No.81 06.10.13 20:09 ページ 1

Can Get Signal® immunostainを用いた
蛍光免疫染色東京工業大学大学院 生命理工学研究科 原田 伊知郎
はじめ に

3．2次抗体反応

近年、蛍光顕微鏡の著しい性能の向上のため、蛍光免疫染色法

Can Get Signal ® immunostain（solution A）に2次抗体

はタンパク質の発現の有無、細胞内タンパク質の局在などの詳細を 1/2000倍希釈、Alexa355標識phalloidinを1/50倍希釈を調べるための有力なツールとなりました。しかし、同じ抗原・し、サンプルのカバーガラスに50μlマウントして室温で1時間抗体反応を利用するウェスタンブロッティングと比較すると、抗反応させました。反応後、3回TBSにて洗浄しました。

体の非特異的な反応であることを視覚的に判断することが難しく、そのためできるだけ抗体反応部分とそれ以外のコントラスト使用した2次抗体:を明確にする必要があります。さらに、蛍光画像を撮影するため

Alexa488標識抗ラビットIgG抗体【Invitrogen社製】には感度のよいカメラを利用し、撮影時の露光時間を大きくする

Alexa546標識抗マウスIgG抗体【Invitrogen社製】

ことが必要ですが、露光時間の延長は蛍光プローブを褪色させてAlexa355標識phalloidin 【Invitrogen社製】しまいます。目的タンパクへの抗体の反応効率の向上は画質のコントラストの向上により上記2点を改善することが期待されます。

4．観察・撮影

免疫染色用Can Get Signal ® immunostain は、従来のCan

蛍光褪色防止剤にProLong Gold【Invitrogen社製】をサン

Get Signal を元に免疫染色用として開発されたものであり、蛍プルにマウントし、スライドガラス上にサンプル面を挟んで顕光免疫染色などサンプルが複雑な状態であっても従来品のような微鏡観察を行いました。観察顕微鏡にはOlympus IX71顕微抗原抗体反応の促進効果が期待されます。今回我々は、抗原抗体鏡にUPlanApo（×60）の対物レンズを使用し、撮影用CCD反応だけではなく、アクチンフィラメントの染色に用いられるカメラにはKeyence社のVB-7000を使用しました。

®

Phalloidinを併用し、従来方法では詳細観察が比較的難しい接着結果及び考察斑の免疫染色としてPaxillinとリン酸化タンパクの3重蛍光免疫染色を行い、免疫染色用Can Get Signal®

図には抗Paxillin抗体をCan Get Signal ® immunostainに希immunostainが従来法に比べて優れているかを検討しました。

釈した場合とTBSに希釈した場合（従来方法）のPaxillinの染色結果を比較しています。2つの結果は明度に大きな差があり露光方法

時間を統一することができなかったため、撮影は異なる露光時間（Can Get Signal ® immunostain 1秒、従来法 3秒）で撮影し1．サンプル処理滅菌した15mm×15mmのカバーガラス上に5μg/mlのフたものであることに注意してください。 Can Get Signal ®

ィブロネクチンをコートし、Swiss 3T3繊維芽細胞を一晩immunostainを使用した場合は、明らかなシグナル増強が認め10%血清入りDMEM培地にて培養しました。24時間後、培られました。また、Phalloidinのような抗原抗体反応ではない反地を除きただちに4%ホルマリンで15分浸し細胞を固定しま応の認識力の低下も認められませんでした。一方、従来方法と同した。TBS（10mM Tris, 0.15M NaCl）にて3回洗浄しじ露光時間で撮影した場合は、バックグラウンドの増強がわずか

0.5%Triton® X-100/TBSにて3分間処理した後、TBSで1ながら認められました。しかしながら、従来方法より目的タンパ

回洗浄しBlocking-One【ナカライテスク社製】にて30分ブ

クからのシグナルの増強が大きく、非常に高いコントラストであロッキングしました。

ったため、露光時間を短縮することで、バックグラウンドおよび非特異的反応の影響を大きく抑えることができました。また、今回示しましたデータは検証の同一条件にて行いましたが、Can2．1次抗体反応1次抗体を、Can Get Signalimmunostain（solutionCan Get Signal ® immunostainを用いることにより、従来よA）で1/200に希釈し、サンプルのカバーガラスに50μlマウり少ない抗体量で検出することも可能でした。以上の結果からントして室温で1時間反応させました。反応後、3回TBSにて

Can Get Signal ® immunostainは蛍光免疫染色にて大きな威洗浄しました。コントロールはTBSに抗体を希釈して同様に反力を発揮するものと考えられました。

®

応させました。
使用した1次抗体:
抗Paxillin ポリクローナル抗体（H-114）【Santa Cruz社製】
抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体（PY20）【Becton Dickinson社製】

8119

No.81 06.10.13 20:09 ページ 2Can Get Signal ® immunostain使用

従来法

従来方法でPaxillinを染色した結果。露光時間は3秒。従来方法では核近傍の細 Can Get Signal ®を用いてPaxillinを染色した結果。露光時間は1秒。本方法で胞中央付近に存在する接着部位（Fibrillar Adhesion）などは確認できない。 は核近傍の細胞中央付近に存在するFibrillar Adhesionのような細かい接着部位（コントラストの変調など画像処理は行っていない。
）
まで鮮明に確認することができた。（コントラストの変調など画像処理は行っていない。
）

Can Get Signal ® immunostain使用

Can Get Signal ® immunostain使用

Can Get Signal ® immunostain使用

Can Get Signal ®を用いたPY20での染色結果。
（画像処理は行っていない。）

Can Get Signal ®を用いたアクチンフィラメントの染色結果。Phalloidinによる染色も問題なく行えた。（画像処理は行っていない。
）

Can Get Signal ®を用いた全てをマージした結果。
本画像はコントラストを調整し明暗の強調を行ったもの。

各種染色結果品 名 及 び 内 容

Can Get Signal
Solution A
Solution B®

Can Get Signal
Solution A®

Can Get Signal
Solution B®

Can Get Signal

®

包装

保存温度

Code No.

価

4℃

NKB-401¥12,000

NKB-501¥30,000

NKB-502¥70,000

NKB-601¥30,000

NKB-602¥70,000

Code No.

価

NKB-101¥30,000

NKB-101T¥10,000格immunostain Starter Set
各5ml

immunostain

20ml×1本20ml×4本

immunostain

20ml×1本20ml×4本

品 名 及 び 内 容
Immunoreaction Enhancer Solution

Solution 1 for primary antibody
Solution 2 for secondary antibody

4℃

包装

4℃

保存温度

各250ml

格4℃
各50ml

®

Can Get Signal
Solution 1 for primary antibody

250ml

4℃

NKB-201¥17,000

250ml4℃

NKB-301¥17,000®

Can Get Signal
Solution 2 for secondary antibody※上記関連商品は特にウェスタンブロッティングやELISAにおいて効果があります。

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