カカオ豆由来リグニン配糖体の新たな活性を求めて
坂上宏（明海大学 歯学部 病態診断治療学講座 薬理学分野 教授）

１．研究目的
我々は、カカオ成分の新規機能性の解明を目的として、カカオマスおよびカカオハスクよりリグニン配糖体（以下LCC）を調製し検討した結果、カカオハスクLCCの生理活性が明らかになった1, 2, 3）。
しかし、試料の溶解性、滅菌性については検討していなかった。そのためLCCを1.39％ NaHCO3に溶解し、更にオートクレーブ滅菌を行い、溶解性と滅菌性を確保した。そして、このように調製されたLCCの活性を再検討した。その結果、カカオマスLCCは、新しい生物作用を示すことが判明した。

２．リグニン画分の調製と収率
カカオマスあるいはハスクに対し、10倍量のヘキサンによる脱脂を3回繰り返した。その後、試料を室温にて2時間、1％NaOHで攪拌抽出を行い、不溶物を遠心により除去した。酢酸を添加して、pH5.0でLCC画分（酸沈殿1回）を沈殿させた。一部を1％NaHCO3に溶解後、不溶物を遠心で除去後、同様に酢酸を添加して、精製LCCを得た（酸沈殿2回）。これらを水に対して透析後、凍結乾燥した（図1）。カカオマスLCC、ハスクLCCの収率は、表1に示した。LCCは、1.39％NaHCO 3に溶かし、オートクレーブ（121℃、2気圧）により滅菌した。
その後、ゲル濾過で求めた分子量は、10万以上であり、高分子状態が維持できていることが確認された。

図１

カカオLCCの調製法

３．抗HIV活性
ヒトT-細胞白血病細胞MT-4を、HIV-1IIIBで感染させ細胞を死滅させる条件を設定し、HIV-感染、非感染MT-4細胞を5日間、試料とともに培養して相対的生細胞数をMTT法で測定した。非感染あるいは感染細胞から、それぞれ50％の細胞を生存させる濃度（CC50、EC50）を測定した。抗HIV活性は、選択係数SI （SI=CC50/EC50）により数値化した（図2）。
カカオマスLCC（酸沈殿1回）（図2）は、ハスクLCC（酸沈殿1回）（図3）よりも高い抗HIV活性を示した（表1）。アルカリ可溶化と酸沈殿を再度行っても、カカオマスLCCの抗HIV活性は（図2）は、ハスクLCC（図3）よりも高かった。

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図２ カカオマスLCCの抗HIV活性
各点は、3回の実験値の平均値を示す。

表１

図３ カカハスクLCCの抗HIV活性
各点は、3回の実験値の平均値を示す。

カカオマスおよびカカオハスクLCCの収率、ホルメシス誘導活性および抗HIV活性４．ホルメシス効果
低濃度のカカオマス及びハスクLCCは、MT-4細胞の増殖を若干（15％程度）促進した（図2、3、
表1）。低濃度における増殖促進効果は、ホルメシスとして知られており、種々の薬物、放射線照射により誘導されることが報告されている4, 5）。カカオマスおよびハスクLCCに対して、ホルメシス効果を示す細胞は、その細胞の膜表面に受容体を発現している可能性が示唆される。

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５．マウスマクロファージ様細胞におけるNO産生に及ぼす影響
RAW264.7細胞あるいはJ774.1細胞を、24時間、LCCとインキュベーションし、放出されたNOおよび生細胞数を測定した。培養液中のNO濃度は棒グラフ、生細胞数は丸印で示した。白あるいは灰色は、それぞれ、酸沈殿1回、あるいは2回により調製されたサンプルを示した。各点は、2回の平均値を示し、NO定量には、LCCの着色によるバックグランド値を差し引いた。
カカオマスLCCは、酸沈殿1回あるいは2回のいずれでも、RAW264.7細胞あるいはJ774.1細胞によるNO産生を、125μg/mlまでの濃度では促進しなかった（図4）。
また、RAW264.7細胞を、LPS（100ng/ml）

図４ カカオマスLCCによるマウスマクロ
ファージ様細胞のNO産生に及ぼす効果

存在あるいは非存在下において、カカオマ
スLCCと24時間インキュベーションし、誘導型NO合成酵素（iNOS）の発現をウェスタンブロット解析により調べた。カカオマスLCCは、50μg/mlまで、単独では、RAW264.7細胞におけるiNOSの発現を誘導しなかった。しかし、カカオマスLCCは、LPSにより促進されるiNOSの発現を濃度依存的に促進することが判明した（図5）。

図５LPSのiNOSタンパク質発現に対するカカオマスLCCの影響

一方、培養液中のNO濃度は、NOの産生と分解により規定される。そこで、カカオマスLCCおよびcarboxy-PTI存在下において、NOC-7から発生するNO産生量をESRにより測定した。NOラジカ
ル強度は、矢印で示したcarboxy-PTIのピークの高さと、外部標準のMnOのピークの高さの比を求め、controlに対する％に換算して表した。各点は、平均値±S.D. (n=3)を示した。
カカオマスLCCは、NOC-7から発生するNOを濃度依存的に消去した。50％抑制濃度は、53μg/mlであった（図6）。これに対して、LPSは、顕著なNO消去活性を示さなかった（data notshown）。以上の結果は、カカオマスLCCとLPSは作用点が異なることを示唆する。

16図６

カカオマスLCCのNOラジカル消去活性６．サイトカイン産生に及ぼす影響
RAW264.7(A)およびJ774.1細胞(B)を種々の濃度のカカオマスLCCと24時間インキュベーションし、培養液中のTNF-αの濃度を、ELISAにより測定した。白あるいは灰色は、それぞれ酸沈殿1回、あるいは2回により調製されたサンプルで、2点の平均値を示した。RAW264.7細胞(A)と比較して、
J774.1細胞(B)は高濃度のTNF-αを自発的に培養液中に産生・放出していた（図7）。この結果は、J774.1細胞は培養上清に、TNFのマウスホモログであるtumor killing factorを産生・放出するという報告6）を支持する。ただし、カカオマスLCCによるTNF-α産生促進はLPSに比べればかなり弱いものであった。
また同様に、RAW264.7細胞の培養上清中のIL-1β(A)、IFN-α(B)、IFN-γ(C)の濃度を、ELISAにより測定した。白あるいは灰色は、それぞれ、酸沈殿1回、あるいは2回により調製されたサンプルを示した。
各点は、平均値±S.D.(n=3)を示した。カカオマスLCC（0.005〜500μg/ml）は、RAW264.7細胞によるインターロイキン-β(IL-1β)、インターフェロン-α(IFN-α), IFN-γの産生を促進しなかった（図8）。

図７ カカオマスLCCのマウスマクロファージ様細胞のTNF-α産生に及ぼす効果

図８ カカオマスLCCのマウスマクロファージ様細胞の種々のサイトカイン産生に及ぼす効果 ＊ <0.05.

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７．考察
我々の研究により、緩和なアルカリ条件で、オートクレーブ滅菌することにより、高分子構造を維持したLCCを完全に可溶化されたことが初めて明らかになった。この様にして調製されたカカオマスLCCの抗HIV活性は、カカオハスクLCC、他のLCC、タンニン類、フラボノイド類7, 8）を凌ぐものであった。可溶化されたLCCはシグナル伝達経路の解明に貢献すると思われる。
最近、我々はシイタケ菌糸体培養液（LEM）由来LCCが、種々の免疫応答遺伝子の発現を誘導すること、大半はLPSで誘導される遺伝子と重複することを明らかにした9）。また、免疫応答遺伝
子の発現は、LPSの方が強く誘導することを見い出した9）。カカオマスLCCも同様な活性を示すか、また、濃度が異なる際に同様の活性を示すか否か、今後の検討課題である。
今回の研究は、LCC自身には、iNOSタンパク質の発現を促進する活性はないが、LPSのiNOSタンパク質の発現を相乗的に増強することを明らかにした。これは、LCCの作用点がLPSとは異なること、また、それ自身では、サイトカインの産生能は低いが、宿主細胞を活性化してサイトカインの産生、あるいは発現を促進する可能性を示唆する。LCCの糖組成の検討が、カカオマスLCCの免疫増強効果発現のメカニズムの解明に必要である。
カカオマスおよびカカオハスクLCCは、今回、MT-4細胞の増殖を若干促進することが見い出された。我々は、カカオLCCが、歯肉線維芽細胞の増殖を促進すること1）、五葉松の松かさLCCは、マウス脾臓リンパ球の幼若化（3H-チミジンのDNAへの取り込み）を促進することを報告している
10, 11）。LCCが、選択的な受容体を介して、正常細胞の増殖を選択的に促進するのか否かは、今後の重要な研究課題である。

文献
１ 坂上宏、前田裕一、大澤謙二：カカオハスクの多様な生物作用と代替医療における機能性、

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２ Sakagami H, Kushida T, Oizumi T and Makino T: Distribution of lignin carbohydratecomplex in plant kingdom and its functionality as alternative medicine. Pharmacology &Therapeutics 128: 91-105, 2010.
３ Sakagami H. Satoh K, Fukamachi H, Ikarashi T, Simizu A, Yano K, Kanamoto T, Terakubo S,Nakashima H, Hasegawa H, Nomura A, Utsumi K, Yamamoto M, Maeda Y and Osawa K:
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In Vivo 22: 327-332, 2008.
４ Calabrese EJ: Paradigm lost, paradigm found: The re-emergence of hormesis as afundamental dose response model in the toxicological sciences. Environmental Pollution 138:379-412, 2005.
５ Calabrese EJ, Staudenmayer JW, Stanek III EJ and Hoffmann GR: Hormesis outperforms
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９ Kawano M, Thet MM, Makino T, Kushida T and Sakagami H: DNA mircoarray analysis ofsignaling pathway in macrophages stimulated by lignin-carbohydrate complex from Lentinus

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