2008/03/14
REV.B

AxoClamp900A
FUNCTIONAL CHECKOUTSTEP1：Axoclamp900A と Axoclamp Commander のセットアップ .......................................... 3
STEP2：Current Clamp (IC) .................................................................................................. 5
STEP3：Discontenious Current Clamp (DCC) ....................................................................... 8
STEP4：Discontenious Single Electrode Voltage Clamp (dSEVC) ........................................ 9
STEP5：Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC)................................................................... 12
I. CLAMP-1U モデルセルを使用する場合 ......................................................................... 12
Ⅱ. MCO-2U モデルセルと VG-9A Bath Clamp ヘッドステージを使用する ......................... 13
STEP6：Auto Mode Switching ............................................................................................. 17
STEP7：High-Voltage Current Clamp (HVIC) ...................................................................... 21________________________________________________________________________
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Axoclamp900A の FUNCTIONALCHECK に下記のものが必要となります。

Axoclamp 900A 本体
電源ケーブルUSB ケーブル（2 本）
Axoclamp 900A Commander
PC Windows 2000, XP
２チャンネルオシロスコープ
BNC ケーブル（３本）
CLAMP-1U モデルセル
ヘッドステージ（２つ）HS-9A x0.1
HS-9A x1________________________________________________________________________
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STEP1：Axoclamp900A と Axoclamp Commander のセットアップ
1.

Axoclamp 900A に電源ケーブルを接続します。

2.

Axoclamp 900A のリアパネルにある CONTROL USB ポートとコンピュータの USB
ポートを USB ケーブルで接続します。

3.

Axoclamp 900A のリアパネルにある SCOPE USB ポートとコンピュータの USB ポートを USB ケーブルで接続します。

4.

HS-9A x0.1 ヘッドステージをリアパネルの CHANNEL 1 HEADSTAGE INPUT に接続します。

5.

HS-9A x1 ヘッドステージをリアパネルの CHANNEL 2 HEADSTAGE INPUT に接続します。

6.

ヘッドステージ１に CLMAP-1U モデルセルの ME1 を接続します。

7.

ヘッドステージ１のシグナルグランドソケットとモデルセルのグランドソケットを接続し、モデルセルのスイッチを BATH に設定します。

8.

ヘッドステージ２に CLMAP-1U モデルセルの ME2 を接続します。

9.

各ヘッドステージとモデルセルをシールドエンクロージャーに入れ、シールドエンクロージャーと Axoclamp900A のシグナルグランドを接続します。

10. Axoclamp 900A の電源をオンにします。
11. Axoclamp 900A Commander を起動します。
12. Select Device ボタンをクリックします。

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13. Scan ボタンをクリックすると Axoclamp 900A のシリアル番号が表示さます。
Axoclamp900A に貼られてシリアル番号と一致していることを確認します。

14. Reset to program Defaults ボタンを押すと警告メッセージが表示されます。”はい”を押して警告を承認します。

15. CHANNEL 1 SCALED OUTPUT とオシロスコープのチャンネル１を BNC ケーブ
ルで接続します。
16. CHANNEL 2 SCALED OUTPUT とオシロスコープのチャンネル２を BNC ケーブルで接続します。
17. Axoclamp 900A のリアパネルにある SYNC OUTPUT BNC とオシロスコープの外部トリガーチャンネルを BNC ケーブルで接続します。

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STEP2：Current Clamp (IC)1.

各ヘッドステージの電流注入抵抗が表示されます。例えば、HS-9A x0.1 ヘッドステージの場合は R0:100MΩ、HS-9A x1 ヘッドステージの場合は R0:10MΩと表示されます。

2.

CLAMP-1U モデルセルのスイッチを BATH に設定し、I-CLAMP 1 タブの Pipette
Offset の Zero ボタンを押します。オフセット電圧は±10mV 未満に設定されます。

3.

Channel 1 Scaled Output を”Headstage 1, Membrane Potential(10mV/mV)”に設定します。

4.

Tuning チェックボックスをチェックします。
オシロスコープ１で 500mV, 10Hz の矩形波を確認できます。この電圧値はモデルセ
ルの 50MΩ抵抗から計算できます。
計算式：1nA x 50MΩ x (10mV/mV)=500mV________________________________________________________________________
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5.

Bridge Balance セクションの Auto ボタンをクリックします。

波形はゼロ付近まで減少して、Bridge resistance は 45-55MΩを表示するはずです。
もしならなければ、Lock ボタンを押して、再度 Auto ボタンを押して下さい。
6.

10Hz 波形のエッジにある 1ms 幅のトランジェントに注目して下さい。このトランジェ
ントは電極容量が原因です。

7.

Pipette Capacitance Neutralization チェックボックスをチェックします。容量トランジ
ェントがゼロになるように数値を変更します。数値は 1-3pF の間になります。

8.

CLAMP-1U モデルセルのスイッチを CELL に設定します。約 400mVp-p の下図の________________________________________________________________________
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ようなの三角波（積分波形）を確認できます。
注意）片方のチャンネルの Tune は OFF に設定して下さい。

9.

I-CLAMP2 についても同様に確認して下さい。

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STEP3：Discontenious Current Clamp (DCC)

1.

Channel 1 を DCC モードに設定します。

2.

Rate を 10kHz に設定します。

3.

オシロスコープ１の波形は IC モードの波形とよく似ていて約 400mVp-p の下図のようなの三角波（積分波形）を確認できます。ノイズは約２倍程度です。

4.

I-Clamp 1 タブの Pipette Capacitance Neutralization と Rate の数値を調整して、各数値の変化における波形の変化を観察して下さい。理想的な波形を得るにはできる限り高レートにします。そうしないと波形の断片が離れ離れになって、くずれてしまいます。

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STEP4：Discontenious Single Electrode Voltage Clamp (dSEVC)
1.

Channel 1 を dSEVC モードに設定します。

2.

Seal Test をチェックします。

3.

Channel 1 Scaled Output を”Headstage 1, Membrane Potential(10mV/mV)”に設定します。

4.

Channel 2 Scaled Output を”Headstage 1, Membrane Current(0.1V/nA)”に設定します。

5.

オシロスコープの膜電位の波形は、立ち上がり時間約 20ms、60mV の矩形波を表示します。（実際には 6mV）10mV の電圧をプログラミングしましたが、6mV まで下がっています。つまり、高ゲインが必要となります。電流波形（IN1）でも似た反応がみられます。dSEVC タブで、Gain を 0.03nA/mV から約 0.35nA/mV に設定します。
オシロスコープに 100mV の矩形波が確認できます。立ち上がり時間は約 2ms になります。

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立ち上がりがスムーズになるように Pipette Capacitance Neutralization と Rate を調整します。Gain を増加させるとき、立ち上がりがオーバーシュートしないよう気をつけます。最適なのは、Gain が 1.5nA/mV より大きく、立ち上がり時間が 300μs 未満で、ノイズが 10mVp-p 程度です。ｘ軸のタイムスケールを広げると見やすくなります。

7.

慣れてくると、もっと Gain を大きくして電流の立ち上がり時間を 0.5mS 未満になるよ
うに Pipette Capacitance Neutralization と Rate を調整することができます。

8.

Channel 2 Scaled Output タ ブ の Signal を ”Headstage 2, MembranePotential(10mV/mVp-p)”に設定します。ヘッドステージ２は細胞膜電位を測定します。Channel 2 Scaled Output と Channel 1 Scaled Output は下図のように100mVp-p となり一致します。Channel 2 のスピードは容量成分の影響で少し遅くなります。これはヘッドステージ２の neutralization で最適な速度に調整できます。

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STEP5：Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC)
I. CLAMP-1U モデルセルを使用する場合
1.

Reset to program Defaults ボタンをクリックし、警告を承認します。

2.

CLAMP-1U モデルセルを BATH に設定して、各チャンネル I-Clamp 1 と I-Clamp 2
タブの Pipette Offset を使って電圧をゼロに調整します。

3.

I-Clamp 1 タブを選択して、電極容量を補正していきます。（I-CLAMP 1 のみ）a.

Tuning をチェックします。

b.

CLAMP-1U モデルセルを CELL に設定します。

c.

Pipette Capacitance Neutralization をチェックします。

d.

Channel 1 のエッジがオーバーシュートする直前まで neutralization の数値を調整します。

4.

Channel 2 を TEVC モードに設定します。

5.

Seal Test をチェックします。

6.

Scaled output の signal を設定します。

7.

a.

Channel 1” Headstage 1, Membrane Potential (10mV/mV)”b.

Channel 2” Headstage 2, 0.1 x Membrane Current (1V/μA)”

Gain をオーバーシュート直前まで調整します。立ち上がり時間は約 200μs になります。

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最適な立ち上がり時間にするために、Pipette Capacitance Neutralization を 1pF単位で増加し、Gain も増加してオーバーシュートを除去します。オシレイションを起こしたら、Pipette Capacitance Neutralization と Gain を増加してはいけません。
練習すれば、立ち上がり時間を 100μs 未満にでき、Gain は約 350-400 になり、ノイズは 20mVp-p（細胞では 2mV）になります。オシロスコープ２の電流では、200μs 未満になります。

Ⅱ. MCO-2U モデルセルと VG-9A Bath Clamp ヘッドステージを使用する
大きいオーサイト細胞はイオンチャネルの研究に使われます。異種発現したチャネル電流は 50μA 以上と非常に大きいです。電流が大きい場合、バス抵抗は通常は数 kΩであり、測定誤差の大きな要因になります。例えば、バス抵抗が 1kΩあると膜電位の測定誤差は 1mV/μA となります。加えて、リガンド依存性チャンネルでは、小さな膜抵抗が失われます。（大電流のボルテージクランプでは厳密な測定ができない）これらの各問題の対策手順を説明します。
準備するものMCO-2U モデルセル
HS-9A x1 ヘッドステージ
HS-9A x10 ヘッドステージ
VG-9A x100 ヘッドステージ
手順
1.

ヘッドステージをリアパネルのヘッドステージコネクタに接続します。
a.

HS-9A x1 を CHANNEL 1 HEADSTAGE に接続します。

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2.

b.

HS-9A x10 を CHANNEL 2 HEADSTAGE に接続します。

c.

VG-9A x100 を axuiliary headstage に接続します。

接続a.

ヘッドステージ１に MCO-2U の E#1 を接続します。

b.

ヘッドステージ２に MCO-2U の E#2 を接続します。

c.

VG-9A ヘッドステージの red(sense), white(bath)ソケットと MCO-2U モデルセルの同色のターミナルを短めに接続します。（2mm ピンで接続できます）3.

MCO-2U スイッチが 1MΩ（膜抵抗）になっていることを確かめる。

4.

Channel 1 と Channel 2 の SCALED OUTPUT BNC をオシロスコープのチャンネ
ル１と２に接続し、リアパネルにある SYC OUTPUT BNC をオシロスコープのトリガー端子接続してトリガーとして使用する。

5.

Reset to program Defaults ボタンをクリックして、警告を承認します。

6.

Headstage 1 の R0 が 10MΩ、Headstage 2 の R0 が 1MΩであることを確認する。

7.

Channel 1,2 の Pipette Offset をゼロに調整する。

8.

Headstage 1 の Tuning を 10.0nA に設定してチェックボックスをチェックする。

9.

Scaled Output の signal を選択します。
a.

Channel 1 は” Membran Potential, 10mV/mV ”b.

Channel 2 は” Membran Potential, 10mV/mV ”

10. オシロスコープのチャンネル１には、+10mV のランプ波形よる+100mV のステップ波形、-10mV のランプ波形による-100mV のステップ波形が確認できます。（実際には+10mV から-10mV）
11. ステップの立ち上がり時間は約 50μs になります。これは既に十分速いので、電極容量の補正は必要ありません。
12. 既に Headstage 2 にモデルセルの E#2 が接続されていて、オシロスコープのチャン________________________________________________________________________
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ネル２は 10mVp-p の三角波を確認できます。

13. TEVC タブの Lag を約 0.2ms に設定します。

14. TEVC モードに設定します。

15. Scaled Output を選択します。
a.

Channel 1 は”Headstage 1, Membran Potential, 10mV/mV””b.

Channel 2 は”Headstage 2, 0.1 x Membran Current, 0.1V/μA””

16. Seal Test をチェックして 50mV に設定します。

17. オシロスコープチャンネル１の電圧波形のエッジをオーバーシュートする直前までGain を増加させます。約 3000-3500 程度になります。オシレイションしたら Gain の増加しないで下さい。下図のような波形がよいです。

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18. MCO-2U スイッチを 10kΩポジションに変更します。オシロスコープチャンネル２では、電圧パルスを増加させると定常状態の電流が約 450mV(45μA)になります。これはボルテージクランプ電圧が 48mV まで下がってしまうのが原因です。この対策として
DC Restore 機能があります。

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STEP6：Auto Mode Switching
ヘッドステージ１の膜電位が負から正の方向で+20mV に達すると、ヘッドステージ２がI-Clamp モードから TEVC モードに切換わる。500ms 間は 0-10mVp-p, 10Hz Seal Testを出力して TEVC を行い、I-Clamp に戻す。このサイクルを繰り返す。以下にこの設定をしていきます。
V-Clamp モードを設定するとき、V-Clamp タブの Oscillation Detection をチェックされていないことをよく確認して下さい。Reset to program Defaults ボタンをクリックし、警告を承認します。
1.

Channel 1,2 を IC モードに設定します。

2.

Scaled Output 1 signal を”Headstage 1, Membrane Potential (10mV/mV)に設定します。

3.

Scaled Output 2 signal を”Headstage 2, Membrane Potential (10mV/mV)に設定します。

4.

SCALED OUTPUT 1 をオシロスコープ１、SYNC BNC をオシロスコープ２に接続します。

5.

I-Clamp2 タブの Tuning をチェックします。

6.

オシロスコープ１には、おおよそ 50-400mV の三角波が確認できます。

7.

TEVC タブの Seal test をチェックします。
ここで、以下の作業を行って下さい。これらの作業は無意味に思えますが、この作業を行わないと Auto Mode が有効になりません。ソフトウェアのバグの可能性があります。
現在の最新バージョンは 1.0.0.60 です。

A) CH2 を TEVC モードに設定する。
B) IC モードに戻す。
8.

Options ボタンを押します。

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9.

Auto タブを選択します。

10. TEVC を選択します。
11. On negative to positive Vm threshold crossing を選択します。
12. Membrane potential Vm threshold を+20mV に設定します。
13. Return to I-Clamp を 500ms に設定します。
14. General タブをクリックします。
15. Sync Output で Mode を選択します。これで、リアパネルの SYNC BNC からモードシグナルが出力されます。LOW は I-Clamp、HIGH は V-Clamp です。

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16. ダイアログを閉じます。
17. headstage 2 のメータの下にある Switch to TEVC on ext input チェックボックスをチェックします。

下図は波形の結果です。

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波形の説明です。
I-Clamp モードでは始めは膜電位がゼロになっています。
Headstage 2 は 1nA の電流を注入しています
Headstage 1 の電流波形の 50ms 付近に注目すると、立ち上がりの膜電位（アクションポテンシャル）が見られます。
膜電位が 20mV に到達すると V-Clamp(TEVC)モードに切換わります。
0-10mV, 10Hz の Seal Test が始まります。
V-Clamp(TEVC)に切換わった 500ms 後、I-Clamp モードに切換わります。
これを繰り返します。

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STEP7：High-Voltage Current Clamp (HVIC)
1.

HEADSTAGE 1 には何も接続しません。

2.

HS-9A x1 ヘッドステージに CLAMP-1U モデルセルを接続し、HS-9A x1 ヘッドステージのシグナルグランドソケットと CLMAP-1U モデルセルのグランドソケットも接続します。

3.

Reset to program Defaults ボタンをクリックし、警告を承認します。

4.

Headstage 2 タブの HVIC モードを選択します。

5.

I-CLAMP 2 タブにおいて、Tuning を 1000nA に設定してチェックボックスをチェックします。

6.

Channel 1 SCALED OUTPUT signal を”Headstage 2, 0.1xMembran Potential”に設定します。

7.

Channel 2 SCALED OUTPUT signal を”Headstage 2, 0.1xMembran Current”に設定します。

この波形の形は通常のカレントクランプとよく似ています。しかし、スピードも遅くなり、振幅は大きくなっています。（±180Vp-p）8.

signal が”Membran Potential(1mV/mV)”のとき、膜電位が±10Vp-p 未満なら、Bridge Balance を使用できます。

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9.

Tuning を 100nA に設定します。

10. “Membran Potential(1mV/mV)”を選択します。

11. Bridge Balance チェックボックスをチェックして、50MΩ付近に設定します。

12. HVIC では Bridge Balance が約 50.1MΩになります。電圧トレースの 1ms スパイク
は HVIC のレスポンス遅れが原因です。

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