〔生物工学会誌第 85 巻

総合論文

第3号

126–131．2007〕

平成18 年度 技術賞 受賞

鮭皮コラーゲンのバイオマテリアル化技術の開発と商品化
井原 慶児 1*・永井 展裕 2
柚木 俊二 2・森 一生 1
Development and Commercialization of Biomaterials
Using Salmon Collagen
Keiji Ihara1*, Nobuhiro Nagai2, Shunji Yunoki2, and Kazuo Mori1 (Ihara & Company Ltd., 3-26323 Zenibako, Otaru, Hokkaido 047-0261 1 and Creative Research Initiative “Sousei” (CRIS), Hokkaido
University, N21-W10, Kita-ku, Sapporo, Hokkaido 001-0021 2) Seibutsu-kogaku 85: 126–131, 2007.

1. コラーゲンとの出会い
まずは弊社が鮭皮コラーゲン研究を開始した経緯につが，当時としては珍しく研究室をもっていた．昭和 50 年
代からバクテリアによる排水浄化（過酸化水素の除去）を研究していたためである．その研究室をベースにコいて述べたい．平成 8 年に社団法人北海道食品産業協議

ラーゲンの研究を始めて 11 年になり，すでに化粧品や食会（道食産協）の常務理事から，海洋性原料からの人工品用のコラーゲンを販売している．

皮膚の開発について紹介された．鮭皮から抽出したコ

本稿では，栄誉ある日本生物工学会技術賞をいただけ

ラーゲンおよびイカの中骨を原料としたキチンからラミるテーマとなった鮭皮コラーゲンのバイオマテリアル研

ネートシートを作製し，それを人工皮膚に応用するとい究について紹介する．弊社ではコラーゲンの利用用途とう．研究開発を進めていた企業が研究室を解体することして医療材料を化粧品・食品用の次のフェイズと位置づになり，道食産協が継続可能な企業を探していた．北海け，大学などと共同で研究を推進している．しかし，鮭

道の開発補助金を利用するため，請負企業は北海道内に皮コラーゲンによって牛・豚コラーゲンを容易に代替で限定されていた．当時コラーゲンという言葉も知らなきるとは考えていない．生体内安定性・安全性などクリかった筆者は「コラーゲンは一般に何から作られるのアしなければならない問題は多々ある．その中で「生体か？」と質問したところ，答えは「牛」であった．それ

内安定性の制御」を鮭皮コラーゲンの医療応用におけるを聞いて筆者は 1990 年初めのカナダ駐在中に見た狂牛最初の課題と認識し，研究を進めてきた．その結果生ま病のニュースを思い出した．米国や日本ではほとんど放れた技術が本受賞研究である．

送されていなかったが，英連邦のカナダはイギリスの2．背ニュースが盛んに流れていた．いつか日本でも狂牛病が景発生してコラーゲンが作れなくなり，代替品が必要になコラーゲンは生体内の細胞外マトリックスとして細胞るに違いないと確信した筆者は上記研究の推進を決断しの増殖・分化の調節を行っており，その高い生体親和性た．

から再生医療・組織工学用バイオマテリアル，主に細胞

井原水産は数の子を主体にした水産加工会社であるの足場材料（スキャフォールド；scaffold）として利用さ* 著者紹介（代表） 1 井原水産株式会社（代表取締役社長） E-mail: ihara@yamani.com
2 北海道大学* 写真 上左より井原，永井；下左より柚木，森．

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れている．コラーゲンは牛，豚，鳥，魚などの真皮や骨トリックスとして機能しているコラーゲンは生体適合性を原料にして得ることができる．中でも魚は人獣共通感や生分解性が高いためにバイオマテリアルとして好適な染症の例がほとんどないため，安全なコラーゲン原料と材料である．

して使用可能と考えた．
3．コラーゲンとは

4．鮭皮コラーゲンの利用と問題点
我々は安全・安心なバイオマテリアルの開発と水産資

コラーゲン（コラーゲンには 20 種類以上の型が存在す源の有効利用を目的に，水産加工後に廃棄処分されているが，本稿のコラーゲンという呼称はすべて I型を示す）

る天然鮭（シロサケ，chum salmon）の皮から抽出したは 3 本のポリペプチド鎖（α鎖）が螺旋を巻いた特徴的なコラーゲンのバイオマテリアル化に取り組んできた．し構造（コラーゲンヘリックス）を有している（図 1A）1)．

かし，水生動物由来のコラーゲンは変性温度が低い（変コラーゲン分子の両端にはヘリックス構造を持たないテ性温度：5 ～ 30°C）ために，ヒトの生体内温度では変性・ロペプチドを持つ．テロペプチドは抗原性を示すためバ溶解する（図 2）．そのためバイオマテリアルへの応用はイオマテリアルへ応用する際にはペプシン処理によって困難とされてきた．変性とはコラーゲンを加熱したときテロペプチドを除去した抗原性の低いアテロコラーゲンに 3 重螺旋（コラーゲンヘリックス）構造がほどけてラが利用される．

ンダムコイル状のゼラチンへと変化する現象のことを言

生体内のコラーゲン分子は自己組織化して線維を形成う（図 2 右下）．変性したコラーゲンは水に溶けやすく強している．このコラーゲン線維はコラーゲン分子が 4 分

度が弱いため，生体内のタンパク質分解酵素によって速の 1 ずつ（約 67 nm）ずれながら規則的に会合した構造やかに分解・吸収される．そのため，鮭皮コラーゲンをを有している（図 1B）2)．生体内のコラーゲン線維は 3バイオマテリアルとして利用するためにはコラーゲンの次元的なネットワーク構造を形成しており，細胞はこの耐熱性を改善しなければならなかった．

コラーゲンマトリックスに接着して増殖や分化機能を維

そこで我々はコラーゲンの線維化と化学架橋を利用し持している（図 1C）．またこのコラーゲンマトリックスた耐熱性改善の検討を行った．生体から抽出したコラーは生体組織に耐熱性と力学的強度を与えている．

ゲン溶液は，生体に類似した温度や pH に保つと自己組コラーゲンは古くから皮革，ゼラチン，食品などに利織化して線維ゲルを形成する性質を持つ．このコラーゲ用されてきた．近年は人工臓器や人工皮膚などのバイオンの線維化はコラーゲンマテリアルの耐熱性向上に寄与

マテリアルとしての利用が多くなった 3)．バイオマテリするだけでなく，生体と類似した線維構造を形成するたアルとは生体に触れて使用される材料を示し，生体に毒めバイオマテリアルとして利用したときには細胞親和性性を示さないことが必須条件である．もともと細胞外マの点で都合が良い．本研究はコラーゲンの線維化途上に化学架橋をコラーゲン分子間に導入することによって，鮭皮コラーゲン線維ゲルの耐熱性改善を試みた．
5．耐熱性鮭皮コラーゲン線維ゲルの開発
コラーゲンは生体内で線維を形成して不溶化している

図1．コラーゲンおよびコラーゲン線維の構造

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図2．コラーゲン変性温度と生息環境温度との関係

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ため一度線維構造を壊してコラーゲン分子を分散させな時に引き起こし，変性温度を 28°C から 55°C まで高めたければ可溶化しない．一般的にコラーゲンは原料（真皮コラーゲンナノ線維ゲルの作製に成功した 5)．架橋剤にや骨）を酸性条件で可溶化させて分離・抽出される．実EDC を選んだ理由は他の架橋剤に比べて生体親和性が際に鮭皮コラーゲンは鮭皮を 4°C で 0.5 M 酢酸に膨潤さ高いためである．EDC はアミノ基とカルボキシル基を脱せて酸性コラーゲン溶液（pH 3）として分離・抽出され水縮合してコラーゲン分子間にアミド結合を形成させるている 4)．分離中の精製過程においてペプシンによるア（図 4）．このとき EDC自体は架橋結合中に残らないため，テロ化が行われ，コラーゲンの抗原性は低下している．

コラーゲンが生体内で分解したときに架橋剤が遊離してこの抽出した酸性鮭皮アテロコラーゲン水溶液はリン酸毒性を示すことがない．一方，グルタルアルデヒド，ポナトリウムバッファーを加えて中性条件の生体内に類似

リエポキシ化合物の場合は架橋結合中に架橋剤が残るた

した温度におくと，コラーゲン分子が自己組織化してナめ，分解後に架橋剤が遊離して細胞毒性を示すことがあノ線維構造を回復する（図 3）．線維化したコラーゲンゲる．図 5 はさまざまな EDC 濃度で作製した SAC 線維ゲル

ルは，コラーゲン分子の規則正しいパッキング効果にの写真である．結果として EDC 濃度が 60 mM のときによって変性温度は約 10 度上昇する．

変性温度が最大となった（図 5D）．一方でEDC 濃度が 70

我々はこの鮭皮アテロコラーゲン（以下 SAC）が低温（15°C 以下）で活発に線維化することに着目した．架橋剤である水溶性カルボジイミド；1-ethyl-3-(3-dimethyl-mM 以上では線維化が阻害されて変性温度は低下した（図 5E–G）．
これは図 6 に示したように今回の反応は架橋反応と線aminopropyl)-carbodiimide, hydrochloride（以下，EDC）維化の競合反応であったことを示している．すなわち，の存在下，4°C でコラーゲン線維を再形成させた結果，EDC 濃度が高い場合（図 6C）は架橋反応が優先して線線 維 化（fibril formation）と 架 橋（cross-linking）を同維化が阻害された一方で，EDC濃度が低い場合（図 6A）

図3．鮭皮コラーゲンの線維化と線維ゲルの写真

図5．架橋したSAC線維ゲルの写真（架橋剤濃度と変性温度の関係）

図4．EDCの反応機構

図 6．架橋剤濃度と変性温度の関係および架橋コラーゲン線維の推定構造図

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は線維化が優先して線維内部の架橋が不十分であったと考えられる．最適条件（図 6B）では架橋が線維間だけでなくコラーゲン分子間にも導入された均一な架橋構造であったと考えられる．
SAC 線維ゲルを走査型電子顕微鏡（SEM）で観察した
結果，約 70 nm のナノ線維からなる線維構造を有していた（図 7）．豚コラーゲンと比較して線維が細く，線維の太さが均一であることを特徴としている．さらに線維 1本の構造を原子間力顕微鏡（AFM）で観察した結果，線維には規則的な横紋構造を有していることがわかった（図 7D）．横紋構造は生体のコラーゲン線維に見られるコラーゲンに特徴的な構造である（図 1B）．この横紋構造の周期は生体のコラーゲン線維と同じであった．これは生体内と同様の正常な線維化が起こっていたことを示し

図7．SAC 線維ゲルの外観写真（A），走査型電子顕微鏡（SEM）
写真（B，C），および原子間力顕微鏡（AFM）写真（D）ている．すなわち生体擬似線維を有するコラーゲンバイオマテリアルとして利用することが可能となった．
一方で今回のSAC線維ゲルの作製は思わぬ結果を生んだ．それは伸縮性コラーゲンである．SAC 線維ゲルは変性温度以上（60°C）で加熱処理するとゲルが溶解することなく収縮して約 2 ～ 3 倍伸びる伸縮性コラーゲンに変化した（図 8）6)．この現象はコラーゲン線維内に架橋が均一に導入されていることを裏づけている．収縮するメカニズムは明らかではないが，SAC 線維ゲルの架橋率が

図8．加熱処理後の伸縮性コラーゲン20％前後であることを考慮すると，コラーゲン分子内には部分的に変性したランダムコイル構造を有していたと推定している（図 9B）．このランダムコイル部分がバネのような働きをして伸縮性を与えていると考えている（図 9C）．従来のコラーゲン担体は伸縮性をほとんど持っていなかった．伸縮性を求められる血管，腱，心筋などの再生医工学材料として新しい応用が期待できる．
6．バイオマテリアルへの応用

図9．伸縮性コラーゲンの推定構造

SAC線維ゲルのバイオマテリアル化として細胞培養基材への応用を検討した．体外で自己の細胞を必要なだけ増幅させることを必要とする再生医工学において細胞培表的な遺伝子も正常に発現していることを確認した 7)．

養は基本的な技術である．このとき細胞が本来持つ分化以上のようにSAC線維ゲルは従来のコラーゲンと同様機能を失わずに維持していることが重要である．本研究に細胞培養基材として利用可能であることがわかった．

ではヒト正常細胞をSAC線維ゲル上に播種して静置培養

SAC線維ゲルの増殖促進メカニズムについてはまだ明らを行い，細胞増殖性と分化機能を評価した．
比較のコラーかになっていないが，鮭と豚ではコラーゲンのアミノ酸ゲンとして，市販の豚コラーゲンを線維化したゲルを用組成やコラーゲン線維構造，ゲル機械強度に差があるこいた．その結果，SAC 線維ゲル上で培養した歯根膜細胞とがわかっており，細胞はこれらの差を認識して増殖・の増殖性は豚コラーゲン線維ゲル対比約 1.5 倍高いこと分化シグナルを変化させていると考えている．

がわかった．また歯根膜細胞の分化機能であるアルカリフォスファターゼ（alkaline phosphatase；ALP）活性は

7．細胞シート化技術の開発

増殖が安定した 7 日目以降から活性が高くなり分化機能最近の新しい再生医工学として細胞シート工学（cell-を維持していることがわかった．さらに歯根膜細胞の代sheet engineering）がある．細胞シートは細胞間の結合

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を組み合わせた人工皮膚の作製にも取り組んでいる．
8．商品化
SAC 線維ゲルは平成 16 年 10 月より「FIBRIGEL」の商品名で細胞培養キットとして発売が開始された．北海
道の大学研究室や研究機関を中心としたサンプル提供によるモニタリングによりデータを蓄積し，それをもとに図10．SAC線維ゲルのコラーゲナーゼ消化によって細胞シートが形成するまでの様子

平成 17 年度以降は展示会を中心とした販促活動を開始した．これまでの蓄積データから，FIBRIGELへの癌細胞の浸潤性が高いことがわかり，癌細胞浸潤アッセイ用が維持された，人工のスキャフォールド成分を含まないのゲルとして利用可能であることがわかった．また，培シート状の細胞凝集塊を示す．細胞シート工学はこの細養が難しいとされる腱由来の細胞がFIBRIGEL上でよく胞シートを重層することによって 3 次元的に組織化され成長することもわかってきた．さらにヌードマウス皮下た人工組織を構築することを目的とする．この手法は従への埋め込み試験では分解性や炎症性は従来のコラーゲ来のスキャフォールド埋め込み型移植医療にあったスンと同等であることもわかった．

キャフォールド分解物由来の炎症反応や低い細胞密度といった問題 8) を解決できる方法として期待されている．
細胞シート化は温度応答性高分子をコーティングしたプ
ラスチック上での剥離法が有名である 9)．

9．まとめコラーゲンの線維化と化学的架橋を組み合わせることによって，変性温度が低い鮭皮コラーゲンのバイオマテ

我々はコラーゲナーゼ（collagenase）と呼ばれるコリアル化に成功した．生体が持つ性質（コラーゲンの線ラーゲンを特異的に分解する酵素を用いてSAC線維ゲル維化）を人為的に応用することによって（これはバイオを消化・分解することによって，SAC 線維ゲル上で培養インスパイア技術と呼ばれる），
鮭皮コラーゲンの耐熱性した細胞をシート状に剥離できることを見いだした 10)．

を大幅に改善するとともに，従来のコラーゲンにはなSAC線維ゲルはコラーゲナーゼによる分解速度が早くゲかった伸縮性担体の作成が可能となった．現在は再生医

ルの分解が均一に起こるため細胞シート化に適してい療への応用を目指し，人工歯根膜，人工皮膚，人工血管る．本方法で細胞がシート状に剥離するメカニズムは次の開発を進めているが，この先の展開として付加価値（高の通りである（図 10）．細胞はコラーゲンに伸展した（伸い細胞増殖性，細胞シート化，伸縮性）を持った新規コびた）状態で接着している．このとき細胞内にはストレラーゲンバイオマテリアルとして再生医工学分野へ利用スファイバーと呼ばれる細胞内骨格タンパク質が発達されることを期待している．

し，細胞内に張力がかかっている（図 10A）．コラーゲ
ナーゼによって細胞の足場となるコラーゲンゲルが徐々

10．最後にに解け始めると，細胞内の張力が優先して（細胞がゲル骨再生を筆頭に，再生医工学を用いた組織再生術が実を引っ張り始めて）徐々にコラーゲンゲルが収縮し始め用化されつつある．世界的に脚光を浴びる万能細胞研究

る（図 10B）．このとき細胞間結合に関与する β カテニンに比べ，組織再生の足場材料に関する研究は比較的地味というタンパク質はコラーゲナーゼによる分解を受けなな印象がある．しかし，現時点で実用化に貢献しているいため，細胞間結合は維持されている．最終的にコラーのは言うまでもなく「材料」である．再生医工学の黎明

ゲンゲルが完全に分解すると細胞だけが収縮した細胞期から現在に至るまで，コラーゲンは最もすぐれた組織シートとして残る（図 10C）．このコラーゲナーゼ処理は再生の足場材料として利用されている．その重要性は今in vitro（試験管内）の実験で細胞の機能（増殖性，分化後も変わらないと考えられる．

機能）にほとんど影響しないことがわかっている．また，弊社は鮭皮コラーゲンの製造・構造制御・安定化など合成高分子を利用した従来方法と比較して，コラーゲンの基盤技術の整備をほぼ終えた．今後は医療材料研究をを細胞シート化基材として利用している本方法は細胞と加速し，一日でも早く実用化に結びつけ，医療の高度化の親和性や増殖性の点で有利と考えている．に貢献したい．そのために用途を絞り込み，医療機関と現在まで歯根膜細胞シートの作製とその重層化に成功

連携しながらの材料設計に研究の軸足を移していく予定

し，歯周病再生治療用のミニ人工歯根膜組織の作製を検である．用途としては人工血管，人工硬膜，および人工討している．また，線維芽細胞シートと角化細胞シート歯根膜などを想定している．特に人工血管については，

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弊社の独自技術である伸縮性コラーゲンの有効性が実証されつつある．
本研究を手掛けるにあたり，北海道大学工学研究科の棟方正信先生，科学技術振興機構の清水條資先生，他多くの方のご指導，ご協力を頂いた．この度，名誉ある日本生物工学会技術賞を受賞し，ゴールまでの道のりが長い医療材料研究を継続・加速するための大きな励みになった．これからも北海道の地域資源を生かし，産学官という取り組みの中で，新たな成果を上げる所存である．

文献

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