やさしいニューガラス講座

ダメージレスを目指す
新しいフローサイトメーターの開発
古河電気工業株式会社

徐傑

月井健

高橋第一生産技術開発センター

享小相澤

久

Development of New Flowcytometer for Damage Less Sorting
Xu Jie, Tsukii Ken, Takahashi Toru, Koaizawa Hisashi
Production Engineering Development Center, The Furukawa Electric Co.,LTD

１．はじめに種々の細胞の存在比を短時間で解析することができる。また，DNA やタンパク質，カルシウ生細胞，特に幹細胞・癌幹細胞（cancer stem

ムなどを定量的に染色する蛍光色素により細胞cells）に関する研究は，再生医療や癌の発生メ内での存在比などを分析することができる。細

カニズム解明及びテーラメード医療等の実現に胞分離機能を持つフローサイトメーター（セル極めて重要である。稀にしか存在しない幹細ソーター）により，細胞の大きさや蛍光などの胞・癌幹細胞を良質に得るシステムの完成は，条件に基づき，細胞を生きたまま分離できる。

熾烈な競争が広げられている世界中の研究者に新版フローサイトメトリー自由自在１）という著切望されている。例えば，米国の加州だけで書にそれらの原理と機能が詳細に解説されていも，今後十年間に３０億ドルの巨額研究投資をる。

幹細胞の研究に投じることが決定されており，本開発の特徴としては，シース容器にレーザ幹細胞関連の研究開発機器の需要が世界規模で照射用及び蛍光等の情報検出用光ファイバを直益々高まると考えられる。本開発は，今日の情結することで，一切の無駄な空間を介さない全報革命を支えている光通信分野で培った光制く新しいフローサイトメーターの構成原理を実御・半導体レーザ・光ファイバ・精密加工など現しました。この構成によって，フローサイトのコア技術を生かし，幹細胞等の研究という異メトリーとして世界で始めて透過光と後方散乱分野である生命科学に寄与する生細胞のダメー

光の情報を新たに取得することを可能としていジレスソーティングの特徴を持つ新しいフローる。今後，前記透過光及び後方散乱光の情報解サイトメーターを目指している。

析が，細胞における分子生物学的な解釈に有益フローサイトメーターは，細胞 １ 個 １ 個のな可能性を示してくれることを期待している。

相対的大きさや形状，内部構造の違い，さらにまた，前記透過光情報の活用と高精度の流速

蛍光標識を行うことにより蛍光強度や蛍光の種制御により，生細胞へのダメージレスソーティ

類を測定し，細胞の同定や細胞群を構成するングを実現する為に，従来のソーティングプロ

〒２９０―８５５５ 市原市八幡海岸通り ６ 番地
２―１６３６TEL ０４３６―４２―９３３４FAX ０４３６―４E―mail : xu@ch.furukawa.co.jp

セスで用いられる超音波による液滴形成と高電圧による液滴荷電方法を全く使用しない，細胞の新しいソーティング方法を導入している。今後，生細胞へのダメージレスソーティング精度
５７NEW GLASS Vol．
２１ No．
３２００６と能力の向上により，ソーティングプロセスの持する為に，フローセル（キャピラリ）の中心

ダメージに弱い，特に分化・誘導を必要とされに正確且つ安定的に流す必要があるため，そのているデリケットな幹細胞等の研究に寄与でき周りに二，三百マイクロメートル程度のシースることを期待している。

流を形成する技術を用いている。

２．ファイバ式フローサイトメーター

図 ２ は，図 １ に示す光学系を用いて，八種類の異なる蛍光強度を持つ蛍光ビーズ（８peaks

図 １ には，光ファイバ式フローサイトメー

Rainbow Calibration Particles）を計測した結ターの光学系構造を示している。従来の空間結果である。図 ２ の結果から分かるように僅か合による光学レンズ系の構成と異なって，励起１００蛍光分子を持つ蛍光ビーズの計測を可能と光と受光機能を担う光ファイバの端面が，シーし，計 測 感 度 は，１００MESF（molecules

スフローを囲む壁の一部として設けられている

equivalent soluble fluorochrome）に達していのが大きな特徴であり，これによって，空気をる。

of介在させずに高感度計測できることと，流路の中心に精度良く固定された光ファイバが，従来必要とされる光軸調整の煩雑な作業を省くことができた。また，計測対象である細胞が，受光側の光ファイバ端面と百マイクロメートル程度しか離れていない為に，従来の前方散乱光の代わりに透過光と，後方散乱光という二つ新しい計測情報を取得することを可能としている。こ
図２ 蛍光感度の計測結果

れらの情報が，今後の細胞解析に新たな可能性

フローサイトメーターは，細胞の遺伝子情報を示唆できることが期待されている。
図 １ に示された光学計測系では，細胞を解や形状情報を解析する機能以外にもう一つ大き析するために透過光と後方散乱光以外にも，側な用途としては，細胞のソーティング機能があ方散乱光及び幾つかの蛍光情報を取得できる解る。従来のフローサイトメーターでは，まず，析機能を備えられている。流路の制御技術とし超音波によって大きさ数十マイクロメートルのては，計測対象である細胞を含む数十マイクロ水滴を形成し，ターゲット細胞を含む水滴にメートルのサンプル流は，計測感度と精度を維１００V の電荷を付与することによって，落下される水滴が，左右に配置される正，負７０００V の 電 圧 板 に 細 胞 を 振 り 分 け てソーティングしている。この従来のソーティング方法では，前記の超音波と高電荷のプロセスが，生細胞にダメージないしストレスを与えることが懸念され，特に分化・誘導を必要とする幹細胞のソーティングには，改善が切望されている。
図 ３ には，透過光，後方散乱光，側方散乱光及び幾つかの蛍光情報を計測することによって，特定されたターゲット

図 １ 光ファイバ式フローサイトメーターの光学系構造
５８細胞を所定位置に，例えば９６ウエルプ

NEW GLASS Vol．
２１ No．
３２００６

レートのあるウエルにソーティングする原理の概要図を示している。この原理による細胞ソー３フローサイトメーターの応用例

ティングは，特に再生医療に期待される幹細胞解析機器としてのフローサイトメーターは，のようなデリケートな生細胞に，限りなくソー細胞周期（細胞は，その性状や生体内での役割ティングによるダメージレスが得られる大きなに応じて，それぞれ決まった周期で細胞分裂を特徴がある。幹細胞のダメージレスソーティン

繰り返し増殖している。この，一回の分裂増殖

グは，例えば再生医療に必要とされる肝臓や脳の周期を細胞周期と呼ぶ）やアポトーシス（多などの組織に幹細胞の分化・誘導を導くプロセ

細胞生物の体を構成する細胞の死に方の一種でスに極めて重要な意味を持っている。

ある）等の細胞解析の研究に不可欠であると同

図 ３ に示す本開発のソーティングの原理と時に，臨床上に特に血液細胞の特定などに重要しては，まず，細胞の流れ方向に精度良く配置な意味を持つ。例えば，肝炎やエイズ等の疾患されている複数の光ファイバによって，通過すには，免疫細胞の変化が極めて重要な指数としるターゲット細胞の流速を正確に計測し，このて捉えられている。

流速情報を元にターゲット細胞がノズルの出口

フローサイトメトリー法によるヒト末梢血リに到達する時間を算出することによって，ノズ

ンパ球サブセット検査は，臨床上に重要な意味

ルの先端を廃液槽から，９６ウエルプレートのを持つ。ヒト末梢血リンパ球は種々の疾患や薬所定のウェルに移動し，該当ターゲット細胞を剤投与により増減する。Ｔ細胞とＢ細胞はおのソーティングする。この方法では，細胞にダおの細胞性免疫と液性免疫を担い，とりわけＴメージを与えるような超音波と高電荷のソーテ細胞は免疫応答の中枢として重要である。したィングプロセスが全く使用されていないため，がって，血液・免疫性疾患，アレルギー性疾患

生細胞にとっては限りなくダメージレスを実現

や感染症において，両者の動向を知ることは診している。また，このソーティング方法では，断・治療のうえで不可欠となってきている。Ｔ

単一のウエルに単一の細胞をソーティングできリンパ球は，胸膜由来のリンパ球で，主としてることから，特に幹細胞の研究に寄与できると遅延型過敏反応，移植片対宿主拒絶反応などに期待されている。

代表される，細胞性免疫を司る細胞である。臨図 ３ ダメージレスソーティング原理概念図
５９NEW GLASS Vol．
２１ No．
３２００６床検査で検索される頻度が高いのは CD３（成す。

熟Ｔリンパ球総数），CD４（免疫補助Ｔリンパ球，helper T cell，Th），CD８（免疫抑制Ｔリンパ球，supressorT cell，Ts）である。
図 ４ は，Ficoll―Paque 比重液を用いた遠心分離により赤血球や顆粒球が取り除かれたヒト
末梢血リンパ球サンプル（PeripheralMononuclearBloodCells）に対して，透過光と側方散乱光の計測情報によるリンパ球と単球の解析結果を示し，従来の前方散乱光と同様に新しく開発した透過光の情報も同様な解析を可能としていることを示している。また，図 ５ は，前記リンパ球細胞に対して，抗体 CD４（蛍光色

図 ５ ヒト末梢血リンパ球サブセットの計測結果

素 FITC 染 色）と CD８（蛍 光 色 素 PE 染 色）によるヒト末梢血リンパ球サブセットの計測結果を示している。

図 ６ ソーティングされた単一脳神経細胞からのコロニー機能を失った脳の細胞組織を再生するために，脳の神経冠幹細胞を効率よく得ることが重図 ４ 透過光と側方散乱光によるリンパ球と単球の解析結果要である。図 ６ は，マウスの受精卵に緑の蛍光蛋白質発現できる遺伝子プロモーターを注入

ソーティング機器としてのフローサイトメーしたマウス胚（受精後９。５日）の脳組織を取ターは，分化・誘導を必要とされる生細胞，例り出し，９６ウエルプレートに単一細胞を単一えば幹細胞にとっては，ソーティング速度よりウエルにソーティングし，約二十日間の培養でもソーティングのダメージ度合いが最も重要な形成される細胞コロニーを示している。この結ファクターとなる。図 ３ に示すソーティング

果から分かる様に極めてデリケットな脳神経細原理では，高精度に流速によるソーティングの胞を我々の装置でソーティングしても，単一細時間を算出できることから，従来のソーティン胞がコロニーと成長でき，ダメージレスであるグプロセスに採用された超音波や高電荷等の手こと示唆している。

法を回避し，最も生細胞にダメージを与えない方式と言え，その実験 例 の 一 つ を 図 ６ に 示
６０NEW GLASS Vol．
２１ No．
３２００６

４

ちながら，単一ウエルに単一細胞をダメージレまとめスでソーティングできる特徴を持っている。ま図 ７ に，我々が開発している二つのフローた，PERFLOW の名前には，高価なイメージサイトメーターを示している。左側の機種は，を持たれた従来のフローサイトメーターに対し解析機能のみであるが，二つのレーザを搭載て，各研究室でも普及できるようにパーソナルし，四色の蛍光（FITC（GFP），PE（PI），PeCy

フローサイトメーターの意味を込められてい５，APC）と透過光，後方散乱光及び側方散乱る。今後，透過光やダメージレスソーティング光が計測できる。まだ独自の光ファイバ式光学等の特徴を生かされ，ライフサイエンス科学の系を採用することによって，極めてコンパクト発展に寄与できることを期待している。

化を実現している。右の機種は，解析機能を持

図 ７ パーソナルフローサイトメーター
謝辞
本研究の一部は，平成１７年 NEDO 次世代戦略技術実用化開発助成事業によって行われている。
参考文献
１）新版フローサイトメトリー自由自在 ２
００５ 主編
中内 啓光
秀潤社発行

６１