新規アレルギー反応制御分子 Ly6G による皮膚ホメオスタシス維持機構の解明
金沢大学医薬保健研究域薬学系

鈴木亮

The role of mast cells (MCs) in the development of allergic diseases is pivotal, with their activation triggered byallergens leading to degranulation and the release of inflammatory mediators, such as histamine. These mediators
not only induce allergic diseases but also elevate vascular permeability, attracting various immune cells to theinflammatory tissues and intricately regulating allergic responses. In a previous study, utilizing a mouse model, wedemonstrated that neutrophils suppress allergic reactions. Notably, we observed proximity and interaction between
activated MCs and neutrophils. While neutrophils are recognized for their defense responses against foreign
substances, the molecular mechanism governing MC-neutrophil interactions in allergic diseases remains elusive. In
this study, our focus turned to Ly6G, a protein specific to neutrophils, to unravel the regulatory mechanism of allergic
responses orchestrated by Ly6G through interactions between MCs and neutrophils. Ly6G was found to migrate
to MCs through neutrophil-MC interactions, with its migration significantly heightened upon allergen stimulation.
To probe the function of Ly6G, we produced recombinant Ly6G (rLy6G) and confirmed its binding to MCs using
flow cytometry. Further analysis revealed that rLy6G mitigated allergen stimulation-dependent enhancement of MCdegranulation. Intriguingly, rLy6G tended to increase mRNA expression and protein secretion of TNFα and CCL2 inMCs. To identify functional sequences, we synthesized nine peptides, derived from Ly6G sequence. Several peptides
were identified to suppress MC degranulation, but TNFα and CCL2 secretion were upregulated. To assess the impactof rLy6G on allergic responses in a disease model, we employed a Passive Cutaneous Anaphylaxis (PCA) model.
Administration of rLy6G demonstrated a reduction in the increase in vascular permeability, a marker of anaphylactic
symptoms, compared to control mice. These results collectively indicate that Ly6G plays a pivotal role in regulatingallergic responses through MC-neutrophil interactions.

１．緒症には、マスト細胞が重要な役割を担っており、アレルゲ

言ンが IgE 受容体を活性化すると、ヒスタミンをはじめとすアレルギー疾患（アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、る炎症性メディエータが分泌され、疾患が惹起される。アアナフィラキシーショックなど）は、世界的患者数の増加

レルギー炎症組織では、マスト細胞と様々な免疫細胞が相など、これまで以上に重大かつ身近な社会問題として注目互作用し、アレルギー疾患の複雑化や難治化を招いているされている。アレルギー疾患は、多様な疾患症状（発症部位、と考えられている。

病態、重症度、加齢変化など）を示すため、予防や根治が我々のアレルギー疾患モデルを用いた in vivo 研究から、難しく、疾患の複雑化・慢性化、更には患者 QOL（quality

アレルゲン親和性が浸潤細胞の種類に大きな違いを生じさof life）の低下を招くなど、解決すべき課題である 1）。

せ、皮膚炎症反応を調節・制御していることを明らかにしこのようなアレルギー疾患に対する予防や治療についてた。特に、マスト細胞の活性化によって、アレルギー炎症は、疾患原因となるアレルゲン（ラテックス、金属、花粉を誘導した皮膚組織では、炎症組織に浸潤する好中球の数など）への曝露の回避をはじめ、抗アレルギー薬や抗炎症が有意に増加しており、更に、マスト細胞と好中球が相互薬など、医薬品による対症療法が中心である。また、根治作用している様子も観察された 2）。これまで、自然免疫に療法として期待されているアレルゲン特異的免疫療法において重要な役割を有する好中球が、アレルギー応答におついても、長期にわたる治療期間の問題や治療にアレルゲいて、どのような役割を担っているのかなど、好中球によンを摂取するため、危険を伴うのが現状である。そのため、るアレルギー応答制御機構を追究してきた。その過程で、アレルギー（マスト細胞）応答を調節する新たなアレルギ

独自に確立した in vitro 共存培養系などを用いた研究から、ー制御因子の解明が期待されている。アレルギー疾患の発脱顆粒したマスト細胞と好中球が接着している様子が観察されており、これら接着を介した相互作用によって、アレ

Ly 6 G protein expressed in neutrophils
is a novel regulator for skin homeostasis
Ryo Suzuki
Faculty of Pharmaceutical Sciences, Institute of Medical, Pharmaceutical and
Health Sciences, Kanazawa University

ルギー炎症の病態を調節している可能性が示唆された。更に、マスト細胞と好中球の接着部位では、好中球に特異的に発現する Ly 6 G 蛋白質が、マスト細胞と好中球の接着部位で移動していることを見出した。本研究では、好中球に特異的に発現する Ly 6 G 蛋白質によるアレルギー応答調節機構の解明を目指した。

− 114 −

新規アレルギー反応制御分子 Ly6G による皮膚ホメオスタシス維持機構の解明

2．方性化に重要な各種シグナル分子（Syk、LAT、PLCγ、Akt、法Erk、p 38 など）のリン酸化を指標に行った。また、炎症

2 . 1．骨髄由来マスト細胞と骨髄単離好中球の invitro 共存培養系を用いた解析性メディエータの遺伝子転写調節機構の解析には、定量的PCR を用いて行った。さらに、即時相の分泌反応の解析

マスト細胞と好中球の相互作用及び両者の相互作用を介には、ヒスタミン分泌（脱顆粒反応）の指標として用いらした好中球蛋白質 Ly 6 G の機能解析を行うため、マスト細れる分泌顆粒内酵素（β-hexosaminidase）の定量を行った。

胞には骨髄由来マスト細胞を用い、好中球には骨髄単離好遅発相（サイトカイン・ケモカイン）の分泌反応の解析には、中球を用いた。骨髄由来マスト細胞は、マウス骨髄細胞

ELISA 法を用いた。

を採取し、IL（Interleukin）- 3 及び SCF（Stem cell factor）存在下で 1 か月間培養し、マスト細胞に分化したものを用いた。骨髄由来マスト細胞の分化率の確認には、マスト細2 . 4．疾患モデルを用いた Ly 6 G によるアレルギー制御機構の解析

胞マーカー蛋白質（骨髄由来マスト細胞：FcεRI、CD 117）

アレルギー疾患モデルとして、マスト細胞の活性化依を用いて行った。また、骨髄単離好中球は、骨髄細胞を採存的アレルギーモデルとして汎用される受動皮膚アナフ取し、精製キットを用いたネガティブセレクション法によィラキシーモデル（PCA: passive cutaneous anaphylaxis）

り単離した。精製率の確認には、マウス好中球マーカー蛋を用いた。受動皮膚アナフィラキシーモデルの作成には、白質（Ly 6 G）を用いて行った。マウス骨髄由来マスト細C 57 BL/ 6 N マウスを用いた。マウスは抗 DNP-IgE 抗体を胞と骨髄単離好中球をマトリゲルコートしたガラスボトム

受動的に感作させた。その翌日、アレルゲン（DNP-HSA）

ディッシュ上で培養する共存系を用いて、抗 DNP-IgE 抗をエバンスブルー色素と同時に投与した。その後、血管か体を感作させた細胞に対して、アレルゲン（DNP-HSA）

ら組織中に浸潤したエバンスブルー色素を組織から抽出しによる特異的刺激応答に伴うマスト細胞と好中球の相互作定量を行うことで、マスト細胞の活性化の指標とした。

用、好中球蛋白質 Ly 6 G の培養上清中への遊離、及び近傍3．結果及び考察のマスト細胞への移動について定量・定性的な解析を行った。

これまで我々は、アレルギー応答の多様性の制御機構について追究してきた。その中で、アレルゲンで活性化され2 . 2．リコンビナント Ly 6 G 蛋白質の作製たマスト細胞によって誘導されたアレルギー炎症組織では、リコンビナント蛋白質は、研究目的や用途に応じて、大マスト細胞と好中球が近傍に存在し、相互作用することに腸菌発現系（BL 21（DE 3）、ClearColi BL 21（DE 3）など）

よって、アレルギー炎症を調節している可能性を明らかにやヒト細胞発現系（HEK 293 細胞など）を用いてリコンビした（図 1）。また、マスト細胞と好中球の in vitro 共存培

ナント Ly 6 G 蛋白質を作製した。リコンビナント蛋白質の養系を確立し、アレルゲン刺激応答に伴うマスト細胞の活精製には、タグとして結合させたヒスチジンやヒト Fab を性化とそれに伴う好中球との相互作用をライブイメージン用いて Ni-NTA ビーズやプロテイン G を用いて行った。リグ法を用いて追究した。マスト細胞をアレルゲンで特異的コンビナント蛋白質の発現及び精製の確認には、電気泳動による CBB（Coomassie Brilliant Blue）染色法や各種特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング法により実施した。

2 . 3．リコンビナント Ly 6 G 蛋白質を用いたマスト細胞応答調節機構の解析
Ly 6 G 蛋白質によるマスト細胞の結合能の解析には、リコンビナント Ly 6 G 蛋白質で処理した骨髄由来マスト細胞を抗タグ抗体で標識し、フローサイトメータを用いて定量した。また、リコンビナント Ly 6 G 蛋白質によるマスト細胞活性化調節機構の解析には、マスト細胞のアレルゲン刺激応答に伴うシグナル分子の活性化や遺伝子転写調節、更にマスト細胞から分泌される炎症性メディエータを指標に解析した。マスト細胞のシグナル分子の活性化の解析には、ウエスタンブロッティング法を用いて、マスト細胞の活図 1 アレルギー疾患モデルでのマスト細胞と好中球の相互作用
脱顆粒反応しているマスト細胞（赤）と血管（白）から組織に浸潤した好中球（緑）が接着し相互作用している。

− 115 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024に活性化すると、炎症性メディエータの分泌に伴いマスアレルゲン刺激に伴う、培養上清中の Ly 6 G 蛋白質量をウト細胞の細胞膜でラッフリングが観察された。一方、好中エスタンブロッティング法で定量した。その結果、未刺球は、マスト細胞の分泌反応後に球状から紡錘形に形態が激状態においても Ly 6 G 蛋白質の遊離が観察されたが、ア変化し、マスト細胞方向への遊走と接着し相互作用する様レルゲン刺激１時間後の培養上清において Ly 6 G 蛋白質量子が観察された（図 2）。次に、相互作用している両細胞をが増加し、アレルゲン刺激 3 〜 6 時間後では培養上清中の判別するため、好中球に特異的に発現し、マーカー蛋白質

Ly 6 G 蛋白質が減少している様子も観察された。マスト細として汎用される Ly 6 G 蛋白質を用いて相互作用している胞の分泌顆粒内には、多くのプロテアーゼが含まれているこ3）

両細胞を染色した 。その結果、Ly 6 G 蛋白質が好中球かとが明らかになっており、マスト細胞の活性化によりヒスタらマスト細胞の細胞膜へ移動していることを見出した。更ミンなど各種炎症性メディエータと共に分泌される 5）。こに、好中球からマスト細胞へ移動した Ly 6 G 蛋白質についれらのプロテアーゼが、マスト細胞と好中球の相互作用（接て定量解析を行ったところ、アレルゲン刺激に伴って、接着）部位の局所で高濃度に分泌され、好中球細胞膜上の着している部分で Ly 6 G 蛋白質の移動が顕著に起こっていLy 6 G 蛋白質が切断されることによって、培養上清中に遊ることが明らかになった（図 3）。また、画像解析の結果か離し近傍のマスト細胞に移動した可能性が示唆された。ま

ら、細胞間接着を介した情報交換や機能調節に必要な細胞た、Ly 6 G 蛋白質がマスト細胞に移動していることは、マ骨格蛋白質（F-actin）が、マスト細胞と好中球の接着部位スト細胞が Ly 6 G 蛋白質を結合する分子を発現しているこ4）に集積していることも明らかになった 。とや Ly 6 G 蛋白質によるマスト細胞の機能調節の可能性が次に、Ly 6 G 蛋白質の移動メカニズムを明らかにするこ考えられた。とを試みた。はじめに、好中球から Ly 6 G 蛋白質の遊離機先の研究成果から、我々は Ly 6 G 蛋白質のマスト細胞の構について追究した。マスト細胞と好中球を共存培養し、機能調節機構について明らかにすることを試みた。そのため本研究では、リコンビナント Ly 6 G 蛋白質を用いた。リ
コンビナント Ly 6 G 蛋白質の作製には、大腸菌発現系やヒト細胞発現系を用いた。はじめに作製したリコンビナント
Ly 6 G 蛋白質のマスト細胞への結合能の解析を行った。リ
コンビナント Ly 6 G 蛋白質を処理したマスト細胞をフローサイトメータで解析したところ、未刺激状態では Ly 6 G蛋白質が約 20 ％程度のマスト細胞で結合していた。一方、アレルゲン刺激を行ったマスト細胞では、Ly 6 G 蛋白質の結合量が増加している様子が観察された。これらの結果か
らも、マスト細胞の細胞膜上には Ly 6 G 蛋白質に対する結合因子が存在し、マスト細胞の機能を調節している可能性

図 2 In vitro 共存培養系におけるマスト細胞と好中球の接着を介した相互作用
矢頭部分でマスト細胞と好中球が接着している。
Bar=10 μmが示唆された。現在は、Ly 6 G 結合分子の同定の前段階として、マスト細胞の Ly 6 G 結合分子の存在について明らか

図 3 In vitro 共存培養系における好中球からマスト細胞への Ly 6 G 蛋白質の移動
マスト細胞と好中球の接着部位で Ly 6 G 蛋白質が移動している。

− 116 −

新規アレルギー反応制御分子 Ly6G による皮膚ホメオスタシス維持機構の解明にするため、プルダウン法やファーウエスタン法を用いた明らかになった。
更に、Ly 6 G による分泌反応調節機構を明らかにするた実験系の確立や最適化を行っている。
更に、Ly 6 G 蛋白質によるマスト細胞応答調節機構を明め、Ly 6 G 蛋白質によるシグナル調節機構の解析を行った。

らかにするため、Ly 6 G 蛋白質による炎症性メディエータ

マスト細胞に発現し IgE 受容体シグナルに関係する重要分泌反応への影響について解析した。はじめに、即時相シグナル分子（キナーゼなど）について、蛋白質のリン酸の炎症反応に重要である脱顆粒反応の解析を行った。脱化を指標にウエスタンブロット法を用いて解析した 6）。こ顆粒反応の解析にはヒスタミン分泌の指標として汎用さ

こでは、マスト細胞の脱顆粒反応に重要である Lyn、Syk、れ る 分 泌 顆 粒 内 酵 素（β-hexosaminidase）の 定 量 を 行 っLAT、PLCγ をはじめ、サイトカイン・ケモカイン転写調た。その結果、Ly 6 G 蛋白質処理によりアレルゲン刺激節に重要な因子である MAPK（Erk、p 38、JNK）に着目に伴う脱顆粒反応が有意に抑制されており、また、そのし解析を行った。Ly 6 G 処理したマスト細胞ではアレルゲ抑制効果は Ly 6 G 蛋白質の濃度依存的であることが明ら

ン刺激に伴ってシグナル分子（Syk、LAT、PLCγ、Akt、かになった（図 4）。更に、遅発相の炎症反応に重要なサErk、p 38 など）において活性化状態が持続している傾向

イ ト カ イ ン（TNFα な ど ）・ ケ モ カ イ ン（CCL 2 な ど ）にが観察された。このことから、Ly 6 G 蛋白質はマスト細胞

ついて ELISA 法を用いて定量解析を行った。その結果、のシグナル伝達分子の活性化状態にも影響を与え、分泌反β-hexosaminidase と同様に抑制効果が観られるとの予想応を調節している可能性が示唆された。に反して、Ly 6 G 蛋白質を処理した細胞では、有意に分泌反応が増強していた（図 4）。

最後に、Ly 6 G 蛋白質による生体レベルでのアレルギー応答制御機構について追究した。本研究では、マスト細胞これまでの研究成果から、Ly 6 G 蛋白質はマスト細胞の依存的な動物モデルとして多くの研究で汎用されている受分泌反応を調節する機能を有する可能性が示唆された。し動皮膚アナフィラキシーモデル（PCA: passive cutaneousかし、β-hexosaminidase とサイトカイン・ケモカインがanaphylaxis）を用いた 7）。その結果、Ly 6 G 蛋白質を投与異なる調節作用を示す原因については未だ不明である。そしたマウスでは、マスト細胞の活性化に伴うマスト細胞のこで、その解析の一環として、Ly 6 G 蛋白質の分泌機能配活性化の指標として用いた血管透過性（Evans Blue 色素の列を明らかにすることを試みた。Ly 6 G 蛋白質を断片化し組織内浸潤）が、未処理の場合と比較して有意に抑制された Ly 6 G 断片化ペプチドを作製し、Ly 6 G 断片化ペプチドていることが分かった（図 5）。このことから、Ly 6 G 蛋白処理によるマスト細胞の脱顆粒反応（β-hexosaminidase）

質は生体レベルでもアレルギー応答を調節している可能性の解析を行ったところ、Ly 6 G 断片化ペプチド（# 4 及びが示唆された。

# 9）処理したマスト細胞では、アレルゲン刺激に伴う脱4．総顆粒量が有意に減少していることが明らかになった。また、

括Ly 6 G 断片化ペプチド処理によるマスト細胞のサイトカイ

本研究は、アレルギー炎症組織においてアレルギー担当ン（TNFα など）及びケモカイン（CCL 2 など）分泌への影細胞であるマスト細胞と主に自然免疫で生体防御応答を担響を解析したところ、Ly 6 G 断片化ペプチド（# 4）の処理

う好中球が近傍に存在し相互作用していることを見出したによりアレルゲン刺激に伴う分泌量が増加していることがことから始まった。その後、骨髄由来マスト細胞と骨髄

図 4 Ly6G蛋白質によるマスト細胞の分泌反応への影響
リコンビナント Ly 6 G 蛋白質処理によるアレルゲン刺激応答に伴うマスト細胞の各種炎症性メディエータの分泌反応− 117 −コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図 5 In vivo 疾患モデルにおける Ly 6 G 蛋白質によるアレルギー応答の調節
リコンビナントLy6G蛋白質処理によってアナフィラキシー反応が抑制されている。

単離好中球の in vitro 共存培養系を用いた実験から、マス新たな知見を獲得し、アレルギー疾患研究の観点から、健ト細胞の活性化に伴って好中球に特異的に発現する Ly 6 G

康な皮膚の維持・増進に貢献したいと考えている。

が、好中球の細胞膜上から切断され、切断された Ly 6 G蛋白質がマスト細胞に移動していることを見出した。更

（引用文献）に、Ly 6 G 蛋白質によるアレルギー調節機構を明らかにす

1） Vitte J, Vibhushan S, Bratti M, Montero-Hernandez

るため、リコンビナント Ly 6 G 蛋白質の作製に着手し、大JE, Blank U: Allergy, Anaphylaxis, and Nonallergic腸菌及びヒト細胞発現系での Ly 6 G 蛋白質の精製に成功しHypersensitivity: IgE, Mast Cells, and Beyond. Medた。作製 Ly 6 G 蛋白質を用いたマスト細胞の機能調節機構

Princ Pract, 31, 501-515（2022）．の解析では、Ly 6 G が濃度依存的にマスト細胞の脱顆粒反2） Suzuki R, Leach S, Liu W, Ralston E, Scheffel J,応を抑制していることが示唆された。その一方で、サイト

Zhang W, Lowell CA, Rivera J: Molecular editing of

カイン・ケモカインの分泌に関しては、Ly 6 G 蛋白質処理

cellular responses by the high-affinity receptor for IgE.

によって、マスト細胞からサイトカイン・ケモカイン分泌Science, 343, 1021-1025（2014）．

が亢進するなど、相反する調節作用を示すことも明らかに

3） Lee PY, Wang JX, Parisini E, Dascher CC, Nigrovic

なった。また、Ly 6 G 断片化ペプチドを作製し、マスト細

PA: Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal

胞の機能調節を行っている機能配列の同定を行ったところ、

of leukocyte biology, 94, 585-594（2013）．

脱顆粒反応を抑制し、サイトカイン・ケモカイン分泌を亢

4） Yu Y, Smoligovets AA, Groves JT: Modulation of T

進する機能配列が存在している可能性が示唆された。炎症cell signaling by the actin cytoskeleton. Journal of cell性メディエータ分泌における Ly 6 G 蛋白質の作用は未だ不science, 126, 1049-1058（2013）．

明な部分が多いが、今後、これら分子メカニズムを明らか

5） Dudeck A, Koberle M, Goldmann O, Meyer N,にすることによって、複雑な炎症性メディエータ分泌メカ

Dudeck J, Lemmens S, Rohde M, Roldan NG, Dietze-ニズムの一端が明らかになるものと期待される。更に、受Schwonberg K, Orinska Z, Medina E, Hendrix S, Metz

動皮膚アナフィラキシーモデル（PCA: passive cutaneous

M, Zenclussen AC, von Stebut E, Biedermann T: Mast

anaphylaxis）を用いた機能解析の結果、Ly 6 G 蛋白質が生

cells as protectors of health. The Journal of allergy and

体レベルにおいてもアレルギー炎症応答を抑制する可能性

clinical immunology,（2018）．

も見出した。今後、各種疾患モデル（全身性アナフィラキ

6） Fujisawa S, Nagata Y, Suzuki R: Leukotriene D4

シー、アトピー性皮膚炎モデル、食物アレルギーモデルなaccelerates antigen-mediated mast cell responses viaど）での研究を展開することによって、Ly 6 G 蛋白質によthe cysteinyl leukotriene 1 receptor. Cell Immunol,るアレルギー調節機構が明らかになることが期待される。

．
382, 104632（2022）

また、Ly 6 G 蛋白質は Ly 6 ファミリーの一つであり、他の

7） Ji N, Pan S, Shao C, Chen Y, Zhang Z, Wang R, Qiu

Ly 6 ファミリー蛋白質によるアレルギー応答調節機構のY, Jin M, Kong D: Spinacetin Suppresses the Mast

解析も現在進めている。引き続き in vitro 及び in vivo レベ

Cell Activation and Passive Cutaneous Anaphylaxis inルの研究を通して、複雑で多様なアレルギー疾患の増悪・Mouse Model. Frontiers in pharmacology, 9, 824（2018）．

緩和機構及び Ly 6 ファミリー蛋白質による制御に関する− 118 −