レーザーアブレーションを用いた希土類添加ナノバイオ蛍光プローブ作製大阪大学 基礎工学研究科
助教 新岡宏彦（平成 25 年度奨励研究助成 AF-2013217）
キーワード：細胞イメージング、蛍光プローブ、レーザーアブレーション

１．研究の目的と背景
近年の蛍光顕微鏡技術の進歩は凄まじく、2 光子顕微鏡、超解像顕微鏡、一分子イメージング等に代表されるよう、生きた試料から生体分子や細胞の情報を引き出してきた。
蛍光プローブについても、蛍光蛋白質、量子ドット、金属ナノクラスター等枚挙に暇が無く、多様化し、様々な現象が見えるようになってきている。しかしながら、これらプローブの殆どは可視光を使った計測に限定される。そのため、生体への透過性が低く、生体深部イメージングには適さなかった。
近赤外光は生体の窓と呼ばれる波長域に属し、水や生体分子によって引き起こされる光散乱や 吸収の影響が低く、

図 2 三種の蛍光体それぞれの近赤外蛍光体の発光スペク
トル (980 nm 励起)

生体に対する透過性が非常に高い1),2)。また、励起光によって発生する自家蛍光の影響や光毒性も少ない(図 1)。私のグループではこれまでに、酸化イットリウム(Y2O3)に希２．実験方法
2.1蛍光体の合成

土類イオンを導入した 3 種の希土類蛍光発光プローブ

蛍光体の作製にはゾルゲル法を用いた。ゾルゲル法は原料

Y2O3:Tm,Yb、Y2O3:Ho,Yb、Y2O3:Er,Yb(以下、蛍光体)の合成の入った溶液(ゾル)を高温で熱処理し、水分を蒸発させるを行なって来た経緯がある。980 nm の近赤外光励起によことでゲルとした後、さらに高温で熱処理することによりりそれぞれ 800 nm、1200 nm、1550 nm 付近で発光するこ酸化物を得る方法である。まず始めに、0.264 g のグルタとを確認した(図 2)。

ミン酸と希土類硝酸塩をアルミナるつぼ中で 15 ml の超純それぞれの蛍光体はゾルゲル法によって合成を行なっ水に溶解させた。このとき、希土類硝酸塩中の希土類元素たが、粒径が数 µm 程度と大きく細胞染色には不向きであが 合 計 0.09 mol と な る よ う に 計 量 し た ( 例 え ばった。特に、細胞のエンドサイトーシス(食作用)を用いた

Y2O3:Tm(0.2%),Yb(10%)を作製する場合、Y:Tm:Yb の mol 比細胞への蛍光体導入では、粒径はおよそ 100 nm 以下であが 189.8:0.2:10 となるようにする。リチウムを加えるとることが望ましい。従って本研究では、粒径 100 nm 以下

きも同様であり、リチウム硝酸塩を用いる)。80℃で 1 時の蛍光体作製を目的とし、液相レーザーアブレーション

間加熱し、希土類硝酸塩とグルタミン酸を溶解した。その(Liquid-phase Laser Ablation (LLA))法による蛍光体の後、120℃ 2 時間で溶液をゲル化させ、るつぼを電気炉へ微細化を行なった。さらに、得られた蛍光体を用いて培養移し、900℃で 3 時間大気焼成させることにより、蛍光体細胞の近赤外イメージングを行なった。の粉末を得た。
2.2

レーザーアブレーションによる蛍光体の微細化蛍光体微細化のために、LLA 法を用いた。LLA 法は高強度のパルスレーザーを集光した際に生じるプラズマや衝撃波を用い、液中ナノ粒子の微細化/分散化を行なう手法である3)。図 3 はその光学系である。光源として、ナノ秒
Nd:YAG レ ー ザ ー ( 繰 り 返 し 周 波 数 10 Hz, New wave
research, Tempest)の 2 倍波を、ペランブロッカプリズムを用いて選択し、単レンズ(F=100 mm)により蛍光体試料へ集光した。このとき、蛍光体試料は超純水中に分散させ、
図 1 近赤外光による生体深部イメージング

スターラーで撹拌しながらレーザーを集光した。

蛍光強度の増強を試みた。
各近赤外蛍光体粉末をゾルゲル法によって作製した後、Nd:YAG Laser

粉末を圧縮することでペレットを作製した。励起には 980nm レーザー(IRM980TR-500, Laser Century)を集光照射した。レーザー強度は 100 mW とした。Y2O3:Tm,Yb の場合はLi+濃度 10 mol%で 6.5 倍、Y2O3:Ho,Yb の場合は Li+濃度 10mol%で 8.6 倍、Y2O3:Er,Yb の場合は Li+濃度 20 mol%で 1.6倍の発光増強が確認された(図 5)。

ペランブロッカプリズム

図32.3レンズ

試料溶液

レーザーアブレーション光学系
近赤外蛍光顕微鏡観察

近赤外光励起可能なレーザー走査顕微鏡は市販されていないため、図 4 のような顕微鏡を作製した。励起光源として波長 980 nm のレーザー(IRM980TR-500, Laser Century)を用いた。励起光は光電子増倍管(PMT)直前のバンドパスフィルターによってカットされ、発光のみが光電子増倍管へ導かれる。光電子増倍管(H7844, 浜松ホトニクス)により Y2O3:Tm,Yb 蛍光体からの 800nm 付近の近赤外発光検出を行なった。深部イメージング実験ではヒト皮膚と光散乱特性が同様である生体模倣材料として 2%イントラリピッ
ド(2%IL)を用いた4)。図 4 に厚さ 0.5 mm の 2%IL の写真を示す。0.5 mm 厚で既に可視光が殆ど透過しないことが分かる。2%IL の厚さはシリコンゴムの厚さを変えることにより調整した。

図 4 近赤外顕微鏡光学系。左上の写真は、試料を上方から観察したもの。

３．研究成果3.1

高輝度蛍光体の作製

生体の奥深くの細胞・組織をイメージングするためには、
発 光 強 度 の 高 い 蛍 光 体 が 必 要 で あ る 。 Y2O3:Tm,Yb 、
Y2O3:Ho,Yb、Y2O3:Er,Yb に Li+をドープすることで、近赤外図 5 各 Li+濃度における Y2O3 蛍光体の近赤外蛍光スペクト
ル。Li+濃度 0 mol%時の近赤外蛍光強度を 1 として規格化した。それぞれ、(a) Y2O3:Tm,Yb、 (b) Y2O3:Ho,Yb、(c)Y2O3:Er,Yb である。

3.2

微細化した蛍光体の粒径分布

子溶液を混ぜ、24 時間培養を行なった後 4%パラホルムア

LLA 処理により微小蛍光体の作製および分散化を行なっルデヒド固定し、試料とした。2%IL の厚さをそれぞれ、0、た。蛍光体として、ゾルゲル法で作製した

0.5、1、1.5 mm に調整し、計測を行なった。

Y2O3:Tm(0.2%),Yb(2%),Li(10%)を用いた。レーザーエネル

実験結果を図 8 に示す。2% IL の厚さが 1.5 mm の場合

ギーは 10 mJ/pulse、処理時間は 2 時間であった。また、でも近赤外蛍光体からの発光を検出し、イメージングに成粒子濃度は 0.5 mg/ml とし、水溶液には分散剤として功した。2% IL を用いる際は、透過像を取得する事は出来

0.1wt%の PVP を加えた。図 6 に LLA 処理前後における蛍光ないため、同じ細胞を観察することは難しく、それぞれの体の SEM 画像を示す。凝集していた蛍光体の微細化及び分蛍光像で輝点の分布が異なる。図 8 (b)-(d)より 1 細胞を散化に成功した。さらに、LLA 処理後の蛍光体試料を TEM区別可能な空間分解能があることがわかる。従って、今後、により観察し、粒径分布を計測した(図 7)。100 nm 以下の生体深部での分子イメージングや、発光波長の異なる蛍光粒子の作製に成功した。

体により細胞を染め分けることにより、組織内部の細胞分布の可視化が可能であると考える。

図 6 蛍光体の SEM 像。(a)レーザーアブレーション処理前および(b)処理後。

図 8 HeLa 細胞の透過像および近赤外蛍光像。

4. 結び
励起光と発光の波長が共に近赤外域にある蛍光体の作製を行ない、液相レーザーアブレーション処理を用いることにより粒径 100 nm 以下のナノ粒子蛍光体を得ることに成功した。さらに、得られた蛍光体を用いて細胞の染色を行ない、生体模倣材料(2%IL)を用いて 1. 5 mm 深部の近赤外細胞イメージングに成功した。
深部イメージングする手法として２光子顕微鏡が知ら
図 7 レーザーアブレーション処理後の蛍光体の TEM 像。
(a)低倍像、(b)高倍像、(c)粒径分布。
3.3

生体模倣材料を用いた近赤外深部細胞イメージング
培 養 HeLa 細 胞 に LLA 処 理 を 行 な っ た 蛍 光 体(Y2O3:Tm(0.2%),Yb(2%),Li(10%))を導入し、図 4 の顕微鏡を用いて近赤外イメージング行なった。蛍光体の導入にはエンドサイトーシス(食作用)を用いた。培養液に蛍光体粒れているが、生体透過性の低い可視光発光を検出するために 1 mm の生体深部観察が限界と言われている。今後、より生体透過性の高い波長域での発光を示す Y2O3:Ho,Yb、
Y2O3:Er,Yb のナノ粒子を用いたイメージングや、更なる高輝度化、微細化、抗体修飾による細胞染色を行い、生体深部顕微鏡イメージング手法として確立することを目指す。
また、これらの蛍光体は電子線励起によっても発光を呈す

るので、電子顕微鏡を用いたカラーイメージングへの応用

773 (2009)3) M.Kawasaki and K.Masuda, J. Phys. Chem. B, 109, 9379にも挑戦したい5),6)。

(2005)
4) A.M.De Grand, S.J.Lomnes, D.S.Lee, M.Pietrzykowski,

謝 辞

S.Ohnishi, T.G.Morgan, A.Gogbashian, R.G.Laurence

本研究の一部は、公益財団法人天田財団の平成 25 年度一and J.V.Frangioni, J. Biomed. Opt., 11, 014007

般研究開発助成によって行なわれました。ここに深く感謝(2006)の意を表明致します。

5) S.Fukushima, T.Furukawa, H.Niioka, M,Ichimiya,J.Miyake, M.Ashida, T.Araki and M.Hashimoto, Micron,

参考文献

67, 90 (2014)

1) A.M.Smith, M.C.Mancini and S.Nie, Nature Nanotech.,4, 710 (2009)2) K.Welsher,Z.Liu,

6) T.Furukawa, S.Fukushima, H.Niioka, N.Yamamoto,
J.Miyake, T.Araki and M.Hashimoto, J. Biomed. Opt.,

S.P.Sherlock,J.T.Robinson,Z.Chen, D.Daranciang and H.Dai, Nature Nanotech., 4,20, 056007 (2015)