2009.11.26

Axoclamp 900A
日本語マニュアル

株式会社インターメディカル____________________________________________________________________________
AXOCLAMP 900A 日本語マニュアル, COPYRIGHT JUNE 2006, INTERMEDICAL CO., LTD.

2

目次

1.

2.

3.

パネルの説明 ................................................................................................................. 3
1.1.

フロントパネル ......................................................................................................... 3

1.2.

リアパネル ............................................................................................................... 5

Axoclamp Commander の説明....................................................................................... 7
2.1.

画面の説明 ............................................................................................................. 7

2.2.

ツールボタン ............................................................................................................ 8

2.3.

Option ボタン ........................................................................................................... 9

2.3.1.

General タブ ..................................................................................................... 9

2.3.2.

Auto タブ ........................................................................................................ 13

2.3.3.

Audio タブ ...................................................................................................... 15

2.3.4.

Quick Select タブ ........................................................................................... 16

2.3.5.

About タブ ...................................................................................................... 17

2.4.

メータ表示とモード選択 .......................................................................................... 18

2.5.

各モードの設定 ...................................................................................................... 19

2.5.1.

I=0 モードの設定 ............................................................................................ 19

2.5.2.

IC モードの設定 .............................................................................................. 20

2.5.3.

DCC モードの設定 .......................................................................................... 22

2.5.4.

HVIC モードの設定 ......................................................................................... 23

2.5.5.

dSEVC モードの設定 ...................................................................................... 24

2.5.6.

TEVC モードの設定 ........................................................................................ 25

チュートリアル ............................................................................................................... 26
3.1.

チェックリスト .......................................................................................................... 26

3.2.

Axoclamp900A と Axoclamp Commander のセットアップ ....................................... 27

3.3.

Tutorial 1:Current Clamp (IC) ............................................................................... 29

3.4.

Tutorial 2:Discontenious Current Clamp (DCC) .................................................... 34

3.5.

Tutorial 3:Discontenious Single Electrode Voltage Clamp (dSEVC) ..................... 36

3.6.

Tutorial 4:Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC) .................................................. 39

3.6.1.

I. CLAMP-1U モデルセルを使用する場合 ....................................................... 39

3.6.2.

Ⅱ. MCO-2U モデルセルと VG-9A Bath Clamp ヘッドステージを使用する........ 42

3.7.

Tutorial 5:Auto Mode Switching ............................................................................ 46

3.7.1.

Example of Auto Mode Switching .................................................................. 46

3.7.2.

Setup of Auto Mode ....................................................................................... 47

3.8.

Tutorial 6:High-Voltage Current Clamp (HVIC) ..................................................... 50

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1. パネルの説明
1.1.

フロントパネル

ボルテージクランプ用の外部コ
電源 LED

マンド入力端子通信 LED
自動モード切り替えの信号入力
電源スイッチオーディオ信号の出力端子

測定信号の出力端子

膜電流の出力端子

カレントクラモード LED

ンプ用の外部
コマンド入力端子____________________________________________________________________________
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測定信号の出力端子

膜電流の出力端子

カレントクランプ用の外部
コマンド入力端子

モード LED

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1.2.

リアパネル

CH2 内部コマ

CH1 の電圧をンドの有効/

保持する信号無効を制御すを入力する端る信号を入力子する端子。

CH2 のヘッドステージ接続CH1 内部コマ

コネクタ

ンドの有効/
CH1 のヘッドステージ接続コネクタ

無効を制御する信号を入力する端子。

ケースグラン
ド端子

CH1 追加ヘッドステージのシグナルグランド端子

測定信号の出力端子

Monitor scope 波トリガー信号形の出力端子の出力端子CH1 追加ヘッドステージを
Monitor scope のトリ

接続するコネクタ

ガー信号____________________________________________________________________________
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CH2 追 加 ヘ ッ
ドステージを接続するコネクタCH2 追加ヘッドステージの

REMOTE BUZZ スイッ

測定信号の出力端子

チの接続コネクタ

Monitorscopeを使用するための USB コネクタ

AC 電源コネクタ

Axoclamp900
A を制御する
USB コネクタ
ヒューズホルダー

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2. Axoclamp Commander の説明
2.1.

画面の説明

ツールボタン
メータ表示とモード設定のセクションです。

コマンドや補正など、実験
の設定をするセクションです。

出力信号の設
定をするセクションです。

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2.2.

ツールボタン

アイコン

メニュー名

ショート

機能

カットキー

ウィンドウを小型化する。
Resize windows

F2

Always on Top

F3

Load Configuration

F4

Save Configuration

F5

Reset to Program Defaults

F6

Select Device

F7

Configure Soft Panel

F8

Audio Options

F9

Options

F10

Monitor Scope

F11

Quick Select

－

Help

(F1

常に他のウィンドウの手前に表示する。
設定ファイルを開く。
設定ファイルを保存する。
デフォルト設定にする。
Axoclamp 900A と Soft Panel を認識させる。
Soft Panel を設定する。
オーディオ機能を設定する。
測定電流範囲など、各種項目を設定する。
Monitor Scope ウィンドウを表示する。
保存した設定ファイルへのショートカット。
ヘルプを開く。

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2.3.

Option ボタン

2.3.1. General タブ
外部コマンド、ローパスフィルタ、外部トリガーの設定と追加ヘッドステージの情報を表示する
タブです。

各チャンネル、各モードの外部コマンドを設定します。
各チャンネル、各モードのローパスフィルタを設定します。
Sync Output 端子から出力する 5V TTL トリガー
信号を選択します。
追加ヘッドステージの情報が表示されます。
警告メッセージの表示/非表示などを設定します。

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External Command Sensitivity
各チャンネル、各モードの外部コマンドを設定します。カレントクランプはヘッドステージのゲインによってスケーリングが異なります。

カレントクランプの外部コマンドのスケーリング
モード

ヘッドステージIC

HVIC

スケーリング

最大電流

HS-9A x0.1

1 nA/Vmax ±10nA

HS-9A x1

10 nA/V

max ±100nA

HS-9A x10

100 nA/V

max ±1000nA

HS-9A x0.1

10 nA/V

max ±100nA

HS-9A x1

100 nA/V

max ±1000nA

HS-9A x101000 nA/V

max ±10000nA

Lowpass Filter Type各チャンネル、各モードのローパスフィルタを設定します。Bessel か Butterworth を選択できます。

フィルタの種類特徴
時間領域の解析に使用される。

Bessel

位相差が少なく、波形のかたちを保つ。
周波数領域の解析に使用される。

Butterworth

Bessel と比較してノイズが少ない。
オーバーシュートが発生する。

時間領域の解析：信号が時間と共にどう変化するか解析する。
周波数領域の解析：信号にどれだけの周波数成分が含まれているか解析する。

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Sync Output
Sync Output 端子から出力する 5V TTL トリガー信号を選択します。

Sync Output の設定
Tuning or Seal Test in channel 1

出力するトリガー信号
チャンネル１の Tuning, Seal Test コマンドに同期した信号

Tuning or Seal Test in channel 1

チャンネル２の Tuning, Seal Test コマンドに同期した信号

Tuning or Seal Test in selected channel

タブで選択しているチャンネルの Tuning, Seal
Test コマンドに同期した信号

Mode

モードに同期した信号

内部コマンドに同期した信号：Seal Test, Turning, Pulse, Clear, Zap
モードに同期した信号：VC(dSEVC)のとき HIGH, IC(I=0, IC, DCC, HVIC)のき LOWs

Auxiliary Headstage Information
AUXILIARY HEADSTAGE 1 と AUXILIARY HEADSTAGE 2 のコネクタに接続された、追加ヘッドステージの情報が表示されます。HS-9A, VG-9A, HS-2A, VG-2A のヘッドステージを使用できますが、HS-2A, VG-2A はアダプタケーブル（parts# 1-2100-0934）が必
要になります。

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その他
その他の機能について設定します。

チェックボックス

内容Show monitor scope

DCC, dSEVC モードのときに monitor scope ウィンドin DCC or dSEVC mode
Show warning

ウの表示/非表示を選択する。
発振検出メッセージの表示/非表示を選択する。

when coscillation suppressed
Show advanced signals

Scaled Output 端子からコマンド信号を出力できるよう

in scaled output tabs

にする。

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2.3.2. Auto タブ
自動モード変換機能の条件を設定するタブです。

IC モードから切り替えるモードを選択します。
IC モ ー ド か ら dSEVC,TEVC モードに切り換わる
条件を設定します。

dSEVC, TEVC モードから
IC モードに戻る条件を設定します。

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Switch from I-Clamp to dSEVC or TEVC
IC モードから dSEVC, TEVC モードに切り換わる条件を設定します。

Switch to voltage clamp の設定
When external mode logic goes HIGH

When external mode logic goes LOW

On negative-to-positive Vm threshold crossing

On positive-to-negative Vm threshold crossing

IC から VC へ切り換わる条件
MODE 端子に入力されている信号が HIGHになったときMODE 端子に入力されている信号が LOWになったとき測定電圧が閾値 Vm をマイナス方向からプラス方向へ変化したとき

測定電圧が閾値 Vm をプラス方向からマイナス方向へ変化したとき

Delay change to voltage clamp by：IC から VC へ切り換わるまでの待ち時間
Membrane potential (Vm) threshold：閾値 Vm

Return to I-ClampdSEVC, TEVC モードから IC モードに戻る条件を設定します。
When external mode logic
goes HIGH 以外のときは
HIGH になります。

Return to current clamp の設定
After xxms
When external mode logic goes LOW（HIGH）
Manually

VC から IC へ戻る条件
設定した時間が経過したとき
MODE 端子に入力されている信号が LOW（HIGH）になったとき
手動で IC ボタンをクリックしたとき

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2.3.3. Audio タブ
オーディオ機能を設定するタブです。

チェックすると消音します。
音量を設定します。

モードを設定します。

各モードでのオーディオ出
力信号を設定します。

Audio Mode
Audio Mode の設定

動作
測定信号をダイレクトにスピーカで鳴らすモード

Direct Signal Monitoring

例）EMG, 中枢神経のレコーディング
測定信号を周波数変換してスピーカでならすモード

Voltage Controlled Oscillator(VCO)例）細胞内記録(シールテスト、膜電位 DC モニター)＊ Axopatch 1D は VCO モードを使用しています。

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2.3.4. Quick Select タブ
Quick Select ボタンに設定ファイルを指定するタブです。

保存した設定ファイルを指定する。

クリックすると指定した設定ファイルが読み込まれる。

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2.3.5. About タブ

ACC900A のバージョンを表示します。

Axoclamp900A のハードウ
ェア情報を表示します。

ACC900A のアップデートを行います。また、定期的にアップデートを促すメッ
セージを表示することもできます。

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2.4.

メータ表示とモード選択

ヘッドステージを認識して、電流注入抵抗を表示します。
膜電位と膜電流を表示します。

トータル抵抗を

モードを選択表示します。

します。

自動モード切替の有効 / 無効を設定します。
電流注入抵抗ヘッドステージ

電流注入抵抗HS-9A x0.1

100MΩHS-9A x1

10MΩHS-9A x10

1MΩ

モード選択
モード

名称

I=0

カレントクランプ（コマンドなし）

IC

カレントクランプ（コマンドあり）

DCC

非連続カレントクランプ

HVIC

ハイボルテージカレントクランプ

dSEVC

１電極非連続ボルテージクランプ

TEVC

２電極ボルテージクランプ

トータル抵抗I=0 では使用できません。

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2.5.

各モードの設定

2.5.1. I=0 モードの設定
I=0 モードはコマンド機能が使用できないカレントクランプです。バス電位と電極容量を補正する機能のみ使用できます。また、チャンネル１と２の両方で使用することができます。

バス電位の補正機能
電極容量の補正
機能

設定項目

機能
バス電位の補正機能

Pipette Offset
Pipette Capacitance
Neutralization

マニュアル±250mV, オート±200mV
電極容量の補正機能-10～35.5pF____________________________________________________________________________
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2.5.2. IC モードの設定
IC モードはコマンド機能が使用できるカレントクランプです。I=0 モードと比較して、様々な機能が使用できます。また、チャンネル１と２の両方で使用することができます。

コマンド電流の設定

ベースラインの補正機能
電極抵抗の補正

単一パルスの大電機能

流コマンド機能
発振の検出機能

単一パルスのコマンド機能設定項目
Holding

機能
DC コマンド電流x0.1：±10nA, x1：±100nA, x10：±1000nA
ステップコマンド電流

Tuning

電流：x0.1：±100nA, x1：±1000nA, x10：±10000nA
周波数：2Hz – 5kHz
ベースラインの補正機能（トラック機能）

Inject slow current to
Maintain potential at

電圧：±1000mV
速度：20ms, 60ms, 200ms, 600ms, 2s
電極抵抗の補正機能

Bridge Balance

10MΩ, 100MΩ, 1000MΩ
単一パルスの大電流コマンド

Clear +, Clear -電流：x0.1：±100nA, x1：±1000nA, x10：±10000nA
時間：0.5s発振の検出機能

Detect oscillation, then

Disable neutralization：電極容量の補正を停止
Reduce Neutralization in 1pF Steps：電極容量の補正値
1pF に変更する。

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単一パルスの電流コマンド
Pulse

電流：x0.1：±100nA, x1：±1000nA, x10：±10000nA
時間：100μ, 200μ, 500μ, …, 100ms, 200ms, 500ms
単一パルスの電圧コマンド

Buzz

電圧：2.5V
時間：100μ, 200μ, 500μ, …, 100ms, 200ms, 500ms____________________________________________________________________________
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2.5.3. DCC モードの設定
DCC モードは非連続のカレントクランプです。非連続測定のサンプリング速度を設定する必要があります。また、チャンネル１のみで使用することができ、同時にチャンネル２は I=0, IC モード
で使用することができます。

非連続測定のサ
ンプリング

設定項目

機能
非連続測定のサンプリング速度

Rate

dSEVC モードと共通

23

2.5.4. HVIC モードの設定
HVIC モードは大電流を流すことができるカレントクランプです。IC モードと比較して、10 倍の電流を流すことができますが、様々な機能に制限があります。また、チャンネル２のみで使用することがで、同時にチャンネル１は I=0, IC モードで使用することができます。

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2.5.5. dSEVC モードの設定
dSEVC は１電極非連続ボルテージクランプです。チャンネル１のみで使用することができ、同時にチャンネル２は I=0, I モードで使用することができます。

コマンド電流の設定

ボルテージゲインの設定

発振の検出機能
単一パルスのコマンド機能設定項目
Holding

機能
DC コマンド電圧±200mV
ステップコマンド電圧

Seal Test

電圧：±1000mV
周波数：2Hz – 5kHz
電圧クランプするための設定を行います。
Gain：電圧がクランプでき、発振しない程度に Gain を増加して下さい。

V-Clamp Control

Lag：ノイズが大きい場合は増加して下さい。但し、レスポンスが悪くなるので注意して下さい。
DC Restore：大電流測定などのとき、電圧がクランプできない場合はチェックして下さい。
単一パルスの電流コマンド
Pulse

電圧：±1000mV
時間：100μ, 200μ, 500μ, …, 100ms, 200ms, 500ms

25

2.5.6. TEVC モードの設定
TEVC は２電極ボルテージクランプです。また、チャネル２のみで使用することができ、同時にチャンネル１は I=0 に固定されます。Gain 以外は dSEVC と共通設定になっています。

ボルテージゲインの設定のみ、dSEVC と個別に設定します。

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3. チュートリアル
3.1.

チェックリストセットアップとチュートリアルを確認するには以下のものが必要です。
Axoclamp 900A 本体
電源・電源ケーブル
USB ケーブル（2 本）
Axoclamp 900A Commander
PC Windows 2000, XP
２チャンネルオシロスコープ
BNC ケーブル（３本）
ヘッドステージ（４つ）HS-9A x0.1
HS-9A x1
HS-9A x10
VG-9A x100
モデルセル２つCLAMP-1U
MCO-2U
VG-9A x100 ヘッドステージと MCO-2U モデルセルはオプションです。

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3.2.

Axoclamp900A と Axoclamp Commander のセットアップ

1.

Axoclamp 900A に電源ケーブルを接続します。

2.

Axoclamp 900A のリアパネルにある CONTROL USB ポートとコンピュータのUSB ポートを USB ケーブルで接続します。

3.

Axoclamp 900A のリアパネルにある SCOPE USB ポートとコンピュータの USB
ポートを USB ケーブルで接続します。

4.

コンピュータに Axoclamp 900A Commander をインストールします。

Axoclamp 900A の電源がオンのとき、ヘッドステージを接続しても問題ありません。
ですが、Axoclamp 900A Commander を起動するときはヘッドステージが接続されていなければなりません。
5.

HS-9A x0.1 ヘッドステージをリアパネルの CHANNEL 1 HEADSTAGE INPUT に接続します。

6.

HS-9A x1 ヘッドステージをリアパネルの CHANNEL 2 HEADSTAGE INPUT に接
続します。

7.

ヘッドステージ１に CLMAP-1U モデルセルの ME1 を接続します。

8.

ヘッドステージ１のシグナルグランドソケットとモデルセルのグランドソケットを接続し、モデルセルのスイッチを BATH に設定します。

9.

各ヘッドステージとモデルセルをシールドに入れ、シールドと Axoclamp900A のシ
グナルグランドを接続します。

10. Axoclamp 900A の電源をオンにします。ウィンドウズオペレーティングシステムが２つのデバイスを認識します。
11. Axoclamp 900A Commander を起動します。自動的に Select Device ダイアログが表示されます。

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12. Scan ボタンをクリックすると Axoclamp 900A のシリアル番号が表示されます。
Axoclamp900A に貼られてシリアル番号と一致していることを確認します。
13. Reset to program Defaults ボタンを押すと警告メッセージが表示されます。”

はい”を押して警告を承認します。

Reset to program Defaults を行うと、細胞にトランジェントが印加されるので注意してください。
14. CHANNEL 1 SCALED OUTPUT とオシロスコープのチャンネル１を BNC ケーブ
ルで接続します。
15. CHANNEL 2 SCALED OUTPUT とオシロスコープのチャンネル２を BNC ケーブ
ルで接続します。
16. Axoclamp 900A のリアパネルにある SYNC OUTPUT BNC とオシロスコープの外部トリガーチャンネルを BNC ケーブルで接続します。

29

3.3.

Tutorial 1:Current Clamp (IC)1.

リアパネルの CHANNEL 1 HEADSTAGE INPUT コネクタに HS-9A x0.1 ヘッドス
テージを接続します。

2.

リアパネルの CHANNEL 2 HEADSTAGE INPUT コネクタに HS-9A x1 ヘッドステージを接続します。

3.

ヘッドスステージ１に CLAMP-1U モデルセルの ME1 を接続します。

4.

ヘッドステージのシグナルグランドソケットと CLAMP-1U モデルセルのグランドを接
続します。

5.

ヘッドステージとモデルセルをシールドの中に入れ、シールドと Axoclamp900A のシグナルグランドを接続します。

6.

Axoclamp 900A の電源を入れます。

7.

Axoclamp 900A Commander を起動します。

8.

Reset to program Defaults ボタンを押すと警告メッセージが表示されます。”

はい”を押して警告を承認します。

Reset to program Defaults を行うと、細胞にトランジェントが印加されるので注意してください。
各ヘッドステージの電流注入抵抗が表示されます。例えば、HS-9A x0.1 ヘッドステージの場合は R0:100MΩ、HS-9A x1 ヘッドステージの場合は R0:10MΩと表示されます。
9.

CLAMP-1U モデルセルのスイッチを BATH に設定し、I-CLAMP 1 タブの Pipette____________________________________________________________________________
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Offset の Zero ボタンを押します。オフセット電圧は±10mV 未満に設定されます。

10. Channel 1 Scaled Output を”Headstage 1, Membrane Potential(10mV/mV)”に設定します。
11. Tuning チェックボックスをチェックします。
オシロスコープ１で 500mV, 10Hz の矩形波を確認できます。この電圧値はモデル
セルの 50MΩ抵抗から計算できます。
計算式：1nA x 50MΩ x (10mV/mV)=500mV

12. Bridge Balance セクションの Auto ボタンを押します。

波形はゼロ付近まで減少して、Bridge resistance は 45-55MΩを表示します。再現されない場合は、Lock ボタンを押して、再度 Auto ボタンを押して下さい。また、
Bridge resistance のフィールドをクリックすれば、bridge balance resistance がグ
リッド調整できるはずです。その他のフィールドについても数値をクリックしてグリッ31

ド調整、直接入力ができます。数値を右クリックするとグリッド幅を設定できます。
設定範囲は設定項目によってことなります。
Note:Bridge Balance の Auto 機能は BATH 状態で使用して下さい。
13. 10Hz 波形のエッジに 1ms 幅のトランジェントが確認できます。このトランジェントは電極容量が原因です。

14. Pipette Capacitance Neutralization チェックボックスをチェックします。容量トラン
ジェントがゼロになるように数値を変更します。数値は 1-3pF の間になります。

15. CLAMP-1U モデルセルのスイッチを CELL に設定します。約 400mVp-p の下図のようなの三角波（積分波形）を確認できます。

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Oscillation Detection
16. Detect oscillation チェックボックスをチェックし、Disable Neutralization を選択します。

Pipette Capacitance Neutralization を 5pF に設定します。オシレイション（振動）が発生し、ポップアップダイアログが表示されます。

Pipette Capacitance Newtralization のチェックボックスは無効になります。
Pipette Capacitance Newtralization を前の数値（2pF 以下）に戻し、再度 Pipette
Capacitance Newtralization のチェックボックスをチェックします。
Note: Oscillation Detection 機能は IC, DCC, TEVC, dSEVC モードで使用でき
ますが、HVIC モードでは使用できません。

33

Slow Current Injection
17. Slow current injection (track)
この機能は実験中の電極ドリフトで発生するオフセット対策として、I-Clamp モードにおける膜電位のベースラインを維持するのに使用します。
Injection slow current to maintain potential at を選択して、10mV に設定します。

波形の歪曲が確認され、手順１５の波形と比較しても一致しません。これは“SlowCurrent”の時定数がテスト波形周波数より短いからです。また、図の赤線は平均値で、100mV（実際は 10mV）です。
Time constant を 2s に変更します。Injection slow current to maintain potential atを再設定します。平均値が安定して、テスト波形の歪曲もなくなります。

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3.4.

Tutorial 2:Discontenious Current Clamp (DCC)

Discontinuous current clamp(以下 DCC)モードは正確な電圧を測定し、特に実験中に発生する電極抵抗の微小な変化に有効です。DCC モードでは、CHANNEL 1 は電流を流すのに使用され、電圧も CHANNEL 1 で測定されます。電流注入の周期に合わせて
サンプル・アンド・ホールド回路によって測定するので、トランジェントも減少します。よって、膜電位は IR（電極）電圧効果と独立して記録することができます。
DCC モードは Bridge Balance による I-CLAMP モードと比較して、電極抵抗の微小な変化に有効です。欠点は I-CLAMP モードよりノイズが多いことです。
準備するものCLAMP-1U モデルセル
HS-9A x0.1 ヘッドステージ
HS-9A x1 ヘッドステージ
設定は Tutorial 1 手順１５の状態にします。

1.

Channel 1 を DCC モードに設定します。

2.

Rate を 10kHz に設定します。

Note: DCC モードに設定すると Scope window が表示され、monitor 波形が自動的に表示されます。

この monitor 波形の立ち上がり・立下り時間は 20μs 未満になります。ここで、トラン35

ジェントが完全に減少されていることに注目して下さい。（Figure 17：矢印のところ）
3.

オシロスコープ１の波形は IC モードの波形とよく似ていて、ノイズは約２倍程度です。

4.

I-Clamp 1 タブの Pipette Capacitance Neutralization と Rate の数値を調整して、各数値の変化における波形の変化を観察して下さい。理想的な波形を得るにはできる限り高レートにします。そうしないと波形の断片が離れ離れになって、くずれてしまいます。

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36

3.5.

Tutorial 3:Discontenious Single Electrode Voltage Clamp (dSEVC)dSEVC モードは小さい細胞のボルテージクランプに使用し、２電極のインパラには使用できません。このモードは固有の大きな直列抵抗（電極抵抗など）を除去する機能があります。
準備するものCLAMP-1U モデルセル
HS-9A x0.1 ヘッドステージ
HS-9A x1 ヘッドステージ
設定は Tutorial 1 手順１５の状態にします。
1.

Tutorial 2 の設定にして DCC モードを選択します。

2.

Channel 1 を dSEVC モードに設定します。
Note: DCC モードと dSEVC モードを選択すると monitor 波形が自動的に表示されます。

ここで、トランジェントが完全に減少されていることに注目して下さい。
（矢印のところ）最低でもスイッチング周波数（サンプリング）はトレースの２倍は必要です。
3.

Seal Test チェックボックスをチェックする。

4.

Channel 1 Scaled Output を”Headstage 1, Membrane Potential(10mV/mV)”に設定します。

37

5.

Channel 2 Scaled Output を”Headstage 1, Membrane Current(0.1V/nA)”に設
定します。

6.

オシロスコープの膜電位の波形は、立ち上がり時間約 20ms、60mV の矩形波を表示します。（実際には 6mV）10mV の電圧をプログラミングしましたが、6mV まで下がっています。つまり、高ゲインが必要となります。電流波形（IN1）でも似た反応がみられます。dSEVC タブで、Gain を 0.03nA/mV から約 0.35nA/mV に設定します。
オシロスコープに 100mV の矩形波が確認できます。（実際には 10mV）立ち上がり
時間は約 2ms になります。

7.

立ち上がりがスムーズになるように Pipette Capacitance Neutralization と Rate を調整します。Gain を増加させるとき、立ち上がりがオーバーシュートしないよう気をつけます。最適なのは、Gain が 1.5nA/mV より大きく、立ち上がり時間が 300μs
未満で、ノイズが 10mVp-p 程度です。ｘ軸のタイムスケールを広げると見やすくなります。

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8.

慣れてくると、もっと Gain を大きくして電流の立ち上がり時間を 0.5mS 未満になる
ように Pipette Capacitance Neutralization と Rate を調整することができます。

9.

ヘッドステージを CHANNEL 2 に接続し、CLAMP-1U モデルセルの ME2 に接続します。Channel 2 Scaled Output タブの Signal を”Headstage 2, Membrane
Potential(10mV/mVp-p)”に設定します。ヘッドステージ２は細胞膜電位を測定します。Channel 2 Scaled Output と Channel 1 Scaled Output は下図のように100mVp-p となり一致します。Channel 2 のスピードは容量成分の影響で少し遅くなります。これはヘッドステージ２の neutralization で最適な速度に調整できます。

39

3.6.

Tutorial 4:Two-Electrode Voltage Clamp (TEVC)

3.6.1. I. CLAMP-1U モデルセルを使用する場合

Two-Electrode Voltage Clamp は dSEVC より高速、低ノイズ、安定したボルテージクラ
ンプに適しています。しかし、細胞に２本電極を差し込む必要があり、小さな細胞では困難です。Headstage 1 は常に電圧クランプし、Headstage 2 は常に電流測定をします。
準備するものCLAMP-1U モデルセル
HS-9A x0.1 ヘッドステージ(電圧クランプ)
HS-9A x1 ヘッドステージ(電流測定)
手順
1.

2.

ヘッドステージをリアパネルのヘッドステージコネクタに接続します。
a.

HS-9A x0.1 を CHANNEL 1 HEADSTAGE に接続しますb.

HS-9A x1 を CHANNEL 2 HEADSTAGE に接続します。

接続
a.

Channel 1 SCALED OUTPUT をオシロスコープ１に接続します。

b.

Channel 2 SCALED OUTPUT をオシロスコープ２に接続します。

3.

Reset to program Defaults ボタンをクリックし、警告を承認します。

4.

モデルセル
a.

ヘッドステージ１に CLAMP-1U モデルセルの ME1 を接続します。

b.

ヘッドステージ２に CLAMP-1U モデルセルの ME2 を接続します。

c.

ヘッドステージのシグナルグランドソケットをモデルセルのグランドソケットに接
続します。

5.

CLAMP-1U モデルセルを BATH に設定して、各チャンネル I-Clamp 1 と I-Clamp 2
タブの Pipette Offset を使って電圧をゼロに調整します。

6.

I-Clamp 1 タブを選択して、電極容量を補正していきます。（I-CLAMP 1 のみ）a.

Tuning チェックボックスをチェックします。

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b.

CLAMP-1U モデルセルを CELL に設定します。

c.

Pipette Capacitance Neutralization チェックボックスをチェックします。

d.

Channel 1 のエッジがオーバーシュートする直前まで neutralization の数値を調整します。

7.

Channel 2 を TEVC モードに設定します。

8.

Seal Test のチェックボックスをチェックします。

9.

Scaled output の signal を設定します。
a.

Channel 1” Headstage 1, Membrane Potential (10mV/mV)”b.

Channel 2” Headstage 2, 0.1 x Membrane Current (1V/μV)”

10. Gain をオーバーシュート直前まで調整します。立ち上がり時間は約 200μs になります。

11. 最適な立ち上がり時間にするために、Pipette Capacitance Neutralization を 1pF
単位で増加し、Gain も増加してオーバーシュートを除去します。オシレイションを起こしたら、Pipette Capacitance Neutralization と Gain を増加してはいけません。
練習すれば、立ち上がりお時間を 100μs 未満にでき、Gain は約 350-400 になり、ノイズは 20mVp-p（細胞では 2mV）になります。オシロスコープ２の電流では、200μs 未満になります。

41

Oscillation Detection
12. TEVC タブの Detect oscillation セクションで Reduce gain 50% steps か Gain tominimum を選択します。

13. Detect oscillation, then チェックボックスをチェックします。
14. Gain をどんどん増加させるとオシレイションを起こします。オシレイションを検出す
るとメッセージが表示されます。例えば、TEVC モードでは 1000-2000 の間で発生します。

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15. 下図はオシレイションの例です。オシレイションを検出して約 2ms に戻されています。

Note: Oscillation detection は IC（両チャンネル）, DCC, dSEVC, TEVC モードで使用できます。I=0, HVIC モードでは使用できません。
3.6.2. Ⅱ. MCO-2U モデルセルと VG-9A Bath Clamp ヘッドステージを使用する

オーサイトのイオンチャネルでは電流が 50μA 以上と非常に大きいです。電流が大きい場合、バス抵抗は通常は数 kΩであり、測定誤差の大きな要因になります。
例えば、バス抵抗が 1kΩあると膜電位の測定誤差は 1mV/μA となります。加えて、リガンド依存性チャンネルでは、膜抵抗が失われます。
大電流のボルテージクランプでは厳密な測定ができません。これらの問題の対策としてバーチャルグランドヘッドステージを使用します。
準備するものMCO-2U モデルセル
HS-9A x1 ヘッドステージ
HS-9A x10 ヘッドステージ
VG-9A x100 ヘッドステージ（バーチャルグランドヘッドステージ）
手順
1.

ヘッドステージをリアパネルのヘッドステージコネクタに接続します。
a.

HS-9A x1 を CHANNEL 1 HEADSTAGE に接続します。

b.

HS-9A x10 を CHANNEL 2 HEADSTAGE に接続します。

c.

VG-9A x100 を AUXILIARY HEADSTAGE 1 に接続します。

43

2.

接続
a.

ヘッドステージ１に MCO-2U の E#1 を接続します。

b.

ヘッドステージ２に MCO-2U の E#2 を接続します。

c.

VG-9A ヘッドステージの red(sense), white(bath)ソケットと MCO-2U モデルセルの同色のターミナルを短めに接続します。（2mm ピンで接続できます）

3.

MCO-2U スイッチが 1MΩ（膜抵抗）になっていることを確かめる。

4.

Channel 1 と Channel 2 の SCALED OUTPUT BNC をオシロスコープのチャンネ
ル１と２に接続し、リアパネルにある SYNC OUTPUT BNC をオシロスコープのトリガー端子に接続してトリガーとして使用する。

5.

Reset to program Defaults ボタンをクリックして、警告を承認します。

6.

Headstage 1 の R0 が 10MΩ、Headstage 2 の R0 が 1MΩであることを確認する。

7.

Channel 1,2 の Pipette Offset をゼロに調整する。

8.

Headstage 1 の Tuning を 10.0nA に設定してチェックボックスをチェックする。

9.

Scaled Output の signal を選択します。
a.

Channel 1 は” Membrane Potential, 10mV/mV ”b.

Channel 2 は” Membrane Potential, 10mV/mV”

10. オシロスコープのチャンネル１には、+10mV のランプ波形よる+100mV のステップ
波形、-10mV のランプ波形による-100mV のステップ波形が確認できます。（実際には+10mV から-10mV）
11. ステップの立ち上がり時間は約 50μs になります。これは既に十分速いので、電極容量の補正は必要ありません。
12. 既に Headstage 2 にモデルセルの E#2 が接続されていて、オシロスコープのチャ
ンネル２は 10mVp-p の三角波を確認できます。

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13. TEVC タブの Lag を約 0.2ms に設定します。

14. TEVC モードに設定します。

15. Scaled Output を選択します。
a.

Channel 1 は”Headstage 1, Membrane Potential, 10mV/mV”

b.

Channel 2 は”Headstage 2, 0.1 x Membrane Current, 0.1V/μA”

16. Seal Test をチェックして 50mV に設定します。

17. オシロスコープチャンネル１の電圧波形のエッジをオーバーシュートする直前まで
Gain を増加させます。約 3000-3500 程度になります。オシレイションしたら Gainの増加しないで下さい。下図のような波形がよいです。

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18. MCO-2U スイッチを 10kΩポジションに変更します。オシロスコープチャンネル２では、電圧パルスを増加させると定常状態の電流が約 450mV(45μA)になります。これはボルテージクランプ電圧が 48mV まで下がってしまうのが原因です。この対策として DC Restore 機能があります。
DC Restore
DC Restore は大電流測定時に発生するステップ電圧不足を解消して、正確な電圧制御を提供します。例えば、リガンド依存性チャンネルの測定などに役立ちます。
この機能は TEVC, dSEVC モードで使用できます。
1.

DC Restore をデモするために Seal Test のチェックをはずし、Holding をチェックします。

2.

MCO-2U スイッチを 1MΩに変更します。

3.

Holding を 50mV に設定すると、Headstage 1 のメータ” V ”は 50mV を表示します。

4.

MCO-2U スイッチを 10kΩに変更します。

5.

メータ” V ”の表示は 47mV まで減少します。

6.

DC Restore をチェックします。

7.

メータ” V ”は 50mV に戻ります。DC Restore は DC Gain を大きくします。（通常1,000,000 以上）

8.

(AC) Gain を 500 まで減少しても、メータ” V ”は 50mV を維持します。AC Gain が低くても、高い DC Gain でクランプしているからです。

9.

AC Gain が低いことを検証します。DC Restore のチェックをはずすと、メータ” V ”
は 40mV まで減少します。10mV 以上が不足分となります。

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3.7.

Tutorial 5:Auto Mode Switching

通常、モード切換えはマニュアル操作で行いますが、I-Clamp から V-Clamp に自動的に切換える（V-Clamp から I-Clamp に戻す）機能があります。この自動モード
切換えには、I-Clamp から dSEVC や TEVC に切換えるときのパラメータを設定する必要があります。切換え条件は外部トリガーか、正負のスレッシュホールド Vmの判定に同期できます。
モード自動切換えを有効にするに前にI-Clamp モードを設定します。
V-Clamp モードを設定します。
I-Clamp モードから V-Clamp モードに切換える方法は２つあります。
MODE BNC に high(2-5V)か low(0-0.8V)を入力する。
ヘッドステージ１がある一定の膜電位をクランプするときの方向で決めます。
（正から負へ、または負から正へ）＊切り替え時間は 2-500ms の間で設定できます。
I-Clamp モードに戻す方法は３つあります。
マニュアル操作で戻す
MODE BNC に high(2-5V)か low(0-0.8V)を入力する。V-Clamp モードに切り替えたときが high なら、I-Clamp モードに戻すときは Low となります。
時間で戻す（2ms-500s の間で設定する）
3.7.1. Example of Auto Mode Switching

ヘッドステージ１の膜電位が負から正の方向で+20mV に達すると、ヘッドステージ２がI-Clamp モードから TEVC モードに切換わる。500ms 間は 0-10mVp-p, 10Hz Seal
Test を出力して TEVC を行い、I-Clamp に戻す。このサイクルを繰り返す。以下にこの設定をしていきます。
V-Clamp モードを設定するとき、V-Clamp タブの Oscillation Detection をチェックされていないことをよく確認して下さい。Reset to program Defaults ボタンをクリックし、警告を承認します。

47

1.

Channel 1,2 を IC モードに設定します。

2.

Scaled Output 1 signal を”Headstage 1, Membrane Potential (10mV/mV)に設
定します。

3.

Scaled Output 2 signal を”Headstage 2, Membrane Potential (10mV/mV)に設
定します。

4.

SCALED OUTPUT 1,2 をオシロスコープの１と２に接続します。

5.

I-Clamp2 タブの Tuning をチェックします。

6.

オシロスコープ１には、おおよそ 50-400mV の三角波が確認できます。

7.

TEVC タブの Seal test をチェックします。

3.7.2. Setup of Auto Mode

1.

Options ボタンを押します。

2.

Auto タブを選択します。

3.

TEVC を選択します。

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4.

On negative to positive Vm threshold crossing を選択します。

5.

Membrane potential Vm threshold を+20mV に設定します。

6.

Return to I-Clamp を 500ms に設定します。

モード自動切換えタイミングは SYNC BNC から出力されます。
7.

General タブをクリックします。

8.

Sync Output で Mode を選択します。これで、リアパネルの SYNC BNC からモードシグナルが出力されます。LOW は I-Clamp、HIGH は V-Clamp です。

9.

ダイアログを閉じます。

10. オシロスコープ１を Headstage 1 SCALED OUTPUT に接続します。
11. オシロスコープ２を Headstage 2 SCALED OUTPUT に接続します。

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12. headstage 2 のメータの下にある Switch to TEVC on ext input チェックボックスをチェックします。

下図は波形の結果です。

波形の説明です。
I-Clamp モードでは始めは膜電位がゼロになっています。
Headstage 2 は 1nA の電流を注入しています
Headstage 1 の電流波形の 50ms 付近に注目すると、立ち上がりの膜電位（アクションポテンシャル）が見られます。
膜電位が 20mV に到達すると V-Clamp(TEVC)モードに切換わります。
0-10mV, 10Hz の Seal Test が始まります。
V-Clamp(TEVC)に切換わった 500ms 後、I-Clamp モードに切換わります。
これを繰り返します。

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3.8.

Tutorial 6:High-Voltage Current Clamp (HVIC)

ハイボルテージカレントクランプ（HVIC）はヘッドステージ２のみで使用できます。HVIC
は大電流を必要とする細胞外イオン導入や、電極抵抗が大きいときなどに使用されます。例えば、1μA 電流を CLMAP-1U にモデルセルに導入したいなら、100V 以上のダ
イナミックレンジが必要となります。
欠点は、電極容量の補正ができず、通常のカレントクランプに比べて、スピードも遅く、ノイズも大きくなります。
Note:10nA 以下の電流を使用する場合は、オフセット電圧を確認が発生する場合があります。その場合は、ホールディング電流を使用して削除して下さい。
準備するものCLAMP-1U モデルセル
HS-9A x1 ヘッドステージ
手順1.

HS-9A x1 を HEADSTAGE 2 コネクタに接続します。

2.

HEADSTAGE 1 には何も接続しません。

3.

HS-9A x1 ヘッドステージに CLAMP-1U モデルセルを接続し、HS-9A ヘッドステー
ジのシグナルグランドソケットと CLMAP-1U モデルセルのグランドソケットも接続します。

4.

Reset to program Defaults ボタンをクリックし、警告を承認します。

5.

Headstage 2 タブの HVIC モードを選択します。

6.

I-CLAMP 2 タブにおいて、Tuning を 1000nA に設定してチェックボックスをチェック
します。

7.

オシロスコープ１と SCALED OUTPUT 1 を接続します。

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8.

Channel 1 SCALED OUTPUT signal を”Headstage 2, 0.1xMembran Potential”に設定します。

9.

オシロスコープ２と SCALED OUTPUT 2 を接続します。

10. Channel 2 SCALED OUTPUT signal を”Headstage 2, 0.1xMembran Current”に設定します。

この波形の形は通常のカレントクランプとよく似ています。しかし、スピードも遅くなり、振幅は大きくなっています。（±180Vp-p）
11. signal が”Membrane Potential(1mV/mV)”のとき、膜電位が±10Vp-p 未満なら、
Bridge Balance を使用できます。
12. Tuning を 100nA に設定します。
13. “Membrane Potential(1mV/mV)”を選択します。

14. Bridge Balance チェックボックスをチェックして、50MΩ付近に設定します。

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15. HVIC では Bridge Balance が 50.1MΩになります。
電圧トレースの 1ms スパイクは HVIC のレスポンス遅れが原因です。