ヒト 3 次元培養角膜上皮
LabCyte CORNEA-MODEL を用いた眼刺激性試験法

OECD TG492(in vitro 培養角膜組織眼刺激性試験法 収載)

1目次
1. 眼刺激性試験法について
1.1 試験の概要
1.2 作業スケジュール例
1.3 適用・洗浄のタイムスケジュール例
2.準備
2.1 眼刺激性試験セット 製品構成内容
2.2 LabCyte CORNEA-MODEL24 取扱い上の注意点
2.3 消耗品
2.4 その他必要機器・器具・消耗品
3.試験方法3.1 事前準備
3.1.1 陽性対照
3.1.2 陰性対照
3.1.3 リン酸緩衝液充填 洗浄用ポリ洗浄ビン
3.2 試験操作
3.2.1 LabCyte CORNEA-MODEL24 の準備
3.2.2 被験物質（液体）の適用・洗浄・後培養
3.2.3 被験物質（固体）の適用・洗浄
3.2.4 WST-8 試験の準備
3.2.5 WST-8 反応
3.2.6 WST-8 反応液の測定
4.評価
4.1 試験成立条件
4.2 判定基準
5.WST-8 試験系に干渉する被験物質の検出試験
5.1 培養組織を染色する被験物質の検出
5.1.1 ステップ 1（予備検討）
5.1.2 ステップ 2（培養組織を用いた検討）
5.2 WST-8 還元作用のある被験物質の検出
5.2.1 ステップ 3（予備検討）
5.2.2 ステップ 4（凍結死させた培養組織を用いた検討）
正式な S.O.P は英語版になります。

2

1. 眼刺激性試験法について
1.1 試験の概要
前培養（15-30 時間）

被験物質の適用（液体・1 分間）

被験物質の適用（固体・24 時間）

リン酸緩衝液での洗浄後培養（24 時間）

リン酸緩衝液での洗浄

WST-8 による生細胞率（対陰性対照）の測定

刺激性判定
生細胞率≦40% Category 1 もしくは Category 2
生細胞率＞40% No Category31.2 作業スケジュール例＜被験物質が液体の場合＞
月

火

水

木

前培養（15-30時間）

後培養（24時間）

8:00
9:00
10:00
納品
（地域によって午前または午後）

11:00
12:00

適用・洗浄

13:00

WST-8反応開始（4時間±20分）

出荷日
14:00
15:00
後培養（24時間）
16:00

前培養開始

吸光度測定

17:00
前培養
（15-30時間）

18:00
19:00

＜被験物質が固体の場合＞
月

火

水

木

前培養
（15-30時間）

暴露（24時間）

8:00
9:00
10:00
納品
（地域によって午前または午後）

11:00
12:00

適用
洗浄

13:00
出荷日
14:00

WST-8反応開始（4時間±20分）

15:00
暴露（24時間）
16:00

前培養開始

17:00
18:00

吸光度測定
前培養（15-30時間）

19:00

4

1.3 適用・洗浄のタイムスケジュール例＜全被験物質が液体の場合＞
サンプルNo. 1
2345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 240min
1min 添加2min 洗浄
3min
添加
4min
洗浄5min
添加
6min
洗浄
7min
添加
8min
洗浄9min添加10min
洗浄11min
添加12min
洗浄13min
添加
14min
洗浄
15min
添加
16min
洗浄17min
添加
18min
洗浄
19min
添加
20min
洗浄
21min
添加
22min
洗浄
23min
添加
24min
洗浄
25min
添加
26min
洗浄
27min
添加
28min
洗浄
29min
添加
30min
洗浄31min
添加
32min
洗浄
33min
添加
34min
洗浄
35min
添加
36min
洗浄
37min
添加
38min
洗浄
39min
添加
40min
洗浄
41min
添加
42min
洗浄
43min
添加
44min
洗浄
45min
添加
46min
洗浄47min
添加
48min
洗浄

1 度に 24 検体を処理できます。各被験物質につき 3 個の培養角膜上皮組織を使用します（N=3）。
1 プレートで試験を実施できる被験物質は、陰性対照と陽性対照を含めて 8 つです。作業の習熟度によって、1～3 分間隔での操作をお薦めいたします。
固体の場合は、順に被験物質を適用した後、CO2 インキュベーターに移して被験物質の暴露を 24 時間行ってください。

52.準備2.1 眼刺激性試験セット 製品構成
名称

数量保存方法LabCyte CORNEA-MODEL プレート 24

1

寒天培地中に固定された培養カップ上のヒト 3 次元培養
角膜上皮 24 個、常温保存（出荷日含め 5 日間）

アッセイ培地（30ml）

2

試験用の培地、冷蔵保存

24 ウェルアッセイプレート

4

試験用の空プレート、室温保存

2.2 LabCyte CORNEA-MODEL24 取扱い上の注意点
LabCyte CORNEA-MODEL24 プレートは培養開始まで、未開封のまま常温保存してください。保存期間は出荷日含めて 5 日間です。保存期限は製品裏面に記載しております。開封後は全ての培養角膜上皮の培養を開始してください。開封後の再保存はしないでください。
LabCyte CORNEA-MODEL24 に使用しているヒト角膜上皮は、HIV、HBV、HCV 陰性である健常ドナー由来の細胞を使用していますが、ヒト由来原材料を用いた製品であることから、LabCyte CORNEA-MODEL24 の取扱いには充分に注意していただき、各施設のバイオセーフティ基準に基づいてお取扱いください。
2.3 消耗品
本セットを用いて眼刺激性試験を行う時に必要な消耗品です。
消耗品

用途・ご用意いただく量の目安

エタノール

陽性対照（液体）として使用。数 mL 程度。

リン酸緩衝液陰性対照（液体）として使用。また被験物質の洗浄に使用。1L 程度（1 プレート分）。

ラウリン酸

陽性対照（固体）として使用。10mg × 3 培養カップ分。

滅菌綿棒

洗浄後、培養カップを拭くために使用。24 本（1 プレート分）

WST-8

Cell Counting Kit-8, 100 test（同仁化学:CK04）

EBSSEarle balanced salt solution (シグマ-アルドリッチ: E3024) 10mL 程度。

ディッシュ

ディッシュ（10cm）2 枚、PBS を 20mL ずつ入れて培養カップの洗浄に使用。

96 ウェル測定プレート※

マイクロプレートリーダーでの吸光度測定に使用。

※別売品として取扱っております。
96 ウェル測定プレート（1 枚）型番：406096

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2.4 その他必要機器・器具・消耗品
・安全キャビネット（またはクリーンベンチ）・ウォーターバス（37℃）
・CO2 インキュベーター（37℃、5% CO2、高湿度を維持可能であるもの）
・オートクレーブ・96 ウェルマルチプレートリーダー（必要フィルター：450nm、650nm）
・精密天秤（0.1mg）
・ストップウォッチ・マイクロピペット（10-200μL, 200-1000μL）
・先の尖ったピンセット（滅菌済）・スパーテル(滅菌済)・ビーカー（1-2L：滅菌済）
・滅菌可能な広口ポリ洗浄ビン（容量 500-1,000mL、口径＞3mm）
・乳鉢・乳棒・ポジティブディスプレイスメントピペット（10-100μL）

7

3.試験方法
3.1.1～3.2.6 の操作は安全キャビネット（又はクリーンベンチ）内で無菌的に実施してください。
各被験物質、N=3 で実施いただきます。
3.1 事前準備
3.1.1 陽性対照
液体：エタノール
固体：ラウリン酸（予め 10mg をマイクロチューブに測りとっておきます）
3.1.2 陰性対照
液体：リン酸緩衝液
固体：未処理3.1.3 リン酸緩衝液充填 洗浄用ポリ洗浄ビン① ポリ洗浄ビンをオートクレーブで滅菌しておきます。
② 滅菌済みのポリ洗浄ビンにリン酸緩衝液を無菌操作で充填します。

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3.2 試験操作
3.2.1 無菌操作 LabCyte CORNEA-MODEL24 の準備① アッセイ培地を 37℃ウォーターバスで 30 分温めます。
② アッセイプレート第 1 行（被験物質暴露用）に温めたアッセイ培地を 0.5mL ずつ分注します。
1 つの被験物質につき、3 個の培養角膜上皮組織（培養組織）を使用します（N=3）。

【図１】
アッセイプレート
第1行
第2行
第3行
第4行

③ LabCyte CORNEA-MODEL24 プレートをアルミ包装袋より取り出します。
④ プレートの蓋を開け、培養組織が入った培養カップを滅菌済みピンセットで取り出します。
⑤ 培養カップをアッセイ培地の入った第 1 行目（前培養・被験物質暴露用）の各ウェルに移します。
注意点■培養カップ内の培養組織表面には触れないよう注意してください。
■培養カップの外側に付着した寒天培地は、ピンセットなどで取り除いてください。

【図 2】

アッセイプレート

第1行
第2行
第3行
第4行

注意点
■培養カップ底面と培地の間に気泡が入らないように注意してください。
⑥ アッセイプレートに蓋をして、CO2 インキュベーターに入れます。
⑦ 3.2.2、3.2.4 項 被験物質の適用と洗浄まで、一晩（15～30 時間）静置します（前培養）。
3.2.2 無菌操作 被験物質（液体）の適用・洗浄・後培養
3.2.2.1 後培養用ウェルの準備① アッセイ培地を 37℃ウォーターバスで 30 分温めます。
② 前培養を終了したアッセイプレートを CO2 インキュベーターから取り出します。
③ アッセイプレートのフタを開け、第 3 行（後培養用）の各ウェルに、温めたアッセイ培地を 0.5mL ずつ分注します。
9

【図 3】

アッセイプレート

第1行
第2行
第3行
第4行

3.2.2.2 被験物質の適用
被験物質を第 1 行（被験物質暴露）の培養組織の表面に添加します。各被験物質につき 3 個の培養組織を使用します（N=3）。
マイクロピペットを用いて 50μL を添加します。
培養カップ内の培養組織の中央部付近にチップを近付け、注意深く適用してください。適用後、アッセイプレートに蓋をしてプレート横側を軽くタッピングすることにより、培養組織表面全体にゆきわたらせます。被験物質適用
後はアッセイプレートの蓋を閉じて 60±10 秒間暴露させます。
必要に応じて、スパーテルを使用して被験物質を広げます。スパーテルで培養組織を押し付けないよう注意してください。粘度の高い物質の場合、セルセイバータイプ（広口）もしくはポジティブディスプレイスメントピペットを使用してください。
セルセイバータイプチップ（広口）

ポジティブディスプレイスメントピペット用チップ

注意点■被験物質の性状については、事前にピペット操作などで確認しておき試験に臨んでください。
■被験物質の適用時以外は、アッセイプレートの蓋を閉めて試験を実施しください。
3.2.2.3 被験物質の洗浄① 被験物質暴露 60±10 秒後、アッセイプレートの蓋を開け、培養カップを滅菌済ピンセットで取り出します。培
養カップをビーカー上でタッピングして、培養カップ内の被験物質を廃棄します。
② リン酸緩衝液を充填した洗浄用ポリ洗浄ビンを使用し、ビーカー上でリン酸緩衝液を培養カップ内の培養組織表面に当てながら、培養カップ内に満たしてください。

10

注意点
■強い流れで組織にダメージを与えないよう、洗浄ビンは広口タイプをご使用ください（口径は 3mm 以上）。
③ 培養カップ内のリン酸緩衝液をビーカーに廃棄します。培養カップをビーカー上でタッピングして培養カップ内のリン酸緩衝液を完全に除去します。

④ ②③の操作を少なくとも 10 回繰り返し、培養組織表面の被験物質を除去します。被験物質の性状により洗浄中に泡が発生することがあります。泡が完全になくなるまで洗浄してください。
⑤ 滅菌綿棒で培養カップ内側と外側に残存したリン酸緩衝液を軽く除去してください。滅菌綿棒を培養組織表面に押し付けないようにご注意ください。

⑥ 培養カップを、予めアッセイ培地を入れておいた 3 行目のウェルに移します。

【図 4】

アッセイプレート

第1行
第2行
第3行
第4行

⑥ ①～⑤の作業を 1 分から 3 分間隔で実施してください。
⑦ 培養組織が入ったアッセイプレートに蓋をして、CO2 インキュベーターに入れます。
⑧ 24 時間±1 時間静置します。（後培養）11

3.2.3 無菌操作 被験物質（固体）の適用・洗浄① アッセイ培地を 37℃ウォーターバスで 30 分温めます。
② 前培養を終了したアッセイプレートを CO2 インキュベーターから取り出します。
③ アッセイプレートの蓋を開け、第 2 行と第 3 行の各ウェルに、温めたアッセイ培地を 0.5mL ずつ分注します。

【図 5】

アッセイプレート

第1行
第2行

第3行
第4行

④ 予め測り取った固体 10±2mg を培養カップ内の培養組織表面に適用します。
必要な場合、固体を乳鉢ですりつぶし微粉砕します。また被験物質をスパーテルで培養組織表面全体にゆきわたらせます。各被験物質につき 3 個の培養組織を使用します（N=3）。

⑤ 被験物質適用後は、培養カップを第 1 行から第 2 行に移します。

【図 6】

アッセイプレート

第1行
第2行
第3行
第4行

⑥ 培養組織が入ったアッセイプレートに蓋をして、CO2 インキュベーターに入れます。
⑦ 24 時間±1 時間静置します。
⑧ 暴露終了後、アッセイプレートを CO2 インキュベーターから取り出します。
⑨ 暴露終了後のサンプルをピンセットで取り出し、液体の被験物質の洗浄と同様（3.2.2.3 被験物質の洗浄）にリン酸緩衝液を充填した洗浄用ポリ洗浄ビンを使用して培養組織表面の被験物質を完全に洗い流します。
⑩ 洗浄後のサンプルを、全て第 3 行目のウェルに移します。
12

【図 7】
アッセイプレート
第1行
第2行
第3行
第4行

3.2.4 WST-8 試験の準備① 予め EBSS を 37℃ウォーターバスで 30 分温めます。
② CCK-8 (WST-8 ストック液)を EBSS で希釈し（CCK-8：EBSS = 1：10）、WST-8 反応液を調製します。
③ 液体被験物質もしくは固体被験物質適用用のアッセイプレートをインキュベーターから取り出します。
④ WST-8 反応液を 0.3mL ずつ、アッセイプレートの第 4 行目に入れます。

【図８】

アッセイプレート

第1行
第2行
第3行
第4行

注意点
■吸光度測定用にブランクを設定します。
WST-8 反応液をアッセイプレートに 0.3mL 入れて、3.2.5 WST-8 反応⑤に従ってインキュベーションします。

3.2.5 WST-8 反応① 20mL の PBS を入れたディッシュを 2 枚準備します。

ディッシュ 1

ディッシュ 2② 液体被験物質・固体被験物質を適用したアッセイプレートのフタを開け、滅菌済みピンセットで培養カップを取り出します。

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③ 培養カップに付着した液体培地を除去するため、ディッシュ 1 とディッシュ 2 で培養カップ外側を洗浄し、ペーパータオルで培養カップ周辺の PBS を除去します。
①ディッシュ 1 で培養カップを洗浄②ディッシュ 2 で培養カップを洗浄③ペーパータオルで PBS の除去④ PBS で洗浄・除去を行った培養カップを、第 4 行目に入れます。
底面に気泡が入らないようにしてください。

【図 8】

アッセイプレート

第1行
第2行

第3行
第4行

⑤ アッセイプレートのフタを閉め、4 時間±20 分 CO2 インキュベーターに入れます。
3.2.6 WST-8 反応液の測定① 反応時間終了後、アッセイプレートを CO2 インキュベーターから取り出します。
② アッセイプレートのフタを開けて、第 4 行目の培養カップを取り除きます。
③ 十分に撹拌した後、200μL を吸光度測定用 96 ウェルプレートに入れます。
④ 96 ウェルプレートリーダーを用いて、450nm および 650nm の吸光度を測定し、吸光度(450nm)から吸光度(650nm)を差し引いた値を測定値とします。
測定値=【検体の吸光度（450nm）-検体の吸光度(650nm)】-【ブランクの吸光度(450nm)-ブランクを吸光度(650nm)】⑤下記式より被験物質の生細胞率を計算します。

生細胞率（%）=

被験物質の測定値平均※
陰性対照の測定値平均※×100※N=3 の試験から算出した平均値

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4. 評価4.1 試験成立条件
本試験における試験成立条件は、下記条件にいずれも適合する場合とします。
・生細胞数： 0.5 ≦ 陰性対照の吸光度測定値平均 ≦ 1.6
・陽性対照： エタノール（液体）、ラウリン酸（固体）の生細胞率 ≦ 40%
・陰性対照・陽性対照、及び各被験物質の生細胞率の SD≦ 18%
4.2 判定基準
生存率予測

≦40%

カテゴリー1 もしくは 2＞40%

区分外155.

WST-8 試験系に干渉する被験物質の検出試験
WST-8 試験系を干渉する被験物質は、下記の 2 種類があります。
① 培養組織を染色してしまう被験物質② WST-8 還元作用のある被験物質
培養組織を染色する被験物質は、培養組織から抽出液に移行して吸光度測定値に影響を及ぼす可能性があります。WST-8 還元作用のある被験物質は、洗浄後の培養組織に残留した被験物質が WST-8 を還元してフォルマザンを産生することにより、吸光度測定値に影響を及ぼす可能性があります。
これらの被験物質を検出する試験法を下記に示します。

5.1 培養組織を染色する被験物質の検出
5.1.1 ステップ 1（予備検討）① 被験物質を液体の場合 50L、固体の場合 10mg ずつ、0.5ml の蒸留水が入ったアッセイプレートに添加します。対照として、被験物質が液体の場合は 50L の PBS を 0.5ml の蒸留水が入ったウェルに添加します。
被験物質が固体の場合は、蒸留水 0.5ml をそのまま対照としてお使いください。
② アッセイプレートにフタをして、CO2 インキュベーターに入れ、15 分間静置します。
③ 15 分後、プレートを静かに攪拌し、目視で蒸留水の着色を確認します。
④ 明らかな着色が確認できる場合は、培養組織を染色する可能性がある被験物質として、次にステップ 2 を実施します。明らかな着色を確認できない場合は、培養組織を染色しない被験物質と判定します。
5.1.2 ステップ 2（培養組織を用いた検討）① 試験は、3.2 項 試験操作に従って実施します。
② 5.1.1 項 ステップ 1（予備検討）で明らかな着色を示した被験物質を液体の場合 50L、固体の場合 10mg、および陰性対照として PBS 50L を培養組織上に添加します。3.2 項試験の操作に従って試験を実施します。ただし、WST-8 試験の操作では、培養組織の染色を確認するため、WST-8 反応液の代わりに、EBSSを用いて 4 時間培養します。
③ 補正された吸光度は、以下の式を使用して計算されます。
補正された吸光度= A-(B-C)
A：被験物質で暴露し、WST-8 反応させた培養組織の吸光度値
B：被験物質で暴露し、EBSS のみで反応させた培養組織の吸光度値
C：陰性対照で暴露し、EBSS のみで反応させた培養組織の吸光度値④ 補正された吸光度値が 0 以下の場合は、0 とみなします。
⑤ 3.2.6 WST-8 反応液の測定に記載された手順に従って算出された生細胞率が 40％以下の場合、被験物質の刺激物質（GHS カテゴリー1 もしくは 2）であると予測され、補正吸光度を算出する必要はありません。

16

5.2

WST-8 還元作用のある被験物質の検出

5.2.1 ステップ 3（予備検討）① CCK-8(WST-8 ストック溶液)を EBSS で希釈して（CCK:EBSS=1:10）、WST-8 反応液を調製します。
② WST-8 反応液を、24 ウェルアッセイプレートのウェルに 0.3mL ずつ入れます。
③ 被験物質を液体の場合 50L、固体の場合 10mg ずつ希釈した WST-8 培地に入れます。
④ アッセイプレートのフタを閉めて、4 時間 CO2 インキュベーターで培養します。
⑤ インキュベーション後、静かにアッセイプレートを撹拌し、目視で WST-8 反応液の染色を確認する。
⑥ 被験物質により WST-8 反応液が著しく着色する場合、ステップ 4 に進みます。
5.2.2 ステップ 4（凍結死させた培養組織を用いた検討）① 希釈した WST-8 反応液を明らかに着色する、被験物質（液体の場合 50L、固体の場合 10mg）を②の凍結死させた培養組織表面に適用します。対照については、液体の場合は PBS、固体の場合は未処理の培養組織をお使いください。
② 3.2 項 試験操作の手順に従います。生存した培養組織の代わりに、－80℃以下で 30 分凍結死させた培養組織を使用します。
③ 補正された吸光度値は以下の計算式で算出します。
補正された吸光度値=A-(B-C)
A：被験物質で暴露し、WST-8 反応させた培養組織の吸光度値
B：被験物質で暴露し、凍結死させた培養組織の吸光度
C：陰性対照で暴露し、凍結死させた培養組織の吸光度④ 補正された吸光度が 0 以下の場合、吸光度は 0 とみなします。
⑤ 試験方法に従って生細胞率が 40％以下の時、その被験物質は刺激性（GHS カテゴリー1 もしくは 2）とみなします。

■お問合せ先株式会社ジャパン・ティッシュエンジニアリング 営業部
TEL: (0533)66-2129/ FAX: (0533)66-2018
E-mail: jtec-info@jpte.co.jp
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