称号及び氏名

博士(獣医学)

学位授与の日付

平成２１年３月３１日

論Cytolethal distending toxin 産生性大腸菌の分子疫学調査及び cdt-I
遺伝子のファージ伝達性に関する研究

文

名

論文審査委員

主査
副査
副査

山崎
小崎
三宅

日根野谷

淳

伸二
俊司
眞実

論文要旨
緒言
ヒトに下痢症をおこす大腸菌は下痢原性大腸菌（DEC）と呼ばれ、保有する病原因子の違いにより腸管病原性大腸菌 (EPEC)、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、志賀毒素産生性大腸菌 (STEC)、腸管凝集性大腸菌、分散付着凝集性大腸菌の 6 種類に分類されている。DECが産生する毒素は、主にSTECが産生する志賀毒素、ETECが産生する易熱性腸管毒素、耐熱性腸管毒素がある。1987 年、JohnsonとLiorによって細胞膨化致死毒素（CDT）が新たに報告された。CDTは、CdtA、CdtBおよびCdtCの 3 つのサブユニッ
トからなるホロ毒素である。CDTは 24~48 時間後に標的細胞を膨化させ、96~120 時間後に致死させるというユニークな作用機序をもつ。CdtAとCdtCはレセプターへの結合に関与し、CdtBはDNase活性に基づき染色体DNAを傷害し、細胞周期のG1期あるいはG2/M期で停止させ致死させる。CDTは細菌毒素の中で唯一核内に到達してDNAを傷害することからGenotoxinとも呼ばれる。
CDT 産生性大腸菌（CTEC）は、CDT のアミノ酸配列の違いにより少なくとも 5 つのバリアント（CDT-I~CDT-V）を産生する大腸菌（CTEC-I~CTEC-V）が見つかっている。発展途上国を中心に下痢症患者から CTEC-I の分離例が多数報告され、動物実験においてもCDT の下痢原性、感染の持続化や病態の重篤化への関与が報告されている。しかしながら過去に行われたケースコントロール研究では、下痢症患者と健常者との間で分離率に有意差が認められず、CTEC の下痢症起因菌としての位置づけは未だ明確でない。CDT は

大腸菌で最初に報告されて以来、Campylobacter 属菌、Shigella 属菌など様々なグラム陰性菌で見つかっているが、菌種内及び菌種を越えた cdt 遺伝子の水平伝播機構についても十分明らかにされていない。
本研究では、我が国における小児下痢症と CTEC との関わりを明らかにすることを目的として、小児下痢症患者便から CTEC を分離し、細菌学的性状を解析した。また、我々の研究グループは世界に先駆けて、ある種の EPEC が CDT-1 ファージ（CDT-1Φ）を産生することを見出したので、cdt-I 遺伝子の水平伝播機構について明らかにすることを目的として、CDT-1Φ の性状及びゲノムの多様性を解析した。
第1章

小児下痢症患者からの CTEC の分離と細菌学的性状解析

我々はインドとの共同研究で CTEC が小児の血性下痢症に関わっている可能性を示した。そこで、我が国の小児の血性下痢便から分離された大腸菌 4 株を含む 8 株について
CDT 産生性に関するレトロスペクティブな解析を行った。その結果、血便を伴う持続性下痢を呈した 8 ヶ月齢の乳児由来の大腸菌 1 株で CDT-I 産生性を確認した。更に、CDT-I産生株が遺伝学的・血清学的解析から EPEC に属さない大腸菌 O2:H12 であることを明らかにした。これは、CTEC が我が国の小児下痢症にも関わっている可能性を示した最初の事例である。更に詳細な CTEC の疫学調査を行うことを目的に、2004 年 3 月から１年間、小児を中心とした下痢症患者便 362 検体について cdt 遺伝子の検出を行った。検出には、大腸菌で報告されている 5 種類の cdtB 遺伝子を検出・型別できる PCR-RFLP 法を開発し適用した。分離した CTEC は、血清型及び DEC や腸管外感染性大腸菌（ExPEC）で報告されている主な病原遺伝子の保有状況について解析した。
調べた 362 検体中 35 検体（9.7%）で cdtB 遺伝子が検出され、その中の 24 検体では他の下痢原性病原体は検出されなかった。毒素型別の結果、cdt-I、cdt-II、cdt-III、cdt-IV、cdt-V 及び型別できない cdt 遺伝子がそれぞれ 21、3、4、3、4、1 検体で陽性となり、内 1 検体は cdt-I と型別できない cdt 遺伝子陽性菌の混合感染であった。分離
できた 30 株の血清型の内、12 株（43%）が O2 であり、EPEC の血清型に属した株は CTEC-I
O142 の 1 株と CTEC-V O166 の 2 株であった。一方、EPEC の病原遺伝子を保有した株はbfpA/eaeA 遺伝子両陽性の CTEC-I O142 の 1 株、eaeA 遺伝子陽性の CTEC-I OUT、CTEC-IIOUT 及び CTEC-V OUT の 3 株のみで、CTEC-I O2 の 8 株と CTEC-IV Orough の 1 株が ExPECの病原遺伝子（cnf1、hly）を保有していた。
以上の結果より、我が国の小児下痢症にも CTEC が関わっている可能性を初めて示した。我が国で分離される CTEC は、EPEC ではなく ExPEC の特徴を有する CTEC が多かったことから、発展途上国で分離される CTEC の性状とは異なっていた。ほとんどの CTECが既知の DEC の病原遺伝子を保有していなかったことから、CTEC を新たな DEC の一つに分類できる可能性が示された。
第2章

CDT-1 ファージの性状解析

インドの小児下痢症患者から分離した EPEC の産生する CDT-I がラムボイドファージ（CDT-1Φ）にコードされること、ゲノム構造が 6 つの機能領域（Head & Tail、Virulence、Integrase、Unknown、Regulation、Lysis）からなることを見出した。そこで、cdt-I
遺伝子の水平伝播機構について調べることを目的として、CDT-1Φ の性状を解析した。
O86、O127 や O142 の O 群血清型に属する CDT-I 産生性 EPEC をマイトマイシン C（MMC）存在下で培養し、プラークアッセイ及び Dot blot hybridization 法により CDT-1Φ の産生性を解析した。大腸菌 C600 株に CDT-1Φを溶原化した溶原化株から回収した CDT-1
Φを酢酸ウランで染色し、透過型電子顕微鏡下でその形態を観察した。種々の膜蛋白欠損 C600 株（ΔlamB、ΔompF、ΔompC、ΔfadL）に対するプラーク形成能を測定した。
また、各機能領域に結合する遺伝子プローブを用いた Southern hybridization 法により CDT-1 プロファージ（CDT-1ProΦ）ゲノムの多様性を調べた。その結果、O127 と O142の EPEC から CDT-1Φ が誘導され、CDT-1Φ は形態学的に Siphoviridae 科に分類された。
また、ΔompC 株ではプラークが形成されず、相補株ではプラーク形成能が復帰したこと か ら 、 OmpC が CDT-1 Φ に 対 す る レ セ プ タ ー で あ る と 考 え ら れ た 。 Southernhybridization 法によって様々な RFLP パターンが得られたことから cdt-I 遺伝子の上流・下流には多様性があり、CDT-1Φ が誘導されない菌株が保有する cdt-I 遺伝子の上流・下流にも CDT-1Φ と相同性のある DNA が存在することがわかった。
以上の結果より、インドで分離した O127 および O142 の EPEC が産生する CDT-I がラムボイドファージにコードされ、OmpC を CDT-1Φに対するレセプターとして水平伝播されることがわかった。
第3章

CDT-1Φ ゲノムの多様性解析

EPEC が産生する CDT-I がラムボイドファージにコードされていることを明らかにした。しかしながら、CDT-1Φが誘導されるのは特定の O 群血清型に属する EPEC のみであり、我が国で分離したほとんどの CTEC-I は EPEC の特徴を有さず、全ての cdt-I 遺伝子がファージを介して水平伝播しているかどうかは明らかでない。そこで、cdt-I 遺伝子のファージ伝達性についてより詳細に解析した。
分離した地域及び血清型が異なる 46 株の CTEC-I を被検菌とし、プラークアッセイにより MMC 存在下での CDT-1Φ産生性を調べた。CDT-1ProΦ ゲノムを 8 領域に分け、各領域を特異的に増幅できるプライマーを設計し、PCR-RFLP 法により CDT-1Φ ゲノムの多様性を解析した。CDT-1Φ が誘導されない CTEC-I（非誘導型 CTEC-I）は、Tail 領域から cdt-I 遺伝子領域間を増幅できる PCR 及び得られた PCR 産物のシークエンスにより、cdt-I 遺伝子上流におけるファージ関連遺伝子の有無を調べた。その結果、被検菌 15株から CDT-1Φ が誘導され、それらは O127、O142 及び OUT の EPEC であった。PCR-RFLP法による解析では 13 株の CDT-1ProΦ はほぼ同じ RFLP パターンを示した。我が国由来の 1 株の CDT-1ProΦ は 3 領域しか増幅産物が得られなかったが、単離した CDT-1Φはインド由来の CDT-1Φ と同様 Siphoviridae 科に属し、OmpC をレセプターとしていた。
一方、非誘導型 CTEC-I では、ほぼ全ての領域で増幅産物が得られなかったが、EPEC のCDT-1ProΦ の Virulence 領域は全て同一の RFLP パターンを示した。cdt-I 遺伝子上流の解析では、非誘導型 CTEC-I の cdt-I 遺伝子上流には様々なファージ関連遺伝子が存在し、CDT-1Φとは異なるラムボイドファージと高い相同性を有していた。
以上の結果より、非誘導型 CTEC-I の cdt-I 遺伝子もファージにより水平伝播されたと考えられた。異なる RFLP パターンを示した株の cdt-I 遺伝子上流は他のラムボイドファージと高い相同性が見られたことから、CDT-1Φ は様々なラムボイドファージとの相同組換えにより多様化し、菌株間に拡がったと考えられた。一部の CDT-1Φ は、3 型分泌装置のエフェクター蛋白である NleH や Cif もコードし、cdt-I 遺伝子以外の病原因子の水平伝播にも関わっていた。
総括
1. 我が国の小児下痢症患者から初めて CTEC を単離した。
2. 大腸菌の 5 つのタイプの cdt 遺伝子を型別できる PCR-RFLP 法を開発した。
3. 我が国で分離される CTEC が発展途上国で分離される CTEC とは異なる性状であることを明らかにした。
4. 分離株のほとんどが既知の DEC の特徴を有さなかったことから、CTEC は DEC の新たなカテゴリーに分類できる可能性が考えられた。
5. CDT-I が Siphoviridae 科に属する新規のラムボイドファージにコードされ、OmpC をレセプターとして水平伝播することを明らかにした。
6. 非誘導型 CTEC-I においても cdt-I 遺伝子の上流にファージ関連遺伝子が存在していることを明らかとした。
7. CDT-1Φ は様々なラムボイドファージとの相同組換えにより多様化したと考えられた。
8. CDT-1Φ は、cdt-I 遺伝子の他に 3 型分泌装置のエフェクター蛋白である NleH や Cifをコードする遺伝子の水平伝播にも関わっていると考えられた。

審査結果の要旨

ヒトに下痢症をおこす大腸菌は下痢原性大腸菌（DEC）と呼ばれ、現在 6 種類に分類されている。DECが産生する毒素は、志賀毒素、易熱性腸管毒素、耐熱性腸管毒素がある。1987 年に標的細胞を膨化させ、最終的に致死させるというユニークな作用機序をもつ細胞膨化致死毒素（CDT）が新たに発見された。CDTはCdtA、CdtB及びCdtCの 3 つのサブユニットからなるホロ毒素でCdtAとCdtCがレセプターへの結合に関与し、CdtBが毒素本態であり、CdtBのDNase活性に基づき染色体DNAを傷害し、細胞周期のG1又はG2/M期で停止させ致死させる。CDTは細菌毒素の中で唯一核内に移行しDNAを傷害することからGenotoxinとも呼ばれ注目を集めている。
大腸菌が産生する CDT には少なくとも 5 つのバリアント（I—V）があり、発展途上国を中心に下痢症患者から CDT-I 産生菌が多数報告されている。動物実験において CDTIの下痢原性、感染の持続化や病態の重篤化への関与が報告されているが、CDT 産生性大腸菌（CTEC）の下痢起因菌としての位置づけは未だ明確でない。また、我が国においては分離報告例すらない。一方、CDT は大腸菌で最初に報告されて以来様々なグラム陰性菌で見つかっているが、菌種内及び菌種間を越えた cdt 遺伝子の水平伝播機構についても十分明らかにされていない。
本研究では、我が国における小児下痢症と CTEC との関わりを調べることを目的として、小児下痢症患者便から CTEC を分離し、細菌学的性状を解析した。また、EPEC が産生する CDT-I が新規のラムボイドファージにコードされていることを見いだした。そこで、cdt-I 遺伝子の水平伝播機構を明らかにすることを目的として、CDT-1Φ の性状及びゲノムの多様性を解析した。
第１章では、CTECのレトロスペクティブな解析で我が国の小児下痢症、特に血性下痢にCTECが関わっていることを初めて明らかにした。さらに、５種類のcdt遺伝子を検出・型別できるPCR-RFLP法を開発し、小児を中心とした下痢症患者便 362 検体について調べたところ、約 10%に相当する 35 検体でcdt遺伝子が陽性であることを示した。単離したCTECの細菌学的性状から、我が国で分離されるCTECは開発途上国と異なり、EPECではな
くExPECの特徴を有すること、さらに、ほとんどのCTECが既知のDECの病原遺伝子を保有していないことを示し、CTECを新たなDECのカテゴリーに分類できる可能性を示した。
第２章では、cdt 遺伝子の水平伝播機構を明らかにすることを目的として CDT-IΦの性状を解析した。その結果、特定の EPEC に属する菌株のみが CDT-IΦを産生すること、
CDT-IΦは形態学的に６角形の頭部と細長い尾部を持つ Siphoviridae に属すること、外膜蛋白である OmpC をレセプターとして大腸菌に感染・溶原化すること、ファージゲノ
ム中での毒素遺伝子の位置が志賀毒素ファージとは異なるにも関わらず、マイトマイシ
ン C で CDT 産生が誘導されること及びファージが誘導されない株にも CDT-IΦ関連遺伝子が存在し、CDT-IΦの誘導の有無に関わらず CDT-IΦゲノムに多様性があることを明らかにした。
第３章では、cdt-I 遺伝子のファージ伝達性についてより詳細に解析することを目的に、分離した地域及び血清型が異なる 46 株の CTEC のファージ誘導能を調べたところ、特定の EPEC の血清型に属する株でのみ CDT-IΦが誘導されることを示した。全ファージゲノムを８つの領域に分け８領域に対する PCR-RFLP 法を開発し、CDT-IΦゲノムの多様性調べたところ、ファージ誘導の有無に関わらず、CDT-IΦ関連遺伝子が存在し、CDT-I
Φファージゲノムにはかなりな多様性があることを示した。CDT-IΦは、様々なラムボイドファージの相同組み換えによって多様性を獲得し、菌株間に拡がったと考えられた。
一部の CDT-1Φ は、3 型分泌装置のエフェクター蛋白である NleH や Cif もコードし、cdt-I 遺伝子以外の病原因子の水平伝播にも関わっていることを明らかとした。
以上、本研究は、我が国の小児下痢症に CTEC が関与していることを初めて示しただ
けでなく、CTEC が新たな DEC のカテゴリーとして分類できる可能性を示した。さらに、
CDT-1Φ は様々なラムボイドファージとの相同組み換えによって多様性を獲得し、様々な菌株間に拡がった知見を示した。ヒトの下痢症起因菌としてのみならず動物の腸管内・腸管外感染症の起因菌としても重要視されている CTEC に関する本成果は、獣医学の分野のみならず医学領域においても多大な貢献をすると考えられる。従って、最終試験の結果と併せて、博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。