加水分解酵素型受容体 HTL 経路で働く新規植物ホルモンに関する研究
Studies on a novel plant hormone that works in a hydrolase type receptor HTL（日本農芸化学会推薦）

代表研究者

明治大学

瀬戸 義哉

Meiji UniversityYoshiya SETO

協同研究者

岡山理科大学

福井 康祐

Okayama University of ScienceKosuke FUKUIStrigolactones (SLs) were originally characterized to be root derived signals for parasitic and symbiotic interactions,
yet are now well known to be endogenous hormones that regulate shoot branching. D14, which is a member of /hydrolase super family, was characterized to be the SL receptor in plants. There is a closely related homolog of D14,
which is called to be HTL/KAI2 in Arabidopsis. HTL/KAI2 was identified as a receptor of smoke-derived germinationinducer, Karrikin (KAR). However, KARs are not endogenously occurring in plant tissues, and also htl/kai2 knockout
mutant shows longer hypocotyl phenotype. Thus, it is thought to be that there is an unidentified hormone that is working
in the HTL/KAI2 pathway. In this study, we focused on HTL in a model basal plant, Marchantia polymorpha (MpHTL).
Toward identification of the endogenous ligand of MpHTL, we first tried to identify a synthetic agonist that canspecifically interact with MpHTL. Moreover, we tried to establish an efficient bioassay method to identify the endogenous
ligand molecule using MpHTL and its signaling partner protein.
研究目的

い る （ F ig . 1 ） 。 ま た 、 D1 4 と の 相 同 性 等 かス ト リ ゴ ラ ク ト ン （ 以 下 SL ） は 寄 生 と 共

ら 、 HT L 経 路 で 働 く 未 知 の 新 規 植 物 ホ ル モ

生を制御する化学シグナルとして知られてンが存在することが示唆されているものの、い た 化 合 物 で あ っ た が 、 2008 年 に 第 三 の 作用として、植物の枝分かれを制御する内生のホルモン分子として機能することが明らか と な っ た 。SL が ホ ル モ ン と し て 見 出 さ れて以降、その生合成や信号伝達メカニズムに関する研究が飛躍的に進展し、その全容が 明 ら か と な り つ つ あ る 。SL は 加 水 分 解 酵
素 に 属 す る 受 容 体 D1 4 に 受 容 さ れ る こ と で機 能 す る 。 D1 4 に は 相 同 性 の 高 い パ ラ ロ グが存在し、シロイヌナズナにおいては
HTL/ KAI2（ 以 下 HT L ）と 呼 ば れ て い る 。HTLは煙由来の発芽誘導分子であるカリキン（ K AR ）の 受 容 体 と し て 見 出 さ れ た が 、K AR
は植物の内生分子としては含まれておらず、か つ 、興 味 深 い こ と に 、シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に おける本遺伝子の欠損変異体の解析から、本経路は発芽や胚軸伸長など、光形態形成において重要な役割を担うことが示唆されて現在までに同定には至っていない。本研究

温度の変化により低分子との相互作用を評価可能なで は 、 HTL 経 路 で 働 く 新 規 ホ ル モ ン の 同 定手法である Differential Scanning Fluorimetry 法（DSFに向け、主に基部植物であるゼニゴケを用法）を用いた。その結果、ゼニゴケ HTL と作用可能

い 、本 経 路 で 作 用 す る ア ゴ ニ ス ト の 探 索 や 、なデブラノンを幾つか見出すことに成功した（Fig.

ホルモン探索に有効な生物検定系の構築を2）。

行うことを目的とした。

続いて、ゼニゴケの HTL をシロイヌナズナの htl変異体にて発現させた形質転換体を作成した。本形

研究経過

質転換体においては、過去の報告の通りに、表現型代表者は、以前にゼニゴケの HTL について結晶構の相補は見られなかった。これが、内生リガンドが造解析を行っており、既に報告されているシロイヌ異なることに起因する場合、上記のゼニゴケ HTL にナズナの HTL と比較すると、ポケットの形や大きさ作用するデブラノンを与えた際には表現型が相補さに違いがあることを見出してる。さらに、ゼニゴケれると考え、添加試験を行った。シロイヌナズナにの HTL はシロイヌナズナの htl 欠損変異体に導入しおいては、30℃を超える高温条件においてはその発た際に、その表現型を相補しないことが報告されて芽が著しく阻害される。一方で、高温条件下で SL アいた。表現型が相補しない理由として、内生のリガナログである GR24（ラセミ体）を添加すると、発芽ンド化学構造が異なるということが一つの可能性と阻害が回復することが報告されている（参考文献 1）。

して考えられたため、この点について詳細に検討す

さらに、この際には、GR24 のラセミ体のうち、天然ることとした。ゼニゴケの HTL については、特異的に作用するアゴニスト分子については報告されていなかったことから、まずは、ゼニゴケ HTL に作用するアゴニストを探索することとした。共同研究者の福井は、以前に SL 受容体である D14 や、シロイヌナズナの HTL に作用する人工アゴニストとしてデブラノン類を報告している（参考文献 1, 2）。デブラノンは、種々の置換基を有するフェノール化合物と、ストリゴラクトンに特徴的なメチルブテノライド環をエーテル結合で連結させた化合物であり、置換基を変えることで、多種多様な分子を合成することが可能である。そこで、デブラノンの中に、ゼニゴケHTL と相互作用可能な分子が存在すると考え、合成
デブラノン約 50 種類の中からスクリーニング試験を行った。スクリーニングには、タンパク質熱変性

Fig. 2. Chemical structures of debranones that
can interact with MpHTL.

に存在する SL とは逆の立体化学を有する異性体が、った。この際、mphtl は、野生型と比べると、アゴニHTL 経路に作用することによって発芽阻害が回復すスト分子に対して耐性の表現型を示した。そもそも、ることが知られている。よって、この実験系を利用

mphtl 欠損変異体では、葉状体が小さくなることに加して、MpHTL を導入したシロイヌナズナ形質転換体

え、葉状体が培地面に対して立ち上がるような表現種子が、本研究で見出した MpHTL アゴニスト依存型を示しており（参考文献 2）、光に対する応答に異的に発芽するか否かを検証した。その結果、アゴニ常が見られたような表現型を示している。今後、得ストの投与によっても発芽阻害の回復は見られなかられたアゴニストの投与濃度をさらに低くするなどった（Fig. 3）。

して、本経路がゼニゴケの生育に及ぼす影響につい上記の結果から、MpHTL 導入によってシロイヌナてより詳細に調べていく必要がある。

ズナの htl 変異体の表現型が相補されなかった原因としては、内生リガンドの化学構造の相違によるの考察ではなく、ゼニゴケの HTL がシロイヌナズナにおけ本研究にて、D14 や HTL に対するアゴニスト分子る下流伝達因子とうまく相互作用することが出来なが同定されているデブラノン類の中からゼニゴケいことによるという可能性が考えられた。シロイヌ

HTL に作用可能な分子を見出すことに成功した。一ナズナの HTL の信号伝達経路においては、リプレッ方で、得られたアゴニスト分子を利用しても、サータンパクとして SMAX1 が同定されており、さMpHTL を発現させたシロイヌナズナ組み換え体にらに、SMAX1 のユビキチン化に関与する因子として、おける表現型の相補が見られなかったことから、表F-box タンパク質である MAX2 が同定されている。

現型が相補しなかった要因は、内生リガンドの化学よって、この点を明らかにするために、ゼニゴケ HTL構造が異なるということよりも、下流の信号伝達因とシロイヌナズナにおける下流伝達因子である子との相互作用に問題がある、という可能性が高い。

SMAX1 との相互作用を、酵母ツーハイブリッド法を

この点については、上記の通り、今後酵母ツーハイ用いて調べることとした。こちらについては、現在

ブリッド法を用いて検証を行う予定である。また、実験を進行中である。

ゼニゴケ HTL とシロイヌナズナやその他、高等植物また、内生リガンドを探索するためのバイオアッの HTL と配列を比較した結果、SMAX1 との相互作セイ系を構築する目的で、ゼニゴケの HTL とゼニゴ用に関与すると予想される領域に、ゼニゴケでは 1ケの SMAX1 オルソログを用いた酵母ツーハイブリ

アミノ酸の置換が見られることを見出している。よッド系を構築することとした。こちらについても現って、このアミノ酸をシロイヌナズナ型に変異させ在実験を進行中である。本実験においては、まずは、ることにより、シロイヌナズナ htl 変異体の表現型を

MpHTL と MpSMAX1 を発現した酵母に対して、本相補できる可能性がある。HTL において、SMAX1 と研究で見出されたアゴニスト分子を添加することにの相互作用に重要な領域に関してはこれまで全く報より、両者の相互作用が誘導されるか否かを明らか告がないため、この点についても今後調べていく予にする。そのうえで、ゼニゴケの植物体抽出物等を定である。

添加することで両者の相互作用が誘導されれば、内本研究で見出したアゴニスト分子の投与試験にお生リガンドを探索する際の検定に用いることが可能

いては、顕著な生育阻害作用が見出された。この作であると考えている。

用は、mphtl 変異体に対してもみられているため、同続いて、本経路の信号が過剰に流れた際に、ゼニ定したアゴニスト分子は何かしらの副作用が強い可

ゴケの生育にどのような影響が及ぼされるのかを明能性も考えられる。最近、SL 類に特徴的な部分構造らかにするために、見出した上記のアゴニスト分子であるメチルブテノライド環のメチル基を除去するをゼニゴケの野生型、ならびに CRISPR-CAS9 法でことにより、SL 関連分子が HTL 経路に働く際の特ノックアウトした欠損変異株に投与する試験を行っ異性をより高めることが出来ることが報告されたた。変異株については、東北大学経塚淳子教授が作（参考文献 5）。よって、今回見出された MpHTL ア成したものを分与頂いた。その結果、アゴニスト分ゴニストとなるデブラノンについても、メチル基を子は、mphtl 欠損変異体、野生型いずれに対しても、除去したタイプの化合物を既に合成しており、本化

1 M の濃度で生育阻害的に働くことが明らかとな合物を用いることにより、MpHTL に対する特異性がより高まることが期待される。メチル基除去型の化(4) Mizuno Y., et al, Major components of the合物を用いて、ゼニゴケに投与した際の影響についKARRIKIN INSENSITIVE2-dependent signalingてもより詳細に検討していきたい。

pathway are conserved in the liverwort Marchantia

以上のように、内生ホルモンの同定には至らなか

polymorpha. The Plant Cell, in press

ったものの、内生ホルモンの探索の際にも有効とな(5) Yao J., et al, Desmethyl butenolides are optimal

るであろう、ゼニゴケ HTL に作用するアゴニスト分

ligands for karrikin receptor proteins. New Phytologist,子の同定に成功するとともに、本分子を利用したこ

230 (3), 1003-1016, 2021とで、ゼニゴケ HTL がシロイヌナズナの htl を相補出来ない理由について、下流信号伝達因子との相互誌上発表作用に問題があるということが強く示唆された。

1.

Takeuchi J, Fukui K., Seto Y., Takaoka Y., Okamoto
M., Ligand-receptor interactions in plant hormone
signaling. The Plant Journal, 105 (2) 290-306, 2021

引用文献
(1) Fukui K., et al, New branching inhibitors and their

2.

Mashiguchi

K*.,

SetoY*.,

YamaguchiS.,

potential as strigolactone mimics in rice, Bioorganic &Strigolactone biosynthesis, transport, and perception.

Medicinal Chemistry Letters, 21 (16) 4905-4908, 2011

The Plant Journal, 105 (2) 335-350, 2021 (*=co-first(2) Fukui K., et al, Synthetic agonist of HTL/KAI2 showsauthor)

potentstimulating

activityfor

Arabidopsis

seed3.

瀬戸義哉、山口信次郎、ストリゴラクトンの受

germination, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,

容：加水分解の役割は？

29 (17) 2487-2492, 201955、110-115、2020

植物の生長調節、(3) Toh S. et al, Thermoinhibition uncovers a role for4. 安井令, 瀬戸義哉, 山口信次郎, 植物のストリ

strigolactones in Arabidopsis seed germination, Plant

ゴラクトン信号伝達メカニズム, 化学と生物,

Cell Physiology, 53 (1), 107-117, 2012

58: 673-680, 2021