２０１９年度「新産業創出研究会「研究成果報告書」

シンプル酵素触媒による有用化学品の効率的な変換システムの構築 」［ 広島大学 大学院統合生命科学研究科・助教 ］ ［ 田島 誉久 ］

１．はじめに発酵産業では大きな設備投資を必要とせずに産業廃棄物を資源化する技術が切望されている。焼酎の製造では、麹菌はイモ、米、麦等のデンプンを糖に変換する酵素を生産し、酵母によるアルコール発酵の原料となる糖を生産するとともに腐敗を防止するためにクエン酸を副産物として生産する。このクエン酸は焼酎粕に主要な成分として含まれるが、焼酎粕の多くは産業廃棄物として多大なコストをかけて処理されている。以前は海洋投棄により処理されていたが、海洋汚染防止を目的としたロンドン条約により海洋投棄が禁止され、全量を陸上処分しなくてはならない。これまでに焼酎粕の有効活用策として、メタン発酵、堆肥化、飼料化、健康飲料への転換など実用化もされている。しかし、これら研究費や設備投資費は多額であり、中小の焼酎メーカーではメタン発酵施設の初期投資や再利用場所への輸送コストを要することから、やむなく産業廃棄物として処分しているのが現状である。その処理コストは安くなく、簡便に有効活用できるプロセスが切望されている。
一方、シンプル酵素触媒は煩雑な変換酵素を精製することなく、シンプルな熱処理で触媒を調製し、効率よく物質変換反応を行える革新的なバイオ触媒である。本酵素触媒のコンセプトは、物質変換に必要な中・高温性酵素だけを機能させるために、中温の熱処理により宿主である低温菌由来の代謝系を失活させることで収率が大幅に向上すること、熱処理で細胞膜が部分的な変性することにより基質の透過性が向上し、酵素とのアクセスが良くなり高速な変換が実現できることである。これまでに申請者らは低温菌に中温菌由来の変換酵素を発現させ、ポリマー原料や海洋バイオマスの変換に成功してきた（T. Tajima
et al., 2013; T. Tajima et al., 2015; T. Tajima et al., 2018）。
そこで本触媒のコンセプトを用いて、焼酎粕に含まれる発酵副産物クエン酸を効率的な酵素反応により有用化学品であるイタコン酸に変換できれば、焼酎粕の一部を高付加価値な化学品に転換することができ、産業廃棄物コストを低減させるとともに資源の有効活用策を示すことができる。
２.概要
本研究ではシンプル酵素触媒を用いて発酵副産物を効率的に資源化する変換プロセスの構築を目的とした。そのために発酵副産物であるクエン酸をイタコン酸に効率的に変換するシンプル酵素触媒を構築し、変換酵素の生化学的解析と触媒の持続的利用について検討を行った。
イタコン酸を効率的に変換するシンプル酵素触媒は海洋性 Shewanella 属細菌を宿主として、広宿主域プラスミドベクターにて中温性酵素である大腸菌由来のアコニターゼと糸状菌由来の cis-アコニット酸脱炭酸酵素（CAD）を発現させることで構築した。これを用いてクエン酸を添加して中温にて反応を行うことで高収率な変換を行うことができたが、一定以上のイタコン酸蓄積が見られないことが問題として挙げられた。その原因を解明するために 2 つの変換酵素を精製し、生化学的な諸性質を調べたところ、CAD がイタコン酸により阻害を受けることが明らかとなった。
また、焼酎粕を用いたイタコン酸の変換を行った。焼酎粕中にはクエン酸の他に各種有機酸が発酵産物として含まれていたが、顕著なクエン酸量が見られなかったため、クエン酸を添加して触媒反応を行った。その結果、純粋なクエン酸を基質とした変換と同様に焼酎粕を含む反応においてもイタコン酸の効率的な変換が可能となった。したがって、本触媒は各種有機酸等が混在する系においても高生産が可能であることが示された。
最後にシンプル酵素触媒を繰り返して利用するために包括的固定化による触媒の固定化を行い、評価した。アクリルアミドによる固定化では重合阻害剤による酵素失活が懸念されたため、添加濃度の検討を行い、イタコン酸生成に影響のない濃度での固定化を行った。しかし、イタコン酸の生成量が乏しい結果となった。そこで他の一般的な包括的固定化担体による固定化触媒で検討を行った。アガロースによる固定化が最もイタコン酸生産量が高く、2 回目の繰り返しでも 60%程度の活性が保持されていた。しかし、CAD の漏出が見られたため、持続的な利用にはさらなる改良が必要である。また、細胞そのものの繰り返し利用を検討したところ、4 回程度は生成量が低下することなく利用することが可能であることが示された。
３.研究成果および今後の課題
本研究では構築した酵素触媒における課題を明らかにすることため、変換酵素の生化学的解析、焼酎粕
を用いた変換、触媒の繰り返し利用について検討を行った。

相対活性値

相対活性値

（１） イタコン酸生成酵素の解析
アコニターゼCAD
クエン酸をイタコン酸に変換する 2 種類の酵素
1.21.2について生化学的解析を行った。使用した酵
110.80.8
素は大腸菌 Escherichia coli のアコニターゼと0.60.6
糸状菌 Aspergillus terreus の cis-アコニット酸脱0.40.4
炭酸酵素（CAD）である。CAD については宿主0.20.200である Shewanella 属細菌のコドン頻度に合わ
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90熱処理温度[℃]
熱処理温度[℃]
せて人工合成した遺伝子配列を用いた。pET
発現ベクターによる各酵素の発現を行い、カラ図 1 各酵素の熱安定性ム精製して得た酵素を用いて活性を測定した。
アコニターゼ活性は cis-アコニット酸のクエン酸への反応を、CAD は cis-アコニット酸からイタコン酸への反応を行い、HPLC にて生成したクエン酸もしくはイタコン酸を HPLC にて定量することで評価した。安定性についてはあらかじめ酵素液を 4～80℃で 30 分間処理したものを用いて活性を測定することで評価した。熱安定性は、アコニターゼでは 70℃まで、CAD では 50℃まで安定であった（図 1）。しかし、それら以上の温度で処理することで急激に低下することが示された。いずれにしても両酵素は 50℃までの熱処理には耐えうることが明らかとなった。次に基質濃
表 各酵素の生化学的諸性質度による活性を測定し、Lineweaver-burk プロッCAD
アコニターゼトによる生化学的パラメーターを算出した（表）。
70℃まで活性あり50℃まで活性あり
熱安定性
その結果、アコニターゼでは Km = 7.83 mM,Km (mM)
7.83
5.89
Vmax (mM･min )
0.115
0.423
Vmax = 0.115 mM/min であったのに対し、CAD
Kcat (min )2174660
は Km = 5.89 mM, Vmax = 0.423 mM であり、比Kcat /Km (min ･mM )27.7791
較的近い値を示した。一方で触媒の回転数を2.0871.76
比活性 (μmol･min ･mg )示す Kcat や反応効率を示す Kcat / Km は CAD が混合阻害
生産物阻害－KI 約58 mM
アコニターゼよりも 20～30 倍高い値を示した。しかし、CAD は生成物であるイタコン酸により阻害を受け、その形式は混合阻害であり、KI=58 mM であることが示された。これまでに 300～400 mM のイタコン酸の蓄積があると生産が停止する結果が得られており、高濃度のイタコン酸が生産された場合は影響を受けることが改めて示された。
-1-1-1-1-1-1（２） 焼酎粕を用いた物質変換
焼酎粕を基質として本触媒による変換を行い、純クエン酸を基質とした反応と比較した。ただし、今回使用した焼酎粕のクエン酸含有量が少なかったため、焼酎粕にクエン酸を添加することで反応を行なった。
その結果、焼酎粕の系でも純クエン酸の系と同様に変換することが示された。

（３） 細胞の繰り返し利用
シンプル酵素触媒を用いた繰り返し利用について検討を行った。イタコン酸生成酵素を発現させた
Shewanella 属細菌を用いて 5 回の反応を繰り返した。その結果、細胞を緩衝液にて洗浄を行わない系に

おいて 4 回までは生産性低下を抑制できることが示された（図 2）。洗浄操作による細胞への物理的なダメージが生産性低下の原因と思われる。

次に、その他の固定化担体として知られるアガロース、オルトケイ酸テトラエチルを担体に用いて菌懸濁液やアクリルアミド固定化とのイタコン酸生産量の比較を行った。アガロースを用いて固定化を行ったものについて、1 回目の反応で最も高いイタコン酸生産を示した。また、1回目の反応後に触媒をリン酸緩衝液で洗浄して 2 回目の反応に用いたところ、同じくアガロース固定化触媒が最も活性保持率（2 回目の生産量／1 回目の生産量）が高かった。菌懸濁液では活性保持率が 12.5%に対してアガロース固定化担体では約 60%と 5 倍程度の向上が見られた（図 4）。その一方で、繰り返し用いることでイタコン酸生産量が低下する原因として酵素の漏出が考えられた。そこで、反応

Itaconic acid productivity (g/L/h)cells without washingcells with washing

0.60.50.40.30.20.101st2nd3th4th5th

図 2 シンプル酵素触媒を繰り返し利用した変換
イタコン酸濃度(mM)
イタコン酸濃度 (mM)

過硫酸アンモニウム（AP）

過硫酸カリウム
（PP）

VA044

6040200(%)

イタコン酸濃度 (mM)

各重合開始剤濃度

菌懸濁液

菌懸濁液
( 37℃、3時間熱処理 )13% アクリル
アミド( 開始剤：AP )1回目 2回目

1回目 2回目

1回目 2回目

13% アクリル
アミド( 開始剤：PP )13% アクリル
アミド( 開始剤：VA044)

60
5040302010ND0ND

ND

NDND

1回目 2回目

ND

1回目 2回目

過硫酸アンモニウム 0.05%
5% アクリルアミド

13% アクリルアミド

10% アクリルアミド

イタコン酸濃度 (mM)

543210

1回目

2回目

1回目

2回目

NDND1回目

2回目

図 3 アクリルアミドにより固定化した触媒の変換：開始剤の検討（上）、13%アクリルアミドによる固体化触媒による変換（中）、アクリルアミド濃度の検討（下）イタコン酸（mM/mg-cell)（４） シンプル酵素触媒の包括的固定化と繰り返し利用
シンプル酵素触媒の細胞を包括的に固定化することにより持続的な利用を可能にできると考え、一般的な固定化担体による固定化を試みた。糸状菌においてはグルコースを原料としたイタコン酸生産菌株のアクリルアミドによる固定化が可能であることが示されている（千畑ら）。そこでアクリルアミドを用いて固定化を行い、クエン酸を基質とした変換反応を行ったところ、ほとんど生産が見られなかった。そこで、アクリルアミドの固定化に用いる重合開始剤（過硫酸アンモニウ
ム、過硫酸カリウム、VA044）の検討を行った（図 3 上）。これらが変換反応に影響を与えない濃度（それぞれ 0.10, 0.10, 0.50%）において13%アクリルアミドにて固定化を行い反応させたが、顕著な改善が見られなかった（図 3 中）。さらにアクリルアミドの濃度を 5～13%にし、さらに重合開始剤の濃度をさらに低下した 0.05%にして固定化を行い反応したところ、アクリルアミド
濃度 5%では 4.5 mM の生産が確認された（図 3下）が、反応性は低下した。クエン酸を基質とした反応においては固定化した触媒内部の酵素とのアクセスが悪くなり、アクリルアミドによる固定化は適さないことが示された。

0.71

活性保持率=

0.859.9%

0.6

1回目

2回目の生産量
1回目の生産量

2回目

クエン酸 50 mM
反応: 12 h, 28℃

0.4
0.2
012.5%
菌懸濁液

21.3%
アガロース

ポリアクリルアミド

32.2%
TEOS

(オルトケイ酸テトラエチル)

図 4 シンプル酵素触媒を繰り返し利用した変換上清を用いて変換反応を行ったところ、クエン酸の添加ではなく、CAD の基質である cis-アコニット酸の添加によりイタコン酸の生産が見られたことから 2 段階目の反応を触媒する CAD の漏出が生産低下の要因と推察された。CAD はアコニターゼよりも小さな酵素であることから固定化したアガロース格子から漏出しないように改変することで利用が可能になると考えられる。
４．おわりに
本研究により、シンプル酵素触媒が廃棄物とされる焼酎粕のクエン酸をイタコン酸に効率的に変換できることが示された。このことは酵素変換そのものに阻害がない限りは生育阻害を受けるようなものであっても問題なく変換できるという本触媒の特長を示すものであり、実証された。また、細胞そのものを 5 回繰り返し利用できることもメリットとして示された。その一方で、cis-アコニット酸脱炭酸酵素の生産物阻害が見られたこと、触媒の包括的固定化において酵素の漏出や失活が見られたことから、担体の選抜や固定化法の検討がさらに必要なことが課題として示された。
５．本研究の今後の計画
触媒の固定化について、包括的固定化においては CAD が漏出しないための固定化触媒の検討を行うとともに、包括的固定化以外の化学的固定化等を検討する。CAD の生産物阻害を解除した酵素の改変もイタコン酸を高生産には求められるため取得を試みる。
６．その他（１）出願特許（タイトル・出願番号・発明者・特許権者など）なし（２）投稿論文（タイトル・学会名等）
G. Luo, M. Fujino, S. Nakano, A. Hida, T. Tajima, J. Kato: Accelerating itaconic acid production byincreasing membrane permeability of whole-cell biocatalyst based on a psychrophilic bacterium
Shewanella livingstonensis Ac10, Journal of Biotechnology, 312, 56-62 (2020)○中野翔，羅宮臨風，田島誉久，緋田安希子，加藤純一：低温菌シンプル酵素触媒を活用したイタコン酸の効率的な生産，2019.11.9 日本農芸化学会 2019 年度西日本・中四国支部合同沖縄大会○藤野美穂，羅宮臨風，中野翔，田島誉久，緋田安希子，加藤純一：イタコン酸変換酵素の高機能化に関する研究，2019.11.9 日本農芸化学会 2019 年度西日本・中四国支部合同沖縄大会○Takahisa Tajima, Gonglinfeng Luo, Syo Nakano, Miho Fujino and Junichi Kato: Efficient bioproductionby psychrophile-based simple biocatalyst2019.11.23 25th Symposium of Young Asian BiologicalEngineers’ Community（３）本研究会の参加企業・団体名
中国醸造株式会社

この事業は、競輪の補助を受けて実施しました。
競輪の補助事業

https://www.jka-cycle.jp/