大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）

細胞表層のドメイン構造と細胞運動
The Role of Plasma Membrane Domains in Cell Adhesion and Migration
村井稔

幸Toshiyuki Murai
大阪大学大学院医学系研究科
要

旨

細胞運動は，がん細胞などに顕著に認められ，細胞外マトリックスとの相互作用を通して調節される．近年，細胞膜に存在する微細な機能ドメインの役割が大きな注目を集めている．特に，脂質ラフト（lipid raft）は細胞膜における細胞内外の情報変換の中心的な部位であると考えられており，細胞接着・細胞運動を司るタンパク質が存在する．本稿では，脂質ラフトの細胞運動における役割に焦点を当て，大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）を用いた成果を交えて論考した．

キーワード：細胞膜，脂質ラフト，細胞接着，大気圧走査電子顕微鏡（ASEM），光―電子相関顕微鏡（CLEM）

1.

不明な点が多かったが，最近，膜ドメインの役割が明らかにはじめに細胞接着の変調と細胞運動の亢進は，がん細胞に顕著に認なってきた 2,3）．

められる特徴であり，がんの浸潤・転移において重要な役割

3.

を果たしている．がん細胞は，腫瘍組織に形成される細胞外現在考えられている細胞膜モデルの基礎となっているのマトリックスとの相互作用を通して浸潤能を獲得し，転移すは，Singer と Nicolson により 1972 年に提唱された流動モザる．近年，腫瘍組織の主なマトリックス成分であるヒアルロイクモデル（fluid mosaic model）である．流動モザイクモデ

ン酸の断片化によるリモデリングが，がん細胞の浸潤性を亢

ルにおいては，グリセロリン脂質が配列した脂質二重膜を基進することがわかってきた．本稿では，細胞膜における脂質本として細胞膜が成り立ち，その中に膜タンパク質がモザイラフトの役割に焦点を当て，膜ドメインによる細胞接着と細ク様に存在し，熱拡散運動により自由に流動する．このモデ

胞運動の制御機構について解説する．

ルでは，脂質の多様性や脂質間の相互作用はあまり考慮され2.

脂質ラフトの構造ておらず，脂質は基本的に同一面内で均一分布するとされて細胞外マトリックスリモデリングいた．

がん細胞は細胞外マトリックスと相互作用して細胞運動性

しかし，細胞膜を構成する脂質は，主にグリセロリン脂質，を亢進し，浸潤する．近年の研究により，担がん患者に検出スフィンゴ脂質，コレステロールから成り，それらの物性のされるヒアルロン酸オリゴ糖が，がん細胞表面レセプター違いなどにより，膜構造に様々な影響を与える．現在では，

CD44 に結合してがん細胞の運動性を亢進することが見出さ

細胞膜の同一面内での脂質の分布には偏りがあり，微小な機れ，腫瘍微小環境で生じるヒアルロン酸オリゴ糖や上皮成長能ドメインを形成していると考えられている．なかでも，最因子（EGF）のがん進展における新たな分子機序が明らかにも注目されているのが，Simons らにより提唱された脂質ラ1）なってきた ．CD44 は，ヒアルロン酸に対する接着分子とフト（lipid raft）モデルである 4）．脂質ラフトモデルでは，して機能する I 型細胞膜貫通タンパク質であり，がんの浸潤・上皮細胞のアピカル膜にコレステロールとスフィンゴ脂質に転移に密接に関わる．細胞外マトリックスリモデリングは発富む膜マイクロドメインがあるとされ，その後，真核細胞に生や組織構築に必須の現象であるが，ヒアルロン酸オリゴ糖対して一般化された概念が定着した．脂質ラフトには，膜受生成といった腫瘍微小環境で起こる細胞外マトリックスリモ

容体や G タンパク質，アダプタータンパク質など，さまざデリングの情報は，CD44 を介して細胞内にもたらされ，がまなシグナル伝達分子が見いだされ，脂質ラフトは細胞膜にんの悪性化を助長する．1 回膜貫通タンパク質である CD44

おける細胞内外の情報変換の中心的な部位であると考えられの機能が，細胞膜上でどのように制御されるのかについてはている 4）．

〒 565–0871 大阪府吹田市山田丘 2–2
2013 年 12 月 18 日受付
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脂質ラフトについては，その大きさや存在寿命がまだ確定されておらず，慎重な取り扱いが提言されている．脂質ラフ
顕微鏡 Vol. 49, No. 1（2014）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

トを難解にしている主な原因は，当初に生化学的アプローチ

ディッシュ内で細胞を培養し，脱水処理をすることなく，電に依存して提唱されたことにある．脂質ラフトは，Triton子顕微鏡観察に供することができる（図 1）．正に荷電した金X-100 な ど の 非 イ オ ン 性 界 面 活 性 剤 に 対 す る 不 溶 性 膜

ナノ粒子（positively-charged Nanogold）を用いて細胞表面の（detergent-resistant membrane; DRM）画分として，密度勾染色を行い，ASEM により水溶液中での細胞の微細形態が観配遠心法により濃縮，回収される膜ドメインだとされている．

（図 2A）．また，ASEM では水溶液中で細胞が電子察された 7）

しかし，処理の過程で界面活性剤による膜の再編成があるた

顕微鏡観察できるため，従来の光学顕微鏡観察で標識に用いめ，DRM が処理前の生体膜における脂質ラフトと完全にはてきた抗体が幅広く使える利点がある．さらに，ASEM では，一致しない．

ディッシュ設置部の上部に光学顕微鏡が，下部に倒立 SEM

細胞膜における分子の膜ドメイン局在を可視化する既存のが同軸配置されており，同一視野を，光学顕微鏡と電子顕微方法には，光学顕微鏡による一分子追跡法や超解像法，電子鏡で観察可能である（図 1C）．したがって，光―電子相関顕顕微鏡による凍結割断レプリカ標識法などがある．脂質ラフ微鏡法（correlative light and electron microscopy; CLEM）がトの大きさは 10 nm から 200 nm の範囲にあり，光の回折限可能である．これらの特徴を生かし，蛍光色素 Alexa Fluor

界の理由から通常の光学顕微鏡では正確に捉えられないと考488 と金コロイド（Nanogold）とを結合した抗体を用い，リえられている．一方，電子顕微鏡は遥かに高い分解能を有すンパ球について CD44 の細胞表面分布が観察された 7）．そのるが，従来の電子顕微鏡法では試料を真空下に置くために脱結果，光学顕微鏡では明瞭に観察できなかった微絨毛が電子水処理をする必要があった．

顕微鏡観察ではっきりと捉えることができ，そこに CD44 がそうした状況の中，大気圧走査電子顕微鏡（atmospheric5）

scanning electron microscope; ASEM）が開発された ．ASEM（日本電子株式会社 ClairScopeTM存在することが認められた（図 2B）．
ASEM は 8 nm の空間分解能を達成しており 5），超解像光学

JASM-6200）の特徴は，開顕微鏡の分解能を遥かに凌駕する．直径 1.4 nm の金ナノ粒子

放型ディッシュ内の液中試料について 10 万倍の高倍率像をを金増感した ASEM による免疫電子顕微鏡法で，がん細胞に得られる点にあり，細胞を構成するタンパク質のダイナミッおける CD44 の細胞表面分布が可視化された 2）．CD44 は通常クな離合集散などの容易な観察を可能にする 6）．底部に厚さは膜ドメインに局在するが，脂質ラフトを破壊する作用のあ

100 nm の窒化シリコン（SiN）薄膜を有するプラスチック製

るメチル-b-シクロデキストリン（MbCD）処理により，CD44

図 1 大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）
A，ASEM ディッシュ．取り外しが可能な 35 mm 径ディッシュ
は底部に 100 nm 厚の窒化シリコン（SiN）薄膜を担持し，それにより大気圧（上部）と真空（下部）を隔てる．B，ASEM
ディッシュの SiN 薄膜領域の走査電子顕微鏡像．スケールバー
は 500 mm．C，ASEM の構成（日本電子株式会社 ClairScopeTM
JASM-6200）．ASEM ディッシュの下部に倒立した走査電子顕微鏡（SEM）が配置され，上部には光学顕微鏡が配置される．
下部より収束電子線が大気圧下の試料に照射され，反射電子イメージング（BEI）検出器により像を得る．文献 7 より転載．

図 2 ASEM に よ る 光 ― 電 子 相 関 顕 微 鏡 法（correlative lightand electron microscopy; CLEM）
A，正荷電金ナノ粒子染色によるリンパ球の電子顕微鏡像．細胞表層の微細構造が観察された．スケールバーは 5 mm（a）および 2 mm（b）．B，光―電子相関顕微鏡観察によるリンパ球における CD44 の細胞表面分布．Alexa Fluor 488 の蛍光（a）とNanogold（b）を，それぞれ光学顕微鏡と電子顕微鏡により検出した．スケールバーは 5 mm．文献 7 より一部改変して掲載．

特集

細胞表層のドメイン構造と細胞運動11【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 3 ASEM により明らかになった細胞表層における CD44 の分布
リンパ球細胞株のコントロール処理細胞（A）と MbCD 処理した細胞（B）の ASEM による CD44 の免疫電子顕微鏡像．A1–
A5，B1–B5 は，それぞれ A, B の部分拡大像．スケールバーは 2 mm（A, B）および 1 mm（A1–A5, B1–B5）．文献 8 より一部改変して掲載．

は分散した分布を示すことがわかった 2）．血球系細胞についても，ASEM を用いた免疫電子顕微鏡法により，脂質ラフト破（図 3）．
壊による CD44 の細胞表面分布の変化が観察できた 8）
4.

脂質ラフトと細胞接着・細胞運動

脂質ラフトが種々の膜タンパク質の酵素切断と解離（shedding）に関わることが報告されていることから 9），コレステロール低下により脂質ラフトを破壊することによる，CD44の局在，shedding，機能への影響が検討された．CD44 は，Triton X-100 不溶性の含コレステロール膜マイクロドメイン（脂質ラフト）に存在し，MbCD の添加により，CD44 shedding が亢進した（図 4A）．その上，コレステロールに結合し脂質ラフトを破壊する作用のあるマクロライド系抗生物質
フィリピン（filipin）もまた，CD44 shedding を誘導した 2）．
CD44 shedding は ADAM ファミリーの膜型メタロプロテアー
ゼ ADAM10 の 活 性 に 依 存 的 で あ り，ADAM10 は Triton X-

図 4 脂質ラフトと細胞運動A，MbCD によるコレステロール除去効果で脂質ラフトを破壊することにより，CD44 shedding が亢進した．B，コレステロール合成阻害薬シンバスタチンの CD44 shedding に対する作用．
C，シンバスタチンの細胞運動に対する作用．細胞をシンバスタチン存在あるいは非存在下で培養し，ヒアルロン酸オリゴ糖（o-HA）あるいは上皮成長因子（EGF）で処理した．D，脂質ラフトによるがん細胞の接着・運動の制御機構の想定される模式図．文献 9 より一部改変して掲載．
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顕微鏡 Vol. 49, No. 1（2014）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

100 可溶性（非脂質ラフト）画分に存在した 2）．MbCD 依存性 の CD44 shedding は， 合 成 メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 剤

謝辞

TAPI，ならびに内因性メタロプロテアーゼ阻害タンパク質

産業技術総合研究所・佐藤主税博士をはじめとする共同研である TIMP-1，および，
ADAM10 に対する RNA 干渉（RNAi）

究 者 の 皆 様 に 感 謝 申 し 上 げ る． 大 気 圧 走 査 電 子 顕 微 鏡により抑制されたことから，ADAM10 がこの過程にかかわ（ASEM）について，日本電子株式会社・須賀三雄氏，西山ることが示唆された 2）．また，高コレステロール血症の治療英利氏に多大なるご協力をいただいた．に用いられるコレステロール合成阻害薬シンバスタチン（Simvastatin）の投与により，がん細胞の CD44 shedding が亢進し（図 4B），ヒアルロン酸基質上でのヒアルロン酸オリゴ糖あるいは EGF による運動性亢進が阻害されることが明らかになった（図 4C）．これらの結果より，コレステロール低下による CD44 の膜ドメイン局在と shedding の操作が，悪性腫瘍の進展に対する予防効果を有することが示唆される（図 4D）9）．
5.

おわりに以 上 の 結 果 よ り， コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 に よ る CD44
shedding 誘導の操作を通して，がん細胞運動の阻止への手段を提供することができると考えられる．本研究により，細胞接着制御の新地平が開け，がん浸潤・転移の阻止手段の開発に貢献できる．今後，脂質ラフトに代表される細胞膜ドメイ
ンの構造と機能の解明が進むことにより，細胞ダイナミクス

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6）海老原達彦，村井稔幸，西山英利，佐藤真理，須賀三雄，佐藤
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Mol. Sci., 14: 20809–20819 (2013)8）Murai, T., Sato, C., Sato, M., Nishiyama, H., Suga, M., Mio, K. andKawashima, H.: J. Cell Sci., 126: 3284–3294 (2013)9）Murai, T.: Int. J. Cell Biol., 2012, 763283 (2012)

への理解がさらに進展すると考えられる．

特集

細胞表層のドメイン構造と細胞運動

13【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】