弱毒ウイルスによる防除技術利用及び種苗技術との連携における課題
ワクチン接種区

無接種区

０．イントロダクション
平成以前の弱毒ウイルス研究の歴史
１．弱毒ウイルスの分子作用機構
２．ZYMVにおける優良ワクチン株の選抜
３．ZYMVワクチン株の製剤化～豊かな発想を地域に，新たな知を世界へ～
宇都宮大学農学部生物資源科学科

４．産学官連携体制と今後の課題

夏秋知英

干渉効果（cross protection）
植物に免疫系はないが、あるウイルスに全身感染するとその後は同種の近縁なウイルスに感染しなくなるという現象がある

干渉効果の研究史
1929年 McKinney：タバコモザイクウイルス（TMV）とタバコの組み合わせで最初の報告
1933年 Salaman：ジャガイモXウイルス（PVX）とジャガイモの組み合わせで弱毒系が強毒系の感染を防ぐことを報告
1949年 Mathews：ʺcross protection ʺを提案
1951年 Grant and Costa：カンキツトリステザウイルス（CTV）でウイルス病の防除に利用できることを報告
1952年 Webbら：汁液接種できず師部局在のジャガイモ葉巻ウイルス（PLRV）で報告
1955年 Posnette and Todd：Cacao swollen shoot disease で防除に応用できることを報告

弱毒ウイルスの利用例
・トマトモザイクウイルス (TMV-L11A)
・キュウリモザイクウイルス・トウガラシマイルドモットルウイルス (TMV-P)
・スイカ緑斑モザイクウイルス・ズッキーニ黄斑モザイクウイルス・ヤマノイモえそモザイクウイルス・ダイズモザイクウイルス・カンキツトリステザウイルス
日本デルモンテのCMVワクチンは有名
海外ではパパイヤリングスポットウイルスなども干渉効果の研究史（続）★干渉効果は近縁のウイルス間で起き、強毒系統間でも起きる
1950年代 干渉効果はウイルスの系統を調べる重要な試験★干渉効果はDNAウイルスでもみられる
1978年 Tomlinson and Shepherd ：カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）で干渉効果を報告
2004年 Owor ら：キャッサバモザイク病で報告★干渉効果はウイロイド（裸のRNA）でもみられる
1978年 Niblettら：ウイロイドで干渉効果を報告⇒干渉効果に外被タンパク質は必須でない？
★これまでに弱毒ウイルスを防除に用いる試みが多数報告された★干渉効果の原理に関していくつかの仮説が提案された★静岡県のマスクメロンの例
キュウリ緑斑モザイクウイ
ルス(CGMMV)のワクチン（弱毒ウイルス）の利用

弱毒ウイルスの利用の歴史は古い

ハウスの入口では靴や手を消毒する

1

④

①②

さまざまな理由でワクチンの実用化例、商品化例は少なかった

０．イントロダクション
平成以前の弱毒ウイルス研究の歴史
１．弱毒ウイルスの分子作用機構
２．ZYMVにおける優良ワクチン株の選抜③

以前の干渉効果に関する仮説
・ウイルスの外被タンパク質による二次ウイルスRNAの隔離（encapsidation）
・一次ウイルスRNA複製酵素による二次ウイルスRNAの隔離 （複製阻害）
・代謝異状による植物のストレス（複製の場やリボソー
ム、増殖素材の不足）
・一次ウイルスによって誘発される防衛物質①脱外被タンパク質→RNA複製酵素の翻訳②ウイルスのRNA複製酵素によるウイルスRNAの複製③その他のウイルスタンパク質の合成④ウイルス粒子の形成⑤隣接細胞への細胞間移行（cell to cell movement）、再び複製増殖⑥長距離移行（long distance movement）に より植物の全身に感染「弱毒性」と「干渉効果」を分けて考える
二つのタイプの弱毒ウイルスが実用化① 京都タイプ② デルモンテタイプ

３．ZYMVワクチン株の製剤化
４．産学官連携体制と今後の課題「弱毒性」と「干渉効果」を分けて考える
二つのタイプの弱毒ウイルスが実用化① 京都タイプ② デルモンテタイプ
何が違うのか？
① 京都タイプは製剤で販売② 接種苗で販売「弱毒性」のメカニズムが異なる

二つのタイプの弱毒ウイルスが実用化①京都タイプ強毒ウイルスの持つサイレンシング
サプレッサーが壊れている②デルモンテタイプ
ウイルスに寄生するRNAを利用
デルモンテのCMVワクチンはCMVに寄生するサテライトRNAを含んでいる

2

CMVのゲノム構造

CMVの性状• キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus,CMV）はブロモウイルス科ククモウイルス属に属する• 植物ウイルスにおいて最大の宿主範囲を持ち、単子葉植物から双子葉植物まで1,000種以上の植物に感染する• 100種以上のアブラムシによる非永続伝搬する・一本鎖(＋)RNA 3分節
RNA15’

RNA25’

1a protein
2a protein

Subgenomic RNA4aRNA35’3’5’3’

2b protein

3’3a protein

Subgenomic RNA43’5’

CP protein

3’

1a,2a protein－ RNA複製とサブゲノムRNAの合成に関与
2b protein－ RNAサイレンシングに関与（病徴に関与）
3a protein,CP－ 細胞間移行とウイルス感染に関与
CMV粒子

Bar 100ｎｍ

欠損性干渉ＲＮＡ (Defective interfering RNA、DI-RNA）

CMVのサテライトRNA
・300～400塩基の一本鎖RNA・CMVに寄生して増殖
・CMVの病徴に影響

DI RNAは、ゲノムRNAの内部配列が欠失していてかなり短い。ゲノムRNAより効率的・優先的に複製されるので、ゲノムRNAの複製を抑制し、病原性を抑えると考えられていた。
DI RNAの構造

内部配列が欠失する
末端配列どうしが結合

ゲノムRNA
ゲノムRNAの複製

DI RNAの複製

以前はsatRNAがCMVのウイル
スRNAの複製酵素を乗っ取るために、CMVの増殖が抑制されると考えられていた
2011年に複数の論文が、satRNAから生じるsiRNAが植物のRNAやCMVのRNAに影響を与えることを報告した

短いので効率的優先的に複製

図 ＣＭＶから検出される3種のsatRNA
大きさはI-Ⅲが各約370, 335, 300塩基(A)。
塩基配列に相同性が認められ(B-D)、大きいものがCMVに弱毒性を付与できる。

０．イントロダクション
平成以前の弱毒ウイルス研究の歴史

抑制

DI RNAでも、最近は植物のサイレンシングを誘導するためにウイルスの増殖が抑えられるのではないか、と考えられている。
⇒ satRNAはCMVのみであるが、DI RNAは幅広く適用できるので、今後の利用が考えられる

ズッキーニ黄斑モザイクウイルス(ZYMV)
全国のキュウリで被害が多発

１．弱毒ウイルスの分子作用機構
２．ZYMVにおける優良ワクチン株の選抜
３．ZYMVワクチン株の製剤化
４．産学官連携体制と今後の課題

果実にモザイクや奇形を起こす→ 著しい商品価値の低下
接ぎ木栽培では急性萎凋や枯死も起こる3

ズッキーニ黄斑モザイクウイルス(ZYMV)
・長さ約750nm、幅約13nmのひも状・アブラムシ伝播
・汁液接種容易
・宿主範囲はほぼウリ科植物
・ポティウイルス科ポティウイルス属
・約１万塩基の一本鎖ＲＮＡゲノムZYMVのゲノム構造
P1 HC-Pro P36K1CI

6K2 Vpg NIaProNIb

CP

弱毒株

・アブラムシで媒介されない（他のウリ科作物に実害が出る可能性はほとんどない）・長期栽培でも弱毒性が変化しない
・他のウイルスが混合感染しても病原性が強くならない
・各地で実用的な防除効果を示す

０．イントロダクション
平成以前の弱毒ウイルス研究の歴史

元の強毒株

無接種An

ZYMV-2002の実用性（まとめ）・激発条件では防除効果に地域差が出ることが予想される・少発生となっても、接種苗の導入リスク（収量・品質への影響）は小さい

京都府内のキュウリ分離したZYMVより優良弱毒株ZYMV-2002を選抜

温室内接種試験による各地ZYMV分離株に対する干渉効果
HC-PROのアミノ酸配列に基づくZYMV
分離株の系統樹

干渉効果 ○

干渉効果 ○
発生が農家圃場レベルであれば他県でも干渉効果 ○ZYMV-2002は優れた実用性を示す

干渉効果 ◎

干渉効果 ▲

初めて農薬登録された
弱毒ウイルス（CUBIO ZY-02）

１．弱毒ウイルスの分子作用機構
２．ZYMVにおける優良ワクチン株の選抜
３．ZYMVワクチン株の製剤化
４．産学官連携体制と今後の課題㈱微生物化学研究所

4

ZYMV弱毒株の「ワクチン性」を決定している遺伝子を解明

０．イントロダクション
平成以前の弱毒ウイルス研究の歴史

HC-Proタンパク質における４つの塩基の変異が病原性（弱毒性）とアブラムシ伝搬性を決定している⇒アブラムシに伝播されないワクチン株を天然の変異株の中から選抜できる

１．弱毒ウイルスの分子作用機構

選抜したワクチン株を塩基配列を用いて特許申請する開発したワクチン株を保護する
他種ウイルスへの応用を考える

２．ZYMVにおける優良ワクチン株の選抜
病徴の激しさを決定

３．ZYMVワクチン株の製剤化

長距離移行

宿主範囲決定に関与？

細胞間移行
6K1

P1

HC-Pro

6K2

P3CI

４．産学官連携体制と今後の課題

細胞間移行

VPg Pro

NIbCP

An

RNAポリメラーゼ

アブラムシ伝搬性に関与

６K1

P1

HC-ProP3６K2

CI

VPg ProNIbAｎCP☆HC-Pro領域がキュウリにおけるZYMVの病原性に関与している。
☆ 強毒株Z5-1 を実用的に弱毒化にするにはHC-Proにおける4ヵ所のアミノ酸変異のうち、少なくとも3ヶ所が必須であり、 4ヵ所の導入が望ましい。

アミノ酸番号350

636

733

761

Z5-1

A

L

L

2002

TS

S

1402

1987

K

C

T

R

G

A

HC-Proにおける弱毒株2002に特異的な塩基とアミノ酸配列の変異☆以上の結果から、HC-Proにおける4ヵ所のアミノ酸変異による弱毒株2002の弱毒化はより安定であり、かつ実用的であることが示された。
→特許申請☆また、この４種の変異がZYMVのカボチャでのえそ症状、キノアでの局部病斑形成、そしてアブラムシ伝搬性を決定していることが示された。

長野NA

2002-YFP接種苗の蛍光写真

2002（弱毒株）
022421

京都

202337

EM1
8B

I2046

CH1187Z5-1

塩基番号m48

KAMO
N
TA

TO

A

A
EM18 14KM

KYO（京都市株）

KYO

Eh
im
Miyaz eaki
MK2

Kagawa2004A-422
ZY
EYCSVB
EYM

EM17

MU
0K4

四国・九州

aaw
4S Okin
COVO

0.01

ate
Iw
Miy
agiHC

本研究で決定した
日本産27分離株のHC-Proの塩基配列による無根系統樹

SH

MU
05-1

I

5-1

2

EM17

広域 （愛媛県宇和島市株）0東北
沖縄

MU05-10（宮城県東松島市株）5宮城の強毒株の単独接種

同じウイルスで弱毒株と強毒株をYFPとCFPで標識して干渉効果を観察する

宮城の強毒株のチャレンジ接種
病徴発現の明確な遅延★サテライトRNAや欠損性干渉RNAが弱毒性をもたらす場
合もある★TMVではゲノムRNAの構造が弱毒性を決定したり、サプレッサー以外の要因で弱毒化も起きる★干渉効果にサイレンシングが関与しているが、HC-Proは干渉効果を決定してはいない★干渉効果の決定に外被タンパク質が関与する例もある★「一次ウイルスと二次ウイルスの競合」も考えられる

行 政
応用研究

大 学
基礎研究
生産現場
普 及

民間企業
商品化
・ワクチンの製剤化
・接種苗の大量育苗

・遺伝子レベルの基礎研究
・遺伝子によるワクチン株選抜法の開発★他のウイルスでもサプレッサーが弱毒性に関与している

キュウリにおけるワクチン開発と産学官連携体制

・弱毒ウイルスの作出
・産地に適したワクチンおよび品種の選抜（圃場試験）★ポティウイルスではジーンサイレンシングサプレッサーのHC-Proが弱毒化を大きく決定している

知的財産としてのワクチンを特許で保護する

さいごに

植物ウイルス病ワクチン開発のこれからの課題
１．接種方法をより簡単に
２． 1種のワクチンですべてのウイルス病を防除できない例）キュウリでは
ズッキーニ黄斑モザイクウイルスキュウリモザイクウイルス
カボチャモザイクウイルス
パパイアリングスポットウイルス⇒混合ワクチンの開発が急務
３．抵抗性品種や天敵利用といった他の防除方法との組み合わせ
IPM（integrated pest management）の考え方が大切
４．汁液接種できないウイルスのワクチンをどうするか
５．遺伝子組み換え技術との兼ね合い（競争）6