No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 17

高効率逆転写酵素「ReverTra Ace®」の反応効率・伸長性能と逆転写反応温度の検討
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 川井 淳
はじめ に（98℃ 10sec → 68℃ 2min）×30サイクルのPCRを行いま「ReverTra Ace®」は、M-MLV RTaseを遺伝子工学的に改変した。PCR終了後、電気泳動を行い、目的バンドのシグナル強度、して開発された高効率逆転写酵素であり、伸長性、および反応効率非特異バンドの出現パターンにより逆転写反応効率、および特異®

性を評価しました（図2）。

が格段に向上しています。この「ReverTra Ace 」は、高効率逆転写キット「ReverTra Ace -α-®（Code No. FSK-101）」やリアルタイムPCR用逆転写キット「ReverTra Ace ® qPCR RT Kit（Code No. FSQ-101）」に用いられており、ご好評いただいてい

M-MLV Reverse transcriptaseます。
今回は、この「ReverTra Ace®」の優れた反応効率、および伸長遺伝子工学的改変性を確認するために、高次構造を取りやすく、逆転写が難しいとされる18SリボソームRNAを鋳型とした逆転写反応において、他社のReveTra Ace逆転写酵素と比較を行いました。

方法

高効率逆転写キット
ReverTra Ace -α-®

（1）使用酵素

伸長性・反応効率が向上

リアルタイムPCR用
高効率逆転写キット

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

・ReverTra Ace®
図1．ReverTra Ace®のキットへの応用（Code No.TRT-101、100U/μl、推奨反応温度42℃）
・A社逆転写酵素（改変型M-MLV RTase、200U/μl、推奨反応温度42℃）
・B社逆転写酵素（改変型M-MLV RTase、200U/μl、推奨反応温度55℃）（1）逆転写反応（42℃および55℃）（2）逆転写反応

RNAcDNA

まず、鋳型となる200ngのHeLa細胞由来total RNAと、4

各種
逆転写酵素

pmolの配列特異的リバースプライマー（5 -GTTCGACCGT
CTTCTCAGCGCTCC-3 ）、各逆転写酵素推奨量のdNTPs、リバース
プライマー

およびRNase-free水を混合し（合計液量13μl）、65℃、5min.
インキュベート後、氷上で急冷して、プライマーのプレアニーリングを行いました。その後、各逆転写酵素の反応バッファー、40UのRNase inhibitor（Code No. SIN-101）、2μlの各逆転写酵（2）PCR（KOD FX使用）

素、およびRNase-free水を混合し（合計液量20μl）、42℃またcDNA

は55℃、20分間の逆転写反応を行い、最後に、85℃、5min.処理することにより、酵素を失活させました。
（3）PCRによる検出（2）で調製した逆転写反応液を鋳型として、高成功率PCR酵素「KOD FX （Code No. KFX-101）」を用いて様々な鎖長領域

フォーワードプライマー（4種）のPCRを行いました。リバースプライマーは逆転写反応で用いたものと同一のもの、フォーワードプライマーはプライマー#1（5'-リバース
プライマー
（共通）

TGACGGAAGGGCACCACCAGGAG-3'、増幅鎖長600bp）、プライマー#2（5'-AGCTAGGAATAATGGAATACGACCG
C-3'、増幅鎖長950bp）、プライマー#3（5'-TAACGAGGATC（3）アガロースゲル電気泳動

CATTGGAGGGCAAGC-3'、増幅鎖長1220bp）、プライマー#4（5'- GCCATGCATGTCTAAGTACGCACGG -3'、増幅鎖長1760bp）を、それぞれ5pmol使用しました。その後、逆転写

図2．逆転写反応効率・伸長性比較の実験スキーム

反応液2μlを用いて、反応液量25μlで、温度条件98℃ 2min →

2008

9017

No.90.qx 08.3.21 17:09 ページ 18a ）600塩基b ）950塩基
55℃

42℃
RAABRA

A

55℃

42℃
RAB

A

B

RA

A

B

950bp600bpc ）1220塩基d ）1760塩基
55℃

42℃
RAA

B

RAA55℃

42℃
B

RAA

B

RAA

B

1760bp1220bp

図3．逆転写伸長性の比較結果
RA：ReverTra Ace®、A：A社逆転写酵素、B：B社逆転写酵素

結果及び考察の高さより、酵素に元来備わっている基本性能が重要であることが結果を図3に示します。cDNA合成量、および伸長距離のいずれ示唆されました。なお、本酵素の反応効率・伸長性などの基本性能においてもReverTra Ace®が最も良好な結果を示しました。図3のの高さは、弊社独自の遺伝子改変によるものです。

中でエキストラバンドがみられるものがありますが、それは、rRNAの複雑な立体構造が原因で逆転写のスリップが原因で生じた短い増幅産物であると考えられます。ReverTra Ace®は最もエキストラ

まとめ

バンドが少なく、特異性の高い逆転写が行われていることが示唆さ

今回の結果より、ReverTra Ace®の基本性能は、他社品と比較しれました。また今回、逆転写の反応温度を2水準（42℃および55℃）て極めて優れており、様々な逆転写反応のアプリケーションにおいで比較しましたが、いずれの酵素においても、高温で反応を実施すて安定した性能を発揮すると考えられます。ReverTra Ace®は、単るより、それぞれの至適温度（ReverTra Ace ®およびA社酵素：品での販売（TRT-101）のほか、様々なキット製品の酵素としても42℃、B社酵素: 55℃）で反応を行った方が良好な結果を示し、用いられており、1st strand cDNA合成、定量PCR用のcDNAサ

18S rRNAのような高次構造をとりやすい鋳型においても、高温でンプル調製、RT-PCRによる遺伝子クローニングなど、多様な用途の逆転写は必ずしも結果の改善には結びつかないことが示唆されにおいて簡便にご使用いただけます。是非一度、ReverTra Ace®おました。これらの結果から、逆転写酵素の選択においては、反応温度よび各種キット製品をお試しください。

品 名 お よ び 内 容

ReverTra Ace®

品 名 お よ び 内 容

包装

2,000U×1本
10,000U×1本（10,000U×1本）
× 5（10,000U×1本）
×10

TRT-101T
TRT-101
TRT-101X5
TRT-101X10価格¥6,000¥15,000¥60,000¥105,000

Code No.

価

100回用（20μl反応）-20℃

FSK-101￥53,000

200回用（10μl反応）-20℃

FSQ-101￥38,000

RNase Inhibitor（Native type）

2,500U×1本-20℃

SIN-101￥9,000

RNase Inhibitor（Recombinant type）

2,500U×1本-20℃

SIN-201￥9,000

ReverTra Ace -α-®
リアルタイムPCR用高効率逆転写キット

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

装Code No.

-20℃

保存温度

高効率逆転写キット

包保存温度

18格

200890