関東森林研究論 文69-2(2018)

野外でのマツノザイセンチュウ接種において接種後の降雨が影響するタイミング
Effect time between inoculation and precipitation on the effectiveness of Bursaphelenchus xylophilus onpines in an artificial inoculation test at an open-air nursery山野邉太郎＊1
Taro YAMANOBE＊1＊１ 森林総合研究所林木育種センター
Forest Tree Breeding Center, Forestry and Forest Products Research Institute, Hitachi 319-1301
要旨：マツノザイセンチュウ抵抗性育種事業における抵抗性個体のスクリーニングにおいては，野外の苗畑で育成した多数のマツ個体にマツノザイセンチュウを人工接種する必要がある。しかし，発病に適した人工接種の時期は 7月上旬～7 月下旬で，その大半が梅雨にあたる。マツノザイセンチュウは水懸濁液の状態で接種されることから，接種後に降雨があった場合，接種部位から接種源が流亡することが危惧される。本報告では，接種と降雨の間隔がどの程度であれば接種が有効になるかを検証するため，夏季に線虫接種を行った後に接種部位に水を流す処理を行し，冬期に生存率を調べ，水を流さない場合と比較した。120 分後から 10 分後の流水は生存率に影響を及ぼさなかったが接種直後の流水は生存率を高めた。このことから，野外におけるマツノザイセンチュウ接種による抵抗性個体のスクリーニングにおいて，接種に引き続くような降雨がない範囲において，接種後の降雨が影響することはきわめてまれであると推察された。
キーワード：人工接種，流水処理，生存率，アカマツ，クロマツ
Abstract: Artificial inoculation of Pinus densiflora and Pinus thunbergii with Bursaphelenchus xylophilus in an open-air nursery isnecessary for screening resistant clones from an enormous number of candidates because green houses have limited space capacityas compared to an open-air nursery. The appropriate season for a higher incidence of infection by artificial inoculation is aroundJuly. In Japan, this is the season when the temperature reaches above 25 °C, which promotes pine wilt disease; additionally, it israiny. Precipitation following inoculation could trigger the failure of the artificial inoculation because the inoculum is an aliquot ofwater suspension of the nematodes that could be washed away from the inoculation point. This could result in a higher survival rate,
thus skewing results. To determine the sufficient interval between inoculation and precipitation for effective inoculation, the time
between inoculation and water flow was measured in relation to the development of an infection. Water flow immediately following
inoculation lead to a higher survival rate than artificial inoculation without water flow, whereas water flow 10 minutes to 120 minutes
after inoculation did not affect survival rates compared to artificial inoculation without water flow. We determined that a sufficientinterval between the inoculation and precipitation for effective inoculation to screen resistant clones is 10 minutes or more.
Key-word: Artificial inoculation, Water flow treatment, survival rate, Pinus densiflora, Pinus thunbergii

Ⅰ はじめに執すると，施設の面積により年度ごとの接種本数が抑制

日本のマツノザイセンチュウ抵抗性育種における抵抗され，抵抗性育種事業の進捗が滞りがちになる。近年で性個体のスクリーニングでは，毎年，多数のアカマツ個は，日本各地のマツノザイセンチュウ抵抗性育種担当者

体およびクロマツ個体に，マツノザイセンチュウを水懸の知見の蓄積により，7 月中を目途に，天気予報を活用濁液の接種源に調整し，露出させた木部に滴下し接種しし，接種前後に気温が高くなる時間が多くなるタイミンている(以下，「人工接種」)。マツ材線虫病は気温 25℃以グを見計らい人工接種を行うことで，露地の苗畑に植栽上において発病が促進されるため(3)，人工接種をビニルしたマツにおいても安定的に高い発病率が確保できるよハウス等の保温しやすい施設内で行うことで高い発病率うになってきている。

を得ることができる。しかし，施設内での人工接種に固－一方，7 月はその大半が梅雨時期のため，人工接種に1 －(受理日 2018 年 3 月 1 日)

対する降雨の影響については，露地における接種の試行

紙面の都合上略号で記載する。これら被接種マツは 2 年段階から何点か危惧がされる点があった。まず，施設内

3 ヶ月生の夏季にマツノザイセンチュウを接種した。流接種において潅水による生存率が高まる事例があり(6)，

水処理は，接種後一定の時間が経過した後に接種部位に降雨による被接種マツ個体への水分供給で感受性個体の水を流す処理を行い，水を流さない場合(以下，「通常」)淘汰圧が下がることが危惧された。この点については倉と比較した。接種から流水処理までの間隔については，

本ら(5)によって接種後 8 週間および接種前後 21 日間の家系毎に，処理する個体順を決め，接種および流水処理

降水量は，接種試験における生存率に影響しない結果が各々について開始と終了の時刻を記録した。接種と流水示され，問題にならないことがわかった。次に，接種直処理の開始時刻間および終了時刻間の時間差を算出し，前に相当量の降雨があると，被接種マツ個体の皮層に水最小値および最大値をそれぞれ最短および最長の間隔で分が多く含まれた状態になり，この水分が呼び水になっあったと仮定すると，120 分後流水処理(以下，「120 分て滴下した接種源の大部分が露出させた木部の外へ流れ後」)は 115 分後～131 分後(最短～最長，以下同じ)，60出てしまう点である。この点については，危惧でなく実分後流水処理(以下，「60 分後」)は 56 分後～72 分後，10際に起こる現象であり，現在のところ生存率への影響が分後流水処理(以下，「10 分後」)は 8 分 50 秒後～10 分確認されたことはないが，降雨がない時間の継続に伴っ53 秒後の範囲であった。処理後の被接種マツは，露地のて皮層に含まれる水分が低下することを待ち，一部接種場合は潅水せず，ガラス室内の場合は用土全体が濡れる木を供試し，滴下した接種源が露出させた木部の外へ漏程度の潅水を週 2 回行い，観察まで養生した。観察は，れださなくなることを確認してから接種による抵抗性個外観がすべて褐変しているものを枯死，それ以外を生存体のスクリーニング作業を開始することで対応している。

として記録した。

さらに，接種後の降雨により接種部位上で流水が発生し，2002 年は 120 分後と 60 分後についてそれぞれ通常と接種したマツノザイセンチュウが露出させた木部から流比較した。被接種マツはクロマツとしその家系は，120 分れ出てしまう点も危惧されてきた。戸田(7)には，降雨前後では波方 37 号，波方 73 号，小浜 30 号および田辺 54

1 時間を目安に接種を終えることが指南されているが，号，60 分後では，頴娃 425 号，三崎 90 号，大瀬戸 12

この記述は，接種 30 分後に接種部位を水で洗い，こぼ号，志摩 64 号および津屋崎 50 号を使用した。家系と処れ落ちた水の中に少数の生存線虫と多数の死亡線虫を確

理の組み合わせごとの供試本数は，35～66 本であった

認した経験を保守的にとらえたことによっている(戸田，(表―１)。接種および流水処理は苗畑の露地において 25

私信)。この点について，実際の接種試験による判断が行本/m2 で育成したマツに行った。流水処理は家系内の本われてきていない。

数を問わず 1 家系あたり 18L の水道水をジョウロを用

本研究では，上記の接種終了の目安について，接種試いて，接種部位にかけた。接種および流水処理は 2002 年
8 月 5 日に行い，同年 11 月 25 日に観察した。

験における生存率で検証した。

2003 年は 60 分後と 10 分後に通常と比較した。被接種マツはクロマツとしその家系は，波方 37 号，波方 73

Ⅱ 材料および方法試験の概要を表－１に示す。試験は 2002 年，2003 年号，三崎 90 号，津屋崎 50 号および田辺 54 号とし，家および 2006 年に行った。試験はいずれも国立研究開発系と処理を直交させた。家系と処理の組み合わせごとの法人森林研究・整備機構森林総合研究所林木育種センタ

供試本数は，9～11 本であった(表―１)。接種および流水ー関西育種場(岡山県勝田郡勝央町)構内で行った。試験処理は，素焼きの 8 号鉢に 2 本植えしガラス室で育成しに用いた被接種マツはいずれも林木育種センターで公表たマツに行った。流水処理は駒込ピペットで 1 本あたりしている優良品種を母樹とする自然交配家系であるが，20ml の滅菌水を滴下した。接種および流水処理は 2003

表－１．試験概要(家系数(家系内本数))
Table 1. Design of test (No. of family (No. of subjects per family))
接種年

樹種

植栽

施設

2002

クロマツ

苗畑2003

クロマツ

2006

アカマツ

処理
通常

120 分後

60 分後露地

9(42-64)4(46-62)5(35-66)

素焼鉢

ガラス室

5(9-11)5(9-11)5(9-11)

素焼鉢

露地

4(16)

4(12-16)

4(16)

－2 －

10 分後

直後

疑似無処理

4(16)

4(8)

4(8)

関東森林研究年 7 月 23 日に行い，2004 年 1 月 5 日に観察した。

69-2(2018)2002 年の試験では，120 分後および 60 分後ともに，2006 年は 60 分後，10 分後，接種直後について通常と通常との差異は認められなかった(逸脱度検定，120 分後比較した。また，ネガティブコントロールとして水を擬でχ2(d.f.=1) = 0.02 (p=0.88) (図－１)，60 分後 でχ2(d.f.=1)

似的に接種する処理(以下，「擬似」)と接種も流水処理も= 3.39 (p=0.07) (図－２))。2003 年の試験では，流水処理しないマツ(以下，「無処理」)も準備し，観察した。被接間に差は認められなかった(逸脱度検定，χ2(d.f.=2) = 0.56

種マツはアカマツとしその家系は，新居浜 7 号，大分 203(p=0.76)，図－３)。2006 年の試験では，流水処理間に差号，佐賀関 118 号および総社 39 号とし，家系と処理をが認められ(逸脱度検定，χ2(d.f.=3) = 57.80(p<0.005))，2 処直交させた。
家系と処理の組み合わせごとの供試本数は，理間の比較で，接種直後の流水は他の処理より生存率が60 分後，10 分後，接種直後および通常が 12～16 本，擬高くなった(Family wise-error rate，p<0.05)(図－４)。

似および無処理が 8 本であった(表―１)。接種および流水処理は，素焼きの 8 号鉢に 2 本植えし露地で育成したマツに行った。流水処理は駒込ピペットで 1 本あたり20ml の滅菌水を滴下した。接種および流水処理は 2006
年 7 月 31 日に行い，2006 年 12 月 12 日に観察した。
解析は，2002 年は流水処理ごとに，他は年ごとにデータセットを作成し(2006 年の擬似および無処理は解析対象から除外)，応答変数を被接種マツ個体の生死，説明変数を流水処理(通常を含む，固定効果)ならびに家系(変量効果)とする一般化線形混合モデルで行った(R バージョン 3.4.1，lme4 パッケージの glmer，誤差構造は二項分布を仮定)。家系については切片として関与するモデル(以下，「m1」)，傾きとして関与するモデル(以下，「m2」)および，切片と傾き双方に独立して関与するモデル(以下，「m3」)の 3 通りを試行し，AIC 最小のものを採用した(4)。採用されたモデルについては Pearson のχ2 と残差自由度から Dispersion Parameter を算出し過分散の傾向の有無について確認を行った(2)。また，逸脱度検定を

図－１．2002 年における通常接種(通常)と接種 120 分
後流水処理(水 120)との生存率の違い
棒グラフおよび点がそれぞれ処理ごとの平均生存率と各家系の生存率である。
Fig.1 Difference in survival rates between no waterflow and water flow 120 minutes after inoculation in
2002.
Bars and dots are average of survival rates in thesame treatment of water flow and survival rates ofeach family within the same treatment of water flow,respectively.

行い，処理に有意差が検出された際には，2 処理間の総当りの逸脱度検定で得られる p 値を用いて，False
Discovery Rate(Benjamini & Hochberg(1)) に よ り
Family-wise error rate が p<0.05 となる処理の組み合わせを多重比較により検出した。
Ⅲ 結果および考察
2006 年の試験における擬似および無処理においては枯死が認められなかったことから，2006 年の試験の枯死は線虫により引き起こされたことが確かめられた(図－4)。おそらく，2002 年および 2003 年の試験にもこのことは当てはまると推察される。
解析モデルは，すべてにおいて m1 が採用され，そのDispersion Parameter は，2002 年の 60 分後，2002 年の 120 分後，2003 年および 2006 年でそれぞれ 0.99，0.95，1.04 および 0.98 で，二項分布に仮定されている
Dispersion Parameter＝1 に近かった。このことから，

図－２．2002 年における通常接種(通常)と接種 60 分後流水処理(水 60)との生存率の違い
棒グラフおよび点がそれぞれ処理ごとの平均生存率と各家系の生存率である。
Fig.2 Difference in the survival rates between nowater flow and water flow 60 minutes after
inoculation in 2002.
Bars and dots are the average survival rates in thesame treatment and family within the same
treatment of water flow, respectively.

仮定した誤差構造は妥当なものと判断された。

－3 －(受理日 2018 年 3 月 1 日)

これらのことから，接種直後に強い降水がない限り，降雨により接種部位上での流水が発生し，接種したマツノザイセンチュウが露出させた木部から流れ出て，生存率が高くなることはおそらくないと推察された。
よって，
戸田(7)による降雨前 1 時間を目安に接種を終える指南は妥当であることが確認された。近年では雨雲レーダーによる降水予測がインターネットで容易に閲覧できるため，接種試験中に降水予測を確認し，降水予測の誤差を保守的にとらえたとしても降雨 30 分前を目安として接図－３．2003 年における通常接種(通常)，接種 60 分後流水(水 60)および接種 10 分後流水(水 10)における生存率の違い
棒グラフおよび点がそれぞれ処理ごとの平均生存率と各家系の生存率である。
Fig.3 Difference in survival rates between no waterflow, water flow 60 minutes after inoculation, andwater flow 10 minutes after inoculation in 2003.
Bars and dots are the average survival rates for thesame treatment and family within the same
treatment of water flow, respectively.

種作業を終えれば，梅雨の合間の降水のない時間帯を有効に活用して，より効率的な抵抗性個体のスクリーニングが行えると期待される。
謝辞：元林木育種センター九州育種場の戸田忠雄氏には，降雨前の目安作成の推移について情報提供をいただいた。
森林総合研究所林木育種センター関西育種場の諸氏には材料育成，試験補助について多大なご協力をいただいた。
以上の方々に，厚く御礼申し上げる。
引用文献
(1)

BENJAMINI,Y.,

HOCHBERG,Y.

(1995)

Controlling the false discovery rate: a practical andpowerful approach to multiple testing. Journal of theRoyal Statistical Society. Series B (Methodological) 57:
289-300(2) 大東健太郎 (2010) 線形モデルから一般化線形モデ
ルへ(GLM)へ．雑草研究 55: 268-274(3) 清原友也 (1973) マツノザイセンチュウを接種したクロマツ苗の発病に及ぼす温度の影響．日林講 84：334図－4．2006 年における通常接種(通常)，接種 60 分後流水処理(水 60)，接種 10 分後流水処理(水 10)，接種直後流水処理(水直後)，水接種(擬似)および無処理における生存率の違い
棒グラフおよび点がそれぞれ処理ごとの平均生存率と各家系の生存率である。同じアルファベット間に有意差は認められない。
Fig.4 Difference in survival rates between no waterflow, water flow 60 minutes after inoculation, waterflow 10 minutes after inoculation, and water flow
immediately following inoculation.
Bars and dots are the average of survival rates for thesame treatment of water flow and each family within
the same treatment of water flow, respectively.
Survival rates with the same letter are notsignificantly different.

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－4 －

(4) 久保拓弥 (2012) データ解析のための統計モデリン
グ入門．岩波書店，東京：267pp(5) 倉本哲嗣・平岡裕一郎・大平峰子・岡村政則・藤澤義武 (2010) マツノザイセンチュウ接種検定後の抵抗性クロマツ自然交配家系の生存率と接種前後の期間および開花期間の降水の関係．日林誌 92：120－123(6) 大山浪雄・川述公弘・斎藤明 (1975) マツノザイセン
チュウ接種クロマツ苗の発病に及ぼす土壌乾燥の影響．
日林九支研論 28：107-108(7) 戸田忠雄 (2000) 抵抗性マツを生産するための材線虫の培養技術と接種技術．林木育種センター九州育種場
年報 28: 50-61