第7575回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
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第微生物発現と構造安定性を考慮した機械学習支援による抗体断片の親和性成熟伊藤智之 1・河田1

早矢 1・中澤

光 1・村上明一 2, 3・梅津

光央 1, 4＊東北大学工学研究科，2 徳島大学医歯薬研究部, 3 RePHAGEN, 4 理研
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標的特異的な結合能を持つ抗体は医薬品や研究試薬として広く用いられているが、標的に対して低親和性であった場合、改めて変異を導入して親和性を向上させる必要がある。しかし親和性は構造安定性と相反する場合があり、親和性が向上しても構造が不安定化してしまうことがある。本研究では、抗体断片の構造安定性を維持しつつ親和性を向上させることを目的として、複数条件を同時に満たす機械学習を行い、目的分子の取得を試みた。

1 . はじ め にそこで本研究では、SARS-Cov-2 のレセプター結合ド

抗体は標的特異的な結合能を持つタンパク質で、生メイン(RBD)に対する結合能を有するラクダ由来抗体体内では免疫機構を担う。産業界では、抗体の分子認

断片 (VHH)を対象として、微生物発現量と構造安定性識能を利用した医薬品の開発が、世界のバイオ医薬品を維持しつつ親和性を向上させることを目的とし、複市場拡大の大きな原動力となっている。標的特異的な数条件を同時に満たす答えを導けるように機械学習を

抗体は生体の免疫反応を利用して取得できるが、得ら利用しすることで、相反関係にある 2 つの機能の同時れた抗体がいつも高い親和性を示すとは限らないため、最適化するタンパク質プロセスの開発を試みた。

アミノ酸配列を改変して親和性を向上させる「親和性成熟」が必要になる。しかし抗体の親和性と構造安定

2. 結果 と 考察性は負の相関関係にあり、親和性成熟の結果、構造が不安定化してしまうことがある [1]。そのため、タンパク質の構造安定性維持と親和性成熟を同時に達成できるタンパク質進化プロセスの開発が必要である。

ラクダ由来抗体断片

変異導入
微量培養

機械学習- 配列解析
- 結合力測定- 発現量測定

結合力・発現量同時向上

図 1. 機械学習支援による抗体断片の親和性成熟

16１( 1 ) 親和性 成 熟 に 効果 的 な 変 異導 入 残 基の 選 定
抗 RBD VHH の遺伝子断片にエラープローン PCR で変異導入したファージミドベクターを作製し、大腸菌 TG-1株を形質転換することで、抗 RBD VHH のランダム変異体を提示したファージライブラリーを 109 規模で作製した。同時に、抗 RBD VHH の相補性決定領域(CDR)の一部を 1 残基ずつランダム化した変異体を提示するファージライブラリーも 108 規模で作製した。作製したファージライブラリーを磁性粒子に固定した RBD と混合し、RBD に結合したファージを回収し増幅する生体外選択操作を 4 回行った後、次世代シークエンス解析を行った。その結果、VHH 中の 5 残基(G16, E89, P105,Y106, S110)に変異をもつ変異体が、生体外選択操作後に多く残存してることがわかった。そこで我々は、この 5 残基が親和性向上に寄与する可能性があると考え、

1.5( 2 ) 学習デ ー タ の 取得 と 機 械 学習
選択した 5 残基を同時にランダム変異させた VHH 変異体遺伝子を持つ発現ベクター群を用いて大腸菌を形質転換した。生じたコロニーから 200 個程度選択し、遺伝子配列を解析すると共に、微量培養した大腸菌の培地上清を用いて発現量と標的親和性を測定した。発現量はバイオレイヤー干渉法(BLI)を、標的親和性は酵素固定化免疫吸着法(ELISA)を用いて測定した。その結果、117 種の変異体配列が収集され、そのうち野生型より高い発現量と親和性を示す有望変異体が 20 種あり、全体の 17%であった(図 2 中の白丸)。
機械学習には、アミノ酸配列とその機能値を紐づけしたデータが必要となる[2,3]。我々は、発現量が大きい変異体は折りたたみ効率が高く構造安定性と正相関すると仮定し、機械学習で高発現量な変異体を予測すれば、構造的に安定な変異体も得られるのではないかと考えた。そこで発現量と結合活性を掛け合わせた数値を機能スコアと定義し、得られたアミノ酸配列―機能紐づけデータを用いてベイズ最適化による機械学習を行い、全変異体(205=3.2x106)の機能スコアを予測した。
予測システムにはベイズ最適化ソフトウェアである
COMBO を使用した[4]。機械学習が提案した機能スコア
予測上位 40 変異体に着目すると、各残基位置で特徴的なアミノ酸が提案されており(図 3)、特に 16 位はアスパラギン酸のみが提案されていた。

1.2( 3 ) 機械学 習 提 案 変異 体 の 機 能評 価提案された上位 40 変異体遺伝子を持つ発現ベクターを個別に作製し、学習データ取得時と同様の手法で標的親和性と発現量を評価した。その結果、機械学習が提案した変異体の方が、発現量、親和性共に向上している変異体が多く得られた。
親和性と発現量共に高かった機械学習提案変異体を3 つ選んで再度大腸菌で発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)およびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製した。その結果、選択した変異体は単量体で発現し、野生型よりも 4～5倍高い収量が得られた(表 1)。またサーマルシフトア
ッセイを用いて熱変性中点を測定した結果、野生型と同等以上の熱安定性を示した。さらに BLI 法により結合速度定数を求めたところ、野生型より 70 倍近く親和性が向上していた。これらの結果から、一般的には相反する 2 つの機能であっても、本手法を用いることにより、抗体断片の親和性を向上させつつ物性も最適化できる可能性が示唆された。

規格化吸光度 (-)

抗 RBD VHH の 5 残基変異体を作製することにした。

0.9

予測変異体

0.6
学習前変異体0.30.0

野生型

0510152025

規格化発現量 (µg/mL)

図 2. 学習用変異体(白丸)と機械学習提案変異体(黒丸)の機能評価
学習データ

機械学習予測上位40変異体

16 89 105 106 110

16 89 105 106 110

Position

Position

図 3. 学習データ(左)および機械学習予測上位 40
配列(右)におけるアミノ酸出現頻度
表 1. 機械学習提案変異体の機能値
収量(mg/L-broth) Tm値 (℃)

KD (M)

野生型

565

4.5×10-80

機械学習提案変異体12367

6.4×10-10

機械学習提案変異体22066

8.0×10-10

3. 今後 の 展望
本研究では、相反関係にある 2 つの機能の同時最適化するタンパク質プロセスの開発を試み、微生物発現量と構造安定性を維持しつつ親和性を向上に成功した。
この手法は抗体以外のタンパク質進化にも応用でき、食品・環境・医薬品など幅広い分野での活用が期待できると考えている。

文献[1] Lilia, A., R., et al., Biochem. Eng. J., 137,365-374 (2018)[2] Saito, Y., et al., ACS Synth., 7, 2014-22 (2018)[3] Saito, Y., et al., ACS Catal., 11, 14615-24 (2021)[4] Ueno, T., et al., Mater. Discov., 4, 18-21 (2016)

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