CEMOVIS 試料作製法
Cryo-Electron Microscopy of Vitreous Sections
岩崎憲治ａ，ｂ，宮崎直幸ａ，ｂ，伊藤喜子ｂ，ｃ，高木淳一ａKenji Iwasaki, Naoyuki Miyazaki, Yoshiko Ito and Junichi Takagiａ

大阪大学蛋白質研究所
ｂ

CREST, JSTｃ

要旨

ライカマイクロシスムズ（株）

CEMOVIS は，液体に近いガラス状の氷に細胞や組織等の厚い試料を固定し，そのまま冷却ガス窒素雰囲気中で超薄切片を作製する技術である．樹脂切片のように架橋・脱水・染色を行わないため，それにともなう微細構造の破壊や，構成分子の流出が起きない．
尚かつ水和した状態の試料を観察できるので，より生きている状態に近い細胞・組織観察が期待できる．一方で，新しい方法ゆえにアーティファクトに対する検証も続いている．本講座では，CEMOVIS の手順と必要な道具，その利点とアーティファクトの詳細，それらを考慮した上での CEMOVIS の利用方法を紹介する．

キーワード：CEMOVIS，非晶質，クライオ，加圧凍結

く加工しなければならない．薄くする方法としては現在，ク1.

はじめにライオミクロトームを使用して超薄切片を作製する Cryo-

一般に，細胞や組織のような生物試料を透過型電子顕微鏡

Electron Microscopy of Vitreous Sections（CEMOVIS）と Focus（TEM）で観察するには，樹脂に包埋し超薄切片に切削してIon Beam（FIB）を使用した削りだし（イオンミリング）2,3）の観察する．この樹脂包埋法には，アルデヒドやオスミウムに二法が現実レベルに達しているが，FIB を使用した Cryo-

よる試料の固定，有機溶媒による脱水，樹脂への置換操作がTEM 観察は装置も含めてまだまだ一般化しているとは言い含まれ，その過程により微細構造が破壊され，構造アーティ

難い．

ファクトが生じる．例えば，固定の過程では細胞内の物質の一方，CEMOVIS は様々なレビュー記事や教科書にも紹介凝集が生じ，脱水，樹脂置換の過程では固定されなかった物

さ れ る 程， 安 定 し て き た 方 法 で あ る と い え る 3,4）． こ の質の流出が起こる．その結果，観察される試料は生理的条件

CEMOVIS という言葉は 2004 年のレビュー記事において，からはかけ離れた状態のものとなってしまう．

Jacques Dubochet によって初めて使われるようになった 1）．

この問題は試料をガラス（非晶質）状の氷になるように瞬本方法は非晶質の層に試料を凍結物理固定し，そのまま相転時に凍結し，水和した状態で観察できるクライオ電子顕微鏡移が起きないように層を維持して薄切し，Cryo-TEM で観察（Cryo-TEM）法を使うことで解決できる．通常生物試料でするという技術である．よって，いわゆる徳安法を指す意味の Cryo-TEM といえば，精製したタンパク質を液体エタンで使われる凍結超薄切片法とは大きく異なる．本講座では，に浸漬凍結した氷包埋試料の観察を指すが，比較的小さな原

この誤解を避けるため，表題とも併せて CEMOVIS で統一し，核細胞や真核細胞でも接着細胞の薄く広がった領域において

CEMOVIS の手法に関して紹介する．CEMOVIS は，細胞あはこの浸漬凍結によりそのまま Cryo-TEM 観察できる．

るいは組織を天然に近い水和した状態で観察ができる点で従しかしながら組織や細胞の内部を観察するには，試料が来法と比べ非常に優れており，高分解能観察の可能性がある

厚過ぎてそのままでは観察できない．これは Cryo-TEM にが欠点もある．それは氷をそのまま薄切することによる様々限ったことではないが，TEM で観察するには電子線が透過なアーティファクトであり（3 節参照），これについての評出来るほど試料は薄くなければならないという制約を受ける価は，現在も続いているところである．また，全ての構成分からである．そのような厚い組織や細胞を観察するには，子が像に含まれ，かつ互いに近い密度（電子顕微鏡像ではグ非晶質に凍結した試料を Cryo-TEM で観察できるように薄レースケールの濃度）としてコントラストを形成するので，微形態からの構造物の帰属が困難な点もあげられる．

ａ〒 565–0871 吹田市山田丘 3–2
TEL: 06–6879–8608
E-mail: ikenji@protein.osaka-u.ac.jp
2011 年 11 月 15 日受付44

これら CEMOVIS の利点欠点の詳細，そしてそれらを考慮した上での CEMOVIS の利用方法をその手順と必要な道具を紹介したうえ述べていきたい．尚，実際実験をする上でも役
顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

に立つ CEMOVIS の詳細なプロセスは，文献 5 にも詳しく記述されている．参考にされたい．
2.

CEMOVIS 試料の作製手順

2.1

加圧凍結

本方法を用いる眼目の一つは，氷晶の形成を防ぎながら非晶質状態に試料を凍結することである．厚さ 1 μm 程度の非常に小さな体積であれば，液体エタンを使用した浸漬法にて達成させられる．しかし 1 μm をはるかに超える培養細胞や，図1

組織片等であれば，その内部と表面の熱伝導に時間がかかるため，凍結時に氷晶の成長が起きてしまう．特に大きな六方晶は細胞内の構造を壊し，歪め，Cryo-TEM の通常観察条件
では結晶の多重散乱のため，電子線を殆ど通さない像として現れる（大抵の CCD カメラでは，真っ黒なコントラストとして表示される（図 3a の黒矢頭部参照））．ここで登場するのが加圧凍結装置である．2100 bar（≒ 2072 気圧）を瞬時に試料にかけることで液体の粘性を高め，これと同期して液体窒素で急速冷却を行うことで，試料の深部まで晶質形成を
抑 え た 状 態 で 凍 結 を 行 う こ と が で き る． 試 料 表 面 か ら
200 μm までは非晶質層を形成できるという報告もあるが 6），無論，試料の組成に依存する．1960 年代にスイス ETH のMoor と Riehle によって開発された本装置の使用は，むしろ凍結置換法においてよく知られており，オルガネラ等の微形
図2

態保持が非常に良いのもこの晶質形成抑制のおかげであ7）

る ．現在市場に出回っており，ポピュラーな加圧凍結装置は 2 種類である．一つはライカ社の EM PACT2（図 1a）で2.2あり，もう一つも現在はライカ社の（かつて Baltec/Balzers

この節の表題はトリミングと書いたが，化学固定切片の場試料キャリアのトリミングと精密トリミング社が扱っていた装置の後継機に相当する）Leica EM HPM100合とは大きく異なる．クライオミクロトームでは低温環境下である（図 1b）．筆者らは EM PACT2 を使用している．本のもと，ナイフワークのみでトリミング作業を行うため，銅装置では培養細胞やバクテリア，単離したオルガネラ等の溶製の試料キャリアの外壁をあらかじめ除去しておかないと膨液試料の場合は，内径 0.35 mm の銅製のチューブ（図 2a）大なトリミング作業を行うことになる．そこで，前節のチューに吸引し（図 2b，c），組織片の場合は真ん中が窪んだ外径ブを使って凍結した場合は専用のチューブカッターを使用

2.8 mm の平板キャリア（図 2d）の上に載せ，装填する．スイッし，チューブの両端を切断する．平板キャリアの場合も，こチを押せば，コンプレッサーで蓄えられた空気圧が液体の加れ専用のカッターを使用し，小さく切り出す．この場合は目圧媒体（通常メチルシクロヘキサン）を通して試料にかかり，的によって様々な切り方があるが，扇状に切ると試料まで早同じくして液体窒素のジェットが双方向から試料を冷却する

く到着でき，手早く薄切に着手できる．
この後，一般的な樹脂包埋法で行う精密トリミングを行う．

仕組みになっている．
さて，加圧凍結をする前に凍結防止剤を試料に加える．我々

各種キャリアカッターの金属ナイフで切出した断面はかなりがよく使用するのはデキストランで，最終濃度が 20％になラフなため，電顕レベルの薄切が出来るレベルまで面精度をるように加える．Dubochet らのやり方に従っているわけだ

上げる必要がある．また，カッターが触れた凍結試料面に小が，浸透圧による影響があまりないことがデキストランを選さな亀裂（クラック）が入っている事が多く，ここを除去す5）

んだ理由として記述されてある ．図 3a は我々のラボで大る必要もある．さらに銅キャリアと凍結試料は共存して超薄腸菌に対して，デキストランを加えずに CEMOVIS を行った切片を作製することが出来ないため，試料部のみを突出させ画像であり，図 3b のデキストランを加えた場合と比べると，る必要がある．

非常に氷が歪んで強度が弱いように見える．一方，図 3b のそこで，ダイヤモンドナイフ製のクライオ用トリミングナ方では氷がしわしわに歪んでいないのがわかる．このことか

イフを使用して薄切に不要な銅キャリア部を削除し，クラッら，凍結防止剤は晶質形成抑制としての役目だけでなく，粘クの無い凍結試料部を突出させ，希望する超薄切片に最適な性の保持にも役に立っていると考えている．

サイズへの調整を行う（図 4）．切削安定性のためには 45°のクライオ用トリミングナイフを用いるとピラミッド状に試講座

CEMOVIS 試料作製法

45【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図3

るため，Dubochet たちはこの利便性を述べている 5）．
さて，本プロセスで必要になるのは無論，冷却ガス窒素雰囲気下で薄切作業のできるクライオミクロトーム（図 5）である．非晶質部分の相転移がおきないように −135°C 以下に試料温度を保ちながら，薄切を行う．無論このときに空気中の水分による霜ができるだけ混入しないようにする．我々が用いているのはライカ社の UC6 及び FC6 だが，液体窒素がミクロトームチャンバー左下部のプールに常に供給され，わ図4

ずかに加温された冷却ガス窒素が，常にチャンバーの下部よ料ブロックが出来上がる．しかし，銅チューブの場合は使用りフローアウトしている．そのため，チャンバー内部は常にできる試料面直径が 350 μm しかないため，20° のクライオ内圧が少し高い状態で冷却ガス窒素雰囲気に保たれている．

用トリミングナイフを使ってより切り立ったピラミッド状にこのため外気の流入を最小に抑えることが出来る．温度は，することで切削効率をあげると良いだろう．

この冷気をモニターしながらヒーターにより正確にコント

2.3クライオセクション

ロールしている．よって温度コントロールに心配はないのだ

構造観察向けの凍結置換法では加圧凍結後，凍結状態に試が，水気がない乾燥状態にあるため，試料自体が非常に静電料を保持しながら四酸化オスミウムを含む有機溶媒に置換，気を帯びやすい．そこで，イオナイザーを頻繁に使用する．

脱水し，最後は樹脂包埋をして薄切する．CEMOVIS では，我々は，CEMOVIS 用に開発された CRION というイオナイ加圧凍結後そのまま薄切を行う．つまり，操作行程自体は減ザーと静電帯電銃の切り換えが可能な装置を使用している．

図546

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先程のトリミングが終了したあと，これから薄切する氷がられる仕組みである．この場合，グリッドは，ある程度目の透明であれば非晶質層であり，白色であれば晶質である．こ細かいメッシュの方が切片の引き付け効果が高くなるため，の状態で，クライオ専用のダイヤモンドナイフ（免疫電子顕200 メッシュ以上の細かいものが適当だと思われる．

微鏡用ではない CEMOVIS 用が望ましい）にて薄切を行う．

このようにして準備したグリッドをグリッドケースに入非晶質であれば粘性が高いので，干渉色を帯びたセロファン

れ，液体窒素中に保存し，Cryo-TEM 観察作業へと移る．当の様な透明な切片が得られる（図 6）．しかし，晶質であれたり前であるが，観察は低電子線照射システム（Minimum

ば白っぽく，ガリガリと壊れていく．切片の厚みは一般にDose System；MDS あるいは Low Dose Kit）が必須である．

50 ～ 100 nm の場合が多い．ダイヤモンドナイフの刃角であ通常の氷包埋試料と同様，電子線損傷を受けやすいからである が， 経 験 的 に 小 角 度 の 方 が 良 い 結 果 が 得 ら れ や す く，る．

Diatome 社製の CEMOVIS 専用の 25° の刃角のものを筆者らは使用している．

3.

CEMOVIS のアーティファクト

CEMOVIS では，樹脂切片の場合における水のような伸展CEMOVIS は，細胞あるいは組織を天然に近い水和した状剤が使えないので，薄切の際に切片が丸まってしまう．連続態で観察ができる点で従来法と比べ非常に優れている．特にして薄切する際は毛先でリードすることで，丸まってしまわ架橋，脱水等の処理がないため，生体試料構成分子の変性やないようにするのだが，この切片の湾曲性が薄切の作業を最非架橋分子の流出が起きないので微細構造が保持される．まも困難なものにする．CEMOVIS 作業の中での最大の難関でた，重金属による電子染色を行わず，試料中の構成要素そのあろう．さらに，このときに前述の試料の帯電効果が作業をものの主に位相コントラストによる観察を行うので試料の構より困難にする．氷のリボンが，静電反発と思われる影響で成分子のポテンシャルを反映した画像情報が得られ，高分解飛んでなくなってしまうこともしばしばある．静電気制御の能観察の可能性がでてくる．これらの利点を考慮すると，細加減も，スムーズに切片を滑り出させる大切なポイントであ胞の中の，あるいは細胞―細胞間や組織において，分子分解る．さて，最後にリボン状の氷をグリッドにのせるわけであ能で観察を目指すときの候補となる手法である．

るが，これらの作業はマイクロ・マニュピレータがあると便一方，CEMOVIS にも欠点はある．それは氷をそのまま薄利である（図 5b）．グリッドは，マイクログリッドあるいは切 す る こ と に よ る 様 々 な ア ー テ ィ フ ァ ク ト で あ る．

1000 メッシュのものを用いることが多い．小さなメッシュ

CEMOVIS で観察上現れる薄切のアーティファクトは，主にサイズは，試料支持に都合がよいからである．カーボン膜を4 つのアーティファクトである；（1）ナイフマーク（2）ク貼り付けることもあるが，なくてもよい．

レバス（3）チャター（4）圧縮．どれも CEMOVIS 特有の問

この後，一般的には鏡面仕上げしたステンレス棒や専用圧題ではなく，常温の樹脂切片でも水に浮かべるという操作が着ツールを使ってグリッドに載せたリボン状切片の上から圧なければ，生じる問題である．ナイフマークは，図 3 にあ力をかけ，グリッドとの密着度を高める．さもなければ，切る通りで，切削方向に生じる線状のアーティファクトである．

片面がグリッドから離れて不安定で凹凸のある面を形成する

これは，ダイヤモンドナイフの刃が完全にフラットでないこので観察が難しくなる．しかし，この圧着法ではアーティファとや薄切の際に生じた硬い氷の断片がダイヤモンドナイフのクトの一つである“割れ目”を引き起こしている疑いもあり，刃先に付着することにより生じる．クレバスは，切削の圧力近年，意図的に帯電させた試料をグリッドにすいつけてしまにより非晶質凍結切片の表面に生じる亀裂のことである．

8）

う静電気法が Petersen らによって紹介された ．CRION は，Cryo-TEM 観察においては鱗状に見えるものである（図 7a）．

ここで役に立つ．通常はイオナイザーとして直流電流で強いクレバスが，図 7a に観察されるように大きな裂け目の元に負の電場をつくる．切り換えスイッチを入れると静電帯電銃なっているのかもしれない（アスタリスク部分）．にかわり，低い電圧で負の電場をつくる．このため，絶縁体クレバスは，薄切する切片の厚みを薄くすると圧力が軽減の氷のリボンが負に帯電する．一方，アースされたグリッドされ生じにくくなるという報告もあるが，切片の厚みを薄くは伝導性があるため，これに帯電した氷のリボンがひきつけすると逆に圧縮のアーティファクトがひどくなる 11）．電子線照射を繰り返すと，損傷によってナイフマークやクレバス部位が溶けて，あたかもないように観察されることがある．これは無論，ナイフマークやクレバスが試料表面にしかないからである．
図 7b の CEMOVIS 像の右下から左上方向に，黒い帯状のコントラストと明るい帯状のコントラストが繰り返されているが，チャターとは，この周期性のあるアーティファクトのことである．Zierold は，大きくゆるく波打つ非晶質凍結切片の様子を走査型電子顕微鏡（SEM）像で報告している 9）．

図6

講座

CEMOVIS 試料作製法

これらのアーティファクトに比べ，構造の解釈を難しくす
47【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図7

るのが切片の圧縮によるアーティファクトである．というのことで抑えることができる 16）．ナイフマークの問題は，表面もこれは切片ごとに，あるいは同じ切片の中でも圧縮の割合構造の議論を避けることで回避できる．圧縮に関しては現状が 異 な っ て い る こ と に 起 因 す る． こ の 圧 縮 に 関 し て は，では如何ともしがたく，今後さらなる試行錯誤が必要となるElectron energy-loss spectroscopy（EELS）の測定によって，ものであるが，ナノメートルレベルでの構造に関しては影響

一 般 的 に 35–55 ％ 程 度 と 見 積 も ら れ て い る 10）． こ れ は，がないという報告はある 17）．その報告では，CEMOVIS で観Richter が CEMOVIS において実際の構造がどれだけ変形し察された酵母の 80S リボソームの構造と浸漬凍結したリボているかという実測値の報告と矛盾がない 11）．問題は，このソームの構造を比較し，このような 30 nm 未満のナノメー試料の圧縮をどのように構造の解釈に反映するかである．

トルスケールの構造では，影響がみられなかったということ

図 3b を見て頂きたい．筆者らの研究室で撮られた大腸菌のを示している．我々も未発表ではあるが，同様の結果を得て

CEMOVIS 像であるが，再現性よく楕円形をしている大腸菌いる．従って，分子レベルでは内部のアーキテクチャーにはの断層像が得られる．これは大腸菌が長軸方向に沿って切断ほとんど影響がないと考えてよいだろう．そうではあるが，されて楕円形に写っているのではなく，もともと短軸方向にまだ検証段階ということもあり，従来の樹脂包埋法等との比沿って切断され丸い形であったものが圧縮によって楕円形に較をしながら構造解析を進めていくのが最良のアプローチでなったものである．切削方向と楕円の向きの関係が常に一定あろう．

であることが大きな証拠である．また，内膜と外膜の間の距離が切削方向に対して垂直と水平方向では顕著に異なってい（TOVIS）
4. CEMOVIS のクライオ電子線トモグラフィー

ることも圧縮による変形を表している．大腸菌の長軸方向に非晶質凍結切片を使用したクライオ電子線トモグラフィー

平行な断面が観察されないのは，加圧凍結に使用する銅のことを，Tomography of Vitreous Sections（TOVIS）と呼ぶ

チューブに吸引する操作で起きると推測されている 12）．圧縮ことがある．この方法は MDS を使用しながら低倍率で目標がおきると，その分，切片の厚みが増す．仮に切削方向に圧物を探し，尚かつ，そこで数十枚におよぶクライオ撮影を行

縮が均一だと仮定し，密度が薄切前と後で変わらないと仮定

わなければならないので難易度は高く，樹脂切片の電子線トすれば，幾何学的に元の大きさに補正できる（樹脂切片の観モグラフィーとは比較にならないくらい神経を使う（図 8）．

察の際に電子線照射によって生じる収縮とは，異なるので誤我々が始めたころは，そもそもクライオ電子線トモグラ

解のないようにして頂きたい 13））．無論，均一な圧縮と扱っフィーを考慮した制御システムを装備した電子顕微鏡システている時点で，この方法には異論が出るだろう．大きな構造

ムが国内にはなかった（現在も，国産では存在しない）．よっの歪みを作ってしまうが故に，4 つのアーティファクトの中て，一枚一枚 MDS を使いながら手動でクライオ撮影していでも最も懸念されるアーティファクトである 14）．

たが，現在は自動でデータ取得が可能となっている．

しかしながら，これらのアーティファクトを克服するため

これまでの TOVIS の報告で顕著な成果をあげた一つの例に様々な試みがなされてきている．例えば，クレバスはは，Frangakis らのグループが報告した，上皮細胞における50 nm 以下の薄い切片では，あまり観察されなくなるとされデスモソームの構造であろう 18）．彼らはデスモソームの構造ている
4815）．また，チャターはナイフの薄切速度を大きくするを TOVIS によって解析し，そこに存在するカドヘリン構造
顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ため，単独では不向きである．しかし，数十ナノメートルの大きさの超分子構造等の観察には向いているといえる．変性のない水和した，より天然に近い状態で細胞環境下における分子複合体観察ができるからである．クレバスをできるだけ抑え，小さな領域の観察を行うのが良いだろう．一方で，架橋―脱水操作では破壊あるいは脱落した構造が，CEMOVIS
では観察されることもある．よって筆者らは，CEMOVIS は常に従来法と併せて相補的に情報を補間しながら使用するのが，現在は最良であると考えている．
6. おわりに筆者らは分子分解能観察を目指して CEMOVIS を導入し，立ち上げた．X 線結晶構造解析や NMR による非常な勢いでの蛋白質構造解析であるが，その情報の蓄積とともに細胞や組織においてその単離精製された構造情報が如何に使われているかに研究の焦点が移ってきた．このような中で電子顕微鏡は要求に応えるポテンシャルをもっており，実際，デスモソームの構造のようにある程度の成果を収めつつある．しか図8

し，日本はこの分野では欧米に 20 年とも揶揄される程大幅に遅れていた．我々は，まず「追いつけ」から始めて追いつの可視化にサブトモグラム平均化法を用いた．非晶質凍結切いたと自負している．これからは，追い抜かさなければなら片ではもちろん，信号／ノイズ（S/N）比が非常に小さく，ない．

周期性構造物でない限り，単分子一つ一つを見分けるのは現状では不可能に近い．しかし TOVIS の場合，同一分子種の謝同一構造体が複数あれば，その分子を含む領域のトモグラ

本技術の導入は，独立行政法人科学技術振興機構（JST）フィーデータ（サブトモグラム）の平均化によって S/N 比をの行う戦略的創造推進事業（CREST）の支援のもと，岡田（岸改善し，分子のおおよその構造を可視化できる．この技術は本）愛子特任研究員とライカマイクロシステムズ（株）の協

クライオ電子線トモグラフィーによる分子可視化が試されて力により始められました．また，加圧凍結装置，クライオミくるようになってから，発達してきた．好熱菌の分子シャペ

クロトームは文部科学省・特定領域「細胞の運命と挙動を支ロンのサブトモグラム平均化から始まり

19）

辞，最近ではコント配する細胞外環境のダイナミズム」の協力を頂きました．

ラスト伝達関数（CTF）による補正を考慮したサブトモグラム

CEMOVIS 観察では，京都大学大学院理学研究科・藤吉好則

20）平均化法が登場し，より分解能改善が進んでいる ．注意した

研究室の JEM-Z2100FC を使用させて頂くに当たり，藤吉好いのは単に三次元再構成像を足し合わせて，その数で割った則教授，日本電子株式会社小林一美氏には大変御世話になりものではないことである．大抵，逆空間においてデータ欠損ました．また，同様に JEM-3200FSC/BU を使わせて頂くに領域を考慮に入れつつデータをマージしてから新たに三次元あたり，大阪大学大学院生命機能研究科難波啓一教授，加藤再構成像を算出する．理論的には，単純な平均化より高品質

貴之助教には大変御世話になりました．の三次元像が得られる．このようにして得られたデスモソー
ムのカドヘリン構造と，2003 年に報告された加圧凍結―凍結置換法により作製された試料の電子線トモグラフィー像 21）とを是非，比較して頂きたい．非晶質凍結切片ではカドヘリン分子が整然と並んで細胞間を接着している一方，加圧凍結―凍結置換法で作成した切片では高コントラストのため，サブトモグラム平均化をせずとも明瞭にカドヘリンが紐状に観察されたが，その構造は変形してしまっていた．これらの結果からも，それぞれの手法の長所短所が良く分かる．
5.

CEMOVIS の適用方法

これまでのことをまとめると，CEMOVIS はオルガネラ等の形態を観察し，その形状を論じるにはアーティファクトの講座

CEMOVIS 試料作製法

文

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