ペプチドマトリックスを用いた化粧品香料の超高感度センシング
東京工業大学田中祐圭

In recent years, the development of ultra-sensitive sensing technology for volatile organic compounds (VOCs) has
extended beyond environmental monitoring to encompass a wide range of applications including cosmetics and food quality
inspection, body odor analysis, fatigue and stress marker detection, and hazardous substance detection. In response, there has
been significant progress in the development of compact devices targeting various VOCs using semiconductor manufacturing
technologies such as MEMS. However, existing VOC sensors like gas chromatography have been unable to meet thedemands for real-time detection, miniaturization, and ultra-sensitivity. Therefore, this study aims to create an ultra-sensitive
bioelectronics VOC sensor that meets inspection needs by integrating target recognition molecule design techniques withbiosensing technology on two-dimensional atomic thin films. Initially, peptides binding to nonanal, a major component ofcosmetic fragrances and a key contributor to aging odor, were explored. Functional materials capable of efficiently capturing
nonanal were developed by modifying the surface of ZnO nanowire arrays with these peptides. Furthermore, graphenefield-effect transistor (GFET) sensing using peptides binding to other aldehyde molecules identified previously, such as
benzaldehyde, demonstrated ultra-sensitive VOC detection.

１．緒言

近年、揮発性有機化合物（VOC）の超高感度センシングが注目されている。これは、環境モニタリングだけでなく、化粧品や食品の品質検査、体臭の分析、疲労やストレスのマーカーの検出、そして危険物の探知など、幅広い用途に期待されている（Chem Soc Rev. 2020 ; 49 : 6364 - 401）。し図 1 ペプチドマトリックスがもつ分子特性と標的 結合能の模式図

かし、ガスクロマトグラフィーやイオンモビリティー質量分析などの既存の VOC センサは、リアルタイムの検出や小型化、超高感度などの検査ニーズに十分に応えられてい体よりもサイズの小さい分子設計が可能となれば、超高感ない。
電解効果トランジスタ（FET）センサに用いられる電極度 VOC センサの開発が期待される。

表面では、溶液内のイオンが引き寄せられ、デバイ長とこれまで、申請者はアミノ酸が 5 ~ 20 程度繋がった様々呼ばれる 10 nm 程度の領域で電位の傾きが生じる。FETな標的認識ペプチドについて研究を進めてきた 1 ‒ 3）。しかセンサでは、この領域内に捉えた標的分子による微小なしながら、これらの直鎖ペプチドは一般に優れた保存安電位変化を検出することで高感度センシングが可能とな定性をもつものの、標的への特異性や親和性に課題がある。したがって、センサ感度の向上には、グラフェンなどる。このため、申請者はシステインを両端に付与した機の電極表面に修飾される標的認識分子のサイズが重要であ能性ペプチドを開発した。システインはチオール（SH）基る。しかし、一般的に利用される標的認識分子である抗体をもつため、このペプチドを材料表面に滴下すると、各ペは、分子サイズが 10 - 15 nm 程度と大きいため、既存の界プチド分子が S-S 結合により繋がった複雑な構造を形成す

面分子設計ではグラフェンがもつ優れた導電性を最大限活る。このマトリックス構造を標的分子との結合界面に利用かしたセンシングを実現することが難しい状況である（図すると、サイズの大きい類似分子には結合せず、標的小分１）。そのため、抗体と同等の標的認識能を有し、かつ抗子を複数のペプチドで同時に捉えることが可能となる。実際に、このペプチドマトリックスを表面プラズモン共鳴（SPR）センサ基板上で合成したところ、標的小分子トリニトロトルエン（TNT）に対して、抗体に匹敵する結合親

Ultra-sensitive sensing of cosmetic fragrances using peptide matrices
Masayoshi Tanaka

和性（KD= 10 . 1 nM）を示した 4）。このような特性をもつペプチドマトリックスは、グラフェン FET による超高感度 VOC 検出に求められる理想的な界面分子となる。
そこで本研究では、これまでに開発を進めている標的認Tokyo Institute of Technology− 33 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

2 . 2 . ZnO ナノワイヤアレイの合成とペプチド修飾
シリコン基板上にスパッタリングによって Ti 薄膜、Au薄膜、ZnO 薄膜を順に形成し、完全に風乾させた後、窒素ガスで不純物を除いた。その後、0 . 9 % のポリエチルイミン、6 mM ヘキサメチレンテトラミン（HMTA）、24mM 硝酸亜鉛六水和物を MilliQ に溶解した反応液に基板を浸漬し、ナノワイヤアレイを伸長させた。伸長したナノワイヤアレイは、走査型電子顕微鏡（SEM）で観察され、その表面積を算出した。

図 2 開発するペプチドマトリックス修飾グラフェ
ン FET による超高感度 VOC センサの概要

合 成 さ れ た ZnO ナ ノ ワ イ ヤ ア レ イ を 同 定 さ れ た
ノナナール結合性ペプチドで修飾した。具体的には、
3 -aminopropyl-tri-ethoxy-silane（APTES, 1 %）を調製し、識分子の設計技術を用い、検査ニーズを満たすこれまでに15 分間超音波攪拌を行い、その後 ZnO ナノワイヤアレイない超高感度 VOC センサを創出することを目的とした（図

基板を浸漬し、30 分間反応させた。反応後、MilliQ に 1 回２）。

ディップし、100 ℃で 1 時間加熱することで焼結した。そ２．方の後、基板を MilliQ とエタノールでそれぞれ 2 回洗浄し、

法70 ℃で一晩乾燥させた（図 3）。

2 . 1 . VOC 結合ペプチドの探索ペプチド溶液（5 mM in DMF）、HBTU 10 mM、DIEA

ノナナール結合性ペプチドの探索には、ファージディス

20 mM、となるよう各試薬を溶解し、アミノ基修飾した

プレイライブラリー（NEW ENGLAND BIOLABs、PhageZnO ナノワイヤアレイ基板を浸漬させ 2 時間反応させた。

display library kit）を使用した。最初に、カバーガラスを反応後、DMF、メタノールでそれぞれ 4 回洗浄し、風乾した。

MilliQ 水とエタノールで 2 回ずつ洗浄して 70 ℃で 1 時間

主鎖を保護する Fmoc 基は、20 % の piperidine に 50 分乾燥させた。次に 70 ％エタノール中に 0 . 1 M の濃度とな間浸漬させることで脱保護した。脱保護した溶液は回収し、るようにノナナールを溶解し、洗浄したカバーガラスの301 nm での吸光度を測定することで、修飾されたペプチ上に 400 µL スポットし、ガラス表面全体に引き伸ばした。

ド量を定量した。

その状態で 30 分間静置し、エタノールの蒸発とともにノチドを提示しているファージ溶液を滴下し、60 分静置後、

2 . 3 . GC/MS によるペプチド修飾 ZnO ナノワイヤ
アレイのノナナール捕捉量定量測定

Tris buffered saline（TBS, pH 7 . 4）で６回洗浄した。次に、作製したペプチド修飾 ZnO ナノワイヤアレイのノナナ

Gly-HCl buffer（pH 2 . 6）を 500 µL をスポットし、20 分間ール捕捉能を評価するために、飽和ノナナール蒸気（p=静置することで強固にノナナール修飾基板に吸着したファ49 . 3 Pa）に 5 分間暴露した。その後、GC/MS によって捕ージを回収した。ファージ DNA を回収し DNA 配列を取捉されたノナナール量を定量し、ペプチド修飾前後でのノ得することで、ノナナール修飾基板に高い結合能をもつペナナール捕捉量を比較した。バイアル瓶の中に針金で籠をプチド配列を同定した。

作り、ペプチド修飾基板を籠の内部に入れ、バイアル瓶にナナールを吸着させた。その後、７残基のランダムペプ液体のノナナールを加えることにより、飽和ノナナール蒸

図 3 ZnO ナノワイヤアレイへのペプチド修飾方法− 34 −

ペプチドマトリックスを用いた化粧品香料の超高感度センシング

気にペプチド修飾ナノワイヤアレイ基板を暴露した。そのmm 2 と比較して約 5 倍の密度であった。これによりナノ後、400 ℃で 20 分加熱することで吸着したノナナールをワイヤ構造により表面積を増加させることで単位面積あた脱離させ、GC/MS で気相内のノナナールを計測した。

りのペプチド修飾密度を向上できることが示された。一方
で表面積としては 20 倍あるのに対して、修飾密度の向上

2. 4. ペプチドを利用したべンズアルデヒドのGFET センシングは 6 倍程度であった。これは、ナノワイヤアレイ上部にはGFET を使用して、ペプチドの結合特性を評価した。単に密になっており、ペプチドなどの分子の物質移動が制限

層グラフェンは熱化学気相合成法で合成され、リソグラフされ、修飾効率が低下している可能性がある。ペプチドのィー技術を用いてマイクロ電極を接触させることで、電気分子サイズは、7 残基ペプチドで 1 . 5 nm 程度であり、今伝導を測定した。この GFET を電気化学セル中に設置す回使用したナノワイヤアレイの間隙と比較すると十分小さることで、グラフェンに適宜電圧を印加することが可能とな分子であるが、ナノワイヤ表面には活性点（アミノ基）なる。GFET 表面に自己組織化的にペプチドを修飾し、べが無数に存在している点、静置して反応させていることかンズアルデヒドの結合応答をグラフェンの電気伝導率変化

ら、物質移動が拡散による点を考慮すると、ナノワイヤ下をもとにリアルタイム測定した。標的分子に対する標的分部には未反応点がかなり存在する可能性がある。よりペプ子の濃度依存性（1 pM~ 10 nM）から結合特性を定量的にチド修飾密度の向上が求められた場合は、この辺りの検討評価するとともに、電気伝導率の測度論的な解析を実施しが必要と考えられた。

比較的大きな間隙が存在するのに対し、根元付近では非常た。

3 . 3 . ペプチド修飾 ZnO ナノワイヤアレイを用いたノナナールの捕捉

３．結果と考察3 . 1 . ノナナール結合ペプチドの探索

ノナナール結合候補ペプチド X 及びコントロールペプチ

ノナナール修飾基板に対して、ファージディスプレイライブラリーを用いたところ、今回解析した 24 クローンのド AAAA を修飾した ZnO ナノワイヤアレイ基板を加えて、ノナナール吸着量の評価を GC-MS を用いて行った。

うち、全ての配列がペプチド X であった。そのため、こその結果、ペプチド配列 X を修飾した ZnO ナノワイヤの配列 X は分子内に酸性アミノ酸も塩基性アミノ酸ももたアレイ基板では、ノナナール捕捉量がネガティブコントロず、分子内での構造を取りにくい、比較的自由度の高い疏ールである AAAA 修飾基板に対して 8 . 27 倍向上すること水的な物性をもっていることが考えられた。今回標的とすが示された（図４）。従来行われてきた芳香族化合物検出や、るノナナールは疎水性の強い炭化水素鎖の部分と、極性及アルコール類や酢酸、アンモニアといった極性の強い小分びマイナスチャージが強いアルデヒド基を有している。そ子の検出のみならず、疎水性が強く特徴的な官能基の少なのため結合部位としては、ノナナールの分子サイズ（約アい揮発性有機物に対しても特定のアミノ酸配列を有するペミノ酸 3 残基）程度の疎水性の高い領域に対して結合してプチドを分子認識プローブとして利用することで、デバイいると考えられる。今回の配列 X のうち、N 末端側にこのスの捕捉・濃縮効率を高めることが可能であることを示すような特性に該当する領域があることから、この部位がノものである。

ナナール結合領域であると考えられた。

3. 4.

ペプチドを利用したべンズアルデヒドのGFET センシング

3 . 2 . ZnO ナノワイヤアレイ合成とペプチド修飾合成されたナノワイヤアレイの SEM 画像からナノワイ

これまでに同定してきたべンズアルデヒド結合性ペプチヤの直径と長さを算出したところ、それぞれ平均すると直径約 500 nm、長さ約 7 µm と見積もられた。そこから算出される表面積は、基板 1 mm 2 あたり約 20 mm 2 である。
このことから、ナノワイヤアレイ基板を用いることにより、ノナナール捕捉量が平板と比べて最大で 20 倍に向上する可能性が見込まれるが、現実にはナノワイヤアレイ間のスペースは物質移動が制限され、反応効率が低下すると考えられる。
ここで得られたナノワイヤアレイにペプチド X を修飾し、その密度を算出したところ、69 . 1 pmol/mm 2 であった。
これは平面ガラス基板を用いた際の修飾密度 11 . 2 pmol/− 35 −図 4 ペプチド修飾 ZnO ナノワイヤ
アレイを用いたノナナールの捕捉コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図5

べンズアルデヒド修飾 GFET を用いたべンズアルデヒド検出

ドを利用した GFET センシングについても検討を進めた。

研究によって得られた成果は非常に波及効果が大きく、更今回用いたペプチド配列 Y とグラフェン結合配列を連結しなる研究の発展が強く期待される。

た二機能性ペプチドを調製し、これをグラフェン表面に滴下することで表面を機能化し、異なる濃度のべンズアルデ（引用文献）

ヒドに対する応答性評価をもとに乖離定数を評価した。そ1） Tanaka, M.; Hayashi, M.; Roach, L.; Kiriki, Y.;の結果、べンズアルデヒドとの乖離定数が数 pM であるこKadonosono, T.; Nomoto, T.; Nishiyama, N.; Choi, J.;とが示され、非常に優れた結合親和性を保つことが示されCritchley, K.; Evans, S. D.; Okochi, M. Synthesis ofた。また 1 pM のべンズアルデヒドに対しても応答が得ら

Near-Infrared Absorbing Triangular Au Nanoplates

れており、べンズアルデヒドを超高感度に検出できるセン

Using Biomineralisation Peptides. Acta Biomater.

シング技術を開発することができた（図５）。

2021, 131, 519‒531. https://doi.org/10.1016/J.ACTBIO.
2021.06.010.

４．まとめ

2） Suwatthanarak, T.; Tanaka, M.; Miyamoto, Y.;

本研究により、これまでに報告例の非常に乏しい VOCMiyado, K.; Okochi, M. Inhibition of Cancer-Cellに対するペプチドプローブを探索する方法を確立し、同Migration by Tetraspanin CD9-Binding Peptide.

定されたペプチドを用いることで気相の VOC を濃縮回収

Chem. Commun. 2021, 57（40）, 4906‒4909. https://doi.

できること、そして GFET センサ表面を修飾することでorg/10.1039/D1CC01295A.

VOC を超高感度に検出できることが確認された。今後は、

3） Yoshikawa, K.; Saito, S.; Kadonosono, T.; Tanaka, M.;

標的選択性の評価、そしてこれまでに研究を進めているペOkochi, M. Osmotic Stress Induces the Formation of

プチドマトリックス構造を利用することによる結合親和性、Migrasome-like Vesicles. FEBS Lett. 2 0 2 4, 5 9 8（4）,437‒445. https://doi.org/10.1002/1873-3468.14816.

選択性の向上に向けた研究開発が進められることが期待される。また本研究により微細加工による VOC の濃縮、そ4） Komikawa, T.; Tanaka, M.; Yanai, K.; Johnson, B.

して小型化が容易なセンシング技術である GFET への適R. G.; Critchley, K.; Onodera, T.; Evans, S. D.; Toko,用可能性が示されたことは、今後 VOC を携帯可能なレベ

K.; Okochi, M. A Bioinspired Peptide Matrix for theルでの小型センサを利用したリアルタイム検出の足がかり

Detection of 2,4,6-Trinitrotoluene（TNT）. Biosens.となる研究成果である。そのため今後ますます健康、安全

Bioelectron. 2 0 2 0, 1 5 3. https://doi.org/1 0.1 0 1 6/などに関わるセンシング技術の開発が求められる中で、本j.bios.2020.112030.

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