紫外線による細胞老化と光老化を繋ぐ分子基盤の解明
公益財団法人東京都医学総合研究所基礎医科学研究分野

笹沼博之

As we are now facing an era of hyper aging society, maintaining mental and physical youthfulness throughout a lifetime
is directly linked to healthy longevity and the quality of life (QOL). Youthful is often assessed by appearance, including
signs of aging such as skin blemishes and wrinkles. Therefore, inhibiting these skin aging signs holds immense importancefor maintaining QOL. Sunspots and wrinkles are attributed to photoaging, caused by exposure to ultraviolet (UV) irradiationfrom sunlight. Since the continuous exposure of UV and subsequent photoaging leads to solar keratosis and skin cancer,
investigation of molecular mechanism of photoaging and its prevention are necessary for the maintenance of QOL. In
this study, we aim to investigate photoaging in terms of genomic alternation by exposure of UV, especially the molecularmechanism underlying cause of photoaging. Our research would help provide fundamental insights for seeking “photoagingscavenger compounds” in future.

１．緒を 10 % 加えた。さらに L- グルタミン、ピルビン酸ナトリ

言ウム、ペニシリン、ストレプトマイシンをそれぞれ、最終細胞に存在する DNA は、絶えず内的外的要因によっ濃度 2 mM、1 mM、100 U/mL、100 mg/mL 加えた。細胞て損傷を受ける。内的要因としては活性酸素種が最も多培養液は、CO 2 濃度 5 %、湿度 100 %、37 ℃で培養した。

い、一方で、外的要因で最も多いのが紫外線である。紫外線は DNA 鎖にぶつかるとそのエネルギーにより塩基間を2 . 2 . 遺伝子改変細胞の樹立共有結合により架橋してしまう。架橋された二つの塩基2 . 2 .1. RAD18 遺伝子破壊細胞の樹立は、転写や DNA 複製を行うポリメラーゼによって認識でTK 6 細胞の RAD 18 遺伝子を CRISPR/Cas 9 技術を使用きないため正しい塩基を合成鎖に挿入することができなし、相同組換え法により破壊した。RAD 18 遺伝子破壊のい。こうした架橋塩基は、複数の修復経路によって修復さ方法は、2023 年 9 月に出版された『Cosmetology』
最新号（第れる。Translesion DNA synthesis（TLS）経路とヌクレオ31 号）の津田雅貴先生による研究課題「新規変異評価シスチド除去修復（NER）経路は、主要な紫外線損傷経路であテムを用いた長波長の紫外線（UVA）による突然変異誘発る。TLS 経路では、TLS ポリメラーゼが架橋塩基を乗り機構の解明」に記述されている。

越えることによって DNA 合成を継続する。また NER 経路

2. 2. 2.

Auxin による BRCA 2 遺伝子発現抑制細胞のでは、架橋塩基を含む周辺の塩基をヌクレアーゼにより除樹立

去し、除去された領域を DNA ポリメラーゼが合成するこAuxin による BRCA 2 遺伝子発現抑制細胞とは、植物とで修復する。TLS と NER 経路は本研究では、それらにホルモンである Auxin を培地中に加えることで、AID 配加えて DNA 二重鎖切断修復経路である相同組換え（HR）列を融合させた標的分子（BRCA 2 -AID）がプロテアソ修復経路の紫外線損傷修復における役割を明らかにするこーム依存的に分解を起こす細胞である 1 , 2）。最初に、F 1 ,とを目的とした。

5’ -ACTGTGGCATAGAGAGAGGTTAAGCAATTG と２．方R 1 , 5’ -ATGGTAAAACCCAGTCTCTACTAAAAATGC法

プライマーを用いてヒトゲノムより約 2 kb の断片を増2 . 1 . 細胞培養

幅、精製した（AMP 1）。AMP 1 を鋳型として、Left アー

ヒト B リンパ芽球細胞由来である TK 6 細胞を使用した。
TK 6 細胞の培養には、RPMI 1640 培地に非働化ウマ血清

ム を Left_F 2 , 5’ -AGGGCGAATTGGAGCTCCCCACTG
TGGCATAGAGAGAGGTTAAGCAATTG と Left_R 2 ,5’ -TTGGCGCCTGCACCGGATCCGATATATTTTTTElucidation of the molecular basis linking UV-induced cellular aging and dermatoheliosis
Hiroyuki Sasanuma
Department of Basic Medical Sciences,
Tokyo Metropolitan Institute of MedicalScience

AGTTGTAATTGTGTCCTG プライマーを使って、またRight ア ー ム を Right_F 2 , 5’ -CGAAGTTATTAGGTCCC
TCGTGTTGCACAATGAGAAAAGAAATTAGTTTC
Right_R 2 , 5’ -GGGAACAAAAGCTGGGGAACCTCTTATGGTAAAACCCAGTCTCTACTAAAAATGC を 使 って増幅した。増幅した Left と Right アームを精製し、制− 105 −コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

限酵素 SmaI と EcoNI で消化した pBS-AID ベクターを混ぜ た。 そ れ ぞ れ の DNA 断 片 を Seamless kit（Invitrogen,US）によって連結し、ターゲティングベクターを作製した。BRCA 2 遺伝子座は、染色体 13 番にある。TK 6 細胞の染色体 13 番はトリソミーであるため、全ての BRCA 2遺伝子座に AID タグを挿入するために、3 種類のマーカー遺伝子を持つターゲティングベクターを作製した（図1）。BRCA ２遺伝子の終結コドン直前に AID 配列を挿入するために終結コドン直後の 3’ UTR を標的とする gRNA（5’ -ACCTTTCCAGTTTATAAGAC）を Cas 9 -gRNA 発現ベクターである pX 330 にクローニングした。6 × 106 細胞に対して、3 種類のターゲティングベクター（Neomycin,Hygromycin, Histidinol）と pX 330 -gRNA を 同 時 に エ レ
ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 法（NEON, Invitrogen, US）に よ り細胞に導入した。エレクトロポレーション後、24 時間抗生物質なしの培地で培養し、96 ウェルプレートに細胞をNeomycin, Hygromycin, Histidinol 入りの培地ともに塗布し、10 日間培養した。コロニーを 2 mL 培地で増やし、1mL から細胞ストック、1 mL からゲノムを抽出した。AID
タグが BRCA 2 遺伝子の C 末端に導入されたかどうかを次のプライマーを用いて確認した 3）（図 2）。
BRCA2_AID_chkR, 5’-CTATTAAACCTAAGAAAGTA

図１ BRCA 2 AID 細胞の作製方法
約 1kb の Left armとRight armをAID タグを挟んでクローニングした。gRNA-Cas 9 が終結コドン直後を切断すると、ピンク領域の相同配列間で相同組換えが起こる。相同組換えによりAID
タグとマーカー遺伝子がゲノムに挿入される。

ACAAATATTG,HIS_AID_F, 5’-ATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGA
GCTT,
HYGRO_AID_F, 5’-CGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGT,NEO_AID_F, 5’-AGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGC

３．結果

3 . 1 . BRCA 2 と合成致死性を示す遺伝子変異のス
クリーニングと結果の検証実験

BRCA ２遺伝子は、相同組換えに重要な役割を果たす。
BRCA 2 遺伝子変異は、家族性乳がん卵巣がん症候群やフ

図 2 PCR 増幅による標的組換えの確認⇄で示すプライマーを使用した。野生型細胞では、→プライマーがアニールする抗生物質耐性遺伝子がないので、予想される位置に増幅断片が検出されない。

ァンコーニ貧血を引き起こす。BRCA 2 -AID 細胞を用いて、BRCA 2 遺伝子発現を抑制したときに合成致死性を示す遺伝子変異のスクリーニングを行った。方法は、図 3 に示す通り、ヒトゲノムにコードされているほぼ全ての遺（FDR< 0 . 05）。その中で紫外線損傷修復に非常に重要な役伝子（約 2 万遺伝子）に対して gRNA を発現するレンチウ割を果たす XPA 遺伝子変異が見つかった。このスクリー

ィルスを Cas 9 発現 BRCA 2 -AID 細胞に感染させた。感染

ニング結果の再現性を調べる目的で、XPA 遺伝子を標的細胞のみを選択するため Puromycin を含む培地で培養しとする gRNA をクローニングし Cas 9 -gRNAXPA を発現すた。増殖細胞を 2 つのグループに分け、一つを Auxin 含有るウィルスを作製したのち、BRCA 2 AID 細胞に感染させた培地でもう一つを Auxin 不含有培地で培養した。その結果、 （図 4）。BRCA 2 と XPA 遺伝子が両方発現している細胞に約 100 遺伝子変異が BRCA ２遺伝子発現抑制細胞の増殖比べ、XPA 遺伝子単独欠損では、その増殖に違いがなか能をより悪くすること、約 70 遺伝子変異が逆に BRCA ２った。BRCA 2 と XPA 遺伝子発現を両方無くした細胞では、遺伝子発現抑制細胞の増殖能を回復させることがわかった

増殖能が単独に比べて有意に悪くなることわかった。

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図 3 BRCA 2 発現抑制細胞を用いた遺伝的スクリーニング概略図
BRCA 2 AID 細胞に Cas 9 を安定的に発現する細胞株を樹立した。その細胞に約 2 万遺伝子に対するgRNAを発現するレンチウィルスを感染させた。感染細胞をPuromycin によって選択した
のち、生存した細胞を二つに分け、一つをAuxinあり培地でもう一つをAuxin なし培地で 5 日間培養した。5 日間培養したのち細胞からゲノム DNAを抽出し、レンチウィルスに含まれるバーコード配列を含む約 200 baseを増幅した。増幅した領域をNGS により配列解読をおこなった。

図 4 BRCA 2 とXPA 遺伝子の遺伝的関係
BRCA 2 AID 細胞に XPA 遺伝子を標的とするgRNA-Cas 9 を発現するレンチウィルスを感染させ、Auxin 有無の培地での細胞増 殖を調 べた。Auxin なし培 地（BRCA 2が発現）かつXPA 遺伝子が発現している時の細胞密度を 1として、それぞれの細胞密度を相対値として示す。

図 5 BRCA 2 と RAD 18 遺伝子の遺伝的関係
BRCA 2 AID 細胞に RAD 18 遺伝子を破壊した。BRCA 2 AID 細胞培養液に Auxinを0 .1mM 加え、BRCA 2 発現を抑制した。

3 . 2 . TLS 経路と HR 経路の関係

受性を示した。面白いことに BRCA 2 と RAD 18 遺伝子をRAD 18 遺伝子は TLS ポリメラーゼ Polη と相互作用し、紫外線によって発生する損傷部位で停止した複製フォー

両方なくした細胞では、紫外線に対して単独変異細胞に比べ、より強い感受性を示した。

クを認識して集積する。RAD 18 欠損では、TLS ポリメラ

４．考ーゼ Polη による損傷部位の乗り越えが起きずに、RAD 18察

欠 損 細 胞 は 紫 外 線 に 対 し て 感 受 性 を 示 す。RAD 18 とこのことは、紫外線損傷修復経路であるヌクレオチド除BRCA 2 との関係を調べるために、BRCA 2 AID 細胞から去修復（NER）と相同組換え（HR）が細胞増殖能を維持すRAD 18 遺伝子を欠損させた。その細胞において、紫外線るために重要な役割を果たしていることを示唆した。お細胞の紫外そらく細胞では内因性の DNA 損傷が絶えず起こってお線感受性は、Auxin 存在下で野生型と同程度であった。予り、 そ れ を XPA が 関 わ る NER 経 路 と BRCA 2 が 関 わ る

想された通り、RAD 18 遺伝子欠損は、紫外線に対して感HR 経路が常に修復しているのかもしれない。NER 修復や感受性を調べた（図 5）。その結果、BRCA 2AID− 107 −コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

TLS 修復経路は、紫外線の造る損傷（ピリミジンダイマ老化のリスク評価が可能となり、光老化や皮膚がん予防にーや 64 光産物）に重要な役割を果たすことが知られていつながると推察される。

る。近年では、その詳細な分子メカニズムも明らかになっている。今回の結果は、紫外線による損傷修復に重要な役（引用文献）

割を果たす NER や TLS 経路がなくなった場合に、細胞は

1） N. N. Hoa, R. Akagawa, T. Yamasaki, K. Hirota,

その傷を HR によって修復している可能性を示唆する結果

K. Sasa, T. Natsume, J. Kobayashi, T. Sakuma, T.

を得た。BRCA 2 発現抑制細胞単独では、紫外線に対して

Yamamoto, K. Komatsu, M. Kanemaki, Y. Pommier,感受性を示さないことから、紫外線による DNA 損傷修復

S. Takeda, H. Sasanuma, Relative contribution ofは、まず NER や TLS 経路が重要な役割を果たし、その損

four nucleases, CtIP, Dna2, Exo1 and Mre1 1, to the

傷の多くが修復されるが、これらの経路のいずれかが機能

initial step of DNA double-strand break repair by不全に陥ると、その傷は相同組換えが必要な損傷、すなわ

homologous recombination in both the chicken DT4 0

ち DNA 二重鎖切断に変換されると考えられる。紫外線損and human TK6 cell lines. Genes Cells 20, 1059-1076

傷がどのような過程を経て DNA 二重鎖切断に変換される（2015）．のかは不明である。

2） Nishimura, K., T. Fukagawa, H. Takisawa, T.

５．総Kakimoto, M. Kanemaki, An auxin-based degron

括system for the rapid depletion of proteins in nonplant

本研究を通して、複数ある DNA 損傷修復経路の相補性

cells. Nat Methods 6, 917- 922（2009）．

が明らかとなった。現在の概念では、DNA 損傷の種類に

3） A. Tomita, H. Sasanuma, T. Owa, Y. Nakazawa, M.

対応して NER や TLS、HR といった経路分けがされている。

Shimada, T. Fukuoka, T. Ogi, S. Nakada. Inducing

しかし本研究を含め、近年では例えば HR 経路の因子がmultiple nicks promotes interhomolog homologous

TLS に関与するといった、予期しない報告が相次いでいrecombination to correct heterozygous mutations in4）

る 。このことは、紫外線による DNA 損傷によって NERsomatic cells. Nat Commun 14,（2023）．

経路に関わる因子が活性化されても、結果として HR や非

4） S. Pathania, J. Nguyen, S. Hill, R. Scully, G. O.

相同末端結合経路によって修復される可能性を示唆していAdelmant, J. A. Marto, J. Feunteun, D. M. Livingston.

る。紫外線によって発生する光老化を DNA 損傷という観BRCA1 is required for postreplication repair after UV-点から考えてみると、NER、TLS 経路と HR 経路の DNA

induced DNA damage. Mol Cell 44, 235-251（2011）．

修復能を数値化することができるようになれば、将来の光− 108 −