NMR 及び Cryo-TEM 併用によるエマルション中の化粧品原料の分散・溶解状態の定量的評価基盤の確立
千葉大学大学院薬学研究院

植田圭祐

This study aimed to investigate the effect of different types of oil used in emulsions on the supersaturated dissolution
behavior and liquid-liquid phase separation (LLPS) of active ingredients. Labrafil® M 1944 CS (M1944, hydrophiliclipophilic balance (HLB): 9.0) and LabrafacTM PG (PG, HLB: 1.0) were used as oils with different hydrophobicity.
Fenofibrate (FFB) was used as a model active ingredient that is poorly water-soluble. Cryo-TEM observations showedemulsion droplets less than 20 nm in diameter and FFB-rich droplets ranging from several tens nm to over 100 nm indiameter in each emulsion. 1H NMR analysis indicated that M1944 had minimal impact on the molecular environment of
the FFB-rich phase. In contrast, the distribution of PG into the FFB-rich phase in the PG emulsion changed the molecularenvironment of the FFB-rich phase. This change reduced the chemical potential of the FFB-rich phase and, consequently,
the FFB concentration dissolved in the bulk water. The present study clarified that LLPS of FFB occurs even in emulsions,forming the FFB-rich phase. The LLPS behavior of FFB varied depending on the type of oil used in the emulsion. Highlyhydrophobic PG was liable to partition into the hydrophobic active ingredient-rich phase and reduce the concentration of
the active ingredient dissolved in the bulk water. To improve the absorption of active ingredients in supersaturation-forming
emulsion formulations, it is important to consider the effect of emulsion components on the LLPS of the active ingredient.

１．緒

ション構成成分と適応部位の相性や、エマルション構成成

言分と有効成分の相溶性等によって変化する。しかし、有効エマルションは化粧品や医薬品有効成分の吸収性や使用成分の吸収性を最大化するためのエマルション設計指針は感の向上等を目的として、様々な用途に用いられている。

未だ確立されておらず、製品開発は依然トライ＆エラーの

近年では脂質製剤の一種である自己乳化型マイクロエマル状況である。これはエマルション中における、有効成分のション製剤（SMEDDS 製剤 : Self-microemulsifying drug

分子状態について十分な評価基盤が確立されていないためdelivery system）が広く研究されている。SMEDDS 製剤である。例えば、水中油（O/W）型のエマルションを例には oil、surfactant、co-surfactant で構成される脂質製剤で挙げると、有効成分は水相及び油相中に分配することに加あり、水との接触により自己乳化し、マイクロエマルシえて、界面活性剤により形成されたミセル中にも分配する。

ョン（Microemulsion, ME）を形成する 1 - 2）。ME は一般的過飽和形成型の製剤において有効成分濃度が非晶質溶解度なエマルションのように水や oil 等の 2 種類の液体を含むに達すると、有効成分は単分子状態でバルクの水中に溶解一方、oil が直径 100 nm 以下の膨潤ミセルとして水溶液にすることができずに水相と有効成分濃縮相に相分離を起こ分散した熱力学的に安定な分散系である。ナノサイズ化にすことが報告されている。この現象は液―液相分離（LLPS）よる液滴の表面積の増大により、有効成分が効率的に水中と呼ばれる 4）。有効成分濃縮相は有効成分のリザーバーとに放出される。このような利点から難溶性成分の吸収性改して機能する一方、バルクの水中に溶解した有効成分濃度

善において SMEDDS 製剤の有用性が示されている。また、は非晶質溶解度で維持されるため、過飽和形成による吸収近年では過飽和形成型の SMEDDS 製剤が有効成分の更な性向上は LLPS により制限される 5）。エマルション中でもる吸収改善を目的として研究されている 3）。過飽和形成型

同様に有効成分濃度がある一定の濃度以上になるとバルクの SMEDDS 製剤ではバルクの水中に溶解した有効成分濃の水相から有効成分が LLPS を起こすと考えられるが、oil度が結晶溶解度以上に到達しており、受動拡散による吸収を含むエマルションにおける有効成分の LLPS 現象についを効果的に改善する。ては十分な研究が行われていない。
そこで本研究では、SMEDDS 製剤構成成分が有効成分エマルションからの有効成分の吸収は、一般的にエマルの過飽和溶解挙動に及ぼす影響の評価を目的として、核Development of quantitative evaluation
methodology of cosmetic ingredients inemulsions by combined use of NMR
and Cryo-TEM

磁気共鳴法（NMR）及び極低温透過型電子顕微鏡（cryoTEM）を組み合わせた、エマルション中の有効成分の分散・溶解状態の定量的評価技術確立を目的とした検討を行った。

Keisuke Ueda
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University− 10 −

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２．方とにより SMEDDS 製剤を得た。調製した SMEDDS 製剤に法対して難水溶性モデル有効成分として Fenofibrate（FFB）

2 . 1 . 試料調製を加え、完全に溶解させることで FFB 封入 SMEDDS 製®

Oil と し て 疎 水 性 の 異 な る Labrafil M 1944 CS剤を調製した。FFB 未封入 SMEDDS 製剤及び FFB 封入（M 1944 , Hydrophilic-Lipophilic Balance（HLB）= 9 . 0） 及

SMEDDS 製剤を PBS に分散させることにより ME を調製

び LabrafacTM PG（PG, HLB=1 . 0）を用 いた。Surfactant

した。同様の調製法により、oil を含まない HCO 40 ミセルとし て NIKKOL HCO- 40（HCO 40 , HLB=12 . 5)及 び co-溶液及び oil、surfactant を含まない blank 溶液も調製した。

®

surfactant として Transcutol P を そ れ ぞ れ 用 い た。Oil,

調製した各試料の組成を Table 1 に示す。

surfactant, co-surfactant を秤量し、40 ℃にて混合するこ

Table 1 Composition of samples（unit: g）．FFB dose in FFB-loaded samples represents in parentheses.

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2 . 2 . Cryo-TEM 測定

液滴の形成が示唆された。加えて、PG 濃度が最も高い PG

JEM- 2100 F を 用 い て、 加 速 電 圧 120 kV で cryo-TEMME（oil 0 . 1）の cryo-TEM 画像中においても FFB 濃縮相に由来する液滴が認められたことから、今回調製したすべ測定を行った。ての PG ME において、見かけの FFB 非晶質溶解度は FFB

12 . 3 . 溶液 H NMR 測定

仕込み濃度（1000 µg/mL）以下であることが示唆された。

JNM-ECZ 600（14 . 1 T）を用いて 1 H NMR 測定を行った。
DANTE presaturation による水消しを用い、37 ℃におい更に、PG 含量の増加に伴い FFB 濃縮相液滴のサイズが小さくなったことから、PG の共存が FFB 濃縮相液滴サイズに影響を及ぼすことが認められた。

1て H NMR スペクトルを取得した。

３．結 果

3. 2.

1H NMR 測定による分子状態評価

3 . 1 . Cryo-TEM による FFB 封入 ME の形態評価

Fig. 3 に は FFB 封 入 M 1944 ME の 1 H NMR ス ペ ク

M 1944 ME（oil 0 . 01） 及 び M 1944 ME（oil 0 . 02） でトルにおける FFB の芳香環プロトン部分の拡大図を示

は、直径約 20 nm の膨潤ミセル由来の液滴に加えて直径す。M 1944 濃度が 0 . 03 % 以下の FFB 含有 M 1944 ME の150 nm 程 度 の 大 き な 粒 子 が 観 察 さ れ（Fig. 1）、FFB 濃NMR スペクトルにおいては、水相に溶解した FFB 及び縮相の形成が示された。また、FFB 封入 M 1944 ME（oilFFB 濃縮相に由来するピークがそれぞれ認められ、FFB0 . 03）で は 20 nm 程 度 の膨潤ミセルに加えて 100 nm 程が M 1944 ME 中において FFB 濃縮相を形成したことが示度の FFB 濃縮相液滴と考えられる粒子が観察された。一された。波形分離により得られた各相の FFB のピークの方、M 1944 ME（oil 0 . 05）及び M 1944 ME（oil 0 . 1）では、面積値から水相及び FFB 濃縮相中に存在する FFB 量を算直径 20 nm 程度の膨潤ミセルのみが観察された。これら出した（Fig. 4 a）。M 1944 含量の増加に伴い水相中の FFBの 結 果 か ら、M 1944 ME（oil 0 . 05）及 び M 1944 ME（oil濃度が増加し、FFB 濃縮相量が減少した。この結果か0 . 1）中では仕込み FFB すべてが膨潤ミセル中に可溶化さら、FFB 濃縮相存在下における ME 中の FFB 濃度、すなれ、FFB 濃縮相が形成されなかったと考察した。すなわ

わち見かけの非晶質溶解度は M 1944 の増加に応じて増加

ち、これらの溶液中における見かけの FFB 非晶質溶解度することが示された。また、M 1944 濃度が 0 . 05 % 以上のは FFB 仕込み濃度（1000 µg/mL）以上であることが示唆

M 1944 ME では溶解 FFB 濃度が仕込み FFB 濃度と同様のされた。

値となり、すべての FFB が ME 中に溶解した状態である

FFB 封入 PG ME について cryo-TEM 測定を行った結ことが確認された。

果、 直 径 10 ~ 20 nm 程 度 の 膨 潤 ミ セ ル に 加 え て 直 径 約

FFB 濃縮相中に由来する FFB ピークのケミカルシフ

50 ~ 100 nm 程度の粒子が観察され（Fig. 2）、FFB 濃縮相

トは M 1944 濃度に依存せず一定であった（Fig. 3）。更に、

Fig. 1 Cryo-TEM images of FFB-loaded M1944 ME. The arrows indicate FFB-richphases.

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Fig. 2 Cryo-TEM images of FFB-loaded PG ME. The arrows indicate FFB-richphases.

Fig. 3 1H NMR spectra of aromatic region of FFB in FFBloaded M1944 ME.

NMR スペクトルにおいて認められた M 1944 ピークの面積値から算出した FFB 封入 M 1944 ME の水相に存在するM 1944 量は仕込み M 1944 量と一致しており、ほぼすべての M 1944 が水相に存在することが確認された（Fig. 4 b）。
以上の結果から、M 1944 の添加は FFB 濃縮相中の FFB のFig. 4（a）Dissolved FFB in aqueous phase and phaseseparated FFB concentrations calculated by the FFB peakarea.（b）M1944 concentration in aqueous phase.

分子環境に影響を及ぼさないことが示された。
Fig. 5 に FFB 含有 PG ME の 1 H NMR スペクトルにおける FFB の芳香環プロトン部分の拡大図を示す。PG 濃度められた。一方、PG 含量の増加に伴い、FFB 濃縮相に由が 0 . 05 % 以下の PG ME においては、溶解 FFB に由来す来するピークが低磁場シフトし、PG ME（oil 0 . 1）のスペるピーク及び FFB 濃縮相に由来するピークがそれぞれ認

クトルにおいては各相の FFB ピークの波形分離が行えな− 13 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

Fig. 5 1H NMR spectra of aromatic region of FFB in FFBloaded PG ME.

かった。しかし、cryo-TEM を用いた解析より、FFB 含有 PG ME（oil 0 . 1）中においても FFB 濃縮相の形成が示されていることから、PG ME（oil 0 . 1）の NMR スペクトル中では FFB 濃縮相に由来するピークが水相に溶解したFFB ピークと重なっていると考察した。Fig. 6 a には波形分離により得られたピークの面積値より算出した水相及びFFB 濃縮相中の FFB 量を示す。水相及び FFB 濃縮相中のFFB 量は PG 仕込み量を変化させてもほとんど一定であった。この結果から、FFB 濃縮相存在下における水相中のFFB 濃度、すなわち見かけの非晶質溶解度は PG 濃度にかかわらずほぼ一定であることが示唆された。
先にも述べたように FFB 濃縮相に由来する FFB ピー
クは PG 量の増加に伴い大きく低磁場シフトした（Fig. 5）。
また、NMR 測定結果の解析から、一部の PG が FFB 濃縮相に分配していることが示されており、PG の混合によりFFB 濃縮相の分子環境が変化したことが示された。NMR

Fig. 6（a）Dissolved FFB in aqueous phase and phaseseparated FFB concentrations calculated by the FFB peakarea.（b）PG concentration in aqueous phase.（c）Weightratio of PG to FFB in FFB-rich phase（n = 3, mean ± S.D.）．

スペクトル上の PG ピークの面積値から水相及び FFB 濃縮相中の PG 量を算出した結果（Fig. 6 b）
、水相及び FFB 濃縮相に存在する PG 量は共に PG 含量の増加に伴って増加４．考した。FFB 濃縮相量及び FFB 濃縮相中に分配した PG 量

察から FFB 濃縮相中の FFB に対する PG の質量比を算出しFig. 7 には各 ME 中における FFB 分散状態の模式図を示た結果（Fig. 6 c）
、PG 仕込み量の増加に伴い、FFB 濃縮相す。M 1944 ME 中では M 1944 濃度の増加に伴い可溶化さ中の PG 比率が増加することが示された。従って、PG 仕込れる FFB 量が増加し、見かけの FFB 非晶質溶解度が上昇み量の増加に伴う FFB 濃縮相への PG 分配量の増加によりした。一方、NMR 測定結果より、FFB 濃縮相の分子環境FFB 濃縮相の分子環境がより大きく変化し、FFB 濃縮相は M 1944 の共存により変化しないことが示された。以上

中の FFB ピークがより低磁場側へシフトしたと考察した。の結果から、M 1944 ME 中のバルクの水中の最大 FFB 濃度は FFB 本来の非晶質溶解度（~ 4 . 5 µg/mL）で一定となり、− 14 −NMR 及び Cryo-TEM 併用によるエマルション中の化粧品原料の分散・溶解状態の定量的評価基盤の確立

Fig. 7 Schematic illustration of FFB dissolved state in（a）M1944 ME and（b）PG
ME.

FFB 濃縮相の形成が認められた M 1944 濃度範囲では膨潤に伴い FFB 濃縮相中に分配した PG 量が増加し、バルクのミセルに可溶化された分だけ溶解有効成分濃度（= 見かけ水中に溶解可能な最大 FFB 濃度が減少したと考えられた。の非晶質溶解度）が上昇したと考察した。一方、M 1944

PG 濃度依存的にバルクの水中に溶解した FFB 濃度が低下

濃度 0 . 05 % 以上の ME 試料では FFB 濃縮相が形成されてした結果、膨潤ミセルによる可溶化作用が PG 濃度依存的おらず、本試験で用いた FFB 仕込み濃度（1000 µg/mL）に増加したにもかかわらず、見かけの FFB 非晶質溶解度が ME 中における見かけの非晶質溶解度に到達していないが PG ME 中において一定になったと考察した。

ことが示された。

５．総

一方、PG ME では PG 含量にかかわらず、水相に溶解し括た FFB 量がほとんど変化せず、すべての系において FFBNMR を用いた解析により ME 中に用いる oil が有効成濃縮相形成が認められた。M 1944 ME と比較して PG ME分の過飽和溶解挙動に大きな影響を及ぼすことが示されは FFB の可溶化作用が弱いことが示されている一方、ミた。M 1944 の添加は FFB のバルクの水中における過飽和セル溶液と比較して PG ME（oil 0 . 1）中において FFB 溶解度を低下させるリスクは小さかった一方、M 1944 濃度が度が改善していることが示されており、少なくとも PG 添高い場合、M 1944 の強い FFB 可溶化能力によって、バル加により FFB 可溶化作用は強くなっていると推察される。

クの水中における FFB 過飽和度は低下することが示され

一 方、FFB 封 入 PG ME の NMR 解析 より、PG は FFB 濃た。一方、PG の添加は PG の FFB 濃縮相中への分配によ縮相に分配することが示されている。有効成分濃縮相へのり FFB の到達可能な最大過飽和度を直接的に低下させた。

添加剤成分の分配は有効成分濃縮相中の有効成分の化学ポ

このようにエマルション中のオイルは有効成分の過飽和溶テンシャルを低下させ、有効成分濃縮相と平衡状態にある解挙動や LLPS 挙動に大きな影響を及ぼし、分子状態評価

バルクの水中にフリーで溶解する有効成分濃度を減少させに基づく最適なエマルション組成選択が、ME を活用したることが報告されている

6 - 7）。PG ME では PG 含量の増加吸収改善において重要であると考えられた。本研究より、− 15 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

エマルション中の有効成分の分散状態の定量的評価におけ

４）G. A.Ilevbare, L. S. Taylor Liquid‒liquid phaseseparation in highly supersaturated aqueous solutions

る NMR の有用性が示された。

of poorly water-soluble drugs: Implications for
謝辞

solubility enhancing formulations. Cryst. Growth Des.
1497-1509, 2013.
13（4），

本研究を遂行するにあたり、ご援助を賜りました公益財
団法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上５）A. S. Indulkar, Y. Gao, S. A. Raina，G. G. Z. Zhang,
L. S. Taylor Exploiting the phenomenon of liquid­

げます。

liquid phase separation for enhanced and sustained（引用文献）

membrane transport of a poorly water-soluble drug.

１）C. W. Pouton Formulation of self-emulsifying drug

Mol. Pharm. 13（6）, 2059-2069, 2016.

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formulations and drug supersaturation: harnessing

phase behavior and implications for combination

the unique benefits of the lipid digestion/absorption

products. J. Pharm. Sci. 104（8），2583-2593, 2015.

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