PDC の３次元培養法の構築及び薬効評価の検討

熊本研究所 薬理研究部
2023. © Mediford Corporation

背 景非臨床試験を経て抗がん剤が申請に至るまでの確率は５%しかない[1, 2]

 従来の抗がん剤のin vitro 薬効評価方法① 細胞バンクより入手したがん細胞株を使用→ 遺伝子発現パターンが臨床がんとがん細胞株で異なる. [3, 4]② ２次元培養下で評価→ 臨床がんと２次元培養下のがん細胞の構造が異なる. [5, 6]

臨床がんに近い構造をもつ in vitro の薬効評価系の構築が求められている．

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目的
胃がんPDCを用いた３次元培養法による抗がん剤の薬効評価系の立ち上げ
PDCを用いた３次元培養法 (スフェロイド
実験１培養) の条件検討
実験２ ３次元培養PDCによる抗がん剤の薬効評価

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PDC及び３次元培養法の概要と利点
Patient-Derived Cell Line (PDC)[7, 8] とは？
がん患者の腹水より回収した細胞株従来の細胞株より臨床がん検体の状態に近いため，抗がん剤の薬効の臨床予測性を上げることが期待される．

3

PDC及び３次元培養法の概要と利点
３次元培養法(スフェロイドの培養)[1, 9]とは？

 細胞が立体的に配置された培養法
 スフェロイド：

細胞外基質なしで細胞同士が結合して形成された３次元の構造体

 ３次元培養下細胞の構造(スフェロイド)：

２次元培養下の構造(単層)より臨床がんに近い構造

 栄養，酸素，抗がん剤等の浸透する割合は，スフェロイドの表面と内部で異なる．
 抗がん剤がスフェロイドの内部の細胞まで浸透しにくいため，２次元培養法より３次元培養法で抗がん剤に対する抵抗性が上がるという報告がある．

4

実験1 目的
PDCを用いた３次元培養法 (スフェロイド実験１培養) の条件検討
実験２ ３次元培養PDCによる抗がん剤の薬効評価

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試験方法

● 実施内容細胞低吸着96ウェルプレートに胃がんPDCを播種した．
細胞播種日をDay 0として，Day 4, 7, 11および14に細胞数の指標として細胞内のATP を測定した．

● 試験スケジュール
細胞播種

ATP測定

ATP測定

ATP測定

ATP測定

Day 0Day 4Day 7

Day 11Day 14● 試験条件• 胃がんPDC：

NSC-11C, NSC-22C(国立がん研究センターより入手)• 播種細胞数：
500, 1000 cells/well• 96ウェルプレート： Prime Surface (住友ベークライト株式会社)• ATP測定：
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay(Promega Corporation)

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試験結果

3NSC-11C

播種数
500 cells/well2

播種数1000 cells/well

10Day4

Day7

NSC-22C

4

細胞分裂回数

細胞分裂回数

4Day11

播種経過日数播種数
500 cells/well32

播種数1000 cells/well

1Day140Day4

平均値±標準偏差 (n=3)

Day7細胞分裂回数 = Log2 {(D－B)/(D4－B4)}
D： 各サンプルの発光強度
B： ブランク (培地のみ) の発光強度
D4： Day 4の発光強度の平均値
B4： Day 4のブランクの発光強度

Day11

播種経過日数Day14

実験1 まとめ細胞増殖阻害の抗がん剤の至適処理期間を決定▶ 細胞が複数回分裂する日数から選択した．
Day４からDay 11の期間で，NSC-11C 及び NSC-22Cいずれも２回以上の細胞分裂が認められた．
(播種細胞数：500 cells/wellの場合)
実験２では培養期間のエンドポイントをDay 11に決定し，胃がんPDCの３次元培養法による抗がん剤添加試験を実施した．

実験2 目的
PDCを用いた３次元培養法 (スフェロイド実験１培養) の条件検討
実験２ ３次元培養PDCによる抗がん剤の薬効評価

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試験方法

● 実施内容細胞低吸着96ウェルプレートに播種した胃がんPDCにDay 4及びDay 7で抗がん剤を添加し，Day 11に細胞内のATPを測定し，細胞生存率を算出した．

● 試験スケジュール細胞播種

抗がん剤添加抗がん剤添加ATP測定

Day 0Day 4Day 7Day 1110● 試験条件
抗がん剤試験方法

 ドセタキセル
ドセタキセルに対するヒト胃がん細胞株の細胞生存率は３次元培養法で上がるという報告がある．[10] シスプラチン
シスプラチンに対するヒト胃がん細胞株の細胞生存率は３次元培養法と２次元培養法で変わる報告と変わらない報告がある．[11, 12]• 胃がんPDC：

NSC-11C, NSC-22C(国立がん研究センターより入手)• 播種細胞数：
500 cells/well• 96ウェルプレート： Prime Surface(住友ベークライト株式会社)• ATP測定：
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay(Promega Corporation)11試験結果：ドセタキセル
200180

細胞生存率 (%)

細胞生存率 (%)

18016016014014012012010010080608060

Assay No.14010Assay No.220

Assay No.3
1

Assay No.1

40

Assay No.2

200

NSC-22C200

NSC-11C

100

ドセタキセル (pM)

1000

Assay No.3
110平均値±標準偏差 (n=3)

細胞生存率 (%) = 100×(T－B)/(C－B)
T： 各サンプルの発光強度
B：ブランクの発光強度
C：コントロールの発光強度*1：第79回日本癌学会学術総会にて発表*2：NC : Not Calculated

0

100

1000

ドセタキセル (pM)

IC50

ドセタキセル

2D*1

NSC-11C

29.1 pM

NSC-22C

36.9 pM

3D

NC *2

NC *2

試験結果：シスプラチン
Assay No. 1

細胞生存率 (%)

130

Assay No. 2110

Assay No. 39070130

Assay No. 1

Assay No. 2110

Assay No. 39070505030301010-10NSC-22C

150

細胞生存率 (%)

NSC-11C

1500.1110

シスプラチン (µM)

100-100.1

1

平均値±標準偏差 (n=3)

細胞生存率 (%) = 100×(T－B)/(C－B)
T： 各サンプルの発光強度
B：ブランクの発光強度
C：コントロールの発光強度

10100

シスプラチン (µM)

IC50
NSC-11C

NSC-22C*1：第79回日本癌学会学術総会にて発表*2：全濃度の細胞生存率が50％以下であったため，IC50を算出しなかった．

シスプラチン

2D*1

0.8 µM

0.5 µM

3D0.7 µM-*2

胃がんPDCの顕微鏡画像

IC50付近の抗がん剤の濃度とコントロールのスフェロイドの大きさの比較
ドセタキセル 62.5 pM*1 シスプラチン 1.56 µM*2

NSC-22C

NSC-11C

コントロール

スケールバー：500 µm*1：2次元培養法のIC50付近のドセタキセルの濃度*2：3次元培養法のIC50付近のシスプラチンの濃度実験2 まとめ抗がん剤

ドセタキセル

シスプラチン

細胞生存率の低下に必要な抗がん剤の濃度
3次元培養法 ＞ 2次元培養法

3次元培養法 ≒ 2次元培養法

３次元培養法では胃がんPDCに対する抗がん剤の効果に違いがみられる．

総 括
 胃がんPDCの３次元培養法の試験条件を決定

 ３次元培養法の胃がんPDCに対する抗がん剤の薬効評価法を確立

必要に応じて，各種PDCでの検討は可能です．

参考文献
[1]

Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences
2015; 16(3): 5517-5527[2] Genta S, Cobum B, Cescon DW, Spreafico A. Patient-derived cancer models: Valuable platforms for anticancer drug testing. Frontiers inOncology 2022; 12: 976065[3] Niu N, Wang L. In vitro human cell line models to predict clinical response to anticancer drugs. Pharmacogenomics 2015; 16(3): 273-285[4] Zeeberg BR, Kohn WK, Kahn A, Larionov V, Weinstein JN, Reinhold W, Pommier Y. Concordance of gene expression and functionalcorrelation patterns across the NCI-60 cell lines and the Cancer Genome Atlas glioblastoma samples. Plos One 2012; 7(7): e40062[5] Nath S, Devi GR. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol & Therapeutics 2016;
163: 94-108[6] Weisward LB, Bellet D, Dangles-Marie V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia 2015; 17(1): 1-15
[7］Tanaka Y, Chiwaki F, Kojima S, Kawazu M, Komatsu M, Ueno T, Inoue S, Sekine S, Matsusaki K, Matsushita H, Boku N, Kanai Y, Yatabe Y,Sasaki H, Mano H. Multi-omic profiling of peritoneal metastases in gastric cancer identifies molecular subtype and therapeuticvulnerabilities. Nature Cancer 2021; 2(9): 962-977[8] Kitayama J, Ishigami H, Yamaguchi H, Sakuma Y, Horie H, Hosoya Y, Kawarai LA, Sata N. Treatment of patients with peritoneal
metastases from gastric cancer. Annals of Gastroenterological Surgery 2018; 2(2):116-123[9] Perche F, Torchilin VP. Cancer cell spheroids as a model to evaluate chemotherapy protocols. Cancer Biology & Therapy 2012; 13(12):1205-1213[10] Hajimoradi M, Mohammad Hassan Z, Ebrahimi M, Soleimani M, Bakhshi M, Firouzi J, Samani FS. STAT3 is overactivated in gastric cancerstem-like cells. Cell Journal 2016; 17(4): 617-628[11] To HTN, Le QA, Bui HTT, Park JH, Kang D. Modulation of Spheroid Forming Capacity and TRAIL Sensitivity by KLF4 and Nanog in GastricCancer Cells. Current Issues in Molecular Biology 2022; 45(1):233-248[12] Yoon C, Park DJ, Schmidt B, Thomas NJ, Lee HJ, Kim TS, Janjigian YY, Cohen DJ, Yoon SS. CD44 expression denotes a subpopulation ofgastric cancer cells in which Hedgehog signaling promotes chemotherapy resistance. Clinical Cancer Research 2014; 20 (15):39743988

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