ランを成功させるための最適なクラスター密度を得る方法
イルミナ株式会社
福世 裕貴子© 2019 Illumina, Inc. All rights reserved.

Field Applications Scientist

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

本ウェビナーのゴール

クラスター密度に影響を与える要素とは？

クラスタリングに関する問題があったときの診断方法

最適なクラスター密度を得る方法

2

本ウェビナーのアジェンダ
1
2

クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

4

ランダムフローセルにおける最適なクラスタリングの診断方法

5

パターン化フローセル（ iSeq・NovaSeq ）6

サポート資料3

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本ウェビナーのアジェンダ
1
2

クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

4

ランダムフローセルにおける最適なクラスタリングの診断方法

5

パターン化フローセル（ iSeq・NovaSeq ）6

サポート資料4

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次世代シーケンサーでデータを得るまでの4つの工程

Illumina Sequencing Workflow
LibraryPreparation
ライブラリー調製

Cluster
Generation
クラスター形成

Sequencing
シーケンシング

DataAnalysis
データ解析

5

次世代シーケンサー（NGS）でデータを得るまでの4つの工程

Illumina Sequencing Workflow
LibraryPreparation
ライブラリー調製

Cluster
Generation
クラスター形成

Sequencing
シーケンシング

DataAnalysis
データ解析

6

クラスター形成とはクラスター形成の目的は？
調製したライブラリーのDNA量だけではシーケンシングで検出する際に量が不十分なため、PCR増幅をフローセル（流路をもったガラス基板）上で行うことにより検出に十分なDNA量を確保する

クラスターとは？
フローセルの表面上で断片化されたライブラリーが増幅された領域

フローセル

クラスター
=1分子由来のライブラリーの束

7

クラスター形成に使われるフローセルとは？
流路を持ったガラス基板で、クラスター形成が行われる場所

8

ランダムフローセル

パターン化フローセル• HiSeq 2500, MiSeq, NextSeq, MiniSeq•クラスタがランダムな位置で増幅される•インサート長対応の柔軟性• Duplication率が低い• HiSeq 3K/4K/X, NovaSeq, iSeq 100•サイズと位置が決定•クラスタの高密度化•イメージングを簡略化クラスター形成とは- 多数のクラスターがフローセルの表面上に形成される- Read1シーケンシングプライマーが結合し超並列でシーケンシングが開始される- 1クラスター= 1リード 例：

910,000クラスター= 10,000リード

どうやってクラスターの画像取得が行われるのか？
- クラスターは、Read1シーケンシングプライマーが適切に結合されている状態でのみ確認することができる- 最初の1塩基が取り込まれると、画像取得が開始される- クラスターが検出されると、シーケンサーはSequencing By Synthesis(SBS)法を利用し伸長反応を進める
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Sequencing
By Synthesis
伸長反応- Sequencing
by (SBS)
Synthesis
Example with four channel chemistry

MiSeq

GTA

CTT

T

A

蛍光色素付
NTP’s + ポリメラーゼを加える

蛍光色素付NTPが励起され画像取得が行われる (4 画像/塩基)X # of bp in read11

NTPからブロックと蛍光色素が取り除かれる

HiSeq

取得した画像解析から塩基情報を決定するまでシーケンシング中に、Real-time analysis software (RTA software)が装置内で自動で立ち上がり得られたクラスターの画像データから主に下記の工程を行い最終的に塩基情報を決定する

フローセル上のクラスター密度がRTAの解析の下記工程に影響を与える

クラスターの位置決め

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蛍光強度（インテンシティー）の抽出

クラスター品質による選別(Passing Filter)

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クラスターの位置決め- ランダムフローセルの場合は、ライブラリーがフローセルに流入した際にランダムにフローセル上に結合しその後クラスターを形成するクラスターが形成される場所がランダムなため最初にクラスターの位置を探す工程が必要になる-RTAは最初の4~7サイクルでクラスターの位置を特定する- 位置の特定後、次の補正の工程に進む-

13

iSeq、NovaSeqで使用されるパターン化
フローセルは整列されたウェルの中にクラスターが形成されるのでクラスターの位置決めの工程は不要

蛍光強度（インテンシティー）の抽出
クラスターの位置決めをした後、各クラスターの蛍光強度を抽出しクラスターの分離を行う

実際のクラスターは上記のように完璧な円状ではない

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バックグラウンドの各クラスターの蛍光強度を計算

蛍光強度を計算

蛍光強度が低く暗いピクセルの平均値を使ってバックグラウンの蛍光強度を計算する

各クラスターの蛍光強度が高く最も明るいピクセルを用いてクラス
ターの蛍光強度を抽出する

各クラスターの蛍光強度からバックグラウン
ドを引く

抽出した各クラス
ターの蛍光強度からバックグラウンドの蛍光強度を引く

クラスター品質による選別

Passing Filter

Passing Filterは、重なり合って分離ができなかったクラスターのような純度の低いクラスターを取り除く役割がある-

塩基伸長が始まって1塩基目～25塩基目で、蛍光強度の抽出結果に基づき純度の低いクラスターをふるい落とす-

Passing Filterを通った純度の高いクラスターのみデータ収量として考慮され、塩基決定の精度を表すスコア（Q30）に貢献する

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本ウェビナーのアジェンダ
12

クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

4

ランダムフローセルにおける最適なクラスタリングの診断方法

5

パターン化フローセル（ iSeq・NovaSeq ）6

サポート資料16

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なぜクラスター密度のコントロールが重要なのか？
クラスター密度は画像解析から塩基情報の決定を行う際の工程で大きな影響を与えるため、最終的なデータの品質とデータの収量に密接に結びついている最適なクラスタ密度でランを行う上でoverclusterとunderclusterの間のバランスのよい密度を見つけることが重要
目標はoverclusterを避けて適切なSignal/ Noise比を確保しつつ、十分なデータ量を確保できるくらいクラスター密度を高くする

低クラスター密度の状態

Underclustering

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最適な密度

高Overclustering

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OverclusteringとUnderclusteringがもたらす影響
Overcluster – クラスターが多すぎる状態
原因

ライブラリーのローディング量が多い

症状

・・・・

Q30スコアの低下
Cluster Passing Filterの低下
インデックスの振り分け(demultiplexing)不良
ランが止まる

Undercluster – クラスターが足りない状態
原因

ライブラリーのローディング量が少ない

症状・ 最終的なデータ収量が非常に少ない
・ ただしデータの質は良好なことが多い

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装置別 推奨のクラスター密度装置

シーケンシング用試薬

推奨クラスター密度(K/mm2)

HiSeq 2500 (High Output)

HiSeq v4

950 – 1050

TruSeq v3

750 – 850

HiSeq 2500 (Rapid Run)

HiSeq v2, TruSeq(v1), Rapid Duo 850 – 1000

MiniSeq

MiniSeq High/Mid Output

170 – 220

MiSeq

MiSeq v3

1200 – 1400

MiSeq v2

1000 – 1200High/ Mid Output (v2.5 and v2)

170 - 220

NextSeq※19

上記推奨密度は塩基多様性に偏りのないライブラリーを使用した場合を想定

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本ウェビナーのアジェンダ
1
2

クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

4

ランダムフローセルにおける最適なクラスタリングの診断方法

5

パターン化フローセル（ iSeq・NovaSeq ）6

サポート資料20

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一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

ライブ
ラリーの品質装置へローディングする際の最終濃度

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ライブ
ラリーの定量

塩基の多様性ExAmpReagentの調整

ライブラリーの品質ライブラリーの品質が影響を与える理由- ライブラリー調製の際に残ったアダプターダイマー、プライマーダイマーがライブラリー定量やクラスター形成に影響を与える- ライブラリーの精製が不十分だと、上記のコンタミネーションが残る可能性が高い

推奨の定性確認・ライブラリー精製方法
各ライブラリー調製キットのガイドに従った方法でライブラリーの定性確認、およびライブラリーの精製を行う- 定性確認方法の例：Bioanalyzer, Fragment Analyzer- 精製方法の例：

AMPure Beads

ライブラリーのモル濃度の計算に使用するため、平均ライブラリーサイズを確認する

22

ライブラリーの定量精度の高いライブラリー定量が最適なクラスター密度のコントロールには不可欠

qPCR

Qubit/ PicoGreen

Bioanalyzer• ライブラリーのサイズ分布が近似している場
合は最も効果的な定量方法• 両端にアダプター付加された構造的に問題ないライブラリーのみ測定することができる• ライブラリーのサイズ分布がブロードなライ
ブラリーに効果的• アダプターダイマーを含めたすべての二本鎖DNAを測定する恐れがあるがBioanalyzer
で定性確認しコンタミネーションがない場合は非常に正確に測定できる• TruSeq Small RNA,
TruSight Tumor 26,
TruSeq Targeted
RNA Expressionの3種類では測定可能

NanoDropや吸光度測定は一本鎖DNAやRNAも測定されライブラリーの濃度が多めに推定される恐れがある
23

装置へローディングする際のライブラリー最終濃度
ライブラリー調製後、ライブラリーはライブラリーの種類、装置、シーケンシング用試薬に合わせて適切に最終濃度に希釈する必要がある

最終濃度を誤ってしまうと起こること• 高濃度だとoverclusterになる可能性大 → Cluster Passing Filter低下、ラン不良• 低濃度だとunderclusterになる可能性大→ データ収量が低下、データ精度低下

最適な最終濃度を決定するためには• 装置へローディングする際の濃度を少しずつ調整していくことがお勧め• 装置ごとに推奨のライブラリー最終濃度が異なるため下記ガイドを参照する- The denature and dilute guide- 各装置のSystem Guide• クラスター密度とライブラリー最終濃度は直線状に比例しない 最終濃度を上げるときは、少しずつ濃度を上げランを行い、次回以降参考にする

NaOH• ライブラリーの一本鎖DNAへの変性で使用 用事調整してpH>12.5のものを使用（最終ライブラリ－中に1mM以内になるように注意）• 消費期限切れまたは酸化したNaOHは変性の効率が下がり、2本鎖ライブラリーの変性がうまくいかない可能性がある 2本鎖ライブラリーはフローセルに結合しないため注意が必要• 中和されずに過剰なNaOHがフローセルに入ることでクラスター形成が抑制される

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塩基の多様性
塩基バランスのよいライブラリー

TEMPLATE

CGAT
12個のクラスターが認識されるそれぞれのクラスターが異なる配列を持つので、サイクルごとに異なるシグナルが得られる
隣り合ったクラスターを区別することができる
CYCLE 1CYCLE 2CYCLE 3CYCLE 4塩基の多様性が乏しいライブラリー（例：PCRアンプリコン）

TEMPLATE

CGAT

12個のクラスターがCYCLE 1
CYCLE 3CYCLE 2CYCLE 48個と認識される- ローディングする際の最終濃度を低くする 物理的にクラスターの重なりを低減させる- PhiXや塩基の多様性が高いライブラリーをspike-inして使用する
それぞれのクラスターが同じ配列を持つ（異なるシグナルが得られない）ので、- 25装置ごとのPhiX spike-inの推奨量を参考にする
隣り合った2つのクラスターを1つと認識してしまう

塩基の多様性
下記の装置別のPhiX Spike-inの推奨量を参考にしてspike-inを行う
最初はspike-inを多めにし、徐々に様子を見ながら少な目に調整していくとよい

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塩基の多様性に関するウェビナー

https://jp.illumina.com/events/webinar/2019/webinar-191120-j.html
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ExAmp Reagentの調整
HiSeq3000/4000、NovaSeqではマニュアルでExAmp Reagentを調整する必要があるが、誤った調整方法は結果に影響を与える

調整の際の注意点-

ExAmp reagentは粘性が高いので、混ぜる際はゆっくりピペッティングするよう注意する-

ExAmp reagentが劣化しないように、調整後フローセルに載せるまでに長い時間置かないようにする-

NovaSeq Xp workflowの場合は、フローセルにExAmp reagentとlibrary mixのMixtureをローディングした後ランを開始するまでに時間が空いてしまうと最適な条件下でない状態でクラスターが形成されてしまう

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本ウェビナーのアジェンダ
1
2

クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

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ランダムフローセルにおける最適なクラスタリングの診断方法

5

パターン化フローセル（ iSeq・NovaSeq ）6

サポート資料29

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ランダムフローセルとは？

-HiSeq 2500, MiSeq, NextSeq, MiniSeq- クラスターがランダムな位置で増幅される- ランダムな位置でクラスター形成が行われるため、overclusterになるとクラスター同士の重なりが多発する可能性が高くなる- 塩基決定のための補正が問題なく行われるためにはクラスター密度のコントロールが重要な要素になる- ランの状態を適切に確認し調整を行う必要がある

30

シーケンシングランがうまくいったかどうかの確認方法

イルミナでは主にシーケンシングランの状態を確認するためのツールを２つご用意

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Illumina Sequencing Analysis
Viewer (SAV)

BaseSpace Sequence Hub• 装置上にインストールされている
ラン結果確認用ソフウェア• ご自身のPC（Windowsのみ）にインストールしてご使用も可能• 当社が展開しているクラウドサー
ビス• ランデータを転送しネットワーク上で解析のモニタリングが可能

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Sequence Analysis Viewer (SAV)を使用する際に必要なファイル

ランフォルダ∟InterOp
RunInfo.xml
RunParameters.xml

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クラスター密度の問題同定に役立つランパラメーター
代表的なランパラメーター*

代表的なトラブルの原因%>=Q30Cluster PF

ライブラリーの濃度が適切でない

Density%Aligned**

33* いずれも25サイクル目の画像解析後に表示** サンプルにPhiXを混合した場合のみ計算・表示

%>=Q30: 決定した塩基の信頼性を示すスコア● Quality Scores (Q Score)- 決定された塩基が正しい確率- 高い値 ≒ 高い信頼性- 塩基ごとに計算- 計算式: −10×log10Perror● %>=Q30- >=Q30が割り当てられた塩基の割合- リード長に応じた基準値で、ランの品質を確認可能

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Q Score% Error%Correct

Q1010%

90%

Q201%

99%

Q30

0.1%

99.9%

Q40

0.01%

99.99%

Cluster Passing Filter
Passing Filterは、重なり合って分離ができなかったクラスターのような純度の低いクラスターを取り除く役割がある- 塩基伸長が始まって1塩基目～25塩基目で、蛍光強度の抽出結果に基づき純度の低いクラスターをふるい落とす
Passing Filterを通った純度の高いクラスターのみデータ収量として考慮され、塩基決定の精度を表すQ30のスコアに貢献する-SAVでのCluster PFは純度の高いクラスターが全体のクラスターの内何%存在していたかを表わす指標35

SAV Summary Tabの確認
SAV上のSummaryタブを確認する
Summary Tab

11 Aligned (%)- PhiXをSpike-inした時のみ数値が表示される- PhiXの参照配列とどの程度アライメントが取れたのかがわかる- 25% spike-inした場合は通常25%に近い値を取る
低く表示されたとき：
実サンプル由来のライブラリー濃度が過剰である可能性がある 通常はOverclusterである可能性が高い
高く表示されたとき：
実サンプル由来のライブラリーの濃度が低すぎる可能性がある Underclusterである可能性が高い

2

32 Density (K/mm2)- 各装置の推奨クラスター密度に範囲内か確認する

3 Cluster PF (%)- Filterをパスしたクラスター（純度の高いクラター）の数が十分に高いか確認する

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SAV Imaging Tabの確認：クラスター画像
各装置によってクラスター画像の見え方は異なるが、実際のクラスターの画像を確認可能
下記はMiSeq v2試薬でランした際のクラスター画像

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正常な場合の例

推奨クラスター密度の範囲で一番高い状態の例

Overclusterの例

Overclusterでサチュレーションを起こしている例

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SAV Analysis Tabの確認：蛍光強度の低下
SAV上のAnalysisタブにあるData By CycleをIntensityに変更して確認する

クラスター密度が正常な時の例

MiSeq V2試薬を使用した際の例
通常はこのようにスパイクのない曲線がみられる

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Overclusterでランが失敗した時の例

Overclusterの結果クラスターの位置決めができず全塩基で最初の数サイクルで蛍光強度が下がってしまうことがある

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SAV Analysis Tabの確認：%>=Q30の低下
SAV上のAnalysisタブにあるData By Cycleを%>=Q30に変更して確認する

クラスター密度が正常な時の例

Read1

OverclusterでRead2開始後ランが止まってしまった例

OverclusterでRead2開始前の再合成でOverclusterが悪化した例

Read2-OverclusterはRead1とRead2いずれにも影響を与えるが、Read2がより影響を受ける傾向にある
Read2のシーケンシング開始前に数サイクルDNAの再合成を行う際に、クラスターのサイズが大きくなりクラスター同士の重なることが増えるためである- クラスター同士が重なると補正がうまくいかずQ30が下がり、結果としてランが失敗してしまう恐れがある

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SAV Analysis Tabの確認：Cluster Pass Filterの低下
SAV上のAnalysisタブにあるData By Laneを確認する
青ボックスプロットは形成されたすべてのクラスターの数、緑ボックスプロットは純度の高いクラスター（＝filterをパスした配列情報決定に使用されるクラスター）の数を表している

最適なクラスター密度の時

Overclusterの時

ひどくOverclusterの時

生のクラスター数と純度の高いクラスターの数が近い＝青と緑のボックスプロットの距離が近い傾向を示す

補正がうまくいかず純度の高いクラスターの数が少なくなる＝青と緑のボックスプロットの距離が遠くなる傾向を示す

ひどいoverclusterになると純度の高いクラスターがなくなる＝緑のボックスプロットは0を示し、青ボックスプロットのみ表示される

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本ウェビナーのアジェンダ
1
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クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

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ランダムフローセルにおける最適なクラスタリングの診断方法

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パターン化フローセル（ iSeq・NovaSeq ）6

サポート資料41

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パターン化フローセルとは？
- パターン化フローセルは数百万以上の整列されたウェルから構成される- 整列したウェル中にクラスターが形成される仕組みになっており、クラスターのサイズとクラスター間の幅が予めコントロールされているためoverclusterにはなりにくい構造になっている- 構造的にはoverclusterにならないためランダムフローセルのように厳密なクラスター密度のコントロールは不要だが、良好な結果を得るためにはライブラリーのローディング量を適正にコントロールする必要がある- 適切なローディング量を確認するための項目：
・ Cluster Passing Filter(%PF)
・ % Occupancy
・ %>=Q30

42

Cluster Passing Filter(%PF):
塩基を決定できるクラスター数の指標%PFが高いと、1回のランでより多くの塩基配列を決定できる
空のウェル

ポリクローナルウェル

モノクローナルウェル

PF
Total Wells

43

PF数
%PF =
Total Wells数

Cluster Passing Filter(%PF):
塩基を決定できるクラスター数の指標%PFが高いと、1回のランでより多くの塩基配列を決定できる
空のウェル

ポリクローナルウェル

モノクローナルウェル

PF
Total Wells

44

PF数%PF =Total Wells数

ライブラリー濃度による%PFの変動ライブラリー濃度

過少通常範囲

ウェルの状態%PF45

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過多%Occupancy・%Occupied:
クラスターが形成されたウェルの割合を示す指標
ポリクローナルウェルなど、塩基配列を決定できないクラスターも含む
空のウェル

ポリクローナルウェル

モノクローナルウェル

Occupied Wells
Total Wells

46

Occupied Wells数%Occupancy =Total Wells数

ライブラリー濃度による%Occupancyの変動ライブラリー濃度

過少通常範囲

ウェルの状態%Occupancy

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過多パターン化フローセルの場合の診断方法
ライブラリー濃度が過剰量または非常に少ないとデータに影響するため、下記マトリックスの傾向の組み合わせをSAV、BaseSpace Sequence Hub、または装置25サイクル後のControl Software画面で確認し評価することが望ましい-%Occupancy-%Passing filter-% ≧Q30※48

iSeqとNovaSeq 6000パターン化フローセルの場合はクラスター密度が固定されている

パターン化フローセルの場合の診断方法
下図はiSeqとNovaSeqのラン結果に基づいた%Occupancyと%PF metricsの相関図

フローセルに過剰量ライブラリーがローディングされた状態だと%Occupancyが高く、%PFが下がる傾向
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本ウェビナーのアジェンダ
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クラスター形成とは？クラスターとは？
最適なクラスター密度の重要性とは？
- Overclustering と Underclusteringが与える影響 -3

一般的にみられるクラスタリングに関する問題への回避策

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サポート資料50

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クラスター密度の最適化に関する最新版ガイド

https://jp.support.illumina.com/downloads/cluster-optimization-overview-guide-1000000071511.html
51

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装置に関するサポートページ

https://jp.support.illumina.com/
52

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関連ウェビナー
PCRアンプリコンDNAライブラリーなどのLow Diversityサンプルのシーケンスランを成功させるコツ
https://jp.illumina.com/events/webinar/2019/webinar-191120-j.html

SAV（Sequencing Analysis Viewer）でランの評価と改善を行う【イルミナiSchool 初級】
https://jp.illumina.com/events/webinar/2017/webinar_170614_j.html

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その他サポート資料
Library quantification and quality control quick reference guide
https://jp.support.illumina.com/bulletins/2016/05/
library-quantification-and-quality-control-quickreference-guide.html?langsel=/jp/

Support Bulletins https://jp.support.illumina.com/bulletins.html?langsel=/jp/- Cluster Density Specifications for Illumina Sequencing Platforms- Considerations when migrating non-Illumina libraries between
sequencing platforms- Cluster density considerations when migrating Illumina libraries between
sequencing platforms
Illumina Sequencing Analysis Viewer (SAV) のガイドとインストーラー
https://jp.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/sequencing_analysis_viewer_sav.html?langsel=/jp/54

参考資料

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％Occupancy vs %PF相関図の描き方

56

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57

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