関東森林研究 67-1(2016)

論 文

ポプラ培養苗の葉肉細胞と遊離細胞の培養
Culture of poplar cells derived from mesophyll tissue and suspensions
細井佳久＊１・伊ヶ崎知弘＊１・二村典宏＊１・西口満＊１・丸山 E. 毅＊１
Yoshihisa HOSOI＊１, Tomohiro IGASAKI＊１, Norihiro FUTAMURA＊１, Mitsuru NISHIGUCHI＊１ and Tsuyoshi E. MARUYAMA＊１＊１ 森林総合研究所
Forestry and Forest Products Research Institute, Tsukuba 305-8687
要旨：ゲノム編集や遺伝子組換えを行うことを目的とした細胞培養系開発のため，クロポプラとギンドロについてシュートカルチャーの葉から単離したプロトプラストの培養を行った。また，シュートカルチャーの葉，葉柄，葉軸の各切片について液体振とう培養により遊離細胞の誘導を行い，部位別の細胞の形態を比較した。その結果，葉切片から誘導した細胞では，培養開始 2,3 週間程度では，遊離して肥大しただけで分裂していない細胞が多く観察された。増殖させた培養細胞から酵素処理により単離したプロトプラストの培養を行い，コロニーを得た。さらに遊離細胞については分裂前の単一細胞を 96 ウェル培養プレートで１細胞ずつ液体培養し，分裂細胞が得られることを確認した。単一細胞から細胞壁のみを酵素により取り除いた状態のプロトプラストや，遊離細胞の分裂前の単一細胞からの植物体再生が可能となれば，顕微鏡下での遺伝子導入に関わるマイクロマニピュレーション後の細胞培養が，キメラ化を回避して可能となる。
キーワード：ギンドロ，クロポプラ，プロトプラスト，細胞培養
Abstract: For the purpose of genome editing and genetically modifying about black poplar and white poplar, the isolated protoplasts
from leaves of the shoot culture were cultured. In addition, suspension cells were derived from fine section of leaves, stems andpetioles of the shoot culture by liquid shaking culture. During and after culture, the form of cells according to the part was comparedby observation using a microscope. After two or three weeks of culture, many cells which were not divided only by enlargement
were obtained from fine section of leaves. Protoplasts isolated from suspension cells were cultured and formed colonies. Furthermore,
single cell before the division were cultured by 1 cell per 1 well in 96 well culture plates and confirmed cell division and colonyformation. If the plant regeneration from a single cell before the division or a protoplast without the cell wall is enabled, a cell culture
avoiding chimerization will be enabled after the micromanipulation to be concerned with the gene introduction.
Keywords: Populus alba, Populus nigra, protoplast, cell cultureとクロポプラ(Populus nigra) を用い，組織培養と，プロⅠ はじめに筆者らは，内閣府の「SIP 次世代農林水産業創造技術」

トプラストを含めた細胞培養を行った。のプロジェクトにおいて，「CRISPR / Cas9 を用いたポプラのゲノム編集技術の開発」という課題で研究を進めている。

Ⅱ 方法

本課題においては，ポプラやスギについて様々な遺伝子導１．実験材料 ギンドロについては，2014 年 10 月に茨入法によりゲノム編集を行い，植物体再生させることを目

城県つくば市内の森林総合研究所構内に生育する成木個的としている。その際，ゲノム編集後の細胞を，キメラ化体から誘導したフラスコ苗を用いた。クロポプラについてを回避して個々の細胞ごとに植物体を作出することは重は，森林総合研究所の人工気象室内で育成中のポット苗か要である。筆者らは，これまで針葉樹の細胞についてマイら，2014 年 1 月に誘導したフラスコ苗を用いた。フラスコ

クロマニピュレーターを介して単一細胞からの再分化系

苗は，培地条件についてはギンドロの場合，６µM IBA を添の開発を行ってきた（１，２）
。今回は，ポプラについて加し，硝酸アンモニウム濃度を 1/4 に下げ，他の無機塩濃分裂面を持たない単一の細胞と，葉肉や培養細胞から単離度を 1/2 に下げた MS 寒天培地を用いた。
クロポプラは１µMしたプロトプラストについて分裂細胞を得るための培養

IBA と５µM GA3 を添加した MS 寒天培地を用いた。培養は，条件を検討した。実験材料には，ギンドロ(Populus alba)

２種とも 16 時間蛍光灯照明下，25℃，湿度 55%に保った培－ 81 －(2016 年 3 月 15 日受理)

養室で行った。

10µM 2,4-D と，0.1µM あるいは１µM BAP を添加して培養

２．葉肉細胞からのプロトプラストの単離・培養 ギン
ドロについて，酵素液の組成を 0.6M マンニトール，１％した。
培養密度は，２種とも 104 プロトプラスト／ml とし，24 ウェル培養プレートで暗黒下，28℃で培養した。

セルラーゼオノズカ RS，0.25%ペクトリアーゼ Y-23 とし，100ml 広口培養フラスコに酵素液 30ml を入れ，細断した葉Ⅲ 結果と考察を入れて約４時間静置して処理した。プロトプラストの回

１．葉肉細胞から単離したプロトプラストの培養 ギン

収は，40µm のナイロンメッシュで濾過して未消化な組織をドロについて,培養開始１ヶ月後の結果を表－１に，単離除去し，80rpm.で３分間遠心分離した後，沈殿した部分を直後のプロトプラストと細胞壁を再生した細胞を図－１

0.6M マンニトール中に移して洗浄し，再度 80rpm.で３分に示した。30µM 2,4-D と３µM Zeatin を添加し，無機塩を間遠心分離することにより行った。クロポプラについても1/2 濃度に下げたMS 培地で培養した場合に最もコロニー形手順は同様であるが，遠心を 50rpm.で行った。培養につい成数が多くなり，15 個のコロニーが得られ，培養効率はては，ギンドロの場合，浸透圧を 0.6M マンニトールで調15%であった。クロポプラのプロトプラストと増殖中のコ整し，1/2MS，硝酸アンモニウム無添加の MS，MS の３つのロニーを図－２に示した。コロニー形成数については，表基本の液体培地に 2,4-D と，サイトカイニンとして BAP と－２に示した。培地としては，硝酸アンモニウム無添加のZeatin のどちらかを組み合わせて添加し，細胞の分裂条件MS 培地で，サイトカイニンとして Zeatin を用いた場合にを比較した。培養密度は２×103 プロトプラスト／ml としコロニー形成が多く見られ，最高 32%の培養効率であった。

た。培養は 96 ウェル培養プレートを用い，暗黒下，28℃２種のポプラともサイトカイニンとして用いる場合，で行った。１ウェルの培地量は 50µl とした。クロポプラ

Zeatin の有効性が認められた。また，クロポプラの方が低の場合，10µM 2,4-D に，3µM BAP あるいは３µM Zeatin を密度で培養しているにもかかわらず，培養効率ではギンド添加した硝酸アンモニウム無添加の MS，硝酸アンモニウムロの倍以上であり，少数細胞の培養に向いているようであ濃度を 1/8 濃度に下げた MS の２つの基本培地で培養した。

る。マイクロインジェクション等の遺伝子導入処理後には

2

培養密度は５×10 プロトプラスト／ml とした。培養は 24

少数の細胞を低密度で培養できた方が都合がよいため，クウェル培養プレートを用い，暗黒下，28℃で行った。１ウ

ロポプラの方がより実験材料として適しているようであェルの培地量は 500µl とした。２種のポプラともコロニーる。

については，培養開始１ヶ月後に５分裂以上細胞分裂を繰り返しているものをカウントした。

２．フラスコ苗から誘導した培養細胞の形状 ギンドロ，クロポプラともに葉切片を培養した場合，２，３週間後ま

３．フラスコ苗からの培養細胞の誘導 ギンドロ、クロでは切片から肥大しながら遊離してくる細胞がほとんど

ポプラともに葉，葉柄，葉軸について，葉は４mm 角程度，で，分裂面がなく，単一の細胞の状態であった（図－３）。

葉柄や葉軸については長さ８mm 程度に細断し，10µM 2,4-D

このような細胞は，遺伝子導入処理後にキメラ化を回避しを添加した 20ml の MS 液体培地で 100ml 広口培養フラスコながら培養するのに非常に都合がよい。ただし，細胞によを用いて培養した。培養は，25℃，暗黒下，60rpm.で振とっては遊離後に増殖しない場合もあるため，その後の細胞う培養した。の顕微鏡観察を行った。その結果，問題なく分裂増殖可能

４．培養細胞の単一細胞培養 クロポプラの葉切片からであることを確認した。葉柄や葉軸切片から遊離した細胞誘導した培養細胞について，10µM 2,4-D と３µM BAP を添

は，培養初期から葉切片よりも旺盛に分裂を繰り返しなが加した MS 液体培地を用い，96 ウェル培養プレートでウェら増殖した（図－４）。

ルあたり１細胞になるよう調整し，培養した。培養は暗黒下，25℃で行った。

３．葉切片由来の単一細胞の培養 クロポプラの葉切片由来の単一細胞について培養したところ，15%の効率（９５．培養細胞から単離したプロトプラストの培養 ギン細胞／60 ウェル）でコロニーが得られた（図－５）。今回

ドロ，クロポプラともにプロトプラスト単離と培養方法は，の実験で，遺伝子導入処理用の材料としての有用性が確認

葉肉細胞の場合と同様の手順で行った。ギンドロの葉柄由できたが，細胞分裂を開始する２，３週間目までに使用し来の培養細胞について，0.6M マンニトールを含む MS 液体なければならず，遺伝子導入実験ごとに遊離細胞を誘導し培地に 10µM 2,4-D と，サイトカイニンとして３µM BAP あ直す必要がある。

るいは３µM Zeatin のどちらかを組み合わせて添加し，細４．葉柄由来の培養細胞から単離したプロトプラストの胞の分裂効率を比較した。クロポプラの葉柄由来の培養細培養 培養結果を表－３，４に示した。ギンドロの場合，胞については，0.6M マンニトールを含む MS 液体培地にサイトカイニンとして BAP を添加した場合，コロニーはま－ 82 －

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ったく観察されず，コロニー形成には Zeatin が必要であることがわかった。クロポプラについては，オーキシンとして加えた 2,4-D 濃度により，コロニー形成数に大きな差がみられた。
今回は Zeatin との組合せは調べていないが，BAP 添加よりもコロニー形成数の向上がみられるかもしれない。
50µm

Ⅳ まとめ
今回の実験では，クロポプラについて単一細胞の培養に100µm

図－２．クロポプラ葉柄由来細胞から単離したプロトプラ

より分裂が確認できたが，今後実際に遺伝子導入を行う場

ストと分裂増殖中のコロニー合には細胞へのダメージが加わるため，さらに安定した効

Fig.2 Protoplasts isolated from cells derived from petiole

率の良い培養条件を見つける必要があると思われる。また，

tissues and proliferating colonies

形態形成させるための培養条件の検討を行う事も重要である。
謝辞
今回の報告は，27 年度 SIP プロジェクト内の国立開発研究法人農業・食品産業技術総合研究機構，戦略的イノベーシ
100µmョン創造プログラム委託研究の成果によるものであり，関係各位の多大なご協力に感謝いたします。

図－３．クロポプラ葉片由来の単一細胞
Fig.3 Single cells derived from leaflets of black poplar

引用文献（１）MARUYAMA, E., TANAKA, T., HOSOI, Y., ISHII, K. andMOROHOSHI, N. (2000) Embryogenic

cell culture,

protoplast regeneration, cryopresearvation, biolistic
gene transfer and plant regeneration in Japanese ceder.
Plant Biotechnol. 17: 281-296

200µm（２）細井佳久・丸山エミリオ・石井克明・長谷純宏・田中淳 (2007) γ線照射したヒノキ培養細胞からの分化.
関東森林研究 58: 91-94

図－４．クロポプラ葉柄切片由来の培養細胞
Fig.4 Suspension culture derived from excised petiole
tissues of black poplar

50µm

50µm

100µm

図－１．ギンドロ葉肉細胞由来のプロトプラストと細胞壁200µmを再生した細胞
Fig.1 Protoplasts and cultured cells regenerated the cell

図－５．96 ウェルプレートで分裂する単一細胞

wall of white poplar

Fig.5 A single cell cultured in a 96well plate and thedividing cells－ 83 －表－１．ギンドロ葉肉由来プロトプラスト培養により得られたコロニー数
Table 1 Number of colonies proliferated from mesophyll protoplasts of white poplar＊数値は４ウェルの平均コロニー形成数，括弧内は標準偏差
表－２．クロポプラ葉肉由来プロトプラスト培養により得られたコロニー数
Table 2 Number of colonies proliferated from mesophyll protoplasts of black poplar＊数値は４ウェルの平均コロニー形成数，括弧内は標準偏差
表－３．ギンドロ葉柄由来培養細胞から単離したプロトプラストから生じたコロニー数
Table 3 Number of colonies proliferated from protoplasts isolated from petiole-derived suspensionsof white poplar

BAP [3µM]

Zeatin [3µM]0140.5 (5.1)＊共通培地組成：MS + 0.6M マンニトール + 10µM 2,4-D

コロニー数は６ウェルの平均，括弧内は標準偏差

表－４．クロポプラ葉柄由来培養細胞から単離したプロトプラストから生じたコロニー数
Table 4 Number of colonies proliferated from protoplasts isolated from petiole-derived suspensionsof black poplar

BAP [µM]

0.11

コロニー形成数

2 (0.75)

27.5 (7.3)＊共通培地組成：MS + 0.6M マンニトール + 10µM 2,4-D

コロニー数は６ウェルの平均，括弧内は標準偏差－ 84 －