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高効率リアルタイムPCR用マスターミックス「KODSYBR® qPCR Mix」を用いたプロモーター領域、CpGアイランドを含む領域の定量的増幅の事例
東洋紡（株）

敦賀バイオ研究所 松本 弘嵩
はじめ にPCRではGCリッチな配列、例えばCpGアイランドを含む領域の増幅が困難であることが知られています。CpGアイランドは、哺乳類遺伝子のプロモーター領域の約50％以上を占めており、エピジェネティック解析の対象となる領域の一つです。このプロモー
ター領域の解析には、クロマチン沈降（ChIP）法を用いる方法が知られており、リアルタイムPCRによる定量が行われています。しかしながら、従来のTaq DNA polymeraseを用いたリアルタイムPCR試薬では、GC含量に偏りがあるGCリッチなターゲットを定量的に増幅ができない場合があるため、CpGアイランドを含むプロモーター領域のリアルタイムPCRでは、プライマー設計が著しく困難になることがあります。
KOD SYBR® qPCR Mixは、KOD DNA polymerase（KOD）を使用したSYBR® GreenⅠ検出系によるリアルタイムPCR用
マスターミックスです。3 →5 エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）を除去したKOD exo（−）DNA polymeraseと最適化されたバッファー条件を組み合わせることで、KODの優れた合成能を最大限に発揮し、70%を超えるようなGCリッチなターゲットにおいても安定したリアルタイムPCR測定が可能になっております。
今回は、本キットを用いて、GC含量に偏りのあるプロモーター領域と、CpGアイランドを含む領域の定量的な増幅を行った例をご紹介いたします。

方法【増幅ターゲットとプライマー設計】
ターゲット1：Homo sapiens telomerase RNA（TR）gene のプロモーター領域（GC含量：64％、増幅長：219bp）
CCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTT

Primer ＃1：CCCGCCCGAGAGAGTGAC（18bp、Tm：68.6℃）

Primer ＃2：AAGTCAGCGAGAAAAACAGC（20bp、Tm：61.1℃）
ターゲット2：Human β-actin のCpGアイランド（GC含量：73％, 増幅長：131bp）
GCTTCCTTTGTCCCCAATCTGGGCGCGCGCCGGCGCCCCCTGGCGGCCTAAGGACTCGGCGCGCCGGAAGTGGCCAGGGCGGGGGCGACTTCGGCTCACAGCGCGCCCGGCTATTCTCGCAGCTCACCATG

Primer ＃1：GCTTCCTTTGTCCCCAATCT （20bp、Tm：64.1℃）
Primer ＃2：CATGGTGAGCTGCGAGAATA（20bp、Tm：63.9℃）【PCRサイクル】【反応組成】

98℃, 2 min.

KOD SYBR® qPCR Mix

10μl

50×ROX

0.4μl

10pmol/μl Primer ＃1

0.4μl

98℃, 10 sec.

10pmol/μl Primer ＃2

0.4μl

60℃, 10 sec.

Human genomic DNA

Xμl

68℃, 30 sec.

↓DWYμl↓total20μl

Melting

40 cycles＊Data collectionは伸長ステップに設定しました。

【使用機器】
Applied Biosystems StepOnePlusTM※比較のため、TaqベースのリアルタイムPCR試薬でも、取扱説明書推奨の条件にてリアルタイムPCRを実施し、比較を行いました。

2013

11

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結果及び考察ターゲット1：Homo sapiens telomerase RNA（TR）geneのプロモーター領域（GC含量：64％、増幅長：219bp）
KOD SYBR® qPCR Mix

従来型リアルタイムPCR試薬（Taq使用）

従来型リアルタイムPCR試薬（Taq使用）〔A社リアルタイムPCR試薬〕〔B社リアルタイムPCR試薬〕

1043530

104104

Ct値

25101 copy

201510024Log（鋳型量）

101 copy

6101 copy

NTC no-template control)

ターゲット2：Human β-actin のCpGアイランド（GC含量：73％、増幅長：131bp）
KOD SYBR® qPCR Mix35

従来型リアルタイムPCR試薬（Taq使用）

従来型リアルタイムPCR試薬（Taq使用）〔A社リアルタイムPCR試薬〕〔C社リアルタイムPCR試薬〕

10430

104Ct値

2510420110 copy

1510024Log（鋳型量）

101 copy

6101 copy

NTC

GC含量が偏ったプロモーター領域をターゲットとした場合、従来のTaq DNA polymeraseをベースとしたリアルタイムPCR
試薬では定量的な増幅が認められませんでしたが、KOD SYBR® qPCR Mixを使用することで、特異性が高く、定量的な増幅が認められるようになりました。また、no-template control（NTC）においてもプライマーダイマーが検出されませんでした。
通常のPCRと同様に、GC含量が偏ったターゲットのリアルタイムPCRによる増幅は、KOD DNA polymeraseを使用したリアルタイムPCR試薬の方が、Taq DNA polymeraseを使用したリアルタイムPCR試薬よりも適していると考えられます。

まとめ
本事例でお示ししたように、Taq DNA polymeraseを用いたリアルタイムPCR試薬で定量的な増幅が困難であった場合でも、
KOD SYBR® qPCR Mixを使用することで、定量的増幅が可能となります。GC含量が高いターゲットでも増幅可能であるため、従来困難であったプロモーター領域の定量も、KOD SYBR® qPCR Mixをご使用いただくことで、容易に行うことができると考えられます。
また、本キットはGCリッチなターゲットに限らず、Taq DNA polymeraseを用いたリアルタイムPCR試薬では困難な、長鎖ターゲット（〜2kb）の定量的な増幅、クルードサンプル（マウステール、植物、血液等）からの増幅が可能です。そのため、Taq DNA
polymeraseをベースとしたリアルタイムPCR試薬を用いた解析でお困りのターゲットをお持ちの方は、是非一度、KOD SYBR®
qPCR Mixをお試しください。
品名および内容
KOD SYBR® qPCR Mix
・KOD SYBR® qPCR Mix
・50×ROX reference dye

保存温度Code No.

価

1ml×1本〔40回用〕

包装-20℃QKD-201T¥9,8001.67ml×3本〔200回用〕-20℃

QKD-201¥32,000（1.67ml×3本）
×5〔1,000回用〕-20℃

QKD-201X5¥147,000

格※50×ROX reference dyeがマスターミックスとは、別添付されています。
※包装欄に記載の反応回数は、50μl反応時のものです。容量は、KOD SYBR® qPCR Mixのみ示しています。

122013