フォトサーマルイメージングのための off-axis 型
デジタルホログラフィック顕微鏡の開発
戸倉川研究室 丸山 朋希
1. はじめに
我々は波⾧ 2-20 µm 帯の中赤外光源の開発を行ってきた。この波⾧ 2-20 µm 帯には分子の指紋領記録する技術である [2]。光の干渉を利用して、物体の振幅と位相の情報を記録する。
デジタルホログラフィはホログラフィの一種で、域と呼ばれる 2.5-20 µm 帯が含まれており、生体光学系で情報を記録し、イメージセンサーで現像分子を含む様々な分子(分子結合)固有の共鳴吸収し、コンピュータデジタルに情報を再生する。透線を有する。これらは基本音に相当する共鳴を多過物体の情報を記録する場合、図 2-1 のようなマく含み近赤外帯の高次振動に比べて強い共鳴となッハ・ツェンダー型の干渉計がよく用いられる。

る。よって波⾧ 2-20µm 帯の光源は、この中赤外領域の吸収を利用して高感度な分子の特定が可能とする。
生体のような微小な試料を観察する手法として
フォトサーマル効果 [1]を用いたものがあり、これを用いた顕微鏡をフォトサーマル顕微鏡と呼ぶ。
フォトサーマル効果とは、試料に光を照射したときの光エネルギーによる温度上昇のことである。

図 2-1

マッハ・ツェンダー型による干渉計

従来の赤外吸収顕微鏡では赤外光をプローブ光として検出していたため，空間解像度が赤外光の回

このとき参照光と物体光を角度をつけて撮像す折限界で制限されてしまうという問題点があった

る構成を off-axis 型と呼ばれる。この構成では角が，対してフォトサーマル顕微鏡では局所的な赤度に依存した干渉縞がのった干渉画像が得られ、外のポンプ光による吸収を波⾧の短い可視光のプ

この後記載するフーリエ変換法によって単一画像ローブ光で検出するため，より高い空間解像度がから位相情報の取得が可能となる。

得られる。
本研究では、フォトサーマル顕微鏡で試料の位相情報を定量的に得るために、off-axis 法を用いた2.2 フーリエ変換法 [3] [4]off-axis デジタルホログラフィによって得られデジタルホログラフィック顕微鏡の開発を目指し、 た干渉画像にフーリエ変換を用いると干渉縞の空光学系の構築及びフーリエ変換を用いた画像解析間周波数スペクトルの検出が可能となる。フーリを行った。

エ変換法は干渉縞の空間周波数スペクトルに含まれる強度分布と位相の情報を算出する手法である。

2. 原理
2.1 デジタルホログラフィ
ホログラフィとは、物体から回折された波面を干渉縞画像に対してフーリエ変換を行うと、回折されていない非回折光、物体の情報が記録されている物体像、その共役像の成分に分離された空間周波数スペクトルが得られる。この物体像の成収され温度上昇が起きる。この現象をフォトサー分のみをフィルタリングで抽出し、空間周波数面マル効果と呼び、その結果、照射された領域で屈の中心に平行移動させる。この空間周波数スペク折率が変化する。この屈折率変化を検出する顕微

トルに対して逆フーリエ変換を行うと、振幅と位鏡をフォトサーマル顕微鏡と呼ぶ。フォトサーマ

相の情報をもった複素振幅が得られる(図 2.2)。こル顕微鏡は、ポンプ・プローブ顕微鏡の一種で、強の複素振幅から強度と位相の情報が得らえる。

度変調されたポンプ光と、もうひとつのプローブ光を試料に照射する。ポンプ光によって試料の温度が上昇し、それによる屈折率の変化をプローブ光で検出する。ホログラフィック顕微鏡技術によって 1/1000℃程度のごく僅かな温度変化の検出も可能である。
生体分子を含む様々な分子は波⾧ 2.5-20 µm の間に固有の吸収を示すため、この波⾧帯は分子の指紋領域と呼ばれる。そのため、この波⾧帯の光源をポンプ光に用いることによって、標識を用いずに分子の特定が可能な顕微イメージングを行うことができる。
従来のラベルフリーイメージングにおいて、赤外吸収顕微鏡は空間分解能が低く、ラマン散乱顕微鏡は感度が低く、コヒーレントラマン散乱顕微
鏡はパルス光を試料に照射するため侵襲性が高い

図 2-2

フーリエ変換法による画像処理のプロセスという欠点を有する。そこでフォトサーマル顕微鏡は、高空間分解能、高感度、非侵襲性のラベルフ

2.3 デジタルホログラフィック顕微鏡

リーイメージングとして注目されている [6]。

デ ジ タ ル ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク 顕 微 鏡 (DigitalHolographic Microscopy :DHM)は、顕微鏡のシステムにデジタルホログラフィの技術を導入したものである [5]。特徴として 1 回の露光で全焦点画像を取得できること、ラベルフリーで微細な透明体の定量イメージングが可能であることが挙げられる。定量的に光波の位相状態を得るため、細胞のような透明体を定量観測できる。このことから、

図 2-3

フォトサーマル顕微鏡概念図

DHM は定量位相顕微鏡とも呼ばれる。
本研究ではこれをフォトサーマル顕微鏡に利用することを将来的な狙いとしている。

3. デジタルホログラフィック顕微鏡の構築
デジタルホログラフィック顕微鏡の構成を図3-1 に示す。光源にはスペクトル幅が狭く、コヒー

2.4 フォトサーマル顕微鏡
試料にポンプ光を照射すると光エネルギーが吸レンス⾧の⾧い He-Ne レーザーを用い、ビームスプリッターで物体光と参照光に分けられる。試料

(a) 干渉縞画像全体

図 3-1

構築したデジタルホログラフィック顕微鏡から回折された光は対物レンズと結像レンズで(b) (a)の赤枠部分の拡大図干渉縞画像全体に左下から50 倍に拡大される。このとき対物レンズの NA は右上にかけての縞模様が入っている0.42 であり、波⾧ 633nm では空間分解能は 0.65

図 4-1

干渉縞画像µm ときまる。参照光側にレンズとピンホールを配置し、レンズとピンホールの位置を変えることに拡大画像図 4-1(b)をみると干渉縞が確認できる。

よって仮想点光源の位置、強度を調整できるようこの干渉縞の周期Λ、参照光と物体光の角度𝜃、光にした。参照光側のミラーの傾きを変化させるこ源の波⾧𝜆の関係はとでイメージセンサーに入射する参照光に角度がつき、イメージセンサー面上で干渉縞が発生する。

Λ=𝜆sin 𝜃

イメージセンサーのピクセルサイズは 5.86 µm×で表される。干渉縞の周期は 29.6 µm で、光源の5.86 µm で、視野範囲 0.142 mm×0.227 mm、露波⾧は 632.8 nm であったので、この式から参照光

光時間 1.794 ms で撮影した。この露光時間はプロと物体光の角度は 1.23°であることが分かった。

ーブ光の光出力を増加することによって一桁以上

また、サンプリング定理より、干渉縞の最小周期短くできる。試料は透明なマウスの骨格筋細胞をはピクセルサイズから 5.86 µm×2 = 11.72 µm と用いた。

計算され、角度は 3.10°未満にする必要がある。

4. 画像解析4.2 空間周波数スペクトル4.1 干渉縞画像

次に、干渉縞画像に対して Python を用いて二次撮影された干 渉縞画像を図 4-1 に示す。図元フーリエ変換を行い、図 4-2 の空間周波数スペ4-1(a)の黄色の枠の部分に、同心円状のゴーストクトルを得た。非回折光、物体像、共役像の成分がが発生した。これは拭きにくい場所のレンズの汚重ならないように分離できた。この分離量が先にれ、試料での面反射が原因であると考えられる。

説明した干渉縞の空間周波数に相当している。こ図 4-4図 4-2

空間周波数スペクトルのとき高次周波数成分が発生した。これは干渉縞の断面方向の強度分布が三角関数の形状になっておらず、フーリエ変換時に高次成分が発生したと考えられる。off axis の角度を浅くし干渉縞の空間周期を広げると高次の成分は除去できるが、非回折光、物体像、共役像の成分が重なってしまい、画像の空間分解能が低下してしまう。高次成分が発生しても分解能への影響はないためこの画像で解析を進めた。

位相分布

5. まとめと今後の展望
デジタルホログラフィック顕微鏡を設計し構築した。また、画像処理によって、生体試料の 0.142mm×0.227 mm の範囲を分解能 0.65 µm で強度分
布と位相分布を取得し、組織による位相の違いを検出した。
今後の展望として、ワンショットで高速な撮影を利用した動画の撮影や、試料に中赤外光を照射してフォトサーマル顕微鏡の構築を試みる。
参考文献

4.3 強度分布・位相分布
得られた空間周波数スペクトルに対して、物体像の成分のみをフィルタリングで抽出し、中央に平行移動させて搬送波の成分を除去する。その空間周波数スペクトルに対して逆フーリエ変換を行い、振幅と位相の情報を含んだ複素振幅を得た。
図 4.３、図 4-4 より、組織によって強度位相の違いを検出できたことが分かった。

[1] M. Tamamitsu, et.al., “Label-free biochemicalquantitative phase imaging with mid-infrared
photothermal effect,” Optica Vol. 7, Issue 4, pp.
359-366(2020).
[2] 早崎芳夫, "光学ライブラリー7 ディジタルホログラフィ", 朝倉書店(2016).
[3] 武田光夫, "フーリエ変換によるしま画像解析とその応用", 応用物理 第 62 巻 第 6 号(1993).
[4] M. Takeda, et.al., "Fourier-transform method offringe-patternanalysisforcomputer-based

topography and interferometry", J. Opt. Soc.
Am./Vol. 72, No. 1, pp.156-160(1982).
[5] T. Tahara, et.al., “ Digital holography and its
multidimensional

imagingapplications,”

Microscopy, Vol.67, Issue 2, pp.55-67(2018).
[6] K. Toda, et.al., "Molecular contrast on phasecontrast microscope", Scientific Report, 9,No.9957, 2019.
図 4-3

強度分布