関東森林研究論 文71-1(2020)

ポリクロス由来のスギ未熟種子のインビトロ発芽の試み
金枝拓実 1 ・丸山 E.毅 2 ・上野真義 2 ・平山聡子 3 ・伊藤由紀子 4 ・番塲由紀子 4 ・森口喜成 1
１ 新潟大学２ 森林総合研究所
３ 新潟県新潟市地域振興局
4 新潟県森林研究所
要旨：遺伝的に多様な実生苗を省力的に作出する方法の一つとして、ポリクロス（複数親の混合花粉を使用する人工交配）由来の種子の利用が考えられる。ポリクロスに由来する成熟種子の花粉親寄与率は期待値から有意に歪むことが報告されているが、成熟する前の種子発達過程（未熟段階）で調べた事例はない。しかし、未熟種子から種子胚を取り出し、DNA 抽出を行うのは困難である。そこで、本研究ではインビトロでのスギ未熟種子の発芽を試みた。2019年 3 月に 2 種類の混合花粉（3 親の花粉を等量混合した 3Mix、10 親の花粉を等量混合した 10Mix）を用いた人工交配を実施し、2019 年 7 月下旬に球果を採取した。球果から未熟種子を取り出し、滅菌後に種子胚を含む雌性配偶体を 3種類の培地に置床した。その結果、スギ未熟種子はインビトロ条件で発芽することが確認できた。
キーワード：Cryptomeria japonica，ポリクロス，未熟種子，インビトロ，発芽In vitro germination of immature seeds derived from polycross of sugi (Cryptomeria japonica)
Takumi KANEEDA1 , Tsuyoshi E. MARUYAMA2 , Saneyoshi UENO 2 , Satoko HIRAYAMA 3 , Yukiko ITOH 4 , Yukiko
BANBA 4 , Yoshinari MORIGUCHI 1
1 Niigata University,
2 Forestry and Forest Products Research Institute3 Niigata Prefecture Niigata Regional Promotion Breau
4 Niigata Prefecture Forestry Research Institute
Abstract: As one of the methods for labor-saving production of genetically diverse seedlings, it is conceivable to use immature
seeds derived from polycross (artificial crossing using mixed pollen of multiple parents). Although the pollen parent contribution
rate of mature seeds derived from polycross has been reported to be significantly distorted from the expected value, there is no caseexamined in the seed developmental stage (immature stage). However, it is difficult to extract seed embryos from immature seeds
and extract DNA. In this study, we considered germination method of immature seeds of the Japanese cedar in vitro. In March 2019,artificial crossing was conducted using two type of pollen mixture (3Mix with equal amounts of 3 parental pollen and 10Mix withequal amounts of 10 parental pollen), and cones were collected in late July 2019. We extracted immature seeds from cones andsterilized immature seeds and placed megagametophytes containing seed embryos on three types of media. As a result, it wasconfirmed that immature seeds of cedar germinated under in vitro condition.
Key-word: Cryptomeria japonica, polycross, immature seed, in vitro, germination

Ⅰ はじめにとが報告されている種もあるが，Cryptomeria japonica

ポリクロスとは複数親の混合花粉を使用する人工交配（３），Pseudotsuga menziesii（１， ４ ），Picea mariana

である。ポリクロスを行うことで遺伝的に多様な苗を省（５）などいくつかの樹種で期待値から有意に歪むこと力的に作出することが可能である。

が報告されている。一方で，成熟前の種子発達段階（未ポリクロス由来の成熟種子における花粉親寄与率は，Chamaecyparis obtusa（６， ７）のように均等であるこ－熟段階）で花粉親の寄与率を調べた事例はない。
未熟段階で花粉親を解析するためには，未熟種子から45 －（受理日 2019 年 1 月 23 日）

の DNA 抽出が必要である。種子発達過程（未熟段階）

表－1．ポリクロスに使用した母樹と花粉親

では種子胚の発達が不十分であり，さらにスギの種子胚

Table-1．Maternal tree and Paternal used for（2n）は，雌性配偶体（母親由来の n）に囲まれているこ

polycrossとから，DNA 抽出・解析を行うためには，種子胚の摘出母樹をしなければならない。種子胚のみを摘出するのは労力

花粉親
3Mixのかかる作業である。種子胚を未熟段階でも発芽させる

新大11号

ことができれば，DNA 抽出・解析は省力的に行うことが可能となる。

10Mix

東蒲原5号 東蒲原5号
岩船9号

中頸城2号

そこで本研究では，インビトロ条件でポリクロス由来

中頸城2号 中頸城4号のスギ未熟種子における発芽方法の検討を目的とした。

南蒲原3号
両津市1号

Ⅱ 材料と方法

岩船2号

1．人工交配・球果の採取 2019 年 3 月上旬に 2 種類

岩船8号の混合花粉（3 親の花粉を等量混合させた 3Mix、10 親の花粉を等量混合させた 10Mix）を用いた人工交配を行っ

岩船9号

た（表－1）。2019 年 7 月下旬に球果を採取し，球果から岩船16号取り出した種子を実験に供試した。

岩船17号

２．使用培地・培地への置床 種子の滅菌は，1%次亜塩素酸ナトリウム溶液で 15 分撹拌し，滅菌水で洗浄をして行った。滅菌後，種子胚を含む雌性配偶体を次の 3Ⅲ 結果と考察
1．未熟種子における発芽率への影響

種類の培地へ置床した。A：無機塩を 1/2 濃度にした EM

培養開始から 1 週間後には培地 A と培地 B で未熟種培地（２）に，ショ糖 10g/L，カゼイン 0.5g/L，グルタミ子の発芽が確認され，培養開始から 8 週目の発芽率は培ン 1g/L，バクト寒天 8g/L，活性炭 2g/L を添加した固形

地 A で約 43%，培地 B で約 10%，培地 C で 0%となった培地（表－2）。B：無機塩を 1/2 濃度にした EM 培地に，（表－5，図－1）。AIC によるモデル選択の結果，説明変ショ糖 20g/L，寒天 10g/L，活性炭 2g/L を添加した固形数において培地の種類と混合花粉に使用した花粉親数の培地（表－3）。C：無機塩を 1/2 濃度にした EM 培地に，両方が選択された。GLM の解析結果から，未熟種子の発ショ糖 10g/L，カゼイン 0.5g/L，グルタミン 1g/L，ゲラン

芽には，培地の組成と混合花粉に使用した花粉親数の影

ガム 3g/L，2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）10µM，響が示唆された（表－6）。発芽が確認された培地 A と培

6-ベンジルアミノプリン（BAP） 5µM を添加した固形培

地 B は植物ホルモンを含まない培地であり，発芽がみら地（表－4）。培地への置床数は培地 A に 320 種子（3Mix

れなかった培地 C は植物ホルモンを含んだ培地であった

110 種子，10Mix 210 種子），培地 B に 607 種子（3Mix 192（表－2，3，4）。従って，未熟種子の発芽における培地

種子，10Mix 415 種子），培地 C に 1614 種子（3Mix 841

条件に植物ホルモンの有無が影響していると考えられる。

種子，10Mix 773 種子）とした。培養は暗黒下，25℃で行培地 B は一般にスギ不定胚の発芽用培地として用いられった。根の伸長が確認されたものを発芽とし，培養開始ている。しかし，今回，培地 B より培地 A の方が未熟種から 8 週間後に発芽の有無を調査した。

子の発芽においては適していることが確認された。培地

3．統計解析

A と培地 B では，ショ糖濃度など培地の組成がいくつか

発芽の有無は一般化線形モデル（GLM）で解析を行っ異なっている。より効率的なスギ未熟種子の発芽方法とた。応答変数は、未熟種子の発芽の有無（発芽ありを 1，培地の組成や交配家系の影響についてはさらに検討する

発芽なしを 0）
，説明変数は培地の種類，混合花粉に使用必要があるだろう。

した花粉親数として，AIC（赤池情報量基準）によるモデ2．培地の組成による不定胚形成細胞の誘導率の違い

ル選択を行った。応答変数は二項分布に従うと仮定し，本研究では，不定胚形成細胞の誘導も確認された。培リンク関数は logit とした。統計解析は，R ver. 3.5.2 を使養開始から 2 週間後には，すべての培地において不定胚用し，glmmML package，glm 関数によりパラメータを推形成細胞の誘導が観察され，培養開始 8 週目における不定した。

定胚形成細胞誘導率は培地 A で約 66%，
培地 B で約 29%，
培地 C で約 51%となった（表－5，図－2）。今後，培地－46 －関東森林研究71-1(2020)の組成が誘導率に与える影響も検討する必要があると考えられる。
謝辞：本研究は、農研機構生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」の支援によって実施された。
引用文献(1) Apsit J, Nakamura R, Wheeler N（1989）Differential male
reproductive success in Douglas-fir.．Theor Appl Genet 77:681-684(2) Maruyama E, Tanaka T, Hosoi Y, Ishi K, Morohoshi N（ 2000) Embryogenic cell culture, protoplast regeneration,cryopreservation, biolistic gene transfer and plant regeneration

表－2．培地A の組成
図－2．不定胚形成細胞の誘導
Table
Compositioncellof medium
Fig.22.Embryogenic
inductionAin Japanese cedar (Cryptomeria japonica D. Don) ． Plant
Biotechnology 17: 281-296.

CompoundKNO3
MgSO4 ・7H2 O
CaCl2 ・2H2 O
Ca(NO3 )2 ・4H2 O
NaNO3KH2 PO4
NaH2 PO4・2H2 OKClMnSO4 ・4H2 O
H3 BO3ZnSO4 ・7H2 O
KICuSO4 ・5H2 O
Na2 MoO4 ・2H2 O
CoCl2 ・6H2 O
FeSO4 ・7H2 O
NaEDT AT hiamine HCl
Pyridoxine HCl
Nicotinic acidGlycine
myo-Inositol
Casein Acid Hydrolysate
L-glutamine
SucroseBacto agar
Activated Charcoal
pH5.6-5.8(3) Moriguchi Y, Ishiduka D, Kneko T, Itoo S, Taira H,
Tsumura Y（2009）The contribution of pollen germination rates
to uneven paternity among polycrosses of Cryptomeria
japonica．Silvae Genet 58: 139(4) Nakamura R, Wheeler N（1992）Pollen competition andpaternal success in Douglas-fir．Evolution 46: 846-851(5) Roger L, Boyle T （ 1991 ） Unequal paternal
contributions in black spruce polycross seedlots.
Heredity 67: 373-379(6) 清藤城宏（2000）葉緑体 DNA マーカーを用いたヒノ
キにおける選択受粉の影響．日林誌 82: 380-383(7) 若尾みか・小林沙希・幸由利香・遠藤良太・松本麻子・
森口喜成（2017）DNA マーカーを用いた少花粉ヒノキの種子生産方法の評価．日林誌 99: 165-171

図－1．未熟種子の発芽
Fig.1 Germination of immature seed－47 －Amounts
500
250
37.5
30303580
40
1020
12.50.5
1.20.10.1
1520
2.50.25
2.52.5500500100010000
8000
2000[mg/L]

表－3．培地 B の組成

表－4．培地 C の組成

Table 3. Composition of medium B

Table 4. Composition of medium C

Compound
KNO3MgSO4 ・7H2 O
CaCl2 ・2H2 O
Ca(NO3 )2 ・4H2 O
NaNO3KH2 PO4
NaH2 PO4・2H2 O
KCl
MnSO4 ・4H2 O
H3 BO3ZnSO4 ・7H2 O
KI
CuSO4 ・5H2 O
Na2 MoO4 ・2H2 O
CoCl2 ・6H2 O
FeSO4 ・7H2 O
NaEDT AT hiamine HCl
Pyridoxine HCl
Nicotinic acid
Glycinemyo-Inositol
SucroseAgar
Activated Charcoal
pH5.6-5.8

Amounts
500
250
37.53030358040
1020
12.5
0.5
1.2
0.1
0.1
1520
2.5
0.25
2.5
2.5
500
20000
10000
2000

Compound
KNO3MgSO4 ・7H2 O
CaCl2 ・2H2 O
Ca(NO3 )2 ・4H2 O
NaNO3KH2 PO4
NaH2 PO4・2H2 O
KCl
MnSO4 ・4H2 O
H3 BO3ZnSO4 ・7H2 O
KI
CuSO4 ・5H2 O
Na2 MoO4 ・2H2 O
CoCl2 ・6H2 O
FeSO4 ・7H2 O
NaEDT AT hiamine HCl
Pyridoxine HCl
Nicotinic acid
Glycinemyo-Inositol
Casein Acid Hydrolysate
L-glutamine
SucroseGellan Gum
2,4-D
BAP
pH5.6-5.8[mg/L]

Amounts500250
37.530303580
40
102012.5
0.5
1.20.10.1
1520
2.50.25
2.52.5
500
500
1000
10000
3000
105[mg/L][μM]

表－5．培地・ポリクロス別の発芽率と不定胚形成細胞の誘導率
Table 5. Germination and embryogenic cell induction
rate from media and polycross

培地A
培地B
培地C

3Mix
10Mix
合計
3Mix
10Mix
合計
3Mix
10Mix
合計

発芽率
34.54548.09543.4384.688
12.53010.049
0.000
0.000
0.000

誘導率
73.63661.90565.93828.64629.15728.99556.00544.63150.558表－6．スギ未熟種子におけるインビトロ発芽の有無を応答変数とした GLM 解析結果
Table 6. Result of the generalized linear model for in vitro germination of the immature seeds of cedar as a response
variable

切片培地（基準：培地B）

花粉親数（基準：10Mix）

培地A培地C

3Mix

推定値-2.005＋1.981*-18.232-0.727*

±SD

0.141

0.179

437.808

0.199*は結果が有意であることを示す（P<0.01）－48 －