を用いたマウス精子の融解と体外受精凍結保存の手順―準備器材など―
１２３４５６７８９１０１１１２１３

過排卵処理した雌マウス
CARD FERTIUP マウス精子前培養培地（九動株式会社 fertiup@kyudo.co.jp）
CARD MEDIUM®（九動株式会社 fertiup@kyudo.co.jp）
CARD mHTF
チップ（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）
ディッシュ（コーニング 35mm X 10mm Cat.No.430588）
ストロー操作用シリンジ
恒温水槽（37°C）
精子融解用フロート
オートピペッター（GILSON PIPETMAN P-10 P-20）
CO2 インキュベーター（37°C 5% CO2 95% air）
ハサミ
キムタオル

―方法―
●精子融解用フロートの作製
１ 50mL 遠沈管と発泡スチロールを右図のように組み合わせ、精子融解に用いるフロートを作製する。

●融解前の準備
１ 恒温水槽を準備する（37°C）。
２ 精子融解用フロートの中に 37°C の温水を満たし、恒温水槽に、右図のように浮かべてセットする。
３ 精子を融解する３０分前に、下図（左）のように精子前培養用ディッシュ（90µL の CARD FERTIUP マウス精子前培養培地ドロップ 1 個）を作製し、インキュベーター内に静置しておく。
*CARD FERTIUP マウス精子前培養培地は開封後、使い切るようにする。
４ 採卵１０分前に、下図（右）受精用ディッシュ（90µL のCARD MEDIUM®ドロップ 1 個）を作製し、インキュベーター内に静置しておく。
＊体外受精にどのような精子を用いるかで、CARD MEDIUM®の調整方法が異なる。CARD MEDIUM®添付の取扱説明書を参照すること。

CARD FERTIUP
マウス精子前培養培地 90 μL

CARD MEDIUM® 90 μL

Page1

５ 卵子洗浄用ディッシュ（80µL の CARD mHTF ドロップ 4 個）を作製し、インキュベーター内で３０分以上静置しておく。

CARD mHTF 80 μL●卵子の採取１ 過排卵処理を施した雌マウスを hCG 投与１５～１７時間後に安楽死させ、採卵した卵子塊を、受精用ディッシュのCARD MEDIUM®ドロップに導入する（１ドロップあたり２～３匹分の卵子塊）。
＊安楽死から、卵管を採取・卵子塊を受精用 CARD MEDIUM®ドロップに導入するまでの操作は、極力短時間で行う（30 秒以内）。
＊＊1 人で行う場合は、一度に複数の雌を安楽死させるのではなく、1 匹ずつ安楽死させ、すばやく採卵する。
２ 採卵後、受精用ディッシュを CO2 インキュベーター内に静置し、３０～６０分間培養する。

CARD MEDIUM® 90 μL●精子の融解１ ピンセットを用いて、液体窒素保管器からストローを取り出し、空気中で５秒間保持し、37°C 恒温水槽中のフロート内に素早く移し、10 分間加温する。
ポイント：確実に 37°C で加温するために、凍結精子の部分を下方に向けて、ストローを精子融解用フロートへ入れる。
ポイント：凍結・融解したマウス精子は、おかれている周囲の環境の変化に弱いので、精子が動き出す前に粘性が高い精子保存液から粘性の低い培地（CARD FERTIUP マウス精子前培養培地）に移すと、融解後の運動性が十分に回復しない。融解したマウス精子は、５分以上３７°C で加温すると動き出すため、必ずストローを１０分間３７°C の温水中に静置した後、精子懸濁液を前培養用培地（CARD FERTIUP マウス精子前培養培地）に移す。
２ 加温後、ストローを 37°C 恒温水槽中から取りだし、ストロー表面の水分をキムタオルでふき取る。

CARD mHTF

Page2

●精子懸濁液の取り出しと前培養
１ ストローの CARD mHTF とシール部分の間をカットする（ストロー操作用シリンジの内筒を、あらかじめ引いておく）。

精子懸濁液

CARD mHTF２ カットしたストローを、ストロー操作用シリンジに差し込む。

３ ストローをストロー操作用シリンジに差し込むと、ストロー内の圧力が高くなるので、その圧力を抜くため、三方活栓のコックを一回転させる。

４ コックを上に戻し、精子懸濁液とシール部分の間をカットする。

５ シリンジの内筒をゆっくり押して、精子懸濁液のみを精子前培養用ディッシュのドロップに導入する。

CARD FERTIUP
マウス精子前培養培地
精子懸濁液
CARD mHTF

６ ５の精子前培養用ディッシュをインキュベーターに入れ、３０分間前培養を行う。
ポイント：精子が前培養培地へ十分に泳ぎ出すまで、精子前培養用ディッシュは、インキュベーター内へ入れて静置しておく。
精子が十分動き出す前にディッシュを揺すったりすると、精子の運動性が回復しない場合があるので、注意する。
Page3

●媒精１ チップ（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）を用いて、前培養した精子懸濁液 10µL を吸引し、卵子を含む受精用ディッシュの CARD MEDIUM®ドロップに添加する（媒精）。
２ 媒精が終了した受精用ディッシュをインキュベーター内にもどして培養する。

CARD FERTIUP
精子前培養培地 90 μL

ポイント：媒精に用いる精子懸濁液は、良好な精子が集まる前培養液ドロップの辺縁から採取する（下図参照）。
ポイント：精子懸濁液の採取は、1 ドロップから３～４回の実施が可能である。
ポイント：精子懸濁液を卵子塊に吹きかけるように、受精用ディッシュのドロップに添加する。

チップ
CARD FERTIUP
精子前培養培地 90 μL
運動性の高い精子

CARD FERTIUP
精子前培養培地 90 μL

チップ

流動パラフィン

運動性の低い精子

３ 媒精から 3 時間後、形態的に正常な卵子のみを卵子洗浄用ディッシュ CARD mHTF ドロップ（a→b→c）で洗浄する。
＊洗浄時に透明帯表面に多数の精子が付着している場合は、チップを装着したオートピペッター（20µL）を用いて、受精用ディッシュ内の CARD MEDIUM®ドロップを 20～30 回ピペッティングした後、卵子の洗浄を行う。
＊＊洗浄の際は、極力、CARD MEDIUM®を卵子洗浄用ディッシュのドロップに持ち込まないように注意する。

４ 媒精から約６時間後、卵子をよく観察し、単為発⽣卵と判定されたもの（卵細胞質内に１つの前核のみが認められるもの） を取り除き、翌日まで培養する。 媒精から約６時間後、卵子をよく観察し、単為発⽣卵と判定されたもの（卵細胞質内に１つの前核のみが認められるもの）を取り除き、翌日まで培養する。
５ 翌日、卵子洗浄用ディッシュの残りのドロップに２細胞期へ発⽣した胚のみを移し（d）、胚数をカウント後、移植あるいは凍結保存に用いる。

Page4マウス⽣殖工学技術マニュアル
マウス⽣殖工学技術の詳細については、以下をご参照ください。
国立大学法人熊本大学 ⽣命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野 Web サイト
http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/manual/index.html

参考文献
１）Takeo T, Hoshii T, Kondo Y, Toyodome H, Arima H, Yamamura K, Irie T, and Nakagata N, Methylbeta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after freezing and thawing
by facilitating cholesterol efflux from the cells. Biol Reprod. 2008, 78(3):546-51.
２）Takeo T, and Nakagata N, Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamineand methyl-{beta}-cyclodextrin in a preincubation medium yields a high fertilization rate forcryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab Anim. 2010, 44(2):132-7.

参考文献
CARD FERTIUP®および CARD MEDIUM®は研究利用のみを対象としており、診断・治療目的には使用できません。

【製造・販売】〒841-0075 佐賀県鳥栖市立石町惣楽 883-1
TEL：0942-82-6519 FAX：0942-85-3175
E-mail：fertiup@kyudo.co.jp※ 「FERTIUP」は弊社の登録商標です
Page5