〔生物工学会誌

第 96 巻第3号

113–120．2018〕2017 年度 生物工学奨励賞（斎藤賞） 受賞

超好熱菌由来酵素の構造機能相関研究とその応用
古賀雄一

Studies on structure-function relationships of
hyper-thermostable enzymes and their application
Yuichi Koga (Department of Material and Life Science, Faculty of Engineering, Osaka
University, 2-1 Yamadaoka, Suita, Osaka 565-0871) Seibutsu-kogaku 96: 113–120, 2018.

はじめに

免疫反応など多くの生物学的プロセスに関わっているのと同時に，産業用酵素の世界市場の 65％を占め，応用

タンパク質の構造を改変し新しい機能を創出すること面でも重要である 3)．プロテアーゼは洗剤，食品，薬品，

は，タンパク質工学の大きな目標である．たとえば，高皮革，診断，廃棄物処理などさまざまな用途に使われる．

温，低温，高塩濃度など特殊な条件下で機能するように

特に，バクテリア由来のアルカリプロテアーゼは洗剤へ酵素の構造を改変することがあるが，どのような変異をの添加剤として利用され，大きな市場を形成している．

加えれば望んだ機能を付与できるかといったタンパク質

これらの酵素は，アルカリ条件下でタンパク質のシミを機能のデザイン原理はまだ確立されてはいない．超好熱

高効率で分解することで洗浄力を強化している．一方で，菌のように極限環境に適応した生物のタンパク質は天然

酵素は界面活性剤存在下では安定性が十分であるとはいの お手本 として，構造−機能のデザインの指標を与え，えず，活性を維持するための対策が必要になる．この問

酵素利用の新しい可能性を示してくれる．

題を解決するために，好熱菌からより安定なプロテアー

超 好 熱 菌 と は 生 育 至 適 温 度 が 80°C 以 上 で あ る か，
90°C 以上で生育できる微生物と定義される 1)．これら

ゼを探しだす試みと，タンパク質工学的に既存の酵素への多くはアーキアに分類され，火山や温泉といった天然

筆者らは，超好熱菌 Thermococcus kodakarensis KOD1の単離源に限らず，コンポストなどの人工的な高温環境

を は じ め， 好 冷 菌 Shewanella sp. SIB1 ， 好 塩 菌

界面活性剤耐性を付与する試みが行われている．

からも単離されている．好熱性の微生物は，タンパク質

Halobacterium salinarum などの極限環境微生物からさまなどの生体分子を過酷な環境で生き残れるように高温にざまな酵素を単離し，その構造と機能を常温性ホモログ

適応させていると考えられ 2)，タンパク質の安定性メカのものと比較して特性を明らかにしてきた．本稿では超ニズムの研究のための題材や，産業用酵素のソースとし好熱菌から単離された subtilisin-like Ser protease について活用されている．高温で酵素反応を行えば，反応速度て明らかになった知見と，今後の展望について述べたい．

や基質溶解度が上がり，コンタミネーションのリスクも下がることから高い生産性の実現が期待できる．さらに，

Subtilisin-like Ser protease について

耐熱性酵素は酸化剤や，変性剤，界面活性剤などに対しSubtilisin-like protease (subtilase) super family は，セて耐性を持っている場合もあり，既存の酵素では実現でリンプロテアーゼでアーキア，バクテリア，カビ，酵母，

きないような反応条件下で使うことも可能である．

高等真核生物に見いだされている 4)．原核生物の subtilase

数ある酵素の中でも，プロテアーゼは，成長，分化，は細胞外に分泌されタンパク質を分解し，細胞外の栄養

著者紹介

大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻（准教授） E-mail: kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp

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島の熱水硫気孔から単離された超好熱菌である 12,13)．その生育温度は 60°C から 100°C で生育至適温度は 85°Cである．この生物は産業的に有用な酵素の有望な単離源で，これまでにも高い効率と高い正確性を持った PCR
用の DNA polymerase（KOD polymerase; Toyobo, ltd,を経て成熟化する．Propeptide は subtilisin ドメインの折Jpn）などが単離されている．T. kodakarensis のゲノム情報 14) を探索すると，subtilisin 様プロテアーゼをコー，ドすると思われる三つの ORF［Tk-1675（P184088）
Tk-1689（YP184102），Tk-0076（YP182489）］が存在している．Tk-1675 と Tk-1689 はそれぞれ，Prepro-Tksubtilisin15)，Prepro-Tk-SP16) として同定され，大腸菌で発現させた組換え酵素で活性が確認されているが，Tk0076 については活性体の発現産物は得られていない．
T. kodakarensis 由来の三つの subtilisin のアミノ酸配列を Bacillus subtilis 由来の subtilisin E（AAA22742）の．Prepro subtilisin E は推定上のシものと比較した（図 2）
グナル配列，propeptide と成熟化ドメイン（subtilisin E）
からなる．同様に，Prepro-Tk-subtilisin は，シグナル配，propeptide（Tkpro Gly1-Leu69）
列（Met(-24)-Ala(-1)）と成熟化ドメイン（Tk-subtilisin Gly70-Gly398）からな，る．Prepro-Tk-SP は，シグナル配列（Met(-23)-Ala(-1)）
propeptide（ProN Ala1-Ala113）と成熟化ドメイン（TkSP Val114-Gly640）からなる．
Tk-subtilisinとTk-SPの組換え酵素をそれぞれ調製し，その酵素特性を解析すると，両酵素は常温性の subtilisin

りたたみを補助する分子内シャペロンとして働くほか，に比べ非常に強い安定性があることが示された．枯草菌

propeptide の C 末端領域が，触媒部位に基質のように結由来の subtilisin である Subtilisin Carlsberg と Proteinase
K が 70°C 以 上 の 温 度 で 失 活 し て い く の に 対 し，Tksubtilisin と Tk-SP は 90°C 以上の高温でも高い活性を維持 で き る（ 図 3）． 超 好 熱 菌 由 来 の プ ロ テ ア ー ゼ はProtease S などが知られているが，Tk-subtilisin，Tk-SP
はともに Protease S と同様に熱安定性が高く世界最高レ

図 1．Subtilisin の活性化プロセス（上原らの図を一部改変）7)．
Subtilisin はシグナルペプチド（Pre 配列，白色），Pro ペプチド（黒色），活性ドメイン（灰色）から構成される．Pre 配列
は分泌後に切断され，Pro 配列は構造形成後に自己触媒的に切断，分解されて，最終的な活性酵素になる．

を取り込むために働いているのに対し，真核生物のsubtilase は PCSK9（前駆タンパク質転換酵素サブチリ
シン / ケキシン 9）によるコレステロール代謝 5) やヒトの細胞の furin6) のように，ホルモンの前駆体の成熟化といった細胞内の事象に対して不可欠な役割を果たす．
多くの subtilisin は prepro-subtilisin と呼ばれる不活性な前駆体として合成され，分泌シグナル（Pre）とプロペプチド（Pro）を subtilisin ドメインの N 端に持っている．Pre 配列は細胞外への移動を補助し，分泌とともに切断される．その subtilisin 前駆体は，pro 体として分泌され，1）pro-subtilisin の折りたたみ，2）propeptide の切断，3）propeptide の分解（図 1）7) の 3 段階のプロセス

合し，競争的に活性を阻害する 8,9)．常温性の subtilisinの propeptide は intrinsically unstructured protein（IUP）
であるため，複合体から乖離すると，構造が崩れ，活性化した subtilisin によってすぐに分解されてしまう 10,11)．
このような成熟化メカニズムをはじめとする subtilisinの酵素学的諸性質は枯草菌由来の subtilisin で主に研究

ベルの熱安定性を持っていることがわかる．

されており，subtilisin を取り扱ううえで不可欠なノウ

さらに，5％ SDS（図 4）や 8 M Urea，6 M グアニジ

ハウを提供するものである．しかしながら，超好熱菌由

ン塩酸塩のような変性剤中での残存活性を比較した．い来 subtilisin においては，その成熟化プロセスや安定性

ずれも通常のタンパク質であれば完全に変性する条件でについてユニークな特性は明らかであったが，分子構造あるが，両酵素ともに 60 分までに不可逆的な変性は見レベルでの理解は限られていた．筆者らは，超好熱性アーられず，超好熱菌から単離された両酵素の熱に安定な分

キ ア Thermococcus kodakarensis KOD1 か ら 2 種 類 の子構造は，界面活性剤や変性剤による変性作用にも耐性

subtilisin ホモログ（Tk-subtilisin と Tk-SP）を単離し，を持つことが明らかとなった．

それらが高温環境で効果的に成熟化し，安定な構造をと

Tk-subtilisin

ることを明らかにするとともに，産業応用に向けた研究展開を行ってきた．

T. kodakarensis 由来 subtilisin-like protease

Thermococcus kodakarensis KOD1 は，鹿児島県小宝
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Tk-subtilisin の安定性がどのような構造に由来するのか，詳細な構造解析からそのメカニズムを明らかにすることができた．

Pre 配列（シグナル配列）を除いた Pro-Tk-subtilisin
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図 2．T. kodakarensis 由来 subtilisin のアミノ酸配列の比較．Tk-subtilisin（図中 Tk-sub），Tk-SP，Tk-0076 と枯草菌由来 subtilisin
E との比較．●は触媒 3 残基，○はオキシアニオンホールを表す．Tk-subtilisin には，ユニークな挿入配列（IS1 〜 IS3）が存在する．

図 3．Subtilisin の 温 度 依 存 性 比 較． 枯 草 菌 由 来 Subtilisin
Carlsberg（Carlsberg），Proteinase K，および Tk-subtilsin，
Tk-SP の 20 〜 80°C に お け る 酵 素 比 活 性 を 比 較 し た．Tksubtilisin，Tk-SP はともに 90°C 以上の高温で最大の活性値をとる．

図 4．Subtilisin の SDS 耐 性． 枯 草 菌 由 来 Subtilisin Carlsberg（Carlsberg），Proteinase K，および Tk-subtilsin，Tk-SP を 5％
SDS 溶液中で保温した後残存活性を測定した．Tk-subtilisin と
Tk-SP は高い残存活性を示した．

（Gly1-Gly398, 45 kDa）を 5 mM CaCl2 存在下，pH 9.5

80°C で 保 温 す る と， 活 性 ド メ イ ン の Tk-subtilisin（Gly79-Gly398, 37 kDa）と Tkpro（Gly1-Leu69, 8 kDa）の間のペプチド結合が自己切断された後，Tkpro が Tksubtilisin によって分解されていく（図 5）．これは，一般的な subtilisin と同様の成熟化過程を経て Tk-subtilisinも特徴がある．Tk-pro は単独で発現させても，立体構造を保っており，高い安定性を有している．成熟ドメイ
ンから乖離すると同時に構造を取らなくなるバクテリア
由来 subtilisin の pro 配列と大きく異なる点である．Tk-

pro の高い安定性は，高温環境下で Tk-subtilisin を効率が活性化していくことを示している．ただし，本酵素は的に活性化するために必要な分子機構の一つになって成熟化開始に Ca イオンが要求され，さらに，ProTk-

いる 17,19–21)．

subtilisin の成熟化速度は温度と密接に関連している 17–19)．
また，Tk-subtilisin はその pro ペプチド（Tk-Pro）に
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また Tk-subtilisin は，熱安定な分子構造をとることで活 性 を 維 持 す る こ と が で き る と 考 え ら れ る．Tk-

115

図 5．Tk-subtilisin の 成 熟 化 過 程．5 mM CaCl2 存 在 下 で Tksubtilisin を 80°C に保温すると成熟化が進行する．まず，ProTk-subtilisin で Pro ペプチド（Tk-Pro）の切断がおこり，30 分以上の保温で遊離した Tk-Pro が完全に分解されることで，成熟化が完了する．

図 7．Ca2，3 結合ドメイン欠失体のリフォールディング速度．
Ca2, 3 を失うと構造形成速度が 10 分の 1 に低下する．

的で，活性中心変異体と，それぞれ Ca2,Ca3 結合ドメ
インを欠損させた変異体である⊿ Ca2-Pro-S324A，⊿

Ca3-Pro-S324A について，折りたたみ速度を速度論的に解析した（図 7）．30°C，10 mM CaCl2 存在下でのそれぞれの折りたたみ速度の速度定数は，Pro-S324A で1.3 min–1 で，⊿ Ca2-Pro-S324A では 0.02 min–1，⊿ Ca3Pro-S324A では 0.019 min–1 であった．一方で，これらのタンパク質の熱安定性は Pro-S324A に比べて減少してはいなかった．これらの結果は Ca2 と Ca3 結合ドメイ
ン（もしくはイオン）は Tk-subtilisin の Ca に依存した
折りたたみに貢献するが，折りたたみ後の安定性には貢．
献していないことを示す（Takeuchi ら未発表データ）
図 6．S324C Tk-subtilisin の結晶構造．Tk-subtilisin の主鎖構
造は枯草菌由来の subtilisin E とほぼ同じであるが，挿入配列と Ca イオンの配位数が特徴的である．

Tk-subtilisin は Ca 結合ループの形成によって，立体構造形成に必要な高いカイネティックバリアを克服し，高温環境下でも素早く正しい立体構造を形成することができると考えられる．

subtilisin の自己分解を回避するため，活性中心 Ser324
を Cys に変異した酵素を調製して X 線結晶構造解析を行った 22–25)．S324C 変異体では，わずかな酵素活性が残存するため Pro ペプチドの自己切断のみが行われ，
Pro ペプチド分解前の分子構造の解析が可能となった．
Pro-S324C の全体構造（図 6）を観察すると，主鎖構造は枯草菌由来の subtilisin E と類似しているものの，三つの挿入配列（IS1，IS2，IS3）を持ち，7 つの Ca イオ

他の Ca イオン（Ca1，Ca6，Ca7）は，それぞれが離れた位置にある表面ループ上に配位している．Ca1，

Ca6，Ca7 の結合ループや，Ca を配位させる Asp を欠損させたPro-Tk-subtilisinとPro-S324Aの変異体を用いて，示差走査型カロリメトリー（DSC）を用いた熱安定性解析を行った結果，Ca1，Ca6，Ca7 結合ドメイン欠失体の Tm は，S324A に比べてそれぞれ 26.6°C，11.7°C，ンが配位しているなどユニークな構造的特徴が明らかと4.0°C 低くなっていた．これらの結果から，Ca1，Ca6，
Ca7 は Tk-subtilisin の安定性に寄与しており，特に Ca1なった．Tk-subtilisin の Ca イオンの配位数はこれまで

は安定性に対して大きな効果があると言える 27–29)．

報告されている subtilisin の中でもっとも多く，Ca1 結

こ の よ う な 挿 入 配 列 は，Tk-subtilisin に 加 え て，
Thermococcus onnurineus NA1（accession YP_002308296），Pyrolobus fumarii
や Pyrococcus sp. NA2（YP_004424756）
1A（YP_004781243），Aeropyrum pernix K1（NP_147093），
Ferroglobus placidus DSM 10642（YP_003436500）のような超好熱菌由来の subtilase にのみ見られる．これ
らの超熱安定性プロテアーゼの中で，IS2 と IS3 の配列相同性は高いが，IS1 の相同性は低い．これは，IS1 が合部位は多くの subtilisin に保存されているが他の 6 つは Tk-subtilisin にユニークである．特に挿入配列 2（IS2）には 4 つの Ca イオンが配位していた．この Ca 結合ループは Dx[DN]xDG モチーフという Ca 結合モチーフとして知られ，多くの Ca 結合タンパク質に見られる配列であった 26)．
それぞれの Ca イオンが果たす役割を明らかにする目

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他の部位と相互作用しない伸長配列であることによると思われる．これらの他の subtilase の挿入配列の特性解

A. pernix K1 subtilase（pernisine）
析は行われていないが，は EDTA のようなキレート剤処理によって活性が著しく低下する 30)．このように，Ca 依存的な折りたたみは
超好熱菌由来 subtilisin に共通する可能性があり，挿入配列の獲得が，超好熱 subtilase が高温環境に適応するための戦略になっているのかもしれない．

Tk-SP
一方，Pro-Tk-SP（68 kDa）を大腸菌で異種発現させると，バクテリア由来 subtilisin のように，菌体内で成熟化を開始し55 kDaと44 kDaのタンパク質が蓄積する．

80°C で 熱 処 理 を す る と，Pro-Tk-SP（68 kDa） は
55 kDaの中間体を経て44 kDaのタンパク質に成熟化し，高温によってこの成熟化反応が促進されていることがわ
かる．

MALDI-TOF MS スペクトロメトリーによって，44 kDaの タ ン パ ク 質 は N 末 端（Ala1-Ala113）， と C 末 端（Asp540-Gly640） を 欠 失 し た Pro-Tk-SP の 派 生 物（Val114-Val539）であることが明らかとなった 16)．この結果より，Pro-Tk-SP は N- 末端ドメインと C 末端ドメ
インが切断されて成熟化することが示された．In vitro
で行ったリフォールディング試験では，Tk-SP は Ca がなくても正しい構造に折りたたまれることから，Tksubtilisin と異なり，Tk-SP の折りたたみには propeptide
も Ca イオンも必要ないことが示唆される．
Pro-Tk-SP（Pro-Tk-S359A*）の結晶構造を図 8 に示す．
この構造は propeptide ドメイン（ProN, Lys4-Ala113），
subtilisin ドメイン（Val114-Thr421），ȕ-jelly roll ドメイン（Ala422-Pro522）からなる．Pro-Tk-SP の構造はPro-Tk-subtilisin に似ているが，挿入配列や subtilisin ド
メインの Ca 結合サイトは存在せず，その代わり ȕ-jellyroll ドメインと，それにつながる伸長ループが追加されており，それぞれに Ca1 結合サイトと Ca2 結合サイトが局在する .
S359A-SP* から Ca1 結合サイトを含む ȕ-jelly roll ド
メインと Ca2 結合サイトの両方を欠損させた変異体（⊿
J-S359A-SP*Ca）を構築し，CD スペクトルによる熱変性 曲 線 を 測 定 し た と こ ろ， 熱 変 性 の 遷 移 中 点 Tm が29.4°C 低かった．このことから ȕ-jelly roll 周辺に形成される Ca 結合サイトが，タンパク質を安定化することに寄与していることが示唆された 31)．

Tk-SP の N 末端 propeptide ドメイン（ProN）は他の
subtilisin の propeptide と同様に subtilisin ドメインに基質のように結合しており，Tk-SP の活性を競合阻害すると思われる．ProN は分子間相互作用によって Tk-SP*の活性を阻害するが，ProN を含まない Tk-SP* でも invitro で再構成した場合に活性を示すことから，本酵素の折りたたみには ProN は要求されないと考えられる．
医療用洗浄剤としての活用

Subtilase は洗浄用酵素として広く活用されているが，酵素を失活させぬよう使用温度は酵素の耐熱温度以下に限られていた．一般的に温度が高いほうが洗浄効果は高い．きわめて安定性の高い Tk-subtilisin および Tk-SP は，界面活性剤をはじめ洗浄成分との相性もよく，これまでの洗浄用酵素では実現できなかった，高温洗浄，変性条
件下での洗浄が可能になった．これにより，異常プリオ
ンタンパク質（PrPSc）のように洗浄が困難とされていた難分解性タンパク質の除去に活用できると考え，これらの酵素の医療用洗浄剤としての可能性を検証した．

Prion 病はヒトの Creutzfeldt-Jakob disease（CJD）や
Gerstmann Sträussler Scheinker syndrome（GSS），kuru，，羊
ウシの bovine spongiform encephalopathy（BSE）のスクレイピーを含む致死性の神経変性疾患である 32)．
これらの疾患は Į ヘリックスに富んだノーマル型プリオ
ンタンパク質（PrPC）から変換される ȕ シートに富んだ異常型（PrPSc）に関連付けられている．感染因子となる PrPSc は，細胞性の PrPC を未知の機構によって異常型に変換することで増殖する．したがって，医療器具に付着した PrPSc の除去は二次感染防止の重要なポイントであるが，PrPSc は標準的な医療器具の滅菌方法，汚染除去方法に強い耐性がある．世界保健機構（WHO）の感染防止ガイドラインでは，器具を汚染した PrPSc の完全な 不 活 化 に は，135°C で の 蒸 気 滅 菌，SDS や NaOH，

図 8．Tk-SP の結晶構造．Pro ペプチドと成熟化ドメインの主鎖構造は Tk-subtilisin と共通しているが，C 末端側に，ȕ-jerryroll ドメインが付加している．

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次亜塩素酸のような強い薬剤による処理を推奨している．しかし，これらの方法は，特殊な装置を必要としたり，強い薬剤によって器具にダメージを与えたり，洗浄117

作業に危険を伴う可能性があることから，器具の再生とが有効なのである．Tk-SP でもスクレイピー感染マウス

いった煩雑な作業が重荷である医療現場に普及しにくいの脳ホモジネート中の PrPSc を，化学薬品との組合せでという問題があった．

分解できることが確認されており 34)，Tk-SP を PrPSc のそこで，活性の強いプロテアーゼが，普及しやすく，
なおかつ高度な洗浄安全性を実現できる，新しい医療用

感染性を減少させる洗浄剤添加剤として利用した試作品も作製されている．

洗浄剤に利用できると考えた．Tk-subtilisin の最大活性

特殊な洗浄剤としての活用には，さらなる可能性がは市販のプロテアーゼである subtilisin E のおよそ 7 倍で考えられる．Caliciviridae family，Reoviridae family，ある 17)．さらに，ほとんどのタンパク質が変性する 5％

Picornavidae family のような非エンベロープ型のウイル

SDS，8 M Urea もしくは 6 M GdnHCl（グアニジン塩酸塩）存在下でも Tk-subtilisin は 100％の活性を保っていることから，Tk-subtilisin は，タンパク質を変性する化
学的，物理的条件のもとで PrPSc を酵素分解することがスは，タンパク質から構成されるカプシドで覆われていできると考えられる．

次亜塩素酸での拭き取りが有効であるが，絨毯や衣類な羊のプリオン病であるスクレイピーに感染したマウ
ス の 脳 ホ モ ジ ネ ー ト（SBH） を， 多 様 な 濃 度 の Tk-

る．ノロウイルスは感染力が強く，吐瀉物などに含まれるウイルスを完全に不活化しないと集団感染の原因になる．ウイルスの汚染が床やテーブルなど硬質表面の場合，どが汚染した場合，除染対象にダメージを与える可能性のある薬剤は使いにくい．

subtilisin で処理した．SBH の酵素分解物を，抗プリオ

非エンベロープ型ウイルスの一種であるネコカリシウ

ンタンパク質抗体を用いたウエスタンブロット法で検出

イルスを 0.01％ w/w 以下の Tk-SP と室温で接触させ，Scしたところ，PrP は検出限界以下に分解することがで
33)

その感染価の低下を TCID50 で評価したところ，およそSc

きた ．Tk-subtilisin の PrP 除去能力は汎用的な製品と5 分で感染価は検出下限（LogTCID50 = 1.5 以下）に達して流通している Proteiase K のそれよりも高く，90 mU．食品のすることがわかった（Adachi ら未発表データ）の Tk-subtilisin は脳ホモジネート中の PrPSc を 16700 mU

残渣や体液などが混ざった吐瀉物中のウイルスを効果的の Proteinase K よりも効果的に分解している．SBH はに除去するためには，界面活性剤を使って，ウイルスと加熱によって凝集体を生じるため，Tk-subtilisin が均一

酵素の接触機会を増やしてやる必要がある．界面活性剤に作用できない可能性があるが，SDS やその他の界面に強い特性はこのように酵素の利用範囲を広くすること

活 性 剤 の 存 在 下 で は 凝 集 が 抑 制 さ れ る た め，Tk-ができる．

subtilisin による分解が効果的に行われると考えられる．Tk-subtilisin は通常の洗浄剤だけでなく，PrPSc（図 9）が，酵素としての安定性の限界が，利用範囲を限定しての除去を目的とした医療用特殊洗浄剤にも利用できるこいた面もある．Tk-subtilisin と Tk-SP のような安定性のとが期待される

33)．

Tk-SP は Tk-subtilisin よりも洗浄用酵素としてさらに有望である．先述のように，Tk-subtilisin はその安定性に Ca イオンが要求されることから，キレート剤存在下

Subtilisin は産業用酵素として身近に活用されてきた高い酵素は，酵素の新しい利用法を提案することに貢献できると考えられる．

Tk-subtilisin および Tk-SP の生産性

では不安定化してしまう．洗浄有効成分としてキレート

Tk-subtilisin および Tk-SP に産業用酵素として有用性剤が含まれるような場合には，Ca に依存しない Tk-SPが示されたことから，これらを大量生産できれば実用化が期待できる．洗浄用酵素としては 1 g/L-culture 以上の生産効率が求められているが，Tk-SP は常温でも宿主細胞内でタンパク質分解活性を示すため，宿主細胞の生育を阻害してしまい，十分な生産量が得られないという課題があった．Tk-subtilisin に関しては大腸菌の菌体内で不溶性沈殿として発現するため，菌体の生育阻害を回避
し，高濃度培養を行うことができる．しかし，Ca イオン，
温度，Tk-Pro ペプチドなど成熟化条件に関わる要因を適正に調整する必要があり，不溶性沈殿からの再構成法が複雑で，産業用酵素の生産法としては適さない．
一方，Tk-SP は立体構造形成能力が高く，宿主細胞内図 9．Prion タンパク質の分解

118で可溶性発現しやすいため，煩雑な再構成操作は不要で
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あるものの，上述のようにその活性が宿主細胞の生育を阻害することもあり，高発現系の構築には課題が残っている．
これまでに，分泌発現系や Tk-SP の活性を一時的に不活化する試みを行っている．従来，Tk-SP は不活性な

Pro 体として発現した後，成熟化するものであるが，Tk-SP の Pro ペプチドは，安定性が低く速やかに分解し図 10．ȕ-jerryroll ドメインと Camel VHHてしまうことから宿主細胞内では活性制御ができていな
い．一方，Tk-subtilisin のプロペプチド（Tk-Pro）は単独で菌体内発現でき，安定な立体構造を形成することができるうえ，Tk-SP に対しても競争的に活性阻害すること が 確 認 さ れ て い る． そ こ で，Tk-Pro 過 剰 発 現 下 でTk-SP の活性を抑制することを目的として，Tk-Pro と
Tk-SP の共発現系を構築した．野生型 Tk-SP は発現誘導をかけると十分な生育ができなくなっていたが，Tk-Pro

VHH ドメインの抗原認識に関わる CDR 2, 3 に相当する
部 分 も BJR 上 に 存 在 し て い る こ と か ら（ そ れ ぞ れ EF
loop および CD loop），両者は構造的に高い類似性を示すといえる．さらにBJRを大腸菌で組換え発現させると，
熱変性温度が 85°C と高く，安定なドメインであることから，タンパク質工学的に機能をデザインするためのプ
ラットフォームとして活用できる可能性が考えられる．

との共発現によって，宿主細胞の生育阻害は改善され，

本ドメインについては，抗原認識部位に相当するループ

Tk-SP の収率をおよそ 10 倍程度改善することができてい る． こ れ に よ り 大 腸 菌 の 発 現 系 に お い て 200 mg/
L-culture の 生 産 性 を 達 成 し て い る（Adachi ら 未 発 表上にランダムな変異を導入して変異ライブラリーを構築

データ）．

のようにターゲットを認識する特異的 binder scaffold とまた，本酵素の活性を抑制するためには propeptide の阻害効果を高めることが有効と考え，活性ドメインとの間に静電的相互作用や疎水性相互作用を新たに導入する

し，ターゲットタンパク質に対する結合特性を指標としたスクリーニングを行うことを計画しており，今後抗体しての利用が期待される．
おわりにようなアミノ酸置換を propeptide 上に設計した．変異

Subtilisin のように，成熟化過程が複雑で，自己分解

propeptide を有する Tk-SP は 60°C 以下の温度領域で成の可能性もある酵素は取り扱いが難しく産業化の課題と熟化しにくくなることが分かっており，さらなる生産性なっていたが，構造と機能の詳細な解析によって，分子の向上に貢献できると考えられる．

レベルでの成熟化機構，安定化機構が明らかになれば，

現在，産業用酵素の生産実績のある宿主で，成熟化抑

その調製法，利用法を新たに開発することができる．超制効果のある変異酵素の発現系を構築しており，Tk-SP

好熱菌由来 subtilisin の構造と機能の相関について得らの産業用酵素としての高生産系の開発が期待される．

れた知見が蓄積されてきたことで，取り扱いが難しく，

新しい protein scaffold としての展開

生産性も高くない Tk-subtilisin と Tk-SP の性能を最大限に活用するために必要な手法が確立されつつある．両酵

超好熱菌のタンパク質はその酵素活性だけでなく，タ素の特殊な酵素特性をうまく利用することができれば，ンパク質工学の新しいプラットフォームとしての活用も

産業応用の可能性は医療用洗浄剤にとどまらず，これま期待できる．Tk-SP の C 末端に形成される ȕ-jerry roll ド

では酵素を用いることができなかったような新しい用途

メイン（BJR）は，抗体の可変領域（VL または VH ドメへのプロテアーゼの新展開が期待できる．

イン）に見られる，ȕ サンドウィッチ構造とよく似た主タンパク質の構造と機能の関係には，未知の可能性が鎖構造を取っている．このような構造のドメインは，相広がっている．超好熱菌に限らず多くの極限環境微生物

互作用に関わる他のタンパク質に見いだされており，同が生産するタンパク質は，天然の見本である．これらの様の構造を取るヒトの fibronectin のドメインは，抗体タンパク質は我々の常識を超えた魅力的な，機能を持っのようにターゲットに特異的に結合するタンパク質のていると考えられる．その機能を発現するのに必要な分

scaffold として開発されている．
BJR ドメインとラクダ科動物の重鎖抗体の可変領域（VHH ドメイン）の主鎖構造を重ね合わせると，タンパ ク 質 構 造 の 類 似 性 の 指 標 と な る root mean squaredeviation（RMSD）が 2.0 Å 以下で重なり合う（図 10）．

子構造を明らかにすることで，タンパク質機能をより深

生物工学

第96巻

第3号（2018）

く理解できれば，新しい機能を持ったタンパク質をデザインすることも可能だと考える．極限環境生物由来のタ
ンパク質の構造と機能の研究を通して，バイオテクノロ
ジーの新しい可能性を拓くことに挑戦したい．

119

謝

辞

本研究は大阪大学院工学研究科極限環境生命工学領域（現，
生物化学工学領域）で行われたものであり，タンパク質の構
造機能相関研究をご指導いただいた大阪大学名誉教授金谷茂
則先生，現北海道大学教授森川正章先生に深く御礼申し上げます．また，大阪大学教授大政健史先生，本研究にご指導頂きました現日本大学教授春木満先生，現京都府立大学教授高野和文先生に御礼申し上げます．実用化研究において多大な御支援を賜わりました現釧路工業技術センター土居幹生氏，徳島大学坂口末廣教授，内山圭司准教授，琉球大学作道章一准教授，アマノエンザイム株式会社小池田聡様，サラヤ株式会社平田善彦様，尾田友香様，中村絵美様に御礼申し上げます．
また，成果の大半は大阪大学で一緒に研究を行ってきた Maria
Purido 博士，田中俊一博士，上原了博士，Tita Foophow 博士
をはじめとする 22 名の同窓学生によるものです．ここに深く感謝いたします．
本研究の一部は，日本学術振興会，科学技術新興機構，厚生労働省，関西バイオメディカルクラスターの助成を受けて実施されたものです．

文

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