第５３回近畿アグリハイテクシンポジウム
第３回大豆研究会シンポジウム
ご来場頂きまして誠に有難うございます

題目

大豆発酵生産物の生理活性とこれを利用した健康食品（エコサンテ液）の紹介

２０１１年３月１０（木）主催：近畿アグリハイテク 農林水産省
会場：京都メルパル

エコサンテ物産

エコサンテ物産

この研究を始めた経緯

本日皆様にお伝えしたこと

食品メーカ在籍当時、豆乳アイスの商品化に携わる（京都の企業がきっかけ）

大豆由来で大腸がん細胞に直接作用
大学で栄養学を教える講師から大豆を利用した興味深い発酵物がある、研究してみないか

抗がん剤等との併用、又はＥＳのみで数々の症例抗がん剤等との併用 又はＥＳのみで数々の症例

縁を感じながらも専門家ではないので、しばらく思案やるなら今しかない！
１９９２年３０歳の時、オフィス新井を創業
年 歳 時、
ィ 新井を創業

昨年末より都内総合病院でﾋﾄ臨床試験開始
注意！
この発表は弊社研究食品素材の発表であり、の発表は弊社研究食品素材の発表であり、（創造法事業・ＳＢＩＲ事業の研究成果）、商品説明ではありません

会社概要

会社沿革

有限会社エ サンテ物産
有限会社エコサンテ物産

社名

創業1992年5月 設立1999年1月27日

創業・設立

1992年

5月

オフィス新井創業（大田区）

1999年

1月

（有）エコサンテ物産設立（江東区）

2000年

3月

東邦大学医学部薬理学教室と試験

資本金3,300万円

2004年

8月

行政の研究機関と試験

事業内容

ES大豆発酵生産物の研究開発
健康食品エコサンテ液の販売

2005年

5月

筑波大学と第1次共同研究開始

2006年

2月

筑波大学と第2次共同研究開始

2007年

4月

筑波大学と第3次共同研究開始

新井行雄（代表取締役）
役員

取引銀行

羽鳥元久

橋本敏紘

渡邉一生

外江義明

2008年

6月

三井住友銀行深川森下支店（当座 普通）
三井住友銀行深川森下支店（当座・普通）

2008年

8月

筑波大学と第3次共同研究完了報告

東京三菱銀行長原支店（普通）2010年 10月

都内総合病院でヒト臨床試験開始

東日本銀行深川支店（普通）2011年 3月

第５３回近畿アグリハイテクシンポジウム参加

ＥＳ大豆発酵生産物とは一次発酵【大豆（豆乳）＋乳酸菌】

二次発酵「産学官連携成功１２８社」に選ばれ感謝状を授与

ＥＳ大豆発酵生産物食品研究公的支援
熟成

江東区中小企業産学連携共同研究補助金事業（江東区）
新事業開拓助成金交付事業（研究開発分野）（中小企業基盤整備機構）
中小企業創造活動促進法認定（創造法）（東京都）

大豆を原料に独自の乳酸菌調合環境下により発酵させて生成される生産物。

熟成期間を入れておよそ33年
熟成期間を入れておよそＳＢＩＲ事業（中小企業技術革新制度）
生物系特定産業技術研究推進機構（関係省名：農林水産省）

ＥＳ大豆発酵生産物・名前の由来
創造法認定の研究題目「エコサンテ大豆発酵生産物の研究開発」

機能性研究 第１ステージ

商品名・エコサンテ液に決定
研究題目と商品名がリンクし薬事法上問題（東京都）

ＥＳ大豆発酵生産物
抗菌力試験

研究題目をエコサンテ横文字の頭文字を取ってＥＳ

東邦大学医学部薬理学教室
研究題目「ＥＳ大豆発酵生産物」に変更

ES大豆発酵生産物抗菌試験
東邦大学医学部薬理学教室
ピロリ菌、ＭＲＳＡ、0157
ピロリ菌、ＭＲＳＡ、0157抗菌効果実証
抗菌効果実証財団法人 本食品分析セ タ
財団法人日本食品分析センター
カンピロバクター抗菌効果実証
カンクタ 抗菌効果実証（社）東京都食品衛生協会 東京食品技術研究所
大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ、腸炎ビブリオ、抗菌効果実証
抗カビ効果実証

ピロリ菌
東邦大学医学部薬理学教室

ＭＲＳＡ

0-157

東邦大学医学部薬理学教室

東邦大学医学部薬理学教室

試験菌ＣＦＵ/ｍｌ90
万 80

試験菌ＣＦＵ/ ｍｌ

原液1000倍希釈液

ＭＲＳＡ Ｎｏ.1 株

万80

Ｅ.ｃｏｌｌ Ｏ157：Ｈ7 Ｒ27株

1000倍希釈液

4040

40357060
50
40302010030254040202019182015200208.4241.2850.024

0 120.12024024824

作業時間（ｈ）

カンピロバクター

大腸菌財団法人日本食品分析センター
財団法人日本食品分析センタ（社）東京都食品衛生協会 東京食品技術研究所

カンピロバクター抗菌効果試験

大腸菌抗菌試験

エコサンテ液原液

3,000,000
菌数数（CFU/ml）

1,600,000
1,400,000
1,200,000
1,000,000
800,000
600,000
400,000
200,00001810

作業時間（ｈ）

生菌数（/ml)

原液

45

2,500,000
2,000,000
1,500,000

エコサンテ液1,000,000
500,000
0
00

12時間

32

4
経過時間

824サルモネラ菌（社）東京都食品衛生協会 東京食品技術研究所（社）東京都食品衛生協会 東京食品技術研究所

黄色ブドウ球菌抗菌試験

サルモネラ菌抗菌試験

5,000,000

1,200,000

4,000,000,,1,000,000

3,000,000
エコサンテ液2 000 000
2,000,000
1,000,000

菌数（CFU/ml)

菌数数（CFU/ml))

黄色ブドウ球菌

800,000
600,000

エコサンテ液400,000
200,000

0024
経過時間

80240

エコサンテ液

824

経過
過時の菌数

菌数（CFU/ml)

抗カビ試験

1,600,000
1,400,000
1,200,000
1,000,000
800,000
600,000
400,000
200,000
0
経過時間

24（社）東京都食品衛生協会 東京食品技術研究所

腸炎ビブリオ抗菌試験

48

カビ（社）東京都食品衛生協会 東京食品技術研究所

24
経過時間

腸炎ビブリオ024,000,000
3,500,000
3,000,000
2,500,000
2,000,000
1 500 000
1,500,000
1,000,000
500,000
0

エコサンテ液

248
経過時間

24

平成１６年
産学公・東京技術交流会
機能性研究 第２ステージ
第２ステ ジ
東京都から技術交流会参加要請
筑波大学が関心を示し共同研究へ
ＥＳ大豆発酵生産物
生理活性試験

連携のきっかけ連携のき かけいつい2004年12月
2004年
12月
どこで東京技術交流会(東京都庁）東京都産業労働局主催
だれと筑波大学・技術移転マネージャー 産学官コーディネーター
なにを
ＥＳ大豆発酵生産物
なぜ機能性追及とエビデンスの充実を図るため
どのように
上記マネ ジ
上記マネージャーとコーディネーターに相談し関心のある先生の紹介を受けたと
デ ネ タ に相談し関心のある先生の紹介を受けた

筑波大学産学リエゾン共同研究センター

筑波大学との共同研究成果

エコサンテ物産
腸がん細胞・Caco－
腸がん細胞
腸がん細胞・Caco
C－2
ヒトの腸管上皮細胞

方法
86.5％
86.5％

65.4％
65.4％

細胞周期

細胞分裂

腸がん細胞・Caco－
腸がん細胞・Caco－2
ヒトの腸管上皮細胞

GUAVA-PCA
DNAを染色し、細胞周期を評価する。

細胞周期

結果
ＥＳ大豆発酵生産物 (×1/100) 処理

Control

G0/G1期G0/G1期
S期

S期

＊

＊

G2/M期

Representative plot cell cycle of Caco-2
Caco 2 cells

G2/M期

Representative plot cell cycle of Caco-2
Caco 2 cells

Ｇ2/M期

G2/M期が制御されている！！

細胞周期G2
細胞周期
G2／Ｍ期
／Ｍ期

シマウマ魚（ゼブラフィッシュ）
体長５ｃｍほどの小魚

正常細胞に影響の少ないきわめて適切なもの
食品機能性としては稀アポト シス誘導メカニズム
アポトーシス誘導メカニズム

結論
p53依存性経路

p53非依存性経路（ＥＳ大豆発酵生産物）

p53の活性化ES大豆発酵生産物による大腸がん細胞(Caco-2)における増殖阻害のメカニズムを調べた結果 細胞周期のG2/M期で制御されること害のメカニズムを調べた結果、を見出した。

ES大豆発酵生産物による大腸がん細胞(CES大豆発酵生産物による大腸がん細胞(Caco-2)における増殖
2)における増殖阻害効果は、p５３非依存性アポトーシスによるものと考えられる。

p53が発現しない
p53とは？
代表的なアポトーシス
代表的なアポトシス

p21の活性化誘導タンパク質Rbタンパク質のリン酸化の低下

E2F1の活性化

E2F1の放出停止

G2/M期での停止

G0/G1期での停止

Caspase-8 の活性
アポトーシスとは？
細胞がシグナルを受けて、自ら死んでいくこと

アポトーシス

第１次～第２次共同研究
ＥＳ大豆発酵生産物研究の総括
結果①

ＥＳ大豆発酵生産物で処理した大腸がん細胞の増殖率

そのメカニズムは？

実験②予想されるメカニズム
左側のような経路を介して大腸がん細胞の細胞周期をG2/M期で制御

アポトーシス誘導

がん細胞増殖の抑制

アポトーシス

月刊フ ドケミカル 2006年１２月号
月刊フードケミカル年 月号

実験①
ＥＳ大豆発酵生産物による大腸がん細胞の増殖抑制

Rbタンパク質のリン酸化の増加

ＥＳ大豆発酵生産物で処理した大腸がん細胞の細胞周期

結果②
大腸がん細胞のG2/M期を制御

アポトーシス誘導作用の試験
アポト シス誘導作用の試験
フローサイトメトリーを用いた
フロ
サイトメトリ を用いた
MultiCaspase Assay

機能性研究 第３ステージ

フローサイトメトリー法とは、対象の細胞を流体中に分散させ、その流体を細く流して、個々の細胞を光学的に分析する手法

ＥＳ大豆発酵生産物
アポトーシス誘導作用はあるのか？！

筑波大学との共同研究

エコサンテ

MultiCaspase assay

アポトーシス細胞の継時的変化• 細胞がアポトーシスのどの期に存在するかを測定– 2種類の蛍光試薬で染色し、その染まり具合から判断する– SR-VAD-FMK» 細胞浸透性。アポトーシスで活性化するmultiple caspaseと共有結合する 得られるシグナルは 細胞に存在する活と共有結合する。得られるシグナルは、細胞に存在する活性化カスパーゼ酵素の数と比例する– 7-AAD» 膜構造の完全性指示薬。生細胞、健康な細胞の細胞は染まらない– 以下の表のように、判断する
staining

7-AAD

SR-VAD-FMKSR
VAD FMK・コントロール

・10 μl/ml ＥＳＤ処理・30
30 μμl/ml/ＥＳＤ処理Ｓ 処理

処理時間（ｈ）

生細胞

アポトーシス細胞

死細胞

686.11%

11.11%

2.78%

1292.71%

3.82%

3.47%

24

86.55%

12.18%

1.26%

48%
84.21%

14.03%
%

1.75%
%

72

81.98%

12.17%

5.86%

処理時間（ｈ）

生細胞

アポトーシス細胞

死細胞

678.77%

12.33%

8.90%

1286.32%

7.55%

6.13%

24

80.33%

17.21%

2.46%

48

71.72%

27.27%

1.01%

72

75.00%

20.58%

4.41%

処理時間（ｈ）

生細胞

アポトーシス細胞

死細胞

686.31%

9.78%

3.91%

1285.55%

8.67%

5.78%

Apoptosis

24

71.62%

27.03%

1.35%

Apoptosis

48

50.82%

45.91%

3.28%

72

71.67%

26.66%

1.67%

×

○

○

Dead

×Live

エコサンテMultiCaspase Assay

エコサンテアポトーシス細胞の継時的変化
アポト
シス細胞の継時的変化 グラフ化

細胞生存率＆細胞数

measured by Guava

80

アポトーシス細胞
アポト
シス細胞
死細胞

001030ＥＳＤ濃度(μl/ml)

Total細細胞(％)

48 h
90
80
7060
5040302010030

10090807060
504030201002580
生細胞
アポトーシス細胞
死細胞

01060

400 ul/ml
10 ul/ml
30 ul/ml3020

ＥＳＤ濃度(μl/ml)

Total cell number
T5(x 1 0 cells)

40
20

Cell number

Viabillity

72 h

生細胞

Ceell v iabillity (% )60

Total細細胞(％)

otal細胞(％)
To24 h1000 ul/ml
10 ul/ml
30 ul/ml2015105

生細胞
アポトーシス細胞
死細胞0103030μl/mlのＥＳＤ処理により生細胞が減り、アポトーシス細胞が増加した。しかし、死細胞の変化は見られなかった。

000612244872061224

Treatment time (h)4872Treatment time (h)ＥＳＤ濃度(μl/ml)

エコサンテ

エコサンテ

Ｍ ｌ ｉＣ
ＭｕｌｔｉＣａｓｐａｓｅ
Ａssay 実験の結論
・長い処理時間(10 μl/ml ＥＳＤ48,72h処理；30ＥＳＤ48 72h処理；30 μl/ml ＥＳＤ12,48,72h処理)
ＥＳＤ12 48 72h処理)においてアポトーシス細胞が著しく増加する傾向が見られた。
・Caco-2細胞生存率においてコントロールの細胞生存率と比べ、ＥＳＤ処理による影響は見られなかった。
・Caco-2細胞数においてコントロールは細胞数が増加するのに対し、ＥＳＤ処理においては 濃度依存的に細胞数の増加が鈍くなった。
理においては、濃度依存的に細胞数の増加が鈍くなった。

機能性研究 第４ステージ

ＥＳ大豆発酵生産物
活性物質は何なのか？！

筑波大学との共同研究
ＥＳＤによるヒト由来大腸がん細胞に対する抑制効果はアポトーシス細胞を誘導することや細胞分裂を抑制することによるものと考えられる。
エコサンテ

同定・単離試験
同定 単離試験
Fig.1

ＥＳ大豆発酵生産物（ＥＳＤ）の分離スキーム
液液分配して減圧乾固

同定・単離試験
同定 単離試験

ＥＳＤ(500 ml)

EtOAc
E
OA llayer(0.9550 g)partit. with BuOH
(300 ml ×2)
2)

conc. by evaporator

BuOH layer(0.5216 g)

conc. by evaporator

水水層
水ブブタノール層ブ

ル

酢酸エチル層層層

H2O layerconc. by evaporator

水層層層

partit. with EtOAc
partit(500 ml ×2)

ブ

ES大豆醗酵生産物からの大腸がん増殖抑制活性を指標とES大豆醗酵生産物からの大腸がん増殖抑制活性を指標として、活性物質の単離および同定を目的として実験を行った

H2O layer(7.6900 g)

MTT assay
エコサンテ

Fig.2 MTT
MTT法によるスクリーニング法によるスクリーニング11
酢酸エチル層、ブタノール層、水層の大腸癌細胞増殖抑制活性、、腸増（コント100（コント100％とした場合の相対値）％とした場合の相対値）

エコサンテ

Fig.3gEＳＤ
ＳＤ--EAの分離スキーム
EAの分離スキーム

シリカゲルカラムクロマトグイラフィにより分画

Cell; Caco-2 ((2 x 103 cells / well))

EＳＤ-EA

Sample; EtOAc (E), BuOH (B), H2O (W) Treatment time; 72 h(379.2 mg)

Sample conc.; 0.1, 1.0, 10 g / ml

Solvent of samples; EtOH
140

SiO2 column (φ 1.1 x 29 cm)

Cell viabilllity (%)

120

CHCl3:MeOH=98:2→19:1→9:1→4:1→1:1→0:100

100
80
60

ESD-EA1ESD
EA1 ESD
ESD-EA2EA2 ESD
ESD-EA3EA3 ESD
ESD-EA4EA4 ESD
ESD-EA5EA5 ESD
ESD-EA6EA6 ESD
ESD-EA8EA8 ESD
ESD-EA9
EA9
ESD-EA7EA7 ESD40

0.3 mg 192.5 mg 4.8 mg

20

4.5 mg

7.5 mg

4.6 mg

6.5 mg

1.3 mg

5.8 mg

0
E0.1

E1.0

E10

B0.1

B1.0

B10

W0.1

W1.0

W10

エコサンテ

エコサンテ

これまでの総括
れまでの総括ＥＳ大豆発酵生産物の生理活性に関する研究

最終的に４つの物質を同定

1 大腸がんに細胞増殖抑制効果を確認
1.大腸がんに細胞増殖抑制効果を確認
1.
2、そのメカニズムは？

hexanoic acid（ﾍｷｻﾉｲｯｸｱｼﾄﾞ、ﾍｷｻﾝ酸）acid（（ﾍｷｻﾉｲｯｸｱｼﾄﾞ、ﾍｷｻﾝ酸）
ｷｸﾞ ｷ 酸）3、大腸がん細胞の細胞周期、大腸がん細胞の細胞周期G2/G2/Ｍ期抑制
Ｍ期抑制

genistein（ゲニステイン）
genisteini t i （ゲニステイン）

4、アポト
アポトーシス誘導作用が推察？
シス誘導作用が推察？
5、アポトーシス誘導作用を確認

daizein（ダイゼイン）
daizein（ダイゼイン）6、活性物質の同定

その他

7、 hexanoic acidacid（ﾍｷｻﾉｲｯｸｱｼﾄﾞ、ﾍｷｻﾝ酸）（ﾍｷｻﾉｲｯｸｱｼﾄﾞ、ﾍｷｻﾝ酸）
7、 genisteingenistein（ゲニステイン）（ゲニステイン）7、 daizein
daizein（ダイゼイン）（ダイゼイン） その他
エコサンテ

産学官連携成功１２８社に選定され感謝状授与エコサンテ

主な死因別に見た死亡率の推移

本日皆様にお伝えしたこと
大豆由来で大腸がん細胞に直接作用

課題・募集
遺伝子レベルでの解明
免疫産性能に及ぼす影響

抗がん剤等との併用、又はＥＳのみで数々の症例
抗がん剤等との併用 又はＥＳのみで数々の症例
医療機関とのマッチング
昨年末より都内総合病院でﾋﾄ臨床試験開始
その他個人レベルでも関心がありましたらお問い合わせください注意！
この発表は弊社研究食品素材の発表であり、の発表は弊社研究食品素材の発表であり、（創造法事業・ＳＢＩＲ事業の研究成果）、商品説明ではありません

エコサンテ物産

ES大豆発酵生産物を使用

健康食品〈健康食品〈エコサンテ液〉
サンテ液〉

エコサンテ液の問題点
サ テ液 問題点
発酵食品のため独特な発酵臭がある。

しかし！
発酵臭に力のあることを筑波大学との共同研究で確認

1ヶ月～
ヶ月～55ヶ月分

価格：21,000
価格：21,000（税込み）
（税込み）

20ＣＣ
20
ＣＣ××4本飲みやすさより力・質を優先江東区産業会館 常設展示の様子

健康食品エコサンテ液の公的支援・評価
17年度 市場開拓支援助成事業に採択
健康食品として初の採択

18年度 市場開拓支援助成事業に採択
2年連続は全業種含め数社程度（財）東京都中小企業振興公社
２２年～ 区内公共施設（江東区産業会館）に常設展示
健康食品として唯一健康食品として唯

江東区

江東区産業会館 常設展示の様子
今後の予定
厚生労働省が募集する「がんの代替医療における有効症例の調査研究」申請を予定
がんの代替医療における有効症例の調査研究」申請を予定

エコサンテ物産物産

近畿圏での協力者を募集中です
エコサンテ液にご関心を頂いた皆様にご関心を頂いた皆様
またご質問などある方々
終了後、お声をかけてください

エコサンテ物産

第５３回近畿アグリハイテクシンポジウム
第３回大豆研究会シンポジウム
弊社は今後とも科学的根拠の充実を図って参ります

ご清聴頂きまして誠に有難うございます

２０１１年３月１０（木）主催：近畿アグリハイテク 農林水産省
会場：京都メルパル

エコサンテ物産