemia cell line

赤芽球様白血病細胞

14KUSA-A1接着

M. musculus

bone marrow stromal stem cell line

骨芽細胞様株

15L929接着

M. musculus

aneuploid fibrosarcoma cell line

結合組織

16MCF7接着

H. sapiens

breast adenocarcinoma cell line

乳腺がん

17

Neuro2a接着

M. musculus

neuroblastoma cell line

神経芽細胞腫18

NIH-3T3接着

M. musculus

embryo fibroblast cell line

胎仔由来線維芽細胞

19PC12接着R. norvegicus

adrenal pheochromocytoma cell line

副腎褐色細胞腫

20rMSC接着

R. norvegicus

bone marrow stromal stem cells (primary cell)

骨髄間質細胞

21THP-1浮遊

H. sapiens

acute monocytic leukemia cell line

単球

22U937浮遊

H. sapiens

leukemic monocyte lymphoma cell line

単球

特長3 ハイスループット解析のバラツキ低減
プロトコールから少量の分注工程や希釈工程を減らすことで、ハイスループット解析におけるバラツキを低減しました。また、細胞溶解時のピペッティング操作を無くし、DNaseⅠ処理を並行して行うことで操作性を向上させました。DNaseⅠの反応の停止
はStop Solutionを加えるのみで、RNAを不安定化する加熱工程などは不要です。

特長4 様々なリアルタイムPCR試薬に使用可能
様々なリアルタイムPCR試薬（SYBR® GreenⅠ、TaqMan®アッセイ両方に対応可能）と組み合わせて使用可能です。
また、弊社THUNDERBIRD® qPCR Mix（Code No. QPS-101、QPS-201）等と組み合わせて用いることによって、培養細胞から簡便かつ高精度の遺伝子発現解析が可能であることを確認しています。
（p.5〜p.6をご参照ください）さらに、弊社RNA-

directTM Realtime PCR Master Mix（Code No. QRT-101、QRT-201）等の1-stepリアルタイムPCR試薬と組み合わせる簡易アッセイも可能です。

22013

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実施例1 データのバラツキを考慮したアッセイ系の質の評価
HeLa S3細胞を96ウェルプレートに2×10 4cells/wellずつ播種し、100nM phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）を加えて 24 時間インキュベートしました。その後、PMA処理した12ウェル、未処理の12ウェルについてPBS（−）で細胞を洗浄し、SuperPrep TM Cell Lysis & RT Kit for qPCRで処理してcDNA合成を行いました。このcDNAを鋳型にTHUNDERBIRD® Probe qPCR Mix（Code No.QPS-101）を用いてIL-6、IL-1β、β-actin遺伝子についてTaqMan®プローブアッセイを行いました（n＝12にて実施 ）。 同様にA社同等品を用いてリアルタイムPCR解析を行いました（逆転写反応試薬とリアルタイムPCR試薬もA社キット付属品を使用）。IL-6、IL-1β遺伝子のCt値をβ-actin遺伝子で補正し（ΔCt）、PMA処理の有無の差（ΔΔCt）を算出しました。続いてZ -factorを算出し、比較を行いました。
〈SuperPrepTM Ct値〉

Ct3533312927252321191715

SuperPrepTM

051015IL-6IL-1ββ-actin20

well no.
IL-1βIL-6β-actin

PMAの添加+-++ - -〈A社同等品Ct値〉

Ct3533312927252321191715

A社同等品

051015IL-6IL-1ββ-actin

20

well no.
IL-1β

IL-6β-actin

PMAの添加図3．Ct値の比較+ - ++ - -

図4．増殖曲線の比較

表2. 解析結果からのZ の算出〈 IL-6 〉

SuperPrepTM

A社同等品

Δ Ct (IL-6 -β-actin)

PMA

Ct (IL-6)
平均(+)

26.96

6.27

0.14(-)

30.24

10.12

0.35(+)

26.50

4.30

0.34(-)

29.44

8.18

0.19

PMA

Ct (IL-1β)
平均

(+)

28.62

7.93

0.15(-)

33.99

13.87

0.38

(+)

28.00

5.80

0.47(-)

33.26

11.99

0.34

平均

標準偏差

ΔΔ Ct

Z'-3.850.62-3.88

0.59

ΔΔ Ct

Z'-5.94

0.74-6.19

0.61〈 IL-1β 〉

SuperPrepTM

A社同等品

Δ Ct (IL-1β -β-actin)
平均標準偏差＊Z -factor：
データのバラツキを考慮した、ハイスループットアッセ
イ系の質の目安となる数値です。
一般に0.5以上で良好と考えられます。今回は下記の式で算出しました。
Z -factor=
1−3×(ΔCt(＋)標準偏差+ΔCt(−)標準偏差)/ ΔΔCt

この結果、いずれもZ -factorとしてはアッセイ系の質の目安となる0.5をクリアしましたが、SuperPrepTM Cell Lysis & RT
Kit for qPCR、THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix（Code No. QPS-101）を用いた実験において、A社同等品と比較して高い Z -factorを示し、アッセイ系としてよりバラツキが少なく良好であることが分かりました。

20133

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実施例2 精製RNAと細胞ライセートでのCtの相関の検証
30
精製したTotal RNA(Ct)

SuperPrep™ Cell Lysis & RT Kit for qPCRを用いて、HEK293 細胞2.5×104cells からcDNAを合成しました（40μl反応系）。また、HEK293細胞から抽出したTotal RNA 66.6ngからReverTra Ace® qPCR RT Master Mix（CodeNo. FSQ-201）を用いてcDNA合成（40μl 反応系）を行いました。
その後、それぞれのcDNAを鋳型にTHUNDERBIRD ® SYBR ® qPCR Mix（Code No. QPS-201）を用いて15種類のHouse Keeping GeneについてリアルタイムPCRを行い、得られたCt値の相関性を検証しました。この結果、今回解析しR2=0.9832520151010た15種類の遺伝子において、精製RNAと細胞ライセートを用いた解析に良好な相関が認められました。

15203025細胞ライセート(Ct)〈SuperPrepTM 〉
図5．精製RNAとの定量性の比較

実施例3 RNase活性が強い細胞における解析効率の検証
単球由来の細胞株U937は比較的RNaseの活性が高く、細胞溶解液を用45いるアッセイは困難であるとされてきました。

35

本実験では、U937細胞1×104、1×103、1×102、1×10cellsから調製
Ct

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（Code No.QPS-201）を用いて、検量線からの逸脱

30した細胞ライセート8μl を用いて cDNA合成（40μl 反応系）を行った後、β-actin遺伝子についてリアルタイム PCR を行いました。
同様に、A社同等品を用いて同様のアッセイを行いました（逆転写反応試薬

25150とリアルタイムPCR試薬もA社キット付属品を使用）。
また、同じサンプルから精製したTotal RNAの相当量を用いて解析を行

増幅効率の低下2001

いました（ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix［Code No.FSQ-201］、234Log (Cell Number)SuperPrepTM

5A社同等品

精製RNA

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix［Code No.QPS-201］使用）。
この結果、弊社品での解析においてのみ、精製RNAを用いた場合同様に

図6．U937細胞におけるβ-actin遺伝子の検出

高い直線性を示しました。

品名および内容包装

保存温度

Code No.

通常価格

キャンペーン価格-20℃

SCQ-101¥76,000¥45,600-20℃

SCQ-101X5￥325,000

対象外

SuperPrep
Cell Lysis & RT Kit for qPCR
100回用＊1〈Lysis Reagents〉〈RT Reagents〉
・Lysis Solution
・5 x RT Master Mix
・Stop Solution
・5 x RT Master Mix no-RT control・gDNA Remover ・Nuclease free Water 評価用サンプル 100回用×5ございます・RNase Inhibitor
TMSuperPrep TM/THUNDERBIRD ® Probe qPCR set＊3・SuperPrepTM Cell Lysis & RT Kit for qPCR（SCQ-101）とTHUNDERBIRD® Probe qPCR Mix（QPS-101）＊2とのセット

1セット-20℃

SCQ101/
QPS101￥99,750￥59,850

SuperPrep TM/THUNDERBIRD ® SYBR® qPCR set＊4・SuperPrepTM Cell Lysis & RT Kit for qPCR（SCQ-101）とTHUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（QPS-201）＊2とのセット

1セット-20℃

SCQ101/
QPS201￥99,750￥59,850

SuperPrep TM Cell Lysis Kit for qPCR＊5・Lysis Solution ・gDNA Remover・Stop Solution ・RNase Inhibitor

100 回用-20℃

SCQ-201￥39,000

対象外

評価用サンプルございます＊1 40μlで逆転写反応をした場合に100回用としてご使用いただけます。
＊2 50μl反応で 200回用、20μl反応で 500回用としてご使用いただけます。
＊3 SuperPrep TM Cell Lysis & RT Kit for qPCR（100回用）［￥76,000 → ￥72,450］とTHUNDERBIRD® Probe qPCR Mix（Code No.
QPS-101：200回用 ）［￥29,000 → ￥27,300] とのセット販売品です。
＊4 SuperPrep TM Cell Lysis & RT Kit for qPCR（100回用）［￥76,000 → ￥72,450］とTHUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix（Code No.
QPS-201：200回用 ）［￥29,000 → ￥27,300] とのセット販売品です。
＊5 SuperPrep TM Cell Lysis & RT Kit for qPCR に含まれる Lysis Reagents の別売り品です。

高効率1-step用リアルタイムPCR試薬品

包装＊保存温度

Code No.

0.5ml×5本-20℃

QRT-101¥33,000

0.5ml×5本-20℃

QRT-201¥33,000

名価格®

（TaqMan アッセイ用）

RNA-direct TM Realtime PCR Master Mix
®

（SYBR

GreenⅠアッセイ用）

RNA-direct TM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix＊ 50μl反応で100回用、20μl反応で250回用としてご使用いただけます。
＊ SYBR® は Molecular Probe Inc.の登録商標です。TaqMan® は Roche Molecular Systems Inc.の登録商標です。

42013