〔生物工学会誌

第 87 巻第3号

116–122．2009〕

平成20 年度 生物工学奨励賞（斎藤賞）受賞

高親和性抗体の産生機構に関する研究とその工学的応用
金山

直樹

Basic Research and Development on Generation Mechanism of High Affinity Antibodies
Naoki Kanayama (Department of Bioscience and Biotechnology, Okayama University Graduate Schoolof Natural Science and Technology, 3-1-1 Tsushima-Naka, Okayama 700-8530) Seibutsu-kogaku 87:
116–122, 2009.

ウスの高親和性抗体の産生過程に関して独自の解析手法

はじめにの構築とその結果得られた成果を報告するとともに，生抗体は標的抗原に特異的かつ高親和性に結合すること
により，生体防御において重要な役割を果たす．この抗体内の抗体産生機構に着想を得て構築してきた新規な invitro 抗体作製システムについて解説したい．

体の抗原に対する高い結合特異性を利用して，免疫組織

抗体の親和性成熟

化学，ELISA，ウエスタンブロットなど実験試薬，診断薬としてだけでなく，癌，自己免疫疾患，新興・再興感

抗 原 特 異 的 な 抗 体 の 産 生 機 構 は，1957 年 に Frank染症などの難治性疾患の治療薬，いわゆる抗体医薬としMacFarlene Burnet が提唱したクローン選択説によってての開発が近年活発に展開されている．そうした抗体医

その概略が記述された 1)．その後，多くの実験的証拠に薬となる高特異性・高親和性のモノクローナル抗体の効基づく修正を経て，現在，生体内の抗体産生は以下のよ

率的な作製技術の開発へのニーズの高まりから，生体内

うに進むと考えられている（図 1）2)．①個々の B 細胞クの抗体産生機構に関する基礎研究を基盤とした新規技術

ローンは 1 種類の抗体を発現し，B 細胞の発生段階で抗の開発がますます重要となってきている．本稿では，マ体可変部遺伝子の V(D)J 組換えによって多様な抗体レ

図1．抗体の親和性成熟
著者紹介

116

岡山大学大学院自然科学研究科機能分子化学専攻（准教授） E-mail: nkanayam@cc.okayama-u.ac.jp

生物工学 第87巻

パートリーが用意される．この段階で自己に反応性のクローンは除去される（自己免疫寛容）．②抗原に感作した
特異的クローンは活性化して増殖し，抗体を大量産生す
る形質細胞に分化する．③活性化 B 細胞の一部は，胚中心という微小環境をリンパ組織中に形成し，活発に増殖する．④胚中心 B 細胞の抗体可変部遺伝子に体細胞突然変異が導入され，抗原に対して高親和性を獲得したクローンが選択される．⑤高親和性クローンは形質細胞や記憶細胞に分化する．特に，②～⑤で高親和性抗体を産生する過程は親和性成熟と呼ばれ，液性免疫の重要な機構の一つである．この過程で，抗体の親和性の向上に伴って抗体定常部遺伝子が組換えられ，抗体アイソタイプがIgM から IgG や IgA などにクラススイッチする．しかしながら，親和性成熟の一連の過程において，③胚中心への選択，④体細胞突然変異の誘導と高親和性クローンの選択，⑤記憶細胞や形質細胞への分化の振り分けに決定

図 2．QM マウスを用いた親和性成熟の解析．（A）QM マウスの B 細胞レパートリー，（B）pNP ハプテンの構造，（C）pNPCGGを免疫したQMマウスリンパ球から作製した抗pNP抗体産
生ハイブリドーマの解析結果．

的な役割を果たす細胞レベルおよび分子レベルの制御因子は明らかになっていない 3–6)．この解明のためには，膨あった 9)．活性化している B 細胞クローンを，抗 pNP 抗

大なレパートリーから抗原特異的クローンが選択される体を産生するハイブリドーマを作製して解析したとこ

過程を明確にモニターできる in vivo 解析系，および，胚ろ，VHT/λ 1 と VHT/λ 2 の両方のクローンが活性化して低中心における細胞の活性化や相互作用を精密に解析でき

親和性 IgM 抗体産生細胞に分化していたのに対して，親る in vitro培養系が必要である．

和性成熟により高親和性 IgG 抗体産生細胞に分化したの

QM マウスを用いた親和性成熟の解析

はVHT/λ 2クローンのみであった（図2C）．すなわち，pNP
に対する初期の親和性がより高い VHT/λ 2 クローンの方

Quasimonoclonal mouse（QM マウス）は，1996年にが優先的に親和性成熟に動員されることが示唆された 9)．

UCSFのCascalhoとWablらによって樹立されたマウスで高親和性抗体の重鎖可変部に導入された共通の変異あり，ハプテン 4-hydroxy-3-nitrophenylacety（NP）に（T313A）が親和性成熟に重要であることも明らかにな

特異的な抗体重鎖可変部遺伝子（VHT）が JH 遺伝子座にり，QM マウスの抗 pNP 抗体応答における VHT/λ 2 の選

ノックインされており，κ 軽鎖遺伝子がノックアウトさ

択と T313A 変異の導入をモニターすることにより，親和れているため，VHT 重鎖と λ 1 軽鎖または λ 2 軽鎖を発現

性成熟における初期親和性の寄与を詳細に解析できるこする2種類のNP特異的B細胞がそのB細胞集団のほとんとが示された．まず，親和性成熟の場である胚中心領域

どを占める（図 2A）7)．さらに，VHT が本来の抗体重鎖への VHT/λ 1 と VHT/λ 2 の両クローンの移行能を比較し遺伝子座の位置に挿入されていることから，正常に体細た．蛍光標識した各 B 細胞を pNP 化抗原により刺激し，

胞突然変異やクラススイッチが起こる 7,8)．

あらかじめ免疫して胚中心を形成させておいたマウスに

我々は，QM マウス B 細胞（VHT/λ 1, VHT/λ 2）の産生

養子移入すると，VHT/λ 2 クローンの方がより効率よくするNP特異的抗体が，NPの類縁帯であるp-nitrophenyl-

胚中心に移行していることが免疫組織化学染色により示

acetyl（pNP）に対して NP よりも 1/20の低親和性を示す

された 11)．このことは，VHT/λ 1 と VHT/λ 2 の両クローン

こと，VHT/λ 2抗体の方が VHT/λ 1抗体よりも pNP に対しの比較では初期親和性のより高いクローンの方が胚中心て 50 倍ほど親和性が高くかつ特異性にも違いがあるこへの移行能が高いことが示唆している．次に，胚中心内とを見いだした（図 2B）9,10)．そこで，特異性が明確でにおける選択の動態を解明するために，胚中心 B 細胞の親和性の異なる 2 種類の B 細胞クローンの競合をモニ抗体遺伝子を単一細胞レベルで PCR により解析する技

ターすることによって，親和性成熟を含むさまざまな B術を開発した 12)．胚中心 B 細胞は特有の細胞表面抗原を細胞の選択機構を解析できると考えた．pNPを結合した発現するので，それを指標に胚中心 B 細胞をセルソー

ニワトリ γ グロブリン（pNP-CGG）を QM マウスに免疫ターで単一細胞ごとに単離し，各細胞の抗体遺伝子をすると，血清中の抗 pNP IgG 抗体の抗体価と親和性が経PCR によって解析することにより，免疫後の胚中心内で時的に上昇し，pNP に対する親和性成熟が誘導可能でのVHT/λ 1とVHT/λ 2の両クローンの存在比および変異導2009年 第3号

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入を経時的に観察した．その結果，胚中心内での VHT/
λ 2の優先的選択，変異の蓄積，高親和性型変異の発生が段階的に起こっており，胚中心内での選択においても B
細胞の初期親和性の重要性が示された 12)．QM マウス以外の抗体遺伝子導入マウスを用いた系においても，胚中心への動員や高親和性抗体産生形質細胞への分化における選択過程で，抗原に対する初期の親和性が重要である
ことを示唆する知見が蓄積されてきている 13–15)．これら
抗体遺伝子導入マウスを用いた今後の研究により，抗原に感作された特異的 B 細胞が一様に活性化して確率論的にその後の運命が決定されるのか，B 細胞クローンが有する固有の親和性がその後の運命に重要な役割を果たすのかが明らかになっていくものと期待される．
一方で，QM マウスと野生型マウスを掛け合わせて作
製した B 細胞のレパートリーを限定したマウスを用いた解析系によって，1996 年に疋田，大森らによって初めて発見された末梢 B細胞における V(D)J 組換えが 16)，親和
性成熟に寄与していること見いだし，体細胞突然変異以外の抗体遺伝子改変の親和性成熟への関与という新しい発見につながった 17)．また，B 細胞の分化過程において，
B 細胞の自己抗原に対する反応性によって，B1細胞という通常の B 細胞とは異なる機能を担当する B 細胞亜集団へ振り分けられることが報告されている 18)．QM マウス

図3．FDC 用細胞株を用いたin vitro 培養系による活性化B細胞機能の支持．
（A）pFL は活性化 B細胞とクラスターを形成する．
多数ある小さな細胞は B 細胞で，その背景にある樹状突起のある大型の細胞が pFL である．
（B, C）NP特異的 B細胞，CGG 特
異的ヘルパー T細胞，pFLの共培養系に，抗原として NP-CGGを添加して培養すると，pFL および抗原に依存的に胚中心 B 細胞（GL-7+Fas+）の表現型を示すB細胞が増加し（B），抗体産生およびクラススイッチが亢進した（C）．

においても，抗原に対する反応性の異なる 2 つの B 細胞
クローンが脾臓において異なる B 細胞亜集団に振り分けすることが困難であること，FDCの表現型を有するマウられることを見いだしており，QMマウスがB細胞亜集団

ス由来細胞株が樹立されていないことから，親和性成熟の分化機構の解析に利用できることが示された 10)．以上

における FDC の役割について決定的な証拠は得られてのように，QM マウスの利用は，特定の特異性を示す B

いない．我々は，FDC を単離して株化するためにさまざ細胞クローンの活性化や分化の過程での選択機構を解析

まな培養法を検討し，コラーゲンゲルにリンパ節断片をする上で非常に有用であると考えられる．

封入する 3 次元培養法を導入することによって，マウス

In vitro培養系による親和性成熟過程の再構築

由来の FDC 様の表現型を示す細胞株を樹立することに初めて成功した 20)．primary FDC like line（pFL）と名

親和性成熟が起こる胚中心には，抗原特異的な B 細胞

付けたこの細胞株は，FDC特有の細胞表面マーカーを発の他にヘルパー T 細胞および濾胞樹状細胞（follicular現し，抗原を細胞表面に保持可能であり，B 細胞とクラ

dendritic cell, FDC）などの B 細胞以外の細胞も少数存在

スターを形成する樹状細胞である（図 3A）．さらに，こし，親和性成熟に関与する 5)．特に，FDC は，抗原を免の細胞株から長期培養可能な細胞株 FL-Y を樹立した．

疫複合体として細胞上に長期間保持する能力を有し，胚pFL と抗原特異的 B 細胞および T 細胞からなる in vitro 細中心の形成に重要な役割を果たすだけでなく，胚中心内胞培養系を構築し，pFL の機能を評価したところ，活性において体細胞突然変異により高親和性を獲得した抗原

化 B 細胞，特に胚中心 B 細胞の生存を維持すること（図特異的 B 細胞の選択に関与すると考えられている 6)．し3B），抗体産生とクラススイッチを促進することが明らか

かし，FDC 上の免疫複合体あるいは FDCそのものを欠損になった（図 3C）．すなわち，FDC の機能として想定ささせるいくつかの実験系においても親和性成熟は起こる

れる胚中心における活性化 B 細胞の生存および分化の支ことから，FDC の親和性成熟への関与について否定的な持能力の一部を，pFL を用いた in vitro 培養系により再現

説明もなされている 19)．FDC の機能を解明するには，inできることが示された．この FDC 様細胞株を用いた invitro 培養系を用いた実験系が有効であるが，FDC は組織

vitro 培養系は，高親和性抗体産生細胞の選択機構や胚中中に少数しか存在しないために機能を保持した形で単離

心 B 細胞で選択的に起こる体細胞突然変異の誘導機構を

118

生物工学 第87巻

解明するのに有効な解析系となることが期待される．胚中心内での諸反応を in vitro 培養系で再現するために，B
細胞，T 細胞および FDC の 3 者で必要十分なのか，他の細胞種や因子の関与があるかどうかを解明することは今後の課題の一つであろう．
変異能力を有した培養細胞を用いた
In vitro抗体産生システムの開発
Köhler と Milstein によって報告されたモノクローナル
抗体作製法は，生体内での親和性成熟により高親和性抗体を取得するための有効な方法である 21)．しかし，反復免疫により得られた高親和性抗体産生 B 細胞をミエロー
マ細胞と融合し，目的のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマクローンを得るには，時間と多大な労力を必要とする．また，抗体医薬の標的となるヒトのタン
パク質の機能的に重要な抗原エピトープの多くは，種間での相同性が高く，免疫寛容のためにマウスを免疫しても高特異性抗体を得ることが困難な場合も多い．そこで，免疫寛容の制限を回避するために，ファージディスプ
レー法に代表されるin vitro抗体作製システムが開発されているが 22,23)，この方法による抗体取得の成否は，用い

図 4．
（A）DT40-SW を用いた抗体作製システムの概要．
（B）
AID の発現制御ベクターの構造．
（C）Cre/loxP システムによる
AID 発現の制御とモニター．

たファージライブラリーの質に依存している．また，このシステムには変異機能が備わっていないため，得られ

える；4）細胞増殖が非常に早いので細胞の育種やクローた抗体の機能を改良するためには，選択したクローンへ

ン選択が迅速に行える．特に，3）は他の細胞株にはなの人工的変異導入，変異遺伝子の発現と機能評価といっい決定的に重要な特長である．DT40 細胞は抗体遺伝子た一連の操作が必要である．

への変異導入に必須のタンパクである AID（activation-

我々は，これらの技術的課題を克服するものとして，

induced cytidine deaminase）を発現しており，AID依存

培養中に抗体遺伝子を自発的に変異・多様化し，十分な的に遺伝子変換や点突然変異によって培養中に抗体 V 遺規模の抗体レパートリーを内包するような培養 B 細胞集伝子を多様化し続ける 27–29)．遺伝子変換は，ニワトリ，

団を抗体ライブラリーとして利用することを発案した

ウサギ，ウシなどに見られる抗体多様化機構であり，V（図 4A）．このような培養 B 細胞集団は，増殖過程で免疫遺伝子の上流に存在する偽 V 遺伝子群の一部の配列が V

寛容機構によるクローン除去を受けにくいため，広範な遺伝子上のコピーされることによって起こる．長期培養

抗体ライブラリーを形成することが期待できる．あらかすることにより作製した DT40 ライブラリーから目的抗じめ用意された十分な規模の培養 B 細胞集団から目的抗体を産生するクローンを単離できたとしても，その変異体を産生する細胞を選択できれば，迅速かつ効率的な in機能が維持されていると，更なる変異導入によってそのvitro 抗体作製システムとなる．抗体遺伝子の高頻度変異

抗原特異性は失われる危険性がある．目的クローンを単機能を保持した培養可能な B 細胞株としては，ヒト，マ

離したら速やかに変異機能を OFF にして抗体遺伝子をウス，ニワトリ由来の B 細胞株がいくつか知られている安定化するために，我々は変異導入に必須の AID の発現が，ニワトリ B 細胞株 DT40 は，次のような優れた性質

を可逆的に ON/OFF 制御できる仕組みを導入した細胞を持っている 24–26)．1）培養中に抗体遺伝子に変異を高株 DT40-SW を樹立し，抗体作製システムに利用した

頻度に導入し，多様な抗体ライブラリーを形成できる；（図 4）30,31)．DT40-SW では，2 つある AID 遺伝子の一方

2）IgM 抗体を細胞表面に膜結合型として発現するととを標的相同組換えによりノックアウトしておき，もう一もに，一部を培養上清中に分泌している；3）外来遺伝子

方の AID遺伝子は，互いに逆向きに配置した loxP 配列でを導入すると，動物細胞としては例外的に高い頻度で相AID cDNA を挟んだコンストラクトで置き換えた（図同組換えされるので，遺伝子のノックアウトや特定部位

4B）．これに Cre リコンビナーゼが働くと loxP 間の組換への外来遺伝子の挿入による細胞機能の改変が容易に行え反応により AID 遺伝子の向きが反転し，AID遺伝子が2009年 第3号

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最終的に得られたクローンはAIDをOFFにすることにより変異を停止させ，その形質を安定化させることができた（図 5C）．一次スクリーニングで十分な親和性の抗体が得られなくても，さらに培養を続けて変異導入と選択を繰り返すことにより，親和性成熟の原理に基づいて，高親和性抗体が得られることも実証している．この抗体作製システムにより，各種タンパク質，低分子量のハプ
テンやペプチド，DNA などの免疫原性の低い非タンパク性抗原といった種々の抗原に対する抗体の取得が可能であることを確認している．ニワトリにとっての自己抗原である卵白アルブミンやリゾチーム，ssDNA などに対する抗体も得られているので，このシステムでは免疫寛容も回避できていると考えられる．
図5．DT40-SW 抗体ライブラリーからの抗原特異的クローンの単離．
（A）ELISA と（B）FACSによりNP 特異的クローンの特異性を評価した．
（C）変異機能が ON の状態で 2ヶ月維持すると抗原特異性を失った集団が出現するが，OFF にすることによって特異性を安定に維持できた．

In vitro抗体産生システムの高機能化
上述のように DT40-SW 細胞は，in vitro 抗体作製システムに利用できる有用な細胞株であることが示された．
さらに，DT40 細胞の遺伝子操作による機能改変の容易

プロモーターと同方向の場合は転写されAIDが発現するさを利用して，このシステムをより高機能化することをが，逆方向の場合は転写が OFF となって発現が停止する試みた．

（図 4C）．AID-ON の細胞は，IRES を挟んで AID 遺伝子

抗体産生能の増強

DT40 細胞の抗体産生量はマウと同方向に組み込んだ GFP を発現する．一方，AID-OFF

スハイブリドーマに比べて1/2～1/10程度であるので，取の細胞では，ピューロマイシン耐性遺伝子が発現するの得した抗原特異的抗体産生細胞の抗体産生量を簡便かつで，両状態の細胞を識別することができる．Cre は変異

安定的に増強するために，B細胞の分化を制御している転型エストロゲンレセプターとの融合タンパク質（Mer-

写因子 Paired box gene 5（Pax5）の遺伝子発現を部分的Cre-Mer）として DT40 細胞に発現させてあるので，エに抑制することを試みた．B 細胞の発生に必須な転写因

ストロゲン誘導体（4- ヒドロキシタモキシフェン，4-

子 Pax5 は，未感作 B細胞では，抗体産生細胞への分化にOHT）を培地に添加すると Mer-Cre-Mer は核に移行し重要な転写因子である X-box binding protein 1（XBP-1）て loxP に作用する 32)．DT40-SW 細胞を AID-ON の状態

やB-lymphocytes-induced maturation protein 1（Blimp1）

で 2ヶ月培養後，ライブラリーの半数のクローンに変異を抑制するが，抗体産生細胞では Pax5 の発現が低下してが導入されており，1 年後ではすべてのクローンに変異その抑制が解除される 34)．Pax5 をノックアウトしたが複数個蓄積していた．また，遺伝子変換が起こる部位，

DT40ではXBP-1やBlimp1の発現が増大して抗体産生量

使用する偽 V 遺伝子に偏りが見られなかったことからは増大するが，細胞増殖が非常に悪いことが報告されてDT40-SW 抗体ライブラリーは十分多様なライブラリー

おり，複数ある Pax5対立遺伝子のノックアウトを簡便にを形成していると考えられる 33)．まず，モデル抗原とし行うことはできない 35)．そこで，Pax5 の対立遺伝子の一て NP ハプテンに対する抗体を産生しているクローンをつを破壊することによってその発現量を部分的に抑制す

ライブラリーから単離した 33)．単離方法としては，抗原ることを検討したところ，細胞増殖に影響を与えることを結合させた磁気マイクロビーズとライブラリーの細胞なく簡便な操作で抗体産生量を 2 ～ 3 倍程度高めること（約 108 個）を反応させ，磁気ビーズと結合した細胞を磁が可能であった 36)．

石により分離する方法，蛍光標識した抗原を結合した細変異頻度の向上

迅速にライブラリーを作製した

胞をセルソーターによって単離する方法を用いた．単離り，得られたクローンを親和性成熟させたりするには，したクローンを培養し，培養上清に分泌された抗体を変異頻度が高い方が効率的である．AID は核内 DNA鎖上ELISA で定量し，細胞表面に発現された抗体を FACS でのシトシンをウラシルに変換することによって変異導入

評価して取得したクローンの NP 特異性を確認した（図を開始すると考えられているが 37)，その AIDの機能発現

5A，5B）．この一連の操作は約 2 週間で完了でき，得らの制御には C 末端に存在する核からの輸出シグナル配列

れた抗 NP 抗体の親和性は，KD = 100 nM 程度であった．

が関与することが報告されている 38)．我々は，AIDの核120

生物工学 第87巻

内での活性の増大を期待して，この部分を欠失させた変である．親和性成熟は，体細胞突然変異という，厳密な異 AID 遺伝子を DT40-SW の AID 遺伝子と置き換えた細制御がなければ発ガンのリスクになる諸刃の剣を用いる

胞株 DT40-SWΔC を樹立した．変異機能を ON にして軽ことによって，抗体の親和性を改良する機構であり，そ鎖への変異導入効率を評価したところ，DT40-SW と比こには免疫システムと病原体との闘争の歴史が刻み込ま

べて 3 倍程度増加した 39)．また，DT40-SW と同様に V 遺れていると考えられる．本稿で紹介した親和性成熟の解

伝子上に偏りなく変異が導入されており，DT40-SWΔ C

析系は，この学問的に興味の尽きない機構の一端を解明において抗体遺伝子の多様化の能力が強化されたと考えする有用なツールとなると期待される．また，in vitro培られる．別の方法としては抗体遺伝子座特異的な転写因

養系での親和性成熟の再構築が実現されれば，液性免疫子E2Aの大量発現や抗体遺伝子の組換えを誘導するトリ応答を制御することによる自己免疫疾患や感染症の治療

コスタチン A の添加が変異頻度を増大させるとの報告が法の開発や，さらに本稿で紹介した抗体作製システムへあるが 40–42)，導入される変異に偏りが生じる場合があるの応用につながると考えられる．

ことが分かっている 43)．抗体の作製システムにおいては

DT40-SW を用いた抗体作製ステムは，培養細胞を用

変異頻度の向上のみならず生み出される抗体ライブラ

いた in vitro系であるために免疫寛容の制限を受けず，従リーの多様性が重要であることから，今回，我々が試み来の方法では取得が困難であった標的に対する抗体の取た変異頻度の向上方法は，抗体の多様化の促進方法とし得に利用可能であると考えられる．DT40 の高い増殖性て有効であると考えられる．

により目的クローンの単離と評価を簡便かつ効率的に行遺伝子変換型から点突然変異型への転換

ニワトリえるという特長を生かして，現在いくつかの標的を設定

では，B 細胞の発生段階において V(D)J 遺伝子再編成やして抗体医薬の候補を探索しつつある．さらに利用価値

遺伝子変換のような組換え反応により多様な抗体遺伝子の高い抗体作製システムの構築に向けて，ニワトリ IgMが生成されて初期 B 細胞レパートリーが形成されるが，抗体を産生する DT40 をヒト IgG 産生型へ改変すること

親和性成熟の過程では点突然変異が主に起こるようになが，今後の課題の 1つであろう．これとは別に，我々は，る 44)．DT40 では遺伝子変換が優位で点突然変異の頻度

DT40-SW 細胞の抗体 L 鎖遺伝子座に非抗体タンパク質は低いが，生体内でみられる抗体の多様化機構の転換ををコードする外来遺伝子を導入すると，それが AIDの標

in vitro で実現することは，一次スクリーニングで単離し的となって変異を受けることを報告している 50)．異種動たクローンの抗体をさらに親和性成熟させる場合に有利物由来の抗体の改良や，種々の非抗体タンパク分子の遺である．遺伝子変換は相同組換機構に依存していること

伝子レベルでの機能改変を行うための道具として利用すから，相同組換えに関与する Rad51 パラログの一つをるために，DT40-SW 細胞を機能拡張することも興味深

ノックアウトすると点突然変異優位になる 45)．Rad51パ

い研究課題である．

ラログノックアウト株は点突然変異型の細胞株として有用であるが 46)，この細胞は増殖速度が低く 47)，点突然変
異のみでは抗体の多様化には不利であることから，初期
ライブラリー構築において効率が落ちることが想定される．我々は Rad51 パラログの一つである XRCC3 遺伝子の一方の対立遺伝子を破壊し，発現を低下させるだけで，点突然変異優位となることを見いだした 48)．1 次スク
リーニングで得られた抗NP抗体産生クローンをXRCC3
ヘテロノックアウト体にして親和性成熟を試みたところ，NPに対して結合性の高いクローンを取得可能であった 49)．この方法は簡便かつ細胞増殖に影響を与えないことから，必要に応じて変異様式を転換する方法として有効である．これらの DT40-SW の機能改良を組み合わせ
ることにより，この抗体作製システムによる抗体取得をより効率化できると考えられる．
おわりに

本研究は岡山大学工学部生物機能工学科細胞機能工学研究室で行った仕事です．岡山大学へ赴任以来，門外漢だった私を忍耐強くかつ温かくご指導いただきました大森 齊 教授，免疫学を一から手ほどきくださいました疋田正喜 現京都大学准教
授に深く感謝いたします．本研究の成果は，曲 正樹 助教，西川由美子 博士，藤堂景史 博士，池田美香 研究員をはじめ，多くの大学院生および学部学生の力によるものです．ここにあらためて感謝の意を表します．共同研究でお世話になりました
Michigan大学 Marilia Cascalho 准教授，岡山県立大学 森 將晏 教授，理化学研究所RCAI 黒崎知博 教授，北村 浩 博士，
Max Plank研究所 Michael Reth 教授に感謝いたします．本賞の受賞に際しまして，推薦いただきました宇都宮大学農学部の前田 勇 准教授に御礼申し上げます．研究者の道へ導いていただ
きました田中渥夫 京都大学名誉教授（現中部大学教授），植田充美 京都大学教授，跡見晴幸 京都大学准教授に感謝申し上げます．本研究の一部は，科学研究費補助金，NEDO産業技術研
究助成，JST シーズ発掘試験などの支援を受けて実施されました．

抗体は，有顎類以降の生物種に見られる生態防御因子
2009年 第3号

121

文

献

1) Burnet, F. M.: Aust. J. Sci., 20, 67–69 (1957).
2) Rajewsky, K.: Nature, 381, 751–758 (1996).
3) MacLennan, I. C., Toellner, K. M., Cunningham, A. F.,
Serre, K., Sze, D. M., Zuniga, E., Cook, M. C., andVinuesa, C. G.: Immunol. Rev., 194, 8–18 (2003).
4) Calame, K. L., Lin, K. I., and Tunyaplin, C.: Annu. Rev.
Immunol., 21, 205–230 (2003).
5) MacLennan, I. C.: Annu. Rev. Immunol., 12, 117–139(1994).
6) Tew, J. G., Wu, J., Fakher, M., Szakal, A. K., and Qin, D.:
Trends Immunol., 22, 361–367 (2001).
7) Cascalho, M., Ma, A., Lee, S., Masat, L., and Wabl, M.:
Science, 272, 1649–1652. (1996).
8) Cascalho, M., Wong, J., Steinberg, C., and Wabl, M.:
Science, 279, 1207–1210 (1998).
9) Kanayama, N., Kimoto, T., Todo, K., Nishikawa, Y.,
Hikida, M., Magari, M., Cascalho, M., and Ohmori, H.:
J. Immunol., 169, 6865–6874 (2002).
10) Kanayama, N., Cascalho, M., and Ohmori, H.: J.
Immunol., 174, 1438–1445 (2005).
11) Kouyama, E., Nishikawa, Y., Okazawa, T., Magari, M.,
Ohmori, H., and Kanayama, N.: Immunol. Lett., 109, 28–
35 (2007).
12) Okazawa, T., Magari, M., Kimoto, T., Kouyama, E.,
Ohmori, H., and Kanayama, N.: Immunol. Lett., 117, 96–
105 (2008).
13) Shih, T. A., Meffre, E., Roederer, M., and Nussenzweig,
M. C.: Nat. Immunol., 3, 570–575 (2002).
14) Paus, D., Phan, T. G., Chan, T. D., Gardam, S., Basten,A., and Brink, R.: J. Exp. Med., 203, 1081–1091 (2006).
15) Phan, T. G., Paus, D., Chan, T. D., Turner, M. L., Nutt,
S. L., Basten, A., and Brink, R.: J. Exp. Med., 203, 2419–
2424 (2006).
16) Hikida, M., Mori, M., Takai, T., Tomochika, K.,
Hamatani, K., and Ohmori, H.: Science, 274, 2092–2094(1996).
17) Magari, M., Sawatari, T., Kawano, Y., Cascalho, M.,
Wabl, M., Kanayama, N., Hikida, M., and Ohmori, H.:
Eur. J. Immunol., 32, 957–966 (2002).
18) Hayakawa, K., Asano, M., Shinton, S. A., Gui, M.,
Allman, D., Stewart, C. L., Silver, J., and Hardy, R. R.:
Science, 285, 113–116 (1999).
19) Kosco-Vilbois, M. H.: Nat. Rev. Immunol., 3, 764–769(2003).
20) Nishikawa, Y., Hikida, M., Magari, M., Kanayama, N.,
Mori, M., Kitamura, H., Kurosaki, T., and Ohmori, H.:
J. Immunol., 177, 5204–5214 (2006).
21) Kohler, G. and Milstein, C.: Nature, 256, 495–497 (1975).
22) Smith, G. P.: Science, 228, 1315–1317 (1985).
23) McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., and Chiswell,
D. J.: Nature, 348, 552–554 (1990).
24) Buerstedde, J. M., Reynaud, C. A., Humphries, E. H.,
Olson, W., Ewert, D. L., and Weill, J. C.: EMBO J., 9,
921–927 (1990).

12225) Kim, S., Humphries, E. H., Tjoelker, L., Carlson, L., andThompson, C. B.: Mol. Cell. Biol., 10, 3224–3231 (1990).
26) Buerstedde, J. M. and Takeda, S.: Cell, 67, 179–188(1991).
27) Muramatsu, M., Kinoshita, K., Fagarasan, S., Yamada,S., Shinkai, Y., and Honjo, T.: Cell, 102, 553–563 (2000).
28) Arakawa, H., Hauschild, J., and Buerstedde, J. M.:
Science, 295, 1301–1306 (2002).
29) Harris, R. S., Sale, J. E., Petersen-Mahrt, S. K., andNeuberger, M. S.: Curr. Biol., 12, 435–438 (2002).
30) 特開 2006-1097111 (2006)31) Kanayama, N., Todo, K., Reth, M., and Ohmori, H.:
Biochem. Biophys. Res. Commun., 327, 70–75 (2005).
32) Zhang, Y., Riesterer, C., Ayrall, A. M., Sablitzky, F.,
Littlewood, T. D., and Reth, M.: Nucleic Acids Res., 24,
543–548 (1996).
33) Todo, K., Miyake, K., Magari, M., Kanayama, N., andOhmori, H.: J. Biosci. Bioeng., 102, 478–481 (2006).
34) Shapiro-Shelef, M. and Calame, K.: Nat. Rev. Immunol.,5, 230–242 (2005).
35) Nera, K., Kohonen, P., Narvi, E., Peippo, A., Mustonen,
L., Terho, P., Koskela, K., Buerstedde, J. M., and Lassila,
O.: Immunity, 24, 283–293 (2006).
36) Magari, M., Aya, T., Ikeda, M., Todo, K., Kanayama, N.,
and Ohmori, H.: J. Biosci. Bioeng., 107, 206–209 (2009).
37) Di Noia, J. M. and Neuberger, M. S.: Annu. Rev. Biochem.,
76, 1–22 (2007).
38) Ito, S., Nagaoka, H., Shinkura, R., Begum, N.,
Muramatsu, M., Nakata, M., and Honjo, T.: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 101, 1975–1980 (2004).
39) 金広優一，曲 正樹，藤堂景史，金山直樹，大森 齊：
日本生物工学会大会講演要旨集，p.109 (2008).
40) Seo, H., Masuoka, M., Murofushi, H., Takeda, S.,
Shibata, T., and Ohta, K.: Nat. Biotechnol., 23, 731–735(2005).
41) Conlon, T. M. and Meyer, K. B.: Eur. J. Immunol., 36,
139–148 (2006).
42) Schoetz, U., Cervelli, M., Wang, Y. D., Fiedler, P., andBuerstedde, J. M.: J. Immunol., 177, 395–400 (2006).
43) Lin, W., Hashimoto, S., Seo, H., Shibata, T., and Ohta,
K.: Genes Cells, 13, 255–268 (2008).
44) Arakawa, H. and Buerstedde, J. M.: Dev. Dyn., 229, 458–
464 (2004).
45) Sale, J. E., Calandrini, D. M., Takata, M., Takeda, S., andNeuberger, M. S.: Nature, 412, 921–926 (2001).
46) Cumbers, S. J., Williams, G. T., Davies, S. L., Grenfell, R.
L., Takeda, S., Batista, F. D., Sale, J. E., and Neuberger,
M. S.: Nat. Biotechnol., 20, 1129–1134 (2002).
47) Takata, M., Sasaki, M. S., Tachiiri, S., Fukushima, T.,
Sonoda, E., Schild, D., Thompson, L. H., and Takeda,
S.: Mol. Cell. Biol., 21, 2858–2866 (2001).
48) 特願 2007-231741 (2007)49) 梶田真道，藤堂景史，曲 正樹，金山直樹，大森 齊：
日本生物工学会大会講演要旨集，p.109 (2008).
50) Kanayama, N., Todo, K., Takahashi, S., Magari, M., andOhmori, H.: Nucleic Acids Res., 34, e10 (2006).

生物工学 第87巻