水産庁委託事業
地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価･適応技術開発委託事業
成果報告書

平成 26 年 3 月「温暖化適応技術」共同研究機関

はじめに「地球温暖化対策推進費のうち、地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価･適応技術開発委託事業」（略称：温暖化適応技術開発事業）（平成 21～25 年度）は、多くの成果を挙げ、無事終了いたしました。
本研究に参画された各大学、県試験研究機関及び水研総合研究センター傘下の各研究所担当者の皆さまにお礼を申し上げるとともに、本事業の機会を与えて下さった水産庁増殖推進部研究指導課に感謝いたします。
本事業は、地球温暖化による水産業への影響が懸念されるなか、養殖業への影響を軽減させる目的で始まりました。水産総合研究センターは昨年、水産育種研究戦略を公表しましたが、それに先立ち、地
球温暖化による海水温の上昇という環境変化に対し、育種研究による高水温耐性品種の作出、あるいは
高水温耐性の指標となるマーカー等の開発を通じて養殖現場へ貢献しようとするものでした。
陸上養殖が主流であり、夏季高水温の影響を受けるヒラメ、河川水・湧水を利用した冷水性魚類を代表するニジマス、あるいは水温の低下時期の遅れから漁期の短縮が懸念されるアマノリを対象として事業を進めてきました。そして、ヒラメでは高水温耐性評価法の開発、評価法に基づいて選抜した個体と次世代の作出による遺伝性の確認、高水温に付随する低酸素耐性個体解析のための評価法の開発と解析家系の作出および QTL 解析による候補 DNA マーカーの開発、ニジマスでは冷水性魚類で高水温耐性個体を選抜する指標となるようなマーカーの開発、さらにアマノリでは自然界に存在する高水温耐性アマノリ類の特性評価や、実際に開発された高水温耐性アマノリ品種を用いた高水温時に特異的に発現するタンパク並びに高水温耐性マーカーとして有用な遺伝子等を明らかにしました。
本事業を推進した結果、特許申請にいたる成果や、高水温耐性個体作出に向けて育種素材となる候補の確保など、大きな成果を挙げつつあります。育種研究においては 5 年間という期間は短く、今後、これらの成果を生かしつつ、養殖現場に広められるような系統（品種）の作出に繋がることを念頭に、本事業の成果がさらに多くの研究･技術開発に広く資することを祈念いたします。

平成 26 年 3 月

独立行政法人増養殖研究所長

水産総合研究センター
飯田貴次

目

次

1．ヒラメチーム課題別研究成果
1）高温耐性ヒラメの評価法と探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4（増養殖研究所・日本海区水産研究所・大分県農林水産研究指導センター）2) 高水温耐性を持つ天然ヒラメの探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・9（日本海区水産研究所・増養殖研究所・大分県農林水産研究指導センター）
3）低酸素耐性ヒラメの評価法と探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・14（神奈川県水産技術センター）
4）ヒラメの高温耐性関連形質の評価と DNA マーカー等の探索・・・・・・・・・・・・・・・・・19（東京海洋大学）
5）ヒラメの高温耐性関連形質の評価とDNAマーカー等の探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・22（東京海洋大学・神奈川県水産技術センター）

2．ニジマスチーム課題別研究成果
1）遺伝子マーカーの選別と高密度化および量的形質遺伝子座解析・・・・・・・・・・・・・・・・25（東京大学）
2）ニジマス解析家系の作出および高温耐性の生物学的評価・・・・・・・・・・・・・・・・・・・31（宮崎県水産試験場）
3）ニジマスの高温影響を評価するバイオアッセイ系の開発・・・・・・・・・・・・・・・・・・37（中央水産研究所）

3．アマノリチーム課題別研究成果
1）南方系アマノリ類野生種等の高水温耐性に関する特性評価・・・・・・・・・・・・・・・・・・44（西海区水産研究所）

12）アマノリ類の短期的高水温耐性に関与する遺伝子の探索と解析・・・・・・・・・・・・・・・・49（中央水産研究所・千葉県水産総合研究センター）
3）アマノリ類の長期的高水温耐性及び適応に関与する遺伝子の探索・・・・・・・・・・・・・・55（三重大学・三重県水産研究所）

2

1．ヒラメチーム課題別研究成果

1）高温耐性ヒラメの評価法と探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4（増養殖研究所・日本海区水産研究所・大分県農林水産研究指導センター）2) 高水温耐性を持つ天然ヒラメの探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・9（日本海区水産研究所・増養殖研究所・大分県農林水産研究指導センター）
3）低酸素耐性ヒラメの評価法と探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・14（神奈川県水産技術センター）
4）ヒラメの高温耐性関連形質の評価と DNA マーカー等の探索・・・・・・・・・・・・・・・・・19（東京海洋大学）
5）ヒラメの高温耐性関連形質の評価とDNAマーカー等の探索・・・・・・・・・・・・・・・・・・22（東京海洋大学・神奈川県水産技術センター）

3

チーム名：ヒラメチーム
担当課題名：高温耐性ヒラメの評価法と探索研究機関・担当 者名：（独 ）水産総合 研究セン ター増養殖研究 所・名古屋 博之（0972-32-2125、
hnagoya@affrc.go.jp）・岡本裕之・尾崎照遵･岡内正典、日本海区水産研究所・竹内宏行・長副聡・髙原英生・有元操、大分県農林水産研究指導センター・金澤健･
景平真明
研究期間：平成 21～25 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

槽に 10 尾のヒラメを収容し、ポンプで循環させな

ヒラメは主に陸上水槽によって養殖されていがら、投げ込み式ヒーターで温度を設定した。実る。海水温の上昇により、生産過程でいろいろな

験期間中はエアレーションによる十分な曝気を行問題が起こり、対策が必要となることが考えられった。

る。本課題では、ヒラメ養殖産業における地球温③ 32℃と 33℃に上昇してからの生存時間を調べ

暖化による悪影響の回避策として、飼育水温上昇

た。

に耐性を持つヒラメの探索を行い、遺伝的形質評

2）家系間、成長段階による高水温耐性調査価法を開発することによって、高水温耐性のヒラ① 増養殖研究所で飼育していた 3 家系のヒラメメを選抜し、養殖生産の安定化に貢献することをを用いた。60cm 水槽を用いて、ポンプで海水を循目的とする。

環しながら、投げ込み式ヒーター2 個を使用して22℃・4 日間、29℃・3 日間、32℃に上昇してから

イ

研究方法

の死亡時間を 1 時間毎に集計した（短期間評価法）。

高水温耐性のヒラメを作出するため高水温耐性

実験期間中はエアレーションによる十分な曝気を評価法を開発し、家系間の違いや成長段間による行った。

耐性の違いを確認した後、日本各地から集めたヒ② 増養殖研究所で飼育していた 1 家系を用いて、ラメを用いて高水温に対する耐性の違いを確認し平均体長が 7.2±0.6cm、10.1±1.0cm、15.6±1.6cm おた。これらの中から、高水温に耐性のある個体をよび 23.7±2.3cm の個体をそれぞれ 19 から 21 尾を選抜し、成熟したものについて次世代を作出し、用いて、2）-①で用いた評価法で 32℃に上昇して高水温耐性を調べ遺伝性について確認した。最後からの死亡時間を 1 時間毎に集計した。実験期間に高水温耐性と思われる親魚から事業規模で種苗中はエアレーションによる十分な曝気を行った。

の量産を行い、養殖試験を行った。

なお、実験開始時に飼育水温が 22℃を超えていた

具体的な方法を以下に記述する。

場合は、29℃･3 日間の前処理を行ってから 32℃に

1）高水温耐性評価法の開発

水温を上昇させた。

① 60cm 水槽を用いて、ポンプで海水を循環しな

3）6 カ所（九州 2 カ所、四国 1 カ所、本州 3 カ所）

がら、投げ込み式ヒーター2 個を使用して 27℃かから集められたヒラメ種苗の高水温耐性調査

ら 32℃まで 1℃ずつ水温を設定した。この中にヒ6 カ所から集めたヒラメ種苗は平均体長 10cm 以

ラメを 5 尾ずつ収容し、収容後 12 時間までの生存下の場合は、約 10cm になるまで増養殖研究所で時間を調べた。

飼育をしてから実験に供した。10cm を超えている②32℃まで飼育水温を上昇させる際の条件設定を場合は、研究所の水槽に収容後 2 週間ほど給餌を決めるため、1 日に 1℃から 4℃水温を上昇させ生しながら飼育を行ってから実験に供した。1 時間

存時間を調べた。収容条件は①と同様に 60cm 水

毎に死亡数を集計し、12 時間経った段階で高水温4

処理を終了し、原海水を注水した。

系を用いた結果、31℃に収容したヒラメが 4 時間4）選抜によって作出した個体から得られた次世代

後に 1 尾、6 時間後に 2 尾、10 時間後に 1 尾死亡の高水温耐性評価試験した。

① H22 年度に愛媛県下で生産された種苗を用い② １日に 1℃上昇区では 7.5 日後に、1 日 2℃上昇て高水温耐性試験を行った結果、12 時間生存した区と 1 日 3℃上昇区では 5 日後に、1 日 4℃上昇区

3 尾の個体の精子と日本海区水産研究所で飼育水
温より 2、3℃上昇させた水槽で高成長を示したヒラメを産んだ雌親魚の卵を 1 対 1 で受精させた 3組の家系を作出した。このうち、1 家系は疾病と思われる原因で 1 尾を残して死亡した。残りの 2家系について体長 10cm 前後になるまで飼育を行い、実験に供した。
5）短期間評価法と長期間評価法の比較
日本海区水産研究所で飼育している高水温期に

図 1．32℃に収容したときの死亡数の変化

成長の良かった子供を産んだ親魚（雌 7 尾、雄 7尾）と大分県農林水産研究指導センターで高水温に強いと思われる親魚（雌 1 尾、雄 3 尾）をほぼ同時に受精させ、同一水槽で飼育をし、体長 10cm前後になったときに、短期間評価法によって高水温耐性を評価した。これらの個体は親子判別手法
によって親魚を特定した。また、同じ種苗を養殖現場で飼育し、夏季高水温前後でサンプリングし、親子判別手法によって親魚を特定した。両手法で図 2．33℃に収容したときの死亡数の変化

特定した親魚を比較した。
6）養殖場における種苗評価
では 3 日後にすべての個体は死亡した。

前年度までの結果から高水温耐性ヒラメと推定された親魚（雌 3 尾、雄 3 尾）を用いて総当たり③ 22℃･4 日間、29℃･3 日間の馴致期間を設けた交配を行い、種苗を作出した。種苗を養殖業者に後、32℃に飼育水温を上昇したときの死亡数の変飼育して評価をおこなうとともに、体長 10cm 前化を図 1 に示す。半数以上の個体が 12 から 24 時

後の時に短期間評価法を行い、高水温耐性につい間後に死亡した。これに対し、33℃に上昇させたて評価を行った。

場合にはすべての個体は 12 時間以内に死亡した（図 2）。

ウ

研究結果

2）家系間、成長段階による高水温耐性調査① 家系間による高水温耐性の違いを図 3 に、成長各実験に対する結果は以下の通りである。
1）高水温耐性評価法の開発段階による高水温耐性の違いを図 4 に示す。

① 27℃から 31℃に収容したヒラメは収容後 12 時

図 3 で A 家系は 4～7 時間の間にすべて死亡した

間経った段階でもすべて生存した。32℃に収容しのに対し、B 家系では 5～9 時間、C 家系では 3～

たヒラメは 2 時間以内にすべて死亡した。別の家

10 時間の間に死亡した。図 4 の成長に伴い高水温55.4±2.6（愛媛）、7.4±3.2（大分）、6.5±4.9（鹿児島）となった。一番平均生存時間の短い青森産ヒラメに対して t 検定を行った結果、5％の危険率ですべて有意差があった。
4）選抜によって作出した個体から次世代を作出し、短期間評価法によって高水温耐性を評価した結果、評価のできた 2 家系の結果を図 5 に示す。
平均生存時間はそれぞれ 8.9±0.26 と 8.7±0.19 とな

図 3．家系の違いによる高水温耐性の変化

り、前年度、日本各地から集められて評価された集団より高い平均生存時間となり、選抜効果が認められた。
5）短期間評価法と長期間評価法の比較
長期間評価法（自然水温より数度加温した水槽でヒラメを飼育し、成長の良い個体を産んだ親を親子判別法によって特定する評価法）で選んだ親魚から得られた子供を短期間評価法で評価をし、33℃に上昇してから 5 時間以内、5～6 時間、6～7

図 4．成長に伴う高水温耐性の変化

時間及び 7～12 時間に死んだ個体の親を特定した
結果を表 1．に示す。長期間評価法で高水温に強いと推定された m9 や f4 の子供は短期間評価法で耐性の変化では平均 7.2cm の個体では 12～15 時間

も比較的生存時間が長かった個体の割合が高かっまで生存した個体がいたが、成長するに従い 32℃た例もあったが、強いと推定された f8 の子供は短に上昇してからの生存時間が短い傾向が認められ期間評価法では水温上昇後 7 時間以内にほとんどた。

死亡した例もあった。
表 1．短期間評価法で死亡した個体の親魚の割合

図 5．高水温耐性選抜世代の 33℃に上昇した

♂親

n

m1
m2
m3
m4
m5
m6
m7
m8
m9
m10
m11

9
8
33
15
2
2
2
10
14
0
2

♀親

n
1
0
0
24
15
10
12
34
1

f1
f2
f3
f4
f5
f6
f7
f8
f9

ときの死亡数の変化

3）6 カ所から集めたヒラメを用いて高水温耐性試
験 を 行 っ た 結 果、 そ れ ぞれ の 平 均 生存 時 間 は処理後の時間
~5
22%
38%
30%
20%

5~6
11%
25%
30%
20%

6~7
11%
13%
18%
40%

7~12
56%
25%
21%
20%

20%
14%

20%
21%

30%
21%

30%
43%

~5

5~6

6~7

7~12

8%
20%
30%
33%
38%

17%
40%
20%
17%
26%

29%
7%
10%
17%
29%

46%
33%
40%
33%
6%

注；黒字太字：長期間評価法で高水温4.4±3.4（青森）、5.9±4.0（京都）、6.6±3.2（三重）、耐性と推定された親魚
6上昇してからの死亡時間が最も早く 1～2 時間の6）養殖場における種苗評価
養殖業者に種苗を渡して飼育してもらうため、間に 19 尾が死亡し、10 時間以内にすべての個体

長日･加温処理によって平成 25 年 3 月 2 日に長期が死亡した。死亡平均時間は 4.4±3.4 時間となり、間評価法等によって選ばれた雌 3 尾と短期間評価調査した集団の中で最も短い平均生存時間となっ法によって選抜された雄 3 尾の総当たり交配によた。これに対し、西日本から集められた集団は 2、って種苗を作出した。これらの種苗を大分県内の3 時間後から死亡する個体が現れるものの 10 時間

5 経営体に飼育してもらった結果、生存率は 70.1

を超えても生存する個体がいた。また、33℃に水～96.2％であり、日間成長は 1.06～1.26mm であっ温を上昇してからの平均生存時間も 5.9±4.0～

た。
これらの種苗を体長 6.8±0.1 と 9.2±0.2cm の時、7.4±3.2 時間となった。青森の種苗に対してｔ検定

短期間評価法で評価した結果、平均生存時間はを行った結果、危険率 5％で平均生存時間に有意6.8±0.1 時間であった。

差を認めた。
次世代を残すため、最終的に愛媛の種苗の中か

エ

考

察

ら 33℃に上昇させてから 12 時間生存した個体 5

ヒラメの適水温は 10～25℃にあると考えられ、尾が得られた。しかし、このうちの 2 尾はその後、21℃付近で最も成長が良く、25℃を超えると死亡死亡したが、3 尾の成熟個体が得られた。これら率が高くなる1、 2、 3）

。今回の結果でも 22.5～30℃の 3 尾はすべて雄であった。

までの水温では死亡魚は無く、32℃ですべての個33℃で 12 時間生存した個体から得られた雄の体が死亡した。27～32℃の範囲で徐々に水温を上精子と日本海区水産研究所で飼育している高水温げた試験では 32℃で 24 時間以内にすべての個体

耐性個体と思われる雌から得られた卵を人工授精が死亡した。そこで、22℃･4 日間、29℃･3 日間のして 3 組の交配を行い、うち 2 組を使って、高水

高水温馴致機関を設けた後、32℃に水温を上昇し温に対する評価を行った結果、それぞれの平均生てからの死亡時間を調べる評価法を開発したが、存時間は 8.9±0.26 と 8.7±0.19 時間となり、これま

この試験では 32℃に上昇してから死亡する個体のでで一番長い平均生存時間を示した。

多くが 12～24 時間以内に死亡した。一方、33℃に同じ種苗を短期間評価法と長期間評価法を使っ上昇させた場合には、多くの場合、すべての個体て調べた結果、長期間評価法で高水温耐性候補とは 12 時間以内で死亡した。高水温耐性形質は量的推定された親魚から得られた子供が短期間評価法

形質であり、12 時間後や 24 時間後の死亡数を確で比較的早く死んだ例も認められた。これは長期認するだけでは解析ができず、死亡した時間を把間評価法が高水温での子供の成長と親子判別によ握しなければならないことから 12 時間でほぼ全って推定したもので、子供の高成長は高水温に対数が死亡する 33℃での死亡時間を評価することにする耐性という要因のみで、成長が良かったわけ

した。

ではなく、その他の要因も含まれていた可能性も増養殖研究所で飼育していた 3 家系を用いて前あることを示唆しているものと思われる。

述の短期間評価法で評価した結果、比較的早く全同様に短期間評価法で選んだ雄と長期間評価法

滅する家系があった（図 3）。また、成長に伴いで選んだ雌を交配して、事業規模で種苗を生産し、高水温に弱くなる傾向も認められた（図 4）。

養殖業者に渡して養殖試験をした結果、疾病が発

国内の 6 カ所から集められたヒラメ種苗を短期生したと思われた養殖場では生存率が 70％近くま間評価法で評価した結果、北日本から集められたで落ち、疾病が発生しなかったと思われる養殖場

種苗が最も弱く、調べた集団の中で 33℃に水温をでは 96％生存した。本事業では高水温耐性という
7

形質に的を絞って交配を行った。その結果、耐病評価した結果、北日本のヒラメが高水温に弱く、性等の形質を考慮することは無かった。したがっ西日本のヒラメが強いことが判明した。これらのて、疾病が発生した養殖場では感染して生存率が集団から 33℃で 12 時間生存したヒラメを選抜し下がり、疾病が発生せず、高水温という環境だけた。一方、夏季高水温期に成長の良かった子供をでは生存率を下げることは無く、96％の生存率を産んだ親魚を親子判別手法によって特定し、高水示した、と考えられる。

温親魚候補とした。これらの親魚を交配して作出した種苗を評価した結果、平均生存時間が 8.9±0.26

オ

今後の課題

と 8.7±0.19 時間の種苗が得られ、選抜効果がある
ことが実証された。翌年、同様に種苗を量産し、5 年間と限られた期間で評価法の開発から始養殖試験を行った結果、約 70～96％の生存率が得めた研究では選抜 2 世代目までを作出するまでしられた。生存率の低かった養殖場では疾病が発生

か世代交代ができなかった。2 世代目を評価した

したと思われ、高水温耐性のみで選抜した種苗が結果、確実に高水温耐性が増していると思われた。

実際の養殖場で、必ずしも夏季高水温期に高い生しかし、年度を変えた種苗では平均生存時間は既存率を残すという結果を得られなかった。今後、存の集団と比べると高いと思われるが、養殖場で高水温耐性形質に耐病性形質を付与するなどして、の成績は良くなかった。これは今回の選抜が高水

高水温に耐性のある個体作出を進めていく必要が温耐性だけを指標にして選抜をしていて、成長やあると思われた。

耐病性に対しては着目していないので、疾病が発生した場合には今回のように 70％近くまで生存率

キ

文 献が下がることもあり得る問題であった。今後は高水温耐性候補親魚を増やして、元集団の数を増や

1) 原田輝雄（1980）．ヒラメ養殖の現状と問すとともに、これらの中で交配を行い、高水温耐

題点．養殖．17（4）：48-53．

性だけをホモ化して、残りはなるべく多様性を保

2) 原田輝雄（1981）．ヒラメ養殖入門（下）．

つような交配をしていく必要がある。そのために養殖．18（4）：44-48．

は DNA マーカー等を開発し、それを指標にしてい

3) 森実康男（1984）．ヒラメの養殖に関するくのが効率的である。また、耐病性等を持つ個体基礎的研究-Ⅱ．水産増殖．32（3）：127-131．

と交配して、耐病性形質も付与して利用する雑種
強勢のような利用方法も考えていく必要がある。
カ

要

約

ヒラメの高水温耐性個体を作出するため評価法を開発した。22℃・4 日間、29℃･3 日間の高水温馴致をした後、33℃に水温を上昇させ、生存時間を測定する方法を開発した。最初に家系間と異なる成長段階で高水温耐性に違いがあるか検討した。
その結果、家系間及び成長段階による違いが示唆された。次に国内の 6 カ所から集められた集団を
8

チーム名：ヒラメチーム
担当課題名：高温耐性ヒラメを持つ天然ヒラメの探索
研究機関・担当者名：（独）水産総合研究センター日本海区水産研究所・竹内宏行（0772-25-1306
takechan@affrc.go.jp）・町田雅春・長副名古屋博之・岡内正典・原聡・中川 亨・升間主計、増養殖研究所・素之・尾崎照遵・山田敏之、大分県農林水産研究指導センター・景平真明
研究期間：平成 21～23 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

ずつ徐々に飼育水温を上げ、死亡魚数を求めた。

地球的規模での温暖化に伴い海水温の上昇が顕27～32℃の範囲で 1℃ずつ温度を変え、死亡魚数

著になると予測されており、海面養殖業においてを求めた。ヒラメ臨界水温と推察される「32℃」

重要な位置を占めているヒラメ養殖業でも、疾病を、高水温馴致効果を加味して調査した。

の増加や代謝異常による死亡など、生産性の低下♂が異なる 3 家系を用いて、上述の各試験を行が懸念されている。このような状況のなか、今後

い、31～32℃での死亡魚数に家系間差異があるかの対応策として、温暖化による海水温の上昇に対を調べた。

して耐性を持つ、すなわち、高い飼育水温でも成【試験 3】天然ヒラメ♂13 尾と♀10 尾を人工授長や生残に優れた生物特性を持つヒラメ養殖家系

精し得られた受精卵を同一水槽に収容し、150 日の開発・確保が期待されている。そこで、遺伝的間飼育した。得られた当歳魚種苗を 180 尾ずつの多様性が豊富な素材として、種苗生産施設で飼育

2 つの水温区（自然水温区：平均水温 24.5℃、加されている多数の天然ヒラメ親魚を対象に、遺伝

温区：28.0℃）に分けて、40 日間の飼育実験を行的形質としての高温耐性を評価する方法の検討、い、その間の成長と生残を調べた。

ならびにそれらの特性を持つ家系を探索すること

2 つの試験区の飼育開始時および終了時に鰭のを目的として、養殖生産の安定化に貢献すること一部を採集した。その中から、それぞれ 96 尾につを目指す。

いて、DNA マーカーによる親子判別を行い、親別の種苗の体重の成長率を調べた。

イ 研究方法1 歳、2 歳および 3 歳魚を用いて、それぞれにつ【試験 1】150 日令のヒラメ種苗（放流用に用いいて自然水温区と加温区を設け、60 日間飼育した。

る家系化されていない魚）を、約 100 尾ずつ、加供試尾数はそれぞれ 61～82 尾とし、飼育開始時に温区と自然水温区を設定し、40 日間の飼育を行い、全個体に PIT タグを装着して個体識別した。飼育試験開始時と終了時における親別の成長・生残を開始時に鰭を採集し、親別の成長と生残を調べた。

調べた（親の判別は適切な DNA マーカーを使用）。

なお、2、3 歳魚は①とは異なる親魚群から生産さ3 歳魚を用いて、加温区と自然水温区に 40 尾ずつれた種苗を使用した。

収容し、同様な調査を行った。

【試験 4】高温耐性家系候補を含む天然ヒラメ【試験 2】既報の知見（ヒラメの飼育限界水温♂11 尾と♀9 尾から人工授精によって採卵されたは 27～28℃）に基づき、当歳魚（全長 5～20cm、受精卵を大分県水産試験場の同一水槽に収容し、染色体操作によりある程度家系化した魚）を用い、養殖用種苗を生産した。得られた 10cm サイズの以下の手順で臨界水温を詳細に求めた。22.5～

当歳魚種苗を養殖場に持ち込み、事業規模の養殖

32.5℃の範囲で 2.5℃ずつ温度を変え、死亡魚数を試験を行った。7 月中旬に 36 ㎡の養殖池に 1,500求めた。22～32℃の範囲で、1 日に 1、2、3、4℃

尾の種苗を収容し、10 月まで選別を行わず養殖試9験を行い、その間の成長を調べた。

94g と比べ劣っていた。生残率では、両者とも 97%

養殖試験開始時と 10 月に、それぞれ 200 尾につと差がなかった。

いて体サイズの測定と鰭の一部の採集を行った。

当歳魚の自然水温区と加温区の飼育開始およびDNA マーカーによる親子判別を行い、親別の種苗

終了時の親子判別率は 88～96%であった。2 つのの成長を調べた。

区とも雌雄すべての親からの種苗が検出されたが、21 年度に生産された高温耐性家系候補(F1)を引

親別の種苗の個体数には偏りがあった。5 個体以

き続き飼育し、親魚候補として養成した。

上の種苗の再生産に関与した親についてのみ成長率を比較した。

ウ

研究結果

当歳魚の飼育試験では、試験後すべて成長して【試験 1】生残率では、加温区と自然水温区にいたが、自然水温区に比べて加温区ではほとんど

差異は見られなかった。加温飼育により、♂親のの親で成長率が低くなった。

違いにより成長差が大きく異なる傾向が見られた。

1 歳魚加温区で飼育 36 日目に調温装置の故障に具体的事例としては、♂親を T11 とする種苗は加より水温が一時的に 32℃以上にまで上昇したこと

温開始時および終了時ともに成長が良好であったで全滅したため、1 歳魚についてはその時点で比こと、♂親を T12、T16 とする種苗は加温飼育によ較した。1 歳魚、2 歳魚および 3 歳魚の飼育試験でり成長が劣ったことなどであった。♀親の違いには、自然水温区では体重が増加した群もみられたよる種苗の成長では、加温飼育の影響は出なかっが、加温区ではすべて体重が減少した。しかし、た。

減少する度合いは親によって異なり、親魚によっ【試験 2】22.5～30.0℃までの水温では死亡魚はて高温耐性に差があることがうかがえた（図 2）。

なく、32.5℃ではすべての魚が死亡した。この結【試験 4】7/12 および高水温期終了後の 10/25 に果に家系間の差異はなかった。つまり、既報の知測定と鰭採集を行った。生残率は 76.9％で、10/25

見は曖昧で、信頼性に欠けることが明らかになっにおける平均全長は 220(163～268)mm であった。

た。

7/12 の 155 尾および 10/25 の 167 尾について親徐々に昇温を行った飼育試験で、臨界水温は子判別を行い、各親別の組成を求め、成長の指標「32℃」であることが推察できた。27～32℃の範として全長を比較した（表 1、2）。親子判別率は

囲で 1℃ずつ飼育水温を変えた試験で、31℃区で98％であった。各親別の組成比は均等ではなく、は 1～3 日の間に死亡が起こり、32℃区では 24 時

雄では 7 月が 1～30％、10 月が 1～22％と大きく間以内に全滅することが明らかになった。32℃でばらついていた。雌でも同様で前者が 0～39%、後の飼育を行う前に、22℃で 2～4 日間、29～30℃で者が 0～38%であった。

4 日間の馴致を行った場合、臨界水温での生存時

高温耐性家系候補(F1)については全個体に PIT間が延長することがわかった。

タグを装着して個体識別して飼育した。24 年春で3 家系を用いて飼育試験を行い、【試験 1】と同

満 3 歳となり、親魚候補として成熟養成する。現様に♂親が異なる条件で高水温耐性に家系間の差

在 130 尾養成中である。

異があることが分かった。
【試験 3】当歳魚の 2 つの水温区における飼育

エ

考

察

開始時の平均全長、平均体重はともに 163mm、45g【試験 1】の結果から、♂親の違いにより、加温であった。しかし、40 日間の飼育で加温区の成長時における種苗の成長差が生じた可能性は高く、は 196mm、79g と、対照とした自然水温区の 206mm、

家系間に差があると推察できた。

10

加温区は全長が約 1mm 減少していたが、加温は、家系ごとの成長・生残等の生産性を実際の養により死亡が起こり、大きな個体が死亡した可能

殖業で行われているような出荷サイズにおいて検性があり、本年度の試験では加温による家系間の証する必要がある。そのため、継続して事業的飼差異を考察するには至らなかった。

育を行い、出荷サイズでの成長と親別の成長率を【試験 2】の結果から、高水温耐性を客観的に調査する。

評価する方法として次の手法が考えられた。当歳
魚を 22℃で約 4 日間馴致飼育した後、29～30℃で

カ 要

約約 4 日間馴致飼育し、最終的に 32℃で個別飼育により生存する個体数を求める。この 3 段階を異な

150 日令のヒラメ種苗を加温区と自然水温区をる家系間で比較することにより、「高水温耐性家設定し、40 日間の飼育を行い、親別の成長・生残系」を作出できる可能性が高いと考えられた。

を調べた結果、♂親の違いにより、加温時におけ【試験 3】の結果から、当歳魚では、成長率のる種苗の成長差が生じた可能性は高く、家系間に落ちる度合いは親によってばらつきがあり、雄の差があると推察できた。翌年同様の試験を行った

2 尾(Jm1、3)、雌の 2 尾（Jf1、5）については、他

結果、雄 2 尾雌 2 尾について高温耐性候補であるの親に比べて高水温下でも比較的良好な成長を示可能性があると考えられた。高水温飼育におけるし、高温耐性候補である可能性があると考えられ成長率を比較することによって高温耐性を持ったた（図 1）。1 歳を越えた魚については、加温区は家系候補を見付けられる可能性が示唆された。

成長せず、逆に体重は減少する結果となった。こ

当歳魚を用いて臨界水温を詳細に求めたところ、のことから、1 歳魚以上の評価については、高水

臨界水温は「32℃」であることが推察できた。高

温環境下でも体重を維持できることを評価する必水温耐性を客観的に評価する方法として、2 段階要があると考えられた。

の水温で馴致飼育し、最終的に 32℃で個別飼育に高水温飼育における成長率を比較することによより生存する個体数を求める手法が考えられた。

って高温耐性を持った家系候補を見付けられる可この 3 段階を異なる家系間で比較することにより、能性が示唆された。

高水温耐性家系を作出できる可能性が高いと考え【試験 4】の結果から、雄では 7 月は m1、m2、られた。

m11 が、越夏後の 10 月では m1、m9 の成長が平均

当歳魚種苗を用いて事業規模の養殖試験を行い、よりも優れていた（図 3）。m9 は短期間の高温耐

親別の種苗の成長を調べた結果、平均より成長の性評価試験においても生残成績の良かった親であ優れた親が認められた。短期間の高温耐性評価試

り、このことは養殖現場でも m9 の性能が実証さ験においても生残成績の良かった親も見付かり、れたことを示している。また、m1 については 22

このことは養殖現場でもその性能が実証されたこ

年度の加温飼育においても比較的良好な成長を示とを示している。また、前年度の加温飼育においしており、高温耐性候補である可能性が高まった。

ても比較的良好な成長を示した親については、高雌では f8 の成長が良い傾向がみられた（図 4）。

温耐性候補である可能性が高まった。

しかしいずれも有意な差は認められなかった。
キ
オ

今後の課題

実用的な高温耐性ヒラメ家系を確保するために
11

文献

140

自然水温区 BW(％)

120

加温区 BW(％)♂

自然水温区 BW(％)

140

加温区 BW(％)

成長率（％）

80
60

100
80
60

40

40

20

20

0

0
Jf1

Jm1 Jm2 Jm3 Jm4 Jm5 Jm6 Jm7 Jm8 Jm9 Jm10 Jm12 Jm13

図1

♀

120

100

成長率（％）

160

Jf5

Jf7

Jf8

Jf9 Jf10 Jf12 Jf15 Jf17

当歳種苗の自然水温区と加温区における飼育開始と終了時の親別の体重の成長率

10♀

自然水温区BW(％)
0-20

成長率（ ％）-4
成長率（ ％）

加温区BW(％)

5

-6
-8
-10

♂

-12

-5

-10

自然水温区BW(％)
加温区BW(％)

-15

-14
Kym8

Kyf1

Kym10

Kyf2

Kyf3

Kyf4

Kyf5

Kyf6

図2

3 歳魚の自然水温区と加温区における飼育開始と終了時の親別の体重の成長率

表1

雄別の全長と組成

n
m1
m2
m3
m4
m5
m6
m7
m8
m9

17
15
47
22
3
4
4
11
18

ｍ10

1

m11

7

unknown

6

全数

155

表2

7/12

10/25

ave .TL(mm)

ave .TL
(mm)

99.1
98.1
92
91

89.3
95.2
97.7
93.8

組成

n

11%
10%
30%
14%
2%
3%
3%
7%
12%

26
17
37
21
1
5
4
12
26

1%

4

5%

9

4%

5

100%

167

223
220
218
221
215
220
224

7/12

220

10/25

n

ave .TL
組成
(mm)

n

ｆ1
ｆ2
ｆ3
ｆ4
ｆ5
ｆ6
ｆ7
ｆ8
ｆ9

2
1
0
36
18
14
15
61
2

1%
1%
0%
23%
12%
9%
10%
39%
1%

0
1
3
38
13
19
23
63
2

3%

unknown

6

4%

5

100%

全数

155

100%

167

組成
16%
10%
22%
13%
1%
3%
2%
7%
16%
2%

212

雌別の全長と組成

5%

12

92.1
93.9
89.9
93.1
95.7

93.8

ave .TL
(mm)

213
214
217
220
226

組成
0%
1%
2%
23%
8%
11%
14%
38%
1%
3%

220

100%

240

240

235

235
230
全長（mm）

全長（mm）

230
225
220
215

225
220
215

210

210

205

205
200

200
M1

M2

M3

M4

M5

M6

M7

M8

M9

M10

F1

M11

F2

F3

F4

F5

F6

F7

雌親魚別の種苗の全長の平均値

雄親魚別の種苗の全長の平均値

図 3 雄親魚別の種苗の全長

図 4 雌親魚別の種苗の全長

13

F8

F9

チーム名：ヒラメチーム
担当課題名：低酸素耐性ヒラメの評価法と探索研究機関・担当者名：神奈川県水産技術センター栽培推進部・長谷川理（電話番号 046-882-2314、 e-mail hasegawa.fav1@pref.kanagawa.jp）
研究期間：平成 21～23 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

イ）系統間における低酸素特性の比較

近年、温暖化の影響により海水温度が上昇し、・B系統（低酸素非耐性系統）とC系統（貧酸ヒラメなどの養殖業においては、夏季に飼育水

素耐性系統）

温が著しく上昇するとともに、これら飼育環境試験区としては、循環濾過機、エアレーションの悪化に起因する斃死が多発している。このた及び投げ込み式ヒーターを設置したポリカーボネート水槽(100ℓ)に80ℓの海水を注水した試験区を設

め、温暖化への適応対策として、高水温下でも定した。これにB系統（17尾）及びC系統（15尾）

生残率の高い系統魚を開発することが、斃死をの各系統魚を混合して収容し、25℃にて2日間馴致軽減させるための有効な対策のひとつと考えら

後に、循環濾過機及びエアレーションを停止し、れる。神奈川県で継代してきたヒラメ系統魚の止水状態とした後、30分毎に溶存酸素量と各系統

中には、高水温期の低酸素状況下において、酸の斃死魚を確認し、系統間の低酸素に対する生物

欠による斃死状況が系統間で異なっていること

特性を比較した。なお、供試魚にはイラストマーが知られている。

タグを施し、外見から系統判別を行った。

そこで、本課題においては各系統の低酸素に

・低酸素非耐性系統、低酸素耐性系統及び天然系

対する生物特性を把握するため、系統間の低酸との比較

素に対する耐性の相違を詳細に調査する。また、

上記試験と同様の水槽に 80ℓの海水を注水し、B

低酸素耐性を選抜育種するためのＤＮＡマー

系統（低酸素非耐性系統）28 尾、C 系統（低酸素

カーを量的形質解析（QTL 解析）により、開発

耐性系統）34 尾及び天然系魚（天然魚間の交配にするため、低酸素に対する耐性の強弱を数値化より作出した F1 魚）33 尾を混合して収容し、25℃するための評価方法を開発する。

で一週間の馴致飼育を行った後に、水槽の循環とエアレーションを停止し、水槽を止水状態後に、

イ

30 分ごとに溶存酸素量と供試魚の状況を確認し、研究方法最初に斃死魚が観察された時点からは、15 分ごとア）低酸素と水温（25℃、28℃、30℃、32℃）に溶存酸素量と系統ごとの斃死魚数を確認し、系の関係について
循環濾過機、エアレーション及び投げ込み式

統間及び天然系との低酸素特性を比較した。

ヒーターを設置した４つのポリカーボネート水ウ）低酸素耐性系統と低酸素非耐性系統との交配槽(容量100ℓ)に60ℓの海水を注水し、ふ化後約7系統（CB系統）と天然系との比較

ヶ月の稚魚を30尾ずつ収容した。それぞれの試・低酸素耐性系統と低酸素非耐性系統との交配系

験区の水温を25℃、28℃、30℃、32℃まで、供統（CB 系統）

試魚の様子を観察しながら、一週間ほどかけて

循環濾過機、エアレーション及び投げ込み式ヒ

昇温し、各水温にて２日間馴致した後、循環濾ーターを設置したポリカーボネート水槽(200ℓ)に過機およびエアレーションを停止した。その後、30分ごとに溶存酸素量と斃死魚数を確認し、水160ℓの海水を注水した試験区を設定した。この試
験区に B 系統（低酸素非耐性系統）、C 系統（低温と低酸素との関係を調べた。

酸素耐性系統）及び両系統間の交配により作出し14

た F１魚（CB 系統）各 30 尾ずつを混合し、25℃

ウで一週間馴致飼育を行った。その後、水槽の循環

研究結果

ア）低酸素と水温（25℃、28℃、30℃、32℃）との関係についてとエアレーションを停止し、止水状態とした後、30 分ごとに各系統の斃死魚数と溶存酸素量を把握

25℃、28℃、30℃の 3 試験区においては試験開始した。

後 12 時間後にも、生残個体が存在し、終了時点の全個体が斃死した系統が確認された時点で、試

溶存酸素量は各試験区とも 2.0mg/l 前後であった。

験を中止し、再び、水槽の循環とエアレーション

一方、32℃の試験区においては試験開始後 4 時間を再開した。

ですべての供試魚が斃死し、試験を終了した。終（以下:前期試験）了時における溶存酸素量は 2.2mg/l であった。32℃

その後、終了時点で生残した低酸素耐過魚（生における斃死の主要因は溶存酸素量よりも高水温残魚）の体力を回復させるために、一週間 25℃にが影響して、斃死に至ったことが推定された。して飼育し、再び、同水槽に天然系魚を加えて、前かし、30℃試験区では、試験終了時には生残した期試験と同様の低酸素耐性試験を行い、前期試験個体があったものの、その後、十分な溶存酸素下の生残魚と天然系魚との低酸素耐性を比較した。

で飼育しても、これらは試験後、一週間以内に斃（以下:後期試験）死した。このため、低酸素形質を詳細に調査するエ）ＱＴＬ解析のための試験条件の検討ためには、28～25℃の水温帯において低酸素耐性試験を実施することが、適当と考えられた。

低酸素耐性形質に関して、ＱＴＬ解析を実施するためには、戻し交配魚の低酸素の耐性に対する強弱を個体ごとに数値化して把握することが必要

イ）系統間における低酸素特性の比較である。そこで、ポリカーボネート水槽（容量 1000・B系統（低酸素非耐性系統）とC系統（低酸素耐性系統）ℓ）に、500ℓの海水を注水し、止水状態とした試験

試験開始 2 時間後（DO 3.2mg/ℓ）から B 系統の区に、養殖用として市販されている通常種苗 200

供試魚で斃死が発生し、3 時間後には、累積死亡

尾（平均全長 10.9ｃｍ）を搬入し、斃死に至るま

率は 76.5%となり、試験開始 8.5 時間後(DO 1.1mg/

での時間をどの程度まで細分化して、把握するこℓ)には B 系統魚は、すべて斃死した。一方、C 系とが出来るか検討した。

統は、試験開始 9 時間後(1.1mg/ℓ)に、はじめて斃オ）QTL解析家系の作出

死魚が確認された。試験開始 10 時間後に溶存酸素♀F１（♀低酸素耐性×♂低酸素非耐性）×♂（低量が平衡状態となったため、本試験を終了した。

酸素非耐性）間において交配し、QTL 解析家系を

(図 2)
4 .5
4

C系統

B系統

非耐性系

ＤＯ（ｍｇ／ｌ）

3 .5
耐性系

F1 (CB)

3

Ｃ（ 斃 死魚）

7

Ｃ生 残

6

ＤＯ

5

2 .5

4

2

3

1 .5
1

2

0 .5

1

0

0

戻し交配魚
(CB×B)

図1

8Ｂ （ 斃死魚）

個体数

作出する(図１)。

経過時間（Ｈ）

QTL 解析のための戻し交配家系

図2

低酸素耐性(C 系統)と非低酸素耐性系

統(B 系統)の低酸素に対する耐性の相違
15

8

との比較

30
Ｃ（斃死魚）

7

天 然 系で 斃 死魚 が 確認 され た 。3 時 間後 (DO1.3mg/ℓ)には、B 系統魚は 93.3%が斃死し、天然系においても、累積死亡率が 51.5％に達した。一ＤＯ（ｍｇ／ｌ）

試験開始 2.25 時間後(DO 1.4mg/ℓ)に B 系統及びＣ（生残魚）

6Ｂ（斃死魚）

5

ＣＢ（斃死魚）ＣＢ（生残魚）

4

ＤＯ

3

25
20
15

個体数

・低酸素非耐性系統、低酸素耐性系統と天然系

102方、C 系統においては、試験開始 2.75 時間後から

1

斃死魚が出現し、3 時間後の累積死亡率は、29.4%050であった。その後、溶存酸素量は平衡状態となり経過時間(h)試験開始 3.75 時間後に、循環濾過とエアレーシ

図4 低酸素耐性系統、低酸素非耐性系統およョンを再開した。最終的な生残率は、B 系統 6.7%、

び両系統の交配系統（CB系統）の比較

C 系統 70.5%、天然系 48.5%であった。(図 3)（前期試験）

30
Ｃ（斃死魚）
Ｃ（生残魚）
Ｂ（斃死魚）
Ｂ（生残魚）
天然系（斃死魚）
天然系（生残魚）
ＤＯ

前期試験終了後の馴致期間中に CB 系統で 1 検体が25斃死した。その結果、後期試験においては、C 系

2015

統 29 尾、CB 系統 28 尾と新たに天然系魚 33 尾を個体数

加えて、前期試験と同様に低酸素に対する特性を10比較したところ、試験開始 5 時間後(DO 1.0mg/ℓ)

5に斃死魚が出現し、5.75 時間後(DO 1.1mg/ℓ)には、0

天然魚の累積死亡率が 51.5%となり、溶存酸素量も平衡状態を示したために、開始 6 時間後に後期

図 3 低酸素耐性(C 系統)、非低酸素耐性系試験を終了した。終了時における各系統の生残率

統(B 系統)と天然系の低酸素に対するは C 系統 100%、CB 系統 96.4%、天然系 48.5%であ耐性の相違った(図 5)。

ウ）低酸素耐性系統、低酸素非耐性系統、両系統

10の交配系統（CB系統）及び天然系との比較

9

前期試験
試験開始 4.5 時間後(DO 1.3mg/ℓ)に B 系統魚で斃死が確認され、5.75 時間後(1.1mg/ℓ)には B 系統の供試魚はすべて斃死した。一方、C 系統、CB 系

Ｃ（斃死魚）
Ｃ（生残魚）

8

ＣＢ（斃死魚）7ＣＢ（生残魚）6

天然系（斃死魚）

5

天然系（生残魚）

4

25
20
15

ＤＯ

10

3

統では、B 系統がすべて死亡した時点において、

30

個体数

経過時間（ｈ）

ＤＯ（ｍｇ／ｌ）

2

5

1

両系統とも斃死したのは１検体のみであった

0

0

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.25
5.5
5.75
6
6.25

ＤＯ（ｍｇ／ｌ）

後期試験
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

(図 4)。

経過時間（ｈ）

図 5 低酸素耐性系統、交配系統（CB 系統）および天然系の低酸素に対する耐性の相違
16

史が短く、品種として確立されているものがほとエ）ＱＴＬ解析のための試験条件の検討
試験開始 5 時間が経過した時点から斃死する個

んどないことが関係していると考えられる。本試体が出現後、連続的に斃死し、1 時間後にはすべ験で検証したヒラメの系統についても、突発的にての検体が斃死した。

発生した取水事故により注水が止まり、その結果

本試験においては、低酸素により斃死が生じてとして生じた酸欠による斃死の状況が系統間で異いる間に、各個体の斃死時間を 1 分単位で把握すなっていたことから、系統間による低酸素耐性のることが可能であった。本試験方法を用いること相違について、着目することになった。

により、各個体の低酸素に対する強弱を、斃死に本試験により、神奈川県において継代飼育して至る時間を用いて、連続的な変異として数値化す

きたヒラメの系統魚は、低酸素に対する耐性が、することが出来た。

系統間で異なっていることが明らかになった。
また、系統間の交配魚の低酸素に対する耐性も、オ）QTL 解析家系の作出

耐性系統と同様の様相を示しており、本県の系統♀F1（♀低酸素耐性魚が有している低酸素耐性は、優勢形質であるこC 系統×♂低酸素非耐性

B 系統）×♂（低酸素非耐性 B 系統）間においとが示唆された。

て戻し交配魚（以下 CB×B 約 150 尾）を作出し、ヒラメの生産現場では、夏季に疾病による斃死

QTL 解析のための低酸素耐性試験を実施した(図被害が多発している。夏季の飼育水温の上昇に対6)。

する適応能力の相違が、疾病の発生を誘引している原因のひとつであることも考えられる。
また、ヒラメ養殖の多くは、陸上施設において行われている。このため、揚水ポンプを用いて海水を取水しており、台風等の自然災害により取水が困難となり、酸欠による斃死被害がしばしば生じている。
これら、ヒラメ養殖の置かれた飼育環境を考えると、低酸素に対する耐性形質はヒラメ養殖を振興する上で重要な経済形質のひとつになるものと

図 6 戻し交配魚(CB×B)に対する低酸素耐性考えられる。

試験エ

考察オ 今後の課題

低酸素に対する耐性は魚種ごとに異なっていること 1)、2)や酸素消費量と低酸素の関係 3)、4)について

新たな戻し交配家系を作出し、これらに対しては既に報告されている。しかし、同一の魚種におも、本課題において明らかにした試験条件により、いて低酸素に対する耐性に相違があることについ

低酸素耐性試験を実施し、戻し交配魚の低酸素にては 3 倍体と 2 倍体における酸素消費量の違い
6)5)、

対する強弱を個体ごとに把握し、これらをＱＴＬ

ついては報告されているが、遺伝的背景の異なる解析に供する。

同一魚種内において低酸素耐性が異なることにつ

ＱＴＬ解析により、低酸素耐性と連鎖するＤＮ

7)いて報告されている事例は少ない 。

Ａマーカーを開発することにより、同耐性を有す

この原因としては、水産においては、育種の歴る優良系統を確立する。
17

カ

要 約

・神奈川県において、継代飼育してきた２種類の系統魚の低酸素に対する耐性には、遺伝的な相違があることが明らかになった。
・供試魚の斃死に至るまでの時間を、１分刻みで把握するための試験条件を開発し、各検体の低酸素に対する耐性の強弱を、量的形質として捉えることが可能となった。
・QTL 解析のための、解析用家系（戻し交配魚）を作出することが出来た。
キ

文献1) 山元憲一・細木誠・上村達也(1987)．低酸素下におけるマダイ、アオハタ、カワハギ、キュウ
セン、ハナオコゼの酸素消費量の変化．水産増
殖．35(3):143-146
2) 山元憲一・廣中孝始・山下秀幸・綿石慶太(1990)．
低酸素下におけるブリ、クラカケトラギス、カサゴ、ネズミゴチ、トラフグの酸素消費量の変化．水産増殖．38(1):35-39
3) 山元憲一(1991)．マアジの酸素消費に及ぼす低酸素の影響．水産増殖．39(4):399-402
4) 山元憲一(1997)．イシダイの酸素飽和と低酸素の状態における呼吸．水産増殖．45(4):513-517
5) 山本淳・飯田貴次(1994)．三倍体ニジマスの酸素消費量と低酸素濃度耐性．魚病研究．
29(4):245-251
6) 小林徹・堀勝利・伏木省三・中村聡一・上野紘
一．三倍体アマゴの安静時および強制運動時の酸素消費量ならびに鰓蓋運動数．水産増殖．
43(3):395-400
7) 工藤飛雄馬・井ノ口伸幸・木島明博(2002)．ニジマス(Oncorhnchus mykiss)における低酸素耐性
形質の遺伝率の推定について．水産増殖．
50(3):396-374.

18

チーム名：ヒラメチーム
担当課題名：ヒラメの高温耐性関連形質の評価と DNA マーカー等の探索
研 究 機 関 ・ 担 当 者 名 ： 東 京 海 洋 大 学 大 学 院 海 洋 科 学 技 術 研 究 科 ・ 坂 本 崇 （ 03-5463-0450,
takashis@kaiyodai.ac.jp）・岡本信明
研究期間：平成 21～23 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的を有する家系を探索し、確保することで、高温耐

2010）を利用して、天然魚の親魚判別を可能にする DNA マーカーを探索した。既存の約1000 個のマイクロサテライトマーカーより、神奈川県で放流稚魚作出用に飼育されていた親魚群を判別できるようなマーカーを探索した。
親魚から抽出したゲノムを蛍光（TET）標識
プライマーで PCR し、変性アクリルアミドゲ
ルにて電気泳動後、FLA9000（FUJIFILM）にて可視化した。
④ 低酸素耐性魚の探索：親魚群の判別が可能で性に関する育種技術の発展が望まれる。本課題であったマーカーを用いて、神奈川県が行ったは高水温耐性を有する個体や家系を探索・確保し、酸欠耐性試験の試験区（合計 8 試験区）の個DNA マーカー等を用いて、その遺伝性の評価を行

体の親魚鑑定を行った（グループ共同研究）。

近年、地球温暖化が問題視され、ヒラメ養殖でも対応が求められている。その一つとして、育種により、高水温耐性家系を作出することが挙げられる。地球温暖化の影響と推察される海水温の上昇により、ヒラメ飼育水温も上昇し疾病の多発や酸素欠乏による斃死が起こり、養殖生産量の低下が懸念される。その対策の一つとして、高温耐性

うことを目的とした。

⑤ 高温耐性魚の探索：天然魚同士の自然交配から得た魚を用い、28℃で馴致した後、6 時間おイ 研究方法きに 1℃ずつ上昇させ、死亡個体を一尾ずつ取① 高温耐性魚の探索準備：神奈川県で漁獲されり上げて、死亡時水温の記録とともに鰭を保た天然魚を餌付けし、栄養状態ならびに感染存し、親子鑑別を行った（合計 4 試験区）。

症罹患に注意を払いながら飼育・育成した（神奈川県と共同研究）。

ウ

研究結果

② 天然魚から高温耐性の親魚を選抜するための① 高温耐性魚の探索準備：神奈川県で漁獲され形質評価法の確立：飼育試験によって水温とた天然魚を産卵可能な状態まで飼育・育成しヒラメの動向、生死の関連を見た。飼育は人た（神奈川県と共同研究）。

工海水（SEALIFE/MARINETECH）、エアポ② 野生魚から高温耐性の親魚を選抜するためのンプ（INNO β6000/ニッソー）、ろ過機（EHIME

形質評価法の確立：

professional）、ヒーター（NEW IC AUTO 500）

【飼育試験 1】30℃以下の水温では摂餌は良を用いて 60Ｌ水槽により行った。

好で、上層にとどまり餌を催促する個体もい【飼育試験 1】20℃から、2 日おきに 2.5℃ずつたが、31.6℃に水温を上げた 6 日後から、餌水温を上昇させ、飼育限界水温を探索した。
【飼に対する反応が薄くなり、上層に留まる個体

育試験 2】30℃に馴致した後、6 時間おきに 1℃

もいなくなった。

ずつ上昇させ、飼育限界水温を探索した。

【飼育試験 2】飼育試験１の結果より、30℃③ 天然魚の親魚判別を可能にする DNA マーカーの開発：既存のマーカー（Sanchez et al.,以下では正常の状態を保って飼育できると判19

断したため、30℃に馴致した後、6 時間おき

もしくはそれ以上に酸欠に強いことが示唆さに 1℃ずつ上昇させ、飼育試験を続けた。それた。天然系個体の雌由来と雄由来を確かめの結果、31℃から死亡が確認され、試験開始

たところ、酸欠試験 5～8 何れの試験区においから 24 時間後、33℃ですべての個体が死亡しても酸素耐性に偏りはなく、特に酸欠に強いた。同時に、DO（mg/l）や呼吸回数（秒/10

親の存在は認められなかった。以上の結果よ回）を測定していたが、水温の上昇、DO のり、B 系は酸素欠乏耐性が弱く、C 系は同耐低下に伴って、呼吸回数が増加する様子が確性が強かった。また、その F1（CB 系）は C認できた。

系と同じかやや弱い程度の耐性を示した。

③ 天然魚の親魚判別を可能にする DNA マーカ⑤ 高温耐性魚の探索：高温試験 1 では 33.4℃でーの開発：神奈川県で放流稚魚作出用に飼育死亡が始まり、34.3℃ですべてが死亡した。

されていた親魚群を判別できるようなマーカ

高温試験 2 では 29℃で死亡した一尾を除き、ーを探索できた。

32.8℃で死亡が始まり、34.1℃ですべてが死亡④ 低酸素耐性魚の探索：【酸欠試験 1 および 2】した。両試験ともに、最初の死亡個体から最親魚判別を可能にする DNA マーカーを使っ後の死亡個体まで、1℃程度しか温度差はなかて酸欠耐性試験の親魚鑑定を行った結果、供った。本試験では、複数の天然親魚由来の交

試魚には雄親魚に偏りがあることがわかった

配個体を用いているので、ヒラメ（平均値：（♂No.5；66.7％、50％、♂No.2；14％、25％）。

全長 11.1ｃｍ、体重 11.3ｇ）が 33℃程度まで

また、酸欠耐性を示した魚の雄親魚も明らか耐えられることが確認できたが、本試験ではになり、酸欠試験 1 と酸欠試験 2 で、終了 1

飛びぬけて高温耐性があると認めるに十分な

時間前まで生き残った供試魚の雄親魚とし個体は認められなかった。しかし、この狭いて、♂No.6 があげられた。また、酸欠試験１

温度範囲であるが、雌親を基準にすると、継のみで使われた雄親魚では、♂No.14、酸欠試

代家系である B 系と C 系の親由来の個体は両験 2 のみで使われた雄親魚では、♂No.11 由来

試験においてより低い温度で死亡し、個体の供試魚が酸欠耐性を示した。

No.5E46 と 5C78 を雌親とする天然系個体は【酸欠試験 3 および 4】酸欠試験 3、酸欠試験

比較的高い温度まで生存したものが多かっ

4 ともに、2.1ppm の酸素濃度で供試魚の大半た。また、雄親を基準にすると、個体 No.2878が死亡した。この時点で生存した個体の雌由を親魚とする天然系個体がより高い温度で死来と雄由来を確かめたところ、試験 3 では偏亡する傾向があった。なお、個体数が少ない

りはなく、特に酸欠に強い親の存在は認めらものの中に、より高い温度まで生存した個体

れなかった。酸欠試験 4 では雌由来に偏りはがいたが（雌由来：個体 No.4E4E、雄由来：なかったが、雄由来では個体 No.2878（試験個体 No.3C71, No.7033）、それらの評価につ

1, No.6）が酸欠に強い傾向があった。

いては個体数を増やした試験結果で判断すべ【酸欠試験 5 から 8】酸欠試験 5 から 8 におきであると考えた。

いては、天然魚とともに神奈川県で飼育され高温試験 3 では 33℃で死亡が始まり、ている B 系、C 系、その F1 である CB 系を実33.5℃ですべてが死亡した。高温試験 4 では

験に供試した。酸欠試験 5 から 8 の何れの系

32.5℃で死亡が始まり、34.5℃ですべてが死亡

統においても 1.5ppm 以下の酸素濃度で死亡した。本試験では、複数の天然親魚由来の交が始まった。C 系、CB 系は、天然魚と同等、配個体を用いているので、ヒラメ（平均値：20全長 11.3 cm、体重 12.5 g）が 34.5℃程度まで

耐性魚および低酸素耐性魚を見いだすことはでき耐えられることが確認できたが、最初の死亡なかったが、事業は順調に進行しており、大きな個体から最後の死亡個体までの温度差が 2℃

課題はない。

程度であり、37℃でも生存するような、飛びぬけて高温耐性がある個体は認められなかっカ

要 約

た。この狭い温度範囲であるが、雌親を基準にすると、個体 No.5C78 を雌親とする天然系

神奈川県で漁獲された天然魚を用いて、複数の個体は高い温度まで生存したものが多かっ

天然親魚由来の交配集団を作出し、酸欠耐性試験

た。また、雄親を基準にすると、個体 No.071F

および高温耐性試験を実施した。その後、交配集を親魚とする天然系個体がより高い温度で死団について DNA マーカーを用いて親子鑑定を行亡する傾向があった。また、個体 No.5C78 とない、各試験で優良な成績を示した個体の由来を個体 No.071F を両親とする個体は最も強い高調べた。酸欠耐性試験および高温耐性試験ともに、温耐性を示した。

遺伝的要因の関与を期待させる結果が得られたが、個体数を増やした試験結果で判断すべきであエ考 察ると考えた。また、神奈川県で継代飼育している酸欠試験 1 および酸欠試験 2 の二度の試験にお系統において、B 系は酸素欠乏耐性が弱く、C 系

いても、個体 No.2878 を雄親とする個体はそのいは同耐性が強いことが明らかになった。また、そずれにおいても酸欠に強い傾向が認められておの F1（CB 系）は C 系と同じかやや弱い程度の耐

り、酸欠耐性に遺伝的要因の関与を疑わせるもの性を示したことから、酸素欠乏耐性形質は優性遺で、興味深い結果であった。

伝形質である可能性が考えられた。本研究期間中

高温耐性試験に用いたヒラメ（平均値：全長に作出した F1（CB 系）を活用し、今後、戻し交

11.1ｃｍ、体重 11.3ｇ）は、おおよそ 33℃程度ま配家系を作出し分子遺伝学的解析により C 系ので耐えられることが確認できたが、飛びぬけて高酸素欠乏耐性形質に関連する DNA マーカーを探

温耐性があると認めるに十分な個体は認められ索することが期待された。

なかった。神奈川県で継代飼育している系統におキ

いて、B 系は酸素欠乏耐性が弱く、C 系は同耐性

文献が強いことが明らかになった。また、その F1（CB系）は C 系と同じかやや弱い程度の耐性を示した

1）C. C. Sanchez, K. Fuji, A. Ozaki, O. Hasegawa, T.

ことから、酸素欠乏耐性形質は優性遺伝形質であSakamoto, K. Morishima, I. Nakayama, A. Fujiwara,

る可能性が考えられた。本研究期間中に作出した

T. Masaoka, H. Okamoto, K. Hayashida, M. Tagami,

F1（CB 系）を活用し、今後、戻し交配家系を作

J. Kawai, Y. Hayashizaki and N. Okamoto; A

出し分子遺伝学的解析により C 系の酸素欠乏耐

second generation genetic linkage map of Japanese

性形質に関連する DNA マーカーを探索すること

flounder (Paralichthys olivaceus). BMC Genomics,が期待された。

11 (554), (2010).

オ 今後の課題
これまでのところ、飛び抜けて能力の高い高温
21

チーム名：ヒラメチーム
担当課題名：ヒラメの高温耐性関連形質の評価と DNA マーカー等の探索
研究機関・担当者名：東京海洋大学大学院海洋科学技術研究科・坂本 崇（電話：03-5463-0450, Email :takashis@kaiyodai.ac.jp）、神奈川県水産技術センター栽培推進部・長谷川理
研究期間：平成 24～25 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

系の各個体のヒレサンプルからゲノム DNA を抽

近年、地球温暖化による気温および海水温度上出し、分子遺伝学的解析に用いる。東京海洋大学

昇が問題となり、ヒラメなどの養殖でも対応が求が作成したヒラメ高密度マイクロサテライト連鎖

められている。その一つとして、育種により、高地図（Castaño-Sánchez et al., 2010）を参考に、各

水温耐性家系を作出することが挙げられる。本研

連鎖群から DNA マーカーを選択する。選択した究課題では、高温耐性家系の作出に貢献する DNA

各 DNA マーカーを用いて、低酸素耐性形質解析

マーカー等を探索することを目的としている。養家系の各個体を解析し、マーカー型データを得る。

殖業における温暖化への対策として、高水温下で低酸素耐性形質解析家系の各個体の低酸素耐性形の低酸素状態においても生残率の高い系統魚を開

質評価データとマーカー型データとの関連性につ発することは、温暖化対策の一助として有効な手

いて解析する（連鎖解析・QTL 解析）。

法であり、夏場の高水温時期への対策として必要とされている。そこで、神奈川県が維持継代してウいる低酸素耐性形質が異なる系統を用いて、低酸

研究結果① 低酸素耐性形質解析家系の作出と維持管理

素耐性形質に関連する DNA マーカーの開発を目

神奈川県水産技術センターにおいて、低酸素耐的とする。

性系統（C 系統）、低酸素非耐性系統（B 系統）
およびその系統間の F1（CB 系統）と低酸素耐性

イ

形質解析家系との間で戻し交配家系を作出した。

研究方法

解析家系は、KP-CBB 家系、KP-CBC-1 家系およ

① 低酸素耐性形質解析家系の作出と維持管理
神奈川県水産技術センターにおいて、低酸素耐

び KP-CBC-2 家系の 3 家系を作出した。これらに性系統（C 系統）、低酸素非耐性系統（B 系統）

低酸素耐性試験を実施し、解析家系の各個体の低およびその系統間の F1（CB 系統）を用いて、低酸素耐性形質を評価した（図 1）。

酸素耐性形質解析家系として戻し交配家系を作出する。低酸素耐性試験で生存した個体について
は、将来的なマーカー選抜育種のための親魚候補として飼育する。
② DNA マーカーを用いた低酸素耐性形質の QTL
解析
神奈川県水産技術センターにおいて、これまでに確立した実験条件で低酸素耐性試験を行い、解析家系の各個体の低酸素耐性形質を評価する。実験供試魚からヒレを採取し、分子遺伝学的解析の
図1

サンプルとする。
東京海洋大学において、低酸素耐性形質解析家
22

KP-CBB 家系の低酸素耐性試験

② DNA マーカーを用いた低酸素耐性形質の QTL

び次世代で検討することが望ましいと考えられた。

解析

今後、マーカー選抜育種法によって選抜された

神奈川県水産技術センターにおいて、東京海洋

親魚候補の交配が行われれば、低酸素耐性を有す

大学において、低酸素耐性形質解析家系の各個体

る新規ヒラメ系統の開発が期待され、より安全、のヒレサンプルからゲノム DNA を抽出し、分子

安心な魚の産業への利用・MAS 育種技術の開発へ

遺伝学的解析に用いた。ヒラメ高密度マイクロサと前進できるものと考えられる。本研究では得ら

テライト連鎖地図を参考に、各連鎖群から DNA

れた知見は、分子遺伝育種をはじめとする様々なマーカーを選択し、各 DNA マーカーを用いて、今後研究の推進と産業の活性化に役立つものであ

低酸素耐性形質解析家系の各個体を解析し、マーると考えている。

カー型データを得た。低酸素耐性形質解析家系の各個体の低酸素耐性形質評価データとマーカー型

オ

今後の課題

データとの関連性について解析（QTL 解析）した。
KP-CBB 家系における解析の結果、連鎖群（LG）

本課題において、C 系統は低酸素状態に耐性を24 上の 2 マーカー座近傍にヒラメの低酸素耐性形有することは確認するとともに、同系統由来の選質を司る遺伝子座があることがわかった。

抜マーカーも開発することが出来た。一方、すで

KP-CBC-1 家系および KP-CBC-2 家系におけるに実用化されているリンホシスチス耐性系統は解析の結果、それぞれ 1 連鎖群 1 マーカー、2 連

酸欠状態に弱い傾向が確認されている。今後は、

鎖群 4 マーカーで有意な結果が得られたが、強いそれぞれの長所を合わせ持った新系統を開発し関連性は見られなかった。

ていくことが必要である。

エ

考 察

カ

要 約

本研究により、KP-CBB 家系における解析の結果、ヒラメの低酸素耐遺伝子座は、連鎖群 24 上の本研究は、ヒラメ MS 連鎖地図から全連鎖群を2 マーカー座近傍にあることが明らかになった。

網羅するように、マイクロサテライトマーカーを

これらの MS マーカーは、今後のマーカー選抜育

選び、戻し交配家系 KP-CBB（167 尾）を用いて種法に利用できると期待される。近年報告された解析を行った。その結果、1 連鎖群（連鎖群 24）2

低酸素誘導因子（Hypoxia Inducible Factor, HIF）

マーカー座で低酸素耐性形質との強い関連性が示（Nikinmaa and Ress, 2005）は、低酸素耐性の候補唆された。本研究により得られた低酸素耐性形質遺伝子として今後の解析が期待される。

と連鎖する MS マーカーは、今後のマーカー選抜

KP-CBC-1 家系および KP-CBC-2 家系における育種法に利用できると期待された。

解析の結果、それぞれ 1 連鎖群 1 マーカー、2 連
鎖群 4 マーカーで有意な結果が得られたが、強いキ

文献

関連性は見られなかった。KP-CBC-1 家系およびKP-CBC-2 家系で有意な結果が得られた MS マー

1) Nikinmaa M and Rees BB (2005): Oxygen -カーは、KP-CBB 家系で関連性の見られた 2 マー

dependent gene expression in fishes. Am J

カーとは異なるマーカー座位だった。これらのPhysiol Regul Integr Comp Physiol, 288:

MS マーカーは、低酸素耐性形質と関連性を示す

R1079-R1090.

新規 MS マーカーの可能性があるが、他家系およ23

2．ニジマスチーム課題別研究成果

1）ニジマス高温耐性連鎖マーカーの探索と関連遺伝子の同定・・・・・・・・・・・・・・・・・・25（東京大学、宮崎県水産試験場）
2）ニジマス解析家系の作出および高温耐性の生物学的評価・・・・・・・・・・・・・・・・・・・31（宮崎県水産試験場）
3）ニジマスの高温影響を評価するバイオアッセイ系の開発・・・・・・・・・・・・・・・・・・37（中央水産研究所）

24

チーム名：ニジマスチーム
担当課題名：ニジマス高温耐性連鎖マーカーの探索と関連遺伝子の同定
研 究 機 関 ・ 担 当 者 名 ： 東 京 大 学 大 学 院 農 学 生 命 科 学 研 究 科 ・ 渡 部 終 五 （ 042-778-9094 、
awatabe@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp）・浅川修一・木下滋晴、宮崎県水産試験場・稲野
俊直・山田和也・田牧幸一・毛良明夫
研究期間：平成 21～25 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

個体から採卵を行い、同胞（両親が同じ）およびニジマス Oncorhyncus mykiss は水産上重要なサ

半同胞（両親の一方が同じ）の F2 を作出した。

ケ科魚類の一種であるが、冷水性であるため温暖
臨界最大温度と死亡温度による高温耐性評価

な気候での養殖には限界がある。また 21 世紀後半
から顕在化した地球温暖化は冷水性魚の育種環境

供試魚を 2 週間以上 20℃に馴致後、1 時間あたに大きな影響を与える可能性が懸念される。宮崎

り 5℃の昇温により、魚が平衡喪失する水温（臨県では 1966 年から開始した選抜育種により、比較

界最高温度、CTM）と鰓蓋運動を停止する水温（死的高い水温でも養殖できるニジマス系統（高温耐亡温度、DT）を測定した。

性系）を作出している。当該系統は、通常のニジ
平衡喪失までの時間による高温耐性評価

マス（標準系）に対し、半数致死温度、孵化率、
1,2)

また、

供試魚を 2 週間以上 20℃に馴致後、水温 28℃に高温耐性系では高温暴露による組織の損傷が少な保った水槽に収容し、平衡喪失するまでの時間を摂餌率に有意な高温耐性が認められる。
3)

いことも明らかになっている。 本担当課題は、計測するとともに、平衡喪失後に元の水温に戻し

この高温耐性系ニジマスを対象に、遺伝子発現解て生残率を調べた。

析やゲノムシーケンシングによって高温耐性に関

また、平衡喪失時間を表現型として 4 階級に区わる遺伝子を探索し、冷水性魚が高温耐性を獲得

分し、1 か月後に再度同条件で平衡喪失時間を測するメカニズムの解明を目指した。

定し再現性を調べた。

イ

COXII mRNA 量の定量

研究方法

標準系の検討と解析家系の作出

高温耐性系ニジマスと標準系ニジマス（長野系

高温耐性系ニジマスの対照となる標準系候補とおよび日光系）を用いた。各系統の幼魚 5 個体かして、中央水産研究所日光支所（日光系）および

ら脳、心臓、肝臓、筋肉、鰭の各組織を採取し、青森県内水面研究所（青森系）のドナルドソン系

全 RNA を抽出した。
定量的 real-time PCR により、ニジマスを検討した。各系統の幼魚を 15℃あるいEF-1α 遺伝子を内部標準として各組織におけるチは 20℃に馴致し、5℃/時間の昇温速度で加温し、ト ク ロ ー ム c オ キ シ ダ ー ゼ サ ブ ユ ニ ッ ト II

平衡喪失温度（臨界最高温度，CTM）と死亡温度(COXII) mRNA 量を定量し、両系統間で比較した。

（DT）を測定した。家系作出は、高温耐性系および標準系の雌雄各 5 個体を用いて、雌雄各 1 個体

トランスクリプトーム解析

あるいは雌雄 5 個体ずつを混合することで行った。

高温耐性系 5 個体および標準系（日光系）5 個

解析家系として、日光系雌雄 5 個体と高温耐性体を用い、26℃の高温暴露前後で脳、筋肉、肝臓、系雌雄 5 個体と総当たり交配して計 40 家系を作出

鰓を採取し RNA 抽出用試料とした。各組織からした。交雑群（F1）の中、順調に成育・成熟した得られた全 RNA から cDNA ライブラリーを構築
25

し、Illumina GA を用いたペアーエンドシーケンスを加工後、最終的に Excel ベースで両群間で多型に供した。得られたシーケンスデータは Velvetの頻度差のある SNP サイトを抽出した。

および Oases を用いでアセンブルした。得られた

また、高温耐性群および非耐性群各 32 尾の鰓のcontig は Blast によりアノテーションするとともに、 Total RNA を抽出し、cDNA を作成後、定量的 real
各 contig に高温耐性系および標準系のリードをマ

time PCR により HSP70b 遺伝子の発現量を定量しップし、リードの発現頻度解析から高温耐性系にた。

特徴的な遺伝子群を探索した。高温耐性系と標準系で発現量に顕著な違いがみられた遺伝子につ2012 年度産高温耐性系ニジマスにおける HSP70b

いては、定量的 real-time PCR によって発現量を検の発現量解析
2012 年度産高温耐性系ニジマスにつき、28℃高証した。

温暴露で平衡喪失するまでの時間が 80 分以上のリファレンスゲノムの構築

高温耐性群と 20 分以下の非耐性群を選別し、各高温耐性系ニジマスの尾鰭からゲノム DNA を

群 5 尾の鰓の Total RNA を抽出した。Total RNA抽出した。RNase 処理により混入した RNA を除去

から cDNA を作成し、定量的 real time PCR により後、定量的 real-time PCR により、予め定量した

HSP70b 遺伝子の発現量を解析した。

COXII 遺伝子(COXII)の PCR 産物から作成した検量線を基に COXII のコピー数を算出し、ミトコン

ウ

研究結果

標準系の検討と解析家系の作出

ドリアゲノムの混入量を推定した。得られたゲノム DNA からライブラリーを調製し、GS FLX454

20℃で馴致した供試魚の CTM は、高温耐性系とシーケンサによるショットガンシーケンシングを日光系間で有意差が認められた（P<0.05）。した

行った。

がって日光系を標準系として解析家系を作出することとした。

また、宮崎県水産試験場で、高温耐性系雌の卵から作成された第一卵割阻止型雌性発生 2 倍体の交雑群（F1）のメス 137 尾、オス 72 尾を用いて稚魚からゲノム DNA を抽出し、Illumina GA を用採卵を行い、66,388 粒の発眼卵（F2）を得た。用いて平均 400bp と 700bp のペアーエンドシーケン

いた F1 は 13 家系で日光系のメス親由来の F1 が 5

シングおよび平均 2kb と 5kb のメートペアシーケ

家系、宮崎系のメス親由来の F1 が 8 家系であった。

ン シ ン グ を 行 っ た 。 得ら れ た塩 基 配列 か ら、
高温耐性系と標準系間の COXII mRNA 蓄積量のSoapdenovo を用いて de novo アセンブリを行った。

比較
F2 のゲノムシーケンシングと SNP タイピングお先行研究で、高温耐性系ニジマスの未受精卵および HSP70b の発現量解析

よび初期胚では、COXII などのミトコンドリア

F2 の高温耐性群と非耐性群につき、各群それぞDNA にコードされるエネルギー産生関連遺伝子

れ 32 尾の鰭から抽出した DNA でゲノムライブラ

群の mRNA 蓄積量が増加していることが明らかに

リーを調製し、llumina Hiseq2000 を用いてマルチなっている。4) しかしながら、定量的 real-time PCRプレックスシーケンシングを行った。CLC genomic

で幼魚の各組織における発現量を定量した結果、

workbench を用いて、各個体のリードを高温耐性系

日光系統と比較すると、脳を除く 4 組織で高温耐由来雌性発生 2 倍体から構築したリファレンスゲ

性系の方が COXII mRNA の蓄積量が高い傾向をノムにマッピングし、UNIX コマンド等でデータ示したが、有意差は認められなかった。また、長26

35．1％

野系統に対しては、高温耐性系の鰭で、COXII

26．4％

22．4％

mRNA の蓄積量が高い傾向を示したが、筋肉と肝16％

臓ではむしろ低く、いずれも有意差は認められなかった。
初期胚と違って幼魚では COXII 遺伝子の発現上昇が起きていない可能性が考えられる。少なくとも今回用いた系統について、COXII 遺伝子はニジマスの高温耐性の選別マーカーとしては有用といえないと判断した。

図 1．F2 の 28℃暴露による高温耐性評価試験．平衡喪失

F1 の高温耐性評価までの時間で 4 つの階級に分類することで、再現性の高高温耐性系と F1 の平衡喪失温度に差は認めらい評価方法を確立した．

れなかったが、日光系と F1 の間には有意な差が認それぞれ 100M リード以上のシーケンスデータをめられた。また、F1 同士の比較では同じ系統で雄得た。これらの一部（50M、または各条件 12.5M

由来、雌由来の差は認められなかった。

のミックス）を用いてアセンブルを行い、遺伝子モデルを構築した。このうち、鰓で発現しており、高温耐性評価法の検討

１kb 以上の 13,736 種類の遺伝子の発現量を両系

水温 28℃でニジマスを保持した場合、平衡喪失

統で比較した結果、高温耐性系で標準系より発現

時間は 18~55 分と幅広く、温度耐性の違いを容易が多い遺伝子が多数同定され（図 2）、ここにはに検出できることが期待できた。また、実験後の複数の熱ショックタンパク質（heat shock protein,

生残率は 100％であり遺伝子発現解析等、他の実HSP）遺伝子が含まれていた（表 1）。5) 特に HSP70b

験にも使用可能であった。したがって F2 の高温耐については、標準系に対し高温耐性系で 2000 倍

性評価には本評価法を用いることとした。

以上上昇しており、定量的 real-time PCR でも同様の結果が確認された。また、c-fos およびその関連

F2 の高温耐性評価と高温耐性群、非耐性群の選別

遺伝子の発現も高温耐性系で恒常的に上昇して1 回目の 28℃高温暴露による平衡喪失時間をもいた（表 1）。

とに F2 稚魚を 0~30 分未満、30～45 分未満、45
Before Heat-exposureBoth～60 分未満および 60 分以上の 4 階級に分類した（図 1）。1 か月後に同様の条件で平衡喪失時間

Gillを測定しところ、高温耐性群（60 分以上）と非耐

308

Muscle性群（30 分未満）の階級で、結果の再現性が認め
られた。

546

226 64

Liver
Heart

247

Brain

414

520

707
819

305

349

798

125

801

500

1000

297

トランスクリプトーム解析
0

高温耐性系および標準系（日光系）それぞれ 1

1500

図 2．高温耐性系ニジマスで標準系に対して発現量の多個体につき、熱ストレス付加前後の各組織から、い遺伝子の数（青：高温曝露前、赤：高温曝露前後、緑：
高温曝露後）

27

表 1．高温耐性系で顕著に発現量が増大していた遺伝子の標準系に対する発現量比

発現量の値は標準系に対する高温耐性系の発現量の比率.
heat shock protein 70kDa isoform b: HSP70b.
付加前/後: 高温暴露前/高温暴露後

脳、心臓、肝臓および筋肉についても同様に解第一卵割阻止型雌性発生 2 倍体の DNA をソース

析したところ、それぞれの組織で高温耐性系で発に、Illumina GA を用いてシーケンシングを行い、現量が上昇している遺伝子が多数同定され（図 2）、60×ゲノム相当のシーケンスデータが得られた。こ鰓と同様に、ここには複数の HSP 遺伝子およびれを用い、k-mer 値の設定を様々に変更し de novo

c-fos 関連遺伝子が含まれており、特に HSP70b のアセンブリを行った結果、k-mer 値を 59 bp 前後発現上昇が顕著であった（表 1）。本結果から、に設定することで、良好な結果が得られた。この

高温耐性系の組織全体で HSP の恒常的な発現上

時 、ア セ ン ブル で 得 ら れた ゲ ノ ムの サ イ ズは昇が起きていることが示された。

2.2Gb で、N50 値は 15,046b、推定ゲノム被覆度は0.92 倍であった。

レファレンスゲノムの構築
抽出したゲノム DNA につき、ミトコンドリア

F2 高温耐性群と非耐性群の SNP タイピングによる Genome Wide Association Study (GWAS)

ゲノムにコードされる COXII 遺伝子を指標に定量 PCR 法でミトコンドリア DNA の含有量を定量

F2 につき、28℃暴露による平衡喪失までの時間

した結果、5%以下と見積もられたため、そのまから分類した高温耐性群 32 尾と非耐性群 32 尾かまシーケンシングの出発材料として使用するこらそれぞれ 56.4Gb と 89.9Gb のデータを得た。全ととした。GS-FLX454 シーケンサにより、高温耐

ゲノムのドラフト配列（2.32Gb）に対する被覆度

性 系 の ゲ ノ ム か ら 4,634,401 リ ー ド 、はそれぞれ 24.3 倍および 38.8 倍であった。全ゲノ

1,531,336,345bp の配列情報を取得した。また、こムのドラフト配列をレファレンスに SNP 解析した

こから 193,432 のマイクロサテライト遺伝子座が結果、13,595,569 ヵ所の SNP サイト候補が得られ、検出された。

出現頻度は 1 サイト/170bp であった。このうち高さらに、リピートの多いニジマスゲノムからよ温耐性群と非耐性群間で多型構成の差が特に大きり正確に、かつより多く配列情報を得るため、全

な SNP サイトを 5907 個抽出した。さらにこれら遺伝子座がホモ接合していることが期待されるの中で特定のゲノム領域に集中してクラスターを28形成する SNP、695 個（34 クラスター）を抽出し発現上昇がニジマスに高温耐性を付与したと考た。さらに当該領域から有力遺伝子を見いだした。

えることは蓋然性が高く、今後ニジマスや他の魚また、この F2 高温耐性群および非耐性群につき、種で高温耐性個体を選別する際に、HSP の発現レベルが有効な指標になると考える。

各 32 個体の HSP70b mRNA 量を定量したところ、

また、先行研究では高温耐性系の未受精卵およ高温耐性群で HSP70b の発現が亢進している個体

び初期胚で、COXII などミトコンドリアでの ATPは検出されなかった。

産生に関わる一群の遺伝子の発現量が上昇して2012 年度産高温耐性系ニジマスにおける HSP70b

いることが報告されているが、3) HSP は変性タンの発現量解析

パク質の修復時に ATP を消費することから、HSP

高温耐性群 5 個体および非耐性群 5 個体を解析の発現上昇との関連に興味が持たれる。ただし、したが、いずれにおいても HSP70b を高発現して本課題において高温耐性系の幼魚で COXII の発いる個体はみられなかった。

現上昇は確認できなかった。

一方、この 2012 年度産高温耐性系を用いて、一方、高温耐性系の一部に HSP の高発現を示

28℃暴露による平衡喪失時間で階級分類を行ったさない個体が存在することは以前から判明してところ、0～20 分未満が 8%、 60 分以上が 49％でおり、HSP の発現上昇とは別の高温耐性獲得メカあった。上述の F2 の階級分類結果 では 0～20 分

ニズムもあると考えられる。実際に、本課題で解未満が 16％、60 分以上が 22％であったことから、析した 2012 年度産の高温耐性系および F2 の高温

HSP70b の高発現がないにもかかわらず、当該高温耐性群については HSP70b の発現上昇がみられな耐性系が高水温に強いことが確認された。

かった。これら供試魚の家系は、トランスクリプ
トーム解析に用いた集団と同祖であるが、その祖

エ

先集団の一部を 2008 年度に海水飼育して生き残

考 察

変性タンパク質の修復や除去を行う HSP はったものを F0 として作出している。海水飼育の個体のストレス耐性に直接的に寄与し、HSP の強段階で HSP 高発現型個体が淘汰された可能性が

制発現は生体のストレス耐性を向上させる。トラ

大きい。したがって、この F2 集団の SNP 解析か

ンスクリプトーム解析では、真核生物の代表的ならは、HSP70b には依存しない新たな高温耐性関連

HSP である HSP70b の発現が、高温ストレスの有遺伝子が同定されるものと期待できる。現在、F2

無に関わらず、高温耐性系で恒常的に発現が亢進

高温耐性群および非耐性群間で特定のゲノム領域しており、それは組織によっては mRNA レベルにクラスターを形成する SNPs が多数検出されてで標準系の数千倍に達した。なぜ HSP の発現量おり、これらは高温耐性の表現型と直接関連するが上昇しているかは不明であるが、c-fos およびそ多型、あるいはそれらの連鎖している多型と考えの関連遺伝子の発現も同様に高温耐性系で恒常られ、高温耐性の表現型を追跡するマーカーとし的に上昇しており、ほ乳類では HSP 遺伝子プロて使用できる。今後の解析で、これらのクラスタ

モーターに存在し、そのストレス依存的な発現にー領域から高温耐性獲得の原因遺伝子が同定され関わるヒートショックエレメント（heat shock

るものと期待する。

element, HSE）が c-fos 遺伝子のプロモーターにも含まれ、in vivo で機能していることが示されていオ 今後の課題る。したがって、高温耐性系では HSE をプロモ
ーターに有する遺伝子の発現が活性化している

海水飼育を通していない高温耐性系からのかもしれない。いずれにせよ、HSP の恒常的なHSP70b の高発現個体を選別し、HSP70b の高発現29

と高温耐性との関連を遺伝学的に調べることがーであり、当該領域から高温耐性の原因遺伝子の必要である。また、SNP 解析に用いた F2 および同定が期待される。本成果は活用可能なゲノムシ2012 年度産高温耐性系におけるトランスクリプ

ーケンスデータが存在しない段階から研究を開

トーム等の遺伝子発現解析を行い、HSP70b を高始し、ヒト以外で GWAS を行って有力遺伝子の発現していない高温耐性個体で、どのような遺伝同定に至った先駆的な研究成果であり、いち早く子の発現変化が高温耐性を付与しているかを検各種水産生物で同様の手法の応用が望まれる。

討することも望まれる。F2 の高温耐性群と非耐性群間の多型解析からは、特定のゲノム領域に高キ

文 献

温耐性群と非耐性群間で多型頻度に大きな差のある SNP がクラスターを形成して検出された。

1) Ineno T, Tsuchida S, Kanda M, Watabe S. (2005).

これら領域には高温耐性の表現型と関連する遺Thermal tolerance of a rainbow trout Oncorhynchus

伝子（多型）の存在が見込まれるため、その同定

mykiss strain selected by high-temperature breeding.

のためには、さらなる個体の解析が望まれる。

Fish. Sci., 71:767-775.
2) Ineno T, Endo M, Watabe S. (2008). Differences inカ

要 約

self-feeding activity between thermally selected andnormal strains of rainbow trout Oncorhynchus

宮崎県で作出された高温耐性ニジマス系統（高mykiss at high temperatures. Fish. Sci., 74:372-379.

温耐性系）を対象に、遺伝子の発現解析とゲノム

3) Itoi S, Ineno T, Kinoshita S, Hirayama Y, Nakaya

シーケンシングによって、高温耐性獲得の原因とM, Kakinuma M, Watabe S. (2001). Analysis on

なった遺伝子の探索を行った。高温耐性系と標準

serum proteins from rainbow trout Oncorhynchus

系の様々な組織につき、次世代シーケンサによる

mykiss exposed to high temperature. Fish. Sci.,

トランスクリプトーム解析を行った結果、高温耐67:191-193.

性系では熱ストレス応答に関わる HSP の発現量が4) Ikeguchi K, Ineno T, Itoi S, Kondo H, Kinoshita S,

恒常的に上昇しており、これにより宮崎系は高温

Watabe

耐性を獲得していること、HSP がニジマスの高温

mitochondrial gene transcripts in the thermally

耐性のマーカーとして利用できることが考えられ

selected rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

た。一方、高温耐性系の一部個体は HSP の恒常

strain的な発現上昇を示さないこと、本検討課題で解析

Biotechnol., 8:178-188.

S.

during(2006).

Increased

embryonic

levelsdevelopment.

of

Mar.

した F2 の高温耐性群では HSP の発現上昇が認め

5) Tang E, Wongwarangkana C, Kinoshita S, Suzuki Y,

られなかったことから、HSP の高発現とは別の高Oshima K, Hattori M, Ineno T, Tamaki K, Kera A,

温耐性のメカニズムもあると考えられる。F2 のMuto K, Yada T, Kitamura S, Asakawa S, Watabe

高温耐性群および非耐性群を用いたゲノムシー

S. (2012). Global gene expression analysis of gill

ケンシング／SNP タイピングによる GWAS では、

tissues from normal and thermally selected strains

特定のゲノム領域に両者間で多型頻度に大きな差

of rainbow trout. Fish. Sci., 78:1041-1049

がある SNP を 695 個（34 クラスター）抽出することができた。またそれらのクラスター領域から高温耐性と関連する有力な候補遺伝子を見いだすことができた。これら SNP は有力な高温耐性マーカ
30チーム名：ニジマスチーム
担当課題名：ニジマス解析家系の作出および高温耐性の生物学的評価
研究機関・担当者名：宮崎県水産試験場生物利用部小林分場・稲野俊直（0984-23-3358、
ineno-toshinao@pref.miyazaki.lg.jp）田牧幸一・山田和也・毛良明夫
研究期間：平成 21～23 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

9 尾の高温耐性系の精液を人工精しょうで 10 倍

地球温暖化の進行は、産業的に重要な冷水性魚に稀釈し、円筒形の浅型蓋付き容器に 10ml ずつ収類のニジマス生産に大きな影響を与えることが懸容し、氷冷して水産総合研究センター中央水産研念される。宮崎県では 1966 年から開始した選抜飼究所日光支所に運搬した。この内、採卵時に顕微育実験により、高い水温でも養殖できるニジマス

鏡下で活発な運動性が確認された 5 尾分の精液をの系統（高温耐性系）を作出している。本研究で授精に用いた。日光系のメス 5 尾を用い、1 尾ずは、この系統を対象に、生物学的な高温耐性の評

つ採卵した卵を重量割りで 5 等分し、それぞれに

価 手 法 を 開 発 する と と もに 量 的 形 質遺 伝 子 座

異なるオスの精液を媒精した。受精卵は、25 通り（quantitative trait loci, QTL）解析に用いるニジマの家系を個別に発眼期まで管理し、その後、宮崎ス家系を確立し、高温耐性関連遺伝子の同定とそ

県水産試験場小林分場に移送してふ化させた。同の機構解明の一助とすることを目指す。

様に日光支所で採精した 9 尾分の精液を宮崎県水産試験場小林分場に運搬し、高温耐性系のメス 5

イ

研究方法

尾の卵と日光系のオス 5 尾の精液を用いて 25 通り（１）対照系統の高温耐性の評価の交配を行った。

供試魚は、尾叉長 50 mm 前後（約 10 g）の水産正常ふ化した 40 通りの F1 を群別の水槽で飼育

総合研究センター中央水産研究所日光支所で生産した。飼育水は周年 17℃程度の湧水を用い、給餌されたドナルドソン系ニジマス（以下「日光系」

率はライトリッツの給餌率表に従った。なお、魚という。）、青森県内水面研究所で生産されたド体重 50g 程度に成長した時点で群識別のため蛍光

ナルドソン系ニジマス（以下「青森系」という。）

色素により標識を施し一部は混合飼育を行った。

および宮崎県水産試験場で生産された高温耐性系（３）解析家系 F1 の高温耐性評価

ニジマス（以下「高温耐性系」という。）をそれ

供試魚は、高温耐性系メス×日光系オスの F1 がぞれ 50 尾程度用いた。これらの供試魚は、実験前平均体長 101 mm、平均体重 18g、日光系メス×高2 週間以上、15°C および 20°C に馴致した。実験水

温耐性系オスの F1 が平均体長 108mm 、平均体重槽には１水槽につき日光系または青森系を 3 尾と23g であった。それぞれ 30 尾用いて実験前 2 週間

宮崎系を 2 尾収容し、1 時間あたり 5°C の昇温速

以上、 20°C に馴致した。実験水槽には 1 水槽に度で加温し、供試魚が平衡喪失する水温（臨界最つき 6～10 尾収容し、1 時間あたり 5°C の昇温速

高温度、CTM）と鰓蓋運動を停止する水温（死亡度で加温し、供試魚が平衡喪失する水温（臨界最温度、DT）を測定して、高温耐性系と交配する対

高温度、CTM）と鰓蓋運動を停止する水温（死亡照系統を選択した。更に、選択した対照系統の発温度、DT）を測定した。

眼卵を宮崎県水産試験場小林分場でふ化させ、高（４）解析家系Ｆ2 の作出

温耐性系と同一飼育条件で育成した後に CTM を

平成 21 年に高温耐性系の雌雄 5 個体と日光系の測定し比較した。

雌雄 5 個体を総当たり交配して得た 40 通りの交雑（２）解析家系 F1 の作出及び育成

群（F1）の中で順調に成育・成熟した個体から採31

卵を行い、同胞（両親が同じ）および半同胞（両られた（P<0.05、 t-test、ANOVA）（図 1）。し親の一方が同じ）の F2 を作出した。

かし、20°C で馴致した供試魚の鰓蓋運動停止温度（５）表現型としての高温耐性評価手法の検討（死亡温度、DT）は、系統間で差が認められなか量的形質を比較する手法を検討するため、平成った。

20 年度に作出した高温耐性系メスと長野県産オス

また、15°C で馴致した供試魚は、CTM およびの交雑群 F1 の雌雄 3 尾ずつの同胞による交配で作DT の系統間の差は認められなかった。

出した F2 の平衡喪失時間を調べた。
すなわち 17°C
8で飼育していた供試魚を 6 尾ずつ水温 28°C に保っ

N=28

7

た水槽に収容して平衡喪失するまでの時間を計測

6

した。

4

高温耐性系
30.0℃±0.3047

53

同様に水温 28℃に保った水槽に高温耐性系(F0)2を収容し、平衡喪失するまでの時間を計測して、

8
0

1

7

平衡喪失した個体を個別に元の飼育水温の水槽に

日光
29.7℃±0.4791

5

戻して生残率を調べた。さらに平衡喪失時間を表

＊

N=18

6
4
3

現型として 4 階級に区分し、再度 28°C で平衡喪失

21

時間を測定して再現性を調べた。

80
7
6
5
4
3
2
1
0

（６）F2 の高温耐性評価
高温耐性系と日光系を交配して得た交雑群（F1）の同胞（両親が同じ）から作出した F2 の 2 群と日光系を用いた。それぞれの平均体重は 4.1g、6.2g、

N=23

青森
29.9℃±0.2874

28

28.5

29

29.5

30

30.5

31

20℃馴致したニジマスのCTM ℃

4.7g であった。各群 32～33 尾用いて実験前 2 週間
図1

以上、 20°C に馴致した。実験水槽には 1 水槽に

高温耐性系と対照系の CTM の比較

つき 6～10 尾収容し、CTM と DT を測定した。
（７）表現型の分類と再現性の確認（２）解析家系 F1 の作出及び育成

投込み式ヒーターを設置し通気しながら 28°C に対照系統の高温耐性の評価結果を踏まえて、日光保った 60cm 水槽に上記と同じ F2 を 50 個体ずつ系を対照系統とし、高温耐性系メスと日光系オス収容して、平衡喪失した個体を順次取り出し平衡を 5 尾ずつ用いて 25 通りの家系を作出した。また、喪失までの時間を個体毎に調べ、0～20 分未満、

日光系メスと高温耐性系オスを 5 尾ずつ用いて 25

20～40 分未満、40～60 分未満、60 分以上に 4 分通りの交配を行い、うち 15 通りの交配から発眼卵類した。次に 4 分類した群毎に再度同じ方法で平が得られた(表 1、2)。

衡喪失時間を調べた。さらに平衡喪失時間 0～20得られた 40 交雑群の F1 の内、36 群が順調に成分未満と 60 分以上の群は、再度（3 回目）同じ方長した。

法で平衡喪失時間を調べた。
ウ

研究結果（１）対照系統の高温耐性の評価
20°C で馴致した供試魚の平衡喪失温度（臨界最高温度、CTM）は、高温耐性系（30.0°C±0.3047）と日光系（29.7°C±0.4791）の間で有意な差が認め
32

表1

解析家系の作出結果は認められなかった（図 2）。

（交配の組合せと発眼卵数及び発眼率）（４）解析家系 F2 の作出
F1 のメス 137 尾、オス 72 尾を用いて採卵を行い、66,388 粒の発眼卵を得た。用いた F1 は 13 群であり、日光系（F0）のメス親由来の F1 が 5 群、高温耐性系(F0)のメス親由来の F1 が 8 群であった。F1の同胞及び半同胞の組み合わせであった。
（５）表現型としての高温耐性の評価法の検討
F2 の平衡喪失時間の分布(図 3)を高温耐性系(図4)と比較した。F2 の平衡喪失時間は、高温耐性系に比べて長い個体が多く、分布域が広かった。

表 2 解析家系の作出結果

30（交配の組合せと発眼卵数及び発眼率）

25
20
尾

15
10
5
0

1～10 11～20 21～30 31～40 41～50 51～60 61～
平行喪失時間図3分

F2 の平衡喪失時間の分布（３）解析家系 F1 の高温耐性評価
尾

高温耐性系と F1 の平衡喪失温度を比較すると、両者に差は認められなかった。
（尾数）

（尾数）

12
10

12

高温耐性系
30.0℃±0.3047

10

8

8

6

6

4

4

2

2

0

0

12

12

10

F1（F0メスが宮崎）
30.1℃±0.143

8

6

6

4

4

2

2

0

0

10

高温耐性系(F0)の 1 回目の高温暴露による平衡喪失時間をもとに 30 分未満、30～45 分未満、45～60 分未満、60 分以上の 4 階級に分類し、1 か月

＊

＊
12

日光系
29.7℃±0.4791

後に同様の条件で階級別に 2 回目の平衡喪失時間

10

8

8

6

6

4

4

2

2

0

を測定した。60 分以上の階級では 71％が 1 回目と同じ階級であったが、30 分未満階級では 17％、

0
28.5 28.8 29.1 29.4 29.7

30

30.3 30.6 30.9 31.2

CTM

図2

分

図 4 高温耐性系の平衡喪失時間の分布
F1（F0メスが日光）
30.1℃±0.153

10

8

12

平行喪失時間28.5 28.8 29.1 29.4 29.7

30

30.3 30.6 30.9 31.2

30～45 分未満階級では 50％、45～60 分未満階級℃

解析家系 F1 とその親系統 F0 の CTM の比較

では 29％が 1 回目と同じ階級となり、60 分未満

しかし、日光系（29.7°C）と F1（30.1°C）の間には平衡喪失温度に有意な差が認められた。また、
F1 同士の比較では両親(F0)の系統の違いによる差33の 3 階級は 2 回目の高温暴露で平衡喪失時間が長くなる傾向を示した(表 3)。

平衡喪失時間 0～20 分未満の群を再度高温暴露(2 回目)したところ処理後へい死した個体を除いて 207 尾中 118 尾(57%)で再現性が確認された（図7）。

表 3 高温暴露による平衡喪失時間の再現性
1回目

平行喪失時間
1回目と同階級
2回目 1回目より早く平行喪失
1回目より遅く平衡喪失

30分未満
17%(1/6)－
83%(5/6)30～45分未満
50%(3/6)
17%(1/6)
33%(2/6)45～60未満
29%(2/7)
14%(1/7)
57%(4/7)

60分以上
71%(5/7
29%(2/7-（６）F2 の高温耐性評価

150

図 5 に示すとおり CTM は F2 の 2 群で日光系よ100

り高い個体が現れ、F2 の No.15 群では日光系より

20分未満2回目

50低い個体が現れた。2 群の F2 の CTM は、30.2 及

0び 30.1°C であった。しかし、各群の間で CTM に50差は認められなかった（t 検定、p>0.05）

0F2：No.15 群

0～20分 20～40分 40～60分 60分～
20分未満３回目
0～20分

20～40分

40～60分60分以上

平衡喪失時間図7

平衡喪失時間 20 分未満の個体の再現性の確認

再現性があった群の 33 尾を用いて再々度高温暴
露したところ、平衡喪失時間は全個体が 0～20 分
F2：No.31 群

未満であり、再現性(100%)が認められた（図 7 下）。
また、平衡喪失時間 60 分以上の群を再度高温暴
露すると 142 尾中 124 尾(85.5%)が 60 分以上の平衡喪失時間を示し、高い再現性が認められた(図

日光系

図5

8)。

CTM の分布の比較

臨界最高温度は F2 の 2 群で日光系より高い個体が現れ，F2の No.15 群では日光系より低い個体（７）表現型の分類と再現性の確認
F2 を 1,614 尾用いて図 6 のとおり 4 分類した。0～20 分未満が 269 尾(16%)、20～40 分未満が 426
尾(26.4%)、40～60 分未満が 567 尾(35.1%)、60 分
以上が 362 尾(22.4%)であった。

図8

平衡喪失時間 60 分以上の個体の再現性の確認

エ 考 察
かつて宮崎県で系統保存していたドナルドソン
系ニジマスの CTM は、29.9°C であった 1）ことから、日光系は高温耐性系の比較対象として遜色な
いと考えられた。また、15°C で馴致した場合には系統間で差が認められなくなることも過去の実験結果と一致しており、CTM および DT による高温耐性を評価する場合には、供試魚を 20°C で馴致す

図6る条件で実験を行うことが望ましいと考えられた。

F2 の 28℃における平衡喪失時間の分布

遺伝的に分離した世代を養成するため、高温耐34

性を示す高温耐性系と高温に対する耐性が低い日考えられる。

光系を交配して F1 世代を作出した。この F1 の表

CTM の低い系統のニジマスに高温耐性系ニジ

現型が高温耐性系と日光系の中間的な表現型を示

マスを交配することで、CTM が上昇することがすと予想したが、図 3 に示すように CTM は日光系

F1 の作出によって分かった。しかし、実際の養殖より高いものの中間的な分布を示さなかった。し現場において CTM の差がどの程度高温耐性に反かし、CTM の範囲は、F1 で 29.5～30.4°C であり映するか不明である。同様に平衡喪失時間による高温耐性系の 29.1～30.4°C より狭く、表現型の変階級分類についても、この手法により得られた表異の幅が小さくなったと考えられた。

現型が養殖環境下でも有用な高温耐性の形質とな

分離世代には F1 にその親世代 F0 を交配する戻るか検証する必要がある。

し交配を作出する方法も考えられるが、F1 が成熟し交配に供することができるまでに 2 年を要する

カ

要

約

ことから、F0 を確実に保存できないため、兄弟交
配(full-sib)及び半兄弟交配(half-sib)2）の F2 を作出１した。

QTL 解析に用いる解析家系を作出するため水産総合研究センター中央水産研究所日光支所

2 群の F2 の CTM は、30.2 及び 30.1°C であり高で生産されたドナルドソン系ニジマス（以下

温耐性系 F0 と同程度であったが、CTM の範囲は

「日光系」という。）と青森県内水面研究所で28.3～30.6°C で高温耐性系 F0 より幅が広がった。

生産されたドナルドソン系ニジマス（以下「青これは F2 で表現型の変異が大きくなったためと森系」という。）の臨界最高温度（CTM）を比考えられた。

較し、29.7±0.4791°C の日光系を対照系群に選

これまでに高温耐性の評価手法として CTM をんだ。

用いてきたが、CTM では表現型の差が小さいため

２

分類が難しいことから、平衡喪失時間の長短によ高温耐性系と日光系の雌雄 5 尾ずつを総当たり交配し、40 通りの F1 が得られた。

る分類を行ったところ、凡そ 10～60 分の範囲で個３体別に平衡喪失時間を計測できた。また、平衡喪F1 の CTM は 30.1°C で日光系 F0 の 29.7°C より有意に高かった。

失した個体は速やかに取り上げて飼育水に戻すこ

４

F2 作出に用いた F1 は 13 群であり、日光系（F0）とで生残するため、28°C の高温暴露により平衡喪のメス親由来の F1 が 5 群、高温耐性系(F0)のメ

失時間 20 分毎に 4 分類とし、各階級別に再度同じ

ス親由来の F1 が 8 群であった。

方法で 4 分類すると非常に高い再現性を示す表現

５28°C の高温暴露による平衡喪失時間をもと型に分類できた。さらに、表現型の階級分類を行に 30 分未満、30～45 分未満、45～60 分未満、った個体を継続飼育し、次世代を得ることができ

60 分以上の 4 階級に分類し、再現性を調べた

れば、平衡喪失時間の遺伝率を調べる手法や選抜

ところ 2 回目の高温暴露では平衡喪失時間が手法としても利用可能と考えられた。

長くなる傾向を示した。
６

オ 今後の課題

CTM の範囲は 28.3～30.6°C で高温耐性系 F0より幅が広がった。これは F2 で表現型の変異が大きくなったためと考えられた。

分離世代として養成した F2 について、QTL 解

７28°C の高温暴露による平衡喪失時間で 4 分

析を実施するにあたり複数得られた F2 の何れの類した群れを再度階級毎に同じ方法で 4 分類す群を用いるかによって解析の効率が左右されるとると 0～20 分未満では再現性(100%)が認められ35た。また、60 分以上の群でも 85.5%の高い再現性が認められた。
キ

文献1）Ineno T, Tsuchida S, Kanda M, Watabe S (2005)
High temperature tolerance of rainbow trout
Oncorhyncus mykiss selected by high temperature
breeding. Fish. Sci. 71: 767-775.
2)

鵜飼保雄 (2001) ゲノムレベルの遺伝解析
MAP と QTL 原著第 2 版．東京大学出版会．
45-50.

36

チーム名：ニジマスチーム
担当課題名：ニジマスの高温影響を評価するバイオアッセイ系の開発
研究機関・担当 者名：（独 ）水産総合 研究セン ター中央水産研 究所・尾島 信彦（045-788-7640、
ojima@affrc.go.jp）・馬久地みゆき・大原一郎
研究期間：平成 21～25 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ア

研究目的

パク質（ヘモシアニン）に結合させ、それぞれウ

内水面の主要な養殖対象種であるニジマスは、サギに免疫して抗血清を得た。
また、その他の HSP

通常 10〜24℃付近の淡水に生息する冷水性魚でや分子シャペロンも検出して分析するため、主にある。そのため、もし地球温暖化により環境水温

哺乳類の分析用に市販されている抗体（抗 Hsp90、が上昇すれば、
その成長・繁殖などに影響が及び、

Hsp60、Hsp47、Hsp40、Hsp30、Hsp25、Hsp10、生産量が減少する可能性がある。このような背景

Grp94、Grp78、Grp75 抗体）を入手した。各抗血の下、高水温耐性を有するニジマス系統の作出が清や抗体の目的遺伝子産物に対する結合特異性は望まれている。これまで宮崎県ではニジマスの高ウェスタンブロット法により評価した。分析用の水温飼育実験により比較的高水温で養殖できるニ試料として、ニジマス RTgill-W1 培養細胞から抽ジマス系統（高温耐性系）を生産できることを明出した総タンパク質を用いた。RTgill-W1 細胞は1、 2)、東京大学では高温耐性系でミトコ

18℃で培養し、高温処理（28℃、1 時間→18℃、5ンドリアの電子伝達系に関連する遺伝子が特異的時間）を行った。また、ヒト HeLa 細胞から抽出

らかにし

3)

。一方、

した総タンパク質を比較用として用いた。市販のその他の遺伝子の発現特性については未だ不明な抗体で検出できなかった HSP については、上述の点が多く、選抜効果を評価するためには高温耐性

方法により新規に抗体を作製した。

に発現していることを見いだしている系の遺伝的特性を多面的に分析する必要がある。

次に、培養細胞を用いてバイオアッセイ系の構

そこで本課題では高水温によって発現が誘導され築と最適化を試みた。18℃で培養したニジマス

るニジマス遺伝子に着目し、それら遺伝子産物をRTgill-W1 細胞を異なる温度（21、24、28、32℃）

特異的に検出・定量できるバイオアッセイ系を開に 1 時間曝露したのち、18℃に戻して 5 時間培養

発する。これにより、高温耐性系と標準系ニジマした。これらの細胞から総タンパク質を抽出し、ス間で高水温による遺伝子発現変化を比較し、選高 温処理 によ り顕著 な発現 誘導が 観察さ れ た

抜育種の効果を検証することを目的とする。

Hsp70、
Hsp40 および Hsp30 を中心に 7 種類の HSP
蓄積量をウェスタンブロット法により分析した。

イ

研究方法

28℃に 24 時間曝露し、経時的にサンプリングした

本課題では高温影響を評価するためのマーカー

RTgill-W1 細胞においても、同様に HSP の検出を候補遺伝子として、分子シャペロン機能をもち生行った。

物の高温耐性に関与する熱ショックタンパク質

続いて、培養細胞を用いて構築したアッセイ系（Heat Shock Proteins、HSP）遺伝子に着目した。

の個体への適用可能性について検討した。水温

最初に、これら遺伝子の翻訳産物であるタンパク

17℃で飼育された宮崎系♀×長野系♂の F2 稚魚（宮質群を特異的に検出可能とするため、ニジマス

崎県で作出）を 28℃の高温接触試験に供し、平衡

Hsp70、Hsc70、Hsp47、Hsp27 の演繹アミノ酸配喪失までの時間が 30 分未満の個体群（低耐性群）

列に基づき、抗原として用いるペプチドを設計しと 60 分以上の個体群（高耐性群）の 2 群に分けた。

た。これらペプチドを化学合成してキャリアタン

両群の個体とも水温 17℃で 1 週間以上飼育して定37

常状態に回復させた後、26℃の水温に 3 時間接触

演繹し、HSP70 の検出量が多かった個体と少なかさせ、尾鰭の一部を切除して Allprotect Tissueった個体との間でアミノ酸配列を比較した。

Reagent（キアゲン社）に浸漬した。尾鰭の採取は高温耐性系ニジマスをオイゲノール（FA100）

各群からそれぞれ 6 個体ずつ（対照 3 個体、高温

麻酔下で解剖して脳、鰓、心臓、肝臓、筋肉（普接触 3 個体）の計 12 個体から行った。これらの尾通 筋）お よび 尾鰭の 各組織 を採取 し、直 ち に鰭試料から総タンパク質を抽出し、抗 HSP 抗体を

Allprotect Tissue Reagent（キアゲン社）に浸漬した。

用いてウェスタンブロット法により各タンパク質

また、宮崎県水産試験場小林分場から、高温耐性を検出した。

系 30 個体の尾鰭［RNAlater（ライフテクノロジー

宮崎県水産試験場小林分場において水温 17℃

ズ社）浸漬］試料の供与を受けた。これら試料かで飼育されたドナルドソン系ニジマスと高温耐性

ら AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit（キアゲン社）系ニジマス各 10 個体から尾鰭の一部を切除しておよび NucleoSpin TriPrep（マッハライ・ナーゲル

Allprotect Tissue Reagent（キアゲン社）に浸漬した。

社）を用いてタンパク質を抽出し、ウェスタンブ

これら尾鰭から総タンパク質および全 RNA を抽ロット法により HSP70 および HSC70 を検出した。

出した。先の実験において高水温耐性をもつ F2稚魚で発現量が多かった HSP70、HSP60、HSP40

ウおよび定常的発現型 HSP である HSC70 の発現量

ウェスタンブロット分析の結果、新たに作製しをウェスタンブロット法により分析した。また、た４種類の抗血清のうち、抗 HSP70 および抗全 RNA を DNase 処理した後 cDNA を合成し、こHSC70 抗血清において分子量約 70 kDa の特異的れを鋳型としてリアルタイム PCR 法により 7 種類なバンドが検出された（図 1）。市販の抗の遺伝子（ATPase 6、COX Ⅱ、HSC70、HSP70、

HSP70/HSC70 抗体（HSP70 と HSC70 を区別でき

HSP60-1、HSP60-2、HSP40）の転写産物（mRNA）

ない抗体）と比較した結果、今回新たに作製した量を定量した。その際、β-アクチン遺伝子を内部抗血清２種は HSP70 と HSC70 を区別して検出で標準として用いた。

きることが示唆された（図 1）。

研究結果

最後に、尾鰭試料と抗 HSP70 抗体を用いたアッセイの妥当性について確認実験を行った。先に実施したバイオアッセイの結果に基づき、定常温度下で飼育された高温耐性（宮崎）系ニジマスの尾鰭において HSP70 の検出量が多い個体と少ない個体を選定した。これらの尾鰭から全 RNA を抽出し、GeneRacer キット（ライフテクノロジーズ社）を用いて完全長 cDNA を合成した。本 cDNAを鋳型とし、高正確性 PCR 酵素 KOD -Plus- Neo

図1

ニジマス HSP70 および HSC70 の検出（東洋紡）を用いて 3'-RACE 法により HSP70 遺C：対照（18℃）、H：高温処理（28℃、1 時

伝子断片を増幅した。これら断片をプラスミドベ

間→18℃、5 時間）

クターにサブクローニングした後、各個体からそれぞれ 24 クローン（計 48 クローン）を単離し、市販抗体の結合特異性をウェスタンブロット法

各塩基配列をサンガー法により決定した。得られで分析した結果、ニジマス試料で HSP40 の特異的た cDNA 配列に基づいて HSP70 のアミノ酸配列をなバンドが検出され、その発現は高温で顕著に誘38導されることがわかった（図 2）。HSP90 につい

セイ系では 26℃の水温に 3 時間接触させる条件をては、新規に入手した抗体のうちの一種類で強い選定した。また、Allprotect Tissue Reagent（キアゲシグナルが検出された（図 2）。また、サケ科のン社）に浸漬した尾鰭サンプルから特に問題なく

HSP70 を特異的に検出可能とされている市販抗体

総タンパク質を抽出することができたため、本タでは、対照群でも HSC70 と考えられるバンドが検ンパク質を用いて個体レベルのアッセイを行った。

出され、本抗体は真に HSP70 特異的な抗体ではないことが示唆された（図 2）。新規に作製した抗血清により、Grp75、Hsp47 のバンドが新たに検出され、また市販の抗体で Hsp30 のシグナルも検出された（データ未掲載）。

図2

市販および自作抗体を用いた HSP の検出
C：対照（18℃）、H：高温処理（28℃、1 時
間→18℃、5 時間）

図3

曝露温度（A）および時間（B）の変化に伴う HSP 蓄積量の変化

以上の結果、ニジマスにおいて Hsp90、Grp75、Hsp70、Hsc70、Hsp60、Hsp47、Hsp40、Hsp30 の高温耐性（宮崎）系♀×標準（長野）系♂の F2

8 種類のタンパク質を個別に検出することが可能

稚魚のうち、高水温に対する低耐性群と高耐性群となった。

との間で定常状態（17℃）における HSP 量を比較

ニジマス RTgill-W1 細胞を異なる温度に曝露ししたところ、高耐性群にのみ HSP70 の蓄積が検出た結果、28℃において Hsp70、Hsp40、Hsp30 の顕された（図 4）。また、HSP60 と HSP40 の蓄積量

著な蓄積が観察された（図 3A）。蓄積量が特に顕にも統計的に有意な差（P＜0.05）が認められた。

著であった Hsp70 と Hsp30 を 28℃に曝露した

一方、高温接触後における HSP 量を同様に 2 群間RTgill-W1 細胞で経時的に検出したところ、いずで比較したところ、HSC70 の蓄積量に有意な差（Pれも曝露 3 時間後から蓄積が観察され、その量は＜0.05）がみられ、高耐性群における HSC70 の蓄次第に増加する傾向が見られた（図 3B）。これら

積量は低耐性群よりも少ないことが示唆された。

のモデルアッセイ系による結果と宮崎県で行われ上記以外の HSP の蓄積量は個体によるばらつき

た予備実験の結果に基づき、個体レベルでのアッがあり、統計的に有意な差は検出されなかった。
39

図4

F2 稚魚の尾鰭における HSP 蓄積量の分析
図5

L1-6：低耐性個体、H1-6：高耐性個体

ドナルドソン系と高温耐性系における HSP
蓄積量の比較

定常飼育温度（17℃）下のドナルドソン系 5 個
体および高温耐性（宮崎）系 5 個体の尾鰭における HSP 量をウェスタンブロット分析により比較したところ、HSP70 の蓄積がドナルドソン系では全く検出されず、高温耐性系では 4 個体で検出された（図 5）。この結果は、先の結果（宮崎系♀×
長野系♂の F2 稚魚における高水温に対する低耐性群と高耐性群との比較結果）と類似していた。
HSC70 と HSP60 の蓄積量については個体間でばらつきが観察されたものの、両系統間では明瞭な違いは見出されなかった（図 5）。HSP40 については高温耐性系において 2 つのバンドが検出され、うち高分子量側のバンドはドナルドソン系では検図6出されなかった（図 5）。

尾鰭における HSP mRNA の相対定量
内部標準遺伝子：β-アクチン。ドナルドソン

ドナルドソン系 6 個体と高温耐性系 6 個体の尾系における各遺伝子 mRNA 量を 1 とし、平均鰭における遺伝子 7 種類の mRNA 量をリアルタイ

値±標準誤差で表示。

ム PCR 法により定量比較したところ、高温耐性系
における HSP70 の mRNA 量はドナルドソン系の高温耐性系のうち HSP70 の検出量が多い個体

約 1.8 倍であり、統計的にも有意な差であった（Pと少ない個体とで同タンパク質の演繹アミノ酸配＜0.05；図 6）。同様に、高温耐性系における列を比較した結果、本課題の自作抗体が認識する

HSP60-1 と HSP60-2 の mRNA 量はそれぞれドナル

部位のアミノ酸配列は、配列が確定された両個体

ドソン系の約 2.1 倍と約 2.0 倍であり、統計的に有由来の 46 クローンで全て同一であった（データ未

意な差であった（P＜0.05；図 6）。一方、ATPase掲載）。このことから、本課題のアッセイ系によ6、COX Ⅱ、HSC70、HSP40 については両系統間る HSP70 検出量の多寡は、アミノ酸配列多型によで有意な差は検出されなかった（図 6）。

る抗体結合能の違いではなく、HSP70 蓄積量の違いを反映しているものと考えられた。この結果を受け、宮崎県水産試験場から供与を受けた高温耐性系 10 個体の尾鰭でアッセイを行ったところ、全40

ての個体で定常飼育温度下における HSP70 の蓄エ積が検出されたが、その蓄積量は個体によって顕本課題の成果として、ニジマスの尾鰭試料を用著に異なっていた（図 7A）。また、高温耐性系ニ

いて高温影響を評価するバイオアッセイ系が確立

ジマスから採取した 6 組織のウェスタンブロット

された。また、本アッセイ系を活用し、HSP70 の分析を行った結果、尾鰭以外の組織でも定常飼育

恒常的発現を指標とすることによって高温耐性

温度下で HSP70 の蓄積が検出された（図 7B）。

（宮崎）系の選抜効果が確認された。

考 察

その蓄積量は組織間で顕著に異なっていたが、尾本課題の結果から、高温耐性を有するニジマス

鰭組織には検出に十分な量の HSP70 が蓄積して個体においては HSP70 が恒常的に発現しているいた（図 7B）。

ことが示唆された。また、高温耐性（宮崎）系♀×
標準（長野）系♂の F2 稚魚のうち、高温に対する高耐性個体においては、低耐性個体よりも HSP60
および HSP40 蓄積量の増加が認められた 4)。同様に、鰓組織における HSP70 と HSP40 の mRNA 蓄
積量（特に HSP70 mRNA の蓄積量）がドナルドソン系よりも高温耐性系で顕著に多いことが東京大学の成果として明らかになっている 5)。HSP70、
HSP60、HSP40 は HSP ファミリーの中でタンパク質の高次構造形成の介助に最も関与することが知

高温耐性系における HSP70 および HSC70

られている 6)ことから、高温耐性個体ではこれら蓄積量の個体間差（A）および組織間差（B）

HSP の蓄積量を恒常的に増大させることにより、

図 7細胞内タンパク質の熱変性を抑制したり修復した
一方、2012 年度産の高温耐性系 30 個体ではりする能力が通常個体より高まっていると考えら

HSC70 のバンドは検出されたが、HSP70 の明瞭なれる。また、高温耐性系と F2 稚魚（高耐性個体）

バンドは検出されなかった（図 8）。この結果は、で HSP70 の恒常的発現が共通に観察されたこと

ドナルドソン系♀×高温耐性系♂の F2 の一群で得から、F2 稚魚の高耐性個体は高温耐性系の形質をられた結果と類似していた（データ未掲載）。

遺伝的に受け継いだことが示唆される。
一方、尾鰭においては HSP70 の mRNA 量はタ
ンパク質量ほど顕著な差異が検出されなかったことから、HSP70 を高水温耐性の分子マーカーとして利用する際にはその mRNA よりもタンパク質を検出する方がより適切であると考えられる。また、高温耐性系から採取された尾鰭組織には検出に十分な量の HSP70 が蓄積していたことから、尾鰭片を用いた HSP70 蓄積量の分析が有効である

図 8

高温耐性系（2012 年度産）尾鰭におけることが確認された。このように尾鰭試料を用いる

HSP70 および HSC70 の検出ことにより個体を殺さずに HSP 蓄積量を分析可

P：陽性対照（HSP70 恒常発現型の高温耐性能であることから、本課題で構築したアッセイ系系尾鰭）。数字は個体番号。

は高温耐性をもつ個体の選抜に有用であると考え
41

られる。

2)

Ineno T, Endo M, Watabe S. (2008). Differences
in

オ

今後の課題

self-feeding

activity

betweenthermally

selected and normal strains of rainbow trout
Oncorhynchus mykiss at high temperatures. Fish.

高温耐性形質は複数の遺伝子が関与する量的Sci., 74:372–379.

形質であると考えられることから、生物の高温耐3)性を向上させる機構は複数存在する可能性があIkeguchi K, Ineno T, Itoi S, Kondo H, Kinoshita
S, Watabe S.

る。ニジマスにおいても HSP70 の恒常発現以外に(2006). Increased levels of

mitochondrial gene transcripts in the thermally

高温耐性を向上させる機構が存在する可能性が本

selected rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)

課題の結果から示唆されている。

strain during embryonic development. Mar.

育種においては形質間のトレードオフ（ある形Biotechnol., 8:178–188.

質を向上させると別の形質が低下する）が問題となることがしばしばあるため、複数の異なる系統

4)

Ojima N, Mekuchi M, Ineno T, Tamaki K, Keraを準備するという意味で、別の高温耐性機構につA, Kinoshita S, Asakawa S, Watabe S. (2012).

いても今後の研究の進展が望まれる。

Differential expression of heat-shock proteins in
F2 offspring from F1 hybrids produced betweenカ

要 約

thermally selected and normal rainbow trout
strains. Fish. Sci., 78:1051–1057.

本課題の目的は、分子シャペロン HSP を特異的
5)に検出・定量できるバイオアッセイ系を開発し、Tan E, Wongwarangkana C, Kinoshita S, Suzuki

高温耐性系ニジマスの選抜効果を検証することでY, Oshima K, Hattori M, Ineno T, Tamaki K,ある。そこで、各種 HSP を特異的に検出できる抗Kera A, Muto K, Yada T, Kitamura S, Asakawa S,

体を作製あるいは入手し、ニジマス培養細胞を用Watabe S. (2012). Global gene expression

いてアッセイ系の構築と最適化を行った。さらに

analysis of gill tissues from normal and thermally

尾鰭試料を用いた個体のアッセイ系を確立した。

selected strains of rainbow trout. Fish Sci.,

その結果、高温耐性系における HSP70 の恒常的発

78:1041–1049.

現を見出し、その選抜効果が確認された。個体を6)

殺さずに HSP 量を分析できる本アッセイ系は、高folding. Physiol. Rev., 79:425–449.

温耐性ニジマスの選抜に有用であると考えられる。
キ 文献

1)

Ineno T, Tsuchida S, Kanda M, Watabe S. (2005).
Thermaltolerance

Oncorhynchusofmykissastrainrainbow
selected

Fink A.L. (1999). Chaperone-mediated protein

trout
by

high-temperature breeding. Fish. Sci., 71:767–
775.

42

3．アマノリチーム課題別研究成果

1）南方系アマノリ類野生種等の高水温耐性に関する特性評価・・・・・・・・・・・・・・・・・・・44（西海区水産研究所）
2）アマノリ類の短期的高水温耐性に関与する遺伝子の探索と解析・・・・・・・・・・・・・・・・・49（中央水産研究所・千葉県水産総合研究センター）
3）アマノリ類の長期的高水温耐性及び適応に関与する遺伝子の探索・・・・・・・・・・・・・・・55（三重大学・三重県水産研究所）

43

チーム名：ノリチーム
担当課題名：南方系アマノリ類野生種等の高水温耐性に関する特性評価
研究機関・担当者名：（独）水産総合研究センター西海区水産研究所・資源生産部・藻類グループ・玉城泉也（095-860-1600, tama242@affrc.go.jp）・藤吉栄次、中央水産研究所・水産遺伝子解析センター・機能研究グループ・小林正裕
研究期間：平成 21～23 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

ノリについて、国内３産地（島根、長崎および鹿

地球温暖化の進行が予測される中、海洋環境等への深刻な影響が懸念されている。ノリ養殖業においても平成 19 年度漁期当初の高水温の影響で漁期開始が一ヶ月近く遅れた事例があり、温暖化の進行に伴う今後の影響が懸念されている。このため、DNA マーカー等のゲノム情報を活用して短期間で効率的に高水温耐性等の優良な形質を評価し、選抜や交雑等によりこれらの影響を回避できる養殖品種を開発することで養殖業への影響を最小限に止めることが必要である。しかし現在のノリ養殖品種は長年の選抜により遺伝的多様性が減少しているとみられており、高水温耐性を有する
養殖品種は開発途上である。そこで、遺伝的多様性と高水温耐性をともに有していることが期待される南方系アマノリ類野生種を用いて高水温耐性の特性評価試験を行った。
イ

図1

供試株の採集場所児島県）由来の各株の培養を行った。各株の採集研究方法

場所を図 1 に記す。これらの場所で採集し、冷凍

平成 21 年度は、本州から沖縄諸島の岩礁域等に保存した葉状体を解凍後、培養し、単胞子をビニ広く生育し、同一種内での生息地による高水温耐

ロン単糸に採苗して以下の培養試験に供した。

性の差異を比較する上で適切と考えられたマルバ

培養試験は、各株とも 15℃、20℃、25℃およびアマノリについて、国内４産地（岩手、長崎、鹿

30℃の 4 水温区で実施し、各株の生長と単胞子放児島および沖縄県）由来の各株の培養を行った。

出の有無を調べ、生育適水温及び高水温耐性の差

平成 22 年度は、九州西岸から南西諸島に至る西日異について確認した。生育の指標として葉長を用本各地に生育し、マルバアマノリより高水温耐性

い、1 週間毎の培養液の換水時にあわせて葉長のを有することが期待されるツクシアマノリについ計測を実施した。培養液は塩分 30 psu に調整したて、国内４産地（石川、山口、鹿児島および沖縄県）由来の各株の培養を行った。平成 23 年度は、マルバアマノリやツクシアマノリと同様に九州西

1/10 SWM-Ⅲ１）海水補強培地を用い、光量 60 μmol
m-2 s-1、短日条件（10 時間明期：14 時間暗期）で63～84 日間の培養を行った。

岸から南西諸島に至る西日本各地に生育し、高水温耐性を有することが期待されるタネガシマアマ
44

表１

PCR およびシーケンシングに使用したプライマーの配列#は PCR に、*はシーケンシングに使用したプライマー名塩基配列（5’側から 3’側に向けて表記）

出典

F-50 *#AATGGTATAAACAACGCAAAAGA

樽田ほか(2007)2)

F495 *ATGGACAAATTTGGCAGACC

玉城ほか(2012)3)

F963 *

GCGTATGGCAGGTGTTGAC

玉城ほか(2012)

R297 *

ATCAGCAACATTTGGCACTG

玉城ほか(2012)

R753 *GCTCTTTCATACATATCTTCC

Hommersand et al. (1994)4)

R1172 *TGCATTTGACCAGCATGAAT

玉城ほか(2012)

R1938 #CTAGCTCCTTCAGGCTT

樽田ほか(2007)
トストラップ法 8) (1000 回) を用いた。

これらと併せて、実験に供試した 3 種計 11 株について、葉緑体 DNA の RuBisCO 領域 L サブユニ
ットの塩基配列を調べ、それぞれの種に属するこウとを確認した。各株の葉状体（湿重量約 100 mg）

マルバアマノリについては、織笠（岩手県）及から ISOPLANT II（（株）ニッポンジーン）を用び手熊（長崎県）両株については、15℃区で最も

3)

研究結果

いて DNA を抽出し、玉城ほか（2012） に従い生長が良く、20℃区はその次に良好であったが、

TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ（株））と表 1 に示

25℃以上では葉体縁辺部から単胞子の放出（図２

す F-50 および R1938 の 2 本のプライマーを用いて右）がみられ、葉体はほとんど生長しなかった（図PCR を行い、RuBisCO 領域の増幅を行うとともに、

１）。これに対し垂水（鹿児島県）株は 15℃・20℃

表１に示したシーケンシング用プライマーを用いで順調に生育、25℃区はその半分程度の生長を示て RuBisCO 領域 L サブユニットのシーケンシング

し、30℃でほとんど生長しなかった。供試株中最反応を行い、マルバアマノリおよびタネガシマア

も南方由来の那覇なうら橋（沖縄県）株は 15℃・

マノリについては 1467 塩基、ツクシアマノリにつ

20℃・25℃区で順調に生育し、30℃ではほとんど

いては 1461 塩基の配列を決定した。

生長しないことを確認した。

また、GenBank 上に存在するアマノリ属の情報

ツクシアマノリについては、珠洲（石川県）かのうち、rbcL 先端部からの配列情報が揃っている

ら宜野湾（沖縄県）の国内４産地由来の各株の 15℃

マルバアマノリ、スサビノリ、アサクサノリ、カ～25℃における最大葉長は 25℃≧20℃≧15℃の順

イガラアマノリ、ソメワケアマノリ、ウップルイとなり、高水温ほど良好に生長した（図 2）。まノ リ 、 ダ ン シ サ イ 、 オ ニ ア マ ノ リ 、 Porphyra

た 30℃区では珠洲（石川県）株は単胞子放出が著

purpurea および Porphyra umbilicalis の計 10 種の

しくほとんど生長しなかったのに対して、宇田（山RuBisCO 領域 L サブユニットの塩基配列情報も

口県）株は約 20 mm、種子島（鹿児島県）及び宜5)を用いて各塩基配列のアライ

野湾（沖縄県）両株は約 50 mm まで生長した。ツンメントを行った。塩基欠失箇所を取り除いた後、クシアマノリは、25℃区において株間で差異が見

合わせ、MEGA 5

6)

Maximum Composite Likelihood Method により遺られたマルバアマノリよりも高い、30℃区におい伝学的距離を求め、近隣結合法 7)による分子系統て株間で生長に差異がみられた。

樹の作成を行った。枝の信頼性の検定には、ブー45

図 2 供試株の培養試験結果

図 3 供試株とアマノリ属各種の葉緑体 RuBisCO 領域 L サブユニットの塩基配列をもとに近隣結合法により描いた樹形図
種名のみの試料は GenBank から塩基配列を得て比較に使用した。
46

タネガシマアマノリについては、国内３産地（隠は 20℃と 25℃で 30～50 mm の葉状体となり、30℃

岐（島根県）、宇久（長崎県）及び種子島（鹿児でも葉長 3～4 mm に達することを示している。本島県））由来の各株について生長性を比較した結事業において試験したマルバアマノリについても、果、隠岐（島根県）及び宇久（長崎県）両株は 30℃

株により生長に違いがみられたことから、生育適

区では葉体縁辺部から大量の単胞子を放出し、葉水温が異なることが示唆された。

長 1mm 未満でほとんど生長しなかったのに対しまた、ツクシアマノリとタネガシマアマノリはて、種子島（鹿児島県）株は同様に単胞子を放出

25℃でも良好に生長し、30℃でも株によってはマしたものの、約 20mm まで生長し（図 2）、ツク

ルバアマノリより大型の 20～50 mm まで生長した

シアマノリと同様に 30℃区において株間で生長にことから、これらの 2 種はマルバアマノリと比較差異がみられることが明らかになった。

して高水温への耐性がより強いものと考えられる。

また、これらの供試株について葉緑体 DNA

以上より、本事業で培養試験を実施した南方系

RuBisCO 領域 L サブユニットの塩基配列を調べた

アマノリ類 3 種は、南方由来の株ほど高水温耐性

結果、マルバアマノリ織笠（岩手県）、手熊（長を有していることから、野生株の遺伝資源として崎県）、垂水（鹿児島県）および那覇なうら橋（沖の重要性が示された。

縄県）の 4 株については既往のマルバアマノリと、ツクシアマノリ珠洲（石川県）、宇田（山口県）、

オ

今後の課題

種子島（鹿児島県）および宜野湾（沖縄県）の 4
株はツクシアマノリ副基準標本の配列と相同性が今回研究対象とした野生種 3 種だけでなく、ス

高く、樹形図においても他種とは離れた位置にそサビノリについても同様に、産地によって高水温れぞれ単一の群を形成し、株間の違いが小さかっ耐性等の特性に差異がみられる可能性が考えられた。また、タネガシマアマノリ隠岐（島根県）、ることから、野生株の採集と培養試験による特性

宇久（長崎県）および種子島（鹿児島県）の 3 株

評価を今後行う必要がある。

については、マルバアマノリよりツクシアマノリ
カにやや近い位置に 3 株が単一の群を形成し、株間要

約の違いが小さかった（図 3）。これらのことから、今回使用した各株はそれぞれマルバアマノリ、ツ高水温耐性を有することが期待される南方系ア

クシアマノリおよびタネガシマアマノリに属する

マノリ類野生種としてマルバアマノリ、ツクシア

ことを確認した。

マノリおよびタネガシマアマノリ葉状体の培養試
験を行い、既存のスサビノリ養殖品種が正常に生エ

考長しない 25℃においても一部の株は良好に生長し察

異なる産地由来のアマノリ葉状体を室内培養した。また、マルバアマノリは 25℃で、ツクシアマ

生育的水温を調べた例としては、Monotilla andノリおよびタネガシマアマノリは 30℃において株9)

Notoya (2004) による国内外 5 産地のマルバアマノにより生長に違いがみられたことから、生育適水

リの培養試験が挙げられる。韓国統営市産株は温が株によって異なる可能性が示唆され、野生株

10℃と 15℃で、神奈川県産および鹿児島県産の株の遺伝資源としての重要性が示された。

は 10℃、15℃および 20℃でそれぞれ良好に生長し、葉長約 50 mm の葉状体となることを明らかにしている。また、中国汕尾市産およびフィリピン産株
47

キ

文献

Porphyra suborbiculata Kjellman (Bangiales,
Rhodophyta) blades from five localities. Bot.

1) Fujiyoshi E and Kikuchi N (2006) Growth ofMar. 47: 323–334.

excised pieces containing elongated denticles
from the lower marginal parts of Porphyra
tanegashimensis

and

P.

haitanensis

gametophytes. Bull. Fish. Res. Agen. 16: 9-13.
2) 樽田真依ら（2007）アマノリ属植物の SSUrRNA 遺伝子と RuBisCO 遺伝子領域の解析による類縁関係の推定と種同定法の開発.
海苔と海藻 73: 1-42.
3) 玉城泉也ら (2012) 沖縄県宜野湾市にて採集したツクシアマノリ葉状体の形態的特徴と分子生物学的解析. 沖縄生物学会誌 50:
1-15.
4) Hommersand MH et al. (1994) Phylogenetic
systematics

andbiogeography

of

the

Gigartinaceae (Gigartinales, Rhodophyta) basedon sequence analysis of rbcL. Bot. Mar. 37:
193-203.
5) Tamura K et al. (2011) MEGA5: Molecular
Evolutionary

Genetics

Analysisusing

Maximum Likelihood, Evolutionary Distance,and Maximum Parsimony Methods. Mol. Biol.
Evol. 28: 2731-2739.
6) Tamura K et al. (2004) Prospects for inferring
very

large

phylogenies

by

using

the

neighbor-joining method. Proc. Nat. Acad. Sci.
101: 11030-11035.
7) Saitou,

N.

and

M.

Nei,

1987.

The

neighborjoining method: A new method forreconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol.
Evol. 4: 406-425.
8) Felsenstein, J., 1985. Confidence limits on
phylogenies: An approach using the bootstrap.
Evolution 39: 783-791.
9) Monotilla

DW

and

NotoyaM(2004)Morphological and physiological responses of48

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価・適応技術開発事業

チーム名：アマノリチーム
担当課題名：アマノリ類の短期的高水温耐性に関与する遺伝子の探索と解析
研究機関・担当者 名：（独）水 産総合研究セ ン ター中央水産研究 所・尾島信彦 （045-788-7640、
ojima@affrc.go.jp）、馬久地みゆき、小林正裕、千葉県水産総合研究センター東京
湾漁業研究所・島田裕至、林俊裕、鳥羽光晴
研究期間：平成 21～25 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
ア

研究目的

した。
17℃で培養した U-51 株の葉状体を水温 27℃

アマノリ類は、通常、水温 11〜21℃付近の水域に曝露して 24 時間まで経時的にサンプリングし、に分布しており、もし地球温暖化により海水温が液体窒素で急速凍結した。凍結したサンプルを SK

上昇すれば、その生育・収穫等に影響が及び、ノミルで粉砕し、0.05 M トリス塩酸バッファー

リの生産量が減少するおそれがある。近年、ノリ（pH7.5）でタンパク質を抽出した。本タンパク質

養殖の現場では水温の上昇による養殖漁期の短縮

を SDS-PAGE 法により分析した。

化が実際に問題となっており、高水温に対して耐

次に、遠隔地から輸送されたノリからでも安定性を有するアマノリ類の作出が望まれている。一

的に RNA 等を抽出可能とするため、葉状体のサン方、生物の高水温耐性を評価するためには、持続プリング方法について検討した。17℃で培養した的な水温（週・月単位）に対する耐性と、一過的U-51 株を対照群とし、27℃で 24 時間培養した同な高水温（時間・日単位）に対する耐性の二つの株を高水温曝露群としてノリ葉状体試料が西海区観点からアプローチする必要がある。そこで本研

水産研究所で調製された。葉状体は RNAlater（ラ究では後者の観点からアマノリ類の高水温耐性に

イフテクノロジーズ社）に浸漬後、RNA 等の抽出関与する遺伝子を探索し、その候補遺伝子の構造まで 4℃で保存した。本葉状体から polyA RNA を等を解明する。これによりノリが高水温耐性の遺抽出して cDNA を合成した後、高水温曝露群で特伝的形質をもつのかを明らかにし、高水温耐性を異的に発現する遺伝子を濃縮する目的でサブトラ有するノリの育種に有用な遺伝子情報を得ること

クト cDNA ライブラリーを作製した。国際塩基配を目的とする。

列データベースに登録されているノリ EST 配列等に基づいてプライマーを設計し、作製した cDNA

イ

研究方法

を鋳型として PCR 法により Actin、GAPDH、Hsp70、

本課題の開始時点では、ノリが高水温に対するHsp20 各遺伝子ホモログ断片の増幅を試みた。ま何らかの防御機構を遺伝的にもつのか自体が不明

た増幅された断片の塩基配列を決定した。

であった。もしノリがそのような機構をもっていRNAlater に浸漬された葉状体のタンパク質分析をれば、高水温下で誘導的に発現するタンパク質（遺行うため、タンパク質抽出法の改良を試みた。タ伝子）が存在することが予想される。そこで、まンパク質抽出試薬（P-PER；サーモフィッシャー

ずは高水温処理したノリ葉状体において蓄積量が社）を用いて葉状体からタンパク質を抽出し、2-D増大するタンパク質が存在するか否かを調べた。

Clean-Up キット（GE ヘルスケア社）で不純物を室内培養したスサビノリ U-51 株の葉状体を液体除去したのち超遠心によりタンパク質サンプルを窒素で凍結させ、３種類の方法（乳鉢あるいは凍調製した。本サンプルを二次元電気泳動法により結粉砕器具（SK ミル）による粉砕法、およびホモ分析した。

ジナイザーによる破砕法）によりタンパク質を抽

高水温耐性のマーカー候補遺伝子を探索するた出した。本タンパク質を SDS-PAGE 法により分析

め、本課題で作製したサブトラクト cDNA ライブ
49

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価・適応技術開発事業

ラリーからランダムに 102 個のクローンを選択し、 する実験を行った。これらの葉状体から全 RNA を
5'末端側から部分塩基配列を決定した。これらの配抽出し、高水温耐性マーカー候補遺伝子の発現量列をクエリーとし、NCBI の BLAST 検索により各を定量して品種間で比較した。また、高水温曝露

クローンがコードする遺伝子の同定を試みた。

後の各品種の死細胞数を計測した。

17℃で培養したスサビノリ U-51（対照株）およびMCF1（高水温選抜株；千葉県で作出）を 27℃の

ウ

研究結果

水温に 24 時間曝露した。各葉状体から全 RNA をノリ葉状体からのタンパク質抽出法として 3 種

抽出し、DNase 処理したのち cDNA を合成した。

類の方法を試みた結果、いずれの方法でもHsp20 ホモログおよび内部標準遺伝子 GAPDH を

SDS-PAGE 法で分析可能な品質のタンパク質が抽含む 12 種類の遺伝子に特異的な PCR プライマー出できた。水温 27℃に曝露した U-51 葉状体のタを設計し、合成した cDNA を鋳型としてリアルタ

ンパク質を SDS-PAGE 法で分析した結果、時間の

イム PCR 法により各遺伝子 mRNA の相対量を測経過に伴い、分子量 90 kDa 付近、70 kDa 付近およ定した。供試株の高水温耐性を調べるため、U-51

び 38 kDa 付近のタンパク質など、複数種のタンパ

および MCF1 を水温 18、22、24 および 26℃の 4

ク質蓄積量が増加した（図１）。増加したタンパ

区で 14 日間培養し、高水温障害（多層化）が生じ

ク質のバンドは高水温曝露後 9 時間以降に強く検た葉状体の発生率を指標にして高水温耐性を評価出された（図１）。

した。水温以外の培養条件は全ての試験区で同一とした。
続いて、高水温曝露からの回復培養前後における遺伝子発現変化を分析した。千葉県水産総合研
究センター東京湾漁業研究所において、スサビノ
リ U-51 および MCF1 を 17℃で培養した後 27℃で
24 時間処理（高水温曝露）し、17℃に戻して 13
日間回復培養した。得られた葉状体を RNAlater に浸漬し、本サンプルから全 RNA を抽出して DNase
処理した後 cDNA を合成した。本 cDNA を鋳型としてリアルタイム PCR 法により 4 種類の遺伝子（遺伝子 H、I、Hsp20、フィコエリトリン）の mRNA量を定量した。その際 GAPDH 遺伝子を内部標準

図 1 ノリ葉状体の高水温曝露に伴うタンパク質として用いた。また、高水温曝露直後および回復発現パターン変化

培養後における葉状体の多層化状態や生長等について株間で比較した。

西海区水産研究所より供与された U-51 株から最終的に、スサビノリ U-51 および MCF1 におけ調製した cDNA を鋳型として PCR を行ったところ、る遺伝子発現データを総合的に再検討し、高水温Actin、GAPDH、Hsp70、Hsp20 各遺伝子ホモログ

耐性マーカー候補となる遺伝子を追加探索した。

断片の増幅が認められた（図 2）。増幅断片の DNA

高水温耐性が異なることが報告されている養殖ノ

塩基配列を決定した結果、間違いなく各遺伝子のリ品種 6 種類を千葉県水産総合研究センター東京

ホモログであることが確認された。Hsp20 ホモロ

湾漁業研究所において室内培養し、高水温に曝露

グ遺伝子については、高水温曝露群 cDNA とサブ
50

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価・適応技術開発事業

トラクト cDNA のみで増幅断片が検出された（図をリアルタイム PCR 法で測定した結果、17℃の培2）。このことから、サブトラクト cDNA ライブラ

養温度において、遺伝子 I の mRNA 量が MCF1 でリ ー の 品 質 が 良好 で あ るこ と が 確 認さ れ た 。

約 31 倍、U-51 よりも多かった（図 4）。また、

RNAlater に浸漬された葉状体から上述の方法でタ

MCF1 における遺伝子 B、C および H の mRNA 量

ンパク質を抽出し、二次元電気泳動法により分析

は、U-51 のそれぞれ約 0.008 倍、0.02 倍および 0.1を行った結果、特段の問題なくタンパク質の分析倍であった（図 4）。一方、27℃に 24 時間曝露しを行うことが可能であった（図 3）。また、タンた後では、MCF1 において遺伝子 H の mRNA 量が

パク質調製の過程で超遠心の工程を追加すること顕著に多く、U-51 の約 17 倍であった（図 4）。

により、鮮明な電気泳動像を取得することができ

MCF1 と U-51 において高水温障害（多層化）が生た（図 3）。

じた葉状体の発生率を調べたところ、培養温度18℃では両株とも 0％、26℃では両株とも 100％となり、両水温区で株間の差は生じなかった（表 1）。
一方、培養温度 22℃では若干ながら株間で発生率に差が生じ、24℃では MCF1 における発生率が31.7％であったのに対して U-51 では 100％となった（表 1）。

図 2 PCR 法によるサブトラクト cDNA ライブラ
リーの品質確認

図 4 U-51（U）および MCF1（M）間におけるmRNA 蓄積量の相対比較
表1
図 3 葉状体（RNAlater 浸漬）から抽出したタン
パク質の二次元電気泳動分析

MCF1 と U-51 の高水温障害発生率(％)
18℃

22℃

24℃

26℃

MCF1

0

0

31.7

100

U-51

0

3.8

100

100

高水温誘導性遺伝子と予想される cDNA クロー
ン 102 個の部分塩基配列を決定したところ、同じ

MCF1 で特徴的な mRNA 蓄積量の変化を示した配列をもつ重複クローンが 13 組（計 76 個）、単遺伝子 H と I を中心にして回復培養後の mRNA 量

一クローンが 26 個得られたことから、計 39 種類を調べたところ、U-51 では遺伝子 H の mRNA 量の遺伝子が単離されたことが推定された。顕著にはほぼ高水温曝露前のレベルまで回復した（図 5）。

重複して検出された遺伝子を中心に 11 種類の遺回復培養後の遺伝子 I と Hsp20 の mRNA 量は高水

伝子（仮に遺伝子 A〜K とした）の mRNA 相対量

温曝露直後よりも減少したが、元のレベルまでは51

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価・適応技術開発事業

回復していなかった（図 5）。フィコエリトリンで死細胞が発生していた。各品種の死細胞数を計の mRNA 量は高水温曝露前後で特に変化しなかっ測した結果、品種 2 と品種 3 は他の品種よりも有た（図 5）。一方、MCF1 では遺伝子 I の mRNA

意に死細胞数が多かった（p＜0.01、Tukey 多重比

量は高水温曝露前から U-51 の約 120 倍あり、回復較）が、それ以外の品種間では有意差はなかった

培養後には約 230 倍に増加していた（図 5）。そ（図 7）。

の他の遺伝子の mRNA 量変化は U-51 とほぼ同様の傾向を示した（図 5）。また、同実験で葉状体の高水温障害（多層化）について観察したところ、回復培養後の多層化発生数は U-51 が平均 2.5 カ所／mm2 であったのに対し、MCF1 は 1.6 カ所／mm2であった（図 5）。回復培養後には葉状体全体に多数のシワが生じたものの、その生じ方に株間の違いは見られなかった。一方、回復培養後の生長率は MCF1 で高い傾向が見られた（データ省略）。
図6

24℃培養下における未知遺伝子 A の発現量2

死細胞数（個／mm ）と多層化耐性との相関分析結果

図 5 回復培養前後における mRNA 量の変化（グラフ）と多層化発生数（写真）の株間比較
内部標準遺伝子：GAPDH。17℃培養下の U-51
における各遺伝子の mRNA 量を 1 とし、n＝3の平均値±標準誤差で表示。PE：フィコエリ
トリン。

図 7 27℃曝露直後の葉状体死細胞数

本課題で得られたノリの遺伝子発現データをエ

考 察

総合的に再検討したところ、高水温耐性マーカー

本課題の成果として、ノリが高水温に対する適候補となりうる遺伝子は最終的に 5 種類となっ応応答機構を遺伝的にもつことが明らかとなった。

た。これら遺伝子の発現量を養殖ノリ 6 品種間でまた、ノリの高水温耐性マーカーとして有用な遺比較したところ、2 種類の遺伝子の発現量と多層伝子の同定に成功した（特許出願中）。

化耐性との間に正の相関が認められた。中でも未本課題の結果から、スサビノリ葉状体は短期的

知遺伝子 A の発現量と多層化耐性との間には特な高水温に対する防御機構として熱ショック応答に強い相関があった（図 6）。一方、6 品種を 27℃現象を示し、複数種のタンパク質の蓄積量を増加の高水温に曝露すると、その直後には全ての品種させることによって高水温に対する抵抗性を高め
52

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価・適応技術開発事業ていることが示唆された。それらタンパク質のうオ 今後の課題

ちの一つと考えられる Hsp20 をコードする遺伝子

本課題の結果から、選抜育種によってノリの高の発現が高水温により誘導されることが本課題の水温耐性を向上させることができる可能性が開結果から示唆されている。この結果は高温誘導性

かれた。その一方、ノリは複雑な生活史をもつたの Hsp20 ファミリー遺伝子が植物の高温耐性に関め、選抜された形質が各生活史段階でも同様に観1)察されるのか、あるいは形質が何世代まで保持さと整合する。このように、ノリが遺伝的に高水温れるのかなど未解明の課題が残されている。まに対する防御機構をもつことが初めて明らかになた、本課題において一部のノリ遺伝子で高水温にったことから、この機構に優れた株を選抜するこ

よる誘導発現が観察されたが、このような遺伝子とにより、高水温耐性を向上させたノリ品種の作の発現調節機構についても現時点では不明のま出が可能であると考えられる。実際、高水温選抜

まとなっている。

与する有力な候補遺伝子であるとの従来の報告により作出された千葉県のノリ株で高水温耐性がこれらの課題を解明するため、今後は既報のノ向上したことが本課題の結果から示されている。

リゲノム情報 2)等の活用により、各生活史段階にまた、本課題において RNAlater に浸漬されたノおける遺伝子の発現解析や、ノリの遺伝子プロモーターの解析等の研究の進展が望まれる。

リ葉状体から RNA とタンパク質を安定的に回収できることが明らかになったことにより、遠隔地から供与された試料でも再現性良く遺伝子発現をカ

要 約

分析することが可能となった。このようなサンプ

本課題の目的は、ノリが高水温耐性の遺伝的形リング法を活用した結果、異なるノリ株間で一部質をもつのかを明らかにし、ノリの高水温耐性育の高水温誘導性遺伝子の mRNA 量に違いがあるこ

種に有用な遺伝子情報を得ることである。そこで、とが初めて示唆された。このように再現性の高いノリからのタンパク質抽出法を確立し、高水温曝遺伝子発現分析を実施できたことが、最終的にノ露による葉状体タンパク質の発現パターン変化を

リの高水温耐性に関与する遺伝子の同定につなが調べた。また、高水温誘導性遺伝子の発現と高水ったと考えられる。

温耐性形質との相関を分析した。その結果、ノリ

また、ノリの短期的高水温耐性を評価する方法

が高水温に対する防御機構を遺伝的にもつことがの一つとして葉状体死細胞数を指標とする方法

明らかとなり、ノリの高水温耐性マーカーとしてについて検討したところ、死細胞数は、本課題で有用な遺伝子の同定に成功した。これにより、ノ高水温耐性形質とした高水温障害（多層化）の各

リの高水温耐性を向上させる選抜育種への可能

品種における程度とは相関しなかった。スサビノ性が開かれた。

リ U-51 と MCF1 においては、高水温曝露後に定キ

常温度に戻して培養すると死細胞が脱落し、脱落部位を周囲の生細胞が修復することが観察され

1)

文献
Waters E.R. (2013). The evolution, function,ている（データ省略）。このことから、短期的高

structure, and expression of the plant sHSPs. J.

水温による葉状体死細胞の発生は、ノリの高水温

Exp. Bot., 64:391–403.

耐性形質を必ずしも反映していないことが示唆

2)

Nakamura Y, Sasaki N, Kobayashi M, Ojima N,

される。このため、ノリの高水温耐性形質評価法

Yasuike M, Shigenobu Y, Satomi M, Fukuma Y,

としては、多層化発生率を指標した方法が現時点

Shiwaku K, Tsujimoto A, Kobayashi T, Nakayama

では最も有用であると考えられる。

I, Ito F, Nakajima K, Sano M, Wada T, Kuhara S,

53

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価・適応技術開発事業

Inouye K, Gojobori T, Ikeo K. (2013). The firstsymbiont-free genome sequence of marine red alga,
Susabi-nori (Pyropia yezoensis). PLoS One, 8(3).

54チーム名：アマノリチーム
担当課題名：アマノリ類の長期的高水温耐性及び適応に関与する遺伝子の探索
研究機関・担当者名：三重大学大学院生物資源学研究科・柿沼誠 （ 059-231-09558 、kakinuma@bio.mie-u.ac.jp ） ・ 秋 山 敏 男 、 三 重 県 水 産 研 究 所 ・ 岩 出 将 英（059-386-0163、iwades00@pref.mie.jp）
研究期間：平成 21～25 年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
Ⅰ）三重県が開発した高水温耐性品種の室内培養

ア 研究目的試験による特性評価

我が国において産業上、最も重要なスサビノリ葉状体は、低水温・短日期に養殖されているが、近年

１）高水温降下培養試験による特性評価の海水温の上昇傾向により採苗、育苗、秋芽網栽培

供試品種 U51 および MET11 を採苗後、18℃で 6が特に大きな影響を受け、生産量や品質の低下、病時間通気培養した。芽立を確認後、高水温（24℃）

障害の発生が懸念されている。このため、高水温耐から両品種の培養を開始し、3.5 日で 0.5℃ずつ水温性品種の選抜育種やその効率化が急務となっているを降下させながら 21 日間培養した。培養期間中、葉が、スサビノリを含むアマノリ類の高水温耐性・適状体の生長と形態を指標として両品種の特性評価を応に関与する分子についての基礎的知見はほとんど行った。なお、水温以外の培養条件は、1 L 枝付球

なく、選抜された高水温耐性品種の特性評価基準も形フラスコ、1/2 SWM-III 改変培地、明期 11 時間・

確立されていない。そこで本課題では、以下の 2 つ

暗期 13 時間（11L/13D）の光周期、光量子密度の小課題研究に取り組んだ。

60μmol/m2/s とした。

Ⅰ）三重県が開発した高水温耐性品種の室内培養

２）長期的高水温培養試験による特性評価試験による特性評価

採苗した U51 および MET11 を 24℃で 14 日間通高水温耐性品種の特性評価基準を確立するための気培養し、両葉状体における高水温障害（多層化）

基礎情報を得るために、スサビノリ基準品種（U51）

発生率と生長を指標として、MET11 葉状体の長期的と養殖品種の選抜育種により三重県が開発した高水

高水温耐性能を評価した。なお、多層化の有無は顕温耐性品種（みえのあかり；MET11）の室内培養試

微鏡観察で判別し、多層化が 1 箇所以上みられた葉験を行い、高水温環境下における MET11 葉状体の状体は多層化発生葉状体とし、1 試験あたりの計測

生長特性を調べた。

数を 100 葉状体以上として 3 反復行った。水温以外

Ⅱ）アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関与

は１）と同条件とした。

する遺伝子の探索

３）短期的高水温培養試験による特性評価

アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関わる分採苗した U51 および MET11 を 17℃で 21 日間通子情報を得るために、U51、MET11、広温性マルバ

気培養後に 27℃で 24 時間処理（高水温暴露）し、

アマノリ岩手株（PSI）と沖縄株（PSO）の葉状体を17℃に戻して 13 日間回復培養した。回復培養後、葉主対象として発現遺伝子の比較解析を行い、長期的状体上の単位面積当たりの多層化発生箇所数（箇所

高水温耐性・適応に関与する候補遺伝子の単離・同/mm2）を指標として短期的高水温耐性能を評価した。

定を試みた。また、MET11 葉状体における候補遺伝

なお、試験は 3 反復行い、水温以外は１）と同条件

子の発現特性を調べ、候補遺伝子の選抜育種用分子とした。

マーカーとしての有効性を評価した。

Ⅱ）アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関与する遺伝子の探索

イ 研究方法１）スサビノリ基準品種とマルバアマノリ分離株
55および U51 葉状体（U51-H）の cDNA ライブラリーの室内培養試験を作製した。

水温変化がU51葉状体と糸状体の生長や形態などに与える影響を調べるために室内培養試験を行った。

３）cDNA サブトラクション

葉状体については、Provasoli 栄養補強海水（PES）

計 10 種の cDNAライブラリーと PCR-Select cDNA培地を用いて 10～25℃、光周期 10L/14D、光量子密Subtraction Kit（Clontech）を用いて、計 6 区（U51-20

度 20μmol/m /s で 14 日間通気培養した。
培養期間中、と U51-10、U51C-30 と U51C-10、PSI-20 と PSI-10、

24 時間毎に葉長と細胞状態を調べ、培養終了時に色PSO-25 と PSO-15、PSO-25 と PSI-20、MET-H と彩色差計による色調測定を行った。糸状体について

U51-H）の cDNA サブトラクションを行い、各サブ

は、PES 培地を用いて 5～30℃、光周期 13L/11D、トラクション区に用いた cDNA ライブラリー間で発光量子密度 20μmol/m2/s で 14 日間静置培養した。培現差のある遺伝子の cDNA プールを作製した。

2４）サブトラクション cDNA の発現・配列解析

養期間中、48 時間毎に細胞状態を調べた。
広温性マルバアマノリ PSI および PSO 葉状体につcDNA サブトラクションによって得られた各

いては先ず、PES 培地を用いて最も生長が良い水温

cDNA プールをプラスミドベクターにサブクローン（PSI は 15℃、PSO は 20℃）、光周期 10L/14D、光化後、大腸菌を形質転換させた。形質転換後の大腸

量子密度 20μmol/m2/s で通気培養した。葉長 1～2 cm

菌を LB 寒天培地に塗布後、cDNA が挿入されたプとなった時点で 5～30℃に移して14 日間通気培養し、ラスミドを含む大腸菌コロニーをランダムに選抜し、24 時間毎に葉長と細胞状態を調べた。

コロニーPCR により挿入 cDNA を増幅した。増幅

２）cDNA ライブラリーの作製

cDNA をナイロンメンブレンに転写後、DIG 標識しU51 葉状体については、PES 培地を用いて高水温

た cDNA プローブをハイブリダイズさせ、各 cDNA

（20℃）または低水温（10℃）、光周期 10L/14D、の発現解析（ドットブロット解析）を行った。なお、

光量子密度 20μmol/m /s で 14 日間通気培養した後にプローブの検出・定量には ECF と蛍光イメージスキ

回収した。U51 糸状体については、PES 培地を用い

ャナ（Typhoon 8600、GE Healthcare）を利用した。

2て 18℃、光周期 13L/11D、光量子密度 20μmol/m /s

各 cDNA プールのドットブロット解析結果から、で静置培養して増枝後、高水温（30℃）または低水

U51 葉状体および糸状体、PSI および PSO 葉状体、温（10℃）に移して 14 日間静置培養した後に回収しMET11 葉状体の長期的高水温耐性・適応に関与するた。PSI および PSO 葉状体については、PES 培地を候補遺伝子群の cDNA を特定し、それらの塩基配列用いて高水温（PSI は 20℃、PSO は 25℃）または低を決定後、CAP3 プログラムを利用して塩基配列デ水温（PSI は 10℃、PSO は 15℃）、光周期 10L/14D、ータのアセンブルを行った。得られたコンティグ配

光量子密度 20μmol/m /s で 14 日間通気培養した後に列データにつき Blast2GO プログラムを利用した配回収した。MET11 葉状体については、Ⅰ－１）の室

列解析を行い、長期的高水温耐性・適応に関与する内培養試験後に回収した。
なお、比較対照となる U51

候補遺伝子群を同定した。

22５）候補遺伝子の分子マーカー評価

葉状体も同時に回収した。
培養調製した葉状体および糸状体から mRNA を

各 cDNA プールのドットブロット解析データと抽出・精製（DNase 処理）し、これらを鋳型としてcDNA 配列データを整理・統合し、アマノリ類の長高水温または低水温培養した U51 葉状体（U51-20

期的高水温耐性・適応に関与する候補遺伝子 29 種類と U51-10）、U51 糸状体（U51C-30 と U51C-10）、を選定した。各候補遺伝子の発現解析には、リアル

PSI 葉状体（PSI-20 と PSI-10）、PSO 葉状体（PSO-25

タイム PCR（プローブ法）を用いた。なお、スサビと PSO-15）、高水温培養した MET11 葉状体（MET-H）

ノリ（U51、MET11）から選定された候補遺伝子に
56

ついては、cDNA 配列情報を基にプライマー・プロ

３）短期的高水温培養試験による特性評価

ーブセットを設計した。
一方、
マルバアマノリ（PSI、

高水温暴露した時の多層化発生箇所数は、U51 葉PSO）から選定された候補遺伝子については、スサ状体で 10.4 箇所/mm2、MET11 葉状体で 2.1 箇所/mm2

ビノリESTデータベースから対応するcDNAの配列であった（表 3）。なお、高水温暴露後の回復培養 4

情報を取得し、それらを基にプライマー・プローブ～7 日目で両葉状体に多層化が確認された。回復培

セットを設計した。

養 13 日目の U51 葉状体では、多層化発生箇所が癒解析試料には MET11 および U51 を用い、採苗後着してシワが生じていたが、MET11 葉状体では癒着

24℃で 14 日間培養（24T/14D）、採苗後 18℃で葉長は観察されず生長にも顕著な違いが現れた（図 3）。

数 cm まで培養（18T）、さらに 24℃で 14 日間培養Ⅱ）アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関与（18-24T/14D）した。各葉状体から全 RNA を抽出・する遺伝子の探索

精製（DNase 処理）し、これを鋳型としてリアルタ

１）スサビノリ基準品種とマルバアマノリ分離株

イム PCR 用 cDNA を合成した。各葉状体 cDNA をの室内培養試験鋳型としたリアルタイム PCR（7300 Real-Time PCR

U51 葉状体については、10～25℃、14 日間の通気

System、Applied Biosystems）により、各候補遺伝子

培養で栄養細胞の生殖細胞への分化は認められなかの相対定量解析を行った（内部標準 18S rRNA、検量

ったが、水温の違いは生長率に大きく影響した。ま

線法）。

た、
25℃培養葉状体では培養 10 日目以降に明らかな生長異常（ちじれ、脆弱化、色調変化）が認められ

ウ 研究結果た。U51 糸状体については、5～30℃の静置培養で生Ⅰ）三重県が開発した高水温耐性品種の室内培養長率に差が認められたが、10～30℃で正常に生長す試験による特性評価

ることが分かった。PSI と PSO 葉状体についてはそ

１）高水温降下培養試験による特性評価

れぞれ、10～20℃と 15～25℃で良好な生長が認めら

U51 葉状体の培養 4 日後の平均細胞分裂数は 4.1、れた。

培養 7、14、21 日後の平均葉長はそれぞれ 157μm、以上の結果から、高水温および低水温培養条件を

1.9 mm、7.2 mm であった。一方、MET11 葉状体のU51 葉状体と PSI 葉状体では 20℃と 10℃、PSO 葉

培養 4 日後の平均細胞分裂数は 8.8、培養 7、14、21状体では 25℃と 15℃、U51 糸状体では 30℃と 10℃

日後の平均葉長はそれぞれ 253μm、3.6 mm、11.8 mmに設定した。培養試料の回収は、水温以外の培養条であり、いずれの値も MET11 葉状体で有意に大き件（光周期や光強度）が遺伝子発現に及ぼす影響をかった（表 1）。また、U51 葉状体では培養初期か最小限に抑えるために暗期終了時とした。

ら芽落ちなどの著しい形態異常が認められたのに対２）cDNA サブトラクション

して、MET11 葉状体に形態異常はほとんどみられな

培養調製した各試料（湿重約 0.5～1.0 g）から約かった（図 1）。

30～50μg の精製 mRNA が得られ、これを鋳型とし

２）長期的高水温培養試験による特性評価て計 10 種類の cDNA ライブラリー（U51-20、U51-10、

長期的高水温培養した時の高水温障害（多層化）U51C-30、U51C-10、PSI-20、PSI-10、PSO-25、PSO-15、発生率は、U51 葉状体で 98.9%、MET11 葉状体でMET-H、U51-H）を作製した。次に計 6 区の cDNA

61.3%であり（表 2）、葉状体の形態にも明瞭な差がサブトラクションを行い、U51-20 と U51-10 から高認められた（図 2）。培養 14 日後の平均葉長は U51

水温および低水温培養 U51 葉状体の高発現遺伝子

葉状体で 1.7 mm、MET11 葉状体で 3.7 mm であった

cDNA プール（U51-FS および U51-RS）、U51C-30（表 2）。

とU51C-10から高水温および低水温培養U51糸状体
57

の高発現遺伝子 cDNA プール（U51C-FS および

Hsp90-2）、calmodulin（CaM-1、CaM-2）、small GTPase

U51C-RS）、PSI-20 と PSI-10 から高水温および低水（Ran、Rab1、Rab11、Sar）、superoxide dismutase（SOD）、

温培養 PSI 葉状体の高発現遺伝子 cDNA プール

thioredoxin （ Trx ） 、 ubiquitin ligase （ UbiE3 ） 、（PSI-FS および PSI-RS）、PSO-25 と PSO-15 から高senescence-associated protein（SAP）、vacuolar-ATPase

水温および低水温培養 PSO 葉状体の高発現遺伝子（vATPase）、multiprotein binding factor 1（MBF1）、

cDNA プール（PSO-FS および PSO-RS）、PSO-25

protein phosphatase 2A（PP2A）、mitogen-activatedと PSI-20 から高水温培養 PSO および PSI 葉状体のprotein kinase（MAPK）、Snf1 protein kinase（Snf1）、

高発現遺伝子 cDNA プール（PSO/I-FS および

TonB-dependent outer membrane receptor protein

PSO/I-RS）、
MET-H と U51-H から高水温培養 MET11（TonB）、hypothetical protein（HyP-14、15、19）、および U51 葉状体の高発現遺伝子 cDNA プール

unknown（UnG-9、26、36、37、41、42）遺伝子を（MET/U51-FS および MET/U51-RS）を作製した。

選定した。
選定候補遺伝子の相対定量解析の結果、Hsp70-1、

３）サブトラクション cDNA の発現・配列解析
計 12 種の cDNA プールを各々プラスミドベクタ

Hsp70-3、Hsp90-1、Hsp90-2、CaM-1、Ran、Rab1、ーにサブクローン化後、大腸菌を形質転換させた。

Rab11、Sar、SOD、Trx、vATPase、MBF1、PP2A、

U51-FS/RS、PSI-FS/RS については、各 cDNA が挿入

MAPK、Snf1、UnG-26、UnG-36、UnG-37 遺伝子にされたプラスミドを含む大腸菌コロニーを 1152 個

ついては、18T 葉状体や 18-24T/14D 葉状体よりもず つ 選 抜 し た 。 U51C-FS/RS 、 PSO-FS/RS 、

24T/14D 葉状体で高発現している傾向が認められた。

PSO/I-FS/RS、MET/U51-FS/RS については、各 FS で

一 方 、 18T 葉 状 体 や 24T/14D 葉 状 体 よ り も

864 個ずつ、各 RS で 576 個ずつ大腸菌コロニーを選

18-24T/14D 葉状 体で高 発現が 認め られた のは抜した（表 4）。各 cDNA のドットブロット解析に

UnG-42 遺伝子のみであった。MET11 について 18T

より、U51 葉状体および糸状体、PSI および PSO 葉

葉状体の発現量を基準とした 24T/14D 葉状体の相対状体、MET11 葉状体の長期的高水温耐性・適応に関発現量をみると、Hsp70-3、Hsp90-1、Hsp90-2 遺伝

与する候補遺伝子群（FS cDNA については約 520～

子で約 53～81 倍の著しい発現差が、Hsp70-1、Ran、690 個、RS cDNA については約 320～900 個）を特Rab1、Rab11、Sar、SOD、Trx、MBF1、PP2A、UnG-26、定した。

UnG-36、UnG-37 遺伝子で約 2～4 倍の有意な発現差特定された cDNA（U51-FS/RS、PSI-FS/RS についが認められた。これらのうち、Hsp70-1、Hsp90-2、ては各 288 個ずつ）の塩基配列を決定し、CAP3 プ

Ran、Rab1、Rab11、Sar、SOD、Trx、MBF1、PP2A、ログラムによるアセンブルを行ったところ、各

UnG-36、UnG-37 遺伝子は、U51 の 24T/14D 葉状体

FS/RS cDNA から約 60～300 種類の配列データが得よりも MET11 の 24T/14D 葉状体で高発現していた。

られた（表 4）。各配列データについて Blast2GO プ
ログラムによる配列解析を行ったところ、各 FS/RS

エ 考 察

cDNA において 35～171 種類については既知遺伝子Ⅰ）三重県が開発した高水温耐性品種の室内培養との類似性が認められた（表 4）。

試験による特性評価

４）候補遺伝子の分子マーカー評価

U51 葉状体を比較対照とした MET11 葉状体の室サブトラクション cDNA のドットブロット解析デ内培養試験により、MET11 葉状体は長期的高水温のータと配列解析データを基に、アマノリ類の長期的みならず短期的高水温に対しても高い障害（多層化）

高水温耐性・適応に関与する候補遺伝子として、heat

耐性と高生長を示すこと（表 1～3）、MET11 葉状

shock protein 70（Hsp70-1、Hsp70-3）、Hsp90（Hsp90-1、体の長期的高水温耐性能は採苗後から生長初期の生58長特性と関係していることが明らかとなった（図 1、分解などに関与する 1）。SOD は生体成分の酸化的損2）。実際の海苔漁場での高水温障害には、多層化の傷の抑制、Trx は同機能に加え細胞内シグナル伝達

他に生長低下や芽落ちなどがある。本課題研究によ分子や転写因子の活性制御に関与する 2、3）。転写制

り、これまで高水温耐性・適応能の評価指標とされ御因子として機能する MBF1 や細胞内シグナル制御ていた多層化に加え、生長性や形態も有用な評価指に関わる PP2A は、陸上植物の温度ストレス応答・

標候補となることが示された。

適応機構において重要な役割を果たす 4、5）。長期的Ⅱ）アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関与

高水温環境下の生長初期 MET11 葉状体における候する遺伝子の探索

補遺伝子の発現特性と生体内機能から、Hsp70/90、

一般的な条件下で培養調製されたスサビノリ葉状

SOD、Trx、MBF1、PP2A 遺伝子が生長初期葉状体

体と糸状体の EST データベースが既に整備されての長期的高水温耐性評価に有効な分子マーカー候補

いるが、アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関と考えられる。

与する候補遺伝子の単離・同定には、養殖品種のみ
ならず広温性品種や高水温耐性品種などを対象とし

オ 今後の課題

た発現遺伝子解析が必要と考えられる。このような背景のもと本課題研究では、スサビノリ基準品種

本課題研究により、MET11 葉状体は生長初期で長U51 と高水温耐性品種 MET11 に加え、広温性マル期・短期的高水温に対して高耐性・高生長を示すこ

バアマノリ分離株 PSI と PSO を対象とした発現遺伝と、この生長特性の一部に Hsp70/90、SOD、Trx、子の比較解析結果を基に（表 4）、アマノリ類の長MBF1、PP2A 遺伝子などが関与している可能性が示

期的高水温耐性・適応に関わる分子情報を整備し、唆された。各候補遺伝子の発現定量解析は長期的高品種間での遺伝的特性の差異や、生息地域の異なる水温処理した U51 および MET11 葉状体に限定され同一種間での遺伝的特性の差異を調べた。
その結果、たため、今後は他の高水温耐性品種を解析対象に含長期的高水温培養したアマノリ類葉状体では、分子め、且つ長期・短期的高水温処理に対する発現特性

シャペロン、シグナル伝達系、酸化還元系、転写制を明らかにする必要がある。

御系遺伝子などが高発現していることが分かった。

マルバアマノリ葉状体の cDNA サブトラクション

また、アマノリ類の長期的高水温耐性・適応に関与

区から単離された候補遺伝子の中には、スサビノリ

する候補遺伝子の一部につき、高水温耐性品種

EST データベースに対応する配列情報が見出せなかMET11 葉状体における発現特性を調べたところ、ったため、発現定量解析を断念したものがあった。

Hsp70、Hsp90、Ran、Rab1、Rab11、Sar、SOD、Trx、

高水温耐性能が明らかに異なる広温性マルバアマノ

MBF1、PP2A、UnG-36、UnG-37 遺伝子が長期的高

リ岩手・沖縄株間の遺伝的特性の差異を明らかにす

水温処理した生長初期 MET11 葉状体で高発現してるためには、マルバアマノリ葉状体の遺伝子解析をいた。長期的高水温処理した MET11 葉状体は、同進めていく必要がある。

処理 U51 葉状体よりも高耐性・高生長を示すことか

長期的高水温環境における MET11 葉状体の生長ら（表 1、2）、MET11 葉状体の長期的高水温耐性・特性と候補遺伝子の発現特性から、生長初期葉状体

適応には、分子シャペロン、シグナル伝達系、抗酸の長期的高水温耐性・適応能が高水温耐性品種の重化系、転写制御系の活性化に関わるこれら候補遺伝

要形質の一つと考えられる。本課題研究では、ある子が重要な役割を果たしていると考えられる。

程度まで生長させた葉状体を対象に候補遺伝子群のHsp70/90 は細胞内で分子シャペロンとして機能し、探索を進めてきたが、生長初期 MET11 葉状体を解タンパク質のフォールディング、輸送、凝集抑制や析対象とすることで、長期・短期的高水温耐性・適59

応に関与する新規遺伝子や高水温耐性評価に有効な

表 1 細胞分裂数と生長の比較（高水温降下培養）

新規分子マーカーを同定できる可能性がある。
カ 要 約

表 2 多層化発生率と生長の比較（長期的高水温培養）

室内培養試験により、スサビノリ高水温耐性品種（MET11）は長期・短期的高水温に対する耐性を有し高水温環境下でも高生長を示すこと、生長初期葉

表 3 多層化発生箇所数の比較（短期的高水温培養）状体の生長特性が高水温耐性能に大きく影響することが明らかとなった。また、スサビノリ基準品種（U51）、広温性マルバアマノリ岩手株（PSI）と沖
縄株（PSO）、スサビノリ高水温耐性品種（MET11）の葉状体を主対象として、長期的高水温処理により

表 4 サブトラクション cDNA の解析結果

発現変動する遺伝子を調べ、分子シャペロン、シグ
ナル伝達系、抗酸化系、転写制御系の活性化が長期
的高水温耐性・適応に関与していることを明らかにした。各遺伝子の発現特性解析により、一部遺伝子の選抜育種用分子マーカーとして有用性が示唆され
た。
キ 文 献

1) Boston RS, Viitanen PV, Vierling E (1996). Molecularchaperones and protein folding in plants. Plant Mol.
Biol. 32: 191-222.
2) Davison IR, Pearson GA (1996). Stress tolerance in
図 1 高水温降下培養した葉状体の形態

intertidal seaweeds. J. Phycol. 32: 197-211.
3) Santos CVDS, Rey P (2006). Plant thioredoxins are
key actors in the oxidative stress response. TRENDS
Plant Sci. 11: 329-334.
4) Suzuki N, Sejima H, Tam R, Schlauch K, Mittler R(2011). Identification of the MBF1 heat-response
regulon of Arabidopsis thaliana. Plant J. 66: 844-851.
5) Yu RMK, Zhou Y, Xu ZF, Chye ML, Kong RYCK(2003). Two genes encoding protein phosphatase 2A

図 2 長期的高水温培養した葉状体の形態

catalytic subunits are differentially expressed in rice.
Plant Mol. Biol. 51: 295-311.
60図 3 短期的高水温培養した葉状体の形態

61

地球温暖化対策推進費のうち地球温暖化による沿岸漁場環境への影響評価･適応技術開発委託事業
成果報告書

平成 26 年 3 月 印刷･発行

編集兼 〒516-0193 三重県度会郡南伊勢町中津浜浦 422-1
発行者 独立行政法人水産総合研究センター増養殖研究所

印刷 〒876-0832 大分県佐伯市船頭町 2-52（有）勉強堂美術精版社

62