ボトムアップ生物工学

細胞機能のボトムアップデザインとシステム化
庄司
はじめに

観 1・川野竜司 2ンパク質を用いたナノポアセンシングは，高感度，高時間分解能で一分子レベルの計測が可能である．そこで筆細胞は生命の最小ユニットであり，厚さ約 5 ナノメー

者らは，液滴接触法のストラテジー（図 1a）を応用し，トルの脂質二分子膜に覆われた数マイクロメートルサイ

マイクロ・ナノ電極の先端に人工細胞膜を形成し，ポアズの空間内に，さまざまな分子が精緻な構造を構築し高形成膜タンパク質を再構築した生体ナノポアプローブを度な機能を発現している．さらに，それぞれの細胞同士開発することで，ナノポアセンシングによる局所的なケが互いにコミュニケーションを取り合うことで，さまざミカルセンシング，およびハイスループットナノポアセ

まな生命現象が引き起こされている．

ンシングの実現を目指している．

近年，これらの生命システムの構造や仕組みを理解す

まず，マイクロ・ナノ電極を用いた脂質二分子膜の形るために，生体分子をボトムアップ的なアプローチで再成手法について説明する．筆者らのグループでは，高分構築し，人工的に細胞構造・機能を構築する人工細胞 1)・子で修飾した金ナノニードル電極 16)，およびガラス管に人工細胞膜 2) に関する研究が合成生物学の分野において内包された銀 / 塩化銀マイクロ電極 17) を用いた生体ナノ活発に行われている．さらに，医学・創薬・環境科学・ポアプローブの開発に成功している．どちらの手法におエネルギー工学など，さまざまな分野において実用的ないても，電極を脂質溶液と水溶液が層となった浴溶液にアプリケーションを目指した，人工細胞型マイクロロ挿入し，電極先端に形成される脂質単分子膜と溶液界面ボット工学に関する 分子ロボティクス のコンセプトに形成される脂質単分子膜を接触させることで脂質二分が提案されている

3–6)．分子ロボットは，DNA ナノテク子膜を形成することが可能である（図 1b）．

ノロジー，合成生物学，高分子化学，電気化学，ロボッ

生体ナノポアプローブによる局所センシングの可能性

ト工学など，さまざまな技術を組み合わせ，ボトムアッを実証するために，H 型マイクロ流路内に形成される化学プ的なアプローチによって構築させる．
筆者らのグループでは，マイクロ微細加工技術を用いることで安定，かつ再現性の高い人工細胞膜の作製手法を提案してきた 7,8)．これまでに，脂質単分子膜に覆われた油中水滴を接触させ，人工細胞膜を形成する「液滴」（図 1a）を開発し，人接触法（Droplet Contact Method）
工細胞膜に再構築したイオンチャネルなどの膜貫通ペプ
チド・タンパク質の電気生理学実験を効率良く行うことが可能となっている 9–12)．本稿では，筆者らが最近取り組んでいる，液滴接触法の原理を応用したプローブ型の人工細胞膜形成手法，ボトムアップ的配列設計により構築した人工イオンチャネル，分子ロボットの開発を目指した人工細胞の駆動技術に関して紹介する．
プローブ型人工細胞膜システム
筆者らのグループでは，マイクロデバイスを用いることで人工細胞膜の安定的な形成に成功しており，これまでポア形成膜タンパク質・ペプチドの活性評価 9–12)，ナ
ノポアセンシングによるバイオセンサ 13–15) に関する研究を行ってきた．人工細胞膜に再構築したポア形成膜タ
著者紹介生物工学12

図 1．a）液滴接触法による人工細胞膜形成の原理図．
b）マイクロ・ナノ電極を用いた人工細胞膜の作製手法．

長岡技術科学大学 産学融合トップランナー養成センター（産学融合特任講師） E-mail: kshoji@mech.nagaokaut.ac.jp
東京農工大学大学院工学研究科生命機能科学部門（教授） E-mail: rjkawano@cc.tuat.ac.jp

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特集

図 2．a）金ナノニードル電極生体ナノポアセンサを用いたマイクロ流体デバイス内の濃度勾配計測．得られた阻害頻度を解析することで流路内の局所的な化学物質濃度を測定した．その結果，流体シミュレーションによる計算値と同様な直線的な濃度勾配が得られた．
b）銀 / 塩化銀マイクロ電極生体ナノポアプローブを用いた簡易・ハイスループットナノポアセンサ．3D プリンタを用いて作製したチャンバを用いて液滴を形成，プローブを移動させることにより，異なるサンプルのナノポアセンシングを連続で行うことに成功した．

濃度勾配の計測を行った．マイクロ流路内に金ナノニー

ポアセンシングには一定サイズのポアを再現性良く形成

ドルを用いた生体ナノポアプローブを挿入し，ナノポアセすることが可能な α ヘモリシン（αHL）や Mycobacterium

ンシングによる化学物質の濃度を計測した結果，流体シ

smegmatis porin A（MspA）などの自然界に存在するポミュレーションによって計算された値と同様な濃度勾配

ア形成膜タンパク質が用いられているが，それぞれポアが形成されていることが確認でき，生体ナノポアプローブ

直径が 1.4，1.2 nm と小さく，タンパク質などの巨大分を用いた局所ケミカルセンシングを実現した（図 2a） ．

子を計測することは困難である．また，直径 5 nm 以上

さらに，銀 / 塩化銀マイクロ電極生体ナノポアプローの巨大なポアを形成する天然ポア形成膜タンパク質も存ブを用いた簡易ナノポアセンシングプラットフォームを在するが，得られるポアサイズの制御が困難であること，開発した．本生体ナノポアプローブは，プローブの上下検出可能な分子サイズがポアサイズに依存することか動のみで脂質二分子膜形成を制御することが可能である

ら，天然ポア形成膜タンパク質を巨大分子のナノポアセため，簡易・ハイスループットなナノポアセンサを構築

ンシングに応用することは困難である．そこで筆者らは，

16)することが可能である．3D プリンタを用いてドロップ

αHL などの堅牢なポアを形成するポア形成膜タンパク

レット形成するマイクロウェルが連なったチャンバを作質が有する β シート構造から構築される β バレル構造に製，電極を移動させることで異なるサンプルのナノポア着目し，従来の天然ポア形成膜タンパク質に比べ巨大なセンシングを連続で行うことに成功した（図 2b） ．

サイズのポアを再現性良く構築可能な人工イオンチャネ

17)

以上のように，プローブ状の人工細胞膜システムを開発

ルの開発を試みた 20)．

することで，「局所的な化学物質センサ」および「簡易・β バレル構造を有した人工イオンチャネルを構築するハイスループットナノポアセンサ」の開発に成功している．

ために，以下の三つの設計概念に基づいてペプチドのア

De novo デザインペプチドによる人工イオンチャネル
近年，天然に存在するタンパク質をモデルとして模倣ミノ酸配列をデザインした（図 3a）．

1．両親媒性 β シートモチーフの形成による β バレル構造体の構築

脂質二分子膜中においてペプチド同士した，人工タンパク質だけではなく，一からアミノ酸配が水素結合により強固な相互作用を形成し β バレル構造列をデザインして構築した de novo 人工タンパク質が，数を構築するために，親水性アミノ酸である Ser と疎水性多く提案されている．特に，ワシントン大学の Baker らアミノ酸である Val を交互に配列し，β シートのそれぞのグループは，タンパク質の構造予測アルゴリズムであれの面が親水性・疎水性に分かれるようになる．

る Rosetta を用いて，β バレル構造を有する光活性タンパ

2．シュノーケリング効果による膜貫通ペプチド構造体の安定化
リン脂質のグリセリン部分と Tyr が水素ク質18)や α ヘリックス構造による膜貫通タンパク質19)などさまざまな人工タンパク質を提案している．

結合することにより，脂質二分子膜の親水層と疎水層の筆者らのグループも de novo 人工タンパク質のナノポア

界面においてアンカーとして機能し，膜貫通ペプチドがセンシングへの応用を目指し，ボトムアップ配列設計によ脂質二分子膜内で安定して存在することが可能となる．

る人工イオンチャネルの開発を行っている．現在，ナノ652

生物工学

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ボトムアップ生物工学
成し，液滴接触法を用いたチャネル電流計測により，SV28 によって構築されるナノポアの評価を行った．その結果，7 から 18 の SV28 モノマーによって形成される，直径 1.6 から 6.2 nm の堅牢なナノポアが形成されている．さらに，本ナノポアのナノことが確認できた（図 3c）
ポアセンシングへの応用を試みた．その結果，従来の天然由来のポア形成膜タンパク質を用いたナノポアセンシ
ングでは検出が困難であった長鎖二本鎖 DNA のポア通過を電気的に検出することに成功し，de novo デザイン
ナノポア構造体を用いたナノポアセンサ開発の可能性を示すことができた（図 3d）．
浸透圧エンジンによる分子ロボットの駆動分子ロボットは，ボトムアップ的なアプローチによって生体分子により構築された「センサ」「知能」「アクチュエータ」が一つのコンパートメントに集積化された微生物様マイクロロボットである．現在，巨大リポソームをコンパートメントとした分子ロボットのアクチュエータとして，微生物を模倣した分子モーターによる駆動メカ
ニズム 22,23) が検討されているが，微生物や細胞のように分子モーターを複雑，かつ精密に配列させることが困難であるため，分子モーターによる駆動力をロボットの移動に変換し，本体を一方向に移動させることには成功していない．
図 3．De novo デザインペプチドによる人工イオンチャネル．a）
De novo ペプチドの設計概念．b）MD シミュレーションによるポア形成の確認．c）電流計測によって得られた人工イオンチャ
ネルのポアコンダクタンスのヒストグラム．d）人工イオンチャ
ネルを用いた二本鎖 DNA のナノポアセンシング．

そこで筆者らのグループは，細胞の遊走メカニズムの一つである浸透圧エンジン 24) を応用した分子ロボットの駆動メカニズムを提案している25)．浸透圧エンジンは，脂質二分子膜を介した浸透圧流によって移動力を発生させる．巨大リポソームにおいては，水は通過させるがイオンは通過させない脂質二分子膜の半透膜性によって，3．極性アミノ酸による β シートモチーフの電気的β シートモチーフが脂質二分子膜内で逆平行に配向浸透圧差による浸透圧流が発生する．巨大リポソームの配向し，それぞれのペプチド同士が水素結合により強固透圧差を作り出すことで，低塩濃度側から高塩濃度側へ前後を塩濃度の異なる溶液で満たし，それぞれの膜に浸な相互作用を形成するために，β シート構造体の両端に浸透圧流が発生する．その結果，溶液の体積変化により正と負に帯電したアミノ酸を配置した．ナノポアのチャ膜が低塩濃度側に変形，膜変形に伴う，せん断力によりネル電流計測では，脂質二分子膜を介して電圧を印加す

巨大リポソームが移動する（図 4a）．

るため，β シート構造体が脂質二分子膜中で一方向に配向すると考えられる．

筆者らは，巨大リポソームを捕捉し，捕捉された巨大リポソームの前後に塩濃度の異なる溶液を流すことが可

上記の設計概念を満たすペプチド構造体として 28 のア能なマイクロ流体デバイスを開発，巨大リポソームの浸ミノ酸によって構築される SV28 ペプチドを設計した ．

透圧エンジンによる駆動実験を行った．その結果，巨大本ペプチドによって構築されるポア形状を MD シミュ

リポソームが低塩濃度側へマイクロ流路内を一方向に駆レーションにより確認したところ，脂質二分子膜中で安動していることを確認し，分子ロボットのアクチュエー定した β バレル構造を持ったナノポアが形成されることタとして浸透圧エンジンを用いた駆動メカニズムの可能が確認できた（図 3b）．

性を示すことができた（図 4b）．しかしながら，本結果

20)

次に，イソアシルジペプチド法
生物工学

第98巻21)

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を用いて SV28 を合は浸透圧流から概算される巨大リポソームの移動速度に653

特集を用いることで，従来のシステムに比べ，シンプルなデザイン・簡易な手法で構築することが可能である．そのため，これらの技術を用いることで生体材料を用いたバイオデバイスの実用的な応用を幅広い分野において実現可能となると確信している．
今後は，筆者らのグループでこれまでに開発してきたナノポアセンシングによる DNA コンピューティングのデコーディング技術等と組み合わせることで，より高度な診断手法・ロボット技術・プローブ顕微鏡など本手法を応用した新たなシステムの創製を目指す．
文

図 4．浸透圧エンジンによる巨大リポソームの駆動実験．a）浸透圧エンジンによる駆動メカニズム．b）マイクロ流路内を移動する巨大リポソーム．

比べ 10 倍程度遅い速度しか得られなかった．今後は流路形状やリポソームと流路壁面の接着力を最適化することで，リポソームの変形による牽引力を効率良くリポソームの移動に変換することが可能なシステムの開発を目指す．
おわりに
本稿では，筆者らのグループで行っている「人工細胞膜」「人工イオンチャネル」「分子ロボティクス」に関する最近の研究成果について概説した．ボトムアップ的なアプローチによって構築されるこれらのシステムは，微献1) Buddingh, B. C. and van Hest, J. C. M.: Acc. Chem.
Res., 50, 769 (2017).
2) Kansy, M. et al.: J. Med. Chem., 41, 1007 (1988).
3) Murata, S. et al.: New Generat. Comput., 31, 27 (2013).
4) Hagiya, M. et al.: Acc. Chem. Res., 47, 1681 (2014).
5) Kawano, R.: ChemPhysChem, 19, 359 (2018).
6) Shoji, K. and Kawano, R.: Micromachines, 11, 788 (2020).
7) Funakoshi, K. et al.: Anal. Chem., 78, 8169 (2006).
8) Kawano, R. et al.: Sci. Rep., 3, 1995 (2013).
9) Tsuji, Y. et al.: Anal. Chem., 85, 10913 (2013).
10) Watanabe, H. et al.: Anal. Chem., 89, 11269 (2017).
11) Sekiya, Y. et al.: Analyst, 143, 3540 (2018).
12) Sekiya, Y. et al.: ACS Appl. Bio Mater., 2, 1542 (2019).
13) Hiratani, M. et al.: Anal. Chem., 89, 2312 (2017).
14) Ohara, M. et al.: ACS Synth. Biol., 6, 1427 (2017).
15) Hiratani, M. and Kawano, R.: Anal. Chem., 90, 8531 (2018).
16) Shoji, K. et al.: ACS Nano, 13, 2606 (2019).
17) Shoji, K. et al.: Anal. Chem., 92, 10856 (2020).
18) Dou, J. Y. et al.: Nature, 561, 485 (2018).
19) Lu, P. L. et al.: Science, 359, 1042 (2018).
20) Shimizu, K. et al.: ChemRxiv,
DOI: 10.26434/chemrxiv.12286337.v2. (2020).
21) Sohma, Y. et al.: Chem. Commun., 124 (2004).
22) Sato, Y. et al.: Sci. Robot., 2, eaal3735 (2017).
23) Tanaka, S. et al.: Commun, Phys., 1, 1 (2018).
24) Stroka, K. M. et al.: Cell, 157, 611 (2014).
25) Shoji, K. and Kawano, R.: Lab Chip, 19, 3472 (2019).

細加工技術，ペプチド工学，マイクロ流体制御技術など

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