T 細胞のステムネスを標的とした、乾癬治療法の研究
慶應義塾大学医学部

竹馬俊介

IL-17-producing helper T (Th17) cells are long-lived and serve as central effector cells in chronic autoimmune diseases.
The underlying mechanisms of Th17 persistence remain unclear. We demonstrated that abatacept, a CD28 antagonist,effectively prevented the development of skin disease in a Th17-dependent experimental autoimmune dermatitis model.
Abatacept selectively inhibited the emergence of IL-7R-negative effector-phenotype T cells while allowing the survival andproliferation of IL-7R+ memory-phenotype cells. The surviving IL-7R+ Th17 cells expressed genes associated with alcohol/
aldehyde detoxification and showed potential to transdifferentiate into IL-7R-negative effector cells. Inhibiting aldehyde
dehydrogenase reduced IL-7R+ Th17 cells in vivo, independently of CD28, and exhibited additive effects when combinedwith abatacept. Our findings suggest that CD28 blockade prevents inflammation without eliminating persistent memory
cells. These remaining memory cells can be targeted by other drugs, such as aldehyde dehydrogenase inhibitors, to limit theirsurvival, thereby facilitating the treatment of chronic autoimmune diseases.

１．緒機構を明らかにしようと試みた 3）。

言

2．方T 細胞による免疫反応は、（1）抗原特異性、（2）対応する抗原の多様性、（3）記憶能を備え、ウイルスや細菌に対法

2 . １．実験的皮膚炎する生体防御に必須である。一方、Ｔ細胞の強すぎる活性高橋ら 4）が樹立した、デスモグライン３反応性 Dsg 3 H 1化は時に生命を脅かす自己免疫疾患の原因となる。自己免TCR トランスジェニックマウスを CD 45 . 1 コンジェニッ

1）

疫疾患は人口の５％もが罹患すると言われ 、この病理をクマウスに交配した。このマウスのリンパ節よりマグネテ理解することは重要である。筆者は、T 細胞の抑制レセプィックソーティングを用いて調整した T 細胞を、抗 CD 3ターである CTLA- 4 や PD- 1 分子の解析から、免疫の第抗体、および抗 CD 28 抗体によって刺激し、Th 17 誘導に4 の法則である、「寛容」と、その破綻の結果として起こる用いる TGFβ（2 ng/mL）、IL- 6、（20 ng/ml）、IL- 23（20 ng/自己免疫疾患の発症機構をテーマとして研究を行っている。

mL）に加え、炎症性サイトカインである IL- 1 β（10 ng/慢性の皮膚角化疾患である乾癬は、自己反応性の IL- 17mL）を添加することで誘導病原性 Th 17 へと分化誘導させ産生型ヘルパー T 細胞（Th 17）によって起こり、患者にた。培養後 6 日後に回収した細胞を、同系野生型マウスで著しい「生活の質」の低下をもたらすばかりか再発を特徴ある C 57 BL/ 6 N に静脈注射した。その後、肉眼的な皮膚とする難治性疾患である。近年の研究では、Th 17 は他の炎の発症を観察すると同時に、移入後 2 - 3 週間で病理組T 細胞に比して生体内で長期間生存し、自己複製を行う織解析、FACS 解析に供した。一部の実験では、生体内で2）という、幹細胞様の性質（ステムネス）を有するとされ 、の細胞分裂を評価するため、移入前の T 細胞を CellTrace

これが、治療抵抗性や再発の原因であると考えられていViolet 溶液（Thermo Fisher）で標識した。

る。しかしながら Th 17 細胞が本当にステムネスを持つのか、あるいは長期生存に関する他のメカニズムがあるのかは明らかになっていない。

2 . 2．病理組織解析
イソフルラン深麻酔により犠牲死させたマウスの耳介

本研究では、皮膚反応性 Th 17 細胞の移入によって、マを、4 % パラホルムアルデヒドで浸漬固定し、パラフィンウスに乾癬に類似した慢性皮膚炎を起こす実験系を樹立し、包埋を行った。4 μm 厚の病理切片を作成し常法によって移入した Th 17 細胞を追跡することで、Th 17 細胞の生存ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。キーエンス BZX800 顕微鏡およびEVOS M5000 顕微鏡によって撮像した。

2 . 3．細胞分離と FACS 解析
皮膚所属リンパ節細胞は、腋下、鼠径、腕頭、頸部リ

Development of a Therapy for Psoriasis
Targeting Stemness of T-helper 17

ンパ節を、滅菌プラスチック注射筒のピストン部によりShunsuke Chikuma

機械的に破砕することで得た。表皮および真皮からの細Keio University School of Medicine

胞分離に関して、マウス耳介をまずピンセットにより 2 層− 119 −コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024に 剥 離 し、2 . 5 g/l-Trypsin/ 1 mmol/l-EDTA 溶 液（ ナ カ子の同定には DEseq 2 を用いた。変動遺伝子に基づく生物ライテスク）内で 30 分酵素消化した後、表皮の分離を行

学 的 解 析 に は、Metascape（metascape.org）お よ び Geneった。軟骨を含む真皮層は、コラゲナーゼ D（1 . 6 mg/mL,

Set Enrichment Analysis（GSEA, www.gsea-msigdb.org）

Roche）、ヒアルロニダーゼ（1 . 2 mg/mL, Wako）およびを用いた。

Dnase I（0 . 1 mg/mL, Roche）を添加した RPMI 培地中で3．結１時間酵素消化することによって得た。以上のようにして粗精製したリンパ節、表皮、真皮細胞を 100 μm セルストレ

果

3 . １．Th 17 依存性皮膚炎モデル

ーナでろ過し、Flexible Viability Dye eFlour 780（Thermo

Th 17 が体内で長期間生存し、自己免疫疾患を起こすモFisher）および蛍光標識抗体によって免疫染色した。このデルを確立し、このモデルを解析することを試みた。皮膚細胞を BD 社 FACS CANTOII または Beckman Coulter 社

抗原を認識する Dsg 3 H 1 TCR マウスのＴ細胞を、in vitroCytoFlex S にて解析した。また、RNA シークエンス解析で活性化させ、多種の炎症性サイトカインを加えることで、に供するＴ細胞は BD FACS ARIA 3 セルソーターによりTh 17 へと分化誘導させた。このＴ細胞は、Th 17 細胞の分離した。

特徴である IL- 17 A だけでなく、病原性 Th 17 細胞に特徴的な IL 17 F サイトカインや、IL- 23 レセプター、GM-2 . 4．治療モデル

CSF の産生も起こすことがわかり、高い病原性を持つ病 原 性 Th 17 を 移 植 し た マ ウ ス に、 ア バ タ セ プ ト

Th 17 が誘導されたと考えられた。この病原性 Th 17 を野（Bristol-Myers Squibb; 100 - 200 μg/body）ま た は 同 量生型マウスに移植したところ、２～３週間を経て非常に強のヒト免疫グロブリン（Jackson ImmunoResearch Lab）

く慢性的な（３か月以上）皮膚炎を発症することがわかっを、 移 植 時、2 日 目、4 日 目 の 3 回 腹 腔 内 注 射 し た。 また。このような皮膚炎は、Dsg 3 H 1 TCR マウスを Th 1 にた、ALDH 阻害剤の投与実験では、アバタセプトに加えて、分化させ移植したマウスには全く起こらなかった。移植しシアナミド（東京化成工業）を水溶液として移植後毎日経た T 細胞に特異的に発現する CD 45 . 1 をマーカーとして用口投与（80 mg/kg 体重）した。シアナミドの対照マウスにい、移入後２週間後のマウスを解析したところ、Th 1 誘は滅菌水を投与した。

導した T 細胞が体内で消失する一方で、病原性 Th 17 の移入では 2 次リンパ組織（リンパ節、脾臓）での長期の生存と、

2 . 5．RNA シークエンス解析皮膚への浸潤を起こし、皮膚炎を発症した。以上の結果よ

T 細胞からの RNA 抽出は、Qiagen RNeasy Plus Micro
キ ッ ト を 用 い て 行 っ た。 イ ル ミ ナ NOVOSEQ を 用 いり、Th 17 依存性の慢性皮膚炎モデルを樹立することができた（図 1）。てペアエンドリードにて 6 Gbp 程度のデータを取得し、HISAT 2 , Samtools, および FeatureCount を用いて、マウ3 . 2．実験的皮膚炎モデルは、CD 28 阻害薬で完全スゲノム参照配列 GRCm 38 p 4（mm 10）へマッピングしリに阻害されるードカウントを得た。データの正規化および発現変動遺伝

アバタセプトは、T 細胞の活性化を担う CD 28 シグナルＡ

図１ Th 17 依存性慢性皮膚炎モデル
当モデルの概略。 Ｂ マウスに起こる皮膚炎。

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T 細胞のステムネスを標的とした、乾癬治療法の研究

図２ Th 17 依存性皮膚炎におけるアバタセプトの効果
Ａ アバタセプトの作動原理。自己免疫において、T 細胞へ自己抗原を提示する自己細胞は同時に副刺激分子であるCD 28 のリガンド（CD 80 および CD 86）を発現する。アバタセプト（CTLA 4 -Ig）はこのリガンドに高親和性で結合し、CD 28 からのシグナルを阻害することで、T 細胞を抑制する。ＢおよびＣ アバタセプトは、マウスに起こる肉眼的（Ｂ）組織学的な（Ｃ）皮膚炎を完全に抑制した。

を競合阻害する免疫抑制剤で、リウマチ性関節炎などの治療に用いられる。前項で樹立した皮膚炎モデルを免疫抑制剤であるアバタセプトにより治療できるかを検討した。病原性 Th 17 を投与し、アバタセプト投与を行ったマウスでは、皮膚炎の発症が完全に抑制された（図 2）。

3 . 3．CD 28 阻害薬は、Th 17 による炎症性反応を抑制する

CD 28 刺激は、ナイーブ T 細胞の活性化時に必要であるとされる一方で、すでに分化した Th 17 における機能は不明であった。そこで、分化させた Th 17 を CD 28 で刺激し、遺伝子発現の変化を調べた。CD 28 で刺激した細胞には、組織炎症に関わる多種の遺伝子が、わずか 2 時間で誘導され、CD 28 が炎症反応に重要であることがわかった（図 3）。
そこで、アバタセプト治療群のマウスにおいて、炎症性サイトカインの発現を調べたところ、これらのマウスでは無治療群に比して、自己を攻撃する炎症性サイトカインが大幅に抑制されていることがわかった。

3 . 4．CD 28 阻 害 に よ っ て 治 療 し た マ ウ ス に はTh 17 の一部が残存する治療により皮膚炎を発症しなかったマウスで、移植したTh 17 が完全に消失したのかを FACS により解析した。意− 121 −図３ アバタセプトによる炎症抑制効果
Ａ CD 28 はin vitroで炎症性遺伝子の発現を強力に刺激する。Ｂ アバタセプトによって皮膚炎発症抑制されたマウスでは、多くの炎症性遺伝子が抑制される。

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024わかった。このような細胞は記憶性（メモリー）T 細胞の3 . 5．治療後生存した Th 17 は、アルデヒド脱水素酵素を発現し、この阻害剤で除去できる特徴である IL- 7 レセプターを発現し、リンパ節や脾臓とIL- 7 レセプター陽性細胞が、幹細胞のようにふるまういった、リンパ組織に残存していることがわかった（図 4）。

ことから、この細胞を体内から除去できれば自己免疫疾患

この、メモリー様 Th 17 細胞を体内から回収し、あらたなの完治を目指せると考えた。メモリー様 Th 17 細胞と、炎マウスに移植すると、この細胞から、また炎症性サイトカ

症性 Th 17 細胞を体内より分離し、発現遺伝子を詳細に比インを出す Th 17 細胞が産生されることがわかった。つま較した。前者の細胞は、アルコール代謝に関わる酵素群、りこの細胞は、免疫抑制治療を行っても体内に潜伏し、疾特に、いくつかのアルデヒド脱水素酵素（ALDH）遺伝子患の再発に貢献する細胞であることが考えられた。

を発現していた（図 5）。ALDH は、がん細胞や造血幹細胞外なことに、一部の Th 17 が生存し、分裂していることが図 4 アバタセプトは、メモリー様 Th 17 は抑制しない
Ａ 無治療およびアバタセプト治療群のマウスより、リンパ節細胞を調整し FACS 解析した。多く分裂し、CellTrace Violetを低発現した細胞には IL-7 R 陽性および陰性細胞が観察され、治療群では IL-7 R 陰性の細胞が顕著に減少している一方、IL-7 R 陽性細胞はほとんど影響を受けず体内に残存していることがわかった。

図 5 残存する Th 17 は、アルデヒド脱水素酵素阻害剤で減少する
Ａ 無治療およびアバタセプト治療群のマウスより、CD 4 陽性Ｔ細胞を調整し RNAシークエンス解析に供した。治療群に多く発現する遺伝子より、代謝関連酵素を抽出すると、いくつかのアルデヒド脱水素酵素（ALDH）を含む、アルコール代謝に関わる遺伝子が多数見出された。 B ALDH 阻害薬であるシアナミドを、Th17 依存性皮膚炎モデルに適用したところ、アバタセプトでは阻害できなかった IL-7 R 陽性のメモリー細胞の生存阻害することがわかった。

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T 細胞のステムネスを標的とした、乾癬治療法の研究の生存と深く関わっていることが知られている。IL- 7 レ

まず、CD 28 阻害薬であるアバタセプト治療後にマウスセプター陽性細胞が、ALDH を発現することから、ALDHのリンパ組織を解析することで、Th 17 細胞には異なる性阻害薬によってこの細胞を阻害できるのではないかと考質を有する少なくとも 2 種の細胞があることを見出した。

え、古典的な ALDH 阻害薬であるシアナミドを皮膚炎モ

一つは、IL- 17 , TNF, GM-CSF といった炎症性サイトカデルに適用した。結果として、シアナミドを投与したマウインを放出し、自己組織を攻撃し皮膚炎の発症に寄与する

スでは、体内に残存する IL- 7 レセプター陽性細胞の数がが、アバタセプト治療によってほぼ完全に抑制された。一優位に減少すること、この治療は、アバタセプトと相加的方で、炎症性サイトカインは放出しないものの、アバタセに、Th 17 の活性化と生存を抑制することがわかった。以プトに全く影響を受けず分裂し、再び炎症性細胞に分化す

上の実験より、Th 17 のうち、体内で長期生存するものはる能力を持つメモリー様 Th 17 細胞が存在することがわかALDH 阻害剤で除去できることが示された。

った。Th 17 は、長期生存し炎症細胞を産生する「幹細胞様の性質（ステムネス）」を持つと言われるが、メモリー4．考察とまとめ様 Th 17 細胞が体内で残存し、炎症細胞を生み出すという、近年、自己免疫疾患には、抗サイトカイン療法や T 細胞まさに幹細胞様の性質を示すことが明らかになった（図 6）。

をターゲットとする治療が行われるが、治療不応答や再発さらに、アバタセプト抵抗性のメモリー様 Th 17 細胞がが問題となる。本研究で樹立した皮膚炎モデルは、多くのALDH 遺伝子を発現し、この阻害薬で生存抑制できるこ

自己免疫疾患の中心とされる Th 17 細胞が、体内で長期的とを示した。シアナミドは、飲酒時に服用すると肝臓の（数か月）の単位で生存し慢性皮膚炎を起こすという新規ALDH を阻害することで、二日酔いの症状を増強するため、のモデルであり、自己免疫疾患の治療法探索には最適であアルコール依存症の患者が飲酒習慣から脱却するためのると考える。

「嫌酒薬」として数十年の古くから用いられる。本研究では、

図 6 本研究のまとめ
自己反応性 Th17 の中には CD 28 依存性に活性化する炎症性 Th17 と、CD 28 に依存せず生存するメモリー様 Th17 があることがわかった。さらに後者の細胞は、ALDH 依存性に生存すること、この阻害薬で生存抑制をできることが明らかになった。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

シアナミドが Th 17 に作用してこの生存を阻害するという（引用文献）

意外な効果を見出した。ALDH 阻害薬は健常な組織にも

1） Hayter, SM, Cook, MC. Updated assessment of

毒性を持つため、直ちに免疫治療薬として臨床応用するこ

the prevalence, spectrum and case definition ofとは難しいと考えられる。しかしながら今後、免疫抑制剤

autoimmune disease. Autoimmun Rev 1 1, 7 5 4-7 6 5,

治療に抵抗性のメモリー様 Th 17 細胞をさらに深く調べる

2012.

事で、ALDH に準ずる弱点を見つけ制御することができ

2） Muranski P, Borman ZA, Kerkar SP, Klebanoff CA,

れば自己免疫疾患の根治につなげることができると考えら

Ji Y, Sanchez-Perez L, Sukumar M, Reger RN, Yuれる。

Z, Kern SJ, Roychoudhuri R, Ferreyra GA, Shen W,Durum SK, Feigenbaum L, Palmer DC, Antony PA,

謝辞

Chan CC, Laurence A, Danner RL, Gattinoni L, Restifo

本研究を行うにあたって、多くの実験を補助していただ
いた慶應医学部微生物学免疫学教室技術員 時藤夕紀子さNP. Th17 cells are long lived and retain a stem cell-likemolecular signature. Immunity. 35: 972-85, 2011.

ん、修士課程学生の早渕帆高さん、RNA シークエンスの3） Tokifuji Y, Hayabuchi H, Sasaki T, Hara-Chikuma

データ解析をご指導いただいた慶應医学部百寿総合セン

M, Hirota K, Takahashi H, Amagai M, Yoshimura A,

ター 佐々木貴史先生、マウスをご提供いただきました慶Chikuma S. Targeting abatacept-resistant T-helper-1 7

應医学部皮膚科学教室 天谷雅行先生および高橋勇人先生、

cells by aldehyde dehydrogenase inhibition. iScience

実験の遂行および論文執筆にあたり多くの助言や討論を27, 108646, 2024.

いただいた、慶應医学部薬理学教室 竹馬真理子先生およ4） Takahashi H, Kouno M, Nagao K, Wada N, Hata T,び京都大学 廣田圭司先生に深く感謝いたします。最後に、Nishimoto S, Iwakura Y, Yoshimura A, Yamada T,研究の場を与えていただいた吉村昭彦教授には、いつも暖Kuwana M, Fujii H, Koyasu S, Amagai M. Desmoglein

かく細やかなご指導をいただき深く感謝いたします。

3-specific CD4+ T cells induce pemphigus vulgaris andinterface dermatitis in mice. J Clin Invest. 121: 3677-88,
2011.

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