相澤「次世代バイオセラミックス」プロジェクト

研究概要集

平成 25 年 9 月 30 日

プロジェクトリーダー 相澤 守
公益財団法人 神奈川科学技術アカデミー

目

次

＜総括＞
1.

基本構想 ......................................................................................................................................... i2.

全体計画と遂行方針 ...................................................................................................................... i3.

研究体制および組織 ..................................................................................................................... ii

4.

研究成果の概要 ........................................................................................................................... iii
4.1

生体内安定性アパタイトセメントの実用化研究 ................................................................ iii

4.2

生体内吸収性リン酸三カルシウムセメントの実用化研究 ................................................. iii

4.3

骨誘導能を備えたキレート硬化型アパタイトセメントの開発 ......................................... iii

4.4

インテリジェント DDS の構築(抗菌性) .............................................................................. iv

4.5

イノシトールリン酸の抗腫瘍効果の検証 ........................................................................... iv

4.6

非崩壊性および Non-fragmentation を担保した革新的骨修復セメントの開発と評価 .........v

4.7

多機能型アパタイトセメントの開発と評価 .........................................................................v

5.

課題および今後の展望 ................................................................................................................ vi

6.

業績 ..............................................................................................................................................vii

7.

プロジェクト参加者一覧............................................................................................................xix＜研究報告＞
1.

生体内安定性アパタイトセメントの創製とその評価..................................................................12.

生体内吸収性リン酸三カルシウムセメントの創製とその評価 ...................................................83.

種々のリン酸カルシウム相をもつセメント試験片の in vitro および in vivo における吸収性の比較とその連関性の解明..............................................................................................21

4.

非崩壊性および Non-fragmentation を担保した革新的骨修復セメントの開発とその評価 .......255.

高い骨伝導性を備えた HAp 系セメントの創製とその評価(1)−骨ミネラル含有アパタイトによるアプローチ−.......................................................................296.

高い骨伝導性を備えた HAp 系セメントの創製とその評価(2)−ケイ素含有アパタイトによるアプローチ− ..............................................................................35

7.

骨形成レベルを視覚化する評価・解析手法の確立(1)−クサビラオレンジブタによるアプローチ− ..............................................................................408.

骨形成レベルを視覚化する評価・解析手法の確立(2)−遺伝子導入による double-colored osteoblasts の創出− ..............................................................449.

抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(1)–銀含有アパタイトによるアプローチ− ......................................................................................48

10. 抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(2)−抗生物質を担持させたリン酸カルシウム微小球によるアプローチ− .....................................54

11. 抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(3)−プロタミンによるアプローチ− .................................................................................................58
12. 抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(4)−ラクトフェリンによるアプローチ− .........................................................................................62
13. イノシトールリン酸単独の抗腫瘍効果の検証 ...........................................................................67
14. 抗腫瘍効果を備えたキレート硬化型アパタイトセメントの創製とその評価 ..........................71
15. キレート硬化型アパタイトセメントの抗腫瘍効果の発現機構の解析−セルサイクルからのアプローチ− .............................................................................................75

総	
  括	
 
	
 
１． 基本構想
平成 22 年総務省統計局の調べによると、我が国は 65 歳人口が 23.1％に達し、既に「超高齢社会」に突入している。他の先進国に先駆けて、超高齢社会を迎えた我が国においては、骨粗鬆症などの疾患に対する高度先進医療を実現することが急務な課題である。本プロジェクトでは、例えば、高齢者特有の骨粗鬆症などの骨疾患に対して、注射器などで注入可
能な低侵襲治療を具現化する「次世代ペースト状人工骨」を開発することを目的として研究を推進した。
骨移植を伴う疾患に対する現在の治療法は自家骨を補填する方法がゴールデンスタンダードであるが、採取量の限界や二次的な侵襲などの問題がある。その代替手段としては、水酸アパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2; HAp)などのバイオセラミック
スを利用する方法がある。実際、HAp は骨組織と直接結合する「生体活性」を有するため、整形外科や口腔外科などの領域で骨充填材として臨床応用されている。水酸アパタイトの材料形態には緻密体・多孔体・顆粒・セメント（ペースト状人工骨）などがあるが、これらの材料形態のなかで任意形状に成形可能なペースト状人工骨、すなわち「アパタイトセ
メント」は今後の発展が期待される材料である。しかしながら、現行のアパタイトセメントは酸性物質のリン酸水素カル
シウム(CaHPO4)と塩基性物質のリン酸四カルシウム(Ca4(PO4)2O)との酸-塩基反応を利用することが多く、セメントの硬化にはリン酸水素カルシウムの溶解が律速となるためにかなりの時間を要する。また、硬化時に pH の変動を伴うため、組
織周辺の炎症反応を惹起する恐れもある。さらに、硬化時に血液が介在すると硬化時間が遅れる、あるいは硬化しなくなるという報告もあり、現行製品はユーザの要求を十分に満たしているとはいえない。
本プロジェクトを通して、我々は強力な「医工連携」により、従来の骨修復セメントの問題点をすべて解決した新しいメカニズムで硬化する「ペースト状人工骨」の創製に成功した。その硬化メカニズムが「イノシトールリン酸(IP6)」のキレート結合によることから、我々はこのセメントを「キレート硬化型骨修復セメント」と呼んでいる。また、企業との連携により、このペースト状人工骨の実用化を指向した研究も推進している。さらに、骨粗しょう症の患者に臨床的に適用しても確実な骨癒合を得、さらに医者が安心して使用し、患者の方々の生活の質(Quality of life; QOL)を向上させるには、
このセメントに新たな機能を付与させる必要がある。そこで、本プロジェクトでは、「次世代型ペースト状人工骨」の開発を指向し、「骨誘導（より高い骨形成能）」・「抗菌性（感染防止）」
・「抗腫瘍効果（適用症例の拡大）」の３つの機能を付与させた新規な「多機能性キレート硬化型骨修復セメント」の創製を試み、実際に高い骨形成能や抗菌性を備えたセメン
ト、腫瘍細胞に細胞のプログラム死であるアポトーシスを誘導するセメントの試作に成功している。
本研究プロジェクトで得られた成果は、例えば、ペースト状の人工骨を注射器などで患部に経皮的に注入するだけで骨折を治癒させる「低侵襲治療」を実現するものであり、超高齢社会を迎えた我が国だけでなく全世界の人々の QOL 向上に大いに貢献するものと期待できる。
	 ２． 全体計画と遂行方針
本研究の目的は、例えば、高齢者の「圧迫骨折」を適用症例とする注射器などで患部に注入可能な低侵襲治療を実現す
るセメント（ペースト状人工骨）を開発することである（図 1）。これまでに我々は「医工連携」により従来の骨修復セ
メントの問題点をすべて解決した新しいメカニズムで硬化する「ペースト状人工骨」を開発した。その硬化メカニズムがIP6 のキレート結合によることから、我々はこのセメントを「キレート硬化型骨修復セメント」と呼んでいる。
このペースト状人工骨の実用化を目指し、本プロジェクトの枠組みの中で実用化に向けた研究開発に取り組んだ。また、
骨粗しょう症の患者に臨床的に適用しても確実な骨癒合を得、さらに医者が安心して使用し、患者の QOL を向上させるには、このセメントに新たな機能を付与させる必要がある。そこで、本研究プロジェクトでは、「次世代型ペースト状人工骨」の開発を指向し、「骨誘導」
・「抗菌性（感染防止）」
・「抗腫瘍効果」の３つの機能を単独あるいは複数同時に付与させた新規な「多機能性キレート硬化型骨修復セメント」の開発にも取り組んだ。
本プロジェクトでは、前半の「フェーズ I（平成 21 年 10 月から 23 年 9 月までの 2 年間）」において以下のサブテーマを実施したことから、それらの研究内容を概説する。
① 生体内安定性アパタイト(HAp)セメントの実用化研究② 生体内吸収性リン酸三カルシウム(TCP)セメントの実用化研究③ 骨誘導能を備えたキレート硬化型アパタイトセメントの開発④ インテリジェント薬剤送達システム(DDS)の構築(抗菌性の付与)⑤ イノシトールリン酸の抗腫瘍効果の検証
まず、①および②では、セメントの材料特性を実用化可能なレベルまで引き上げ、さらにそれらの試料片の in vitro お
よび in vivo における生体適合性と生体吸収性を確認している。③では、骨誘導性（より高い骨形成能）の付与を目的とし、生体必須微量元素などを含有した生体活性のより高いセメント原料の合成方法を確立し、セメント試料片を試製し、i

in vitro および in vivo の両面から骨形成能を評価している。④では、抗菌性付与を目的とし、薬剤の二段階徐放を可能にする「ナノサイズの孔をその表面に備えた中空微小球」を調製し、この微小球に抗生物質などを担持させ、その抗菌活性を評価している。また、抗菌性をもつ金属イオンである銀(Ag)を担持させた HAp 微小球を合成し、その粉体を出発原料として抗菌性セメントの試作も行なってい図 1 本プロジェクトの概要と主な適用症例る。⑤では、抗腫瘍効果の検証を目的とし、試製したセメントと腫瘍モデル細胞との共存培養を行ない、その増殖性や形態とともに、アポトーシスの誘導が抗腫瘍効果の成因であることを明らかにしている。
なお、平成 23 年 10 月以降は、「フェーズ II（平成 23 年 10 月から 25 年 9 月までの 2 年間）」にはいったため、より実用化を意識して、①および②のテーマを昇華させて「⑥ 非崩壊性および Non-fragmentation を担保した革新的骨修復セメントの開発と評価」を、また③④⑤のテーマを融合させて「⑦ 多機能性アパタイトセメントの開発と評価」を推進している。まず、⑥の課題は、現在、リン酸カルシウムセメント(CPC)の臨床応用において最も問題とされている Fragmentationを解決した新しいセメントの創製を推進するとともに、いまだ確立していない Fragmentation の評価方法を提案することを目的としている。実際、セメントペーストの Fragmentation を評価するプロトコルを提案し、関連学会で報告している。
また、我々が開発したβ-TCP をベースとした「非崩壊性セメント」をモデル材料として、擬似的な臨床環境（血液中およびブタ脛骨内）で Fragmentation を生じないセメントの試作にも成功している。次に、⑦の課題では、骨形成を促進する
元素や生体骨を模倣したアパタイトをセメント原料とすることで、骨代謝レベルの低下した高齢者に対して、特に有効な高い骨形成能を備えたセメントの試作に成功している。また、サケ由来のタンパク質を利用した、新しいタイプの抗菌性セメントの試作にも成功しており、このセメントがバイオフィルム形成を阻害する機能を備えていることも明らかにしている。さらに、抗腫瘍効果を備えたセメントの開発では、IP6 が細胞周期の G1 期に作用することでアポトーシスを誘導することを明らかにしている。
上記のようなペースト状で使用する人工骨は、高齢者特有の骨粗鬆症性圧迫骨折などに対して低侵襲治療を可能にする（図 1）。本研究による成果は、今後の超高齢社会において非常に重要な研究であり、県民だけでなく日本およびグロー
バルな視点で、多くの人々の QOL 向上にも大きく貢献するともに、産業的な波及効果も大きいと考えられる。
	 ３． 研究体制および組織
本プロジェクトは、かながわサイエンスパーク（KSP）東棟の研究室（404, 405）を主な研究拠点として実験を行なった。本研究プロジェクトは、「医療の現場で本当に求められている医療材料を創製する」という観点から、専門を異とす
る 3 つ研究チームを構成し、それらのチームの有機的連携により遂行した（図 2）。まず、1) 材料創製とその機能評価を行なう研究者（工学系チーム）」は、バイオマテリアルな「 次 世 代 型 ペ ースト状 人 工 骨 の 開 発 」

どを専門とするメンバー（相澤、小西、水本ほか）で構成
し、主に「骨修復セメントの開発」を推進した。2) 創製

1)	
  骨修復セメントの開発した材料を生物学的な視点で評価・解析できる研究者

バイオマテリアルを専門とする研究者（相澤、水本、小西ら）（理・農系チーム）」では、分子生物学や生化学、発生工学などを専門とするメンバー（本田、神澤、長嶋ほか）で3チームの有機的連携2)	
  生化学的解析

構成し、主に「生化学的解析・動物実験(ブタ)」を遂行し生化学を専門とする研究者(本田、長嶋、神澤ら）

た。さらに、3) 実際の病態に即して創製した材料の臨床3)	
  臨床モデルによる検証
背骨を専門とする医学系研究者(松本、石井ら）

的研究を行なえる研究者（医学系チーム）」では、整形外科学を専門とするメンバー（松本、石井ほか）で構成し、

図 2 本プロジェクトの研究体制

主に「動物実験(ウサギ)・臨床モデルによる検証」を遂行した。これらの 3 つのチームの連携により、新しい「次世代型ペースト状人工骨の開発」を推進した。
プロジェクト期間中、総計 3 名の常勤研究員・常勤準研究員とコアメンバーとし、上述した専門を異とする総計 6 名の非常勤研究員に研究を分担していただくことで幅広い分野の研究を効率的に実施して研究推進を加速させた。また、コア
メンバーが創造的な研究に取り組む時間をより多く確保するため、総計 5 名の研究補助員を採用し、ルーチンワーク的な仕事を担当していただいた。プロジェクトリーダーの本務先である明治大学理工学部および明治大学大学院理工学研究科

ii

の卒研生・博士前期課程に在籍する学生諸君にも研究協力員として当該プロジェクトに参画してもらい（総計 18 名）、当該プロジェクトの推進に協力していただいた。明治大学理工学部・明治大学大学院理工学研究科は、神奈川県川崎市に拠点があり、研究協力員の学生はすべて神奈川県内の大学生および大学院生である。研究員や準研究員は当然として、彼らもまた国内学会や国際会議などで研究成果を発表し、なかには「優秀賞」に採択される学生も複数おり、非常に優れた研究成果を挙げた。また、研究協力員の中には論文投稿・掲載や特許出願を行なう者も複数おり、さらに 4 年間という短い研究期間でありながら博士取得者も 1 名いる。したがって、我々のプロジェクトは単なる研究成果のみならず、神奈川県内の学生への教育上の貢献についても極めて多大であったと自負している。
	
 ４． 研究成果の概要
４．１ 生体内安定性アパタイトセメントの実用化研究
このサブプロジェクトでは、最終的な製品の形として、低侵襲治療を可能とする「インジェクション型デバイス」を想定していることから、ペースト状人工骨の材料特性を臨床的に使用可能な特性に最適化する実験を推進した。評価項目として、ハンドリング性、圧縮強度、生体適合性および非崩壊性を掲げ、フェーズ I 終了時に達成する目標値を表 1 のように設定した。これまでに粉体の調製方法やイノシトールリン酸の表面修飾条件、適切な混練液の選択などを行ない、注射器でインジェクション可能であり、非崩壊性で、硬化時間 ~17 min、圧縮強度 ~22 MPa のセメントの開発に成功している。一例として、湿式法で合成したアパタイト粉体を 8000 ppm のイノシトールリン酸水溶液を媒体とし、ボールミル粉
砕することで、粉砕とイノシトールリン酸による表面修飾を同時に行なって「セメント原料粉体」を調製した。これを10 mass%キトサンおよび 2.5 mass%リン酸二水素ナトリウムを含む混練液と混ぜることで、上記のようなバランスの良い
材料特性を備えたセメント試験の創製に成功している。以下、表 1 にフェーズ I 終了時における「評価項目、それらの目
標値、成果(到達度)および自己評価」をまとめて示す。概ね目標値を越える成果を上げている。この研究成果を昇華させて「非崩壊性および Non-fragmentation を担保した革新的骨修復セメント」の創製につなげていく。
表 1 インジェクション型 HAp セメントの研究成果
評価項目

ハンドリング性

圧縮強度

生体適合性

非崩壊性

目標値
(フェーズ I 終了時)

初期硬化 20 min 以内

ヒト脊椎の約 2 倍の 30
MPa 以上到達度

17 min22 MPaIn vitro → ○In vivo → ○

○

自己評価

◎

○

○

○

In vitro および in vivo での 水中にいれても崩壊せず
検証に形状を維持	 ４．２ 生体内吸収性リン酸三カルシウムセメントの実用化研究
このサブプロジェクトおいても、低侵襲治療を可能とする「インジェクション型デバイス」を想定し、実用化を指向した研究を展開した。これまでに徒手混練や注射器で注入可能なセメントペーストを試作し、臨床上不可欠な特性である「非崩壊性」を担保したセメントの作製に成功している。なお、この研究成果は、2012 年 3 月 22 日発行の日経産業新聞に「人工骨 ペースト状材料」としてプレスリリースされ、メディアからも注目されている。評価項目として、HAp 系で前述した四項目：ハンドリング性、圧縮強度、生体適合性および非崩壊性に「生体吸収性」を加え、フェーズ I 終了時に達成する目標値を表 2 のように設定した。概ね目標値を超える成果を上げている。より具体的には、これまでに粉体の調製方法
やイノシトールリン酸の表面修飾条件、適切な混練液の選択などを行ない、注射器でインジェクション可能であり、非崩壊性で、硬化時間 ~25 min、圧縮強度 ~25 MPa のセメントの開発に成功している。
今後は、「非崩壊性および Non-fragmentation を担保した革新的骨修復セメント」の創製を目指し、より実用化を意識してより高いスペックを備えたセメントに作りこんでいくとともに、生体吸収性に関わるセメント試験片の in vitro と in vivoでの相関関係を明らかにする。
	 表 2 インジェクション型 TCP セメントの研究成果
評価項目

ハンドリング性

圧縮強度

生体適合性

目標値
(フェーズ I 終了時)

初期硬化 20 min 以内

ヒト脊椎よりも高い
20 MPa 程度

In vitro および in vivo で
の検証

生体吸収性

非崩壊性

到達度

25 min25 MPaIn vitro → ○In vivo → ○In vitro → ○In vivo → ○

○

自己評価

○

◎

○

○

○

In vitro および in vivo で 水中にいれても崩壊せずの確認に形状を維持	 ４．３ 骨誘導能を備えたキレート硬化型アパタイトセメントの開発
このサブプロジェクトでは、フェーズ I において、フェーズ II で実施する「多機能性キレート硬化型アパタイトセメンiii

ト」を開発するための要素技術のひとつである「骨誘導能（より高い骨形成能）の付与」を目指した研究を展開した。ここでは、骨形成を促進する元素であるケイ素を添加した「ケイ素含有アパタイト」と生体骨と類似した化学組成をもつ「骨ミネラル含有アパタイト」を、それぞれ、セメントの出発原料に使用する２つのアプローチで研究を推進した。
まず、「骨ミネラル含有アパタイト」を出発物質とし、これにイノシトールリン酸を表面修飾して、セメントを試作したところ、圧縮強度 15 MPa 以上を備えたセメント試料片の試作に成功した。ついで、得られた試験片をモデルとして、実際にアパタイトよりも優れた生体活性を備えているかどうかを骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1 やラット骨髄由来間葉系幹細胞などにより in vitro での生体適合性評価を行なった。ここでは、試験片表面の粗さによる影響を取り除くため、緻密な骨ミネラル含有アパタイトセラミックスを別に作製し評価したが、純粋なアパタイトよりも骨ミネラル含有アパタイトの方がより高い骨芽細胞の分化誘導能（特に、初期・中期の分化を促進）を示すことが明らかとなった。さらに、ウサギ
脛骨にモデル試験片をインプラントし、その生体硬組織反応を比較検討したところ、インプラント 4 週の予備的研究では、
骨ミネラル含有アパタイトの方が純粋なアパタイトよりも材料周囲での高い骨形成量が約 30％も多いことが分かった。
また、「ケイ素含有アパタイト」をセメントの出発原料とすることで、高い細胞増殖性や骨形成能を備えたセメント試験の試作にも成功している。
これらのセメント試験片は、従来のアパタイト系セメントよりも極めて優れた骨形成能を担保しており、特に骨代謝レ
ベルの低下した高齢者向けのペースト状人工骨の素材として臨床応用が期待される。
	
 ４．４ インテリジェント DDS の構築(抗菌性)
このサブプロジェクトでは、フェーズ I において、フェーズ II で実施する「多機能性キレート硬化型アパタイトセメント」を開発するための要素技術のひとつである「抗菌性の付与」を目指した研究を展開した。ここでは、２つのアプロー
チで研究を推進した。一つは、i) 表面にナノサイズの細孔を備えた中空微小球を合成し、これをバンコマイシンなどの抗生物質のキャリアとして利用し、バンコマイシン担持中空微小球をセメント原料に添加して「抗菌性セメント」を創製する研究である。もう一つは、ii) 抗菌性のある銀(Ag)に着目し、Ag 担持リン酸カルシウム粉体を合成し、これをセメン
ト原料に添加することで、「抗菌性セメント」を創製するアプローチである。
まず、i)のアプローチでは、「塩添加法超音波噴霧熱分解法」により表面にナノサイズの気孔を備えたアパタイト系中
空微小球の合成に成功し、特に抗菌剤の担持と徐放の観点から、微小球の表面構造の最適化を進め、抗生物質（バンコマイシン）の二段階徐放が可能な微小球の調製に成功している。このバンコマイシン担持リン酸カルシウム微小球を用いて、セメント試作も進めている。また、ii)のアプローチにより、上記の方法により、銀を担持させたアパタイト(Ag-HAp)微小球を調製し、その抗菌性を in vitro および in vivo で調査し、その抗菌性を確認している。In vivo においても抗菌性の発現が認められたため、その結果をもとに、②で確立したセメント作製のプロトコルに Ag-HAp 粉体を添加し、「抗菌性セメント」の試作を行ない、非崩壊性でかつ抗菌性を備え、細胞毒性のほとんどないセメント試験片の試作にも成功している。なお、この研究はバイオセラミックスの分野で唯一の国際会議である 23rd International Symposium Ceramics in Medicine
において、Best Poster Award を受賞している(Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y. Habuto, N. Kanzawa and M.
Aizawa, “Preparation of silver-containing hydroxyapatite powder by ultrasonic spray-pyrolysis technique and its antibacterial
property”, Bioceramics23, Ceylan InterContinental Istanbul Hotel, Istanbul, Turkey, 6th-11th, November, 2011.)。これは我々の研究がグローバルな視点で front line にいることを示すエビデンスであり、特筆に値する。
これらのセメント試験片は、従来、感染に弱いと指摘されていたリン酸カルシウム系バイオセラミックスに耐感染性を付与させるものであり、術後感染の問題をクリアした「医者も患者も安心して使用できる新しいペースト状人工骨」の素材として臨床応用が期待される。
	
 ４．５ イノシトールリン酸の抗腫瘍効果の検証
このサブプロジェクトでは、フェーズ I において、フェーズ II で実施する「多機能性キレート硬化型アパタイトセメント」を開発するための要素技術のひとつである「抗腫瘍効果の付与」を目指した研究を展開した。
まず、ヒト骨腫瘍由来の「細胞種 HOS (human osteosarcoma)細胞」をモデルとしてイノシトールリン酸(IP6)単独およびIP6 で表面修飾したキレート硬化型アパタイトセメント(IP6-HAp セメント)上での細胞応答性について検証した。その結果、HOS 細胞に対し IP6 を処理することにより、アポトーシスが誘導され、濃度依存的に細胞増殖性が抑制されることが明らかになった。なお、この結果は別に独立して行なった「HeLa 細胞」における検証結果とも一致している。
また、IP6 の表面修飾濃度をかえ、異なる IP6 濃度をもつ IP6-HAp セメントを作製した。それらをモデル材料として上記と同様な評価を行なったところ、IP6 の表面修飾濃度が高濃度(5000 ppm 以上)になるとセメント上の細胞に形態異常が認められ、細胞増殖性にも影響を与えることが分かった。また、DNA マイクロアレイ法により、アポトーシス関連遺伝
子の発現を調べたところ、IP6-HAp セメントにおいて、アポトーシス関連遺伝子の発現が亢進していることが明らかとなった。したがって、IP6 による表面修飾濃度をコントロールすることにより、がん細胞の増殖性を制御できることが分かった。

iv

このセメント試験片は、リン酸カルシウム系ペースト状人工骨に抗腫瘍効果を付与させるものであり、骨腫瘍掻把後の骨充填材として応用すると、腫瘍の再発防止につながるような新機能を付加させた新しいタイプの「ペースト状人工骨」の素材として臨床応用が期待される。
前述した「骨誘導能（4.3 節）」「抗菌性（4.4 節）」「抗腫瘍効果（4.5 節）」に関する研究成果を融合させて、骨誘導・抗菌性・抗腫瘍効果の３つの機能を単独あるいは複数同時に付与させた「多機能性骨修復セメント」の創製につなげていく。
	 ４．６ 非崩壊性および Non-fragmentation を担保した革新的骨修復セメントの開発と評価
ここでは、Phase I での研究実績を基盤として、臨床医が求めるニーズをすべて満たしたスペックを備えたペースト状
人工骨、特に、血液介在時での確実な硬化および硬化後に fragmentation を生じない革新的なセメントを試作し、実際にそのモデル材料の創製に成功している。
まず、研究を始めるに際し、上記の Non-fragmentation を実験的に検証するための方法について、文献調査などを実施した。我々の文献調査の結果から、現状のリン酸カルシウムセメントは、血液介在時に確実な硬化が得られないことが第一の問題点であることがわかったが、その検証方法が現在ないことも判明し、そのプロトコル作成から研究を開始することにした。簡単に述べると、我々の提案しているプロトコルは、血液中に浸漬した型枠にセメントペーストを注入し、その硬化状態および fragmentation を X 線 µ-CT などにより検証するというものである。
本サブプロジェクトにおいても、最終的な製品の形として、低侵襲治療を可能とする「インジェクション型デバイス」を想定しているため、インジェクション法によりセメントを作製する条件において、達成項目とその目標値を以下のように定めた。
1) 非崩壊性：セメントペーストを所定の型枠に注入し、硬化後に純水中に投入しても崩壊しないセメントを作製する。
2) ハンドリング性：上記の「非崩壊性」を担保した上で、硬化時間 20 分以内を達成する。
3) 最大強度に達する時間：上記の「非崩壊性」を担保した上で、HAp セメント試料片の圧縮強度が 24 時間程度でヒト脊椎の圧縮強度(15 MPa)よりも高い 20 MPa 以上を達成させる。また、β-TCP セメントは生体吸収性であるため、10 MPa 程度を達成させる。
4) Non-fragmentation の検証：実験動物から腰椎を取出し、その髄腔内にセメントペーストを注入し、fragmentation の有無を X 線 µ-CT を使って検証する。
まず、生体内安定性セメントに関しては、これまでに粉体の調製方法やイノシトールリン酸の表面修飾方法検討、混練液の検討を行なうことにより、非崩壊性で初期硬化時間 17 分､圧縮強度 22 MPa のセメントの開発に成功している。また、
in vivo での生体適合性を確認するため、このセメントのブタ脛骨へ 4 週間埋入し、組織学的評価を行なったところ、埋入
セメント材料周囲で炎症等は見られず、旺盛な骨形成が認められるとともに、材料付近に類骨、低石灰化骨、骨単位も観察されている。さらに、このセメントのブタ脛骨内での non-fragmentation も X 線 µ-CT により確認している。
生体内吸収性セメントに関しては、これまでに、IP6 中で β-TCP を粉砕および表面修飾同時処理することで得られた粉体を用いると、「非崩壊性」を備えたペースト状人工骨を作製できることを明らかにしてきた。ここでは、この粉体とクエン酸-リン酸水素ナトリウム−アルギン酸からなる混練液を用いることで、インジェクション可能なペーストが 17 分で初期硬化開始し、圧縮強度が約 25 MPa であるセメント作製条件を見いだしている。この条件から作製したセメントは、
上記 1)−3)の目標はクリアしている。一方、項目 4)では、ブタの脛骨および筋肉内にセメントペースト注入し、その硬化状態および fragmentation を検討した。注入したペーストは脛骨および筋肉内で一塊となって硬化しており、µ-CT 像から
fragmentation を起こしていないことを確認している。
今後は、上記同様、骨粗鬆症モデル骨を用い、繰り返し荷重を負荷させた場合の fragmentation について検討する予定である。なお、これらの研究課題は企業との共同研究を開始しており、プロジェクト終了後、臨床応用を目指した実用化研究を展開する。
	 ４．７ 多機能型アパタイトセメントの開発と評価
ここでは、Phase I での研究実績を基盤として、次世代を見据え、骨誘導・抗菌性・抗腫瘍効果の３つの機能を単独あるいは複数同時に付与させた「多機能性骨修復セメントの開発」を推進した。骨誘導能に関して、一例をあげると、ケイ素は骨形成を促進する元素として知られている。ここでは、ケイ素含有量の異なるアパタイト粉体を湿式法により合成し、これらを出発物質として、イノシトールリン酸を表面修飾し、セメント試料片を試作した。これまでに圧縮強度 15 MPa
以上を備えたセメント試料片の試作に成功している。ついで、得られた試験片をモデルとして、実際にアパタイトよりも優れた生体活性を備えているかどうかを骨芽細胞様細胞 MC3T3-E1 を用いて、細胞増殖性を評価した。その結果、純粋なアパタイトに比べて、ケイ素を仕込み組成で 2.4 mass%含有したケイ素含有アパタイトは約 2 倍も細胞増殖性が向上することが明らかとなった。さらに、ブタ脛骨にモデル試験片をインプラントし、その生体硬組織反応を比較検討したところ、いずれの試料片を用いた場合も、骨と直接結合し、優れた骨伝導性を示すことが明らかになった。特に、低石灰化骨の形成に関しては、0.8 mass%含有したケイ素含有アパタイトにおいて形成量の増大が確認された。また、2.4 mass%の場v

合もコントロール(アパタイトのみ)に比べ、低石灰化骨量の増加が認められた。以上のことから、ケイ素含有アパタイト
セメントは優れた生体適合性を有し、さらに骨形成能を促進し得るセメントとして大いに期待できる。また、骨ミネラル
含有アパタイトを用いた研究が 2012 年 9 月 11 日の日経産業新聞に「ペースト状でミネラルを配合：骨の形成を促す効果が高い人工骨材料を開発」としてプレスリリースされている。
また、抗菌性セメントでは、サケ由来のタンパク質である「プロタミン」を利用し、バイオフィルム形成を阻害する、
新しいセメントの試作にも成功している。この課題は企業との共同研究も進行しており、ここでは詳細の記載は避ける。
なお、この研究に関連して、2012 年 9 月 14 日に化学工業日報に「サケ由来のたんぱく質利用	
  新規抗菌性材料を創製」
として研究成果が掲載されている。
さらに、抗腫瘍効果を備えたセメントでは、抗腫瘍効果の発現誘導メカニズムを明らかにするために、細胞周期関連遺伝子の発現解析を行ない、その結果、HOS 細胞において細胞周期 G1 期に関する遺伝子である Cyclin D1 の発現量の低下が確認されている。このことから、IP6-HAp セメントから溶出した IP6 が HOS 細胞に選択的に作用し、細胞周期 G1 期の進行を阻害することで細胞増殖抑制効果を発揮している可能性が考えられる。IP6 により引き起こされた細胞周期の異常がこれまでに確認されたアポトーシスを誘導したと考えられる。
また、これらの機能を複数同時に付加させるアプローチについても検討を開始している。今後は、より付加価値の高い「次世代型ペースト状人工骨」としての展開をはかるべく、骨誘導・抗菌性・抗腫瘍効果の発現メカニズムの解明とともに、実際の臨床応用に使用可能なレベルに材料特性を作りこむ計画である。
	
 ５． 課題および今後の展望
これまで「創造展開プロジェクト」として推進した 4 年間の研究成果の概略を述べてきた。我が国は他の先進国に先駆けて既に「超高齢社会」に突入している。そのため、骨粗鬆症などの疾患に対する高度先進医療を実現することが急務な課題である。本プロジェクトでは、例えば、高齢者特有の骨粗鬆症などの骨疾患に対して、注射器などで注入可能な低侵襲治療を具現化する「次世代ペースト状人工骨」を開発することを目的として研究を推進した。また、現在、骨移植を伴う疾患に対する現在の治療法は自家骨を補填する方法がゴールデンスタンダードであるが、採取量の限界や二次的な侵襲などの問題がある。これを解決する方法は、人工骨により骨誘導能（より高い骨形成能）を付与させる技術を確立する必要がある。また、最近、人工骨や金属インプラントなどのバイオマテリアルの利用が増加しているが、術後感染がひとつの大きな問題となっている。これを解決する手段は材料自身に抗菌性を付与させることである。さらに、悪性新生物（がん）はここ 20 年来我が国における死亡率の第 1 位であり、抗腫瘍効果を備えた材料開発も重要な課題と言える。
当該プロジェクトでは、そのような社会的背景を鑑み、低侵襲治療を可能にし、「非崩壊性および non-fragmentation を備えた新規なペースト状人工骨」の開発を推進してきた。これまでに、非崩壊性および non-fragmentation を担保したセメ
ント試験片モデルの試作に成功しており、現在、さらに材料特性・生体適合性・医療現場での操作性に関してバランスのとれたセメントに作りこむべく「作製条件の最適化」を推進しているところである。この革新的なペースト状人工骨は、企業と既に連携しており、プロジェクト終了後は、本務先の明治大学で、その企業と実用化研究を進めていく。また、骨誘導・抗菌性・抗腫瘍効果を備えた「多機能性ペースト状人工骨」は「次世代」のペースト状人工骨として位置づけられ、メディアにも取り上げられているように、これまでに優れた研究成果（骨形成能の大幅な向上など）を上げている。今後
は、機能発現メカニズムの解明とともに、より臨床応用を意識して材料特性などを向上させる研究を本務先で継続して進めていく。近い将来、この研究プロジェクトにもとづく成果が、我が国だけでなく全世界の「患者さんのもとに届く」ことを願い、さらに研究を遂行していきたい。
	 vi

６． 業績（丸印の論文を巻末に掲載）【原著論文】
1.

Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y. Habuto, N. Kanzawa, T. Uchino, and M. Aizawa, “Preparation of
apatite microspheres with nano-size pores on the surface via salt-assisted ultrasonic spray-pyrolysis technique and its drug
release behavior”, J. Aust. Ceram. Soc., 46, 6-10 (2010).

2.

S. Sato, Y. Horiguchi, M. Mizumoto, T. Konishi, M. Honda, K. Oribe, and M. Aizawa, “Effects of mixing solutions on theinitial setting time and compressive strength of chelate-setting apatite cements”, Arch. BioCeram. Res., 10, 133-136 (2010).

3.

S. Takahashi, T. Konishi, K. Nishiyama, M. Mizumoto, M. Honda, S. Sato, K. Oribe, and M. Aizawa, “Fabrication ofchelate-setting β-tricalcium phosphate cements for minimally-invasive treatment and their evaluations”, Arch. BioCeram. Res.,10, 145-148 (2010).

4.

M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, H. Matsunari, H. Nagashima, and M. Aizawa, “Cell proliferation, morphology anddifferentiation of transgenic-cloned pig calvarial osteoblasts on the silicon-substituted hydorxyapatite ceramics fabricated via
ultrasonic spray-pyrolysis technique”, J. Aust. Ceram. Soc., 47, 37-41 (2011).

5.

S. Takahashi, T. Konishi, K. Nishiyama, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Horiguchi, K. Oribe, and M. Aizawa, “Fabrication ofnovel bioresorbable β-tricalcium phosphate cement on the basis of chelate-setting mechanism of inositol phosphate and its
evaluation”, J. Ceram. Soc. Jpn., 119, 35-42 (2011).

6.

T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Z. Zhuang, and M. Aizawa, “Fabrication of calcium-phosphate cements fromhydroxyapatite powders surface-modified with various concentrations of sodium inositol hexaphosphate and their material
properties”, World J. Engineer., 7 (Suppl 3), 595-596 (2011).

7.

H. Konishi, M. Honda, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Biochemical Studies of the Potential Anti-Tumor Activity of Novel
Chelate-Setting Apatite Cements”, Key Eng. Mater., 493-494, 315-319 (2012).

8.

M. Aizawa, T. Miki, Y. Yasutomi, M. Honda, and H. Yoshimura, “Hydroxyapatite Ceramics Including Bone Minerals Promote
Differentiation of Osteoblasts Derived from Rat Bone Marrow Cells”, Key Eng. Mater., 493-494, 320-324 (2012).

9.

Y. Nakashima, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting cement using
silicon-substituted hydroxyapatite and its property”, Key Eng. Mater., 493-494, 370-374 (2012).

10. Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y. Habuto, N. Kanzawa, and M. Aizawa, “Preparation of silver-containinghydroxyapatite powder by ultrasonic spray-pyrolysis technique and its antibacterial property”, Key Eng. Mater., 493-494,
678-683 (2012).
11. H. Funao, K. Ishii, S. Nagai, A. Sasaki, T. Hoshikawa, M. Aizawa, Y. Okada, K. Chiba, S. Koyasu, Y. Toyama, and M.
Matsumoto, “Establishment of a Real-Time, Quantitative, and Reproducible Mouse Model of Staphylococcus Osteomyelitis
Using Bioluminescence Imaging”, Infect. Immun., 80, 733-741 (2012).
12. T. Konishi, Z. Zhuang, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting cements from hydroxyapatite
powders surface-modified with various sodium inositol hexaphosphate concentrations and their mechanical properties”,
Procedia Eng., 36, 137-143 (2012).
13. Z. Zhuang, T. Miki, M. Yumoto, T. Konishi, and M. Aizawa, “Ultrastructural observation of hydroxyapatite ceramics withpreferred orientation to a-plane using high-resolution transmission electron microscopy”, Procedia Eng., 36, 121-127 (2012).

vii

14. T. Konishi, Z. Zhuang, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting cement from hydroxyapatite
powder prepared by simultaneously grinding and surface-modifying with sodium inositol hexaphosphate and their material
properties”, J. Ceram. Soc. Jpn., 120, 159-165 (2012).
15. H. Manabe, T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “In vitro bioresorbability of chelate-setting cements withvarious calcium-phosphate phases”, Phosphorus Res. Bull., 26, 105-108 (2012).
16. T. Ganmoto, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, H. Matsunari, Y. Takeuchi, H. Nagashima, and M. Aizawa, “In vivo
biocompatibility of apatite-fiber scaffold with enhanced mechanical property using pig model by implanting into tibia”,
Phosphorus Res. Bull., 26, 1-3 (2012).
17. T. Konishi, S. Takahashi, M. Mizumoto, M. Honda, K. Oribe, and M. Aizawa, “Effect of the addition of various
polysaccharides on the material properties and cytotoxicity of chelate-setting β-tricalcium phosphate cement”, Phosphorus Res.
Bull., 26, 59-64 (2012).
18. Z. Zhuang, T. Konishi, H. Yoshimura, and M. Aizawa, “Ultrastructural analysis of hydroxyapatite nano particles synthesizedunder different initial pH conditions using high-resolution transmission electron microscopy”, Phosphorus Res. Bull., 26, 81-86(2012).
19. M. Honda, K. Kikushima, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, “Enhanced early osteogenic differentiation bysilicon-substituted hydroxyapatite ceramics fabricated via ultrasonic spray pyrolysis technique”, J. Mater. Sci. Mater. Med., 23,2923-2932 (2012).
20. T. Konishi, S. Takahashi, M. Mizumoto, M. Honda, K. Kida, Y. Horiguchi, K. Oribe, K. Ishii, H. Morisue, Y. Toyama, M.
Matsumoto, and M. Aizawa, “Comparative study on bioresorbability of chelate-setting cements with various calcium-phosphate
phase using rabbit”, Key Eng. Mater., 529-530, 167-172 (2013).
21. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Adsorption behavior of sodium inositol hexaphosphate on the surface ofhydroxyapatite”, Key Eng. Mater., 529-530, 161-166 (2013).
22. M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, “In vitro evaluation of anti-tumor effect of the chelate-settinghydroxyapatite cement using inositol hexaphosphate”, Key Eng. Mater., 529-530, 173-177 (2013).
23. Y. Nakashima, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, “In vitro evaluation of chelate-setting cements fabricatedfrom silicon-containing apatite powder using osteoblastic cells”, Key Eng. Mater., 529-530, 183-186 (2013).
24. T. Inayama, H. Konishi, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Studies on the anti-tumor action of chelate-setting apatite cements”, Key
Eng. Mater., 529-530, 178-182 (2013).
25. H. Ishii, Y. Mukai, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Analysis of gene expression and morphology of P19 cells cultured in an
apatite-fiber scaffold”, Key Eng. Mater., 529-530, 370-373 (2013).
26. H. Ohsugi, Y. Habuto, M. Honda, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Evaluation of the anti-bacterial activity of a novel
chelate-setting apatite cement containing lactoferrin”, Key Eng. Mater., 529-530, 187-191 (2013).
27. E.S. Thian, T. Konishi, Y. Kawanobe, P.N. Lim, B. Ho, C. Choong, and M. Aizawa, “Zinc-substituted hydroxyapatite: abiomaterial with enhanced bioactivity and antibacterial properties”, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24, 437-445 (2013).
28. T. Konishi, Y. Horiguchi, M. Mizumoto, M. Honda, K. Oribe, H. Morisue, K. Ishii, Y. Toyama, M. Matsumoto, and M. Aizawa,viii

“Novel chelate-setting calcium-phosphate cements fabricated with wet-synthesized hydroxyapatite powder”, J. Mater. Sci.
Mater. Med., 24, 611-621 (2013).
29. Z. Zhuang, T.J. Fujimi, M. Nakamura, T. Konishi, H. Yoshimura and M. Aizawa, “Development of a,b-plane-orientedhydroxyapatite ceramics as models for living bones and their cell adhesion behavior”, Acta Biomater., 9, 6732-6740 (2013).
30. T. Konishi, S. Takahashi, Z. Zhuang, K. Nagata, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H. Nagashima, and M.
Aizawa, “Biodegradable β-tricalcium phosphate cement with anti-washout property based on chelate-setting mechanism of
inositol phosphate”, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24, 1383-1394 (2013).
31. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Horiguchi, K. Oribe, H. Morisue, K. Ishii, Y. Toyama, M. Matsumoto, and M. Aizawa,“Fabrication of novel biodegradable α-tricalcium phosphate cement set by chelating capability of inositol phosphate and its
biocompatibility”, J. Nanomater., 2013, 1-11 (2013).
32. M. Honda, Y. Watanabe, T. Tsuchiya, N. Kanzawa, and M. Aizawa, “Selective differentiation of bone marrow-derived
mesenchymal stromal cells into osteocytes via endochondral ossification in an apatite-fiber scaffold”, J. Ceram. Soc. Jpn.,(Accepted).

【総説・解説・書籍】
1.

本田みちよ, 「バイオマテリアル開発における異分野融合」, バイオマテリアル-生体材料-, 28, 130 (2010).

2.

相澤 守, 「無機リン化学とアパタイト」, Phosphorus Letter, 67, 2-4 (2010).

3.

相澤 守, 「明治大学理工学部応用化学科 生体関連材料研究室 神奈川科学技術アカデミー 相澤「次世代バイオセラ
ミックス」プロジェクト」, Phosphorus Letter, 68, 34-41 (2010).

4.

相澤 守・小西敏功・松本守雄, 「キレート硬化型骨修復セメントの開発」, セラミックデータブック 2010, 38, 201-205(2010).

5.

小西敏功, 「学会印象記 第 3 回国際セラミックス会議」, バイオマテリアル-生体材料-, 29, 58-59 (2011).

6.

相澤 守･松本守雄, 「生体硬組織への応用を目指したアパタイト系材料の創製とその生物学的評価」, 材料の科学と工学, 49, 242-245 (2012).

7.

相澤 守･小西敏功･松本守雄, 「第 11 回「次世代バイオセラミックス」−低侵襲治療を指向したペースト状人工骨の開発−」, 工業材料, 60, 46-54 (2012).

8.

本田みちよ･相澤 守, 「抗菌性を有するキレート硬化型骨修復セメントの開発」, 無機マテリアル, 19, 423-429 (2012).

9.

相澤 守, 「バイオセラミックスの現状と新展開」, 無機マテリアル, 19, 363-370 (2012).

10. 相澤 守, 「高い骨形成能を備えたキレート硬化型骨修復セメントの開発」, Ceramics Japan (セラミックス), 48, 57(2013).
11. 本田みちよ, 「学会印象記 日本セラミックス協会 第 25 回秋季シンポジウム」, バイオマテリアル-生体材料-, 31,
51-52 (2013).
12. 本田みちよ, 「抗菌性 生体材料を活用した研究開発テーマの発掘」, 技術シーズ, (In press).

【口頭発表（ポスター発表を含む）】〔国内学会〕ix

1.

○相澤 守, 「生体材料の現状と将来、水酸アパタイトの形態制御とその応用」, 日本無機リン化学会, 2010/3/4 (招
招待
講演)

2.

○本田みちよ･水本みのり･神澤信行･相澤 守, 「キレート硬化型骨アパタイトセメントの抗腫瘍効果-ヒト骨肉腫細胞による基礎研究-」, 日本セラミックス協会 2010 年年会, 2010/3/22-24

3.

○水本みのり･吉川哲史･堀口悠紀子･織部一弥･相澤 守, 「機械粉砕アパタイト粉体から作製した高強度化キレート
硬化型セメントの生体適合性」, 日本セラミックス協会 2010 年年会, 2010/3/22-24

4.

○佐藤静磨･堀口悠紀子･水本みのり･織部一弥･相澤守, 「キレート硬化型アパタイトセメントの圧縮強度および細胞毒性に及ぼすコンドロイチン硫酸添加の影響」, 日本セラミックス協会 2010 年年会, 2010/3/22-24

5.

○相澤 守, 「バイオセラミックスを利用した新しい癌化学塞栓療法の開発」, 第 60 回福岡がん化学療法研究会,
2010/3/31 (招
招待講演)

6.

○川延勇介･本田みちよ･神澤信行･相澤 守, 「塩添加超音波噴霧熱分解法によるリン酸カルシウム微小球の合成と薬剤除放特性」, 無機マテリアル学会第 120 回学術講演会, 2010/6/4

7.

○猪股義彦･本田みちよ･水本みのり･小西敏功･平岡和佳子･相澤 守, 「イノシトールリン酸濃度の異なるキレート硬化型アパタイトセメントの作製とその評価」, 第 20 回無機リン化学討論会, 2010/10/7

8.

○大山 遼･藤見峰彦･本田みちよ･前橋はるか･松浦知和･相澤 守, 「アパタイトファイバースキャフォルドを用いて三次元培養した血管内皮細胞の増殖性およびその形態観察」, 第 20 回無機リン化学討論会, 2010/10/7

9.

○鴈本拓也･島田愛生･安冨由美子･本田みちよ･水本みのり･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤 守, 「クサビラオレンジ蛍光遺伝子を導入したブタを用いた高強度化アパタイトファイバースキャフォルドの in vivo 評価」, 第 20回無機リン化学討論会, 2010/10/7

10. ○相澤 守･小西敏功･木田弘毅･高橋周平･織部一弥･森末 光･戸山芳昭･松本守雄, 「生体吸収性の異なるキレート硬化型骨修復セメントの生体内反応」, 第 25 回日本整形外科学会基礎学術集会, 2010/10/15
11. ○本田みちよ･小西敏功･水本みのり･相澤 守, 「キレート硬化型骨アパタイトセメントの抗腫瘍性評価」, 無機マテ
リアル学会第 121 回学術講演会, 2010/11/4 (講講演奨励賞)
12. ○相澤 守･小西敏功･松本守雄, 「キレート硬化型ペースト状人工骨の創製とその機能」, 第 32 回日本バイオマテリ
アル学会大会, 2010/11/30 (招招待講演)
13. ○本田みちよ･菊島光一･水本みのり･小西敏功･相澤 守, 「ケイ素含有アパタイトセラミックス上で培養した骨芽細胞の増殖・形態および分化」, 第 32 回日本バイオマテリアル学会大会, 2010/11/30
14. ○水本みのり･吉川哲史･堀口悠紀子･織部一弥･小西敏功･本田みちよ･相澤 守, 「機械粉砕アパタイトおよびコンド
ロイチン硫酸を利用したキレート硬化型セメントの高強度化およびその細胞毒性」, 第 32 回日本バイオマテリアル
学会大会, 2010/11/30
15. ○川延勇介･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･羽太優理･神澤信行･相澤 守, 「表面にナノサイズの細孔を備えたリン酸カルシウム中空微小球の調整とその薬剤徐放特性」, 第 32 回日本バイオマテリアル学会大会, 2010/11/30
16. ○猪股義彦･本田みちよ･水本みのり･小西敏功･平岡和佳子･相澤 守, 「イノシトールリン酸を用いて創製したキレー
ト硬化型アパタイトセメントの抗腫瘍効果 –HeLa 細胞による検討–」, 第 32 回日本バイオマテリアル学会大会,
2010/11/30

x17. ○湯沢 琴･初川淳一･相澤 守・神澤信行,「大腸菌発現 BMP-2 の骨形成促進能の評価」, 第 32 回日本バイオマテリア
ル学会大会, 2010/11/29
18. ○小西秀典･湯沢 琴･相澤 守･神澤信行,「多機能性キレート硬化型骨修復セメントの抗腫瘍性に関する評価と解析」,
第 32 回日本バイオマテリアル学会大会, 2010/11/29
19. ○大山 遼･前橋はるか･松浦知和･本田みちよ･藤見峰彦･相澤 守, 「アパタイトファイバースキャフォルドを用いて三次元培養した血管内皮細胞の増殖性およびその形態」, 第 32 回日本バイオマテリアル学会大会, 2010/11/30
20. ○初川淳一･湯沢 琴･相澤 守･神澤信行, 「蛍光タンパク質を用いた生体材料の骨誘導能評価システムの構築」, 第32 回日本バイオマテリアル学会, 2010/11/30
21. ○本田みちよ･水本みのり･小西敏功･松成ひとみ･長嶋比呂志･相澤 守, 「クサビラオレンジブタ頭蓋骨より単離した
骨芽細胞の骨分化過程の解析」, 第 14 回生体関連セラミックス討論会, 2010/12/3
22. ○高橋周平･小西敏功･西山晃司･水本みのり･本田みちよ･織部一弥･相澤 守, 「低侵襲治療を指向した生体吸収性キ
レート硬化型 β-リン酸三カルシウムセメントの作製とその評価」, 第 14 回生体関連セラミックス討論会, 2010/12/3
23. ○相澤 守, 「バイオセラミックスの研究動向-次世代ペースト状人工骨の開発-」, 第 310 回応用化学コロキウム,
2010/12/18
24. ○水本みのり･吉川哲史･小西敏功･本田みちよ･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤守, 「機械粉砕アパタイトとキトサン溶液を利用したキレート硬化型セメントの作製とその生体適合性」, 日本セラミックス協会 2011 年年会,
2011/3/16
25. ○猪股義彦･平岡和佳子･本田みちよ･小西敏功･水本みのり･相澤 守, 「HeLa 細胞をモデルとしたキレート硬化型ア
パタイトセメントの抗腫瘍効果の検証」, 日本セラミックス協会 2011 年年会, 2011/3/17
26. ○鴈本拓也･島田愛生･安冨由美子･本田みちよ･水本みのり･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤 守, 「クサビラ
オレンジブタ脛骨埋入による高強度化アパタイトファイバースキャフォルドの生体適合性評価」, 日本セラミックス
協会 2011 年年会, 2011/3/16
27. ○本田みちよ･小西敏功･水本みのり･松成ひとみ･長嶋比呂志･相澤 守, 「ケイ素含有アパタイトセラミックス上でのクサビラオレンジブタ頭蓋骨由来骨芽細胞の骨分化過程の解析」, 無機マテリアル学会 第 122 回講演会, 2011/6/2
28. ○本田みちよ･小西敏功･水本みのり･松成ひとみ･長嶋比呂志･相澤守, 「クサビラオレンジブタ頭蓋骨由来骨芽細胞の単離とその生物学的評価」, 第 20 回硬組織再生生物学会学術大会, 2011/8/27
29. ○鴈本拓也･本田みちよ･水本みのり･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤 守, 「ブタの脛骨埋入による高強度化
アパタイトファイバースキャフォルドの生体適合性評価」, 第 20 回硬組織再生生物学会学術大会, 2011/8/27
30. ○真部弘毅･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「種々のリン酸カルシウム相からなるキレート硬化型セメ
ントの in vitro における生体吸収性の評価」, 第 24 回日本セラミックス協会 秋季シンポジウム, 2011/9/7
31. ○小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「種々のイノシトールリン酸濃度で表面修飾したアパタイト粉体からの骨修復セメントの作製とその評価」, 第 24 回日本セラミックス協会 秋季シンポジウム, 2011/9/7
32. ○中島佑亮･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「湿式法により調製したケイ素含有アパタイトによるキレート硬化型セメントの作製とその評価」, 第 24 回日本セラミックス協会 秋季シンポジウム, 2011/9/7
33. ○千布悠貴･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･松本守雄･石井 賢･相澤 守,「骨ミネラル含有アパタイトから作製しxi

たキレート硬化型セメントのウサギ脛骨埋入による組織学的評価」, 第 24 回日本セラミックス協会 秋季シンポジウ
ム, 2011/9/8
34. ○三木拓也･安冨由美子･本田みちよ･吉村英恭･相澤 守, 「骨ミネラル含有アパタイトセラミックスによるラット骨髄間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化誘導」, 第 21 回無機リン化学討論会, 2011/9/30
35. ○本田みちよ･小西敏功･水本みのり･相澤 守, 「キレート硬化型骨アパタイトセメントにおける骨肉腫細胞の生化学的評価」, 第 33 回日本バイオマテリアル学会大会, 2011/11/21
36. ○水本みのり･小西敏功･本田みちよ･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤 守, 「キトサン添加によるインジェク
ション型アパタイトセメントの試作と大型動物による生体適合性の検証」, 第 33 回バイオマテリアル学会大会,
2011/11/22
37. ○鴈本拓也･安冨由美子･本田みちよ･水本みのり･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤 守, 「大型動物であるブタの脛骨に埋入した高強度化アパタイトファイバースキャホルドの硬組織適合性」, 第 33 回バイオマテリアル学会大会, 2011/11/22
38. ○川延勇介･本田みちよ･水本みのり･小西敏功･羽太優里･神澤信行･石井 賢･松本守雄･相澤 守, 「超音波噴霧熱分解
法により合成した銀担持ハイドロキシアパタイト微小球の抗菌性評価」, 第 33 回バイオマテリアル学会大会,
2011/11/22
39. ○千布悠貴･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･松本守雄･石井 賢･相澤 守, 「骨ミネラル含有アパタイトから作製したキレート硬化型セメントの生体適合性評価」, 第 33 回バイオマテリアル学会大会, 2011/11/22
40. ○三木拓也･藤野匡敏･安冨由美子･深澤倫子･吉村英恭･相澤守, 「骨ミネラル含有アパタイトセラミックスの材料特性」, 第 33 回バイオマテリアル学会大会, 2011/11/22
41. ○羽太優理･相澤 守･神澤信行, 「キレート硬化型骨修復セメントへの生理活性ペプチド添加による抗菌性付与」, 第33 回バイオマテリアル学会大会, 2011/11/21
42. ○稲山哲哉･小西秀典･相澤 守･神澤信行, 「腫瘍治療に有効なキレート硬化型骨修復セメントの評価」, 第 33 回バイオマテリアル学会大会, 2011/11/22
43. ○水本みのり･小西敏功･本田みちよ･船尾陽生･石井 賢･戸山芳昭･松本守雄･相澤 守, 「キトサンを添加したインジェクション型アパタイトセメントのウサギ脛骨への埋入による硬組織適合性評価」, セラミックス協会 2012 年年会,
2012/3/19
44. ○中島佑亮･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「ケイ素含有アパタイトから作製したキレート硬化型セメ
ントの骨芽細胞を用いた in vitro 評価」, 日本セラミックス協会 2012 年年会, 2012/3/20
45. ○相澤 守･本田みちよ･小西敏功･水本みのり･神澤信行･長嶋比呂志･石井賢･戸山芳昭･松本守雄, 「多機能性キレー
ト硬化型リン酸カルシウムセメントの開発」, 第 85 回日本整形外科学会学術総会, 2012/5/17 (招招待講演)
46. ○相澤 守, 「バイオセラミックスの現状と新展開」, オリンパステルモバイオマテリアル株式会社セラミックス塾,
2012/8/24
47. ○相澤 守, 「先端機能性セラミックスの作製と応用 −バイオセラミックスを例にして−」, 日本セラミックス協会東北北海道支部郡山地区セミナー, 2012/9/8 (招招待講演)
48. ○本田みちよ･川延勇介･小西敏功･水本みのり･相澤 守, 「バイオフィルム形成阻害可能な抗菌性材料の開発」, 日本

xii

セラミックス協会 第 25 回秋季シンポジウム, 2012/9/19
49. ○水本みのり･小西敏功･本田みちよ･相澤 守, 「イノシトールリン酸溶液中での粉砕および表面修飾の同時処理を施した湿式合成アパタイト粉体によるキレート硬化型セメントの作製」, 日本セラミックス協会 第 25 回秋季シンポジ
ウム, 2012/9/19
50. ○持田直輝･川延勇介･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･羽太優理･神澤信行･相澤 守, 「バンコマイシン担持リン酸
カルシウム微小球を用いた抗菌性セメントの作製とその評価」, 日本セラミックス協会 第 25 回秋季シンポジウム,
2012/9/20
51. ○目黒佑太･猪股義彦･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「抗腫瘍効果を備えたキレート硬化型アパタイト
セメントの作製とその評価」, 日本セラミックス協会 第 25 回秋季シンポジウム, 2012/9/20
52. ○永田幸平･小西敏功･高橋周平･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「非崩壊性を備えたキレート硬化型 β-リン酸三カルシウムセメントの作製とその材料特性」, 第 22 回無機リン化学討論会, 2012/9/25
53. ○相澤 守, 「低侵襲治療に貢献する次世代バイオセラミックスの開発」, グンゼ株式会社, 2012/9/27 (招招待講演)
54. ○庄 志･中村まり子･小西敏功･吉村英恭･相澤 守, 「a 面配向アパタイトセラミックスによる生体骨モデルの構築とその評価」、第 125 回無機マテリアル学会学術講演会, 2012/11/1
55. ○本田みちよ･川延勇介･小西敏功･水本みのり･清水友亮･神澤信行･石井賢･松本守雄･戸山芳･相澤守, 「銀含有リン酸カルシウム微小球による抗菌性セメントの創製とその評価」, 日本バイオマテリアル学会シンポジウム 2012,2012/11/26
56. ○眞部弘毅･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･石井 賢･船尾陽生･戸山芳昭･松本守雄･相澤 守, 「種々のリン酸カル
シウム相からなるキレート硬化型リン酸カルシウムセメントの in vitro/in vivo における生体吸収性の評価」, 日本バ
イオマテリアル学会シンポジウム 2012, 2012/11/27
57. ○千布悠貴･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･石井賢･船尾陽生･戸山芳昭･松本
守雄･相澤 守, 「骨ミネラル含有アパタイトから作製したキレート硬化型セメントの硬組織適合性」, 日本バイオマ
テリアル学会シンポジウム 2012, 2012/11/27
58. ○鴈本拓也･本田みちよ･水本みのり･松成ひとみ･竹内靖浩･長嶋比呂志･相澤 守, 「高強度化アパタイトファイバー
スキャフォルドの骨誘導能の検証」, 日本バイオマテリアル学会シンポジウム 2012, 2012/11/27
59. ○持田直輝･川延勇介･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･羽太優理･神澤信行･相澤 守, 「バンコマイシン担持リン酸
カルシウム微小球を用いた抗菌性セメントの作製とその評価」, 第 16 回生体関連セラミックス討論会, 2012/11/30
60. ○眞部弘毅･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･石井賢･船尾陽生･戸山芳昭･松本守雄･相澤 守, 「種々のリン酸カル
シウム相からなるキレート硬化型カルシウムセメントの in vitro/in vivo における生体吸収性評価」, 第 16 回生体関連
セラミックス討論会, 2012/11/30
61. ○千布悠貴･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･石井 賢・船尾陽生･戸山芳昭･松本守雄･相澤 守, 「骨ミネラル含有
アパタイトから作製したキレート硬化型セメントの生物学的評価」, 第 16 回生体関連セラミックス討論会,
2012/11/30
62. ○小西敏功･高橋周平･庄 志･永田幸平･水本みのり･本田みちよ･竹内靖浩･松成ひとみ･長嶋比呂志･相澤 守, 「β-リン酸三カルシウムを用いたキレート硬化型ペースト状人骨の開発」, 第 51 回セラミックス基礎科学討論会, 2013/1/10

xiii

63. ○目黒佑太･猪股義彦･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「種々のイノシトールリン酸濃度で作製したキレート硬化型アパタイトセメントに対する腫瘍モデル細胞の細胞応答性」, 第 51 回セラミックス基礎科学討論会,
2013/1/10
64. ○相澤 守, 「多機能性キレート硬化型リン酸カルシウムセメントの開発」, ライフサイエンス分野シンポジウム：バ
イオマテリアルの新展開, 2013/1/29
65. ○相澤 守, 「生体硬組織への応用を目指したアパタイト系材料の創製とその生物学的評価」, 第 4 回医用・生体材料分科会講演会, 2013/3/4
66. ○藤岡 恵･永田幸平･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･相澤 守, 「Non-fragmentation を担保したリン酸カルシウム
セメントの試作とその評価方法」, 日本セラミックス協会 2013 年年会, 2013/3/18
67. ○横田倫啓･三木拓也･千布悠貴･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･船尾陽生･戸山芳昭･石井 賢･松本守雄･相澤 守,「骨ミネラル含有アパタイトセラミックスの in vivo 評価」, 日本セラミックス協会 2013 年年会, 2013/3/17
68. ○清水友亮･川延勇介･小西敏功･本田みちよ･相澤 守, 「抗菌性を備えた非崩壊型骨修復セメントの作製とその細胞毒性評価」, 明治大学･北見工業大学 大学院研究交流プログラム 2013, 2013/3/21
69. ○本田みちよ, 「抗菌性生体材料のニーズと研究開発動向」, 技術情報協会セミナー, 2013/3/29 (依依頼講演)
70. ○相澤 守, 「バイオセラミックスの現状と新展開 － 低侵襲治療を目指したペースト状人工骨の開発－ 」, 株式会社
豊田中央研究所, 2013/5/31 (招招待講演)
71. 中島佑亮･小西敏功･水本みのり･本田みちよ･新井良和･中野和明･長屋昌樹･長嶋比呂志・○相澤 守, 「ケイ素含有ア
パタイトを用いたキレート硬化型セメントの創製とその硬組織適合性」, 無機マテリアル学会 第 126 回学術講演会,
2013/6/6
72. ○本田みちよ･水本みのり･川延勇介･清水友亮･持田直樹･小西敏功･石井 賢･松本守雄･相澤 守, 「銀含有リン酸カル
シウムセメントの創製とその生物学的評価」, 無機マテリアル学会 第 126 回学術講演会, 2013/6/6
73. ○小西敏功, 「キレート硬化メカニズムによる新規なリン酸カルシウムセメントの創製とその材料特性」, 第 13 回次世代医工学研究会, 2013/6/21〔国際会議〕
1.

S. Sato, Y. Horiguchi, M. Mizumoto, K. Oribe, and M. Aizawa, “Effects of mixing solutions on mechanical property ofchelate-setting apatite cements for minimally invasive treatment”, 2010 Annual Meeting of the Orthopaedics Research Society,
7th Mar, 2010.

2.

M. Aizawa, T. Konishi, K. Kida, K. Oribe, H. Morisue, Y. Toyama, and M. Matsumoto, “Development of novel
calcium-phosphate cements on the basis of chelate-setting mechanism of inositol phosphate”, Fourth International Conference
on Science and Technology of Advanced Ceramics (STAC-4), 23th Jun, 2010 (Invited talk).

3.

M. Aizawa, “Development of hollow calcium- phosphate ceramics microsphere loaded with anti-angiogenic agent for novel
chemical and embolic therapy”, Research Seminar: Angiogenesis Inhibition in Cancer and Biomaterial Science, National Cancer
Center of Mongolia, 11th Jun, 2010, (Invited talk).

4.

S. Sato, Y. Horiguchi, M. Mizumoto, T. Konishi, M. Honda, K. Oribe, and M. Aizawa, “Effects of mixing solutions on thexivinitial setting time and compressive strength of chelate-setting apatite cements”, Asian BioCeramics Symposium 2010
(ABC2010), 3rd Nov, 2010.
5.

S. Takahashi, T. Konishi, K. Nishiyama, M. Mizumoto, M. Honda, S. Sato, K. Oribe, and M. Aizawa, “Fabrication ofchelate-setting β-tricalcium phosphate cements for minimally-invasive treatment and their evaluations”, Asian BioCeramics
Symposium 2010 (ABC2010), 3rd Nov, 2010.

6.

T. Konishi, S. Takahashi, K. Nishiyama, K. Kida, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Horiguchi, K. Oribe, H. Morisue, Y. Toyama,and M. Matsumoto, and M. Aizawa, “In vivo evaluation of chelate-setting calcium phosphate cements with bioresorbability
using rabbit model”, 3rd International Congress on Ceramics (ICC3), 16th Nov, 20107.

M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, H. Matsunari, H. Nagashima, and M. Aizawa, “Cell proliferation, morphology anddifferentiation of Transgenic- cloned pig calvarial osteoblasts on the silicon- substituted hydorxyapatite ceramics fabricated via
ultrasonic spray-pyrolysis technique”, 5th International Symposium on Apatites and Correlative Biomaterials (ISACB5), 12th
Dec, 2010.

8.

T. Konishi, M. Mizumoto,M. Honda, S. Sato, K. Oribe, and M. Aizawa, “Effect of the addition of citric acid to mixing solution
on handling ability and mechanical property of chelate-setting calcium- phosphate cement”, 5th International Symposium on
Apatites and Correlative Biomaterials (ISACB5), 11th Dec, 2010.

9.

Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y. Habuto, N. Kanzawa, and M. Aizawa, “Preparation of apatite
microsphere with nano-size pores on the surface via salt-assisted ultrasonic spray-pyrolysis technique and its drug release
behavior”, 5th International Symposium on Apatites and Correlative Biomaterials (ISACB5), 11th Dec, 2010.

10. T. Konishi, S. Takahashi, M. Mizumoto, S. Sato, M. Honda, K, Kida, Y. Horiguchi, K. Oribe, K. Ishii, K. Morisue, Y. Toyama,
M. Matsumoto, and M. Aizawa, “In vivo comparative study of chelate-setting calcium-phosphate cements with various
bioresorbability using rabbit model”, 2011 Annual Meeting of the Orthopaedic Research Society, 13 Jan, 2011.
11. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Z. Zhuang, and M. Aizawa, “Fabrication of calcium-phosphate cements fromhydroxyapatite powders surface-modified with various concentrations of sodium inositol hexaphosphate and their material
properties”, 19th International Conference on Composites/Nano Engineering (ICCE-19), 27th Jul, 2011 (Invited talk).
12. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting cements from hydroxyapatite powders
surface-modified with various sodium inositol hexaphosphate concentrations and their mechanical properties”, IUMRSInternational Conference in Asia 2011 (IUMRS-ICA 2011), 19th Sep, 2011.
13. M. Aizawa, T. Miki, Y. Yasutomi, M. Honda, and H. Yoshimura, “Hydroxyapatite ceramics including bone minerals promote
differentiation of osteoblasts derived from rat bone marrow cells”, 23rd International Symposium for Ceramics in Medicine(Bioceramics 23), 7th Nov, 2011.
14. H. Konishi, M. Honda, M. Aizaw,a and N. Kanzawa, “Biochemical studies on novel chelate-setting apatite cements in antitumor
action”, 23rd International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 23), 7th Nov, 2011.
15. Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y. Habuto, N. Kanzawa, Z. Zhuang, and M. Aizawa, “Preparation ofsilver-containing hydroxyapatite powder by ultrasonic spray-pyrolysis technique and its antibacterial property”, 23rd
International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 23), 7th Nov, 2011 (Best Poster Presentation Award).

xv

16. Y. Nakashima, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting cement using
silicon-substituted hydroxyapatite and its property”, 23rd International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 23),
8th Nov, 2011.
17. H. Manabe, T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Evaluation of in vitro bioresorbability of chelate-setting
calcium phosphates cements”, 11th Asian BioCeramics Symposium (ABC2011), 30th Nov, 2011.
18. T. Ganmoto, M. Honda, M. Mizumoto, H. Matsunari, Y. Takeuchi, H. Nagashima, and M. Aizawa, “Hard tissue compatibilityof apatite-fiber scaffold with enhanced mechanical property using pig model by implanting into tibia”, 11th Asian BioCeramics
Symposium (ABC2011), 30th Nov, 2011.
19. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Z. Zhuang, and M. Aizawa, “Effect of concentration of inositol hexaphosphate on
material properties of chelate-setting apatite cement”, 11th Asian BioCeramics Symposium (ABC2011), 30th Nov, 2011 (ABCAward 2011).
20. Z. Zhuang, M. Yumoto, T. Miki, T. Konishi, and M. Aizawa, “Development of hydroxyapatite ceramics with preferredorientation to a-plane”, 11th Asian BioCeramics Symposium (ABC2011), 30th Nov, 2011.
21. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Material properties of chelate-setting α-tricalcium phosphate cement
using Inositol Hexaphosphate”, 9th World Biomaterials Congress (WBC), 4th Jun, 2012.
22. T. Konishi, Z. Zhuang, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Development of calcium-phosphate cements fromhydroxyapatite powders surface-modified with various concentrations of sodium inositol hexaphosphate and their evaluation”,
International Conference of Young Researchers on Advanced Materials 2012 (ICYRAM 2012), 2nd Jul, 2012 (Invited talk).
23. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H Nagashima, and M. Aizawa, “Enhancement of handling and mechanicalproperty of chelate-setting α-calcium phosphate cement by addition of citric acid and chitosan to mixing solution and its invitro/vivo evaluations”, 4th International Congress on Ceramics (ICC4), 16th Jul, 2012.
24. M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa,“In vitro biological evaluation of anti-tumor effect of the chelate-settinghydroxyapatite cement”, 24th International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 24), 22nd Oct, 2012.
25. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Adsorption behavior of sodium inositol hexaphosphate on the surface ofhydroxyapatite”, 24th International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 24), 22nd Oct, 2012.
26. T. Konishi, S. Takahashi, M. Mizumoto, M. Honda, K. Kida, Y. Horiguchi, K. Oribe, K. Ishii, H. Morisue, Y. Toyama, M.
Matsumoto, and M. Aizawa, “Comparative study of bioresorbability of chelate-setting cements with various calcium-phosphate
phase using rabbit model”, 24th International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 24), 22nd Oct, 2012.
27. Y. Nakashima, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, “In vitro evaluation of chelate-setting cements fabricatedfrom silicon-containing apatite powder using osteoblastic cells”, 24th International Symposium for Ceramics in Medicine(Bioceramics 24), 22nd Oct, 2012.
28. T. Inayama, H. Konishi, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Studies on the anti-tumor action of chelate-setting apatite cements”,
24th International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 24), 22nd Oct, 2012.
29. H. Ohsugi, Y. Habuto, M. Honda, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Evaluation of the anti-bacterial activity of a novel
chelate-setting apatite cement containing lactoferrin”, 24th International Symposium for Ceramics in Medicine (Bioceramics 24),xvi

22nd Oct, 2012.
30. M. Aizawa, T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, H. Morisue, K. Ishi, Y. Toyama, and M. Matsumoto, “Development of novel
calcium-phosphate cements on the basis of chelate-setting mechanism of inositol phosphate”, 12th Asian BioCeramics
Symposium (ABC2012), 18th Nov, 2012 (Invited talk).
31. K. Nagata, S. Takahashi, T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting β-tricalcium
phosphate cements with anti-washout ability and their material properties”, 12th Asian BioCeramics Symposium (ABC2012),
18th Nov, 2012.
32. K. Fujioka, K. Nagata, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of novel calcium-phosphate cements with nonfragmentation property and their evaluations”, 12th Asian BioCeramics Symposium (ABC2012), 18th Nov, 2012.
33. T. Inayama, H. Konishi, M. Aizawa, and N. Kanzawa, “Studies on the anti-tumor action of a novel apatite cement”, 12th Asian
BioCeramics Symposium (ABC2012), 18-21 Nov.2012.
34. K. Nagata, S. Takahashi, T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of chelate-setting β-tricalcium
phosphate cements with anti-washout ability and their material properties”, 4th PCGMR-NCKU Symposium, 21st Nov, 2012.
35. K. Fujioka, K. Nagata, M. Mizumoto, M. Honda, and M. Aizawa, “Fabrication of novel calcium-phosphate cements with nonfragmentation property and their evaluations”, 4th PCGMR-NCKU Symposium, 21st Nov, 2012.
36. H. Ohsugi, J. Hatsukawa, Y. Otsuka, M. Aizawa and N. Kanzawa, “Establishment of a real-time evaluation system of theosteoconduction using fluorescent proteins”, 2012 ASCB Annual Meeting, 15th Dec, 2012.
37. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H. Nagashima, and M. Aizawa, “Fabrication of α-tricalcium
phosphate cement using chelating mechanism of inositol phosphate and its histological evaluation”, International Symposium on
Apatite and Correlative Biomaterials (ISACB6), 6th Jun, 2013.
38. T. Konishi, S. Takahashi, K. Nagata, Z. Zhuang, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H. Nagashima, and M.
Aizawa, “Fabrication of biodegradable β-tricalcium phosphate cement with anti-washout property based on chelate-setting
mechanism of inositol phosphate and its biocompatibility”, 4th Asian Biomaterials Congress (ABMC4), 27 Jun, 2013 (Racquel
LeGeros Young Scientist Award).

【特許】
1.

相澤 守・水本みのり・小西敏功・高橋周平・佐藤静磨、特許公開 2012-130672、「注入可能なペースト状組成物及びそれから成る骨又は歯充填材」、出願人: 財団法人神奈川科学技術アカデミー・学校法人明治大学・昭和医科工業株
式会社

2.

相澤 守・小西敏功・高橋周平、特許公開 2012-210346、「組成物及びそれを用いた骨又は歯充填材の製造方法」、出
願人: 財団法人神奈川科学技術アカデミー・学校法人明治大学

3.

相澤 守・高橋周平・小西敏功・水本みのり、特開 2012-228383、「セメント用材料の製造方法、セメント原料粉体、セメントの製造方法、およびセメント」、出願人: 財団法人神奈川科学技術アカデミー/学校法人明治大学(出願日 2011年 11 月 29 日)

他未公開 3 件xvii

【共同研究】
6件【記者発表・取材】1.

2010 年 8 月 26 日；日経産業新聞に研究成果掲載（抗菌性セメント 抗菌剤担持に成功）

2.

2011 年 4 月 13 日；日本経済新聞社より取材（蛍光タンパク質を用いた生体材料の骨誘導能評価システムの構築；共
同研究員：神澤信行）

3.

2012 年 2 月 8 日；日経産業新聞に研究成果掲載（抗菌性セメント）

4.

2012 年 2 月 28 日；日本経済産業新聞に研究成果掲載（人工骨 ペースト状材料）

5.

2012 年 9 月 11 日；日経産業新聞に研究成果掲載（骨ミネラル含有セメント）

【展示】
1.

2011 年 2 月 2−4 日；テクニカルショウヨコハマ 20112.

2012 年 4 月 25−27 日；第 11 回国際バイオテクノロジー展／技術会議（BIO Tech 2012）3.

2013 年 1 月 30 日−2 月 1 日；Nano tech 2013

	
 

【受賞】
1.

ABC Award 2009 (9th Asian BioCeramics Symposium，佐藤，2009)2.

講演奨励賞 (無機マテリアル学会 第 121 回学術講演会，本田，2010)

3.

ABC Award 2011 (11th Asian BioCeramics Symposium，小西，2011)4.

Best Poster Presentation Award (23rd Symposium and Annual Meeting of International Society for Ceramics in Medicine(Bioceramics 23)，川延，2011)5.

Racquel LeGeros Young Scientist Award (6th International Symposium on Apatite and Correlative Biomaterials 2013
(ISACB6)，小西，2013)【学位取得者】
小西敏功（博士（工学）2013 年 9 月）

xviii

７． プロジェクト参加者一覧
〔氏名〕

〔役職〕

〔在籍期間〕

相澤	  守

プロジェクトリーダー(明治大学理工学部・教授)

2009 年 10 月～2013 年 9 月

本田みちよ

常勤研究員(サブプロジェクトリーダー)

2009 年 10 月～2013 年 9 月

水本みのり

常勤準研究員2009 年 10 月～2013 年 9 月

小西敏功

研究協力員

2009 年 10 月～2010 年 3 月

常勤準研究員2010 年 4 月～2013 年 9 月

長嶋比呂志

非常勤研究員(明治大学農学部・教授)

2009 年 10 月～2013 年 9 月

松本守雄

非常勤研究員(慶應義塾大学医学部・准教授)

2009 年 10 月～2013 年 9 月

石井	
  賢

非常勤研究員(慶應義塾大学医学部・講師)

2009 年 10 月～2013 年 9 月

Eng San Thian

非常勤研究員(National University of Singapore, Assistant professor)

2012 年 1 月～2012 年 2 月

庄	  志非常勤研究員(明治大学理工学部・助教)

2013 年 4 月～2013 年 9 月

神澤信行

非常勤研究員(上智大学理工学部・准教授)

2009 年 10 月～2010 年 3 月

共同研究員(上智大学理工学部・准教授)

2010 年 4 月～2013 年 9 月

三木拓也

研究補助員

2011 年 1 月～2011 年 3 月

呉	
  哲宇

研究補助員

2011 年 5 月～2012 年 3 月

岡野恵子

研究補助員

2011 年 12 月～2012 年 3 月

中城京子

研究補助員

2012 年 4 月～2012 年 6 月

高田明李

研究補助員

2012 年 4 月～2013 年 3 月

菊島光一

研究協力員

2009 年 10 月～2010 年 3 月

猪俣義彦

研究協力員

2009 年 10 月～2011 年 3 月

高橋周平

研究協力員

2009 年 10 月～2011 年 3 月

藤井拓也

研究協力員

2009 年 10 月～2012 年 3 月

川延勇介

研究協力員

2009 年 10 月～2012 年 3 月

中島佑亮

研究協力員

2010 年 4 月～2013 年 3 月

千布悠貴

研究協力員

2010 年 4 月～2013 年 3 月

研究補助員

2013 年 4 月～2013 年 9 月

真部弘毅

研究協力員

2010 年 4 月～2013 年 3 月

藤岡	
  恵

研究協力員

2010 年 4 月～2013 年 3 月

兼子千里	
 

研究協力員

2011 年 4 月～2012 年 3 月

永田幸平

研究協力員

2011 年 4 月～2013 年 9 月

目黒佑太

研究協力員

2011 年 4 月～2013 年 9 月

持田直輝

研究協力員

2011 年 4 月～2013 年 9 月

xix

清水友亮

研究協力員

2012 年 4 月～2013 年 9 月

小林慧太

研究協力員

2013 年 4 月～2013 年 9 月

沢田知也

研究協力員

2013 年 4 月～2013 年 9 月

松岡健人

研究協力員

2013 年 4 月～2013 年 9 月

佐々木裕美

事務補助員

2009 年 10 月～2011 年 3 月

坂井知子

事務補助員

2011 年 3 月～2013 年 9 月

佐藤静磨

派遣研究員(昭和医科工業株式会社)2009 年 10 月～2010 年 12 月

	
 

xx

研 究 報 告生体内安定性アパタイトセメントの創製とその評価
水本みのり、佐藤静磨、本田みちよ、長嶋比呂志、石井 賢、松本守雄、相澤 守

１． はじめに作製したセメントは、注射器等のデバイスを用いてインジ

現在、「超高齢社会」に突入した我が国において、高齢ェクションする際のハンドリング性に乏しく、また、圧縮者の生活の質(QOL)の向上を目指す上で、骨粗鬆症などの強度も 3-5 MPa と低い。そこで本項では、セメント混練液

疾患に対する低侵襲な医療を実現させることは、早急に解に、生物学的に安全性が高く、かつ高粘度の多糖類を添加決すべき重要な課題である。当プロジェクトでは、骨組織剤として用いることを検討した。まず、10 種類以上の多と直接結合する「生体活性」を有する水酸アパタイト

糖類を混錬液に用いてセメントを作製後、圧縮強度を測定(Ca10(PO4)6(OH)2; HAp)の表面をイノシトールリン酸(IP6)した。そのうち強度が高かった多糖類について、表 1 に示で表面修飾し、IP6 のキレート能により硬化する新しい硬す条件の混錬液で、最適な条件を検討した。粉と混錬液の化メカニズムをもった「生体内安定性骨修復セメント」、

割合(固液比)を 1/0.90-1/1.10 [g/cm3]となるように加えセメ

すなわち「キレート硬化型 HAp セメント」の開発を推進

ント試料片(φ 5 mm, h 8 mm)を作製した。インキュベータ

してきた。本研究では、高齢者特有の脊椎圧迫骨折などを(37°C, 相対湿度 100%)中で 24 h 養生後圧縮強度を測定し適用症例とし、低侵襲治療を実現する骨修復セメントを開た(図 1)。その結果、混練液に多糖類を添加したことによ発する。これまでに本プロジェクトで開発した基盤技術

り、ハンドリング性は格段に向上し、より広い固液比でセ[1,2]を応用し、インジェクション型ペースト状人工骨の実

メントの作製が可能となった。特に chito W10 を用いて作用化に向けて、1) ハンドリング性、2) 圧縮強度、3) 生体

製したセメントは、固液比 1/1.05 において 35 MPa であり、適合性について目標値を設定し、研究を推進している。

他の混錬液と比較して高い強度であった。つぎに、セメン

本研究は、より臨床に近い形でのインジェクションセメ

トペーストの初期硬化試験を測定した。初期硬化時間測定

ントの創製を目的として、作製時に用いる混練液を比較検は JIS 規格(JIS T 6602)[3]に準じて行なった。室温で粉体と混討し、その材料特性および動物埋入試験での生体適合性評

練液を所定の固液比(粉体/液体) [g/cm3]で混練後、セメントを価をおこなった。つぎに、セメントペーストの硬化時間の作製し、容器(φ 8 mm, h 4 mm)に充填後、表面を均した。一定

短縮・非崩壊性のセメント創製を目的として、HAp 原料
粉体の粉砕・調製方法を再検討した。さらに、改良セメン

表 1 混練液に用いた添加剤の組成

トの動物埋入試験での生体適合性試験もおこなったので

添加剤

これを報告する。

２ 実験と結果
２．１ 湿式合成 HAp 表面修飾粉体の作製

濃度

A

B

Con

コンドロイチン硫酸 Na－

Con-koh

コンドロイチン硫酸 Na コハク酸

溶媒25 1000 ppm IP6
5-25 1000 ppm IP6

Chit GL

キトサン

－

10

乳酸

Chit W10

キトサン

－

10

乳酸

0.5 mol・dm-3 水酸化カルシウム懸濁液に、Ca/P 比が 1.67になるように 0.3 mol・dm-3 リン酸水溶液を撹拌しながら40

滴下し、25 mass% NH4OH 溶液で pH 調整後、1 h 撹拌した。
インキュベータ内で 24 h 熟成させた後、吸引ろ過・凍結
乾燥し「湿式合成 HAp 粉体」を得た。

圧縮強度 / MPa30

得られた粉体をφ 10 mm の ZrO2 ボールを用い、遊星型
ボールミル(Fritsch 社製)で 5 min 粉砕処理した。その後、あらかじめ 1000 ppm に調製した IP6 溶液で 5 h 表面修飾
し、吸引ろ過・凍結乾燥し、湿式合成 HAp 表面修飾粉体「IP6-HAp 粉体」を得た。

chito W10
chito GLcon
con-koh20

10

２．２ キレート硬化型アパタイトセメントの試製とその材
料特性
２．２．１ 混練液の検討とその特性評価

0
1/0.9

1/0.95

1/1.0

1/1.05

固液比 / g・cm-3

ハンドリング性および圧縮強度の向上を目的に、セメント作製時の混練液を改良・検討した。純水を混練液として

図 1 セメントの圧縮強度 (n=5)

1

1/1.10時間インキュベータで養生後、ギルモア針を静かに下ろし、表て、培養 1, 2 および 4 日後に細胞数を測定し細胞増殖性を面に圧痕がつかなくなるまでの時間を「初期硬化時間」とした。

調べた。その結果、chito GL 混練液に pH 調整を行うこと

なお、圧痕が見られる場合は速やかにインキュベータ内に戻で、細胞が完全に死滅することなく増殖することが確認さ

して養生させた。

れた(図 2 上)。また、コントロール(ポリスチレンプレート)

混練液に chito W10 を用いたセメントの初期硬化時間は固と比較しても作製したセメントからは細胞の増殖性を阻

液比 1/1.05 において 45 min、chito GL を用いたセメントは固液害する物質が溶出しないことが明らかとなった(図 2 下)。

比 1/1.10 において 92 min であり、硬化に時間がかかることが２．２．２ 実験動物を用いたセメントの in vivo 評価わかった。セメントペースト作製の際の、混練液量が多いことがIn vitro 試験における生体適合性評価において結果が良原因として考えられる。また、混練液の粘性が高いためキレー好であった「chito GL」を混練液に用いたセメント試料片

ト結合に時間がかかってしまったと考えられる。
つぎに、作製したセメント試料片の生体適合性の一次スについて、動物埋入試験を行なった。具体的には、作製しクリーニングとして、トランズウェル(Corning 社)を用いたセメントを実験動物(ウサギ・ブタ)の脛骨に所定の期間て、間接細胞培養試験を行った(図 2)。この試験では、セ

埋入後、セメント周辺組織での炎症反応の有無、骨組織とメントから細胞増殖に好ましくない物質が溶出している

セメントとの結合性を確認することを目的とした。

か否かを調べることを目的としている。トランズウェルは

まず、湿式合成 HAp セメントペーストの in vivo 評価とプレート上部より吊り下げる構造をしている。メンブラン

して、ウサギを用いて生体硬組織に対する反応を調査した。

膜とプレート底部の間は 1 mm の間隔がありプレート底部

ウサギは日本白色種体重 3 kg、16 週齢を用いた。麻酔で細胞培養を行うことができる。 細胞は新生児 C57BL/6

後、ウサギ後肢の両膝内側部を剃毛・切開し、骨膜を剥がマウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立株 MC3T3-E1 を用いして脛骨を露出させドリルで穿孔(φ 4.2 mm)し、作製したセメントペースト硬化体(φ 4.0 mm、h 7-8 mm)を埋入した。
埋入期間は 4 週とした。所定期間埋入後、インプラント部

40	
  Cell number / 10-44	
  

30	
  
30	
  

Plate

分の脛骨を取り出し、凍結組織切片を作製し、組織学的観

water	
  1 /0.35

察を行なった。

chito	  GL	  1 /0.35

図 3 に湿式合成 HAp セメントの埋入 4 週におけるトル

chito	  GL	  1 /1.10

イジン青(TB)染色および HE 染色による組織学的観察写真を示す。埋入したセメント周辺に炎症は見られなかった。
トルイジン青染色(a)では埋入セメント(C)周辺に新生骨20	
  (矢印)が結合している様子が観察された。また、HE 染色(b)においても埋入セメント周辺に新生骨が結合している様子が観察された。

10	
  以上の結果より、ウサギ脛骨への埋入試験において、混練液にキトサンを用いた湿式合成 HAp セメントはその生体適合性が良好であることがわかった。

0	
  
0

1

2

3

4

5

(a)

Culture time / day

C

120

Day 4

C

Bone

100

Cell viability / % of control

(b)

Bone
100 µm

80

Bone

Bone

100 µm

図 3 TB 染色および HE 染色の組織学的観察(埋入 4 週)(a) 湿式合成 HAp (TB 染色, 拡大図)

60(b) 湿式合成 HAp (HE 染色, 拡大図)
40

つぎに、よりヒトに近い大型動物であるブタを用いて、セメント試料片の生体硬組織に対する組織反応を調べた。

20

当プロジェクトの非常勤研究員である長嶋らは、これま
でにクサビラオレンジ蛍光蛋白を遺伝子導入したクロー

0
Plate

water 1/0.35

chito GL
1/0.35chito GL
1/1.10ン豚(huKO)の作出に成功している[4]。huKO ブタは、蛍光蛋白を遺伝子導入したクローンブタであり、細胞が蛍光下

図 2 セメントの細胞培養試験結果(上: 細胞増殖曲線, 下: 細胞相対増殖率)で赤く光ることが報告されている。
本試験ではこの huKO ブタを用い、作製したセメントペ2

ースト試料片について、生体硬組織に対する組織反応を調ント(図 5 a, b)も蛍光下において、埋入セメント周辺で赤く査した。huKO ブタは体重 200 kg、1 歳齢の雌を用いた。

光る細胞が観察された(図 5 a’, b’)。

麻酔後、ブタ後肢の左膝内側部を剃毛・切開し、骨膜を剥以上の結果から、混練液にキトサンを用いた湿式合成がして脛骨を露出させドリルで穿孔(φ 4.4 mm)した。2.2 節

HAp セメントは、その生体適合性が良好であることがわで調整した混練液を用いて、セメントペーストを固液比かった。

1/1.10 [g/cm3]の条件で作製し、室温で 24 h 養生させた硬化

つぎに、より臨床利用に近い形での確認試験として、ブ体(φ 4.0 mm、h 7-8 mm)を埋入した。コントロールとしてタを用いてセメントペーストのインジェクション法によ現在臨床的に使用されている Biopex®-R を使用した。埋入る埋入試験を行なった。ブタは体重 200 kg、1 歳齢の雌を期間は 4 週とした。所定期間埋入後、インプラント部分の用いた。麻酔後、ブタ後肢の左膝内側部を剃毛・切開し、脛骨を取り出し、凍結組織切片を作製し、組織学的観察を

骨膜を剥がして脛骨を露出させドリルで穿孔(φ 4.2 mm)し行なった。

た。2.2 節で作製した混練液を使用し、湿式合成 HAp；固図 4 に Biopex®-R セメント、湿式合成 HAp セメントの液比 1/1.10[g/cm3]、の条件で作製したセメントペーストを、

埋入 4 週におけるトルイジン青(TB)染色による組織学的インジェクションデバイスを用いて直接埋入した。埋入期観察写真を示す。トルイジン青は主に、軟骨基質の新しい間は 4 週とし、所定期間経過後、インプラント部分の脛骨骨(新生骨)を濃青に染める。

を取り出し、凍結組織切片を作製し、組織学的観察を行な

埋入した湿式合成 HAp セメント(図 4 b, b’)はセメントった。

（C）周辺に炎症はみられなかった。コントロール(図 4 a,

図 6 に湿式合成 HAp セメントの埋入 4 週におけるトルa’)と比較しても、同様に埋入セメント(C)の周辺に新生骨イジン青染色による組織学的観察写真を示す。埋入したセ(矢印部分)が結合している様子が観察された。また、作製

メント周辺に炎症は見られず埋入セメント周辺に骨組織した標本を蛍光下で観察したところ(図 5)、いずれのセメが結合している様子が確認された。
以上の結果から、混練液にキトサンを用いた湿式合成

(a’)

(a)

HAp セメントは、より臨床利用に近い形でのインジェクション法による埋入試験の生体適合性試験でも問題ないCC
1.0 mm

Ｃ

100 µm

皮質骨

(b’)

(b)

ことがわかった。

Bone

C

C

Ｃ

Bone
1.0 mm

C ; セメント

100 µm

100 µm

1.0 mm

図 4 TB 染色による組織学的観察(埋入 4 週)®

®

(a) Biopex -R(全体像), (a’) Biopex -R(拡大像)(b) 湿式合成 HAp(全体像), (b’) 湿式合成 HAp(拡大像)

図 6 TB 染色によるインジェクションセメントの組織学的観察

(a’)

(a)

２．３ 湿式合成 HAp 粉体の表面修飾条件の検討

Bone

2.2 項では、セメント作製時に用いる混練液に多糖類を添加することでインジェクション可能な高強度セメントCCの作製に成功し、その安全性も確認した。本項ではセメントの硬化時間の短縮を目的として、HAp 原料粉体の粉砕・

100 µm(b)

表面修飾条件を再検討した。

(b’)

まず、原料粉体の粉砕に使用するボール径および粉砕時

Bone間の検討をした。2.1 項で調製した「湿式合成 HAp 粉体」
をφ 10 mm(50 個)またはφ 2 mm(180 g)の ZrO2 ボールを用いて遊星型ボールミル(Fritsch 製)で純水を溶媒として粉砕し、CC

100 µm

経時的にボールミル中のスラリーの粒径(メジアン径)をレーザー回折/散乱式粒子径分布装置 LA-300 (堀場製作所製)

図 5 TB 染色および蛍光下での組織学的観察(埋入 4 週)®

を用いて測定した。図 7 に粉体のメジアン径と粉砕時間の®

(a) Biopex -R(拡大像), (a’) Biopex -R(蛍光下))関係を示す。φ 10 mm のボールを用いて粉砕したスラリー(b) 湿式合成 HAp(拡大像), (b’) 湿式合成 HAp(蛍光下)3

は時間とともにその粒径は小さくなっていき、粉砕 180

それらの材料特性を評価した。セメントは純水を混練液とmin 程度で粒径が変化しなくなったのに対し、φ 2 mm のボして用い、インジェクション可能な固液比で作製した。イールを用いて粉砕したスラリーは粉砕 60 min 程度で粒径

ンキュベータ中で 24 h 養生した後、圧縮強度を測定した。

が変化しなくなった。φ 2 mm に変更することで、粉砕時

圧縮強度試験後のセメント破断面について SEM を用いての ZrO2 ボールが小さく、数も増加する。HAp 粉体との衝観察した。さらに、セメントペーストの初期硬化試験、ち突回数が増えたことにより短時間で粒径が小さくなった

ょう度試験も測定した。図 11 にセメントの圧縮強度と相と考えられる。また一定の粒径まで粉砕されると粉砕時間

対密度の結果を示す。IP6 濃度 0-4000 ppm では圧縮強度がを長くしても粒径はそれ以上変わらないことがわかった。

5 MPa 程度であったのに対し、8000 ppm 以上になると強以上の結果より、湿式合成 HAp 粉体はφ 2 mm の ZrO2 ボールを用いて 60 min 粉砕することで、より効率的に微粒

60

IP6吸
吸 着量 / mg･･ g-1子化できることがわかった。
10
9

Φ 2mm

8

Φ10mm

メジアン径 / µm

7

6
5

50
40
30
20
10

4

0

3

0

4000

2

8000

12000

IP6濃
濃 度 / ppm

1

図 8 調製した HAp 粉体の IP6 吸着量

0
0

60

120

180

240

300

粉砕時間 / min
-40

図 7	
  粉体のメジアン径と粉砕時間の関係

つぎに、湿式合成 HAp 粉体と IP6 溶液 40 cm3, φ 2 mm-30

表 面 電位 / mV

ZrO2 を遊星型ボールミルで 60 min 粉砕するとともに、IP6の表面修飾処理を同時に行った。IP6 は 0, 1000, 4000, 8000,
12000 ppm の濃度を用いた。粉砕後に得られたスラリーを吸引ろ過・凍結乾燥することで「bmIP6-HAp 粉体」を得た。bmIP6-HAp 粉体に対する IP6 吸着量を図 8 に示す。IP6

-20

-10

吸着量は粉砕後のスラリーを遠心分離し、上清に含まれる
0リン(P)量を測定することで算出した。IP6 濃度の増加に従0

い IP6 吸着量は増加し、8000 ppm 以上の濃度で飽和吸着

4000

8000

12000

IP6濃
濃 度 / ppmに達することがわかった。
つぎに、レーザードップラー法を用いて bmIP6-HAp 粉

図 9 調製した HAp 粉体の表面電位

体の表面電位を測定した(図 9)。IP6 濃度の増加に伴い、表面電位は負電荷側にシフトしていき、8000 ppm 程度で平衡に達していることがわかった。IP6 が HAp 粒子に吸着することにより、HAp 粒子表面の OH‐基が増加していくた

1.69

Ca / P比比/-めだと考えられる。つぎに、bmIP6-HAp 粉体の Ca/P 比を測定した結果を図 10 に示す。湿式合成 HAp 粉体の Ca/P
比は仕込み組成である 1.67 であった。IP6 濃度の増加にともない、Ca/P 比が低下していき、IP6 濃度が 8000 ppm 以

1.67
1.65
1.63

上で平衡に達することがわかった。これは、IP6 が HAp
粒子に吸着したことにより粉体中のリン(P)量が増加した

1.61ためと考えられる。IP6 吸着量および表面電位、Ca/P 比の1.59

結果はほぼ一致しており、これらの結果より HAp 粉体の

0

4000

8000

IP6濃
濃 度 / ppm

IP6 吸着量は IP6 濃度が 8000 ppm 以上になると飽和に達すると考えられる。

図 10 調製した HAp 粉体の Ca/P 比

つぎに、0, 1000, 4000, 8000 および 12000 ppm IP6 溶液で表面修飾した bmIP6-HAp 粉体を用いてセメントを作製し、

4

12000

度が高くなり、最大強度は IP6 濃度が 12000 ppm セメントるにつれてインジェクションが可能な固液比は高くなり、の 10 MPa であった(図 11 上)。また、相対密度が向上する

IP6 の濃度が 8000 ppm 以上になると調製したセメントペにつれて圧縮強度も向上することがわかった(図 11 下)。

ーストがより少ない混練液量でペースト状になることがさらに、SEM を用いてセメントの内部を観察した結果、わかった。IP6 中で粉砕と表面修飾を同時に行うことによIP6 濃度が 0-および 1000 ppm のセメントは多くの空隙(図り、HAp 粉体への IP6 吸着量が増えるため、セメントペー

12 a ,b)が確認されたのに対して、4000 ppm のセメント(図スト中では HAp 粒子間の摩擦が減り、より少ない固液比12 c)では減少し、8000 および 12000 ppm セメント(図 12

でのインジェクションが可能になったと考えられる。また、

d ,e)ではさらに減少し、セメント粒子同士が密に充填されセメントの初期硬化(図 14)は、IP6 濃度 4000 ppm 以上になていることを確認した。

ると、0-1000 ppm のセメントと比較して硬化時間が大幅に

また、セメントペーストのハンドリング性を確認するた短縮した。12000-IP6-HAp セメントの硬化時間は最短でめに、JIS T 6602 [3]に準じて稠度を測定した。調製したセ25.3 min (固液比 1/0.45 [g/cm3])であった。12000-IP6-HAp

メントペーストの上にガラス板を乗せ、セメントペースト

セメントは高い IP6 濃度と高い固液比(混練液量が少ない)の広がり面積から稠度を算出した。図 13 に湿式合成 HApのため、イノシトールリン酸による HAp 粒子間がキレー

セメントの固液比と稠度の関係を示す。IP6 濃度が高くな

ト結合する時間が短縮されていると考えられる。
以上のことから、IP6 濃度が 8000 ppm 以上で粉砕およ15

び表面修飾の同時処理をした粉体を用いることで、より少1000 ppm

ない混練液量でインジェクション可能なセメントペース

4000 ppm

トを調製でき、そのセメントは高い圧縮強度を有すること8000 ppm

10

圧 縮 強 度 / MPa

0 ppmがわかった。

12000 ppm

9

5

0 ppm
1000 ppm
4000 ppm
8000 ppm
12000 ppm

8
7

0
1/0.5

1/0.6

1/0.7

1/0.8

1/0.9

1/1.0

1/1.1

6

1/1.2

稠度 / -

固 液 比 / g・・ cm-3

0 ppm

60

5
4
3

1000 ppm
4000 ppm2

相対密度 / %8000 ppm

1

12000 ppm

40

1/0.401/0.501/0.601/0.701/0.801/0.901/1.001/1.101/1.20固 液 比 / g・・ cm-3

図 13	
  IP6 濃度の異なるセメントの稠度

20

100

0
1/0.5

1/0.6

1/0.7

1/0.8

1/0.9

1/1.0

1/1.1

90

1/1.2

固 液 比 / g・・ cm-380(a)

硬 化 時 間 / min

図 11	
  IP6 濃度の異なるセメントの圧縮強度(上)および相対密度(下)

(b)

70
60
50
40
30
20
10

(c)

(d)

(e)
0
0 ppm

1000 ppm 4000 ppm 8000 ppm 12000 ppm-IP6-HAp-IP6-HAp-IP6-HAp-IP6-HAp-IP6-HAp（ P/L=1/1.1)（ P/L=1/1.1)（ P/L=1/0.8)（ P/L=1/0.6)（ P/L=1/0.45)

図 14	
  IP6 濃度の異なるセメントの初期硬化
20 µm

図 12	
  IP6 濃度の異なるセメントの微細構造(a) 0 ppm, (b) 1000 ppm, (c) 4000 ppm, (d) 8000 ppm, (e)12000 ppm

5

２．４ 非崩壊型湿式合成 HAp セメントの作製とその評
価
２．４．1 混練液の検討とその材料特性評価であったが、本研究の bmIP6-HAp セメントペーストの初

本項では、セメントの非崩壊性を担保するために IP6 溶

期硬化はどの混練液でも 20 min 以下(図 17)と大幅に短縮

これまでの報告[5]より、原料粉体を従来法で調製した
IP6-HAp セメントの初期硬化は固液比 1/0.95 の時に 87 min

液中で粉砕・表面修飾した bmIP6-HAp 粉体および α-TCP

され、最短で 25%cond + 22.5%NaH2PO4 の 12 min であった。

粉体の混合粉体を用いてセメントを作製し、それらの材料

これは、調製粉体の IP6 吸着量が増加したこと、またセメ

特性を評価した。つぎに、非崩壊性を担保したセメントのント作製時の混練液量が減少したことにより、HAp 粒子

ハンドリング性および圧縮強度の向上を目的として、セメがより密になりキレート硬化時間が早くなったためと考ント作製時に使用する混練液に多糖類を加え検討した。粉えられる。これにより、強度、非崩壊性、硬化時間を考慮

体は 2.3 項と同様に 8000 ppm IP6 溶液中で 60 min 粉砕しするとバランスの良いセメントとして、混練液にた bmIP6-HAp 粉体(8000 ppm bmIP6-HAp)を用いた。市販

10%chit+2.5%NaH2PO4 を固液比 1/0.70 で使用した場合、非α-TCP 粉体(α-TCP-A)は純水中で 120 min(φ 10 mm, 50 個)

崩壊性であり、22 MPa の強度を得られることがわかった。

粉砕し調製した。8000 ppm bmIP6-HAp 粉体と α-TCP 粉体

またその初期硬化時間は 17 min であった。

を重量比(8:2)となるように V 形混合機(筒井理学器械)に入30れ、混合した調製粉体を使用した。セメントは 2.5 mass%

10%chit+2.5%NaH2PO4リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)を混練液として用い、25%cond+2.5%NaH2PO4
25%dex+2.5%NaH2PO43

固液比 1/0.70 [g/cm ]で作製した。図 15 に湿式合成 HAp セ

2.5%NaH2PO4

圧 縮 強度 / MPa

メント崩壊性試験の結果を示す。これまでの従来法[4]で作製した IP6-HAp セメント(a), (a’)は純水中では硬化していないのに対し、粉砕および表面修飾の同時処理に行った8000 ppm bmIP6-HAp セメント(b), (b’)は硬化していること

20

10が確認された。

(a)

(a´)
0
1/0.601/0.701/0.80固 液 比 / g・・ cm-3

図 16 混練液に多糖類を用いたセメントの圧縮強度

(b)

(b´)
硬 化 時 間 / min

25

図 15	
  湿式合成 HAp セメントの崩壊性試験(a), (a’): 従来法 HAp セメント

20

15

10

(b), (b’): bmP6-HAp セメント

つぎに、非崩壊性を担保したセメントのハンドリング性

5および圧縮強度の向上を目的として、セメント作製時に使0

用 す る 混 練 液 に 多 糖 類 を 加 え 検 討 し た 。 混 練 液 は 2.5

2.5%NaH2PO4

mass%リン酸二水素ナトリウム(2.5%NaH2PO4)および、2.5

10%chit
25%cond
25%dex
+2.5%NaH2PO4 +2.5%NaH2PO4 +2.5%NaH2PO4

mass% NaH2PO4 溶液に 10 mass%キトサン GL (10%chit +図 17	
  混練液に多糖類を用いたセメントの初期硬化

2.5%NaH2PO4), 25 mass%コンドロイチン硫酸(25%cond +2.5%NaH2PO4), 25 mass% デ キ ス ト ラ ン 硫 酸 イ オ ウ 5

２．４．２ 実験動物を用いたセメントの in vivo 評価(25%dex + 2.5%NaH2PO4)をそれぞれ添加した溶液を用いた。粉体は 2.2.1 項で混合調製した粉体を用いて、各混練

非崩壊性を担保した改善法セメント試料片について、生液を固液比 1/0.60-1/0.80 [g/cm3]となるように加え、混練・体適合性を評価するために動物埋入試験を行なった。ブタ

成形後、24 h 室温で養生した。

は体重 130 kg、8 カ月齢の雌を用いた。麻酔後、ブタ後肢

図 16 に bmIP6-HAp セメントの圧縮強度の結果を示す。

の左膝内側部を剃毛・切開し、骨膜を剥がして脛骨を露出

混練液に多糖類を加えることにより、ハンドリング性およ

させドリルで穿孔(φ 4.4 mm)した。2.3.1 項で調製した粉体

び圧縮強度が向上した。混練液に 10%chit + 2.5%NaH2PO4に 10%chit + 2.5%NaH2PO4 と 、 コ ン ト ロ ー ル と 2.5%を用いて作製したセメントは固液比 1/0.70 [g/cm3]におい

NaH2PO4 混練液を用いて、セメントペーストを固液比て 22 MPa であった。これは他の混練液と比較して高い圧

1/0.7[g/cm3]の条件で作製し、室温で 24 h 養生させた硬化

縮強度であった。

体(φ 4.0 mm、h 7-8 mm)を埋入した。埋入期間は 4 週とし6た。所定期間埋入後、インプラント部分の脛骨を取り出し、でも、セメント周辺に細胞が結合している様子が確認でき、

非脱灰研磨標本を作製し、組織学的観察を行なった。

その生体適合性が良好であることがわかった。しかしなが

図 18 に埋入 4 週におけるビラヌエバ骨染色による組織

ら、このペーストは初期硬化時間が 92 min と今後臨床利学的観察写真を示す。埋入した改善法 HAp セメントは混用するにはやや問題があった。また、純水に浸漬させると練液 10%chit + 2.5%NaH2PO4 および 2.5%NaH2PO4 を使用し崩壊する場合があった。そこで、2.3 節では、硬化時間のたどちらのセメントも材料セメント(C)周辺で炎症等は見

短縮と非崩壊性のセメントの作製を目的として、粉砕条件

られず(図 18 a, b)、旺盛な骨形成が認められた。また、そと IP6 表面修飾条件の検討をおこなった。湿式合成 HApの拡大像(図 18 a’, b’)から、茶色に染色された低石灰化骨、粉体をφ 2 mm の ZrO2 を用いて 8000 ppm IP6 溶液中で 60

矢印部分に示した類骨の形成、三角で示したハーバース管

min 粉砕・表面修飾を同時に処理することにより、より短の形成も確認でき、セメントが良好な硬組織適合性を示す

時間で HAp が微粒子化され、また IP6 吸着量が増加する

ことが明らかとなった。

ことがわかった。作製したセメントペーストは、より少な(a)

い混練液量でインジェクション可能となり、その初期硬化(a´)

時間も短縮された。さらに、2.4 節では α-TCP を添加する
ことにより、非崩壊性で硬化していることが確認された。

C

またセメントペーストに用いる混練液を検討した結果、圧C縮強度において 10%chit + 2.5%NaH2PO4 を混練液として作製したセメントの強度は 22 MPa という高強度が得られた。

Bone

セメントペーストの初期硬化時間は 17 min で硬化するこ
500µm

(b)
(a)

とがわかった。このセメント硬化体をブタに埋入したとこ

100µm

ろ、材料周辺に炎症を起こすことなくその生体適合性に問(b´)

題ないことも確認した。

Bone

今後はより臨床利用に向けて Non-fragmentation を担保したリン酸カルシウムセメントの作製に応用展開していC

く予定である。

C【参考文献】
500µm

1. M. Aizawa, Y. Haruta, and I. Okada, Arch. BioCeram. Res.,

100µm

3, 134-138 (2003).

図 18 ビラヌエバ骨染色による組織学的観察(埋入 4 週)

2. Y. Horiguchi, A. Yoshikawa, K. Oribe, and M. Aizawa, J.

（a） 10%chit+2.5%NaH2PO4 セメント, (a’) (a)の拡大図

Ceram. Soc. Jpn., 116, 50 (2008).

（b） 2.5%NaH2PO4 セメント, (b’) (b の)拡大図

3. JIS T 6602 (1993),「歯科用りん酸亜鉛セメント」

３． 考察及び今後の展望

4. H. Matsunari, M. Onodera, N. Tada, H. Mochizuki, S.

本研究では、湿式合成により得られた HAp 粉体を出発

Karasawa, E. Haruyama, N. Nakayama, H. Saito, S. Ueno,

原料として研究を推進している。これまでに本プロジェク

M. Kurome, A. Miyawaki, and H. Nagashima, Cloning andトで開発した基盤技術[1, 2]を応用し、インジェクション

stem cells, 10, 313 (2008).

型ペースト状人工骨の実用化に向けて、1) ハンドリング

5. 水本みのり, 佐藤静磨, 本田みちよ, 長嶋比呂志, 相澤

性、2) 圧縮強度、3) 生体適合性について目標値を設定し、

守, “平成 22 年度研究概要”, 36-39 (2011).

研究を推進している。2.2 節ではセメント作製時の混錬液検討をおこなった。混練液に多糖類を用いることにより、ハンドリング性は格段に向上され、インジェクションによるセメント作製が可能となった。圧縮強度においては、「キトサン W10」および「キトサン GL」を混錬液として作製したセメントが高強度であった。また「キトサン GL」
を pH 調製することで細胞毒性試験(in vitro)でも良好な結果が得られた。
つぎに、ハンドリング性、圧縮強度、生体適合性(in vitro
試験)の全てに優れているキトサン GL を混練液に使用したセメントペーストについて、生体適合性(in vivo)試験をおこなった。その結果、ウサギおよびブタという異種動物間において、周辺組織での炎症はみられずセメント周辺に新生骨が結合している様子が確認できた。さらに、より臨床応用に近い形でのインジェクション法による埋入試験

7

生体内吸収性リン酸三カルシウムセメントの創製とその評価
小西敏功、永田幸平、高橋周平、庄 志、長嶋比呂志、石井 賢、松本守雄、相澤 守

１． はじめに

２． 実験と結果

ハイドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2; HAp)および

２．１ キレート硬化型 β-リン酸三カルシウムセメントの創製
２．１．１ キレート硬化型 β-リン酸三カルシウムプロトタ
イプセメントの試作とその材料特性評価

リン酸三カルシウム(Ca3(PO4)2; TCP)は、生体適合性・骨親和性を有することから、バイオセラミックスとして整形外科領域において広く臨床応用されている。しかしながら、それらは顆粒状やブロック状の自形を有することから、骨欠損の補填に際して、欠損形状に合わせて製品形状を選択

セメント原料粉体は、市販 β-TCP (β-TCP-100)粉体を遊するか、しばしば製品自身を加工する必要が生じる。また、

星ボールミルにより湿式粉砕して調製した。まず、φ10 mm

顆粒の散乱や欠損部に形状通りに充填できない問題[1]、ZrO2 ボールで 4 h 粉砕(β-TCP-4h)した。得られたスラリー

ある程度大きな手術侵襲は避けられず、患者への負担が大をそれぞれ吸引ろ過、凍結乾燥し、粉砕粉体を得た。ついきいという問題などもある。そうしたことから、補填時にで、その粉体を 3000 ppm に調製した IP6 溶液中で 24 h 表は小さな孔から注入可能で、体内で欠損形状に合わせて硬面修飾後、吸引ろ過、凍結乾燥し、表面修飾 β-TCP 粉体化する「ペースト状人工骨(以下、セメント)」が待望され、(IP6-β-TCP-4h)を得た。
図 1 に調製した β-TCP 粉体の X 線回折(XRD)パターン

開発されてきた。
現行のセメントは、酸性のリン酸水素カルシウムを示す。4 h 粉砕後、結晶性はわずかに低下したが、粉砕(CaHPO4)と塩基性のリン酸四カルシウム(Ca4O(PO4)2)から後および表面修飾前後で結晶相に変化はなかった。表 1 に

HAp を形成する酸-塩基反応を利用することが多く、硬化調製粉体のメジアン粒子径、比表面積およびゼータ電位のに時間がかかるほか、硬化時に pH 変動を伴うため、組織結果を示す。粉砕によってメジアン粒子径は減少し、比表周辺に炎症反応を起こす恐れもある[2]。また、硬化時に面積は向上したが、表面修飾前後で差異は見られなかった。

血液が介在すると硬化時間がさらに遅れ、硬化しないとい

一方で、ゼータ電位は、β-TCP 粒子への IP6 の吸着によっう報告もある[3]。さらに、酸-塩基反応により形成されるて表面修飾前後で大きく低下した。また、走査型電子顕微

上述のリン酸カルシウムセメントは生体内でほとんど吸鏡(SEM)観察からも β-TCP 粒子が微粒化していることも確収されない欠点もある[4]。そのため、最終的に生体内で吸収されて自家骨と置換するような素材による「生体吸収(a)

性ペースト状人工骨」の開発が医療の現場から強く望まれ
X-ray intensity (a.u.)
ている。
そこで、本研究では、全く新しい硬化メカニズムを導入し、従来の骨修復セメントの問題点を全て解決した新規のペースト状人工骨を開発する。具体的には、イノシトール
リン酸(C6H18O24P6; IP6)で TCP の表面を修飾し、IP6 とカルシウムのキレート結合により硬化する生体吸収性ペー
スト状人工骨を創製する。このペースト状人工骨は、IP6

(b)

(c)

のキレート結合で硬化するため、硬化時間も短く、炎症反応の心配もないほか、化学反応を伴わずに TCP のまま直接硬化するという特長を持っている。
10

本研究では、溶解性の異なる二種類の TCP (β-およびα-TCP)を用いて、異なる溶解性を有するキレート硬化型ペ20

30
2! / ° CuK"

4050

図 1 調製粉体の XRD パターン(a) β-TCP-100, (b) β-TCP-4h, IP6-β-TCP-4h

ースト状人工骨の開発をそれぞれ行った。2.1 節では、
β-TCP を用いて、プロトタイプセメントの作製から臨床応

表 1 調製粉体のメジアン粒子径、比表面積およびゼータ電位用を指向した材料特性を有する非崩壊性セメントへの改良を行った。2.2 節では、α-TCP を用いて、プロトタイプ
セメントの作製からクエン酸塩を混練液とした非崩壊性

β-TCP-0h
β-TCP-4hIP6-β-TCP-4h

セメントへの改良を行った。

8

メジアン粒子径
(µm)
5.1
1.5
1.4

比表面積
(m2/g)
2.5
20.3
21.4

ゼータ電位
(mV)
−19.7
−7.73
−29.7

(a)

(b)

(c)

C
F

C

!

N

!

(b)

C
200 !m

1 mm

(d)

(e)

50 !m

(f)

(e)

N

C
C

!

!

!
C
200 !m

1 mm

50 !m

図 2 ウサギ脛骨に 4 および 24 週間埋入後のセメントの組織学像(a)-(c)は 4 週、(d)-(f)は 24 週埋入後の組織像を示し、(a, b), (d, e)は HE 染色像、(c),(f)は TRAP 染色像である。セメント(C)周囲でピンク色の新生骨(N)の形成が認められた。(b)では、セメントと新生骨の間に線維性組織(F)が見られたが、矢印(→)で示すように骨芽細胞による旺盛な骨形成が確認できる。一方で、(c)および(f)では、TRAP 陽性の破骨細胞(*)による材料の吸収も確認された。

ついで、調製した IP6-β-TCP-4h 粉体に固液比(粉体/混練

２．１．２ 高強度化キレート硬化型 β-リン酸三カルシウ
ムセメントの試作とその材料特性評価

液(P/L)=1/0.20 [g/cm3]になるように混練液(純水)を加え、混

我々は最終的に、低侵襲治療を実現するシリンジなどの認した。

練・成形して IP6-β-TCP-4h セメント(φ4.2 mm, h7~8 mm)を

インジェクションデバイスで注入可能なペースト状人工作製し、室温で 24 h 養生した。得られたセメントの生体骨の開発を目標としている。純水を混練液として用いたセ適合性・生体吸収性を評価するため、ウサギ脛骨にφ4.4 mm

メントは、混練時のハンドリング性(操作性)に乏しく、力の骨欠損を作製し、作製したセメントを 4 および 24 週間

学強度が低いという欠点がある。そこで、これらの問題を埋入した。その後、脱灰標本を作製し、酒石酸耐性酸性ホ

解決するために、表 2 に示す粘性多糖類を混練液として用

スファターゼ(TRAP)染色を、非脱灰研磨標本を作製し、いてセメントを作製した[6]。

ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色をそれぞれ行い、その2.1.1 項で調製した IP6-β-TCP-4h 粉体および混練液(粘性

組織学的観察・評価を行った[5]。HE 染色は細胞核・骨組多糖類)を、固液比 1/0.45-1/0.55[g/cm3]になるように加え、織などが赤く染色される。TRAP 染色は、材料や骨の吸収

混練することでセメントペーストを調製し、稠度および硬を行う TRAP 陽性の破骨細胞が赤く染色される。

化時間を測定した。また、ペーストを徒手またはシリンジ

図 2 に IP6-β-TCP-4h セメントの埋入 4 週(a-c)および 24

を用いてインジェクションで成形し、セメント試料片(φ6週(d-f)後の組織学像を示す。(a, b), (d, e)は HE 染色像、(c),(f)mm, h12 mm)を作製し、インキュベータ(37°C, 相対湿度:

は TRAP 染色像である。埋入 4 週では、セメント(C)とピ

100%)で 24 h 養生した後、圧縮強度および XRD を測定し、ンク色で示した新生骨(N)の間に線維性組織の介在が見ら

セメント破断面を走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて観察れたが、セメント上および新生骨周囲で骨形成を行う骨芽した。

細胞(→)の存在も確認された。また、TRAP 染色像(c)から

まず、セメントペーストのハンドリング性を評価するたは、TRAP 陽性の破骨細胞の存在が観察され、材料が吸収めに稠度(ペーストの広がり)を測定した(図 3)。純水を混練されていることが確認された。埋入 4 週では、セメント(C)

表 2 混練液として使用した多糖類が成熟した新生骨(N)で覆われている様子がわかる。TRAP

略語

染色像(f)から、試料片周囲に TRAP 陽性の破骨細胞の存在濃度(mass%)

添加剤

溶媒が観察され、24 週においても材料が吸収され続けている

Water

0

-

-

ことが明らかとなった。これらの結果から、IP6-β-TCP-4hAlg2

アルギン酸ナトリウム3000 ppm IP6

セメントは、生体適合性、生体吸収性に優れたセメントで

Dex

20

デキストラン硫酸ナトリウム3000 ppm IP6

あるといえる。

Chond

20

コンドロイチン硫酸ナトリウム 3000 ppm IP6

Chito GL

10

キトサン

乳酸

Chito W10

10

キトサン

乳酸

9

図 4 セメントの圧縮強度
図 3 セメントペーストの稠度(a) water, (b) Alg, (c) Dex, (d) Chond, (e) Chito W10(a) water, (b) Alg, (c) Dex, (d) Chond, (e) Chito GL,(f) Chito W10
20液とした場合、高い稠度(低い粘性)のセメントペーストで(f)


Compressive strength / MPa

あったのに対して、多糖類を添加した混練液を用いた場合、低い稠度(高い粘性)のセメントペーストが得られた。しかしながら、各多糖類の間で稠度に差は見られなかった。この結果から、混練液に多糖類を添加して使用することで、ペーストに適度な粘性を付与させることが可能となり、純水のみで混練した時よりも、ハンドリング性(操作性)が向上することが明らかとなった。また、Chito W10 を混練液として調製したセメントペーストの硬化時間は、P/L=

15

(e)

10
(d)

(b)


5

(c)


1/0.50 [g/cm3]で 8.0±1.0 min、P/L=1/0.55 で 20±1.0 min であ

(a)


った。

0

次に、徒手成形で作製したセメント試料片の圧縮強度を40

図 4 に示す。純水を混練液として用いた場合、セメントの45
50
Relative density (%)


55

圧縮強度はいずれの固液比でも約 0.5 MPa であったのに対

図 5 セメントの圧縮強度と相対密度との関係

して、多糖類を添加した混練液を用いた場合、いずれのセ(a) water, (b) Alg, (c) Dex, (d) Chond, (e) Chito GL,

メントの圧縮強度も向上した。特に、Chito W10 を混練液(f) Chito W10, P/L=1/0.45 [g/cm ]3として用いた場合、高い圧縮強度(17.4±1.8 MPa)のセメン

20

トが得られることがわかった。また、シリンジを用いてイ
Cell number / 104 cell・・well-1ンジェクションで成形したセメントにおいても、Chito GL
および Chito W10 を混練液として用いた場合、他の混練液を用いた場合よりも高い圧縮強度が得られることがわかった(Chito GL: 10.5±1.8 MPa (P/L=1/0.55 [g/cm3])、Chito
W10: 15.9± 2.0 MPa (P/L=1/0.55 [g/cm3]))。
セメントの圧縮強度と相対密度との関係を図 5 に示す。
セメントの相対密度が増加するにつれて、指数関数的に圧縮強度が増加することが明らかとなった。高い圧縮強度

Control
Water
Cond
Chito GL
Chito W10

15

10

5

(17.4±1.8 MPa)を有していた Chito W10 を混練液として用いたセメントは、高い相対密度(51.7±0.9%)も有していた。

00

このことから、Chito W10 を混練液として用いたセメントが高い圧縮強度となった要因は相対密度の増加であると

2
4
Culture time / day
6

図 6 セメントと共培養した細胞の増殖性いえる。しかしながら、SEM を用いてセメント破断面の微細構造を観察した結果、各セメント間でセメント粒子のが原料粉体の結晶相を維持したまま硬化したことを示し充填性に違いは確認できなかった。これは、各セメント間ている。

の相対密度の差が約 5%しかないためだと考えられる。

ついで、セメント試料片の生体適合性を調べるため、水および多糖類を添加した場合、いずれのセメントもTranswell® (Corning, USA)を用いて間接培養を行った。純水を混練液として作製したセメントは、コントロールと同

β-TCP 単一相からなることがわかった。これは、セメント等な細胞増殖を示した(図 6)。一方、Chond, Chito GL およ

さらに、セメントの XRD パターンを測定した結果、純10

び Chito W10 を混練液として作製したセメントの細胞増殖
は、1 日目に大きく低下した。しかしながら、3 日目には(a)

播種した細胞数にまで回復し、5 日目まで増殖し続けた。
X-ray intensity (a.u.)

細胞増殖の低下は、混練液の成分がセメントから溶出し培
地中の pH を変化させたことが原因と考えられる。

２．１．３ 非崩壊性キレート硬化型 β-リン酸三カルシウ
ムセメントの試作とその材料特性評価
2.1.2 項では、多糖類を混練液として用いることで、インジェクション可能かつ高い圧縮強度を有するセメント

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)


の作製に成功した。しかしながら、セメントの作製条件によっては、作製したセメントが水中に浸漬した場合に崩壊(g)


してしまうという問題が見られた。
一方で、我々はこれまでに、非崩壊性 HAp セメント作

1020

製のための新規な粉体調製プロセス（以降、改善法）を考案してきた[7]。これまでは、市販 HAp 粉体を湿式粉砕後、

30
2! / ° CuK!


40

50

図 7 β-TCP 粉体の XRD パターン(a) β-TCP-0h(0), (b) β-TCP-1h(3000), (c) β-TCP-2h(3000), (d)β-TCP-3h(3000), (e) β-TCP-4h(3000), (f) β-TCP-5h(3000), (g)β-TCP-6h(3000). ●: β-TCP, ◯: HAp

IP6 で表面修飾することでセメント原料粉体を調製した（以降、従来法）[8]。一方で、改善法では、IP6 中で市販
HAp 粉体を湿式粉砕すると同時に IP6 による表面修飾を120行うことで、セメント原料粉体を調製した。
Amount of Ca2+ ion released / mg・・g-1

本項では、新規な粉体調製プロセス（改善法）を
IP6-β-TCP セメントの作製のために適用し、セメントの材
料特性、とりわけ非崩壊性に及ぼす粉砕時間および IP6 濃
度の影響を検討した[9]市販 β-TCP-100 粉体 10 g および 3000 ppm IP6 水溶液(pH7.3) 40 cm3、φ2 mm ZrO2 ボール(180 g)を ZrO2 ポットに入れ、遊星型ボールミルを用いて 1-6 h 湿式粉砕するとともに、IP6 による表面修飾処理を同時に行った。粉砕後に得られたスラリーを吸引ろ過、凍結乾燥し、表面修飾 β-TCP
粉体を得た。ここで、例えば 3000 ppm IP6 を用いて、φ2 mm
ZrO2 ボールで 3 h 粉砕した粉体を「β-TCP-3h(3000)」とす!-TCP-3h(3000)

100!-TCP-2h(3000)
!-TCP-1h(3000)

80!-TCP-0h(0)

60!-TCP-5h(3000)
!-TCP-4h(3000)
!-TCP-6h(3000)

40

20

0
0

る。「β-TCP-0h(0)」は市販 β-TCP-100 粉体である。
図 7 に調製した β-TCP 粉体の XRD パターンを示す。粉30

60Time / min90

図 8 Tris-HCl バッファーにおける β-TCP 粉体の溶解性

砕時間 3 h までは、ほぼ β-TCP 単一相であったが、4-6 hの粉砕時間では β-TCP/HAp 混合相であることがわかった。

お よ び β-TCP-3h(3000) で は 、 そ れ ら の 粒 子 表 面 は

4 h 以上の粉砕時間では、β-TCP が IP6 中で加水分解され、β-TCP-0h(0)と比較して凹凸が増加し、粒子表面は極めて

HAp が形成したと考えられる。

非晶質に近い状態になっていることがわかる(図 9d およびHCl)バッファー(pH7.3)中での調製粉体の溶解性をカルシf)。一方、β-TCP-4h(3000)では、粒子径は減少したものの(図9g)、その粒子表面は微細な針状粒子の凝集体であること

ウムイオン電極を用いて調べた(図 8)。1-3 h の粉砕時間でがわかった(図 9h)。これは、IP6 中で β-TCP が加水分解さは、粉砕時間の増加とともに溶解性が高まり、3 h 粉砕粉

れ、低結晶性 HAp 粒子が析出したためであると考えられ体(β-TCP-3h(3000))では、最も溶解性が高いことが明らかる。実際に、β-TCP-3h(3000)と β-TCP-4h(3000)を比較するとなった。一方、4 h 以上粉砕した粉体は粉砕前の粉体よと、比表面積(SSA)は 18.6±1.1 m2/g から 76.5±0.5 m2/g に、次に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸(Tris-

りも溶解性が低下した。4 h 粉砕粉体は β-TCP/HAp 混合相

粉体中の HAp 含有率は 4.9±2.4%から 25.1±2.6%に増加しであり、低結晶性 HAp は中性溶液中で溶解しにくいためたことを確認しており、これらの結果は TEM 観察結果と溶解性が低下したと考えられる。

よく一致している。
これらの粉体および 2.5 mass%リン酸水素二ナトリウム

調製粉体の粒子形態を透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて観察した(図 9)。β-TCP-0h(0)は数 µm からなるスムーズ(Na2HPO4)を混練液として調製したセメントペーストの非な表面の焼結粒子(図 9a)であり、拡大像(図 9b)から一次粒崩壊性を調べた結果(図 10)、最も高い溶解性を示した

子は 10 nm 以下であることがわかった。粉砕時間の増加に

β-TCP-3h(3000)粉体から調製したペーストのみ 5 min 以内

伴って粒子径が減少し、ナノサイズの粒子が増加しているに純水中で非崩壊性を示した。
ついで、粉体性状に及ぼす IP6 濃度の影響を検討するたことが確認した(図 9c, e および g)。また、β-TCP-2h(3000)11図 9 β-TCP 粒子の TEM 像(a, b) β-TCP-0h(3000), (c, d) β-TCP-2h(3000), (e, f) β-TCP-3h (3000), (g, h) β-TCP-4h(3000)!-TCP-1h(3000)

!-TCP-2h(3000)

!-TCP-3h(3000)

!-TCP-4h(3000)

!-TCP-5h(3000)

!-TCP-6h(3000)

No setting

No setting

SettingNo setting

No setting

No setting

図 10 非崩壊性試験後のセメントの外観

Compressive strength / MPa

16

(a)

!-TCP-3h(0)
!-TCP-3h(1000)
!-TCP-3h(3000)
!-TCP-3h(5000)
!-TCP-3h(10000)

14
12

(b)

10
8
1 µm

6

0.5 µm

図 12 β-TCP-3h(3000)セメント破断面の微細構造(a) 低倍像, (b) 高倍像、矢印は未反応の β-TCP

42した β-TCP-3h 粉体および 2.5 mass%リン酸水素二ナトリ
ウム(Na2HPO4)を混練液としてセメントを作製し、それら0の材料特性を評価した。セメントは、各 β-TCP 粉体に固1/0.5 1/0.6 1/0.7 1/0.8 1/0.9 1/1.0 1/1.1
P/L ratio (g/cm3)


液比(P/L)が 1/0.5-1/1.1 [g/cm3]となるように混練液を加え、

図 11 β-TCP セメントの圧縮強度

混練することで作製した。インキュベータ中で 24 時間養め、粉砕時間を 3 h に固定し、0-10,000 ppm IP6 水溶液(pH

生した後、圧縮強度および相対密度、XRD パターンを測

7.3)中で市販 β-TCP-100 粉体を上記と同様な方法で粉砕し定した。また、XRD パターンのピーク強度から HAp 転化た。粉砕後、得られたスラリーを吸引ろ過、凍結乾燥し、率を算出した。さらに、圧縮強度試験後のセメント破断面

表面修飾 β-TCP 粉体を得た。

を走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて観察した。

調製粉体の XRD パターンを測定した結果、IP6 中で粉図 11 に β-TCP セメントの圧縮強度を示す。圧縮強度は砕したすべての調製粉体は、β-TCP 単一相であったが、純固液比の減少とともに低下した。また、相対密度について

水中で粉砕した粉体は一部 HAp 相が含まれていることがも同様な傾向が確認された。最も高い圧縮強度のセメント確認できた。また、1,000-10,000 ppm IP6 中で粉砕した粉(13.4±0.8 MPa)は、β-TCP-3h(3000) (P/L=1/0.7 [g/cm3])粉体

体では、SSA はほとんど変化しなかったが、純水中で粉砕から得られ、その相対密度についても最も高い値

した粉体の SSA は、IP6 中で粉砕した粉体のそれよりも増(53.3±1.5%)であった。XRD パターン測定の結果から、こ加した。純水中で粉砕した粉体表面は微細な HAp 結晶がのセメントの HAp 含有率は 24.9%であった。つまり、粒析出したため、SSA が増加したと考えられる。

子同士が密にパッキングされ、高い相対密度となったこと、
β-TCP から HAp への相転移によって粒子同士のアンカリ

次に、0 および 1000, 3000, 5000, 10000 ppm で表面修飾

12

ング(絡まり)が起こったことで高い圧縮強度が得られたと料の吸収が、セメントとは反対側で骨芽細胞(黒矢印)によ考えられる。

る類骨の形成(白破線矢印)が行われている様子が確認でき

さらに、β-TCP-3h(3000)セメントの破断面の微細構造をる。この結果から、埋入した β-TCP-3h(0)、β-TCP-3h(3000)

SEM を用いて観察したところ、密に充填された粒子間に両セメントは、生体内で骨リモデリングサイクルの状態に矢印で示したように未反応の大きな β-TCP 塊(図 12a)およ

あるといえる。さらに、図 14d では、血管や神経が通るハび析出した針状 HAp 粒子 (図 12b)の存在が確認できた。

ーバース管(*)が形成されつつあることが確認できる。この

この結果は、粉砕によって β-TCP 粒子表面に形成した非ことからも 4 週間という短い埋入期間でありながらも形晶質に近い微細粒子のみが加水分解され、図 12b に示した成された新生骨は良好に成熟していることがわかる。以上

ような針状 HAp に転化することでセメント硬化に寄与し、の結果から、β-TCP-3h(0)および β-TCP-3h(3000)セメントは十分に粉砕されずに残った大きな β-TCP 塊はセメント硬良好な生体適合性を有するといえる。

化に寄与しなかったことを意味している。
続いて、酢酸−酢酸ナトリウムバッファー(pH 5.5)中での3
Amount of Ca2+ ions released / mg・・cm-2

β-TCP-3h(0) お よ び β-TCP-3h(3000) セ メ ン ト (P/L=1/0.7[g/cm3])の溶解性をカルシウムイオン電極を用いて調べた(図 13)。溶解性の比較として、純水を混練液として作製した HAp セ メ ン ト (P/L=1/0.3) も 同 様 に 測 定 し た 。
β-TCP-3h(3000)セメントは β-TCP-3h(0)セメントよりも高い溶解性を示し、HAp セメントと比較した場合、3 倍以上の溶解性を示した。
In vivo での改善法 β-TCP セメントの生体適合性を評価
す る た め に 、 β-TCP-3h(0) (P/L=1/1.0 [g/cm ]) お よ び
3β-TCP-3h (3000) (P/L=1/1.1 [g/cm3])セメントをブタ脛骨骨端部に 4 週間埋入し、組織学的観察を行った。
図 14 にトルイジンブルー染色した凍結薄切切片像を示!-TCP-3h(3000)(P/L=1/0.7)

2!-TCP-3h(0)(P/L=1/0.7)
1

IP6-HAp(P/L=1/0.3)
00す。図 14a および c から、β-TCP-3h(0)、β-TCP-3h(3000)両
セメント(C)ともに周囲の骨および新生骨と直接結合して

30

60

90
120
Time / min

150

180

図 13 酢酸バッファーにおける β-TCP セメントの溶解性いる様子が確認できる。また、その拡大像(図 14b およびd)から、セメントの表面上では破骨細胞(白矢印)による材

(b)


(a)


C

C


M

50 µm
500 µm


(c)


(d)

M


*
C


C

500 µm

100 µm

図 14 β-TCP セメントの組織学的観察(TB 染色)(a, b) β-TCP-3h(0), (c, d) β-TCP-3h(3000)セメント。(b)および(d)はそれぞれ(a)および(c)中の拡大像。セメント(C)は周囲の骨および新生骨と直接結合している(a, c)。また、骨芽細胞(黒矢印)による類骨(白破線矢印)の形成および破骨細胞(白矢印)による材料吸収が確認できる。(d)では、血管の通り道であるハーバース管(＊)が形成されつつある。

13

２．１．４ 非崩壊性キレート硬化型 β-リン酸三カルシウ
ムセメントの高強度化とその材料特性評価

セメント試料片(B)の HAp 転化率を示す。図 15A では、混練液に純水(0-0-0)を用いて作製したセメント試料片の圧

2.1.3 項では、改善法を β-TCP セメント原料粉体の調製

縮強度は 9.1±1.4 MPa であった。また、混練液にリン酸水に適用することで、非崩壊型 β-TCP セメントの作製に成素二ナトリウム(0-2.5-0)を用いた場合、セメント試料片の功した。また、そのセメントが in vitro において高い溶解

圧縮強度は 9.4±1.5 MPa であった。混練液にリン酸水素二性を示すこと、in vivo において優れた生体適合性と破骨細ナトリウムを添加することにより、PO43-イオンが供給され、胞による吸収を受けることを示した。

β-TCP の HAp への転化を促進し、圧縮強度が高くなったと考えられる。また、混練液にアルギン酸ナトリウム

本項では、このセメントを臨床応用可能な材料特性へと向上させるために、セメント作製に用いる混練液の改良を(0-0-1.0)を添加して作製したセメント試料片の圧縮強度は行った。混練液には、クエン酸(和光純薬工業株式会社)、

11.0±3.4 MPa であり、純水(0-0-0)を用いて作製したセメン

リン酸水素二ナトリウム(和光純薬工業株式会社)、アルギ

ト試料片と比較してわずかに向上した。このことから、混ン酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社)の三種類の溶質を練液にアルギン酸ナトリウムを用いるだけでも圧縮強度

純水中に溶解し用いた。クエン酸は β-TCP の Ca イオンに影響を及ぼすことが示唆された。また、混練液にリン酸2+と結合し、粒子を負に帯電させ、粒子間の反発によっての水素二ナトリウムおよびアルギン酸ナトリウム(0-2.5-1.0)

分散性を向上させること[10]が期待できる。リン酸水素二を用いた場合のセメント試料片の圧縮強度は、純水(0-0-0)、ナトリウムは既報[9]で報告したように、β-TCP の HAp へ

リン酸水素二ナトリウム(0-2.5-0)、またはアルギン酸ナトの転移を促進させることで、圧縮強度の向上、硬化時間のリウム(0-0-1.0)を用いた場合と比較して向上した。このこ短縮に寄与する。アルギン酸ナトリウムは β-TCP 中の Ca2+とは、リン酸水素二ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、イオンと結合しゲル化することで、崩壊性の抑制に期待でいずれの混練液もセメントの強度向上に影響しているこ

きる[11]。混練液は三種類の溶質を溶解した後、水酸化ナとを示している。また、混練液にクエン酸、リン酸水素二トリウム水溶液を加えて pH 7.0 に調整した。混練液の略

ナトリウム、アルギン酸ナトリウムの三種類(1.0-2.5-1.0,

称は｢クエン酸濃度-リン酸水素二ナトリウム濃度-アルギ

1.5-2.5-1.0, 2.5-2.5-1.0, 3.0-2.5- 1.0)を用いた場合、セメント

ン酸ナトリウム濃度｣とする。例えば、1.5 mass%クエン酸、

試料片の圧縮強度は、それぞれ 21.7±1.8, 20.5±3.1, 21.8±2.0,

2.5 mass%リン酸水素二ナトリウム、1.0 mass%アルギン酸

30.7±8.1 MPa であり、純水(0-0-0)を用いた場合と比較して、ナトリウムの場合には｢1.5-2.5-1.0｣となる。表 3 に使用した混練液の組成を示す。
セメントペーストは、β-TCP-3h(3000)粉体に固液比(P/L)
が 1/0.9 [g/cm3]となるように上記の混練液を加え、混練す
ることで調製し、徒手でテフロン割型に充填し、セメント
試料片(φ6 mm, h12 mm)を作製した。その後、インキュベータ(37°C, 相対湿度 100%)中で 24 時間養生した。また、
生体環境下でのセメントの硬化を模倣するため、テフロン
割型の上下をクランプを用いて挟みこみ、水中に浸漬し、インキュベータ(37°C, 相対湿度 100%)で 72 時間養生した。

Compressive strength / MPa(A)


所定時間養生後、セメント試料片の圧縮強度および XRD

45
Incubator for 24 h

40

Water for 72 h

35
30
25
20
15
10
5

0

0

51.

3.
0-

2.

0

51.

2.
5-

2.

0

51.
2.

1.
5-

0

51.

51.

2.

1.
0-

1.
0
0-

02.

0-

00

2.
0-

0-

図 15 にインキュベータで 24 時間養生後および水中で50

0パターンを測定した。
72 時間養生後のセメント試料片の圧縮強度(A)および相対

Incubator for 24 h

55
50

クエン酸
ナトリウム
(mass%)

リン酸水素二ナトリウム(mass%)

アルギン酸
ナトリウム
(mass%)

0-0-0

0

0

0

0-2.5-00

2.5

00-0-1.0

0

0

1.0

35

0-2.5-1.0

0

2.5

1.0

30

1.0-2.5-1.0

1.0

2.5

1.0

1.5-2.5-1.0

1.5

2.5

1.0

2.5-2.5-1.0

2.5

2.5

1.0

3.0-2.5-1.0

3.0

2.5

1.0

45

01.
0
02.
51.
1.
0
02.
51.
1.
0
52.
51.
2.
0
52.
51.
3.
0
02.
51.
0

0-

0-

0

40

0

表 3 使用した混練液の組成

Water for 72 h

5-

Relative density / %600-

養生後のセメント試料片(A)および水中で 72 時間養生後の

65

2.

(B)


0-

密度(B)を示す。また、図 16 にインキュベータで 24 時間

図 15 セメントの圧縮強度(A)および相対密度(B)14圧縮強度は約 2~3 倍に向上した。クエン酸を添加すること

トいずれの場合も、クエン酸濃度が増加するにつれて、により、β-TCP 中の Ca2+イオンとクエン酸の COO-イオン

HAp 含有率が低下する傾向にあった。クエン酸濃度が増が結合することでセメント粒子の分散性が向上し、その結加するにつれて、β-TCP 中の Ca2+イオンと結合する COO-

果、セメント粒子が密に充填され、圧縮強度が向上したとイオンが増加し、β-TCP から HAp への転移が抑制された考えられる。

と考えられる。

一方で、水中で 3 日間養生後のセメント試料片の圧縮強セ メ ン ト ペ ー ス ト の 非 崩 壊 性 を 検 討 し た ( 図 17) 。

度(図 15B)は、全てのサンプルにおいて、インキュベータ

2.5-2.5-1.0 および 3.0-2.5-1.0 を混練液として用いたセメン中で 24 時間養生後のセメント試料片と比較して低下した。

トのみ水中で崩壊した。高いクエン酸濃度を用いた場合、最も高い圧縮強度は、混練液に 1.5-2.5-1.0 を用いた場合にβ-TCP 中の Ca2+イオンと結合する COO-イオンが増加し、得られ、その圧縮強度は 7.4±2.0 MPa であった。2.5 およ

β-TCP から HAp への転移が抑制されたため、水中で崩壊

び 3.0 mass%のクエン酸濃度で圧縮強度が低くなった原因したと考えられる。

は、過剰のクエン酸を添加したため、分散性は向上したもセメントペーストのハンドリング性を評価するために、の β-TCP の HAp への転移を阻害したためであると考えら

稠度を測定した(図 18)。混練液に 0-0-0 を用いて調製したペーストの稠度は 1.2±0.3 であった。混練液に 0-2.5-0,れる。
ついで、インキュベータ中で 24 時間養生後のセメント

0-2.5-1.0 を用いて調製したセメントペーストの稠度は約

試料片および水中で 72 時間間養生後のセメント試料片の1.0 であり、0-0-0 を用いて調製した場合と比較して、ほと圧縮強度試験後の XRD パターンを測定し、HAp 含有量をんど変化はなかった。一方で、混練液に 0-0-1.0 を用いてそれぞれ求めた(図 16)。作製したセメント試料片は、混練調製されたペーストの稠度は約 1.5 であった。これは、混液および養生条件に関わらず全て β-TCP と HAp の混合相

練液にアルギン酸ナトリウムを用いることでペーストがであることが分かった。水中で 72 時間養生後のセメント

ゲル化し稠度が増加したと考えられる。また、混練液のク

試料片の HAp 含有量は、24 時間養生後のセメント試料片

エン酸濃度が 1.5, 2.5, 3.0 mass%のとき、稠度は約 2.5, 4.0,のそれよりも増加したが、養生時間の違いもこの要因とし3.7 に増加した。クエン酸の COO-イオンが β-TCP 中の Ca2+て考えられる。また、混練液として 0-2.5-0 を用いた場合、イオンと結合することで、負に帯電した β-TCP 粒子同士

インキュベータ中および水中で養生後のセメントは、いずが反発し、液状化のような減少を起こしたため、ペースト

れも最も高い HAp 含有量であった。リン酸水素二ナトリの稠度が増加したと考えられる。

ウムを単独で用いた場合、供給された PO43-イオンが β-TCP

セメントペーストの硬化時間を図 19 に示す。最も硬化から HAp への転移を最も促進したと考えられる。

時間が長かったのは混練液に 0-0-0 を用いた場合であり、一方で、インキュベータ中および水中で養生したセメン

硬化時間は 31.8±1.3 min であった。一方で、混練液に 0-2.5-0

5

70

35

Incubator for 24 h

30

Water for 72 h

Consistency

40
30

Setting time / min


4

50

3

2

20

25
20
15
10

1

10

5
0

混練液

図 18 セメントペーストの稠度

51.
1.
0
52.
51.
2.
0
52.
51
.0
3.
02.
51.
0

1.
02.

1.
0

-1
.0

0-

.5

0-

02

00-

02

.5

0

-0

0

0

51.

02.
3.

0
52.

51.

0

51.

52.

2.

0

51.
1.

02.

1.

0

51.

02.

0

01.

0
0-

2.
5-

0-

0-

02
3.

図 16 セメントの HAp 含有量

0
0-

.0

.0

52

.5

-1

.0

-1

-1
52

2.

.5

-1
1.

.5
02

1.

.5

0

.0

0

1.
52.

0-

0

1.
00-

5-

00-

2.

0

0
0-

HAp content / %60

図 19 セメンペーストの硬化時間

0-0-0

0-2.5-0

0-0-1.0

0-2.5-1.0

1.0-2.5-1.0 1.5-2.5-1.0 2.5-2.5-1.0 3.0-2.5-1.0

崩壊性

非崩壊

非崩壊

非崩壊

非崩壊

非崩壊

非崩壊

少し崩壊

崩壊

崩壊率

0.1%

0.3%

0.1%

0.3%

2.0%

2.6%

4.8%

73.9%

外観

図 17 非崩壊性試験後のセメントの外観

15を用いた場合、硬化時間は 10.3±0.4 min に短縮した。これと HAp の混合相であることが明らかとなった。この HAp

は、PO4 イオンの供給が β-TCP の HAp への転移を促進し相の生成は、水和反応と機械粉砕によるメカノケミカル反たためだと考えられる。混練液に 0-0-1.0 を用いて作製し応によるものと考えられる。また、SEM 観察と粒度分布たセメントの硬化時間は 27.0±0.7 min であり、0-0-0 と比測定の結果から、α-TCP 粒子が微粒化していることも確認

較してほぼ同等の硬化時間であった。このことは、アルギ

している。

3-

ン酸ナトリウムが硬化に影響を及ぼさないことを示して調製した α-TCP 単一相からなる IP6-α-TCP120 粉体に固いる。また、クエン酸濃度が増加するにつれて硬化時間も液比が 1/0.40 [g/cm3]となるように混練液(純水)を加え、混増加した。これは、クエン酸の COO-イオンが Ca2+イオン

練・成形してセメント(φ4.2 mm, h7~8 mm)を作製し、室温と結合し、β-TCP の HAp への転移を抑制したためであると考えられる。
IP6-"-TCP270


２．２ キレート硬化型 α-リン酸三カルシウムセメントの創製
２．２．１ キレート硬化型 α-リン酸三カルシウムプロトタ
イプセメントの試作とその材料特性評価"-TCP270


X-ray intensity (a.u.)

IP6-"-TCP180


セメント原料粉体は、市販 α-TCP (α-TCP-A)粉体を遊星
ボールミルにより湿式粉砕して調製した。まず、ZrO2 製ポッドとφ10 mm ZrO2 ボール 50 個を使用し、30, 60, 120, 180,
270 min 粉砕した。粉砕した粉体を吸引ろ過後、1000 ppm"-TCP180

IP6-"-TCP120
"-TCP120
IP6-"-TCP60
"-TCP60
に調製した IP6 溶液中で 24 h 表面修飾後、吸引ろ過、凍結

IP6-"-TCP0

乾燥し、表面修飾 α-TCP 粉体を得た[12]。粉体の略称は、"-TCP0

例えば 120 min 粉砕した粉体を「α-TCP120」、さらに IP6による表面修飾を行った粉体を「IP6-α-TCP120」とする。

25

図 20 に調製した α-TCP 粉体の XRD パターンを示す。

30●: α-TCP, △: HApを維持していたが、粉砕時間が 180 min 以上の場合、α-TCP
(d)


(g)


**
*
*
*
C

**

C

N

C

(b)


40

図 20 α-TCP 調製粉体の XRD パターン

α-TCP については、粉砕時間 120 min までは α-TCP 単一相

(a)


35
2! / ° CuK"


(e)


(h)

C

N


C


**

*
*

C

(c)


(f)


C


*
*

(i)


*

C


C


*

*
* *
* *

N

1 mm


200 µmC

100 µm

図 21 ウサギ脛骨に 4, 8 および 24 週間埋入後のセメントの組織学像(a), (d), (g)は 4 週、(b), (e), (h)は 8 週、(c), (f), (i)は 24 週埋入後の組織像を示し、(a)-(f)は HE 染色像、(g)-(i)は TRAP 染色像である。セメント(C)周囲でピンク色の新生骨(N)の形成が認められた。セメントと新生骨の間には、一部で線維性組織の形成が見られたが、矢印(→)で示すように骨芽細胞による旺盛な骨形成が確認できる。一方で、(g)-(i)では、いずれの埋入期間においても TRAP 陽性の破骨細胞(*)による材料の吸収も確認された。

16

で 24 h 養生した。得られたセメントの生体適合性・生体

球状に成形し、純水に浸漬させ、非崩壊性試験を行った。

吸収性を評価するため、ウサギ脛骨にφ4.4 mm の骨欠損を各種カルボン酸を用いたセメントの非崩壊性試験結果お作製し、作製したセメントを 4, 8 および 24 週間埋入した。

よび各種カルボン酸の構造式を図 22 に示す。グリコール

その後、脱灰標本を作製し、酒石酸耐性酸性ホスファター

酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸溶液の pH はそれぞれゼ(TRAP)染色を、非脱灰研磨標本を作製し、ヘマトキシ

pH1.9, 1.6, 1.7, 7.6 であった。クエン酸およびリンゴ酸を用

リン・エオジン(HE)染色をそれぞれ行い、その組織学的観

いた場合には崩壊は見られず、セメントも硬化していた。

察・評価を行った。HE 染色は細胞核・骨組織などが赤くグリコール酸を用いた場合には低い pH であるのにも関わ染色される。TRAP 染色は、材料や骨の吸収を行う TRAP

らず硬化しなかった(2 mol·dm-3 溶液でも同様)。グリコー陽性の破骨細胞が赤く染色される。

ル酸とクエン酸またはリンゴ酸を比較すると、カルボキシ

図 21 に IP6-α-TCP120 セメントの埋入 4 週(a, d, g)、埋入ル基の数に違いがあるため、これが硬化に関わっていると

8 週(b, e, h)および 24 週(c, f, i)後の組織学像を示す。(a)-(f)考えられる[13]。コハク酸を用いた場合には pH がほぼ中は HE 染色像、(g)-(i)は TRAP 染色像である。セメント(C)性であるため硬化しなかったと考えられる。

周囲でピンク色の新生骨(N)の形成が認められ、埋入期間(ii) カルボン酸塩を用いたセメントの作製とその評価の増加とともにその新生骨が成熟している様子が見られ水酸化ナトリウム溶液を用いて pH7.0 に調整した 0, 0.3,

た(d-f)。また、セメントと新生骨の間には一部で線維性組

mol·dm-3 クエン酸塩(Citrate)溶液を調製し織の形成が見られたが、矢印(→)で示すように骨芽細胞に0.5 および 0.7

よる旺盛な骨形成が確認できる。一方で、(g)-(i)では、いた。また、この溶液を溶媒として、1 mass%アルギン酸ナ

ずれの埋入期間においても TRAP 陽性の破骨細胞(*)によト リ ウ ム を 添 加 し た 溶 液 (Alg-Citrate) を 調 製 し た 。

るセメントの吸収も確認されたことから、24 週においてIP6-α-TCP120 粉体に調製した各混練液を固液比 1/0.60 にもセメントが吸収され続けていることが明らかとなった。

なるように加え、混練することでセメントペーストを調製

これらの結果から、IP6-α-TCP120 セメントは、生体適合性、した。その後、非崩壊性試験および稠度測定を行った。ま

生体吸収性に優れたセメントであるといえる。

た、テフロン割型にセメントペーストを成形後、24 h 室温で養生し、圧縮強度および XRD パターンを測定した。

２．２．２ 非崩壊性キレート硬化型 α-リン酸三カルシウ
ムセメントの試作とその材料特性評価

強度(A)および相対密度(B)をそれぞれ示す。いずれのセメ

本項では、非崩壊性セメントを作製することを目的としントにおいてもクエン酸塩または、アルギン酸を添加したて、2.2.1 項で調製した IP6-α-TCP120 粉体からセメントをクエン酸塩を用いることで、圧縮強度は向上したが、アル

図 23 に、クエン酸塩を用いて作製したセメントの圧縮作製し、その材料特性を評価した。まず、混練液として用の後、クエン酸塩を混練液として用いてセメントを作製し、評価した。
(i) セメント硬化に及ぼすカルボン酸種の影響
セメント硬化に有効なカルボン酸の種類を調べるため、代表的なカルボン酸であるグリコール酸、クエン酸、リン
ゴ酸、コハク酸を用いて、1 mol·dm-3 溶液を調製した。グ
リコール酸のみ 2 mol·dm-3 溶液も調製した。IP6-α-TCP120

Compressive strength / MPa

(A)
 16

いるセメント硬化に有効なカルボン酸の種類を検討し、そ14
12

IP6-!-TCP_Citrate!-TCP_Citrate
IP6-!-TCP_Alg-Citrate!-TCP_Alg-Citrate

10
8
6
4
2
0

粉体に、適切な固液比になるように混練液を加え混練後、

0
0.3
0.5
0.7
Citrate concentration / mol・・dm-3

Relative density / %

(B)
 60
IP6-!-TCP_Citrate!-TCP_Citrate
IP6-!-TCP_Alg-Citrate!-TCP_Alg-Citrate

50

40

30

図 22 セメントの非崩壊性試験後のセメントの外観

0
0.3
0.5
0.7
Citrate concentration / mol・・dm-3

および混練液の構造式

図 23 セメントの圧縮強度(A)および相対密度(B)(a) グリコール酸, (b) クエン酸, (c) リンゴ酸, (d) コハク酸

17

ギン酸を添加したクエン酸塩を用いた方が、クエン酸塩よで、稠度が増加することが明らかとなった(図 26)。これは、りも圧縮強度向上に効果的であった。圧縮強度は、α-TCP

α-TCP 粉体表面の Ca2+とカルボキシル基が結合し、負に帯セメント > IP6-α-TCP セメントであった。また、いずれの電した α-TCP 粒子の反発で粒子の分散性が向上したため混練液を用いた場合でも、カルボン酸が含まれる溶液では、だと考えられる。クエン酸塩にアルギン酸を添加した場合純水と比較して、10%程度の相対密度の増加がみられた。

には、変化は見られなかった。

これは、α-TCP 粉体表面の Ca2+とカルボキシル基の相互作

最後に、in vivo での非崩壊性 IP6-α-TCP120 セメントの用によるものだと考えられる。

生 体 適 合 性 を 評 価 す る た め に 、 IP6-α-TCP120 粉 体 とセメントの XRD パターン測定の結果から、α-TCP セメ

Alg-0.5M Citrate (P/L=1/0.6 [g/cm3])から作製したセメント

ントは水和反応によって高い HAp 含有量となった(図 24)。

をブタ脛骨骨端部に 4 週間埋入し、組織学的観察を行った。

そのため、α-TCP セメントは、IP6-α-TCP セメントよりも

図 27 にトルイジンブルー染色した凍結薄切切片像を示

高い圧縮強度を示したと考えられる。一方で、IP6-α-TCPす。図 27a および b から、セメント(C)は自家骨および新セメントの場合、いずれの混練液を用いても HAp 転化率

生骨と直接結合している様子が確認できた。また、拡大像

は 10%以下であることがわかった。このことから、セメン(図 27c)から、セメントの周囲では一列に並んだ骨芽細胞

トは IP6 のキレート結合およびカルボキシル基の相互作用(矢印)による新生骨の形成(ピンク色部分)が行われ、石灰のみで硬化したと考えられる。

化前線の存在が認められた。この結果から、IP6-α-TCP120
セメントは良好な生体適合性を有するといえる。

次に、非崩壊性試験後のセメントの外観を図 25 に示す。
いずれのクエン酸濃度のセメントペーストにおいてもセ３． 考察及び今後の展望

メントの崩壊は認められなかった。カルボン酸塩を混練液として用いると、水中でも硬化することが明らかとなった。

生体内で安定な現行のアパタイトセメントや PMMA セ

このことから、血液介在時でも硬化することが期待されるメントは、患者の骨代謝や骨格変化に対応できず、アパタ

セメントの稠度を測定した結果、クエン酸を添加すること

イトセメントや PMMA に代わる「生体内吸収性ペースト

60

HAp contents / %

50

IP6-!-TCP_Citrate!-TCP_Citrate
IP6-!-TCP_Alg-Citrate!-TCP_Alg-Citrate

Citrate concentration [mol・・dm-3]

0.3


0.5


0.7


40

Citrate


30
20
10

Alg-Citrate


0
0

0.3

0.5

0.7

Citrate concentration / mol・・dm-3

図 24 セメントの HAp 含有量

図 25 非崩壊性試験後のセメントの外観
(a)


(b)


(b)


Water(1/0.60)(c)

Cement

0.5M Citrate(1/0.60)

Alg-water(1/0.60)

100 µm

Cement
石灰化前線(c)

500 µm

Alg-0.5M Citrate(1/0.60)

0

2

4
6
8
Consistency / -


10

骨芽細胞

50 µm


図 27 α-TCP セメントの組織学的観察(TB 染色)

図 26 セメントペーストの稠度(b)および(c)はそれぞれ(a)および(b)中の拡大像。セメント(C)は自家骨および新生骨と直接結合している(a, b)。また、骨芽細胞(矢印)により新生骨が形成され、石灰化前線の存在も確認できる。

18

状人工骨」を開発することは重要な課題であり、医療の現練液の改良を行った。その結果、β-TCP-3h(3000)粉体およ

場からも切望されている。そのため、本研究では、異なる

び 1.5 mass%クエン酸-2.5 mass%リン酸水素二ナトリウム

溶解性を有する β-TCP および α-TCP を原料粉体として用-1.0 mass%アルギン酸を混練液としてセメントを作製した

い、セメントを作製した。

場合に、インキュベータで養生後の強度が 20.5±3.1 MPa、

β-TCP 系セメントについては、まず、2.1.1 項において、水中で養生後の強度が 7.4±2.0 MPa であることがわかった。

キレート硬化型 β-TCP プロトタイプセメントを試作した。

海綿骨の強度は約 5 MPa であり、このセメントは水中で養ウサギを用いた in vivo 評価では、そのセメント周囲で旺

生後も海綿骨と同等の強度を有していることが明らかと盛な新生骨の形成が認められ、セメント表面では、TRAPなった。

陽性の破骨細胞の存在が観察された。これらの結果から、

α-TCP 系セメントについても、まず、2.2.1 項において、

IP6-β-TCP セメントは、生体適合性、生体吸収性に優れた

キレート硬化型 α-TCP プロトタイプセメントを試作した。

セメントであることが明らかとなった。

その結果、120 分間純水中で粉砕し、表面修飾したセメン

2.1.2 項では、IP6-β-TCP セメントの力学強度およびハント原料粉体から作製したセメントは、α-TCP 単一相からな

ドリング性に及ぼすセメント混練液への種々の多糖類添り、in vivo において良好な骨形成と TRAP 陽性の破骨細胞加の影響を検討した。添加剤を含まない純水と比較して、によるセメントの吸収が行われることが明らかとなった。

添加剤を含む混練液を使用することによって、すべてのセ2.2.2 項では、非崩壊性セメントを作製することを目的

メントの力学強度およびハンドリング性が改善された[5]。

として、2.2.1 項で調製した IP6-α-TCP120 粉体およびクエ

特に、Chito GL または Chito W10 を混練液として用いるこン酸塩を混練液としてセメントを作製し、その材料特性をとで、高い力学強度と優れたハンドリング性を有するセメ評価した。その結果、クエン酸塩または、クエン酸塩にアントを作製できることがわかった。

ルギン酸ナトリウムを添加した溶液を混練液として用い

2.1.2 項で作製したセメントは、高い力学強度と優れたることで、IP6 のキレート能およびカルボキシル基の相互ハンドリング性を有していたが、セメントの作製条件によ作用のみを利用して、非崩壊性セメントを作製できることっては、作製したセメントが水中に浸漬した場合に崩壊しが明らかとなった。また、ブタ脛骨にセメントを埋入し、てしまうという問題が見られた。

生体内での生体適合性を組織学的に評価したところ、セメ

そこで、2.1.3 項では、非崩壊性 HAp セメント作製のたント周囲で、骨芽細胞による新生骨の形成が確認された。

めの新規な粉体調製プロセス（改善法）を IP6-β-TCP セメ

このことから、このセメントは良好な生体適合性を有するントの作製のために適用し、セメントの材料特性、とりわ

ことが明らかとなった。

け非崩壊性に及ぼす粉砕時間および IP6 濃度の影響を検討した。その結果、非崩壊性 β-TCP セメントは、3000 ppm IP6【参考文献】

中で 3 h 粉砕した β-TCP 粉体と 2.5 mass%リン酸水素ナト

1. A.R.M. Wittkampf, J. Oral. Maxillofac. Surg., 46,

リウムとを混練することで得られ、その圧縮強度は

1019-1021 (1988).

13.4±0.8 MPa であった。また、このセメントは、in vitro

2. Y. Miyamoto, K. Ishikawa, M. Takechi, T. Toh, T. Yuasa,

および in vivo において生体吸収性および生体適合性に優

M. Nagayama, and K. Suzuki, J. Biomed. Mater. Res. Appl.

れたセメントであることが明らかとなった。

Biomater., 48, 36-42 (1999).

この改善法セメントの硬化メカニズム(図 28)について

3. T. Umeda, K. Itatani, H. Endo, H. Takeuchi, K. Mizutani,

考察すると、粉砕によって形成された溶解性の高い「低結and Y. Musha, J. Euro. Ceram. Soc., 26, 525 (2006).

晶性ナノ β-TCP 粒子」が、リン酸水素二ナトリウムと反4. D. Apelt, F. Theiss, A.O. El-Warrak, K. Zlinszky, R.

応し、HAp へ転化することでセメントの硬化を促進した

Bettschart-Wolfisberger, M. Bohner, S. Matter, J.A. Auer,と考えられる。実際に、セメントの破断面の SEM 観察か

and B. Von Rechenberg, Biomaterials, 25, 1439 (2004).

ら、十分に粉砕されずセメントの硬化に寄与しなかった

5. K. Nishiyama, S. Takahashi, M. Mizumoto, K. Oribe, M.

「未反応の β-TCP」および析出した「針状 HAp 粒子」のMatsumoto, H. Morisue, Y. Toyama, and M. Aizawa,
Bioceramics, 22, 871-874 (2009).

存在も確認している(図 12)。

6. T. Konishi, S. Takahashi, M. Mizumoto, M. Honda, K.
Oribe, and M. Aizawa, Phosphorus Res. Bull., 26, 59-64(2012).
7. T. Konishi, Z. Zhuang, M. Mizumoto, M. Honda, and M.
Aizawa, J. Ceram. Soc. Jpn., 120, 159-165 (2012).
8. T. Konishi, Y. Horiguchi, M. Mizumoto, M. Honda, K.
Oribe, H. Morisue, K. Ishii, Y. Toyama, M. Matsumoto,and M. Aizawa, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24, 611-621

図 28 改善法 β-TCP セメントの硬化メカニズム(2013).

さらに、2.1.4 項では、このセメントを臨床応用可能な

9. T. Konishi, S. Takahashi, Z. Zhuang, K. Nagata, M.

材料特性へと向上させるために、セメント作製に用いる混Mizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H.

19

Nagashima, and M. Aizawa, J. Mater. Sci: Mater. Med., 24,1383-1394 (2013).
10. S. Sarda, E. Fernández, M. Nilsson, M. Balcells, and J.A.
Planell, J. Biomed. Mater. Res., 61, 653-659 (2002).
11. Y. Miyamoto, K. Ishikawa, M. Yuasa, M. Takechi, M.
Nagayama, M. Kon, and K. Asaoka, Biomaterials, 17,1429-1435 (1996).
12. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Horiguchi, K.
Oribe, H. Morisue, K. Ishii, Y. Toyama, M. Matsumoto, M.
Aizawa, J. Nanomater., 2013, 1-11 (2013).
13. J.E. Barralet, M. Tremayne, K.J. Lilley, and U. Gbureck,
Chem. Mater., 17, 1313-1319 (2005).

20

種々のリン酸カルシウムセメントの in vitro および in vivo における吸収性の比較とその連関性の解明
小西敏功、眞鍋弘毅、石井 賢、松本守雄、相澤 守

１． はじめに

２． 実験と結果

我々は、これまでに生体内安定性のキレート硬化型ハイレート硬化型 β-リン酸三カルシウム(β-TCP)[2]、α-TCP セ

２．１ 種々のキレート硬化型リン酸カルシウムセメントの作製とそのキャラクタリゼーション

メント[3]をそれぞれ開発してきた。これらのリン酸カル(i) 湿 式 合 成 HAp 粉 体 の 調 製 と セ メ ン ト の 作 製

ドロキシアパタイト(HAp)セメント[1]、生体内吸収性のキ

湿式合成 HAp 粉体(wHAp)は、既報に従って合成した[1]。

シウムセメントの生体吸収性・生体適合性を評価すること

wHAp 粉体を ZrO2 ポットとφ10 mm ZrO2 ボール 50 個を使は、医療器具を開発する上で必須である。しかしながら、生体材料の吸収性・生体適合性の評価は、動物実験による用し、5 min 粉砕した(IP6(-)-wHAp)。ついで、1000 ppm IP6

検証に限られているため動物愛護や動物福祉といった問

溶液中で 5 h 表面修飾後、吸引ろ過、凍結乾燥し、表面修

題が常につきまとう。動物実験に反対する運動の思想的背飾 wHAp 粉体(IP6(+)-wHAp)を得た。セメントは固液比

景をみると、動物は可愛がる存在である「動物愛護」、動

1/0.35 [g/cm3]で純水と混練し、φ5 mm 成形器を用いて 100

物の立場に立って動物に接する「動物福祉」という思想か

MPa で成形し、作製した。

ら、動物には他の生物に侵されずに「生きる権利」がある(ii) 市 販 HAp 粉 体 か ら の セ メ ン ト の 作 製という「動物権」、動物種による差別「Speciesism」というHAp-100 粉体(太平化学製)を遊星ボールミルにより湿式

考え方にまで広がっている。さらに、「動物の開放」とい粉砕して調製した。まず、ZrO2 ポットとφ10 mm ZrO2 ボー

う思想のもと、すべての動物を人の手から開放せよという

ル 50 個を使用し、5 min 粉砕した(IP6(-)-cHAp)。得られた手段を選ばず動物を開放する過激な活動にまで発展してスラリーをそれぞれ吸引ろ過、凍結乾燥し、粉砕粉体を得おり、動物実験に反対する動きが拡大しているのが現状でた。ついで、1000 ppm IP6 溶液中で 24 h 表面修飾後、吸ある。

引ろ過、凍結乾燥し、表面修飾 cHAp 粉体(IP6(+)-cHAp)を得た。セメントは固液比 1/0.30 [g/cm3]で純水と混練し、また、動物実験ではその結果を得るのに数週間から数カ月といった時間を要してしまうという問題もあり、動物実

φ5 mm 成形器を用いて 100 MPa で成形し、作製した。

験を行わずに短期間で生体内での材料の吸収性を評価が(iii) β-TCP 粉 体 か ら の セ メ ン ト の 作 製できるような手法を確立することは急務な課題である。

β-TCP-100 粉体(太平化学製)を遊星ボールミルにより湿バイオセラミックス分野において in vivo 実験を in vitro

式粉砕して調製した。まず、ZrO2 ポットとφ10 mm ZrO2 ボで代替し、減らそうとする動きとして、バイオセラミックール 50 個を使用し、4 h 粉砕した(IP6(-)-β-TCP)。得られた

スの溶解性に関する規格、JIS T 0330-3:2012「生体活性バ

スラリーをそれぞれ吸引ろ過、凍結乾燥し、粉砕粉体を得

イオセラミックス‐第 3 部：溶解速度試験方法」が制定さた。ついで、3000 ppm IP6 溶液中で 24 h 表面修飾後、吸れた。これは、緻密質、多孔質または顆粒状のリン酸カル

引ろ過、凍結乾燥し、表面修飾 β-TCP 粉体(IP6(+)-β-TCP)

シウム系セラミックスを対象にした溶解速度試験に関すを得た。セメントは固液比 1/0.20 [g/cm3]で純水と混練し、る規格であり、リン酸カルシウム系セラミックスの 30 分

φ5 mm 成形器を用いて 100 MPa で成形し、作製した。

後の初期溶解速度の相対値が、動物実験での 4 週埋入後の(iv) α-TCP 粉 体 か ら の セ メ ン ト の 作 製
α-TCP-A 粉体(太平化学製)を遊星ボールミルにより湿式

相対吸収量と一致しているという実験結果を基に作成さ粉砕して調製した。まず、ZrO2 ポットとφ10 mm ZrO2 ボー

れている[4]。
そこで本研究では、種々のリン酸カルシウム相からなる

ル 50 個を使用し、2 h 粉砕した(IP6(-)-α-TCP)。ついで、1000

キレート硬化型セメントのような異種材料間でも、動物実

ppm IP6 溶液中で 24 h 表面修飾後、吸引ろ過、凍結乾燥し、験を行わずに短期間で生体内での材料の吸収性を評価が

表面修飾 α-TCP 粉体(IP6(+)-α-TCP)を得た。セメントは固できるような手法を確立するため、JIS T0330-3:2012 に準液比 1/0.40 [g/cm3]で純水と混練し、φ5 mm 成形器を用いてじてカルシウムイオン電極を用いた in vitro での生体吸収

100 MPa で成形し、作製した。

性評価を行った。また、実際にウサギを用いて in vivo で作製したセメントの XRD パターンを図 1 に示す。

の生体吸収性を評価した。さらに、in vitro および in vivo

IP6(−)-α-TCP を除くすべてのセメントは、セメント原料粉における吸収性の連関性の解明を試みた。

体の結晶相を維持したまま硬化していることが確認され21た。一方、IP6 で表面修飾していない IP6(−)-α-TCP セメン

16

(a)

トは水和反応によって一部 HAp に転移していた。

IP6(!)-"-TCP

14

Ca2+ ion / mg・・g-1

IP6($)-wHAp


X-ray intensity (a.u)

IP6($)-HAp
IP6($)-#-TCP
IP6($)-"-TCP

IP6(!)-HAp

6
4

30

60 90 120 150 180
Time / min

16

(b)

IP6-!-TCP

14
25 30 35
2! / ° CuK"

40

45

Ca2+ ion / mg··g-1

20

8

0

IP6(+)-"-TCP

15

10

0

IP6(+)-HAp


10

IP6(!)wHAp

2

IP6(+)-wHAp


IP6(+)-#-TCP

5

IP6(!)-#-TCP

1250

図 1 作製したセメントの XRD パターン○: HAp, △: β-TCP, □: α-TCP	 ２．２ セメントの in vitro 溶解性

12
10
8

IP6-"-TCP

6

IP6-wHAp

4
IP6-HAp

2.1 節で作製したセメントの in vitro での溶解性をカルシ
ウムイオン電極（8203-10C, 堀場製作所）を用いて測定し2た。測定は 0.08 mol･dm-3 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液003(pH5.50±0.02) 200 cm 中にネットを用いてセメントを浸漬し、撹拌速度 430±15 rpm で撹拌しながら、180 分間経時的30

60 90 120 150 180
Time / min2+

図 2 セメントからの Ca イオン溶出量(a) IP6(-)セメント, (b) IP6(+)セメントにカルシウム溶出量を測定した。
図 2 にセメント試料片からの Ca2+イオン溶出量を示す。
IP6 の表面修飾の有無に関わらず、Ca2+ イオン溶出量はIP6($)-wHAp


α-TCP > β-TCP > wHAp > HAp の順であった。図 2(a)ではIP6(−)-wHAp および IP6(−)-HAp セメントの溶解性が高く

IP6($)-HApなった。IP6(−)-α-TCP, IP6(−)-β-TCP, IP6(−)-wHAp およびX-ray intensity (a.u)

IP6(−)-HAp セメントの相対密度は、それぞれ 58.5±0.7%,57.4±3.7%, 44.5±2.7%, 50.2±2.7%であった。HAp 系セメントの相対密度は TCP 系セメントのそれよりも低いことから、相対気孔率は HAp 系セメントの方が高いといえる。
そのため、HAp 系セメントの溶解性が高い結果となったと考えられる。また、IP6-β-TCP セメントは、3000 ppm IP6
で表面修飾したため 1000 ppm IP6 で表面修飾した他のセメントと比べて溶解性が低下したと考えられる。さらに、

IP6($)-#-TCP
IP6($)-"-TCP
IP6(+)-wHAp

IP6(+)-HAp

IP6(+)-#-TCP

急激に溶解して飽和に向かう粉体の溶解性とは異なり、セメント試験片ではその表面から少しずつ溶解が進んだた

IP6(+)-"-TCP

め 180 分間継続して一次関数的な溶解曲線になったと考
えられる。

5

図 3 には溶解性試験後のセメントの XRD パターンを示

10

15

20

25 30 35
2! / ° CuK"

40

45

50

図 3 溶解性試験後のセメントの XRD パターン○: HAp, △: β-TCP, □: α-TCP	 す。IP6(−)-α-TCP はわずかに XRD 含有量が増加したが、その他のセメントの結晶相は溶解試験前と比較して変化

測定時間 t [min]の平均溶解速度 Rat [mmol･s-1] =(t 分後の Ca 濃度[mg･dm-3] × 液量[dm3] × 106)

していなかった。
ついで、セメントの溶解性を比較するため、平均溶解速／(3 or 10 × 40.08 [mg･mmol-1] × t [min] × 60 [s･min-1])度を以下の式を用いて算出した。

22

ここで、TCP の場合は 3、HAp の場合は 10 を定数としてさせ、φ4.1 mm のドリルで穿孔することで骨欠損を作製し用いた。40.08 [mg･mmol-1]は Ca のモル質量である。

た。そこに、セメント試料片(直径 4 mm, 高さ 7 mm)を埋上記の式を用いて計算した測定時間 30 min での単位質入、再縫合した。所定期間埋入後、ソムノペンチルの過剰量あたりの平均溶解速度 Ra30/W を図 4 に示す。平均溶解投与によりウサギを犠牲にし、埋入した試料片を含む脛骨

速度 Ra30/W は、α-TCP > β-TCP > wHAp > HAp の順であっを摘出した。組織学的評価のために、摘出した脛骨をビラた。IP6(−)と IP6(+)との間には、β-TCP 系セメントを除い

ヌエバ骨染色し、非脱灰研磨標本を作製した。

て平均溶解速度に有意な差は認められなかった。前述した作製した標本を生物顕微鏡（BX-41, オリンパス）を用

ように、IP6-β-TCP セメントは、3000 ppm IP6 で表面修飾いて観察し、WinRoof（三谷商事）を用いて画像解析によしたため 1000 ppm IP6 で表面修飾した他のセメントと比りセメントの吸収率を算出した。吸収率は以下の式を用い

べて平均溶解速度も低下したと考えられる。そのため、て算出した。

IP6-β-TCP と IP6-wHAp セメントとの間には有意差は認められなかった。

セメントの吸収率 [%]= 100 – (残存セメント面積／埋入自のセメント面積) × 100

Ra30/W / mmol・・s-1・g-1

25

*

*

20

ウサギ脛骨に 4 および 24 週間埋入後のセメントの組織像を図 5 に示す。IP6-α-TCP および IP6-β-TCP セメントでは、いずれの埋入期間においても新生骨がセメントと直接

IP6(-)
IP6(+)

15

結合している部分は少なく、セメントから少し離れたとこ
ろで新生骨の形成が確認された。一方で、IP6-wHAp セメ

10ントおよび Biopex®-R では、セメント周囲で新生骨の形成*が認められ、それらはセメントと直接結合していることが確認された。

5

ついで、図 6 に in vivo でのセメントの吸収率を示す。
0

セメントの吸収率は α-TCP > β-TCP > Biopex®-R > wHAp
IP6!-TCP!-TCP

IP6- wet-HAp
IP6"-TCP
"-TCP

wHAp

IP6HApの順であり、いずれのセメントも 24 週での吸収率は 4 週

HApのそれよりも高かった。Biopex®-R は α-TCP から HAp へ

図 4 単位質量あたりのセメントの平均溶解速度Ra30/W (* P<0.01)の水和反応によって硬化するためカルシウム欠損 HAp が生成する。カルシウム欠損 HAp は HAp よりも熱力学的に不安定なため IP6-wHAp セメントよりも吸収されたと考え

２．３ セメントの in vivo 吸収性られる。

In vivo でのセメント試料片の生体吸収性を調べるため
足脛骨に 4 および 24 週間埋入した。また、対照試料とし２．４ In vitro および in vivo におけるセメントの吸収性の連関性て市販の Biopex®-R (HOYA)も同様に試験した。まず、静In vitro および in vivo におけるセメントの吸収性の連関

脈注射によりソムノペンチル（共立製薬）を投与し、全身性について検討した。リン酸カルシウム系セラミックスの麻酔を行った。ついで、ウサギ後肢の膝内側部を剃毛して30 分後の初期溶解速度の相対値が、動物実験での 4 週埋に、セメント試料片をウサギ（平均体重 3 kg, 16 週齢）両

縦に 3 cm 程度皮膚を切開し、骨膜を剥がして脛骨を露出

IP6-!-TCP

IP6-"-TCP

IP6-wHAp

Biopex®-R

Cement4w


Newly-formedbone

Cement
Newly-formedbone

Cement

Newly-formedbone

24w


Newly-formedbone

CementCement

Newly-formedbone

Newly-formedbone

Newly-formedbone
Newly-formedbone

CementCementCement

図 5 ウサギ脛骨に 4 および 24 週間埋入後のセメントの組織像

23

50 µm

30

Rate of resorption (24w) / % (in vivo)

30

Rate of resorption / %

4w
24w

25
20
15
10
5

y = 0.83 x + 6.06
R! = 0.95
25

IP6-"-TCP

20
15
IP6-#-TCP10
Biopex®-R
IP6-HAp


5
0

0

!-TCP

"-TCP

HAp

0

®

Biopex -R

5
10
15
20
Ra15/W / mmol・・s-1・g-1 (in vitro)


図 6 in vivo でのセメントの吸収率

図 8 Ra15/W と in vivo での埋入 24 週における吸収率の関係

入後の相対吸収量と一致しているという報告[4]を基に、Biopex®-R > wHAp の順であり、いずれのセメントも 24 週

まず、Ra30/W と埋入 4 週での吸収率との関係を検討した

での吸収率は 4 週のそれよりも高かった。
In vitro および in vivo におけるセメントの吸収性の連関（図 7）。しかしながら、両パラメータの間に高い相関関性について検討した結果、カルシウムイオン電極を用いて係は認められなかった。
ついで、種々のタイムポイントでの初期溶解速度と 4 週測定した 15 分後の異種材料間の初期溶解速度 Ra15/W とまたは 24 週の埋入期間での吸収率を比較したところ、

ウサギ脛骨に 24 週埋入後の吸収率との間に高い相関があRa15/W と埋入 24 週での吸収率との間に高い相関関係

ることが明らかとなった。このことから、カルシウムイオ（r=0.95）があることが明らかとなった（図 8）。この結果

ン電極を用いてセメントの初期溶解速度 Ra15/W を求める

は、カルシウムイオン電極を用いて測定した 15 分後の異ことで、動物実験を行わずに短期間で異種材料の生体内吸

種材料間の初期溶解速度が、ウサギ脛骨に 24 週埋入後の収性を予想できることが示唆された。
今後は、β-TCP/HAp および α-TCP/HAp 混合セメントな吸収率と高い相関があることを示している。

どの in vitro および in vivo での吸収性を調べ、図 8 で示し

３． 考察及び今後の展望

た「Ra15/W と in vivo での埋入 24 週における吸収率の関係」

本研究では、種々のリン酸カルシウム相からなるキレーの信憑性について検討する必要がある。

ト硬化型セメントのような異種材料間でも、動物実験を行
わずに短期間で生体内での材料の吸収性を評価ができる【参考文献】

手 法 を 確 立 す る こ と を 目 的 と し た 。 そ の た め に 、 JIS

1. T. Konishi, Y. Horiguchi, M. Mizumoto, M. Honda, K.

T0330-3:2012 に準じてカルシウムイオン電極を用いた in

Oribe, H. Morisue, K. Ishii, Y. Toyama, M. Matsumoto,vitro での生体吸収性およびウサギを用いて in vivo での生

and M. Aizawa, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24, 611-621

体吸収性を評価し、それらの連関性を検討した。

(2013).

In vitro では、測定時間 30 min での単位質量あたりの平均

2. S. Takahashi, T. Konishi, K. Nishiyama, M. Mizumoto, M.

溶解速度 Ra30/W は、α-TCP > β-TCP > wHAp > HAp の順で

Honda, Y. Horiguchi, K. Oribe, and M. Aizawa, J. Ceram.

あった。In vivo でのセメントの吸収率は α-TCP > β-TCP >Soc. Jpn., 119, 35-42 (2011).
3. T. Konishi, M. Mizumoto, M. Honda, Y. Horiguchi, K.

Rate of resorption (4w) / % (in vivo)

25

Oribe, H. Morisue, K. Ishii, Y. Toyama, M. Matsumoto,y = 0.43x + 6.15
R! = 0.84

and M. Aizawa, J. Nanomater., 2013, 1-11 (2013).

20

4. A. Ito, Y. Sogo, A. Yamazaki, M. Aizawa, A. Osaka, S.
Hayakawa, M. Kikuchi, I. Akahane, K. Yamashita, Y.

IP6-"-TCP
15

Tanaka, M. Tadokoro, and H. Ohgushi, Extended abstractsof the 26th International Japan-Korea Seminar on

10

Ceramics, 425-428 (2009).
IP6-#-TCP
Biopex®-R

5

IP6-HAp

0
0

5
10
15
20
Ra30/W / mmol・・s-1・g-1 (in vitro)


図 7 Ra30/W と in vivo での埋入 4 週における吸収率の関係

24

非崩壊性および Non-fragmentation を担保した
革新的骨修復セメントの開発と評価
水本みのり、藤岡 恵、小西敏功、本田みちよ、長嶋比呂志、相澤 守

１． はじめにるかどうか、硬化時における Fragmentation の有無を確認

近年、骨粗鬆症による椎体骨折への低侵襲ペースト状人した。さらに、生活運動による Fragmentation の予備的検

工骨による治療に注目が集まっている。この治療法には椎証として、セメントペーストをブタの脛骨および筋肉内に体形成術が確立しており、椎体に針で穴をあけ、骨セメン

注入し、一定期間埋入後、セメントを X 線マイクロ CT にトを充填することで低侵襲治療、短い手術時間、任意の形より調査しその硬化状態と Fragmentation の有無を確認し状での硬化を実現する。現在、最も臨床応用されている骨たので、これを報告する。

セメントは Polymethylmethacrylate (PMMA)セメントであ２． 実験と結果

りハンドリング性の高さや、優れた初期安定性、高い強度と剛性による壊れにくさなどの利点をもつ。しかしながら、

２．１ セメントペーストの調製および特性評価

その高すぎる強度に伴う術後の隣接椎体の骨折[1]や、硬化反応にともなう発熱および pH 変動による患部周辺の神市販 β-TCP-100 粉体 10 g と 3000 ppm IP6 水溶液(pH 7.3)

経の炎症[2]、モノマーの毒性による術中の患者の血圧低40 cm3 をφ2 mm ZrO2 ボール(180 g)と共に遊星型ボールミ

下[3]、などの問題も抱える。そのため、これらの問題をル内に入れ 3 h 湿式粉砕するとともに、IP6 による表面修

解決した新規な骨セメントが求められている。一方、リン飾処理を同時に行った。粉砕後に得られたスラリーを吸引

酸カルシウム系ペースト状人工骨は、骨と類似した組織、ろ過、凍結乾燥し、表面修飾 β-TCP 粉体「IP6/β-TCP」を優れた組織反応、および骨伝導性から注目を集めており、得た。この粉体に対して、2.5 mass%リン酸水素二ナトリ

緻密体、多孔体、顆粒、セメントと様々な形態をとること

ウム(Na2HPO4)水溶液が固液比(P/L)=1/1.3 [g/cm3]になるよができる。

う調製し、2 min 混合することでセメントペーストを得た。

これらのセメントは PMMA セメントと比較して、炎症

セメントペースト 0.5 mL を、シリンジの先端部をカット

反応が少なく、また自家骨より高い強度をもつために骨セしたシリンジに充填し、水中に静かに押し出した。その後メントとして期待されている[4]。現在、様々なリン酸カ

24 h 静置し、円柱状に押し出されたセメントの崩壊の有無

ルシウムセメントが存在しているが、ペースト硬化時、あにより、セメントが非崩壊能を有しているかを判断した。

るいはセメントへの患者の生活に伴う繰り返しの荷重に

つぎに、セメントペーストをテフロン型(6 mm φ, 12 mm h)

より部分破壊やクラックなどの Fragmentation を生むことにパテ法およびインジェクション成形により充填した。イが臨床上の課題として報告されている[5]。Fragmentation

ンキュベータ(37 °C, 相対湿度 100%)中で 24 時間養生したはセメントの強度を低下させ、壊れたセメントの破片は新後、圧縮強度および相対密度を測定した。さらに、セメン

たな問題を引き起こす可能性があるため、患者に再手術を

トペーストを 1 mL シリンジに充填し、内径の異なる種々もたらす。そのため、Non-fragmentation の性質はペーストの注射針を取り付け、セメントが注射針から押し出せるか状人工骨の評価には非常に重要な要素であると言える。し

を試験した。図 1 に崩壊性試験の結果を示す。水中で 24 h

かしながら、Fragmentation を材料の視点で調査した報告は経過しても崩壊しないことが明らかとなり、用手で確認し少なく、その評価法も確立されていない。

たところセメントは硬化していたため「非崩壊性」が担保

本研究はこの Non-fragmentation を実験的に検証するた

(b)

(a)

めの方法について、文献調査などを実施した。その調査結果をもとに、当プロジェクトのキレート硬化型セメントを
モデル材料として、擬似的な臨床環境での Fragmentationの評価法を確立するとともに、そのプロトコルの作成やNon-fragmentation の性質を検証した。具体的には、イノシ
トールリン酸(C6H18O24P6: IP6)で β-TCP の表面を修飾し、5 min 後IP6 と カ ル シ ウ ム の キ レ ー ト 結 合 に よ り 硬 化 す る

24 h 後IP6-β-TCP セメントをモデル材料とし、このペーストをシ

図 1 崩壊性試験後のセメントの外観

リンジで型に流し込み、水、および血液中で一体化してい(a) 5 min 後, (b) 24 h 後

25された。図 2 に作製したセメントの圧縮強度および相対密向において Fragmentation の有無を観察した。図 5 に溶液度の結果を示す。作製したセメントはパテ法では圧縮強度

中で充填、成形させた各セメントを示す。大部分のペース

14.3 MPa、相対密度 36%、インジェクション法では圧縮強トはテフロン型に充填され、いずれの条件で作製されたセ度 11.8 MPa、相対密度 30.5 %であった(図 2)。骨粗鬆症のメントでも一塊であることが確認された(図 5)。しかしな

ヒト海綿骨は 2-3 MPa の強度であるため、このセメントががら、セメントペーストの一部は溶液内に拡散し、その後十分な強度をもつことが明らかとなった。また、インジェ

沈殿していた。また、テフロン型枠から外したセメントかクション法よりパテ法の方が高い圧縮強度と相対密度を

らは、いずれの溶液を用いた場合でも、セメント表面に部示した。これは成形時の圧力の違いであり、パテ法の方が分的にくぼみが見られ、テフロン型に完全に充填できていペーストをテフロン型に押し込むため、充填率が高くなり、ないことが明らかとなった。これは、型の上部が開放系で強度と相対密度を上昇させたと考えられる。表 1 に注射針あることにより、セメント同士を密着させるほど圧力がか種類と針直径に伴う、押し出しの評価を示す。注射針は、

からず、溶液のたまりができたと考えられる。臨床では、

18G の 1.2 mm 径では十分に押し出せ、0.8 mm 径では 3 回

腰椎体内部に針を刺して充填するため、ある程度充填時に圧力がかかると考えられる。そのため、このような表面の欠陥は減ると予想できる。また、血液中で硬化したセメン

リンジ針を使用することとした。

トからは、取り出したセメントが血液の色で染まっている

20

40

15

30

10

20

5

10

0

ことが確認できた(図 5b, d)。これは、ペースト充填時に、ペーストと溶液が混ざっていることを反映しており、臨床の環境に近い厳しい環境下でもこのセメントペーストがRelative density / %Compressive strength / MPa に 1 回詰まり、0.65 mm 径では押し出せないことが明らかになった。したがって、Fragmentation 評価には 18G のシ成形できることを明らかにした。
(a)	
  

(b)	
  

0
PackingInjection
インジェクション

パテ

図 2 セメントの圧縮強度および相対密度

(c)	
  

表 1 インジェクション試験
ゲージ

注射針内径
(mm)

注射針外径
(mm)

インジェクション成功率(成功回数 / n)

18

0.94

1.2

6/6

21

0.57

0.8

2/6

23

0.40

0.65

0/2

図 3 Non-fragmentaion 試験法(a) テフロン型の溶液内への浸漬(b) 溶液内でのセメントペーストの充填

２．２ 擬似生体環境下で硬化したセメントの評価(c) 充填後のセメント

セメント硬化時に介在させる溶液として、水、血液(緬羊無菌保存液：抗血液凝固剤 50％混合)を使用した。テフ!$#%

ロン型(6 mm φ, 12 mm h)をビーカーに入れ、テフロン型の!"#

孔が完全に浸る高さまで各溶液を加えた(図 3a)。テフロン
型をビーカーごとインキュベータに入れ、溶液が 37 ℃と同温になるまで静置した。その後、シリンジおよび 18G
注射針(1.2 mm φ)を用いて孔にセメントペーストを充填し(図 3b, c)、インキュベータ中で 24 h 養生した。比較対象として、IP6 の代わりに水で粉砕した 0 ppm IP6/β-TCP 粉体も同様に調製し試験をおこなった(図 4)。得られたセメン

図 4 セメントペーストの状態

トをテフロン型から外し、表面を観察した。つぎに、Ｘ線(a) IP6/β-TCP セメントマイクロ CT (卓上型マイクロフォーカス X 線 CT システム(b) 0 ppm IP6/β-TCP セメント

inspeXio SMX-90CT, Shimadzu)により内部を観察した。マイクロ CT 観察は、セメントに対して上下方向および横方

26

!"#

水中 !$#

ても多数の亀裂が観察され、Non-fragmentation を担保して血液中いないことが明らかとなった(図 7)。さらに、Fragmentation
は矢印で示した溶液の介在によるクラックと、ひし形矢印で示した充填時に内包した溶液のたまりと思われる大きな空隙の 2 種が存在することが明らかとなり、また、この2 種がつながっている部分が多いことも明らかとなった。
どちらも、セメントペーストが溶液内で一塊になりにくい
ことが原因であると考えられる。Non-fragmentation の担保には、セメントペーストの高いインジェクション能および、

!%#

水中

!&#

血液中

粘性が求められ、それらを同時に満たすことで、溶液内でFragmentation を起こさずに一塊に硬化することが示唆さ
れた。

(a)

図 5 各溶液内で成形したセメントの外観(a, b) IP6/β-TCP セメント, (c, d) 0 ppm IP6/β-TCP セメント
(a)

水中

(b)
(b)

血液中

図 6 IP6/β-TCP セメントの CT 像(a) 水中, (b) 血液中

つぎに、得られた IP6/β-TCP セメントの CT 画像を図 6 に、

図 7 0 ppm IP6/β-TCP セメントの CT 像

比 較 対 象 と し て IP6 の 代 わ り に 水 で 粉 砕 し た 0 ppm(a) 水中, (b) 血液中

IP6/β-TCP セメントの CT 画像を図 7 に示す。目視で観察

２．３ ブタ生体内で硬化したセメントの評価したように表面にはセメントが十分に充填されていない箇所が部分的に見られた。特に、型の上部は開放系である

In vivo 試験として、2.2 項で検証した IP6/β-TCP セメン

ためにセメントが十分充填せず、一塊に硬化していない部

ト(P/L=1/1.0 [g/cm3])をシリンジに充填した後、インジェク分が見られた。しかしながら、大きな欠陥は認められず、ション法により、ブタ(体重 120 kg)脛骨および筋肉内に注

目視で見られた血液とペーストが混合した部分でも十分入し 4 週間埋入後取り出した。埋入セメントをマイクロ硬化していることが明らかとなった。また、内部の CT 像

CT により観察しその硬化状態を観察した。また、対照試

からは、どちらの溶液中でもセメントの部分的な崩壊は認料として市販の Biopex®-R (HOYA)も同様に試験した。図

められず、一塊であることが分かった(図 6)。しかしなが8 に取り出し後のセメントの CT 画像を示す。脛骨埋入(図ら、どちらの溶液でも非常に小さな空隙がセメント内に見8-a, c)では、ドリルで穿孔後に注入したセメントペースト

られた。これはセメントペースト作製過程での混練で混入が髄腔内に落ちることなく、一塊の状態で硬化している事した空気および、充填時の溶液のたまりであると推測されが観察された。また、筋肉内に注入したペースト(図 8-b, d)

る。いずれにせよ、材料の性質ではなく、セメント充填時も同様に大きな亀裂は見られず生体内においてもの脱気等の方法の改善により十分回避できることが推測

Non-fragmentation を担保していることが示唆された。

できる。一方、比較対象として IP6 の代わりに水で粉砕した 0 ppm IP6/β-TCP セメントは水中、血液中いずれにおい

27

(a)

(b)
皮質骨

C

筋肉

皮質骨

C
髄腔
髄腔

筋肉

50	
  mm

(c)

50	
  mm

(d)
皮質骨

C

筋肉

皮質骨

C
髄腔

髄腔

50	
  mm

筋肉

50	
  mm

図 8 ブタ埋入 4 週後のセメントの CT 像®

(a, b) IP6/β-TCP セメント, (c, d) Biopex -R セメント

３． 考察及び今後の展望

た、ブタを用いた in vivo 試験でも脛骨および筋肉内に注

β-TCP セメントは最も臨床応用されている PMMA と比入したセメントペーストは大きな亀裂などの較して、高い生体適合性や、早期より周辺に新生骨が形成

Fragmentation を起こすことなく一塊の状態で硬化していされること、自家骨に対して高すぎない強度をもつことがた。擬似的な臨床環境下でのセメントの Fragmentation の知られている。また、市販の HAp, α-TCP ベースのセメン

評価法を確立したことで、多くの利点をもつリン酸カルシ

トと比較して、生体吸収性をもち、HAp へ転化しにくい

ウムセメントが臨床応用に耐えうるかを判断可能になっという明確な利点をもつ。さらに、本研究で開発された IP6た。また、IP6/β-TCP セメントの Non-fragmentation の担保を用いた β-TCP 微粒子の表面修飾は、β-TCP と IP6 のキレが確認され、臨床応用可能であることが明示された。今後ート結合により硬化させることで、HAp への転化を抑え、は、セメントへの患者の生活に伴う繰り返しの荷重による硬化時の pH の変化を生じさせないため、患者への負担が部分破壊やクラックなどの Fragmentation の検証として、より低くなる[6]。様々な利点をもつリン酸カルシウムセ

骨粗鬆症モデル材料を用いて、繰り返し荷重を負荷させたメントが存在するが、一方でペースト硬化時、あるいはセ場合の Fragmentation について検討の必要がある。

メントへの患者の生活に伴う繰り返しの荷重により部分破壊やクラックなどの Fragmentation を生むことが臨床上【参考文献】の課題として報告されている。しかしながら、

1. H.J. Wilke, U. Mehnert, L.E. Claes, M.M. Bierschneider, H.

Fragmentation を材料の視点で調査した報告は少なく、そのJaksche, and B.M. Boszczyk, Spine, 31, 2934-2941 (2006).

評価法も確立されていない。そのため、本研究では新しい

2. H. Deramond, N.T. Wright, and S.M. Belkoff, Bone, 25,

キレート硬化型セメントをモデル材料として、擬似的な臨S17-21 (1999).

床環境での Fragmentation の評価法を確立するとともに、

3. P. Kim and R. Kurokawa, Jpn. J. Neurosurg., 18, 121-130

そのプロトコルに基づく Non-fragmentation の性質を探索(2009).

することを目的として、以下の知見を得た。

4. 松家茂樹, 石川邦夫, セラミックス, 43, 298-302 (2008).

擬似的な生体環境を得るため、37 °C の水、血液中で注

5. S. Nouda, S. Tomita, A. Kin, K. Kawahara, and M.

射針を用いたインジェクションによりセメントを成形しKinoshita, Spine, 34, 2613-2618 (2009).

た。用いた IP6/β-TCP セメントは、予備的な試験で注射針

6. T. Konishi, S. Takahashi, Z. Zhuang, K. Nagata, M.

から押し出せていることが分かっており、この環境下でもMizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H.

充填することができた。得られたセメントはいずれの溶液

Nagashima, and M. Aizawa, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24,

でも一塊に成型され、部分破壊は見られなかった。また、

1383-1394 (2013).

µCT による内部観察からも部分破壊やクラックは見られず、Non-fragmentation を担保していることが明らかとなった。しかしながら、小さな空隙が観察された。これはペー
スト混練時の空気の混入だと考えられ、充填時の脱気等の充填法の改善により十分回避できることが推測できる。ま28

高い骨伝導性を備えた HAp 系セメントの創製とその評価(1)‐骨ミネラル含有アパタイトによるアプローチ‐
相澤 守、千布悠貴、横田倫啓、三木拓也、長嶋比呂志、
石井 賢、松本守雄、水本みのり、小西敏功、本田みちよ

１． はじめに状人工骨の開発」に先立ち、骨ミネラルを含有した緻密な

骨肉腫や外傷を含む種々の骨の疾患やその治療においてHAp セラミックス(Bone HAp セラミックス)を試製し、そのセラミ病変部を外科的に切除することにより骨に欠損が生じる。このックス上でラット骨髄由来間葉系幹細胞(RBMC)を培養し、そ骨欠損部の再建や補填には、現在、①自家骨移植（患者自らのナノ欠陥構造を備えたモデル材料と骨芽細胞との分化誘導の骨を正常部より摘出移植する）、②他家骨移植（骨バンクでについて調査した。さらに、この Bone HAp セラミックスをウサ保存されている他人から提供された骨を移植する）、③人工骨

ギ脛骨に埋入し、その硬組織適合性を純粋な HAp と比較した。

移植などが行われている。

ここで得られた基礎的知見をもとに、Bone HAp 粉体からセメ

このうち自家骨移植は移植片に骨芽細胞など骨形成に関ント試験片を試作し、その材料特性を明らかにするとともに、ウわる細胞が多く含まれていることから、皮下や筋肉内など骨のサギ脛骨および大型動物であるブタ脛骨にインプラントし、組ないところで骨形成を促進させる能力、すなわち“骨誘導能”

織学的評価を行なった。以下、得られた知見を報告する。

が備わっているだけでなく、力学特性も周囲の骨に適している

２． 実験と結果ことから、現在のところ最も効果の望める治療法である。しかしながら、自分の健全な骨の一部を削り取って移植するため、

２．１ Bone HAp セラミックスの作製とその評価

採取部の疼痛や摘出量の制限などの問題が残る。一方、他

Bone HAp 粉 体 は 、 既 報 [2] に 従 っ て 、 出 発 物 質 と し て家骨移植は骨の入手が困難なことと安全性が疑問視されてい

Ca(OH)2, MgCl2･6H2O, NaCl, KCl, (NH4)2CO3, H3PO4 およびる点から、我が国においてはあまり実施されていない。
そこで、上記の問題を克服させるために開発されたのが、NH4F を用いて湿式法により合成した。MgCl2･6H2O, NaCl お

骨の無機成分であり、骨と直接結合する水酸アパタイト(HAp)

よび KCl を含む Ca(OH)2 懸濁液を撹拌し、そこにマイクロチュなどの人工骨である。この人工骨は一般に材料を骨の上や中ーブポンプで(NH4)2CO3 および NH4F を含む H3PO4 水溶液をに移植した際に新生骨を材料表面に沿って形成させる能力、滴下した。得られた白色沈殿を M にて 3 日間熟成し、ろ過

すなわち“骨伝導能”を有するものの骨誘導能は保持しておらおよび凍結乾燥して「Bone HAp 粉体」を得た。なお、対照試ず、自家骨移植の代替方法となるまでには至っていないのが料として、Ca(OH)2 および H3PO4 を出発原料として、骨ミネラル

現状である。

を含まない Pure HAp 粉体も同様な方法で合成した。

したがって、自家骨に匹敵する骨誘導能を持ち、十分な骨濾過・乾燥後、得られた粉体を水蒸気を含む二酸化炭素雰再建を実施できる骨再生医療技術の開発が急務とされている。

囲気下にて 800 °C, 1 h 仮焼した。それをボールミル粉砕した

そこで、本研究では、生体骨の成分に酷似した組成からなる

のち、一軸加圧成形（質量 0.30 g, 直径 10 mm, 厚さ 2-3 mm,「骨ミネラル含有アパタイト(Bone HAp)」を用いて、骨誘導能

成形圧 100 MPa）を行い、得られた粉体を水蒸気を含む二酸（より高い骨伝導能）を備えたペースト状人工骨を開発すること

化炭素雰囲気下にて 1000 °C, 1200 °C および 1300 °C で 5 hを目的とした。

焼成して、「Bone HAp セラミックス」を作製した。また、同様なプロセスで、Control である純粋水酸アパタイト(Pure HAp)セラ

以下、Bone HAp について述べる。我々の生体骨の無機成

ミックスも作製した。

分は HAp に類似しているが、生体骨中のアパタイト構造中には、ナトリウムやマグネシウム、炭酸イオンなど多くのイオン種得られたセラミックスは、粉末 X 線回折測定(XRD)、フーリが固溶している。これらのイオン種の固溶はアパタイト構造を

エ変換型赤外分光光度法(FT-IR)、走査型電子顕微鏡(SEM)、

歪ませるため、生体骨は多くの欠陥を包含している。我々はそ

透過型電子顕微鏡(TEM)、エネルギー分散型 X 線回折分析の欠陥構造が HAp の生体活性を誘起していると考えており、(EDX)およびラマン散乱測定(Raman)を用いて特性評価を行

そのようなナノレベルの欠陥構造を積極的に HAp に導入するなった。
得られた Bone HAp セラミックスの相対密度は、1000 °C 焼ことができれば、HAp の生体活性を大幅に向上させることが可成では 94.5%、1200 °C 焼成では 77.3%、1300 °C 焼成では能であると推測している[1]。

77.2%であり、1000 °C で焼成した場合に緻密体が得られるこ

そこで、本研究では、「骨誘導能を備えた次世代型ペースト

29

とがわかった。XRD により結晶相を調べたところ、

 M で

２．２ Bone HAp セラミックスの生体活性
本節では、2.1 節で記載した Bone HAp セラミックスの生体焼成したセラミックスでは HAp 単一相が、1200 °C および
1300 °C で焼成したセラミックスでは HAp に加えて酸化カルシ

活性を in vitro および in vivo の両面から評価した結果についウム(CaO)が認められた。また、FT-IR スペクトルからはいずれて述べる。まず、in vitro 評価として、Bone HAp セラミックの焼成条件でも OH-, PO43-および CO32-確認され、これらのア

ス上でラット骨髄由来間葉系幹細胞(RBMC)を培養し、そのナパタイトは炭酸含有であることがわかった。

ノ欠陥構造を備えたモデル材料と骨芽細胞との分化誘導に

SEM による微細構造観察から、焼成温度が高くなるにつれついて調査した結果について記載する。

て粒成長をしていること、また EDX スペクトルより添加したミネ

RBMC は以下の方法により採取し、細胞培養試験に使ラルの存在が確認された。その結晶粒の大きさは Pure HAp セ

Aラミックスよりも Bone HAp セラミックスの方が小さいことがわかった。これは EDX でミネラルの存在が確認されていることから、添加したミネラルの一部が粒界に偏析し、粒界の移動を抑制したためと考えられる。
次に、マクロレベルでの欠陥構造を調べるため、代表的なPure HAp および Bone HAp セラミックスのラマンスペクトルを測定した。いずれも OH-および PO43-の吸収が確認されたが、Pure HAp と Bone HAp の散乱ピークとを比較すると、各々のピークの強度、本数が異なっていることが明らかになった。これは OH-が CO32-と置換して消失していること、PO43-がミネラルの置換により伸縮を起こしているためと考えられる。このことから、作製した Bone HAp セラミックスにはミネラルが含有され、Pure
HAp と比較するとより多くの欠陥および歪みが含まれているこBとが確認された。
ついで、ナノレベルでの情報収集を目的として HR-TEM に
よ る 観 察 を 行 な っ た 。 図 1 は イ オ ン ス ラ イ サ ー (JEOL
EM-09100IS)でおよそ 30-40 µm の薄片を作製し、カーボン蒸着したものを観察した結果である。TEM により M 焼成したセラミックスの内部観察を行ったところ、結晶内に欠陥と歪みが確認された。EDX による定性分析を行なったところ、内部にも微量のミネラルが確認された。
以上の結果から、本研究で作製された骨ミネラル含有アパ
タイトセラミックスは水蒸気を含む二酸化炭素雰囲気下で1000 °C で焼成を行うと、アパタイト単一相の緻密体が得られ、欠陥および歪みがそのアパタイト構造に導入されていることが確認された。

C

Bend contour(Strain)defect100 µm100
nm

図 2 各培養期間における骨髄間質細胞のDNA 濃度，ALP 活性，OC 産生量(A) DNA 量, (B) ALP 活性を DNA 1 µg あたりに換算したもの,(C) OC 産生量を DNA 1 µg あたりに換算したもの

図 1 Bone HAp セラミックスの TEM 像（1000 °C, 5 h 焼成）

30

用した[3]。4 週齢の Wistar rat から骨髄間質細胞を採取し、を用いて計測した。

培養液として標準培地（α-MEM + 10% FBS）を培養液といずれのセラミックス試料片も炎症などの反応は認めして用いて、必要細胞数が得られるまで培養した。密度られず、材料と新生骨とが直接結合している様子が見られ3×104 cells/cm3 の骨髄間質細胞を各材料（Pure HAp，Bone

た。特に、4 週間埋入した Bone HAp セラミックスで材料

HAp）およびコントロール（12 孔プレート）に 2 mL ずつ

周囲での旺盛な骨形成が認められた(図 3)。画像解析によ播種した（n=9）。骨芽細胞に分化誘導するため、培養 4

る骨接触率及び骨形成率の測定結果は、24 週埋入試料で

日 目 に 分 化 誘 導 培 地 （ α-MEM + 10% FBS + 10 nM

は Pure HAp と Bone HAp 間で有意な差が見られなかった

Dexamethasone + 1 mM β-glycerophosphate + 200 µM

が、4 週間埋入 Bone HAp セラミックスでは骨接触率およascorbic acid）に切り替えて一定期間培養した。ついで、

び骨形成率いずれも Pure HAp より約 1.5 倍も高い値を示

骨芽細胞への分化誘導後、培養 7，14，21，28 日目に細胞した。

を回収し、DNA 濃度，Alkaline phosphatase (ALP)活性，

この結果は、Bone HAp セラミックスが Pure HAp セラ
ミックスよりも早期に骨形成を促進させる優れた骨形成

osteocalcin (OC)産生量を測定した。
まず、各培養条件での細胞数を確認するため DNA 濃度能を備えていることを示すものであり、Bone HAp は次世を測定した。細胞培養 21 日目までは、12 孔プレートに骨代のペースト状人工骨の素材として極めて有望である。

髄間質細胞を播種した場合でも材料に播種した場合でも培養期間が長くなるにつれて DNA 量が多くなり、培養 21
図日目以降は DNA 量にほとんど変化がみられなかった（図2A）。このことから、骨髄間質細胞が骨芽細胞へと分化誘導するため細胞分裂が抑えられるものの、未分化な細胞は増殖し続け、培養 21 日目あたりで全ての細胞が骨芽細胞へと分化するのではないかと考えた。
そこで、骨芽細胞の分化レベルと、Pure HAp と BoneHAp の分化誘導能の違いをタンパク質レベルで調べるた
め、ALP 活性値と OC 産生量を測定した。各培養条件での単位 DNA あたりの ALP 活性は、全ての培養期間においてBone HAp に播種した細胞がもっとも高く、ついで Pure
HAp に播種した細胞、12 孔プレートに播種した細胞の順

図 3 Villanueva Bone 染色による Bone HAp セラミックス

図 2B）。このことから、Bone HApに活性値が高かった（図の組織学的評価と Pure HAp は初期・中期の分化において 12 孔プレートよ２．３ Bone HAp セメントの作製とその評価

り骨芽細胞への分化誘導能が高く、また Bone HAp は骨芽

本節では、2.2 節で優れた骨伝導性を有することを明ら

細胞への分化誘導能が最も高い材料であることが分かっかにした Bone HAp 粉体からキレート硬化型セメントを作た。

製するプロセスと得られたセメント試験片の材料特性に

各培養条件での OC 産生量は、培養期間が長くなるにつ
図 2C）。OC 産生量が経時れて減少することが分かった（図ついて記載する。

的に減少したのは、OC 産生量が各培養期間での差が生じ

まず、Bone HAp 粉体は 2.1 節の方法で合成した。ついないほどごく少量であったのに対し、DNA 量は経時的にで、得られた Bone HAp 粉体をボールミルを用いて 5 min

増加したためではないかと考えられる。OC 産生量がごく

湿式粉砕し、1000 ppm に調整した IP6 溶液で 5 h 表面修飾

少量であったのは、細胞の分化レベルが低く、そのため後した。その後、吸引ろ過、24 h 凍結乾燥させ、表面修飾し期分化マーカーである OC の産生量が少なかったのではた粉体(IP6-Bone HAp)を得た。また、対照試料の Pure HAp

ないかと考えた。

粉体にも同様な操作を施した。

これらの結果は、ナノ欠陥構造を持つ Bone HAp は Pure

IP6 による表面修飾前後の Bone HAp および Pure HAp

HAp に比べて骨芽細胞の分化を促進させることが可能で粉体のキャラクタリゼーションは、粉末 X 線回折測定あることを示している[4]。この結果を受けて、次にウサ(XRD)、フーリエ変換型赤外分光光度法(FT-IR)、走査型電ギ脛骨に、この Bone HAp セラミックスを埋入した結果に子 顕 微 鏡 (SEM) 、 高 周 波 誘 導 結 合 プ ラ ズ マ 発 光 分 析

ついて述べる。

(ICP-ES)などを用いて行なった。

埋入実験に使用した Bone HAp セラミックスは直径: 4

図 4 は Bone HAp 粉体とこれを IP6 で表面修飾したmm、高さ: 8 mm、相対密度: ~95%の円柱状試料片である。

IP6-Bone HAp 粉体の XRD 図を示している。Bone HAp 粉

これを日本白色種ウサギ (♂, ~3 kg) の脛骨骨端部に埋入体および IP6-Bone HAp 粉体はいずれも低結晶性の HApした。埋入 4 週および 24 週間後に取り出し、Villanueva

単一相であり、IP6 の表面修飾による結晶相の変化は認め

Bone 染色を行ない、非脱灰研磨標本を作製し、組織学的られなかった。また、データは省略するが、Pure HAp で観察を行なった。また、材料と新生骨の接触率および材料

も同様な結果が得られた。
また、Bone HAp 粉体の FT-IR スペクトルの結果からは周囲の骨形成率を画像解析ソフト WinROOF (三谷商事)

31

表 1 IP6 表面修飾前後の Pure および(図図 5 )、1100～960, 600, 560 cm-1 付近にリン酸イオン
3-Bone HAp 粉体の化学組成-1(PO4 )に基づく吸収が、3600 cm 付近に HAp の O-H 伸縮

Caに基づく吸収が観察され、いずれも HAp に特徴的な吸収

P

Na

K

Mg

[mass%] [mass%] [mass%] [mass%] [mass%]が認められた。また、1455, 1430 および 880 cm-1 付近に炭酸イオン (CO32-) に帰属される吸収も認められた。このこ

Pure HApとから、Bone HAp 粉体は炭酸含有アパタイトであること

IP6-Pureがわかった。また、データは省略するが、炭酸イオンに帰HAp

属される吸収は低いレベルであったが、Pure HAp でも同

BoneHAp

様な結果が得られた。

IP6-Bone

表 1 に IP6 による表面修飾前後の Pure および Bone HAp

HAp

Ca/P

36.1

16.7

-

-

-

1.67

36.6

17.0

-

-

-

1.61

34.0

15.2

0.5

0.4

0.1

1.75

34.9

15.5

0.7

0.4

0.1

1.73

の化学組成を示す。Pure HAp の Ca/P 比は 1.67 で、合成時に仕込んだ Ca/P 比と近い値になった。一方で、Bone HAp

修飾を施した IP6-Pure HAp および IP6-Bone HAp は Pureの Ca/P 比は 1.75 であり、目的とするイオンが含有されてHAp および Bone HAp よりも Ca/P 比が低下していた。こいることが確認された。Bone HAp の Ca/P 比が Pure HAp

れは表面修飾により固定化された IP6 の分だけが P が増加と違って高いのは、Bone HAp が炭酸含有アパタイトであしたためであると考えられる。

り、HAp のリン酸サイトに炭酸が置換し、P の含有量が減

２．４ Bone HAp セメントの骨形成能

り、Ca/P 比が向上したためだと考えられる。また、表面

本節では、2.3 節で試作した IP6-Bone HAp セメント試験片をウサギおよびブタ脛骨にインプラントし、その周囲での骨形
成能について評価した結果を述べる。
まず、上記の IP6-Pure HAp 粉体および IP6-Bone HAp 粉体を用いて、ウサギおよびブタ脛骨インプラント用の試験片（直径 4 mm, 高さ 7-8 mm）を作製した。IP6-Pure HAp 粉体に固液比（粉体[w]/水[w]）が 1/0.35 となるように混練液（水）を加え、混練・成形し、24 h 養生して「IP6-Pure HAp セメント」を作製した。同様に、IP6-Bone HAp 粉体を用いて固液比が 1/0.40 となるように水を加えて「IP6-Bone HAp セメント」を作製した。作製した IP6-Pure HAp セメントの相対密度および圧縮強度は43.0±1.0%および 13.2±0.6 MPa であり、IP6-Bone HAp セメントのそれらは 43.1±0.7%および 13.4±0.7 MPa であった。これら２つの試験片の相対密度および圧縮強度はほぼ同レベルであり、in vivo 実験に際し、材料間の影響はほとんど無視できるものと考えられる。
まず、セメント試験片のウサギ脛骨に対する生体硬組織反図 4 IP6 表面修飾前後の Bone HAp 粉体の XRD パターン

応を調べるために、所定の期間(4, 24 w; 各 n=3)、ウサギの両足脛骨骨端部に埋入した。実験動物には、体重約 3 kg, 16 週
齢の日本白色種(JW)のウサギを用いた。まず、ソムノペンチル
を 50 mg･kg-1 になるように静脈注射により投与し、麻酔を行なった。その後、ウサギ後肢の膝内側部を切開し、骨膜を剥がして脛骨を露出させ、ドリルで穿孔（4.2 mmφ）し、セメント試料片を埋入した。左足に IP6-Bone HAp セメント（4 mmφ×7-8 mm）、
右足に IP6-Pure HAp セメント（4 mmφ×7-8 mm）の円柱状試料片をそれぞれ一本ずつ埋入した。所定の期間経過後(4 w)、
周囲の骨組織とともに試験片を取り出し、凍結薄切標本および非脱灰研磨標本を作製し、組織学的評価を行なった。凍結薄切標本では、トルイジンブル(TB)染色、ヘマトキシリンエオ
ジン(HE)染色、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、酒石酸
耐性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色を行なった。また、非脱灰研磨標本では、ビラヌエバ骨染色を使用した。
図 6 は TB 染色した組織像である。IP6-Pure HAp および

図 5 IP6 表面修飾前後の Bone HAp 粉体の FT-IR スペクトル

IP6-Bone HAp セメントいずれもセメント周囲での旺盛な骨形成が認められた。また、セメントと新生骨とが直接結合している

32

様子も観察された。データは省力するが、HE 染色でも同様な方がより高い骨形成能を示したことは、この Bone HAp の人工結果を得ている。24 w 群についても良好な硬組織適合性を骨の素材としての極めて高いポテンシャルを想像させる。今後、示していた。

追試を行ない、この知見を精査していく。

図 7 は ALP および TRAP 染色した結果である。ALP 染色

実験動物として、ウサギで優れた結果を得たため、よりヒトにで陽性の部分（←でマーク）は骨芽細胞が、TRAP 染色で陽近い大型動物であるブタを用いて、セメント試験片の生体硬性の部分（←でマーク）は破骨細胞が存在していることを示し

組織に対する組織反応を調べた。所定の期間(4, 24 w; 各ている。IP6-Pure HAp および IP6-Bone HAp セメントいずれもn=4)、ブタの左足脛骨骨端部に埋入した。実験動物には、体ALP 陽性および TRAP 陽性の部分が散見され、これらのセメ

重約~110 kg, 188 週齢のブタ(Wild type)を用いた。まず、ソム

ントが骨のリモデリングサイクルに適応していることが分かっ

ノペンチルを静脈注射により投与して麻酔を行なった後、ブタた。
ついで、セメント周囲での骨形成量を定量するため、ビラヌ

後肢の膝内側部を切開し、骨膜を剥がして脛骨を露出させ、ドリルで穿孔（4.2 mmφ）し、8 つのセメント試料片を埋入した。

エバ骨染色の組織像を用いて、セメント周囲の骨形成率を画所定の期間経過後(4 w)、周囲の骨組織とともに試験片を取り像解析により算出した。なお、ここで「骨形成率(%)」は「骨の出し、凍結薄切標本および非脱灰研磨標本を作製し、組織学面積」を「セメント周辺の面積（円全体の面積‐セメントの面的評価を行なった。凍結薄切標本では、トルイジンブル(TB)積）」で除して 100 をかけたものである。実際、Pure HAp セメン

染色、アルカリフォスファターゼ(ALP)染色、酒石酸耐性酸性

トの骨形成率は 57%、Bone HAp セメントのそれは 74%であっフォスファターゼ(TRAP)染色を行なった。

た。Bone HAp セメントの方が Pure HAp セメントよりも約 30%も

図 8 はブタ脛骨に 4 および 24 週間インプラントしたセメント

その周囲で多くの骨が形成されており、Bone HAp が Pure

試験片の組織像を示す。図 8A は、4 週(a, b)および 24 週(c, d)

HAp よりも高い骨伝導能を備えていることが明らかとなった。こ埋入後のセメント試料片の TB 染色像である。図 8B および Cの結果は、2.2 節で示した Bone HAp セラミックスと Pure HAp

はそれぞれ 4 および 24 週間インプラントしたセメント試験片のセラミックスとの比較実験とほぼ同等な結果である。セラミック

連続組織像である。
図 8A より、Pure HAp および Bone HAp セメントいずれもセスとセメントと材料形態が異なるにもかかわらず、Bone HAp のメント周囲での旺盛な骨形成が認められた。また、セメントと新生骨とが直接結合している様子も観察された。今回の組織学的所見では、Pure HAp よりも Bone HAp の方がその周囲において、旺盛な石灰化骨の接触が見受けられた。
図 8B お よ び C は、4 および 24 週間インプラントしたセメン
ト試験片から連続切片を作成し、それらを TB、ALP および
TRAP 染色した結果である。4 および 24 週いずれの埋入期間においても、TB 染色では新生骨がセメント試料片と結合している様子が確認できる。また、ALP 染色で陽性の部分（←でマーク）は骨芽細胞が、TRAP 染色で陽性の部分（←でマーク）

図 7 セメント試験片の組織学的評価 (ウサギ：4 w)：
図 6 TB 染色による Pure HAp および Bone HAp セメント(a, b) Pure HAp セメント、(c, d) Bone HAp セメント、試験片の組織学的評価 (ウサギ：4 w)(a, c) ALP 染色、（b, d） TRAP 染色

33

(A)

(B)

(C)

図 8 ブタ脛骨に 4 および 24 週間インプラントしたセメント試験片の組織学的評価(A) 4 週(a, b)および 24 週(c, d)埋入後のセメント試料片の TB染色像。 (a, c) Pure HAp, (b, d) Bone HAp(B) 4 週間インプラントしたセメント試験片の連続組織像(C) 24 週間インプラントしたセメント試料片の連続組織像

は破骨細胞が存在していることを示している。Pure HAp およ【参考文献】び Bone HAp セメントいずれも ALP 陽性および TRAP 陽性の

1. 相澤 守, 神澤信行, 松本守雄, バイオマテリアル, 23,

部分が散見され、これらのセメントが骨のリモデリングサイクル

336-342 (2005).

に取り込まれていることが分かった。

2. T. Fujino and M. Aizawa, Arch. BioCeram. Res., 7,
175-178 (2007).

３． 考察及び今後の展望

3. C. Maniatopoulos, J. Sodek, and A.H. Melcher, Cell Tissue

自家骨移植の問題点を解決する目的で生体親和性に優れRes., 254, 317-330 (1988).

たリン酸カルシウム系セラミックスを用いた人工骨が開発され、4. M. Aizawa, T. Miki, Y. Yasutomi, M. Honda, and H.

広く臨床応用されている。骨移植に際し、人工骨の利用は

Yoshimura, Key Eng. Mater., 493-494, 320-324 (2012).

年々増加傾向にあるが、人工骨は現在のところ、自家骨の持つ“骨誘導”がまだ備わっていないため、人工骨だけでの骨再建は難しい。
そこで、本研究では、生体骨の成分に酷似した組成からなる骨ミネラル含有アパタイト(Bone HAp)を合成した。Bone HAp
では、これまでにウサギ脛骨にセメント試験片をインプラントし、その生体硬組織反応を比較検討したところ、インプラント 4 週
では、Bone HAp の方が Pure HAp よりも材料周囲での高い骨形成量が約 30%も高いことが分かった。これは極めて優れた骨形成能である。また、今回、行なったブタへのインプラント実
験においても良好な硬組織適合性を示している。
今後は、セメントの材料特性の向上とともに、より詳細な invitro および in vivo 評価を進め、これまでにない“骨誘導能（より高い骨伝導能）”を担保した次世代型ペースト状人工骨の創
製につなげたい。

34

高い骨伝導性を備えた HAp 系セメントの創製とその評価(2)‐ケイ素含有アパタイトによるアプローチ‐
本田みちよ、長嶋比呂志、中島佑亮、相澤 守

１． はじめに

２． 実験と結果

水酸アパタイト(hydroxyapatite; HAp)は骨と歯の無機成

２．１ Si-HAp 粉体の合成とキャラクタリゼーション

分と化学的、生物学的に類似しており、優れた生体適合性、
骨伝導能、骨結合性を有することからバイオセラミックス

Si-HAp は湿式法により、水酸化カルシウム（Ca(OH)2）

材料として用いられている[1-5]。しかしながら、他の生体懸濁液に、オルトリン酸水溶液(H3PO4)ならびテトラオル

活性ガラスやガラスセラミックスに対して、純粋な HAp

トケイ酸(Si(OC2H5)4; TEOS)混合水溶液を滴下して合成しインプラントの表面に有意な骨接合が起こるのにはかな

た。仕込みの Si 含有量は 0, 0.4, 0.8, 1.6 および 2.4 mass%

りの時間が必要とされる[6-8]。

とした。得られた粉体の性状を粉末 X 線回折法(XRD), 赤

HAp の生体活性を高める一つの方法は骨のミネラル相

外分光光度法(IR), 走査型電子顕微鏡法(SEM)および誘導の化学組成と構造的に類似した置換型アパタイトを得る

結 合 プ ラ ズ マ 発 光 分 光 法 (Inductively Coupled Plasma

ことである[9, 10]。硬組織の無機成分を構成するアパタイ

Atomic Emission Spectrometry; ICP-AES)などを用いて調査

ト相は多置換のリン酸カルシウムである。Si, Mg, Zn, Sr,

した。

Na などを含む小さな微量元素が生物学的アパタイトの特合成した Si-HAp 粉体の XRD パターンを図 1 に示す。

徴と関連していることや、これらの微量元素が骨や象牙質

XRD パターンからの生化学での主な役割を果たしていることはよく知られ合成した粉体は Siている。Carlisle によって行われた研究では、骨形成と石の含有量に関わら

灰化におけるケイ素(Si)の重要性を示した[11]。

ず、HAp 単一相でSi 置換アパタイトは様々な方法での合成が試みられてあることがわかっいる。

た。また、ピーク

Ruy らはゾルゲル法を用いて Si 置換アパタイト合成しが全体的にブローたが、これらの物質では HAp 相のほかに、Si の置換の程ドであったことか

度に応じて他の結晶相を含んでいた[12]。Boyer らは固相ら、これら粉体は反応を用いて Si 置換アパタイトの研究を行ったが、これ低結晶性であるとらの場合、ランタンや硫酸塩に似た二次イオンの取り込みいえる。その原因が必要となった[13]。また、Gibson らと Kim らは湿式法をは合成した粉体を用いて Si 置換アパタイトを合成したが、高温で焼結する

焼結していないたと通常よりも結晶径が大きくなることを示した[14,15]。まめ、低結晶性であた、我々はこれまでに超音波噴霧熱分解法(USSP 法)を用ったと考えられる。

図 1.

Si-HAp 粉体の XRD パターン

いて、Si-HAp 微小球を合成し、これを焼結させることで、また、FT-IR スペクトルから、Si(0)-HAp, Si(0.4)-HAp お

Si-HAp セラミックスを創製することに成功している[16]。

よび Si(0.8)-HAp では、リン酸イオン (PO43-)の吸収、水酸

本研究では、キレート硬化型 Si-HAp セメントと細胞応

化物イオン(OH-) の微弱な吸収、炭酸イオン(CO32-)に帰属

答性の調査に先立ち、湿式法で Si 含有 HAp 粉体（Si-HAp）

される吸収が確認された (data not shown)。これに対し、を合成した。この粉体を用いてキレート硬化型セメントをSi(1.6)-HAp と Si(2.4)-HAp の FT-IR スペクトルでは、リン作製し、得られた原料粉体のキャラクタリゼーションを行

酸イオン (PO43-)の吸収、炭酸イオン(CO32-)に帰属されるなうとともに、キレート硬化型 Si-HAp セメントと従来の吸収が見られたが、水酸化物イオン(OH-)の吸収が観察さキレート硬化型 HAp セメントとの材料特性の比較を行なれなかった。明確な理由は分からないが、Si の含有が OH-った。

の微弱な吸収に影響を与える可能性が考えられる。

さらに、キレート硬化型 Si-HAp セメントを用いた生体

次に、SEM により合成後の Si-HAp 粉体の観察を行なっ適合性の評価として、骨芽細胞様細胞を用いた in vitro 評

た。その結果、合成粉体はいずれも 100 µm 程度の大きさの粒子と 10 µm 程度の粒子、さらに小さい粒子などが混在

価と大型動物を用いた in vivo 評価を行なった。

していた(data not shown)。さらに高倍率で観察してみると、

35

Si-HAp 粉体は小さな粒子の凝集体であることが分かった。

結果、いずれの粉体でも約 13-17%の Si が 1 日目に溶出し

ただし、Si の含有量の違いがその形態に大きな影響を与えており、7 日目においては約 15-17%の Si が溶出した。こるものではないということがわかった。

れらの結果から、溶出率は Si の含有量が増えても上昇し続いて、ICP を用いて Si- HAp 粉体中の Ca, Si, P 含有量

ないことが分かった。したがって、粉体中の Si 含有量をを測定した。まず、各 Si-HAp 粉体中の Si 含有量を図 2 に調節することで Si の溶出量はコントロールできると考え

示 す 。 0.4られる。

mass%の Si が

２．２ Si-HAp によるキレート硬化型セメントの作製と力学的評価

含まれている
粉体ではほぼ全量が取り込湿式法によってまれているこ合成された粉体とが分かる。さ10.0 g と純水 40.0

らに 0.8 mass%,

cm3 を 遊 星 ボ ー ル

1.6 mass%, 2.4

ミル中で湿式粉砕

mass% と仕込した。粉砕には 10

み量を変化さmm 径のジルコニせていったとアボールを用い、5ころ、これらの分間粉砕した。1000

粉体では全量図 2.

ppm に調製したイ

Si-HAp 粉体中の Si 含有量

ではないものノシトールリン酸の仕込み量に比例して Si が含有されていることが分かっ(IP6) 溶 液 200 cm3た。したがって、湿式法による合成でも Si を十分に含有と湿式粉砕したさせることができるという結果が得られた。

Si-HAp 粉体を 500 cm3 ビーカーに入れ、攪拌機で毎分 400

図 3.

Si-HAp 粉体からの Si 溶出量

そこで、実際に、ケイ酸イオンがリン酸サイトに置換さ回, 4 時間室温で攪拌した。これを吸引ろ過し、-80 °C で 1れているかを調べるために、格子定数を求めた。その結果

日凍結させた。凍結後、粉体を凍結乾燥機を用いて 24 時

を表 1 に示す。Si(0)-HAp では Si を含有していないので、間乾燥させて表面修飾したケイ素含有アパタイト

HAp の理論値とほぼ同じ値であった。Si を含有している(IP6-Si-HAp)を得た。得られた粉体を固液比が 1/0.3 [g/cm3]

粉 体 Si(0.4)-HAp, Si(0.8)-HAp, Si(1.6)-HAp お よ びとなるよう純水と混練し、一軸加圧成形し、IP6-Si-HAp

Si(2.4)-HAp では a 軸が減少する結果が得られた。また、セメントを作製した。その後、それらのセメントの力学的Si の含有量が増えるに従い、a 軸の値は小さくなっていっ

評価を行なった。

た。リン酸サイトに Si (ケイ酸)が置換した場合、a 軸が減始めに各セメントの相対密度を測定した結果、Si の含有

少すると報告されている[13]。この結果は格子内に Si が取量および IP6 の表面修飾に関わらず、相対密度は 50%程度り込まれたことを示唆している。

であった。これらの結果から、セメント中の Si 含有量お表 1.
SampleSi(0)-HAp
Si(0.4)-HAp
Si(0.8)-HAp
Si(1.6)-HAp
Si(2.4)-HAp
HAp 理論値

よび IP6 表面修飾の有無は試料片の相対密度に大きな影響

Si-HAp 粉体の格子定数a 軸 (nm)c 軸 (nm)0.942(3)0.688(2)0.946(3)0.689(3)0.941(6)0.688(4)0.934(5)0.688(4)0.933(5)0.691(4)0.942(3)0.688(2)を与えるものではないと確認された(data not shown)。

次に、Si 含有量の異なる Si-HAp 粉体からの Si 溶出量を調べた。単位質量当たりの Si 溶出量を図 3 に示す。
Si(0)-HAp 粉体については、Si を含有していないので当然溶出は起こらない。Si(0.4)-HAp~Si(2.4)-HAp の粉体の単位
質量あたりの溶出量は、浸漬 7 日目で、Si(0.4)-HAp: 0.79
mg·g-1、Si(0.8)-HAp: 1.41 mg·g-1、Si(1.6)-HAp: 2.62 mg·g-1、Si(2.4)-HAp: 3.42 mg·g-1 であることが分かった。すなわち、Si を含有している粉体では、Si の含有量に準じて、溶出量が大きくなっていることが分かった。また、これらの結果から Si は 1 日目で大きく溶出し、その後緩やかに溶出

図 4.

しているが分かった。さらに、この時の溶出率を算出した

36

Si 含有量と IP6 表面修飾の圧縮強度への影響

次に、Si 含有量の圧縮強度への影響について調べた(図

胞毒性を評価した(間接培養試験)。さらに、セメントへ細4)。その結果、IP6 表面修飾にかかわらず、Si(1.6)-HAp と胞を直接播種し、その増殖性や形態についても評価した

Si(2.4)-HAp のセメント試料片の圧縮強度が低くなる傾向(直接培養試験)。セメント上における細胞の形態についてがわかった。現時点で Si 含有量が圧縮強度に影響を与えは、細胞を固定後、Alexa Fluor 488-phalloidin で actin を染色

るメカニズムは分からないが、Si が含有され結晶構造が変し 、DAPI で 核 を 染 色 し た 後 に 、倒 立 型 リ サ ー チ 顕 微 鏡化したことなどが圧縮強度の向上に影響している可能性

IX71(Olympus)を用いて観察した。

が考えられる。一方、Si(0)-HAp, Si(0.4)-HAp, Si(0.8)-HAp

始 め に 、セ メ ン ト 試 料 片 の 細 胞 毒 性 を 調 べ る た め にから作製されたセメント試料片間では大きな圧縮強度のTranswell®を用いた間接培養試験を行なった(図 5)。

変化は認められなかった。したがって、Si を含有していてSi を含有していない Si(0)と低濃度の Si を含有したも従来の IP6-HAp セメントと同様の作製条件で圧縮強度

Si(0.4)について比較すると、control (ポリスチレンプレート)の向上ができることがわかった。

よりもやや低い値を示した。これはセメント試料片に培地

また、セメントの圧縮強度は HAp 粉体を IP6 により表中のタンパク質やイオンが吸着したことにより増殖性が面修飾することで向上することが分かった。実際、すべて低下したものと考えられる。IP6 表面修飾前後で増殖性をの Si 含有量で表面修飾を施したセメント試料片の圧縮強比較すると IP6 吸着後の方がその影響は小さいと思われる。

度が大きくなり、Si(0)-HAp , Si(0.8)-HAp , Si(1.6)-HAp にお

次に、Si を中程度含有した Si(0.8)および高濃度含有させた

いて、5%の有意差が確認された。これは Si-HAp 粒子が IP6

Si(1.6), Si(2.4)において検証してみると、これらのサンプルを介してキレート結合したために強度が向上しためだとでは control よりも優れた細胞増殖性を示した。この時、考えられる。

培地中に溶出した Si 濃度を測定した結果、Si(0.8), Si(1.6),

２．３ 骨芽細胞様細胞を用いた IP6-HAp セメントの invitro 生体適合性評価

セメントから溶出した Si が細胞増殖へ影響を与えたといIP6-Si-HAp セメント試料片の生体適合性を調べるための三点を比較すると仕込み量の差ほど溶出量に差は生じに、新生児 C57BL/6 マウス頭蓋冠由来の骨芽細胞様樹立なかった。この結果から、Si の溶出はある一定の濃度で平株 MC3T3-E1 を用いて in vitro における細胞培養試験を行衡に達していると考えられる。

Si(2.4)では Si(0.4)に比べて溶出量が大きかった。これは、うことを意味する。しかしながら、Si(0.8), Si(1.6), Si(2.4)

なった。In vitro 評価用セメントには、1000 ppm IP6 表面修

次に、IP6-Si-HAp セメントへ細胞を直接播種した時の細飾した IP6-Si-HAp 粉体を用い、粉体と純水を 1/0.35 [g/cm3]となるよう混練し、その後加圧成形したものを IP6-Si-HAp
セメントとした。また、本研究では、溶出した Si の細胞増殖性への影響を調べるために、Transwell® (CORNING)
キットを用いて、細胞とセメントを共存培養させた時の細図 7. 直接培養による細胞増殖性

図 5.

Transwell を用いた間接培養による細胞増殖性

図 8. 直接培養時におけるセメントからの Si 溶出

胞増殖性について示す(図 7)。Control では 1 日目に細胞数は減少し、その後、対数的に増加した。一方、各セメント
試料片における細胞は、材料の表面粗さ等の影響により 1日目に control と比べて著しく減少したが、その後、良好に細胞が増殖していることがわかった。5 日目の細胞数を比較すると Si(0), Si(0.4), Si(1.6) では control に比べ、細胞図 6. 間接培養時におけるセメントからの Si 溶出37

数が少なかった。この理由は初期に付着した細胞数を反映の凹凸などの影響により control に比べて細胞の増殖に不し、対数増殖期に入るのが遅延したことや表面が粗く細胞利な条件であるためだと考えられる。Si(0), Si(0.4)では丸が増殖しにくい環境であること、セメント試料片は多孔質まった細胞が多く見られたが Si(0.8), Si(1.6)においては細であるために試料片内部に培地中の栄養分を吸着してし胞数が増えているように見受けられた。この結果は、細胞まったことなどが挙げられる。

増殖性試験の結果と一致していた。

しかし、Si(0.8), Si(2.4)において、表面粗さなどの諸条件

２．４ 大型動物(ブタ)を用いた IP6-HAp セメントの invivo 生体適合性評価は同じであるのにも関わらず、細胞増殖性が Si(0), Si(0.4),
Si(1.6)に比べ亢進されていることがわかる。Si(1.6)の細胞

IP6-Si-HAp セメントの生体適合性を調査するため大型増殖が優れなかったことから一概には言えないが、Si の含動物ブタ)を用いて in vivo 評価を行った。IP6-Si-HAp セメ

有が生体適合性の向上に寄与していると推察される。
また、細胞増殖に及ぼす Si 含有量の影響を検討するた

ントの in vivo 評価には、生後 200 週齢のオスで、体重がめに培地中に溶出した Si 量を測定した結果を図 8 に示す。

109 kg のクサビラオレンジ蛍光遺伝子を導入したクロー

この結果、ある閾値を超えた場合においてセメント生体適

ン豚 (huKO ブタ)を用いた。huKO ブタの脛骨に、それぞ合性が向上するのではないかと考えられる。すなわち、Si

れの試験片の大きさに合わせてドリル (直径 4.1 mm また含有セメントを作製する場合、Si の含有量の検討が重要では 4.2 mm)を 用 い て 穿 孔 し 、 各 2-3 個 ず つ 計 8 個 のあると考えられる。

IP6-Si-HAp セメントを埋入した。埋入期間は 4 週間とした。

IP6-Si-HAp セメント上で培養された細胞の形態を観察

試験片を埋入してから 4 週間後に、埋入部位を取り出しするために、細胞形態を蛍光染色した結果を図 9 に示す。

た。まず、取り出した脛骨を、バンドソーを用いて試験片

細胞核 (DNA)を DAPI により青色に、細胞骨格タンパク質周辺で 8 つに切り分け X 線µCT を撮影した。その後、70%であるアクチンを Alexa Fluor 488-phalloidin で緑色に染色

エタノール水溶液で脱脂を行った。これらの試料片についした。観察の結果、control であるポリスチレンプレート上て非脱灰研磨標本を作製した。非脱灰研磨標本の作製にあの細胞では、アクチンのストレスファイバーが発達し、細たり、あらかじめ villanueva bone stain を行ない組織学的に胞内を走っている様子が認められた。またそれぞれの細胞評価した(図 10)。なお、骨形成量計測は普通光下で観察さ形態を比較すると、control は細胞が大きく広がり、面で付れた切片において WinRoof を用いた画像処理によって行着しているようであり、1 day から 5 day にかけて見ると順なった。この方法を用いて試料片近傍の低石灰化骨の量を調に増殖していきコンフルエントに近づいていく様子が定量、比較した。
Si(0)において、明視野では材料の周囲にドリル径の後と観察された。
一方、セメント上の細胞は、細胞が細長く、糸状仮足を思われる部位が存在し、そこに茶色に染色された低石灰化

発達させている様子が見られた。これは、圧粉体上は表面骨の形成が認められた。また材料周囲と分け隔てなく結合されており良好な生体適合であると言える。Si(0.8)においても Si(0)と同様に周囲の骨組織との分け隔てない結合が確認された。拡大した図においてはフォルクマン管と思わ

図 9.

IP6-Si-HAp セメント上における細胞形態観察

図 10.

IP6-Si-HAp セメントの組織染色像

Villanueva bone stain 後の明視野観察像
左図中の破線枠を拡大したものが右図

下段は上段の拡大図であり、スケールバーは各々50 µm, 5 µm である。

38

れる細胞組織が散見された。これらの結果は材料の周辺部とともに、緻密なセラミックスを作製し、その上で骨芽細において優れた骨再生が行われていることを示唆してい胞を培養すると骨芽細胞の分化を促進することを明らかる。Si(2.4)においては材料周辺が細胞組織に覆われていたにした[16]。なお、USSP 法は合成粉体の組成制御を行う

ものの直接材料と結合している部位も確認された。このサことが容易であり、水蒸気雰囲気下で直接粉体を合成でき

ンプルは材料周囲の骨がスポンジ上になっていることかるため HAp などの水酸基を含む化合物の合成に有利な方

ら、皮質骨ではなく仮骨近傍で作製されたサンプルと推察法である。この USSP 法により合成した Si-HAp 粉体を利される。再試験も含めた検討を行う必要がある。

用して、キレート硬化型セメントを試作し、その材料特性

続いて、これらのサンプルの明視野における新生骨の形について調べたが、この方法で合成される微粒子は「球状」

成量を計測した。明視野において低石灰化骨は茶色に染めであり、所望の材料特性を得るに至らなかった。そこで、られている。WinRoof を用いて茶色に染められた部位を検本研究では、Si-HAp の合成方法を見直し、湿式法により出し、その面積を測定した(図 11)。この結果から Si を含

微細な粉体を合成して、これをセメント原料に適用し、そ有したサンプルにおいて Si(0)と比較して優れた低石灰化の材料特性と骨芽細胞による in vitro 評価を行なった。

骨の形成が確認された。また Si(0.8)と Si(2.4)を比較するとその結果、湿式法により微細な Si-HAp 粉体を合成し、Si(0.8)がより優れた骨形成であったことが確認された。しほぼ目的とする強度を備えたセメント試験片の試作に成かし Si(2.4)については前述のように再検討が必要と考え功した。また、このセメントは骨芽細胞の増殖性を向上さられる。

せるだけではなく、in vivo においても低石灰化骨の骨量を増加させることも明らかにしている。
今後は生体活性を高めるこれまでにない“骨誘導能”を保持した次世代型生体材料の創製に応用したい。
【参考文献】
1. C. Lavernia, and J.M. Schoenung, Am. Ceram. Soc. Bull, 70,
95-100 (1991).
2. W. Cao, and L.L. Hench, Ceram. Int., 22, 493-507 (1996).
3. T.S.B. Narasaraju, and D.E. Phebe, J. Mater. Sci, 31, 1-21
(1996).

図 11. IP6-Si-HAp セメント周囲の低石灰化骨量

4. G. Willmann, Br. Ceram. Trans, 95, 212-216 (1996).

以上の結果から、IP6-Si-HAp セメントの in vivo におけ

5. E.

る生体適合性は、4 週間の埋入後に試験動物に炎症の惹起

Schepers,

M.

Declercq,

P.

Ducheyne,

andR.

Kempeneers, J. Oral Rehabil, 18, 439-452 (1991).

などは確認されなかったことから、良好であったと評価で6. G. Dalculsi, R.Z. Legeros, E. Nery, K. Lynch, and B.

きる。Villanueva bone stain による非脱灰研磨標本で各材料

Kerebel, J. Biomed. Mater. Res., 23, 883-894 (1989).

と骨との界面を観察した結果、材料周辺部に新生骨の形成7. W. Holand, W. Vogel, K. Naumann, and J. Gummel, J.

が確認され、ホストの骨と結合していた。また、Si を含有

Biomed. Mater. Res., 19, 303-312 (1985).

させたサンプルは Si を含有していないサンプルに比べて8. R.Z. LeGeros, M.A. Miravite, G.B. Quirolgico, and M.E.J.

優れた骨形成を示した。これらの結果から本材料は骨形成

Curzon, Calcif. Tissue Int., 22, 362-367 (1976).

を促進する材料として期待される。

9. L.J. Jha, J.C. Best, S.M.J Knowles, I. Rehman, J.D. Santos,
and W. Bonfield, J. Mater. Sci., Mater, 8, 185-191 (1997).

３． 考察及び今後の展望

10. E.M. Carlisle, Science, 167, 179-180 (1970).

ケイ素(Si)は生体必須微量元素のひとつで、人の健康を

11. A.J. Ruys, J. Aust, Ceram. Soc, 4, 83-88 (1993).

保つためには欠くことができない重要な元素である。高等12. L. Boyer, J. Carpena, and J.L Lacout, Solid State Ion., 95,

動物の骨格はリン酸カルシウムからなるが、その形成には

121-130 (1997).

ケイ素が必須であることがニワトリやラットを用いた研13. I.R. Gibson, S.M. Best, and W. Bonfield, J. Biomed. Mater.

究から明らかにされている[17,18]。ケイ素が不足するとニRes, 4, 422-428 (1994).
14. S.R. Kim, J.H. Lee, Y.T. Kim, D.H. Riu, S.J. Jung, Y.J. Lee,

ワトリでは骨格の発達が悪く、頭蓋骨の奇形が生じる[4]。
また、Gibson らは Si を HAp に置換固溶させると、HAp

S.C. Chung, and Y.H. Kim, Biomaterials, 24, 1389-1398の骨伝導性が向上することを報告している[13]。

(2003).

そこで、本研究では、この骨形成能を促進させると考え

15. R. J. Anderson, J. Biol. Chem., 17, 141-150 (1914).

られている Si を HAp に含有させることにより、骨誘導能16. M. Honda, K. Kikushima, Y. Kawanobe, T. Konishi, M.

を保持した新規のペースト状人工骨の開発を進めてきた。

Mizumoto, and M. Aizawa, J. Mater. Sci: Mater. Med., 23,

これまで超音波熱噴霧分解(USSP)法によりケイ素を置換2923 -2932 (2012).

したアパタイト（ケイ素含有アパタイト；Si-HAp）粉体を17. K. Schwarz, and D.B. Milne, Nature, 239, 333-334 (1972).

合成し、得られた粉体のキャラクタリゼーションを行なう

18. E.M. Carlisle, J. Nutr., 106, 478-484 (1976).

39

骨形成レベルを視覚化する評価・解析手法の確立(1)‐クサビラオレンジブタによるアプローチ‐
本田みちよ、長嶋比呂志

１． はじめにを、また新生児大腿骨より間葉系幹細胞(mesenchymal stem

骨は破骨細胞により吸収され、骨芽細胞により形成されcell; MSC)を単離し、さらに異なる材料基材における細胞ることで微妙なバランスを保ちながら、新しく生まれ変わの増殖・分化・形態を調べ、細胞の応答性を比較し、解析るが、骨粗鬆症の場合、このバランスが崩れ、骨吸収に傾した。MSC は骨、軟骨、心臓、脂肪、神経などの多種類く。現在我が国では約一千万人もの骨粗鬆症患者がいるとの細胞に分化する能力を有しており、再生医療にも適応さ推定されており、治療法・治療薬の開発が切望されている。

れている[2]。胚を利用する胚性幹細胞(ES 細胞)に比べ、開発に当たっては、骨代謝に関する研究を行うことが必須

生命倫理上のハードルは低く、また、人工多能性幹細胞となるが、その際、器官培養系による総合的な評価に加え、(iPS 細胞)と比較すると癌化のリスクが低いと考えられて個々の骨細胞の活性について理解することが重要である。

いる[3-5]。

しかし、現在多用されている株化細胞は生体内での骨芽細２． 実験と結果胞の機能が全て発現しているわけではなく、個々の細胞の特性を十分に理解できるとは言えない。そのため、より生

２．１ クサビラブタ頭蓋骨由来骨芽細胞株樹立

体に類似した機能を有する骨芽細胞を単離することが重要である。そこで、本研究では、生体に類似した機能を有実験は以下のような手順ですすめられた[6]。分娩直後する骨芽細胞を単離し、その生化学的評価を実施することの huKO ブタの頭蓋骨片 (3×3 cm 程度)を 3×3 mm 程度にを目的とした。なお、本研究では、ヒトと類似した生物学

細かく切断し、濾過滅菌済 2 ml 0.1%コラゲナーゼおよび的要素を有する大型動物であるブタに注目し、一度に多量

0.2%ディスパーゼ含有 0.01 M phosphate buffered salineの細胞を単離することが可能な実験方法を確立すること(PBS)にて処理した。頭蓋骨片 10 個あたりに上記の酵素処を目標とした。

理液 2 ml を 50 ml 遠沈チューブにいれて、37°C、10 分間、

クサビラオレンジ(humanized Kusabira-Orange; huKO)ブ

振とうさせた。上清のみを 100 µm セルストレーナーで濾タ(図 1)はサンゴ由来の赤色蛍光タンパク遺伝子を導入し過した。新しい酵素処理液を添加して、同様の操作を繰り返した。5 回目の濾過液に 10% FBS/α-MEM を 6 ml 添加し、たブタで全ての組織が赤色蛍光を示す[1]。

毎分 2,000 回転で 5 分間遠心した。細胞ペレットを確認し、上清を吸引し、新しい 10% FBS/α-MEM を 10 ml 添加した。
細胞塊を静かにピペッティング後、細胞懸濁液を 100 mm
カルチャーディッシュ上へ播種した。1 日おきに培地交換を行い、70~80%のコンフルエント状態まで増殖させた。
他方、骨移植片培養法については、以下の通りである。
骨片を 2～3 mm 大に細切し、これらをディッシュに数個の骨片を入れ、10%の FBS を含む α-MEM 培地中、37℃、5%CO2 下で培養した。数日後、骨片から細胞が多数遊出

図 1. クサビラオレンジ新生仔ブタ

してきた細胞を Trypsin-EDTA により剥離した後、適切な

通常、生体材料の生物学的な評価を実施する際には材料細胞数に希釈した細胞をディッシュへ再度播種し、培養をと細胞との相互作用を理解することが非常に重要となる行った。

が、現在、その相互作用を調べるためには細胞の固定や溶

huKO 新生仔ブタの頭蓋骨片を連続的に酵素処理するこ解などといった操作を行った後に観察、解析しなければなとにより、骨芽細胞様細胞を分離した(図 2)。得られた細らない。しかし、huKO ブタ由来の細胞を用いることにより、細胞を生きた状態のままで観察することが可能となる。
これは細胞をより生体に近い状態で観察できるだけでな

胞を蛍光顕微鏡により観察するとクサビラオレンジ遺伝
子由来のオレンジ色の発色が認められた。
次に、得られた huKO 細胞を 7 日間培養した後、cDNA

く、一つの細胞群での経時的な変化も解析することを可能

pool を合成した。それを鋳型に RT-PCR を行い、単離したとする。そこで、本研究では、huKO 頭蓋骨より骨芽細胞

細胞が骨芽細胞であるかどうかを骨分化関連マーカー遺40

伝子の発現から評価した(図 3)。その結果、様々な分化段階における骨関連遺伝子の発現が認められ、単離した細胞が骨芽細胞であることを同定した。また、各種マーカー遺伝子の発現が確認されたことから、単離した huKO 細胞群
は株化細胞とは異なり、様々な分化段階にある細胞集団であることが明らかになった。

図 4. huKO 由来骨芽細胞と MC3T3-E1 細胞におけるALP 活性の比較

図 2. 頭蓋骨から単離した骨芽細胞様細胞図 5. HAp セラミックスおよび培養プレート上でのhuKO 由来骨芽細胞の形態観察

非侵襲的に細胞の形態を経時的に観察することができる
ことは、材料と細胞との相互作用を理解する上で非常に有益であり、単離した細胞は様々な生体材料の評価に使用可能であると考えられる。さらに、本研究では、頭蓋骨の一部を利用し、細胞の単離・同定・評価を行ったが、新生仔
ブタ頭蓋骨を用いれば、一度に多量の細胞も単離可能であると思われる。したがって、連続酵素消化法により新生仔

図 3. 頭蓋骨から単離した骨芽細胞様細胞における骨分化マーカー遺伝子の発現

huKO ブタ頭蓋骨からより生体に近い状態の骨芽細胞を単離する本法は有用な方法であると判断できる。

さらに、得られた huKO 細胞を一定期間培養し、骨芽細胞の代表的な分化マーカーである ALP の活性染色を行っ

２．２ クサビラオレンジ新生児ブタ由来 mesenchymal
stem cell (MSC)の単離と培養技術の確立たところ、全ての細胞は紫色に染色され、また培養日数の経過と共にそれらの細胞は紫色に濃染されたことから高い分化能を有する骨芽細胞であることが分かった。続いて、
この単離した huKO 骨芽細胞と骨芽細胞の株化細胞であクサビラオレンジ新生児ブタ由来間葉系幹細胞の単離には、生後 1 週齢のクサビラオレンジ(humanized kusabiraorange; huKO) 新生児ブタ(約 3 kg)を犠牲にし、両足大腿る MC3T3-E1 細胞についてその分化能を比較するために骨を用いた(明治大学農学部、長嶋教授ご提供)。以下に示ALP 活性染色を実施した。その結果、huKO 細胞は培養しす方法で間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell; MSC)を単離た全ての期間において、MC3T3-E1 細胞よりも著しく高いした。

活性を有することが明らかになった(図 4)。

大腿骨の骨端をノミで割り落とし、骨端を落とした骨はしかし、単離した huKO 細胞を継代培養し、長期的な培

100 mm dish に入れて、乾燥しないように PBS に浸漬した。

養を継続したところ、ALP 活性の低下が認められ、初期のシリンジを使い、抗生物質含有 PBS(-)で骨髄を灌流し、出分化能が損なわれることが分かった。このことから、高いてきた液を 70 µm セルストレイナーで濾過した。濾液を遠分化能を維持したまま細胞を培養するためには、継代は 2

心分離(310 g x 5 min, 室温)し、上清除去後、PBS(-) 50 ml

回程度までとするのがよいと考えられた。

で懸濁した。懸濁液をさらに 40 µm セルストレイナーで濾さらに、単離した細胞を緻密な水酸アパタイト(HAp)セ

過し、濾液を遠心分離(310 g x 5 min, 室温)した。上清を除ラミックス上へ播種し、その形態観察を行った(図 5)。通去した後に、培養培地 10 ml で懸濁し、細胞数をカウント

常、光を透過しないセラミックス上で細胞の形態を観察すした。この際、チュルク液とトリパンブルーを加えてカウる際には細胞の固定、膜処理、蛍光染色といった操作を経ントを行った。翌日、PBS(-)で洗浄した後に培地交換を行る必要があるが、単離した huKO 細胞ではその工程を省くった。その後、3-4 日間ごとに半培地交換を行った。なお、ことができ、ポリスチレンプレート上の細胞を観察する時

培養液には、20%FBS/D-MEM を使用した。

と同じように生きたままの細胞の形態を蛍光下で直接観続いて、得られた MSC の分化誘導は以下の手順で行な察することができた。このように非透過性の生体材料上で41った。MSC は骨、脂肪、軟骨、筋肉など様々な組織の細(a)胞に分化することが可能である。そこで、今回単離した細胞が多分化能を有する MSC であるかを評価するために、はじめに骨(芽)細胞と脂肪細胞への分化誘導を行った。
上記で培養した細胞を 24 well plate へ播種し直し、コン
フルエントになるまで培養した。その後、各細胞へ分化誘導 す る こ と が で き る 培 地 (Osteogenesis Differentiation
medium, Adipogenesis Differentiation medium (Gibco))を用いて、分化誘導を行った。なお、分化の評価には、骨(芽)細胞は ALP 活性染色および Osteoimage Mineralization assay(b)(Lonza)を用い、脂肪細胞は Oil Red O 染色および Lipidtox(Invitrogen)を用いた。
はじめに、得られた MSC の分化能について調べるために、脂肪細胞と骨細胞への分化について検証した。細胞をコンフルエントになるまで培養した後、各細胞専用の分化誘導培地を用いて、培養を行い、誘導 7 日目と 14 日目の細胞の形態および分化マーカーの発現などを観察した。誘導 7 日目における MSC の脂肪細胞への分化能を調べた結
果、脂肪が存在すると緑色の蛍光が確認される Lipidtox は分化誘導していないもの(Non), 脂肪細胞へ分化誘導したもの(Adipocyte), 骨細胞へ分化誘導したもの(Osteoblast)いずれにおいても同程度に認められ、その蛍光は非特異的なものであることが考えられた(図 6)。また、Oil red O 染色も行ったが陽性反応は認められなかった(data not shown)。
このことから、誘導 7 日目では脂肪細胞へは分化していな
いことが明らかになった。
図 7. huKO MSC の骨細胞への分化 (誘導 7 日目)(a) ALP stain, (b) Osteoimage Mineralization assay

positive な細胞が多く認められたことから、増殖培地を用いて培養しても、骨細胞への分化が進行してしまうことが分かった。Mineralization assay では、Osteoblast のバックグ
ラウンドが高くなっていたが、特異的な蛍光は確認できなかったことから、石灰化はまだ起こっていなかったと推測される。
さらに、誘導 14 日目の分化能について調べたところ、
Adipocyte にのみ Lipidtox に反応した脂肪滴が確認された(図 8)。増殖培地(Non)でも骨細胞への分化が進行してしまったことから、脂肪細胞へ分化する割合が低減してしまったため、脂肪滴が確認できるまでに時間を要したと考えられる。なお、脂肪滴は他の培地を用いた場合には確認されなかった。骨分化に関しては、7 日目と同様に、Non においても ALP positive 細胞が多数観察され、骨細胞特有な配行性を示した(図 9a)。Adipocyte は僅かに紫色を呈したが、他の 2 条件と比較すると明らかに淡染色であったことか
図 6. huKO MSC の脂肪細胞への分化 (誘導 7 日目)

ら、骨への分化は抑制されていることが分かる。一方、骨続いて、骨細胞への分化能を ALP 活性染色(図 7a)と細胞へ分化した Osteoblast に関しては、細胞が完全に剥離

Mineralization assay (図 7b)を用いて検証した。ALP 活性染

してしまい、残った一部の細胞でしか評価できなかったが、色の結果、Osteoblast > Non >Adipocyte の順に活性が高い

細胞塊は強い ALP 活性を示し、さらに Mineralization assay

ことが分かった。特に、骨細胞へ分化誘導した細胞においても Osteoblast でのみ石灰化が観察されたことから、(Osteoblast)では、強い ALP 活性を示した。しかし、シー骨化が優先的に進行していることが明らかになった(図ト状になった細胞は dish に接着し続けることが困難で一9b)。以上のことから、今回単離した MSC は脂肪細胞や骨細胞へ分化可能な多分化能を有する細胞であることが分部剥離した細胞が存在した。他方、Non においても、ALP

42

かった。

単離することができれば、材料評価にも広く応用できると期待できる。

３． 考察及び今後の展望
本研究より、ブタ新生仔頭蓋骨から分離した細胞は優れた分化能を有する骨芽細胞であったということが明らかになった。複数のクローン間で細胞増殖や分化について検討した。各クローン間での有意な差は認められなかったが、増殖・分化の優れたクローンを検索するには最低 14 日程
度の培養を実施し、評価すべきであるということがわかった。しかし、形態から判断予想ができればもう少し短期間での評価が可能となると考えられる。いずれにしても本法で細胞の分離を実施することにより、骨分化能を有した骨芽細胞を単離できることが示された。
一方、huKO 新生仔ブタ大腿骨からも多分化能を有する
MSC を単離することができた。しかしながら、使用した培地(20%FBS/D-MEM)では骨細胞への分化が進行したと考えられ、脂肪細胞への分化はわずかであった。また、一般的に骨髄より採取した細胞に含まれる MSC の割合は極めて低いことから、本実験においてもその割合は低かった

図 8. huKO MSC の脂肪細胞への分化 (誘導 14 日目)

ことが推測できる。高純度の MSC を単離するためには、
FACS でソートをかける必要があるが、そこまでしなくと(a)も、ficoll などを用いて細胞の精製を行うことで純度を向上させることが可能であると考えられる。高い分化能と様々な組織への分化能を有する MSC を単離することができれば、材料評価にも広く応用できると期待できる。
また、今回の実験で培養開始時に用いる培地を十分に吟味する必要性があることも分かった。骨細胞への分化が優先的に起こってしまうと他の組織の細胞への分化は抑制(b)

されてしまうことが考えられる。多分化能を維持した
MSC の単離が最重要であると思われる。
【参考文献】
1. H. Matsunari, M. Onodera, N. Tada, H. Mochizuki, S.
Karasawa, E. Haruyama, N. Nakayama, H. Saito, S. Ueno,
M. Kurome, A. Miyawaki, and H. Nagashima, Cloning
Stem Cells, 10, 313-323 (2008).
2. M.F. Pittenger, A.M. Mackay, S.C. Beck, R.K. Jaiswal, R.
Douglas, J.D. Mosca, M.A. Moorman, D.W. Simonetti, S.
Craig, and D.R. Marshak, Science, 284, 143-147 (1999).
3. J.A. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S.S. Shapiro, M.A.
Waknitz, J.J. Swiergiel, V.S. Marshall, and J.M. Jones,
Science, 282, 1145-1147 (1998).

図 9. huKO MSC の骨細胞への分化 (誘導 14 日目)(a) ALP stain, (b) Osteoimage Mineralization assay

4. K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006).
5. M. Nakagawa, M. Koyanagi, K. Tanabe, K. Takahashi, T.

しかしながら、一般的に骨髄より採取した細胞に含まれIchisaka, T. Aoi, K. Okita, Y. Mochiduki, N. Takizawa, andる MSC の割合は極めて低いことから、本実験においても

S. Yamanaka, Nat. Biotechnol., 26, 101-106 (2008).

その割合は低かったことが推測できる。高純度の MSC を

6. A.D. Bakker and J. Klein-Nulend, Meth. Mol. Biol., 816,

単離するためには、FACS でソートをかける必要があるが、19-29 (2012).

そこまでしなくとも、ficoll などを用いて細胞の精製を行うことで純度を向上させることが可能であると考えられる。高い分化能と様々な組織への分化能を有する MSC を

43

骨形成レベルを視覚化する評価・解析手法の確立(2)‐遺伝子導入による double color 遺伝子導入 osteoblasts の創出‐
神澤信行、大杉仁美、初川淳一

１． はじめにあり、現在までに研究・改良が進められ様々な色の蛍光を

我が国では超高齢社会の到来に伴い、骨粗鬆症等の骨疾発するタンパク質が同定・製品化されている。GFP は遺伝患に苦しむ患者の方々が増加している。そのため、我々は、子発現とタンパク質間相互作用を生きた細胞内でリアル

骨疾患患者の Quality of Life の維持あるいは向上の実現を

タ イ ム に 可 視 化 で き 、 florescence-activated cell sorting

目指して、水酸アパタイト（HAp）表面をイノシトールリ(FACS)技術により細胞亜種を単離出来るといった応用例

ン酸（IP6）で修飾し、IP6 のキレート作用により硬化するから注目を集めている。本研究でもそれらの特徴を利用し、「キレート硬化型骨修復（IP6-HAp）セメント」を創製し蛍光タンパク質を骨分化マーカー遺伝子の promoter によた。また、我々は IP6-HAp セメントの多機能化をはかり、って細胞内で発現させることで、細胞を生かしたままリア

キレート硬化型骨修復セメントに「骨誘導能」
・
「抗菌性」
・

ルタイムで骨分化マーカー遺伝子の発現を可視化するこ「抗腫瘍効果」の 3 つの機能を付与した多機能性キレートとにした。これにより、RNA 抽出や染色などの複雑な操

硬化型骨修復セメントの開発を進めている。我々はこの 3作を行うことなく顕微鏡観察のみで骨分化過程の解析行

つの機能の中でも「骨誘導能」に着目し、骨修復セメント

えるようになるため、上述の障害を克服できると言える。

の骨誘導能評価方法の検討を試みている。

また GFP の蛍光は真核細胞において定量的であるという報告があるため[6]、簡便なだけでなく骨誘導の定量解析

１．１ 骨誘導と骨分化解析が行えると考えられる。骨形成に関する分野では現在まで

骨誘導とは骨外部に骨を形成するプロセスとして定義に GFP を type I collagen promoter のレポーターとしてされ、非骨芽細胞を骨芽細胞に分化させ骨を形成するプロ

promoter 活性の解析に用いる他に、骨髄間質細胞などにおセスを含んでいる。そのため生体材料の骨誘導能は、主にける骨分化集団の単離や[7,8]、骨形成能を持った薬剤や生

その材料上で未分化細胞を培養し、その細胞の骨分化過程

物活性物質のスクリーニングなどに用いた例[9,10]が報告を解析することで評価することが出来る。細胞の骨化過程されている。しかし、二種のプロモーターに異なる蛍光タの解析には alkaline phosphatase (ALP)や type I collagen

ンパク質を繋ぎ、骨化過程を経時的に観察出来る系はこれ(Col1a1)、bone sialoprotein (BSP)や osteocalcin (OC)などのまでに存在しない。この方法を用いれば、セメントの骨誘

骨分化マーカー遺伝子の発現解析などの分子生物学的手導能を顕微鏡で観察するだけで評価でき、迅速、簡便な評法[1]、骨分化マーカータンパク質や STRO-1 [2]や SB-10価が可能となる。

[3]、HOP-26 [4]といった細胞表面抗原に対する免疫染色な２． 実験と結果

どの免疫組織化学的手法、そして ALP 染色やアリザリン
レッド染色などの各種染色法などが主に用いられている。

２．1 蛍光タンパク質発現コンストラクトの作製

これらの手法はいずれも細胞を回収もしくは固定化する

マウス頭蓋冠由来骨芽細胞様樹立細胞株 MC3T3-E1 を必要があり、継続的な観察に不向きである。またこれらの実験操作は複雑な作業を伴うため実験技術の習得が必要

10-cm dish で培養し、genome DNA を抽出した。この genome

で、かつ時間とコストもかかるといったデメリットがある。

DNA を template として PCR により、各 promoter 配列を増そのため、より簡便で迅速な評価方法が必要とされている。

幅した。Type I collagen の promoter である col1a1 (約 2.3 kbp)

我々は新たな評価システムを構築することで、骨修復セメ

はント開発の迅速化に貢献出来ると考えている。

TCTAGACCCTAGACATGTAGA-3’の primer により増幅し、と5’-AAGCTTGGAACCCATTGCC-3’

5’-osteocalcin の promoter である OG2 (約 1.0 kbp)は 5’-

１．２	
  蛍光タンパク質の利用

AAGCTTGAATTGCTCATCGCAGC-3’と5’-骨誘導能評価システムの新しい手法として有用だと考TGCACCCTCCAGCATCCA-3’の primer で増幅した。それえられるのが蛍光タンパク質の利用である。蛍光タンパク

ぞれ増幅された promoter 配列は pGEM T-easy Vector にク

質とは 1960 年代にオワンクラゲから単離された Green

ローニングし、配列の確認を行った。図 1 に示す様にクロ

Fluorescent Protein (GFP)に代表されるように[5]、ある特定ーニング済みの col1a1 については promoterless 蛍光タンの波長の光をあてると蛍光を発するタンパク質のことでパク質発現 vector の pmCherry-1 と、OG2 については同様

44

２．４ Double color 遺伝子導入細胞の作製と観察
Col1a1-mcherry を安定に発現する細胞を選び出し、同細胞に対して、上記と同様に OG2-EGFP を遺伝子導入し、
安 定 株 の 単 離 を 行 っ た 。 こ の 際 、 OG2-EGFP に はhygromycin 耐性遺伝子を融合し、hygromycin (100 µg/ml)と G418 による二重選択を行った。その結果、図 3 に示す様に、培養期間によって同一細胞内で異なる蛍光発色を示す細胞が単離・精製出来た。分化誘導培地で培養開始後 4
図 1. 発現コンストラクトの模式図

日目(day4)においては、赤色蛍光を発する細胞が多く、緑Type I collagen の promoter は mCherry の上流に、osteocalcin

色蛍光を発する細胞が少ないのに対し、経日的に赤色蛍光の promoter は GFP の上流に繋ぎ、発現解析用プラスミドを構築しを発する細胞は減少し、緑色蛍光を発する細胞が増加してた。

いる様子が観察された。Day7 では両蛍光が重なり、黄色の細胞として観察する事も出来た。このことから、2 色のに pEGFP-1 と Eco RI および Hin dIII のサイトを使い蛍光の発現様式が骨分化マーカー遺伝子の既知の発現様

ligation し、形質転換用のプラスミドを構築した。

式と一致していると考えられた。また、21 日間経ってもGFP の蛍光を確認できたことから、プラスミドが 2 種類の選択抗生物質（G418 と hygromycin）を用いてスクリーニ

２．２ 遺伝子導入ングした事で安定的に導入されたと考えられた。

形質転換の前日に細胞数を計測し、翌日に 90% コンフ
ルエントになるように 6-well plate に MC3T3-E1 細胞を播種した。定法に従い、LipofectamineTM2000 (Invitrogen)を用いて、細胞に各プラスミド遺伝子を導入した。その後、
G418 を 400 µg/ml 含んだα-MEM 培地で 1 週間に 2 回培地交換しながら培養し、2 週間後に G418 耐性コロニーが形成されるのを確認した。シングルコロニーを単離し、希釈培養する事で、コロニー精製を行った。

２．３ 蛍光顕微鏡による経過観察
Col1a1 promoter を導入したものはその 1 週間後、OG2
promoter を導入したものはその 10 日後に蛍光顕微鏡で細胞を観察した。そこで蛍光が観察された細胞を精製・継代し、さらに同様の期間培養した後に顕微鏡で観察し(図 2)、
図 3. 蛍光顕微鏡を用いた double color 遺伝子導入細胞の観察

3 次スクリーニングでも蛍光が確認された細胞を、安定導2 種のプラスミドを導入した MC3T3-E1 細胞を分化誘導後 4, 7, 14,

入遺伝子細胞株としてその後の実験に用いた。

21 日目に観察した。左のパネルは col1a1 の発現を中央のパネルはOG2 の発現をそれぞれ観察し、右のパネルはそれらを重ね合わせたものである。

２．５ Double color 遺伝子導入細胞の増殖性評価
Double color 遺伝子導入細胞の増殖能と形態について、野生型の MC3T3-E1 細胞と比較した。遺伝子導入はゲノム上にランダムに起こる事から、細胞の生存や増殖、分化等に影響をあたえることが考えられる。そこで分化誘導培地
で細胞を経日的に培養し、増殖曲線の作成と位相差顕微鏡による細胞の形態観察を行った(図 4)。
その結果、増殖曲線には野生型の細胞との差はみられず、遺伝子導入したことによる増殖能への変化はないものと考えられた。しかしながら形態観察を行うと、野生型の細胞ではあらゆる方向に足をのばして、広々と張り付いてい図 2. 遺伝導入後の 2 次スクリーニングの一例

る様子が確認されたのに対し、double color 遺伝子導入細Type I collagen の promoter を mCherry の上流導入したプラスミド

胞は細長い形態をしている細胞が多く、二つの方向に足をで細胞を形質転換した。1 次スクリーニングでポジティブでも、2 次ス

のばしていることが観察された。2 種類のコンストラクト

クリーニングでは蛍光が失われてしまうものが多く、安定に導入できを挿入していることから、挿入した時もしくは細胞のスクた細胞だけを 3 次スクリーニングに回した。

45

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図 4. Double color 遺伝子導入細胞の増殖性評価と形態観察
Double color 遺伝子を導入した細胞について、その細胞増殖性(A)と図 5. Double color 遺伝子導入細胞の遺伝子発現解析

形態(B)について経時変化を追って野生型 MC3T3-E1 細胞と比較しDouble-color 遺伝子を導入した細胞について、実際にそのマーカー

た。

遺伝子の発現と、内在性のマーカー遺伝子の発現が同期しているかを確認するため、RT-PCR によって遺伝子発現解析を行った。

リーニングを行う際に使用する選択抗生物質が細胞の形態に影響を及ぼしたことが考えられた。詳細には付いては(図 6)。その結果 day 14 までは両細胞とも同じような活性

今後の解析が必要である。

を示した。しかしながら day 21 において double color 遺伝

２．６ Double color 遺伝子導入細胞の遺伝子発現解析

子導入細胞において著しい活性の減少が見られた。過去の

蛍光タンパク質の遺伝子発現が、内在する骨分化マーカ

ALP 活性染色の結果と合わせると、継代を重ねた細胞ではー遺伝子の発現と対応しているかどうかを確かめるため、培養後期に活性の速やかな低下が見られることが示唆さ

double color 遺伝子導入細胞を分化誘導培地で経日的に培れ、今後精査する必要があると考えられる。

養し、RNA 抽出および RT-PCR を行って遺伝子発現を解析した。増幅した各遺伝子は内部標準である gapdh のバン
ド強度で標準化し、各遺伝子の平均バンド強度を 1 として相対バンド強度をグラフにした(図 5)。その結果、骨化の初期マーカーである Type I Collagen の発現は培養初期に高く、後期に低下していく傾向を示した。これと同じ様に、
mCherry 遺伝子の発現は培養初期に高く後期に低下した。
また、骨化の後期マーカーである osteocalcin と EGFP の発
現はどちらも培養初期には低く抑えられ、後期に向けて高くなっていることが確認出来た。このように蛍光タンパク質の遺伝子としての発現量は、内在するマーカー遺伝子の発現量とよく対応する事が分かった[11]。また、蛍光観察の結果ともよく一致し、遺伝子の発現を蛍光の発光量として捕らえる事が期待出来る。上記の様な結果から形質転換細胞の作製に成功したと考えられる。

２．７ Double-color 遺伝子導入細胞の ALP 活性評価
骨分化後期マーカーである osteocalcin は分化した骨芽細胞によって合成されるのに対して、ALP は未分化な骨芽図 6. Double color 遺伝子導入細胞の ALP 活性評価

細胞活性を反映する。従って ALP の活性を測定する必要

分化誘導培地で培養開始後 21 日目までの細胞について、ALP 活性もあると考えた。通常細胞と double color 遺伝子導入細胞を測定し比較した。上段は活性測定時の発色の様子。下段は吸光度とで経日的にどの様に ALP 活性が変化するのかを調べた。

測定の結果をグラフ化した。

46

２．８ Double color 遺伝子導入細胞の石灰化の解析なかった。今後、再度 genome を抽出し、genomic PCR を増殖曲線における増殖挙動の解析で得られた結果から、行っていく必要がある(data not shown)。

増殖能に問題ないことが確認できた一方で、野生型の今後は導入遺伝子細胞を用いた応用実験を行なっていMC3T3-E1 細胞との比較実験で day 21 において ALP 活性

く。具体的には生体材料の早期実現化に向けて、この細胞に差がみられたため、分化誘導培地で MC3T3-E1 細胞とを用いた評価を行っていくとともに、まだ分化誘導培地とdouble color 遺伝子導入細胞を 21 日間培養し、Alizarin red

して条件が定まっていない培地の検討もこの細胞を用い染色により石灰化状態を解析した(図 7)。その結果、分化れば遺伝子発現解析などの方法よりも正確なデータが出

誘導促進剤を添加していない DEX 0 nM と DEX 10 nM をせると考えている。

添加した場合、細胞の染色は両細胞ともに確認されなかった。しかし、ハイドロコルチゾンを含む骨芽細胞分化試薬【参考文献】を添加した場合は両細胞共に赤く染色されていることが1.

I. Kalajzic, Z. Kalajzic, M. Kaliterna, G. Gronowicz, S.H.

確認できた。よって、増殖曲線の結果と合わせて double

Clark, A.C. Lichtler, and D. Rowe, J. Bone Miner. Res., 17,color 遺伝子導入細胞の正常な成長・分化を確認すること

15-25 (2002).

が出来た。しかし、DEX は分化誘導促進剤といわれてい2.

るのにも関わらず、今回の実験では石灰化が起こらないこ

P.J. Simmons and B. Torok-Storb, Blood, 78, 44-62(1991).

とが確認でき、過去に報告された通り、最適化された濃度

3.

S.P. Bruder, N.S. Ricalton, R.E. Boynton, T.J. Connolly,

以外では石灰化を抑制していることが示唆された[12]。学

N. Jaiswal, J. Zaia, and F.P. Barry, J. Bone Miner. Res., 13,

術論文にも石灰化を抑制するという報告が多くされてい

655-663 (1998).

る事から、今後はハイドロコルチゾンを含む骨芽細胞分化

4.

試薬を添加して double color 導入遺伝子体を培養していく

C.J. Joyner, A. Bennett and J.T. Triffitt, Bone, 21, 1-6(1997).

とこととする。

5.

O. Shimomura, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 48,
5590-5602 (2009).

6.

M.R. Soboleski J. Oaks, and W.P. Halford FASEB J., 19,449-442 (2005).

7.

M.L. Stover, C.K. Wang, M.B. McKinstry, I. Kalajzic, G.
Gronowicz, S.H. Clark, D.W. Rowe, and A.C. Lichtler,
Mol. Ther., 3, 543-550 (2001).

8.

A. Balic and M. Mina, Orthod. Craniofac. Res., 8,252-258 (2005).

9.

K. Jang, K. Sato, K. Igawa, U.I. Chung, T. Kitamori Anal.
Bioanal. Chem., 390, 825-832 (2008).

10. Y. Takahashi, S. Tsuji, Y. Kazuki, M. Noguchi, I Arifuku,
Y. Umebayashi, T. Nakanishi, M. Oshimura, and K. Sato,
図 7. Alizarin red 染色による石灰化の解析

J. Biochem., 148, 29-34 (2010).

Double color 遺伝子を導入した細胞について、実際にそのマーカー

11. A. Sakaue-Sawano, H. Kurokawa, T. Morimura, A. Hanyu,

遺伝子の発現と、内在性のマーカー遺伝子の発現が同期しているかを確認するため、RT-PCR によって遺伝子発現解析を行った。

H. Hama, H. Osawa, S. Kashiwagi, K. Fukami, T. Miyata,
H. Miyoshi, T. Imamura, M. Ogawa, H. Masai, and A.
Miyawaki, Cell, 132, 487-498 (2008).

３． 考察及び今後の展望

12. Y.F. Chou, W.B. Huang, J.C.Y. Dunn, T.A. Miller, and

二種類のコンストラクトを挿入した MC3T3-E1 細胞は、

B.M. Wo, Biomaterials, 26, 285-295 (2005).

蛍光顕微鏡での観察結果と遺伝子発現解析結果をふまえると、骨分化マーカー遺伝子の発現に対応して蛍光タンパ
ク質が経日的に発現していることが確認された。また増殖曲線の作成、ALP 活性測定、石灰化の解析結果から、二種類のコンストラクトを MC3T3-E1 細胞に挿入しても、増殖能や骨分化能は通常細胞と差がみられないことが確認できた。
しかし、目的の遺伝子が genome 上のどの部位に挿入されたかを特定する必要がある。今回 genomic PCR で導入遺伝子体の genome への組み込みを確認するために PCR により目的配列の増幅を試みたが、非特異のバンドが多く検出されてしまい、目的サイズのバンドを確認することができ

47

抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(1)‐銀含有アパタイトによるアプローチ‐
本田みちよ、石井 賢、川延勇介、清水友亮、相澤 守

１． はじめにそこで、本研究では、キレート硬化型セメント原料中へ

骨疾患患者の生活の質(quality of life; QOL)の向上をめ

抗菌性を保持するよう作製した微小球[4]を添加し、抗菌ざすためにはより高度な先進医療を実現する必要がある。

性を有する骨修復セメントを創製した。

現在、骨疾患の治療法には自家骨移植が多く行われている

より具体的には、セメント原料中に抗菌性を有する銀をが、健常部位への二次的な侵襲や採取量の限界といった問含有させた微小球を添加して、セメントを作製することで、題があり、自家骨に代わる人工材料の開発に注目が集まっ

銀イオンの溶出により抗菌性を発現するようなマテリアている。

ルデザインである。本研究では、抗菌性セメントの開発をこれまでに水酸アパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2; HAp)など行うための要素技術の一つとして、銀含有リン酸カルシウのバイオセラミックスを利用した骨補填剤が整形外科なム微小球を作製し、これによる抗菌性セメントを開発する

どの領域で臨床応用されており、その材料形状には緻密ことを目的とした。

体・多孔体・顆粒・セメント(ペースト状人工骨)などがあ

２． 実験と結果る。そのなかでも任意の形状に成形可能なセメントは、よりニーズの高い材料であり、その開発にも期待が高まっている。また、このペースト状人工骨を用いた骨セメント注

２．１ In vivo での抗菌性発現の可視化入療法は低侵襲性という点で患者への負担を軽減できる	  抗菌性生体材料の創製に際し、in vitro での評価は当然ことから、医療現場からのニーズは高まる一方で、国内外であるが、in vivo においても抗菌性が発現しているかどうの熾烈な競争を生んでいる要因の一つと考えられる。しかかを調査することは非常に重要なことである。そこで、本しながら、現在臨床現場で利用されているセメントは硬化研究では、まず in vivo イメージングが実施できる装置時における力学特性や生体適合性を含め、多くの問題を抱（IVIS）を利用して、in vivo での抗菌性試験に使用できる

えているのが現状である。

モデルマウスの作出を行なった(図 1)。

そこで、我々は現状の問題(硬化時間、pH 変動、体内への残存など)を解決するために、「イノシトールリン酸(inositol hexaphosphate; IP6)」のキレート作用を利用して従来の反応とは異なったメカニズムで硬化する新規の骨修復セメントの開発を行っている[1]。さらに、医者も患者も安心して使用することができるセメントを創製するために、このセメントに新たな機能を付与し、単なる骨セメ
ントとしてではなく、その用途を拡充させた高機能セメントの作製も試みている。ここでは、キレート硬化型骨修復
セメントとそれに新たな機能として「抗菌性（感染防止）」を付与したセメントについて報告する。
抗菌性を付与させる理由には、外部から埋入部への細菌感染という問題があげられる[2]。生体材料を体内に留置する手術では、術後感染の危険性が高く、いったん発病す
ればその予後は不良であり、感染は治療を困難なものとする。感染症の遷延化の原因の一つに細菌の形成するバイオフィルムがあるが、バイオフィルムは一度インプラント表

図 1. 抗菌 in vivo 実験用マウスの作出(IVIS: in vivo imaging system)

面に形成されるとバイオフィルム内部の細菌が抗生物質や免疫に対し、強い抵抗性を示し、インプラントの抜去や

図 1A は、ルシフェラーゼ活性をもつ黄色ブドウ球菌をシ

多数回の手術を含めた加療が必要となる[3]。そのため、ャーレ状に播種し、コロニー形成を行なったものである。

患部への効率的な薬剤送達を目的とし、薬剤と人工骨など

化学発光もしくは蛍光のフォトンカウントから細菌数をを複合化した材料の開発の推進が強く望まれている。

定量化でき、光強度と菌数は比例関係にあることが分かる

48

(図 1C, 左)。さらに、図 1B は実際に作出したモデルマウ
スの写真である。マウス大腿骨に遺伝子改変した黄色ブドウ球菌を植え付け、同一個体における生菌数をリアルタイ
ムで追跡することができる。その結果が図 1C, 右に示されており、in vivo においても生菌数が可視化および定量化できることが理解できる。このシステムを利用することで、同一個体において、非侵襲的に in vivo における抗菌性を評価することを可能とした[4]。

２．２ 銀含有リン酸カルシウム中空微小球の合成
試料溶液は Ca/P 比が 1.67 となるように、0.50 mol·dm-3
Ca(NO3)2·4H2O, 0.30 mol·dm-3 (NH4)2HPO4, 0.40 mol·dm-3
HNO3 および AgNO3 を混合して調製した。なお、Ag 添加

1 µm

量は HAp に対して 0, 1, 5 および 20 mol%とした。上記の 4種類の試料溶液について、熱分解条件を上部電気炉温度

図 3. 銀含有微小球の表面形態

850 °C、下部電気炉温度 300 °C とし、超音波振動数は 2.4

２．３ 銀含有リン酸カルシウム中空微小球の特性評価
２．３．１ 	  銀含有リン酸カルシウム中空微小球のキャ
ラクタリゼーション

MHz に設定して超音波噴霧熱分解[5]を行い、銀含有 HAp(Ag-HAp) 微小球を得た。過剰な硝酸塩は、微小球を合成
後、純水中で超音波洗浄することで除去した。これを「洗Ag-HAp 中の Ag+の担持量を測定するために、ICP-AES

浄粉体」とした。

を用いて Ag イオンの定量を行った。その結果、全ての系得られた合成粉体および洗浄粉体の粉体性状を粉末 X

列で Ag の仕込み量に対し、約 80%の Ag を担持できてい線回折法(XRD), 赤外分光光度法(IR), 走査型電子顕微鏡ることが確認された。

法(SEM)および誘導結合プラズマ発光分光法 (Inductively

また、Ag が HAp の格子内に取り込まれているか否かを

Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry ; ICP-AES)な検討するために、Ag-HAp 加熱粉体を調製した後、そのキどを用いて調査した。

ャラクタリゼーションを行った。まず、合成した 4 種類の始めに、それAg-HAp 粉体（0-20 mol%）0.5 g を箱型電気炉を用いて、ぞれ Ag 添加量

保持温度 900 ºC, 1 h、昇温速度 10 ºC/min の条件で焼成をが異なる 4 種類行った。これを「加熱粉体」とした。焼成の際、着色防止の試料溶液(0, 1,のためアルミナボートを使用した。「加熱粉体」のキャラ

5, 20 mol%)からクタリゼーションを SEM, XRD を用いて行った。調製し得られた粉体のた「加熱粉体」の表面形態観察を行った結果より、加熱後結晶相を XRD にでも表面形態に大きな変化はなく、球状粒子を保っていた。

より同定した。

さらに、「加熱粉体」の格子定数測定結果より、Ag 添加に

これより、Ag を

より a 軸, c 軸ともに多少の変化は認められた(表 1)。しか添加した洗浄粉

し、Ag のイオン半径は 1.30 Å であり、Ca のイオン半径体および Ag 無（1.14 Å）と比較して大きいため、Ag が HAp 格子内に取添加の洗浄粉体
ともに、HAp にり込まれていると仮定すると a 軸, c 軸ともにさらに大幅

図 2. 銀含有微小球の XRD パターン

な上昇が確認されるはずである。

帰属される回折

表 1. 銀含有微小球の格子定数ピークのみ認められた(図 2)。また、Ag の含有に伴い、ピークがブロードとなったことから、合成粉体は低結晶性の粉体であることが分かる。一方、FT-IR スペクトルより、合成粉体に残存している硝酸イオン(NO3-)は純水で洗浄処理することにより除去されることが確認された (data notshown)。
次に、得られた洗浄粉体の SEM による形態観察結果を格子定数 / nm

Samplea軸

c軸

Ag-HAp(0)Ag-HAp(1)Ag-HAp(5)Ag-HAp(20)0.9415(2)0.94222(7)0.94217(12)0.94211(9)0.68789(3)0.68796(8)0.68809(14)0.68781(11)

図 3 に示す。Ag 添加、無添加いずれの場合も、球状粒子

したがって、本法で合成した Ag-HAp 粉体中の Ag は、で構成されており、球状粒子の中には窪んだ粒子も観察さ固溶しているのではなく、微小球中に分散していると考えれた。Ag 添加量は微小球の形態に大きな影響を与えないられる。特に、Ag-HAp(20)粉体について、TEM により観ことが分かった。なお、いずれの微小球も平均メジアン径察を行った結果、粉体の表面にドット状の Ag ナノ粒子がは約 2 µm であった。

確認されている。さらに、エネルギー分散型 X 線分析(EDX)による元素分析の結果からは、Ag-HAp(20)粉体表面

49

上の Ag ナノ粒子には Ca, P, O および Ag のピークが検出

g 微 小 球 粉 体 (Ag-HAp(0), Ag-HAp(1), Ag-HAp(5),されている。これらの結果も、Ag+イオンが HAp 構造中に

Ag-HAp(20))を混合し、37°C, 48 時間培養を行った。培養

置換固溶しておらずに、微小球中に均一に分散しているこ

後、コロニー数をカウントすることにより、抗菌性を評価とを裏付けている。結果として、本研究で合成した Ag-HAp

した(表 2)。

粉体は従来の Ag-HAp 粉体よりも Ag による着色が抑制さ

表 2. Ag-HAp 粉体の S. aureus に対する抗菌性評価れているものと推測できる。
Sample２．３．２ 銀含有リン酸カルシウム中空微小球からのAg イオン放出挙動の調査

Bacterial strain

Bacterial number Number of colony/cells/ 48 h
8.06×103

Control

6.05×103
2.87×102
4.00
0

それに HEPES バッファー(pH 7.3)を 10 cm3 加えて、

Ag-HAp(0)Ag-HAp(1)Ag-HAp(5)Ag-HAp(20)

Ag-HAp 微小球からの Ag+イオン放出挙動調査を行った。

Ag+イオンの仕込み量が 1 mol%以上の場合、菌の増殖を放出試験後に遠心分離を行い、上清に含まれる Ag+イオン

抑制することがわかった。さらに、Ag+イオンの仕込み量

4 種類の Ag-HAp 粉体 0.1 g を 15 cm3 チューブに秤取り、+

S.aureus

4.00×102の量を ICP-AES により定量した。図 4a に Ag イオンの放が 5 mol%以上ではほぼコロニー形成が確認されず 20

出量測定結果、図 4b に Ag+イオンの放出率を示す。

mol%になると、菌は全く生存できなかった[6]。

(a)り、Ag-HAp ディスクを作製した。これを粉体での抗菌性

次に、この粉体を水と混練、一軸加圧成形することによ(b)

評価と同様に標準寒天培地中に設置し、S.aureus と共に
37°C, 48 時間培養を行った。培養後、形成された阻止円を画像解析ソフト(ImageJ)を用いて、相対抗菌面積を算出した(図 5)。その結果、Ag+イオンの添加量に依存して、阻止円が大きくなることが明らかになった。また、相対抗菌面積を比較したところ、5 mol%以上の Ag+イオン添加で抗菌性の大幅な上昇が確認された。これらの結果は、粉体で行った抗菌性試験の結果(表 1)と一致している。また、通常、
図 4. 銀含有微小球からの Ag+イオンの放出量（a）と放出率（b）

Ag 含有セラ

Ag+イオンの放出量は Ag の添加量に比例して増加した。

ミックスでまた、浸漬時間の経過とともに、総計 Ag+イオンの放出量

は，Ag の酸が増加したことも確認できた。さらに、Ca2+イオンと PO43-化により着イオンの放出についても調べたところ、いずれのイオンも色現象が起浸漬時間の経過とともにその放出量が増加していた。つまこるが、超音+り，Ag イオンは微小球表面からだけではなく、微小球の波噴霧熱分溶解に伴い、内部からも放出されたものであると推測でき

解法により

+

(a)

合 成 し たる。なお，Ag イオン放出試験後の粉体を回収し、特性評価を行ったところ、表面形態には大きな変化はなかったが、Ag-HAp 微小Ag 添加量が 5 mol%以上の粉体では微小球表面に Ag ナノ

球は、黒色に粒子の存在が確認できた。これは微小球の溶解により内部呈色しない。

に担持されていた Ag ナノ粒子が表面に現れたものである

これは、本法と考えられる。また、XRD の結果から、結晶相の変化はは溶液を介確認されなかったが、いずれの粉体も結晶性が低下していして粉体がた。これらの結果は、合成した Ag-HAp 微小球がその溶解

調製される

+

性を利用し、表面および内部に局在する Ag イオンを長期ため、Ag がにわたり、放出させることが可能な材料であることを示し

微小球中に

ている。

均一に分散

(b)

***: P < 0.001

することで、

２．４ 銀含有リン酸カルシウム中空微小球の抗菌性評
価２．４．１ 銀含有リン酸カルシウム中空微小球粉体およびディスクの in vitro 抗菌性評価

黒色に着色
しなかった
と考えられ
る。

Ag-HAp 微小球粉体単独での抗菌性を in vitro で調査するために、標準寒天培地中に黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus IAM 1011; S.aureus, 1×102 cells)と 0.150

図 5. Ag-HAp ディスクの抗菌性の比較(a) ディスクにより形成される阻止円(b) 阻止円の相対面積比による抗菌性の比較

２．４．２ 銀含有リン酸カルシウム中空微小球の invivo 抗菌性評価

Ag-HAp 粉体と任意の割合（Ag-HAp[w]: β-TCP[w] =100:0,

Ag-HAp(0)および(5)洗浄粉体 0.35 g に対し、純水を固液

75:25, 50:50, 25:75 および 0:100）で瑪瑙乳鉢内で混合し、

IP6/β-TCP 粉 体 は 既 報 [7] に 従 い 、 調 製 し た 。 こ れ を「Ag-HAp/ β-TCP 粉体」を得た。

比 1/0.3 [g/cm3]の割合で加え、直径 10 mm の成形器を用いて、成形圧 100 MPa で一軸加圧成形を行った。24 時間室

以後、β-TCP 粉体に Ag-HAp(5)粉体を 25 mass%混合し温で養生後、180°C, 3 h の条件で乾熱滅菌を行ったディス

た粉体を“Ag(5)-(25)”のように略記する。

クを「IVIS 評価用ディスク」とした。Balb/c 12 w (♂)のマ
および 9.6×105 CFU·cm–3 に調製したメチシリン感受性黄２．５．１	
  Ag-HAp/β-TCP セメントのキャラクタリゼーシ
ョン色ブドウ球菌[4]とともに共培養し、所定の時間で IVIS を

Ag-HAp/β-TCP セメントの結晶相を同定するために、用いて生物発光イメージング（BLI）を経時的に観察した。

XRD による評価を行った。Ag-HAp(5)/β-TCP セメントのさらに、BLI のフォトンカウントから細菌数を定量した。

代表的な XRD パターンを図 7 に示す。Ag(5)-(25)粉体およ

ウスを用いて皮下ポケット内で「IVIS 評価用ディスク」

Ag-HAp 微小球を圧縮成形したディスクでの抗菌性を in

びそれより作製したセメントともに、HAp およびβ-TCP

vivo で調査した結果を図 6 に示す。

の混合相であることが確認された。
また、混合

(a)

粉体をセメ
(b)

ントにする
こ と で 、
β-TCP の 割合が減少し、
HAp の 割 合
が増加して
いることが
わかる。この時 β-TCP か

図 6. Ag-HAp 微小球の in vivo 抗菌性評価

ら HAp への(a) IVIS による in vivo イメージング(b) 黄色ブドウ球菌の増殖曲線

転 化 率 を
XRD パターそ の 結 果 、 Ag+ イ オ ン を 添 加 し て い な い サ ン プ ル

ンの回折線

図 7. Ag-HAp/β-TCP セメントの XRD パターンAg-HAp(0)では、術後直後から菌数が増加し続けており、の相対強度から算出した結果、β-TCP は 74%から 50.4%へ抗菌性が発現していないことがわかる。一方、Ag+イオン

減少し、HAp は 26%から 49.6%に増加した。これは、セメを添加したサンプル Ag-HAp(5)は術後 2 日目までに菌数がント作製の際に純水ではなく、2.5 mass%の Na2HPO4 水溶激減しており、顕著な抗菌性を発現していることが分かる。

液を使用しているため、水和反応が加速され、最終生成物

つまり、Ag-HAp ディスクは in vitro [6]だけではなく、inの HAp 含有量が増加したことが原因であると考えられる。

vivo においても強い抗菌性を発現する優れた材料である

抗菌性試験でポジティブなデータが得られた

ことが明らかになった。しかし、現行のディスクでは強度

Ag-HAp(5)粉体を添加剤として使用し、「Ag(5)/β-TCP セメに問題があり、長期的な観察および評価は難しい。また、ント」を作製して、その圧縮強度試験を行った。その結果、背部皮下への埋入は感染巣を覆う組織がないため、細菌増セメントの圧縮強度は約 10 MPa 程度であったが、Ag-HAp

殖と炎症が局在化せずに広く分布してしまう可能性があの添加量に伴い、圧縮強度の低下が確認された(data notる。そこで、サンプルの高強度化を図ると共に、in vivo にshown)。これは、β-TCP セメントに混合した微小球がクラおける評価方法を検討する必要がある。

ックの発生源となるため、微小球の添加量に比例して破断しやすくなったためであると考えられる。したがって、圧２．５ Ag-HAp/β-TCP セメントの試作と評価

縮強度をさらに求めるためには微小球表面の加工を行い、Ag-HAp は、粉体およびディスク単独で、抗菌性を有す

摩擦を多くすることでパッキング性能を向上させるなどる優れた材料であることを証明した。さらに、実用化を指の改善が必要であるといえる。

向するためには、生体内で非崩壊性を有するセメントを作

Ag-HAp 粉 体 よ製する必要がある。しかしながら、Ag-HAp 粉体だけではり作製したディス

非崩壊性のセメントを作製することはできなかった。

クは水中では崩壊

そこで、本節では、実用化を指向し、Ag-HAp 粉体を我々してしまうため、がこれまでに開発した「非崩壊性 β-TCP セメント」への寒天培地以外で培添加材として利用することで、「非崩壊性 Ag-HAp/β-TCP

養することが困難

セメント」を作製し、その評価を行った。

であった。そこで、

51

Ag-HAp デ ィ ス ク

Ag-HAp セ メ ン ト

図 8. 水中での崩壊性試験

作製した Ag-HAp/β-TCP セメントが水中で崩壊しないかがわかった。一方、Ag-HAp(20)/β-TCP 粉体も同様に、どうかを調べた。β-TCP 粉体に Ag-HAp(5)粉体を 50 mass%

Ag-HAp 粉体の添加量が 25, 50 および 75 mass%の粉体で抗添加したサンプルまでは、非崩壊性のセメントが作製でき菌性が発現した。Ag-HAp(5)/β-TCP セメントと比較するとていることが確認された(図 8)。しかしながら、75 mass%

その相対抗菌面積の値が大きかった(data not shown)。

以上添加してしまうと崩壊していることが確認された。

次に、バイオフィルム形成試験を実施した。ここでは、Ag(0)/β-TCP と Ag(5)/β-TCP セメントについて示す(図 11a)。

２．５．２	
  Ag-HAp/β-TCP セメントからの Ag イオン放出挙動の調査LIVE/DEAD® BacLight 染色後に蛍光顕微鏡で観察した結果、Ag+イオン添加に伴い、セメント表面上の菌が減少し+次に、Ag-HAp/β-TCP セメントからの Ag イオン溶出量ていることが確認された。さらに、材料表面上の菌形態おを調査するために、37 ºC、pH 7.3 の HEPES バッファー中

よび材料と菌との接着を確認するために SEM による菌の+形態観察を行った(図 11b)。その結果、Ag(0)-(25)セメント

イオン放出量は経過時間に比例し、増加していることが確

上には、大量の菌が確認されたのに対し、Ag(5)-(25)セメ

認できた。5 日目から 7 日目に粉体の時と同様に微小球表

ント上では、明確に菌の付着を阻害していることが確認さ面に存在している Ag ナノ粒子が多量に放出されるため、れた。さらに、Ag 含有セメント上の細菌で溶菌と思われ初期の放出量が多くなっていることが確認された。しかし、る現象が確認された。この理由として、Ag+イオンが菌へ粉体と比較してセメントは、β-TCP 粉体と混合しているこ

直接的に作用をしていることが考えられる。

で Ag (図 9)および Ca, P (図 10)の放出挙動を調べた。Agとで、Ag+イオンの溶出が遅くなり、さらに長期間の Ag+(a)

イオンの徐放が期待できる。特に Ag(5)-(25)サンプルは、5日目から 21 日目まで細菌感染を阻止できる Ag+イオンの徐放が確認された。したがって、これらのセメントは粉体よりもゆっくりかつ長期間にわたって抗菌性が持続すると考えられる。

(b)

図 9. Ag-HAp セメントからの Ag+イオン溶出

(a)

(b)
図 11. Ag-HAp セメントによるバイオフィルム形成阻害(a) LIVE/DEAD® BacLight 染色による評価(b) SEM による菌の形態観察

２．７	
  Ag-HAp/β-TCP セメントの生体適合性評価
セメントの生体適合性を調査するために、骨芽細胞様樹立株(MC3T3-E1)を用いた直接播種試験を行った(図 12)。
細胞増殖性および細胞の形態観察の結果から、Ag(0)-(25)図 10. Ag-HAp セメントからの Ca2+ (a)および PO43- (b)イオンの溶出セメント試料片における細胞は、初期付着率を反映して 1
日目に減少したが、その後、良好に細胞が増殖していることがわかった。しかしながら、Ag(2)-(25)セメントおよび

２．６	
  Ag-HAp/β-TCP セメントの in vitro 抗菌性評価

Ag(5)-(25) セ メ ン ト に 接 着 し て い る 細 胞 数 は 各 日 数 ではじめに Ag-HAp/β-TCP セメントの抗菌性評価をする

control（ポリスチレンプレート）および Ag(0)-(25)セメン

ために、阻止円法による試験を行なった。Ag(2)/β-TCP 粉体から作製したセメントは、β-TCP の添加量にかかわらず、
β-TCP を混合した全てのセメントで明確な阻止円を形成

トよりも下回っていた。特に、Ag(2)-(25)セメントよりもAg(5)-(25)セメントの細胞数が少ないこと確認された。このような結果が得られた理由としては、サンプルの表面粗しなかった。Ag(5)/β-TCP 粉体に関しては、Ag-HAp 粉体

さや Ag の放出が関係していると考えられる。

の添加量が 25, 50 および 75 mass%の粉体で抗菌性を発現

一方、Ag(2)-(25) および Ag(5)-(25)セメントでは、培養し、添加量の増加に比例して抗菌面積が増加していること52

1 日目から 3 日目にかけて細胞増殖が抑制されたが、培養その結果、β-TCP 粉体に Ag-HAp(5) 粉体を 50 mass%添

3 日目以降では細胞数が増加する傾向にあったことから、加したサンプルまでは、非崩壊性のセメントが作製できて

Ag-HAp セメント上において細胞は、培養初期にはリリーいることがわかった。そこで、次に Ag-HAp/β-TCP セメンスされた Ag+イオンの影響を受けるが、長期間培養するとト用いた抗菌性評価を行った。その結果、Ag+イオンの仕その影響は軽減されることが推測された。

込み量が 5 mol%以上の粉体かつ Ag-HAp 粉体の添加量が25 mass%以上のとき、明確な阻止円が確認された。さらに、
これらのセメント表面には黄色ブドウ球菌がバイオフィ
ルムを形成しないことが確認された。また、明確な阻止円を形成したサンプルでは、溶菌と見られる現象が確認された。続いて、このセメントの生体適合性を調査するために、
骨芽細胞様樹立株(MC3T3-E1)を用いた細胞増殖性試験を行ったところ、Ag+イオンを含有したセメントでは，培養
1 日目から 3 日目にかけて細胞増殖性能が含有していないものに比べて低下した。しかしながら、培養 3 日目以降では細胞数が増加する傾向にあったことから、Ag-HAp セメ
ント上において細胞は、培養初期にはリリースされた Ag+

図 12. Ag-HAp セメント上での細胞増殖性試験

イオンの影響を受けるが、長期間培養するとその影響は軽減されることが推測された。
以上の結果より、Ag-HAp/β-TCP セメントは抗菌性・非３．	
  考察及び今後の展望

崩壊性・生体適合性を備えた次世代型キレート硬化型セメ

我々は、良好な生体親和性を有する HAp に Ag+イオン

ントとして期待できる。

を担持させることで、細菌感染が生じた場合でも再手術の今後は、圧縮強度や生体吸収性などの機能を向上させる

必要性がなく、患者の QOL を向上させることができるとために、Ag-HAp から Ag-TCP などに粉体性状を変化させ考えた。

ることで、よりハイパフォーマンスな抗菌性セメントの開

本研究の最終的な目的は、「抗菌性を備えたリン酸カル発が期待できる。

シウムセメントの開発」である。その目的を達成するため、
超音波噴霧熱分解法により Ag 担持 HAp（Ag-HAp）中空
微小球を合成し、その粉体性状、抗菌性および生体適合性【参考文献】について明らかにするとともに抗菌性セメントの試作を

1. H. Funao, K. Ishii, S. Nagai, A. Sasaki, T. Hoshikawa, M.

行った。

Aizawa, Y. Okada, K. Chiba, S. Koyasu, Y. Toyama, and

その結果、合成されたすべての Ag-HAp 粉体は、HAp

M. Matsumoto, Infect. Immun., 80 , 733-741 (2012).

に帰属される回折ピークのみ認められ、Ag 添加量の増加

2. Y. Horiguchi, A. Yoshikawa, K. Oribe, and M. Aizawa, J.

による結晶相の変化はなかった。さらに、HAp 格子内に

Ceram. Soc. Jpn., 116, 50-55 (2008).

Ag を取り込んでいなく、微小球中にナノ分散しているこ

3. Y.H. An and R.J. Friedman, J. Hosp. Infect., 33, 93-108とがわかった。また、Ag-HAp 粉体は Ag+イオンの徐放性(1996).

を有する材料であることが確認された。さらに、粉体を圧

4. P.S. Stewart and J.W. Costerton, Lancet, 358, 135-138

縮成形したディスクを用いて、黄色ブドウ球菌を用いた抗(2001).

+

菌性評価を行った結果、Ag イオンの仕込み量が 2 mol%以

5. M. Aizawa, K. Itatani, and I. Okada, Phosphorous Res.

上で、抗菌性を示すことがわかった。Ag+イオン濃度が 5Bull., 20, 61-78 (2006).

mol%の粉体より作製したディスクを用いて生体適合性を

6. Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y.

評価したところ、Ag+イオンの溶出による細胞毒性は発現

Habuto, N. Kanzawa, and M. Aizawa, Key. Eng. Mater.,

しなかった。また、in vitro で確認された抗菌作用を in vivo

493-494, 678-683 (2012).

においても発揮できるかどうかを評価した結果、Ag を添

7. T. Konishi, S. Takahashi, Z. Zhuang, K. Nagata, M.

加したサンプルは術後 2 日目までにバックグラウンドまMizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H.

で ROI が低下しており、顕著な抗菌性を発現しているこ

Nagashima, and M. Aizawa, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24,とが確認された。このように、Ag-HAp 粉体は粉体でもデ1383-1394 (2013).

ィスク状に成形しても寒天培地中で抗菌性を示すことが確認された。
しかしながら、このディスクは粉体を圧縮成形したもの
で、水中では崩壊してしまう。そこで、実用化を指向し、
非崩壊性β-TCP セメントの原料である「IP6/β-TCP 粉体」と Ag-HAp 粉体を混合し、それらを出発原料として非崩壊性の抗菌性セメントを試作し、その評価を行った。

53

抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(2)‐抗生物質を担持させたリン酸カルシウム微小球によるアプローチ‐
本田みちよ、持田直輝、川延勇介、神澤信行、相澤 守

１． はじめに部電気炉温度 300 °C とし、超音波振動数は 2.4 MHz に設

リン酸カルシウムは整形外科領域で緻密体、顆粒、多孔

定して超音波噴霧熱分解を行い、リン酸カルシウム微小球体、セメントなどの形状で広く利用され、その中でリン酸を得た。添加した塩は、微小球を合成後、純水中で超音波

カルシウムセメントは、骨欠損部位の形状に合わせて任意洗浄することで除去した。これを「洗浄粉体」とした。得に加工できるという特長をもつ。しかし、一般的に、リンられた合成粉体および洗浄粉体の粉体性状を粉末 X 線回酸カルシウムは感染に弱く、一度細菌感染を引き起こすと、折法(XRD)、赤外分光光度法(FT-IR)および走査型電子顕微再手術や長期間にわたる抗菌薬治療を行う必要がある。そ鏡(SEM)などを用いて調査した。

こで、細菌感染の問題を解決した、抗菌性を備えたリン酸

まず、それぞれ NaCl 添加量が異なる 3 種類の試料溶液

カルシウムセメントが必要となっている。

から得られた粉体の結晶相を XRD により同定した。これ

現在、リン酸カルシウムセメントに抗菌薬を含有させ抗より、NaCl 添加をした洗浄粉体では、アパタイト単一相菌性を付与したセメントが臨床応用されている。しかし、であり、NaCl 無添加の洗浄粉体では、アパタイトおよび

この問題点として抗菌薬の放出を制御できないことがあ

リン酸三カルシウム（β-TCP）に帰属される回折ピークがげられる。

認められた。また、FT-IR スペクトルより、合成粉体に残存している塩化ナトリウムおよび硝酸イオン（NO3-）は洗

そこで、本研究では、我々がこれまでに水酸アパタイト

浄処理することで除去されることが確認された。

（HAp）など種々のアパタイト関連化合物の合成に成功している超音波噴霧熱分解法[1]を用いて、表面に細孔を備

次に、合成粉体および洗浄粉体の SEM による形態観察

えた中空状リン酸カルシウム微小球を合成し、これを抗菌結果を図 1 に示す。NaCl 無添加の粉体は、球状粒子で構薬のキャリアとして応用させることを考案した。この中空成されており、洗浄処理による微小球の形態への影響は観状微小球に抗菌薬を担持させることにより、抗菌薬の微小察されなかった。NaCl 濃度 0.60 および 1.00 mol·dm-3 で合球表面からの迅速な放出と微小球内部からの緩慢な放出成して得られた洗浄粉体では、一次粒子がロッド状の凝集の二段階の薬剤放出を可能とした[2]。

二次粒子を形成し、中にはロッド状一次粒子が複雑に絡み合い、表面にナノサイズの微細な気孔を有する粒子も観察

この抗菌薬を担持させたリン酸カルシウム微小球をされた。

我々がこれまでに開発したイノシトールリン酸(IP6)のキレート作用で硬化する新規なペースト状人工骨(セメント)[3]に添加することにより、抗菌薬の放出を制御した抗菌性セメントの試作を行った。
以下ではモデル薬剤としてバンコマイシン塩酸塩(VCM)を担持させたリン酸カルシウム微小球の抗菌性、これをセメントに添加して得られた抗菌性を備えたセメン
トの圧縮強度、抗菌薬の放出挙動、抗菌性について検討を行った。

２． 実験と結果
２．１ VCM 担持微小球の調製
２．１．１ 表面にナノサイズの気孔を備えたリン酸カル
シウム中空微小球の合成

図 1	
  リン酸カルシウム中空微小球の粒径制御

試料溶液は Ca/P 比が 1.50 となるように、0.60 mol·dm-3
Ca(NO3)2·4H2O, 0.40 mol·dm-3 (NH4)2HPO4, 0.40 mol·dm-3

２．１．２ リン酸カルシウム微小球への VCM の担持

HNO3 および NaCl を混合して調製した。なお、NaCl 濃度

洗浄粉体 0.6 g に対して VCM 水溶液を 12 cm3 加え超音は 0, 0.60 および 1.00 mol·dm-3 とした。上記の 3 種類の試波洗浄機を用いて 20 min 超音波処理を行った。その後料溶液について、熱分解条件を上部電気炉温度 850 °C、下3000 rpm にて遠心分離を行い、上澄み液を除去した。得ら

54

れた粉体を凍結乾燥し、「薬剤担持微小球」とした。なおNaCl(0)

NaCl(0.6)

NaCl(1.0)

加える VCM 水溶液の濃度は 1~1000 ppm の範囲で調製し、0

1000 ppm の濃度で得られた薬剤担持微小球を用いて薬剤放出実験を、それぞれの濃度で得られた薬剤担持微小球を用いて抗菌性試験を行った。また、得られた微小球を 1.0測定した。1000 ppm の粉体では NaCl(0)で 2.4 µg·mg-1,
NaCl(0.6)で 4.4 µg·mg-1, NaCl(1.0)で 4.8 µg·mg-1 であった。

２．２ VCM 担持微小球の in vitro 抗菌性試験
２．２．１ 薬剤担持微小球からのディスクの作製
抗菌性試験を行うため、薬剤担持微小球からのディスク50を作製した。以下、その方法を記載する。

10 

Concentration of VCM (ppm)

定することにより微小球 1 mg 中に担持された薬剤の量を1

mol·dm-3 の塩酸水溶液に溶解させ、280 nm の吸光度を測

ディスクは一軸加圧成形法により作製した。薬剤担持微
小球 0.3 g をメノウ乳鉢にわけとり、そこへ純水 75 mm3を加えよく混練し、15 mmφの成形器へ移し、100 MPa の100

圧力を加えた。このようにして作製したディスクを「薬剤担持微小球ディスク」とした。

２．２．２ 薬剤担持微小球ディスクにおける in vitro 抗
菌性試験

図 2.	
  阻止円法による抗菌性試験結果

２．３．１ β-TCP 粉体の調製阻止円法による抗菌性試験を行なった。培地は LB 寒天

IP6 溶液を 3000 ppm となるように純水にて希釈した。

培 地 を 使 用 し 、 菌 種 は 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 (Staphylococcus

この時、NaOHaq を加えて pH を 7.3 となるようにした。

aureus)を用いた。
LB 寒天培地上に 15mmφディスク試料を置き、そこへ菌市販β-TCP 粉体 10 g を調製した IP6 溶液 40 cm3 に加え、

液 0.1 cm3 を加えたトップアガー10 cm3 を流し込んだ。な

ジルコニアボールは 2 mmφを用いて、遊星型ボールミルでお、溶液中の菌数は 1×105 個程度となるように LB 培地で

3 h 粉砕した。得られたスラリーをろ過後、凍結乾燥し、調製した。流し込んだトップアガーが固まるまで静置し、

IP6-β-TCP 粉体を調製した。この IP6-β-TCP 粉体に薬剤担35±1 °C、40～48 時間培養を行い、阻止円の有無を観察し持微小球を添加することにより、抗菌性を備えたキレート

た(図 2)。この結果から VCM の担持濃度が 10 ppm 以上か

硬化型セメントの試作を行った。

らわずかに阻止円が観察され、50 ppm 以上では顕著な阻

２．３．２ 圧縮強度試験

止円が確認できた。したがって、微小球をキャリアとした
場合、VCM の担持濃度が 50 ppm 以上で顕著な抗菌性を発IP6-β-TCP 粉体と薬剤担持微小球を質量比が 100 : 0, 75 :

現するといえる。一方、NaCl を添加し、表面に細孔を備

25, 50 : 50, 25 : 75 となるようにわけとり(全量 0.2 g)、メノ

えた微小球を用いた場合、添加しなかった場合と比較して

ウ乳鉢と乳棒を用いて混合した。ここに混練液として 2.5

阻止円が大きいことが確認できる。これは表面に細孔を備

mass%Na2HPO4 水溶液を固液比 1/0.3 (g·cm-3)となるようにえたことにより、微小球内部にも薬剤が担持できるため薬加え、5 mmφの成形器を用いて 100 MPa で一軸加圧成形し剤の担持量が増加し、最終的な放出量が多かったためではた。作製した成形体を 37 °C, 湿度 100%のインキュベータ

ないかと考えられる。

ーに 1 日静置し、得られた成形体の圧縮強度を測定した。

マウス大腿骨に黄色ブドウ球菌を植え付け、同一個体に

図 3 に圧縮強度の結果を示す。図 3 から微小球の添加量がおける生菌数をリアルタイムで追跡することができる。そ増えるにつれて、圧縮強度が低くなっていく傾向が観察さの結果を示した図が図 3C 右であり、in vivo においても生れた。これは球状の粒子がセメント内に入り込むことによ

菌数が可視化および定量化できることが理解できる。

り、球状粒子同士が触れ合う面でクラックが生じやすくなるためではないかと考えられる。
また、NaCl 濃度を 1.0 mol·dm-3 にて合成した微小球を添

２．３ 抗菌性セメントの試作とその圧縮強度
薬剤担持微小球を我々が開発した IP6-β-TCP セメント

加したセメントでは強度の低下が小さいことが観察されへ添加することにより、抗菌性セメントの試作を行った。

た。これは、ロッド状の一次粒子により、微小球表面に凹

また、薬剤担持微小球を添加することにより、セメントの凸が多くなるため、微小球同士が触れ合った場合でも摩擦

機械的特性に影響が出ないかを確かめるために圧縮強度が大きくなり、クラックが生じにくいのではないかと考え試験を行った。

られる。一方で、NaCl 無添加の微小球を添加したセメン
トは添加量 50 mass%まで高い圧縮強度を示した。これは55

図 3.	
  微小球添加セメントの圧縮強度微小球が、β-TCP 粉体どうしの隙間に入り込み、より緻密なセメントを作ることができたためではないかと考えられる。一方で、NaCl を添加した微小球をセメントに添加した場合、微小球を添加していないセメントと比較して常に低い圧縮強度となっていた。これは、NaCl を添加した
微小球は添加していないものと比較して表面に細孔が存在するため、微小球自体の強度がやや低くなってしまっているためかもしれない。
この結果から圧縮強度が最も高い、微小球添加量 25
mass%が最適な微小球の添加量であると判断した。

２．４ 抗菌性セメントからの薬剤放出挙動
VCM の放出実験は 1000 ppm の濃度で担持を行った微図 4	
  VCM の総計放出量(A)と放出率(B)

小球を IP6-β-TCP 粉体に 25 mass%添加した混合粉体を一２．５ 抗菌性セメントの in vitro 抗菌性

軸加圧して得られた試料片を用いて行った。試料片は 0.3 gの混合粉体に 75 mm3 の純水を加えてよく混練し、これを異なる濃度の VCM 溶液により担持を行った微小球を

全量 15 mmφの成形器に入れ 100 MPa の圧力をかけて作製

IP6-β-TCP 粉体に 25 mass%添加し、作製したセメント試料した。作製した試料片を 24 well plate に入れ、ここに生理片において阻止円法による抗菌性試験を行った。

食塩水を 2 cm3 加え、37 °C のインキュベーター内に静置

なお、セメント試料片は 2.4 節(薬剤徐放実験)と同様なした。サンプリング時間ごとに生理食塩水を全量取り除き方法で作製した。形成された阻止円の面積から相対抗菌面

新たに生理食塩水を加える操作を行った。取り除いた生理積を算出し抗菌性の比較を行った(図 5)。VCM 担持濃度

食塩水を 0.22 µm のメンブレンフィルターに通した後、分500 ppm 以上から顕著な阻止円が形成されることがわかっ

光光度計にて 280 nm の吸光度を測定することにより、た。また、NaCl を添加した溶液から作製した微小球を添VCM の放出量を測定した。

加したセメントでは、抗菌性が強くなる傾向が確認された。

徐放実験の結果を図 4 に示す。図 4 (A)から、NaCl を添この結果は徐放実験の結果と一致しており、薬剤が多く放出されるため、抗菌性が強くなったと考えられる。

加した溶液から作製した微小球を添加したセメントは、
NaCl を添加していない溶液から作製した微小球を添加し３．考察および今後の展開たセメントと比較して、VCM の放出量が多いことが確認できる。これは VCM の担持量の違いによるものである。

ここでは「多機能性キレート硬化型アパタイトセメン

一方で図 4 (B)から VCM の放出率は NaCl 無添加の溶液かト」を開発するための要素技術のひとつである「抗菌性のら作製した微小球をセメントに添加した場合に最も高く付与」を目指した研究を展開している。より具体的には、なることが観察された。これは、NaCl を添加し、表面に塩添加法超音波噴霧熱分解法によりアパタイト系中空微細孔を備えた微小球は、セメントに混ぜ込んだ場合、表面小球を合成しここに抗菌薬を担持させ、これをセメントにの細孔がセメント片によってふさがり、微小球内部の薬剤添加することにより、抗菌薬の放出を制御した抗菌性セメが放出されにくくなるためであると考えられる。このようントの作製を目指している。

にセメントに取り込まれたままの薬剤は、セメントの溶解

本研究の特筆すべき成果として、表面に細孔を備えた微と共に放出されると考えられる。そのため、溶解性の異な小球をセメントへ添加することにより、より多くの薬剤をるセメントを作製することで薬剤徐放を制御可能となる担持させ放出させることに成功した。実際に抗菌性試験をと期待できる。

行い、抗菌性の強さを比較したところ、NaCl を添加した溶液で作製した微小球を添加したセメントではより強い

56

抗菌性を得られることが確認された。以上のことからセメ

M. Matsumoto, Infect. Immun., 80, 733-741 (2012).

ントに抗菌性を付与することに成功したといえる。
今後は細胞への毒性等を調査し、抗菌薬の担持濃度の最適化を行う必要がある。

(A)

NaCl(0.6)

NaCl(1.0)

50 
100 
1000

500

Concentration of VCM (ppm)0

NaCl(0)

(B) 2.5
相対抗菌面積NaCl(0)
2
1.5

NaCl(0.6)
NaCl(1.0)

1
0.5
0
0

50

100

500

1000

担持VCM溶液濃度 / ppm図 5	
  VCM 担持微小球添加セメントの抗菌性試験(A) 抗菌性セメントによる阻止円の形成(B) 阻止円の相対的な面積の比較【参考文献】
1. Y. Kawanobe, M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, Y.
Habuto, N. Kanzawa, T. Uchino, and M. Aizawa, J. Aus.
Ceram. Soc., 46, 6-10 (2011).
2. M. Aizawa, K. Itatani, and I. Okada, Phosphorous Res.
Bull., 20, 61-78 (2006).
3. Y. Horiguchi, A. Yoshikawa, K. Oribe and M. Aizawa, J.
Ceram. Soc. Jpn., 116, 50-55 (2008).
4. H. Funao, K. Ishii, S. Nagai, A. Sasaki, T. Hoshikawa, M.
Aizawa, Y. Okada, K. Chiba, S. Koyasu, Y. Toyama, and57

抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(3)‐プロタミンによるアプローチ‐
本田みちよ

１． はじめに硝酸イオンを除去したものを洗浄粉体として、以降の実験

世界的に進む高齢化や新興国での人口増加を背景に医に用いた。得られた合成粉体および洗浄粉体の粉体性状を療機器に対する需要は現在増加傾向にある。我が国は世界

粉末 X 線回折法(XRD), 赤外分光光度法(IR), および走査でも突出した高齢化先進国であり、国内医療市場は世界市型電子顕微鏡（SEM）などを用いて調査した。

場の伸び率を上回るペースで拡大しており、世界第 2 位のはじめに、合成粉体の結晶相を XRD により同定した(図規模を有する。今後、医療技術の充実は以前にも増して重1)。その結果、洗浄粉体ではアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2;

要な課題となり、患者のニーズを満たす新たな生体材料のHAp)およびリン酸三カルシウム(β-Ca3(PO4)2; β-TCP)に帰

開発が急務となる。同時に新規材料の導入に伴って予想さ属される回折ピークが認められた。また、FT-IR スペクト

れる有害な細菌や感染症を制御するためには、有効な抗菌

ルより、合成粉体に残存している硝酸イオン(NO3-)は洗浄薬の開発と生体材料自体に抗感染性や抗菌性を付与する

処理することで除去されることが確認された(図 2)。

技術の開発も不可欠となる。抗菌薬の開発に関しては、

次に、合成粉体および洗浄粉体の SEM による形態観察

次々に出現する薬剤耐性菌をいかに征圧するかという課結果を図 3 に示す。粉体はいずれも球状粒子で構成され題を国際的な協力のもと解決しようとする取り組みが進ており、洗浄処理による微小球の形態への影響は観察されめられている。一方、生体材料に関連する感染症についてなかった。さらに、合成粉体および洗浄粉体の比表面積をは、その需要の増加に対し、感染率の十分な低減は認められておらず、新規な抗感染性材料の創出が期待されている。
感染制御は、患者の生活の質(Quality of life; QOL)の向上に貢献するだけではなく、膨大な医療コストの削減にもつながるため、医療経済の観点からも非常に重要な開発テーマの一つである。
なかでも、生体材料を体内に留置する手術では，術後感染の危険性が高く、いったん発病すればその予後は不良であり，感染は治療を困難なものとする。感染症の遷延化の原因の一つに細菌の形成するバイオフィルム[1]がある。
一度、バイオフィルムがインプラント表面に形成されると抗菌薬の全身投与などの治療に抵抗し、インプラントの抜去を余儀なくされる場合や多数回の手術を含めた長期間
図 1. 洗浄前後の微小球の XRD パターンの加療が必要となる場合もある。
そこで、本研究ではバイオフィルム感染症の効果的な予防を目指し、バイオフィルム形成を阻害可能な生体材料の開発を目的とし、抗菌性タンパク質であるプロタミン[2]を利用し、新規の抗菌性材料を創製した。

２． 実験と結果
２．１ リン酸カルシウム中空微小球の合成と評価
試料溶液は Ca/P 比が 1.50 となるように、0.60 mol·dm-3
Ca(NO3)2·4H2O, 0.40 mol·dm-3 (NH4)2HPO4, 0.40 mol·dm-3
HNO3 を混合して調製した。それを熱分解条件を上部電気
炉温度 850 °C、下部電気炉温度 300 °C とし、超音波振動数は 2.4 MHz に設定して超音波噴霧熱分解を行い、リン酸
カルシウム微小球を得た。得られた粉体を純水で洗浄し、

図 2. 洗浄前後微小球の FT-IR スペクトル58

BET 法により測定した。合成粉体の場合、その比表面積体からの Ca2+の溶出挙動はプロタミンのリリース挙動と(Specific surface area; SSA)は 10.6 m ·g であったのに対し、一致していたことから、固定化されたプロタミンは破骨細粉体を洗浄することにより SSA は 14.4 m ·g に増大した胞により粉体が吸収されると同時に体内でリリースされ(data not shown)。

ることが予想できる。すなわち、破骨細胞の吸収を受け、

2

-1

2

-1

材料が溶解することにより、抗菌性を発現することが考え
られる。
(a)

Before(b)

After

図 3. 洗浄前後微小球の SEM による形態観察

２．２ プロタミン担持微小球の作製とその評価
2.1 節で合成した微小球粉体をプロタミン溶液(0-1.0

図 5. 破骨細胞模倣条件下におけるプロタミン担持微小球からの Ca2+ (a)とプロタミン(b)のリリース

mg/mL)に加えた後、室温にて一定時間振とうした(120rpm)。これを 9000 rpm で遠心分離し、上清と沈澱に区別

一方、得られたプロタミン担持微小球粉体の結晶相はした。上清のプロタミン濃度を測定することにより、担持

XRD により同定した(図 6)。担持前の微小球と同様に、HAp

前後の溶液の濃度差を求めることで微小球へのプロタミ

およびβ-TCP に帰属される回折ピークが認められた。しかンの吸着量を算出した。一方、沈殿は 24 時間凍結乾燥し、し、プロタミン溶液と微小球粉体とを 24 時間反応させた

これをプロタミン担持微小球とした。また、得られたプロ

ため、β-TCP は水和反応により一部が HAp へ相転移した。

タミン担持微小球を酢酸バッファー(0.08 M, pH 5.5)に懸濁し、室温にて任意の時間振とうし、放出されたプロタミ
ン濃度を測定し、徐放量を算出した。サンプリング時間毎に懸濁液を遠心分離し、上清のみを回収した後、再び酢酸
バッファーを加え懸濁、振とうを繰り返し、経時的な徐放量を調べた。上清中のプロタミン量は Bradford 法により測定した。得られた粉体性状については XRD, SEM, 表面電位計などを用いて調べた。
リン酸カルシウム微小球粉体とプロタミン溶液を共にtube へ入れ、振とうさせるバッチ法を利用して、微小球へのプロタミン担持を試みた結果、微小球へのプロタミンの吸着量はプロタミン濃度と振とう時間に依存して増加し、反応 72 時間程度でほぼ一定となることが分かった(図 4)。
また、プロタミンは Langmiur 型に吸着することが明らか

図 6. プロタミン担持前後微小球の XRD パターンになった。

また、プロタミン担持後の粉体は担持前に比べ、結晶性が低下することが分かった。続いて、粉体形態を SEM により観察した(図 7)。粉体はプロタミンの有無に関わらず、球状粒子であった。しかし、プロタミン担持微小球は微小球表面にプロタミンのコーティング膜状の層が形成された上に、β-TCP が HAp へ転移したことにより、針状の析出物が観察された。さらに、この粉体の表面電位(ζ-potential)を測定した結果、プロタミンを担持させたこと
により、ζ-potential は吸着したプロタミンに相応して、正図４. プロタミンの微小球への吸着

電荷側へシフトした(図 8)。吸着(図 4)および表面電位(図次に、調製したプロタミン担持微小球粉体を酢酸バッフ8)の結果から、プロタミンは微小球粉体に吸着していると

ァー(0.08 M, pH 5.5)に浸漬、振とうすることで粉体からの考えられる。

プロタミンの放出挙動を調べた(図 5)。この条件は、破骨

そこで、プロタミンと微小球との関係を詳細に調べるた細胞による骨吸収時における条件を模倣している。その結

めに X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS)によりプロタミ

果、振とう 5 分後で全吸着タンパク質量の約 70%が溶出し、ン微小球の表面状態を解析した(図 9)。その結果、N 1s ス

120 分後に 100%に達することが分かった。このとき、粉ペクトルにおいてプロタミン担持微小球は、微小球に比べ59

２．３ プロタミン担持微小球セメントの抗菌性評価

強いピークが認められた。さらに、この N 1s スペクトルを詳細に解析した結果、プロタミンに由来するアミド態窒

プロタミン担持微小球粉体からなるディスクは、微小球

素、アミノ態窒素、アンモニア態窒素のピークが確認され、またはプロタミン微小球粉体を固液比 1/0.3 (w/w)となる

プロタミンと微小球との吸着が裏付けられる結果となっよう純水と混練し、100 MPa で一軸加圧成形をすることにた。この吸着は微小球の HAp もしくは β-TCP のリン酸基より作製し、これらを in vitro 抗菌性試験(阻止円法)に用い(PO4-)とプロタミンのアミノ基(NH2+)がイオン結合したもた。一方、非崩壊性のセメントを作製するためには、我々のと推測される。

がこれまでに開発した IP6/β-TCP 粉体[3]を用いた。具体的には、調製したプロタミン担持微小球粉体と IP6/β-TCP 粉
体を重量比 1:1 となるよう混合した粉体をセメントの原料粉体とした。この粉体を固液比 1/0.3 (w/w)となるよう 2.5
mass% Na2HPO4 と混練し、100 MPa で一軸加圧成形し、φ15mm のセメントを作製した。作製したセメントを用いて in vitro 抗菌性試験(バイオフィルム形成試験)に用いた。

Protamine (-)

プロタミン担持微小球セメントの抗菌性評価には、阻止

Protamine円法による抗菌性評価とバイオフィルム形成法による抗図 7. プロタミン担持前後微小球の SEM による形態観察

菌性評価を実施した。阻止円法では、作製したセメントを寒天培地上に静置した後、黄色ブドウ球菌(1x105 cfu)を加えた top agar を流し込み、37°C インキュベータ中で 48 時
間静置培養した。培養後、形成された阻止円の面積から抗菌性を評価した。一方、バイオフィルム形成法では、黄色ブドウ球菌を LB 培地中で 18 時間前培養し、これをOD600=0.05 となるよう希釈した。希釈した菌液 1.2 mL を
24 well plate へ設置したセメント上へ播種し、25°C インキ
ュベータ中で 24 時間静置培養した。培養後、バイオフィ
ルムの形成を評価するために LIVE/DEAD BacLight dye で
黄色ブドウ球菌を染色し、蛍光顕微鏡により菌の生死の状

図 8. プロタミン担持微小球の表面電位態を観察した。
プロタミンは微生物に対する抗菌性を保持しているこ(a)とから、リン酸カルシウム微小球へ担持させた場合にも同様に抗菌性を示すことが期待できる。そこで、はじめにプ
ロタミン担持微小球粉体からセメントを作製し、その抗菌性を阻止円法を用いて評価した。その結果、予想に反して阻止円の形成は認められず、抗菌活性を示さなかった(図10)。これは、プロタミンが微小球へ吸着しているため、寒天培地中へ放出されるプロタミン量が僅かとなり、阻止円を形成することができなかったと考えられる。

(b)

図 10. 阻止円法によるプロタミン担持微小球の抗菌性評価

そこで、抗菌性の評価方法を変更し、バイオフィルム形
成能の有無でプロタミン担持微小球の抗菌性評価を行っ

図 9. XSP によるプロタミン担持微小球の解析(a)プロタミン(±)微小球のワイドスペクトルた。その際、セメントを培地中へ浸漬させ、バイオフィル(b)プロタミン(±)微小球のナロースペクトル

ム形成の可否を調べるため、水中において崩れない「非崩壊性のセメント」の作製が必要となる。しかし、微小球粉体のみで作製したセメントは水中では崩壊してしまった。
そこで、我々が既に開発済みである β-TCP 粉体と各微小60

球とを混合することで、非崩壊性のセメントを作製した。

本研究では、抗菌性タンパク質と骨補填剤として利用さその結果、コントロールのβ-TCP セメント上では、菌が大れるリン酸カルシウムとを組み合わせることにより、抗菌量に付着しバイオフィルムが形成されたのに対し、微小球性を発現するリン酸カルシウムの創製を試みた。抗菌性タとの混合セメントではいずれも菌が僅かにしか存在せず、ンパク質を静電相互作用に基づきリン酸カルシウムへ吸バイオフィルムの形成を阻害できた(図 11)。これはセメン

着させ、材料表面上に抗菌性タンパク質をコーティングす

トからの僅かな未洗浄プロタミンの放出と微小球に吸着る技術である。リン酸カルシウム表面に吸着した抗菌性タ

したプロタミンと菌とが接触することで細胞内の電子分

ンパク質は、破骨細胞によるリン酸カルシウムの溶解（吸布の不均衡が起こることにより細胞壁が破壊され、バイオ収）に伴い、材料表面よりリリースされ、これが細菌に作フィルムが形成されなかったものと考えられる(図 12)。

用することで、細菌の膜構造を破壊し，生体材料上でのバ以上の結果から、プロタミン担持リン酸カルシウム微小

イオフィルム形成を阻害する。本技術は、耐性菌の出現を球は、菌と接触することによりその抗菌性を発現すること抑制することが可能で、かつ細菌感染の主要な原因とされが可能な上に、微小球からのプロタミンの放出は僅かであるバイオフィルムの形成を阻害することができ、感染症のることから、安全性も非常に高いと考えられる。したがっ

リスクを低減させる新規の抗菌性生体材料として利用さて、本研究で作製したプロタミン担持リン酸カルシウム微れることを期待する。

小球はバイオフィルム形成を阻害可能な優れた生体材料

世界的に高齢化が進み、2040 年には先進国のみならずとして活用されることが期待できる。

中国，ロシアといった新興国でも高齢化率が超高齢化社会とされる 21%を超える。なかでも日本は世界最速のペースで高齢化が進行し、2040 年には高齢化率が 40%を超える見通しである。高齢化に伴い疾病の予防や診断・治療に使用される医療機器への需要は増加の一途をたどっており、今後も高い成長を維持することが予想される。医療機器、生体材料の導入には有害な細菌や感染症を伴う事例が多いことから、有効な抗菌薬の開発と共に生体材料自体に抗図 11. バイオフィルム法によるプロタミン担持微小球

感染性や抗菌性を付与する技術の開発がより一層求めら

含有セメントの抗菌性評価れる。ワクチンや抗体、抗菌ポリマーの開発というように抗菌薬に依存しない薬剤耐性菌感染症に対する治療戦略の検討とその技術を生体材料にも応用、発展させることが重要である。
最後に、抗菌性と生体適合性はトレードオフの関係にあり、高い抗菌力を要求すると細胞を寄せ付けないほどの生体不適合性を招くことが多い。しかし、十分な抗菌作用がなければ、感染症を征圧することは不可能である。抗菌性と生体適合性、両者の微妙なバランスを保ちつつ、それぞ図 12. 抗菌性発現メカニズムの模式図

れの機能を存分に発揮できるような材料設計および材料創製が必要である。

３． 考察及び今後の展望【参考文献】

プロタミンを含む抗菌性ペプチド（タンパク質）はヒト

1. P.S. Stewart and J.W. Costerton, Lancet, 358, 135-138

を含むあらゆる生物に共通の先天性免疫機構に関与し，病(2001).

原菌の侵入の際に働く生体防御機構として近年注目を集めている[4]。微生物の細胞膜に直接作用して膜構造を破2. R. Balhorn, Genome. Biol., 8, 227.1-227.8 (2007).

壊する膜作動型ペプチドは耐性が生じにくいと考えられ、

3. T. Konishi, S. Takahashi, Z. Zhuang, K. Nagata, M.

新薬の開発にも期待が寄せられている。多くの抗菌性ペプ

Mizumoto, M. Honda, Y. Takeuchi, H. Matsunari, H.

チドは、静電相互作用で膜に結合し、細胞膜を亢進させ、

Nagashima, and M. Aizawa, J. Mater. Sci. Mater. Med., 24,

これが主要な殺菌機構であると考えられている[5]。この

1383-1394 (2013).

抗菌性ペプチドは皮膚・気道・消化管などの外界と接触す

4. M. Zasloff, Nature, 415, 389-395 (2002).

る上皮組織あるいは貪食性の血球に存在しており、様々な5. K.A. Brogden, Nat. Rev. Microbiol., 3, 238-250 (2005).

細菌に活性を示し、さらに宿主に対して毒性が低いといった優れた特性も備えている。従来の薬剤とは異なる作用機序を有する抗菌性ペプチドは抗菌薬への応用が待望されるとともに、近年、ペプチドの構造や作用機序からヒントを得て、ポリマー抗菌剤の開発にも応用されるなど幅広い展開に貢献している。

61

抗菌性を備えたリン酸カルシウムセメントの創製とその評価(4)‐ラクトフェリンによるアプローチ‐
神澤信行、羽太優理、松本 純、川延勇介、相澤 守

１． はじめにした[3]。このように生体材料に抗生物質を添加し、抗菌Hydroxyapatite (HAp)は骨や歯など硬組織を形成する無性を付与させた材料開発は国内外で行われているが、耐性

機成分に類似した化学組成をもち、骨組織と直接接合でき菌の出現などにより新たな抗菌物質を用いた生体材料のる、「生体活性」を持つことから、整形外科や口腔外科な開発が定期的に必要であることや、耐性菌は他の抗生物質

どの領域で骨充填剤として臨床応用されている。また HApに 対 し て も 最 小 発 育 阻 止 濃 度 Minimum Inhibitoryの材料形態には、緻密体、多孔体、顆粒、セメントなどがConcentration (MIC)値が高くなることが問題となっている。

あるが、特に骨欠損部の補填に際して小さな孔から注入可

１．２ ラクトフェリンについて能で、体内で欠損形状に合わせて硬化するセメントは臨床現場からのニーズも高いとされている。しかしながら、現先述の様な耐性菌に対するアプローチとしては２つあ在のアパタイトセメントは、酸塩基反応を利用し硬化させげられる。１つめは新たな抗菌物質または現行の抗生物質

ることが多く、問題点として硬化時の pH 変動によって患の構造変化による改良である。そして２つめは２種以上の部での炎症が惹起されたり、硬化に時間がかかってしまう

抗菌物質を組み合わせることで、相乗効果により MRSA

ことなどが問題として挙げられてきた。そこで、従来とはなどの耐性菌にも一種類の抗菌剤の濃度をあげることな

全く異なった硬化メカニズムをもつ、アパタイトセメント

く抗菌効果を持たせる方法である。注目されている抗菌物

が明治大学相澤らにより開発された[1]。

質のひとつとして、ヒトやウシなどの母乳、鼻水、涙の構成成分であり、抗菌性、抗腫瘍性、骨分化促進なども報告

１．１ 抗菌性の付与されている、lactoferrin（LF, 図 1) があげられる[4, 5]。LF

相澤らは、イノシトール 6 リン酸(IP6)のキレート作用には単体で抗菌活性をもつだけでなく、抗生物質と同時に使より HAp を表面修飾し、水と混練することで硬化させる

用することにより、耐性菌の MIC 値を下げることも報告

新しい硬化メカニズムを持つ HAp セメントを作製した。

されている。また、in vitro だけでなく、in vivo で免疫系にその結果、pH 変動を伴うことなく、短時間で HAp セメン

作用し炎症を緩和することも報告されている。In vitro 実トは硬化し、生体適合性などが検証されてきた。また、臨験では同じ涙などの構成成分で抗菌物質としても知られ

床応用を前にして、更に付加価値として抗菌性を付与した

る lysozyme (LZ)と同時に菌懸濁液に添加することにより、セメントの創製が検討されてきた。キレート硬化型の HAp相乗効果によって抗菌活性があがることが報告されていセメントに限らず、体内にインプラントした際に起きる術

る[6]。この相乗効果は LF および LZ が細菌の細胞壁に結後感染 Surgical Site Infection (SSI)は大きな問題である。現合し、細胞壁の構造変化により細胞内に運ばれ、細胞内の在、人工骨を体内にインプラントするには、クリーンルー

物質にも作用するためとされているが、詳細は分かっていムを用いて無菌状態で行うが、抗菌剤を同時に投与すると、SSI 発生率は低くなることが報告されている[2]。しかし、
SSI の予防目的での抗生物質投与は、多剤耐性菌の発生を促しかねないとの懸念もあり問題視されている。さらに骨組織は、全身投与では抗菌剤が移行しにくい部位であり、いったん感染が発症すると、人工骨を除去しなくてはならず、抗菌剤投与が有効であるかは疑問視されている。そこで国内では、人工骨置換術後の MRSA (メチシリン耐性黄色ブドウ球菌)感染に対し、バンコマイシン含有骨セメン
トを補填する試みが行われており、その有効性が報告されている。欧州でもバンコマイシン含有骨セメントを用いた
in vivo 実験が 20 年以上前から行われている。これ以外に

図 1. Lactoferrin

も、Alt らは家兎を用いた動物実験で、骨セメントにゲン

Lactoferrin は分子量 78 kDa のタンパク質で、母乳や涙に含まれる。

タマイシンを含有させ、術後感染発症率を減少させうるこ

分子内には 2 つの鉄がキレート結合しており、抗菌性の他に抗腫瘍性や骨分化促進能があるとされている。

とを骨組織の抗菌剤濃度、組織学的検討によって明らかに

62

ない。
LF を HAp に添加した生体材料の抗菌効果は、in vivo 、in vitro ともに報告されており、抗菌剤としての有用性が示されてきた[7, 8]。また、LF は抗菌効果だけでなく、破骨細胞分化抑制や、抗腫瘍効果も報告されており、骨の生体材料として用いることで多機能性を付与できることも期待できる。しかしながら in vitro 評価系において、LF の抗菌活性は十分に評価されておらず、生体材料への機能付
与に関しても基礎的な解析を行う必要がある。
そこで本研究ではキレート硬化型骨修復セメントに LF
をモデル抗菌物質として添加し、抗菌性を付与させるにあたり、LF および LF セメントが大腸菌や黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成にどのような影響をおよぼすのか、
さらにバイオフィルム内の生死菌の局在や形態について
詳細に解析し、最終的には生体材料に多機能性を付与できる因子としての可能性について検討した。
図 2.

２． 実験と結果

LF 存在下でのバイオフィルム形成

異なる条件の LF または LZ を加え、培養 dish 上で培養した。一定期
間後、クリスタルバイオレット染色によりバイオフィルムを染色後、比２．１ 菌の培養

色し形成量としてグラフにまとめた。

大腸菌 Escherichia coli K12 W3110 [Wild Type]および、黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus IAM1011[Wild Type]を、それぞれ LB 寒天培地上で培養(37℃、一晩)し、この寒天

２．３ LIVE/DEAD 染色による評価

培地よりシングルコロニーを取り、LB 液体培地で培養

LF 添加時に形成されたバイオフィルム内の菌の生死細(37°C、一晩)したものを overnight culture として使用した。

胞の局在を調べるため、形成されたバイオフィルムをLIVE/DEAD viability kit を用い蛍光染色し、共焦点レーザ
ー顕微鏡により観察した（図 3）。LF を添加していない菌

２．２ LF によるバイオフィルム形成抑制
主に生体材料に対する医療の現場では、材料表面に付着と比べ、どちらの菌も死細胞の個数の増加は観察されず、する菌によって形成されるバイオフィルムの形成が問題

菌数自体の減少が見られた。また、この時接着しなかった

視されている。バイオフィルムの形成は抗菌剤が菌にアク菌がどの程度死滅しているかをコロニーカウント法によセスすることを阻害し、長期にわたって菌の感染を維持さり測定した(data not shown)。その結果、生菌数が control

せる働きがある。そこで、付着菌に対して LF が抗菌活性と比べ差が見られなかったことから、LF によるバイオフ

を示すか調べるため、LB 培地中で 18 時間前培養した S.

ィルム形成阻害は、殺菌作用によるものではなく、接着阻-1aureus と E. coli の菌液中に、LF 2 mg･ml と LZ 6 mg･ml

害であることが示唆された。LF の現在までに報告されて-1を単独あるいは共に添加し、12-well plate dish に播種し 24 h

いるグラム陰性菌に対する抗菌メカニズムは、細胞壁の構培養後、バイオフィルムの形成量をクリスタルバイオレッ

成物質である Lipopolysaccharide (LPS) の、特に Lipid A をト染色により比較した（図 2 上段）。LF を単独で添加した遊離させる作用であり、グラム陽性菌に対しては、リポ多ものでは、S. aureus によって作られるバイオフィルム形
成量が何も加えてない場合と比べて有意に減少した。しかしながら、LF と LZ と共に加えた場合や、LZ を単独で加えた場合はバイオフィルムの形成に変化が見られなかった。この結果は過去の報告とは異なるが、本研究では LF
単独で HAp セメントに添加する抗菌物質として用いることとした。また、LF によるバイオフィルム形成抑制がどの添加濃度からそれぞれ起こるかを調べるため、培地中に0～3 mg･ml-1 の添加濃度で同様の実験を行った（図 2 下段）。
その結果、どちらの菌も LF 濃度依存的にバイオフィルム形成が抑制されたが、S. aureus では 0.1 mg･ml-1、E. coli
では 2 mg･ml-1 からバイオフィルムの形成が抑制された。
図 3. Dish 上に培養した菌の LIVE/DEAD 染色
黄色ブドウ球菌(上段)と大腸菌(下段)を異なる濃度の LF 存在下でdish 培養し、接着した菌の様子を LIVE/DEAD 染色した。

63

２．５ IP6-HAp セメントの作製

糖に結合し、細胞の細胞壁の構造変化を起こさせる作用あるとされているが、詳細に関しては今後検討の必要がある。

HAp セメントは既報に従い、湿式合成した。Ca(OH)2 37
g を 1 dm3 の超純水に溶解してから懸濁溶液を 3 dm3 ビー

２．４ LF の細胞増殖への影響評価

カーに入れ、液温が 37°C になるまで恒温槽で温めた。0.3
mol·dm-3 H3PO4 を 1 dm3/h の速さで滴下し、pH が 10 を切

E. coli と S. aureus の両菌で接着阻害が起きた LF の濃度-1

条件(2 mg･ml )が正常細胞の増殖に影響を与えるかを調らないように 25%アンモニアを加えた。滴下終了後、さらべるため、dish 上に MC3T3-E1 細胞を 1×105 個播種し、終に 1 時間攪拌し、37℃、24 時間インキュベートした。次-1

濃度 0.1 および 2 mg･ml の LF を培地に添加後 24 h 培養に、42 Ashless φ90 mm のろ紙 (GE healthcare)で濾過後、アした MC3T3-E1 細胞を観察した(図 4)。また、DAPI によりンモニア臭がしなくなるまで水洗浄した。液体窒素で凍結

核染色、Alexa Fluor® 594 phalloidin により actin の染色をさせ、水分がなくなるまで減圧乾燥し保存した。また、IP6行い、蛍光顕微鏡により観察した（data not shown）。LF をでの表面修飾効率を向上させるため、合成 HAp 10 g に超添加した MC3T3-E1 細胞は何も添加していない control の

純水 40 ml を加え、容器に ZrO2 ボール 50 個入れ、5 分間細胞と比べて形態に差異は見いだせなかった。蛍光観察で300 rpm でボールミル(FRITSCH, WATERLOO, German)粉も核の形態異常や、細胞骨格への影響を精査したが、顕著砕した。

な違いは見られなかった。このことから、添加濃度 2 mg･
ml-1 の LF は MC3T3-E1 細胞に対し外見上有意な影響を及
ぼさないものと考えられた。	
 

図 6. 成形後の IP6-HAp セメント

図 4. LF 添加による細胞形態へ影響の解析

粉砕後の粉末は 400 ml の 1000 ppm IP6 溶液に懸濁し、5抗菌性が明らかな濃度で LF を添加した培地で dish 培養した
MC3T3-E1 細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。

h 攪 拌 す る こ と で 粉 末 表 面 を IP6 コ ー テ ィ ン グ し た(IP6-HAp)。IP6-HAp は減圧乾燥し、メノー乳鉢で塊を粉さらに、LF が MC3T3-E1 細胞の細胞増殖にどのような砕し、ビニール袋に入れてデシケーター内で保存した。セ

影響があるかを調べる為に、MC3T3-E1 細胞を用いて、培-1

メントに成形する際には、この粉体 1 g を量りとりメノー-1

地に LF を 0.1 mg･ml および 2 mg･ml の濃度になるよう乳鉢に入れ、精製水 0.25 ml を加えて 2 分間ゴムベラとスに添加し、3 日目までの細胞増殖を、血球計算盤を用いてパチュラを使って混ぜ合わせた。混ぜ終わったら成形器に測定した（図 5）。その結果、LF の濃度が 0.1 mg･ml-1 では

移し、15 MPa の圧力をかけて成形体を得た(IP6-HAp セメ-1control と比べ有意差がみられなかったが 2 mg･ml 添加でント、図 6)。1 日乾燥させた後、E.O.G.滅菌(elk, Osaka, Japan)

は培養 3 日目において control より増殖が抑えられるといをして保存した。

う結果になった。菌の接着自体は 24 時間以内に押さえ込
むことが出来るため、細胞への影響を考慮した場合、2 日

２．６ LF セメントの作製間程度までの添加が妥当であることがわかった。	
 遠心チューブ内(50 ml)で IP6-HAp 粉末 1 g に対しフィルター滅菌した LF 5 mg･ml-1 溶液を 3 ml 加え(total LF 15
mg/g HAp)、24 h rotator でゆっくりと撹拌した。その後凍結乾燥し、得られた LF を含む粉末を IP6-HAp と同様に成形、滅菌した。これにより作製されたセメントを LF セメ
ントと以後表記する。

２．７ LF セメントからの LF 溶出量
LF セメントを精製水に浸漬し、3 日間の LF 溶出量の変化を Bradford 法により調べた（図 7）。その結果、バイオ
フィルム形成（24 h 後）までに 1 g の LF セメントから 1 ml

図 5. LF 添加による細胞増殖への影響の解析

中に 41.64 µg の LF が溶出されたことがわかった。また、

LF 添加後 3 日間までの増殖性を細胞数をカウントすることで調べた。

溶出挙動を調べたところ、30 min までに大量の溶出が見ら-12 mg・ml の LF 濃度では、僅かに増殖抑制が見られた。

れ、その後一定に溶出されることが分かった。この結果を	
 踏まえた上で、LF セメントの生化学的な評価、解析を行

	
 

った。

64

セメント上に比べてバイオフィルムの厚さが増え、正のチ
ャージを持つ LZ セメント上では LF セメント上ほど顕著ではないが、E. coli では初期接着菌数の低下がみられた。
S. aureus では、LZ セメント上でも LF セメントと同様な接着菌数の減少が見られた。これらの結果から、LF が示す
抗菌性は、単に溶液状態で菌数を抑えるだけでなく、セメ
ントに埋め込まれた際には、セメントの表面電位を変え、菌の接着を防いでいる事が考えられた。各セメントの表面電位の測定は今後の課題となる。

図 7. LF セメントからの LF 溶出挙動
LF セメント及び control セメントから溶出する LF のタンパク質濃度をBradford 法により測定した。積算した値を縦軸としてプロットした。

２．８ LF セメント上で培養した菌の観察
LF セメント上に接着した菌の様子を観察するために、
S. aureus 及び E. coli を LF セメント上に一定量播種し、LFを添加していない control セメント上での増殖と比較した。
菌の生死は、LIVE/DEAD viability kit により染め分け、2種間で違いが見られるかどうかを共焦点レーザー顕微鏡により観察した（図 8）。E. coli に対しては、control セメ
ント自体に菌の接着を抑制する傾向が見られ、初期状態から接着した菌の数が少なかった。しかし、LF セメントと図 8. LF セメント上で培養した菌の LIVE/DEAD 染色

control セメントで差が見られず、LF 添加による増殖抑制

LF セメントおよび control セメント上で各菌を培養し、LIVE/DEAD 染

効果は見られなかった。しかし S. aureus に対しては control

色により生死の判定を行うと共に、共焦点レーザー顕微鏡による観セメントに対して LF セメントで顕著な増殖抑制が観察さ察で、菌の存在する層の厚さを求めバイオフィルム形成の指標としれた。LF セメント上では control セメント上と比較し接着た。

細胞の数が減少し、バイオフィルムの形成が抑制されたと

２．１ SEM による LF セメント上の菌の観察考えられる。実際に共焦点レーザー顕微鏡で菌の存在する
Z 軸方向の暑さを測定しバイオフィルム量として評価しLF セメントの材料表面が菌の形態に及ぼす影響を詳細た。その結果 control セメント上で存在する菌の層（5.25に解析する為に、LF セメント上に形成したバイオフィルµm）に対して、LF セメント上での菌の層(3.85 µm)には有ム内の菌を SEM によって観察した（図 9）。E. coli は LF

意な減少が見られ、バイオフィルム形成を抑制しているこ

セメント上では菌が偏在化し、細胞のまわりにファイバーとが確認出来た。同様の実験を E. coli に付いても行ったが、状のネットが観察され、バイオフィルム特有の細胞外リポ菌の存在する層の厚みには変化が見られず、LF 添加によ多糖類のネットワークと思われるものが観察できた。また、る効果は見られなかった。

LIVE/DEAD 染色の結果では S. aureus は LF セメント上でLF セメントからの LF の溶出(40 µg･ml )は、より感受

接着菌数が減少していたが、SEM による観察では control

性が強い S. aureus においても十分な量(100 µg･ml )とは言

セメント上と比較し顕著な違いは見られず、菌形態に異常-1-1えなかったが、LF セメント上でのバイオフィルム形成がcontrol セメントと比較し顕著に抑制されたことから、材料
表面のチャージ変化が菌の接着や増殖に影響を与えているのではないかと考えた。そこで正のチャージをもつタンパク質代表として LZ、またチャージの傾きがなく、HApに添加するタンパク質の control として BSA を用い、LFと同じ濃度で HAp 紛体に添加し作製した各セメント上でも LIVE/DEAD assay を行った（data not shown）。Control
タンパク質として添加した BSA セメント上では無添加の

図 9. LF セメント上で培養した菌の SEM 観察

65

も見られなかった。

響を与えることなく S. aureus の接着を抑制した。E. coliへの影響は、その詳細を解明するに至らなかった。今後更３． 考察及び今後の展望

なる抗菌効果を望むためには LF の IP6-HAp セメントへの

我々は本研究に先立ち、キレート硬化型骨修復セメント

添加量をあげることにより、セメントからの溶出量を増や自体の抗菌性評価を行い、IP6 および IP6-HAp セメント自し溶出された LF により菌を死滅させるか、抗菌活性部位

体には抗菌性がないことを明らかにしている。そこで本研が表面に出るようにセメントの作製方法を改善する必要

究では、in vitro、in vivo 共に抗菌性を有することが報告さがあると考える。

れている LF をモデル抗菌物質として IP6-HAp セメントに添加した。

【参考文献】

本研究ではまず LF 2 mg･ml-1 を単独あるいは LZ 6 mg･

1. Y. Horiguchi, A. Yoshikawa, K. Oribe, and M. Aizawa, J.

ml-1 とともに添加した培地での菌の増殖について調べた

Ceram. Soc. Jpn, 116, 50-55 (2008).

(data not shown)。既報と同様に LF 単独で加えるよりも、

2. S.M. Mchugh, M.A. Corrigan, B.D. Dimitrov, S. Cowman,

LZ と共に添加した場合の方が菌の増殖は抑制された。LZ

S. Tierney, A.D.K. Hikll, and H. Humphreys, J. Hosp.

と LF のどちらも、菌の細胞壁に結合し、構造変化を起こ

Infec., 78, 312-316 (2011).

す作用がある事では一致するものの、結合部位が異なるた

3. V. Alt, A. Bitschnau, J. Osterling, A. Sewing, C. Meyer, R.

め、相乗的な抗菌作用が見られたものと考えられた。しかKraus, S.A. Meissner, S. Wenisch, E. Domann and R.

し、同じ添加濃度にも関わらず、付着菌に対する抗菌評価

Schnettler, Biomaterials 27, 4627-4634 (2006).

であるバイオフィルム形成能について調べたところ、バイ

4. J. Cornish and D. Naot, Biometals, 23, 425-430 (2010).

オフィルム形成量は LF 単独添加の場合のみで有意に減少

5. L.T. Eliassen, G. Berge, A. Leknessund, M. Wikman, I.

した。今回は LF 単独添加による抗菌性付与の可能性につ

Lindin,

いて以後検討を行った。

C.

Lokke,

F.

Ponthan,J.I.

Johnsen,B.

Sveinbjornsson, P. Kogner, T. Flaegstad, and O. Rekdal, Int.

LF によるバイオフィルム形成抑制は、LF 濃度依存的でJ. Cancer, 119, 493-500 (2006).
6. E.C. Leitch and M.D.P. Willcox J. Med. Microbiol., 47,

あった。また、LF セメント上のバイオフィルム形成の様子は、LIVE/DEAD 染色と共焦点レーザー顕微鏡によって837-842 (1998).

観察した。E. coli では、初期播種時の IP6-HAp セメントへ

7. J.Z. Qiu, D.R. Hendrixson, E.N. Baker, T.F. Murphy, J. W.

の接着の悪さから抑制効果の評価が難しく、S. aureus でのGeme, and A.G. Plaut, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95,

み接着後の顕著な増殖抑制が見られた。また、Z 軸方向へ

12641-12646 (1998).

の観察から、バイオフィルムの形成自体も LF の添加によ8. H.P. Stallmann, R. deRoo, C. Faber, A.V.N. Amerongen

り抑制された。Bradford 法により測定した LF セメントかand P.I.J.M. Wuisman J. Orthop. Res., 26, 531-538 (2008).

らの LF 溶出量は、dish 上のバイオフィルム形成抑制を示

9. C.C. Yen, C.J. She, W.H. Hsu, Y.H. Lin, H.L. Chen, C.M.

す LF 濃度よりも少量であったにも関わらず、LF セメント

Chen. Biometals, 24, 585-594 (2011).

上でのバイオフィルム形成は control セメントと比較し有10. J.L. Gifford, H.N. Hunter, and H.J. Vogel, Cell Mol. Life

意に抑制された。このことは LF が正のチャージを持ち、

Sci., 62, 2588-2598 (2005).

細菌の細胞壁に結合し、負電荷を減らすことが報告されて11. F. Lorget, J. Clough, M. Oliveira, M.C. Daury, A. Sabokbar,いるため、材料表面のチャージが変化したことに起因する

and E. Offord, Biochem. Biophys. Res. Commun., 296,のではないかと考えられた。しかし、LF の抗菌効果とし

261-266 (2002).

ては細胞壁の他にも強い鉄イオンのキレート作用による細胞増殖の静菌的な抑制が報告されている[9]。
このように、LF セメントの抗菌評価は、S. aureus に代表されるグラム陽性菌、E. coli に代表されるグラム陰性菌
どちらに対しても菌を死滅させるような殺菌的作用はな
く、静菌的な抗菌作用が示された。近年、LF の抗菌活性部位である N 末端側の 1-11 番までのアミノ酸配列であるLF(1-11)を、水酸アパタイトに添加したセメントの抗菌評価が行われ始めている[8]。また、LF の pepsin 分解物であり、LF 抗菌活性部位を含み、LF に対して 10～100 倍の抗菌活性をもつ LFcin についても、抗菌評価だけでなく抗腫瘍効果に関する研究が報告されてきている[5, 10]。しかし、骨分化促進や破骨細胞分化抑制などは限定的にしか報告されておらず[4, 11]、生体材料への応用を考えるためには、
更なる検討が必要である。
今回作製された LF セメントは骨芽細胞の細胞増殖に影66

イノシトールリン酸単独の抗腫瘍効果の検証
本田みちよ、猪股義彦、相澤 守

１． はじめになヒト細胞のモデルとして多くの研究に利用されている。

世界保健機関の国際ガン研究機関は、ガンによる年間

そこで本研究ではまず IP6 の抗腫瘍効果を検証するため、死亡者数は 2030 年までに、2008 年からほぼ倍増の 1330

HeLa 細胞に種々の濃度(0-100 mM)の IP6 を一定期間(1, 3,

万人に達するとの予測を発表した。27 種類のガンに焦点

5 days)処理し、ガン細胞の増殖性について調べた。その結をあてたこの予測は、2030 年までに、ガンの年間罹患者

果、IP6 処理 3 日目以降において、1 mM の IP6 を処理し数は 2130 万人（08 年は 1270 万人）、年間死亡者数は 1330た細胞ではその増殖が有意に抑制され、5 mM を超えると万人（08 年は 760 万人）に跳ね上がるとしている。組織細胞がほとんど生存できなくなることが明らかになった

別に見ると、罹患数が多いのは肺ガンで、次いで多かった(data not shown)。そこで、処理期間 3 日、IP6 濃度 5 mMのは乳ガン、大腸ガンの順であった。骨転移しやすいガン

以下の条件において、ガン細胞の増殖抑制についてより詳には肺ガン、乳ガン、前立腺ガンなどがあるが、乳ガンや細な解析を行った。

前立腺ガン、甲状腺ガンは骨転移してから 2 年以上の生命

まず IP6 濃度と細胞増殖性および細胞障害性の関係につ予後が期待できる。乳ガンは肺ガンに次いで世界で 2 番目

いて調べるために、生細胞数の測定と乳酸脱水素酵素に多いガンで、女性では最も多い。2006 年のアメリカに(Lactate Dehydrogenase; LDH)活性に基づく細胞障害性試験

おける新規乳ガン患者は年間約 100 万人を超え、死亡数はを行った(図 1)。

年間約 40 万人と推定される。2004 年の日本における乳ガン患者の罹患数は年間 3.2 万人、死亡数は年間 8,882 人と推定される。世界的に増加傾向にある乳ガンは骨転移の発生頻度は高く、再発の約 50％は骨転移で発見されると言われる。さらに骨転移しても 50%生存期間が約 30-40 ヶ月と長い乳ガンは、脊椎転移に対して有効な治療法の開発が必要である。
イノシトールリン酸(inositol hexaphosphate; IP6)は、米や小麦、豆類などの穀物繊維に多く含まれ、
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)に匹敵するほどの強いキレート能を有しており、様々な金属イオンを強く結合
図 1．HeLa 細胞における IP6 の細胞増殖に与える影響する。IP6 は多くの動植物の細胞内に普遍的に発現し、細その結果、2 mM IP6 を処理した場合、生存率は未処理胞の増殖や分化など極めて重要な細胞機能を制御していると考えられている。また抗酸化作用や高度の抗腫瘍効果の細胞に対し約 70%であった。これに対し、3 mM ではを示すだけではなく、化学療法、薬物療法を含む現在のガ

16.3％、5 mM では 2.2%であり、高濃度の IP6 をガン細胞

ン治療法の多くで問題となっている重篤な副作用を引きである HeLa 細胞に処理することにより著しい細胞増殖抑起こしにくい物質と考えられており、ガン治療への応用が制を発揮することが示された。次に、同条件において、細期待されている[1]。

胞障害性について調べた。LDH は全ての細胞に存在する

そこで、はじめに IP6 セメントにおける効果を検証する

原形質酵素であり、原形質膜が損傷を受けることにより、前に、IP6 単独での抗腫瘍効果を調べるために代表的な株

LDH が細胞培養液に放出される。この LDH 放出量から損化ガン細胞であるヒト子宮頸ガン由来 HeLa 細胞を用いて傷を受けた細胞の割合を算出した。その結果、細胞生存率

IP6 の効果について検証した。さらに、本研究のターゲッの結果を支持するように、細胞死が誘導され始めた IP6 処トとなる“骨”に生じるガン、ヒト骨肉腫細胞(HOS)を用い

理濃度が 2 mM 以上の場合から、急激に細胞障害性が増加て IP6 の抗腫瘍効果について調べた。本報告では、2 種のした。以上 2 つの結果から、IP6 が HeLa 細胞において細ガン細胞における IP6 の効果について検証した結果を示す。

胞死を誘導し、ガン細胞の増殖を抑制することが分かった。
次に、IP6 がどのようなメカニズムで細胞死を誘導した

２． 実験と結果のかを調べた。一般に、細胞死は、細胞内外の環境の悪化によって起こる細胞死（ネクローシス）と個体をより良い

２．１ HeLa 細胞における IP6 の抗腫瘍効果の検証

状態に保つために積極的に引き起こされる細胞死（アポトHeLa 細胞はヒト子宮頸癌由来の細胞株であり、一般的ーシス）に分類することができる。そこで、今回 IP6 を処67

理することにより引き起こされた細胞死がネクローシス

質量がどのように変化するかを調べた(図 3)。その結果、によるものかアポトーシスによるものかを調べるために、IP6 濃度依存的に p53 タンパク質量は有意に増加した。つフローサイトメトリー(fluorescence activated cell sorting:

まり、IP6 を処理することにより、p53 によるアポトーシ

FACS)を用いて、Annexin V とヨウ化プロピジウム(PI)によスが誘導され、ガン細胞の増殖抑制をもたらしたものと考るアポトーシスの解析を行った(図 2)。Annexin V は Ca

2+

えられる。

存在下で通常脂質二重層の内側に存在している
phosphatidylserin に対し強い親和性を持つためアポトーシ
スによって引き起こされる細胞膜の変化を検出することができる[2]。また PI はアポトーシスの進行に伴い、細胞膜の構造が壊れると細胞内に入り込み、DNA と結合する。
この特徴を利用し、5 mM IP6 を 3 日間処理した際の細胞の状態について調べた。その結果、IP6 を処理した細胞(図2b, d, f)においては未処理の細胞(図 2a, c, e)に対し、Annexin V 陽性の細胞が増加し、さらに PI と DNA の結合が優位に増加したことも確認された。この結果から、HeLa細胞に IP6 を処理することにより、アポトーシスが誘導さ
図 3．IP6 処理による p53 タンパク質量の変化

れ、本条件においては、細胞が後期のアポトーシスの状態にあることが示された。

２．２ HOS 細胞における IP6 の抗腫瘍効果の検証
広くガン研究に用いられている HeLa 細胞において、IP6が抗腫瘍効果を示したことから、次に、今回我々の研究のターゲットとなる“骨のガン”、骨肉腫細胞においても IP6が抗腫瘍効果を発揮するかを検証した。HeLa 細胞の場合と同様に、種々の濃度の IP6 (0-1.0 mM)を一定期間(1, 2, 3days)処理し、HOS 細胞の生存率を調べた(図 4)。

図 4．HOS 細胞における IP6 の細胞増殖に与える影響

その結果、HeLa 細胞の場合と同様に IP6 の濃度依存的に細胞死が誘導され、細胞増殖抑制が起こることが分かった。しかしながら、HeLa 細胞に比べ、IP6 の処理時間、処理濃度が短期間かつ低濃度で細胞死が誘導されることが分かった。HOS 細胞では 0.2 mM 以上の IP6 処理を処理することにより細胞死が誘導され始め、0.8 mM では細胞生存率が約 20%となった。これは HeLa 細胞における 3 mM

図 2．HeLa 細胞における IP6 によるアポトーシスの誘導(a, c, e) non treatment, (b, d, f) treatment of 5 mM IP6
for 3 daysと同程度である。また HeLa 細胞では処理 3 日後から強い細胞抑制が確認されたが、HOS 細胞では処理 1 日後からその効果が現れた。つまり、細胞腫によって IP6 に対する

さらに、IP6 処理に伴う p53 の発現量の変化に着目した感受性がかなり異なることが示された。IP6 の抗腫瘍効果[3]。p53 は多くのヒトガン患者において機能が喪失していを求める場合には、組織や細胞種などによってその有効濃るがん抑制遺伝子の一つで、アポトーシスを活性化し、ガ度を明らかにし、最適な条件を設定することが重要である。

ンに対する主要な防御機能として作用する。そこで、IP6次に、IP6 を 24 時間処理し、増殖抑制が確認された濃度

を 3 日間様々な濃度で処理した細胞において p53 タンパク68

における細胞の形態について観察した(図 5)。その結果、

表 1. HOS 細胞での IP6 処理による発現変動遺伝子

0.6 mM IP6 を処理した細胞は、細胞数の減少は確認された

Non treatment vs1 mM IP6 treatment

が、コントロールの細胞群と比較し、形態的には大きな変

Reliable genes

5837

2X up-regulated genes

204

胞が丸く委縮した形態に変化していた。さらに、1 mM の

2X down-regulated genes

324

場合は、細胞膜の崩壊や明らかな形態異常が確認された

4X up-regulated genes

19(図中矢印)。またこの時の細胞核を DAPI により染色し、

4X down-regulated genes

20化が見られなかった。0.8 mM の IP6 を処理した場合においては、細胞数が著しく減少し、図中＊で示したように細蛍光顕微鏡により観察したところ、一部に核の断片化が認められた(図 6)。今回確認された細胞の委縮、核の断片化、細胞の断片化という現象はアポトーシス時に見られる現象と一致している。さらに、IP6 処理に伴い、caspase も検出されたことから、細胞がアポトーシスを起こしていることが分かった。つまり、HOS 細胞においても HeLa 細胞と同様に IP6 を処理することにより、アポトーシスが誘導され、細胞死を引き起こされるというメカニズムで抗腫瘍効
果が発揮されることが明らかになった。
図 7.

IP6 処理に伴うアポトーシス関連遺伝子の発現変動

響について解析する必要がある。
しかし、ここまでの研究において、IP6 を腫瘍細胞へ処理するとアポトーシスを介した細胞死が誘導されることが明らかになっている。そこで、変動遺伝子群の中でもアポトーシスに注目して、その変化について調べた(図 7)。
その結果、TNF (tumor necrosis factor) と呼ばれるアポトー
シス誘導因子（=デス因子）の発現が IP6 処理に伴い 2 倍以上に増加し、また caspase の発現も約 1.5 倍に増加した。
このように形態学的な変化と同時に遺伝子レベルでの変動も確認され、IP6 による細胞死はアポトーシスが主な経図 5.

路として引き起こされていることが明らかになった。

IP6 処理に伴う HOS 細胞の形態変化

３． 考察及び今後の展望
本研究では、キレート硬化型セメントの開発において、IP6 の有するキレート能を利用し、新規のメカニズムでセメントの硬化を促進させるだけでなく、IP6 の抗腫瘍効果を応用し、ガン細胞の増殖抑制などこれまでにない付加価値を有する高機能セメントの創製を最終的な目標としている。
そこで、抗腫瘍効果を有するセメントの創製に先立ち、
まず IP6 単独での抗腫瘍効果について検証した。IP6 は過去の研究において、大腸ガン、乳ガン、前立腺ガン、肝ガ
図 6.

ンなどの臓器、組織においてガンを抑制するという報告がIP6 処理によるアポトーシスの誘導ある[4]。そこで本研究では、ヒト子宮頸ガン由来 HeLa 細

そこで、次に、HOS 細胞に対し、1 mM IP6 溶液を 24胞とヒト骨肉種由来 HOS 細胞において、IP6 が過去の報告

時間処理し、DNA マイクロアレイにより IP6 処理に伴うと同様に抗腫瘍効果を発揮するかを検証した。その結果、遺伝子発現変動について解析した。

いずれの細胞においても有効濃度は異なったが、IP6 はガ

その結果、5,837 遺伝子において発現に変動が確認されン細胞の増殖を抑制することが明らかになった。またそのた(表 1)。その遺伝子の中には遺伝子産物のネットワーク

増殖抑制は、IP6 を処理することによりアポトーシスが誘を担う機能・遺伝子産物が担う機能・遺伝子の発現場所な導され、細胞死が引き起こされるというメカニズムに基づ

ど機能や発現部位などが大きく異なっているものが存在

くことも示された。さらにガン抑制遺伝子である p53 の発した。必ずしも大きく変動した遺伝子が重要とも限らない

現も IP6 処理により増加した。p53 の発現量増加に伴い、ので、一つ一つ遺伝子の機能を確認しつつ、IP6 による影細胞増殖の抑制と細胞成熟の促進つまりガン細胞の浸潤

69

増殖する機能が著しく低下することが考えられる。一方、今回は検証しなかったが、IP6 のもつ抗酸化作用や免疫力増強作用により、ナチュラルキラー細胞が活性化されていることも予想できる。また、過去の研究から IP6 が細胞分裂の抑制にも関与するという報告[5]もあり、IP6 が DNA
合成の速度を低下させたことにより、ガン細胞の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を発揮した可能性も考えられる。
以上の結果から、IP6 の抗腫瘍効果は様々な細胞においてその効果が発揮されるが、その有効濃度が異なるため、細胞種により処理濃度を検討する必要性があることが示された。
本研究で使用する骨肉腫の細胞においても抗腫瘍効果が示されたことから、今後 IP6 キレート硬化型セメント上
で HOS 細胞を培養した際にも同様な効果が発揮されることが推察できる。IP6 キレート硬化型セメントにおいてはHOS 細胞の抗腫瘍効果を検証するとともにセメントに対する細胞の生体適合性についても評価する必要性がある。
最終的な臨床での使用を考慮すると腫瘍部もしくは腫瘍掻爬部へのインプラントが想定されるため、腫瘍細胞だけ
ではなく、正常細胞を用いても良好な生体適合性を示さなければならない。したがって、作製したセメント上で未分化間葉系幹細胞などを培養し、その細胞応答性の観点から生物学的な評価を実施し、IP6 キレート硬化型セメントの安全性と有用性の検証を行う必要がある。
それらの検証結果については、次頁以降で報告する。
【参考文献】
1. Vucenik and A.M. Shamsuddin, J. Nutr., 133, 3778-3784(2003).
2. S. Huerta, E.J. Goulet, S. Huerta-Yepez and E.H.
Livingston, J. Surg. Res., 139, 143-156 (2007).
3. F. Rodier, J. Campisi, and D. Bhaumik, Nucleic Acids Res.,35, 7475-7484 (2007).
4. A.M. Shamsuddin, I. Vucenik, and K.E. Cole, Life Sci., 61,
343-354 (1997).
5. J. Singh and K.P. Gupta, J. Environ. Pathol. Toxicol., 27,
209-217 (2008).

70抗腫瘍効果を備えたキレート硬化型アパタイトセメントの創製とその評価本田みちよ

１． はじめに

２． 実験と結果

日本人の死亡原因の第一位はガンで、現在では死亡数の２．１ セメント原料粉体の調製とセメントの作製

30％を超えて、3 人に 1 人はガンで死亡する状況であり、社会問題ともいえる。そのガンは様々な組織から血管を通セメント原料粉体には、湿式法により合成した水酸アパ

過して、骨に転移する可能性を持っている。骨転移を起こ

タイト(wHAp)を用い、その粉体を 1000, 2000, 3000, 5000,

すと疼痛や脆弱化による病的骨折を引き起こし、quality of

10000 ppm に調製した IP6 溶液中で 5 時間表面修飾した。

life (QOL)が著しく低下する。疼痛、麻痺の進行や病的骨

その後、吸引ろ過、凍結乾燥し、表面修飾 wHAp 粉体折を起こしてしまった場合には、早期の離床を目指し、骨(IP6-wHAp)を得た。XRD パターンより、表面修飾に用い修復セメントで補強する治療を基本とし、症状に合わせた IP6 溶液の濃度に関わらず、得られた粉体はいずれも様々な人工材料で再建する治療方法が行われている。

HAp 単一相であり、IP6 による表面修飾は粉体の結晶性に影響を与えないことを確認した(図 1)。

そこで、近年、病変部の骨欠損に移植するために様々な材質、形状の人工骨が開発されている。水酸アパタイトに代表される骨充填剤には、緻密体、多孔体、顆粒、セメントなどがあるが、中でも任意の形状に成形可能なセメントは臨床現場からのニーズも高い[1-4]。しかしながら、現在臨床現場で利用されているセメントは硬化時における力
学特性や生体適合性を含め、多くの問題を抱えているのが現状である。そこで、本プロジェクトでは現状の硬化時の問 題 を 克 服 す る た め に 、「 イ ノ シ ト ー ル リ ン 酸 (inositol
hexaphosphate; IP6)」のキレート作用を利用して従来の反応とは異なったメカニズムで硬化する新規の骨修復セメントの開発を試みている[5]。

図 1. セメント原料粉体の XRD パターン

前頁にて報告した通り、この IP6 は抗腫瘍効果を示すだ
けではなく、ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)に匹敵するほどの強いキレート能を有しており、様々な金属イオ
ンを強く結合する。
本研究では、IP6 の持つ利点を応用し、従来の骨修復セ
メントを用いた「骨の強度を高め、疼痛緩和させる治療」に使用するだけでなく、「転移したガン細胞の増殖抑制やガンの予防など」を付加し、単なる骨セメントとしてではなく、その用途を拡充させた高機能セメントを作製し、その有用性を生物学的に証明することを目的としている。な
お、本研究ではセメントの作製およびセメント上での細胞応答性の調査を実施した。具体的には、様々な濃度の IP6溶液で HAp 粉体を表面修飾した IP6-HAp 粉体を調製し、図 2. wHAp 粉体に対する IP6 の吸着量

粉体のキャラクタリゼーションを行った。さらに、得られさらに、wHAp 粉体に対する IP6 の吸着量について調べた粉体を用いて、IP6-HAp セメントを作製した。作製したたところ、IP6 は wHAp 粉体に対して典型的な Langmuir

セメント上で正常細胞および腫瘍細胞を培養することに型の単分子層吸着し、5000 ppm 以上で飽和に達すること

より、IP6-HAp セメントに対する細胞の応答性を生物学的が示された(図 2)。この結果は、HAp-100 粉体を用いた場に検証した。

合と同様な結果であったが、湿式合成した wHAp の方が粒

71

子が微小化されたことから、粉体に対する IP6 吸着量は増クチンをファロイジンにより染色し、落斜型蛍光顕微鏡で観察加した。しかしながら、IP6 の粉体への吸着様式は粉体のした(図 4)。なお、形態観察の際には細胞を固定後、Alexa

種類を問わず Langmuir 型の単分子層吸着であり、一様で488-phalloidin で actin を染色し、DAPI で核を染色した。

あることが分かった。さらに、調製した IP6-HAp 粉体の表

その結果、培養 3 日目以降 3000 ppm 以上の IP6 で表面修

面電位をレーザードップラー法を用いて測定した。その結飾したセメント上では細胞数が著しく減少していたのが分かる。

果、IP6 による表面修飾濃度が 2000 ppm までは濃度依存

さらにそれらの形態を詳細に観察したところ、細胞膜が崩壊し的にゼータ電位が負電荷側にシフトしたが、それ以上の濃度域ではほぼ一定の値を示した(data not shown)。IP6 の吸着量の増加に伴い、表面の OH 基が増加したことによりゼータ電位が負電荷側へシフトしたと考えられる。HAp 粉
体への IP6 の吸着が飽和に達したことによりゼータ電位も一定値を示したと考えられる。
また各種評価を行うために、固液比が 1/0.3 [g/cm3]となるように、IP6-wHAp 粉体と水を混練し、一軸加圧成形することにより、セメントを作製した。なお、各セメントの表面粗さはほぼ一定となるよう作製した。材料基板の表面
粗さは細胞接着、強いては細胞増殖、分化に大きな影響を与える因子である。各セメント試料片の表面粗さは IP6 濃

図 4. IP6-HAp セメント上での HOS 細胞の形態観察度に依存せず、1.52±0.21 µm であり、これはポリスチレンたもの(図 5:*)や楕円形や紡錘形に変形した細胞が多く認めら

プレートに比べ非常に大きい。表面粗さを小さくすること

れ、形態に異常が見られる細胞が多数存在することが明らか

により細胞の接着性が向上することが予想できることかになった。また、播種 1 日後に関しても 3000, 5000IP6-wHAp

らも、粒子同士のパッキング力、充填性を高める必要があ

セメント上で培養した場合は細胞増殖が抑制された。しかし、ると考えられる。

その増殖抑制率は 3 日目以降に比べると小さかった。これらの結果より、セメント上での細胞増殖性に関しては、初期の培養

２．２ セメントにおける細胞応答性

環境に加え、培養過程における環境の変化が大きく影響することが考えられた。

各セメント試料片における細胞の増殖性を調べるために、ヒ
4ト骨肉腫細胞(HOS)をセメント(φ22 mm)上へ 6×10 cells となるように播種し、CO2 インキュベータ内で一定期間培養した後、細胞数をカウントすることにより増殖曲線を作成した(図 3)。

図 5.

IP6-HAp セメント上での HOS 細胞の形態異常

次に、細胞増殖性に最も違いが認められた 5000IP6-wHAp
セメントと wHAp および 1000IP6-wHAp セメントにおける HOS
細胞の遺伝子発現変動について、DNA マイクロアレイを用いて解析した。各セメントに HOS 細胞を播種し、24 時間培養した細胞から得た cDNA を解析用のサンプルとした。DNA マイク
ロ ア レ イ に よ る 解 析 の 結 果 、 HAp セ メ ン ト に 対 し 、 1000,
5000IP6-HAp セメント上で培養した細胞では表 1 に示すように
図 3. IP6-HAp セメント上での HOS 細胞の増殖曲線

遺伝子発現が変動した。

そ の 結 果 、 1000 ppm IP6 溶 液 で 表 面 修 飾 し た 粉 体

表 1. HAp および IP6-HAp セメントにおける発現変動遺伝子数(1000IP6-wHAp)を用いて作製したセメント上で培養した HOS

HAp vs 1000-IP6-HAp HAp vs 5000-IP6-HAp

細胞は表面修飾をしていない wHAp セメント上で培養した細胞と同程度の増殖性を示した。これに対し、3000IP6-wHAp セ

Reliable genes

メントにおいては、5 日目以降増殖性が低減し、培養 7 日目に

2x up-regulated
genes
2x downregulated genes
4x up-regulated
genes
4x downregulated genes

おける生細胞数は wHAp に対し、57.06%にまで低下した。一方、5000IP6-wHAp セメントでは、培養 3 日目より著しくその増殖性が低下し、wHAp に対し 3 日目では 11.06%、5 日目は1.42%、7 日目は 1.12%にまで細胞増殖が抑制されていた。次に、この時の細胞形態について細胞骨格タンパク質であるア

72

23,124

22,118

2,280

2,259

2,584

4,201

550

440

416

378

変動が認められた遺伝子群は、1) 細胞間シグナル伝達・した抗腫瘍性という機能がどのように発現されているのかという細胞増殖や分化・形態形成など生物学的に重要な工程に関ことについて検証するために、2.1 節で作製した IP6-wHAp セ

わる遺伝子や 2) 細胞内や細胞外・細胞外マトリックスを含む

メント(1000, 3000, 5000 ppm)を水中に一定時間浸漬させ、溶細胞構成成分に関わる遺伝子、また 3) アポトーシス調節・出する IP6 量について調べた(図 7)。

様々な分子との結合・細胞接着分子・転写因子など分子機能に関わる遺伝子と多岐にわたった。中でも、高濃度のIP6-wHAp セメント上で細胞死が誘導されたことから、今回はアポトーシスに関連する遺伝子に注目し、HAp セメントと 5000
ppm IP6-HAp セメント上での遺伝子発現変動について解析した(図 6)。

図 7. IP6-HAp セメントからの IP6 の溶出

その結果、1000IP6-wHAp セメントからは IP6 の溶出が認め

図 6. IP6-HAp セメント上での遺伝子発現変動(アポトーシス)

られなかったが、3000IP6-wHAp セメントからは 0.01mM 程度

アポトーシスが誘導されるには多くの経路が存在する[3]。

の IP6 が溶出することが分かった。また、5000IP6-wHAp セメン

TNF (tumor necrosis factor)と呼ばれるサイトカインは炎症性サ

トからは約 0.1 mM の IP6 が溶出することが確認された。検出さイトカインであると同時にアポトーシス誘導因子（=デス因子）とれた IP6 は一度 wHAp へ吸着した IP6 が脱着後に溶出したとしても知られる[6]。今回、この TNF は 5000IP6-wHAp セメントいうより、粉体を表面修飾する際に用いた IP6 のうち wHAp 粉上で培養した細胞において、コントロール(wHAp)と比較し、発体へ未吸着であったものが徐々に溶出したと推測できる。ここ

現レベルが約 5 倍に増加した。また、それに伴い TNF 受容体

で、IP6 溶液単独で HOS 細胞の増殖性に影響を及ぼす濃度の発現レベルも増加した。これらの現象は 1000IP6-wHAp セメ

が 1 mM 以 上 で あ る の に 対 し 、 増 殖 抑 制 が 認 め ら れ た

ントにおいては確認されていないことから、高濃度の IP6 で表5000IP6-wHAp セメントから溶出した IP6 の濃度は最大でも 0.1

面修飾した際にアポトーシス誘導因子である TNF の発現が亢

mM 程度であり、両者に大きな違いが生じた。この違いは、セ

進するということが示された。次に、アポトーシスを促進する遺メント表面上では溶出された IP6 が局所的に高濃度となり、そ伝子(Bax, [7])及び抑制する遺伝子(BCL-2, [8])に注目した。

の IP6 を細胞が取り込んだことで、細胞死が引き起こされたとマイクロアレイの解析による結果、5000 IP6-wHAp セメント上で推測することができる。

培養した HOS 細胞において、Bax はコントロールに対し 2.63

すなわち、IP6-wHAp セメントにおけるアポトーシスを介した

倍、BCL-2 は 0.226 倍の発現レベルであった。つまり、5000

細胞増殖抑制は 1) IP6 の表面修飾によるセメント材料表面のppm IP6 溶液で表面修飾したセメントで HOS 細胞を培養する

構造変化に対しての応答、2) 溶出された局所的に高濃度とことにより、アポトーシスが促進されたことが分かる。また他のアなった IP6 を細胞が取り込んだことに対しての応答により引きポトーシス誘導因子も複数発現レベルの向上が認められた。

起こされたと考えられる。つまりこの時、セメントは薬剤を担持

しかしながら、アポトーシスの検出によく使用される caspase 群

した DDS (drug delivery system)キャリアの様に機能していると[5]の遺伝子発現に関しては、caspase14 のみ増加が認められ思われる(図 8)。

たが、他は増加せず、むしろ減少していた。高濃度の IP6 でwHAp 粉体を表面修飾した場合、アポトーシスが誘導されることは確かであるが、24 時間の培養時間ではカスケードの最終
ポイントまで達していない可能性もある。調べる遺伝子を絞り込み、時系列を追って遺伝子発現を定量することにより詳細を解明することが重要であると考える。

２．３ セメントと細胞の相互作用
2.2 節の結果より、3000 ppm 以上の IP6 溶液で表面修飾した粉体を用いて作製した IP6-wHAp セメント上で HOS 細胞を

図 8. IP6-HAp セメントからの IP6 の溶出と細胞への作用

培養すると、細胞形態の異常、細胞増殖の抑制が生じ、アポト

続いて、IP6-wHAp セメントに対する応答性が細胞種によりーシスに関連する種々の遺伝子発現に変動が認められること異なると作業仮説を立て、腫瘍細胞と正常細胞をセメント上でが分かった。そこで、セメント上で確認されたアポトーシスを介培養することにより応答性を比較した。3000IP6-wHAp セメント73

へ HOS 細胞と MC3T3-E1 細胞を播種し、その形態と増殖性にによる影響は確認されなかった。この腫瘍細胞特異的な細ついて解析した(図 9)。その結果、3000IP6-wHAp セメントにお胞死がどのようなメカニズムで引き起こされたかを調べ

いて HOS 細胞では増殖抑制、形態異常が誘発されたのに対た結果、この細胞増殖抑制はアポトーシスを介した細胞死

し、MC3T3-E1 細胞ではそのような異常は観察されず、良好なにより誘引されたものであることがわかった。

細胞形態を維持したまま、旺盛な増殖を続けた。つまり、細胞

さらに、この時セメントから溶出した IP6 の濃度を測定

種によって IP6 や IP6-wHAp セメントに対する感受性が異なるしたところ、1000IP6-wHAp セメントからは IP6 の溶出がことが明らかになった。この細胞種による IP6 への感受性の違認められなかったが、3000IP6-wHAp セメントからは 0.01

いを利用し、粉体への表面修飾時の IP6 濃度を変化させ、セメ

mM 程 度 の IP6 が 溶 出 す る こ と が 分 か っ た 。 ま た 、ントを作製することで、正常細胞へは影響を与えず、腫瘍細胞

5000IP6-wHAp セメントからは約 0.1 mM の IP6 が溶出すのみの増殖を抑制することが可能なセメントの作製が実現できることが確認された。これまでの研究から、IP6 は HOSると示唆された。

細胞に対し、1 mM 以上の濃度で処理すると細胞が生存できない。しかし、今回検出された IP6 の濃度は溶液単独でHOS 細胞の増殖性に影響を及ぼす濃度よりもはるかに低濃度であることがわかった。この結果は、溶出された IP6がセメント表面上で局所的に高濃度となり、細胞増殖に影響を及ぼしたと推測できる。つまり、セメント内部の IP6が徐々に溶出し、セメント自体が DDS キャリア様に機能したことで抗腫瘍性の発現に関与したと考えられる[9]。
また、これまでの研究結果より、IP6 の表面修飾に伴った材料表面の構造変化も細胞へ影響を及ぼすことが示唆されており、IP6-wHAp セメントにおいては、2 つの作用が抗腫瘍性に寄与すると思われる。
さらに、正常細胞と腫瘍細胞において IP6-wHAp セメン
トに対する感受性が異なることが明らかになり、IP6 による表面修飾濃度をコントロールすることにより、細胞の応答性を制御でき、腫瘍細胞特異的に機能性を発現させる材
料創製が可能であるということが示された。
今後は、本法を応用し、生体内で吸収されるリン酸三カルシウム系の出発材料を選択し、セメントの溶解と共にIP6 が放出されるような新たな材料設計を行い、より機能

図 9. 細胞種による IP6-wHAp セメントに対する応答性の違い性の高いセメントの作製の実現を目指す。

３． 考察及び今後の展望【参考文献】

本研究では、キレート硬化型骨修復セメントの開発にお

1. C. Lavernia, and J.M. Schoenung, Am. Ceram. Soc. Bull, 70,

いて、IP6 の有するキレート能を利用し、新規のメカニズ

95-100 (1991).

ムでセメントの硬化を促進させるだけでなく、IP6 の抗腫2. W. Cao, and L.L. Hench, Ceram. Int., 22, 493-507 (1996).

瘍効果を応用し、ガン細胞の増殖を特異的に抑制するこれ

3. T.S.B. Narasaraju, and D.E. Phebe, J. Mater. Sci., 31, 1-21までにない付加価値を有する高機能性セメントの創製を(1996).

試みた。

4. G. Willmann, Br. Ceram. Trans, 95, 212-216 (1996).

HAp は湿式法により合成し微粒子化したことで粉体に5. T. Konishi, Z. Zhuang, M. Mizumoto, M. Honda, and M.

対する IP6 の吸着量を増加させた。HAp と IP6 がキレート

Aizawa, J. Ceram. Soc. Jpn., 120, 159-165 (2012).

作用で結合したことにより、粉体の表面電位は低下した。

6. A. Ashkenazi, and V.M. Dixit, Science, 281, 1305-1308

さらに、HAp へ IP6 が吸着したことで、培地中のタンパク(1998).

質の吸着やイオンの吸着も抑制されたと考えられ、これに7. J.M. Adams and S. Cory, Science, 281, 1322-1326 (1998).

より低濃度(3000 ppm 以下)の IP6-HAp セメントでは、細胞8. Z.N. Oltvai, C.L. Milliman, and S.J. Korsmeyer, Cell, 74,

接着性が HAp セメントに比べ改善される傾向にあった。

609-619 (1993).

さらに、IP6-wHAp 粉体を調製後、セメントを作製し、9. M. Honda, T. Konishi, M. Mizumoto, and M. Aizawa, Key.

そのセメント上での細胞の応答性を正常細胞および腫瘍

Eng. Mater., 529-530, 173-177 (2013).

細胞を用いて解析した。その結果、3000 ppm 以上の IP6溶液を用いて粉体を表面修飾し、作製したセメント上で細胞を培養すると腫瘍細胞に対してのみ細胞増殖性を低下させた。正常細胞においては、良好な細胞増殖を示し、IP674キレート硬化型アパタイトセメントの抗腫瘍効果の発現機構の解析‐セルサイクルからのアプローチ‐
神澤信行、稲山哲哉、小西秀典、本田みちよ

１． はじめにとが明らかとなった[6]。IP6 は癌細胞へのアポトーシス誘

我が国において、悪性腫瘍は 1981 年以後死亡原因の第導、細胞周期 G1 期の停止、ナチュラルキラー細胞等の免1 位であり、根本的な治療法の確立が大きな課題となって疫細胞の活性化を通じて抗腫瘍効果を発揮することが示いる。特に骨は、肺や肝臓とともに癌の転移や再発を起こ

唆されているが[7, 8]、その分子メカニズムは完全には明

しやすい臓器であり、様々な組織の悪性腫瘍から血管を通らかとなっていない。

過して、骨転移することで疼痛や病的骨折、さらに脊椎でIP6 は腫瘍細胞だけではなく、骨芽細胞や血管内皮細胞は脊髄圧迫による麻痺を惹起し、Quality Of Life (QOL)のなど、正常な組織の細胞にも少なからず影響を及ぼすこと著しい低下を引き起こす。骨腫瘍の治療に伴う骨欠損には、が報告されている[9, 10]。有用な抗癌剤である、シクロホ

自家骨や他家骨の移植が一般には行われるが[1, 2]、健常

スファミドやイホスファミドといった薬剤においてもこ部位への二次的な侵襲や採取量の限界、また他家骨によるの問題は同様であり、正常組織への悪影響は、脱毛、貧血、患者の拒絶反応といった問題があり、患者のニーズを満た倦怠感、吐き気や嘔吐といった深刻な副作用として患者にした治療とは言い難い段階に来ている。そこで、自家骨に多大なる苦痛を与え続けている[11]。このことから、癌治

代わる人工材料を用いた治療が俄かに脚光を浴びている。

療において副作用の少ない抗癌剤の開発や、特異性のある

その中でも、骨や歯など硬組織を形成する無機成分に類似

抗腫瘍効果を持つ生体材料の開発が重要である。

した材料である hydroxyapatite (HAp)は特に注目を集めている。

１．３ IP6-HAp cement の抗腫瘍性

１．１ IP6-HAp セメント

IP6 及び IP6-HAp cement の抗腫瘍効果の評価と解析を行っ

本研究に先立ち、ヒト骨肉腫様細胞株(HOS)をもちいて
HAp は、緻密体、多孔体、顆粒、セメントといった多た。その結果、HOS 細胞の増殖抑制効果、及びアポトー

様な形態を持つが、その中でも骨欠損部の形状に合わせてシス誘導を確認することができ、IP6 及び IP6-HAp cement

任意に成形が可能であるセメントに本研究では注目しての抗腫瘍効果が明らかになった[12]。しかしながら、ラッいる。現在利用されているセメントは、酸性物質のリン酸

ト骨髄間質細胞(BMSC)を用いて同様の実験をおこなった

水素カルシウム(CaHPO4)と塩基性物質のリン酸四カルシ

ところ、正常細胞である BMSC に関しても、HOS 細胞にウム(Ca4(PO4)2O)との酸塩基反応を介して硬化するため、比べて程度は低いが増殖抑制効果が確認され、正常細胞に硬化時間が長く、硬化時に pH の変動を伴うため、患部周

対する細胞毒性の存在が問題視された。そこで本研究では、辺組織の炎症反応を惹起するといった問題点もある[3]。

IP6-HAp cement から徐放される高濃度 IP6 の挙動と、長期

そこで、明治大学相澤らによりこれらの問題点を克服する

培養した際の IP6 の細胞への影響を複数種の細胞についてような「キレート硬化型骨修復セメント(IP6-HAp cement)」

評価した。具体的には、HOS 細胞及びヒト由来子宮頚癌が開発された[4]。このセメントは HAp の表面をイノシト細胞株(HeLa)、正常細胞としてマウス頭蓋冠由来骨芽細胞

ール 6 リン酸(IP6)で修飾することにより、IP6 のキレート様細胞株(MC3T3-E1)及びチャイニーズハムスター卵巣 K1作用を介して硬化する全く新しい硬化メカニズムを有し細胞株(CHO-K1)を用いて、IP6-HAp cement の抗腫瘍効果

たセメントである。IP6-HAp cement は、硬化時間も短く、や腫瘍特異性、及び骨分化能について生化学的な評価と解炎症反応の恐れもないほか、化学反応を伴わずに HAp の析を行った。

まま直接硬化するという特長をもつ。

２． 実験と結果
１．２ IP6 の抗腫瘍性
２．１ IP6-HAp 粉末の調製

IP6 はイノシトール環に 6 つのリン酸基が結合した単純な構造をもつ低分子化合物であり、穀類のような高繊維食

IP6-HAp cement は定法に従い調製した。詳細は別項｢抗物に数多く含有されている。1980 年代半ばに、メリーラ

菌性を備えたリン酸化カルシウムセメントの創製とそのンド大学のシャムスディン博士らにより、IP6 の抗腫瘍効評価(4)｣に記した。異なる部分は以下の通りである。

果が最初に報告された[5]。その後の研究から、IP6 は特定合成 HAp と 0.1, 0.5, 1% IP6 溶液 400 ml を 500 ml ビーカ

組織の癌細胞だけではなく、大腸癌、肺小細胞癌、神経膠ーに入れ 400 rpm で 5 時間撹拌した。その後沈殿物を凍結芽腫、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、皮膚癌、悪性リンパ腫や乾燥した。乾燥後、メノー乳鉢で粉砕し、3 種の IP6-HAp白血病など数多くの癌細胞に対して抗腫瘍効果を示すこ粉体を得た。これらのうち 0.1% IP6 溶液で表面修飾した

75

粉体を IP6-HAp-1 粉体、0.5% IP6 溶液で表面修飾した粉体

用い、HAp cement を同様に作製した。3 種の IP6-HAp

を IP6-HAp-5 粉体、1% IP6 溶液で表面修飾した粉体を

cement と HAp cement は 1 日乾燥させた後、E.O.G.滅菌 (elk,

IP6-HAp-10 粉体とした。対照試料として湿式ボールミル

Osaka, Japan)をして使用した。

粉砕した未修飾の HAp 粉体を調製した。3 種の IP6-HAp

２．３ IP6-HAp cement からの IP6 溶出挙動

粉体と HAp 粉体はビニール袋に入れてデシケーター内で作製した 1-cement、5-cement、10-cement からの培地中へ保存した。
IP6-HAp-1 粉体、IP6-HAp-5 粉体、IP6-HAp-10 粉体 1 gの IP6 放出濃度の測定を 21 日目まで行った(図 2)。その結当たりの IP6 吸着量の測定を行った(Table 1)。その結果、

果、1-cement＜5-cement＜10-cement の順に増加した。また、

IP6-HAp 粉体 1 g 当たりの IP6 吸着量は、IP6-HAp-1 粉体

IP6-HAp cement の IP6 の放出量は 1 日目が最大で、時間経が 36.3 mg、IP6-HAp-5 粉体が 48.4 mg、IP6-HAp-10 粉体が過とともに減少していくことが分かった。なお、1-cement、

76.1 mg と な り 、 IP6-HAp-1 粉 体 ＜ IP6-HAp-5 粉 体 ＜5-cement、10-cement における IP6 放出濃度の最大値は、そIP6-HAp-10 粉体の順に多くなっている事が分かった。まれぞれ約 0.1 mM、0.35 mM、0.45 mM であった。本研究でた今回 0.1～1% IP6 溶液で HAp に IP6 を表面修飾したが、はさらに、IP6 の放出量の異なる 3 つの IP6-HAp cement

HAp に対する IP6 の吸着は 1%で飽和するという報告もあについて生化学的な評価、解析を以下のように行った。

り、詳細は今後の検討課題である。
Table 1. IP6-HAp cement の IP6 吸着量

IP6 吸着量(mg)

1-cement

5-cement

10- cement

36.3±4.32

48.4±5.99

76.1±10.3

また、HAp 粉体および IP6-HAp 粉体の粉末 X 線回折(X-ray diffraction: XRD)解析を行った。その結果、XRD のピーク位置から、これらすべての粉体が典型的な HAp 単一相から成ることが確認された(図 1)。
図 2. IP6-HAp cement から溶出する IP6 の濃度変化

２．４ IP6 を添加して長期期間培養した MC3T3-E1 細胞の増殖曲線
IP6 cement の増殖抑制効果の解析を行う前段階として、
IP6 溶液を用いて増殖抑制試験を行った。6-well culture
plate に MC3T3-E1 細胞を 4.0 × 104 cells/well 播種し、0～0.5
mM となるように IP6 溶液を添加した培地で 21 日間培養後、細胞増殖曲線を作成した(図 3 左)。この際、培養 7 日
目 ま で は α-MEM 、 そ れ 以 降 は 分 化 誘 導 培 地(Osteoblast-Inducer Reagent, TaKaRa)を用いて培養を行った。
そ の 結 果 、 0 ～ 0.3 mM IP6 存 在 下 で は 細 胞 は 正 常 にconfluent に達したが、0.5 mM IP6 存在下では confluent に達するまでに遅れが生じていた。

図 1. XRD による結晶構造解析

IP6-HAp cement を用いて同様に増殖試験を行った。

２．２ IP6-HAp cement の作製

12-well culture plate 及び 12-well culture plate 上に設置した3 種の IP6-HAp 粉体 1 g を量りとりメノウ乳鉢に入れ、

1-cement、5-cement、10-cement の 3 種類の cement に、そ

精製水 0.30 ml を加えて 2 分間ゴムベラとスパチュラを使れぞれ MC3T3-E1 細胞を 4.0 × 104 cells/well、8.0 × 104って混ぜ合わせた。混ぜ終わったら成形器に移し、15 MPa

cells/well 播種し、21 日間培養した後、細胞数を測定した(図の圧力をかけて成形し、3 種の IP6-HAp cement を得た。こ3 右)。その結果、1-cement、5-cement に関しては dish 培養

れらのうち IP6-HAp-1 粉体を用いて成形した cement をの値と比較して有意差は見られず(p>0.05)、十分な増殖がIP6-HAp-1 cement (1-cement)、IP6-HAp-5 粉体を用いて成形確認された。しかしながら、10-cement に関しては、dishした cement を IP6-HAp-5 cement (5-cement)、 IP6-HAp-10

培養と比較するとわずかではあるが有意差があった

粉 体 を 用 い て 成 形 し た cement を IP6-HAp-10 cement(p<0.05) 。 以 上 か ら 、 用 い た 1-cement 、 5-cement で は(10-cement)とした。対照試料として未修飾の HAp 粉体をMC3T3-E1 細胞の増殖には大きな影響を与えないことが76

明らかとなった。また、図 2 から、IP6-HAp cement から溶から IP6-HAp cement から溶出する IP6 濃度は最大でも 0.5

出する IP6 は一過的であり、6 日目を経過した頃には IP6mM 程度であり、IP6-HAp cement に抗腫瘍性を付与するた

濃度は、1-cement、5-cement、10-cement に関してそれぞれめに IP6 表面修飾濃度を高く設定しても MC3T3-E1 細胞の0.05 mM、0.2 mM、0.25 mM となる。これらの結果から、石灰化には大きな影響が無いことが示された。

溶液状態では 0.3～0.5 M の範囲で顕著な差がみられたも

２．６ IP6 に対する HOS 細胞と MC3T3-E1 細胞の増殖
挙動の比較のの、セメント上での培養では、その溶出挙動から、高濃度の IP6 にさらされる期間は限られ、結果として IP6 の正

任意の濃度に設定した IP6 を用いて腫瘍細胞 HOS と、常細胞に対する影響は限定的であると考えられた。

正常細胞 MC3T3-E1 とを 6-well culture plate 上で培養した。
IP6-HAp cement から溶出する IP6 濃度は、初期段階で比較的高い値であり、その後は徐々に低い値をとることが上述の結果から明らかとなっている。そのため、本実験では
IP6 の溶出挙動を模倣して、IP6 添加条件を以下の①~③の様に設定した。①Day 1 まで 1.0 mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養 ②Day 2 まで 1.0 mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養 ③Day 3 まで 1.0 mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養した。このような条件で 7 日間培養した細胞をサンプルとして増殖曲線を作成した(図 5)。
図 3. IP6 が細胞増殖性に与える影響の解析
MC3T3-E1 細胞を一定濃度の IP6 を常に添加し Dish で培養した場
合と、IP6-HAp cement 上で培養した場合とでその増殖性を評価した。

２．５ IP6 が MC3T3-E1 細胞の石灰化状態に与える影響
IP6 存在下で長期培養した MC3T3-E1 細胞の石灰化状態
を、いくつかの方法で評価した。6-well culture plate に

図 5. IP6 添加期間の違いによる細胞増殖挙動の変化

MC3T3-E1 細胞を 4.0 × 104 cells/well 播種し、0~5.0 mM とHOS 細胞と MC3T3-E1 細胞について、Dish 培養開始後 1 日目まで 1なるように IP6 溶液を添加した培地で 21 日間培養したもmM IP6 で培養し、その後通常培養に移した(1.0 mM until day1)場合、のをサンプルとし、ALP 活性染色と Alizarin red 染色を行同様に 2 日目、3 日目まで IP6 存在下で培養し、その後通常培地で培養った(図 4)。この際、培養 7 日目まではα-MEM、それ以降した場合について、その増殖性を評価した。

は分化誘導培地を用いて培養を行った。その結果、0.1~1.0

図 3 で示した結果の様に、1 mM の IP6 が常時添加されmM の IP6 濃度範囲で MC3T3-E1 細胞が赤色に染色されてた場合では、増殖は顕著に抑えられる事が予想された。しいることがわかった。ゆえに、図 3 で示す様に、増殖性にかし、添加期間を cement からの溶出挙動を参考に限定す問題が有るような高濃度条件下でも、MC3T3-E1 細胞が良ることで、どちらの細胞でも培養 2 日目まで IP6 が存在し好な石灰化状態が示すことが明らかとなった。また、図 2ても増殖性にほとんど影響は見られなかった。しかし、腫瘍細胞である HOS 細胞では、3 日目まで IP6 を添加することで全体の増殖性に影響が見られた。このことから、細胞によって IP6 に対する感受性の違いがある事が明らかになった。実際に Day 4 の HOS 細胞を位相差顕微鏡で観察し撮影したところ、増殖曲線と対応するように HOS 細胞がcontrol に比べて丸みを帯び、形態に異常をきたしているよ
うな細胞が散見された(data not shown)。

２．７ LIVE/DEAD 染色による IP6 に対する HOS 細胞と
MC3T3-E1 細胞の細胞生存率の比較

図 4. IP6 が骨分化に与える影響の評価

IP6 による細胞増殖抑制効果をより詳細に解析するため、Dish 培養した MC3T3-E1 細胞について、IP6 を含む通常培地で 7

LIVE/DEAD 染色により細胞生存率の評価を行った。この日間培養後、分化誘導培地で 14 日目(ALP 染色)または 21 日目ま染色方法は、蛍光試薬 SYTO9 と PI の膜透過性の違いを利で(Alizarin red 染色)培養した。分化の中後期マーカーである ALP の用し、生細胞と死細胞をそれぞれ緑と赤色に染め分けるこ

活性染色、および後期の石灰化を評価するために Alizarin red 染色
を行った。

77

とで細胞生存率(cell viability)の評価を可能にする方法である。35-mm dishに HOS 細胞、MC3T3-E1 細胞を 4.0 ×
104 個播種し、終濃度 0～1.0 mM となるように IP6 溶液を添加した培地で 3日間培養したものをサンプルとし、LIVE/DEAD 染色を行った(図 6)。その結果、どちらの細胞でも IP6 濃度依存的に総細胞数が減少していることが確認された。しかし、赤色蛍光に着目すると、MC3T3-E1 細胞に比べ HOS細胞の方が僅かに死細胞数が多い事が確認された。
IP6-HAp cement に関しても同様の

図 6. IP6 存在下で Dish 培養した細胞の生存評価(LIVE/DEAD 染色)実験を行った。1-cement、5-cement、 Dish で培養した両細胞に各濃度の IP6 を添加し、3 日目まで培養後 LIVE/DEAD 染色で生細胞10-cement の 3 種類のセメント及び (緑)と、死細胞(赤)を蛍光染色により染め分けした。
HAp cement を用いて初期播種数 8.0
× 104 個の HOS 細胞と MC3T3-E1 細胞を 3 日間培養したものをサンプルとし、LIVE/DEAD 染色を行った(図7)。その結果、IP6-HAp cement から溶出する IP6 濃度依存的な増殖抑制効果が確認された。また両細胞共、死細胞数の増加が確認されたが、こ
こでも MC3T3-E1 細胞と比較してHOS 細胞の方が、死細胞数が多い傾向が見られた。

２．８ MTT assay による IP6 に対す
る HOS 細胞と MC3T3-E1 細胞の細胞生存率の比較
上記で確認された IP6 による細胞図 7. IP6-HAp cement 上で培養した細胞の生存評価(LIVE/DEAD 染色)
上

間培養 た

細胞を

染色 染め分け た

IP6-HAp cement 上で培養した HOS 細胞の cell viability

生存率への影響を定量的に解析するため、MTT assay を用の低下は、dish 上で IP6 を添加した培地で培養した HOS

いて細胞生存率の評価を試みた。6-well culture plate に HOS細胞よりも著しく、最も IP6 表面修飾濃度の低い 1-cement

細胞と MC3T3-E1 細胞を 4.0 × 104 個播種し、終濃度 0～1.0

でも day 3 には HOS 細胞の cell viability は約 10%程度まで

mM となるように IP6 溶液を添加した培地で 3 日間培養し低下していた。一方で、IP6 が MC3T3-E1 細胞の cell viability

たものをサンプルとし、MTT assay を行った(図 8)。そのに及ぼす影響は、dish 上で IP6 を添加した培地で培養した

結果、HOS 細胞では cell viability が IP6 濃度依存的に低下

MC3T3-E1 細胞の cell viability よりも大きいことが確認さしていることが明らかとなった。特に 1.0 mM では HOS

れたが、HOS 細胞に比べて cell viability は全体的に高く、細胞の cell viability が約 30%程度まで低下していた。一方

最も大きな影響を受けていた 10-cement 上で培養した

で、IP6 が MC3T3-E1 細胞の cell viability に及ぼす影響は

MC3T3-E1 細胞でも cell viability は約 45%程度であった。

小さく、最も大きな影響を受けていた 1.0 mM でも cell
viability は約 65%程度であった。先述の LIVE/DEAD 染色
では腫瘍特異性を確認することは出来なかったが、MTT
assay により定量的に解析することで、IP6 が増殖に及ぼす影響が顕在化する以前に、HOS 細胞の細胞内機能に著しく影響を及ぼしていることが確認できた。
IP6-HAp cement に関しても MTT assay を行った。3 種類のセメントを用いて上記と同様の培養条件下で 3 日間培
養した HOS 細胞と MC3T3-E1 細胞をサンプルとし、MTT
assay を行った(図 9)。その結果、Dish 培養に比べて cement
上では cell viability の値がさらに減少することが分かった。

78

図 8. Dish 培養した細胞の生存評価(MTT assay)

Dish に対して IP6 を添加していない HAp では、初期定着による増殖抑制効果を殆ど受けなかった。一方で、HeLa

が 60-70%になることが知られており(data not shown)、これ細胞は HOS 細胞と同様に Day 3 まで 1.0 mM IP6 を添加しを加味しても、十分な効果の違いが見いだされた。これらた条件下において control との有意差が見られ(p<0.01)、強のことから、上述の LIVE/DEAD 染色で見られる最終的ない増殖抑制効果を受けたことがわかった。このことから、現象とは異なり、細胞内の生理機能は初期段階で、腫瘍細IP6 が様々な腫瘍細胞に対して特異的に増殖抑制効果を発胞特異的に、その後の増殖性にまで影響するような致命的揮すると考えられた。

な影響を与えていることが明らかになった。現段階では

２．１０ IP6 及び IP6-HAp cement の細胞増殖抑制機構の解析

IP6 の腫瘍特異性が何に起因するものなのか不明である。
これに関しては後述する。

これまでの実験から、IP6 が細胞増殖抑制効果と細胞生存抑制効果を有すること、さらにそれらが腫瘍細胞に対して特異的に作用することが明らかとなっている。ここでは、これらについてより詳細な解析を行うため、遺伝子発現解析を行った。過去の研究から IP6 及び IP6-HAp cement が、腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導することが明らかになっている。このことから、本研究では細胞周期関連遺伝子に着目し、実験を行った。
6-well culture plate に HOS, MC3T3-E1 両細胞を 4.0 × 104
播種し、①Day 1 まで 1.0 mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養 ②Day 2 まで 1.0 mM IP6 を添加し、その後は

図 9. IP6-HAp cement 上で培養した細胞の生存評価(MTT assay)

通常培地で培養 ③Day 3 まで 1.0 mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養した。このような条件で 3 日間培養し２．９ その他の腫瘍細胞、正常細胞を用いた腫瘍特異性の比較解析を行った(図 11)。なお、この際解析した遺伝子は細胞ここまで、腫瘍細胞 HOS、正常細胞 MC3T3-E1 のみを

周期 G1-S 期の入り口で促進的に関する Cyclin D1 と S 期用いて比較実験を行ってきたが、2 種類の細胞間で比較しへの進行を最終的に決定する Cyclin E、細胞周期進行を抑ただけでは「腫瘍特異性がある」ことの検証には不十分で制する働きを持つサイクリン依存性キナーゼインヒビタある。ここでは腫瘍細胞としてヒト由来子宮頚癌細胞株ー(CKI)の 1 種である p27、癌抑制タンパク質であり、細胞た細胞から抽出した total RNA を元に RT-PCR による発現(HeLa)を、正常細胞としてチャイニーズハムスター卵巣

周期 G1-S 期を制御している Rb、内部標準として GAPDH

K1 細胞株(CHO-K1)を用いて細胞増殖試験を行い、同等のを用いた。その結果、HOS 細胞においては、IP6 を作用さ

腫瘍特異性が見られるか検証を行った。6-well culture plate

せた時間に依存して Cyclin D1 の発現量が減少したのに対に両細胞を 4.0 × 104 cells/well 播種し、①Day 1 まで 1.0 mM

して、MC3T3-E1 細胞においてはほぼ一定であった。同様

IP6 を添加し、その後は通常培地で培養 ②Day 2 まで 1.0に、p27 に関しても HOS 細胞においてのみ IP6 を作用させ

mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養 ③Day 3 までた時間に依存して発現量が増加した。この事から、IP6 は

1.0 mM IP6 を添加し、その後は通常培地で培養した。この腫瘍細胞特異的に作用し、細胞周期 G1-S 期の進行を阻害

ような条件で 7 日間培養した細胞の増殖曲線を作成し解していることが考えられた。一方で、Cyclin E の発現量は析した(図 10)。その結果、CHO-K1 細胞においていずれのHOS 細胞、MC3T3-E1 細胞のどちらにおいても変化はなか条件においても control との有意差が見られず(p>0.05)、IP6った。また、Rb は HOS 細胞において発現量に目立った変化はなく、MC3T3-E1 細胞においても一定であった。以上
から、IP6 は HOS 細胞に特異的に作用し、細胞周期 G1-S期の進行を阻害し、増殖抑制効果を発揮していることが示唆された。
さらに、IP6-HAp cement 上で培養した HOS 細胞と
MC3T3-E1 細胞に関しても同様に遺伝子発現解析を行った。1-cement、5-cement、10-cement の 3 種類の IP6-HAp
cement 及び control として HAp を用いて初期播種数 8.0 ×
104 個の HOS 細胞、MC3T3-E1 細胞を 3 日間培養した。その結果、HOS 細胞では 5-cement、10-cement において Cyclin

図 10. IP6 添加期間の違いによる細胞増殖挙動の変化

D1 の発現量の減少が確認されたのに対し、MC3T3-E1 細HeLa 細胞と CHO-K1 細胞について、Dish 培養開始後 1 日目まで

胞では 10-cement のみ発現量が減少した。また、dish 培養

1 mM IP6 で培養し、その後通常培養に移した(1.0 mM until day1)とは異なり、HOS 細胞、MC3T3-E1 細胞の両細胞において場合、同様に 2 日目、3 日目まで IP6 存在下で培養し、その後通常

Cyclin E の発現量の減少が確認された。さらに、HOS 細胞培地で培養した場合について、その増殖性を評価した。

79

において Rb の発現量が IP6-HAp cement の IP6 表面修飾濃化能について生化学的な評価と解析を行った。

度依存的に減少することもわかった。このことから、

今回の結果からは、IP6-HAp cement において、HAp のIP6-HAp cement においても溶出した IP6 が HOS 細胞に対表 面 に 修 飾 す る IP6 の 濃 度 範 囲 が 0.1~1% で あ れ ばして特異的に作用し、細胞周期 G1-S 期の進行を阻害する

MC3T3-E1 細胞の正常な成長に影響を与えず、正常な骨分ことで細胞増殖を抑制していると考えられた。しかし、p27化が促されるため、骨粗鬆症等の骨疾患療法に対する有効に関しては control のセメントでも発現していることから、な骨補填剤と成り得ることが明らかになった。また、IP6dish 培養に比べ初期播種後に一過的に viability が減少してによる細胞増殖抑制効果を、HOS 細胞と MC3T3-E1 細胞

いる事に起因していることが考えられたが、詳細は不明でを用いて比較したところ、IP6 が、特異的に腫瘍細胞であある。

る HOS 細胞の増殖を抑制することがわかった。またその効果は IP6 単体で作用させた時よりも IP6-HAp cement で細胞を培養した方がより腫瘍細胞特異的に作用し、HOS
細胞の生存率を著しく低下させたことが挙げられた。さらに、HeLa 細胞や CHO-K1 細胞といった他の腫瘍細胞と正常細胞を用いて IP6 の腫瘍特異性を検証した。その結果、HOS 細胞だけではなく IP6 は HeLa 細胞に対しても腫瘍特異性を示した。以上から、IP6 及び IP6-HAp cement は様々な腫瘍細胞に対して特異的に作用し、細胞増殖性や細胞生存を抑制することがわかった。
本研究ではさらに、IP6 の腫瘍特異性メカニズムを解明するため、IP6 を添加した培地で培養した HOS 細胞と
MC3T3-E1 細胞に対して遺伝子発現解析を行った。IP6 は過去の報告から、腫瘍細胞に対して細胞周期の停止を誘導することがわかっており、本研究においても細胞周期関連遺伝子に着目して解析をおこなった。その結果、IP6 は主に Cyclin D1 の発現を抑制することで細胞周期 G1-S 期の進行を阻害していることが明らかとなった。
一般に、腫瘍細胞は正常細胞に比べて cell cycle が早い
ことが知られている。この事から、腫瘍細胞は正常細胞よりも IP6 による細胞周期停止の影響を早く(強く)受けてし

図 11. IP6 存在で培養した細胞の周期関連遺伝子の発現解析まうため、正常細胞に比べて増殖性や細胞生存が著しく低Dish 培養では二種の細胞を、1 日目まで(1)、2 日目まで(2)、3 日目ま下するのだと考えられた。IP6 は単体であれば濃度 2.0 mM

で(3)、1 mM の IP6 存在下で培養した。Cement では、1-cement (1)、～4.0 mM 程度で抗腫瘍効果を発揮することが明らかであ5-cement (5)、10-cement(10)上で培養した細胞について発現解析をるが、本研究で作製した IP6-HAp cement は溶出してくる行った。

IP6 濃度が最大でも 0.5 mM 程度であるにも関わらず、増殖抑制効果を発揮している。その理由として、セメント表
面にダイレクトに細胞が接着することによって IP6 濃度が３． 考察及び今後の展望

局所的に高い環境を創り出すことができ、溶液中に溶出し本研究では IP6-HAp cement の開発において、IP6 が持つた IP6 よりも効果的に作用しているとも考えることができキレート能を利用し、新規のメカニズムでセメントの硬化る。また、HOS 細胞や MC3T3-E1 細胞以外の腫瘍細胞 HeLaを促進させるだけでなく、骨腫瘍治療に有用な抗腫瘍性をや正常細胞 CHO-K1 を用いて増殖試験を行ったところ、他有する IP6-HAp cement を作製するため、IP6-HAp cementの腫瘍細胞においても IP6 が細胞増殖を特異的に抑制しての生化学的な評価と解析を行うことを目的とした。これまいることが明らかとなった。

での結果から、HOS 細胞の増殖抑制効果、及びアポトー

上記のとおり、IP6-HAp cement により強力な抗腫瘍効果

シス誘導能が IP6-HAp cement にはあることが分かっていを担持させることができ、腫瘍治療への応用にも十分期待た。しかし、ラット骨髄間質細胞(BMSC)を用いて同様の出来る。今後、より有効な骨補填剤として IP6-HAp cement

実験をおこなったところ、正常細胞である BMSC に関しを発展させるために、特定の物質を添加させて多機能化をても、HOS 細胞に比べて程度は低いが増殖抑制効果が確認され、正常細胞に対する細胞毒性の存在が問題視された。
そこで本研究では、骨腫瘍細胞としてヒト骨肉腫様細胞図る手段も有益であると考えられる。IP6-HAp cement は、
HAp 表面に抗腫瘍性を有する IP6 を修飾することで骨分化能、及び抗腫瘍効果を獲得した重要な生体材料と成り得株(HOS)と正常細胞としてマウス頭蓋冠由来骨芽細胞様細る。さらに IP6-HAp cement は、高齢社会の未充足な医療胞株(MC3T3-E1)を用いて、IP6 及び IP6-HAp cement の抗

ニーズに貢献し得る有効な生体材料として活躍していく

腫瘍効果について評価し、さらに IP6-HAp cement の骨分ことが期待される。

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81相澤「次世代バイオセラミックス」プロジェクト研究概要集
平成 25 年 9 月 30 日発行

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