X線ライトシートと2次元のX線構造光を用いた三次元イメージング所属 理化学研究所
放射光科学研究所 物理・化学系ビームライン基盤グループ 放射光イメージングチーム
氏名 香村 芳樹
2024年6月20日
1極薄X線ライトシートを使った三次元イメージング
イントロダクション
可視光顕微鏡による3Dイメージング
非等方的な3Dの空間解像度 ＆ 回折限界

面内方向観察共焦点顕微鏡 二光子励起顕微鏡

可視光ライトシート顕微鏡

二次元走査

結像

結像

z-走査

z-走査

奥行き方向観察 z-走査
測定時間

×△

○

照射波長

λλ
可視光

2λ

λλ
可視光

λ
可視光

観測波長

2

イントロダクション
可視光ライトシート顕微鏡→ X線領域へ拡張
マウスの全脳(可視光ライトシート顕微鏡)
2mm

Matsumoto et al.
Nature Protocols (2019)

可視光ライトシート顕微鏡

X線ライトシート顕微鏡

集光サイズ
(厚み)

~0.4 µm〜0.05 µm

焦点深度(FOV)~10 µm≧50 µm

開口数(NA)0.20.00210µm
Dean et al.
BioPhysical Journal 2015
3高解像度3Dイメージングでの奥行解像度のブレークスルー

最小集光サイズ

4000
3500

50nmは電顕用切片の厚みに匹敵

X線ライトシート顕微鏡

MAXWELL(Microscopy by Achromatic
X-rays With Emission of Laminar Light ）Intensity (a. u.)

3000
2500
2000

幅 65 nm (FWHM)

1500
1000
500
0-600

-400

-200

0200

400

600

Position (nm)

可視光顕微鏡の焦点深度
1.4 µm (20x), 1.1 µm (50x)

X線ライトシートの厚み
0.065 µm

20x lens,
0.3µm/pixel

Y.Kohmura et al., Sci. Rep.
12:9668 (2022)

シンチレーターナノ粒子からの可視発光の観察
4

シンチレーター微粒子の開発(I)•

希土類(ランタナイド)元素微粒子: NaGdF4@Tb, NaGdF4@Eu (Academia Sinica)B.

A.

(a)NaGdF4@Eu,(b)NaGdF4@Tb
発光スペクトル(Cryst. Eng. Comm.2017, 19, 2065)
276 nm excitation

50 nm

NaGdF4:Tbの微粒子のサイズの分布

X-ray
NaGdF4@Tb SciNP

X-ray
NaGdF4@Eu SciNP(Y.Kohmura et al., Sci. Rep. 2022, 12:9668).

5シンチレーター微粒子の開発(II)•

Perovskite型量子ドットのナノ粒子, CsPbBr3 (Quantum Corp., Academia Sinica)

A.

B.

X-ray

UV light

UV lightX-ray

365 nm excitation

立方晶系のCsPbBr3 の結晶構造のシミュレー
シ ョ ン 結 果 . (J. Mater.
Chem. C, 2020, 8,17090)

CsPbBr3 の 発 光 ス ペ ク ト ル .
(Optics Express, 2016, 24,15071)

6X線ライトシート顕微鏡システム@ BL29XUL-EH3 of SPring-8
可視光顕微鏡Olympus BX50 :x5~50＋
HAMAMATSU
ORCA Quest

硬X線アンジュレーター
ビームライン
9-11keV(典型例)

試料
PZT-z
stage～45 m

垂直制限スリット幅
10 ～ 30 µm(典型例)

WolterI型
一次元集光ミラー
長さ：261 mm,
NA: ～0.002
7-6003000

幅400400
350
300
250
200
150
100
500-400

0200

FOV~400 µm(FWHM: <200 nm)

450-300

2000-200-1000100200300

400

Focal position (micrion)

強度プロファイル@最良集光条件

視野600

40000-300-200-100 0 100 200 300
X線光軸方向の位置(µm)

3500

1000

ライトシート幅
65 nm (FWHM)

3000

Intensity (a. u.)-200- 強度半値の位置

強度(a.u.)

垂直位置 (nm)-400

Intensit
4000y

集光ビームの幅(FWHM)

500

FWHM (nm)

ナイフエッジスキャン結果, 9 keV
可視光

奥行き解像度(nm)X線ライトシートの評価

2500
2000
1500
1000
500
0-600

-400

-200

0200

400

600

Position (nm)Y.Kohmura et al., Sci. Rep. (2022)12:96688標準試料上の単一粒子イメージング
Perovskite型量子ドットのナノ粒子(CsPbBr3) ：サイズ～20 nm

Y.Kohmura et al., Sci. Rep. (2022) 12:9668

ライトシート顕微鏡実験

70nm

試料提供者
Hwu教授(AS, Taiwan)

３次元でほぼ等方的な超解像性能!

Intensity(Α.U.)

11 keV, 露光時間: 1秒
SU8 test pattern(UV irradiated)

70nm
幅~400nmPosition(µm)

面内分解能 ~20nm(STORM計算利用による典型例)～ 超解像性能

奥行き分解能～70nm～超解像性能9チャイニーズハムスター(卵巣)細胞
Eu & Tbをドープした粒子を用いた二色の三次元イメージング

細胞核内の二色イメージン

10

STORM法による面内超解像の向上[面内分布]
可視光のSTORM法では、蛍光体の明滅によって、回折限界(0.6λ/NA)内での、複数のX線ライトシート蛍光の同時発生を防ぐ。
↓→
X線ライトシート顕微鏡でも、回折限界内での複数の蛍光の同時発生が防げてSTORM法の有用性が高い。

S. W. Hell,
Science, 316,
1153, 200711等方的な超解像性能の方向性(X線ライトシートの奥行き超解像⊗ライトシート内微細構造による面内超解像)
ライトシート内の微細構造の形成法• 屈折光学素子を用いた干渉縞• 回折光学素子を用いた干渉縞

12

X線ライトシート面内の干渉縞
X線エネルギー = 9keV
ピッチ = 2.6ミクロン

低密度領域

高密度領域

正弦波状→矩形波状の構造光より微細・高コントラストの構造光13従来技術とその問題点
既に実用化されている可視光ライトシート顕微鏡、共焦点顕微鏡、X線ライトシート顕微鏡などの三次元顕微鏡では、面内分解能が悪い特徴がある。
孤立粒子が存在する場合のみ、重心計算により面内に超解像イメージングが可能。
→高密度に存在する粒子に対し面内分解能を上げる手法が必要。

14

新技術の特徴・従来技術との比較• 従来の可視光蛍光顕微鏡技術では、試料中の蛍光粒子が孤立した場合のみ、重心演算による解像度改善が可能で、超解像イメージングが可能だった。
• 新技術では、粒子が密集した試料に対し、微細構造を与えたX線を照射し、重心演算無しでの微粒子の超解像イメージングが可能となる。

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想定される用途• 細胞、オルガネラ内の高分子、薬剤分子の分布などを複数色で可視化する超解像イメージング。
• 厚みを持った器官の内部構造を可視化。

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実用化に向けた課題• 顕微鏡の高解像度化のためX線構造光の微細構造化、試料中に導入するシンチレーター粒子の微小化、発光効率の向上。
• シンチレーター粒子の生体器官への特異標識。
• 実用化に向けて、三次元の解像度50→20nmの達成を目指した条件出し。

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企業への期待• 微細化されたX線構造光と、実験室レベルでの実験を想定したビジネス展開。
• シンチレーター粒子の化学組成、構造の最適化による、微小化、発光効率の向上。
• 生体器官への特異標識の技術開発。
• 生命科学・医学薬学分野における本技術を用いた単分子イメージング。
以上における共同研究をご検討頂けると有難いです。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：X線照明顕微鏡および発光物質像の撮影方法• 出願番号 ：特願2023-035109• 出願人：理化学研究所• 発明者：香村芳樹、高野秀和、横田秀夫

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お問い合わせ先
株式会社理研鼎業（りけんていぎょう）

新技術説明会事務局
Email:senryaku@innovation-riken.jp20

終わり21