東北の雑草 7:2
7‑31(2007).
TohokuWeedJ
研究・技術情報

数種水田雑草におけるスルホニルウレア系除草剤抵抗性迅速検定法の改良
内野彰＊・尾形茂＊＊・渡邊寛明＊

Improvemento
fther
api
ddiagnosiso
fsu
lfonylurearesist
ancei
nsev
era
lpaddyweeds

AkiraUchino*,ShigeruOgata**andH
iroakiWatanabe*

キーワード：除草剤抵抗性，スルホニルウレア系除草剤，アセト乳酸合成酵素，
ALS, 水田雑草

はじめに検定法の原理

スルホニルウレア系除草剤 (SU剤）に対して抵抗性SU剤の作用点は ALSであり，この検定法は SU剤によを持つ SU抵抗性バイオタイプが数多くの水田雑草で見nvivoassay法を利用して視覚的に確る ALSの活性阻害を iつかっており（内野 2003)，特にアゼトウガラシ属の水認するというものである (Gerwicketal.1993)。ALSに田雑草（アゼナ，アメリカアゼナ，タケトアゼナ，アゼよって生成されたアセト乳酸は ketol‑acidreductoisomerase

トウガラシ）やイヌホタルイ，コナギでその確認事例が(KARI) によって代謝されるが， KARIの阻害剤 (l,多くなっている（内野ら 2(X)5，児嶋 2(X)5)。
抵抗性バイオタイプの検定法としては発根法（村岡1‑cyclopropanedicarboxylieacid) を処理するとアセト乳酸が代謝されず植物体内に蓄積する（第 1図）。このアセ2000;Hamamuraetal.2(X)3) や地上部再生法（大野ら 2004)

卜乳酸の蓄積量が ALS活性に比例して増加するため，などが報告されているが，少量の植物片から迅速に抵抗その蓄積量を定量することで ALS活性の測定が可能とALS)の性を検定する方法としてアセト乳酸合成酵素 (なる。アセト乳酸はアセトインに変換すると比色分析でinv
iv
oassay法を利用した迅速検定法がある (Gerwicket999)。この方法は植物体を残したまま検al.1993;内野 1

赤色に発色させることができ，これを利用すると ALS定できる点，多故の検体を短期間で検定できる点が長所る。となっており，抵抗性雑草の後代の解析や分布調査などに極めて有用な検定手法となっている。の活性を赤色の発色として視覚的に確認することができ実際の抵抗性検定では，各試料につき無処理区と SU剤処理区を用意して赤色の発色を調べる。無処理区で赤筆者らは以前，アゼトウガラシ属水田雑草の迅速検定

色の発色があり SU剤処理区で発色がなければ， SU剤に999)，その後，更に法について紹介しているが（内野 1

よって ALS活性が阻害されていると判断でき， SU感受

この方法に改良を加え，現在ではイヌホタルイとコナギ性バイオタイプと診断される。無処理区と SU剤処理区も対象とした安定した検定手法を確立している。本稿でとで同じように赤色の発色があれば， SU剤によっては，改良した部分も含めて迅速検定法の原理と手順につALS活性が阻害されていないと判断でき， SU抵抗性バいてあらためて紹介する。

イオタイプと診断される。
この方法で重要なのは，無処理区で強い赤色の発色が得られる実験系を確立することである。無処理区の発色＊束北農業研究センター〒014‑0102 秋田県大仙市四ツ屋字下古道 3

NationalAgricultu
ralResearchCenterforTohokuRegion,Yotsuya,Daisen,紘 ita014‑0102,Japan
現在：中央農業総合研究センター 〒 305‑8666 茨城県つくば市観音台 3‑1‑1Presentaddress:NationalAgr
iculturalResearchCenter,Tsukuba,Ibaraki3
05‑8
666,Japan＊＊岩手県農業研究センター

現在：岩手県大船渡農業改良普及センター

28

東北の雑草

戸三7号 (2007)

2Xピルビン酸

H+,60℃

アセト乳酸―----------► アセトイン＊

戸三ハリi，ロイシン

第 1図

バリン，ロイシンの生合成経路の流れと SU剤抵抗性検定法の原理
ALS;ア セ ト 乳 酸 合 成 酵 素 (Acetolactatesynthase), KARI;
Ketol‑acidreductoisomerase, SU;スルホニルウレア系除草剤，CPCA;1,
1‑cyclopropane山carboxylicacid,<>;阻害効果を示す。
＊アセトインは比色分析で赤色に発色する。

第 1表 試 薬 処 理 の 手 順(I) ］サンプルにつき 2本の 15ml試験管を用意し， 4mlの処理溶液＊を入れる。
↓(2) 2本の試験管の片方に除草剤＊＊を加える。
↓(3) 各試験管に 30 60mgの検定試料を入れ＊＊＊， 30℃
明条件で 2日間 (40‑55時間程度）静置する。
↓(4) 試験管から試料を取り出し，冷凍保存する。

＊処理溶液
25% ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類500J1MI,1‑cyclopropanedicarboxylicacid!OmM ピルビン酸ナトリウム**SU剤処理区では，試験管内で IOOng/mlとなるように，!Omg/Lに調製した 75％チフェンスルフロンメチル水和剤（ハーモニー 75DF水和剤．デュポン）を 40J1L加える。
＊＊＊アゼトウガラシ属水田雑草では成長点を含む茎頂部及び幼葉 2 4枚，イヌホタルイでは花茎上部約 10cm を 1 2本，コナギでは未展開葉 1 2枚を試料とする。イヌホタルイは花茎を 3 5mmに切断する。
検定試料は生育の旺盛な個体から採取し，採取後直ちに試薬処理を行う。

が不明瞭であれば， SU剤処理による阻害効果を判定す

第 2表ることができない。従って，無処理区で高い ALS活 性が検出できるよう，下記に記すように検定試料や処理条件などに注意することが甫要となる。
実際の検定手順
検定の手順は，（ 1) 対象雑草の試料について試薬・除草剤処理を行う（第 1表），（ 2）処理試料からアセト乳酸を抽出して比色分析を行う（第 2表），という順になる。
1. 試薬処理

処理溶液を調製して試験管に分注し，雑草の葉（花茎 ） を 切 り 取 っ て 入 れ ， 約 2日問，明条件で静置する

アセト乳酸の抽出と比色分析(1) 1.
5mlチューブに 300叫の蒸留水を入れて凍結保存試料を浸し， 60℃ で 5分間静置する。
↓(2) 常温で 45分間静置する。
↓(3) 試料が入らないように 100叫とり，新たな 1.
5mlチューブに移す。
↓(4) 1011!の 5% (v/v)比S04を加え， 60℃で 30分間静置する。
↓(5) 50叫の 0.
5%(w/v) クレアチン溶液と 50ulの 5%(w/v) 1ーナフトール溶液＊を順に加える。
↓(6) 37℃ で 30分間静置し，赤色の発色により抵抗性を検定する＊＊。

（第 1表）。この間に，試料の ALS活性に依存して植物組織内にアセト乳酸が蓄積する。一つの試料に対して 2本の試験管を用意し，片方に SU剤を加える。
両方に加える処理溶液の組成は 25％ムラシゲ・スクー
グ培地用混合塩類， 50011M1,1‑cyclopropanedicarboxylicacid,*I‑ナフトールは 2.
SNNaOH溶液に溶かして 5% (w/v)溶液とする。また，使用直前に調製する。
＊＊無処理区で赤色の発色がない場合は再検定が必要。
SU剤処理区で赤色の発色があれば抵抗性，なければ感受性と判定する。

lOmMピルビン酸ナトリウムとする。この処理溶液は冷凍保存が可能であり，あらかじめ調製して小分けしたものを冷凍保存しておけば毎回調製する手間が省ける。筆ど）を使用すると調製が容易にできる。以前の方法（内者らの研究室では， 4倍濃度の溶液を 1Lで調製した後野 1999;Uchinoetal.1999) ではピルビン酸を加えていなに 50mLずつに小分けして冷凍保存し，使用時に必要量かったが， ALSの基質となるピルビン酸を加えることで，を溶かして蒸留水で 4倍に薄めて使用している。また，より強い発色が得られるようになる (Uchino& Watanabe

ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類は市販の混合品（ム2007;内野・渡邊 2007)。

ラシゲスクーグ植物培地用混合塩類，和光純薬工業な検定に使用する SU剤には，市販のチフェンスルフロ内野ら：除草剤抵抗性迅速検定法の改良

B‑‑0‑‑
A：成熟花茎上部

B415I

アゼトウガラシ

6アゼトウガラシ属水田雑草の異なる部位における発色の差異
アセトインの蓄積速度で発色程度を表示した。

24゜，

葉齢 12＼巨芝翌︶

︐

OO翌︶
q＼臣 ＼

1515(q＇
タケトアゼナ

12

葉齢

321

12

葉齢

毯莱遷誨入}上ギド︐︐

OO 翌 ︶ ︵(q臣 ＼＼302520151050302520151050

把架亮誨入}上ギト毯架亮擁入}上ギト一

アメリカアゼナ

B ：成熟花茎下部

葉齢
第 2図

1日ぷ謬を含む茎頂部 I30アゼナ

2981012
播種後期間（週）1416

第 3図 イヌホタルイの異なる部位における発色の差異

アセトインの蓄積速度で発色程度を表示した。に生育している部位を採取して使用することが重要となる。アゼトウガラシ属水田雑草では幼葉 2‑4枚を含む茎ンメチル 75％水和剤（ハーモニー 75DF水和剤，デュポ頂部をまるごと切り取って使用すると，下の成葉より安ン）を使用する。ハーモニーは畑用の除草剤商品である

定して強い発色が見られる（第 2図，内野・渡邊 2007)。

が，他の有効除草剤成分が混合されていないため，任意イヌホタルイでは部位による差が顕著でないが，花茎上の濃度の SU剤溶液を調製することができる。チフェン部10cmほどを使用すると安定した発色が得られる（第 3スルフロンメチル 75％水和剤の濃度を lOOng/mlになる

図，内野・渡邊 2007)。イヌホタルイを処理溶液に浸すよう調製すると感受性ではアセトインの蓄積による発色

際には，浸透性を良くするために花茎を 2‑5mm 程度のがほとんど見られず，抵抗性との差異が明確に区別でき長さに細断してから浸す必要がある。コナギでは展開葉る。ただしアゼナの感受性個体については，この濃度でよりも株元に隠れている未展開葉を 1‑2枚使用すると強薄い発色が見られる場合があるため， lμ,g/mlで検定すい発色が見られる（第 4図）。開花期のコナギでは未展るのがよい。検定に使用する SU剤にチフェンスルフロ開葉を採取するのが難しくなるため，開花期前の個体をンメチル以外の化合物（例えばベンスルフロンメチルな試料とするのが望ましい。

ど）を使用する場合は，適切な処理濃度が異なると予想されるので，処理濃度の再検討が必要である。
原著 (Gerwicketal.1993) では溶液の葉への浸透性を試料は 2日間ほど処理溶液に浸して静置するが，この際，アゼトウガラシ属水田雑草は明条件でないとアセト高めるために界面活性剤 (0.025% TritonX‑1()()）を処理

乳酸が蓄積せず，結果的に発色が得られない (Uchinoetal.1999)。イヌホタルイとコナギでも暗所に置くとその溶液に加えているが，水田雑草の場合は原著の濃度で界蓄積量が低くなる。また，少なくとも 48時間程度は明面活性剤を加えると葉の周辺部が白化して損傷がみられ条件でアセトイン蓄積量が直線的に増加するため，静置る場合がある。水田雑草の場合は界面活性剤を加えなくを 2日間ほど行うと明瞭な発色が得られる（第 5図）。処ても検定に問題はない。

理が終わった試料は冷凍して保存する。一旦冷凍する事

ALSは一般に，代謝活性の高い分裂組織で高い活性をによりアセト乳酸の抽出効率が良くなるため，処理後す示すとされる (Dugglebyetal.2000)。従って検定試料とぐにアセト乳酸を抽出する場合でも一旦冷凍した方がよ

しては，どの草種でも成長が盛んな時期の個体から旺盛し)

030

東北の雑草□■7号 (2007)
10

A ：未展開葉8︵芝巨翌翌︶642

毯舟墨誨入}上ギド

B ：展開葉

゜
未展開葉

展開葉

コナギ部位
第 4図 コナギの異なる部位における発色の差異
アセトインの蓄積速度で発色程度を表示した。

2000

試料とする。また定量のためには． 20!
1M︵巨翌翌︶

園⑩色させて検量線を作成する作業も必要となる(Westerfeld1945)。
500

検定上の注意点゜躙墨掬八}上ギドのアセトインの標準品を調製し．毎回．試料と同様に発●イヌホタルイ

この方法は， 2 3日で抵抗性の検定が可能で，夏期

24
第 5図

100/JM程度0 アゼナ

4872
処理時間 (h)96アゼナとイヌホタルイにおけるアセトイン蓄積量の経時的推移の圃場で採取した雑草について短期間に多数の検体を検定できるところに利点がある。しかし，種子や発生初期の雑草を検定する場合にはある程度生育するのを待つ必要があり，短期間では検定できない。また，ある程度の実験設備を要するために，設備のないところでは検定で2. アセト乳酸の抽出と比色分析
原著 (Gerwicketal.1
993) では乳棒と乳鉢を用いて葉001) や発根きない。こうした場合は，ポット試験（注 2000;HamamuraetaL2003)，地上部再生法（大法（村岡 2を磨砕しているが，試料中のアセト乳酸は蒸留水に浸し野ら 2004) などの他の検定方法を検討し，効率の良い検）。て撹拌するだけで抽出される（第 2表定を行うことが重要である。

抽出液に硫酸を加えて 60℃ に 30分間静猶することで，さらに注意が必要なのは，この方法がアゼトウガラシ

アセトインの脱炭酸が進みアセトインができる。その後，属水田雑草，イヌホタルイ，コナギ以外の草種の検定をクレアチンと 1 —ナフトールを順に加えることにより，保証していない点である。例えばキカシグサでは比色分アセトインが赤色に発色する。 1ーナフトール溶液は，2.SNの NaOH溶液に溶かして 5% (v/v) 溶液とし，毎析の際に別の色が強く出るため検定できない。オモダカ

回使用直前に調製する。アセトインの発色は，時間ととれた草種でも，検定結果をもとにバイオタイプを判定す

でも別の色が強く出る場合がある。きれいな発色が見ら0 40分で最大となる。アセトインのもに濃くなり約 3るためには，圃場試験やポット試験との整合性の確認が定量は 530nmの 吸 光 度 の 測 定 に よ っ て 可 能 で あ る が必要であろう。これら別の草種については，現段階では(Westerfeld1945)，検定では特にアセトインを定量しなポット試験や地上部再生法など，別の試験で抵抗性検定

くとも，赤色の発色で視覚的に診断できる。すなわち，を行うのが確実といえる。

SU剤処理区で赤色の発色があれば抵抗性，なければ感受性と診断される。もちろん前述のように無処理区で赤謝 辞色の発色を確認することが前提となる。アセトインの定量を行う場合は，上記の操作で抽出液に硫酸を加える代本検定法の改良にあたっては，東北農業研究センター) の操作） 2．
5Nの NaOHを加えたわりに（第 2表の（ 4の藤田せいこ氏，鈴木奈美子氏から多大なるご協力を頂

試料を同時に作り，これを吸光度測定時のレファレンスいた。ここに記して謝意を表す。

内野ら：除草剤抵抗性迅速検定法の改良

日本農薬学会誌 28:4
79‑483.

引用文献

Duggleby,R.G.andS.S.P
ang2
000.A
cetohydroxyacidsynthase.J.B
iochem.Mo!
.B
iol.3
3:1‑36.
.
,L.C.M
irelesandR.J.Eilers1
993.RapidGerwick,B.CdiagnosisofALS/AHAS‑resistantweeds.WeedTechnol.
7:5
19‑524.
Hamamura,K.
,T.M
uraoka,J.Hashi
moto,A.Tsu
ruya,H.
Takahashi, T. Takeshita and K. Noritake 2003.
Identificationofsulfonylurea‑resist
antb
iotypeso
fp
addyfieldw
eedsu
sin
ganov
elmet
hodb
asedont
heirrootingres
ponses.WeedB
iol.M
anage.3:2
42‑246.
児嶋 清 2005. 稲作雑草の発生状況の変化と防除対策．
「今月の農業 3月号 (2005)」，化学工業日報， ppl
7‑23.
村岡哲郎 2000. イヌホタルイの発根への影響を利用し

内野彰・渡邊寛明・菊池晴志・三浦嘉浩・尾形茂・

臼井智彦・吉田修ー・谷なつ子・三浦恒子・田口奈
穂子・矢野真ニ・伊藤博樹・新田靖晃 2005. 東北 6
県における 200
3年までのスルホニルウレア系除草剤抵抗性水田雑草の確認状況．東北の雑草 5:24‑28.

涼・村岡哲郎 2004. スルホ

ニルウレア系除草剤抵抗性簡易検定法としての地上

汗光熙 2001. ポット試験法． H本 雑 草 学 会 編 「 雑 草 科部再生法の確立．雑草研究 4
9:2
77‑293.

学実験法」， pp3
62‑363.
WesterfeldW.W.1
945.Acolorimetricdeterminationofbloodacetoin.J.B
iol.Chem.1
6
1:4
95‑502.
(2007年 5月 2日受理）

3
4:6
7‑71.
大野修ニ・柳沢克忠・花井彰 1999. スルホニルウレア抵抗性水田雑草の迅速検定法．植調 3
3:3
54‑3
60.

内野Uchino,A.andH.Watanabe2
007.E
ffectso
fp
yruv
atea
n
dsu
croseona
cetolactatesynthaseactiv
ityinLindemiaspp.
andSchoenoplectu
sjuncoidesi
naninv
ivoassay.WeedBiol.
Manage.7:1
84‑187.
内野 彰・渡邊寛明 2007. アゼトウガラシ属水田雑草(Linderniaspp.）及びイヌホタルイ (Scirpu
sju
ncoidesv
ar.
ohw
ianus)におけるアセト乳酸合成酵素活性の生育ス
テージ及び部位による差異．雑草研究 5
2:1
1‑16.

Uchino,A.
,H.Watanabe,G‑X.WangandK.Itoh1999.Lightrequirementi
nrapi
ddiagnosisofsulfonylurea‑resistantweedsofL
indemiaspp.(
Scrophulariaceae).WeedTechnol.
1
3:680‑684.

たスルホニルウレア抵抗性の簡易検定法植調内野31彰 2003．雑草の ALS阻害剤抵抗性とその機構．