タンパク質の研究に行き着くまで	
最終講義	
平成22年3月12日	
山根 隆	

花や葉を離れ、茎を掴め	
Victor Horta(1861-1947)今日の内容	• Part 1 : タンパク質の結晶化	
• Part 2 ： タンパク質の構造と機能	
• Part 3 : インドとの国際交流	
– 構造解析の方法論の開発	

Part 1 : タンパク質の結晶化	
• タンパク質の結晶成長	
– AFM, cytochrome c• 宇宙でタンパク質結晶を作る	
– congerin• タンパク質結晶の凍結	– pectate lyase

原子間力顕微鏡によるタンパ
ク質の結晶成長速度	

• Dr. L. Rong,• 新村信雄先生	

• MgATP induced conformational changes in a single
myosin molecule observed by atomic force microscope:
Periodicity of substructures in myosin rods, M.
Taniguchi, O. Matsumoto, S. Suzuki, Y. Nishino, T. Taga
& T. Yamane, Scanning, 25 No.5, 223-229 (2003)• Measurement and control of the crystal growth rate of
tetragonal hen egg-white lysozyme imaged with an atomic
force microscope, Long Rong, T. Yamane and N.
Niimura, J. Crystal Growth, 217, Nos. 1/2, 161-169 (2000)

Charactersitics of mixed reverse
micelles• Dr. Long Rong (栄龍)The effect of nitrate ions in thepacking of cytochrome c crystal	Cytochrome cの結晶成長因子	

• 2.1/2.3/1.8 Å resolution• M. Akita, J. Noda, T. Shirai,
K. Homma, M. Ataka	

ＮＡＳＤＡ「STS-107 宇宙実験計画」パンフレット

最初の宇宙実験 STS-84 mission• STS-84: May 15 - May 24, 1997
• Cape Canaveral Kennedy Space Center, Florida

思い出すのはM1の夏；1969年7月20日	

Congerinの構造と機能 	• バクテリアなどを凝集させ、侵入を防ぐ
生態防御の機能	
白井剛先生、	
光山くらら、	
松井優香、	
小川智久先生、	
村本光二先生	Crystallization of congerin II
The other crystal form of congerin II
Mother liquor
Protein conc. 1%(w/v)
Buffer 0.1M Tris-HCl (pH 7.4)
Reservoir solution
Precipitant 1.6M MgSO4 in
0.1M MES (pH 6.5) buffer
Drop 3ml(mother liq.)+3ml(reservoir sol.)
Period 1 month
Size 0.5 x 0.5 x 0.5 mm
P42212, a=61.2, c=80.9 Å(Isomorphous to the crystal without MES)

MES: 2-morpholinoethanesulfonic acid松井優香

名古屋大学卒業論文（1999年3月）

Structure analyses ofcongern I and congerin II
1) Congerin I complexed with lactose at 1.5 Å
resolution (R=0.206)
2) Lactose-free congerin I at 1.6 Å resolution(R=0.196)
3) Congerin II complexed with lactose and MES at
1.45 Å resolution (R=0.199)
4) Congerin II crystallized using the refinedconditions
Resolution
25-0.99 ÅCompleteness
99.2%
Rmerge0.091
Number of reflections 74,403
Rc 0.127
Rfee 0.156

タンパク質の結晶化は芸術	

丹羽裕輔、宮部優美子、光山くらら、安宅光雄先生、
小川智久先生、村本光二先生、相原茂雄先生	
宮部優美子

名古屋大学卒業論文（2002年3月）

After 7 days

Congerin II ;crystal morphology
宮部優美子

名古屋大学卒業研究発表資料（2002年3月）

After 15 days

Congerin II ;crystal morphology
宮部優美子

名古屋大学卒業研究発表資料（2002年3月）

Congerin II;The solubility
curve and crystal morphology

山根隆「STS-107 科学研究最終報告書」（2003年6月）

STS-107 mission (Jan 16-Feb 1, 2003)

The Crystal structure of congerin II at
1 Å resolution；近藤和良	
アミノ酸１３４残基の内、15残基の側鎖とMESに	
double conformationが存在	
Glu5

MES

C-terminal

Glu135gray:2Fo-Fc map contoured at 1.5σ
green:Fo-Fc map contoured at 3.0σ
近藤和良

名古屋大学卒業論文（2003年3月）

The Crystal structure of congerin II at
1 Å resolution

糖鎖結合部位	

糖鎖結合部位にGalactoseのような電子密度が存在	

Glu72

また、Gal-O3の先端にも電子密度が現れ、糖が存在する可能性がある。	

gray:2Fo-Fc map contoured at 1.5σ
green:Fo-Fc map contoured at 3.0σ
red:Fo-Fc map contoured at ‐3.0σ

O3	

Gal	
His44	

微小重力のための動物レクチン(コンジェリン)の結晶化条件の精密化および結晶の評価
山根隆・丹波祐輔・宮部優美子・塩生くらら・近藤和良・鈴木淳巨・
小川智久・村本光二・中村裕彦・佐藤勝・吉崎泉・安宅光雄 (2004).
日本マイクログラビティ応用学会誌, 21, (1), 52−62.

E72

R48

Gal	

糖鎖結合部位	

Y51

N61
O3	

R29

H44
H2O	

MES	

Y122

H2O	
H2O	

これまでGalは８ヶ所、
MESは２ヶ所でアミノ酸の側鎖と相互作用
することが分かっていたが、新たに3つの水分子がMESと水素結合を形成していることが分かった。	

R3
山根隆

STS-107化学研究

最終報告書（2003年6月）

タンパク質結晶凍結
秋田昌岳	
1) 抗凍結溶液中に結晶をソーク. 2) 急速凍結.
結晶は氷を作らないように	
 100 Kまで、急激に冷やさなければならない	 山根隆

2003年9月「超強力Ｘ線回折実験室 講習会」資料

The crystal structure ofhigh-alkaline, low molecular-weightpectate lyase, Pel-15
Masatake Akita,1 Atsuo Suzuki,1＊ Tohru
Kobayashi,2 Susumu Ito2 and Takashi Yamane1
1Department of Biotechnology, Graduate School ofEngineering, Nagoya University, Chikusa-ku, Nagoya
464-8603, Japan
2Tochigi Research Laboratories of Kao Corporation,
2606 Akabane, Ichikai, Haga, Tochigi 321-3497,
Japan

Pectate lyases
植物の細胞壁に含まれるpectin成分を分解	
 • The molecular weight of Pel-15 is 20 924
Da, and consists of 197 amino acidresidues.

Pel-15の構造と機能	 • バイオ精錬	
• 化学精錬品に比べて風合いがよい	• 理由は化学精錬と比べて徹底した精錬ではないため	
• しかも、化学精錬品と比べて吸水性・強度では優れている	"The first structure of pectate lyase belonging to polysaccharide lyase family 3"
M. Akita, A. Suzuki, T. Kobayashi, S. Ito and T. Yamane ,Acta Crystallogr. D57, 1786-1792 (2001)

Part 2 : タンパク質の構造と機能	
• タンパク質立体構造・リガンド予測	
– EMPLICS• 細胞内タンパク質分解に関係する酵素	– Atg4b, Fbs2-Skp1• D-アミノ酸代謝に関係する酵素	
– D-amino acid amidase, ACL racemaseデータベース経験則に基づくタン
パク質立体構造・リガンド予測法	
 • Emprical
Peprideprotein
Potential(EP3)• 石田裕一、白井剛先生	

"EmPLiCS: An empirical approach for structure-based design of natural peptide drugs"
H. Ishida, T. Shirai, Y. Kato, M. Ohno, T. Isaji and T. Yamane ,J. Biochem., 128, No.4, 561-574 (2000)

Docking Search• Rgid-body search
回転異性体は既知のリガンド
構造で固定。探索領域はタンパ
ク質全体	

• Flexible-docking
seach 探索領
域は結合部位周辺	

Upper MHC I, Lower MHC II
The known peptides are shown in blue.
"EmPLiCS: An empirical approach for structure-based design of natural peptide drugs"
H. Ishida, T. Shirai, Y. Kato, M. Ohno, T. Isaji and T. Yamane ,J. Biochem., 128, No.4, 561-574 (2000)

タンパク質を補充しないと？	
• 細胞が飢餓状態（栄養失調）	
↓ オートファジー（自食作用）が働く	
• オートファジーは、細胞周辺の栄養が枯渇した時に自分の組織を分解して栄養源にする基本的な生理現象で、人では空腹時の肝臓細胞で起きている	• 無理なダイエットは体に害！ 	

Part 2a: 細胞内タンパク質分解
水島恒裕先生、田中啓二先生	
• タンパク質分解酵素ープロテアーゼ	 • 細胞外タンパク質分解酵素	
 – 胃腸でのタンパク質分解、血液凝固	 • 細胞内タンパク質分解系	
• オートファジー系	
• ユビキチンープロテアソーム系	
 細胞内での異常なタンパク質の蓄積を防ぐ	
 細胞の代謝回転、余分なオルガネラの除去	
オートファジーが起こらなくさせたマウス
では、神経細胞内に異常タンパク質が蓄積して運動障害（パーキンソン病）を発症	
 	
 
	
 	
 	
 細胞のがん化抑制に関与	 	 オートファジーの機構	
Atg12-Atg5-Atg16（Atg12系）	

リソソーム	
融合	

分解	

隔離膜	
LC3-Ⅱ
（LC3系）	

オートファゴソーム	

プロセシング	

脱脂質化	

Atg4bはシステインプロテアーゼとして機能	

・オートファジーには、分解するタンパク質などを取り込んで	隔離する[オートファゴソーム]と呼ぶ特殊な袋が必要 	
・２つのユビキチン様結合システム（Atg12系とLC3系）が必須	

Atg4bのドメインの分類	
活性部位残基	
C74、D278、H280、Y54

他のシステインプ
ロテアーゼには見られず、何らかの機能を持つ？	
C
D278

N
H280

サブドメインの	境界に位置	

C74
Y54

190

パパインの
構造に類似	
Protease domain

216

Auxiliary domain"The Crystal Structure of Human Atg4b, a Processing and Deconjugating Enzyme for Autophagosome-forming Modifiers"
Taichi Tanida, Yu-shin Sou, Takashi Ueno, Eiko Kominami, Keiji Tanaka, Takashi Yamane, J. Mol. Biol., 355(4), 612-618 (2006)

Atg4bの活性部位	
UCH-L3
HAUSP
PapainCathepsin B

His280Cys-S‐/His-Im＋
の形成 	

Tyr54
オキシアニオンホール 	

逆側に位置	

Catalytic water

Cys74
ペプチド結合のカルボ
ニル炭素原子を攻撃 	

3.59Å

2.78Å

3.23Å
"The Crystal Structure of Human Atg4b,
a Processing and Deconjugating Enzyme for
Autophagosome-forming Modifiers"
Taichi Tanida, Yu-shin Sou, Takashi Ueno,
Eiko Kominami, Keiji Tanaka, Takashi Yamane,
J. Mol. Biol., 355(4), 612-618 (2006)

Asp278
触媒反応に適した方向にHis280を向ける 	Atg4bとパパイン (papain from papaya)

Protease domain"The Crystal Structure of Human Atg4b, a Processing and
Deconjugating Enzyme for Autophagosome-forming Modifiers"
Taichi Tanida, Yu-shin Sou, Takashi Ueno, Eiko Kominami,
Keiji Tanaka, Takashi Yamane,
J. Mol. Biol., 355(4), 612-618 (2006)

http://maikaiohana.dreamblog.jp/

制御された細胞内タンパク質分解
破綻すると脳・神経疾患	
• タンパク質の品質管理	 • 不良品の割合は？	
 – 工業製品の不良品は
1/1,000,000以下	
 – タンパク質の不良品は？	
 タンパク質の機能の発現	• タンパク質の機能は精妙な立体構造に基づき発現されるが！	
– その立体構造の構築は、細胞内の条件・タンパク質の作られ方に依存	– タンパク質に出来損ないは無いのか	• タンパク質の品質管理システム	 ‒ 合成時における品質管理	
 ‒ 利用時における品質管理	
 小胞体：タンパク質の品質管理	

糖鎖を認識する
ユビキチンリガーゼ
Fbs
	
 SCF ファミリーの構造と機能	
 役割→不良タンパク質を認識してユビキチンを付加して分解サイクルにまわす	
三輪由紀子、手嶋直人、中西麻里、鈴木舞美、
中川朋美、高橋信彦、川上龍邦、立浪和也、武市裕貴、
三輪美希子、尾崎洋子、長谷川優子、熊埜御堂太一、
高木賢治、小西奈緒、高橋健、大場由記子、	
金相佑博士、水島恒裕先生	多数のタンパク質を認識する
ユビキチンリガーゼE3の戦略	
 SCF complex (E3)	
RINGフィンガー	
 タンパク質	
 Rbx1

プラットフォーム	
 タンパク質	
 Cul1

アダプター	
 タンパク質	
 

Skp1

基質認識	
 
タンパク質	
 F-box
protein
100種以上	 F-­‐box	  protein	
 	
 	
 

Skp1	
  	
  

E2	
  	
  

Rbx1	
  	
  

Cul1	
  	
  	
  

Fbs2-Skp1複合体構造	
長谷川優子、小西奈緒、	
高橋健、熊埜御堂太一	
SCF	
 complex	
 基質認識	
 タンパク質	
 F-box	
 protein	
 アダプター	
 タンパク質	 Skp1	 RINGフィンガー	
 タンパク質	
 Rbx1	 プラットフォーム	
 タンパク質	
 Cul1	
 発現・培養	

精製	

高橋健

結晶化	

構造解析	

名古屋大学卒業論文（2009年度）

Fbs1-glycoRNaseB複合体1に基づく	
基質-E2-E3 3元モデル構造	
水島、吉田、実験医学、Vol.26 No.2（増刊）2008年

水島、吉田、実験医学、Vol.26 No.2（増刊）2008年

The Tenth Korea-China-Japan Joint Symposium on Enzyme Engineering
Haeundae Centum Hotel & BEXCO, Busan, Korea, November 2 – 5 2008

The novel structure and function ofpyridoxal-5’-phosphate-dependent
fold-type I racemase, α-amino-εcaprolactam racemase
Seiji Okazaki1,2, Atsuo Suzuki1, Hidenobu Komeda3,
Yasuhisa Asano3, Takashi Yamane1
1 Department of Biotechnology, Graduate School ofEngineering, Nagoya University
2 Venture Business Laboratory, Nagoya University
3 Biotechnology Research center, Toyama
Prefectural University

α-amino-ε-caprolactam
racemase (ACLR)• ACLR from Achromobactor obae is a uniquepyridoxal-5’-phosphate (PLP)-dependent enzymethat catalyzes the racemization of aminolactam oramino acid amide.
• ACLR can not racemize amino acids.

PLP• ACLR is composed of 436 residues.
• α-Amino-ε-caprolactam (ACL) is one of the substrates.
• Amino acid and ε-caprolactam are known as inhibitors.

Novel application of ACLR
1ACLR is combined with L-ACL hydrolase from Cryptococcus
Laurentii to produce L-lysine from D,L-ACL.

ACLR

2

ACLR can be used to produce D-amino acid effectively by
combining with D-stereospecific amino acid amidase.

D,L-amino acid amide
ACLR

D-体特異的認識酵素の利用	
• D-アミノ酸は、多くの医薬品や食品添加物や除草剤の合成中間体として利用されていて、その需要はますます拡大している。	
• D-アミノ酸やD-アミノ酸含有ペプチドのほとんどが、高いD-立体特異性を有する酵素(例えば、D-アミノペプチターゼ(DAP)や、 D-アミノ酸アミダーゼ(DAA)など)を用いた酵素法により生産されている。	
• DAPやDAAは、ラセミ体のアミノ酸アミドをD-立体選択的に加水分解し、D-アミノ酸とアンモニアを生成するセリンプロテアーゼ(アミダーゼ)である。	

DAAのD-Phe複合体の全体構造	
Helical domain
61-242α/βdomain
1-60, 243-363

Ω-loop207-223"Crystal structure and functional characterization of a D-stereospecific amino acid amidase from Ochrobactrum
anthropi SV3, a new member of the penicillin-recognizing proteins." ,Seiji Okazaki, Atsuo Suzuki,
Hidenobu Komeda, Shigenori Yamaguchi, Yasuhisa Asano, and Takashi Yamane, J. Mol. Biol., 368(1) 79-91 (2007)

DAAのD-Phe複合体における活性部位	
Asn151
Glu114

Gln214Tyr149

Z204
Z74
Z164

Lys63

Trp215

Ser60
Gln310D-Pheの側鎖のフェニル基は、Ala59、Phe113、
Glu114、Trp215、Phe234、Ala239、Ala242、Gly243、Ile311により形成される疎水性ポケットに位置。	

かさ高い疎水性側鎖を好む、 DAAの基質特異性を決定。	

"Crystal structure and functional characterization of a D-stereospecific amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3, a new member of the penicillin-recognizing
proteins." ,Seiji Okazaki, Atsuo Suzuki, Hidenobu Komeda, Shigenori Yamaguchi, Yasuhisa Asano, and Takashi Yamane, J. Mol. Biol., 368(1) 79-91 (2007)

DAAのD-立体選択性の構造的要因	
Asn151
Glu114Tyr149

鏡面	

Lys63

Ser60
Trp215

Ser60
Ala336Gln310(1) 基質の側鎖を収容する疎水性空洞領域	
(2) 基質のアミノNの固定化に関与する
Gln310 OとGlu114の側鎖	
(3) Ser60 OγとAla336の近
くの、2つの空間	

"Crystal structures of D-amino acid amidase complexed with
L-phenylalanine amide: Insight into D-stereospecificity of• D-Phe 複合体 ： ピンク ； D-Phe : マゼンダ	
Seiji Okazaki, Atsuo Suzuki, Tsunehiro Mizushima,• L-Phe-NH2 複合体 ： 薄緑 ; L-Phe-NH2 : 深緑	
 Hidenobu Komeda, Yasuhisa Asano and Takashi Yamane,D-amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3" ,Acta Crystallogr. D64(3), 331-334(2008)

DAAにおける推定上のNH3チャンネル	
F281

M147

P283

• 長さ約20Åの疎水性チャンネル(Tyr149 Oηから開始し、多くの疎水性残基の側鎖から形成)。	
• 誘導適合における基質結合状態に近い状態と考えられるOrdered
type(分子A-E)でのみ存在し、
disordered type(分子F)では、
Phe282の側鎖により閉鎖。	

F339
Y149
F282
L295
L308

ordered typeの分子C ：緑	disordered typeの分子F：橙	

この疎水性チャンネルは、NH3チャンネルの有力な候補。	

• NH3を排出するのに適した位置。	

Crystallization of ACLR
Crystallization conditions
Mother liquor 23.3 mg/ml ACLR
70 mM KPB (pH 7.0)
100 µl PLP
Reservoir sol. 30%(w/v) PEG4000
0.2 M MgCl2
0.1 M Tris-HCl (pH 8.7)
Additive sol.
30%(w/v) Sucrose
Mixing ratio
1.3:1.5:0.3
Size	
0.5×0.05×0.03mm3
Period2 weeks• Crystals of ε-Caprolactam complex were prepared bysoaking native crystals in the reservoir solution containing
20mM ε -caprolactam for 30 second.

Overall structure of ACLR
NC

• N-terminal domain(residues 3-58)• PLP-binding domain(residues 59-318)• C-terminal domain(residues 319-436)
The active site is locatedin the cleft between
the PLP-binding site
and the C-terminal
domain

PLP covalently bound to
Lys267, to form theinternal aldimine linkage"The novel structure of a pyridoxal-5'-phosphate-dependent fold-type Iracemase,α-amino-ε-caprolactam racemase from Achromobacter obae."
Seiji Okazaki, Atsuo Suzuki, Tsunehiro Mizushima, Takeshi Kawano, Hidenobu Komeda, Yasuhisa Asano and Takeshi Yamane, Biochemistry,48(5),941-950(2009).

Overall structure of ACLR
• The two PLP cofactors
are located close to eachother at the subunit
interface of the dimer(the PLP phosphorus
atoms are 16.2 Å apart).
↓	• ACLR forms a dimerin solution like otherfold-type I enzymes.

"The novel structure of a pyridoxal-5'-phosphate-dependent fold-type Iracemase,α-amino-ε-caprolactam racemase from Achromobacter obae."
Seiji Okazaki, Atsuo Suzuki, Tsunehiro Mizushima, Takeshi Kawano, Hidenobu Komeda, Yasuhisa Asano and Takeshi Yamane, Biochemistry,48(5),941-950(2009).

The active site of ACLR
The pyridine N of PLP
makes a salt bridgewith Asp238.

D238
D210

V240

V152

PLP

ε-caprolactam issandwiched
between
W49 and Y137.

Y137
K241
ε-caprolactam

W436*

K267
T295*
E396

L19

W49
L78*
native ：pink； PLP：orange
ε-caprolactam complex：green； PLP and ε-caprolactam：light green

Substrate specificity of ACLR
Supplemental No.1
• L-α-amino-ε-caprolactam• L-2-aminobutyric acid amide• L-alanine amide• L-threonine amide• L-leucine amide• L-methionine amide• L-serine amide• L-phenylalanine amide

100%
2.7
2.1
1.7
1.3
0.94
0.47
0.052

Asano et al., J. Mol. Catal. B. Enzym. 36, 22-29. (2005).

ACLRの構造学的研究の展望	• 反応中間体アナログであるN-(5’-phosphopyridoxyl)-LACL (PLP-L-ACL)や、PLP-D-ACLとの複合体の結晶構造を決定することにより、基質と酵素間の相互作用や、反応機構を解明。	
• L-アミノ酸アミドに対するラセマーゼ活性は、ACLに比べると50~100倍ほど弱いので、変異を導入することにより、 L-アミノ酸アミドに対するラセマーゼ活性を向上
させ、産業上有用な変異ACLラセマーゼを創出。	
↓	• L19V，L78T変異ACLラセマーゼの合成、構造解析
鈴木康二	

結晶学データと精密化	
L-Phe-NH2

L-Leu-NH2

L-Ile-NH2

P21

P21

P21

P21

a (Å)

56.5

56.5

56.8

56.7

b (Å)

61

61.4

61.1

61.1

c (Å)

104.9

104.6

105.2

105.2

β (°)

102.9

103.2

102.9

102.9

Wavelength (Å)

0.9

0.9

0.9

0.9

Resolution (Å)

50-1.77(1.80-1.77)

50-1.8(1.83-1.80)

50-1.8(1.83-1.80)

50-1.8(2.83-1.80)

Rmerge (%)a4.5 (18.9)

5.0 (21.5)

5.7 (21.2)

5.1 (16.5)

Average I/σ(I)47.4 (8.9)

30.4 (6.1)

27.5 (4.3)

32.3 (6.1)

Completeness (%)

99.9 (100)97.6 (96.7)

99.4 (98.8)

98.1 (96.5)

Multiplicity

3.8 (3.6)

7.4 (5.2)

5.1 (5.0)

5.6 (5.6)

Rwork/Rfee

0.165/0.210

0.171/0.225

0.185/0.244

0.191/0.252

Apoenzyme
Space groupcomplexcomplexcomplex

Unit cell parameters

ACLラセマーゼ変異体の全体構造	
L-Phe-NH2複合体構造	

Phe-NH2 ！ 	
鈴木康二

名古屋大学卒業研究論文（2009年度）

基質結合ポケットの構造	
L-Phe-NH2複合体構造	

電子密度に	
フィット！ 	鈴木康二

名古屋大学卒業研究論文（2009年度）

Part 3 : インドとの国際交流
・ 構造解析の方法論の開発
Prof. D. Velmurugan, University of Madras, India
Dr. Kanagaraj Sekar, Indian Institute of Science,
India
Dr. Arul Venkatesan, Pondicherry University, India
Prof. Amit Sharma, International Centre for Genetic
Engineering and Biotechnology, India
Dr. Jayaraman Sivaraman, National University ofSingapore, Singapore 	インドとの国際共同研究 2001〜; Prof. D. Velmurugan,
University of Madras & Dr. S. S. S. Raj

Prof. Devadasan Velmuruganとの共同研究の成果	
• タンパク質の新しい構造解析法の開発	
 • 12報発表、1報論文投稿中	
 • The use of ACORN in solving a 39.5 kDa
macromolecule with 1.9 Å resolution laboratory source
data, V. Rajakannan, S. Selvanayagam, T. Yamane, T.
Shirai, T. Kobayashi, S. Ito and D. Velmurugan, J.
Synchrotron Radiation, 11, 358-362 (2004)• High throughput structure determination for singlewavelength laboratory X-ray source anomalous
diffraction data sets using iodine tyrosines, S.
Selvanayagam, D. Velmurugan, T. Yamane, and A.
Suzuki, Indian J. Phys. 82(1) 27-37 (2008)

Availability of the X-ray data collected with a
Cr rotating-anode for phasing protein crystals
PLA2 frombovine pancreas,
P3121
a=46.2, c=101.4 Å
A total of 89,573 ref.
2.4 Å resolution
Rc=0.211
Rfree=0.249
谷沢英樹

修士論文（2004年度）• A. Suzuki, S. Okazaki, Hideki Tanizawa, Tatsuo
Hikage, V. Rajakannan, D. Velmurugan, K. Sekar

異常散乱効果の比較	
f’’

f=f0+f’+if’’

CuKα線	
1.54Å

CrKα線	
2.29Åヨウ素(I)

セレン(Se)臭素(Br)

硫黄(S)Wavelength(Å)

ヨウ素は、実験室系のＸ線でセレンよりも効果的である。	

NISによるチロシンのヨウ素化	

谷沢英樹

修士論文（2004年度）

ＮＩＳ(N-iodosuccinimde)を用いた反応	
3.2%• チロシン残基特異的に反応する。	
• 化学反応であるため、高い占有率を期待できる。	
• チロシン残基はメチオニン残基より多いため、多くの異常散乱子の導入が期待される。	

2.4%

谷沢英樹

修士論文（2004年度）

ミオグロビン	

ミオグロビン	 分子量17kDa

ミオグロビンは、筋肉中にあって酸 残基数154

素分子を代謝に必要な時まで貯蔵

 チロシン残基は3残基	する色素タンパク質である。	

 硫黄原子は3残基	

谷沢英樹

修士論文（2004年度）

異常分散原子サイトの決定	

Anomalous差パターソン図	

Rank

Relative height

Atom

Site

1

1

I

TYR 151

2

0.797

S

MET 55

3

0.780

S

MET 131

4

0.675

S

SO4

5

0.590

Fe

6

0.577

S

SO4

7

0.479

I

TYR 103

8

0.312

I?

SHELXによるサイトの	
検索結果	

3個中2個のチロシン残基のヨウ素修飾を確認	ミオグロビンの分子モデルの
自動構築	
ヨウ素	

硫黄	

青 ： 電子密度	
赤 ： 異常散乱効果のある部分	

154残基中、152残基（99%)を自動構築	
• 分子量に対するヨウ素の割合が多かったため、容易に解くことができ	• Connectivity Index =0.99, R=0.207,
Rfree=0.251

Guest House, International Center ofGenetic Engineering and Biotechnology,
with Prof. Amit Sharm(2008年 招へい)

やりたいと思うタンパク質の研究に行き着く	• 名古屋医療センターとの共同研究	
– 杉浦亙先生、岩谷靖雅先生、金田次弘先生	
– HIV protease, HIV integrase 他	
– 村瀬泰之、栗本佑介、木村雄貴、北村紳悟	

• 東京理科大学との共同研究	
– 小祝修先生	
– 鋳型に依存しないDNA polymerase制御因子他	
– 小祝孝太郎	•富山県立大学との共同研究	
•浅野泰久先生	
•工業応用に有用な酵素群	
•岡崎誠司、Charles Cielo、鳥本大介、鈴木康二	

•名古屋地区へのシンクロトロン光源 	
•設置の実現	
•SADへの挑戦	

タンパク質構造を決められなかったのは残念	
今後の発展は	
渡邊信久先生、鈴木淳巨先生に	Helderlinturm, Tuebingen, Germany
http://als.wikipedia.org/wiki/Friedrich_H%C3%B6lderlin

幾たびか海外出張の機会に	恵まれて、貴重な経験	
何事も行って見ないと解らない	
１，２年の内にドイツに！	

謝辞	
 研究室関係教職員	 芦田玉一先生、鈴木淳巨先生、白井剛先生、
水島恒裕先生、渡邉信久先生、日影達夫技
術職員	
 長坂美奈子さん、光井秀子さん、小島廣子
さん、恒川安代さん、河口洋子さん	
 Dr. S. Raj, D. V. Rajakannan, 金相佑博士、	
 岡崎誠司博士、河村高志博士	
 化学・生物工学科の先生方、事務職員、技術職員の方々	 環境安全衛生管理室、環境安全支援課の方々、全学技術センターの方々	
 共同研究	
 信州大学 	
 関口順一先生	 名古屋大学遺伝子実験施設 	
 杉田護先生、杉山康雄先生 	
 名古屋大学理学研究科	
 渡辺芳人先生、上野隆文先生	
 花王栃木研究所 	
 伊藤進先生	
 日本原子力研究所東海研究所	
 
新村信雄先生	 大阪大学理学研究科	
 倉光成紀先生、増井良治先生	
 構造解析	 石川拓生、加藤雅規、高橋健夫、長谷川輝明、陸田真宏、結城幸一、木伏英史、久山和雄、沼田淳、
田崎弘、上野真義、山田裕人、松本房子、森部鎌志、藤掛真広、山田洋樹、岸田信之、大竹康貴、
吉田修、田中道明、木林秀行、小田竜一、齋藤玲子、野尻佳子、平岡浩佑、堀田博嗣、篠田宜宏、
下田俊明、小山康広、角野広治、Kuang Yunhong、
戸田雄之、河野正晴、松脇洋平、加古武士、武本明弘、堀口由紀子、金海松、呉雄介、岩田翔也、毛利雄大、谷内麻美、Siu Ching Tat、岡田和之、山田裕之	
 タンパク3000牧香里、河合健太郎、木原崇志、恩田大輝、鬼頭佑輔、大橋菜芳、近藤和良、山下毅、Charles Cielo	 インフォマティクスー白井剛先生	
 石田裕一、加藤裕二、松田佳子、賀島一恵、大野
雅範、伊佐治知也、光山くらら、堀田秋津、安井友二郎、恩田基弘、別所真知子、Cetin Hikmet
新規結晶化、解析法ー鈴木淳巨先生	 日高輝夫、佐藤敬、大原卓、寺島貴信、長谷川嘉弘、谷澤秀樹、高谷周、松田賢司、福島旭仁、加藤泰平、石井宏明、吉田祐士、米津真之介	
 ＡＦＭ研究ー谷口美恵子先生	
 松原勉、鈴木繁仁、広瀬貴士、松岡透、江坂宗佳、
岡田千真理、大西寛貴、平野智子、辰田陽介、白石聡史