新規枝作り酵素による高保湿剤としての多分岐グルカンの合成と構造・物性解析
東京工業大学生命理工学院

八波利恵

In recent years, the development of environmentally friendly materials with reduced environmental impact has beenpromoted in various fields in order to realize a sustainable society. Among them, materials synthesized by microbial enzymes
are attracting attention as environmentally friendly materials because they do not require organic solvents during synthesis
and are decomposed by microorganisms without causing environmental pollution.
Haloarcula japonica, a halophilic archaeon that requires high concentrations of salt, harbors the malA gene encoding
an enzyme of the α-amylase family in its genome, and recombinant MalA expressed in H. japonica efficiently catalyzes thetransfer of short glucose chains and produces highly water-soluble hyperbranched glucan This property has been shown toproduce a highly water-soluble hyperbranched glucan. This property makes the synthesized glucan potentially applicable asa high-performance moisturizer.
In this study, recombinant MalA was prepared to gain insight into the substrate specificity of MalA, and highmolecular weight glucans were synthesized utilizing various maltodextrins and polysaccharides to analyze their chain
length distribution. Furthermore, the solubility of glucans synthesized with MalA was evaluated under different NaClconcentrations. The results revealed that MalA mainly synthesizes highly branched glucans from maltodextrins of degree ofpolymerization (DP) 3 or higher and shows a unique ability to produce branched glucans from very short oligosaccharides
such as G3. Furthermore, the glucan synthesized with MalA showed higher solubility than those synthesized without
enzymatic treatment, suggesting its potential as a high-performance moisturizer.
The synthesized glucans have potential applications in the cosmetics industry as an environmentally friendly alternative
to palm oil and squalene, addressing concerns regarding deforestation, human rights issues, and species extinction. Further
studies on the structure and properties of the synthesized branched glucan will facilitate its use as a high-performancemoisturizer in cosmetic formulations.

１．緒て合成した高重合度グルカンは多くの分岐をもち，その分言

岐鎖は非常に短いことが推測された（図 1）。またこの構造

近年、持続可能な社会の実現のために、環境負荷低減型の素材開発が様々な分野で行われている。中でも、微生物から、本グルカンは極めて水溶性が高く高保湿剤として利用できると考えられた。

酵素によって合成される素材は、「合成の際に有機溶媒をそこで本研究では、まず MalA に関する知見を得るた使用しない」、「河川等に排出されても微生物が分解でき、め、組換え MalA を調製し、基質特異性の解析を行うこ環境汚染とならない」という 2 つの利点から環境に非常にととした。またこのグルカンは、非常に短い分岐鎖を数多優しい素材として注目されている。

く有する多分岐グルカンであることが推測されたが、そのHaloarcula japonica は、生育に高濃度の塩を要求する高1）構造の詳細は調べられていない。そこで、各種マルトオリ度好塩性古細菌である 。また、H. japonica のゲノム上ゴ糖および多糖に組換え MalA を作用させて高重合度グルに α- アミラーゼファミリー酵素をコードする malA 遺伝子

カンを合成し、その分岐鎖解析および水に対する溶解性をが見出され、発現型プラスミド pJMalA を用いた親株 H.

評価した。なお、MalA との比較として、Rhodothermus

japonica における組換え MalA の発現と性質検討が行われobamensis 由来枝作り酵素 Branchzyme を用い、基質特異た。その結果、MalA は非常に短いグルコース鎖を極めて性の解析および Branchzyme を作用させて合成した高重合

効率よく α- 1 , 6 転移する新規な好塩性枝作り酵素であるこ度グルカンの解析も行った。。とがわかった

2 , 3）。薄層クロマトグラフィー（TLC）を用い

２．方た予備的解析の結果、オリゴ糖に組換え MalA を作用させ法

2 . 1 . 組換え MalA の発現および精製
Synthesis, structure and property analysis of hyperbranched glucan as a highmoisturizing agent by a novel branching enzyme
Rie Yatsunami
Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of TechnologyMalA 発現型プラスミド pOMJ 2 を H. japonica に導入し、形質転換体を取得した。取得した形質転換体を 37 ℃で 7日間培養し、可溶性画分を取得した。可溶性画分をニッケ
ル固定化担体を用いた FPLC に供した。溶出した試料を透析し、SDS-PAGE を行った。

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新規枝作り酵素による高保湿剤としての多分岐グルカンの合成と構造・物性解析

図 1 MalA が合成する新規多分岐グルカンの構造模式図
新規多分岐グルカンは、多くの分岐をもち、その分子鎖は非常に短い。

2 . 2 . 組換え MalA および Branchzyme の基質
特異性の評価衝 液（pH 6 . 5）8 . 0 µl に、2 . 0 % 各 種 基 質 溶 液 10 µl お よ び

基質には、マルトオリゴ糖としてグルコース（G 1）、マ50 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7 . 5）2 . 0 µl を加え、37 ℃にルトース（G 2）、マルトトリオース（G 3）、マルトテトラ

おいて 24 時間反応を行った。反応産物は、TLC によりオース（G 4）を、多糖として可溶性デンプン、アミロース、解析した。すなわち試料を、TLC プレートにスポットし、アミロペクチンおよびグリコーゲンを用いた。可溶性基質

展開溶媒として 1 - ブタノール / 酢酸 / 水（混合比 2 : 2 : 1、（マルトオリゴ糖、可溶性デンプン、アミロペクチンおよv/v/v）を使用して室温で展開した。展開後の TLC プレーびグリコーゲン）の調製は以下のように行った。マイクロトを風乾し、発色液に浸潤した後、加熱して発色させた。

チューブに 20 mg の基質および 1 . 0 ml の滅菌イオン交換

発色液には 6 . 5 m MN- 1 - ナフチルエチレンジアミン二塩

水を加え、設定温度 100 ℃で加熱溶解した。溶解後、遠心酸塩および 3 % 硫酸を含むメタノール溶液を使用した 4）。

MalA 精製標品（60 ISU/ml）あるいは 2 . 0 M NaCl を含む分離により回収した上清を、2 . 0 %（w/v）基質溶液としてスに 2 . 0 M NaOH を加え、適宜撹拌しながら溶解後、等

2 . 3 . 組換え MalA および Branchzyme による高重合度グルカンの合成

量の 2 . 0 M HCl で中和し、2 . 0 % 溶液を調製した。MalA

2. 2. 1. MalAによる高重合度グルカンの合成用いた。不溶性基質であるアミロースの調製は、アミローの活性は、ヨウ素デンプン反応を用いた加水分解活性に

4 . 5 M NaCl を 含 む 200 mM ク エ ン 酸 緩 衝 液（pH 6 . 5）より算出した。2 . 0 M NaCl を含む 50 mM Tris-HCl 緩衝

1 . 6 ml に、5 . 0 % 各種基質溶液（G 3、G 7、アミロペクチン液（pH 7 . 5）40 µl に、5 . 0 µl の 2 . 0 % 可溶性デンプ ン お よおよびグリコーゲン溶液）2 . 0 ml および MalA 精製標品（60

び 5 . 0 µl の酵素精製標品を加え、37 ℃において 15 分間反ISU/ml）あるいは 2 . 0 M NaCl を含む 50 mM Tris-HCl 緩応を行った。反応液に 150 µl のヨウ素試薬および 1 . 1 ml の衝液（pH 7 . 5）400 µl をポリエチレンチューブに加え、37イオン交換水を加え、波長 660 nm の吸光度を用いて測定℃において 96 時間反応を行った。ただし、G 3 に関してはした。上述の測定条件において、1 分間に A 660 を 0 . 1 減

合成効率の低さを考慮して、4 倍スケールで反応を行った。

少させるのに必要な酵素量を 1 ヨウ素デンプンユニット

反応終了後、TLC 解析用に少量採取し、残りの反応液か（ISU）と定義し、酵素活性を算出した。比活性（ISU/mg）

ら高重合度糖転移産物の抽出を行った。

は酵素精製標品中に含まれるタンパク質濃度より見積った。

2. 2. 2. Branchzymeによる高重合度グルカンの合成

Branchzym は 100 mM Tris-HCl 緩 衝 液（pH 7 . 2）40 µl に、

100 mM Tris-HCl（pH 7 . 2）1 . 6 ml に、5 . 0 % 各種基質溶

5 . 0 µl の 2 . 0 % 可溶性デンプンおよび 5 . 0 µl の酵素精製標液（G 3、G 7、アミロペクチンおよびグリコーゲン溶液）

品を加え、70 ℃において 15 分間反応を行った。組換え

2 . 0 ml および Branchzyme 精製標品（60 ISU/ml）あるい

MalA と同様に 1 分間に A 660 を 0 . 1 減少させるのに必要なは 100 mM Tris-HCl（pH 7 . 2）400 µl をポリエチレンチュ

酵素量を 1 ヨウ素デンプンユニット（ISU）と定義し、酵ーブに加え、70 ℃において 96 時間反応を行った。反応終素活性を算出した。

了後、TLC 解析用に少量採取し、残りの反応液から高重MalA による基質特異性の解析は、以下のようにして行合度糖転移産物の抽出を行った。

った。すなわち、4 . 5 M NaCl を含む 200 mM クエン酸緩− 67 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

2 . 4 . 組換え MalA および Branchzyme が合成した高重合度グルカンの抽出が認められた。そこで、可溶性画分をニッケル固定化担上述した糖転移反応溶液を遠心分離し、不溶性物質を除SDS-PAGE に供し、CBB 染色を行ったところ、単一バンいた上清をマイクロチューブに分注し、15 分間（5 分間× 3、ドのタンパク質が検出され、MalA が精製されたことが確

適宜激しく撹拌）加熱して、反応溶液中に存在する MalA認された。

体を用いた FPLC に供し、精製を行った。溶出後の試料を（あるいは Branchzyme）を失活させた。遠心分離により変性した MalA（あるいは Branchzyme）などの不溶性物質を除き、上清を得た。2 倍量の冷 100 % エタノールを加え、3 . 2 . 組換え MalA および Branchzyme の基質特異性の解析

ドライアイス上で 20 分静置し、遠心により沈殿を回収しマルトオリゴ糖を基質として組換え MalA の基質特異性た。沈殿物を冷 70 %エタノールおよび冷アセトンで洗浄し、を解析した。その結果、組換え MalA は G 1、G 2 には作用再度遠心した後、遠心濃縮機により減圧乾燥した。この沈せず、G 3 以上のマルトオリゴ糖から、もとの大きさ以上殿に対して 0 . 4 M NaCl 含有滅菌イオン交換水 500 µl を加のオリゴ糖および多分岐グルカンを合成することが明らか

えて加熱溶解後、遠心分離し、不溶物を除去した。この操となった（図 2）。G 3 という非常に短いオリゴ糖から多分作を繰り返し、上清を凍結乾燥したものを高重合度グルカ

岐グルカンを合成する酵素はこれまで例がなく、全く新しン抽出物とした。また、高重合度グルカン抽出物を滅菌イ

い多分岐グルカンを合成している可能性が示唆された。まオン交換水に溶解した溶液を高重合度グルカン溶液とした。

た、各種多糖（可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンおよびグリコーゲン）を基質として用いたところ、い2 . 5 . 枝切り酵素による高重合度グルカンの分解と分解産物の解析

ずれの場合も多分岐グルカンが合成することがわかった。

2 . 0 % 各高重合度グルカン溶液 4 . 0 µl に、滅菌イオン交用させたのちの産物を TLC によって解析した。その結果、

換水 4 . 0 µl およびそれぞれ 10 mU/µl となるよう調製したいずれの基質を用いた場合も加水分解産物および高重合イソアミラーゼ、プルラナーゼ、オリゴ - 1 , 6 - グリコシダ度グルカンは検出されなかった。これより、Branchzymeーゼ混合酵素液（以降、枝切り酵素ミックスと呼ぶ）2 . 0 µl

は G 3 および G 7 に作用しないと考えられた。これに対し、を加え、37 ℃において 14 時間程反応を行った。反応終了後、アミロペクチンあるいはグリコーゲンを基質に用いた場合、TLC 解析を行った。

いずれも加水分解産物と高重合度グルカンが検出され、糖一方、G 3 および G 7 を基質に用いて、Branchzyme を作転移反応の進行が確認された。

2 . 6 . 高重合度グルカンの各塩濃度下における溶解性評価
G 7、グリコーゲンおよびアミロペクチンに組換え MalA

3 . 3 . 各種マルトオリゴ糖および多糖に酵素を作用させて合成した高重合度グルカンの解析を作用させて合成した高重合度グルカン［以後、それぞれG 3 あるいは G 7 に MalA を作用させて合成した高重合度

G 7（MalA+）、グリコーゲン（MalA+）およびアミロペクグルカンに枝切りミックスを加え、その分岐鎖を調べた［図チン（MalA+）と呼ぶ］に 0-4.0 M NaCl溶液 100µlを加えた。

3（a）］。その結果、G 3 あるいは G 7 に MalA を作用させて37 ˚C あるいは 100 ˚C のもと、15 分間静置した（適宜激し合成した高重合度グルカンは、G 1 を含む非常に短い分岐く撹拌）。その後、遠心分離により上清を回収した。上清鎖を数多く有する多分岐グルカンであることが示唆された。

を滅菌イオン交換水で 500 倍に希釈したのち、フェノー

また、主な分岐鎖は G 2 -G 4 と推測された。次に、基質でを用いて試料に含まれるグルカン量を測定しあるアミロペクチンに対し、枝切り酵素ミックスで処理した。溶解率（%）は、100 ˚C で溶解したグルカン量（G 100 ˚C）てその分岐鎖を調べたところ、G 3 以上の分岐鎖を確認でと 37 ˚C で溶解したグルカン量（G 37 ˚C）の割合を以下の式にきた。しかしながら、G 3 -G 4 のスポットは G 6 以上に比より算出した。

べ薄いことから、アミロペクチンには非常に短い分岐鎖は

ル硫酸法

5 , 6）少なく、G 6 より長い分岐鎖を多く有することが推察され

溶解率（％）= G 37 ˚C /G 100 ˚C × 100

た。そこで、アミロペクチンに MalA を作用させて合成し３．結果および考察た高重合度グルカンに枝切り酵素ミックスを加え、その分

3 . 1 . MalA 精製標品の取得

岐鎖を調べたところ、G 2 以上の分岐鎖を確認できた。こMalA 発現型プラスミド pOMJ 2 を導入した H. japonica

れより、アミロペクチンに MalA を作用させることで、よ形質転換体を培養後、菌体破砕後に得られた可溶性画分おり短い分岐鎖をもつグルカンを合成できることがわかった。

よび不溶性画分を SDS-PAGE に供したところ、可溶性画一方で、グリコーゲンに MalA を作用させたものと、させ分に MalA が過剰に生産されていることを示唆するバンドていないものとでは、その分岐鎖のパターンに変化はなか− 68 −

新規枝作り酵素による高保湿剤としての多分岐グルカンの合成と構造・物性解析

図 2 マルトオリゴ糖を基質とした組換え MalA による加水分解および糖転移反応産物の TLC 解析
MalA に基質を加え、2.0M NaCl 存在下、37℃で 24 時間反応後の産物をTLC に供した。多分岐グルカンを破線の丸で囲った。

図 3 マルトオリゴ糖あるいは多糖に酵素を作用させて合成した高重合度グルカンの TLC による分岐鎖解析
各基質に組換え MalA（a）あるいは Branchzyme（b）を用いて高重合度グルカンを合成したのち、枝切り後の試料を TCL に供した。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024った。これより MalA はグリコーゲンには作用しにくいこG 3 以上のマルトオリゴ糖から、もとの大きさ以上のオリとが推測された。

ゴ糖および高重合度グルカンを合成することが明らかとな同様にして、アミロペクチンあるいはグリコーゲンにった。また、各種多糖（可溶性デンプン、アミロース、アBranchzyme を作用させて合成した高重合度グルカンに枝ミロペクチンおよびグリコーゲン）を基質に用いた結果、切り酵素ミックスを加え、その分岐鎖を調べた［図 3（b）］。

可溶性デンプン、アミロース、アミロペクチンおよびグリアミロペクチンに Branchzyme を作用させて合成したグル

コーゲンを基質として用いた場合、いずれも高重合度グルカンからは、G 2 以上の分岐鎖を確認できた。一方で、グカンを合成することがわかった。G 3 という非常に短いオリコーゲンに Branchzyme を作用させたものと、させていリゴ糖から多分岐グルカンを合成する酵素はこれまで例がないものとでは、その分岐鎖のパターンに変化はなかった。

なく、全く新しい多分岐グルカンを合成している可能性

これより MalA と同様、Branchzyme はグリコーゲンにはが示唆された。各種基質に組換え MalA を作用させて合成作用しにくいことが推測された。

した高重合度グルカンの分岐鎖を解析したところ、G 3 お以上の結果より、G 3 あるいは G 7 に MalA を作用させよび G 7 に MalA を作用させて合成した高重合度グルカンて合成した高重合度グルカンが、極めて短い分岐鎖を最もは、G 1 を含む非常に短い分岐鎖を数多く有する多分岐グ多くもつことがわかった。これより、本グルカンがより高ルカンであることが示唆され、主な分岐鎖は G 2 -G 5 と推い水溶性を有すると考えられた。

測された。このような短い分岐鎖をもつグルカンは既報のBranchzyme を用いても得ることができず、MalA は極め3 . 4 . G 7 および多糖に MalA を作用させて合成した多分岐グルカンの溶解性解析て短い分岐鎖をもつ新規な多分岐グルカン合成を触媒する新規な酵素であることが示唆された。さらに、MalA が合G ７（MalA+）、グリコーゲン（MalA+）およびアミロ成したグルカンの溶解性を調べたところ、多糖に MalA をペクチン（MalA+）の 37 ℃における各 NaCl 濃度下の溶解作用させることで溶解性が高くなることが明らかとなった。

性を、溶解率を算出して評価した（図 4）。その結果、すべ

現在、様々な分野で地球環境に優しいものづくりが求めての多分岐グルカンにおいて NaCl 濃度における溶解性のられ、コスメトロジーにおいても新しい技術開発が強く望差は見られなかったものの、MalA を作用させることで溶まれている。これまで化粧品原料として使用されてきたパ解率が高くなることがわかった。このことから、MalA をーム油（植物油）は、東南アジアなどで生産されるアブラ作用させて合成した短い分岐鎖を有する多分岐グルカン

ヤシから採取されている。そのため、プランテーション開は、NaCl 濃度に関わらず高い溶解性を示すことが示唆さ発に関わる熱帯雨林の破壊・人権面などの問題が挙げられれた。また、MalA を作用させて合成したグルカンのうち、てきた。他にも化粧品用保湿剤として使用されているスク

G 7（MalA+）は、グリコーゲン（MalA+）およびアミロペアレンは、深海ザメの肝油から生産されている。しかしな

クチン（MalA+）に比べ、全ての NaCl 濃度下で最も高い

がら深海ザメが絶滅危惧種であるため、今後漁獲に規制が溶解率を示すことがわかった。

入り生産が大幅に減少すると推定されている。これらに対４．総し、本研究で合成する新規多分岐グルカンは、微生物酵素

括による合成であるため、環境破壊・人権問題・種の絶滅と本研究により、組換え MalA は G 1、G 2 には作用せず、(a)いった問題が全くない。また、本研究で合成したグルカン(b)(c)

図 4 グリコーゲン、アミロペクチンおよび G7 に組換え MalA を作用させて合成した多分岐グルカンの各 NaCl 濃度下における溶解性解析（a）および（b）はグリコーゲンおよびアミロペクチンを基質として MaA を作用させて合成した多分岐グルカンの溶解率を、（c）はグリコーゲン、アミロペクチンおよび G7 に MaA を作用させて合成した多分岐グルカンの溶解率を比較した。

− 70 −

新規枝作り酵素による高保湿剤としての多分岐グルカンの合成と構造・物性解析は高い溶解性を有することからコスメトロジー分野におけHaloarcula japonica. Biosci. Biotechnol. Biochem., 7 7,

る高保湿剤として応用が期待される。今後は、本研究にお281-288（2013）

いて合成した多分岐グルカンの構造および物性をさらに詳3） S u e d a R , Y o s h i d a K , O n o d e r a M , F u k u i T ,細に調べ、高保湿剤としての応用を検討していく予定であYatsunami, R Nakamura S. Characterization of aる。

GlgC homolog from extremely halophilic archaeon
Haloarcula japonica. Biosci. Biotechnol. Biochem., 8 5,謝辞1441‒1447（2021）

本研究の遂行にあたり，ご支援を賜りました公益財団法

4） Bounias M. N-（1-Naphthyl）ethylenediamine

人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝申し上げ

dihydrochloride as a new reagent for nanomoleます。

quantification of sugars on thin-layer plates by amathematical calibration process. Anal. Biochem., 106,

（引用文献）

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