別紙42 (課程博士(和文))2023年

電気・電子情報学:条菩老早号'

工学専攻

第D189201号

指導教員

1月5日

澤田和明

士井英生

氏名

論文内容の要旨(博士)
博士学位論文名

非標識バイオイメージセンサの開発と海馬からの化学種の可視化(要旨 1,200字程度)
脳の生理機能および病態生理機能解明のためには,神経伝達に重要な役割を果たす細胞外の化学物質を高い時空間分解能で可視化解析する技術の開発が重要である。蛍光顕微鏡によるイメージング技術は感度・空間分解能が高いが,細胞外の神経伝達物質やイオンを観察するために蛍光色素やたんぱく質等の標識を必要とするため,神経伝達を阻害する恐れや励起光照射による細胞への悪影響が懸念される。標識を用いずに可視化する生物発光法は,非常に感度が高いが,反応による発光量が微弱なため空間分解能は100μm程度と神経伝達の局所応答の可視化は困難である。一方, Field Effect Transistor (FET)を用いた電位検出型のバイオセンサアレイは検出素子の微細化および多点同時計測を可能とし,イメージングへの可能性を秘めている。本研究室で開発されてきた電荷転送型イオンイメージセンサは液中の水素イオン拡散を非標識でりアルタイムに観察でき,特定のイオン感応膜を形成することでバイオイメージセンサとして機能する。本論文では,計漁挾ナ象物質としてのAdenosine・5'・triphosphate (ATP), Lactate,カノレシウムイオン(ca2→,カリウムイオン(K→のような主要な神経伝達物質を非標識で可視化するイメージング技術の創出を目的とし, CMOSイメージセンサ技術に分子検出膜を融合した非標識バイオイメージセンサの開発によるバイオイメージングへの可能性を検討した。
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まず,画素ピッチ37.3μmの電位検出型アレイセンサ上にATP分解酵素を機能膜として修飾した酵素型非標識ATPイメージセンサを提案した。センサ表面の親水化処理および酵素の多量固定が可能なポリイオンコンプレックス法による成膜で液中ATP拡散の画像化に成功した。 ATPの高感度検出に向けた膜厚依存性の検討実験では,厚さを20o nm程度にすることで濃度10μMの検出を実現した。マウスの急性脳スライス標本を用いた細胞外応答の可視化実験では,電気刺激により細胞外に放出されたATPの非標識観察に成功した。また,液中のPH緩衝作用がセンサの検出限界を著しく悪化させる問題点を明らかにした。

次に,PH緩衝作用による原理的な課題を解決するための酸化還元型ATPイメージセンサを提案した。金/チタンを堆積したアレイセンサに,3種類の酸化酵素,フェロセンメディエータを用いた電子反応検出技術に基づいて, PH緩衝作用が10 mMのような生物的実験下で2.8μMの最低検出下限を示し,センサの高感度化を実証した。また,酸化還元反応検出系を応用し, ATP, Lactateを含む5種類の分子検出にも成功した。細胞外応答の計測実験では, ATP放出の可視化には至らなかった一方で,海馬スライスからの乳酸放出応答のりアルタイムイメージングに初めて成功し,イメージングデバイスとしての機能を実証した。

続いて,イオノフォア含有PVC膜型のCa2‑およびK、イメージセンサ(画素ビッチ23.55 μm)を製作し,高感度・高解像イメージングに向け膜厚依存性を検討した。 ca2、イメージセンサの実験では,膜溶液の溶媒量および成膜量を制御することで理論感度を示し出力分布の均一化に成功した。 K、イメージセンサの実験では,理論感度が低下せず面内バラツキを5%程度にできる成膜条件を見出した。共存イオンおよび神経伝達物質に対する電位応答の計測実験より,生物的実験環境を模倣した溶液中でイオンの選択的検出を実証した。
最後に, PVC膜型イオンイメージセンサを海馬スライスの薬剤刺激実験に応用し,細胞外応答を検討した。興奮性のシナプス伝達を模倣したグルタミン酸刺激により,細胞外Ca2、濃度がダイナミックに低下すること,この応答が海馬脳部位で全く異なった(CAI, DG>CA3)。また,受容体の阻害実験を通じて,細胞外Ca2、低下およびK、上昇にNMDA型のグルタミン酸受容体が強く関与することを明らかにした。また厚さの異なるセンサを用いた空間解像度の検証実験では,感応膜の膜厚が細胞外応答の時空間ダイナミクスに及ぼす可能性を実証し,薄膜化の有用性を示した。

本研究では,細胞外ATP,乳酸, ca2、, K,を画素ピッチ数十μmの電位検出型アレイセンサ上で非標識観察することに成功し,海馬スライスのような脳神経組織における細胞外応答の時空間解析センサとして有用である可能性を示した。開発した細胞外イメージング技術は,脳の生理および病態生理機能の解明に貢献することが期待でき,新たなバイオイメージングツールと成り得る。

別紙41 (課程博士(英文))Date of submission (month day, year)

J飢Uary 5th,2023

Depadmentof
Electrical and Electronic

StudentlDNumber

Supervisors

Information En牙ineerlng
Pplicatlt's name

Kazuakisawada

D189201

Hideo Doi

Abstract (Doctor)
Title ofThesis

Development ofa label‑free bio‑image sensor atld
Visualization ofchemicals from the hippocampus

Approx 80o wordsTo elucidate the physi010gical and pathophysi010曾ical functions of the brain, it is im
Portant to develop techniques to visualize and analyze extrace11Ular chemical substanceS that play an important role in neurotransmission with high spatiotemporal resolution. AlthoU牙h auorescence microscopy has hi曾h sensitivity and spatial resolution, it requires labels such as fluorescent dyes and proteins to visuaHze extrace11Ular neurotransm
itters and ions, which may interfere with neurotransmission and adversely affect ce11S

due to the irradiation of excitation Hght. The bioluminescence method, which aⅡOWS V
isualization without labelin牙, is very sensitive to the tar套et molecules. However, the sPatial resolution is only about lo0 μm due to the weak luminescence from the reaction, m.akin牙 it difficult to visuaHze the local release of neurotransmitters. on the otherhand, field effect transistor (FET)'based potentiometric biosensor arrays have a potenti
al for bioimaging, because they enable the miniaturization of sensin牙 elements and si
multaneous measurement of multiple points. The char曾e'transfer'type ion ima牙e sensordeveloped in this laboratory can visualize the diffusion of hydr0宮en ions in real time
and without any labeHn晉. By immobilizing a specific ion'sensitive membrane, it can f

Unction as a bioimage sensor.1n this paper, we describe the development of an ima号in曾 technique to visualize neurotransm北ters, such as Adenosine・5'・triphosphate (ATP),Lactate, calcium ions (ca2+), and potassium ions (K+) in a non'1abeled manner as thetar牙et molecules. X入re discussed the possibility of bioimagin牙 by developing a label・freebioima牙e sensor that integrates cMos ima宮e sensor techn010容y with a molecular detec
tion membraneFirst, we proposed an enzyme"based label"free ATp ima牙e sensor with an ATP"de晉radin牙 enzyme modified as a functionalized membrane on a potentiometric sensor array
With a 37.3 μml'esolution. The thickness'dependent ATp diffusion was investigated for
hi牙hly sensitive detection of ATP, and the limit of detection 訊las achieved to be l0 μ
M by decreasing the film thickness to approximately 20o nm.1n visualization experim
ents of extrace11Ular responses usin牙 acute mouse brain tissues, unlabeled ATp released extrace11Ularly by electrical stimulation was successfU11y visualized.＼入le also clarified
the problem that pH bufferin牙 in the solution si曾nificantly deteriorates the detection
Iimit of the sensor.

Next, a redox、type ATp ima今e sensor was proposed to overcome the principle proble
m caused by pH buffer action. Based on an electronic reaction detection technique usi
ng three oxidase enzymes and an electron mediator on a sensor array deposited 牙oldand titanium layer, a lower detectable concentration waS 2.8 μM was demonstrated under bi010宮ical experiments where the pH bufferin牙 Was lo mM, demonstratin牙 the hig
h sensitivity of the sensor.1n addition, by applyin曾 the redox reaction detection system, we succeeded in detecting five chemicals includin宮 ATp and Lactate. From visualiz
ation experiments of extrace11Ular responses, ATp release could not detect while label・f
ree real、tilne ima牙in曾 of lactate from hippocampal sHces for the first time, demonstrating its function as an ima曾ing deviceIn the experiment of the ca2+ ima牙e sensor, the theoretical sensitivity and uniformity
Of the output distribution were successfUⅡy obtained by contr011in宮 the volumes of solv
ent and the film thickness. For the K+ image sensor, we found the film. deposition con
ditions that can reduce the in'plane variation to about 5% without decreasin牙 the theOretical sensitivity. The selective detection of ca2゛ and K, under bi010曾ical conditions
Was delnonstrated

Fina11y, pvc membrane'based ion ima牙e sensors were applied to bi010牙ical experiments with che血.ical stimulation in hippoca血Pal slices. Based on glutamate sti皿Ulation,
Which mimics exC北atory synaptic transmission, dynamica11y decreased extrace11Ular ca2‑ concentration ([ca2+]0), and this response was different in hippocampal sub、re牙ions(CAI, DG>CA3). Through receptor inhib北ion experiments, we found that N'Methyl'D・aSpartic Acid (NMDA)'type 部Utamate receptors are stron曾ly involved in the [ca2‑]o dec
rease and K+ increase. Additiona11y, usin牙 different thick sensors, it was demonstrated

that the film thicknesS 曾reatly affects the spatial resolution of [ca2+]o and [K+10 dynamics, and the thinner film is e任ective for be此er extrace11Ular ima牙in曾In this study, we succeeded in label、free ima曾ing of extrace11Ular ATP,1actate, ca2+, and K+
On a potentiometric sensor array with severaltens of micrometers pitch and delnonstrated
that the sensor may be useful for spatiotem.poral analysis of extrace11Ular responses in brain
tissue such as hippocampal slices. The developed extrace11Ular ima曾in曾 technique is expected
to contribute to the elucidation ofphysi010曾ical and pathophysi010曾ical functions ofthe brain
as a novel bioima.牙ing to01