Application Note

大腸がんオルガノイドの表現型スクリーニングとMillicell® マイクロウェルプレート上での均一なマウス腸オルガノイドの生成
要約

生物医学研究分野でますます一般的に使用されるツールであるオ

イントロダクション

オルガノイドは、生体外で再現可能な、臓器の 3 次元的で小型化、ルガノイドは、体外で再現できる臓器の 3D ミニチュア モデルです。 単純化されたバージョンであり、天然組織の主要な特徴の一部を
1
オルガノイドは、がん研究、化学療法の開発、個別化医療の開発 模倣しています 。従来のオルガノイド培養には、オルガノイドをなどの用途に有望なモデルです。従来のオルガノイドは、多くの場合再現できない固化した細胞外マトリックス（ECM）内で培養されます。形成されたオルガノイドは、不均一なサイズと形状を持つことができ、ハイドロゲル内の複数の位置と焦点面にランダムに配置される場合があります。

本資料では、Millicell® マイクロウェル 96 ウェル プレートで培養した後のマウス腸オルガノイドの発達と特性についてご説明します。
生成されたオルガノイドはマイクロウェル内に限定され、均一なサイズでした。また、Millicell® マイクロウェル 96 ウェル プレートで実施した、患者由来の大腸がん（CRC）オルガノイドと HCT-116

スフェロイドに対する 80 種類の抗がん化合物を使用した自動薬物スクリーニングについても記載します。分析により、Millicell® マイ固化した細胞外マトリックス（ECM）の滴内に埋め込んだ培養がしばしば含まれます。生物医学研究におけるさまざまな用途に有望ではあるものの、従来のオルガノイド培養法には、本質的に再現性がありません 2。このようにして得られたオルガノイドは、サイズや形状が非常に不均一であるだけでなく、複数の焦点面や位置にランダムに配置されるため、堅牢な定量データの生成が妨げられます 3。初代細胞からオルガノイドを生成することで、さまざまな治療薬をより生理学的に適切な設定で試験することができます。

しかし、オルガノイドをスクリーニング用途に産業応用することは、固形 ECM でのオルガノイド培養の均質性の欠如、取り扱いの難しさ、および面倒な分析によって、これまでのところ困難でした。

クロウェル プレートで培養されたオルガノイドに毒性レベルのアフルセルチブを投与した際に、これまで観察されなかった表現型が明らかになりました。

A)B)

図 1. 従来のオルガノイド培養（A）と Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレートでのオルガノイド培養（B）

The life science business of Merck
operates as MilliporeSigma in theU.S. and Canada.

材料と方法

A. Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレート

Millicell® マイクロウェルプレートには、外部の固形 ECM をほとんどまたはまったく必要とせず、各マイクロウェルには独自の水性Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレートは、ハイスループットでポリエチレングリコール（PEG）ハイドロゲルが含まれています。

再現性の高いオルガノイド培養のためのすぐに使用できるプラット

PEG ハイドロゲルにより、ウェル内での細胞播種とアッセイ開発がフォームです。これらのプレートには、ウェル内に非接着性のマイク可能になり、プレート内イメージング中の回折が少なくなります。

ロウェルが含まれており、均質なオルガノイドの収量が増加します。

図 2. インビトロ 3D オルガノイドスクリーニング法の概略図。左から右に、Matrigel®、非接着性表面、および Millicell® マイクロウェル プレート。

表 1. Millicell® マイクロウェルプレートのマイクロウェルサイズと容量マイクロウェルサイズ（μm）

マイクロウェル数 / ウェル有効容積（μL）

底面材質

カタログ番号

600 μm55*200

Plastic

MC96U6005

400 μm121*200

Plastic

MC96U4005*ウェルあたりのマイクロウェルの最大数を示します。
正確な数はウェルごとにわずかに異なる場合があり、7%より少ない差異がある場合があります。

B. Millicell® マイクロウェルプレート上のマウス腸オルガノイド

オルガノイドは、播種、成長、およびイメージングでモニターし、マウス腸オルガノイドは、最初に記載されたオルガノイド システム

時間の経過とともに 1 つのウェルに 121 個の単一オルガノイドが生成しました。それらは均一なサイズであり、マイクロウェル内にのひとつであり、本試験では Millicell® プレート上で生成しました。 限定されていることで、イメージングを容易にしました。マウス腸細胞は Millicell® マイクロウェル 96 ウェル 400 µm マイクロウェル オルガノイドは分化後に典型的な出芽形態を示し、分化した腸細プレートに播種し、96 ウェルプレートの各ウェルで時間の経過とともに生成した 121 個の単一オルガノイドが見られました。
A)

B)

C)

胞は特定の腸マーカーを発現しました。
D)E)

図 3. Millicell® Microwell プレート上で増殖させたマウス腸オルガノイド。播種後、A）1 時間、B）10 時間、C）2 時間、D）3 日、E）4 日。
2C. Millicell® マイクロウェルプレート上での大腸がんオルガノイドの生成とスクリーニングのセットアップ

Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレートを使用して、HCT-116

スフェロイドおよび患者由来の大腸がんオルガノイドに対して 80

均質な微小組織の治療に対する反応は、高コンテンツイメージン

グ表現型スクリーニングによって評価し、250 を超える表現型メトリックを抽出しました。

種類の抗がん化合物の自動薬物スクリーニングを実施しました。

D0Organoids

D1D2D3D4D5Organoid expansion
Spheroid expansion

Spheroids
Organoid dissociationand cell seeding

D6D7D8D9tC)
MANUAL

AUTOMATED

Organoid disscociation

Hydrogel equilibration
Cell seeding

Drug exposition

Medium changes & drug exposure

Drug exposition

Analysis

HCT 116 disccociationand cell seeding

Percentage of microwells
containing a colony [%]B)

A)

ns
100

500

ManualRobotic

図 4. CRC オルガノイド薬物スクリーニングのワークフロー。 A）Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレート上の CRC オルガノイドおよび HCT-116 スフェロイドの化合物スクリー
ニングのプロトコル、B）自動（ヒドロゲル平衡、細胞播種、培地交換および薬物曝露および分析）と手動（オルガノイド解離）のオルガノイド生成概略図、C）手動オルガノ
イド生成と自動オルガノイド生成におけるコロニーを含むウェルの割合の定量化。

薬物ばく露後、微小組織の生存率を評価し、ハイコンテンツ画像解析でその表現型を調査しました。ウェルごとに 40 個の微小組織陽性対照と陰性対照を使用して、化合物の有効性を分類できます。
反復スクリーニングでは高い再現性を示しています（スフェロイドをセグメント化し、それぞれから 250 を超える指標を抽出しました。 では R2 = 0.9、オルガノイドでは 0.79）。

結果

A. マウス腸オルガノイドの開発と特性評価

オルガノイドの面積は、Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレートで経時的に画像化することで定量化しました。オルガノイドは特定の微小空洞内に閉じ込められ、成長の最初の 1 ～ 3 日間は均一なサイズでしたが、オルガノイドが出芽し始めると広がりました。

オルガノイドは、これらの腸オルガノイドに典型的な出芽表現型を示し、腸内分泌細胞、腸管上皮細胞、パネート細胞、杯細胞などの分化細胞を含んでいました。特定のマーカーと上皮極性は、ガラスイメージングスライド上で免疫蛍光法によってモニタリングされました（図 6）。Millicell® マイクロウェルプレートを使用したオルガノイド生成は拡張可能で、同様のサイズと形状のオルガノイドが生成されます。

図 5. A）3 日目に Millicell® マイクロウェルプレート上で増殖させたマウス腸オルガノイドの代表的な例。B）5 日目 ; および C）8 日目
図 6. マイクロウェルアッセイで増殖させたオルガノイドにおける杯細胞の存在を強調するムチン -2 タンパク質発現。

3B. アフレセルチブの大腸がんオルガノイドに対する効果

Millicell® マイクロウェル 96 ウェルプレートで培養したオルガノイドの表現型を分析したところ、アフルセルチブの投与中に、これまで観察されなかった表現型が明らかになりました。
A)

80 種類の化合物の分析により、キナーゼ阻害剤アフルセルチブが、大きな表現型アウトライアであることが明らかになりました。この阻害剤は、毒性濃度未満でオルガノイドに大きな腫脹を引き起こしますが（スフェロイドには影響しません）、これは従来の生存率分析では見逃される表現型です。

B)C)

図 7. アフレセルチブの CRC オルガノイドスクリーニング。A）異なるアフレセルチブ濃度におけるオルガノイドのサイズを示す広視野画像と蛍光画像、B）微小組織領域別のアフレセルチブ濃度の増加に対するオルガノイドの表現型反応（IC50=0.31 µM）、C）アフレセルチブ濃度の増加におけるオルガノイドの生存率 IC50=10.67 µM。 ガンボギ酸：
GA.

結論

Millicell® マイクロウェルプレートを使用すると、ウェルあたり 70

Millicell® マイクロウェルプレートでのオルガノイド生成は、播種から読み取りまで、自動液体処理システムと互換性があります。プレー

トは、集団ベースの読み取りではなく、単一のオルガノイド分析を提供し、分析しなければ気付かない表現型を明らかにします。

Millicell® マイクロウェルプレートで 121 個のマウス腸オルガノイドが生成され、播種から成長までコントラストと蛍光イメージングでモニターしました。オルガノイドは分化後に典型的な出芽形態を示し、腸内分泌細胞、パネート細胞、腸管上皮細胞、杯細胞の特定のマーカーを発現しました。

さらに、Millicell® マイクロウェルプレートで形成された患者由来のCRC 腫瘍様細胞は、対応する生体内腫瘍を非常によく模倣しており、治療に対する患者固有の反応の違いを研究するために使用できます。

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ファインダー個を超える CRC オルガノイドをスケーラブルに生成でき、そのうち 40 個は単一視野でのハイコンテンツイメージ分析用にセグメント化されます。単一ウェルで最大 73 個の均質な微小組織が生成され、ハイコンテンツイメージングによって投薬に対する反応を評価しました。各微小組織から 250 個を超える表現型メトリックを抽出し、完全自動化のハイスループットスクリーニングワーク

フローで単一オルガノイド レベルでの薬剤効果が示されました。
参考文献

1. Lancaster, M. A. & Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish:Modeling development and disease using organoid technologies.
Science (80-. ). 345, (2014). doi:10.1126/science.1247125
2. Fatehullah, A., Tan, S. H. & Barker, N. Organoids as an in vitro
mode of human development and disease. Nature Cell Biology
18, 246–254 (2016). doi:10.1038/ncb3312
3. Schneeberger, K. et al. Converging biofabrication and organoid
technologies: The next frontier in hepatic and intestinal tissue
engineering? Biofabrication 9, (2017).

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