生物工学会誌

第95巻 第6号

タンパク質を巻き戻すコツと原理
二見淳一郎
組換えタンパク質の生産において，愛しの発現タンパ左）．ちなみに変性状態でありながら高い水溶性を示すク質が不溶性のインクルージョンボディとして沈殿してタンパク質の代表的なものがゼラチンであり，そのアミしまい，暗澹たる気持ちになった人は多いであろう．な

ノ酸組成は疎水性アミノ酸がほとんど含まれていない特ぜ私のタンパク質は沈殿してしまったのだろうか？と実徴がある．

験ノートを見返して可溶化してくれそうな条件検討を練（b）塩析による不溶化り直したとしても，その努力が報われないことも多い．

ける際には陽イオンと陰イオンになり水に溶けるが，イそんな時はインクルージョンボディから試験管内で活性オンの周りには複数の水分子が強く水和している．この構造に巻き戻すこと（リフォールディング）も一つの手

理由は Na+ と Cl– がペア（塩）を形成するよりも，水和段であることを思い出してほしい．この方法で比較的高している方が安定だからである．水溶性のタンパク質の効率に巻き戻せるタンパク質がある一方で，残念ながら周りにも水溶性を保つために必須の多数の水和水が存在塩化ナトリウムが水に溶どう頑張ってもリフォールディングできないタンパク質もあるのが現実ではある．ここではまずタンパク質の凝集機構を整理し，変性状態のタンパク質から活性構造を形成する原理を科学的な視点で理解を進め，リフォールディングが神頼みではなく，タンパク質分子の物理化学的な性質に依存していることを実感してほしい．
水の世界に馴染むためにヒト成人の体重の約 6 割は水分である．つまり水溶性の球状タンパク質の周辺は水だらけだ．タンパク質が水に溶けているという状態は，液体の水分子同士で形成される水素結合ネットワークへの仲間入りが許された状態

図 1．水溶性タンパク質分子表面へのアミノ酸側鎖の露出度と疎水性度の関係 1)と言えよう．物質が水に馴染むためには界面の性質が重要である．

X 線結晶構造解析で立体構造が判明している水溶性タンパク質における各アミノ酸の露出度と各アミノ酸の疎水性度をプロットすると，親水性のアミノ酸側鎖が分子表面に露出し，疎水性アミノ酸側鎖が分子内部に隠れている傾向が明確にわかる（図 1）．このような水溶性タンパク質が不溶化する二つの典型例を整理してみよう．
（図 2）（a）変性による不溶化

タンパク質が正しい立体構造を形成できていない変性状態では分子内部に隠しておくべき疎水基が露出してしまうため，主に疎水性の分子間相互作用が強まり大きな凝集塊が形成されてしまう．多くのインクルージョンボディに含まれるタンパク質は変性状態で凝集しており，宿主細胞内で正しくフォールディングできなかったことが主因である（図 2
著者紹介328

図 2．タンパク質の変性による不可逆的な凝集（a）と塩析による可逆的な凝集（b）

岡山大学大学院自然科学研究科（准教授） E-mail: futamij@okayama-u.ac.jp

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する．タンパク質の水溶液に過剰量の塩を添加していく

ペプチド鎖の合成後に構造を形成する post-translationalと，水和力の強いイオンに水分子がどんどん奪われ，次folding でタンパク質が合成される．一方で，真核生第にタンパク質分子表面の水和水も奪われていく．水和，ポリ物のリボソームの翻訳速度は遅く（〜 3 a.a./sec）

水を奪われたタンパク質どうしが凝集した状態を塩析とペプチド鎖の合成とともにモジュール単位で構造を形成呼ぶ．比較的安定性の高い血清中のタンパク質などは立しながら活性構造となる co-translational folding で合体構造を維持したまま塩析するため，沈殿物に水を加え成されている（図 3 左）．タンパク質は各細胞内で正しくると再び溶解する（図 2 右）．

フォールディングできるように適応しているため，この宿主細胞の環境はフォールディングに適していたか？

両者の違いが，異種宿主内ではタンパク質のフォールディングがうまく進まない原因の一つとして推定されて生命活動を担う万能素材であるタンパク質は，各仕事いる．大腸菌の低温培養で真核生物由来の組換えタンパ場で最高の機能発現ができるように適応進化してきた産ク質の可溶化率が改善する成功例も知られており，翻訳物であり，組換えタンパク質が生産される環境が適切で速度とフォールディングの関係がより好ましい条件に近ないこともある．細胞外に分泌されるタンパク質には高づいたことが一因と考察される．翻訳速度にはコドン使い安定性が求められ，分子内の複数のジスルフィド（SS）用頻度や mRNA の 2 次構造といった因子も関わるため，結合が熱力学的な安定化に大きく寄与している．還元的人工合成遺伝子で最適化することで可溶化率が向上するな環境である大腸菌の細胞質内でこれらのタンパク質をこともある．

合成しても，適切な SS 結合が形成されず，大半が不溶（b）複合体形成とフォールディングの関係性のインクルージョンボディとなる．一方で，真核生物生物の細胞内タンパク質はきわめて濃厚な環境下で相互の細胞質内のタンパク質を，原核生物の細胞質内で発現作用パートナーと出会い，複合体を形成している．近年，させる場合には，SS 結合の形成が不要なので比較的う

これらの相互作用は両者が出会う前は不規則な構造であまく行きそうなものであるが，実際はインクルージョンり，両者が出会ってから構造を形成する例がきわめて多真核ボディを形成してしまう例が多いことが知られている．

いことが判明している（図 3 右）．したがって，相互作用自発的なフォールディングが困難なタンパク質の可溶化

パートナーと出会えない状態で強制発現された組換えタはシャペロンの介在で説明される場合もあるが，それ以ンパク質は，いつまでも安定な複合体の活性構造を形成

外に次の二つの本質的な理由が考えられる．

することができない．この不規則領域は疎水性アミノ酸（a）翻訳速度とフォールディングの関係

2)

原核生が少ない特徴があり，ただちに凝集する引き金とはなり物のリボソームの翻訳速度は速く（〜 15 a.a./sec），ポリにくいが，不規則領域が多いタンパク質（天然変性タン

図 3．タンパク質の翻訳速度とフォールディングの関係（a）と不規則領域を持つタンパク質の複合体形成（b）

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事前にごく少量の水で沈殿物をピペッティングなどでほ変性タンパク質の活性構造へのリフォールディングぐしておいてから変性剤を添加すると，きれいに溶けてくれる．

1961 年に $Q¿QVHQ は分子内に四つの SS 結合を持つウ
シ膵臓由来型 RNaseA（124 a.a.）を変性・還元した後，空気酸化により熱力学的にもっとも安定な Native 構造へと自発的に再生できることを示した 3)．8 個の SH 基から分子内のみで SS 結合を形成すると仮定しても，7 ×5 × 3 = 105 通りの組合せがあり，もっとも安定な 4 ペアのみが Native 構造の形成に選択されている．RNaseA

を，凝集との競争反応という危険な橋を渡りながら，立の場合，エントロピーが高い変性・還元ポリペプチドかに SS 結合の形成が必要なタンパク質の場合は，本来のら出発し，分子内で構造形成に関わるさまざまな化学結フォールディング環境である ER/ ゴルジ内の適切な酸化合が蓄積（ǻH < 0）して，安定な Native 構造を形成（ǻS

還元系（酸化型 / 還元型グルタチオンが汎用される）を< 0）するまでの一連の自由エネルギー変化（ǻG = ǻH– TǻS）値は負であり，自発的に進む．正しい SS 結合準備してあげる必要もある．リフォールディングの手順

ペアをリフォールディング過程で見つけてもらうために液を透析チューブ内に保持しながら，徐々に変性剤を抜変性剤の「保護」からの独り立ちがリフォールディング
高濃度の変性剤中で溶かされている変性タンパク質派に独り立ちできる活性構造までリフォールディングできるようにサポートしてあげる場を提供するのがリフォールディング実験の最重要ポイントである．分子内としては高濃度の変性剤中に存在する変性タンパク質溶も，反応系は SH/SS 交換反応が触媒されるように酸化いていく「透析法」と，一気に低濃度に下げる「希釈法」（図型 / 還元型グルタチオンなどで適切な酸化還元系にして4）の二つに大別される．前者はタンパク質濃度を高めおくことが好ましい．リフォールディング過程での最大に保つことができるため，複合体形成を伴うリフォールの問題が分子間凝集による不溶化である．Anfinsen がディングには有利である．後者はタンパク質濃度が一気用いた RNaseA は比較的疎水性アミノ酸が少ないタンパに低下するので，変性タンパク質どうしが凝集するリスク質で，変性・還元状態でもある程度の溶解性を維持しクが軽減できる利点がある．高濃度の変性剤中で溶解さており，低濃度にしておけば凝集が進まずリフォールれている変性タンパク質を出発材料として透析法や希釈ディングが進行する．まさにこの証明実験に好適なタン法でリフォールディングを開始する際に，低濃度の変性パク質であった．

剤がリフォールディングの途上のタンパク質分子間の好インクルージョンボディの夾雑物に注意せよ

ましくない疎水相互作用を軽減してくれる凝集抑制効果をうまく活用すべきである．リフォールディングするタ

大腸菌を宿主としたタンパク質発現では，pET システンパク質の安定性にもよるが，塩酸グアニジンではムのような過剰発現系を利用すると，菌体の溶菌・破砕0.4 M 程度，尿素では 2 M 程度が凝集抑制効果の至適濃後のインクルージョンボディの純度が SDS-PAGE 上で度となる．その他にもリフォールディング効率を改善す90％を超えることも珍しくない．これを変性剤で溶解る添加剤として L- アルギニンや高濃度のグリセロール

すればそのままリフォールディングに使えそうなものでが汎用されている．L- アルギニンのフォールディング促あるが，核酸をはじめとした非タンパク質性の菌体由来

進効果は，低濃度の塩酸グアニジンと類似の凝集抑制作の夾雑物がリフォールディング効率を大幅に低下させて用と考えられる．タンパク質の保存安定化剤としても汎しまうことがある．核酸の場合は高塩濃度（> 0.4 M）共用されているグリセロールにも併用効果が期待できる．

4)

存下で不都合な静電相互作用が軽減されるが ，HisTag

糖類が示すタンパク質の安定化機構にはさまざまな議論などの変性剤中でも利用できるタグを利用してあらかじがあるが，高濃度の糖類が存在すると変性状態のタンパめ精製したり，TAPS-Sulfonate のような Cys 残基に対ク質分子表面に特異的な水和水が増えてくる例が観察さする可逆的な化学修飾試薬を活用して粗精製しておくれる 6)．これは変性状態のエントロピーを低下させること，その後のリフォールディング効率が大幅に改善するとで，相対的に活性構造との ǻG を大きくしている機構

5)ことがある ．ちなみにインクルージョンボディの沈殿が推定される．経験的な結論としてタンパク質の種類と物を効率的に溶解する際にもコツがある．変性剤としてリフォールディングを改善する添加剤には「相性」があ

6 M 塩酸グアニジンや 8 M 尿素が一般的に用いられる

るようで，スクリーニングにより最適条件を見いだすこが，これらを粘性の高いインクルージョンボディの沈殿とが成功の鍵となる．さまざまな成功例をベースに開発

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図 4．インクルージョンボディ由来タンパク質の「希釈法」による酸化還元系でのリフォールディング条件の最適化例 4)．添加剤によるリフォールディング改善は相乗効果として現れる．

された市販のリフォールディング条件のスクリーニングキットもあるので，これらの条件でまず試してみるのもよい．
組換えタンパク質の発現系の構築段階でまずは可溶性発現を願い，GST 融合タンパク質のように大腸菌での可溶性発現効率の向上と簡便なアフィニティ精製を同時に達成できる発現系からスタートする場合が多いであろう．しかし残念ながら GST 融合タンパク質がインクルージョンボディを形成してしまう事態も少なくない．GST融合タンパク質のリフォールディングには GST ドメインと目的タンパク質の二つのドメインを同時にリフォールディングする必要があり，より複雑な系となる．筆者の経験上，GST ドメインのリフォールディング効率はあまりよくなく，GST ドメインを含まない構築でリフォールディング条件をスクリーニングしたほうが，効

図 5．MHC クラス I（細胞外ドメイン）上に抗原提示可能なペプチドのスクリーニングは ȕ2 ミクログロブリン（ȕ2m）とともに複合体を形成するリフォールディングの成否で判断ができる．

率が良さそうである．
リフォールディングを指標としたスクリーニング例

る細胞傷害性 T 細胞は，がん細胞内のがん抗原がペプチ

近 年， ヒ ト 由 来 の 組 換 え タ ン パ ク 質 の 調 製 に はドに分解されて MHC クラス I 上に提示されている状態

Hek293 細胞や CHO 細胞といった培養細胞を宿主としを認識している．このがん抗原には，発がんの過程で生た組換えタンパク質の高発現システムがラボレベルで簡じた変異タンパク質由来の neo-antigen が含まれるが，便に取り扱えるようになり，研究に必要なタンパク質を個々の患者で異なっている．したがって個別化医療の領活性構造で生産できる可能性が高まっている．タンパク域になるが，neo-antigen に対する免疫応答の強化はき質の機能解析のためにインクルージョンボディからのリわめて有望な治療法であり，個々の患者で細胞傷害性 Tフォールディングを試さざるを得ない機会は減ってきて細胞を強化できるペプチドワクチンの探索研究が進んでいるかもしれない．一方で，タンパク質が変性状態からいる．この抗原ペプチドには MHC クラス I 上に提示さ試験管内でリフォールディングできるか否かを指標としれる能力が必須である．きわめて多様なペプチドと結合たスクリーニング法が重宝されている例がある．近年，する能力がある MHC クラス I であるが，抗原性のある腫瘍免疫応答の活性化が，がん治療にきわめて重要なこペプチドと会合したときのみ正しくリフォールディングとが明らかとなってきた．がん細胞を殺傷する能力があできるため，リフォールディングの成否でペプチドワク

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チンのスクリーニングが可能となる 7)（図 5）．このリフォールディングアッセイの場合は 3 者の複合体形成が必要なので，タンパク質濃度を比較的高濃度に保つ必要があり，「透析法」が採用されている．
最後にタンパク質は高精細な仕事ができる「生もの」であり，変性しないように細心の注意を払って取り扱うことが生化学の常識である．しかしあまり崇拝して盲目的に扱っていると本質を見逃してしまうかもしれない．DIY（日文献1) Hermanson, G. T.: Bioconjugate Techniques, 3rd Ed.,
p. 143, Academic Press (2013).
2) Netzer, W. J. and Hartl, F. U.: Nature, 388, 343 (1997).
  $Q¿QVHQ&%DQG+DEHU(J. Biol. Chem., 236, 1361
(1961).
4) Futami, J. et al.: J. Biochem., 127, 435 (2000).
5) TAPS-Sulfonate ユ ー ザ ー ガ イ ド： KWWSZZZ
katayamakagaku.co.jp/img/TAPS-sulfonate_model_protcol_3.6.pdf (2017/4/11)
6) Abe, M. et al.: Protein Sci., 22, 467 (2013).
7) Redenko, B. et al.: Nat. Protoc., 1, 1120 (2006).

曜大工）で家具を作ると家具の強度や耐久性のポイントがよくわかる．タンパク質のリフォールディングをやってみると，タンパク質構造の構築原理が見えてくる．

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