称号及び氏名

博士(獣医学)

学位授与の日付

平成２２年３月３１日

論

わが国で発生した A 型および B 型乳児ボツリヌス症起因菌の文

名

梅田薫

遺伝学的解析
論文審査委員

主査
副査
副査

小崎
三宅
山崎俊司
眞実
伸二

論文要旨

緒言
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、耐熱性芽胞を形成する偏性嫌気性グラム陽性桿菌であり、強力な神経毒素 (BoNT)を産生する。本菌は毒素の抗原性の違いにより A型～G 型の 7 型に分類されている。また、生化学的性状および rRNA 遺伝子の相同性から 4 つの群(第 I 群～第 IV 群)に分類することができるが、毒素型による分類とは一致しない。ヒトにボツリヌス症を引き起こすのは A, B, E, F, G 型菌で、C, D 型菌はトリや家畜などに中毒を引き起こす。一方 A, B, C, D, E 型毒素は、各型内で複数の subtype に分類されている。A 型毒素は 5 種類の subtype (BoNT/A1～A5)に分類されるが、ほとんどの株は BoNT/A1 もしくは BoNT/A2 に属し、BoNT/A3、BoNT/A4 および BoNT/A5 は各1 株のみが報告されている。タンパク分解性（第 I 群）B 型菌産生毒素は 3 種類の subtype(BoNT/B1～B3)に分類されるが、ほとんどの株は BoNT/B1 もしくは BoNT/B2 に属し、
BoNT/B3 は 1 株のみが報告されている。ヒトのボツリヌス症は発症機序により、ボツリヌス食中毒、乳児ボツリヌス症、創傷性ボツリヌス症および成人腸管定着性ボツリヌス症に分けられるが、わが国では、1951 年～2007 年の間に 24 症例の乳児ボツリヌス症および 117 事例のボツリヌス食中毒の発生が報告されている。乳児ボツリヌス症は、初めての国内症例が報告された 1986 年から翌年にかけてハチミツを感染源とする 10 症例が連続して報告され、毒素型が調べられた 7 症例はすべて A 型であった。その後当時の厚生省から乳児にハチミツを与えないよう指導する通達が出されたこともあり、ハチミツを原因とする同症の発生は報告されなくなったが、1990 年以降、感染源が不明な A型および B 型症例の発生が認められている。本研究では、発生動向が変化しつつある
わが国の A 型および B 型乳児ボツリヌス症起因菌を中心に遺伝学的解析を行った。
第 1 章 A 型ボツリヌス症分離株の分子疫学的解析
国内で発生した乳児ボツリヌス症分離株 10 株、ボツリヌス食中毒分離株 4 株に食品分離株等を加えた 27 株の A 型菌について、BoNT/A subtype を決定するとともに、boNT/A
遺伝子クラスター型別および制限酵素 Sma I を用いた PFGE 解析を行った。boNT/A 遺伝
子クラスター型別は、新たに構築した Multiplex PCR 法による BoNT/A subtype 遺伝子(boNT/A1, A2)と無毒成分遺伝子(ha33, p47)の検出により 3 種類の boNT/A 遺伝子クラスター型（1, 2, 3）に分類した。1986 年～1987 年の乳児ボツリヌス症分離株 7 株と当時市販されていた南米産ハチミツ分離株は boNT/A 遺伝子クラスター2 型に分類され PFGEパターンもよく類似しており、高い関連性が示唆された。1999 年～2007 年の同症分離株 3 株は boNT/A 遺伝子クラスター3 型に分類されたが、このうち 1999 年広島県および2006 年宮城県で発生した乳児ボツリヌス症分離株と 1999 年千葉県で発生した食中毒分離株（boNT/A 遺伝子クラスター3 型）は同一の PFGE パターンを示した。これらの 3株は、他の制限酵素（Xho I, Sac II, Nru I）を用いた PFGE パターンも同一であったため、遺伝学的に同一あるいは極めて関連性が高いと考えられた。以上の結果から、A 型乳児ボツリヌス症分離株の遺伝子型は発生年代によって変化していることが分かった。輸入ハチミツを感染源とする 1986 年～1987 年の事例と異なり、1999 年以降のハチミツ非関連事例では食中毒事例との関連も示唆されたことから、今後は病型に関わりなくボツリヌス症対策として種々の食品についてリスク評価の必要があると考えられた。
第 2 章 B 型乳児ボツリヌス症分離株の毒素遺伝子の解析
わが国のB型乳児ボツリヌス症は 1995 年に石川県で初めての発生が報告されて以来、10 年間発生がなかったが、2005 年、2006 年に大阪府下で相次いで 2 症例が発生した。
3 症例ともハチミツ摂取歴がなく感染源は特定されていない。各症例分離株（111 株、Osaka05 株、Osaka06 株）に、米国での同症分離株や食品分離株等を加えた 15 株の第I群B型菌について、boNT/B遺伝子の解析および制限酵素Sma Iを用いたPFGE解析を行った。Osaka05 株およびOsaka06 株のboNT/B遺伝子塩基配列全長（3,876 bp）を決定し、既知のboNT/B遺伝子塩基配列とともに分子系統解析を実施した結果、Osaka05 株のboNT/B
遺伝子は既存の第I群BoNT/Bの subtypeに属さなかったため、新たなBoNT/B subtypeであることが示唆された。Osaka05 株とOkra株(BoNT/B1 株)および 111 株(BoNT/B2 株)との毒素アミノ酸配列の相同性は、96.2％および 98.5％であった。なお、Okra株と 111 株の相同性は 95.7%である。BoNTは軽鎖(L)、重鎖N末端領域（HN）、重鎖C末端領域（HC）の 3 つの機能的ドメインに分けられるが、subtype間の毒素アミノ酸置換はHCドメインに集中していた。Osaka06 株は 111 株と同じくBoNT/B2 に分類された。米国での乳児ボツリヌス症分離株 5 株はすべてBoNT/B1 に分類され、わが国での同症分離株とはsubtypeが異なっていた。食品分離株は豚肉分離株 2 株がBoNT/B1、ショウガ分離株およびハチミツ分離株がBoNT/B2 に分類された。国内のB型乳児ボツリヌス症分離株 3 株のPFGEパターンは明らかに異なっており、事例間の疫学的関連性は低いと考えられた。毒素遺伝子の多様性を利用してBoNT/B subtype遺伝子(boNT/B1, B2, Osaka05)を検出する
Multiplex PCR法を確立した。本法はB型菌の分子型別に応用可能と考えられる。2007 年にOkra株のboNT/B遺伝子が約 150 kbpのプラスミド上に存在することが報告されたことから、供試菌株のboNT/B遺伝子の存在位置を確認した。その結果、BoNT/B1 に属する10 株中Okra株と食品分離株 407 株および米国の乳児ボツリヌス症分離株 89E00061-2 株がそれぞれ 150 kbpおよび 260 kbpのプラスミド上に、BoNT/B2 に属する 4 株中 111 株が275 kbpのプラスミド上に、Osaka05 株が 280 kbpのプラスミド上にboNT/B遺伝子が存在していた。その他の株は染色体上にboNT/B遺伝子が存在したことから、BoNT/B subtypeとboNT/B遺伝子の存在位置とは関連しないことが示唆された。
第 3 章 Osaka05 株が産生する B 型毒素の抗原性の解析
前章で毒素遺伝子の分子系統解析から新たなBoNT/B subtypeであると考えられた
Osaka05 株の産生するBoNTの抗原性をBoNT/B1 およびBoNT/B2 と比較した。BoNT/B2はBoNT/B1 と異なる抗原性を有し、その抗原決定基はHCドメイン上に存在することが明らかにされている。Osaka05 株、Okra株（BoNT/B1）および 111 株（BoNT/B2）のリコンビナントHCドメイン（rHC/Osaka05, rHC/OkraおよびrHC/111）をそれぞれpQE30 ベク
ターで発現、精製し、これらのrHCに対する抗体を調製した。Sandwich ELISA法により各抗体のrHC/Osaka05, rHC/OkraおよびrHC/111 への反応性を比較した。抗rHC/Osaka05 抗体を用いたELISAでは、rHC/111 およびrHC/Okraの反応性は有意に低く、rHC/OkraはrHC/111 よりも低い反応性を示した。抗rHC/Okra抗体を用いたELISAでは、rHC/Osaka05およびrHC/111 は顕著に低い反応性を示した。抗rHC/111 抗体を用いたELISAでは、rHC/Osaka05 およびrHC/Okraの反応性は有意に低く、rHC/Okra はrHC/Osaka05 よりも低い反応性を示した。Osaka05 株、Okra株および 111 株のPYG培地培養上清を用いたSandwich
ELISAにおいても、rHCを用いた場合と同様の結果が得られた。以上の結果より、Osaka05株が産生するBoNT/Bの抗原性は、BoNT/B1 およびBoNT/B2 とは異なることが明らかになった。BoNT/Bアミノ酸配列の相同性から予想された通り、Osaka05 株産生BoNT/BとBoNT/B1 との抗原性の差異は、Osaka05 株産生BoNT/BとBoNT/B2 との差異よりも大きかった。他の供試第I群B型菌株についてもboNT/B遺伝子塩基配列から決定したsubtypeと、PYG培地培養上清を用いたELISAの結果は一致した。
第 4 章 連続継代培養によるボツリヌス B 型菌の毒素産生性への影響
ボツリヌス菌は毒素型や群によって生化学性状や毒素遺伝子の存在位置が異なるとされてきた。しかし第２章において、一部のB型菌では毒素遺伝子が大型プラスミドに存在することが明らかになった。本章では、B型菌における毒素遺伝子の存在位置と毒素産生性との関連をさらに調べるため、毒素遺伝子がプラスミドおよび染色体に存在するB型菌を連続継代培養し、毒素産生性および毒素プラスミドの安定性について検討した。毒素遺伝子がプラスミドに存在するB型菌 4 株（Okra株、111 株、Osaka05 株、89E00061-2 株）および染色体に存在する 2 株（67B株、Osaka06 株）を供試し、PYG培地を用いて 37°C・嫌気下にて 3～4 日間隔で継代培養し、初代および 10 回、20 回、30回継代時に培養液の毒力(LD50/ml)を測定した。また、各培養液をGAM-EY寒天培地に塗抹し、37°C・嫌気下にて培養後 10 コロニーを釣菌し、PCR法で毒素遺伝子の検索を行った。釣菌した菌株は適宜、PFGE、毒素産生性および生化学性状の確認を行った。毒素遺伝子がプラスミドに存在する 4 株の 30 回継代培養液の毒力は、初代培養液と比較して 1/100～1/1000 未満に低下していた。Okra株および 89E00061-2 株では、継代培養菌株はすべて毒素遺伝子を保有し、PFGEパターン、生化学性状ともに初代培養菌株と同一であり、毒素産生性が低下した原因は不明である。111 株およびOsaka05 株では、継代培養により毒素プラスミドが脱落した無毒株が分離されたが、Osaka05 株は 111 株と比較して分離頻度が低く、また毒素遺伝子を保有しながら毒素産生性が低下した株の出現は認められなかった。毒素遺伝子が染色体に存在する 2 株では、継代培養による毒力の変化および毒素遺伝子の脱落は認められなかった。B型菌において多彩な毒素産生性が生じる原因を究明するには、今後より詳細な解析が必要と考えられる。
総括
1. 新たな分子型別法として、迅速、簡便に A 型毒素遺伝子クラスター型別および B 型毒素 subtype 型別を行う Multiplex PCR 法を確立し、ボツリヌス症の疫学解析への応用を試みた。
2. わが国で発生した A 型乳児ボツリヌス症分離株の解析から、A 型菌では発生年代により遺伝子型が異なっていること、病型に関わりなく感染源や感染ルートを究明する必要があることが明らかになった。
3. わが国で発生した B 型乳児ボツリヌス症分離株の解析から、大阪市内で同症より分離された Osaka05 株が、遺伝学的および免疫学的見地から新規 B 型毒素 subtype であることが示された。
4. 一部の B 型菌では毒素遺伝子が約 150～280 kbp の大型プラスミドに存在していることが分かった。それらの菌株では連続継代培養による毒素産生性の低下や毒素プラスミドの脱落が確認されたが、毒素プラスミドの安定性は菌株間で差異が見られた。

審査結果の要旨

ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)は、耐熱性芽胞を形成する偏性嫌気性グラム陽性桿菌であり、強力な神経毒素 (BoNT)を産生する。本菌は毒素の抗原性の違いにより A 型～G 型の 7 型に分類されている。また、生化学的性状および rRNA 遺伝子の相同性から 4 つの群(第 I 群～第 IV 群)に分類することができるが、毒素型による分類とは一致しない。ヒトにボツリヌス症を引き起こすのは A, B, E, F, G 型菌で、C, D 型菌はトリや家畜などに中毒を引き起こす。一方 A, B, C, D, E 型毒素は、各型内で複数のsubtype に分類されている。わが国では、1951 年～2007 年の間に 24 症例の乳児ボツリヌス症および 117 事例のボツリヌス食中毒の発生が報告されている。乳児ボツリヌス症は、初めての国内症例が報告された 1986 年から翌年にかけてハチミツを感染源とする10 症例が連続して報告され、毒素型が調べられた 7 症例はすべて A 型であった。その後当時の厚生省から乳児にハチミツを与えないよう指導する通達が出されたこともあり、ハチミツを原因とする同症の発生は報告されなくなったが、1990 年以降、感染源が不明な A 型および B 型症例の発生が認められている。本研究では、発生動向が変化しつつあるわが国の A 型および B 型乳児ボツリヌス症起因菌を中心に遺伝学的解析を行った。
第１章では、国内で発生した乳児ボツリヌス症分離株、ボツリヌス食中毒分離株に食品分離株等を加えた A 型菌について、BoNT/A subtype の同定と boNT/A 遺伝子クラスター型別および PFGE 解析を行った。boNT/A 遺伝子クラスター型別（1, 2, 3）は、新たに構築した Multiplex PCR 法による BoNT/A subtype 遺伝子(boNT/A1, A2)と無毒成分遺伝子(ha33, p47)の検出により検討した。1986 年～1987 年の乳児ボツリヌス症分離株は
boNT/A 遺伝子クラスター2 型に分類されたが、1999 年～2007 年の同症分離株は boNT/A遺伝子クラスター3 型に分類された。
第 2 章では、B 型乳児ボツリヌス症分離株（111 株、Osaka05 株、Osaka06 株）に、米国の分離株、食品分離株等について、boNT/B 遺伝子の解析および PFGE 解析を行った。
Osaka05 株および Osaka06 株の boNT/B 遺伝子塩基配列から既知の boNT/B 遺伝子塩基配列と共に分子系統解析を行った結果、Osaka05 株 boNT/B 遺伝子は既存の subtype B1 お
よび B2 ではなく新たな BoNT/B subtype であることが示唆された。Osaka06 株は 111 株と同じく BoNT/B2 に分類された。試菌株の boNT/B 遺伝子の存在位置を確認した結果、
subtype B1 の Okra 株を含む 3 株で 150 kbp あるいは 260 kbp プラスミドに、subtype B2に属する 111 株で 275 kbp プラスミドに、Osaka05 株で 280 kbp プラスミドに boNT/B遺伝子が存在することを確認した。
第 3 章では、Osaka05 株の産生するBoNTの抗原性をBoNT/B1 およびBoNT/B2 と比較するために、リコンビナントHC（rHC/Osaka05, rHC/OkraおよびrHC/111）を調製し、これらの抗体を作成した。Sandwich ELISA法により各rHC の免疫学的交叉性を調べた結果、
rHC/Osaka05 はrHC/111 およびrHC/Okraとは抗原性が異なることを明らかにした。さらに各BoNT/Bのアミノ酸残基の相同性から、BoNT/Osaka05 とBoNT/B1 との抗原性の差異はBoNT/B2 よりも大きいことが予想された。
第 4 章では、B 型菌における毒素遺伝子の存在位置と毒素産生性との関連をさらに調べるため、毒素遺伝子がプラスミドあるいは染色体上に存在する B 型菌を各々連続継代培養し、毒素産生能の安定性について検討した。毒素遺伝子が染色体に存在する菌株では、継代培養による毒力の変化および毒素遺伝子の脱落は認められなかった。毒素遺伝子がプラスミドに存在する菌株においては、すべて 30 回継代培養液の毒素産生量が初代培養液と比較して 1/100～1/1000 未満に低下していた。しかし、これらの原因については、継代培養中すべて毒素遺伝子を保有しながら、毒素産生性が低下する菌株、プラスミド脱落の程度により毒素産生性の程度の違いがみられる菌株が存在するなど多彩であった。この理由を明らかにするためには今後より詳細な解析が必要と考えられた。
以上の結果は、わが国で発生した A 型および B 型乳児ボツリヌス症起因菌の持つ遺伝学的背景を明らかにし、A 型乳児ボツリヌス症の原因菌の遺伝子型が発生年代により異なっていることを明らかにした。また、B 型乳児ボツリヌス症起因菌が新規の subtypeに分類できることを示すと共に、一部の B 型ボツリヌス菌の毒素遺伝子が大型プラスミドに存在すること、その安定性は菌株間で差異が認められることを明らかにした。本論
文の成績は、わが国における乳児ボツリヌス症の発生に対する対策に有用な知見を提供するものであり、獣医感染症学ばかりでなく公衆衛生学分野にも大きく貢献すると考えられる。したがって、最終試験の結果と併せて、博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。