CYP2A6遺伝子多型の測定法の検討〇 鈴木 玄樹（株式会社ＬＳＩメディエンス 医薬品分析部）

目的・背景

検討結果：CYP2A6*4CYP（シトクロムP450）：• 主に肝臓で発現し、異物、薬剤代謝に関与。多種類存在し、基質特異性、誘導性が異なる。
• その内の一つCYP2A6は代謝活性の個人差が大きく、遺伝子型に依存する。

測定結果 (n=2)*4/*4*1/*4

CYP2A6の基質：• ニコチン（タバコ）、レトロゾール（閉経後乳癌治療剤）、テガフール（抗癌剤）等• 日本人、アジア人では*4（欠失）、*7（活性低下）および*9（転写活性低下）のアリル頻度が高い⇒ PM（Poor Metabolizer）の頻度が高い

*1/*1

NTC

Sample

事前情報

測定値

Sample011|0*1/*4

Sample020|1*1/*4

Sample030|0*1/*1

Sample040|0*1/*1Sample050|0*1/*1

Sample060|1*1/*4

Sample071|0*1/*4

Sample080|0*1/*1

Sample090|0*1/*1

Sample101|1*4/*4

Sample110|0*1/*1

Sample120|0*1/*1

Sample130|0*1/*1

AllileCaucasian

Japanese

CYP2A6*40.00

0.19

CYP2A6*70.00

0.00～不明

Sample141|1*4/*4

CYP2A6*90.05

0.28

Sample150|0*1/*1

Sample160|0*1/*1

Sample171|0*1/*4

検討用 DNA 90検体

従来のCYP2A6遺伝子型測定法は比較的煩雑である。
本検討では、酵素活性に影響し、高アリル頻度の*4,*7について、簡便、正確な測定法を開発し、既存*9測定法と合わせて、CYP2A6表現型を予測できるレディメイドの系を構築する。

検討内容

検討結果：CYP2A6*7
従来法
RFLP法

CYP2A6*4（欠失）従来法
TaqMan Copy Number Assay

PCR ⇒制限酵素処理 ⇒電気泳動

手法
所要時間（抽出含まず）*1/*1 *1/*4 *4/*4
それぞれを明瞭にクラスタリングできた• 判定率 ＝ 100%
• 事前情報との一致率 ＝ 100%

～3時間／12検体

12（概算）▲目視判断要CYP2A6*7（rs5031016 SNP）
手法
所要時間
（抽出含まず）

試薬コスト
（概算）

*7/*7
*1/*7～5時間／96検体
0.7▲ N=4推奨▲ 要参照遺伝子◎目視判断不要◎参照遺伝子不要
Sample10,NTC Sample14

従来法
シーケンス法

新規手法

PCR ⇒シーケンス

前処理⇒
リアルタイムPCR

8～9時間／48検体～5時間／96検体

10.2▲ 長時間、高コスト

測定結果 (n=2)

前処理 ⇒リアルタイムPCR

リアルタイムPCR

7～8時間／96検体

試薬コスト

新規手法

*1/*1

*1/*1 14検体
*1/*7 2検体
*7/*7 1検体

◎短時間、低コスト

従来の問題点：• CYP2A6に酷似した遺伝子がゲノム上に存在し特異的増幅が困難• *4はCYP2A6を欠失したアリルのため検出が困難
検討内容：• *1、*4をそれぞれ2色の蛍光値に変換する• *7:CYP2A6のみ増幅したのち TaqMan Assayを実施• 遺伝子型既知のDNA使用により検証

内容
アリルの種類障壁方法
事前情報との一致

正確性
PCR産物の配列確認
ソフトウェア自動判定
頑健性
明瞭なクラスタリング
再現性 Duplicateの同一結果*7/*7

Sample02*1/*4

Unknown*1/*1

Sample03*1/*1

Unknown*1/*7

Sample04*1/*1Unknown*1/*1

Sample05*1/*1Unknown*1/*1

Sample06*1/*4Unknown*1/*1

Sample07*1/*4Unknown*1/*1

Sample08*1/*1Unknown*1/*1

Sample09*1/*1Unknown

Sample10*4/*4Unknown*1/*1*1/*1（低シグナル）

Sample11*1/*1

Unknown*1/*1

Sample12*1/*1

Unknown*1/*7

Sample13*1/*1

Unknown

Sample14*4/*4

Unknown*1/*1*1/*1（低シグナル）

Sample15*1/*1Unknown*1/*1

Sample16*1/*1Unknown*1/*1

Sample17*1/*4Unknown*1/*1• それぞれを明瞭にクラスタリングできた• 低シグナルのサンプルは*4/*4（2A6がない）であり、妥当である

判定

表現型
予測**4/*7PM*1/*1*1/*1*1/*1*1/*1EM*1/*1*1/*4IM*1/*1*1/*1*1/*7*1/*7

IM or EM

*1/*7*1/*9*7/*9PM*1/*1*1/*1*7/*7*7/*7PM*1/*1*1/*1*1/*9*1/*9

IM or EM

*1/*1

*1/*9*1/*1*1/*9

IM or EM

Sample05*1/*1*1/*1*1/*1*1/*1EM*1/*1*1/*9*1/*7*7/*9PM

Sample06*1/*4*1/*1*9/*9*4/*9PM*1/*1*9/*9*1/*1*9/*9PM

Sample07*1/*4*1/*1*9/*9*4/*9PM*1/*4*1/*1*1/*1*1/*4IM

Sample08*1/*1*1/*1*1/*9*1/*9

IM or EM

*1/*4*1/*1*7/*7*4/*7PM

Sample09

*1/*1

*1/*1

*1/*9*1/*9

IM or EM

*1/*4

*9/*9*1/*1*4/*9PM

Sample10*4/*4（低シグナル）

Negative*4/*4PM

*4/*4

any

*4/*4PM

TaqMan（市販）

Sample11*1/*1*1/*1*1/*9*1/*9

IM or EMany
上記以外

Sample12*1/*1*1/*7*1/*1*1/*7IM or EM〇

Sample13

*1/*1

*1/*1

*9/*9*9/*9PM*4/*4（低シグナル）

Negative*4/*4PM点変異－

Unknown*7点変異〇*1/*4*9欠失

カスタムプローブ

Sample01*4

CYP2A6*9

カスタムプローブ

*7測定値

表現型
予測

CYP2A6*7相同遺伝子の存在*7事前情報【遺伝子型判定表】

CYP2A6*4相同遺伝子の存在欠失を検出*4測定値

CYP2A6の遺伝子型判定

まとめ項目

Sample－*9測定値（市販） 遺伝子型

Sample

*4測定値

*7測定値

Sample01

*1/*4

*7/*7

*1/*1

Sample02

*1/*4

*1/*1

Sample03*1/*1

Sample04－〇－

Sample14
Sample15

*1/*1

*1/*1

*9/*9*9/*9PM〇〇〇

Sample16*1/*1

*1/*1

*1/*9

*1/*9

IM or EM

Sample17*1/*4*1/*1

*1/*1

*1/*4

IM〇〇〇

日本人集団において高頻度、かつCYP2A6の活性低下に関与するア
リルは、今回検討した測定法で測定可能である

Undetermined*Affymetrix DMET annotation

PM: Poor Metabolizer（活性欠損）
IM: Intermediate Metabolizer（活性低下）
EM: Metabolizer（通常活性）*9/*9

測定した17検体すべてについて、矛盾なく遺伝子型を判定し、表現型を予測することが可能であった*1/*9*9（市販プローブ）
検証結果*1/*1