第7575回日本生物工学会大会回日本生物工学会大会 Topics
Topics ofof 20232023
第Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 が誘導生産する新規酵素エラグ酸ラクトナーゼの同定と機能解析〇片所 杏野 1・渡邊 寛子 1・工藤 眞丈 2・中島 賢則 3・山本 浩明 3・小川 順 1・岸野 重信 1*
1 京都大学大学院農学研究科, 2 ダイセル・ヘルスケア SBU, 3 ダイセル・事業創出センター〒606-8502

京都府京都市左京区北白川追分町

Tel: 075-753-6122

Fax: 075-753-6113

E-mail: kishino.shigenobu.3e@kyoto-u.ac.jp
OHOO

HO

ザクロ等

OHO

OH

O

エラグ酸 (EA)HOHO

HOOOHOOHOM5

HOHOOO

HOOH

OHE

HOOH

OHO

M7OHOisoAOH

HOO

HO

エラグ酸代謝の初発反応を触媒する鍵酵素UroHを特定した。

OH

D

O

O

C

OH

O

O

O

HOM6
OH

HOHO

OH

HOOH

OH

O

HO

UroH

OH

HOO
O

OH

O

O
O

A

O

B

抗酸化・抗炎症作用

M8

要旨
エラグ酸はザクロ等に含まれるポリフェノールの一種であり、腸内細菌の代謝により、抗酸化・抗炎症などの生理機能を有するウロリチン A や B に変換される。このエラグ酸代謝はある種の腸内細菌にのみ観察される特異な代謝であり、関連する酵素やその反応機構は未解明であった。本研究では、ヒト糞便由来腸内細菌 Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213
におけるエラグ酸代謝の初発反応を触媒する鍵酵素 UroH の特定に成功した。

1. はじめにエラグ酸はザクロやイチゴ、クルミなどに含まれるポリフェノールの一種であり、抗酸化作用や抗炎症作用、がん細胞の増殖抑制などの健康効果が注目されている。近年、エラグ酸が腸内細菌により代謝されウロリチン類となり (上図)、中でもウロリチン A、B の生理活性が高いことが明らかにされてきている 1)。これより、ウロリチン類の需要が高まることが予想されている。
一方、ウロリチン類の化学合成では毒性のあるレゾ

18２ルシノールが使用されるため、食品素材の生産法としては安全面での課題がある 2)。また、腸内におけるエラグ酸代謝は非常に複雑であり、複数の腸内細菌が関与することが想定されている。近年、各反応を行う菌が明らかになりつつあるが、それらの菌における責任酵素は明らかになっていない 3) 4)。
ヒ ト 糞 便 由 来 腸 内 細 菌 Gordonibacter
urolithinfaciens DSM 27213 は、エラグ酸の分子内ラクトンの加水分解を初発反応としてエラグ酸をウロリチン M5 へと変換し、さらにウロリチン M5 を M6、M6
を C へと脱水酸化する。しかし、本菌のエラグ酸変換に関わる酵素や反応機構などの詳細な分子メカニズムは未解明である。そこで本研究では、G. urolithinfaciens
DSM 27213 がもつエラグ酸のウロリチン M5 への変換を触媒する酵素 UroH を特定し、その機能解析を行った。この検討を端緒に、腸内でのエラグ酸代謝を理解するとともに、効率的かつ安全な微生物酵素によるウロリチン生産系を構築することを目指している。

を培養し、発現誘導を行った後、SDS-PAGE で単一バンドを示す UroH 精製酵素を取得した。
得られた精製酵素を、エラグ酸を基質とする反応に供したところ、エラグ酸からのウロリチン M5 の生成が確認された (図 2)。これより、UroH は、エラグ酸の分子内ラクトンの加水分解を介してウロリチン M5 を誘導する新規ラクトナーゼであることを明らかにした。

2. 方法

UROs concentration [mM]10.8

urolithin C0.6urolithin M6

0.40urolithin M5

notdetected
non-induced

EA-induced

EA+

Resting cells

図 1 エラグ酸非添加もしくは添加培地で培養した菌体(EA-もしくは EA+) のエラグ酸変換活性3. 結果と考察
3.1 比較プロテオーム解析
誘導菌体と非誘導菌体から調製したペプチド断片を用いるプロテオーム解析結果を本菌のゲノム情報に帰属させることで、それぞれの菌体で発現しているタンパク質を選抜した。その結果、エラグ酸を含む培地で培養した誘導菌体に特異的に発現するタンパク質 59種類を特定した。その中から、加水分解酵素と相同性を示す誘導菌体高発現タンパク質 UroH を見いだした。
3.2 異種タンパク 質発現系の構築
UroH のエラグ酸代謝への関与を調べるために、大腸菌 Escherichia coli Rosetta2 (DE3) を宿主とするUroH の異種発現系を構築した。得られた形質転換体

Intensity [µV]

本菌を、エラグ酸非添加培地と添加培地にて培養し、得られた休止菌体におけるエラグ酸変換活性を比較した。その結果、エラグ酸添加培地にて培養した菌体(EA+) でのみエラグ酸変換活性を確認した (図 1)。これより、本菌のエラグ酸変換酵素はエラグ酸添加培地で培養することにより誘導される酵素であることが明らかとなった。そこで、プロテオーム解析により誘導菌体 (EA+) と非誘導菌体 (EA-) で発現しているタンパク質を比較し、誘導菌体のみで高発現しているタンパク質に着目することでエラグ酸代謝の初発反応に関与する酵素を特定できると考えた。

0.2EA(×104)

M514.06.0

UroH
Blank02345

Retention time [min]図 2 UroH 精製酵素とエラグ酸 (EA) 反応液のHPLC クロマトグラム
3.3 UroH の諸性質の解析
3.2 により得られた精製酵素 UroH を用いて詳細な機能解析を行った。その結果、本酵素が pH 7.0 ~ 9.0,50 °C にて高い活性を示すこと、本酵素の活性が Ca2+や Ni2+の添加により上昇することを明らかにした。

4. 今後の展望
本研究では、エラグ酸代謝の初発反応を触媒する酵素 UroH の同定と機能解析を行った。この反応に引き続き起こるウロリチン類の脱水酸化反応を触媒する酵素を同定することにより、エラグ酸の各種ウロリチン類への変換が可能となり、微生物酵素を用いたウロリチン類生産系構築への応用が期待できる。今後、ウロリチン脱水酸化酵素の同定を行い、ウロリチン代謝の詳細な解明を目指す。

文

献1) Tomás-B, F. A., González-S, A., García-V, R., NúñezS, M. A., Selma, M. V., García-C, M. T., Espín, J. C.:Mol. Nutr. Food Res ,61 1500901 (2017).
2) Ito, H., Iguchi, A., Hatano, T.: J. Agric. Food Chem.,
56 393-400 (2008).
3) Selma M. V., Beltrán, D., García-V, R., Espín, J. C.,Tomás-B, F. A.: Food Funct., 5 1779-1784 (2014).
4) Iglesias-A, C. E., García-V, R., Beltrán, D., Frutos-L,
M. D., Espín, J. C., Tomás-B, F. A., Selma M. V.: J.
Agric. Food Chem., 71 4029-4035 (2023).

３19