皮膚角化細胞の老化を防ぐ脂質分子種の網羅的探索とその分子機構
慶應義塾大学薬学部

前川大志

Skin is exposed to a variety of DNA damage-inducible stimulations such as chemicals and ultraviolet rays. Theaccumulation of DNA damages causes cell senescence of keratinocytes, which causes solar keratosis and melanoma. Thosediseases not only threaten the life of patients itself but also decrease the quality of life of the patients. Thus, it is importantto uncover molecular mechanisms and signatures of keratinocyte senescence. We have previously found that knockdown ofSPOP, a substrate recognition receptor for cullin-3 (CUL3) ubiquitin ligase, in non-cancerous human keratinocyte-derived
HaCaT cells exhibited cell senescence phenotypes (e.g. upregulation of p21 mRNA) as well as dysregulation of intracellularcholesterol distributions. These results suggest the relationships between cell senescence and lipid metabolisms controlled by
the CUL3/SPOP ubiquitin ligase. In this study, we aim to characterize SPOP-knockdown HaCaT cells from the standpointof cell cycle and to measure lipid molecular species in SPOP-knockdown HaCaT cells using untargeted lipidomics by thecombination of LC-MS/MS9030 and MS-DIAL 4. We showed that SPOP knockdown drastically inhibited the translationof CDC6 and CDT1, which is essential for DNA replication licensing, leading to the upregulation of p21 mRNA and G1/S arrest (Sanada, Maekawa et al., BBRC. 2023). Our untargeted lipidomics revealed that neutral lipids were decreased inSPOP-knockdown HaCaT cells. Our results suggest a decrease of neutral lipids as a lipid signature of G1/S arrest HaCaTcells that mimic keratinocyte senescence.

１．緒

domain containing protein（BTBP）遺伝子がアノテーショ

言ンされている 1）。各 BTBP が異なる基質タンパク質と結合

皮膚は我々の内部と外界を隔てる一番外側に存在する組し、その後に修飾されるユビキチン鎖のパターン（ユビキ織であり、人体最大の組織とも言える。日常生活において、チンコード）やユビキチン化基質タンパク質の運命（分解

衣類で覆われていない皮膚の領域は恒常的に外界からのや新規機能付加）も多様であることから、CUL 3 /BTBP の多様な刺激に晒されており、化学物質や紫外線などは皮膚軸は極めて多岐にわたる生理機能を発揮できる。我々は今組織、特にケラチノサイトの DNA 損傷を引き起こす。こまでに、幾つかの BTBP に関して、機能的な基質タンパクの DNA 損傷の蓄積はケラチノサイトの加齢依存的な細胞質を同定し、それぞれの軸の血管内皮細胞、各種癌細胞に老化に繋がり、日光角化症などの原因となる。日光角化症おける機能を解明してきた（図 1）。

は皮膚癌の発症誘発だけでなく、シミやシワの主因となり、SPOP（speckle-type POZ protein）は、BTBP の一つで患者の容姿への影響（生活の質の低下）が大きく懸念されあり前立腺癌や子宮体癌などにおいて基質結合領域に非常る。従って、ケラチノサイトの細胞老化の分子機構やそのに多くのアミノ酸変異が同定されている極めて重要な癌関

分子マーカーを同定することができれば、当該分子基盤に連タンパク質であり、その腫瘍増殖における機能解析が進対する介入方法の開発に繋がり、将来的には皮膚の老化進んでいる 2）。一方で、ケラチノサイトに代表される癌化し行抑制剤の開発に資する。即ち、皮膚癌などの疾患予防、ていない細胞における機能は殆ど不明なままである。我々

容姿維持に伴う生活の質の向上のために、老化進行抑制剤は今までに、SPOP をヒト不死化ケラチノサイト HaCaTの開発標的となるケラチノサイトの細胞老化の新しい分子

cells において発現抑制すると細胞増殖が著しく阻害され、機構の導出が必要である。

p 21 の mRNA レベルが増加することを明らかにしている。

Cullin- 3（CUL 3）ユビキチンリガーゼは、基質認識受容この表現型は細胞老化の表現型に酷似しており、SPOP 発体を介して標的基質タンパク質をユビキチン化する E 3 複

現抑制 HaCaT cells が老化したケラチノサイトをミミック合体である。CUL 3 ユビキチンリガーゼの基質認識受容体していると示唆される。また興味深いことに、SPOP 発現は BTB domain を有しており、ヒトには 183 種類の BTB

抑制 HaCaT cells における細胞内生体膜コレステロール局在を D 4 H プローブ 3）により観察した結果、その局在や蛍光強度の減少を見出した（前川 , 未発表）
。D 4 H の生体膜

Comprehensive screen of lipid species
that prevent keratinocyte cell senescence
Masashi Maekawa
Department of Pharmacy, Keio University

コレステロールへの結合性はコレステロールの量だけでなく、周辺の脂質環境により影響を受ける 4）。即ち、SPOP発現抑制 HaCaT cells ではコレステロールに加え、リン脂質や中性脂質などの脂質代謝全体が変動している可能性が強く示唆される。以上より、SPOP を介入点とすることで、− 145 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図1

我々が明らかにしてきた CUL 3 /BTBP/ 基質タンパク質軸の多様な生理機能

細胞老化と脂質代謝変動の因果関係を探ることができると

3．結着想した。そこで本研究では、1）SPOP 発現抑制 HaCaT
cells の性状を cell cycle の観点から解き明かし、2）SPOP発現抑制 HaCaT cells の脂質代謝変動をノンターゲットリピドミクスによりノンバイアスに捉えることを目的とした。

2．方果

3 . 1．SPOP は HaCaT cells において DNA 複製
ライセンス因子 CDC 6 と CDT 1 の翻訳を正に制御する
SPOP を 発 現 抑 制 し た HaCaT cells の 性 状 の 解 析 を 進法めた結果、p 21 の mRNA レベルの増加に加えて（図 2 A）、2 . 1．SPOP 発現抑制 HaCaT cells の性状解析

Edu の新規合成された DNA への取り込みが著しく阻害さ

SPOP に対し、配列の異なる 2 種類の siRNA を RNAimaxれることが分かった（図 2 B）。これらの結果は SPOP のにより、HaCaT cells にそれぞれトランスフェクションし、発現抑制により、p 21 が転写レベルで発現上昇し、G 1 /72 時間後に細胞を定量 PCR、ウェスタンブロット法に供S arrest が 生 じ て い る 可 能 性 を 強 く 示 唆 す る も の で あし、細胞周期や DNA 複製に関与する遺伝子やタンパク質る。次にこの分子機構を調べるため、DNA 合成の初期の量を検討した。DNA 合成能については、チミジンアナ段階に関与する DNA 複製ライセンス因子 CDC 6、CDT 1ログ（Edu）の取り込みにより評価した。Cdt 1 と Cdc 6 のと、DNA 2 本鎖をほどき、DNA polymerase と DNA との翻訳活性については、シクロヘキシミド（CHX）の pulse-結合を可能にする MCM complex（MCM 2 - 7）の発現をウ

chase 実験と L-homopropargylglycine（HPG）のクリックェスタンブロット法により調べた。その結果、CDC 6 とケミストリーにより解析した。

CDT 1 のタンパク質が SPOP の発現抑制により顕著に減少し、MCM complex のタンパク質発現には影響は見られな

2 . 2．ノンターゲットリピドミクス

かった（図 2 C）
。これら分子群の mRNA レベルを調べた

SPOP お よ び、CDC 6、CDT 1 の 下 流 で 代 謝 制 御 を 受

結果、SPOP の発現抑制により有意に減少する遺伝子は存

け る 脂 質 分 子 種 を 網 羅 的 に 捉 え る た め LC/Q-TOFMS在しなかった。また、CDC 6 や CDT 1 の発現抑制によっ（Shimadzu LC-MS 030）を 用 い た ノ ン タ ー ゲ ッ ト リ ピても、p 21 の mRNA 発現の増加が認められた。以上の結ドミクスを行った。具体的には、配列の異なる 2 種類の果 か ら、SPOP 発 現 抑 制 HaCaT cells で は、DNA 複 製 ラ

SPOP、CDC 6、CDT 1 に対する siRNA を RNAimax により、イセンス因子 CDC 6、CDT 1 の翻訳が阻害されることで、HaCaT cells にそれぞれトランスフェクションし、72 時間

p 21 の発現が上昇し、G 1 /S arrest が生じ、細胞老化に似後に細胞を一層抽出後、ノンターゲットリピドミクスに供た表現型を示していることが示唆された。更に、翻訳阻害

5）

5）

した 。データ解析は MS-DIAL 4 software を用いた 。

剤であるシクロヘキシミドを一定時間処理した後、wash− 146 −皮膚角化細胞の老化を防ぐ脂質分子種の網羅的探索とその分子機構

図 2 SPOP の発現抑制により、p 21 mRNAレベルの上昇（A)、DNA 新輝合成の抑制（B）、CDT 1とCDC 6のタンパク質レベルの減少（C）、翻訳阻害（D、E）が認められる。細胞は全て HaCaT cells。Figures werereproduced from Sanada et al., BBRC. 2023 .

out して、その後のタンパク質の新規合成を調べた結果、動を確認した。以上より、G 1 /S arrest を伴う細胞老化にSPOP の発現抑制により CDC 6 と CDT 1 のタンパク質新規おいて、細胞内では中性脂質の量が減少することが示唆さ合成が著しく阻害された（図 2 D）
。同様の結果は、クリッれた（大谷 , 前川 , 未発表）
。中性脂質の生合成関連遺伝子

クケミストリーが可能なアミノ酸アナログ HPG でも得らの mRNA レベルには顕著な上昇が見られていなかったこれた（図 2 E）
。以上より、SPOP は HaCaT cells において、とから、中性脂質の分解が亢進していると考えられた。

DNA 複製ライセンス因子である CDC 6 と CDT 1 の翻訳を4．考正に制御していることが明らかになった 6）。

察

SPOP は前立腺癌や子宮体癌の患者において、高い頻度

3 . 2．SPOP 発現抑制 HaCaT cells では中性脂質が減少する

でアミノ酸変異が見つかってきたことから、癌細胞におG 1 /S arrest を 起 こ し 細 胞 老 化 に 似 た 表 現 型 を 示 す

型 SPOP を発現する非癌細胞である HaCaT cells において、SPOP 発現抑制 HaCaT cells をノンターゲットリピドミク

SPOP の DNA 複製ライセンス因子の翻訳制御因子としてスに供した結果、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファの機能を初めて明らかにした 6）。興味深いことに、CDC 6、チジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルセリン

CDT 1 の mRNA の 5’ -UTR 領域は非常に短く、且つ G/C（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）に代表される主rich な領域を有する。これらの配列を認識する特異的な翻要リン脂質の量に大きな変化は見られなかった。一方で興訳関連タンパク質が SPOP の標的ユビキチン化基質タンパ

味深いことに、SPOP 発現抑制により、中性脂質の量が減ク質である可能性が考えられる。今後、SPOP 結合タンパ少していた。SPOP 発現抑制時と同様に、G 1 /S arrest をク質の網羅的解析を進めることで、当該ユビキチン化基質誘導する CDC 6、CDT 1 の発現抑制の際にも同様の脂質変タンパク質の同定が期待される。

ける機能解析を中心に展開されてきた。本研究では野生− 147 −コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

SPOP を発現抑制し、細胞老化をミミックした HaCaTで細胞老化を自在に制御することが期待される。

cells の脂質代謝解析より、G 1 /S arrest により中性脂質の本研究は愛媛大学プロテオサイエンスセンター・細胞増減少を見出した。また、遺伝子発現変動から中性脂質の分殖腫瘍制御部門・東山繁樹先生の研究室に在籍していた際解が進んでいる可能性が示唆された。SPOP などを発現抑に開始した研究です。暖かくも厳しくご指導いただきまし

制しない状態で、強制的に中性脂質の分解を誘導（リパーた同部門の東山繁樹先生、実験サポートをしてくださっゼの強制発現など）することで、G 1 /S arrest や細胞老化た長生真未 先生、SPOP 発現抑制 HaCaT cells の性状解析の表現型が促進するか検証することで、当該脂質代謝と細を共に進めてくれた愛媛大学医学部附属病院 形成外科 眞

胞老化の因果関係に迫ることが可能である。中性脂質が細田紗代子先生、中岡啓喜先生、愛媛大学医学部附属病院

胞老化を防ぐ分子である可能性を今後、更に詳細に検討す

皮膚科 佐山浩二先生、藤澤康弘先生に感謝申し上げます。

ることが必要である。細胞周期が進むプロセスにおいて、また、ノンターゲットリピドミクス解析は現所属の慶應義各チェックポイントが存在するが、その基準の一つに細胞塾大学薬学部 有田誠先生の研究室で進めたものです。ご内脂質の質と量があり、細胞内脂質変動が細胞周期の状態

指導とご支援をいただきました有田誠先生、実際に実験をや細胞老化を評価できる新たなシグナチュアとなる可能性

進めてくれた大谷航平君、MS-DIAL 4 の解析をご指導頂を秘めている。

きました東京農工大学 津川裕司先生、理化学研究所 内野

5．総春希先生に御礼申し上げます。最後に本研究の推進におい括て多大な援助を賜りました公益財団法人コーセーコスメト

本研究により、ケラチノサイトの細胞老化をミミック

ロジー研究財団の関係者の皆様に厚く御礼申し上げます。

した G 1 /S arrest HaCaT cells の脂質シグナチュアとして中性脂質の減少を明らかにした。今後は、SPOP の下流でユビキチン化を受け、中性脂質の代謝を担う責任基質タンパク質を同定する必要がある。更に当該基質タンパク（引用文献）
1） Petroski and Deshaies., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6,9-20（2005）．

質に介入した際の細胞老化への影響を調べる必要もある。

2） Zhang et al., Cancer Res. 83（4）, 489-499（2023）．

HaCaT cells は不死化された細胞であるので、今後はより

3） Maekawa and Fairn. J. Cell Sci. 128（7）, 1422-1433

生理的な細胞老化と脂質代謝の関連を調べる。具体的には、（2015）．

初代培養系ケラチノサイトを継代老化させて、時間依存的

4） Ercan et al., EMBO J. 40（6）, e106524（2021）．

な老化に伴う脂質代謝をノンターゲット解析によって調べ、

5） Tsugawa et al., Nat. Biotechnol. 38（19）, 1159-1163

本研究で得られた脂質代謝変動と比較し、細胞老化と密接（2020）．に関連する脂質代謝を同定する。近年、高度不飽和脂肪酸

6） Sanada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 651,が酸化されたオキシリピンの一種に細胞老化を促進させる機能が報告されている

7 , 8）。今後、細胞老化に伴い変動する脂質代謝変動の全貌をノンターゲットリピドミクスによ30-38（2023）．
7） Wiley et al., Cell Metab. 33（6）, 1124-1136（2021）．
8） Liu et al., Cell Metab. 35（4）, 667-684（2023）．

り高深度で計測し、明らかにし、当該経路に介入すること− 148 −