22-05

Emerald Luc Vector Series

pELuc-test(Code No. ELV-101)
pELuc(PEST)-test (Code No. ELV-201)

取扱説明書

TOYOBO CO., LTD.
Bioproducts Sales and Marketing Department
OSAKA JAPANA3629K－目次－[1] はじめに…………………………………………………………………………… 2[2] 製品内容 ………………………………………………………………………… 3[3] Emerald Luc ベクターの説明……………………………………………………
4
4
1. ルシフェラーゼ遺伝子…………………………………………………………
5
2. Short life タイプのルシフェラーゼ遺伝子……………………………………
3. ベクターの構造………………………………………………………………… 5[4] 哺乳類細胞におけるアッセイ方法の概略 ………………………………………
7
1. 被験配列（プロモーターなど）のクローニング………………………………… 77
2. リポーターアッセイ……………………………………………………………
[5] ベクターマップ及び配列情報 ……………………………………………………
8[6] ベクター制限酵素認識部位及び塩基配列………………………………………
9[7] トラブルシューティング…………………………………………………………… 13[8] 参考文献 ………………………………………………………………………… 13[9] 関連商品 ………………………………………………………………………… 14

ご注意
本製品は研究用試薬です。診断・臨床用試薬として決して使用しないでください。本製品の使用にあたっては、実験室での一般の注意事項を厳守し、安全に留意してください。
本製品に用いられるルシフェラーゼ遺伝子並びにこれらを用いた遺伝子転写活性測
定技術について、独立行政法人産業技術総合研究所及び弊社より特許出願中です。本
製品の利用は研究目的に限られます。研究目的以外でのご利用は弊社までお問い合わ
せください。

ELV-101_201

1[1] はじめに

リポーター遺伝子を用いた遺伝子発現解析は、ある遺伝子のプロモーターなどの転写制御配列をリポーター
遺伝子に連結したプラスミドを細胞へ導入し、このリポーター酵素の活性を指標に遺伝子発現を評価する手法です。特にルシフェラーゼの発光を利用したシステムは感度が高く、活性測定が簡便なことから、リポーターとして広く用いられています。
Emerald Luc システムは、産業技術総合研究所・近江谷先生らのグループとの共同研究によって開発された新規なルシフェラーゼ（Emerald Luc）を用いたリポーターアッセイシステムです（1, 特許出願中）。Emerald Luc
システムに用いられるルシフェラーゼは、ホタル由来ルシフェラーゼと同じ D-luciferin を発光基質としております
が、ホタルルシフェラーゼと比べ、生細胞において安定で、シグナル強度の高い発光が観察されます。
本製品は、この Emerald Luc システムのベクターシリーズです。本ベクターに転写制御配列を挿入していただくことによって、生細胞での発光イメージングや非破壊計測によるリポーターアッセイにご利用になれます。また、本ルシフェラーゼは、細胞を溶解し発光測定を行うような in vitro アッセイ（破壊計測）における発光安定性も高く、in vitro アッセイ用のルシフェラーゼとしても最適です（図 1）。

図 1. リポーターアッセイの実験フロー

本製品には以下の特長があります。

特長 1 生細胞における高い発光シグナル
ホタル由来ルシフェラーゼと比べ、生細胞において高い発光が観察されます。細胞培養液に D-luciferin を添加することによって、生細胞において発光を測定することが可能です。現在注目されている発光イメージングのプローブとして最適です。
2

ELV-101_201

特長 2 動的な変動解析が可能 【Emerald Luc –Short life タイプ- (Code No. ELV-201)】
時計遺伝子のリズム解析などの特に動的な転写変動を解析するには、ルシフェラーゼの C 末端に分解促進シ
グナル(PEST 配列)を付加した Emerald Luc –Short life タイプ- (Code No. ELV-201)が適しています。高発光検出には、スタンダードな Emerald Luc (Code No. ELV-101)をご利用ください。

特長 3 高い発光安定性
ホタル由来ルシフェラーゼと比べ、in vitro アッセイ（破壊計測）において高い発光持続性を示しますので、発光の減衰が少なく、HTS アッセイに最適です。In vitro アッセイには専用の下記試薬をご利用になれます。

Emerald Luc システム in vitro アッセイ用試薬
品名
Emerald Luc
Luciferase Assay Reagent Neo

サイズ（＊）

Code No.

10mL×1 本

ELA-301（＊）96 ウェルプレートでアッセイを行う場合、100 反応分に相当します。

細胞をあらかじめ溶解し、ライセートを用いて測定を行う場合には下記の試薬を別途ご利用ください。
Code No.
品名
サイズ
Emerald Luc Lysis Solution
100mL×1 本
ELA-201[2] 製品内容

Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃベクターシリーズ
品名
Emerald Luc プロモーター挿入用ベクター
pELuc-test
Emerald Luc-Short life タイプ-プロモーター挿入用ベクター
pELuc(PEST)-test

ELV-101_201

3

包装

Code No.

10μg×1 本ELV-101

10μg×1 本ELV-201[3] Emerald Luc ベクターの説明

1. ルシフェラーゼ遺伝子
Emerald Luc は、ブラジル産ヒカリコメツキ Pyrearinus termitilluminans 由来のルシフェラーゼ遺伝子をもとに、哺乳類細胞で効率よく翻訳されるように遺伝子工学的に改変されたルシフェラーゼ遺伝子です。ホタル由来のルシフェラーゼと同じ D-luciferin を発光基質としておりますが、生細胞においてより高い発光が観察されます（図 2,3,4）。また、一般的に行われる細胞を溶解して行う検出においても優れた発光安定性を示します（図 5）。

HO

S

N

N

S

ELuc

COOH

+ ATP + O2

D-luciferin

Mg2+

Light

Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 +

図 2. Emerald Luc による発光反応

2.0E+04

RLU

1.5E+04SV40

1.0E+04

HSVtk

5.0E+03

0.0E+00

ELuc

ELuc

fLuc

fLuc

図 3. 細胞の発光像

図 4. 生細胞中での発光量比較

Emerald Luc (ELuc) と ホ タ ル ル シ フ ェ ラ ー ゼ (fLuc) を
NIH3T3 細胞にトランスフェクションして各ルシフェラーゼを発現させ、培地に 0.2 mM D-luciferin を加え、細胞を撮影しました。

SV40 プロモーター及び HSVtk プロモーターに Emerald
Luc (ELuc)とホタルルシフェラーゼ(fLuc)に連結し、HeLa
S3 細胞にトランスフェクションしました。24 時間後に培地に0.2 mM D-luciferin を添加し、発光を測定しました。

2.5E+06

ELuc / 専用試薬

図 5. 細胞破壊検出における発光安定性
SV40 プロモーターの下流に Emerald Luc (ELuc)とホタルルシフェ
ラーゼ(fLuc)を連結し、CHO 細胞にトランスフェクションし各ルシフェ
ラーゼを発現させました。ELuc 導入細胞には専用の発光試薬（Emerald Luc Luciferase Assay Reagent（Code No. ELA-101））
を、fLuc 導入細胞には他社ホタルルシフェラーゼ検出用試薬 A ま
たは B を、培養液と等量添加しました。10 分間放置した後、繰り返し発光を測定し、発光の強度・推移を調べました。上図に発光強度を、下図に相対活性（各測定で最初の計測値を 100）を示します。

1.5E+06
1.0E+06

fLuc / 試薬A
fLuc / 試薬B

5.0E+05
0.0E+00
120 0

20

40

60

80

80

100

120

ELuc / 専用試薬

min

100

%

RLU

2.0E+06

fLuc / 試薬B

60
40fLuc / 試薬A

20
0
0

20

40

60

80

100

120

min

4

ELV-101_201

Emerald Luc は、最大発光波長 538nm の緑色の発光を呈します。この発光スペクトルは pH の影響をほとん
ど受けません。さらに、発光検出に使用される光電子増倍管（PMT）や CCD カメラではこの領域に高い量子効率を示すものが多く、ハード面からも好適なルシフェラーゼといえます。

2. Short life タイプのルシフェラーゼ遺伝子
一般に、一度発現したルシフェラーゼなどのリポータータンパク質が細胞内に比較的長時間とどまることによってバックグラウンドとなるシグナルが生じ、遺伝子発現の変化を過小評価してしまうケースがあります。Li らは、
マウス ornithine dehydrogenase 由来 PEST 配列をリポーターに付加することによって、リポータータンパク質を不安定化させることに成功しました(2)。Short life タイプベクターはこの技術を応用した高レスポンス型ルシフェ
ラーゼベクターです。Emerald Luc の C 末端に PEST 配列を連結されているので、細胞内においてルシフェラー
ゼが速やかに分解されます（図 6、7）。この結果、該日時計遺伝子の転写変動など、動的な発現変動が解析しやすくなっています（図 8）。
ELuc

図 6. スタンダードタイプの Emerald Luc と Shortlife タイプの Emerald Luc (PEST)

ELuc

PEST

ELuc（PEST)

図7. Emerald Luc及び-Short lifeタイプ-の細胞内安定性

3.0E+05
2.5E+05

Emerald Luc(Eluc)、Emerald Luc –Short lifeタイプ(ELuc(PEST))を安定発現するCHO細胞をシクロヘキシミド処理して翻訳反応を停止させました。その後、各経過時間における残存発光活性を測定し、プロットしました。●及び破線:ELuc、▲及び実線:ＥLuc(PEST)。この結果、Emerald Luc–Short lifeタイプ- (ELuc(PEST))の細胞内半減期は約3時間と見積もられました。

ELuc(PEST)

RLU

2.0E+05
1.5E+05
1.0E+05

ELuc
5.0E+04
0.0E+00
0

1

2

3

4

5

6

シ ク ロヘキ シ ミド処理 (h)1.0E+06

6.0E+06

図 8. 概日時計遺伝子の転写変動解析
pELuc (RLU/min)

pELuc-test、pELuc(PEST)-test のルシフェラーゼ遺伝子上流に概日変動性の報告されている Bmal1 遺伝子プロモーターを挿入したプラスミドを、NIH3T3 細胞へトランスフェクションしました。その後、この細胞を 100nM デキサメタゾンで処理し、0.2mM D-luciferin を含む培地に置換し、培養しながら連続発光測定装置で 3 日間発光を測定しました。破線は ELuc、実線
は ELuc(PEST)を示します。

8.0E+05

5.0E+06
6.0E+05

4.0E+06
3.0E+06

4.0E+05

2.0E+06
2.0E+05

1.0E+06
0.0E+00

pELuc(PEST) (RLU/min)

7.0E+06

0.0E+00
024Time (hr)48

72

3. ベクターの構造
Emerald Luc ベクターシリーズは、弊社 MultiReporter Assay System –Tripluc®– ベクターシリーズと同じマルチクローニングサイトを有しております。その他、Emerald Luc ベクターシリーズは以下のエレメントを有しております（ベクターマップは p. 8 に示します）。
SV40 late poly(A) signal
ELV-101_201

5

ポリアデニル化シグナルは RNA Polymerase II の転写終結に寄与し、転写産物の 3’末端に 200～250 bp
程度のアデノシンを付加します。これにより、RNA の安定性や翻訳効率が増大します。
Background reduction signal
ポリアデニル化シグナルである AATAAA を 2 つ含む SV40 early poly(A) signal をタンデムにルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置し、より強力な転写終結のためのシグナルとしてベクターバックボーンに起因するノイ
ズシグナルを低減します(3)。マルチクローニングサイトの上流にタンデムに配置されているため、インサート
確認用のプライマーを設計される場合には注意が必要です。（p.7 をご参照下さい）。

6

ELV-101_201

[4] 哺乳類細胞におけるアッセイ方法の概略

1. 被験配列（プロモーターなど）のクローニング
pELuc-test、pELuc(PEST)-test のマルチクローニングサイトへプロモーターなどの転写制御配列をクローニングします。被験配列のクローニングには、弊社 high fidelity ホットスタート PCR 酵素 KOD –Plus– （CodeNo. KOD-201）や KOD –Plus– Ver.2（Code No. KOD-211）のご使用をお勧めいたします。
インサートをご確認いただくためのコロニーダイレクト PCR あるいはシーケンス反応には、下記の挿入配列確認用プライマーのご使用をお勧めいたします。
図 9. pELuc-test マルチクローニングサイトとインサート確認用プライマー

インサート確認用フォワードプライマー
5’ CAATGT ATCTTATCAT GTCTGGATCGCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGGATCA TAATCAGCCATACCACATTT GTAGAGGTTT TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACACCTCC CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAATTGTTGTTGT TAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA
TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGCTCGAGGT CGACGGTATC
Xho I

Sal I

Cla I (Ban III)GATAAGCTTA CGCGTGCTAG CGCATGCAGA TCTACTAGTC GGCCGGATAT CGAATTCCTG CAGCCCACCA CCATGGAGAG
Hind III(*)Mlu I
Nhe I Sph I Bgl II Spe I
EcoR V EcoR I Pst I (*) Nco I (*)
ELucAGAGAAGAAC GTGGTGTACG GCCCCGAGCC CAAGCACCCT CTGGGCAACT TCACCGCCGG
CCACATGC CGGGGCTCGG GTTCGTG 5’
インサート確認用リバースプライマー(注 1)

pELuc(PEST)-test もマルチクローニングサイトは同じ塩基配列を有しておりますが、(*) 印の制限酵素はベクター
内の他の部位も切断しますので、クローニング部位としてはお勧めできません。インサート確認用プライマーは同じ配列のものを使用できます。
(注２) バックグラウンド低減シグナルとして SV40 poly(A) signal が複数配置されているため、プライマーをマルチクローニ
ングサイトの上流近傍に設計されますと、PCR 反応やシーケンス反応を上手く行うことができません。

2. リポーターアッセイ
プロモーターなどの被験配列を Emerald Luc に連結したプラスミドを哺乳類細胞へトランスフェクションします。
その後、必要に応じて調べたい薬剤で細胞を処理し、Emerald Luc の活性を測定します。測定方法については下記の 2 種類の方法があります。
(1) 生細胞アッセイ（非破壊計測、in vivo アッセイ）
細胞培養液に 0.2～1 mM D-luciferin を添加し、調べたい条件で細胞をインキュベートし、ルミノメーターある
いは発光イメージングシステムで検出します。生細胞でアッセイするため、時間経過による変動解析、リアル
タイム解析が可能です。特に、発光イメージングシステムではシングルセルで転写変動を解析できます。
(2) in vitro アッセイ（破壊計測）
調べたい条件で細胞をインキュベートした後、細胞溶解・発光反応を行う Emerald Luc Luciferase Assay
Reagent Neo（Code No. ELA-301）を培地と等量添加します。10 分間インキュベートした後、発光をルミノメー
ターで検出します。生細胞計測に比べ、発光強度の高い測定が可能です。
ELV-101_201

7[5] ベクターマップ及び配列情報(1) pELuc -test

pELuc-test
Multiple cloning region
Emerald Luc gene (ELuc)
SV40 late poly(A) signal
β-lactamase (Amp (r)) genebackground reduction signal

Poly(A)
Poly(A)

Kpn I
3743

1-89
91-1719
1733-1958
2052-2912
3743-4222

pELuc-test
4222 bp

ELuc(Emerald
Luc)

Xho I
1
Sal I
7
Cla I
16
Hind III 22
Mlu I28
Nhe I 34
Sph I 40
Bgl II 46
Spe I 52
EcoR V 64
EcoR I 70
Pst I
76
Nco I 89

Amp(r)
Poly(A)
Xba I1720
Not I 1726
Sca I 2356
Sac I 1959
SspI 2032
Sac
II
1965
BamH I 1977
Sma I 1971

(2) pELuc(PEST)-test

pELuc(PEST)-test
Multiple cloning region
Emerald Luc gene (ELuc)PEST
SV40 late poly(A) signal
β-lactamase (Amp (r)) genebackground reduction signal

Kpn I
3873

1-70
91-1716
1717-1839
1863-2087
2182-3042
3873-4352

Poly(A)
Poly(A)

Xho I
1
Sal I
7
Cla I
16
Mlu I 28
Nhe I 34
Sph I 40
Bgl II 46
Spe I 52
EcoR V 64
EcoR I 70

pELuc(PEST)-test
4352 bp

Amp(r)

ELuc(Emerald Luc)

PEST
Poly(A)

Xba I1850
Not I 1856
Sac I 2089
BamH I 2107 Sac II 2095
Sma I 2101

Sca I 2486
SspI 2162(注) pELuc(PEST)-test についても、制限酵素 Hind III、Pst I、Nco I の認識配列が ELuc 遺伝子上流のマルチクローニン
グサイトに存在しますが、ベクター内の他の部位にも存在しますので、クローニング部位としてはお勧めできません。

8

ELV-101_201

[6] ベクター制限酵素認識部位及び塩基配列(1) pELuc -test
表 1. pELuc ベクターを 1 または 2 箇所切断する制限酵素
酵素

Acc I
Alw 44I
Ase I
Bam HIBan III
Bcl I
Bgl I
Bgl IIBst XICfr 9I
Cla I
Eco 52I
Eco 81I
Eco RI

箇所
2
2
1
1
1
2
1
1
2
1
1
2
2
1

切断部位
7 11102167 3413
2663
1977
16
932 1400
2715
46
83
285
1971
16
58 1727484 1611
70

酵素

Eco RVEhe I
Fsp I
Hae II
Hin 1I
Hind III
Kpn I
MLu I
Nar I
Nco I
Nhe I
Not I
PpuM I
Pst I

箇所
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1

切断部位
64
1546
2614
1546 3483
1546 2298
22
3743
28
1546
89
34
1726
1257
76

表2. pELuc-testベクター内に認識部位のない制限酵素
Aat I
Aat II
Afl IIApa I
Bbr PI
Bfr I
Csp45 I
Csp I
Dra IIIEco 105I Eco 47III
Eco T22I
Nsp V
Pac I
Pvu II
SanD I
Sfi I
Srf I

Bpu 1102I
Mro I

酵素

Pvu I
Sac I
Sac II
Sal I
Sca I
Sma I
Spe I
Sph I
Ssp I
Sty I
Xba I
Xho I
Xmn I

Bsi WI
Msc I

箇所
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

切断部位
2467
1959
1965
7
2356
1971
52
40
2032
89
1720
1
2235

Bss HII
Nde I

Bst EII
Nru I

pELuc-test ベクター配列 （弊社ウェブサイトからダウンロード可能です。）
1
81
161
241
321
401
481
561
641
721
801
881
961
1041
1121
1201
1281
1361
1441
1521
1601
1681
1761
1841

ctcgaggtcg acggtatcga taagcttacg cgtgctagcg catgcagatc tactagtcgg ccggatatcg aattcctgca
gcccaccacc atggagagag agaagaacgt ggtgtacggc cccgagccca agcaccctct gggcaacttc accgccggcg
agatgctgta caacgctctg cacaagcact cccacatccc ccaggccatc ctggacgtga tgggcaacga gtccctttcc
taccaggagt tcttcgacac tactgtgaag ctgggccaga gcctccagaa ctgtggctac aagatgaacg atgtcgtgtc
gatctgtgca gagaacaaca agagattctt catccccatc atctccgcct ggtacatcgg catggtggtg gcccctgtga
acgaggacta tatcccagac gagctgtgta aagtgaccgg catctccaag ccgatcctgg tcttcaccac taggaagatc
ctgcctaagg ttttggaggt taaagacaga accaactaca taaagaggat catcatactg gactctgaag agaacctgct
gggctgcgag agcctgcaca acttcatgtc caggtactcc gacaacaacc tccaaacatt caagcctctg cactacgacc
ctgtggacca ggtagccgcc atcctgtgct cctccggcac aaccggcctg cctaaaggcg tgatgcagac ccacaggaac
atctgtgtga gactcacaca cgcatctgac cccagagtgg gtacacaact catccccggc gtatccgtgc tggcctacct
gccattcttc cacgccttcg gcttcagtat caacctgggc tatttcatgg tgggcctgag agtggtgatg ctccgaaggt
ttaaccagga ggtgttcctg aaggccatcc aggactacga ggtgaggagc gtgatcaacg ttccctccac aatcctgttc
ctgtccaaga gccctctggt ggacaagtac gacctatcca ccctggcgga gctgtgctgt ggagccgctc ctctggcgaa
ggaggtggcc gagatcgccg tgaagaggct gaacctgcca gggatacggt gtggctacgg tctaacagag tctacctccg
ccaacatcca tactctgcac aacgagttca agtccggctc cctgggcaag gtgacacctt acatggccgc caagatcatc
gacaggaaca ccggcgaggc cctgggtcca aaccaggtgg gcgagctgtg catctgggga cctatggtaa caaaaggcta
tgtgaacaac ccacaggcta ctaaggaggc catcgacgac gacggctggc tgcactctgg cgacttcggc tactacgacg
aggacgagta tttctacatc gtggaccggt acaaggagct gatcaaatac aagggctatc aggtcgcccc tgtggagctg
gaggagatcc tccttcagca cccaggcatc agggacgtgg ccgtcgtggg tatccctgac atcgaggccg gcgagctgcc
agccggcttc gtggtgaagc agcccggcgc ccaactcacc gctaaggagg tgtacgactt cctggcccag agggtgtctc
actccaagta cctgaggggc ggcgtaaggt tcgtggactc tatccccagg aacgtgacag gcaagattag tcgaaaagag
ctgagggagg ccctgatgga gaaggcttct aagctgtaat ctagagcggc cgcccagaca tgataagata cattgatgag
tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac
cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg

ELV-101_201

9

1921
2001
2081
2161
2241
2321
2401
2481
2561
2641
2721
2801
2881
2961
3041
3121
3201
3281
3361
3441
3521
3601
3681
3761
3841
3921
4001
4081
4161

ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatgga gctcccgcgg cccgggggat cctcaaatat gtatccgctc
atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct
tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt
tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg
tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacagtaagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg
aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc
cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac
ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt
ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga
tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg
agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt
catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt
ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc
aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc
gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact
caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg
acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta
tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg
tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc
aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcggtaccga tcataatcag
ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg
caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa
gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatca taatcagcca
taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa
ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca
tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tg(2) pELuc(PEST) -test
表 1. pELuc(PEST)ベクターを 1 または 2 箇所切断する制限酵素
酵素

Acc I
Alw 44I
Ase I
Bam HIBan III
Bcl I
Bgl I
Bgl IIBst XICfr 9I
Cla I
Eco 52I
Eco 81I
Eco RI

箇所
2
2
1
1
1
2
1
1
2
1
1
2
2
1

切断部位
7 11102297 3543
2793
2107
16
932 1400
2845
46
83
285
2101
16
58 1857
484 1611
70

酵素

Eco RVEhe I
Fsp I
Hae II
Hin 1I
Hind III
Kpn I
MLu I
Nar I
Nco I
Nhe I
Not I
PpuM I
Pst I

箇所
1
1
1
2
2
2
1
1
1
2
1
1
1
2

10

切断部位
64
1546
2744
1546 3613
1546
2428
22 1711
3873
28
1546
89 1719
34
1856
1257
76 1805

酵素

Pvu I
Sac I
Sac II
Sal I
Sca I
Sma I
Spe I
Sph I
Ssp I
Sty I
Xba I
Xho I
Xmn I

箇所
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1

切断部位
2597
2089
2095
7
2486
2101
52
40
2162
89 1719
1850
1
2365

ELV-101_201

表2. pELuc(PEST)-testベクター内に認識部位のない制限酵素
Aat I
Aat II
Afl IIApa I
Bbr PI
Bfr I
Csp I
Dra IIIEco 105I Eco 47III
Eco T22I Mro I
Pac I
Pvu II
SanD I
Sfi I
Srf I

Bsi WI
Msc I

Bss HII
Nde I

Bst EII
Nru I

Csp45I
Nsp V

pELuc(PEST)-test ベクター配列 （弊社ウェブサイトからダウンロード可能です。）
1
81
161
241
321
401
481
561
641
721
801
881
961
1041
1121
1201
1281
1361
1441
1521
1601
1681
1761
1841
1921
2001
2081
2161
2241
2321
2401
2481
2561
2641
2721
2801
2881
2961
3041
3121
3201
3281
3361
3441
3521
3601
3681
3761
3841

ctcgaggtcg acggtatcga taagcttacg cgtgctagcg catgcagatc tactagtcgg ccggatatcg aattcctgca
gcccaccacc atggagagag agaagaacgt ggtgtacggc cccgagccca agcaccctct gggcaacttc accgccggcg
agatgctgta caacgctctg cacaagcact cccacatccc ccaggccatc ctggacgtga tgggcaacga gtccctttcc
taccaggagt tcttcgacac tactgtgaag ctgggccaga gcctccagaa ctgtggctac aagatgaacg atgtcgtgtc
gatctgtgca gagaacaaca agagattctt catccccatc atctccgcct ggtacatcgg catggtggtg gcccctgtga
acgaggacta tatcccagac gagctgtgta aagtgaccgg catctccaag ccgatcctgg tcttcaccac taggaagatc
ctgcctaagg ttttggaggt taaagacaga accaactaca taaagaggat catcatactg gactctgaag agaacctgct
gggctgcgag agcctgcaca acttcatgtc caggtactcc gacaacaacc tccaaacatt caagcctctg cactacgacc
ctgtggacca ggtagccgcc atcctgtgct cctccggcac aaccggcctg cctaaaggcg tgatgcagac ccacaggaac
atctgtgtga gactcacaca cgcatctgac cccagagtgg gtacacaact catccccggc gtatccgtgc tggcctacct
gccattcttc cacgccttcg gcttcagtat caacctgggc tatttcatgg tgggcctgag agtggtgatg ctccgaaggt
ttaaccagga ggtgttcctg aaggccatcc aggactacga ggtgaggagc gtgatcaacg ttccctccac aatcctgttc
ctgtccaaga gccctctggt ggacaagtac gacctatcca ccctggcgga gctgtgctgt ggagccgctc ctctggcgaa
ggaggtggcc gagatcgccg tgaagaggct gaacctgcca gggatacggt gtggctacgg tctaacagag tctacctccg
ccaacatcca tactctgcac aacgagttca agtccggctc cctgggcaag gtgacacctt acatggccgc caagatcatc
gacaggaaca ccggcgaggc cctgggtcca aaccaggtgg gcgagctgtg catctgggga cctatggtaa caaaaggcta
tgtgaacaac ccacaggcta ctaaggaggc catcgacgac gacggctggc tgcactctgg cgacttcggc tactacgacg
aggacgagta tttctacatc gtggaccggt acaaggagct gatcaaatac aagggctatc aggtcgcccc tgtggagctg
gaggagatcc tccttcagca cccaggcatc agggacgtgg ccgtcgtggg tatccctgac atcgaggccg gcgagctgcc
agccggcttc gtggtgaagc agcccggcgc ccaactcacc gctaaggagg tgtacgactt cctggcccag agggtgtctc
actccaagta cctgaggggc ggcgtaaggt tcgtggactc tatccccagg aacgtgacag gcaagattag tcgaaaagag
ctgagggagg ccctgatgga gaaggcttct aagcttagcc atggcttccc gccggaggtg gaggagcagg ctgctggcac
gctgcccatg tcttgtgccc aggagagcgg gatggaccgt caccctgcag cctgtgcttc tgctaggatc aatgtgtaga
tgccattctt ctagagcggc cgcccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga
aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa
caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat
gtggtatgga gctcccgcgg cccgggggat cctcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc
tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg
ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt
ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat
gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct
ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta
cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt
aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt
gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt
tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcggtaccga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc

ELV-101_201

11

3921
4001
4081
4161
4241
4321

tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag
cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt
aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tg

12

ELV-101_201

[7] トラブルシューティング(1) クローニング
現象
対応
ターゲット領域の PCR 増幅が上手くい ターゲット領域に GC リッチな領域が含まれる場合、かない
PCR 反応効率が低下することがあります。下記のようにPCR を行うことによって改善される場合があります。
・ PCR を 2 ステップサイクルにする。
・ PCR の Denature ステップを 98℃、10 秒にする。
・ 5%程度の DMSO を PCR 反応液に添加する。
コロニーダイレクト PCR が上手くいか 適切なプライマーを使用してください（p.5 参照）。
ない
また、上記のように PCR を行うことによって改善される場合があります。
(2) トランスフェクション
現象
対応
ルシフェラーゼが発現しない、または発 ･ もともと発現の低いプロモーターの可能性がありま現が低いす。
・ トランスフェクション試薬あるいは条件が不適当な可能性があります。試薬や条件を変えて実施してください。
・ プラスミド抽出の際、大腸菌が混入した可能性があります（顕微鏡で観察すると、細胞以外に菌体が認められます）。フェノール／クロロホルム抽出を実施してください。
・ プラスミドの純度が低い可能性があります。
Endotoxin の混入が少なくなるように再精製してください。

[8] 参考文献
1. 中島芳浩、近江谷克裕 バイオテクノロジージャーナル, 3-4, 230-232 (2006)
2. Li, X., Zhao, X., Fang, Y., Jiang, X., Duong, T., Fan, C., Huang, C.C., Kain, S.R. J. Biol. Chem. 273,
34970-34975(1998)
3. Andrew G.B., Joanna B., Cameron S.O., and Peter N.C. Plasmid, 44, 173-182(2000)

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13[9] 関連商品●クローニング
品名High Fidelity PCR 用酵素
KOD –Plus–
High Fidelity PCR 用酵素
KOD –Plus– Ver.2
Taq ベースのブレンド型 PCR 用酵素
Blend Taq®
Taq ベースのブレンド型 PCR 用酵素（Hot start 対応）
Blend Taq® –Plus–
簡単ライゲーション
Ligation highコンピテントセル
Competent high DH5α

包装

Code No.

200 U×1 本

KOD-201

200 U×1 本

KOD-211250 U×1 本

BTQ-101

250 U×1 本

BTQ-201

50 回用

LGK-101

0.1mL×10 本

DNA-903

10mL×1 本

ELA-301

100mL×1 本

ELA-201

20μg×1 本

MRV-101

20μg×1 本

MRV-102

20μg×1 本

MRV-10320μg×1 本

MRV-201

20μg×1 本

MRV-202

20μg×1 本

MRV-20320μg×1 本

MRV-301

10mL×1 本(10mL×1 本)×5

MRA-301
MRA-301X5●アッセイ
in vitro アッセイ用発光試薬
Emerald Luc
Luciferase Assay Reagent Neo
in vitro アッセイ用細胞溶解剤
Emerald Luc Lysis Solution●多色レポーターアッセイ
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

プロモーター挿入用ベクター pSLG-test
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

プロモーター挿入用ベクター pSLO-test
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

プロモーター挿入用ベクター pSLR-test
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SV40 コントロールベクター pSLG-SV40 control
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SV40 コントロールベクター pSLO-SV40 control
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

SV40 コントロールベクター pSLR-SV40 control
MultiReporter Assay System -Tripluc®-

HSVtk コントロールベクター pSLG-HSVtk control
Tripluc®システム用 1 液アッセイ試薬

Tripluc Luciferase Assay Reagent

14

ELV-101_201

【製造・販売元】－価格・在庫に関するお問い合わせ－
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (大阪)〒530-0001 大阪府大阪市北区梅田一丁目１３番１号
大阪梅田ツインタワーズ・サウス
TEL 06-6348-3786 FAX 06-6348-3833
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp
東洋紡株式会社 バイオプロダクト営業部 (東京)〒104-8345 東京都中央区京橋一丁目 17 番 10 号 住友商事京橋ビル
TEL 03-6887-8819 FAX 03-6887-8951
E-mail : order_lifescience@toyobo.jp－製品の内容・技術に関するお問い合わせ－テクニカルライン
TEL 06-6348-3888 FAX 06-6348-3833
開設時間 9:00～12:00 , 13:00～17:00 (土日祝日、休日を除く)
E-mail : tech_osaka@toyobo.jp［URL］ https://lifescience.toyobo.co.jp/

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