〔生物工学会誌

第 89 巻第2号

72–78．2011〕

総説

全自動１細胞単離解析装置の開発
伸男 1・徐良元
1

傑 2・黒川正也 3・近藤昭彦 4・藤井郁雄 5・黒田俊一 1*

名古屋大学大学院生命農学研究科，2 古河電気工業株式会社，3 スターライト工業株式会社，4
神戸大学大学院自然科学研究科，5 大阪府立大学大学院理学系研究科（2010 年 9 月 16 日受付

2011 年 1 月 11 日受理）

Development of automated single-cell isolation and analysis system ̶Review̶
Nobuo Yoshimoto1, Xu Jie2, Masaya Kurokawa3, Akihiko Kondo4, Ikuo Fujii5, and Shun’ichi
Kuroda1 (Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University, Furo-cho, Chikusa-ku,
Nagoya, Aichi 464-86011; Furukawa Electric Co., Ltd., 6 Yawata-kaigandori, Ichihara, Chiba
290-85552; Starlite Co., Ltd., 2222 Kamitoyama, Ritto, Shiga 520-30043; Graduate School of
Science and Technology, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, Hyogo 657-85014;
Graduate School of Science, Osaka Prefecture University, 1-2 Gakuen-cho, Sakai, Osaka 59985705) Seibutsu-kogaku 89: 72–78, 2011.
Various cells have been utilized in not only research fields (biochemistry, molecular biology, stem cellresearch) but also industrial fields (tissue engineering, medicine, energy, foods). It is important to isolate
and breed cells possessing most purposive characters. However, cell heterogeneity within an isogenic cell
population is a widespread event. Stochastic gene and protein expression has been clearly demonstrated at
the single cell level. We here propose a novel concept “single cell breeding” to overcome the potential
problem and describe the development of “automated single-cell isolation and analysis system” to realize
the concept.
［Key words: single cell analysis, single cell breeding technology, cell surface engineering,high-throughput screening］

はじめに種菌体や細胞は純化後，ライブラリー化されており，研究者は容易にこれらの細胞を購入し，ただちに使用して生物工学や細胞生物学を中心とする基礎研究から，医いる．しかし昨今，1 細胞レベルの解析が進むにつれ，

薬・エネルギー・食糧に関する応用研究に至る幅広い分

必ずしもコロニーが均一な細胞集団ではないことが明ら野において，細菌・酵母・昆虫・植物・動物・ヒトなど

かになってきた 5–8)．実際に筆者らの解析でも，各種幹に由来する細胞群は，タンパク質，生理活性ペプチド，

細胞マーカーを指標として純化されたマウス由来

抗生物質，ビタミンあるいはアルコールなどの生産源とembryonic stem cell（ES 細胞）の pluripotency（多能性）

して長い間活用されている．これらの研究において解析や，抗体産生用に純化されたハイブリドーマの抗体分泌結果の精度を高めたり，物質生産効率を上げたりするた能を分析したところ，実際の細胞群はヘテロな集団であめに，対象細胞の純度を均一にするモノクローン化（純．そこで今後は，細胞を用いるると判明している（Fig. 1）化）は重要である

1–4)．これまでの細胞の純化は，各コ研究においては，目的細胞を 1 細胞単位で単離解析し育

ロニー（細胞塊）に含まれる細胞の性質が基本的に均一種する技術（1 細胞育種技術 ; single cell breeding tech-であるという前提の上で，各種細胞をコロニー単位で単nology）が要となる．

離操作することがほとんどであった．特に最近では，各* 連絡先 E-mail: skuroda@agr.nagoya-u.ac.jp

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生物工学

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Fig. 1. Heterogeneity of mouse ES (embryonic stem) and hybridoma cells before single cell isolation. (A) Microscopic observation
for mouse ES cells. OLG (ES cells harboring Oct4-EGFP gene) and No. 10 (ES cells harboring Rex1/EGFP gene) were observed
under the confocal laser-scanning microscopy. While OLG cells showed homogenous expression of Oct4-EGFP (panel b), No. 10
cells showed heterogeneous expression of Rex1/EGFP (panel d). Bar = 100 nm. (B) Expression profiles of ES markers of OLG and
No. 10 cells. The histograms of EGFP expression of both cells were obtained by the As One cell picking system. Horizontal axis,
fluorescent intensity associated with the expression levels of ES markers; vertical axis, number of wells showing respective
fluorescence. While the Oct4-EGFP expression in OLG cells was convergent (panel a), the Rex1/EGFP expression in No. 10 cells
was dispersive (panel b). (C) Antibody secretion profile of hybridoma cells. The amounts of antibody secretion from each hybridoma
cell were determined by the cell surface FIA (fluorescence-linked immunosorbent assay) as described in Fig. 5 and the As One cell
picking system. The amounts of antibody secreted from each hybridoma cell were found to be heterogeneous. Horizontal axis,
fluorescent intensity associated with the secretion levels of antibodies; vertical axis, number of wells showing respective
fluorescence. MIN, minimum threshold of fluorescence intensity for positive wells; MAX, maximum threshold of fluorescenceintensity for positive wells.

従来の 1 細胞解析と単離技術（Fig. 2）．浮遊細胞あるいはトリプシン処理などにより単細胞化した接着細胞を FACS のマイクロ流路にシース

以前より，細胞懸濁液から目的細胞を単離する技術と液と共に通すと，ラミナフローの原理により細胞懸濁液

して，手動による限界希釈法が用いられてきた．まず，の流れが細く絞り込まれて細胞が 1 列に並んで流れる．

理論的に 1 細胞になるように希釈系列をマルチウェルプ

解析系では，1 列に流れる細胞に対してレーザー光を照レートに作製し，正確に 1 ウェルに 1 細胞だけ入ってい射し，発現する蛍光タンパク質や，細胞を標識した蛍光

るかどうか顕微鏡などを用いて観察する．しかし，本法は物質を励起する．同時に，細胞サイズを前方散乱光の強広大なプール底に沈んでいる小石の個数を正確に 1 個だ

度として，顆粒状構造体の概要を側方散乱光の強度としけかを勘定するような作業であり，大変な時間と根気がて数値化し，蛍光情報と併せて目的細胞を特定できる．

必要である．現在では，目的細胞を効率よく 1 細胞単離す

分取系では，マイクロ流路から出てきた細胞懸濁液をピるツールとして fluorescence-activated cell sorter（FACS）

エゾ振動子によりエンベロープ（液滴）化し，同時に荷が用いられており，それまで手作業に頼っていた 1 胞レ電する．帯電した目的細胞を含む液滴は，解析系からのベルの研究を著しく効率化し，各研究分野へ多大な貢献

情報に基づき偏向板を通過する際に逆極に引き寄せられをしてきた．

サンプル回収容器に滴下される．最新の FACS では，1

FACS は，細胞群を分析する解析系および各細胞を電秒間に 70,000 細胞以上の解析が可能で，高密度な細胞荷により分離する分取系（ソーター）から構成される懸濁液では不向きとされるソート時でも 1 秒間に 30,000

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細胞からの 1 細胞単離を実現している．
しかし，最新の FACS でも困難な 1 細胞単離がある．
具体的には，実際のサンプルの一部を用いて解析し，蛍光輝度分布から目的細胞の蛍光値を予測してゲーティン
グする必要があるが，目的細胞の存在比が 0.1% を下回
ると全体のヒストグラムにおける目的細胞の位置が予測できなくなる．また，106 細胞 /ml 以上の濃度がないと分析困難であり，解析およびソートには FACS 内部のラインを満たすために 0.5 ml 以上のサンプル容量が要求される．つまり，仮にサンプルの総細胞数が 106 細胞以
上と潤沢にあったとしても，目的細胞が100細胞（0.01%）
以下だと FACS にとっては存在比不足であり，総細胞数が 105 細胞以下だと，目的細胞が 1000 細胞（1%）以上あったとしても細胞濃度の不足になる．また，FACS は目的
細胞回収時に，細胞を約 30 m/s の高流速や数千 V に達する高電荷に曝すため，脆弱な細胞の単離には適していない．そこで筆者らは，これまで 1 細胞解析のツールとして最有力とされてきた FACS にも，不向きな解析対象があることに着目し，きわめてマイルドな環境で，貴重なサンプルに含まれる低存在比の目的細胞を単離できる
新たな 1 細胞単離解析技術が必要と考えた．
全自動 1 細胞単離解析装置の開発
Fig. 2. Workflows of FACS and automated single-cell isolation
and analysis system. In FACS system, fluorescence-labeledcells are kept in the sample tube. The cells are injected into theflow channel by laminar flow (panel A). Each cell is envelopedby an oscillator, and exposed to excitation laser. The fluorescentintensity, forward scatter light (FSC), and side scatter light(SSC) of each cell are measured by the respective detectors.
Threshold of the fluorescent intensity is determined by pre-run,which utilizes positive control cells. These cells are discarded
after the measurement. The FSC-SSC dot plot and representative
histogram for fluorescence are shown (panel B). Again, newfluorescence-labeled cells are injected into the flow channel as
described in panel A. Based on the pre-determined threshold,each cell is enveloped by an oscillator and concomitantly
charged. If cells show stronger fluorescence than the threshold,the cells are attracted toward opposite polarity side by apolarizer, and then sorted to collection tubes (panel C). In
automated single-cell isolation and analysis system, fluorescencelabeled cells are introduced into the nanochamber slide (seealso Fig. 3) covered with an aluminum frame. Each cell issedimented to the bottom of each nanochamber well by brief
centrifugation (panel D). Both fluorescence and transmission
image of each cell on the nanochamber slide are obtained by
the excitation light source, the filter unit, and the CCD camera(see also Fig. 3) to generate the cell list of both fluorescentintensity and address of each cell and the histogram. Based on
the fluorescent intensity of each cell, the cells of interest can beselected freely on the PC-based program (panel E). Eachselected cell is automatically picked up with a glass capillaryequipped on the recovery unit (micromanipulator) (see also
Fig. 3) and moved into each well of the reserver plate (panel F).
Time required for each step is indicated at the right-bottom ofeach panel.

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2003 年，筆者らは上記 FACS の限界を克服するために，
FACS とはまったく異なるコンセプトの全自動 1 細胞単離解析装置に関する基礎技術の開発に着手した．具体的には，微弱な蛍光でも S/N 比良く分析できるナノチャン
バーの開発（スターライト工業担当），CCD カメラによる形態・蛍光観察技術と連動した多数の微粒子から標的粒子を 1 個ずつマイルドに単離するキャピラリー吸引シ
ステムの開発（古河電工担当）である（Fig. 2，Fig. 3）．
その結果，2007 年に初号機を完成させ，2008 年にアズワン社から “As One cell picking system”（Fig. 3）としFig. 3. Automated single-cell isolation and analysis system.
Body appearance (left panel) and internal structure (rightpanel). The system consists of microarray (nanochamber slide),fluorescent microscopy (excitation light source，excitation/
emission filter unit，CCD camera), and micromanipulator(recovery unit，reserver plate).
生物工学

第89巻

て販売を開始した．本装置で使用するナノチャンバーはでき，全細胞の蛍光を解析してから目的細胞の選別を行（Fig. 4），シンクロトロンを併用する LIGA（Lithographie

うことから，理論上 0.01% 以下の存在比でも確実に目

9)Galvanoformung Abformung）射出成形技術により ，プラスチックスライド上の 1.45 cm × 2.33 cm の領域に直径 10 〜 30 μm の丸型ウェルが整然と微細加工され，最大 40 万ウェルが 1 スライド上に成形されている．材質

的細胞を単離できる．さらに，本装置の細胞接触箇所はには蛍光のきわめて少ないプラスチック（ポリスチレン，

ションに対する危険性はきわめて少ない．今までの経験

ポリメチルメタアクリレート，ポリジメチルシロキサン）

から，酵母細胞は直径 10 μm の丸型ウェルに収まり，血を用いており，各種表面処理（官能基導入，親水化処理

球系細胞は直径 10 〜 20 μm の丸型ウェル ,など）も比較的容易にできる．キャピラリー吸引システ

物細胞は直径 30 μm の丸型ウェルに収まることが分かっすべてディスポーザブルのガラスキャピラリーとナノ
チャンバーであるので，FACS では回避の難しいウイル
スや細菌の二次感染および異種細胞間のコンタミネー

その他の動ムは，ナノチャンバーの各ウェルに培養液のまま 1 細胞ている．もし，細胞がトリプシン処理などによる 1 細胞ずつ導入した各細胞の蛍光と透過像を CCD カメラで測化が困難な場合には，直径 100 〜 200 μm の丸型ウェル

定し，PC により解析した蛍光強度順位に基づき，自動を有するナノチャンバーを用いて数細胞から成る塊のま的に目的細胞を同定して 1 細胞ずつマイルドに単離するまで取り扱う．また，培養基への接着性がきわめて高いことができる（Fig. 2）．目的細胞は，微弱なポンプによ細胞の場合には，プラスチック表面の親水処理程度を調り吸引するため，高電荷や高流速に曝されないことから，

節して細胞接着を回避し，それでも困難な場合にはナノ細胞への物理的ストレスはきわめて少ない．全自動 1 細チャンバー内に 1 細胞単位で播種した後，数回細胞分裂

胞単離解析装置を用いると培養液中の細胞群から目的細させ，トリプシン処理してから 1 細胞単離解析に供する．

胞を高感度に検出し，高速かつダメージレスに 1 細胞単今後，1 細胞単離解析対象となるさまざまな細胞に対し離できる．FACS とは異なり，少量サンプル（3000 細ては，ナノチャンバーの素材と表面処理，キャピラリー

胞でも可能）をすべて解析して単離操作に供することが内径，ナノチャンバーの丸型ウェルの直径を最適化する
ことにより適用可能になると考えている．
全自動 1 細胞単離解析装置の実際例
近年，再生医療，抗体医薬を含むバイオ医薬品，超早期癌診断，癌予後診断に対する社会的な関心が著しく高まってきている．これらの研究開発には，幹細胞群（iPS細胞，ES 細胞，造血幹細胞，組織幹細胞など），抗体産，バイオ医薬品産生細胞群（B 細胞，ハイブリドーマ）
生細胞群（CHO 細胞，酵母など），癌判定基準としての末梢循環腫瘍細胞（circulating tumor cells, CTC）や癌幹細胞などを 1 細胞レベルで単離解析する必要がでてきており，現在 FACS が用いられようとしている．しかし，これらの細胞の 1 細胞単離を行うにあたって FACS では
困難なケースがある．ここでは，全自動 1 細胞単離解析装置を用いる利点について述べる．

Fig. 4. X-ray LIGA process and nanochamber slide. (A)Outline of X-ray LIGA (lithographie galvanoformung abformung)process. Microfabrication on polymethylmethacrylate (PMMA)
plate is generated by an X-ray mask and an X-ray lithography
technology combined with synchrotron radiation. With thepatterned PMMA plate as a master plate, a nickel mold part ismade by electro-forming process, resulting in effective productionof the Ni-made mold part possessing replicated micro-patterns.
Then, the mold part is inserted in a mold base and injected to
produce a polystyrene slide. (B) Nanochamber slide. The
30 × 103 wells with a diameter of 30 μm (panel c, bar = 30 μm)
are systematically arranged on a polystyrene slide (panels aand b, bar = 200 μm).

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幹細胞の 1 細胞単離
今回筆者らは，樹立されたマウス由来 ES 細胞に多能性マーカー（Oct4 および Rex1）と緑色蛍光タンパク質（EGFP）との融合遺伝子を導入し，多能性のレポーター
アッセイを可能にして，本装置で多能性遺伝子発現についての解析を行った．その結果，本来均一であるべき

ES 細胞において，多能性マーカーの発現量が大幅にバラついていた（Fig. 1）．そこで，本装置により Rex1EGFP 発現 ES 細胞（約 50,000 細胞）から蛍光輝度の高75

い順に 24 株を単離したところ，生存率 100% で親細胞

だちに 1 細胞単離を行い，個々の iPS 細胞について遺伝群より高い蛍光輝度を有するバラツキの少ない細胞群を子発現の揺らぎを解析し，遺伝的に安定な iPS 細胞を迅得ることに成功した．一方，理化学研究所・発生・再生

速に得る方法の確立が急務であることを示している．

科 学 総 合 研 究 セ ン タ ー の 笹 井 ら は， ヒ ト ES 細 胞 をハイブリドーマの 1 細胞単離

FACS で分離した場合，トリプシン処理やメカニカルス
トレスにより 99% 以上の細胞にアポトーシスが生じる
こと，Rho kinase（ROCK）阻害剤で処理すると約 30%

ブリドーマである．現在，ハイブリドーマ樹立および抗の生存率でソーティング可能なことを報告している 10)．

体産生能の高いハイブリドーマ選別において，前述した

この脆弱性は幹細胞研究分野にブレイクスルーをもたら

限界希釈法により 1 細胞化を行い，個々について培養し，した induced pluripotent stem cells（iPS 細胞）の樹立に

培養上清に分泌された抗体量を ELISA（enzyme-linked

現在急成長している抗体医薬を支える細胞は主にハイおいても問題となっている．さらに，本来 ES 細胞は初immunosorbent assay）法により測定して選抜しており，期化されていて比較的均質な幹細胞であるのに対し，多大な時間（約 2 ヶ月）を必要としている．本目的におiPS 細胞は一度分化した細胞を初期化して再分化させる

いて FACS は，ハイブリドーマ特異的表面抗原（CD19，

ため，遺伝的背景が均一ではないと考えられる．実際，

CD28，CD38，CD138 など）によるハイブリドーマ樹

マウス iPS 細胞から分化させて得た心筋組織は，心筋梗立に使用されるが，抗体産生能の高いハイブリドーマ選

塞マウス半数に治療効果を示したが，半数のマウスに腫別には分泌阻害剤（たとえば GolgiPlug；タンパク質輸11)

瘍を形成したとの報告がある ．この結果は，ヒト iPS

送阻害剤）を作用させて細胞内に留まった抗体分子を免細胞の医療現場での実用化には，細胞作製時においてた

疫蛍光法により検出する必要があり，抗体産生能の高い

Fig. 5. Cell surface FIA for measurement of antibodies secreted from hybridoma at one cell level. (A) Outline of cell surface FIA.
After seeding of hybridoma cells on a nanochamber slide, the cells are treated with a trapping molecule (e.g., anti-mouse IgG
antibody) fused with anchoring molecule (e.g., phospholipids) (left scheme), incubated for a short time (5–10 min) to allow theantibody secretion (middle scheme), and treated with an Alexa 488 (fluorescence)-labeled anti-antibody molecules (e.g., antigen,anti-mouse IgG antibody) (right scheme). (B) Analysis of hybridoma cells by cell surface FIA. After treatment with a trappinganchoring molecule (anti-mouse IgG antibody-conjugated phospholipid), the hybridoma cells were treated with an Alexa 488-labeledanti-mouse IgG antibody and visualized under the fluorescence microscopy. The cells exhibited fluorescence from each cell surface
in a dose-dependent manner of antibody secretion.

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生物工学

第89巻

ハイブリドーマを生きたまま選別することはできない．
今回筆者らは，特定の抗体を分泌発現するハイブリドー

全自動 1 細胞単離解析装置が拓く希少細胞解析の世界

マをナノチャンバー上に展開し，抗体捕捉用分子（抗マ

これまでは，全自動 1 細胞単離解析装置が「1 細胞育種」

ウス IgG 抗体，抗原など）と細胞膜アンカリング分子のや「de novo 薬剤スクリーニング」に有効であることを示

融合分子（トラップ分子）を添加して短時間抗体分泌をしてきたが，貴重かつ目的細胞の存在比がきわめて低い

促し，蛍光標識抗マウス IgG 抗体を作用させて，ハイブリ「希少細胞解析」に適していることを述べる．近年，新ドーマ表層において分泌抗体に対する FIA（fluorescencelinked immunosorbent assay）を成立させた（Fig. 5）．そ（末梢循環腫瘍細胞）の末梢血中の濃度が注目されていの結果，個々のハイブリドーマの抗体分泌量に応じて細る 12–14)．現在は患者血液を 7.5 ml 採取し，EpCAM 抗体

胞表層の蛍光輝度を相関させ，樹立されたはずのハイブを用いた磁性ビーズを用いて CellSearch により 3000 〜

たな癌の超早期診断法として原発巣から遊離した CTC

リドーマでも抗体産性能に大幅なバラつきが生じている

5000 細胞まで濃縮し，サイトケラチン抗体で染色してことを見いだした（Fig. 1）．また，全自動 1 細胞単離解

目視により解析している．血球系細胞約 106 個のうち析装置を用いることにより，短時間で約 50,000 細胞か

CTC が 1 〜 5 細胞であると，その患者の癌の悪性度は高らの抗体分泌能の高いハイブリドーマの 1 細胞単離を達いと判定され 14,15)，後の治療法決定の指針とされる．あ成 す る こ と が できた．なお，本細胞表層提示技術をるいは癌治療後の患者に適用すれば，予後が良好か不良

FACS 用サンプルにも応用することも検討したが，ハイブリドーマの蛍光染色をナノチャンバー内のように 1 細かの判断基準となる．このように，末梢血に含まれる

胞単位で行うことができないため，細胞表層の蛍光色素

CTC の検出は今後の癌判定として非常に高精度のパラメータになると期待されており，米国 FDA により乳癌，が他細胞へ移り込み，FACS には適用不可であることが大腸癌，前立腺癌の診断において認可された検査方法で判明した．以上から，
本装置および本細胞表層提示技術は，もある．しかし，きわめて存在比が低いために単離同定

ハイブリドーマのみならず種々のバイオ医薬品などの高が困難であり，FACS による分取も前述の理由により困分泌細胞の 1 細胞単離を高速化できると期待される．

難である．筆者らは，本装置が末梢血中のきわめて低い

これまでの実験例は直径 10 〜 25 μm の培養細胞であ

CTC 存在比（106 細胞に 1 〜 5 細胞，すなわち 0.0001 〜
0.0005% の存在比）でも，CellSearch による濃縮後の微量細胞数（3000 〜 5000 細胞）でも対応可能であること

り，ナノチャンバーの内径は 30 μm のものを使用してから，今後の癌診断法研究において多大な貢献ができる

いた．ここでは，直径 5 μm の出芽酵母を内径 10 μm のと期待している．

出芽酵母の 1 細胞単離

ナノチャンバーを用いて選抜した例を紹介する．今回筆者らは，出芽酵母表層に上皮成長因子受容体（EGFR）

結語

全長を機能を保ったまま発現させ，同時にランダムペプ

本稿で述べたように，全自動 1 細胞単離解析装置は “Asチドライブラリー（helix-loop-helix 構造の 1 側面の 5 ア

One cell picking system” として実用化され，再生医療

ミノ酸残基を可変化した 320 万通りのライブラリー）をおよびバイオ医薬品製造において，物質生産を支える細細胞壁に固定化されるように発現させた．その後，細胞胞の育種を 1 細胞レベルにまで高めること（1 細胞育種）

膜透過処理を行い，蛍光標識した抗リン酸化 EGFR 抗に成功し，従来にない均一な細胞を迅速に得ることを可体で標識してナノチャンバー上に移し，本装置で約 360

能にした．また，莫大な予算と時間を要する薬剤スクリー

万の酵母クローンから蛍光強度の高い順に計 12 クロー

ニングにおいても，本装置は創薬領域に新たな方法を提ンを 1 細胞単離した．得られた酵母クローンを 1 細胞

案することができた．さらに本装置は，CTC のような

PCR に供し，ライブラリー部分の配列の重複を除外して 9 クローンとした．次に，大腸菌を用いてライブラリー
部分を大量発現させて精製を行い，EGFR を高発現する
ヒト扁平上皮癌由来細胞 A431 の培養液に添加したとこ
ろ，7 クローン由来のライブラリータンパク質が EGF 様

希少細胞の解析を可能にすることから，新たな癌検査お活性を示した．この結果は，本装置が培養細胞のみならり，次年度中には次世代機が完成する予定である．今後，ず，酵母のような微生物にも適用可能であることを示す

本装置は，FACS と共に，それぞれの長所短所を補完しとともに，創薬において de novo 薬剤スクリーニングとあいながら（Table 1），さまざまな分野での 1 細胞単離いう新しい手法が可能であると示している．

解析技術を支えると考えられる．

2011年 第2号

よび診断技術を生み出す基盤技術になると期待される．
しかしながら，本装置の適用可能な研究分野は，上記の例のみに留まらないのは明らかである．現在，本装置は，細胞培養装置および多重蛍光検出装置の搭載を進めてお77Table 1. Comparison of FACS and automated single-cell isolation and analysis system.
Properties

Automated single-cell isolation
and analysis system

FACS

Cell sample:
Minimum content of positive cells for sorting> 0.1%~ 0.01%

Optimal cell density

106 ~ 107 cells / 1 ml

~ 250,000 cells / 1 ml

Maximum cell number for sorting∞

250,000 cells
6

Minimum cell number for sorting

10 cells

103 cells

Suspension solution

Buffer (usually Sheath soln)

Culture medium

Cell cluster

Not acceptable

Acceptable

1) Laminar flow formation
2) Enveloping by oscillator
3) Sort by charge

1) Nanochamber array installation
2) Pick up by glass capillary3) Sort by micromanipulator

Processibility for analysis~ 70,000 cells / s~ 250,000 cells / 20 min

Processibility for sorting~ 30,000 cells / s

96 cells / 30 min

Disposability of apparatus for cell handling

Difficult (path flow)

Easy (capillary, nanochamber)

Gating methods for positive cells

1) Determination of threshold of fluorescenceintensity by pre-run2) Cell group showing over-thresholdfluorescence are judged as positive cells

1) Generation of cell list of fluorescence intensity
and address (not necessary for pre-run)2) Each cell showing fluorescence intensity ofinterest is judged as a positive cell

Multicolor detection> 8 colors~ 3 colors

Observation of cell morphology

Not acceptable

Acceptable

Machine:Single cell isolation mechanism

本研究は，近畿経済産業局（平成 15 年度および平成 17 年度
中小企業地域新生コンソーシアム研究開発事業）およびアズワン株式会社，長瀬科学技術振興財団（平成 22 年度研究助成金）
による支援を受けて実施致しました．また，本研究遂行におきまして大阪大学産業科学研究所 谷澤克行教授，立松健司
助教，山崎智子研究員，池田優子氏，神戸大学大学院自然科
学研究科 石井純特命助教，大阪府立大学大学院理学研究科
円谷健准教授，植田淳子研究員，兒島孝明助教（現 名古屋大学大学院生命農学研究科），古河電気工業株式会社 杉山聡氏，木村健一氏，アズワン株式会社 松下政宏氏，上向健
司氏，理化学研究所 上田泰己チームリーダー，二階堂愛研
究員，宇野健一郎研究員，名古屋大学農学部 木田晶子氏の協力を賜りましたことに感謝いたします．

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生物工学

第89巻