Real-Time Library Searchを利用した代謝物分析について
質量分析フォーラム2024 大阪，東京

2024.7.30 大阪， 2024.8.1 東京

石塚啓仁

2024. © Mediford Corporation

病理事業

CRO事業

バイオメディカ事業

2024 年 3 月末

PHCグループ
従業員数

約9,200人

診断薬事業

2024 年 3 月末
Mediford 従業員数

ヘルスケア
ITソリューション事業

約440 人LSIM事業（臨床検査事業）

BGM事業
CGM事業
（糖尿病マネジメント）

2パナソニックヘルスケア㈱

1969

2010

2012

2014

パナソニックヘルスケアからPHCにコーポレートブランドを変更

2018

2016

2019

2020

パナソニックヘルスケア
ホールディングス㈱松下寿電子工業㈱1977 1985 1988 2007㈱三菱油化ビーシーエル㈱三菱化成安全科学研究所

2022

2023

PHCホールディングス㈱が東証一部へ上場㈱パナファーム・ラボラトリーズ
三菱化学メディエンス㈱2021

PHCホールディングス傘下となる

2019㈱LSIメディエンスの治験事業を承継，メディフォード㈱発足

20212023.11㈱LSIメディエンスの非臨床事業が分社化㈱株式会社LSIM安全科学研究所 発足

3

メディフォード拠点一覧

本社・営業部（東京都板橋区清水町）

熊本研究所（熊本県宇土市）⚫ イメージングMS⚫ LMD

治験事業部・志村サテライト
大阪オフィス鹿島研究所（茨城県神栖市）⚫ Orbitrap IQ-X（LC-RAD/MS）⚫ 定量用 LCMS（RIエリア 1台）⚫ 定量用 LCMS（6台）

医薬品分析センター（東京都板橋区志村）

鹿島研究所
静岡分室

⚫ Q EXACTIVE FOCUS⚫ 定量用 LCMS（18台）
4

5

薬物動態試験鹿島研究所はAAALAC認証を取得したGLP適合施設で、申請資料の信頼性の基準（医薬品医療機器等法）、農薬GLP、OECD-GLPに対応した薬物動態試験を実施

In vivo 薬物動態試験• 吸収・分布・排泄試験• In vivo, In vitro 代謝試験

• トキシコキネティクス（TK）試験• ファーマコキネティクス（PK）試験

In vitro 薬物動態試験• In vivo, In vitro 血球移行
• In vivo, In vitro 蛋白結合
• 薬物代謝酵素阻害試験• 薬物代謝酵素・分子種同定試験• In vitro ヒト CYP 誘導試験
• In vitro 経皮吸収試験

6Orbitrap IQ-Xについて⚫ 運用開始 2024年1月⚫ 放射線管理区域内に設置⚫ UHPLCに接続⚫ RAD(Radioactivity detector)接続（非標識体分析時は分離可能）⚫ 電源関係✓ 鹿島研究所の電源は3系統• 東京電力系統• 鹿島動力系統（天候悪化時にガスエンジン発電による同時送電で瞬電防止）• メディフォード自家発電系統（上記2系統遮断時に自動起動．
連続運転が可能であり災害級事態への対応に使用）

Orbitrap
IQ-X

UHPLC

RAD7

Orbitrap IQ-Xの特徴
CID
Ion Trap

HCDAcquisition rate OTMS2 40 Hz with 7500 resolution at m/z 200
Maximum resolution 500K FWHM at m/z 200-500K(50万)Mass range Full MS: 50–2000 m/z
Mass Accuracy 1 ppm int
Dissociation / Ion Activation CID, HCD
MSn Up to MS10 with the ion trap or Orbitrap mass analyzer
Analyzers OTMS, ITMS
Detectors Ion Trap, Orbitrap mass analyzer

CID (Ion Trapで実施)••設定するエネルギーに依存しないスペクトルパターンが得られる．
m/zに依存するエネルギーで開裂を起こすためn次開裂しない．

AUTO READY• 分解能@m/z 200（スキャン速度）7,500 （40スキャン/秒）
15,000 （22スキャン/秒）
30,000 （12スキャン/秒）
50,000 （10スキャン/秒）
60,000 （7スキャン/秒）
120,000 （3スキャン/秒）
240,000 （1.5スキャン/秒）
500,000 （0.7スキャン/秒）• 質量精度
3 ppm以内(外部標準法)
1 ppm以内(内部標準法)
sub 1ppm以内(EASY-IC)

AUTO READY
キャリブレーション液が内蔵
週末に自動制御でキャリブレーションを実施

8

Orbitrap IQ-X選択理由

LTQ Orbitrap XL

更新前機器：LTQ Orbitrap XL（2008年導入）
特徴• 精密質量，Ion Trapでの多段階MSnを利用した構造解析が可能
LTQ Orbitrap XLの利点• MS3により得られたフラグメントイオンより代謝部位の更なる絞り込みが可能であった（代謝物分析を当社で受託している化合物の2-3割程度 ）．
• 当社顧客においてもサーモフィッシャーサイエンティフィック社の精密質量MSは，ユーザー数が多く，顧客の測定・解析条件に合わせることが可能．また測定データも顧客の環境下での確認が可能．

LTQ Orbitrap XLの課題• MS2の取得速度が遅くCompound Discoverer の様なMS2情報を利用する解析ソフトの性能を活かしきれない• 代謝物において選択的なMS3を取得する設定が難しい（選択的にMS3測定が可能であれば，代謝部位を絞り込めることが増える）
LTQ Orbitrap XLでの課題を解決できる機種としてIQ-Xを選択． IQ-Xは多段階MSn機能， 選択的にMS3測定が可能なReal-Time Library Search，有用なMS2取得ができるAcquireXを搭載しており当社のニーズを満たしていた．
9

Real-Time Library Search(RTLS)

10

RTLSの概要説明
代謝物の構造推定時に有益なMS3スペクトルとは？
• 未変化体，標準物質と一部異なるMS2スペクトルに対してMS3を取得したデータ• 同時に検出されているスペクトルが，未変化体と類似している

標準品
MS2スペクトル

m/z
RTLSは• 未変化体又は標準物質と類似したMS2スペクトルが「観測された場合のみ」，MS3の取得を実施する．
• 取得するMS3は予め登録している未変化体等のフラグメン
トライブラリーを参照して，「観測されていないMS2スペクトル」からMS3を取得「自動的」かつ「効率的」に「代謝物特異的なMS3を取得」を取得することが可能
RTLSは，上記以外も多数の機能を搭載

代謝サンプル
MS2スペクトル

未変化体，標準物質で観測されて11いないMS2スペクトル未変化体又は標準物質と代謝サンプルのMS2が一致したスペクトルメディフォードでのRTLSを使用した分析方法
No.

内容

1

イオン化条件，コリジョンエネルギーを決める．

2

ライブラリー作成のため，1.で設定した条件で未変化体，代謝物標品などを分析．
標識化合物（14C等）の場合は，代謝物の質量が異なるためサンプルを分析．

3mzVaultを用いて，分析したデータからRTLSに用いるライブラリーを作成（1ライブラリーに複数化合物を登録可能）.

4

メソッドにRTLS用のライブラリーを反映する．

5

サンプル測定することでRTLSが適用される．

12

mzVaultでのライブラリー作成
1.登録したいMS2をフィルターで選択
2.登録したいピークを選択3.Inrensity Threshold (Auto，Manual)で強度の低いスペクトルを除去．
赤線より上がライブラリーに登録される．

4.ライブラリーに登録される． 複数の化合物を1つのライブラリーに登録可能（未変化体，代謝物標品等）

13当社の使用しているMS3メソッド

RTLSノード設定

14

Omeprazole のライブラリーと一致したMS2スペクトル

RTLSの実測データ

Omeprazoleの標準溶液を測定した結果

MS3が取得できたスペクトル
標品サンプルOmeprazole MS2

代謝サンプルOmeprazole +O MS2

標品サンプル拡大
Omeprazole MS2

代謝サンプル拡大
Omeprazole +O MS2CYP発現酵素（3A）を用いて，Omeprazoleを代謝させた結果

RTLSを用いて未変化体で観測されないm/z 152, 184, 196, 214のMS2スペクトルに対応するMS3スペクトルを取得した．
MS2で得られたフラグメントイオンに対してRTLSを用いることで有用なMS3を自動的に取得した．
15

代謝サンプル
Omeprazole +O MS2

152@MS3

196@MS3

181.0191 : C8H7NO2S
164.0164 : C8H6NOS

16AcquireX17

サーモフィッシャーサイエンティフィックの資料より抜粋

18

AcquireX BACKGROUND & COMPONENT INCLUSION
ブランク
試料

Full Scanのみ：Exclusion listを作成

Wash
試料

Full Scanのみ： Wash分析中にExclusion listを作成しMSn測定メソッドに反映 (10-15分）

サンプル

Full Scanのみ： Inclusion listを作成

精密質量のスペクトルのアップダウンや常時観測される成分を判定

精密質量のスペクトルのアップダウンを考慮して成分を判定

分析前にInclusion listをMSn測定メソッドに反映 (10-15分）

サンプル

MSn測定： Exclusion list, Inclusion listが反映されたメソッドで測定
このデータを構造推定に用いる

19実際のAcquireX

MSn 測定メソッド (RTLSとの同時利用可能）
Target Massノード設定

Target Mass Exclusionノード設定

Listは入力しない

Listは入力しない

20

Acquire Xのシーケンス画面

ブランクサンプルで検出されたバックグランドイオン強度に対して指定倍数以上のイオン強度をもつイオンをMSnのプリカーサーイオンとする指定が可能

21

Acquire X

測定後のMSnメソッド
Target Massノード設定

Target Mass Exclusionノード設定

1917個のInclusion List

15340個のExclusion List

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Acquire XとRTLSを併用した代謝物の探索
確認方法
ラットにOmeprazole, Midazolamを経口投与し，血漿中代謝物をAcquire XとRTLSで分析．
ブランク試料は，代謝物と同様の前処理を実施したラット血漿を使用． 文献で報告されている代謝物が，MSn取得（Inclusion list 登録）されているかの確認を実施．
結果
化合物/代謝物+O+O2+(O3 S)-(CH2O)-(CH2) +(O)-O-(CH2)-H2 +O-H2 +O2Glucuronide

Omeprazole

MS3MS3MS3MS3MS3MS3MS3MS3MS3MS3

ExpectedCompounds MS3 : 72/1444
化合物/代謝物+O+O2-(CH2)+O
Glucuronide+2O
GlucuronideMidazolamMS3MS3MS3MS2MS2

考察

その他のMS3:文献で確認できなかった代謝物候補2種 +(H2 O2), +O3が取得されていた．
ExpectedCompounds MS3 : 23/2684

2つの異なる化合物においても，AcquireXにより複数化合物の代謝物がInclusion listに登録され， MSnが取得が確認された．また多くの代謝物でMS3の取得が確認された．
23

Intact189.0217

Intact 対 +O+O

Cosine Score：17.5

Intact 対 +O+GlucCosine Score：3.07
189.0215

24

まとめサンプルの初回分析において⚫ Real-Time Library Searchにより 特異的なMS3データ取得が可能になった．
（ライブラリー作成・検索含め当社内で完結）．
⚫ AcquireXにより機器とソフトウェアが自動制御されることで不要なMS2データを減らし，目的化合物の網羅的なMS2の取得を実施できる．

これらを組み合わせて迅速かつ解析に有用であるデータ収集が可能

25

Mission「生きていく」を明るく、前向きにする。
Vision

心身の健康や充実を叶える方法を、人々が主体的に選べる世界にする。

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