〔生物工学会誌

第 84 巻第4号

127–132．2006〕平成17 年度 斎藤賞 受賞

総合論文

微生物による石油成分系化合物の代謝研究とその多角的応用研究
野村 暢彦

Analysis and Application of Microorganisms Utilizing Petroleum Constituentsand Compounds Thereof
NOBUHIKO NOMURA (Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba,
1-1-1 Tennodai, Tsukuba 305-8572) Seibutsu-kogaku 84: 127-132, 2006.
Interest in biosurfactants has been increasing in recent years due to their diversity, environmentallyfriendly nature, the possibility of producing them through bioconversion, and their potential applications
in environmental protection, crude oil recovery and as medical agents. Candida antarctica synthesizes abiosurfactant when waste oils are added to the medium, indicating that biosurfactants can be produced
utilizing waste oils as substrates. The author characterized the degradation properties of various alkylated
poly-aromatic compounds of Sphingomonas paucimobilis TZS-7 and Mycobacterium sp. G3, and cloned andsuccessfully expressed the related genes for each substance.

［Key words: poly-aromatic compounds, microbial degradation, biosurfactants, conjugated polymers,
waste oils］

はじめにが 40 年以上にわたって行われてきた．DBT 分解菌は，
C-C 結合を切断する環開裂型と C-S 結合切断型に大別

n- アルカン，脂肪酸，あるいは難分解性アルキル化多される 1–3) が，それらのほとんどはアルキル化されてい環芳香族などを代謝材料にできる微生物の機能を利用しない PAH，PASH の微生物分解の報告であった．近年，て，石油，油脂あるいは産業廃油の高度利用また深度処

石油汚染サイトに残留している PAH，PASH の大部分は理を目的として研究を進めた．また，それらの機能を司

アルキル化されたものであることが明らかとなってきる酵素遺伝子について遺伝子工学的手法を用いて改良すた 4)．アルキル化 PAH および PASH において，アルキルることで，高生産性などの機能強化あるいは新しい付加基の数が多いほど分解性が低くなるとの報告があり 5)，

価値産物の創製を図った．

なかでも 4,6-dimethyl DBT（4,6-DMDBT）は特に難分アルキル化含硫多環芳香族の微生物分解

解性であり，その毒性も高いことから，近年注目を集めている物質である．4,6-DMDBT は流出油の汚染の他に，これまで石油汚染の生物的処理（バイオレメディエー

ディーゼル自動車の動力源である軽油中にも多く存在しション）や石油のバイオ脱硫（BDS）を目的として，石ており，その脱流も困難であることから，ディーゼル排油系の多環芳香族炭化水素（PAH）あるいは含硫多環芳

気ガスに含まれる diesel exhaust particles（DEP）として

香族炭化水素（PASH），石油汚染のマーカーであるジベの人体への影響，また酸性雨の原因物質としても注目さ

ンゾチオフェン（DBT）などの微生物分解に関する研究れている 6)．そこで，我々は 4,6-DMDBT分解菌の探索を

著者紹介

筑波大学大学院生命環境科学研究科生物機能科学専攻（助教授） E-mail: nomunobu@sakura.cc.tsukuba.ac.jp127

としては DBT が一般的に用いられていたが，DBT の代謝産物などが後段の脱硫反応を抑制することが危惧されていた．そこで，G3 株の菌体生育条件と高い脱硫活性を誘導する生育硫黄源を検討した結果，最適硫黄源として
硫酸イオンなどを見いだし，DBT を用いない新しい培養方法で従来の脱硫菌（野生株）には報告例がない高い脱硫活性（178 µmol/g-DCW/h）を得ることができた 13)．
BDS においては油水二相系反応が想定され，脱硫処理
軽油と菌体懸濁液との油水分離が重要となるが，これまでに報告されている他の脱硫菌を用いた脱硫反応においてはエマルジョンが生成し，油水分離が困難になることが問題とされてきた．G3 株の油水分離能を調査したと
ころ，G3 株においては油相と水相が速やかかつ明確に分離され，エマルジョンの生成も見られず，すぐれた油水分離能が認められた 14)．しかしながら，油水二相系反応では分子量が比較的大きいアルキル DBT に関する油
水二相系反応の脱硫速度は，水系反応と比較し大きく低
図 1．軽油脱硫の GC-AED 解析．4 日間の脱硫反応（BDS）に供した 2 ロットの軽油についての GC-AED 解析．22.4 min のピークは 4,6-dimethyl DBT（C2-DBT），24 ～25 min のピーク
は C3-DBTs．最下段はモデル化合物の保持時間を示し，DBT，
4,6-dimethyl DBT，4,6-diethyl DBT，4,6-dipropyl DBT，4,6dibutyl DBTと4,6-dipentyl DBTは，それぞれ 18.4，22.4，25.5，
28.2，31.3と34.1 min を示す．

下した．そこで，基質の疎水性に着目し，logk'値として定量的に疎水性を評価した結果，脱硫活性と相関することを見いだした 15)．さらに，油水二相系反応における反応速度論的解析を行い，この相関を裏づけた．また，溶媒であるn-アルカンについてはその鎖長に伴い反応性が向上し，基質だけでなく溶媒の疎水性も脱硫反応に関わる可能性を見いだした．

行った結果，その C-C 結合環開裂型分解菌 Sphingomonas
strain TZS-7 7) と C-S 結 合 切 断 型 分 解 菌 Mycobacterium
sp. G3 8) を取得することができた．解析の結果，それぞれの分解菌は DBT 以外の多環芳香族基質に対しても

以上，G3 株は分解能だけでなくその細胞特性もユ
ニークな性質を有することが示された．
各種芳香族のモノヒドロキシル化とIT 素材
先述のように，それらの細菌はアルキル化多環芳香族

広い分解スペクトルを有しており，TZS-7 株は 2,3-dihidroxybiphenyl 1,2-dioxygenase, catechol 2,3-dioxy-を含む種々の多環芳香族に対して，高い分解活性を示す

genase などの環開列酵素群を有していることが明らかことが示された．それは言い換えると，それら細菌はとなった ．一方，G3 株はより分子量の大きいアルキル

種々多環芳香族などの疎水性基質を許容しうる宿主細胞

化 DBT（4,6-dipentyl DBT）に対しても C-S 結合切断にであるとともに，それら幅広い基質に対する代謝酵素遺伴う脱硫反応を示し，従来菌にない高い基質取り込み

伝子（群）を有していることに他ならない．そこで，そ能と広い脱硫スペクトルが示したことから 10)，その脱硫の能力に着目し，多環芳香族化合物の分解から合成へと酵素遺伝子群を取得し発現解析を行った結果，それら酵発想を転換してみた．分解酵素遺伝子（群）などに変異

素に高分子アルキル化 DBT に対する広い反応性が見を導入することにより，種々多環芳香族からモノヒドロいだされた 11)．この反応性は，工業的な軽油（2 ロット）

キシ体へのバイオコンバージョン可能な分子育種に成功の脱硫反応に適用した結果においても同様であり，高いした 16)．たとえば，DBT であれば休止菌体反応により2脱硫率を得ることができた（図 1）．また，通常の DBT

時間後には反応水溶液上清から，そのモノヒドロキシル

脱硫反応においては最終産物として硫酸イオンと 2-

体としてほぼ 100％ 回収できた（図 2）．同様に図 3 に示hydroxybiphenyl（2-HBP）が生成されるが，興味深い

すような各種多環芳香族を短時間で種々多環芳香族のモことに，G3 株の DBT 代謝経路の詳細な解析を行ったとノヒドロキシ体に変換し，かつそれを高効率で細胞外へころ，G3 株では DBT から 2-HBP 生成だけでなく，HBP

分泌できることが確認できた．ここで特徴的なことは，からさらに 2-methoxybiphenyl（2-MBP）への変換反応

高い変換効率のみだけでなく，その変換されたモノヒドが行われることが見いだされた 12)．脱硫菌の生育硫黄源

ロキシル体が細胞外の上清に移行しているところであ

9)

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図 2．分子育種菌による DBT から hydroxy DBT の生成．●，
DBT；▲，hydroxy DBT．

図 5．分子育種菌を利用した芳香族モノヒドロキシル体生産の流れ

環芳香族モノヒドロキシル体生産のハイスループットシ
ステムであるといえる（図 5）．
種々多環芳香族のモノヒドロキシ体は，OH 部位において分子修飾を簡便に行うことが可能であるため医薬・化学さらに IT 産業の原料として期待できる．特に種々の含硫多環芳香族のモノヒドロキシ体は，高分子型導電性ポリマー合成のためのモノマーとして有用である．近図3．種々の PASHとPAH

年，高分子型導電性ポリマー 17) は，次世代液晶と目されている高分子型有機電界発光素子（EL 素子）や，また太陽電池の材料としても開発が求められている．しかし，ポリマー合成にはそのモノマー素材である高分子多環芳香族の特異的部位に分子修飾を施す必要性があり，その化学合成が非常に困難あるいは不可能なことから，その材料開発がキーポイントとなっている．そこで，そのモノマー候補となりうる各種多環芳香族のモノヒドロキシル体を本育種菌を用いてハイスループット生産し，そ

図 4．分子育種菌の細胞がモノヒドロキシル体を精製してくれている

れらの性能を調べた．具体的には得られたモノヒドロキ
シル体のモノヒドロキシル基に，修飾基質を化学法により付加させ精製後，電解重合法により導電性ポリマーを合成する（図 6）．そして，得られた新規導電性ポリマー

る．これまで，化学合成法あるいは微生物反応による芳をサイクリックボルタンメトリー法などを用いて評価し香族類のモノヒドロキシル体の合成はいくつか報告があた．その結果，酸化還元のバンドギャップが狭い特徴的るが，その回収に難があることがほとんどである．本育な性質を示すものが得られた（図7）．酸化還元のバンド

種菌は，その細胞自身がモノヒドロキシル体を粗精製すギャプが狭い高分子型導電性ポリマーは，有機 EL 素子

る（図 4）ので，反応後の上清から有機溶媒抽出するのの発光層あるいはバッファー層への使用が期待される．

みで，モノヒドロキシル体をガスクロマトグラフィーに

そこで，新規導電性ポリマーのエレクトロクロミック素てワンピークにまで精製できる，いわばすぐれた各種多子としての性能を調べたところ，光シャッター能を有し

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図6．導電性ポリマーの合成．分子育種菌により芳香族をモノヒドロキシル体に変換後，化学法により Rに置換したものを電解重合させる．

図 8．マンノシルエリスリトールリピッド（MEL）とサクシノ
イルトレハロースリピッド（STL）の構造

油脂・廃油からの糖脂質生産とその生理活性
微生物が生産する糖脂質系のバイオサーファクタント
は比較的多量に生産されることが知られており，その両親媒性の構造と生分解性の特質を利用した氷スラリー
凝集・塊状化防止剤としての利用やバイオレメデーショ
ンへの利用，および生理活性作用を利用したナノバイオ
素材として医薬品への利用などさまざまの機能面での応用が検討されており 18) 工業的な生産・利用に関して最も図 7．得られた新規導電性ポリマーのサイクリックボルタンメ
トリー法による評価

将来性のあるバイオサーファクタントの一つと考えられている．また，Candida antarctica T-34 株が著量に生産す
る，炭化水素や油脂などを原料とする糖脂質マンノシル
エリスリトールリピッド（MEL）（図 8）19) や，Rhodococcusていることが明らかとなり発光素子として有望であるこ

sp. SD-74 株が石油成分中の n- アルカンなどから生産すとが示された．高分子型の発光素子は，その加工性の容る脂肪酸糖エステル，サクシノイルトレハロースリピッ

易さと柔軟性から電子ペーパーの表示素子として研究開ド（STL）（図 8）20) は新規な特性として，種々の癌細胞発が進められており，また，太陽電池素材やさらに外部

増殖抑制作用などの生理活性を持つことが明らかとなっ電場により発色を変えるエレクトロクロミック素子としている 21–25)．興味深いのは，MEL，STL は両者とも HL-て，電子ペーパー分野への応用も可能である．

60 の分化を誘導するが，それぞれ異なった方向を有する

これらのバイオ（分子育種菌）を介してつくられる各ことである 26)．その違いがそれぞれの糖骨格の違いによ

種チオフェン化合物類のモノヒドロキシ体においてヒドるのかなどのメカニズムはまだわかっていない．
しかし，

ロキシル基のつく位置は，化学合成法では非常に困難あ

それは微生物産生糖脂質の生理活性物質としてのさらなるいは合成不可能な箇所であるため，そのヒドロキシルる用途を期待させる．

基に分子修飾したものを材料として合成された導電性ポ

さらにSTL 生産菌であるRhodococcus sp. SD-74株は非

リマーは，ほとんどすべて新規かつオリジナルなものと常に特徴的な性質を有している．これまで報告されていなる．さらに，その製法もバイオ技術を介することで常る微生物は炭素源などの条件を変えても同じ糖脂質を生

温・常圧での合成が可能となり，また純度も高いことか産するが，SD-74 株は，加える炭素源のアルカン類や脂ら精製も含めて，化学合成法よりも環境に優しくかつ簡肪酸をそのままトレハロース骨格に結合させ，その STL素である．しかし，性能評価程度に必要なモノヒドロキの側鎖として生合成できる．その際，鎖の長さが 10 ～シル化体の生産量は本育種菌の性能で十分であるが，そ20 程度の炭素鎖であれば Cl の修飾あるいは不飽和結合の大量生産にはまだ大きな改良が必要とされる．

などが入っていてもそのまま STL の側鎖となる 23)．この

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特徴により STL の側鎖部位を自由に設計しうることかする収率は約 40％）．また，他の植物性廃食油やラードら，用途に応じた STL の創製が可能となり，さまざまなどの動物性廃食油においてもそれぞれ分解率 80％以な分野での応用が期待できる．また，SD-74 株が有する上かつ MEL 生産量が 25 g/l 程度であった 29)．T-34 株と側鎖とトレハロースの結合を媒介する酵素は，その側鎖ほぼ同等のMEL生産能力をもつとされているKurtzmano-の結合している部位がトレハロースの 2 位や 3 位と通常

myces sp.I-11 では，大豆油を炭素源とした流加培養法に修飾が困難な位置であることから，トレハロースの誘導より，現在実用化されているバイオサーファクタントで体合成にも応用が可能である．

あるソホロリピッドに近い生産効率（約 200 g/l）が達成

微生物による物質生産を工業的に考える場合では依然できることが実証されている 30)．T-34 株を用いると大豆として生産コストが高くつくという問題点があり，安価

油の代わりに種々廃油を用いても同程度のバイオサー

な原料の利用や生産および精製手段の効率化が求められファクタント生産が期待されることから，そのマスプロている．その一方で，油脂はあらゆる産業活動や社会生

ダクトとしての用途が見つかれば環境調和型の微生物変活を通じて廃棄され，一部は環境中に放出されることに換技術による有用物質生産が実現できる可能性は高いとより水質悪化などの環境汚染の原因となっている．そこいえよう．

で産業廃油を原料として微生物変換技術によりバイオ

おわりにサーファクタントを生産することができれば，原料コストの削減と環境問題の両面の解決につながる再生資源を利用した環境調和型の微生物生産の一例となろう．

以上の研究に使用された菌株の中には，20 年以上前の当研究室の石油発酵の研究で分離された菌株を掘り起こ

しょうゆ油は生揚醤油の清澄工程において液上面に浮しているものもある．昔に，目的は違えども得られた菌

上した油分で，その回収量は丸大豆醤油の場合では生揚

株でも，現在だからあるいは現在の技術があるからこそ醤油の数％に相当する．しょうゆ油は，リノール酸エチ

別の応用あるいは基礎としても使用できる可能性があル，オレイン酸エチルなどの脂肪酸エチルエステルを 50

る．もともと日本は微生物のスクリーニングが上手な国％程度，その他に脂肪酸，トリグリセライド，スフィンであり，多くの微生物が分離保存されているはずである．

．また，しょうゆ油は醤

それらをバイオリソースとして見直すことも必要かもし

ゴ脂質などの微量成分を含む

27)

油色素であるメラノイジンによる着色のため黒褐色を帯れない．

び，酸価が高いため金属を腐食するなどの欠点があるこ

また本研究は，分解経路あるいは合成経路の代謝を基とから，多くは焼却処分されているのが現状である．そ礎的に解析し，そこから有用物質・有用酵素の発見ある

こで，C. antarctica T-34 株の油資化能およびバイオサー

いは高生産につながった経緯があり，基礎から（予想もファクタント生産能を利用することにより，しょうゆ油しなかった）応用が生まれることを経験した．また，その微生物分解と糖脂質系のバイオサーファクタント生産

こには IT 分野の研究者（同大学）の偶然の出会いが不について検討を行った．しょうゆ油を唯一の炭素源とし可欠であった．それは，たまたま官舎の上の住人があのて T-34 株を培養した場合，しょうゆ油の主成分である脂白川先生のお弟子さんで，官舎の階段での立ち話から共肪酸エチルエステルはほぼ完全に分解され，その他の油同研究が始まった．今後とも，出会いやコミュニケーショ

成分も含めしょうゆ油の分解率を添加濃度に対する残存ンを大切にし大学の特徴を生かしながら，本研究もより濃度の割合として求めると最終的には 87％の分解率を高度に，また学際的に発展させていきたい．

示した ．T-34 株の油分解率は，遊離脂肪酸，脂肪酸エ28)

チルエステル，しょうゆ油，大豆油の順に高かった．また，しょうゆ油特有の黒褐色が消失して透明になっていたことから，T-34 株は油脂の微生物脱色能力も有することが示唆された．続いて，T-34 株を用いた微生物変換によるしょうゆ油からのバイオサーファクタント生産について検討した．油脂の中で MEL を高収率で生産することが知られている大豆油との比較では，大豆油からのMEL 生産量は油脂濃度が 6 , 12％で，それぞれ MEL が25, 34g/l であったのに対して，しょうゆ油の MEL 生産
量は，それぞれ 24, 35g/l であり，大豆油とほぼ同程度の生産量が認められた（しょうゆ油と大豆油とも原料に対
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本研究は筑波大学の微生物生理化学研究室で行った仕事です．この間多大なご助言とご教示を頂きました中原忠篤教授（名誉教授）ならびに内山裕夫教授に深甚なる感謝を表します．
中原先生からは農芸化学の，内山先生からは環境および微生物
生態それぞれの視野を広げていただきました．また，本賞の受賞に際しまして，学会への推薦をしていただきました筑波大学
大学院生命環境科学研究科の田中秀夫教授にお礼申し上げます．これらの研究を遂行するにあたり，共同研究者である同研究室の中島（神戸）敏明助教授，コスモ石油株式会社中央研究所の岡田秀樹博士，理化学研究所遺伝子材料開発室室長の横山和尚博士，ヒガシマル醤油株式会社研究所の古林万木夫博士に感謝いたします．また，全くの異分野の共同研究を快く受け入れてくださった旧白川英樹研究室の筑波大学大学院数理物質

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研究科の赤木和夫教授ならびに後藤博正講師に感謝いたします．研究をサポートしていただいた NEDO に感謝いたします．
そして，ここで紹介した研究成果は，間世田英明博士，篠原優
子博士，呂傑博士，高田真樹博士，諸氏をはじめとする多くの博士研究員，大学院，および学部学生の努力の賜です．ここであらためて感謝いたします．
最後に，サイエンスの道へ誘っていただいた恩師である大阪大学大学院工学研究科の室岡義勝教授（現大阪大学サンフランシスコセンター長）に感謝申し上げます．

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