称号及び氏名

博士（獣医学）

学位授与の日付

平成１８年２月２０日

論「Dynamic Aspects of Antioxidant Metabolisms and Transport」

文名

笠原恵美子

（生体内における抗酸化物質代謝と輸送の動的様相）
論文審査委員

主査

小森雅之

副査

中野長久

副査

津山伸吾

副査

竹中重雄

論文要旨
第１章

緒言

好気性生物は生命維持に大量のエネルギー（ＡＴＰ）を必要とし、ヒトではそのために 1 日に約５００ Ｌの酸素を代謝利用している。体内で消費される酸素の殆どはミトコンドリアの電子伝達系により最終的にＨ2Ｏに代謝されるが、その数％は活性酸素種（1Ｏ2,Ｏ2- , Ｈ 2Ｏ2 , ・ＯＨ）に代謝されている。生体内で必要以上の活性酸素が産生されると、脂質、たんぱく質、ＤＮＡなどと反応して細胞傷害やアポトーシスを誘起する。
生体内にはこれに対抗する種々の抗酸化酵素や抗酸化物質が存在し、レドックス制御系を介して活性酸素代謝のバランスを維持している。生体内での酸化反応と抗酸化能のバランスが崩れて活性酸素が優位になる酸化ストレスは、生体の機能制御や病態発現に深く関与している。
生体内の抗酸化物質の多くは常に代謝回転により再生されて抗酸化能力を維持し続けている。血中のグルタチオン（ＧＳＨ）濃度は臓器のそれに比べて２桁低いが、肝腎を主とする臓器間サイクルにより代謝回転しているので、循環血液中へのＧＳＨ動員量は臓器内と同程度である。アスコルビン酸（ＡＡ）も同様に臓器間輸送と酸化還元サイクルにより循環血液中の濃度を一定に維持しているが、その動的様相は不明な点が多い。
また、これらの水溶性抗酸化物質は ビタミンＥ（ＶＥ）などの脂溶性抗酸化物質の還元再生にも利用され、生体内で抗酸化ネットワークを形成している。従って、生体内におけるこれら水溶性抗酸化物質の動的様相を知ることは、酸化ストレス病態を理解するうえで重要である。

本研究では、水溶性抗酸化物質であるＧＳＨとＡＡに着目し、様々な酸化ストレス下におけるその動態と病態生理化学的意義を解析した。
第２章 グルタチオンとアスコルビン酸の共役作用

生体内ではグルタチオン（ＧＳＨ）とアスコルビン酸（ＡＡ）が共役して抗酸化ネットワークを形成し、抗酸化機能を発揮している。ＧＳＨは自身が抗酸化能を発揮するのみでなく、ＡＡの還元再生にも働いており、両者のネットワークは酸化ストレスに対する生体防御に重要である。
ラットやマウスなどと異なり、ヒトではＡＡ合成能がない。本研究では、ＡＡ合成不能のＯＤＳラットを用い、生体内でのＧＳＨとＡＡの動的相互作用を検討した。ＯＤＳラットをアスコルビン酸欠乏食で飼育［ＯＤＳ(-)］すると、約２週間で臓器中のＡＡ濃度が著明に低下した。このとき、肝腎のＧＳＨ濃度には変化がみられなかった。ＧＳ
Ｈ合成阻害剤（L-buthionine sulfoximine, ＢＳＯ）を投与してＧＳＨ動員量を解析した結果、ＯＤＳラットでは肝ミトコンドリアと腎サイトゾルのＧＳＨ動員量が著明に増加していた。通常食で飼育したＯＤＳ(+)ラットに比べ、アスコルビン酸欠乏食を与えたＯＤＳ(-)ラットでは肝腎のＧＳＨ動員量が増加傾向を示した。一方、生体内ＧＳＨの低下は主に肝ＡＡの de novo 合成を促進させるが、ＯＤＳ(+)ラットではＢＳＯ投与によるＧＳＨの低下に伴い肝のＡＡが著明に低下した。
以上のことより、ＡＡ欠乏状態では肝腎のＧＳＨ代謝回転が代償的に加速されること、及びＧＳＨ低下状態では細胞内ＡＡが代償的に代謝亢進することにより、酸化ストレスから生体を防御していることが示唆された。
第３章

循環血液中におけるアスコルビン酸還元再生機構

ＡＡはＧＳＨやＶＥなどと共役して抗酸化代謝を制御しているが、その体内動態には不明な点が多い。ＡＡはラジカル反応や酸化反応により、モノデヒドロアスコルビン酸（ＭＤＡ）やデヒドロアスコルビン酸（ＤＡＡ）に代謝される。このためＡＡを合成できないヒトなどでは、ＭＤＡやＤＡＡからＡＡを還元再生するシステムが重要である。

in vitro の実験系では、細胞外のＤＡＡがグルコーストランスポーターを介して細胞内に取り込まれ、ＧＳＨやＮＡＤＰＨ存在下でＡＡに還元再生されることにより細胞内のＡＡを高濃度に維持することが知られているが、生体内での挙動は不明である。本研
究では、ラットの体外循環系を構築し、electron spin resonance（ＥＳＲ）により循環血液中のアスコルビン酸ラジカルを経時的に検出するシステムを確立した。また、生体内でのＡＡ還元再生機構を知る目的で、循環血中のＡＡを瞬時に酸化させる長時間循環型ＡＡ酸化酵素（ＰＥＧ−ＡＯａｓｅ）を開発し、循環血中のＡＡおよびその酸化代謝産物の挙動を動力学的に解析した。
解析の結果、循環血中のＡＡは１ Ｕ/ｋｇのＰＥＧ−ＡＯａｓｅを投与することにより常時ラジカルに代謝されるが、驚くことにＡＡの血中濃度は一定に維持されていた。このとき臓器内のアスコルビン酸濃度は変化しないことより、循環血液中で酸化されたＡ
Ａは驚異的な速度でＡＡに還元再生され、その濃度を一定に維持していることが示唆された。
腎臓はアスコルビン酸のろ過や再吸収などに関与する臓器であるが、腎臓摘出ラットにおいても、ＡＡの還元再生能は維持されており、血中ＡＡ濃度の維持に腎臓の関与は少ないと考えられた。一方、ＢＳＯ投与により肝腎のＧＳＨ濃度を低下させたラットでは、ＰＥＧ−ＡＯａｓｅによる血中ＡＡの酸化が加速された。これらのことより、循環血液中のＡＡ還元再生機構には肝のＧＳＨが重要であることが示唆された。
第４章

高血圧と高脂血漿病態における内因性抗酸化物質動態

多くの動物では、肝腎をはじめとする臓器間ＧＳＨ代謝輸送システムが存在し、細胞内外のレドックス状態を制御している。動脈硬化や高血圧などにおける血管の生理的機能変化や血管病態には活性酸素代謝の歪みが関与している可能性が考えられるが、その実体は不明な点が多い。各種病態における酸化ストレスの実体とレドックス制御機能の関与を知る目的で、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）及び高脂質血症家兎（ＷＨＨＬ）におけるＧＳＨとＡＡの代謝動態を解析した。両動物の体内ＧＳＨレベルには変化がみられなかった。ＧＳＨ合成阻害剤であるＢＳＯを投与してＧＳＨ代謝回転動態を解析した結果、両病態動物（ＳＨＲ,ＷＨＨＬ）では、ＧＳＨの代謝回転量がいずれも約 50％低下している事が判明した。また、循環血中へのＧＳＨ動員量やＡＡ代謝も低下しており、血流空間での酸化防御能の低下が示唆された。更に、ＳＨＲの高血圧はＧＳＨの静脈内投与により改善されることより、循環血中へのＧＳＨ動員量の低下が高血圧に関与している可能性が示唆された。これらの結果から、高血圧や動脈硬化症においては、生体内のＧＳＨやＡＡの代謝能力が低下し、両抗酸化物を有効利用できないことにより酸化ストレスが増強し、病態を増悪させている可能性が示唆された。
第５章

内分泌撹乱物質による生殖細胞のアポトーシスと酸化ストレス

精巣は酸化ストレス、温度、炎症、放射線などのストレッサーに対して感受性が高い。
酸化ストレスは生殖細胞の分化異常や機能低下を引き起こす重要な因子であるため、精巣にはＧＳＨやＡＡなどの抗酸化物質が高濃度に存在している。
現代の生活環境は膨大な種類の合成化学物質により汚染されており、生殖細胞への影響が社会的に大きな問題となっている。プラスチック製のパッケージや医療器具などの可塑剤として汎用されているフタル酸ジエステル（ＤＥＨＰ）は、精巣萎縮や精子数の減少など、生殖組織に影響する内分泌攪乱物質の一つであるが、その作用機構は不明な点が多い。本研究では、ＤＥＨＰによる精巣萎縮と酸化ストレスの関与を明らかにした。
ラットにＤＥＨＰを投与すると、生殖細胞がアポトーシスを起こして精巣が萎縮し、成熟した精子が殆ど見られなくなった。酸化ストレスは種々の細胞でアポトーシスを誘起することから、これと本現象との関係を解析した。ＤＥＨＰ投与ラットの精巣内ＧＳＨとＡＡ濃度はコントロール群に比べて有意に減少していた。また、酸化ストレスにより代償的に上昇してくる酵素であるglutathione peroxidase (ＧＰｘ)やcatalase (ＣＡＴ)の活性、及び酸化ストレスのマーカーである脂質過酸化物質（ＴＢＡＲＳ）などが有意に上昇していた。Ｌ０１２を用いた化学発光法により精巣細胞の活性酸素産生動態を解析した結果、ＤＥＨＰ経口投与６時間後よりＯ2-やＨ2Ｏ2などの産生が上昇していた。ＤＥＨＰの代謝産物であるフタル酸モノエステル（ＭＥＨＰ）は精巣ミトコンドリアからチトクロームC遊離を強く促進しており、活性酸素によるミトコンドリア傷害がアポトーシス誘導に関与していることが示唆された。
以上の結果より、ＤＥＨＰの加水分解産物であるＭＥＨＰが活性酸素代謝を介して精細胞系列のアポトーシスを特異的に誘起し、精巣萎縮に関与することが示唆された。
第６章

総括

抗酸化代謝系はネットワークを介して活性酸素代謝を制御し、酸化ストレスから生体を防御するのみならず、細胞のシグナル機能をレドックス制御している。従って、抗酸化代謝系による生命の制御機構を解明すると同時に、それを有効に制御することにより様々な疾患に対する新たな治療戦略を確立しうると考えられる。

審査結果の要旨
好気性生物の体内で消費される酸素の殆どはミトコンドリアの電子伝達系により最終的にH2Oに代謝される。しかし、わずか数％の酸素はO2-などの活性酸素種に変換され、生体内で様々な生体高分子と反応して細胞傷害やアポトーシスを誘起する。生体内にはこれに対抗する種々の抗酸化酵素や抗酸化物質が存在し、レドックス制御系を介して活性酸素代謝のバランスを維持している。生体内での酸化反応と抗酸化能のバランスが崩れて活性酸素が優位になる酸化ストレスは、生体の機能制御や病態発現に深く関与している。アスコルビン酸（AA）はグルタチオン（GSH）と同様に肝腎を主とする臓器間輸送と酸化還元サイクルにより循環血液中の濃度を一定に維持しているが、その動的様相は不明な点が多い。また、これらの水溶性抗酸化物質とビタミンEなどの脂溶性抗酸化物質は生体内で抗酸化ネットワークを形成している。従って、生体内における水溶性抗酸化物質の動的様相を知ることは、酸化ストレス病態を理解するうえで重要である。本研究では、GSHとAAに着目し、様々な酸化ストレス下におけるその動態と病態生理化学的意義を解析し、以下のような成果を得た。
1.

ヒトのように AA 合成能がない ODS ラットをアスコルビン酸欠乏食で約２週間飼育［ODS(-)］すると、臓器中の AA 濃度が著明に低下したが、肝腎の GSH 濃度には変化がみられなかった。GSH 合成阻害剤（L-buthionine sulfoximine, BSO）を投与して GSH 動員量を解析したところ、ODS ラットでは肝ミトコンドリアと腎サイトゾ
ルの GSH 動員量が著明に増加していた。 通常食で飼育した ODS(+)ラットに比べ、ODS(-)ラットでは肝腎の GSH 動員量が増加傾向を示した。また、コントロールラットでは生体内 GSH の低下は主に肝 AA の de novo 合成を促進させるが、ODS(+)ラットでは BSO 投与による GSH の低下に伴い肝の AA が著明に低下した。これらの結果
より、AA 欠乏状態では肝腎の GSH 代謝回転が代償的に加速されること、及び GSH低下状態では細胞内 AA が代償的に代謝亢進することにより、酸化ストレスから生体を防御していることが示唆された。

2.

ラットの体外循環系を構築し、electron spin resonance により循環血液中のアスコルビン酸ラジカルを経時的に検出するシステムを確立した。また、生体内でのAA 還元再生機構を知る目的で、循環血中の AA を瞬時に酸化させる長時間循環型 AA酸化酵素（PEG-AOase）を開発し、循環血中の AA およびその酸化代謝産物の挙動を動力学的に解析した。その結果、循環血中の AA は 1 U/kg の PEG-AOase を投与することにより常時ラジカルに代謝されるが、AA の血中濃度は一定に維持されていることが分かった。すなわち、循環血液中で酸化された AA は驚異的な速度で AA に還元再生され、その濃度を一定に維持していることが示唆された。また、腎臓摘出ラットにおいても、AA の還元再生能は維持されており、血中 AA 濃度の維持に腎臓の関与は少ないと考えられた。一方、BSO 投与により肝腎の GSH 濃度を低下させたラットでは、PEG-AOase による血中 AA の酸化が加速された。これらの結果より、循
環血液中の AA 還元再生機構には肝の GSH が重要であることが示唆された。
3.

各種病態における酸化ストレスの実体とレドックス制御機能の関与を調べるために、自然発症高血圧ラット（SHR）及び高脂質血症家兎における GSH と AA の代謝動態を解析した。両動物の体内 GSH レベルには変化がみられなかった。両病態動物にBSO を投与して GSH 代謝回転動態を解析したところ、いずれも代謝回転量が約 50％低下している事が判明した。また、循環血中への GSH 動員量や AA 代謝も低下しており、血流空間での酸化防御能の低下が示唆された。更に、SHR の高血圧は GSH の静脈内投与により改善されることより、循環血中への GSH 動員量の低下が高血圧に関与していると考えられた。これらの結果から、高血圧や動脈硬化症においては、生体内の GSH や AA の代謝能力が低下し、両抗酸化物を有効利用できないことにより酸化ストレスが増強し、病態を増悪させている可能性が示唆された。

4.

ラットにフタル酸ジエステル（DEHP）を投与したところ、生殖細胞がアポトーシスを起こして精巣が萎縮し、成熟した精子が殆ど見られなくなった。DEHP投与ラットの精巣内GSHとAA濃度はコントロール群に比べて有意に減少していた。また、酸化ス ト レ ス に よ り 代 償 的 に 上 昇 し て く る 酵 素 で あ る glutathione peroxidase やcatalaseの活性、及び酸化ストレスのマーカーである脂質過酸化物質などが有意に上昇していた。L012 を用いた化学発光法により精巣細胞の活性酸素産生動態を解析した結果、DEHP経口投与６時間後よりO2-やH2O2などの産生が上昇していた。DEHPの代謝産物であるフタル酸モノエステル（MEHP）は精巣ミトコンドリアからチトクロームC遊離を強く促進しており、活性酸素によるミトコンドリア傷害がアポトーシス誘導に関与していることが示唆された。
以上のように本研究は、GSH と AA の共役作用により酸化ストレスから生体を防御していること、循環血液中の AA 還元再生機構には肝の GSH が重要であること、高血圧や動脈硬化症では酸化ストレスに対する両抗酸化物の防御能が低下していること、DEHPの加水分解産物である MEHP が活性酸素代謝を介して精細胞系列のアポトーシスを特異的に誘起し、精巣萎縮に関与することを示唆するものである。これらの成果は、人や動物医学に貢献するところが大きく、本論文の審査および学力確認の結果から、博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。