Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 10, No. 2, 79–89, 2010

総

説（一般）

塩素化エチレンを対象とした嫌気性バイオレメディエーション技術の開発と現場適用
Development and Practical Application of in situ Anaerobic Bioremediation of Soil and
Groundwater Contaminated with Chloroethenes
上野俊洋 *，奥津

徳也，水本

正浩，石田

浩昭

TOSHIHIRO UENO, NORIYA OKUTSU, MASAHIRO MIZUMOTO and HIROAKI ISHIDA
栗田工業株式会社 〒 329–0105 栃木県下都賀郡野木町川田五丁山 1–1
Kurita Water Industries Ltd., 1–1 Gochoyama, Kawada, Nogi-machi, Shimotsuga-gun, Tochigi 329–0105 Japan* TEL: 0280–54–2847 FAX: 0280–57–3317* E-mail: toshihiro.ueno@kurita.co.jp
キーワード：土壌・地下水汚染，トリクロロエチレン，バイオレメディエーション，Dehalococcoides 属細菌，RealTime PCR
Key words: Contamination of soil and groundwater, trichloroethene, bioremediation, Dehalococcoides, Real-Time PCR（原稿受付 2010 年 11 月 5 日／原稿受理 2010 年 11 月 12 日）

1.

はじめに

テトラクロロエチレン（PCE）やトリクロロエチレン（TCE）等の塩素化エチレンはドライクリーニングの溶剤や金属の洗浄剤として使用されてきたが，発ガン性や肝機能障害を誘発する可能性が指摘されており，土壌・地下水汚染が社会問題となっている。
土壌・地下水汚染対策としては，これまで，掘削除去や揚水処理が多く用いられてきたが，掘削除去への偏重
は，ブラウンフィールド問題の深刻化や搬出汚染土壌の不適正処理につながりかねない。本年 4 月には，掘削除去偏重の是正をひとつの目的として，改正土壌汚染対策
法が施行されている。
一方，嫌気性バイオレメディエーションは，揚水処理に比べて浄化期間が短く，掘削除去よりも低コストであることなどの理由から近年適用されるケースが増えている。バイオレメディエーションは，バイオスティミュレー
ションとバイオオーグメンテーションに大別される。前者は有機物や栄養塩等の増殖基質を供給して土着微生物を活性化するものであり，後者は外来微生物を導入するものである。現在適用されているのは主としてバイオス
ティミュレーションであるが，2005 年，経済産業省・環境省により「微生物によるバイオレメディエーション
利用指針」（以下利用指針と称する）が告示されたこともあり，バイオオーグメンテーションも徐々に普及しつつある。
当社は，環境庁「平成 10 年度土壌汚染浄化新技術確立・実証調査」においてバイオスティミュレーションの現場実証を行い34)，その後数多くの現場で実浄化を行っている24,28,36,37)。また，2008 年 6 月には，複合微生物系として初めて，利用指針に対する適合確認を経済産業大
臣・環境大臣から取得，現在バイオオーグメンテーショ
ンの現場適用を進めているところである25)。
ここでは，当社における嫌気性バイオレメディエー
ションの検討結果と現場適用事例について紹介する。
2.

嫌気性バイオレメディエーションの概要

塩素化エチレン分解反応の概念図を図 1 に示す。嫌気条件下，PCE や TCE は，ジクロロエチレン（DCE），
塩化ビニル（VC）を経て，エチレンやエタンに脱塩素化される。脱塩素化反応において塩素化エチレンは電子受容体となるが，電子供与体としては，有機酸 2）やアルコール6,9)，糖類16)，酵母エキス16)，有機酸エステル15)，
植物油30) 等，多くの有機物が，また，水素7) が利用できる。
多くのバクテリアが塩素化エチレン分解菌として単離され，その分解能力が調べられている。例えば，Dehalospirillum multivorans22)，Enterobacter agglomeransMS-127)，Dehalobacter restrictus PER-K2314) は PCE や
TCE を DCE に脱塩素化して増殖できる。しかし，筆者の知る限り，エチレンまで完全に脱塩素化できる微生物
として単離されているのは Dehalococcoides 属細菌のみである。報告されている Dehalococcoides 属細菌の塩素化エチレン分解能を表 1 に示した。CBDB1 株を除き，いずれの Dehalococcoides 属細菌も塩素化エチレンの脱塩 素 化 に よ り 増 殖 す る こ と が で き る。 菌 体 収 率 は
108 copies/μmol-Cl 程度4) である。
Dehalococcoides 属細菌はそのリボソーム RNA19) やTCE 還元デハロゲナーゼ18)，VC レダクターゼ17,21) の遺

80

上野

他

図 1．塩素化エチレン分解反応の概念図．

伝子配列が明らかにされており，特異的な配列部を利用して Dehalococcoides 属細菌 13,23) あるいはその酵素の検出が行われている26)。
前述のように，多くの有機物が電子供与体として利用できるが，Dehalococcoides 属細菌が電子供与体として直接利用するのは分子状水素とされている。ただし，嫌気条件下，多くの有機物から水素が生成すること，現場の安全管理上水素ガスは取扱いにくいことなどの理由
で，実際の現場では多くの場合，水素ではなく，有機物が電子供与体として用いられている。
嫌気性バイオレメディエーションとは地下環境を，上述した嫌気的脱塩素化反応に適した条件に整えることにより塩素化エチレンを分解する技術であり，①供給する増殖基質（電子供与体，栄養塩類，その他の微量栄養素
等）や微生物の種類，量および濃度の設定，②増殖基質や微生物の供給地点，深度，方法および頻度の設定が設計上重要となる。また，地下環境は土質分布等の不確実要素があるため，実際には浄化進捗をモニタリングし，適時設計諸元を微修正しながら浄化を進めることが多い。そのためモニタリング手法や頻度等の設定も重要となる。
増殖基質や微生物の供給方法はさまざまなものがある38)。例えば，①井戸からの注入や②ボーリング孔からの注入（ボーリングしながら注入）がある。この場合，
地下水循環を行い，増殖基質の拡散を促進させることも可能である。また，③トレンチを設置し，そこに徐放性の増殖基質を充填し，地下水浄化壁とする場合もある。
浄化対策では，しばしば汚染源と拡散域を概念的に区分けして対策方法が論じられる。アメリカ空軍の資料 32)によると，汚染源では汚染の除去や汚染拡散の抑制を，
拡散域では汚染拡散の抑制を目的とし，例えば，汚染源
では格子状に，拡散域では列状に注入地点を配置，嫌気性バイオレメディエーションを実施することが示されている（図 2）。しかしながら，日本では汚染源と拡散域を含む汚染範囲全域の浄化（汚染の除去）を目指すことが多く，汚染拡散の抑制を目的として適用されることは少ないようである。
3.

嫌気性バイオレメディエーションの開発

以下に，嫌気性バイオレメディエーションの検討結果を紹介する。

表 1．報告されている Dehalococcoides 属細菌
菌株

PCE

cis- trans- 1,1TCE DCE DCE DCE

195 株19)○○

VS 株5)
FL2 株11)
BAV1 株12)
CBDB1 株1,3)
GT 株31)
MB 株4)

○

○

○
○

○
○
○
○
○

VC

○

1,2DCA
○

○
○
○

○

○

○

○

○

“ ○ ” は脱塩素化により増殖できることを示す。

図 2．汚染源と拡散域における注入地点配置例．

3.1.

テトラクロロエチレン分解菌の集積培養 33)

嫌気性バイオレメディエーションの検討を進めるにあたっては，まず PCE をエチレンに分解する系を確立する必要がある。そこで，流動床リアクターを用い，分離源として嫌気汚泥，活性汚泥，汚染土壌・地下水を添加しながら PCE で集積培養を行った。電子供与体は培養開始当初メタノールとしたが，349 日後からはスクロー
ス，プロピオン酸，n- 酪酸，メタノールおよびエタノー
ルの混合物に変更した。
その結果，PCE は約 400 日後からエチレンに，約 500
日後からエタンに分解されるようになり，PCE をエチレンおよびエタンに分解する微生物群を取得することができた（図 3）。そこで，培養体から DNA を抽出し，2種の制限酵素（BstU1, HhaI）を用いて T-RFLP 解析を行った。図 4 には BstU1 の結果を示す。エレクトロフェ
ログラムには数多くのピークが認められたが，図中 B1

嫌気性バイオ法の開発

81に Dehalococcoides 属細菌に相当するピークが認められ，PCE 集積培養体に Dehalococcoides 属細菌が存在していることが確認された。
3.2.

cis-ジクロロエチレン分解菌の集積培養 20)

バイオオーグメンテーションに利用するための分解微生物（以下「利用微生物群」と称する）を取得するため，
さらに集積培養を行った。実際の現場では，自然状態でPCE や TCE が cis-DCE に変換され，cis-DCE が比較的高濃度に残留している場合が多く見受けられる。バイオオーグメンテーションの実用化には cis-DCE 以降の分解がより重要となるため，ここでは cis-DCE を確実にエチレンにまで脱塩素化する微生物群の取得を試みた。
集積培養中，図 5 に示すように，cis-DCE で培養した場
合に，しばしば VC の脱塩素化能が失われることがあったため，最終的には VC で集積培養を行った（電子供与体は有機酸）。
その結果，Trichococcus pasteurii を優占種とし，Dehalococcoides 属細菌を含む培養体が得られた。この培養体から DNA を抽出し，3 種の制限酵素（BstU1, HhaI,
Sau96I） を 用 い て T-RFLP 解 析 を 行 っ た と こ ろ， 図 6（BstU1 を用いた結果）に示すようにエレクトロフェル
グラムは単純な形態となった。
上記培養体においては，T. pasteurii が全バクテリアの約 98％を占め，塩素化エチレン分解菌である Dehalococcoides 属細菌の存在率は 1％程度と小さい。そこで，
実際のバイオオーグメンテーションでは，集積培養液中の Dehalococcoides 属細菌を特異的に濃縮して存在率を50％以上にあげたものを利用微生物群として使用している。利用微生物群の電子顕微鏡写真を図 7 に示す。
3.3.

電子供与体，および硫酸イオンの影響の検討 33)

嫌気性バイオレメディエーションでは，有機物を地下に供給し，水素生成菌の作用により，間接的に水素を供給する。一方，Dehalococcoides 属細菌は，メタン生成
菌や硫酸還元菌など，水素を消費する微生物と水素をめぐって競合する。Dehalococcoides 属細菌の水素に対す
る飽和定数はメタン生成菌や硫酸還元菌に比べて低く，親和度が高い10,29,39)。そのため，プロピオン酸など，エネルギー論上，生成する水素濃度が低く抑えられる物質
が，上記競合において Dehalococcoides 属細菌に有利とされる8)。
そこで，この点を実用面で検証するため，前述（3.1.）の PCE 分解菌を種菌とし，土壌充填カラムに電子供与体として様々な有機物を通水し，また，硫酸を添加して，PCE 分解に与える影響を調べた。

図 3．PCE 分解菌集積培養におけるエチレン類およびエタンの濃度変化．

図 4．PCE 集積培養体の T-RFLP 解析結果

82

上野

電子供与体としてエタノール（30 mg/L），
乳酸（30 mg/L）， ス ク ロ ー ス（50 mg/L）， あ る い は プ ロ ピ オ ン 酸（60 mg/L） を 供 給 し た と こ ろ， い ず れ も 水 滞 留 時 間（HRT）4〜5 時間で 4 mg/L の PCE をエチレンにまで分解し，PCE，TCE および cis-DCE を地下水基準（それぞれ 0.01 mg/L 以下，0.03 mg/L 以下，0.04 mg/L 以下）に，VC を 0.01 mg/L 以下にすることができた。図 8A，
図 8B にそれぞれエタノールとプロピオン酸を用いた試
験の結果を示す。
また，硫酸イオンを添加（14〜61 mg/L）することにより，HRT 4 時間では VC 濃度が上昇し，若干脱塩素化反応への阻害が認められたものの，HRT 12 時間でPCE はエチレンにまで分解された。図 8C に硫酸イオン
61 mg/L の試験結果を示す。当社が調査した国内 1,032地点の地下水では，その 64％が硫酸濃度 60 mg/L 以下であった（図 9）。これらのことから，水素をめぐる競合という点では，実用上，電子供与体の種類や地下水中の硫酸が大きな課題や障害になることはないと判断した。

他

3.4.

バイオスティミュレーションの適用性と Dehalococcoides 属細菌の検出35)

Hendricksonら13) は Dehalococcoides 属 細 菌 が 北 米 や
欧州に広く分布すること，およびバイオレメディエーショ
ンにおいて有効に働く可能性があることを報告している。
しかしながら，日本国内において，Dehalococcoides 属
細菌がどの程度分布し，あるいはバイオスティミュレー
ションがどの程度適用できる可能性があるのかは明らかでなかった。そこで，国内 14 箇所の TCE 汚染現場から土壌・地下水を採取，TCE と有機酸で培養し，TCE
分解の有無からバイオスティミュレーションの適用性を調べた。また，プライマーとして表 2 に示す De624f
および De1232r を用い，Dehalococcoides 属細菌の 16S
rDNA を標的とした PCR によって Dehalococcoides 属
細菌の検出を試みた。
結果を表 3 に示す。14 種類の土壌のうち半数にあた
る 7 つの土壌で TCE がエチレンあるいはエタンまで分解し，これらの土壌を採取した現場にはバイオスティ
ミュレーションが適用できるものと考えられた。
また，TCE がエチレンあるいはエタンにまで分解した土壌では PCR 反応によりアガロースゲル上に DNAの増幅が認められ，培養後の土壌・地下水中に Dehalococcoides 属細菌が存在することがわかった。
これらのことから，Dehalococcoides 属細菌がエチレンへの分解を担っていることが示唆された。逆に，Dehalococcoides 属細菌が生育していない現場にはバイオ
スティミュレーションを適用できないことが予想され，
PCR を用いた Dehalococcoides 属細菌の検出によりバイオスティミュレーションの適用性を予想できると考えられた。
現在，当社では適用性判断と浄化進捗予測を行うため，

図 6．cis-DCE 集積体の T-RFLP 解析結果

図 5．VC 集積体および cis-DCE 集積体による cis-DCE の脱塩
素化．

図 7．利用微生物群の顕微鏡写真．

83

嫌気性バイオ法の開発

プ ラ イ マ ー と し て De624f お よ び De1232r（ 表 2） を，ハイブリダイゼーションプローブとして De971fL および De997fR（表 2）を用い，Dehalococcoides 属細菌の16S rDNA を標的とした Real-Time PCR により Dehalococcoides 属細菌の定量検出を行っている。また，状況に応じて，TCE 還元デハロゲナーゼや VC レダクター
ゼの定量検出も行っている。
3.5.

バイオオーグメンテーションの有効性確認 20)

バイオオーグメンテーションの有効性を確認するため，カラム試験を実施した。カラム試験には塩素化エチ
レン汚染現場より採取した土壌および地下水を利用した。カラムは同一のものを 2 本設置し，一方はバイオス
ティミュレーション用，他方はバイオオーグメンテー
ション用とした。オーグメンテーションカラム，スティ
ミュレーションカラムともに，嫌気条件とするために
15 日間予備通水を行った後，本試験を開始した。オーグメンテーションカラムには，本試験開始時および 8 日
後に利用微生物群培養液（前述（3.2.）で集積培養したもの）を 1 mL（Dehalococcoides 属細菌の 16S rDNA 濃度として約 107 copies/mL）植種した。また両カラムには本試験開始時，8 日後，14 日後に，電子供与体として有機酸を添加した。
両カラムにおける cis-DCE の分解挙動を図 10 に示す。
スティミュレーションカラムでは試験期間中 cis-DCEの分解はほとんど認められなかったのに対し，オーグメ
ンテーションカラムでは，本試験開始 29 日目に cis-DCE
が 0.04 mg/L 以下（地下水基準）まで分解された。また，
オーグメンテーションカラムでは，28 日後に vcrA コ
ピー数に有意な上昇が認められた。これは，当初は植種した Dehalococcoides 属細菌（vcrA を保有）のほとん
どが土壌へ吸着し，塩素化エチレンの分解に伴って Dehalococcoides 属細菌が増殖，一部が液相に移動したことによるものと考えられる。
これらの結果から，本利用微生物群を土壌・地下水に供給することにより，塩素化エチレン分解菌が生息しな
い汚染現場の浄化が可能となるだけでなく，土着の分解菌が生息している現場でも，分解菌量を増やすことにより，浄化期間の短縮化が期待できると考えられた。さらに，塩素化エチレンを，VC の蓄積なくエチレンまで確
実に分解できるものと期待された。

図 9．国内の地下水中硫酸イオン濃度の検出頻度

表 2．PCR プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブ
Bact27f
De624fBact1492r
De1232r
De971fL
De997fR
図 8．PCE 分解における電子供与体・硫酸イオンの影響．

: 5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’: 5’-CAGCAGGAGAAAACGGAATT-3’: 5’-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’: 5’-GACAGCTTTGGGGATTAGC-3’: 5’-GTAGTGAACTGAAAGGGGAACGACC-3’（3’FITC 標識）: 5’-GTTAAGTCAGGAACTTGCACAGGTG-3’（5’LCRed640 標識）

84

上野

他

表 3．TCE 分解試験と Dehalococcoides 属細菌検出の結果．
TCE 分解試験結果： ○（エチレン・エタンまで分解）△（cis-DCE で分解が停止）
×（全く分解せず）．
Dehalococcoides 属細菌検出結果：○（検出），×（未検出）．
サンプル
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N

土質

採取深度

TCE 分解試験結果

Dehalococcoides 属
細菌の検出結果

腐植物混じり粘土
腐植物混じり
シルト
砂
粘土
シルト
砂
砂
粘土
シルト
粘土
シルト
シルト
マサ土
風化岩

GL –3 m○○GL –3 m○○GL –10 m
GL –5 mGL –12 m
GL –1 mGL –7 mGL –9 mGL –8 m不明
不明
Gl –2 mGL –5 mGL –7 m

○
○
○
○
○
△
△
△
△
△
×
×

○
○
○
○
○
×
×
×
×
×
×
×

7/14

7/14

土壌

結果まとめ

3.6.

図 10．土壌カラムにおける cis-DCE の分解におけるバイオオー
グメンテーションの効果．

利用微生物群の安全性把握 20)

利用微生物群の安全性を把握することを目的に，利用微生物群培養液（前述（3.2.）で集積培養したもの）について，細菌 16S rDNA のランダムクローニングを行った。 得 ら れ た 96 の ク ロ ー ン そ れ ぞ れ に つ い て，16S
rDNA の前方部約 500 bp の塩基配列の決定を試み，最終的に 92 クローン分について塩基配列データを取得した。Ribosomal Database Project データベースを利用して近縁種の推定を行った。
その結果，90 クローンが T. pasteurii（相同性：98.4％〜99.8％），2 クローンが Clostridium peptidivorans（相同性：99.0％〜99.6％）に最も近縁であることが明らかとなった。
「バイオセーフティー指針」（日本細菌学会）およびドイツ DSMZ の各データベースを調べた結果，T. pasteurii，C. peptidivorans についてはいずれも病原性の報
告はなかった。また，その存在率が小さいため Dehalococcoides 属細菌由来のクローンは得られなかったが，Dehalococcoides 属細菌についても病原性の報告はない。
また，利用微生物群にヒト病原体が存在しないことを確認するため，95 種類の代表的ヒト病原体について特
異的な遺伝子配列を対象とした定量 PCR を実施した。
その結果，これらの該当遺伝子の濃度は定量下限値（約2.5×102 copies/mL）未満であった。
これらの結果より，本利用微生物群は有意な数の病原性細菌を含まないことが明らかとなり，バイオオーグメ
ンテーション利用の安全性を十分に確保できると考えられた。

嫌気性バイオ法の開発

4.

嫌気性バイオレメディエーションの現場適用

以下に，嫌気性バイオレメディエーションの現場適用事例を紹介する。
4.1.

バイオスティミュレーションの現場適用事例 36)

対象サイトではかつて洗浄溶剤として TCE が使用されていた。土壌・地下水調査を実施したところ，GL–5 m 以上の土壌と帯水層地下水が TCE および cis-DCE
で汚染されていることが判明した。そこで，調査結果に基づき，一部掘削除去を行うとともに揚水処理を行った。
しかしながら，対策開始後 2 年を経ても地下水濃度に顕著な変化は認められなかった。そこで，短期浄化を目指してバイオスティミュレーションを適用した。適用は，揚水処理による浄化対策を開始した 760 日後，汚染エリ
ア 2 から開始した（図 11）。また，970 日後からはエリア 1 にも適用を拡大した。
当サイトには，地表から深度 1 m に盛土が分布し，以下深度 1〜5 m に粘性土，5〜15 m に砂礫，15 m 以下に粘性土が分布している。地下水は深度 5〜15 m の砂礫層に存在し，これが帯水層となっている。
増殖基質は，脱炭素塔に通した水道水でその濃厚溶液を希釈することにより調製，帯水層全深度（5〜15 m）にスクリーンをもつ井戸より注入した（図 12）。
地下水流向の下流側，敷地境界の井戸では，汚染拡散防止対策として揚水処理を継続したが，それ以外の井戸については揚水処理を停止し，増殖基質注入井戸に転用した。
汚染エリア 1 では観測井戸 MW-1 で，汚染エリア 2
では観測井戸 MW-2 でモニタリングを行った。MW-2
におけるモニタリング結果を図 13 に示す。
バイオスティミュレーションを適用する前までは地下水濃度に大きな変化は認められなかったが，適用（増殖
基質注入）後，TCE 濃度は速やかに低下し，cis-DCE
濃度が上昇，TCE から cis-DCE への変換が観察された（760〜780 日 ）。 次 に，Dehalococcoides 属 細 菌 16S
rDNA のコピー数が増加し，Dehalococcoides 属細菌の増殖が確認された（780〜920 日）。この期間は cis-DCEに顕著な濃度変化は観察されなかった。その後 cis-DCE
濃度が低下，VC，エチレンあるいはエタンの濃度が上昇し，cis-DCE のエチレンあるいはエタンへの分解が観察された（920〜1,170 日）。また，MW-1 についても同様に，TCE から cis-DCE への変換，cis-DCE のエチレンあるいはエタンへの分解，および Dehalococcoides 属
細菌の増殖が認められた（データ示さず）。
最終的には，MW-1，MW-2 ともに，適用 410 日後（揚水処理開始から 1,170 日後）までに TCE と cis-DCE がそれぞれ 0.03 mg/L 以下，0.04 mg/L 以下（地下水基準）となり，対象サイトを浄化することができた。
前述のように，TCE が cis-DCE に変換された後，cisDCE に顕著な濃度低下が観察されない期間があった（780〜920 日）。この期間，塩素化エチレンの濃度変化からだけでは浄化の進捗を把握できないが，Dehalococcoides 属細菌の増殖を確認することにより浄化の進捗状
況を把握することができた。Real-Time PCR による定量
検出23) は浄化進捗予測に有効であると言える。
4.2.

図 11．井戸の平面配置．

85

バイオオーグメンテーションの現場実証試験 25)

前述のように，当社は，複合微生物系として初めて利用指針に対する適合確認を取得した。そこで，確認申請した事業計画に従って実証試験を行い，バイオオーグメ

図 12．増殖基質注入・揚水処理フロー．

86

上野

他

図 13．バイオスティミュレーション適用サイトにおけるモニタリング結果．

ンテーションの有効性を評価した。
実証サイトの土質は砂礫層であり，地下水位は深度
6 m 前後，帯水層厚みは約 13 m である。
本サイトにおける TCE の汚染状況と設置井戸の配置
は図 14 に示す通りである。TCE 濃度 0.1〜1 mg/L の範囲に利用微生物群注入井戸（オーグメンテーション井
戸：AIW）を設置し，AIW より 1 m 離れた地点にモニ
タリング井戸 MW-1 を設置した。また対照井戸として，
AIW より約 20 m 離れた地点に増殖基質注入のみの井戸（スティミュレーション井戸：SIW）を，約 30 m 離れた地点に増殖基質も注入しないモニタリング井戸（MW-3）を設置した。さらに安全性評価の目的で，AIW の約
150 m 上流側にモニタリング井戸（MW-4），3 m 下流に
MW-2，約 100 m 下流側には系外流出防止用揚水井戸とモニタリング井戸（MW-5）を設置した。全ての井戸には，
深度 6〜19 m の帯水層に対してスクリーンを設置した。
な お， 実 証 試 験 開 始 前 に 測 定 し た と こ ろ，AIW，
SIW，MW-1 および MW-3 における地下水中の Dehalococcoides 属細菌 16S rDNA コピー数はいずれも定量下限値（5 copies/mL）未満であった。
利 用 微 生 物 群 は，10 L 規 模 の 発 酵 槽 を 用 い て 前 述（3.2.）のように VC で培養し，専用タンクを用いて嫌気条件を保持したまま実証サイトに輸送した。合計約
25 L の 利 用 微 生 物 群（Dehalococcoides 属 細 菌 16S
rDNA コピー数：約 1×108 copies/mL）を増殖基質とともに AIW に注入した。なお，地下水中を嫌気条件にするため，利用微生物群注入にあたっては事前に増殖基質を注入した。バイオオーグメンテーションでは増殖基質の注入を 2 回実施したことになる。一方，バイオスティ
ミュレーションでは増殖基質の注入は 1 回であるが，増殖基質の注入量は両者とも同じである。
AIW および SIW でのエチレン類の濃度変化，ならびに Dehalococcoides 属細菌 16S rDNA および vcrA コピー
数の変化をそれぞれ図 15 および図 16 に示す。
AIW では，利用微生物注入後に TCE 濃度の低下に伴い cis-DCE 濃度が一時的に上昇，その後低下しエチレ
ン濃度が上昇した。ここで VC 濃度が著しく上昇することはなかった。このように，AIW では VC が蓄積することなく，TCE および cis-DCE がエチレンへ分解した（図 15A）。また，注入 2 ヵ月後（図中 100 日目）には，TCE，cis-DCE ともに地下水基準（それぞれ 0.03 mg/L
以下，0.04 mg/L 以下）を達成した。MW-1 でも同様に

嫌気性バイオ法の開発

87

図 14．地下水中の TCE 濃度分布および井戸の平面配置．

図 16．バイオオーグメンテーション実証試験における Dehalococcoides 属細菌 16S rDNA および vcrA のコピー数変化．

図 15．バイオオーグメンテーション実証試験におけるエチレ
ン類の濃度変化．

TCE および cis-DCE がエチレンに分解し，地下水基準を達成した（データ示さず）。
一方，SIW については，増殖基質注入後に TCE に濃度低下が観察されたものの，cis-DCE 濃度が上昇するのみで，VC およびエチレン濃度に顕著な変化は認められなかった（図 15B）。MW-3 では塩素化エチレン類に顕
著な濃度変化は認められなかった（データ示さず）。
また，AIW では，利用微生物群注入後 Dehalococcoides
属細菌 16S rDNA および vcrA コピー数が上昇し，注入
2 ヵ月後（図中 100 日目）には約 1.0×106 copies/mL となった。（図 16A）。また，AIW 下流の MW-1 においても有意な上昇が確認された（データ示さず）。
一方，SIW では，Dehalococcoides 属細菌 16S rDNA
および vcrA コピー数ともに注入 2 ヵ月後（図中 100 日目）まで定量下限値未満であり，注入約 3.5 か月後（図中 115 日後）に約 40 copies/mL 検出されたのみであった（図 16B）。MW-3 では常時定量下限値未満であった（データ示さず）。
これらの結果から，バイオオーグメンテーションに
よって地下水中の Dehalococcoides 属細菌数を増やすことができ，バイオスティミュレーションと比較してより短期間で塩素化エチレン汚染地下水を浄化できることが示された。
一方，AIW の下流に設置したモニタリング井戸（MW-2
および MW-5）において病原性細菌のモニタリングを継

88

上野

続しているが，利用微生物群注入後 2.5 カ月経過した時点において病原性細菌の有意な増加は確認されていない。
5.

おわりに

本稿では，当社における嫌気性バイオレメディエー
ションの検討結果と現場適用事例について述べた。バイ
オスティミュレーションについては，「揚水処理より短く，掘削除去より安く」，といった市場ニーズに対応し，近年かなり普及してきた。しかしながら，まだまだ浄化
期間・費用に対する期待は大きい。また，バイオスティ
ミュレーションではそもそも塩素化エチレン分解菌が生息しない現場には適用できない。これに対してバイオオーグメンテーションは塩素化エチレン分解菌の濃度を高めることで浄化期間を短縮，さらに費用を低減することが期待できる。また，分解菌が生息しない現場にも適用することも期待できる。今後は，さらにバイオオーグ
メンテーションの現場適用を進め，短期間・安価で，適切な浄化を行うことにより土壌・地下水環境の保全に貢献していきたいと考えている。
謝辞

この度は当社の技術を評価いただき，環境バイオテク
ノロジー学会技術賞という大変栄誉ある賞をいただいた
こと，誠に光栄に存じます。
本技術開発の一部は NEDO プロジェクト「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術開発」の一環として実施したのものです。開発にあたって多岐にわたるご指導をいただきました東北学院大学工学部の中村寛治教授に心より感謝申し上げます。
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