鳥取臨床科学 1(1), 138-142, 2008

アストロサイトによるのアストロサイトによる Low density lipoprotein receptor-related protein (LRP)の発現と発現とベータアミロイドペプチドのベータアミロイドペプチドの取り込み
山田友紀 1) 加藤智子 1) 佐藤晴久 1) 田口弘康 1) 遠山育夫 1)*
1) 滋賀医科大学・分子神経科学研究センター

Clearance of amyloid ß peptide by astyrocytes exerted throughlow density lipoprotein receptor-related protein
Yuki Yamada1), Tomoko Kato1), Haruhisa Sato1), Hiroyasu Taguchi1), Ikuo Tooyama1)*
1) Molecular Neuroscience Research Center, Shiga University of Medical Science*Correspondence:kinchan@belle.shiga-med.ac.jp〒520-2192 滋賀県大津市瀬田月輪町, Seta-Tsukinowa cho, Otsu, Shiga, 520-2192
要旨
アストロサイトがアミロイドベータペプチド（Aß）を取り込んで分解することが報告されているが, その取り込み機構についてはよくわかっていない. 本研究では, マウスアストロサイトのセルラインを用いて,Aß の取り込みにおける low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) の関与について検討を行った. ア
ストロサイトにおける LRP の発現を RT-PCR 法, ウエスタンブロット法, 免疫組織化学法で検討した. 次に,アストロサイトの培養上清に蛍光標識 Aß (1-40) を投与し, 共焦点レーザー顕微鏡と蛍光顕微鏡で観察した
後, LRP 免疫蛍光染色を行い, 細胞内局在を比較した. さらに, Aß（1-40）と同時に LRP の競合的リガンドのラクトフェリンを種々の濃度で培養液中に加えた. その結果, 培養アストロサイトが LRP を発現していた.
アストロサイトに取り込まれた蛍光標識 Aß (1-40) は, LRP の存在部位とよく一致していた. Aß (1-40) の取り込みは, LRP の競合的リガンドであるラクトフェリンにより, 量依存的に阻害された. 以上の結果は, アストロサイトが LRP を介して Aß を細胞内に取り込んでいることを示唆している. 鳥取臨床科学 1(1), 138-142,
2008

Abstracts
Although it has been suggested that astrocytes can participate in the uptake and degradation of amyloid β
peptide (Aβ), the uptake mechanism remains unclear. We have previously shown that reactive astrocytes
surrounding senile plaques express α2-macroglobulin receptor/low density lipoprotein receptor-related protein(LRP). In this study, therefore, we examined the involvement of LRP in Aβ uptake by astrocytes. The
astrocytic expression of LRP was estimated with RT-PCR, Western blot and immunohistochemical techniques.
Next, we added fluorescently labeled Aβ (1-40) into cultures of mouse astrocytic lined cells. Theinternalization of Aβ was observed under a fluorescence microscope, then we conducted LRP
immunofluorescence to compare the intracellular localization of Aβ with that of LRP. Furthermore, different
concentrations of lactoferrin, a competitive ligand for LRP, was added to the cultures to visualize a138dose-dependent inhibition of Aβ uptake by lactoferrin in the cultured astrocytes. As a result, localization ofthe fluorescent Aβ incorporated into the astrocytes matched well that of the immunofluorescence for LRP.
The uptake of Aβ into the astrocytes was inhibited by lactoferrin in a dose-dependent manner. The present
results indicate LRP-mediated clearance of Aβ by astrocytes. Tottori J. Clin. Res. 1(1), 138-142, 2008
Key words: アルツハイマー病, アミロイド β タンパク, グリア細胞, ラクトフェリン, low density lipoprotein
receptor-related protein (LRP); Alzheimer’s disease, amyloid β peptide (Aβ), glial cells, lactoferrin, LRP
1. はじめにDulbecco‘s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco,最近, Aβ の異常蓄積がアルツハイマー病の根本病

UK) に 10% normal calf serum (大日本製薬)と抗生物態であるとする Aβ カスケード仮説が注目されてい質 penicillin and streptomycin を加えたものを基本培る 1). しかしながら一部の家族性アルツハイマー病

地とし, 37oC で 5% CO2 環境下で培養した.

を除くと, Aβ の質的異常は明らかではない. 従って

Aβ (1-40) および蛍光標識 Aß (1-40) は, AnaSpec

アルツハイマー病の大部分を占める孤発性アルツハ(San Jose, CA, USA)から購入した. また, 滋賀医科大

イマー病の発症には, Aβ の質的異常よりも Aβ の産学実験実習機器センターで人工合成し, 高速液体ク生から分解に至る代謝過程の変化の方が重要と考えロマトグラフィーで精製したものも用いた. 両者のられる.

間で結果に差は認められなかった. 滅菌した生理食

Wyss-Coray ら 2) は, マウスアストロサイトが Aβ塩水加 10 mM リン酸緩衝液 (-) PBS（pH 7.4）で 1を取り込んで分解することを報告した. しかしながmg/ml の濃度に溶解後, 小分けして-80oC の冷凍庫にら, アストロサイトが Aβ を取り込むメカニズムの保存した.

詳細については, 不明である. 我々は以前にアルツ

蛍 光 標 識 Aβ (1-40) は ,dimethyl sulfoxide

ハイマー病患者の剖検脳で, 老人斑を取り囲む活性(DMSO)で 1 mg/ml の濃度に溶解後, 小分けして-80化したアストロサイトが, low density lipoproteinoC の冷凍庫に保存した.

receptor-related protein（LRP）を発現していることを報告した 3). LRP はニューロンやアストロサイトの2-2. RT-PCR 法

細胞膜上, エンドゾーム, ライソゾームなどに存在

reversetranscription-polymerase

chain

reaction

し , APP を含む様々な物質と結合して取り込み, ラ(RT-PCR) 法を用いて, 培養アストロサイトの LRP

イソゾームに運んで分解する役目を担う 4, 5). こうしmRNA の発現を解析した. 60 mm 組織培養デッシュ

た LRP の機能を勘案すれば, アストロサイトにおけ(Asahi Techno Co., Tokyo) にアストロサイトを 80%る Aβ の取り込みに LRP が関与していることが推測

コンフルエントになるように, 37oC, 5% CO2 の環境される.

下で培養した. 実験直前にデッシュを PBS で 1 回洗4)

そこで本研究では, マウスのアストロサイトのセ浄を行い, 血清を除去した. 1 ml の 0.25%トリプシンルラインを用いて, LRP の発現の有無を確認した後,液（Nacalai, Osaka）を用いてアストロサイトを回収

アストロサイトの Aβ の取り込みにおける LRP の関

後 , Trizol 溶 液 を 用 い て 総 RNA を 回 収 し ,与について検討した.

SuperScriptII（Life Techmologies, USA）を用いてcDNA を作成した.

2. 方法

LRP の PCR は, upper primer を GTGCGGACT

2-1. 細胞培養

CAAGCCATCAAAAGG, lower primer を GTGCCC

マウスのアストロサイトのセルライン（ATCC;ATCTTCTCTGACACCTGA とし, denature を95oC, 30

CRL-2541）を用いた. 培養液は, 4 mM L-glutamine,秒, annealing を 95oC, 30 秒, extension を 72oC, 60 秒の1.5 g/L sodium bicarbonate, 4.5 g/L glucose を添加した

条件で, 35 サイクル増幅した. PCR 産物は, 2%のアガ139