関東森林研究

論 文70-1(2019)新潟県産スギ由来の不定胚形成細胞からの無花粉個体の再生
丸山 E.毅１・細井佳久１・宮澤真一１・上野真義１・大西昇２・戸塚聡子３・岩井淳治３・森口喜成４
１ 森林総合研究所
２ キリン株式会社
３ 新潟県森林研究所
４ 新潟大学要旨：深刻な社会問題となっているスギ花粉症対策の一環として，花粉を飛散させない無花粉スギの活用が期待されている。我々は，不定胚形成技術による大量増殖法と，遺伝マーカーによる早期選抜技術を組み合わせた無花粉苗の大量生産方法の確立を目指している。昨年は，新潟県の無花粉スギを母樹とする種子から不定胚形成細胞を誘導し，誘導効率について報告を行った。今回は，雄性不稔遺伝子を持つスギ不定胚形成細胞からの無花粉個体の再生について検討を行った結果、無花粉個体を再生するための培養条件を明らかにした。
キーワード：Cryptomeria japonica，花粉症，雄性不稔，不定胚形成，無花粉スギ

Pollen-free plant regeneration from embryogenic cells derived fromsugi (Cryptomeria japonica) of Niigata prefecture
Tsuyoshi E. MARUYAMA1, Yoshihisa HOSOI1, Shinichi MIYAZAWA1, Saneyoshi UENO1,Noboru ONISHI2, Satoko TOTSUKA3, Junji IWAI3, Yoshinari MORIGUCHI4
1 Forestry and Forest Products Research Institute2 Kirin Company Limited
3 Niigata Prefecture Forestry Research Institute4 Niigata University
Abstract: As part of countermeasures against sugi pollinosis, which has become a serious social problem, the utilization of pollenfree plants is expected. We are aiming to establish a mass production method for pollen-free seedlings combining mass propagationmethod by somatic embryogenesis technology and early selection technique by genetic markers. Last year, somatic embryogenic
cells were induced from seeds of pollen-free mother trees in Niigata prefecture, and the induction efficiency was reported. In thisstudy, regeneration of pollen-free sugi plantlets from somatic embryogenic cells with male-sterile gene is reported.
Key-word: Cryptomeria japonica, pollinosis, male sterility, somatic embryogenesis, pollen-free sugi

Ⅰ はじめに苗コストもかさんでいる。これらの問題を解決するため

日本におけるスギ花粉症患者は 2500 万人を超え，そに，我々は遺伝マーカーによる無花粉個体の未分化細胞の治療などにかかる費用は毎年 5000 億円を下らないもの段階で早期選抜と，不定胚形成技術による大量増殖をのと考えられ（１０），大きな社会問題となっている。そ組み合わせることによって，判別に必要な時間を短縮し，の対策の一環として，無花粉スギの普及・拡大が急務と無花粉スギ苗の効率的な増殖技術の確立を目指していなっている。現在，無花粉スギの実生苗は，雄花の着花る。昨年は，新潟県の無花粉スギを母樹とする種子からを誘導したうえで無花粉個体を選抜し，供給されている。

不定胚形成細胞を誘導し，誘導効率について報告を行っこの方法では，かなりの時間と手間がかかる上に，分離た。今回は，雄性不稔遺伝子を持つスギ不定胚形成細胞の法則により無花粉にならない約半数の苗を除去しなけからの無花粉個体の再生について検討を行った。

ればならないため，生産効率が極めて悪く，その分の育－37 －（受理日 2019 年 4 月 3 日）Ⅱ 材料と方法

その後，ほとんどの発芽不定胚は幼植物体を形成した。

不定胚形成細胞の誘導と増殖

不定胚形成細胞の誘得られた幼植物体を発芽用と同一組成の培地に移植し，導と増殖については丸山ら（８）が報告した方法に従いさらに培養すると，図‐６に示すように健全に成長した。

行った。不定胚の誘導には，固形培地で２～３週間ごとに継代培養して増殖させた不定胚形成細胞を用いた。
不定胚の誘導と成熟化

IV おわりに種子胚から誘導した不定胚

不定胚誘導に関しては，家系間差や系統間差がみられ形成細胞を増殖させた後，成熟用培地に移植した。培養たが，全ての家系において不定胚を誘導し，植物体を形には， EM 基本培地（９）に 3% マルトース，17.5% ポ成させることができた。今回の結果により，雄性不稔遺リエチレングリコール，0.2% 活性炭，100μM アブシジ

伝子を持つスギ不定胚形成細胞から無花粉個体を再生す

ン酸，2 g/l グルタミン，1 g/l アスパラギン，0.5 g/l アルるための培養条件を明らかにすることができた（図‐７）。

ギニン，0.079 g/l シトルリン，0.076 g/l オルニチン，0.055

今後，再生した植物体の初期成長をモニタリングする予g/l リシン，0.040 g/l アラニン，0.035 g/l プロリン，0.3%

定である。

ゲランガムを添加した培地を用いた。培養は暗黒下，25℃で行った。
不定胚の発芽と個体再生

引用文献
培地上で成熟した不定胚(1) Garin E, Isabel N, Plourde A (1998) Screening of large

は，植物成長調節物質を含まない EM 培地に移し，16 時

numbers of seed families of Pinus strobus L. for somatic

間蛍光灯照明（約 4,000 lx），25℃ の環境下で培養した。

embryogenesis from immature and mature zygotic embryos.

次に，発芽した不定胚を，培養フラスコに移植し，同一Plant Cell Rep 18: 37-43

組成の培地で培養して幼植物体に成長させた。

(2) Igasaki T, Sato T, Akashi N, Mohri T, Maruyama E,Kinoshita I, Walter C, Shinohara K (2003) Somatic

Ⅲ 結果と考察

embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic

不定胚形成細胞の誘導と増殖 無花粉スギ（母）と雄embryos of Cryptomeria japonica D. Don. Plant Cell Rep 22:性不稔遺伝子をヘテロ接合体で保有する個体（父）を交239-243

配した４家系の種子から不定胚形成細胞を誘導した（図(3) Klimaszewska K, Trontin JF, Becwar MR, Devillard C,‐１）。得られた不定胚形成細胞は，誘導時と同一の培養Park YS, Lelu-Walter MA (2007) Recent progress in somatic

条件下で２～３週間ごとに継代培養することで細胞の維embryogenesis of four Pinus spp. Tree For Sci Biotech 1: 11-25

持・増殖が可能であった（図‐２）。

(4) Maruyama E, Hosoi Y, Ishii K (2007) Somatic embryo

不定胚の誘導と成熟化

４家系から誘導した不定胚

production and plant regeneration of Japanese black pine (Pinus

形成細胞系統を用いて，不定胚の誘導実験を行った。不thunbergii). J. For. Res. 10: 403-407

定胚形成細胞を成熟用培地に移植すると，培養開始約６(5) Maruyama E, Hosoi Y, Ishii K (2007) Somatic週間後に成熟不定胚の形成が見られた（図‐３）。そのうembryogenesis and plant regeneration in yakutanegoyou, Pinus

ち，各家系からの最もよい結果を示した３細胞系統ずつ

armandii Franch. var. amamiana (Koidz.) Hatusima, anを選抜した。成熟不定胚の平均形成数について、「新大不endemic and endangered species in Japan. In Vitro Cell. Dev.

稔 3 号×珠洲 2 号」の家系は直径 90 mm のシャーレ当たBiol.-Plant 43: 28-34

り 900 個以上の不定胚が形成され，最も高い形成率を示(6) 丸山 E.毅・細井佳久・勝木俊雄（2011）不定胚形成した。一方，「福島不稔 1 号×大井 7 号」の家系は最も低によるヤツガタケトウヒの個体再生．関東森林研究 62:

い値を示した。全ての家系において不定胚を誘導できる

127-130

ことは確認できたが，図‐４に示したように，家系によ(7) Maruyama E, Ishii K, Hosoi Y (2005) Efficient plant

る成熟不定胚の平均形成数が異なった。このような結果

regeneration of Hinoki cypress (Chamaecyparis obtusa) via

は，通常の可稔スギ系統（２，９），ヒノキ（７），ヤツsomatic embryogenesis. J. For. Res. 10: 73-77

ガタケトウヒ（６），クロマツ（４），ヤクタネゴヨウ（５）(8) 丸山 E.毅・宮澤真一・上野真義・大西昇・戸塚聡子・

や他の海外マツ（１，３）でも報告されている。

岩井淳治・森口喜成（2018）新潟県産無花粉スギ種子か不定胚の発芽と個体再生 成熟させた不定胚を，植物らの不定胚形成細胞誘導の家系間差．関東森林研究 69:

成長調節物質を含まない培地に移すと，約１-２週間後に1-2発芽し始め（図‐５），４週間後には９割以上が発芽した。

(9) Maruyama E, Tanaka T, Hosoi Y, Ishii K (2000)－38 －関東森林研究

Embryogeniccellculture,protoplast70-1(2019)

regeneration,cryopreservation, biolistic gene transfer and plant regenerationin Japanese cedar (Cryptomeria japonica D. Don). Plant
Biotechnology 17: 281-296(10) 椎名大介（2011）都市周辺のスギ人工林とスギ花粉症に関する経済分析．政策研究大学院大学まちづくりプ
ログラム MJU10053: 1-4

図‐3．成熟不定胚の形成
Fig. 3 Mature somatic embryo formation

不定胚形成数1200

図‐1．不定胚形成細胞の誘導
Fig. 1 Embryogenic cell induction

1000
800
600
400
2000S③⑦⑧

家系Ｓ：新大不稔３号×珠洲 2 号，③：福島不稔１号×S3-37(1)，⑦：福島不稔１号×大井７号，⑧：福島不稔１号×S3-118(2)※S3-37(1)：新大不稔 3×カミキリ 2，S3-118(2)：新大不稔 3×柏崎市 3

図‐4．無花粉スギ４家系細胞系統からの不定胚形成
Fig. 4 Somatic embryogenesis from 4 families of pollen-freesugi

図‐2．不定胚形成細胞の増殖
Fig. 2 Embryogenic cell proliferation

図‐5．不定胚の発芽
Fig. 5 Somatic embryo germination－39 －図‐6．不定胚から植物体の再生
Fig. 6 Plant regeneration from somatic embryos

不稔

不定胚形成細胞の誘導

不定胚形成細胞の増殖マーカーによる
無花粉系統の選抜

植物体の再生不定胚の発芽不定胚の誘導

図‐7．不定胚形成細胞からの無花粉スギ植物体再生のプロセス
Fig. 7 Regeneration process of pollen-free sugi plantlets derived from embryogenic cells
謝辞：本研究は、農林水産業・食品産業科学技術研究推
進事業および農研機構生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」の支援によって実施した。

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