〔生物工学会誌

第 85 巻第2号

69–74．2007〕

平成18 年度 斎藤賞 受賞

総合論文

細菌ポリエステルおよび関連代謝の新規利活用システムに関する研究前田勇Studies on Novel Applied Systems Using Bacterial Polyesters
and Their Related Metabolisms
Isamu Maeda (Department of Bioproductive Science, Faculty of Agriculture, Utsunomiya University,
350 Minemachi, Utsunomiya, Tochigi 321-8505) Seibutsu-kogaku 85: 69–74, 2007.

はじめに携わった経緯から 6–8) PHA の有する貯蔵物質としての特性や生分解性，生体適合性に特化した応用的研究の必要

細菌が生合成するポリ（3- ヒドロキシアルカン酸）性を感じたため，PHA やその代謝をバイオプラスチック（PHA）は生分解性プラスチックとしての利用が期待さ以外の用途に利活用する系を新たに開発するという課題

れるポリエステルの一種である（図 1）．これまでに PHAを設定した．研究開始時の知見から一定の成果を期待での合成系 1) や分解系 2)，それらの調節系 3)，微生物や植物

きた 3 つの課題，すなわち①水溶性薬物の経皮ドラッグを宿主とした生産プロセス 4,5) に関する多くの知見や成デリバリーシステムの基剤としてのPHA の利活用，②光果が得られている．いくつかの細菌で PHA 合成の研究に合成細菌による水素生産を廃水処理と共役させる，橋渡し代謝としての PHA 代謝の利活用，③真核細胞の脂肪酸代謝の解析ツールとしての PHA 合成酵素遺伝子の利活
用についての研究成果を報告する．
PHAを基剤とした経皮ドラッグデリバリーシステム
経皮ドラッグデリバリーシステム（TDDS）9) は経口投与による胃腸障害を回避できる，投薬管理が容易であるなどの利点を有するすぐれた薬物投与法である．しかしながら，水溶性薬物を TDDSにより投与する場合には疎水性の皮膚角質層がバリアとなるため，効率的な角質層透過が前提条件となる．本研究においては，塩酸タム
スロシン（前立腺肥大症治療薬）10)，ケトプロフェン（非ステロイド性抗炎症薬）11)，そして塩酸クロニジン（高血圧治療薬）12) をモデル薬物として PHA を基剤とした

図 1．細菌が蓄積するポリエステルの一種，ポリ（3- ヒドロキ
シアルカン酸）（PHA）の構造と PHA 合成酵素（PhaC）により触媒される重合反応
著者紹介

パッチを作製した．本研究では Psudomonas putida のオク
タン酸流加培養により得られたPHA を用いた．モノマー
組成を分析したところ，0.08 と 0.92 の比率で（R）-3- ヒ

宇都宮大学農学部生物生産科学科（助教授） E-mail: i-maeda@cc.utsunomiya-u.ac.jp69図 2．経皮ドラッグデリバリーシステムにおけるポリ（3- ヒド
ロキシアルカン酸）（PHA）のパッチ基剤としての利活用

ドロキシヘキサン酸と（R）-3- ヒドロキシオクタン酸から構成されていた 13,14)．上記の薬物は疎水性の PHA 分子中においても良好に分散することが確認された 14)．ヒト
皮膚角質層のモデルとしてはアミメニシキヘビ Python
reticulatus の脱皮殻を用いた 15)．PHA パッチは脱皮殻と良好な親和性を示したのに対し，ポリ（3- ヒドロキシ酪

図3．光合成細菌 Rhodovulum sulfidophilumの野生株と phaC 破壊
株における水素の発生速度と発生量の菌体濃度に対する変化．
野生株ではポリ（3- ヒドロキシ酪酸）（PHB）を蓄積した菌体を，phaC 破壊株では PHB を蓄積しない菌体をそれぞれ水素発生条件に移行させた．外部基質として50 mM コハク酸二ナトリ
ウムを添加した条件（●，▲）と外部基質を添加しない条件（○，△）を検討した．

酸）（PHB）は脱皮殻と馴染みにくく基剤としては向かないことが示唆された 14)．PHA パッチと飽和水溶液から内に蓄積した．その菌体を基質非添加培地に再懸濁し水の薬物透過をそれぞれ調べた結果，水溶液からの薬物透素発生条件に移行させると，菌体内 PHB 含量の低下に伴過速度はクロニジンで 75 µg/cm2/d，タムスロシンとケト

い水素が発生した 22)．一方，コハク酸二ナトリウムを添

プロフェンではほとんど透過が認められなかったのに対加して培養した場合，PHB の蓄積は 1% しか認められず，し，PHA 基剤からはそれぞれ 285，15，205 µg/cm2/dとこの時には外部基質の非存在下において水素発生は認めなり，いずれの薬物においても透過が大幅に向上するこられなかった．

とが明らかとなった 14)．本研究は，実験動物を用いて実菌体内 PHB からの水素発生を詳細に解析するために，証するまでには至っていないが，PHA の TDDS基剤としR. sulfidophilumの PHA 合成酵素遺伝子（phaC）の破壊株ての利用を初めて提唱したものであり（図2），これによを育種した 23)．野生株と phaC 破壊株を光照射下においり PHAの医薬への応用範囲が広がることを期待する．

て酢酸ナトリウムを添加して培養したところ，phaC 破壊光合成細菌の PHA代謝を介した水素生産

株は野生株と同等の基質取り込み速度を示したが，PHB蓄積は認められなかった．一方，野生株は細胞増殖と連水素は次世代クリーンエネルギーとして注目されてい動し PHB を合成したが酢酸の枯渇後には増殖と連動しる．紅色非硫黄細菌はニトロゲナーゼの触媒下，光依存

た PHB 含量の低下が認められた．酢酸で培養後の野生の水素発生を行うことが知られている 16)．Rhodovulum

株と phaC 破壊株の菌体を用いて水素発生試験を行った

sulfidophilum を用いた水素生産の研究に携わった経緯か（図 3）．phaC 破壊株を，外部基質を添加せずに水素発生

ら 17–19)，紅色非硫黄細菌が菌体内に蓄積するポリ（3-ヒ条件に移行させた場合，水素発生は認められなかったこ

ドロキシ酪酸）（PHB）代謝 20) と水素発生の関係についとから外部基質非添加時に発生する水素の還元当量はて研究を行った．Rhodobacter sphaeroidesと Rhodospirillum

PHB から供給されることが証明された．基質としてコハ

rubrum を用いた研究から，基質である酢酸からの還元当

ク酸二ナトリウムを添加して菌体濃度に対して水素発生

量消費において水素発生と PHB 合成が競合関係にある

速度と発生量を調べた結果，一定の菌体濃度でプラトーことが示された 21)．このことから，紅色非硫黄細菌ではに達したため，この値をそれぞれ最大生産速度そして最PHB 分子内にいったん貯蔵された還元当量を消費する

大生産量とした．最大生産速度そして最大生産量共に野ことで水素生産が行われるのではないかという発想に生株の値が phaC 破壊株の値を上回った．この結果から，至った．R. sulfidophilum を光照射下，酢酸ナトリウムを外部基質の存在下においても菌体内 PHB は水素発生速添加して培養すると菌体乾燥重量の 50％の PHB が菌体

度あるいは発生量を向上させる働きがあることが明らか

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生物工学

第85巻

オエステルに対して活性を示す．
モデル真核生物である出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae
を研究試料として用いることにより，これまでにさまざ
まな真核生物の生命活動の仕組みや代謝が解明されてきた．S. cerevisiae において脂肪酸の分解はオルガネラの一つ，ペルオキシソームにおける β- 酸化回路を介して行われる．Poirier らは，クラスIIの PHA 合成酵素をコードする緑膿菌 Pseudomonas aeruginosa の遺伝子 phaC 26) の 3' 末
端にペルオキシソームターゲティングシグナル（PTS）の配列を付加することで，PhaC 活性を S. cerevisiae のペ
図 4．光合成細菌を用いた廃水処理と水素生産．好気的な廃水処理の後，ポリ（3- ヒドロキシアルカン酸）（PHA）を蓄積した菌体を濃縮し光生物反応器において水素生産を行う．光合成
細菌は低 BOD条件下でPHAを分解しつつ水素を生産する．

ルオキシソームに局在化させた 27)．形質転換株をオレイン酸（シス -9- オクタデセン酸）の存在下で培養した結果，6 以上 14 以下の偶数の炭素数を有する（R）-3- ヒド
ロキシ脂肪酸モノマーから構成される PHA が合成されとなった．さらに，野生株の外部基質非添加時の最大水

た．

素発生速度は 33.0 ml/l/h となり野生株と phaC 破壊株のしたがって，合成されたPHA のモノマー組成はペルオ

コハク酸添加時の最大速度 29.9 と 26.6 ml/l/h を上回っ

キシソームに局在化させた PhaC の基質特異性により決た．コハク酸を外部基質に用いた場合に他の有機酸やア定づけられたと考えられる．また，S. cerevisiae に偶数鎖ルコールの場合と比較し，R. sulfidophilum はより高い水長の脂肪酸を供給した場合は偶数鎖長の（R）-3- ヒドロ

素発生速度を示すが，菌体内 PHBを基質とした場合にはキシ脂肪酸，奇数鎖長の脂肪酸を供給した場合は奇数鎖

更に高い速度で水素発生が行われることが示された．

長の（R）-3- ヒドロキシ脂肪酸をモノマーとする PHA が光合成細菌は食品工場などから排出される有機廃水のそれぞれ合成されたことから，PhaC の基質である（R）-

分解処理にも活用可能であり 24,25)，本研究成果は有機廃

3- ヒドロキシアシル -CoA は脂肪酸 β- 酸化回路の中間代

水の処理過程で生じた余剰菌体質量の低減と水素の副次謝産物から供給されることが明らかとなった．β- 酸化回的生産に結びつくものとして，次に示すようなことが期路は4つの酵素活性，
すなわちアシル-CoAオキシダーゼ，

待される（図 4）．提案する系において，有機廃水処理はトランス -2- エノイル -CoA ヒドラターゼ，（R）-3- ヒドロ

開放型処理槽における好気培養により行われる．この過キシアシル -CoA デヒドロゲナーゼ，3- ケトアシル -CoA

程で廃水中の BOD が低減する．水素発生を触媒するニチオラーゼから構成される（図 5）．アシル -CoA オキシ

トロゲナーゼは嫌気条件で活性化されるため 16)，廃水処

ダーゼは fox1 に，トランス -2- エノイル -CoA ヒドラター

理時に水素発生は行われず廃水中に存在した有機物の還ゼと（R）-3- ヒドロキシアシル -CoA デヒドロゲナーゼは

元当量の一部が菌体内 PHA として貯蔵される．廃水処理

fox2 に，3- ケトアシル -CoA チオラーゼは fox3にそれぞれで生じた余剰の菌体を濃縮後に密閉型の光生物反応器へコードされる．したがって，fox1 と fox2 の遺伝子破壊株と導き水素生産を行う．水素生産開始時にすでに廃水のは β 酸化活性を有しておらず，phaC を導入したこれらの

BOD は低下しているため菌体内 PHA を基質とした効率破壊株をオレイン酸と共に培養した場合に菌体内 PHA

的水素生産が期待される．また，密閉型の反応器は開放は検出されなかったことから 28)，蓄積した PHA 含量とβ-型のものと比較し製造コストがかかるが，本系を用いる

酸化活性との間に一定の相関があることが明らかとなっことで水素生産用の光生物反応器の小型化が可能となる

た．これらの実験結果より，phaC を異種発現させた S.

ため，水素生産コストの低減にも結びつくと考えられる．

cerevisiaeが合成したPHAのモノマー量と組成を解析する

phaC 導入酵母における脂肪酸代謝の解析

ことで，脂肪酸の β- 酸化スパイラル上の代謝産物を解析する手法が考案された（図 5）．クラス I あるいはクラス

PHA 合成酵素は DNA 塩基配列から推定されるアミノIIに属する PhaC，またはその両方をペルオキシソームに酸配列と酵素の基質特異性，サブユニットの構成から 4

局在化させることにより，β- 酸化回路を介して生成したつのクラス (タイプ ) に分類される 26)．クラス Iとクラス

炭素数 4 から 14 の（R）-3- ヒドロキシ脂肪酸の CoA チオ

II の PHA 合成酵素は 1 種類のサブユニット，すなわちエステルについて，設定した条件間における相対量の変PhaC のみから構成され，それぞれ炭素数 3 から 5 と 6 か化を調べることが可能となった．

ら 14 の（R）-3- ヒドロキシ脂肪酸の補酵素 A （CoA）チ
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第2号

本手法はオルガネラに局在する PhaC が脂肪酸の代謝71

図5．ペルオキシソーム配向型の PHA 合成酵素（PhaC）活性を利用した出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae の脂肪酸β-酸化回路における代謝産物の解析

産物を PHA 分子中へと取り込むことにより代謝産物が子に PTS の塩基配列を付加し S. cerevisiae 株に導入した．

ポリエステル分子中に固定化され，以後の代謝や輸送を

phaCを導入した株はゲノムDNA上のfox2 ∆をプラスミド

受けないという原理に基づく．したがって，培養期間をDNA 上の fox2，fox2-a∆，fox2-b∆ でそれぞれ相補した株通じて PHA 分子内に継続的に捕捉された，鎖長の異なるである．オレイン酸を添加し各形質転換株を培養したと（R）-3- ヒドロキシアシル -CoA の定性ならびに定量が可ころ，P. aeruginosa phaC を導入した株では炭素数 14 から能である．このため，サンプリング時の一時的な細胞内6の(R)-3-ヒドロキシ脂肪酸からなるPHAが合成された．

濃度が強く反映される直接定量法と比較し，定量感度に

そのモノマーの組成は fox2∆（fox2）と fox2∆（fox2-a∆）すぐれ代謝過程の全体像をより反映した結果を得ることがほぼ同じであるのに対し，fox2∆（fox2-b∆）では C6 モができる点ですぐれている．本手法で得られた，S. cere-

ノマーのモル比が増加し C8-14 モノマーのモル比が減少

visiae の脂肪酸 β- 酸化に関するいくつかの知見を以下にするという傾向が認められた．W. eutropha phaC と A. cav-示す．

iae phaC を導入した株では炭素数 6 から 4 の（R）-3- ヒド

前述のように fox2 はトランス -2- エノイル -CoA ヒドラ

ロキシ脂肪酸からなる PHA が合成された（図6）．この試ターゼと（R）-3- ヒドロキシアシル -CoA デヒドロゲナー

験で用いられた PhaC は短鎖の基質に対して活性を示す

ゼ活性を有する multifunctional enzyme type 2（MFE-2）

ため，B ドメイン欠損株にのみ PHA 含量の著しい増加がをコードする 29)．MFE-2 の A ドメインと B ドメインは認められた．（R）-3- ヒドロキシアシル -CoA デヒドロゲ（R）-3- ヒドロキシアシル -CoA デヒドロゲナーゼとしてナーゼと PhaC はそれぞれの基質である（R）-3- ヒドロキ

機能する．組換えタンパク質を用いた酵素反応のカイネ

シアシル -CoA を消費する上で競合し合う酵素である．しティクス解析の結果，B ドメインの機能を欠損させた B∆

たがって，B ドメイン欠損により C6 モノマーのモル比や酵素は長鎖（C16）と中鎖（C10）に活性を示し短鎖（C4）短鎖モノマーからなる PHA の含量が増加するという実とはまったく反応しないのに対し，A ドメインの機能を験結果は，生体内においても B ドメインが短鎖の (R)-3-

欠損させた A∆ 酵素は長中鎖より短鎖の基質に対し高いヒドロキシアシル -CoA の脱水素反応を担うということ

反応速度を示すことが明らかとなった．この研究で示さを示している．

れた A∆ そして B∆ 酵素のカイネティクスが S. cerevisiae 細また，S. cerevisiae のペルオキシソームに局在するアシ胞内においても反映されることが示された 30,31)．クラス

ル -CoA チオエステラーゼ（Pte1）の遺伝子破壊株に P.

I の Wautersia eutropha (Ralstonia eutropha) PhaC26) とクラ

aeruginosa phaC を導入し，合成された PHA を解析するこス I に対するホモロジーが高く 3- ヒドロキシ酪酸と 3- ヒとにより短鎖脂肪酸と分枝脂肪酸のβ-酸化におけるPte1

ドロキシヘキサン酸の共重合体を合成する Aeromonasの生理学的役割を明らかにした 33)．Pte1 はアシル -CoAcaviae PhaC32)，クラス II の P. aeruginosa PhaC の各遺伝のチオエステル結合を加水分解し脂肪酸とCoAを生成さ

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生物工学

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図6．
（R）-3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼの Aドメ
イン欠損（fox2-a∆）と B ドメイン欠損（fox2-b∆）が phaC を導入した S. cerevisiaeのPHA 合成に及ぼす影響．バーは C4（ ），C5（ ），C6（ ）の（R）-3-ヒドロキシ脂肪酸を示す．

図7．S. cerevisiaeペルオキシソームでの β-酸化におけるアシル CoAチオエステラーゼ（Pte1）の生理学的役割．奇数鎖長短鎖
脂肪酸や分枝脂肪酸の β- 酸化では，初発のアシル -CoA に対して生成するアセチルCoA のモル比が低くなり，CoA 再生におけるPte1 活性への依存度が高まる．

いった要素が強調される利用法を開発することも肝心であると考える．たとえば，医薬分野における利用では本研究で示した TDDS 基剤としての利用以外にも，抗生物せる酵素である．長鎖（C17）や中鎖（C13，C11，C9）

質投与のための DDS 担体 35,36) や心臓弁の再生医療用のの直鎖型脂肪酸を添加して培養を行った場合に，親株と足場 37) としての利用などが挙げられる．水処理分野におpte1 破壊株の PHA 含量に有為な差は認められなかった．

いては，バイオ脱窒処理の際の還元当量の供給源と微生

一方，短鎖脂肪酸（C7），あるいは 8-メチル-ノナン酸物フィルム床としての利用が提案された 38,39)．また，（C9）や 9- メチル - アンデカン酸（C11），10- メチル - ア

phaC を S. cerevisiae やモデル植物の Arabidopsis thaliana にンデカン酸といった分枝脂肪酸を添加して培養を行った

導入することで，脂肪酸代謝に関するいくつかの知見が場合には，親株と比較し pte1破壊株の PHA 含量が著しく得られた 40,41)．さまざまな生物種に phaC を導入し合成さ低下した．実験結果より，Pte1 は短鎖脂肪酸や分岐脂肪

れる PHA を解析することで，新たな生化学的知見や油脂

酸のβ-酸化過程において重要な役割を担うことが示されを原料とした有用物質生産のための代謝工学，脂肪酸代た．Pte1 はアシル -CoA を加水分解し CoA を生成するこ謝異常に起因する疾患の原因究明などに役立つ可能性がとでペルオキシソーム内のCoAプールとβ-酸化を維持す考えられる．

ると考えられている（図 7）．β- 酸化によりアセチル -CoA

現在，得られている生化学的あるいは物性学的知見をが生成するとアセチルユニットのペルオキシソーム外へ

基に，今後も PHA の用途や応用分野が拡大し，さらに汎の輸送システムにより Pte1 非依存的に CoA が再生され用プラスチックとしての生産を可能にする技術が進展する 34)．この点を考慮すると，短鎖脂肪酸や分岐脂肪酸のることが期待される．

β- 酸化過程におけるアセチル -CoA の生成効率が高くな
いため，CoA 再生における Pte1 活性への依存度が高くなるというメカニズムが推察される．
おわりに
PHA や関連する代謝の利活用を考える上で理想となるのはコモディティケミカルとして素材化あるいは製造法の構築であろう．その一方で，PHA より価格競争力のあるバイオプラスチックが開発されている現状がある．
したがって，PHA の利活用を押し進めるという観点か
ら，汎用から脱却し機能性や生体適合性，生分解性と
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第2号

本研究を遂行するにあたり大阪大学大学院薬学研究科の八木清仁 教授，川瀬雅也 助教授（現大阪大谷大学薬学部教授），
三浦喜温 名誉教授，溝口 正 教授（現大手前大学社会文化学部教授），宇都宮大学農学部の上田俊策 教授，ローザンヌ大学
生物学舎のYves Poirier教授から指導と助言をいただきました．
本研究は研究室に在籍した大学院生と学部生の多大なる協力により行われました．また，関西電力株式会社と同社の宮坂均
チーフリサーチャーに研究の一部をサポートしていただきました．日本学術振興会の二国間交流事業のサポートによりPoirier 研究室に留学させていただきました．ここであらためて深謝いたします．

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文

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