微弱な生体発光の測定系の開発
丹治研究室 川田秀斗
2023 年 3 月 7 日

1. 序論
1.1. 生体発光の分光器では分光することができない。そのため、微弱光の分光が可能な分光器の開発が必要である。

生命活動の解明において、生体イメージングはよく用

そこで、本研究ではこのような分光器の開発を目的といられる手法である。生体イメージングの中でも生体発して、高感度カメラである EMCCD(electron multiplying

光現象は、蛍光等の他の生体イメージング手法に比べてCCD)カメラを用いた微弱光の測定系を作製し、その特性バックグラウンドノイズが少ない手法であるため、有望を評価した。また、作製した測定系を用いて L-L 反応と視されている。

TokeOni と Luciferase の反応による発光強度の時間変化をそれぞれ測定した。

生体発光を生体イメージングに用いる場合、特に高効率で応答性の良いホタルの発光基質(Firefly Luciferin)を2.

用いた Luciferin-Luciferase 反応(L-L 反応)がよく用いら微弱光測定系のノイズ
本節では測定系で発生するノイズについて検討する。

れている。ホタルの L-L 反応の発光の中心波長は 560 nmであるが、観測可能な強度を向上させるためには、生体での透過率が最も高い波長 650 nm ~ 900 nm の、生体の2.1.

窓(NIR window)と呼ばれる波長帯の発光が望ましい。そこで、本学化学生命工学プログラム牧研究室において、(Photometrics 社製 Evolve512)を用いた。EMCCD カメ

発光中心波長が 675 nm である、ホタルの発光基質の類似

ラとは、光子の入射により CCD イメージセンサに蓄えら物質である TokeOni が開発された。

1.2.

れた光電子を読み出す際に、衝突電離(impact ionization)を用いて増幅する(EM ゲイン)ことにより、高感度イメー

TokeOni によるネズミの肝臓の発光ジングを可能とする CCD カメラである。

TokeOni には特殊な発光現象が確認されている。

EMCCD カメラに由来するノイズとしては、バイアス

L-L 反応においては、発光基質である Luciferin と発光のゆらぎ、読み出しノイズ、熱ノイズの三種類のノイズ酵素である Luciferase の二つが必要である。そのため、が想定される。

生体イメージングに用いる際には、ウイルスに感染させここではそれぞれのノイズについて説明する。

ることや、遺伝子組み換え等を用いることで、あらかじ
め生体内に Luciferase を発現させる必要がある。

2.1.1.

しかし、TokeOni の場合、Luciferase を発現させていバイアスのゆらぎ

EMCCD カメラでは CCD イメージセンサ―の１ピクないネズミに注射した際にも、ネズミの肝臓が発光するセルに蓄えられた光電子によるアナログ信号をデジタル現象が確認されている。この現象の発光プロセスが解明

信号に変換する際、デジタル信号が負の値をとらないよできれば、より非侵襲な生体イメージング手法の開発にうにオフセットとしてバイアスが印加される。このバイつながることが期待できる。

1.3.

EMCCD カメラのノイズ

本研究では撮影機器として EMCCD カメラアスの値は撮影の１フレームごとに変化するため、バイアスのゆらぎがノイズとなる。

研究の目的

発光プロセスを解明するためには、発光スペクトルを2.1.2.

測定することが有効である。しかしながら、TokeOni を読み出しノイズ

読み出しノイズとは、A/D コンバーターにおいて電子用いたネズミの肝臓の発光強度は非常に低いため、通常1

をデジタル信号に変換する際に発生するノイズであり、フレーム中の総ピクセル数、𝑆𝑖 は各ピクセルの 16 bit のデCCD の各ピクセルそれぞれに発生するノイズである。読ータの読み値である。このようにして求めた、バイアスみ出しノイズはアナログ信号を読み出す際にのみ発生すのフレーム毎の変化は図 1 の通りである。また、このとるため、露光時間に比例しない。また、真値を中心に正きのバイアスは494 ± 3 ADUであった。

規分布するノイズである。読み出しノイズは使用する読み出しポートと読み出し速度によって異なる。本研究で使用した読み出しポートと読み出し速度における読み出しノイズの仕様値は表１の通りである。
表 1: Evolve512 の読み出しノイズの仕様値
読み出しポートおよび読み読み出しノイズ(RMS出し速度値)

1.25 MHz non-EM Port

6 𝑒−

2.1.3.

熱ノイズ

熱ノイズは暗電流(dark current)ともいい、CCD 内で熱図 1: 各フレームのバイアスの変化励起されたキャリアが光電子のようにふるまい、実際には存在しない光子を観測してしまうことによるノイズでまた、読み出しノイズの大きさは撮影したデータにつある。熱ノイズは露光時間に比例して増加し、EM ゲイン

いて式(2)のような計算により見積もることが出来る。

によって増幅されるノイズである。そのため、微弱光の観測において支配的なノイズの一つである。

2.2.

𝑛frame 𝑛pixel

12
𝑁r = √∑ ∑ (𝑆𝑖 − 𝑆̅)
𝑛pixel × 𝑛frame

暗箱内の残留光子

𝑗=1

本測定系では実験系外からの光子の入射を避けるため

(2)

𝑖=1

ここで、𝑁r は読み出しノイズの大きさ、𝑛frame は撮影したフレーム数、𝑆̅は各フレームのピクセルあたりの読み値のに暗箱を用いるが、暗箱を用いてもすべての光子を遮光できるわけではない。そのため、不完全な遮光によって平均値である。

カメラのセンサーに入射した光子はノイズとなる。暗箱撮影した画像について、式(2)を用いて計算した読み出の残留光子は露光時間に比例して増加し、EM ゲインによしノイズの大きさは 12.03 e− であった。って増幅されるノイズである。そのため、熱ノイズと同様に、微弱光の測定において支配的なノイズの一つである。

3.1.2.

熱ノイズの測定

3. 実験
3.1. EMCCD カメラの特性評価

光時間を 1 s、10 s、100 s と変化させて撮影を行うことで熱ノイズは露光時間に比例するノイズであるため、露3.1.1.

測定した。撮影したデータにはバイアスのゆらぎおよび読み出しノイズが含まれている。

バイアスのゆらぎおよび読み出しノイズのまず、バイアスのゆらぎの影響を見積もるために、各測定ピクセルの読み値からそのピクセルが属するフレームのEMCCD カメラのバイアスのゆらぎおよび読み出しノ平均値(バイアス)を減算した。

イズは露光時間に比例しないため、カメラの受光面に蓋さらに読み出しノイズの影響を排除するために、(各ピをし、露光時間 0 s で撮影することで測定できる。ここでクセルの読み値)―(そのフレームの平均値)のヒストグラ

は、100 フレームの画像から、これら二種類のノイズを評

ムを作製した(図 2)。

価した。

読み出しノイズは真値を中心に正規分布するため、ヒバイアスは、撮影した各フレームについて、式(1)のよストグラムの 0 付近に存在する大きなピーク除去するこ

うに、全ピクセルの平均値をとることで求めることが出とで、読み出しノイズの影響を排除することができると来る。

考えられる。そこで、ピークのすそである+60 ADU を閾
𝑛pixel𝑏𝑖𝑎𝑠 =1∑ 𝑆𝑖
𝑛pixel値に設定し、閾値より大きい値を持つピクセルのデータ(1)を合算した後に全ピクセルで平均値をとり、熱ノイズの𝑖=1値を計算した。得られた熱ノイズの測定値を、横軸露光

ここで、bias は各フレームのバイアスの値、𝑛pixelは 12

時間にとって図 3 にプロットし、直線でフィッティングした。

図 4: 暗箱の外観
図 2:露光時間 1s のヒストグラム

3.2.2.

暗箱内の残留光子束の測定

暗箱内の残留光子束の大きさを測定するために、カメラの開口部にレンズを取り付け、カメラ受光部の手前に設置されたアイリスを全開にした。作製した暗箱上に遮光用ゴム加工布を 2 重に重ねて被せることで、部材間の隙間から入る漏れ光を遮断した。
露光時間を 10 s、20 s、40 s、60 s、100 s に変化させて100 フレームずつ撮影した。得られたデータを全フレーム全ピクセルで平均化したのち、露光時間を横軸にとってPixel あたりの測定値 /ADUプロットし、直線でフィッティングした(図 5)。

図 3: 熱ノイズの値
近似直線の傾きから求めた熱ノイズを仕様値と共に
表 2 にまとめた。表 2 から、熱ノイズの測定値はおおむね仕様値と一致していることが分かった。

表 2: 熱ノイズの使用値および測定値
仕様値

測定値

0.001 𝑒 − /pixel ∙ s

0.0016 ± 0.0001 𝑒 − /pixel ∙ s

3.2.
3.2.1.

露光時間
図 5:/s暗箱の残留光子束
図 5 の直線の傾きは熱ノイズと暗箱の残留光子束の合計

暗箱の作製と特性評価であり、その測定値は0.012 ± 0.007 e− /pixel ∙ sであった。

暗箱の作製

熱ノイズの測定値は0.0016 ± 0.0001 𝑒 − /pixel ∙ sであった

前述の通り、暗箱内の残留光子は、EMCCD カメラのた め 、 暗 箱 の 残 留 光 子 束 の 大 き さ は 0.010 ± 0.007 e− /熱ノイズとともに、微弱光の測定において支配的なノイpixel ∙ sと見積もられた。これは熱ノイズの約 6 倍の値とズとなる。熱ノイズは使用するカメラの特性で決まり、なっており、暗箱の遮光を改善する必要があることが分それ以下に低減させることはできないため、暗箱の作製かった。

においては、暗箱の残留光子束の大きさがカメラの熱ノイズと同程度以下であるという条件を課した。実際に作3.3.

製した暗箱の外観は図 4 の通りである。

測定可能な発光の条件測定した測定系のノイズは表 4 の通りである。

3

表 4: 測定系のノイズ
バイアス

読み出し

熱ノイズ

残留光子束

0.0016± 0.0001 e−/pixel ∙ s

0.010 ±0.007 e− /pixel ∙ s

ノイズ494 ± 3
ADU

12.03 e−

表 4 より、現状で測定可能な発光の条件は、発光の光子数が 12.03 𝑒 − /pixel 以上かつ 0.012 e− /pixel ∙ s以上であることがわかった。
図 7: D-Luciferin および TokeOni と Luciferase の混合試

3.4.

試料発光の測定料の発光作製した測定系を用いてホタルの発光基質である DLuciferin および類似物質である TokeOni を Luciferase とTokeOni の発光の時定数は Luciferin の約 6.3 倍であり、混合した試料の発光の時間変化を測定した。

50 分程度であった。

カメラの受光部にレンズを取り付け、試料発光を露光
時間 60 s で 30 フレーム撮影した(図 6)。

4. まとめと今後の展望
4.1. まとめ
本研究では、微弱な生体発光の測定系の開発と評価を行った。
はじめに、EMCCD カメラに由来する、バイアスのゆらぎ、読み出しノイズ、熱ノイズの三種類のノイズの測図 6:Luciferin の発光(左)と TokeOni と Luciferase の混合定を行った。

試料の発光(右)次に、実験系外からの入社光子を遮断するための暗箱を作製し、暗箱内の残留光子束の大きさを測定した。

撮影したデータについて、各フレーム毎にバイアスと最後に、D-Luciferin および TokeOni と Luciferase の混

熱ノイズおよび残留光子数を引いた後に平均値を計算し合試料の発光強度の時間変化を測定した。

た。計算した値について、時刻を横軸にとって図 7 にプロットし、式(3)の関数を用いてフィッティングを行っ

4.2.

た。

今後の展望

今後の展望としては、暗箱の残留光子束の大きさが熱ノイズと同程度となるように暗箱を改良し、改良した測∑(𝑆𝑖 − 𝑏𝑖𝑎𝑠) − (熱ノイズ + 残留光子束)定系を用いて生きたネズミの肝臓の発光を測定する予定である。

𝑡= 𝐴0 𝑒𝑥𝑝 (− )
𝜏(3)ここで、𝐴0 は発光強度の初期値、t は時刻、τ は発光参考文献の時定数である。
発光強度の初期値と時定数は表 3 の通りである。

[1] Ralph, W., A clear vision for in vivo imaging, NatureBio.2001, 19, 316-317
表 3: 試料発光の測定値
D-Luciferin

TokeOni𝐴0(6.3 ± 0.2) × 104(7.3 ± 0.2) × 103

τ

460 ± 10 s

2900 ± 300 s[2] Evolve512 manual[3] Evolve512 datasheet4