上皮での炎症性サイトカイン産生を担う新規分子群の役割とそれを制御する化合物の探索
熊本大学大学院生命科学研究部免疫学講座

押海裕之

RIG-I-like receptors (RLRs) recognize viral RNAs as well as endogenous retroelement RNA, leading to the expressionof pro-inflammatory cytokines. Since abnormal regulation of RLRs causes auto-immune-like disorders, their activation
should be strictly regulated. We investigated the proteins and small chemicals that affect this regulation and found that theRiplet ubiquitin ligase fine-tunes RLRs-mediated pro-inflammatory cytokines via K63-linked polyubiquitination of theLGP2 protein. Moreover, we conducted a chemical screening and identified several chemicals that augment RLR-mediatedpro-inflammatory cytokine expression. Interestingly, the identified molecules target a metabolite that attenuates inflammatory
responses. We found that the addition of the metabolite reduces pro-inflammatory cytokine expression in epithelial cells.
These findings are expected to be utilized to develop a new method and chemicals to attenuate inflammatory reactions in theskin.

１．緒言

２．方法

粧品においても接触性皮膚炎や、いわゆる化粧品かぶれな2 . 1 . LGP 2 のユビキチン化を介した炎症性サイトカイン産生の制御どが問題となっている。本研究では、上皮における炎症をRiplet 分子依存的な炎症性サイトカイン産生の新たな制御する分子メカニズムを解明すること、さらに、炎症を制御機構を解明するために、HeLa 細胞や HEK 293 細胞、抑制する化合物を新たに同定することを目的とする。これ

A 549 細胞などの細胞を用い解析を行った。解析では、そらの目的を達成することで、化粧品によるかぶれや皮膚炎れぞれの分子を発現するベクターや、それぞれの分子に対の問題を解決する基礎基盤を作ることが可能になると期待する siRNA を用いることで、個々の分子が炎症性サイトされる。

カインの産生にどのような役割を果たすのかを調べた。遺皮膚での炎症は腫れや赤みや痛みなどの原因となり、化我々はこれまで炎症について、上皮細胞での炎症性サイトカイン産生を誘導する Riplet E 3 ユビキチンリガーゼ

伝子発現の網羅的な解析としてマイクロアレイ解析は東レの３D-Gene を用いた。

を同定しその機能を解明したほか、上皮成長因子である

ユビキチン化において、HA や Myc などのタグ付きのユEGF が細胞内のヘリケース分子を介して炎症を抑制する

ビキチン発現ベクターを用いるとともに、ユビキチンに対メカニズム、さらに、ZNF 598 分子による炎症性サイトカする抗体などによりタンパク質のユビキチン修飾を調べた。

インを抑制するメカニズムなどを解明した 1）。本研究ではまた、LGP 2 タンパク質のユビキチン修飾については、質

我々のこれまでの研究をさらに発展させ、炎症を誘導す量分析として LC-MS/MS を用いた解析を実施した。

る Riplet E 3 ユビキチンリガーゼの活性を抑制する新たな化合物をケミカルスクリーニングによって単離し、さらに、

2 . 2 . 炎症を制御する新たな化合物の探索

ZNF 598 分子や Riplet 分子依存的な炎症のメカニズムをケミカルスクリーニングでは大阪大学のオリジナル化解明する。これらにより、化粧品かぶれのメカニズムを解合物ライブラリーおよび東京大学創薬機構の既存薬ライ明するとともに、かぶれを抑える新たな成分を同定できるブラリーから分与をえて使用した。ケミカルスクリーニと期待される。

ングの実験系においては、Riplet 依存的なシグナルを検出するためにサイトカイン遺伝子のプロモーターの下流にmCherry 遺伝子を繋いだレポータープラスミドと同時に、恒常的に発現する遺伝子のプロモーターに GFP 遺伝子を繋いだレポータープラスミドを細胞に導入し、mCherry
Role of new molecules and chemicals
regulating inflammatory responses inthe skin
Hiroyuki Oshiumi
Department of Immunology, Faculty ofLife Sciences, Kumamoto University

による赤色の蛍光と、内在性コントロールとなる GFP の緑色の蛍光のバランスが大きく変化する化合物を選択した。
ケミカルスクリーニングでは合計でおよそ 3200 化合物についてスクリーニングを実施した。

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３．結を介しているかを調べるため、63 番目以外のリジンを全果てアルギニンに置換した組換えユビキチン（K 63 only Ub）

3 . 1．炎症性サイトカイン産生を制御する新たな分子メカニズムの解明を発現させ調べたところ、この組換えユビキチンが Ripletの発現により効率的に LGP 2 分子に取り込まれることが明Riplet は炎症性サイトカインの産生を誘導する RIG-I をらかとなった。また、この組換えユビキチンの LGP 2 分子活性化する分子である。Riplet は RIG-I をユビキチン化すへの結合は Riplet KO 細胞では大きく減少することも示さることで、RIG-I 依存的な炎症性サイトカインの産生を誘れた。また逆に Riplet を KO した細胞では LGP 2 のユビキ導する 。炎症性サイトカインは外来の微生物に対する免チン化を示すシグナルが大きく減弱した。これらのデータ

疫応答に重要である反面、その過剰な産生は自己炎症性疾から Riplet が LGP 2 をリジン 63 鎖を介したポリユビキチ患や自己免疫疾患、アレルギーなどの原因ともなることン修飾することが示唆された。

2）から、その抑制機構が重要である。我々は、Riplet による実際に、LGP 2 分子がポリユビキチン修飾を受ける残RIG-I 依存的な炎症性サイトカイン産生を抑制するメカニ基を決定するために、質量分析を行ったところ、39 番目、ズムとして、RIG-I ファミリー分子である LGP 2 タンパク532 番目、599 番目、629 番目のリジン残基がユビキチン質に着目し研究を進めた。

化を受けることが示された。これらの４つのリジン残基のまず、LGP 2 遺伝子を CRISPR-Cas 9 のシステムを用いポリユビキチン修飾は、Riplet を共発現することで増加すてノックアウト（KO）した細胞を用い、Riplet 経路を刺激ることが、LFQ 法による解析により示唆された。これら

する poly I: C で刺激後の炎症性サイトカインを野生型細のリジン残基のユビキチン化が LGP 2 分子の機能に関与す胞と比較したところ、IFN-β、IL- 6、IP- 10 などの炎症性るかどうかを調べるために、これらの４つのリジン残基をサイトカインの mRNA の発現が LGP 2 KO により亢進すアルギニンに置換した LGP 2 分子として、LGP 2 - 4 KR 分ることが定量 PCR 法により示された。Riplet はユビキチン子を作成し細胞へ発現させると、Riplet 依存的な炎症性サリガーゼ活性を有するため、LGP 2 のユビキチン化を調べ

イトカインの産生や、IP 10 や Ccl 5 などの炎症に関与するるために、LGP 2 と Riplet 分子をそれぞれ細胞に発現させケモカインの発現が上昇することが示された（図 1）。

ると、Riplet を共発現した際に LGP 2 のポリユビキチン化が顕著に増加することがウェスタンブロット法により示さ

これらの結果は、Riplet は、LGP 2 が存在すると、逆に、炎症性サイトカインの産生を抑制することを示唆する 3）。

れた。この LGP 2 のポリユビキチン化を定量的に測定する
想通り、Riplet を共発現させることで、LGP 2 のユビキチ3 . 2．炎症を抑制する新たな化合物の探索（ケミカルスクリーニング）

ン化を示すシグナルが統計的に有意に増加することが示さ

Riplet 分子は I 型インターフェロンの他に IL- 6 などの炎れた。さらに、Riplet と LGP 2 分子が結合するかどうかを症性サイトカイン産生の誘導で非常に重要な働きをする分調べるために免疫沈降法により調べたところ、これらの二子である。我々は Riplet の活性化を評価する実験系を作製つの分子が結合することが示された。

したことから、この実験系を用いて Riplet の活性を制御すために蛍光色素を用いた顕微鏡観察を実施したところ、予

Riplet による LGP 2 のユビキチン化が 63 番目のリジンる化合物についてケミカルスクリーニングを実施した。お図 1 LGP 2 のユビキチン修飾と炎症性サイトカインユビキチン化を受けるリジンをアミノ酸置換し、ユビキチン化されない LGP 2 分子を発現させ、炎症に関与するサイトカインとして IFN-β、IP-10、Ccl 5 のｍ RNA の発現を調べたところ、ユビキチン化されない変異型 LGP 2 タンパク質（LGP 2 - 4 KR）を発現する細胞では、それらのサイトカインの産生が亢進していた。これらの結果は、ユビキチン化されることで炎症性サイトカインの産生を抑制することを示唆する。

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よそ 3200 個の化合物についてケミカルスクリーニングを実施したところ、興味深いことに複数の化合物を同定することができた。
これらの薬剤（化合物 X）を、HeLa 細胞などの、ヒト上皮細胞の培養上清に加え、細胞を刺激後に炎症性サイトカインの産生を調べたところ、この化合物 X が IFN-β やIL- 6 などの炎症性サイトカインの産生を非常に強く増強することを発見した。
化合物 X が標的とする分子 Z に対する siRNA を用いたノックダウン実験を実施すると、化合物 X の添加と同様に上皮細胞から産生される炎症性サイトカインの産生が亢進した。さらに、化合物 X が代謝産物 Y の合成を阻害することから、逆に、この代謝産物 Y を培養上清に加えて細胞を刺激したところ、炎症性サイトカインの産生を有意に抑制することを発見した（図 2）。これらの結果は、細胞中の代

図 2 代謝産物による炎症性サイトカインの抑制培養細胞を刺激し炎症性サイトカイン産生を誘導する実験において、培養液にあらかじめ代謝産物を添加することで、炎症性サイトカインの産生が有意に低下した。

謝物 Y の量が、細胞が産生する炎症性サイトカイン量と逆相関することを示唆する。
そのメカニズムについて調べたところ、この代謝産物をンスポゾンなどにより、内因性に炎症を誘導すると考えら合成する合成酵素の転写を制御する転写因子が、実は炎症れる。このようなウイルス非存在下で RIG-I や LGP 2 が関性サイトカインの産生誘導に関与する分子の発現も制御す

与する炎症性サイトカインの産生の誘導や抑制が、化粧品ることを明らかとした。これらの結果は、化合物 X が標的によるかぶれなどにどのように関与するのかはまだ明らかとする代謝産物 Y が、炎症を抑制する働きをすることを示となっていないが、紫外線などの照射により活性化した唆する。

内在性のレトロ因子が RIG-I による炎症を誘導することが次に、マウス個体実験を実施するため、化合物 X をマウ報告されており、本研究で明らかとした Riplet の新たな役スへ投与し、Riplet 経路を刺激する薬剤を投与後の炎症性割が、紫外線などによる炎症にどのように関与するのかは、サイトカインの産生を調べたところ、化合物 X の投与によ今後のさらなる研究により解明されると期待される。

りマウス組織での炎症性サイトカインの産生量が増加するケミカルスクリーニングにより同定された化合物 X と代結果を得た。逆に、代謝物 Y の量が増えるマウス動物モデ

謝物 Y について、これらが炎症性サイトカインの産生を制ルを用いると炎症性サイトカイン量が低下することが示さ御することを示唆する結果は他のグループからも報告があれた。これらのことから、代謝物 Y は炎症を抑制する効果るが、その詳細な分子機構は不明であった。本研究で、代を持つことが示された。

謝物 Y が炎症性サイトカインの産生を抑制する詳細なメカ

４．考ニズムを解明したことで、代謝物 Y の抗炎症作用を用いた

察化粧品の開発などにつながると期待される。

Riplet はユビキチンリガーゼ活性を有し、RIG-I 分子依５．総存的な炎症性サイトカインの産生を亢進する働きを持つ。

括

一方で、今回の研究から、LGP 2 依存的な炎症性サイトカ

本研究の結果、炎症の制御に関与する新たなメカニズムインの抑制にも関与することが示された。この一見相反すとして、Riplet 分子による LGP 2 分子のポリユビキチン修る Riplet の作用は、Riplet が、RIG-I と LGP 2 のタンパク飾と、代謝産物 Y による炎症抑制効果を新たに明らかとし質量のバランスによって、その役割を変えることを示唆すた。炎症性サイトカインは血管内皮細胞に作用し血管透過る。つまり、炎症性サイトカインの産生量は、ユビキチン性を亢進することなどにより、局所での腫脹、発赤、疼痛化された RIG-I と、ユビキチン化された LGP 2 分子のバラの原因となる。一方で炎症反応の誘導としては、自然免疫ンスによって制御されていることを示唆している。

応答と獲得免疫応答の二つの経路が存在する。獲得免疫に

RIG-I や LGP 2 はウイルス感染時に主に機能すると考えおいては抗原が炎症反応を誘導するが、自己免疫疾患以外られているが、ウイルス非存在下においても炎症性サイトでは外来微生物やアレルゲンの存在により炎症が誘導されカインの産生に関与することが明らかとなっている。特に、る。一方で、自然免疫はパターン認識受容体のリガンドとRIG-I 遺伝子の変異により自己炎症性疾患を誘導することなるものが炎症を誘導する。Riplet 分子は、ウイルス感染が明らかとなっており、細胞内に元々存在するレトロトラ時の炎症性サイトカイン産生に必要な分子として同定され− 103 −

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たが、最近の研究から、この Riplet が関与する経路が内在性のレトロ因子により誘導される炎症にも関与することが示唆されており、アレルゲンや抗原に非依存的な炎症誘導に関与すると考えられる。特に、内在性レトロ因子は紫外線などの刺激により活性化することが報告されていることから 4）、本研究で明らかとなった炎症の制御機構は、紫外線などによる抗原非依存的な炎症を抑制する新たな方法の開発などにつながると期待される。特に、本研究で同定した代謝産物 Y は従来の化粧品にも配合されることがあるた
め、今後、この代謝産物 Y の割合を高めることで炎症を抑える機能的な化粧品として利用できると期待される（図 3）。
（引用文献）
1） Wang G, Kouwaki T, Okamoto M, Oshiumi H.

図 3 炎症を制御する新たな成分
本研究で解明した新たな分子メカニズムを標的とした物質（成分）を用いることで、今後、抗炎症性作用を示す化粧品などの開発につながると期待される。

Attenuation of the innate immune response against
viral infection due to ZNF5 9 8-promoted binding of
FAT10 to RIG-I. Cell Reports 28: 1961-1970（2019）2） Naesens L, Haerynck F, Gack MU. The RNA

response. EMBO Reports 24: e54844（2022）

polymerase III-RIG-I axis in antiviral innate immunity

4） Mix X, Zheng M, Yu Y, Wu J, Kuang Q, Hu Z,

and inflammation Trends Immunol. 44: 435-449（2023）

Ouyang L, Lu S, Zhao M. Ultraviolet light induces

3） Kouwaki T, Nishimura T, Wang G, Nakagawa R,HERV expression to activate RIG-I signaling pathway

Oshiumi H. K6 3-linked polyubiquitination of LGP2

in keratinocytes. Exp Dermatol 31: 1165-1176（2022）

by Riplet regulates RIG-I-dependent innate immune− 104 −