肌温度感受性を有する細胞増殖因子送達ナノ粒子の開発
広島大学大学院医系科学研究科

長瀬健一

In this study, we aimed to develop basic fibroblast growth factor (bFGF)-releasing nanoparticles for regeneration ofdermal tissue. The nanoparticles were prepared by electrospray a bFGF-dispersed poly(D,L-lactide-co-glycolide) emulsion.
bFGF-loaded PLGA nanoparticles can be developed by optimizing the applied electrospray voltage and the oil: water ratioof the emulsion. The prepared nanoparticles exhibited prompt release at the initial duration and continuous gradual releaseat the subsequent duration. These results indicated that the prepared bFGF-releasing nanoparticles would effectively deliverbFGF to dermal tissue.  

１．緒µL に分注し、凍結保存しているものを融解し、水を加言

え て 0 . 25 µg/mL の bFGF 水 溶 液 を 得 た。PLGA 溶 液 に現在、皮膚の再生医療において細胞増殖因子（GrowthbFGF 水溶液と Span 80 を加えボルテックスで撹拌し、分Factor）を疾患部位に効果的に働かせて、疾病部位を治療散させた。作製したエマルションを 5 mL プラスチックシする治療法が注目を集めている。これらの細胞増殖因子はリンジに入れ、電界紡糸装置により電圧を印可しながらポ日常的に皮膚に作用させることで、皮膚機能を効果的に改リマー溶液をアルミホイルに噴霧するエレクトロスプレー善することが可能となるため、化粧品への応用が期待されによりナノ粒子を作製した（図 1）。この時、エマルションている。しかし、これらの細胞増殖因子を肌内部に効果的の水相：油相の比率、印可電圧を変化させて作製した（表 1）。に作用させる手法が確立されておらず、化粧品としての有効利用はできていない。また、これらの細胞増殖因子は安2 . 2 . ナノ粒子の物性評価

定性が著しく低いため、化粧品の状態で、活性を安定に維

2. 2. 1. ナノ粒子の形状観察持する方法が必要である。

作製したナノ粒子の形状を電界放出形走査電子顕微鏡

そこで本研究では、これらの細胞増殖因子の活性を維持（FE-SEM）により観察した。ナノ粒子をオスミニウムでしたまま、効果的に表皮、真皮へと送達する機能性ナノ粒コーティングし、FE-SEM によりナノ粒子の形状を観察子を開発する。細胞増殖因子を内包したポリ乳酸 - ポリグした。ナノ粒子の粒子径は、FE-SEM 画像を ImageJ によリコール酸共重合体（PLGA）の生分解性高分子から構成る画像処理により解析した。

されるナノ粒子を、電圧をかけて微粒子を作製するエレク

2. 2. 2. ナノ粒子中のbFGF含有量の測定

トロスプレー法1 - 4）により作製する。これにより、細胞増クロロホルム 1 mL および、超純水 1 mL からなる混合殖因子を生分解性高分子内に内包することで活性を安定に溶媒を調整した。PLGA-bFGF を混合溶媒に入れ、短時維持することができる。これにより、細胞増殖因子を効果間ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、1 時間静置した的に肌に作用させるナノ粒子の開発を行う。

後に水相を採取した。採取した水相中のタンパク質量を

２．方

®︎

NanoOrange Protein Quantitation Kit を用い、マイクロ法

プレートリーダーにて蛍光を測定し、ナノ粒子が担持する

2 . 1 . エレクトロスプレーによるナノ粒子作製

bFGF の総量を測定した。

PLGA をアセトン：エタノール＝ 9：1 の混合溶媒に、

2. 2. 3. ナノ粒子のbFGF放出挙動
1 mL の PBS 中に作製した bFGF 含有ナノ粒子を浸漬し、40 ℃で加熱撹拌しながら溶解し、0 . 2 w/v のポリマー溶液を作製した（図 1）。また、bFGF はあらかじめ 0 . 5 µg/37 ℃で振盪しながらインキュベートした。所定の時間に®

上澄み液を少量とり、NanoOrange Protein Quantitation
Kit を用いてサンプルの蛍光を測定し、PBS 中に放出されDevelopment of thermoresponsive nano-particle for effective delivery ofgrowth factor
Kenichi Nagase
Graduate School of Biomedical and
Health sciences, Hiroshima University

た bFGF を定量した。

３．結果および考察
3 . 1 . 作製したナノ粒子の形状− 41 −

エレクトロスプレーにより作製されたナノ粒子を FE-コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図１ エレクトロスプレーによるナノ粒子作製方法
表 1 エレクトロスプレー条件SEM により観察した（図 2）。印加電圧が 12 . 0 kV ではエ3 . 2 . 作製したナノ粒子の bFGF 含有量

レクトロスプレーの電圧が不十分ではないため、粒子状に作製したナノ粒子に含まれている bFGF の総量を測定しならなかった。印加電圧が 15 . 0 kV の場合では粒子径が均た（表 2）。印加電圧が高い 15 kV で作製したナノ粒子の一な凝集体を形成していることがわかった。また、印加電方が 12 kV で作製したナノ粒子よりも bFGF の含有量が小圧が 20 kV の場合は、粒子径がより小さくなり単一の粒子さいことがわかった。これは、12 kV で作製したナノ粒子としてアルミホイル状に分散して付着していることがわかはシート状の構造を取っているため、体積が大きくなりった。この状態ではアルミホイルから回収するのが困難でbFGF の含有量も大きくなったと考えられる。また、油相あるため、印可電圧は 15 kV が最適であるとわかった。まの割合が小さい 15 kV- 200 の方が bFGF の量が小さくなった、印可電圧 15 kV でエマルションの油相：水相の比率をた。これは、油相の割合が小さい 15 kV- 200 は粒子径が変化させたところ、O：W= 500：1 の方が O：W= 200：1 より大きくなるが、粒子に含有されている bFGF の量は増えなも粒子径が小さいことがわかった。これは、これは水溶液いことを示している。の比率が小さい方がより揮発性が高くなるためであると考3 . 3 . 作製したナノ粒子の bFGF 放出挙動えられる。
これらの結果より、印可電圧 15 . 0 kV、油相：水相の比作製したナノ粒子の生理条件下での bFGF 放出挙動をリ率 O：W= 500：1 が均一なナノ粒子を作製するのに適したン酸緩衝液に浸漬することで観察した（図 3）。24 時間以エレクトロスプレーの条件であることがわかった。

内での放出挙動を比較すると、6 時間で 40 ％程度の bFGF

− 42 −

肌温度感受性を有する細胞増殖因子送達ナノ粒子の開発

図 2 FE-SEM による作製ナノ粒子の形状評価

表 2 ナノ粒子の bFGF 含有量

図 3 ナノ粒子の bFGF の放出挙動の観察− 43 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024を放出することがわかった。これはナノ粒子の表層付近に子は生体内で効果的な bFGF 放出を促すことが示唆された。

含有している bFGF が放出されたためであると考えられる。

今後はナノ粒子の表面修飾による機能化により、さらなる96 時間後までの放出挙動を観察したところ、12 kV- 500、機能性向上が期待できる。

15 kV- 200 の bFGF の放出は 24 時間からそれほど変わらないのに対して、15 kV- 500 の bFGF 放出は約 80 % 程度（引用文献）にまで上昇した。これは、15 kV- 500 の粒子の形状が生理

1） I. K. Shim, H. J. Chung, M. R. Jung, S. Y. Nam, S. Y.

条件での PLGA の分解と bFGF の放出に適しているためと

Lee, H. Lee, S. J. Heo, and S. J. Lee, J. Biomed. Mater.

考えられる。これらの結果より、15 kV- 500 のナノ粒子がRes. A, 102, 3639-3648,（2014）.
2） H.-J. Chung, J.-T. Kim, H.-J. Kim, H.-W. Kyung, P.

生体内での bFGF の放出に適していることが示された。

4．総Katila, J.-H. Lee, T.-H. Yang, Y.-I. Yang, and S.-J. Lee,括J. Control. Release, 205, 218-230,（2015）.

本研究では、生分解性高分子である PLGA で皮膚の再3） K. Nagase, Y. Nagumo, M. Kim, H.-J. Kim, H.-生を促す bFGF を内包したナノ粒子を作製した。様々な条

W. Kyung, H.-J. Chung, H. Sekine, T. Shimizu, H.

件でエレクトロスプレーを行ったところ、印可電圧 15 kV、Kanazawa, T. Okano, S.-J. Lee, and M. Yamato,

油相：水相の比率 O：W ＝ 500：1 が均一なナノ粒子を作製

Macromol. Biosci., 17, 1700073,（2017）.

するのに適した条件であることがわかった。また、bFGF

4） K. Nagase, M. Nagaoka, Y. Nakano, and R. Utoh, J.の放出挙動を観察したところ、96 時間で 80 ％の bFGF の放出が可能であった。これらの結果より、作製したナノ粒− 44 −Control. Release, 366, 160-169,（2024）.