日呼吸誌

3（4），2014607●ファイザーフェローシップ報告

肺組織修復とマイクロ RNA―そして再生へ―
佐藤緒

匡

制御，おもに抑制すると考えられる．最近では，全遺伝

言子の約 60％がマイクロ RNA によって制御されていると2007 年度（第 7 回）日本呼吸器財団ファイザーフェロー

推測されている3）．これまでに，マイクロ RNA は，発シップによる助成を受け，2007 年 4 月から 2010 年 3 月

生や細胞死，細胞増殖といった多くの生物学的プロセスまでの 3 年間にわたり，アメリカ・ネブラスカ州のネブに関与することがわかってきており，さまざまな疾患とラスカ大学メディカルセンターでの研究留学の機会を得の関連についての報告が増え続けている．

ることができた．師事した Dr. Stephen I. Rennard は，近年のマイクロ RNA 研究の進捗に合わせて，肺・呼慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary dis-

吸器領域においてもマイクロ RNA 関連の報告が増加しease：COPD）を主な対象疾患とし，多くの日本人研究ており4），さまざまな呼吸器疾患の病態における重要な者と数多くのすばらしい研究をされている．本稿では，役割が今後さらに解明されていくものと予想される．ま著者が留学中に行った研究について報告する．

た，マイクロ RNA が呼吸器疾患における新たな治療ター

研究の背景：マイクロ RNA とは
これまで，遺伝形質の発現は，DNA 複製→転写→ゲットとなる可能性も期待される．

肺組織修復とマイクロ RNA

RNA 発現・翻訳→蛋白質合成の経路を経て遺伝情報がRennard らは肺組織修復における線維芽細胞の役割伝達された結果であるとする，セントラルドグマ仮説にに注目し，COPD 患者由来の肺組織から分離培養され基づいて説明されてきた．しかし近年，DNA 配列の変た線維芽細胞の解析を行った．線維芽細胞が産生する主化を伴わない遺伝子変異機構，すなわちエピジェネティ要な炎症メディエーターであるプロスタグランジン E2クス的な機構が見いだされてきた．さらに，DNA メチ（PGE2）は，線維芽細胞上にある受容体を介して，線維ル化やヒストン修飾といったエピジェネティクスの制御芽細胞自体の遊走，増殖，細胞外基質産生能を低下させに，マイクロ RNA と呼ばれる低分子 RNA が重要な役ることがわかっており5）6），さらに COPD 由来の線維芽割をもつことが明らかとなりつつある．

細胞では，定常状態での PGE2 の産生が非 COPD 喫煙

マイクロ RNA とは，約 22 塩基の短い一本鎖 RNA で，者由来の線維芽細胞と比べて高くなっており，遊走能な蛋白質への翻訳がなされないノンコーディング RNA のどの細胞機能も低下していることが報告されている7）．

一種である．マイクロ RNA の端緒は，1993 年に Lee

そこで我々は，ほぼ同様の喫煙歴を有する COPD との研究において，非 COPD コントロール肺由来の線維芽細胞に，インターsmall temporal RNA として記述された lin-14 とされてロイキン（IL）-1βおよび腫瘍壊死因子（TNF）-αといっいるが1），その後マイクロ RNA はさまざまな植物およた炎症性サイトカインを反応させたところ，COPD 線び動物で確認されており ，ヒトにおいてもこれまでに維芽細胞では，コントロール細胞よりも格段に多くの1,000 種類近くのマイクロ RNA が同定されている．マPGE2 が産生されることを見いだした8）．そのメカニズム

イクロ RNA の発現は，発生段階，組織または細胞種にとして，PGE2 産生に関わる酵素であるシクロオキシゲよりそれぞれ異なっており，翻訳レベルで遺伝子発現をナーゼ（COX）-2 のメッセンジャーRNA（mRNA）のらによる線虫

2）安定性が，COPD において有意に亢進していることを連絡先：佐藤 匡〒113‑8421 東京都文京区本郷 2‑1‑1
順天堂大学大学院医学研究科呼吸器内科学（E-mail: satotada@juntendo.ac.jp）

見いだした．COX-2 mRNA の安定性に何らかのマイクロ RNA が関与するのではないかという仮説から，マイクロアレイ解析を用いて肺線維芽細胞のマイクロ RNAの発現解析を行った．炎症性サイトカインにより発現が608

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Fig. 1 MiR-146a expression following IL-1β and TNFα（IL-1β/TNF-α）stimulation by COPD and control fibroblasts. Effect of IL-1β/TNF-α on miR-146a expression by real-time PCR. Fourteen COPD and 16 control
cell strains were stimulated with or without cytokines（2 ng/ml each）for 24 h. MiR-146a expression is normalized to the amount of rRNA and expressed as
2-ΔΔCT values. Each dot represents a separate subject. *p＜0.01, **p＜0.0001.

Fig. 3 MiR-155 expression in undifferentiated hESCs,EBs, and differentiated fibroblast-like cells. Cell layersof differentiated cells were extracted after 48 h treatment with or without TGF-β1（100 pM）. MiR-155 expression by real-time PCR is normalized to theamount of rRNA and expressed as 2-ΔΔCT values. *p＜0.01, compared with other groups.

誘導され，かつ，COPD 肺線維芽細胞とコントロール法を確立した11）．さらに，3 次元培養中の培地に IL-4 を細胞で発現が異なるものを抽出し，さらにオンライン添加すると，分化誘導された線維芽細胞は，通常の培地データベースを利用したマイクロ RNA のターゲット遺を用いて誘導された細胞（コントロール細胞）と比べ，伝子解析によりCOX-2との対合性があるものを絞り込み，コラーゲン収縮能，遊走能，フィブロネクチン産生能の最終的にmiR-146aを候補マイクロRNAとして抽出した．

亢進といった「ﬁbrogenic」なフェノタイプをもつこと

miR-146a は，炎症性サイトカインなどで誘導されるを見いだした12）．こうして誘導された線維芽細胞に対しマイクロ RNA として，免疫応答あるいは発癌に関連して，マイクロ RNA プロファイリングを行ったところ，定量PCR法を用いて，た報告がなされている9）10）．我々は，IL-4 を用いて分化誘導された細胞において miR-155 が肺線維芽細胞での miR-146a 発現を検討した．その結果，極端に低発現であることがわかった（Fig. 3）．

COPD 細胞，コントロール細胞とも定常状態では低発現

miR-155 は多機能性マイクロ RNA として知られ，悪で，IL-1βおよび TNF-αにより著明に発現が誘導された．

性腫瘍，関節リウマチ，心血管疾患などとの関連が報告

しかしながら，COPD 肺線維芽細胞ではコントロールとさ れ て い る． 呼 吸 器 疾 患 で は Pottier ら が，keratino-比べて，miR-146a の発現誘導が有意に軽度であった（Fig.

cyte growth factor を標的遺伝子として，肺線維化に関1）．さらに，miR-146a が COX-2 mRNA に直接結合し，わることを報告している13）．今回，miR-155 低発現であその安定性を低下させることで，COX-2，さらには PGE2る IL-4 誘導の線維芽細胞に miR-155 のトランスフェクの発現に対して抑制的に働くことを確認した．COPDションを行ったところ，コラーゲン収縮能，遊走能，フィにおいては炎症性サイトカイン刺激に伴う miR-146a のブロネクチン産生能がそれぞれコントロール細胞と同程発現誘導が不十分であるために，COX-2 および PGE2 が度に制御されるという結果を得た（Fig. 4）．このことか過剰に上昇し，炎症が遷延すると考えられた（Fig. 2）．

ら，miR-155 もまた，線維芽細胞が関与する組織修復のすなわち，miR-146a は，COPD の重要な病態である「異制御因子となりうると考えられる．

常な炎症反応」を制御することで，肺組織修復の新たなメディエーターとなりうると考えられる．

そして再生へまた，別のプロジェクトとして，我々は ES 細胞ある

肺・呼吸器に対する再生研究は，その発生学的およびいは iPS 細胞といった未分化幹細胞から，コラーゲンゲ

構造学的複雑性から他臓器に比較して立ち遅れているのル内 3 次元培養を用いて，線維芽細胞を分化誘導する方が 現 状 で あ る． 今 回 の 一 連 の 研 究 よ り，miR-146a，

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Fig. 2 MiR-146a regulates COX-2 expression and PGE2 production via a direct binding to 3′UTR of COX-2 mRNA.
（A）Effect of miR-146a mimic or inhibitor on COX-2 mRNA expression. COX-2 mRNA expression represented as apercentage of control（indicated as a black bar）
（B）.
Effect of miR-146a mimic on COX-2 mRNA stability.（C）Effectof miR-146a inhibitor on COX-2 mRNA stability. COX-2 mRNA was assessed after 6 h treatment of actinomycin D（2µg/ml）following IL-1β and TNF-α stimulation and is expressed as a percentage of mRNA level at the time of adding actinomycin D.（D）Direct binding of miR-146a to COX-2 3′UTR-LUC construct. Cells were cotransfected with aCOX-2 3′UTR-LUC construct, control vector, miR-146a mimic, miR-146a inhibitor, and control miRNA. Cell layers
were harvested 48 h after transfection, and LUC activities were determined by Dual-Luciferase assay. Data are normalized toLUC activity and expressed as a relative value to control（indicated as a black bar）
（E）.
Modulation of COX-2 protein in cytokine-treated COPD fibroblasts by miR-146a mimic. Densitometric quantification of COX2 is expressed relative to control after normalization to β-actin.（F）Effect of miR-146a mimic on PGE2 production bycytokine-treated COPD fibroblasts. Two strains each of COPD or control cells were evaluated on three separate occasions in all experiments. Values are mean±SEM. *p＜0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001.

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Fig. 4 MiR-155 regulates the differentiated fibroblast-like cell phenotype.（A）Collagen gel contraction on day 3.（B）Chemotaxis toward fibronectin.（C）Cell migration by wound closure assay.（D）Fibronectin production. Three different batches of control and IL-4-induced cells were evaluated on three separate occasions in all experiments. Values are mean±SD. *p＜0.05, **p＜0.01.

miR-155 といったマイクロ RNA は組織修復において重引用文献要な因子となると考えられ，病的細胞から正常細胞への治療に応用できる可能性があると考えている．肺の再生という「夢」の実現へのプロトコールはまだ明らかとはなっていないが，肺の修復および再生を制御するマイクロ RNA を探索していくことは，その手がかりとなりうるのではないかと期待される．
謝辞：留学の機会を与えてくださった順天堂大学医学部呼吸器内科

高橋和久教授，瀬山邦明先任准教授，福地義之助客員教授および順天堂大学医学部呼吸器内科医局の先生方に深甚の謝意を表します．また，今回の留学および研究は，日本呼吸器疾患研究基金ファイザーフェローシップ，上原記念生命科学財団ならびにネブラスカ大学メディカルセンター基金（The Larson Endowment）の援助によりなされたものです．

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