第 70 回（平成30年）

日本生物工学会大会
講演要旨集
会

期

2018 年 9 月 5 日（水）～ 7 日（金）

会

場

関西大学

千里山キャンパス

公益社団法人 日本生物工学会

第 70 回
日本生物工学会大会プログラム（2018）
一般講演・シンポジウム
会期2018 年 9 月 5 日（水）〜 7 日（金）

会

場

関西大学

千里山キャンパス（吹田市山手町 3 丁目 3 番 35 号）

授賞式典・受賞講演
日

時

会

場

2018 年 9 月 5 日（水）9：00 〜 11：30
関西大学 千里山キャンパス 第 2 学舎 4 号館 1 階 BIG ホール 100（A 会場）（生物工学奨励賞・アジア若手賞の講演日程については大会日程表をご覧下さい）

懇 親 会
日

時

会

場

2018 年 9 月 5 日（水）18：00 〜 20：00
関西大学 千里山キャンパス 100 周年記念会館ホール

ランチョンセミナー
期

間

会

場

2018 年 9 月 5 日（水）〜 7 日（金）関西大学 千里山キャンパス 第 4 学舎 2 号館・4 号館（LS1, LS2, LS3 会場）

展 示 会
期

間

会

場

2018 年 9 月 5 日（水）〜 7 日（金）関西大学 千里山キャンパス 第 4 学舎 4 号館 3 階

ワークショップ日時

会場

2018 年 9 月 6 日（木）16：40 〜 17：40
関西大学 千里山キャンパス 第 4 学舎 3 号館 1 階 D 会場

生物工学若手研究者の集い（若手会）総会・交流会／ものづくり交流サロン
日時2018 年 9 月 6 日（木）17:00 〜 20:00

会

場

関西大学

千里山キャンパス

公益社団法人凜風館 2 階食堂・ディノア

日 本 生 物 工 学 会

TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp

目

次

大会日程表 ………………………………………………………………………………………… （3）一般講演座長一覧 ………………………………………………………………………………… （5）実行委員会担当者表 ……………………………………………………………………………… （6）
会場案内図 ………………………………………………………………………………………… （7）受賞者一覧 …………………………………………………………………………………………（11）
各種講演番号の見方 ………………………………………………………………………………（12）プログラム
第 1 日目

授賞式・受賞講演，一般講演，ランチョンセミナー ………………………（13）第 2 日目

受賞講演，一般講演，ランチョンセミナー，ワークショップ，
ものづくり交流サロン …………………………………………………………（31）

第 3 日目

招待講演・シンポジウム，一般講演，ランチョンセミナー ………………（53）

要旨
第 1 日目

受賞講演 …………………………………………………………………………（77）一般講演 …………………………………………………………………………（79）

第 2 日目

第 3 日目

受賞講演 ……………………………………………………………………… （139）
一般講演

午前の部 ………………………………………………………… （141）

一般講演

午後の部 ………………………………………………………… （175）

招待講演・シンポジウム（午前の部） …………………………………… （209）シンポジウム（午後の部

13:00–15:00）………………………………… （211）

招待講演・シンポジウム（午後の部

15:20–17:20/17:50）…………… （235）

一般講演 ……………………………………………………………………… （263）
人名索引 ………………………………………………………………………………………… （291）キーワード索引 ………………………………………………………………………………… （305）
ランチョンセミナープログラム ……………………………………………………………… （317）
ランチョンセミナー要旨 ……………………………………………………………………… （319）
ワークショップ要旨 …………………………………………………………………………… （328）
ものづくり交流サロン要旨 …………………………………………………………………… （329）2018 年 8 月 22 日（水）～ 11 月 6 日（火）まで
大会 HP（https://www.sbj.or.jp/2018/abstract/）
で講演要旨集 E-PUB 版のダウンロードが可能になり
ます。

3

大会日程表
9 月 5 日（水）
会場

午

前

午

昼
11:45-12:45

9:00-11:30

後

13:30-17:30

18:00-20:00

A 会場
授賞式・受賞講演（功労賞，生物（第 2 学舎 4 号館 1 階） 工学賞，功績賞，技術賞）
C 会場（第 4 学舎 3 号館 2 階）

脂質工学 / 食品科学，食品工学

D 会場（第 4 学舎 3 号館 1 階）

抗体工学

E 会場
（第 4 学舎 2 号館 1 階）

ペプチド工学 / 核酸工学 / 植物細胞工学，組織培養，育種工学

F 会場（第 4 学舎 2 号館 1 階）

生物化学工学 / 培養工学 / バイオプロセス

G 会場（第 4 学舎 2 号館 2 階）

遺伝子工学

H 会場
（第 4 学舎 2 号館 2 階）

バイオマス，資源，エネルギー工学

I 会場（第 4 学舎 2 号館 3 階）タンパク質工学

J 会場（第 4 学舎 2 号館 3 階）

発酵生理学，発酵工学 / 代謝工学 / オミクス解析

K 会場（第 4 学舎 2 号館 3 階）

発酵生理学，発酵工学 / 代謝工学 / オミクス解析

L 会場（第 4 学舎 2 号館 3 階）

バイオセンシング，分析化学 / センサー，計測工学

M 会場（第 4 学舎 2 号館 3 階）

酵素学，酵素工学

N 会場（第 4 学舎 2 号館 4 階）

分類，系統，遺伝学 / 環境浄化，修復，保全技術 / 環境工学，廃水処理技術

O 会場（第 4 学舎 2 号館 4 階）

生体医用工学 / セル＆ティッシュエンジニアリング

LS1 会場（第 4 学舎 4 号館 2 階）

[L] 株式会社島津製作所

LS2 会場（第 4 学舎 4 号館 2 階）

[L] エッペンドルフ株式会社

LS3 会場（第 4 学舎 2 号館 5 階）

[L] ノバ・バイオメディカル
株式会社
懇親会

100 周年記念会館

9 月 6 日（木）
会場

午

前

9:00-11:36
B 会場（第 4 学舎 3 号館 4 階）
C 会場
食品科学，食品工学（第 4 学舎 3 号館 2 階）

昼
11:45-12:45

午
13:30-13:50

後

14:06-16:30(11:50-13:00)
受賞講演
（江田賞）

醸造学，醸造工学[W] 生物工学系の研究・開発の安全のために（16:40-17:40）

D 会場
醸造学，醸造工学（第 4 学舎 3 号館 1 階）
E 会場
（第 4 学舎 2 号館 1 階）
F 会場
生物化学工学 / 培養工学 /（第 4 学舎 2 号館 1 階） バイオプロセス
G 会場
遺伝子工学
（第 4 学舎 2 号館 2 階）
H 会場
バイオマス，資源，エネル（第 4 学舎 2 号館 2 階） ギー工学

16:40-20:00

代議員会

生物化学工学 / 培養工学 / バイオプロセス
受賞講演
（照井賞）

生物化学工学 / 培養工学 / バイオプロセス
遺伝子工学

受賞講演
バイオマス，資源，エネルギー工学（アジア若手賞）

I 会場
タンパク質工学（第４学舎2号館3階）

タンパク質工学 / 生体情報工学，バイオインフォ
マティクス / システムバイオロジー

J 会場
発酵生理学，発酵工学 / 代（第４学舎2号館3階） 謝工学 / オミクス解析

発酵生理学，発酵工学 / 代謝工学 / オミクス解析

4

K 会場
発酵生理学，発酵工学 / 代（第４学舎2号館3階） 謝工学 / オミクス解析

発酵生理学，発酵工学 / 代謝工学 / オミクス解析

L 会場
糖鎖工学 / 生合成，天然物（第 4 学舎 2 号館 3 階） 化学

酵素学，酵素工学
受賞講演
（斎藤賞）

M 会場
酵素学，酵素工学（第 4 学舎 2 号館 3 階）

酵素学，酵素工学

N 会場
環境浄化，修復，保全技術（第 4 学舎 2 号館 4 階） / 環境工学，廃水処理技術

環境浄化，修復，保全技術 / 環境工学，廃水処理技術

O 会場
セル＆ティッシュエンジニ
（第 4 学舎 2 号館 4 階） アリング

セル＆ティッシュエンジニアリング

LS1 会場（第 4 学舎 4 号館 2 階）

[L] タカラバイオ株式
会社

LS2 会場（第 4 学舎 4 号館 2 階）

[L] 三洋貿易株式会社

LS3 会場（第４学舎2号館5階）[L] 宇宙航空研究開発
機構 (JAXA)
若手会総会・交流会
ものづくり交流サロン

凛風館 2 階ディノア(17:00-20:00)

9 月 7 日（金）
会場

午

前

昼
11:35-12:35

9:00-11:24[S]1 細胞解析に向けた刺激応答性分子ツー

B 会場（第 4 学舎 3 号館 4 階）
C 会場
（第 4 学舎 3 号館 2 階）午

ルの創製と応用展開[S]SDGs に資する環境共生微生物を活用したアグリバイオ工学研究の新展開

醸造学，醸造工学後

13:00-15:00

15:20-17:20/17:50[S] 構造と機能デザインによる有用人工酵素の創製と応用展開 ※シンポジウムに先立ち，KSBB 招待
講演を開催（Prof. Tae-Joon Jeon (Inha University)）[S] 資源作物生産から発酵生産までをトータルシス
テムとして俯瞰する[S] 新しい農業と未来の食料のための生物工学《国際シンポジウム》【本D 会場
部企画】 ※シンポジウムに先立ち，（第 4 学舎 3 号館 1 階）
KSBB 招待講演を開催（Prof. Si
Wouk Kim (Chosun Univ.)）[S] 発酵食品の機能性を考える〜一次機能か
ら三次機能まで【本部企画】

E 会場
生物化学工学 / 培養工学 / バイオプ
（第 4 学舎 2 号館 1 階） ロセス[S] エネルギーを使う，捨てる光合成の再最適化―光合成生物工学にむけた未踏研究―

F 会場
生物化学工学 / 培養工学 / バイオプ
（第 4 学舎 2 号館 1 階） ロセス[S] 半金属元素のバイオテクノロジー[S] スマートセル開発のためのバイオ技術とG 会場
バイオマス，資源，エネルギー工学（第 4 学舎 2 号館 2 階）デジタル技術の革新と融合 バイオ生産に資する DBTL サイクルの構築に向けて[S] 生物系研究者のための電気化学入門〜その実験
大丈夫？〜[S] 環境は持続可能か？―地球規模の物質循環を生物工学から考える―[S] タンパク質と材料界面の相互作用の本質に迫る※シンポジウムに先立ち，KSBB 招待講演を開催（Prof. Jeong Hyun Seo (Yeungnam Univ.)）[S] スマートバイオデザイン：ナノからマクロスケー

ノムを大規模に編集する。代謝計測から設
計図を書く

ルまでの様々な階層レベルにおけるバイオ関連機能と構造の合理的創出を目指して ※シンポジウムに先立ち，KSBB 招待講演を開催（Prof. Jong Wook
Hong (Hanyang Univ.)）[S] 地域から世界へ，グローカルバイオテク[S]ASEAN における生物資源の社会実装を目指し[S] 新時代の物質生産宿主開発の方法論：ゲ

H 会場
バイオマス，資源，エネルギー工学（第 4 学舎 2 号館 2 階）

[S] 黒麹菌・白麹菌の研究からつなげる産業振興

I 会場
生体情報工学，バイオインフォマ（第 4 学舎 2 号館 3 階） ティクス / システムバイオロジー
K 会場
発酵生理学，発酵工学 / 代謝工学 /（第４学舎2号館3階） オミクス解析

ノロジーで創る新しい価値[S] 複雑組織製造に必要な基盤技術を考える

L 会場
酵素学，酵素工学（第４学舎2号館3階）―どこまで出来て，何が足らないのか？―[S] 真核微生物におけるシグナル伝達と代謝

M 会場
酵素学，酵素工学（第 4 学舎 2 号館 3 階）の接点を探る―発酵調節の根源的な理解に
向けて―

N 会場
環境工学，廃水処理技術 / 環境浄化，（第 4 学舎 2 号館 4 階） 修復，保全技術
O 会場
セル＆ティッシュエンジニアリング（第 4 学舎 2 号館 4 階）
LS1 会場（第 4 学舎 4 号館 2 階）
LS2 会場（第 4 学舎 4 号館 2 階）
LS3 会場（第 4 学舎 2 号館 5 階）

[L] ヒューマンメタ
ボロームテクノロ
ジーズ株式会社[L] 東ソー株式会社[L]P&G イノベーション合同会社

S：シンポジウム L：ランチョンセミナー W：ワークショップ

た研究ネットワーキング《国際シンポジウム》[S] 工学が見出すエッセンシャル細胞培養 〜動物

細胞培養の根本に工学はどう立ち向かうか〜【本部企画】[S] 糖鎖工学技術がもたらすバイオ医薬品の新潮流

5

座長一覧
一般講演
9 月 5 日（水）13:30–17:30
会 場 講演番号
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O

9 月 6 日（木）時間

1Cp01–06 13:30–14:42
1Cp07–12 14:54–16:06
1Cp13–18 16:18–17:30
1Dp01–06 13:30–14:42
1Dp07–12 14:54–16:06
1Ep01–06 13:30–14:42
1Ep07–12 14:54–16:06
1Ep13–17 16:18–17:18
1Fp01–06 13:30–14:42
1Fp07–12 14:54–16:06
1Fp13–18 16:18–17:30
1Gp01–06 13:30–14:42
1Gp07–12 14:54–16:06
1Gp13–18 16:18–17:30
1Hp01–06 13:30–14:42
1Hp07–12 14:54–16:06
1Hp13–18 16:18–17:30
1Ip01–06 13:30–14:42
1Ip07–12 14:54–16:06
1Ip13–18 16:18–17:30
1Jp01–06 13:30–14:42
1Jp07–12 14:54–16:06
1Jp13–18 16:18–17:30
1Kp01–06 13:30–14:42
1Kp07–12 14:54–16:06
1Kp13–18 16:18–17:30
1Lp01–06 13:30–14:42
1Lp07–12 14:54–16:06
1Lp13–17 16:18–17:18
1Mp01–06 13:30–14:42
1Mp07–12 14:54–16:06
1Mp13–18 16:18–17:30
1Np01–06 13:30–14:42
1Np07–12 14:54–16:06
1Np13–18 16:18–17:30
1Op01–06 13:30–14:42
1Op07–12 14:54–16:06
1Op13–18 16:18–17:30

座

長

橋本 雅仁
田代 陽介
福田伊津子
川﨑 浩子
藤田 憲一
松崎 弘美
中野 秀雄
田丸
浩
一二三恵美
金山 直樹
本多 裕之
池野 慎也
加藤
晃
浅野竜太郎
福島 エリ オデット
梶浦 裕之
田中
剛
花井 泰三
Prihardi Kahar 小島
基
星野 一宏
田島 誉久
鈴木 宏和
栗原 達夫
金井
保
秀瀬 涼太
中島田 豊
吹谷
智
佐藤
伸
佐々木千鶴
平井 浩文
炭谷 順一
黒田 真史
久保
幹
朴
龍洙
加藤 竜也
二見淳一郎
田中 瑞己
石川 聖人
上田
宏
児玉 浩明
向山 正治
原
清敬
清水
浩
廣田 隆一
豊島 正和
志田 洋介
佐々木大介
中山 泰宗
丸山 潤一
渡邉 研志
岡橋 伸幸
新間 秀一
馬場 健史
竹山 春子
舟橋 久景
福﨑英一郎
岡澤 敦司
野田 尚宏
佐藤 喬章
三宅 英雄
阿部 勝正
中山
亨
蒲池 利章
山崎 敦史
新谷 政己
井口 博之
田中 裕也
武尾 正弘
遠山
忠
森
英樹
髙木
睦
蟹江
慧
井藤
彰
岩井 良輔
大貫 喜嗣

9:00–11:36
会 場 講演番号
C
D
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O

14:06–16:30
会 場 講演番号
C
E
F
G
H
I
J

9 月 7 日（木）9:00–11:24
会 場 講演番号
C
E
F
G
H
I
K
L
M
N
O

K
時

間

3Ca01–06 9:00–10:12
3Ca07–11 10:24–11:24
3Ea01–06 9:00–10:12
3Ea07–11 10:24–11:24
3Fa01–06
9:00–10:12
3Fa07–09 10:24–11:00
3Ga01–06 9:00–10:12
3Ha01–06 9:00–10:12
3Ha07–11 10:24–11:24
3Ia01–06
9:00–10:12
3Ia07–11 10:24–11:24
3Ka01–06 9:00–10:12
3Ka07–11 10:24–11:24
3La01–06
9:00–10:12
3La07–11 10:24–11:24
3Ma01–06 9:00–10:12
3Ma07–11 10:24–11:24
3Na01–06 9:00–10:12
3Na07–10 10:24–11:12
3Oa01–06 9:00–10:12
3Oa07–10 10:24–11:12

座

長

二神 泰基
明石 貴裕
多賀 直彦
青柳 秀紀
岡村 好子
中谷
肇
常盤
豊
田口 精一
蓮沼 誠久
堀之内貴明
滝口
昇
由里本博也
和田
大
柘植 丈治
河原崎泰昌
有馬 二朗
西矢 芳昭
杉山 友康
山下 光雄
河原 正浩
金岡 英徳

L
山形
吉田
竹原
倉田
堀

洋平
聡
宗範
淳志
克敏

麻生
藤森
片倉
兒島
青木
石井
吉田
里村
古屋
古賀
稲垣
諸星
森川
山野
河邉

祐司
一浩
啓雄
孝明
航
純
信行
武範
俊樹
雄一
賢二
知広
正章
範子
佳典

M
N
O

時

間

時

間

2Ca01–06 9:00–10:12
2Ca07–12 10:24–11:36
2Da07–12 10:24–11:36
2Fa01–06
9:00–10:12
2Fa07–12 10:24–11:36
2Ga01–06 9:00–10:12
2Ga07–12 10:24–11:36
2Ha01–06 9:00–10:12
2Ha07–12 10:24–11:36
2Ia01–06
9:00–10:12
2Ia07–12 10:24–11:36
2Ja01–06
9:00–10:12
2Ja07–11 10:24–11:24
2Ka01–06 9:00–10:12
2Ka07–12 10:24–11:36
2La01–06
9:00–10:12
2La07–12 10:24–11:36
2Ma01–06 9:00–10:12
2Ma07–11 10:24–11:24
2Na01–06 9:00–10:12
2Na07–11 10:24–11:24
1Op01–06 13:30–14:42
1Op07–12 14:54–16:06

2Cp01–06 14:06–15:18
2Cp07–11 15:30–16:30
2Ep01–06 14:06–15:18
2Ep07–11 15:30–16:30
2Fp01–06 14:06–15:18
2Fp07–11 15:30–16:30
2Gp01–06 14:06–15:18
2Gp07–11 15:30–16:30
2Hp01–06 14:06–15:18
2Hp07–11 15:30–16:30
2Ip01–06 14:06–15:18
2Ip07–11 15:30–16:30
2Jp01–06 14:06–15:18
2Jp07–11 15:30–16:30
2Kp01–06 14:06–15:18
2Kp07–11 15:30–16:30
2Lp01–06 14:06–15:18
2Lp07–11 15:30–16:30
2Mp01–06 14:06–15:18
2Mp07–11 15:30–16:30
2Np01–06 14:06–15:18
2Op01–06 14:06–15:18
2Op07–11 15:30–16:30

座

長

座

長

西野 智彦
Putri Sastia
栗林
喬
中島 一紀
鬼塚 正義
原田 尚志
松岡 正佳
仲山 英樹
二又 裕之
新井 亮一
木賀 大介
根来 誠司
安藤 晃規
菅野
学
尾島 由紘
松川 哲也
一瀬 博文
五味 勝也
跡見 晴幸
鈴木 市郎
荒木希和子
長森 英二
秋山 佳丈

倉橋
敦
小西 正朗
堀内 淳一
芦内
誠
熊田 陽一
大河内美奈
内山
進
横尾 岳彦
荻野 千秋
三﨑
亮
今中 洋行
相馬 悠希
阿野 嘉孝
山崎 思乃
東
雅之
富永 大介
吉田 豊和
梅野 太輔
大城
隆
森本 兼司
徳本 勇人
中村
史
堀江 正信

村中
荻田
五島
阿部
横田
藤原
熊谷
井沢
阿野
座古
梅津
折田
菊地
北出
渡辺
大橋
吉田
志水
櫻庭
井上
酒井
山田
立花

俊哉
亮
徹也
敬悦
早希
伸介
孝則
真吾
貴司
保
光央
和泉
淳
幸広
大輔
貴生
磨仁
元亨
春彦
大介
謙二
真澄
亮

尾関 健二
吉﨑由美子
石井 伸佳
石井 正治
田代 康介
志田 洋介
杉山 峰崇
笹野
佑
中澤 昌美
渡邉 研志
伊藤 伸哉
荒木 通啓
根本 理子
山本 恵理
高野 真希
岡野 憲司
松村 洋寿
關
光
杉森 大助
桐村光太郎
金原 和秀
村松 和明
西島 謙一

6

第 70 回日本生物工学会大会（2018）
実行委員会・業務分担（○：責任者）
実行委員長

片倉 啓雄

実行副委員長高木 博史・大政 健史

総務○岩木 宏明・河原 秀久・松浦 友亮・阪本 龍司・三﨑 亮・山中 一也・
東 雅之・山崎 思乃

会計○紀ノ岡 正博・黒田 浩一

広報○高木 博史・加藤 晃・渡辺 大輔

プログラム○藤原 伸介・岡澤 敦司・青木 航・赤坂 直紀・大橋 貴生・岡野 憲司・
梶浦 裕之・梶山 慎一郎・金 美海・黒田 真史・古賀 雄一・駒 大輔・
新間 秀一・秀瀬 涼太・藤田 聡史・松田 史生・三﨑 亮

会場○松浦 友亮・阪本 龍司・山出 和弘・市橋 伯一・伊藤 洋一郎・
猪熊 健太郎・上田 光宏・加藤 泰彦・川口 秀夫・岸田 正夫・
岸野 重信・木谷 茂・清水 義宏・張 斯来・戸谷 吉博・中村 泰之・
藤原 大佑・三浦 夏子・若井 暁

シンポジウム○清水 浩・大政 健史・片倉 啓雄

ランチョンセミナー○福﨑 英一郎・本田 孝祐・河原 秀久

受付・クローク○長谷川 喜衛・炭谷 順一・關 光・立花 亮・永尾 寿浩・西岡 求・山本 佳宏

授賞式○藤山 和仁・老川 典夫

展示○河原 秀久・岩木 宏明

懇親会○松村 吉信・高木 博史・坊垣 隆之・堤 浩子・畠中 治代

若手交流会○原田 和生・岩木 宏明

ものづくり交流サロン○根来 宏明・玉田 佳大

託児ルーム○山崎 思乃・中澤 昌美

7

会場への交通案内
アクセス概要図

関西大学 千里山キャンパスへのアクセス【大阪（伊丹）空港からのアクセス】
大阪モノレール「大阪空港」駅から「門真市（かどまし）」行で「山田」駅下車，阪急電鉄に乗り換え「関大前」駅下
車（この間約 30 分）【新幹線「新大阪」駅からのアクセス】

JR「新大阪」駅から地下鉄御堂筋線梅田方面行で「西中島南方」駅下車，阪急電鉄に乗り換え「南方（みなみかた）」
駅から「北千里」行で「関大前」駅下車（この間約 30 分）．または「南方」駅から京都「河原町」行で「淡路」駅下車，「北千里」行に乗り換えて「関大前」駅下車．
【大阪（梅田）からのアクセス】
阪急電鉄「梅田」駅から，千里線「北千里」行で「関大前」駅下車（この間約 20 分）．または京都「河原町」行（通勤特急を除く）で「淡路」駅下車，「北千里」行に乗り換えて「関大前」駅下車．

8

会場案内
関西大学千里山キャンパス会場案内図

第４学舎会場案内図

9

10

11

日本生物工学会 2018 年度受賞者

去る 5 月 24 日，理事会が開催され，本年度の受賞者が決定しましたのでお知らせ申し上げます．
■第 37 回 生物工学賞 浅野 泰久（富山県立大学工学部・教授）「微生物から動植物へと展開する酵素利用技術とその基盤開拓」■第 12 回 生物工学功績賞 清水浩（大阪大学大学院情報科学研究科・教授）「計算機工学に基づく代謝設計とその有効性の実証に関する研究」■第 12 回 生物工学功労賞 滝澤昇（岡山理科大学工学部・教授）「生物工学および関連分野の JABEE 認定審査への多大な貢献」■第 51 回 生物工学奨励賞（江田賞） 浅野静（アサヒビール（株）酒類技術研究所・主任研究員）「ビール醸造における微生物検査法の迅速化に関する研究」■第 54 回 生物工学奨励賞（斎藤賞） 本田 孝祐（大阪大学大学院工学研究科・准教授）「好熱性酵素を用いた細胞外人工代謝経路の構築と利用に関する先駆的研究」■第 41 回 生物工学奨励賞（照井賞） 井藤彰（九州大学大学院工学研究院・准教授）「機能性磁性ナノ粒子の開発と医療技術への応用に関する生物工学的研究」■第 27 回 生物工学技術賞 佐藤 俊輔 1・有川 尚志 1・小林 新吾 1・藤木 哲也 1・松本 圭司 2
（1（株）カネカ・2 大阪大学大学院工学研究科）「微生物による生分解性ポリマー PHBH 製造法の開発」■第 15 回 生物工学アジア若手賞（Young Asian Biotechnologist Prize） Verawat Champreda（Director, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), Thailand）「Exploration of lignocellulose degrading enzymes from hidden bioresource for bioreﬁnery and green industries」■第 7 回 生物工学アジア若手研究奨励賞（The DaSilva Award） Pau-Loke Show
（Associate Professor, The University of Nottingham, Malaysia）「Converting wastewater to bioenergy and bio-products using microalgae technology」■第 26 回 生物工学論文賞
1）和田 圭介 *・戸谷 吉博・坂野 聡美 **・吉川 勝徳 ***・松田 史生・清水浩（大阪大学，* 現，産業技術総合研究所，** 現，神戸大学，*** 現，積水化学）
132）張C-metabolic ﬂux analysis for mevalonate-producing strain of Escherichia coli

斯来 1*・伴暁彦 1**・江原 直樹 1***・水谷治 2****・田中 瑞己 1*****・新谷 尚弘 1・五味 勝也 1
（1 東北大学，2 酒類総合研究所，* 現，神戸大学，** 現，中外製薬，*** 現，味の素，**** 現，琉球大学，***** 現，
静岡県立大学）

Self-excising Cre/mutant lox marker recycling system for multiple gene integrations and consecutive gene deletionsin Aspergillus oryzae3）青井 議輝 1・金子 裕司 2*・常田聡2（1 広島大学，2 早稲田大学，* 現，キリン株式会社）
pH-gradient ion-exchange microbial cell chromatography as a simple method for microbial separation4）加藤 晃代 1,2*・永井 里美 1*・中野 秀雄 1
（1 名古屋大学，2 知の拠点あいち，* 現，iBody 株式会社 / 名古屋大学）
N-terminal SKIK peptide tag markedly improves expression of difﬁcult-to-express proteins in Escherichia coli and
Saccharomyces cerevisiae
5）Le Gao*・秀瀬 涼太 **・藤原 伸介（関西学院大学，* 現，Changchun University of Science and Technology，** 現，神戸大学）
Function of a thermophilic archaeal chaperonin is enhanced by electrostatic interactions with its targets
6）藤谷 将也 1・Noor Saika Huddin2*・河合
駿 1**・蟹江慧 1・清田泰次郎 2・清水 一憲 1・本多 裕之 1・
加藤 竜司 1
（1 名古屋大学，2 株式会社ニコン，* 現，Google Malaysia，** 現，大日本住友製薬株式会社）Morphology-based non-invasive quantitative prediction of the differentiation status of neural stem cells
7）Suman C. Nath*・堀江 正信 **・長森 英二 ***・紀ノ岡正博（大阪大学，* 現，University of Calgary，** 現，京都大学，*** 現，大阪工業大学）
Size- and time-dependent growth properties of human induced pluripotent stem cells in the culture of single
aggregate■第 7 回 生物工学学生優秀賞（飛翔賞）
1）上原 千央（東北大学大学院工学研究科バイオ工学専攻）「酵母のストレス応答に関わる陽イオン輸送体の機能解析」

2）小川 雅人（早稲田大学大学院先進理工学研究科生命医科学専攻）「網羅的シングルセルゲノム解析フローの構築に向けた高精度シングルセルゲノム解析ツールの開発」

3）竹村 謙信（静岡大学大学院自然科学系教育部バイオサイエンス専攻）「金ナノ粒子−量子ドット間で誘起される局在表面プラズモン共鳴効果による迅速・高感度ウイルス検出に関する研究」
4）上野 大心（奈良先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科バイオサイエンス領域）「mRNA の内部切断に関わる配列的特徴の解明」
5）堀采音（広島大学大学院先端物質科学研究科分子生命機能科学専攻）「免疫グロブリン製剤による新たな免疫抑制作用の発見と次世代抗体医薬設計への応用」
6）眞榮田麻友美（琉球大学大学院農学研究科亜熱帯農学専攻，現，鹿児島大学）「黒麹菌 Aspergillus luchuensis 由来フェノール酸脱炭酸酵素に関する研究」

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各種講演番号の見方
一般講演

最初の数字は発表日，次の大文字のアルファベットは会場，次の小文字のアルファベットは午前（a）または午後（p）次の数字はその会場での講演の順番を示します．（たとえば，2Cp01 は，大会 2 日目，C 会場，午後の部，1 番目の講演です）．

一般講演の開始時間は，次の通りです（★印は「PC 接続確認時間」）．
9 月 5 日（水）p [pm]（午後）
★

13：18

01. 13：30

02. 13：42

03. 13：54

04. 14：06

05. 14：18

06. 14：30

★

14：42

07. 14：54

08. 15：06

09. 15：18

10. 15：30

11. 15：42

12. 15：54

★

16：06

13. 16：18

14. 16：30

15. 16：42

16. 16：54

17. 17：06

18. 17：18

9：48

06. 10：00

9 月 6 日（木）a [am]（午前）および 9 月 7 日 ( 金 ) a [am]（午前）
★

8：48

01.

9：00

★

10：12

07. 10：24

02.

9：12

03.

9：24

04.

9：36

05.

08. 10：36

09. 10：48

10. 11：00

11. 11：12

12. 11：24

06. 15：06

9 月 6 日（木）p [pm]（午後）
★

13：54

01. 14：06

02. 14：18

03. 14：30

04. 14：42

05. 14：54

★

15：18

07. 15：30

08. 15：42

09. 15：54

10. 16：06

11. 16：18

受賞講演・シンポジウム

最初のアルファベットは受賞講演（A）またはシンポジウム（S），次の数字は発表日，次の大文字のアルファベット（以上，
は会場，次の小文字のアルファベットは午前（a）または午後（p），また受賞講演の場合），あるいは，9：00 開始（a），13：00 開始（b）
は 15：20 開始（c）（以上、シンポジウムの場合），次の数字はその会場での講演の順番を示します（たとえば，S3Bc01 は，大会 3 日目，B 会場，

15：20 開始のシンポジウム，1 番目の講演です）．
ランチョンセミナー

最初の数字は開催日，次の LS1，LS2，または LS3 は会場を示します（たとえば，2LS1 は，大会 2 日目，LS1 会場のランチョンセミナーです）．

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第 1 日（9 月 5 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

授賞式・受賞講演（生物工学功労賞，生物工学賞，生物工学功績賞，生物工学技術賞）

A 会場 BIG ホール 100，第 2 学舎 4 号館 1 階（9:00～11:30）
授賞式
9:00

会長挨拶

9:05

韓国生物工学会（KSBB）会長挨拶

9:10

功労会員推戴

9:20

各賞授賞

9:55

A1Aa01〈生物工学功労賞〉
第 12 回日本生物工学会功労賞受賞にあたって.......................................................................................................................... ○滝澤 昇（岡山理大・工）

10:05

A1Aa02

座長：木野 邦器

〈生物工学賞〉

微生物から動植物へと展開する酵素利用技術とその基盤開拓...................................................................................................................... ○浅野 泰久（富山県大・工）10:40

A1Aa03

座長：高木 昌宏

〈生物工学功績賞〉

計算機工学に基づく代謝設計とその有効性の実証に関する研究.......................................................................................................................... ○清水 浩（阪大院・情報）
11:10

A1Aa04

座長：今井 泰彦

〈生物工学技術賞〉

微生物による生分解性ポリマー PHBH 製造法の開発............................................................... 佐藤 俊輔 1, 有川 尚志 1, 小林 新吾 1, 藤木 哲也 2, ○松本 圭司 3
（1 （株）カネカ バイオテクノロジー研究所, 2 （株）カネカ R&D 企画部,
3

大阪大学 大学院工学研究科）

一般講演

C 会場 第 4 学舎 3 号館 2 階（13:30～17:30）【脂質工学／食品科学，食品工学】
13:30

1Cp01

ストレス状態モデル膜と低刺激性界面活性剤の相互作用......................................... ○高橋 祐菜, 辻野 義雄, 高木 昌宏, 下川 直史（北陸先端大・マテリアル）

13:42

1Cp02

低刺激性界面活性剤による生体模倣膜への作用機構の解析..................................... ○佐々木 陽介, 辻野 義雄, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）

14

13:54

1Cp03

膜小胞高分泌細菌が形成する多層膜小胞の特性解析........................................................................... ○高木 航太郎 1, 長谷川 雄将 1, 田原 悠平 3, 新谷 政己 1,
大熊 盛也 4, 宮田 真人 3, 二又 裕之 1,2, 田代 陽介 1
（ 静大院・総合科技, 静大・グリーン研, 3 阪市大院・理, 4 理研・バイオリソースセ）
1

2

14:06

1Cp04

大腸菌の細胞表層改変による外膜小胞大量分泌株の構築................................................................. ○澤邊 朋美, 児波 克哉, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）

14:18

1Cp05

酢酸菌由来外膜小胞の収量改善の検討...................................... ○橋本 雅仁, 松元 太一, 中村 佳祐, 大薗 まみ, 橋口 周平（鹿児島大・理工）

14:30

1Cp06

Lactobacillus sakei 由来メンブランベシクルを介する IgA 産生促進作用の解析................................................................... ○三好 柚紀 1, 山崎 思乃 2, 中山 知哉 2, 國澤 純 3, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 医薬基盤・健康・栄養研）

14:54

1Cp07

Culturomics によるヒト腸内細菌の網羅的な分離方法の検討................................................. ○山副 敦司, 島村 麻美子, 三浦 隆匡, 古川 雅崇, 内野 佳仁, 川﨑 浩子（NITE・NBRC）

15:06

1Cp08

グリコシルセラミドの腸内細菌への影響解析.......................... ○北島 悠花 1, 佐藤 友哉 1, 宮川 幸 1, 阪本 真由子 1, 許 志豪 1, 中山 二郎 2, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 九大院・農）

15:18

1Cp09

腸内細菌と食物繊維の接着現象の解析................................................................................ ○谷口 茉莉亜 1, 倉光 香奈 1, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工）

15:30

1Cp10

腸内細菌 Bacteroides thetaiotaomicron による食物繊維の資化性に関する研究............................................................................... 篠原 涼平 1, 古根 隆広 2, ○生田 直子 1, 佐々木 大介 3,
佐々木 建吾 3, 福田 伊津子 4, 大澤 朗 4, 坂本 憲広 1
（ 神戸大院・医, シクロケムバイオ, 3 神戸大院・科技イノベ, 4 神戸大院・農）
1

15:42

1Cp11

2

in vitro 培養系ヒト腸内細菌叢モデル（KUHIMM）を用いた難消化性食物繊維の影響評価................................... ○佐々木 大介 1, 佐々木 建吾 1, 生田 直子 2, 福田 伊津子 3, 近藤 昭彦 1, 大澤 朗 3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大院・医, 3 神戸大院・農）

15:54

1Cp12

In vitro 培養系ヒト腸内細菌叢モデルによる潰瘍性大腸炎患者の代謝プロファイル異常の検出.................. ○佐々木 建吾 1, 井上 潤 2, 星 奈美子 2, 佐々木 大介 1, 福田 伊津子 3, 近藤 昭彦 1, 大澤 朗 3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大院・医, 3 神戸大院・農）

16:18

1Cp13

Lactobacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテリオシン生合成関連遺伝子の解析....................................................................................................... ○河原 あい 1, 善藤 威史 2, 松崎 弘美 1,3（1 熊本県大院・環境共生, 2 九大院・農, 3 熊本県大・環境共生）

16:30

1Cp14

酵母 Saccharomyces cerevisiae YM41 株の保持するキラー遺伝子の取得 ~第二報~........................................................................................... ○三木 健夫, 篠笥 光慶（山梨大院・医工総）

16:42

1Cp15

梨幼果抽出液添加による出芽酵母の寿命延長に関与する遺伝子............................. ○長谷川 真梨菜 1, 酒瀬川 世瑠 1, 荻田 亮 2,3, 藤田 憲一 2, 田中 俊雄 2, 村田 和加惠 1（1 米子高専・物質, 2 阪市大院・理, 3 阪市大・健康研セ）

16:54

1Cp16

リンゴ細胞壁可溶化とセラミド濃縮.................................................................................... ○笠井 尚哉 1, 是常 友紀 1, 向井 克之 2, 松山 彰収 2
（1 阪府大院・生環科, 2 株式会社 ダイセル）

17:06

1Cp17

コーヒー豆におけるアラビノガラクタンプロテイン分解酵素とセルラーゼの併用効果..................................................... ○柴田 晃, 松野 善治, 山田 みなみ, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）

17:18

1Cp18

茶殻における細胞内顆粒組織の酵素分解........................................................................ ○中嶋 優里, 花崎 麻由, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）

15

D 会場 第 4 学舎 3 号館 1 階（13:30～16:06）【抗体工学】
13:30

1Dp01

N 末端 SKIK ペプチドによるモノクローナル抗体生産量増大と機構解明..................................................................................................... ○加藤 晃代 1,3, 田村 廣人 2, 中野 秀雄 1,3（1 iBody（株）, 2 名城大院・農, 3 名大院・生命農学）

13:42

1Dp02

Ecobody 法によるウサギモノクローナル抗体迅速取得法の開発.............................. ○新海 佑介, 森下 しおみ, 加藤 晃代, 兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）

13:54

1Dp03

Ecobody 法によるヒトモノクローナル抗体の迅速取得と大腸菌による生産.................................. ○小森 有華, 内田 由乃, 加藤 晃代, 兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）

14:06

1Dp04

核酸分解能を示すヒト型抗体軽鎖クローン..................................................................................................... ○清水 美里 1, 宇田 泰三 2, 一二三 恵美 3
（1 大分大院・工, 2 九州先端科学技術研究所, 3 大分大・全学研究推進）

14:18

1Dp05

生体内タンパク質を標的にした新規立体構造認識モノクローナル抗体の作製とそのリガンド作用................................................................................ ○磯﨑 勇志, 湊元 幹太, 冨田 昌弘（三重大院・工）

14:30

1Dp06

キンギョ由来抗体遺伝子の多様性解析と抗原特異的 scFv 断片の取得................................................................................. 岡﨑 文美 1,2,3, 額田 夏生 1, 百瀬 直樹 1, ○田丸 浩 1,2,3（1 三重大院・生資・生物圏生命, 2 三重大・先端科学研支セ・バイオインフォ,
3

14:54

1Dp07

三重大・スマートセルイノベ研セ）

スプライシング因子の過剰発現及び標的遺伝子配列の操作によるニワトリ B 細胞株における遺伝
子変異の増強............................................................. ○金山 直樹, 太田 愛美, 西山 由美子, 岡 知里, 曲 正樹, 徳光 浩
（岡山大院・ヘルスシステム・細胞機能）

15:06

1Dp08

ホタルルシフェラーゼ生物発光活性制御におけるアルパカ抗体の利用....................................... ○鶴田 篤弘 1, 加藤 太一郎 1, 有馬 一成 1, 伊東 祐二 1, 赤澤 陽子 2, 中島 芳浩 2
（1 鹿児島大院・理工, 2 産総研）

15:18

1Dp09

ラクダ科動物由来重鎖抗体を用いた蛍光免疫センサー mini Q-body の構築................................................................... ○上田 宏 1, 山田 映未 2, 井上 暁人 3, 大室 有紀 1, 北口 哲也 1
（1 東工大・研究院・化生研, 2 東工大院・生命理工, 3 東工大・生命理工）

15:30

1Dp10

ヒト型抗体酵素 #7 シリーズの生化学的性質と酵素活性サイト..................................................................................................... ○宇田 泰三 1, 田口 博明 2, 一二三 恵美 3
（1 九州先端科学技術研究所, 2 鈴鹿医療大・薬, 3 大分大・全学研究推進）

15:42

1Dp11

ヒト型抗体軽鎖 Subgroup I における酵素活性に関する検討....................................................... ○渡辺 万由子 1, 秋吉 裕子 2, 田口 博明 3, 宇田 泰三 4, 一二三 恵美 2
（1 大分大院・工, 2 大分大・全学研究推進, 3 鈴鹿医療大・薬, 4 九州先端科学技術研究所）

15:54

1Dp12

免疫グロブリン製剤による新たな免疫抑制作用の発見........................................................................ ○堀 采音, 藤村 孝志, 河本 正次（広島大院・先端物質）

E 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（13:30～17:18）【ペプチド工学／核酸工学／植物細胞工学，組織培養，育種工学】
13:30

1Ep01

納豆抽出物に含まれるカチオン性ペプチドは LPS 中和活性と血管新生促進活性を発揮する...................................... ○相田 涼介, 斉藤 寿槻, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

13:42

1Ep02

コメ糠タンパク質由来多機能型カチオン性ペプチドの創傷治癒作用とその機構の解明...................................... ○斉藤 寿槻, 生江 俊樹, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）

16

13:54

1Ep03

Screening of exosome-binding peptides from EWI-2 protein...................................................................... ○Thanawat Suwatthanarak, Masayoshi Tanaka, Mina Okochi

14:06

1Ep04

多孔性シリカゲルを用いた機能性ペプチドの腸デリバリーに適したペプチドの in silico 設計と評価.............................................................. ○今井 健人 1, 清水 一憲 1, 上村 光浩 2, 小川 光輝 2, 本多 裕之 1,3（Dept. Chem. Sci. Eng., Sch. Mat. Chem. Technol., Tokyo Tech）（1 名大院・工, 2 富士シリシア化学, 3 名大院・予防早期医療創成セ）
14:18

1Ep05

焼成多孔性シリカゲルを用いた苦味ペプチドの選択的除去手法の開発............................................. 池田 彩 1, 今井 健人 1, 清水 一憲 1, 上村 光浩 2, 小川 光輝 2, ○本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 富士シリシア化学, 3 名大・予防早期医療創成セ）

14:30

1Ep06

LEA ペプチドの発現による大腸菌の紫外線耐性の向上............................................ ○池野 慎也 1, フワイジ アラー 2, パサック ニシット 1, シャヒル アミル 2（1 九工大院・生体工, 2 マレーシアプトラ大・生物工）

14:54

1Ep07

新規ラッソペプチド vesicusin A および B の異宿主生産............................................................................................... ○不破 啓貴, 小谷 真也（静大・創科技院）

15:06

1Ep08

蛍光発光アプタマー Spinach に対する変異導入とその蛍光への影響評価.................................. ○上野 絹子 1, 塚越 かおり 1, Porchetta Alessandro 2, Ricci Francesco 2, 池袋 一典 1
（1 農工大院・工, 2 Dept. Chemist., Univ. Rome Tor Vergata）

15:18

1Ep09

Bevacizumab に対する抗イディオタイプアプタマーの結合特性の改良....................................... 池袋 一典 1, ○清水 裕 1, 齊藤 太郎 1, 塚越 かおり 1, 山田 朋宏 2, 轟木 堅一郎 2（1 農工大院・工, 2 静県大院・薬食生命）

15:30

1Ep10

水耕栽培によるミヤコグサのベツリン酸生産能の増強................................................................... ○鈴木 隼人, 福島 エリ オデット, 村中 俊哉（阪大院・工）

15:42

1Ep11

UV-B LED 照射によるポリフェノールの増産........................................... ○鶴本 智大 1, 藤川 康夫 1, 泉田 智史 2, 三島 俊介 3, 太田 大策 4, 岡澤 敦司 4
（1 日亜化学工業, 2 ヒューマンチップス, 3 大塚電子, 4 阪府大院・生環科）

15:54

1Ep12

マイクロセンサーを用いたイネの葉のガスフィルムの解析........................................................ ○ターナー ピーター 1, 井上 貴行 1, Dalsgaard Tage 2, Pedersen Ole 3（1 セントラル科学貿易, 2 Unisense, Denmark, 3 Univ. of Copenhagen, Denmark）

16:18

1Ep13

Unraveling N-glycan patterns of glycoproteins extracted from intra- and extracellular fractions of Nicotiana
benthamiana suspension cell culture and the effect of kifunensine treatment.
...................................................... ○Yayon Pamula Mukti, Takao Ohashi, Ryo Misaki, Kazuhito Fujiyama（ICBiotech, Osaka Univ.）

16:30

1Ep14

Production and N-glycan analysis of recombinant β-glucocerebrosidase in Nicotiana benthamiana root
culture..................................... ○Naphatsamon Uthailak 1,2, Takao Ohashi 1,2, Ryo Misaki 1,2, Kazuhito Fujiyama 1,2（1 ICBiotech, Osaka Univ., 2 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

16:42

1Ep15

マーカーフリー RDR6 ノックダウン株における外来遺伝子の導入効率および発現効率................................................................................ ○下川 麻優子 1, 三上 達也 2, 梅山 幸子 3, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 千葉大院・融合, 3 千葉大・園芸）

16:54

1Ep16

mRNA の内部切断に関わる配列的特徴の解明..................................................... ○上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃（奈良先端大・バイオ）

17:06

1Ep17

イネの大粒変異の次世代シーケンス解析........................................................................................... ○富田 因則, 土屋 智顕（静大・グリーン研）

17

F 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（13:30～17:30）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
13:30

1Fp01

Enhanced activity and stability of lipase in deep eutectic solvents.................................................................................................. ○Yujin Oh, Sung Hee Kim, Sang Hyun Lee（Dept. Bioeng., Konkuk Univ., South Korea）

13:42

1Fp02

Optimization on biodiesel synthesis from palm oil mill effluent (POME) by integrated strategy with lipasecatalyzed ethanolysis....................... ○Nova Rachmadona 1, Jerome Amoah 1, Shinji Hama 2, Ayumi Yoshida 2, Akihiko Kondo 3,
Chiaki Ogino 1（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Bio-energy Corp., Japan, 3 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.）

13:54

1Fp03

The enhancement of culture conditions for high cell and lipid production of oleaginous yeast Lipomyces
starkeyii D35...... ○Rezky Lastinov Amza 1, Prihardi Kahar 1, Ario Betha Juanssilfero 1,2, Hiromi Otsuka 1, Chie Kihira 1,
Chiaki Ogino 1, Akihiko Kondo 3（ Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., LIPI, Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.）
1

14:06

1Fp04

2

3

Selection of oleaginous yeast capable of high lipid accumulating during challenges from inhibitory chemicalcomplexes........... ○Ario Betha Juanssilfero 1,2, Prihardi Kahar 1, Rezky Lastinov Amza 1, Yopi Yopi 2, Chiaki Ogino 1,
Bambang Prasetya 3, Akihiko Kondo 4（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 LIPI, Indonesia, 3 BSN, Indonesia, 4 Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.）

14:18

1Fp05

海洋珪藻 Fistulifera solaris の代謝改変による高付加価値脂肪酸の効率的生産............................................... ○嶋田 礼迪 1, 松本 光史 2, 野島 大佑 1, 前田 義昌 1, 吉野 知子 1, 田中 剛 1（1 農工大院・工, 2 電源開発）

14:30

1Fp06

Improvement of mass mixing by Max-Blend and anchor shape impeller in the high-solid state scarificationof kraft pulp............................................................... ○Deddy Triyono Nugroho Adi 1, Chiaki Ogino 1, Akihiko Kondo 2（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.）

14:54

1Fp07

遺伝子組換えシアノバクテリアを用いた 1,3-プロパンジオールの高効率連続生産...................... ○武田 真由子 1, 端 瞭太 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 広川 安孝 2, 花井 泰三 2, 村上 明男 3（1 京工繊大院・工芸科学, 2 九大院・農, 3 神戸大院・工）

15:06

1Fp08

合成生物学的手法によるエチレン生成シアノバクテリアの改良.................................................................................... ○神藤 定生 1, 内山 友香 2, 細田 晃文 2, 田村 廣人 2
（1 名城大・理工, 2 名城大院・農）

15:18

1Fp09

気相培養による気生微細藻類 Coelastrella sp. KGU-Y002 のカロテノイドのエステル化...................... ○恩田 岳英, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

15:30

1Fp10

植物 P450 発現大腸菌を用いたモノテルペノイド変換条件最適化........................................................... ○小島 基, 小森 彩, 鈴木 宗典, 中村 克哉（神戸天然物化学(株)）

15:42

1Fp11

組換えコリネ型細菌を用いた 3-アミノ-4-ヒドロキシ安息香酸の発酵生産における酸素制限による促進作用...................................................... ○川口 秀夫 1,2, 宮崎 翔子 2,3, 荻野 千秋 2,3, 大西 康夫 2,4, 近藤 昭彦 1,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 JST・CREST, 3 神戸大院・工, 4 東大院・農生科）

15:54

1Fp12

遺伝子組換え乳酸菌によるコーンコブを原料とした高収率 D-乳酸生産............................................... ○内藤 秋花 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 岡野 憲司 2, 近藤 昭彦 3, 田中 勉 3（1 京工繊大院・工芸科学, 2 阪大院・工, 3 神戸大院・工）

18

16:18

1Fp13

Single cell protein (SCP) production using waste milk as a substrate by flower yeasts...........................................................○ Khin Thandar Myint, Mitsuo Otsuka, Toshiaki Nakajima - Kambe

16:30

1Fp14

赤色酵母を用いた未利用バイオマスからのアスタキサンチン・キシリトール生産................................................................ ○井上 順允, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）

16:42

1Fp15

白色腐朽菌 Trametes versicolor K-41 株による好気的水素産生経路の解析.......................................................... ○髙橋 沙綾 1, 曽我 亜由美 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Tsukuba Univ.）（1 静大院・総合農, 2 静大農・応生科, 3 静大・グリーン研, 4 静大院・創造）
16:54

1Fp16

低温菌を活用したシンプル酵素触媒によるジカルボン酸の効率的生産..................................................... ○中野 翔, 羅 宮臨風, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・先端物質）

17:06

1Fp17

子嚢菌 Talaromyces trachyspermus による多価カルボン酸含有バイオサーファクタントの効率的生産................................................................ ○林 真人, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工・生命工）

17:18

1Fp18

Extracellular pigment production from Talaromyces purpurogenus and their applications.................................................................................. ○Sharad Bhatnagar 1, Takashi Ueno 2, Hideki Aoyagi 1（1 Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2 Dept. Mater. Environ. Eng., Hakodate Natl. Coll.Tech.）

G 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（13:30～17:30）【遺伝子工学】
13:30

1Gp01

大腸菌発現システムを用いた医薬中間体，(R)-2-クロロマンデル酸の新規産生方法....................................................................................... ○山村 栄虎, 北 伸二（協和ファーマケミカル）

13:42

1Gp02

エチレン生成酵素の方向付け進化による耐熱化のためのコハク酸要求性 Thermus thermophilus 変異
体の解析..................................................... ○魚住 昇平, 中山 泰宗, 長濱 一弘, 松岡 正佳（崇城大・生物生命）

13:54

1Gp03

超好熱性アーキア Pyrococcus chitonophagus における遺伝子組換え系の構築......................................... 山田 将大, 中田 菜月, Aslam Mehwish, ○金井 保, 跡見 晴幸（京大院・工）

14:06

1Gp04

メタン酸化細菌 Methylococcus capsulatus (Bath)の効率的なカウンターセレクション法の開発........................................................................................ ○石川 聖人 1, 横江 奨 1, 加藤 創一郎 2, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 産総研・生物プロセス）

14:18

1Gp05

酢酸菌を宿主とした異種タンパク質生産の試み....................................................................................... ○繁 宥樹 1, 東久保 遥 1, 石井 友理 1, 赤坂 直紀 2,
佐古田 久雄 2, 秀瀬 涼太 1, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1
（1 関西学院大院・理工, 2 マルカン酢）

14:30

1Gp06

低温菌 Pseudoalteromonas sp. Sq02 株を宿主とした タンパク質低温分泌生産システムの構築............................. ○河合 総一郎, Puti Wanguyun Aken, 川本 純, 小川 拓哉, 栗原 達夫（京大・化研）

14:54

1Gp07

タンパク質高生産株を選別する遺伝子直列配置型蛍光レポーター法の提案........................................................................................ ○鈴木 宏和 1, 大谷 千晶 1, 奥村 友太 2, 大城 隆 1（1 鳥取大院・工, 2 鳥取大院・持社創生）

15:06

1Gp08

Geobacillus 属で機能する高発現プロモーターを網羅的転写解析で探索する............................................................... ○奥村 友太 1, 坂口 由希菜 2, 倉敷 凌太 2, 大城 隆 2, 鈴木 宏和 2
（1 鳥取大院・持社創生・工, 2 鳥取大・工）

15:18

1Gp09

100 kb を超える枯草菌染色体 DNA セグメントの簡便迅速な接合伝達.................................... ○吉田 健一 1, 宮野 恵 1, 石川 周 1, Miguel-Arribas Andres 2, Meijer Wilfried J. J. 2
（1 神戸大院・科技イノベ, 2 マドリード自治大）

19

15:30

1Gp10

枯草菌スポアの発芽レセプターコンポーネントの機能解析......................................................................................................... ○坂元 仁 1, 古田 雅一 1,2,3, 土戸 哲明 1
（1 大阪府大・微制研, 2 大阪府大・放研セ, 3 大阪府大院・工・量子）

15:42

1Gp11

プラスミドの保持に「非感受性」を示す宿主を利用した新規宿主ベクター系開発の可能性...................................... ○上田 朋美, 河野 響, 水口 千穂, 岡田 憲典, 野尻 秀昭（東大・生物工学セ）

15:54

1Gp12

有用嫌気性菌の遺伝子導入・破壊の効率的検出システム構築............................................................... ○深谷 愛衣 1, 水口 千穂 1, 岡田 憲典 1, 井上 謙吾 2, 野尻 秀昭 1
（1 東大・生物工学セ, 2 宮崎大・農・応生科）

16:18

1Gp13

Visualization of ecdysteroid activities using genetically encoded reporter gene in Daphnia magna.................................................. ○Nikko Adhitama, Yasuhiko Kato, Tomoaki Matsuura, Hajime Watanabe

16:30

1Gp14

チョウザメ由来ナイーブ抗体の応用に向けた抗体遺伝子の配列解析........................................................... ○近藤 秀裕 1, 安本 玖太郎 1, 小祝 敬一郎 1, 平岡 潔 2, 廣野 育生 1

（Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）（1 東京海洋大学, 2 フジキン）
16:42

1Gp15

マウス腸内への定着に寄与するビフィズス菌遺伝子の網羅的同定に向けた INSeq 法の確立.............................................. ○久保 勇貴 1, 中島 森 1, 中川路 伸吾 1, 阪中 幹祥 2, 小椋 義俊 3, 吉本 真 4,
吉田 圭佑 4, 清水 （肖）金忠 4, 小田巻 俊孝 4, 林 哲也 3, 横田 篤 1, 吹谷 智 1（1 北大院・農, 2 石川県大．生資環, 3 九大院・医, 4 森永乳業・基礎研）

16:54

1Gp16

環状 RNA を用いた miRNA とその前駆体の阻害....................................................................................................... ○地白 和樹, 立花 亮（阪市大院・工）

17:06

1Gp17

複合系中の標的 mRNA 直接検出法の開発............................................................................... ○堀尾 京平 1, 大川内 雅彦 1, 高橋 宏和 1, 小堀 俊郎 2,
秋 庸裕 1, 松村 幸彦 3, 中島田 豊 1, 岡村 好子 1
（ 広島大院・先端物質, 2 農研機構, 3 広島大院・工）
1

17:18

1Gp18

環状 RNA にコードしたペプチド生成に関与する要因...................................................................................................................... ○浅野 悠太（阪工大院・工）H 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（13:30～17:30）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
13:30

1Hp01

Dilute maleic acid pretreatment of sugarcane bagasse and oil palm empty fruit bunch fiber for enhanced
enzymatic digestibility............○Lucky Risanto 1,2, Deddy Triyono Nugroho Adi 1,2, Triyani 2, Hiroshi Teramura 1, Euis Hermiati 2,
Chiaki Ogino 1, Akihiko Kondo 1,3（1 Grad. Sch. of Eng., Kobe Univ., Japan, 2 Res. Center for Biomaterials, Indonesian Inst. Sci., Indonesia,
3

13:42

1Hp02

Grad. Sch. Sci., Technol. and Innov, Kobe Univ., Japan）

高活性水蒸気処理と粉砕処理を併用したバイオリファイナリーシステムの開発................................................................................ ○鈴木 昭浩 1, 淺田 元子 2, 佐々木 千鶴 2, 中村 嘉利 2
（1 徳島大院・先端技科, 2 徳島大学・生物資源産業学部）

13:54

1Hp03

高活性水蒸気処理を用いたセルロースナノファイバーの製造とバイオマスコンポジットへの応用................................................................................ ○橋本 和紀 1, 淺田 元子 2, 佐々木 千鶴 2, 中村 嘉利 2
（1 徳島大院・先端技科, 2 徳島大学・生物資源産業学部）

14:06

1Hp04

最少量の低毒性イオン液体を用いたバイオマスからバイオ燃料への High-loading ワンポット変換............................................................... ○杉野 雄規 1, 柘植 陽太 2, 荻野 千秋 3, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術, 3 神戸大院・工・応化）

20

14:18

1Hp05

最少量の低毒性イオン液体を用いた前処理に基づく木質系バイオマスリファイナリー
.............................. ○仁宮 一章 1, Amaliyah Rohsari Indah Utami 2, 柘植 陽太 1, 荻野 千秋 3, 髙橋 憲司 2
（1 金沢大・新学術, 2 金沢大院・自科, 3 神戸大院・工）

14:30

1Hp06

イオン液体前処理と酵素糖化により得られる残渣リグニンの特性評価............................................................... ○江口 真央 1, 杉野 雄規 1, 柘植 陽太 2, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

14:54

1Hp07

木材腐朽菌による加硫天然ゴムの分解.............................................................................................. ○佐藤 伸（公立鳥取環境大学・環境学部）

15:06

1Hp08

白色腐朽菌が有するアルコール発酵能の生理学的役割の解明....................................................................................... ○増田 茜 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1 静大院・総合農, 2 静大・農, 3 静大・グリーン研, 4 静大・創科技院）

15:18

1Hp09

生きた植物からの非破壊糖取出し方法の検討....................................................................... ○米倉 円佳 1, 青木 直大 2, 廣瀬 竜郎 3, 近藤 聡 1, 大音 徳 4（1 トヨタ自動車・アグリバイオ事業部, 2 東大院・農生科, 3 農研機構・中央農研,
4

15:30

1Hp10

トヨタ自動車・T-フロンティア部）

イネいもち病菌 Magnaporthe oryzae 由来セロビオース脱水素酵素と新規ヘム含有膜タンパク質の解析............................................................................... ○本間 陽名 1, 土居 友梨子 1, 松村 洋寿 1, 鮫島 正浩 2,
五十嵐 圭日子 2, 小川 信明 1, 伊藤 英晃 1, 尾高 雅文 1
（1 秋田大院・理工, 2 東大院・農生科）

15:42

1Hp11

Aspergillus aculeatus 由来キシラナーゼの天然バイオマス分解に対する効果......................................................... ○梶本 真由, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）

15:54

1Hp12

磁気細胞アレイ技術を用いたペクチン分解活性評価法の開発.............................................................. ○吉川 真広 1, 石原 真以 2, 清水 一憲 1, 鈴木 宏昭 2, 本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 トヨタ紡織, 3 予防早期医療創生セ）

16:18

1Hp13

異なるストレス条件下における Aquitalea magnusonii H3 のコウキクサ成長促進効果に関する検討........................................... ○多田 三菜美 1, 石澤 秀紘 1, 黒田 真史 1, 井上 大介 1, 森川 正章 2, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 北大院・地環科）

16:30

1Hp14

ウキクサバイオマスの増産へ向けた植物成長促進細菌と阻害細菌との競争関係の解析........................................... ○石澤 秀紘 1, 黒田 真史 1, 井上 加奈子 2, 井上 大介 1, 森川 正章 3, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 阪大・超高圧電顕セ, 3 北大院・地環科）

16:42

1Hp15

好熱菌発酵産物から単離されたエンドファイトが植物の生長に与える影響................................................................ ○金子 由喜 1, 渡邉 凌 2, 井藤 俊行 3, 宮本 浩邦 1,4,5, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 千葉大院・融合, 3 京葉プラントエンジニアリング, 4 サーマス, 5 理研・IMS）

16:54

1Hp16

森林バイオマスの新規利用 -土壌改良効果の検討..................... ○連 綾香 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）

17:06

1Hp17

土壌細菌バイオマス量と地温の関係解析................. ○宇野 貴裕 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）

17:18

1Hp18

土壌環境および植物栽培が土壌微生物叢に及ぼす影響解析................. ○前田 憲慶 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）

21

I 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:30～17:30）【タンパク質工学】
13:30

1Ip01

REIC/Dkk-3 タンパク質の相互作用分子解析と抗がん免疫活性化の分子機構解明............................................................................ ○羽田 彩夏 1, 中川 そらみ 1, 木下 理恵 2, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・自科, 2 岡山大院・医歯薬）

13:42

1Ip02

抗腫瘍関連抗原抗体をバイオマーカーとした高感度測定系の開発................................................................................ ○吉岡 実咲 1, 本莊 知子 1, 木下 理恵 2, 二見 淳一郎 1（1 岡山大院・ヘルスシステム統合科学（工）・蛋白質医用工学, 2 岡山大・医・細胞生物）

13:54

1Ip03

複合免疫療法に向けたがんの抗原性向上に関する基礎検討............................................... ○勝河 祐希 1, 丸山 悠 2, Ahmadi Hannaneh 3, 本莊 知子 1, 二見 淳一郎 1,2,3（1 岡山大院・ヘルスシステム, 2 岡山大・工・化学生命, 3 岡山大院・自然科学）

14:06

1Ip04

変性タンパク質への部位特異的 biotin 化条件の最適化と neoantigen スクリーニングへの応用..................................................................................................... ○峯苫 智晴 1, 垣見 和宏 2, 二見 淳一郎 1（1 岡山大学院・ヘルスシステム, 2 東大病院・免疫細胞治療）

14:18

1Ip05

（講演中止）

14:30

1Ip06

カイコによるマラリア原虫のメロゾイト表面タンパク質の発現とヒト血清との結合............○林谷 美貴子 1, 稲垣 裕 1, Murhandarwati Elsa Heridiana 2, Widya Asmara 2, Vipin Kumar Deo 3,
朴 龍洙 1,4（ 静大院・農・応生化,
1

2Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Universitas Gadjah Mada, Indonesia,
3

14:54

1Ip07

静大・国際連携推進機構, 4 静大・グリーン科技研）

Neospora caninum antigens displaying-virus-like particles as a vaccine candidate against neosporosis....................... ○Jian Xu 1, Rikito Hiramatsu 2, Hamizah Suhaimi 3, Tatsuya Kato 1,2,3, Mayuko Kabayashi 4,
Akari Fujimoto 4, Kazunori Ike 4, Enoch Y. Park 1,2,3（ Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., Grad. Sch. of Integr. Sci. Technol., 3 Grad. Sch. Sci.
1

2

Technol. Shizuoka Univ., 4 Lab. Veter. Parasit., Nippon Veter. Life Sci. Univ.）
15:06

1Ip08

Gag protein displaying different rHA mutants in silkworm........................................ ○Muzajjad Gozal Goffar 1, Vipin Kumar Deo 2, Tatsuya Kato 1,3, Y.Enoch Park 1,3（1 Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2 Office Int’l Collab., Shizuoka Univ.,
3

15:18

1Ip09

Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.）

Study on efficient purification of recombinant protein from the silkworm larval haemolymph targeting
pharmaceutical grade............................................................................................................ ○Robert Minkner 1, Enoch Y. Park 1,2,3（1 Dept. of Biosci., Grad. Sch. of Sci. and Technol., Shizuoka Univ.,
2
3

15:30

1Ip10

Coll. of Agric., Grad. Sch. of Integr. Sci. and Technol. Shizuoka Univ.,

Green Chem. Res. Div., Res. Inst. of Green Sci. and Technol., Shizuoka Univ.）

シリカ粒子形成促進タンパク質「グラシン」の特徴的な領域構造とシリカ形成能............................................................... ○西 美智佳 1, 小林 大起 1, 美藤 友博 2, 有馬 二朗 2, 清水 克彦 3
（1 鳥取大院・農, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大・CoRE）

15:42

1Ip11

イネディフェンシンの Candida albicans に対するアポトーシス誘導効果の解析....................................... ○小川 広大 1, 落合 秋人 1, 福田 美南海 1, 田中 孝明 1, 提箸 祥幸 2, 谷口 正之 1
（1 新潟大・自然研, 2 農研機構・北農研）

15:54

1Ip12

北海道白糠町産植物からの Aβ 凝集阻害物質の探索と機能性評価............................................... ○渡邉 輝 1, 久保 研二 1, 杉村 康司 2, 大場 慶司 3, 上井 幸司 1, 徳樂 清孝 1
（1 室工大院・工, 2 熊大院・薬, 3 東北大院・薬）

22

16:18

1Ip13

麹菌界面活性タンパク質 RolA の固体表面への吸着過程解析.................................................................. ○寺内 裕貴 1, 永山 恵美 1, 田中 拓未 1, 田邊 弘毅 1, 高橋 徹 1,
藪 浩 3, 有田 稔彦 3, 樋口 剛志 3, 阿部 敬悦 1,2（ 東北大院・農, 2 東北大・未来研, 3 東北大・多元研）
1

16:30

1Ip14

高接着性蛋白質 AtaA の反復配列を利用した部分欠損体の構築と機能ドメイン探索...................................................................................... ○青木 壮太 1, 吉本 将悟 1,2, 石川 聖人 1, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 名大・VBL）

16:42

1Ip15

シアノバクテリアの分子シャペロンパラログの生化学的解析....................................................................................... ○仲本 準, 山口 湧己（埼玉大院・理工・分子）

16:54

1Ip16

Effect of pH change on the function of a transcriptional regulator in acetic acid bacteria.............................. ○Afi Candra Trinugraha 1, Yuri Ishii 1, Yuki Shige 1, Naoki Akasaka 2, Wakao Fukuda 1,
Shinsuke Fujiwara 1（1 Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2 Marukan Vinegar Co., Ltd.）

17:06

1Ip17

複数発現でのみ機能発現する走化性センサータンパク質の特性化...... ○堀 雄一, 緋田 安希子, チュンチャイ マッタナ, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・先端物質）

17:18

1Ip18

カルボキシソーム外殻タンパク質 CcmO の機能解析............................................................................... ○中村 隆太郎 1, 中口 雄貴 2, 三木 智寛 2, 松村 洋寿 1,
福谷 洋介 2, 野口 恵一 2, 養王田 正文 2, 尾高 雅文 1,2（1 秋田大院・理工, 2 農工大院・工）J 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:30～17:30）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
13:30

1Jp01

好熱菌発酵産物の給与が Sod1 ノックアウトマウスに与える影響.................................................................. ○鷺 陽香 1, 戸田 年彦 2, 小澤 裕介 2, 加藤 完 3, 中西 裕美子 3,
大野 博司 3, 宮本 浩邦 1,3,4, 清水 孝彦 2, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 千葉大院・医, 3 IMS 理研, 4 サーマス）

13:42

1Jp02

吉草酸を産生するブタ排泄糞由来の乳酸資化菌 Megasphaera elsdenii Y2 株の有機酸代謝の特徴............................................................ ○荒岡 亮祐 1, 吉川 翔太 2, 井藤 俊行 3, 宮本 浩邦 1,4,5, 児玉 浩明 1
（1 千葉大院・園芸, 2 千葉大院・融合, 3 京葉プラントエンジニアリング, 4 理研・IMS, 5 サーマス）

13:54

1Jp03

好熱菌発酵産物の給与がブタ腸内の乳酸資化菌 Megasphaera elsdenii の多様性に与える影響...................................................... ○板谷 かえで 1, 吉川 翔太 2, 新名 俊仁 3, 宮本 浩邦 2,4,5, 児玉 浩明 1,2（1 千葉大・園芸, 2 千葉大院・融合, 3 京葉プラントエンジニアリング, 4 サーマス, 5 理研・IMS）

14:06

1Jp04

Target-AID を利用したゲノム編集による高収率ブタノール発酵性クロストリジウム属微生物の育種................................................................... ○向山 正治 1, 市毛 栄太 1, 田中 勉 2, 西田 敬二 3, 近藤 昭彦 3
（1 日本触媒, 2 神戸大院・工, 3 神戸大院・科技イノベ）

14:18

1Jp05

Influence of pH controllers on alginate beads containing co-immobilized Clostridia during acetic acidfermentation........................................................................Siew Thing Phang, ○Harifara Rabemanolontsoa, Shiro Saka
（Dept. Socio-environment Energy Sci., Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.）

14:54

1Jp07

光駆動 ATP 再生系による Vmax 細胞の創製.................................. 弘埜 陽子 1, 戸谷 吉博 2, 叶 暁亭 3, 石井 純 3, 柘植 謙爾 3, 松田 史生 2, ○原 清敬 1
（1 静県大院・食栄環・環境科学, 2 阪大院・情報・バイオ情報, 3 神戸大院・イノべ）

15:06

1Jp08

ロドプシンを利用した大腸菌における光駆動 ATP 再生............................................... ○鎌田 健太郎 1, 戸谷 吉博 1, 弘埜 陽子 2, 原 清敬 2, 松田 史生 1, 清水 浩 1（1 阪大院・情報・バイオ情報, 2 静岡県大院・食品栄養環境・環境科学）

23

15:18

1Jp09

代謝動態制御を介して菌体集団規模を制御する Quorum Sensing 型遺伝子回路の構築とメタボロー
ム解析による機能評価.................... ○相馬 悠希 1,2, 篠原 玉樹 2, 藤原 由梨 2, 角田 一真 2, 秦 康祐 2, 和泉 自泰 1,2, 馬場 健史 1,2（1 九大・生医研, 2 九大院・シス生科）

15:30

1Jp10

チロシンの水酸化反応を最適化することによるベンジルアルカロイド生産大腸菌プラットフォーム
株の改良.......................... ○中川 明, 松村 栄太郎, 八島 悠里乃, 高尾 美月, 南 博道（石川県大・生物資源研）

15:42

1Jp11

大腸菌による L-theanine の発酵生産法の開発............ ○大野 翔登, 林 幹朗, 田畑 和彦（協和発酵バイオ・リサーチ＆イノベーションセンター）

15:54

1Jp12

Metabolic engineering of Escherichia coli for production of shikimate pathway derivatives............................................... ○Ryosuke Fujiwara 1, Shuhei Noda 2, Tsutomu Tanaka 1, Akihiko Kondo 1,2,3（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 BMEP, RIKEN, 3 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.）

16:18

1Jp13

海水培養が可能なシアノバクテリアへの亜リン酸資化能の付与..................................................................... ○堀川 凌平 1, 本村 圭 1,2, 神原 亮大 1, 戸田 成美 1, 池田 丈 1,
石田 丈典 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1,2, 廣田 隆一 1,2（1 広島大院・先端物質, 2 JST・ALCA）

16:30

1Jp14

亜リン酸依存性を利用したシアノバクテリアのバイオセーフティ技術....................................................................... ○佐野 公亮 1, 本村 圭 1,2, 神原 亮大 1, 渡辺 智 2,3, 池田 丈 1,
石田 丈典 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1,2, 廣田 隆一 1,2（ 広島大院・先端物質, 2 JST・ALCA, 3 東農大院・農）
1

16:42

1Jp15

藍藻由来亜リン酸デヒドロゲナーゼの酵素学的諸性質と選択培養技術への応用......................................................................................... ○本村 圭 1,2, 神原 亮大 1, 堀川 凌平 1, 池田 丈 1,
石田 丈典 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1,2, 廣田 隆一 1,2（1 広島大院・先端物質, 2 JST-ALCA）

16:54

1Jp16

ラン藻窒素代謝メカニズムの解明と物質生産への応用................................................................ ○見市 絢香, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

17:06

1Jp17

動的代謝モデルアンサンブルを用いたエタノール生産シアノバクテリアの代謝工学..................................................................... ○西口 大貴, 永井 暉, 松田 史生, 清水 浩（阪大院・情報）

17:18

1Jp18

シアノバクテリア中心炭素代謝における光量変化時の短期応答の解析.............................................. ○丸山 正晴, 西口 大貴, 豊島 正和, 松田 史生, 清水 浩（阪大院・情報）

K 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:30～17:30）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
13:30

1Kp01

油脂生産酵母 Rhodosporidium toruloides の炭素源応答解析.................................................................. ○岩本 孝信 1, 高見沢 健留 1, Pham Khanh Dung 1, 志田 洋介 1,
荒 学志 2, 山崎 晴丈 2, 高久 洋暁 2, 小笠原 渉 1（1 長岡技科大, 2 新潟薬大・応生命）

13:42

1Kp02

バイオエタノール生産に向けた耐熱性酵母 Kluyveromyces marxianus の特性解析及び糖資化能............................................................................. ○阿部 拓哉 1, 廣田 潤哉 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1 山口大院・創成科学・化学系, 2 山口大・中高温微生物セ, 3 山口大・生命医工セ）

13:54

1Kp03

酵母を利用した S-アリル-L-システイン生成可能性検討.......................................... ○辻 史忠, 山本 英樹, 山岸 一雄, 菅原 誠吾, 小寺 智博（味の素株式会社）

14:06

1Kp04

油脂酵母 Lipomyces starkeyi D35 株の 繰り返し発酵による脂肪酸組成変化解析.............................................................................. ○宮本 捺央 1, Kahar Prihardi 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ）

24

14:18

1Kp05

組換え出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae によるキシロースからのグルタチオン生産...................... ○小林 淳平, 佐々木 大介, 番場 崇弘, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

14:30

1Kp06

Moniliella megachiliensis を用いた廃グリセリンからのエリスリトール発酵生産 ～バイオベース C4ケミカルズ生産プラットフォーム構築への試み～.................... ○村上 紀里子 1, 東田 英毅 1, 岩田 悠志 2, 渡邉 泰祐 2,3, 荻原 淳 2,3, 春見 隆文 2,3, 新井 隆 4（1 ちとせ研究所, 2 日大生資科・生命化, 3 日大院生資研究科・生資利用, 4 ダイセル）

14:54

1Kp07

CRISPR-Cas9 システムによるラビリンチュラ類オーランチオキトリウム属の脂質生産性の改変.................................................................. ○畑 浩介 1, 青井 真人 1, 渡邉 研志 1, 北堀 智希 1, 高橋 宏和 1,
岡村 好子 1, 松山 恵介 2, 黛 新造 3, 秋 庸裕 1
（ 広島大院・先端物質, 2 長瀬産業, 3 出光興産）
1

15:06

1Kp08

Growth, lipid and metabolite profile analysis of Aurantiochytrium limacinum SR21 grown on acetate-based
medium for biotechnological applications....................................... ○Charose Marie Ting Perez, Ran Hirotani, Kenshi Watanabe, Yoshiko Okamura,
Yutaka Nakashimada, Tsunehiro Aki（Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.）

15:18

1Kp09

界面バイオプロセスを用いた香気性ラクトンの生産........................................................................................ ○大澤 果穂 1, 杉本 恭子 2, 寺西 綾香 2, 小田 忍 2（1 金工大院・工, 2 金工大・ゲノム研）

15:30

1Kp10

乳酸高生産性黄麹菌における乳酸生産フラックス強化による乳酸生産性の向上........................................................... ○張 斯来 1, 若井 暁 1, 荻野 千秋 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大院・工, 3 月桂冠・総研）

15:42

1Kp11

脱デンプン小麦フスマ培養における麹菌へミセルラーゼの生産...................... ○和田 竜之介, 山形 雄一郎, 高橋 奈津美, 卜部 喬史, 尾関 健二（金工大・ゲノム研）

15:54

1Kp12

gSELEX 法による糸状菌の分化に関与する転写因子の DNA 結合配列の同定............................................... 藤井 陽平 1, 岡 大椰 2, 片山 琢也 1, 兒島 孝明 2, 中野 秀雄 2, ○丸山 潤一 1
（1 東大院・農生科・応生工, 2 名大院・生命農学）

16:18

1Kp13

イメージング質量分析を用いたショウジョウバエ体内におけるイミダクロプリド可視化手法の確立............................................................................ ○大津 誠太郎 1, 山口 政光 2, 福﨑 英一郎 1, 新間 秀一 1（1 阪大院・工, 2 京工繊大・工芸科学）

16:30

1Kp14

イメージング質量分析を用いたショウジョウバエ幼虫体内の神経伝達物質の可視化法の開発................................................................................ ○榎本 陽介 1, 山口 政光 2, 福﨑 英一郎 1, 新間 秀一 1（1 阪大院・工, 2 京工繊大・工芸科学）

16:42

1Kp15

バルブスイッチング LC-MS/MS に基づくキラルアミノ酸の多検体分析.................................................................................... ○中野 洋介, 馬越 泰, 福﨑 英一郎（阪大院・工）

16:54

1Kp16

ガスクロマトグラフィー負化学イオン化質量分析法を用いた糖リン酸新規分析法の構築と 13C 代謝
フラックス解析への応用............................................. ○岡橋 伸幸 1, 前田 昂亮 1, 川名 修一 2, 飯田 順子 2,3, 清水 浩 1, 松田 史生 1
（1 阪大院・情報, 2 島津製作所, 3 阪大院・工）

17:06

1Kp17

質量分析のダイナミックレンジ拡張技術の開発とメタボロミクスへの応用............................................................... ○中山 泰宗 1, 和泉 自泰 2, 長濱 一弘 1, 松岡 正佳 1, 馬場 健史 2
（1 崇城大院・工, 2 九大・生医研）

17:18

1Kp18

Automated data processing for quality monitoring of biotherapeutics by multiple attribute methods (MAMs)................................................................................................................. ○Naohiko Heida（Genedata KK）

25

L 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:30～17:18）【バイオセンシング，分析化学／センサー，計測工学】
13:30

1Lp01

金ナノ粒子―量子ドットのプラズモン共鳴現象を用いたノロウイルス RNA 検出法................................................................. ○森田 真広 1, Jaewook Lee 2, Oluwasesan Adegoke 2, 朴 龍洙 1,2（1 静大院・総科研・農, 2 静大・グリーン科技研）

13:42

1Lp02

A label free sensing system for the detection of Dengue virus serotype............................. ○Ankan Dutta Chowdhury 1, Nasrin Fahmida 2, Kenshin Takemura 2, Indra M. Khoris 3,
Jaewook Lee 1, Enoch Y. Park 1,2（ Lab. Biotech., Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ, Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.,
1

2

3

13:54

1Lp03

Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integrat. Sci. Technol.）

Silver-enhanced colorimetric detection of norovirus-like particles using peroxidase-like activity ofnanozyme................ ○Indra M. Khoris 1, Kenshin Takemura 2, Jaewook Lee 3, Vipin Kumar Deo 4, Tetsurou Suzuki 5,
Enoch Y. Park 1,2,3（ Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
12
3

Dept. Biosci., Grad. Sch. Biosci. Technol., Shizuoka Univ.,

Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4 Office Inter’l Collab., Shizuoka Univ,,
5

14:06

1Lp04

Dept. Infect. Dis., Hamamatsu Univ. Sch. Med.）

Magnetofluoro-immunosensing system by using plasmonic/magnetic graphene for virus detection................................................................................ ○Jaewook Lee 1, Kenshin Takemura 2, Enoch Y. Park 1,2（1 Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2 Grad. Sch. Integ. Sci. Technol., Shizuoka Univ.）

14:18

1Lp05

磁気分離免疫蛍光ナノバイオセンサーを用いた糞便中からのノロウイルス高感度・迅速検出.......................................................... ○竹村 謙信 1, 李 在郁 2, Vipin Kumar Deo 3, 鈴木 哲朗 4, 朴 龍洙 1,2（1 静大・創科技院, 2 静大・グリーン科技研, 3 静大・国際連携推進機構, 4 浜医大・医・医学科）

14:30

1Lp06

Highly sensitive detection of norovirus-like particles using LSPR behavior of CdSeTeS QDs and AuNPs.................................. ○Fahmida Nasrin 1, Ankan Dutta Chowdhury 2, Kenshin Takemura 1, Jaewook Lee 2,
Oluwasesan Adegoke 2, Vipin Kumar Deo 3, Tetsuro Suzuki 4, Enoch Y. Park 1,2（1 Lab. Biotech., Grad. Sch. Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
2
3Lab. Biotech., Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.,

Office Inter’l Collab., Shizuoka Univ, 4 Dept. Infect. Dis., Hamamatsu Univ. Sch. Medicine）

14:54

1Lp07

Gel-based cell manipulation 法に基づく環境微生物の単一細胞解析技術の開発......................................................................... ○茅 逸皓, 根岸 諒, 田中 剛, 吉野 知子（農工大院・工）

15:06

1Lp08

（講演中止）

15:18

1Lp09

バイオナノカプセル整列固定化技術による DNA アプタマーセンサーの高感度化............................................ ○山田 裕紀 1, 飯嶋 益巳 1,2, 黒田 俊一 1（1 阪大・産研, 2 東農大・応生科）

15:30

1Lp10

DNA ナノ構造体修飾ビーズを用いた標的核酸のイメージング検出......................................................... ○吉田 知哲, 池田 丈, 石田 丈典, 廣田 隆一, 黒田 章夫, 舟橋 久景

15:42

1Lp11

段階的な酵素反応に基づいた抗体結合タンパク質含有ポリマーの固相基板上での調製技術の開発......... 宮尾 寛樹 1, 上村 侑太郎 1, ○末田 慎二 1,2（1 九工大院・情報工・生命情報, 2 九工大・RCBT）

15:54

1Lp12

酵母細胞における生理活性物質メラトニンをモニタリングするための G タンパク質共役型受容体（広島大院・先端物質）（GPCR）を用いたメタボライトセンサの開発.............................. ○田畑 琢也, 中村 泰之, 加藤 寛子, 近藤 昭彦, 石井 純（神戸大院・科技イノベ）

26

16:18

1Lp13

A potentiometric plant condition monitoring method..................... ○Tae Hang Yoon 1, Hak Jin Song 1, Kwang Jin Kim 2, Yong-Keun Choi 1, Wu-Young Jeong 1,
Ji Eun Kim 1, Sang Hyun Lee 1, Yung-Hun Yang 1, Hyung Joo Kim 1（ Dept. Biological eng., Konkuk Univ., Natl. Horticultural Res. Inst., Rural Development Administration.）
1

16:30

1Lp14

2

高性能バイオデバイスを目指したカーボンナノチューブ配向電極の開発............................................................ ○藤原 郁也 1, 大池 智明 1, 松崎 祥平 1, 坂元 博昭 1,2, 末 信一朗 1,2（1 福井大院・工・繊維, 2 福井大学・生命セ）

16:42

1Lp15

緩和時間プロファイリングとデータ駆動型アプローチによる魚肉特性評価............................................. ○伊達 康博 1,2, 魏 菲菲 1, 坪井 裕理 1, 清水 智子 1, 坂田 研二 1, 菊地 淳 1,2,3（1 理研・CSRS, 2 横市院・生医, 3 名大院・生命農）

16:54

1Lp16

血漿メタボロミクスに資する固相誘導体化法を用いた GC/MS 分析法の開発............................................................................ ○新川 翔也 1, 佐々野 僚一 2, 古野 正浩 1, 福﨑 英一郎 1（1 阪大院・工, 2 アイスティサイエンス）

17:06

1Lp17

光切断性ペプチドアレイと質量分析計を組み合わせた新規アッセイ法による，2 種プロテアーゼ間の切断同等性評価............................................. ○栗本 昌樹 1, 久保 智里 1, 清水 一憲 2, 越智 浩 1, 阿部 文明 1, 本多 裕之 2,3（1 森永乳業, 2 名大院・工, 3 名大・予防早期医療創生セ）

M 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:30～17:30）【酵素学，酵素工学】
13:30

1Mp01

亜硝酸酸化細菌における Toxin-Antitoxin 機構の生理学的意義の考察....................................... ○葵 理恵 1,2, 宮本 龍樹 1,2, 横田 亜紀子 2, 大田 悠里 1,2, 常田 聡 1, 野田 尚宏 1,2（1 早大院・先進理工, 2 産総研・バイオメディカル）

13:42

1Mp02

Streptomyces sp. NT1 株由来 L-グルタミン酸オキシダーゼのフルコンセンサス設計による耐熱性の向上....................................................................................... ○齋藤 貴広 1, 久保田 瞳 1, 林 優花 2, 中野 祥吾 3,
伊藤 創平 3, 浅野 泰久 4, 酒瀬川 信一 5, 杉森 大助 1,2（1 福島大・共生システム理工, 2 福島大院・理工, 3 静県大・食栄, 4 富山県大・生工研セ,
5

旭化成ファーマ）

13:54

1Mp03

リンゴ酸デヒドロゲナーセの Closed 構造不安定化による比活性の向上および低温適性化............................................................................................... ○下澤 勇弥, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）

14:06

1Mp04

メカノエンザイム・ダイナミン GTPase によるアクチン線維束化機構の解析........................................... ○山田 浩司 1, 阿部 匡史 1, 竹田 哲也 1, 高島 英造 2, 森田 将之 2, 竹居 孝二 1（1 岡山大院・医歯薬, 2 愛媛大・プロテオサイエンスセンター）

14:18

1Mp05

イオン液体を用いた標識酵素を含む各種酵素に対する長期安定性・高温耐熱性の評価................................................................................................... ○金子 恒太郎, 河合 功治（ミヨシ油脂）

14:30

1Mp06

Chamaemelum nobile および Durio zibethinus 由来のアルコールアシルトランスフェラーゼの精製と酵素化学的諸性質の解明......................................................... ○大島 遼太郎 1, 吉川 千晶 1, 森 利明 1, 加藤 康夫 1, 七田 沙耶香 1,2,
礒部 公安 1,2, 元島 史博 1,2, 石田 裕幸 1,2, 浅野 泰久 1,2（1 富山県大・工, 2 JST, ERATO）

14:54

1Mp07

ハロアルキル有機リン酸トリエステル加水分解酵素中のシグナル様ペプチドの機能解析.............................................. ○今野 聖矢, 今井 俊宏, 阿部 勝正, 高橋 祥司, 解良 芳夫（長岡技科大）

15:06

1Mp08

変異型ハロアルキル有機リン酸トリエステル加水分解酵素の大腸菌発現系の構築と諸特性解析................................................................. ○阿部 勝正, 田中 成美, 高橋 祥司, 解良 芳夫（長岡技科大）

27

15:18

1Mp09

イノシトール遊離能をもつフィターゼ Phy9-3B の触媒機構の解析............................................................... ○武生 みのり 1, 佐々木 海 1, 尾瀬 農之 2, 阿部 歩 1, 曾根 輝雄 1
（1 北大院・農, 2 北大院・生命科学）

15:30

1Mp10

シトクロム P450BM3 と酵素活性化分子を利用した大腸菌内でのベンゼンの直接酸化.................................................................................. ○唐澤 昌之 1, 柳澤 颯太 1, 荘司 長三 1,2, 渡辺 芳人 3
（1 名大院・理, 2 JST CREST, 3 名大・物国セ）

15:42

1Mp11

ゴマ由来セサミノール配糖体特異的な新規配糖体化酵素の機能解析.................................. ○及川 大樹 1, 和氣 駿之 1, 小埜 栄一郎 2, 村田 純 3, 白石 慧 3, 堀川 学 3, 中山 亨 1（1 東北大院・工, 2 サントリーグローバルイノベーションセンター, 3 サントリー生命科学財団）

15:54

1Mp12

The additional N-terminal domain of the beta-propeller phytase of Pseudomonas sp. FB15 serves to increase
low-temperature activity and catalytic efficiency............................................................................. ○WonJe Jang, Hae Dae Park, Yu Bin Choi, In-Soo Kong
（Dept. Biotechnol., Pukyong Natl. Univ., Busan, Republic of Korea）

16:18

1Mp13

Methylobacterium extorquens AM1 のランタノイド依存型メタノールデヒドロゲナーゼの解析............................................... 吉川 友理 1, 北村 純一 1, 矢野 嵩典 1, 中川 智行 2, 谷 明生 3, ○三井 亮司 1
（1 岡山理大・理, 2 岐阜大・応生科, 3 岡山大・資源植物科研）

16:30

1Mp14

光化学系 II 再構成メタンモノオキシゲナーゼ膜画分を用いたメタン酸化反応..................................................... 近藤 龍一, 森 史也, 伊藤 栄紘, ○蒲池 利章（東工大院・生命理工）

16:42

1Mp15

Clostridium cellulovorans 743B 由来エンドグルカナーゼＥの酵素学的諸性質................................................................................................... ○幸崎 涼, 三宅 英雄（三重大院・生資）

16:54

1Mp16

バイオマス分解酵素の大規模スクリーニングで見出した希少放線菌.................... ○竹中 武藏 1, Lee Jae Min 2, Pamella Apriliana 2, 柏木 紀賢 1, Prihardi Kahar 1, 荻野 千秋 2,
近藤 昭彦 1
（ 神戸大院・科技イノベ, 神戸大院・工）
1

2

17:06

1Mp17

リン酸化合物加水分解酵素フィターゼの活性に重要なループ領域の変異解析............................................................................ ○和田 愛未, 林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）

17:18

1Mp18

海藻多糖由来の新しい希少糖であるアルギン酸デオキシ糖の製造方法.............. ○三宅 英雄 1, 村瀬 祥光 1, 濱地 野乃香 2, モリ テツシ 3, 田中 礼士 1, 植田 充美 4, 柴田 敏行 1
（1 三重大院・生資, 2 三重大・生資, 3 農工大院・工, 4 京大院・農）N 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（13:30～17:30）【分類，系統，遺伝学／環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術】
13:30

1Np01

運動性乳酸菌の選択分離法の構築.................................................................... ○田中 悠二, 柳田 藤寿, 乙黒 美彩（山梨大生・ワイン研）

13:42

1Np02

低温菌シンプル酵素触媒の宿主とその培養に関する基盤的解析.......................................................... ○鴨木 明子 1, 田島 誉久 1, 小西 正朗 2, 八久保 晶弘 2, 坂上 寛敏 2,
南 尚嗣 2, 山下 聡 2, 中島田 豊 1, 加藤 純一 1
（1 広島大院・先端物質, 2 北見工大）

13:54

1Np03

コリネ型細菌におけるトキシン/アンチトキシン系の解析........................................................................................................... ○田中 裕也 1, 前田 智也 2, 乾 将行 1,3（1 RITE, 2 理研・生命システム, 3 奈良先端大・バイオ）

14:06

1Np04

コリネ型細菌におけるトレハロース‐6‐リン酸合成酵素のフィードバック阻害........................................................................○生出 伸一 1, 乾 将行 1,2（1 RITE, 2 奈良先端大・バイオ）

14:18

1Np05

コリネ型細菌における ECF シグマ因子の認識プロモーター配列の解析........................................................................○豊田 晃一 1, 乾 将行 1,2（1 RITE, 2 奈良先端大・バイオ）

28

14:30

1Np06

光照射により誘導される葉面細菌の色素生産......................................... ○井口 博之, 金ヶ崎 三千翔, 石井 沙弥, 田口 和真（京都学園大・バイオ）

14:54

1Np07

Lipomycetaceae 科酵母の国内各地における種分布及び新種について...................................................................................................................... ○山崎 敦史（NITE・NBRC）

15:06

1Np08

白神こだま酵母における経時寿命の制御メカニズムの解析.............................................................. ○中沢 伸重 1, 高橋 慶太郎 2（1 秋田県大・生資, 2 秋田総食研）

15:18

1Np09

糸状菌の鉄恒常性維持に関与する転写因子 HapX の C-末端ドメインの機能解析.......................................... ○辻上 誠也, 山下 美春, 村田 俊輔, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大院・農）

15:30

1Np10

ジャンボファージ RSP13 の特殊なゲノム DNA の解析.................................................................. ○川崎 健, Meslhi Alaaeldin, 山田 隆（広島大院・先端物質）

15:42

1Np11

宿主染色体上のプロファージの有無によるプラスミド保持株の fitness 変化..............○Pham Thi Kim Dung 1, Le Thi Thanh Thu 1, 森内 良太 2, 道羅 英夫 2, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1
（1 静大院・総合科技, 2 静大グリーン研）

15:54

1Np12

好気・微好気・嫌気条件下におけるプラスミドの接合伝達性の比較.......................................................... ○越智 健太郎 1, 柳谷 洸輔 1, 大熊 盛也 2, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1,2（1 静大・工, 2 理研・BRC-JCM）

16:18

1Np13

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株の合成化合物分解における不安定化要因の探索..................... ○村上 将和 1, 村澤 友紀恵 1, 松村 吉信 1,2（1 関西大・生命生物工, 2 関西大・ORDIST）

16:30

1Np14

Pseudomonas sp. KU-51 株のニトロフェノール分解系遺伝子の解析............................................................................ ○劉 雅軒, 岩木 宏明, 長谷川 喜衛（関西大・化生工）

16:42

1Np15

ビスフェノール A を特異的に吸着する微生物を用いた排水処理系の機能強化.......................................... ○青木 好辰, 市村 栄諭, 遠山 忠, 田中 靖浩, 森 一博（山梨大院・医工総）

16:54

1Np16

Pseudomonas sp. TB-98 株によるテレフタル酸からのプロトカテク酸の生産................................................................... ○金森 拓 1, 中島 鈴佳 1, 岡村 匡浩 2, 内堀 孝博 3, 中島 敏明 1
（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大, 3 パナック工業）

17:06

1Np17

Indoor airborne toluene removal activity of Pseudomonas putida with plant, Solanum lycopersicum.............................. ○Hak Jin Song 1, Wu-Young Jeong 1, Tae Hang Yoon 1, Ji Eun Kim 1, Kwang Jin Kim 2,
Sang Hyun Lee 1, Yung-Hun Yang 1, Hyung Joo Kim 1（1 Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2 Natl. Horticultural Res. Inst., Rural Development Administration）

17:18

1Np18

ノニルフェノール酸化酵素遺伝子を用いたビスフェノール S の完全無機化の取り組み.............................. ○武尾 正弘, 近成 直斗, 栗岡 純平, 猪野 椋太, 根来 誠司（兵県大院・工・応化）

O 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（13:30～17:30）【生体医用工学／セル＆ティッシュエンジニアリング】
13:30

1Op01

多糖高分子を用いたペプチドハイブリッド足場材料の構築と評価.............................. ○王 悦 1, 蟹江 慧 1, 金子 喬士郎 1, 緒方 藍歌 2, 成田 裕司 2, 竹澤 俊明 3, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬, 2 名大院・医, 3 農研機構）

13:42

1Op02

放射線架橋ポリビニルアルコールゲル上で培養した神経幹細胞／前駆細胞の接着関連分子の発現解析............................................................................................ ○森 英樹, 中村 泰斗, 原 正之（阪大院・理）

13:54

1Op03

光増感色素固定化培養基材を用いて培養したラット間葉系幹細胞の生存・分化の解析........................................................................................ ○八木 秀郁, 森 英樹, 原 正之（阪府大院・理）

14:06

1Op04

ヒトリンパ球への高効率遺伝子導入に向けたシリコンナノニードル表面における核酸の吸脱着制御......................................................................................... ○本多 裕基 1, 山岸 彩奈 2, 金 賢徹 1,2, 中村 史 1,2（1 農工大院・工, 2 産総研・バイオメディカル）

29

14:18

1Op05

ディッシュと不織布で増殖した間葉系幹細胞の細胞外マトリックス量の比較................................................................................................ ○傅 博, 藤原 政司, 高木 睦（北大院・工）

14:30

1Op06

Polycaprolactone nanoparticles for evaluation of the collagen synthesis............ ○David Wu-Young Jeong 1, Hak Jin Song 1, Woo Sung Lee 2, Sok Young Shim 2, Hyeon Jin Jeon 2,
Tae Hang Yoon 1, Ji Eun Kim 1, Sang Hyun Lee 1, Yung-Hun Yang 1, Hyung Joo Kim 1（1 Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2 Roselab）

14:54

1Op07

毛細血管様構造を有するスフェロイドをバイオ 3D プリンターにより積層した三次元組織の生・死細胞ならびに毛細血管様構造の分布の解析..................................... ○稲垣 慶一 1, 高橋 憲司 2, 仁宮 一章 2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

15:06

1Op08

がん細胞を含む多細胞スフェロイドをバイオ 3D プリンターにより配置した三次元組織の作製..................................... ○谷内 達彦 1, 高橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

15:18

1Op09

脂肪由来間葉系幹細胞のスフェロイドをバイオ 3D プリンターにより積層した三次元組織の作製とその分化............ ○神並 美華 1, 高橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大学 新学術創成研究機構）

15:30

1Op10

接着細胞の自己集合化誘導剤を用いた幹細胞凝集塊の新規作製法の開発と評価....................................... 草加 直幸 1,2, 浅見 優月 1,2, 安部 菜月 3, 広井 佳臣 4, 西野 泰斗 3, ○岩井 良輔 1
（1 岡山理大・技科研, 2 岡山理大・工, 3 日産化学工業（株）・生物科学研,
4

日産化学工業（株）・工・材料科学研）

15:42

1Op11

肝細胞スフェロイドに短期間で細胞極性を付与する方法の開発..................... ○小島 伸彦 1, 田尾 文哉 1, 青木 茂久 2（1 横市大院・生命ナノシステム, 2 佐賀大・医）

15:54

1Op12

培養デバイス TASCL による神経細胞スフェロイドの構築................................................................................................... ○宮本 義孝, 池内 真志（東大・先端研）

16:18

1Op13

胚様体形成期間中の CHIR99021 処理濃度がヒト iPS 細胞の心筋細胞分化誘導に与える影響........................................................................ ○依田 聖未, 大貫 喜嗣, 黒澤 尋（山梨大院・統合応生）

16:30

1Op14

iPS 細胞由来運動神経を利用した神経筋接合を有する三次元筋組織の構築................................................................. ○吉岡 貫太郎, 井藤 彰, 河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）

16:42

1Op15

毛包を有する皮膚組織の作製.................................................................................... ○楯 芳樹, 景山 達斗, 福田 淳二（横国大院・工）

16:54

1Op16

不飽和カルボニル化合物が血管構成細胞に及ぼす影響の解明.................................................................... ○東 恒仁, 眞井 洋輔, 真崎 雄一（北大院・医・細胞薬理）

17:06

1Op17

培養骨格筋組織の形状および機能の維持に適した FBS 濃度の探索.................................................................................... ○長谷 洸輝 1, 堀江 正信 2, 藤田 英明 3, 長森 英二 4（1 阪工大・工・生命, 2 京大・RIRC, 3 早大・WABIOS, 4 阪工大院・工）

17:18

1Op18

過酸化水素が培養骨格筋細胞の構造と機能に影響を与える濃度域の検証........................................................................................ ○前 佳佑 1, 堀江 正信 2, 藤田 英明 3, 長森 英二 4（1 阪工大・工・生命, 2 京大・RIRC, 3 早大・WABIOS, 4 阪工大院・工）30

ランチョンセミナー
1LS1 株式会社島津製作所
LS1 会場

第 4 学舎4 号館 2 階（11:45～12:45）

1LS2 エッペンドルフ株式会社
LS2 会場

第 4 学舎4 号館 2 階（11:45～12:45）

1LS3 ノバ・バイオメディカル株式会社
LS3 会場

第 4 学舎2 号館 5 階（11:45～12:45）

31

第 2 日（9 月 6 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

受賞講演（生物工学奨励賞（江田賞・斎藤賞・照井賞），生物工学アジア若手賞）
C 会場
13:30

A2Cp01

第 4 学舎3 号館 2 階（13:30～13:50）
座長：吉田 聡〈生物工学奨励賞（江田賞）〉

ビール醸造における微生物検査法の迅速化に関する研究.......................................................................................................................... ○浅野 静（アサヒビール）

M 会場
13:30

A2Mp01

第 4 学舎 2 号館 3 階（13:30～13:50）
座長：高木 博史

〈生物工学奨励賞（斎藤賞）〉

好熱性酵素を用いた細胞外人工代謝経路の構築と利用に関する先駆的研究.......................................................................................................................... ○本田 孝祐（阪大院・工）

F 会場
13:30

A2Fp01

第 4 学舎 2 号館 1 階（13:30～13:50）
座長：田口 精一

〈生物工学奨励賞（照井賞）〉

機能性磁性ナノ粒子の開発と医療技術への応用に関する生物工学的研究.............................................................................................................................. ○井藤 彰（九大院・工）

H 会場
13:30

A2Hp01

第 4 学舎 2 号館 2 階（13:30～13:50）〈生物工学アジア若手賞〉

座長：跡見 晴幸

Exploration of lignocellulose degrading enzymes from hidden bioresource for biorefinery and green
industries..................................................................................................................................... ○Verawat Champreda（Natl. Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Thailand）

32

一般講演（午前の部）

C 会場 第 4 学舎 3 号館 2 階（9:00～11:36）【食品科学，食品工学】
9:00

2Ca01

LC/ESI-MS/MS を用いた玄米米糠麹 (FBRA) 中ポリアミンの定量と製造過程における含有変動解析................ ○堀江 裕紀子 1,3, 後藤 綺花 2, 伊藤 麻里 3, 津吹 澄 2, 池川 繁男 4, 小川 祥二郎 1,2, 東 達也 1,2（1 東理大院・薬, 2 東理大・薬, 3 コーケン, 4 玄米酵素）

9:12

2Ca02

トランスクリプトミクスによるキトサン処理時のバナナ果実における網羅的遺伝子発現解析................................................................... ○山本 佳奈 1,2, Putri Sastia 1,2, Dwivany Fenny 2, 福﨑 英一郎 1（1 阪大院・工, 2 バンドン工科大学院・生命科）

9:24

2Ca03

Metabolic Profiling of Cavendish Banana (Musa acuminata cv AAA) to understand its color changes..... ○Anjaritha Aulia Rizky Parijadi 1, Fenny Martha Dwivany 2, Sastia Prama Putri 1,2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ,
2

9:36

2Ca04

Dept. Biology., Sch. of Life Sci. and Technol., Inst. Technol. Bandung）

Quality prediction and authentication of Indonesian specialty coffee using GC/MS-based metabolomics
approach.......................................... ○Sastia Putri 1, Tomoya Irifune 1, Yusianto 2, Ucu Sumirat 2, Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Indonesian Coffee and Cocoa Research Institute）

9:48

2Ca05

GC-MS-based metabolomics for the classification of tempe along to different regions and production
processes in Indonesia............................ ○Adinda Darwati Kadar 1, Pingkan Aditiawati 2, Made Astawan 3, Sastia Prama Putri 1,2,
Eiichiro Fukusaki 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Dept. Biotechnol., Institut Teknologi Bandung,
3

10:00

2Ca06

Dept. Food Sci. Technol., Bogor Agric. Univ.）

Non-targeted metabolomics-based prediction of sensory value of Litopenaeus vannamei (white leg shrimp)..................... ○Safira Latifa Erlangga Putri 1, Felicia Irene Saputra 2, Gede Suantika 2, Sastia Prama Putri 1,
Eiichiro Fukusaki 1（ Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.,
1

2

10:24

2Ca07

Dept. Microbiol., Sch. of Life Sci. and Technol., Inst. Technol. Bandung）

Evaluation of in-vivo skin-whitening activity of 8-methoxydaidzein coupled with 3'-hydroxygenistein.......................................................................................... An-Ni Ke 1, Jiumn-Yih Wu 2, ○Te-Sheng Chang 1（1 Dept. Biological Sci. & Technol., National Uni. Tainan, Taiwan,
2

10:36

2Ca08

Dept Food Sci., National Quemoy Uni., Taiwan）

梅干しの脂質代謝改善効果.............................................................. ○芦田 久 1, 伊藤 あずさ 1, 大東 夏海 1, 吉原 侑希 1, 米野 雅大 1,
永井 宏平 1, 石島 智子 2, 阿部 啓子 2, 岡田 晋治 2, 鈴木 利雄 3
（1 近大・生理工, 2 東大院・農生科, 3 阪市大院・工）

10:48

2Ca09

熱処理によっておこるポリ-γ-グルタミン酸の低分子量化に対するキレート剤の影響................................................................ ○岩本 七虹 1, 山口 良弘 1,2, 荻田 亮 1,3, 田中 俊雄 1, 藤田 憲一 1（1 阪市大院・理, 2 阪市大・複合先端, 3 阪市大・健康研セ）

11:00

2Ca10

植物発酵エキスにおける抗酸化成分の分析........................................................... ○高木 康裕 1, 石井 もも子 2, 吉川 秀一 2, 柘植 圭介 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 小林製薬, 3 佐賀工技セ）

11:12

2Ca11

サワードウの継代過程における化学成分変化と微生物叢変化の関連性...................................................................................... ○大城 麦人 1,2, 百田 理恵 1, 田中 優 1, 中山 二郎 1
（1 九大院・農, 2 山崎製パン・中央研）

33

11:24

2Ca12

ミドリムシの有用脂質の構造と有用性の解析.......................................................... ○宮川 幸 1, 藤川 彩美 1, 阪本 真由子 1, 小濱 可奈絵 1, 柘植 圭介 2,
鈴木 健吾 3, 中島 綾香 3, 杉本 良太 3, 北垣 浩志 1
（ 佐賀大・農, 2 佐賀県工技セ, 3 株式会社ユーグレナ）
1

D 会場 第 4 学舎 3 号館 1 階（10:24～11:36）【醸造学，醸造工学】
10:24

2Da07

ハイビスカス花から採取した酵母の特性と泡盛醸造への応用.................................................................................... ○阿部 峻之 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2, 塚原 正俊 1
（1 バイオジェット, 2 奈良先端大・バイオ）

10:36

2Da08

ハイビスカス酵母の変異株におけるロイシン高蓄積機構の解析...................... ○豊川 洋一 1, 杉本 幸子 1, 那須野 亮 1, 渡辺 大輔 1, 阿部 峻之 2, 塚原 正俊 2, 高木 博史 1
（1 奈良先端大・バイオ, 2 バイオジェット）

10:48

2Da09

清酒酵母の機能性アミノ酸蓄積変異株の分離と醸造特性の解析.................................. ○大橋 正孝 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2（1 奈良産振セ・バイオ・食品グループ,
2

11:00

2Da10

奈良先端大・バイオ）

カプリル酸高生産酵母の醸造特性............................................................... ○畠山 明 1, 遣水 潤 2, 栗林 喬 3, 原 崇 4, 城 斗志夫 4, 有本 圭吾 1
（1 吉乃川, 2 中越酵母工業, 3 新潟県醸造試, 4 新潟大・農）

11:12

2Da11

Saccharomyces arboricola と醸造酵母の交配株の作成とその醸造特性の解析........................... ○山本 裕貴 1, 藤丸 裕貴 1, ワイナンス マシュー 2, 五島 徹也 3, 赤尾 健 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大・農, 2 ウエストバージニア大学・生科, 3 酒総研）

11:24

2Da12

Bafilomycin A1 耐性を指標として育種した高発酵性酵母の諸性質解析......................................................................... ○中瀬 舞, 山内 隆寛, 窪寺 隆文, 明石 貴裕（白鶴酒造）

F 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（9:00～11:36）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
9:00

2Fa01

酵母脂肪滴蓄積に及ぼすゴム粒子タンパク質発現の影響................................................................................................... ○横田 早希, 後藤 猛（秋田大院・理工）

9:12

2Fa02

Introduction of late embryogenesis abundant peptide co-expression system for adequate expression of
insecticidal crystal proteins in Bacillus thuringiensis............... ○Mahmuda Akhtar 1, Mizuta Kazuhiro 1, Shimokawa Tomoko 2, Maeda Minoru 2, Ikeno Shinya 1（1 Kyushu Inst. Technol., 2 Kyushu Medical Co., Ltd.）

9:24

2Fa03

海綿由来シリカ重合酵素の可溶性発現と凝集コントロール................................................................. ○中島 一紀, 小栗 秀俊, 岡本 淳之介, 川﨑 了（北大院・工）

9:36

2Fa04

麹菌内で同調的発現挙動を示すプロモーターを用いたタンパク質生産挙動の解析...................................... ○片山 周平 1, 張 斯来 2, 若井 暁 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 月桂冠・総研）

9:48

2Fa05

麹菌 Aspergillus oryzae の液体培養における菌糸完全分散株の作製とその酵素生産への応用............................................. ○宮澤 拳 1, 吉見 啓 2, 古明地 敬介 1, 田畑 風華 1, 佐野 元昭 3, 阿部 敬悦 1,2（1 東北大院・農, 2 東北大・未来研, 3 金工大・ゲノム研）

34

10:00

2Fa06

麹菌 Aspergillus oryzae 菌糸完全分散変異株の液体培養における酵素高生産性の評価................................................. ○古明地 敬介 1, 宮澤 拳 1, 吉見 啓 2, 市川 暉 3, 佐野 元昭 4, 阿部 敬悦 1,2（1 東北大院・農, 2 東北大・未来研, 3 東北大・農, 4 金工大・ゲノム研）

10:24

2Fa07

エクソソームのアフィニティ分離が可能な単鎖抗体固定化担体の開発................................................... ○小林 巧 1, 新 裕太 1, 片山 淳子 2, 的場 一隆 2, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 日産化学）

10:36

2Fa08

単鎖抗体固定化ラテックスの調製と高感度ラテックス凝集検査への応用.................. ○中尾 貴一 1, 谷端 玲奈 1, 高橋 浩一 2, 小笠原 真也 2, 権平 文夫 3, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 デンカ, 3 デンカ生研）

10:48

2Fa09

改変型型糖鎖をもつ抗体医薬品生産を目指した細胞外糖鎖修飾反応の開発...........................................○鬼塚 正義 1,2, 嶋津 敦子 2, 天羽 宏枝 2（1 徳島大院・社会産理工, 2 MAB）

11:00

2Fa10

昆虫細胞における 2A ペプチドを用いた抗体生産................................................................................... 溝手 結 1, ○増見 恭子 1,2, 勝田 知尚 1,2, 山地 秀樹 1,2（1 神戸大院・工, 2 MAB 組合）

11:12

2Fa11

組換え大腸菌を用いた流加培養による種々の単鎖抗体の菌体外生産特性.......................... ○坂本 祐一朗, 井嶋 浩一朗, 李 歓, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）

11:24

2Fa12

Monoclonal antibody production in a novel bioreactor using high cell-density mammalian cells........................................................................................................................... ○Chi-Hsien Liu, Yi-Xin Liu（Chang Gung University, Taiwan）

G 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（9:00～11:36）【遺伝子工学】
9:00

2Ga01

選択的白色腐朽菌 Ceriporiopsis subvermispora が産生する脂質関連代謝物 ceriporic acid の生合成候
補遺伝子の探索と解析.................. ○渡邊 崇人 1, 秋好 陽香梨 1, 森田 暁人 1, 二神 泰基 2, 木村 信忠 3, 後藤 正利 4, 渡辺 隆司 1
（1 京大・生存研, 2 鹿児島大院・連農, 3 産総研・生物プロセス, 4 佐賀大・農）

9:12

2Ga02

Streptomyces achromogenes subsp. streptozoticus のゲノムおよび二次代謝の解析................................................. 山本 美也子, 中村 和音, 黒田 照夫, 森田 大地, 杉山 政則, ○熊谷 孝則（広大院・医歯薬保健学）

9:24

2Ga03

ナノポアシーケンサを用いた遺伝子組換え麹菌ゲノム上の長鎖タンデムリピート構造の解析........................................................................... ○若井 暁 1, 荻野 千秋 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 神戸大院・工, 3 月桂冠・総研）

9:36

2Ga04

麹菌における環境ストレス応答性 MAP キナーゼ経路の glaB 遺伝子発現への関与.................................................. ○荒井 啓, 田中 瑞己, 吉村 緑, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）

9:48

2Ga05

黒麹菌 Aspergillus luchuensis におけるアミラーゼ遺伝子の発現制御機構解析........................................................... ○橋本 渉 1, 荒井 啓 1, 水谷 治 2, 山田 修 3, 新谷 尚弘 1, 五味 勝也 1
（1 東北大院・農, 2 琉球大・農, 3 酒総研）

10:00

2Ga06

ジペプチド取り込み能を有する麹菌のトランスポーターの同定................................................................................ ○田中 瑞己 1, 伊藤 圭祐 1, 河原崎 泰昌 1, 五味 勝也 2
（1 静県大・食栄, 2 東北大院・農）

10:24

2Ga07

海洋性珪藻類におけるエピソーム導入型多重遺伝子改変システムの開発....................................................................................................... 北川 諒治, ○原田 尚志（鳥取大・工）

10:36

2Ga08

珪藻殻への有用タンパク質提示発現による機能性材料開発........................................................................................ ○大西 菜月 1, 中島 健介 2, 辻 敬典 1, 松田 祐介 1
（1 関西学院大・理工, 2 バイオパレット）

35

10:48

2Ga09

珪藻固定化酵素を利用した効率的アグマチン産生..................................................... ○片山 翔太, 福田 青郎, 松田 祐介, 藤原 伸介（関西学院大・理工）

11:00

2Ga10

オオミジンコを用いた GAL4 ツーハイブリッドシステムによる内分泌撹乱物質検出法の開発..................................................................... ○加藤 泰彦, 山崎 勇人, 松浦 友亮, 渡邉 肇（阪大院・工）

11:12

2Ga11

野生型及びキメラ蛍光タンパク質を用いた蛍光色を決定する配列の解析.................................................................................................. ○鈴木 寛人 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1 山口大院・創成科学・化学系, 2 山口大・中高温セ, 3 山口大・生命医工セ）

11:24

2Ga12

耐熱性 D1/D2 ヘテロダイマーをシアノバクテリア光化学系 II 複合体に組み込むための D1 ポリペ
プチド C 末端プロセシングの最適化..................................................... 塩屋 健一, 鶴田 開生, 原口 典久, 中山 泰宗, 長濱 一弘, ○松岡 正佳（崇城大・生物生命）

H 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（9:00～11:36）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
9:00

2Ha01

竹粉の田面施用が土壌の細菌叢と窒素固定活性に及ぼす影響..................................................................... ○前田 勇, 嵐田 遥, 飯郷 雅之, 平井 英明（宇都宮大・農）

9:12

2Ha02

好塩性細菌 Halomonas elongata を用いた高塩廃バイオマス由来の炭素源及び窒素源からの GABA
生産システムの開発........................................................................ ○仲山 英樹, 鄒 子燕, 小川 純平（長崎大院・水産環境）

9:24

2Ha03

リグニン由来フェノール類を唯一の炭素源とした cis,cis-ムコン酸生産の効率化に関わる培養要素の同定...................................................... ○杉田 晴佳 1,3, 栗本 祐樹 1,3, 上村 直史 2,3, 政井 英司 2,3, 園木 和典 1,3（1 弘前大院・農生, 2 長岡技大・生物, 3 JST-ALCA）

9:36

2Ha04

9:48

2Ha05

燻炭が Bacillus 属細菌 IA 株の生育を促進するメカニズムの解明 3................................. ○江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工・生物工）
高濃度バニリンによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳される新規酵母遺伝子 VFH1 の解析とそのプロ
モーターの活用.............................................................................. Nguyen Trinh, ○井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）

10:00

2Ha06

廃菌床由来バイオエタノールの発酵生産.......................................... ○小林 洋介 1, 藤森 一浩 2, 西島 拓人 1, 杉本 直久 1, 藤野 尚人 1, 今井 史規 3,
金松 雅俊 3, 山田 憲治 3, 荒井 進 3, 吉田 浩爾 1, 佐賀 清崇 1, 泉 可也 1
（1 Biomaterial in Tokyo, 2 産総研・生物プロセス, 3 三友プラントサービス）

10:24

2Ha07

ミミズが土壌微生物燃料電池に及ぼす効果.................................. ○雪本 寛, 江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工）

10:36

2Ha08

微生物発電に伴う有用物質生産の試み......................................................... ○福本 悠地, 雪本 寛, 江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工・生物工）

10:48

2Ha09

種々の遺伝子改変の組み合わせが微生物燃料電池の出力に与える影響................................................... ○川口 太一 1, 菊池 亮太 1, 駒 大輔 2, 大本 貴士 2, 尾島 由紘 1, 東 雅之 1
（1 阪市大院・工, 2 阪技術研）

11:00

2Ha10

Desulfovibrio 属細菌由来の蓄電性バイオミネラルの特性に寄与する関連遺伝子の比較解析..................................... ○工藤 優輝 1, 安藤 翔太 1, 分部 友紀 2, 安池 一貴 2, 田代 陽介 1,3, 二又 裕之 1,3,4（1 静大院・総科技, 2 静大・工, 3 静大創造大学院, 4 静大・グリーン研）

36

11:12

2Ha11

Desulfovibrio sp. HK-II 株の細胞外電子伝達と硫酸呼吸が及ぼす影響..................................... ○安藤 翔太 1, 工藤 優輝 1, 分部 友紀 2, 安池 一貴 2, 田代 陽介 1,3, 二又 裕之 1,3,4（1 静大院・工, 2 静大・工, 3 静大・創造大学院, 4 静大・グリーン研）

11:24

2Ha12

下水汚泥のメタン発酵におけるハザードケミカルの影響................. ○星子 裕貴, 藤江 秀斗, ムスタファ ヌルル・アシファ, 前田 憲成（九工大院・生体工）

I 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:36）【タンパク質工学】
9:00

2Ia01

高性能な蛍光バイオセンサー構築のための抗体結合プローブの開発........................................................................................ ○高橋 昌樹 1, 児島 智樹 2, 北口 哲也 3, 上田 宏 3（1 東工大院・生命理工, 2 東大院・工・化生, 3 東工大・化生研）

9:12

2Ia02

細胞内のアセチル化能を感知するセンサの開発..................................................... ○渡邉 荘爾, 小林 一幾, 木村 友紀, 河合 繁子, 斎藤 恭一, 梅野 太輔

9:24

2Ia03

デノボタンパク質ナノブロック ePN-Blocks による自己集合超分子ナノ構造の創製と解析................................................................. 小林 直也 1,2, 稲野 紘一 1, 笹原 健嗣 1, 佐藤 高彰 1, 宮澤 佳甫 3,（千葉大院・融合）

福間 剛士 3, Hecht Michael 4, 宋 致宖 5, 村田 和義 5, ○新井 亮一 1,6（1 信州大・繊維, 2 自然科研機構・生命創成探究セ, 3 金沢大院・自科, 4 プリンストン大・化学, 5 生理研,
6

9:36

2Ia04

信州大・菌類微生物セ）

様々なタンパク質のアミロイド凝集形成に対するポリアミン由来 8 員環化合物の影響評価.................................................○國富 理紗子 1, 福永 隼大 1, Pradipta Ambara R. 2, 田中 克典 2, 座古 保 1（1 愛媛大院・理工, 2 理研）

9:48

2Ia05

Aβ のアミロイド凝集体が NLRP3 インフラマソーム活性化に及ぼす影響........................................................................................ ○中西 文香 1, 金子 直恵 2, 増本 純也 2, 座古 保 1（1 愛媛大院・理工, 2 愛媛大学院医学）

10:00

2Ia06

耐熱性 Encapsulin ナノカプセルの内包系の構築............................................................. ○野中 衛, 松村 洋寿, 小川 信明, 尾高 雅文（秋田大院・理工）

10:24

2Ia07

コドン指定があいまいになった遺伝暗号表が進化を促進させる........................................................................ ○榎本 利彦, 鮎川 翔太朗, 木賀 大介（早大・先進理工）

10:36

2Ia08

遺伝子発現と共役するゲノム DNA 複製系を in vitro で確立する.................................... ○酒谷 佳寛 1, 松田 史生 1, 市橋 伯一 1,2（1 阪大院・情報, 2 阪大院・生命機能）

10:48

2Ia09

両端を β ドメインで終端した Coiled-Coil をベースとするランタニド結合タンパク質の設計........................................................................................ ○鈴木 淳巨, 北原 知恵, 堀 克敏（名大院・工）

11:00

2Ia10

CBH 触媒モジュール高発現型人工セルロソームの設計.............................. ○中澤 光 1, 石垣 友理 1, 張 鈺爽 1, 山田 浩之 2, 坪井 宏和 2, 幸田 明生 2, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 大関株式会社）

11:12

2Ia11

AI はタンパク質進化を導くか？：機械学習支援による GFP の YFP 化検証.................. ○及川 未早来 1, 齋藤 裕 2, 亀田 倫史 2, 中澤 光 1, 二井手 哲平 1, 津田 宏治 3,4, 梅津 光央 1,4（1 東北大院・工, 2 産総研・人工知能研究セ, 3 東大院・新領域, 4 理研・革新知能統合研究セ）

11:24

2Ia12

抗体データベースを利用した熱安定性向上と発現量向上に向けた大規模変異導入プロセスの開発.......................................................... ○服部 修平 1,2, 本田 亜由美 1, 二井手 哲平 1, 中澤 光 1, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 (独) 日本学術振興会特別研究員 DC）

37

J 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:24）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
9:00

2Ja01

遺伝子破壊による Citrobacter 属細菌のキトサン様バイオ凝集剤高生産株の育種..................................................................................... ○金尾 圭太 1, 柏 雅美 1, 木村 和幸 1,2, 宮本 弘毅 1,
山口 翔太 1, バランワル プリヤンカ 1, 根来 誠司 1, 武尾 正弘 1
（1 兵県大・工・応化, 2 （株）兵庫分析センター）

9:12

2Ja02

Identification and functional analysis of genes involved in polymerization and secretion in the production ofa chitosan-like polysaccharide in Citrobacter spp.
........................ ○Priyanka Baranwal 1, Keita Kanao 1, Shin Odagaki 1, Kazuyuki Kimura 1,2, Seiji Negoro 1,
Masahiro Takeo 1（ Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, Hyogo Analysis Center Co., Ltd.）
1

2

9:24

2Ja03

高い汚泥凝集能を持つポリグルタミン酸の生産性改善に向けた菌株育種と培養工学的な検討......................................................................... ○小林 誠治, 劉 涛, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）

9:36

2Ja04

Metabolic engineering of Ralstonia eutropha for production of 2-propanol from sugars...................................... ○Dyah Candra Hapsari Subagyo, Izumi Orita, Satoshi Nakamura, Toshiaki Fukui

9:48

2Ja05

メタノールを原料にした共重合ポリヒドロキシアルカン酸生合成のための Methylobacterium（Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech）
extorquens の代謝改変と培養条件の検討.................................. ○折田 和泉, 海野 源人, 加藤 りさ, 中村 聡, 福居 俊昭（東工大院・生命理工）
10:00

2Ja06

遺伝子組換え水素酸化細菌による CO2 からの共重合ポリエステルの生合成と C6 ユニットモル分率の変化................................................................... ○鈴木 尚幸 1, 森 瞬也 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2, 田中 賢二 1
（1 近大・産理工, 2 東工大院・生命理工）

10:24

2Ja07

アンモニア化成と硝酸化成に有用な微生物の探索ならびに硝化微生物コンソーシアの構築.................................................................. ○安藤 晃規 1,2, 岡田 若子 1, Sakuntala Saijai 1, Tsai You-Shan 1,
宮本 憲二 3, 加藤 康夫 4, 篠原 信 5, 小川 順 1,2（ 京大院・農, 京大・生理化学, 慶大・理工, 4 富山県大・生工研セ, 5 農研機構）
1

10:36

2Ja08

2

3

Identification of proteins related to tooth mineralization in Cryptochiton stelleri by integrated transcriptomic
and proteomic analysis............................. ○Michiko Nemoto 1, Dongni Ren 2, Steven Herrera 2, Takashi Tamura 1, Kenji Inagaki 1,
David Kisailus 2（1 Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okyama Univ., 2 Dept. Chem. Environ. Eng., Univ. California Riverside）

10:48

2Ja09

サンゴ養殖により得られた温度耐性株に共在する細菌叢の環境応答......................................... ○伊藤 遼 1,2, 安田 直子 3, 藤村 弘行 3, 中野 義勝 4, 金城 浩二 5, 竹山 春子 1,2,6（1 早大・先進理工, 2 産総研・早大 CBBD-OIL, 3 琉球大・理, 4 琉大・熱生研, 5 有限会社海の種,
6

11:00

2Ja10

早大・ナノライフ創研）

データサイエンスに基づくウナギ幼生飼料開発のための重要因子抽出...................... ○朝倉 大河 1, 坂田 研二 1, 伊達 康博 1, 長井 敏 2, 黒木 洋明 2, 長谷川 大介 2, 菊地 淳 1,3,4（1 理研 CSRS, 2 水産研究・教育機構, 3 横市院・生命医, 4 名大院・生命農学）

11:12

2Ja11

クロマグロ稚魚の入出力代謝応答に基づく飼料候補物質の探索技術高度化........ ○坂田 研二 1, 朝倉 大河 1, 相馬 智史 2, 馬久地 みゆき 2, 伊達 康博 1,3, 横山 佐一郎 4, 菊地 淳 1,3,5（1 理研 CSRS, 2 水産教育機構, 3 横市院・生命医, 4 鹿児島大学・水産, 5 名大院・生命農学）

38

K 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:36）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
9:00

2Ka01

ロングリード RNA-seq が明らかとするバクテリアオペロンの発現実態 ～二次代謝産物生合成遺伝
子群のオペロンバリアントを捉える～................................................................... ○菅野 学 1, 三谷 恭雄 1, 野田 尚宏 2, 木村 信忠 1, 田村 具博 1
（1 産総研・生物プロセス, 2 産総研・バイオメディカル）

9:12

2Ka02

糖からの直接発酵を目指したエルゴチオネイン高生産放線菌の開発...................................... ○仲谷 豪, 嘉悦 佳子, 仲島 菜々実, 山田 佑樹, 野口 祐司, 曽田 匡洋, 劉 暁麗
（長瀬産業）

9:24

2Ka03

Metabolic engineering of Actinosynnema pretiosum for hyper-production of antitumor ansamitocin P-3................................................................................................................. ○Jian-Jiang Zhong, Zhi-Qiang Du

9:36

2Ka04

放線菌 Streptomyces coelicolor 株のメタボローム分析における分析対象代謝物範囲の拡大.......................................................................... ○新田 克章 1, Putri Sastia 1, Takano Eriko 2, 福﨑 英一郎 1（State Key Lab. Microb. Metab., Sch. Life Sci. Biotechnol., Shanghai Jiao Tong Univ.）（1 阪大院・工, 2 Fac. of Sci. and Eng., Univ. of Manchester）
9:48

2Ka05

代謝改変コリネ型細菌による 4-ヒドロキシ安息香酸の高生産......................................................... ○北出 幸広 1,2, 橋本 龍馬 1,2, 須田 雅子 1,2, 平賀 和三 1,2, 乾 将行 1,2,3（1 RITE, 2 グリーンケミカルズ(株), 3 奈良先端大・バイオ）

10:00

2Ka06

ナイロンオリゴマー分解菌 Arthrobacter の 2 種類の 6-アミノヘキサン酸アミノトランスフェラーゼ
NylD1・NylD2 の機能解析.............................................. ○藤井 翼, 竹原 一起, 橋本 悠, 武尾 正弘, 根来 誠司（兵庫県大院・工）

10:24

2Ka07

釜石はまゆり酵母の系統解析と発酵力の強化....................................................................... ○齊藤 隆行 1, 井上 諭宜 2, 赤尾 健 3, 山田 美和 1, 下飯 仁 1（1 岩手大院・農, 2 釜石市, 3 酒総研）

10:36

2Ka08

Saccharomyces cerevisiae 由来の乳化およびマクロファージ活性化に 関与する細胞表層タンパク質の同定と解析................................................................. ○上田 茉奈, 齋藤 大輝, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）

10:48

2Ka09

出芽酵母におけるマルチストレス耐性優性変異株の分離と解析................................................. ○小林 日花梨, 中川 洋史, 山村 英樹, 早川 正幸（山梨大院・総研部）

11:00

2Ka10

酵母のストレス応答に関わる陽イオン輸送体の機能解析........................................................................... ○上原 千央 1, 浜本 晋 1, 星 直美 1, 笠原 紳 2, 魚住 信之 1

11:12

2Ka11

酵母非遺伝的因子[GAR ]がアルコール発酵と遺伝子発現に及ぼす効果................................................. ○渡辺 大輔, 熊野 舞香, 杉本 幸子, 高木 博史（奈良先端大・バイオ）

11:24

2Ka12

パン酵母の冷凍保存後の発酵力に重要なプロテアソーム関連遺伝子の発現............................................... ○高木 博史 1, 渡辺 大輔 1, 関口 拓史 2, 杉本 幸子 1, 長澤 淳 2, 喜田 直孝 2

（1 東北大院・工, 2 宮城大・環境科学）+（1 奈良先端大・バイオ, 2 テーブルマーク）

39

L 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:36）【糖鎖工学／生合成，天然物化学】
9:00

2La01

ササユリ（Lilium japonicum）系統間および類縁種間の花香組成を指標とした化学分類の試み.......................... ○藤澤 瑞希 1, 松川 哲也 1, 瀧川 義浩 5, 荒井 滋 2, 秋野 順治 3, 柳川 綾 4, 梶山 慎一郎 1（1 近畿大院・生物理工・生物工, 2 大神神社, 3 京都工繊大・CBFS, 4 京都大学・RISH,
5

9:12

2La02

近畿大学先端研）

ショウガ由来のデヒドロジンゲロンが出芽酵母の薬剤耐性に及ぼす影響........................................... ○尾山 昌弘 1, 山脇 千佳 1, 山口 良弘 1,2, 荻田 亮 1,3, 田中 俊雄 1, 藤田 憲一 1（1 阪市大院・理, 2 阪市大・複合先端, 3 阪市大・健康研セ）

9:24

2La03

黄ニラ抽出物が示す赤血球凝集素の阻害効果と阻害物質の単離........................................................................................○大西 優 1, 中島 凌 2, Eltigani Sara 3, 鈴木 菜月 2,
美藤 友博 2, 清水 克彦 4, 畑中 唯史 5, 有馬 二朗 2
（ 鳥取大院・農, 鳥取大・農, 鳥取大院・連農, 4 鳥取大・CoRE, 5 岡山県生科総研）
1

9:36

2La04

2

3

チューリッポシド/チューリッパリン類の抗細菌活性の精査.......................................................... ○加藤 康夫 1,2, 中川 恵蔵 2, 近堂 菜月 2, 北岡 直樹 1,2, 野村 泰治 1,2（1 富山県大・生工研セ, 2 富山県大工・生物工）

9:48

2La05

組換え分裂酵母を用いたナリンゲニン二糖配糖体の生産.................................. ○大橋 貴生, 窪村 有紗, 長谷川 友香, 三﨑 亮, 藤山 和仁（阪大・生工国際セ）

10:00

2La06

気生微細藻類由来の抗菌活性を有する新規クロロフィル類の単離とその産生株の探索...................... ○三田 一至, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

10:24

2La07

赤潮プランウトン Heterocapsa circularisquama から分離された光依存性溶血毒素の多彩な生物活性........................................................................ ○小田 達也, 李 文成, 山口 健一（長崎大院・水産環境）

10:36

2La08

糸状性細菌 Sphaerotilus montanus が形成するマイクロチューブの化学構造と伸長パターン.................................................................. ○藤原 篤男 1, 柏原 大輔 1, 河﨑 雄太 1, 近藤 敬子 2, 川村 出 1,
佐藤 道夫 3, 新田見 匡 1, 鈴木 市郎 1, 片平 正人 2, 武田 穣 1（1 横国大院・工, 2 京大・エネルギー理工学研究所, 3 明治大・農）

10:48

2La09

糸状菌シトクロム P450 の機能多様性とテルペノイドのコンビナトリアル生合成.................................................................................... ○大園 昂貴 1, 筌場 将太 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

11:00

2La10

Pseudmonas fluorescens 由来のピラジン生合成機構の解明................................................. ○津田 佑介, 生井 智仁, 桝尾 俊介, 高谷 直樹（筑波大院・生命環境）

11:12

2La11

放線菌由来揮発性有機化合物が植物病原菌に与える影響............................................. ○前田 みのり, 大池 達矢, 岡南 政宏, 松川 哲也, 梶山 慎一郎, 阿野 貴司

11:24

2La12

卵菌による長鎖多価不飽和脂肪酸生産能の比較............................................... ○吉田 磨仁 1, 永峰 賢 2, 松下 貴子 1, 田中 淳和 3, 松浦 昌平 4, 東條 元昭 3

（近畿大院・生物理工・生物工）（1 北大院・地環科, 2 ロム, 3 阪府大院・生環科, 4 広島県・農技セ）

40

M 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:24）【酵素学，酵素工学】
9:00

2Ma01

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium 由来の class 3 に属するシトクロム P450 CYP505D6 の機能
解析........................................... ○ワイズ 里沙 1, 酒井 優 1, 酒井 杏匠 1, 神藤 定生 2, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 名城大・理工）

9:12

2Ma02

酸素ラジカル処理がセルロース分解に及ぼす影響.............................................................. ○糀谷 紗季 1, 酒井 杏匠 1, 上條 順也 1, 前林 正弘 1, 伊藤 昌文 2,
呉 準席 2, 堀 勝 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 名城大・理工, 3 名大院・工）

9:24

2Ma03

糸状菌 Aspergillus nidulans が種々の多糖応答的に生産する細胞外酵素の網羅的解析.......................................................... ○山口 愛彩 1, 酒井 杏匠 1, 糀谷 紗季 1, 木島 尚輝 1, 大堀 紗貴子 1,
小栗 莉奈 1, 高須賀 太一 2, 堀 千明 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1 名城大院・農, 2 北大院・農, 3 北大院・工）

9:36

2Ma04

Aspergillus glaucus MA0196 由来ハイマンノース型アスパルティックプロテアーゼの遺伝子クローニ
ングと異種発現......................................................... ○林 理希 1, 土居 幹治 2, 竹中 慎治 1（1 神戸大院・農, 2 マルトモ）

9:48

2Ma05

Aspergillus oryzae で高発現させたタンナーゼ AoTanBO の酵素学的諸性質.................. ○市川 響太郎 1, 佐々木 克仁 1, 塩野 義人 1, 新谷 智子 2, 渡部 昭 2, 五味 勝也 2, 小関 卓也 1
（1 山形大農, 2 東北大院・農）

10:00

2Ma06

Talaromyces cellulolyticus 由来新規 GH30 エンドキシラナーゼの同定..................................................... ○中道 優介, 藤井 達也, 松鹿 昭則, 井上 宏之（産総研・機能化学）

10:24

2Ma07

好熱性アーキア由来色素依存性 D-アミノ酸脱水素酵素のアーキアを宿主としたタンパク質発現系の構築と発現タンパク質の酵素化学的性質の解析........................................... ○里村 武範 1,2, 江本 慎 1, 黒沢 則夫 3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2（1 福井大・工, 2 福井大・ライフ, 3 創価大, 4 香川大・農, 5 阪工大院・工）

10:36

2Ma08

Sulfolobus tokodaii 由来色素依存性 L-乳酸脱水素酵素の性質の解明....................................... ○宇野 紘平 1, 里村 武範 1,2, 黒沢 則夫 3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2（1 福井大院・工, 2 福井大ライフ, 3 創価大, 4 香川大・農, 5 阪工大院・工）

10:48

2Ma09

好熱好酸性アーキアのマルチプル分子シャペロニンの機能解析....................................○魚住 奎太, 山田 芽生, Putri Azalea, 福田 青郎, 藤原 伸介（関西大院・理工）

11:00

2Ma10

超好熱性アーキアにおけるユビキチン様タンパク質の機能解析................................................................................ ○榊原 早津季 1, 秀瀬 涼太 2, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1

11:12

2Ma11

超好熱菌における NAD 熱分解産物の再利用代謝機構の解明......................................... ○佐藤 喬章 1,2, 蜂須賀 真一 1,2, 跡見 晴幸 1,2（1 京大院・工, 2 JST・CREST）（1 関西学院大・理工, 2 神戸大院・科技イノベ）+

N 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（9:00～11:36）【環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術】
9:00

2Na01

ナイロン-6 分解候補株の取得のためのスクリーニング法の検討及び分解能の評価...................................... ○上江田 真衣 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）

9:12

2Na02

スルファニル酸分解微生物への亜硫酸イオンの影響................................................................. ○東山 明広, 喜多 晃久, 中川 克彦, 早瀬 伸樹（新居浜高専）

41

9:24

2Na03

排水中の有機共存物質が Pseudonocardia sp. N23 株の 1,4-ジオキサン分解に与える影響の評価............................................................... ○大久保 忠相 1, 井上 大介 1, 山本 哲史 2, 黒田 真史 1, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 大成建設）

9:36

2Na04

担子菌バイオリアクターによるトリクロサンの除去............................................................. ○山口 和真, 本間 裕人, 数岡 孝幸, 舘 博, 藤本 尚志, 徳田 宏晴（東農大・醸造）

9:48

2Na05

塩素化エチレン類の加温による浄化促進における細菌群集の動態解析................................................... ○鈴木 市郎 1,2, 田 小維 2, 川村 美帆 1, 北村 岳 3, 山﨑 祐二 3, 小林 剛 2,4（1 横国大院・理工, 2 横国大・リスク共生セ, 3 竹中工務店, 4 横国大院・環）

10:00

2Na06

ポリ塩化ビフェニル類汚染地区に棲息する嫌気性微生物に関する調査................................................. 髙塚 由美子 1, ○原 富次郎 1, 平野 竜行 2（1 京大エネ研, 2 竹中工務店）

10:24

2Na07

水田土壌における生物的環境の解析....... ○荒木 希和子 1, Aziz Amin ABD 2, 久保 幹 1（1 立命館大・生命科学, 2 立命館大院・生命科学）

10:36

2Na08

農薬が土地微生物へ及ぼす影響解析................................................................................ ○中村 明日香 1, 森田 涼斗 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1 立命館大院・生命科学, 2 立命館大・生命科学）

10:48

2Na09

ATAD プロセスにおける未培養主要好熱細菌の分離および FISH 法による直接観察................................○新井 智博, Tu Phuong Trang, 藤本 遼, 田代 幸寛, 酒井 謙二（九大院・生資環）

11:00

2Na10

白色腐朽菌-細菌共培養系におけるアセタミプリドの分解....................................................................................... ○大野 遥 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1 静大院・総合農, 2 静大・農, 3 静大・グリーン研, 4 静大・創科技院）

11:12

2Na11

回転型スラリーバイオリアクタを用いた高濃度 A 重油汚染土壌の浄化................................................................... ○三好 佑奈 1, 浦田 智宇 1, 岡田 丈 2, 新谷 政己 1, 金原 和秀 1
（1 静大院・総合科技, 2 静大・工）

11:24

2Na12

下水処理施設におけるバルキング関連糸状性細菌 Kouleothrix の季節変動とその影響因子.................................................................. ○鈴木 康太 1, 新田見 匡 1, 小林 稔真 1, 笠倉 理紗 1, 武田 穣 1,
小柴 佑介 1, 福田 淳二 1, 鈴木 市郎 1, 飛野 智宏 2
（1 横国大院・工, 2 東大院・工）O 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（9:00～11:36）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
9:00

2Oa01

iPS 細胞の分化能に対するフローサイトメトリー法の考察................................................................. ○藤本 舜, 岡野 健太郎, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）

9:12

2Oa02

タッピング剥離操作におけるヒト iPS 細胞の応答評価........................................................... ○山本 航平 1, 澤川 史明 2, 堀口 一樹 1, 越田 一朗 2, 紀ノ岡 正博 1
（1 阪大院・工, 2 澁谷工業）

9:24

2Oa03

インクジェット技術による超瞬間細胞凍結保存法の hiPS 細胞への応用................................................................... ○渡部 広機 1, 瀧澤 秀世 1, 山田 茂 2, 諫田 康成 2, 秋山 佳丈 1
（1 信州大・繊維, 2 国立医薬食衛研）

9:36

2Oa04

希少細胞の連続的化学処理を可能とする多段階溶液交換プロセッサーの開発......................................................................... ○穆 廷林, 豊田 一, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・融合）

9:48

2Oa05

低温処理が脂肪代謝およびベージュ脂肪細胞への分化に及ぼす影響........................................................ ○塩見 尚史, 冨士原 由貴, 渡邊 桂子（神戸女学院大・人間科学）

10:00

2Oa06

骨格筋細胞ゲルアクチュエータの量産に向けた電気刺激培養システムの構築................................................................................ ○中野 翔太, 瀧澤 秀世, 秋山 佳丈（信州大・繊維）

42

10:24

2Oa07

形態的逸脱 iPS コロニーの生物学的プロファイル解析.......................... ○吉田 啓 1, 長坂 理紗子 1, 館野 浩章 2, 小沼 泰子 2, 伊藤 弓弦 2, 蟹江 慧 1, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬, 2 産総研）

10:36

2Oa08

画像情報解析を用いた iPS 細胞製造機械化における振動ストレスの評価.................................................. ○酒井 徹平, 今井 祐太, 吉田 啓, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）

10:48

2Oa09

細胞形態情報解析による培養面コーティング剤のプロファイリング
.................................................................................... ○藤谷 将也, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）

11:00

2Oa10

画像情報解析技術を用いた 3D 培養がん細胞におけるヘテロ性解析............................................................. ○渋田 真結 1, 加藤 寛人 1, 田村 磨聖 2,3, 日下部 涼子 4, 蟹江 慧 1,
松井 裕史 4, 金森 敏幸 3, 柳沢 真澄 5, 杉浦 慎治 3, 加藤 竜司 1
（1 名大院・創薬, 2 阪大・核物理研, 3 産総研, 4 筑波大, 5 エンジニアリングシステム）

11:12

2Oa11

画像情報解析を用いたスフェロイド培養環境プロファイリング
................................................................. ○山本 涼平, 渋田 真結, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）

11:24

2Oa12

3 次元構造体 Stroid を用いた細胞挙動の研究......... ○犬伏 祐作 1, 伊田 寛之 2, 立花 亮 1（1 阪市大院・工, 2 新田ゼラチン株式会社・総合研究所）

一般講演（午後の部）

C 会場 第 4 学舎 3 号館 2 階（14:06～16:30）【醸造学，醸造工学】
14:06

2Cp01

脱脂粉乳と豆乳で培養した乳酸菌の増殖と酸耐性の比較....................................................................... ○オウ カン, 西野 智彦（東京工科大院・バイオニクス）

14:18

2Cp02

凍結耐性を有する醤油酵母 Zygosaccharomyces rouxii を用いたパンの物性調査........................................................................................................... ○森本 一輝, 小西 正朗（北見工大）

14:30

2Cp03

日本酒の高圧発酵制御技術の確立に向けた清酒酵母の高圧不活性化挙動の解析.............................. ○野村 一樹, 片岡 ちひろ, 氏家 沙織里, 井口 晃徳, 重松 亨（新潟薬大・応生命）

14:42

2Cp04

紅麹品質における水浸漬工程の影響........................................... ○曾 伝濤 1, 吉﨑 由美子 2, 奥津 果優 2, 二神 泰基 2, 玉置 尚徳 2, 髙峯 和則 2
（1 鹿児島大院・連農, 2 鹿児島大・農）

14:54

2Cp05

小曲米酒の製造における固体糖化工程の意義....................... ○Yin Xuan 1, 吉﨑 由美子 2, 池永 誠 2, 奥津 果優 2, 二神 泰基 2, 玉置 尚徳 2, 髙峯 和則 2
（1 鹿児島大院・連農, 2 鹿児島大・農）

15:06

2Cp06

南極産菌類を利用した日本酒の醸造の試み...................................................... ○辻 雅晴 1, 星野 保 2（1 国立極地研究所, 2 産総研・生物プロセス）

15:30

2Cp07

京都伝統野菜「桂瓜」の奈良漬粕における米貯蔵タンパク質の解析........................................................................ ○沼本 穂, 中村 貴子, 増村 威宏（京府大院・生命環境）

15:42

2Cp08

α-EG 発酵物の美容食品としてのコラーゲンスコアへの影響.................................................................. ○三井 雅貴 1, 遠藤 佳純 2, 横田 大輝 2, 風 友稀 2, 徳田 耕二 3,
塩谷 侑子 3, 町田 雅之 1, 大箸 信一 1, 尾関 健二 1
（ 金工大・ゲノム研, 金沢工大・バイオ・化学・応用バイオ, 3 車多酒造）
1

15:54

2Cp09

2

吟醸粕焼酎発酵物中の機能性物質の研究............................................................... ○高橋 雅弥 1, 横山 春花 1, 吉田 知華 1, 徳田 耕二 2, 尾関 健二 1
（1 金工大・ゲノム研, 2 車多酒造）

43

16:06

2Cp10

健常成人女性における米糀甘酒摂取による皮膚バリア機能改善効果の検討................................................................... ○植田 愛美 1, 北川 学 1, 伊藤 成輝 1, 山本 哲郎 2, 近藤 澄夫 3
（1 マルコメ, 2 TTC, 3 医療法人健昌会福島健康管理セ）

16:18

2Cp11

麹甘酒の過剰摂取による安全性評価...................................... ○倉橋 敦 1, 米井 嘉一 2（1 八海醸造・研究開発, 2 同志社大院・生命医科学）

E 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（14:06～16:30）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
14:06

2Ep01

微生物を用いた液体培養におけるフラスコ気相環境の解析....................................................................................... ○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

14:18

2Ep02

好気性微生物培養におけるウルトラファインバブルの効果........................................................... ○小西 正朗 1, 川﨑 はるか 1, 江田 智一 2, 清水 友佑 2, 熊谷 和晃 2
（1 北見工大, 2 ノリタケカンパニーリミテド）

14:30

2Ep03

DO-stat 流加培養による組換え大腸菌を用いた単鎖抗体の高濃度菌体外生産..................................... ○井嶋 浩一朗, 坂本 祐一朗, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）

14:42

2Ep04

培養槽用 OTR シミュレータの開発.............................................................................................................................. ○石井 伸佳（長瀬産業）

14:54

2Ep05

粘度測定による微生物由来生体高分子の分子間力および濃度の推算（予備的考察）............................................. ○古瀬 久幹 2, 石井 正治 1, 戸田 清 2（1 東大院・農生科, 2 東大・分生研）

15:06

2Ep06

Streptococcus zooepidemicus によるヒアルロン酸生産の最適化............................................... ○小川 愛未 1, 小野 聡子 2, 成田 琴美 3, 武内 章 3, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1 関西大院・理工, 2 関西大・化生工, 3 キユーピー）

15:30

2Ep07

新規殺菌剤過硝酸を用いたノロウイルスモデルの不活化........................................................................................ ○小豆澤 友希 1, 井川 聡 2, 北野 勝久 3, 座古 保 1（1 愛媛大院・理工, 2 大阪府立産技総研, 3 阪大院・工）

15:42

2Ep08

ナノバブルと超音波と組み合わせた効率的な殺菌手法の開発.................................................................................... ○細井 啓貴 1, 廣部 綾乃 1, 高橋 憲司 1, 仁宮 一章 2
（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・新学術）

15:54

2Ep09

ABC 光半導体の暗所での殺菌作用における遮光後放電による影響の可能性........................................................... ○辻塚 誠一郎 1, 宮本 樹里 1, 俗多 秀美 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1
（1 近大・産理工, 2 伊都研）

16:06

2Ep10

マイクロ波（非熱効果）が微生物の生理活性に及ぼす影響の解析..................................... ○松田 将典 1, 堀越 智 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 上智大・理工）

16:18

2Ep11

抗菌素材“ＰＧＡＩＣ”の生成機構分析とオンサイトコーティングへの応用...................................................................................... ○白米 優一 1, 中山 沢水 2, 東内 遥菜 2, 芦内 誠 1,2（1 愛媛大院・連合農, 2 高知大・農）44

F 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（14:06～16:30）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
14:06

2Fp01

低分子化抗体精製用アフィニティクロマトグラフィー担体の応用・改良研究...................................................... ○西八條 正克 1,2, 村田 大 1,2, 鴻池 史憲 1,2, 吉田 慎一 1,2, 水口 和信 1,2（1 カネカ, 2 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

14:18

2Fp02

治療用酵素ヒト-Kynureninase の高効率分離プロセスの開発.................................................................... ○杉山 友亮, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大・工芸科学）

14:30

2Fp03

B 型肝炎ウイルス様粒子(HBsAg-VLP)の効率的なクロマトグラフィ精製手法の確立........................................................................................ ○小木戸 謙, 丸田 秀平, 青木 裕史（昭和電工）

14:42

2Fp04

バイオマス発酵プロセス向け低ファウリング膜の開発............................................................................. ○志村 芙美, 小岩 雅和, 畠平 智子, 木村 将弘（東レ）

14:54

2Fp05

ポリアミンによる荷電脂質膜の相分離......................................... ○引地 啓太, 山本 耀吾, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）

15:06

2Fp06

エマルションドロップレットを用いた土壌微生物の培養............................................... ○村井 雄大 1, 川島 万凜 1, 森田 直樹 1, 土居 克実 2, 久原 哲 1, 田代 康介 1
（1 九大院・生資環, 2 九大院・農）

15:30

2Fp07

water-in-oil エマルションを用いた微生物の培養および検出技術の構築................ ○大田 悠里 1,2, 斉藤 加奈子 1,2, 松倉 智子 2, 髙木 妙子 2, 森田 雅宗 2, 常田 聡 1, 野田 尚宏 1,2（1 早大院・先進理工, 2 産総研・バイオメディカル）

15:42

2Fp08

エマルション培養法を用いた微生物由来ペプチダーゼスクリーニング系基盤構築に向けて........................................... ○本間 宣行 1, 中村 彰宏 1, 鈴木 義之 1, 志田 洋介 1, 野田 尚宏 2, 小笠原 渉 1（1 長岡技科大, 2 産総研・バイオメディカル）

15:54

2Fp09

脂質膜被覆球形粒子を用いた曲率認識タンパク質スクリーニング手法の開発.................................................................................... ○田中 祐圭, 矢内 健太郎, 大河内 美奈（東工大）

16:06

2Fp10

GP64 融合ビオチンリガーゼによる近接依存反応を利用した Sf9 昆虫細胞表面 GP64 結合レセプターの探索....................................................................... ○岡本 園子 1, 横田 早希 1, 鈴木 健裕 2, 堂前 直 2, 後藤 猛 1（1 秋田大院・理工, 2 理研・CSRS）

16:18

2Fp11

pH 変動培養法を活用した耐酸性微生物や好酸性微生物の高効率なスクリーニング系の開発..................................... ○高野 力 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1（1 筑波大院・生命環境, 2 フタムラ化学）

G 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（14:06～16:30）【遺伝子工学】
14:06

2Gp01

メタノール資化性酵母 Ogataea minuta の PER1，GUP1，CWH43 遺伝子は細胞壁の強度維持に関与する.............................................................. 胥 欣欣 1,2, 小松崎 亜紀子 1, 千葉 靖典 1, 高 暁冬 2, ○横尾 岳彦 1
（1 産総研・創薬基盤, 2 江南大（中国））

14:18

2Gp02

Multi-step 細胞融合による多倍体酵母の創製........................................................................... ○福田 展雄, 本田 真也（産総研・バイオメディカル）

14:30

2Gp03

DNA 切断型抗生物質を用いたカロテノイド高生産酵母変異株の取得............................................................. ○渡部 裕介, 阿部 勝正, 解良 芳夫, 高橋 祥司（長岡技科大院）

45

14:42

2Gp04

出芽酵母における染色体からのセントロメア DNA の切り出し誘導時に出現する生存細胞の解析................................................. ○松崎 浩明, 藤原 祐気, 平島 宗一郎, 宮本 昭弘, 柳本 敏彰, 秦野 琢之

14:54

2Gp05

新奇染色体工学技術を用いた多様なゲノム組成を持つ出芽酵母菌株ライブラリーの構築と菌株育種............................................. ○笹野 佑, 生田 宗一郎, 高木 佑希子, 高田 和真, 井出口 浩迪, 田口 久貴（福山大・生命工）（崇城大・生物生命）
15:06

2Gp06

CRISPR/Cas9 による担子菌系酵母 Pseudozyma antarctica の高効率相同組換え................................................. ○田中 拓未 1, 國武 絵美 1,2, 鎗水 透 1, 遠藤 亮 1, 加藤 悦子 1, 北本 宏子 1
（1 農研機構, 2 三重大院・生資）

15:30

2Gp07

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica による組換え酵素生産に有用なプロモーターの探索と利用................................................................... ○鎗水 透 1, 小池 英明 2, 森田 友岳 3, 田中 拓未 1, 北本 宏子 1
（1 農研機構・農業環境セ, 2 産総研・生物プロセス, 3 産総研・機能科学）

15:42

2Gp08

韓国伝統的麹 Nuruk から単離された酵母 Pichia kudriavzevii N77-4 の機能解析.............................................. ○杉山 峰崇 1, 松下 青葉 2, 高島 匠平 2, 宮下 夏美 2, 村山 亮太 1, 石田 圭 1,
深谷 健 1, 内山 進 1, Baek Seong Yeol 3, Mun Ji-Young 3, Kim Soyoung 3, Yeo Soo-Hwan 3（1 阪大院・工, 2 阪大・工, 3 Dept. Agrofood Resources・NIAS・RDA）

15:54

2Gp09

遺伝子組換え効率向上に向けた DNA リガーゼ IV 欠損 Pichia pastoris 株の開発.................................................................. ○伊藤 洋一郎 1, 渡邉 徹 2, 藍川 晋平 1, 西 輝之 2, 西山 陶三 2,
中村 泰之 1, 蓮沼 誠久 1, 八十原 良彦 2, 石井 純 1, 近藤 昭彦 1（1 神戸大院・科技イノベ, 2 カネカ）

16:06

2Gp10

Pichia pastoris におけるセントロメア DNA 配列を用いた自律複製型プラスミドベクターの開発............................................ ○中村 泰之 1, 西 輝之 1,2, 野口 理紗 3, 伊藤 洋一郎 1, 渡邉 徹 2, 西山 陶三 2,
藍川 晋平 1, 蓮沼 誠久 1, 石井 純 1, 八十原 良彦 2, 近藤 昭彦 1
（ 神戸大院・科技イノベ, 2 カネカ, 3 高機能遺伝子デザイン技術研究組合）
1

16:18

2Gp11

Pichia pastoris における自律複製型ベクターを用いた効率的な DNA マルチアセンブル法..................................................................... ○西 輝之 1,2, 西山 陶三 2, 山路 大樹 3, 玉井 雅也 3, 渡邉 徹 2,中村 泰之 1, 伊藤 洋一郎 1, 石井 純 1, 近藤 昭彦 1, 八十原 良彦 2（ 神戸大院・科技イノベ, 2 カネカ, 3 高機能遺伝子デザイン技術研究組合）
1

H 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（14:06～16:30）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
14:06

2Hp01

海洋性紅色光合成細菌の形質転換系の開発と窒素固定能の評価.................................................. ○樋口 美栄子, 森崎 久美子, 沼田 圭司（理研 CSRS・バイオ高分子）

14:18

2Hp02

ユーグレナ低酸素下ワックスエステル合成におけるミトコンドリア電子伝達系の機能解明................................................... ○西本 歩紗 1, 中澤 昌美 1, 石川 孝博 2, 乾 博 3, 上田 光宏 1, 阪本 龍司 1
（1 阪府大院・生環科, 2 島根大・生物資源, 3 阪府大院・栄養）

14:30

2Hp03

セルフクローニングを反復利用した代謝工学による単細胞性緑藻 Coccomyxa 属の脂質生産性改良...................................... ○笠井 由紀, 塚原 拓也, 池田 富貴子, 井出 曜子, 原山 重明（中央大・理工）

14:42

2Hp04

屋外培養可能な新奇微細藻類による有用油脂の生産................................................... ○佐々木 美月 1, 福田 寛史 1, 佐々木 智子 2, 佐々木 大作 2, 朝山 宗彦 1
（1 茨城大院・農, 2 Biox 化学工業）

46

14:54

2Hp05

Effect of immobilized Chlorella Sorokiniana culture on lipid accumulation and CO2 sequestration.
................................. ○Daniel Alejandro Alfaro Sayes 1, Jerome Amoah 1, Shinji Hama 3, Ayumi Yoshida 3,
Akihiko Kondo 2, Chiaki Ogino 1（ Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
1

2

3

15:06

2Hp06

Bioenergy Corp, Res. Dev. Lab.）

排水中の細菌群集による微細藻類の増殖促進....................................................................... ○遠山 忠 1, 糟谷 まり 2, 田中 靖浩 1, 森川 正章 3, 森 一博 1
（1 山梨大院・総研部, 2 山梨大院・医工農, 3 北大院・環境）

15:30

2Hp07

Nitratireductor sp. OM-1 の軽油生産におけるアンモニウムの影響................................................... ○登 祐介 1, 高橋 宏和 1, 秋 庸裕 1, 中島田 豊 1, 松村 幸彦 2, 岡村 好子 1
（1 広島大院・先端物質, 2 広島大院・工）

15:42

2Hp08

海洋性菌叢を用いた塩環境下でのアルギン酸からの高効率揮発性脂肪酸生産.......................................... ○喜多 晃久 1,4, 三浦 豊和 2,4, 越智 匠 1, 早瀬 伸樹 1, 岡村 好子 2,4, 秋 庸裕 2,4,
松村 幸彦 3,4, 加藤 節 2, 田島 誉久 2,4, 加藤 純一 2, 中島田 豊 2,4（1 新居浜高専, 2 広島大院・先端物質, 3 広島大院・工・エネ環, 4 JST・CREST）

15:54

2Hp09

気相培養における気生微細藻類 Coccomyxa sp. KGU-D001 の脂質蓄積と細胞内 CN 比...................... ○川島 成貴, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

16:06

2Hp10

Enhanced oleic acid production by overexpressing delta 9-fatty acid desaturase gene in oleaginous yeast
Rhodosporidium toruloides for designed biodiesel production.
................................. ○Yung-Yu Tsai 1, Takao Ohashi 1, Chih-Chan Wu 1, Bataa Dolgormaa 1, Ryo Misaki 1,
Savitree Limtong 2, Kazuhito Fujiyama 1（ ICBiotech, Osaka Univ., 2 Fac. Sci., Kasetsart Univ.）
1

16:18

2Hp11

Multiple stress tolerances in a thermotolerant L1-1 isolated from oleaginous yeast Rhodosporidium
toruloides DMKU3-TK16..................................○Chih Chan Wu 1, Takao Ohashi 1, Yung Yu Tsai 1, Ryo Misaki 1, Savitree Limtong 2,
Kazuhito Fujiyama 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol., 2 Fac. Sci., Kasetsart Univ., Thailand）

I 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（14:06～16:30）【タンパク質工学／生体情報工学，バイオインフォマティクス／システムバイオロジー】
14:06

2Ip01

ドライとウェットの両側面からの抗体に代わる分子標的足場タンパク質の検討............................................... ○伊藤 智之 1, 西 羽美 2, 亀田 倫史 3, 二井手 哲平 1, 中澤 光 1, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 東北大院・情, 3 産総研・人工知能研究セ）

14:18

2Ip02

抗体移植を意識した β-ヘアピン構造足場を利用した分子標的ペプチド取得............................................................... ○菊地 真裕 1, 二井手 哲平 1, 中澤 光 1, 今中 洋行 2, 梅津 光央 1
（1 東北大院・工, 2 岡山大院・自科）

14:30

2Ip03

高度機能的分子認識素子の創出を志向した，クッション性足場タンパク質としての多価 CutA1 の開発............................................................. ○東 秀隆, 石田 尚之, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・自科）

14:42

2Ip04

超好熱菌由来酵素の基質結合に関するドメインに基づいた新規標的結合分子の開発................................................................. ○来住 秀憲, 大政 健史, 山野 範子, 古賀 雄一（阪大院・工）

14:54

2Ip05

配列情報を利用した SUMO2 変異体ライブラリからの TNF-α 親和性選択................................................................................ ○牧野 祥嗣, 角岡 良亮, 伊藤 伸哉（富山県大・工）

47

15:06

2Ip06

モノクローナル抗体のペプチドレベルでのエピトープ解析に基づく人工抗体のデザイン................................................................... ○初野 優花 1, 足立 遥華 2, 中村 匠汰 2, 熊澤 皆 2, 田中 眞人 2
（1 電機大 ・理工, 2 電機大院 ・理工）

15:30

2Ip07

様々な波長の光照射下におけるシアノバクテリアの解析.............................................. ○豊島 正和, 阪田 真澄, 戸谷 吉博, 松田 史生, 清水 浩（阪大院・情報）

15:42

2Ip08

微生物による有用物質生産に資する代謝モデルの実験データを用いた妥当性検証と予測精度の改善............................................................................................................... ○厨 祐喜 1, 大山 彰 2, 荒木 通啓 1,3（1 神戸大院・科技イノベ, 2 インシリコバイオロジー, 3 京大院・医）

15:54

2Ip09

有用物質を生産・増産する準最適な代謝流束均衡モデルのデザイン.......................................................................................................................... ○田村 武幸（京大・化研）

16:06

2Ip10

代謝情報基盤整備のための多様な微生物資源の活用の可能性.................. ○寺尾 拓馬 1, 細山 哲 1, 土金 恵子 1, 宮澤 せいは 1, 鋤先 まゆ子 1, 白井 智量 2, 川﨑 浩子 1
（1 NITE・NBRC, 2 理研・CSRS）

16:18

2Ip11

機械学習を用いた酵素の EC number 予測............................................................ ○渡邉 直暉 1, 村田 昌浩 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 1,2, 荒木 通啓 2,3（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 京都大院・医）J 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（14:06～16:30）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
14:06

2Jp01

遺伝子発現データを用いた代謝制御因子の同定 ～包括的転写制御による効率的物質生産～................................................................................................... ○竹屋 壮浩, 小山内 崇（明治大院・農）

14:18

2Jp02

Euglena gracilis におけるアミノ酸生産時の培養条件検討............................................. ○冨田 結芙子 1, 小山内 崇 1, 鈴木 健吾 2（1 明治大院・農, 2 ユーグレナ）

14:30

2Jp03

Widely targeted metabolomics-based improvement of Synechococcus elongatus 1-butanol-producing strain...................... ○Artnice Mega Fathima 1, Sastia Putri 1, Eiichiro Fukusaki 1, James Liao 2, Derrick Chuang 2（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA）

14:42

2Jp04

Bacterial consolidated bioprocessing of paper sludge for acetic acid production........................................................................... ○Eka Triwahyuni, Harifara Rabemanolontsoa, Shiro Saka
（Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.）

14:54

2Jp05

Acidomonas 属酢酸菌によるグリセロールの酸化変換............................................................................ ○西江 百加, 宇都宮 大貴, 阿野 嘉孝（愛媛大院・農）

15:06

2Jp06

好熱性ホモ酢酸 Moorella thermoacetica 代謝改変株によるエタノール生産.................................................................................... ○竹村 海生 1, 岩崎 裕樹 1, 喜多 晃久 2, 中島田 豊 1（1 広島大院・先端物質, 2 新居浜高専）

15:30

2Jp07

スクロースを糖源とした乳酸菌培養による乳酸生産抑制........................................... ○佐野 杏奈 1, 河合 美桜 1, 土屋 麻美 2, 依田 伸生 2, 山崎 思乃 3, 片倉 啓雄 3
（1 関西大院・理工, 2 （株） 明治, 3 関西大・化生工・生命生工）

15:42

2Jp08

グルコースリプレッションを回避した流加培養による乳酸菌の乳酸生産抑制............................................................... ○河合 美桜 1, 土屋 麻美 2, 依田 伸生 2, 山崎 思乃 3, 片倉 啓雄 3
（1 関西大院・理工, 2 （株）明治, 3 関西大・化生工）

15:54

2Jp09

梅の花由来乳酸菌 Enterococcus faecalis の機能性の探索........................................................... ○平野 美佳子 1, 草場 裕貴 1, 中野 雄揮 2, 柘植 圭介 3, 北垣 浩志 1
（1 佐賀大院・農, 2 インパクト（株）, 3 佐賀工技セ）

16:06

2Jp10

Gluconobacter 属酢酸菌の 5-ケトグルコン酸資化系の制御に関与する転写因子............................................................................................... ○和田 征太郎, 阿野 嘉孝（愛媛大院・農）

48

16:18

2Jp11

培地の乳糖分解が LB81 スターターの増殖性に及ぼす影響の解析............................................................ ○山本 恵理, 渡部 玲子, 市村 武文, 木村 勝紀（株式会社 明治）

K 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（14:06～16:30）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
14:06

2Kp01

Aspergillus oryzae 由来転写因子 XlnR による遺伝子発現制御システムの網羅的解析................................................................... ○岡 大椰 1, 兒島 孝明 1, 井原 邦夫 2, 小林 哲夫 1, 中野 秀雄 1
（1 名大院・生命農学, 2 名大・遺伝子実験施設）

14:18

2Kp02

接合菌 Mucor circinelloides の二形成変化における分子生物学的解析................................................................ ○高野 真希, 岩倉 遼, 星野 一宏（富山大院・理工・生命工）

14:30

2Kp03

土壌環境中での糸状菌の呼吸活性の調節................................................................................ ○宮崎 つぐみ 1, 大泉 太於 2, 中澤 奈美 2, 高谷 直樹 2
（1 筑波大, 2 筑波大院・生命環境）

14:42

2Kp04

固／液界面培養法の菌株スクリーニングへの応用：培養条件の最適化.............................................................. ○椎名 一樹 1, 小田 忍 2（1 金工大院・工, 2 金工大・ゲノム研）

14:54

2Kp05

乳化を指標とした細胞壁に作用する抗真菌性化合物の探索............................................................. ○谷畑 友基, 根路銘 伸介, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）

15:06

2Kp06

Free fatty acids as antibacterial compounds found in soybean tempe............................................................................................................... ○Dewi Kusumah 1, Isamu Maeda 1,2（1 United Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2 Fac. Agric., Utsunomiya Univ.）

15:30

2Kp07

二次代謝系の動的特性解析における大過剰化合物測定の有無の影響の数理解析............................................... ○富永 大介 1, 川口 秀夫 2, 堀 良美 2, 蓮沼 誠久 2, 荻野 千秋 3, 油谷 幸代 1
（1 産総研・生体ビッグデータラボ, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 神戸大院・工）

15:42

2Kp08

Metabolic profiling of three terminal alkene producing Jeotgalicoccus spp. during different growth phase..................................................................... ○Filemon Jalu N Putra, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki

15:54

2Kp09

Global metabolite changes during laboratory evolution of 1-butanol producing Escherichia coli grown in（Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）
minimal media.........................○Sana Subhan Memon Sakurai 1, Sammy Pontrelli 2, Sastia Prama Putri 1, James C. Liao 2,
Eiichiro Fukusaki 1（ Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ, Dept. Chem and Biomol Eng., UCLA）
1

2

16:06

2Kp10

メタノールをメチル基供与体とした S-アデノシルメチオニン再生経路の構築........................................................................................ ○岡野 憲司 1, 永田 悠 1, 井上 翔太 2, 本田 孝祐 1

16:18

2Kp11

高温域での NAD 濃度の安定化と耐熱性酵素を用いた物質生産反応への寄与.................................................................................... ○谷口 博範, 岡野 憲司, 本田 孝祐（阪大院・工）（1 阪大院・工, 2 阪大・工）+L 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（14:06～16:30）【酵素学，酵素工学】
14:06

2Lp01

部位特異的変異導入により改変したサリチル酸脱炭酸酵素によるメチルサリチル酸の生成..................................................... ○石原 真奈, 荒木 優大, 石井 義孝, 桐村 光太郎（早大・先進理工）

49

14:18

2Lp02

ニトリルヒドラターゼの触媒反応機構解析－シリアルフェムト秒結晶構造解析に向けて.................................................................. ○林 英輝 1, 北條 晴佳 1, 松村 洋寿 1, 小川 信明 1, 野村 高志 2,
當舎 武彦 2, 城 宜嗣 3, 野口 恵一 4, 養王田 正文 4, 尾高 雅文 1
（ 秋田大院・理工, 2 理研・SPring-8, 3 兵庫県大院・生命理, 4 農工大院・工）
1

14:30

2Lp03

INTMSAlign_Angler を用いたニトリラーゼのインシリコスクリーニング........................................................................................ ○井上 梨沙 1, 中野 祥吾 2, 篠田 優 1, 浅野 泰久 1
（1 富山県大・生工研セ, 2 静県大・食栄）

14:42

2Lp04

二置換プロパンジオールの S 体選択的酸化を触媒する微生物の探索........................................... ○清水 慈 1, 菊川 寛史 2, 八十原 良彦 3, 伊藤 紀幸 3, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2
（1 岐阜大院・自科技, 2 岐阜大・工, 3 （株）カネカ）

14:54

2Lp05

没食子酸脱炭酸酵素によるピロガロールの合成............................................................... ○大江 史花 1, 岡村 佳樹 1, 菊川 寛史 2, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2
（1 岐阜大院・工, 2 岐阜大・工）

15:06

2Lp06

微生物酵素による α 置換マロン酸ジエステルの立体選択的加水分解........................ ○菊川 寛史 1, 鵜飼 文広 2, 村上 陽亮 2, 川端 潤 3,4, 三宅 良磨 3, 満倉 浩一 1, 吉田 豊和 1
（1 岐阜大・工, 2 岐阜大院・工・生命工学, 3 三菱ケミカル株式会社,4

株式会社エーピーアイコーポレーション）

15:30

2Lp07

ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 の酵素フマラーゼ(FumC)の生化学解析及び機能改変....................................................................................................... ○片山 徳賢, 小山内 崇（明治大・農）

15:42

2Lp08

ボトリオコッセン生合成経路のプロダクト特異性改変...................................... ○多田 和樹, 坂本 康二, 河合 繁子, 斎藤 恭一, 梅野 太輔（千葉大院・融合）

15:54

2Lp09

変異解析によるラン藻由来アルカン合成関連酵素の機能発現に重要な部位の同定............................................................. ○工藤 恒, 野村 匡志, 林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）

16:06

2Lp10

細胞内酵素活性の可視化を利用したアシル ACP 還元酵素の高活性変異体のハイスループットスク
リーニング............................................................................................... ○林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）

16:18

2Lp11

Identification of key residue determining product regioselectivity of Medicago truncatula beta-amyrin C30oxidase......... ○Much Zaenal Fanani 1, Ery Odette Fukushima 1, Satoru Sawai 2, Kiyoshi Ohyama 2,3, Hikaru Seki 1,
Kazuki Saito 2,4, Toshiya Muranaka 1（1 Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 RIKEN CSRS., 3 Dept. Chem. Mat. Sci., TITECH.,
4

Grad. Sch. Pharm. Sci., Chiba Univ.）

M 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（14:06～16:30）【酵素学，酵素工学】
14:06

2Mp01

Luteolibacter algae SW 由来フコイダナーゼ遺伝子のクローニングと異種発現............................................. ○荒井 良仁 1, 長尾 達彦 2,4, 藤原 卓人 3, 八木 寿梓 3, 鈴木 宏和 3, 大城 隆 3（1 鳥取大院・持社創生・工, 2 鳥取大院・工, 3 鳥取大・工, 4 日本ジッコウ）

14:18

2Mp02

グルコマンナン分解細菌の探索および Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum KT13 株からのマンナナーゼ精製................................................................ 瀧上 和也 1, ○林 秀謙 1,2（1 前橋工大院・工, 2 前橋工大・工）

14:30

2Mp03

メタゲノム由来アルコール脱水素酵素遺伝子の探索とバルキーケトン不斉還元反応への応用.................................................................................... ○粟谷 晃也, 戸田 弘, 伊藤 伸哉（富山県大・工）

50

14:42

2Mp04

コリン型リゾプラズマローゲン特異的ホスホリパーゼ D の基質認識における Phe211 および Tyr258の役割.......................................................... ○河原 光希 1, 小山 貴之 2, 酒瀬川 信一 3, 村山 和隆 4, 杉森 大助 1,2（1 福島大・共生システム理工, 2 福島大院・理工, 3 旭化成ファーマ, 4 東北大院・医工）

14:54

2Mp05

超深海性ヨコエビ，カイコウオオソコエビの糖質分解酵素遺伝子の解析......................... ○小林 英城 1, 長濱 統彦 2, 荒井 渉 1, 笹川 洋平 3, 梅田 茉奈 3, 林 哲太郎 3, 二階堂 愛 3,
渡部 裕美 1, 小栗 一将 1, 北里 洋 1, 藤岡 勘太郎 4, 木戸 ゆかり 1, 高見 英人 1
（ 海洋研究開発機構, 2 ノートルダム清心大・食品栄養, 3 理研・生命機能, 4 神奈川大・工）
1

15:06

2Mp06

黄麹菌が生産する難消化性澱粉分解酵素の探索 第 2 報......................................................... ○伊藤 俊彦, 笹渕 優衣, 藤田 直子, 橋爪 克己（秋田県大・生資）

15:30

2Mp07

Shinella sp. NN-6 が有する 2 種のケトース 3-エピメラーゼ遺伝子のクローニングと発現した酵素の諸性質............................................................................................ ○鈴木 琢磨 1, 池田 光 1, 堀 玄澄 1, 森本 兼司 2
（1 香川大・農, 2 国際希少糖研究教育機構）

15:42

2Mp08

納豆菌 B1 由来の L-ラムノースイソメラーゼの諸性質の検討および固定化酵素を用いた D-プシコー
スから D-アロースの生産........................................................................................ ○後閑 俊哉 1, 池田 光 1, 鈴木 琢磨 1, 森本 兼司 2
（1 香川大・農, 2 国際希少糖研究教育機構）

15:54

2Mp09

Pseudomonas 属細菌におけるアコニット酸イソメラーゼの構成的生産................................................. ○滝口 有沙, 小田 祐之亮, 吉岡 育哲, 桐村 光太郎（早大・先進理工）

16:06

2Mp10

Xanthomonas campestris WU-9701 由来のグルコース転移酵素を利用した alkyl α-glucosides の選択的生産...................................... ○渡邉 理沙, 恩田 裕, 中里 美穂, 石井 義孝, 桐村 光太郎（早大・先進理工）

16:18

2Mp11

FAD 依存型グルコース脱水素酵素変異体の速度論解析..................... ○白井 裕貴 1, 西矢 芳昭 2, 中嶋 義隆 2（1 摂南大院・理工, 2 摂南大・理工・生命科学）

N 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（14:06～15:18）【環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術】
14:06

2Np01

微生物と線虫を用いた 137Cs 汚染土壌に対する新規除染技術の構築............................................... ○合田 亮 1, 伊藤 みさご 1, 星 英之 2, 倉橋 健介 3, 吉原 静恵 4, 徳本 勇人 4（1 阪府大院・工, 2 阪府大院・人社, 3 阪府大高専, 4 阪府大院・理）

14:18

2Np02

重金属吸収後の植物バイオマスに対する微生物と線虫を利用した重金属分離回収法の構築................................................................... ○岡野 凌一 1, 濵野 樹 2, 倉橋 健介 3, 吉原 静恵 2, 徳本 勇人 2
（1 阪府大院・工, 2 阪府大院・理, 3 阪府大高専）

14:30

2Np03

自然界からの希土類元素分離を可能とするリン酸基修飾酵母の開発................................................................. ○木原 摩耶, 奥村 一仁, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）

14:42

2Np04

Lactobacillus casei JCM1134 の二価金属イオンの吸着傾向の解析........................................................................................... ○遠藤 輪, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

14:54

2Np05

Development of method for the estimation of phosphate accumulation in microbes...................................................................................................................... ○Ajeeta Anand, Hideki Aoyagi（Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ.Tsukuba）

15:06

2Np06

Comparative study on adsorption of metal ion in dead Saccharomyces cerevisiae...................................... Tu Dang 1, Kazuki Honda 2, Tuan Anh Do 1, ○Masao Kishida 2, Masakazu Furuta 1（1 Dept. Quant. Rad. Eng. Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ.,
2

Dept. Appl. Life Sci. Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.）

51

O 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（14:06～16:30）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
14:06

2Op01

Visualization of methylation index in human colon cancer tissues using imaging mass spectrometry.................. ○Nathanael Steven 1,2, Keiichi Okano 3, Masahiro Aoki 4, Yasushi Kojima 4, Marselina I. Tan 2,
Eiichiro Fukusaki 1, Tomoyoshi Soga 5, Shuichi Shimma 1（1 Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Dept. Biotechnol., Bandung Inst. Technol., 3 Dept. Gastroenterological
Surgery, Kagawa Univ. Hosp., 4 Aichi Cancer Center, 5 Inst. Adv. Biosci., Keio Univ.）

14:18

2Op02

原子間力顕微鏡を用いた B 型肝炎感染機構の解明........................................................... ○西田 真一朗 1, 竹中 武藏 2, 西村 勇哉 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ）

14:30

2Op03

自公転遊星式撹拌技術を活用した組織培養の有用性............................................................................... ○小田 彰恭 1, 吉田 春菜 1, 関口 はつ美 1, 柳田 湧太 1,
金子 凜 1, 高宮 良太 1, 野辺 善仁 2, 村松 和明 1
（1 電機大院 ・理工, 2 (株)大洋技研）

14:42

2Op04

がん種の異なる細胞間での中心代謝における C 代謝フラックス解析.................... ○上原 ひかる 1, 荒木 千絵 1, 前田 昂亮 1, 岡橋 伸幸 1,2, 松田 史生 1, 髙橋 智聡 3, 清水 浩 1
13（1 阪大院・情報, 2 理研, 3 金沢大・がん進展制御研）
14:54

2Op05

公共データベースを利用した脱分化脂肪細胞における肝細胞分化制御因子の探索............................................................................ ○萩原 玲子, 沖 嘉尚, 加野 浩一郎（日大院・生資科）

15:06

2Op06

アガロース精密鋳造法と幹細胞分化パターン分析..................................................................○田中 信行 1, 山下 忠紘 2, 佐藤 麻子 1, Vogel Viola 3, 田中 陽 1（1 理研・生命機能科学, 2 慶応大, 3 ETH Zurich）

15:30

2Op07

慢性血液透析療法における心筋細胞拍動能の数理解析................................................ ○濱田 浩幸 1,2,3（1 九大院・農, 2 九大院・生資環, 3 九大院・シス生科）

15:42

2Op08

マウス乳癌細胞の転移性と細胞弾性に起因するネスチンのテール領域の機能解析......................................................................................... ○水澤 愛衣 1, 須崎 萌 2, 山岸 彩奈 3, 中村 史 1,2,3（1 農工大, 2 農工大院・工, 3 産総研・バイオメディカル）

15:54

2Op09

ヒト三次元筋萎縮モデルを搭載した 96 ウェルプレートフォーマット収縮力評価系の開発...................................................................................... ○大隅 早紀 1, 清水 一憲 1, 吉原 賢 2, 本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 塩野義製薬・創薬疾患研, 3 名大・予防早期医療創成セ）

16:06

2Op10

mRNA サイレンシングを用いた過酸化チタンナノ粒子の放射線増感機序解明............................................................... ○大取 靖秀 1, 森田 健太 2, 西村 勇哉 3, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 3
（1 神戸大院・工, 2 神戸大研究基盤センター, 3 神戸大院・科技イノベ）

16:18

2Op11

感染防御に関わるニワトリムチンの解析......................................... 森脇 脩一郎 1, 吉田 琢哉 1, 原 駿平 1, 飯島 信司 1,2, 金岡 英徳 1, ○西島 謙一 1（1 名大院・工, 2 現愛工大・工・応化）

52

ランチョンセミナー
2LS1 タカラバイオ株式会社
LS1 会場

第 4 学舎4 号館 2 階（11:45～12:45）

2LS2 三洋貿易株式会社
LS2 会場

第 4 学舎4 号館 2 階（11:45～12:45）

2LS3 宇宙航空研究開発機構（JAXA）
LS3 会場

第 4 学舎2 号館 5 階（11:45～12:45）

ワークショップ
生物工学系の研究・開発の安全のために
D 会場

第 4 学舎－基本的な考え方と実践例－

3 号館 1 階（16:40～17:40）

講師：片倉 啓雄（関西大学 化学生命工学部 教授）
主催：生物工学教育委員会
協力：株式会社 化学同人
安全は研究・開発において全てに優先する事項です．また，安全は特定の部署や担当者が担うものではなく，組織の構成員全員が能動的に参加して実現するものです．生物工学教育委員会では，大学・高専・企業等の研究における安全のために「バイオ実験を安全に行うために(仮)」の編集に協力しましたが，本書をより有効にお使い頂くため，安全・安心を実現するための基本的な考え方と安全教育の実践例を紹介します．学生実験や社員教育で安全指導を担当される方々をはじめ，安全な研究・開発に関心をお持ちの方は，是非ご参加下さい．

生物工学若手研究者の集い（若手会）
ものづくり交流サロン～学生・若手研究者×企業・公設試～

凛風館 2 階ディノア（17:00～20:00）
主催：日本生物工学会関西支部若手企画委員会
共催：生物工学若手研究者の集い（若手会）「若い世代の研究者・学生と実学に携わる技術者との交流」と「生物工学の知識やものづくりの心の発展的な継承」を目的とした，サロン風のポスターセッションです．企業や公設試験研究機関が開発した技術や製品について，開発者のやりがい，こだわり，苦労話をじかに聞くことができる貴重な機会ですので，お気軽にご参加ください．
出展企業・機関，参加費などの情報は大会ホームページ（https://www.sbj.or.jp/2018/）に掲載しますので，是非ご覧くだ
さい．

53

第 3 日（9 月 7 日）
太字の一般講演は今年度の生物工学学生優秀賞（飛翔賞）受賞者の発表です．
開始時間

講演番号

演

発表者氏名（所属）題○印は講演者を示す

招待講演・シンポジウム（午前の部）

D 会場 第 4 学舎 3 号館 1 階（9:00～11:24）
Bioengineering for Sustainable Agriculture and Food Production for the Future「新しい農業と未来の食料のための生物工学」【本部企画】＜国際シンポジウム＞
はじめに........................................................................................................................................................ 今井 泰彦

9:00
9:02

S3Da01〈招待講演（韓国生物工学会）〉

座長：髙木 忍Effects of several growth factors on the biomass and total lipid production of microalgae under different
culture modes....................................................................................................................... ○Si Wouk Kim, Geun Ho Gim（Dept. Environ. Eng, Chosun Univ.）
座長：髙木 忍
9:29

S3Da02

土壌をゼロからデザインする～有機質肥料活用型養液栽培から派生した新技術～...................................................................................... ○篠原 信（農業・食品産業技術総合研究機構）

9:56

S3Da03植物成長を促進する新しい遺伝子・化合物の単離を目指す植物ケミカルバイオロジー研究........................................................... ○中野 雄司 1, 山上 あゆみ 1, 長田 裕之 1, 篠崎 一雄 1, 浅見 忠男 2

座長：田口 精一

（1 理研・環境資源科学センター, 2 東大院・農生科）
休憩

10:23

座長：児島 宏之
10:28

S3Da04Novel sustainable plant-based protein: Scientific evidence of health and nutrition benefits in humans.............................................................................................................................. ○Ron Salpeter 1, Iris Shai 2（1 Hinoman Ltd, Israel, 2 Dep. of Public Health, Faculty of Health Sciences , Ben Gurion Univ., Israel）
座長：安原 貴臣

10:55

S3Da05

持続可能な農業がもたらす新たなビジネスチャンス～エネルギー消費型農業からエネルギー創造・利用型農業への転換～................. ○齊藤 三希子（NTT データ経営研究所 ライフ・バリュー・クリエイションユニット）

11:22

おわりに
........................................................................................................................................................ 安原 貴臣

54

シンポジウム（午後の部

13:00～15:00）

B 会場 第 4 学舎 3 号館 4 階（13:00～15:00）
1 細胞解析に向けた刺激応答性分子ツールの創製と応用展開
はじめに........................................................................................................................................................ 山口 哲志

13:00

座長：山口 哲志
13:05

S3Bb01

細胞機能をタンパク質分解能で解析・制御するための分子技術.............................................................................................................................. ○浜地 格（京大院・工）13:45

S3Bb02

光応答性ゲルを用いた単一がん細胞の分離と核酸解析への応用...................................................................................................................... ○吉野 知子（農工大院・工）座長：吉野 知子

14:10

S3Bb03細胞内ドラッグデリバリーシステムを基盤とする光細胞工学.............................................................. ○村上 達也 1,2（1 富山県大・工, 2 京大・高等研究院・iCeMS）

14:35

S3Bb04光分解性ゲル包埋培養系からの癌生細胞分離装置の開発.................................................. ○杉浦 慎治 1, 田村 磨聖 1, 山平 真也 1, 進 和美 1, 佐藤 琢 1, 高木 俊之 1,
金森 敏幸 1, 渋田 真結 2, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 2, 柳沢 真澄 3, 松井 裕史 4
（1 産総研・創薬基盤, 2 名大院・創薬, 3 エンジニアリングシステム（株）, 4 筑大・医）C 会場 第 4 学舎 3 号館 2 階（13:00～15:00）
SDGs に資する環境共生微生物を活用したアグリバイオ工学研究の新展開
座長：菊地 淳
13:00

S3Cb01

家畜・家禽類の腸内機能を制御する環境微生物.................................................................................................. ○宮本 浩邦 1,2,3, 大野 博司 2, 児玉 浩明 1,3,4（1 千葉大院・融合, 2 理研・生命医科学, 3 サーマス, 4 千葉大・園芸）

13:25

S3Cb02

フィールドアグリオミクスにより有機農業を科学する............................. ○市橋 泰範 1,2（1 理研・バイオリソース研究セ, 2 科学技術振興機構・さきがけ）

13:50

S3Cb03

自吸式通気撹拌と槽内共棲細菌によるし尿のユニークな自家熱型高温好気消化....................................................................................................... ○酒井 謙二, 田代 幸寛（九大院・農）

14:15

S3Cb04

三菱ケミカルが取り組む KAITEKI 実現（SDG ｓ）への取組み................................................................................................................ ○水無 渉（三菱ケミカル（株））

14:40

S3Cb05

魚類腸内環境と水環境のエコインフォマティクス................................................ ○菊地 淳 1,2,3（1 理研・環境資源, 2 名大院・生命農, 3 横市院・生命医）

座長：宮本 浩邦

55

D 会場 第 4 学舎 3 号館 1 階（13:00～15:00）
発酵食品の機能性を考える～一次機能から三次機能まで～【本部企画】
はじめに........................................................................................................................................................ 髙瀬 良和

13:00

座長：髙瀬 良和
13:02

S3Db01

味噌の多様化における麹菌の可能性.......................................................................................................................... ○今野 宏（秋田今野商店）

13:31

S3Db02鹿児島の壺造り黒酢の発酵と機能性.............................................................................................................................. ○長野 正信（坂元醸造）

14:00

S3Db03

樽酒が食品の味わいに与える影響.......................................................................................................................... ○高尾 佳史（菊正宗酒造）

14:29

S3Db04

生活者のすこやかな暮らしに貢献する味噌と米糀甘酒の可能性.................................................................................................................................. ○北川 学（マルコメ）

座長：堤 浩子

おわりに............................................................................................................................................................ 堤 浩子

14:58

E 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（13:00～15:00）
エネルギーを使う，捨てる光合成の再最適化－合成生物工学にむけた未踏研究－
はじめに............................................................................................................................................................ 清水 浩

13:00

座長：魚住 信之
13:05

S3Eb01

プロトン駆動力による光合成のフィードバック制御.............................................................................................................. ○皆川 純（基生研・環境光生物）

13:35

S3Eb02

代謝工学による光合成の統合解析と工学応用................................................................. 豊島 正和, 戸谷 吉博, 松田 史生, ○清水 浩（阪大院・情報）

14:00

S3Eb03

中枢代謝を利用した物質生産と光合成能の改変........................................................... ○小俣 達男 1, 高谷 信之 1, 池田 和貴 2, 愛知 真木子 3, 西山 佳孝 4

座長：清水 浩（1 名大院・生命農学, 2 理研・統合生命医科学研究セ, 3 中部大・応生, 4 埼大院・理工学）
14:35

S3Eb04

駆動力形成を担うイオン輸送による光合成調節............................................................. ○魚住 信之, 辻井 雅, 狩野 文香, 解良 康太, 浜本 晋, 斉藤 俊也（東北大院・工）

14:55

おわりに
........................................................................................................................................................ 魚住 信之

56

F 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（13:00～15:00）
半金属元素のバイオテクノロジー
はじめに............................................................................................................................................................ 池 道彦

13:00

座長：池 道彦
13:10

S3Fb01

ケイ素を胞子表面に蓄積する Bacillus 属細菌の解析と界面バイオテクノロジーへの応用........................................................................ ○池田 丈, 廣田 隆一, 黒田 章夫（広島大院・先端物質）

13:35

S3Fb02

微生物を用いた土壌からのヒ素可溶化：知られざる発酵細菌の重要性............................................................................................................. ○天知 誠吾 1, 堀 知行 2, 山村 茂樹 3
（1 千葉大・園芸, 2 産総研, 3 国環研）
座長：山下 光雄

14:00

S3Fb03Pseudomonas 属細菌のセレン・テルル代謝の解析と半導体ナノ粒子合成への応用..................................................... ○黒田 真史 1, 惣田 訓 2, 池 道彦 1（1 阪大院・工, 2 立命館大・理工）

14:25

S3Fb04

アンチモン酸還元細菌を用いた水中からのアンチモン除去・回収.................................................................................... ○山村 茂樹 1, 飯田 千里 2, 小林 弥生 1, 天知 誠吾 2
（1 国立環境研, 2 千葉大院・園芸）
おわりに........................................................................................................................................................ 山下 光雄

14:50

G 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（13:00～15:00）
スマートセル開発のためのバイオ技術とデジタル技術の革新と融合
バイオ生産に資する DBTL サイクルの構築に向けて
座長：向山 正治
13:00

S3Gb01

デジタルとの融合による新たなバイオ戦略の取組み.......................................................................................................... ○水無 渉（三菱ケミカル株式会社）

13:15

S3Gb02

分子動力学シミュレーションを用いたタンパク質高機能化法の開発........................................................................................... ○亀田 倫史, 池部 仁善（産総研・人工知能）

13:40

S3Gb03

DNA 分子バーコード法を利用した長鎖 DNA 合成...................................................................................................................... ○谷内江 望（東大・先端研）
座長：近藤 昭彦

14:05

S3Gb04

スマートセル創出プラットフォームに資するメタボローム解析技術の開発...................................................................................................... ○蓮沼 誠久（神戸大院・科技イノベ）

14:30

S3Gb05

スマートセル開発を加速する AI の開発に向けた取組み............................................. ○武田 志津 1, 伊藤 潔人 1, 荒木 通啓 2（1 日立・研究開発, 2 京大院・医）

14:55

おわりに
........................................................................................................................................................ 近藤 昭彦

57

H 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（13:00～15:00）
新時代の物質生産宿主開発の方法論：ゲノムを大規模に編集する．代謝計測から設計図を書く．
座長：丸山 潤一
13:00

S3Hb01

物質生産宿主・麹菌で自在にかつ無限に遺伝子を改変する～ゲノム編集技術の進展.................................................................................................. ○丸山 潤一（東大院・農生科・応生工）

13:24

S3Hb02

大規模な代謝経路をデザインすることへの挑戦...................................................................................................... ○柘植 謙爾（神戸大院・科技イノベ）

13:48

S3Hb03芳香族化合物合成プラットホームの開発～芳香族モノマー合成に理想的な大腸菌代謝デザイン～............................................................................ ○野田 修平, 白井 智量, 近藤 昭彦（理研・環境資源）

14:12

S3Hb04

物質生産宿主としての酵母の代謝経路改変とゲノム改変に向けた合成生物工学的手法開発.......................................................................................................... ○石井 純（神戸大院・科技イノベ）

14:36

S3Hb05

大腸菌中心炭素代謝システムの動力学モデル開発と有用物質生産の合理的設計.................................................................................................................................. ○倉田 博之（九工大）

K 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:00～15:00）
地域から世界へ，グローカルバイオテクノロジーで創る新しい価値
はじめに........................................................................................................................................................ 古賀 雄一

13:00

座長：仲嶋 翼13:05

S3Kb01

バイオテクノロジーが拓くバイオエコノミーー新たなバイオ戦略についてー.............................................................................................. ○上村 昌博（経済産業省生物化学産業課）
座長：古賀 雄一

13:30

S3Kb02

生物工学を通じたイノベーションの創出と地域貢献の可能性............................................................................... ○仲嶋 翼（三菱 UFJ リサーチ&コンサルティング）
休憩

13:55

座長：古賀 雄一
14:00

S3Kb03

さまざまな生物資源から単離された微生物の活用.............................................................................................................. ○櫻谷 英治（徳島大・生物資源）

14:25

S3Kb04

地域発！世界へはばたく事業の創出～科学技術の「種」を地域で育てる～.......................................................................................................................... ○髙橋 修一郎（リバネス）

座長：河原崎 泰昌

14:50

おわりに
.................................................................................................................................................... 河原崎 泰昌

L 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:00～15:00）
複雑組織製造に必要な基盤技術を考える－どこまで出来て，何が足らないのか？－
13:00

はじめに
........................................................................................................................................................ 長森 英二

58

座長：長森 英二
13:05

S3Lb01細胞シートを基盤とした機能的立体組織構築の現状と展望..................................................................... ○清水 達也（東京女子医科大学 先端生命医科学研究所）
座長：境 慎司

13:30

S3Lb023 次元組織モデルの足りていること，足りていないこと.......................................................................................... ○松崎 典弥 1,2（1 阪大院・工, 2 JST-さきがけ）

13:50

S3Lb03

細胞製造性について考える.................................................................................................................. ○紀ノ岡 正博（阪工大院・工）14:15

S3Lb04血管を含む立体組織をつくるアプローチ...................................................................................................................... ○福田 淳二（横国大院・工）14:35

S3Lb05

3D バイオプリンティング...................................................................................................................... ○境 慎司（阪大院・基礎工）

座長：藤田 聡史

おわりに........................................................................................................................................................ 長森 英二

14:55

M 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（13:00～15:00）
真核微生物におけるシグナル伝達と代謝の接点を探る－発酵調節の根源的な理解に向けて－はじめに........................................................................................................................................................ 水沼 正樹

13:00

座長：渡辺 大輔
13:01

S3Mb01

ストレス耐性や寿命延長におけるメチオニン代謝の役割.......................................................................................................... ○水沼 正樹（広島大院・先端物質）

13:15

S3Mb02

細胞表層の傷による出芽酵母の運命決定................................................................................... ○河野 恵子, 森山 陽介（沖縄科技大院・膜生物）

座長：水沼 正樹

座長：渡辺 大輔
13:30

S3Mb03糸状菌の菌糸生長の分子機構.......................................................................................................... ○竹下 典男（筑波大院・生命環境）

13:45

S3Mb04グルコースによる麹菌アミラーゼ生産の抑制機構...................................................................................................................... ○田中 瑞己（静県大・食栄）座長：水沼 正樹

座長：渡辺 大輔
14:00

S3Mb05

清酒酵母のリンゴ酸高生産株に見出した遺伝子変異と代謝変化.................................................. ○根来 宏明, 小高 敦史, 松村 憲吾, 堤 浩子, 秦 洋二（月桂冠・総研）

14:15

S3Mb06

NAD+-依存性デアセチラーゼ欠損を中心とした解糖系の代謝リプログラミング.............................................................. ○増本 博司 1, 松山 茂 2（1 長崎大・医, 2 筑波大院・生命環境）

座長：水沼 正樹

座長：渡辺 大輔
14:30

S3Mb07

酵母栄養源飢餓ストレスと発酵制御.................................................................................................................. ○善本 裕之（キリン・酒類研）

14:45

S3Mb08

酵母は何を感知してアルコール発酵を調節しているのか？
....................................................................................... ○渡辺 大輔, 高木 博史（奈良先端大・バイオ）座長：水沼 正樹59

おわりに........................................................................................................................................................ 渡辺 大輔

14:59

招待講演・シンポジウム（午後の部

15:20～17:20／17:50）

B 会場 第 4 学舎 3 号館 4 階（15:20～17:50）
構造と機能デザインによる有用人工酵素の創製と応用展開
はじめに........................................................................................................................................................ 大島 敏久

15:20
15:25

S3Bc01

座長：大島 敏久

〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Biomimetic membrane technology and its engineered applications...............................................................................................................................................○Tae-Joon Jeon
（Dept. Biol. Eng., Inha Univ., Korea）
座長：神谷 典穂
15:55

S3Bc02耐熱性酸性コラゲナコーゼ Kumamorisin-As：構造機能解析と反応最適 pH の変換.......................................................................................................................... ○中山 亨（東北大院・工）16:15

S3Bc03

モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素の熱安定性の向上と新しい核酸増幅法の開発......................................................... ○滝田 禎亮, 馬場 美聡, 片野 裕太, 岡野 啓志, 兒島 憲二, 保川 清
（京大院・農）休憩

16:35

座長：中山 亨16:45

S3Bc04D-アミノ酸脱水素酵素の構造情報に基づく基質特異性の改変................................................................... ○櫻庭 春彦 1, 林 順司 2, 秋田 紘長 3, 大森 勇門 4, 大島 敏久 4（1 香川大・農, 2 立命館大・生命科学, 3 産総研, 4 大阪工大・工）17:05

S3Bc05

人工補酵素-ギ酸脱水素酵素系による炭酸ガスからのギ酸合成.......................................................................................................... ○天尾 豊（大阪市大・複合先端研）

17:25

S3Bc06架橋触媒機能を有する微生物由来トランスグルタミナーゼ前駆体の設計..................................................................................... ○神谷 典穂 1,2, 松崎 隆 1, 林 浩之輔 1, 南畑 孝介 1,3

座長：櫻庭 春彦

（1 九大院・工, 2 九大・未来化セ, 3 KAICO）
おわりに........................................................................................................................................................ 大島 敏久

17:45

C 会場 第 4 学舎 3 号館 2 階（15:20～17:50）
資源作物生産から発酵生産までをトータルシステムとして俯瞰する
はじめに........................................................................................................................................................ 酒井 謙二

15:20

座長：伊藤 幸博
15:25

S3Cc01

木質バイオマスの質と量：オーダーメイド改変に向けて.................................................................................................. ○出村 拓（奈良先端大・先端科学技術）

60

座長：酒井 謙二
15:45

S3Cc02

食糧・バイオリファイナリー共用イネの開発を目指した稲わらの糖化性向上...................................................................................................................... ○伊藤 幸博（東北大院・農）

16:05

S3Cc03

培地・基質及びダウンストリームから考える発酵生産.......................................................................................................................... ○園元 謙二（九大院・農）
休憩

16:25

座長：酒井 謙二
16:35

S3Cc04

発酵微生物のスクリーニングを考える................................................................................ ○青柳 秀紀 1, 高橋 将人 1, 松﨑 大典 2, 長谷川 智弘 1
（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）
座長：青柳 秀紀

16:55

S3Cc05複合微生物系から考える発酵生産....................................................................................................... ○田代 幸寛 1, 宮本 浩邦 2,3, 酒井 謙二 1
（1 九大院・農, 2 （株）サーマス, 3 千葉大・園芸）

17:15

S3Cc06

発酵生産のための人工代謝経路デザインの合理化と制約.......................................................................................................................... ○本田 孝祐（阪大院・工）
おわりに........................................................................................................................................................ 青柳 秀紀

17:35

D 会場 第 4 学舎 3 号館 1 階（15:20～17:20）
黒麹菌・白麹菌の研究からつなげる産業振興
はじめに........................................................................................................................................................ 外山 博英

15:20

座長：外山 博英
15:25

S3Dc01

黒麴菌の学名は Aspergillus luchuensis です...................................................................................................................................... ○山田 修（酒総研）

15:45

S3Dc02

全ゲノム情報を用いた泡盛黒麹菌を含む Aspergillus luchuensis の系統解析.................................................................................................................. ○塚原 正俊（バイオジェット）

16:05

S3Dc03Aspergillus luchuensis の遺伝子破壊株の造成方法と応用....................................................................... ○水谷 治 1, 渡嘉敷 直杏 2, 高橋 徹 3, 山田 修 3, 外山 博英 1
（1 琉球大・農, 2 鹿児島大院・連農, 3 酒総研）
休憩

16:25

座長：塚原 正俊
16:30

S3Dc04

黒麹菌による泡盛古酒香バニリン前駆体の生成～古酒と老麹～...... 眞榮田 麻友美 1, 渡嘉敷 正司 2, 渡嘉敷 みどり 2, 後藤 正利 3, 伊藤 進 1, 上地 敬子 1, ○平良 東紀 1
（1 琉球大・農, 2 石川種麹店, 3 佐賀大・農）

16:50

S3Dc05

白麹菌のクエン酸高分泌生産機構に関する研究～トランスクリプトームを手掛かりとしてわかってきたこと～.................................................................................... ○二神 泰基 1, 門岡 千尋 1, 後藤 正利 2, 玉置 尚徳 1
（1 鹿児島大院・連農, 2 佐賀大・農）

17:10

おわりに
........................................................................................................................................................ 塚原 正俊

61

E 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（15:20～17:20）
生物系研究者のための電気化学入門～その実験大丈夫？～
はじめに............................................................................................................................................................ 若井 暁

15:20

座長：若井 暁15:25

S3Ec01

環境の酸化還元電位，水溶液や付着物の電気抵抗，電気的中性条件について考慮しましたか？
.......................................................................................................... ○伊藤 公夫（新日鐵住金・先端研）

15:50

S3Ec02微生物鉄腐食研究が与える異分野融合のチャンス.......................................................... ○岡本 章玄（物材研・国際ナノアーキテクトニクス研究拠点）

16:15

S3Ec03

医療用金属材料開発における電気化学の基礎と応用.................................................................................................. ○堤 祐介（医科歯科大・生材研・金属）

16:40

S3Ec04光合成を電気化学で測る，操る......................................................... ○中西 周次 1,2（1 阪大・太陽エネ化学研究セ, 2 阪大院・基礎工）
パネルディスカッション................................................................................................................................................................. 全員

17:05

F 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（15:20～17:20）
環境は持続可能か？－地球規模の物質循環を生物工学から考える－
はじめに........................................................................................................................................................ 加藤 純一

15:20

座長：新谷 政己
15:25

S3Fc01

工学システムの進展から見る窒素マネジメントの現状と課題...................................................................................................................... ○寺田 昭彦（農工大院・工）15:55

S3Fc02硫化カルボニルの生物地球化学循環と安定同位体比を用いた動態解析............................................................... ○服部 祥平 1, 亀崎 和輝 1, 小川 貴弘 2, 片山 葉子 2, 吉田 尚弘 1
（1 東工大, 2 農工大）座長：金原 和秀

16:20

S3Fc03結晶性酸化鉄の微生物還元とその地球炭素循環との関わり...................................................................................................................................... ○堀 知行（産総研）

16:45

S3Fc04リン最前線－Ｐイノベーションとリン循環産業ビジョン－...................................................... ○大竹 久夫 1, 常田 聡 2（1 早大・総合研究機構, 2 早大・先進理工）

17:15

おわりに
........................................................................................................................................................ 寺田 昭彦

G 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（15:20～17:50）
タンパク質と材料界面の相互作用の本質に迫る
15:20

はじめに
........................................................................................................................................................ 黒田 章夫

62

15:25

S3Gc01

座長：黒田 章夫

〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Analysis of carbohydrate-protein interaction........................................................................................................................................... ○Jeong Hyun Seo（Sch. Chem. Eng., Yeungnam Univ., Republic of Korea）
座長：黒田 章夫
15:50

S3Gc02

進化工学からみた材料結合性ペプチド・タンパク質の雰囲気...................................................................................................................... ○梅津 光央（東北大院・工）16:10

S3Gc03

水中強接着性細菌タンパク質 AtaA の非特異的相互作用の謎に迫る.............................................................................................................................. ○堀 克敏（名大院・工）
座長：堀 克敏

16:30

S3Gc04タンパク質の天然変性領域が関与する材料との相互作用........................................................................................... ○黒田 章夫, 池田 丈（広島大院・先端物質）
休憩

16:50

座長：堀 克敏
16:55

S3Gc05

フラグメント分子軌道(FMO)法のナノバイオ系への応用事例..................................................................................................... ○望月 祐志 1,2, 加藤 幸一郎 3, 福澤 薫 2,4（1 立教大・理, 2 東大・生産研, 3 みずほ情報総研, 4 星薬科大・薬）17:25

S3Gc06材料のナノ構造が誘起するタンパク質吸着および細胞接着............................................................................ ○高井 まどか 1, 平口 侑香里 1, 荒木 保幸 2, 和田 健彦 2
（1 東大院・工, 2 東北大・多元研）
おわりに............................................................................................................................................................ 堀 克敏

17:50

H 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（15:20～17:50）
スマートバイオデザイン：ナノからマクロスケールまでの様々な階層レベルにおけるバイオ関連機能と構造の合理的創出を目指して
15:20

S3Hc01

座長：新井 亮一

〈招待講演（韓国生物工学会）〉

Nanometer scale biological particle separation with flow controls and electrical field controls...................................................................................................................................... ○Jong Wook Hong 1,2（1 Grad. Sch. Dept. Bionano Technol., Hanyang Univ., Korea,
2

Grad. Sch. Dept. Bionano Eng., Hanyang Univ., Korea）

はじめに........................................................................................................................................................ 新井 亮一

15:50

座長：新井 亮一
15:53

S3Hc02

耐熱性を保ったまま好熱菌酵素の触媒特性を常温菌型に変える.......................................................................................................................... ○赤沼 哲史（早大・人科）

16:16

S3Hc03

人工知能を用いたタンパク質高機能化........................................................................................ ○亀田 倫史 1, 齋藤 裕 1, 津田 宏治 2, 梅津 光央 3
（1 産総研・人工知能, 2 東大院・新領域, 3 東北大院・工）座長：座古 保16:39

S3Hc04バイオ分子の自己集合化に潜む機能...................................................................................................... ○池添 泰弘（日工大・基幹工・応化）

17:02

S3Hc05クモ糸の階層構造の解明と人工的再構築...................................................................................................................................... ○沼田 圭司（理研）

63

座長：梅津 光央
17:25

S3Hc06

オリゴ DNA の腸管送達系の構築と経口用素材への展開...................................................................................................... ○下里 剛士（信州大・菌類微生物セ）
おわりに............................................................................................................................................................ 座古 保

17:48

K 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（15:20～17:20）
Networking of Researches Toward Social Implementation of Bioresources Rich in ASEAN「ASEAN における生物
資源の社会実装を目指した研究ネットワーキング」＜国際シンポジウム＞
はじめに........................................................................................................................................................ 藤山 和仁

15:20

座長：藤山 和仁
15:23

S3Kc01

生物資源管理に関する世界動向を踏まえた ASEAN と日本の連携によるバイオ科学技術の発展を目指して........................................................................................○川﨑 浩子（製品評価技術基盤機構・NBRC）
座長：川﨑 浩子

15:47

S3Kc02ASEAN Network for microbial utilization (ANmicro): A step forward to the global ASEAN......................................................................................................................................... ○Lily Eurwilaichitr（TBRC, BIOTEC, Thailand）
休憩

16:10

座長：Lily Eurwilaichitr
16:15

S3Kc03

The role of PSM in enhancing academe-industry partnership for the utilization of indigenous bioresources in
the Philippines............................................................................................................................ ○Leslie Michelle Dalmacio（Dept. Biochem. Mol. Bio., Coll. Med., Univ. of the Philippines Manila）
座長：Leslie Michelle Dalmacio

16:35

S3Kc04

A case study on cooperative development on utilization of microbial bioresource between Vietnam andJapan......................................................................................................... ○Duong Van Hop, Nu Nguyen Kim Nu（Inst. Microbiol. Biotechnol., Vietnam National Univ., Hanoi）
座長：Duong Van Hop

16:55

S3Kc05Indonesian bioresource utilization for health and beauty........................................................................................................................................ ○Irmanida Batubara（Trop BRC IPB, Indonesia）

17:15

おわりに
.................................................................................................................................................... 福﨑 英一郎

L 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（15:20～17:50）
工学が見出すエッセンシャル細胞培養 ～動物細胞培養の根本に工学はどう立ち向かうか～【本部企画】
15:20

はじめに
........................................................................................................................................................ 加藤 竜司

64

座長：児島 宏之
15:23

S3Lc01

動物細胞培養の産業応用の変遷 －テクノロジーからエンジニアリングへ－............................................................................................... ○大政 健史 1,2（1 阪大院・工, 2 MAB 組合）

15:48

S3Lc02

新規 CHO 細胞による抗体医薬品生産 － 5 g/L/6days の高いポテンシャルと工業化への課題 －...................................................................................................... ○堀内 貴之（株式会社ちとせ研究所）
座長：河原 正浩

16:08

S3Lc03

DNA バーコードとゲノム編集による分子・細胞動態計測...................................................................................................................... ○谷内江 望（東大・先端研）

16:28

S3Lc04

塩基編集技術 Target-AID の工学的応用...................................................................................................... ○西田 敬二（神戸大院・科技イノベ）

16:48

S3Lc05細胞培養における代謝解析ツールとしてのメタボロミクス................................................................................................... ○馬場 健史, 和泉 自泰（九大・生医研）

17:08

S3Lc06受容体ライブラリーによる機能性細胞の創製.......................................................................................................................... ○河原 正浩（東大院・工）座長：加藤 竜司

座長：河原 正浩
17:28

S3Lc07細胞形態計測による細胞フェノミクス解析...................................................................................................................... ○加藤 竜司（名大院・創薬）
おわりに........................................................................................................................................................ 河原 正浩

17:48

M 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（15:20～17:50）
糖鎖工学技術がもたらすバイオ医薬品の新潮流
座長：三﨑 亮
15:20

S3Mc01糖転移酵素を用いた糖ペプチド合成と糖鎖創薬への応用展開.............................................................. ○千葉 靖典 1, 吉村 弥生 1,2, 高橋 佳江 1, 横尾 岳彦 1, 清水 弘樹 3
（1 産総研・創薬基盤, 2 バイオインダストリー協会, 3 産総研・生物プロセス）

15:35

S3Mc02糖タンパク質の精密化学合成.......................................................................................................................... ○梶原 康宏（阪大院・理）

16:00

S3Mc03糖タンパク質合成の制御とバイオ医薬品への機能付与.................................................................................................................. ○朝井 洋明（糖鎖工学研究所）

16:25

S3Mc04糖アナログを利用した糖鎖機能の追跡と改変..............................................................................................................○木塚 康彦（岐阜大・G-CHAIN）

座長：千葉 靖典

座長：加藤 紀彦
16:50

S3Mc05

バイオ医薬品開発を指向した化学合成糖鎖からのアプローチ................................................................................................. ○松崎 祐二（東京化成工業 糖鎖技術部）

17:15

S3Mc06

エンドグリコシダーゼと機能性合成 N 型糖鎖を利用するネオ糖タンパク質医薬品の開発を目指して....................... ○伊藤 孝司 1,6, 西岡 宗一郎 1,6, 小林 功 2,6, 笠嶋 めぐみ 2,6, 立松 謙一郎 2,6, 瀬筒 秀樹 2,6,
松崎 祐二 3, 飯野 健太 3, 木下 崇司 4, 堂崎 雅仁 4, 灘中 里美 5, 北川 裕之 5（ 徳島大院・医歯薬学研・創薬生命工, 2 農研機構・カイコ機能改変技術開発ユニット, 3 東京化成工業,
1

4

17:40

伏見製薬所, 5 神戸薬科大・生化学, 6 SERIREVO）

おわりに............................................................................................................................................................ 三﨑 亮

65

一般講演

C 会場 第 4 学舎 3 号館 2 階（9:00～11:24）【醸造学，醸造工学】
9:00

3Ca01

白麹菌における推定 RNA 結合タンパク質 NrdA の機能解析.......................................................... ○門岡 千尋 1, 泉津 弘佑 2, 浅井 禎吾 3, 奥津 果優 1, 吉﨑 由美子 1,髙峯 和則 1, 後藤 正利 4, 玉置 尚徳 1, 二神 泰基 1
（ 鹿児島大・農, 滋賀県立大・環境科学, 3 東大院・総合文化, 4 佐賀大・農）
1

9:12

3Ca02

2

プロテアーゼを高生産する黒麹菌の育種と芋焼酎醸造試験による評価.................................... ○瀬戸口 翔 1,2, 益留 綾菜 2, 一谷 勝之 3, 橋本 文雄 3, 吉田 理一郎 3, 岡本 繁久 3,
内海 俊樹 4, 尾上 昌平 5, 岩井 謙一 2, 髙瀬 良和 2, 二神 泰基 3, 玉置 尚徳 3
（ 鹿児島大院・連農, 2 霧島酒造, 3 鹿児島大・農, 4 鹿児島大院・理工, 5 鹿児島大・RI）
1

9:24

3Ca03

黒麹菌における 1-octen-3-ol 生合成遺伝子の解析............................................................ ○片岡 涼輔 1, 植松 千暁 2, 長谷川 泰子 2, 渡邉 泰祐 1,2, 荻原 淳 1,2（1 日大院・生資科, 2 日大・生資科）

9:36

3Ca04

泡盛黒麹菌 Aspergillus luchuensis の系統解析と毒素関連遺伝子の解析....................................................... 阿部 峻之 1, 東 春奈 1, 外山 博英 2, 水谷 治 2, 山田 修 3, ○塚原 正俊 1
（1 バイオジェット, 2 琉球大・農, 3 酒総研）

9:48

3Ca05

10:00

3Ca06

10:24

3Ca07

10:36

3Ca08

10:48

3Ca09

11:00

3Ca10

11:12

3Ca11

Aspergillus luchuensis 由来フェノール酸脱炭酸酵素の各種米麹中の発現量と泡盛もろみおよび蒸留
液中の 4-VG 量の相関........................................... ○眞榮田 麻友美 1, 渡嘉敷 正司 2, 渡嘉敷 みどり 2, 上地 敬子 1, 平良 東紀 1
（1 琉球大・農, 2 石川種麹店）
黄麴菌 Aspergillus oryzae におけるペプチダーゼ遺伝子の転写に窒素源が与える影響.................................................................................... ○白石 敦士, 前田 浩, 山形 洋平（農工大院・農）Visualizing metabolites in rice koji using MALDI imaging mass spectrometry..................................... ○ Adinda Putri Wisman 1, Yoshihiro Tamada 2, Takahiro Akashi 2, Katsuya Gomi 3,
Eiichiro Fukusaki 1, Shuichi Shimma 1
1（ Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2 Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd.,
3
Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.）
イメージング質量分析を用いた清酒における麹米品種の特性解析..................... ○玉田 佳大 1, Wisman Adinda Putri 2, 窪寺 隆文 1, 明石 貴裕 1, 福﨑 英一郎 2, 新間 秀一 2
（1 白鶴酒造, 2 阪大院・工）生もと系酒母製造工程において各種微生物が呈味成分に与える影響............................................................................................ ○高橋 正之, 喜多 靖子, 向井 伸彦（酒総研）
清酒酵母のアルギニン取込能の差に起因するタンパク質解析............................................................................................ ○清野 珠美, 和田 潤, 廣岡 青央（京産技研）
濃縮果汁を用いたワイン発酵における発酵遅延の原因成分の同定と改善法の開発...................... ○菊地 のぞみ 1, 稲留 弘乃 2, 高橋 沙織 2, 篠原 裕之 3, 鈴木 克彦 1, 吉田 聡 1, 高田 良二 1
（1 キリン・ワイン技術研, 2 キリン・酒類技術研, 3 キリン・基盤技術研）

66

E 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（9:00～11:24）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
9:00

3Ea01

抗菌性物質が皮膚常在菌の生理活性に及ぼす影響の解析....................................................................................... ○菊田 実花, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

9:12

3Ea02

抗菌性食品添加物が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響の解析....................................................................................... ○箱田 優奈, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

9:24

3Ea03

皮膚常在菌の増殖に対する化粧品添加の影響..................................................................... ○多賀 直彦, 今村 香乃, 大場 輝, 川上 茅咲（東海大・農）

9:36

3Ea04

増殖の速い微生物が環境試料からの微生物の培養化に及ぼす影響の解析と利用.................... 長谷川 智弘 1, ○原田 玲奈 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）

9:48

3Ea05

植物試料の凍結前処理が培養微生物群集に与える影響の解析....................................................................................... ○小林 和輝, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

10:00

3Ea06

模擬微小重力培養が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響の解析(第 3 報)................ 長谷川 文香 1, ○増田 亜理沙 2, 青柳 秀紀 1,2（1 筑波大院・生命環境, 2 筑波大・生物資源）

10:24

3Ea07

放線菌由来の新規塩基性ポリアミノ酸： Poly(diaminopropanoic acid) の単離とキャラクタリゼー
ション................................................. ○加藤 芳尚, 稲葉 悠, 室 尚吾, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）

10:36

3Ea08

Streptomyces 属放線菌由来の Poly(ε-L-lysine) が示す抗真菌作用機構の解析................................................... ○松井 旺大 1, 星山 貴文 1, 永田 智 1, 竹原 宗範 1, 野村 亘 2, 井上 善晴 2
（1 滋県大院・工・材料科学, 2 京大院・農・応用生命）

10:48

3Ea09

Poly(ε-L-lysine) の生分解可能なカチオン性分散剤への利用研究............................................................................... ○武内 正輝, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）

11:00

3Ea10

好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus の培養特性解析............................................... ○三原 笑 1, 竹中 武藏 2, 柏木 紀賢 2, 曽田 匡洋 3, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ, 3 長瀬産業）

11:12

3Ea11

深海細菌 Aneurinibacillus sp.YR247 の抗真菌ペプチドの特性の解明............................................................... ○福井 瑞季 1, 山浦 由登 1, 倉田 淳志 2, 岸本 憲明 2, 上垣 浩一 2
（1 近畿大院・農, 2 近畿大・農）F 会場 第 4 学舎 2 号館 1 階（9:00～11:00）【生物化学工学／培養工学／バイオプロセス】
9:00

3Fa01

海洋性細菌が形成する CdS ナノ粒子のキャラクタリゼーション............................................. ○佐坂 文武, 高橋 宏和, 富永 依里子, 岡村 好子（広島大院・先端物質）

9:12

3Fa02

バイオミネラリゼーションによるシリカナノシートの構築........................................................................................ ○畠中 孝彰, 大橋 雅卓, 石田 亘広（豊田中研）

9:24

3Fa03

外膜表層に金属結合ペプチドを提示した微生物の無機固体表面に対する選択的な吸着特性........................................................................................ ○岩田 至叡, 中島 一紀, 川﨑 了（北大院・工）

9:36

3Fa04

気生微細藻類と窒素固定菌の共生系を利用した壁面培養法...................... ○塚越 崇之, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）

67

9:48

3Fa05

Preparation and characterisation of robust whole cell biocatalyst from Aspergillus oryzae expressing
Fusarium heterosporum lipase immobilized onto activated carbon for biodiesel synthesis..................... ○Emmanuel Quayson 1, Jerome Amoah 1, Akihiko Kondo 2, Shinji Hama 3, Ayumi Yoshida 3,
Chiaki Ogino 1（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
3

10:00

3Fa06

Res. Dev. Lab., Bioenergy Corpo.）

ナノファイバータンパク質 AtaA の塩濃度依存的な接着性を利用した細菌の可逆的固定化.......................................................................................... ○吉本 将悟 1,2, 小原 優季 1, 中谷 肇 1, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 名大・VBL）

10:24

3Fa07

Acinetobacter sp. Tol 5 の難付着材料に対する付着性の評価.......................................................................................... ○川尻 彩音 1, 飯尾 魁 1, 吉本 将悟 1,2, 堀 克敏 1
（1 名大院・工, 2 名大・VBL）

10:36

3Fa08

固定化細胞培養法を活用した生物細胞の選択的取得法の開発....................................................................................... ○吉田 真梨, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）

10:48

3Fa09

培地成分が大腸菌フロック形成に与える影響................................................................. ○本間 裕章, 大塚 未音, 尾島 由紘, 東 雅之（阪市大院・工）G 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（9:00～10:12）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
9:00

3Ga01

生分解性プラスチックの海水，河川水での生分解........................................................ ○中山 敦好, 川崎 典起, 山野 尚子（産総研・バイオメディカル）

9:12

3Ga02

発酵(R)-3-ヒドロキシ酪酸と α-ヒドロキシ酸の共重合体の化学合成と生分解.................... ○常盤 豊 1,4, 中山 敦好 1, 川崎 典起 1, 山野 尚子 1, 伊田 小百合 1, 楽 隆生 2, 世嘉良 宏斗 3
（1 産総研, 2 甲南化工, 3 沖縄県工技セ, 4 トロピカルテクノプラス）

9:24

3Ga03

(R)-3-ヒドロキシ酪酸生産菌の代謝制御に関わる無機塩類.................................................................................. ○世嘉良 宏斗 1, 花城 隆二 1, 合田 雅浩 1, 常盤 豊 2,3（1 沖縄県工技セ, 2 トロピカルテクノプラス, 3 産総研）

9:36

3Ga04

酸性溶液による変性 PET の加水分解と分子量変化.......................................... ○廣田 泰志 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）

9:48

3Ga05

Thiol-ene 反応を用いたビニル化合物生産菌の分離技術の開発........................................... ○佐野 芽生 1, 黒田 ひかり 1, 小原 仁実 1, 安藤 寛 2, 松本 圭司 2, 麻生 祐司 1
（1 京都工繊大院・工芸科学, 2 (株)カネカ・R&D 企画部）

10:00

3Ga06

Heck 反応を用いたビニル化合物生産菌の分離技術の開発............................................... ○矢田 椋己 1, 佐野 芽生 1, 小原 仁実 1, 安藤 寛 2, 松本 圭司 2, 麻生 祐司 1（1 京工繊大院・工芸科学, 2 カネカ・R＆D 企画部）

H 会場 第 4 学舎 2 号館 2 階（9:00～11:24）【バイオマス，資源，エネルギー工学】
9:00

3Ha01

Bio-alcohol production in engineered Bacillus subtilis through restoration of nutritional depletion stress........................................................... Kim Eunjoo 1, Seo Dahee 1, Yang Yung-Hun 2, ○Choi Kwon-Young 1（1 Dept. Environ. Eng. Ajou University, 2 Dept. Microbial Eng. Konkuk University）

68

9:12

3Ha02

酵素の生産・放出を行う大腸菌と物質生産を行う大腸菌の共培養による有用物質生産.......................... ○岩崎 建史朗 1, 本庄 宏 2, 相馬 悠希 3, 盧 鎮栄 2, 鶴野 圭悟 2, 濱田 浩幸 1, 花井 泰三 1
（1 九大院・生資環, 2 九大院・シス生科, 3 九大・生医研）

9:24

3Ha03

グルコース／キシロース切替え流加法による乳酸ベースポリマー生産組換え大腸菌の高密度培養.......................... 山崎 貴史 1, Ribordy Greg 2, 堀 千明 1,3, ○松本 謙一郎 1,3, 大井 俊彦 1,3, Zinn Manfred 2,
田口 精一 3,4
（1 北大院・工, 2 Hes-SO Walais Wallis, 3 JST・CREST, 4 t 東農大・生命科学）

9:36

3Ha04

Clostridium beijerinckii を宿主としたタンパク質発現系の開発 ―プロモーターの検討―............................................................................ ○須江 夏希, 平松 愛子, 三宅 英雄（三重大院・生資）

9:48

3Ha05

発酵阻害物質耐性酵母 KS47-1 株の特徴づけと 1 倍体の取得............................................................... ○竹内 健人 1, 加藤 勇太 1, 荒川 知子 1, 堀内 淳一 2, 小西 正朗 1
（1 北見工大, 2 京工繊大院・工芸科学）

10:00

3Ha06

キシローストランスポーター GAL2 の脱ユビキチン化によるグルコース・キシロース同時消費酵
母の作成.................................................................. ○藤森 一浩 1, 小林 洋介 1,2, 佐原 健彦 1, 扇谷 悟 1, 鎌形 洋一 1
（1 産総研・生物プロセス, 2 Biomaterial in Tokyo）

10:24

3Ha07

酵母 Scheffersomyces stipitis を宿主とした新規細胞表層提示システムの開発......................................... ○猪熊 健太郎, 小林 優真, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

10:36

3Ha08

接合型変換を利用したセルラーゼ群表層提示酵母の糖化活性及び発酵阻害物耐性向上......................................... ○北田 雄基, 猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

10:48

3Ha09

Repeated ethanol fermentation from membrane-concentrated sweet sorghum juice by flocculating yeast
Saccharomyces cerevisiae................ ○Hans Wijaya 1,2, Kengo Sasaki 3, Prihardi Kahar 1, Yopi 2, Chiaki Ogino 1, Bambang Prasetya 4,
Akihiko Kondo 3（1 Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2 LIPI, 3 Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 4 BSN）

11:00

3Ha10

人工知能や統計的手法による天然培地成分からの発酵生産量予測.............................................. ○渡辺 一樹 1, 小西 正朗 2（1 北見工大院・工・バイオ環境, 2 北見工大）

11:12

3Ha11

潜性形質に注目したレアメーティングによる非遺伝子組換え酵母の育種.................................................................................... ○海道 直生 1, 金子 嘉信 2, 山崎 思乃 3, 片倉 啓雄 3
（1 関西大院・理工, 2 阪大院・工, 3 関西大・化生工）

I 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:24）【生体情報工学，バイオインフォマティクス／システムバイオロジー】
9:00

3Ia01

バイアスドランダム化と DNA バーコード付加によるプロモーター変異体のハイスループット解析......................................................................................... ○青木 航 1,2, 古村 崚 1, 元根 啓佑 1,3, 植田 充美 1
（1 京大院・農, 2 JST さきがけ, 3 日本学術振興会）

9:12

3Ia02

サンゴ共在細菌の機能予測に向けた環境因子応答 Endozoicomonas 属の系統解析........... ○井手 圭吾 1,4, 伊藤 通浩 2, 藤村 弘行 3, 須田 彰一郎 3, 中野 義勝 2, 細川 正人 5,6, 竹山 春子 1,4,5（1 早大・先進理工, 2 琉球大・熱生研, 3 琉球大・理, 4 産総研・早大 CBBD-OIL, 5 早大ナノライフ創研,
6

9:24

3Ia03

JST・さきがけ）

環境中難培養微生物のゲノム解析に向けた高精度シングルセルゲノムアセンブリツールの開発............................................................ ○小川 雅人 1,2, 西川 洋平 1, 森 一樹 2, 細川 正人 3,4, 竹山 春子 1,2,3（1 早大・先進理工, 2 産総研・早大 CBBD-OIL, 3 早大ナノライフ創研, 4 JST・さきがけ）

69

9:36

3Ia04

DNA 塩基配列の人工知能による生物分類・進化・機能の解析............................................... ○三宅 淳 1, 馬場 俊輔 1, 山本 修也 2, 島林 真人 2, 田川 聖一 3, 新岡 宏彦 4
（1 阪大国際医工情報センター, 2 阪大院・基礎工, 3 阪大先導的学際研究機構,
4

9:48

3Ia05

阪大データビリティーフロンティア機構）

大規模実験室進化を用いた転写因子の破壊による大腸菌の薬剤耐性化の制御.............................................................. ○堀之内 貴明 1, 前田 智也 1, 小谷 葉月 1, 酒井 亜希 1, 古澤 力 1,2（1 理研・生命機能, 2 東大院・理）

10:24

3Ia07

機械学習を用いた機能性ペプチド探索手法の開発............................................. ○山下 春来 1, 藤谷 将也 2, 清水 一憲 1, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 2, 本多 裕之 1,3（1 名大院・工, 2 名大院・創薬, 3 名大予防早期医療創成セ）

10:36

3Ia08

細胞形態情報解析における情報コンテントの重要性................................................................. ○加藤 寛之, 藤谷 将也, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）

10:48

3Ia09

細胞形態情報解析を応用した神経系細胞の非侵襲的評価......................................................... ○今井 祐太, 藤谷 将也, 寺澤 摩周, 岡田 真衣, 蟹江 慧, 加藤 竜司

11:00

3Ia10

ファンクショナルセロミクスによる神経ネットワークのハイスループットアノテーション...................................................................................... ○山内 悠至 1, 松倉 秀典 1, 青木 航 1,2, 植田 充美 1

（名大院・創薬）（1 京大院・農, 2 JST・さきがけ）
11:12

3Ia11

マウスのにおい学習実験における引き返し行動とおよび自発的不正解選択の関係............................. ○滝口 昇 1,2, 矢野 達也 3（1 金沢大・理工, 2 金沢大院・自科, 3 松本工業高等学校）

K 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:24）【発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析】
9:00

3Ka01

メタノール資化性酵母 Candida boidinii 合成生物学によるグルカル酸の高発酵生産....................................................... ○幅田 亜香莉 1, 由里本 博也 1, 山本 恭士 2, 湯村 秀一 2, 阪井 康能 1
（1 京大院・農, 2 三菱ケミカル）

9:12

3Ka02

Combinatorial biosynthesis in engineered yeast of morolic acid: a promising lead compound for anti-HIV
drug development................. ○Pisanee Srisawat, Ery Odette Fukushima, Shuhei Yasumoto, Hikaru Seki, Toshiya Muranaka（Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）

9:24

3Ka03

脂質生産酵母 Lipomyces を利用した再生可能資源からのバイオディーゼル用脂質生産における実験上の問題点とその解決........................................................................ ○柳場 まな, 松本 美穂, 長沼 孝文（山梨大院・医工総）

9:36

3Ka04

鉄硫黄タンパク質高活性化に基づくキシロースからの 1,2,4-ブタントリオール生産技術の開発............................................. ○湯川 貴弘, 番場 崇弘, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

9:48

3Ka05

酵母 Scheffersomyces stipitis を用いたレスベラトロール生産プロセスの開発......................................... ○小林 優真, 猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）

10:00

3Ka06

出芽酵母 2,3-ブタンジオール生産に向けた不活性型 Cas9 によるエタノール生合成経路の抑制....................................................................... ○森田 啓介 1, 松田 史生 1, 石井 純 2, 近藤 昭彦 2, 清水 浩 1（1 阪大院・情報, 2 神戸大院・科技イノベ）

10:24

3Ka07

T7 発現系を応用したプラスミドフリーで誘導剤が不要なフェニルアラニン高生産菌の開発.......................... ○岸田 隆寛 1, 駒 大輔 2, 大橋 博之 2, 山中 勇人 2, 森芳 邦彦 2, 長森 英二 1, 大本 貴士 2
（1 大工大・工・生命, 2 阪技術研）

70

10:36

3Ka08

大腸菌の NADH 脱水素酵素 I とシトクロム bo3 オキシダーゼ両欠損株における NDH-II 過剰発現が中枢代謝に与える影響.......................................................... ○濱田 和宏, 瀬島 祐大, 吹谷 智, 和田 大, 横田 篤（北大院・農）

10:48

3Ka09

Rhodococcus erythropolis N9T-4 株の低栄養生育に関与する推定トランスポーター遺伝子の機能解析........................................................................................... ○松岡 友洋, 吉田 信行（静大院・総合科技）

11:00

3Ka10

フェノールが大腸菌の中枢代謝に及ぼす影響の解析................................................................................ ○北村 さや香, 戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

11:12

3Ka11

大腸菌の ArcA による酸素消費速度の感知システム.................................................................................... 後野 直哉, ○戸谷 吉博, 清水 浩（阪大院・情報）

L 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:24）【酵素学，酵素工学】
9:00

3La01

PET 分解酵素クチナーゼの Ca2+結合に伴う熱安定性及び構造機能解析....................................................... 山上 由莉 1, 千賀 明香音 1, 沼本 修孝 2, 織田 昌幸 1, ○河合 富佐子 3（1 京府大院・生命環境, 2 医科歯科大・難研, 3 京都工繊大・繊科セ）

9:12

3La02

PHA 重合酵素への親水化タグ付与がポリマー重合能へ与える影響............................................................................................... ○原田 憲, 柘植 丈治（東工大・物質理工）

9:24

3La03

Citrobacter sp. S-77 由来の新規[NiFe]ヒドロゲナーゼの構造遺伝子と水素活性化機構........................................................................................................................... ○尹 基石 1,2,3, 小江 誠司 1,2,3（1 九大・WPI-I2CNER, 2 九大院・工・応化, 3 九大・小分子エネルギーセ）

9:36

3La04

ケッチェンブラックを用いた高性能バイオ電池の構築................................... ○渡邉 好一 1, 坂元 博昭 1,3, 里村 武範 2,3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5, 末 信一朗 1,2,3（1 福井大院・工・繊維, 2 福井大院・工・生物応用化, 3 福井大・ライフセ, 4 香川大・農, 5 阪工大）

9:48

3La05

分子揺動性を考慮した耐熱性酵素の配向固定による高性能バイオアノードの構築........... ○鈴木 治人 1, 高村 映一郎 2, 坂元 博昭 1,3, 里村 武範 3,4, 櫻庭 春彦 5, 大島 敏久 6, 末 信一朗 1,3,4（1 福井大院・工・繊維, 2 福井大院・工・総合, 3 福井大学・ライフセ, 4 福井大学院・工・生物応用化,
5

10:00

3La06

香川大・農, 6 大阪工大）

電極－酵素界面における異種間電子移動の距離依存性解析............................................................................. ○高村 映一郎 1, 鈴木 治人 2, 中村 卓登 2, 坂元 博昭 2,4,
里村 武範 3,4, 櫻庭 春彦 5, 大島 敏久 6, 末 信一朗 2,3,4（ 福井大学院・工・総合, 福井大学院・工・繊維, 福井大学院・工・生物応用化, 4 福井大学・ライフセ,
1

2

3

5

香川大・農, 6 大阪工大）

10:24

3La07

GFP を融合したシリカ重合酵素の機能解析..................................................................... ○竹田 雄大, 小栗 秀俊, 中島 一紀, 川﨑 了（北大院・工）

10:36

3La08

Development of cellulose hydrogel microsphere for lipase immobilization................................................................................................. ○Soyeon Jo, Sae Rom Park, Sang Hyun Lee（Dept. Biol. Engn., Konkuk Univ., South Korea）

10:48

3La09

Preparation of biopolymer-based hybrid hydrogel beads for enzyme immobilization...................................................................................................................... ○Saerom Park, Sang Hyun Lee

11:00

3La10

大腸菌包括菌体によるバニリンの効率的生産プロセスの開発.......................................................................................... ○齋藤 翼 1, 青野 陸 1, 古屋 俊樹 2, 木野 邦器 1,2（Dept. Biol. Engn., Konkuk Univ.）（1 早大院・先進理工・応化, 2 早大・理工総研）

71

11:12

3La11

ポリニュートラルレッド修飾電極を用いたリンゴ酸酵素による CO2 固定化システムの構築............................................................................... ○大田 竹留 1, 坂元 博昭 1,2, 里村 武範 1,2, 末 信一朗 1,2（1 福井大院・工, 2 福井大学ライフイノベセ）

M 会場 第 4 学舎 2 号館 3 階（9:00～11:24）【酵素学，酵素工学】
9:00

3Ma01

エリンギ由来セリンアミノペプチダーゼの基質取り込み経路の酸化が及ぼすペプチド結合形成反応への影響.................................................................................... ○東海 彰太 1, 美藤 友博 2, 清水 克彦 3, 有馬 二朗 2
（1 鳥取大院・連農, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大・CoRE）

9:12

3Ma02

D-アミノ酸含有ジペプチドの汎用的な酵素合成法の開発.................................................................................. ○賀野 壮一朗 1, 鈴木 伸 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1 早大・先進理工, 2 早大・理工総研）

9:24

3Ma03

菌体反応系によるイミダゾールジペプチドの効率的生産法の開発......................................................................................................... ○駒林 卓磨 1, 倉本 歩 2,3, 木野 邦器 1,2（1 早大院・先進理工・応化, 2 早大・理工総研, 3 東海物産）

9:36

3Ma04

アミノペプチダーゼによるアレルゲンペプチドの分解................................................................... ○畑中 唯史 1, 万 クン 2, 裏地 美杉 3, 東海 彰太 1, 中東 良太 4
（1 岡山生物研, 2 中国西南大学, 3 神戸大院・科技イノベ, 4 ナガセケムテックス(株)）

9:48

3Ma05

Split intein の protein trans-splicing を利用した耐熱性プロテアーゼ再構成の検討.................................................. ○巽 祐介, 足立 航平, 山野 範子, 大政 健史, 古賀 雄一（阪大院・工）

10:00

3Ma06

Tk-subtilisin の有機溶媒耐性の解析................................................................. ○宮田 大暉, 大政 健史, 山野 範子, 古賀 雄一（阪大院・工）

10:24

3Ma07

環状イミノ酸に対する反応性が向上したサルコシンオキシダーゼ変異体............................................................................................... ○黒部 督惠, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）

10:36

3Ma08

Chloroflexus aurantiacus 由来のサルコシンオキシダーゼの N-メチルアミノ酸に対する反応性............................................................................................... ○松本 美徳, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）

10:48

3Ma09

Pyrococcus horikoshii 由来馬尿酸加水分解酵素の機能改変............................................................... ○今井 皐 1, 名越 健太郎 1, 新木 翔太 1, 馬場 利明 2, 西矢 芳昭 1
（1 摂南大院・理工, 2 ニプロ 総研 第三研究開発）

11:00

3Ma10

高基質特異性 L-アミノ酸オキシダーゼの 1 種 L-リシン α-オキシダーゼから部位特異的変異により作成した 新規な芳香族アミノ酸オキシターゼの性質.......................... ○松本 侑也 1, 北川 雄輝 2, 今田 勝巳 2, 根本 理子 1, 田村 隆 1, 日下部 均 3, 稲垣 賢二 1
（1 岡山大院・環境生命, 2 阪府大院・理, 3 エンザイムセンサ）

11:12

3Ma11

Pseudomonas aeruginosa PAO1 株由来アセチルコリンエステラーゼによるアミノ酸のアセチル化反応........................................................................................ ○井上 尚 1, 美藤 友博 2, 清水 克彦 3, 有馬 二朗 2
（1 鳥取大院・農, 2 鳥取大・農, 3 鳥取大・CoRE）

72

N 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（9:00～11:12）【環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術】
9:00

3Na01

六価クロム還元細菌 Flexivirga alba ST13 株のフラグメント解析を利用した追跡法........................................................ ○桶田 凜, 池上 健仁, 杉山 友康（東京工科大院・バイオニクス）

9:12

3Na02

メタン発酵消化液中のリンの再資源化方法の検討.......................................... ○下出 崇樹 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1 金沢大院・自科, 2 金沢大・理工）

9:24

3Na03

Pseudomonas stutzeri NT-I による水相からのテルルの揮発化除去と回収................................................................. ○黒田 真史, 畠中 玄彦, 井上 大介, 池 道彦（阪工大院・工）

9:36

3Na04

水中からアンチモンを除去する微生物集積系の特徴付け................................................... ○細川 久顕 1, 森 健太朗 1, 黒田 真史 1, 惣田 訓 2, 井上 大介 1, 池 道彦 1
（1 阪大院・工, 2 立命館大・理工）

9:48

3Na05

セレン酸還元細菌内包ポリマーカプセルによる新たなセレン廃水の浄化と資源化...................................................................... ○平谷 朋之 1, 小竹 史哉 1, 永 直文 1, 大塚 治 2, 山下 光雄 1,2（1 芝工大院・理工・応化, 2 芝工大・SIT 総研）

10:00

3Na06

バイオレメディエーションによるセレン汚染土壌浄化....................................................... ○山下 光雄 1, 小竹 史哉 1, 大塚 治 2, 西里 亮 3, 奥野 稔 3, 武藤 宏行 3
（1 芝浦工大院・理工・応化, 2 芝浦工大・総研, 3 ケー・エフ・シー）

10:24

3Na07

Visualization of metabolites in Pseudomonas putida biofilms using imaging mass spectrometry......................................................................... ○Pitchapa Rattanaburi, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma

10:36

3Na08

淡水域におけるバイオフィルム形成を介した生分解性プラスチック分解機構の解析........................................... ○大井 太士郎 1, 佐藤 俊輔 2, 諸星 知広 1（1 宇都宮大院・工, 2 (株)カネカ）

10:48

3Na09

工場冷却水由来 Sphingopyxis 属細菌によるアシル化ホモセリンラクトン分解機構の解析................................................................................ ○佐藤 新菜 1, 上村 哉生樹 1, 飯泉 太郎 2, 諸星 知広 1

（Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.）（1 宇都宮大・工, 2 栗田工業(株)）
11:00

3Na10

Sphingopyxis 属細菌おけるアシル化ホモセリンラクトン分解遺伝子の多様性解析................................................................................ ○上村 哉生樹 1, 佐藤 新菜 1, 飯泉 太郎 2, 諸星 知広 1
（1 宇都宮大院・工, 2 栗田工業(株)）O 会場 第 4 学舎 2 号館 4 階（9:00～11:12）【セル＆ティッシュエンジニアリング】
9:00

3Oa01

CRISPR/Cas9 システムによる eGFP ノックインニワトリの作製.............................................................. 萩原 遥太 1, 奥嵜 雄也 1, 飯島 信司 1,2, ○金岡 英徳 1, 西島 謙一 1（1 名大院・工, 2 現愛工大・工・応化）

9:12

3Oa02

受容体モチーフライブラリのスクリーニングによる効率的な細胞増殖誘導の実現................................................................................................... ○梅根 輝来人, 河原 正浩（東大院・工）

9:24

3Oa03

時計遺伝子 Per2 発現の再振動とグルコース添加条件との関係............................................... 深浦 恵梨 1, ○藤原 政司 1, 西出 真也 2, 本間 さと 2, 本間 研一 2, 高木 睦 1（1 北大院・工, 2 北大院・医）

9:36

3Oa04

長期的に安定な組換えタンパク質高生産株の構築に向けたＣＨＯ細胞における染色体多様性の解析..................................................................................... ○北 一真 1, 山野 範子 1,2, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2（1 阪大院・工, 2 MAB 組合）

73

9:48

3Oa05

ミニサークル DNA ベクターを用いた CHO 細胞への逐次遺伝子組込み............................................................................ ○河邉 佳典 1,2, 汪 雪 1, 羽田 毅 1, 井藤 彰 1, 上平 正道 1,2（1 九大院・工, 2 次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）

10:24

3Oa07

レトロトランスポゾンベクターにおけるレトロ転位のための構成要素の解析.................................................................. ○村上 舞 1, 高橋 真美加 2, 河邉 佳典 2, 井藤 彰 2, 上平 正道 1,2（1 九大院・シス生科, 2 九大院・工）

10:36

3Oa08

M2 型腫瘍随伴マクロファージ標的化バイオナノカプセルの開発............................................ ○李 昊 1,2, 曽宮 正晴 1,2, 黒田 俊一 1,2（1 阪大・産研, 2 阪大院・生命機能）

10:48

3Oa09

網羅的匂い分子解析のリアルタイム定量化を目指したヒト嗅覚受容体発現細胞の樹立.................................................................................. ○中村 実世 1, 立松 健司 1, 山﨑 智子 2, 黒田 俊一 1,2（1 阪大産研, 2 香味醗酵）

11:00

3Oa10

免疫クリアランスを回避する生体膜由来ドラッグデリバリーキャリアの開発........................................................................................ ○赤嶺 藍 1, 西村 勇哉 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1 神戸大院・工, 2 神戸大院・科技イノベ）

ランチョンセミナー
3LS1 ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社
LS1 会場

第 4 学舎4 号館 2 階（11:35～12:35）

3LS2 東ソー株式会社
LS2 会場

第 4 学舎4 号館 2 階（11:35～12:35）

3LS3 P&G イノベーション合同会社
LS3 会場

第 4 学舎2 号館 5 階（11:35～12:35）

9 月 5 日（水）

l2

9

3

授賞式・受賞講演（9:00 〜 11:30）

A 会場 BIG ホール 100 第 2 学舎 4 号館 1 階

授賞式（会長挨拶，KSBB 会長挨拶，功労会員推戴，各賞授賞）〈生物工学功労賞〉
受賞者

滝澤 昇（岡山理大・工）第 12 回日本生物工学会功労賞受賞にあたって

A1Aa01

p. 77

A1Aa02

p. 77

A1Aa03p. 78〈生物工学賞〉
受賞者

浅野 泰久（富山県大・工）微生物から動植物へと展開する酵素利用技術とその基盤開拓〈生物工学功績賞〉
受賞者

清水 浩（阪大院・情報）

計算機工学に基づく代謝設計とその有効性の実証に関する研究〈生物工技術賞〉

受賞者 佐藤 俊輔 1，有川 尚志 1，小林 新吾 1，藤木 哲也 2，○松本 圭司 3
（1 カネカ バイオテクノロジー研究所，2 カネカ R&D 企画部，3 阪大院・工）微生物による生分解性ポリマー PHBH 製造法の開発

A1Aa04p. 78

一般講演 （13:30 〜 17:30）
脂質工学／食品科学，食品工学
抗体工学
ペプチド工学／核酸工学／植物細胞工学，組織培養，育種工学
生物化学工学／培養工学／バイオプロセス
遺伝子工学
バイオマス，資源，エネルギー工学
タンパク質工学
発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析
バイオセンシング，分析化学／センサー，計測工学
酵素学，酵素工学
分類，系統，遺伝学／環境浄化，修復，保全技術／
環境工学，廃水処理技術

生体医用工学／セル＆ティッシュエンジニアリング

C 会場

D 会場
E 会場
F 会場

G 会場

H 会場
I 会場

J 会場， K 会場
L 会場

M 会場
N 会場

O 会場

p. 79
p. 83
p. 86
p. 90
p. 95
p. 99
p. 104
p. 108
p. 117
p. 121
p. 126
p. 130

77

A1Aa01

第 12 回日本生物工学会功労賞受賞にあたって○滝澤 昇（岡山理大・工）takizawan@dac.ous.ac.jp

この度，小職の「生物工学および関連分野の JABEE 認定審査への多大な貢献」に対しまして，第 12 回生物工学功労賞を頂くこととなり，身に余る光栄と存じます．大学が社会に対して果たす役割として，教育・研究・社会貢献が 3 本の柱ではありますが，概して教育活動は研究活動と対等に評価されない傾向にあります．大学は学校教育法に定められた教育機関であり，こと工学系学科においては，高等技術者を育成するという責務を負っており，教育は第一義に位置づけられるべきものと考えます．この度の受賞では，教育面での活動に対して高く評価頂いた本学会の懐の深さに敬意を表しますと共に，ご関係の諸先生に厚く御礼申し上げます．
さて JABEE（Japan Accreditation Board for Engineering Education）についてはご存じの方も多いこととは思いますが，大学・高等専門学校の技術者教育プログ
ラムの審査認定を行う非営利団体であり，1999 年に発足しています．審査認定
を通して教育の改善を促し，教育プログラムの国際的通用性を担保することを意図し，社会の要求水準や技術者に必要な知識と能力，それを支援する教育体
制などの観点から審査が行われます．JABEE はワシントン協定（Washington
Accord）他に加盟していることから，認定を受けた技術者教育プログラムは国
際的同等性が認められ，プログラム修了者は世界に通用する教育を受けた技術者であると認められます．また国内的には技術士の 1 次試験が免除され，4 年以上の実務経験により 2 次試験を受験することができます．技術士は国家資格であり，海外ではサイエンスにおける Ph. D に並ぶものとして認識されています．
JABEE のプログラム認定は 2001 年度から始まり，JABEE ホームページによれば，2016 年度までの認定プログラムの累計は 501，認定プログラム修了生数の累計は約 26 万人に至っているとのことです．米国の ABET(Accreditation Board
for Engineering and Technology)では，ハーバードや MIT 等の著名な大学をはじめとして 776 大学において 3800 を越えるプログラムが認定を受けていますが，国内では，まだ有力大学の認定受審が多くなく，企業側の認知度も決して高いものとは言えない状況にあり，認定プログラムの数は伸び悩んでいる状況にあります．しかしながら，近年，技術士合格者に JABEE 認定プログラムを修了した若手が大きく増大しているという効果が表れてきており，高等技術者の育成に寄与していることが認められます．
JABEE の審査は，JABEE 会員である専門学協会より推薦された大学・高等専門学校の教員や技術士，企業技術者等で構成される審査チームにより実施されます．各審査員（オブザーバーを含む）は，受審校が作成した膨大な自己点検書と，その裏付け資料やデータを事前に精査し，審査項目ごとにあらかじめ認定
基準を満たしているかどうかチェックを済ませたのち，実地審査において学生や教員との面談，施設や授業の視察，成績原簿や試験答案・レポート等の根拠
資料の確認などを行い，JABEE の認定基準を満たしているかどうかを判断して審査結果を報告します．最終的には，この報告に基づいて JABEE において審議・認定が行われます．近年は複数プログラムの同日一斉審査がおこなわれることも多く，その場合は，複数分野の審査チーム間の審査意見の調整・判定の統一，分野を越えて共通する部分の審査，受審校との対応等を行うために，審査チームを取りまとめる団長・副団長が置かれます．時には 20 人余りの審査団が構成されることもあります．
小職は 2011 年度に生物工学分野のオブザーバーとしての参加以来，今年度に至るまで，本学会が担当する生物工学領域での審査員および審査長として 3 プロ
グラムの審査に携りました．更に，本学会の推薦および JABEE 本部からの依頼により一斉審査の団長および副団長を 4 度務めましたが，いずれの審査においても，受審に際しての多大な労苦をいとわない受審校の技術者教育への熱意には心動かされます．審査員の活動はボランティアではありますが，審査に際しては受審校の教育プログラムや教育システムについて微に入り細に至るまで視察し教育に対する考えを伺うことができ，得られた知見や情報を本務校での教育システムやプログラム改善の糧とすることができます．これは審査員としての最高の報酬であり，多くの方に審査に携わって頂きたい所以です．
現在，大学は機関レベルで認証評価を受けることが義務化されていますが，個別の教育プログラムの認証にまでは至っていません．今後益々グローバル化が進む社会において，我が国の高等教育機関が国際的に認知されるためには，国際基準の認定を受けた教育プログラムを実践し，国際的に通用する技術者を育成，輩出していかなければなりません．ここ数年，アジア諸国において高等教育機関での技術者教育認証制度の整備が進められつつあること鑑みると，技術立国を詠う日本においても JABEE 等による教育プログラムの認証は不可欠となると考えられます．今回の受賞を励みに，微力ながら JABEE 審査活動を通して国際的に通用する優れた技術者の育成，特に生物工学分野で活躍する技術者の育成に貢献を続けていきたいと意を新たにする次第です．

Acceptance speech-Meritorious Service Award○Noboru Takizawa(Fac. Eng., Okayama Univ. Sci.)

Key words

engineering education, accreditation, JABEE

A1Aa02微生物から動植物へと展開する酵素利用技術とその基盤
開拓○浅野 泰久
（富山県大・工）asano@pu-toyama.ac.jp

我々は，微生物のみならず植物や節足動物において「アルドキシムーニトリル
経路」の存在を明らかにし，それらの構造と機能の関係を解明して物質生産に利用して来た．また酵素タンパク質の構造に関する情報を，酵素遺伝子の探索
から酵素の改変に至るまで積極的に取り入れ，新規酵素や機能改変酵素を用いて有用物質の合成反応を構築し，酵素の有効利用法を拡大した．このように，
新しく見出した酵素群の代謝における重要性を明らかにするとともに，酵素タ
ンパク質の構造と機能に関する知見およびその応用に関する成果を蓄積して来た．
第一に，従来，酵素の探索は，ほとんどが微生物を対象として行われてきたが，植物や節足動物（ヤスデ）に酵素探索の範囲を拡大し，特に植物および動物の「アルドキシムーニトリル経路」について遺伝子および酵素レベルで詳細に調べ，細菌との違いを明らかにした．研究開始時には，植物のニトリル代謝経路は一部解明されていたが不明な点も多く，動物のニトリル代謝経路は全く未解明であった．動植物の経路では，P450 の酵素群によってアミノ酸からニトリル
あるいはシアノヒドリンが生合成されることを明らかにした．さらに，植物のみならず動物（ヤスデ）から一次構造を大きく異にする多数の新規なヒドロキ
シニトリルリアーゼ(HNL)類を見出し，それらの酵素化学的諸性質，立体構造および反応機構を明らかにした．特にヤスデ由来の酵素は，応用酵素一般としても著しく高い比活性（7,500U/mg）を有し，データベースからの類推もできない新しい構造であることを発見した．そして，これらの酵素が有用な(R)-および(S)-シアノヒドリン合成に有用であることを示した．このような広範囲の動植物からの酵素の発見を通して，植物および動物が今後有用酵素の新たな探索源になることを示した．
第二に，酵素の産業利用をさらに拡大するための基盤整備を目的として，新規反応の探索，タンパク質工学による産業上有用な酵素の開発，酵素的結晶変換法による物質生産技術の開発などを行った．新規反応の探索では，微生物由来のアルドキシム脱水酵素を用いて，シアン化物を使用しないエナンチオ選択的
ニトリル合成反応を可能にし，同酵素が新規酵素反応として Kemp 脱離反応を触媒することを見出した．また α-アミノ ε-カプロラクタムラセマーゼにアミノ酸アミドラセミ化活性を見出し，アミノ酸アミドやアミノニトリルを原料とするダイナミックな光学分割法によって，光学活性アミノ酸の効率的な合成を可能にした．有用酵素の開発では，これまでに自然界から発見されていない酵素
を，タンパク質工学を用いて作ることに挑戦し，ブタ腎臓由来の D-アミノ酸酸化酵素の変異によって，未だ自然界にその存在が認められていない，R-アミン
酸化酵素を創製した．本変異型酵素を還元剤の共存下，ラセミ体アミンを原料にしてデラセミ化反応を行い，各種の光学活性アミンを合成した．そして本変異型酵素は，酸化的シアン化反応も触媒することから，さらに変異型酵素のＸ
線結晶構造解析により反応機構を明らかにして，基質特異性を拡大させる合理的変異を行った．また，ω-アミノラウリン酸，ルミクロムなど溶解度の低い化
合物の酵素的結晶変換法を開発した．大環状エノンの不斉還元を可能にした．
第三に，バイオインフォマティックスの手法を，酵素の可溶性発現や酵素の探索などの研究に融合させた．現在，遺伝子組換え技術は，酵素を安価に生産することを可能にし，酵素の産業利用のために極めて重要な技術の一つとなっている．しかし，現在の技術では，封入体が形成されるなどの障害があり，しばしば酵素の実用化の律速となっている．そこで，まず，Blast 検索の結果から多数回のアライメントと解析を行うプログラムを開発した．また，植物酵素 HNLの遺伝子は大腸菌において不溶性タンパク質として発現されるが，遺伝子変異によって可溶性タンパク質として発現できることを発見した．そこで，この変異による可溶化の概念を拡張し，異種宿主で活性を持つ酵素タンパク質として発現させる一般性の高い二つの手法を見出した．第一の方法は，α-ヘリックス
上のアミノ酸残基の親水性および疎水性に着目した変異導入法(α-ヘリックス法)であり，第二の方法は，アミノ酸の疎水性インデックスを加味した HiSol 値を用いてホットスポットを見出し，予想したアミノ酸に置換する手法(INTMSAlign-HiSol 法)である．これらの合理的なアミノ酸置換法による異種タ
ンパク質の可溶性発現は，従来封入体などの形成で遅れていた酵素タンパク質の開発研究の進展を加速する技術として期待されている．また，バイオインフォ
マティックスの手法を用いて，ゲノム情報から α-アミノ ε-カプロラクタムラセ
マーゼなどを探索し，本方法で目的酵素が極めて効率的に見出せることを明らかにした．

Development of microbial, plant and animal enzymes and their basis forapplication○Yasuhisa Asano(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words
aldoxime-nitrile pathway, aggregation, enzymatic conversion,
bioinformatics

78

A1Aa03

計算機工学に基づく代謝設計とその有効性の実証に関する研究

A1Aa04○清水 浩（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

この度，栄誉ある 2018 年度生物工学功績賞を頂くこととなりました．これまで，ご指導いただいた先生方，研究室の教職員，学生諸氏に心よりお礼申し上げます．対象となりました研究概要を以下に示します．
多くの生物のゲノム情報が明らかになるとともに，生命の営みを遺伝子，タンパク質，代謝の各階層で解析する技術，遺伝子を効率よく操作する技術が急速に発展してきている．生物機能を利用した物質生産において，利用可能な資源や生産可能な物質の範囲拡大，生産収率や生産速度の向上のための育種を合理的に行う生物工学手法の確立の重要である．演者は，物質収支や反応速度論に立脚した生物化学工学の概念を細胞内代謝の解析と設計に導入し，「計算機工学に基づく代謝工学」分野の開拓を行ってきた．すなわち，微生物生産において代謝を合理的に設計する方法を開発し，その有効性を実証する代謝工学の研究を一貫して行ってきた．その研究内容は，1）代謝フラックスバランス解析による代謝設計（生産収率の最適化），2）13C 代謝フラックス解析による細胞評価，
3）代謝鍵反応の同定（生産性の向上）に大別することができる．
1）代謝フラックスバランス解析による代謝設計（生産収率の最適化）：細胞の代謝を多段階反応プロセスとして捉え，細胞内の代謝の流れ（フラックス）を統一的に計算機で扱えるよう情報を整理し，目的物質を高収率で生産可能な代謝経路を設計する方法を開発した．コリネ型細菌やシアノバクテリアといった重要な微生物のゲノムスケールの代謝反応モデルを構築した．このモデルを用いて，代謝フラックスバランス解析法（FBA）により環境変化，遺伝子導入・削除によってもたらされる代謝フラックスが精度よく予測できるようになった．
また，大腸菌において目的物質生産収率を最大にするための多重遺伝子破壊セッ
トの探索方法の開発を行った．さらに，従来困難であった 10 を超える多重遺伝
子破壊の探索，多種の異種遺伝子の導入による生産化合物生成経路の自動設計，増殖停止期に目的物質生産を最大化する代謝設計が確立した．これらの方法は，大腸菌による 3 ヒドロキシプロピオン酸，メバロン酸，コハク酸などの生産，
シアノバクテリアのエタノール生産などにおいて高生産菌を代謝設計に用いられた．また，その設計に基づいて育種された株の生産性の向上が実験的に確認された．
2）13C 代謝フラックス解析による細胞評価：実際に細胞内で起こっている代謝
フラックスを精度よく捉えることを目的として解析法の基盤開発を行った．この方法は，培養中に安定同位体 13C を含む栄養を細胞に取り込ませて，その同位体標識の代謝物質への蓄積量を質量分析によって解析し，微生物の代謝フラックスを解析する方法である．この方法を利用する研究者が容易に行えるようにするために安定同位体の物質収支の情報を用いたモデルの自動構築，代謝フラックス解析，統計学的評価を行えるソフト上ウェア OpenMebius が開発され，ホームぺージで公開されている．OpenMebius は，非定常の同位体標識データを利用することも可能となり，光合成微生物の光独立条件における代謝解析を行うことが可能となった．この方法によって，コリネ型細菌，大腸菌，シアノバクテ
リアなどの代謝の様態が実験的に解明されており，グルタミン酸，メバロン酸，
イソプロピルアルコール，S-アデノシルメチオニン生産など，代謝解析とそれに基づく代謝改良政略立案に応用され，生産性の向上を実現することで，有効性が実証されている．また，上述の FBA 代謝設計法と組み合わせることで，有用微生物の設計と細胞評価のサイクルの加速化が実現された．
3)生産性を向上させるため代謝鍵反応の同定：目的物質の生産収率の最適化に加えて最大の生産速度をもたらす代謝系を持つ微生物の設計は非常に重要である．多数の反応が関わる代謝系では，どの反応が生産性向上をもたらす鍵反応
かを同定することが容易ではない．酵素量を増減させた際に目的物質を最も感度の高く変化させる，そのような反応の同定法の理論構築，遺伝子や酵素の発現量を変動させた際の代謝フラックス解析を行って重要反応を同定する実験解析法を開発し，リジン発酵，グルタミン酸発酵の代謝制御メカニズム解析などに応用された．また，FBA で得られた代謝改変株の予測と実際の生産量の差を解消するため，実験室進化により得られた高生産変異株と親株との比較ゲノム解析により必要な変異，代謝律速点を同定，解消することで生産性向上が認められた．
微生物を育種する技術や細胞内を解析する技術の革新は目覚ましいものがあり，今後，育種のスピードや利用する遺伝子の探索範囲は加速，拡大すると考えられる．また，分析技術の革新により生命現象によりもたらされるデータも膨大なものとなるであろう．あらゆる産業分野において情報処理技術によるビッグ
データの利用が注目される中，計算機工学を基盤とする育種や解析法の発展と，生物を利用した物質生産のための育種，プロセス開発への応用が期待される．

In silico Metabolic Pathway Design and Flux Analysis for Bio-Production○Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
metabolic engineering, genome scale model (GMM), 13C metabolic
flux analysis, metabolic control analysis

微生物による生分解性ポリマー PHBH 製造法の開発
佐藤 俊輔 1, 有川 尚志 1, 小林 新吾 1, 藤木 哲也 2, ○松本 圭司 3（1（株）カネカ バイオテクノロジー研究所, 2（株）カネカ R&D
企画部, 3大阪大学 大学院工学研究科）
Keiji.Matsumoto@kaneka.co.jp

1900 年代に石油由来のプラスチックが実用化されたことによって，人々の生活は飛躍的に便利になった．例えばレジ袋，飲料ボトル，電子機器の筐体，車のパーツなどに利用され，日々，その恩恵を受け取っている．プラスチックの生産量は年々増加しており，2017 年は 3 億トン以上に達している．近年，増大する石油資源の利用に伴い，地球規模での持続可能性，気候変動抑制が問われているが，プラスチックの使用に関する規制についても活発に議論されている．
株式会社カネカは，再生可能資源から，微生物発酵によってバイオポリマーを生産することで，プラスチック産業が持つ課題を解決することを目的として，研究開発を実施した．
今から 27 年も前，1991 年に，カネカ高砂工業所の土壌より，柔軟な物性を有するポリヒドロキシアルカン酸を生産する微生物を発見したことから，本研究が開始された．このポリヒドロキシカン酸は炭素数 4 のモノマーである 3-ヒド
ロキシブタン酸（3HB）と炭素数 6 のモノマーである 3-ヒドロキシヘキサン酸(3HHx)からなる共重合ポリエステル（PHBH）であることを明らかにし，物質特許を取得した．
現在は多くの遺伝子工学手法，ツールが開発され，研究速度は著しく向上したが，研究開発当初は今ほど遺伝子工学技術，ツールなどが発達しておらず，理化学研究所との共同研究，NEDO からの資金提供によるオープンイノベーショ
ンによる技術導入を進め，当時としては先進的な取り組みとして PHBH 生産微
生物の分子育種研究を進めた．
PHBH 生産宿主としては，PHB 高蓄積菌として知られていた Cupriavidus necator
H16 株を選択した．研究開発では迅速な分子育種が求められることから，工業生産に利用可能な安定遺伝子導入技術開発を行った．その結果，同属別種の細菌由来のプラスミド複製領域，並びに安定化因子（par 遺伝子群）を導入した
新規プラスミドベクターの開発に成功した．本ベクターは，薬剤選択圧がなくても安定に保持されるため，各種遺伝子の機能などを迅速かつ正確に評価でき，育種速度が大きく加速された．
次に，PHBH 社会実装最大の課題であった，プラスチックとしての実用性（物性，加工性）を高めるための育種研究を実施した．プラスチックの物性はその一次構造と分子量に大きく依存する．PHBH の場合，一次構造は共重合比率（3HHx 比率）を指す．PHBH は 3HHx 比率が高くなるにつれ結晶性が低下し，柔軟な性質を示すようになる．特に，軟質性が特徴である PHBH にとっては，
3HHx 比率を自在に制御する技術開発が求められた．また，樹脂強度は分子量が高くなるにつれ向上するため，成型加工後の品質を満たすことができるように PHBH 発酵終了時の分子量を高くすることも重要であった．
3HHx 組成制御技術に関しては，細胞内の代謝制御による 3HHx モノマー供給
経路の強化と PHBH 重合酵素の改良の両方向から取組んだ．両技術開発ならびにそれらを組み合わせることで，各種製品に要求される柔軟性に応じた PHBH
を自在に発酵生産できる菌株の育種に成功した．
分子量に関しては，PHBH 発酵工程における経時的な分子量変化に着目した．
詳細検討により，細胞内での PHBH 発酵過程では PHBH が重合されるだけでな
く分解も同時に起こっていることが強く示唆された．C. necatorH16 株は 7 種類の PHA デポリメラーゼ遺伝子と 2 種類の PHA オリゴマーハイドロラーゼ遺伝子を保有している．その多くは機能未知であったため，各遺伝子を 1 つずつ破壊した株を作製し，それぞれの酵素が細胞内に蓄積された PHBH の分子量に与える影響を解析した．その結果，phaZ6 遺伝子破壊株においてのみ，分子量向上効果があることが明らかとなった．本検討の結果より，phaZ6 遺伝子が細胞内の PHBH の分子量制御において中心的な役割を果たしていることが明らかとなった．
以上のような様々な分子育種により，プラスチック材料としての実用性（物性，
加工性）を満たす PHBH 発酵技術を開発したことで，実用に耐えうるバイオポ
リマーを工業的に，且つ，市場に受け入れられる価格にて生産することが可能となった．
当社は，JST の支援を受け，実証プラント（1,000 トン／年規模）の建設を行い，2011 年より当社高砂工業所にて PHBH（商標：カネカ生分解性ポリマー
PHBHTM）の製造，販売を行っている．既に多くの企業にて製品開発が進められており，複数の製品が社会実装されている．特に欧州においては，PHBH が再生可能原料から製造されることや高い生分解性を有することが高く評価され，コンポストバッグや野菜/果物袋用途などでの使用が拡大している．
更に，PHBH は元来微生物が生産する天然高分子であり，土壌やコンポスト環
境のみならず，高い海洋分解性を有することが分かってきている．近年，プラスチックが断片化したマイクロプラスチックが海洋に大量に蓄積していという多数の研究報告，実地調査結果が報告され，海洋生物，海鳥などへの影響が危惧されている．PHBH は海洋で分解するプラスチック素材として，社会にソリューション提供ができると期待している．

Development of microbial production process for Biodegrable Polymer
PHBH
Shunsuke Sato1, Hisashi Arikawa1, Shingo Kobayashi1, Tetsuya Fujiki2,○Keiji Matsumoto3(1Biotechnol. Lab., KANEKA CORP., 2Corporate R&D Planning Depertment,
KANEKA CORP., 3Grad. Sch. Eng., OSAKA Univ.)
Key words

biodegradable plastic

79

1Cp01

ストレス状態モデル膜と低刺激性界面活性剤の相互作用○高橋 祐菜, 辻野 義雄, 高木 昌宏, 下川 直史（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp【背景・目的】低刺激性界面活性剤は化粧品などに含まれており，その細胞への刺激性を定量評価することが望まれている．生体膜と類似した組成・構造を示すリポソームを用いた先行研究によって，界面活性剤を滴下することで膜ダイナミクスを生じることや，界面活性剤の種類や濃度によって異なる膜ダイナミクスを示すことがわかっている．また，細胞は常にストレスに晒されており，代表的なストレスとして紫外線による光老化がある．そのため，通常の細胞とストレス状態の細胞では界面活性剤の刺激に対して異なる応答を示す可能性がある．よって，本研究では UV 照射したリポソーム(ストレス状態モデル膜)とUV 未処理のリポソームにおける膜ダイナミクスを比較し，低刺激性界面活性剤の見かけ上の刺激性変化を考察する．

1Cp03

膜小胞高分泌細菌が形成する多層膜小胞の特性解析○高木 航太郎 1, 長谷川 雄将 1, 田原 悠平 3, 新谷 政己 1,
大熊 盛也 4, 宮田 真人 3, 二又 裕之 1,2, 田代 陽介 1
（1静大院・総合科技, 2静大・グリーン研, 3阪市大院・理, 4理研・バイオリソースセ）
tashiro.yosuke@shizuoka.ac.jp【結果・考察】UV 処理については，1～5h の処理を 1h ごとで行い，蛍光やレーザーを照射し，観察を行った結果，4,5 時間の処理を行うと揺らいでいるリポ
ソームの増加が見られた．この膜変形は界面活性剤による変形と誤認する恐れがあるため，リポソームが変形を起こさない 1～3h の照射にすることとした．
ストレス状態リポソームに低刺激性界面活性剤である Tween20 や Tween80 を滴下したところ，UV 未処理のリポソームとは異なる膜ダイナミクスが観察された．それらの変化は，紫外線によって脂質の過酸化が促進され，界面活性剤と脂質，および脂質同士の相互作用の関係性が UV 未処理のリポソームと異なると考えられる．

【緒言】細菌は自身の細胞膜からリポソーム様の構造体である Membrane vesicles(MVs)を分泌している．MVs は細胞間のコミュニケーションツールや毒素の輸送体としての役割を有することから，ドラックデリバリーシステムの媒体やワクチンなどの応用が期待されている．しかしながら MVs の生産量や内包物質の封入の制御など，上記の技術的応用に向けた課題は多く残されている．我々は
こ れ ま で に 高 い MVs 生 産 能 を 有 す る 非 病 原 性 細 菌 Buttiauxella agrestis
CUETM77-167 において，ペリプラズム局在タンパク質 TolB の欠失により MVs
生産量が増加することを確認した．本研究では B. agrestis ΔtolB 由来の MVs の特性ならびに物質輸送媒体としての機能の解析を行った．
【方法・結果】B. agrestis ΔtolB 培養上清より回収した MVs (ΔtolB-MVs)の電子顕微鏡観察を行ったところ，粒径 50 nm 程度の粒子と粒径 100-300 nm 程度で内腔に複雑な多層構造を有した特徴的な球状構造体が多く確認された．また ΔtolBMVs を超遠心分離 (100,000 × g, 4 ℃, 120 min)により沈降させると，形質の異なる 2 層のペレットに分離された．上層の半透明でゼラチン質のペレット，下層の白色で固体状のペレットをそれぞれ t-MVs, w-MVs とし，動的光散乱法による粒径測定を行った．その結果 t-MVs は 50-80 nm 程度の粒径であったのに対し
w-MVs は粒径 120 nm 前後であったことから，電子顕微鏡観察で見られた 50 nm程度の粒子が t-MVs であり，100-300 nm 程度の多層構造を有するものが w-MVs
であるものと考えられた．多層構造を有する w-MVs には内膜ならびに細胞質成分が封入されていると推察されたため，PicoGreen により各 MVs における二本鎖 DNA の含有量を測定したところ，w-MVs に高濃度の DNA が検出された．
以上のことから，ΔtolB は野生株とは異なり細胞質成分を多く含む多層構造のMVs を形成することが示された．

Deformation dynamics of stressed model biomembranes by low irritating
surfactants

Characterization of multi-lamellar membrane vesicles produced by a hyper
vesicle-secreting bacterium【方法】不飽和脂質である DOPC の単分子膜を静置水和法で作成した．UV 照射には，UV-B に位置する波長 302nm を用いた．リポソーム溶液を観察用特殊チャ
ンバーに封入し，界面活性剤を滴下して膜ダイナミクスの観察を行った．膜ダ
イナミクスは各 UV 処理時間・各界面活性剤において 5 回以上の観察を行い，代表的な膜ダイナミクスを決定した．

○Yuna Takahashi, Yoshio Tsujino, Masahiro Takagi, Naohumi Shimokawa(Sch. Mater. Sci., JAIST)○Kotaro Takaki1, Yusuke Hasegawa1, Yuhei Tahara3, Masaki Shintani1,
Moriya Ohkuma4, Makoto Miyata3, Hiroyuki Futamata1,2, Yosuke Tashiro1(1Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ., 3Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 4BRC, RIKEN)

Key words

liposome, UV irritation, sarfactant, peroxide

Key words

membrane vesicles, multilamellar vesicles, tolB

1Cp02

低刺激性界面活性剤による生体模倣膜への作用機構の
解析

1Cp04

大腸菌の細胞表層改変による外膜小胞大量分泌株の構築○佐々木 陽介, 辻野 義雄, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp○澤邊 朋美, 児波 克哉, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）ojima@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp【背景と目的】界面活性剤の応用において，人体への刺激性評価は必須である．
従来，ウサギに点眼するドレイズ試験法がとられているが，動物愛護の観点，
さらに動物の個体差や目視判定による差異等が問題となっている．我々は，細胞模倣膜(リポソーム)を用いた，刺激評価法の開発を行っており，高刺激性界面活性剤は，リポソームが膨張し，低刺激性界面活性剤では，リポソームが収縮する事を明らかにした．しかし，界面活性剤の構造と刺激性の関係は，解明されていない．そこで，界面活性剤が膜に与える影響について，頭部と尾部の分子量を考慮した解析を行った．
【方法】不飽和脂質 DOPC からなるリポソームを用いて，頭部と尾部の組み合わせの異なる界面活性剤ポリオキシエチレンアルキルエーテル CH3(CH2)x(OCH2CH2)y OH ( x , y ) = ( 15 , 20 ), ( 17 , 20 ), ( 21 , 5 ), ( 21 , 10 ), ( 21 , 20 ),( 21 , 30 ) （x:疎水部）（y:親水部）を添加し，ダイナミクスを共焦点顕微鏡により観察し，画像処理を用いてリポソームの膨張・収縮速度の測定を行った．
【結果と考察】濃度 10 mM では，どの界面活性剤でもリポソームが破裂した．
濃度 1 mM では親水部が小分子量の ( x , y ) = ( 21 , 5 ), ( 21 , 10 ) において，リポ
ソームが膨張し続ける，刺激性のダイナミクスが多く観察された．( x , y ) = ( 15 ,20 ), ( 17 , 20 ) においては，低刺激性ダイナミクスである収縮の後，リポソームの破裂が観察され， ( x , y ) = ( 21 , 20 ), ( 21 , 30 ) においては，リポソームが収縮し続けた．つまり，親水部の構造が小さいほど，刺激性が高く，尾部の構造が長いほど，刺激が弱くなると考えられた．発表では，リポソームを形成する
脂質と界面活性剤の相互作用について，さらに詳細な考察を加える．

【背景と目的】大腸菌の外膜小胞(OMVs)は外膜の一部が隆起することで遊離す
る細胞外小胞で，近年ナノキャリアやワクチンなど，その利用法が盛んに研究されている．我々は，OMVs がペリプラズム内の成分を包んで遊離する特性に注目し，タンパク質の新たな分泌生産ツールとしての利用を検討している．さらにモデル生産系として，外膜タンパク質 OmpW と GFP を融合発現し，内部に組換えタンパク質を包括した状態で OMVs を産出させたが，分泌量は少なく，実用化に向けた障害となっていた．本研究では，OMVs の産生量が向上した株を構築することで，タンパク質の分泌生産量を増加させることを目的とした．
【方法と結果】現在，欠損により OMVs 産生量が向上する細胞表層関連遺伝子
が幾つか知られている．本研究では，P1 ファージを用いた形質導入法 1)を用い，nlpI, degP, yrbE, vacJ の欠損を組み合わせた二重欠損株を作製した．OMVs
は，100 mL の LB 培地で培養後，フィルター濾過した上清を超遠心分離(109,000
×g, 1 h)することにより回収した．OMVs 産生量は，SDS-PAGE 後の OMVs に多く含まれる外膜タンパク質 OmpA (35 kDa)と OmpC/F (37 kDa)のバンド強度から定量的に評価した．タンパク質生産は，ウエスタンブロットでの OmpW と GFPの融合タンパク質のバンド強度から評価した．複数の二重欠損株を評価した結果，OMVs 産出量は nlpI と yrbE を欠損させた株が最も高く，WT の約 30 倍となり，単独欠損株と比べても大幅に増加した．また，構築した遺伝子組換え株に OmpW と GFP を融合発現させたところ，OMVs 産生量と同様に，nlpI と yrbEの二重欠損株が最も多くの融合タンパク質を分泌し，約 3.3 mg/L となった．
1) Daisuke K., et al., Appl Microbiol Biotechnol., 93, 815-829 (2012).

Analysis of mechanism of action on biomimetic membrane by low irritantsurfactants

Construction of the hyper-vesiculation strains by modifying the cell surfaceof Escherichia coli

○Yousuke Sasaki, Yoshio Tsujino, Naofumi Shimokawa, Masahiro Takagi(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words

membrane lipids, lipid vesicle, surfactant, irritation○Tomomi Sawabe, Katsuya Konami, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words
Escherichia coli, outer membrane vesicles, secretory expression,
protein production

80

1Cp05

酢酸菌由来外膜小胞の収量改善の検討○橋本 雅仁, 松元 太一, 中村 佳祐, 大薗 まみ, 橋口 周平（鹿児島大・理工）
hassy@eng.kagoshima-u.ac.jp

1Cp07

Culturomics によるヒト腸内細菌の網羅的な分離方法の検討○山副 敦司, 島村 麻美子, 三浦 隆匡, 古川 雅崇, 内野 佳仁,
川﨑 浩子（NITE・NBRC）
yamazoe-atsushi@nite.go.jp

外膜小胞(OMV)は，リポ多糖(LPS)，タンパク質などを含んだ親株由来の膜構造を持つため，哺乳類細胞に対し免疫調節能を示すことが知られており，アジュ
バントとして用いられている．しかし大腸菌などの一般細菌由来の OMV は LPSの強毒性のため弱毒化などの操作が必要である．酸酸菌 A. pasteurianus は黒酢の発酵に関与している細菌であり，長い食経験を持つ安全な細菌である．最近
我々は，酢酸菌が OMV を分泌し，それが免疫系を刺激しうることを明らかにした．しかしその収量は少なく，詳細な免疫学的性質の解析が困難であった．
そこで，OMV 収量の増加を目指して培養条件や分離方法について検討した．
まず酢酸菌の培養条件を検討した．従来使用していた 804 培地にエタノールまたはマイトマイシンを添加して培養したところ，後者の場合に OMV の分泌量が大きく増加することがわかった．またこの際は，菌表面が大きく損傷しており，バクテリオファージ様の構造体も観察されているため，溶菌による影響であると考えられた．ついで OMV の分離・精製法として，硫安沈殿法とゲル濾過について検討した．まず硫酸アンモニウムの濃度について検討したところ，60%以上の濃度で OMV が効率よく沈殿することがわかった．しかし，70%では多くの莢雑物が共沈することから 60%が最適であることがわかった．ついで，
ゲル濾過カラムについて検討したところ，Sephacryl S-500 カラムにて精製が可能であることがわかった．以上の検討の結果，従来の分離法に比べて数倍の収量で OMV を得ることが可能となった．

【背景と目的】近年，ヒトマイクロバイオームのヘルスケア産業への活用が関心を集めている． 産業化に向けて腸内細菌と人の健康との因果関係を特定することが必要であるが，腸内細菌の大部分は未分離または未整備であることが課題である．そこで，NITE・NBRC では腸内細菌の収集提供に向け，様々な培養方法を用いた網羅的な腸内細菌の分離法（Culturomics）について検討した．
【方法】ヒト糞便から腸内細菌の分離は，変法 GAM や BHI 等の複数培地の使用，抗生物質や胆汁酸等の添加および加熱処理等を組み合わせた条件で集積培養を行った後に，希釈平板培養によりコロニーを分離した．分離株の同定は
MALDI-TOF MS および 16S rRNA 遺伝子配列の解析により行った．
【結果および考察】25 通りの条件で集積培養を行い，新種候補株を含む 26 属 35
種に同定される 1100 株以上の細菌を分離した．Eggerthella lenta, Bacteroides
uniformis，および Hungatella hathewayi については複数の培養条件から高頻度に単離された．一方で，ヒト腸内での優先種（Bifidobacterium pseudocatenulatum，Collinsella aerofaciens，Coprococcus comes）を含むほとんどの種は限られた条件
でしか分離されなかった．各培養条件により分離される腸内細菌は異なることから，網羅的な分離を行うには複数の培養条件を用いる必要があるが，変法
GAM を培地として抗生物質の添加等による集積培養を組み合わせることで，腸内細菌を効率的に分離できることが明らかになった．本発表では，各培養条
件における分離結果に加え，効率的に腸内細菌を分離する方法について紹介する．なお，本研究で分離した菌株は，NBRC より提供を行う予定である．

Improvement of outer membrane vesicles production from acetic acidbacteria

Culturomics for extensively culturing anaerobes from human feces○Masahito Hashimoto, Taichi Matsumoto, Keisuke Nakamura, Mami Ozono,
Shuhei Hashiguchi(Sci. & Eng. Area, Kagoshima Univ.)○Atsushi Yamazoe, Mamiko Shimamura, Takamasa Miura, Masataka Furukawa,
Yoshihito Uchino, Hiroko Kawasaki(NBRC, NITE)

Key words

acetic acid, outer membrane vesicles, lipopolysaccharide

Key words

1Cp06

Lactobacillus sakei 由来メンブランベシクルを介する IgA
産生促進作用の解析

1Cp08○三好 柚紀 1, 山崎 思乃 2, 中山 知哉 2, 國澤 純 3, 片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3医薬基盤・健康・栄養研）
shino.ya@kansai-u.ac.jp

Culturomics, gut microbiome, MALDI-TOF MS, isolation

グリコシルセラミドの腸内細菌への影響解析○北島 悠花 1, 佐藤 友哉 1, 宮川 幸 1, 阪本 真由子 1, 許 志豪 1,
中山 二郎 2, 北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2九大院・農）ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp【背景と目的】細菌が産生するメンブランベシクル（MV）と呼ばれる膜小胞は，タンパク質や核酸，細胞壁成分，シグナル物質などを含み，病原因子の送達やクオラムセンシングに関わるほか，宿主の免疫調節機能に影響することが報告されている．しかし，MV 研究はグラム陰性菌や病原性のグラム陽性菌に関するものが多く，プロバイオティクスである乳酸菌の MV 産生については未知の部分が多い．そこで本研究では，免疫調節作用を有する乳酸菌 Lactobacillus
sakei subsp. sakei NBRC 15893 からの MV 産生を検証すると共に，MV の IgA 産生促進作用を解析した．
【方法】 L. sakei NBRC 15893 は MRS 培地で静置培養した．遠心分離（8,500×g,
5 min, 4℃）で菌体を除去した上清を 0.45 μm 孔フィルターでろ過し，超遠心分離（100,000×g, 1 h, 4℃）により難沈降性画分を回収した．さらに，OptiPrep を用いた密度勾配超遠心分離（100,000×g, 6 h, 4℃）を行い，生じた茶色のバンド
を MV 画分として回収した．IgA 産生促進作用は，マウスパイエル板細胞に各画分を添加して 4 日間培養した後，上清中の IgA 産生量を ELISA 法で定量し評価した．
【結果と考察】MV 画分を透過型電子顕微鏡で観察したところ，直径 70～300 nmの球状構造物が確認され，本菌株が MV を産生することが示された．また，MV
画分はマウスパイエル板細胞からの IgA 産生を有意に増加させた．乳酸菌の免
疫調節作用の多くは，グラム陽性菌の細胞壁成分をリガンドとする Toll 様受容体（TLR）2 を介してもたらされることから，MV による IgA 産生促進に対す
る抗 TLR2 抗体の影響を検証した．その結果，MV の添加による IgA 産生量の増加は，抗 TLR2 抗体により完全に抑制された．以上より，L. sakei NBRC 15893
は IgA 産生促進作用を有する MV を産生し，MV による IgA 産生は MV 中に含まれる細胞壁成分によってもたらされる可能性が示された．

伝統発酵食品には整腸効果があると考えられているが，その機構はわかっていなかった．当研究室では，みそや甘酒など日本伝統の発酵食品に広く用いられる麹に着目し，麹中にセラミドと糖が結合した構造を持つグリコシルセラミド（以下 GC）が他の食品に比べ高濃度に含まれること，更にその GC が大腸に到
達し腸内改善効果を発揮することを発見した 1)．しかし，GC が腸内細菌に与える影響に関しては，まだほとんど明らかになっていない．一方で，西洋型の高脂肪な食事により分泌が増加する胆汁酸は腸内細菌叢へダメージを与えることが報告されている．そこで本研究では胆汁酸の腸内細菌へのダメージを GC が緩和するとの仮説を立て，代表的な植物 GC である大豆 GC が腸内細菌に胆汁酸耐性を賦与するかを検証し，GC の腸内細菌への新たな機能性を解明することを試みた．
【方法】コール酸 Na 濃度 0～15 mM に調製した 702 培地に Sphingobacterium
spiritivorum，Sphingobacterium composti，Sphingobacterium feacium，Sphingobium
japonicum，Sphingomonas asaccharolytica を接種し，初期菌体濃度を OD600 ＝ 0.05に調整後，30℃で培養し，24 時間後の OD600 を測定した．コール酸濃度 0mMの OD 値を基準に，生育が 50％となる濃度をコール酸 Na の IC50 とした．次に，
上記と同条件に調製した培地に，大豆 GC を 20μg/mL または 40μg/mL になるよ
うに加えて培養し，IC50 の推移を比較した．
【結果・考察】 大豆 GC を加えて培養したところ，S.asaccharolytica の大豆 GC
濃度 20 μg/mL 群において，Ctrl 群と比較して有意に生育が向上した(p=0.03)．
他の菌体では，差は有意ではなかったが，生育が向上する傾向が観察された．
以上の結果は，GC が腸内細菌の胆汁酸ストレスを緩和する可能性を示し，大豆や麹を含む発酵伝統食品が腸内環境維持に寄与することを示唆した．
1)SpringerPlus, 5, 1321 (201)

Analysis of IgA-enhancing effect via membrane vesicles derived from
Lactobacillus sakei

Influence of Glycosylceramide on the intestinal bacteria

Key words
lactic acid bacteria, membrane vesicle, IgA-enhancing effect,
Lactobacillus sakei

Key words○Yuki Miyoshi1, Shino Yamasaki-Yashiki2, Tomoya Nakayama2, Jun Kunisawa3,
Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
NIBIOHN)○Yuka Kitajima1, Tomoya Satou1, Miyuki Miyagawa1, Mayuko Sakamoto1,
Chihhao Hsu1, Jiro Nakayama2, Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Glycosylceramide, Bile acid, microorganisms

81

1Cp09

腸内細菌と食物繊維の接着現象の解析○谷口 茉莉亜 1, 倉光 香奈 1, 山崎 思乃 2, 片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工）
katakura@kansai-u.ac.jp

1Cp11

in vitro 培養系ヒト腸内細菌叢モデル（KUHIMM）を用いた難消化性食物繊維の影響評価○佐々木 大介 1, 佐々木 建吾 1, 生田 直子 2, 福田 伊津子 3,
近藤 昭彦 1, 大澤 朗 3（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大院・医, 3神戸大院・農）daisuke@port.kobe-u.ac.jp【背景と目的】腸内細菌は，腸管を覆うムチンの糖鎖などを認識して接着・定着すると考えられている．しかし，腸内には食物繊維も存在しており，これまで
当研究室では乳酸菌の表層タンパク質がマンナンなどの食物繊維にも接着することを明らかにしている．これは，乳酸菌が食物繊維に接着すれば蠕動運動に
より体外に排出される可能性を示すことから，微生物の腸管への接着機構を明らかにするには，食物繊維を含めた 3 者の相互作用を考える必要がある．そこ
でまず，腸内に存在する乳酸菌，ビフィズス菌，大腸菌の食物繊維に対する接着率を評価するとともに，接着率に対する pH とイオン強度の影響を検討した．
【方法】乳酸菌およびビフィズス菌は MRS 培地，大腸菌は LB 培地を用いて対数後期まで培養した．セルロースパウダー（ナカライテスク）およびキチンパ
ウダー（Wako）を pH 7.0 および 5.0 の 0.15 M NaCl 含有クエン酸リン酸緩衝液
で 30 mg/ml に懸濁し，菌体懸濁液と 6 rpm，10 分間，37℃で混合した．500×g，
10 秒の遠心後，5 分間静置し，懸濁液上部の OD660 を測定することで，腸内細菌の食物繊維に対する接着率を算出した．
【結果と考察】16 種の細菌の食物繊維に対する接着率を調べた結果，セルロー
スおよびキチンの両方，セルロースのみ，キチンのみに接着する株，セルロー
スおよびキチンのいずれにも接着しない株に分類された（各 7, 2, 4, 3 菌株）．また，ほとんどの菌株において pH 5.0 の方が接着率は高くなった．さらに，食物繊維に対する接着率がイオン強度にも影響されたことから，接着には疎水性相互作用と静電的作用の関与が示唆された．現在，腸内細菌と食物繊維の接着機
構を明らかにするため，接着因子となる菌体表層タンパク質等の同定を進めている．

【目的】難消化性食物繊維は，胃や小腸で分解・吸収されずに大腸まで届き，腸内細菌による分解を受けることで宿主への様々な健康効果が期待されている．
これまでの各種食物繊維の機能性評価は，多量摂取による動物給餌試験やヒト介入試験が行われており，現実的な影響との齟齬が指摘されていた．この問題を解消すべく，我々は in vitro 培養系ヒト腸内細菌叢モデル(Kobe University
Human Intestinal Microbiota Model [KUHIMM])と呼ばれる大腸細菌群の菌数・菌種の保持および短鎖脂肪酸(SCFAs)濃度のバランスを再現できるシステムを構築し，成果を報告している．本研究は，実際に無理のない摂取量を 6 g/日(1 日 3L の食物摂取と仮定すると 0.2%に相当)とし，種々の食物繊維の摂取による菌叢および代謝プロファイルへの影響評価を目的とした．
【方法】健常人の便検体を接種源とし，構造の異なる食物繊維を 0.2%添加・非添加でそれぞれ 30 時間の培養を行い，SCFAs を測定するとともにメタ 16S 解析を行った．さらに KUHIMM の結果をヒト介入試験(6 g/日摂取)の結果と比較するため，便中の菌叢構造を解析した．
【結果】食物繊維の種類よって培養後期に特異的な pH の低下が観察され，難消化成分の分解を示すと予測された．菌叢を非添加時と比較したところ，被験者全体の統計解析からは有意に増加する菌種は検出されなかった．またヒト介入試験においても，1 週間の難消化成分の摂取では腸内細菌叢に大きな変化は起きなかった．しかしながら KUHIMM では，SCFAs の中でも特に酢酸とプロピオン酸濃度に有意な上昇が検出された．したがって 6 g/日という無理のない摂取量は，腸内細菌叢を劇的に変化させるには至らないが，代謝の活性化による
SCFAs の増産が起こることを示唆した．KUHIMM は，機能性食品が持つヒトの健康に対する影響予測，つまりプレ評価技術としての有用性を示した．

Analysis of adhesion of intestinal bacteria to dietary fibers

Effects of Indigestible Dietary Fibers on Human Colonic Microbiota
Simulated in a Single-Batch Fermentation System○Maria Taniguchi1, Kana Kuramitsu1, Shino Yamasaki-Yashiki2, Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.)○Daisuke Sasaki1, Kengo Sasaki1, Naoko Ikuta2, Itsuko Fukuda3, Akihiko Kondo1,
Ro Osawa3(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Med., Kobe Univ., 3Grad.
Sch. Agric., Kobe Univ.)

Key words

intestinal bacteria, adhesion, cellulose, chitin

Key words

microflora, indigestible dietary fiber, human colon, in vitro model

1Cp10

腸内細菌 Bacteroides thetaiotaomicron による食物繊維の資化性に関する研究

1Cp12

In vitro 培養系ヒト腸内細菌叢モデルによる潰瘍性大腸炎患者の代謝プロファイル異常の検出○佐々木 建吾 1, 井上 潤 2, 星 奈美子 2, 佐々木 大介 1,
福田 伊津子 3, 近藤 昭彦 1, 大澤 朗 3（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大院・医, 3神戸大院・農）sikengo@people.kobe-u.ac.jp

篠原 涼平 1, 古根 隆広 2, ○生田 直子 1, 佐々木 大介 3,
佐々木 建吾 3, 福田 伊津子 4, 大澤 朗 4, 坂本 憲広 1
（1神戸大院・医, 2シクロケムバイオ, 3神戸大院・科技イノベ, 4神
戸大院・農）
naoko.ikuta@people.kobe-u.ac.jp【目的】我々はこれまでに培養系ヒト腸内細菌叢モデル(Kobe University Human
Intestinal Microbiota Model [KUHIMM])を利用した in vitro 試験および健常人におけるヒト介入試験を行い，種々の食物繊維が腸内の細菌叢およびその代謝プロファイルに及ぼす影響を評価してきた．これらの先行研究において食物繊維は
個人ごとに異なる Bacteroidetes 門細菌を増加させたが，その詳しいメカニズムについては明らかになっていない．そこで本研究では，ヒトの腸内における最優勢菌のひとつである B. thetaiotaomicron を使用して，単菌による種々の食物繊維の資化性について評価した．
【方法】糖を含まない液体培地で培養した B. thetaiotaomicron に，糖源としてグ
ルコース，難消化性デキストリン，α-シクロデキストリン，デキストランを
0.5%添加して嫌気培養し，24 時間後まで経時的に培養液の濁度を測定した．また，24 時間培養後の菌数および培養液中の短鎖脂肪酸濃度を測定した．
【結果】24 時間後の濁度はグルコース添加時が最も高く，次いでデキストラン，
α-シクロデキストリン，難消化性デキストリンの順であった．一方，菌数は，
難消化性デキストリン，α-シクロデキストリン，グルコース，デキストランの順で多かった．また，短鎖脂肪酸などの有機酸（SCFAs；酢酸，コハク酸，プ
ロピオン酸，酪酸，乳酸）分析の結果，添加した食物繊維の種類によって，培養液中の SCFAs 濃度が異なることが分かった．これらの実験結果から，食物繊維の種類によって B. thetaiotaomicron の資化性が異なることが示唆された．さらに，培養液中の食物繊維の残存量を測定し，食物繊維の構造と関連付けて資化性を評価したのでそれらについても併せて報告する．

【背景・目的】潰瘍性大腸炎は大腸の粘膜に炎症ができる病気であり，欧米のみ
ならず日本でも患者数が増加してきているが，根治的治療法は確立されていな
い．発症には環境要因や遺伝的要因が関わっているとされているが，腸内細菌叢の乱れが関連している事が近年，注目されてきている．一方，腸内細菌叢に関する評価は動物給餌試験やヒト介入試験による in vivo 系で行われてきたが，コストや倫理的制限の問題点が存在する．そこで我々は in vitro 培養系ヒト腸内細菌叢モデル(Kobe University Human Intestinal Microbiota Model [KUHIMM])を構築して，1000 種に及ぶ細菌種の保持や臨床検体（ヒト糞便）中の酢酸・プロ
ピオン酸・酪酸の組成すなわち代謝プロファイルの近似を可能とし，既知のプレバイオティクスへの Bifidobacterium 属の応答を評価できる事を報告している
1)．しかし，潰瘍性大腸炎患者の代謝プロファイルの再現は困難とされていた．
そこで，本研究では KUHIMM にて潰瘍性大腸炎患者の腸内細菌叢を模した上でその代謝プロファイルについて検証する事を目的とした．
【方法・結果】KUHIMM に潰瘍性大腸炎患者および健常人の，それぞれ 13 人ずつの臨床検体を投入して 37℃で培養した．培養開始後 24 時間以降には菌量や細菌種の構成は定常に達しつつあったために，培養時間は 30 時間を採用した．．臨床検体および培養液中より DNA を抽出し，メタ 16S 解析を行った結果，943～1143 種の細菌配列が得られた．また，臨床検体および培養液中において α 多様性について差は認められず，細菌種数や多様性については再現できたと考えられた．興味深い事に，潰瘍性大腸炎患者では健常人と比べて KUHIMM
での酪酸生成濃度が減少していた．本発表では，本モデルの潰瘍性大腸炎患者の腸内環境の評価ツールとしての可能性について論じる．
1) 2016 年度日本生物工学会

Effect of dietary fibers on the production and utilization of short chain fatty
acids by B. thetaiotaomicron

Abnormal metabolic profile of ulcerative colitis patients ascertained in in
vitro human colonic microbiota model

Ryohei Shinohara1, Takahiro Furune2, ○Naoko Ikuta1, Daisuke Sasaki3,
Kengo Sasaki3, Itsuko Fukuda4, Ro Osawa4, Norihiro Sakamoto1(1Grad. Sch. Med., Kobe Univ., 2Cyclochem Bio Co., Ltd., 3Grad. Sch. Sci. Technol.
Innov., Kobe Univ., 4Grad. Sch. Agric., Kobe Univ)

Key words

microbial flora, dietary fiber, Bacteroides, intestinal microbiota○Kengo Sasaki1, Jun Inoue2, Namiko Hoshi2, Daisuke Sasaki1, Itsuko Fukuda3,
Akihiko Kondou1, Rou Osawa3(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Med., Kobe Univ., 3Grad.
Sch. Agric., Kobe Univ.)

Key words

microbial flora, ulcerative colitis, human colon, in vitro model

82

1Cp13

Lactobacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテ
リオシン生合成関連遺伝子の解析

1Cp15○河原 あい 1, 善藤 威史 2, 松崎 弘美 1,3（1熊本県大院・環境共生, 2九大院・農, 3熊本県大・環境共生）
matusaki@pu-kumamoto.ac.jp

梨幼果抽出液添加による出芽酵母の寿命延長に関与する遺伝子○長谷川 真梨菜 1, 酒瀬川 世瑠 1, 荻田 亮 2,3, 藤田 憲一 2,
田中 俊雄 2, 村田 和加惠 1（1米子高専・物質, 2阪市大院・理, 3阪市大・健康研セ）
murata@yonago-k.ac.jp【目的】乳酸菌が生産するバクテリオシンは，その安全性の高さから天然の食品
保存料として期待されている．熊本県球磨地方の伝統的発酵食品「味噌漬け豆
腐」から分離した Lactobacillus plantarum PUK6 が生産する多成分バクテリオシ
ンの構造遺伝子を含む生合成関連遺伝子の同定と解析を行うことを目的とした．
【方法および結果】L. plantarum PUK6 の培養液上清から硫安沈殿，透析，SepPak Plus tC18 および逆相 HPLC を行ってバクテリオシンを精製した．HPLC で抗菌活性を示すピークのアミノ酸配分析を行った結果，既知のバクテリオシンである plantaricin A, NC8β および F と相同性を示した．これらバクテリオシン遺伝子に特異的なプライマーを用いて PCR を行い，増幅産物の塩基配列を決定した．その結果，plantaricin A, NC8 および EF の構造遺伝子を見出し，plnNC8βα，plnA および plnFE（逆向き）の並びで存在していることが明らかとなった．これらの遺伝子の位置や BLAST 検索の結果から，PUK6 株の多成分バクテリオシンの生合成関連遺伝子は，L. plantarum の一部の株と同様の遺伝子クラスターを有していると考えられた 1)．そこで，これらのゲノム情報を参考に複数のプライマーを設計し，PUK6 株ゲノム DNA の PCR クローニングおよび primer walking
により，PUK6 株の plantaricin 生合成関連遺伝子群 pln locus（約 17 kb）の全塩
基配列を決定した．現在，生合成関連遺伝子について機能解析を進めている．
1) Tsapieva, A. et al., Benef. Microbes, 2, 255-261 (2011)

近年，日本社会の高齢化や健康ブームなどと相まって，寿命を延ばしたいという意識が高まりつつある．昨今の研究において，寿命の決定機構はヒトから酵母まで共通性があると指摘されている．寿命に関する研究は多岐に渡り，そのひとつに寿命延長物質の付与がある．本研究では，細胞レベルでの寿命・老化研究に適したモデル生物である出芽酵母を用いて，梨幼果抽出液添加による寿命延長，特に経時寿命に着目して研究を行った．経時寿命とは，出芽酵母における寿命の 1 つの考え方で，分裂寿命とわけて考えられている. 経時寿命は分裂を停止した細胞が生存する期間のことを指し，具体的な実験手法として，定常期に入った細胞を選択し，コロニー形成率を求めることで生存曲線を作成し，生存率を求めることができる. また，梨成分が酵母のどの遺伝子を活性化させているのか調べるため RT-PCR も行った．実験の結果，寿命延長効果の観察において，梨成熟果抽出液を与えた酵母と無添加の酵母の間で生存率に差は見られなかったが，梨幼果抽出液を与えた酵母は与えていないものと比べ生存率が高いという結果が得られた．RT-PCR において，9 つの遺伝子を用いて実験を行ったところ，VHR1 において未処理の酵母に比べ梨幼果抽出液を添加した酵母では mRNA の転写量の増加が観察された．この VHR1 は欠失株において寿命の短縮が報告されている遺伝子である. 以上の結果から, 梨幼果抽出液による寿命延
長には VHR1 が関与しているのではないかと考えられる.

Identification and analysis of the biosynthesis genes of the multiple
bacteriocins produced by Lactobacillus plantarum PUK6

Some genes involving lifespan elongation of budding yeast to which young
asian pear fruit extract was added.

○Ai Kawahara1, Takeshi Zendo2, Hiromi Matsusaki1,3(1Grad. Sch. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto, 2Fac. Agric., Kyushu Univ.,
3Fac. Environ. Sym. Sci., Pref. Univ. Kumamoto)○Marina Hasegawa1, Seiru Sakasegawa1, Akira Ogita2,3, Ken-ichi Fujita2,
Toshio Tanaka2, Wakae Murata1(1Yonago Natl. Coll. Thechnol., 2Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 3Res. Center.
UrbanHealth Sports, Osaka City Univ.)

Key words

bacteriocin, Lactobacillus plantarum, lactic acid bacteria

Key words

1Cp14

酵母 Saccharomyces cerevisiae YM41 株の保持するキラー遺伝子の取得 ~第二報~

1Cp16○三木 健夫, 篠笥 光慶（山梨大院・医工総）takemiki@yamanashi.ac.jp

Saccharomyces cerevisiae, chronological lifespan, pear

リンゴ細胞壁可溶化とセラミド濃縮○笠井 尚哉 1, 是常 友紀 1, 向井 克之 2, 松山 彰収 2（1阪府大院・生環科, 2株式会社 ダイセル）
kasai@biochem.osakafu-u.ac.jp

キラー酵母は感受性酵母に対して静菌もしくは細胞破壊を伴う致死作用を示す．
このキラー現象は細胞外にキラータンパク質を放出し，これが感受性酵母に作用することにより発現する．我々は，強いキラー活性を示す Saccharomyces
cerevisiae YM41 株について研究を行っている．これまでに，YM41 株の生産するキラータンパク質（KP41）を精製し，本タンパク質の諸性質について調査を行った結果，pH2.0~5.0 および 20℃以下で安定性を示し，分子質量は約 70 ｋ
Da であることを明らかにしている．本研究では，酵母 S. cerevisiae YM41 株の保持するキラー遺伝子の取得を試みた．KP41 の N 末端アミノ酸配列（A-M-VE-A）に対応する縮重プライマーを作成し，PCR 法により増幅を試みた結果，4 つの増幅断片（1.2，2.0，3.5 および 5.0kbp）を得た．これらのうち 2 つの断片（1.2，2.0kbp）をクローニングし，塩基配列を決定した．これらの配列を
Saccharomyces Genome Database 上で BLAST 検索した結果，一つは S. cerevisiae
EC1118 の XIII 染色体の一部分と 98％の同一性を示し，他方は IV 染色体の一部
分と 97％の同一性を示すことがわかった．これらのうち 2.0 ｋｂｐ断片の塩基配列を基にゲノムウォーキングを行い，KP41 遺伝子のオープンリーディング
フレームの存在について調査した．

[目的] リンゴは世界中で食される重要な果物である．その多くは果実，リンゴ
果汁・シダーあるいはリンゴジャムとして，またリンゴ果汁よりはその香気とペクチンがエタノールで抽出・分別沈殿されて食品産業で広範囲に利用されている．しかしながら，その残渣物であるリンゴ粕は，リンゴ細胞壁は，その酵素分解が難しいとされ，その有効利用も難しいとされており，その大半がリンゴパルプとして飼料として利用される あるいは廃棄されるほかは有効利用されていない．しかし，その一方でリンゴは一般的な植物に比較して当該細胞壁にリンゴ-グルコシルセラミド（A-GC）が豊富に存在するとされ，約 2 倍強程度含有されると報告され，その展開が期待される．リンゴ細胞壁の可溶化は困難とされ，しかもその A-GC の存在場所や形態は細胞壁全体なのか否かなどについて明らかにされていない．

Second report: Cloning of killer gene from yeast Saccharomyces cerevisiae
YM41

Apple pomace high-digestion and isolation of the glycosyl-ceramide○Takeo Miki, Mitsuyoshi Sasaki(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, killer gene

[方法と結果] そこでリンゴ粕の効果的な高度可溶化を検討し，また，各可溶化物において A-GC の有無・所在や形態を明らかにすると共に，その効果的な製造法を以下検討した．リンゴ細胞壁の一次細胞壁，二次細胞壁の可溶化を顕微鏡で観察しながら酵素分解・処理法の検討を行ない，A-GC 酵素分解の可能性，
A-GC の各可溶化物中における存在確認は既報の TLC を用い，標品はトウモロ
コシ・小麦由来グルコシルセラミドと比較した．また GC 同定は TLC 及び MSにて同定した．本方法により濃縮物として約 50 倍程度の A-GC 濃縮が可能であり，リンゴ果汁粕の高度酵素可溶化と A-GC の簡易な調製とこれらの利用が期待される．
○Naoya Kasai1, Yuki Koretsune1, Katsuyuki Mukai2, Akinobu Matsuyama2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2Daicel Corporation)

Key words

apple, ceramide, cell wall degradation, cellulase

83

1Cp17

コーヒー豆におけるアラビノガラクタンプロテイン分解
酵素とセルラーゼの併用効果

1Dp01○柴田 晃, 松野 善治, 山田 みなみ, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）
kasai@biochem.osakafu-u.ac.jp

N 末端 SKIK ペプチドによるモノクローナル抗体生産量増大と機構解明○加藤 晃代 1,3, 田村 廣人 2, 中野 秀雄 1,3（1iBody（株）, 2名城大院・農, 3名大院・生命農学）
kato.teruyo@ibody.co.jp[目的] コーヒー豆はコーヒーとして世界的に飲用されている重要な嗜好飲用原料である．コーヒー豆はガラクトマンナン(GM)のほかに主としてアラビノガラ
クタンプロテイン(AGP)，セルロースから構成されるが，非常に堅く酵素分解が困難な豆である．またコーヒー豆の直接焙煎が一般的な方法であるが，容易な糖化が可能であれば，新しい焙煎法や食品加工などへの展開も考えられる．
本研究グループにおいては，現在までに選抜セルラーゼにおける GM によく作用するマンナナーゼやグルカナーゼを見いだし，当該酵素分解においては AGP
がセルラーゼ類を妨害している主因と考え，AGP 低分子化酵素さえあれば容易に酵素分解できると考え，AGP 低分子化酵素についても研究してきた．今回の発表では，この AGP 低分子化分解酵素とセルラーゼ併用によるコーヒー豆の高度分解可溶化と本結果を用いたコーヒー酸（CA），カフェイン(CF)の定量化改
善やボディ可溶化についても検討した．
[方法と結果] コーヒー豆はブラジル産サントスを用いた．AGP 分解低分子化酵
素は，別途，脱脂粉砕コーヒー豆からアルカリ処理とセルラーゼ処理によりコーヒー AGP を調製し，これを用いた AGP 低分子化酵素を培養上清として得た．
コーヒー豆の酵素分解においては，生豆を熱水処理し，ポリフェノールオキシダーゼを失活させてから，コーヒー豆切片に AGP 低分子化酵素を作用させ，その AGP 分解をヤリブ試薬染色陰性化にて確認した．また，セルラーゼとの併用による酵素選抜並びに，両酵素組み合わせによる一段階酵素処理法による最適化検討を行い，酢酸緩衝液 pH 5.8，30℃においてコーヒー切片可溶化をした．
その結果，数種の有効な組み合わせが得られた．また，コーヒー豆酵素可溶化による CA，CF の抽出定量化改善は認められなかった．

【【背景と目的】
モノクローナル抗体(mAb)は，ライフサイエンス研究・産業に必須なツールであり需要が拡大している．そのため，大腸菌や酵母で mAb を低コストで生産するための技術開発は重要である．我々のグループでは，難発現タンパク質の N
末端に 4 アミノ酸から成る SKIK ペプチドタグ配列を付加することにより，タンパク質発現量を増大可能であることを見出し，応用技術を開発してきた．そこで，本講演では，1) IgG の生産， 2) 小麦無細胞タンパク質合成系における
SKIK ペプチドタグの影響，および 3) SKIK ペプチドタグの転写・翻訳に与える影響解析について，これまでに得られた結果を発表する．
【方法・結果】
1) IgG の生産
ペプチドタグの有無でマウス由来の IgG 遺伝子を大腸菌無細胞タンパク質合成系で発現させた．その結果，タグ無しでは発現量が少なく，ELISA による抗体活性が認められなかった．一方，タグを付加した IgG では優位に発現量が高く，結合活性を有していた．
2) 小麦胚芽無細胞タンパク質合成系における SKIK ペプチドタグの影響
マウス由来 IgG およびウサギ mAb 遺伝子を用い，植物の翻訳系である小麦胚芽抽出液におけるタグの効果を検討した．タグの有無に加え，翻訳促進効果が報告されている 2 種類の非翻訳領域配列を挿入した，6 パターンの mRNA を作製し，翻訳反応を行った．その結果，いずれの非翻訳領域の配列を用いた場合
でも，タグの有無による発現量への影響は見られなかった．
3) SKIK ペプチドタグの転写・翻訳に与える影響解析
ウサギ mAb 遺伝子を用い，大腸菌無細胞タンパク質合成系において転写と翻訳反応をそれぞれ行った．その結果，転写産物の量はタグの有無により変化がな
かった．一方で，等量の mRNA を用いた翻訳反応を行ったところ，タグを有す
る mAb のタンパク質合成量は，タグがない mRNA より有意に大きかった．

Effective co-digestion of arabinogalactan-protein degrading enzyme andcellulases of coffee beans

Improved production of IgG with N-terminal SKIK peptide tag and it’smechanism○Akira Shibata, Yoshiharu Mastuno, Minami Yamada, Naoya Kasai(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)○Teruyo Ojima-Kato1,3, Hiroto Tamura2, Hideo Nakano1,3(1iBody Inc., 2Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 3Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya
Univ.)

Key words

coffee, protease, cellulase, cell wall degradation

Key words

antibody, Escherichia coli, cell-free protein synthesis, translation

1Cp18

茶殻における細胞内顆粒組織の酵素分解

1Dp02

Ecobody 法によるウサギモノクローナル抗体迅速取得法の開発○中嶋 優里, 花崎 麻由, 笠井 尚哉（阪府大院・生環科）
kasai@biochem.osakafu-u.ac.jp○新海 佑介, 森下 しおみ, 加藤 晃代, 兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
hnakano@agr.nagoya-u.ac.jp[方法と結果] 茶葉を常法通り，95℃熱湯で抽出し，緑茶成分を除去したのち，残渣を回収し，乾燥させて試料とした．セルラーゼ処理においては，オートク
レーブ処理，処理濃度について検討した．セルラーゼ処理物においては市販キッ
チン用不織布にて葉脈部分を濾別したのち，通過分を回収し顕微鏡観察した．
またこの残渣について染色，構成成分について検討を行い，各種プロテアーゼとダイズ構造体可溶化選抜麹菌培養上清を用いて酵素分解を試みた．その結果，濾過物は細胞内顆粒と考えられ，Asp. niger 由来プロテアーゼ処理により分解細分化とアミノ基の増加が認められた．

【背景・目的】ウサギモノクローナル抗体（rmAb）は抗原決定部位のバリエー
ションが豊富であり，かつ免疫化や採血がマウスに比べ容易であるため，マウスやラットに代わる抗体探索源として有望である．我々の研究グループでは，動物の末梢血から B 細胞を単離し，1 細胞逆転写反応と PCR により得られた L
鎖と H 鎖の DNA フラグメントから，無細胞タンパク質合成系を用いて改変
Fab(fragment of antigen binding)として発現させ評価する，迅速なモノクローナル
抗体取得法（Ecobody 法）を開発した．本研究では，Ecobody 法により，従来取 得 が 困 難 で あ る 膜 受 容 体 タ ン パ ク 質 ( 例 と し て Epidermal Growth Factor
Receptor: EGFR)に対する rmAb の取得法確立を目指した．
【方法と結果】はじめに EGFR の細胞外ドメインを大腸菌により発現させ，不溶画分からの精製とリフォールディングを行った．これを抗原としてウサギ(New Zealand White Rabbit)に免疫後，その血清を取得し，大腸菌死菌体，および EGFR 非発現のヒト不死化 B 細胞（HEV0011）とインキュベートし，これらに結合する抗体を除去した血清を得た．得られた血清と HiLyte Fluor で標識した Anti-Rabbit IgG を，EGFR 過剰発現株であるヒト細胞 A431 と HEK293 に塗布して蛍光顕微鏡で観察したところ，A431 の蛍光強度が有意に高かった．このことから，細胞表面のネイティブな EGFR に結合する抗体がこのウサギ血清中に存在していることが示唆された．次に，本ウサギ血清から B 細胞を単離し，Ecobody 法により EGFR に対する rmAb の取得を試みた．得られた候補クロー
ンを改変 Fab として無細胞タンパク質合成系にて合成し，ELISA による抗原結合能評価を行ったところ，それらは EGFR のネイティブ構造を認識する可能性が示唆された．

Investigation and the enzymatic digestion of inner cell body of tea leaf
residues

Generation of rabbit monoclonal antibodies from single B cells by Ecobody
technology[目的] 茶葉は緑茶や紅茶として世界的に飲用されている．我が国においても特に昨今では緑茶飲用の増大に伴い，その残渣，すなわち茶殻が副産物として大きな食品残渣となりつつある．茶殻の処理においては，ほとんど行われておらず，キノコ菌床への利用が試み，あるいは，バイオガス化なども試みられているが，未だ十分ではなく，その有効利用は，ほとんど知られていない．またその酵素分解においても充分検討されていない．これらの一因としては，茶葉の組織構造の検討や組織ごとの可溶化酵素が充分に検討されていないためと考えられる．特に，茶葉においても醤油粕や他植物同様に細胞壁組織のほかに細胞内顆粒が多く含まれることが問題と考えられる．
そこで，茶葉のセルラーゼ可溶化処理で残る残渣のうち，茶葉葉脈以外の組織について，その分離と構成物同定及び酵素分解に有効なプロテアーゼについて検討した．

○Yuri Nakajima, Mayu Hanasaki, Naoya Kasai(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

cellulase, protease, waste, tea leaf

○Yusuke Shinkai, Shiomi Morishita, Teruyo Ojima-Kato, Takaaki Kojima,
Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

monoclonal antibody, Rabbit, Cell free expression system

84

1Dp03

Ecobody 法によるヒトモノクローナル抗体の迅速取得と大腸菌による生産1Dp05○小森 有華, 内田 由乃, 加藤 晃代, 兒島 孝明, 中野 秀雄（名大院・生命農学）
hnakano@agr.nagoya-u-ac.jp【背景と目的】
モノクローナル抗体(mAbs)は病気の治療や診断に必須であり，近年その用途はますます拡大している．しかし，ハイブリドーマ法やファージディスプレイ法
等の従来法では，新規 mAbs の取得に長い時間を要し，迅速性に欠けることが課題となっている．一方，我々の研究グループは，動物の末梢血から得られる
B 細胞 1 個から，一細胞逆転写反応と PCR により抗体遺伝子を増幅し，連続的に大腸菌無細胞タンパク質合成系で抗体合成・評価することが可能な，高速mAbs スクリーニング法である Ecobody 法を開発してきた 1)．ここでは，ヒト不死化 B 細胞株から抗インフルエンザワクチン mAbs を取得し，大腸菌を用いた抗体大量発現系の検討と，得られた抗体の結合特異性の解析を目的とした．
【方法・結果】
Ecobody 法により，ヒトの不死化 B 細胞からインフルエンザワクチンに対する
ヒト mAb 遺伝子を 5 種類取得した．そのうち，抗原に対する高い結合活性を示したクローンを用い，大腸菌による発現系構築を試みた．マウス mAbs 遺伝子を使用した先行研究において Fab へのロイシンジッパー(LZ)付加が，大腸菌内での活性型 Fab 可溶性発現に効果的であったことから，LZ 融合 Fab(FabLZ)の大腸菌中での可溶発現を試みた．大腸菌由来プロピルシストランスイソメラー
ゼである FkpA と FabLZ との細胞質内共発現を行い，SDS-PAGE で解析したと
ころ，可溶画分に目的タンパク質の発現が確認できた．この可溶画分をポリヒ
スチジンタグによって精製することで 1 L の培養液あたり約 1.4 mg の FabLZ を回収できた．現在，無細胞タンパク質合成系を用いて合成した FabLZ と大腸菌
生体により発現させた FabLZ について，結合特異性の詳細な解析を行っている．

生体内タンパク質を標的にした新規立体構造認識モノク
ローナル抗体の作製とそのリガンド作用○磯﨑 勇志, 湊元 幹太, 冨田 昌弘（三重大院・工）tomita@chem.mie-u.ac.jp

1)加藤 中野 化学と生物 55, 490-495，2017

生体内で機能しているすべてのタンパク質は，立体構造を有している．特に，GPCR (G タンパク質共役受容体) のような複数回膜貫通タンパク質は複雑な構造を有しており，GPCR に対する立体構造認識モノクローナル抗体の作製は極めて難しいとされている．そこで，本研究では，GPCR のひとつである huCRHR1(ヒト Corticotropin-releasing hormone receptor 1) に着目し，その立体構造認識モ
ノクローナル抗体の作製に取り組んだ．
本研究室で開発された「立体構造特異的モノクローナル抗体作製 (SST) 法」に基づき，立体構造認識モノクローナル抗体の作製を行った．
DNA 免疫によって感作されたマウスから脾臓を取り出し，目的感作 B 細胞を含む脾細胞懸濁液を調製した．懸濁液中の目的の B 細胞の選択には huCRHR1
発現ミエローマ細胞を用いた．その原理は，細胞表面上で高次構造を保持した状態で発現されている huCRHR1 と目的感作 B 細胞の BCR (B 細胞受容体) との抗原抗体反応に基づいている．その後，B 細胞-ミエローマ細胞複合体を電気パルスによって選択的に融合して，抗体産生ハイブリドーマを作製した．
SST 法を用いて細胞融合を行った結果，多数のハイブリドーマを獲得でき，限界希釈法によってクローニングを行った．Cell-ELISA 法および ELISA 法によってハイブリドーマ上清の抗体価およびサブクラスを決定した．その結果，
huCRHR1 発現 CHO 細胞に対する特異的な結合を確認し，IgG2a タイプのモノ
クローナル抗体であることが明らかになった．さらに，免疫蛍光染色を用いて評価を行ったところ，huCRHR1 発現 CHO 細胞の膜表面への立体構造認識モノ
クローナル抗体の特異的結合が確認できた．リガンド分子を用いた競合アッセ
イでは，リガンド分子存在下でわずかにモノクローナル抗体の選択的結合が促進された．
今後は，更なる評価を行うとともに分子標的治療薬としての応用を目指す．

Generation and production of human monoclonal antibodies from single B
cells by Ecobody technology

Selective generation of stereospecific monoclonal antibodies against intact
proteins and their functional analyses○Yuka Komori, Yoshino Uchida, Teruyo Ojima-Kato, Takaaki Kojima,
Hideo Nakano(Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)○Yushi Isozaki, Kanta Tsumoto, Masahiro Tomita(Grad. Sch. Eng., Mie Univ.)

Key words
synthesis

Escherichia coli, human monoclonal antibody, cell-free protein

Key words
B-cell receptor, GPCR, Hybridoma technology, Stereospecificmonoclonal antibody

1Dp04

核酸分解能を示すヒト型抗体軽鎖クローン

1Dp06○清水 美里 1, 宇田 泰三 2, 一二三 恵美 3
（1大分大院・工, 2九州先端科学技術研究所, 3大分大・全学研究推進）
e-hifumi@oita-u.ac.jp

キンギョ由来抗体遺伝子の多様性解析と抗原特異的
scFv 断片の取得
岡﨑 文美 1,2,3, 額田 夏生 1, 百瀬 直樹 1, ○田丸 浩 1,2,3（1三重大院・生資・生物圏生命, 2三重大・先端科学研支セ・バ
イオインフォ, 3三重大・スマートセルイノベ研セ）
ytamaru@bio.mie-u.ac.jp【背景】我々は，酵素活性を有する抗体鎖を Antigenase と名付け，ヒト κ 型軽鎖ライブラリーからスクリーニングにより酵素活性を有するクローンの抽出を進めてきた．核酸分解型 Antigenase はその一つである．
【方法】κ 型軽鎖ライブラリーは，ヒト末梢血の白血球分画より抽出した RNAを用いて作製した．polyA primer により合成した cDNA を用いて κ 型軽鎖
Subgroup II 遺伝子を選択的に PCR 増幅し，pET20b(+)ベクターに挿入後，大腸菌 DH5α に組み込んでライブラリー化した．発現には大腸菌 BL21(DE3)pLysSを用い，Ni-NTA カラムクロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィー(TSKgel sp-5PW カラム,TOSOH)により精製した．核酸分解能は，主に pUC18
plasmid を基質とする DNA 分解実験により調べた．
【結果】核酸分解能を示す完全抗体型抗体酵素は，古くから報告がある 1,2)．これらは Mg2+要求性で中性条件において核酸分解能を示すものであり，当研究室で見出した軽鎖型 Antigenase も同様の性質を示した．その中で T99 クローンは，中性条件では DNA を分解せず，酸性条件下でのみ分解能を示し，Mg2+非要求性であった．このクローンは，Rodkey らの完全抗体型抗体酵素 BV04-012)
で活性部位を構築するとされる H27d, Y32 を有しており，分子モデリング等の結果から，これらを含めた数残基が核酸と相互作用すると推定された．
1)G.Gabibov et al., Science 256, pp665 (1992)
2)L.S.Rodkey et al., Mol. Immunol., 34, pp1083 (1997)【目的】抗体は抗体医薬をはじめ，検査診断薬や分析試薬，最近では CAR-T 細
胞治療など幅広く利用される生体分子であるが，マウスやウサギなどの哺乳動
物ではしばしば免疫寛容によって有用な抗体が作製できない場合があった．このような問題を克服するために，脊椎動物の源流に位置しており，自然免疫系に加えて獲得免疫系を保有する硬骨魚類を用いた抗体生産系の開発に着手した．
本研究では，スイホウガン（水泡眼）という眼下に角膜が肥大化した水泡を有するキンギョを免疫動物として用い，免疫前後の抗体遺伝子の網羅的な塩基配列解析ならびに抗原特異的な scFv 断片の取得を試みた．
【方法】蛍光タンパク質（EGFP）を抗原としてスイホウガン水泡液中に免疫し，
免 疫 前 後 の 水 泡 液 か ら total RNA を 抽 出 し た ． こ れ を 鋳 型 と し て goldfish
Immunoglobulin M（gIgM）遺伝子に対する cDNA を合成し，次世代シークエンサーを用いて塩基配列を決定した後，CLC Genomics Workbench を用いて解析した．さらに，得られた gIgM の cDNA から VH および VL の各領域から scFv 断片を合成し，in vitro パッケージングしたファージディスプレイ法を用いて EGFPに対してバイオパニングを行った．
【結果】免疫前後の水泡液中の gIgM を ELISA 法で測定したところ，いずれの免疫個体も EGFP に対するポリクローナル抗体が検出された．さらに，gIgM 遺伝子を網羅的に解析した結果，免疫前後で明らかな塩基配列の変化が認められ，さらに免疫回数を重ねると塩基配列が収束することがわかった．免疫後の個体から調製した gIgM 遺伝子から作製した scFv 断片のファージライブラリを用いて EGFP に対するバイオパニングを行なったところ特異的に結合するクローンの取得に成功した．

Clones of human antibody light chain showing decomposition ability for anucleic acid

Analysis of gene diversity on goldfish IgM and acquisition of antigenspecific scFv fragment○Misato Shimizu1, Taizo Uda2, Emi Hifumi3(1Grad. Sch. Eng., Oita Univ., 2Div. Nanotech., ISIT, 3Res. Prom. Inst., Oita Univ.)

Key words

catalytic antibody, Subgroup II, antigenase

Fumiyoshi Okazaki1,2,3, Natsuki Nukada1, Naoki Momose1, ○Yutaka Tamaru1,2,3(1Dept. Life Sci., Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Sec. Bioinform., ASRC, Mie
Univ., 3Res. Cent. Smart Cell Innovation, Mie Univ.)

Key words

antibody, goldfish, scFv

85

1Dp07

スプライシング因子の過剰発現及び標的遺伝子配列の操作によるニワトリ B 細胞株における遺伝子変異の増強

1Dp09○金山 直樹, 太田 愛美, 西山 由美子, 岡 知里, 曲 正樹, 徳光 浩
（岡山大院・ヘルスシステム・細胞機能）
nkanayam@okayama-u.ac.jp

我々は抗体遺伝子への体細胞突然変異の導入を任意に ON/OFF 可能なニワトリ
B 細胞株 DT40-SW を用いて，in vitro 抗体作製技術を構築してきた．DT40 細胞の変異能力の改良は抗体遺伝子のレパートリーの多様化を促進する上で重要な課題である．最近，我々はスプライシング因子 SRSF1 のアイソフォーム SRSF1-3が抗体遺伝子への変異導入に重要な役割を果たしていることを見いだした．本
研究では，SRSF1-3 の過剰発現による DT40 細胞の変異能力の改良を検討した．
SRSF1-3 を安定に過剰発現させた DT40-SW 細胞では，野生型細胞に比べて抗体可変部遺伝子への変異導入能力が上昇した．同様の実験系において，抗体可変部遺伝子を外来抗体可変部遺伝子 (anti-Her2, anti-EGFR) や非抗体遺伝子(mCherry) に置換した DT40 細胞においても，SRSF1-3 を過剰発現させることによって SRSF1-3 を過剰発現させない場合の 3 倍程度に変異導入効率が向上した．一方，抗体遺伝子上において，変異導入の hot spot 配列(WRC) が鋳型鎖と非鋳型鎖で重複している overlapping hot spot (OHS; WGCW)では，高度に変異が導入されるとの報告があったことから，OHS 配列を既存の抗体可変部遺伝子(anti-Her2)や非抗体遺伝子(mCherry)の配列上に追加した人工遺伝子を設計し，DT40 細胞の抗体可変部遺伝子と置換して変異導入効率の上昇を試みた．OHSを追加した人工遺伝子を導入した DT40 細胞では，オリジナルの標的遺伝子を導入した細胞と比べて標的遺伝子への変異導入効率が 1.5～2 倍程度上昇した．
SRSF1-3 過剰発現と OHS 追加の両方を組み合わせた際の変異頻度についても相乗的な効果が見られた．SRSF1-3 の過剰発現や標的遺伝子配列への OHS の追加
は，DT40 細胞における標的遺伝子の変異導入頻度の向上と変異体ライブラリーの作製に有効であると考えられる．

Enhancement of immunoglobulin hypermutation in the chicken B cell line
by over-expressing a splicing factor and optimizing specific DNA sequences○Naoki Kanayama, Manami Ohta, Yumiko Nishiyama, Chisato Oka,
Masaki Magari, Hiroshi Tokumitsu(Appl. Cell Biol., Grad. Sch. Health Syst., Okayama Univ.)

ラクダ科動物由来重鎖抗体を用いた蛍光免疫センサー
mini Q-body の構築○上田 宏 1, 山田 映未 2, 井上 暁人 3, 大室 有紀 1, 北口 哲也 1
（1東工大・研究院・化生研, 2東工大院・生命理工, 3東工大・生
命理工）
ueda@res.titech.ac.jp【目的】 Q-body は抗体断片に部位特異的に修飾した蛍光色素がクエンチする現象を利用したバイオセンサーであり，迅速高感度に抗原を検出できることから各種の診断・検出系への応用が期待されている．Q-body 化できる抗体断片としてはこれまで Fab, scFv, そして VH が知られている．一方，ラクダ科動物由来重鎖抗体 VHH は，小さく安定な認識素子として近年その応用が盛んである．そこ
で今回，がん細胞検出への応用を念頭に上皮成長因子受容体（EGFR）に対する VHH を生体透過性の高い近赤外蛍光を出す色素を用いて Q-body (mini Qbody)化できないか試みた．
【方法】 抗 EGFR VHH としてラマ由来の VHH122 を用い，これを Q-body 化する
ため，N 末/C 末に修飾用の Cys つきタグを付加したタンパク質を大腸菌 SHuffle
T7 express lysY を用いて大量発現させ，金属アフィニティークロマトグラフィー
精製後に 蛍光色素修飾と Flag 精製を行った．そして変性剤添加時の蛍光強度増大から抗原不在時のクエンチ度を評価し，次いで抗原を添加した時の蛍光応答を評価した．
【結果と考察】 ATTO655-および ATTO680-maleimide を用いて，色素の数とリンカー長が異なる 4 種類の ATTO680 修飾 Q-body を作製した．なかでもクエンチの大きかったダブルラベルリンカーあり Q-body と N 末ラベルリンカーあり Qbody の抗原応答を確認したところ，ダブルラベルリンカーあり Q-body が 4.8倍，N 末ラベルリンカーあり Q-body が 12 倍の応答を示した．ダブルラベル Qbody では色素間相互作用が強すぎ，抗原を添加してもクエンチが十分に解除されなかったことが考えられる．以上より，scFv では構築が難しかった近赤外蛍
光 Q-body の VHH を用いた構築に成功した．現在，がん細胞検出への応用を試みている．
Reference: Gottlin E.B. et al., J. Biomol. Screen. 14, 77-85 (2009).

Construction of mini Q-body using Dromedary VHH antibody○Hiroshi Ueda1, Emi Yamada2, Akihito Inoue3, Yuki Ohmuro1, Tetsuya Kitaguchi1(1CLS, IIR, Tokyo Tech., 2Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech, 3Sch. Biosci.
Biotechnol., Tokyo Tech.)

Key words

antibody, DT40 cells, somatic hypermutation

Key words

antibody, fluorescence spectra, fluorescent microscopy, Quenchbody

1Dp08

ホタルルシフェラーゼ生物発光活性制御におけるアルパ
カ抗体の利用

1Dp10

ヒト型抗体酵素 #7 シリーズの生化学的性質と酵素活性サイト○鶴田 篤弘 1, 加藤 太一郎 1, 有馬 一成 1, 伊東 祐二 1, 赤澤 陽子 2,
中島 芳浩 2（1鹿児島大院・理工, 2産総研）
kato@sci.kagoshima-u.ac.jp○宇田 泰三 1, 田口 博明 2, 一二三 恵美 3
（1九州先端科学技術研究所, 2鈴鹿医療大・薬, 3大分大・全学研
究推進）
uda@isit.or.jp【研究目的】 ホタル生物発光は酵素ホタルルシフェラーゼの触媒活性により基質 D-ルシフェリンが励起状態のオキシルシフェリンへと変換されることで生じる．本反応は ATP の定量や in vivo イメージング時のバイオマーカーとしてライフサイエンス分野にて幅広く利用されている．バイオマーカーとして利用する際に細胞内で発光活性を制御する一般的な方法は，遺伝子レベルで酵素タン
パク質の発現量を調節することである．しかし私は，このような既存の方法とは異なる，タンパク質レベルでの酵素機能制御方法を確立したいと考え，この活性制御にアルパカ由来の VHH 抗体を用いることを計画した．つまり，発現している酵素タンパク質の量は一定でありながら，抗体によってその機能を制御することができれば，既存の方法とは異なる作用機序の発光活性制御方法を提案できると考えた．よって本研究では，ホタルルシフェラーゼに特異的に結合し，かつその発光触媒活性を阻害する抗体の探索を試みた．
【研究材料と方法】 M13 ファージに VHH 抗体を提示したファージディスプレ
イライブラリを構築し，3 ラウンドのバイオパンニングを行い，ヒカリコメツ
キムシ由来ルシフェラーゼ(E-luc)に特異的に結合するファージの濃縮を行った．
ELISA 分析によって標的ルシフェラーゼへの特異的かつ強い結合が確認された
抗体 9 種を大腸菌 HB2151 株にて発現・精製し，精製タンパク質を用いて E-luc
に対する発光阻害実験を行った．
【結果と考察】 抗体タンパク質を用いた発光阻害実験の結果，E-luc の発光量を20%以下にまで抑える P14F が得られた．Biacore による解析の結果，抗体が Eluc に対して高い結合力を持つことも確認できた．現在，阻害効果の向上を目指
し，異なる部位に結合する VHH 抗体を用いたヘテロ二量体の作成等を行っている．

【背景と目的】 演者らはこれまでにマウス型およびヒト型スーパー抗体酵素を作製してきた．ヒト型については抗体軽鎖バンクの作製を進めており，これまでに同タンパク質として数百種類を発現・精製し，保存している．この抗体バンクの中から，生理活性を有するペプチドやタンパク質をターゲットに抗体酵素としてのスクリーニングを進めており，最近，興味ある結果を得たので報告する．
【方法】ヒト型抗体軽鎖遺伝子は pET20b (+)に組み込んだ後，大腸菌に形質転換
し IPTG で発現誘導した．培養上清の可溶性画分を回収後，Ni-NTA クロマト等で精製した．この時，銅を添加して抗体軽鎖に mono-form structure を取らせるようにした 1)．酵素活性は beta-amyloid やその FRET 基質および合成基質を用いて測定した．
【結果と考察】ヒト型抗体軽鎖バンクの中からランダムに 61 種類を選び，認知症の原因物質である beta-amyloid に対してスクリーニングを実施した．その結果，数種類抗体軽鎖が同 FRET 基質を分解した．その中で高活性な#7TR クロー
ンは beta-amyloid(1-40)に対しても分解能力を示し，His14-Gln15 間で切断されていた．一方で，#7wt クローンは#7TR と非常によく似たアミノ酸配列を有するにも拘わらず，ほとんど分解活性を示さなかった．アミノ酸配列および構造モ
デリングから，#7TR の 30th に存在するアルギニンが酵素活性の発現に大きく関与しおり，Asp1, Ser27a, His27d とは異なる Arg30 を中心とする新しい酵素活性サイトを形成していると推測された．
1) E. Hifumi et al., FASEB J., 30, 895-908(2016)

Utilization of alpaca VHH antibody for controlling the bioluminescentactivity of firefly luciferase

Biochemical features and the catalytic site for #7-series of human antibody
light chain○Atsuhiro Tsuruta1, Dai-ichiro Kato1, Kazunari Arima1, Yuji Ito1, Yoko Akazawa2,
Yoshihiro Nkajima2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kagoshima Univ., 2AIST)

Key words
display

firefly luciferase, bioluminescence, alpaca VHH antibody, phage○Taizo Uda1, Hiroaki Taguchi2, Emi Hifumi3(1Div. Nanotech., ISIT, 2Dept. Pharm., Suzuka Med. Univ., 3Res. Prom., Inst. Oita
Univ.)

Key words

catalytic antibody, amyloid, triad

86

1Dp11

ヒト型抗体軽鎖 Subgroup I における酵素活性に関する
検討

1Ep01

○渡辺 万由子 1, 秋吉 裕子 2, 田口 博明 3, 宇田 泰三 4,
一二三 恵美 2（1大分大院・工, 2大分大・全学研究推進, 3鈴鹿医療大・薬, 4九州先端科学技術研究所）
e-hifumi@oita-u.ac.jp

納豆抽出物に含まれるカチオン性ペプチドは LPS 中和
活性と血管新生促進活性を発揮する○相田 涼介, 斉藤 寿槻, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp【背景】我々は，酵素活性を有する抗体鎖を Antigenase と名付け，各種 Antigenaseの作製を進めてきた．Antigenase は Serine protease 様の活性サイトを持つと推定されたことから，ヒト型では Asp1, Ser27a, His93（あるいはその類似配列）を潜在的に持つ kappa 鎖 Subgroup II を取り扱ってきた．今回，上術の配列を持たない Subgroup I に属する軽鎖クローンについて，新たに酵素活性を有するクローンを見出した．
【方法】kappa 鎖 Subgroup I 遺伝子は，ヒト末梢血の白血球分画より RNA を抽出し，polyA primer により cDNA を合成後，PCR 増幅させた．これを，pET20b(+)
ベクターに組み，大腸菌 BL21(DE3)pLysS により発現させて可溶性画分を調製した．一次精製として Ni-NTA（QIAGEN）カラムクロマトグラフィー，二次精製として TSKgel SP-5PW カラム（TOSOH）を用いるイオン交換クロマトグラ
フィー，または HiLoad 16/60, Superdex200 カラム（GE Healthcare）を用いるサ
イズ排除クロマトグラフィーにより精製した．酵素活性試験では，tau タンパク部分ペプチドおよび pNA 合成基質（ペプチド研究所）を用い，37℃で反応させた．
【結果】tau タンパク部分ペプチドを用いるスクリーニングにより，このペプチドを分解する H34 クローンを見出した．続いて実施した 5 種類の pNA 基質に対する分解試験では，Subgroup II クローンとは異なる分解パターンを示した．
本クローンの配列や構造予測，ならびに他のクローンとの活性比較から活性サイトを推定し，特徴を議論したい．

【目的】 これまでに当研究室では，米や大豆などの食品タンパク質酵素加水分
解物に含まれるカチオン性ペプチドを同定し，それらのペプチドが抗菌活性，
抗炎症活性，創傷治癒活性などを有していることを報告してきた． また，発酵
食品中に含まれるカチオン性ペプチドの生理活性を解明するために，納豆抽出物から等電点電気泳動によって，カチオン性ペプチド画分を調製し，画分に含まれるペプチドを同定した．そこで本研究では，納豆抽出物から同定したペプ
チドを化学合成して，それらの抗菌活性，LPS 中和活性，および血管新生促進
活性について検討した．
【実験方法】 本研究では, 納豆抽出物から調製したサンプルを，等電点電気泳動によって 20 の画分に分画した後，カチオン性画分に含まれるペプチドを逆相ク
ロマトグラフィーによって精製した．次に，得られた各ピークに含まれるペプ
チドを，MALDI-TOF/MS を用いて同定した．同定したペプチドを化学合成し，それらの生理活性を測定した．すなわち，ヒト病原微生物に対する抗菌活性を測定した．また，リムルステストを用いて LPS 中和活性を測定し，さらにヒト
臍帯静脈血管内皮細胞を用いて血管新生促進活性を測定した．
【結果】 等電点電気泳動後に得られた 20 画分のうち，No.19 と No.20 の画分の等電点は 12 以上であった．No.19 と No.20 の画分からペプチドを精製し，同定
した結果，10 種類以上のカチオン性ペプチドを同定できた．そこで，同定したペプチドのうち，正味の電荷がプラスであり，等電点が高い 7 種類のペプチドを選択し，それらを化学合成した．7 種類のペプチドは，すべて抗菌活性を示さなかったが，一方，すべてのペプチドは LPS 中和活性を発揮し，また 6 種類のペプチドは血管新生促進活性を示した．

Study on the enzymatic activity in human antibody light chain of Subgroup
I

Cationic peptides identified from natto extract exhibit LPS-neutralizing andangiogenic activities○Mayuko Watanabe1, Yuko Akiyoshi2, Hiroaki Taguchi3, Taizo Uda4, Emi Hifumi2(1Grad. Sch. Eng., Oita Univ., 2Res. Prom. Inst., Oita Univ., 3Dept. Pharm., Suzuka
Med. Univ., 4Div. Nanotech., ISIT)

Key words

1Dp12○Ryousuke Aida, Kazuki Saito, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

catalytic antibody, Subgroup I, antigenase

Key words
activity

natto extract, cationic peptide, LPS-neutralizing activity, angiogenic

免疫グロブリン製剤による新たな免疫抑制作用の発見

1Ep02

コメ糠タンパク質由来多機能型カチオン性ペプチドの創傷治癒作用とその機構の解明○堀 采音, 藤村 孝志, 河本 正次（広島大院・先端物質）
d183513@hiroshima-u.ac.jp○斉藤 寿槻, 生江 俊樹, 落合 秋人, 田中 孝明, 谷口 正之（新潟大・自然研）
mtanig@eng.niigata-u.ac.jp【目的】 難治性炎症疾患の治療法として，献血健常者由来の IgG 画分を主成分とする免疫グロブリン製剤 (IVIg) を大量投与する免疫グロブリン療法が行われている．本治療法は著明な治療効果を示すにもかかわらず，未だその正確な奏効機序の解明には至っていない．そこで本研究では，IVIg の標的細胞サブセッ
トを再定義すると共に，その免疫抑制機構を解明することを目的とした．
【方法及び結果】マウス由来脾細胞に対する増殖抑制を指標とした IVIg の免疫抑制効果を検討したところ，本分子が未刺激脾細胞の恒常性増殖を抑制することがわかった．そこで本増殖抑制効果を規定する IVIg の標的細胞を検索したところ，本分子は未刺激 B 細胞を標的として凝集塊形成を促すと共に，その恒常性増殖を著明に抑制することが判明した．本作用は既知の IVIg 標的分子（低親和性 Fcγ 受容体）や B 細胞接着分子（integrin β2）を介することなく発揮されており，IVIg が定常状態 B 細胞に未知の機構で直接的に作用し，その恒常性増殖を負に制御しうることが示唆された．一方で，IVIg は定常状態 B 細胞のみならず，T 細胞に対しても直接的に作用してその増殖活性化を抑制しうること，また本分子による T 細胞増殖抑制効果は G1 細胞周期アレストの誘導を基調とす
ることが明らかとなった．以上の結果から，IVIg が活性化ステータスの異なる
複数のリンパ球サブセットを直接の標的細胞として多彩な免疫抑制活性を発揮していることが示唆された．

【目的】当研究室では，コメ糠タンパク質酵素加水分解物から 3 種類のカチオン性ペプチド（SSF，LRR，および EKL）を同定し，それらがヒト病原微生物に対して抗菌活性を示すこと，および LPS 中和活性を示すことを既に報告している 1)．そこで本研究では，3 種類のカチオン性ペプチドの創傷治癒作用を，血管新生促進活性と細胞遊走促進活性を測定することによって検討した．また，作用機構を解明するために，特異的な阻害剤を用いて活性を測定した．
【実験方法】本研究では，創傷治癒作用を評価するために，血管新生促進試験
を，次のようにして行った．予め 96 ウェルプレートに Matrigel を添加し，人工基底膜を作製し，その上にヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）と各ペプチドをそれぞれ添加した．一定時間培養した後に，顕微鏡で血管構造を形成した細胞を観察し，その細胞の長さの合計を測定し，その効果を定量化した．細胞遊走促
進試験（スクラッチ試験）では，24 ウェルプレートに HUVEC を播種し，コン
フルエントな状態まで培養した後，スクラッチスティックによって一定の幅の創傷を作製した．その直後に各ペプチドをそれぞれ添加して，創傷の面積を 24
時間ごとに測定し，創傷閉鎖率を求めた．
【結果】血管新生促進試験において，SSF，LRR，および EKL を添加した場合に，コントロールとして用いた LL-37 と同じように，血管構造をした細胞がより密な状態となり，その細胞の長さの合計が無添加の場合に比べて増加した．
また，細胞遊走促進試験においても，LL-37 と同じように，SSF，LRR，およびEKL を添加した場合に，創傷閉鎖が促進された．今後，特異的な阻害剤を用いて作用機構を検討する予定である．
1) J. Functional Foods, 34, 287-296 (2017).

Discovery of novel immunosuppressive actions of intravenous
immunoglobulin (IVIg)

Wound healing activity and mechanism of action of multifunctional cationicpeptides derived from rice bran proteins.

○Ayane Hori, Takashi Fujimura, Seiji Kawamoto(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

intravenous immunoglobulin, B cells, T cells, immunosuppression○Kazuki Saito, Toshiki Namae, Akihito Ochiai, Takaaki Tanaka,
Masayuki Taniguchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ.)

Key words
promotion

cationic peptide, wound healing, angiogenesis, cell migration

87

1Ep03

Screening of exosome-binding peptides from EWI-2
protein

1Ep05○Thanawat Suwatthanarak, Masayoshi Tanaka, Mina Okochi(Dept. Chem. Sci. Eng., Sch. Mat. Chem. Technol., Tokyo Tech)
okochi@chemeng.titech.ac.jp

焼成多孔性シリカゲルを用いた苦味ペプチドの選択的除去手法の開発池田 彩 1, 今井 健人 1, 清水 一憲 1, 上村 光浩 2, 小川 光輝 2,○本多 裕之 1,3（1名大院・工, 2富士シリシア化学, 3名大・予防早期医療創成セ）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp

Exosomes are 30-150 nm cell-derived vesicles, secreted by various cell types into
extracellular fluids and containing bio-functional molecules (lipids, proteins, DNA andRNA) as the original cells. In cancer research, tumor-derived exosomes are useful not
only to predict metastasis at an early stage but also to treat cancerous disease.
However, exosomes have been difficult to collect and probe due to their nanosize.
Interestingly, peptide is much smaller, more stable, and easier for synthesis compared
to antibody, widely used to collect and probe exosomes, and still remains highsensitivity and specificity to the targets. Here, to improve collection and probe
techniques for exosomes, we screened 8-mer peptides from EWI-2 protein, which
likely interacts with exosome surface markers such as CD9 and CD81 proteins, using
peptide array. Fluorescence-labelled exosomes from MDA-MB-231 cell culture media
were applied to binding assay with peptide arrays, constructed from EWI-2 sequence.
After the binding assay, fluorescence image and intensity suggested that some peptides
from EWI-2 sequence could strongly bind with exosomes from human breast cancer
cell line, MDA-MB 231. Moreover, notable exosome-binding peptides usuallyconsisted of positive and hydrophobic amino acids implying that the binding
interaction depended on charge and hydrophobicity. These short exosome-binding
peptides could be further employed to nanodevices to enhance exosome collecting
ability and to lower limit of detection in exosome probe system.

【目的】
タンパク質加水分解物は，低アレルゲン化食品や経腸栄養食などとして利用されている．しかし，加水分解の過程で苦味ペプチドを生じるため，不快な味を呈してしまう．従来開発されている苦味除去技術には，逆相系樹脂への吸着やエキソ型プロテアーゼによるペプチドの切断などが存在するが，苦味ペプチドの除去効率が悪い，風味が変化するといった問題がある．当研究室ではこれまでに高温焼成した多孔性シリカゲルに対するペプチドの吸脱着特性を明らかにしてきた．本研究では，高温焼成したシリカゲルが苦味ペプチドの除去担体として利用可能かどうかの検討を行った．
【方法】
既報の苦味ペプチド 19 種類と旨味ペプチド 34 種類をペプチドアレイを用いて合成し，焼成シリカゲルへのペプチドの吸着量を評価した．また同様の実験を市販の吸着剤に対しても行った．次に，苦味ペプチドと旨味ペプチドの両方を含む混合液を用いて吸着実験を行い，選択性を評価した．最後に，タンパク質
加水分解物を多孔性シリカゲルで前処理することで苦みが低減するかどうかを官能試験によって評価した．
【結果】
苦味ペプチドと旨味ペプチドの吸着量を評価したところ，焼成シリカゲルは，
旨味ペプチドに比べ苦味ペプチドの吸着量が高かった．また，市販の吸着剤と比較して選択性が高く，苦みペプチドと旨味ペプチドの混合溶液中でも，苦味ペプチドを選択的に吸着した．さらに，タンパク質加水分解物をシリカゲルで前処理，官能試験で比較したところ，苦味が有意に低減されることが示された．
これらの結果から，今回我々が作製した焼成シリカゲルは，苦味ペプチドの選
択的除去特性が高い担体であることが示唆された．

Screening of exosome-binding peptides from EWI-2 protein

Development of the selective elimination methods for bitter peptides withporous silica gel○Thanawat Suwatthanarak, Masayoshi Tanaka, Mina Okochi(Dept. Chem. Sci. Eng., Sch. Mat. Chem. Technol., Tokyo Tech)

Aya Ikeda1, Kento Imai1, Kazunori Shimizu1, Mitsuhiro Kamimura2,
Mitsuteru Ogawa2, ○Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Fuji Silysia Chemical LTD., 3PME, Nagoya
Univ.)

Key words

peptide, peptide array, exosome, cancer cell

Key words

silica gel, bitter peptide, protein hydrolysates, taste

1Ep04

多孔性シリカゲルを用いた機能性ペプチドの腸デリバリーに適したペプチドの in silico 設計と評価

1Ep06

LEA ペプチドの発現による大腸菌の紫外線耐性の向上○今井 健人 1, 清水 一憲 1, 上村 光浩 2, 小川 光輝 2, 本多 裕之 1,3（1名大院・工, 2富士シリシア化学, 3名大院・予防早期医療創成セ）honda@chembio.nagoya-u.ac.jp○池野 慎也 1, フワイジ アラー 2, パサック ニシット 1,
シャヒル アミル 2（1九工大院・生体工, 2マレーシアプトラ大・生物工）
ikeno@life.kyutech.ac.jp【背景】
健康長寿に資する「機能性ペプチド」は，健康食品や機能性食品の有効成分として注目されている．しかし，機能性ペプチドは，そのまま経口摂取すると胃の消化酵素によって容易に分解され，腸まで機能性を保持したまま届けることができないという問題がある．この問題を解決するため，これまでに我々は「多孔性シリカゲル」を用いた分解抵抗性経口投与法の開発に成功しており，疎水性かつ負電荷性のペプチドを，特に効率よく腸輸送できることを発見した．そこで既報の「コレステロール吸収抑制ペプチド」をモデルに，機能性を保持したまま，腸輸送効率を向上させる検討を進めた．今回はその検討結果を報告する．
【方法】
我々の前報の 11 種類のコレステロール吸収抑制ペプチドを選び，その一残基置
換配列を候補ペプチドとした．この候補ペプチドの中からシリカゲルで腸輸送しやすい配列を in silico で選抜し，選抜方法の妥当性を検証するために，得られたペプチドを，in vitro で評価した．胆汁酸結合活性が高いペプチドは，胆汁酸ミセル崩壊活性を示し，コレステロールの吸収を抑制する．このため，ペプ
チドアレイ上にペプチドを合成し，胆汁酸との結合度を測定することで，コレステロール吸収抑制活性を評価した．
【結果】
in silico 選抜によって，1265 種類の候補ペプチドのうち 78 種類を選抜した．これらのペプチドの腸輸送値と胆汁酸結合活性を in vitro 評価したところ，78 種
類中 6 種類が既報のペプチドとほぼ同等の胆汁酸結合活性を示した．またそのうちの 5 種類は腸輸送値を既報のペプチドの 1.5 倍以上に向上させられている可能性が示された．これらの結果から，ペプチドの機能性を保持したまま，腸輸送値を向上させられる設計指針を作成できたと考えられる．また，この方法
は他の機能性ペプチドにも適応可能であると期待される．

【背景と目的】LEA(Late Embryogenesis Abundant) タンパク質は植物の種子や一部の動物から発見された天然変性タンパク質であり，細胞内のタンパク質等を保護する機能を有している．当研究室ではこの LEA タンパク質内の繰り返し配列をモチーフとして LEA ペプチドを設計し，大腸菌内で目的タンパク質と共発現させると目的
タンパク質の発現量が増大することを報告してきた．その一方，LEA タンパクは元来，様々なストレス耐性に関わるタンパク質である．LEA タンパクの発現により塩・熱ストレス耐性が向上する報告があることから，LEA ペプチドも同様に耐性を向上させるのではないかと仮説をたて実験・検証を行ったところ，
LEA ペプチド発現の増大に伴い塩・熱ストレス耐性が向上することを見出した．本研究では，様々紫外線ストレスに対して LEA ペプチドの細胞保護機能を検証することを目的する．
【実験方法と結果】
pET 系の発現ベクターに LEA ペプチド遺伝子を導入し，発現ベクターを構築した．その形質転換大腸菌に発現誘導剤（IPTG）を添加し，細胞内に LEA ペプ
チドを発現させた．4 時間培養した形質転換大腸菌を LB 寒天培地に播種し，紫外線照射環境下で培養後，コロニーカウント法により UV 耐性評価を行った．
その結果，LEA ペプチド発現の増大に伴いコロニー数が増加し，LEA ペプチドの発現による紫外線ストレス耐性の向上を確認した．また，殺菌用途に活用される UV-C の照射条件においてもコロニーの増殖を確認した．本結果より，LEA
ペプチドが塩，熱ストレスのみならず，紫外線ストレスにも耐性を強化し，様々な細胞ストレスに対して耐性を向上させることを示した．現在，その耐性が向上するメカニズムの解明を研究している．
参考論文 N.Pathak, S.Ikeno, Biochem. Biophys. Res. Commun., 492 (3), 386-390,
2017

In silico design and evaluation of appropriate functional peptides forintestinal delivery with porous silica gel

In vivo expression of LEA peptide for enhancing UV stress tolerance in
Escherichia coli

○Kento Imai1, Kazunori Shimizu1, Mitsuhiro Kamimura2, Mitsuteru Ogawa2,
Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Fuji Silysia Chemical LTD., 3PME, Nagoya
Univ.)

Key words

functional food, peptide, bile acid, in siloco screening○Shinya Ikeno1, Alaa Huwaidi2, Nishit Pathak1, Amir Syahir2(1Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol., 2Fac. Biotech. Biomol. Sci.,
Univ. Putra Malaysia)

Key words

Escherichia coli, abiotech stress, LEA peptide, UV-radiation

88

1Ep07

新規ラッソペプチド vesicusin A および B の異宿主生産○不破 啓貴, 小谷 真也（静大・創科技院）
kodani.shinya@shizuoka.ac.jp

1Ep09

Bevacizumab に対する抗イディオタイプアプタマーの結合特性の改良池袋 一典 1, ○清水 裕 1, 齊藤 太郎 1, 塚越 かおり 1, 山田 朋宏 2,
轟木 堅一郎 2（1農工大院・工, 2静県大院・薬食生命）
ikebu@cc.tuat.ac.jp

ラッソペプチドは N 末端にマクロラクタム環を含む投げ輪構造をとり，C 末端の直鎖ペプチド部が N 末端のリングにトラップされたユニークな化合物である．ラッソペプチドはプロテアーゼによる分解を受けにくく，抗菌剤，受容体阻害剤および酵素阻害剤などへの応用が期待されている．プロテオバクテリアに多数のラッソペプチド生合成遺伝子クラスターが見出されており，その構造的多様性から未発見の生理活性が期待できる．大腸菌を用いた異宿主生産が報告されているが，通常の培養条件でラッソペプチドの生産量は少ない．そこで，Sphingomonas 属用に開発した発現用シャトルベクター pHSG396Sp を用い，Sphingomonas subterranea を宿主としてゲノムマイニングによって発見された新規ラッソペプチドを生産することを試みた．ゲノムマイニングによって見出し
た Brevundimonas vesicularis NBRC12165 の新規ラッソペプチドの生合成遺伝子
クラスター（2.7kb）を PCR で増幅した．この遺伝子クラスターには構造遺伝
子二つと修飾酵素群を含む．この遺伝子領域を大腸菌-Sphingomonas のシャトル
ベ ク タ ー pHSG396Sp に 組 み 込 み ， 大 腸 菌 へ 形 質 転 換 す る こ と でpHSG396Sp-12165L を得た．この pHSG396Sp-12165L をエレクトロポレーショ
ン法で S. subterranea NBRC16086 に導入後，MBM 液体培地で培養し，培養物をメタノールで抽出した．得られた抽出液を HPLC と ESI-MS を用いて分析したところ，導入した遺伝子クラスター由来の 2 種類のラッソペプチド（vesicusin
A および B）を発現生産したことを確認した．以上のように，ゲノムマイニン
グによって発見した新規ラッソペプチドを，シャトルベクターを用いてSphingomonas 属細菌で発現させることに成功した．

現在，低分子医薬品と並んで抗体医薬品が広く利用され，その開発が進められている．医薬品の開発を行う際には血中薬物濃度測定を行い，その薬物動態を解析する必要があるが，抗体医薬品は患者由来の抗体と構造が似ているために特異的な検出が難しい．これまでに抗原や抗イディオタイプ抗体などをリガンドに用いた検出が行われているが，これらのリガンドは製造コストが高く，また製造ロットの間で結合能にばらつきがある場合が多いため，抗体医薬品に対して高い特異性を持つ新規リガンドが求められている．
本研究では抗体医薬品に結合可能な新規リガンドとして DNA アプタマーに注目した．DNA アプタマーは，標的分子を特異的に認識できる核酸リガンドであり，安価に化学合成することが可能である．当研究室では過去に抗体医薬品である Bevacizumab に対する抗イディオタイプアプタマーである A14#1 を獲得している．A14#1 は抗体間での特異性を持つことから，Bevacizumab の相補性決定領域と相互作用すると考えられている．本研究では，A14#1 の Bevacizumab
に対する結合能の向上を目的とし，その結合特性の解析を行った．
A14#1 と Bevacizumab の相補性決定領域の等電点から，酸性条件下で分子間の相互作用が増強されると予想し，異なる pH での A14#1 の Bevacizumab に対する結合能の評価を行った．その結果，pH 7.4 の条件と比較して，pH 4.7 で A14#1の Bevacizumab に対する結合能が 100 倍程度向上することが示された．また，
A14#1 は pH 4.7 の条件で，解離定数が 1 nM 以下である可能性が示された．

Heterologous production of vesicusins A and B

Improvement in binding property of the anti-idiotype aptamer against
Bevacizumab○Hiroki Fuwa, Shinya Kodani(Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Kazunori Ikebukuro1, ○Yutaka Shimizu1, Taro Saito1, Kaori Tukakoshi1,
Tomohiro Yamada2, Kenichiro Todoroki2(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Grad. Sch. Integr. Pharm. Nutr.
Sci., Univ. Shizuoka)

Key words
vesicularis

lasso peptide, shuttle vector, heterologous production, Brevundimonas

Key words

DNA, aptamer, antibody drug, anti-idiotype

1Ep08

蛍光発光アプタマー Spinach に対する変異導入とその蛍
光への影響評価

1Ep10

水耕栽培によるミヤコグサのベツリン酸生産能の増強○上野 絹子 1, 塚越 かおり 1, Porchetta Alessandro 2,
Ricci Francesco 2, 池袋 一典 1
（1農工大院・工, 2Dept. Chemist., Univ. Rome Tor Vergata）
ikebu@cc.tuat.ac.jp○鈴木 隼人, 福島 エリ オデット, 村中 俊哉（阪大院・工）muranaka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

アプタマーとは標的分子に対して特異的に結合することが可能な核酸であり，その中でも Spinach アプタマーを含む複数の蛍光発光アプタマーは低分子リガンドである DFHBI を認識し，蛍光を発するアプタマーとして報告されている．
これらのアプタマーを細胞内で転写させることで生体内における特定の転写産
物や代謝産物の挙動を観察することが可能であるが，細胞内におけるより詳細な解析を行うためにこれらのアプタマーの蛍光強度の増強が求められている．
これまでに，Spinach アプタマーがグアニン四重鎖構造 (G4) を有することが結晶構造解析より明らかとなっている．G4 は 4 つのグアニンから形成される Gカルテット構造が積み重なった状態であり，Spinach アプタマーや Baby Spinach
アプタマー，Broccoli アプタマーといった，DFHBI に結合し蛍光を発するアプ
タマーは共通して G4 を有することが報告されている．さらに，Broccoli アプタ
マーの G4 配列に変異導入を行うことで蛍光強度の増強を行った報告もなされており，DFHBI の認識およびアプタマーの蛍光発光では G4 構造が重要であると考えられる．
そこで本研究では，Baby Spinach アプタマーが持つ G4 形成配列に対して一塩基変異導入を行い，その蛍光強度の評価を行った．各変異体を評価した結果，複数の変異体において変異導入前の配列と比較し高い蛍光強度が観察された．
特に Baby Spinach アプタマーの塩基配列において 11 番目に存在するアデニン
をシトシンに置換した場合には，変異導入前の 2.5 倍の蛍光強度となった．一方で，37 番目のアデニンあるいは 39 番目のウラシルに対して変異導入を行った場合には蛍光発光を観察できなかった．これより，G4 構造のループ配列が蛍光発光に重要であると考えられた．また，Baby Spinach アプタマーの G4 形成
配列を最適化することで蛍光発光強度を増強できる可能性が示唆された．

【背景と目的】 トリテルペノイドは多様な構造と薬理活性を持ち，医薬品やそのリード化合物として重要な植物二次（特化）代謝産物である．その生産のほ
とんどは天然の植物からの抽出に依存しており，環境破壊や供給の不安定化が危惧されている．合成生物学的手法による代替生産が盛んに研究されているが，依然として収量が低いことが問題となっている．
一方，ダイズを湛水条件で栽培することで有用トリテルペノイドの一種である
ベツリン酸の生合成遺伝子の発現が誘導されることが報告されている．また，マメ科薬用植物カンゾウの液体培養組織でも生合成遺伝子の高発現とベツリン酸蓄積が報告されている．そのため，マメ科植物を水リッチな環境で栽培することでトリテルペノイドの生産に応用できるのではないかと考えた．加えて，発表者らはマメ科モデル植物ミヤコグサ Lotus japonicus が通常の栽培条件でも多くのベツリン酸を根に蓄積することを明らかにしている．本研究ではミヤコ
グサを材料に用いてベツリン酸をより多く生産する栽培／培養条件の検討を行った．
【結果と考察】 土壌栽培，不定根培養，水耕栽培物，それぞれに含まれる各種
トリテルペノイドを GC-MS により定量し比較した．その結果，水耕栽培体の根は土壌栽培体の根の 10 倍以上のベツリン酸を蓄積し，その蓄積量は乾燥重量
当たり 6.5%に達することが判明した．さらに，根をクロロホルムに数十秒間浸すだけで，類縁夾雑物をほとんど含まないベツリン酸（GC-MS 分析の結果 96%以上の純度であった）を回収することができた．このことは細胞の破砕や精製などの手間を削減できるという点で大きな利点である．今後，遺伝子導入やゲノム編集による代謝改変を行うことで，ミヤコグサを任意のトリテルペノイドの生産ホストとして利用することが可能になると期待される．

Mutational analysis of its fluorescence of Baby Spinach focusing on its Gquadruplex structure

Enhanced betulinic acid production in Lotus japonicus hydroponic culture○Kinuko Ueno1, Kaori Tsukakoshi1, Alessandro Porchetta2, Francesco Ricci2,
Kazunori Ikebukuro1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Dept. Chemist., Univ. Rome Tor
Vergata)

Key words

aptamer, fluorescent aptamer, G-quadruplex, mutational analysis○Hayato Suzuki, Ery Odette Fukushima, Toshiya Muranaka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Triterpenoid, hydroponics, legume, Lotus japonicus

89

1Ep11

UV-B LED 照射によるポリフェノールの増産○鶴本 智大 1, 藤川 康夫 1, 泉田 智史 2, 三島 俊介 3, 太田 大策 4,
岡澤 敦司 4（1日亜化学工業, 2ヒューマンチップス, 3大塚電子, 4阪府大院・
生環科）
okazawa@plant.osakafu-u.ac.jp

1Ep13

Unraveling N-glycan patterns of glycoproteins extracted
from intra- and extracellular fractions of Nicotiana
benthamiana suspension cell culture and the effect ofkifunensine treatment.
○Yayon Pamula Mukti, Takao Ohashi, Ryo Misaki,
Kazuhito Fujiyama(ICBiotech, Osaka Univ.)
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp【背景と目的】紫外光を使うと植物体内でフェノール性化合物を生成できるが，DNA 等に損傷を与えるなど生育には有害であるため，フェノール性化合物の生産手段として実用化が進展していない．従来は幅の広い紫外光スペクトルをもつ光源を使用していたが，そのスペクトルの中でフェノール性化合物の生成に寄与している波長を特定できれば，それ以外の波長の照射は不要となり，損傷を極端に抑えてフェノール性化合物の生産が可能になると考えた．本研究では，波長域が狭く鋭いピークを持つ LED を光源に使用し，フェノール性化合物の含有量を増加できるか検討した．
【方法】①シロイヌナズナを MS 培地に播種して 14 日間，長日条件（明期 16 時
間/暗期 8 時間；照度 200 μmol/m2/s）下で育成した後，②2.5 μmol/m2/s の照度でピーク波長 280 nm，又は 310 nm の LED 光を照射し，③HPLC 分析にて生成されるフェノール性化合物量を未照射のものと比較した．更に，④網羅的な遺伝
子発現の比較を行った．加えて，スダチの実，チャノキの葉に対して，5 μmol/
m2/s の照度でピーク波長 280 nm の LED 光を照射し，同様の評価を行った．
【結果と考察】シロイヌナズナでは，波長 280 nm の短時間照射でポリフェノー
ルであるアントシアニンの検出量が顕著に増加したが，波長 310 nm では増加は見られなかった．遺伝子発現では，波長 280 nm の照射でアントシアニンの生合成制御を担う転写因子 MYB75 の発現が特異的に増加した．また，実用植物であるスダチの実，チャノキの葉でも，波長 280 nm にて数種のフェノール
性化合物の増加が確認できた．以上の結果より，植物のポリフェノール量の増
産には UV-B 光のうち 280 nm 付近の光が効果的であった．
【謝辞】本研究を進めるに当たりご協力いただいたアグリバイオフォトニクス産業化研究会（ABPI 研）の皆様に感謝の意を表します．

Nicotiana benthamiana suspension cell culture offer various advantages for fastdevelopment cycle, relatively less spacious and be able to perform eukaryotic posttranslational modification such as N-glycosylation. Terminal mannose residues ofseveral recombinant proteins and vaccines were proofed to play essential roles in thetargeting to macrophages and internalization via mannose receptor. Here, we looked
over the effect of kifunensine, an α-mannosidase I inhibitor treatment in N.
benthamiana suspension cell culture. The N-glycan structures of glycoproteins in intraand extracellular fractions of N. benthamiana suspension cell cultures with or without
kifunensine (Kif) treatment were analyzed. Hydrazinolysis was used to liberate Nglycans, and the oligosaccharides resulted were labeled with 2-aminopyridine (PA).
Reverse-phase HPLC was used to purify the PA-glycans. The structures of the PAglycans were distinguished by elution time comparison of PA-glucose oligomer
standard and liquid chromatography-tandem mass spectrophotometry (LC-MS/MS).
Plant specific-type N-glycan structures were dominating in intracellular (64.9%) andextracellular (70.6%) fractions of suspension cell culture. Nevertheless, the addition of
kifunensine in N. benthamiana suspension cell culture medium showed relatively
increased the amount of high mannose-type N-glycans in intra- (78.8%) andextracellular (65.5%), compared to wild type

Increase in production of polyphenols by UV-B LED irradiation

Unraveling N-glycan patterns of glycoproteins extracted from intra- andextracellular fractions of Nicotiana benthamiana suspension cell culture andthe effect of kifunensine treatment.

○Tomohiro Tsurumoto1, Yasuo Fujikawa1, Satoshi Izuta2, Shunsuke Mishima3,
Daisaku Ohta4, Atsushi Okazawa4(1Nichia Co., Ltd., 2HumanChips Inc., 3Otsuka Electronics Co., Ltd., 4Grad. Sch.
Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)○Yayon Pamula Mukti, Takao Ohashi, Ryo Misaki, Kazuhito Fujiyama(ICBiotech, Osaka Univ.)

Key words

anthocyanin, LED, polyphenol, UV-B

Key words

N-glycan, Nicotiana benthamiana, suspension cell culture, kifunensine

1Ep12

マイクロセンサーを用いたイネの葉のガスフィルムの
解析

1Ep14

Production and N-glycan analysis of recombinant βglucocerebrosidase in Nicotiana benthamiana root
culture○ターナー ピーター 1, 井上 貴行 1, Dalsgaard Tage 2, Pedersen Ole 3（1セントラル科学貿易, 2Unisense, Denmark, 3Univ. of
Copenhagen, Denmark）
turner@cscjp.co.jp○Naphatsamon Uthailak1,2, Takao Ohashi1,2, Ryo Misaki1,2,
Kazuhito Fujiyama1,2(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp

目的: 水稲の葉と根の酸素摂取量における葉のガスフィルムの影響を理解する．
方法： 本研究では，光合成，二酸化炭素，酸素等をパラメーターとして分析した．完全冠水時の明と暗の状態で，イネの根の pO2 を，酸素マイクロセンサーを用い，実験室内と野外の両方で調査した．さらに，ガスフィルムを界面活性剤によって取り除き，葉のガスフィルムの影響を調べた．
結果： 葉のガスフィルムと根の pO2 の増加において正の相関が見られた．実験
室内と野外での測定を組合せたことで，冠水時において，葉のガスフィルムがどのようにしてイネの生存の助けとなっているか理解が深まった．

Gaucher disease is a lysosomal storage disorder caused by the lack of the enzyme βglucocerebrosidase (GCase). The enzyme replacement therapy has been used as themost effective treatment for Gaucher disease type I and the commercial recombinant
GCase mostly used is produced in mammalian cells. Compared to mammalian cells,
plants provide many advantages on the pharmaceutical protein production including
the low cost for large-scale production and no risk of the contamination by humanpathogens. This study aimed to produce and purified the recombinant GCase as anactive enzyme in a Nicotiana benthamiana root culture. Root of transgenic GCaseproducing plants were induced and cultured in liquid medium supplement withindole-3-acetic acid (1 mg/L). The recombinant GCase was successfully produced inroot culture with the enzyme activity about 81.40 ± 17.99 Units/mg total protein. The
GCase was extracted and purified using two purification steps, concanavalin A andphenyl 650C chromatographies. After protein concentration, the productivity of
purified GCase was approximately 1 μg/g of root. The N-glycan structure of purified
GCase was also analyzed using a nano LC/MS. The typical structure with two plantspecific residue, Man3XylFucGlcNAc2 was found in purified GCase. This research
provides the alternative plant system for the production of recombinant GCase. The
application of this system on the other recombinant proteins production could bestudied in the future.

Analyzing leaf gas films of rice plants using microsensors

Production and N-glycan analysis of recombinant β-glucocerebrosidase inNicotiana benthamiana root culture○Peter Turner1, Takayuki Inoue1, Tage Dalsgaard2, Ole Pedersen3(1Central Scientific Commerce, Inc., Tokyo, 2Unisense, Denmark, 3Univ. of
Copenhagen, Denmark)Key words

microsensor, rice, gas film, oxygen○Naphatsamon Uthailak1,2, Takao Ohashi1,2, Ryo Misaki1,2, Kazuhito Fujiyama1,2(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
Human glucocerebrosidase, Nicotiana benthamiana, Root culture,
Plant-made pharmaceuticals

90

1Ep15

マーカーフリー RDR6 ノックダウン株における外来遺伝
子の導入効率および発現効率

1Ep17○下川 麻優子 1, 三上 達也 2, 梅山 幸子 3, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2千葉大院・融合, 3千葉大・園芸）
kodama@faculty.chiba-u.jp

イネの大粒変異の次世代シーケンス解析○富田 因則, 土屋 智顕（静大・グリーン研）
tomita.motonori@shizuoka.ac.jp【背景・目的】RDR6 (RNA-dependent RNA polymerase 6) は一本鎖 RNA から二本鎖 RNA を合成する．二本鎖 RNA は RNA サイレンシングの起点となるため，RDR6 は RdDM
(RNA-directed DNA methylation) や，PTGS (post-transcriptional gene silencing) 経路において重要な因子である．RDR6 の機能を失った Arabidopsis rdr6 変異体では，Agrobacterium tumefaciens による遺伝子導入効率が上昇した報告もある[1]．
そこで本研究では，形質転換効率の向上を狙い NtRDR6 遺伝子の発現を抑制した NtRDR6 ノックダウン株を作出し，これに過剰発現コンストラクトを再導入
して，遺伝子導入効率および導入遺伝子の発現効率を調べることを目的とした．
【方法・結果】
MAT ベクター[2]を用いることで，コンストラクトの導入に伴う選抜マーカー
遺伝子が残存していない，マーカーフリー NtRDR6 ノックダウンタバコ株を作出した．この形質転換株とタバコ野生株において，毛状根を誘導する Ri プラス
ミドと過剰発現コンストラクトを同時に A. tumefaciens を用いて導入し，毛状根の形成数の測定と各毛状根での導入遺伝子の発現レベルを測定した．その結果，タバコ野生株と比べて NtRDR6 ノックダウン株では，アグロバクテリウム法による形質転換効率は上昇したが，導入した遺伝子の発現量には変化はなかった．
[1] Dunoyer et al. (2006) Nat Genet. 38:258-263[2] Ebinuma and Komamine (20+01) In Vitro Cellular & Developmental Biology.
Plant 37:103-113

コシヒカリを大粒化して低コスト・多収化したスーパーコシヒカリを開発する
ため，品種「いのちの壱」の大粒性に着目し，コシヒカリといのちの壱との F2で分離した大粒型個体を一回親にして，コシヒカリを反復親とする連続戻し交雑を行い，大粒性に関する遺伝分析，SNP マーカーとの連鎖解析，NGS による全ゲノム解析を行った．コシヒカリへの戻し交雑 BC3F2，BC4F2 で分離した大粒
遺伝子 Gg のホモ型個体（粒面積 24.1～25.0 mm2）を用いて SNP マーカーとの連鎖解析を行った結果，第 2 染色体の J521（短腕末端から 7.6 Mb），RM3390（7.7 Mb），J527（8.2 Mb）アリルにおいていずれもいのちの壱ホモ型を示し，Gg との強い連鎖が検出された．一方，これらより下流にある，J536（9.1 Mb），
RM6375（9.6 Mb），J543（10.2 Mb）アリルでは，BC3F2 ではいのちの壱ホモ型が大方で，一部ヘテロ型だったのに対して，BC4F2 では全てコシヒカリホモ型に換わり，4 回目の戻し交雑によって 9.1 Mb より下流の領域がコシヒカリゲノ
ムに置換されていた．以上のように，4 回の戻し交雑を経て，第 2 染色体短腕末端から 7.6～8.2 Mb の DNA 領域が Gg とともに遺伝していることが分かった．大粒遺伝子 Gg のホモ型個体の全ゲノム解読を行うため，Nextera トランス
ポソームでゲノム DNA をタグ付けしつつ断片化し，PCR で両末端にアダプターを合成後，磁性ビーズで DNA 断片をサイズ選択して定性・定量分析し，DNA
ライブリーを作製した．HiSeq4000 で解読されたリード配列を，本研究室で作製したコシヒカリの仮想ゲノムを参照配列としてマッピングした結果，カバー率が 99.24%で，平均 depth が 12.68 となった．第 2 染色体の 8.1 Mb 地点にある糖転移酵素様配列を挟む 5’側，3’側の 2 か所に SNP が検出された．

Effects of knockdown of the RDR6 gene on transformation efficiency andexpression level of the transgene

Next-generation sequencing analysis for large-grain mutant in rice

○Mayuko Shimokawa1, Tatsuya Mikami2, Yukiko Umeyama3, Hiroaki Kodama1(1Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ., 2Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ., 3Fac.
Horticul., Chiba Univ.)

Key words

1Ep16○Motonori Tomita, Tomoaki Tsuchiya(Green Biol. Div., Res. Inst. Green Sci. & Technol., Shizuoka Univ.)

RDR6, gene silencing, Nicotiana tabacum

Key words

rice, grain, genemRNA の内部切断に関わる配列的特徴の解明

1Fp01

Enhanced activity and stability of lipase in deep eutectic
solvents○上野 大心, 山崎 将太朗, 出村 拓, 加藤 晃
（奈良先端大・バイオ）kou@bs.naist.jp○Yujin Oh, Sung Hee Kim, Sang Hyun Lee(Dept. Bioeng., Konkuk Univ., South Korea)
so01068@naver.com

外来遺伝子を細胞内で発現させる上で，mRNA の蓄積量は重要である．この蓄積量を制御する機構のひとつとして，mRNA の分解機構が挙げられる．この分解機構は，ポリ A 鎖の短縮，もしくはエンドヌクレアーゼ等による mRNA 内
部配列の切断に依存する分解機構に大別することができる．ポリ A 鎖の短縮に依存する分解機構に関しては，酵母等において詳細な解析が行われているが，内部配列の切断に依存する分解機構に関しては，酵母を含め動植物を問わず詳細は不明である．植物においては，切断部位を同定する網羅的な分解産物解析がいくつか報告されているが，これらの手法は同一 mRNA 上に存在する複数の切断部位を正確に同定できないことや，検出される切断部位が 3’末端側に偏るなど，実験手法上に問題がある．従って，これらの情報から各切断部位の切断のされやすさを正確に数値化することができず，結果としてその切断に関わる機構や配列的特徴は不明であった．そこで本研究では，これらの問題点を改良し，次世代シーケンサーにより網羅的に切断部位を同定した．この新たな手法
では，検出される切断部位が 3’末端側へ偏ることを大幅に軽減した．また，mRNA の各切断部位の切断率を基に解析を行ったところ，切断部位の周辺には顕著な塩基の偏りが観察された．加えて，遺伝子内における切断部位の分布に着目すると，開始，終止コドンの近傍に切断部位が多く検出され，コード領域内において 3 塩基単位の周期性が観察された．これらの傾向は，リボソームの停止，停滞パターンと一致していることから，翻訳過程も mRNA の切断に関与することを示唆している．これらの解析により切断に関わる配列的特徴を明らかにすることができれば，導入する外来遺伝子について切断率が高いと予想される配列をあらかじめ除去するなど，導入遺伝子の効率的発現に寄与すると考えられる．

DESs (Deep eutectic solvents) are low transition temperature mixtures consisting of atleast one hydrogen bond donor and one hydrogen bond acceptor. DESs have theadvantages of non-volatility, biocompatibility, and biodegradability, compared withconventional organic solvents. In this work, various choline chloride ([Ch][Cl])-based
DESs were used as cosolvents and anhydrous media for the lipase-catalyzed reactions.
Lipase showed enhanced activity and stability for the hydrolysis of p-nitrophenyl
palmitate in aqueous DES mixtures. The activity of lipase in an aqueous solution of[Ch][Cl]:urea:glycerol (1:1:1) was 155% higher than that in buffer. The half-life timeof lipase at 40℃ in an aqueous solution of [Ch]Cl:glycerol (1:2) was enhanced by 9.2
times. The activity and stability of lipase in the transesterification of benzyl alcoholusing anhydrous DESs as reaction media were also higher than those in ionic liquid
and organic solvent which have similar dipolarity/polarizability. The activity of lipase
in anhydrous [Ch][Cl]:urea:formamide (1:1:1) was 11.7 and 1.7 times higher thanthose in acetone and [Bmim][BF4]. In particular, the lipase in anhydrous [Ch]
[Cl]:glycerol (1:2) retained 90% of initial activity after 95 h incubation at 40℃. Whenthe solvatochromic parameters of DESs were correlated with the stability of lipase, it
was found that stability of lipase was associated with the hydrogen bond acidity of
DESs. This study showed the potential possibility of DESs as reaction media forbiocatalysis.

Elucidation of sequence of internal cleavage sites in mRNA

Enhanced activity and stability of lipase in deep eutectic solvents

Key words
cleavage sites, comprehensive analysis, mRNA degradation,
Arabidopsis thaliana

Key words○Daishin Ueno, Shotaro Yamasaki, Taku Demura, Ko Kato
(Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)○Yujin Oh, Sung Hee Kim, Sang Hyun Lee(Dept. Bioeng., Konkuk Univ., South Korea)

deep eutectic solvents, solvatochromic parameters, lipase, stability

91

1Fp02

Optimization on biodiesel synthesis from palm oil milleffluent (POME) by integrated strategy with lipasecatalyzed ethanolysis

1Fp04

Selection of oleaginous yeast capable of high lipid
accumulating during challenges from inhibitory chemicalcomplexes○Nova Rachmadona1, Jerome Amoah1, Shinji Hama2,
Ayumi Yoshida2, Akihiko Kondo3, Chiaki Ogino1(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Bio-energy Corp., Japan, 3Grad. Sch.
Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp○Ario Betha Juanssilfero1,2, Prihardi Kahar1, Rezky Lastinov Amza1,
Yopi Yopi2, Chiaki Ogino1, Bambang Prasetya3, Akihiko Kondo4(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2LIPI, Indonesia, 3BSN, Indonesia,
4Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.)
ochaiki@port.kobe-u.ac.jp

Biodiesel has provided an environmental friendly solution to fuel crisis, as it istypically derived from renewable lipid sources such as vegetable oil through enzymatictransesterification. However, food versus fuel is a dilemma on the risk of transferring
agricultural land or crops for biodiesel production to the detriment of food supply.
Palm oil mill effluent (POME), the waste from palm oil industry, presents as analternative source for biodiesel without interfering food supply. POME contains a highamount of organic matter, oil and grease, total solids and suspended solids. This study
attempted to produce biodiesel from POME with an integrated lipase catalyzed
ethanolysis. Thermomyces lanuginosus lipase is observed as a robust lipase catalyst
that exhibited over 90% conversion by using aqueous ethanol (15 - 99.5% w/w). In thisoptimization study, the effects of enzyme concentration, water content and temperature
condition were considered in the transesterification reaction. The optimal conditions
were 45% ethanol concentration, 0.3% lipase, 4:1 ethanol to oil molar ratio, 4.7%
excess water, 40oC reaction temperature, and under 24 hours. The maximum Fatty
Acid Ethyl Ester (FAEE) yield reached 98.39%±0.93% under this best condition.
Therefore, POME is a promising substrate that can be used for biodiesel synthesis
without distracting food supply chain.

A two-stage selection process was applied to eight oleaginous yeast strains from the
Lipomyces genera. In the primary selection stage, a nitrogen-limited mineral medium(NMM) that contained a mixture of glucose and xylose as a carbon source was used toevaluate the lipid-accumulating abilities of the yeast strains. The strains L.
doorenjongii, L. orientalis, and L. starkeyi were selected as the potential strains in the
primary selection. These three strains exhibited a remarkable ability to simultaneously
assimilate glucose and xylose and achieved a cell biomass of more than 30 g/L. The
values for lipid content in the selected strains were 57.89±1.92, 56.38±1.93, and77.14±1.55% for L. doorenjongii, L. orientalis, and L. starkeyi, respectively. In thesecondary selection, when the NMM medium contained an inhibitory chemicalcompound (ICC), the selected strains showed a different tolerance level against each of
the typical inhibitor compounds. However, L. starkeyi accumulated the highest lipid
content and yield at 68.24±2.48% and 0.19±0.00 (w/w), respectively. L. starkeyi
accumulated high levels of intracellular lipid and tolerated the ICC. The compositionof fatty acid methyl esters (FAMEs) was unaltered by the presence of ICC and the
major FAMEs consisted of oleic, palmitic, stearic, palmitoleic and linoleic acids.

Optimization on biodiesel synthesis from palm oil mill effluent (POME) by
integrated strategy with lipase-catalyzed ethanolysis

Selection of oleaginous yeast capable of high lipid accumulating during
challenges from inhibitory chemical complexes

Key words
palm oil mill effluent, Thermomyces lanuginosus, biodiesel fuel,enzymatic transesterification

Key words
yield

Oleaginous yeast, Lipomyces, Inhibitory Chemical Complexes, Lipid

1Fp03

1Fp05

海洋珪藻 Fistulifera solaris の代謝改変による高付加価
値脂肪酸の効率的生産○Nova Rachmadona1, Jerome Amoah1, Shinji Hama2, Ayumi Yoshida2,
Akihiko Kondo3, Chiaki Ogino1(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Bio-energy Corp., Japan, 3Grad. Sch. Sci. Technol.
Innov., Kobe Univ.)

The enhancement of culture conditions for high cell andlipid production of oleaginous yeast Lipomyces starkeyii
D35○Ario Betha Juanssilfero1,2, Prihardi Kahar1, Rezky Lastinov Amza1, Yopi Yopi2,
Chiaki Ogino1, Bambang Prasetya3, Akihiko Kondo4(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2LIPI, Indonesia, 3BSN, Indonesia, 4Org. Adv. Sci.
Technol. Kobe Univ.)○嶋田 礼迪 1, 松本 光史 2, 野島 大佑 1, 前田 義昌 1, 吉野 知子 1,
田中 剛 1（1農工大院・工, 2電源開発）
tsuyo@cc.tuat.ac.jp○Rezky Lastinov Amza1, Prihardi Kahar1, Ario Betha Juanssilfero1,2,
Hiromi Otsuka1, Chie Kihira1, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2LIPI, 3Org. Adv. Sci. Technol. Kobe
Univ.)
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp
Oleaginous microorganisms such as oleaginous yeasts are well known for the ability toaccumulate lipid within their cells more than 20 % in certain conditions. Lipomyces
starkeyii D35 (LsD35) is one of promising oleaginous yeasts for lipid production. The
purpose of this research is to establish the optimum condition for high cell and lipid
production of LsD35 using high cell density culture by using jar fermentor. The
strategy is to achieve high cell production prior to the high lipid production. The
evaluation of high cell and lipid production were performed both in batch and fedbatch fermentation with low initial carbon/nitrogen (C/N) ratio at 17.9 and initial
agitation speed at 150 rpm. The optimum pH was approached by conducting
fermentation at various pH condition in batch fermentation. It becomes apparent thatthe optimum pH for high cell production is at pH 5 (32.303 g/L of cells only with
39.88 g/L of dry cell weight and 19 % total lipid) respectively. Fed-batch fermentation
was carried out with two conditions: feeding with both single carbon source andammonium sulfate as nitrogen source and feeding with single carbon source (glucose
and/or xylose) only. The best condition in high cell production is the feeding withsingle carbon source only which gave 67.25 g/L and 62.51 g/L of dry cell weight for
both single glucose and xylose as carbon source respectively.

【目的】長鎖不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸は，医薬品や健康食品などの原料として需要が高い．これらの高負付加価値脂肪酸は主に魚油やアブラヤシ，ココナッ
ツなどから供給されているが，より生産性が高い供給源として微細藻類が注目されている．近年，微細藻類の遺伝子組換え技術の発展から，代謝改変による脂肪酸生産性の更なる向上が可能になりつつある．そこで本研究では，遺伝子組み換え可能なオイル高蓄積海洋珪藻 Fistulifera solaris に注目し，長鎖不飽和
脂肪酸であるエイコサペンタエン酸 （EPA），及び中鎖脂肪酸であるミリスチン酸の生産性を評価した．
【方法及び結果】EPA 合成を触媒する内在性 ω3 desaturase，及び中鎖脂肪酸をア
シルキャリアタンパク質（ACP）から遊離させる Cinnamomum camphora（クスノキ）由来 acyl-ACP thioesterase を強発現させるプラスミドをそれぞれ調製し，パーティクルガン法にて F. solaris に導入した．獲得した ω3 desaturase 高発現株における EPA 生産性は野生株と比較して，3.3 倍に向上した．一方，acyl-ACP
thioesterase 高発現株におけるミリスチン酸生産性は野生株の 2.2 倍に向上した．
これらのことから，長鎖，中鎖のいずれの脂肪酸生産においても，F. solaris の遺伝子組み換えによる代謝改変が有効であることが示された．EPA の生産については F. solaris 野生株の培養条件を検討し，これまでに報告されている微細藻類の光独立栄養培養法による EPA 生産性の約 3 倍にあたる 135.7 mg/(l・day)を達成している．今後，ω3 desaturase 高発現株の培養条件を最適化することで EPA
生産性は更に向上すると期待される．以上より，F. solaris は高付加価値脂肪酸生産において有用な生産ホストであることが示めされた．

The enhancement of culture conditions for high cell and lipid production ofoleaginous yeast Lipomyces starkeyii D35

Efficient production of valuable fatty acids by metabolic engineering of themarine diatom Fistulifera solaris

Key words
Oleaginous yeast, Lipomyces starkeyii D35, High cell density culture,
Cell and lipid production

Key words
engineering○Rezky Lastinov Amza1, Prihardi Kahar1, Ario Betha Juanssilfero1,2,
Hiromi Otsuka1, Chie Kihira1, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2LIPI, 3Org. Adv. Sci. Technol. Kobe Univ.)○Hirofumi Shimada1, Mitsufumi Matsumoto2, Daisuke Nojima1, Yoshiaki Maeda1,
Tomoko Yoshino1, Tsuyoshi Tanaka1(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2J-POWER)
diatom, long chain fatty acids, medium chain fatty acids, metabolic

92

1Fp06

Improvement of mass mixing by Max-Blend and anchor
shape impeller in the high-solid state scarification ofkraft pulp

1Fp08

合成生物学的手法によるエチレン生成シアノバクテリアの改良○神藤 定生 1, 内山 友香 2, 細田 晃文 2, 田村 廣人 2
（1名城大・理工, 2名城大院・農）sjindou@meijo-u.ac.jp○Deddy Triyono Nugroho Adi1, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ.)
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp
Mass transfer limitation during the enzymatic scarification in high solid biomass
concentration was one of the major challenges in the bio-refinery. The development of
mixing methodology to provide the optimum distribution of biomass, enzyme,
solvents, produced sugar and side products during the hydrolysis by selection the
impeller is important. In this study, two different types of impeller, Max-Blend andanchor shape were evaluated during the hydrolysis of kraft-pulp. The hydrolysis wasstudied on 3 different types of kraft pulp, the unbleached pulp (LUKP), ozonebleached pulp (LOKP) and bleached pulp (LBKP). The hydrolysis experiment was
conducted in a 2-liter fermentor, using 10-20% solid loading and 5 FPU/g-biomass
enzyme loading for 120 hours. The temperature 50℃ and pH 4.8 by citric/citratebuffer were performed during the experiment to provide the optimum environment forhydrolysis of pulp. The energy consumption, cellulose to glucose conversion wasmeasured and evaluated during the experiment to obtain the optimum strategies of
mixing and hydrolysis of pulp in high solid state situation proposed.

エチレンはプラスチックなどの石油化学製品を製造する初発物質として極めて重要な工業用原料ガスである．我々は CO2 から光合成的にエチレンを生産する
シアノバクテリアを構築し，新規なエチレン製造法の基盤技術を確立した．
具体的には，植物由来のエチレン生合成に関わる 1-アミノシクロプロパン-l-カルボン酸(ACC)合成酵素(ACS)および ACC 酸化酵素(ACO)を複合体化(SOC2)させ，これをシアノバクテリア Synechococcus elongatus PCC 7942 へ導入し SOC2株とした．結果，当該細菌はバイオエチレンを 3.4 nl/ml/O.D.730/h の効率で生産した．また，酵素複合体の形成により 3.7 倍高いバイオエチレン合成活性を得た(Jindou et al., ACS Synth. Biol., 2014)．
いっぽう，さらなるバイオエチレン生産効率の向上を目的として，酵素複合体の酵素組成の変更による以下の反応系最適化を行ってきた．具体的には，SOC2を構成する ACS および ACO の複合体内モル比が 1：2 となるよう，これに対応するキメラ骨格タンパク質 Cip3B を保持する SOC3B 株を構築した．結果，既存の SOC2 株と比較して，1.7 倍高いバイオエチレン生産量増加を示した．また，メチルチオアデノシン(MTA)による ACS の活性阻害を回避させるため MTA
ヌクレオシダーゼ(MTAN)を既存の SOC2 株へ組み込んだ SOC3D2 株を構築した．結果，既存の SOC2 株と比較して，1.9 倍高いバイオエチレン生産量増加を観察した．
以上で得られた，酵素の組成変更によるバイオエチレン生産効率の上昇理論値
より，ACS:ACO:MTAN=1:2:1 の各酵素モル比を持つ酵素複合体は SOC2 株比
3.2 倍のバイオエチレンを生産可能と考えられた．そこで，これを検討する事を目的として，本研究では新規の SOC4 株を構築し，これを保持するシアノバク
テリアのバイオエチレン生産効率を GC で定量したので，この詳細を報告する．

Improvement of mass mixing by Max-Blend and anchor shape impeller inthe high-solid state scarification of kraft pulp

Improved “ethylenome” composition for higher bio-ethylene production bya cyanobacterium.

○Deddy Triyono Nugroho Adi1, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)○Sadanari Jindou1, Yuka Uchiyama2, Akifumi Hosoda2, Hiroto Tamura2(1Faculty of Sci. and Technol., Meijo Univ., 2Grad. Sch. Agric., Meijo Univ.)

Key words

Max-Blend, anchor shape, kraft pulp, high solid state scarification

Key words

cellulosome, ethylene, cyanobacteria, dockerin

1Fp07

遺伝子組換えシアノバクテリアを用いた 1,3-プロパンジ
オールの高効率連続生産

1Fp09

気相培養による気生微細藻類 Coelastrella sp. KGUY002 のカロテノイドのエステル化○武田 真由子 1, 端 瞭太 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 広川 安孝 2,
花井 泰三 2, 村上 明男 3
（1京工繊大院・工芸科学, 2九大院・農, 3神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp○恩田 岳英, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt13347@ns.kogakuin.ac.jp【背景・目的】現在地球温暖化や資源の枯渇が危惧されている．そこで炭酸ガスから物質生産を行う第三世代型バイオリファイナリー研究が進められている．
これまで光合成細菌シアノバクテリア（藍藻）に遺伝子組換え技術を用いて
1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)合成代謝経路を導入し，光合成により炭酸ガスから直接 1,3-PDO を生産する研究を進めてきた．1) 本研究では 1,3-PDO の生産性を更に向上させるため，種々の培養条件を最適化し，エアリフト型バイオリ
アクターを用いた 1,3-PDO の連続生産について検討を行った．
【方法】菌株には Synechococcus elongatus PCC7942 に 1,3-PDO 合成代謝経路を導入した TA2984 株を使用した．培地には抗生物質と誘導物質を添加した BG-11培地を用い，その成分を種々に変化させた．2.0 L 容量のエアリフト型バイオリ
アクターを用いた連続培養では光源に蛍光灯を用い，炭酸ガスを供給し pH を制御する pH-stat システムを導入した．
【結果・考察】1,3-PDO 生産に適した培地組成を検討した結果，K2HPO4 濃度を増加させると 1,3-PDO 生産が促進された．次に光強度の影響を検討を行ったと
ころ，220 ±10 μE/m2s が最適となった．さらに pH-stat システムを用いて 1,3-PDO
生産に最適な pH 条件の検討を行ったところ，pH=8.0 において最も良好な 1,3PDO 生産が得られることが明らかとなった．これらの結果に基づきエアリフト型バイオリアクターを用いて連続培養を行ったところ，約 60 日間の安定した運転と 1,3-PDO 生産を行うことができ，最大 1,3-PDO 濃度 2.45 mM，1,3-PDO 生
産性 0.227 mM/day が得られ，生産性は回分培養の約 2.3 倍に向上させることができた．
1)端瞭太ら, 第 69 回日本生物工学会大会, 3P-N187, 2018

【目的】カロテノイドの中でもキサントフィル類は，その水酸基にアシル基が結合してエステル化することで，より高い抗酸化活性と生理活性を発現することが知られている．様々なエステル型カロテノイドを生合成できる気生微細藻類
Coelastrella sp. KGU-Y002 は，K+添加培養によるアブシシン酸合成の応答が高等植物に類似していた．おそらく，KGU-Y002 株は気相条件下において，CO2を固定し，カロテノイドのエステル化反応を効率的に進行できると考えられた．
本報告では，気相培養による KGU-Y002 株のカロテノイドエステル化反応について検討する．
【方法】BB 培地において前培養した KGU-Y002 株の藻体をフィルター上に集め，細胞フィルムを作製した．シャーレの中に滅菌水 12.5 mL を含ませた脱脂
綿を敷き，その上に細胞フィルムを乗せた．暗所下または明所下（40，100，または 200 μmol photons m-2 s-1），温度 25℃の条件で 7 日間気相培養を行った．培養後の藻体を回収し，そのカロテノイド，クロロフィル，または脂肪酸の含有量を HPLC，分光光度計，または GC を用いて測定した．
【結果・考察】明所下の気相培養により KGU-Y002 は，バイオマス量を 3 倍程増加させたが，暗所下では変化しなかった．また，培養初日と比べ光強度が強くなるに従いクロロフィル含有量は半分以下になり，強光下での気相培養では光合成活性が減少した．総カロテノイド含有量は 5~6 倍程度増加し，その中でエステル体は光強度 40 μmol photons m-2 s-1 で最大となった．各光条件において脂肪酸含有量とエステル体の蓄積とが相関していたため，脂肪酸の生合成がカ
ロテノイドのエステル化に影響していたと考えられる．今後は，カロテノイドのエステル化反応を促進させるために，気相条件における K+添加培養を検討する．

Effective 1,3-PDO production by genetically engineered cyanobacteria

Carotenoid esterification in the aerial microalga Coelastrella sp. KGU-Y002
under aerial culture condition○Mayuko Takeda1, Ryota Hashi1, Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1,
Yasutaka Hirokawa2, Taizo Hanai2, Akio Murakami3(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Fac. Agric., Kyushu Univ., 3Grad.
Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

cyanobacteria, 1, 3-PDO, airlift bioreactor○Takahide Onda, Nobuhiro Aburai, Yasusato Sugahara, Yasutada Imamura,
Katuya Abe(Dept.Chem.Life Sci.,Sch.Adv.Eng.,Kogakuin Univ)

Key words

aerial microalgae, aerial culture condition, esterification, carotenoids

93

1Fp10

植物 P450 発現大腸菌を用いたモノテルペノイド変換条
件最適化

1Fp12

遺伝子組換え乳酸菌によるコーンコブを原料とした高収
率 D-乳酸生産○内藤 秋花 1, 堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1, 岡野 憲司 2, 近藤 昭彦 3,
田中 勉 3（1京工繊大院・工芸科学, 2阪大院・工, 3神戸大院・工）horiuchi@kit.ac.jp○小島 基, 小森 彩, 鈴木 宗典, 中村 克哉（神戸天然物化学(株)）m_kojima@kncweb.co.jp

シトクローム P450(P450)は多くの生物に存在する酸化酵素の一群である．P450
はテルペノイドをはじめとする揮発性物質を基質とするものも多く知られており，テルペノイドの化学構造に多様性を付与する重要な役割を担っていると言える．弊社では P450 発現大腸菌を用いた微生物変換系を有しているが，揮発性物質の変換は物性などの諸問題から評価や大スケールへの展開が難しかった．
そこで，モノテルペノイドを揮発性物質のモデル化合物とし，植物 P450 発現大腸菌を用いたモノテルペノイド変換法の確立ならびに変換効率に影響を及ぼす諸条件について検討を行ったので報告する．
最初に，モノテルペノイドの揮発性を考慮し正確な収率を求めるため，各種反応系によるモノテルペノイド回収率の検討をおこなった．密封系を用いた評価法を確立した後，微生物変換によるモノテルペノイド変換の最適化について検討を行った．一般に植物由来 P450 は膜結合タンパク質であることから，大腸菌での効率的な機能発現を可能とするために N 末端側の膜結合領域の改変検討を行った．その結果，膜結合領域の段階的な削除ならびに可溶性配列の付与により，改変前と比べて反応生成物量は約 1.7 倍に増加した．さらに，反応条件
や P450 発現誘導条件等の最適化を検討した．温度や pH 等の反応基礎条件に加えて，基質添加方法等を最適化することにより，初期条件に比べて約 90 倍の反
応生成物量向上を達成した．特に，P450 酸化反応に必須である酸素分子の供給を改良することにより，反応生成物量向上が認められたことから，密封系評価法において酸素分子供給の重要性が示唆された．これら結果は大スケール展開
時の基礎知見ならびに揮発性物質酸化 P450 のスクリーニング等への応用が期待される．
本研究は，NEDO 委託事業『植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発』の一部として実施した．

【背景と目的】 当研究室ではこれまでバイオマス中のセルロース成分を主原料とした L/D-乳酸の生産を検討してきたが，バイオマス中のヘミセルロース成分も活用できればバイオマスに対する乳酸収率を大幅に向上できる．本研究ではキシロース資化能を付与した D-乳酸生産菌(1)を活用し，コーンコブ（とうもろこしの穂軸）を処理して得られるグルコース・キシロースをともに利用する高収率 D-乳酸生産プロセスの開発を目指した．
【 方 法 】 Lactobacillus plantarum NCIMB 8826 Δldhl1::PxylAB-xpk1::tktΔxpk2::PxylAB を用いた．コーンコブを 1.5 ％希硫酸中で処理し，ヘミセルロー
ス成分をキシロースに酸加水分解し，その後メイセラーゼを添加しセルロース
成分をグルコースに糖化した．この処理により 100g/L のコーンコブからグル
コース約 25g/L，キシロース約 22g/L を含有する加水分解液が得られる．この加水分解液に MRS 培地成分を添加し回分培養を行った．また，効率化のため酸加水分解処理のみを行ったコーンコブを原料とした同時糖化発酵による D-乳酸生産も検討した．
【結果と考察】本菌を用いてコーンコブ加水分解液を原料とした回分培養を行ったところ 43.5g/L の D-乳酸(光学純度 96％)が得られ，本菌を用いてコーンコブ
中のキシロース及びグルコースを利用した D-乳酸生産が可能なことが明らかとなった．次にプロセスの効率化のため同時糖化発酵を検討したところ，46.8g/Lの D-乳酸が得られ，生産性が大幅に向上した．更にコーンコブ濃度を増加させ，D-乳酸の高濃度化を目指したが生産物阻害が観察されたことから，炭酸カルシウムを用いた pH 調整をおこなったところ，生産物阻害が緩和され，250g/L のコーンコブから 99.2g/L の D-乳酸生産を達成した．
1)Kenji Okano et al. , Applied and Environmental Microbiology (2009) 7858-7861

Optimization of monoterpenoid oxidation with E. coli expressed plantderived P450

Efficient D-lactic acid production from corn cobs by genetically engineered
lactic acid bacteria.

○Motoki Kojima, Aya Komori, Munenori Suzuki, Katsuya Nakamura(KNC Laboratories Co., Ltd.)○Shuka Naito1, Jun-ichi Horiuchi1, Youichi Kumada1, Kenji Okano2,
Akihiko Kondo3, Tsutomu Tanaka3(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.,
3
Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

cytochrome P450, monoterpenoid, bioconversion

Key words

biomass, D-lactic acid, Lactobacillus plantarum, corn cob

1Fp11

組換えコリネ型細菌を用いた 3-アミノ-4-ヒドロキシ安
息香酸の発酵生産における酸素制限による促進作用

1Fp13

Single cell protein (SCP) production using waste milk as
a substrate by flower yeasts○川口 秀夫 1,2, 宮崎 翔子 2,3, 荻野 千秋 2,3, 大西 康夫 2,4,
近藤 昭彦 1,3
（1神戸大院・科技イノベ, 2JST・CREST, 3神戸大院・工, 4東大院・農生科）
kawaguchi_h@port.kobe-u.ac.jp○Khin Thandar Myint, Mitsuo Otsuka, Toshiaki Nakajima - Kambe(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Tsukuba Univ.)
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp【背景と目的】芳香族ポリマーであるポリベンズイミダゾール（PBI）は，高い耐熱性と機械的強度を示すスーパーエンプラであるが，既存の生産体系は化石資源に依存している．そこで我々は PBI 系ポリマーを再生可能資源であるバイ
オ マ ス か ら 製 造 す る た め に ， PBI 系 ポ リ マ ー の 原 料 と な る 3-amino-4hydroxybenzoic acid (3,4-AHBA)の発酵法による生産を研究している．遺伝子組換えコリネ型細菌による 3,4-AHBA 発酵生産は酸素制限により顕著に促進することを明らかにしたので，本発表でその詳細を報告する．
【方法】放線菌 Streptomyces griseus 由来の 3,4-AHBA 合成酵素をコードする 2 遺伝子（griH, griI)を発現させた組換えコリネ型細菌 Corynebacterium glutamicumを作製した．作製した組換えコリネ型細菌は，Jar を用いて溶存酸素濃度（DO）
を制御条件下で培養し，グルコースからの 3,4-AHBA 発酵生産を比較した．
【結果と考察】3,4-AHBA 生産は，DO >2.66 ppm では一定レベルであったが（約0.4 g/L），酸素制限（DO <1.5 ppm）によりその終濃度は 1.3 g/L まで増加した．
DO >2.66 ppm では主要な副生物であるアミノ酸の種類と濃度が同程度であったのに対し，酸素制限下ではアミノ酸の総生産量が低下し，また生成するアミノ酸の種類が顕著に変化した．以上の結果より，酸素制限はコリネ型細菌によるアミノ酸生成を抑制し，炭素と窒素の余剰が生じることで 3,4-AHBA 生産を促進している可能性が示唆された．
【謝辞】本研究は，CREST「二酸化炭素資源化を目指した植物の物質生産力強化と生産物活用のための基盤技術の創出」および，文部科学省「先端融合領域
イノベーション創出拠点形成」プログラム（iBioK）の支援を受けて実施した．

The amount of dairy milk production fluctuates depending on weather. When
production exceeds demand, milk become industrial waste resulting in water pollution.
Thus, an environmentally friendly method of effective use of excessively produced
milk is necessary. One of the effective methods is liquid feed. Because of its highmoisture content and susceptible to corruption, there is a portability problem. In thisstudy, we aimed to reduce waste and disposal cost by producing single cell protein(SCP) using milk as substrate by flower yeast. The final aim is to commercialize yeast
in anticipation of industrial use with milk, recovering cells and commercializing SCP
as feed additive. Yeast was newly isolated from flowers and growth in milk was
examined. Strain showing excellent growth from Camellia was obtained. To verify
usefulness, 18S rRNA base sequence was determined and taxon group attribution was
estimated. It was identified as Kluyveromyces lactis and is a Generally Recognized As
Safe (GRAS) yeast with lactose assimilation ability. Kluyveromyces marxianus andRhodotorula glutinis were isolated from Nemophila and Kinmokusei and identified by
26S rRNA D1 / D2 base sequence . Kluyveromyces marxianus is thermo-tolerant SCP
producing yeast. Rhodotorula glutinis is red fat accumulating single cell oil producing
yeast. Currently, we narrow down SCP production stocks and investigate the
combination of flower yeasts with high productivity and wastewater treatment
capacity.Nutritional analysis of cells is also carried out.

Enhanced production of 3-amino-4-hydroxybenzoic acid from glucose by ametabolically engineered Corynebacterium glutamicum under oxygen
limitations

Single cell protein (SCP) production using waste milk as a substrate byflower yeasts○Hideo Kawaguchi1,2, Shoko Miyazaki2,3, Chiaki Ogino2,3, Yasuo Ohnishi2,4,
Akihiko Kondo1,3(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2CREST, JST, 3Grad. Sch. Eng, Kobe
Univ., 4Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo)
Key words
Corynebacterium glutamicum, metabolic engineering, oxygen
limitation, 3-amino-4-hydroxybenzoic acid

○Khin Thandar Myint, Mitsuo Otsuka, Toshiaki Nakajima - Kambe(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Tsukuba Univ.)

Key words

single cell protein, flower yeast, milk, waste water treatment

94

1Fp14

赤色酵母を用いた未利用バイオマスからのアスタキサン
チン・キシリトール生産

1Fp16

低温菌を活用したシンプル酵素触媒によるジカルボン酸の効率的生産○中野 翔, 羅 宮臨風, 田島 誉久, 加藤 純一（広島大院・先端物質）
ttajima@hiroshima-u.ac.jp○井上 順允, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp【背景と目的】リグノセルロース系バイオマスの生物的利用においてはバイオマ
スから得られるグルコース及びキシロースをともに活用することが重要である．
赤色酵母 Xanthophyllomyces dendrorhous はグルコース及びキシロースをともに資化することができ，細胞内にアスタキサンチンを，細胞外にキシリトールを分泌する能力を持つ．本研究ではこの X. dendrorhous を用い，未利用バイオマ
スであるコーンコブを原料としたアスタキサンチン及びキシリトール生産を試みた．
【方法】菌株は Xanthophyllomyces dendrorhous (JCM 9680・9681・9682・9683・
9684・19184)を用いた．培地はグルコース及びキシロースを 25 g/L を含有する合成培地及びコーンコブ加水分解液を用いた．コーンコブ加水分解液は，コー
ンコブを酸加水分解及び酵素糖化後，活性炭処理(白鷺 M)を行い，培地とした．
有効容量 5 L のジャーファーメンターを用い，pH 5.0，通気量 1 vvm，温度 22 ℃とし，撹拌速度を 500～700 rpm に制御し，回分培養を行った．
【結果・考察】合成培地を用いて各菌株の培養特性を比較したところ，いずれの菌株でもグルコース及びキシロースが速やかに資化され，その中でも JCM 9680
及び 9683 はアスタキサンチンを 2.91，3.96 mg/L 生産するとともに，キシリトー
ルを 10.15，16.34 g/L 生産した．そこでコーンコブ加水分解液を用いて JCM 9680を培養したところ，菌体増殖が促進され，3.1 mg/L のアスタキサンチンを生産したが，キシリトールはほとんど蓄積されなかった．このキシリトール生産の減少は，コーンコブ加水分解液に含まれる高濃度のミネラル成分の影響によるものと考えられた．また本発表ではコーンコブ加水分解液を用いた JCM 9683・
9684 の培養についても報告する．
本研究は科研費基盤研究(C)(No.16K0687) 及び 財)発酵研究所の支援を得た．

【目的】低温菌シンプル酵素触媒は，中温性酵素を発現させた低温菌を熱処理することで，宿主の代謝酵素失活による副産物生成抑制と基質の膜透過性向上により効率的な変換が可能である．ジカルボン酸の一種であり，合成繊維等の原料として利用されるイタコン酸は，現在真菌の発酵により生産されるが，生産コストが高い．そこで，シンプル酵素触媒を用いることにより，低コストで効率的な生産が期待される．本研究では，低温菌 Shewanella frigidimarina を用いた効率的な生産プロセスの構築を目的とした．
【方法・結果】Aspergillus 属由来のアコニターゼと cis-アコニット酸デカルボキ
シラーゼ(CAD)の低温菌発現株を用いることにより，高収率でイタコン酸が生産された．しかし，菌体を回収して再度反応を行ったところ，酵素が反応液中に漏出するため繰り返し反応は困難であった．そこで，シンプル酵素触媒の包括的固定化を行った．一般的な固定化担体であるアルギン酸ナトリウムは，基質であるクエン酸が 2 価陽イオンをキレートするためそもそも固定化できない．
そのため，κ-カラギーナン，ポリビニルアルコール，ケイ酸エチル(TEOS)による固定化法を試みた．その結果，TEOS による固定化触媒が最も酵素活性が高いことが明らかとなった．次に，TEOS 固定化触媒を用いた繰り返し反応を行ったところ，2 回目の反応によるイタコン酸生産量は，1 回目の反応の 1/3 程度に低下した．その原因として，TEOS 固定化することでアコニターゼの漏出は防ぐことができたものの，分子量の小さい CAD が漏出したことが考えられた．
よって，現在は CAD が漏れない新たな固定化担体の検討と，アコニターゼと
CAD を連結させたフュージョンタンパク質の構築による高分子化を行っている．

Production of astaxanthin and xylitol from renewable resources by
Xanthophyllomyces dendrorhous

Efficient production of Dicarboxylic acid by psychrophile-based simple
biocatalyst○Kazumasa Inoue, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)○Sho Nakano, Gonglinfeng Lou, Takahisa Tajima, Junichi Kato
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

Xanthophyllomyces dendrorhous, astaxanthin, xylitol

Key words

enzyme production, immobilization, fusion protein, psychrotroph

1Fp15

白色腐朽菌 Trametes versicolor K-41 株による好気的水素産生経路の解析

1Fp17

子嚢菌 Talaromyces trachyspermus による多価カルボン酸含有バイオサーファクタントの効率的生産○髙橋 沙綾 1, 曽我 亜由美 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1静大院・総合農, 2静大農・応生科, 3静大・グリーン研, 4静大院・創造）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp○林 真人, 高野 真希, 星野 一宏（富山大院・理工・生命工）khoshino@sus.u-toyama.ac.jp【背景・目的】近年，従来利用されてきた化石燃料の代替となるエネルギーとして，水素が注目されている．現在の製造法には二酸化炭素の排出といった問題点があり，低炭素循環型社会の実現のため，カーボンニュートラルなバイオマスからの水素産生技術の構築が必須である．これまでに当研究室では自然界より木質バイオマスから好気的に水素を産生可能な白色腐朽菌 Trametes versicolor K-41 株の選抜に成功している．本研究では本菌の好気的水素産生経路について解析を行った．
【方法・結果】
T. versicolor K-41 株が有するヒドロゲナーゼ遺伝子（TvK41hyd）を組換えた大腸菌を作出し，微好気条件下での水素産生量を測定した結果，大幅な水素産生量の増加が確認され，TvK41hyd の水素産生への関与が示された．また，還元型
メチルビオロゲンを電子供与体として，酸素濃度 0%あるいは 10%条件下でTvK41HYD 活性試験を行った結果，両条件で同等の水素産生活性が認められたことから，T. versicolor K-41 株が酸素耐性ヒドロゲナーゼを有している可能性が示唆された．
白色腐朽菌は菌体外にシュウ酸を産生することが知られており，シュウ酸代謝にはシュウ酸デカルボキシラーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼが関与することが知られている．また一般的な生物学的水素産生経路においてギ酸デヒドロゲナー
ゼの関与も報告されている．そこで，本菌の有するギ酸デヒドロゲナーゼ（TvK41fdh）を大腸菌に導入し，水素産生能を調査した結果，TvK41fdh の導入により大幅な水素産生が認められた．以上の結果より，TvK41fdh の水素産生への関与が考えられたため，現在，TvK41hyd 及び TvK41fdh の水素産生における関連性を詳細に調査中である．

【目的】近年，高い生分解性や低い CMC，環境負荷低減の観点からバイオサー
ファクタントが注目されている．さらに，生理活性作用などの特性も有しており，新規バイオマテリアルとしての活用が期待されている．例えば，B.subtilis
が生産する Surfactin は，皮膚への低刺激性や抗菌性，高い界面活性作用を有し，化粧品等に使用されている．さらに，P.spiculisporum が生産する Spiculisporicacid (SA)は 1 個のラクトン環と 2 個のカルボキシル基を有する特異な構造を有しており，これらカルボキシル基を介し薬剤などの有用物質を修飾できる可能性を有している．我々は，昨年，この P.spiculisporum のテレオモルフである子嚢菌 Talaromyces trachyspermus が SA を生産することを新規に見出した．そこで
本研究では，本子嚢菌の培養条件を改善することにより SA を効率的に生産させることを検討した．
【方法・結果】本研究では，P.spiculisporum のテレオモル
フである T.trachyspermus 10 株を使用した．対象として，SA の工業的生産に用いられる P.spiculisporum を用いた．炭素源として 100 g/L Glucose を使用し，培養初期 pH は 2.0 に設定した．培養は 500 mL 三角フラスコに培地 100 mL を入れ，28°C，7 日間振盪した．培養液中の Spiculisporic acid 量は，培養液中の固形 分 を Ethanol で 溶 解 さ せ ， 再 析 出 さ せ た 精 製 物 の 重 量 よ り 求 め た ．
P.spiculisporum の場合，7 日間の振盪培養により SA を 4.2 g/L 生産した．一方，T.trachyspermus の全ての菌株においても SA の生産を確認でき，特に NBRC
32238 株では，11.3 g/L も生産できることが判明した．さらに実験計画法 (DOE)による培地成分の改善により，SA の生産を 30.2 g/L まで向上させることができた．現在，Fed-batch 法による SA 生産性の向上を検討中である．

Analysis of aerobic hydrogen production pathway in white-rot fungus
Trametes versicolor K-41

Effective production of biosurfactant with multivalent carboxyl groups by
Ascomysota Talaromyces trachyspermus○Saaya Takahashi1, Ayumi Soga1, Toshio Mori2, Hirokazu Kawagishi2,3,4,
Hirofumi Hirai2,3(1Graduate School of Agriculture, Shizuoka Univ., 2Faculty of Agriculture, Shizuoka
Univ., 3Research Institute of Green Science and Technology, Shizuoka Univ.,
4
Graduate School of Science and Technology, Shizuoka Univ.)
Key words
white-rot fungi, aerobic hydrogen production, hydrogenase, formate
dehydrogenase○Makoto Hayashi, Maki Takano, Kazuhiro Hoshino(Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama)

Key words

Talaromyces trachyspermus, biosurfactant, Spiculisporic acid

95

1Fp18

Extracellular pigment production from Talaromyces
purpurogenus and their applications

1Gp02○Sharad Bhatnagar1, Takashi Ueno2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Dept. Mater.
Environ. Eng., Hakodate Natl. Coll.Tech.)aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

エチレン生成酵素の方向付け進化による耐熱化のためのコハク酸要求性 Thermus thermophilus 変異体の解析○魚住 昇平, 中山 泰宗, 長濱 一弘, 松岡 正佳（崇城大・生物生命）
matsuoka@bio.sojo-u.ac.jp

Fungal pigment production offers an interesting alternative to chemical pigment
production thrust owing to their natural and environmentally friendly production. But
intracellular production and water insolvent pigments often limit their use in somepotential applications. Ascomycota Talaromyces purpurogenus, previously known as
Penicillium purpurogenum has been touted as a potential producer of various
Monascus like pigments. In our research, we have attempted to realize this potential byutilizing submerged fermentation process for efficient production of water soluble
extracellular pigments. The quantity of produced pigment as well as pigmentcomposition was found to be dependent on concentration of carbon and nitrogensources. Best yields were obtained using sucrose and peptone. Salts such as
magnesium sulfate and dipotassium phosphate influenced the productivity positively.
Initial pigment yields were found to be around 5~8 g/L. Using statistical designs, wehave tried to optimize the media for pigment production, in terms of effect of carbon,
nitrogen sources and other co-factors. The pigment produced was found to be
thermally, chemically and photoprotective in nature. The pigment also exhibits
antibacterial activity against gram-positive bacterium and oxidation-reduction capacity.
Development of potential applications by harnessing these properties such as UVprotective agent and generation of metallic nanoparticles has been attempted.

【目的】微生物由来のエチレン生成酵素(EFE)は，植物の酵素と異なり，2－オキ
ソグルタル酸(2OG)と L-アルギニンからエチレンとコハク酸を生成する反応を
2：1 の割合で触媒する．Pseudomonas syringae 由来 EFE を他の微生物で発現させ，エチレンを様々な炭素源から生産する研究を行ってきた．しかし，EFE の
熱安定性は低く，高温でのエチレン生産は不可能である．この研究では好熱菌
Thermus thermophilus を宿主として，EFE の熱安定化を方向付け進化によって達成することを目的とした．そのために，EFE のもつコハク酸生成反応を利用し，高温でコハク酸要求性 T. thermophilus を相補できるような突然変異体を選択する．
【方法および結果】コハク酸供給経路を削除するため，2OG から脱炭酸反応で生成するコハク酸セミアルデヒドを介してコハク酸を生成するコハク酸セミア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ(ssd)遺伝子を耐熱性カナマイシン耐性遺伝子で破壊した．T. thermophilus KT8(pyrE leuBD)株の ssd 遺伝子を破壊して得られた S1 株
は，ウラシル要求性をもつため，2OG 脱水素酵素(OGDH)のサブユニットをコードする sucA 遺伝子 ORF を pyrE ORF で置換した sucA::pyrE 破壊プラスミド，
pMOSBlue2.2 を作成した．直線状にした pMOSBlue-2.2 を用いて S1 株を形質転換した結果，ウラシルを含まず 10mM コハク酸を含む最少培地上でコロニーが得られた．これらの形質転換体の PCR 分析の結果，sucA::pyrE 遺伝子と野生型
sucA 遺伝子がヘテロな状態であった．さらに 10mM コハク酸培地で植え継ぐことにより，sucA 完全破壊株を取得している．

Extracellular pigment production from Talaromyces purpurogenus andtheir applications

Analysis of succinate-requiring mutants from Thermus thermophilus todevelop thermostable ethylene-forming enzyme by directed evolution○Sharad Bhatnagar1, Takashi Ueno2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Dept. Mater. Environ. Eng.,
Hakodate Natl. Coll.Tech.)○Shiyouhei Uozumi, Yasumune Nakayama, Kazuhiro Nagahama,
Masayoshi Matsuoka(Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)

Key words

pigment, statistical design, Talaromyces purpurogenus, nanoparticles

Key words

thermophile, thermostable enzyme, ethylene

1Gp01

大腸菌発現システムを用いた医薬中間体，(R)-2-クロロ
マンデル酸の新規産生方法

1Gp03

超好熱性アーキア Pyrococcus chitonophagus における遺伝子組換え系の構築○山村 栄虎, 北 伸二
（協和ファーマケミカル）
eitora.yamamura@kyowa-kirin.co.jp

山田 将大, 中田 菜月, Aslam Mehwish, ○金井 保, 跡見 晴幸（京大院・工）atomi@sbchem.kyoto-u.ac.jp【背景と目的】(R)-2-クロロマンデル酸 ((R)-2-CM) は，血小板凝集阻害剤や抗血栓剤として高い有用性が期待されるクロピドグレルなどの合成に使用される医薬中間体の 1 つである．バイオコンバージョンで (R)-2-CM を取得することを目的とし本研究を行った．
【方法と結果】ラセミ体の 2-クロロマンデル酸メチルエステル (2-CMM) を不斉加水分解して(R)-2-CM を産生するスキームを描き，菌株スクリーニング，酵素
精製，遺伝子の単離，そして遺伝子組換え株を作製し，2-CMM から(R)-2-CMを産生した．(1) 不斉加水分解酵素の探索：1095 株の菌をスクリーニングした
結果，70% ee 以上の R 選択性を示す菌が 11 株あった．その菌のうち，Exophiala
dermatitidis NBRC 6857 (Former name: Exophiala jeanselmei until August 2009)が高活性であった． (2) E. dermatitidis NBRC 6857 からの酵素精製：菌を培養したあと超音波で菌体破壊し，酵素精製した．収率 8%，精製倍率約 80%で単一に精製できた．(3) 精製酵素のキャラクタライゼーション：分子量; 42 kDa，Subunit;
Monomer，至適 pH; pH7.5，至適温度; 45℃であった．リシルエンドペプチター
ゼで精製酵素を切断し，内部配列を決定した．(4)遺伝子の単離：精製酵素の内部配列から遺伝子配列を推定し，E. dermatitidis NBRC 6857 の cDNA から遺伝子取得した．β-ラクタマーゼの活性部位モチーフやセリンプロテアーゼの活性部位モチーフがある新規加水分解酵素(EstC)であった．(5): 遺伝子組換え菌の作
製：大腸菌発現プラスミド pQE-70 を使用し組換え大腸菌を作製した．IPTG 誘導株の場合は 21 U/ml-culture の活性で，IPTG 非誘導株は 12 U/ml-culture の活性であった．IPTG 非誘導株を使用し 10%の 2-CMM を加水分解したところ，50%
加水分解し，その光学純度は 95% ee であった．

超 好 熱 性 ア ー キ ア Pyrococcus chitonophagus （ 以 前 の 名 称 は Thermococcus
chitonophagus）はキチンを主な有機物源とした培地により生育可能であり，3つのキチナーゼ遺伝子をもつ．本研究では，キチン分解における各キチナーゼの分子機構の解明を目指して，P. chitonophagus の遺伝子組換え系の構築および各キチナーゼ遺伝子破壊株の作製を目標とした．まずは 5-fluoroorotic acid (5FOA)耐性を指標として，P. chitonophagus の pyrE 破壊株の単離を試みた．その結果，ウラシル要求性と 5-FOA 耐性を示す CHU1 株が得られ，本菌においてpyrE の大部分が欠損している一方で，pyrF には変異が無いことを確認した．次に CHU1 株をホスト株として用いて，各キチナーゼ遺伝子破壊株の作製を試みた．3 種のキチナーゼ遺伝子（chiA, chiC, chiD）に対して pyrE を含む遺伝子破壊ベクターをそれぞれ構築し，これらを用いてシングルクロスオーバー相同組換え（pop-in）と相同組換えによる pyrE の除去（pop-out）による遺伝子破壊を進めた．その結果，chiC と chiD の破壊ベクター（30μg）を添加した場合にウラシルを含まない培地での生育が確認され，遺伝子破壊ベクターのゲノム内への導入が示唆された．続いて，0.1%（w/v）5-FOA を含む液体培地で複数回継代培養することで，chiC と chiD の遺伝子破壊株が培地中で濃縮されていることを確認した．その後，固体培地を用いて，chiC 破壊株（CHDC1 株）と chiD
破壊株（CHDD1 株）をそれぞれ単離することに成功した．

A novel method for producing a pharmaceutical intermediate, (R)-2Chloromandelic acid, using Escherichia coli expression systems

Construction of a genetic system of the hyperthermophilic archaeon,○Ei-Tora Yamamura, Shinji Kita
(Kyowa Pharma Chemical Co., Ltd.)Key words

protein, gene expression, Escherichia coli

Pyrococcus chitonophagus

Masahiro Yamada, Natsuki Nakada, Mehwish Aslam, ○Tamotsu Kanai,
Haruyuki Atomi(Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ.)

Key words
chitin, gene knockout, hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus
chitonophagus

96

1Gp04

メタン酸化細菌 Methylococcus capsulatus (Bath)の効率的なカウンターセレクション法の開発

1Gp06○石川 聖人 1, 横江 奨 1, 加藤 創一郎 2, 堀 克敏 1
（1名大院・工, 2産総研・生物プロセス）
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

低温菌 Pseudoalteromonas sp. Sq02 株を宿主とした タン
パク質低温分泌生産システムの構築○河合 総一郎, Puti Wanguyun Aken, 川本 純, 小川 拓哉,
栗原 達夫（京大・化研）kurihara@mbc.kuicr.kyoto-u.ac.jp【目的】メタン酸化細菌はメタンを分解する微生物としてだけではなく，有用物
質に変換する微生物宿主としても注目されている．しかし，遺伝子操作ツールが限定されていることが大きな足枷となり，メタン酸化細菌を宿主とした代謝工学の多くが実現されていない．Methylococcus capsulatus (Bath)は sacB 遺伝子
を対立遺伝子マーカーとしたカウンターセレクションがわずかに報告されている．我々は，既報に従いカウンターセレクションを実施したが，変異株を取得できなかった．本研究では，sacB 遺伝子に替わる対立遺伝子マーカーを構築し，効率的な変異株の取得を目指した．
【方法】sacB 遺伝子を含む自殺プラスミドは pJQ200sk を使用した．sacB 遺伝子の 代 替 マ ー カ ー と し て 変 異 pheS 遺 伝 子 を 人 工 遺 伝 子 合 成 に よ り 取 得 し ，
pJQ200sk の sacB 遺伝子と置換した．標的遺伝子の上下流配列をクローニング
し，接合伝達を介して Bath 細胞に導入した．カウンターセレクションの効率は寒天培地での生育状態によって評価し，標的遺伝子の変異については PCR にて確認した．
【結果と考察】sacB 遺伝子の導入されたグラム陰性菌はスクロースを含む培地
で致死となる．しかし，グラム陰性菌であっても Bath 株では sacB 遺伝子が十分に機能せず，スクロースを含む培地でも生育することを見出した．一方，変異 pheS 遺伝子の導入された Bath 株は p-chlorophenylalanine を含む培地に対して致死性を示した．この結果に基づき，変異 pheS 遺伝子を対立遺伝子マーカーとしたカウンターセレクションを試みたところ，標的遺伝子の変異株を効率良く取得できた．本研究の成果は，メタン酸化細菌を宿主とした代謝工学に大いに貢献すると考えられる．

【目的】 低温菌を宿主としたタンパク質生産系は熱安定性の低いタンパク質などの生産に適している．一方，タンパク質の分泌生産は目的タンパク質の分離
精 製 の 簡 便 性 と い う 観 点 か ら 有 用 で あ る ． 本 研 究 で は ， ハ マ チ (Seriola
quinqueradiata) 腸管由来の低温適応グラム陰性細菌 Pseudoalteromonas sp. Sq02
を宿主としたタンパク質分泌生産システムの開発に取り組んだ．
【方法と結果】ハマチの腸管から 4 °C での生育速度と分泌タンパク質生産能に秀でた低温菌 Pseudoalteromonas sp. Sq02 を単離した．本菌は 4 °C から 18 °C で良好に生育し，培養上清に機能未知タンパク質 P320 を分泌することが見いだ
された．P320 遺伝子のプロモーターとその下流に β-ラクタマーゼまたは好冷菌
Desulfotalea psychrophila DSM12343 由来の PepF，LAP，PepQ，BglA のいずれかの遺伝子を組み込んだ広宿主域プラスミド pJRD215 を Pseudoalteromonas sp.
Sq02 に導入した．P320 プロモーターの制御下で発現した β-ラクタマーゼの比活性は，18 °C で 0.93 U/mg，4 °C で 0.62 U/mg であり，既存の低温菌 Shewanella
livingstonensis Ac10 を宿主とするタンパク質低温生産系と比較して，18 °C で1.8 倍，4 °C で 2 倍高い比活性を示した．PepF，LAP，PepQ，BglA について
は，18 °C ではそれぞれ 1.0 倍，5.2 倍，1.2 倍，3.2 倍，4 °C ではそれぞれ 5.3
倍，4.1 倍，7.1 倍，10.3 倍の生産量を示し，既存の生産系に対する優位性が認められた．分泌タンパク質である P320 の C 末端に β-ラクタマーゼを融合したタンパク質の遺伝子を組み込んだプラスミドを導入した Pseudoalteromonas sp.
Sq02 では，培養液上清に融合タンパク質が分泌されることが見いだされた．この結果は，本菌による P320 の分泌能を利用することで，低温における異種タ
ンパク質の分泌生産が可能であることを示している．

Development of an efficient counterselection for Methylococcus capsulatus(Bath), a methanotrophic bacterium

Secretory production of recombinant proteins at low temperatures by usinga psychrotrophic bacterium, Pseudoalteromonas sp. Sq02

○Masahito Ishikawa1, Sho Yokoe1, Souichiro Kato2, Katsutoshi Hori1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2BRI. AIST)○Soichiro Kawai, Aken Puti Wanguyun, Jun Kawamoto, Takuya Ogawa,
Tatsuo Kurihara(Inst. Chem. Res., Kyoto Univ.)

Key words

methanotroph, counterselection, pheS

Key words
proteincold-adapted microorganism, promoter, protein expression, secreted

1Gp05

酢酸菌を宿主とした異種タンパク質生産の試み

1Gp07

タンパク質高生産株を選別する遺伝子直列配置型蛍光レポーター法の提案○繁 宥樹 1, 東久保 遥 1, 石井 友理 1, 赤坂 直紀 2, 佐古田 久雄 2,
秀瀬 涼太 1, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1
（1関西学院大院・理工, 2マルカン酢）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp【目的】酢酸菌 Komagataeibacter europaeus は長く食酢製造に用いられ，安全な微生物として認知されている．本菌の菌体収量は高生産される酢酸により雑菌の汚染も防止されるが，細胞内の pH は他の酢酸菌ほど低くない（1）．また K.
europaeus には 3 種の内在性プラスミドが存在し，遺伝子操作系も確立されている．これらの特徴から本菌は物質生産系の宿主としての利用が期待される（2）．
そこで本研究では，K. europaeus で実際に外来遺伝子を発現させ，宿主としての有用性を検証した．また超好熱菌の耐熱性分子シャペロニンを共発現させ，その安定化効果についても調べた．
【結果と考察】外来遺伝子として大腸菌由来の β ガラクトシダーゼ（β-Gal）およ び 好 酸 性 超 好 熱 菌 Sulfolobus solfataricus の 有 機 リ ン 分 解 酵 素 SsoPox （S.
solfataricus paraoxonase）を用いた．まず β-ラクタマーゼ遺伝子プロモーター（Pbla）の直下に β-Gal 遺伝子（lacZ）を導入したプラスミドを構築し，K. europaeusに導入した．K. europaeus 中で β-Gal は発現し，酵素活性は確認されたが，細胞の増殖が定常期に入ると低下した．これは細胞内の pH が低下したことに起因すると考えられる．そこでラクトースオペロンプロモーター（PlacUV5 ）に
Thermococcus kodakarensis 由来分子シャペロニン遺伝子（cpkB）を導入したプ
ラスミドを構築し，β-Gal，CpkB 共発現株を構築した．共発現株では，β-Gal 活
性は定常期においても維持された．次に有機リン加水分解酵素である Ssopox 遺伝子を Pbla の直下に導入したプラスミドを構築し，K. europaeus に導入したとこ
ろ，活性は確認されたが微弱であった．現在，遺伝子の発現量を調節可能（高発現可能）なプロモーター，その制御領域の探索を試みている．
(1) 繁ら 2017 年度生物工学会(2) Akasaka, N., et al., J. Biosci. Bioeng., 119 (6) : 661-668 (2015)

Trial of heterogeneous gene expression in acetic acid bacteria○Yuki Shige1, Haruka Higashikubo1, Yuri Ishi1, Naoki Akasaka2, Hisao Sakoda2,
Ryota Hidese1, Wakao Fukuda1, Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Marukan Vinegar Co., Ltd.)Key words
Acetic acid bacteria, Komagataeibacter europaeus, expression system,
bio-production○鈴木 宏和 1, 大谷 千晶 1, 奥村 友太 2, 大城 隆 1（1鳥取大院・工, 2鳥取大院・持社創生）
hirokazusuzuki@tottori-u.ac.jp【目的】我々は，好熱菌（Geobacillus kaustophilus）細胞を用いた耐熱化変異酵
素遺伝子の高効率発生法を研究している．本手法の有効性は，複数のモデル実験によって証明されており，例えば枯草菌の核酸合成酵素（BSpyrFA）からは，半数変性温度が 10°C ほど向上した変異体（BSpyrFV）が得られた．耐熱化変異
酵素の選別が対象酵素の活性に基づく生育選択圧に依存するため，そのような選択圧がかけられない多くの酵素については対象にできない．そこで近年では，
耐熱化変異酵素の遺伝子を保持した好熱菌細胞を，対象酵素の活性に依存することなく，蛍光レポーター分析のみで選別する新手法の開発に取り組んでいる．
本研究では，そのための設計した蛍光レポーター直列法の有用性について検証した．
【実験と結果】本法では，対象酵素遺伝子を上流に，黄色蛍光タンパク質（Venus）の遺伝子を下流に配置し，好熱菌内で発現させる．さらに上流遺伝子の終始コドン直前に venus とはフレームがずれた開始コドンを挿入する．これにより上流遺伝子からの連続的翻訳が正確に Venus 蛍光に反映されると期待した．
BSpyrFA と BSpyrFV の遺伝子を用いて本方法を評価したところ，残念ながら上流遺伝子産物の耐熱性と産生される蛍光タンパク質量の間に相関性は見られなかった．しかし同プラスミドを大腸菌に導入し，大腸菌内で産生されるモデル
酵素量と大腸菌細胞蛍光強度を調べたところ，その間に強い相関がみられた．
（相関係数，0.82）．本結果は，蛍光レポーター直列法改が，遺伝子高発現株のスクリーニングに利用できることを示唆している．より詳細な解析が必要であるが，本手法は酵素研究分野や酵素産業分野における①酵素高生産株の選別，②酵素高生産条件の探索，および③高生産性変異体のスクリーニング，などに利用できるかもしれない．

Expression level of a target gene may be readily analyzed using afluorescence reporter gene arranged in tandem○Hirokazu Suzuki1, Chiaki Ohtani1, Yuta Okumura2, Takashi Ohshiro1(1Grad. Sch. Eng., Tottori Univ., 2Grad. Sch. Sust. Sci, Tottori Univ.)

Key words

Geobacillus, expression system, screening, thermostability

97

1Gp08

Geobacillus 属で機能する高発現プロモーターを網羅的転写解析で探索する

1Gp10○奥村 友太 1, 坂口 由希菜 2, 倉敷 凌太 2, 大城 隆 2, 鈴木 宏和 2
（1鳥取大院・持社創生・工, 2鳥取大・工）hirokazusuzuki@bio.tottori-u.ac.jp

枯草菌スポアの発芽レセプターコンポーネントの機能
解析○坂元 仁 1, 古田 雅一 1,2,3, 土戸 哲明 1（1大阪府大・微制研, 2大阪府大・放研セ, 3大阪府大院・工・量子）
sakamoto.jj@gmail.com【目的】我々は，Geobacillus 属好熱菌を宿主とした遺伝子発現ツールの開発を進めており，これまでに推定マルトース代謝遺伝子群のプロモーター（Pgk704）
が本好熱菌内における遺伝子発現に有用であることを見出した．Pgk704 はマルトースで誘導できるが，利用できる培地に制限があり，また基底発現レベルが高い．さらに Pgk704 は大腸菌内でも高度に機能するため，その下流にクローニ
ングできない遺伝子も多く見いだされる．そこで本研究では，Geobacillus 属好熱菌で高発現する新規かつ汎用的なプロモーターを，網羅的転写解析を利用しながら探索した．
【方法】G. kaustophilus HTA426 株を LB 培地中 60℃で液体培養し，増殖期中期の細胞を回収した．その細胞から total RNA を抽出し，次世代シークエンサーを用いた網羅的転写解析に供した．転写量が高い遺伝子 5 個の推定プロモーター
領域を PCR で増幅し，蛍光タンパク質遺伝子（venus）上流にクローニングした．本カセットを常法に従い HTA426 株の染色体上に挿入した．得られた変異株を用いたレポーターアッセイにより各プロモーターの発現特性を検討した．
【結果と考察】詳細に解析した 5 つのプロモーターのうち，2 つの有用プロモー
ターが見出された．1 つ目は GK1356 プロモーター（Pgk1356）で，これは培地や培養時間に依存することなく発現した．その発現レベルは，Pgk704 よりもはるかに強く，Pgk1356 は培養条件に影響しにくいプロモーターとして有用と考えられる．ただし，Pgk1356 は大腸菌でも機能しやすかったため，毒性遺伝子の発現には不向きかもしれない．もう 1 つは GK2215 プロモーターで，LB 培地特異的に高発現した．その発現レベルは，定常期において上昇し，大腸菌における機能性が相対的に低いという長所もあった．現在，これらプロモーターを配置した
新たな発現用プラスミドの構築と評価を行っている．

〔背景〕細菌スポアは加熱・薬剤に非常に耐性が高く，食品や環境分野での殺菌で問題となっている．この発芽システムを解明できれば，その制圧に応用できる可能性がある．枯草菌スポアでは L-アラニンによる発芽に関与する GerA 系と，L-アスパラギン・グルコース・フルクトース・KCl による発芽に関与する
GerB GerK 系が報告され，発芽の最終段階ではスポアの細胞壁コルテックスを
2 種類の主要コルテックス分解酵素 CwlJ と SleB が分解する．この発芽レセプ
ターからコルテックス分解酵素の活性化の経路として，スポアコアの保護物質とされるジピコリン酸（DPA）のコア外への漏洩による CwlJ の活性化モデルがSetlow らにより提唱されているが，詳細は不明である．我々は発芽初期の未解
明のブラックボックス”どこから水が入るのか，どこから DPA が放出されるのか”についての解明を試みた．
〔方法と結果〕我々はコルテックス分解酵素ホモログ cwlJ sleB ydhD yaaH の 4
重欠損株に対して発芽レセプター遺伝子 gerA(gerAA gerAB gerAC)，gerB(gerBA
gerBB gerBC)，gerK(gerKA gerKC gerKB)の 3 オペロンの単独，二重，三重セッ
ト欠損のスポアを構築し，初期発芽の光学密度連続測定により，コルテックス
分解酵素非依存性の胞子の光学密度の低下現象を見出した．さらに DPA の細胞外漏洩も検出され，この現象もコルテックス分解酵素非依存性でも起こることが明らかとなった．各発芽レセプターのコンポーネントを A/B/C としてアミノ酸配列から機能検索を試みたところ，A コンポーネントは DPA 取込みポンプ
SpoVAF と共通保存配列があり，B コンポーネントはアミノ酸トランスポーターと低い相同性が検出された．そこで発芽レセプター遺伝子のコンポーネントそのものに水浸入と DPA 排出の役割があるのではないかと考え，各コンポーネン
トの個別遺伝子破壊株を構築し，この仮説の検証を試みた．

Transcriptome-based identification of robust promoters that enable protein
overproduction in Geobacillus spp.

Characterization of compornents of germination receptors in Bacillus
subtilis spores○Yuta Okumura1, Yukina Sakaguchi2, Ryota Kurashiki2, Takashi Oshiro2,
Hirokazu Suzuki2(1Dept. Eng., Grad. Sch. Sust. Sci, Tottori Univ., 2Fac. Eng., Tottori Univ.)○Jin Sakamoto1, Masamazu Furuta1,2,3, Tetsuaki Tsuchido1(1Microorganism control CRes. Osaka Pref. Univ., 2Rad. CRes. Osaka Pref. Univ.,
3
Dept. Quantum, Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ.)

Key words

Geobacillus, RNA-Seq, promoter, venus

Key words

Bacillus subtilis, receptor, spore, germination

1Gp09

100 kb を超える枯草菌染色体 DNA セグメントの簡便迅
速な接合伝達1Gp11

プラスミドの保持に「非感受性」を示す宿主を利用した
新規宿主ベクター系開発の可能性○吉田 健一 1, 宮野 恵 1, 石川 周 1, Miguel-Arribas Andres 2,
Meijer Wilfried J. J. 2
（1神戸大院・科技イノベ, 2マドリード自治大）kenyoshi@kobe-u.ac.jp○上田 朋美, 河野 響, 水口 千穂, 岡田 憲典, 野尻 秀昭（東大・生物工学セ）
anojiri@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

納豆菌に由来する接合伝達プラスミド pLS20cat は，供与細胞と受容細胞を液体培地中で短時間混合するだけで接合伝達される高効率な伝達能力を有する．さらに，pLS20cat はヘルパープラスミドとしても機能することができ，pLS20cat
自身に加えて同一細胞内に共存する oriT 配列（oriT-LS20）を含む他の可動プラ
スミドの伝達を媒介することもできる．一方，pLS20cat は自身を含まない受容細胞にのみ DNA を接合伝達するので，pLS20cat を一旦受け取った受容細胞は再び pLS20cat の機能により DNA の接合伝達を受けることができない．そこで，
pLS20cat を 改 変 し て oriT-LS20 を 削 除 し た ． こ の 改 変 に よ り 得 ら れ た
pLS20catΔoriT は自身の接合伝達を完全に消失したが，共存する可動プラスミド
を高効率に伝達するヘルパープラスミド機能を依然として保持していた．従って，pLS20catΔoriT を保有する供与細胞から受容細胞へ，何度も繰り返して自身
以外の DNA を接合伝達することが可能となった．そこで，枯草菌の染色体にoriTLS20 を挿入し，これを起点として染色体 DNA を pLS20catΔoriT のヘルパー
プラスミド機能によって伝達することができるか否か検討した．その結果，少なくとも 113 kb に及ぶ巨大 DNA セグメントを迅速に接合伝達することができた．昨今，長大な DNA を人工的にデザイン構築する“ゲノム合成”が次世代の生物工学を切り拓く技術として注目されている．我々が開発した pLS20catΔoriTによる染色体 DNA の接合伝達は，100 kb を超える DNA セグメントを簡便迅速，且つ繰り返して受容細胞へと伝達して集積することを可能とするので，ゲノム合成を加速する新たなツールとして利用価値が見込まれる．
参考文献：Miyano et al. (2018) Microb Cell Fact. 17(1):13【背景・目的】プラスミドは宿主に新規形質を付与する一方，非選択条件下ではその保持が生育負荷となりプラスミド保持株が集団から消失する場合が多く，微生物を用いた物質生産ではプラスミド由来の負荷を回避すべく抗生物質添加などの選択圧が必須とされてきた．しかし当グループは，実環境中で難分解性
物質分解プラスミド pCAR1 を保持していた Pseudomonas resinovorans CA10dm4
株が，自然界から単離された特徴の異なる 8 種のプラスミドをそれぞれ保持させた際に非選択条件下でプラスミド保持株が集団から消失しない，いわばプラ
スミド保持に「非感受性」であることを明らかにした．この性質を物質生産に応用すべく，本研究では外来遺伝子発現用に設計された汎用人工ベクターの保持が CA10dm4 株に及ぼす負荷（細胞内でのベクター安定性／ベクター保持株の生残性）を評価した．
【方法・結果】異なるプラスミド由来の複製起点を持つ
広 宿 主 域 ベ ク タ ー pBBR1MCS-5 お よ び pSEVA251 を CA10dm4 株 お よ び P.
putida KT2440 株に保持させた．非選択条件下でベクター保持株を単独培養した際の細胞内でのベクターの安定性，また非保持株と競合培養した際の保持株の生残性をそれぞれ評価した．その結果，単独培養時にはいずれのベクターも両宿主で安定に保持された．一方で非保持株との競合培養では，培養開始時に50%程度存在した保持株の比率が KT2440 株ではいずれのベクターの場合も大きく低下したのに対し，CA10dm4 株では低下せず生残性が高いことが示された．ベクターから lac プロモーター下で GFP を発現させた際も同様の結果が得られた．今後はさらに薬剤耐性遺伝子など別の遺伝子を用いた際の評価も行う
予定である．発表ではこれらの結果から，CA10dm4 株を非選択条件下でベク
ターを安定に利用できる宿主として用いた新規宿主ベクター系開発の可能性について議論する．

Rapid conjugative mobilization of a 100 kb segment of Bacillus subtilis
chromosomal DNA is mediated by a helper plasmid with no ability for selftransfer

The possibility of constructing a novel host-vector system with bacteria
showing “insensitivity” to plasmids○Ken-ichi Yoshida1, Megumi Miyano1, Shu Ishikawa1, Andres Miguel-Arribas2,
Wilfried J. J. Meijer2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Universidad Autonoma, Madrid)

Key words

Bacillus subtilis, bacterial conjugation, synthetic genomics○Tomomi Ueda, Hibiki Kawano, Chiho Suzuki-Minakuchi, Kazunori Okada,
Hideaki Nojiri(Biotechnol. Res. Center, Univ. Tokyo)

Key words

Pseudomonas, plasmid, vector, fitness cost

98

1Gp12

有用嫌気性菌の遺伝子導入・破壊の効率的検出システム
構築

1Gp14

○深谷 愛衣 1, 水口 千穂 1, 岡田 憲典 1, 井上 謙吾 2, 野尻 秀昭 1
（1東大・生物工学セ, 2宮崎大・農・応生科）
anojiri@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

チョウザメ由来ナイーブ抗体の応用に向けた抗体遺伝子の配列解析○近藤 秀裕 1, 安本 玖太郎 1, 小祝 敬一郎 1, 平岡 潔 2, 廣野 育生 1
（1東京海洋大学, 2フジキン）
h-kondo@kaiyodai.ac.jp【背景と目的】近年，生物に有害な物質が土壌や地下水から高頻度で検出され問題となっている．環境中の有害物質を除去する方法として，微生物の汚染物質分解能力を活用したバイオレメディエ－ション技術が注目され，これに用いられる嫌気性細菌の遺伝子レベルでの機能解析が求められている．しかし多くの嫌気性細菌はコロニーの単離や培養に多大な時間と労力を要し，解析に必要な遺伝子導入・破壊系といった遺伝子工学ツール開発が進んでいない場合が多い．
遺伝子導入・破壊系の開発には，遺伝子改変が起こった細胞を他の細胞と見分けるシステムが必要であるため，本研究では，有用嫌気性細菌を対象に一細胞レベルで改変を検出することで，培養を行わずに改変の起こった細胞を検出できるシステムの構築を目的とした．
【方法と結果】遺伝子導入・破壊系開発の報告がある偏性嫌気性細菌 Geobacter
sulfurreducens PCA と通性嫌気性細菌の大腸菌 DH5α をモデルとし，嫌気条件でも発光する蛍光タンパク質 evoglow と，一細胞レベルで細胞を分画できるフロー
サイトメーター (FCM) を用い，蛍光の有無により遺伝子改変を検出できるシステムの構築を試みた．まず，大腸菌に evoglow 遺伝子を持つプラスミドを導入
し，これを好気条件下 LB 培地で培養した．緩衝液で洗浄した細胞を好気条件
下の FCM で蛍光を確認したところ，evoglow は蛍光の有無により細胞を分画できる程度は発現することが明らかになった．これを受けて，G. sulfurreducens に
evoglow 遺伝子配列を持つプラスミドをエレクトロポレーション法により導入した株 (遺伝子導入株) と相同組換えを利用して evoglow 遺伝子を染色体上に挿入した株 (遺伝子導入・破壊株) を作製し，その培養液を用いて好気または嫌気条件の FCM で evoglow 発現量の評価を試みているので，この結果についても報告する．

抗体遺伝子は進化の過程で有顎類魚類が出現した際生じたと考えられ，軟骨魚類よりも後に出現した脊椎動物では生体防御において重要な役割をもつ．当研究室では，軟質亜綱のベステルチョウザメ Huso huso×Acipenser ruthenus の血清中に含まれる抗体の性状を解析し，本種が免疫していない個体であっても様々な抗原に特異的に結合する抗体を有していることを示した．さらに，このような抗体の特徴は成長に伴い獲得したものであることも明らかとした．本種の抗体は免疫を必要とせず様々な抗原と特異的に結合可能であることから，その抗体遺伝子を様々な抗原に対する特異的な人工抗体の鋳型として利用できないかと考えた．そこで本研究は，ベステルチョウザメの抗体（Ig）重鎖および軽鎖遺伝子の配列を決定し，各組織における抗体遺伝子の抗原結合領域における多用度を次世代シークエンサーを用いて解析することを目的とした．まず，本種の抗体重鎖および軽鎖遺伝子の配列を予備的に行ったトランスクリプトームデー
タより検索し，1 つの Ig 重鎖遺伝子および 3 つの Ig 軽鎖遺伝子を同定した．Ig
重鎖遺伝子および 1 つの Ig 軽鎖遺伝子は既報のチョウザメ類の Ig 各遺伝子の配列と高いアミノ酸同一率を示したものの，2 種類の Ig 軽鎖遺伝子は新規のものであった．現在，各 Ig 遺伝子の発現組織，および多様性決定領域の配列多様性について解析を行っている．

Development of effective detection system for recombination of usefulanaerobic bacteria

Characterization of immunoglobulin genes in the sturgen for application of
the naive antibody○Ai Fukaya1, Chiho Suzuki-Minakuchi1, Kazunori Okada1, Kengo Inoue2,
Hideaki Nojiri1(1Biotechnol. Res. Center, Univ. Tokyo, 2Dept. Appl. Biol., Fac. Agric., Univ.
Miyazaki)○Hidehiro Kondo1, Kyutaro Yasumoto1, Keiichiro Koiwai1, Kiyoshi Hiraoka2,
Ikuo Hirono1(1Tokyo Univ. Mar. Sci. Technol., 2Fujikin)

Key words

anaerobes, bioremediation, flow cytometry, flavoprotein

Key words

antibody, sturgeon, natural antibody

1Gp13

Visualization of ecdysteroid activities using geneticallyencoded reporter gene in Daphnia magna

1Gp15

マウス腸内への定着に寄与するビフィズス菌遺伝子の網羅的同定に向けた INSeq 法の確立

○Nikko Adhitama, Yasuhiko Kato, Tomoaki Matsuura,
Hajime Watanabe(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
watanabe@bio.eng.osaka-u.ac.jp○久保 勇貴 1, 中島 森 1, 中川路 伸吾 1, 阪中 幹祥 2, 小椋 義俊 3,
吉本 真 4, 吉田 圭佑 4, 清水 （肖）金忠 4, 小田巻 俊孝 4, 林 哲也 3,
横田 篤 1, 吹谷 智 1（1北大院・農, 2石川県大．生資環, 3九大院・医, 4森永乳業・基礎研）
s-fukiya@chem.agr.hokudai.ac.jp

A transgenic animal to visualize hormonal activity is a useful tool for understanding its
endocrine system and also for detecting endocrine disrupting chemicals in its
surroundings. In crustacean, despite their pivotal role in aquatic ecosystem, roles andmechanisms of the steroid hormone ecdysteroid remain under-studied. Daphnia magna
is one of freshwater crustaceans, which has long served as a model in ecology andecotoxicology. Recently, with its genomic sequence publicly available and genome
editing methods have been developed, D. magna become a newly emerging genetic
model organism. Here we report generation of transgenic D. magna to detect the
spatio-temporal activity of ecdysteroid. We constructed a reporter gene containing four
tandem repeats of Drosophila hsp27 ecdysteroid response element and mCherry red
fluorescent gene. CRISPR-Cas genome editing method, followed by Non-Homologous
End Joining pathway was used to integrate the DNA construct into D. magna genome.
A transgenic containing one copy of reporter gene was obtained. mCherry signal was
detected in embryos as early as 12 hours after ovulation (HAO). mCherry signal
migration was observed originated from posterior toward anterior section of embryo
which may suggest novel roles of ecdysteroid activity in embryonic posterior growth
regulatory signaling. Furthermore, when transgenic embryos were exposed toecdysteroid, there was enhanced expression of mCherry signal, suggesting this system
may also be used for environmental ecdysteroid biosensor.

【背景・目的】ビフィズス菌は整腸作用などの有用効果を示す偏性嫌気性細菌であるが，胆汁酸や他の腸内細菌との競合といった環境ストレスに打ち勝ち，腸内に定着するメカニズムについては未だ不明な点が多い．そこで，転移因子
Himar1C9 を用いた INSeq (insertion-sequencing) 法をビフィズス菌に応用し，腸内定着に寄与する遺伝子の網羅的な同定を目指した．INSeq 法では，①トラン
スポゾン変異株ライブラリーをマウスに投与し，次世代シークエンサーを用いて各遺伝子変異株の数の増減を測定することで，「腸内定着に寄与する候補遺伝子」を網羅的に同定することが出来る．さらに，②in vitro でも培養を行い，「invitro での生育に寄与する遺伝子」の同定を行う．最後に，③ ①と②の遺伝子を比較することで，「腸内定着に寄与する遺伝子」を同定することが可能である．
【方法・結果】まず，前述のトランスポゾン変異導入系を用いて Bifidobacterium
longum subsp. longum 105-A（以下 105-A 株）の約 48,000 株の変異株ライブラリーを作製した．これを投与前サンプルとしてゲノム DNA を抽出後，トラン
スポゾン挿入部位の配列を含むように INSeq サンプルを調製した．解析の結果，105-A 株の全 ORF の 76.2 %が変異していることが示唆された．次に，変異株ライブラリーを定常期まで培養したサンプルについて，同様の解析を行い，投与前サンプルの解析結果と比較することで，「in vitro での生育に寄与する遺伝子」の同定を行った．結果として，in vitro での生育に寄与する遺伝子を 49個同定することができた．これらの中には鉄輸送や酸化ストレス耐性に寄与す
る遺伝子などが含まれていた．現在，無菌マウス投与後のサンプルにおける各変異株の特定と数の計測を進めており，今回の in vitro の結果と比較することで「腸内定着に寄与する遺伝子」の同定を行う予定である．

Visualization of ecdysteroid activities using genetically encoded reporter
gene in Daphnia magna

Establishment of INSeq system aiming for comprehensive identification ofbifidobacterial genes that contribute to colonization in the gastrointestinal
tract of mice

○Nikko Adhitama, Yasuhiko Kato, Tomoaki Matsuura, Hajime Watanabe(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

ecdysteroid, Daphnia magna, genome integration, biosensor○Yuki Kubo1, Shin Nakajima1, Shingo Nakakawaji1, Mikiyasu Sakanaka2,
Yoshitoshi Ogura3, Shin Yoshimoto4, Keisuke Yoshida4, Jin-Zhong Xiao4,
Odamaki Toshitaka4, Hayashi Tetsutya3, Atsushi Yokota1, Fukiya Satoru1(1Res. Fac. Agric., Hokkaido Univ., 2Fac. Bioresour. Environ. Sci., Ishikawa Pref.
Univ., 3Grad. Sch. Med. Sci., Kyushu Univ., 4Next Gen. Sci. Inst., Morinaga Milk
Industry Co., Ltd.)Key words
bifidobacteria, insertion-sequencing, transposon mutagenesis, intestinal
colonization

99

1Gp16

環状 RNA を用いた miRNA とその前駆体の阻害○地白 和樹, 立花 亮
（阪市大院・工）tatibana@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

1Gp18

環状 RNA にコードしたペプチド生成に関与する要因○浅野 悠太（阪工大院・工）tatibana@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

microRNA (miRNA)は RISC を形成し，相補的な配列を持つ mRNA の翻訳を抑制する．miRNA の中には，oncomiR と呼ばれるがん細胞中で過剰に発現し，がんの発生や悪性化に関わっているものがある．oncomiR を阻害すると，がん細胞の増殖が抑制されることが報告されている．環状 RNA (circRNA) は直鎖状
RNA に比べて高い安定性を示し，tRNA のスプライシングの際に産生されることが知られている．今回の研究では，上記の circRNA を産生する系を用いて，細胞中で circRNA として発現する miRNA 阻害剤を作製した．この miRNA 阻害
剤は，miRNA の guide 鎖に相補的な配列をもつことにより，RISC による翻訳抑制を競合的に阻害する．また，pri-miRNA のループ部分にも相補的な配列をもつことにより，pri-miRNA と結合しその構造を壊すことで pri-miRNA から成熟二本鎖 miRNA へのプロセシングも阻害するよう設計されている．このような miRNA 阻 害 剤 を ， pri-miRNA を 標 的 と す る 「 RNA inhibitor for genetranscripts」の意味で「pRING」と名付けた．
pRING の活性を評価するため，レポータージーンアッセイを行った．miR-21 のターゲットサイトを組み込んだ DsRed2 発現ベクターと pri-miR-21 発現ベク
ター，及び pRING 発現ベクターを HEK293T 細胞にトランスフェクションし，
DsRed2 の赤色蛍光を測定することで pRING の活性を評価した．その結果，
pRING はコントロールに比べて有意に大きい DsRed2 の蛍光強度を示した．このことより，pRING は miRNA 阻害剤としての活性をもつことが分かった．また，pRING が pRINGguideON (miR-21 の guide 鎖にのみ相補的な配列をもつ
pRING) よりも高い活性を示したことより，pRING は pri-miRNA から成熟二本鎖 miRNA へのプロセシングも阻害していると考えられる．

背景2015 年，合成環状 RNA からペプチド生成が報告された．また細胞内において
環状 RNA が存在し，タンパク質に翻訳されることが報告された．本研究では，
人工的に細胞内で環状 RNA を産生させ，ペプチドの作製を検討した．環状 RNA
は pre-mRNA の back splicing により生成する場合と tRNA のイントロンが環状化し，生成する場合がある．本研究では，この 2 種類の環状 RNA に機能性ペプチドをコードし，その生成に関与する要因を検討した．
方法と結果
ペプチドの発現は splitGFP 技術を応用し，GFP11tag（16 a.a.）が GFP1-10 と結合し，再構成した GFP の緑色蛍光によった．2 種類の環状 RNA（back splicing
型，tRNA 型）に GFP11tag の配列をコードしたベクターと GFP1-10 発現ベク
ターを HEK293T 細胞にトランスフェクションした．3 日後に蛍光強度を測定した．
back splicing 型よりも tRNA 型の方がペプチドの生成効率が高かった．環状 RNAの生成効率によるものだと考えた．プロテアソーム阻害剤 MG132 添加はペプチドに基づく蛍光強度を増大させた．また，エクソソーム産生促進剤 D609 添加によってペプチド生成効率は低下した．エクソソームは環状 RNA を細胞外へ排出することが知られており，細胞質における環状 RNA 量が低下したためだと考えた．現在，環状 RNA からのペプチド生成に関与するその他の要因を検討している．

Inhibition of miRNA and its precursor by circular RNA

Peptide production corded on circRNA○Kazuki Chishiro, Akira Tachibana(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)○Yuta Asano(Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

circular RNA, microRNA, oncomiR, pRING

Key words

circRNA, peptide, exosome, splitGFP

1Gp17

複合系中の標的 mRNA 直接検出法の開発

1Hp01

Dilute maleic acid pretreatment of sugarcane bagasse andoil palm empty fruit bunch fiber for enhanced enzymatic
digestibility○堀尾 京平 1, 大川内 雅彦 1, 高橋 宏和 1, 小堀 俊郎 2, 秋 庸裕 1,
松村 幸彦 3, 中島田 豊 1, 岡村 好子 1
（1広島大院・先端物質, 2農研機構, 3広島大院・工）okamuray@hiroshima-u.ac.jp○Lucky Risanto1,2, Deddy Triyono Nugroho Adi1,2, Triyani2,
Hiroshi Teramura1, Euis Hermiati2, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo1,3(1Grad. Sch. of Eng., Kobe Univ., Japan, 2Res. Center for
Biomaterials, Indonesian Inst. Sci., Indonesia, 3Grad. Sch. Sci.,
Technol. and Innov, Kobe Univ., Japan)
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp【目的】Rolling Circle Amplification (RCA)法が生体分子の検出方法として近年注目を集めている．RCA 法は Padlock probe と phi29 DNA polymerase を用いて標的配列を増幅することで検出を行う方法であり，高い特異性を有している．しかし，これまでに開発されてきた RCA 法による RNA 検出法は 3’末端のみをターゲットとしているため，検出可能な RNA は限られており，汎用性に乏しい．そこで本研究では，RNase H により RCA 法の反応を効率的に進め，任意の配列をターゲットとすることができる汎用性の高い RNase H-assisted RCA（RHaRCA）法を開発することを目的とした．
【方法・結果】まず，GFP mRNA の内部配列を認識するよう設計した Padlock
probe，DNA/RNA ハイブリッド鎖の DNA を特異的にライゲーションする SplintR
ligase，RNase H を用いて，非ターゲットの RNA 中に混合した，in vitro 転写した GFP mRNA の検出を行ったところ，特異的増幅に成功し，検出感度は 5-10
fmol-GFP mRNA であった．次に，菌体から抽出した total RNA を用いて RCA反応を行った結果，total RNA 中の GFP mRNA からの特異的増幅に成功した．
この時の検出限界は 10 ng-total RNA であった．現在，本方法を細胞に応用し，
in situ での増幅を行うための検討を進めている．
【考察】in situ RHa-RCA により細胞内で cDNA の合成なしに mRNA からの増幅を行うことができれば，増幅した鎖を Fluorescence in situ hybridization（FISH）
で検出することで細胞のラベリングを行うことが可能になると考えられる．

Lignocellulose is resistant to degradation and requires pretreatment to improve
cellulose accessibility for hydrolytic enzymes to release fermentable sugars. Sulfuric
acid has been widely used for biomass pretreatment, but high amount of degradation
products usually occurred when using this method. In addition, sulfuric acid leads tolarge amounts of problematical gypsum when neutralized with low-priced calcium
hydroxide. The performance of several diluted organic acid pretreatments in sugarcane
bagasse and oil palm empty fruit bunch fiber to enhance cellulose accessibility wasstudied as considered a green technology and environmental friendly. Result revealed
that maleic acid gave highest xylose and glucose release among other organic acids.
The effect of concentration, duration of heating and heating temperature was further
studied. Dilute maleic acid pretreatment at 180 °C and 1% (w/w) can be a key
substitute for sulfuric acid. Moreover, furfural and 5-HMF formation in liquidhydrolysate after pretreatment does not seem to be highly promoted by maleic acid.

Development of direct-detection method for mRNA in complex mixture

Dilute maleic acid pretreatment of sugarcane bagasse and oil palm empty
fruit bunch fiber for enhanced enzymatic digestibility○Kyohei Horio1, Masahiko Ohkawachi1, Hirokazu Takahashi1, Toshiro Kobori2,
Tsunehiro Aki1, Yukihiko Matsumura3, Yutaka Nakashimada1, Yoshiko Okamura1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2NARO, 3Div. Ener. Environ. Inst.
Eng. Hiroshima Univ.)

Key words

mRNA, detection○Lucky Risanto1,2, Deddy Triyono Nugroho Adi1,2, Triyani2, Hiroshi Teramura1,
Euis Hermiati2, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo1,3(1Grad. Sch. of Eng., Kobe Univ., Japan, 2Res. Center for Biomaterials, IndonesianInst. Sci., Indonesia, 3Grad. Sch. Sci., Technol. and Innov, Kobe Univ., Japan)

Key words
bagassemaleic acid, oil palm empty fruit bunch, saccharification, sugarcane

100

1Hp02

高活性水蒸気処理と粉砕処理を併用したバイオリファイ
ナリーシステムの開発

1Hp04○鈴木 昭浩 1, 淺田 元子 2, 佐々木 千鶴 2, 中村 嘉利 2
（1徳島大院・先端技科, 2徳島大学・生物資源産業学部）
ynakamu@tokushima-u.ac.jp

最少量の低毒性イオン液体を用いたバイオマスからバイオ燃料への High-loading ワンポット変換○杉野 雄規 1, 柘植 陽太 2, 荻野 千秋 3, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術, 3神戸大院・工・応化）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】現在，石油などの化石資源の枯渇が危惧されている．そこで，食糧と競合しないリグノセルロース系バイオマスに私は注目した．今回は成長速
度が速いタケを利用し，有効利用法の開発を目指す．今回は，高活性水蒸気蒸
煮処理とミルによる粉砕処理を併用した前処理を利用する．使用するのは水蒸
気のみなので，環境低負荷な処理方法である．この処理によりリグニンやセル
ロースなどの成分は低分子量化され，利用しやすくなる．本研究では，これらを利用した総合的有効利用法の開発を目的とした実験を行う．
【実験】タケを水蒸気爆砕機にて蒸煮処理を行った．蒸煮温度（気圧）183℃（10atm）～243℃（35atm）で 5min 処理を行い，サンプルを回収した．
回収したサンプルに粉砕処理を行った．これに，水抽出，アセトン抽出，亜塩
素酸ナトリウム（漂白）処理を連続して行い，水抽出成分，アセトン抽出成分，
漂白処理残渣（ホロセルロース）を回収した．得られた水抽出成分は DPPH ラ
ジカル消去能活性試験にて抗酸化活性を測定した．アセトン抽出成分は主に低分子量化されたリグニンであり，このリグニンにエピクロロヒドリンを用いてエポキシ基を付加させ，リグニンエポキシ樹脂を合成した．硬化剤には同条件で処理し，得られたアセトン抽出成分（リグニン）を使用し，硬化させ，リグ
ニンエポキシ樹脂硬化物を作成した．漂白処理残渣から得られたホロセルロー
スにグラインダー処理を施し，セルロースナノファイバー（CNF）を作成した．
作製した CNF はシート状に成型し，引張強度試験を行った．
【結果・考察】蒸煮処理したタケから高い抗酸化能を持つ水抽出成分が得られ，アセトン抽出成分からはリグニンエポキシ樹脂硬化物を得ることができた．CNF
は蒸煮前処理条件の違いによる顕著な引張強度の変化が見られる結果が得られた．

【目的】近年，食物との競合がない木質バイオマスを酵素糖化・発酵することによる，バイオ燃料の生産が期待されている．しかし，木質バイオマスはセルロー
ス，ヘミセルロース，リグニンが複雑に結合した構造であるため，酵素糖化に用いるためには，高効率な糖化前処理が必要である．本研究では，糖化前処理に低エネルギーで高効率に糖化を可能にするイオン液体を用いた．しかし，イ
オン液体は毒性があるため，糖化前処理後に洗浄が必要であり，ワンポットにおける反応が困難であった．そこで本研究では，最小量の低毒性イオン液体を用いることで，バイオマスからバイオ燃料へのワンポット変換を目指した．
【方法および結果】従来のイミダゾリウム系イオン液体よりも酵素や微生物に対して低毒性であるコリン酢酸を用いた．前処理にはバイオマスの 1.5 倍量のイ
オン液体を最少量として用いた．バイオマスを 110℃，16 h イオン液体前処理を行い，純水と酵素を加え酵素糖化を行った．酵素糖化においては，純水量・酵素の組み合わせの条件検討を行い，最も効率の良い糖化条件を求めた．その後，糖化済バイオマスに酵母，抗生物質を加え，30℃で 48 h 発酵を行った．発酵において，サンプリングを行いグルコース，キシロース，エタノールそれぞれの濃度を測定した．酵素糖化では，純水量 10 mL の条件において糖濃度が最も大きく，この条件を今後の実験に採用した．また，酵素の組み合わせの条件検討を行った結果，Ctec2 と Htec2 の組み合わせによる酵素糖化がグルコース，
キシロースいずれにおいても糖濃度，糖化率が最も大きくなった．また，発酵では Ctec2 と Htec2 の組み合わせにおいて，エタノール収率 88.8%の発酵が行われた．以上，最少量の低毒性のイオン液体を用いた，バイオマスからバイオ燃料へのワンポット変換に成功した．

Development of biorefinery system combining high active steam treatment
and milling treatment

One-pot conversion from biomass to biofuel using minimum amount of
biocompatible ionic liquid○Akihiro Suzuki1, Chikako Asada2, Sasaki Chizuru2, Nakamura Yoshitoshi2(1Grad. Sch. Adv. Technol. Sci., Tokushima Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Bioind.,
Tokushima Univ.)○Yuki Sugino1, Yota Tsuge2, Chiaki Ogino3, Kenji Takahashi1, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ., 3Dept. Chem. Sci. Eng., Grad. Sch. Eng., Kobe Univ.)

Key words

biomass, cellulose, lignin

Key words

lignocellulosic biomass, ionic liquid, one-pot conversion

1Hp03

高活性水蒸気処理を用いたセルロースナノファイバーの製造とバイオマスコンポジットへの応用

1Hp05

最少量の低毒性イオン液体を用いた前処理に基づく木質
系バイオマスリファイナリー

○橋本 和紀 1, 淺田 元子 2, 佐々木 千鶴 2, 中村 嘉利 2
（1徳島大院・先端技科, 2徳島大学・生物資源産業学部）
ynakamu@bio.tokushima-u.ac.jp○仁宮 一章 1, Amaliyah Rohsari Indah Utami 2, 柘植 陽太 1,
荻野 千秋 3, 髙橋 憲司 2
（1金沢大・新学術, 2金沢大院・自科, 3神戸大院・工）ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】セルロースナノファイバー(CNF)は植物細胞壁の基本骨格であり，鋼鉄の 5~8 倍ほどの引張強度で，ガラスファイバー(GF：比重 2.5)やカーボ
ンファイバー(CF：比重 1.8)に比べて低比重(比重 1.5)であることが知られている．近年，軽量化のため，自動車部材の樹脂化が進められている．現在，自動車部材として使われているのは GF と樹脂の複合体である．しかしながら，GF
は作製時に化石燃料を使用することや，廃棄時に燃やした際に GF が残ってしまう問題がある．そこで，GF の代替として再生可能資源である CNF の利用が期待されている．CNF の原料は，食料と競合しないリグノセルロース系バイオマスの利用が進められている．しかしながら，リグニンにより細胞壁が強固な構造となっており，セルロースを取り出すために脱リグニン前処理が必要となっている．そこで，本研究では脱リグニン前処理として高活性水蒸気処理を利用した．高活性水蒸気処理は，水のみの利用で選択的にリグニンを加水分解し，低分子化させることが可能な前処理法である．本実験の目的は，蒸煮条件，粉砕処理時間の異なる CNF を作製し，樹脂との複合体作製に最適な製造条件を決定することである．
【実験方法・結果】タケに 10 , 15 , 20 , 25 atm それぞれ 5min の条件で高活性水
蒸気処理を行った後に，粉砕処理をそれぞれ 1min 行った．水，アセトン抽出，漂白処理を行いリグニン等の不純物を取り除きホロセルロースを回収した．得られたホロセルロースはグラインダー処理を 2 回行い，ナノサイズまで解繊することで CNF を製造した．CNF の評価に SEM（走査型電子顕微鏡分析）と分子量測定を行った．また，CNF とポリ乳酸を混ぜ合わせ 50wt%コンポジットを作製し，機械特性の評価として引張試験を行った．成分分析と引張試験の結果
から，複合体作製に最適な CNF の蒸煮条件は 15 atm であった．

【目的】近年，カーボンニュートラルな資源である木質系バイオマス由来の糖を原料とした燃料や化成品の製造が期待されている．木質系バイオマスに対して効率的に糖化を行なうには，セルロースの非結晶化が必要である．近年，イオン液体を用いたバイオマスの糖化前処理法が提案されている．そこで本研究では，イオン液体を木質系バイオマスの前処理溶媒として用い，またバイオマス
由来の糖だけでなくリグニンも活用する木質系バイオマスのトータルリファイ
ナリーを行う．
【方法および結果】従来のイミダゾリウム系イオン液体よりも酵素や微生物に対して低毒性であるコリン酢酸を用いた．前処理にはバイオマスの 1.5 倍量のイ
オン液体を最少量として用いた．イオン液体による前処理で得られた前処理バ
イオマスは，希硫酸前処理の際に起こるヘミセルロースの消失は見られないう
えに，セルロースの結晶構造の緩和が XRD 分析により確認された．前処理バイオマスを酵素糖化し，糖液を調整した．前処理バイオマスのセルロースおよびヘミセルロースについての糖化率は，それぞれ 96％および 73％であった．得られた糖濃度はグルコース 40 g/L およびキシロース 20 g/L であった．キシロー
ス資化能を付与した酵母株 YPF499/(XR-XDH)株でエタノール発酵を行ったとこ
ろ，48 時間までに，グルコースはすべて，キシロースも 83%が資化された．また得られたグルコース・キシロース混合糖液から得られたエタノール濃度は21g/L であった．糖化残渣リグニンについては，アルカリ酸化分解を行ったところ，リグニンモノマー収率は 48％となり，この値は，希硫酸前処理を行った
場合の・酵素糖化残渣リグニンやアルカリ蒸解リグニンの場合と比較して高かった．イオン液体を回収率約 97％で回収でき，回収したイオン液体のバイオマスの前処理能力には問題なかった．

Production of cellulose nanofiber using high activity steam treatment and its
application to biomass composite

Lignocellulosic biomass refinery based on pretreatment using minimum andbiocompatible ionic liquid○Kazuki Hashimoto1, Chikako Asada2, Chizuru Sasaki2, Yoshitoshi Nakamura2(1Grad. Sch. Adv. Technol. Sci., Tokushima Univ.,
2
Grad.Sch.Biosci.Bioind.,Tokushima Univ)

Key words

cellulose nanofiber, composite○Kazuaki NINOMIYA1, Amaliyah Rohsari Indah Utami2, Yota TSUGE1,
Chiaki OGINO3, Kenji TAKAHASHI2(1Ints. Frontier Sci. Initiative, Kanazawa Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol.,Kanazawa Univ., 3Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)

Key words

lignocellulosic materials, ionic liquid, biorefinery

101

1Hp06

イオン液体前処理と酵素糖化により得られる残渣リグニンの特性評価

1Hp08○江口 真央 1, 杉野 雄規 1, 柘植 陽太 2, 髙橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp

白色腐朽菌が有するアルコール発酵能の生理学的役割の解明○増田 茜 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1静大院・総合農, 2静大・農, 3静大・グリーン研, 4静大・創科技院）
mori.toshio@shizuoka.ac.jp【目的】現在，温暖化や石油資源枯渇が深刻な問題となっており，石油資源の代替資源として木質系バイオマスが期待されている．木質系バイオマス中のリグ
ニンは複雑な構造のため，有効な利用法が開発されていない．そのため，酵素
糖化残渣として得られるリグニンの利用が関心を集めている．本研究では，イオン液体(IL)前処理と酵素糖化により得られる「IL 前処理-酵素糖化残渣リグニン」の特性評価を目的として，アルカリ酸化分解により得られるリグニンモノ
マーである phenolic aldehyde（バニリン＋シリンガアルデヒド）の収率，ならびに，溶媒分画により得られるリグニンオリゴマーの収率・分子量・水酸基当量を評価した．比較として，「希硫酸(DA)前処理-酵素糖化残渣リグニン」についても同様の試験を行い，その結果を比較することで，「IL 前処理-酵素糖化残渣リグニン」の特徴を浮き彫りにした．
【方法および結果】イオン液体(IL)前処理は，110℃で 16 h，希硫酸(DA)前処理においては，180℃で 30 min にて前処理を行った．その後，それぞれ酵素糖化を行うことにより，糖化残渣リグニン「IL 前処理-酵素糖化残渣リグニン」と「DA 前処理-酵素糖化残渣リグニン」を作製した．リグニンのアルカリ酸化分
解試験における phenolic aldehyde 収率は，「IL 前処理-酵素糖化残渣リグニン」と「DA 前処理-酵素糖化残渣リグニン」の場合でそれぞれ 48.0%と 39.5%とな
り，「IL 前処理-酵素糖化残渣リグニン」の方が高い結果となった．アセトン/メ
タノール分画で得られるリグニンオリゴマーの収率と水酸基当量については，「IL 前処理-酵素糖化残渣リグニン」の場合のほうが「DA 前処理-酵素糖化残渣
リグニン」の場合より高い結果が得られた．以上の結果は，IL 前処理は DA 前処理と比較し温和な条件で反応が進むため，リグニンの縮合・変性が少ないためと考えられる．

白色腐朽菌はリグニン分解・糖化・発酵すべての能力を有する唯一の微生物であり，木質バイオリファイナリーに最も適した微生物であると考えられる．白色腐朽菌を用いたアルコール発酵研究は多数存在しているが，多くの場合培養する際に栄養源が豊富な液体培地を加えるなど条件が整えられており，木材腐
朽時におけるエタノール発酵の生理学的意義に関する知見は極めて乏しい．そこで本研究では，白色腐朽菌が持つアルコール発酵能の生理学的意義を解明す
べく，木粉と水のみでエタノール発酵可能な白色腐朽菌を選抜し，木粉上でのエタノール産生挙動を調査した．前培養した供試菌（25 菌株）をブナ木粉上に接種し，20 日間の好気培養による脱リグニン処理の後に，密栓して半嫌気培養を 10 日間行い，培養終了後にヘッドスペースの残存酸素濃度およびエタノール
産生量測定を行った．密栓時に培地を添加し，腐朽木材を炭素源とした発酵液
体培地による半嫌気培養では，供試菌 25 菌株中 15 菌株でエタノール産生が確認されたのに対し，発酵液体培地を添加せず木粉のみの場合では 4 菌株のみでエタノール産生が観察された．この結果から，エタノール産生能を持つ菌であっても自然界で木材腐朽時にエタノール発酵を行っている白色腐朽菌は極めて限定的であることが示唆された．また，木粉のみの培養において最もエタノール
産生をしていた Phanerochaete sordida YK-624 株の発酵特性を調査したところ，
木粉上でのエタノール産生とリグニン分解率に相関がなかったものの，半嫌気培養期間中の遊離糖の濃度変化も見られなかったため，糖化がエタノール発酵
におけるボトルネックであると予想された．現在，セルロース分解に関与する
各種酵素遺伝子導入株を用いて木粉上でのエタノール発酵におけるセルロース
分解の影響について調査している．

Characterization of enzymatic saccharification residue lignin after ionicliquid pretreatment

Clarification of physiological role of alcohol fermentation in white-rot fungi○Mao Eguchi1, Yuki Sugino1, Yota Tsuge2, Kenji Takahashi1, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

1Hp07

lignin, ionic liquid, enzymatic residue

Key words
degradation

white-rot fungi, ethanol fermentation, wood decay, cellulose

木材腐朽菌による加硫天然ゴムの分解

1Hp09

生きた植物からの非破壊糖取出し方法の検討○佐藤 伸（公立鳥取環境大学・環境学部）
s-sato@kankyo-u.ac.jp

天然ゴムを分解する微生物は土壌放線菌を中心に研究されており，天然ゴムのポリマー主鎖を酸化的に切断してポリマーの低分子化を引き起こすことが知られている．放線菌の分泌する酸化酵素が直接作用して天然ゴム成分を分解することが研究で明らかとなっている．一方で，カーボンブラックなどゴム以外の成分を含む加硫天然ゴム製品は一般に微生物分解を受けにくい．我々はこれま
でにきのこの仲間である木材腐朽菌が加硫天然ゴムを分解することを明らかにしたが，この菌は日本では未同定の菌株であり，国産の腐朽菌の中で加硫ゴム分解能を持つ菌を見つけられていなかった．加硫天然ゴムのリサイクルを国内で行うことを考えると，日本国内で分離できる菌株を使うメリットは大きい．
このことから本研究では国産の加硫ゴム分解木材腐朽菌の探索を行うこととした．
本研究ではまず，鳥取県東部で野生のきのこ子実体を採取し，胞子から分離した木材腐朽菌による市販の加硫天然ゴムシートの分解を検討した．その結果，分離したいくつかの菌株で加硫ゴムシートへの影響が認められた．培養 3 ヶ月間の菌処理によって，加硫ゴムシートの重量減少とシート表面の損傷，内部架
橋密度の低下が示唆され，引張試験の結果から菌処理による物性低下を確認した．鳥取で分離したこれらの菌株の分解力は，我々がすでに報告した海外菌株のものより高い分解力を示した．現在，鳥取県内で見つけた加硫天然ゴム分解
菌株がゴム分解中に分泌する酵素などの代謝物を中心にし，その機能を調べながら分解メカニズムの解明に向けて研究を進めている．

Degradation of vulcanized natural rubber by wood rotting fungi○Shin Sato
(Dept. Environment, Tottori University of Environmental Studies)

Key words○Akane Masuda1, Toshio Mori2, Hirokazu Kawagishi2,3,4, Hirofumi Hirai2,3(1Grad. Sch. Agric., Shizuoka Univ., 2Fac. Agric., Shizuoka Univ., 3Res. Inst. Green
Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

vulcanized natural rubber, biodegradation, Wood rotting fungi○米倉 円佳 1, 青木 直大 2, 廣瀬 竜郎 3, 近藤 聡 1, 大音 徳 4（1トヨタ自動車・アグリバイオ事業部, 2東大院・農生科, 3農研
機構・中央農研, 4トヨタ自動車・T-フロンティア部）
madoka_yonekura@mail.toyota.co.jp【背景と目的】
植物から光合成産物である糖を非破壊で連続的に取り出せれば，バイオ製品のコスト削減に繋がると考えられる．既報において，SWEET として知られる糖
トランスポーターを用いて，①葉組織内の糖を細胞外（アポプラスト）に放出させ，それを②葉の排水現象を利用してアポプラストから植物体外に排出させることで，非破壊糖取り出しに成功した（生物工学会誌 96 (3), 2018）．モデル
植物シロイヌナズナでは CladeI から IV に分類される全 17 種類の AtSWEET 遺伝子が知られるが，中でも CladeIII に属する AtSWEET12 を，カリフラワーモザ
イクウイルス(CaMV) 35S プロモーター制御下で過剰発現すると，最も高濃度の糖（単糖当量で平均 6 mM）を含む排水液が得られた．ただし本過剰発現体では顕著な生育の抑制が見られた．
そこで AtSWEET12 遺伝子を発現する最適プロモーターの検討を行った．
【方法】
発現部位や時期，発現量が異なると考えられる，AtSIG1，AtSUC4，CAB1，
HSP18.2 のプロモーターを用いて AtSWEET12 の過剰発現体を作出し，それらの排水液中の糖（ショ糖，グルコース，フルクトース）を HPLC で定量分析した．
【結果】
供試したプロモーターのうち，CAB1 プロモーターの場合に単糖当量で平均 6.7mM の高糖濃度の排水液が得られ，その生育は野生型より若干遅延したものの，ほぼ同等の生育を示した．このことから，プロモーターの最適化により，生育の抑制や遅延を回避しつつ，非破壊で植物から糖を取り出すことが可能である
ことが示された．

Investigation of the non-destructive sugar extracting method from living
plants○Madoka Yonekura1, Naohiro Aoki2, Tatsuro Hirose3, Satoshi Kondo1,
Chikara Ohto4(1Agric. Biotech. Business Div., Toyota Mortor Corp., 2Grad. Sch. Agric. Life Sci.,
Univ. Tokyo, 3NARO/ARC, 4T-Frontier Div., Toyota Motor Corp.)

Key words

bioproducts, SWEET, biofuel, sugar extraction

102

1Hp10

イネいもち病菌 Magnaporthe oryzae 由来セロビオース
脱水素酵素と新規ヘム含有膜タンパク質の解析

1Hp12

磁気細胞アレイ技術を用いたペクチン分解活性評価法の開発○吉川 真広 1, 石原 真以 2, 清水 一憲 1, 鈴木 宏昭 2, 本多 裕之 1,3（1名大院・工, 2トヨタ紡織, 3予防早期医療創生セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp○本間 陽名 1, 土居 友梨子 1, 松村 洋寿 1, 鮫島 正浩 2,
五十嵐 圭日子 2, 小川 信明 1, 伊藤 英晃 1, 尾高 雅文 1
（1秋田大院・理工, 2東大院・農生科）
matsumuh@gipc.akita-u.ac.jp【背景】糸状菌による植物細胞壁の分解では，近年，セルラーゼなどの加水分解
酵素に加えて酸化還元酵素の役割が注目されている．セロビオース脱水素酵素（CDH）や，溶解性多糖モノオキシゲナーゼは，植物細胞壁の主成分であるセルロースの分解においてセルラーゼと協調的に働いていると予想されている．
CDH はフラビンドメインとヘムドメインからなるフラボヘムタンパク質である．CDH の酵素活性には電子伝達反応が必須であるが，電子伝達パートナーに関しては未だ不明な点が多く，その生理的な役割の詳細については明らかになっていない．本研究では，セルロース分解におけるイネいもち病菌 Magnaportheoryzae 内での CDH の機能解明を目指し，M. oryzae ゲノムデータベースにより
CDH ホモログ及び CDH の電子伝達パートナー候補の探索を行った．また，メタノール資化性酵母 Pichia pastoris を用いたタンパク質発現系を構築し，タン
パク質機能解析を行った．
【結果及び考察】M. oryzae のゲノムデータベースにおいて CDH ホモログ遺伝子を探索した結果，高い相同性を示す 2 つの遺伝子 MGG13809 と MGG11036 を発見した．2 種の CDH ホモログを P. pastoris を用いて発現させ，酵素活性を測定したところ，セロビオース酸化活性が確認された．同様に，CDH の電子伝達
パートナー候補を探索し，N 末端側が CDH のヘムドメインと，C 末端がシトク
ロムｂ 561 とそれぞれ高い相同性を示す新規ヘム含有膜タンパク質（MGG01225）を発見した．MGG01225 を発現させた P. pastoris 菌体はヘムタンパク質に特徴的な赤い色を示しており，SDS-PAGE により解析した結果，アミノ酸一次配列から予想される分子量付近にバンドが確認された．また，UV-vis スペクトル測定を行った結果，ヘム由来の吸収ピークが観測された．

【背景と目的】
自動車部品の植物材料化が進む中，ケナフが注目されている．ケナフは生長が早く，二酸化炭素吸収能力が高い 1 年草の植物であり，その繊維は木材の代替として基材に使用されている．ケナフの繊維化は繊維同士を架橋するペクチン
を微生物で分解する工程を要するため，高ペクチン分解能を有する微生物の取得が望まれる．我々は，これまでに磁性微粒子と磁力を用いて 1 細胞ずつ培養可能な磁気細胞アレイ培養技術を開発してきた．本研究では，独自に見出した冷却によるペクチン白濁現象を磁気細胞アレイ技術に応用し，効率的な微生物のペクチン分解活性評価法の開発を行った．
【方法】
ペクチン分解モデル微生物として Bacillus halodurans C-125 株(B.halodurans)を使用した．磁性ビーズを用いて菌体を磁気ラベル化し，磁気細胞アレイ技術を用いてパターニングを行った後，ペクチンを主な炭素源とした厚さ 200 μm の寒天薄膜を被せ培養した．培養後は，4℃で冷却し，ペクチン分解により形成されるハローを顕微鏡を用いて観察した．
【結果と考察】菌体の磁気ラベル化は，B.halodurans や環境微生物を含む 4 種類の菌体で成功した．次に，磁気ラベル化した B.halodurans を磁気細胞アレイ技術によりパター
ニングし，ペクチンを含む寒天薄膜を被せ培養した．その結果，18 時間後にはパターニングを維持したまま増殖し，コロニーを形成している様子が目視可能であった．これを 4℃で冷却したところ，コロニー周辺にハローが形成された．
さらに顕微鏡を用いて撮影した画像を輝度の差で 2 値化を行うことで，ハローの識別が可能であった．今後はこのハローの面積を計算することで，微生物によるペクチン分解活性の定量的評価を目指す．

Expression of cellobiose dehydrogenases and a novel heme-containing
membrane protein from rice blast fungus Magnaporthe oryzae

Development of pectinolytic activity evaluation method using magnetic cellarray technology

Key words
biomass, rice blast fungus, cellobiose dehydrogenase, heme containing
membrane protein

Key words

pectinolytic, microbial cell array, magnetic patterning, halo assay

1Hp11

1Hp13

異なるストレス条件下における Aquitalea magnusonii H3のコウキクサ成長促進効果に関する検討○Haruna Honma1, Yuriko Doi1, Hirotoshi Matsumura1, Masahiro Samejima2,
Kiyohiko Igarashi2, Nobuaki Ogawa1, Hideaki Itoh1, Masafumi Odaka1(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo)

Aspergillus aculeatus 由来キシラナーゼの天然バイオマ
ス分解に対する効果○Masahiro Kikkawa1, Mai Ishihara2, Kazunori Shimizu1, Hiroaki Suzuki2,
Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Toyota boshoku Corp., 3PME, Nagoya Univ.)○梶本 真由, 谷 修治, 炭谷 順一, 川口 剛司（阪府大院・生環科）
takashi@biochem.osakafu-u.ac.jp○多田 三菜美 1, 石澤 秀紘 1, 黒田 真史 1, 井上 大介 1, 森川 正章 2,
池 道彦 1（1阪大院・工, 2北大院・地環科）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】高いヘミセルラーゼ活性を有する Aspergillus aculeatus No. F-50 株
は 3 種のキシラナーゼ FIa-Xyn，FIb-Xyn，FIII-Xyn を生産する．FIa-Xyn と FIIIXyn は GH10 に，FIb-Xyn は GH11 に属し，3 種のうち FIII-Xyn のみ CBM1 を保持する．GH10 に属するキシラナーゼは，主鎖分解において側鎖の影響を受けにくいことが知られている．また，CBM は不溶性基質の分解を促進し，中でも CBM1 はセルロースに結合することが知られている．そこで，CBM1 を有する GH10 キシラナーゼの天然バイオマス分解に対する効果を検討することを目的に，FIa-Xyn と FIII-Xyn，さらに CBM1 を付加した FIa-XynCBM1 と CD のみを保持する FIII-XynCD を作製し，セルラーゼ剤に対する添加効果を比較した．
【方法と結果】5%アルカリ処理バガスに対して 0.1 mg/g dry biomass の FIa-Xyn，
FIII-Xyn，FIII-XynCD を 50℃で 3 日間作用させ，反応後の上清中に含まれる還元糖量を定量することで評価した．精製酵素単独使用時の還元糖生成量は，FIIIXyn で FIII-XynCD の 2.9 倍の値を示した．FIa-Xyn については低い値を示した
が，これは反応温度 50℃での安定性が要因だと考えられた．また，2 mg/g dry
biomass のセルラーゼ剤と併用時の還元糖生成量は，0.1 mg/g dry biomass の FIaXyn，FIII-Xyn，FIII-XynCD を添加することでセルラーゼ剤単独使用時の 1.4
倍，2.6 倍，1.7 倍の値を示し，FIII-Xyn がセルラーゼ剤と最も高い相乗効果を示した．このときの分解産物を HPAEC-PAD で分析すると，FIII-Xyn とセルラー
ゼ剤との相乗効果により，2.8 倍のキシロースに加え，セルラーゼ剤の量に変化はないにも関わらず 1.5 倍のグルコースの存在が確認された．以上の結果から，
CBM1 を有する FIII-Xyn は天然バイオマス分解に効果的であることが示された．現在，FIa-XynCBM1 について調製中であり，併せて報告する予定である．

【背景・目的】ウキクサ亜科植物は成長の速さ，バイオマス組成，栽培，収穫の容易さから有望なバイオマスと考えられており，排水中で栽培することで水質浄化と資源生産を両立するシステムが提案されている．このシステムの生産性を向上させる手法として植物成長促進細菌(PGPB)の利用が注目されており，いくつかの菌株がウキクサ亜科植物の成長を顕著に促進することが報告されている．ここで，現在報告されているウキクサ亜科植物の PGPB はこれまでの研究において植物の生育に好適な環境で試験されてきたため，様々なストレス要因が存在しうる実環境中において同様に成長促進効果を発揮できるかについては明らかになっていない．そこで本研究では，植物の受けるストレス要因の違い
が PGPB の成長促進効果にどのような影響を与えるかについて検討を行った．
【方法・結果】ウキクサ亜科植物の栽培において想定される 7 種類のストレス要
因をそれぞれ付与した条件で，コウキクサの PGPB である Aquitalea magnusonii
H3 株による成長促進効果を評価した．その結果，コウキクサの生育が銅イオ
ン，亜鉛イオン，低温，弱光によって制限される条件下では H3 株の添加により生育が改善され，特に銅イオンと亜鉛イオンの存在下ではストレスの無い場
合よりも大きな成長促進効果を示した．一方，塩ストレス条件下では促進効果は見られなくなり，貧栄養，低 pH ストレス条件下では反対に成長が阻害された．このことから，PGPB の成長促進効果はストレス要因の種類によって大きく変化することが示され，適用する環境条件を考慮することでより高い効果が得られることが示唆された．
本研究は，科学技術振興機構（JST）先端的低炭素技術開発（ALCA）「共生微生物を活用した水生バイオマスの効率生産」の一環として実施した．

Effects of xylanases from Aspergillus aculeatus on biomass degradation.

Evaluation of duckweed growth promotion by Aquitalea magnusonii H3under different stress conditions.

○Mayu Kajimoto, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words

xylanase, Aspergillus aculeatus, biomass, CBM○Minami Tada1, Hidehiro Ishizawa1, Masashi Kuroda1, Daisuke Inoue1,
Masaaki Morikawa2, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ.)

Key words

duckweed, Plant Growth-Promoting Bacteria, stress factor

103

1Hp14

ウキクサバイオマスの増産へ向けた植物成長促進細菌と阻害細菌との競争関係の解析

1Hp16○石澤 秀紘 1, 黒田 真史 1, 井上 加奈子 2, 井上 大介 1, 森川 正章 3,
池 道彦 1（1阪大院・工, 2阪大・超高圧電顕セ, 3北大院・地環科）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp【背景・目的】ウキクサ亜科植物は個体重のほぼ全てを光合成器官に投資した特殊な形態を持つ水生植物であり，好適な環境では植物界で最大級の増殖速度を示す．また，そのバイオマスはデンプンを多く含有し，バイオ燃料への変換の妨げになるリグニンが少ないことから，燃料用作物として期待されている．近年，ウキクサ亜科植物と共生する細菌に宿主の成長を促進するものが発見され，こうした菌株を導入することで栽培を効率化する技術が提案された．一方，多様な細菌の存在する環境中において，目的の菌株を植物に定着させる方法は確立されていない．そこで本研究では，以前の研究で単離された植物成長促進細菌および成長阻害細菌の競争関係を解析することで，有益な菌株を定着させる
方法について考察した．

森林バイオマスの新規利用 -土壌改良効果の検討○連 綾香 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1立命館大院・生命科学, 2立命館大・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

本研究は，科学技術振興機構先端的低炭素技術開発(ALCA)「共生微生物を活用した水生バイオマスの効率生産」の一環として実施した．本研究の一部は，「文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業微細構造解析プラットフォー
ム」の支援を受けて実施した．

【背景・目的】近年，森林資源の利用価値の低下や人手不足による森林の管理放棄に伴う，森林の持つ機能および健全性の低下が課題となっている．森林機能を回復するには，産出される森林資源の持続的な利用を通じて，森林の管理を促していく必要がある．一方，日本の農地土壌における有機物の低下で微生物を含む土壌生物の減少により，農作物の収量や品質が低下している．そこで，森林資源の土壌改良材としての利用が期待されている．本研究では，森林資源の利用価値の向上および土壌環境の改善に向けて，木質資材による土壌改善効
果と，改良土壌の植物成長への影響を明らかにすることを目的とした．
【方法】2 種類の木質繊維 (以下，木質 1，2) について，成分分析を行った．次に，木質繊維を用いた土壌，木質繊維を混合していない土壌 (以下，未混合) について，土壌肥沃度指標 (SOFIX) に基づいて有機資材を用いて調整し，ワグネ
ルポットに 1.0 kg 分取して植物育成室内に 14 日間静置し，土壌総細菌数をeDNA 法により測定した．また，16S rRNA を標的とした PCR-DGGE 法による菌叢解析を行った．
【結果】成分分析の結果，木質繊維は全炭素量 340,000 - 384,000 mg/kg に対し，
全窒素量，全リン量，全カリウム量は低い値を示した．木質繊維を用いた土壌の総細菌数は，未混合土壌と比較して 1.1 - 1.5 倍向上した．また，木質 1 および木質 2 の混合土壌では異なる PCR-DGGE のバンドパターンが確認された．木質繊維の観察から，資材の物理性の違いが菌叢に影響を与えていることが示唆された．木質 2 を用いた改良土壌，市販の培養土を用いたコマツナの栽培実験においても，木質 2 を混合した土壌は培養土に遜色ない成長が見られた．以上
より，木質繊維は土壌への炭素供給源として機能に加え，物理性の改良効果が認められ，それらに伴う細菌数の増加に寄与することが期待できる．

Analysis of competitive relationships between plant growth-promoting and inhibiting bacteria for the improvement of duckweed biomass production

A new method for utilization of forest biomass - study on soil improvementby mixing forest biomass -【方法・結果】成長促進細菌 Aquitalea magnusonii H3，成長阻害細菌 Acinetobacter
ursingii M3，Asticcacaulis excentricus M6 の 3 株をそれぞれ単独でコウキクサに接種すると，接種量の多寡によらず 1～3 日で一定の付着密度に達し，以後安定した．これらのうち 2 種を用いた競争付着実験では，H3 株は M3 株の付着を著しく制限し，M6 株とは概ね 1:1 の比率で共存した．こうした傾向は異なる接種比率や接種する順序によらず一貫して認められたことから，細菌種によるウキクサ亜科植物へ定着には，接種方法よりも用いる菌株の性質が重要であることが示された．また，H3 株は僅かな接種量でも比較的高い割合で付着し，生育を改善したことから，非滅菌環境での応用に適した菌株であることが示唆された．

○Hidehiro Ishizawa1, Masashi Kuroda1, Kanako Inoue2, Daisuke Inoue1,
Masaaki Morikawa3, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Res. Cent. Ultra-High Voltage Electron Microsc.,
Osaka Univ., 3Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ.)○Ayaka Muraji1, Kiwako S. Araki2, Kubo Motoki2(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

plant growth-promoting bacteria, duckweed, biomass

Key words

forest biomass, soil microbe, soil amendment

1Hp15

好熱菌発酵産物から単離されたエンドファイトが植物の生長に与える影響

1Hp17

土壌細菌バイオマス量と地温の関係解析○金子 由喜 1, 渡邉 凌 2, 井藤 俊行 3, 宮本 浩邦 1,4,5, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2千葉大院・融合, 3京葉プラントエンジニア
リング, 4サーマス, 5理研・IMS）
kodama@faculty.chiba-u.jp○宇野 貴裕 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1立命館大院・生命科学, 2立命館大・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp【背景・目的】当研究室では未利用海産資源等を原料として高温で発酵させた資材（好熱菌発酵産物）の研究を行っている．当該産物の施肥によって作物の収量が増加したり，病害菌や病害虫による被害が低減することが農家より報告されている．一般的に，植物―微生物間では様々な相互作用が起こっており，当研究室では，好熱菌発酵産物による植物への有益な効果もまた，植物に直接的に作用する，いわゆる PGPB（plant growth promoting bacteria）が関与すると仮説を立てている．そこで，当該産物を施肥して育てた植物から単離された細菌について，PGPB としての機能を果たすのか否か，その特徴について調べた．
【方法・結果】当該産物を施肥した植物から単離された Paenibacillus barcinonensis
No.40 株及び Paenibacillus cucumis No.41 株について，PGPB としての生化学的特徴と植物成長促進効果の解析評価を行った．その結果，P. barcinonensis No.40
株，及び P.cucumis No.41 株はインドール酢酸産生能，不溶性リン酸の可溶化能を有しており，加えて P. barcinonensis No.40 株はシデロフォアの産生能も有することが確認された．また，これらの菌の懸濁液をアラビドプシスに継続投与して育てたところ，P.cucumis No.41 株投与区において対照区と比較し，成長が促進される傾向が見られたが，P. barcinonensis No.40 株投与区では成長促進効
果は認められなかった．P. barcinonensis No.40 株，及び P.cucumis No.41 株はど
ちらも植物の生育制御に関わる特徴を有するが，No.40 株はシデロフォアの産生能に特徴があり，No.41 株は，特に植物の成長促進効果があることが明らかになった．

【背景・目的】土壌中の有機物は微生物によって無機物へと分解され，微生物はその分解過程で得たエネルギーにより成長，増殖する．微生物はこの有機物の分解に伴い，熱を発生させている．このことから，微生物量の多い土壌ほど土
壌内の温度 (以下：「地温」) が高くなると考えられる．地温は，種子の発芽率，水分・養分の吸収速度，作物の収量など，農業を行う上で重要な要因の 1 つである．しかし，土壌中の物質の分解過程における微生物と熱エネルギーの関係やその熱エネルギーによる地温への影響は不明確である．本研究では，土壌微
生物量と地温の関係を調べることを目的とした．
【方法・結果】微生物の発酵熱による地温への影響調べる為に，滋賀県の有機および化学栽培を行っているハウス内の地温と土壌細菌バイオマス量 (slow stirring
法) を測定した．その結果，有機，化学ハウスの細菌数は前者の方が多かった．
また，外気温の変動に伴い地温も上下していたが，前者の方が地温の振れ幅は小さかった．このことから，土壌細菌が地温の安定性に関与していると考えられた．次に，土壌細菌バイオマス量の違いによる地温差を調べる為に，有機土壌を用いて，未滅菌土壌 1，2 と滅菌土壌 3 を作製した．各ポットを 25℃に設定したインキュベーター内に静置し，7 日間地温と土壌細菌バイオマス量を測定した．地温測定 0 日目における土壌 1，2 の細菌数は 0.3×108 cells/g-soil であったが，7 日目において，土壌 1 では 3.8×108 cells/g-soil，土壌 2 では 6.8×108 cells/
g-soil に増加していた．土壌 3 から細菌は検出されなかった．土壌 1，2 は土壌
3 よりも約 0.5℃地温が高く，土壌 2 は土壌 1 よりも約 0.1～0.2℃地温が高かった．土壌細菌バイオマス量と地温の高さには相関が見られたことから，これらの地温差は土壌微細菌バイオマス量の違いによるものと考えられた．

The effect of endophytes isolated from thermophilic-fermented compost on
plant growth

Relationship between bacterial biomass and temperature in soil

○Yuki Kaneko1, Ryo Watanabe2, Toshiyuki Ito3, Hirokuni Miyamoto1,4,5,
Hiroaki Kodama1(1Grad.Sch.Fac.Horticul.,Chiba Univ., 2Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.,
3
Keiyo Plant Eng., 4Sermas, 5IMS, RIKEN)

Key words

compost, PGPB, Paenibacillus, auxin○Takahiro Uno1, Kiwako S. Araki2, Motoki Kubo2(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Key words

soil bacteria, organic soil, soil temperature, soil water content

104

1Hp18

土壌環境および植物栽培が土壌微生物叢に及ぼす影響
解析

1Ip02

○前田 憲慶 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1立命館大院・生命科学, 2立命館大・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

抗腫瘍関連抗原抗体をバイオマーカーとした高感度測定系の開発○吉岡 実咲 1, 本莊 知子 1, 木下 理恵 2, 二見 淳一郎 1（1岡山大院・ヘルスシステム統合科学（工）・蛋白質医用工学,2
岡山大・医・細胞生物）
futamij@okayama-u.ac.jp【背景と目的】植物の栽培方法には化学栽培と有機栽培の 2 通りがある．植物に対する無機成分を化学肥料により施肥している農地では，微生物の栄養源である有機物量が少なくなり，微生物数や種の多様性が低くなる．一方，様々な成分を含む有機肥料を施肥した場合，微生物の生育源となる有機物質が土壌中に供給されるため，微生物の代謝や増殖が促進され，微生物数や種の多様性が高くなる．その結果，土壌中の菌数や菌種の増加によって，植物病原菌に対する拮抗菌が増加するため，植物病害の抑制につながると考えられている．また，植物は根から有機物を分泌しており，分泌物は植物種や植物の生育段階ごとに組成や量が異なる．植物の根から分泌される物質には，特定の微生物が集まる傾向があり，同一作物の連作によって，微生物叢が単純化することが推測される．本研究では，有機物と植物栽培が土壌微生物叢に与える影響を明らかにすることを目的とした．
【方法】ベース土壌に，有機施肥（有機土壌）および化学肥料の施肥（化学土壌）を行い，コマツナ，クローバー，シュンギクの苗を定植し，植物育成室で4 週間の栽培を行った．栽培前，栽培 2 週目，栽培 4 週目の土壌について細菌数（slow stirring 法）および細菌叢（PCR-DGGE 法）を測定した．
【結果】化学土壌の総細菌数は実験開始から終了まで検出限界（6.6×106 cells/gsoil）以下であったのに対し，有機土壌では，いずれの菌数も 6.0×108 cells/g-soil
以上となっており，有機土壌の方が明らかに高かった．栽培前の土壌細菌叢を確認したところ，化学および有機施肥で PCR-DGGE 泳動後のバンド数に大きな差がみられ，有機施肥の方が菌叢の多様性が高かった．また，植物栽培後の土壌においては，有機土壌では大きな菌叢変化は認められなかったが，化学土壌では菌叢変化が著しかった．

がん免疫治療では,がん細胞内に含まれる異常タンパク質である「がん抗原」が目印となり免疫応答が活性化し,細胞性免疫と同時に液性免疫も誘導され,抗がん抗原抗体が血中で上昇する.後者の抗体価を定量的に評価すれば有益なPharmacodynamic(PD)バイオマーカーとなることが期待される.がん検出に用いられている腫瘍マーカーも健常人の血中には存在しないタンパク質であり,がん抗原として機能する可能性が示唆されている.本研究は PD バイオマーカー探索の一環として肝がん,肺がんに関連するがん抗原のリソース整備を行った.さらに
悪性中皮腫と肝がんの患者の検体を用いて抗体価測定の予備検討を行った.
腫瘍関連抗原をコードする cDNA 断片を PCR 法で取得し,Hek293 細胞での一過的な高発現が可能な SGE ベクター又は大腸菌で発現可能な pET28 ベクターにクローニングし,FreeStyle293F 細胞又は大腸菌を宿主としてタンパク質を生産した.Native 構造の抗原に加え Cys 残基特異的な S-カチオン化修飾を施した変性・
可 溶 化 抗 原 も 調 製 し た . 一 部 の 抗 原 は Multiplex 磁 気 ビ ー ズ に 固 定 化 す る
MUSCAT-Assay(Multiple S-cationized antigen beads array assay)法により抗体価の測定に用いた.
腫瘍関連抗原の生産系は 16 種類の構築が完了した.CA125 抗原に対する抗体価測定で Native の構造エピトープではなく変性抗原の配列エピトープを強く認識する抗体価が有意に上昇する例が確認された.近年,抗がん抗原抗体は生体内でMHC クラス 1 エピトープを含むがん抗原と免疫複合体を形成し,樹状細胞上のFCγRII を介して取り込まれた後,細胞性免疫応答を増強する機構が提唱されている.この機構から推定すると,多様ながん抗原に対する抗体価が上昇する AntigenSpreading は腫瘍関連抗原のみならず体細胞変異に由来する Neo-antigen を免疫系に提示するメディエーターとして機能している可能性が示唆された.

Analysis of microflora influence by soil environment and plant cultivation

Sensitive detection of anti-tumor-associated antigen antibody as immuneoncological biomarker○Kazuyoshi Maeda1, Kiwako S. Araki2, Motoki Kubo2(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)○Misaki Yoshioka1, Tomoko Honjo1, Rie Kinoshita2, Junichiro Futami1(1Grad. Sch. Interdiscip. Sci. Eng. Hel. Syst., Okayama Univ., 2Dept. cell biol. Med.,Okayama Univ.)

Key words
cultivationsoil environment, bacterial microflora, plant growth, organic

Key words
biomarker

protein engineering, tumor associated antigen, antibody, cancer

1Ip01

REIC/Dkk-3 タンパク質の相互作用分子解析と抗がん免疫活性化の分子機構解明

1Ip03

複合免疫療法に向けたがんの抗原性向上に関する基礎検討○羽田 彩夏 1, 中川 そらみ 1, 木下 理恵 2, 二見 淳一郎 1（1岡山大院・自科, 2岡山大院・医歯薬）
futamij@okayama-u.ac.jp○勝河 祐希 1, 丸山 悠 2, Ahmadi Hannaneh 3, 本莊 知子 1,
二見 淳一郎 1,2,3（1岡山大院・ヘルスシステム, 2岡山大・工・化学生命, 3岡山大院・自然科学）
futamij@okayama-u.ac.jp

がん免疫治療では腫瘍局所の免疫抑制状態の解除と，がんの抗原性向上が重要
なポイントである．分泌タンパク質の REIC/Dkk3 は正常細胞で普遍的に発現している一方で，多くのがん細胞で発現が消失している．がん細胞にアデノウイ
ルスベクターを用いて REIC を強制発現させる Ad-REIC 治療では（1）がん細胞内で小胞体ストレスに起因するアポトーシス誘導と，（2）分泌した REIC タ
ンパク質による抗がん免疫活性の活性化が誘導され「がん抗原の露出」と「抗がん免疫の活性化」が同時に誘導できる．実際に腫瘍局所に Ad-REIC を局注す
る前立腺がん・肝がん治療の臨床研究では高い臨床効果が確認されている．本
研究ではこの後者の抗がん免疫活性化の分子機構の解明を進めている．
これまでの研究で，分泌 REIC タンパクが示す作用濃度が高く，REIC と相互作用する分子間は低親和性で結合することが予測されていた．我々は組換え REIC
タンパク質を用いてプロテオミクス手法で結合候補分子を探索し，TGFβ 受容体の細胞外ドメインを見出し，その結合検証実験を進めている．FreeStyle293細胞で共発現させると REIC タンパク質と TGFβ 受容体の細胞外ドメインの 1:1の複合体形成が確認される．また一部の細胞では，TGFβ に対する細胞内シグナル伝達が REIC タンパク質により競合阻害されることをバイオアッセイとル
シフェラーゼアッセイで確認した．この TGFβ の抑制活性は免疫系の細胞に対して特に効果的に誘導されることから，腫瘍局所で免疫抑制状態を誘導する
TGFβ の活性を REIC タンパク質により阻害し，その結果として腫瘍免疫応答が活性化している可能性が示唆された．

腫瘍免疫応答の活性化に伴うバイオマーカーとして，各種の抗がん抗原抗体価が上昇する．我々はがん免疫治療のコンパニオン診断薬として，高感度かつ網羅的な抗体検査診断薬を開発中であるが，がんの「抗原性」が高ければ免疫治療が奏功しやすいとの側面が見えてきた．がん細胞は発がんの過程で DNA 高
メチル化などのエピジェネティック異常が蓄積している．この異常を制御する
エピゲノム薬には，がん抗原の発現を向上させる効果もあり，免疫チェックポ
イント阻害剤等との併用が期待されている．本研究ではエピゲノム薬により発現が変動しやすい抗原の検討を行い，がん複合免疫療法に向けた基礎検討を実施した．
抗体検査薬として整備中の共通がん抗原である Cancer-Testis(CT)抗原を中心に，メチル基転移酵素阻害剤の decitabine 処理に伴う遺伝子・タンパク質レベルでの発現変動を解析した．ヒト卵巣がん細胞株では，細胞増殖レベルにほぼ影響がない decitabine 処理条件で，複数のがん抗原の発現が亢進する例が mRNA レベルおよびタンパク質レベルで確認された．同条件で培養されたヒト正常繊維芽細胞では遺伝子発現変化は確認されなかった．これは体細胞変異が蓄積したがん細胞のゲノム不安定性と強く相関していることが示唆された．同様に，マウスメラノーマおよび線維芽細胞株でも評価をしたが，マウスでは decitabine
処理に伴う発現変動はほとんど確認されなかった．
以上の結果より，エピゲノム薬処理により発現誘導されやすいがん抗原を特定し，対応する抗体検査診断薬を準備しておけば，腫瘍免疫応答の活性化をより高精細にモニタリングできる可能性が示唆された．

Analysis of REIC / Dkk-3 binding protein and molecular mechanism foractivation of tumor immunity

Study on enhanced tumor antigenicity for combination therapy○Ayaka Hada1, Sorami Nakagawa1, Rie Kinoshita2, Junichiro Futami1(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okyama Univ., 2Grad. Sch. Med. Dent. Pharm, Sci.,
Okayama Univ.)

Key words

cancer immunotherapy, TGF beta, protein engineering○Yuki Katsukawa1, Haruka Maruyama2, Hannaneh Ahmadi3, Tomoko Honjyo1,
Jyunichiro Futami1,2,3(1Grad. Sch. Interdiscip. Sci. Eng. Hel. Syst., Okayama Univ., 2Dept. Appl. Chem.
Biotech. Okayama Univ., 3Grad Sch. Natl. Sci. Tech. Okayama Univ.)

Key words

protein engineering, antibody, immunotherapy, epigenetics

105

1Ip04

変性タンパク質への部位特異的 biotin 化条件の最適化と neoantigen スクリーニングへの応用

1Ip06○峯苫 智晴 1, 垣見 和宏 2, 二見 淳一郎 1（1岡山大学院・ヘルスシステム, 2東大病院・免疫細胞治療）
futamij@okayama-u.ac.jp

カイコによるマラリア原虫のメロゾイト表面タンパク質の発現とヒト血清との結合○林谷 美貴子 1, 稲垣 裕 1, Murhandarwati Elsa Heridiana 2,
Widya Asmara 2, Vipin Kumar Deo 3, 朴 龍洙 1,4（1静大院・農・応生化, 2Department of Parasitology, Faculty of
Medicine, Universitas Gadjah Mada, Indonesia, 3静大・国際連携推進機構, 4静大・グリーン科技研）
park.enoch@shizuoka.ac.jp【背景】がん細胞表面では体細胞変異に由来するペプチド断片（neoantigen）がMHC-class I 上に抗原提示されており，neoantigen は個別化医療の重要なターゲットであるため迅速なスクリーニング法の開発が必要だ．MHC-class I は抗原ペプチドと複合体を形成して refolding する特徴と，多量体を形成させると低親和性の T 細胞受容体との結合が検出できる特徴があり，これを neoantigen スク
リーニングに利用する．大腸菌由来 biotin ligase（BirA）は AviTag 配列を付加したタンパク質に部位特異的に biotin 化することができる．本研究では AviTag
付加 MHC-class I タンパク質を変性状態のまま biotin 化する条件を最適化し，
neoantigen スクリーニングの迅速化を進めた．
【方法】BirA は GST 融合タンパク質として生産・精製し，AviTag 付加型の変性タンパク質の NY-ESO-1 をモデルとして biotin 化条件の最適化を行った． 多型性の MHC class I の α 鎖の細胞外ドメインのうちモデル 4 種（ヒト hA2，hA24）と（マウス mH-2Db， mH-2Kb）を biotin 化タンパク質として生産した後 β 鎖とUV 開裂するペプチドとともに refolding・精製し，streptavidin を用いて四量体を形成して安定化させ，UV ペプチド交換により抗原ペプチドを提示させ，T細胞への結合能も確認した．
【結果】インクルージョンボディを形成する AviTag 付加タンパク質は 8M 尿素で溶解後，2M まで希釈し BirA と ATP や D-biotin を含む試薬と混合して室温で1 時間静置することで biotin 化できることを確認した．MHC Class I のテトラ
マーアッセイでは mH-2Db の refolding と精製，UV 照射によるペプチド交換及び CTL の活性化が確認された．本研究により変性状態のタンパク質の高度利用法の開発や，ハイスループットな Neo-antigen スクリーニング法の開発に繋がる基盤が固まった．

【背景と目的】マラリア原虫はヒト体内で肝臓と赤血球内に寄生し，それぞれ形態を変化し，ヒトの免疫系を回避する．そのため効果的なワクチン開発が困難であるが，各形態の抗原を同時に免疫することで効果的にマラリアを予防できることが期待される．本研究では，マラリア原虫の形態の一つであるのメロゾ
イト表面タンパク質である Merozoite surface protein 3 (MSP3)と Merozoite surface
protein 1 の C 末端断片 19kDa である MSP1-19 をカイコで発現及び精製を行い，マラリア原虫に感染したヒト血清との結合能を調べた．
【方法および結果】Plasmodium falciparum 3D7 株の MSP3 (PfMSP3) 遺伝子を，カイコで発現可能な Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) バクミドに挿入することで組換え BmNPV バクミドを構築した．P. falciparum および P. vivax のMSP1-19 (PfMSP1-19，PvMSP1-19)についてもそれぞれ発現用 BmNPV バクミドを構築した．それぞれの組換えタンパク質を FLAG タグや 6×His タグと融合させることで，カイコ幼虫で発現させたところ，カイコ体液への分泌が確認された．それぞれのタンパク質を硫安沈殿やポリエチレングリコール沈殿，およびアフィニティークロマトグラフィーにより，カイコ体液から部分精製を行った．
得られた各組換え抗原タンパク質は，インドネシア Sumba Tengah と Banjarmasin
で採取したマラリア原虫に感染したヒト血清との結合をドットブロット法で確認した．このことから，カイコから精製した各組換え抗原タンパク質は，マラ
リアワクチンの候補となりうることが示唆された．

Site-specific biotinylation technology for denatured protein for neoantigen
screening

Sero diagnostics of Plasmodium falciparum merozoite surface proteins
expressed in silkworm

Key words
biotinylation

protein engineering, antigen, major hitocompatibility complex,○Mikiko Hayashidani1, Yu Inagaki1, Elsa Heridiana Murhandarwati2,
Asmara Widya2, Deo Kumar3, Enoch Y. Park1,4(1Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integ. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Department of
Parasitology, Faculty of Medicine, Universitas Gadjah Mada, Indonesia, 3Office Int’l
Collab., Shizuoka Univ., 4Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ)
Key words
Maralia, Merozoite surface protein 3, Merozoite surface protein 1-19

1Ip05

（講演中止）

1Ip07○Chiharu Minetoma1, Kazuhiro Kakimi2, Junichiro Futami1(1Grad. Sch. Interdiscip. Sci. Eng. Hel. Syst., Okayama Univ., 2Dept.Immunother.,Tokyo Univ. Hosp.)

Neospora caninum antigens displaying-virus-likeparticles as a vaccine candidate against neosporosis○Jian Xu1, Rikito Hiramatsu2, Hamizah Suhaimi3, Tatsuya Kato1,2,3,
Mayuko Kabayashi4, Akari Fujimoto4, Kazunori Ike4,
Enoch Y. Park1,2,3(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. ofIntegr. Sci. Technol., 3Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.,
4Lab. Veter. Parasit., Nippon Veter. Life Sci. Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp
Neospora caninum, one of the coccidian parasites, is the causative and transmissible
agent of dog and bovine neosporosis. The reproductive failures including abortion,
neonatal mortality, and congenital infection in cattle lead to significant economic
losses worldwide. Currently, however, there is no satisfactory treatment or vaccine
available against this neosporosis. Thus, the development of sufficient vaccines tomanage its infection and transmission is desired urgently. In this study, we expressed
Rous sarcoma virus-like particles (RS-VLP) displaying antigens of N. caninum in thesilkworm-baculovirus expression system. The antigen candidates are further modified
by adding a transmembrane domain of GP64 protein from Bombyx morinucleopolyhedrovirus (BmNPV) to the C-terminus of surface antigen 1 (NcSAG1) andSAG1-related sequence 2 (NcSRS2) proteins. Through a co-infection method in
silkworm larvae, we successfully expressed and purified RS-VLPs displaying SRS2
alone or SAG1/SRS2 together by the sucrose density gradient centrifugation. These
VLPs were then utilized for immunizations in gerbils, Meriones unguiculatus, toevaluate the anti-N. caninum effects. We demonstrate that antigen displaying RSVLPs-immunized gerbils have a relatively higher survival rate post infection ofparasites, suggesting that silkworm-expressed VLP vaccines are potentially promising
candidates against N. caninum infections.

Neospora caninum antigens displaying-virus-like particles as a vaccine
candidate against neosporosis○Jian Xu1, Rikito Hiramatsu2, Hamizah Suhaimi3, Tatsuya Kato1,2,3,
Mayuko Kabayashi4, Akari Fujimoto4, Kazunori Ike4, Enoch Y. Park1,2,3(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. of Integr. Sci. Technol.,3
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 4Lab. Veter. Parasit., Nippon Veter. Life
Sci. Univ.)
Key words
Neospora caninum, virus-like particle, silkworm, baculovirus

106

1Ip08

Gag protein displaying different rHA mutants insilkworm

1Ip10○Muzajjad Gozal Goffar1, Vipin Kumar Deo2, Tatsuya Kato1,3,
Y.Enoch Park1,3(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Office Int’l Collab., Shizuoka Univ.,
3
Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)ozzagozal@gmail.com

シリカ粒子形成促進タンパク質「グラシン」の特徴的な領域構造とシリカ形成能○西 美智佳 1, 小林 大起 1, 美藤 友博 2, 有馬 二朗 2, 清水 克彦 3
（1鳥取大院・農, 2鳥取大・農, 3鳥取大・CoRE）
arima@muses.tottori-u.ac.jp

Virus-like Particle (VLP) is well-known platform for display of antigen protein for
vaccine candidate. However, different antigen affects the VLPs size and shape, eventhough using the same VLPs. Our focus in this study is to examine the structuralchanges of gag-577 protein after displaying different type of recombinanthemagglutinin (rHA) H5N1 (A/duck/Hunan/795/2002) mutants. We usedglycoprotein-64 transmembrane (GP64) from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus todisplay each HA mutant. Two rHA Hunan with the different mutation (A160T and
D128S) were co-expressed one by one with gag protein in the silkworm. Examinationof injection virus ratio of rHA and gag was performed by quantitative PCR result andadjusted to 1:1 titer ratio. Collected hemolymph 5 days post-co-injection was purified
sucrose step gradient centrifugation and by fetuin agarose column in a 2 step
purification protocol followed by confirmation by western blotting, rHA and gag-577
respectively. We purified 736 μg of A160T rHA-gag sample from 30 silkworms, andpurified 672 μg of D128S rHA-gag sample from 30 silkworms. VLPs diameter size
was measured by dynamic light scattering and morphological properties bytransmission electron microscope. Different rHA mutant-displaying gag protein
showed a shifting on dynamic light scattering distribution size peak and different sizeas transmission electron microscope picture concurs.

【目的】海綿動物門六放海綿綱カイロウドウケツのシリカ骨格中より発見されたタンパク質「グラシン」は，常温・中性条件下において，ケイ酸を添加すると，速やかにシリカ粒子を形成する．この現象から，グラシンはカイロウドウケツのシリカバイオミネラリゼーションに関与していると考えられている．一方でグラシンは，ヒスチジンとアスパラギン酸に富む HD 領域，プロリンに富む P
領域，ヒスチジンとスレオニンに富む HT 領域がスペーサーを挟んで 2 回繰り返されるタンデムリピート構造を取っており，既知のタンパク質と配列類似性がない．その特徴的な構造とシリカ形成能との相関は明らかではないため，本研究ではグラシン各領域のシリカ形成能を評価した．
【方法と結果】グラシン(全長)，グラシンの C 末端側のリピート構造（R2），C
末端側の各領域(HD2，P2，HT2)とグルタチオン S トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を構築した．続いて GST 部分をプロテアーゼで切断し，切断後のサンプルに対しケイ酸を添加して得られたシリカ量を定量することで，グ
ラシン各領域のシリカ形成能の強さを比較した．その結果，全長グラシンが最も高いシリカ形成能を示し，次に R2 が高く，HD2 からは低いシリカ形成能が確認された．一方で，P2 や HT2 からはシリカ形成能が見られず，グラシンのシリカ形成能を発揮する主領域は HD 領域であることが考えられた．ヒスチジ
ンとアスパラギン酸を交互に配置したポリペプチドでは電子リレー効果によってシラノール基の脱水縮合が促進されることが知られている．グラシンの HD
領域にも似たような配列が見られることから，同様の現象が起きているのではないかと考えられた．

Gag protein displaying different rHA mutants in silkworm

Identification of the region for silica formation in silica particle formation
promoting protein “glassin”○Muzajjad Gozal Goffar1, Vipin Kumar Deo2, Tatsuya Kato1,3, Y.Enoch Park1,3(1Fac. Agric., Shizuoka Univ., 2Office Int’l Collab., Shizuoka Univ., 3Res. Inst.
Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)○Michika Nishi1, Hiroki Kobayashi1, Tomohiro Bito2, Jiro Arima2,
Katsuhiko Shimizu3(1Grad. Sch. Agric. Tottori Univ., 2Fac. Agric., Tottori Univ., 3CoRE. Tottori Univ.)

Key words

Virus-like particles, Hemagglutinin, gag protein, Co-expression

Key words
Euplectella, silica particle formation, histidine rich protein,biomineralization

1Ip09

Study on efficient purification of recombinant proteinfrom the silkworm larval haemolymph targeting
pharmaceutical grade

1Ip11

イネディフェンシンの Candida albicans に対するアポトーシス誘導効果の解析○小川 広大 1, 落合 秋人 1, 福田 美南海 1, 田中 孝明 1, 提箸 祥幸 2,
谷口 正之 1
（1新潟大・自然研, 2農研機構・北農研）
ottie@eng.niigata-u.ac.jp○Robert Minkner1, Enoch Y. Park1,2,3(1Dept. of Biosci., Grad. Sch. of Sci. and Technol., Shizuoka Univ.,
2Coll. of Agric., Grad. Sch. of Integr. Sci. and Technol. Shizuoka
Univ., 3Green Chem. Res. Div., Res. Inst. of Green Sci. andTechnol., Shizuoka Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp
The silkworm Bombyx mori is a promising bioreactor for the production ofrecombinant proteins. Widely used Escherichia coli-based expression system provides
an advantages of the relatively low production cost and easily handling, yet posttranslational modifications are limited. On the opposite the silkworm as an insect
system can execute these post-translational modifications. However, the purification of
the haemolymph is challenging because of a high amount of host proteins. Mostly
purifications are done with a tag or with sucrose gradient centrifugations, but there isno systematically approach to purify from the haemolymph up to date. We have tried topurify GFP fusion protein GFPuv-β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2 from thehaemolymph as a model recombinant protein using only up scalable methods. To
reduce the amount of impurities before using chromatography, different kind of pretreatments were investigated. A centrifugation force with 500 g, 5 min was chosen, thesupernatant then subjected to a 2.5 % PEG precipitation and the precipitate was used in
the following chromatography steps. Anion exchange chromatography showed an
insufficient separation, but hydrophobic interaction chromatography could separate amajor part of the host proteins. Further, a ceramic hydroxyapatite column wasinvestigated for the intermediate purification step. After proofing this purification
principle, it was applied for the purification of enveloped virus-like particles expressedin silkworm and the results are discussed.

【目的】ディフェンシンは，生体防御に関わる先天性免疫物質として様々な生物種に存在する抗菌タンパク質である．当研究室では，長い食経験を持つイネから口腔内ヒト病原性真菌 Candida albicans に対して抗菌活性を示し，熱やプロテアーゼに対して高い安定性を示すディフェンシン OsAFP1 を見出した．植物ディフェンシンの多くは細胞膜損傷作用またはアポトーシス誘導により抗真菌活性を示すことが報告されている．これまでの研究により，OsAFP1 を処理したターゲット細胞においてアポトーシスが誘導されることを見出している．本
研究では，殺菌活性試験と二重染色による蛍光観察法を用いて，OsAFP1 がア
ポトーシスを誘導することにより C. albicans を殺菌することを明らかにする．
【方法と結果】OsAFP1，は大腸菌発現系を用いて組換えタンパク質として大量調製した．殺菌活性試験は，C. albicans 細胞（OD650 = 0.0125）を終濃度 16 μMの OsAFP1 を用いて 0~4 時間処理し，生菌数（CFU）を計測することにより行った．その結果，OsAFP1 の処理時間に伴い生菌数は減少したことから，OsAFP1
はターゲット細胞に殺菌的に作用することがわかった．また，同様に処理した
C. albicans 細胞にアポトーシス検出マーカーである FITC-AnnexinV と死細胞を検出する Propidium Iodide を処理し，蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察した．細
胞膜周辺の FITC 蛍光の蓄積から，OsAFP1 の処理後 0.5 時間においてほぼ全ての細胞に初期アポトーシスが誘導されたことがわかった．また，いずれの処理
時間においてもネクローシス細胞は観察されなかったことから，OsAFP1 はア
ポトーシス誘導により C. albicans に対して殺菌作用を示すことが示唆された．
現在，ターゲット細胞におけるカスパーゼ経路の活性化や DNA の断片化などを解析し，アポトーシス誘導効果の詳細な検証を進めている．

Study on efficient purification of recombinant protein from the silkworm
larval haemolymph targeting pharmaceutical grade

Analysis of apotosis induction of rice defensin against Candida albicans○Robert Minkner1, Enoch Y. Park1,2,3(1Dept. of Biosci., Grad. Sch. of Sci. and Technol., Shizuoka Univ., 2Coll. of Agric.,
Grad. Sch. of Integr. Sci. and Technol. Shizuoka Univ., 3Green Chem. Res. Div.,
Res. Inst. of Green Sci. and Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

silkworm haemolymph, purification, chromatography, separation○Kodai Ogawa1, Akihito Ochiai1, Minami Fukuda1, Takaaki Tanaka1,
Yoshiyuki Sagehashi2, Masayukii Taniguchi1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Niigata Univ., 2NARO/HARC)

Key words

OaAFP1, antifungal activity, apoptosis, Candida albicans

107

1Ip12

北海道白糠町産植物からの Aβ 凝集阻害物質の探索と機
能性評価

1Ip14

○渡邉 輝 1, 久保 研二 1, 杉村 康司 2, 大場 慶司 3, 上井 幸司 1,
徳樂 清孝 1
（1室工大院・工, 2熊大院・薬, 3東北大院・薬）tokuraku@mmm.muroran-it.ac.jp

高接着性蛋白質 AtaA の反復配列を利用した部分欠損体の構築と機能ドメイン探索○青木 壮太 1, 吉本 将悟 1,2, 石川 聖人 1, 堀 克敏 1
（1名大院・工, 2名大・VBL）
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景・目的】アルツハイマー病(AD)は高齢者で多くみられる認知症の中でも最も一般的な病型である．AD 発症の原因として，アミロイド β(Aβ)ペプチドが脳内で凝集，蓄積することで神経細胞死を引き起こし発症するアミロイド仮説が有力である．
本研究では，高い Aβ 凝集阻害活性を示す新たな植物の発見を目指し，北海道
白糠群白糠町に分布しているアイヌ伝承有用植物を含むサンプル抽出液 162 種
類のライブラリーを作成し，その Aβ 凝集阻害活性の評価を行った．また，特に活性が高い植物種については，活性本体の探索を行った．
【方法】
白糠町産の植物抽出物ライブラリーは次のように作成した．白糠町の海岸，湿地帯，山林等で植物 162 種を採取，洗浄後，重量を測定した．5 倍量のエタノー
ルにより 1 週間抽出，乾燥を行い，乾燥物を DMSO に溶解，分注し，-80 ℃にて冷凍保存した．Aβ 凝集阻害活性は微量ハイスループットスクリーニング法(MSHTS 法)と ThT 法により評価し，EC50(50%効果濃度)として数値を算出した．Aβ 細胞毒性緩和能評価は MTT アッセイにより評価した．
【結果と考察】
白糠町産アイヌ伝承有用植物を含む植物種 162 種類の Aβ 凝集阻害活性評価をしたところ，全 31 目中 7 目，全 55 科中 12 科，全 162 種中 42 種が EC50 値 0.1
mg/ml 以下の高い活性を有していることが明らかとなった．42 種中 9 種は，以前，本研究室で報告した 52 種類の香辛料 EtOH 抽出物の中で最も活性の高いス
ペアミント(EC50=0.018 mg/ml)（Ishigaki ら，2013）より高い Aβ 凝集阻害活性を有していることが明らかとなった．今回の発表では，植物の部位，採集時期，採集場所による活性の違い，Aβ 細胞毒性緩和能の評価結果についても報告する．

【背景と目的】Acinetobacter 属細菌 Tol 5 は，細胞表面に存在するファイバー蛋白質 AtaA を介して様々なマテリアル表面に対して非特異的かつ高い接着性を示す．そのため
AtaA はバイオプロセスにおける微生物触媒の新規固定化技術として期待されている．AtaA は 3,630 アミノ酸残基から成る巨大蛋白質で，多種多様なドメインで構成されている．それゆえに，AtaA は単一のドメインで接着するのか，あるいは複数のドメインがそれぞれ別の表面に対して接着性をもつことで分子全体として非特異接着性を示しているのかはわかっていない．各ドメインの接着への寄与を明らかにすることは，AtaA の非特異接着メカニズム解明に不可欠である．そこで本研究は，AtaA の部分欠損変異体を作製し，接着ドメインの特定を
目指した．
【方法】
AtaA の各ドメインを部分欠損した変異株(IFD)を構築し，ポリスチレンやガラスに対する接着性を AtaA 全長と比較することで，欠損したドメインの接着への寄与をみた．ただし，蛋白質の部分欠損体は常に構構造が崩れる懸念がつき
まとう．そこで，本研究では AtaA の各ドメインの間に存在するコイルドコイ
ル構造の周期性を利用して欠損領域をつなぐことで，AtaA 本来の三量体構造を崩さない IFD の設計を行った．さらに，完成した IFD はフローサイトメトリー
や電子顕微鏡によって表層提示量やファイバー形成を確認した．
【結果と考察】完成した IFD はその全てがフローサイトメトリー，電子顕微鏡によって菌体表層に正しく提示されていることを確認した．これは本研究の IFD の設計によって，ファイバー形成が阻害されていないことを示している．よって，各 IFD の接着性の評価は適切にできていると考えられる．さらに，IFD の接着試験によって，AtaA の接着に寄与するドメインを初めて明らかにした．

Screening of inhibitory substances for Amyloid-β aggregation from plants
found in the Shiranuka area of eastern Hokkaido and the functional
assessment

Construction of in-frame deletion mutants using repeat sequence andelucidation of functional domain of highly adhesive protein AtaA.
○Sota Aoki1, Shogo Yoshimoto1,2, Masahito Ishikawa1, Katsutoshi Hori1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2VBL,Nagoya Univ.)○Hikaru Watanabe1, Kenji Kubo1, Koji Sugimura2, Keji Oba3, Koji Uwai1,
Kiyotaka Tokuraku1(1Grad. Sch. Eng., Muroran Inst. Technol., 2Grad. Sch. Pharm. Sci., Kumamoto
Univ., 3Grad. Sch. Pharm. Sci., Touhoku Univ)
Key words
Alzheimer's disease, Amyloid-beta, Qdot, Shiranuka

Key words

Acinetobacter , adhesion, outer membrane protein

1Ip13

1Ip15

シアノバクテリアの分子シャペロンパラログの生化学的解析

麹菌界面活性タンパク質 RolA の固体表面への吸着過程解析○寺内 裕貴 1, 永山 恵美 1, 田中 拓未 1, 田邊 弘毅 1, 高橋 徹 1,
藪 浩 3, 有田 稔彦 3, 樋口 剛志 3, 阿部 敬悦 1,2（1東北大院・農, 2東北大・未来研, 3東北大・多元研）
yuki.terauchi@gmail.com○仲本 準, 山口 湧己（埼玉大院・理工・分子）
nakamoto@mail.saitama-u.ac.jp

Aspergillus oryzae の分泌する界面活性タンパク質であるハイドロフォビン RolA
は，固体表面に吸着し，β-アミロイド様の棒状自己組織化構造 rodlet を形成す
る．また，RolA は生分解性ポリエステル PBSA に吸着し，その後 PBSA 分解能を持つ酵素クチナーゼ CutL1 と相互作用して CutL1 を PBSA 表面に濃縮することで，PBSA 分解効率を上昇させる．ハイドロフォビンが固体表面吸着後に作る構造や示す機能は研究されてきているが，一方で，様々な特性を有する固体
表面とハイドロフォビンとの相互作用機構や，吸着の速度論的性質の詳細は不明である．
本報告では，固体表面に対する RolA の吸着過程と形成される構造に着目し，様々な性質を持った固体表面に対する RolA の吸着機構を解明することを目的とした．吸着速度論的解析に用いる Quartz Crystal Microbalance (QCM)の電極表
面を疎水性，正荷電性，負荷電性の性質を有する Self-assembled Monolayer (SAM)
化試薬で修飾し，液滴の接触角測定及び原子間力顕微鏡(AFM)で QCM 電極表面の改質の均一性を確認した．次に，これらの SAM 化表面に対して異なる pHの緩衝液中で RolA を吸着させ，QCM を用いて吸着過程を解析した．さらに，
SAM 化表面に形成された RolA 吸着構造を AFM で観察した．その結果，すべての性質の固体表面に対し，pH = 4 で吸着速度が非常に早くなり，自己組織化
構造が観察された．RolA の予測等電点が pI = 4.78 であることから，RolA は pI付近において固体表面に吸着力が増し自己組織化構造を形成することが示唆された．

【背景と目的】分子シャペロンは，非天然タンパク質の凝集抑制，折り畳みの介助，凝集塊の可溶化などの働きを通して，細胞のタンパク質恒常性の維持に深く関わる一群のタンパク質である．少なくともバクテリアに関する限り，このような textbook knowledge は，大腸菌を実験材料にした研究によって得られてきた．大腸菌には 1 種類の GroEL や ClpB しか存在しないのに対して，シアノ
バクテリアには，複数種の GroEL や ClpB パラログが存在する．興味深いことに，シアノバクテリアの GroEL1 は，発現調節，必須性や生化学的性質などにおいて，大腸菌と類似しているが，GroEL2 は著しく異なっていることを我々は明らかにしてきた（Nakamoto H, Kojima K. Physiol Plant. 2017）．本研究では，
シアノバクテリアの ClpB パラログの生化学的解析を行った．
【方法】シアノバクテリア（Synechococcus elongatus）の ClpBI と ClpBII を高度に精製した．オリゴマー構造はゲル沪過カラムクロマトグラフィー等で解析した．ATPase 活性（ADP の生成速度）の測定は分光学的に行った．熱変性ある
いは尿素変性処理したリンゴ酸あるいは乳酸脱水素酵素を基質にして折りたたみ反応を解析した．
【結果と考察】我々の比較生化学的解析結果とスウェーデンの Clarke らの clpB
変異株を用いた研究結果から，ClpBI は大腸菌型であるが，ClpBII は今までに報告されたことがないものであることが示唆された．これらの知見に基づき，シアノバクテリアの GroEL や ClpB をコードする（複数）遺伝子は，遺伝子重複後，片方がもともと担っていた機能を維持する一方で，もう片方の遺伝子が新規機能を獲得（neofunctionalization）したものではないかと考えた．

Analysis of adsorption process of Aspergillus oryzae hydrophobin RolA tovarious solid surfaces.

Biochemical analysis of paralogs of molecular chaperones in cyanobacteria

Key words
hydrophobin, Quartz Crystal Microbalance, Atomic force microscopy,
Self-assembed monolayer

Key words
heat shock protein, molecular evolution, molecular chaperone,cyanobacteria○Yuki Terauchi1, Megumi Nagayama1, Takumi Tanaka1, Hiroki Tanabe1,
Toru Takahashi1, Hiroshi Yabu3, Toshihiko Arita3, Takeshi Higuchi3, Keietsu Abe1,2(1Grad. Sch. Agric. Sci, 2NICHe., Tohoku Univ, 3IMRAM.,Tohoku Univ)○Hitoshi Nakamoto, Yuhki Yamaguchi(Dept. of Biochem. Mol. Biol., Grad. Sch. Sci. Eng. Saitama Univ.)

108

1Ip16

Effect of pH change on the function of a transcriptional
regulator in acetic acid bacteria

1Ip18○Afi Candra Trinugraha1, Yuri Ishii1, Yuki Shige1, Naoki Akasaka2,
Wakao Fukuda1, Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Marukan
Vinegar Co., Ltd.)fujiwara-s@kwansei.ac.jp

カルボキシソーム外殻タンパク質 CcmO の機能解析○中村 隆太郎 1, 中口 雄貴 2, 三木 智寛 2, 松村 洋寿 1, 福谷 洋介 2,
野口 恵一 2, 養王田 正文 2, 尾高 雅文 1,2（1秋田大院・理工, 2農工大院・工）modaka@gipc.akita-u.ac.jp

pH change in cytoplasm seems to affect the function of transcriptional regulator invivo. The intracellular pH in acetic acid bacterium Komagataeibacter europaeus
decreased from pH 6.3 to 4.7 depending on cell growth phase by produced acetic acid(1). In contrast, intracellular pH in Eschericia coli was maintained at pH 7.2 to 7.8
during all growth phases. In the present study, we focused on leucine responsiveregulator of K. europaeus (KeLrp) (2) and examined an effect of pH change on KeLrp
function in comparison with that of E. coli (EcLrp).
Histidine-tagged EcLrp and KeLrp were obtained as a recombinant form. To evaluate
DNA binding property, operator regions of ilvIH were respectively isolated from K.
europaeus and E. coli and labeled with IRD700. The DNA probe containing each
operator displayed a typical band shift with increasing concentrations of KeLrp or
EcLrp. Binding efficiency at different pH conditions (from pH 4.0 to 8.0) were
evaluated. The series of gel-shift assays indicated that EcLrp binds to its operator DNA
with higher affinity at pH 7.0 and pH 8.0 than at pH 4.0 to 6.0. In contrast, KeLrp
binds to its operator DNA with higher affinity at pH 4.0 and 5.0 than at pH 6.0 to 8.0,
suggesting that respective Lrps function optimally at their cytoplasmic pHs. Structural
analyses with CD spectrum between EcLrp and KeLrp at various pH conditions are in
progress for understanding their structure-function relationship.
(1) Shige et al., Abstracts of the 69th Annual Meeting of the Society for
Biotechnology, Japan, September 11-14, 2018, (2) Ishii et al., J. Biosci. Bioeng.125,
67-75 (2018)

カルボキシソームは藍藻類が有する直径 150nm 程のタンパク質コンパートメン
トであり，RubisCO を内包している．我々はカルボキシソームをナノリアクターなどに利用する技術開発を目指し，研究を進めている．遺伝子欠損体の電子顕微鏡観察から，7 種類の外殻タンパク質のうち CcmK2，CcmL，CcmO の 3 種がコンパートメント形成に必須と考えられている．本研究では，この中で唯一立体構造の報告されていない CcmO に着目し，機能解析を行なった．
大腸菌発現系により，CcmO 組換え体を作製し，動的光散乱法，透過型電子顕微鏡により形態観察したところ，CcmO がコンパートメント様構造やシート様構造の重合体を形成することが明らかになった．これまで，カルボキシソーム
外殻タンパク質によるコンパートメント様構造や重合体の形成は報告されておらず，CcmO がカルボキシソームのコンパートメント形成において重要な役割を担っている可能性が示唆された．
アミノ酸一次配列比較と高次構造予測により，CcmO の C 末端に disorder していると予想される 40 残基程のアミノ酸配列が存在することがわかった．現在，
C 末端アミノ酸配列を欠損させた CcmO を作製し，解析を行なっている．また，コンパートメント形成に必須とされている CcmK2 と CcmL 共存下での重合体形成についての解析も進めている．

Effect of pH change on the function of a transcriptional regulator in acetic
acid bacteria

Functional Analysis Of Carboxysome Shell Protein, CcmO

Key words
leucine-responsive regulatory protein, intracellular pH, acetic acidbacteria, acidophiles

Key words

protein

1Ip17

1Jp01

好熱菌発酵産物の給与が Sod1 ノックアウトマウスに与える影響○Afi Candra Trinugraha1, Yuri Ishii1, Yuki Shige1, Naoki Akasaka2,
Wakao Fukuda1, Shinsuke Fujiwara1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Marukan Vinegar Co., Ltd.)

複数発現でのみ機能発現する走化性センサータンパク質の特性化○堀 雄一, 緋田 安希子, チュンチャイ マッタナ, 田島 誉久,
加藤 純一（広島大院・先端物質）
jun@hiroshima-u.ac.jp○Ryutaro Nakamura1, Yuki Nakaguchi2, Tomohiro Miki2, Hirotoshi Matsumura1,
Yohsuke Fukutani2, Keiichi Noguchi2, Masafumi Yohda2, Masafumi Odaka1,2(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)○鷺 陽香 1, 戸田 年彦 2, 小澤 裕介 2, 加藤 完 3, 中西 裕美子 3,
大野 博司 3, 宮本 浩邦 1,3,4, 清水 孝彦 2, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2千葉大院・医, 3IMS理研, 4サーマス）
kodama@faculty.chiba-u.jp【目的】走化性とは，運動性細菌がセンサータンパク質（MCP）により化合物を感知して移動する行動である．細菌はそれぞれ複数の MCP を有し，本研究の解析対象である青枯病菌 Ralstonia solanacearum は 22 種類の MCP を保有する．当研究室はこれまでの解析で，本菌の 22 MCP 全破壊株に各 MCP をそれぞれ単独で発現させると，一部の MCP は機能しないという現象を発見した．このような報告は他になく，青枯病菌には未知の走化性機構が存在する可能性が示唆された．そこで本研究では，青枯病菌の単独では機能しない D-リンゴ酸セ
ンサー McpT およびクエン酸センサー McpC をモデルとして，MCP 機能発現メ
カニズムの解明を試みた．
【方法・結果】MCP は膜貫通タンパク質であり，ペリプラズム領域でリガンド化合物を感知し，細胞質領域でそのシグナルを下流へと伝達する．単独発現時における McpT／McpC の機能不全が，いずれの機能不全に起因するのか解析を試みた．まず，各 MCP のリガンド結合能について解析した．MCP のリガンド結合領域（LBD）のみを大腸菌で発現し精製したものを解析に供した．化合物と結合することでタンパク質の熱変性温度（Tm 値）が上昇するという現象を利用して，精製した各 Mcp LBD の機能を評価した．温度変化に伴う円二色性
変化より各々 Tm 値を算出したところ，リガンド添加による各 Mcp LBD の Tm
値の上昇は見られなかった．また，円二色性スペクトルから推定された各 Mcp
LBD の α-ヘリックス含量は，いずれも理論値と比較してかなり低い値であった．これらの結果から，McpT／McpC は単独では構造が不安定であり，リガン
ド化合物と正しく結合できない可能性が示唆された．この可能性についてさらに詳細に解析するために，単独では機能しない MCP（McpC／McpT）と単独でも機能する MCP の LBD とシグナル伝達領域をそれぞれ入れ替えた「キメラMCP」を構築中である．

【背景と目的】未利用の海産資源を 70℃～80℃の高温下で発酵させた発酵産物(以下，好熱菌発酵産物)は，家畜・家禽類の混合飼料として利用されている．
モデル動物を用いた実験では肝臓や筋肉における過酸化脂質の蓄積抑制効果や抗酸化能の向上効果が確認されている．そこで，本研究では，好熱菌発酵産物の給与による抗酸化機能の分子機序を解析することを目的とした．そのために，
抗酸化酵素である Superoxide dismutase 1 (SOD1) を欠損し，活性酸素による酸化ストレスを除去できない Sod1 ノックアウトマウスに対して，腸内細菌叢の変化
ならびに盲腸糞，肝臓，腓腹筋における代謝産物の変化について解析した．
【方法と結果】Wild type (WT) 群 (Sod1+/+), Knockout (KO) 群 (Sod1-/-), 好熱菌発酵
産物給与群 (Sod1-/- + compost)の 3 群 (各 9 匹) について，4 週齢から 15 週齢の約
2 か月間飼育した．15 週齢時に盲腸糞，肝臓，腓腹筋を採取し，次世代シークエンスを用いた盲腸糞中の菌叢の解析，および GC-MS を用いた盲腸糞，肝臓，
腓腹筋のメタボローム解析を行った．その結果，有意差はないものの，好熱菌
発酵産物給与群で Bacteroidetes 門と Proteobacteria 門の増加傾向，Firmicutes 門と Actinobacteria 門の減少傾向が見られた．これらの菌叢の変化は WT のマウスに好熱菌発酵産物を給与した場合と同様の傾向であった．またメタボローム解
析の結果，アミノ酸や解糖系および TCA 回路に関わる分子に変化が見られた．
このように好熱菌発酵産物の給与により腸内細菌叢や代謝産物に変化が生じたが，Sod1-/-マウスの表現型には顕著な変化が確認できなかった．以上の結果か
ら，好熱菌発酵産物の給与による抗酸化機能の向上において Sod1 が重要な役割を果たしている可能性が期待された．

Characterization of unfunctional chemosensory proteins in absence ofothers

Effects of thermophile-fermented compost on the intestinal microbiota andliver metabolites of Sod1 knockout mouse○Yuichi Hori, Akiko Hida, Mattana Tunchai, Takahisa Tajima, Junichi Kato
(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words
receptorchemotaxis, chemosensory protein, Circular Dichroism, chimeric○Haruka Sagi1, Toshihiko Toda2, Yusuke Ozawa2, Tamotsu Kato3,
Yumiko Nakanishi3, Hiroshi Ohno3, Hirokuni Miyamoto1,3,4, Takahiko Shimizu2,
Hiroaki Kodama1(1Grad. Sch.Horticul.,Chiba Univ., 2Grad. Sch.Med.,Chiba Univ., 3IMS,RIKEN,
4
Sermas)
Key words
SOD, intestinal microbiota, metabolic analysis

109

1Jp02

吉草酸を産生するブタ排泄糞由来の乳酸資化菌
Megasphaera elsdenii Y2 株の有機酸代謝の特徴

1Jp04○荒岡 亮祐 1, 吉川 翔太 2, 井藤 俊行 3, 宮本 浩邦 1,4,5, 児玉 浩明 1
（1千葉大院・園芸, 2千葉大院・融合, 3京葉プラントエンジニア
リング, 4理研・IMS, 5サーマス）
Kodama@faculty.chiba-u.jp

Target-AID を利用したゲノム編集による高収率ブタノー
ル発酵性クロストリジウム属微生物の育種○向山 正治 1, 市毛 栄太 1, 田中 勉 2, 西田 敬二 3, 近藤 昭彦 3
（1日本触媒, 2神戸大院・工, 3神戸大院・科技イノベ）
masaharu_mukoyama@shokubai.co.jp【背景と目的】乳酸菌はプロバイオティクスとして用いられることが多いが，一方で乳酸菌の産生した乳酸は宿主動物の腸管でほとんど吸収されないため，乳酸を代謝し，短鎖脂肪酸（SCFA）を産生する乳酸資化菌は宿主動物にとって重要な働きをすると考えられる．当研究室では乳酸資化菌の Megasphaera elsdeniiに注目し研究を行い，これまでに，ブタ排泄糞より 7 種類の M. elsdenii を単離している(1)．これらの菌株の，乳酸を基質とした有機酸代謝を M. elsdenii
JCM 1772T 株（標準菌株）と比較したところ，標準菌株が酢酸，プロピオン酸を産生するのに対し，単離菌株はいずれも吉草酸を最も多く産生した．本研究では，ブタ排泄糞から単離された M. elsdenii の乳酸資化に関わる代謝の特徴を調べ，さらに，乳酸を利用した吉草酸の工業的な生産の可能性について検討を行った．
【方法と結果】7 種類の単離菌株を代表して，Y2 株を研究に使用した．まず，基質にグルコースと乳酸を含む GAM+乳酸培地を用いて，標準菌株と Y2 株の有機酸産生を調べた．標準菌株では時間経過に伴って，酢酸，プロピオン酸に次いで，酪酸，吉草酸を産生した．それに対して，Y2 株は培養初期に酢酸，プロピオン酸を産生し，その後はそれらを消費しつつ吉草酸，酪酸を産生した．
その一方で，グルコースのみを基質とした場合には，Y2 株は酪酸を主に産生した．Y2 株による吉草酸の産生における酢酸，プロピオン酸の必要性について調べるために，基質として酢酸とプロピオン酸のみを加えた培地で培養試験を行うと，Y2 株は吉草酸を産生した．現在，吉草酸の産生量が増加する条件の検討を行っている．
(1) Yoshikawa et al. (2018) J. Biosci. Bioeng. 125. 519-524【目的】n-ブタノールは化学品，自動車燃料として利用可能であるため，再生可能原料からの ABE 発酵が再検討されているが，ブタノール収率が低い問題がある．Clostridium saccharoperbutylacetonicum ATCC27021 株の pta と ptb1 の二つの遺伝子機能を破壊すると n-ブタノール収率が高くなることを見出しており，ゲ
ノムを切らないゲノム編集技術 Target-AID1)を利用して菌株構築を進めている．
pta の破壊と PTB1 の P148S，V251I，A219T，G155R の改変ができたことを 2017年度日本生物工学会大会において報告した．2) 今回は，PTB1 の改変を重ねることで ptb1 の機能を破壊しブタノール高収率株を作成した結果． さらにアセトン生成に関わる ctfB の改変によってアセトンを生成しない株を得た結果について報告する．
【方法】C. saccharoperbutylacetonicum ATCC27021Δpta 株（Target-AID による pta
破壊株）に対して PTB1 の P148，G155，V251 を改変しブタノール収率向上に効果があった改変点を組み合わせることでブタノール高収率株を作成した．また CTFB に対して P85，P121，P112，P112 を改変するプラスミドを処理し得られた株のアセトン生成を評価した．
【結果】pta 破壊株に対して PTB1 の P148L，G155R，G155E を改変した株は有意にブタノール収率が向上し，その傾向は P148S>G155R>G155E>V251I であった．P148S と G155R の改変を重ねることで GroupII イントロンで作成した
ΔptaΔptb1 株と同等の高いブタノール収率を示す株が得られた． また上記の株の CTFB を P121L に改変することによってアセトン生成がなくなり Target-AIDを用いたホモブタノール発酵菌株を得ることができた．
1)Nishida et al. Science 2016:Vol. 353, Issue 6305, aaf8729
2)向山，市毛，田中，西田，近藤 2018 年度日本生物工学会大会要旨集

Lactate metabolism and valerate production by Megasphaera elsdenii Y2
strain isolated from pig feces

Breeding of high yield butanol fermentative Clostridia by genome editing
with Target-AID○Ryosuke Araoka1, Syota Yoshikawa2, Toshiyuki Ito3, Hirokuni Miyamoto1,4,5,
Hiroaki Kodama1(1Grad. Fac. Horticul., Chiba Univ., 2Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.,
3
Keiyo Plant Eng., 4RIKEN IMS, 5Sermas)○Masaharu Mukoyama1, Eita Ichige1, Tsutomu Tanaka2, Keiji Nishida3,
Akihiko Kondo3(1Nippoon Shokubai Co., Ltd., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 3Grad. Sch. Sci.
Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
valetate

Megasphaera elsdenii, lactate-utilizing bacteria, short-chain fatty acids,

Key words
butanol, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Target-AID,
Genome editing

1Jp03

好熱菌発酵産物の給与がブタ腸内の乳酸資化菌
Megasphaera elsdenii の多様性に与える影響

1Jp05○板谷 かえで 1, 吉川 翔太 2, 新名 俊仁 3, 宮本 浩邦 2,4,5,
児玉 浩明 1,2
（1千葉大・園芸, 2千葉大院・融合, 3京葉プラントエンジニアリ
ング, 4サーマス, 5理研・IMS）
kodama@faculty.chiba-u.jp

Influence of pH controllers on alginate beads containing
co-immobilized Clostridia during acetic acidfermentation
Siew Thing Phang, ○Harifara Rabemanolontsoa, Shiro Saka
(Dept. Socio-environment Energy Sci., Grad. Sch. Energy Sci.,
Kyoto Univ.)
rabemanolontsoa.harifara.5c@kyoto-u.ac.jp【背景と目的】海産資源を 70~80℃の高温下で発酵させた飼料(以下，好熱菌発酵産物)をブタに給与すると，死産率の低下，成長促進，筋肉中の余分な脂肪分の減少など様々な生理作用が認められる．この時，ブタの排泄糞では糞中の乳酸含量が低下することから，乳酸代謝に関わる腸内細菌叢の変化が示唆された．
実際に菌叢を解析すると，好熱菌発酵産物給与区では乳酸から短鎖脂肪酸を産生する乳酸資化菌である Megasphaera elsdenii が有意に増加していた．本研究では，好熱菌発酵産物の給与区・非給与区のブタ排泄糞から当該菌種を単離し，遺伝子型により分類するとともに，その乳酸代謝に関する特性を明らかにすることを目的とした．
【方法と結果】好熱菌発酵産物の給与区・非給与区から各 4
頭の豚の排泄糞を回収した．当該糞サンプルを選択培地に塗布した結果，M.
elsdenii 候補菌群として給与区から 41 コロニー，非給与区から 54 コロニーを単離した．単離菌群について，M. elsdenii に特異的なプライマーを用いて菌種を簡易同定するとともに，ERIC-rep-PCR で遺伝子型を基にグループ分けしたとこ
ろ，給与区は 12 グループ, 非給与区は 7 グループに分けることができた．このことから，好熱菌発酵産物の供与によって M. elsdenii の多様性が増す可能性が示唆された．給与区・非給与区において，最も多く単離されたグループの遺伝
子型は共通であったが，2 番目以降のグループの遺伝子型は異なっていた．そこで，給与区・非給与区で，ともに最も多く単離されたグループから 1 株，また 2 番目と 3 番目に多く単離されたグループから，それぞれ代表株を選抜した．
代表菌株(計 5 株)について 16S rRNA 遺伝子配列を決定したところ，M. elsdeniiの 16S rRNA 遺伝子配列と高い相同性(99％以上)を示した．さらに，各代表菌株の有機酸産生能を調べたので，その結果を報告する．

An important aspect of biorefinery is the conversion of biomass to organic acids as
platform chemicals. Acetic acid has an extensive range of applications in polymer,
textile, food and energy industries. For bioproduction of acetic acid, co-immobilized
Moorella thermoacetica (Clostridium thermoaceticum) and Clostridium thermocellumin calcium alginate beads were used under pH-controlled fed-batch fermentation. This
study evaluates the effects of Na(OH) and Ca(OH)2 aqueous solutions as pH controllers
on acetic acid yield and on the integrity of alginate beads containing the immobilized
microorganisms using glucose and cellobiose as substrates. It was found that acetic
acid yields were comparable for Na(OH) and Ca(OH)2. However, Na(OH) solubilized
the beads after 6 days of fermentation. To explain this phenomenon, we propose amechanism showing the dissolution of calcium alginate by sodium ions. Ca(OH)2, on
the other hand, contributed to maintain alginate beads in solid form even after 20 daysof fermentation. Conclusively, Ca(OH)2 is recommended as pH controller for longer
fermentation time, and would also facilitate separation and reusability of the
biocatalysts so that bioprocessing cost would be reduced.

Diversity of lactic acid-utilizing bacteriumMegasphaera elsdenii in theintestine of pigs fed with a thermophile-fermented compost

Influence of pH controllers on alginate beads containing co-immobilized
Clostridia during acetic acid fermentation○Kaede Itaya1, Shota Yoshikawa2, Toshihito Shinmyo3, Hirokuni Miyamoto2,4,5,
Hiroaki Kodama1,2(1Fac. Horticul., Chiba Univ., 2Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ., 3Keiyo
Plant Eng., 4Sermas, 5RIKEN IMS)

Key words
microbiota

Megasphaera elsdnii, lactate-utilizing bacteria, compost, gut

Siew Thing Phang, ○Harifara Rabemanolontsoa, Shiro Saka
(Dept. Socio-environment Energy Sci., Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.)

Key words

acetic acid, immobilized bacteria, alginate, Clostridium

110

1Jp07

光駆動 ATP 再生系による Vmax 細胞の創製
弘埜 陽子 1, 戸谷 吉博 2, 叶 暁亭 3, 石井 純 3, 柘植 謙爾 3,
松田 史生 2, ○原 清敬 1（1静県大院・食栄環・環境科学, 2阪大院・情報・バイオ情報, 3神
戸大院・イノべ）
k-hara@u-shizuoka-ken.ac.jp

1Jp09

代謝動態制御を介して菌体集団規模を制御する Quorum
Sensing 型遺伝子回路の構築とメタボローム解析による機能評価○相馬 悠希 1,2, 篠原 玉樹 2, 藤原 由梨 2, 角田 一真 2, 秦 康祐 2,
和泉 自泰 1,2, 馬場 健史 1,2（1九大・生医研, 2九大院・シス生科）
y-soma@bioreg.kyushu-u.ac.jp

大腸菌や出芽酵母などの微生物に代謝工学的な改良を施し，医薬品や食品，化粧品，燃料，ポリマー原料等の様々な有用物質の発酵生産性を向上させる研究が行われている．しかし，目的物質の生産性が向上するにつれ，微生物が細胞内エネルギー不足に陥り，生育の低下や目的物質の生産性の頭打ちに直面する
ことが少なくない．これは，発酵そのものが，インプットである炭素源を，「細
胞自身の材料（Cell mass）」，「目的生産物」，「細胞内エネルギー」の 3 つのアウ
トプットに振り分けるプロセスであり，これらがトレードオフの関係にあることに，根本的な原因が存在すると考えられる．そこで我々は，この三つ巴の状
態にある発酵プロセスから「細胞内エネルギー」を切り離すべく，本来は光エネルギーを利用できない微生物に，光リン酸化能を賦与することで，光エネル
ギーを利用可能にする新しい光駆動エネルギー再生型有用物質生産宿主（Vmax細胞）の開発を目指している．
具体的には，高度好塩菌 Haloterrigena turkmenica が有する光駆動プロトンポン
プであるデルタドプシンを，大腸菌の細胞膜に発現させた．生化学的手法および生物物理化学的手法により，デルタロドプシンが大腸菌の細胞膜で機能していることを確認した．また，デルタロドプシンを出芽酵母のミトコンドリアに発現させた．その結果，細胞内の ATP 濃度が光依存的に高まった．さらに，生合成に ATP の加水分解エネルギーを要する物質の濃度が，光依存的に高まった．本発表では，我々の Vmax 細胞の開発過程で得られた知見について報告する．

【背景】 合成生物学では，様々な生命現象を担う生物学的システムの設計原理の解明を目指して，生体分子をビルディング・ブロックとした新規生体分子や生体分子ネットワークの設計・再構築が行われてきた．その結果，近年では医学・工学・農学などの幅広い分野において応用が期待される生物工学ツールの創出へと発展している．人工遺伝子回路やバイオセンサーは，遺伝子発現の設
計依存的制御を可能とするツールとして，細胞の表現型・応答・行動の再設計への活用が期待されている．本研究では，大腸菌の代謝制御を介した菌体増殖・
菌体集団規模の制御を目的とする人工遺伝子回路を構築し，メタボローム解析
による回路機能評価に取り組んだ．
【方法・結果】 Quorum Sensing (QS) は，真正細菌が菌体密度を感知して集団で遺伝子発現を制御するための細胞間シグナル伝達機構である．Vibrio fischeri 由
来の QS である lux 系を大腸菌内で再構成し，その制御下に TCA 回路の初発反応を担う酵素遺伝子 (gltA) を置くことで，菌体密度が高まると TCA 回路を遮断
して好気的増殖を抑制する合成 lux 系を構築した．この様な自己抑制的な QS 機
能は，競合相手が存在する環境下で自己集団の優位を確立するための障害となり，進化過程において淘汰され易いと考えられる．一方で，資源の枯渇を免れるために協調して集団規模を調整する機能を有するため，競合相手不在の閉鎖的空間に達すれば，自己集団の持続的発展に不可欠な戦略でもある．この人工遺伝子回路を実装した大腸菌に対して，継代培養による実験室進化を実施する
ことで，協調的かつ自己抑制的な集団規模調整機能の微生物集団の進化過程における安定性を評価した．この際，メタボローム解析を用いた高精度定量表現
型解析を実施することで進化に伴う表現型の変遷を詳細に追跡し，回路機能の安定性との相関を明らかにした．

Development of photo-energetic cell factory

Construction of a Quorum Sensing-type genetic circuits that control the cell
population size via dynamic metabolic flux control and functional evaluation
by metabolome analysis

Yoko Hirono1, Yoshihiro Toya2, Ye Xiaoting3, Jun Ishii3, Kenji Tsuge3,
Fumio Matsuda2, ○Kiyotaka Hara1(1Dept. Environ. Sci., Gra. Sch. Nutri. Environ. Sci, Univ. Shizuoka, 2Dept. Bioinfo.
Eng., Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 3Gra. Sch. Sci., Technol. Innov., Kobe Univ.)○Yuki Soma1,2, Tamaki Shinohara2, Yuri Fujiwara2, Kazuma Sumida2,
Kosuke Hata2, Yoshihiro Izumi1,2, Takeshi Bamba1,2(1Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Syst. Life Sci., Kyushu Univ.)

Key words

smart cell, rhodopsin, ATP, synthetic biology

Key words
analysis

synthetic biology, metabolic engineering, genetic circuit, metabolic

1Jp08

ロドプシンを利用した大腸菌における光駆動 ATP 再生

1Jp10

チロシンの水酸化反応を最適化することによるベンジル
アルカロイド生産大腸菌プラットフォーム株の改良○鎌田 健太郎 1, 戸谷 吉博 1, 弘埜 陽子 2, 原 清敬 2, 松田 史生 1,
清水 浩 1（1阪大院・情報・バイオ情報, 2静岡県大院・食品栄養環境・環境科学）
shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp○中川 明, 松村 栄太郎, 八島 悠里乃, 高尾 美月, 南 博道
（石川県大・生物資源研）
minami@ishikawa-pu.ac.jp【背景と目的】
大腸菌などの微生物を用いた物質生産は，環境への負荷が少ない反面，収率が低いという問題点がある．これは，微生物が物質生産に必要な ATP を，呼吸を介して再生しているからだと考えられる．そこで，ロドプシンを用いた ATP 再生システムに着目した．ロドプシンは，光の照射によりプロトンの細胞外への輸送を促すため，ロドプシンを大腸菌細胞膜で発現させれば，呼吸を介さずにATP を再生できる．本研究では，ロドプシンを用いた光駆動 ATP 再生システムを構築し，ロドプシンの機能を解析した．
【方法と結果】
高度好塩菌 Haloterrigena turkmenica 由来のデルタロドプシンを導入した大腸菌株を構築した．培養は 4 g/ L グルコース含む M9 培地を用いて，好気条件下で回分培養を行った．培地中の代謝物濃度は HPLC，菌体濁度は吸光光度計を用いて測定した．比増殖速度およびグルコース比消費速度は光照射条件・暗所条
件間で差が見られなかった．培養中の菌体を集菌後，非緩衝溶液に懸濁し，光の点灯・消灯を繰り返すことによる細胞外 pH の変化を観察したところ，光照
射時にのみ pH が減少した．この結果から，デルタロドプシンが大腸菌細胞膜で機能的に発現していることが確認された．

ベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)は植物の 2 次代謝産物であり，2500
種以上が知られている．その多くは強い生理活性を持つと考えられ，モルヒネ，
コデイン，ベルベリンといった実際に医薬品または医薬品原料として利用されているものもある．しかし，BIA はその複雑な分子構造から，化学合成が難し
く，その生産は植物からの抽出により行われてる．植物からの抽出は，広大な土地や栽培の手間等，コストがかかり，実際，BIA 派生医薬品は比較的高価である．BIA の殆どは(S)-reticuline を中間体とするため，安価な(S)-reticuline 生産
系の構築は様々な BIA 生産に応用可能である．そこで，安価な BIA 実用生産系の構築を目的とし，我々は，大腸菌を用いた(S)-reticuline 生産菌，すなわち，
BIA 生産プラットフォームを構築してきた．しかし，その生産量は，まだ実用レベルには程遠く，更なる改良が必要であった．
単純な炭素源からの(S)-reticuline 生産においては，基質としてチロシンが生成され，チロシンは水酸化反応を経て，DOPA に転換される．しかし，生産培養後の培地中には mM レベルのチロシンが余っていることから，チロシンの水酸化反応が弱いことが，生産量が少ない一因になっていることが考えられた．そこで，今回，チロシンの水酸化反応を複数の生物種由来のチロシナーゼ，チロ
シンヒドロキシラーゼ，4-ヒドロキシフェニル酢酸 3-酸素添加酵素を用いて，我々の構築したプラットフォーム株に最も適したチロシン水酸化反応を選抜した．その結果，1 mM 近い(S)-reticuline の生産量を示し，初めて発表した生産量の 7 倍もの改良に成功した．
本発表では，多段階反応系による物質生産についてその研究の進め方や酵素選抜の重要性について議論したい．

Light-driven ATP regeneration by rhodopsin in Escherichia coli

Improvement of Escherichia coli platform for benzylisoquinoline alkaloid
production by optimization of tyrosine hydroxylation○Kentaro Kamata1, Yoshihiro Toya1, Yoko Hirono2, Kiyotaka Hara2,
Fumio Matsuda1, Hiroshi Shimizu1(1Dept. Bioinfo. Eng., Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Dept. Environ. Sci., Gra. Sch.
Food Nutr. Environ. Sci., Shizuoka Univ.)

Key words

Escherichia coli, rhodopsin, ATP regeneration, metabolic engineering○Akira Nakagawa, Eitaro Matsumura, Yurino Yashima, Miduki Takao,
Hiromichi Minami(Res. Inst. Bioresour. Biotechnol., Ishikawa Pref. Univ.)

Key words

Escherichia coli, hydroxylation, enzyme reaction

111

1Jp11

大腸菌による L-theanine の発酵生産法の開発○大野 翔登, 林 幹朗, 田畑 和彦（協和発酵バイオ・リサーチ＆イノベーションセンター）
mikiro.hayashi@kyowa-kirin.co.jp

1Jp13

海水培養が可能なシアノバクテリアへの亜リン酸資化能の付与○堀川 凌平 1, 本村 圭 1,2, 神原 亮大 1, 戸田 成美 1, 池田 丈 1,
石田 丈典 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1,2, 廣田 隆一 1,2（1広島大院・先端物質, 2JST・ALCA）
hirota@hiroshima-u.ac.jp

L-theanine は緑茶の旨味成分として知られるグルタミン酸誘導体の一種である．
集中力向上効果やリラックス効果，快眠効果等の作用が報告されており，国内
外で健康食品素材として使用されている．茶葉における L-theanine の生合成経路の詳細は未解明であるが，L-theanine の製法としては茶葉からの抽出法やエチルアミン，グルタミンを原料とした酵素法がこれまでに開発されている．しかしながら，酵素法にて添加するエチルアミンは引火性のある危険な化合物であり，工業原料として用いるには特殊な設備を必要とするため製造コストが高い．エチルアミンを生合成で供給できれば問題を回避できるが，そのような報告はなかった．そこでアセトアルデヒドを基質としてエチルアミンを生成する
アミノトランスフェラーゼを探索した結果，新規の酵素を見出した．本酵素を利用してエチルアミンを供給し，さらに生成したエチルアミンとグルタミン酸
から L-theanine を合成する人工合成経路を設計し，in vitro 酵素反応で実証した．
基質となるアセトアルデヒド，アラニン，グルタミン酸は生物に広く存在する
生化学物質である．そこで，大腸菌 K-12 株を宿主としてこれらの基質供給の強化を実施し，L-theanine の人工合成経路を導入した．結果，グルコースとアンモニアを原料として L-theanine を大量に発酵生産することに成功した．

【目的】 有用微細藻類を利用した物質生産は，光合成により二酸化炭素を吸収して行えるため，グリーンバイオテクノロジーの中心的技術の一つとして注目されている．有用微細藻類の実用化は，コストが低く，管理が容易であるオー
プンポンドの様な屋外開放系での培養が望まれる．しかし，屋外での培養は雑菌のコンタミネーションにより生産性を維持することが難しいという課題がある．当研究室では，通常の生物が利用できない亜リン酸（HPO32-）に対する資化能を宿主生物に付与し，亜リン酸をリン源として供給することで目的生物だけを選択的に増殖させることができる技術を開発した．これまでに淡水性シアノバクテリア Synechococcus elongatus PCC 7942 に本手法が適用可能であることを示した．しかし，実用的な培養における水資源利用の観点から，海水の使用が望まれる場合も想定される．そこで本研究では，海水を使用した培養が可能なシアノバクテリアへの本手法の適用を試みた．
【方法・結果】 海洋性シアノバクテリア Synechococcus sp. PCC 7002 に Anabaena
sp. PCC 7120 の亜リン酸輸送体（PtxABC）及び亜リン酸デヒドロゲナーゼ（PtxD）を導入し，亜リン酸資化能を付与した．その結果，PCC 7120 の Ptx 遺伝子を導入した株では，亜リン酸をリン源とした MA2 培地における増殖速度がリン酸使用時に比べやや劣るものの最終菌体濃度は同等の値を示した．しかし，亜リン酸使用時では，クロロフィル量が低下していることが示唆された．
また，耐塩性を有する淡水性シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 に対しても同様に亜リン酸資化能を付与した他，由来が異なる複数種の PtxD 遺伝子を導入した株を作製した．現在，これらの株の人工海水培地における増殖を調べている．

Development of the fermentative production process of L-theanine by

Application of phosphite oxidizing system to cyanobacteria that can growunder seawater condition

Escherichia coli

○Shoto Ohno, Mikiro Hayashi, Kazuhiko Tabata(KYOWA HAKKO BIO CO., Ltd. Research and Innovation Center)○Ryohei Horikawa1, Kei Motomura1,2, Akihiro Kanbara1, Narumi Toda1,
Takeshi Ikeda1, Takenori Ishida1, Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1,2,
Ryuichi Hirota1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2ALCA, JST)Key words

L-theanine, aminotransferase, direct fermentation, Escherichia coli

Key words

phosphite, contamination, cyanobacteria, seawater

1Jp12

Metabolic engineering of Escherichia coli for productionof shikimate pathway derivatives

1Jp14

亜リン酸依存性を利用したシアノバクテリアのバイオ
セーフティ技術○Ryosuke Fujiwara1, Shuhei Noda2, Tsutomu Tanaka1,
Akihiko Kondo1,2,3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2BMEP, RIKEN, 3Grad. Sch. Sci.
Technol. Innov., Kobe Univ.)
tanaka@kitty.kobe-u.ac.jp○佐野 公亮 1, 本村 圭 1,2, 神原 亮大 1, 渡辺 智 2,3, 池田 丈 1,
石田 丈典 1, 舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1,2, 廣田 隆一 1,2（1広島大院・先端物質, 2JST・ALCA, 3東農大院・農）hirota@hiroshima-u.ac.jp

Shikimate pathway is one of the most important metabolic pathways in bacteria forsynthesizing various aromatic compounds including aromatic amino acid.
Intermediates of the shikimate pathway including chorismate are candidates forstarting compounds in the bio-production of various chemicals (e.g. aromaticcompounds, dicarboxylic acids, and aniline derivatives).
Previous our study, we designed the metabolic pathway of Escherichia coli to enhanceshikimate pathway by accumulating the intracellular PEP concentration and to produce
chorismate derivatives in high yields. In order to avoid consuming PEP when uptake of
glucose, we have generated a recombinant strain with replacing the endogenous
phosphotransferase system (PTS) with GalP/Glk system (GGS) (PTS- GGS+ strain). In
order to prevent leakage of carbon flux to the TCA cycle, we also disrupted two genes
encoding pyruvate kinase (pykA, pykF), from PTS- GGS+ strain1.
In this study, we aimed to further enhancement and optimization of shikimate pathway.
We tried two approaches, upstream optimization and downstream optimization. In
upstream optimization, the effect of disruption of several genes was investigated inorder to further accumulation of PEP. In downstream optimization, we tested the fusion
protein approach. In order to prevent carbon flux leakage to other chorismate
derivatives from chorismate, chorismate synthase and another enzyme that catalyzes
the reaction to convert chorismate to the next metabolite were expressed as one
protein.

【目的】現在，高度な遺伝子組換え技術によって，様々な物質を合成できる有用
微細藻類の作出が可能になっている．しかし，組換え藻類の開放系での使用は
カルタヘナ法により制限されており，オープンポンドのような開放条件での培養に適用する事は困難である．当研究室では，通常の生物が利用できないリン源である亜リン酸に生育を依存するように代謝を改変する技術を開発している．
亜リン酸は環境中にはほとんど存在しないため，本手法は組換え体の拡散を防ぐ生物学的封じ込め手法として利用できる．そこで本研究では亜リン酸依存性を利用した生物学的封じ込め手法をシアノバクテリアに適用することを目的とした【方法・結果】実験のモデルとして Synechococcus elongatus PCC 7942 株を用いた．亜リン酸依存性を与えるためには，①亜リン酸酸化酵素 PtxD の発現による亜リン酸資化能の付与，②リン酸を取り込まない亜リン酸特異的輸送体
HtxBCDE の機能的発現，③内在性リン酸輸送体遺伝子の同定と破壊が必要となる．亜リン酸資化能の付与は Ralstonia 由来の ptxD を導入することにより成功
した．HtxBCDE の機能的発現は，HtxB のシグナルペプチドを Anabaena sp. PCC
7120 由来のシグナルペプチドに置換することにより可能であった．次に，この亜リン酸資化能導入株における内在性リン酸輸送体の破壊を試みた．PCC 7942
でアノテーションされている 2 種類のリン酸輸送体遺伝子(pit，sphX-pstSCAB)
を HtxBCDE-PtxD 発現株において破壊した結果，得られた株は完全な亜リン酸依存性を示した．

Metabolic engineering of Escherichia coli for production of shikimate
pathway derivatives

An engineered phosphite metabolic pathway for a biosafety system of
cyanobacteria○Ryosuke Fujiwara1, Shuhei Noda2, Tsutomu Tanaka1, Akihiko Kondo1,2,3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2BMEP, RIKEN, 3Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ.)

Key words
production

Escherichia coli, metabolic engineering, aromatic ring compound,○Kosuke Sano1, Kei Motomura1,2, Akihiro Kanbara1, Satoru Watanabe2,3,
Takeshi Ikeda1, Takenori Ishida1, Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1,2,
Ryuichi Hirota1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2ALCA, JST, 3Grad. Sch. Agric.,
Tokyo Univ. Agric.)
Key words
biosafety, cyanobacteria, phosphite, biological containment

112

1Jp15

藍藻由来亜リン酸デヒドロゲナーゼの酵素学的諸性質と選択培養技術への応用

1Jp17○本村 圭 1,2, 神原 亮大 1, 堀川 凌平 1, 池田 丈 1, 石田 丈典 1,
舟橋 久景 1, 黒田 章夫 1,2, 廣田 隆一 1,2（1広島大院・先端物質, 2JST-ALCA）
kmotomura@hiroshima-u.ac.jp

動的代謝モデルアンサンブルを用いたエタノール生産シ
アノバクテリアの代謝工学○西口 大貴, 永井 暉, 松田 史生, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】亜リン酸デヒドロゲナーゼ（PtxD）は，還元型リン化合物の一種である亜リン酸（HPO32-）からリン酸（PO43-）への酸化反応を触媒する酵素である．リン酸がほぼ全ての生物のリン源として利用されている一方で，亜リン酸は環境中にほとんど存在せず，PtxD を持つ一部の生物にしかリン源として利用されない．当研究室ではこの特性を利用して，亜リン酸資化能を持たない生物に PtxD を導入し，亜リン酸を唯一のリン源とする培地を用いることで，当該生物のみを選択的に培養する技術を開発してきた．これまでの研究で，PtxD の発現量が亜リン酸培養の重要な要素であることがわかっているが，導入した PtxD の酵素学的性質の違いによる影響についてはほとんど調べられていない．そこで本研究では，物質生産宿主として注目されている微細藻類の亜リ
ン酸選択培養を想定し，適合性が高いと考えられる藻類由来 PtxD の酵素学的諸性質および亜リン酸資化能への影響を解析した．
【方法と結果】種々の細菌由来 PtxD のアミノ酸配列を使った系統解析の結果，藍藻由来の PtxD は独立したグループを形成したことから，それらが類似の性質を有している可能性が示唆された．そこで，複数の藍藻からクローニングした ptxD を組換えタンパク質として発現・精製し，得られた各種 PtxD の酵素学的諸性質を解析した．その結果，これまでに報告された PtxD と比較して，NADPに対する補酵素選択性の高さが共通の性質として認められた．現在，土壌細菌
由来の野生型 PtxD およびアミノ酸置換によって NADP 選択性を高めた改変型
PtxD を比較対象として，藍藻 Synechococcus elongatus PCC 7942 株に導入した際の亜リン酸資化能の違いについて解析を進めている．

【背景と目的】シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 (以下 PCC6803) の光合成能力を活用した有用物質生産が試みられている．生産能のさらなる向上に
は CO2 固定を担う暗反応を含めた合理的な代謝改変が求められる．そこで本研
究では，ランダムに生成した酵素反応パラメーターを持つ動的代謝モデルを多数作成し（アンサンブルモデリング, Tran et al., 2006），エタノール生産能向上に有効な反応を特定し，その効果を実験的に検証した．
【実験方法】PCC6803 を BG11 培地 (100 mL) で培養し，代謝物質を抽出した．
LC-MS/MS と GC-MS で各代謝物の非標識体と[U-13C]標識体をそれぞれ別に測定し，そのピーク面積比から代謝物濃度を求めた．酵素発現量は nanoLCMS/MS の MRM モードで定量し，代謝フラックス値は先行研究のものを利用した（Nakajima et al., 2017）．アンサンブルモデリングは Python2.7 上で自作スクリプトにより行った．
【結果】PCC6803 の中心代謝 33 反応及び，主要な光化学系反応 6 反応の反応速度式を作成した．光独立条件下の代謝物濃度，酵素発現量，代謝フラックス実測値を再現可能なミカエリス定数および反応速度定数をランダムに生成し，1,000,000 個の動的代謝モデルを作成した．ついで，混合条件下の代謝フラック
スおよび代謝物濃度を予測し，予測力の高いモデルを 100 個選抜した．このモ
デルアンサンブルを用いて代謝コントロール解析を行った．得られた結果を見ると，PYK に加え，PGK と PRK の 3 反応がエタノール生合成前駆体のピルビン酸を供給するピルビン酸キナーゼ（PYK）反応のフラックスを正にコントロー
ルしていると予想された．そこで，エタノール生産株に，これらの酵素を追加
で過剰発現した株を作成したところ，PGK の過剰発現株ではエタノール生産量
が 1.4 倍に向上していた．

Enzymatic properties of phosphite dehydrogenase from cyanobacteria andits application as a dominant selection marker

Rational metabolic engineering of ethanol-producing cyanobacteria using
kinetic model ensemble.

○Kei Motomura1,2, Akihiro Kanbara1, Ryohei Horikawa1, Takeshi Ikeda1,
Takenori Ishida1, Hisakage Funabashi1, Akio Kuroda1,2, Ryuichi Hirota1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2JST-ALCA)

Key words

1Jp16○Hiroki Nishiguchi, Hikaru Nagai, Fumio Matsuda, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

phosphite, phosphate metabolism, cyanobacteria, selective cultivation

Key words
Synechocystis sp. PCC 6803, ethanol production, absolute
quantitation, kinetic model

ラン藻窒素代謝メカニズムの解明と物質生産への応用

1Jp18○見市 絢香, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp

シアノバクテリア中心炭素代謝における光量変化時の短期応答の解析
○丸山 正晴, 西口 大貴, 豊島 正和, 松田 史生, 清水 浩
（阪大院・情報）
fmatsuda@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景】窒素は生体構成元素のうちでは水素，酸素，炭素に次いで多く，生命に不可欠の存在である．藻類の中には独立栄養下での増殖能力が高い系統が多く，有用物質を CO2 から直接生産できることから，持続可能な物質生産への展開が期待されているが，藻類の窒素代謝や細胞内の窒素原子の動態は詳しくわかっていない．そこで本研究では，ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803（Synechocystis）のメタボローム解析を行い，独立栄養下における含窒素代謝物の細胞内蓄積量を網羅的に測定することとした．Synechocystis は窒素原子をアンモニア態か硝酸態として細胞に取り込むことが知られているため，安定同位体窒素標識を施した Na15NO3 及び 15NH4Cl を単一窒素源として，含窒素化合物の同位体標識率を経時的に測定する 15N 動的メタボローム解析法を構築し，窒素原子の同化経路を詳細に調べることとした．
【方法】5 mM の NaNO3 及び NH4Cl を用いて 1 ％ (v/v) CO2，100 μmol photons
m-2 s-1 の光独立栄養条件で培養し，細胞密度及び窒素源濃度の経時変化を調べた．その際，回収した藻体から代謝物を抽出し，細胞内の蓄積量を調べた．次に，5 mM の Na15NO3 及び 15NH4Cl を用いて in vivo 標識を行い，培養開始 24 時
間後までの含窒素代謝物の 15N 標識率経時変化を測定した．
【結果と考察】窒素源として NH4Cl を用いると，NaNO3 と比較して高い細胞密度を示し，水溶性一時代謝産物の蓄積量が高い傾向にあった．15N 標識率は，グルタミンやグルタミン酸をはじめとする多くの含窒素代謝物質において NH4Cl
を窒素源とした場合に高い傾向が見られ，窒素源による窒素同化速度の違いを観測することに成功した．また，NH4Cl を窒素源とすると有機酸生産量が増加
する結果が示されており，増産のメカニズムを検討している．

【背景と目的】シアノバクテリアでは，光量の短期的変化に伴う光化学系からのNADPH 供給量の増減に，中心代謝が応答していると考えられる．その解析は
光変化ストレスに強い物質生産株の育種や，中心炭素代謝の制御メカニズムの理解につながる．そこで本研究では Synechocystis sp. PCC 6803 (PCC 6803) の野
生株及び，グルコース-6-リン酸脱水素酵素遺伝子 (zwf ) 破壊株の中心代謝の中間体含量を定量し，明条件から暗条件へ移行したときの変化を解析した．
【方法】 Synechocystis sp. PCC 6803 の野生株と遺伝子破壊株を 100 ml の BG11培地でフラスコ培養した．培養は 34℃, 150 rpm で行った．光の照射のオン (明条件：40 μE/m2 sec) とオフ（暗条件）を 12 時間ごとに切り替えながら培養した．代謝物抽出はフィルター法とメタノール・クロロホルム・水抽出法で行った．GC-MS 用の誘導体化として，オキシム化とトリメチルシリル化を行った．
代謝物はイオンペア LC-MS/MS (SCIEX API 3200) および GC-MS (島津製作所
GCMS-2010) で定量した．
【結果と考察】PCC 6803 野生株では，暗条件移行 1 分で Ru5P 含量が 2.2 倍に増加し，RuBP 含量は 0.27 倍に減少した．これは炭素固定回路のホスホリブロキ
ナーゼ活性の低下を反映していると推測された．一方，6PG 含量は 3.9 倍に増加していたことから，，酸化的ペントースリン酸（OPP）経路が活性化し，NADPH 再生の低下を補っていることが示唆された．そこで OPP 経路の初発酵
素遺伝子 (zwf )破壊株で同様の実験を行った．暗条件移行 10 分で TCA サイクルの Mal 含量が 5.1 倍，αKG 含量が 1.5 倍に増加したことから，OPP 経路の欠損
を TCA サイクルの NADPH 再生反応で補うことが示唆された．以上の結果か
ら，光量が短期的に変化する条件では NADPH の恒常性維持に向けた代謝機構が重要な役割を持つと推定された．

Analysis of cyanobacterial nitrogen metabolism and its application tomaterial production

Short term metabolic response of Synechocystis sp. PCC 6803 during light/
dark transition○Ayaka Miichi, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
engineering

nitrogen metabolism, metabolism, cyanobacteria, metabolic○Masaharu Maruyama, Hiroki Nishiguchi, Masakazu Toyoshima, Fumio Matsuda,
Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
Calvin cycle

Synechocystis sp. PCC 6803, metabolic response, light/dark transition,

113

1Kp01

油脂生産酵母 Rhodosporidium toruloides の炭素源応答
解析

1Kp03

○岩本 孝信 1, 高見沢 健留 1, Pham Khanh Dung 1, 志田 洋介 1,
荒 学志 2, 山崎 晴丈 2, 高久 洋暁 2, 小笠原 渉 1（1長岡技科大, 2新潟薬大・応生命）
s163355@stn.nagaokaut.ac.jp

酵母を利用した S-アリル-L-システイン生成可能性検討○辻 史忠, 山本 英樹, 山岸 一雄, 菅原 誠吾, 小寺 智博（味の素株式会社）
fumitada_tsuji@ajinomoto.com

日本の食用油自給率はカロリーベースで 3% と極めて低い．そこで近年，油糧植物に代わり，気候の影響を受けず狭い土地で連続的に油脂を生産できる油糧
微生物が注目を集めている．特に，油脂生産酵母 Rhodosporidium toruloides は乾燥菌体重量当たり 70% もの多量の油脂を蓄積する．この油脂の脂肪酸組成は植物油のものと類似していることから，食用油の供給源としての応用が期待されている．さらに，抗酸化作用を有するカロテノイドも生合成することから，カ
ロテノイド含有の高機能性油脂の生産も可能である．しかし，産業的利用には至っていない原因の一つとして原材料の糖の価値が高いことが挙げられる．そこで，木質系バイオマスを糖化して得られた糖化液を炭素源として培養に用い，油脂を生産するプロセスの構築が検討されている．本研究では，バイオマス由来の糖が R. toluroides の表現型に及ぼす影響を調査し，糖の代謝および油脂・
カロテノイド生合成機構に関する知見の獲得を目的とした．
通常の培養に用いるグルコースに加え，植物細胞壁の糖化によって得られると予測されるキシロース，ガラクトース，セロビオースを炭素源として培養を行った結果，セロビオースを除く 3 種の糖で生育が観察された．このことから，本菌は二糖を資化できず，一方で五炭糖は資化可能であることが示された．また，油脂生産量測定および顕微鏡観察の結果から，グルコース以外の糖からでも多量の油脂を生合成し，蓄積することが確認された．興味深いことに，培養に用いた炭素源に応じて菌体の色が変化しており，生合成されたカロテノイドの組成が変化していることが示唆された．現在，油脂の脂肪酸組成および網羅的な全遺伝子の発現解析を行っており，表現型が変化した原因の解明を目指している．

【背景・目的】S-アリル-L-システイン（ALC）はニンニクなどの Allium 属植物に含まれるアミノ酸誘導体であり，アリインの前駆体として知られている．今回，我々は微生物系での ALC 生成について検討するため，酵母（Saccharomyces cerevisiae）を利用した L-セリンおよびアリルメルカプタンからの ALC 生成可能性について
検討した．
【方法】
酵母のシステイン生合成経路より cystathionine beta-synthase (Cys4, EC 4.2.1.22)
が L-セリンとアリルメルカプタンを縮合する酵素であると推測し，cys4Δ 変異
株の ALC 生成能を野生株と比較した．また，酵母 Cys4-His-tag 過剰発現株を作成し，その破砕液から Cys4-His-tag をアフィニティー精製した．得られた Cys4His-tag と L-セリン，アリルメルカプタンを用いた酵素反応により，ALC 生成
能を LC/MS で解析した．
【結果・考察】cys4Δ 変異株は野生株に比べ ALC 生成能が顕著に低下した．また，精製 Cys4His-tag を用いた酵素反応により ALC 生成がみられたことから，Cys4 利用により L-セリンとアリルメルカプタンから ALC が生成可能であることが示された．
Cys4 高発現酵母を用いた ALC 生成可能性については現在検討中である．

Analysis of response to some kinds of sugar in oleaginous yeast

Production method of S-Allyl-L-cysteine by Saccharomyces cerevisiae

Rhodosporidium toruloides○Takanobu Iwamoto1, Takeru Takamizawa1, Khanh Dung Pham1, Yosuke Shida1,
Satoshi Ara2, Harutake Yamazaki2, Hiroaki Takaku2, Wataru Ogasawara1(1Nagaoka Univ. Technol., 2Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life
Sci.)

○Fumitada Tsuji, Hideki Yamamoto, Kazuo Yamagishi, Seigo Sugawara,
Tomohiro Kodera(AJINOMOTO CO., INC.)

Key words

Rhodosporidium toruloides, lipid, carotenoid, carbon source

Key words
S-Allyl-L-cysteine, Cystathiine beta-synthase, Saccharomyces
cerevisiae, garlic

1Kp02

バイオエタノール生産に向けた耐熱性酵母
Kluyveromyces marxianus の特性解析及び糖資化能

1Kp04○阿部 拓哉 1, 廣田 潤哉 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1山口大院・創成科学・化学系, 2山口大・中高温微生物セ, 3山
口大・生命医工セ）
hoshida@yamaguchi-u.ac.jp

油脂酵母 Lipomyces starkeyi D35 株の 繰り返し発酵による脂肪酸組成変化解析○宮本 捺央 1, Kahar Prihardi 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ）
185t456t@stu.kobe-u.ac.jp【背景と目的】地球温暖化や化石燃料枯渇の問題を解決する手段の一つとしてバ
イオエタノールがある．酵母 Kluyveromyces marxianus は高温でエタノール発酵が行えるだけでなく，セロビオースやラクトースなど様々な糖を資化することが可能であり，広範囲なバイオマスを原料にした低コストでのエタノール生産が期待できる．本研究では，主にカルチャーコレクションから得た 20 株の K.
marxianus のエタノール生産に関する性質及び糖資化性を比較した．
【結果】バイオエタノール生産に求められる性質である，耐熱性，高糖濃度耐性，エタノール耐性，糖資化能について評価した．同時にブラジルのエタノー
ルに使われていた NCYC3233 株とも比較した．それぞれの特性に対していくつかの条件を調べた後，耐熱性は 45℃での増殖，エタノール耐性は 8%エタノー
ル存在下での増殖と酵母生存率，糖耐性は 20%グルコース培地での増殖を調べた．その結果，K. marxianus のほとんどの株が耐熱性を持っており，NCYC3233
株との大きな違いであった．エタノール耐性は NCYC3233 株よりも優れた株があり，糖耐性は同程度であった．糖資化能ではラクトース及びセロビオース培
地での増殖を調べた．NCYC1429 はラクトースでの増殖が高く，一方セロビ
オース培地では NCYC2791 が特に高かった．そこで増殖の差を利用して，K.
marxianus のラクトース及びセロビオース資化能に重要な遺伝子を探索した．まず，これら二糖を単糖に分解するそれぞれの酵素の活性が原因ではない事がわ
かった．そこで，糖の取り込みに違いがあると考え，増殖の高い株の K. marxianusの 14 個の糖輸送体遺伝子候補を増殖の低い株で過剰発現させた．その結果，
LAC12 遺伝子を導入した形質転換体ではラクトース資化能が向上した．

【背景と目的】近年，C20 以上の長鎖長脂肪酸は，アルツハイマー病・がんの予防に繋がる報告が数多くされており，需要が高まっている．そこで，再生可能資源であるバイオマスを用いた大量生産が注目されている．本研究で使用した油脂酵母 L. starkeyi D35 は，DCW 中の 70 %以上の油脂を溜めることができ，油脂貯蓄能が高い．また，C11～C24 まで幅広い炭素数の脂肪酸を合成することができる．以上の特徴から，長鎖長脂肪酸の生産での利用が期待されている．
本研究では繰り返し発酵による脂肪酸組成の変化の解析を試みた．
【方法】三角フラスコを用いて YMG 培地で前培養を行い，本培養では Glucose
のみ，Glucose と Xylose の混合糖，Xylose のみを加えた-NMM 培地を三種類用意して発酵させ，その後菌体を全て回収して新たな培地に移した．これを計 4
回繰り返して発酵させた．脂肪酸組成は質量分析(GC-MS)を用いて測定し，脂肪酸組成は C8:0 のピークを基準としたモル比で比較した．
【結果と考察】Glucose のみ，Glucose と Xylose の混合糖の場合は 4 回の繰り返
し発酵によって C24:0 にそれぞれ増加傾向が見られたが，C20:0 や C20:5 では
一回目発酵において顕著に増加し，それ以降の増加傾向は見られなかった．
Xylose のみの場合，他二つの条件と比べて繰り返しの回数を多くすることで長
鎖長脂肪酸の増加が期待できる結果となった．C24:0 では，Glucose と Xyloseの混合糖の増加が最も顕著であることから，Glucose と Xylose の糖消費を調節することでさらなる長鎖長脂肪酸の増加が期待できる．しかし，油脂酵母が合成する C16:0 や C18:1 cis といった主成分のモル比は 40 %以上を示すのに対し，
長鎖長脂肪酸の場合は，1.5 %未満でかなり微量であった．以上から，長鎖長脂肪酸の生産量をさらに向上させるためには，繰り返し発酵だけでは不十分であり，遺伝子組み換えが必要であると考える．

Characterization of the thermotolerant-yeast Kluyveromyces marxianus
strains for bioethanol production.

Analysis of fatty acid composition changes during repeated fermentation ofoleaginous Lipomyces starkeyi D35○Takuya Abe1, Junya Hirota1, Hisashi Hoshida1,2,3, Rinji Akada1,2,3(1Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., Yamaguchi Univ., 2YURCTMR,
3
YUBEC)

Key words

Kluyveromyces marxianus, ethanol, lactose, cellobiose○Nao Miyamoto1, Prihardi Kahar2, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
fermentation

Lipomyces starkeyi, oleaginous yeasts, long chain fatty acids, repeated

114

1Kp05

組換え出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae によるキシロースからのグルタチオン生産

1Kp07○小林 淳平, 佐々木 大介, 番場 崇弘, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
jyumpei.kobayashi@people.kobe-u.ac.jp

CRISPR-Cas9 システムによるラビリンチュラ類オーラ
ンチオキトリウム属の脂質生産性の改変○畑 浩介 1, 青井 真人 1, 渡邉 研志 1, 北堀 智希 1, 高橋 宏和 1,
岡村 好子 1, 松山 恵介 2, 黛 新造 3, 秋 庸裕 1
（1広島大院・先端物質, 2長瀬産業, 3出光興産）
aki@hiroshima-u.ac.jp

我々は出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae によるグルタチオン生産を研究している．グルタチオンの発酵生産では多くの場合にグルコースを炭素源にするが，グルコースを利用すると可食バイオマスとの競合が問題になる．そのため，木質バイオマス処理物に多く含まれるキシロースからグルタチオンを生産することを目的とした．まず，以前に構築した高グルタチオン生産株の S. cerevisiae
GCI 株に，メタノール資化酵母 Pichia pastoris 由来のキシロースレダクターゼ，
キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子と，S. cerevisiae 由来のキシルロキナーゼ
遺伝子を高発現させた S. cerevisiae GCI(Xs)株を構築した．次に，この GCI(Xs)
株とコントロール株をグルコースとキシロースから構成される培地で培養し，細胞内のグルタチオン濃度と培地中のグルコースおよびキシロース濃度を測定した．その結果，コントロール株はキシロースを全く消費できなかったのに対して，GCI (Xs)株は 5 日間の培養でほとんどのキシロースを消費した．またGCI(Xs)株はコントロール株よりも，細胞内にグルタチオンを蓄積し，菌体量も増加した．そのため，GCI(Xs)株の培地体積当たりのグルタチオン収率は，コントロール株の約 1.4 倍になった．また，グルコース，キシロース，フルフラー
ル，ギ酸，酢酸等から構成される，硫酸で処理をした木質バイオマスを再現した培地を作成し，同様に培養した．その結果，GCI (Xs)株の細胞内グルタチオ
ン含量はコントロール株とほぼ同等であったが，細胞濃度が増加したため，培地当たりのグルタチオン濃度はコントロール株に比べて約 1.4 倍に増加した．

【背景】ラビリンチュラ類オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）属は高い生理活性を持つ高度不飽和脂肪酸やカロテノイド，化成品原料となる長鎖脂肪酸や炭化水素類など，多様な分野で有用な脂質類を蓄積する．また，増殖性も高いため，各脂質の従来の供給源である魚油などの天然物からの抽出あるいは藻類による発酵生産や化学合成法などに替わる新たな供給源となることが期待される．本研究では本微生物の脂質生産性の向上及び生産脂質の多様化を目的として，CRISPR-Cas9 システムによるゲノム編集の適用を試みた．
【方法・結果】カロテノイド生産性のオーランチオキトリウム属 RH-7A 株において，無色のゲラニルゲラニルピロリン酸から黄色の β-カロテンを合成する酵
素 CrtIBY の遺伝子（crtIBY）を標的として，CRISPR-Cas9 によるノックアウトの成否をコロニーの色調の変化で判別することとした．まず，RH-7A 株にStreptococcus pyogenes 由来 Cas9 遺伝子を導入した Cas9 発現株 RH-7A-CH 株に対して，crtIBY の複数部位を標的とする guide RNA を導入し，細胞内で CRISPRCas9 を誘導した．その結果，親株と比較してコロニーの色が白く変化した 2 株を取得した．また，guide RNA と Cas9 の複合体を細胞外で調製して RH-7A 株に導入し，コロニーが白色を呈する 1 株を取得した．得られた色素生産性喪失株のゲノム DNA 上の crtIBY の塩基配列を解析したところ，どの株においても標的部位付近の塩基の欠失が認められ，いずれも Cas9 認識配列（PAM 配列）の 3 塩基上流で生じた二本鎖切断に起因することが示唆された．オーランチオ
キトリウム属で初めてのゲノム編集技術として CRISPR-Cas9 システムの導入に成功したので，現在，高生産株の育種への適用を試みている．

Glutathione production from xylose by recombinat budding yeast

Improvement of lipid productivity in Aurantiochytrium strains using
CRISPR-Cas9-mediated genome editing

Saccharomyces cerevisiae○Jyumpei Kobayashi, Daisuke Sasaki, Takahiro Bamba, Tomohisa Hasunuma,
Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

yeast, Saccharomyces cerevisiae, xylose, glutathione

1Kp06

Moniliella megachiliensis を用いた廃グリセリンからのエ
リスリトール発酵生産 ～バイオベース C4 ケミカルズ生
産プラットフォーム構築への試み～○Kosuke Hata1, Masato Aoi1, Kenshi Watanabe1, Tomoki Kitahori1,
Hirokazu Takahashi1, Yoshiko Okamura1, Keisuke Matsuyama2, Shinzo Mayuzumi3,
Tsunehiro Aki1
(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2NAGASE & CO., LTD., 3Idemitsu
Kosan Co. Ltd.)Key words
Aurantiochytrium, CRISPR-Cas9, lipid production, carotenoid

1Kp08○村上 紀里子 1, 東田 英毅 1, 岩田 悠志 2, 渡邉 泰祐 2,3, 荻原 淳 2,3,
春見 隆文 2,3, 新井 隆 4（1ちとせ研究所, 2日大生資科・生命化, 3日大院生資研究科・生資利用, 4ダイセル）
kiriko.murakami@chitose-bio.com

Growth, lipid and metabolite profile analysis of
Aurantiochytrium limacinum SR21 grown on acetatebased medium for biotechnological applications○Charose Marie Ting Perez, Ran Hirotani, Kenshi Watanabe,
Yoshiko Okamura, Yutaka Nakashimada, Tsunehiro Aki(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)
aki@hiroshima-u.ac.jp

シェールガスの台頭によりナフサ由来の化学製品の不足が懸念されている．特にナフサを原料とする C4 化成品はシェールガスからは変換されない．そのため代替法として持続的な製造が可能な微生物を用いた C4 化成品製造法の開発が進められている．これまでにバイオコハク酸の商業化が実現しており，フマ
ル酸やリンゴ酸等の商業化も追って期待されている．
我々は，エリスリトールの工業生産菌であり，非常に高い浸透圧耐性を持つ酵母である Moniliella megachiliensis を用いて未利用バイオマスである廃グリセリ
ン（C3）からエリスリトール（C4）の生産を試みている．ゼロカロリー甘味料として知られるエリスリトールは，グルコースを原料に発酵法で工業生産されている C4 の糖アルコールであり，現時点で 30,000 トン程度の需要が推定される．我々のゴールは，エリスリトール発酵生産の経済性をさらに高め，これを精製・化学触媒により変換し，ブタンジオール等の化学品を経済的に得るための複合的な一連のプロセスを確立することである．
初めに，原料をグルコースからグリセリンへ変更することで著しく低下した生産性を改良するため，培養条件の最適化を行った．その結果，200 g/L/week 以
上の生産が可能な培養評価系を構築した．現在は，構築した培養評価系を用いて育種株の取得を進めている．我々は，実生産に向けて課題と考えられる生産速度の向上や培養工程の簡略化を目指して，培養初期に生じるラグタイムの短縮やさらに高い浸透圧への適応をターゲットとした育種を進めている．本報告
では，これらの取得した株の性能について発表する．
本研究の一部は，戦略的創造研究推進事業 ALCA の助成を受けておこなわれた．

Thraustochytrids, a group of marine protists, are continuously gaining attention due totheir capability in producing lipids for various biotechnological applications towards
foods, medicines, chemicals and biofuels. Although glucose is the most common
carbon source for this microalga, it is desirable to produce lipids from cheaper andmore diversified substrate to expand their application range. We are developing twostage lipid production system consisting of the conversion of various unutilizedbiomass and emission gas to simpler sugars or organic acids and the assimilation ofthem by Aurantiochytrium strains for lipid fermentation. In this study, we aimed to
examine the ability of acetate, which can be easily converted from various resources byacetogenic microorganisms, as a substrate of A. limacinum SR21. As a result of flaskscale analysis, specific growth rates (μ) of the strain SR21 grown in 3% acetate- or
glucose-based medium were 0.55 and 0.98 h-1, respectively. The maximum yield of
total fatty acid in acetate medium was 4.8 g/L at 48 h while that in glucose medium
was 6.8 g/L at 30 h, indicating that acetate has potential as substrate. In the aim of
constructing a good biorefinery system, lipid productivity needs to be enhanced andmetabolic engineering is one promising approach, thus suitable method for metabolic
fingerprinting is being constructed in order to comprehensively elucidate characteristic
metabolic fluctuation caused by acetate assimilation and identify targets for
optimization.

Fermentative production of erythritol using Moniliella megachiliensis fromwaste glycerol - as a C4 building-block chemical.

Growth, lipid and metabolite profile analysis of Aurantiochytrium
limacinum SR21 grown on acetate-based medium for biotechnologicalapplications○Kiriko Murakami1, Hideki Tohda1, Hisashi Iwata2, Taisuke Watanabe2,3,
Jun Ogihara2,3, Takafumi Kasumi2,3, Takashi Arai4(1Chitose Laboratory Corp., 2Dept. Chem. Life. Sci., Nihon Univ., 3Dept. Biores.
Util. Sci., Grad. Sch. Biores. Sci., Nihon Univ., 4Daicel Corp.)

Key words

C4 chemicals, Erythritol, Strain development, Waste glycerol○Charose Marie Ting Perez, Ran Hirotani, Kenshi Watanabe, Yoshiko Okamura,
Yutaka Nakashimada, Tsunehiro Aki(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

Thraustochytrid, Lipid production, Acetate

115

1Kp09

界面バイオプロセスを用いた香気性ラクトンの生産○大澤 果穂 1, 杉本 恭子 2, 寺西 綾香 2, 小田 忍 2（1金工大院・工, 2金工大・ゲノム研）
odas@neptune.kanazawa-it.ac.jp

1Kp11

脱デンプン小麦フスマ培養における麹菌へミセルラーゼの生産○和田 竜之介, 山形 雄一郎, 高橋 奈津美, 卜部 喬史, 尾関 健二（金工大・ゲノム研）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp【背景と目的】 6-Pentyl-alpha-pyrone(6PP)等の香気性ラクトン類は，化粧品や食品業界において重要であるが，これらは化粧品や食品に添加されるため，酵素や微生物を使って生産される天然香料としての要求が強い．そこで本研究では6PP を効率的に生産できるバイオプロセスの開発を目的とした．
【方法】 12 穴ディッシュに調整した修正サブロー寒天の中央に，供試カビを一点植菌した．その上に低粘性ジメチルシリコンオイル(KF-96L-1CS，信越化学)を重層して 2 週間培養し，この有機層をガスクロで分析した．ヒット株 KITF0325 について培養条件の最適化を図った．炭素源の異なる 14 種類の修正サブ
ロー培地とマイクロスフェアー(Advancel HB-2051，積水化学)を混和し，それに本株シード液を植菌した．3 日間の前培養後に，KF-96L-1CS を重層して 2 週間
培養後，有機層をガスクロで分析した．その他，窒素源，C/N 比等の最適化や突然変異による KIT-0325 株の育種改良も図った．
【結果と考察】 493 株からの界面スクリーニングの結果，Trichoderma sp. KITF0325 株が 2 週間培養で 1.81 g/L の 6PP を生成した．本株の培養条件の最適化を図ったところ，炭素源に glucose，窒素源に peptone を使用した培地を用いる
こ と に よ り ， 2.75 g/L の 6PP が 得 ら れ た ． マ イ ク ロ ス フ ェ ア ー と し て は
MFL-81GTA が最適であったが，培養時間の伸長に伴い生成した 6PP が分解されることが判明した．この結果より，6PP 分解酵素の遺伝子をノックアウトした変異株の創出にも取り組んだ．

【背景・目的】精麦時に排出する小麦フスマ（WB）は年間 50 万トン以上であり，そのごく一部が利用されているがほとんどが産業廃棄物である．また食品加工用のへミセルラーゼ剤の種類は少なく，小麦フスマには 3 割程度のヘミセ
ルロースを含有し，市販の食品加工用各種酵素剤とへミセルラーゼ剤を併用しても血糖値上昇抑制などの機能性糖である，D-キシロース，L-アラビノース，
アラビノキシロオリゴ糖までほとんど可溶化できない．我々は小麦フスマをク
エン酸溶液でオートクレーブ処理することにより，デンプン質だけ酸加水分解
できることを報告した．この処理での脱デンプン小麦フスマ（SFWB）で麹菌（Aspergillus oryzae RIB40）を生育，酵素抽出液は，アミラーゼ系酵素の生産はほとんどなく，β-キシラナーゼ，β-キシロシダーゼなどが高生産し，従来のへミセルラーゼ剤とは酵素組成が全く異なっていた．しかしながら麹菌の生育は炭素源が限定されていたため，悪いものであった．今回炭素源以外の栄養源を戻すことにより，生育環境を改善し，へミセルラーゼ系酵素生産と性質について焼酎麹菌（A. kawachii SH34）も含めて検討した．
【方法・結果・考察】SFWB に酵母エキスと硫酸アンモニウムを加えることで 2種類の麹菌の生育は大いに改善できた．また SFWB に炭素源としてグルコースを添加した麹菌培養と上記の培養では抽出タンパク量は同程度であり，アミラーゼ系酵素の生産を抑えた環境では上記の条件が最大であることが分かった．βキシラナーゼ活性は RIB40 の至適 pH は 5 で至適温度が 65℃，SH34 の至適 pH
は 3 で至適温度は 65℃であり，焼酎麹菌はこの環境では β-キシラナーゼの生産量も多く，耐酸性の β-キシラナーゼが高生産であることが分かった．β-キシロ
シダーゼでは RIB40 が生産量も多く，耐酸性，耐熱性もある酵素であることが分かった．

Production of aroma lactone, 6-pentyl-alpha-pyrone, in an extractive liquidsurface immobilization system

Production of hemicellulose from Aspergillus oryzae and A. kawachii using
starch-free wheat bran.

○Kaho Osawa1, Kyoko Sugimoto2, Ayaka Teranishi2, Shinobu Oda2
(1Grad. Sch. Eng., Kanazawa Inst. Technol., 2Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa
Inst. Technol.)○Ryunosuke Wada, Yuichiro Yamagata, Natsumi Takahashi, Takafumi Urabe,
Kenji Ozeki(Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

interface cultivation, 6-pentyl-alpha-pyrone, Trichoderma sp.

Key words

Aspergillus oryzae, A.kawachii, hemicellulose, starch-free wheat bran

1Kp10

乳酸高生産性黄麹菌における乳酸生産フラックス強化による乳酸生産性の向上

1Kp12

gSELEX 法による糸状菌の分化に関与する転写因子のDNA 結合配列の同定○張 斯来 1, 若井 暁 1, 荻野 千秋 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大院・工, 3月桂冠・総研）
zhangsilai@people.kobe-u.ac.jp

藤井 陽平 1, 岡 大椰 2, 片山 琢也 1, 兒島 孝明 2, 中野 秀雄 2,○丸山 潤一 1（1東大院・農生科・応生工, 2名大院・生命農学）
amarujun@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

黄麹菌（Aspergillus oryzae）は細胞外に様々な糖化酵素を大量に分泌することが可能であり，植物バイオマスから有用物質を生産する宿主微生物として期待されている．我々は，従来のプラスチックの代替品となるポリエステル系のプラスチックであるポリ乳酸の原料となる物質である乳酸の生産に着目した．乳酸
は解糖系の終点であり TCA 回路，エタノールやアミノ酸生産への分岐点となる
ピルビン酸から生産されるので，効率的な生産のためにはピルビン酸代謝を意
識した代謝改変が必要である．
現在までに，牛 (Bos taurus) 由来 lactate dehydrogenase をコードする遺伝子 (bldh)を導入し，エタノール生合成経路での pyruvate decarboxylase をコードする遺伝子を破壊，ピルビン酸の TCA 回路への流れを抑制するためにミトコンドリア・
ピルビン酸キャリアタンパク質 （MPC） を欠損させた乳酸高生産性黄麹菌の創成に成功している（張ら，日本農芸化学会 2018）．この株では，乳酸生産量が向上した一方で，MPC 非破壊株よりも培地中にピルビン酸が 20 倍以上漏れ出していた．本研究では，ピルビン酸を効率的に変換させるため，生化学的に異なる特徴を持つ LDH の導入による乳酸生産フラックス強化を試みた．
これまでは酵母で高い乳酸生産性が確認されている bLDH を麹菌に導入していた．別途行っていた LDH スクリーニング試験より，乳酸菌 (Lactococcus lactis)
由来の LDH（LlLDH）を発現させた麹菌において bLDH 導入株よりも高い生産量が確認できており，MPC 破壊株に Llldh を導入した．その結果，100 g/L グル
コースからの乳酸生産量は約 92 g/L に向上し，培地中のピルビン酸濃度も著しく低下した．この結果から，MPC 欠損による細胞質に蓄積したピルビン酸が基
質親和性の高い LlLDH により効率的に変換されていると言える．

【背景と目的】 糸状菌の分化には一般に有性生活環と無性生活環があるが，一部の糸状菌では菌糸が凝集・接着して形成する菌核への無性的な分化が起こる．
菌核は耐久性の休眠構造であるが，その内部に有性生殖器官を形成することか
ら，菌核形成は有性生殖と形態的に関連することが示されている．我々は最近，
麹菌 Aspergillus oryzae において，菌核形成に必要な Zn(II)2-Cys6 型の転写因子
TrsA および TrsB を新たに見いだし，さらに，Aspergillus nidulans におけるこれらのオーソログが有性生殖に関与することを明らかにした 1)．糸状菌の分化に関与する転写因子はこれまでに数多く報告されているが，これらが直接制御する遺伝子の同定はほとんど行われていない．本研究では，糸状菌の分化における転写制御ネットワークを解明することを目的として，これらの転写因子のDNA 結合配列の同定を試みた．
【方法と結果】 TrsA および TrsB の全長について，それぞれマルトース結合タン
パク質 MalE と融合して大腸菌で発現させた．そして，精製した融合タンパク質 を 用 い て ， gSELEX (genomic systematic evolution of ligands by exponential
enrichment)法 2)による DNA 結合配列の特定を試みた．A. oryzae のゲノムライブ
ラリーから転写因子と in vitro で結合する DNA 配列を選択・濃縮し，これを高速 DNA シーケンスにより解析した．その結果，TrsB について推定結合モチー
フを抽出することに成功し，また，多くの遺伝子のプロモーター領域が TrsB との結合活性を有することがわかった．現在，trsB 遺伝子破壊株を用いた DNA
マイクロアレイ解析において転写産物量が変動した遺伝子と比較することにより，TrsB が直接制御する遺伝子候補について糸状菌の分化での機能と関連して検討している．
1) 藤井ら，日本農芸化学会 2018 年度大会 2A05a02.
2) Kojima et al. (2016) PLoS ONE, 11, e0159011.

Improvement of lactate production by enhancing lactate producing pathway
in genetically engineered lactate producing Aspergillus oryzae

gSELEX-mediated identification of DNA-binding sequence of thetranscription factor involved in filamentous fungal development○Silai Zhang1, Satoshi Wakai1, Chiaki Ogino2, Hiroko Tsutsumi3, Yoji Hata3,
Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 3Res.
Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words
Aspergillus oryzae, mitochondrial pyruvate carrier protein, lactate
dehydrogenase, metabolic flux

Youhei Fujii1, Hiroya Oka2, Takuya Katayama1, Takaaki Kojima2, Hideo Nakano2,○Jun-ichi Maruyama1(1Dept. Biotechnol., Univ. Tokyo, 2Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)
Key words

gSELEX, transcription factor, filamentous fungi, Aspergillus oryzae

116

1Kp13

イメージング質量分析を用いたショウジョウバエ体内におけるイミダクロプリド可視化手法の確立

1Kp15○大津 誠太郎 1, 山口 政光 2, 福﨑 英一郎 1, 新間 秀一 1
（1阪大院・工, 2京工繊大・工芸科学）
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp

バルブスイッチング LC-MS/MS に基づくキラルアミノ酸の多検体分析○中野 洋介, 馬越 泰, 福﨑 英一郎（阪大院・工）fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

イミダクロプリド（1-（6-クロロ-3-ピリジルメチル）-N-ニトロイミダゾリジ
ン-2-イリデンアミン）は，世界中で広く使用されているネオニコチノイド系殺虫剤の一つであり，ニコチン性アセチルコリン受容体作動薬として知られている．しかしながら，イミダクロプリドが昆虫体内でどのような器官に作用しているのか，局在情報に関する研究は存在しない．そこで本研究では，イメージ
ング質量分析法（IMS）を用いて，モデル生物であるショウジョウバエ体内におけるイミダクロプリド局在情報取得を試みた．IMS では測定試料を薄く切片化する必要がある．しかし，ショウジョウバエは体長約 2 mm と非常に小さく，また組織が不均一であるため，形態を保った切片作製が困難であった．そこで，切片作製に用いる包埋剤として 10%ゼラチンを選択し，前処理としてショウジョウバエを 70%エタノールに浸すことで，包埋剤とショウジョウバエ表面との間隙を減少させることに成功した．また液体窒素による急速凍結を行うこと
で，氷晶による組織へのダメージが減少し，形態を保った切片作製が可能となった．続いてこの切片作製法を用いて，イミダクロプリドの分布情報取得を試みた．イミダクロプリド標準品をマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI），エレクトロスプレーイオン化法（ESI）のそれぞれで測定してみると，MALDI のレーザー照射によりイミダクロプリドがグアニジン化し，グア
ニジンイミダクロプリドとなることが明らかとなった．さらに，LC-MSMS を用いてショウジョウバエ体内でのイミダクロプリド代謝を測定してみたところ，
グアニジンイミダクロプリドは検出されなかった．そこで，標的ピークをグア
ニジンイミダクロプリドとし，ショウジョウバエ体内におけるイミダクロプリ
ドの局在情報の取得に成功した．

D-アミノ酸は L-アミノ酸とは異なる生物学的機能を担うため，近年では医薬，臨床，食品業界を初めとして様々な分野で大きな注目を集めている．D-アミノ
酸と L-アミノ酸は物理化学的性質がほぼ等しく，通常の手法ではそれらの分離・分析が困難であり，従来の光学異性体選択的分析手法では，ターゲット化合物の誘導体化などの特殊な前処理を行うことで，望ましい分離や感度を得ている．近年，我々は光学分割能のあるクラウンエーテルを固定相にもつ分離カラムを利用した液体クロマトグラフ－タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を用いて，誘導体化を行わずに高感度かつハイスループットにタンパク質構成アミノ酸鏡像体を分離分析できる手法を構築した．しかしながら，当該手法を用いて多検体分析する際は，使用する 2 本のカラム（CROWNPAK CR-I(+)および(-)）を手動で切り替えることで分析間において大きな誤差が生じ，得られた結果の信頼性が保証されないという問題があった．そこで，我々は自動流路変換
バルブを LC 部に導入した新規キラルアミノ酸分析システムの開発を行った．
そのシステムの構築にあたり，CROWNPAK CR-I(+)でターゲット化合物を分析した後，すぐに自動で流路を切り替えると同時に試料注入を行い，連続的にCROWNPAK CR-I(-)で同様に分析するプログラムを作成した．この新規分析法と従来の手動で切り替える手法を実際に多検体分析に応用したところ，新規法
では分析間の誤差が非常に小さく，良好な値を示した．これらの結果は，多検体を対象とした新規キラルアミノ酸マーカー探索をハイスループットかつ堅牢に行うための手法として当該分析システムが大きな可能性を有することを示した．

Development of in situ imidacloprid visualization procedure in Drosophilamelanogaster using imaging mass spectrometry

Valve switching-based LC-MS/MS method for large scaled-analysis of chiralamino acids

Key words
MALDI-Imaging Mass Spectrometry, Insecticide, Imidacloprid,
Drosophila melanogasterKey words

D-amino acid, enantioseparation, LC-MS/MS

1Kp14

1Kp16

ガスクロマトグラフィー負化学イオン化質量分析法を用いた糖リン酸新規分析法の構築と 13C 代謝フラックス解
析への応用○Seitaro Ohtsu1, Masamitsu Yamaguchi2, Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)

イメージング質量分析を用いたショウジョウバエ幼虫体
内の神経伝達物質の可視化法の開発○榎本 陽介 1, 山口 政光 2, 福﨑 英一郎 1, 新間 秀一 1
（1阪大院・工, 2京工繊大・工芸科学）
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Yosuke Nakano, Yutaka Umakoshi, Eiichiro Fukusaki(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○岡橋 伸幸 1, 前田 昂亮 1, 川名 修一 2, 飯田 順子 2,3, 清水 浩 1,
松田 史生 1
（1阪大院・情報, 2島津製作所, 3阪大院・工）fmatsuda@ist.osaka-u.ac.jp

γ-アミノ酪酸（GABA），ドーパミン，グルタミン酸，セロトニンといった神経伝達物質は記憶や睡眠などの多くの生物学的行動に関与するだけでなく，筋萎
縮性側索硬化症（ALS）などの神経変性疾患に関与していると言われている．
ショウジョウバエはライフサイクルが短いこと，コストがかからないこと，倫理面の制約が少ないなどの特徴を持ち，神経変性疾患のモデル生物として用いられている．特にショウジョウバエの幼虫は神経筋接合部を用いた神経伝達機
構やシナプス形成に関する研究が多く行われている．神経伝達機構の研究において，これまでの知見に加えてショウジョウバエ幼虫体内で神経伝達物質がど
こでどのように作用しているのかという空間情報が求められている．近年神経伝達物質の空間情報を得る手法として，マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法（MALDI-IMS）が注目されている．MALDI-IMS は
蛍光イメージングや免疫組織化学といった他の分子イメージング手法と異なり，分子を直接可視化する手法であることから，神経伝達機構の研究において有用であると考えられる．そこで本研究では，MALDI-IMS を用いたショウジョウ
バエ幼虫体内の神経伝達物質の可視化法の開発を目的とした．本目的を達成するにあたり，切片作製法とマトリックス供給法を検討した．また，神経伝達物
質のイオン化効率を向上させるために組織上誘導体化を適用することにより，
GABA，ドーパミン，グルタミン酸，セロトニンの 4 種類の神経伝達物質の可視化に成功した．

[背景・目的] 糖リン酸は中心炭素代謝経路の大半を占める重要な代謝物であるが，従来法では異性体の十分な分離分析が達成されていない．このため，糖リン酸の正確な 13C 標識割合が計測できず，細胞増殖や物質生産に必要な前駆体，補酵素等がどの代謝経路で供給されるのかを評価する 13C 代謝フラックス解析法の適用が難しかった．そこで，本研究では，糖リン酸を高分離，高感度に分析できる手法を構築し，糖リン酸の 13C 標識割合を直接計測し，13C 代謝フラックス解析に用いることで解析精度の向上を目指した．
[方法・結果] 糖リン酸標準品を o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) oxime 化およびtrimethylsilyl 化し，ガスクロマトグラフィー負化学イオン化質量分析法（GCNCI-MS）で検出する分析法を構築した．GC での昇温条件を最適化することで従来困難であった糖リン酸の構造異性体をベースライン分離することができた．
また，高感度分析が可能な NCI を用いたことで検出限界 10 nM での分析が可能となった．続いて， [1-13C]glucose を炭素源として培養したヒト乳がん細胞株
MCF-7 の細胞内糖リン酸の 13C 標識割合を構築した手法を用いて分析し，13C 代謝フラックス解析に用いた．従来の 13C 代謝フラックス解析に利用されてきたクエン酸等の有機酸に加えて，糖リン酸の 13C 標識情報を利用したところ，フラックスの推定精度が解糖系の反応で平均 12%，ペントースリン酸経路で平均72%向上した．さらに，糖リン酸の 13C 標識情報を利用することで，従来推定が困難であった可逆反応のフラックスを精度よく推定できた．これらの結果か
ら，核酸合成に必要な前駆体リボースは酸化的 PP 経路のみでなく，非酸化的PP 経路の逆反応でも産生されていることが示唆された．

Establish the method to visualize neurotransmitters in Drosophilamelanogaster larvae using imaging mass spectrometry

Development of novel analytical method for sugar phosphates by GC-NCIMS and its application to 13C-metabolic flux analysis.

Key words
Drosophila melanogaster, imaging mass spectrometry,neurotransmitter

13
Key words
C-metabolic flux analysis, sugar phosphate, GC-MS, negative
chemical ionization○Yosuke Enomoto1, Masamitsu Yamaguchi2, Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)○Nobuyuki Okahashi1, Kousuke Maeda1, Shuichi Kawana2, Junko Iida2,3,
Hiroshi Shimizu1, Fumio Matsuda1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Shimadzu Corp., 3Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

117

1Kp17

質量分析のダイナミックレンジ拡張技術の開発とメタボ
ロミクスへの応用

1Lp01○中山 泰宗 1, 和泉 自泰 2, 長濱 一弘 1, 松岡 正佳 1, 馬場 健史 2
（1崇城大院・工, 2九大・生医研）
ynaka@bio.sojo-u.ac.jp

金ナノ粒子―量子ドットのプラズモン共鳴現象を用いた
ノロウイルス RNA 検出法○森田 真広 1, Jaewook Lee 2, Oluwasesan Adegoke 2, 朴 龍洙 1,2（1静大院・総科研・農, 2静大・グリーン科技研）
Park.enoch@shizuoka.ac.jp

代謝物総体解析”メタボロミクス”は，代謝と関連する生理現象の解明に利用されている．分析は主に質量分析装置（MS）を検出器として用いるが，一般的にダイナミックレンジ（分析対象化合物の濃度により検出器の強度が変化する範囲）が細胞内外の代謝物の濃度範囲より小さい．そのため実際の”総体”解析は困難である．そこで本研究ではデジタルカメラの写真解析技術である”Highdynamic range imaging”(HDR)の概念を応用した新規 MS 解析技術の開発を行っ
た．HDR は低感度と高感度両方のデータを同時に取得し合成することで，擬似的にダイナミックレンジを向上させる技術である．本研究ではこの HDR を MSに応用した”HDR-MS”解析技術の開発を行った．
検出には三連四重極型（QqQ）を用い，各分析対象化合物の分析パラメータはフラグメント化のコリジョンエナジーを最適値及び高エネルギーの 2 種類に設定して分析を行った．2 種類の分析データを HDR 処理するためのシステムを R
language を用いて開発した．HDR 合成の結果，ダイナミックレンジが向上し標
準品化合物の分析ではダイナミックレンジが約 2 桁上昇する化合物も得られた．
性能確認のために，実サンプルとして，酵母培養の天然培地である YPD 培地の時間経過による成分変化を分析した．天然培地には種々の成分が様々な濃度で含まれており，通常すべての濃度範囲をダイナミックレンジ内に収めるのは困難なためである．しかし，HDR-MS の結果，一度の分析で，高濃度から低濃度までの範囲をカバーすることが可能であった．本技術により，化合物濃度範囲が広いサンプルのメタボローム分析が正確になり，代謝研究や疾患診断等に応用されると期待される．

【背景と目的】感染性胃腸炎を引き起こすノロウイルスの診断は，イムノクロマ
ト法によるが，低感度，診断誤差や特異性に問題があり，高感度で迅速なノロウイルスの検出法の開発が急務である．金ナノ粒子はバルク金属にはない性質を有することから近年注目を集めている．量子ドットは既存の有機色素に比べ高い蛍光特性を有している．金ナノ粒子は量子ドットとの相互作用によるプラズモン共鳴効果によって蛍光を増強することが知られている．本研究では，これら二つの粒子を利用して，より高感度で DNA を検出する検出法を開発し，その成果を報告する．
【方法と結果】 金ナノ粒子は layer by layer 法によってスライドガラス状に固定した後，チオール基を修飾した DNA を結合させた．同様に量子ドットも DNAを修飾し，プローブとした．プローブ DNA-量子ドットを検出用の DNA と反応させた後，基板上にスポットし，基板上の DNA とハイブリダイゼーションさせた．検出用の DNA は，ノロウイルスの RNA のうち 25 塩基を，二つのプロー
ブ DNA は，検出用 DNA と互いに異なる部分で相補的な 10 塩基を用いた．プ
ローブの DNA と検出用 DNA は，二本鎖を形成するように設計しているため，基板上の金ナノ粒子の DNA を通して金ナノ粒子と量子ドットが繋がり，両粒子間距離が近づく．そこで両粒子間プラズモン共鳴現象が起き，量子ドットの蛍光が増強される．蛍光は，蛍光顕微鏡で観察し，検出用 DNA の検出を行った．本検出系は，検出用 DNA の濃度依存的に蛍光の増強が確認でき，また非相補的な DNA に対して高い選択性を有していることが確認できた．本検出系の検出限界は 52 fM であり，既存の検出系に比べて高い感度を有していた．本
結果から，本検出系は高感度，高選択的なノロウイルスの検出が可能であり，また用いる DNA の配列を変えることで，他の DNA や RNA の検出にも広く応用できると考えられる．

Development of High-Dynamic Range Mass Spectrometry and Its
Application

Detection of Norovirus RNA using plasmon resonance effect between
quantum dots and gold nanoparticles○Yasumune Nakayama1, Yoshihiro Izumi2, Nagahama Kazuhiro1,
Masayoshi Matsuoka1, Takeshi Bamba2(1Grad. Sch. Eng., Sojo Univ., 2Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.)○Masahiro Morita1, Jaewook Lee2, Oluwasesan Adegoke2, Enoch Y Park1,2(1Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integ. Sci. Technol., Shizuoka Univ, 2Res. Inst.
Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

mass spectrometry, liquid chromatography, metabolomics, yeast

Key words
nanoparticle

Norovirus RNA detection, Plasmon resonance, quantum dot, gold

1Kp18

Automated data processing for quality monitoring ofbiotherapeutics by multiple attribute methods (MAMs)

1Lp02

A label free sensing system for the detection of Dengue
virus serotype○Naohiko Heida(Genedata KK)
naohiko.heida@genedata.com○Ankan Dutta Chowdhury1, Nasrin Fahmida2, Kenshin Takemura2,
Indra M. Khoris3, Jaewook Lee1, Enoch Y. Park1,2(1Lab. Biotech., Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ,
2
Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 3Dept. Agriculture,
Grad. Sch. Integrat. Sci. Technol.)park.enoch@shizuoka.ac.in

Multiple attribute methods (MAMs) can generate significant operational savings by
replacing traditional assays while at the same time enabling a true QbD approach forthe development and production of biotherapeutics. Genedata Expressionist® offers ascalable enterprise software solution for the implementation of MAMs. Fromdiscovery to production, the software enables the end-to-end MAM process, fromproduct attribute identification to automated CQA monitoring and detection of
unknowns. It facilitates communication across organizations, harmonizes MAM
methods across labs, enables complete automation, and supports deployment inregulated environments.

Dengue fever, which affects a significant and ever-increasing portion of the world's
population every year, needs to detect precisely and rapidly. Detection of the Dengue
trusts only on RT-PCR type methodologies for confirmation of dengue virus serotypes
till date. In this research, we are trying to develop detection method for Dengue(DENV) serotype identification along with DNA quantification by using a new class of
LSPR based methodology using gold nanoparticles (AuNP) and fluorometric CdSe
QDs. The distance dependency between the QDs and AuNP has been used for serotype
detection as well as quantification of the DNA. The complementary structured hairpin
assemblies have been employed as nanoprobe for the identification of the serotypes,
creating the desired distance for successive quenching as well as fluorescenceenhancement, as mentioned in the scheme. Results obtained in this study, clearly
demonstrate that the developed system can efficiently detect the four serotypes of
DENV DNA individually without any modification of the analyte DNA prior to
analysis which is the strong advantages over the other PCR based methodologies. To
our best knowledge, this is the first report on the Dengue serotype detection along with
DNA quantification by simple fluorometric technique to get reliable results. We hope
this simple and reliable method can pave an avenue for the development of sensitiveand robust sensing probes in biomedical applications in near future.

Automated data processing for quality monitoring of biotherapeutics bymultiple attribute methods (MAMs)

A label free sensing system for the detection of Dengue virus serotype

Key words
Biotherapeutics, multiple attribute methods, Mass spectrometry,
Critical Quality Attributes

Key words○Naohiko Heida(Genedata KK)○Ankan Dutta Chowdhury1, Nasrin Fahmida2, Kenshin Takemura2,
Indra M. Khoris3, Jaewook Lee1, Enoch Y. Park1,2(1Lab. Biotech., Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ, 2Grad. Sch. Sci.
Technol. Shizuoka Univ., 3Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integrat. Sci. Technol.)
AuNP, dengue virus detection, fluorometric biosensor, LSPR

118

1Lp03

Silver-enhanced colorimetric detection of norovirus-likeparticles using peroxidase-like activity of nanozyme

1Lp05○Indra M. Khoris1, Kenshin Takemura2, Jaewook Lee3,
Vipin Kumar Deo4, Tetsurou Suzuki5, Enoch Y. Park1,2,3(1Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka
Univ., 2Dept. Biosci., Grad. Sch. Biosci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4Office Inter’lCollab., Shizuoka Univ,, 5Dept. Infect. Dis., Hamamatsu Univ. Sch.
Med.)
park.enoch@shizuoka.ac.jp

磁気分離免疫蛍光ナノバイオセンサーを用いた糞便中からのノロウイルス高感度・迅速検出○竹村 謙信 1, 李 在郁 2, Vipin Kumar Deo 3, 鈴木 哲朗 4, 朴 龍洙 1,2（1静大・創科技院, 2静大・グリーン科技研, 3静大・国際連携推進機構, 4浜医大・医・医学科）
park.enoch@shizuoka.ac.jp

Gastroenteritis was caused by norovirus which is known to be infectious even if a low
dose of minimum infection. Available ELISA for norovirus has low detection limit(LoD) at nanogram level due to the catalytic activity of used peroxidase, resulting anecessity to develop a reliably ultrasensitive bioassay. In this study, we apply
peroxidase-like activity of gold nanoparticles (AuNPs) on colorimetric bioassay for
detecting norovirus-like particles (NoV-LPs). In its application, however, antibody
conjugation on gold nanoparticles tends to reduce its performance and loss its
superiority catalytic activity. To overcome this issue, we improved peroxidase (HRP)like activity of gold nanoparticles by silver staining. In this colorimetric bioassay,
NoV-LPs were bounded to antibodies that were immobilized on the surface of 96-wells
microtiter plate. Then, antibodies-conjugated AuNPs (Ab-AuNPs) were added andformed sandwich structure, Ab-NoV-LPs-Ab-AuNPs. Afterward, AgNO3 solution
containing hydroquinone was added to form gold@silver nanohybrid. H2O2/TMB
solution was added to the wells to develop blue colour by oxidation of 3,3’,5,5’tetramethylbenzidine (TMB). 10% H2SO4 was added to stop the reaction and thecolour was turned to yellow, and the absorbance at 450 nm was measured. Thisdeveloped bioassay shows NoV-LPs concentration-dependent with limit of detection of
10.8 pg/ml, which is 100 times lower than HRP-based ELISA, and 1.5 times lower
than only AuNPs with superior colour intensity.

【背景・目的】ノロウイルスの検出には PCR などの遺伝子検出技術が用いられているが，設備や技術，長時間を必要とする為，早期診断には向いていない．
ウイルスの拡散を防止するため，糞便中や吐しゃ物などからの直接ウイルスを迅速にかつ簡便に検出する必要がある．本研究ではナノ粒子間で生じる局所プ
ラズモン共鳴（LSPR）による蛍光増強効果と磁気分離による検体からウイルスを簡便な分離機能を合わせ持った磁気分離型 LSPR 免疫蛍光検出系を構築した．
本研究では複合体合成法最適化及び本検出系を用いて行った糞便中からのノロ
ウイルス様粒子（NoV-LP）検出について得られた結果を報告する．
【方法・結果】蛍光性半導体量子ドット CdSeTeS quantum dot （QD）は，当研究室で作製したものを用いた．AuNP/MNP は室温条件下で磁性ナノ粒子溶液に金イオン及び還元剤を加え一定時間還元反応で作製した．還元速度と温度条件の変更により反応をコントロールすることで AuNP のサイズや表面形状が異なる
5 種類の複合体を形成し，LSPR 誘起効率の高い複合体を選定した．QD と最適化 AuNP/MNP にノロウイルスの特異的抗体を化学修飾し，混合して検出液を作製した．検出液に NoV-LP を加え，10 分間室温で静置した後に検出液から AuNP/
MNP を分離，洗浄した．洗浄済の粒子を超純水中に分散させ，蛍光強度を測定した（励起光 450 nm，蛍光 636 nm）．表面に形成される AuNP は金平糖型かつ40 nm 程度の粒径が最も強く蛍光増強効果を誘起した．また，最適化した複合体を用いて行った NoV-LP の検出限界は純水中の検体では 0.24 pg/ml，糞便中の検体の場合 0.46 pg/ml であり，既存の ELISA などのウイルス粒子検出技術と比べ 100 倍以上の感度であった．

Silver-enhanced colorimetric detection of norovirus-like particles using
peroxidase-like activity of nanozyme

Ultrasensitive and rapid detection of Noro virus from feces using magnetic
separation immunofluorescence nano bio sensor○Indra M. Khoris1, Kenshin Takemura2, Jaewook Lee3, Vipin Kumar Deo4,
Tetsurou Suzuki5, Enoch Y. Park1,2,3(1Dept. Agriculture, Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Dept. Biosci.,
Grad. Sch. Biosci. Technol., Shizuoka Univ., 3Res. Inst. Green Sci. Technol.,Shizuoka Univ., 4Office Inter’l Collab., Shizuoka Univ,, 5Dept. Infect. Dis.,
Hamamatsu Univ. Sch. Med.)Key words
Colorimetric bioassay, norovirus-like particles, peroxidase-like activity,
gold@silver nanohybrids

1Lp04

Magnetofluoro-immunosensing system by using
plasmonic/magnetic graphene for virus detection○Jaewook Lee1, Kenshin Takemura2, Enoch Y. Park1,2(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Integ.
Sci. Technol., Shizuoka Univ.)park.enoch@shizuoka.ac.jp○Kenshin Takemura1, Jaewook Lee2, Kumar Deo Vipin3, Tetsuro Suzuki4,
Enoch Y Park1,2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ., 2Res. Inst. Green Sci. Technol., 3OfficeInter’l Collab., Shizuoka Univ, 4Hamamatsu Medical Univ.)

Key words

Noro virus, detection, quantum dot, AuNP/MNP

1Lp06

Highly sensitive detection of norovirus-like particles
using LSPR behavior of CdSeTeS QDs and AuNPs○Fahmida Nasrin1, Ankan Dutta Chowdhury2, Kenshin Takemura1,
Jaewook Lee2, Oluwasesan Adegoke2, Vipin Kumar Deo3,
Tetsuro Suzuki4, Enoch Y. Park1,2(1Lab. Biotech., Grad. Sch. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Lab.
Biotech., Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 3OfficeInter’l Collab., Shizuoka Univ, 4Dept. Infect. Dis., Hamamatsu
Univ. Sch. Medicine)park.enoch@shizuoka.ac.jp

A multi-functional hybrid nanomaterials have been spotlighted due to their synergic
and unique properties. In this study, binary nanoparticles (NPs) decorated graphene
was prepared as a multi-functional hybrid graphene that has amazing properties such asplasmonic and magnetic property and high electrical conductivity. This plasmonic/
magnetic graphene (PMGRP) was consisted with Au NP, magnetic NP (MNP) andgraphene, and it was prepared via two steps in D.I water at room temperature in order
to utilize for magnetic separation and plasmonic substrate in a magnetofluoroimmunosensing (MFIS) platform. In this case, PMGRP was modified with influenza
virus antibody (Ab) to detect H1N1 virus, and MFIS was conducted under two steps
with a human serum/virus mixture; the PMGRP captured virus was separated from
impurity by magnetic force, and FIS was performed with QD. In this case, limit ofdetection was estimated around 6.07 pg/ml, so PMGRP-based MFIS platform is a as
potential detection system for complex biological sample.

Norovirus is mostly common and extremely contagious virus which causes acutegastroenteritis in a vast population every year where fewer than twenty virus particles
can cause severe infection. Due to its severity and challenges, there is an utmost needfor highly sensitive rapid detection technique for norovirus. In this study, a sensitive,
rapid and specific detection method has been developed using localized surface
plasmon resonance (LSPR)-induced immunofluorescence based on a gold
nanoparticles (AuNPs) induced CdSeTeS quantum dots (QDs) fluorescent signal.
Quaternary alloyed CdSeTeS QDs were capped with L-cysteine and conjugated withnorovirus antibody. AuNPs were synthesized in citrate and thiolated with 11mercaptoundecanoic acid. The concept of the biosensor involves the interaction
between conjugated CdSeTeS QDs and thiolated AuNPs which induces a quenching of
CdSeTeS fluorescence. However, the fluorescence signal shows a significant
enhancement in the presence of norovirus-like particles (NoV-LPs) due to a sterichindrance. The enhancement efficiency is directly related to the virus concentrationand the intermolecular distance between the QDs and AuNPs. A linear range of 10-5 to
10 ng mL-1 NoV-LPs with a detection limit of 8.2 fg mL-1 was obtained. The results ofthe proposed biosensor were used to implement a simple and fast method to determine
the presence of norovirus even in human serum which can open a new avenue for thebiomedical application in near future.

Magnetofluoro-immunosensing system by using plasmonic/magnetic
graphene for virus detection

Highly sensitive detection of norovirus-like particles using LSPR behavior of
CdSeTeS QDs and AuNPs○Jaewook Lee1, Kenshin Takemura2, Enoch Y. Park1,2(1Res. Inst. Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. Integ. Sci. Technol.,Shizuoka Univ.)

Key words
Magnetofluoro immunosensing, Plasmonic-magnetic graphene, sensor,
Virus separation and detection○Fahmida Nasrin1, Ankan Dutta Chowdhury2, Kenshin Takemura1, Jaewook Lee2,
Oluwasesan Adegoke2, Vipin Kumar Deo3, Tetsuro Suzuki4, Enoch Y. Park1,2(1Lab. Biotech., Grad. Sch. Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Lab. Biotech., Res. Inst.
Green Sci. Technol., Shizuoka Univ., 3Office Inter’l Collab., Shizuoka Univ, 4Dept.
Infect. Dis., Hamamatsu Univ. Sch. Medicine)
Key words
quantum dots, localized surface plasmon resonance, biosensor,
norovirus detection

119

1Lp07

Gel-based cell manipulation 法に基づく環境微生物の単一細胞解析技術の開発

1Lp09○茅 逸皓, 根岸 諒, 田中 剛, 吉野 知子（農工大院・工）y-tomoko@cc.tuat.ac.jp

バイオナノカプセル整列固定化技術による DNA アプタ
マーセンサーの高感度化○山田 裕紀 1, 飯嶋 益巳 1,2, 黒田 俊一 1
（1阪大・産研, 2東農大・応生科）
skuroda@sanken.osaka-u.ac.jp【目的】環境中に存在する大多数の微生物は未培養であると考えられているが，新規有用物質の探索対象として期待されている．近年，微生物の培養工程を経ずに，有用物質生産に関連する遺伝子探索を可能とする単一細胞の核酸解析が注目されている．当研究室ではがん細胞の単一細胞解析を目的として，細胞集積が可能な Microcavity array (MCA)法と，任意の単一細胞を光硬化性ハイドロ
ゲルに包埋し，目視観察での確実な分離を可能とする Gel-based cell manipulation(GCM)法を開発し，希少な細胞を対象とした単一細胞の分離技術を確立してきた．そこで本研究では MCA 法および GCM 法による環境微生物の集積化と単一細胞解析への応用を試みた．
【方法及び結果】孔径が 3 μm の微細貫通孔を多数有する PET 製の MCA を設計した (孔数：4 × 103)．細胞のサイズ・形状の異なる微生物として珪藻 Fisturifela
solaris，Thalassiosira pseudonana，Phaeodactylum tricomutum，緑藻 Haematococcas
lacustris を用い，MCA 上への細胞の回収効率を評価した．その結果，細胞サイズが 5 μm 以上の微生物においては，細胞懸濁液から 90%以上の効率で細胞回収が可能であった．さらに微生物を集積した MCA 上に光硬化性のハイドロゲ
ルである poly(ethylene glycol) diacrylate を添加した．標的微生物に対して光照射を行いハイドロゲルにより細胞を包埋し，単一細胞の分離を行った．続いて，本手法により分離した単一微生物から全ゲノム増幅を行い，標的遺伝子の解析を行った．その結果，ゲノム解析が可能な十分量の増幅産物が得られ，18S rDNA
解析により目的の微生物由来のものであることを確認した．本技術は，微生物
アレイの光学観察と標的微生物のゲノム解析が可能な技術であり，環境サンプ
ルへの適応も可能であった．

【目的】 我々は，バイオセンサー表面で IgG-Fc 領域を固定し Fv 領域を放射状に提示できる足場ナノ粒子「Protein A 由来 Fc 結合 Z ドメイン提示型バイオナ
ノカプセル（ZZ-BNC）」を用いて，IgG 及び Fc 融合受容体のクラスター化と精密整列化に成功し[飯嶋ら，Biosens. Bioelectron. 89, 810-821 (2017)]，センシング
分子の最小化と抗原及びリガンド検出の高感度化を同時に達成してきた．しかし，本技術は Fc 領域を有する分子に限定されることから，幅広いセンシング分子への適用拡大が課題であった．本研究では，ZZ-BNC の ZZ ドメインを特異的 DNA 配列結合領域（single-chain Cro（scCro）［Jana ら，Biochem. 37, 6446-6455(1998)］）に置換した scCro-BNC を作製し，DNA アプタマーの精密整列固定化によるリガンド検出の高感度化を目指した．
【方法】 ZZ-BNC 同様に出芽酵母を用いて scCro-BNC を発現・精製し，透過型
電子顕微鏡（TEM），原子間力顕微鏡（AFM）及び動的光散乱法（DLS）を用
いて性状解析を行った．さらに水晶発振子微量天秤法（QCM）のセンサー表面に，トロンビン特異的結合 DNA アプタマーを直接または scCro-BNC を介して固定し，トロンビン結合能を測定した．
【結果】 scCro-BNC は，TEM，AFM 及び DLS の解析から直径約 30 nm のナノ粒子と判明した．次に QCM において，scCro-BNC を介するとトロンビン結合
量が約 1.7 倍に上昇し，DNA アプタマー 1 分子に結合するトロンビン分子数が約 2.5 倍増加した事から，scCro-BNC は DNA アプタマーのクラスター化及び精密整列化が可能な足場分子である事が示された．今後は様々な DNA アプタマー
を用いて scCro-BNC の使用条件の最適化を行い，広範なリガンドを高感度に定量化できる DNA アプタマーセンサーの創製を行いたい．

Development of techniques for single cell analysis of environmental
microorganisms using Gel-based cell manipulation

Bio-nanocapsule-based scaffold for oriented immobilization of DNA
aptamers

Key words
single-cell analysis, environmental microorganisms, whole genome
amplification

Key words

biosensor, bio-nanocapsule, DNA aptamer, oriented immobilization

1Lp08

1Lp10

DNA ナノ構造体修飾ビーズを用いた標的核酸のイメー
ジング検出○Yihao Mao, Ryo Negishi, Tsuyoshi Tanaka, Tomoko Yoshino(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)（講演中止）○Yuki Yamada1, Masumi Iijima1,2, Shun’ichi Kuroda1(1ISIR, Osaka Univ., 2Fac. Appl. Biosci., Tokyo Univ. Agr.)○吉田 知哲, 池田 丈, 石田 丈典, 廣田 隆一, 黒田 章夫, 舟橋 久景（広島大院・先端物質）
hisafuna@hiroshima-u.ac.jp[目的] 当研究室では，標的核酸を認識すると蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）
シグナルやペルオキシダーゼ活性を示す DNA ナノピンセット構造体（DNANT）の開発に成功している．本研究では，DNA-NT を用いたマルチ標的の簡易計測法開発を目指し，ビーズを利用した標的核酸のイメージング検出法について検討した．
[方法] 本研究で用いた DNA-NT は，標的核酸認識配列をもつ 2 本の合成オリゴ
ヌクレオチド（O1, O2）と，両端に蛍光色素 Cy3 と Cy5，中央部分にビオチンを修飾した合成オリゴヌクレオチド（O3）を自己集積させることによって作製した．この構造体は標的核酸認識に伴う構造変化によって Cy3 と Cy5 が近接
し，FRET シグナルを発する．この DNA-NT を，ビオチン-アビジン結合を利用してストレプトアビジン修飾磁性ビーズに修飾した．蛍光顕微鏡を用いたイメー
ジングによって FRET シグナルを解析し，DNA-NT 修飾ビーズを用いた標的核
酸検出の可能性を検討した．
[結果および考察] DNA-NT 修飾ビーズは標的核酸を加えた場合 FRET シグナルを発したことから，DNA-NT はビーズに固定された状態でも標的核酸認識能を有することが示された．その際ビーズを洗浄しても FRET シグナルを発し続けたことから，DNA-NT 修飾ビーズを用いて標的の濃縮が可能であることが示された．また，磁性ビーズを用いたことにより，ビーズを観察平面上に整列させることが容易になり，ビーズの大きさが判別が可能になった．そこで異なる標的核酸を認識する 2 種類の DNA-NT を大きさの異なる 2 種類のビーズに修飾
し，片方の標的核酸のみ加えて蛍光イメージング解析を行った．その結果，加えた標的核酸に対応する DNA-NT を修飾した大きさのビーズのみ FRET シグナ
ルを発した．以上の結果から，大きさの異なるビーズを用いた蛍光イメージン
グによって，複数の標的核酸の同時検出が可能であることが示された．

Detection of targeted nucleic acids by imaging analysis using DNAnanostructure modified beads○Chisato Yoshida, Takeshi Ikeda, Takenori Ishida, Ryuichi Hirota, Akio Kuroda,
Hisakage Funabashi(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat. Hiroshima Univ.)

Key words

biosensor, imaging analysis, DNA sensor

120

1Lp11

段階的な酵素反応に基づいた抗体結合タンパク質含有ポ
リマーの固相基板上での調製技術の開発

1Lp13

宮尾 寛樹 1, 上村 侑太郎 1, ○末田 慎二 1,2（1九工大院・情報工・生命情報, 2九工大・RCBT）
sueda@bio.kyutech.ac.jp

A potentiometric plant condition monitoring method○Tae Hang Yoon1, Hak Jin Song1, Kwang Jin Kim2,
Yong-Keun Choi1, Wu-Young Jeong1, Ji Eun Kim1, Sang Hyun Lee1,
Yung-Hun Yang1, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res.
Inst., Rural Development Administration.)odoosan12345@naver.com【目的】抗原-抗体反応を利用したイムノセンシング技術は，その汎用性の高さ
から様々な化合物の検出に利用されている．一般に高感度な検出系を構築するには抗体を固相基板上に固定化する必要があり，その抗体の固定化が検出感度に大きな影響を及ぼすことが知られている．これまでに，抗原結合活性を維持した状態で抗体を固定化することを目的として，抗体結合タンパク質を利用した，様々な抗体固定化技術が提案されている．しかしこれまで提案されている技術では，主として抗体結合タンパク質は固相基板上に一層だけ固定化さており，抗体の捕捉量が限定的なものとなっている．そこで本研究では，固相基板上で抗体結合タンパク質をポリマー化させ，抗体を三次元的に捕捉・固定化できる技術の開発を試みた．
【実験方法及び結果】上記目的のために Sulfolobus tokodaii 由来のビオチン化酵
素反応を利用した．S. tokodaii 由来の同酵素反応系は，酵素であるビオチンリ
ガーゼ（BPL）が，そのビオチン化された基質タンパク質（BCCP）と非常に安定な複合体を形成するという特異な性質を有している 1)．本研究では，Protein
A の抗体結合ドメインの 1 つである Z-ドメインを，同酵素反応系を利用してポリマー化することを試みた．具体的には，Z-ドメインの両端に BCCP を連結した融合タンパク質と，BPL 二分子を架橋した BPL ダイマーを調製した．これら
両タンパク質を，BPL を固定化した固相基板上に段階的に添加することにより，ビオチン化反応を介して，Z-ドメインを含むポリマーが固相基板上に形成されるものと考えた．本研究では，この反応を表面プラズモン共鳴法のセンサーチップ上で行い，本技術の実行可能性を評価した．
【参考文献】1) S. Sueda et al., Anal. Biochem. (2009) 393, 189

A plant condition monitoring method based on microbial fuel cell technique wasinvestigated. The reducing action of plant exudates on the rhizobacteria was used as
the basis of a potentiometric monitoring system. The potential development (OCV,
open circuit potential) were found to be dependent on the plant conditions andcultivation environments such as vitality, water feeding, addition of fertilizer, etc. In aplant pot, graphite felt was used as electrode (15 × 15 × 0.2 cm). Ardisia pusilla wasused as experimental plant. When the plants were grown in a normal condition (i.e.
periodical water feeding and under normal lighting condition), the OCV from theplants were maintained at the range of 0.25 to 0.41 V. However, in the absence ofplant, no significant increases in OCV were observed from the system. When theexperimental plant was heated by a hot air, a rapid decrease in potential development
was monitored. These results indicates that the OCV from the system is closely related
plant vital conditions. In the presence of live plant, rhizobacteria could generate thepotentiometric signal and a correlation between OCV variations and the cultivation
conditions were established. A range of plant cultivation conditions (e.g. water,
fertilizer, light, temperature, etc.) was examined, and it was founded that the method
could be used successfully for monitoring of plant viability conditions. A mechanistic
model including the electrochemically active bacteria (EAB) is presented to accountfor this finding.

Preparation of the polymer containing the antibody-binding protein basedon the stepwise enzyme reaction

A potentiometric plant condition monitoring method

Hiroki Miyao1, Yutaro Uemura1, ○Shinji Sueda1,2(1Dept. Biosci. Bioinf, Kyushu Inst. Technol., 2RCBT, Kyushu Inst. Technol.)○Tae Hang Yoon1, Hak Jin Song1, Kwang Jin Kim2, Yong-Keun Choi1,
Wu-Young Jeong1, Ji Eun Kim1, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1,
Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res. Inst., Rural
Development Administration.)

Key words

immunosensor, antibody-binding protein, biotin ligase, immobilization

Key words
plant microbial fuel cell, rhizobacteria, open circuit voltage, plantmonitoring system

1Lp12

酵母細胞における生理活性物質メラトニンをモニタリン
グするための G タンパク質共役型受容体（GPCR）を用いたメタボライトセンサの開発

1Lp14

高性能バイオデバイスを目指したカーボンナノチューブ
配向電極の開発○藤原 郁也 1, 大池 智明 1, 松崎 祥平 1, 坂元 博昭 1,2, 末 信一朗 1,2（1福井大院・工・繊維, 2福井大学・生命セ）
hi-saka@u-fukui.ac.jp○田畑 琢也, 中村 泰之, 加藤 寛子, 近藤 昭彦, 石井 純
（神戸大院・科技イノベ）
junjun@port.kobe-u.ac.jp【背景・目的】近年，代謝工学により微生物が本来作らない化合物を大量生産する研究が進められている．これらの研究では従来，クロマトグラフィ等で 1 菌株ごとに生産性を定量するため，評価できる遺伝子組換え体数は限られていた．そこで，作出した菌株の生産性をハイスループットに評価できるメタボライトセンサが注目を集めている．本研究では，G 蛋白質共役型受容体 (GPCR) を利用して代謝工学に応用できるメタボライトセンサを開発することを目的とした．モデルとして GPCR の一種であるヒト由来メラトニン受容体を選択し，発現量やメラト
ニンに対する親和性を改変することで感度調節し，様々な濃度のメラトニンを検出できるシステムの構築を目指した．
【実験方法・結果】
GPCR のシグナル伝達検出には，リガンド刺激に応答すると緑色蛍光蛋白質が発現するようにゲノムを改変した酵母株を用いた．GPCR としてヒト由来メラトニン受容体をベースとし，出芽酵母にコドン最適化した配列や受容体の 1 アミノ酸変異体をコードする配列などを恒常発現型プロモーター制御下で発現させるプラスミドを構築した．これらの形質転換体を様々なメラトニン濃度に調製した培地で培養後，フローサイトメーターにより緑色蛍光強度測定を行った．
その結果，受容体やプロモーターの種類に応じ，メラトニン濃度に依存したレポーター発現強度の違いが見られ，様々な検出感度を持ったメラトニンセンサの開発に成功した．また，添加するリガンドをメラトニンからメラトニン生合成経路の中間物質に変更したところ，受容体の変異体においてメラトニンを特異的に検知可能なメタボライトセンサの開発に成功した．今後，本研究で開発したメタボライトセンサを応用し，代謝工学や進化工学と組み合わせることでメラトニン高生産株を迅速に育種することへ展開していく．

【目的】カーボンナノチューブは(Carbon nanotube, CNT)は，直径が 100nm 以下であり，比表面積が大きく，また高効率な電子移動が可能となることから，高出力バイオデバイスを構成する電極材料としての応用が期待されている．しかし，単に CNT を成膜した電極では，ファンデルワールス力により CNT 同士が凝集する傾向があり電気的抵抗が生じてしまうため CNT の特性を最大限生かす
ことが出来ない．そこで，本研究ではエレクトロスピニング法により紡糸した
ナノファイバーを CNT のガイドとする事で導電性基板表面へ CNT を一定方向に配置する手法の確立とその基板を電極とした高性能バイオデバイスの構築を目的とした．
【方法】10% EVA 溶液に CNT 100 mg 加え一晩撹拌し，超音波処理を行う事により CNT を分散させた．エレクトロスピニング法により CNT 含有 EVA ナノ
ファイバーを Au 基板表面へ紡糸した．EVA/CNT ファイバー作製後，電気炉内400℃で加熱する事で EVA ナノファイバーのみを熱分解させることで，消出したナノファイバーに沿って CNT が配向した Au 基板を得た．作製後，物性や形態 を 観 察 し ， 配 向 CNT 表 面 へ PQQ-GDH(pyrroloquinolinequinone-dependent
glucose dehydrogenase)を修飾させ電気化学特性評価を行った．
【結果と考察】EVA と CNT 混合溶液からエレクトロスピニング法により，太さ
約 820 nm の CNT 含有 EVA ナノファイバーを得た．紡糸した EVA/CNT ナノ
ファイバーを熱分解すると，ナノファイバーに沿って CNT が配列していることが観察された．燃焼後の基板上に PQQ-GDH を修飾し電気化学評価を行った結果，CNT を配向した電極の方が無配向 CNT 電極に比べ，約 2 倍近い酵素触媒
電流を得た．
以上の結果から，本技術は CNT を精密に配列させることが可能であり，さらにその CNT 配向電極は高性能バイオデバイスの構築を可能とすることが示唆された．

Development of G-protein-coupled receptor (GPCR)-based metabolite
sensor for monitoring physiological chemical melatonin in yeast cells

Development of carbon nanotube arranged electrode aiming for highperformance biodevice

Key words
Saccharomyces cerevisiae, metabolite sensor, G-protein-coupled
receptor, signal transduction

Key wordsalignment○Takuya Tabata, Yasuyuki Nakamura, Hiroko Kato, Akihiko Kondo, Jun Ishii(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)○Ikuya Fujiwara1, Tomoaki Oike1, Shohei Matsuzaki1, Hiroaki Sakamoto1,2,
Shin-ichiro Suye1,2(1Dept. Front. Fib., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui,, 2Res. Edu. Prog. Life Sci., Univ.
Fukui,)
carbon nanotube, biodevices, electrospinning, one-dimensional

121

1Lp15

緩和時間プロファイリングとデータ駆動型アプローチによる魚肉特性評価

1Lp17○伊達 康博 1,2, 魏 菲菲 1, 坪井 裕理 1, 清水 智子 1, 坂田 研二 1,
菊地 淳 1,2,3（1理研・CSRS, 2横市院・生医, 3名大院・生命農）
yasuhiro.date@riken.jp

近年の深層学習・機械学習の爆発的な進展により，多様な分野・産業において技術革新が起きつつあり，生物工学分野への波及効果も計り知れないものと推測される．生物系のビッグデータを扱う研究分野の一つであるメタボロミクス
では，NMR 計測等によって得られた多数のデータから有用な情報を取得する
データマイニング技術が急速に進展しており，我々もこれまでに，メタボロミ
クス研究へと適用可能な機械学習・深層学習アルゴリズムを開発し，生体および環境サンプルへと応用してきた【1-4】．本研究では，NMR 計測によって得られる代謝物の構造情報のみならず緩和時間に関する情報にも着目し，緩和減衰曲線の解析に機械学習の各種手法を導入することにより，産地判別技術や環境評価技術として応用可能な緩和時間プロファイリング技術の構築を行った．構
築した本手法を用いて多様な魚類筋肉の緩和減衰曲線を解析したところ，緩和
時間プロファイルから魚類の種や生息地域に関する特徴を捉えることが可能であった．また，データ駆動型アプローチと緩和時間プロファイリングを組み合わせることにより，魚類の特性（回遊性等）や生息環境（根魚，底層魚等）の違い等の特徴を捉えることも可能であった．
【参考文献】[1] Date, Y. and Kikuchi, J., Anal. Chem., 90, 1805－1810, (2018); [2] Asakura, T.,
Date, Y. and Kikuchi, J., Anal. Chim. Acta, (in press.); [3] Shiokawa, Y., Date, Y. andKikuchi, J., Sci. Rep., 8, 3426, (2018); [4] Oita, A., Tsuboi, Y., Date, Y., Oshima, T.,
Sakata, K., Yokoyama, A., Moriya, S. and Kikuchi, J., Sci. Total Environ., 636, 12－
19, (2018).

Characterization of intact fish muscles based on relaxation profiling with
data-driven approach○Yasuhiro Date1,2, Feifei Wei1, Yuuri Tsuboi1, Tomoko Shimizu1, Kenji Sakata1,
Jun Kikuchi1,2,3(1RIKEN CSRS, 2Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ., 3Grad. Sch.
BioAgriSci., Nagoya Univ.)

Key words

machine learning, relaxation time, metabolomics, benchtop NMR

1Lp16

血漿メタボロミクスに資する固相誘導体化法を用いた
GC/MS 分析法の開発

光切断性ペプチドアレイと質量分析計を組み合わせた新規アッセイ法による，2 種プロテアーゼ間の切断同等性評価○栗本 昌樹 1, 久保 智里 1, 清水 一憲 2, 越智 浩 1, 阿部 文明 1,
本多 裕之 2,3
（1森永乳業, 2名大院・工, 3名大・予防早期医療創生セ）
m-kurimoto@morinagamilk.co.jp【背景・目的】食品タンパク質由来のペプチドには，近年多様な生理活性が見出されており，酵素による食品タンパク質加工技術は今後ますます重要になると考えられる．一方，食品加工に用いられる産業用酵素は多種多様な活性を有しており，その切断特異性が明らかになっていないものは多い．本研究では光切断性ペプチドアレイと質量分析計を併用し，配列網羅的に酵素切断部位を同定する技術を開発した．本技術を用いて得られるデータは，機能性ペプチドを効率的に製造するための有用なデータになるものと考えられる．本発表では 2 酵
素間の切断比較について，既存の分析技術では困難であった配列レベルでの定量的同等性評価結果を示し，製品品質向上を目的とした既存酵素代替スクリー
ニングへの応用可能性を報告する．
【方法】Fmoc 固相合成法によりセルロースメンブレン上にペプチドを合成し，乳タンパク質の配列を網羅したペプチドアレイを作製した．C 末端にはフォトリンカーを使用し，ペプチドに光切断性を付与した．酵素溶液中でアレイを加水分解処理し，洗浄・乾燥させたアレイに UV を 2 時間照射したのち，各 SPOT
上で遊離・回収したペプチド断片の質量を分析し，分析結果をもとに酵素の切断部位を特定した．
【結果】カゼインを原料とした，ブタおよびウシ膵臓由来のパンクレアチン加水分解物は，HPLC を用いた分子量分画により同等性の高い分子量分布を描くことができる．一方，カゼインのアミノ酸配列をターゲットに，本技術を用いて各由来の 2 種パンクレアチンを切断評価したところ，酵素毎の特有の切断パター
ンを特定することができたと同時に，切断パターンの一致率が 90%を超える結果を得た．本技術は分子量分布のような定性的な同等性だけでなく，配列レベルでの定量的な情報を示すことができるため，今後の製品開発において幅広い応用が期待できる．

Evaluation of cleavage equivalence between two proteases by a novel assay
technique that combines photo-cleavable peptide array and mass
spectrometer○Masaki Kurimoto1, Chisato Kubo1, Kazunori Shimizu2, Hiroshi Ochi1,
Fumiaki Abe1, Hiroyuki Honda2,3(1Morinaga Milk Industry Co., Ltd., 2Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 3PME, Nagoya
Univ.)
Key words
photo-cleavable peptide array, LC/MS, protease, cleavage equivalence

1Mp01○新川 翔也 1, 佐々野 僚一 2, 古野 正浩 1, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工, 2アイスティサイエンス）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

亜硝酸酸化細菌における Toxin-Antitoxin 機構の生理学的意義の考察○葵 理恵 1,2, 宮本 龍樹 1,2, 横田 亜紀子 2, 大田 悠里 1,2, 常田 聡 1,
野田 尚宏 1,2
（1早大院・先進理工, 2産総研・バイオメディカル）
noda-naohiro@aist.go.jp

ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC/MS）によるメタボロミクス分析においては，誘導体化（トリメチルシリル化）が必要不可欠である．しかしこれらの誘導体化物は不安定であり，オートサンプラーでの待機時間中に他の化合物へと変化するため，GC/MS を用いた多検体分析において大きな問題となっている．それに加えて，サンプル抽出→遠心濃縮→凍結乾燥→誘導体化といった煩雑な前処理工程を行う必要があり，各工程で誤差が蓄積されるため，作業者の技量がデータの質に大きく反映される．この課題を解決するために，我々は固相誘導体化法を用いたオンライン GC/MS システムを提案している．本発表では当システムの概要に加え，前処理としての従来法と固相誘導体化法を比較した当該メソッドの有用性について報告する．
固相誘導体化法を用いた前処理手順は以下のとおりである．サンプルとしてヒト血漿を用いた．はじめに血漿サンプルに抽出溶媒（水およびアセトニトリル）
を加え，その抽出溶液を陽イオン・陰イオン交換複合固相担体に注入し，有機酸・アミノ酸・糖類などを保持させた．50％水/アセトニトリル溶液で糖類を除去した後，残存水をアセトニトリルで除去した．その後，誘導体化試薬を含浸させ，固相上で誘導体化反応を行った．最後にトルエンで溶出した液を胃袋型
インサートへ直接注入し GC/MS 分析を行った．当手法におけるサンプル抽出
後から GC/MS 分析開始までの前処理時間は約 10 分であった．これは従来法での処理時間（10 時間以上）と比較して非常に短い処理時間であった．前処理時間の短縮により GC/MS のバッチ分析中に誘導体化を行うことが可能となり，誘導体化後の待機時間をゼロに統一することができる．また，本分析法は従来法と比較して少量・低濃度のサンプルを高感度に分析することが可能である．

亜硝酸酸化細菌は窒素循環や排水処理における硝化反応の第 2 反応を担う細菌で，地球科学的にも生物工学的にも重要な役割を果たす．しかしながら，増殖速度が遅いことや特定の環境下で休眠状態に容易に移行することから本微生物の培養は困難であり，その生理・生化学的知見は不足している．望ましくない
環境下において自身の転写翻訳を制御し，増殖を抑制することは微生物の生存戦略のひとつであることが近年明らかとなってきたが，その代表的な機構として Toxin-Antitoxin 機構が挙げられる．とりわけ MazEF 機構は，MazF 分子による細胞内 RNA の配列特異的な切断を介して翻訳を包括的に制御し増殖抑制を行う．このことから，MazF の基質特異性を明らかにすることで，亜硝酸酸化細菌が増殖制御を行う分子機構を解明できるのではないかと考えた．
本研究では，MazF タンパク質を形質転換体より回収してカラムクロマトグラ
フィーを用いて精製した．配列既知の基質 RNA を MazF によって切断させた
後，切断箇所である 5’末端にバーコード配列として短鎖 RNA を付加してシー
ケンシングを行い，バーコード配列を含むリードのみを元の基質 RNA 配列と照らし合わせることで，MazF の切断配列候補を選定した．さらに，この候補
配列を含む蛍光修飾プローブを使用し，MazF と反応させた際の蛍光強度の経時的な変化を測定することで，シーケンシングで推定された配列を MazF が実際に切断することを確認した．また，宿主である亜硝酸酸化細菌のゲノム上におけるこの切断配列の出現頻度を MazF 発現時における各遺伝子が受ける翻訳阻害度の指標とし，本微生物が MazEF 機構を保持する生理学的意義を考察した．

Development of GC/MS analytical method by using solid phase
derivatization for plasma metabolomics

Characterization of MazF-mediated RNA Cleavage in Nitrospira○Shoya Arakawa1, Ryoichi Sasano2, Masahiro Furuno1, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Aisti Sci.)

Key words

metabolic analysis, pretreatment, GC/MS, plasma○Rie Aoi1,2, Tatsuki Miyamoto1,2, Akiko Yokota2, Yuri Ota1,2, Satoshi Tsuneda1,
Naohiro Noda1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

Toxin-Antitoxin, MazF, Sequence-specific cleavage, Nitrifying bacteria

122

1Mp02

Streptomyces sp. NT1 株由来 L-グルタミン酸オキシダー
ゼのフルコンセンサス設計による耐熱性の向上

1Mp04

メカノエンザイム・ダイナミン GTPase によるアクチン
線維束化機構の解析○齋藤 貴広 1, 久保田 瞳 1, 林 優花 2, 中野 祥吾 3, 伊藤 創平 3,
浅野 泰久 4, 酒瀬川 信一 5, 杉森 大助 1,2（1福島大・共生システム理工, 2福島大院・理工, 3静県大・食栄,4
富山県大・生工研セ, 5旭化成ファーマ）
sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp○山田 浩司 1, 阿部 匡史 1, 竹田 哲也 1, 高島 英造 2, 森田 将之 2,
竹居 孝二 1
（1岡山大院・医歯薬, 2愛媛大・プロテオサイエンスセンター）
hiroyama@md.okayama-u.ac.jp【背景・目的】
我々は，高い比活性を有する Streptomyces sp. NT1 株由来 L-グルタミン酸オキシ
ダーゼ (LGOXNT1) の耐熱性向上を目指し，温度因子を指標に部位特異的変異導入を行ってきた．これまでに，大腸菌発現 LGOXNT1 (rWT) の点変異により，その耐熱性を 55℃から 60℃まで向上させることに成功したが，実用化に向けて更に高い耐熱性が要求される．そこで，人工タンパク質設計法によりフルコンセ
ンサス型 LGOX (Fc_LGOX) を設計し，さらなる耐熱性向上を目指した．本発表
では，耐熱性向上，酵素生産性，変異体の精製，諸特性解析について報告する．
【方法・結果と考察】
BLAST サーチにより LGOXNT1 の類似配列 4919 配列を入手し，LGOXNT1 と非相同アミノ酸残基（aa）を in silico 解析により同定した．非相同 aa のうち耐熱化が予想される 104 ヵ所の aa を相同 aa に置換することで，コンセンサス配列を有した Fc_LGOX を設計・遺伝子全合成し，Fc_LGOX 遺伝子を pET24a/E. coli
BL21 (DE3) により発現させた．その結果，Fc_LGOX 発現株 cfe 中の LGOX 活
性は 22.3 U/mL，比活性 2.52 U/mg-protein となり，rWT に比べ各々約 2.5 倍酵素
生産性が向上した．さらに，Fc_LGOX は 65℃，30 min 活性を 100%維持し，
rWT に比べ 10℃も耐熱性が向上した．また，Fc_LGOX について詳細な諸特性解析を行うために DEAE カラム精製を行った結果，LGOX 活性 31.8 U/mL，比活性 25.0 U/mg-protein の高純度活性画分を得た．現在，精製 Fc_LGOX の諸特性解析や，目的酵素の精製を簡略化するため pMAL-c5x vector を用いて MBPtag 付加を進めるとともに，さらなる耐熱性向上を目指して独自の多重変異体設計と祖先型設計による LGOXNT1 の改良を試みている．

ほ乳類のダイナミンは，分子量約 85-100kDa の GTPase である．また，ダイナ
ミンは，細胞膜やアクチン線維上で重合し，自身の GTPase 活性と共役して構造をダイナミックに変化させ，細胞膜やアクチン線維に対して，機械的に「曲
げる」
「絞る」
「切る」
「束ねる」作用を持つ，いわゆるメカノエンザイムとして知られている．生理的には，エンドサイトーシス，小胞輸送，オルガネラの分裂や細胞移動に必須な分子である．
我々は，これまでに，ダイナミンがメカニカルにアクチン線維を束ねる現象を発見してきた．今回，GTPase とその構造機能相関を解析するため，ダイナミンの疾患変異体のアクチン動態への影響を調べた．細胞に対する効果では，K562E
変異体は，細胞内のストレスファイバーを減少させ，異常なアクチン線維の凝集を促進した．さらに，コムギ無細胞タンパク発現系を用いてダイナミンタン
パクを調製し in vitro で解析する系を構築した．この系を用いて精製したダイナ
ミンとアクチン線維を反応させたところ，ダイナミン重合体が，スペーサーとなり数本のアクチン線維をまとめていることが新たに判明した．今後，GTPaseとの連関を詳細に調べる予定である．

Thermostability enhancement of L-glutamate oxidase from Streptomyces sp.
NT1 by the full consensus design

Actin bundling mechanism by dynamin GTPase○Takahiro Saito1, Hitomi Kubota1, Yuka Hayasi2, Syogo Nakano3, Sohei Ito3,
Yasuhisa Asano4, Shin-iti Sakasegawa5, Daisuke Sugimori1,2(1Fac. Symbio. Syst. Sci., Fukushima Univ., 2Grad. Sch. Symbio. Syst. Sci.,
Fukushima Univ., 3Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka., 4Biotechnol. Res. Center,Toyama Pref. Univ., 5Asahi Kasei Pharma Corp.)
Key words
L-glutamate oxidase, full consensus design, artificial protein design,
thermostability enhancement

1Mp03

リンゴ酸デヒドロゲナーセの Closed 構造不安定化による比活性の向上および低温適性化○Hiroshi Yamada1, Tadashi Abe1, Tetsuya Takeda1, Eizo Takashima2,
Masayuki Morita2, Kohji Takei1(1Grad. Sch. Med. Dent. Pharm, Sci., Okayama Univ., 2Proteo-Science Center,
Ehime Univ.)

Key words

actin, cytoskeleton, GTPase

1Mp05

イオン液体を用いた標識酵素を含む各種酵素に対する長期安定性・高温耐熱性の評価○下澤 勇弥, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）nisiya@lif.setsunan.ac.jp○金子 恒太郎, 河合 功治（ミヨシ油脂）KANEKOK@so.miyoshi-yushi.co.jp【目的】リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）は TCA サイクルにおいてニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド（NAD）依存的にリンゴ酸からオキサロ酢酸（OAA）を生成する酸化還元酵素である．また，AST 測定や重炭酸イオン測定
等の臨床検査薬用酵素として既に応用されており，その他にも免疫検査用標識
酵素やバイオセンサーへの応用が期待されている非常に用途の広い酵素である．
Geobacillus stearothermophilus 由来 MDH（gs-MDH）は基質親和性が非常に高く
熱安定性にも優れているため，他の MDH と比べ臨床検査薬用酵素として有用性が高い．しかし，好熱性細菌由来で至適温度が 70℃と高く，臨床検査基準法の反応温度（30℃）では最大活性の 13％しか発揮できない．そこで我々は gsMDH の立体構造を基に活性発現メカニズムを考察し，活性部位周辺に部位特異的変異を導入することで，30℃における反応速度の向上（低温適性化）を試みた．
【方法・結果】gs-MDH の変異デザインのため，活性部位の可動ループが開いたOpen 構造と基質の結合により可動ループが閉じた Closed 構造の 2 つのコンホメーションをホモロジーモデリングにより予測した．その結果 Open 構造は多くのイオン結合により非常に安定化されている一方で，Closed 構造では OAAが安定化された構造に変化していた．このことから，Open 構造と Closed 構造のコンホメーション変化が，gs-MDH の反応速度や基質親和性に重要であることが推察された．そこで，Closed 構造における可動ループ周辺の Gly を側鎖の大きい Phe 等に置換し意図的に Closed 構造を不安定化させることで，ターンオーバーの上昇を試みた．その結果，30℃付近の低温における反応速度が野生型と比べ 2.2～2.9 倍向上した．また，変異体の活性化エネルギーは野生型の約50％程度まで低下した．

【背景・目的】
酵素は食品や医薬品分野の他，様々な分野において不可欠な材料であるが，非生理的環境下では容易に変性し，その優れた活性を失ってしまう場合が多く，酵素の安定化技術の探索が以前より行われてきた．これまでに我々は，4 級アンモニウム塩型イオン液体に着目し，中でも，特定官能基を導入したイオン液
体が酵素に対する長期安定性，耐熱性を付与することを見出した．
今回の発表では，本イオン液体の酵素安定化剤への応用を目指して，イオン液
体濃度（高濃度から低濃度）と酵素安定化との相関，工業分野で必要とされる～60℃の高温条件下での安定化効果，免疫染色や ELISA に使用される標識酵素として需要の高いペルオキシダーゼの長期安定性，耐熱性について検討した．

Improved specific activity and at low temperature by destabilization of
Malate dehydrogenase closed form

Long-term stability and thermo stability of various enzymes including
labeling enzyme by ionic liquids

Key words
malate dehydrogenase, protein engineering, destabilization, lowtemperature optimization

Key words○yuya Shimozawa, Yoshiaki Nishiya(Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)【方法・結果】
イオン液体の 1～86％水溶液に酸化還元，加水分解酵素をそれぞれ溶解し，25～60℃で一定期間保存した後，酵素活性を測定した．イオン液体の系は，いずれの水溶液濃度，保存温度においても，リファレンス（アルブミン等の各種安定化剤）より高い酵素活性を示した．
さらに，イオン液体水溶液を用いてペルオキシダーゼの安定化を試みた．溶液・室温保存が困難なペルオキシダーゼは，リファレンス（アルブミン等の各種安定化剤）の系では安定化効果が低かったが，イオン液体溶液においては，高い活性保持性を示した．
以上の結果より，本イオン液体が，高温下，いずれの濃度においても各酵素の安定化効果に優れ，特に，安定性の低いペルオキシダーゼに対しても安定化効
果を示すことが明らかとなった．
これらの結果は，本イオン液体のカチオン，アニオン中の特定の官能基の存在が，酵素の活性保持効果，耐熱性向上に強く影響することを示し，本イオン液
体が酵素を始めとする生体高分子の安定化剤への有用性が高いことが示唆された．

○Kotaro Kaneko, koji Kawai(Miyoshi Oil & Fat Co. Ltd.)

ionic liquid, enzyme, long-term stability, thermo stability

123

1Mp06

Chamaemelum nobile および Durio zibethinus 由来のア
ルコールアシルトランスフェラーゼの精製と酵素化学的諸性質の解明1Mp08

変異型ハロアルキル有機リン酸トリエステル加水分解酵
素の大腸菌発現系の構築と諸特性解析○阿部 勝正, 田中 成美, 高橋 祥司, 解良 芳夫（長岡技科大）katsuabe@vos.nagaokaut.ac.jp○大島 遼太郎 1, 吉川 千晶 1, 森 利明 1, 加藤 康夫 1,
七田 沙耶香 1,2, 礒部 公安 1,2, 元島 史博 1,2, 石田 裕幸 1,2,
浅野 泰久 1,2
（1富山県大・工, 2JST, ERATO）
asano@pu-toyama.ac.jp【背景と目的】植物は多種多様な芳香成分を合成し，その中でアルコールアシル
トランスフェラーゼ（AAT）は，エステル化合物の合成を触媒する酵素である．
AAT はアシル CoA の CoA をアルコールで置換しエステル化する触媒作用を持つ．AAT を用いて，メタクリリル CoA（Met-CoA）とアルコールから ME を合成する研究は，グリーンケミストリーの観点からも意義がある．
【方法と結果】ME を香気成分中に含む植物をスクリーニングし，複数の植物にAAT 活性を確認した．次に，カモミール（Chamaemelum nobile）およびドリアン（Durio zibethinus）が Met-CoA に対して高い AAT 活性を有することを確認した．ドリアンから AAT を精製し，DzibAAT 遺伝子のクローニングを行った．
ドリアンおよびカモミール由来 AAT を大腸菌で発現させ，抽出精製を行った．
本酵素の活性は，反応によって生じるエステル化合物を抽出し，ガスクロマト
グラフィーによって定量することで測定した．本酵素はいずれも分子量 53,000のモノマー酵素であり，至適 pH は 8.0 付近である．本酵素はいずれも主に短鎖のアルコールに対して基質特異性が高く，またドリアン由来の AAT はアセチル
CoA，カモミール由来の AAT はメタクリリル CoA に対して基質特異性が高い
ことが確認された．本報告では，これらの実験の経緯を踏まえ，主として両酵素の酵素化学的諸性質を比較して報告する．

【目的】Tris (1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCPP)は難燃剤等に使用されるハ
ロアルキル有機リン酸トリエステル類の一種で，発ガン性や神経毒性を有することから生態系への影響が懸念されている．これまで我々は TDCPP 分解菌
Sphingomonas sp. TDK1 株，Sphingobium sp. TCM1 株由来のハロアルキル有機リ
ン酸トリエステル加水分解酵素 (Sm-HAD，Sb-HAD)に関する種々の諸特性解析をおこない，両酵素は約 90％のアミノ酸配列の同一性を示すにも関わらず，酵
素活性や金属キレート剤への感受性など特性の違いを示すことを明らかにしている．これらの特性の違いはそれぞれの酵素特有の配列に起因するものと考えられるがその詳細は明らかではない．本研究では，Sb-HAD 特有の配列を挿入した変異型 Sm-HAD の諸特性解析を行うことで，それぞれの HAD の構造・機能に関する知見を得ることを目的とした．
【方法及び結果】HN タグを C 末端に融合させた Sm-HAD-HN，Sb-HAD-HN，
変異型 Sm-HAD-HN の大腸菌発現系を構築した．上記三種のタグ融合 HAD は
大腸菌 BL21(DE3)において活性型酵素として発現することが示されたことか
ら，本酵素を金属アフィニティーカラムで精製した後，至適温度・pH や補因子等の酵素学的諸特性について解析を行った．野生型酵素及び変異型酵素の活性測定の結果，変異型酵素は Sm-HAD-HN の 1/3 程度の活性しか示さず，Sb-HADの高酵素活性という特徴には本特有配列は関与していない可能性が示された．
また，他の諸特性解析の結果からは，この特有配列は至適温度と金属キレート剤に対する感受性に影響を与えず，pH 感受性や金属嗜好性へ関与している可能性が示された．上記の結果より，本研究で用いた Sb-HAD 特有配列は両酵素間で見られる大きな諸特性の違いに関与しておらず，Sm-HAD 特有配列または他のアミノ酸残基がそれらに関与していることが考えられた．

Purification and characterization of alcohol acyltransferases fromChamaemelum nobile and Durio zibethinus

Expression and characterization of a mutated form of thehaloalkylphosphorus hydrolase○Ryotaro Ohshima1, Chiaki Yoshikawa1, Tomoaki Mori1, Yasuo Kato1,
Sayaka Shichida1,2, Isobe Kimiyasu1,2, Fumihiro Motojima1,2, Yuko Ishida1,2,
Yasuhisa Asano1,2(1Fac. Eng., Toyama Pref. Univ., 2JST, ERATO)○Katsumasa Abe, Narumi Tanaka, Shouji Takahashi, Yoshio Kera
(Nagaoka Univ. Technol.)Key words

Methyl methacrylate, Alcohol acyltransferase, Green chemistry

Key words

Sphingomonas, hydrolase, Organophosphorus compounds

1Mp07

ハロアルキル有機リン酸トリエステル加水分解酵素中のシグナル様ペプチドの機能解析

1Mp09

イノシトール遊離能をもつフィターゼ Phy9-3B の触媒機
構の解析

○今野 聖矢, 今井 俊宏, 阿部 勝正, 高橋 祥司, 解良 芳夫（長岡技科大）katsuabe@vos.nagaokaut.ac.jp○武生 みのり 1, 佐々木 海 1, 尾瀬 農之 2, 阿部 歩 1, 曾根 輝雄 1
（1北大院・農, 2北大院・生命科学）
sonet@chem.agr.hokudai.ac.jp【目的】ハロアルキル有機リン酸トリエステル類の一つである tris (2-chloroethyl)
phosphate (TCEP)はプラスチックの可塑剤や難燃剤として広く利用されてきたが,近年,発がん性, 難分解性,変異原性が報告されたことから,本化合物の生態系への影響が懸念されている.当研究では野外試料から TCEP 分解能を有する
Sphingobium sp. TCM1 株を単離し，その初発分解酵素であるハロアルキル有機
リン酸トリエステル加水分解酵素（HAD）の精製，諸特性解析を行ってきた．
その結果，本酵素は一般的なシグナルペプチドとは全く異なる非常に長いシグ
ナル様配列を有する可能性が示唆された．本研究では TCM1 株における本シグ
ナル様ペプチドの機能解析を目的として，本領域欠損 HAD を発現する TCM1
変異株を構築し，種々の解析を行った．【方法及び結果】変異型 had 遺伝子をマーカーレス遺伝子欠失用ベクターである pAK405 を用い，野生型 had 遺伝子と置き換えるように相同組み換えで TCM1 株ゲノム中に挿入した．構築した
TCM1 株変異体についてはコロニー PCR 解析によって確認を行った．野生型
TCM1 株および変異株を had 遺伝子発現条件下（無機リン酸制限下）で培養し，得られた菌体を用いて TCEP 分解活性を測定したところ，野生株のみその分解活性を示し，変異株は TCEP を全く分解しなかった．また，両菌株の生育特性についても解析した結果，無機リン酸存在下では生育速度に違いは見られなかったのに対し，TCEP を唯一のリン源とした条件下では野生株のみ生育し，変異株については全く生育しなかった．以上の結果より，本シグナル様配列は HADの発現または活性に必須であることが明らかとなった．

【研究背景】 フィチン酸（IP6）は，麦や大豆などの植物種子中における主要な
リン酸貯蔵形態である．IP6 から無機リン酸を段階的に遊離させる酵素である
フィターゼは単位動物の栄養効率を改善するために飼料に添加されているが，その多くは IP6 のリン酸基全てを加水分解することはできない．当研究室で得た Klebsiella pneumoniae 9-3B 株由来のフィターゼ Phy9-3B は IP6 を完全分解す
ることができる．そこで本研究では Phy9-3B の触媒機構の解明を目的とした．
【方法と結果】 Phy9-3B を組換え生産・精製し，X 線構造解析により立体構造を決定した．Phy9-3B とイノシトール遊離能を持たないことが報告されている
Eschelichia coli ATCC12435 株由来のフィターゼ AppA 間の立体構造比較を行ったところ，基質結合部位におけるイノシトール 1 リン酸（IP1）との相互作用にTyr238 が関わっていることが予想された．Phy9-3B の Tyr238 はイノシトールの遊離に必須のアミノ酸残基であると仮定し，本アミノ残基とこれに対応する
AppA 上のアミノ酸残基 Phe254 を交換した 1 アミノ酸残基置換体 Phy9-3BY238F及び AppAF254Y をそれぞれ大腸菌に発現させ，純度 95%以上の酵素サンプルを獲得した．次に，これら 4 種のフィターゼについて，IP6 と IP1 の 2 つの基質に対するフィターゼ活性試験を行い，それぞれの比活性を求めた．その結果，両酵素において基質結合部位におけるアミノ酸残基が Tyr の場合，Phe の場合に比べて IP6 に対する比活性が高かった．さらに，フィチン酸触媒活性あたりのイノシトール遊離活性 (IP1 活性 / IP6 活性) を算出した結果，1 アミノ酸置換により IP6 活性が大きく変化したために Phy9-3B ではこの値が増加し，AppA では低下したことがわかった．これらより，Phy9-3B の基質結合部位における Tyr238
はイノシトール遊離活性よりもむしろフィチン酸触媒活性に寄与していたことが示唆された．

Investigation of the role of signal-like sequence of haloalkylphosphorushydrolase

Analysis of catalytic mechanism of phytase Phy9-3B with inositol liberating
activity○Seiya Konno, Toshihiro Imai, Katsumasa Abe, Shouji Takahashi, Yoshio Kera
(Nagaoka Univ. Technol.)Key words

signal peptide, organophosphorus hydrolase○Minori Takyu1, Kai Sasaki1, Toyoyuki Ose2, Ayumi Abe1, Teruo Sone1(1Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Life Sci., Hokkaido Univ.)

Key words

phytase, inositol, phosphatase, phytic acid

124

1Mp10

シトクロム P450BM3 と酵素活性化分子を利用した大腸
菌内でのベンゼンの直接酸化

1Mp12○唐澤 昌之 1, 柳澤 颯太 1, 荘司 長三 1,2, 渡辺 芳人 3（1名大院・理, 2JST CREST, 3名大・物国セ）
shoji.osami@a.mbox.nagoya-u.ac.jp

The additional N-terminal domain of the beta-propeller
phytase of Pseudomonas sp. FB15 serves to increase lowtemperature activity and catalytic efficiency○WonJe Jang, Hae Dae Park, Yu Bin Choi, In-Soo Kong
(Dept. Biotechnol., Pukyong Natl. Univ., Busan, Republic of Korea)
iskong@pknu.ac.kr

シトクロム P450BM3 (P450BM3)はヘム(鉄ポルフィリン錯体)を活性中心とする金属酵素で，長鎖脂肪酸の亜末端を水酸化する．P450BM3 は長鎖脂肪酸の水酸化に適した活性部位を持つため，ベンゼンやプロパンのような有機小分子に対する活性は極めて低い．我々は，長鎖脂肪酸を模した擬似基質(デコイ分子)を用いて，変異導入することなく P450BM3 の酵素機能を改変する「基質誤認識システム」を報告している．デコイ分子は基質と誤認識されて P450BM3 内部へ取り込まれ，酸化活性種の生成を誘起する．また，デコイ分子は鎖長が短く設計されており，ヘム上部に新しい反応空間を作り出す．このため，生成した
酸化活性種によって非天然基質の水酸化反応が効率的に進行する．
我々は，パーフルオロカルボン酸(PFC)がベンゼンやプロパンの水酸化を促進することを報告し，PFC にアミノ酸修飾を施したデコイ分子がより高い活性を示すことを明らかとしている．さらに近年，フッ素を含まないカルボン酸にアミノ酸を修飾したデコイ分子が，ベンゼンの水酸化を著しく促進することを報告している．
しかし，P450BM3 の反応で消費される補酵素 NADPH は極めて高価であるため，in vitro での酵素反応系は実用性に乏しいことが課題である．そこで本研究では，基質誤認識システムと菌体内の補酵素再生系を組み合わせた新しい反応システムを開発し，P450BM3 を過剰発現させた大腸菌内でベンゼンからフェノールへの直接変換に挑戦した．

Pseudomonas sp. FB15 producing phytase with a high activity at low temperature wasisolated from foreshore soil. The phytase gene was cloned and sequenced. Molecularmodeling predictions using its amino acid sequence indicated that it belongs to thegroup of beta-propeller phytases (BPPs). However, it differs from the conventional
structure of BPPs in the number of propeller-shaped domains. Most BPPs have apropeller with six blades that consist of four or five beta-sheets. However, the BPP
from the isolated strain contained a C-terminal domain containing a conserved BPP
sequence and also an N-terminal domain consisting of an additional 275 amino acids.
The characterization of recombinant BPP from Pseudomonas sp. FB15 (PSphy)
revealed the highest activity to be at pH 6 and 40°C. Additionally, it showed that morethan 80% of optimal activity was retained at a relatively low temperature of 25°C. In
addition, CaCl2 was required for activity, and the optimal concentration of CaCl2 was
4mM. The activity at low temperature was reduced in a recombinant protein fromwhich the N-terminal domain was removed, as was catalytic efficiency. These results
suggest that the N-terminal domain is required for the low temperature activity andhigh catalytic efficiency of PSphy.

Direct Hydroxylation of Benzene to Phenol Utilizing Cytochrome P450BM3
and Enzyme Activators in Escherichia coli Whole-Cell Biocatalyst

The additional N-terminal domain of the beta-propeller phytase of
Pseudomonas sp. FB15 serves to increase low-temperature activity andcatalytic efficiency○Masayuki Karasawa1, Sota Yanagisawa1, Osami Shoji1,2, Yoshihito Watanabe3(1Dept. Chem., Grad. Sch. Sci., Nagoya Univ, 2JST CREST, 3Res. Cent. Mat. Sci.,
Nagoya Univ)○WonJe Jang, Hae Dae Park, Yu Bin Choi, In-Soo Kong
(Dept. Biotechnol., Pukyong Natl. Univ., Busan, Republic of Korea)

Key words

P450, Escherichia coli, hydroxylation, benzene

Key words

beta-propeller phytase, alkaline phytase, phytate, Pseudomonas sp.

1Mp11

ゴマ由来セサミノール配糖体特異的な新規配糖体化酵素
の機能解析

1Mp13

Methylobacterium extorquens AM1 のランタノイド依存型メタノールデヒドロゲナーゼの解析
吉川 友理 1, 北村 純一 1, 矢野 嵩典 1, 中川 智行 2, 谷 明生 3,○三井 亮司 1（1岡山理大・理, 2岐阜大・応生科, 3岡山大・資源植物科研）
rmitsui@dbc.ous.ac.jp○及川 大樹 1, 和氣 駿之 1, 小埜 栄一郎 2, 村田 純 3, 白石 慧 3,
堀川 学 3, 中山 亨 1（1東北大院・工, 2サントリーグローバルイノベーションセン
ター, 3サントリー生命科学財団）
nakayama@seika.che.tohoku.ac.jp【緒言】ゴマ（Sesamum indicum L.）中に含まれるリグナンは抗酸化活性を有し，その健康機能性から産業的に広く用いられている．セサミノールはゴマリグナンの一つであり，ゴマ種子中においては三糖が付加したセサミノールトリグル
コシド（STG）として存在している．STG は β(1→6) および β(1→2) グルコシド結合による糖鎖構造を持ち，これまでにセサミノール配糖体の 6’位のグルコー
ス付加を触媒する UGT94D1 が報告されたが[1]，2’位のグルコース付加を触媒する酵素は同定されていなかった．本研究では，STG の生合成経路の解明のため，ゴマの Glycoside-specific glycosyltransferases（GGTs）の探索とその詳細な酵
素機能解析を行った．
【方法と結果】ゴマ種子を 6 つの成熟ステージに分類し，RNA-seq 解析を行った．UGT94D1 と共発現する 3 つの GGT 遺伝子を選抜し，選抜した 20601，
21646，21842 の各酵素遺伝子を大腸菌発現ベクター pET15b に導入した．このベクターを用いて大腸菌 BL21(DE3) 株を形質転換し，各酵素遺伝子を His6-tag
融合タンパク質として異種発現させ，ニッケルアフィニティークロマトグラ
フィーにより精製した．その後，セサミノールやセサミノール配糖体，フラボ
ノイド類を糖受容体，UDP-グルコースを糖供与体として酵素反応を行い，反応生成物を HPLC により解析した．その結果，まず，20601 は，4 種類のセサミ
ノール光学異性体のうち，2-エピセサミノールに対してのみ弱い活性を示すことが確認された．一方，21842，21646 は，セサミノール配糖体に対して高い活性を示し，それぞれ 2’位，6’位へのグルコース付加を触媒することが明らかとなった．また，21842，21646 の触媒効率はそれぞれ基質の種類に因らず同程度の値であり，この触媒効率は UGT94D1 とも同程度であることが示された．
【参考文献】[1] Noguchi, A., et al, Plant J.(2008)【目的】植物に共生するメチロトローフ細菌である Methylobacterium 属は複数のメタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)を保持し，ランタノイドの有無や炭素源に応答して発現をコントロールしている．これらのそれぞれの役割は明らかになっていないが，Methylobacterium が植物葉上で共生する過程において重要な役割を担っているのではないかと推定している．本研究で用いた M. extorquens AM1
は，PQQ を補酵素とする MxaFI, XoxF1, XoxF2 の少なくとも 3 つの MDH を有している．また，MxaFI は Ca2+を補因子として用いるのに対し，XoxF1, XoxF2
は La3+などの軽ランタノイドを補因子としてだけでなく，発現調節にも関与することを明らかにしてきた．今回，ランタノイド依存型の XoxF1 と XoxF2 に着目し，解析用に各種の組換え株を作製して XoxF1, XoxF2 の解析とレポーター
遺伝子を用いた発現解析を行った．
【方法・結果】XoxF1 と XoxF2 に His-tag を融合させて M. extorquens AM1 の各
MDH 遺伝子破壊株に導入することで XoxF1 または XoxF2 単独で発現する株を作製した．Ni アフィニティーカラムを用いて精製を行い，SDS-PAGE にて確認した結果，XoxF1, XoxF2 のバンドとともに 20kDa の位置にバンドが確認された．このバンドを PMF 解析およびエドマン分解によるプロテインシーケンスを行ったところ，Formaldehyde activating enzyme(Fae)であることが明らかになった．Fae はメタノール代謝において MDH によるメタノールの酸化で生じたホルムアルデヒドと C1 キャリアーである H4MPT との結合を触媒することから，
ホルムアルデヒドの速やかな毒性回避に関与するための代謝酵素複合体である可能性が考えられた．XoxF1 と XoxF2 はエドマン分解による N 末端解析より
シグナル配列をもつペリプラズム酵素であると考えられ，Fae の局在に関してもさらなる検討が必要であると考えている．

Functional analysis of novel sesaminol glycoside-specific glucosylation
enzymes from sesame (Sesamum indicum L.)

Analyses of lanthanides-dependent methanol dehydrogenase in M.
extorquens AM1○Daiki Oikawa1, Toshiyuki Waki1, Eiichiro Ono2, Jun Murata3, Akira Shiraishi3,
Manabu Horikawa3, Toru Nakayama1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Suntory Global Innovation Center (SIC), 3Suntory
Fdn. Life Sci. (SUNBOR))

Key words

Sesamum indicum, Lignan, Sesaminol, Glucosyltransferase

Yuri Yoshikawa1, Junichi Kitamura1, Takanori Yano1, Tomoyuki Nakagawa2,
Akio Tani3, ○Ryoji Mitsui1(1Fac. Sci., Okayama Univ. Sci., 2Fac. Appl. Biol. Sci., Gifu Univ., 3IPSR., Okayama
Univ.)
Key words
Lanthanides

Plant symbiotic bacteria, methylotroph, Methylobacterium,

125

1Mp14

光化学系 II 再構成メタンモノオキシゲナーゼ膜画分を用いたメタン酸化反応

1Mp16

近藤 龍一, 森 史也, 伊藤 栄紘, ○蒲池 利章（東工大院・生命理工）tkamachi@bio.titech.ac.jp

バイオマス分解酵素の大規模スクリーニングで見出した希少放線菌○竹中 武藏 1, Lee Jae Min 2, Pamella Apriliana 2, 柏木 紀賢 1,Prihardi Kahar 1, 荻野 千秋 2, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大院・工）ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

天然ガス主成分であるメタンの有効利用に向け，メタンのメタノールへの選択的酸化反応が注目されている．メタン資化細菌由来メタンモノオキシゲナーゼ
は常温常圧下，一段階でメタン/メタノールの変換を触媒する．この反応には電子供与体が必要である．そこで，本研究では，メタンモノオキシゲナーゼと好熱性シアノバクテリア由来光化学系 II を組み合わせて，光駆動型酸化反応系を構築した．光化学系 II は光照射下，水から電子を受容し，キノンを還元することができる．この光化学系 II をメタン資化細菌の膜画分に再構成し，光照射することで，水から得た電子が膜中のキノンを介してメタンモノオキシゲナーゼへ伝達され，酸化反応が進行することが分かった．本研究により，無尽蔵な光エネルギーを利用した低エネルギーのメタノール生産が期待できる．

放線菌は約 2200 種からなる多様性を有するバクテリアであり，自然環境の様々な場所から単離される．そして，自然環境中においては植物バイオマスや動物
バイオマスなどを分解して炭素源を獲得している．そこで，本研究では植物バ
イオマスからのバイオリファイナリーを志向して，高分解能を有する酵素製剤の探索を実施した．
具体的には，NBRC 株 850 種をスクリーニングにかけて段階的に選抜を実施した．本研究では，モデルバイオマスとして希硫酸前処理ソルガムバガスを取り上げて，酸性条件下でのスクリーニングを実施した．数種の放線菌がモデルバ
イオマスを高分解する酵素製剤を分泌していることを見出した．その中で最も高性能であった Nonomuraea fastidiosa についてさらなる解析を実施した．多くの放線菌でセルラーゼがバイオマスによって誘導されていることを示唆する結果と，Nonomuraea fastidiosa がアクセサリー酵素を豊富に分泌していることを示
唆する結果を得た．本研究の成果により，放線菌を用いたバイオリファイナリー
の促進と，未利用放線菌の開拓が期待できる．

Photoinduced methane oxidation of by the PSII reconstituted membrane
containing methane monooxygenase

Large-scale screening of Actinobacteria for biomass degrading enzyme
cocktail with higher titer

Ryuichi Kondo, Fumiya Mori, Hidehiro Ito, ○Toshiaki Kamachi(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Key words

1Mp15○Takenaka Musashi1, Jae Min Lee2, Pamella Apriliana2, Norimasa Kashiwagi1,
Prihardi Kahar1, Chiaki Ogino2, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ.)methane monooxygenase, photosystem II

Key words
enzymeactinomycetes, Biomass degrading enzyme, cellulase, Accessary

Clostridium cellulovorans 743B 由来エンドグルカナーゼ

1Mp17

リン酸化合物加水分解酵素フィターゼの活性に重要な
ループ領域の変異解析

Ｅの酵素学的諸性質○幸崎 涼, 三宅 英雄（三重大院・生資）
miyake@bio.mie-u.ac.jp○和田 愛未, 林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）arai@bio.c.u-tokyo.ac.jp【目的】エンドグルカナーゼＥ（EngE）は嫌気性細菌 Clostridium cellulovorans
が生産する糖質分解酵素である．この酵素は触媒ドメイン，糖質結合モジュー
ル，ドックリンドメイン，そして 3 つの Surface layer homology ドメインと多くのドメインから構成され，糖質分解酵素の中でもユニークな酵素の 1 つである．
本研究では EngE の特性を明らかにすることを目的とし，基質特異性の評価と反応速度論的解析を行った．
【方法・結果】組換え体 EngE を作製し，様々な多糖と反応させ，その生成物をTLC により分析した．その結果，CMC と PASC を基質とした場合は主に 2 糖と 3 糖を生成したが，微結晶セルロースでは生成物が検出されなかった．これより，EngE は結晶度の低いセルロースを好んで分解するセルラーゼであると分かった．また glucomannan や lichenan，beta-glucan では生成物を検出した一方で，xylan では検出されなかった．glucomannan，lichenan，beta-glucan の主鎖にはセルロースと同じグルコース残基が含まれるため，EngE はそれらの beta-1,4グリコシド結合を加水分解したと考えられる．次に CMC を基質として反応速度論的解析を行った．その結果，基質濃度が 3 mg/mL 以上になるとミカエリス
メンテンモデルから逸脱し，反応初速度が低下する現象が見られた．そこで得られたデータに複数の基質阻害モデルを充て，解析したところ，酵素に 2 つの基質が結合した ESS 複合体からも生成物を生産するモデルに適合した．さらにESS 複合体の形成において，基質の結合に順序はなく，基質は酵素の結合サイ
トにランダムに結合し得ることが明らかとなった．

【背景】リン酸化合物であるフィチン酸は，植物の種子に多く含まれるリン貯蔵物質である．しかし，ブタなどの単胃動物ではフィチン酸は分解されないため，
家畜飼料から栄養素としてのリンを吸収することが困難である．そのため，フィチン酸から無機リンを放出できる酵素フィターゼが家畜飼料の添加剤として用いられている．本研究では，フィターゼの中でも特に活性の高い大腸菌由来のフィターゼ AppA に着目した．AppA の基質結合ポケットの前を横切るループには活性残基が含まれており，そのループの動きが基質進入や触媒効率を左右すると考えられている．しかし，ループ中の各残基が酵素の機能発現に果たす役割は未解明である．そこで本研究では，AppA の活性部位を含むループ領域（11 残基）の各残基の活性への寄与を明らかにするため，各残基を Ala と Glyに置換した 19 個の変異体を構築した．【手法】各変異プラスミドで大腸菌を形質転換し，液体培養を行った．菌体破砕上清を用いて酵素反応を行い，フィチン酸塩分解活性を求めた．菌体破砕上清を SDS-PAGE に供し，AppA のバンド強度で活性の規格化を行った．
【結果・考察】活性残基である H17，基質結合残基である R16 の Ala, Gly 変異体において，活性の完全な消失がみられた．5 つの保存残基の Ala, Gly 変異体では，電荷をもつ残基では活性が失われた一方，電荷をもたない残基では活性の部分的な減少に留まった．これは，電荷をもたない保存残基は構造保持に関与しており，AppA の触媒反応に直接的には関わっていないためと考えられる．以上の結果から，ループ上の各残基が機能発現に果たす役割が明らかになった．また，本研究の成果は，高活性化 AppA 変異体を作製し，家畜のリン吸収効率を向上させる上で有用と期待される．

Characterization of Endoglucanase E from Clostridium cellulovorans 743B

Mutational analysis of the loop region essential for the activity of phytase, aphosphate compound-hydrolyzing enzyme○Ryo Kozaki, Hideo Miyake(Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.)

Key words

Clostridium cellulovorans, endoglucanase, kinetics, cellulase○Manami WADA, Yuuki HAYASHI, Munehito ARAI
(Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo)

Key words

phosphate compound, hydrolase, phytase, site-directed mutagenesis

126

1Mp18

海藻多糖由来の新しい希少糖であるアルギン酸デオキシ糖の製造方法

1Np02

低温菌シンプル酵素触媒の宿主とその培養に関する基盤的解析○三宅 英雄 1, 村瀬 祥光 1, 濱地 野乃香 2, モリ テツシ 3,
田中 礼士 1, 植田 充美 4, 柴田 敏行 1
（1三重大院・生資, 2三重大・生資, 3農工大院・工, 4京大院・農）miyake@bio.mie-u.ac.jp○鴨木 明子 1, 田島 誉久 1, 小西 正朗 2, 八久保 晶弘 2, 坂上 寛敏 2,
南 尚嗣 2, 山下 聡 2, 中島田 豊 1, 加藤 純一 1
（1広島大院・先端物質, 2北見工大）
ttajima@hiroshima-u.ac.jp【目的】アルギン酸資化性微生物は，エンド型とエキソ型のアルギン酸リアーゼ
によってアルギン酸を単糖である不飽和ウロン酸にまで分解し，そのピラノース環が開裂した 4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid (DEH) を生成する．
その後，DEH は DEH reductase (DehR) により 2-keto-3-deoxy-D-gluconate (KDG)に還元され，最終的にピルビン酸にまで変換される．DEH と KDG は中間代謝物であり，単離することは困難なため希少性が極めて高い単糖である．我々は，褐藻類を資化する微生物を対象としたスクリーニングを行い，Falsirhodobacter
sp. alg1 からエンド型アルギン酸リアーゼ (AlyFRA) とエキソ型アルギン酸リアー
ゼ (AlyFRB) を報告した．さらに Formosa haliotis strain MA1 から DehR の存在を明らかにした．そこで本研究では，これらの酵素を用いることで海藻多糖由
来の希少糖である DEH と KDG の製造方法を検討した．
【方法・結果】AlyFRA，AlyFRB，DehR の組換えタンパク質を作製した．アル
ギン酸ナトリウムを AlyFRA のみ，AlyFRB のみ，AlyFRA と AlyFRB の 3 通り
で反応させ，反応液を TLC に供した結果，AlyFRB のみと AlyFRA と AlyFRBの両方では 1 つのスポットを検出した．さらに LC/MS で分析した結果，生成物は DEH であった．収率を検討した結果，最大 86.8 %の DEH を得ることに成功した．得られた DEH を NADH 存在下で DehR と反応させたところ，時間の経過とともに NADH の減少を観測した．次に反応液を TLC に供した結果，DEHのスポットは消失し，より低い位置に新しいスポットを検出した．さらにLC/MS で分析した結果，生成物は KDG であった．これら 3 種の酵素を用いることで簡便かつ高い収率で DEH と KDG を得ることに成功し，機能性食品としての利用や海藻から新素材や燃料の製造への応用が期待される．

【目的】我々はシンプル酵素触媒の宿主として低温菌を用いた有用物質の効率的な物質変換触媒の構築を進めている．しかし，低温性 Shewanella 属細菌は増殖が遅く，菌体収量が低いことが工業化における大きな課題である．そこで，その問題点を解決するために，本研究では培養条件の最適化と新たな菌株の探索を試みることで，培養時間の短縮と菌体収量の向上を目的とした．
【方法・結果】まず，これまで低温菌シンプル酵素触媒に用いてきた Shewanella
属細菌の培養条件を検討した．マリン培地を用いた増殖評価の結果，酸素供給量の増加に伴い増殖が大幅に向上した．さらに，複合培地にカザミノ酸を添加することで増殖に正の効果が見られた．カザミノ酸は各種アミノ酸を含んでいるが，そのうち含有量の少ないスレオニンをさらに添加することで増殖が向上
し，マリン培地の約 8 倍(33×109cfu/mL)の収量であった．次に，増殖速度の高い菌株の探索を試みた．北海道道東沖より取得した海底泥を反復回分培養すること で ， 新 た な 低 温 菌 株 を 得 ら れ た ． こ れ ら は 16S rRNA 解 析 に よ り ，Pseudoalteromonas 属，Vibrio 属であった．そのうち，Pseudoalteromonas sp. AK17株は比増殖速度が最も高く(μ=0.80 h-1)，Shewanella 属細菌の約 2 倍であった．
以上より，培養時間の短縮と菌体収量の向上に成功した．現在，培地にビタミンを添加することで比対数増殖後期での増殖停滞の改善を図っている．さらに，
AK17 株を宿主とした異種遺伝子発現用プラスミドの導入を検討している．

Method for producing new rare sugars: alginate deoxy sugars derived fromseaweed polysaccharide

Basic analysis on the host and its culture for psychrophile-based simple
biocatalyst○Hideo Miyake1, Yoshihiro Murase1, Nonoka Hamaji2, Tetsushi Mori3,
Reiji Tanaka1, Mitsuyoshi Ueda4, Toshiyuki Shibata1(1Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ., 2Fac. Bioresour., Mie Univ., 3Grad. Sch. Eng.,Tokyo Univ. Agric. Technol., 4Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words

1Np01

alginate, rare sugar, reductase, alginate lyase

Key words

運動性乳酸菌の選択分離法の構築

1Np03○田中 悠二, 柳田 藤寿, 乙黒 美彩（山梨大生・ワイン研）
motoguro@yamanashi.ac.jp【目的】
乳酸菌は一般的に非運動性であるが，近年 Lactobacillus 属のいくつかの種で運動性が報告されている．しかし，運動性乳酸菌の既知種が少ないため，その運動性の機能において未解明な点が多い．そこで，本研究では運動性乳酸菌の選択分離法を構築し，自然界及び発酵食品中からこれらの菌群を効率的に分離することを目的とした．また，ワイン発酵もろみにおける運動性乳酸菌の分布を調査した．
【方法・結果】
本研究では選択分離法の基盤に毛細管捕集法を起用し，誘引剤として 7 種類のアミノ酸水溶液と酵母エキス水溶液を用い，運動性乳酸菌の既知種 8 株について誘引剤の評価試験を実施した．運動性を発現させるため，菌体をリン酸緩衝
液で懸濁し，30℃，1 時間培養した．培養液をアクリル樹脂製のチェンバー容
器に充填し，4 つのレーンそれぞれに誘引剤を充填したキャピラリーを設置した．30℃，1 時間静置した後，キャピラリー内に誘引された運動性細胞を回収し，MRS 寒天培地に接種することで，出現したコロニー数をカウントした．その結果，ロイシン，セリン，アスパラギン，酵母エキスの各水溶液における回収率が高かったため，以上を誘引剤として，ワイン醸造中の発酵もろみから運動性乳酸菌の分離を試みた．発酵もろみを抗生物質添加 MRS ブロス，トマト
ジュース液体培地でそれぞれ培養した後，評価試験と同様の操作で得られたコロニーから，214 株の乳酸菌を分離した．MRS 軟寒天培養において 34 株で運動性が確認できた．また，MALDI-TOF MS による同定を行った結果，34 株の内 L. brevis が 17 株，L. pentosus/plantarum が 1 株，未同定株が 16 株であった．
現在，未同定の運動性株 16 株については 16S rRNA 塩基配列から種の同定を行っている．今後，フラジェリン遺伝子に着目し，PCR によって分離株の運動性遺伝子の有無を確認する予定である．

Development of selective isolation method of motile lactic acid bacteria○Yuji Tanaka, Fujitoshi Yanagida, Misa Otoguro(Inst. Enol. Vitic., Univ. Yamanashi)

Key words○Akiko Kamogi1, Takahisa Tajima1, Masaaki Konishi2, Akihiro Hachikubo2,
Hirotoshi Sakagami2, Hirotsugu Minami2, Satoshi Yamashita2,
Yutaka Nakashimada1, Junichi Kato1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Kitami Inst. Technol.)lactic acid bacteria, lactic acid bacterial diversity, chemotaxis, motility

psychrophile, Pseudoalteromonas, 16S rRNA, amino acid

コリネ型細菌におけるトキシン/アンチトキシン系の解析○田中 裕也 1, 前田 智也 2, 乾 将行 1,3（1RITE, 2理研・生命システム, 3奈良先端大・バイオ）tanakayu@rite.or.jp【目的】我々は有用工業微生物 Corynebacterium glutamicum を用いて様々な物質生産に取り組んでいる．物質生産を効率的に行うには菌の生育を適切にコントロールする必要がある．細菌は環境ストレス下において DNA 複製や遺伝子発現を抑制し，増殖を抑制する機構，トキシン/アンチトキシンシステム(TA シス
テム)を持っている．TA システムは大腸菌等で制御機構，作用機構が調べられているが C. glutamicum での報告は無い．今回我々は C. glutamicum の TA シス
テムを見出し，制御機構について解析したので報告する．
【方法と結果】C. glutamicum の GrtA，GrtB，GrtC はグルタミンリッチな低分子タンパクである．それぞれの機能を調べるため遺伝子発現強化したところ C.
glutamicum の生育が遅延した．この時に grtA のアンチセンス RNA である AsgRを同時に発現させると生育は回復した．AsgR の転写を抑制した状態では grtA，
grtB，grtC mRNA の半減期が増大すること，RNase III をコードする rnc 遺伝子の破壊により grtA，grtB，grtC mRNA が安定化すること，RNase III の切断部位
が grtA 3’-UTR に存在することをプライマー伸長法により確認したことからAsgR を介した RNase III による切断制御機構の存在が示唆された．さらに grtA，
grtB，grtC の発現がペニシリン G 等のストレスで誘導されること，grtA，grtB，grtC 遺伝子同時破壊でペニシリン G 等のストレスに対する耐性が低下することも観察した．以上の結果は GrtA，GrtB，GrtC および AsgR が C. glutamicum のTA システムとして働くことを示している．

Glutamine-rich proteins with antisense RNA constitute a toxin-antitoxin
system in Corynebacterium glutamicum○Yuya Tanaka1, Tomoya Maeda2, Masayuki Inui1,3(1RITE, 2QBiC, RIKEN, 3Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Corynebacterium glutamicum, toxin-antitoxin, sRNA, RNase III

127

1Np04

コリネ型細菌におけるトレハロース‐6‐リン酸合成酵
素のフィードバック阻害

1Np06○生出 伸一 1, 乾 将行 1,2（1RITE, 2奈良先端大・バイオ）mmg@rite.or.jp

光照射により誘導される葉面細菌の色素生産○井口 博之, 金ヶ崎 三千翔, 石井 沙弥, 田口 和真（京都学園大・バイオ）iguchih@kyotogakuen.ac.jp【目的】産業レベルの物質生産において生産菌は多様なストレスにさらされるた
め，生産菌のストレス耐性は生産性を決定する一因となる．先行研究において，
我 々 は 自 然 変 異 を 利 用 し た 手 法 を 用 い ， ア ミ ノ 酸 生 産 菌 Corynebacterium
glutamicum の高温ストレス耐性株の育種に成功した．耐性株ゲノムの解析により高温耐性に寄与する 3 変異が同定され，うち 1 つが trehalose-6-phosphatesynthase （TPS）の構造遺伝子 otsA 上に生じていることが判明した．本研究は当該変異による高温耐性改善機構の解明を目的とする．
【方法と結果】我々はまず高温耐性株と親株のトレハロース生成について定量解析を行い，前者における菌体内外のトレハロース蓄積量が後者と比較して増大していることを明らかにした．耐性株において変異型 otsA を野生型と置換した復帰株では高温耐性の低下に加えトレハロース蓄積量の減少が観察されたが，本株に近縁種由来のトレハロース輸送タンパク質を導入すると，菌体内トレハロース蓄積量ならびに高温耐性が耐性株と同等に回復した．つぎに，大腸菌発現系を用いて組換えタ
ンパク質を調整し，野生型および変異型 TPS の酵素活性を解析した．その結果，変異型 TPS について基質の 1 つである uridine-5’-diphosphoglucose（UDPG）
に対する親和性の低下が示唆されたほか，野生型 TPS に対しトレハロースがUDPG 競合阻害剤として作用すること，また変異型 TPS がトレハロースによる
フィードバック阻害に対し耐性を有することが明らかになった．ホモロジーモ
デリングにより予測された野生型 TPS の立体構造はこれらの結果と合致し，トレハロースと UDPG による結合部位の競合を示唆した．【結論】一連の結果から，当該変異に起因する TPS の阻害耐性獲得により，耐性株において菌体内ト
レハロース蓄積量が増大しトレハロース依存の高温耐性機構が強化されたと推測される．

【背景】 植物葉の表面は，微生物にとって過酷な生息環境である．温度や水分量の変化，紫外線の照射が規則的あるいは不規則的に生じ，利用可能な栄養物
質も限られている．このため，葉面細菌は高い環境適応能力を持っていると推察される．葉面に直接的に降り注ぐ光は，前述のストレスの原因となる一方，昼夜を始めとした環境状態を知らせるシグナルともなる．しかし，葉面細菌の光に対する応答はほとんど知られていない．そこで本研究では，葉面細菌の明所で培養したときの挙動を分析した．
【結果】 植物葉を採取して滅菌水に懸濁し，これを R2A 寒天培地または TSB 寒天培地に塗布し，生育したコロニーを回収した．これを改めて寒天培地に塗布し，明所（白色蛍光灯）／暗所のもとで培養した．目視で差異を探した結果，
明所で色素生産が誘導された菌を 7 株見つけた．16S rRNA 遺伝子シークエンスの結果，R2A 培地からの 2 株はいずれも Massilia 属であり，TSB 培地からの 5
株は Gordonia 属など Actinobacteria 門に属する細菌であった．菌体から溶媒抽出した色素のスペクトルにより，生産誘導される色素はカロテノイドであることが示唆された．
Massilia sp. ST22 株は，明所で黄色色素が生産誘導されるが，この色素の植物
上での生育における役割を調べるため，NTG 変異により色素非生産変異株を作製した．野生株と変異株の，シロイヌナズナ上での生育を測定したが，差は見られなかった．明所／暗所培養での紫外線耐性を調べたところ，暗所培養では変異株の耐性が野生株より減少していた一方，明所培養では両株とも耐性が高く誘導された．本結果より，暗所では若干量生産する色素がストレス耐性に寄与する一方，明所ではストレス耐性の別の機構が働き色素による保護の寄与は少しであると考えられた．

Trehalose acts as a uridine-5'-diphosphoglucose-competitive inhibitor oftrehalose-6-phosphate synthase in Corynebacterium glutamicum

Light-induced pigment production in the leaf surface bacteria

Key words
trehalose, Corynebacterium glutamicum, trehalose-6-phosphatesynthase, feedback

Key words

leaf bacteria, light response, pigment, stress response

1Np05

1Np07

Lipomycetaceae 科酵母の国内各地における種分布及び新種について○Shinichi Oide1, Masayuki Inui1,2(1RITE, 2Grad. Sch. Sci. Technol., Nara Inst. Sci. Technol.)

コリネ型細菌における ECF シグマ因子の認識プロモー
ター配列の解析○Hiroyuki IGUCHI, Michihiro KANAGASAKI, Saya ISHII, Kazuma TAGUCHI(Fac. Bioenviron. Sci., Kyoto Gakuen Univ.)○豊田 晃一 1, 乾 将行 1,2（1RITE, 2奈良先端大・バイオ）mmg-lab@rite.or.jp【目的】シグマ因子は RNA ポリメラーゼホロ酵素におけるプロモーター認識を行うサブユニットである．細菌ゲノム上には複数のシグマ因子がコードされ，各因子は異なるプロモーター配列を認識する．RNA ポリメラーゼがどのシグマ
因子とホロ酵素を形成するか，そしてそのシグマ因子の認識プロモーターを有しているかによって転写される遺伝子が決定される．extracytoplasmic function(ECF)シグマ因子ファミリーに属する因子は，様々な環境ストレス応答に関与す
ることが知られている．ストレス条件下において特定のシグマ因子が誘導もしくは活性化され，認識プロモーターを有する遺伝子を発現させることにより，細胞のストレス応答，環境適応が行われる．アミノ酸生産菌 Corynebacterium
glutamicum のゲノム上には 5 つの ECF シグマ因子 SigC，SigD，SigE，SigH，SigM がコードされており，各シグマ因子の認識プロモーター，標的遺伝子（レギュロン）およびそれらの生理学的機能が明らかにされてきた．各シグマ因子の認識プロモーター配列は 2 つの保存配列，－35 及び－10 領域から構成される．これら認識プロモーター配列にはゆらぎが存在するとともに配列間に類似性が見られ，因子特異性をもたらす要素の詳細は明らかにされていない．本研
究では SigD の認識プロモーター配列に着目し，その認識に重要な要素の決定を目的とした．
【 方 法 と 結 果 】 SigD の 認 識 プ ロ モ ー タ ー 配 列 の 構 成 要 素 は － 35 領 域 (5′GTAAC-3′)，－10 領域(5′-CGAT-3′)である．－10 領域について変異を導入し，lacZ 遺伝子を用いたレポーターアッセイによってプロモーター活性を解析した
結果，特に中央の GA 配列が認識に重要であることが示された．さらに周辺配列についての特徴を抽出し，変異導入を行いプロモーター活性への影響を検証中である．本研究の一部は JSPS 科研費 17K15256 の助成により実施した．

A study on the ECF sigma factor-specific promoter sequence inCorynebacterium glutamicum○Koichi Toyoda1, Masayuki Inui1,2(1RITE, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Corynebacterium glutamicum, promoter, sigma factor, consensus motif○山崎 敦史（NITE・NBRC）
yamazaki-atsushi@nite.go.jp【背景と目的】Lipomycetaceae 科酵母は，Saccharomycetales 目に属する子のう菌
酵母であり，油脂酵母 Lipomyces 属，Myxozyma 属及び Dipodascopsis 属の 3 属を含む．Lipomyces 属が大量に生産する油脂はバイオ燃料等の原料に利用できるとして期待されている．主な生息域は土壌であるが，生態や種分布について不明な点が多い．
本研究では，国内各地の土壌から Lipomycetaceae 科酵母の分離を行い，得られた各酵母種の分離頻度について集計することで種分布について考察した．また，この取り組みの中で本科に属する新種が合計 14 種得られたため，記載予定としてこれらの分類学的諸性質を報告する．
【方法と結果】土壌試料から無窒素培地（NDM）を用いて形成したムコイド状コロニーを釣菌，純化した．取得した酵母コロニーは，26S rRNA D1/D2 領域の塩基配列を用いた分子系統解析により同定を行った．取得した酵母各種を地域間で比較したところ，鹿児島県以北の日本列島の各地では 60-90%が Lipomyces
starkeyi となり大部分を占めたが，沖縄県西表島では L. starkeyi が全く分離されず Lipomyces yarrowii が 64.0％と多数を占めた．
新種候補となる酵母種については，東京大学北海道演習林（北海道富良野市）の土壌から Dipodascopsis anomala に近縁な Dipodascopsis 属の新種候補 2 種が得られた．東京大学千葉演習林（千葉県鴨川市）からは，Myxozyma 属を多く含む多系統クレード（以下「Myxozyma 属クレード」）に属する新種候補 5 種が得られた．また，沖縄県西表島では，Myxozyma 属クレードに属する新種候補
7 種が得られた．これらの新種候補株に対し分類学的手法に基づく生理・性状試験を実施したため，試験結果を報告する．また，北海道産 Dipodascopsis 属の1 新種において偽菌糸体内に子嚢胞子様の球状の細胞体を多数形成するというユニークな特徴が認められたため併せて報告する．

Species distribution and novel species of Lipomycetaceous yeasts inJapanese several locations○Atsushi Yamazaki(NBRC, NITE)

Key words

Lipomycetaceae, taxonomy, Dipodascopsis, Myxozyma

128

1Np08

白神こだま酵母における経時寿命の制御メカニズムの
解析

1Np10

○中沢 伸重 1, 高橋 慶太郎 2（1秋田県大・生資, 2秋田総食研）
nnakazawa@akita-pu.ac.jp

ジャンボファージ RSP13 の特殊なゲノム DNA の解析○川崎 健, Meslhi Alaaeldin, 山田 隆
（広島大院・先端物質）
takeru@hiroshima-u.ac.jp

1997 年白神山地の腐葉土から採取され，パン酵母として商品化されている白神
こだま酵母（以下白神）は，冷凍，乾燥および浸透圧ストレスに高い耐性を有することが既に報告されている．種々のストレスに高い耐性を示す株は長寿であるとの知見に基づき，本研究では白神の寿命メカニズムの解析を試みた．
先ず白神の経時的寿命を調べたところ，Day6 まで増殖を続け実験室株の寿命より 1.5 倍長かった．静止期の細胞は酸化ストレス耐性を示し，トレハロースやグリコーゲンを細胞内に蓄積することから，Day1 および Day3 の活性酸素種（ROS: reactive oxygen spices）レベル，トレハロースおよびグリコーゲンの含有量を測定した．白神の ROS レベルは実験室株のそれの約半分であり，白神は高い ROS 除去能を示した．白神のトレハロースとグリコーゲン含量は，実験室株のそれと比較すると，それぞれ 38 および 20 倍であった．これらの結果から，
白神ではトレハロースとグリコーゲンの合成系が活性化していることが分かった．lacZ レポーター遺伝子を使って，カタラーゼをコードする CTT1 遺伝子，トレハロース合成酵素をコードする TPS1 遺伝子およびグリコーゲン合成酵素をコードする GSY2 遺伝子の発現を調べた．Day1 の CTT1 遺伝子の発現が実験室株のそれの約 3 倍と高かった．予想に反して，TPS1 遺伝子の発現は両株において差がなく，白神の GSY2 遺伝子の発現は実験室株のそれの約 3 分の 1 であった．AMP 活性化タンパク質リン酸化酵素である Snf1 は，Gsy1/Gsy2 の翻訳後制御に関与している．そこで，Snf1 が活性化すると発現が上昇する ADH2 遺伝子の発現を，lacZ レポーター遺伝子を使って調べた．Day3 の白神の ADH2 遺伝子の発現は実験室株のそれの約 8 倍であったことから，白神の Snf1 が活性化していることが示唆された．

メタゲノミクスの確立によって難培養性微生物のゲノム情報が解読・利用可能となって久しい．今回，一般的なシークエンシング法では塩基配列を取得できない特殊なゲノムを有するファージ RSP13 を発見した，これを報告する．
青枯病菌に感染するジャンボファージ（ゲノムサイズが 200kbp を超える巨大ファージ）RSP13 は，電子顕微鏡による形態観察からヘッドテイル構造を有す
る Myovirus であることが判明している．ファージ粒子に界面活性剤と proteinase
K を加え加温静置後，フェノール抽出を行うと容易にゲノムが得られる．このゲノムは RNase や S1 nuclease に耐性であること，DNase I による分解が確認できる（ただし分解速度は λDNA の 1/100 倍程度）こと，およびファージ粒子構造から直鎖状 dsDNA と予想される．一方，このファージのゲノムは異常な電気泳動速度の遅れを示し，GS FLX+ (Roche 社)，MiSeq (illumina 社)，PacBio RS
II (Pacific Biosciences 社)による塩基配列解析ではいかなるデータも出力されな
かった．また，ゲノム増幅試薬（GenomiPhi，REPLI-g）による増幅も確認できなかった．これらのことから，このファージの持つゲノム DNA は，何らかの修飾がなされているものと予想された．そこで，感染後の宿主から mRNA を抽出し，RNAseq を行い，RSP13 ファージゲノムの部分配列を得た．得られた配列に対する primer を作製し，RSP13 ゲノムを複製可能な方法について探索中である．
当研究室では，現在までに 14 株のジャンボファージを単離しているが，6 株については塩基配列データが取得できていない．このことから，一部の巨大ファージのゲノム DNA は一般的な DNAP による複製が困難であると予想される．
環境中には難読性ゲノムを持つ巨大ファージが，高頻度で存在すると思われる．

Mechanism of regulation for chronological life span in Shirakami kodama
yeast, Saccharomyces cerevisiae

Analysis of odd genomic DNA from jumbo phage RSP13.

○Nobushige Nakazawa1, Keitaro Takahashi2(1Biore., Akita Pref. Univ., 2ARIF)○Takeru Kawasaki, Alaaeldin Meslhi, Takashi Yamada(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

Shirakami kodama yeast, longevity, Snf1, Saccharomyces cerevisiae

Key words

phage, metagenomic libraries, jumbo phage

1Np09

糸状菌の鉄恒常性維持に関与する転写因子 HapX の C末端ドメインの機能解析

1Np11

宿主染色体上のプロファージの有無によるプラスミド保
持株の fitness 変化○辻上 誠也, 山下 美春, 村田 俊輔, 志水 元亨, 加藤 雅士（名城大院・農）mkato@meijo-u.ac.jp○Pham Thi Kim Dung 1, Le Thi Thanh Thu 1, 森内 良太 2,
道羅 英夫 2, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1
（1静大院・総合科技, 2静大グリーン研）
kimbara.kazuhide@shizuoka.ac.jp【目的】HapX は，我々の研究グループが初めて見出した CCAAT-box 結合因子
(HapB/C/E 複合体)と相互作用する真菌類に特有な bZip 型転写因子である．HapX
は鉄欠乏時に鉄関連遺伝子群の転写を制御することで，鉄恒常性維持の中心的な役割を担うことが知られている．しかし，HapX による鉄感知を介した転写制御の分子機構は明らかとなっていない．我々は，HapX の C-末端側ドメインにオルソログ間で保存されたシステイン残基に富む 4 つの Cysteine-rich motif(CrmA-D) が存在を見出し，このドメインが鉄硫黄クラスターを保持することを見出した．本研究では，この C-末端側ドメインと鉄感知を介した転写制御との関係を明らかにするため，糸状菌 Aspergillus nidulans の HapX における CrmAD について解析を行なった．
【結果と考察】hapX 遺伝子破壊株 (ΔhapX 株) および C-末端側欠損株 (hapXNt 株)を作製し，野生株との生育および HapX に抑制される遺伝子の転写量を比較した．鉄制限下での生育の比較では，ΔhapX 株， hapXNt 株の両方で生育が低下した．また，転写量の比較では ΔhapX 株，hapXNt 株両方で転写抑制されていな
かった．以上より C-末端側ドメインが鉄感知を介した転写制御に重要であることが示された．次に，CrmA-D に変異を導入したリコンビナント HapX および
変異導入株 を作製し，鉄硫黄クラスターの保持に及ぼす影響を解析した．変異を導入したリコンビナント HapX の紫外吸光スペクトルを測定した結果，CrmC
への変異は鉄硫黄クラスターを示すピークを顕著に低下させ，CrmA,B,C への変異はピークの完全な消失をもたらした．また，生育の比較では CrmB に変異を加えた株は鉄制限条件下にて ΔhapX 株と同程度生育が低下した．以上より，
HapX は鉄硫黄クラスターを複数保持し，鉄制限下での生育に CrmB が重要であることが示された．

【背景と目的】プラスミドを持つ宿主の fitness（適応度）は，その宿主とプラス
ミドを持たない細胞とを共培養し，どの程度生き残るかを調べて算出され（競合試験），多くの場合低下する．我々は，Pseudomonas putida PpY101 株を，
pBP136 または pCAR1 の宿主とすると，その fitness が上昇する現象を見出した．一方，PpY101 株と同一菌株に由来する KT2440 株を宿主とした場合にはこの現象が認められなかった．双方の宿主について，ゲノム・トランスクリプトー
ムレベルで比較したところ，PpY101 株では，KT2440 株の染色体上に存在する
4 つのプロファージ（P1－P4）のうち，P1 が欠落しており，また PpY101 株ではプラスミドの有無にかかわらず，P4 上の遺伝子群の発現量が増大することが明らかになった．そこで本研究では，プロファージの有無によるプラスミドの宿主の fitness 変化を調べ，プロファージとプラスミドの関係を明らかにすることを目的とした．
【方法・結果・考察】KT2440 株からプロファージを欠落させた ΔP1 株，ΔP2
株，ΔP3 株，または ΔP4 株を pBP136 または pCAR1 の宿主とした場合に生じる
fitness の変化を競合試験で比較した．その結果，いずれのプロファージを欠落させた場合についても pCAR1 の宿主の fitness は上昇した．一方，pBP136 では，ΔP4 株を宿主とした場合に fitness が上昇したのに対し，ΔP2 株及び ΔP3 株
では fitness が低下し，ΔP1 株を宿主としても fitness は変化しなかった．この結果から，各プロファージとプラスミドが宿主内で影響を及ぼしあって fitness に変化をもたらすことが示唆された．また， P4 を欠落させたいずれの宿主のfitness も上昇したため，P4 上に fitness を低下させる因子が存在すると示唆された．現在，P4 上のどの遺伝子産物が fitness を変化させるかについて調べている．

Functional analysis of the C-terminal domain of HapX, the master regulatorof iron homeostasis in filamentous fungi

Fitness alterations of plasmid host in the absence or presence of prophage inits chromosome○Masaya Tsujikami, Miharu Yamashita, Shunsuke Murata, Motoyuki Shimizu,
Masashi Kato
(Grad. Sch. Agric., Meijo Univ.)

Key words
sulfur cluster

Aspergillus nidulans, iron homeostasis, transcriptional factor, iron

○Dung Pham Thi Kim1, Thu Le Thi Thanh1, Ryota Moriuchi2, Hideo Dohra2,
Kazuhide Kimbara1, Masaki Shintani1(1Grad. Sch. Shizuoka Univ, 2RIGST. Shizuoka Univ)

Key words

plasmid, fitness, prophage

129

1Np12

好気・微好気・嫌気条件下におけるプラスミドの接合伝
達性の比較

1Np14

Pseudomonas sp. KU-51 株のニトロフェノール分解系遺伝子の解析○劉 雅軒, 岩木 宏明, 長谷川 喜衛（関西大・化生工）
iwaki@kansai-u.ac.jp○越智 健太郎 1, 柳谷 洸輔 1, 大熊 盛也 2, 金原 和秀 1,
新谷 政己 1,2
（1静大・工, 2理研・BRC-JCM）
kimbara.kazuhide@shizuoka.ac.jp【背景と目的】プラスミドは，供与菌から受容菌へと接合伝達する遺伝因子で，多くの場合，好気条件下の接合伝達性について研究が進められてきた．一方，環境中に多く分布する微好気・嫌気条件の接合伝達性や宿主域については，ほとんど解明されていない．本研究では，異なる種類のプラスミドや供与菌・受容菌を用い，酸素濃度の違いによってそれらの接合伝達性に変化が生じるかを検証した．
【方法】 供与菌には絶対好気性細菌の Pseudomonas putida KT2440 の派生株である SMDBS と，通性嫌気性細菌の P. stutzeri JCM 5965 を用い，プラスミドには
pBP136（IncP-1 群）と pCAR1（IncP-7 群）を使用した．受容菌には 3 種類の通性嫌気性細菌を用いた．好気条件で培養した供与菌・受容菌を，嫌気チャンバー
内（酸素濃度 100 ppm 以下）で，接合させた場合を微好気条件，嫌気条件で培養した菌株を嫌気チャンバー内で接合させた場合を嫌気条件下の接合実験とした．いずれの条件についても接合後の懸濁液を選択培地に塗布し，嫌気チャン
バー内でコロニーの出現を認めた後，酸素に短時間曝露し，GFP に由来する蛍光を示すかどうかを指標にして接合完了体の検出を行った．得られた完了体数を接合後の供与菌数で割ったものを伝達頻度として算出し，各条件下で比較した．
【結果と考察】双方のプラスミドについて，いずれの条件下でも接合完了体が認められ，接合時に酸素が必須でないことが示された．また，供与菌あたりの接合伝達頻度は微好気・嫌気条件下において好気条件下よりも 1/101～1/104 に低下し，酸素の有無は，接合伝達の効率に影響することが示唆された．その伝達頻度の変化は，供与菌と受容菌の組み合わせによって異なり，酸素濃度によって伝達しやすい菌株の種類が変わることが示唆された．現在酸素濃度を変えた場合の宿主域の変化についても調査中である．

【目的】ニトロフェノール (NP) は化学工業的に重要な化合物であり，広く用いられている．一方，強い毒性を有することから，生態系への影響が懸念されており，微生物分解について精力的に研究がなされてきた．本研究では，3 種のNP 異性体（o, m, p-NP）全ての資化性を有する菌株を土壌から分離し，分解系
遺伝子の解析を試みた．
【方法・結果】m-NP を唯一の窒素源とする無機塩培地で集積培養後，寒天培地に塗布し，コロニーを単離した．単離した菌株の NP に対する資化性を調べ，
o, m, p-NP 全てに資化性を有する菌株を 1 株（KU-51 株）選択した．KU-51 株の 16S rRNA 遺伝子配列を解析した結果，Pseudomonas umsongensis, P. mohnii, P.
jessenii, P. vancouverensis のものと 99.0-99.8%一致していたことから，本菌株をPseudomonas sp. とした．KU-51 株の NP 分解性を分子レベルで検討するため，既知の NP 分解経路において，それぞれ初発反応を触媒する酵素である 2-NP モ
ノオキシゲナーゼ，3-NP ニトロレダクターゼ，4-NP モノオキシゲナーゼの配列をもとにプライマーを設計し，PCR による遺伝子領域の増幅を試みた．その結果，3 つ全ての遺伝子が検出され，既知の菌株と類似の分解系遺伝子を有することが示唆された．そこで，インバース PCR でそれぞれの PCR 増幅断片の周辺を増幅し，遺伝子全域の塩基配列を決定した．次に pET システムを用い，それぞれの酵素遺伝子の異種発現系を構築し，遺伝子産物の活性を調べた結果，標的の活性を有することが明らかとなった．現在，分解系の全容を明らかにするため，各遺伝子周辺領域の解析を試みている．

Conjugation frequency of plasmids altered under aerobic, microaerobic andanaerobic conditions

Characterization of nitrophenol degradation genes in Pseudomonas sp.
strain KU-51○Kentaro Ochi1, Kosuke Yanagiya1, Moriya Ohkua2, Kazuhide Kimbara1,
Masaki Shintani1,2(1Fac. Eng. Shizuoka Univ., 2RIKEN BRC-JCM)

Key words

1Np13○Yaxuan Liu, Hiroaki Iwaki, Yoshie Hasegawa(Dept. Life Sci. Biotechnol., Kansai Univ.)gene transfer, anaerobic condition, plasmid

Key words

Pseudomonas, nitrophenol, degradation

Sphingomonas bisphenolicum AO1 株の合成化合物分解

1Np15

ビスフェノール A を特異的に吸着する微生物を用いた排水処理系の機能強化

における不安定化要因の探索○村上 将和 1, 村澤 友紀恵 1, 松村 吉信 1,2（1関西大・生命生物工, 2関西大・ORDIST）
ymatsu@kansai-u.ac.jp○青木 好辰, 市村 栄諭, 遠山 忠, 田中 靖浩, 森 一博
（山梨大院・医工総）mori@yamanashi.ac.jp[背景] ビスフェノール A (BPA) はポリカーボネート樹脂などの原料として利用される物質で，発がん作用や内分泌撹乱作用を示すことが確認されている．そこで当研究室では，BPA 汚染環境の修復に利用可能な BPA 分解菌の探索を試
み，BPA を約 6 時間で分解できる Sphingomonas bisphenolicum AO1 株を単離した．本株はビフェニル類化合物等も分解でき，合成化合物全般の環境浄化に利用できるものと考えている．さらに，AO1 株は Chromosome 1,2，Plasmid 1-4 で構成され，Plasmid 3（pBAR1）に BPA 分解遺伝子を多数コードしていることも明らかとなった．一方，本株は一時的な増殖能低下や BPA 分解能低下が観察されたり，BPA 非分解菌 (AO1L 等) が単離されたり，遺伝子機能の不安定性が実用化への問題点となっている．そこで本研究では培養条件が AO1 株の増殖に及ぼす影響や AO1L 株のゲノム変異部位の確認，これらがゲノム不安定化に及ぼす影響を調査した．
[方法と結果] 保存期間が異なる AO1 株を L 培地や L-BPA (115 μg/mL) 培地で培養すると，L-BPA 培地で増殖能が低下した株が出現した．そこで，BPA 抵抗性を上げるため低濃度 BPA(50 μg/mL)-L 培地で馴化培養したが，増殖能は改善しなかった．さらに馴化培養後に細胞を L 培地洗浄した結果，増殖能は L-BPA(115 μg/mL) 培地で部分的に回復した．この結果は本株の BPA 代謝産物に増殖阻害の原因物質が含まれている可能性を示唆した．次に，AO1L 株のゲノム配列を解読した結果，pBAR1 で 3 ヶ所，Plasmid 4 に 1 ヶ所の欠失が確認され，点変異や挿入変異は確認されなかった．トランスクリプトーム解析の結果，欠失領域にコードされているトランスポゾン遺伝子の一部が AO1 株で高発現であり，この高発現が欠失の要因かもしれない．今後は BPA 培地での増殖が低下した AO1 変異株のゲノム変異も調査する予定である．

【背景と目的】ビスフェノール A（BPA）はポリカーボネートやエポキシ樹脂の原料として広く産業に利用されているが，内分泌かく乱作用が疑われるなど生態系への影響が懸念されている．さらに，生分解性が良くないことなどから効率的な排水処理方法の開発が求められる．これまでに本研究室では BPA を分解する細菌とともに，本物質を特異的に吸着する作用をもつ菌株の分離にも成功している．そこで，本研究では分解菌や馴養活性汚泥と共に吸着菌を併用する
ことによる浄化能力の向上を検討した．
【方法と結果】供試菌株には，環境試料より分離した BPA を特異的に吸着する作用をもつ菌株（吸着菌），高い BPA 分解能力をもつ菌株（分解菌），および長期間 BPA で馴養した活性汚泥（馴養活性汚泥）を用いた．浄化試験では，前培養した吸着菌を，分解菌あるいは馴養活性汚泥と 50mM リン酸バッファー中で混合し，濃度を適宜調整した BPA を添加した後，経時的に液中の BPA の濃度を測定した．同時に，回収菌体を洗浄し回収された BPA 量の測定も行った．吸着菌と分解菌を用いた試験の結果，吸着菌または分解菌を単独で用いた場合および両者の効果の積算値よりも優れた効果が両者の混合系で観察され，液中BPA の減少速度並びに処理系内の全 BPA の分解速度が共に向上することを確認した．続いて，馴養活性汚泥に吸着菌を組み合わせた実験においても同様の傾向が示された．以上の結果から，有機化学物質を含有する生物学的排水処理系
において分解菌と共に吸着菌を併用することで処理能力が強化される可能性が示された．

Exploration of the destabilization factors on the degradation of synthetic
compounds in Sphingomonas bisphenolicum AO1

Enhancement of wastewater treatment system using microorganisms thatspecifically adsorb bisphenol A○Masakazu Murakami1, Yukie Murasawa1, Yoshinobu Matsumura1,2(1Dept. Life science & Biotech., Kansai Univ., 2ORDIST. Kansai Univ.)

Key words

bisphenol A, Sphingomonas, biodegradation, cell diversity○Yoshitatsu Aoki, Eiyu Ichimura, Tadashi Toyama, Yasuhiro Tanaka,
Kazuhiro Mori
(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)

Key words

bisphenol A, activated sludge, biosorption

130

1Np16

Pseudomonas sp. TB-98 株によるテレフタル酸からのプ
ロトカテク酸の生産

1Np18○金森 拓 1, 中島 鈴佳 1, 岡村 匡浩 2, 内堀 孝博 3, 中島 敏明 1
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大, 3パナック工業）
nakajima.toshiaki.ga@u.tsukuba.ac.jp

ノニルフェノール酸化酵素遺伝子を用いたビスフェノー
ル S の完全無機化の取り組み○武尾 正弘, 近成 直斗, 栗岡 純平, 猪野 椋太, 根来 誠司（兵県大院・工・応化）
takeo@eng.u-hyogo.ac.jp【背景と目的】
スマートフォンの保護フィルム等で使用される PET フィルムは PET の基板にコーティングを塗布してできている．これの製造過程で生じた端材や不良品はコーティングを剥離し，PET 基板をリサイクルしている．この際アルカリ処理が施されるが PET の一部も加水分解し，テレフタル酸（TPA)とエチレングリ
コールが生じる．活性汚泥法によるアルカリ廃液処理では，TPA が汚泥中に残存してしまうためその処理が問題となっている．TPA は市場価格が安く，精製や再利用は採算が合わないため，現状ではコストをかけて焼却処理している．
一方，TPA の代謝産物であるプロトカテク酸（PCA)は種々の化成品の前駆体として用途があり付加価値が高い．これまで，当研究室において TPA を効率よく分解する菌株が得られているが，PCA に対する耐性が極めて低く，PCA 生産には不適であった．そこで本研究では，フィルム処理工場の活性汚泥から TPA 分
解能，PCA 生産能，PCA 耐性を備えた菌株の取得を目的とした．
【方法と結果】
活性汚泥を TPA 基本培地に添加後，振盪培養し 3, 4 日ごとに 2 回植え継いだ．
TLC を用いた簡易測定で TPA 分解がみられた汚泥培養液を TPA 寒天培地にプレーティングし，各コロニーでの TPA 分解を確認した結果，TPA 分解菌の取得に成功した．16S rDNA の解析結果から，Psedomonas 属と同定した．鉄含有培
地での培養において培地が赤色を呈したため培養液上清を LC/MS で測定した
ところ，48 時間で約 10 g/L の TPA 分解と約 2 g/L の PCA 生産を確認した．また，PCA 基本培地においての振盪培養では 10 g/L の PCA まで生育可能である
ことが分かり，取得した TPA 分解菌は PCA 生産菌としての活躍が期待できると考える．

ビスフェノール S（BPS）は，耐熱性エンジニアリングプラスティックの合成材料として大量に使用されている重要な化学物質であるが，ビスフェノール Aと同様に環境ホルモン作用が指摘されている．本物質の微生物分解に関する知見は乏しく，分解性が極めて悪いことのみが知られている．我々は，これまでに Sphingomonas 属細菌の有するノニルフェノール酸化酵素が BPS をその NIH
シフト化合物（NIH-BPS），ハイドロキノン（HQ）及びフェノールスルホン酸（PS）に分解することを明らかにしてきた．また，NIH-BPS も同酵素により，
HQ とハイドロキノンスルホン酸(HQS）に分解されることがわかった．そこ
で，本研究では，新たにノニルフェノール酸化酵素の遺伝子 nmoA を HQ 分解菌あるいは PS 分解菌に導入して組換え菌株を構築し，その菌株を用いて BPSの分解・無機化の可能性を検討した．
nmoA を広宿主域ベクター pBBR1MCS-2 にクローン化した組換えプラスミド
pBNMOA-F（6.7kb)を HQ 分解菌 Pseudomonas putidaTSN1 株に導入した．本組換え菌株の菌体懸濁液を用いた分解試験では BPS が効率よく分解されるばかり
でなく，多くの BPS 誘導体やビスフェノール化合物が分解されることがわかった．また，本菌株は，nmoA の導入により BPS を単一炭素源として増殖できるようになった．一方，BPS の分解中に予想通り PS あるいは HQS の蓄積が確認された．そこで，蓄積するこれらの化合物も分解させ，微生物処理だけで BPSの完全無機化を達成するために，新たに PS 並びに HQS の分解菌の分離を試
み，PS 分解菌の取得に成功した．さらに，PS 分解菌を用いた同様の検討を進めている．

Production of protocatechuic acid from terephthalic acid by Pseudomonas
sp. TB-98 strain.

Trial for complete mineralization of bisphenol S using a nonylphenol
monooxygenase gene○Taku Kanamori1, Suzuka Nakajima1, Masahiro Okamura2, Takahiro Uchibori3,
Toshiaki Nakajima1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Univ. Tsukuba, 3Panac ind,inc.)○Masahiro Takeo, Naoto Chikanari, Junpei Kurioka, Ryota Ino, Seiji Negoro(Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo)

Key words

terephthalic acid, protocatechuic acid, activated sludge, Pseudomonas

Key words
Nonylphenol monooxygenase, biodegradation, endocrine disrupting
chemicals, bisphenol S

1Np17

Indoor airborne toluene removal activity of Pseudomonas
putida with plant, Solanum lycopersicum

1Op01○Hak Jin Song1, Wu-Young Jeong1, Tae Hang Yoon1, Ji Eun Kim1,
Kwang Jin Kim2, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res.
Inst., Rural Development Administration)
hyungkim@konkuk.ac.kr

多糖高分子を用いたペプチドハイブリッド足場材料の構築と評価○王 悦 1, 蟹江 慧 1, 金子 喬士郎 1, 緒方 藍歌 2, 成田 裕司 2,
竹澤 俊明 3, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬, 2名大院・医, 3農研機構）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

In this study, a toluene degrading bacterial species isolated from plant rhizospheres
was investigated for the relief of indoor air pollution. Using a conventional enrichment
technique, a series of concentration of toluene was mixed with samples collected fromvarious plant rhizosphere. Among the samples, a bacterial strain which showed thehighest growth rate with toluene removal activity was isolated and identified as
Pseudomonas putida. The bacteria showed high growth rate with toluene removal
activity in the presence of 200 ppm of toluene. For the application of this bacterium forthe indoor air quality control, active P. putida (1 x 106 CFU/ml) suspensions wereadded to freshly germinated Solanum lycopersicum in Hoagland solution agar bottle.
Then toluene (final concentration: 100 ppm) was injected to the bottle and the changeof toluene concentration was monitored using a gas chromatography. In the presence ofthe bacteria (ca. 1.3μg・m-3 per plant) with the plant, complete depletion of toluene wasmonitored within 3 hours. However, without the addition of bacteria, relatively slow
decrease in toluene concentration was observed. When the samples collected from therhizosphere of the examined plants were examined with the P. putida specific FISH
(fluorescent in situ hybridization), the bacteria were successfully grown in therhizosphere of the plant. These results showed that the plant with specific strain ofbacteria has great potential applicability for the indoor air quality control.

生体内への移植を視野にいれた細胞足場材料には，治療効果をもたらす細胞の培養性能および機能性を引き出す効果と共に，患部での生体親和性や機能補助のための物性や特性が求められる．足場基材としての合成高分子は，極めて高度な機能設計が可能であり，強度や分解性を自在にデザインできる柔軟性を有する半面，生体由来分子に比べて細胞との親和性や生体機能性が付与しにくく，安全性と設計性との調節が難しい面などが考えられる．逆に，タンパク質などの生体由来高分子は，高い生体機能性を付与することが容易だが，強度や分解性の自在な設計は難しく，工業的な生産においてもコストが高い．
ペプチドなどの生体由来低分子は，工業的生産コストは低いが，多くの高分子が持つ成形マテリアルとしての物性（強度や弾性など）にペプチド単体では限界がある．即ち，移植用再生医療促進素材には，化学合成可能な高分子の利点と生体高分子の利点とをハイブリッドした足場材料の開発が求められている．
我々はこれまで，細胞接着ペプチドをはじめとした細胞機能を制御する生体由
来短鎖ペプチドの探索を行い，目的細胞と目的外の細胞のバランスを制御する
ような細胞選択的ペプチドなどを報告してきている．本研究では，多糖ゲルを基材とした高分子材料の構築と，ペプチドの機能付加手法を組み合わせた，ハ
イブリッド材料の構築と機能性の評価を行ったので報告する．

Indoor airborne toluene removal activity of Pseudomonas putida with plant,
Solanum lycopersicum

Construction and evaluation of peptide hybrid scaffold materials using
polysaccharide polymers○Hak Jin Song1, Wu-Young Jeong1, Tae Hang Yoon1, Ji Eun Kim1,
Kwang Jin Kim2, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Natl. Horticultural Res. Inst., Rural
Development Administration)

Key words
toluenePseudomonas putida, Solanum lycopersicum, air quality control,○Yue Wang1, Kei Kanie1, Kyoshiro Kaneko1, Aika Ogata2, Yuji Narita2,
Toshiaki Takezawa3, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Med. Nagoya Univ, 3NARO)

Key words

peptide, polysaccharide, polymer

131

1Op02

放射線架橋ポリビニルアルコールゲル上で培養した神経幹細胞／前駆細胞の接着関連分子の発現解析

1Op04○森 英樹, 中村 泰斗, 原 正之
（阪大院・理）morihide@b.s.osakafu-u.ac.jp

ヒトリンパ球への高効率遺伝子導入に向けたシリコンナ
ノニードル表面における核酸の吸脱着制御○本多 裕基 1, 山岸 彩奈 2, 金 賢徹 1,2, 中村 史 1,2（1農工大院・工, 2産総研・バイオメディカル）
chikashi-nakamura@aist.go.jp【背景と目的】ニューロンやグリア細胞への多分化能と増殖能を有する神経幹細胞/前駆細胞（NSPC）を，無血清培地下で高密度に接着培養できる足場の開発
は，中枢神経発生モデルや移植用担体の構築に重要である．我々は放射線架橋
ポリビニルアルコール（PVA）ゲル上に NSPC が接着し，増殖できることを既に報告している．しかし，NSPC が PVA ゲルへどのように接着し，増殖を維持しているかについては解っていなかった．そこで本研究では，放射線架橋 PVA
ゲル上で培養した NSPC における接着関連分子の発現を解析し，NSPC の PVA
ゲルへの接着機構に関する理解を深めることを目的とした．
【方法】PVA 水溶液にガンマ線を照射し，硬さの異なる三種類の放射線架橋 PVA
ゲル（3.75%(w/v) PVA/10 kGy（ヤング率：E = 1 kPa），7.5%(w/v) PVA/20 kGy（E = 10 kPa），15%(w/v) PVA/40 kGy（E = 22 kPa））を作製した．マウス胎仔脳
由来 NSPC を各々の PVA ゲル上に播種し，無血清培地下で培養した．1 週間培養後の細胞から RNA を抽出し，定量的 RT-PCR 法でインテグリン，フィブロネ
クチン，テネイシンなどの接着関連分子の遺伝子発現を調べた．また，遺伝子発現の変化が顕著であったテネイシンに関してはウェスタンブロットでタンパ
ク質の発現量も比較した．ニューロスフェア法で培養した NSPC を対照群とした．
【結果と考察】PVA ゲル上で培養した NSPC は対処群に比べて神経幹細胞マーカーであるネスチンの発現が高く，PVA ゲルが軟らかい方がよりネスチンの発現が高かった．インテグリンの発現は α4，αv が PVA ゲルが軟らかい方が発現が上がる傾向を示した．また，細胞外マトリクスであるテネイシン C は遺伝子の発現と同様にタンパク質の発現も軟らかい PVA ゲルの方が高くなるという結果を得た．NSPC は PVA ゲルの足場の硬さに応じて自らテネイシン C を発現し，接着していることが考えられる．

リンパ球などの特定の細胞では，外来遺伝子の導入効率が低いという問題がある．一方で，我々は直径 200 nm のナノニードルが 3 mm 角のシリコンウェハ上に数万本配列したナノニードルアレイ(NNA)を用いて細胞に核酸を直接導入する手法を開発してきた．シリコンからなる NNA の表面は酸化膜が形成されており，表面のシラノール基が塩基性条件下で脱プロトン化し，DNA のリン酸基が Mg2 ＋ を介して配位結合すると考えている．そこで本研究では，高濃度のMg2 ＋存在下で核酸を NNA に吸着させ，Mg2 ＋濃度の低い細胞内に挿入することで，核酸が NNA から脱離する制御放出による核酸導入を目的とした．
導入する外来遺伝子として蛍光タンパク質 Venus 発現プラスミドを使用し，10mM MgCl2 を含むホウ酸緩衝液(pH 10)と混合した．酸素プラズマ灰化装置により NNA 表面の酸化処理を行った後，このプラスミド溶液に 10 分間浸漬しプラスミドを吸着させた．細胞内へのプラスミド導入は，ディッシュ上に固定した
ヒトリンパ球 JM 細胞にアレイ動作装置を用いてプラスミド吸着 NNA を挿入
し，加振 10 秒，静置 10 分の後に NNA を抜去することで行った．RPMI 培地では NNA を浸漬し，1 分後に NNA 上のプラスミドが脱離することが判明したた
め，まず NNA を細胞に挿入するまで，プラスミドを NNA 表面に安定に保持する溶液を検討した．MgCl2 と浸透圧調整のための各種濃度のグルコースを含む溶液でプラスミド保持条件を検討した．その結果，2.5％グルコースを含む 10mM MgCl2 溶液で NNA 表面に最も安定してプラスミドが保持されることを確認した．この溶液を用いて細胞内にプラスミドを導入し，蛍光顕微鏡観察によりVenus 発現細胞を計数することでプラスミド導入効率を算出した結果，リポフェ
クションによる導入効率が 0.2％であるのに対して，NNA を用いた場合は，0.7％と 3 倍以上の導入効率が得られた．

Expression analysis of cell adhesion-related molecules in neural stem/
progenitor cells cultured on radiation-crosslinked poly(vinyl alcohol) gels

Controlled release of nucleic acid from silicon nanoneedle surface for highefficiency gene transfer to human lymphocyte○Hideki Mori, Taito Nakamura, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Univ.)○Yuki Honda1, Ayana Yamagishi2, Hyonchol Kim1,2, Chikashi Nakamura1,2(1Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

neural stem cell, PVA, extracellular matrix, stiffness

Key words

gene transfer, nanoneedle array, controlled release, human lymphocyte

1Op03

光増感色素固定化培養基材を用いて培養したラット間葉系幹細胞の生存・分化の解析

1Op05

ディッシュと不織布で増殖した間葉系幹細胞の細胞外マ
トリックス量の比較○八木 秀郁, 森 英樹, 原 正之
（阪府大院・理）hara@b.s.osakafu-u.ac.jp○傅 博, 藤原 政司, 高木 睦
（北大院・工）takagi-m@eng.hokudai.ac.jp【背景】活性酸素種（ROS）は細胞傷害性を有する一方で，近年ではシグナル分子として成体幹細胞の細胞死誘導，増殖，分化などの調節にも関わることが解ってきた．成体幹細胞の内外で ROS 発生を制御し，増殖や分化などを誘導する条件を見出だせれば，幹細胞培養の調節技術への応用が期待できる．本研究では
光増感剤固定化培養基材を開発し，光増感反応により可視光照射下で培養基材
表面から生じる ROS 刺激を間葉系幹細胞に負荷して生理状態変化を解析した．
【実験】アミノ基が付加されたスライドグラス表面に，カルボジイミド（EDC）とスクシンイミド（NHS）の反応を用いて光増感色素のヘマトポルフィリン（HP）を固定した．HP 固定化スライドグラス基材に細胞培養のためにチャンバーを取り付け，基材上でラット間葉系幹細胞（rMSC）を培養した．平面照射型白色 LED 光を基材下面から照射し，細胞の接着した基材表面に ROS を発生させた．光照射後の細胞の生死や形態を解析した．また細胞生存条件で光照射後の細胞の分化傾向を知るために定量的 RT-PCR 法を用いて分化マーカー遺伝
子の発現を調べた．
【結果と考察】rMSC は HP を固定化したスライドグラス上に接着した．長時間の光照射や HP 固定化量の増加に応じて ROS 発生量は増加し，rMSC に細胞死が誘導された．また，HP 固定化量と光照射時間の長さにより細胞死の様子が異なり，ROS の発生量に応じて基材表面からの剥がれ方に違いが生じたためと考えられた．ROS 発生量が比較的少ない条件では細胞は生存し，骨分化や脂肪分化に関わる転写因子の発現に変化が見られたが，発現変化が少ないマーカー遺伝子も見られた．以上より，基材表面からの比較的多い ROS 発生条件では細胞死を誘導できたが，細胞が生存できる比較的少ない ROS 発生条件に関しては，さらに分化誘導条件などの検討が必要である．

【緒言】
間葉系幹細胞（MSC：Mesenchymal stem cell）は，分化能と活発な増殖能を有することから再生医療用の細胞ソースとして注目されている．本研究室では，
ポリエステル不織布（NWF: Nonwoven fabric）をスキャフォールドとして利用した MSC の増殖培養における播種方法の改良法を示した．また，NWF 中で増殖した MSC はディッシュで増殖した MSC に比べて，より高い分化能と CD90
陽性率を有していた．一方，細胞周辺の ECM が多分化能の維持に重要との報告がある．そこで，NWF で増殖した MSC とディッシュで増殖した MSC の各
ECM 量を比較することを目的とした．
【方法】
24 穴プレートに入れた NWF(旭化成製 Y-15050，厚さ約 0.1 mm，繊維直径約 20μm)を用いてヒト骨髄 MSC を 3 週間培養した．この後，0.5％ TritonX-100 での処理により細胞を融解し，残った ECM を 0.001％トリプシンや 1％SDS を用いた処理により回収した．回収した ECM のタンパク量を BCA 法で定量した．
【結果と考察】TritonX-100 処理により，ディッシュと NWF で培養した細胞をほぼ完全に除去できることを確認した．次に，トリプシン処理及び SDS 処理により，ディッ
シュや NWF にコーティングした I 型コラーゲンをほぼ 90％以上回収できることを確認した．そこで，NWF（播種密度 0.025×104 cells/cm2）とディッシュ（播種密度 0.01×104 cells/cm2）で培養した細胞周囲の ECM を上記の方法で定量した結果，特に培養の 1，2 週間目，NWF で増殖した MSC の細胞当たりの ECM 量はディッシュより顕著に高かった．以上から，NWF において多かった ECM 量が MSC の高い多分化能や CD90 陽性率に関係している可能性が考えられた．

Analysis on viability and differentiation of rat mesenchymal stem cells
cultured on photosensitizer-conjugated culture vessels

Comparison of amount of extracellular matrix around mesenchymal stem
cells grown on dish and non-woven fabric

Key words
mesenchymal stem cell, reactive oxygen species, photodynamic
reaction, differentiation

Key words○Hidefumi Yagi, Hideki Mori, Masayuki Hara
(Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.)○Fu Bo, Masashi Fujiwara, Mutsumi Takagi(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

mesenchymal stem cell, non-woven fabric, extracellular matrix, CD90

132

1Op06

Polycaprolactone nanoparticles for evaluation of thecollagen synthesis

1Op08

がん細胞を含む多細胞スフェロイドをバイオ 3D プリン
ターにより配置した三次元組織の作製○谷内 達彦 1, 高橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp○David Wu-Young Jeong1, Hak Jin Song1, Woo Sung Lee2,
Sok Young Shim2, Hyeon Jin Jeon2, Tae Hang Yoon1, Ji Eun Kim1,
Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1, Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Roselab)
hyungkim@konkuk.ac.kr

To evaluate the collagen synthesis activity, polycaprolactone (PCL) nanoparticles wereprepared by the ring-opening polymerization of ε-caprolactone. The morphology andsize were analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and particle size analyzer.
The chemical structure was analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Prepared PCL nanoparticles presented a spherical shape and a size of 240 nm. In
animal study, 32 rats were divided into three groups. The control groups are injectedwith saline (n=8) and E product (n=12). The experimental group was injected with
PCL nanoparticles (n=12). For hematologic test, CBC, OT/PT, BUN/Cr tests were
performed and showed no significant differences between the groups. To confirm
organ infiltration and collagen formation, hematoxylin-eosin and Masson trichrome
staining methods were performed. In hematoxylin-eosin staining, the PCL
nanoparticles were not shown in liver and kidney. In the case of Masson trichrome
staining, formation of collagen was observed. This study demonstrated that PCL
nanoparticles are able to form the collagen in vivo.

【目的】現在，薬剤評価系として，培養細胞や動物個体が用いられている．しかし，細胞と動物では代謝や細胞間の相互作用の有無などの違いから薬剤評価の結果に大きな差が生まれることが知られている．そのような評価の差を補完するための，細胞と動物の中間にあたる薬剤評価系として，培養細胞から作製される三次元組織の利用が注目されている．一方，バイオ 3D プリンターはビル
ディングブロックである多細胞スフェロイドを所定の位置に配置することが可能であり，要望に応じた三次元組織を作製することが可能である．そこで，本研究では，正常な細胞のみからなるスフェロイドとがん細胞を含んだスフェロ
イドを配置した三次元組織の作製を行った．
【 方 法 お よ び 結 果 】 ヒ ト 皮 膚 線 維 芽 細 胞 (NHDF) と ヒ ト 臍 帯 静 脈 内 皮 細 胞(HUVEC)，GFP 発現ヒト乳腺がん細胞株(MCF-7/GFP Cell Line)の 3 種の細胞を用いて，種々の播種数と混合比のスフェロイドを作製し，バイオ 3D プリンターによる三次元組織の作製に適するがん細胞を含むスフェロイドの作製条件を検討した．また，スフェロイド内部の血管構造や死細胞数を切片化・染色を行う
ことで評価した．次に，9 個のスフェロイドをバイオ 3D プリンターにより配置
した (3×1×3)の三次元組織の作製を行った．ここで，中心にはがん細胞を含む
スフェロイドを，それ以外にはがん細胞を含まないスフェロイドを配置した．
作成した三次元組織について培養中の観察を行ったところ，組織作製から 24 h
後にはすべてのスフェロイドが融合するとともに，GFP 発現がん細胞の 3 次元
組織全体に広がっていく挙動が確認できた．

Polycaprolactone nanoparticles for evaluation of the collagen synthesis

Production of 3D tissue with spheroids containing cancer cells by bio 3D
printer○David Wu-Young Jeong1, Hak Jin Song1, Woo Sung Lee2, Sok Young Shim2,
Hyeon Jin Jeon2, Tae Hang Yoon1, Ji Eun Kim1, Sang Hyun Lee1, Yung-Hun Yang1,
Hyung Joo Kim1
(1Dept. Biological Eng., Konkuk Univ., 2Roselab)○Tatsuhiko Taniuchi1, Kenji Takahashi1, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

Polycaprolactone, PCL nanoparticle, Collagen synthesis stimulation

Key words

bio-3D printer, cancer cells, 3D tissue

1Op07

毛細血管様構造を有するスフェロイドをバイオ 3D プリ
ンターにより積層した三次元組織の生・死細胞ならびに毛細血管様構造の分布の解析

1Op09

脂肪由来間葉系幹細胞のスフェロイドをバイオ 3D プリ
ンターにより積層した三次元組織の作製とその分化○神並 美華 1, 高橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大学 新学術創成研究機構）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp○稲垣 慶一 1, 高橋 憲司 2, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【目的】ヒト細胞のみから作製される三次元組織においては，組織内部に毛細血管様構造がない場合，酸素や栄養の供給不足による組織の深部での細胞死が懸念されている．これまで，ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などを混合した三次元組織とすることで，組織内部に毛細血管構造が構築され，細胞生存率が改善されたという報告がされている．しかしながら，既往の研究では，作製した三次元組織の切片を用いた二次元的な評価手法が一般的であったため，組織内部の毛細血管構造の三次元的な分布について把握した例はほとんどなかった．そこで本研究では，毛細血管様構造を有する多細胞スフェロイドをビルディング
ブロックとしてバイオ 3D プリンターで三次元組織を作製し，その三次元組織の内部の生・死細胞及び毛細血管構造を空間的に捉え，その局在を評価することを目的とした．
【実験方法】解析対象には「ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)と HUVEC を 8:2 で混合し作製した，毛細血管構造を持つ直径 500 μm のスフェロイド」及び，「そのスフェロイド 27 個を 3×3×3 の構造となるようバイオ 3D プリンターで積層し作製した毛細血管構造を持つ約 1.5 mm の立方体状 3 次元組織」を用いた．そして，それぞれのサンプル作製後，培養 1～7 日における，サンプル内部の生・死細胞分布及び毛細血管構造を調べた．サンプル内部の死細胞および全細胞の染色には，それぞれ膜不透過性核染色試薬の PI および DAPI を用いた．また，サンプル内部の毛細血管構造の検出には，CD31 抗体を用いたホールマウント免
疫染色を行った．染色後，SeeDB2G 法を用いてサンプルの透明化を行い，多光子走査型レーザー顕微鏡で深部観察し，サンプルの 3 次元画像を取得した．そして 3D 画像解析ソフトを用いて生・死細胞数の分布と毛細血管構造の分布の定量化を行った．

【目的】現在，再生医療において，細胞凝集塊である多細胞スフェロイドをビル
ディングブロックとした三次元組織の構築が注目されている．これは従来の細胞シートを用いた方法に比べ，より大きな組織を作ることが容易となるためである．一方，脂肪由来間葉系幹細胞は安全に採取することができ，骨，軟骨，
脂肪に加え神経細胞へ分化することが報告されており，今後の再生医療の重要な細胞ソースの一つである．そこで，本研究では，脂肪由来間葉系幹細胞の多細胞スフェロイドをビルディングブロックとしてバイオ 3D プリンターを用いて三次元組織の作製を行った．また作製した脂肪由来間葉系幹細胞からなる 3次元組織について神経系の細胞へ分化誘導を行った．
【方法および結果】本研究ではヒト脂肪由来間葉系幹細胞 (hADSC)を用いて
15,000 cells からなるスフェロイドを作製した．比較として，ヒト神経幹細胞(hNSC)についても同様にスフェロイドを作製した．次にバイオ 3D プリンターを用いて立方体(3×3×3)の形状に三次元組織を作製し，EGF および bFGF を含む
もしくは含まない神経幹細胞用培地で培養した．培養後，組織を剣山から抜き取り固定化したあと，切片化を経て神経幹/前駆細胞マーカーである Nestin，神経細胞マーカーである Tu ｊ 1，グリア細胞マーカーである GFAP と用いた免疫蛍光染色を行った．免疫染色した切片について，共焦点顕微鏡を用いて画像撮影を行い，内部の神経系細胞への分化挙動について評価した結果について報告する．

Analysis of distribution of viable cells, dead cells, and capillary structure
inside micro-vascularized 3D tissue prepared by bio-3D printerPreparation of three-dimensional tissue by bio-3D printer using adiposederived mesenchymal stem cell spheroids and their differentiation○Keiichi Inagaki1, Kenji Takahashi2, Kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

tissue engineering, micro vascular structure, 3D image analysis○KANNAMI Mika1, TAKAHASHI Kenji1, NINOMIYA Kazuaki2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)

Key words

bio-3D printer, adipose-derived stem cells, 3D tissue

133

1Op10

接着細胞の自己集合化誘導剤を用いた幹細胞凝集塊の新規作製法の開発と評価

1Op12

草加 直幸 1,2, 浅見 優月 1,2, 安部 菜月 3, 広井 佳臣 4, 西野 泰斗 3,○岩井 良輔 1（1岡山理大・技科研, 2岡山理大・工, 3日産化学工業（株）
・生物
科学研, 4日産化学工業（株）・工・材料科学研）
iwai@rit.ous.ac.jp

培養デバイス TASCL による神経細胞スフェロイドの構築○宮本 義孝, 池内 真志（東大・先端研）
myoshi1230@gmail.com【目的】我々の研究グループは，接着細胞の自発的な集合（自己集合化）を誘導する表面コーティング剤（CAT）を開発した．本研究では，CAT を用いた細胞凝集化法の再生医療への応用を目指して，CAT と液滴スポッターを組み合わせることで，任意のサイズの幹細胞凝集塊（スフェロイド）を 1 回の細胞播種操作にて任意の数だけ均一に作製する方法を開発するとともに，形成したスフェロイドの多分化能の評価を行うことを目的とした．
【方法と結果】ナノリットル液滴スポッターを用いて CAT 液を細胞の非接着性培養皿の表面にドット状に滴下し（液量: 40～640 nL, スポット数: 100 以上）乾
燥させた後，ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を 3.0×105 cells/cm2 以上の密度で播種した．播種 1 時間以内に細胞は CAT のドット固着表面にのみ接着してコンフル
エント単層を形成した後，約 6～8 時間の間に一体凝集化することでスフェロイドが形成した．CAT の液滴量（固着面積）に比例して直径約 150～500 μm のサイズのスフェロイドが形成し，そのサイズ誤差はいずれも平均直径に対して10%以内と高いサイズ均一性を有していることが分かった．一方で，これらのスフェロイドを脂肪，骨及び軟骨分化誘導培地にて 3 週間培養することで，それぞれの分化マーカーである脂肪滴，カルシウム及び II 型コラーゲンの顕著な蓄積を認める成熟化した組織が得られた．
【結論】細胞の自己集合化誘導剤である CAT と液滴スポッターを組み合わせることで，任意のサイズを有する均一なスフェロイドを 1 回の播種操作で任意の数だけ得ることができた．これらのスフェロイドは，脂肪，骨及び軟骨組織に分化させることが可能であることが確かめられたことから，本法は再生医療や創薬試験の高効率化に対して高い応用可能性を有していると考えている．

3D 培養を用いた細胞・組織構築物（スフェロイド）の創製，細胞レベルから組
織・臓器レベルへの試みが，近年数多く報告されている．我々も，これまで，
TASCL (Tapered Stencil for Cluster Culture) Device を用いて，肝臓や脂肪様組織構
築物などを構築してきた．本デバイスは，PDMS（ポリジメチルシロキサン）
シート上に所定の形状の貫通孔を多数配置して，貫通孔の壁面は上部から下部に向かうテーパーとしている．デバイス表面は，水平面は全く存在せず，親水化処理を施し，細胞を播種すると，必ずいずれかの貫通孔の底面に向かって沈降する．すなわち，一度の播種操作で，培養基材上で制御された細胞数及び密度条件下でのスフェロイドを大量に生産することができる．これまでに，我々は，細胞播種数に比例して，球状のスフェロイドは大きくなり（φ100-300μm），
個々のスフェロイドの大きさも均一かつ高い形成率を示すことを報告している（Miyamoto Y, Ikeuchi M et al. Cell Medicine. 2015.ほか）．神経幹細胞の培養として，浮遊培養中で単一の神経幹細胞から細胞塊（ニューロスフェア）を形成させる手法が一般的に知られている．そこで，本研究では，3D 培養神経モデルとして，ラット副腎褐色細胞腫（PC12）やヒト神経芽細胞腫（NB-1）などを用いて，TASCL Device による神経細胞様スフェロイドの構築について報告する．

Development and evaluation of novel preparation method of multicellular
shperoids generated from adhered cells using cell self-aggregation inducible
reagent

Construction of nerve cell spheroids using TASCL device○Yoshitaka Miyamoto, Masashi Ikeuchi(RCAST, Univ. Tokyo)

Naoyuki Kusaka1,2, Yuzuki Asami1,2, Natsuki Abe3, Yoshiomi Hiroi4, Taito Nishino3,○Ryosuke Iwai1(1Res. Inst. Tech., Okayama Univ. Sci., 2Fac. Eng., Okayama Univ. Sci., 3Biol. Res.
Lab., Nissan Chemical Industries, LTD., 4Materials Res. Lab., Nissan Chemical
Industries, LTD.)
Key words
tissue engineering, regenerative medicine, spheroid

Key words

nerve cells, 3D culture, medical device, spheroid

1Op11

1Op13

胚様体形成期間中の CHIR99021 処理濃度がヒト iPS 細
胞の心筋細胞分化誘導に与える影響

肝細胞スフェロイドに短期間で細胞極性を付与する方法の開発○小島 伸彦 1, 田尾 文哉 1, 青木 茂久 2（1横市大院・生命ナノシステム, 2佐賀大・医）nobuhiko@yokohama-cu.ac.jp○依田 聖未, 大貫 喜嗣, 黒澤 尋
（山梨大院・統合応生）kurohiro@yamanashi.ac.jp＜背景と目的＞肝細胞をいわゆるスフェロイド状態として培養すると，平面培
養よりも生体に近い機能発現が期待できる．しかし，一般的なスフェロイドは細胞が無秩序に集合しており，特に細胞極性に関する機能評価を短期間のうちに実施することは困難であった．本研究ではスフェロイド構築時に細胞外マト
リクス成分を添加し，短期間のうちに細胞極性を構築する方法の開発を目的とした．
＜方法＞肝細胞として Hep G2 と HuH-7 を，細胞外マトリクス成分としてマトリゲルを使用した．マトリゲルを数十倍程度に希釈した通常培地に細胞を懸濁し，2×106 cells/ml とした．シャーレに分注した 3%メチルセルロース培地に細胞懸濁液を 1 μl 吐出して，細胞とマトリゲルとを凝集・濃縮させ，マトリゲルを含有したスフェロイドを作製した．そのままメチルセルロース培地で 2 日間培養してから各種の解析を行った．
＜結果＞スフェロイドのパラフィン切片を HE 染色して観察したところ，マト
リゲルを添加したスフェロイドはコントロール条件と形態的に大きな変化は見受けられなかった．一方，マトリゲルを薄膜充填したスフェロイドでは，培地中へのアルブミン分泌活性が 2 倍程度まで向上しており，マトリゲルがスフェ
ロイド内に薄膜状に充填されていることが伺えた．極性形成に関するタンパク質について免疫染色をおこなったところ，ZO-1，Ezrin などが細胞―細胞間に局在していた．薬剤排泄に関わる MRP-2 の局在も亢進しており，胆汁酸モデル
化合物の排泄も確認できた．電子顕微鏡による観察では，毛細胆管様構造の形成が観察された．
＜結論＞メチルセルロース培地を用いた細胞・細胞外マトリクスの凝集・濃縮によって，2 日間という短期間で細胞極性・毛細胆管様構造の構築を可能とする手法を開発できた．

【背景・目的】CHIR99021（以下 CHIR）はヒト iPS 細胞の樹立や心筋の分化誘導などに使用される GSK-3β 阻害剤の 1 つである．本研究室では未分化維持培
養 2 日目から高濃度で CHIR 処理を行うことで初期中胚葉分化関連遺伝子の発現が向上することを明らかにした．我々はこの方法によりヒト iPS 細胞から中胚葉系細胞である心筋細胞へ効率的に分化誘導できると考えた．本研究では，
96-well 非接着型 U 底 plate を用いた胚様体（以下 EB）形成期間中の CHIR 処理
濃度がヒト iPS 細胞の心筋細胞分化誘導に与える影響を検討した．
【方法】NutriStem® hESC XF （Biological Industries Ltd.）にて feeder-free 条件下で培養したヒト iPS 細胞 （201B7, 253G1, RIKEN BRC）を AccutaseTM によりシングルセルに分散し，3000 cells/well で Lipdure-coated plate A-U96 上に播種した．播種後は毎日 10 μM の Y-27632 を含む NutriStem® hESC XF で半量の培地交換を行い 4 日間浮遊培養して EB 形成を行った．CHIR 処理は 4 日間の EB 形
成期間のうち後半 2 日間で行い，処理濃度を 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32 μM とした．形成した EB は PSC Cardiomyocyte differentiation kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）の Medium B で 2 日間浮遊培養した．さらに，gelatin コートした 24-well plate
上で同 kit の Maintenance medium で 8 日間接着培養した．
【結果・考察】4 及び 8 μM CHIR 処理条件下で形成された EB は Medium B での浮遊培養中に嚢胞化が確認された．その後，EB を接着培養に移行したところ，
4 μM CHIR で処理した EB において拍動性心筋細胞が確認された．以上の結果
から，EB 形成期間中に 4 μM CHIR で処理を行うとヒト iPS 細胞から心筋細胞への分化誘導が促進されることが示唆された．

Method to add cell polarity to hepatic multicellular spheroid in a shortperiod of time

Effect of the concentration of glycogen synthase kinase-3β inhibitor(CHIR99021) during embryoid body formation on cardiomyocyte
differentiation from human iPS cells○Nobuhiko Kojima1, Fumiya Tao1, Shigehisa Aoki2(1Grad. Sch. Nanobiosci., Yokohama City Univ., 2Fac. Med., Saga Univ.)

Key words

hepatocyte, tissue engineering○Kiyomi Yoda, Yoshitsugu Ohnuki, Hiroshi Kurosawa(Grad. Sch. Int. Appl. Life Sci., Univ. Yamanashi)

Key words
bodycardiomyocyte differentiation, CHIR99021, human iPS cells, embryoid

134

1Op14

iPS 細胞由来運動神経を利用した神経筋接合を有する三次元筋組織の構築

1Op16○吉岡 貫太郎, 井藤 彰, 河邉 佳典, 上平 正道（九大院・工）kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

不飽和カルボニル化合物が血管構成細胞に及ぼす影響の解明○東 恒仁, 眞井 洋輔, 真崎 雄一（北大院・医・細胞薬理）
thigashi@med.hokudai.ac.jp[目的]近年，iPS 細胞を利用した薬剤スクリーニングが注目されている．iPS 細胞由来
運動神経を用いた例では，筋委縮性側索硬化症 (ALS)などの患者由来の細胞から iPS 細胞を作製し，運動神経細胞へと分化誘導を行い，薬剤スクリーニングへの応用が試みられた．しかし，既存の方法では運動神経細胞の生存率や遺伝子発現解析による成熟度を指標に薬剤を評価しており，運動神経細胞が本来有している筋肉を収縮させる働きについては調べられていない．本研究では，運動神経細胞の筋肉を収縮させる働きを調べるために，マウス iPS 細胞由来運動神経とマウス筋芽細胞株 C2C12 細胞を混合した複合三次元筋組織により，神経
筋接合を介して運動神経細胞からのシグナル伝達による筋収縮モデルの作製を試みた．
[結果と考察]初めに，iPS 細胞由来運動神経が筋管と神経筋接合を形成するかを調べるため，
マウス iPS 細胞由来運動神経と C2C12 細胞の平面共培養を行った．共培養 7 日
目に神経伝達物質であるグルタミン酸を添加すると，筋管の収縮が見られたことから，iPS 細胞由来運動神経が筋管と神経筋接合を形成していることが分かった．さらに iPS 細胞由来運動神経と C2C12 細胞の複合三次元筋組織を作製し，筋管上に存在するアセチルコリン受容体の蛍光染色を行ったところ，運動神経細胞と接している領域の筋管上で，神経筋接合が形成されている時に見られるアセチルコリン受容体の集積が観察された．複合三次元筋組織において，グルタミン酸添加により筋組織の収縮力の上昇が認められた．これらのことから三次元筋組織において神経筋接合が形成できたものと考えられ，収縮力を指標とした iPS 細胞を用いた新たな神経筋接合モデルとして薬剤スクリーニングなどへの利用が期待できる．

【背景と目的】アクロレインやメチルビニルケトンに代表される不飽和カルボニ
ル化合物は，有機物が燃焼した際の煙や高温に熱せられた食物油等に含まれる
他，工業材料としても用いられており，ヒトが容易に暴露されうる環境化学物質である．不飽和カルボニル化合物は，高い細胞毒性を有することが報告されているが，毒性メカニズムについては殆ど分かっていない．血管構成細胞は，肺でのガス交換を介して血中に移行するガス性の物質に暴露されやすいことが知られており，不飽和カルボニル化合物の代表的な標的ではないかと考えられる．そこで本研究では，不飽和カルボニル化合物が血管構成細胞に及ぼす影響とその分子機構を調べることを目的とした．
【方法】細胞の生残率は MTS 還元活性測定法で評価した．プロテインキナーゼ（PKC）活性は in vitro キナーゼアッセイで測定した．PKC の局在が GFP 融合法で調べた．
【結果と考察】アクロレインやメチルビニルケトンは，血管平滑筋細胞の細胞死を引き起こした．不飽和カルボニル化合物による血管平滑筋細胞の細胞死は，
PKC 依存的であった．アクロレインは，血管平滑筋細胞において PKC 活性を上昇させた．血管平滑筋細胞で発現している PKC は PKCalpha・PKCdelta・
PKCepsilon・PKCiota の 4 種類であった．不飽和カルボニル化合物により活性化される PKC を調べたところ，PKCalpha と PKCdelta であることが判明した．
以上の結果から，詳細なメカニズムはまだ不明であるものの，不飽和カルボニ
ル化合物は PKC の活性化依存的に血管平滑筋細胞を傷害することが示唆された．

Construction of three-dimensional muscle tissues with neuromuscularjunction using iPS cell-derived motor neuron

Effects of unsaturated carbonyl compounds on vascular cells

Key words
Skeletal muscle tissue engineering, iPS cell, Motor neuron,
Neuromuscular junction

Key words

toxicity, unsaturated carbonyl compounds, protein kinase C

1Op15

1Op17

培養骨格筋組織の形状および機能の維持に適した FBS
濃度の探索○Kantaro Yoshioka, Akira Ito, Yoshinori Kawabe, Masamichi Kamihira(Fac. Eng., Kyushu Univ.)

毛包を有する皮膚組織の作製○楯 芳樹, 景山 達斗, 福田 淳二（横国大院・工）fukuda@ynu.ac.jp○Tsunehito Higashi, Yosuke Mai, Yuichi Mazaki(Dept. Cell. Pharm., Grad. Sch. Med., Hokkaido Univ)○長谷 洸輝 1, 堀江 正信 2, 藤田 英明 3, 長森 英二 4（1阪工大・工・生命, 2京大・RIRC, 3早大・WABIOS, 4阪工大院・工）
eiji.nagamori@oit.ac.jp【目的】創薬分野において，培養皮膚は培養細胞を用いた試験で実現できなかった薬物の透過性や刺激などを簡潔に予測できるツールとして期待されている．
しかし，既存の培養皮膚は，皮膚に存在すべき皮膚附属器をもたないために，
スクリーニングの予測精度や評価できる項目が少ないことが課題である．我々は，これまでに皮膚附属器の 1 つである毛包の原基を大量調製する技術を開発し，これを移植することで毛周期を繰り返す毛髪が再生できることを示してきた（T.Kageyama et al. Biomaterials, 154, 291-300, 2018）．本研究では，この毛包原基を培養皮膚に組み込むことで，皮膚附属器を備えた皮膚組織の構築を目指した．
【方法・結果】マウス皮膚から採取した上皮系細胞と間葉系細胞を 1×104 cells ず
つ 1:1 の比率で混合し，細胞非接着丸底ウェル培養器に播種した．2 種類の細胞は，1 つの凝集体を形成した後，3 日間の培養中に自発的に分離することで，毛包原基を形成した．この毛包原基 50 個を，表皮角化細胞と真皮線維芽細胞を含む細胞懸濁液に混合し，セルカルチャーインサートに播種し，1 日培養することでシート状組織を作製した．続いて，皮膚附属器を備えた皮膚を再生できるかを評価するために，チャンバーモデルマウスへの移植を行った．すなわち，
ヌードマウスの背部皮膚を丸く切りとり，シリコーン製の円筒チャンバー（直径 7.0 mm，高さ 7.5 mm）を取り付けることで移植床を形成させ，そこに作製した培養皮膚を移植した．移植 4 週後の移植皮膚切片の組織染色の結果より，再生した皮膚内に毛包の形成が観察され，毛幹が表皮を貫通している様子も確認された．再生した毛幹を走査型電子顕微鏡で観察すると，生体の毛幹と同様に特徴的なキューティクル構造を有していた．

[背景と目的]以前に，培養骨格筋細胞-短冊型コラーゲン薄膜の複合体を用いた活性張力評価
技術を報告した．電気パルス刺激培養において組織肥大や活性張力の増大が観察されたが，肥大した組織の剥離・凝集が張力値に誤差を生むことが課題であった．平面培養においては，例えば 1 %の FBS を含有する DMEM にて分化培養するのが定法であるが，細胞が密集した組織状態において細胞接着を維持し，機能的な培養を可能とする FBS 濃度はより高いと予想し検討した．
[方法]
まず，可視性に優れた板状組織である積層細胞シートを用い，組織維持と筋分化に適した FBS 濃度を探索した．マウス骨格筋筋芽細胞 C2C12 を積層，1～6 %の FBS を含む DMEM 培地で分化誘導を行った．経時的な組織形状観察の後，120 h にホルムアルデヒド固定し，α アクチニンと核の蛍光染色像から筋分化率を算出した.次に，C2C12 を幅 700 μm に切断したコラーゲン薄膜に播種後，上述の培地で分化培養を 120 h 行ない，さらにパルス幅 20ms，1Hz の電気パルス
を周期的に印加し活性張力を測定した．
[結果と考察]積層組織の形状は 2 %以上の FBS 濃度で剥離がなく，維持された．筋分化率はFBS 濃度と共に上昇し 3 %以上で一定となった．一方，周期的な収縮運動を伴うコラーゲン薄膜上では 3 %でも組織の剥離が観察され，活性張力は 5 %で最大となった．培養筋細胞の平面培養，積層培養，力学的ストレスを伴う組織的培養において，至適な FBS 濃度は異なることが明らかになった．

Fabrication of skin constructs with hair follicle

Exploration of fetal bovine serum concentration suitable for maintaining theshape and function of cultured skeletal muscle cells○Yoshiki Tate, Tatsuto Kageyama, Junji Fukuda(Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ.)

Key words

skin tissue engineering, hair follicle, chamber assay○Hiroki Nagatani1, Masanobu Horie2, Hideaki Fujita3, Eiji Nagamori4(1Dept. Biomed. Eng., Osaka Inst. Technol., 2RIRC, Kyoto Univ., 3WABIOS,
Waseda Univ., 4Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

Skeletal muscle, Tissue culture, Fetal bovine serum

135

1Op18

過酸化水素が培養骨格筋細胞の構造と機能に影響を与える濃度域の検証○前 佳佑 1, 堀江 正信 2, 藤田 英明 3, 長森 英二 4（1阪工大・工・生命, 2京大・RIRC, 3早大・WABIOS, 4阪工大院・工）
eiji.nagamori@oit.ac.jp[背景と目的]以前に，培養骨格筋細胞-短冊型コラーゲン薄膜の複合体を用いた張力評価技術を開発し，この技術を核として，電気パルス刺激培養における組織肥大や活性張力の増大，刺激停止による筋委縮様現象の初期ステップ（サルコメア構造崩
壊とタンパク質分解促進）を観察すると共に，創薬支援等に用いる評価技術としての有用性を説いた．今回，タンパク質分解促進を伴う筋萎縮に関与するとされる酸化ストレスが，培養骨格筋の構造と機能のそれぞれの維持に及ぼす濃度域を検証することで，評価系としての再考察を行った．
[方法]
マウス骨格筋筋芽細胞 C2C12 を 10 ％FBS 含有 DMEM 培地で増殖後，2 ％HS
含有 DMEM 培地で分化誘導した．分化誘導 5 日目に電気パルス刺激（パルス
幅 20ms，1Hz）培養を開始し，発達型培養筋を得た．ここで，酸化ストレスの代表として 0～2 mM の過酸化水素を添加し，サルコメア構造維持率，活性張力維持率，タンパク質含有濃度の維持率，あるいは細胞死滅率に影響を引き起こ
す 50 %阻害濃度（IC50）を算出した．サルコメア構造の維持率は α アクチニンの蛍光免疫染色によりサルコメアを含む筋管数/総筋管数で求めた．活性張力は既報の培養骨格筋細胞-短冊型コラーゲン薄膜複合体を用いる方法を用いた．
[結果と考察]過酸化水素の添加によってサルコメア構造の消失，活性張力の低下，タンパク質含有濃度の低下，細胞死が濃度依存的に起こることが確認された．各項目に対応する IC50 は，それぞれ，0.62 mM，0.94 mM，1.0 mM，1.3 mM，であった．サルコメア構造維持率という新しい指標は，複雑なセットアップを必要とする張力測定法を若干高感度に代替可能な評価指標と成り得ることが明らかになった．

Effect of hydrogen peroxide concentration on structure and function ofcultured skeletal muscle cells○Keisuke Mae1, Masanobu Horie2, Hideaki Fujita3, Eiji Nagamori4(1Dept. Biomed. Eng., Osaka Inst. Technol., 2RIRC, Kyoto Univ, 3WABIOS, Waseda
Univ., 4Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

Skeletal muscle, C2C12, oxidative stress9 月 6 日（木）

l2

9

3

受賞講演（13:30 〜 13:50）〈生物工学奨励賞（江田賞）〉
受賞者

浅野 静（アサヒビール）

ビール醸造における微生物検査法の迅速化に関する研究C 会場

A2Cp01

p. 139〈生物工学奨励賞（斎藤賞）〉
受賞者

本田 孝祐（阪大院・工）

好熱性酵素を用いた細胞外人工代謝経路の構築と利用に関する先駆的研究
M 会場

A2Mp01

p. 139〈生物工学奨励賞（照井賞）〉
受賞者

井藤 彰（九大院・工）機能性磁性ナノ粒子の開発と医療技術への応用に関する生物工学的研究
F 会場

A2Fp01

p. 140〈生物工学アジア若手賞〉
受賞者

Verawat Champreda(Natl. Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Thailand)

Exploration of lignocellulose degrading enzymes from hidden bioresource
H 会場
A2Hp01for biorefinery and green industries

p. 140一般講演（9:00 〜 11:36）
食品科学，食品工学

C 会場

醸造学，醸造工学
生物化学工学／培養工学／バイオプロセス
遺伝子工学
バイオマス，資源，エネルギー工学
タンパク質工学
発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析
糖鎖工学／生合成，天然物化学
酵素学，酵素工学
環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術
セル＆ティッシュエンジニアリング

D 会場
F 会場

G 会場

H 会場
I 会場

J 会場， K 会場
L 会場

M 会場
N 会場

O 会場

p. 141
p. 144
p. 145
p. 148
p. 151
p. 154
p. 157
p. 163
p. 166
p. 169p. 172

一般講演 （14:06 〜 16:30）
醸造学，醸造工学
生物化学工学／培養工学／バイオプロセス
遺伝子工学
バイオマス，資源，エネルギー工学
タンパク質工学／生体情報工学，バイオインフォマティクス／
システムバイオロジー

発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析
酵素学，酵素工学
環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術
セル＆ティッシュエンジニアリング

C 会場

E 会場， F 会場
G 会場

H 会場
I 会場

J 会場， K 会場

L 会場， M 会場
N 会場

O 会場

p. 175
p. 177
p. 183
p. 186
p. 188
p. 191
p. 197
p. 202
p. 204

139

A2Cp01

ビール醸造における微生物検査法の迅速化に関する研究○浅野 静（アサヒビール）
shizuka.asano@asahibeer.co.jp

ビールは，栄養源が少ないこと，炭酸ガスを含み酸素をほとんど含んでいないこと，pH が低いこと，およびアルコールを含むことから，大半の微生物は混入しても増殖することができない．しかしながら，一部の酵母と細菌は増殖することができ，ビールに混濁や異臭をもたらすことが知られている．その中でも乳酸菌をはじめとするビール混濁性細菌は，菌種レベルの解析をしないとビー
ル中での増殖能が判別できない点と，一般的な検査培地に生育しにくいため培養法での検出に時間がかかる点が，ビール醸造の品質管理において大きな問題となっていた．そこで演者らは以下の検査法の開発および迅速化に関する研究を行った．
1.マルチプレックス PCR 法を用いたビール混濁性細菌の包括的な菌種同定検出法の開発
食品業界における微生物検査において多用され，確実で迅速な検査法のひとつが菌種特異的 PCR 法である．一菌種ごとに増幅反応を確認するようなシンプ
レックス PCR 法が一般的ではあるが，近年の新菌種提案の増加に伴いビール混濁性細菌の菌種も増加傾向にあることから，本方法による検出菌同定は実用上困難になりつつあった．そこで，強いビール混濁性細菌として報告されている
12 菌種を対象としたマルチプレックス PCR 法を構築し性能評価を行ったとこ
ろ，実用水準を満たした検出感度，特異性，および同種異株に対する反応性を有していることが示され，簡単で迅速な網羅的検査法を構築することができた．
さらに，ラムダ DNA 配列と対象ビール混濁性細菌の遺伝子配列を組み合わせた人工陽性対照 DNA 溶液の作製法を開発した．本 DNA 溶液を使用することにより，微生物試験環境にビール混濁性菌の DNA 溶液を持ち込むことなく，1 反応系ですべてのプライマーの反応性を確認することが可能となった．
2，ビール馴化が乳酸菌に及ぼす影響の解析
生ビール製造工程の微生物管理において，一般的に除菌フィルターは最後の砦とも言える重要な工程である．しかしながら，これまでビールの除菌フィルターの性能評価試験で用いる微生物種と培養条件について検討した報告例はほとん
どない．一方，ビール環境に生息するビール混濁性乳酸菌が，実験室で通常見られる生態とは異なる可能性については以前から危惧されていた．演者らは，除菌フィルター性能を実情に近い状態で評価する目的で，供試菌とその培養条件について検討を行った．その結果，ビール環境に順応しているビール混濁性
乳酸菌は通常の実験室株よりもフィルターを通過しやすくなっていることが明らかとなり，その要因の一つが矮小化であることが示唆された．そこで，強い
ビール混濁性を示す Lactobacillus lindneri ならびに L. paracollinoides について，
さらに高度にビール馴化を行い性状調査を行ったところ，植え継ぎ回数が増加するに従って，L. lindneri DSM 20692 株および L. paracollinoides JCM 11969T 株
は徐々に MRS 培地での生育性が低下するのが観察された．さらに，ビールで40 回から 70 回程度の植え継ぎを行った株，および 30 回植え継いだ後ヒート
ショックを施した株では，MPN 法や蛍光活性染色法では一定数の生菌数が確認できるのに対して，MRS 培地で全く検出できなくなる現象が観察され，ビールへの高度な馴化，ならびに加熱によるストレスなどによって難培養化が引き起こされることが示唆された．このように，ビールに極度に馴化した乳酸菌株は，培地で検出されることなく品質事故を引き起こす可能性があることが明らかとなり，ビール馴化株を用いた微生物管理の重要性が示された．
3，マイクロコロニー法を用いたビール混濁性乳酸菌の迅速検出法の開発
ビール混濁性乳酸菌はごくわずかな菌数でも製品ビールで増殖することから，ビールの微生物検査には確実な検出力を持つ培養法が用いられてきた．一方，
培養法で結果を得るまでには 1-2 週間と長い時間がかかるため，製品の出荷可否を判定するには不向きであった．そこで演者らは，前述のビール馴化株も含
めて包括的にビール混濁性乳酸菌を検出できる ABD 培地と，蛍光染色法を組み合わせた新規検査系の開発を行い，ビール混濁性乳酸菌を 3 日以内に検出する方法を確立した．本法では第一ステップとして，ABD 培地上での短時間培養によりビール混濁菌を特異的に増殖させ，第二ステップとして，自動検出できる蛍光顕微鏡にて蛍光染色された微小マイクロコロニーを高感度で検出する．
この方法における検出感度および特異性を調査したところ，数 cells/検体レベルの混入混濁菌を検出できる感度を有し，さらにビール混濁性を持たない環境菌に対して擬陽性反応を示さないことが確認された．また，検出されたマイクロコロニーに対して，ビール混濁性乳酸菌の rRNA 遺伝子と相補する配列を持つ
蛍光プローブを用いて蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）を行うこと
により菌種特異的な検出も可能となった．

Studies on rapid detection of beer-spoilage bacteria○Shizuka Asano(Asahi Breweries, Ltd.)Key words

lactic acid bacteria, PCR, beer-spoilage, detection

A2Mp01

好熱性酵素を用いた細胞外人工代謝経路の構築と利用に関する先駆的研究○本田 孝祐（阪大院・工）honda@bio.eng.osaka-u.ac.jp

有用代謝産物の発酵製造に資する微生物株育種のため，代謝工学は欠かすことのできない重要な技術体系へと成熟しつつある．しかし残念ながら，代謝工学に基づく育種が期待どおりの生産性向上に結び付かない事例も少なくない．これは，我々が商業目的で微生物に「作ってほしい代謝物」と，微生物が自身の生存のために「作りたい代謝物」とが必ずしも合致しないジレンマに起因する．
例えば，高蓄積により細胞に毒性を示す代謝物が発酵生産の対象とはなりづら
いことは容易に想像できよう．各種オミクス解析により得られる情報と計算科学を駆使した代謝シミュレーションにより，このジレンマに折り合いをつけようという試みが近年の代謝工学分野における主要なトレンドのひとつとなっている．これに対し演者らのグループでは，生きた微生物の代謝経路を改変するのではなく，代謝反応を担う酵素だけを細胞外で組み合わせ，微生物の生命活動とは独立した（すなわち物質生産に特化した）人工代謝経路を in vitro で構
築・起動することにより，上記のジレンマを解消することを目論んでいる．この際，（超）好熱菌に由来する耐熱性酵素を用いることで，これらを発現させた
中温性微生物（大腸菌など）の熱処理のみによる簡便な酵素調製と，酵素失活による長時間反応への不適合性の回避を実現している．生きた細胞を用いない
本法では，宿主微生物の生理活性に依存しない物質生産が可能であるだけでなく，用いる酵素の組み合わせ次第で，原理上，あらゆる代謝物を選択的かつオ
ンデマンドに製造することができる．In vitro 代謝工学と命名した本法により，演者らはこれまでに，グルコースやグリセロール，コロイド状キチンを原料に，
L-乳酸，L-リンゴ酸，1-ブタノールなどのワンポット生産を実証している 1-5)．
また，これらの取り組みで用いられた in vitro 代謝経路は，単に天然の代謝経路を「コピー&ペースト」しただけのものでなく，補酵素類（ATP/ADP，NAD+/
NADH など）の消費/再生をバランスさせ，これらの消費量を最小化するなどの工夫が施されたものとなっている．このほかにも演者らは，in vitro 代謝工学の実用性を高めるための各種要素技術開発にも取り組んでいる．その成果として
これまでに，(i) 多数の酵素のワンステップ調製を目的とした耐熱性酵素遺伝子
群（最大 9 つ）の人工オペロンへの集積と共発現 6)，(ii) NAD(H)の安定化のための in vitro サルベージ合成法の開発 7)，(iii) 人工代謝経路構築のための酵素濃度比の最適化プログラム構築などに成功している．また，経路構築作業の過程で実施した各種耐熱性酵素の探索・評価試験の一部は，好熱菌がそのユニークな生態を示すにあたって，これらの酵素が果たす生理的機能の解明にもつながっている 8)．本講演では，これらの研究成果について概説するとともに，in vitro
代謝工学による有用代謝物生産の実用化に向けて現在進行中の取り組みについても紹介したい．
Ye X et al (2012) Microbial Cell Fact, 11, 120; 2) Ye X et al (2013) J Biotechnol, 164,34-40; 3) Krutsakorn B et al (2013) Metab Eng, 20, 84-91; 4) Jaturapaktrarak C et al(2014) Bioresour Bioprocess, 1, 18; 5) Honda et al (2017) J Biosci Bioeng, 124,
296-301; 6) Ninh PH (2015) Biotechnol Bioeng, 112, 189-196; 7) Honda et al (2016)
Metab Eng, 114-120; 8) Taniguchi et al (2017) J Bacteriol, 119, e00359-17
1)

Construction and implementation of in vitro synthetic pathway using
thermophilic enzyme○Kohsuke Honda(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

synthetic bioengineering, thermophile, in vitro metabolic engineering

140

A2Fp01

機能性磁性ナノ粒子の開発と医療技術への応用に関する
生物工学的研究

A2Hp01○井藤 彰（九大院・工）akira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp

現在，ガンは不治の病ではなくなってきたが，未だ有効な治療法が少なく，新しい治療法の開発が望まれる．磁性ナノ粒子は交流磁場中で発熱する性質をもつことから，磁性ナノ粒子を腫瘍部位に選択的に集めることができれば，患者の外部から交流磁場を照射することでガン特異的な加温によるガン温熱療法が可能となる．我々は，磁性ナノ粒子を腫瘍に選択的に送達するために，リポソー
ムで包埋してガン特異的な抗体などを結合させた種々の腫瘍標的型磁性ナノ粒子を開発し，これらを用いた温熱療法によって，様々な動物や癌で腫瘍の完全退縮に成功した．また，興味深いことに，磁性ナノ粒子を用いて温熱療法を施すと，抗腫瘍免疫が誘導されることを世界で初めて見いだした．これは，熱でガンを殺す治療法と見なされてきた温熱療法からは全く予想できなかった生体反応であり，原発癌を治療すれば転移癌をも免疫によって殺傷できる可能性を秘めている．この腫瘍免疫を誘導するガン温熱療法について，前臨床研究において，動物モデルの腫瘍で 90%以上の非常に高い完全退縮率を達成した．さらに，ヒトへの臨床応用として，札幌医科大学皮膚科における臨床研究に資する
機能性磁性ナノ粒子を開発した．
近年，京都大学の山中教授らによる iPS 細胞樹立法の確立により，我が国における再生医療の実用化が強く望まれているが，細胞および組織培養プロセスにおける工学的課題は多い．磁性ナノ粒子は磁石に引き寄せられる性質があることから，標的細胞の表面に磁性ナノ粒子を結合して磁気標識することで，外部磁場によって磁気誘導による細胞操作を行うことが可能である．我々は，再生医療における各プロセスに磁力を利用することで，磁力を用いた再生医療技術の開発を行ってきた．これまでに，抗体結合型磁性ナノ粒子を用いたヒト骨髄からの間葉系幹細胞の磁気分離，磁性ナノ粒子を用いた遺伝子導入技術の開発
および微小パターン化磁石を作製して，血管内皮細胞の磁気パターニングに成功している．特筆すべきは磁力を用いた三次元組織構築プロセスで，特に磁力で筋芽細胞を積層していくことで，細胞が密で配向した骨格筋組織を作製する
ことに成功し，電気刺激に応答して収縮力を発揮する筋肉組織を試験管内で作製することに成功した．このティッシュエンジニアリングを用いて作製した骨格筋組織は，収縮力を指標とした薬剤スクリーニング分野への応用が期待される．現在，筋ジストロフィ患者由来 iPS 細胞から骨格筋分化を誘導することで，筋疾患に対する薬剤スクリーニング法の開発を行っている．これら一連の成果から，再生医療という次世代のバイオプロセス分野に磁気細胞操作という新しい方法論を創出したと考えている．再生医療の各工程について，磁力を巧みに利用することでそれぞれのプロセスの効率化に成功したことから，将来的には自動培養装置への導入も期待できると考えられる．
本講演では，機能性磁性ナノ粒子の開発と医療技術への応用に関する生物工学的研究と題し，我々がこれまでに行ってきた機能性磁性ナノ粒子を用いたガン
温熱療法および再生医療プロセスの開発について発表する．

Medical technology using functional magnetic nanoparticles○Akira Ito(Fac. Eng., Kyushu Univ.)

Key words

magnetic nanoparticle, tissue engineering, hyperthermia

Exploration of lignocellulose degrading enzymes fromhidden bioresource for biorefinery and green industries○Verawat Champreda(Natl. Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Thailand)
verawat@biotec.or.th

The world is now stepping towards the age of bioeconomy. Bio-resources are being
explored as the renewable starting materials for conversion to biofuels, chemicals, andbiomaterials and on another side, as a valuable genetic resource for searching potent
microbes and enzymes for industries. The research activities at the Enzyme
Technology Laboratory, BIOTEC aim to understand the complex cooperative
microbial processes on plant biomass degradation in nature and translate theknowledge into efficient enzymes for greener industries. Our works span fromsearching potent lignocellulose-degrading enzymes from the rich microbial bioresource of the country, developing synergistic enzyme systems for lignocellulose
hydrolysis and modification as well as on biocatalyst fabrication in various
immobilization designs, to optimizing bio-processes for enzyme prototype production.
The culture-independent metagenomic technique has been applied as an effective tool
to explore the world of uncultured microbes, which represents up to 99% of the total
biodiversity. A collection of environmental metagenomes from ecosystems active inlignocellulose degradation e.g. peatswamp forest, termite gut, and bagasse collection
site has been explored using combination of activity-based screening and nextgeneration sequencing with the use of advanced bioinformatics tools for gene mining
and in-depth analysis of the dataset. This provides an insight into the diversity anddynamics of lignocellulolytic microbial communities and genes encoding for biomassdegrading enzymes, contributing to our capability to understand biochemical processeson plant biomass decomposition in nature. Together with culture-dependent screening
from the Thailand Bioresource Research Center, our “Enzyme library” which is acollection of crude multi-activity and recombinant single-activity cellulases,
hemicellulases, and ligninases as well as auxiliary components (e.g. expansins andAA9 lytic polysaccharide monooxygenases) derived from cultured and uncultured
microbes has been established. These enzymes have been applied on degradation andmodification of lignocellulosic plant fibers aiming to development of greener
production processes through closed collaboration with local and international
partners. Target applications include chemical and energy saving in pulp and textile
industries, increasing nutrient uptake from animal feed, sugar platform biomass
conversion, and high-value specialty enzymes in healthcare products. In addition,translational research on multi-disciplinary biomass conversion technology has been
initiated on developing low-energy hydrothermal and organosolv fractionation
processes for local biomass, creating efficient synergistic enzyme systems forlignocellulose saccharification, and designing of catalysts and biocatalysts for sugar
conversion to fuels and chemicals. Through closed collaboration with leading local andinternational companies in relevant industries, our research will lead to efficientutilisation of the country’s bio-resources for developing bio-based industry with multidisciplinary technology.

Exploration of lignocellulose degrading enzymes from hidden bioresourcefor biorefinery and green industries○Verawat Champreda(Natl. Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Thailand)

Key words

bioresources, biomass, enzyme, metagenomic libraries

141

2Ca01

LC/ESI-MS/MS を用いた玄米米糠麹 (FBRA) 中ポリアミンの定量と製造過程における含有変動解析

2Ca03○堀江 裕紀子 1,3, 後藤 綺花 2, 伊藤 麻里 3, 津吹 澄 2, 池川 繁男 4,
小川 祥二郎 1,2, 東 達也 1,2（1東理大院・薬, 2東理大・薬, 3コーケン, 4玄米酵素）
horie@genmaikoso.co.jp

Metabolic Profiling of Cavendish Banana (Musaacuminata cv AAA) to understand its color changes○Anjaritha Aulia Rizky Parijadi1, Fenny Martha Dwivany2,
Sastia Prama Putri1,2, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ, 2Dept. Biology.,
Sch. of Life Sci. and Technol., Inst. Technol. Bandung)
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】ポリアミンにはアンチエイジンク，抗酸化，抗炎症などの作用が報告されており，その摂取によって健康増進が期待される．ポリアミンは納豆をはじめ，発酵食品に多く含まれることが報告されている．玄米米糠麹 (FBRA)
は，玄米と米糠を麹菌によって発酵させた健康食品であり，FBRA もポリアミン含量が多いことが期待される．そこで本研究では，FBRA，未発酵原料及び発酵途中試料中のポリアミン [プトレシン (PUT)，スペルミジン (SPD)，スペル
ミン (SPM)] の定量法を構築し，その含量を明らかとした．
【手法】FBRA，未発酵原料及び発酵途中試料について，その 25 mg に 0.1 M の塩酸を加え，超音波処理によってポリアミンを抽出した．このうち 250 μg の試料に相当する抽出液を DBD-F で誘導体化し，LC/ESI-MS/MS に付した．本法は，日内・日間変動係数が 9.5％以下，添加回収率が 94.5－101.8％と，満足しうる精度・正確度を有していた．
【結果・考察】FBRA (n = 18) を分析したところ，PUT の含量は 14－52 μg/g，
SPD のそれは 81－183 μg/g，SPM のそれは 43－91 μg/g であり，FBRA はポリ
アミンを多く含有している食品であることが示された．さらに，製造工程が進むにつれて PUT 及び SPM の含量は減少し，SPD の含量は増加することが明らかになった．SPD の含量は PUT のそれとミラーイメージの挙動を示し，特に麹菌が対数的に増殖することが知られている発酵開始 24 時間後から FBRA 完成までの間に増加した．このため，SPD は麹菌によって PUT から合成されたものと考えられる．現在，菌体量とポリアミン含量との相関について調査している．

Metabolomics, the study of total profiling of metabolites, is an important tool tosupport postharvest fruit development and ripening studies. Monitoring the changes in
the metabolome during fruit ripening is important to obtain insight into themechanisms involved and improve postharvest management strategies. Color changes
is a common parameter used for fruit ripening process. Banana is a climacteric fruit
where the color changes due to ethylene burst around the fruit. GC/MS analysis incombination with multivariate analysis of banana from sixteen observation days were
performed. We first categorized banana samples based on its color changes, andestablished parameter of ripening. Gas chromatography/mass spectrometry analysis
results showed small hydrophilic metabolites were profiled from non-ripened to overripened (day 0 to 16). These metabolites were then correlated with color changes toverify their involvement in banana ripening process. The results from this study
suggests several metabolites are indicated to play a role in banana ripening process.

Changes of the polyamine contents during industrial fermentation of brownrice and rice bran with Aspergillus oryzae.

Metabolic Profiling of Cavendish Banana (Musa acuminata cv AAA) tounderstand its color changes○Yukiko Horie1,3, Ayaka Goto2, Mari Itoh3, Sumi Tsubuku2, Shigeo Ikegawa4,
Shoujiro Ogawa1,2, Tatsuya Higashi1,2(1Drad. Sch. Pharm. Sci., Tokyo Univ. Sci., 2Fac. Pharm. Sci., Tokyo Univ. Sci.,
3
Koken Co., Ltd., 4Gemai Koso Co., Ltd.)○Anjaritha Aulia Rizky Parijadi1, Fenny Martha Dwivany2, Sastia Prama Putri1,2,
Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ, 2Dept. Biology., Sch. of Life Sci.
and Technol., Inst. Technol. Bandung)

Key words

brown rice, fermentation, polyamine, Aspergillus oryzae

Key words

Banana, Musa acuminata cv. AAA, Metabolic profiling, Color changes

2Ca02

トランスクリプトミクスによるキトサン処理時のバナナ
果実における網羅的遺伝子発現解析

2Ca04

Quality prediction and authentication of Indonesian
specialty coffee using GC/MS-based metabolomics
approach○山本 佳奈 1,2, Putri Sastia 1,2, Dwivany Fenny 2, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工, 2バンドン工科大学院・生命科）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp○Sastia Putri1, Tomoya Irifune1, Yusianto2, Ucu Sumirat2,
Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Indonesian Coffee and Cocoa
Research Institute)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

バナナなどの果実は収穫後も呼吸により成熟が進み，トランスクリプトーム解
析により収穫後の貯蔵期間に遺伝子発現が変化することが明らかにされている．
本研究では鮮度保持剤であるキトサンが果実表面に被膜処理された際に遺伝子発現に及ぼす効果を検討するために，トランスクリプトーム解析を実施した．
キトサンは，被膜処理により植物組織への酸素の浸透を阻害し呼吸を抑制する
ことで，果実の成熟を遅らせることができる．しかし，キトサンが遺伝子発現に与える影響を網羅的に解析した報告はなく，果実のキトサン被膜処理に対す
る応答についての詳細は不明である．本研究では，通常状態で成熟させたバナ
ナとキトサン処理を施し成熟させたバナナの 2 群間での遺伝子発現状況の比較を行い，キトサン処理が遺伝子発現に与える影響について網羅的に調査した．
これらのサンプルから抽出した RNA を RNA-seq を用いて配列を解析し，全転
写産物の定量を行った．発現遺伝子について 2 群間の発現量の平均の差を検出
し，t 検定により 2 群間で発現が変動している遺伝子（differentially expressed
genes, DEGs）を同定した．結果，早期の成熟段階でより多くの遺伝子発現が 2群間で変動していることが明らかになった．さらにキトサンが多くの遺伝子の発現を制御していることが示され，成熟に重要な代謝経路などへの関与が示唆された．

Quality evaluation is commonly assessed on the basis of human sensory perception,
particularly for agricultural crops such as coffee and tea. In recent years, metabolomics
approach has been used as a powerful tool for quality prediction of various foodcommodities. In addition, metabolomics is an excellent tool for detection of counterfeit
in food products because it can effectively distinguish phytochemical compositions offood among different origins, varieties, and cultivars. In this study, a non-targeted
GC/MS metabolome analysis was used to classify high quality Indonesian coffees
from different geographical origins such as Java, Sumatra, Bali and Toraja coffee. In
addition, a PLS-based prediction model to predict cupping score of Indonesian
specialty coffee was constructed and important metabolites that correlate significantlywith coffee quality was identified. The result from this study demonstrate that the
species and origins can be rapidly discriminated by evaluating the major metabolites ofgreen coffee beans and cupping score of coffee can be predicted with high accuracy.

Comprehensive gene expression analysis of chitosan-coated banana bytranscriptomics-based approach

Quality prediction and authentication of Indonesian specialty coffee using
GC/MS-based metabolomics approach○Kana Yamamoto1,2, Sastia Putri1,2, Fenny Dwivany2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2School of Life Sci. and Technol., Inst.Technol.
Bandung)

Key words

transcriptome, gene expression, chitosan, banana○Sastia Putri1, Tomoya Irifune1, Yusianto2, Ucu Sumirat2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Indonesian Coffee and Cocoa Research Institute)

Key words

Metabolomics, Specialty coffee, GC/MS

142

2Ca05

GC-MS-based metabolomics for the classification oftempe along to different regions and production processes
in Indonesia

2Ca07

Evaluation of in-vivo skin-whitening activity of 8methoxydaidzein coupled with 3'-hydroxygenistein
An-Ni Ke1, Jiumn-Yih Wu2, ○Te-Sheng Chang1(1Dept. Biological Sci. & Technol., National Uni. Tainan, Taiwan,
2
Dept Food Sci., National Quemoy Uni., Taiwan)
mozyme2001@gmail.com○Adinda Darwati Kadar1, Pingkan Aditiawati2, Made Astawan3,
Sastia Prama Putri1,2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Biotechnol., Institut
Teknologi Bandung, 3Dept. Food Sci. Technol., Bogor Agric.
Univ.)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp
Tempe, a fermented soybean originally from Indonesia, is a meat-substitute protein
source with high nutritional quality. Differences in the production process and uniquefermentation condition result in varieties of tempe. To date, there are very few studies
on the characterization of tempe based on the differences of production process andgeographical origin. Metabolomics is a powerful tool for the analysis of food quality,
food safety, and determination of origin and varietal differences. In this study,
metabolomics is applied for the study of Indonesian tempe obtained from various
regions and production processes. Seventeen samples were collected from 6 different
cities in Java Island, which were produced by home-scale traditional tempe maker,
semi-modern industry and modern industry. Untargeted metabolomics by gas
chromatography coupled with mass spectrometry (GC/MS) was applied to discriminate
various kinds of tempe and identify metabolites that are associated with thesedifferences. Results showed that tempe produced in different places clustered together
according to the cities and their production category. Sugars and amino acids groups
were found to be discriminant metabolites that contributed to this clustering. This is thefirst report that reveals metabolic differences between different varieties of tempe fromdifferent regions and production processes. The knowledge from this study isimportant for future improvement of tempe production.

In our previous studies, two isoflavone derivatives, 3’-hydroxygenistien and 8methoxydaidzein, were identified with potent inhibitory activity on melanogenesis incultured mouse B16 melanoma cells. In the present study, both zebrafish and mice
were used as in-vivo animal models to evaluate skin-whitening activity of the two
isoflavone derivatives. The results showed that 0.1 mM of 8-methoxydaidzein
inhibited melanogenesis of zebrafish larvae to 74.3% of control, and the larvae survival
was not affected by the treatment. Moreover, the two isoflavone derivatives exhibitedsynergetic effects. However, 3’-hydroxygenistien, itself alone, did not show significant
inhibition on melanogenesis under non-toxic concentrations in the zebrafish model. In
the advanced mice assay, creams containing 0.5% of 3’-hydroxygenistien, 8methoxydaidzein, or the combination of the two isoflavones were applied to the skin of
the tested mice for 28 days, and the skin-whitening value (L value) were determined
during the assay. The results showed that neither 3’-hydroxygenistien, 8methoxydaidzein nor the combination of the two isoflavones showed significant skinwhitening activity in the mice skin, while the positive control with 0.5% ofhydroquinone in the cream significantly increase the skin-whitening values. The resultsof the present study highlighted the important role of mice model in the evaluating invivo skin-whitening activity of developing skin-whitening agents.

GC-MS-based metabolomics for the classification of tempe along todifferent regions and production processes in Indonesia

Evaluation of in-vivo skin-whitening activity of 8-methoxydaidzein coupledwith 3'-hydroxygenistein

Key words
Metabolomics, Indonesian tempe, Metabolite profile, Untargeted
metabolomics

Key words

8-methoxydaidzein, skin-whitening, zebrafish, 3'-hydroxygenistein

2Ca06

2Ca08

梅干しの脂質代謝改善効果○Adinda Darwati Kadar1, Pingkan Aditiawati2, Made Astawan3,
Sastia Prama Putri1,2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Biotechnol., Institut Teknologi Bandung,
3
Dept. Food Sci. Technol., Bogor Agric. Univ.)

Non-targeted metabolomics-based prediction of sensory
value of Litopenaeus vannamei (white leg shrimp)

An-Ni Ke1, Jiumn-Yih Wu2, ○Te-Sheng Chang1(1Dept. Biological Sci. & Technol., National Uni. Tainan, Taiwan, 2Dept Food Sci.,
National Quemoy Uni., Taiwan)○Safira Latifa Erlangga Putri1, Felicia Irene Saputra2,
Gede Suantika2, Sastia Prama Putri1, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept.
Microbiol., Sch. of Life Sci. and Technol., Inst. Technol. Bandung)safira_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp○芦田 久 1, 伊藤 あずさ 1, 大東 夏海 1, 吉原 侑希 1, 米野 雅大 1,
永井 宏平 1, 石島 智子 2, 阿部 啓子 2, 岡田 晋治 2, 鈴木 利雄 3
（1近大・生理工, 2東大院・農生科, 3阪市大院・工）ashida@waka.kindai.ac.jp

Shrimp is one of the important commodities in fish industry and its worldwide demandis expected to growth continuously for years to come. Japan as the world’s top seafood
consuming country has become increasingly dependent on imports for seafood productparticularly aquaculture shrimp. At present, the quality of aquaculture product in Japan
mainly focuses on the compliance with food safety regulation. Meanwhile, shrimp
appearance and size are more important for the industries as the price increases
proportionally with size. As such, the present quality evaluation standards for shrimp
lacks taste evaluation method, which is crucial for consumer acceptance. This researchaims to utilize metabolomic for the development of a quality evaluation method for themost important shrimp species in aquaculture industry, Litopenaeus vannamei or whiteleg shrimp. To achieve this objective, non-targeted GC/MS-based analysis and sensory
evaluation were combined to construct a Projection to Latent Structure (PLS) model.
In this study, we optimized the extraction method for shrimp metabolomics analysis
and carried out sensory evaluation using semi-trained panelist. The constructed PLS
model then allowed the identification of key metabolites that are correlated to sensory
attributes. Overall this study may provide useful information for a development ofnovel evaluation method for the taste quality of white leg shrimp in order to improve
quality through feedback to the aquaculture industry【目的】梅干しには，食欲促進効果，抗疲労効果，抗菌効果などのさまざまな機能が知られている．本研究では，梅干しの経口摂取による腸内細菌叢，肝臓における遺伝子発現，および脂質代謝への影響を評価することを目的として，マウスを用いた試験を実施した．
【方法】白干し梅（南高梅）は和歌山県みなべ町より供与していただき，果肉部分を凍結乾燥し粉末化した．C57BL/6J ♂および♀マウスを 3 群に分け，標準食(AIN-93M)，高脂肪食(HFD-60)，2%白干し梅粉末を含む高脂肪食をそれぞれ自由摂取させ，5 週間飼育した．体重と餌摂取量を経時的に測定し，最終日に解剖して肝臓，盲腸，血液を採取した．盲腸内容物は T-RFLP 法による細菌叢解
析に，肝臓はマイクロアレイによる遺伝子発現解析に供した．
【結果】白干し梅群は，高脂肪食群と比較して，♀において体重増加の有意な抑制効果，♂♀において血清中の中性脂肪の有意な低下が見られた．腸内細菌では，ビフィズス菌のわずかではあるが有意な増加，Prevotella 属の有意な増加が見られ，高脂肪食により誘導された高い Clostridia/Bacteroidia 比の肥満型フローラが改善される傾向が認められた．高脂肪食群では，肝臓における炎症関連遺伝子の発現上昇傾向と脂質代謝関連遺伝子の発現抑制傾向が見られたが，白干し梅群ではこれらの多くの遺伝子発現を回復させる効果が示された．

Non-targeted metabolomics-based prediction of sensory value of
Litopenaeus vannamei (white leg shrimp)

Effect of Japanese pickled apricots on lipid metabolism in mice

○Safira Latifa Erlangga Putri1, Felicia Irene Saputra2, Gede Suantika2,
Sastia Prama Putri1, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Microbiol., Sch. of Life
Sci. and Technol., Inst. Technol. Bandung)

Key words

Litopenaeus vannamei, metabolomics, GC/MS, sensory evaluation○Hisashi Ashida1, Azusa Ito1, Natsumi Ohigashi1, Yuki Yoshihara1,
Masahiro Komeno1, Kohei Nagai1, Tomoko Ishijima2, Keiko Abe2, Shinji Okada2,
Toshio Suzuki3(1Fac. Biology-Oriented Sci. Technol., Kinki Univ., 2Grad. Sch. Agric. Life Sci.,
Univ. Tokyo, 3Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words

lipid, triglyceride, microbial flora, metabolism

143

2Ca09

熱処理によっておこるポリ-γ-グルタミン酸の低分子量化に対するキレート剤の影響

2Ca11○岩本 七虹 1, 山口 良弘 1,2, 荻田 亮 1,3, 田中 俊雄 1, 藤田 憲一 1（1阪市大院・理, 2阪市大・複合先端, 3阪市大・健康研セ）
kfujita@sci.osaka-cu.ac.jp

サワードウの継代過程における化学成分変化と微生物叢
変化の関連性○大城 麦人 1,2, 百田 理恵 1, 田中 優 1, 中山 二郎 1
（1九大院・農, 2山崎製パン・中央研）
nakayama@agr.kyushu-u.ac.jp

納豆の粘性成分の一つであるポリ -γ- グルタミン酸 (PGA) は，長期保存中に粘性・分子量が低下し，品質の保持が問題となっている．PGA の低分子量化は100℃の熱処理によって加速される．先行研究から，熱処理による低分子量化はEDTA やクエン酸などのキレート剤の共存によって抑制されることがわかっている．そこで，金属イオンとの選択性が異なる各種キレート剤が PGA の低分子量化に与える影響について調べた．その結果，低分子量化の抑制は EGTA でも観察された．加えて，より Ca2+ に選択性の高いキレート剤 BAPTA では EDTA
や EGTA 処理より，効果は若干弱まったが，低分子量化の抑制は認められた．
しかしながら，Fe2+に選択性の高い BPDS には抑制効果が見られなかった．次
いで，低分子量化の抑制が， PGA に含まれる Ca2+ など二価金属イオンをキレートしたことによるものなのか，あるいは，キレート剤が PGA と相互作用した結果によるものなのかを以下のように検討した． PGA 溶液にグルタミン酸のモル比 1:1 で各種キレート剤を添加して 25℃30 分インキュベーションした後，透析を一晩行い，その後，100℃の熱処理を行った．本発表では各種キレート剤処理による PGA の低分子量化抑制効果について報告する．

【背景と目的】サワードウ（Sourdough）とは小麦粉やライ麦粉と水を混ぜ合わせたものが乳酸菌や酵母によって自然発酵したパン種の一種であり，サワードウを使ったパンは日本を含む世界各国で一定の人気を持っている．サワードウ
は，古くなったサワードウに小麦粉やライ麦粉と水を新たに加えて発酵させこ
れを繰り返して継代する過程で，化学成分と微生物叢が変化していく．先行研
究[1, 2]によって，継代を開始してからの最初の 10 日間に化学成分と微生物叢が著しく変化することが明らかになったが，継代 10 日以降の両変化の詳細は不明な点が多い．そこで本研究では，サワードウを 60 日間継代する過程の化学成
分変化と微生物叢変化を追跡し，両変化の関連性の解明を試みた．
【方法】フランス産，北米産，日本産の小麦産地が異なる小麦粉を使ってサワードウを作成した．それぞれを 60 日間継代（継代回数は 32 回）する中で経時的にサンプリングを行い，pH および発酵関連成分の理化学分析，培養法による乳酸菌数および酵母菌数測定，分離株の菌種同定，MiSeq を用いたメタ 16S 解析を行った．
【結果と考察】サワードウを継代する過程において，サワードウ中のエタノール
変化が酵母 S. cerevisiae または偏性ヘテロ発酵型乳酸菌 Lb. fermentum により引き起こされたと考えられた．また，継代過程で乳酸菌種の変遷が継続したサワー
ドウは，乳酸量が徐々に増加する傾向を示した．継代過程における乳酸菌種の出現時期に着目すると，メタ 16S 解析で検出した乳酸菌種を 3 グループに大別できた．
[1] R. V. der Meulen et al., Appl. Environ. Microbiol. , 73, 4741-4750, 2007
[2] S. Weckx et al., Food Microbiol. , 27, 1000-1008, 2010

The effect of chelating agents on decrease in molecular mass of poly-γglutamic acid during heat treatment.

Tracking of biochemical and microbial dynamics in spontaneous wheat
sourdough during two-month propagation○Nanako Iwamoto1, Yoshihiro Yamaguchi1,2, Akira Ogita1,3, Toshio Tanaka1,
Kenichi Fujita1(1Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 2OCARINA, Osaka City Univ., 3Res. Center.
Urban Health & Sports, Osaka City Univ.)○Mugihito Oshiro1,2, Rie Momoda1, Masaru Tanaka1, Jiro Nakayama1(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Central Laboratory, Yamazaki Baking Co., Ltd.)Key words

Bacillus subtilis, Polymer, poly-gamma-glutamic acidKey words

fermentation, metabolism, flour, food microbiology

2Ca10

植物発酵エキスにおける抗酸化成分の分析

2Ca12

ミドリムシの有用脂質の構造と有用性の解析○高木 康裕 1, 石井 もも子 2, 吉川 秀一 2, 柘植 圭介 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2小林製薬, 3佐賀工技セ）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp○宮川 幸 1, 藤川 彩美 1, 阪本 真由子 1, 小濱 可奈絵 1, 柘植 圭介 2,
鈴木 健吾 3, 中島 綾香 3, 杉本 良太 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2佐賀県工技セ, 3株式会社ユーグレナ）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp[目的]
植物発酵エキス(FPE)は多種多様の野菜や果物を乳酸菌や酵母により発酵・濃糖
抽出することで製造される発酵食品である．植物性発酵食品の市場は拡大しており，その健康機能性に関する研究が進んでいる．近年では DSS 誘発潰瘍性大腸炎モデルマウスへの FPE の投与により潰瘍性大腸炎抑制効果を示すことが明らかになった 1）．しかし FPE において発酵における成分変化の報告は多くなく，健康をもたらすメカニズムは未だ解明されていない．一方，発酵に関与する乳酸菌はアントシアニンを分解し，腸管で吸収されやすいアントシアニジンを生成することが知られている．アントシアニジンはポリフェノールの一種であり，抗酸化成分を有する機能性成分である．そこで本研究では，機能性食品開発研究所(株)の FPE，及び森川健康堂(株)の植物発酵エキス商品 RIPE-100 に存在する抗酸化成分について，アントシアニンを中心としたポリフェノール成
分に着目し調査を行った．
【方法・結果】
FPE は Sep-pak C18 を用いた固相抽出により夾雑物を除去した後に，吸着画分をメタノールで濃縮することで精製した．精製した FPE において TLC-DPPH
及び LC-ESI-MS 分析を行った．TLC-DPPH の結果，機能性食品開発研究所(株)の FPE，及び森川健康堂(株)の RIPE-100 において数種の抗酸化成分の存在が確認された．また機能性食品開発研究所(株)の FPE における LC-ESI-MS 分析の結果 ， Pelargonidin(Pg) に 相 当 す る m/z 271 ， Pg 3-glc に 相 当 す る m/z 433 ，Cyanidin(Cy)に相当する m/z 287，Cy 3-glc に相当する m/z 449 を持つ成分が検出された．FPE に含まれているアントシアニジン類が植物性発酵食品の健康機能性に寄与している可能性が示唆されたので，その抗酸化活性や総ポリフェノー
ル量，未同定の抗酸化成分について現在解析している．
1）山本ら，日本農芸化学大会講演要旨集 2B10p07 （2017）【目的】ミドリムシの市場規模は 100 億円以上と拡大傾向にあり近年その機能性の高さが注目されている．これまでに，アトピー性皮膚炎の症状緩和や血糖値の上昇抑制など多岐にわたる機能性が明らかになっているが，その効能の作用機序などは未知のものもある．一方，スフィンゴ脂質やリン脂質は保湿成分として知られており，化粧品など広く用いられている．そこで本研究では，ミド
リムシ脂質成分を解析することで，その応用可能性について検討を行った．
【方法・結果】ミドリムシ(Euglena gracilis) 粉末からクロロホルム・メタノールを用いて脂質抽出を行ったところ，スフィンゴ脂質とリン脂質と考えられるバンドが検出された．ワカメ・ヒジキ粉末からも同様に脂質を抽出し，TLC 解析
にて他の藻類との脂質含量の比較を行った．TLC の結果，ミドリムシには他の藻類に比べて多くの脂質が含まれていることが明らかになった．次に，スフィ
ンゴ脂質と考えられる脂質を酸加水分解しニンヒドリン染色を行ったところ，
スフィンゴイド塩基が検出された．これより，スフィンゴイド塩基を骨格に持つスフィンゴ脂質であることが判明した．さらに，LC/ESI-MS を用いて脂質の構造解析を行ったところ，m/z=839.2 より，N-2'-hydroxytetracosanoyl-l-O-β-Dglucopyranosyl-9-methyl-4,8,10-sphingatrienine (d19:3/C24:0h) で あ る と 推 測 さ れた．また，Phosphatidylethanolamine (m/z=768，727，755)，Phosphatidylglycerol(m/z=740)と一致したスペクトルが確認され，リン脂質が含まれているということが示唆された．
以上の結果から，ミドリムシには生体にとって有用と考えられる脂質が含まれており，化粧品・健康食品に有効な機能性素材であると考えられた．
本大会ではこれらの脂質の肌細胞への効果も併せて報告したい．

Analysis of antioxidant components in fermented beverage of plant extracts

Analysis of the structure and utility of Euglena lipid○Yasuhiro Takaki1, Momoko Ishii2, Shuichi Yosikawa2, Keisuke Tsuge3,
Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Kobayashi Pharm. Corp, 3Industrial technology Center ofSaga)

Key words

antioxidant, anthocyanin, anthocyanidin, fermented plant extract○Miyuki Miyagawa1, Ayami Fujikawa1, Mayuko Sakamoto1, Kanae Kohama1,
Keisuke Tsuge2, Kengo Suzuki3, Ayaka Nakashima3, Ryota Sugimoto3,
Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Industrial Technology Center of Saga Prefecture,3
euglena Co.,Ltd.)Key words

sphingolipid, phospholipid, Euglena gracillis

144

2Da07

ハイビスカス花から採取した酵母の特性と泡盛醸造への
応用

2Da09

○阿部 峻之 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2, 塚原 正俊 1
（1バイオジェット, 2奈良先端大・バイオ）tsuka@biojet.jp

清酒酵母の機能性アミノ酸蓄積変異株の分離と醸造特性の解析○大橋 正孝 1, 渡辺 大輔 2, 高木 博史 2
（1奈良産振セ・バイオ・食品グループ, 2奈良先端大・バイオ）
m-oha-niid@von.jp

沖縄県の泡盛は，600 年を超える日本最古の蒸留酒である．我々は，泡盛風味のバラエティー化を目指した取り組みとして新たな泡盛酵母の確立を目指している．今回，南国イメージを有する「ハイビスカス」を分離源として，新たな酵母の取得と泡盛醸造への適性を評価した．沖縄県内の複数地域からハイビス
カスの花を収集し，常法に従って酵母を含む微生物の集積培養を行った．これらの試料について，増殖速度，コロニー形態，アルコール生産性，泡盛小仕込み試験などによるスクリーニングを行った．その結果，泡盛醸造に応用可能と考えられる菌株を複数得た．これらの菌株について，小仕込み試験による醸造特性を詳細に評価することで，優良菌株 HC02-5-2 を取得することができた．
次に，分子生物学的見地から HC02-5-2 株の特性評価を行った．NGS による全ゲノム解析を実施し，既知酵母との比較ゲノム解析を進めることで，HC02-5-2
株は Saccharomyces cerevisiae であることが分かった．詳細な系統解析を行った
ところ，泡盛で常用されている 101 号酵母は清酒や焼酎で用いられるグループに含まれるのに対して，HC02-5-2 株はワイン醸造に用いられるグループに含まれた．HC02-5-2 株を用いて小仕込みを行った泡盛の成分を網羅的に解析したところ，従来の酵母と比較して複数かつ特定の果実様香気成分を多く含んでいた．
さらに，官能評価によって従来の酵母と官能的に明らかな差異が感知された．
以上の結果から，ハイビスカス花から採取した酵母 HC02-5-2 株が新たな風味の泡盛開発に貢献できることが明らかとなった．これまでに，本菌を用いて醸造した泡盛の商品化に成功しており，さらに本菌から取得した変異株（C14 株）
を用いて醸造した泡盛も製品化された．

【背景と目的】我々は清酒の消費低迷を打破するために，従来の清酒酵母との差別化が可能な菌株の開発を目指している．これまでの研究で，遺伝子組換え技
術を用いずに，アルコール性疲労の抑制や肝機能の促進などの機能性を有する
オルニチンを細胞内に高蓄積する変異株（オルニチン蓄積酵母）の取得に成功している．その変異株を用いた醸造によって，オルニチン添加で生じるコスト
負荷を伴わずに，オルニチンを多く含む清酒や酒粕を製造できると考えられる．
オルニチン蓄積酵母で醸造した清酒は，協会酵母で醸造した清酒よりも，オル
ニチンを約 6 倍多く含んでいるが（約 14 mg/180 mL），市販のオルニチン含有
飲料には，1 本あたり 100～400 mg のオルニチンが添加されていることから，
清酒 180 mL（1 合）に含まれるオルニチン量をさらに高めることが必要である．
そこで，本研究では，ウラシルアナログをスクリーニングに使用し，オルニチ
ン蓄積酵母から細胞内オルニチン含量が向上した変異株の分離を試みた．得られた変異株を用いて清酒の小仕込み試験を行い，醸造特性を解析するとともに，清酒中のオルニチン量を測定した．
【方法及び結果】オルニチン蓄積酵母を EMS 変異原処理後，ウラシルアナログ（5-フルオロウラシル）及びプロリンアナログ（アゼチジン-2-カルボン酸）を含有する最少（SD）寒天培地で生育できる株を分離した．次に，各株を SD 液体培地で 30℃，2 日間培養後，細胞内のオルニチン含量を LC/MS アミノ酸分析システムで測定した．その結果，親株よりも細胞内オルニチン含量が 1.4 倍に増加した株を分離した．この変異株を用いて，総米 46g の小仕込み試験を行ったところ，変異株で醸造した清酒中のエタノール含量は親株に対して若干減少
し，オルニチン量は約 1/3 に減少していた．現在，清酒中の香気成分，有機酸
組成などを測定している．

Characteristics of yeast collected from hibiscus and its application toawamori brewing

Isolation of Japanese sake yeast mutants that accumulate a functional aminoacid and analysis of their fermentation profiles○Takayuki Abe1, Daisuke Watanabe2, Hiroshi Takagi2, Masatoshi Tsukahara1(1Biojet, 2Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST)○Masataka Ohashi1, Daisuke Watanabe2, Hiroshi Takagi2(1Nara Pref. Inst. Ind. Dev., 2Grad. Sch. Sci. Tech., NAIST)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, Awamori, liquor

Key words

2Da08

ハイビスカス酵母の変異株におけるロイシン高蓄積機構
の解析

2Da10

○豊川 洋一 1, 杉本 幸子 1, 那須野 亮 1, 渡辺 大輔 1, 阿部 峻之 2,
塚原 正俊 2, 高木 博史 1
（1奈良先端大・バイオ, 2バイオジェット）hiro@bs.naist.jp

Japanese sake yeast, A functional amino acid accumulation

カプリル酸高生産酵母の醸造特性○畠山 明 1, 遣水 潤 2, 栗林 喬 3, 原 崇 4, 城 斗志夫 4, 有本 圭吾 1
（1吉乃川, 2中越酵母工業, 3新潟県醸造試, 4新潟大・農）h.aki.1130@gmail.com【背景・目的】沖縄の伝統的蒸留酒である泡盛は，黒麹菌 Aspergillus luchuensisと酵母 Saccharomyces cerevisiae を用いて醸造される．我々は，泡盛の更なる酒
質の多様化を目的として，沖縄県内に自生するハイビスカスの花から分離した酵母を用いた泡盛醸造を検討し，商品化に成功している．今回，このハイビス
カスから分離した酵母を親株として，新たな特性を有する菌株の育種に取り組
み，ロイシンの毒性アナログである 5',5',5'-トリフルオロロイシン（TFL）耐性変異株（T25 株）を取得した．T25 株は，ロイシン代謝に関連し，吟醸香の主要成分である酢酸イソアミルやイソアミルアルコールの生産量が高いことから，親株（HB 株）と比べてロイシン生産能が優れているものと考えられた．そこで，本研究では T25 株におけるロイシン高生産メカニズムを明らかにすることを目的とした．
【方法・結果】HB 株および T25 株の細胞内アミノ酸含量を測定した結果，T25
株のロイシン含量は HB 株に対し，約 3.4 倍に増加していた．さらに両株の細胞抽出液を調製し，ロイシン合成の鍵酵素 α-isopropylmalate synthase（Leu4）の活性を測定した．その結果，HB 株の Leu4 活性は 10mM ロイシン添加により活性が著しく低下し，フィードバック阻害感受性を示したのに対し，T25 株のLeu4 はロイシン存在下においても活性の低下が認められなかった．以上のこと
から，T25 株の Leu4 はロイシンによるフィードバック阻害感受性が低下していることが明らかになった．そこで，T25 株の LEU4 遺伝子の塩基配列を決定したところ，アミノ酸置換（Gly516Ser）を伴うヘテロ変異が存在することが明らかとなった．さらに，Leu4 の分子モデリングを行った結果，Gly516 は Leu4 のアロステリック調節を受けるドメイン内に存在し，Ser への置換によりロイシン結合ポケットに立体障害が生じていることが示唆された．

【目的】清酒の高品質化において，香気（吟醸香）は重要な役割を担っており，その成分として，カプロン酸エチル，カプリル酸エチル，酢酸イソアミル等が知られている．現在，高級酒製造用として脂肪酸合成酵素（FAS）に FAS2G1250S 変異を有し，カプロン酸エチルの前駆物質であるカプロン酸を高生産す
る酵母が広く使用されている．近年，FAS2-F1279Y 変異を有する酵母菌株がカ
プリル酸エチルの前駆物質であるカプリル酸を高生産することが明らかにされた．1) 本研究では，醸造特性の低下が懸念される変異処理を行うことなく，カプリル酸高生産株 K901C8 を取得し，醸造試験により K901C8 の醸造特性の確認を行ったので報告する．
【方法および結果】きょうかい酵母 K901 株から，酵素による遊離脂肪酸定量法を応用したハイスループットスクリーニング法 2) を使用し，FAS2-F1279Y 変異を有するカプリル酸高生産株 K901C8 株を取得した．K901C8 株を用いた醸造試験において，親株である K901 株と比較して約 3 倍量のカプリル酸エチルを含む，良好な製成酒が得られた．また，カプリル酸エチル以外の香気成分やアルコール度数，日本酒度，酸度，アミノ酸度は親株と同程度であったことから，
K901C8 株が優れた醸造特性を維持していることを確認した．
1)新潟県：FAS2 タンパク質, FAS2 遺伝子, カプリル酸高生産酵母, 遊離脂肪酸高生産性酵母の取得方法及び飲食品（特開 2015-228849 号）
2)新潟県：酵母の取得方法（特許第 5963123 号）

Analysis of L-leucine accumuration mechamism of a Hibiscus yeast mutant

Fermentation properties of a sake yeast with high productivity of caprylic
acid○Yoichi Toyokawa1, Yukiko Sugimoto1, Ryo Nasuno1, Daisuke Watanabe1,
Takayuki Abe2, Masatoshi Tsukahara2, Hiroshi Takagi1(1Div. of Biol. Sci., NAIST, 2Biojet)

Key words
Saccharomyces cerevisiae, alpha-isopropylmalate synthase, L-Leucine,5', 5', 5'-trifluoro-DL-leucine resistance○Akira Hatakeyama1, Jun Yarimizu2, Takashi Kuribayashi3, Takashi Hara4,
Toshio Joh4, Keigo Arimoto1(1Yoshinogawa Co., Ltd., 2Chuuetukoubokougyou Co., Ltd., 3Niigata Pref. Inst.
Brewing, 4Fac. Agric., Niigata Univ)

Key words

caprylic acid, FAS2, sake yeast

145

2Da11

Saccharomyces arboricola と醸造酵母の交配株の作成とその醸造特性の解析

2Fa01○山本 裕貴 1, 藤丸 裕貴 1, ワイナンス マシュー 2, 五島 徹也 3,
赤尾 健 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大・農, 2ウエストバージニア大学・生科, 3酒総研）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp【背景と目的】アルコール飲料の製造で主に利用されてきたのは出芽酵母
Saccharomyces cerevisiae だが，S. cerevisiae と Saccharomyces 属の他の出芽酵母が種間交雑を行うことで，親より優れた特性を持つ株が現れることがある．例
えばビール下面発酵酵母は S. cerevisiae が S. eubayanus と交配した株であること
1)が報告されている．これは種間交雑時のゲノムの再編成により，優性遺伝子が劣性遺伝子を抑えて子に優良な形質が現れる雑種強勢が原因として考えられている．本研究では近年自然界で発見された Saccharomyces arboricola2)において，雑種強勢を利用した酵母育種への利用の可能性を探るため，S. arboricola と S.
cerevisiae の清酒酵母を交配させて得られた交配株を用いて清酒を仕込み，交配後の醸造特性の変化を調べた．
【方法】選抜マーカーとして薬剤耐性プラスミドの natMX を S. arboricola 350に，pGS39 を清酒酵母 K7 一倍体 868 (K7868h)にそれぞれ導入し交配試験に用いた．取得した交配株とその親株である S. arboricola 350, K7868h を用いて清酒の小仕込み試験を行い，回収した清酒を GC-FID による成分分析に供した．得られた 26 個の化合物データを変数として PCA を行った．
【結果と考察】PCA の結果，PC2（寄与率 12.4%）軸上で交配株とその親株
K7868h, S. arboricola 350 が分離した．PC2 軸においてミトコンドリアで代謝されるクエン酸，ピルビン酸が負に寄与した．交配株は PC2 軸と親株よりも高い
正の相関を示しており，交配株を用いて仕込んだ清酒醪中にはピルビン酸，クエン酸の残存が親株よりも少ないことが考えられた．この結果より，種間交雑によりミトコンドリアの代謝活性が向上したことが示唆された．

酵母脂肪滴蓄積に及ぼすゴム粒子タンパク質発現の影響○横田 早希, 後藤 猛
（秋田大院・理工）tgotoh@gipc.akita-u.ac.jp【目的】天然ゴムはパラゴムノキ（Hevea brasiliensis，Hb）のラテックスから生産され，合成ゴムでは達成できない優れた物性を持つ．ラテックス中のゴム粒
子には複数のタンパク質が存在するが，特に豊富に含まれる Rubber elongation
factor (REF)とそのホモログである Small rubber particle protein (SRPP)はゴム粒子の安定化に寄与し，ゴム生合成に重要な働きを持つと考えられている．我々はこれまでに，日本で生育でき，ラテックス状でゴムを生産するイチジク（Ficus
carica，Fc）に着目し，イチジクラテックスより 2 種類の REF/SRPP 遺伝子（FcREF/SRPP-1, -2）をクローニングした．本研究では微生物によるゴム生産を視野に，酵母脂肪滴をゴム粒子モデルとし，これらのタンパク質を出芽酵母に発現させ，脂肪滴の蓄積に及ぼす影響を調べた．
【方法と結果】FLAG タグ融合 REF/SRPP (HbREF，FcREF/SRPP-1，-2) 発現プラ
スミドを作製し，出芽酵母 SNY9 にそれぞれ導入した．これらの組換え出芽酵
母および空ベクターで作製した Mock を培養し，FLAG タグの免疫蛍光染色および，BODIPY 493/503 による脂肪滴染色を行った後，共焦点レーザー顕微鏡により観察した．その結果，組換えタンパク質 HbREF，FcREF/SRPP-1，-2 は脂肪滴で発現していることが確認され，これらのタンパク質の発現は脂肪滴の大きさに影響することが分かった．さらに， BODIPY 493/503 で脂肪滴を染色した各組換え体の蛍光強度をフローサイトメーターで分析し，細胞に蓄積された
脂肪滴量の比較を行った．

1) Yeast 32.1 : 17-27 (2015).
2) Trends in Genetics 29.5 : 309-317 (2013).

Outbreeding of Saccharomyces arboricola and brewery yeasts and analysisof their brewing characteristics○Yuki Yamamoto1, Yuki Fujimaru1, Matthew Winans2, Tetsuya Goto3,
Takeshi Akao3, Hiroshi Kitagaki1(1Fac. Agric., Saga Univ., 2Fac. Lifesci., West Virginia Univ., 3NRIB)

Effect on lipid droplet accumulation by expression of rubber particle
proteins○Saki Yokota, Takeshi Gotoh(Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ.)

Key words

Saccharomyces arboricola, interspecific cross, hybrid vigor, PCA

Key words
Lipid droplet

Natural rubber, Rubber particle protein, Saccharomyces cerevisiae,

2Da12

Bafilomycin A1 耐性を指標として育種した高発酵性酵母の諸性質解析

2Fa02

Introduction of late embryogenesis abundant peptide coexpression system for adequate expression of insecticidal
crystal proteins in Bacillus thuringiensis○中瀬 舞, 山内 隆寛, 窪寺 隆文, 明石 貴裕（白鶴酒造）
mai-nakase@hakutsuru.co.jp

我々はこれまでに清酒酵母（S. cerevisiae）のクロトリマゾール（CTZ）耐性株
から，高確率でアルコール高発酵性株を取得できることを見出した 1．しかし，CTZ 耐性株で醸造した清酒は，酸度が上昇する傾向がある．そこで，酸度に影響しない高発酵性株の育種法を検討した．CTZ 耐性株は，ATP binding cassette(ABC)トランスポーターの高発現による細胞内の ATP 量の低下が解糖系を亢進して，アルコール発酵性が向上したと推測している 2．また，ABC トランスポー
ターは細胞内物質を非特異的に排出するため，酸度上昇の原因は細胞内の有機酸排出である可能性が示唆された．そこで，細胞膜局在 ABC トランスポーター
ではなく，液胞膜局在 ATPase(V-ATPase)の活性化により細胞内の ATP 量を低下させることで，酸度に悪影響を及ぼさない高発酵性酵母の育種を試みた 3．
UV 照射で変異誘導した清酒酵母から V-ATPase 活性阻害剤である Bafilomycin
A1 に対して耐性を示す突然変異株を選抜した．選抜株を総米 400 g の小仕込み試験に供したところ，高発酵性の供与と共に，酸度は親株と同程度で，アミノ酸度は親株より低下し，さらに選抜株は醪後半でも発酵が旺盛であり，生菌率が親株よりも顕著に高いことを確認した．
本育種法のターゲットである V-ATPase は，ATP を用いて液胞内に H+を取り込む機能がある．そこで，V-ATPase の活性を測定するために，液胞内 pH を測定し，間接的に V-ATPase の活性を測定したところ，選抜株の液胞内 pH は親株と比較して低い傾向であることがわかった．この結果から，選抜株の V-ATPaseが活性化していることが示唆された．
現在，選抜株の高発酵性および醪末期ストレス耐性のメカニズムの解明に取り組んでいる．
1．広畑ら (1994) 生物工学, 72, 283.
2．Watanabe et.al. (2000) J. Biosci. Bioeng. 89, 577-581.
3．中瀬ら 2018 年度日本農芸化学会大会 2A08a06

Characterization of high fermentative activity mutants bred by screening
method based on resistant to Bafilomycin A1○Mai Nakase, Takahiro Yamauchi, Takafumi Kubodera, Takahiro Akashi(Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd.)Key words

Saccharomyces cerevisiae, sake, sake yeast○Mahmuda Akhtar1, Mizuta Kazuhiro1, Shimokawa Tomoko2,
Maeda Minoru2, Ikeno Shinya1(1Kyushu Inst. Technol., 2Kyushu Medical Co., Ltd.)ikeno@life.kyutech.ac.jp
Bacterial expression system always remains as the preferred choice for the productionof many recombinant proteins. Efficient protein expression by bacteria incorporate
with the colossal yield of functional biological proteins with excluding all sorts ofinterruption and impediment, is the most expected pathway in the domain of bioindustry domain.Considering from this stand point, we may confer that short peptide
co-expression system have been developed to enhance protein expression level in hostcell. The short peptide was designed from late embryogenesis abundant (LEA) proteinthat are expressed for anhydrobiosis both in plant and in animals.
Purpose of this study to enhance the efficient expression of insecticidal crystal (Cry)proteins in Bacillus thuringiensis (BT) by the employment of LEA peptide coexpression system. As well as focusing on efficient expression of Cry proteins in orderto improve the pathogenicity toward the insecticidal larvae, especially mosquito. In
connection with, we constructed three different types of LEA peptide (LEA-I, LEA-II
and LEA-K) expression plasmids. To pursue the adequate expression of insecticidal
Cry proteins we are now trying to proper implementation of three LEA peptides in BT
by using the plasmid of pHT01 as well as to alluring the expression by induction of
IPTG on the basis of different time interval in regards to different concentration. It isnoteworthy that Cry proteins expression by dint of LEA peptide expression is threetimes higher than wild type.

Introduction of late embryogenesis abundant peptide co-expression system
for adequate expression of insecticidal crystal proteins in Bacillus

thuringiensis○Mahmuda Akhtar1, Mizuta Kazuhiro1, Shimokawa Tomoko2, Maeda Minoru2,
Ikeno Shinya1(1Kyushu Inst. Technol., 2Kyushu Medical Co., Ltd.)Key words
peptideBacillus thuringiensis, Crystal protein, Late Embryogenesis Abundant,

146

2Fa03

海綿由来シリカ重合酵素の可溶性発現と凝集コント
ロール

2Fa05

麹菌 Aspergillus oryzae の液体培養における菌糸完全分散株の作製とその酵素生産への応用○宮澤 拳 1, 吉見 啓 2, 古明地 敬介 1, 田畑 風華 1, 佐野 元昭 3,
阿部 敬悦 1,2
（1東北大院・農, 2東北大・未来研, 3金工大・ゲノム研）
kabe@niche.tohoku.ac.jp○中島 一紀, 小栗 秀俊, 岡本 淳之介, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp【背景と目的】 海綿 Suberites domuncula 由来シリカテインはシリカの重合反応を触媒する酵素であり，この反応は常温・中性 pH で進行するため，化学プロセス，医薬品，バイオセンサー，環境修復技術など様々な分野への応用が期待される．しかし，シリカテインは非常に凝集性が高いタンパク質であり，その取り扱いが難しいという欠点がある．本研究では，タンパク質融合によりシリカテインの可溶性を向上させ，凝集性をコントロールすることを目的とした．
【方法】 pCold-ProS2 ベクター（タカラバイオ（株））に S. domuncula 由来シリカテイン遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した．この発現ベクターを用いて大腸菌 BL21(DE3)株を形質転換し，低温発現誘導（15℃）により，ProS2 とシリカテインの融合タンパク質（ProS2-Sil）を発現した．菌体破砕後，沈殿画分の封入体を回収し，透析（4℃，24h）により ProS2-Sil のリフォールディングを行った．HRV 3C Protease により ProS2-Sil 間を部位特異的に切断し，その凝集性を目視および透過型電子顕微鏡（TEM）により観察した．
【結果】 低温発現した ProS2-Sil は封入体として得られたものの，リフォール
ディングにより可溶化し，その後は凝集することなく非常に安定に可溶化した状態で存在することが明らかとなった．一方，可溶性の ProS2-Sil にプロテアー
ゼを添加することにより，ProS2 と Sil の切断を確認し（SDS-PAGE），ProS2 の切断・除去とともに徐々に溶液が白濁していった．この懸濁液の TEM 観察により，シリカテインが再凝集していく様子が確認された．また，可溶化した
ProS2-Sil はシリカテインと同等のシリカ重合活性を示すことが明らかとなった．

糸状菌は多様な物質を生産するが，一般的に液体培養では菌糸が接着して塊を形成するため高密度培養が出来ず，また菌糸塊中心部が嫌気的となり物質生産が制限される．以前我々は，モデル糸状菌 Aspergillus nidulans の細胞壁多糖
α-1,3-glucan（AG）欠損株の菌糸が液体培地中に完全分散する形質を発見し，AG が菌糸接着因子であることを明らかにした 1)．一方，麹菌 Aspergillus oryzaeの AG 欠損株は野生株に比べると小さな菌糸塊を形成し，菌糸は完全分散しなかった 2）．このことは，麹菌が AG 以外の菌糸接着因子を有することを示唆している．本研究では，麹菌の未知の菌糸接着因子の同定を目的とした．
Galactosaminogalactan（GAG）は病原性糸状菌 Aspergillus fumigatus の宿主感染因子として知られる分泌多糖である 3）．我々は GAG が麹菌の第二の菌糸接着因子であると推論し，麹菌 AG 欠損株より GAG 生合成遺伝子破壊株を作製した（AG-GAG 欠損株）．AG-GAG 欠損株は液体培養において菌糸が完全分散し，全く菌糸塊を形成しなかった．次に，野生株, AG 欠損株, AG-GAG 欠損株を親株として生産モデル酵素クチナーゼの遺伝子 cutL1 を 1 コピー導入した株を作製し，各株の酵素生産性をフラスコ液体培養で比較した．その結果，AG-GAG
欠損株の酵素生産性は野生株や AG 欠損株の生産性より有意に高く，AG-GAG
欠損株が酵素生産に好適な宿主株であることが明らかとなった．
1) Yoshimi et al., PLoS ONE (2013) 8:e54893
2) Miyazawa et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2016) 80:1853-1863
3) Fontaine et al., PLoS Pathog.(2011) 7:e1002372.

Soluble expression and aggregation control of silica-polymering enzyme
from marine sponge

Construction of Aspergillus oryzae mutant of which hyphae fully disperse
under liquid culture conditions and its application to enzyme production○Kazunori Nakashima, Hidetoshi Oguri, Junnosuke Okamoto, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)○Ken Miyazawa1, Akira Yoshimi2, Keisuke Komeiji1, Fuka Tabata1,
Motoaki Sano3, Keietsu Abe1,2(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2NICHe, Tohoku Univ., 3Genome
Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

biosilica, fusion protein, self assembly, soluble expression

Key words

Aspergillus oryzae, enzyme production, cell wall, filamentous fungi

2Fa04

麹菌内で同調的発現挙動を示すプロモーターを用いたタ
ンパク質生産挙動の解析

2Fa06

麹菌 Aspergillus oryzae 菌糸完全分散変異株の液体培養における酵素高生産性の評価○古明地 敬介 1, 宮澤 拳 1, 吉見 啓 2, 市川 暉 3, 佐野 元昭 4,
阿部 敬悦 1,2
（1東北大院・農, 2東北大・未来研, 3東北大・農, 4金工大・ゲノム研）
kabe@niche.tohoku.ac.jp○片山 周平 1, 張 斯来 2, 若井 暁 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3,
荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ, 3月桂冠・総研）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

麹菌（Aspergillus oryzae）は，微生物の中でも高いタンパク質分泌生産能力を有するため，酵素生産の宿主として工業的に利用されている．これまで，麹菌を宿主とした有用異種タンパク質生産について盛んに研究されてきたが，複数種のサブユニットにより構成されたマルチサブユニットタンパク質生産に着目した報告はされていない．そこで本研究では，麹菌によるマルチサブユニットタ
ンパク質の生産を目指している．標的タンパク質として再生医療分野の研究で欠かせないラミニン（ヘテロ三量体）を選択した．
麹菌でマルチサブユニットタンパク質を生産するためには，各サブユニットの遺伝子を同時に同程度で高発現する，すなわち同調的に発現する必要がある．
なぜなら，各サブユニットの発現タイミングが異なれば，各サブユニットが会合せずに分泌もしくは分解され，マルチサブユニットタンパク質として期待する生産量が得られない可能性があるからだ．これまでに，種々の培養条件で麹菌を培養し，既報の高発現プロモーターについて同調性を調べ，プロモーター
セットを選抜している．
本研究では，レポーターアッセイによりタンパク質の生産性を評価した．決定
したプロモーターの制御下でセロビオハイドロラーゼ（CBHI）を生産し，その酵素活性を経時的に比較した結果，（1）基質：Glucose，培養温度：25℃，（2）基質：Xylose，培養温度：30℃の二培養条件において，Padh1，PgpdA，あるいは Pgapdh をプロモーターとした形質転換体が CBHI を同調的に高生産していた．この結果から，このプロモーターセットを用いることで 3 つのサブユニッから成るタンパク質の生産が可能と判断した．現在，これらのプロモーターをラミニンの各サブユニットの遺伝子上流に配置したプラスミドを作製し，麹菌への導入を進めている．

【背景及び目的】糸状菌の液体培養では，菌糸同士が接着集合することで菌糸塊を形成するために高密度培養ができないことが課題である．我々は，産業糸状菌の麹菌において，細胞壁多糖 α-1,3-glucan（AG）の欠損に加えて細胞外多糖
galactosaminogalactan（GAG）を欠損させた AG-GAG 二重欠損株で，菌糸が完全分散することを発見した 1)．これまでに，フラスコ培養において AG-GAG 二重欠損株が野生株および AG 欠損株に比べて高い酵素生産性を示すことを確認した 1)．本研究では，5 L ジャー型発酵槽を用いて通気量や攪拌を制御し，工業培養での使用が見込まれる複数の培養条件における AG-GAG 二重欠損株の酵素生産性を評価することを目的とした．
【方法及び結果】麹菌の野生株，AG 欠損株および AG-GAG 二重欠損株の各株
で，生産モデル酵素クチナーゼ の遺伝子 cutL1 をゲノム上の niaD 部位に 1 コ
ピー導入した．これらの株を用いて 5 L ジャー型発酵槽で 30oC, 72 時間培養を行った．酵素生産性は，培地中に分泌された CutL1 量を SDS-PAGE で定量することで評価した．また，攪拌により菌糸が剪断を受け，生育制限が生じると想定されたことから，剪断菌糸から培地中に放出される活性酸素種も定量した．
まず，野生株と AG-GAG 二重欠損株の培養特性を比較したところ，AG-GAG
二重欠損株では野生株に比べて活性酸素種の放出量が増加しているにも関わらず，野生株よりも生育菌体量は増加する傾向が認められた．さらに CutL1 生産
量は培養 48 時間目以降，野生株比で約 2 倍に増加した．以上の結果から，AGGAG 二重欠損株は攪拌回転により剪断ストレスを受けつつも旺盛に生育し，高い酵素生産性を維持していることが明らかとなった．発表では，各株の培養時の表現型と酵素生産性の関係を考察する．
1) 阿部ら, 特願 2017-91734

Analysis of protein production using synchronous expression promoters in

Evaluation of enhanced enzyme productivity of Aspergillus oryzae mutantof which hyphae fully disperse under liquid culture conditions.

Aspergillus oryzae○Shuhei Katayama1, Silai Zhang2, Satoshi Wakai2, Hiroko Tsutsumi3, Yoji Hata3,
Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Res.
Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words
expression

Aspergillus oryzae, laminin, multi-subunit protein, synchronous○Keisuke Komeiji1, Ken Miyazawa1, Akira Yoshimi2, Hikaru Ichikawa3,
Motoaki Sano4, Keietsu Abe1,2(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2NICHe, Tohoku Univ., 3Fac. Agric., Tohoku
Univ., 4Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol.)Key words

cell wall, Aspergillus oryzae, enzyme production, filamentous fungi

147

2Fa07

エクソソームのアフィニティ分離が可能な単鎖抗体固定
化担体の開発2Fa09○小林 巧 1, 新 裕太 1, 片山 淳子 2, 的場 一隆 2, 堀内 淳一 1,
熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2日産化学）
kumada@kit.ac.jp

改変型型糖鎖をもつ抗体医薬品生産を目指した細胞外糖鎖修飾反応の開発○鬼塚 正義 1,2, 嶋津 敦子 2, 天羽 宏枝 2
（1徳島大院・社会産理工, 2MAB）
onitsuka@tokushima-u.ac.jp【背景と目的】エクソソームなどに代表される細胞外小胞は，次世代バイオマー
カーとしての利用が期待されており，疾患エクソソームの特異的分離方法の開発が必要となっている．本研究では，単鎖抗体（ｓｃ F ｖ）を用いる安価かつ高効率なエクソソームのアフィニティ分離技術の開発を目的とし，ｓｃ F ｖの生産，材料親和性ペプチドタグを利用したプラスチック担体への配向固定，さらには，エクソソームの濃縮効果について検討した．
【方法】エクソソーム膜上の CD9 を標的抗原とし，これに特異的に結合可能な
ｓｃ F ｖをファージディスプレイ法によって単離した．ｓｃ Fv は C 末端部にPMMA-tag を導入した状態で組換え大腸菌によって大量生産し，Ni-NTA カラム
を用いて精製した．透析法によってリフォールディング後，固定化状態における抗原結合活性の評価とエクソソーム回収率について評価した．
【結果と考察】単離されたｓｃ F ｖの CD9 に対する結合性を SPR センサーなら
びに ELISA によって確認し，これを用いたエクソソーム分離手法の開発を行った．担体に固定化されたｓｃ F ｖの抗原結合活性を高く維持するために，材料
親和性ペプチドを C 末端に導入したｓｃ Fv を設計し，リフォールディングによって可溶化することに成功した．現在，材料親和性ペプチドタグによる配向
固定の効果を検討中である．さらに，発表では，本担体を用いるエクソソームの濃縮効果についても発表する．

抗体医薬品の N 型糖鎖構造の不均一性は ADCC 活性ならびに CDC 活性に大きな影響を与えることが知られている．そこで均一な糖鎖構造をもつ抗体医薬品の生産を目指して，生産宿主細胞のゲノム改変法や糖タンパク質の完全化学合成法が開発されてきた．これに続く第 3 の方法として，我々は細胞培養液中における糖鎖修飾反応，即ち細胞外糖鎖修飾反応法の開発を試みている．この方法の特徴は既存の抗体生産細胞にすぐに適用でき，製造における生産培養で簡便に適用できることである．本発表では細胞外糖鎖修飾反応の概念を実証するために進めている実験を報告する．具体的には均一な活性向上型糖鎖への改変を目的として，N 型糖鎖のコアフコースの除去反応ならびに末端ガラクトースの付加反応を対象とした．ヒト由来の糖鎖修飾酵素として 2 種類のフコシダー
ゼ（FUCA1，FUCA2）ならびに 3 種類のガラクトシルトランスフェラーゼ（B4GALT1，B4GALT2，B4GALT3）の発現プラスミドを調製した．プラスミド
調製においては各酵素に分泌シグナル配列を付加し，同時に膜貫通領域を除去した．各発現プラスミドを CHO 細胞一過性発現システムに遺伝子導入し，培養上清を用いて SDS-PAGE，キャピラリー電気泳動，活性測定を行った．SDSPAGE ， キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 の 結 果 ， 3 種 類 の 糖 鎖 修 飾 酵 素 FUCA1 ，
B4GALT1，B4GALT2 で多量の分泌発現が確認され，特に B4GALT1 では分泌量が培養上清中の総タンパク質量の 50％以上に至った．さらに培養上清を用いた活性測定においてフコース残基切断活性，ガラクトース残基転移活性を確認した．現在，CHO 細胞発現系で調製した IgG1 抗体含有培養上清（>1g/L IgG1）に対して，一過性発現系で調製した糖鎖修飾酵素の培養上清を添加し細胞外糖鎖修飾反応を検討している．発表ではその結果も合わせて報告する．

Specific separation of Exosomal vesicles using single-chain Fv-immobilized
supportThe challenge of ex vivo glycosylation reaction for the production oftheraputic antibodies with improved glycosyaltion○Takumi Kobayashi1, Yuta Atarashi1, Junko Katayama2, Kazutaka Matoba2,
Jun-ichi Horiuchi1, Yoichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Nissan chem)○Masayoshi Onitsuka1,2, Atsuko Shimazu2, Hiroe Amou2(1Grad. Sch. Biosci. Bioind, Tokushima Univ., 2MAB)

Key words

Exosome, scFv, specific isolation, PMMA-tag

Key words
antibody glycosylation, CHO cells, ex vivo glycosylation, transient
expression system

2Fa08

単鎖抗体固定化ラテックスの調製と高感度ラテックス凝集検査への応用

2Fa10○中尾 貴一 1, 谷端 玲奈 1, 高橋 浩一 2, 小笠原 真也 2, 権平 文夫 3,
堀内 淳一 1, 熊田 陽一 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2デンカ, 3デンカ生研）
kumada@kit.ac.jp[緒言] 抗体固定化ラテックスを用いるラテックス凝集検査は，様々なバイオマー
カーの迅速な定量が可能であり，臨床検査分野で広く用いられている．本研究では，従来よりも安価かつ高感度なラテックス凝集検査法の開発を目的として，
単鎖抗体固定化ラテックスが調製可能かを検討した．さらに，分散条件ならびに反応条件を最適化することで，ラテックス凝集検査の高感度化を目指した．
[実験] C 反応性タンパク質（CRP）をターゲットとし，ファージディスプレイ
法を用いてウサギ抗 CRP scFv を単離した．組換え大腸菌を用いて scFv を培養
上清中に生産し，Ni-NTA カラムを用いて精製した．これらの scFv をラテック
スビーズ上に固定化し，BSA でブロッキング後，pH の異なる緩衝液中に分散した．最後に，scFv 固定化ラテックスと CRP との反応性を自動分析装置を用いて評価した．
[結果と考察] 組換え大腸菌のフラスコ培養によって等電点の異なる 3 種類のウ
サギ scFv を生産したところ，いずれも培養上清中から Ni-NTA レジンによって回収可能であった．これらをラテックス粒子上に固定化後，pH 6.0 ~ pH 8.5 の緩衝液中に分散したところ，分散可能な pH 範囲は scFv の等電点によって大きく異なっていた．さらに，抗原添加時の scFv 固定化ラテックスの凝集反応性も
scFv の等電点の影響を大きく受けることが明らかとなった．これらの結果を踏
まえて scFv 固定化ラテックスの分散 pH ならびに反応 pH を最適化したところ，
ラテックス凝集検査の高感度化が可能であった．

Preparation of scFv-immobilized latex beads for sensitive latex
turbidimetric assay○Kiichi Nakao1, Reina Tanibata1, Koichi Takahashi2, Shinya Ogasawara2,
Fumio Gondaira3, Jun-ichi Horiuti1, Yoichi Kumada1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Denka, 3Denka Seiken)

Key words

scFv, latex, latex turbidimertic, CRP

昆虫細胞における 2A ペプチドを用いた抗体生産
溝手 結 1, ○増見 恭子 1,2, 勝田 知尚 1,2, 山地 秀樹 1,2（1神戸大院・工, 2MAB組合）
yamaji@kobe-u.ac.jp【背景と目的】抗体は抗原に対して高い特異性や親和性を示すことから，治療薬
や診断薬として広く利用されている．我々は昆虫細胞を宿主として用いた抗体生産について検討している．IgG や Fab フラグメントは，一般に H 鎖 (Hc) および L 鎖 (Lc) の遺伝子をそれぞれ挿入した二種類のプラスミドベクターを同一細胞内に導入し共発現させることで生産される．本研究では，DNA 翻訳時に自己切断する 2A ペプチドの DNA を Hc と Lc の遺伝子の間に挿入して作製した
DNA 断片を単一のプラスミドベクターに組み込み，昆虫細胞に導入することにより，Fab フラグメントの生産を試みた．
【方法】抗 RNase A 抗体の Fab フラグメントを構成する Hc および Lc の遺伝子の間に porcine teschovirus-1 由来の 2A ペプチドの DNA を挿入した DNA 断片を作製した．また，furin による開裂部位の DNA を付加した DNA 断片や GSG リ
ンカーを付加した断片も構築し，それぞれプラスミドベクター pIHAneo に挿入した．作製した各プラスミドを昆虫細胞 Trichoplusia ni BTI-TN-5B1-4 (High Five)にトランスフェクションし，72 h 静置培養後，培養上清を western blotting および酵素免疫測定法 (ELISA) により分析した．
【結果と考察】2A ペプチドを用いた場合でも，western blotting により Fab フラ
グメントの分泌発現を確認できた．また，ELISA により培養上清における抗原結合活性を評価したところ，Hc および Lc の遺伝子を二種類のプラスミドベク
ターを用いてコトランスフェクションした場合と同程度の抗原結合活性が確認された．他の DNA 断片を用いた結果についても報告する．

Production of antibody Fab fragment using 2A peptide in insect cells.

Yu Mizote1, ○Kyoko Masumi-Koizumi1,2, Tomohisa Katsuda1,2, Hideki Yamaji1,2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2MAB)

Key words

insect cell, Fab fragment, 2A peptide

148

2Fa11

組換え大腸菌を用いた流加培養による種々の単鎖抗体の菌体外生産特性

2Ga01○坂本 祐一朗, 井嶋 浩一朗, 李 歓, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp

選択的白色腐朽菌 Ceriporiopsis subvermispora が産生する脂質関連代謝物 ceriporic acid の生合成候補遺伝子の探索と解析
○渡邊 崇人 1, 秋好 陽香梨 1, 森田 暁人 1, 二神 泰基 2, 木村 信忠 3,
後藤 正利 4, 渡辺 隆司 1
（1京大・生存研, 2鹿児島大院・連農, 3産総研・生物プロセス, 4佐賀大・農）takahito@rish.kyoto-u.ac.jp【背景と目的】組換え大腸菌を用いて活性型タンパク質の菌体外生産が可能になれば，大腸菌による組換えタンパク質生産コストを大幅に低減できる．これまでに，ペリプラズム分泌シグナル(PelB leader)を導入した組換え大腸菌を用いてDO-stat 流加培養を行うことにより，単鎖抗体(scFv)を菌体外に高濃度に分泌生産できることを報告した 1)．この結果を踏まえ，本研究では scFv の種類及び材
料親和性ペプチドタグの付加が scFv の菌体外分泌生産に及ぼす影響を検討した．
【方法】N 末端側にペリプラズム分泌シグナル（pelB leader），C 末端側に精製用
His タグを導入した Anti-CRP scFv，Anti-human IgG scFv など 3 種の scFv をモデ
ルタンパクとし，pET-22 発現ベクターを用いて Rosseta2(DE3)を形質転換した．
この組換え大腸菌を用いて 2L 容 Jar-fermenter により DO-stat に基づく流加培養を行った．
【結果と考察】scFv の種類が菌体外分泌生産に及ぼす影響を検討するため，3 種の異なる scFv 生産株を用いて DO=40%の条件で約 100 時間の流加培養を行った．その結果，anti-CRP scFv 4.9g/L，anti-human IgG scFv 4.4g/L，No.3 scFv 2.1g/
L の scFv が菌体外にリフォールディング不要な活性型として生産され，scFv の種類に関係なく scFv の菌体外生産が可能なことが明らかになった．次に，生産された scFv の担体への高密度配向固定を目指して，scFv の C 末端側に 3 種の材料親和性ペプチドタグを導入した組換え株を構築した．これらの菌株を用いて同様の実験を行ったところ，菌体外への scFv 分泌量が大幅に減少した．これは導入したペプチドタグが大腸菌の細胞膜に親和性を持つことから，scFv が細胞膜表面に吸着し，菌体外への分泌が抑制された可能性が考えられた．
1)坂本祐一朗 他，組換え大腸菌を用いた流加培養による単鎖抗体の高濃度菌体
外生産，第 69 回日本生物工学会，NO.4P-G044 (2017)【目的】白色腐朽菌 Ceriporiopsis subvermispora は，セルロース等の木材細胞壁
多糖を極力壊さずにリグニンを選択的に分解する．また，本菌は，イタコン酸
骨格を有する長鎖のアルキル（アルケニル）鎖が付加したジカルボン酸（主にceriporic acids A, B, C）を菌体外に産生する．特に，ceriporic acid B は，セルロースの分解の原因となる水酸化ラジカルの発生を抑制する機能を有する．さらに，
木粉やリグニン分解生成物であるバニリン存在下では，ceriporic acids の産生量が増加する．しかしながら，ceriporic acids の生合成系については，クエン酸の生合成に類似したアシル CoA とオキサロ酢酸の縮合から始まるモデルが提唱されているものの詳細な解析はされていない 1)．今回は，その生合成に関与する候補となる遺伝子の探索と単離，そして，異種発現を試みた．
【方法・結果】 Aspergillus 菌のクエン酸及びイタコン酸の生合成に関与するクエン酸合成酵素，アコニット酸ヒドラターゼ，cis-アコニット酸デカルボキシラーゼ等と相同性のある酵素遺伝子が C. subvermispora のゲノム上に存在するかどうかを BLAST 解析等で検索した．その結果，合計 10 個の候補となる遺伝子が見つかった．その内 6 個の候補遺伝子について cDNA を取得した．また，これらの遺伝子の転写はバニリン存在下で誘導されていた．さらに，Rhodococcus
属細菌での発現を試みたところ，全て可溶化発現させることができた．現在，発現した酵素の精製及び活性の有無を確認している．
1) Gutierrez, A. et al. Appl. Environ. Microbiol. 68, 1344-1350 (2002).

Extracellular production of various single-chain variable fragments (scFvs)
using recombinant E.coli by DO-stat fed-batch culture

Screening of candidate genes involved in the biosynthesis of ceriporic acids
in a white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora○Yuichiro Sakamoto, Koichiro Ijima, Huan Li, Yoichi Kumada, Jun-Ichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)○Takahito Watanabe1, Hikari Akiyoshi1, Akito Morita1, Taiki Futagami2,
Nobutaba Kimura3, Masatoshi Goto4, Takashi Watanabe1(1RISH, Kyoto Univ., 2United. Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 3BRI.
AIST, 4Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words

Escherichia coli, fed-batch culture, scFv, DO-stat

Key words

Ceriporiopsis subvermispora, white-rot fungus, lignin, Rhodococcus

2Fa12

Monoclonal antibody production in a novel bioreactor
using high cell-density mammalian cells

2Ga02

Streptomyces achromogenes subsp. streptozoticus のゲノムおよび二次代謝の解析
山本 美也子, 中村 和音, 黒田 照夫, 森田 大地, 杉山 政則,○熊谷 孝則（広大院・医歯薬保健学）
tkuma@hiroshima-u.ac.jp○Chi-Hsien Liu, Yi-Xin Liu(Chang Gung University, Taiwan)
chl@mail.cgu.edu.tw

The successful development of a low-cost culture environment could contribute to a
reduction in the experimental variation, enhance cell productivity, and facilitatebiopharmaceuticals production using an animal cell culture. How can the compositionof the medium and culture bioprocess be adjusted to support the specific cell’smetabolism and recombinant protein production? This article uses statistical strategies
to optimize the serum-free medium and high cell-density culture. A statistical design isadopted to optimize the medium composition for the hybridoma cell in a serum-free
condition. In addition, the operation optimization of hollow fiber bioreactor (HFB) for
hybridoma growth and monoclonal antibody production has been investigated under
the serum-free condition. The operation variables such as culture temperature and the
medium circulating rate in HFB were optimized for the antibody production. Several
monitoring parameters including glucose, lactate, ammonia, conductivity, pH, redox
potential, and dissolved oxygen were related to the cell metabolism and antibody
production in the high cell-density culture. Under the mildly hypothermic condition of
36 ℃ and perfusion rate of 182.5 mL/min, the hybridoma had the maximal antibody
titer of 60.75 μg/mL. We established a facile bioreactor platform that could support thehigh-density viable cells and maintain their antibody productivity under the serum-free
condition.

【目的】 ストレプトゾトシン（STZ）は抗菌活性を保有する抗生物質であるが,最近では, 膵・消化管神経内分泌腫瘍の治療薬として使用されている．本研究では, STZ 生合成遺伝子を明らかにすることを主たる目的として, STZ 生産菌である Streptomyces achromogenes subsp. streptozoticus NBRC14001 のゲノム解析を行った．その結果, STZ 生合成に関与すると推定される遺伝子を見出すとともに, NBRC14001 株が抗真菌化合物を産生することを発見したので報告する．

Monoclonal antibody production in a novel bioreactor using high celldensity mammalian cells

Analysis of genome and secondary metabolism in Streptomyces
achromogenes subsp. streptozoticus○Chi-Hsien Liu, Yi-Xin Liu(Chang Gung University, Taiwan)

Key words

bioreactor, antibody【方法および結果】 PacBio RSII によるシークエンシング, および, アッセンブリの結果, NBRC14001 株のゲノムは線状約 8.9 Mb であることが判明した．続いて, アノテーションを行ったところ, ゲノム上には, 8,014 CDS, 88 tRNA, 18 (6 オ
ペロン) rRNA をコードする遺伝子の存在が明らかになった．BLAST P による詳細な解析の結果, STZ の N-N 結合の形成, および, メチル化に関与するのではな
いかと推測される遺伝子が近接して存在する locus を見出した．現在, 遺伝子破壊により, これらの遺伝子が STZ の生合成に関与するかを調査している．一方,
antiSMASH による解析を行ったところ, 本株にはピマリシンの生合成遺伝子クラスター（BGC）と 63%の相同性を示す BGC が存在していた．そこで, 本株菌体・培養液の抽出物について, Candida albicans を被検菌としたバイオアッセイを行った結果, 本株は抗真菌化合物を産生することが明らかになった．今後, 抗
真菌化合物の単離・精製を進めるとともに, 構造決定を行う予定である．

Miyako Yamamoto, Kazune Nakamura, Teruo Kuroda, Daichi Morita,
Masanori Sugiyama, ○Takanori Kumagai(Grad. Sch. Biomed. & Health Sci., Hiroshima Univ.)
Key words
metabolism

streptozotocin, genome analysis, genome mining, secondary

149

2Ga03

ナノポアシーケンサを用いた遺伝子組換え麹菌ゲノム上の長鎖タンデムリピート構造の解析

2Ga05

黒麹菌 Aspergillus luchuensis におけるアミラーゼ遺伝子の発現制御機構解析○橋本 渉 1, 荒井 啓 1, 水谷 治 2, 山田 修 3, 新谷 尚弘 1, 五味 勝也 1
（1東北大院・農, 2琉球大・農, 3酒総研）
katsuya.gomi.a6@tohoku.ac.jp○若井 暁 1, 荻野 千秋 2, 堤 浩子 3, 秦 洋二 3, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2神戸大院・工, 3月桂冠・総研）
wakaists@pegasus.kobe-u.ac.jp

黄麹菌 Aspergillus oryzae は酵素分泌生産能が非常に高く，古くからの発酵食品分野での利用に加えて，産業用酵素生産の分野においても有用な微生物である．
加えて，本菌に外来遺伝子を導入し，有用な遺伝子組換え体も数多く構築されている．この黄麹菌の遺伝子組換え技術の一つとして，co-transformation という手法があり，この方法ではマーカー遺伝子を載せたプラスミド DNA の他に直鎖状の DNA 断片を染色体上にマルチコピーで導入することが可能である．この技術は古くから使われてきたが，非相同末端結合が関与すること以外の分子メカニズムが明らかにされていない．
我々は，この co-transformation を用いることで黄麹菌に多くの能力を付与することに成功してきたが，ゲノム上のどの位置にどのような形で挿入されているのか明らかにできていなかった．中でも，長鎖 DNA 断片がタンデムに並んで挿入されている場合，サザンブロット解析やショートリード解析用の次世代シー
ケンサ（例えば MiSeq）を用いた解析でタンデムリピート構造や導入位置を同定することはほぼ不可能である．
今回，我々が保有する約 10 kb の鎖長を持つ三種セルラーゼ遺伝子発現カセッ
ト断片が複数挿入された黄麹菌のゲノム配列をナノポアシーケンサ MinION により解析し，この長鎖 DNA 断片が三つ以上タンデムリピートの形で導入されていることを明らかにした．これは，co-transformation 時に非相同末端結合を担う分子装置による導入断片同士の ligation 反応によると考えられる．本発表では，この長鎖 DNA 断片のタンデムリピート構造に加えて，ゲノム上での挿入位置についても言及し，MinION を用いたゲノムリシーケンス解析についてのノウハウについても紹介する．

黒麹菌 Aspergillus luchuensis は泡盛をはじめとするわが国の伝統的な焼酎醸造に用いられる産業微生物であり，非耐酸性 α-アミラーゼ遺伝子 amyA と固体培養
特異的に発現する耐酸性 α-アミラーゼ遺伝子 asaA を有している．アミラーゼ
遺伝子の発現制御機構は麹菌 Aspergillus oryzae において解析が進んでおり，ア
ミラーゼ遺伝子の発現を正に制御する転写因子 AmyR や負に制御する転写因子
CreA，マルトース資化クラスター内の転写因子 MalR などの関与が知られている．黒麹菌では麹菌とは異なるアミラーゼ生産性を示すが，その遺伝子発現制
御機構についてはほとんど解明されていない．そこで，本研究ではアミラーゼ
遺伝子を直接制御する AmyR と CreA の二つの転写因子に着目し，黒麹菌における二種類の α-アミラーゼの発現制御機構について解析を行うことで，アスペ
ルギルス属菌におけるアミラーゼ生産制御機構の多様性の解明を目的とした．
amyR，creA の破壊株において小麦ふすまを基質とした固体培養条件下で培養し，アミラーゼ活性を測定した結果，AsaA の活性は amyR 破壊株において活性が著しく減少し，creA 破壊株では活性が増加した．一方で AmyA の活性はどちらの破壊株においても大きな影響は見られなかった．さらに同条件下でノーザンブロット解析を行った結果，活性測定と同様の傾向を示したことから，AmyA
は AmyR とは別の未知の転写因子によって制御されていることが示唆された．
また，種々の炭素源を用いた液体培養では，AmyA を主体とするアミラーゼが構成的に生産されていることが示唆された．現在は麹菌において固体培養特異的に発現するグルコアミラーゼ遺伝子 glaB などを制御する転写因子として当研究室が見出した FlbC のアミラーゼ遺伝子発現への関与について解析するとともに，AmyR の細胞内局在解析や MalR ホモログの機能解析を進めている．

Analysis of long tandem repeat DNA on the genome of geneticallyengineered Aspergillus oryzae using nanopore sequence

Expression analysis of amylolytic genes in the black koji-mold Aspergillus
luchuensis

Key words

Aspergillus oryzae, MinION, genome, long tandem repeat

Key words
Aspergillus luchuensis, amylase gene, transcriptional regulator gene,transcriptional regulation

2Ga04

麹菌における環境ストレス応答性 MAP キナーゼ経路のglaB 遺伝子発現への関与

2Ga06○Satoshi Wakai1, Chiaki Ogino2, Hiroko Tsutsumi3, Yoji Hata3, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 3Res.
Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)○Wataru Hashimoto1, Hiraku Arai1, Osamu Mizutani2, Osamu Yamada3,
Takahiro Shintani1, Katsuya Gomi1(1Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 3NRIB)

ジペプチド取り込み能を有する麹菌のトランスポーターの同定○荒井 啓, 田中 瑞己, 吉村 緑, 新谷 尚弘, 五味 勝也（東北大院・農）katsuya.gomi.a6@tohoku.ac.jp○田中 瑞己 1, 伊藤 圭祐 1, 河原崎 泰昌 1, 五味 勝也 2
（1静県大・食栄, 2東北大院・農）mizuki.tanaka@u-shizuoka-ken.ac.jp

我々は, 麹菌の固体培養特異的に生産される酵素の中で, 清酒醸造において重要な酵素であるグルコアミラーゼ遺伝子 glaB の発現を制御する因子として C2H2型転写因子 FlbC を見出した．FlbC は glaB のみならず, 固体培養で発現が大幅に上昇するプロテアーゼ遺伝子や酸性カルボキシペプチダーゼの発現にも関与することを明らかにしてきた．本報告では, 固体培養での環境ストレスに着目し, 多くの生物で浸透圧ストレスへの応答として知られる HOG/MAPK 経路とFlbC を介した glaB の発現との関係について解析した結果を報告する．glaB はプレート培養上で低水分活性と菌糸成長阻害ストレスの両条件により誘導されることが知られている．どちらの条件が glaB の発現に重要であるか定量 PCRにより調べたところ, flbC の発現に関わらず glaB は両条件が揃わないと発現量が上昇しなかった．麹菌の MAPK 遺伝子 5 種類それぞれの破壊株を用いて, メ
ンブレンを敷いたプレート培養上で GlaB の生産を調べた結果, 低水分活性の条
件で ΔhogA と ΔmpkC 株において GlaB 生産の上昇が認められた．同様の条件において mpkC と flbC の二重破壊株では GlaB の生産が大幅に減少した．このことから, MpkC が FlbC を介して glaB の発現を制御していることが示唆された．
また低水分活性の条件を 50 mM の NaCl や CaCl2 を加えた条件に変更したところ，野生株では GlaB の生産が見られない一方で ΔmpkC 株において GlaB の生産が認められたことから, 高濃度の無機イオンによる環境刺激が GlaB 生産に関与していることが示唆された．また, HogA および MpkC の活性化に関与する
MAPKKK および MAPKK である sskB および pbsB を単独で破壊した株ではメンブレン上の菌糸成長阻害ストレス条件で著しい生育の悪化が観察された．興味深いことに, これらの遺伝子と flbC の二重破壊株ではその生育の悪化が回復した．

麹菌(Aspergillus oryzae)は 130 個以上のプロテアーゼ遺伝子を有しており，これらが清酒・味噌・醤油などの醸造において重要な役割を担っている．麹菌のプ
ロテアーゼ遺伝子の発現は，大豆ペプチドなどにより誘導されることが知られている．出芽酵母においては，proton-dependent oligopeptide transporter (POT) である Ptr2p によってジ・トリペプチドが取り込まれる．一方，麹菌のゲノム配列中には Ptr2p と高い相同性を有するトランスポーター遺伝子が 15 個存在する
が，いずれも機能が明らかとされていない．本研究では，麹菌においてジペプ
チド取り込み能を有するトランスポーターを同定することを目的に解析を行った．
15 個のトランスポーター遺伝子の発現を RT-PCR により調べた結果，大豆ペプ
チド存在下で強く発現している 2 遺伝子を見出した．これらのトランスポーター
遺伝子を，ヒスチジンおよびロイシン要求性を示す出芽酵母 BY4742 株を親株とした ptr2 破壊株で発現させた．His-Leu ジペプチドを添加したヒスチジンおよびロイシン欠乏培地における生育を調べた結果，いずれのトランスポーター
遺伝子を発現させた場合にも生育が回復した．そこで，これらの遺伝子を potAおよび potB とそれぞれ命名し，麹菌における発現量を定量 PCR により調べた．
その結果，Ptr2p と最も相同性の高いトランスポーター遺伝子である potA は，最小培地を用いた前培養時にはほとんど発現しておらず，大豆ペプチド添加培
地で 6 時間培養することで約 35 倍に発現量が増加した．一方，potB は前培養の時点で既に高い発現量を示したことから，構成的に発現していることが示唆された．以上の結果から，麹菌においては PotA と PotB がジペプチド取り込み能を有しており，これらは異なる発現制御機構によって遺伝子発現が制御されていることが示唆された．

Involvement of the stress-responsive MAP kinase pathway in the glaB gene
expression in Aspergillus oryzae.

Identification of Aspergillus oryzae transporters that mediate dipeptide
uptake○Hiraku Arai, Mizuki Tanaka, Midori Yohimura, Takahiro Shintani, Katsuya Gomi
(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, Solid-state culture, FlbC, glaB

○Mizuki Tanaka1, Keisuke Ito1, Yasuaki Kawarasaki1, Katsuya Gomi2(1Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, dipeptide, transporter, Saccharomyces cerevisiae

150

2Ga07

海洋性珪藻類におけるエピソーム導入型多重遺伝子改変システムの開発

2Ga09

北川 諒治, ○原田 尚志（鳥取大・工）harada@tottori-u.ac.jp

珪藻固定化酵素を利用した効率的アグマチン産生○片山 翔太, 福田 青郎, 松田 祐介, 藤原 伸介（関西学院大・理工）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp【背景と目的】海洋性珪藻類は地球全体の 25%にも達する高い一次生産能を持つことから，工業原料や医薬品原料等の生産に応用できる可能性を秘めている．
近年，微生物を利用した有用物質生産は，バイオマスを利用した循環型・環境調和型の生産技術が求められており，珪藻を含む光合成生物は，これらを両立する究極のエコファクトリーと成り得ることが期待される．珪藻類の遺伝子操作技術は飛躍的に進歩し，分子ボンバードメント法による染色体ゲノムへの遺伝子導入に基づいた遺伝子高発現化，RNAi，ゲノム編集技術が開発されてきた．本研究では，ごく最近開発された珪藻エピソームを利用した遺伝子導入法を用い，マーカーリサイクル系構築による多重遺伝子改変技術の開発を目指した．
【結果・考察】ゲノム上に接合伝達因子を持ち，且つ可動化遺伝子発現プラスミドを保持する大腸菌株を用い，接合伝達により珪藻へのエピソーム導入を行った．その結果，目的とする発現プラスミドを珪藻株に導入，保持させることに成功した．得られたクローンについてキュアリング条件の検討を行った結果，
約 20%の効率でプラスミドを保持しない株を取得した．さらに，一回目のエピ
ソーム導入時と同等の効率で，キュアリング株への再導入が可能であった．以
上の結果より本実験系は，ゲノム編集による多重遺伝子改変に有効である可能性が示唆された．そこで次に，珪藻用 TALEN ベクター構築によるゲノム編集を試みた．ウラシル合成関連遺伝子 Ptumps をターゲットとした遺伝子ノックア
ウトの結果，ウラシル要求性を示す複数のクローンを取得することができた．
現在，取得したクローンを用いて多重遺伝子改変条件を検討している．

アグマチン(Agm)は活性型アルギニン(Arg)とも称され，健康補助効果が注目されている．Agm は Arg に比べ高価であり，効率的な合成法の開発が期待されている．Arg 脱炭酸酵素は Arg から Agm の合成を触媒する酵素であり，特に超好熱菌 Thermococcus kodakarensis 由来の Arg 脱炭酸酵素（Tk-PdaD）は，100℃でも機能する (1)．本研究では本酵素を海洋性珪藻の殻に発現させ，多孔質性の固定化触媒としての利用性を検証することを目的とした．特に珪藻殻を担体として固定化することにより，酵素機能の安定化や回収・再利用が容易になると期待される．また，珪藻自体が炭酸固定を行いながら自己増殖するため，環境に対する負荷も低いと考えられる．本研究では海洋性珪藻 Thalassiosira pseudonanaに注目し，Tk-PdaD を silaffin と共発現，固定化を試みた．
まず珪藻のシリカ被殻表層に Tk-PdaD を発現させるためのプラスミド pSil-TkpdaD-Flagtag を作製し，パーティクルガンによる珪藻の形質転換を行った．形
質転換により得られた候補株のうち，4 株について生育特性解析を行ったが，野生型と比較して顕著な差は見られず良好な増殖を示した．次に増殖した珪藻を 80℃で処理し，完全に死滅させたのち，Arg 脱炭酸活性（Agm 合成活性）の測定を行った．その結果，形質転換体 4 株中 No.4，No.8，No.21 の 3 株において Agm の合成活性が確認された．このときそれぞれの形質転換体において合成される Agm 量に差が見られ，特に No.21 で大きな活性が確認された．活性の差はシリカ被殻表層に存在する酵素量や酵素の固定化状態に起因していると考えられる．また酵素活性検出された No.21 珪藻殻を回収し，洗浄後，再度 Agm 合成反応を行ったところ，良好な Agm 合成活性が確認された．現在，珪藻殻固定化酵素の安定性，再利用性の評価を行なっている．
(1) Fukuda et al., FEMS Lett., 287, 113-120 (2008)

Development of multigene engineering system by episome transfer in marine
diatoms

Efficient production of agmatine by using enzyme immobilized on diatom
surface.

Ryoji Kitagawa, ○Hisashi Harada(Fac. Eng., Tottori Univ.)○Shota Katayama, Wakao Fukuda, Yusuke Matsuda, Shinsuke Fujiwara(Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ.)

Key words

marine microalgae, genome engineering

Key words
Thermococcus kodakarensis, Thalassiosira pseudonana, agmatine,
immobilization

2Ga08

珪藻殻への有用タンパク質提示発現による機能性材料
開発

2Ga10

○大西 菜月 1, 中島 健介 2, 辻 敬典 1, 松田 祐介 1
（1関西学院大・理工, 2バイオパレット）
yusuke@kwansei.ac.jp

オオミジンコを用いた GAL4 ツーハイブリッドシステ
ムによる内分泌撹乱物質検出法の開発○加藤 泰彦, 山崎 勇人, 松浦 友亮, 渡邉 肇
（阪大院・工）watanabe@bio.eng.osaka-u.ac.jp

珪藻はナノメートルオーダーまで微細化されたフラクタルな幾何学構造の被殻(frustule) を，二酸化ケイ素の自己組織化によって作り出す生物である．この被殻形成因子に，silica affinity protein (Silaffin) ペプチドがあり，任意のタンパク質に付加することで，人為的に所望するタンパク質を温和な条件下で被殻に提示発現が可能である．本研究では，海洋性珪藻 Thalassiosira pseudonana の被殻形成機構を利用し，抗菌作用を有する Protamine を被殻に提示発現させ，固定化酵素の物理化学的性質を調べることを目的とした．
protamine 遺伝子を T. pseudonana 由来の Silaffin の被殻への移行シグナル直下に連結したベクター (TpSil3::flag::protamine)，及び緑色蛍光タンパク質遺伝子(egfp) を protamine 遺伝子の 5’ 末端或いは 3’ 末端に連結したベクター (各々TpSil3::flag::egfp::protamine ； TpSil3::flag::protamine::egfp) を作製し，野生型 T.
pseudonana に 導 入 し た ． GFP 標 識 し た Protamine の 局 在 解 析 の 結 果 ，TpSil3:FLAG:Protamine:EGFP は細胞質に，TpSil3:FLAG:EGFP:Protamine は被殻に局在していた．よって，移行シグナルと極端な正電荷を帯びた Protamine の距離が被殻移行に重要であることが示唆された．また，各 Protamine 発現株の抗菌活性は確認できなかった．これは，ケイ酸固体への提示発現による Protamineの不活性化或いは Protamine の発現量が低い可能性が考えられた．現在，固定化酵素の発現量解析及び，安定性の評価を行っている．

【背景と目的】 内分泌撹乱物質はホルモン受容体に結合し，転写を調節するコ
ファクターと受容体の相互作用を引き起こすことで，ホルモン依存的な遺伝子発現を撹乱する．この作用機構を利用して内分泌撹乱物質を検出する方法に，
タンパク質-タンパク質間相互作用をレポーター遺伝子の発現を指標として検出する GAL4 ツーハイブリッドシステムがある．これまでに本システムを導入した培養細胞や遺伝子組み換え魚類が作出され，内分泌撹乱作用を持つ化学物質の in vivo スクリーニングに用いられてきた．オオミジンコは，長い間化学物質の毒性試験に用いられ，サイズが小さい，飼育が容易，世代時間が短いなど，試験のコスト，スループットの両面で優れている．しかしながらこれまでヒトの遺伝子を導入し，内分泌撹乱物質を検出するシステムは開発されていない．
そこで本研究では，オオミジンコにヒト核内受容体，コファクター，レポーター
遺伝子を導入し，GAL4 ツーハイブリッドシステムにより内分泌撹乱物質を検出可能か調べることを目的とした．
【方法と結果】 プロモーターに GAL4 が結合する UAS を 5 つ有する eGFP 発現
プラスミドを構築した．このプラスミドに CRISPR/Cas の切断部位を導入後，Cas9 タンパク質，ガイド RNA と共に卵に注入し，プラスミドがゲノムに導入された UAS-GFP 系統を作出した．エストロゲンを検出するために，GAL4 のDNA 結合ドメインとヒトエストゲン受容体（hER）のリガンド結合ドメインを融合した GAL4-hER，コファクター NCoA2 と VP16 の転写活性化ドメインを融合した VP16-NCoA2 の両タンパク質をバイシストロニックに発現するプラスミ
ドを構築した．そして UAS-GFP 系統に注入し合成エストロゲンであるジエチ
ルスチルベストロールを曝露すると胚が緑色蛍光を発した．

Development of functional material by expressing useful proteins tofrustules of a marine diatom.

Establishment of the GAL4 two-hybrid system in Daphnia magna for
detecting endocrine disrupting chemicals○Natsuki Onishi1, Kensuke Nakajima2, Yoshinori Tsuji1, Yusuke Matsuda1(1Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Bio Palette Co., Ltd.)Key words

diatom, silica, protamine, immobilization○Yasuhiko Kato, Yuuto Yamazaki, Tomoaki Matsuura, Hajime Watanabe(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
Two-Hybrid System, Daphnia magna, genome integration, endocrine
disrupting chemicals

151

2Ga11

野生型及びキメラ蛍光タンパク質を用いた蛍光色を決定する配列の解析2Ha01○鈴木 寛人 1, 星田 尚司 1,2,3, 赤田 倫治 1,2,3（1山口大院・創成科学・化学系, 2山口大・中高温セ, 3山口大・
生命医工セ）
i032vf@yamaguchi-u.ac.jp

竹粉の田面施用が土壌の細菌叢と窒素固定活性に及ぼす影響○前田 勇, 嵐田 遥, 飯郷 雅之, 平井 英明（宇都宮大・農）i-maeda@cc.utsunomiya-u.ac.jp[目的] 蛍光タンパク質は生細胞で目的タンパク質を観察するために不可欠なツールである．蛍光タンパク質の発色団やその周辺の配列に変異を加えることにより蛍光色が変わることから様々な蛍光タンパク質が作られている．このことか
ら，変異アミノ酸と蛍光色との相関性が示唆される．変異体の多くは Aequorea
victoria の GFP などを基本としているが野生型の蛍光タンパク質はあまり用いられていない．そこで，自然界に存在する赤色蛍光タンパク質と相同性を持つ遺伝子では何色を示すのかを調べた．さらにそれらを組み合わせることによって蛍光色を決定する仕組みの解析を試みた．
[方法と結果] サンゴ Acropora millepora (Am と略す)，Echinopora forskaliana(Ef)，Monstastraea cavernosa (Mc)やイソギンチャク Corynactis california (Cc)，
Entacmaea quadricolor (Eq)のゲノムには赤色蛍光タンパク質(EmRFP)と相同性の高いタンパク質が存在した．これらのアミノ酸配列から大腸菌コドンに最適化した DNA 配列を設計し，eAmRFP(e は大腸菌コドン)のように名付けた．各DNA 配列を 60 塩基程度のオリゴ DNA として合成し，ベクタープラスミドと
混 合 し て 酵 母 Saccharomyces cerevisiae に 導 入 し ， 遺 伝 子 を 全 合 成 し た ．
eAmRFP，eEqRFP はピンク色，eEfRFP は赤色のコロニーとなり，eCcRFP，
eMcRFP はコロニーがそれぞれオレンジと黄色となった．RFP と相同性の高い配列であるが，赤色を示さなかったので相同性で蛍光色が決まらないことが示された．次に，赤色を示す eEmRFP と eAmRFP の相同性を利用してキメラタン
パク質を発現させると，特定の領域で組換えを行った場合のみ蛍光を示した．
これらの蛍光は RFP よりも GFP の蛍光が強かったことから，赤色の配列の組
み合わせから別の色を作れることが示された．以上より，蛍光色はタンパク質
全体の構造が関与していることが示唆される．

窒素ガスをアンモニアに変換する生物学的窒素固定反応は，特定の細菌種により行われる．しかしながら，窒素固定が持続するためには細菌に炭素源が供給され窒素固定反応を支えるエネルギーが生成され続ける必要がある．非共生型
窒素固定細菌は，特定植物種との共生関係に依存することなく植物体への窒素源供給が可能である．このような利点を持つ非共生型窒素固定細菌による土壌中の窒素固定活性を高めるために，高 C/N 資材である竹粉施用による耕作地土壌への炭素源の人為的供給を検討した．大学附属農場の水田にて化学肥料施用
区と竹粉・牛糞堆肥施用区を設定し，収穫後の秋耕前に土壌試料の採取を行った．なお，土壌は黒ぼく土を使用した．土壌の窒素固定活性の測定では，アセチレン還元法にて生成したエチレンを GC-FID で定量することで土壌試料のニ
トロゲナーゼ活性を測定した．その結果，化学肥料施用土壌に比べて竹粉・牛糞堆肥施用土壌で高いニトロゲナーゼ活性が認められた．また，非共生型窒素固定細菌の単離用平板培地にて土壌から回収した細菌を培養したところ，化学
肥料施用土壌と比較し竹粉・牛糞堆肥施用土壌においてより多くのコロニーが形成された．これらの結果は，竹粉・牛糞堆肥施用により土壌細菌への炭素源供給が向上し，窒素固定細菌数に関して土壌中生菌数が増加したことを示唆するものである．また，土壌から抽出した DNA を鋳型として 16S rRNA 遺伝子の部分配列を PCR で増幅しアンプリコンシーケンス解析を行うことで土壌の菌叢解析を行った．その結果，化学肥料施用土壌と比較し竹粉・牛糞堆肥施用土壌
では菌叢の偏りが認められ特定の細菌に数が集約化する傾向が認められた．このことから，竹粉・牛糞堆肥施用により土壌菌叢形成においてより高い選択圧がかかったことが示唆された．

Gene synthesis and analysis of wild-type and chimeric fluorescent proteinsin Saccharomyces cerevisiae.

Effects of application of bamboo powder to paddy field on bacterial floraand nitrogen fixation activity in soil

○Hiroto suzuki1, Hisashi Hoshida1,2,3, Rinnji Akada1,2,3(1Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Sci. Tech. Innov., YamaguchiUniv., 2YURC-TMR.,
3
YUBEC.)○Isamu Maeda, Haruka Arashida, Masayuki Iigo, Hideaki Hirai(Fac. Agric., Utsunomiya Univ.)

Key words

fluorescent protein, Saccharomyces cerevisiae, RFP, GFP

Key words

nitrogen fixation, soil bacteria

2Ga12

耐熱性 D1/D2 ヘテロダイマーをシアノバクテリア光化
学系 II 複合体に組み込むための D1 ポリペプチド C 末
端プロセシングの最適化

2Ha02

好塩性細菌 Halomonas elongata を用いた高塩廃バイオマス由来の炭素源及び窒素源からの GABA 生産システ
ムの開発○仲山 英樹, 鄒 子燕, 小川 純平（長崎大院・水産環境）
nakayamah@nagasaki-u.ac.jp

塩屋 健一, 鶴田 開生, 原口 典久, 中山 泰宗, 長濱 一弘,○松岡 正佳（崇城大・生物生命）
matsuoka@bio.sojo-u.ac.jp【目的】D1/D2 ヘテロダイマーは光化学系 II(PSII)複合体の中心に位置し，水からプラストキノンへの電子伝達を触媒する．私達は好熱性シアノバクテリア由来の D1/D2 ヘテロダイマーを発現する中温性シアノバクテリア Synechococcus
elongatus PCC7942 の組換え体を作成し，その PSII 複合体から熱安定性の差を利用して D1/D2 ヘテロダイマーを精製する目的で実験を行ってきた．その過程で耐熱性 D1 タンパク質の C 末端が中温性宿主内でプロセシングされないために速やかに分解されることが推定された．ここでは耐熱性 D1 タンパク質の C
末端プロセシングが可能となるように最適化を行った．
【 方 法 お よ び 結 果 】 S. elongatus PCC7942 の 最 も 発 現 し て い る
psbA1(D1),psbD1(D2)遺伝子を Thermosynechococcus vulcanus 由来の遺伝子で置換した組み換え株 GRPS971 では，耐熱性 D2 タンパク質は PSII 複合体に組み込まれていたが，耐熱性 D1 タンパク質は前駆体がチラコイド膜にわずかに検出された以外，分解を受けていた．これは D1 の C 末端 16 アミノ酸配列の差が原因と考えられた．そこで T. vulcanus 由来の D1 プロセシングプロテアーゼをコードする ctpA 遺伝子をシャトルベクターにクローン化し，GRPS971 株に導入した結果，28℃では耐熱性 D1 の発現は見られず，高温では組換え体は生育しなかった．CtpA の導入はストレスを与えることが分かったので，耐熱性 D1の C 末端 16 アミノ酸配列を中温性 D1 の配列に置換した組換え体を作成し，宿主自体のもつ CtpA によるプロセシングを可能とした系での耐熱性 D1 の成熟とPSII への組み込みを試みている．

【目的】 本研究では，塩分を多く含む醤油搾りかすや，バイオティゼールの副産物グリセリン，及び畜産排水などの高塩廃バイオマス由来の炭素源並びに窒素源の利活用技術の開発を目標とし，中度好塩性細菌 Halomonas elongata を細胞工場とした高効率 GABA 生産システムの開発を目的とした．
【方法】 H. elongata OUT30018 株ゲノム上のエクトイン(Ect)生合成オペロン(ectABC)を欠失させた H. elongata KA1 株を親株とし，高塩ストレス条件下での馴化培養による自然突然変異により，Ect を蓄積しない代わりに，L-グルタミン酸（Glu）を適合溶質として高濃度蓄積する突然変異株 H. elongata GOP（Glutamate Over Producing）株を取得した．さらに本研究では，広範囲の pH 条
件下で活性を示す変異型グルタミン酸脱炭酸酵素を生産させるため，H. elongata
発現用にコドンを最適化した人工遺伝子(HeGadBmut)を設計した．そして，GOP
株に HeGadBmut 遺伝子を導入した組換え H. elongata GABA 株を創製した．
【結果と考察】 3-12％ NaCl の様々な塩濃度条件下で培養試験を行った結果，8%
NaCl 条件下で GOP 株は塩感受性を示すのに対し，GABA 株では GABA が denovo 合成されると同時に塩感受性が抑制された．本結果により，適合溶質として Glu を細胞内に高濃度蓄積する GOP 株では，酸性アミノ酸である Glu の蓄積量増加による酸ストレスのため，6% NaCl を超える条件下では細胞内の浸透圧調節に必要な量の Glu を蓄積できずに塩感受性を示すと推察された．一方，
GABA 株は Glu を GABA に変換して細胞内を中和できるため，細胞内に GABA
を浸透圧調節物質として高濃度蓄積し，高 NaCl 濃度条件下での塩感受性が抑制されたと考えられる．
【展望】今後は，高塩廃バイオマスを原料として生産した GABA を家畜用飼料
添加剤などに再資源化することにより，循環型社会の創成に資する環境バイオ技術の開発を目指す．

Optimization of C-terminal processing of D1 polypeptide for assembling
thermostable D1/D2 heterodimer into the cyanobacterial photosystem II
complex

Development of GABA production system from salty waste-biomass-derived
carbon and nitrogen sources using the moderately halophilic eubacterium,

Ken-ichi Shioya, Kaisei Tsuruda, Norihisa Haraguchi, Yasumune Nakayama,Kazuhiro Nagahama, ○Masayoshi Matsuoka(Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)
Key words

photosystem II, thermostability, protein expression, cyanobacteria

Halomonas elongata○Hideki Nakayama, Ziyan Zou, Junpei Ogawa(Grad. Sch. Fish. Environ. Sci., Nagasaki Univ.)

Key words

GABA, Halomonas elongata, biosynthesis, L-glutamate

152

2Ha03

リグニン由来フェノール類を唯一の炭素源とした cis,cisムコン酸生産の効率化に関わる培養要素の同定

2Ha05○杉田 晴佳 1,3, 栗本 祐樹 1,3, 上村 直史 2,3, 政井 英司 2,3,
園木 和典 1,3
（1弘前大院・農生, 2長岡技大・生物, 3JST-ALCA）
sonoki@hirosaki-u.ac.jp

高濃度バニリンによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳される新規酵母遺伝子 VFH1 の解析とそのプロモーターの活用
Nguyen Trinh, ○井沢 真吾（京工繊大院・工芸科学）
thioredoxin@kit.ac.jp【目的】我々はこれまでに，Pseudomonas putida KT2440 株がリグニン由来のフェノール類を炭素源として増殖できる性質を利用して，バイオ生産の炭素源として多用される糖質を用いることなく，針葉樹を化学処理して得られるリグニン
由来フェノール類だけを炭素源として，多様なポリマー原料へと展開できる基幹化合物である cis,cis-ムコン酸 (ccMA) を生産できる微生物株の作出に取り組んできた 1)．本検討では ccMA 収率を向上させる培養要素の同定に取り組んだ．
【方法と結果】ccMA 収率の向上には，プロトカテク酸 (PCA) を 3-carboxymuconic
acid へと変換する酸化的な PCA 3,4-dioxygenase (PcaHG) 反応を抑制して増殖やエネルギー源への PCA の分配を減らし，非酸化的な PCA decarboxylase (AroY)反応による PCA の catechol への変換を経て ccMA へと分配できる方法を明らかにすることが必要である．pcaHG と ccMA cycloisomerase 遺伝子を欠損させ，同一プロモーター配列の制御下に aroY と pcaHG を連結したプラスミドを導入した P. putida KT2440 株の組換え体を用いた休止菌体反応から，PCA からのccMA 収率には溶存酸素濃度 (DO) または通気量が影響することが示唆された．
そこでミニジャーファーメンターを用いて DO と通気量の ccMA 収率に対する効果を評価した．その結果，DO を 0.38―0.75 ppm O2 に制御することで，リグ
ニン由来のフェノール類モデル (バニリン酸と p-ヒドロキシ安息香酸の混合物)
から 30 wt%以上の収率で ccMA を生産できることを明らかにした．この収率はグルコースを唯一の炭素源とした ccMA 生産と同等以上であった．
本研究は JST 戦略的創造研究推進事業先端的低炭素化技術開発 (ALCA) の支援を受けて実施した．
1)
園木ら, 第 69 回日本生物工学会大会 (2017) .

リグノセルロース系バイオマスの糖化前処理で副産物として生じるバニリンやフルフラール，5-hydroxymethylfurfural (HMF)は，酵母の生育や翻訳を抑制する
発酵阻害物質である．我々はこれまでに，高濃度バニリンによる翻訳抑制下でも優先的に翻訳され，発現が誘導される遺伝子として ADH7 と BDH2 を，また，高濃度エタノールによる翻訳抑制下で優先的に翻訳される遺伝子として
BTN2 を同定している．興味深いことに，このような優先的翻訳は mRNA の配列ではなく，プロモーターの DNA 配列に依存したものである．そのため，ADH7のプロモーターを用いることで，任意の遺伝子の発現を高濃度バニリン存在下でも誘導することが可能である．今回，高濃度バニリン存在下で優先的に翻訳される他の遺伝子を探索し，新たに VFH1 (YLL056C)を同定した．VFH1 の発現は，高濃度のバニリンやフルフラールによる翻訳抑制下で転写が活性化されるとともに，ADH7 や BDH2 よりも高い効率で優先的に翻訳された．一方，熱ショックや過酸化水素，酢酸などでは VFH1 の発現は誘導されなかった．また，
VFH1 プロモーターを使うことで VFH1 以外の遺伝子の発現を発酵阻害物質存在下で誘導することが可能であり，アルデヒド脱水素酵素をコードする ALD6の発現を誘導することで発酵阻害物質に対する耐性が改善された．単なる ALD6の構成的な過剰発現では非ストレス条件下の生育を抑制してしまうが，VFH1
プロモーターを用いた場合には高濃度の発酵阻害物質が存在する時にのみ転写・翻訳が活性化されるため，発酵阻害物質を解毒したのちに不必要な負担を酵母細胞にかけずにすむ利点があると考えられた．

Effective factors on sugar-free cis,cis-muconic acid production from ligninrelated phenols.

The VFH1 (YLL056C) promoter is vanillin-inducible and enables mRNAtranslation despite pronounced translation repression caused by severe
vanillin stress in Saccharomyces cerevisiae○Haruka Sugita1,3, Yuki Kurimoto1,3, Naofumi Kamimura2,3, Eiji Masai2,3,Tomonori Sonoki1,3(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Hirosaki Univ., 2Dept. Bioeng., Nagaoka Univ. Tech.,3
JST-ALCA)

Trinh Nguyen, ○Shingo Izawa(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

cis, cis-muconic acid, Pseudomonas putida, lignin, bio-based monomer

Key words

yeast, vanillin, furfural, bioethanol

2Ha04

燻炭が Bacillus 属細菌 IA 株の生育を促進するメカニズ
ムの解明 32Ha06

廃菌床由来バイオエタノールの発酵生産○江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工・生物工）
ebe.microbiotech@gmail.com○小林 洋介 1, 藤森 一浩 2, 西島 拓人 1, 杉本 直久 1, 藤野 尚人 1,
今井 史規 3, 金松 雅俊 3, 山田 憲治 3, 荒井 進 3, 吉田 浩爾 1,
佐賀 清崇 1, 泉 可也 1
（1Biomaterial in Tokyo, 2産総研・生物プロセス, 3三友プラント
サービス）
kobayashi.y@biomt.onmicrosoft.com

イネの籾殻を焼成することで作られる燻炭は，作物の収量増加をもたらす土壌改良材として利用されてきた．我々は燻炭の役割が土壌の改良だけでなく，土壌中に存在する植物生長に関わる有用微生物の増殖を促進しているのではないかと考えた．そこでこれまでの研究において燻炭存在下で増殖が促進される有用微生物の探索を行い，燻炭を添加した寒天培地上で増殖が促進される微生物
Bacillus 属細菌 IA 株の単離に成功した．さらに燻炭を IA 株の液体培養に添加することで増殖・胞子化・抗生物質生産を促進することを見出した．本研究では燻炭が IA 株の増殖を促進するメカニズムの解明を目的とした．
イネはケイ酸を取り込み植物体内で二酸化ケイ素として蓄積する．そのため焼成後の燻炭の構成成分のうち約 50%を二酸化ケイ素が占める．このことから二酸化ケイ素を添加した培地を用いて IA 株の培養を行った．その結果，IA 株の増殖と胞子化は何も添加せずに培養を行ったものよりは促進されたが，燻炭を添加して培養を行った時と比較するとその促進効果は微弱であった．燻炭を蒸留水に懸濁し高温高圧処理を行うと，透き通った茶褐色を呈する水溶性成分が抽出される．この水溶性成分にも増殖促進効果が存在するか調べた．燻炭抽出液を用いて培地を調製し IA 株の培養を行った結果，二酸化ケイ素と同様に微弱な増殖促進効果が認められ，燻炭から抽出される成分が増殖促進に関わっていることが示された．そこで二酸化ケイ素と燻炭抽出液を組み合わせた培地を作製し IA 株の培養を行ったところ，燻炭を添加した時と同様の活性促進効果が認められた．以上の結果から，燻炭による IA 株の増殖促進には燻炭中に含まれる二酸化ケイ素と燻炭から抽出される成分が重要であることが示された．

【背景】食用キノコの栽培に用いられた菌床（廃菌床）は，現在，残渣として処理されているが，バイオ燃料へ転換可能な未利用バイオマスの一つである．しかし，廃菌床は糖化および発酵効率に影響する阻害物を多く含むため，その利用に関してこれまで十分な研究が進んでいなかった．また，廃菌床は他のバイオマスに比べて Xylose の含有率が高いため，高い Ethanol 収率を得るには Xylose
を Ethanol に変換可能な発酵微生物が必要不可欠である．本研究では，廃菌床から Ethanol を生産する技術の確立を目指し，糖化・発酵条件の検討を行った．
【方法・結果】
連続水蒸気爆砕装置を用いて廃菌床を爆砕し，糖化後の糖濃度が 120 g/L 以上になるように pH5.0, 50℃の条件で糖化反応を行った．この糖化液に対して，
Xylose を資化しない非組換え酵母の培養液を 1/10 量加えて発酵を試みたが，Glucose ですら資化できず，Ethanol をほとんど生産することができなかった．
その理由として，発酵期間中の pH の低下が考えられたため，発酵開始時の pHを検討したところ，pH5.5 以上では Ethanol 生産が可能であることが分かった．
しかし，変換効効率は 65%程度であった．廃菌床に含まれる Xylose からのEthanol 生産を検討するために，Xylose 代謝遺伝子が挿入された C5C6 糖同時発
酵遺伝子組換え酵母 (第 69 回日本生物工学会大会 藤森ら) を用いて発酵試験を行った．その結果，Glucose 及び Xylose のほとんどを 72 h 以内に消費し，全糖から Ethanol への変換効効率は 90%以上に到達した．本研究結果により，廃菌床はセルロース系エタノール生産に適した基質であることをはじめて明らかにした．
本研究はバイオマスエネルギー技術研究開発/セルロース系エタノール生産シス
テム総合開発実証事業/パルプを用いた水蒸気爆砕法によるバイオエタノール生産に関する技術開発および事業性評価(NEDO) による成果である．

Mechanisms of growth enhancement of Bacillus sp. IA in the presence ofrice husk biochar 3

Ethanol production from waste mushroom bed biomass○Shohei Ebe, Tatsuya Ohike, Masahiro Okanami, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kindai Univ.)

Key words
enhancement

Bacillus, rice husk biochar, silicon dioxide, bacterial growth○Yosuke Kobayashi1, Kazuhiro E. Fujimori2, Hiroto Nishijima1,
Naohisa Sugimoto1, Naoto Fujino1, Fuminori Imai3, Masatoshi Kanematsu3,
Kenji Yamada3, Susumu Arai3, Kouji Yoshida1, Kiyotaka Saga1, Yoshiya Izumi1(1Biomaterial in Tokyo Co., Ltd., 2BRI. AIST, 3Sanyu Plant Service Co., Ltd.)Key words
Saccharomyces cerevisiae, ethanol production, fermentation,saccharification

153

2Ha07

ミミズが土壌微生物燃料電池に及ぼす効果○雪本 寛, 江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工）
tano@waka.kindai.ac.jp

2Ha09

種々の遺伝子改変の組み合わせが微生物燃料電池の出力に与える影響○川口 太一 1, 菊池 亮太 1, 駒 大輔 2, 大本 貴士 2, 尾島 由紘 1,
東 雅之 1（1阪市大院・工, 2阪技術研）
azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

近年，石油，石炭などの化石燃料を用いた発電は CO2 排出により地球温暖化を促進するため，再生可能であり持続可能な発電が注目を集めている．微生物燃料電池（microbial fuel cell; MFC）は微生物が有機物を分解した際に生じる還元力を電子として取り出すことで発電できる再生可能かつ持続可能な発電装置である．その MFC の一つに土壌と電極だけで発電することができる土壌型微生物燃料電池（soil MFC; SMFC）がある．SMFC は液体培地や培養液を用いた
MFC とは異なり，陽イオン交換膜を必要とせず，土壌中にアノードを，土壌表面上にカソードを設置するだけで作製することができる．しかし，SMFC には獲得できる電力が低いといった問題がある．その問題の解決のために，土壌中に炭素粉末を混ぜ込むこと，電極素材や設置距離の最適化など SMFC の構成や素材などの検討による電力の向上が報告されている．我々は土壌には本来土壌動物と微生物の共生関係があり，土壌生態系があることに着目した．土壌動物の中でも特に環形動物であるミミズは昔から良い土の指標とされており大地の腸，自然の鍬と呼ばれ，微生物活性を促進することで植物リターの分解などに貢献している．さらに，ミミズを加えることで植物の生長を促進することや，
ミミズ由来の微生物から植物病原菌を抑制する微生物が得られたといった報告もある．これらのことから，我々は SMFC にミミズを加えることで，土壌の肥沃度や微生物活性が高まるなどの土壌改良が行われ，それが SMFC の性能向上につながるのではないかと考え実験を行った．その結果ミミズを SMFC に加えると得られる電圧が上昇した．さらに，ミミズを加えた SMFC の性能を測定したところ，Control と比べて最大電力密度は 800％上昇し，内部抵抗は 90％の減少が認められた．

有機物の分解により生じた電子を利用する微生物燃料電池（MFC）は，再生可
能なバイオマスを原料に電気エネルギーを生み出す技術である．バイオマスが豊富でインフラが未整備な地域における電源の 1 つとしてその応用が期待されるが，その出力はまだ低く，改善が求められている．我々は触媒に大腸菌を用
い，遺伝子改変と出力や燃費（クーロン効率）の関係から触媒能の改善を進めてきた．本研究では，2017 年度の本大会で報告した内容をベースに，出力やクーロン効率の上昇に有効と考えられる遺伝子改変を組み合わせ，さらなる改善を進めた．
燃料はグルコースとし，各電極液量が 7.5 mL の 2 槽型セルを用いた．出力は18 時間の電流と電圧の測定から評価し，燃費（クーロン効率）は負極槽のグル
コース消費の測定から評価した．また，ピルビン酸等の代謝産物量を測定し，代謝の変化を評価した．触媒については，染色体上で遺伝子改変を行い，それらを組み合わせた大腸菌を構築した．具体的には，TCA サイクルで多くの NADHを得ることが重要と考え，TCA サイクルに関わるフマル酸還元酵素遺伝子(frdA)やピルビン酸デヒドロゲナーゼのリプレッサー遺伝子(pdhR)，解糖系から乳酸，
酢酸，アセトアルデヒド合成への分岐反応に関与する遺伝子(ldhA，pta，adhE)の欠損を重ねた 5 重欠損株を作製した．本株では，18 時間の総出力は野生株に比べ 1.5 倍，クーロン効率は 2.5 倍まで改善された．しかし，本株ではピルビン酸の蓄積が見られることから，この株をベースに改変を重ね，さらなる改善を進めている．また，電子伝達系および細胞表層での電子伝達に関する検討も進めており，これらの遺伝子改変の組み合わせが触媒能力に与える影響を報告
する．

Effect of earthworm on the performance of soil microbial fuel cell

Effects of combinations of various genetic modifications on the power ofmicrobial fuel cells using Escherichia coli

○Hiroshi Yukimoto, Shohei Ebe, Tatsuya Ohike, Masahiro Okanami, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kindai Univ.)

Key words

2Ha08○Taichi Kawaguchi1, Ryouta Kikuchi1, Daisuke Koma2, Takashi Ohmoto2,
Yoshihiro Ojima1, Masayuki Azuma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ., 2Osaka Research Institute of Industrial Scienceand Technology)

microbial fuel cell, soil ecosystem, earthworm, generate electricity

Key words

microbial fuel cell, MFC, metabolism, Escherichia coli

微生物発電に伴う有用物質生産の試み

2Ha10

Desulfovibrio 属細菌由来の蓄電性バイオミネラルの特性に寄与する関連遺伝子の比較解析○福本 悠地, 雪本 寛, 江邉 正平, 大池 達矢, 岡南 政宏, 阿野 貴司（近畿大院・生物理工・生物工）
tano@waka.kindai.ac.jp○工藤 優輝 1, 安藤 翔太 1, 分部 友紀 2, 安池 一貴 2, 田代 陽介 1,3,
二又 裕之 1,3,4（1静大院・総科技, 2静大・工, 3静大創造大学院, 4静大・グリーン研）
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp

微生物燃料電池（Microbial Fuel Cell：MFC）は，微生物が有機物を分解する際に生じる電子を電極で回収する事で電力生産を行う装置である．Geobacter 属，Shewanella 属細菌をはじめ多くの微生物が土壌から単離され，MFC に利用できる事が報告されている．
そこで，土壌中に広く分布している根菌微生物である Bacillus subtilis に着目した．B. subtilis は 2009 年に MFC を用いた電力生産が報告されており，胞子，バ
イオフィルムを形成する事で，生育に不利な環境に耐性があると報告されている．また，B. subtilis は植物病原菌に対する抗真菌活性物質を生産する事が示されている．本研究では，B. subtilis のバイオフィルム形成による環境ストレスに対する耐久性を活かし，高濃度な培地での生育を検討した．高濃度培地条件での生育は培養スペースを抑え，コンタミネーションのリスクも下げる事が期待できる．本研究では，MFC を用いた B. subtilis における電力生産と抗真菌活性物質生産を同時に行う事を試みた．
Polypepton-S 濃度が 10%，20%，30%，40%，50%の溶液を培地に用いた．菌株には，研究室保有株 Bacillus subtilis RB14 株を用いて，各濃度におけるバイオフィルムの重量の比較とバイオフィルム及び培養液を用いた抗真菌活性試験を行った．次に，B. subtilis RB14 株を植菌した一槽式の MFC の電圧値，抗真菌活性試験の経時変化を測定した．その結果，B. subtilis RB14 株は電力生産と抗真菌活性物質生産を同時に行う事が示された．また，培地濃度に応じてバイオフィルム重量に差が認められた．これ等の性質を利用し，さらなる抗真菌活性物質生産量の増加を目的として検討中である．

グリーンエネルギーの生産および貯蔵は低炭素社会に向けて必須の技術であり,多面的な取り組みが必要不可欠である．当研究室では, 微生物燃料電池から分離した Desulfovibrio sp. HK-II 株および HK-IV 株が, Fe3+存在および硫酸呼吸時において, 蓄電ミネラル（Mackinawite）を生産することを明らかにした．両菌株は系統学的に極めて近縁であるにも関わらず, HK-IV 株の蓄電鉱物の充放電容
量は HK-II 株の約 2 倍であった．そこで本研究では, 蓄電能の違いを生み出す微生物の特性を明らかにすることを目的としてゲノム比較を実施した．
HK-II 株および HK-IV 株のゲノムサイズはそれぞれ, 3.92 Mbp および 3.97 Mbp
であり, Average Nucleotide Identity （ANI） 解析の結果, ゲノム間の相同性は99.91％であった．微生物由来の Mackinawite は数日掛けて生成されるのに対し,化学合成では一瞬にして生成され形態および充放電容量も異なった．そのため,蓄電ミネラル生成速度が影響していると推察し, まず硫酸還元に関わる代謝プロセスを遺伝的に特定した．その結果, 両菌株とも電子伝達鎖, 硫酸還元経路, 亜硫
酸還元経路と既存の硫酸還元プロセスを有していた．遺伝子 sat, aprAB, qmoABC,
dsrAB, tplc3, qrcABCD, dsrMKJOP とそれらの周辺領域, さらに制御タンパク遺伝子 rex が 100％一致していた．しかし, HK-IV 株に特有の遺伝子領域が少なく
とも 4 ヶ所見出された．その内の 1 つに亜硫酸排出に関わるタンパク TauE をコードする遺伝子が見出され, ゲノム全体としては HK-II 株および HK-IV 株にそれぞれ 10 および 11 の遺伝子と多様性が確認され，硫化水素生成速度の差が影響していることが示唆された．現在, 上記関連遺伝子の発現量比較を進めている．

Production of useful substances by the microbial fuel cell of Bacillus subtilis

Characterization of rechargeable bio-mineral produced by Desulfovibrio
spp. strains and comparison of genes related to production of the mineral○Yuji Fukumoto, Hiroshi Yukimoto, Shohei Ebe, Tatsuya Ohike,
Masahiro Okanami, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kindai Univ)

Key words

Bacillus subtilis, biofilm, antibiotics, microbial fuel cell

○Yuki Kudo1, Shota Ando1, Yuki Wakebe2, kazuki Yasuike2, Yosuke Tashiro1,3,
Hiroyuki Futamata1,3,4(1Grad. Sch. Eng., Shizuoka Univ., 2Dept. Eng., Shizuoka Univ., 3Grad. Sch. Sci.
Tech., Shizuoka Univ., 4Inst. Green Sci. Tech., Shizuoka Univ.)

Key words
metabolism

Rechargeable bio-mineral, Sulfate-reducing bacteria, electron,

154

2Ha11

Desulfovibrio sp. HK-II 株の細胞外電子伝達と硫酸呼吸が及ぼす影響2Ia01

高性能な蛍光バイオセンサー構築のための抗体結合プ
ローブの開発○安藤 翔太 1, 工藤 優輝 1, 分部 友紀 2, 安池 一貴 2, 田代 陽介 1,3,
二又 裕之 1,3,4（1静大院・工, 2静大・工, 3静大・創造大学院, 4静大・グリーン研）
futamata.hiroyuki@shizuoka.ac.jp○高橋 昌樹 1, 児島 智樹 2, 北口 哲也 3, 上田 宏 3（1東工大院・生命理工, 2東大院・工・化生, 3東工大・化生研）
ueda@res.titech.ac.jp

クリーンエネルギーの効率的生産は低炭素社会構築に向けて必須の課題である．
その一つとして, 廃棄物処理とエネルギー生産を一石二鳥的に行える微生物燃料
電池（MFC）が着目されている．MFC の効率化を図る一環として, 細胞外電子授受機構の制御が必要であるが, 特定の微生物に関する知見が集積しつつ有り,
他の嫌気微生物については未解明な部分が多い．そこで本研究室では, MFC から分離した蓄電性バイオミネラルを生産する硫酸還元細菌に着目し, その細胞外電子伝達（EET）機構の解明を目的とした．
供試菌株 Desulfovibrio sp. HK-II 株を硫酸還元条件下で前培養し, 菌体を集菌洗浄後 MFC に接種した．乳酸を電子供与体, 電極を電子受容体として培養した結果, 乳酸の減少に伴い, 菌体量の増加と微弱な電流が生産され EET が確認された．SDS-PAGE の結果, 外膜に特異的なタンパクの発現が確認された．HK-II 株
は硫酸還元条件下で乳酸を酢酸に変換する不完全酸化型の代謝を行うが, MFC
では酢酸集積が確認されず代謝変換が示唆された．MFC に硫酸を添加した結果, 乳酸および硫酸の減少に伴い急激な発電量の増加と酢酸の蓄積が確認された．硫酸添加に伴う発電量の増加が細胞外電子伝達系の活性化であれば, 酢酸の蓄積は矛盾する．そこで, より厳密な解析を実施する為, 負極電位を 0 から 0.1 V
間隔で 0.5 V まで設定した条件で運転した．全ての条件下で乳酸および硫酸の消費が確認された一方, 電流生産は+0.2 V 以上で観察された．開回路条件と比較すると, 発生した H2S 量は約 40%減少しており負極を EDX 解析した結果, 硫黄の付着が確認された．その為, 硫酸添加時に生じる急激な電流生産は H2S を介した化学的反応に因ると推察された．ゲノム解析の結果, 細胞外電子伝達タン
パクをコードする遺伝子も複数確認されており, 現在これらの関与について解析を進めている．

【背景と目的】微量分子の簡便かつ正確な測定を行うための技術の一つとしてQuenchbody(Q-body)を使用した方法がある．Q-body は抗体に部位特異的に蛍光色素を修飾した免疫測定素子である．Trp 残基による蛍光の消光を利用した Qbody は迅速・簡便・高感度な測定ができるため様々な応用が期待される一方，新規抗体の Q-body 化には多くの時間と労力を要することが課題である．本研
究では，抗体結合タンパク質である Protein A および Protein G の抗体結合ドメ
インをペプチドリンカーで繋ぎ，蛍光色素を修飾した PAxPG probe を作製し，プローブ添加による抗体 Fab 断片の簡便な Q-body 化を試みた．
【実験方法】ドメイン間のリンカーとして α ヘリックス構造をとりやすい(EAAAK)4 と柔軟な (DDAKK)4 を使用した．また Protein A と色素標識部位間のリンカーとして剛直なポリプロリン(Pro)12 と柔軟な(GGGS)5 を使用した．これらの PAxPG probe を大腸菌を用いて発現精製した後，N 末端側の標識用配列(Cystag)に対し蛍光色素(Tetramethylrhodamine, TAMRA)を修飾，更に精製した．一定
濃度の PAxPG probe を各濃度の抗オステオカルシン(BGP)抗体 Fab 断片と混合し，蛍光強度を測定(Ex: 544 nm Em: 580 nm)する事でクエンチ効率を調べた．
さらに，クエンチ効率が最大となる Fab 濃度条件で各濃度の抗原ペプチド(BGPC7)を添加し，蛍光強度を測定することで脱クエンチ効率を調べた．
【結果と考察】 種々の PAxPG probe で測定した結果，最も高性能な Probe はドメイン間のリンカーとして(EAAAK)4，色素標識部位リンカーとしてポリプロリンを使用したものであり，最大クエンチ効率は 47%となった．またクエンチが最大の濃度において，抗原を加えた際の最大脱クエンチ効率は 38%となった．
Probe を構成するリンカーは剛直である方が，クエンチ状態がより安定化し高い性能を示すものと考えられた．

Effects of sulfate-reducing metabolism on the extracellular electron transfer
of Desulfovibrio sp. HK-II

Development of antibody binding probes for the construction of highperformance fluorescent biosensors○Shota Ando1, Yuki Kudo1, Yuki Wakebe2, Kazuki Yasuike2, Yosuke Tashiro1,3,
Hiroyuki Futamata1,3,4(1Grad. Sch. Eng., Shizuoka Univ., 2Dept. Eng., Shizuoka Univ., 3Grad. Sch. Sci.
Tech., Shizuoka Univ., 4Inst. Green Sci. Tech., Shizuoka Univ.)

Key words
respiration

2Ha12○Masaki Takahashi1, Tomoki Kojima2, Tetsuya Kitaguchi3, Hiroshi Ueda3(1Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech, 2Dept. Chem. Biotechnol., Univ.
Tokyo, 3Lab. Chem. Life Sci., Tokyo Tech)extracellular electron transfer, sulfate-reducing bacteria, sulfate-

Key words

biosensor, antigen, synthetic biology, fluorescence

下水汚泥のメタン発酵におけるハザードケミカルの影響

2Ia02

細胞内のアセチル化能を感知するセンサの開発○星子 裕貴, 藤江 秀斗, ムスタファ ヌルル・アシファ,
前田 憲成（九工大院・生体工）
toshi.maeda@life.kyutech.ac.jp○渡邉 荘爾, 小林 一幾, 木村 友紀, 河合 繁子, 斎藤 恭一,
梅野 太輔（千葉大院・融合）
umeno@faculty.chiba-u.jp【背景と目的】下水汚泥は，古くからメタン発酵の原料として資源化されてきたが，近年，下水処理場に流入する排水中には，病気治療や予防等で用いられる
医療系高生理活性物質や工業廃水に含まれる工業系内分泌かく乱物質が含まれているという報告がある．これらのハザードケミカルの中には，毒性と有害性を持つものを知られているため，これらの性質により，下水汚泥中の菌叢を変え，メタン発酵に影響を与える可能性があるが，その詳細な影響を調査した報告はない．そこで本研究では，これらのハザードケミカルの存在下において，下水汚泥のメタン発酵がどのような影響を受けるのかを検証することを目的とした．
【方法】，北九州市の下水処理場から採取した下水汚泥は，滅菌水により 50%にしたのち，この汚泥（3 g）を 50 mL の発酵バイアルに入れ，さらに環境汚染物
質を 50 mg/L となるように滅菌水を用いて調製した．その後，窒素ガスにて嫌気条件下にして，37℃，120 rpm，20 日間発酵処理を行い，メタンの生成量を4 日毎にガスクロマトグラフィーにて測定した．また，実験終了時に，検知管を用いて，発生した硫化水素の濃度も測定した．今回，使用した環境汚染物質
は，抗がん剤フルオロウラシルと内分泌かく乱物質ビスフェノール類（ビスフェ
ノール A，ビスフェノール F，ビスフェノール S）とした．
【結果】20 日後，ビスフェノール F においては，メタン発酵はあまり阻害されなかったが，フルオロウラシル，ビスフェノール A，ビスフェノール S の順にメタン生成が阻害されていた．一方，顕著にメタン生成が抑制されたフルオロ
ウラシルを添加した汚泥では，硫化水素濃度が増加していた．本学会では，これらのメタン生成および硫化水素生成の結果を報告すると共に，ハザードケミ
カルによるメタン生成抑制と硫化水素生成促進のメカニズムについても報告する．

【背景と目的】 タンパク質の翻訳後修飾の一つとして知られるアセチル化の大部分は，表面リジン残基とアセチルリン酸との間に起こる非酵素的反応の産物である．近年，細胞内の多くのタンパク質が非酵素的にアセチル化されること，
そのアセチル化が，酵素活性や細胞内の代謝状態を積極的に制御していることが明らかになりつつある．
本研究では，転写因子に，アセチル化依存的に機能変化を示す性質を賦与し，細胞内のアセチル化能を感知・レポートするセンサを開発することを目的とした．そこでまず，標的タンパク質へアセチル化されうるリジン残基を導入し，アセチル化依存的に機能変化を示すタンパク質の作製を試みた．
【方法】アラビノース応答性転写調節タンパク質 AraC の表面にリジン残基を複数導入した．導入個所として，AraC を構成する 292 アミノ酸のうち，表面に存在し，かつ，グルタミンに置換した場合の安定性がリジンへ置換した場合よりも顕著に安定と計算された 10 残基を選んだ．これらを全てリジン残基に置換し，その遺伝子全域に EP-PCR 法を用いてランダム変異を導入した．得られた
AraC ライブラリの中から，AraC プロモータ下流に配置した蛍光タンパク質(GFP) 遺伝子の発現量を，グルコース添加によって高めるものを選抜した．
【実験と結果】 グルコース添加に応答して蛍光強度をあげる変異体の多くは，培地に酢酸ナトリウムを添加した場合でも蛍光強度が増加した．いずれの添加
も，細胞内のアセチルリン酸レベルを高める効果を持つ．リジンのアセチル化
によって表面近傍の電荷変化が，読み出し可能な機能・構造変化を引き起こしたものと思われる．

Effect of hazardous chemicals on methane fermentation using sewage
sludge.

Evolutionary design of sensors for the cellular capacity of protein
acetylation○Yuki Hoshiko, Shuto Fujie, Nurul Asyifah Mustapha, Toshinari Maeda(Grad. Sch. Life Sci. Syst. Eng., Kyushu Inst. Technol.)Key words
communitymethane fermentation, hazardous chemical, sewage sludge, microbial○Soji Watanabe, Ikki Kobayashi, Yuki Kimura, Shigeko Kawai, Kyoichi Saito,
Daisuke Umeno(Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.)

Key words

acetylation, post-tlanslational modification, biosensor, acetylome

155

2Ia03

デノボタンパク質ナノブロック ePN-Blocks による自己集合超分子ナノ構造の創製と解析

2Ia05

Aβ のアミロイド凝集体が NLRP3 インフラマソーム活性化に及ぼす影響小林 直也 1,2, 稲野 紘一 1, 笹原 健嗣 1, 佐藤 高彰 1, 宮澤 佳甫 3,
福間 剛士 3, Hecht Michael 4, 宋 致宖 5, 村田 和義 5, ○新井 亮一 1,6（1信州大・繊維, 2自然科研機構・生命創成探究セ, 3金沢大院・
自科, 4プリンストン大・化学, 5生理研, 6信州大・菌類微生物セ）
rarai@shinshu-u.ac.jp
これまでに，ドメインスワップ二量体形成 4 本ヘリックスバンドル新規人工タ
ンパク質（デノボタンパク質）WA20 の特徴的構造を活かしたタンパク質ナノブロックを設計開発し，対称構造を幾何学的に組み合わせることで，多様な超分子ナノ構造複合体を創出してきた(Kobayashi et al., JACS, 2015)．本研究では，
WA20 をタンデムに連結した新たなタンパク質ナノブロック extender Protein
Nanobuilding Blocks (ePN-Blocks)を設計開発し，自己集合ナノ構造複合体を創製することを目的とした．2 つの WA20 ドメイン間のリンカー配列には，ヘリックスリンカー (EAAAK) 4 またはフレキシブルリンカー(GGGGS)4 を用いた．これらの人工タンパク質を大腸菌で発現，精製し，Native PAGE を行ったところ，
ラダー状のバンドパターンが見られ，自己集合により様々な会合体を形成する
ことが示唆された．これらをサイズ排除クロマトグラフィーにより分画し，多角度光散乱による分子量測定や X 線小角散乱による解析，電子顕微鏡による観察等を行ったところ，2～5 量体のホモ多量体の形成が明らかとなった．次に，
WA20 (sPN-Block)と混合して変性及びリフォールディングしたところ，2 種類のタンパク質ナノブロックを再構成したヘテロ複合体(esPN-Block)の構築に成功
し，直鎖状フォームへのダイナミックな構造変換が示唆された．さらに，このタンパク質ナノブロック複合体に金属イオンを添加して基板上で超分子ナノ構
造体を構築し，原子間力顕微鏡で観察した．以上の結果は，タンパク質ナノブ
ロックの組み合わせによる自己集合超分子ナノ構造創製に成功したことを示す成果であり，次世代タンパク質工学の一端として今後の発展も期待できる．
(Kobayashi et al., ACS Synth. Biol. 2018)

Self-assembling supramolecular nanostructures constructed from de novo
extender protein nanobuilding blocks

Naoya Kobayashi1,2, Kouichi Inano1, Kenji Sasahara1, Takaaki Sato1,
Keisuke Miyazawa3, Takeshi Fukuma3, Michael H. Hecht4, Chihong Song5,
Kazuyoshi Murata5, ○Ryoichi Arai1,6(1Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2ExCELLS, Natl. Inst. Nat. Sci., 3Grad.
Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 4Dept. Chem., Princeton Univ., 5Natl. Inst.
Physiol. Sci., 6CFMD, Shinshu Univ.)
Key words
protein engineering, supramolecular complex, nanostructure, protein
nanobuilding block

2Ia04

様々なタンパク質のアミロイド凝集形成に対するポリア
ミン由来 8 員環化合物の影響評価○中西 文香 1, 金子 直恵 2, 増本 純也 2, 座古 保 1（1愛媛大院・理工, 2愛媛大学院医学）
zako.tamotsu.us@ehime-u.ac.jp【背景と目的】
細胞内シグナル伝達複合体インフラマソームは Nod-like receptor（NLR），連結
因子 ASC，カスパーゼ 1 の 3 つのタンパク質分子で構成される．NLR の 1 種である NLRP3 はトリガー因子と相互作用することで ASC と会合し，ASC を介してカスパーゼ 1 と会合することで NLRP3 インフラマソームを形成し活性化させる．これによって，炎症性サイトカインである IL-1β の分泌を制御し，生体防御反応を働かせている一方で，IL-1β の異常制御は 2 型糖尿病などの疾患に関与していると考えられている．
また，アミロイド β（Aβ）のアミロイド凝集体（Aβ 凝集体）はアルツハイマー病の原因物質とされている．Aβ 凝集体には可溶性 Oligomer と不溶性 Fibril の2 種類が存在し，構造状態，細胞毒性などの性質が異なる．近年，Aβ Oligomer
によって活性化されたミクログリアが NLRP3 インフラマソーム活性化に関与することが報告された（Parajuli B et.al Cell Death Dis. 4, e975 (2013)）．しかし，
Aβ が NLRP3 インフラマソーム活性化に与える直接的な影響は未解明である．
そこで，本研究では Aβ 凝集体（Oligomer，Fibril）が NLRP3 インフラマソーム
活性化へ与える直接的な影響を評価することを目的とした．
【方法及び結果】
Aβ 凝集体をそれぞれ作成した後，構造状態を評価することで 2 種類のアミロイ
ド凝集体（Oligomer，Fibril）をそれぞれ作成できていることを確認した．次に，Aβ 凝集体が NLRP3，さらには NLRP3 インフラマソーム活性化に与える影
響を化学増幅型ルミネッセンス プロキシミティホモジニアスアッセイ（ALPHA）
を用いて評価した．その結果，Aβ Oligomer，Aβ Fibril 共に NLRP3 と直接相互作用し，NLRP3 インフラマソームを活性化することが示された．

The affect to NLRP3 inflammasome activation by Aβ amyloid aggregation○Ayaka Nakanishi1, Naoe Kaneko2, Junya Masumoto2, Tamotsu Zako1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Ehime Univ., 2PROS, Sch. Med., Ehime Univ.)

Key words

amyloid, inflammasome, Alzheimer's diseases, Amyloid-beta

2Ia06

耐熱性 Encapsulin ナノカプセルの内包系の構築○國富 理紗子 1, 福永 隼大 1, Pradipta Ambara R. 2, 田中 克典 2,座古 保 1（1愛媛大院・理工, 2理研）
zako.tamotsu.us@ehime-u.ac.jp○野中 衛, 松村 洋寿, 小川 信明, 尾高 雅文（秋田大院・理工）
modaka@gipc.akita-u.ac.jp【背景・目的】 多くのタンパク質が自己集合することによって，可溶性オリゴ
マーや不溶性の線維状フィブリル，いわゆるアミロイド凝集を形成することが知られている．アミロイド凝集は細胞毒性を有するため，組織に沈着することで様々な疾病が発症すると考えられている．近年，我々のグループでは，ポリアミンであるスペルミンやスペルミジンと高い細胞毒性を有する不飽和アルデヒドであるアクロレインから生成される 8 員環化合物が，アルツハイマー病の原因とされているアミロイド β40 (Aβ40) の凝集を抑制することを発見した(Tsutsui et al. Adv. Sci. (2016))．しかしながら，この 8 員環化合物が他のアミロイ
ド凝集形成タンパク質に与える影響は未だ明らかではない．本研究では，スペルミン由来 8 員環化合物 (cSPM) が Aβ 以外のアミロイド凝集形成タンパク質に与える影響を評価した．凝集タンパク質にはヒトの疾病に関係していることからアミリンおよびトランスサイレチン (TTR) 変異体 L55P を用いた．
【方法】 45 μM アミリン，15 μM TTR をそれぞれ様々な濃度の cSPM 存在下において 37℃でインキュベートしたあと，Thioflavin T (ThT) assay による評価を行った．
【結果・考察】 ThT assay の結果により，cSPM 存在下でのアミリンおよび TTRの凝集量は cSPM 非存在下のときと比較して同程度であることが示された．したがって，cSPM はアミリンおよび TTR L55P の凝集形成には影響を与えないことが示唆された．cSPM は Aβ の凝集のみを抑制することから cSPM による凝集抑制効果は Aβ 特異的である可能性が示唆された．

Encapsulin（Enc）は，粒径約 24 nm の中空ナノカプセル構造を形成するタンパク質であり，Enc 認識アミノ酸配列を有するペルオキシダーゼやフェリチン様タンパク質などを内包することで酸化ストレス耐性に関与していると考えられている．好熱性細菌 Thermotoga maritima 由来 Enc (TmEnc)の結晶構造が 2008 年に報告され，分子量約 30 kDa のサブユニットのホモ 60 量体で正二十面体構造をとることが明らかにされた．これまでに当研究室では，Enc の機能性ナノ粒子としての利用を目指し，外来タンパク質の C 末端に Enc 認識アミノ酸配列を付加することで，外来タンパク質を常温菌 Rhodococcus jostii RHA1 由来 Enc の内腔への導入に成功しており，この結果は Enc がナノケージとして高い有用性をもつことを示唆している．また，Enc の工学的な利用を目指し，好熱菌由来であり構造的な安定性が期待できる TmEnc の大腸菌発現系構築を行い，リコン
ビナント TmEnc が 90 °C の熱処理後においても，ナノカプゼル構造を維持していることを明らかにしている．
外来タンパク質の Enc 内腔への導入には，Enc 認識アミノ酸配列の付加が必要であるが，外来タンパク質が複合体を形成する場合等，立体構造上 Enc 認識ア
ミノ酸配列の付加が困難なことがある．そこで本研究は，Enc のナノカプセル
構造が，酸性 pH 条件下で単量体へした後，中性 pH で再構成できる性質を利用した Enc 認識アミノ酸配列を用いない外来タンパク質の導入法について検討した．

Influences of eight-membered polyamine-acrolein heterocycle on
aggregation of amyloidgenic proteins

Development of protein encapsulation system by hyperthermophilic
Encapsulin○Risako Kunitomi1, Jyunta Fukunaga1, Ambara R. Pradipta2, Katsunori Tanaka2,
Tamotsu Zako1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Ehime Univ., 2RIKEN)

Key words

amyloid, amyloidgenic proteins, polyamine, acrolein○Mamoru Nonaka, Hirotoshi Matsumura, Nobuaki Ogawa, Masafumi Odaka(Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ.)

Key words

encapsulation, nanocapsules, hyperthermophilic

156

2Ia07

コドン指定があいまいになった遺伝暗号表が進化を促進
させる

2Ia09

○榎本 利彦, 鮎川 翔太朗, 木賀 大介（早大・先進理工）kiga@waseda.jp

両端を β ドメインで終端した Coiled-Coil をベースとするランタニド結合タンパク質の設計○鈴木 淳巨, 北原 知恵, 堀 克敏
（名大院・工）asuzuki@chembio.nagoya-u.ac.jp

合成生物学の分野では遺伝暗号表を人為的に改変することで，様々な翻訳系を構築し，工学分野で有用性を示してきた．ここで，本研究では無細胞翻訳系と変異体 tRNA 使用することでコドンの指定があいまいになった翻訳系を構築し，この新規暗号表を用いた分子進化に関する研究結果を発表する．私たちは変異
体 tRNA を加えることによって，1 コドンに対して 2 つのアミノ酸が対応する(Thr コドンに対して Thr だけでなく Ser が挿入されることもある)ような新しい
遺伝暗号表を試験管内で構築することを行った．この翻訳系で得られるタンパ
ク質は近傍アミノ酸配列のヘテロ集団となり，活性はヘテロタンパク質集団の平均をとることになる．このような活性の平均をとる性質に由来して，本研究ではこの新規遺伝暗号表を「移動平均遺伝暗号表」と名付けた．
タンパク質の特性を向上させるためには，一般に複数の変異が必要であるが，変異蓄積の順序によっては活性が低下することがあり，進化には変異蓄積の順序の制約が生じることが知られていた．一方，本研究で構築した移動平均暗号表を使用した際の翻訳産物は類似配列を持つ変異体群の活性平均をとるため，
この制約が緩和されることが予想される．そこで実証例として，複数の変異によって耐熱性が上昇することが既知である GFP について，種々の変異の組み合わせを持つ変異体群の耐熱性を解析した．結果的に，普遍暗号表では活性が低下し使用できない変異蓄積の順序が，移動平均暗号では使用可能なことが確認できた．本実験で構築した移動平均暗号表は，今までの進化の過程において生じていた組み合わせの制約を緩和するという特徴をもつことで，普遍遺伝暗号
表よりも効率よくタンパク質を進化させることができる有用性をもっていると考えている．

【背景と目的】3 本または 4 本の α へリックスの束から成る Coiled-Coil の中心の疎水性のコアを形成するアミノ酸の一部を金属配位子となるアミノ酸に置換して，金属結合サイトを形成する研究が報告されている．窒素や硫黄を配位子とする Cu や Z ｎのような金属では，親水性が高くない Cys や His を中心コアに導入するが，荷電酸素を配位子とするランタニドでは，Coiled-Coil の安定性を大きく低下させる電荷をもったアミノ酸 Asp や Glu の導入が必要で，例えば人工ペプチドから成る Coiled-Coil の例では，金属イオン存在下でも一部は unfold
していることが報告されている．そこで，本研究では，Coiled-Coil の unfold を避けるため，Coiled-Coil の両端が β 構造ドメインで終端された天然タンパク質をベースに，ランタニドの 1 つであるテルビウム（Tb）と結合するタンパク質の設計を試みた．
【方法】グラム陰性細菌表層のタンパク質，Trimeric autotransporter adhesin（TAA）
を設計ベースに用いた．TAA は，分子中に β ドメインに挟まれた多数の平行 3
本鎖 Coiled-Coil 領域を持ち，中には Asn や Asp を Coiled-Coil の中心に持つ領域がある．これらの領域は他より安定と考え，変異を加えて，2 種類の Tb 結合
タンパク質を設計した．
【結果と考察】大腸菌で発現，精製後，CD スペクトルを測定したところ，両タ
ンパク質とも Tb の有無にかかわらず，天然タンパク質と同じ折りたたみ構造をとっていた．また，Tb イオンの解離定数は，1.3μM と 0.32μM となり，既報の人工ペプチド Coiled-Coil より 8 倍，34 倍小さかった．さらに結晶解析から，
Coiled-Coil の構造は天然型とほぼ同じだが，Tb 結合サイト付近で各 α へリック
スが約 0.5Å外側に膨らみ，金属配位として新たに導入した親水性アミノ酸とその隣の疎水性アミノ酸の間に空洞が生じるなど，今後の金属サイト設計に有用な情報が得られた．

The genetic codes with ambigous reassginment promote moleculat evolution.

Design of lanthanide binding protein based on coiled-coil terminating at
both ends with β domain○Toshihiko Enomoto, Syotaro Ayukawa, Daisuke Kiga
(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)○Atsuo Suzuki,, Chie Kitahara, Hori Katsutoshi(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

genetic code, evolution, synthetic biology

Key words
Coiled-Coil, Terbium binding protein, Trimeric autotransporter
adhesin, crystallographic study

2Ia08

遺伝子発現と共役するゲノム DNA 複製系を in vitro で
確立する

2Ia10

○酒谷 佳寛 1, 松田 史生 1, 市橋 伯一 1,2（1阪大院・情報, 2阪大院・生命機能）
ichihashi@ist.osaka-u.ac.jp

CBH 触媒モジュール高発現型人工セルロソームの設計○中澤 光 1, 石垣 友理 1, 張 鈺爽 1, 山田 浩之 2, 坪井 宏和 2,
幸田 明生 2, 梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2大関株式会社）mitsuo@tohoku.ac.jp

有用物質生産に向けた新技術として，試験管の中で既知の分子から細胞の機能を人工的に再現した「人工細胞」を構成する試みが，注目を集めている．人工細胞は，全ての構成要素が既知であるため，ブラックボックスのある天然の細胞よりデザインしやすいはずである．また，細胞毒性のある物質や，非天然ア
ミノ酸など，天然の細胞では扱えなかった物質を扱えるようになるだろう．これまでに，細胞分裂や遺伝子発現といった機能を再現した人工細胞が構築されてきたが，ゲノム DNA の複製系を持つ人工細胞は実現されていない．人工細胞が遺伝子発現に加えてゲノム DNA 複製できるようになれば，物質生産や育種の効率化につながるはずである．
本研究では，phi29DNA ポリメラーゼ遺伝子と Cre リコンビナーゼを組み合わせることで，ゲノム DNA 複製系を達成することを計画した．phi29DNA ポリメ
ラーゼは環状 DNA を鋳型として直鎖状 DNA を合成し，Cre リコンビナーゼは
直鎖状 DNA を環状 DNA へ組換える．したがって，phi29DNA ポリメラーゼ遺伝子をコードした環状ゲノム DNA を，Cre リコンビナーゼを含む無細胞転写翻訳系中で反応させれば，「遺伝子発現と共役するゲノム DNA 複製系」を構成できると考えた．ただし，Cre リコンビナーゼは phi29DNA ポリメラーゼの DNA合成反応を阻害するので，最初にこの問題を進化工学的に解決した．
我々は，phi29DNA ポリメラーゼ遺伝子をコードした DNA への変異導入と，
Cre リコンビナーゼ存在下での DNA 合成能力が高い変異体の選択を約 50 回繰り返した．すると，Cre リコンビナーゼの存在下で野生型の約 100 倍の直鎖状
DNA を合成する進化型 DNA が得られた．この進化型 DNA を，無細胞翻訳系と Cre リコンビナーゼと反応させると，環状ゲノム DNA が複製されたことを示唆する結果を得た．つまり，「遺伝子発現と共役するゲノム DNA 複製系」を確立できたと考えられる．

非可食系植物バイオマスからのバイオエタノール製造へ糖化酵素（セルラーゼ）を利用するには，糖化能力を数十倍は向上させる必要がある．我々は，一般的なセルラーゼが触媒ドメイン(CD)とセルロース結合ドメイン(CBD)からなるモジュール構造であることに着目し，セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）をモ
ジュールライブラリーとして分割調製し，それらをナノ粒子表面で 3 次元的に再編成させることによって糖化能力を十数倍向上させたハイブリットナノセル
ロソームを報告している．この人工セルロソームのコストダウンのためにはモ
ジュールライブラリーを大量生産することが望まれている．
本研究では，大腸菌にて難発現であることが報告されているセロビオハイドロ
ラーゼ（CBH）を，麹菌を宿主として g/L オーダーで発現させ，金属ナノ粒子
上にクラスター化を行った．クラスター化の方法は CBH の C 末端にポリヒス
チジンタグを融合させ，ポリヒスチジンタグと金属粒子との配位結合を利用して行った.その結果，構築した人工セルロソームは，CBH モジュールのみに比較して 2 倍程度活性が向上した．さらに 2 種のクラスター化 CBH を混合し，糖化反応における生成還元糖量を測定したところ，単独の場合に比較して還元
糖量の増加が見られ，相乗効果を示していることが観測された．このことは
CBH モジュールが粒子上で酵素の機能を十分発揮していることを示しており，
現在，メカニズムの詳細な解析を進めている．

in vitro constitution of a genomic DNA replication system with gene
expression

A design of artificial cellulosome with high expression of CBH catalytic
moduleKey words
in vitro coupled transcription/translation, replication, DNA polymerase,in vitro molecular evolutionary engineering

Key words
Nanoparticle○Yoshihiro Sakatani1, Fumio Matsuda1, Norikazu Ichihashi1,2(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Frontier Biosci., Osaka Univ.)○Hikaru Nakazawa1, Yuri Ishigaki1, Yushuang Zhang1, Hiroyuki Yamada2,
Hirokazu Tsuboi2, Akio Kouda2, Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Ozeki corporation)

Aspergillus oryzae, cellulose-binding domain, cellobiohydrolase,

157

2Ia11

AI はタンパク質進化を導くか？：機械学習支援による
GFP の YFP 化検証

2Ja01○及川 未早来 1, 齋藤 裕 2, 亀田 倫史 2, 中澤 光 1, 二井手 哲平 1,
津田 宏治 3,4, 梅津 光央 1,4（1東北大院・工, 2産総研・人工知能研究セ, 3東大院・新領域, 4理研・革新知能統合研究セ）
mitsuo@tohoku.ac.jp

遺伝子破壊による Citrobacter 属細菌のキトサン様バイ
オ凝集剤高生産株の育種○金尾 圭太 1, 柏 雅美 1, 木村 和幸 1,2, 宮本 弘毅 1, 山口 翔太 1,
バランワル プリヤンカ 1, 根来 誠司 1, 武尾 正弘 1（1兵県大・工・応化, 2（株）兵庫分析センター）
takeo@eng.u-hyogo.ac.jp

大規模な変異体ライブラリーの作製技術やスクリーニング操作の発展は，変異研究の黎明期では隔世の感がある確率でタンパク質の機能改変を可能としている．しかし，目的変異体の迅速・確実な開発にはそれなりの設備と資金を必要とすることが多く，有機合成に対抗しえる機能性分子の創出には，よりスマー
トな方法論が必要である．そこで本研究では，変異体ライブラリーの作製に機
械学習による機能性予測を導入し，目的変異体が含まれる確率を飛躍的に向上させたスマートホットライブラリーを構築する技術を開発することで，設備と資金の規模を必要としない高機能性分子の創出法を提案する．
本研究では，緑色蛍光タンパク質(GFP)を出発点とした，高輝度黄色蛍光タンパ
ク質(YFP)の創出を目指した．まず，GFP の YFP 化に重要な 4 残基を対象に，効率的に飽和変異を導入できる 22c-trick 法を応用して，4 残基を同時にランダ
ム変異させた GFP 変異体群 96 穴プレートにて微量培養することで，配列解析とプレートリーダによる機能評価を同時並行で行える系を構築した．そして，
このプロセスを用いて取得した 155 のデータを用いてベイズ法を用いた機械学
習プログラムにより学習し，全 16 万種の変異体について機能性予測を行った．
その結果，推測された上位 100 程度の変異体について再度調製し機能評価した
ところ，それら変異体の多くが学習前と比べて蛍光波長が黄色化し，かつ蛍光強度が向上していた．その中には，既知の YFP を越える黄色度・輝度を示すものも存在したことから，機械学習支援によるスマートホットライブラリーを用いた高機能性分子創出技術の有効性が示唆された．

Citrobacter 属細菌の多くの菌株は，酢酸を基質にキトサン様多糖を培地に分泌生産する．この多糖は水中の懸濁質に対して優れた凝集作用を示すことから，
バイオ凝集剤として水処理での活用が期待されている．本研究室では，凝集剤の生合成経路や生産菌のゲノム配列の情報に基づいて遺伝子破壊や遺伝子組換えを実施し，高生産株の育種を行なっている．これまでの研究により，凝集剤
生産菌 C. freundii IFO 13545 において，ホスホフルクトキナーゼ遺伝子(pfkA)とグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ遺伝子(nagB)あるいはグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(g6pd)の 2 遺伝子の破壊の組み合わせで高い凝集活性を示す菌株が得られた．本研究では，野生株レベルでより高い凝集活性を示す
C. youngae GTC 01314 を用いて同様の遺伝子破壊を実施し，その効果を確かめた．
GTC 01314 株に遺伝子破壊用直鎖 DNA 断片を直接エレクトロポレーションで導入し，相同組換えを起こさせる定法にて，一重破壊株（pfkA 欠損），二重破壊株（pfkAnagB 欠損），三重破壊株（pfkAnagBg6pd 欠損）を構築した．次いで，これらの凝集活性をカオリン法で評価したところ，野生株に比べ，一重破壊株
は 1.4 倍，二重破壊株は 2.2 倍，三重破壊株は 3.2 倍高い凝集活性を示し，これらの遺伝子の有用性が示唆された．さらに，以前に得た，多糖化と膜分泌に関わると推定した遺伝子群 bfpABCD を市販大腸菌発現ベクターに繋いでこれらの破壊株に導入したところ，さらに活性の増加が認められた．

Can AI guide protein in desired evolution? : Machine-learning -guided
evolution from GFP to YFP?

Molecular breeding of chitosan-like bioflocculant-producing Citrobacterstrains by gene disruption○Misaki Oikawa1, Yutaka Saito2, Tomoshi Kameda2, Hikaru Nakazawa1,
Teppei Niide1, Koji Tsuda3,4, Mitsuo Umetsu1,4(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Comp. Omics Res. AIRC, AIST, 3Dep. Comp.
Biol. Med. Sci., Grad. Sch. Frontier Sci., Tokyo Univ., 4Adv. Intell. Pro., RIKEN)○Keita Kanao1, Masami Kashiwa1, Kazuyuki Kimura1,2, Koki Miyamoto1,
Shota Yamaguchi1, Priyanka Baranwal1, Seiji Negoro1, Masahiro Takeo1(1Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Hyogo Analysis Center Co.,Ltd.)

Key words
evolution

artificial intelligence, green fluorescent protein, process engineering,

Key words

Citrobacter, gene disruption, chitosan, production

2Ia12

抗体データベースを利用した熱安定性向上と発現量向上に向けた大規模変異導入プロセスの開発

2Ja02

Identification and functional analysis of genes involved inpolymerization and secretion in the production of achitosan-like polysaccharide in Citrobacter spp.

○服部 修平 1,2, 本田 亜由美 1, 二井手 哲平 1, 中澤 光 1,
梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2(独) 日本学術振興会特別研究員DC）mitsuo@tohoku.ac.jp○Priyanka Baranwal1, Keita Kanao1, Shin Odagaki1,
Kazuyuki Kimura1,2, Seiji Negoro1, Masahiro Takeo1(1Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Hyogo
Analysis Center Co., Ltd.)takeo@eng.u-hyogo.ac.jp

抗体医薬品は，低分子医薬品に比べ標的特異性が高いため副作用の少ないバイオ医薬品として利用されている．さらに，標的認識能を持つ抗体の可変領域(Fv)から設計された低分子抗体を利用した医薬品開発も行われている．しかし，低分子抗体の安定性が低いことが医薬品開発のボトルネックとなっている．その大きな要因の一つに，免疫による抗体取得の際におこる体細胞変異があり，その際に変異導入された箇所が要因となり安定性の低下が引き起こされる．そこで本研究では，天然でよく使用されているアミノ酸配列はフォールディングを容易に組みやすく安定であるという仮説をたて抗体データベースを利用し，抗体断片に大規模な変異導入を行い安定性の向上を試みた．
抗体中の分子認識機能を持つ断片(Fv)は，相補性決定領域(CDR)以外のフレーム
ワーク領域(FR)ではアミノ酸配列の相同性が高い．我々は，Fv について，他の抗体の Fv と比較して配列相同性が低い残基を高い残基へ置換していった．野
生型抗体の配列を抗体データベースである abYsis により配列相同性を算出し，フレームワーク領域の配列相同性を 5 段階の変異体を作製した．その結果，FR中の 30%までに至る 50 個のアミノ酸を相同性の高いアミノ酸へ置換することによって変性中点(Tm)が発現量の増加とともに向上した一方，結合親和性が 10倍低下していた．この結果から，発現量と安定性は相関がとれると考え，結合力と発現量の観点から結合能を保持したまま安定性を向上した変異体の取得を行う．段階的に野生型か使用頻度の高いアミノ酸かを選択するライブラリーを作製し，新規変異体の取得を行ったところ，微量培養スクリーニングにおいて2 倍程度発現量が向上した変異体の取得に成功した．

Chitosan is a biopolymer consisting of glucosamine (and partially Nacetylglucosamine) with beta-1,4 glycosidic bonds and industrially produced from theexoskeletons of crabs and shrimps. We found that some Citrobacter spp. excrete a
chitosan-like biopolymer (CB) in the culture media, which can be used as a flocculant
in water treatment.
In this study, to investigate the mechanisms of the polymerization and secretion in the
CB production, genes encoding a glycosyltransferase related to polysaccharide
production were selected from the genome sequence of a CB-producing strain, C.
freundii IFO 13545, and disrupted one by one in IFO 13545 by homologous
recombination. When a glycosyltransferase gene (named bfpC) in a gene cluster
consisting of 4 genes (named bfpABCD) was disrupted, the gene disruptant completely
lost the CB-producing ability. The gene cluster was very similar in nucleotide sequence
to the pgaABCD gene cluster of E. coli MG1655 involved in the production of one
constituent of biofilm, poly-beta-1,6-N-acetylglucosamine. From the homologies with
pgaABCD, bfpB was expected to encode a deacetylase to deacetylate the precursor
biopolymer of the CB. To prove the function of bfpB (2.0kb), it was cloned into an
expression vector and overexpressed in E. coli. The expressed protein was purified as ahistidine-tagged protein (His-BfpB). The enzymatic activity of the His-BfpB was
evaluated by analyzing free amino groups in the CB or acetic acid released from theCB.

Simultaneous improvent on the themal stability and expression of antibody
fragment by means of database-dependent mutagenesis process

Identification and functional analysis of genes involved in polymerizationand secretion in the production of a chitosan-like polysaccharide in
Citrobacter spp.

○Shuhei Hattori1,2, Ayumi Honda1, Teppei Niide1, Hikaru Nakazawa1,
Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2JSPS Research Fellow)

Key words

antibody, database, mutagenesis, thermal stability○Priyanka Baranwal1, Keita Kanao1, Shin Odagaki1, Kazuyuki Kimura1,2,
Seiji Negoro1, Masahiro Takeo1(1Dept. Appl. Chem., Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo, 2Hyogo Analysis Center Co.,Ltd.)
Key words
chitosan, Citrobacter, gene disruption, secretion

158

2Ja03

高い汚泥凝集能を持つポリグルタミン酸の生産性改善に向けた菌株育種と培養工学的な検討

2Ja05○小林 誠治, 劉 涛, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

メタノールを原料にした共重合ポリヒドロキシアルカン酸生合成のための Methylobacterium extorquens の代謝
改変と培養条件の検討○折田 和泉, 海野 源人, 加藤 りさ, 中村 聡, 福居 俊昭（東工大院・生命理工）
iorita@bio.titech.ac.jp

ポリ-γ-グルタミン酸（以下 γ-PGA）はグルタミン酸を構成単位とするポリマー
で，Bacillus 属細菌などによる生産が報告されている．γ-PGA は，生体適合性に優れかつ増粘性や保湿性を有することから，食品や化粧品に応用されている．
また，粒子凝集能も有しており凝集剤としても利用されている．我々は，以前に 農 村 集 落 の 生 活 排 水 処 理 に 適 し た 生 分 解 性 凝 集 剤 を 探 索 し ， Bacillus
licheniformis RK14-46 株が生産する高分子量の γ-PGA がそれに適しており，キトサンとの併用が有効であることを明らかにしてきた 1, 2）．また，その生産はフラスコレベルの培養で最大 21 g/Ｌに達した．しかし，B. Subtilis の遺伝子組み換え株による γ-PGA の生産では 40 g/L を超える例も報告されている．そこで，
本研究では RK14-46 株の遺伝子改変により γ-PGA の生産性改善を試みた．B.
subtilis では，培養後半に栄養がなくなると，γ-PGA 分解酵素を分泌して自ら生産した γ-PGA を分解し, 栄養源として細胞内に取り込むことが知られている．
RK14-46 株でも培養後半に γ-PGA の分子量が小さくなる傾向が見られたため，
γ-PGA 分解酵素欠損株を作製し，その影響を調べた．結果として，構築した 1
つの株でその分子量の低下が抑制され，最大 30 g/Ｌの γ-PGA を生産することが分かった．また，培養液はかなりの粘性を有し，酸素供給が難しい状況であるため，培養工学的な検討も開始しており，それらの結果も報告する．
1) T. Liu et al., J. Chem. Eng. Japan, 50(3), 201-6 (2017).
2) T. Liu et al., J. Chem. Eng. Japan, 51(5), 1-7 (2018).

【目的】Methylobacterium extorquens AM1 は安価かつ持続供給可能な次世代資源であるメタノールを単一炭素源にして生育しながら貯蔵物質として生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）のポリ((R)-3-ヒドロキシブタン酸) [P(3HB)]を蓄積する．本菌は PHA 重合酵素の置換のみでメタノール
からポリ((R)-3-ヒドロキシブタン酸-co-(R)-3-ヒドロキシ吉草酸-co-(R)-3-ヒドロ
キシヘキサン酸）[P(3HB-co-3HV-co-3HHx)]三元共重合体を蓄積するが 3HV，
3HHx ユニット分率，PHA 蓄積率ともに低かった．本研究では，メタノール代謝の過程で生じる CoA チオエステルを効率的に 3HV，3HHx ユニットに導くことを目的として，人工代謝経路を構築と培養条件の検討を行った．
【方法と結果】メタノール代謝に必須の代謝経路であるエチルマロニル-CoA（EMC）経路上に存在する 3HV，3HHx ユニットの前駆体，プロピオニル-CoAとブチリル-CoA の供給量を強化するために，EMC 経路を逆行させるエチルマ
ロニル-CoA デカルボキシラーゼを導入した．その結果，生育速度が顕著に低下
し予想通り EMC 経路が逆行していることが推測されたが PHA 組成は変化せず，前駆体をモノマーユニットに導く経路が十分機能していない可能性が考えられた．次に，モノマーユニット合成経路として逆向き β-酸化経路を構築した
結果，3HV，3HHx ユニット分率が導入前の 3 倍程度増加したが，生育速度とメタノール消費能がさらに低下した．そこで，メタノール酸化反応を強化するために培地中にランタンを添加した結果，3HV，3HHx ユニット分率を低下させずにメタノール生育能を回復させることに成功した．

Strain breeding and culture engineering study for improving productivity ofpolyglutamic acid with high sludge flocculation ability

Metabolic engineering and examination of culture condition of
Methylobacterium extorquens for production of polyhydroxyalkanoate
copolymer from methanol○Joji Kobyashi, Tao Liu, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)○Izumi Orita, Gento Unno, Risa Kato, Satoshi Nakamura, Toshiaki Fukui(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Key words

Bacillus licheniformis, Poly-gamma-glutamic acid, Flocculant

Key words

polyhydroxyalkanoate, methanol, methylotroph, PHA

2Ja04

Metabolic engineering of Ralstonia eutropha for
production of 2-propanol from sugars

2Ja06

遺伝子組換え水素酸化細菌による CO2 からの共重合ポ
リエステルの生合成と C6 ユニットモル分率の変化○Dyah Candra Hapsari Subagyo, Izumi Orita, Satoshi Nakamura,Toshiaki Fukui(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)
tfukui@bio.titech.ac.jp○鈴木 尚幸 1, 森 瞬也 1, 折田 和泉 2, 福居 俊昭 2, 田中 賢二 1
（1近大・産理工, 2東工大院・生命理工）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp【Background】Biofuels, produced by living organisms from renewable biomass, areincreasingly important as a promising alternative to petroleum-based fuels. A
facultative chemolithoautotrophic bacterium Ralstonia eutropha has been shown to be
useful for production of various useful compounds including polyhydroxyalkanoates.
This study focused on production of 2-propanol by engineered R. eutropha.
【Methods and Results】Codon-optimized genes of acetoacetate decarboxylase andalcohol dehydrogenase from Clostridium spp. were introduced into a glucose-utilizable
and PHA-negative R. eutropha strain lacking NADPH-acetoacetyl-CoA reductase gene
phaB1 and phaB3 and PHA synthase gene phaC. The resulting strain produced 2propanol from glucose with the highest titer of 11.95 mmol/L. As our previous results
clarified that two kinds of NADH-dependent (S)-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases
were functional in R. eutropha, further engineering is examining to increase themetabolic flux from acetoacetyl-CoA to 2-propanol by deleting the two dehydrogenase
genes.

【緒言】3-ヒドロキシ酪酸(3HB)と炭素数 6-12 の 3-ヒドロキシアルカン酸(3HA)の共重合ポリエステル（ポリヒドロキシアルカン酸, PHA)は，ホモポリエステ
ル P(3HB)に較べ生分解性プラスチックとしての物性に優れている．福居らが作成した水素酸化細菌 Ralstonia eutropha の遺伝子組換え株は，従属栄養条件下でフルクトースから 3-ヒドロキシヘキサン酸(3HHx)を高含有率で含む P(3HBco-3HHx)を生合成し，化学合成独立栄養条件下でも良好に CO2 から P(3HBco-3HHx)を生合成する 1）．今回，組換えや培地・培養条件によって PHA 生合成
がどう変化するか検証した．
【実験・結果】4 種類の組換え株を，無機塩合成培地を用いて H2/O2/CO2 ＝ 8：
1：1 の混合ガスを基質としてフラスコによる振とう培養試験を行った．窒素源
として硫安 1.0g/L を用いた場合，4 種の組換え株のうち，MF01/JAc 株は菌体濃度が最も高く（OD600=67），P(3HB-co-3HHx)蓄積率も最も高かった（74.2wt%）．
MF01ΔB1/J4a 株は，40mol%を超える驚異的な 3HHx モル分率を示した．一方，
短鎖長(R)-3HA-CoA に高活性を示す(R)-エノイル-CoA ヒドラターゼ遺伝子を導入した MF01ΔB1/JAc 株では，3HHx モル分率はポリエステル物性上の最適値に近い 8.5mol%に抑えられた．窒素源に塩安を用いた場合，組換え株では硫安に較べて菌体濃度が低くなる傾向が見られた．また，閉鎖循環ガス発酵を用いてpH 制御による回分培養試験を行ったところ，菌体濃度とポリエステル蓄積率ともに増加した．各組換え株から抽出・精製した P(3HB-co-3HHx)の GPC による分子量測定も行った．

Metabolic engineering of Ralstonia eutropha for production of 2-propanol
from sugars

Biosynthesis of copolyester from CO2 and change in molar ratio of C6 unit
by the engineered strain of hydrogen-oxidizing bacterium○Dyah Candra Hapsari Subagyo, Izumi Orita, Satoshi Nakamura, Toshiaki Fukui(Grad. Sch. Biosci. Biotechnol., Tokyo Tech)

Key words

2-propanol, biofuel, Ralstonia eutropha○Naoyuki Suzuki1, Shunya Mori1, Izumi Orita2, Toshiaki Fukui2, Kenji Tanaka1(1Fac. Humanity-Oriented. Sci. Eng., Kinki Univ., 2Grad. Sch. Biosci. Biotechnol.,Tokyo Tech)

Key words

Ralstonia eutropha, PHA, hydrogen-oxidizing bacteria, CO2 fixation

159

2Ja07

アンモニア化成と硝酸化成に有用な微生物の探索ならびに硝化微生物コンソーシアの構築

2Ja09○安藤 晃規 1,2, 岡田 若子 1, Sakuntala Saijai 1, Tsai You-Shan 1,
宮本 憲二 3, 加藤 康夫 4, 篠原 信 5, 小川 順 1,2（1京大院・農, 2京大・生理化学, 3慶大・理工, 4富山県大・生工
研セ, 5農研機構）
aando@kais.kyoto-u.ac.jp

サンゴ養殖により得られた温度耐性株に共在する細菌叢の環境応答○伊藤 遼 1,2, 安田 直子 3, 藤村 弘行 3, 中野 義勝 4, 金城 浩二 5,
竹山 春子 1,2,6（1早大・先進理工, 2産総研・早大CBBD-OIL, 3琉球大・理, 4琉
大・熱生研, 5有限会社海の種, 6早大・ナノライフ創研）
haruko-takeyama@waseda.jp【背景】
これまでに有機物の効率的なアンモニア化成と硝酸化成を実現する土壌微生物
群の集積化に成功し，集積菌群を活用することで，再現性のよい窒素動態が観察できる硝化反応を，繰り返し実施することができることを明らかにしている．
また，硝化反応中の菌叢の推移を DGGE 解析にて観察した結果，土壌に比べ比較的単純な菌叢に収斂していることを明らかにしている．本研究では，アンモ
ニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌，ならびに，任意の従属栄養細菌の 3 菌種での効率的な硝化を実現する硝化微生物コンソーシア（アンモニア化成，硝酸化成）の構築を検討したので報告する．
【方法・結果】
Nitrosomonas europaea NBRC14298，Nitrobacter winogradskyi NBRC 14297，任意の従属栄養細菌を，有機態窒素含有栄養培地を用い好気条件下にて共培養し，三態窒素（アンモニウムイオン，亜硝酸イオン，硝酸イオン）の推移を指標に，硝化を実現できる従属栄養細菌のスクリーニングを行った．結果，いくつかの従属栄養細菌と硝化菌群を共培養した際に，効率的な硝化が実現できることを明らかにした．特に Bacillus badius NBRC 15713 と共培養した際に pH7-10，
C/N 比 10-50，有機物濃度 0.2%以下の条件下において，種々の有機態窒素の効率的な硝化が可能であることを明らかにした．また，3 菌による硝化反応終了
後，菌を回収し再度硝化反応に供したところ，より速やかな硝化反応が観察できた．硝化後に 0.1%の濃度で有機物を添加したところ硝化反応に伴う硝酸イオンの増加と，硝化菌の増殖が観察できた．本知見は，難培養性硝化菌の大量培養への展開が期待できる有用な知見である．

造礁サンゴ類は極めて高い生物多様性を示す熱帯・亜熱帯の沿岸生態系の基盤であるにも関わらず，近年の地球環境変動の影響から，その生存に欠かせない共生藻類を喪失する白化現象と呼ばれるサンゴの危機的状態が世界的に広がっている．これに対し，近年の研究ではサンゴが示す白化などの環境ストレス応
答には，サンゴと共生藻類に加え，サンゴの生体に共在する微生物も関わっていることが示唆されている．そこで本研究では，温度耐性を持つサンゴに共在する細菌に着目し，水槽実験および野外移植実験により，生育環境に応じたサンゴの共在細菌叢の変化から，サンゴの環境応答に関与する細菌叢を検出し，また，これらの経時変化を明らかにすることを目的とした．
実験は沖縄県・読谷村のサンゴ養殖場で行った．造礁サンゴの一種であるウス
エダミドリイシ(Acropora tenuis)の養殖によって得られた温度耐性株の遺伝的なクローンを(1)海水温，(2)塩濃度，(3)光量の異なる環境で飼育し，共在する細菌叢の経時的な変化を追った．サンゴ共在細菌叢は採取したサンゴ枝からメタゲノムを抽出し，16S 配列を対象とするアンプリコンシーケンスによってメタ 16S
データを取得した．
サンゴ共在細菌の飼育環境間比較を行ったところ，特定の環境下において特徴的な細菌叢が検出された事から，これらの細菌叢はサンゴの恒常性維持および環境応答に関わっていることが示唆された．さらに経時変化を比較すると群体によって菌叢の変化度合いに差異が見られたことから，サンゴの環境応答にも群体間差異があることが考察できる．総合すると環境変化に伴うサンゴの共在
細菌叢の変化がサンゴの環境適応に繋がる可能性が示唆された．

Screening of heterotrophic bacteria and construction of nitrifying microbialconsortia useful for ammonification and nitrification

Environmental adaptation of microbial communities in thermally tolerant
coral strain obtained by coral culture○Akinori Ando1,2, Wakako Okada1, Saijai Sakuntala1, You-Shan Tsai1,
Kenji Miyamoto3, Yasuo Kato4, Makoto Shinohara5, Jun Ogawa1,2(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2Res. Unit Physil. Chem. Kyoto Univ., 3Dept.
Biosci. Inform., Keio Univ., 4Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 5NARO)

Key words

nitrification, nitrifying bacteria

2Ja08

Identification of proteins related to tooth mineralizationin Cryptochiton stelleri by integrated transcriptomic andproteomic analysis○Haruka Ito1,2, Naoko Yasuda3, Hiroyuki Fujimura3, Yoshikatsu Nakano4,
Koji Kinjo5, Haruko Takeyama1,2,6(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2CBBD-OIL, AIST., 3Fac. Sci., Univ. Ryukyus,
4
Tropical Biosphere Res. Center, Univ. Ryukyus, 5Sea seed Co., Ltd., 6Res. Org. for
Nano & Life Innov., Waseda Univ.)
Key words
16S rDNA, Coral, microbial community

2Ja10

データサイエンスに基づくウナギ幼生飼料開発のための重要因子抽出○朝倉 大河 1, 坂田 研二 1, 伊達 康博 1, 長井 敏 2, 黒木 洋明 2,
長谷川 大介 2, 菊地 淳 1,3,4（1理研 CSRS, 2水産研究・教育機構, 3横市院・生命医, 4名大院・
生命農学）
jun.kikuchi@riken.jp○Michiko Nemoto1, Dongni Ren2, Steven Herrera2, Takashi Tamura1,
Kenji Inagaki1, David Kisailus2(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okyama Univ., 2Dept. Chem.
Environ. Eng., Univ. California Riverside)mnemoto@okayama-u.ac.jp
The chitons have been known to deposit magnetite (Fe3O4) on their mineralized radular
teeth. Recently, much attention has been paid to the superior mechanical property ofradular teeth in chitons which is a promising model for the development of a novel
abrasion resistant materials. We have studied radular teeth biomineralization using theworld largest species of chitons, Cryptochiton stelleri. In this study, to reveal theproteins involved in the mineralization of radular teeth, transcriptome and proteome
analysis of C. stelleri was conducted.
First, total RNA was extracted from radular tissue including radular teeth and epithelial
cells. RNA-seq was conducted on the extracted RNA using illumina Hiseq. The
obtained reads were then de novo assembled to build a transcriptome data. To identify
highly expressed transcripts in mineralized and non-mineralized teeth regions, each setof reads from two regions were aligned to the assembled transcriptome. Furthermore,
the radular teeth proteins were identified from MS/MS spectra by searching themagainst the transcriptome data.
Transcriptome analysis revealed that the most expressed transcripts in non-mineralized
teeth region include ferritin genes, while those in mineralized teeth region include anumber of mitochondrial respiratory chain enzymes. Proteome analysis identified 22
mineralized teeth specific proteins including a novel protein which are good candidates
for future research on biomineralization of radular teeth.

日本国内でのウナギの消費量は数万トンと言われ，重要な食用魚の一種であり，国立研究開発法人水産研究・教育機構によって卵からの人工シラスウナギの生育，人工親魚からの卵を孵化させる「完全養殖」に成功している．しかし量産化のための飼育システムには課題が残り，孵化幼生（レプトセファルス）の適正な環境の構築や餌料のさらなる最適化が必要とされる．本研究の一部は農水技会の核心的技術開発・緊急展開事業「水産物の国際競争に打ち勝つ横断的育種技術と新発想飼料の開発」によって遂行され，太平洋のウナギの天然幼生の採集及び周囲の海水の大量ろ過を行い，養殖幼生及び餌料を加え，天然ウナギ
幼生が利用している成分の探索を目的とした．
採集した幼生の筋組織と腸内容物，人工餌料は凍結乾燥および粉末化処理を行い，海水ろ過物は超音波処理によって粉末を回収し，KPi/D2O を加え熱・振とう処理によって抽出後，NMR による計測を行った．
シグナルの強度比較及び主成分分析の結果，ウナギ幼生の種類や天然・人工幼生の特徴を捉えることが可能であった．また，ウナギ目幼生のサイズに依存する代謝物を，機械学習によって判別し，分岐鎖アミノ酸などが成長に応じて増加することを明らかにした．腸内容物については低分子成分について特徴的なスペクトルを得ることに成功し，天然幼生の摂食物が示唆された．腸内容物の低分子成分は，海水ろ過物とは異なる点が多く，むしろ現在最適化されている餌料に比較的似ていた．さらに腸内微生物組成についても，同様にサイズに依存した微生物を機械学習により情報抽出した．これらの技術及び結果は人工ウナギ幼生の餌料開発及び量産化技術に貢献し得ると期待される．

Identification of proteins related to tooth mineralization in Cryptochiton
stelleri by integrated transcriptomic and proteomic analysis

Feed development for larvae of Anguilla japonica utilizing omics analysis○Michiko Nemoto1, Dongni Ren2, Steven Herrera2, Takashi Tamura1,
Kenji Inagaki1, David Kisailus2(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okyama Univ., 2Dept. Chem. Environ. Eng., Univ.
California Riverside)

Key words

chiton, biomineralization, RNA-seq○Taiga Asakura1, Kenji Sakata1, Yasuhiro Date1, Satoshi Nagai2, Hiroaki Kuroki2,
Daisuke Hasegawa2, Jun Kikuchi1,3,4(1CSRS, RIKEN, 2FRA, 3Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ., 4Grad.
Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)

Key words

NMR, Japanese eel, marine snow, feed development

160

2Ja11

クロマグロ稚魚の入出力代謝応答に基づく飼料候補物質の探索技術高度化

2Ka02○坂田 研二 1, 朝倉 大河 1, 相馬 智史 2, 馬久地 みゆき 2,
伊達 康博 1,3, 横山 佐一郎 4, 菊地 淳 1,3,5（1理研CSRS, 2水産教育機構, 3横市院・生命医, 4鹿児島大学・水産, 5名大院・生命農学）
jun.kikuchi@riken.jp

糖からの直接発酵を目指したエルゴチオネイン高生産放線菌の開発○仲谷 豪, 嘉悦 佳子, 仲島 菜々実, 山田 佑樹, 野口 祐司,
曽田 匡洋, 劉 暁麗
（長瀬産業）
takeshi.nakatani@nagase.co.jp【背景と目的】近年，太平洋クロマグロの資源量は顕著な減少を辿り，国際自然保護連合 (IUCN)
により絶滅危惧種に指定された．そこで我々はこの豊かな生物海洋資源の維持に加え，持続的水産業への貢献を目指し，非侵襲的魚類代謝評価法[1]と組織代
謝プロファイリング法[2]の利用，機械学習による重要因子探索法[3]，および
13
C 安定同位体追跡技術法[4]を援用することにより，完全養殖技術の実用化に向けてボトルネックとなっているクロマグロ稚魚の飼料吸収消化特性の評価を，
水産庁事業「クロマグロ養殖高機能・高効率餌料」の一部支援を受けて遂行した．
【方法】人工飼料にアミノ酸，13C アミノ酸混合物等を添加した飼料を作製し，クロマグロ稚魚に給餌した．糞便サンプリングは毎日行い，試験最終日に稚魚を採集し，各試料を NMR 計測した．得られた NMR スペクトルは数値化し，データ駆動型の多変量解析や機械学習により，クロマグロ稚魚における成長重要因子(栄養素)の探索を行った．
【結果】クロマグロ稚魚の入力源飼料，出力としての糞便 NMR スペクトルを用いたノンターゲット解析から，消化吸収に関係する特徴的な成分が抽出された．
筋組織中に含まれる水溶性成分の評価では，アミノ酸添加群とコントロール群を比較すると，添加したアミノ酸のシグナル強度が高い傾向があったことから，
飼料中に添加したアミノ酸は筋肉中に取り込まれたことが示唆された．更に 13C
アミノ酸混合物群では多くのアミノ酸が筋肉中に吸収される直接的証拠データが得られ，また時系列データから 13C ラベル率が増加する重要栄養素も情報抽出された．
Ref. [1] Asakura, T., et al. (2014) PeerJ, 2, e550, [2] Yoshida, S., et al. (2014) Sci.
Rep., 4, 7005. [3] Date & Kikuchi (2018) Anal. Chem. 90, 1805. [4] Tokuda G., et al.
(2014) Proc. R. Soc. B 281: 20140990.

【背景・目的】
エルゴチオネイン（EGT）は，一部の微生物のみが生合成可能な含硫アミノ酸である．近年，ヒトにおける EGT 特異的な取り込み輸送体や，脳における神経新生の誘導効果等が発見され，その生理活性が注目されている．当社では放線菌の一種，Streptomyces 属細菌を用いた物質生産プラットフォーム N-STePP®を開発しており，本属細菌が元来保有する EGT 生合成系を強化することで，従来の製法より安価に製造可能な微生物発酵法の開発に取り組んできた．これまでに，主要前駆体となるヒスチジン（His）を培地添加し EGT を生産させるバイ
オコンバージョン法開発に関する報告は，大腸菌等において複数存在する．しかし，より安価な糖から His を生産させ EGT へと変換する，直接発酵法に関する報告はない．本研究では，放線菌を用いた「糖からの EGT 直接発酵法」の開発を目指し，生産菌の育種を行った．
【結果と考察】
ホストである S. lividans TK64 へ，同菌の EGT 合成遺伝子クラスター egtABCDを高コピーベクターにより導入し，EGT 生産株を取得した．EGT 生産株における合成遺伝子のプロモーター検討，及び EGT 合成の硫黄源の検討を行うこと
で，EGT 生産性を元株の 10 倍以上に向上させた．次に，培地への His 無添加
条件での EGT 生産を検討した結果，興味深いことに本菌は同条件下でも数百
mg/L オーダーと高い EGT 生産性を示した．また，産生された EGT の約 80％が培養液中に蓄積しており，本菌が高い EGT 排出能をもつことが明らかとなった．さらに，上記菌株に自然変異による実験室進化手法を適応することで，His
合成制御系の解除変異株を取得することに成功した．
（本研究は NEDO スマートセルプロジェクトの支援を受けて行われました．）

Advancement of exploring the feed candidate substances based on inputoutput metabolic analysis of juvenile Bluefin Tuna

Development of ergothioneine high producing Actinomycetes aimed at
direct fermentation from sugar○Kenji Sakata1, Taiga Asakura1, Satoshi Soma2, Mekuchi Miyuki2,
Yasuhiro Date1,3, Saichiro Yokoyama4, Jun Kikuchi1,3,5(1Riken CSRS, 2FRA, 3Grad. Sch. Med. Life Sci., Yokohama City Univ.,
4
Kagoshima Univ., 5Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ.)○Takeshi Nakatani, Keiko Kaetsu, Nanami Nakashima, Yuuki Yamada,
Yuji Noguchi, Masahiro Sota, Xiaoli Liu(Nagase & Co., Ltd)Key words

NMR, Metabolic profiling, 13C-Isotope labeling, Machine learning

Key words

Streptomyces, ergothioneine, histidine, metabolic engineering

2Ka01

ロングリード RNA-seq が明らかとするバクテリアオペ
ロンの発現実態 ～二次代謝産物生合成遺伝子群のオペ
ロンバリアントを捉える～

2Ka03

Metabolic engineering of Actinosynnema pretiosum for
hyper-production of antitumor ansamitocin P-3○Jian-Jiang Zhong, Zhi-Qiang Du(State Key Lab. Microb. Metab., Sch. Life Sci. Biotechnol.,Shanghai Jiao Tong Univ.)
jjzhong@sjtu.edu.cn○菅野 学 1, 三谷 恭雄 1, 野田 尚宏 2, 木村 信忠 1, 田村 具博 1
（1産総研・生物プロセス, 2産総研・バイオメディカル）
manabu-kanno@aist.go.jp

有用物質の高効率なバイオものづくりを実現するうえで，その生合成遺伝子群の発現挙動の理解は極めて重要である．バクテリアの RNA の大半は複数の遺伝子からなるポリシストロン転写単位として存在し，二次代謝産物生合成遺伝
子群は一般に数 kb から数十 kb の複数のオペロンから構成される．しかし，既存の RNA-seq 解析で汎用されるイルミナ社の次世代シーケンサー（NGS）では，1 リード長が数百 bp と短いために，数 kb を超える転写産物の全長をありのままに解析することが出来ない．すなわち，二次代謝産物生合成遺伝子群における各ポリシストロニック mRNA の発現単位のばらつき（転写開始位置や転写終結位置の不均一性）を，1 分子レベルで捉えることは不可能であった．
そこで本研究では，長鎖 mRNA の発現情報取得に優れた解析手法の確立を目的に，二次代謝産物の生産能に優れる放線菌 Streptomyces coelicolor A3(2)株の菌体を用いて，(1)RNA 抽出工程の検討，(2)cDNA 調製手法の改良，(3)NGS 機種間の解析データの比較に取り組んだ．その結果，通常手法と比較して長鎖 cDNA
調製に優れる逆転写メソッドを開発し，ナノポア社 MinION や PacBio を用いた解析によって 10kb を超えるトランスクリプトを 1 リードとして検出することに成功した．興味深いことに，転写開始／終結位置は厳密に制御されておらず，
当菌株の二次代謝産物生合成遺伝子群は多様なオペロンバリアントで構成されている可能性が示唆された．本解析技術の広範な適用によって，真核生物 mRNAのスプライシングバリアントを想起させるこの不均一なバクテリアオペロンの発現実態が，今後明らかになるものと期待される．
本研究は，NEDO スマートセルプロジェクトの支援を受けて行われました．

Cancer is a major threat to human health and the drug R&D for cancer treatment has
been attracting great attention. Ansamitocin P-3 (AP-3), produced by Actinosynnema
pretiosum, is used as a “war-head” for antibody-drug conjugates for cancer treatment.
However, the low production titer of AP-3 greatly restricts its wide commercial
application. In this work, we report precursor pathway engineering and bioprocessengineering strategy for enhancing the AP-3 production.
AP-3 biosynthesis involves: 3-amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA) as its starter
unit, subsequently condensed with methoxymalonyl-acyl carrier protein (ACP),
malonyl-CoA (MA) and methylmalonyl-CoA (MMA) to give proansamitocin,
followed by post-modifications to finally lead to AP-3.
Here, the asmUdpg gene (UDP-glucose pyrophosphorylase) was overexpressed toenhance the supply of AHBA in A. pretiosum. Supply of the unusual glycolate unit inAP-3 biosynthesis was improved by overexpressing asm13-17. Furthermore, coexpression of asmUdpg and asm13-17 was done, enhancing the AP-3 titer to 680.5
mg/L in shake flask, which is higher than other groups' reports.
Finally, the engineered strain Oasm13-17:asmUdpg was applied to 10-L bioreactor. By
pulse feeding fructose in bioreactor, an AP-3 titer of 757.7 mg/L was achieved, 135%higher than that of batch bioreactor.
The work also provided useful information for AP-3 production from genetranscription analysis and metabolite intermediate detection to further understand themechanism of AP-3 high production.

Log-read RNA-seq using single-molecule real-time sequencer reveals operon
complexity of secondary metabolite biosynthetic genes in bacteria

Metabolic engineering of Actinosynnema pretiosum for hyper-production of
antitumor ansamitocin P-3

Key words
transcriptome, full-length cDNA synthesis, MinION nanopore
sequencing, Streptomyces coelicolor A3(2)Key words○Manabu Kanno1, Yasuo Mitani1, Naohiro Noda2, Nobutada Kimura1,
Tomohiro Tamura1(1BRI. AIST, 2Biomed. Res. Inst., AIST)○Jian-Jiang Zhong, Zhi-Qiang Du(State Key Lab. Microb. Metab., Sch. Life Sci. Biotechnol., Shanghai Jiao Tong
Univ.)
antibiotics, actinomycetes, fermentation, metabolic engineering

161

2Ka04

放線菌 Streptomyces coelicolor 株のメタボローム分析における分析対象代謝物範囲の拡大

2Ka06○新田 克章 1, Putri Sastia 1, Takano Eriko 2, 福﨑 英一郎 1（1阪大院・工, 2Fac. of Sci. and Eng., Univ. of Manchester）
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

ナイロンオリゴマー分解菌 Arthrobacter の 2 種類の 6アミノヘキサン酸アミノトランスフェラーゼ NylD1・
NylD2 の機能解析○藤井 翼, 竹原 一起, 橋本 悠, 武尾 正弘, 根来 誠司（兵庫県大院・工）f.tbs-t6y5k@iris.eonet.ne.jp

メタボロミクスは生体内の代謝物を網羅的に分析する学問であり, 生体サンプルの精密表現型を捉えることが可能であることから様々な学問領域で注目されている．その学問領域のひとつが代謝の最適化により有用物質の生産量向上を目指す代謝工学分野である．代謝工学における目的物質は一次代謝物と二次代謝物に分けられるが，適用例は一次代謝物の生産に大きく偏っている．本研究では二次代謝物を生産する菌株のメタボローム分析の適用範囲を広げるべく，放線菌 Streptomyces coelicolor 株における抗生物質生産へのメタボローム分析適用に注目した．放線菌のメタボローム分析における問題点としては，検出可能な代謝物が少ないことや(過去の研究では約 30 代謝物のみが検出)，培地成分により，分析装置のイオン源が汚れることによる分析の不安定性が観測されることであった．本研究では菌体回収法を従来のコールドメタノール法から吸引ろ過およびフィルターを用いた回収に変え，洗浄溶媒での培地除去を行った．洗浄
溶媒には 2.63%の塩化ナトリウム溶液と同濃度の炭酸水素ナトリウム溶液を洗浄溶媒として選出し，洗浄を行ったのちイオンペア LC-MS/MS を用いて代謝物を分析し，評価を行った．結果として，炭酸水素ナトリウム溶液による洗浄が良好な結果を示した．その後，抽出溶媒の選考検討を行った．本研究では 100%
メタノールおよび Bligh & Dyer 法 (メタノール：水：クロロホルム＝ 5：2：2 v/v/v)を用いて検討を行った．結果として，Bligh & Dyer 法がより良好な RSD 値を示した．放線菌サンプルにこれらの前処理法を適用した後，イオンペア LCMS/MS および PFPP カラムを用いた LC-MS/MS によるターゲット分析および
GC/MS によるノンターゲット分析を用いて分析することで計 137 の代謝物同定
に成功した

<目的>
環境負荷低減化の観点から，ポリマーの再資源化やモノマーのバイオ生産が重要視されている．Arthrobacter sp. KI72 株はナイロンオリゴマー分解酵素 NylA/
NylB/NylC により，6-アミノヘキサン酸(Ahx)オリゴマーをモノマーの Ahx まで分解する．最近，i）Ahx はアミノトランスフェラーゼ(NylD)によりアジピン酸
セミアルデヒドに変換され，その後，デヒドロゲナーゼ(NylE)によりアジピン酸へと代謝されること，ii）NylD については 2 種，NylE については 20 種の相同遺伝子が認められること，iii）NylD1,NylE1 を共役させた反応系により，Ahx
は 約 90% の 変 換 率 で ア ジ ピ ン 酸 へ 変 換 さ れ る こ と を 明 ら か に し た (Appl.
Microbiol. Biotechnol.102,801-814,2018)．本研究では，アミノトランスフェラー
ゼ NylD1，NylD2 の触媒機能の比較，類縁酵素の立体構造を基盤とした基質結合部位の推定と活性との関連性について検討した．
<方法および結果>
nylD1,nylD2 遺伝子を，各々，大腸菌発現ベクター pColdI に組み込み，高発現
させ，超音波破砕後，His-Tag 精製を行った．NylD 活性は，反応基質として，アミノ基供与体（Ahx，または，4 アミノ酪酸（GABA)），アミノ基受容体（αケトグルタル酸等），補酵素（NADP+,PLP），および，NylD 活性に対して過剰量の NylE を添加した共役系を構築し，340nm の吸光度の変化からアミノトラ
ンスフェラーゼ活性を測定した．その結果，NylD1 に比べて NylD2 は，Ahx では約 17 倍，GABA では約 2.5 倍高い活性が確認できた．Arthrobacter auresceusの 4 アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは立体構造が解明されており，NylD1,
NylD2 に対して，各々 95％，49％のアミノ酸配列相同性を示す．活性中心近傍の構造比較を行ったところ，PLP 結合部位（Lys295）周辺のアミノ酸残基が保存されていた．立体構造とアミノ酸残基の保存性に基づき，触媒機構について考察する．

Expansion of metabolite analysis targets for metabolome analysis ofStreptomyces coelicolor

Functional analysis of 6-aminohexanoate aminotransferase NylD1,NylD2
from Arthrobacter○Nitta Katsuaki1, Sastia Putri1, Eriko Takano2, Eiichiro Fukusaki1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Fac. of Sci. and Eng., Univ. of Manchester)○Tsubasa Fujii, Ikki Takehara, Yuu Hashimoto, Masahiro Takeo, Seiji Negoro(Grad. Sch. Eng., Univ. Hyogo)

Key words
optimization

metabolic engineering, metabolic analysis, Streptomyces, Pre-treatment

Key words

6-aminohexanoate, Arthrobacter, metabolism, aminotransferase

2Ka05

代謝改変コリネ型細菌による 4-ヒドロキシ安息香酸の高
生産

2Ka07

釜石はまゆり酵母の系統解析と発酵力の強化○北出 幸広 1,2, 橋本 龍馬 1,2, 須田 雅子 1,2, 平賀 和三 1,2,
乾 将行 1,2,3（1RITE, 2グリーンケミカルズ(株), 3奈良先端大・バイオ）mmg-lab@rite.or.jp○齊藤 隆行 1, 井上 諭宜 2, 赤尾 健 3, 山田 美和 1, 下飯 仁 1（1岩手大院・農, 2釜石市, 3酒総研）
simoi@iwate-u.ac.jp【目的】4-ヒドロキシ安息香酸(4-HBA)は，液晶ポリマーやパラベンの原料として用いられる有用な芳香族化合物であり，数十年にわたり石油由来のフェノー
ルから化学プロセスにより工業的に生産されてきた．近年，再生可能なバイオマスを原料としたバイオプロセスによる代替生産法が注目されているが，これまで細胞毒性が高いことや生産濃度と対糖収率が低いことから工業化には至っていない．そこで本研究では，工業微生物として知られるコリネ型細菌の代謝改変と増殖非依存型バイオプロセスの適用によって 4-HBA を高生産することを目的とした．
【方法と結果】コリネ型細菌の生産宿主としての優位性を比較評価するため，既報の 4-HBA 生産宿主とコリネ型細菌(野生株)について，各種 4-HBA 濃度条件
下での増殖試験を行った．その結果，コリネ型細菌のみが 300 mM の高濃度条
件で増殖可能であり，比較した中では最も高い 4-HBA 耐性を有することが示された．また，コリネ型細菌は 4-HBA 生合成経路の最終反応酵素を持たないため，複数種の微生物からコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ(UbiC)のスクリーニン
グを行った．その結果，4-HBA 高阻害耐性を示すタイプの酵素が最も生産に適していることが明らかになった．さらに，上記 ubiC が導入され，かつシキミ酸経路を順次強化した株を構築し，これらのうちフラスコ培養で高い生産濃度を示した株については，ジャーファーメンターを用いた増殖非依存型バイオプロ
セスにおいて，グルコースから 4-HBA への生産性を評価した．
Kitade et al., Appl. Environ. Microbiol. 84(6): e02587-17(2018).

【目的】釜石はまゆり酵母は岩手県釜石市のはまゆりから取得された酵母群であり，そのうち KS5 及び KS6 の 2 株が清酒醸造用酵母としての適性を持っていた 1）．しかし，釜石はまゆり酵母の今後の利活用のためには，本酵母が他の酵母と異なる独自の遺伝子資源であることを確立し，更に発酵力も強化する必要がある．本研究では，次世代シーケンサーを用いて KS5 及び KS6 のゲノム DNA
を解析し，他の醸造用酵母と比較して系統学的な位置の解明を試みた．また，
KS6 からストレス感受性変異株を取得することで発酵力の強化を目指した．
【方法及び結果】①系統解析 KS5 及び KS6 からゲノム DNA を抽出し，次世代シーケンサー（イルミナ）で塩基配列を解析した．得られた塩基配列データを DDBJ の Read
Anotation Pipeline で処理し，清酒酵母きょうかい 7 号（K7）ゲノムを基準とした SNP データを抽出した．染色体上の SNP 分布図を作成して比較した結果，
KS5 及び KS6 は類似しているものの異なる菌株であり，K7 とは全く異なる SNP
パターンを示すことがわかった．また，KS5 及び KS6 と他の産業用酵母のホモ
SNP データから距離行列を算出し近隣接合法を用いて系統樹を作成した．その結果，KS5 及び KS6 は清酒酵母の系統に含まれているが，他の清酒酵母菌株とは独立した系統であることが判明した．
②発酵力の強化 我々は以前の研究で，ストレス感受性変異株の中には発酵力が向上した菌株が含まれることを報告した 2）．そこで，高発酵力の変異株を取得するために，KS6 を紫外線処理して得られた約 6000 コロニーの中から 55℃30分の熱処理で死滅しやすくなった変異株を選抜した．得られたストレス感受性
株 28 株について清酒小仕込試験を行った結果，K7 と同等以上の高い発酵力を示した変異株を取得した．
(1) 齊藤隆行ら，第 69 回日本生物工学会大会(2017)(2) 前田岳彦ら，日本農芸化学会 2017 年度大会

Overproduction of 4-hydroxybenzoic acid using metabolically engineered

Phylogenetic analysis of Kamaishi Hamayuri yeast and improvement of its
fermentation activity

Corynebacterium glutamicum○Yukihiro Kitade1,2, Ryoma Hashimoto1,2, Masako Suda1,2, Kazumi Hiraga1,2,
Masayuki Inui1,2,3(1RITE, 2Green Chemicals Co., Ltd., 3NAIST)

Key words
Corynebacterium glutamicum, aromatic compound, 4hydroxybenzoate, UbiC

○Takayuki Saito1, Yuki Inoue2, Takeshi Akao3, Miwa Yamada1, Hitoshi Shimoi1(1Grad. Sch. Agric., Iwate Univ., 2Kamaishi city, 3NRIB)

Key words

yeast, fermentation, Saccharomyces cerevisiae, phylogenetic analysis

162

2Ka08

Saccharomyces cerevisiae 由来の乳化およびマクロ
ファージ活性化に 関与する細胞表層タンパク質の同定
と解析

2Ka10

○上田 茉奈, 齋藤 大輝, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

酵母のストレス応答に関わる陽イオン輸送体の機能解析○上原 千央 1, 浜本 晋 1, 星 直美 1, 笠原 紳 2, 魚住 信之 1
（1東北大院・工, 2宮城大・環境科学）
uozumi@biophy.che.tohoku.ac.jp

我々は，免疫担当細胞であるマクロファージとの細胞同士の接触により，マクロファージを強く活性化できるパン酵母の変異株を見いだし，それら変異株の細胞表層構造の解析を進めてきた 1,2)．その解析過程で，マクロファージ活性化
株の細胞懸濁液と油を混合した時に，野生株と比べ顕著に乳化が生じる現象を見いだした．さらに，酵母の細胞表層には乳化およびマクロファージ活性化に関与するタンパク質が存在すると予想し，それらの取得と同定を進めてきた．
2017 年度の本大会では，GPI アンカーのリモデリングに関与する GUP1 遺伝子の欠損株が培養上清に分泌するタンパク質の解析を行い，酵母の細胞表層に局在する GPI アンカー型タンパク質である Gas1 を培養上清から精製し，精製標品はマクロファージ活性化能と乳化能の両方の活性を併せ持つことを報告した．
本研究では，Gas1 タンパク質の構造と乳化やマクロファージ活性化の関係を明らかにするため，Gas1 の類似タンパク質や変異タンパク質を調製し，それらの乳化能やマクロファージ活性化能の評価を進めている．また，これまでにマク
ロファージ活性化酵母を浸透圧保護下で培養し得られた菌体を PBS に懸濁した時に，細胞から乳化タンパク質が遊離することを明らかにしてきた．現在，乳化を指標にして PBS 懸濁液から乳化タンパク質の精製を進めており，乳化タン
パク質は複数存在し，その中の 1 つに注目し精製とその同定を進めている，本
発表ではそれらの成果について報告する．
1) Sakai et al., J Biosci Bioeng, 2007, 103(2):161-6.
2) Takada et al., FEMS Yeast Res, 2014, 14(2):261-9.

【背景と目的】出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）は，発酵などの食品製造プ
ロセスに用いられる産業用微生物である．出芽酵母のストレス応答において，浸透圧の変化や熱などの刺激によって細胞質のカルシウム（Ca2+）濃度が一過的に上昇して行われる Ca2+ シグナリングが重要である． 細胞内の Ca2+濃度は細胞膜と細胞内小器官の膜に発現する Ca2+ 輸送体によって制御されるが， 未知のCa2+輸送体の存在が示唆されている．本研究では新規 Ca2+ 輸送体の同定をめざし，植物の Ca2+輸送体と相同性を示す Spo75， Csc1， Rsn1， Phm7 の 4 つの機
能解析を行った．
【方法と結果】発表者はこれまでに Csc1 が液胞膜， Rsn1 と Phm7 が細胞膜に存在することを明らかにした．Spo75 の細胞内局在性を明らかにするために，
Spo75 と GFP 融合タンパク質を発現させた出芽酵母に細胞膜とオルガネラ膜をそれぞれ標識して共焦点顕微鏡で GFP 蛍光を観察した．その結果， Spo75 が小胞体膜に存在することが明らかになった．spo75 と rsn1 の欠損株がそれぞれ細胞壁合成阻害剤に対して感受性を示すため， 細胞壁分解酵素への耐性を検討した．その結果， spo75 欠損株の細胞壁分解酵素への耐性が低く， 細胞壁合成に関わることが示唆された．さらに, 低浸透圧処理を行った各遺伝子欠損株の生存率を測定した結果， spo75 欠損株の生存率が野生株と比較して五割程度に低下した．多くの Ca2+輸送体が Ca2+以外にもカリウムイオン（K+）などの陽イオンを輸送するため， 低 K+感受性大腸菌変異株に Ca2+輸送体候補遺伝子を発現させて K+取り込み量を測定した．その結果， Spo75， Rsn1 と Phm7 が K+を輸送することが示された．以上より， 本研究において Spo75， Rsn1， Phm7 が陽イ
オン輸送活性を示し， spo75 の欠損により細胞壁に異常が生じることで浸透圧ストレスに感受性を示すことが明らかとなった．

Identification and analyses of cell surface proteins involved in emulsificationand macrophage activation from Saccharomyces cerevisiae

Functional Analysis of Cation Transporters Involved in Stress Responses in
Saccharomyces cerevisiae○Mana Ueda, Daiki Saito, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)○Chihiro Uehara1, Shin Hamamoto1, Naomi Hoshi1, Shin Kasahara2,
Nobuyuki Uozumi1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Dept. Env. Sci., Miyagi Univ)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, biosurfactant, Macrophage, emulsification

Key words

Saccharomyces cerevisiae, transporter, stress response, cell wall

2Ka09

出芽酵母におけるマルチストレス耐性優性変異株の分離
と解析

2Ka11

酵母非遺伝的因子[GAR+]がアルコール発酵と遺伝子発現に及ぼす効果○渡辺 大輔, 熊野 舞香, 杉本 幸子, 高木 博史（奈良先端大・バイオ）d-watanabe@bs.naist.jp○小林 日花梨, 中川 洋史, 山村 英樹, 早川 正幸（山梨大院・総研部）
youji@yamanashi.ac.jp【背景・目的】パン酵母は製パン過程において冷凍や高糖濃度等の多様なストレス，すなわちマルチストレスによって障害を受けるため，マルチストレス耐性を持つパン酵母の開発が望まれている．本研究室では酵母からマルチストレス
耐性変異株を効率的に取得できる致死的濃度過酸化水素法 (LCH 法) を開発している．しかし，LCH 法によって取得されるマルチストレス耐性変異株の原因
変異遺伝子に関する知見は少ない．そこで本研究では，遺伝学的解析の容易な実験室酵母から，LCH 法により自然発生的に取得されるマルチストレス耐性変異株を分離し，原因変異遺伝子の同定に向けた解析を行うことを目的とした．
【方法・結果】野生型株である実験室酵母株を 10 mM の過酸化水素含有 YPDA
平板培地にプレーティングし，生育コロニーを分離・純化後，スポット試験を行うことによって過酸化水素耐性変異株である S-5-7-1 株，S-6-1-1 株の 2 株を取得することに成功した．これらの株について優性劣性試験を行ったところ，
2 株とも過酸化水素に対して優性のストレス耐性変異遺伝子を持っていることが判明した．そこで，これらの株のマルチストレス耐性能を検討するために，
エタノール，高ショ糖濃度，乾燥，高温，冷凍に対するストレス耐性をスポット試験により調べた．その結果，S-6-1-1 株は高ショ糖濃度，乾燥，高温，冷凍に対して優性のストレス耐性変異遺伝子を持っていることが明らかになった．
そこで四分子解析を行ったところ，S-6-1-1 株の持つマルチストレス耐性変異は
二遺伝子変異である可能性が考えられた．現在，マルチストレス耐性を示す四分子分離体株の次世代シーケンス解析を進めている．

酵母とバクテリアの共培養により，プリオン様非遺伝的因子[GAR+]の酵母内での形成が促進され，アルコール発酵の抑制につながることが報告されている．
我々は以前に，伝統的な清酒醸造法である生酛造りに用いられる乳酸菌
Leuconostoc mesenteroides や Lactobacillus sakei が酵母 Saccharomyces cerevisiae
における[GAR+]形成促進能を有することを明らかにした．本研究では，[GAR+]の形成が，アルコール発酵と遺伝子発現に及ぼす効果について，実験室酵母を用いて解析を行った．実験室酵母の元株（[gar-]株）および[GAR+]形成株を用いた発酵試験を実施したところ，グルコースのみを炭素源とした培地では[GAR+]
により発酵速度が顕著に低下したのに対し，グルコースとスクロースを混合した場合には[GAR+]による影響が抑圧された．次に，グルコースによる遺伝子発現の変化に対して[GAR+]が及ぼす影響を明らかにするために，グルコースアナ
ログであるグルコサミン添加前後の酵母を用いて RNA-seq 解析を実施した．その結果，まず，スクロースの資化に必要なインベルターゼをコードする SUC2
遺伝子の発現量が[GAR+]株において高いことを見出した．SUC2 遺伝子の発現はグルコース抑制を受けることから，[GAR+]株ではグルコース抑制が解除されており，グルコースと非グルコース炭素源の両方を含む環境でのアルコール発酵に有利となる可能性が示唆された．また，[GAR+]株では，高浸透圧ストレス
応答において中心的な役割を果たす HOG シグナル伝達経路の標的遺伝子の発現が恒常的に低いことも見出され，アルコール発酵の抑制と関連していることが推測された．以上の結果を考え合わせると，バクテリアにより形成が促進される[GAR+]は，酵母による急激なグルコース消費を抑えることで酵母とバクテリアが共存しやすい環境の維持に貢献しているのかもしれない．

Isolation and analysis of multistress-tolerant dominant mutants of
Saccharomyces cerevisiae

Effects of yeast non-genetic factor [GAR+] on alcoholic fermentation andgene expression○Hikari Kobayashi, Youji Nakagawa, Hideki Yamamura, Masayuki Hayakawa(Grad. Fac. Interdisc. Res., Univ. Yamanashi)

Key words
peroxide

Saccharomyces cerevisiae, mutant, muiltistress tolerance, hydrogen○Daisuke Watanabe, Maika Kumano, Yukiko Sugimoto, Hiroshi Takagi(Div. Biol. Sci., NAIST)

Key words

yeast, [GAR+], alcoholic fermentation, glucose repression

163

2Ka12

パン酵母の冷凍保存後の発酵力に重要なプロテアソーム
関連遺伝子の発現

2La02

ショウガ由来のデヒドロジンゲロンが出芽酵母の薬剤耐性に及ぼす影響○尾山 昌弘 1, 山脇 千佳 1, 山口 良弘 1,2, 荻田 亮 1,3, 田中 俊雄 1,
藤田 憲一 1（1阪市大院・理, 2阪市大・複合先端, 3阪市大・健康研セ）
kfujita@sci.osaka-cu.ac.jp○高木 博史 1, 渡辺 大輔 1, 関口 拓史 2, 杉本 幸子 1, 長澤 淳 2,
喜田 直孝 2
（1奈良先端大・バイオ, 2テーブルマーク）
hiro@bs.naist.jp

パン酵母が発酵力を保持したまま冷凍状態で流通することができれば，製パン産業において有用な技術になると期待される．ところが，実際にパン酵母を 2
週間冷凍保存した後，高ショ糖生地を模倣した液体培地で発酵速度を測定した
ところ，発酵力が低下する株が存在することが明らかとなった．そこで本研究では，まずパン酵母の冷凍保存が，発酵中の細胞の遺伝子発現に及ぼす影響をDNA マイクロアレイ解析により調べた．その結果，冷凍保存後の発酵力が低下した株では，細胞内でタンパク質分解を行うプロテアソーム複合体に関連する遺伝子のほとんどが低い発現レベルを示していた．また，ユビキチン化タンパ
ク質の解析の結果，ストレスにより変性したタンパク質が分解されずに蓄積していることも判明した．次に，プロテアソームの機能低下を引き起こす原因を明らかにするために，冷凍保存後に発酵力が低下した株の全ゲノム解析を実施した．その結果，プロテアソーム関連遺伝子の発現を引き起こす転写因子 Rpn4の 上 流 で 機 能 す る 転 写 因 子 Pdr3 に ア ミ ノ 酸 置 換 （ Ala148Thr/Ala229Val/
His336Arg/Leu541Pro）を伴う変異が見出された．この変異はドミナントネガ
ティブ型であり，パン酵母においてこの変異アレルを欠失させたところ，冷凍保存後の発酵力や生存率の低下が抑圧された．以上の結果から，冷凍保存後のパン酵母が冷凍ストレスを克服し，高い発酵力を維持する鍵が，Pdr3 と Rpn4を介したプロテアソーム関連遺伝子の発現にあると結論づけられた．また，プ
ロテアソームによる変性タンパク質の分解を強化することでパン酵母の冷凍耐性や発酵力が向上する可能性が示された．本研究で得られた知見は，冷凍スト
レス耐性パン酵母の育種技術への応用や，細胞が冷凍ストレスに応答し，生命機能を保持するメカニズムの理解に繋がる有用なものであると考えられる．

【背景および目的】ウコンの根茎に含まれるクルクミンは脂溶性のポリフェノー
ルであり，in vitro において抗酸化，抗がん，脂質代謝改善など多くの生理活性が報告されている．抗菌活性についても古くから報告されているが，その活性は微弱である．加えて，クルクミンは動物培養細胞や真菌の薬剤排出ポンプを阻害し，他の薬剤と組み合わせた場合，相乗効果を発揮する．しかしながら，
クルクミンは水溶性が低いため，薬剤としての実用化は困難である．そこで，今回は，クルクミンの 1/2 の構造を持つデヒドロジンゲロンに着目し，真菌の薬剤耐性への影響をモデル生物である出芽酵母を用いて検討した．なお，本物
質はショウガに含まれる水溶性のフェノール類である．
【方法および結果】デヒドロジンゲロンは出芽酵母の生育にはほとんど影響を与えなかったが，薬剤耐性のため一過性の殺菌作用を示すドデカノールと組み合わせた場合，持続的かつ相乗的な抗真菌作用を発揮することが明らかになった．
加えて，本物質は，薬剤排出ポンプによって排出される蛍光物質 rhodamine 6Gの排出を抑制することがわかった．さらに，本物質は，薬剤耐性の原因の一つである多剤耐性薬剤排出ポンプ PDR5 の遺伝子発現を抑制した．以上の結果より，デヒドロジンゲロンは薬剤排出を抑制することで相乗的な抗真菌作用を発揮する可能性が示唆された．

Importance of proteasome gene expression during model doughfermentation after preservation of baker’s yeast cells by freezing

Effect of dehydrozingerone, a constituent in the rhizomes of ginger, on drugresistance of budding yeast○Hiroshi Takagi1, Daisuke Watanabe1, Hiroshi Sekiguchi2, Yukiko Sugimoto1,
Atsushi Nagasawa2, Naotaka Kida2(1Grad. Sch. Biol. Sci., NAIST, 2TableMark Co., Ltd.)○Masahiro Oyama1, Chika Yamawaki1, Yoshihiro Yamaguchi1,2, Akira Ogita1,3,
Toshio Tanaka1, Ken-ichi Fujita1(1Grad. Sch. Sci., Osaka City Univ., 2OCARINA, Osaka City Univ., 3Res. Center.
Urban Health & Sports, Osaka City Univ.)

Key words

baker's yeast, dough fermentation, freeze-thaw stress, proteasome

Key words
resistance

Saccharomyces cerevisiae, dehydrozingerone, n-dodecanol, drug

2La01

ササユリ（Lilium japonicum）系統間および類縁種間の花香組成を指標とした化学分類の試み

2La03

黄ニラ抽出物が示す赤血球凝集素の阻害効果と阻害物
質の単離○藤澤 瑞希 1, 松川 哲也 1, 瀧川 義浩 5, 荒井 滋 2, 秋野 順治 3,
柳川 綾 4, 梶山 慎一郎 1（1近畿大院・生物理工・生物工, 2大神神社, 3京都工繊大・CBFS, 4京都大学・RISH, 5近畿大学先端研）
kajiyama@waka.kindai.ac.jp○大西 優 1, 中島 凌 2, Eltigani Sara 3, 鈴木 菜月 2, 美藤 友博 2,
清水 克彦 4, 畑中 唯史 5, 有馬 二朗 2
（1鳥取大院・農, 2鳥取大・農, 3鳥取大院・連農, 4鳥取大・CoRE, 5岡山県生科総研）
arima@muses.tottori-u.ac.jp【背景および目的】ササユリ（Lilium japonicum）はユリ科ユリ属に属する日本
固有の植物種であり，西日本に広く分布する球根植物である．本植物は古くか
ら観賞用，薬用，食用として利用されてきた．また，1300 年前から神事に使用され，その花を持ち帰ると疫病除けになると言い伝えがあるなど，その代謝産物が生理活性を有する可能性が指摘されている．しかし，本植物種は獣害や乱獲，さらには開花に播種後約 6 年を要するなど独自の生活環をもつことから，絶滅の危機に瀕しており，本植物の生物有機化学および分子生物学的知見は乏しい．また，ササユリは極めて多様性の高い植物種であり，主として形態による分類が行われているが，自生地により異なる形質を示すことが知られている．
そこで本研究では，ササユリの多様性を化学的視点から解析することを目的として，異なる自生地から採取されたササユリの香気成分を網羅的に分析し，比較を行った．また，ヤマユリを主とした他の類縁種についても同様の分析を行い，ササユリの化学的形質の特徴について解析を行った．
【方法および結果】植物材料は大神神社で管理・栽培されている中部地方から中国地方で採集されたササユリ，および類縁の在来ユリを用いた．植物体長，葉身長および葉身幅を記録するとともに，活性炭と ODS から構成される吸着材を環状に組み合わせ，ササユリの花弁内の生殖器官に引っ掛け一晩吸着させることにより香気成分を捕集した．吸着材を内部標準を添加したジクロロメタン 2mL で溶出し，GC/MS 分析に供した．MS スペクトルおよび標品との比較により香気成分を同定し，分析結果を多変量解析に供した．また，ササユリ以外の品種も同様に分析を行い，ササユリと他の類縁種との比較も進めている．

【背景・目的】Porphyromonas gingivalis は，主な歯周病原菌として知られる偏性
嫌気性グラム陰性細菌で，糖を資化できず，ヘムやペプチド，アミノ酸を栄養源として取得する．そのため，様々なペプチダーゼや赤血球凝集素を産生する
ことが知られ，これらの阻害は，菌の生育や歯周組織・赤血球破壊の抑制につながる．黄ニラは青ニラを遮光軟化栽培したものであり，青ニラとは成分が大きく異なる．我々はこれまでに，歯周病原因子の一つである P. gingivalis による赤血球凝集の阻害活性を，黄ニラ抽出物から見出した．本研究では，黄ニラ抽
出物に存在する赤血球凝集抑制物質の単離と同定を目的とした．
【方法・結果】5 品種の黄ニラと青ニラ（計 6 サンプル）の水抽出物を調製し，それぞれについて P. gingivalis の溶血，赤血球凝集，及びペプチダーゼ活性における阻害を評価した結果，いずれも青ニラより黄ニラが強い阻害活性を示した．
特に黄ニラ品種の 1 つであるミラクルグリーンベルトで，赤血球凝集に対する強い阻害活性が確認された．一方で，過熱や凍結乾燥，透析を行うと凝集阻害活性は減少した．また，単離工程の検討において，逆相クロマトグラムで複数の画分から阻害活性が見られたため，阻害に関与している物質が複数存在していることが示唆された．最も強い凝集阻害活性を示す物質の同定を目的として，
ミラクルグリーンベルトの水抽出物に対し，溶媒抽出，順相カラムクロマトグ
ラフィー，Sep-Pak C18 に供した結果，水抽出物（MIC：29.8 μg/mL）よりも87.8 倍高い活性を持つ画分（MIC：0.36 μg/mL）が得られた．しかし TLC 分析
において，分画後のサンプルにはアルデヒド，ケトン基やベンゼン環を持つ化合物が複数混在していることが示唆されたため，単離にはまだ工程が必要であることが分かった．

Chemotaxonomic analysis of floral scent composition in Lilium japonicum
populations and related species

Water-extract of yellow chive exhibit hemagglutinin inhibitory activity○Mizuki Fujisawa1, Tetsuya Matsukawa1, Yoshihiro Takikawa5, Shigeru Arai2,
Yoshiharu Akino3, Aya Yanagawa4, Shin'ichiro Kajiyama1(1BOST, Bioeng, Kindai Univ, 2Omiwa shrine, 3CBFS, Kyoto Inst., Technol., 4RISH,
Kyoto Univ., 5Plant Cnter, Kindai Univ)

Key words

Lilium japonicum, GC/MS, floral, chemotaxonomy○Yu Onishi1, Ryo Nakashima2, Sara Eltigani3, Natsuki Suzuki2, Tomohiro Bito2,
Katsuhiko Simizu4, Tadashi Hatanaka5, Jiro Arima2(1Grad. Sch. Agric., Tottori Univ., 2Fac. Agric, Tottori Univ., 3United. Grad. Sch.
Agric. Sci., Tottori Univ., 4CoRE., Tottori Univ., 5RIBS., Okayama)

Key words
chive

Porphyromonas gingivalis, Periodontal disease, Hemagglutinin, Yellow

164

2La04

チューリッポシド/チューリッパリン類の抗細菌活性の
精査

2La06

○加藤 康夫 1,2, 中川 恵蔵 2, 近堂 菜月 2, 北岡 直樹 1,2, 野村 泰治 1,2（1富山県大・生工研セ, 2富山県大工・生物工）
ykato@pu-toyama.ac.jp

気生微細藻類由来の抗菌活性を有する新規クロロフィル類の単離とその産生株の探索○三田 一至, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt13347@ns.kogakuin.ac.jp【目的】チューリップ組織中には糖エステルであるチューリッポシド (Pos) 類(PosA，B) が二次代謝産物として著量蓄積している．一方で，Pos 類のアグリコ
ンのラクトン化体であるチューリッパリン (Pa) 類 (PaA，B) も微量ながら存在している．チューリップ組織中において Pos 類は貯蔵物質であり，新規カルボ
キシルエステラーゼである Pos 変換酵素によって抗菌等の生理活性を示す Pa 類
へと変換される．しかしながら，Pa 類の各種細菌に対する IC50 値は百 μM～mM
オーダーであり，その活性は抗菌物質というには低い．今回演者らは，Pos/Pa
類の抗細菌活性を再精査し，評価したので報告する．
【方法及び結果】抗細菌活性の測定は，被検菌として枯草菌，大腸菌，肺炎桿菌，緑膿菌，黄色ブドウ球菌を用い，比濁法 (ISO 20776-1 に準拠；18 hr 培養)にて行った．抗菌活性測定中における Pos/Pa 類の安定性をみるため，培養後の培地中の Pos/Pa を定量したところ，ISO が推奨する Mueller-Hinton (MH) 培地中
では PosA，PaA は 18 hr 以上安定であったのに対し，PosB，PaB は化学的に極めて不安定（半減期 1 hr 以内）であり，MH 培地中では正しい抗菌活性が求められていないことが分かった．MH 培地に含まれる肉汁やカゼイン分解物に由来するペプチド成分が PosB，PaB の安定性に影響を及ぼすと考えて培地成分を検討し，M9 培地に酵母エキスを 0.2%とビタミン混液を添加した改変 M9 培地(mM9-0.2 培地) を設定した．mM9-0.2 培地中での Pos/Pa 類の安定性を確認した
ところ，MH 培地と比べて PosB，PaB の半減期は大きく伸びていた．同培地を用いて再度比濁法にて抗細菌活性測定を行い先の結果と比較したところ，
PosA，PaA の IC50 値はほぼ変化がなかったのに対し，PosB，PaB ともに大きく
抗細菌活性が向上し，特に PaB は kanamycin と同等の数～数十 μM の IC50 値を示すことが分かった．

【目的】陸上の基物表面上で生活している気生微細藻類のなかには，機能性脂質を蓄積する種が存在することが分かってきた．さらに，様々な生理活性物質を産生している可能性がある．抗菌活性を指標に抽出物を分離したところ，新規
クロロフィル類と考えられる画分が得られた．しかし，微量なため構造推定や機能評価が困難などの課題があった．そこで本報告では，気生微細藻類のコロニーからの抗菌活性を有するクロロフィル類の単離とその産生株の探索について述べる．
【方法】気生微細藻類のビロード状のコロニーは奥多摩地区檜原村の下元郷と数馬にある擁壁から採集し，そこから希釈平板法およびマイクロピペット法で 6種の藻株を単離した．コロニーについては緑化処理を施した後，クロロホルム/
メタノールを用いて粗抽出物を得た．シリカゲルカラムクロマトグラフィー，
TLC，HPLC で得た活性画分は，LC-MS または抗菌活性評価(ペーパーディスク法)により特徴づけを行った．抗菌活性評価の試験菌には，Kocuria rhizophila を使用した．
【結果と考察】気生微細藻類のコロニーの粗抽出物から各種クロマトグラフィー法を用いて活性画分を 5 画分得た．そのなかで，緑色画分 B-3-2 は，最大の阻止円(直径 15.2 mm)が認められた．抗菌活性を示す 5 画分は，いずれもクロロ
フィル b の吸収スペクトルに類似していたが，質量数が異なっており，新規のクロロフィルが含まれていると考えられる．一方，6 種の培養株の粗抽出物から得た画分では，Trentepohlia sp.を含む 3 種の藻体において抗菌活性が示された．培養株の活性画分の吸収スペクトルは一致せず，気生微細藻類はそれぞれ独自の抗菌活性を有するクロロフィル類を産生していると考えられる．今後，
構造および作用機構を解明すると共に，コロニーに存在する新規クロロフィル
類産生株を特定する．

Evaluation of an antibacterial activity of tuliposides and tulipalins

Isolation of antibacterial chlorophylls and screening of their producing
aerial microalgae○Yasuo KATO1,2, Keizo NAKAGAWA2, Natsuki KONDO2, Naoki KITAOKA1,2,
Taiji NOMURA1,2(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2Dep. Biotechnol., Toyama Pref.
Univ.)○Kazushi Mita, Nobuhiro Aburai, Yasusato Sugahara, Yasutada Imamura,
Katsuya Abe(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv. Eng., Kogakuin Univ.)

Key words

tuliposide, tulipalin, antimicrobial activity

Key words

aerial microalgae, antibacterial chlorophylls2La05

組換え分裂酵母を用いたナリンゲニン二糖配糖体の生産

2La07

赤潮プランウトン Heterocapsa circularisquama から分離された光依存性溶血毒素の多彩な生物活性○大橋 貴生, 窪村 有紗, 長谷川 友香, 三﨑 亮, 藤山 和仁（阪大・生工国際セ）
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp○小田 達也, 李 文成, 山口 健一（長崎大院・水産環境）
t-oda@nagasaki-u.ac.jp【背景】フラボノイドは主要な植物二次代謝産物の一つであり，単糖および糖鎖が付加した配糖体として存在している．これらの糖鎖構造は多様であり，物性および生物学的特性に影響を与える．苦味配糖体であるナリンギンは柑橘類に豊富に存在し，糖鎖としてラムノース（Rha）α1,2-グルコース（Glc）構造を持ったナリンゲニン二糖配糖体であり，抗酸化活性や血流改善効果を示すことが知られている．本研究では，これらの糖鎖合成を担う糖転移酵素群を分裂酵母に導入し，アグリコンであるナリンゲニンを基質とした連続的糖転移による
in vivo ナリンゲニン二糖配糖体生産を行った．
【 方 法 】 分 裂 酵 母 に シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 由 来 ナ リ ン ゲ ニ ン -7-O-Glc 転 移 酵 素（AtGT2），ブンタン由来 α1,2-Rha 転移酵素（Cm1,2RhaT），およびシロイヌナズ
ナ由来 UDP-Rha 合成酵素遺伝子を導入し，分裂酵母形質転換体を得た．形質転換体を用いた静止菌体法によるナリンギンの in vivo 生産を行い，逆相 HPLC により生成物を解析した．
【結果と考察】逆相 HPLC 解析の結果，3 つの酵素遺伝子を導入した酵母形質転換体は，ナリンゲニンからナリンギンを in vivo 生産することを確認した．次に，二糖目の糖転移に関与する Cm1,2RhaT をジャガイモ由来 Glc 転移酵素
（StGT）に替えることで，非天然型のナリンゲニン二糖配糖体が in vivo 生産できるかを検討した．その結果，AtGT2 および StGT 遺伝子を導入した酵母形質転換体を用いることで，基質ナリンゲニンから非天然型グルコシル化フラボノイ
ド配糖体の in vivo 生産に初めて成功した．

日 本 近 海 で 発 生 す る 赤 潮 の 原 因 微 細 藻 類 で あ る 渦 鞭 毛 藻 類 Heterocapsa
circularisquam は，カキやアコヤガイなどの二枚貝類に強い毒性を示す一方，魚類やその他の海洋生物に対する毒性はあまり示さない事が知られている．これまでの研究で本種は少なくとも 2 種類の溶血毒素を有していることを見出している．その 1 つは細胞表層に存在し，二枚貝類との直接接触により毒性を発現すると推定されている．本毒素は比較的高分子で，物理化学的に不安定である
ことからその精製は難しく，実態解明には至っていない．一方，他の溶血毒素
は細胞内に局在し，細胞破壊に伴い細胞外に放出される事，さらにアルコール抽出で分離可能であることが見出されている．アルコール抽出によって得られた毒素の精製により，本毒素は光依存性の溶血活性を示すポルフィリン誘導体
である事を見出している．
本研究では，このポルフィリン誘導体の生理活性解明を目的として抗菌作用について解析した．本ポルフィリン誘導体は光依存的抗菌作用を濃度及び光照射
時間依存的に示した．特にグラム陽性菌である S. aureus 及び B. subtilis により強い作用を示した．その抗菌スペクトルは市販の抗菌ポルフィリン誘導体とは異なっていた．光照射溶液中では時間と共に一重項酸素濃度が上昇した．その検出値は一重項酸素の特異的消去剤 histidine 添加により低下し，その抗菌作用も histidine により抑制された．以上より，H. circularisquama から得られた毒素
は光依存性抗菌作用を示す新規ポルフィリン誘導体であり，その作用には光活性化による一重項酸素産生が関与すると推定された．

Production of diglycoside naringenin using recombinant fission yeast

Photo-active hemolytic toxin isolated from red tide phytoplankton
Heterocapsa circularisquama○Takao Ohashi, Arisa Kubomura, Yuka Hasegawa, Ryo Misaki, Kazuhito Fujiyama(ICBiotech, Osaka Univ.)

Key words
rhamnose

Flavonoid, glycosyltransferase, Schizosaccharomyces pombe, UDP-

○Tatsuya Oda, Wencheng Li, Kenichi Yamaguchi(Grad. Sch. Fish. Sci. Environ. Stud., Nagasaki Univ.)

Key words

pigment, plant cell culture, marine, microorganisms

165

2La08

糸状性細菌 Sphaerotilus montanus が形成するマイクロチューブの化学構造と伸長パターン

2La10○藤原 篤男 1, 柏原 大輔 1, 河﨑 雄太 1, 近藤 敬子 2, 川村 出 1,
佐藤 道夫 3, 新田見 匡 1, 鈴木 市郎 1, 片平 正人 2, 武田 穣 1（1横国大院・工, 2京大・エネルギー理工学研究所, 3明治大・農）takeda-minoru-bd@ynu.ac.jp

Pseudmonas fluorescens 由来のピラジン生合成機構の解明○津田 佑介, 生井 智仁, 桝尾 俊介, 高谷 直樹（筑波大院・生命環境）
takaya.naoki.ge@u.tsukuba.ac.jp【背景と目的】Sphaerotilus montanus は活性汚泥常在の糸状性細菌である S.
natans に当初は包括されたが，2011 年に類縁種として独立した．Sphaerotilus 属の糸状化は，非連結性の桿状細胞列がマイクロチューブに内包されることによってもたらされる．内包される細胞の連携によって形成されるマイクロチューブ
は菌体外高分子による特異な微細造形物とみなせる．なぜなら，大半の菌体外
高分子は個々の細胞に粘質層や莢膜をもたらすに過ぎないからである．斬新な微細造形技術への手がかりを得るべく，我々はマイクロチューブの化学的実体と伸長機構の解明に注力している．今回は S. natans との対比を念頭に S.
montanus 型マイクロチューブの特徴づけを試みた．
【結果と考察】S. montanus からのマイクロチューブの調製を，以前に S. natansに対して確立したものと同じ手順で行ったところ，反復熱処理過程でマイクロチューブの崩壊が認められた．S. natans 型マイクロチューブ（システイニルグ
リシンと多糖の複合体）との耐熱性の差異を念頭に，熱処理を一回とすることで本来の形状を持つマイクロチューブを得た．マイクロチューブの固体 NMR
スペクトルと糖組成は S. natans とほぼ同じだったもののシステインは検出されず，熱感受性は S-S 架橋の欠如によると思われた．N-アセチル化を施すとマイクロチューブを可溶させることができたので溶液 NMR に供した．スペクトル解析の結果，多糖部分の構造は S. natans と同じながらアミノ酸は含まれず，ア
ミノ酸残基は安定化には寄与するものの形態形成の必須要素ではないと判明した．また，形態形成への遊離アミノ基の関与が示された．生菌に N-ビオチン化を施して培養した後，蛍光標識化した抗ビオチン抗体を作用させたところマイ
クロチューブの中央部のみが蛍光を放ち，S. natans と同じく末端伸長することが明らかとなった．

【背景および目的】 ピラジン化合物は香料や化成品の原料などとして広く利用される．また，抗菌活性や抗ガン活性など様々な生理活性を有する化合物も知られており，医薬・農薬原料としても重要な化合物である．産業利用されるピラジン化合物の多くは化学合成されたものであるが，ある種の植物や微生物は二次代謝産物として多様なピラジン化合物を生産することが知られている．しかしながら，これら天然のピラジン化合物の生合成機構はほとんど明らかになっていない．近年，我々は Pseudomonas fluorescens SBW25 株の papABCDEF 遺伝
子クラスターが，新規なピラジン化合物である 2,5-ジメチル-3,6-ビス(4-アミノベンジル)ピラジン (DMBAP) の生合成に関与することを見出した．本クラス
ターは 4-アミノフェニルアラニン (4APhe) の生合成に必要な papABC とピラジン環の形成に関与すると予想される papDEF からなる．本研究は，papDEF の機能を明らかにし，DMBAP の生合成機構の全貌を解明することを目的とする．
【結果および考察】 papABCDEF を導入した大腸菌を培養した後，培養液の上清を HPLC に供し分析したところ，4APhe，DMBAP，3-アミノ-4-(4-アミノフェニ
ル)-2-ブタノン (APB) の生産が確認された．APB の減少に伴って DMBAP の量が増加していること，また，その構造から APB は DMBAP の中間体であると考えられた．また，PapD，PapE，PapF の各酵素をそれぞれ精製し，各種分析を行なったところ，PapD は 4APhe にアセチル CoA のアセチル基を転移し APBを生じる反応を触媒するアセチル基転移酵素，PapE は DMBAP にメチル基を転移しメチル化 DMBAP を生じる反応を触媒するメチル基転移酵素，PapF は 2 分
子の APB が縮合して生じたジヒドロピラジンを酸化し DMBAP を生じる反応を触媒する FAD 依存酸化酵素であることが明らかになった．

Chemical structure and elongation pattern of the microtube formed by afilamentous bacterium, Sphaerotilus montanus

Mechanism for pyrazine biosynthesis by Pseudmonas fluorescens○Yusuke Tsuda, Tomohito Namai, Shunsuke Masuo, Naoki Takaya(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Atsuo Fujiwara1, daisuke Kashiwabara1, Yuta Kawasaki1, Keiko Kondo2,
Izuru Kawamura1, Michio Sato3, Tadashi Nittami1, Ichiro Suzuki1, Masato Katahira2,
Minoru Takeda1(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Inst. Adv. Ener., Kyoto Univ., 3Sch.
Agric., Meiji Univ.)
Key words
microtube, structural analysis, elongation, Sphaerotilus montanus

Key words

Pseudomonas fluorescens, pyrazine, biosynthesis

2La09

2La11

放線菌由来揮発性有機化合物が植物病原菌に与える影響

糸状菌シトクロム P450 の機能多様性とテルペノイドのコンビナトリアル生合成○大園 昂貴 1, 筌場 将太 1, 北岡 卓也 2, 一瀬 博文 2（1九大院・生資環, 2九大院・農）ichinose@agr.kyushu-u.ac.jp○前田 みのり, 大池 達矢, 岡南 政宏, 松川 哲也, 梶山 慎一郎,
阿野 貴司
（近畿大院・生物理工・生物工）
tano@waka.kindai.ac.jp【背景と目的】テルペノイドは植物や微生物の二次代謝産物として自然界に広く存在し，創薬シード化合物の探索資源としても興味が持たれている．その生合成では，テルペン骨格の形成を担うテルペン合成酵素と，骨格化合物への酸化修飾を施すシトクロム P450（P450）が重要な役割を果たしている．本研究では，木材腐朽担子菌および麹菌に由来する 425 種類の P450 を酵母細胞内においてテルペン合成酵素と共発現させ，多種多様なセスキテルペノイド（STP）
およびトリテルペノイド（TTP）のコンビナトリアル生合成を試みた．
【方法】ビサボレン（STP）およびルペオール（TTP）誘導体の合成を試みた．
ビサボレン合成酵素およびルペオール合成酵素を発現する酵母（Saccharomyces
cerevisiae）を得た後，糸状菌 P450 の発現プラスミドを形質転換してテルペン合成酵素と P450 を共発現させた．形質転換酵母が産生する代謝物を GC-MS 分
析に供し，ビサボレンおよびルペオールに活性を示す P450 を同定した．
【結果と考察】ビサボレン合成酵素と P450 を共発現する 425 種類の形質転換酵母を作製した．培養液中に蓄積する代謝物を分析したところ，P450 反応に依存
した 7 種類のビサボレン水酸化体が得られた．糸状菌 P450 機能の大規模スク
リーニングにより，セスキテルペノイドの戦略的合成を可能とする生合成マシナリーが発掘可能であることを示している．また，ルペオール合成酵素と P450を共発現させたところ，5 種の糸状菌 P450 がルペオールに対して活性を持つことが示され，3 種類の代謝物が得られた．糸状菌がルペオール合成能を有さないにもかかわらず，ルペオール変換活性を示す P450 が見出されたことは大変興味深い．本結果より，糸状菌 P450 を活用することで様々なトリテルペノイドの生産が可能になると期待された．

【背景と目的】世界人口の増加に伴い食糧問題が深刻化する昨今では，農業において更なる生産性の向上が求められている．特に農作物に悪影響を及ぼす植物病原菌の防除は，安定した作物生産には必要不可欠である．現在，その手段としては化学農薬が主流であるが，より複合的な効果を持つ微生物農薬にも注目が集まっている．微生物農薬の候補株として，当研究室では複数の植物病原菌
に対し抗菌活性を持つ放線菌の単離に成功している．これらの放線菌は培地上での抗菌活性のほか，気体状の抗菌活性物質を生産することが判明している．
今回は放線菌由来の揮発性有機化合物(VOCs; Volatile Organic Compounds)について知見を得るべく，植物を用いた感染防除試験にて防除効果がみられた放線菌 AR3，AR4 および AR10 株由来の揮発性抗菌活性物質に着目し調査を行った．
【方法と結果】まず各放線菌由来の VOCs が植物病原菌の菌糸生育に与える影響を調べた．放線菌胞子懸濁液（107 CFU/mL）100 μL を PDA 培地に全面塗布し，室温にて 3 日間培養した．その後，植物病原菌の寒天片を置いた PDA 培地と上下で組み合わせ，数日間培養し植物病原菌の生育面積を観察した．放線菌を植菌していないコントロール区と比較して抑制率を求め，それぞれの植物病原菌に対する抗菌活性を調査した．その結果，放線菌処理区では植物病原菌の生育が抑制された．また，放線菌由来の VOCs を回収し，GC-MS 分析に供した．先の試験と同様に放線菌を全面塗布したシャーレの内部に吸着材（Mono Trap
DCC18）を置き，さらに 3 日間静置培養し VOCs を吸着させた．吸着材を回収しジクロロメタンで抽出後，GC-MS 分析に供した．その結果，AR3 および AR4株ではごく近似したピークが検出された．AR10 株由来 VOCs の分析も含めて，現在同定を試みている．

Combinatorial biosynthesis of terpenoids using fungal cytochrome P450
monooxygenases.

Effects of volatile organic compounds derived from actinomycetes on
phytopathogens○Koki Ozono1, Shota Ukeba1, Takuya Kitaoka2, Hirofumi Ichinose2(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words

terpenoid, cytochrome P450, filamentous fungi○Minori Maeda, Tatsuya Ohike, Masahiro Okanami, Tetsuya Matsukawa,Shin'ichiro Kajiyama, Takashi Ano(Grad. Sch. BOST, Kindai Univ.)

Key words

actinomycetes, antimicrobial substances, phytopathogens

166

2La12

卵菌による長鎖多価不飽和脂肪酸生産能の比較○吉田 磨仁 1, 永峰 賢 2, 松下 貴子 1, 田中 淳和 3, 松浦 昌平 4,
東條 元昭 3
（1北大院・地環科, 2ロム, 3阪府大院・生環科, 4広島県・農技セ）
majin@ees.hokudai.ac.jp

2Ma02

酸素ラジカル処理がセルロース分解に及ぼす影響○糀谷 紗季 1, 酒井 杏匠 1, 上條 順也 1, 前林 正弘 1, 伊藤 昌文 2,
呉 準席 2, 堀 勝 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2名城大・理工, 3名大院・工）mkato@meijo-u.ac.jp

エイコサペンタエン酸(EPA)やドコサヘキサエン酸(DHA)などの長鎖多価不飽和
脂肪酸はヒトの必須脂肪酸であり，動脈硬化や心筋梗塞，脳梗塞などへの予防効果があるとされる．特に，EPA は抗脂血症薬などの医薬品としての需要が高
い．EPA や DHA の供給源は主に魚油であるが，漁獲高の不安定化や減少，食生活の変化などにより，EPA や DHA の摂取量は年々減少しいる．原生生物に属する卵菌(Pythium)のいくつかの種は EPA を作ることが知られている．そこ
で，魚油に代わる供給源として，Pythium を使って EPA を商業生産できないか検討している．
Pythium は，水中や土壌に生息する腐性菌として熱帯から寒帯にかけて広く分布する微生物である．これまでに 150 種以上が知られているが，脂肪酸の組成が調べられたのはわずか数種に限られており，EPA 生産の研究も 2，3 種についてのみである．そこで，EPA を合成する Pythium が他にも存在しないか，そして，EPA の商業生産に利用可能な種はいないかについて調べた．
まず，Pythium 16 種 29 系統について EPA 産生の有無を調べた．その結果，7 種
18 系統が EPA を産生していることがわかった．この 7 種のうち，3 種について
は，EPA を産生していることが今回初めて確認された．また，EPA 産生種である P. myriotylum について，様々な由来を持つ 12 系統でその EPA 含有量を比較したところ，系統間で大きな変異のあることがわかった．商業生産に適する系統を選抜するうえでの指標のひとつである増殖速度を EPA 生産株 18 系統で測定した．その結果，増殖速度は系統間で大きく異なることがわかり，その差は3 倍近くに達した．菌体密度が低いことなどの課題はあるが，測定された最も大きな増殖速度を基に試算すると，商業生産への利用も可能ではないかと考え
られる．

【目的】
セルロース分解の効率化は，バイオリファイナリーにおいて重要である．酸およびアルカリ前処理のような化学的方法は難分解性リグノセルロース構造を破壊するのに有効であることが実証されている．しかし，これらの方法は環境に悪影響を与えるため，新しい方法の確立が期待される．本研究では，プラズマによって生成する酸素ラジカルの反応性に着目し，酸素ラジカル処理がカルボ
キシメチルセルロース (CMC) ，および，麦わらの酵素分解に及ぼす影響について検討した．
【方法・結果】
酸素ラジカル処理または酸素ガス処理（コントロール）した CMC 溶液の粘度を測定したところ，酸素ラジカル処理によって，CMC 溶液の粘度が低下した．
従って，セルロース鎖が開裂し，低分子化していることが示された．さらに，
酸素ラジカル処理した CMC を Phanerochaete chrysosporium の培養上清と反応させ，反応溶液中の還元糖量を測定したところ，酸素ラジカル処理によって反応溶液中の還元糖量が 2.0 倍増加した．P. chrysosporium 培養上清中の細胞外タン
パク質のプロテオーム解析を行ったところ，Glycoside hydrolase 7 (GH7) familyに属するセロビオヒドロラーゼ I (CDH I) および GH6 family に属するセロビオ
ヒドロラーゼ II (CDH II) が主なセルロース分解酵素として検出された．市販のCDH I および CDH II と，酸素ラジカル処理した CMC を反応させたところ，コントロールに比べて還元糖量が 1.7 倍増加した．また，酸素ラジカル処理した
麦わらを P. chrysosporium 培養上清と反応させたところ，還元糖量が 1.8 倍増加
した．これらのことから，酸素ラジカル処理はセルラーゼによるセルロース分解を促進することが明らかになった．以上のことから，植物バイオマスの酸素
ラジカル処理は，リグノセルロースの分解効率を向上させることが示唆された．

Production of polyunsaturated fatty acids by Pythium

Effect of oxygen-radical pretreatment on cellulose degradation○Kiyohito Yoshida1, Tadashi Nagamine2, Takako Matsushita1, Yoshikazu Tanaka3,
Shohei Matsuura4, Motoaki Tojo3(1Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ., 2ROM, 3Grad. Sch. Life Environ. Sci.,
Osaka Pref. Univ., 4Hiroshima Pref. Agri. Res. Cent.)○Saki Kojiya1, Kiyota Sakai1, Junya Kamijo1, Masahiro Maebayashi1,
Masafumi Ito2, Jun-Seok Oh2, Masaru Hori3, Motoyuki Shimizu1, Masashi Kato1(1Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2Fac. Sci. Technol., Meijo Univ., 3Grad. Sch. Eng.,
Nagoya Univ.)

Key words
fungi

polyunsaturated fatty acid, eicosapentaenoic acid, Pythium, filamentous

Key words
pretreatment

atmospheric pressure plasma, biorefinery, cellulose, oxygen-radical

2Ma01

白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium 由来の class 3に属するシトクロム P450 CYP505D6 の機能解析

2Ma03

糸状菌 Aspergillus nidulans が種々の多糖応答的に生産する細胞外酵素の網羅的解析○ワイズ 里沙 1, 酒井 優 1, 酒井 杏匠 1, 神藤 定生 2, 志水 元亨 1,
加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2名城大・理工）
mkato@meijo-u.ac.jp○山口 愛彩 1, 酒井 杏匠 1, 糀谷 紗季 1, 木島 尚輝 1, 大堀 紗貴子 1,
小栗 莉奈 1, 高須賀 太一 2, 堀 千明 3, 志水 元亨 1, 加藤 雅士 1
（1名城大院・農, 2北大院・農, 3北大院・工）mkato@meijo-u.ac.jp【目的】白色腐朽菌 Phanerochaete chrysosporium はゲノム中に少なくとも 154 のP450 遺伝子を有しており，その中で class 3 に属するシトクロム P450 と P450
レダクターゼの融合タンパク質が 7 種存在していた．これまで，class 3 P450 の機能については，糸状菌 Fuzarium oxysporium 由来の P450foxy や，枯草菌のP450BM3 について詳細に研究がなされ，飽和脂肪酸の ω-1 ~ ω-3 位 を水酸化することが明らかになっている．しかしながら，P. chrysosporium の class 3 P450の機能については明らかとなっていない．本研究では，P. chrysosporium 由来のclass 3 P450 である CYP505D6 の機能解析を行った．
【方法および結果】 炭素鎖長 12 の脂肪アルコール （1- ドデカノール） 及び脂肪酸 （ラウリン酸） を CYP505D6 と反応させた．1- ドデカノールは ω-1 ~ ω-7位，ラウリン酸は ω-1 ~ ω-6 位が水酸化された．また，炭素鎖長 9 から 18 の飽和脂肪酸を基質として反応させたところ，炭素鎖長 9 から 15 までの飽和脂肪酸については ω-1 ~ ω-6 位，16 から 18 までの飽和脂肪酸については ω-1 ~ ω-4 位が水酸化された．さらに，CYP505D6 はナフタレン及び 1- ナフトールを水酸化した．以上のことから，P450foxy や P450BM3 と比較して，CYP505D6 は広い
基質特異性を有していることが明らかになった．現在，その理由について変異型酵素を調製し検討している．

【目的】 糸状菌 Aspergillus nidulans はデンプン，セルロース，ヘミセルロースの分解能を有していることから，それら多糖類の分解に関わる細胞外酵素およびそれらの転写制御についての研究が盛んに行われている．本研究では，種々の多糖類（結晶性セルロース (MCC)，カルボキシメチルセルロース (CMC)，キチン，キシラン，グルコマンナン，ガラクトマンナン）をそれぞれ唯一の炭素源として生育させた際に，A. nidulans が細胞外に分泌するタンパク質を網羅的に同定するため，セクレトーム解析を行った．また，同定されたタンパク質のうち，機能が既知のタンパク質とはアミノ酸配列の相同性がない HypotheticalProtein (HP) を選抜し，機能を明らかにすること目的とした．
【方法および結果】 種々の多糖類 (MCC，CMC，キチン，キシラン，グルコマ
ンナン，ガラクトマンナン) をそれぞれ唯一の炭素源として生育させた A. nidulansの培養ろ液から TCA/アセトン沈殿によりタンパク質を回収した．トリプシン
処理後，LC-MS/MS にてセクレトーム解析したところ，MCC，CMC，キチンを炭素源にして生育させたものと比較して，キシラン，グルコマンナン，ガラク
トマンナンを炭素源にした場合，より多種類のタンパク質が生産されていた．
CMC，キチンではセルロース加水分解酵素である GH5 や AA9 に属する lytic
polysaccharide monooxygenase が発現していた．GH26 と GH134 は β -マンナンに特異的に発現していた．同定されたのべ 578 種類のタンパク質の中で，82 種がHP であった．現在，いくつかの HP に関して大腸菌およびメタノール資化酵母
Pichia pastoris を用いて異種発現，機能解析を進めている．

Biochemical characterization of a self-sufficient cytochrome P450
CYP505D6 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium

Secretome analysis of Aspergillus nidulans in response to various
polysaccharides○Lisa Wise1, Yu Sakai1, Kiyota Sakai1, Sadanari Jindou2, Motoyuki Shimizu1,
Masashi Kato1(1Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2Sci. Tecknol., Meijo Univ.)

Key words

self-sufficient P450, Phanerochaete chrysosporium, CYP505D6○Aya Yamaguchi1, Kiyota Sakai1, Saki Kojiya1, Naoki Kijima1, Sakiko Ohori1,
Rina Oguri1, Taichi Takasuka2, Chiaki Hori3, Motoyuki Simizu1, Masashi Kato1(1Grad. Sch. Agric., Meijo Univ., 2Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ., 3Grad. Sch.
Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

Aspergillus nidulans, hypothetical proteins, secretome

167

2Ma04

Aspergillus glaucus MA0196 由来ハイマンノース型アス
パルティックプロテアーゼの遺伝子クローニングと異種
発現

2Ma06

Talaromyces cellulolyticus 由来新規 GH30 エンドキシラ

ナーゼの同定○中道 優介, 藤井 達也, 松鹿 昭則, 井上 宏之（産総研・機能化学）
nakamichi-y@aist.go.jp○林 理希 1, 土居 幹治 2, 竹中 慎治 1
（1神戸大院・農, 2マルトモ）
stakenaka@people.kobe-u.ac.jp【目的】
我々は，かつお節かび付けに伴う色相変化の機構を明らかにすることを目的とし，かび付けに用いられる Aspergillus 属糸状菌の生成する脱色因子の特性解析を行い，アスパルティックプロテアーゼが脱色に関与していることを明らかにした 1, 2)．分離株の中で A. glaucus MA0196 株は，MY20 培地で培養するとハイマンノース型の糖鎖を有するアスパルティックプロテアーゼ (PepA_MA0196) を分泌することがわかっているが，同酵素の一次構造の詳細や糖鎖の生理学的意義は明らかではない．そこで，遺伝子クローニングと Pichia pastoris による組換え酵素および変異酵素の異種発現を行ったので報告する．
【方法・結果】
精製酵素を PNGase F および Endo H で処理して糖鎖を切断し，SDS-PAGE に供すると，約 40 kDa のバンドが見られた．精製酵素をトリプシン消化した後，HPLC に供し，ペプチドマッピングを行った．分取したペプチドのアミノ酸配列の解析を行ったところ，既報の Aspergillus 属糸状菌由来のアスパルティック
プロテアーゼと高い類似性を示した．内部アミノ酸配列を基にプライマーを設計し，プロテアーゼ遺伝子のクローニングを行った．同酵素遺伝子の ORF は
1,367 bp で，4 つのエキソンと 3 つのイントロンから構成されていた．cDNA から推測される PepA_MA0196 のアミノ酸配列は，20 アミノ酸残基からなるシグ
ナル配列を含む 396 アミノ酸残基からなると推定した．また，推定アミノ酸配列中には N 結合型糖鎖の付加に必要とされているコンセンサス配列 (Asn-X-Ser/Thr) が 2 カ所見られた．つづいて，親株酵素と，コンセンサス配列中の Asn を
Gln に置換した一重および二重変異酵素を P. pastoris-pPICZαA 発現系にて分泌生産させ，いずれも N 型糖鎖修飾された活性体を得ることができた．
1) J. Sci. Food Agric. 93:1349-1355, 2013; 2) J. Sci. Food Agric. 97:95-101, 2017

CAZy データベースでファミリー GH30 に分類されるキシラナーゼとして，4O-メチルグルクロン酸側鎖を認識してキシラン主鎖を分解する細菌由来のグル
クロノキシラナーゼが知られている．近年，リグノセルロースを分解する糸状菌においても GH30 タンパク質の分泌生産が報告されているが，その機能はほとんど明らかにされていない．また，糸状菌由来の GH30 キシラナーゼは，細菌由来酵素において保存されている 4-O-メチルグルクロン酸側鎖を認識するア
ミノ酸残基が保存されておらず，基質キシランに対して異なる分解特性を示すものも報告されている．本研究では，リグノセルロース糖化酵素を高生産する
糸状菌 Talaromyces cellulolyticus (旧 Acremonium cellulolyticus) に由来する GH30
キシラナーゼを新たに同定し，その諸性質を明らかにした．
炭素源としてセルロースを含む培地中で培養した T. cellulolyticus の培養上清について，セクレトーム解析を行ったところ，GH30 に属するタンパク質が見出された．本タンパク質は，一次構造から，ファミリー GH30 の触媒ドメインとセルロース結合モジュール (CBM) ドメインを有することが示唆された．本菌のホモロガス発現系を用いて，本酵素を大量発現させ，精製後に酵素化学的諸性質を決定した．本酵素は，アラビノキシランとグルクロノキシランの両方に対して高いキシラナーゼ活性を示したことから，グルクロノキシラナーゼではな
く，新規のエンド β-1,4-キシラナーゼであることが分かった．また，本酵素はキシロースをほとんど生成せず，主として重合度が 2 以上のキシロオリゴ糖を生成した．

Cloning and heterologous expression of aspartic protease with highmannose oligosaccharides from Aspergillus glaucus MA0196

Identification of a novel GH30 endo-xylanase from Talaromyces
cellulolyticus○Lihui Lim1, Mikiharu Doi2, Shinji Takenaka1(1Grad.Sch.Agric.,Kobe Univ., 2Marutomo Co., Ltd.)○Yusuke Nakamichi, Tatsuya Fujii, Akinori Matsushika, Hiroyuki Inoue(Inst. Sustain. Chem., AIST)

Key words

Aspergillus glaucus, aspartic protease, glycosylation, Pichia pastoris

Key words
Talaromyces cellulolyticus, glucuronoxylanase, Glycoside hydrolase
family 30, xylooligosaccharide

2Ma05

Aspergillus oryzae で高発現させたタンナーゼ AoTanBOの酵素学的諸性質

2Ma07○市川 響太郎 1, 佐々木 克仁 1, 塩野 義人 1, 新谷 智子 2, 渡部 昭 2,
五味 勝也 2, 小関 卓也 1
（1山形大農, 2東北大院・農）tkoseki@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp

好熱性アーキア由来色素依存性 D-アミノ酸脱水素酵素のアーキアを宿主としたタンパク質発現系の構築と発現タンパク質の酵素化学的性質の解析○里村 武範 1,2, 江本 慎 1, 黒沢 則夫 3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5,
末 信一朗 1,2
（1福井大・工, 2福井大・ライフ, 3創価大, 4香川大・農, 5阪工大
院・工）satomura@u-fukui.ac.jp［背景・目的］タンナーゼはタンニンやカテキンガレート中の没食子酸エステルの加水分解を触媒し，茶飲料やワインの清澄等の食品産業や，生理機能を有す
る没食子酸の回収に利用されている．本研究では酵素製剤作製に向け，Aspergillus
oryzae 由来タンナーゼ遺伝子 AotanB（AO090023000047）を A.oryzae で発現させ，その酵素学的諸性質を解析した．また，Pichia pastoris で発現させた AotanB
を AoTanBP，A.oryzae で発現させた AotanB を AoTanBO と名付け，それぞれの諸性質の差異を明らかにすることを目的とした．
[方法・結果] AoTanBO は高発現用 glaA142 プロモーターの制御下で AotanB を形質転換した A.oryzae を，マルトースを含む液体培養で誘導し，発現させた．
AoTanBP は AotanB を形質転換した P.pastoris GS115 株を，メタノールを含む液体培養で誘導し，発現させた．AoTanB の生産性は A.oryzae を宿主した AoTanBOが顕著に優れていた．陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマ
トグラフィーで精製した AoTanBO は SDS-PAGE において 80-100kDa 付近，一方 AoTanBP では 90-120kDa 付近にスメアなバンドを示したことから，両酵素は糖鎖付加様式が異なることが示唆された．AoTanBO は AoTanBP と同様に最適
pH6.0，最適温度 30-35℃を示した．また，AoTanBO は 60℃(＞ 85%)まで安定
で，40℃(＞ 80％)までの AoTanBP との差異が見られた．なお，特許で報告されている A.oryzae を宿主として精製された AoTanB(P4370395)は，最適 pH7.0，最適温度 70℃，熱安定性 65℃(＞ 80％)と，AoTanBO とは特に，最適温度で異なる結果が得られ，アッセイ方法の違いが考えられた．現在，基質特異性解析を進めている．

[緒言]
色素依存性 D-アミノ酸脱水素酵素（Dye-DADH）は FAD を補酵素として含み
2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)のような人工酸化還元色素存在下で様々な D-アミノ酸の酸化反応を触媒する一群の酵素である．我々は好熱好酸性アー
キア Sulfolobus tokodaii に既存の Dye-DADH と 40%程度の相同性を示す DyeDADH ホモログを見出した．本研究では S. tokodaii に存在する Dye-DADH ホモログの機能同定と酵素化学的性質の解析を行うことを目的として研究を行った．
[方法・結果]S. tokodaii ゲノム情報から見出した Dye-DADH ホモログ遺伝子の大腸菌を宿主としたタンパク質発現の構築を行った．その結果，大腸菌で発現させた組換えタンパク質は封入体を形成しており酵素の機能同定ができなかった．そこで，
好熱好酸性アーキア S. acidocaldarius を宿主としたタンパク質発現系の構築を行った．S. acidocaldarius 細胞内で組換えタンパク質の発現を行った結果，可溶化酵素として発現することに成功した．本ホモログタンパク質を精製し酵素の機能同定を行ったところ，疎水性 D-アミノ酸に高い反応性を示す Dye-DADH
であることが明らかとなった．これまでに，バクテリア，アーキアで Dye-DADHは見出されているが，疎水性 D-アミノ酸に高い反応性を示す Dye-DADH の報
告例は無く新規酵素であることが明らかとなった．現在，本酵素のさらに詳細な酵素化学的性質の解析を行っている．

Enzymatic properties of recombinant tannase, AoTanBO, highly expressedin Aspergillus oryzae

A novel dye-linked D-amino acid dehydrogenase from thermophilic archaea:
purification, characterization and expression in archaea.

○Kyotaro Ichikawa1, Katsuto Sasaki1, Yoshihito Shiono1, Tomoko Shintani2,
Akira Watanabe2, Katsuya Gomi2, Takuya Koseki1(1Fac. Agric., Yamagata Univ., 2Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, tannase○Takenori Satomura1,2, Shin Emoto1, Norio Kurosawa3, Haruhiko Sakuraba4,
Toshihisa Ohshima5, Shin-ichiro Suye1,2(1Grad. Sch Eng., Univ, 2Life Sci., Univ Fukui, 3Souka Univ., 4Fac. Agric., Kagawa
Univ., 5Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words
flavoprotein, thermostable enzyme, D-amino acid, dye-linkd
dehydrogenase

168

2Ma08

Sulfolobus tokodaii 由来色素依存性 L-乳酸脱水素酵素の性質の解明2Ma10○宇野 紘平 1, 里村 武範 1,2, 黒沢 則夫 3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5,
末 信一朗 1,2
（1福井大院・工, 2福井大ライフ, 3創価大, 4香川大・農, 5阪工大
院・工）satomura@u-fukui.ac.jp

超好熱性アーキアにおけるユビキチン様タンパク質の機能解析○榊原 早津季 1, 秀瀬 涼太 2, 福田 青郎 1, 藤原 伸介 1
（1関西学院大・理工, 2神戸大院・科技イノベ）
fujiwara-s@kwansei.ac.jp[背景と目的] 色素依存性 L-乳酸脱水素酵素（Dye-LLDH）は FAD を補酵素とし人工酸化還元色素存在下で L-乳酸からピルビン酸への酸化反応を触媒する酵素である．我々は，好熱性アーキア S. tokodaii のゲノム情報から Dye-LLDH をコードしていると予測される遺伝子を見出した．Dye-LLDH をコードしていると考えられる遺伝子は本遺伝子の他に 3 つの機能未知遺伝子とクラスターを形成していた．このことから，これら 3 つの機能未知遺伝子は本酵素の機能に関与していることが示唆された．そこで，好熱性アーキア S. acidocaldarius を宿主としたタンパク質発現系を作成し，本遺伝子クラスターの発現を行った．その結果，
この遺伝子クラスターの発現産物から Dye-LLDH 活性を検出することができた．そこで，本研究では S. acidocaldarius を宿主としたタンパク質発現系で発現した Dye-LLDH の詳細な機能解析を行った．
[方法] dye-lldh 遺伝子を含む遺伝子クラスターを導入した Sulfolobus 用発現ベク
ターを用いて S. acidocaldarius の形質転換を行った．得られた形質転換株を培養し，Ni キレーティングクロマトグラフィー，陰イオン交換クロマトグラフィー
により目的タンパク質の精製を行った．次に，精製酵素について酵素化学的性
質の測定を行った．
[結果と考察] 2 段階の精製方法により S. acidocaldarius 形質転換株より DyeLLDH を生成することに成功した．精製酵素を SDS-PAGE で確認したところ
Dye-LLDH タンパク質の他にもう一つ，別のタンパク質を確認することができた．このことから，本酵素は異なるサブユニットから構成されるヘテロサブユ
ニット構造を有していることが明らかとなった．さらに，精製酵素の酵素化学的性質の測定を行った結果，本酵素の基本的性質の測定に成功した．現在，本酵素のさらに詳細な解析を進めている．

【目的】あらゆる生物において，モリブドプテリン（MPT）など含硫補因子やtRNA のチオ化修飾は生命維持に寄与している．常温生物ではユビキチン様タンパク質（ULP）が硫黄転移のキャリアーとして，MPT の生合成や tRNA のチオ化修飾に関与している．しかし，初期生命の形質を強く残す超好熱性アーキ
ア に お い て ， ULP の 全 容 は 不 明 で あ る ． 超 好 熱 性 ア ー キ ア Thermokoccus
kodakarensis は 3 つの ULP をもつ．本研究ではこれら ULP の生理機能を解明することを目的とした．
【結果と考察】T. kodakarensis の 3 種の ULP（TK1065, TK1093, TK2118）遺伝子を相同組換えによりそれぞれ破壊した．得られた破壊株のマルトオリゴ糖含有
栄養培地（85℃）での生育特性解析を行った．本菌はマルトオリゴ糖を資化でき，その経路には MPT 含有酵素が関与する．TK1093 や TK1065 破壊株はマル
トオリゴ糖含有栄養培地で野生株と同等に生育した一方，TK2118 破壊株は生育しなかった．TK2118 遺伝子破壊により MPT 含有酵素の活性が著しく減少したことから，TK2118 が MPT 合成に関与すると考えられた．次に，元素硫黄含
有栄養培地において高温ストレス環境下(93℃)でそれぞれの破壊株を培養した
ところ，野生株と比べて TK1093 破壊株のみ生育遅延を示した．好熱菌において tRNA のチオ化修飾は高温での生育に重要であるため，TK1093 は tRNA のチオ化修飾に関与すると予想された．T. kodakarensis 由来無細胞タンパク質生合成システムの至適反応温度は，本菌の生育至適温度（85℃）に比べて極めて低い（65℃）ことが問題となっている 1)．TK1093 が関わる tRNA の修飾機構は，高温下での効率的無細胞タンパク質合成技術開発への寄与が期待される．現在，
TK1093 破壊株の HPLC による tRNA のヌクレオチド残基のチオ化の有無の検証している．1) Endoh et al., J Biotechnol., 1,126, 186-95 (2006)

Characterization of dye-linked L-lactate dehydrogenase from Sulfolobus
tokodaii

Physiological role of ubiquitin-like protein in a hyperthermophilic archaeon

Key words
flavoprotein, thermostable enzyme, L-lactic acid, dye-linked
dehydrogenase

Key words

archaea, ubiquitin-like, thermophile, sulfur transfer

2Ma09

2Ma11

超好熱菌における NAD+熱分解産物の再利用代謝機構の解明○Kohei Uno1, Takenori Satomura1,2, Norio Kurosawa3, Haruhiko Sakuraba4,
Toshihisa Ohshima5, Shin-ichiro Suye1,2(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Life Sci. Univ. Fukui, 3Souka Univ., 4Fac. Agric.,
Kagawa Univ., 5Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)

好熱好酸性アーキアのマルチプル分子シャペロニンの機
能解析○Satsuki Sakakibara1, Ryota Hidese2, Wakao Fukuda1, Shinsuke Fujiwara1(1Sch. Sci. Technol., Kwansei Gakuin Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe
Univ.)○魚住 奎太, 山田 芽生, Putri Azalea, 福田 青郎, 藤原 伸介（関西大院・理工）fujiwara-s@kwansei.ac.jp○佐藤 喬章 1,2, 蜂須賀 真一 1,2, 跡見 晴幸 1,2（1京大院・工, 2JST・CREST）
takaakisato@sbchem.kyoto-u.ac.jp【背景と目的】分子シャペロニンはタンパク質の凝集を防ぎ，可溶化を促進す
る．好熱好酸性アーキア Sulfolobus 属は複数の分子シャペロニンサブユニット(α，β，γ)を有し，これらは温度環境の変化で組成変化を起こすことが明らかにされている．Sulfolobus acidocaldarius は，3 種類の分子シャペロニンサブユニット α(Saci_1401)，β(Saci_0666)，γ(Saci_1203)を持つ．本研究ではこれら 3 つの分
子シャペロニンに注目し，温度変化に加え pH ストレス環境下での発現動態を調べた．また遺伝子の破壊を試み，環境応答の変化からそれぞれのサブユニッ
トの生理的意義の解明を目指した．
【結果と考察】培養温度，pH を変化させて各分子シャペロニン遺伝子の転写産物量の変動を解析した．高温ストレス下(82℃)では，至適温度条件(75℃)と比較
して α 遺伝子と β 遺伝子の転写量が増加し，低温ストレス下(60℃)では 3 種類
すべての転写量が増加した．次にそれぞれを組換え体として取得し，ATPase 活性を調べた．ホモ α とホモ β 分子シャペロニンは 85℃以上でも活性の上昇が認められたが，ホモ γ は 65℃以上では活性が低下した．以上の結果から，高温ス
トレス下では α や β サブユニットが，低温ストレス下では 3 種の全てが機能していると予想された．この特徴は他の Sulfolobus 属と同様である．一方，生育
至適温度下で pH ストレスを与えたところ，pH2 では，3 種類とも転写量が減少
し，pH4 では β 遺伝子の高発現が維持された．β 遺伝子は温度ストレスに加え，pH ストレスに対しても応答，機能していると示唆される．次にシャペロニンの遺伝子破壊株の作成を試みたところ，γ 遺伝子破壊株のみ得られた．この株の生育を野生株と比較したところ，すべての温度，pH 条件でわずかな生育遅延が見られた．以上の結果は，γ サブユニットは生育に関与はしているものの必須ではないことを示している．

超好熱菌とは至適生育温度が 80℃以上の微生物の総称である．超好熱菌由来タ
ンパク質はほぼ全て高い耐熱性を有しており，工業的利用の面からも注目される．一方，超好熱菌が利用している小分子に目を向けると，意外と熱に弱い化合物もある．例えば nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form: NAD+)は，
超好熱菌を含め多くの生物にとって酵素による酸化反応における重要な補酵素であるが，85℃で ADP-ribose と nicotinamide に分解してしまうことが分かっている．NAD+を利用する酸化酵素を工業的に扱う可能性も踏まえて，我々は超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensis が NAD+の熱分解産物をどのように代謝しているのかを明らかにすることを目的として研究を進めてきた．ADPribose に関しては 2016 年度大会において，一般的な経路で代謝され得る ribose
5-phosphate および AMP に分解していることを報告した．Nicotinamide については 一 般 的 に 4-step 経 路 （ deamination→phosphoribosylation→adenylylation→amidation）か 2-step 経路（phosphoribosylation→adenylylation）と呼ばれる経路
によって NAD+に再生されることが知られている．しかし，本菌においてどちらの経路で代謝されるのかは不明であった．そこで，本菌においてphosphoribosylation を触媒すると予測される TK1676 タンパク質の生化学的解析
および 4-step 経路で機能する nicotinamide deamidase (TK1650)の遺伝子破壊株の作製・解析を行った．その結果，本菌は 4-step 経路により nicotinamide を NAD+に再生していることを明らかにできた．つまり nicotinamide は一度脱アミド化されてから，ホスホリボシル化およびアデニリル化され，その後再度アミド化される．なぜこのような一見無駄と思われる経路を利用しているのかについても議論したい．

The functional analysis of multiple chaperonins from thermoachidophilicarchaeon

Identification of a metabolic pathway salvaging thermal degradation
product from NAD+ in hyperthermophiles○Keita Uozumi, Mei Yamada, Azalea Putri, Fukuda Wakao, Fujiwara Shinsuke(Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ.)

Key words

chaperonin, archaea, thermoachidophiles, Sulfolobus acidocaldarius○Takaaki Sato1,2, Shin-ichi Hachisuka1,2, Haruyuki Atomi1,2(1Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ., 2CREST, JST)Key words

NAD(P)H, hyperthermophile, archaea

169

2Na01

ナイロン-6 分解候補株の取得のためのスクリーニング法の検討及び分解能の評価

2Na03

排水中の有機共存物質が Pseudonocardia sp. N23 株の1,4-ジオキサン分解に与える影響の評価○大久保 忠相 1, 井上 大介 1, 山本 哲史 2, 黒田 真史 1, 池 道彦 1
（1阪大院・工, 2大成建設）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp○上江田 真衣 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【背景】 プラスチックは優れた特徴から広く利用されている．一方で，焼却や埋め立て，リサイクルなど使用後の処理方法については，解決すべき課題を多く抱えている．そこで現在注目されているのが微生物分解処理である．しかし，本研究で着目したナイロン-6 についてこれまでに報告されている分解菌の種類は非常に少ない．そこで，我々の研究室ではポリエチレンテレフタレートや生分解性ポリエステル，ナイロン-6 などのプラスチックをモデルに酸やアルカリを用いた前処理を施し，プラスチックの表面構造を変化させ，プラスチック分
解能を有する微生物を簡便に取得できるスクリーニング方法を考案している．
本研究の目的はスクリーニングにより取得したナイロン-6 分解候補株の分解能の解析を行い，将来的にナイロン-6 の微生物処理を実現することである．
【方法】1×1 cm のナイロン-6 片を 60%ギ酸水溶液に 10 分間浸し，前処理を施した．次に炭素源を含まない培地 10 ml に前処理を施したナイロン-6 片と埋立地より採取した土壌 1 g を加え，30℃で 1 週間培養を行った．ナイロン片上に付着生育していた株をナイロン-6 分解候補株として寒天培地にて単離を行い，16S
rRNA 解析により同定を行った．その後，候補株を用いて同様の培地条件で分解実験を行い，培地成分の分析，ナイロン-6 片の重量や粘度変化を測定することにより分解能力を評価した．
【結果・考察】ナイロン-6 に前処理を施したものは，施していないものよりも寒天培地上に生育したコロニーの種類・数が多いことが分かった．スクリーニ
ングの結果，Pantoea agglomerans および Arthrobacter uratoxydans の 2 種をナイ
ロン-6 分解候補株として単離した．両株ともに分解実験前後のナイロン-6 表面構造に特徴的な変化が見られた．

【背景と目的】 1,4-ジオキサン (DOX) は，難分解性であり，また，発がん性の疑いがあることから，水環境中に放出されることによる環境リスクが懸念されている．近年，複数の DOX 分解菌が分離されているが，中でも Pseudonocardia
sp. N23 株は，高い DOX 分解能力を有し，酸性条件下でも高い分解活性を維持出来ることから 1)，実排水処理に有望な DOX 分解菌とみなされている．本研究では，N23 株の工場排水処理への適用に向けた検討として，DOX 含有排水中に含まれているアルコール類，アルデヒド類，有機酸，環状エーテル類，アセトンの共存が N23 株による DOX 分解に及ぼす影響を評価した．
【方法】DOX 50 mg-C/L と，各有機共存物質 50 または 500 mg-C/L を添加し，pH5.0 または pH7.0 に調整した 200 mL の無機塩培地を 500 mL 容三角フラスコに加え，MGY 培地で前培養した N23 株の菌体を 50 mg/L の濃度で植種し，28℃，120 rpm で 3 日培養し，分解試験を行った．
【結果】DOX 濃度の経時変化と 3 日間の菌体増加量を調べた結果，pH5.0 では，アルデヒド類や一部の有機酸の共存による DOX 分解の顕著な阻害が見られたが，それ以外の物質の共存では分解に大きな影響は見られなかった．他方，
pH7.0 では，試験した殆どの物質において，DOX 分解への顕著な影響は見られなかった．いずれの pH 条件でも顕著な DOX 分解阻害を示したのは，2-クロロ
メチル 1,3-ジオキソラン，500 mg-C/L の酢酸及びエタノールであった．これらの阻害物質を前処理で除去することにより，N23 株による良好な DOX 除去が可能であると示唆された．
【参考文献】1) Yamamoto et al. (2018) J. Biosci. Bioeng. (印刷中)

Evaluation of nylon-6 degrading bacteria screened by the efficient screening
method from the environment

Evaluation of 1,4-dioxane degradation ability of Pseudonocardia sp. N23 in
the presence of co-existing organic substances○Mai Ueta1, Takuya Kawanishi1,2, Noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)○Tadasuke Ookubo1, Daisuke Inoue1, Norifumi Yamamoto2, Masashi Kuroda1,
Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Taisei Corp.)

Key words

nylon-6, plastic degrading bacteria, screening

Key words

2Na02

スルファニル酸分解微生物への亜硫酸イオンの影響

2Na04○東山 明広, 喜多 晃久, 中川 克彦, 早瀬 伸樹（新居浜高専）hayase@chem.niihama-nct.ac.jp

1, 4-dioxane, bacteria, biodegradation, wastewater treatment

担子菌バイオリアクターによるトリクロサンの除去○山口 和真, 本間 裕人, 数岡 孝幸, 舘 博, 藤本 尚志, 徳田 宏晴（東農大・醸造）44617017@nodai.ac.jp【背景・目的】合成染料の一種であるアゾ染料は，現在最も利用されている染料である．これまでの研究により，水溶性アゾ染料は，微生物により比較的容易に分解しスルホン化芳香族アミン化合物を生成することが明らかになっている．
このスルホン化芳香族アミン化合物は染料と同様に難分解性で環境に悪影響を与える原因の一つになっている．本研究では，アゾ染料の一種である OrangeIIを分解することによって生成するスルホン化芳香族アミン化合物であるスルファ
ニル酸をモデルとして，微生物による分解，無毒化の検討を行った．
【方法・結果】本研究室でスルファニル酸を唯一の炭素源として長期間継代培養している集積培養液より，スルファニル酸分解微生物である 11A 株を新たに単離した．16SrRNA の塩基配列解析により 11A 株は Aminobacter sp.と同定された．スルファニル酸を単一炭素源とした無機塩液体培地に 11A 株を植菌し，振とう培養を行いスルファニル酸の分解試験を行ったところ，10 日間の培養で5.5mM のスルファニル酸を完全に分解した．また，培養上清の亜硫酸イオン濃度，硫酸イオン濃度の測定を行ったところ，スルファニル酸の分解にともない硫酸イオンが蓄積した．これまでに分離しているスルファニル酸分解菌 624S
株と比較して，11A 株では顕著な亜硫酸の蓄積は観察されず，11A 株にはスルファニル酸を分解し，同時に生成する亜硫酸イオンを酸化する能力がある可能性が示唆された．現在，スルファニル酸分解菌である 11A 株及び 624S 株の亜硫酸イオンの酸化能力について検討を行っている．

【目的】トリクロサン（TCS）は，石鹸や化粧品等の殺菌剤として広く利用されてきた．しかし，水生生物への毒性や健康への悪影響に対する懸念から 2016 年に FDA（米国食品医薬品局）により使用が禁止され，わが国でも代替品への転換措置がとられるに至った．本研究は，担子菌利用による TCS 除去を目的に，優良菌株の検索，取得菌の TCS 除去特性の解明，ならびに TCS 除去用バイオ
リアクターの構築を試みたものである．
【実験方法】（1）優良菌株の検索：当研究室保存菌（計 152 株）の培養液（PDB 培地を用い 30℃で 14 日間振盪培養）と TCS 溶液とを混合（混合後の TCS 濃度 1ppm）して穏やかに撹拌しながら30℃で 24 時間保持し，液中の TCS 濃度の低下により優良菌を選抜した．（2）
TCS 除去処理条件の検討：TCS 濃度，使用菌体量，処理温度・時間などを検討した．
（3）TCS の定量：HPLC（カラム：Wakosil II 5C18HG，カラム温度：50℃，
移動相＝メタノール：20mM リン酸溶液＝ 75：25，流量 0.8mL/min，検出器：
SPD-6AV（λ ＝ 230nm） 島津）によった．
【結果】TCS 除去率が 90％以上となった菌株は 3 株（ベッコウタケ SKB015，タマチョレイタケ SKB020 および
NBRC31332）であり，10ppm-TCS(水溶解度に相当)の除去も可能であった．TCS除去の主たる要因を探索すると共に，不織布を担体として気相生育法※）により調製した固定化担子菌を用いる TCS の繰り返し回分除去を試みたところ，繰り返し 12 回，延べ 288 時間以上にわたり安定した TCS 除去を行うことができた．
【参考文献】※）Tokuda.et al.,Food Preservation Science, 44(2) 71-77 (2018).

Effect of sulfite ion on sulufanilic acid degrading microorganisms

Biological removal of triclosan using basidiomycetes○Akihiro Higashiyama, Akihisa Kita, Katsuhiko Nakagawa, Nobuki Hayase(Niihama Natl. Coll. Technol.)Key words

sulfanilic acid, biodegradation, sulfite ion○Kazuma Yamaguchi, Hiroto Honma, Takayuki Kazuoka, Hiroshi Tachi,
Naoshi Fujimoto, Hiroharu Tokuda(Dept. of Ferment. Sci. Tokyo Univ. of Agric.)

Key words

Triclosan, basidiomycetes, bioreactor

170

2Na05

塩素化エチレン類の加温による浄化促進における細菌群
集の動態解析

2Na07○鈴木 市郎 1,2, 田 小維 2, 川村 美帆 1, 北村 岳 3, 山﨑 祐二 3,
小林 剛 2,4（1横国大院・理工, 2横国大・リスク共生セ, 3竹中工務店, 4横国大院・環）
suzuki-ichiro-db@ynu.ac.jp

水田土壌における生物的環境の解析○荒木 希和子 1, Aziz Amin ABD 2, 久保 幹 1（1立命館大・生命科学, 2立命館大院・生命科学）
kiwakosa@fc.ritsumei.ac.jp【緒言】塩素化エチレン類による地下水汚染等の生物学的浄化では，加温により微生物の生育や汚染物質の土壌からの脱離を促進することで浄化期間の短縮が期待できる．トリクロロエチレン(TCE)やシス 1,2-ジクロロエチレン(cDCE)を添加した培地に Dehalococcoides 属を含む集積培養系を植種し 15℃～35℃で培養した結果，TCE の脱塩素化速度定数は 30℃が最大であったのに対し，反応で生じたクロロエチレン(VC)の脱塩素化は 25℃で最大値を示した(1)．そこで，各温度における細菌叢の動態の違いを次世代シーケンスにより解析した．
【方法】培地に TCE または cDCE を添加した脱塩素化実験で経時的に採取したサンプルより DNA を抽出し，16S rRNA 遺伝子の V4 領域を含む約 250 bp を
PCR で増幅し，Illumina MiSeq で塩基配列を解読した．Qiime で操作的分類単位(OTU)に振り分けたのち，優占度上位の OTU 群の割合の経時変化（動態）をHorn 指数を用いて比較し，類似した動態を示す OTU を階層的クラスタリング
で分けてその動態をグラフ化した．
【結果】TCE，cDCE を用いた培養て検出された細菌群の OTUs のうち，優占度の上位を占める 821 OTUs をクラスタリングし，15 クラスターに分割した．
25℃で増殖が極大を示したクラスターは 1 つで，その中に TCE から VC まで脱塩素化が可能な Dehalococcoides が含まれていた．一方，25-30℃で高い増殖を示した 2 つのクラスターには TCE の脱塩素化が報告されている Deslfovivrio の近縁種が含まれていた．これらの傾向は TCE，cDCE で大差なく，細菌叢の動態には添加した塩素化エチレンの種類よりも加温による影響が大きいことが判明した．
(1)Tian et al., Water and Environ. Technol. Conf. 2016 (WET2016), 3A-08 (2016).

【背景と目的】土壌環境には，その土の性質に加え，土地の利用方法が大きく影響する．継続的な管理が行われる耕作地では，人為的な管理体制の影響が大き
い．耕作地の一つである水田では，耕作期に土壌を冠水させるため，一年を通じて土壌中の環境条件（水分量や好気・嫌気性）が変化する．一方，様々な作物に合わせた管理がなされる畑作地に対し，イネのみを繰り返し栽培する水田
では，イネに特化した施肥管理が行われる．さらに，化学肥料や有機肥料，農薬といった使用する資材の違いも土壌環境に変化をもたらすと考えられる．本
研究では，水田の土壌環境の特性を把握し，有機農法による適切な管理体系を確立することを目的とし，日本の水田土壌を解析し，畑土壌およびアジア諸国の土壌との比較解析を行った．
【結果と考察】日本各地の水田より採取した土壌を調べたところ，土壌中の炭素
量 は 平 均 15,100 mg/kg ， 窒 素 量 は 1,050 mg/kg ， 細 菌 数 は 3.1×107 ～ 4.0×109
cells/g であった．畑土壌と比較して，炭素量と窒素量が少なく，微生物量が多いことがわかった．特に土壌が冠水されている時期に総細菌数が高かった．これは水田では資材投入量が少なく管理されていることが考えられる．また冠水することで，土壌細菌叢が調整され，窒素固定菌など嫌気性細菌を含む多様な微生物が維持されていることが示唆される．さらに窒素量が高いほど総細菌数が増加し，C/N 比のバランスが崩れると総細菌数と窒素循環活性 (硝化細菌の働き) が減少する傾向があった．一方，アジア諸国の水田土壌は炭素量が低いもしくは高い土壌に二分され，いずれの土壌でも総細菌数が低かった．このことから，水田では冠水環境で生育する微生物に適した有機施肥を行うことが，イ
ネの有機栽培に重要であると考えられる．

Population changes of bacterial communities on thermally-enhanced
biodechlorination of chlorinated ethenes.

Characterization of biological environments of paddy fields

Key words
bioremediation, volatile organic compound, Dehalococcoides, next
generation sequencing

Key words

2Na06

2Na08

○Ichiro Suzuki1,2, Xiaowei Tian2, Miho Kawamura1, Gaku Kitamura3,
Yuji Yamazaki3, Takeshi Kobayashi2,4(1Grad. Sch. Eng. Sci., Yokohama Natl. Univ., 2CCSSR, Yokohama Natl. Univ.,
3
Takenaka Corp., 4Grad. Sch. Environ., Yokohama Natl. Univ.)

ポリ塩化ビフェニル類汚染地区に棲息する嫌気性微生物に関する調査○Kiwako S. Araki1, ABD Amin Aziz2, Motoki Kubo1(1Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)髙塚 由美子 1, ○原 富次郎 1, 平野 竜行 2
（1京大エネ研, 2竹中工務店）
t-hara@iae.kyoto-u.ac.jp

soil bacteria, organic matter, paddy field, soil environment

農薬が土地微生物へ及ぼす影響解析○中村 明日香 1, 森田 涼斗 1, 荒木 希和子 2, 久保 幹 2（1立命館大院・生命科学, 2立命館大・生命科学）
kubo@sk.ritsumei.ac.jp

ポリ塩化ビフェニル類 (PCBs) は，深刻な環境汚染を引き起こす難分解性の有機
塩素化合物の一つである．我々は，大阪市内の PCBs 汚染原位置とその周辺域の自然浄化の一要因として，そこに棲息する微生物種を調査・解析し，PCBsの科学的自然減衰モデルの構築を最終目標に研究を進めている．本講演では，とりわけて PCBs を脱塩素化すると報告のある嫌気性微生物の集積について調査したので報告する．実験は，まず原位置とその周辺域に設けられた 4 本の井戸 （No.1，No.2，No.3，ピット外） から，微量な砂礫を含んだ揚水を，月 1回，合計 6 回採取した．次に，採取した試料に PCBs 脱塩素化微生物が含まれることを確認するため，16S リボソーム遺伝子による系統分類解析を試みた．
さらに，微生物による PCBs 脱塩素化反応は，テトラクロロエチレン (PCE) から塩素を離脱させる Dehalococcoides 属や Dehalobacter 属，Desulfitobacterium 属の細菌に認められることから，これらを取得するため，先の解析によってこれ
ら細菌を含むと予断した試料へ，PCE や炭素源，電子供与体を添加した集積培養を試みた．以上の結果，系統分類解析から，Dehalococcoides 属は No.1 とピッ
ト外，Dehalobacter 属は No.1～No.3，Desulfitobacterium 属は 4 本全ての揚水井に棲息すると推定した．一方，集積培養の結果，No.1～No.3 の揚水井から
Desulfitobacterium 属が増殖したことを，遺伝子レベルで確認した．本要旨の投稿時において，これら細菌種の低い増殖性の影響から，純粋培養までに至っていない．細菌を単離した後は，PCBs から塩素を離脱させるかどうか確認したい．

【背景と目的】単一の作物を栽培する畑土壌では，土壌中の微生物叢に偏りが生じやすく，作物に病害を与える病原菌や病害虫が増殖することがある．病原菌への対処法として，土壌を燻蒸するという方法が用いられている．土壌燻蒸法には，熱を用いる方法と燻蒸剤を用いる方法がある．燻蒸剤の継続的な使用は，土壌中の複雑な微生物群集に影響を及ぼし，生物多様性をより低下させることが懸念される．また，農薬の成分が土壌中で分解され，その過程で生じる中間分解産物が周辺の環境に影響を及ぼす可能性も考えられる．本研究では農薬が微生物に与える影響を調べるとともに，農薬に耐性のある微生物の分離・同定を目的とした．
【方法】30 年以上にわたり燻蒸剤が使用されていた土壌中の細菌数の測定を，
スローステアリング法を用いて行った．次に農薬が細菌に与える影響を調べる
ため，3 種の農薬（クロルピクリン，DD 剤，ネマトリンエース）を 4 段階の濃度で，Escherichia coli JM109 と Bacillus subtilis (natto) TAKAHASHI を植菌した液体培地に添加し，培養した．培養後，寒天培地に培養液を塗布し生育を観察した．次に，農薬耐性菌株を単離するため，30 年以上にわたり土壌燻蒸が使用されていた土壌から微生物を単離し，DNA シークエンス解析を行い菌株の同定を行った．
【結果】農薬を長期的に使用した土壌中の細菌量は検出限界（6.0×106 cells/g）以下であった．3 種の農薬の内，クロルピクリンと DD 剤を添加すると E. coli と
B. subtilis 共に減少した．農薬の種類により単一菌株に対する影響は異なり，同一の燻蒸剤の場合でも細菌の種類により影響は異なることが考えられた．農薬
耐性菌株を同定したところ，Bacillus 属細菌であることが明らかになった．この菌は，今後農薬のバイオレメディエーションに活用できる可能性がある．

The investigation for anaerobic bacteria in sand-laden water from
Polychlorinated biphenyls-contaminated sites.

Impact of long-term use of chemical substances on agricultural soil
environment

Key words
Polychlorinated biphenyls, Monitored Natural Attenuation, anaerobic
bioremediation, dehalogenation

Key words

Yumiko Takatsuka1, ○Tomijiro Hara1, Tatsuyuki Hirano2(1IAE, Kyoto Univ., 2Takenaka Corp.)○Asuka Nakamura1, Ryo-to Morita1, Kiwako S. Araki2, Motoki Kubo2(1Grad. Sch. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 2Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ.)

Agrochemicals, soil, microorganisms

171

2Na09

ATAD プロセスにおける未培養主要好熱細菌の分離および FISH 法による直接観察

2Na11○新井 智博, Tu Phuong Trang, 藤本 遼, 田代 幸寛, 酒井 謙二（九大院・生資環）
kensak@agr.kyushu-u.ac.jp

回転型スラリーバイオリアクタを用いた高濃度 A 重油
汚染土壌の浄化○三好 佑奈 1, 浦田 智宇 1, 岡田 丈 2, 新谷 政己 1, 金原 和秀 1
（1静大院・総合科技, 2静大・工）kimbara.kazuhide@shizuoka.ac.jp【背景・目的】 自家発熱型高温好気消化(ATAD)は，微生物群による有機物の好気的分解熱を利用して高温下で汚泥・し尿等を液肥に変換するプロセスである．
理化学特性・微生物群集構造解析の変化追跡により，福岡県築上町で稼働する
本プロセスはユニークな 3 段階で進行することを報告している(Tashiro et al.,
AEM, 2018)．特に，消化終期には，Heliorestis baculataT に 84%と低い相同性を示す未培養細菌が主要菌となることが明らかとなったが，本菌の性状・機能は不明である．そこで本研究では，本細菌の分離および蛍光 in situ ハイブリダイ
ゼーション (FISH)法による直接観察を行い，その形状を明らかにした．
【方法】 消化中・終期の液肥より調製した固体培地を用いて，消化終期の ATAD
試料から主要細菌の分離を 57°C で試みた．16S rRNA 遺伝子情報を基に目的細菌及び近縁種に特異的な FITC 蛍光プローブを設計した．FISH 法により染色した ATAD 試料をフローサイトメトリーで検出し，目的細菌の形状を蛍光顕微鏡で観察した．
【 結 果 ・ 考 察 】 固 体 培 地 で は ， 消 化 中 期 の 主 要 菌 で あ る Geobacillus
stearothermophilus 類縁菌が分離できたが，消化終期の目的細菌は分離されなかった．FISH 法により染色した消化終期の ATAD 試料をフローサイトメトリーに供した結果，FITC 由来の高強度蛍光ピークが検出され，同時に，高 FSC（forward
scatter）および高 SSC（side scatter）を示した．さらに，蛍光顕微鏡観察により，ATAD 試料中のフロックから強い蛍光が観察された．以上の結果，設計したプローブは有効であり，目的細菌がフロックを形成して存在していると考えられた．現在，顕微蛍光マニピュレータを用いてフロックの液系分離を検討している．

【背景と目的】油類の流出による土壌汚染は，近年大きな問題として取り上げられ，その解決方法として，分解微生物を投入するバイオオーグメンテーションがある．本手法は，低コスト，低環境負荷とされている一方，浄化に必要な期間が予測できないなど確実性が低いとされている．我々は，燃料油の一種である A 重油で汚染された土壌の効率的浄化法の開発を行っており，Rhodococcus
erythropolis に属する 2 種の油分解菌，菌株 A，C（「微生物によるバイオレメ
ディエーション利用指針」適合確認済）を用い汚染土壌中の A 重油分解を報告している．本研究では，高濃度の A 重油で汚染された実汚染土壌の高速処理を目指し，回転型スラリーバイオリアクタを用いた浄化法の開発を行った．
【方法】ドラム型リアクタを用い，赤玉土 180 g，芝目砂 120 g，無機培地 200mL を混合したモデルスラリーを調製した．そこに菌株 A，C を約 3.0×108 cells/
g-slurry となるよう接種し，A 重油を終濃度 2500，5000 mg/kg-slurry で加え，15°C の低温条件下で分解試験を行い，2 日毎に A 重油残存濃度および菌数の測定を行った．また，分解菌を接種せずに回転させた試料や，分解菌を接種して回転させない試料を準備して対照実験を行った． 並行して使用したモデル土や水などから土着の A 重油分解菌の単離を試みた．
【結果と考察】A 重油濃度 2500 ならびに 5000 mg/kg とした試料において，分解菌を接種し，リアクタを回転させることで，それぞれ 96 h までに約 98％，144
h までに約 91％の A 重油が分解された．対照実験の結果と比べると，分解菌の接種と，リアクタの回転によって，A 重油分解の速度・効率が促進したことが示された．なお分解菌を接種しない条件でも 6 日後に分解が認められた．使用したモデル土・水から A 重油分解菌が単離されたことから，土着の分解菌が A
重油分解に寄与したと考えられた．

Isolation of unculturable thermophilic bacteria in ATAD process and theirdetection by FISH method

Remediation of contaminated soil by high concentration A-fuel-oil withrotated slurry bioreactor

Key words
autothermal thermophilic aerobic digestion, closest species to
Heliorestis baculataT, FISH, isolation

Key words
bacteria

rotated slurry bioreactor, bioaugmentation, A-fuel-oil, oil degrading

2Na10

2Na12

下水処理施設におけるバルキング関連糸状性細菌
Kouleothrix の季節変動とその影響因子○Tomohiro Arai, Phuong Trang Tu, Ryo Fujimoto, Yukihiro Tashiro, Kenji Sakai(Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.)

白色腐朽菌-細菌共培養系におけるアセタミプリドの分解○Yuna Miyoshi1, Tomotaka Urata1, Joh Okada2, Masaki Shintani1,
Kazuhide Kimbara1(1Grad. Sch. Shizuoka Univ., 2Fac. Eng., Shizuoka Univ.)○鈴木 康太 1, 新田見 匡 1, 小林 稔真 1, 笠倉 理紗 1, 武田 穣 1,
小柴 佑介 1, 福田 淳二 1, 鈴木 市郎 1, 飛野 智宏 2
（1横国大院・工, 2東大院・工）nittami@ynu.ac.jp○大野 遥 1, 森 智夫 2, 河岸 洋和 2,3,4, 平井 浩文 2,3（1静大院・総合農, 2静大・農, 3静大・グリーン研, 4静大・創科技院）
hirai.hirofumi@shizuoka.ac.jp

世界で広く使用されている殺虫剤の一つであるネオニコチノイド系殺虫剤（NEOs）は，1990 年代に開発された比較的新しい農薬である．NEOs はニコチ
ン性アセチルコリン受容体のアゴニストであり，昆虫の中枢神経系を撹乱する
ことによって選択的な生物学的毒性を発揮する．最近では，その残効性や植物
浸透移行性に由来する環境に対する悪影響やヒトへの影響が懸念されており，
すでに EU では NEOs に対する規制が実施されている．そのため NEOs 汚染環
境の浄化・無毒化技術の開発は喫緊の課題である．
我々はこれまでに白色腐朽菌 Phanerochaete sordida YK-624 株によって，種々のNEOs が分解可能であり，その分解反応にシトクロム P450（CYP）が関与していることを報告している．一方で，同属の P. chrysosporium も ACE を 6-chloro-3pyridinemethanol（IM 0）へと分解可能であり，P. chrysosporium 由来 CYP 酵母
異種発現機能スクリーニングシステムにより，この分解反応には CYP5147A3が関与していることを明らかにした．以上の様に，白色腐朽菌は NEOs の側鎖構造の変換には優れているものの，完全分解を考えた場合，NEOs の複素環構
造を分解可能な細菌との共培養系の確立が必要となってくる．そこで，P.
chrysosporium による ACE の完全分解を目的に，自然界より IM 0 を単一炭素源として生育可能な細菌を単離し，P. chrysosporium と共培養を行った結果，ACE
分解を促進あるいは抑制する細菌が得られた．現在，ACE 分解を促進する機構について解析中である．

【背景と目的】糸状性細菌により誘引される活性汚泥のバルキングは，廃水処理施設の運転管理における未解決問題の一つである．我々の先行研究において，横浜市の複数の下水処理施設では，夏季に糸状性細菌 Kouleothrix の存在量と活性汚泥の沈降性との間に正の相関がみられ，Kouleothrix がバルキングの原因となっている可能性が示唆された．本研究では両者の関係を年間を通して確認するとともに，下水処理施設の水質・運転管理データを解析し，Kouleothrix の増減に影響を与える因子を探索することを目的とした．
【方法】横浜市内の都市下水処理施設 A において，処理方式の異なる 2 系列（系
列 1, 2）より活性汚泥試料を採取した．各試料 1 mL から DNA を抽出し，既報の real-time PCR 法により Kouleothrix の 16S rRNA gene のコピー数を定量した．
得られた Kouleothrix のコピー数のデータを下水処理施設の水質・運転管理デー
タとともに偏相関分析に供した．
【結果と考察】系列 1 では年間を通して遺伝子コピー数と活性汚泥の沈降・濃縮性指標である SVI に大きな変化はなく，両者の関係は不明瞭であった．一方系
列 2 においては遺伝子コピー数と SVI が類似した増減挙動を示した．両系列のコピー数と SVI との関係について季節ごとに分けて相関分析を行ったところ，
系列 2 の夏季から秋季において両者に強い正の相関があることを確認した．系
列 2 では Kouleothrix の増殖に影響を与えていた因子を特定するため，Kouleothrixの遺伝子コピー数，および下水処理施設の水質・運転管理データを用いて偏相関分析を行った．その結果，遺伝子コピー数は生物反応槽の汚泥滞留時間および最初沈殿池越流水中の浮遊物質量と強い正の相関を示した．

Degradation of acetamiprid by co-culture of white-rot fungi and bacteria

Seasonal variation of bulking-causing filamentous bacteria Kouleothrix in a
municipal wastewater treatment plant and its influential factors○Haruka Ono1, Toshio Mori2, Hirokazu Kawagishi2,3,4, Hirofumi Hirai2,3(1Grad. Sch. Agric., Shizuoka Univ., 2Fac. Agric., Shizuoka Univ., 3Res. Inst. Green
Sci. Technol., Shizuoka Univ., 4Grad. Sch. Sci. Technol. Shizuoka Univ.)

Key words

white-rot fungi, bioremediation, coculture, neonicotinoid○Kota Suzuki1, Tadashi Nittami1, Toshimasa Kobayashi1, Risa Kasakura1,
Minoru Takeda1, Yusuke Koshiba1, Junji Fukuda1, Ichiro Suzuki1, Tomohiro Tobino2(1Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ., 2Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

activated sludge, bulking, filamentous bacteria, Kouleothrix

172

2Oa01

iPS 細胞の分化能に対するフローサイトメトリー法の
考察

2Oa03

○藤本 舜, 岡野 健太郎, 金 美海, 紀ノ岡 正博（阪大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

インクジェット技術による超瞬間細胞凍結保存法のhiPS 細胞への応用○渡部 広機 1, 瀧澤 秀世 1, 山田 茂 2, 諫田 康成 2, 秋山 佳丈 1
（1信州大・繊維, 2国立医薬食衛研）
aki@shinshu-u.ac.jp【背景と目的】iPS 細胞の創薬支援や細胞治療への応用に向けて，より多くの均質な細胞を得る培養手法の開発が必要である．培養手法の開発と平行して，培養中の細胞の状態を評価する手法を構築することが重要である．フローサイト
メトリー（FCM）はヘテロな細胞集団をシングルセルで解析することが可能な点から一般的な評価方法である．しかし，機器の感度設定や蛍光補正，対象とする細胞集団のゲーティングといった測定者の主観に依存した誤差が存在することや抗体反応を用いるため目的細胞を分離できる反応条件を検討する必要があることが課題となっている．本研究では FCM の性能及び限界に着目し，iPS
細胞の未分化性と分化能の評価における有用性を考察する．
【方法と結果】ヒト iPS 細胞を StemFit 培地とラミニン 511-E8 フラグメントでコ ー ト し た 培 養 面 上 で 培 養 を 行 い ， 未 分 化 マ ー カ ー （ SSEA4, TRA-1-60,
OCT3/4）の発現を FCM にて解析した．FCM 分析のヒストグラムでの解析を行う際，非特異性な吸着によるバックグラウンドを除くために，陰性コントロー
ル（アイソタイプコントロール）を用いるが，OCT3/4 においては陰性コント
ロールのヒストグラムと完全に分離できなかった．このことから，より精度の高い測定を行うため，反応条件（抗体濃度，温度，時間など）の最適化を行い，目的細胞の蛍光の感度を調節する必要があることが分かった．一方，分化誘導
培養における細胞集団の定量評価のためには，未分化性と分化能を特徴づける
細胞表面マーカーと細胞内マーカーの組み合わせによる表現型を同定する必要があるため，細胞表面マーカーと細胞内マーカーの特徴（細胞内での位置，他の分子との関係，安定性）を考慮し，FCM にて解析する必要があると考えられた．今後は，細胞培養工程にて，培養特性と細胞特性の変動による未分化性と分化能への影響を検討する．

細胞生物学研究において，細胞凍結は必要不可欠な技術である．従来の細胞凍結法では，DMSO やグリセロール等の凍結保護剤の添加が必須であった．しかし，これらの凍結保護剤は，一般に細胞毒性を有しており，操作者の熟練度によっては多くの細胞が死滅する可能性もある．特に，ヒト人工多能性幹細胞（hiPS 細胞）を含む幹細胞においては，DMSO が分化因子として作用してしまう問題も存在している．これまでに，我々は，インクジェット技術を用いて細胞をこれまでになく高速で冷却することで，超瞬間的に凍結できる装置を開発した．本装置では，インクジェットにより細胞を微小液滴中に内包し，液体窒素で冷却した基板に吐出する．これにより，冷却速度を飛躍的に向上させ，凍結保護剤を用いることなく，細胞に損傷を与える氷晶の生成・成長を抑制することができる．そして，本装置により，マウス繊維芽細胞 NIH-3T3 を凍結保護
剤無しで凍結後融解したところ，80%以上の生存率が得られている．本研究では，凍結保護剤無添加での hiPS 細胞凍結保存手法確立に向けて，超瞬間凍結法の適用可能性について検討した．hiPS 細胞の懸濁液をインクジェットヘッドにより約 40pL の液滴として，液体窒素で冷却したガラス基板に吐出し凍結した．
この細胞を融解し，Calcein および PI 染色により生存率を求めたところ，約 20%であった．以上から，生存率は十分でないものの，hiPS 細胞を凍結保護剤フリーで凍結保存できる可能性を見出せた．今後，液滴の微小化による冷却速度の向上や ROCK 阻害剤によるアポトーシスの抑制などによりに生存率の向上を目指したい．

Consideration of the flow cytometry analysis for the differentiation potential
of induced pluripotent stem cells

Attempt of hiPS cell cryopreservation by ultra-flash freezing method basedon inkjet printing○Shun Fujimoto, Kentaro Okano, Mee-Hae Kim, Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
potential

2Oa02○Hiroki Watanabe1, Hideyo Takizawa1, Shigeru Yamada2, Yasunari Kanda2,
Yoshitake Akiyama1(1Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ., 2Natl. Inst. Health. Sci.)

human induced pluripotent stem cell, flow cytometry, differentiation

Key words

Cryopreservation, Ink jet printing, hiPS cells

タッピング剥離操作におけるヒト iPS 細胞の応答評価

2Oa04

希少細胞の連続的化学処理を可能とする多段階溶液交換プロセッサーの開発○山本 航平 1, 澤川 史明 2, 堀口 一樹 1, 越田 一朗 2, 紀ノ岡 正博 1
（1阪大院・工, 2澁谷工業）
kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp○穆 廷林, 豊田 一, 山田 真澄, 関 実（千葉大院・融合）
m-yamada@faculty.chiba-u.jp【背景及び目的】ヒト iPS 細胞を用いた再生医療の産業化において，品質にばらつきのない細胞製品を安定して製造することは重要である．そのためには，再現性の高い培養工程の設計・最適化が求められるが，iPS 細胞の培養は主に手作業で行われており，再現性に乏しい．そこで，本研究では継代工程における剥離操作に着目し，機械的に物理的衝撃を与える装置を用いて培養容器に再現
性よく衝撃加速度を加え，細胞を慣性力によって剥離する系を設計した．この装置を用いて様々な衝撃加速度・衝撃回数でタッピングして細胞を剥離し，細胞回収率および回収された細胞の活性を評価した．
【方法及び結果・考察】ラミニン 511 フラグメント (iMatrix-511) コート上で継代培養したヒト iPS 細胞 (1383D2 株) を，ROCK 阻害剤 (Y-27632) を含む EDTA お
よびトリプシン様酵素 (TrypLE select) を用いて酵素処理した．その後，衝撃装置を用いて容器を打撃することで細胞を剥離し，浮遊した細胞を回収した．その後，細胞を iMatrix-511 コート上に再播種して 96 h まで培養し，播種してから 24 h における細胞接着率および 24 h から 96 h までの比増殖速度を算出した．
その結果，細胞に加える慣性力および回数を増加させることで，剥離された細胞数は増加し，再播種後の細胞接着率は増加したが，比増殖速度には影響しないことが明らかとなった．以上から，タッピングによる慣性力を用いた剥離法
は，細胞の接着能力を維持しつつ，細胞を効率よく剥離回収できる手法である
ことが示唆された．

【背景と目的】末梢血幹細胞や血中循環がん細胞のような生体内の希少細胞の性質を解析することは，病態の解明や新たな治療法の開発などにつながると期待されている．細胞の性質を解析するためには，細胞内部の特定の分子や器官を特異的に染色することが必須となる．通常，遠心分離によって溶液交換操作を繰り返すことで，複数種の溶液による多段階の化学処理が行われている．しかしながら，溶液交換操作を繰り返すうちに細胞回収率が徐々に低下してしまう
ため，希少な細胞を効率的に処理する上で問題があった．そこで本研究では，
マイクロ流路層流系を利用して，複数回の細胞処理液の交換を連続的に行うことで，細胞をロスすることなく高効率に処理する新規システムの開発を目的とした．
【方法】ソフトリソグラフィーおよびレプリカモールディングを用いて，PDMSガラス製のマイクロ流体デバイスを作製した．デバイス内における細胞処理のモデルとして，phalloidin および Hoechst33342 を染色剤として用いた細胞骨格
および細胞核の二重染色を行なった．JM 細胞（T 細胞株・非接着性）の懸濁液，固定剤，透過処理剤，染色剤，および洗浄液をそれぞれシリンジポンプによって導入し，流路内で 4 回溶液交換し，連続的に細胞処理を行なった後，主流路の下流出口から得られた溶液中に含まれる細胞数をカウントし，蛍光顕微
鏡観察を用いて細胞を観察した．
【結果と考察】送液終了後に主流路の下流出口から回収された細胞を観察したところ，細胞骨格および細胞核が染色されていることが確認された．また，細胞回収率は 99±17%（n=3）であり，導入した細胞のほぼ全てを回収することができた．本研究で開発したマイクロ流体システムは，高効率な細胞処理を可能とするため，基礎医学研究や臨床検査などにおいて有用なツールとなることが期待される．

Evaluation of cell response in tapping procedure during passaging

Development of multistep fluid-exchange processors for continuous
chemical treatment of rare cells○Kohei Yamamoto1, Fumiaki Sawakawa2, Ikki Horiguchi1, Ichiro Koshida2,
Masahiro Kino-oka1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Shibuya Corp.)

Key words
force

human induced pluripotent stem cell, dissociation, tapping, inertial○Tinglin Mu, Hajime Toyoda, Yamada Masumi, Seki Minoru(Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.)

Key words

microfluidic device, hydrodynamic filtration, cell processing

173

2Oa05

低温処理が脂肪代謝およびベージュ脂肪細胞への分化に
及ぼす影響

2Oa07

○塩見 尚史, 冨士原 由貴, 渡邊 桂子（神戸女学院大・人間科学）
n-shiomi@mail.kobe-c.ac.jp

形態的逸脱 iPS コロニーの生物学的プロファイル解析○吉田 啓 1, 長坂 理紗子 1, 館野 浩章 2, 小沼 泰子 2, 伊藤 弓弦 2,
蟹江 慧 1, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬, 2産総研）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【目的】褐色脂肪細胞は，糖や脂肪の分解が非常に早く，これらの細胞へ分化誘導を行うことが，2 型糖尿病の有効な治療手段として期待されている．その分化誘導の手段のひとつが低温処理で，低温環境下では，脳からノルアドレナリンが分泌され，褐色脂肪細胞への分化誘導が促進すると考えられている．しかし，その詳細はよくわかっておらず，低温刺激が細胞に及ぼす影響については，
ほとんど明らかにされていない．そこで，本研究では直接的な低温刺激が褐色およびブライト脂肪細胞への分化に及ぼす影響について調べた．
【結果および考察】マウス筋芽細胞 C2C12 を，4℃，16℃にしておいた培地と素早く交換し，その温度で培養することで低温刺激を与えた．その後，即座にｍ
RNA を精製し，リアルタイム PCR により遺伝子発現を調べた．その結果，1時間の低温刺激により，PRDM16，UCP1 などの褐色脂肪細胞に分化誘導を促す遺伝子が誘導され，その値はノルアドレナリンによる刺激よりも高かった．
そして，糖代謝関連遺伝子やミトコンドリアの量も増加した．さらに，この低温刺激を繰り返すことにより褐色脂肪細胞へ分化することを試みたが，UCP1が発現せず，褐色脂肪細胞へは分化しなかった．一方，白色脂肪細胞 3T3-L24
を 4℃，1 時間で低温処理した場合も，同様に褐色脂肪細胞に分化誘導を促す遺伝子が誘導された．この低温刺激を繰り返し，ベージュ脂肪細胞へ分化することを試みた結果，UCP1 が発現したブライト脂肪細胞が得られた．以上のこと
から，低温環境下では，細胞は緊急措置として自らが熱を発生して細胞を守る機構が備わっていること，脂肪細胞が低温刺激によりベージュ脂肪細胞に分化することを見いだした．

iPS 細胞は，再生医療や創薬研究において幅広い可能性を秘めた有用なツールとして期待されている．近年では，iPS 細胞の産業応用に向けて，最先端の工学的技術を導入し，iPS 細胞を効率的かつ高い再現性をもって拡大培養するための細胞製造技術の開発が進んでいる．これまでに我々のグループでは，細胞の位相差顕微鏡画像から得られる iPS コロニーの形態情報を用いて，情報解析と組み合わせることによって，iPS 細胞の製造プロセスを最適化するための技術開発を行ってきた．長期にわたり iPS コロニーの形態は，未分化状態から分化状態への移行などの細胞の生物学的変化を反映する重要な指標であると考えられていたが，その評価は人間の判断に依存するものであった．今回我々は，
iPS コロニー形態の詳細な定量分析によって，技術的な培養の結果として増加する可能性のある「通常状態を僅かに脱した iPS コロニー（逸脱 iPS コロニー）」を見出すことに成功した．本研究は，画像ベースのスクリーニングとクローニングを用いて日常の培養で生じうる逸脱クローンのプロファイルを定義し，画像評価による全コロニーのモニタリングの重要性を示唆するものである．

Effects of cold temperature on elimination of fat and differentiation to beige
adipocytes

Characterization of morphologically irregular iPS colonies○Naofumi Shiomi, Yuki Fujiwara, Keiko Watanebe(Dept. Hum. Sci., Kobe Coll.)○Kei Yoshida1, Risako Nagasaka1, Hiroaki Tateno2, Yasuko Onuma2, Yuzuru Ito2,
Kei Kanie1, Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2AIST)

Key words

beige adipocytes, low temparature, UCP1

Key words
human induced pluripotent stem cell, cloning, deviated cell state,colony morphological analysis

2Oa06

骨格筋細胞ゲルアクチュエータの量産に向けた電気刺激
培養システムの構築

2Oa08○中野 翔太, 瀧澤 秀世, 秋山 佳丈（信州大・繊維）
aki@shinshu-u.ac.jp

画像情報解析を用いた iPS 細胞製造機械化における振動
ストレスの評価○酒井 徹平, 今井 祐太, 吉田 啓, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

近年，マイクロマシニング技術の発展により，マイクロマシンの開発が進んでいる．マイクロマシンの省エネルギー，省スペースを達成するためには駆動要素であるアクチュエータの高エネルギー効率化，小型化の必要がある．そこで
我々は筋細胞や筋組織に着目し，これらをバイオアクチュエータとして活用するために研究を進めている．バイオアクチュエータの一つとして骨格筋ゲルア
クチュエータがあるが，一般に骨格筋ゲルの収縮力は，数十 μN と微小なデバ
イスの駆動源としても不十分である．より大きい収縮力を出せるようにするた
めには筋芽細胞をより分化させる必要がある．これまでに，培養中の筋芽細胞
は電気刺激を与えることにより分化が促進されることが報告されている．本研
究では，より大きい収縮力をもった骨格筋ゲルアクチュエータを量産するために電気刺激培養システムを開発する．電気刺激は，LabVIEW（ナショナルイン
スツルメンツ社）を用いてアナログ波形を生成し，それをアンプにて増幅することで行った．これにより，任意のパルス幅と電圧のバイポーラーパルスを印加することができた．培地交換は，培地交換システム（高砂電気工業株式会社）にて行った．骨格筋ゲルは，マウス筋芽細胞 C2C12 を，マトリゲルを含むコ
ラーゲン typeI のゲルに懸濁することで得た．分化培地には DMEM + 7 %ウマ血清を用いた．本装置を用いて骨格筋ゲルアクチュエータを長期間培養し，その収縮力を評価した．今後，この装置を用いて，より収縮力の大きい骨格筋ゲ
ルアクチュエータの製作に適した電気刺激条件の決定に向けて，研究を進めて行きたい．

近年の再生医療における産業化の加速と共に，細胞製品としてヒト細胞を大量製造する細胞製造加工技術の重要性が高まっている．医療に用いられる細胞製品において，その品質管理は治療の安全性および有効性を左右する重要な課題
であるが，現在まだ培養工程において細胞品質に影響を与える因子はまだ未解
明なものが多く，工学的な影響因子の定量と理解が望まれている．
細胞製品の産業的な安定製造の実現に向けて，培養の機械化・自動化技術の導入に期待が集まっている．細胞培養の機械化では，従来人間が行っていた培養操作を機械的操作に置き換えていくことが望まれるが，どのようにパラメータや条件を設定するか明確な基準が無い．これは，人間が行っていた作業そのものの影響力の大きさが定量化来なかったためであり，「どれだけ繰り返してよいか」「ストレスとして閾値を超えていないか」などが理解されていないためである．
我々はこれまで，リアルタイムに得られる顕微鏡画像を解析することで induced
pluripotent stem (iPS) 細胞の大量製造における「環境因子の影響」を評価することが可能なことを示してきている．本研究では，培養機械化によって細胞に伝わる「振動」のストレスを，自動操作キャリブレータを用いて定量化し，その細胞への経時的な影響を画像情報解析により定量的に評価を行ったのでこれを報告する．

Electrical stimulation culture system toward masss production of skeletalmuslce gel actuators

Image-based assessment of vibration stress in mechanization of iPS cell
culture○Shota Nakano, Hideyo Takizawa, Yoshitake Akiyama(Fac. Textile Sci. Technol., Shinshu Univ.)

Key words

tissue engineering, bioactuator, bioMEMS○Teppei Sakai, Yuta Imai, Kei Yoshida, Kei Kanie, Ryuji Kato
(Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

Key words

cell morphology, iPS cell, image-based assesment, quality control

174

2Oa09

細胞形態情報解析による培養面コーティング剤のプロ
ファイリング

2Oa11○藤谷 将也, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

画像情報解析を用いたスフェロイド培養環境プロファイリング○山本 涼平, 渋田 真結, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

再生医療用の細胞培養において，培養容器表面の機能性分子によるコーティン
グは，培養細胞の接着向上だけでなく，未分化・分化性能の維持や制御のために極めて有効である．しかし同時に，コーティング剤は高価であることが多い
ため最適な利用量・方法の検討は安定な培養に重要である．しかし，自らの細胞培養において，最適化や標準化，動物性由来分子の排除，コストダウンなどをしたいと考えたとき，培養面コーティング条件の網羅的最適化は極めて難しい．まず，コーティングのための分子にはあまりにも多種多様なものが存在しており，比較すべき条件が多すぎる．また，例え同じタンパク質由来の分子や同一タンパク質を含む試薬であっても，分子量の均一性・精製度・由来組織の違いなどの差が存在し，時にそれは培養性能に大きく影響する．さらに，コー
ティング対象である培養容器は，同じポリスチレン素材の細胞培養用容器であったとしても，各社表面性状は僅かに異なり，その差異は数量的に特定・比較が困難であるため，容器との相性までを含めると最適化には膨大なコストと労力を要してしまう．筆者達はこれまで顕微鏡画像中の細胞形態の変化を情報として，培養環境や培養性能の定量的比較を行う手法を開発している．本発表では細胞形態プロファイルを用いた，簡便・安価かつ高速なコーティング性能の定量的評価方法を開発したのでこれを報告する．

近年，再生医療における組織構築や創薬探索の現場において，生体内の立体構
造や機能性を模倣した培養方法として三次元培養法が着目されている．三次元培養法には浮遊培養やハイドロゲル，高分子化合物などの足場材料を用いた培
養系，液滴内培養系など多様な培養方法が研究されている．しかし，三次元培養により構築された細胞凝集塊(スフェロイド)は，その培養方法や製作者，培養中の品質管理方法などの違いによりその機能性（品質）が異なることが指摘されている．よって同品質なスフェロイドを大量生産し，細胞治療や研究モデ
ルとして安定して利用するためには，個々のスフェロイド品質を安定化させる
培養環境を非侵襲的に評価する必要があるが，これまで有効な非破壊的評価法
はまだ少なかった．
我々は，非侵襲的なスフェロイド評価技術として細胞画像情報解析技術に着目し，画像情報を利用した非破壊的な品質評価法の開発を目指した．本研究では，治療や組織構築におけるスフェロイド製造を想定し，細胞製造などで検証が必要になると考えられる培養条件を比較し，その増殖性・遺伝子発現などの生物学的な評価と画像情報解析により取得したスフェロイドの形態情報と関連付けることで，スフェロイド安定形成のための培養環境評価の開発を行ったのでこれを報告する．

Morphology-based profiling of culture condition for optimization of stem
cell culture

Image-based profiling of spheroid culture conditions

Key words
image-based evaluation, cell morphology, mesenchymal stem cell,transcriptome

Key words

3D culture, spheroid, cell quality control, image analysis

2Oa10

2Oa12

3 次元構造体 Stroid を用いた細胞挙動の研究○Masaya Fujitani, Kei Kanie, Ryuji Kato
(Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

画像情報解析技術を用いた 3D 培養がん細胞におけるヘテロ性解析○Ryohei Yamamoto, Mayu Shibuta, Kei Kanie, Ryuji Kato
(Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)○渋田 真結 1, 加藤 寛人 1, 田村 磨聖 2,3, 日下部 涼子 4, 蟹江 慧 1,
松井 裕史 4, 金森 敏幸 3, 柳沢 真澄 5, 杉浦 慎治 3, 加藤 竜司 1
（1名大院・創薬, 2阪大・核物理研, 3産総研, 4筑波大, 5エンジニア
リングシステム）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp○犬伏 祐作 1, 伊田 寛之 2, 立花 亮 1（1阪市大院・工, 2新田ゼラチン株式会社・総合研究所）
tatibana@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

創薬探索やがん研究の分野において，腫瘍組織を形成する細胞集団の不均一性（ヘテロ性）の理解や制御が重要であることが示されつつある．多くの先行研究から，腫瘍ヘテロ性はがん組織の薬剤耐性や浸潤能の獲得，転移，再発の一因である可能性が報告されており，この腫瘍ヘテロ性を加味した新規薬剤の開発が求められている．しかし，従来の分子生物学的手法において，タンパク質マー
カーなどを用いた分類技術だけでは腫瘍内の未知な細胞を検出・分類・評価す
ることは難しく，腫瘍ヘテロ性やがんの特性評価は病理組織などにおける組織学的な特徴の形態的評価が主流であった．また，in vitro において，がん細胞を生体内に近いような機能性を維持したまま培養することも技術的には難しく，
細胞アッセイで見られた薬効が in vivo 評価や臨床現場における治療効果を反映
しにくいという問題もあった．近年の研究にて，生体内組織の機能性を in vitro
で再現できる 3 次元培養法が着目され，三次元培養凝集塊（スフェロイド）の形態と細胞増殖性や薬剤感受性との関連が報告されるなど，診断技術としても着目された．しかし，高いスループット性を維持しながら非侵襲的に培養中の細胞情報を解析することは難しかった．そこで我々は，細胞画像情報解析技術
を用いて，形態情報に基づくがん細胞分類法を考案し，表現型による未知の細胞集団の分類を試みた．本研究では，このような 3 次元培養された細胞塊におけるヘテロ性や機能解析を，細胞が生きた状態で定量評価し，これらをクローニングすることでより詳細なメカニズム解明を行うツールの一つとして，3 次
元細胞集塊の画像解析技術の有効性について検証した．

[背景]生体組織，臓器は 3 次元構造体である．それらは多数かつ多種類の細胞や物質が集まって構成されており，また，細胞群は絶妙に配置されている．細
胞同士は同種異種を問わず，細胞間コミュニケーションを行っており，その結果，3 次元構造体全体として機能が発揮されている．今まで細胞に対する物質の影響は平面培養を用いて研究が行われてきた．しかし，生体内では本来細胞
は 3 次元に配置され，様々な物質と相互作用を行っていることを考えると平面培養では十分ではないと考えられる．3 次元培養を行うことで，細胞の本来の機能が発揮されることも知られている．近年，3 次元構造体として，オルガノ
イドを形成させる系での研究や細胞シートの積層させる方法が考案されてきた．
そこで，今回我々は 3 次元細胞環境における細胞挙動を研究するための単純簡便な方法を考案した．
[方法と結果]内径 500 μm のシリコンチューブにゼラチン含有細胞懸濁液を入れた．その後，シリコンチューブから細胞塊を押し出すことによって，3 次元構造体を作製した．この時，縫合糸を共存させておき，構造体作製後に除去すると，その部分に貫通した穴ができた．すなわち，ストロー状の 3 次元細胞構造
体 Stroid(straw + spheroid）を得た．また，Stroid の中空部に別種の細胞や様々な物質を導入することもできた．Stroid など 3 次元細胞構造体は非接着プレート
上で構造を保ったまま培養が可能であった．この方法の応用例として，がん細胞の Stroid の内部に脂肪細胞を導入し，3 次元細胞間コミュニケーションを観察した．結果，脂肪細胞を導入したものではがん細胞 Stroid の崩壊が見られた．
以上より，3 次元構造体 Stroid を用いて細胞挙動の研究が行えるようになった．

Image-based evaluation of heterogeneity in 3D cultured cancer cells

Fabrication of 3D structure ‘’straw-like spheroids’’ for cell behavior
research○Mayu Shibuta1, Hirohito Kato1, Masato Tamura2,3, Ryoko Kusakabe4, Kei Kanie1,
Hirohumi Matsui4, Toshiyuki Kanamori3, Masumi Yanagisawa5, Shinji Sugiura3,
Ryuji Kato1(1Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 2RCNP, Osaka Univ., 3AIST, 4Univ.
Tsukuba, 5ESCO)

Key words
morphology

Cancer heterogeneity, Image analysis, 3D culture, Spheroid○Yusaku Inubushi1, Hiroyuki Ida2, Akira Tachibana1(1Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ., 2Res. Development Center Nitta Gelatin Inc.)

Key words

spheroid, 3D culture, gelatin, cell-cell interactions

175

2Cp01

脱脂粉乳と豆乳で培養した乳酸菌の増殖と酸耐性の
比較

2Cp03

○オウ カン, 西野 智彦（東京工科大院・バイオニクス）
nishino@stf.teu.ac.jp

日本酒の高圧発酵制御技術の確立に向けた清酒酵母の高圧不活性化挙動の解析○野村 一樹, 片岡 ちひろ, 氏家 沙織里, 井口 晃徳, 重松 亨
（新潟薬大・応生命）
nomura@nupals.ac.jp【背景と目的】現在，市場に流通しているヨーグルトは一般的に脱脂粉乳を発酵させて作られている．しかし，近年は豆乳を発酵させて作られたものも流通している．脱脂
粉乳と豆乳は成分が大きく異なるため，これらを栄養源として増殖する乳酸菌は，異なる性質を持つのではないかと考えられる．
本研究では，乳酸菌が「プロバイオティクス」として効果を発揮するために必要な酸耐性を脱脂粉乳で培養した乳酸菌と豆乳で培養した乳酸菌間で比較した．
【方法】
Lactobacillus casei NBRC15883 を用いて作成したヨーグルト（培養温度 30℃）のｐ H，滴定酸度，生菌数と酸耐性を測定した．培地 pH が約 4 となった時点で培養を終了し，人工胃液（pH1.2）に 37℃，30 分間処理した後の生残菌数を測定することで酸耐性を評価した．
【結果と考察】豆乳で培養した乳酸菌は脱脂粉乳で培養した時より増殖が速かった．酸耐性は豆乳で培養した乳酸菌のほうが 30 分処理時では 10 倍以上高い生残菌数を示した．このように，豆乳で培養した乳酸菌のほうが増殖，酸耐性が優れていたことから，脱脂粉乳に豆乳を混合した条件で検討を行った．その結果，豆乳を脱脂粉乳に 10％混合するだけで酸耐性が高くなることが分かった．現在，豆乳に含まれるタンパク質，脂質，糖質などの成分を脱脂粉乳培地に添加することで，有用な成分の特定を試みている．

【背景と目的】 高圧技術とは，1,000 気圧 (100 MPa) 以上の非常に高い圧力により，非熱的に微生物を殺菌 (不活性化) する食品加工技術の一つである．我々は，高圧技術を応用した日本酒の新しい発酵制御 Pressure Regulated Fermentation(PReF) 技術の確立を目指している．しかし，高圧処理にかかるコストが処理圧力レベルに比例して増加するため，高圧発酵制御の報告は皆無である．本研究では，日本酒醸造工程への PReF 技術の適用可能性を評価するために清酒酵母の高圧不活性化挙動を評価した．
【方法】 清酒酵母株として Saccharomyces cerevisiae Sake yeast Kyokai No. 7 株(K7 株)，圧力感受性清酒酵母株として S. cerevisiae KE45 株，対照株として S.
cerevisiae BY4743 株を用い，YPD 培地，15-30°C，48 h の条件で培養した．200
MPa，室温，1-10 min の条件で高圧処理し，生菌数を算出して不活性化挙動を評価した．
【結果と考察】 30°C で培養し，1 min の条件で高圧処理した結果，KE45 株の生菌数が有意に減少したが，K7 株および BY4743 株の生菌数の減少は認められなかった．その一方で，15°C にて培養した結果，KE45 株だけでなく K7 株においても生菌数が有意に減少した．10 min の条件で高圧処理した結果，K7 株が最も生菌数が減少した．これらの結果から，清酒酵母の高圧不活性化挙動に培養温度が寄与することが明らかとなり，低温条件で発酵させる日本酒醸造工程
への PReF 技術の適用が可能となった．本研究は，生研支援センターの「革新的技術開発・緊急展開事業 (地域戦略プロジェクト) 」により実施した．

Growth and acid resistance of Lactic acid bacteria grown in the skim milk
and the soy milk.

High pressure inactivation behavior of sake yeast for pressure regulated
fermentation technology of sake○Han Wang, Tomohiko Nishino(Grad. Sch. Bionics., Tokyo Univ. Technol.)○Kazuki Nomura, Chihiro Kataoka, Saori Ujiie, Akinori Iguchi, Toru Shigematsu(Fac. Appl. Life Sci., Niigata Univ. Pharm. Appl. Life Sci.)

Key words

lactic acid bacteria, acid tolerance

Key words
control

2Cp02

凍結耐性を有する醤油酵母 Zygosaccharomyces rouxii
を用いたパンの物性調査

2Cp04○森本 一輝, 小西 正朗（北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp

Saccharomyces cerevisiae, sake yeast, high pressure, fermentation

紅麹品質における水浸漬工程の影響○曾 伝濤 1, 吉﨑 由美子 2, 奥津 果優 2, 二神 泰基 2, 玉置 尚徳 2,
髙峯 和則 2（1鹿児島大院・連農, 2鹿児島大・農）k7814020@kadai.jp

背景:冷凍生地製パン法は製パン時の作業の軽減化や少量多品種生産に向いているため,利用が進んでいるが,生地の凍結により酵母が凍結障害を受け損傷・死滅
し,パンの風味や食感の低下,発酵不足になる場合がある．より安定した冷凍パン
法による製造には凍結に強い酵母が求められる．我々が環境中から分離した醤油酵母 Zygosaccharomyces rouxii SRT88 株は食経験があり,通常のパン酵母の 12倍の凍結耐性を持つことが分かっている．SRT88 株の凍結生地製パン法への適用性を評価するため,凍結前後での発酵量の評価ならびに,焼成後のパンの硬さ,
揮発成分の変化について評価した．
方法:比較対象として,市販のドライイーストを用いた．パン生地は,ホームベー
カリーで調製し,混錬後,1 時間 1 次発酵した．1 次発酵後の生地を-30 ℃で 1~2
週間保存した．冷蔵庫で一晩解凍後,二次発酵量を体積変化で評価した．焼成サンプルは 1 時間の二次発酵後に焼成した．焼成後,パンの高さ・硬さを測定した．硬さの測定方法は,AACC 法を用いた．揮発成分は固相マイクロ抽出法を用いた GC-MS により分析した．
結果・考察:凍結前後の発酵量は,凍結 2 週間後ドライイーストの場合,未凍結と比べて 70.1％減少したのに対して,SRT88 株の発酵量は 6.4％減少した．SRT88
株はパン生地内でも高い凍結耐性を示した．パンの硬さは,ドライイーストを用いた場合,1 週間の凍結で CFV 値が 0.875N から 1.68N まで増加したが，2 週間
で 1.44N まで減少した．ドライイーストは発酵力が強いため,凍結しない場合,柔らかいが,凍結により硬化し,長期間の凍結では細胞内成分の溶出による軟化が認められた．一方 SRT88 の場合,発酵力の弱さから,当初の CFV 値は 1.17N であったのに対して,2 週間の凍結で徐々に硬化する傾向が認められた．揮発成分分析
では,SRT88 株を用いた場合,ドライイーストとよりアルコール類が少ないことがわかった．

【目的】紅麹は，Monascus sp. で造られる麹の一つであり，中国の南部や台湾，
日本の一部の発酵食品の製造に用いられる．中国の紅麹製麹には特徴的な工程があり，製麹途中で麹を水に 1～数回浸漬する．しかしながら，水浸漬工程がもつ意義は不明である．本研究では，この製麹途中における水浸漬の効果と最適な浸漬条件を検討した．
【方法】種麹は，（株）秋田今野商店から購入した Monascus anka を用いた．米を一般的な方法で蒸煮した後，米重量の 1％ (w/w) の種麹を植菌した．植菌後，35℃の恒温恒湿器にて約 48 時間静置した．その後，麹を二等分し，一方はそのまま製麹を続け，もう一方は滅菌水に 1 分間浸漬後，20 分間水切りを行った後に恒温恒湿器に移し，製麹を継続した．製麹は約 96 時間で終了した．両麹について各段階で麹をサンプリングし，水分，酸度，酵素活性，菌体量および色素生成量を測定した．浸漬時間試験では，製麹 48 時間で麹を二等分し，それぞれ
1 分間または 10 分間水浸漬を行った．培養温度試験では，水浸漬工程を行った
後，四等分し， 25℃，30℃，35℃，40℃で製麹を行った．
【結果】製麹 72 時間後からすべての分析項目において著しい増加が確認された．
また水浸漬ありで作製した麹の方が酵素活性および菌体量は約 1.1～1.8 倍高
かった．最も顕著に異なる項目は色素量であり，水浸漬ありで作製した麹が水浸漬なしと比べて約 6 倍多かった．浸漬時間を検討した結果，1 分浸漬で製麹
した紅麹は糖化力が高くなり，一方，10 分浸漬で製麹した紅麹は菌体量および色素含有量が高くなった．水浸漬後の培養温度の実験では，温度が高くなるにつれて，糖化力および菌体量は増加したが，色素量は 40℃で著しく低下した．
これらの結果から水浸漬工程は，紅麹の品質を左右する重要な工程であることが明らかになった．

Evaluation of bread using freeze tolerant yeast, Zygosaccharomyces rouxii

The effect of water soaking in red koji making○Kazuki Morimoto, Masaaki Konishi(Kitami Inst. Technol.)Key words

yeast, stress resistance, freeze tolerant○Chuantao Zeng1, Yumiko Yoshizaki2, Kayu Okutu2, Taiki Futagami2,
Hisanori Tamaki2, Kazunori Takamine2(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Agric., Kagoshima Univ.)

Key words

monascus anka, pigment, water soaking

176

2Cp05

小曲米酒の製造における固体糖化工程の意義○Yin Xuan 1, 吉﨑 由美子 2, 池永 誠 2, 奥津 果優 2, 二神 泰基 2,
玉置 尚徳 2, 髙峯 和則 2
（1鹿児島大院・連農, 2鹿児島大・農）k7814020@kadai.jp

2Cp07

京都伝統野菜「桂瓜」の奈良漬粕における米貯蔵タンパ
ク質の解析○沼本 穂, 中村 貴子, 増村 威宏（京府大院・生命環境）
masumura@kpu.ac.jp【背景と目的】小曲米酒とは，米と小曲から造られる中国の蒸留酒の一種である．小曲は，糸状菌や酵母を穀物に接種・培養することで調製され，醸造用酵
素と酵母の供給源として使用される．小曲米酒の製造は，蒸米と 1%（w/w）小曲を混合して室温で約 24 時間置く固体糖化工程から始まる．本研究では，小曲
米酒の特徴的製造方法である固体糖化工程の意義を明らかにすることを目的とした．
【方法】小曲は中国で市販されている「安琪」を使用した．固体糖化前後のサン
プルの真菌数，酵素活性および有機酸量を分析した．糖化時の温度を 25～40℃に設定し，糖化後のグルコースと還元糖を測定した．糖化時に 8 時間おきに採取したサンプルより DNA を抽出した．LNA-オリゴヌクレオチドによる PCR 技術を用いて米由来の DNA 増幅を抑え，真菌の ITS 領域全長を選択的に増幅した．次いで，gITS7/ITS4 のプライマーセットを用いて ITS2 領域を nested PCR
増幅し，次世代シーケンサーにより真菌叢解析を行った．
【結果と考察】固体糖化前後で，真菌数は約 50 倍に増え，α-アミラーゼ，グルコアミラーゼおよびプロテアーゼ活性は約 5～50 倍高くなった．乳酸は約 3000
倍増加した．固体糖化時の温度の影響を調べると，最も高い糖化効率を示す温度は 30-35℃であった．次世代シーケンスの結果より，スターターである小曲は Rhizopus sp. と Saccharomyces sp. が主たる真菌であったが，糖化時に増殖す
るのは Rhizopus sp.であることが明らかになった．また小曲より単離した Rhizopus
sp. に乳酸生成能が認められた．固体糖化工程で増加した乳酸は発酵時の雑菌汚染防止に，増加した酵素活性は迅速な発酵の遂行に寄与すると考えられる．従って，固体糖化工程は，単に糖化だけではなく，Rhisopus sp. の培養と，それに伴う乳酸と酵素の生産のためという，新たな意義が明らかになった．

【背景・目的】 酒造りにおける米貯蔵タンパク質には，清酒の香味を形成する
重要な役割がある．米貯蔵タンパク質の内，グロブリン，グルテリンはプロテインボディタイプ II(PB-II)に蓄積しており，全貯蔵タンパク質の 70%以上を占め，発酵工程における製麹や酵母の重要な窒素源であり，醸造工程において消化される．一方，プロラミンは PB-I に蓄積しており，全貯蔵タンパク質の 20%程度存在するが，難消化性のため，醸造工程において麹菌や酵母は利用できず，圧搾後の酒粕内に多く残存する．本研究は，京都の伝統野菜である桂瓜を原材料として用い，醸造後の酒粕に漬け込んで作られた「桂瓜奈良漬」における奈
良漬粕に存在する米貯蔵タンパク質について解析を行った．
【方法・結果】 清酒原料米，酒粕，桂瓜奈良漬粕（以下，奈良漬粕）からそれ
ぞれタンパク質を抽出し，SDS-PAGE を行った．その結果，酒粕中のグルテリ
ン，グロブリンの割合は，原料米と比較して減少していたが，プロラミンの割合は多かった．奈良漬粕では，グルテリン，グロブリンはほとんど存在しなかったが，プロラミンは残存していた．各プロラミン分子種の特異的抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところ，16, 13 kDa プロラミンは酒粕と奈良漬粕
で変化がない一方，10 kDa プロラミンの割合は酒粕と比べ，奈良漬粕では減少していた．そこで，プロラミンが蓄積している PB-I の形態観察を行ったところ，興味深いことに原料米，酒粕では球状を示す PB-I が一部楕円状に変形していた．これらのことから，奈良漬の工程においてプロラミンを分解する機構が存在することが示唆された．本研究は，京都府立大学地域貢献型特別研究（府大 ACTR）で実施された．

The significance of solid-state saccharification process in Xiaoqu-Mijiu
production

Analysis of rice storage proteins in bed of sake lees for Narazuke○Xuan Yin1, Yumiko Yoshizaki2, Makoto Ikenaga2, Kayu Okutsu2, Taiki Futagami2,
Hisanori Tamaki2, Kazunori Takamine2(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Agric., Kagoshima Univ.)○Minori Numamoto, Takako Nakamura, Takehiro Masumura(Grad. Sch., Life Environ. Sci., Kyoto Pref. Univ.)

Key words
sp.

Xiaoqu-Mijiu, Chinese spirits, Solid-state saccharification, Rhizopus

Key words

storage protein, sake lees, prolamin, Narazuke

2Cp06

南極産菌類を利用した日本酒の醸造の試み

2Cp08

α-EG 発酵物の美容食品としてのコラーゲンスコアへの影響○辻 雅晴 1, 星野 保 2（1国立極地研究所, 2産総研・生物プロセス）
spindletuber@gmail.com○三井 雅貴 1, 遠藤 佳純 2, 横田 大輝 2, 風 友稀 2, 徳田 耕二 3,
塩谷 侑子 3, 町田 雅之 1, 大箸 信一 1, 尾関 健二 1
（1金工大・ゲノム研, 2金沢工大・バイオ・化学・応用バイオ, 3車
多酒造）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp

担子菌酵母の Mrakia 属菌は大陸性南極から報告されている菌類の中で，唯一エタノール発酵が可能な菌類として知られている．Mrakia 属菌のエタノール発酵
については，低温では一般的な酵母 Saccharomyce cerevisiae より発酵効率が良いと報告もあるが，南極の雪などから分離した Mrakia 属菌でビールを作った結果，2 %(v/v)以上のエタノールを作ることは出来なかったという報告もある．
しかし，Mrakia 属菌のエタノール発酵については，この 2 報しか存在しなかったことから，この菌のエタノール発酵については，ほとんど分かっていなかった．
まず，南極のスカルブスネス露岩域から分離した Mrakia 属菌のエタノール発酵
能について調べてみることにした．その結果，Mrakia 属菌のエタノール発酵能はエタノール耐性と相関があることが分かった．また，最もエタノール生産能が高い Mrakia blollopis SK-4 株は pH が 4.0～10.0 の範囲で効率良く発酵が可能であり，最大で 5% (v/v)以上のエタノールを生産することが可能という野生株
としては，高いエタノールを生産する能力を持っている事がわかった．そこで，
この SK-4 株を利用して日本酒の醸造を試みることにした．SK-4 株単独では，もろみ中に大量のグルコースが蓄積しており，日本酒の醸造は出来なかったが，SK-4 株と協会酵母を共発酵させる事で，日本酒を醸造できることが判明した．
SK-4 株を添加した条件では，清酒酵母のもろみ末期死滅が抑制され，わずかながら発酵力が向上したことが判明した．また，SK-4 株を添加して醸造した日本酒ではメロンのような果実臭である酢酸イソアミルの含有量が協会酵母単独で醸造した日本酒より 1.25 倍向上した．これらのことから，南極産菌類と協会酵
母を共発酵することにより，協会酵母単独で醸造した日本酒と遜色のない日本酒が醸造可能であることが確認できた．

【目的】これまでに α-EG が飲用でも塗布でもヒトのコラーゲン密度を高めることを報告した．前回の飲用試験では，1.1%α-EG 純米酒（α-EG 濃度：550 mg/
日）を 6 日間 50 ml 飲用で，コラーゲン上昇の効果を確認した．そこで本研究では，前回より低濃度の α-EG 純米酒と酒粕甘酒のヒト飲用試験によるコラー
ゲンスコアへの効果があるかを検証した．加えて，酒粕甘酒飲用試験では，角質水分量への効果も検証した．
【方法】0.8 %α-EG 純米酒を毎晩 40 mL（α-EG 濃度：320 mg/日）を 2 週間飲用
し，週間単位で両前腕のコラーゲンスコアを測定（Derma Lab）した（女性 8
名, 年齢 20-60 代）．酒粕甘酒を毎朝・晩コップ 1 杯分（300 mL：酒粕, 50 g×2
回=α-EG 濃度：600 mg/日）を 1 週間飲用し週間単位で両前腕のコラーゲンスコ
ア，角質水分量を測定（Corneometer）した（女性 4 名, 年齢 40-50 代）．
【結果・考察】純米酒飲用試験において，0 週目と比較して 2 週目で平均 1.5 ポ
イント，3 週目で平均 1.3 ポイント，4 週目で平均 2.2 ポイント有意に上昇し，コラーゲンの上昇の継続性が見られた．酒粕甘酒飲用試験では，コラーゲンス
スコアは 0 週目と比較して 1 週目から平均 4.0 ポイント上昇の速効性の効果，2週目で平均 8.5 ポイント上昇の効果が認められた．角質水分量は，1 週目で 3.0%
上昇し，2 週目では 8.0%上昇した．これらの結果より，酒粕 50 g を 2 週間継続
摂取すればコラーゲンスコアが高まることが推測できる．

Japanese sake co-brewed by Antarctic Basidiomycetous yeast and sake yeast

Effect of collagen score on alpha-EG fermentations as internal beauty
material○Masaharu TSUJI1, Tamotsu HOSHINO2(1NIPR, 2BRI. AIST)

Key words

yeast, fermentation, sake

○Masaki Mitsui1, Kasumi Endo2, Daiki Yokota2, Tomoki Kaze2, Koji Tokuda3,
Yuko Shiotani3, Masayuki Machida1, Shinichi Ohashi1, Kenji Ozeki1(1Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol., 2Dept. Appl. Biosci.,KIT,
3
Shata Syuzo)

Key words

alpha-EG, collagen score, beauty materials

177

2Cp09

吟醸粕焼酎発酵物中の機能性物質の研究○高橋 雅弥 1, 横山 春花 1, 吉田 知華 1, 徳田 耕二 2, 尾関 健二 1
（1金工大・ゲノム研, 2車多酒造）
ozeki@neptune.kanazawa-it.ac.jp

2Cp11

麹甘酒の過剰摂取による安全性評価○倉橋 敦 1, 米井 嘉一 2
（1八海醸造・研究開発, 2同志社大院・生命医科学）
a.kurahashi@hakkaisan.jp【背景・目的】米の難消化性タンパク質であるレジスタントプロテイン（RP）
はプロラミン画分として 10-15％程度含有している．日本酒の並行複発酵方式
では，麹のプロテアーゼによる分解を受けずに酒粕中に RP として残存する．
液化仕込による酒粕を再発酵させると RP が多くなり，便通改善，コレステロール低減などに効果が高いサプリメントとして市販されている．しかし，酒粕焼
酎発酵における RP などの機能性物質の研究はなく，蒸留残渣の有効活用の技
術開発については重要な課題の 1 つである．吟醸酒粕の再発酵物を蒸留して米焼酎を製造している．この焼酎発酵時に醸造副産物の白ヌカと α-グルコシダー
ゼ剤の添加，発酵温度の工夫で，蒸留した焼酎には品質的に問題はないか，蒸留残渣に RP，α-EG の各種機能性成分がどの程度含有した素材になるかを検討した．
【方法・結果・考察】蒸留残渣は凍結乾燥を行い，RP はタンパク質を抽出後，SDS-PAGE により，サプリメントの 13 kDa のプロラミン量から定量した．α-EGは HPLC で定量した．酒粕を再発酵した醪（前者）を蒸留した焼酎と，白ヌカを液化して酒粕に加え，α-グルコシダーゼ剤を添加し，温度を 20℃とした醪（後者）を蒸留した焼酎とは品質的に同等であった．前者の蒸留残渣の RP は2.2mg/g 乾物に対して後者の白ヌカを添加したものは 129-149mg/g 乾物と 70 倍
程度高いことが分かり，RP のヒトでの有効量（113mg/日）が乾物 1g で超える量であった．α-EG は前者の醪は 0 に対して後者の醪で 2％を生産し，蒸留残渣
中に全量回収された．今回の乾燥物中の α-EG は，2.4mg/g 乾物であった．この量は蒸留残渣の圧搾の仕方により有効量（550mg/日；6 日間摂取で 1-5 週間のコラーゲン密度の増加）を含有させることができる．従って，これまで廃棄処理していた蒸留残渣に各種機能性を付与した全活用の技術開発に目途が立った．

【目的】 麹甘酒は，米麹（又は米と）を糖化させてつくられる日本の伝統甘味飲料である．古来より飲用され，江戸時代には夏を乗り切るための栄養補給飲料として好まれた．近年，麹甘酒の魅力が再認識され，その含有成分や機能性に大変注目が集まっている．著者らは，これまでに麹甘酒に含まれる成分のメ
タボローム解析について報告している 1)．一方で，麹甘酒の主成分はグルコースであることから，血糖値への影響や体重増加が懸念されている．しかしながら，科学的根拠に基づいた検証はなされていない．そこで，著者らは麹甘酒の過剰摂取による安全性を検討したので報告する．
【方法】 本試験はオリエンタル上野健診センター倫理審査委員会における倫理審査委員会の承認の元に実施した．事前検査によって選抜した空腹時血糖が正常高値（100 mg/dL 以上 110 mg/dL 未満）もしくは境界域（110 mg/dL 以上 126
mg/dL 未満）の 20 歳以上 65 歳以下の男女計 24 名に，麹甘酒 118 g（八海醸造製）を 1 日あたり 3 本，4 週間連続摂取してもらった．摂取前，摂取 2 週後，摂取 4 週後，摂取期間を終え非摂取 2 週後の血圧/脈拍，体重/体脂肪率/BMI，
血液生化学的検査，尿一般検査，医師による問診から有害事象の判定を行った．
【結果】 被験者都合による試験中止 1 名を除く，23 名による評価を行った．試験において 15 件の有害事象が観察されたが，医師によっていずれも本試験と因果関係なしと結論付けられた．また，全ての評価項目について変化なし又は軽微な変化にとどまった．以上より，麹甘酒を適切に摂取する場合は安全であると評価した．
【利益相反】 本麹甘酒は，八海醸造(株)により提供された．また，本試験は八海醸造(株)より(株)TES ホールディングスに委託し，医療法人社団成守会 成守会
クリニックにて実施した．
1) Oguro et al., J. Biosci. Bioeng., 124, 178-183 (2017)

Study of it functionality in shochu brewing from ginjyo cake.

The verification study for safety evaluation of koji amazake overdose in
humans○Masaya Takahashi1, Haruka Yokoyama1, Tika Yoshida1, koji Tokuda2,
Kenji Ozeki1(1Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa Inst. Technol., 2Shata Shuzo)○Atsushi Kurahashi1, Yoshikazu Yonei2(1R&D Dept. Hakkaisan Brewery Co., Ltd., 2Grad. Life Med. Sci., Doshisha Univ.)

Key words

Resistantprotein, Prolamine, ethyl alpha-D-glucoside (alpha-EG)

Key words

koji, amazake, safety evaluation

2Cp10

健常成人女性における米糀甘酒摂取による皮膚バリア機能改善効果の検討

2Ep01

微生物を用いた液体培養におけるフラスコ気相環境の解析○植田 愛美 1, 北川 学 1, 伊藤 成輝 1, 山本 哲郎 2, 近藤 澄夫 3
（1マルコメ, 2TTC, 3医療法人健昌会福島健康管理セ）
manami_ueda@marukome.co.jp○高橋 将人, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【背景・目的】米糀甘酒は米糀を原料として作られる日本の伝統的な発酵食品であり，ビタミ
ン B 群や必須アミノ酸，オリゴ糖等の栄養成分を含み，栄養価が高い食品として古くから認知されている．米や米糀に含まれるスフィンゴ糖脂質であるグル
コシルセラミドは，肌の保湿改善作用や肌バリア機能の改善効果が報告されている．また，米糀に含まれる N-アセチルグルコサミンも，肌の保湿改善作用が報告されていることから，米糀甘酒の飲用による肌の保湿効果について検討した．
【方法】
肌の乾燥を自覚している 20～64 歳の健常女性 203 名のうち，角層水分量の低い者から 64 名を選択した．32 名ずつの 2 群に分け，米糀甘酒（A 群）またはプラセボ（P 群）をそれぞれ 8 週間にわたり，1 日 125ml 摂取させた（無作為化
二重盲検プラセボ対照並行群間比較試験）．摂取前および摂取中（4，8 週）に，
左上腕および左頬の角層水分量と経表皮水分蒸散量（TEWL）の測定，肌状態
自覚アンケートを実施した．
【結果】
40 歳以上かつ TEWL が中央値（14.7g/hm2）以上の被験者 19 名を対象に解析を行った．左上腕の角層水分量において，4 週目の摂取前からの変化量は，A 群で有意に増加し，改善が認められた．また 8 週目の摂取前からの変化量は，A群で改善傾向であった．左頬の TEWL においては，4 週目の摂取前からの変化
量は，A 群で有意に低下し，改善が認められた．また 8 週目の摂取前からの変化量は，A 群で改善傾向であった．以上の結果から，米糀甘酒が肌保湿効果および肌のバリア機能改善効果を有する健康食品として利用できる可能性が見出された．

【目的】 我々は，土壌試料の振盪フラスコ培養中に新奇な現象（手作業のサンプリングに伴う短時間［30 sec］の無菌的な培養栓の開封により培養微生物群
集構造が大きく変化する）を見出した 1)．新奇な現象を解明するために，振盪
培養中に培養栓の開封や振盪の中断を行わずに，フラスコ気相部と培養液のCO2 と O2 の連続的なモニタリングと経時的なサンプリングができるシステム（CDMSS）を開発した 2)．本研究では，CDMSS を用いて，様々な液体培養時のフラスコ気相部の CO2 と O2 濃度をモニタリングし，サンプリングをおこなう
際に付随する種々の操作がフラスコ気相部に及ぼす影響の定量的解析を試みた．
【方法と結果】 Saccharomyces cerevisiae の液体培養中，CDMSS を用いて，気相部内の様々な高さにおける CO2 と O2 濃度を測定した結果，循環バイパス速度が遅い場合に，フラスコ気相部にガス濃度勾配が形成された（速い場合には形成されなかった）．特に CO2 の鉛直分布は顕著であった．気相部内を混合した測定条件で，Escherichia coli を振盪フラスコ培養した結果，フラスコ気相部と培養液中に CO2 濃度が一時的に高濃度に蓄積した．そこで，CDMSS の気相部の循環バイパス部分に CO2 吸着カラムを挿入し，振盪フラスコ培養した結果，フラスコ気相部の CO2 濃度の上昇を抑えると伴に，溶存 CO2 濃度を低く維持でき，E. coli の増殖が向上した．また，サンプリング操作に含まれる培養栓の開封や火炎殺菌がフラスコ気相部に及ぼす影響を定量的に解析した結果，CO2 濃
度が大きく変化することが初めて明らかとなった．
1）J Biosci Bioeng, doi: 10.1016/j.jbiosc.2018.01.009.
2）AMB express, 7, 163 (2017).

Effect of intake of amazake on skin barrier functions in healthy adultwomen subjects

Analysis of the headspace environment in flasks during liquid culture withmicroorganisms○Manami Ueda1, Manabu Kitagawa1, Seiki Itou1, Yamamoto Tetsuro2,
Sumio Kondo3(1Marukome Co.,Ltd., 2TTC Co.,Ltd., 3Medical Corporation Kensho-kai, Fukushima
Healthcare Center)

Key words

rice koji, amazake, skin condition, skin barrier function○Masato Takahashi, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

carbon dioxide, headspace, liquid culture, monitoring device

178

2Ep02

好気性微生物培養におけるウルトラファインバブルの
効果

2Ep04

○小西 正朗 1, 川﨑 はるか 1, 江田 智一 2, 清水 友佑 2, 熊谷 和晃 2
（1北見工大, 2ノリタケカンパニーリミテド）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp

培養槽用 OTR シミュレータの開発○石井 伸佳（長瀬産業）
nobuyoshi.ishii@nagase.co.jp【背景・目的】好気発酵プロセスや廃水処理における活性汚泥法では，低エネル
ギーかつ効率的な酸素供給方法が求められている．水中では気液界面積が酸素供給の律速段階と成っているため，気液界面積を増加させることで通気効率を改善できる．本研究ではアルミナ多孔体を用いたウルトラファインバブル（FB）
発生器を用いた培養方法について評価した．
【方法】水中における kLa の推定には亜硫酸 Na 法を用いた．培養中の kLa ならびに微生物増殖への影響を調べるた
め，絶対好気性菌の Pseudozyma hubeiensis を指標菌とし，2L 通気攪拌槽ならびにエアリフト型リアクターで培養した．培地は YPD 改変培地を用い，28℃，
200 rpm，0.5 vvm に設定した．菌体量の測定には濁度法，kLa の推定には排ガス法を用いた．FB 発生器はアルミナ多孔体ならびに SPG(Shirasu Porous Glass)を用いた．
【結果】アルミナ多孔体(細孔径 1.3～10 μm)を使用したエアリフト型リアクター
における亜硫酸 Na 法による kLa は発生直後に FB が会合しているため 50 h-1 程度であり，細孔径に依存しなかった．一方で界面張力が低い YPD 改変培地を用いた場合，FB が会合しないため，3 μm 以上の領域で細孔径に依存して大きく
kLa が増加した．3 μm の細孔径を持つ FB 発生器を用いることで攪拌槽(200 rpm)とエアリフトの場合の kLa は約 100 h-1 に達した．通常の通気攪拌槽の 525 rpmの通気効率に相当した．指標菌の菌体増殖は通気効率に比例して良好な結果が得られた．アルミナ多孔体は構造的に空気の漏れが少なく同孔径の SPG 膜より通気効率が高かった．

好気的な培養では，培養槽内の気相から液相への酸素移動速度（Oxygen Transfer
Rate; OTR）が目的物質の生産性と高く相関することが多い．このため，好気培
養のスケールアップにおいては，OTR を定めるパラメータの一つである酸素移
動容量係数（kLa）が指標としてよく用いられる．しかし例えば，ラボスケールのジャー検討の段階で，所定の生産性を得るのに非常に高い kLa が必要と判明することがある．このとき，もし現場実機で通気撹拌能力不足のためにその kLa
を再現できなければ，kLa を基準とする限りスケールアップは断念せざるを得ない．このような状況であっても，現場実機でコンタミ防止等の目的で加圧が行われ，かつ大きな液深による静水圧が加わるならば，飽和溶存酸素濃度の増加に伴う OTR の増大が見込めるので，OTR を一致させる方法によってスケー
ルアップを行える可能性がある．すなわち，OTR 自体を指標とする方が，kLaを用いる方法よりも実用上，適切な場合がある．
OTR に着目したスケールアップの可否について，実機試験や実生産の事前に判断するためには，所与の条件における OTR の予測計算が必要となる．しかし，従来法では，計算に必要な一部のパラメータ（溶存酸素濃度, 飽和溶存酸素濃度）として仮定値を用いての簡易計算が行われてきた（溶存酸素濃度は 0 ある
いは臨界溶存酸素濃度等，飽和溶存酸素濃度は通気気体の酸素分圧より計算）．
このため，OTR として過大な値が算出されてしまうことがあり，実際にスケールアップを行ってみると実機に適合する条件が得られない場合も少なくなかった． そこで，OTR を従来よりも厳密な手順で求めるシミュレータを開発したので報告する．

Effect of ultrafine babble on oxygen transfer and the growth of aerobes inaerobic cultivation

Development of an OTR simulator for fermentors○Masaaki Konishi1, Haruka Kawasaki1, Tomokazu Eda2, Yusuke Shimizu2,
Kazuaki Kumagai2(1Kitami Inst. Technol., 2Noritake Co. Ltd.)○Nobuyoshi Ishii(Nagase & Co., Ltd)Key words

ultrafine babble, oxygen transfer performance, yeast

Key words

oxygen transfer rate, fermentor, simulation, scale-up

2Ep03

DO-stat 流加培養による組換え大腸菌を用いた単鎖抗体の高濃度菌体外生産

2Ep05

粘度測定による微生物由来生体高分子の分子間力および濃度の推算（予備的考察）○古瀬 久幹 2, 石井 正治 1, 戸田 清 2（1東大院・農生科, 2東大・分生研）
hi-to.furuse@nifty.ne.jp○井嶋 浩一朗, 坂本 祐一朗, 熊田 陽一, 堀内 淳一（京工繊大院・工芸科学）
horiuchi@kit.ac.jp【背景と目的】 これまでの研究でペリプラズム分泌シグナル(PelB leader)を導入
した組換え大腸菌を用い DO-stat 流加培養を行うことにより，単鎖抗体(scFv)を菌体外に高濃度に分泌生産できることを報告した 1)．この結果に基づき，本研
究では，酸素供給速度及び DO 条件が scFv の菌体外分泌生産に及ぼす影響を検討した．
【方法】 モデルタンパクとして anti-CRP scFv を用い，N 末端側にペリプラズム
分泌シグナル（PelB leader），C 末端側に精製用 His タグを導入した anti-CRP scFv
遺伝子を pET-22b(+)発現ベクターを用いて大腸菌 Rosseta2(DE3)を形質転換した．この組換え大腸菌を用い，2L 容 Jar-fermenter にて PID 制御に基づき DO 値が一定となるようグルコースを流加する流加培養を行い，酸素供給速度(OTR)
及び DO 値を変化させ，その影響を検討した．
【結果と考察】 酸素供給速度の影響を検討するため，OTR=35.8 mM/hour (500rpm, DO=3.30 mg/L)及び OTR=86.8 mM/hour (800 rpm, DO=3.30 mg/L)の条件で流加培養を行ったところ，OTR=86.8 mM/hour では菌体外に 2.90 g/L の活性型
scFv が分泌されたが，OTR=35.8 mM/hour では 0.67 g/L に減少した．これは，OTR が小さい場合 DO-stat ではグルコース流加速度が低下し，その結果菌体増殖が抑制されたためと考えられ，scFv の菌体外生産のためには酸素供給速度を大きく設定し，グルコース供給速度を高く維持することが重要と考えられた．
次に，DO を 3.30 mg/L(飽和値の 40 %), 4.96 mg/L(同 60%), 6.61 mg/L(同 80 %)に変化させ，その影響を検討した．その結果，DO=3.30 mg/L から 6.61 mg/L の条
件で 2.85 g/L から 3.18 g/L の scFv が生産され，この範囲では DO レベルは scFvの可溶化率及び菌体外生産濃度に大きな影響を与えないことが明らかになった．
1)坂本祐一朗, 他, 第 69 回日本生物工学大会要旨集, 講演番号 4P-G044, p.283(2017)

Extracellular production of concentrated soluble single chain antibodies
using recombinant E. coli with DO-stat fed-batch culture○Koichiro Ijima, Yuichiro Sakamoto, Yoichi Kumada, Jun-ichi Horiuchi(Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

Escherichia coli, scFv, fed-batch culture, DO-stat【背景と目的】多くの微生物は培養過程において菌体外に多糖類などの高分子を生成し，培養液は粘稠となる．生体高分子は食物の食感，また微生物凝集塊の形成にかかわると考えられる．多様な特性を有する各種微生物の培養条件によりもたらされる生成量の相違などに関して，あらかじめ様々な角度から検討することは実際的に必要不可欠な事柄といえる．溶液の粘度特性は液中に溶解する高分子の特性，たとえば分子同士に働く分子間力，高分子量，濃度などに密接にかかわる．比較的容易と考えられる粘度の測定から，微生物培養液に溶解する高分子の分子間力や，濃度を推算し，微生物の培養条件との相関について検討することを目的とする．
【方法】従来高分子の溶液に関しては，その粘度特性を説明する多くの試みがなされている．本報はせん断流動下において高分子同士が絡み合い，流動に抗して働く力が溶解分散する高分子を介して伝達することを基礎として解析した．
得られた粘度式を既往の測定結果に適用して粘度式の妥当性を確認する．また，
式中にはせん断流動下で絡み合う高分子間に作用する分子間力や濃度に関する項を含んでいる．測定結果に対する粘度式によるシミュレーションからこれら
分子間力などの値を推算可能と考えられる．
【結果と考察】バクテリア Xanthomonas campestris が生成する xanthan の水溶液について粘度のせん断速度依存性，および濃度依存性に関して粘度式の適用を試みた．測定されている既往の粘度特性に対して良くシミュレーション可能なことが確かめられた．導いた粘度式は一般的に多糖類などの高分子を溶解する
各種微生物の培養液に適用可能と考えられる．いろいろな培養条件下，粘度測定により微生物が生成する高分子の分子間力や濃度などの特性について比較検討が可能と考えられる．

Estimations of force between solute bio-polymers and concentration
originated from microbes by viscosity measurement (preliminary
consideration)○Hisamoto Furuse2, Masaharu Ishii1, Kiyoshi Toda2(1Grad. Sch. Agric. Life Sci., Univ. Tokyo, 2Inst. Molecu. and Cellu. Bio-Sci., Univ.
Tokyo)

Key words

bio-polymer, culture fluid, traveling force, viscosity measurement

179

2Ep06

Streptococcus zooepidemicus によるヒアルロン酸生産の

最適化

2Ep08

○小川 愛未 1, 小野 聡子 2, 成田 琴美 3, 武内 章 3, 山崎 思乃 2,
片倉 啓雄 2
（1関西大院・理工, 2関西大・化生工, 3キユーピー）
katakura@kansai-u.ac.jp

ナノバブルと超音波と組み合わせた効率的な殺菌手法の開発○細井 啓貴 1, 廣部 綾乃 1, 高橋 憲司 1, 仁宮 一章 2（1金沢大院・自科, 2金沢大・新学術）
ninomiya@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】ヒアルロン酸は保水力を持ち，眼球治療や関節治療などに利用されている．また，ヒアルロン酸は加齢とともに減少することが分かっており，
近年では，アンチエイジングへの関心から，化粧品やサプリメントへの需要も高まっている．ヒアルロン酸は従来，動物組織より抽出されていたが，経済性の観点から近年では微生物による生産が主流となっている．しかし，微生物生産で得られるヒアルロン酸は，動物由来のものと比較すると分子量が低いことが課題となっており，収率の改善も望まれている．ヒアルロン酸合成は炭素源
において菌体増殖と競合するため，基質あたりの収率を高めるには菌体増殖を抑制する必要があるとされている．そこで本研究では，アミノ酸を培養途中で枯渇させることで菌体増殖を抑制できるか検討した．
【方法】Streptococcus zooepidemicus KK-21 をヒアルロン酸生産菌とした．炭酸カルシウムを添加して，19 種のアミノ酸，5 種の核酸，14 種のビタミン，8 種の無機塩および微量元素，スクロースから成る合成培地 15 mL に対して 0.006 OD
unit の菌体を植菌し，36℃，200 spm で振盪培養した．水酸化ナトリウムで pH制御を行いながら培養し，OD660，ヒアルロン酸の濃度および分子量を測定した．
【結果と考察】培地中のフェニルアラニン濃度が 0.14 g/L である場合，OD660 は3.9 に達したのに対して，0.012 g/L とした場合，OD660 は 1.4 に制限できた．増殖停止以降のヒアルロン酸増加速度はそれぞれ，0.10 および 0.28 g・g-cell-1・
h-1 となり，菌体濃度を制限することによってヒアルロン酸の比生産速度が増加することが分かった．今後，ヒアルロン酸濃度が高まっても十分に撹拌できる
ようにジャーファーメンターを改良するとともに，その酸素供給能力に合わせて菌体濃度を制限することで，ヒアルロン酸の高効率生産を検討していく．

【目的】超音波を液中に照射すると，液中の気体分子に正・負の圧力が交互にかかり，気泡が数 μm～100 μm 程度に圧縮・膨張を繰り返すなかで，圧縮時の高い圧力の限界でマイクロバブル気泡がはじけ，「衝撃波」や「局所的な高温高圧場」が生じる．これを超音波キャビテーションという．この際「衝撃波による物理的作用」，「局所的な高温高圧場における水の熱分解で生じる OH ラジカルによる化学的作用」が生じる．一方，近年，10～100 nm サイズの微細な気泡であるナノバブルが注目を集めている．この「ナノバブル」は，1 μm サイズ以上のマイクロバブルと異なり，水中で準安定的に存在する．このナノバブルが，
超音波キャビテーション発生の核になるのではないかという作業仮説を立てた．
そこで，ナノバブルと超音波の組み合わせにより，超音波キャビテーションの際の「衝撃波による物理的作用」，「局所的な高温高圧場における水の熱分解で生じる OH ラジカルによる化学的作用」を相乗的に増大させることで，環境負荷のない効率的な水質浄化を行う手法の開発を行った．
【方法および結果】「操作変数」は，A)超音波照射条件（周波数 38 もしくは 1600
kHz，強度）および B)ナノバブル濃度とした．
「評価項目」として，ナノバブル
粒径分布・濃度，OH ラジカル，大腸菌生存率の経時変化を評価した．超音波
照射はソノリアクターを用い，照射強度については，カロリメトリ法を用いて評価・設定した．ナノバブル水調整は，旋回液流出式ナノバブル製造装置を用い，ナノバブルの粒径分布および濃度は，Nano Tracking Analysis 法により測定した．OH ラジカルは Aminophenyl Fluorescein を用いて検出した．殺菌試験は，大腸菌のコロニーカウントを行った．ナノバブルと超音波の組み合わせにより，
OH ラジカルの生成や殺菌効率は相乗的に向上する現象が見出された．

Optimization of hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus

Disinfection process by combined use of nanobubble and ultrasound

Key words
Streptococcus zooepidemicus, hyaluronic acid, specific production rate,phenylalanine

Key words

disinfection, nanobubble, ultrasound

2Ep07

2Ep09

ABC 光半導体の暗所での殺菌作用における遮光後放電による影響の可能性○Ami Ogawa1, Satoko Ono2, Kotomi Narita3, Akira Takeuchi3,
Shino Yamasaki-Yashiki2, Yoshio Katakura2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Fac. Chem. Mater. Bioeng., Kansai Univ.,
3
Kewpie Co.)

新規殺菌剤過硝酸を用いたノロウイルスモデルの不活化○小豆澤 友希 1, 井川 聡 2, 北野 勝久 3, 座古 保 1（1愛媛大院・理工, 2大阪府立産技総研, 3阪大院・工）zako.tamotsu.us@ehime-u.ac.jp○Hiroki Hosoi1, Ayano Hirobe1, Kenji Takahashi1, kazuaki Ninomiya2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Ints. Frontier Sci. Initiative,
Kanazawa Univ.)○辻塚 誠一郎 1, 宮本 樹里 1, 俗多 秀美 1, 伊東 謙吾 2, 田中 賢二 1
（1近大・産理工, 2伊都研）
tanaka@fuk.kindai.ac.jp【背景と目的】
ノロウイルスは食中毒の原因の約半数を占め，その制御は食中毒対策上の重要な課題である．ノロウイルスはエンベロープを持たないウイルスであるため，薬剤の耐性が強く，不活化が困難である．そのため有用な薬剤の開発が求められている．
我々はこれまでに，大気圧低温プラズマを水に照射したプラズマ処理水を用いた殺菌実験を進め，殺菌有効成分が過硝酸（HOONO2，PNA: peroxynitric acid）
であることを明らかにし，PNA による殺菌という世界初の技術の開発に至った．150 μM の PNA にて大腸菌の殺菌実験を行ったところ，30 秒で菌数を 10-6
以下にできるなど，PNA は非常に高い殺菌力を有していることが明らかになっている．また，生体への安全性も動物実験による検証が進んでいる．そこで本
研究では，PNA がノロウイルスに対しても有効かを，ノロウイルスのモデルとして一般的に用いられるネコカリシウイルス(FCV)を用いて評価した．
【方法および結果】
酸性条件下において過酸化水素と亜硝酸より PNA を合成した．PNA の半減時間および反応速度（殺菌力）は温度と pH に依存するため，FCV を不活化する
際の溶液は 25℃，pH3.0 に固定した．またウイルス液から PNA を取り除くのは困難であるため，一定時間経過後，高濃度のタンパク質を含む培地と混合することで PNA を瞬時に失活させ，不活化効果を停止させた．FCV の感染価は，50％の細胞が FCV 感染による形態変化を起こすウイルス濃度を求める 50%
Tissue Culture Infectious Dose 法にて算出した．合成した PNA の原液（1M）を
1 万倍希釈した 100 μM の溶液で FCV を不活化処理したところ，10 秒間で感染
価を 4 桁減少させることができた．今後，様々な角度から有用性の検討を行っていく予定である．

【目的】伊都研究所が開発した平板状銀ナノ粒子 （AgNPL），ボロン樹脂(B)，
クレイ(C)で構成される ABC 光半導体は，可視光や近赤外光照射により起電力を生じる．また，有機溶媒中での分散と安定性に優れ，物体表面への塗布による薄膜化が容易である．ABC 光半導体は，これらの光照射下で細菌やカビ胞子に強い抗菌作用を示す．また，いわゆる光触媒とは異なり，暗所でも抗菌作用を示す．暗所での抗菌は，銀成分である AgNPL の抗菌力に由来すると考えられてきたが，他の B，C 成分を無くすと抗菌力が顕著に低下することや，暗所での抗菌力は試験前操作における照明の影響を強く受けることがその後明らかになった 1)．このため，本光半導体では，光照射で発生した電気が蓄積されその後放電されることによる殺菌が起きているのではないかと考え，抗菌試験実施前の本半導体への光照射の影響について検証した．
【実験】ABC 光半導体の希薄液を PET フィルムに塗布・固定化させて試験片を作成し，これに大腸菌の菌液をマウントし，素の PET フィルムを被せ 30℃で8 時間放置することにより抗菌処理した．試験片上の菌液を回収し平板培地で培養しコロニー数を比較することで抗菌活性を評価した．コロニー計数以外の操作は全て暗所で実施した．
【結果】抗菌処理前に暗所で長時間保存した試験片と白色 LED（1000lx）を照射した試験片について抗菌活性を比較したところ，暗所保存したものでの活性は非常に弱かったが，光を 30 分間事前照射した試験片ではある程度の活性増加が見られた．さらに 24 時間の事前照射では高い抗菌活性が認められた．この結果
は，ABC 光半導体では遮光後もしばらくの間は放電が続くこととも一致する．
参考文献 1）辻塚ら．第 69 回日本生物工学会大会講演要旨集 P241，2017 年

Inactivation of Norovirus model using novel disinfectant, Peroxynitric acid

Investigation on antimicrobial effect of an electric discharge from novel
paintable ABC photoconductor after shading visible light○Tomoki Azukizawa1, Satoshi Ikawa2, Katsuhisa Kitano3, Tamotsu Zako1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Ehime Univ., 2Tech. Res. Inst. Osaka Pref., 3Grad. Sch. Eng.,
Osaka Univ.)

Key words

Peroxynitric acid, Disinfectant, Feline calicivirus, Norovirus model○Seichiro Tsujitsuka1, Juri Miyamoto1, Hidemi Muta1, Kengo Ito2, Kenji Tanaka1(1Fac. Humanity-Oriented. Sci. Eng., Kinki Univ., 2Ito Lab.)

Key words

antibacterial, photoconducter, silver nanoplate

180

2Ep10

マイクロ波（非熱効果）が微生物の生理活性に及ぼす影
響の解析

2Fp01

○松田 将典 1, 堀越 智 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2上智大・理工）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

低分子化抗体精製用アフィニティクロマトグラフィー担体の応用・改良研究○西八條 正克 1,2, 村田 大 1,2, 鴻池 史憲 1,2, 吉田 慎一 1,2,
水口 和信 1,2
（1カネカ, 2次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）
Dai.Murata@kaneka.co.jp【目的】 過去 50 年間にマイクロ波が微生物，酵素，タンパク質，遺伝子などに及ぼす影響が検討され，様々な現象が報告されてきた．しかしながら，マイクロ波が照射された試料の温度測定や管理が適切になされていなかったため，これまで報告されてきた現象が，(1) 試料の加熱により生じたのか？，(2) マイク
ロ波の特異的効果により生じたのか？，あるいは，(3) 両者の相乗効果により生じたのか？，という点については未解明である．この現状を踏まえ，本研究では，適切な温度管理の下で実験をおこない，マイクロ波（非熱効果）が微生物の生理活性に及ぼす影響を解析した．
【方法と結果】 マイクロ波照射中の試料の温度は，常に光ファイバー温度計でモニターし，温度の上下に応じてマイクロ波の出力を調整し，一定に維持した．
マイクロ波（非熱効果）が Escherichia coli K12 に及ぼす影響を種々検討した結果，適切な条件でマイクロ波（周波数：2.45 GHz，出力：約 50～65 W で 30℃を維持）を照射しながら液体培養をおこなった場合，E. coli K12 の比増殖速度はコントロールと比べて 1.3 倍増加し，最終菌体濃度も 1.2 倍に向上することが明らかとなった．同様の実験を土壌試料懸濁液でおこない，PCR-変性剤濃度勾
配ゲル電気泳動（DGGE）法で解析した結果，培養微生物叢に変化はみられな
かった．しかしながら，孔径 0.8 μm のフィルターを用いてサイズの大きな微生物を除去した土壌試料では，マイクロ波（非熱効果）により培養化される微生物叢が，コントロールと異なった．以上の結果より，マイクロ波（非熱効果）
により，培養化が促進（あるいは抑制）する微生物の存在が示唆された．

【背景と目的】
低分子化抗体は，Fab や scFv に代表されるような多様なフォーマットがあり，次世代型抗体医薬品や検査診断薬として開発が進められている．これまでは汎用性のある高性能な低分子化抗体精製用のアフィニティー担体が入手できなかったことから，品目毎にイオン交換担体等を組み合わせた複雑な条件設定が必要であり，プロセス開発に時間と労力を要することが課題であった．
我々は，低分子化抗体の精製工程のプラットフォーム化の確立を目指し，Fab結合能が高い改変型プロテイン G（SpG）および抗体結合スペクトルの広い改
変型プロテイン L（PpL）をそれぞれセルロース基材に固定化した KANEKA
KanCapTM G と KANEKA KanCapTM L を開発した．本報告では，これらの担体の基本性能の紹介と共に，簡略化された低分子化抗体精製プラットフォームプロ
セスの提案を行う．
【方法と結果】
KANEKA KanCapTM G は，市販のモノクローナル抗体から調製した 3 種類の Fabについて，市販の SpG 担体（2 種類）と比較して，いずれの Fab にも 2 倍以上高い動的結合容量を示した．酵母培養上清中に発現させた Fab を精製したとこ
ろ，高結合容量と高回収率により，市販担体に比べ約 6 倍高い生産性で Fab が精製できた．KANEKA KanCapTM L も，市販の PpL 担体と比較して，高い Fab
結合容量を示した．評価した Fab のうち一種については市販品では動的結合容量が 3 mg/mL に対して，25 mg/mL と約 8 倍高い結合容量となり，汎用性の高さを示した．また，KANEKA KanCapTM L は，Diabody に対しても Fab と同様に高い結合容量を示した．さらに，KANEKA KanCapTM G および L の実用性能向上を目的としたリガンドの改良研究も継続的に実施しており，低分子化抗体精製プラットフォームプロセスの提案とあわせて報告する．

Influence of microwave (non-thermal effect) on the physiological activities of
microbes

Application/improvement study of affinity chromatography resins for
purification of antibody fragments○Masanori Matsuda1, Satoshi Horikoshi2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Fac. Sch. Technol. Sophia Univ.)○Masakatsu Nishihachijo1,2, Dai Murata1,2, Fuminori Konoike1,2,
Shinichi Yoshida1,2, Kazunobu Minakuchi1,2(1Kaneka Corp., 2Manufacturing Technology Association of Biologics)

Key words

Escherichia coli, microwave, non-thermal effect, PCR-DGGE

Key words

affinity chromatography, antibody fragments, Protein G, Protein L

2Ep11

抗菌素材“ＰＧＡＩＣ”の生成機構分析とオンサイトコー
ティングへの応用

2Fp02

治療用酵素ヒト-Kynureninase の高効率分離プロセスの開発○白米 優一 1, 中山 沢水 2, 東内 遥菜 2, 芦内 誠 1,2（1愛媛大院・連合農, 2高知大・農）yuichi.haku@gmail.com○杉山 友亮, 堀内 淳一, 熊田 陽一（京工繊大・工芸科学）
kumada@kit.ac.jp【背景】感染・食中毒を防止する目的から，コーティング機能を備えた抗菌性ポリマーの需要が高まっている．実際，微生物に侵された材料表面は重大な媒介要因になること，特に抵抗力が低下した患者への影響は甚大とされる．第 4 級
アンモニウム化合物（QA）は，化粧品の保存剤から一般公衆衛生の目的に適う除菌剤まで様々な社会領域で利用されている．QA には，広域抗菌スペクトル・
ｐＨ耐性・低毒性・無臭性等，多くの利点がある．ただし，QA 主体の被膜面は不安定，抗菌機能を維持するのも困難であり，これは「両親媒性」に起因す
る．そのため，水ばかりか，アルコール類をはじめとする有機溶媒に触れた場
合でも材料表面から簡単に剥がれ落ちる．かかる課題の克服を目指し，ポリ γグルタミン酸イオンコンプレックス（PGAIC）が開発された．続いて，二頭型
QA（キノリニウムタイプ）を利用することで，PGAIC に優れた耐熱性・化学耐久性が付与できることも示された．ただし，PGAIC 形成機構については不明な部分が多く，他方では超耐久性 PGAIC（PGA/DEQ 等）をコーティング基材として用いるための方法論について手付かずの状態で残されていた．今回，現状打破に繋がるブレークスルーを探ったので報告する．
【方法・結果】PGA/DEQ の NMR 分析は，これが PGA の全カルボキシル基とDEQ のキノリニウム部位が結合してなる複合体であることを示した．本生成反応と既知の吸着（結合）モデルを照らして解析を進めた結果，NICA モデルに従うことが判明した．先例多数のラングミュラモデルにはそぐわなかったことから，ここに協奏的な分子メカニズムが働いていることが明らかになった．
PGAIC の「“材質不問，かかる表面に自発接着後，被膜化する”多用途性コー
ティング能」を組み合わせることで，PGA/DEQ の薄層を材料上で直接（オンサイト）合成する簡便技術を導くことができた．

【背景と目的】Kynureninase (KYNase)は，血中の L-Kynurenine (KYN)濃度を低下させ，免疫系の機能を向上させることから，バイオ医薬品としての利用が期待されている．本研究では，組換え大腸菌におけるヒト KYNase の大量生産プロ
セスの構築を目的とし，特に，菌体破砕液からの KYNase の少ステップかつ高効率な精製プロセスの開発を行った．すなわち，KYNase のクロマトグラフィ
分離における最適な分離担体の選定を行うとともに，担体への吸着における pH
依存性や構造安定性を評価した．
【方法】N 末端に 6xHis-tag を融合した KYNase をモデルとし，発現ベクターで形質転換された大腸菌 C43(DE3)株を得た．得られた形質転換体を用いてフラス
コ培養を行い，菌体内可溶性画分に活性型の KYNase を得た．さらに，Ni-NTA
カラムを用いて KYNase を精製後，種々の実験に用いた．KYNase の吸着分離担体として，これまでの研究で実績の高かったヒドロキシアパタイトを用いた．
各 pH における KYNase の吸着性，安定性，ならびに触媒活性を評価した．
【結果】組換え大腸菌を用いてヒト KYNase を生産したところ，39 mg/L の濃度で菌体内可溶性画分に局在していた．アフィニティ精製後の KYNase の触媒活性における反応 pH の影響を調べたところ，pH 8.5 において最大の反応速度が得られた．現在，KYNase の pH 安定性を調査中であるが，弱アルカリ pH において触媒活性を高く維持できることから，ヒドロキシアパタイト（HA）への吸着と大腸菌細胞内タンパク質との群特異的アフィニティ分離を行う予定である．特に，HA 担体への KYNase の吸着における pH 依存性や溶出挙動の最適化に関する結果についても発表する予定である．

Engineering and on site coating of poly-γ-glutamate-based antimicrobial
materials

Development of efficient separation process for therapeutic enzyme, humanKynureninase○Yuichi Hakumai1, Sawami Nakayama2, Haruna Higashiuchi2, Makoto Ashiuchi1,2(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Ehime Univ., 2Fac. Agric. Agric. Sci. Prog., Kochi
Univ.)

Key words

poly-gamma-glutamate, on site coating, antimicrobial materials○Yusuke Sugiyama, Jun-ichi Horiuchi, Yoichi Kumada(Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

Kynureninase, kinetics, Hydroxyapatite, purification

181

2Fp03

B 型肝炎ウイルス様粒子(HBsAg-VLP)の効率的なクロマ
トグラフィ精製手法の確立

2Fp05○小木戸 謙, 丸田 秀平, 青木 裕史（昭和電工）
kokido.yuzuru.xhflx@showadenko.com

ポリアミンによる荷電脂質膜の相分離○引地 啓太, 山本 耀吾, 下川 直史, 高木 昌宏（北陸先端大・マテリアル）
takagi@jaist.ac.jp【背景と目的】 近年，ウイルス様粒子(VLP)をワクチン・ウイルスベクター・ド
ラッグデリバリー担体として利用する応用研究が盛んに進められており，それらの効率的な精製・分析技術が求められている．本研究は，高速・低背圧で運用可能なバイオナノ粒子領域に適性をもつポリマーモノリスカラムと，VLP 領域に最適化したポアサイズと基材設計を持つ当社試作ゲル濾過カラムを組み合わせることにより，従来の超遠心精製法や既存のクロマトグラフィ精製法より生産性高く，効率的に B 型肝炎ウイルス VLP (HBsAg-VLP) を精製することを目的とした．
【方法】 B 型肝炎ウイルス VLP (HBsAg-VLP) を含む粗抽出液は，組換え酵母系を用い，破砕抽出により調製した．得られた粗抽出液を BIA separtaions 社製モノリス強陽イオン交換カラム(CIMmultus SO3-1)に 5CV/min で通液し，塩化ナト
リウムのグラジエントによる濃縮画分を調製した．さらに，濃縮画分を当社試
作ゲル濾過カラムに供試した．各溶出画分に含まれる HBsAg-VLP のサイズを粒度分布により，純度をタンパク質量当たりの ELISA 価および SDS-PAGE により，また，形態を電子顕微鏡観察により評価した．
【結果と考察】 初段に CIMmultus SO3-1 を適用することにより，宿主由来のDNA ほか夾雑物の吸着を抑え，高速かつ効率的に HBsAg-VLP を精製・濃縮することができた．また，当社試作ゲル濾過カラムは，不定形の HBsAg-VLP と
サイズ均一性の高い球状 HBsAg-VLP とを分離することができ，さらに各画分の ELISA 価にも違いが見られた．本手法は，医薬品としての品質要求を満たす
高度な VLP 精製技術の確立に貢献できると考える．

【背景】両親媒性分子であるリン脂質は，水中で自発的に二重膜構造を形成す
る．二重膜が球状に閉じた構造はリポソームと呼ばれ，細胞膜のモデル系として用いられている．多成分のリン脂質からなる二重膜では，低温で相分離が観察される．相分離に関する研究に関して，我々は，荷電脂質の役割や荷電脂質とカチオンの相互作用に興味がある．本研究では，多価イオンであるポリアミ
ンをはじめ，様々な塩を添加した際の荷電脂質膜の相分離を観察した．
【材料・方法】脂質は中性飽和脂質 DPPC，負電荷不飽和脂質 DOPS，コレステ
ロール(Chol)を用い，脂質組成は DOPS/DPPC/Chol=40:40:20 に固定した．蛍光試薬としてローダミン DHPE を用いた．リポソームは静置水和法で作成した．
また，水和の際にカチオンとしてポリアミン(プトレシン(+2)，スペルミジン(+3)，スペルミン(+4)，N4-bis(aminopropyl)spermidine (+5))を添加した．また比較のため，NaCl(+1)，MgCl2(+2)，CaCl2(+2)，ヘキサメチレンジアミン(+2)も用いた．相分離は蛍光顕微鏡を用い，さらにゼータ電位測定も行った．
【結果・考察】DPPC,DOPS,コレステロールのみからなるリポソームの場合，室温で相分離は観察されないが，いずれの塩を添加した場合においても相分離が観察された．これは DOPS 間の静電反発が添加塩により遮蔽されたためと考えられた．価数依存性を見ると，価数が大きいほど，より低濃度で相分離が観察された．価数が同じ場合には基本的にカチオンサイズが小さい塩ほど低濃度で相分離が観察された．カチオンが膜面に吸着した際，小さいカチオンほどカチ
オン間の立体斥力が小さいため，より多くのカチオンが吸着できるためであると考えられた．

Establishment of efficient chromatographic purification method of hepatitis
B surface antigen virus-like particles (HBsAg-VLPs).

Phase separation induced by addition of polyamine in charged lipid
membranes○Yuzuru Kokido, Shuhei Maruta, Hirobumi Aoki
(Showa Denko.K.K.)○Keita Hikichi, Yougo Yamamoto, Naofumi Shimokawa, Masahiro Takagi(Sch. Mater. Sci., JAIST)

Key words

chromatography, monolith, virus-like particles, HBsAg

Key words

2Fp04

バイオマス発酵プロセス向け低ファウリング膜の開発

2Fp06○志村 芙美, 小岩 雅和, 畠平 智子, 木村 将弘（東レ）
Satoko_Hatahira@nts.toray.co.jp

lipid vesicle

エマルションドロップレットを用いた土壌微生物の培養○村井 雄大 1, 川島 万凜 1, 森田 直樹 1, 土居 克実 2, 久原 哲 1,
田代 康介 1
（1九大院・生資環, 2九大院・農）murai@grt.kyushu-u.ac.jp［背景・目的］当社は長年培ってきた高分子技術，独自のナノテクノロジーにより，逆浸透（RO）膜，ナノろ過（NF）膜，限外ろ過（UF）膜，精密ろ過（MF）
膜を水処理用途向けに開発してきた．これらの各種高分子膜について，バイオマス変換用途への新規展開を目指しており，その一つとして，分離膜を用いた連続発酵法「膜利用連続発酵プロセス」の開発を進めている．これは発酵液中の菌体を膜分離により濃縮する技術であり，これまでに本プロセスを適用した実例として，D-乳酸連続発酵において 700 時間以上の長期安定運転を実現しており，バッチ発酵法に対して 7.5 倍の生産速度を得ている．一方で，長期運転時の膜ファウリングは依然課題であり，膜間差圧の上昇を抑制しながら連続発酵を可能とする膜の開発が求められている．そこで，発酵液のろ過用途における新規低ファウリング膜の開発を目的とし，検討を行った．
［実験方法］まず，発酵液ろ過におけるファウラントを同定するため，特定の発酵液をろ過して得られた閉塞膜について，飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて付着物解析を行った．併せて，ろ過途中の膜に対して各種酵素を作用させることで，ファウラントの半同定を実施した．ファウラントの同定結果に基づき，低ファウリングポリマーのスクリーニングを実施した．最後に，選定されたポリマーを発酵液ろ過膜に適用し，実発酵液での評価に供した．
［結果と考察］付着物解析の結果，膜閉塞時にはタンパク質及び β グルカンが主要ファウラントであることが示唆された．解析結果に基づきスクリーニング
された低ファウリングポリマーをろ過膜に適用し，実発酵液のろ過を行った結果，弊社従来膜に比べてろ過量が 3 倍向上することを確認した．本分離膜を適用した発酵プロセスは各種バイオプロセス，食品・飲料製造分野等に展開可能性があると考える．

【緒言】 環境中には膨大な量と種の微生物が存在しており，そのうち単離，培養ができる微生物は 1％未満とされる．難培養である原因として，生育の早い
他の微生物による淘汰や環境中の未知の生育因子への依存等が考えられる．本
研究では，エマルションドロップレットを用いた土壌微生物培養を検討した．
難培養性微生物の発見および，その単離・培養が本研究の最終的な目標である．
【実験】 ドロップレットジェネレータを用いて，直径 40-50 μm の土壌微生物を封入したエマルションドロップレットを作製した．その後，土壌微生物の生育と微生物叢のダイナミクスを，次世代シーケンシングによる 16S rRNA 遺伝子
解析によって評価した．また，ドロップレット培養と従来の培養法（液体培養法・平板培養法）の比較を行い，ドロップレット培養の特性を評価した．
【結果および考察】 土壌微生物を封入した各ドロップレットにおいて，菌体の増殖を確認し，土壌微生物におけるドロップレット培養の可能性を示した．また，経時的な DNA 量の変化より，ドロップレット培養は従来の液体培養，平板培養に比べて，緩やかな増殖を示すことが明らかとなった．さらに，16S 解析の結果から，ドロップレット培養は，従来の培養法と比較して特徴的な微生物叢のパターンを示し，有意に微生物種が保存されていることが明らかとなった．今後，本培養システムを用いた，難培養性微生物の培養が期待される．

Development of low fouling membrane for membrane integrated continuous
fermentation process

Culture of soil micro-organisms by emulsion droplet○Fumi Shimura, Masakazu Koiwa, Satoko Hatahira, Masahiro Kimura(Toray Industries, Inc.)

Key words

membrane reactor, continuous culture, fouling, glucan○Yuta Murai1, Marin Kawashima1, Naoki Morita1, Katsumi Doi2, Satoru Kuhara1,
Kosuke Tashiro1(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
dropletmicroorganisms, uncultured bacteria, microfluidic device, emulsion

182

2Fp07

water-in-oil エマルションを用いた微生物の培養および検出技術の構築

2Fp09○大田 悠里 1,2, 斉藤 加奈子 1,2, 松倉 智子 2, 髙木 妙子 2,
森田 雅宗 2, 常田 聡 1, 野田 尚宏 1,2（1早大院・先進理工, 2産総研・バイオメディカル）
noda-naohiro@aist.go.jp

脂質膜被覆球形粒子を用いた曲率認識タンパク質スク
リーニング手法の開発○田中 祐圭, 矢内 健太郎, 大河内 美奈（東工大）
okochi@chemeng.titech.ac.jp【背景と目的】環境中には様々な微生物が生息しており，寒天平板法，限界希釈法といった手法により，種々の微生物が単離されてきた．しかしながら，これまでに培養されてきた微生物は環境中に生息すると推定される微生物のうち 1%にも満たない．近年，water-in-oil エマルションを用いた微生物培養技術が注目されつつある．マイクロ流体デバイスを使用することで一度に大量の均一サイズを有するドロップレットを作製でき，ハイスループットな培養場を提供できるため，難培養微生物の培養技術として期待されている．本手法の構築においてはドロップレット内で微生物を培養した後に微生物が増殖したドロップレッ
トを検出し，選択的に回収するという過程が必要となる．そこで，本研究では微生物をドロップレットに封入して培養し，セルソーターを用いたドロップレッ
トの蛍光検出により，微生物増殖ドロップレットを検出する技術を構築した．
【方法】水相には培地を使用し，オイル相にはフッ素系オイルおよび界面活性剤を使用して，直径約 130 μm 程度のドロップレットを作製した．モデル微生物として大腸菌，枯草菌，放線菌，根粒菌を選択し，空のドロップレットが 90%程度，微生物封入ドロップレットが 10%程度となるようにモデル微生物をド
ロップレットへ封入した．封入直後と一定時間培養後にドロップレットの顕微
鏡観察を行い，同時にチップ式セルソーターを用いてドロップレットの蛍光強度を測定した．
【結果と考察】各モデル微生物がドロップレット内で増殖することが確認された．また微生物種によって増殖形態が異なる様子も観察された．微生物が増殖したドロップレットでは蛍光強度が上昇しており，セルソーターによるドロップレットの蛍光強度測定により，微生物増殖ドロップレットを検出することが
できた．

【背景】
生体膜小胞形成は，細胞機能やがんなどの疾病に関与するバイオプロセスであり，様々なタンパク質により制御される．特に，平面生体膜から小胞構造を形作る上で，生体膜の曲率を認識するタンパク質が重要な役割を果たす．一方で，生体内で形成される小胞の多様性を既存の曲率認識タンパク質だけでは説明できないため，未知の曲率タンパク質の存在が示唆されている．そこで本研究では，生体膜で被覆した粒径の異なる球形材料を利用した，新たな曲率認識タン
パク質を同定するための基盤技術を創出に向けた研究開発を実施する．
【方法】
粒径が 100 nm，1 μm の SiO2 粒子を調製し，単層 liposome と混合することで粒子に脂質膜を修飾し，特定の異なる曲率をもつ生体膜模倣材料を作製した． また，すでに曲率認識能をもつことが知られる Amphiphysin をモデルタンパク質とし，GST との融合タンパク質を大腸菌により発現させた．大腸菌破砕液と脂質膜修飾粒子を混合し，遠心分離により粒子に結合した GST-Amphiphysin を回収し，得られたタンパク質を SDS-PAGE によって分析した．
【結果・考察】サイズの異なる SiO2 粒子に対して生体膜が被覆されていることを示し，これに対する曲率認識モデルタンパク質 Amphiphysin との相互作用解析から，曲率の異なる生体膜に対して異なる親和性を示すことが確認された．またこれまでに同定されていない曲率認識能をもつタンパク質の存在が示唆された．今後は混合するタンパク質サンプルや脂質成分を検討することで，新規な曲率認識タン
パク質が同定されることが期待される．

Development of droplet-based bacterial cultivation and detection techniques

Screening technique development of membrane curvature-sensing proteinusing lipid membrane-coated spherical particles○Yuri Ota1,2, Kanako Saito1,2, Satoko Matsukura2, Taeko Takagi2,
Masamune Morita2, Satoshi Tsuneda1, Naohiro Noda1,2(1Grad. Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Biomed. Res. Inst., AIST)○Masayoshi Tanaka, Kentaro Yanai, Mina Okochi(Tokyo Tech)

Key words
detection

droplet microfluidics, emulsion, bacterial cultivation, bacterial

Key words

membrane lipids, screening, membrane curvature-sensing protein

2Fp08

エマルション培養法を用いた微生物由来ペプチダーゼス
クリーニング系基盤構築に向けて

2Fp10

GP64 融合ビオチンリガーゼによる近接依存反応を利用した Sf9 昆虫細胞表面 GP64 結合レセプターの探索○本間 宣行 1, 中村 彰宏 1, 鈴木 義之 1, 志田 洋介 1, 野田 尚宏 2,
小笠原 渉 1
（1長岡技科大, 2産総研・バイオメディカル）
owataru@vos.nagaokaut.ac.jp○岡本 園子 1, 横田 早希 1, 鈴木 健裕 2, 堂前 直 2, 後藤 猛 1（1秋田大院・理工, 2理研・CSRS）
tgotoh@gipc.akita-u.ac.jp

地球上には無数の微生物が存在するが，既存の技術で培養可能な微生物は 1%にも満たない．しかし，人類はその一部の培養可能な微生物の機能を利用し，多大な恩恵を受けている．そのため，新規微生物の単離培養および微生物資源の利用は，さらなる産業の発展につながる．我々は油中液滴 (ドロップレット)の分散系である「エマルション」を用いた微生物培養法に着目した．微小培養器であるドロップレットは 1 時間未満で 100 万という高速生産が可能である．
このことから，エマルション培養により膨大な環境微生物をハイスループットに培養，スクリーニングすることで新規微生物の単離が期待される．
当研究室では糖非発酵性グラム陰性菌 Pseudoxanthomonas mexicana WO24 を単離した(Ogasawara et al., 1996)．これまでに我々は本菌が保持するペプチド分解機構について解明を行ってきた．そこで本菌を，環境中から微生物由来ペプチ
ダーゼのスクリーニング系を構築する上でのモデル微生物とした．
本研究ではエマルションにおける種々の検討および通性嫌気性細菌 Escherichia
coli と好気性細菌 P. mexicana WO24 を用いた培養の条件検討を行った．ドロップレットジェネレーターを用いて様々な圧力条件下でエマルションの作成を行った．その結果，直径 90 μm-360 μm のドロップレットの作成に成功し，作成したドロップレットは少なくとも 7 日間安定だった．さらに，E. coli および P. mexicana
WO24 のエマルション培養を行った結果，6 時間程度でドロップレット内部全域に菌体の増殖が観察され，7 日間安定的に培養が可能であることを確認した．
また，エマルション培養を用いて各菌体のエンドペプチダーゼ活性に基づいたスクリーニングに成功した．今後は，菌体エキソペプチダーゼ活性に基づいたスクリーニング系の構築を目指す．

【背景と目的】バキュロウイルスは鱗翅目などの昆虫に特異的に感染するウイルスであり，翻訳後修飾された哺乳動物タンパク質の昆虫細胞による高効率生産のためのベクターとして広く利用されている．バキュロウイルスの昆虫細胞への侵入は，ウイルスエンベロープ表面の 3 量体を形成した糖タンパク質 GP64
が昆虫細胞表面のレセプタータンパク質に結合することから始まると考えられているが，このレセプターは未だ同定されていない．本研究では GP64 融合ビ
オチンリガーゼを有する組換えバキュロウイルスを用いてレセプター候補タン
パク質を探索することを目的とした．
【方法と結果】ビオチンリガーゼ変異体（BirA）融合 GP64 の cDNA を導入した
組換えバキュロウイルス(vBirA-GP64)を調製した．これを Sf9 昆虫細胞に MOI
10 pfu/cell で感染させて 24 h 後のタンパク質を SDS-PAGE により分離し，GP64抗体を用いた Western blot により分析したところ，BirA が融合した GP64 の 3量体の形成が認められた．続いて vBirA-GP64 感染 Sf9 細胞の膜画分のタンパク質を SDS-PAGE により分離し，ストレプトアビジン-AP を用いた Western blot
によりビオチン化タンパク質を Mock 感染培養の結果と比較したところ，約 52
kDa のタンパク質が特異的にビオチン化されていた．これは Sf9 細胞表面レセ
プターがウイルス表面の BirA 融合 GP64 と結合して近接した BirA によりビオチン化されたためと考えられた．そこでこの約 52 kDa のタンパク質をレセプ
ター候補とし，vBirA-GP64 感染 Sf9 細胞の膜画分から陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより粗精製した後，二次元電気泳動を行った．候補タンパク質領域のゲルを切り出してトリプシン消化し，LC-MS/MS によりペプチド解析を行って NCBI の動物（Metazoa）タンパク質データベースに対して検索したところ，
3 つのレセプター候補タンパク質が見い出された．

Toward the construction of microbial peptidase screening method employing
emulsion cultivation

Explorative study of a GP64 receptor on the surface of Sf9 insect cells using
proximity-dependent reaction by GP64-fused biotin ligase○Nobuyuki Honma1, Akihiro Nakamura1, Yoshiyuki Suzuki1, Yosuke Shida1,
Naohiro Noda2, Wataru Ogasawara1(1Nagaoka Univ. Technol., 2Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

emulsion, peptidase, cultivation○Sonoko Okamoto1, Saki Yokota1, Takehiro Suzuki2, Naoshi Dohmae2,
Takeshi Gotoh1(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2RIKEN CSRS)

Key words

baculovirus, Sf9 cell, receptor protein, GP64

183

2Fp11

pH 変動培養法を活用した耐酸性微生物や好酸性微生物の高効率なスクリーニング系の開発

2Gp02○高野 力 1, 村山 晃一 2, 青柳 秀紀 1
（1筑波大院・生命環境, 2フタムラ化学）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【緒言】 強酸性，高温などの特殊環境に存在する微生物は特殊な酵素や機構などを有するため，学術面，産業面で重要性が高い．微生物の単離培養には寒天
平板培養法が広く用いられているが，強酸性条件下では寒天が加水分解するため，使用が困難となる．我々はこれまで，強酸性条件下で安定して使用可能な，Specialized Cellulose Film (SCF) 法を用いた微生物の単離培養系を構築してきた
1)．本研究では，自然界の強酸性環境に生育する好酸性微生物や，中性環境で生育し強酸性条件下で生存可能な耐酸性微生物に焦点を当て，効率的な単離培養系の構築を試みた．
【方法と結果】 強酸性環境（pH 1.7-1.9）で採取した種々の試料を，pH 1 の液体培地で振盪培養 (200 rpm, 30℃,14 d) し，SCF 培地に植菌して培養を行った結果，複数の微生物を単離培養できた．耐酸性微生物の単離培養のため，SCF 法
を用いて培地の pH を 7→1→7 と変動させる pH 変動培養法 1)の諸条件（A: pH
1 の培地と強酸希釈液の使用，B: 変動前後の培養時間， C: 強酸性条件下での培養時間）を，培養菌叢の比較に基づき，最適化した．pH 1 の培地で 48 h 培養した場合と，100 倍希釈硫酸を用いた場合を比較した結果，両者の培養菌叢が大きく異なった．それぞれの菌種を同定，比較した結果，前者では Bacillus 属が優占したが，後者ではほとんど検出されず，Clostridium 属が検出された．変動前後の培養時間を種々検討した結果，変動前後に 48 h ずつ培養した場合に培養菌叢が大きく変化した．強酸性条件下での培養時間を種々検討した結果，48 hの変動培養で，耐酸性を持たない菌体の排除が可能であることが示された．現在，変動培養により得られる微生物種の傾向や未培養微生物の培養化について検討中である．
1) H29 日本生物工学会要旨 p. 161

Multi-step 細胞融合による多倍体酵母の創製○福田 展雄, 本田 真也（産総研・バイオメディカル）
nob-fukuda@aist.go.jp

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae は，最も理解された生命システムの 1 つであり，数多くの有用化合物の生産に利用されてきた．有性生殖に基づく酵母株の創製・改良方法では，各親株から一部の遺伝情報が継承され，次世代には多様な特性を有する酵母細胞群が生み出される可能性がある．しかしながら，次世代の各細胞に注目すれば，親株から継承できずに失われる配列情報が必ず存在
し，望みの表現型を有する酵母株を合理的に創製することは困難であった．一方，プロトプラスト融合を用いた多倍体の創製法では，一過的には両親株の遺伝情報を統合することが可能であるが，その安定性に問題がある．
そこで本研究では，接合型遺伝子座特異的エンドヌクレアーゼ Ho を用いた多倍体酵母の創製法を確立した．酵母の接合型遺伝子には a 型と α 型が存在し，有性生殖の一環として a 型と α 型の酵母が融合して a/α 型の酵母を形成する．
酵母の細胞内で Ho を発現すると双方向の接合型変換が生じるが，S288C 株由来の実験室酵母は一塩基変異を有しており，a 型から α 型への変換が殆ど発生しない．すなわち，a/α 型酵母に Ho を発現させれば，全ての接合遺伝子座が a型となった酵母のみを得ることができ，これを α 型酵母と融合することで多倍体化が可能となる．さらに得られた酵母に Ho を発現させることで，再び a 型
酵母を生み出すことができる．
本研究において，緑色・赤色蛍光タンパク質や転写因子など異なる遺伝子を有する α 型酵母を用いて細胞融合を行ったところ，創製した酵母株が想定の蛍光特性を発現することが確認された（ACS Synth. Biol., in press）．S288C 派生株は実験室酵母として広く利用されており，本手法は既存の酵母株にも利用することが可能であるため，豊富なリソースを活用した多倍体酵母の創製が促進されるものと期待する．

Development of efficient screening system for acid tolerant and acidophilic
microbes by taking advantage of pH shift culture

Polyploid generation by multi-step mating of Saccharomyces cerevisiae

Key words
acid tolerance, microbial dark matter, pH slide culture, specialized
cellulose film

Key words

yeast, endonuclease, mating

2Gp01

2Gp03

DNA 切断型抗生物質を用いたカロテノイド高生産酵母
変異株の取得○Chikara Takano1, Kouichi Murayama2, Hideki Aoyagi1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Futamura Chemical Co., Ltd.)

メタノール資化性酵母 Ogataea minuta の PER1，
GUP1，CWH43 遺伝子は細胞壁の強度維持に関与する○Nobuo Fukuda, Shinya Honda(Biomed. Res. Inst., AIST)胥 欣欣 1,2, 小松崎 亜紀子 1, 千葉 靖典 1, 高 暁冬 2, ○横尾 岳彦 1
（1産総研・創薬基盤, 2江南大（中国））
t.yoko-o@aist.go.jp○渡部 裕介, 阿部 勝正, 解良 芳夫, 高橋 祥司（長岡技科大院）
shoutaka@vos.nagaokaut.ac.jp

グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）は糖脂質の一種であり，膜タンパク質の一部は GPI を介して細胞膜に結合している．GPI は小胞体で合成され，ポリペプチドに付加して GPI アンカー型タンパク質となり，ゴルジ体を経由して細胞表層に輸送される．Ogataea minuta は，異種タンパク質の大量生産に適したメタノール資化性酵母である．本種における GPI の生合成系の解析を試みた．出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae において GPI の脂質リモデリングに関与する遺伝子 PER1，GUP1，CWH43 の相同遺伝子がゲノム上に存在していたため，これらのクローニングを行い，その機能が出芽酵母の遺伝子と互換性を保っていることを明らかにした．O. minuta における gup1 あるいは cwh43 遺伝子破壊株は高温感受性を示し，これらの表現型は培地に浸透圧調整剤を添加することで抑圧された．また，gup1 破壊株は Calcofluor White および SDS に超感受性を示した．これらの表現型より，細胞壁の強度維持に欠損を生じている
ことが示唆された．O. minuta の per1 破壊株においては同様だがさらに顕著な表現型を示し，増殖により重要であることが示された．Gas1 タンパク質は酵母
における代表的な GPI アンカー型タンパク質であるが，O. minuta には 2 コピーの GAS1 遺伝子が存在することを見出し，それぞれ GAS1A，GAS1B と命名した．per1 あるいは gup1 遺伝子破壊株では Gas1A および Gas1B タンパク質の局在が異常になったことから，脂質リモデリングは O. minuta においても GPI ア
ンカー型タンパク質が正しく局在するために必須であることが明らかになった．

【背景と目的】カロテノイドは機能性素材として，食品，動物飼料や化粧品などの製品に添加されている．この様な状況から，カロテノイドの効率的な生産技術の開発が求められている．酵母 Rhodotorula gracilis は細胞乾燥重量の約 75％のカロテノイドを生産することが知られていることから，本酵母を用いたカロ
テノイド生産が注目されている．しかし，本酵母を用いたカロテノイドの商業生産には，さらなる生産量の増加が求められている．本酵母を DNA 切断型抗生物質を含む寒天培地に塗布したところ，カロテノイド由来の赤色強度が増加
した株の生育が観察された．このことから，DNA 切断型抗生物質によるゲノム
変異導入によりカロテノイド生産能が増強された変異株の取得が可能であると考えた．これまでに，DNA 切断型抗生物質を用いたゲノム変異導入法は報告されていないことから，新規の変異株取得方法としてカロテノイド高生産変異株の取得を検討した．
【方法と結果】R. gracilis ATCC 26217 株を用いて DNA 切断型抗生物質によるカ
ロテノイド高生産株変異株のスクリーニング条件を検討した．YPD 液体培地で培養した本酵母細胞をプレートあたりの細胞数が 1.0×107 cells になるようゼオ
シン（0 - 3 μg/ml）またはフレオマイシン（0 - 0.7 μg/ml）を含む YPD 寒天培地に塗布し，生育した株の赤色強度を野生株と比較した．その結果，1.0 μg/ml ゼ
オシンもしくは 0.3 μg/ml フレオマイシン含む寒天培地において赤色強度が増加
した株の割合は 0 - 3%だったが，ゼオシンおよびフレオマイシンをそれぞれ 2.0
μg/ml と 0.5 μg/ml に増加させた培地では 5 - 10%と増加し，最も高い割合となった．したがって，これら抗生物質濃度をカロテノイド高生産変異株取得の最適条件とした．現在，得られた変異株のカロテノイド生産能の評価を行っている．

PER1, GUP1 and CWH43 of methylotrophic yeast Ogataea minuta are
involved in cell wall integrity

Mutagenesis and selection of carotenoid hyper-producing mutants using
DNA-cleaving antibiotics

Xin-Xin Xu1,2, Akiko Komatsuzaki1, Yasunori Chiba1, Xiao-Dong Gao2,○Takehiko Yoko-o1(1BRD, AIST, 2Jiangnan Univ. (China))
Key words

GPI anchor, methylotrophic yeast, Ogataea minuta, lipid remodeling○Yusuke Watabe, Katsumasa Abe, Yosio Kera, shouji Takahashi(Nagaoka Univ. Technol.)Key words

Rhodotorula gracilis, carotenoids, antibiotics

184

2Gp04

出芽酵母における染色体からのセントロメア DNA の切り出し誘導時に出現する生存細胞の解析

2Gp06

CRISPR/Cas9 による担子菌系酵母 Pseudozyma
antarctica の高効率相同組換え○田中 拓未 1, 國武 絵美 1,2, 鎗水 透 1, 遠藤 亮 1, 加藤 悦子 1,
北本 宏子 1
（1農研機構, 2三重大院・生資）
kitamoto@affrc.go.jp○松崎 浩明, 藤原 祐気, 平島 宗一郎, 宮本 昭弘, 柳本 敏彰,
秦野 琢之（福山大・生命工）matsuzak@bt.fubt.fukuyama-u.ac.jp

出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae のセントロメアはポイントセントロメアであり，動物細胞や分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe の多数の繰り返し配列からなるセントロメアとは異なる．我々は，S. cerevisiae において pSR1 プラスミドの R-RS 部位特異的組換え系を利用して染色体からセントロメア DNA を切り出すことで細胞死を誘導するシステムを構築した．セントロメア DNA の切り出
しは，一倍体細胞の第 IV 番染色体のセントロメア DNA の両側に組換え標的部
位 (RS) を同じ方向に挿入し，ガラクトースにより R レコンビナーゼの発現を誘導して行う．レコンビナーゼの発現により生存率が大きく低下し，細胞死を誘導できた(生存率：1.4x10-5)．しかし，僅かな数の生存細胞が生じたので，生存細胞が出現するメカニズムを解析した．51 クローンの生存細胞のセントロメ
ア DNA 近傍の PCR 解析や RS 領域のシークエンス解析から，主な出現メカニ
ズムは，染色体から RS が 1 個欠失し，切り出しが起こらなかったことが示唆された(38 クローン）．また，生存細胞の中には，セントロメア DNA が切り出された細胞が低い割合で出現した(3 クローン)．これら 3 クローンの生存細胞について解析した．生存細胞の増殖速度は，切り出し前の株と顕著な差は認められなかった．パルスフィールドゲル電気泳動による染色体パターンの解析で生存細胞の第 IV 番染色体は少し短くなっている可能性が生じた．サザン解析から CEN4 DNA は第 IV 番染色体から消失しているが，左腕テロメア近傍のPHO13 遺伝子と右腕テロメア近傍の HSP31 遺伝子は第 IV 番染色体に存在することが分かった．第 IV 番染色体が新たにセントロメア DNA を獲得した可能性があるので，生存細胞の第 IV 番染色体上のセントロメア DNA の位置や配列を解析し，出現メカニズムについて検討しようとしている．

イネ常在性の担子菌系酵母 Pseudozyma antarctica は，強力な生分解性プラスチック（生プラ）分解酵素 PaE，リパーゼ CALB 等の酵素や，化粧品材料に用いられる糖脂質 MEL を生産する，産業上有用な微生物である 1)．本菌は遺伝子操作が難しく，その能力の向上や生物学的解析は進んでいない．我々は以前，薬剤
耐性遺伝子をマーカーとし，P. antarctica を宿主として PaE を大量生産する方法を示した 2)．また，栄養要求性遺伝子をマーカーとした相同組換え技術も構築
した 3)．しかし相同組換え効率は 3~13%程度と低く，選抜に労力を要するため，高効率な相同組換え法の構築が望まれる．本報告では，高効率なゲノム編集技術である CRISPR/Cas9 を利用した相同組換えを試みた．
宿主には P. antarctica ウラシル要求性株（Paura3）を選択した．PaE 遺伝子である PaCLE1 部位に対し PaURA3 を相同組換えした場合，ウラシル要求性が相補されると共に生プラ分解活性が失われることを，形質転換と相同組換えの成否の指標に用い，実験を進めることとした．PaCLE1 に設計したガイド RNA と精製 Cas9 を混合して複合体を形成させた．PaURA3 の両端に PaCLE1 の上流・下流配列を連結した DNA 断片を混合した後，プロトプラストに対して形質転換を行った．
条件検討の結果，CRISPR/Cas9 により P. antarctica の形質転換体を得ることができ，その相同組換え効率は 70%程度と，従来法より顕著に高かった．また，
100bp 未満の短い相同領域を持つ DNA 断片を導入した場合でも相同組換え株が得られた．以上から，P. antarctica を容易に相同組換えすることが可能となった．
（本研究は農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業 25017AB の助成を受けて実施した）

Analysis for surviving cells appeared with induction of excision ofcentromeric DNA from a chromosome in Saccharomyces cerevisiae

Efficient homologous recombination in basidiomycetous yeast Pseudozyma
antarctica by CRISPR/Cas9○Hiroaki Matsuzaki, Yuki Fujiwara, Soichiro Hirashima, Akihiro Miyamoto,Toshiaki Yanamoto, Takushi Hatano(Fac. Life Sci. Biotechnol., Fukuyama Univ.)

1)
2)
3)

Kitamoto H et al. AMB Express (2011) 1:44
Watanabe T et al. Appl Microbiol Biotechnol (2016) 100:3207
Yarimizu T et al. Yeast (2017) 34:483○Takumi Tanaka1, Emi Kunitake1,2, Tohru Yarimizu1, Akira Endoh1, Etsuko Katoh1,
Hiroko Kitamoto1(1NARO, 2Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.)

Key words
cerevisiae

cell death, centromere, site-specific recombination, Saccharomyces

Key words
basidiomycetes, Pseudozyma antarctica, Homologous recombination,
CRISPR/Cas9

2Gp05

新奇染色体工学技術を用いた多様なゲノム組成を持つ出芽酵母菌株ライブラリーの構築と菌株育種

2Gp07

担子菌酵母 Pseudozyma antarctica による組換え酵素生産に有用なプロモーターの探索と利用○鎗水 透 1, 小池 英明 2, 森田 友岳 3, 田中 拓未 1, 北本 宏子 1（1農研機構・農業環境セ, 2産総研・生物プロセス, 3産総研・機能科学）
kitamoto@affrc.go.jp○笹野 佑, 生田 宗一郎, 高木 佑希子, 高田 和真, 井出口 浩迪,
田口 久貴（崇城大・生物生命）
sasano@bio.sojo-u.ac.jp【背景と目的】 近年，微生物育種技術としてゲノム工学技術の注目が高まっている．ゲノム工学技術は，個々の遺伝子に着目し組換え操作を繰り返す従来の遺伝子工学による育種技術とは異なり，ゲノムスケールで操作を行うことにより多数の遺伝子を一挙に操作することが可能である．大規模なゲノム機能解析
や多様なゲノムの創出により，従来の技術では取得困難な有用微生物の育種が期待される．このような背景のもと，我々は出芽酵母 Saccharomyces cerevisiaeを対象として，多彩な染色体操作技術を開発してきた．なかでも CRISPR-PCD
法と CRISPR-PCDup 法は一度の操作で複数の染色体領域をそれぞれ欠失・重複する技術である．そこでこれらの新奇染色体工学技術を用いて，多様なゲノム組成を持つ菌株ライブラリーを創り出し，有用な菌株を選抜育種することを試みた．
【結果と考察】 出芽酵母の 17 箇所の染色体末端領域が様々な組み合わせで複数箇所欠失した菌株ライブラリーを CRISPR-PCD 法により得た．得られた菌株ラ
イブラリーからギ酸やフルフラール等の様々な発酵阻害物質に対して耐性を示す酵母菌株をスクリーニングし，得られた菌株での欠失領域を解析した．その結果，11 番と 15 番染色体の右末端が同時に欠失した株は，35 mM ギ酸及び 80
mM 酢酸に対して耐性を示すことが明らかとなった．さらにギ酸含有培地での発酵試験を行ったところ，エタノール生産量に変化は無かったものの，野生株よりも増殖の立ち上がりが早くなり，エタノール生産性が向上した．また，4番染色体左末端と右末端が同時に欠失した株はフルフラールとヒドロキシメチ
ルフルフラールに耐性を示した．以上のように，新奇染色体工学技術の菌株育種における有用性が示された．現在，CRISPR-PCDup 法を用いた複数領域同時
重複株ライブラリーの作製と有用菌株の選抜を行っている．

プラスチックは社会の様々な場面で利用されるが，自然環境中にごみとして拡散し，蓄積されていることが世界的な問題である．これに対して環境微生物が代謝できる素材で作られた生分解性プラスチック（生プラ）の利用が進められているが，分解の制御が困難であるなど，課題が多い．
植物から単離された担子菌酵母 Pseudozyma antarctica は，農業用の資材に用いられる生プラを分解するエステラーゼ（PaE）を生産する．我々は PaE を大量生産する技術の開発を進め，本菌がキシロース誘導的に PaE を分泌生産することを明らかにした(1)．さらに，キシロース存在下で働く強力なプロモーターの制御下で PaE を大量生産できる P. antarctica の組換え体を取得することに成功
した(2)．今回は，キシロースよりも安価な糖から PaE を生産することを目標に，グルコース存在下で働く強力なプロモーター配列を探索して利用することに着手した．
まず，グルコース存在下で培養された P. antarctica の転写産物をマイクロアレ
イによって解析した．この解析から転写量の多いことが示された 13 種の遺伝子に注目し，これらのプロモーター配列の活性を調べた．レポーターアッセイには，ルシフェラーゼを用いた．ルシフェラーゼはセレンテラジンをセレンテラ
ミドに変換する酵素であるが，反応の過程で発生した光の強度から遺伝子の発現量が評価できる．我々は，各プロモーター遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子を接続して P. antarctica に導入し，形質転換体のルシフェラーゼ活性を比較した．今回調べた中で特に高発現であったものを用いて PaE を発現させることで，グルコース存在下での PaE の生産を可能とした．
（本研究は農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業 25017AB で実施した．）(1) Watanabe et al., J Biosci Bioeng., 2013.
(2) Watanabe et al., Appl Microbiol Biotechnol., 2016.

Construction of a strain library with genomic diversities by the novel
chromosome engineering technology and its application for strain breedingin the budding yeast

Isolation of the effective promotor sequences for recombinant gene
expression in basidiomycetous yeast Pseudozyma antarctica

Key words
Saccharomyces cerevisiae, Chromosome engineering, CRISPR-PCD,
Synthetic biology

Key words
expression○Yu Sasano, Soichiro Ikura, Yukiko Takaki, Kazuma Takata, Hiromichi Ideguchi,
Hisataka Taguchi(Fac. Biotechnol. Life Sci., Sojo Univ.)○Tohru Yarimizu1, Koike Hideaki2, Tomotake Morita3, Takumi Tanaka1,
Hiroko Kitamoto1(1Institute for Agro-Environmental Sciences., 2BRI. AIST, 3AIST)

Pseudozyma antarctica, gene expression analysis, promoter, protein

185

2Gp08

韓国伝統的麹 Nuruk から単離された酵母 Pichia
kudriavzevii N77-4 の機能解析

2Gp10

Pichia pastoris におけるセントロメア DNA 配列を用いた自律複製型プラスミドベクターの開発○杉山 峰崇 1, 松下 青葉 2, 高島 匠平 2, 宮下 夏美 2, 村山 亮太 1,
石田 圭 1, 深谷 健 1, 内山 進 1, Baek Seong Yeol 3, Mun Ji-Young 3,
Kim Soyoung 3, Yeo Soo-Hwan 3（1阪大院・工, 2阪大・工, 3Dept. Agrofood Resources・NIAS・RDA）
sugi2@bio.eng.osaka-u.ac.jp○中村 泰之 1, 西 輝之 1,2, 野口 理紗 3, 伊藤 洋一郎 1, 渡邉 徹 2,
西山 陶三 2, 藍川 晋平 1, 蓮沼 誠久 1, 石井 純 1, 八十原 良彦 2,
近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2カネカ, 3高機能遺伝子デザイン技術
研究組合）
junjun@port.kobe-u.ac.jp

Pichia kudriavzevii N77-4 株は韓国の伝統的麹である Nuruk から単離された揮発性成分を高生産する酵母である．本研究では，P. kudriavzevii N77-4 の特徴解析とストレス耐性能力や発酵能力の改良を目指して機能解析を行った．発酵試験を行ったところ，2%グルコース培地では良好な生育を示し，7.4 g/L のエタノー
ルを生産した．しかし，25%グルコース培地では，エタノールを 14 g/L 程度生
産した辺りから増殖が抑えられエタノール生産収率も低下した．エタノール耐性を調べたところ，2%グルコース条件下では，1%エタノール添加から感受性を示し，25%グルコース条件下では，9%エタノール添加で生存率が極端に低下した．従って，比較的低い濃度からエタノールストレスを受けることがわかった．倍数性を解析したところ，N77-4 は 2 倍体であり，相同組換えによる遺伝的改変が可能であることがわかった．全く明らかとなっていない本酵母のエタ
ノールストレス適応機構を探るためその転写応答を調べたところ，Saccharomyces
cerevisiae において様々なストレス適応に必須となる転写因子遺伝子 MSN2 のオーソログである PkMSN2 などがエタノールストレスに応じて発現誘導を受けることを見出した．しかし，S. cerevisiae のエタノール耐性に必要でありイノシ
トール合成の律速酵素をコードする INO1 のオーソログである PkINO1 の発現は低下することを見出した．そこで，PkINO1 を過剰発現させたところ N77-4 のエタノール耐性は向上し，イノシトールの添加によっても耐性が向上することがわかった．PkINO1 の発現低下が強いエタノール感受性の一因である可能性が示唆された．

【背景・目的】 メタノール資化性酵母 Pichia pastoris は菌体増殖能に優れ，蛋白質の分泌生産能が高い特性を有する．遺伝子発現系においてはゲノム組込み型
ベクターが一般的に用いられているが，ベクターをゲノム組込みする形質転換法では，低い形質転換効率や組込み位置の影響等の問題がある．また，従来の自律複製配列（ARS）を含むプラスミドでは安定的なプラスミド保持が難しい
ため，評価結果にバラつきが生じてしまう問題がある．そこで本研究ではセントロメア DNA 配列を同定し，その配列を含む自律複製型プラスミドを構築することで，高安定性自律複製型プラスミドベクターを開発することを目的とした．
【方法・結果】 P. pastoris における高安定性自律複製型プラスミドの開発には，
セントロメア DNA 配列と ARS が必須であるため，RNA-Seq を実施し P. pastorisのセントロメア DNA 配列の同定を行った．次に同定したセントロメア DNA 配列全長（Cen2）を含むプラスミドを構築した結果，その形質転換体はコロニーを形成したことから，Cen2 は自律複製活性を有することが示唆された．さらに，プラスミド複製および保持に関する安定性評価を行うため，緑色蛍光蛋白質（GFP）発現ベクターに長さの異なる 4 種類のセントロメア DNA 配列を導入して自律複製型プラスミドとし，P. pastoris に形質転換させることで GFP を細胞内で発現させ，フローサイトメーターにより 1 細胞ごとの蛍光強度を測定した．その結果，Cen2 ベクターの形質転換体は安定的にプラスミドが保持されていることが示唆された．また，qPCR によりプラスミドコピー数を測定した
結果，Cen2 ベクターはシングルコピー型ベクターであることが示唆される．セントロメア配列を含む自律複製型プラスミドを構築することで，P. pastoris における高安定性自律複製型プラスミドの開発に成功した．

Functional analysis of Pichia Kudriavzevii N77-4 isolated from the Korean
traditional fermentation starter Nuruk

Construction of a new stable, autonomously replicating plasmid vector
containing Pichia pastoris centromeric DNA○Minetaka Sugiyama1, Aoba Matsushita2, Shohei Takashima2, Natsumi Miyashita2,
Ryota Murayama1, Kei Ishida1, Takeru Fukaya1, Susumu Uchiyama1,
Seong Yeol Baek3, Ji-Young Mun3, Soyoung Kim3, Soo-Hwan Yeo3
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Faculty of Eng., Osaka Univ., 3Dept. Agrofood
Resources・NIAS・RDA)
Key words
Pichia kudriavzevii, yeast, ethanol stress

2Gp09

遺伝子組換え効率向上に向けた DNA リガーゼ IV 欠損
Pichia pastoris 株の開発
○伊藤 洋一郎 1, 渡邉 徹 2, 藍川 晋平 1, 西 輝之 2, 西山 陶三 2,
中村 泰之 1, 蓮沼 誠久 1, 八十原 良彦 2, 石井 純 1, 近藤 昭彦 1
（1神戸大院・科技イノベ, 2カネカ）
junjun@port.kobe-u.ac.jp○Yasuyuki Nakamura1, Teruyuki Nishi1,2, Risa Noguchi3, Yoichiro Ito1,
Toru Watanabe2, Tozo Nishiyama2, Shimpei Aikawa1, Tomohisa Hasunuma1,
Jun Ishii1, Yoshihiko Yasohara2, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Kaneka Corp., 3TRAHED)

Key words
Pichia pastoris, centromere, autonomously replicating plasmid,
plasmid retention

2Gp11

Pichia pastoris における自律複製型ベクターを用いた効
率的な DNA マルチアセンブル法○西 輝之 1,2, 西山 陶三 2, 山路 大樹 3, 玉井 雅也 3, 渡邉 徹 2,中村 泰之 1, 伊藤 洋一郎 1, 石井 純 1, 近藤 昭彦 1, 八十原 良彦 2
（1神戸大院・科技イノベ, 2カネカ, 3高機能遺伝子デザイン技術
研究組合）
Teruyuki.Nishi@kaneka.co.jp

メタノール資化性酵母 Pichia pastoris（Komagataella phaffii）は，高密度培養が可能であり，タンパク質の分泌生産能に優れていることから，組換えタンパク
質生産のための宿主として利用されている．しかし，非相同性組み換え機構が強いことから，正しい部位への遺伝子組換え効率（ターゲット効率）が低いことが知られている．そこで本研究では，P. pastoris の非相同組換え機構の一つ
DNA リガーゼ IV（Dnl4p）に着目し，その遺伝子を破壊することで，ターゲッ
ト効率への影響を調べた．具体的には，Dnl4p 及び，先行研究にてターゲット
効率が増加することが知られている非相同組換え機構に関するタンパク質の一つである，Ku70p をコードする遺伝子（DNL4 及び KU70）をそれぞれ破壊した
株を作製した．なお破壊株の作製には，遺伝子破壊後に選択マーカーを取り除
く 2 つのマーカーリサイクリング技術を用いた．これらの破壊株及び野生株を用いて，ダブルクロスオーバー相同組換えのモデル実験を行なった結果，DNL4
破壊株のターゲット効率は 70～80%と，野生型（～10％）及び KU70 破壊株（20～30％）と比較して増加していた．またこれらの二重破壊株では，さらにター
ゲット効率が 75～85%へと増加した．本発表では，DNL4 破壊株を用いた応用研究に関しても議論したい．

バイオ医薬品の製造実績があるメタノール資化性酵母 Pichia pastoris における高安定性自律複製型ベクター開発には，セントロメア DNA 配列が必須である．
我々は，P. pastoris の 4 本の染色体ゲノム配列情報解析から，約 0.9～1.4 kbp の領域を挟んだ両側に約 2～2.7 kbp もの長い逆向き繰り返し配列を有するセントロメア DNA 配列を同定し，本セントロメア DNA を含む，高い安定性を有する
自律複製型プラスミドベクターを開発している（WO2016/088824）．
本発表では，直鎖状にした自律複製型プラスミドベクターと，本ベクターとの相同領域を有する DNA 断片を同時に形質転換し，P. pastoris 内において高効率かつ正確に連結・環状化させる in vivo アセンブル法を紹介する．本手法により，合計約 24 kbp からなる独立した 8 本の DNA 断片の連結においても，90%以上の高効率で正確な配列を有する環状プラスミドベクターを取得することが出来た．これは，P. pastoris 内において複数の DNA 断片を高効率に連結させて数十 kbp もの長鎖ベクターを構築させた初めての報告例である．

Deletion of DNA ligase IV homolog confers higher gene targeting efficiency
on homologous recombination in Pichia pastoris

A simple and efficient DNA multi-assemble method using episomal vector in
Pichia pastoris○Yoichiro Ito1, Toru Watanabe2, Shimpei Aikawa1, Teruyuki Nishi2,
Tozo Nishiyama2, Yasuyuki Nakamura1, Tomohisa Hasunuma1,
Yoshihiko Yasohara2, Jun Ishii1, Akihiko Kondo1(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Kaneka Corp.)

Key words
recycling

Pichia pastoris, homologous recombination, DNA ligase IV, marker○Teruyuki Nishi1,2, Tozo Nishiyama2, Taiki Yamaji3, Masaya Tamai3,
Toru Watanabe2, Yasuyuki Nakamura1, Yoichiro Ito1, Jun Ishii1, Akihiko Kondo1,
Yoshihiko Yasohara2(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2Kaneka Corp., 3TRAHED)

Key words
Pichia pastoris, Autonomously replicating plasmid, DNA assemble,
Synthetic biology

186

2Hp01

海洋性紅色光合成細菌の形質転換系の開発と窒素固定
能の評価

2Hp03

セルフクローニングを反復利用した代謝工学による単細胞性緑藻 Coccomyxa 属の脂質生産性改良○笠井 由紀, 塚原 拓也, 池田 富貴子, 井出 曜子, 原山 重明（中央大・理工）ykasai@kc.chuo-u.ac.jp○樋口 美栄子, 森崎 久美子, 沼田 圭司（理研CSRS・バイオ高分子）
keiji.numata@riken.jp

非酸素発生型光合成細菌は，水のかわりに有機物などを電子供与体として用いることから，有機性廃棄物の処理への利用が可能であり，また大気中の窒素を用いた窒素固定能を有する種類が存在することから，クリーンで持続可能な生産技術としての利用が期待できる有用な生物である．我々は海洋性の紅色光合成細菌に注目し，人工海水を用いた培養でバイオプラスチックの 1 つであるポリヒドロキシアルカン酸（PHA）合成が可能であること，高分子量の PHA を合成できるなどの応用展開に有利な性質を報告している．光合成細菌に外来遺伝子を導入する手段としては，主に接合法が用いられている．しかし接合法では，汎用的なベクターなどを直接用いることができず，簡便な手法の開発が望まれている．そこで，カナマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドの導入を複数の海洋性紅色光合成細菌を用いて検証した．その結果，光合成細菌を塩化カル
シウムで処理することにより作成したコンピテントセルを形質転換に用いたところ，カナマイシン耐性のコロニーが得られ，プラスミド DNA の光合成細菌への導入が確認できた．次に，紅色光合成細菌の持つ窒素固定能について検証した．窒素源を窒素ガスのみとした培地における生育を複数の細菌株について観察した結果，数株の紅色光合成細菌については生育が認められた．窒素のアンモニアへの変換を触媒するニトロゲナーゼの活性をアセチレン還元アッセイ
により評価した結果，窒素ガス環境下でよい生育を示した株は，高いニトロゲ
ナーゼ活性を示していた．これらの結果から，紅色光合成細菌は，ニトロゲナー
ゼによる窒素固定により窒素ガスを単独の窒素源として生育できることが示唆された．

近年，単細胞性緑藻を利用したバイオ燃料の生産が注目を集めている．我々はバイオ燃料生産性の改良を目指して，より実用化への障壁が少ないセルフクロー
ニング技術を利用した分子育種に取り組んでいる．現在 Coccomyxa 属のセルフ
クローニングに利用可能な選択マーカーはウラシル合成遺伝子（UMPS）のみで，同一株に複数の遺伝子を個々に導入する事ができない．この問題を解決するために，Cre/loxP system を利用して選択マーカー遺伝子の繰り返し使用を可能にする方法を開発した．ウラシル要求突然変異（Ura－）株に loxP 配列で挟まれた UMPS 発現カセット（loxP_UMPS_loxP）を導入し，ウラシル要求性を回復
した形質転換体（Ura+）を選抜した．精製した Cre タンパク質を Ura+形質転換株に導入したところ，loxP_UMPS_loxP が切り出されて再度 Ura－になったため，
UMPS の再利用が可能になった．
本方法を使い，脂質合成に関与する acyl-(acyl-carrier-protein) thioesterase 遺伝子（FAT1）および type-2 diacylglycerol acyltransferase 遺伝子（DGAT2d）を逐次導入した脂質高生産株の作製を試みた．初めに Ura－株に loxP_UMPS_loxP と FAT1
発現カセットを共導入し，脂質生産性が野生株の 1.1 倍に増加した形質転換株を作製した．この株から loxP_UMPS_loxP を Cre タンパク質で切り出して Ura－
株を分離した後，loxP_UMPS_loxP と DGAT2d 発現カセットを共導入した．その結果，脂質生産性が野生株の 1.4 倍に増加した形質転換株が得られた．本方法は他の微細藻類にも適用可能で，選択マーカー等外来遺伝子の除去に有用である．

Development of transformation method and evaluation of nitrogen fixation
ability using marine purple photosynthetic bacteria

Metabolic engineering using iterative self-cloning to improve lipid
productivity in Coccomyxa○Mieko Higuchi, Kumiko Morisaki, Keiji Numata(RIKEN CSRS, Biomacromolecules)○Yuki Kasai, Takuya Tsukahara, Fukiko Ikeda, Yoko Ide, Shigeaki Harayama(Fac. Sci. Eng., Chuo Univ.)

Key words

transformation, nitrogen fixation, photosynthetic bacteria

Key words

2Hp02

ユーグレナ低酸素下ワックスエステル合成におけるミト
コンドリア電子伝達系の機能解明

2Hp04○西本 歩紗 1, 中澤 昌美 1, 石川 孝博 2, 乾 博 3, 上田 光宏 1,
阪本 龍司 1（1阪府大院・生環科, 2島根大・生物資源, 3阪府大院・栄養）
mami@biochem.osakafu-u.ac.jp

Cre/LoxP system, Coccomyxa, self-cloning, triglyceride

屋外培養可能な新奇微細藻類による有用油脂の生産○佐々木 美月 1, 福田 寛史 1, 佐々木 智子 2, 佐々木 大作 2,
朝山 宗彦 1
（1茨城大院・農, 2Biox化学工業）
munehiko.asayama.777@vc.ibaraki.ac.jp

微細藻類ユーグレナは好気状態で貯蔵多糖パラミロンを細胞内に蓄積する．パラミロンは低酸素曝露により速やかに分解され，ワックスエステル (WE) へと変換される．WE の主成分はミリスチン酸ミリスチルであり，バイオディーゼ
ル燃料やバイオジェット燃料の原料としての利用が期待されている．ユーグレ
ナの WE 蓄積量は細胞乾燥重の約 30%に達するが，実用化にはさらなる生産量向上が望まれている．その達成には，未だ不明な点が多い WE 合成メカニズムの解明が必須である．当研究グループでは，低酸素状態での WE 合成量がミト
コンドリア電子伝達系複合体 I 阻害剤の存在下で大幅に減少することを明らかにしてきた．しかし，WE 合成における電子伝達系の具体的な機能は不明である．本研究では，ユーグレナのミトコンドリア電子伝達系の構成要素である電子伝達タンパク質 (ETF) と ETF 酸化還元酵素 (ETFOR) の発現抑制を行い，低酸素状態での WE 合成に及ぼす影響を調べた．さらに，脱共役剤による電子伝達系調節が WE 合成に及ぼす影響を調べた．
ETF，ETFOR の各発現抑制群ではコントロール群と比べ WE 合成量が約 20%まで減少した．このことから，低酸素状態のユーグレナは，ミトコンドリア電子伝達系で生じた還元力を，WE 合成に繋がるミトコンドリア脂肪酸合成系で利用していることが示唆された．またこのとき，各発現抑制群でもパラミロンが分解されていたことから，各発現抑制群においてパラミロン由来の炭素が WE
合成以外の経路で代謝されていることが示唆された．最後に，ミトコンドリア
膜内外のプロトン勾配を解消することで電子伝達を促進することが知られている脱共役剤 CCCP を作用させたところ，低酸素状態でパラミロンはほぼ完全に分解され，同時に WE 合成量が 2 倍以上に増加した．このことから，電子伝達の促進により WE 生産の向上が可能であることが示唆された．

【目的】 通年を通して屋外培養可能な新奇天然藻を単離し，この株を用いてバイオ燃料や飲食品向け有用油脂生産に資する基盤研究を行なった．
【方法】 天然水ベースの培養液から微細藻類を混釈法により寒天培地上で単離した．本株の 18S rDNA 配列を決定し，分子進化系統樹を作成して分類した．
BX1.5 株を 1.5 から 10 トン規模で屋外培養をして，バイオマス量を測定した．
回収した菌体から油脂を抽出し，薄層クロマトグラフィー (TLC) やガスクロマ
トグラフィー/水素炎イオン化検出器 (GC/FID) により組成分析した．
【結果と考察】 18S rDNA 配列などの分析結果より，本株はトレボウクシア藻網
パラクロレラ属に分類される新種 (或いは亜種) 株であり，これを BX1.5 と命名した．本株は本州域でも通年培養が可能であり，培養液 1 トンあたり乾燥重量
で 100 グラム以上のバイオマスが得られた．屋外培養由来の BX1.5 株を，さらに窒素源欠乏やリン源欠乏培地で培養すると，数日のうちに細胞内に大量の油滴を蓄積することが明らかとなった．この様子を光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察すると，油滴蓄積とともに細胞の肥大が確認された．また細胞内に蓄積した油脂の組成を分析した結果，培地の栄養源欠乏条件に依存して，脂質の成分や生産量に変化が見られた．特に，窒素・リン源欠乏で培養した場合には，バイ
オ燃料や飲食品向け油脂の増産・蓄積が顕著に観察され，本株の有用性が明らかとなった．

Contribution of mitochondrial anaerobic respiration in wax ester
production under hypoxia in Euglena

Production of useful lipid by the novel microalga from outdoor culture

Key words
Euglena, wax ester fermentation, anaerobic respiration, electrontransfer flavoprotein

Key words○Ayusa Nishimoto1, Masami Nakazawa1, Takahiro Ishikawa2, Hiroshi Inui3,
Mitsuhiro Ueda1, Tatsuji Sakamoto1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ., 2Fac. Life Environ. Sci., Shimane
Univ., 3Dep. Nutri., Osaka Pref. Univ.)○Mitsuki Sasaki1, Hirofumi Fukuda1, Satoko Sasaki2, Daisaku Sasaki2,
Munehiko Asayama1(1Grad. Sch. Agric., Ibaraki Univ., 2Biox Chemical Industries Co. Ltd.)

biofuel, lipid, microalgae, outdoor cultivation

187

2Hp05

Effect of immobilized Chlorella Sorokiniana culture on
lipid accumulation and CO2 sequestration.

2Hp07○Daniel Alejandro Alfaro Sayes1, Jerome Amoah1, Shinji Hama3,
Ayumi Yoshida3, Akihiko Kondo2, Chiaki Ogino1(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ., 3Bioenergy Corp, Res. Dev. Lab.)ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

Nitratireductor sp. OM-1 の軽油生産におけるアンモニウ

ムの影響○登 祐介 1, 高橋 宏和 1, 秋 庸裕 1, 中島田 豊 1, 松村 幸彦 2,
岡村 好子 1
（1広島大院・先端物質, 2広島大院・工）okamuray@hiroshima-u.ac.jp

Immobilized cells entrapped within a polymer matrix have advantages over free cell
culture, easier harvesting of biomass, enhanced water treatment and enrichedbioproduct generation, so far this method has been used mostly with the purpose ofremoval of nutrients and biosensors.
On this study the effects of immobilized culture on cell growth, lipid productivity andCO2 sequestration of green microalgae Chlorella Sorokiniana were investigated, to thisend the microalgae strain was cultured both in free and in immobilized conditions
under optimal autotrophic growth parameters in Bold 3N medium in 500 ml batch
reactors for a period of 10 days. The immobilization method chosen for this study wascell entrapment inside alginate beads. The CO2 sequestration between the two types ofculture was similar between the two types of culture but there were notable differences
between the light transmittance, biomass and lipid productivity. The light transmittancein the immobilized culture was 5 times higher than in the free cell culture, the highest
amount of biomass obtained for free cell culture was 2.639±0.050 g/L compared to
6.280±0.063g/L in immobilized culture and the amount of lipid for free cell culture
was 0.416±0.087 g/L compared to 1.464±0.095 g/L in immobilized culture, thebiomass and lipids produced by the immobilized culture were over 2 times the amounts
obtained by the free cell culture, this shows that the immobilized culture has afavorable effect on the growth and lipid accumulation of the microalgae.

【目的】我々は，バイオマスから 2 段階培養によって遺伝子組み換えを行わずにバイオ燃料を生産する研究を行ってきた．当研究室では，ギ酸から吉草酸までの低級有機酸をバイオディーゼルに変換することができる Nitratireductor sp.
OM-1 株を取得している．OM-1 株は，窒素飢餓条件下で細胞あたり約 90%のバ
イオディーゼルを蓄積することができる．しかし，有機酸廃液及びバイオマス
発酵液中には，高濃度の NH4 ＋が含まれており，高効率にバイオディーゼルを生産するには，液中の NH4 ＋を減少させることが課題である．そこで，本研究では，OM-1 株のバイオディーゼル生産における廃液中の NH4 ＋の影響を調べ，
電気化学的に NH4 ＋を除去することを検討した．
【方法及び結果】実発酵廃液中での OM-1 株の軽油生産に対する NH4 ＋の影響を調べるために，実発酵廃液組成を合成培地で再現した．NH4 ＋なしの時，252.2
mg/g-DCW で NH4 ＋ありの条件より約 4.4 倍の油脂生産が確認され，NH4 ＋による油脂生産の阻害が証明された．次に，NH4 ＋を電気化学的に誘引除去するために次のリアクターを設計した．本実験で用いたリアクターは，2 つのチャンバーの間に陽イオン交換膜を挟み，陽極槽に窒素源として NH4Cl 1.0 g/L を含むモデ
ル培地を，陰極槽に PBS をそれぞれ加えた．3V の電圧印加では，24 時間以内に約 90%の NH4 ＋除去に成功したが，培養液中の Cl－の酸化も生じ，OM-1 株の生育が阻害された．また，0.8 V の電圧印加では，48 時間後，NH4 ＋は 321.5 mg/
L から 147.0 mg/L の減少にとどまったが，Cl－の酸化は生じず，有機酸濃度の減少もあまり見られず，OM-1 株の生育が可能であった．今後はリアクターの稼働条件をさらに検討し，NH4 ＋の完全除去を試みる．

Effect of immobilized Chlorella Sorokiniana culture on lipid accumulation
and CO2 sequestration.

The effect of ammonium on biodiesel production in Nitratireductor sp. OM 1

○Daniel Alejandro Alfaro Sayes1, Jerome Amoah1, Shinji Hama3, Ayumi Yoshida3,
Akihiko Kondo2, Chiaki Ogino1(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
3
Bioenergy Corp, Res. Dev. Lab.)○Yusuke Noboru1, Hirokazu Takahasi1, Tsunehiro Aki1, Yutaka Nakasimada1,
Yukihiko Matumura2, Yoshiko Okamura1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Inst. Eng., Hiroshima Univ.)

Key words
beads

Chlorella sorokiniana, marine microalgae, immobilized cell, Alginate

Key words

biodiesel fuel, biomass, volatile fatty acids

2Hp06

排水中の細菌群集による微細藻類の増殖促進

2Hp08

海洋性菌叢を用いた塩環境下でのアルギン酸からの高効率揮発性脂肪酸生産○遠山 忠 1, 糟谷 まり 2, 田中 靖浩 1, 森川 正章 3, 森 一博 1
（1山梨大院・総研部, 2山梨大院・医工農, 3北大院・環境）
ttohyama@yamanashi.ac.jp○喜多 晃久 1,4, 三浦 豊和 2,4, 越智 匠 1, 早瀬 伸樹 1, 岡村 好子 2,4,
秋 庸裕 2,4, 松村 幸彦 3,4, 加藤 節 2, 田島 誉久 2,4, 加藤 純一 2,
中島田 豊 2,4
（1新居浜高専, 2広島大院・先端物質, 3広島大院・工・エネ環,
4
JST・CREST）
kita@chem.niihama-nct.ac.jp【目的】経済的かつ持続可能な微細藻類燃料生産を目指し，排水を利用した微細藻類培養が注目されている．排水中の細菌群は微細藻類の増殖に大きな影響を及ぼすものと考えられるが，その詳細は分かっていない．本研究では，排水中の細菌群が 3 種類の微細藻類（Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris,
Euglena gracilis）の増殖に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした．
【方法および結果】3 種類の排水処理施設から採取した排水をオートクレーブにて滅菌処理したものと，オートクレーブ処理せずに生菌を残したものとに分け，合計 6 種類の排水を用いて 3 種類の微細藻類を培養した．その結果，排水中の細菌群が微細藻類の増殖を有意に促進することが観察され，その増殖促進は 3
種類の排水および 3 種類の微細藻類に共通していた．この結果から，排水中には微細藻類増殖促進細菌（microalgae growth-promoting bacteria: MGPB）が広く分布していることが示唆された．微細藻類に共生する細菌を 80 株以上分離して系統解析したところ，そのほとんどが Alphaproteobacteria 綱に属していた．また，分離株の 7 割程度が宿主微細藻類の増殖を促進したものの，1 割程度の分離菌株は宿主微細藻類の増殖を阻害した．このことから，排水中において微細藻類は MGPB と共生関係を築いているものの，増殖阻害細菌もその共生細菌群に含まれていることが示唆された．今後，優秀な MGPB を選抜し，微細藻類培養のプロバイオティクス材料として応用することが期待できる．

【背景と目的】 アルギン酸は褐藻類由来の有望な炭素源である．しかし，大腸菌などの工業的に利用されている微生物では，遺伝子組換え無しにアルギン酸を資化することができない．そのような中で，我々は遺伝子組換えを伴わずにアルギン酸を効率的に嫌気分解し，揮発性脂肪酸（VFAs）を生産することができる海洋性菌叢の取得に成功した．VFAs はバイオプラスチックやバイオガス，
バイオディーゼル生産などへ広く応用できる．これまで VFAs の商業生産は主に化学合成によって行われてきたが，石油価格の高騰などにより，生物学的生産への関心が高まっている．そこで，本研究ではバイオリアクターを用いて，海洋性菌叢による塩環境下でのアルギン酸からの高効率 VFAs 生産を試みた．
【方法と結果】50 g/l のアルギン酸ナトリウムを単独炭素源とし，バイオリアク
ターにより pH を 7~7.5 に制御して 3％塩環境下で海洋性菌叢を培養したところ，培養 36 時間で約 15.6g/l の total VFAs を生産することができた．主な VFAs
は酢酸，プロピオン酸，コハク酸であった．さらに，その最大生産速度は約26.2g/l/d であり，既報の遺伝子組換えされた Sphingomonas によるアルギン酸ナ
トリウムからのピルビン酸およびエタノール生産の速度と比較しても顕著に高かった．また，我々の研究グループでは，アルギン酸ナトリウムから生産された VFAs を用いた二段階培養により，バイオディーゼルの原料となる有用脂質を生産することにも成功している（喜多ら，2017 年生物工学会大会）．従って
本研究の結果から，微生物共生系および二段階培養システムを応用することによって，単菌よりも高効率に，遺伝子組換えを伴わないアルギン酸からの高機
能性化学品生産システムを構築することができる可能性が示された．

Growth promotion of microalgae by indigenous bacteria in wastewater
effluent

High-rate fermentation of alginate to volatile fatty acids under salinecondition by marine bacterial consortium○Tadashi Toyama1, Mari Kasuya2, Yasuhiro Tanaka1, Masaaki Morikawa3,
Kazuhiro Mori1(1Grad. Fac. Interdisc. Res., Univ. Yamanashi, 2Sch. Med. Eng. AGR., Univ.
Yamanashi, 3Grad. Sch. Environ. Sci., Hokkaido Univ.)

Key words

microalgae, biomass, microalgae growth-promoting bacteria○Akihisa Kita1,4, Toyokazu Miura2,4, Takumi Ochi1, Nobuki Hayase1,
Yoshiko Okamura2,4, Tsunehiro Aki2,4, Yukihiko Matsumura3,4, Setsu Kato2,
Takahisa Tajima2,4, Junichi Kato2, Yutaka Nakashimada2,4(1Niihama Natl. Coll. Technol., 2Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 3Div.
Ener. Environ., Inst. Eng. Hiroshima Univ, 4CREST, JST)Key words
alginate, bacterial consortium, volatile fatty acids, symbiosis

188

2Hp09

気相培養における気生微細藻類 Coccomyxa sp. KGUD001 の脂質蓄積と細胞内 CN 比2Hp11

○川島 成貴, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt13347@ns.kogakuin.ac.jp

Multiple stress tolerances in a thermotolerant L1-1
isolated from oleaginous yeast Rhodosporidium
toruloides DMKU3-TK16○Chih Chan Wu1, Takao Ohashi1, Yung Yu Tsai1, Ryo Misaki1,
Savitree Limtong2, Kazuhito Fujiyama1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol., 2Fac. Sci., Kasetsart Univ.,
Thailand)fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp【目的】大気中の CO2 を効率的に供給できる気相培養は，培養装置を省スペー
ス化でき，脱水や回収も容易にする．気生微細藻類 Coccomyxa sp. KGU-D001(Coccomyxa sp.)は，気相培養により，油滴形成に伴う脂質蓄積量の増加が引き起こされることがわかってきた．細胞内外の窒素源は脂質合成に影響を与える
ため，細胞増殖と油滴形成の同時進行は困難である．炭素源と窒素源の割合が脂質蓄積に関与していることから，本研究では，気相培養における Coccomyxa
sp.の脂質蓄積と細胞内 CN 比について検討した結果を述べる．
【方法】トレボクシア藻綱 Coccomyxa sp. KGU-D001 を，BB 培地を用いて対数増殖期となる 10 日目まで液相培養した．その後，藻体をメンブレンフィルターに吸着させ，Coccomyxa sp.の細胞フィルムを作製した（厚さ：17μm）．純水を含ませた綿上に細胞フィルムを置き，温度 25℃，光強度 40 μmol photons m-2 s-1，
7 日間シャーレ内で気相培養した．細胞フィルムの脂肪酸含有量は GC により，
全有機炭素量（TOC）および全窒素量（TN）は TOC-TN 計により，それぞれ測定した．
【結果・考察】Coccomyxa sp.の細胞フィルムを 7 日間気相培養すると，細胞内CN 比の増加に伴い脂肪酸含有量は 2.4 倍増加した．培養 2 日目では，細胞内TN が約半分，細胞数が約 2 倍となり，細胞は一度分裂したことが分かった．
さらに，オレイン酸含有量は約 7 倍増加したことから，対数増殖期にある藻細胞は，液相から気相条件に切り替わると，細胞内の窒素源を用いて細胞分裂し，それと同時に油滴形成を開始することが示された．おそらく気相培養により
CO2 の供給量が増え，細胞内 CN 比が増大したためと考えられる．今後は気相条件における藻細胞の脂質代謝を明らかにするため，窒素源の供給を検討するとともに，細胞分裂前後と油滴形成時の細胞内全糖と光合成活性について分析する．

Oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides has recently drawn considerable attention
as a great producer for lipid-related chemicals feedstocks and fuels because of its highlipogenesis capability. R. toruloides DMKU3-TK16 (TK16), which was isolated fromThailand, produces high oleic acid-containing lipids. In our previous study, we isolated
one thermotolerant mutant L1-1 from TK16 which exhibits better thermotolerance andgreater oleic acid-producing ability at 37°C. In this study, we assessed the stressresistant ability of the mutant strain against other stresses such as osmotic, oxidative,
salt stress, organic acid, and alcohol stress. The thermotolerant mutant revealed
significantly greater growth in the medium containing ethanol and hydrogen peroxide
in comparison than those in wild-type TK16. In the model yeast Saccharomyces
cerevisiae, high concentration of ethanol and hydrogen peroxide influence themembrane fluidity and become toxic to membrane proteins, resulting in the cell growth
inhibition and even death. The studies of S. cerevisiae also indicated that ethanol andoxidative stress induced the similar responses to heat-induced cell death. Althoughfurther evidence is indispensable to unravel the protective machinery against thosestresses behind, our work indicated the thermotolerant mutant L1-1 had better resistantto ethanol and oxidative stress. The work also implied the enhanced thermotolerance
may be connected to the greater ethanol and hydrogen peroxide resistance.

Lipid accumulation and carbon/nitrogen ratio in the aerial microalga
Coccomyxa sp. KGU-D001 biofilm

Multiple stress tolerances in a thermotolerant L1-1 isolated from oleaginous
yeast Rhodosporidium toruloides DMKU3-TK16○Naritaka Kawashima, Nobuhiro Aburai, Yasusato Sugahara, Yasutada Imamura,
Katsuya Abe(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv Eng., Kogakuin Univ.)○Chih Chan Wu1, Takao Ohashi1, Yung Yu Tsai1, Ryo Misaki1, Savitree Limtong2,
Kazuhito Fujiyama1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol., 2Fac. Sci., Kasetsart Univ., Thailand)

Key words

aerial microalgae, biofilm, lipid accumulation, carbon/nitrogen ratio

Key words
stress tolerance, thermotolerant mutant, oxidative stress,
Rhodosporidium toruloides

2Hp10

Enhanced oleic acid production by overexpressing delta
9-fatty acid desaturase gene in oleaginous yeast
Rhodosporidium toruloides for designed biodiesel
production.

2Ip01

ドライとウェットの両側面からの抗体に代わる分子標的
足場タンパク質の検討○伊藤 智之 1, 西 羽美 2, 亀田 倫史 3, 二井手 哲平 1, 中澤 光 1,
梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2東北大院・情, 3産総研・人工知能研究セ）
mitsuo@tohoku.ac.jp○Yung-Yu Tsai1, Takao Ohashi1, Chih-Chan Wu1, Bataa Dolgormaa1,
Ryo Misaki1, Savitree Limtong2, Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Fac. Sci., Kasetsart Univ.)
fujiyama@icb.osaka-u.ac.jp
Rhodosporidium toruloides, a potential microbial-based platform for lipid production,
yet the limited understanding of genetic manipulation has confined its further study
and application. Previous studies have suggested that the enrichment of oleic acid
(OA) by over 60% of proportion in the biodiesel providing improved fuel properties
such as stability and emission after use. In order to genetically operate R. toruloides
strains for the designed lipid content towards the preferable fuel performance, a lithium
acetate based transformation system was developed.
Saccharomyces cerevisiae OLE1 (ScOLE1) gene encodes stearoyl-CoA desaturase tocatalyze palmitic acid and stearic acid for yielding palmitoleic acid and oleic acid.
However, the function of Δ9-fatty acid desaturase (RtΔ9-FAD) gene from R. toruloides
NP11, a homologous gene of ScOLE1 has yet be determined. Thereby, RtΔ9-FAD wascomplementary tested to rescue the survival of ole1 disrupted S. cerevisiae strain. For
the further OA-enriched lipid production, ScOLE1 and RtΔ9-FAD gene were thenindividually introduced in R. toruloides strains (DMKU3-TK16 and NP11). While,
successful overexpression of ScOLE1 and RtΔ9-FAD in transformants enabled gaining
higher OA content by the proportion over 60% in total lipid. Moreover, thetransformants also provided higher lipid productivity compared with wild type.
Overall, the overexpression of ScOLE1 and RtΔ9-FAD in R. toruloides strains could
supply OA-enriched lipid as a suitable source of designed biodiesel.

抗体分子は生体の免疫機構を利用した手法があるため，バイオ医薬品や分子認
識プローブとして確固たる地位を築いてきた．一方近年では遺伝子工学の発展により，免疫系を使わずとも大規模な変異体群を微生物で作製することが可能となったことや，生体外選択法によって最適機能を持つクローンを変異体群から選出できるようになったことで，様々な抗体様分子が提案されている．抗体様分子は，構造的に最小単位のタンパク質を足場構造として用いることで，抗体の構造に囚われない新たな分子認識薬のデザインを可能とする．そこで本研
究では，生物情報科学を用いた足場タンパク質群の抽出と，それらの物性評価からフォーマット候補の絞り込みを試みた．
最適フォーマット群の構築に向けてまず，プロテインデータバンク（PDB）に登録されているタンパク質から，安定な低分子であること，多様性のあるフォー
マット群を作製すること，分子認識部位を持つことを念頭に網羅的な必要条件抽出を行い，複数のフォーマット群候補を選定した．そして，これらを大腸菌で発現させ，精製後に収量と変性温度を測定することで高発現かつ安定なフォー
マットを特定した．続いてループ状のランダム変異への寛容さをループのフォー
ルディング速度とアミノ酸残基保存度の観点から推測した後，実際に培養してその発現率を調査することで，さらにフォーマット候補を絞り込むことに成功した．さらに生体外選択手法を用いた操作で標的タンパク質への分子認識能を付与したフォーマットの取得を試みたため，合わせて報告する．

Enhanced oleic acid production by overexpressing delta 9-fatty aciddesaturase gene in oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides for designed
biodiesel production.

A novel antibody mimic reaserch by the combination of dry wet techniques○Yung-Yu Tsai1, Takao Ohashi1, Chih-Chan Wu1, Bataa Dolgormaa1, Ryo Misaki1,
Savitree Limtong2, Kazuhito Fujiyama1(1ICBiotech, Osaka Univ., 2Fac. Sci., Kasetsart Univ.)

Key words

Rhodosporidium toruloides, biodiesel, oleic acid

○Tomoyuki Ito1, Hafumi Nishi2, Tomoshi Kameda3, Teppei Niide1,
Hikaru Nakazawa1, Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. information Sci., Tohoku Univ.,
3Comp. Omics Res. AIRC, AIST)

Key words
displayprotein engineering, antibody mimetics, protein data bank, phage

189

2Ip02

抗体移植を意識した β-ヘアピン構造足場を利用した分子
標的ペプチド取得

2Ip04○菊地 真裕 1, 二井手 哲平 1, 中澤 光 1, 今中 洋行 2, 梅津 光央 1
（1東北大院・工, 2岡山大院・自科）
mitsuo@tohoku.ac.jp

超好熱菌由来酵素の基質結合に関するドメインに基づいた新規標的結合分子の開発○来住 秀憲, 大政 健史, 山野 範子, 古賀 雄一（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp

コドン変異を利用した大規模なライブラリーの作製が可能であるペプチドは，
有機低分子化合物と比較して高い標的特異性創出が期待できる．しかし，ペプ
チドは標的分子と結合できる面積が小さいため，標的分子の構造によっては高い標的親和性を創出できないときがある．そこで我々は，抗体の相補性決定領域（CDR）へ移植が可能な構造フォーマットをもつペプチドを開発することによって，高い標的親和性をより創出しやすい抗体への展開も可能なペプチドと抗体の同時開発プロセスの構築を試みた．
まず，ラクダ抗体断片（VHH）の抗原認識部位である相補性決定領域（CDR）
が二本の β-シート構造をループでつないだ β-ヘアピン構造を形成していることに着目し，この構造を模倣したペプチドを用いることで VHH の CDR への移植が可能になると発想した．そこで β-ヘアピン構造を形成するペプチドとして，
トリプトファンジッパー(Wzip)を形成するペプチド間を 7 残基で繋げた Wzip
ループを用い，そのループ領域 7 残基をランダム化した Wzip ループを T7 ファー
ジに提示し，β-ヘアピン構造ペプチドライブラリーを作製した．選択操作によって標的分子へ結合を示すペプチドの取得に成功したのち，アラニンスキャンニ
ング法によって結合に関与する残基を特定した．その後，結合に関与する残基以外を再びランダム化したライブラリーを作製し，同様に選択操作を行ったと
ころ，結合力の向上に成功した．さらに，取得したペプチドのループ配列を
VHH の CDR へ移植した変異体を大腸菌発現系によって作製したところ，VHHの構造保持しつつ標的分子に対して結合を示した．これより，β-ヘアピン構造
間の配列移植が有効であることがわかった．

【背景・目的】Scaffold タンパク質に基づいて設計された標的結合分子は，一般的に低分子量や高い熱安定性を有し，ジスルフィド結合を有さないことから還元条件や高温条件下での診断薬や研究ツールへの応用が期待されている．設計された標的結合分子の多くは，抗体の CDR と同様のループ構造を有しており，その構造で標的分子を認識している．本研究では，ラクダ抗体の VHH との構造相同性が高く，分子表面の一方に複数のループ構造を有することから超好熱菌由来酵素
Islandisin の β-sandwich domain 1(SD1)と超好熱古細菌（始原菌）由来酵素 Tk-SPの β-jelly roll domain(BJR)を新規 scaffold タンパク質として見出した． SD1 は 21残基の長いループにより標的分子内の隠れたエピトープを認識可能な新たな標的結合分子の開発を目指し，BJR は変性剤や界面活性剤条件下で機能を維持する酵素のドメインであることから高い安定性を有する新たな標的結合分子の開発を目指した．
【方法・結果】
SD1 及び BJR に対して天然の scaffold タンパク質であるラクダ抗体 VHH との構造相同性を評価した結果，RMSD 値が 1.542Å及び 1.998Å であり，高い構造相同性を示した．この結果からラクダ抗体の CDR と類似の改変可能なループ構造を SD1 及び BJR 各々に見出した．さらに単ドメインでのフォールディン
グや熱安定性を評価するため，大腸菌での発現系を構築した後，CD 測定によりフォールディング及び熱安定性を評価した．その結果，SD1 及び BJR ともに
β シートリッチな構造を形成していることが示唆され，SD1 は 77.5℃，BJR は
85℃の変性温度を有したことから高い熱安定性が確認できた．これらの結果から SD1 及び BJR は scaffold タンパク質となりうる可能性が示唆された．現在，
ファージライブラリーを構築した後，TNF-α や Her2 に対する親和性選択を行っており，その結果についても報告する．

Molecular recognition peptide on β-hairpin structure with the potential ofgrafting into antibody

Development of novel target-specific binding proteins based on putative
substrate-binding domains of enzymes derived from hyperthermophile○Masahiro Kikuchi1, Teppei Niide1, Hikaru Nakazawa1, Hiroyuki Imanaka2,
Mitsuo Umetsu1(1Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okyama Univ.)○Hidekazu Kishi, Takeshi Omasa, Noriko Yamano, Yuichi Koga
(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

beta hairpin peptide, VHH, phage display, protein engineering

Key words

scaffold protein, molecular design, phage display, affinity selection

2Ip03

高度機能的分子認識素子の創出を志向した，クッション
性足場タンパク質としての多価 CutA1 の開発

2Ip05

配列情報を利用した SUMO2 変異体ライブラリからのTNF-α 親和性選択○東 秀隆, 石田 尚之, 今村 維克, 今中 洋行（岡山大院・自科）
imanaka@okayama-u.ac.jp○牧野 祥嗣, 角岡 良亮, 伊藤 伸哉（富山県大・工）makino@pu-toyama.ac.jp

生体分子間相互作用は生命活動の厳密な制御に寄与する中心的な現象であるが，これを細胞内外で再現・検出する技術は，ライフサイエンス分野において，生命現象の解明のみならず，創薬，医療診断，環境分析など幅広い領域への応用に役立つ．生体分子間相互作用検出技術を確立し，応用する際，抗体や抗体様分子に代表される分子認識素子の開発，改良は非常に重要で，構造安定性，細胞透過性や生産効率などの課題を克服すべく，研究が進められている．
我々のグループでは，これまでに超好熱菌由来タンパク質 CutA1 をリガンド分子の足場とした，生体分子間相互作用精密制御技術の開発を進めてきた．CutA1
はホモ三量体を形成し，非常に高い構造安定性（Tm は約 150℃）を有し，低分
子量（13 kDa）で，大腸菌を用いた迅速・大量生産が可能である．CutA1 が本質的に有する構造安定性は，分子内部へのペプチドやタンパク質の挿入を許容
し，リガンド分子の提示とアフィニティタグを介した配向固定化を通じ，従来法に比べて極めて感度良く相互作用を検出できることを示してきた．
本研究では，CutA1 の多価化を目的とし，新たなリガンド分子挿入サイトの探索ならびに分子デザインの可能性について調査した．推定二次構造形成領域周辺で，分子内あるいはサブユニット間相互作用への寄与などを考慮し，設定した複数の候補サイトへのリガンド分子挿入を試みた．その結果，可溶化発現が可能な新たなサイトを見出した．三量体の野生型 CutA1 では同一のリガンド分子を 3 カ所で提示できるが，挿入サイトを新たに決定したことで，足場分子（CutA1）における提示数は最大 6 となる．すなわち，多価化による分子デザインの多様化を通じ，CutA1 が，標的分子の高度特異的認識を可能とする分子認
識素子の創出に資するプラットフォームとなり得ると考えられた．

【目的】レミケードなどの腫瘍壊死因子-α(TNF-α)に高親和な抗体医薬は，関節リウマチに対し劇的な治療効果を発揮する．しかし薬価が高く，患者および医療財政への負担となる．そこで，抗体ではないがその機能を代替可能な蛋白質を創出し，微生物を用いて安価に生産し利用する試みが進められている．本研
究では，大腸菌を発現系として生産可能な，TNF-α への結合活性を代替する非抗体タンパク質の創出を目指した．
【方法】我々は既に，SUMO2（small ubiquitin-related modifier 2）の分子表面上 5
アミノ酸残基のランダムアミノ酸置換体を提示する，ファージディスプレーラ
イブラリを構築し利用している．まず，TNF-α，BSA などの各種リガンドと本ライブラリを混合し，親和性選択を行った．次に，各親和性条件の下で選択されたライブラリに含まれる SUMO2 変異体遺伝子の塩基配列を，次世代シーケ
ンサーで網羅的に解析した．その後，オリジナルライブラリや，他のコントロー
ルリガンドでのパニング後と比較して高頻度に見いだされたクローンの遺伝子を再構築し，組換えタンパク質を調製して，親和性解析を行った．
【結果】親和性選択は，NNK コドン置換ライブラリ (Lib1)，NNB コドン置換ラ
イブラリ (Lib2) の 2 ライブラリを用いて行った．続くシーケンス解析により，
TNF-α 存在下での親和性選択時に特異的に高頻度で出現する配列があることがわかった．そのような遺伝子配列を Lib1 から 10 種類，Lib2 から 6 種類選び，組換えタンパク質を調製した．ELISA による親和性解析を行ったところ，複数のクローンで TNF-α への親和性を示すシグナルが認められた．これらのクロー
ンの特異性は十分ではなかったが，いくつかのクローンは非特異的結合と比較して有意に高いシグナルを示した．Biacore を用いて測定したところ，最も親和性の高いクローンでサブ μM の Kd が認められた．

Development of multivalent proteinaceous cushion scaffold, CutA1, for thecreation of highly functional molecular recognition element

Selection of SUMO2 mutants with TNF-α affinity using ampliconsequencing○Hidetaka Azuma, Naoyuki Ishida, Koreyoshi Imamura, Hiroyuki Imanaka(Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Okyama Univ.)

Key words

scaffold, biosensing, CutA1, immobilization○Makino Yoshihide, Ryosuke Tsunooka, Nobuya Itoh(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words

phage display, affinity selection, TNFalpha, next generation sequencing

190

2Ip06

モノクローナル抗体のペプチドレベルでのエピトープ解析に基づく人工抗体のデザイン

2Ip08○初野 優花 1, 足立 遥華 2, 中村 匠汰 2, 熊澤 皆 2, 田中 眞人 2
（1電機大 ・理工, 2電機大院 ・理工）mtanaka@mail.dendai.ac.jp

微生物による有用物質生産に資する代謝モデルの実験
データを用いた妥当性検証と予測精度の改善○厨 祐喜 1, 大山 彰 2, 荒木 通啓 1,3（1神戸大院・科技イノベ, 2インシリコバイオロジー, 3京大院・医）araki@port.kobe-u.ac.jp【背景と目的】ゲノム科学の進展により，多くの生物の遺伝子配列が明らかになったが，今後の機能解析には，すべてのタンパク質に対する抗体供給が必要である．すべての抗体産生 B 細胞のハイブリドーマが単離されて，それぞれの抗体の抗原認識の構造，エピトープが最小ペプチド配列まで同定されれば，必要な抗体をそのハイブリドーマの中から選び，利用することが可能となり，植物や細菌，昆虫など抗体資源のほとんどない分野へ抗体試薬を一挙に供給できる．本研究では，抗ヒト DNA トポイソメラーゼ II 抗体を例としてエピトープ
解析を詳細に進め，人工抗体のデザインが可能か否かを検討した．
【方法】抗ヒト DNA トポイソメラーゼ II 抗体 (4E12b 抗体) のエピトープ解析を
短鎖ペプチドレベルまで行い，さらにこのペプチドに隣接するアミノ酸残基の影響を調べるために N 端側，C 端側のアミノ酸残基を変更して抗原性に与える影響を調べた．その配列の網羅的な BLAST 検索から，これらの配列を含むタ
ンパク質を検索し，由来する生物種の抽出物の 4E12b 抗体を用いたイムノブ
ロッティングを行った．また 4E12b 抗体 L 鎖，H 鎖の cDNA クローニングを行い，動物細胞での発現を実施した．得られた組換え抗体が 4E12b 抗体と同じ特異性を示し，トリプシン分解ペプチドマッピング解析でも，cDNA から予想される L 鎖，H 鎖のアミノ酸配列と一致することを確認した．この cDNA の超可変領域のアミノ酸を様々なアミノ酸に置換した組換え抗体を作製し，本来のエピトープへの結合解析を行った．
【結果および考察】ほとんどの置換は特異性に大きな変化を与えなかったが，ある種の置換は結合性を失わせた．また，いくつかの組換え抗体は本来の結合性を失い新たな結合特異性を獲得する例を見出した．抗体の新規デザインが可能なことを示していると思われる．

【背景・目的】近年，微生物による有用物質の生産が盛んに研究されている．このような有用物質の生産に，代謝モデルを用いた Flux balance analysis (FBA)などによる in silico での解析・設計が有用なことが示唆されており，その予測精度の改善が求められている．また，培養プロファイルだけでなく，種々のオミ
クスデータも比較的ハイスループットに取得可能になってきている．そのため，
in silico での解析・設計の妥当性検証と予測精度の改善に種々のオミクスデータを含めた実験データの利用は非常に有用と考えられた．そこで，本研究では，
実験データの利用による代謝モデルの妥当性検証とそれを用いた解析・設計の
予測精度の改善を目的とした．
【方法・結果】ケーススタディとして，大腸菌をホストとして選択した．代謝モ
デルは，以前，ゲノム配列や KEGG などの反応データベースを基にラフなモデ
ルを自動構築し，不足反応の追加，不要反応の削除，可逆性・補酵素関係の修
正などの処理を施した大腸菌の代謝モデルを使用した．そして，構築した代謝モデルの妥当性検証のために，文献より得られた培養データと 13C を利用した
フラックス分布のデータを用い，実験値と FBA によるシミュレーション値とを比較した．構築した代謝モデルは，炭素源がグルコース，酢酸，コハク酸の場
合比較的予測精度が高かった．一方で，グリセロール，乳酸が炭素源の場合は，予測精度が高くなかった．また実験により得られた細胞内フラックス分布と比較すると，構築した代謝モデルによる結果は解糖系と PPP への分配が実験値と大きく異なっていた．なお，検証した条件については代謝モデルの修正を施したところ，概ね予測精度の改善が見られた．このように，実験データの利用は代謝モデルを用いた解析・設計の予測精度の改善に大いに寄与することが示唆された．

Fine epitope mapping of monoclonal antibody specific to human DNA
topoisomerase II and design of the antibody with a different epitope.

Validation and prediction accuracy improvement with experimental data on
metabolic model that contributes to the production of valuable chemicals in
microorganisms○Yuka Hatsuno1, Haruka Adachi2, Shota Nakamura2, Kai Kumazawa2,
Masato Tanaka2(1Dept Sci. Eng. Tokyo Denki Univ., 2Grad. Sch. Sci. Eng. Tokyo Denki Univ.)○Yuki Kuriya1, Akira Ohyama2, Michihiro Araki1,3(1Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 2in silico biology, Inc., 3Grad. Sch.
Med., Kyoto Univ.)

Key words
monoclonal antibody, epitope mapping, recombinant antibody,
Designed antibody

Key words
integration

metabolic model, flux balance analysis, model validation, data

2Ip07

2Ip09

有用物質を生産・増産する準最適な代謝流束均衡モデルのデザイン

様々な波長の光照射下におけるシアノバクテリアの解析○豊島 正和, 阪田 真澄, 戸谷 吉博, 松田 史生, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp○田村 武幸（京大・化研）tamura@kuicr.kyoto-u.ac.jp

光合成生物は光エネルギーと二酸化炭素を使い，様々な物質を生産している．
その生産性向上のためには，強い光の照射や光エネルギーの利用効率を上げる必要がある．しかし，過剰な光エネルギーの利用は光合成システムの傷害を引き起こすため，光合成生物は光エネルギーの利用効率を下げるなどの生育環境に対する順化を行っている．また，その生育環境により有効利用できる光の波
長が異なるため，クロロフィルやフィコシアニンなどの光合成色素を進化の過程で獲得し，環境に適応してきた．そのため，光環境に対する光合成生物の適
応メカニズムを理解することが過剰な光環境下での光エネルギーの利用効率を向上し，光合成生物の生産性向上に繋がる．本研究では，光合成生物のシアノ
バクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 を用いて，様々な波長の光照射下における応答反応を明らかにする．白色 LED とピーク波長が 460nm（青色），530nm（緑色），590nm（黄色），640nm（赤色 1），680nm（赤色 2）の LED を用いて培養した Synechocystis sp. PCC 6803 の増殖速度や光合成活性，吸収スペクトルの変化など生理学解析と光合成装置や代謝酵素の定量解析を行った．その結果，
赤色 2，黄色，白色，赤色 1，緑色，青色の順に比増殖速度が高かった．また，光合成活性も赤色 2 照射下の細胞が最も高かった．さらに赤色 2 や黄色では他の色に比べてクロロフィルに対するフィコシアニンの吸収が高かった．これらの結果とフラックスバランス解析による代謝シミュレーションによる結果から，
赤色 2 照射下では光エネルギーを有効に吸収し，光化学系の循環的電子伝達経路を活用して細胞が生育していることが示唆された．また，定量プロテオーム
解析による各色照射下のタンパク質の量的変化についても報告する．

制約モデルの代謝流束均衡解析は，微生物等を用いた有用化合物の生産シミュ
レーションにおいて有用である．近年の DNA 合成技術の発達に伴い，有用化合物を生産・増産する最適な代謝ネットワークのデザインの計算が近い将来重要になるかもしれない．そこで本研究では，細胞の成長率と目的化合物の生産率に関する制約を小さなグリッドを用いて表し，グリッドごとに最小の代謝流束分布を計算して，準最適な代謝ネットワークのデザインを見つける手法
GridProd を開発した．流束変動解析(FVA)に基づく時間制限を伴う計算機実験の結果，FastPros や IdealKnock 等の既存手法では，全目的化合物の 50%以下しか生成できなかったが，GridProd は 90%以上の化合物を生成に成功した．

Study of cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 grown under different
spectral lights

Design of semi-optimal metabolic flux models for production of valuable
compounds○Masakazu Toyoshima, Masumi Sakata, Yoshihiro Toya, Fumio Matsuda,
Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words

cyanobacteria, photosynthesis○Takeyuki Tamura(Inst. Chem. Res., Kyoto Univ.)

Key words

metabolic flux analysis, bioinformatics, metabolic engineering

191

2Ip10

代謝情報基盤整備のための多様な微生物資源の活用の
可能性

2Jp01

遺伝子発現データを用いた代謝制御因子の同定 ～包括的転写制御による効率的物質生産～○竹屋 壮浩, 小山内 崇（明治大院・農）tosanai@meiji.ac.jp○寺尾 拓馬 1, 細山 哲 1, 土金 恵子 1, 宮澤 せいは 1, 鋤先 まゆ子 1,
白井 智量 2, 川﨑 浩子 1
（1NITE・NBRC, 2理研・CSRS）
terao-takuma@nite.go.jp【背景と目的】“Bioeconomy”推進を目的として，微生物等が持つ物質生産能力を
人工的に最大限引き出した「スマートセル」を構築し，化学合成では生産困難
な有用物質の創製，または従来法を凌駕する生産技術開発のための基盤情報整備が進められている．基盤となる生物情報（ゲノム配列，酵素，代謝）を基に，
人工代謝経路を設計することで，スマートセルの効率的な構築が可能になるとされる．人工代謝経路の予測精度の向上と多様化を図るためには，基盤情報の拡充が必要不可欠である．しかしながら，研究が進んでいる生物資源は限られていることを考慮すると，未知の代謝経路が自然界に数多く存在することが予想される．そこで本研究では，NBRC が保有する多様な微生物を対象に，工業原料となり得る有用な汎用化合物の生産能を評価し，未知の代謝経路の存在について可能性調査を行った．
【方法】NBRC 保有の微生物約 700 株を対象に，密栓したバイアル瓶を用いて数日間静置培養した後，ヘッドスペース GC-MS により，78 種類の化合物を標的として気相成分の一斉分析を行った．得られたクロマトグラムのピーク面積から培地成分由来のピーク面積を差し引くことにより，各微生物における化合物
生産能を評価した．生産性が確認された微生物については，ゲノム配列上の各化合物の合成に関与するとされる酵素遺伝子の有無を，KEGG 等のデータベースと照合することで，代謝経路の新規性を調査した．
【結果と考察】工業原料物質を中心に十数種類の化合物において，未知とされる代謝経路の存在が示唆された．本結果から，スマートセル構築において，人工代謝経路の高度化および精度向上を図る上で，スクリーニング源としてカルチャーコレクションに眠る微生物資源の有効活用が期待される．

【背景と目的】
微細藻類は，CO2 から直接的にバイオ燃料やバイオプラスチックの原料を合成できるため，石油資源を代替する資源として注目されている．我々は，微細藻類を利用したプラスチック原料（乳酸やコハク酸）の生産に取り組んでいる．
目的物質を増産するために，代謝経路を構成する複数の酵素遺伝子を過剰発現することは，一般的な手法である．しかしこの手法は，局所的な代謝経路の活性化しか出来ず，各遺伝子の発現バランスを制御するのが困難である．一方で，代謝経路の酵素遺伝子を制御する転写因子を改変する手法は，代謝経路を包括的かつ効果的に活性化できることが知られている．だがこの手法は，代謝活性化転写因子を実験的に同定する必要がある．そこで我々は，遺伝子発現データ
から代謝活性化に重要な転写因子を推測した．
【実験方法】
Synechocystis sp. PCC 6803 の 117 セットのマイクロアレイ発現量データを正規化した．強化したい代謝経路を構成する酵素遺伝子群の発現量をクラスター解
析に供し，同調的に発現制御を受けている遺伝子群を抽出した．抽出された遺伝子群の発現量と転写因子の発現量のあいだで相関係数を算出し，相関係数の和が高いものを代謝活性化転写因子と推測した．
【結果と考察】
遺伝子発現解析は，SigE と Rre9 という制御因子が，コハク酸生産経路を活性化すると推測した．Rre9 過剰発現株を作製し，コハク酸生産経路に関与する 44遺伝子の発現量を RT-PCR で測定したところ，包括的に上昇していた．ゲルシ
フトアッセイは，Rre9 がエノラーゼやピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体遺伝子を制御することを明らかにした．SigE/Rre9 共過剰発現株において，コハク酸，乳酸，酢酸の生産量が約 3～4 倍になった．

Potential use of microbial collections in infrastracture development of
metabolic pathway information for valuable chemicals

Metabolic engineering with metabolic transcription regulator identified byco-expression analysis: improvement of succinate production incyanobacteria○Takuma Terao1, Akira Hosoyama1, Keiko Tsuchikane1, Seiha Miyazawa1,
Mayuko Sukisaki1, Tomokazu Shirai2, Hiroko Kawasaki1(1NBRC, NITE, 2CSRS, RIKEN)

Key words

2Ip11○Masahiro Takeya, Takashi Osanai(Grad. Sch. Agric., Meiji Univ.)biosynthetic pathway, headspace GC-MS, culture collection, screening

Key words
cyanobacteria, metabolic engineering, transcriptional regulator gene,bioinformatics

機械学習を用いた酵素の EC number 予測

2Jp02○渡邉 直暉 1, 村田 昌浩 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 1,2, 荒木 通啓 2,3（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ, 3京都大院・医）ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

Euglena gracilis におけるアミノ酸生産時の培養条件
検討○冨田 結芙子 1, 小山内 崇 1, 鈴木 健吾 2
（1明治大院・農, 2ユーグレナ）
tosanai@meiji.ac.jp[背景と目的]分子生物学データベースには数百万の遺伝子・タンパク質が登録されている．それらの機能は主に実験やタンパク質のアミノ酸配列の相同性によって決定されている．しかし，機能が未知であるものも数多く存在する．そのため，機能未知の遺伝子・タンパク質にアノテーションを付与するために，それらの機能を予測することができるシステムの開発が必要とされる．本研究では，機械学習を用いて酵素の EC number の予測システムの開発を行った．
[方法]EC number1 桁目が既知の酵素情報を学習させたモデルと，酵素に基質・生成物の化学構造情報を加えたモデルを SVM を用いて作成し，EC number1 桁目の予測を行った．その際，酵素のアミノ酸配列を PROFEAT を用いて 1437 次
元，基質・生成物情報を DRAGON を用いてそれぞれ 1387 次元のベクトルで表現し，EC number1 桁目をラベルとして学習させた．そして，それぞれのモデルの予測精度を比較するために交差検定や EC number が既知の Escherichia coli
K-12 の酵素をモデルで検定することによって評価した．
[結果と考察]交差検定においてそれぞれのモデルの EC number1 桁目の正答率と精度評価のため AUC を比較したところ，酵素のみのモデルよりも基質・生成物を加えたモデルのほうがの正答率と機械学習の精度評価パラメータの AUC
が高くなった．さらに，E.coli K-12 テストにおいても後者のモデルのほうが高い結果となり予測精度は高いことが考えられる．また，基質-酵素-生成物モデルの酵素の EC number を約 92 %判別することができた．これらの結果より，酵素情報にさらに基質・生成物の化学構造情報を加えることによってモデルの精度が大幅に向上した．

【背景と目的】Euglena gracilis (以下 E. gracilis )は，緑藻由来の葉緑体を二次共生により獲得したといわれている真核微細藻類である．植物と同様に光合成をする一方で，鞭毛による運動性を示すなど，動物的な側面も併せ持つ．近年，
E.gracilis を用いた物質生産として，貯蔵多糖であるパラミロンや，化石燃料の代替エネルギーとしてワックスエステルなどの細胞内の代謝産物が注目されている．しかし，細胞外での代謝産物についての研究は乏しく，本研究では，細胞外アミノ酸に着目し，排出条件について検討を試みた．
【方法・結果】光独立栄養的に生育させた E. gracilis を暗・嫌気条件下に移行
し，3 日間培養を行った．嫌気培養後の培養上清中のアミノ酸量を HPLC にて測定したところ，様々なアミノ酸が細胞外に排出されていることが分かった．
また，条件検討として，暗・嫌気培養中の培地の窒素源の量を変化させたところ，細胞外アミノ酸量が変動した．その中でも，グルタミン酸については，興味深い挙動を示した．培地の窒素源として，(NH4)2HPO4 を使用していたため，
アンモニアの影響とリン酸の影響を調べたところ，どちらの影響も受けていないことが分かった．そこで，リン酸アンモニウム添加による pH の変動による影響を調べるために，緩衝液を用いた培養を行ったところ，嫌気培養時の pHがグルタミン酸の排出に寄与している可能性が示唆された．アミノ酸を増産させる方法として pH という無機物が有効であるということは，糖類や植物由来の有機物を必要としないという利点となる．ユーグレナは光独立栄養的に増殖するため，固定した CO2 を発酵時に細胞外に放出したアミノ酸を，今後は飼料や食糧としての活用をすることを目指している．ユーグレナの自己発酵能を利用し，温室効果ガスの低減によって，持続可能な循環型社会への寄与が期待できる．

Machine Learning Prediction of Enzyme EC Numbers

Investigation of culture conditions during amino acid production in Euglena○Naoki Watanabe1, Masahiro Murata2, Tiaki Ogino1, Akihiko Kondo1,2,Michihiro Araki2,3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Grad.
Sch. Med, Kobe Univ.)

Key words

bioinformatics, enzyme, machine learning, svm

gracilis○Yuko Tomita1, Takashi Osanai1, Kengo Suzuki2(1Grad. Sch. Agric., Meiji Univ., 2Euglena Co., Ltd.)Key words

fermentation, amino acid, glutamate fermentation

192

2Jp03

Widely targeted metabolomics-based improvement ofSynechococcus elongatus 1-butanol-producing strain

2Jp05○Artnice Mega Fathima1, Sastia Putri1, Eiichiro Fukusaki1,
James Liao2, Derrick Chuang2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Acidomonas 属酢酸菌によるグリセロールの酸化変換○西江 百加, 宇都宮 大貴, 阿野 嘉孝（愛媛大院・農）anoy@agr.ehime-u.ac.jp

In recent years, metabolomics approach for strain improvement is being widely
employed in various field of life sciences. By means of rapid detection of relevant
metabolic perturbations, metabolomics can identify specific targets for strain
improvement. These may include identification of rate limiting steps in a production
pathway or metabolite or product toxicity. The highest 1-butanol titer is reported to beas high as 317 mg/L in Syenchococcus elongatus (BUOHSE strain) with modified
CoA-dependent pathway. In order to further improve production titer, widely targeted
metabolomics approach using ion-pair LCMS was carried out to find rate-limitng
steps, and its result has been addressed to modify the strains through metabolicengineering work. Two higher 1-butanol producing strains, so called DC7 and DC11,
were obtained from this study. Strain DC7 showed a 33% increase in 1-butanol
production compared to the BUOHSE strain. In addition, DC11 strain was able toreach a production titer of 418.7 mg/L in 6 days, compared to DC7 that can reach asimilar titer in 12 days. In this study, the iterative cycle of genetic modification basedon insights from metabolomics successfully resulted in shorter production time andhigher 1-butanol titer for transgenic Synechococcus elongatus.

【目的】バイオディーゼル燃料の副生物である廃グリセリンの処理問題の深刻化が懸念されている．酢酸菌は，グリセロールをジヒドロキシアセトン（DHA）
やグリセリン酸（GA）などの有用物質に酸化変換できることから，廃グリセリ
ンの資源化触媒としての応用が期待されている．本研究で着目している
Acidomonas 属酢酸菌は，廃グリセリンの夾雑物であるメタノールに強く，メタ
ノール含有培地でも良好なグリセロール酸化能を示す．これまでに酢酸菌では，細胞膜に局在するキノプロテイングリセロール脱水素酵素（PQQ-GLDH）で
DHA を，キノプロテインアルコール脱水素酵素（PQQ-ADH）で GA を生成することが報告されているが，本菌は DHA を生成するにも関わらず，ゲノム上に PQQ-GLDH 遺伝子を持たないことから，他の酢酸菌とは異なるグリセロー
ル酸化系を有していると考えられる．本研究では廃グリセリンの資源化技術の構築を目指して，本菌のグリセロール酸化系を明らかにすることを目的とした．
【結果】 本菌の細胞膜画分に DHA 生成能力があることを確認し，本菌の細胞膜画分からグリセロール酸化酵素の可溶化・精製を行った．グリセロール酸化活性に加え，エタノール酸化活性を追跡したところ，両活性は同じ画分で確認された．精製酵素は PQQ-ADH と同じ性質を示し，ウエスタンブロッティングでも PQQ-ADH 抗体に良い反応性を示した．精製酵素の酸化反応物を調査すると
GA ではなく，DHA であることが明らかとなった．一方，PQQ-ADH 遺伝子破壊株を用いた休止菌体反応において，DHA が生成能を失い GA が良好に生産されたことから，本菌の PQQ-ADH は GA ではなく DHA 生成に関与することが明らかになった．以上より，Acidomonas 属酢酸菌の PQQ-ADH は他の酢酸菌酵素とは異なる性質を持つことが示唆された．現在，これらの情報に元づいた廃グリセリンの資源化技術を構築中である．

Widely targeted metabolomics-based improvement of Synechococcus
elongatus 1-butanol-producing strain

Oxidative bioconversion of glycerol by Acidomonas methanolica○Artnice Mega Fathima1, Sastia Putri1, Eiichiro Fukusaki1, James Liao2,
Derrick Chuang2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Chem. Biomol. Eng., UCLA)○Momoka Nishie, Daiki Utsunomiya, Yoshitaka Ano(Grad. Sch. Agric., Ehime Univ)

Key words

cyanobacteria, butanol, metabolic analysis, metabolic engineering

Key words

acetic acid bacteria, waste glycerol, Acidomonas methanolica

2Jp04

Bacterial consolidated bioprocessing of paper sludge for
acetic acid production

2Jp06

好熱性ホモ酢酸 Moorella thermoacetica 代謝改変株によるエタノール生産○竹村 海生 1, 岩崎 裕樹 1, 喜多 晃久 2, 中島田 豊 1（1広島大院・先端物質, 2新居浜高専）
nyutaka@hiroshima-u.ac.jp○Eka Triwahyuni, Harifara Rabemanolontsoa, Shiro Saka
(Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.)
saka@energy.kyoto-u.ac.jp

Around 3 million tons of paper sludge (PS) are available annually in Japan as a waste
without further valorization. PS is a cellulose-rich waste stream from pulp and paper
mills and could be a good candidate for biorefinery applications by consolidated
bioprocessing (CBP). Acetic acid is an important biorefinery product used as reagent
and precursor in chemical industries. Several studies were conducted on acetic acidproduction from model compounds, food products, or lignocellulosic hydrolyzates but
CBP of solid biomass to acetic acid has not been reported yet. Therefore, this work
explores the direct fermentation of PS provided by a company in Fuji city to acetic
acid by free cells of cellulolytic (Clostridium thermocellum), hemicellulolytic(Clostridium clariflavum), and acetogenic bacteria (Moorella thermoacetica) in coculture. Variation in the volumetric ratio of these microorganisms was conducted inthis study. As a result, fermentation of 10 g/L PS in 500-mL fermenter by C.
thermocellum, C. clariflavum, M. thermoacetica added in same volumetric ratio
provided the highest total products concentration of 5.4 g/L including 4.0 g/L of acetic
acid and 1.4 g/L of ethanol, with a conversion efficiency of 69.3% after 7 days. Higher
conversion efficiency of 91.1% to total products was obtained in 5-L fermenter withlonger treatment time. These results indicate the possibility to directly convert PS toacetic acid without using expensive enzymes and can be a major breakthrough toreduce biomass conversion cost.

【目的】
現在，化石資源を利用した物質生産が中心となっているが，枯渇や地球温暖化の促進が懸念される．そこで近年，代替物質として再生可能な生物由来の有機資源であるバイオマスの利用が積極的に行われている．バイオマスは主に糖に変換され，微生物発酵に利用されるが，合成ガス (H2+CO2+CO) に変換する事で糖化困難なリグニンを含む全ての有機物を基質として利用できる．そこで，当研究室では合成ガスを資化できる Moorella 属を宿主として物質生産を目指している．現在までにホモ酢酸菌 Moorella thermoacetica ATCC39073 株の遺伝子組み換え技術を開発した．この技術を用いて，酢酸及び ATP 生産に関わる遺伝子を破壊し，エタノール生産に関わる遺伝子を導入することでエタノール生産株を作成した．この変異株はフルクトース培養時にはエタノールを生産した．しかし，H2+CO2 ガス培養時には生育せず，ギ酸の蓄積が確認された．ギ酸はガス資化経路中の代謝中間物質であり，ATP 加水分解と共役し，Acetyl-CoA を合成，その後，最終産物を生産する．そのため，遺伝子改変によるギ酸消費反応
への ATP 供給の減少がギ酸の蓄積の原因と考え，培養工学的手法を用いて ATP
供給を増加させ，合成ガスからのエタノール生産を実現する事が本実験の目的である．

Bacterial consolidated bioprocessing of paper sludge for acetic acidproduction

Ethanol production by genetically enginerred thermophilic acetogen

Key words
acetic acid bacteria, Clostridium thermocellum, Clostridium
clariflavum, Moorella thermoacetica

Key words○Eka Triwahyuni, Harifara Rabemanolontsoa, Shiro Saka
(Grad. Sch. Energy Sci., Kyoto Univ.)【方法及び結果】
休止菌体によるエタノール生産
休止菌体を用いる事で増殖に使用する ATP をギ酸消費反応に供給でき，合成ガスからエタノール生産が可能となると考えた．対数増殖期の菌体を集菌後，リン酸緩衝液に懸濁し，休止菌体を作成した．培養は H2+CO2 で行ない，CO2 を利用できない N2+CO2 をネガティブコントロールとした．その結果，H2+CO2 でエタノール，酢酸，ギ酸が検出され，N2+CO2 で酢酸が検出された．

Moorella thermoacetica○Kaisei Takemura1, Yuki Iwasaki1, Akihisa Kita2, Yutaka Nakashimada1(1Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ., 2Niihama Natl. Coll. Technol.)metabolic engineering, carbon dioxide, ethanol production

193

2Jp07

スクロースを糖源とした乳酸菌培養による乳酸生産抑制○佐野 杏奈 1, 河合 美桜 1, 土屋 麻美 2, 依田 伸生 2, 山崎 思乃 3,
片倉 啓雄 3
（1関西大院・理工, 2（株） 明治, 3関西大・化生工・生命生工）
katakura@kansai-u.ac.jp

2Jp09

梅の花由来乳酸菌 Enterococcus faecalis の機能性の探索○平野 美佳子 1, 草場 裕貴 1, 中野 雄揮 2, 柘植 圭介 3, 北垣 浩志 1
（1佐賀大院・農, 2インパクト（株）, 3佐賀工技セ）
ktgkhrs@cc.saga-u.ac.jp【背景と目的】乳酸菌は消費した糖の 50％以上を乳酸に変える微生物と定義されており，解糖系で ATP を獲得する際に消費される NAD ＋を乳酸脱水素酵素(LDH)によって再生するために乳酸が生産される．増殖に伴って乳酸が蓄積すると，例え pH を調整しても増殖や代謝が阻害されるため，乳酸菌の高効率の培養や物質生産は困難である．解糖系以外で ATP を得る経路はいくつか報告されているが，それらはグルコースで抑制される．また，膜結合型のオキシダー
ゼなどのように LDH 以外で NAD ＋を再生する経路も知られている．そこで本
研究では，スクロースを糖源とし，さらに好気環境で酸素を電子受容体にすることで，乳酸生産が抑制できるかを検討した．
【方法】グルコースまたはスクロースを 6 g/L を含む合成培地 20 mL に対して
20 OD unit の菌体を植菌し，各菌株の至適温度で静置または振盪(200 spm)して培養した．乳酸の比生産速度を比増殖速度で除して菌体増加量あたりの乳酸生
産量 Y を求めた．
【結果と考察】Lactobacillus reuteri JCM 1112 と Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides NBRC 100496 において，グルコースを糖源とした静置培養における Y はそれぞれ 5.6 と 7.8 g-lactate/g-cell であったのに対して，振盪した場合は4.8 と 4.0 に，糖源をスクロースとして静置培養すると 3.7 と 3.0 に低下し，さらに，振盪培養した場合は 2.5 と 2.2 に低下した．即ち，糖源をグルコースとした静置培養に比べて，糖源をスクロースに代えて振盪培養すると Y は 45％,29％に低下した．代謝産物の分析と炭素の物質収支から，Lb. reuteri ではアルギ
ニン消費による ATP 獲得とマンニトール生産による NAD ＋再生が起こり，乳酸生産が抑制されたと考えられた．Leu. mesenteroides では物質収支が 42％と低かったことから，他の代謝物による ATP 獲得または NAD ＋再生が行われていると考えられた．

【目的】近年日本人にはアレルギー患者が激増しており，その要因としてヘルパー T 細胞の分化が Th2 に傾いていることが指摘されている．ヘルパー T 細胞の分化を Th1 に傾けるアプローチとして，腸管を通じた乳酸菌の摂取とそれによる腸管免疫の活性化がある．乳酸菌が腸管免疫組織に接触すると，その細胞壁構成成分がマクロファージ表面の TLR2 に結合し NF-κB が活性化され，一酸化窒素（NO）や腫瘍壊死因子 α（TNF-α）が産生されることが知られている．
NO は NK 細胞を活性化させ，TNF-α は T 細胞や B 細胞の増殖に関与すること
で，ガン細胞や病原体への攻撃活性を持つようになり，Th1 に媒介される細胞性免疫を賦活化する．これまで発酵乳食品などから乳酸菌は分離されてきたが，梅の花から分離した研究は非常に少なかった．そこで我々は，大分県の梅の花
から乳酸菌 Enterococcus faecalis を単離した．今回の研究で梅の花由来乳酸菌の健康に寄与する免疫活性が明らかとなれば梅の花を活用した新たな免疫調整作用のある素材となりうる．そこでマクロファージ RAW264.7 細胞を使って梅の花乳酸菌の活性化能を調べた．
【方法・結果】梅の花から単離した乳酸菌 Enterococcus faecalis を MRS 液体培地
で 30℃で静置培養を行い，106, 107, 108 cells/mL に調整した不活化菌体をRAW264.7 細胞株に添加した． Griess 反応を用いて NO 産生量を，ELISA 法を用いて TNF-α 産生量を測定したところ，両者に濃度依存的な増加が確認された（最大添加区は NO 量約 9 倍，TNF-α 量約 5 倍）．一方生細胞率の結果より，細胞傷害性が無いことが分かった．これらの結果は梅の花由来乳酸菌がマクロ
ファージ細胞内の NF-κB を活性化，NO や TNF-α を増強させ，免疫機能の向上に貢献することを示唆している．また，本大会では梅の花由来 Enterococcus
faecalis の代謝物をメタボローム解析した結果も併せて報告したい．

Repression of lactic acid production by lactic acid bacteria culture using
sucrose as a sugar source

Exploring the functionality of Enterococcus faecalis isolated from Plumflower○Anna Sano1, Mio Kawai1, Asami Tsuchiya2, Nobuo Yoda2,
Shino Yamasaki-Yashiki3, Yoshio Katakura3(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Meiji Co., Ltd., 3Fac. Chem. Master. Bioeng.,
Kansai Univ.)○Mikako Hirano1, Yuki Kusaba1, Yuki Nakano2, Keisuke Tsuge3, Hiroshi Kitagaki1(1Fac.Agric., Saga Univ., 2Impact Co., 3Industrial Technology Center of Saga)

Key words

lactic acid bacteria, sucrose, metabolism, NAD/NADH balance

Key words

lactic acid bacteria, TNF-alpha, metabolome

2Jp08

グルコースリプレッションを回避した流加培養による乳酸菌の乳酸生産抑制

2Jp10

Gluconobacter 属酢酸菌の 5-ケトグルコン酸資化系の制御に関与する転写因子○和田 征太郎, 阿野 嘉孝（愛媛大院・農）anoy@agr.ehime-u.ac.jp○河合 美桜 1, 土屋 麻美 2, 依田 伸生 2, 山崎 思乃 3, 片倉 啓雄 3
（1関西大院・理工, 2（株）明治, 3関西大・化生工）
katakura@kansai-u.ac.jp【背景と目的】
乳酸菌は糖をピルビン酸に代謝することによって ATP を獲得し，この過程で必要となる NAD+を乳酸脱水素酵素（LDH）によりピルビン酸から乳酸へと変換することで再生する．増殖に伴い生産される乳酸は増殖阻害を引き起こすため，乳酸菌の高密度培養は困難とされている．LDH 以外の経路で NAD +を再生する
か，NAD +の消費を伴う解糖系以外の方法で ATP を獲得できれば乳酸の生産は抑えられるが，これらの経路はグルコースによって抑制されてしまう．本研究では，グルコース以外の糖源を炭素源とした流加培養によって，グルコースリ
プレッションを回避するとともに解糖系のフラックスを少なくすることで，エネルギー代謝に占める LDH の寄与を相対的に下げ，乳酸生産を抑制できるか
検証した．
【方法】
グルコース，スクロース，ガラクトースを糖源とする MRS 培地を用い，回分培養および流加培養を行った．各培養における乳酸の比生産速度を比増殖速度で除すことによって菌体増加量あたりの乳酸生産量 Y L/X を算出した．
【結果と考察】ゲノム配列が既知かつスクロースを糖源として増殖できる Lactobacillus reuteri
JCM1112, Lb. plantarum NCIMB8826, Lb. gasseri NCIMB11718, Lb. casei
ATCC334, Lactococcus lactis l JCM7638 の 5 菌株全てにおいてスクロース流加培
養により菌体増加量当たりの乳酸生産量が，グルコース回分培養の約 1/4～3/4に抑制された．スクロースの代謝が遅い Lb. rhamnosus ATCC53103 については，
ガラクトース流加培養によって菌体増加量当たりの乳酸生産量がグルコース回
分培養の約 1/3 に抑制された．菌株に適したグルコース以外の糖源を選択し，さらに流加培養を行うことによって，通常グルコースで抑制されてしまう NAD+
再生系や ATP 生産経路の寄与が相対的に高まり，乳酸生産の抑制につながったと考察された．

【目的】 5-ケトグルコン酸（5KGA）は，酒石酸やビタミン C，キシリトール，
生分解性プラスチック等の合成中間体となる汎用性の高い化学素材であり，5KGA の工業生産系の確立が期待されている．これまで Gluconobacter 属酢酸菌
は，細胞表層でグルコースを 5KGA まで酸化変換した後，5KGA を細胞外に安定に蓄積するとされていたが，最近，一部の菌株において細胞内で 5KGA を資化し再増殖することが確認された．我々はこれまでに 5KGA の細胞内代謝にはグルコン酸輸送体 GntP と 5KGA 還元酵素 5KGR が関与していることを明らかにしており，その発現調節の解明を目指している．本研究では，5KGA 資化の誘導に関与する転写因子の特定とその機能を明らかにすることを目的とした．
【方法・結果】 Gluconobacter の gntP，5KGR はゲノム上で隣接しており，その周辺に転写因子は存在しなかった．そこで，これらの発現調節においても，グ
ルコン酸代謝関連遺伝子の発現調節を担う GntR が関与していると仮定し，G.
thailandicus NBRC3255 のゲノム情報を調査したところ，複数の gntR ホモログが存在していた．5KGA 生産条件における gntR 遺伝子群の発現誘導を調査した
ところ，特に gntR4 と名付けた遺伝子の発現が強く誘導された．そこで，gntR4
破壊株を作製し，野生株との比較解析を行った．その結果，破壊株では野生株に比べて 5KGA 資化速度の低下がみられ，5KGA の取り込み活性，5KGR 活性にも低下をもたらしていた．これらのことから，gntR4 が 5KGA 資化の誘導に関与することが示唆された．以上の結果から，安定な 5KGA 生産には gntR4 を制御することが重要であると考えられ，現在，本因子の機能解析を進めている．

Suppression of lactic acid production by lactic acid bacteria using fed-batch
culture for avoiding glucose repression

Transcriptional regulator involved in assimilation of 5-keto-D-gluconate in

Key words
lactic acid bacteria, glucose repression, fed-batch culture, NAD+/
NADH balance

Key words○Mio Kawai1, Asami Tsuchiya2, Nobuo Yoda2, Shino Yamasaki-Yashiki3,
Yoshio Katakura3(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Meiji Co., Ltd., 3Fac. Chem. Mater. Bioeng.,
Kansai Univ.)

Gluconobacter○Seitaro Wada, Yoshitaka Ano(Grad. Sch. Agric., Ehime Univ.)

Gluconobacter, 5-keto-D-gluconate, tanscriptional regulator

194

2Jp11

培地の乳糖分解が LB81 スターターの増殖性に及ぼす影
響の解析

2Kp02

接合菌 Mucor circinelloides の二形成変化における分子生物学的解析
○高野 真希, 岩倉 遼, 星野 一宏（富山大院・理工・生命工）khoshino@sus.u-toyama.ac.jp○山本 恵理, 渡部 玲子, 市村 武文, 木村 勝紀（株式会社 明治）
eri.yamamoto@meiji.com【背景と目的】一般に，ヨーグルトは 2 種類の乳酸菌 Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus（L. bulgaricus）と Streptococcus thermophilus（S. thermophilus）の共生発酵によって作られる．通常，脱脂粉乳培地で 2 種の乳酸菌を共生発酵させると，発酵終了時の L. bulgaricus の菌数は S. thermophilus の菌数の 1/5～
1/10 倍となる．一方，予めラクトースをグルコースとガラクトースに分解した
乳糖分解培地を用いると，S. thermophilus の菌数は大きく変わらないものの，L.
bulgaricus の菌数が大幅に高まり，S. thermophilus の菌数の 1～1/2 倍となる．本現象のメカニズムを解析するため，自社ヨーグルトスターターである LB81 ス
ターター（S. thermophilus 1131，L. bulgaricus 2038）をモデル菌株とし，各種検討を実施した．
【結果】まず，乳糖分解培地における培地成分が，直接的に L. bulgaricus の増殖性を高める可能性を検証するため，L. bulgaricus 2038 を単独で発酵させた．しかし，培地の乳糖分解の有無で L. bulgaricus 2038 の増殖性に差は見られず，S.
thermophilus と の 共 生 関 係 が 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ． そ こ で ， S.
thermophilus 1131 についても同様の検討を行った結果，乳糖分解培地では，非分解培地に比べて溶存酸素除去速度が速く，L. bulgaricus の増殖促進物質であるギ酸の産生濃度が高いことが分かった．現在マイクロアレイによる遺伝子発現解析を実施中であり，その結果についても併せて報告する予定である．

【目的】二形性真菌とは pH，温度，CO2，窒素源といった外的要因により糸状体と酵母体に形態を可逆的に変化させる真菌である．本研究室で開発した Mucor
circinelloides 4572J 株は好気条件で糸状体，CO2 存在嫌気条件で酵母体へと形態変化し，両条件下ともにエタノール発酵が可能な非病原性の菌株である．二形
性変化は二形性真菌症による皮膚感染症治療のために以前より研究されているが，これに伴う細胞内シグナルの詳細は不明である．そこで本研究では，好気・嫌気条件下における二形性変化に関わる遺伝子発現を解析し，M.circinelloidesの形態変化メカニズムを分子生物学的に検討した．
【方法・結果】M.circinelloides
4572J を 70%N2+30%CO2 の完全嫌気条件下で培養し酵母体とし，4572J の酵母体を本培養に用いた．まず，CO2 細胞内取り込みに関する Carbonic anhydrase(CA)遺伝子 Nce103 は糸状体と酵母体の間で発現量の違いは認められなかった．
CA の下流に存在する GTPase 遺伝子の Ras1 発現量は培養 6 h から 24 h で糸状
体では 2.8 倍増加し，酵母体では 0.03 倍にまで減少した．また，二形性変化は
細胞内 cAMP 含量が影響するとの報告があり，cAMP 生合成に関する Adenylyl
cyclase (AC)および Phosphodiesterase (PDE)の遺伝子発現量を解析した．酵母体の AC および PDE 発現量は培養 6，24 h においてそれぞれ糸状態の 2 倍であった．さらに，菌糸伸長因子 Efg1 発現は糸状体の場合，培養 6 h において酵母体より 8.5 倍高く発現した．一方，細胞骨格に関する Tubulin4 の遺伝子発現量は酵母体の方が低いことが判明した．実際，Tubulin 重合阻害剤 Griseofulvin の添加により菌糸成長が抑制され，酵母体が維持された．以上の結果より，細胞内cAMP 蓄積が下流の Efg1 発現を低下させ，さらに細胞骨格成分の重合が抑制されることで菌糸が伸長せず酵母体が維持できることが示唆された．

Analysis of the effect of lactose degradation of the medium on the growth of
LB81 starter

Molecular elucidation of dimorphic-changing mechanism on zygomycota
Mucor circinelloides sp.

Key words
Lactobacillus bulgaricus, streptococcus thermophilus, lactic acidfermentation, oxidase

Key words

Mucor circinelloides, dimorphism, cAMP, tubulin

2Kp01

2Kp03

土壌環境中での糸状菌の呼吸活性の調節○Eri Yamamoto, Reiko Watanabe, Takefumi Ichimura, Katsunori Kimura(Meiji Co.,Ltd)

Aspergillus oryzae 由来転写因子 XlnR による遺伝子発現制御システムの網羅的解析○Maki Takano, Ryo Iwakura, Kazuhiro Hoshino(Grad. Sch. Sci. Eng., Univ. Toyama)○岡 大椰 1, 兒島 孝明 1, 井原 邦夫 2, 小林 哲夫 1, 中野 秀雄 1
（1名大院・生命農学, 2名大・遺伝子実験施設）
kojimat@nuagr1.agr.nagoya-u.ac.jp○宮崎 つぐみ 1, 大泉 太於 2, 中澤 奈美 2, 高谷 直樹 2
（1筑波大, 2筑波大院・生命環境）
takaya.naoki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】
転写因子のゲノム上における結合配列及び制御遺伝子を同定することは遺伝子
発現システムを理解する上で非常に重要である．Genomic SELEX-Seq (gSELEXSeq)は，ゲノム上の標的転写因子が in vitro で結合する配列情報を高感度に出力する手法である．本研究では，Aspergillus oryzae におけるキシラン及びセルロー
ス代謝に関与する転写因子 AoXlnR をターゲットとし，gSELEX-Seq 法とマイクロアレイ法より取得した情報を統合することにより，AoXlnR によって発現制御される遺伝子をゲノムワイドに同定し，AoXlnR 制御転写ネットワークを網羅的解析する．
【方法・結果】
A.oryzae ゲノミックライブラリーと AoXlnR を用いた gSELEX を実施し，高速DNA シークエンサーによって各選択プールの配列を取得した．これによって得られた配列データの解析を行い，AoXlnR 結合活性を示す 5´-UTR 及びその下流に位置する遺伝子を同定した．この候補制御遺伝子とマイクロアレイによって同定された発現変動遺伝子（DEGs）72 種類と照合したところ，51 遺伝子において重複が確認された．5´-UTR に結合部位を有し，かつ発現変動を受けるこれ
らの遺伝子は AoXlnR によって直接的に発現制御される遺伝子であると推定された．さらに，上記 DEG の 5´-UTR における AoXlnR 結合モチーフ数と発現変動レベルとの相関解析を行ったところ，AoX1nR 結合モチーフが下流の遺伝子の発現変動に密接に関与していることが明らかとなった．
本研究で得られた知見は，A. oryzae における AoXlnR を介したキシラン，セル
ロース代謝制御ネットワークの解明に大きく寄与することができる．

【背景と目的】フミン酸（Humic acid, HA）は土壌の腐植の構成成分であり，化学構造が特定されない難分解性の芳香族高分子化合物である．肥沃な土壌に普遍的に含まれることから，土壌微生物は HA と相互作用しながら生息していると予想されるが，この詳細は不明である．本研究では，土壌糸状菌による HAの代謝と HA による土壌糸状菌の代謝調節を明らかにすることによって，土壌環境中での HA の生理的機能と環境中の微生物による腐植の恒常性の維持機構を解明することを目的とした．
【結果と考察】HA が糸状菌 Aspergillus nidulans の代謝に与える影響を調べるた
めに，一般的な呼吸酵素であるシトクロム c オキシダーゼ（Cytochrome c oxidase,
COX）に依存した呼吸とシアン耐性呼吸（Alternative oxidase, AOX）に対する
HA の効果を検証した．液体振とう培養させた菌体を回収し，酸素電極を用いて溶存酸素濃度を測定することによって，それぞれの呼吸活性を定量した．HAを添加した培養によって得られた菌体では，HA 未添加のそれに比べて全呼吸活性に占める AOX 活性の割合が高かった．この呼吸活性の変化は，A. nidulans
以外の 15 種の糸状菌においても観察された．また，HA の添加によって細胞内の活性酸素種の蓄積が減少したことから，HA は AOX 活性を亢進することで活性酸素の生産を抑制することが推察された．滅菌土壌を添加して培養した際にも AOX 活性の割合が増加し，このときの COX 活性は，HA と滅菌土壌のいずれも添加しない場合と比べて著しく低かった．このことから，HA および土壌が A. nidulans の呼吸代謝に影響を与えることが明らかとなった．本研究は，土壌成分が糸状菌の代謝調節に関与することを初めて示したものであり，環境中での糸状菌の代謝に関する新たな知見を与えるものである．

Comprehensive investigation of the gene expression system regulated by an
Aspergillus oryzaetranscription factor XlnR using integrated mining ofgSELEX-Seq and microarray data

Regulation of respiratory activity of filamentous fungi in soil environment○Hiroya Oka1, Takaaki Kojima1, Kunio Ihara2, Tetuo Kobayashi1, Hideo Nakano1(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2Center for Gene Research. Nagoya
Univ.)

Key words

Aspergillus oryzae, transcriptome, bioinformatics, gSELEX-Seq○Tsugumi Miyazaki1, Tao Oizumi2, Nami Nakazawa2, Naoki Takaya2(1Univ. Tsukuba, 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

Aspergillus nidulans, humic acid, respiration, alternative oxidaze

195

2Kp04

固／液界面培養法の菌株スクリーニングへの応用：培養条件の最適化

2Kp06○椎名 一樹 1, 小田 忍 2（1金工大院・工, 2金工大・ゲノム研）
odas@neptune.kanazawa-it.ac.jp

Free fatty acids as antibacterial compounds found insoybean tempe○Dewi Kusumah1, Isamu Maeda1,2(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Fac.
Agric., Utsunomiya Univ.)
kusumahdewi0402@yahoo.com【目的】 新規な二次代謝物生産システムとして，抽出液面固定化システム（ExtLSI）が報告されている．Ext-LSI では，中空マイクロスフェアー（MS）の液面
浮上性を利用することで液体培地の液面にカビマットを形成させ，その上に有機溶媒を重層することでカビが生産する脂溶性二次代謝物を自動的に抽出することができる．しかし，Ext-LSI には増殖の遅いカビを適用すると，カビ-MS 複合マットが容易に崩壊してしまうという問題がある．一方，寒天平板／疎水性
有機溶媒の固／液界面培養法（S/L-IC）がある．この培養系では寒天平板上にカビマットを安定に形成させることができる．本研究では S/L-IC による二次代謝物生産カビのスクリーニング法について，様々な因子を標準化し，プロトコル化を図ることを目的とした．
【方法・結果】 寒天平板に標準カビを 1 点植えで植菌し，数日の静置培養を通じて培地上にカビマットを形成させた．その後，低沸点ジメチルシリコンオイル（KF-96L-1CS or 0.65CS, 信越化学）をカビマット上に重層し，所定の日数培養を行った．培養後有機層を回収し，HPLC-PDA で二次代謝物の解析を行った．本培養系について，培地種や有機溶媒種，培養期間等の標準化を図った．
また，低酸素下における培養との比較も行った．
標準化した培地種，培養期間はそれぞれ Potato dextrose broth 培地，14 日間(前培養 3 日間，本培養 11 日間)であった．有機溶媒種では，KF-96L-1CS でカビ
マットの胞子形成が活発になり，二次代謝物が多く生産される傾向があった．
シリコンオイルは，他の溶媒に比べて酸素を取り込みやすい，水酸化を受けにくい，微生物毒性が低い等といった特徴がある．一方，低酸素条件における培養では，二次代謝活性と胞子形成の抑制が確認された．

Tempe is known as a fermented soybean food that includes beneficial compounds suchas antibacterial compound. The goal of this study is to identify antibacterial
compounds and clarify a production process of the compounds in tempe.
Tempe was produced after fermentation by Rhizopus oligosporus for 72 hours.
Antibacterial compounds were extracted from the tempe using ethanol at 4℃ for 8hours with vigorous shaking. Antibacterial compounds were purified by HPLC
equipped with an ODS column. The compounds were identified by HPLC, GC-MS,and NMR. Growth inhibition by the antibacterial compounds was shown in Gram
positive bacteria (Bacillus subtilis subsp. natto and Staphylococcus aureus) but not inGram negative bacterium (Escherichia coli) and yeast (Saccharomyces cerevisiae).
The main antibacterial compounds were linoleic acid and linolenic acid, which arefatty acids originally found in soybean as the form of triglyceride. It is known that fatty
acids show unique properties, in which their antibacterial activities are affected
depending on their chain length, number and position of double bond(s), cis-transisomerism, kinds of functional group, and carboxyl group modification. Therefore, it issuggested that lipase produced by R. oligosporus might release free fatty acids fromtriglycerides included in soybean during a fermentation period of tempe, and linoleic
acid and linolenic acid among the free fatty acids showed strong antibacterial activities
in tempe extract.

Application of a solid-liquid interface cultivation to the screening of
microorganisms : Optimization of cultivation conditions

Free fatty acids as antibacterial compounds found in soybean tempe○Kazuki Shiina1, Shinobu Oda2
(1Grad. Sch. Eng., Kanazawa Inst. Technol., 2Genome Biotechnol. Lab., Kanazawa
Inst. Technol.)○Dewi Kusumah1, Isamu Maeda1,2(1United Grad. Sch. Agric. Sci., Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Fac. Agric.,
Utsunomiya Univ.)

Key words

fermentation, solid-liquid interface, secondary metabolite

Key words

antibacterial, fermentation, fatty acid, functional property

2Kp05

乳化を指標とした細胞壁に作用する抗真菌性化合物の
探索

2Kp07

二次代謝系の動的特性解析における大過剰化合物測定の有無の影響の数理解析○谷畑 友基, 根路銘 伸介, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp○富永 大介 1, 川口 秀夫 2, 堀 良美 2, 蓮沼 誠久 2, 荻野 千秋 3,
油谷 幸代 1
（1産総研・生体ビッグデータラボ, 2神戸大院・科技イノベ, 3神
戸大院・工）
tominaga-daisuke@aist.go.jp

真菌症の治療に使用されている抗真菌薬は，種類が少ない上に副作用や耐性菌の出現が問題となっている．医療現場から新たな抗真菌薬の開発が求められているが，ヒトと真菌で細胞構造が類似しているため，薬剤ターゲットは限られている．我々はヒトにはない真菌特有の構造体である細胞壁をその標的として注目し，新たなスクリーニング法の開発を進めてきた．2017 年度の本大会において，モデル生物である Saccharomyces cerevisiae や病原性酵母 Candida albicans
を用い，浸透圧保護下で β-1,3-グルカン合成阻害薬 Micafungin を添加した培地
でこれら酵母を培養すると，その培養液と油を混合した時に強い乳化が生じる現象を報告した．細胞壁構造の変化に伴い細胞表層の乳化物質が細胞から遊離したと考えられ，この結果から昨年度は乳化を指標とした細胞壁に作用する化合物の新規スクリーニング法を提案した．
本研究では，提案したスクリーニング法の有用性を証明するために，乳化を指標とした細胞壁に作用する新規化合物のスクリーニングに取り組んだ．具体的には，浸透圧保護剤と供試化合物を含む培地で C. albicans を培養し，得られた培養液に油を添加し撹拌した後に目視で乳化を評価する非常に簡単な方法でス
クリーニングを進めた．結果として，約 500 種類の化合物ライブラリーから，
5 種類の化合物で乳化が検出された．次に，5 種類の化合物について，浸透圧保
護がない時の供試化合物の増殖抑制作用と細胞形態への影響を評価した．その結果，1 つの化合物では弱い増殖阻害，別の 1 つの化合物では細胞形態変化が見られ，それら化合物が細胞壁に作用する可能性が示唆された．上記の試験から，乳化を指標としたスクリーニングが有用であると判断し，現在は微生物の培養液ライブラリーからのスクリーニングに取り組んでいる．

微生物の工業利用における有用物質生産の最適化などを目的として，その生物における目的物質生産に関わる二次代謝系の解析が行われることがある．多くの場合収量の最大化を目的として，グルコースなど微生物に与える基質 1 分子から，得られる目的物質の分子数の理論的最大値と実際の終了を比較するなどといったことが行われるが，この際に，最終的な収量に加えて生成速度も重視
したいことがある．それには微分方程式モデルなどを使った解析が行われるが，モデルが大規模になると解析が困難になることがあるため，モデルに組み込む代謝物質の数を抑えるため，共役反応に関わる物質を省いて数理モデルを作ることがある．これは，ＡＴＰやＮＡＤなどは分子数が豊富であり（大過剰），それらが関わる反応が進んでも大きな濃度変化はない，という仮定に基づく．これにより実験観測のコストも抑えることができる．
しかし近年メタボローム測定の大規模化，システム化が進んでおり，コストの問題は解決されつつあることを踏まえ，著者らは大腸菌の酪酸代謝に関わる代謝物とエネルギー分子を 131 種選び，対数増殖期における濃度変化を観測し，そのうちの二十種程度について速度モデルにおける大過剰分子の有無の妥当性を検証した．データ点数は 10 点であり，速度モデルには S-system 形式を用いた．その結果，大過剰分子を取り入れたモデルは精度が高く，また取り入れない場合は無視できない誤差が生じ得ることが示された．

Screening for antifungal compounds acting on fungal cell walls using
emulsification as an index

Mathematical analysis for consideration of excessive metabolites on
dynamical analysis of secondary metabolic pathways○Yuuki Tanibata, Shinsuke Nerome, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words

Candida albicans, antifungal agents, screening, emulsification○Daisuke Tominaga1, Hideo Kawaguchi2, Yoshimi Hori2, Tomohisa Hasunuma2,
Chiaki Ogino3, Sachiyo Aburatani1(1CBBD-OIL, AIST, 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Grad. Sch. Eng,
Kobe Univ.)

Key words

dynamical analysis, S-system, Escherichia coli, mathematical model

196

2Kp08

Metabolic profiling of three terminal alkene producing
Jeotgalicoccus spp. during different growth phase

2Kp10○Filemon Jalu N Putra, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
sastia_putri@bio.eng.osaka-u.ac.jp

メタノールをメチル基供与体とした S-アデノシルメチオ
ニン再生経路の構築○岡野 憲司 1, 永田 悠 1, 井上 翔太 2, 本田 孝祐 1
（1阪大院・工, 2阪大・工）okano@bio.eng.osaka-u.ac.jp

The demand for terminal alkene has increased due to their application as chemical
feedstock in commercial industries. However, terminal alkene is mainly produced bychemical synthesis from non-renewable sources. Jeotgalicoccus genus has beenreported to be able to produce terminal alkene by using a unique cytochrome P450
fatty acid decarboxylase enzyme named OleTJE, which directly decarboxylates freefatty acids into terminal alkenes via CYP catalyzed oxidation. LC-MS/MS analysis
was performed to monitor central carbon metabolism of Jeotgalicoccus halotolerans
JCM 5429, Jeotgalicoccus huakuii JCM 8176, and Jeotgalicoccus psychrophilus JCM
5429 at logarithmic and stationary phases. Production profile of terminal alkene wasmeasured by GC/MS splitless injection mode. In this study, J. halotolerans and J.
psychrophilus showed higher terminal alkene production compared to J. huakuii.
Terminal alkene showed highest production at logarithmic phase and therefore,
detailed PCA analysis of the metabolite profiles of the three species were performed
for the logarithmic phase. This is the first study on metabolite profiling of
Jeotgalicoccus spp. in different growth phases. The results might provide a better
understanding of terminal alkene production in Jeotgalicoccus spp. at the metabolome
level.

【背景・目的】S-アデノシルメチオニン（SAM）は生物に普遍的に存在するメチル基供与体である．SAM 依存性メチラーゼを利用した反応には，複雑骨格を有した機能性分子の生合成，修飾に関与するものも多く含まれ，多様な機能性分子の創出が期待されるが，産業応用された事例は未だない．これは，生体内における SAMの再生効率の低さに起因する．SAM の再生には他のメチル基供与体を必要とす
るが，生体内において炭素源の大半は一次代謝に利用されるため，SAM の再生に利用される炭素は少量となる．そこで本研究では，メタノールに由来するメ
チル基を化学量論的に SAM の再生に利用できる組換え大腸菌の創製に向けて，
メタノールデヒドロゲナーゼ（MDH）と O-メチルトランスフェラーゼ（OMT）の共発現株の作成を行った．本株では，MDH と大腸菌内在性酵素の作用により，メタノールに由来するメチル基が逐次的に転移し，SAM 再生とメチル化反応に利用できると期待できる．
【実験手法・結果】
Cupriavidus necator N-1 由来の MDH，および Streptomyces avermitilis MA-4680 由
来の OMT を，温度誘導型の発現ベクターである pRCI に導入した．構築した共発現プラスミドを Escherichia coli BW25113 株に導入し，エスクレチンのスコポ
レチンとイソスコポレチンへのメチル化反応を行った．20 mg-wet cell/mL の菌体，0.2 mM エスクレチン，1 M メタノール，1 mM ATP を混合し，37℃で 16 h反応を行った結果，0.16 mM のメチル化物の生産が確認できた．OMT のみを発現した株では，メチル化物の生産量が 3 分の 1 程度であったことから，メタノー
ルをメチル基供与体とした SAM 再生経路が機能していることが示唆された．
また ATP の代わりに 10 mM のグルコースを添加した場合でもメチル化反応が可能であり，メタノール存在下でもグルコースを用いた ATP 生産が行われていることが示唆された．

Metabolic profiling of three terminal alkene producing Jeotgalicoccus spp.
during different growth phase

Construction of a S-adenosylmethionine regeneration pathway using
methanol as a methyl donor○Filemon Jalu N Putra, Sastia Prama Putri, Eiichiro Fukusaki(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Kenji Okano1, Haruka Nagata1, Shota Inoue2, Kohsuke Honda1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

Jeotgalicoccus, terminal alkene, metabolomics

Key words
coli

S-adenosylmethionine, methanol, methylation reaction, Escherichia

2Kp09

Global metabolite changes during laboratory evolution of
1-butanol producing Escherichia coli grown in minimal
media

2Kp11

高温域での NAD+濃度の安定化と耐熱性酵素を用いた物
質生産反応への寄与○Sana Subhan Memon Sakurai1, Sammy Pontrelli2,
Sastia Prama Putri1, James C. Liao2, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ, 2Dept. Chem andBiomol Eng., UCLA)
fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp
Adaptive laboratory evolution (ALE) has become a widely used tool in metabolicengineering to allow for fast strain development and/or improvement. ALE results inaccumulation of beneficial mutations, the effect of which results in fitness
improvement of the strain. The metabolome of a cell is thought to reflect the effect ofgenomic interventions or implementations. Therefore, the effect of the mutations, that
arose during ALE, on the phenotype can be most closely studied using metabolomics.
In this study, we demonstrate the utility of metabolomics for understanding theimproved growth and 1-butanol production in minimal media, acquired as a result ofALE, using an engineered Escherichia coli strain. Comparative metabolic profiling of
the parental and evolved E. coli strain was carried out using widely-targeted IP-RP-LC/
QqQ-MS analysis. Relative intensity of several metabolites, including CoAcompounds, central carbon metabolites, nucleosides and its phosphate derivatives,
were different among the two strains. Overall 44 of the 64 annotated metabolites weresignificantly perturbed suggesting that laboratory evolution of E. coli withheterologous expression of 1-butanol pathway enzymes resulted in global metabolicchanges that allowed for better glucose consumption, growth and production inminimal media.

○谷口 博範, 岡野 憲司, 本田 孝祐（阪大院・工）honda@bio.eng.osaka-u.ac.jp

好熱菌が有する耐熱性酵素は高い安定性をもち高温域でも長時間活性を保つため，これらの酵素を用いた高温域での物質変換は反応速度や冷却コストの面での利点を有する．一方で，多くの酵素反応に必須な NAD+は高温域で安定性が低く，高温で長時間にわたる変換を行う際には，高価な NAD+を随時添加する必要がある．
そこで我々は，好熱菌由来の耐熱性酵素群を用いて，NAD+の熱分解産物であるニコチンアミドと ADP リボースから，NAD+を再合成するサルベージ経路を
in vitro で構築し，高温で NAD+濃度を一定に保つ方法を提示した[1]．これをさらに発展させ，NAD+の再合成経路に必要な 6 つの酵素を共発現する実用性の高いモジュール株を設計・構築した．今回，構築した株から得られた酵素群とNAD+/NADH 依存型の耐熱性酵素による物質生産反応とを組み合わせ，当該モ
ジュール株の有用性を実証する実験を行ったので報告する．
酵素は，各菌体を超音波破砕し，上清を熱処理した後の可溶性画分を回収することで調製した．NAD+/NADH 依存型のモデル反応として，ピルビン酸から乳酸への変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼ及びグルコースからグルコノラク
トンへの変換を触媒するグルコースデヒドロゲナーゼをカップリングした反応を用いた．ピルビン酸とグルコースの初発濃度を 100 mM として変換を行った
結果，NAD+を外部から全く添加しない場合でも，モジュールを加えたときにのみ，24 時間以内にピルビン酸を乳酸に完全に変換することができた（100 mM±0.4 mM）．一方，モジュールを加えなかった場合では，変換速度が時間とともに減少し，24 時間での乳酸への変換は 22.3 mM±0.3 mM にとどまった．
現在は多段階の NAD+/NADH 依存型カスケード反応と組み合わせることでモジュール株の有用性に関するさらなる検証を行っている．
[1] Honda K et al, (2016) Metab Eng, 35: 114-120

Global metabolite changes during laboratory evolution of 1-butanol
producing Escherichia coli grown in minimal media

Stabilization of NAD+ concentration at high temperatures and its
contribution to bioconversion with thermophilic enzymes

Key words
Escherichia coli, metabolomics, adaptive laboratory evolution,
minimal media

Key words
in vitro metabolic engineering, NAD+ salvage synthesis, thermostable
enzyme, L-lactic acid

○Sana Subhan Memon Sakurai1, Sammy Pontrelli2, Sastia Prama Putri1,
James C. Liao2, Eiichiro Fukusaki1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ, 2Dept. Chem and Biomol Eng.,UCLA)○Hironori Taniguchi, Kenji Okano, Kohsuke Honda(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

197

2Lp01

部位特異的変異導入により改変したサリチル酸脱炭酸酵
素によるメチルサリチル酸の生成

2Lp03

INTMSAlign_Angler を用いたニトリラーゼのインシリ
コスクリーニング○石原 真奈, 荒木 優大, 石井 義孝, 桐村 光太郎（早大・先進理工）
kkohtaro@waseda.jp○井上 梨沙 1, 中野 祥吾 2, 篠田 優 1, 浅野 泰久 1（1富山県大・生工研セ, 2静県大・食栄）
asano@pu-toyama.ac.jp【目的】Trichosporon moniliiforme WU-0401 由来 salicylate decarboxylase (EC:4. 1.
1. 91, Sdc) は，常温常圧下の水系反応でサリチル酸の脱炭酸およびフェノール
への炭酸固定を可能にする可逆的な脱炭酸酵素である[1]．演者らは Sdc の活性
中心付近の残基への変異導入により F195Y-Sdc や Y64T-F195Y-Sdc を作製し，pアミノサリチル酸の高収量生産(21.4 g L-1) を達成している[1, 2]．本研究では，
変異体 K23A-Sdc を創製し，メチルサリチル酸の生成について検討した．
【方法および結果】演者らは X 線構造解析をもとに推定された Sdc の立体構造により基質の流入口を見出した．そこで，流入口付近のアミノ酸残基の中でも嵩高い 23 番目の Lys を Ala に置換し，流入口を拡大した変異体 K23A-Sdc を創製した．K23A-Sdc では，Sdc では検出されない o-クレゾールから 3-メチルサリ
チル酸および m-クレゾールから 4-メチルサリチル酸への炭酸固定活性が検出された．一方，Sdc のメチルサリチル酸に対する活性は微弱なため，サリチル酸とフェノールを基質として，Lineweaver-Burk plot を用いて動力学定数を算出した．サリチル酸の脱炭酸反応では Sdc と比較して K23A-Sdc の kcat, kcat/Km がそれ
ぞれ 1.17 倍, 1.13 倍に増大し，フェノールへの炭酸固定反応ではそれぞれ 1.34
倍, 1.44 倍に増大した．以上より，K23A-Sdc では基質の流入口を拡大した変異によって基質の活性中心への進入が容易になり，速度定数(kcat) および触媒定数(kcat/Km) が増大し，脱炭酸反応と炭酸固定反応の両者に関して Sdc と比較して触媒効率が向上したものと考えられる．
[1] K. Kirimura and Y. Ishii, Future Directions in Biocatalysis, 2nd ed. (T. Matsuda,ed.), p. 135-147, Elsevier, London (2017).
[2] S. Ienaga, et al, Bull. Chem. Soc. Jpn., 86, 628-634(2013).

【目的】近年，膨大な遺伝子情報がデータベースに登録されるようになり，その中から有用な遺伝子情報を探索するための新たな方法が求められている．本研
究ではデータベース上から有用酵素を探索することを目的として作成されたプ
ログラムの一つである INTMSAlign_Angler1 を用いて，産業酵素ニトリラーゼを探索した．
【方法・結果】本研究では，α-ヒドロキシニトリルやアミノニトリルから医薬品原料となるカルボン酸を生成するニトリラーゼ AY4875332 に着目し，相同性が低いが，同様の酵素活性を有する新規なニトリラーゼのスクリーニングを行った．先ず，INTMSAlign_Angler を用いて，本酵素の一次構造を基にデータベー
スからニトリラーゼ候補を抽出し，その中からニトリラーゼ AY487533 のアミノ酸配列と 40%~50%の相同性を持ち，かつニトリラーゼとして登録されていな
い 8 種類のニトリラーゼ候補（細菌由来 5 種類，糸状菌由来 3 種類）を選出した．各ニトリラーゼ候補のアミノ酸配列情報より DNA を合成し，大腸菌で発現させたところ，6 種類は可溶性に発現したが，糸状菌由来の 2 種類は不溶性であった．可溶性発現したニトリラーゼ候補にマンデロニトリルを基質として反応させたところ，全ての細菌由来の候補においてマンデル酸を生成する酵素活性を有することを確認した．さらにフェニルグリシノニトリルを基質として反応を行ったところ，全ての細菌由来の候補でフェニルグリシンの生成が確認できた．L-アルギニン酸化酵素 1，L-スレオニン脱水素酵素 1 の例と今回の探索結果を併せて，INTMSAlign_Angler を用いることにより，元の配列より相同性が低くとも目的の活性を有する酵素を効率的に取得できることが分かった．
1. 中野祥吾ら，日本農芸化学会 2017 年度大会講演要旨集 講演番号 3J34p04
2. N. Kawahara, et al, Green Chem., 19, 418-424 (2017).

Methylsalicylic Acid Production by Salicylate Decarboxylase Improved
through Site-directed Mutagenesis

in silico screening of nitrilase by INTMSAlign_Angler○Mana Ishihara, Masahiro Araki, Yoshitaka Ishii, Kohtaro Kirimura(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)○Risa Inoue1, Shogo Nakano2, Suguru Shinoda1, Yasuhisa Asano1(1Biotechnol. Res. Center, Toyama Pref. Univ., 2Sch. Food Nutr. Sci., Univ.
Shizuoka.)

Key words
moniliiforme

reversible decarboxylase, salicylate decarboxylase, Trichosporon

Key words

nitrile, nitrilase, in silico screening, INTMSAlign_Angler

2Lp02

ニトリルヒドラターゼの触媒反応機構解析－シリアル
フェムト秒結晶構造解析に向けて

2Lp04

二置換プロパンジオールの S 体選択的酸化を触媒する微生物の探索○林 英輝 1, 北條 晴佳 1, 松村 洋寿 1, 小川 信明 1, 野村 高志 2,
當舎 武彦 2, 城 宜嗣 3, 野口 恵一 4, 養王田 正文 4, 尾高 雅文 1
（1秋田大院・理工, 2理研・SPring-8, 3兵庫県大院・生命理, 4農工
大院・工）modaka@gipc.akita-u.ac.jp○清水 慈 1, 菊川 寛史 2, 八十原 良彦 3, 伊藤 紀幸 3, 満倉 浩一 2,
吉田 豊和 2
（1岐阜大院・自科技, 2岐阜大・工, 3（株）カネカ）
toyosida@gifu-u.ac.jp【背景と目的】ニトリルヒドラターゼ (NHase)はニトリル化合物を水和してアミドを合成する反応を触媒する酵素である．NHase はバイオ法によるアクリルア
ミドの工業生産に利用され，世界のアクリルアミド総生産量の約 1/2 を占めている．また，近年シアン系廃液のバイオレメディエーションでも注目されている，産業的に極めて重要な酵素である．NHase はシステインスルフェン酸(CysSO-)とシステインスルフィン酸(Cys-SO2-)を配位子に含む特異な非コリンコバ
ルトまたは非ヘム鉄を反応中心とすることから，触媒機構は未だ明らかにされていない．また，鉄型 NHase は暗条件下ではニトロシル化で不活性化し，NOを光解離させることで瞬時に再活性化する性質を持っている．我々はこの光応答性を利用し，触媒反応速度を遅くした変異体で時間分割 X 線結晶構造解析を行うことによって，環状の反応中間体の結晶構造を捉えた．しかし，従来法の時間分割構造解析では時間分解能に限界がある．そこで，我々は，X 線自由電子レーザーによる NHase のシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）を目指して，研究を進めている．
【実験・結果・考察】NHase を発現している Rhodoccous sp. N771 に暗条件で NO
発生試薬を加えて不活性化(NO-NHase)した後，陰イオン交換並びに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより単離精製した．精製 NO-NHase を暗条件下でハ
ンギングドロップ法，バッチ法により結晶化した．これまで，部分的に NO が解離し，Cys-SO-配位子が酸化された構造が得られていたが，NO 発生試薬による不活性化条件を改良することで再現性良く NO-NHase の結晶構造を得られるようになった．また，SFX に用いる大量の微結晶の作成条件をバッチ法により確立した．今後，微結晶による X 線照射実験と SFX 用マトリクス条件の検討を行う．講演では，得られた最新のデータを含めて紹介する．

【背景と目的】
光学活性ヒドロキシカルボン酸は，医薬品，ポリマーの原料として有用な化合物である．プロキラルジオールを酸化して，光学活性ヒドロキシカルボン酸を合成する場合，化学選択性と立体選択性の両方を制御する必要がある．これまでに我々は，一置換プロパンジオールの不斉酸化を触媒する微生物を見出しており，高い光学純度で S 体と R 体のヒドロキシカルボン酸の合成を達成している．一方，二置換プロパンジオールを用いた酵素活性スクリーニングでは，R体を選択的に生産する微生物を発見している．本研究では，二置換プロパンジ
オールを S 体選択的に酸化する微生物の取得を試みた．
【方法と結果】
プロキラルな二置換プロパンジオールである 2-エチル-2-メチル-1,3-プロパンジ
オール（EMPD）を含んだ培地を用いて，不斉酸化を触媒する微生物を土壌サ
ンプルから探索した．単離した微生物の培養液上清を TLC 分析したところ，76
株が EMPD 酸化活性を示した．次に，一方のヒドロキシメチル基のみに作用
し，カルボン酸を生成した 8 菌株を選択した．生成した 2-ヒドロキシメチル-2メチルブタン酸（HMMBA）をキラル HPLC 分析した結果，E2 株では光学純度
は 32.5%ee と低いものの S 体の HMMBA を優先的に生成した．16S rDNA 遺伝
子解析により，E2 株を Agromyces sp. E2 と同定した．Agromyces sp. E2 の培養菌体を用いて基質特異性を調べたところ，EMPD の他に 2-メチル-2 プロピル-1,3プロパンジオールに対して良く作用した．培養条件検討で，E2 のジオール酸化
酵素は誘導酵素であると判明した．菌体を用いた反応では pH 8.0，35℃で最大活性を示した．調製した E2 株の無細胞抽出液で SDS-PAGE を行った結果，酸化反応を触媒する酵素は約 30 kDa のタンパク質であることが示唆された．

Analysis of Reaction Mechanism for Nitrile Hydratase Serial Femtosecond
Crystallography

Screening of microorganisms catalyzing S-selective oxidation of 2, 2 Disubstituted propanediols○Hideki Hayashi1, Haruka Hojo1, Hirotoshi Matsumura1, Nobuaki Ogawa1,
Kushi Nomura2, Takehiko Tosha2, Noritugu Jou3, Keiichi Noguchi4,
Masafumi Yohda4, Masafumi Odaka1(1Grad. Sch. Eng., Sci., Akita Univ., 2RIKEN Spring-8 Center, 3Grad. Sch. Life Sci.,
Univ. Hyogo., 4Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words
SFX, nitrile hydratase, Cys-SO-○Shigeru Shimizu1, Hiroshi Kikukawa2, Yoshihiko Yasohara3, Noriyuki Ito3,
Koichi Mitsukura2, Toyokazu Yoshida2(1Grad. Sch. Eng., Gifu Univ., 2Fac. Eng., Gifu Univ., 3Kaneka corp.)

Key words
Asymmetric oxidation, Alkanediols, Agromyces sp., 2-Ethyl-2methyl-1, 3-propanediol

198

2Lp05

没食子酸脱炭酸酵素によるピロガロールの合成○大江 史花 1, 岡村 佳樹 1, 菊川 寛史 2, 満倉 浩一 2, 吉田 豊和 2
（1岐阜大院・工, 2岐阜大・工）
toyosida@gifu-u.ac.jp

2Lp07

ラン藻 Synechocystis sp. PCC 6803 の酵素フマラーゼ(FumC)の生化学解析及び機能改変○片山 徳賢, 小山内 崇（明治大・農）tosanai@meiji.ac.jp【目的】ピロガロールは医薬品合成中間体などに幅広く用いられている．ピロガ
ロールの合成法として，再生可能資源であるタンニン酸を出発原料に用いた，(1)加水分解による没食子酸の生成，(2)没食子酸の脱炭酸が知られている．酵素
合成法では，(1)の反応にタンナーゼ，(2)の反応に没食子酸脱炭酸酵素の利用が考えられる．しかし，これまでに報告されている没食子酸脱炭酸酵素は，酸素感受性が強く失活しやすい欠点がある．我々は高活性な没食子酸脱炭酸酵素活性を示す微生物を探索し，高活性菌 Rahnella sp. Y77 を見出してきた．近年，乳酸菌由来の没食子酸脱炭酸酵素遺伝子(lpdC）の組換え体が報告されたが，活性が低いという問題がある．そこで，Y77 株を用いて没食子酸からのピロガロー
ル合成を検討した．また，没食子酸脱炭酸酵素遺伝子を導入した組換え体の作製とピロガロールの高効率合成を進めた．
【方法と結果】Y77 株の無細胞抽出液を調製し，没食子酸脱炭酸酵素の安定性を評価した．4℃で 6 日間の保存後においても細胞破砕直後の活性と同程度の活性を示し，酸素感受性が低く安定な酵素であると判断した．Y77 株の休止菌体によるピロガロール合成の反応条件を検討したところ，最適温度および pH は50℃，pH 4.8 であった．リン酸緩衝液中で 250 mM 没食子酸を用いて菌体反応を行った結果，30 分後に変換率 100%で，31.5 g/L のピロガロールが蓄積した．
Y77 株の全ゲノム解析データを利用したホモロジー検索により，lpdC と 56％の相同性を示す遺伝子を見出した．組換え体を作製後，休止菌体で活性を評価したところ，微弱な没食子酸脱炭酸酵素活性を示した．そこで，没食子酸脱炭酸
酵素遺伝子の近傍に存在する ORF も導入した組換え体を作製したところ，活性が著しく向上した．

【背景と目的】フマラーゼは，回路内のリンゴ酸とフマル酸の相互変換反応を触媒する酵素である．酸化的に還元力を生成する経路である TCA 回路ではフマル酸からリンゴ酸が生成されるが，還元的反応ではリンゴ酸からフマル酸が生成される．モデルラン藻である Synechocystis sp. PCC 6803 のフマラーゼ（以後SyFumC と表記）の生化学的特徴については報告がない．そこで，本研究では，
SyFumC の生化学解析とアミノ酸残基の改変による機能改変を試みた．
【方法】GST タグを付加した SyFumC を Escherichia coli を用いて発現させ，回収した E. coli の細胞破砕液からアフィニティークロマトグラフィーによって
SyFumC の精製を行った．分光光度計(UV-1850, 島津製作所)を用いて，フマル酸の波長 250 nm における吸収の減少及び増加を測定することで，酵素活性を測定した．他のシアノバクテリアとの FumC のアミノ酸配列の比較から，活性部位周辺において特徴的なアミノ酸残基を決定し，この 314 番目のアラニンを変換したタンパク質である SyFumC_A314E を作製し，同様に酵素活性を測定した．
【結果と考察】SyFumC の生化学解析から至適温度及び至適 pH は 30℃，pH 7.5
であるとわかった．また，酸化的方向及び還元的方向の Km はそれぞれ 0.306
mM，0.928 mM となり，還元的方向の基質親和性が低いということが分かった．また，kcat/Km はそれぞれ 195.1，38.5 s-1 mM-1 となった．SyFumC_A314E では至適温度及び至適 pH は違いがほとんど見られなかったが，酸化的方向および還元的方向の km においてそれぞれ 0.203 mM と 0.359 mM となり，還元的方向で基質親和性がおよそ 2.6 倍に上昇したことが分かった．しかし，各 kcat/Km
は 118.8 と 25.6 s-1 mM-1 となり，kcat が低下したことが分かった．
以上より，今回改変した活性部位近傍部位のアミノ酸残基は基質親和性に重要な残基であると考察される．

Synthesis of pyrogallol using gallic acid decarboxylase

Biochemical characterisation Fumarase C properties from a unicellularcyanobacterium demonstrates substrate specificity altered by an amino acidsubstitution.

○Fumika Oe1, Yoshiki Okamura1, Hiroshi Kikukawa2, Koichi Mitsukura2,
Toyokazu Yoshida2(1Grad. Sch. Eng., Gifu Univ., 2Fac. Eng., Gifu Univ.)○Noriaki Katayama, Takashi Osanai(Sch. Agric., Meiji Univ.)

Key words

pyrogallol, gallic acid, decarboxylase, Rahnella sp.

Key words

2Lp06

微生物酵素による α 置換マロン酸ジエステルの立体選択
的加水分解

2Lp08

○菊川 寛史 1, 鵜飼 文広 2, 村上 陽亮 2, 川端 潤 3,4, 三宅 良磨 3,
満倉 浩一 1, 吉田 豊和 1
（1岐阜大・工, 2岐阜大院・工・生命工学, 3三菱ケミカル株式会
社, 4株式会社エーピーアイコーポレーション）
kikukawa@gifu-u.ac.jp

cyanobacteria, fumarase, Synechocystis, enzyme activity

ボトリオコッセン生合成経路のプロダクト特異性改変○多田 和樹, 坂本 康二, 河合 繁子, 斎藤 恭一, 梅野 太輔（千葉大院・融合）
umeno@faculty.chiba-u.jp【背景】 α,α-二置換マロン酸モノエステルは，四級炭素の合成ブロックとして有用であり，医薬品合成などに利用される．光学活性マロン酸モノエステルの酵
素合成法として，ブタ肝臓由来エステラーゼによる不斉加水分解が報告されているが，アイソザイムが存在するため，反応性や立体選択性が不安定になるという課題がある．本研究では，汎用性の高い立体選択的な微生物エステラーゼの発見と，光学活性マロン酸誘導体の酵素合成法の開発を目指した微生物酵素の特徴解析を行った．
【方法・結果】立体障害の大きな置換基をもつ α 置換マロン酸類を炭素源として集積培養を行い，土壌サンプルから計 42 株のエステラーゼ活性菌を単離した．なかでも，ジエチルマロン酸ジエチル（DEDEM）を資化する Rhodococcus
sp. D32 は，プロキラルマロン酸エステル類に対しても活性を示した．D32 株の最適培養条件を決定した後，調製した休止菌体を用いて 10 mM DEDEM 及び 10mM ベンジルマロン酸ジエチル（DEBM）の加水分解を経時的に観察した．その結果，96 時間の反応では，DEDEM に対してモル変換率 36.4%である一方，
DEBM に対しては 12 時間の反応で 100%の変換率を示した．D32 株は 2-エチ
ル-2-メチルマロン酸ジエチル（DEMM）に対する反応性が高いことから，DEMM
を基質として用いて酵素活性を評価した．D32 株の無細胞抽出液を硫安分画，
各種カラムクロマトグラフィーに供した結果，収率 57%で D32 株由来エステ
ラーゼを単離精製した．ゲルろ過クロマトグラフィーにより，本酵素は分子質
量 36 kDa のモノマー酵素であることが明らかとなった．精製酵素を用いて特徴解析し，基質特異性を調べた結果，α 位にメチル基；エチル基；イソプロピル基をもつ一置換ジエステルに対して高い活性を示した．また，DEMM の加水分
解生成物をキラル HPLC 分析したところ，＞ 99 % ee と高い光学純度を示した．

【背景と目的】微細藻類 Botryococcus braunii の蓄積するボトリオコッセン (Bo)は石油代替燃料や保湿剤，特殊潤滑油の前駆体として注目を集めている．これ
らの生合成酵素は，スクアレン合成酵素（SQS）やカロテノイド合成酵素（CrtM,
CrtB）と同一の祖先から分岐したと推察される．これら近縁酵素がそれぞれどのようにして似た化合物を作り分けているのかを明らかにできれば，鎖長や局所構造にさまざまなバリエーションをもつ炭化水素分子群を，自由に作ることができると期待される．
ボトリオコッセンは，ファルネシル二リン酸 (FPP) の 2 分子縮合反応による
presqualene diphosphate (PSPP)合成を経る，二酵素反応により得られる．以前我々は，PSPP→Bo を触媒する酵素，SSL3 に多数の遺伝子変異を導入し，単独で二つのステップを触媒する能力を賦与することに成功した．本研究では，B. braunii
由来のボトリオコッセン合成酵素を実験室内で漸進的に「進化」させ，SQS,
CrtM, CrtB 同様の機能を持つ酵素へと作りかえることを試みた．
【方法】単独でスクアレン合成ができる SSL3 変異体（Squalane Synthase-Like
SSL3, SSLSSL3）にランダム変異を導入し, フィトエンデサチュラーゼ(CrtI)の共発現下，色素を蓄積するクローンを探索した．得られた変異体を単離し，遺伝型および細胞機能を解析した．
【実験と結果】第一反応を回復した「2 ステップ型」SSL3 変異体は，Bo を合成
せず，Sq のみを与える．この SSLSSL3 を親としてランダム変異の導入→スクリーニングを行ったところ，カロテノイド前駆体型のプロダクト（phytoene,
diapo-phytoene）を合成できる変異体が得られた．本発表では，得られた CrtBLike SSL3（CBLSSL3），CrtM-Like SSL3（CMLSSL3）変異体の性質に加え，第を担う SSL1 について行った同様の試みについても報告する．
1 反応（FPP→PSPP）

Stereoselective hydrolysis of diethyl malonates by microbial enzyme

Directed evolution of botryococcene biosynthetic pathways for alteredproduct specificity○Hiroshi Kikukawa1, Fumihiro Ukai2, Yosuke Murakami2, Hiroshi Kawabata3,4,
Ryoma Miyake3, Koichi Mitsukura1, Toyokazu Yoshida1(1Fac. Eng., Gifu Univ., 2Dept. Biomol. Sci., Grad.sch.Eng.,Gifu Univ., 3Mitsubishi
Chemical Corp., 4API Corp.)

Key words

asymmetric hydrolysis, hydrolase, Diester, Rhodococcus○Kazuki Tada, Kouji Sakamoto, Shigeko Kawai, Kyoichi Saito, Daisuke Umeno(Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ.)

Key words

isoprenoid, triterpenoid, synthetic biology, bioenergy

199

2Lp09

変異解析によるラン藻由来アルカン合成関連酵素の機能発現に重要な部位の同定

2Lp11○工藤 恒, 野村 匡志, 林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）arai@bio.c.u-tokyo.ac.jp

Identification of key residue determining productregioselectivity of Medicago truncatula beta-amyrin C30oxidase○Much Zaenal Fanani1, Ery Odette Fukushima1, Satoru Sawai2,
Kiyoshi Ohyama2,3, Hikaru Seki1, Kazuki Saito2,4, Toshiya Muranaka1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2RIKEN CSRS.,
3
Dept. Chem. Mat. Sci., TITECH., 4Grad. Sch. Pharm. Sci., Chiba
Univ.)
muranaka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

ラン藻はアシル ACP 還元酵素（AAR）とアルデヒド脱ホルミル化オキシゲナー
ゼ（ADO）によって，主に軽油に相当する炭化水素（C15, C17）を合成でき
る．AAR はアシル ACP（Cn）をアルデヒド（Cn）に還元し，ADO はアルデヒ
ドを炭化水素（Cn-1）に変換する．AAR，ADO を大腸菌内で共発現させると炭化水素を合成できることから，AAR，ADO は炭化水素合成に必須である．
しかし活性が非常に低いため，産業に利用するには AAR，ADO の高活性化が重要である．AAR は立体構造が未知であり，機能発現に重要なアミノ酸部位などについて未解明な部分が多い．そこで本研究では，変異解析により AAR の活性などに重要な部位の同定を目指した．触媒活性部位である C294 での飽和変異は全て活性を喪失した．また，NADPH 結合部位と推測される GXXGXXG
モチーフのグリシンをアラニンに置換すると活性が大幅に低下した．これらの残基は AAR の活性に必須と考えられる．一方，C294 以外の 6 つのシステイン
残基を全て別のアミノ酸に置換すると活性は 8 割ほど保持したが，構造が不安定化した．次に，様々なラン藻由来 AAR の活性を比較した以前の我々の結果を利用し，ラン藻 PCC7336 由来 AAR（低活性型，C16 アルデヒドを多く合成）のアミノ酸配列をラン藻 PCC7942 由来 AAR（高活性型，C18 アルデヒドを多く合成）のアミノ酸配列に近づけるように，非保存部位 40 箇所において 1 アミノ酸置換変異を導入した．その結果，7336 AAR の活性と可溶性発現量をそれぞれ向上させうる部位を同定できた．さらに，これら変異の同時多重導入により，基質特異性を保ったまま C16 アルデヒド合成量を著しく増加させた 7336
AAR 変異体の創出に成功した．この AAR 変異体を ADO と同時に用いれば C15
アルカンを多く合成できるため，用途に応じた炭素数の異なるバイオ燃料生産に応用可能である．

Triterpenes are a large structural diverse group of specialized metabolites with wide
range of application. Cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) are believed to be
essential for producing triterpene chemodiversity. Beta-amyrin C30-oxidase waspreviously identified from Glycyrrhiza uralensis as an important enzyme inglycyrrhizin aglycone biosynthesis. Increase of glycyrrhizin aglycone production inengineered yeast was achieved by using beta-amyrin C30-oxidase homolog from
Medicago truncatula. Still, the underlying mechanism of its product regioselectivity ispoorly understood. Here, we identified amino acid residues responsible for productregioselectivity of beta-amyrin C30-oxidase. In M. truncatula, C30-oxidase gene isfound in a cluster with other homologs on chromosome. We selected six amino acidresidue candidates located in putative substrate recognition sites of these clusteredgenes. Site-directed mutagenesis analysis showed that, two residues, 149 and 398 are
important for product regioselectivity. Further investigation in beta-amyrin C30oxidase natural variants revealed that combination of amino acid residues Leu/Ile149
and Leu398 is more favorable in producing beta-amyrin C30-oxides. This study
revealed key amino acid residues in determining beta-amyrin C30-oxidase productregioselectivity useful in production of valuable triterpene compounds.

Identification of residues essential for the function of a cyanobacterial
enzyme related to alkane biosynthesis

Identification of key residue determining product regioselectivity of
Medicago truncatula beta-amyrin C30-oxidase○Hisashi Kudo, Masashi Nomura, Yuuki Hayashi, Munehito Arai
(Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo)○Much Zaenal Fanani1, Ery Odette Fukushima1, Satoru Sawai2, Kiyoshi Ohyama2,3,
Hikaru Seki1, Kazuki Saito2,4, Toshiya Muranaka1(1Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2RIKEN CSRS., 3Dept. Chem.
Mat. Sci., TITECH., 4Grad. Sch. Pharm. Sci., Chiba Univ.)

Key words
engineering

acyl-ACP reductase, cyanobacteria, alkane biosynthesis, enzyme

Key words
triterpene, product regioselectivity, cytochrome p450 monooxygenase,
Medicago truncatula

2Lp10

細胞内酵素活性の可視化を利用したアシル ACP 還元酵
素の高活性変異体のハイスループットスクリーニング

2Mp01○荒井 良仁 1, 長尾 達彦 2,4, 藤原 卓人 3, 八木 寿梓 3, 鈴木 宏和 3,
大城 隆 3（1鳥取大院・持社創生・工, 2鳥取大院・工, 3鳥取大・工, 4日本
ジッコウ）
ohshiro@bio.tottori-u.ac.jp○林 勇樹, 新井 宗仁（東大院・総合文化）arai@bio.c.u-tokyo.ac.jp

微生物の生成するアルカン（軽油相当）は，石油を代替するバイオ燃料の 1 つとして注目されている．2010 年に，ラン藻のアルカン合成に関わる 2 つの酵
素，アシル ACP 還元酵素（AAR）とアルデヒド脱ホルミル化オキシゲナーゼ（ADO）が同定され，遺伝子組換え微生物を利用したアルカン合成が可能となった．AAR は脂肪酸合成経路の中間産物であるアシル ACP を基質としてアルデヒドを生成し，ADO はこれをアルカンへと変換する．しかし，AAR の活性は非常に弱いため，微生物を利用したアルカン生産を実用化するには，AAR の高活性化が必要不可欠である．AAR の活性を調べるためには，大腸菌内で AARを発現し，AAR により精製したアルデヒドを菌体と培養液から抽出し，ガスク
ロマトグラフ質量分析計（GC-MS）により定量という多段階プロセスを要す
る．そのため，多数の変異体 AAR の活性を評価するには，多くの時間と労力を要した．そこで，発表者は大腸菌内での AAR によるアルデヒド生成量（AARの活性）に応じて発光する大腸菌を開発した．この活性評価法は，変異体 AARを発現した大腸菌をコロニー（もしくは液体培地）の状態で培養し，外部からその発光量をモニターすることで，変異体 AAR のアルデヒド生成量を非侵襲的に，かつリアルタイムに，多検体同時に評価できる画期的な方法である（昨年の大会で報告）．本研究では，多数の変異体 AAR ライブラリを有する大腸菌を調製し，その中から，この評価法を用いて高発光大腸菌をハイスループット
で選択することにより，高活性変異体 AAR の取得を目指した．大会では得られた高活性な変異体 AAR について報告する．

Luteolibacter algae SW 由来フコイダナーゼ遺伝子のク
ローニングと異種発現【目的】フコイダンとは昆布やワカメなどの褐藻のヌメリ成分に含まれる硫酸化
多糖の一種であり，L-フコースが数千個も繋がった化合物で，平均分子量は約200,000 とされている．フコイダンは血中コレステロール低下作用などの生理活性を持つことが示されており，健康食品分野で現在注目を集めている．
当研究室では，オキナワモズク由来フコイダンにおける生理活性と構造との関連の解明を目的とした研究を行っている．活性と構造の関連解明には，フコイ
ダン低分子化酵素（フコイダナーゼ）の利用が有効であると考え，既にオキナ
ワモズク由来フコイダン資化性菌 Luteolibacter algae H18 からフコイダナーゼ遺伝子を同定し，異種発現に成功している．今回，そのアミノ酸配列情報を基に，H18 株同様オキナワモズク由来フコイダン資化性菌であり，ドラフトゲノム情報が明らかになっている Luteolibacter algae SW からフコイダナーゼ遺伝子を探索し，発現検討を行った．
【方法・結果】SW 株のドラフトゲノム情報に対して，H18 株のフコイダナーゼ(Fct114，MW: 111,720) をコードする遺伝子と相同性の高い領域の検索を行った
ところ，Fct114 と 40%の相同性を示す ORF が一つ見いだされ，その遺伝子産物の分子量は 92,963 であった．本遺伝子をクローニングし，大腸菌で異種発現させ，組換え株の無細胞抽出液を調製した．それを用いてオキナワモズク由来
フコイダンを基質として酵素反応を行ったところ，明らかな低分子化が認められ，目的の酵素活性を持つことが示唆された．
現在，遺伝子が明らかになっているフコイダナーゼは 4 例知られており，それらは全て GH ファミリー 107 に属している．しかし本酵素はそれらと有意な相同性は見られなかったため，GH ファミリー 107 には属さないフコイダナーゼであると考えられた．

High-throughput screening of highly active mutants of acyl-ACP reductase
by visualizing in vivo enzyme activity

Cloning and expression of fucoidanase gene from Luteolibacter algae SW

Key words
alkane biosynthesis, directed evolution, high-throughput screening,bioluminescence

Key words○Yuuki Hayashi, Munehito Arai
(Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo)○Arai Yoshihito1, Nagao Tatsuhiko2,4, Fujiwara Takuto3, Yagi Hisashi3,
Suzuki Hirokazu3, Ohshiro Takashi3(1Dept. Eng., Grad. Sch. Sust. Sci., Tottori Univ., 2Grad. Sch. Eng., Tottori Univ.,
3Fac. Eng., Tottori Univ., 4NipponJikkou Co.)fucoidan, polysaccharide-degrading enzyme, algae

200

2Mp02

グルコマンナン分解細菌の探索およびThermoanaerobacterium thermosaccharolyticum KT13株からのマンナナーゼ精製

2Mp04

コリン型リゾプラズマローゲン特異的ホスホリパーゼ Dの基質認識における Phe211 および Tyr258 の役割○河原 光希 1, 小山 貴之 2, 酒瀬川 信一 3, 村山 和隆 4,
杉森 大助 1,2
（1福島大・共生システム理工, 2福島大院・理工, 3旭化成ファーマ, 4東北大院・医工）
sugimori@sss.fukushima-u.ac.jp

瀧上 和也 1, ○林 秀謙 1,2（1前橋工大院・工, 2前橋工大・工）h-hayashi@maebashi-it.ac.jp【背景と目的】 コンニャクの主成分，グルコマンナンの分解生産物であるマン
ノオリゴ糖はヒトが消化することができないオリゴ糖であり，食物繊維やプロ
バイオティクスとしての機能を有する可能性がある．本研究ではマンノオリゴ
糖生産に利用できる新規酵素の取得を目指し，グルコマンナン分解菌の探索を行った．さらに，単離した KT13 株よりマンナナーゼの部分精製を行ったので合わせて報告を行う．
【方法】 採取した土壌サンプルをコンニャク片を含む培地に添加し，嫌気または好気条件で集積培養を行った．集積培養後，菌株の単離を行った．単離した菌株は再度，コンニャク片の分解を確認した後，16S rRNA 遺伝子配列の決定を行い，菌株の同定を行った．さらに，NBRC の RD 株（83 株）もコンニャク片を分解する菌株のスクリーニングに使用した．最もコンニャク片の分解が早かっ
た菌株についてはコンニャク粉を炭素源とした培地で培養後，培養上清の回収を行い，マンナーゼの精製を行った．
【結果及び考察】 嫌気または好気条件の集積培養より 481 菌株を単離した．RD
株を含め 564 菌株のコンニャク片の分解活性を確認したところ，52 株よりン
ニャク片の分解活性が認められた．これらの菌株のコンニャク片の分解の強さ
を分解時間で比較したところ，KT13 株のコンニャク片を最も早く分解した．
KT13 株を同定したところ，Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum であった．コンニャク粉を炭素源として KT13 株の培養を行い，培養上清よりマンナ
ナーゼの精製を行ったところ，複数のマンナナーゼからなる複合体を形成している可能性が示唆された．

【緒言】プラズマローゲン（Pls）は sn-1 位にアルケニルエーテル結合を持つリン脂質で，軽度認知症や冠動脈疾患（心筋梗塞等）の早期発見バイオマーカーとなることが近年報告されている．我々は，これまでにコリン型リゾプラズマ
ローゲン（LyPlsCho）特異的ホスホリパーゼ D（LyPlsCho-PLD）を見出し，Plsの酵素定量法を確立した．LyPlsCho-PLD はホスファチジルコリンのようなジアシル型リン脂質には全く作用しないことから，その基質認識メカニズムに関心が持たれた．そこで演者らは，基質認識メカニズム解明を目指し，部位特異的変異解析を進めてきた．本発表では，基質結合部位に位置し，基質認識に関与すると予想された芳香族アミノ酸残基 F211, Y258 の点変異体に関する速度論解
析の結果を報告する．
【方法】LyPlsCho-PLD の立体構造モデルおよび基質類似化合物とのドッキング
シミュレーション解析の結果より，基質ヘッドグループあるいは sn-1 位アルケ
ニルエーテル鎖と相互作用する可能性が予想された F211, Y258 に着目し，部位
特異的変異導入とそれら点変異体の速度論解析を行った．F211 と Y258 変異体
を pET-24a/BL21(DE3)を用いて組換え発現させた．得られた変異体については
カラム精製を行い，LyPlsCho，リゾ型血小板因子（Lyso-PAF）に対する基質特異性試験および速度論解析を行った．
【結果と考察】F211 変異体については，Wild Type が本来基質とする LyPlsCho
に対する活性が顕著に低下し，Lyso-PAF に対する活性が増大した．速度論解析の結果，基質特異性を決定づける要因は Km（基質 sn-1 位エーテル鎖の認識）よりむしろ kcat（反応生成物の解離過程）に関与すると結論づけた．現在，Y258
変異体については詳細な速度論解析を進めており，発表では得られた知見について報告する予定である．

Screening of glucomannan degrading bacteria, and purification of
mannanase from Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum KT13.

Role of Phe211 and Tyr258 in substrate recognition of choline
lysoplasmalogen-specific phospholipase D

Kazuya Takigami1, ○Hidenori Hayashi1,2(1Grad. Sch. Eng., Maebashi Inst. Technol., 2Eng., Maebashi Inst. Technol.)Key words

Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, mannanase

2Mp03

メタゲノム由来アルコール脱水素酵素遺伝子の探索とバ
ルキーケトン不斉還元反応への応用○粟谷 晃也, 戸田 弘, 伊藤 伸哉（富山県大・工）nbito@pu-toyama.ac.jp【目的】各種光学活性アルコールは医薬品合成の中間体として用いられている．
Leifsonia sp.S749 由来アルコール脱水素酵素(LSADH)は，各種ケトンを光学活性なアルコールへと還元すると同時に，2-プロパノールを水素供与体として補酵
素 NADH を再生可能な有用酵素である．本酵素に加え，様々な機能を持つ酵素
遺伝子を取得するため，メタゲノムに注目した．我々はこれまでにメタゲノム
DNA を鋳型として直接 PCR を行い，各種有用酵素遺伝子を効率的に取得可能
な S-GAM 法(Screening of Gene-specific Amplicons from Metagenomes)を開発・提唱し，LSADH 類縁酵素遺伝子を取得，解析している 1)．ターゲットとする化合物は医薬品前駆体となる嵩高い置換基を持つケトンであり，従来の酵素では立体選択的な還元が困難であった．本研究では同法を用いて，嵩高い置換基を持
つケトンを効率的に不斉還元できる lsadh 類縁遺伝子(hladh)を環境 DNA から取得することを目指した．
【方法・結果】LSADH 及び SDR(short-chain alcohol dehydrogenase/reductase)のア
ラインメント情報を基に相同性の高い領域を選択し，hladh 遺伝子が増幅されるように縮重 GAM プライマーを設計した．高温発酵中のバーク堆肥より抽出したメタゲノム DNA を鋳型として PCR を行い，目的遺伝子の増幅を試みた．
増幅産物を In-Fusion 法により発現ベクターと融合させ，E.coli JM109 へ形質転換しライブラリーを作製した．コレステロール吸収阻害剤であるエゼチミブの前駆体をターゲット化合物としてスクリーニングを行った結果，本化合物に対して立体選択的に還元活性を示す酵素を複数取得した．この内，より高い立体
選択性と変換率を示したクローンについて酵素精製及び各種ケトンに対する基質特異性や至適温度，至適 pH を検討した．
1) N. Itoh, et al., Appl. Environ. Microbiol. 2014, 80, 6280/Erratum 2016, 82, 61.

Isolation and characterization of alcohol dehydrogenase genes frommetagenomes to develop asymmetric reduction of bulky ketones○Akinari Awatani, Hiroshi Toda, Nobuya Itoh(Fac. Eng., Toyama Pref. Univ.)

Key words
alcoholmetagenome, alcohol dehydrogenase, bulky ketone reduction, chiral○Koki Kawahara1, Takayuki Oyama2, Shin-ichi Sakasegawa3,
Kazutaka Murayama4, Daisuke Sugimori1,2(1Fac. Symbio. Syst. Sci., Fukushima Univ., 2Grad. Sch. Symbio. Syst. Sci.,
Fukushima Univ., 3Asahi Kasei Pharma Corp., 4Grad. Sch. Biomed. Eng., Tohoku
Univ.)
Key words
phospholipase D, substrate specificity, LysoPlasmalogen

2Mp05

超深海性ヨコエビ，カイコウオオソコエビの糖質分解酵素遺伝子の解析○小林 英城 1, 長濱 統彦 2, 荒井 渉 1, 笹川 洋平 3, 梅田 茉奈 3,
林 哲太郎 3, 二階堂 愛 3, 渡部 裕美 1, 小栗 一将 1, 北里 洋 1,
藤岡 勘太郎 4, 木戸 ゆかり 1, 高見 英人 1
（1海洋研究開発機構, 2ノートルダム清心大・食品栄養, 3理研・生命機能, 4神奈川大・工）hidekik@jamstec.go.jp【目的】カイコウオオソコエビは，マリアナ海溝チャレンジャー海淵や伊豆・小笠原海溝，日本海溝の最深部に生息する超深海性ヨコエビである．これまで我々
は，カイコウオオソコエビがセルラーゼを始めとする多糖分解酵素を保持し，深海で沈降植物片を栄養源としていることを報告した 1)．特にセルラーゼは，
セルロースからグルコースとセロビオースを生産する新規酵素であり，天然セルロースの糖化酵素として有用であると考えられた．そこで，本研究では本セルラーゼを含むカイコウオオソコエビの多糖分解酵素のクローニングのため，
その遺伝子情報を得ることを目的とした．
【実験方法】伊豆・小笠原海溝深部海底 (32°12.5766N, 142°08.0411E, depth: 9,450m)よりベイトトラップにて採取したカイコウオオソコエビを用い，多糖分解酵素の活性を測定した．また，凍結ヨコエビ個体をビーズ式破砕機で破砕後，RNeasy lipid tissue kit (QIAGEN, Hilden, Germany) を用いて，RNA 抽出を行った．
抽出した RNA について，Hiseq 2500 (Illumina) を用いて mRNA シーケンスを決定した．得られた mRNA シーケンスデータから，多糖分解酵素を Blast 検索し，相同性から多糖分解酵素遺伝子の情報を得た．
【結果】伊豆小笠原海溝海底よりカイコウオオソコエビ個体は 500 個体以上採取できた．しかし，300 個体以上から RNA の抽出を試みたが，ほとんどの個体でRNA が完全に分解されていた．RNA が比較的良好に保存されていた個体は 2,3個体だった．これらの RNA 試料を用い，RNA シーケンスを行った結果，162,388
本の contig が得られた．また Blast 検索を行った結果，多糖分解酵素遺伝子として 6 contig が検出された．アミラーゼ，β-1, 3 グルカナーゼ，セロビオヒド
ラーゼがそれぞれ 2contig ずつ存在していた．
1) Kobayashi et al. PloS one 7.8 (2012): e42727

Analysis of polysaccharide hydrolase genes of the hadal zone amphipods

Hirondellea gigas○Hideki Kobayashi1, Takahiko Nagahama2, Wataru Arai1, Yohei Sasagawa3,
Mina Umeda3, Tetsutaro Hayashi3, Itoshi Nikaido3, Hiromi Watanabe1,
Kazumasa Oguri1, Hiroshi Kitazato1, Kantaro Fujioka4, Yukari Kido1,
Hideto Takami1(1JAMSTEC, 2Dept. Foods, Human Nutr. Notre Dame Seishin Univ., 3Adv. Centr.
Comp. Comm, RIKEN, 4Faculty Tech, Kanagawa Univ.)
Key words
polysaccharide-degrading enzyme, cellulase, marine, deep-seaorganism

201

2Mp06

黄麹菌が生産する難消化性澱粉分解酵素の探索 第 2 報○伊藤 俊彦, 笹渕 優衣, 藤田 直子, 橋爪 克己（秋田県大・生資）
toito@akita-pu.ac.jp

2Mp08

納豆菌 B1 由来の L-ラムノースイソメラーゼの諸性質の検討および固定化酵素を用いた D-プシコースから D-ア
ロースの生産○後閑 俊哉 1, 池田 光 1, 鈴木 琢磨 1, 森本 兼司 2
（1香川大・農, 2国際希少糖研究教育機構）
morimoto@ag.kagawa-u.ac.jp[目的]
演者らはこれまでに高温登熟障害米の消化補助酵素の開発を目的とし，強い難消化性を示す変異体米（澱粉合成酵素及び澱粉分枝酵素の二重欠損変異体米：
以下#4019 と表記）を基質に用いた難消化性澱粉分解酵素活性測定法を構築した．この難消化性澱粉分解酵素活性を指標とし，焼酎用白麹菌 (Aspergillus
luchuensis)が生産する耐酸性グルコアミラーゼ，及び#4019 を麹米とし，清酒麹菌 (A. oryzae) で製麴した麹に含まれる α-アミラーゼとグルコアミラーゼの混合
酵素に強い難消化性澱粉分解活性を見出し報告した．今回新たに難消化性澱粉
分解に α-グルコシダーゼの強い関与が認められたので報告する．
[方法]#4019 及び日本晴を 70%精米したものを原料米とし，清酒用麹菌 (No. 5 : 秋田今野商店) を用いて 31℃, 湿度 90% で 24 時間麹菌を生育した後，手入れを行いその後 38℃, 湿度 85% で 22 時間生育し，出麹とした．得られた麹から 0.5% NaClを含む酢酸緩衝液で酵素を抽出した．酵素活性は難消化性澱粉分解活性測定法
及び糖化力分別定量キット（キッコーマンバイオケミファ）により測定した．
酵素精製は陰イオン交クロマトグラフィー (Syncropak AX300 : Eperogen) 及びゲ
ルろ過クロマトグラフィー (TSK gel G3000SW : 東ソー) を用いた．
[結果]
日本晴を原料米とした麹酵素と#4019 を原料米とした麹酵素を比較すると#4019
を原料米とした麹酵素において顕著な α-グルコシダーゼ活性の上昇が認められ，両麹酵素を用いた蒸米消化試験では#4019 を原料米とした麹酵素で高い難消化性澱粉分解活性と共に，顕著なイソマルトースの生成が認められた．

【背景と目的】枯草菌（Bacillus subtilis）は L-ラムノースイソメラーゼ（L-RhI）を発現することが報告されているが，類縁菌である納豆菌（B. subtilis natto）においては未だ詳細な報告はない．そこで納豆菌由来の L-RhI が枯草菌由来の酵素と違いがあるのか，また希少糖生産に応用できるかについて検討することを本研究の目的とした．
【方法】市販の納豆菌株を購入し，そこから当研究室で納豆菌 B1 株を単離した．本菌を 1％L-ラムノースを含む LB 培地で培養した．回収した菌体から超音波処理により粗酵素を抽出し，硫安分画により粗精製した後，L-RhI 活性画分を常法により L-RhI を精製した．本酵素を SDS-PAGE およびゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーに供して分子量を測定した．精製酵素を用いて至適 pH，至適
温度，熱安定性，基質特異性を測定した．また，ポリエチレングリコール 6,000
により部分精製した L-RhI を陰イオン交換樹脂 HPA25L に結合させ，得られた固定化酵素を 1％の D-プシコース溶液と反応させ，反応液を HPLC で分析した．
【結果と考察】精製酵素は比活性 49.2 U/mg，精製度 150 倍，収率 0.06％で得られた．ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの結果から本酵素の分子量は約 86,000であることが分かった．SDS-PAGE による本酵素の単量体の分子量は約 45,000であったことから本酵素はホモ 2 量体であると推測された．報告されている枯草菌由来の L-RhI はホモ 4 量体であるため，納豆菌由来の本酵素とはサブユニッ
ト構造が異なることがわかった．本酵素の至適 pH はトリス-塩酸緩衝液 pH
8.5，至適温度は 60℃であった．L-ラムノースへの活性を 100％としたとき L-リ
キソース，D-リボース，L-マンノース，D-アロースに対してそれぞれ 24.7％，
5.9％，3.3％，2.5％の相対活性であった．固定化酵素を用いて D-プシコースから D-アロースが生産され，その平衡比は 66：34 であった．

Resistant starch digestive enzyme investigation form Aspergillus oryzae.
Second Report

Characterization of L-rhamnose isomerase from Bacillus subtilis natto B1
and its application of D-allose production from D-psicose○Toshihiko Ito, Yui Sasabuchi, Naoko Fujita, Katsumi Hashizume(Dept. Bioresour. Sci., Akita Pref. Univ.)○Toshiya Gokan1, Hikaru Ikeda1, Takuma Suzuki1, Kenji Morimoto2(1Fac. Agric., Kagawa Univ., 2International Institute Rare sugar Res. Educ)

Key words

resistant starch, alpha-glucosidase

Key words

2Mp07

Shinella sp. NN-6 が有する 2 種のケトース 3-エピメラー
ゼ遺伝子のクローニングと発現した酵素の諸性質

2Mp09○鈴木 琢磨 1, 池田 光 1, 堀 玄澄 1, 森本 兼司 2
（1香川大・農, 2国際希少糖研究教育機構）
morimoto@ag.kagawa-u.ac.jp

Bacillus subtilis natto, L-rhamnose isomerase

Pseudomonas 属細菌におけるアコニット酸イソメラーゼの構成的生産○滝口 有沙, 小田 祐之亮, 吉岡 育哲, 桐村 光太郎（早大・先進理工）
kkohtaro@waseda.jp[背景と目的]
希少糖 D-プシコースは食後血糖値上昇抑制作用を示すことが報告されており世界的に注目されている．当研究室ではこれらを微生物由来のケトース 3-エピメ
ラーゼ(K-3E)を用いて生産している．K-3E については世界中で多くの報告がなされているが，より希少糖生産に適した K-3E の探索はいまだに続けられている．当研究室が所有する微生物 Shinella. sp NN-6 はカーボンカタボライト抑制を受けない K-3E を実用レベルで発現する唯一の微生物である．NN-6 株は報告されている K-3E と類似した遺伝配列を複数有することが分かっており，本研
究では 2 種の K-3E 類似遺伝子を大腸菌で発現させ，その諸性質を検討比較す
ることを目的とした．
[方法]
NN-6 株のゲノム配列から，既知の K-3E に類似する 2 種の遺伝子(それぞれ K-3E,
K-3Eβ 遺伝子とする)を大腸菌で発現させるために合成 DNA を作製した．この合成 DNA を pQE-60 ベクターに連結し Escherichia coli JM109 を形質転換させた．この組換え大腸菌から常法によりそれぞれのタンパク質を調製した．菌体を超音波で破砕したのち，その上清に金属，熱処理を施したのち，硫安分画により粗精製タンパク質を得た．粗精製タンパク質をさらに種々のカラム処理を施すことにより精製し，両者の諸性質を検討した．
[結果と展望]K-3E, K-3Eβ はともに D-プシコースに対して K-3E 活性を示すことを確認した．
精製酵素の SDS-PAGE から単量体の分子量はともに約 38 kDa であること，ゲルろ過クロマトグラフィーにより多量体の分子量もともに 75 kDa であることが分かり，これらの酵素はいずれも二量体を形成することが明らかとなった．本
研究より NN-6 株は複数の K-3E を同時に発現する可能性が示唆された．このような微生物は今までに例がなく，今後さらに詳細な検討を行うことにより本菌における K-3E ファミリーの発現機構の解析を進める必要がある．

【背景・目的】アコニット酸イソメラーゼ (EC 5.3.3.7；以下 AI) はトリカルボン
酸回路中間体である cis-アコニット酸と trans-アコニット酸 (tAA) を異性化する酵素である．AI 活性は一部の植物や Pseudomonas 属細菌に検出されているが，その酵素的諸性質に関する知見は乏しかった．そこで，演者らは，tAA 資化性菌 Pseudomonas sp. WU-0701 由来 AI (PwAI) の精製により酵素的諸性質を明らかにし，さらにその遺伝子を同定した[1]．また，AI 遺伝子を高発現させた大腸菌細胞を生体触媒として利用し，クエン酸から tAA を生産することに成功している[2]．本研究では，AI 活性を示す Pseudomonas 属細菌における増殖と AI 活
性の関連性について考察した．
【方法・結果】Pseudomonas sp. WU-0701 は tAA 資化性菌として土壌より取得され，当該菌株は AI 活性を示す[1]．PwAI のアミノ酸配列との相同性検索を行ったところ，一部の推定 ABC 輸送体基質結合タンパクと高い相同性が認められ，と く に Pseudomonas oryzihabitans NBRC 102199 由 来 の 推 定 上 遺 伝 子 産 物(WP_027599585.1) に 90% の相同性が見出された[1]．そこで，WP_027599585.1
をコードする遺伝子を大腸菌で発現させて活性試験を行い，AI 活性を示すことを明らかにした．また，NBRC 102199 株は，tAA を唯一の炭素源とする培地で増 殖 が 認 め ら れ た (40 時 間 で OD660 ＞ 1.8) ． さ ら に ， WU-0701 株 お よ び
NBRC102199 株をグルコース，クエン酸，および tAA を炭素源として培養し AI
活性を測定したところ，炭素源や培養時間に関わらず AI 活性が細胞内に検出された．以上より，WU-0701 株や NBRC 102199 株では AI は構成的に生産される酵素であることを明らかにした．
[1] K. Yuhara, et al., FEBS J., 282, 4257-4267 (2015). (Editor’s choice.)[2] K. Koboyashi, et al., Chemistry Select, 6, 1467-1471 (2016).

Cloning and characterizatin of two ketose 3-epimerase genes from Shinella
sp. NN-6

Constitutive Production of Aconitate Isomerases in the Bacteria Belonging
to the Genus Pseudomonas○Takuma Suzuki1, Hikaru Ikeda1, Gencho Hori1, Kenji Morimoto2(1Fac. Agric., Kagawa Univ., 2International Institute Rare sugar Res. Educ.)

Key words

Shinella sp. NN-6, ketose 3-epimerase○Arisa Takiguchi, Yunosuke Oda, Isato Yoshioka, Kohtaro Kirimura(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

aconitate isomerase, trans-aconitic acid, Pseudomonas

202

2Mp10

Xanthomonas campestris WU-9701 由来のグルコース転移酵素を利用した alkyl α-glucosides の選択的生産

2Np01○合田 亮 1, 伊藤 みさご 1, 星 英之 2, 倉橋 健介 3, 吉原 静恵 4,
徳本 勇人 4（1阪府大院・工, 2阪府大院・人社, 3阪府大高専, 4阪府大院・理）
tokumoto@chemeng.osakafu-u.ac.jp○渡邉 理沙, 恩田 裕, 中里 美穂, 石井 義孝, 桐村 光太郎（早大・先進理工）
kkohtaro@waseda.jp【目的】Xanthomonas campestris WU-9701 由来のグルコース転移酵素(XgtA)は αglucosidase (EC 3.2.1.20)に分類され，マルトースを糖供与体として，アルコール性やフェノール性-OH 基にグルコースを転移し，マルトオリゴ糖の副生なく目的の α-glucoside を選択的に合成可能である[1,2]．演者らは，XgtA について酵
素的性質を明らかにし，遺伝子クローニングと大腸菌における高発現にも成功している[3]．一方，ethyl α-glucoside (α-EG)は日本酒に約 4g/L 含有され，整肌作用や保湿作用を有し化粧品素材としての用途がある．しかし，酵素的合成法
ではオリゴ糖などの副生があり，既往の方法では選択的生産は困難であった．
本研究では，α-EG を含む alkyl α-glucosides の XgtA を利用した選択的生産について検討した．
【結果】精製 XgtA を用い，マルトースを糖供与体，ethanol を糖受容体とした反応による α-EG 生産では，1-batch, 60 h の反応で 42.1 g/L の α-EG 生産に成功した．また，反応で遊離するグルコースによるグルコース転移反応の阻害を見出したため，glucose isomerase (GI)を添加しグルコース濃度を低下させた反応条件を設定した．当該反応条件では，1-batch, 100 h の反応で 61.4 g/L の α-EG 生産を達成した．さらに，本反応系を用いた C3-C8 の直鎖のアルコール(propanol から octanol)を糖受容体とした反応においても alkyl α-glucosides の生成を TLC 分
析により確認した．

微生物と線虫を用いた 137Cs 汚染土壌に対する新規除染技術の構築[1] H. Nakagawa et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 138-144 (2000).
[2] J. Kurosu et al., J. Biosci. Bioeng., 93, 328-330 (2002).
[3] T. Sato et al., J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 80, 20-27 (2012).

【背景・目的】福島第一原発事故で拡散した放射性物質は，森林や山地などの居住範囲外では未だ残存している．費用対効果の高い微生物による除染方法が注目されているが，微生物を低コストで回収することは難しい．そこで，137Cs を吸収した微生物を線虫に捕食させ，光や熱を避ける習性を利用して土壌から線虫を回収できれば，新たな除染技術の構築に繋がると着想した．本研究では，
寒天培地及び滅菌土壌において，微生物から線虫体内への Cs の移行について検討を行った．
【方法・結果】本実験では，線虫に Caenorhabditis elegans（C. elegans），137Cs 吸収菌に Rhodococcus erythropolis CS98 株（R. erythropolis）を用いた．まず，137Cs
濃度が 1000 Bq/mL となるように調整した培養液中で， 137Cs を吸収させた R.
erythropolis を C. elegans に給餌し，20℃で 9 日間静置培養した．培養後，ガン
マカウンターを用いて，回収した C. elegans から放出されるガンマ線を計測した．その結果，回収した線虫から放出されるガンマ線の検出に成功した．このことから，一度のバッチプロセスにも関わらず，137Cs が R. erythropolis から C.
elegans 体内へ移行したと考えられる．プロセス設計のモデル実験として，C.
elegans 及び CsCl を吸収させた R. erythropolis を寒天培地で 9 日間静置培養した．その結果，R. erythropolis から C. elegans 体内へ 20.1%の CsCl の移行が確認できた．さらに，滅菌土壌で同様に培養したところ，寒天培地より C. elegansの回収効率が低下する土壌であっても，R. erythropolis から C. elegans 体内へ
3.0%の CsCl の移行が確認できた．以上より，初期線虫数や処理回数などの操作因子を最適化することで，Cs 回収量を向上できるのではないかと考えている．

Selective Production of Alkyl α-Glucosides by α-Glucosyl Transfer Enzymeof Xanthomonas campestris WU-9701

Construction of new decontamination technique for 137Cs contaminated soil
using bacteria and Nematodes○Risa Watanabe, Yutaka Onda, Miho Nakazato, Yoshitaka Ishii, Kohtaro Kirimura(Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
WU-9701

2Mp11

alkyl alpha-glucoside, alpha-glucosidase, Xanthomonas campestris

FAD 依存型グルコース脱水素酵素変異体の速度論解析○白井 裕貴 1, 西矢 芳昭 2, 中嶋 義隆 2
（1摂南大院・理工, 2摂南大・理工・生命科学）
nakaji@lif.setsunan.ac.jp○Ryo Goda1, Misago Ito1, Hidenobu Hoshi2, Kensuke Kurahashi3,
Shizue Yoshihara4, Hayato Tokumoto4(1Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2Grad. Sch. Humanities and Sustainable Syst.
Sci., Osaka Pref. Univ., 3Osaka Pref. Univ. Coll. Technol., 4Grad. Sch. Sci., Osaka
Pref. Univ.)
Key words
Caenorhabditis elegans, Radioactive substances, Cesium,bioremediation

2Np02

重金属吸収後の植物バイオマスに対する微生物と線虫を利用した重金属分離回収法の構築○岡野 凌一 1, 濵野 樹 2, 倉橋 健介 3, 吉原 静恵 2, 徳本 勇人 2
（1阪府大院・工, 2阪府大院・理, 3阪府大高専）
tokumoto@chemeng.osakafu-u.ac.jp

血糖値の測定などに利用される A .oryzae 由来グルコース脱水素酵素（GDH , EC
1.1.99.10）は，グルコース・メタノール・コリン（GMC）酸化還元酵素ファミリに属し，およそ 62000 のサブユニット分子量を有する 572 残基から構成される単量体酵素として知られている．GDH は，FAD 依存的に β-D-グルコースから δ-グルコノラクトンへの酸化反応を触媒する．このとき還元された FAD は，
ジクロロフェノールインドフェノールといった電子受容体によって再酸化される．一方，同じファミリに属するグルコース酸化酵素（GOX , EC 1.1.3.4）は，同一の還元的半反応を触媒するにもかかわらず，酸素によって FAD が再酸化され，両者は酸化的半反応が異なる．我々は，2 つの酵素の酸素応答性の違い興味を持ち，その分子構造と速度論解析からそのメカニズムを明らかにすることを目的に研究行ってきた．これまでの研究から，pH 6.5 と pH 8.5 条件下での還元型 GDH の結晶構造において，触媒塩基と考えられる His506 が，それぞれ異なるコンホメーションを取ることを見出した．このことから，GDH の至適 pHの 6.5 では，His506 は自身のプロトン化に伴って，FAD のイソアロキサジン環
から遠ざかるようにコンホメーションを変化すると考えられる．今回，pH 6.5
における還元型 GDH の His506 周辺に存在するアミノ酸残基である Leu550 にPCR 法を用いて変異を導入し，L550A と L550V 変異体を作製した．大腸菌 BL21
(DE3) pLysS 株による大量発現から，組換えタンパク質を調製した．精製サンプルを用いた反応速度論解析を行い，その結果について報告する【背景・目的】植物を用いるファイトレメディエーションは，低濃度の汚染地域を対象に広範囲な除染に適している．しかし，重金属を吸収した大量の植物バ
イオマスが廃棄物として発生する．そこで，この植物バイオマスを微生物によって分解し，増殖した微生物が重金属を吸着・吸収し，この微生物を線虫による捕食で回収することができれば，生物濃縮を利用したバイオレメディエ―ショ
ン技術の構築に繋がると考えた．本研究では，嫌気発酵汚泥に重金属を添加して培養し，植物バイオマスの分解挙動，微生物への重金属移行量を解析した．
さらに，汚泥の構成菌叢をメタゲノム解析するとともに，線虫 Caenorhabditis
elegans を使用し，汚泥中の微生物が吸収した重金属の回収試験も行った．
【方法・結果】除染対象の重金属にはカドミウム(Cd)を用いた．嫌気発酵汚泥にでんぷんを植物バイオマスとして加え，さらに Cd を任意の濃度になるように
バイアル瓶に封入し，嫌気条件下で静置培養を行った．培養期間中のバイオガ
ス生成量および，そのときの発酵汚泥に，Cd の有無による変化が見られなかっ
たため，汚泥中の微生物が Cd 耐性を有し，植物バイオマスを良好に分解していることが分かった．続いて，汚泥中の微生物が吸収・吸着した重金属量を逐次抽出法により分画化し，ICP-MS を用いて分析した結果，投与した Cd のうち
約 99%が微生物に吸収，もしくは強固に吸着されることが判明し，Cd は微生物に固定化されていることが分かった．最後に，Cd が移行した汚泥中の微生物を餌として線虫を培養し，線虫が吸収した Cd 量を測定した．その結果，投与線虫数が少ない初期検討ながら，8%の Cd が線虫に回収されていた．今後は，初期線虫数や処理回数を増加させれば，Cd 回収量を増加させることが可能ではな
いかと考えられる．

Kinetic analysis of FAD-dependent glucose dehydrogenase mutants

Construction of heavy metal separatiom recovery method using
microorganisms and nematodes in heavy metal-containing phytomass.

○Yuki Shirai1, Yoshiaki Nishiya2, Yoshitaka Nakajima2(1Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ, 2Dept. Life Sci. Fuc. Sci. Eng., Setsunan
Univ)

Key words

glucose dehydrogenase, flavoprotein○Ryoichi Okano1, Itsuki Hamano2, Kurahashi Kurahashi3, Shizue Yoshihara2,
Hayato Tokumoto2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ., 3Osaka
Pref. Univ. Coll. Technol.)Key words
anaerobic bioremediation, heavy metal pollution, microbialcommunity, nematodes

203

2Np03

自然界からの希土類元素分離を可能とするリン酸基修飾
酵母の開発

2Np05

○木原 摩耶, 奥村 一仁, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）azuma@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp

Development of method for the estimation of phosphate
accumulation in microbes○Ajeeta Anand, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ.Tsukuba)
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【緒言】 希土類元素の需要は年々増加しているが，資源の偏在性から安定供給が難しいという課題を抱えている．海底や温泉水にも希土類元素が含まれているが，その回収は実用には至っていない．我々は，優れた回収方法の開発が課
題解決に繋がると考え，微生物を用いた金属吸着剤に注目し研究を進めてきた．
中でも酵母は自然沈降による分離が容易で，安全性が確保されている等，吸着剤に適した特徴を持つ．この酵母を吸着材料として捉え，リン酸基修飾を加えた酵母の開発を進めている．2014 年度の本大会では，リン酸基の導入により重金属や希土類元素に対してイオン交換樹脂と同程度の吸着が可能となり，さらに酸性溶液で脱離できることを報告した．また，メッキ廃液からの金属回収も可能であること等も報告してきた．本研究では，リン酸基修飾酵母のより詳細な性能を明らかにするため検討を進めた．
【実験方法】 リン酸基修飾酵母は，市販のドライイーストをアルカリ条件下で
Na3P3O10 と 20 時間撹拌することにより作製した．また金属吸着試験は，リン酸基修飾酵母を金属イオン溶液に懸濁した後 10 分間振とうし，その上清を ICPOES で測定することにより行った．
【結果と考察】 吸着能を正確に評価するため，吸着等温式から飽和吸着量を求めた．Langmuir の吸着等温式に対して高い相関が見られ，Cu2+ に対して 1.23
mmol/g dw と算出された飽和吸着量からは，微生物吸着剤としてかなり高い能力であることが示された．また，リン酸基修飾酵母は価数の高い希土類元素を優先的に吸着できる傾向が見られた．そこで Na+や Mg2+等の多くの夾雑物を含む海水を模した溶液から，Dy3+を中心とした希土類元素の選択的な回収について検討した．結果として選択回収が可能であることが分かったため，報告する．

Phosphate removing agents have been implemented to address the issues ofhyperphosphatemia. Here, we employed a microbial approach for phosphate removal.
Screening of phosphate accumulation microbes revealed the 11th strain (L11) and 8th
strain (B8) of Lactobacillus casei JCM 1134 and Bifidobacterium adolescentis JCM
1275, respectively as potential phosphate accumulators. However, current methods formeasuring microbial phosphate accumulation capacities demand amendments inspecificity, cost, and simplicity. The presented method analyzes broth supernatant toindirectly assess the phosphate accumulation capability of cells. Phosphate-deficient
cells were constructed, and phosphate accumulation capabilities were subsequently
assayed by reactions with toluidine blue O. Interfering agents and other metabolic
molecules were negated by taking supernatants from phosphate-containing cells asblanks. In contrast to previous studies, shifts in the first peak of absorbance scans wereinversely related to phosphate concentrations. Validation results were significant (pvalue<0.05). The minimum detectable phosphate concentration for the L11 isolate of
L. casei JCM 1134 and B8 isolate of B. adolescentis JCM 1275 were 1 and 0.3 mg/L,
respectively. The presented method is safer, cheaper, more accurate and rapid than theconventional methods. This method can also be applied for phosphate estimation in
waste water streams, chemical and biological samples with some modifications.

Development of phosphorylated yeast enabling separation of rare earth
elements from natural environment

Development of method for the estimation of phosphate accumulation in
microbes○Maya Kihara, Kazuhito Okumura, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)○Ajeeta Anand, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ.Tsukuba)

Key words

yeast, biosorption, rare earth, metal recovery

Key words
blue ohyperphosphatemia, intestinal bacteria, phosphate estimation, toluidine

2Np04

Lactobacillus casei JCM1134 の二価金属イオンの吸着傾
向の解析

2Np06

Comparative study on adsorption of metal ion in dead
Saccharomyces cerevisiae○遠藤 輪, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

Tu Dang1, Kazuki Honda2, Tuan Anh Do1, ○Masao Kishida2,
Masakazu Furuta1(1Dept. Quant. Rad. Eng. Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2Dept.
Appl. Life Sci. Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)
masyksd@biochem.osakafu-u.ac.jp【目的】
生命活動には多種類の金属が関与しており，その摂取は必須であるが，その一方で摂取する金属の量や種類によっては生物に有害な作用を及ぼす．近年，腸内細菌を用いて，消化管内で有害な金属イオンを吸着除去するコンセプトが登場してきた．しかしながら，腸内環境は土壌や湖沼等の環境と比較すると多くの夾雑物が存在し，これらが拮抗的に働くことで金属イオンの吸着が阻害される可能性がある．従って，腸内細菌の金属イオンの吸着能の有無だけでなく，どのような金属イオンを吸着しやすいのかを明らかにする必要がある．本研究では乳酸菌 Latobacillus casei JCM1134 による 7 種類の 2 価の金属イオンに対する吸着能を比較して，金属イオンに対する吸着親和性を解析した．
【方法と結果】
金属イオンの吸着量は金属イオンを添加した緩衝液に任意の条件で培養した L.
caseiJCM1134 を懸濁させ，懸濁前後の緩衝液中の金属濃度を測定することにより求めた．7 種類の金属イオンのうち，Sr2+や Ba2+の吸着量は L. casei JCM1134の莢膜多糖量と正の相関を示し，吸着部位として莢膜多糖が関与している可能性が示唆された．また，培養 9 h の L. casei JCM1134 が示す最大吸着量を各金属イオン間で比較すると，Cu2+ > Ba2+> Sr2+ > Cd2+ > Co2+ > Mg2+ > Ni2+の順となり，殺菌作用を示した Cu2+を除外するとイオン半径が大きな金属イオンほど吸着されやすいことが明らかになった．この傾向から，L. casei JCM1134 による金属イオンの吸着にはイオン交換メカニズムが大きく寄与していることが推測された．

Metals absorption by dead biomass of Saccharomyces cerevisiae has been studied as
an ideal candidate for the metal treatment in waste waters due to its safety and highefficiency. As the metal absorption process in dead cells is unaffected by nutrient
supply or toxicity of pollutants, it might be more applicable than living biomass in thepractical approach to remove different types of toxic metal contaminated in water. In
this research, we examined the absorbing ability for various metals of lived and deadyeast cells of S. cerevisiae, treated with under toxic level (less than 10 mM) of metals.
The test also carry out at the yeast strains S. cerevisiae BY4741 and IM3, bred from
BY4741, which can grow up in very high concentration of Mn (15mM) and over 4
times more accumulate Mn than BY4741. Dead cell of BY4741 and IM3 was obtainedby autoclaving, drying in oven, or irradiating UV and gamma ray. Dead cells were put
in 1 ml of solution containing Ca2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Cr3+, or Fe2+. Metal absorbanceamount was recorded with reference to the appropriate standard, showing the effect ofdifferent killing conditions to the absorption ability of dead cells. Results from thisexperiment show that the highest absorption of Mn by both strains can be obtained by
autoclaving at 110oC in 5 min. This result also provides the information for the
optimization condition of metal contact and killing procedure. And this study
reconfirmed the passive uptake mechanism also known as surface absorption of metals
in dead yeast cells.

Adsorption preference for divalent metal ions by Lactobacillus casei
JCM1134

Comparative study on adsorption of metal ion in dead Saccharomyces
cerevisiae○Rin Endo, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

bioremediation, biosorption, ion characteristics, lactic acid bacteria

Tu Dang1, Kazuki Honda2, Tuan Anh Do1, ○Masao Kishida2, Masakazu Furuta1(1Dept. Quant. Rad. Eng. Grad. Sch. Eng., Osaka Pref. Univ., 2Dept. Appl. Life Sci.
Grad. Sch. Life Environ. Sci., Osaka Pref. Univ.)

Key words
manganese

Saccharomyces cerevisiae, metal absorption, bioremediation,

204

2Op01

Visualization of methylation index in human colon cancer
tissues using imaging mass spectrometry

2Op03○Nathanael Steven1,2, Keiichi Okano3, Masahiro Aoki4,
Yasushi Kojima4, Marselina I. Tan2, Eiichiro Fukusaki1,
Tomoyoshi Soga5, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Biotechnol., Bandung Inst.
Technol., 3Dept. Gastroenterological Surgery, Kagawa Univ. Hosp.,
4
Aichi Cancer Center, 5Inst. Adv. Biosci., Keio Univ.)
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp

自公転遊星式撹拌技術を活用した組織培養の有用性○小田 彰恭 1, 吉田 春菜 1, 関口 はつ美 1, 柳田 湧太 1, 金子 凜 1,
高宮 良太 1, 野辺 善仁 2, 村松 和明 1
（1電機大院 ・理工, 2(株)大洋技研）
k-muramatsu@mail.dendai.ac.jp

S-adenosylmethionine (SAM) and S-adenosylhomocystein (SAH) are two important
metabolites related to methylation process in living cell, particularly in global genome
methylation of eukaryotic cells. In cancer cells, less genome methylation occurs ascompared to normal cells. Information of SAM and SAH distribution and its
correlation to tissue structure and components can provide insights into methylation
process in cancer cells. We have visualized distributions of SAM and SAH in humancolon cancer tissue from three different patients, each with different stages, using
iMScope TRIO (Shimadzu, Kyoto, Japan). α-CHCA matrix application was done using
manual spraying method. Imaging mass spectrometry (IMS) results showed that SAM
was found to be accumulated specifically in cancer region, whereas SAH was found to
be distributed evenly in cancer and normal region. Therefore, methylation index(SAM/SAH) of cancer region was found to be higher compared to normal regions.
Together with hematoxylin-eosin staining, this information can give better
understanding of cancer genome methylation and also the progression of human coloncancers.

【背景・目的】自家培養軟骨細胞移植術など自家細胞を原料とした再生医療等製品の製造では，限定された採取組織からより多くの細胞を効率よく単離することが求められる．生体組織から細胞を単離するプロセスは，酵素消化を伴い，このとき撹拌・振とう法の違いが細胞の回収効率に大きな影響を及ぼす．そこで本研究では，検体中の粒子に及ぼす物理的ダメージが少ないとされる，撹拌
効率の高い自公転遊星式撹拌技術が，軟骨組織工学において細胞の単離プロセスに有効であるか検討した．
【方法】ラット肋軟骨を約 1mm 片に細断後，37℃条件下にて約 0.4g 相当量の軟骨組織を 0.1 mg/mL リベラーゼ THR（Roche）10mL で 4 時間消化した．このとき，酵素消化のプロセスは 2 群の 50mL 遠沈管で行い（各 n=3），一方は自公転式遊星式撹拌機にて，他方は通常の旋回振とう機にて行った（各 120 rpm）．組織の消化効率は，消化前後の軟骨組織の質重量測定から算出し，単離された生細胞数を比較した．また，それら細胞を初代培養し，細胞の特性を増殖性（DNA定量）と遺伝子発現解析（RT-PCR 法）にて評価した．
【結果・考察】軟骨組織の消化効率および細胞回収効率（「得られた生細胞数」/「消化組織の湿重量」）は，自公転遊星式撹拌群の方がいずれも優れていた．また，自公転遊星式撹拌で単離された軟骨細胞は，増殖性やマーカー分子（SOX9,
ACAN, COLII,等）の発現レベルにおいて旋回振とう法と同等以上であり，一般的手法で単離された細胞の特性との違いは全く確認されなかった．以上の結果
より，細胞に与える物理的ダメージが少ないとされる自公転遊星式撹拌技術がもたらす高い撹拌性は，酵素消化において同一量の組織からより多くの正常細胞を単離することに繋がることが実証された．

Visualization of methylation index in human colon cancer tissues using
imaging mass spectrometry

Utility of a rotation/revolution type agitator for the process of primaryculture○Nathanael Steven1,2, Keiichi Okano3, Masahiro Aoki4, Yasushi Kojima4,
Marselina I. Tan2, Eiichiro Fukusaki1, Tomoyoshi Soga5, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Biotechnol., Bandung Inst. Technol., 3Dept.
Gastroenterological Surgery, Kagawa Univ. Hosp., 4Aichi Cancer Center, 5Inst. Adv.
Biosci., Keio Univ.)
Key words
S-adenosylmethionine, S-adenosylhomocysteine, methylation index,
imaging mass spectrometry

2Op02

原子間力顕微鏡を用いた B 型肝炎感染機構の解明○西田 真一朗 , 竹中 武藏 , 西村 勇哉 , 荻野 千秋 , 近藤 昭彦（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp
1

2

2

1

○Akinori Oda1, Haruna Yoshida1, Hatsumi Sekiguchi1, Yuta Yanagita1,
Rin Kaneko1, Ryouta Takamiya1, Yoshihito Nobe2, Kazuaki Muramatsu1(1Grad. Sch. Sci. Eng. Tokyo Denki Univ., 2Taiyo Giken Co.,Ltd.)Key words

chondrocytes, isolation

2Op04

がん種の異なる細胞間での中心代謝における 13C 代謝フ
ラックス解析

2○上原 ひかる 1, 荒木 千絵 1, 前田 昂亮 1, 岡橋 伸幸 1,2,
松田 史生 1, 髙橋 智聡 3, 清水 浩 1（1阪大院・情報, 2理研, 3金沢大・がん進展制御研）
shimizu@bio.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】B 型肝炎の感染は，B 型肝炎ウイルス(HBV)が肝細胞表層のタンパク質と結合することで引き起こされるが，感染に関与するタンパク質は特定されていない．過去の研究では HBV 側の感染に関与するタンパク質として，L
タンパク質中の PreS1 領域が報告されている．また細胞側の候補として，ヘパ
ラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）やナトリウムタウロコール酸共輸送体（NTCP）が報告されている．従来の研究では細胞内の取り込み後の評価が行われており，細胞へ結合する瞬間の評価は行われていない．そこで本研究では，分子間相互作用の測定が可能な原子間力顕微鏡（AFM）を用いて，細胞とウイルスの結合に焦点を当て，感染機構の解明を目指した．AFM を用いることで，細胞表層に対しナノスケールでのアプローチが可能となり，細胞表層タンパク質との相互作用を定量的に評価することが可能となる．本研究では PreS1 ドメ
インを AFM の探針に修飾し，肝細胞表層タンパク質との相互作用を測定する
ことで，感染機構の解明を目指した．
【実験操作】蛍光プローブと AFM によるアプローチを可能とするため，GFP を融合させた PreS1S2GFP を作製，その後 PreS1S2GFP の発現確認を行った．
PreS1S2GFP の肝細胞認識能力を確認するため，フローサイトメトリー(FACS)を用いて細胞の蛍光強度の解析をおこなった．その後，AFM を用いて相互作用測定を行った．測定系の構築を確認後，受容体候補である HSPG に焦点を当て，感染機構の評価を行った．
【結果と考察】FACS を用いた解析では PreS1S2GFP の肝癌細胞に対する特異的な結合を確認できた．また AFM を用いた測定では，HepG2 表面でより大きな相互作用が観測された．これらの結果から肝細胞表面受容体検出系の構築を確認することができた．またこの系を用いて HSPG を評価し，感染機構に関与する可能性を示唆する結果が得られた．

［背景・目的］13C 代謝フラックス解析は細胞内中心代謝経路の活性や，補酵素の再生消費バランスを推定できる．そこで本研究では，これまで微生物中心代謝の解析に利用されてきた 13C 代謝フラックス解析用いてヒトがん細胞 3 株の代謝フラックス分布を推定することを試みた．がん細胞は，代謝リプログラミ
ングにより正常細胞と異なる特異的な代謝状態を持ち，がんの悪性化や転移に寄与すると考えられている．がん特異的の解明は創薬に有益な情報となることが期待される．そこで，ヒトがん細胞 3 株の代謝フラックス分布を推定し，がん種間での共通性や特異性を代謝フラックスレベルで明らかにすることを目指した．
［結果］ MCF7（ヒト乳がん由来細胞株），HeLa（ヒト子宮頸がん細胞株），
HepG2（ヒト肝がん由来細胞株）を[1-13C]グルコースを含む DMEM 培地で培養し，培地中代謝物濃度を液体クロマトグラフィーで定量した．また細胞内代謝物の 13C 標識割合を GC-MS で測定した．いずれの株でも 13C 代謝フラックス解
析の適用に必要な代謝定常と同位体定常状態を取ることを確認した．そこで，実測した比速度と細胞内代謝物の 13C 標識割合から，細胞内代謝フラックス分布を推定することに成功した．3 株の代謝フラックス分布を比較すると，解糖系とペントースリン酸経路の分岐比はおよそ 9：1 と 3 株間で大きな差はなかった．一方，TCA サイクルに流入するピルビン酸デヒドロゲナーゼの反応の代謝
フラックスは MCF7，HeLa，HepG2 で各 32, 12, 40 mol/100 mol-glucose と株間で大きく異なっていた．また，推定したフラックス分布から NADPH の再生・消費速度を算出したところ，3 株ともにリンゴ酸 NADP+オキシダーゼが触媒する反応が NADPH の主な供給源であることが推測された．

Elucidation of hepatitis B infection mechanism by Atomic force microscopy

Comparison of central metabolic fluxes of cancer cell lines○Shinichiro Nishida1, Musashi Takenaka2, Yuya Nishimura2, Tiaki Ogino1,
Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

Atomic Force Microscopy(AFM), Hepatitis B virus(HBV)○Hikaru Uehara1, Chie Araki1, Kousuke Maeda1, Nobuyuki Okahashi1,2,
Fumio Matsuda1, Chiaki Takahashi3, Hiroshi Shimizu1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2RIKEN, 3Cancer Res. Inst., Kanazawa Univ.)

Key words

C-metabolic flux analysis, Cancer metabolism

13

205

2Op05

公共データベースを利用した脱分化脂肪細胞における肝細胞分化制御因子の探索

2Op07○萩原 玲子, 沖 嘉尚, 加野 浩一郎（日大院・生資科）
kano.kouichirou@nihon-u.ac.jp

慢性血液透析療法における心筋細胞拍動能の数理解析○濱田 浩幸 1,2,3（1九大院・農, 2九大院・生資環, 3九大院・シス生科）
hamada@brs.kyushu-u.ac.jp

我々は，成熟脂肪細胞を体外培養すると自発的に脱分化し，線維芽細胞様の脱分化脂肪細胞(DFAT)になることを明らかにしている．また，DFAT は骨芽細胞や骨格筋細胞など間葉系の細胞へと分化するだけでなく，外胚葉に由来する神経細胞へ分化することも明らかにしている．しかし，間葉系幹細胞と類似した特性をもつ DFAT を内胚葉系細胞へ分化させた報告はなく，サイトカインや増殖因子を用いた分化誘導法ではそれらの分化細胞を取得するのは困難であると考えられている．本研究では，網羅的遺伝子発現解析によって DFAT が肝細胞に分化するために必要な核内転写因子を抽出し，肝細胞分化制御因子を同定する目的で行った．マウスの皮下脂肪組織から酵素処理によって単離した脂肪細胞(AC)および DFAT から全 RNA を抽出し，Affymetrix 社の GeneChip を用いてマイクロアレイ解析を行った．肝細胞(HC)および肝臓由来幹細胞(RLSC)のマイ
クロアレイデータは，NCBI の遺伝子発現データベース(GEO)から取得し，統計処理ソフトウェア「R」を用いて正規化を行った．マイクロアレイデータから
核内転写因子を絞 り込むために，PANTHER データベースから取得した”
transcription factor”のアノテーション情報を付加したのち，Absolute call によって遺伝子発現の有無を解析した．さらに，TIBCO Spotfire を用いて発現差のある転写因子を抽出した．その結果，AC および DFAT と比較して，HC およびRLSC で高く発現している 3 つの核内転写因子が抽出され，これらが肝細胞分化制御因子であると推定された．レトロウイルスベクターによって抽出された
核内転写因子を DFAT へ遺伝子導入し，肝細胞分化誘導すると，アルブミンおよびグリコーゲンの合成が認められた．以上の結果から，網羅的遺伝子発現解析により抽出された核内転写因子は DFAT における肝細胞分化制御因子である
ことが示唆された．

「低 Ca2+濃度透析液の使用」【背景と目的】 慢性血液透析療法（HD）において，と「血清と透析液の間の Ca2+濃度の大きな較差」は突然の心停止のリスクを高めることが報告されている（Pun, 2013）．そして，心筋細胞の拍動リズムは細胞内 Ca2+循環動態（Calcium clock: Lakatta, 2009）に，収縮力は細胞質 Ca2+濃度（E-C coupling: Bers, 2002）に支配されることが明らかになっている．これらの知見に基づくと，治療中の血清 Ca2+濃度の低下が心負荷の要因の 1 つであると考えられる．本研究では，電気生理学的数理解析を用いて，HD における血清および間質液の電解質濃度の変動と心筋細胞拍動能の関係を精査し，治療中のCa2+動態が拍動能におよぼす影響を検討した．
【方法】 HD の数理モデル（Gotch, 2010）と電気生理学に基づく心筋細胞の拍動および興奮収縮連関の数理モデル（Hamada, 2012, Rudy, 2011）を統合し，透析液‐血清‐間質液‐細胞内液から構成される HD 中の心筋細胞拍動能を表現す
る数理モデルを構築した．そして，催不整脈評価試験 CiPA initiative: in silico
analysis（Colatsky, 2016）に基づいて，この数理モデルを適用し，本邦で実施されている治療における Ca2+動態および拍動能（拍動リズムおよび収縮力）の推移を評価した．
【結果と考察】HD において，Ca2+濃度 2.5mEq/L の透析液を用いる治療は 3.0mEq/
L の透析液を用いる治療に比して血清および間質液 Ca2+濃度を低下させ，治療中の心筋細胞拍動能を低下させた．そして，Ca2+濃度 2.5mEq/L の透析液を用いる治療において Ca2+濃度 3.5mEq/L の補充液 10mL/min を返血に注液すると，血清および間質液 Ca2+濃度の低下が穏やかとなり，拍動数および収縮力の低下が半減した．以上より，治療中の血清および間質液 Ca2+濃度の低下の抑制が治療中の心負荷軽減に貢献する可能性が示された．

Identification of master regulator genes for hepatocyte differentiation in dedifferentiated fat cells

Mathematical analysis of cardiomyocyte beating on chronic hemodialysis
treatment○Reiko Hagiwara, Yoshinao Oki, Koichiro Kano
(Grad. Sch. Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ.)

Key words

2Op06○Hiroyuki Hamada1,2,3(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ.,
3
Grad. Sch. Syst. Life Sci., Kyushu Univ.)

de-differentiated fat cells, hepatocyte, gene expression analysis

Key words
Cardiomyocyte beating, Hemodialysis, Electrophysiology,
Mathematical analysis

アガロース精密鋳造法と幹細胞分化パターン分析

2Op08○田中 信行 1, 山下 忠紘 2, 佐藤 麻子 1, Vogel Viola 3, 田中 陽 1（1理研・生命機能科学, 2慶応大, 3ETH Zurich）
nobuyuki.tanaka@riken.jp

マウス乳癌細胞の転移性と細胞弾性に起因するネスチンのテール領域の機能解析○水澤 愛衣 1, 須崎 萌 2, 山岸 彩奈 3, 中村 史 1,2,3（1農工大, 2農工大院・工, 3産総研・バイオメディカル）
chikashi-nakamura@aist.go.jp

幹細胞は細胞分裂によって元の細胞と同じ細胞を作る自己複製能と別の種類の細胞に分化する能力を有し，特に複数の種類の細胞に分化できる場合を多分化能と呼ぶ．幹細胞の分化は，単に生化学的な作用だけに依存しているだけでな
く，硬さなどの細胞周囲の物理的環境にも大きく影響を受けることが知られている[Engler et al., Cell, Vol. 126, pp. 677-689, 2006]．近年，細胞集団の形状に応じて，幹細胞分化の方向性が空間的なパターンをもつことが示されている[Ruiz etal., Stem Cells, Vol. 26, pp. 2921-2927, 2008]．本研究では，このような細胞集団の形状に対する幹細胞分化の空間パターンを簡便に解析することを目的として，
アガロースの精密鋳造法を活用した細胞培養用微小構造体を開発している[Nobuyuki Tanaka, Tadahiro Yamashita, et al., PLoS ONE, Vol. 12, e0173647]．本発
表では，アガロース微小構造体を利用した間葉系幹細胞の解析について紹介する．本研究は，日本学術振興会二国間交流事業の支援を受けて実施されたものである．

中間径フィラメントの一種であるネスチンは，癌細胞の転移性に関与すると考えられている．これまでに我々は，高転移性マウス乳癌細胞株 FP10SC2 を用いてネスチン欠損株を作製し，同タンパク質の機能解析を行ってきた．その結果，野生株と比較してネスチン欠損株では細胞弾性率が上昇することが確認されている．中間径フィラメントはヘッド，ロッド，テールの 3 つの領域で構成されており，ロッド領域の束化により繊維を形成する．ネスチンは 160 kDa もの巨
大なテール領域を持ち，単独で繊維形成出来ないため，本株ではビメンチンと共重合している．ビメンチンはテール領域でアクチンと結合し細胞骨格のネッ
トワークを形成するが，ネスチンと共重合した場合にはテール領域が隣接することでアクチンとの結合が阻害され，これによって細胞骨格の柔軟性が上昇す
ると我々は推察している．
本研究では，ネスチン欠損株に対してネスチン発現ベクターを導入し，細胞弾性を評価することで，ネスチンの細胞柔軟化機能の回復を検証した．円柱型
AFM 探針で細胞を圧入し，得られたフォースカーブを Hertz モデルでフィッ
ティングすることで弾性率を算出した．弾性測定後，抗ネスチン抗体を用いた免疫染色を行い，蛍光強度解析によりネスチン発現量を評価した結果，ネスチ
ン発現量と弾性率に負の相関が確認され，ネスチンが細胞柔軟化に寄与することが明らかとなった．現在，テール領域を欠失した発現ベクターを用いて，ネ
スチンの細胞柔軟化機能におけるテール領域の寄与について調査を行っており，
この結果についても併せて報告する．

High-precision agarose micro-casting and pattern analysis of stem celldifferentiation

Functional analysis of tail domain of intermediate filament nestin
attributing to metastaticity and stiffness of mouse breast cancer cell

○Nobuyuki Tanaka1, Tadahiro Yamashita2, Asako Sato1, Viola Vogel3, Yo Tanaka1(1BDR, RIKEN, 2Keio Univ., 3ETH Zurich)

Key words

microfluidic device, differentiation, agarose, mechanobiology○Mei Mizusawa1, Moe Susaki2, Ayana Yamagishi3, Chikashi Nakamura1,2,3(1Tokyo Univ. Agric. Technol., 2Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.,3
Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words

intermediate filament, cell stiffness, AFM, cancer metastasis

206

2Op09

ヒト三次元筋萎縮モデルを搭載した 96 ウェルプレート
フォーマット収縮力評価系の開発

2Op11○大隅 早紀 1, 清水 一憲 1, 吉原 賢 2, 本多 裕之 1,3（1名大院・工, 2塩野義製薬・創薬疾患研, 3名大・予防早期医療
創成セ）
honda@nubio.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】筋萎縮とは，筋肉がやせ細ることで筋力が低下し，運動機能が損なわれる疾患である．超高齢社会を迎え，筋萎縮の予防薬や治療薬の開発が求められている．
抗筋萎縮薬開発のための in vitro 試験では，筋細胞の太さや筋タンパク量の変化を個別に評価するだけでなく，それらの影響が総合的に反映された表現型である収縮力を評価することが望ましい．我々はこれまでに，収縮力測定マイクロデバイス上でマウス筋芽細胞 C2C12 を用いた三次元筋萎縮モデルを構築してきた[1]．本研究では，より実用的な筋収縮力評価系の構築を目指し，ヒト初代骨格筋細胞を搭載した 96 ウェルプレートフォーマットの収縮力評価系の開発を行った．
【方法と結果】
収縮力測定マイクロデバイスは，ポリジメチルシロキサン(PDMS)製で，収縮力測定機構として 2 本の柱を持つ．構築した筋組織が電気刺激に応答して収縮することで柱が動き，その変位から収縮力を算出することが可能である．96 ウェ
ルプレートの 1 ウェルに収まるように，従来デバイス[1]を 65%縮小した．柱の太さなどが異なるデバイスを複数作製し，最適デバイス形状を得た．さらに 96
ウェルプレート用 8 連電極を開発したことで，ハイスループットな筋組織収縮
力測定が可能となった．その測定系で，ヒト骨格筋細胞の三次元培養を行い，収縮力の測定に成功した．デキサメタゾンを加えたところ，有意に収縮力が低下したことから，ヒト筋萎縮モデルの構築として利用できることを実証した．
[1] Shimizu, K., Genma, R., Goto, Y., Nagasaka, S., Honda, H.: Bioengineering, 4(2):56 (2017)

感染防御に関わるニワトリムチンの解析
森脇 脩一郎 1, 吉田 琢哉 1, 原 駿平 1, 飯島 信司 1,2, 金岡 英徳 1,○西島 謙一 1（1名大院・工, 2現愛工大・工・応化）
nishijima@chembio.nagoya-u.ac.jp[背景と目的] 鳥インフルエンザは世界中で蔓延し続けている．スペイン風邪と呼ばれた 1918 年のウイルスを始め，解析可能なパンデミックウイルスはすべてトリ由来であることが知られており，トリでのインフルエンザ蔓延を防ぐこと
は畜産業のみならず公衆防疫の観点からも重要である．しかし，インフルエン
ザウイルスは変異が多いため，特異抗体により免疫を長期間持続するのは困難である．そこで，粘膜表面を覆うタンパク質であり，初期防御に関わるムチンに着目した．ニワトリムチンについては解析例がほとんど無い．本発表ではニワトリムチンの基礎解析結果を報告する．
[方法および結果] NCBI データベースに登録されていたニワトリムチンの候補
配列の多くは分泌シグナルと推定される配列を含んでいなかった．データベー
ス上で分泌配列を持つと判断された遺伝子の発現を定量 RT-PCR 法により測定した．その結果 Muc13 が鳥類におけるインフルエンザ感染に重要な臓器の一つである腸での発現が高いことが示唆された．そこで，Muc13 の cDNA をクローン化し発現ベクターを作製した．ニワトリ細胞株に強制発現させたところ，ア
ミノ酸配列から計算される 67kD よりはるかに大きな 100kDa 以上であったことから，O 型糖鎖が附加されているものと考えられた．次に細胞内での局在を調べた．遺伝子導入した細胞を蛍光染色したところ，N 末に付加した抗 FLAG 抗体による染色では，細胞全体と核周囲で蛍光が観察されたことから，Muc13 は細胞質もしくはタンパク質輸送経路の細胞内小器官に多く局在していることが示唆された．一部は細胞膜上での発現が確認された．今後，ウイルス感染能に対する影響を検討する予定である．

Human skeletal muscle atrophy models using 96 well-plate format
contractile force measuring systems.

Analysis of chicken mucin

Key words
96 well plate format, high-throughput screening, human skeletal
muscle cells, atrophy

Key words○Saki Ohsumi1, Kazunori Shimizu1, Ken Yoshihara2, Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Shionogi & Co., Ltd., 3PME, Nagoya Univ.)

2Op10mRNA サイレンシングを用いた過酸化チタンナノ粒子の放射線増感機序解明○大取 靖秀 1, 森田 健太 2, 西村 勇哉 3, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 3
（1神戸大院・工, 2神戸大研究基盤センター, 3神戸大院・科技イ
ノベ）ochiaki@port.kobe-u.ac.jp【背景・目的】 すい臓がんに代表される生体深部に発生する難治性がんは，未だ効果的な治療法が確立されていない．そこで当研究室では，二酸化チタンを
過酸化水素で機能化した過酸化チタンナノ粒子(PAA-TiOx NPs)と放射線を併用した，新たながん放射線治療法を開発してきた．現在まで，PAA-TiOx NPs を腫
瘍に局所注射した後に放射線照射を行うことで，放射線の治療効果が顕著に増大することを，マウスを用いた in vivo 実験によって見出している．また，PAATiOx NPs は過酸化水素（H2O2）を徐放することで腫瘍細胞の放射線感受性を向上していることが示唆された．しかし，PAA-TiOx NPs が放射線の抗腫瘍効果を増大する作用機序は，細胞生物学的レベルではまだ解明されていない．そこで
本研究では，ナノ粒子から放出される H2O2 が放射線治療効果を増大しているという仮定の下，いくつかの活性酸素除去機構をノックダウンしたすい臓がん
細胞株を作製し，それが放射線治療効果に与える変化を in vitro 毒性試験によって調べた．
【方法・結果】スーパーオキシドアニオンを酸素と過酸化水素へと不均化する
スーパーオキシドディスムターゼ(SOD2)，過酸化水素を水と酸素へと不均化す
るカタラーゼ(CAT)を発現する遺伝子を shRNA のトランスフェクションによってそれぞれノックダウンした BxPC3 株の作製に成功した．ノックダウンは PCRとウェスタンブロッティングにて確認された．作製した SOD2 または CAT ノッ
クダウン BxPC3 株に H2O2(200 μM)もしくは PAA-TiOx (1mg/ml) を投与し，直ちに放射線照射 (1.5, 3, 5 Gy)を行った．この操作による細胞毒性を，コロニーアッ
セイ法を用いて評価した．その結果，通常 BxPC3 株と作製したノックダウン
BxPC3 株の間に放射線と PAA-TiOx の相乗効果による細胞毒性の有意な差が見られた．

Investigation for radiosensitizing mechanism of titanium peroxide
nanoparticles with gene-silencing technique○Seishu Otori1, Kenta Morita2, Yuya Nishimura3, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Inst. Anal. Div., Kobe Univ., 3Grad. Sch. Sci.
Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
dismutasepancreatic cancer, nano particle, hydrogen peroxide, superoxide

Shuichiro Moriwaki1, Takuya Yoshida1, Shunpei Hara1, Shinji Iijima1,2,
Hidenori Kaneoka1, ○Ken-ichi Nishijima1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Fuculty Eng., Aichi Inst. Tech.)chicken, mucin, expression

9 月 7 日（金）

l2

9

3

招待講演・シンポジウム（9:00 〜 11:24）〈招待講演 （韓国生物工学会）〉

D 会場 (S3Da01)

p. 209

Bioengineering for Sustainable Agriculture and Food Production for the Future「新しい農業と未来の食料のための生物工学」【本部企画】

D 会場

p. 2091 細胞解析に向けた刺激応答性分子ツールの創製と応用展開

B 会場

p. 211

SDGs に資する環境共生微生物を活用したアグリバイオ工学研究の新展開

C 会場

p. 213D 会場

p. 216E 会場

p. 218F 会場

p. 220G 会場

p. 222ゲノムを大規模に編集する．代謝計測から設計図を書く．

H 会場

p. 224

地域から世界へ，グローカルバイオテクノロジーで創る新しい価値K 会場

p. 227L 会場

p. 229M 会場

p. 231〈国際シンポジウム〉

シンポジウム（13:00 〜 15:00）

発酵食品の機能性を考える〜一次機能から三次機能まで〜 【本部企画】

エネルギーを使う，捨てる光合成の再最適化―合成生物工学にむけた未踏研究―

半金属元素のバイオテクノロジー
スマートセル開発のためのバイオ技術とデジタル技術の革新と融合
バイオ生産に資する DBTL サイクルの構築に向けて新時代の物質生産宿主開発の方法論：

複雑組織製造に必要な基盤技術を考える―どこまで出来て，何が足らないのか？―

真核微生物におけるシグナル伝達と代謝の接点を探る―発酵調節の根源的な理解に向けて―

招待講演・シンポジウム（15:20 〜 17:20/17:50）
B, G, H 会場 (S3Bc01, S3Gc01, S3Hc01) p. 235, 248, 251〈招待講演 （韓国生物工学会）〉

構造と機能デザインによる有用人工酵素の創製と応用展開 （〜 17 ： 50）

B 会場

p. 235C 会場

p. 238黒麹菌 ・ 白麹菌の研究からつなげる産業振興

D 会場

p. 241

生物系研究者のための電気化学入門〜その実験大丈夫？〜

E 会場

p. 244F 会場

p. 246G 会場

p. 248H 会場

p. 251

資源作物生産から発酵生産までをトータルシステムとして俯瞰する（〜 17 ： 50）

環境は持続可能か？

―地球規模の物質循環を生物工学から考える―タンパク質と材料界面の相互作用の本質に迫る （〜 17 ： 50）
スマートバイオデザイン：ナノからマクロスケールまでの様々な階層レベルにおけるバイオ関連機能と構造の合理的創出を目指して （〜 17 ： 50）

Networking of Researches

Toward Social Implementation of Bioresources Rich in ASEAN「ASEAN における生物資源の社会実装を目指した研究ネットワーキング」〈国際シンポジウム〉

K 会場

p. 254L 会場

p. 256M 会場

p. 260C 会場

p. 263

工学が見出すエッセンシャル細胞培養〜動物細胞培養の根本に工学はどう立ち向かうか〜 【本部企画】（〜 17 ： 50）

糖鎖工学技術がもたらすバイオ医薬品の新潮流 （〜 17 ： 50）

一般講演 （9:00 〜 11:24）
醸造学，醸造工学
生物化学工学／培養工学／バイオプロセス
バイオマス，資源，エネルギー工学
生体情報工学，バイオインフォマティクス／システムバイオロジー
発酵生理学，発酵工学／代謝工学／オミクス解析
酵素学，酵素工学
環境浄化，修復，保全技術／環境工学，廃水処理技術
セル＆ティッシュエンジニアリング

E 会場， F 会場

G 会場， H 会場
I 会場

K 会場

L 会場， M 会場
N 会場

O 会場

p. 265
p. 270p. 275
p. 277
p. 280p. 285
p. 288

209

S3Da01 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

S3Da02

Effects of several growth factors on the biomass and total
lipid production of microalgae under different culturemodes

土壌をゼロからデザインする～有機質肥料活用型養液栽
培から派生した新技術～○篠原 信（農業・食品産業技術総合研究機構）
shsh@affrc.go.jp○Si Wouk Kim, Geun Ho Gim(Dept. Environ. Eng, Chosun Univ.)
swkim@chosun.ac.kr
We attempted to enhance the growth and total lipid production of three microalgal
species, Isochrysis galbana LB987, Nannochloropsis oculata CCAP849/1, andDunaliella salina, which are capable of accumulating high content of lipid in cells.
Low nitrogen concentration under photoautotrophic conditions stimulated total lipid
production, but a decreasing total lipid content and an increasing biomass wereobserved with increasing nitrogen concentration. Among the different carbon sources
tested for heterotrophic cultivation, glucose improved the growth of all three strains.
The optimal glucose concentration for growth of I. galbana LB987 and N. oculata
CCAP849/1 was 0.02 M, and that of D. salina was 0.05 M. Enhanced growth occurred
when they were cultivated under heterotrophic or mixotrophic conditions comparedwith photoautotrophic conditions. Meanwhile, high total lipid accumulation in cells
occurred when they were cultivated under photoautotrophic or mixotrophic conditions.
During mixotrophic cultivation, biomass production was not affected significantly by
light intensity; however, both chlorophyll concentration and total lipid content
increased dramatically with increasing light intensity up to 150 μmol/m2/s. The amountand composition ratio of saturated and unsaturated fatty acids in cells were different
from each other depending on both species and light intensity. The highest
accumulation of total fatty acid (C16-C18) among the three strains was found from
cells of N. oculata CCAP849/1, which indicates that this species can be used as asource for production of biodiesel.

土壌は，食糧生産のほとんどを担う，人類生存に不可欠な媒体である．植物が育つのは，土壌が動植物の老廃物などの有機物を適切に分解し，無機養分を生成するからである．しかし有機物を無機養分に適切に分解できる媒体は，土壌以外に存在しない．ロックウールなどの人工媒体中では，有機物は腐敗し，植物も育たない．
「都合のよい微生物分解」を発酵と定義するならば，土壌は有機物を無機養分に分解できる唯一の発酵槽である．
植物の生育に適した無機養分とは，端的には硝酸態窒素である．有機物に含まれる有機態窒素は，土壌以外の媒体でも容易にアンモニア態窒素にまで分解（アンモニア化成）が進む．しかし次の硝酸化成（アンモニア態窒素が硝酸態窒素に変換される過程）は，土壌以外の媒体では進まない．この過程を担う硝化細菌が，有機物の曝露に極めて弱く，活性を失ってしまうためである．有機物を加えて硝酸態窒素を生成する微生物生態系を人工媒体で形成できるならば，人工的に土壌を創出することが可能だが，硝化細菌が有機物の曝露を受けて不活性化するという技術的問題を，長らく克服することができなかった．このため，土壌を人工的に創出する技術は，これまで存在しなかった．
ブレークスルーとなったのが，有機質肥料活用型養液栽培である．水耕栽培では不可能とされていた，有機質肥料の活用を実現した栽培技術である．これは，本来土壌中でしか働かなかった，硝化菌を含む土壌微生物を，水中でも活動できる培養方法（並行複式無機化法）を発見し，有機物を硝酸態窒素にまで分解することができたためである．養液栽培で有機質肥料を活用することは，生産者だけでなく研究者にとっても待望の技術であったため，現場でも普及が進みつつある．
この有機質肥料活用型養液栽培により，人工土壌の創出が可能になった．ロッ
クウールやウレタンなど，人工媒体に微生物群を固定化し，土壌機能（有機物を分解し植物に好適な無機養分（硝酸態窒素など）を供給する機能）を付与することが可能になった．これにより，適切な媒体を選抜・加工することにより，
土壌の物理性・化学性を自在にデザインすることができるようになった．これは土壌学として画期的なことである．土壌機能を有するのはこれまで自然土壌だけだったため，客土をしてもそれには微生物が定着しておらず，微生物生態系が構築されるまで相当の時間を要し，そのために食糧生産に適した「土づくり」には，時に 10 年もの歳月が必要だとされてきた．しかし，並行複式無機化法で培養した微生物群を人工媒体に定着させれば，希望する物理性・化学性をデザインした人工土壌を創出することが可能になる．これまで不可能であった，「土壌のデザイン」が可能になるわけである．
次に課題になるのが，微生物の種類である．土壌学では，土壌を物理性・化学
性・生物性の三つの観点から研究を行う．上述のように，希望する媒体を土壌化（土壌機能を付与すること）することができるようになったため，物理性・化学性はデザインできるようになった．しかし生物性においては，並行複式無機化法では，自然土壌を微生物源として利用するため，活動する微生物種は 1万種類以上と非常に多様で，目的の微生物を活性化するなどのコントロールはできなかった．
そこで京都大学，名古屋大学，慶應義塾大学，富山県立大学などと協力して，数種類の培養可能な微生物だけで土壌機能を再現する試みを行った．種々の検討の結果，硝酸化成を担う 2 種類の細菌（アンモニア酸化細菌，亜硝酸酸化細菌）にもう一菌株，アンモニア化成を担う微生物を加えれば，土壌機能を再現できることが分かった．我々は，わずか 3 菌株だけで土壌機能を再現できる共培養系を「エレメンタル土壌微生物」と呼んでいる．これにより，無数と表現するにふさわしいほど多様な微生物で構成されていた土壌微生物の世界を，わずかな菌種の微生物だけで土壌機能を再現できる，モデル系を構築できることが明らかとなった．
次なる課題は，このエレメンタル土壌微生物に，食糧生産に有利な諸性質を付与（デザイン）することができるかどうかである．その性質の一つとして，病原菌の増殖抑制を研究している．病原菌の生育や感染を妨害する微生物を拮抗菌という．この拮抗菌をエレメンタル土壌微生物と組み合わせようという発想である．
しかしこれまでの拮抗菌研究から，単独では拮抗作用を示しても，他の微生物と共培養すると作用を示さなくなる，あるいは生態系から排除され，検出限界以下にまで数を減らすなどの現象が起きることが知られている．
そこで有機質肥料活用型養液栽培の微生物群から，拮抗菌の候補を分離し検討したところ，単独では病原菌を抑えることはできないが，2 菌株のペア，あるいはさらに多くの微生物と混合培養すると拮抗作用を示す，「創発性」を示す拮
抗菌カクテルが見出された．
これをエレメンタル土壌微生物と組み合わせ，植物病原菌をその培養液に接種したところ，病原菌の増殖を抑えることに成功した．これは人工的抑止土壌の開発につながる画期的な成果である．
以上のように，「土壌をゼロからデザインする」技術は，農業生産を根本的に革新する可能性がある．

Effects of several growth factors on the biomass and total lipid production of
microalgae under different culture modes

Artificial design of soil - a novel technology derived from hydroponics usingorganic fertilizer (organic hydroponics) -○Si Wouk Kim, Geun Ho Gim(Dept. Environ. Eng, Chosun Univ.)

Key words

biomass, lipid, microalgae, culture condition○Makoto Shinohara(NARO)

Key words

biofilm, soil bacteria, nitrification, antimicrobial

210

S3Da03植物成長を促進する新しい遺伝子・化合物の単離を目指す植物ケミカルバイオロジー研究

S3Da04○中野 雄司 1, 山上 あゆみ 1, 長田 裕之 1, 篠崎 一雄 1, 浅見 忠男 2
（1理研・環境資源科学センター, 2東大院・農生科）
tnakano@riken.jp

Novel sustainable plant-based protein: Scientific evidenceof health and nutrition benefits in humans○Ron Salpeter1, Iris Shai2(1Hinoman Ltd, Israel, 2Dep. of Public Health, Faculty of Health
Sciences , Ben Gurion Univ., Israel)ron@hinoman.com

ケミカルバイオロジーは，ケミカルと生物の関わりに着目して，その解明を目
指す新しい研究領域であり，微生物由来の天然化合物，医薬品のリード化合物
としての合成化合物など，主にヒトや動物の健康や医療への貢献をアウトプットとして研究領域が展開してきている．一方，光合成によって二酸化炭素と水から，酸素と炭素化合物を作り出植物は，自らの成長をコントロールするためにも植物自身が作った化合物（ケミカル）を活用している．そのひとつとして「植物ホルモン」と呼称される一群の生理活性化合物が知られるが，この植物ホルモンの研究史が示すように新しいケミカルの発見は，その生理活性の発現機構の解析から，生合成経路やシグナル伝達経路の解明などを進める起点となり，植物科学の発展の重要な起点となってきた．我々は，このようなケミカルと植物の関係性を明らかにする基礎科学研究的側面と，植物成長に有用な形質をもたらす新しい遺伝子，ケミカルを探索する応用科学的側面の両輪の推進を目指
す植物ケミカルバイオロジー研究を進めてきた．
植物ホルモンの一種類であるブラシノステロイド（BR）は，発芽，栄養成長，生殖成長など植物生理サイクルの様々な局面において，重要な役割を果たすことが知られている．遺伝子レベルでは，BR の生合成経路はほぼ全貌が明らかにされているが，BR 情報伝達経路については未解明の部分が多く残されている．このような状況下において，我々は，BR 生合成阻害剤 Brz に対して耐性を示す実験植物アラビドプシスの突然変異体をスクリーニングするケミカルバ
イオロジー研究を進め，新規な BR 情報伝達因子群の単離，及び，その植物形態形成における機能について解明を進めて来た．その中でも特に強い Brz 耐性
胚軸徒長形質を示す bil7 変異体は，最終的な花茎長が野生型の 1.5 倍程度になる．この BIL7 タンパク質は，通常条件下では細胞膜近傍に局在し，BR 処理に
よって細胞膜から核内に移行する過程において，マスター転写因子 BIL1/BZR1を核に連行する機能を持つ事が明らかにされている． また，BIL7 高発現アラビ
ドプシスでは，花茎の伸長化に応じて鞘数，種子数も増大することが明らかとなっている．BIL7 遺伝子のイネでの相同性遺伝子 OsBIL7 について，イネにおいて形質転換を行なったところ，生育伸長が認められ，種子収量が 130%の増加することが明らかとなった．さらに，サトウキビに形質転換した結果，T1 世
代の複数系統において，茎長が 200%に増大し，茎乾燥重は 300%に増大する，という結果が得られた．これらの結果より，BIL7 は，植物種を越えた収量増産
遺伝子として，今後の展開が期待される．
理化学研究所 NPDepo ケミカルライブラリーから，植物に胚軸伸長阻害様活性を付与するケミカルとして単離した FPX は，発芽後の植物を FPX 存在下でさらに育成させると，低濃度で根端に，高濃度で茎長に，共に植物初期化細胞塊であるカルスを誘導する活性を持つことが明らかとなった．さらに，FPX によるカルス誘導活性は，既存技術であるオーキシンとサイトカイニンによる最適
カルス誘導条件における誘導活性よりも高いことが確認された．さらに，誘導されたカルスからの植物葉（シュート）や根の再分化は植物種によって未だに困難であること場合が多々あるが，FPX により誘導されたカルスからはシュートが再分化され得ること，この再分化効率は，オーキシン/サイトカイニン系によって誘導されたカルスからのシュート再分化効率よりも高いことが明らかになった．一方，この植物カルス細胞へのアグロバクテリウム感染という組み合
わせは，現在も多くの植物の遺伝子組み換え法に用いられる．この FPX により誘導されたカルスは，オーキシン/サイトカイニン系によって誘導されたカルスに対するアグロバクテリウムの感染効率よりも高いことが明らかとなった．すなわち，FPX は，植物遺伝子組み換え技術に重要な「カルス誘導」「カルスへのアグロバクテリウム感染」「カルスからのシュート再分化」の 3 ステップにおいて，従来のオーキシン/サイトカイニン系よりも高い活性を持つことが明らかとなった．実用化植物においては，これらの 3 ステップのいずれかが困難であるために，形質転換が困難な植物種がまだ多く残されている．FPX は，植物分化のメカニズムを解明するための基礎科学的ツールとして重要であると期待されると共に，遺伝子導入が可能な植物種を拡大し得る新しいバイオテクノロジーのツールとして実用化研究においても重要な技術になり得ると期待される．
現在，FPX は，植物体内で CPX と PPG の 2 種のケミカルに代謝されること，
カルス誘導の主活性は CPX によって行われ，PPG は CPX によるカルス形成を促進させる活性を持つことが明らかとなっている．さらに，この PPG の植物個体への生理活性を解析したところ，植物体に異常形態を生じさせることなく，葉の面積，茎の分枝，根の側根数，を増加させる活性を持つことも明らかとなった．この PPG の生理活性についても，紹介したい．

Mankai, a cultivated strain of Wolffia is an aquatic plant, the smallest higher-plant onearth (0.7mm). Mankai is rich in all essential amino acids (more than 45% protein, drymatter), dietary fibers, omega 3, polyphenols, minerals (as iron, zinc, folic acid) andvitamins (as vitamins A, E and, and surprisingly B12). There is a long history of
Wolffia as food in Southeast Asia, where it has been traditionally considered as “watereggs” or “meat for the poor”. Given its tiny size, this non-GMO veggie can beembedded “as is” into the fabric of numerous daily foods, enhancing their nutritional
value without affecting their taste or smell. This will enable people to eat healthier without substantially changing their way of eating, often a critical obstacle for mostpeople when wanting to eat more responsibly. Mankai is grown using proprietarycultivation algorithm in a highly monitored system, preserving its distinguishednutritional wholesomeness. Given its highly clean production technology process andits neutral taste and smell, Mankai could also be consumed as a fresh green shake.
Moving from composition to bioavailability and bioactivity, we will present
preliminary results from large-scale long-term and acute clinical trials in human andfrom animals experiments, which suggest that Mankai, as a clinically-tested food, isbeneficial in terms of essential amino acids, B12, and iron bioavailability and in further
clinical parameters related to obesity, glycemic control, inflammation, cardiometabolicand iron state.

Plant chemical biology research to identify novel genes and compounds that
promote plat growth

Novel sustainable plant-based protein: Scientific evidence of health andnutrition benefits in humans○Takeshi Nakano1, Ayumi Yamagami1, Hiroyuki Osada1, Kazuo Shinozaki1,
Tadao Asami2(1Center for Sustainable Resource Science, RIKEN, 2Grad. Sch. Agric. Life Sci.,
Univ. Tokyo)

Key words

plant chemical biology, phytohormone, plant growth regulator, biomass○Ron Salpeter1, Iris Shai2(1Hinoman Ltd, Israel, 2Dep. of Public Health, Faculty of Health Sciences , Ben
Gurion Univ., Israel)

Key words

Wolffia, randomized controlled trials, glycemic control, amino acids

211

S3Da05

持続可能な農業がもたらす新たなビジネスチャンス～エ
ネルギー消費型農業からエネルギー創造・利用型農業への転換～

S3Bb01○浜地 格（京大院・工）ihamachi@sbchem.kyoto-u.ac.jp○齊藤 三希子（NTTデータ経営研究所 ライフ・バリュー・クリエイションユ
ニット）
saitom@keieiken.co.jp
気候変動による農業への影響は，諸外国の問題などと，もう他人事ではいられない状況である．気候変動は，世界の食料システムに対する脅威となっている．
近年の異常気象などの気候変動により，世界的な食料生産に大きな影響を受けている昨今，誰もがバランスの取れた食事をするためには持続可能な農業の実現を推進することが，かつてなく重要になっている．
気候変動は，国内農業に大きな影響を及ぼしており，昨年夏に九州北部などで発生した豪雨災害による農業被害額は全国で約 208 億円，昨年 10 月の台風によるに被害額は約 1,300 億円に上る．
また，昨年 10 月の大型台風及び昨秋の長雨など気候変動の影響を受け，今冬の野菜は平年の 1.5 倍～2.7 倍と軒並み高騰しており，我々の食生活に大きな影響を及ぼしている．カルビーは，異常気象の影響で北海道産ジャガイモが不足し，
昨年 4 月にポテトチップスが販売休止に追い込まれたことより，3 ヶ月で約 57億円の減収となった．近年の異常気象や干ばつなどの気候変動は，消費者だけではなく企業の経営活動にも大きな影響をもたらしている．
「緑の革命」以降，化学肥料や農薬の開発，潅漑施設・農業機械の進展など，さまざまな技術革新が起こり，食糧生産量が画期的に向上した．しかし，FAO（国際連合食糧農業機関）は，2050 年の世界人口 100 億人を養うためには，食料生産全体を現在よりも 1.7 倍引き上げる必要があると提言している．
本稿では，世界の食料安定供給を図るため，国内外の現状及び欧米で注目を集めているフェイクフードや培養肉などの食品代替策等に関して概説し，日本の「食料安全保障」のためには，まずは，過剰な鮮度を求める日本の消費文化から大きく変えていく必要があることに関して言及する．

細胞機能をタンパク質分解能で解析・制御するための分子技術2014 年に JST は「統合一細胞解析のための基盤技術」という研究課題で，CRESTとさきがけプロジェクトを同時に開始した．当時ゲノムやトランスクリプトー
ム解析が，1 細胞レベルの解像度で可能になりつつあり，同じ細胞株間でのheterogeneity が実験データとして明らかにされるとともに，遺伝子以外の生体成分の精密解析への広がりや，1 細胞レベルの分解能から見えてくる新しい生
物学や生物工学など，様々な研究展開や応用が期待されたからであろう．浜地
は，この中のさきがけ研究（通称「1 細胞さきがけ」）を領域総括としてお世話することになった．ここでは，そのプロジェクトの内容を一部紹介させていただきながら，自分自身の研究に関しても少し議論させて頂きたい．
「1 細胞さきがけ」領域は，2014 年から 2016 年までの 3 年間，研究提案を募集した．最初の 2 年間は，200 件を超える研究提案が寄せられ，3 年目でも 150 件
以上の応募があった．この分野が，若手研究者にとって注目される研究領域であることを端的に示すものと思われる．その中から，12 名の領域アドバイザーの先生方の多大なご協力のもの，書類審査とヒアリングを行い，3 年間で総勢39 名（14 名／14 名／11 名）のさきがけ研究者を選考した．募集から選考段階までで特に意識したのは，できるだけ広い分野から，異なるバックグラウンドをもち，かつ 1 細胞研究にチャレンジしようとする優れた若手研究者を集める，ということであった．1 細胞研究自体は，とても大きな領域であり，さきがけ研究者 1 名で全てをカバーすることは不可能であるので，特定の分野や技術やアイデアが尖った（さきがけらしい）ユニークな若手を選考し，いろいろな方
向から 1 細胞へ挑戦を促す狙いである．お陰様で，生命科学だけでなく化学，
材料科学，光科学，生物工学，ナノ・マイクロテクノロジー，計算科学，神経科学，発生学など幅広い分野の研究者が集うユニークな集団ができたと自負している．1 年に 2 度泊まり込みで実施する領域会議では，自由な Discussion の
もと，それぞれの専門分野をまたいだ共同研究が研究者主導で幾つも始まって
おり，個々の成果も着実に出てきている．特にイメージング技術においては，
1 細胞レベルで特定の生体機能物質を選択的に可視化できる分子プローブの開発，組織深部まで高解像度で観察可能な独自の顕微鏡システム，電気化学応答
性のナノ顕微鏡や超高速イメージングサイトメトリー装置，など特徴的な成果が得られてきた．一方，遺伝子解析においては，バーコードやマイクロ流体を制御したシステムを使って，体内細菌叢の解析や免疫細胞の分類・分析，細胞系譜の同定技術などが進んでいる．現在，本領域は 2 期生，3 期生の研究活動が本格化してきており，今後とも注目頂くとともに，ご支援を賜りたい．
さて浜地研では，主として哺乳類細胞での特定のタンパク質の構造と機能解析を可能とする分子技術の開発をめざした研究を進めている．タンパク質の発現や機能の異常は，生体システムの恒常性の破綻を招き，ガンやアルツハイマーなど様々な疾病の原因となる．そのため，細胞に内在する標的タンパク質を選択的に解析することは，基礎研究として興味深いだけでなく，疾病診断や制御（創薬開発）のための分子ツールを提供することにも繋がる．これまでに我々は，生細胞夾雑系で狙った特定タンパク質の解析のために，様々なイメージン
グプローブをラベル化する分子技術：リガンド指向性化学を開発してきた．特に最近，膜タンパク質に広く適応できるリガンド指向性アシルイミダゾール化学（LDAI）法を開発し，これを使ってがん細胞表層のバイオマーカータンパク
質のイメージングや，脳神経系で主要な神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体タンパク質の培養細胞系や脳組織切片での可視化や動態解析に成功している．また，タンパク質工学と小分子錯体とを組み合わせた配位ケミカルジェネ
ティックス法を開発して，特定の神経細胞におけるグルタミン酸受容体の活性化を鍵とした神経細胞 1 細胞レベルでの活性化にも成功している．本講演では，
このような最近の我々の成果に関しても紹介し，議論させて頂きたい．
Reference(a) Takaoka. Y.; Ojida, A.; Hamachi, I. Angew. Chem. Int Ed., 52, (review) 4088-4106(2013). (b) Tsukiji, S.; Miyagawa, M.; Takaoka, Y.; Tamura, T.; Hamachi, I. Nature
ChemBio., 5, 341-343 (2009) (c) Takaoka, Y.; Sakamoto, T.; Hamachi, I. et.al., Nature
Chem., 1, 557-561 (2009). (d) Kiyonaka, S.; Kubota, R.; Hamachi, I. et.al., Nature
Chem., 8, 958-967 (2016). (e) Yamaura, K.; Kiyonaka, S.; Hamachi, I. et.al., Nature
ChemBio., 12, 822-830 (2016). (f) Miki, T.; Hamachi, I. et.al., Nature Methods, 13,
931-937 (2016). (g) Kiyonaka, S.; Hamachi, I. et.al., Nature Commun., 8, 14850(2017). (h) Tamura, T.; Hamachi, I. et.al., Nature Commun., 9, in press (2018).

New business opportunities brought by sustainable agriculture○Mikiko Saito(NTT DATA INSTITUTE OF MANAGEMENT CONSULTING, Inc.)

Key words

agricultural waste, sustainable

Molecualr technologies for analyzing and regulating live cells with protein
molecule resolution○Itaru Hamachi(Grad. Sch. Eng., Kyoto Univ.)

Key words

protein labeling, chemical biology, bioimaging

212

S3Bb02

光応答性ゲルを用いた単一がん細胞の分離と核酸解析への応用

S3Bb03○吉野 知子（農工大院・工）y-tomoko@cc.tuat.ac.jp

次世代シーケンサーの技術革新をはじめ，単一細胞解析技術の飛躍的な進展により，細胞集団の不均質性の解明や希少細胞集団の解析が現実のものとなっている．特に，腫瘍における細胞集団は，ゲノムの異なる複数のクローンが存在し，腫瘍内の不均質性があるため，治療抵抗性の要因にもなることが考えられている．このように，今後のがん診断や治療においては，細胞集団の不均質性を理解することが重要となることが予想される．がん患者血液中に存在する血中循環腫瘍細胞(Circulating tumor cell: CTC) は，がん組織から血管内に侵入し，血流に乗り全身を循環するがん細胞であり，転移に関与することから，がん転移機構の解明や新たな治療標的の発見への利用が期待されている．一方で，CTC
は血液 1 ml 中に含まれる約 50 億の血球細胞に対し，僅か数個から数十個程度しか存在しない非常に希少な細胞であるため，既存の細胞解析技術による検出が困難であることが課題である．そのため，末梢血からロス無く CTC を回収
し，核酸解析までを実施可能な技術の開発が求められている．
本発表では，当研究グループで構築した CTC をはじめとする様々な希少細胞の単一細胞レベルでのゲノム解析，トランスクリプトーム解析を可能とする核酸解析のプラットフォームに関して紹介する．本プラットフォームは，細胞サイ
ズ と 変 形 能 の 差 を 利 用 し て CTC と 血 球 細 胞 を 分 離 す る “Microcavity array(MCA)”法[1]，及び MCA 上に補足された単一の CTC を光硬化性のハイドロゲ
ルで包埋し，確実に分離・核酸増幅を可能とする“Gel-based cell manipulation(GCM)”法[2] から構成される．MCA 法による CTC 回収は，孔径 8 μm の金属製フィルターである MCA を介して吸引捕捉した．MCA 上の細胞に対し，細胞染色を行った後，光硬化性ハイドロゲルである poly(ethylene glycol) diacrylate を添加し，カバーガラスを積層した．続いて顕微鏡観察により同定された CTC 候補細胞に対して光照射を行い，単一細胞をハイドロゲルで包埋した．CTC は直径
数十 μm 程度であり，観察には顕微鏡での観察が必須となるが，細胞に肉眼で視認可能な目印であるハイドロゲルをつけることで，目視観察下で細胞分離が可能となった．また，ハイドロゲルで包埋した単一細胞を全ゲノム増幅または全トランスクリプトーム増幅反応に供することが可能であった．さらにトランスクリプトーム解析においては，MCA を用いて細胞を分離後，RNA 安定化までに要する時間は，約 40 分であり，既存の CTC 解析技術と比較して迅速化を達成できた．本手法を用いて，がん・感染症センター 都立駒込病院の協力の下，臨床試験を実施し，CTC のトランスクリプトーム解析を進めている．このような核酸解析プラットフォームは CTC のみならず，接着細胞や微生物など
様々な細胞に対しても適用できることが示されており，生命科学分野における革新的な研究支援ツールとしての汎用化を目指している．

細胞内ドラッグデリバリーシステムを基盤とする光細胞工学○村上 達也 1,2（1富山県大・工, 2京大・高等研究院・iCeMS）
murakami@pu-toyama.ac.jp

ドラッグデリバリーシステム(DDS)は，薬剤と添加物を混合することにより，その体内での動きを制御することを目的としている．これにより薬剤を疾患部位へ安全かつ高効率に輸送することができる．近年，この薬剤を再定義し，DDSの応用範囲を拡大しようとする動きがある(DDS 学会誌 2017 年 1 月号)．具体的には，何らかの活性を有する物質すべてを薬剤ととらえ，基礎生物医学研究に役立つ技術を積極的に開発することである．
我々がドラッグキャリア（医薬品添加物）として研究を進めてきた脂質／脂質結合タンパク質複合体は再構成可能な血清成分であり，高い生体適合性(ポリエチレングリコール修飾不要)，小さなサイズ(~10 nm)，豊富な改変手法，抗動脈硬化作用，といった特徴がある．昨年，薬剤を内包させた本複合体は，加齢黄斑変性マウスモデルに対して点眼投与で著効を示すことを報告したところである(J. Control. Release, 2017)．一方で，本複合体は多様な金属ナノ粒子の表面修飾剤としても機能することを我々は見出している(ACS Nano, 2014)．具体的には，近赤外光を吸収して発熱する金ナノロッド(AuNR)を，細胞膜透過ペプチドを結合させた本複合体で被覆すると，AuNR のコロイド安定性，生体適合性，がん細胞取込みが同時に達成される．さらにその後光照射すると，細胞内 AuNRの発熱によりがん細胞は死滅する．すなわちここで薬剤は AuNR ととらえることができ，安全な細胞内輸送という DDS の概念は，AuNR の表面化学の制御を介して達成されている．
本講演では，表面修飾 AuNR を用いる神経細胞に発現する熱感受性イオンチャ
ネル(TRPV1)の光活性化(Angew. Chem. Int. Ed., 2015)と，プラスミド DNA の細胞内輸送と光転写活性化(Sci. Rep., 2017)について紹介する．さらにこれらの詳細な作動メカニズムについても議論したい．

[1] Hosokawa, M., et al., Anal. Chem., 85(12):5692-8 (2013)[2] Yoshino, T., et al., Anal. Chem., 88(14):7230-7 (2016)

Techniqus for isolation of single-cancer cells using visualization of hydrogel
encapsulation and its application towards genome and transcriptome
analysis○Tomoko Yoshino(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

single-cell analysis, circulating tumor cell, hydrogel

Optical Cell Engineering Using Subcellular Drug Delivery Systems○Tatsuya Murakami1,2(1Fac. Eng., Toyama Pref. Univ., 2iCeMS, Kyoto Univ. Inst. Adv. Study)

Key words

drug delivery system, surfactant, gold colloid, gene expression

213

S3Bb04光分解性ゲル包埋培養系からの癌生細胞分離装置の開発

S3Cb01○杉浦 慎治 1, 田村 磨聖 1, 山平 真也 1, 進 和美 1, 佐藤 琢 1,
高木 俊之 1, 金森 敏幸 1, 渋田 真結 2, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 2,
柳沢 真澄 3, 松井 裕史 4
（1産総研・創薬基盤, 2名大院・創薬, 3エンジニアリングシステ
ム（株）, 4筑大・医）shinji.sugiura@aist.go.jp
がん細胞は 3 次元培養によってはじめてその本来の性質 (増殖能，浸潤性，転移能など)を発現することが知られており，その増殖に伴い様々な形態のコロニーを形成する．我々は，3 次元培養環境下の関心細胞を局所光照射により分離・培養可能な光分解性ゲルの開発を行い，細胞培養，撮像，光照射による細胞回収の一連の操作を自動化した装置を開発してきた．本講演では，この光分解性ゲルと自動化細胞分離装置について紹介する．
我々はこれまでに，ゼラチン等のアミノ基を有するバイオマテリアルのアミノ基と反応し，光照射に応じて分解する活性エステル型の光開裂性架橋剤を合成している．一方，この活性エステル型光開裂性架橋剤を用いて細胞を包埋すると，高濃度条件において細胞毒性があることが確認されている．そこで我々は，アジド修飾ゼラチンとジベンゾシクロオクチル基を末端に有する光開裂性架橋剤（DBCO-PC-4armPEG）からなるクリック架橋型光分解性ゼラチンゲル（PDゼラチン）を開発した． PD ゼラチンは，マトリゲル等の生理活性タンパク質を含むプレゲル溶液を用いて調製することもでき，調製されたゲル内で癌細胞の形態変化を確認することができた．また，得られた PD-ゼラチンゲルにマイクロパターン光（365nm，156mW / cm 2，30 秒）を投影したところ，光照射のパターンに応じた分解を確認した．
PD ゼラチンゲルの表面または内部でがん細胞を培養し，光の照射によってゲルを溶解させることで，特定の細胞のみを単離することができる．例えば，マニュアル操作での形態別の細胞単離に成功している．我々は，細胞培養，撮像，
光照射による細胞回収の一連の操作を自動化した装置を開発した．現在，細胞形状識別アルゴリズムを実装して，蛍光標識モデル細胞を対象として実証試験を実施している．

家畜・家禽類の腸内機能を制御する環境微生物○宮本 浩邦 1,2,3, 大野 博司 2, 児玉 浩明 1,3,4（1千葉大院・融合, 2理研・生命医科学, 3サーマス, 4千葉大・園芸）
hirokuni.miyamoto@riken.jp

常温，あるいは常圧でない条件下において生息可能な微生物は，極限環境微生物と呼ばれている．なかでも，至適生育温度 45℃以上，生育限界温度 55℃以上の高い温度帯に耐えられる好熱性・耐熱性微生物は，なかなか死滅しにくい特性があることから我々の生活圏に深く入り込んでいる．しかしながら，好熱性・耐熱性微生物が動植物の生理機能に与える影響に関する研究成果は意外にも少ない．
一方，千葉大学を中心とした産学連携グループでは，バシラス科を主体とした好熱菌群によって海産資源を 75℃前後の高温下で発酵した産物（以下，好熱菌
発酵産物）が，動植物に与える影響に関して研究を推進している．飼料として
好熱菌発酵産物を活用した場合，養殖ヒラメ，採卵鶏，豚において，死魚率，消耗率，死産率などを減少させ生産性を向上させる（JGAM 56,61-5,2010; Res
Vet Sci 93,137-42,2012; JBB 121,659-664,2016）．モデル動物（ラット・マウス）を用いた実験を行った結果，腸管免疫系の賦活化に寄与する遺伝子発現が高まり，特に分泌型 IgA の糞中濃度を増加させる（JBB 114,500-5,2012）．また，肝臓，並びに筋肉中において，抗酸化活性が高まった結果，過酸化脂質を減少させ る 傾 向 が あ る こ と が 明 ら か に な っ て い る （ JBB 116,203-208,2013; JBB
121,530-535,2016）．そこで，無菌動物を用いた実験系において，好熱菌発酵産物中の機能性候補微生物群の単離を試みたところ，腸内生着性のある好熱菌としてヤシ酒の発酵菌である Bacillus thermoamylovorans の近縁種などが同定された．これらの菌株をコンベンショナル条件下で飼育したマウスに経口投与すると腸内で分泌型 IgA の産生を誘導した．さらに，飼料エネルギーの利用効率を調節するとともに，特に低濃度では飼料摂取量当たりの体重増加率を改善させる性質があることが示唆され（JAM 114,1147-57,2013），併せて排泄糞中の未消化な飼料成分による環境負荷の低減効果も確認された．これらの性質から，畜産向けのプロバイオティクスとしての利用価値があるため，NITE に国際寄託され，米国，EU，中国，日本などで国際特許として登録されている．その後，
DNA-DNA ハイブリダイゼーションや全ゲノム解析などの結果から，新菌種として Bacillus hisashii と命名された（IJSEM 65,3944-3949,2016）．当該好熱菌株
は，宿主の腸内フローラとの相互作用が確認されており，マウス，鶏，豚では，肥満制御に関与する乳酸菌群や一部の Clostridium 属菌などの腸内におけるポピ
レーションを制御するとともに，腸内の短鎖脂肪酸の産生をともなって，脂肪蓄積軽減効果や成長促進効果などをもたらすことが確認されている．また，豚においては，乳酸菌が産生する乳酸を短鎖脂肪酸に変換する乳酸資化菌が増加する傾向が確認され，乳酸資化菌の一つである Megasphaera sp.を分離することに成功している（Anaerobe 48, 160-164, 2017; JBB 125, 519-524, 2018）．
これらの結果から，一つの仮説として，当該好熱菌 B. hisashii は宿主腸内の乳酸菌と乳酸資化菌の機能バランスを制御する役割があるのではないかと推察している．実際，有胞子性の耐熱性乳酸菌として，ヒトの食品用を中心に長年市販されている B. coagulans (商品名ラクリス:三菱ケミカルフーズ)と併用して，肉用鶏に給与した結果，飼料要求率が従来よりも改善し，筋肉中の過酸化脂質
マロンジアルデヒドの減少傾向が増強することが明らかになっている．当該 B.
coagulans は，そもそも緑麦芽から単離した耐熱菌であり，山梨大学名誉教授の中山大樹博士と世界的な発酵醸造研究の権威で「酒の博士」として知られる東京大学・名誉教授(のちに理化学研究所・副理事長)である坂口謹一郎博士(いずれも故人)が戦後まもなく発見した環境微生物として社会に役立ってきた．異なるフィールドから採取された環境微生物群が腸内で相互作用を果たし，動物の健康的な飼育に貢献しうるという現象は極めて興味深い．
環境微生物と動物との間の相互作用は，食品科学，農学，畜産学，環境学，並びに医学などの幅広い視点で捉えるべき研究対象である．本研究の視点は，今後，最新の解析技術を活用していくことによって，さらに人類に貢献しうる持続可能な社会構築のための SDGs 技術のツールを見出すことにもつながってい
くものと期待される．
謝辞
本研究は，早稲田大学大学院創造理工学研究科 教授・理化学研究所 IMS チー
ムリーダー 服部正平先生，理化学研究所 IMS 研究員 須田亙先生，慶應義塾大学先端生命科学研究所 准教授・福田真嗣先生の御協力の上で成り立っております．ここに深謝致します．

Development of automated cancer cell separation system fromphotodegradable hydrogel○Shinji Sugiura1, Masato Tamura1, Shinya Yamahira1, Kazumi Shin1, Taku Satoh1,
Toshiyuki Takagi1, Toshiyuki Kanamori1, Mayu Shibuta2, Kei Kanie2, Ryuji Katoh2,
Masumi Yanagisawa3, Hirofumi Matsui4(1AIST BRID, 2Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 3ESCO, 4Dept. Med. Tsukuba
Univ.)
Key words
cell sorter, three dimension, hydrogel

Environmental microbes to modulate the gut function of livestock andpoultry animals.

○Hirokuni Miyamoto1,2,3, Hiroshi Ohno2, Hiroaki Kodama1,3,4(1Grad. Sch. Adv. Integr. Sci., Chiba Univ., 2IMS,RIKEN, 3Sermas co. ltd., 4Fac.
Horticul., Chiba Univ.)

Key words

thermophile, Livestock, poultry, gut

214

S3Cb02

フィールドアグリオミクスにより有機農業を科学する○市橋 泰範 1,2（1理研・バイオリソース研究セ, 2科学技術振興機構・さきがけ）
yasunori.ichihashi@riken.jp

S3Cb03

自吸式通気撹拌と槽内共棲細菌によるし尿のユニークな
自家熱型高温好気消化○酒井 謙二, 田代 幸寛（九大院・農）kensak@agr.kyushu-u.ac.jp

近年，有機農業は世界的な食料および環境問題解決に関して注目されている．
有機農法の一つである太陽熱処理は，土壌中の植物病原体を防除する方法として開発されたが，主要な植物病原体がいない場合でも植物の成長を促進する効果が知られている．その成長促進効果のメカニズムを明らかにするため，私た
ちは同じ圃場内において異なる農法（化成肥料もしくは有機堆肥を施肥して太陽熱処理有無の試験区を設置）でコマツナを栽培し，全代謝物解析および微生物プロファイル解析によるフィールドアグリオミクス研究を行った．
本研究の太陽熱処理は，日積算温度 1000℃を超える 5 週間の期間で行った．その結果，太陽熱処理が農作物の収量（乾燥重量）をおよそ 1.7 倍に増加させる
ことが明らかになり，一方で農作物の他の形質（植物地上部の全代謝物，葉の形，光合成活性，糖度，酸度，葉の色素，病害，食味）に有意な違いは検出されなかったため，太陽熱処理は同等の品質を維持した上でコマツナの収量を増加させることが明らかになった．また翌年でも太陽熱処理による成長促進効果を確認することができた．
その成長促進効果のメカニズムを明らかにするため，作付け前および収穫時の土壌について NMR による代謝プロファイリングを遂行した．検出できた代謝物データを用いて主成分分析を行なった結果，試験区間で明確な違いが検出されたため，物理的に異なった場所に設置した試験区であっても，異なる処理による土壌特性を反映していることを示す．しかし，無機態窒素（アンモニア態
および硝酸態）は太陽熱処理間で有意な違いはなく，現在の農学分野で主流である「植物は無機物で栄養を吸収する」というリービッヒの無機栄養説では今回の太陽熱処理による成長促進効果を説明できないことがわかった．
次世代シーケンサーを利用して土壌および根圏のおける微生物プロファイル解析を行った結果，太陽熱処理は土壌全体の微生物でなく，コマツナの根圏に生息する微生物の種類に大きく影響することがわかった．門レベルでの大きな影
響が確認され，デイノコックス・テルムス門やフィルミクテス門が太陽熱処理をした根圏で多くなること，特に植物の成長促進に関与する根圏バクテリアとしてパエニバシラス属とシュードモナス属が太陽熱処理により多くなることがわかった．これらの結果から，自然の物質循環である有機物と根圏微生物叢の相互作用が太陽熱処理による成長促進効果に関与していることが示唆される．
そこで太陽熱処理による成長促進効果の重要な因子を抽出するために，コマツナの形質や土壌の代謝物，根圏微生物など全てのデータを統合したネットワー
ク解析を行うと，個別の比較解析では明らかにできなかった収量に強く相関した有機態窒素（アミノ酸など）および根圏微生物が明らかになった．そのため，
ここで検出された有機態窒素が太陽熱処理によって誘導された有機物と根圏微
生物叢の相互作用の最終産物として植物の成長を促進させているという仮説を立てた．これを検証するために，コマツナの無菌培養系を確立して有機態窒素の添加実験を行うと，特定の有機態窒素が栄養源や生理活性物質として収量を増加させることを明らかにした．特にダブルラベルしたアミノ酸を使うことで，コマツナが直接アミノ酸を吸収していることを証明した．
現在の慣行農法はリービッヒの無機栄養説をもとに確立されているが，本研究の結果は，従来の研究ではその複雑さゆえに十分に解析されていなかった，自然の物質循環である有機物と根圏微生物叢の相互作用がもたらす農作物への効
果を強く示唆する．過去の研究で実験室レベルでは有機態窒素が植物に吸収されることは実証されているが，本研究により初めて圃場レベルで有機態窒素が農作物の生育促進に関与していることを実証した．本研究の発見から，有機態窒素を利用した新規農法の技術開発につながることが期待される．

自家熱型高温好気消化（Autothermal Thermophilic Aerobic Digestion, ATAD）は，有機物の好気分解で発生する自家発熱により高温状態を維持し，高濃度有機廃水を短期間で安定な有機液肥に変換する．
我々は福岡県築上町で稼働している屎尿の ATAD プロセスと循環システムに注目してきた．ここでは自給式通気撹拌装置を装着したバッチ式のバイオリアク
ターを用いて，収集屎尿を 3 週間程度処理し町内農地で有機液肥として循環利用している．本プロセスは温度や溶存酸素濃度，細菌群集構造で区別される 3段階のフェーズを経て進行することが明らかになっている．それは既知の ATAD法や活性汚泥法とは全く異なる，ダイナミック且つユニークな細菌群集構造の遷移を見せる 1）．即ち，（1）市販酵素粉末（EP, 300PPM)を添加した貯留し尿を処理槽に導入し曝気を開始すると，1-2 日の急激な酸素消費による溶存酸素濃度（DO)，酸化還元電位（ORP)の低下，有機酸の分解消失とｐ H 上昇を引き起こす（初期）．その後，DO， ORP の漸次回復とともに温度上昇速度も徐々に減衰するが一週間以内に品温は 50 度 C を超える（中期）．その後高い DO と高温は一週間以上安定に維持される(後期）．
（2）消化初期では Proteobacteria 門の特定細菌種が活発に増殖して優占し，有機酸の分解に関わっていると考えられる．本菌は中期に向かって急速に死滅するが，この際グラム陰性細菌に対して特異的な溶菌活性が上昇している 2)．消化中期では Bacteroidetes 門細菌が台頭し遷移的細菌叢が形成される．後期においては Actinomycetes 門および Firmicutes 門の OTU(Operational Taxonomic Unit)が優占するが，これらはいずれも既知の近縁菌と分子系統学的に遠く離れた未分離菌である．
（3）本プロセスでは活性汚泥法などで観察される硝化反応が進行せず硝酸が蓄積しない．従ってある種の Proteobacteria が好気条件下で行う脱窒反応も観察されない．COD は低下するが弱アルカリ条件下でアンモニア濃度は維持され，液系の窒素肥効成分のロスは少ない．これらは 16S ｒ RNA アンプリコン解析
による細菌群集構造変化と共に，各消化期試料のメタゲノム解析からも支持された．
我々はこのような類例を見ない ATAD プロセスが進行する理由について明らかにするために，1．5L 容の自吸式通気撹拌装置を備えたリアクターを設計して，通気撹拌の効果，EP の添加効果，および実機槽内に共棲する細菌群の効果について検討した．その結果，強い通気撹拌と温度上昇が初期における細菌群集構造遷移に重要であり，EP の効果は低いこと，消化後期の特徴的な細菌群集構造
形成と迅速な安定化には消化槽共棲細菌群が大きく関わっていると考えられた．本シンポジウムでは，槽内に共棲し消化後期に優占する未分離好熱菌とともに，興味深い複合微生物系の形成に関係するシステム, 有機液肥が水田土壌細菌叢に及ぼす影響についても議論をしたい．
1) Tashiro Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 84(6):e02537-17(2018)
2) Cheng H. et al., J. Biosci. Bioeng. (2018) In press

Field agri-omics dissects organic agriculture

A unique autothermal thermophilic aerobic digestion system with concern
to self-inducing aeration and inhabiting bacterial community○Yasunori Ichihashi1,2(1BRC, RIKEN, 2PRESTO, JST)Key words

field omics○Kenji Sakai, Yukihiro Tashiro(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
autothermal aerobic digestion, bacterial consortium, human excreta,liquid fertilizer

215

S3Cb04

三菱ケミカルが取り組む KAITEKI 実現（SDG ｓ）への取組み

S3Cb05○水無 渉（三菱ケミカル（株））
mizunashi.wataru.mv@m-chemical.co.jp

魚類腸内環境と水環境のエコインフォマティクス○菊地 淳 1,2,3（1理研・環境資源, 2名大院・生命農, 3横市院・生命医）
jun.kikuchi@riken.jp

国連は，2015 年に開催した「国連持続可能な開発サミット」において，持続可能な開発目標（SDG ｓ）を掲げた．これは，「極度の貧困解消」と「持続可能な社会」の実現の二本柱であり，全ての国が達成する目標としている．SDG ｓ
で設定されている 17 の達成目標において，バイオテクノロジーやバイオ素材利活用などは一つの有力な手段であり，どのように取り組むかが本開発目標の達成のみならず，事業化促進や経済成長のためにも重要と思われる．
目標 2（飢餓をゼロに），目標 3（すべての人に健康と福祉を）においては，ス
マート農業等による革新的な食糧増産及び高品位・高機能な食品の生産や食を通した健康増進への取組み．目標 6（安全な水とトイレを世界中に），目標 11（住み続けられるまちづくりを）などは，生物機能を用いた廃水・廃棄物処理技
術この高度化や農業・工業との連携などによる安全な水環境・地環境の維持への取組み．目標 7（エネルギーをみんなに そしてクリーンに），目標 9（産業と技術革新の基盤をつくろう），目標 12（つくる責任 つかう責任）などは，バイオベース素材の有効な活用や人工光合成も含めた光エネルギーの利活用を通したモノ作り改革などへバイオは有効な手段の一つである．その他の目標についても上記の目標達成の過程を通して大きく貢献するものと考えられる．いずれにしても SDG ｓの目標達成に向けて多くの手段を連携させて，社会システムの革新に繋がる取り組みが重要である．
本シンポジウムでは，三菱ケミカルが取り組んでいる環境負荷軽減について，広い観点から紹介して SDG ｓ目標達成を通した「持続可能な社会」の実現への議論をさせていただければと考えている．
(1)植物由来バイオプラスチック(2)環境調和型生産技術(3)植物工場を用いた高機能品(4)MBR（Membrane Bio Reactor）による高度廃水処理(5)機能性食品素材(6)機能設計に関する技術開発 など
日本企業の取組みも当初の認知度は高くはなかったものの，最近では急速に認知が進んで，積極的に取り組む姿勢が増えているように思われる．目標 17（パートナーシップで目標を達成しよう）に示されているように国内外含めた各企業
やアカデミアとの強力な連携により，持続可能な社会の実現という目標の達成を目指したい．
最後に弊社のコーポレートビジョンを紹介する．
『三菱ケミカルホールディングス（MCHC）グループは，環境・社会課題の解決に貢献し，持続可能な社会を皆さまと一緒に築くこと，すなわち「KAITEKI 実
現」をビジョンに掲げている．
「KAITEKI」とは，「時を越え，世代を超え，人と社会，そして地球の心地よさが続く状態」を表し，環境・社会課題の解決にとどまらず，社会そして地球の持続可能な発展に取り組むことを提案した MCHC
グループオリジナルのコンセプトです．MCHC グループは，その実現をビジョンに掲げ，化学を基盤とした，機能商品，素材，ヘルスケア分野で，グループ
総合力による製品・技術・サービスの提供を通じた企業活動を展開しています．』
弊社ホームページより．

今世紀に進行する第 4 次産業革命では，IoT/ビッグデータ/AI 関連技術の進展により，1 次産業にデジタル化および将来予測化とフィードバック制御を導入し得る．しかし AI 関連技術が発展する一方[1]，その学習データ取得のために試料数(N)を多くすると分析コストが高くなるため，「予測科学」領域において多因子数(P)データを産出するオミクス手法の導入は鈍い（新 NP 問題）．そこで
我々は，日本各地の環境水[3,4]，底泥[5]，天然海藻[6,7]，や天然魚類[8-11]を対象とし，試料数 N が因子数 P より多い場合，あるいは試料数 N が因子数 P より少ない場合について，それぞれ環境評価法と将来予測法の開発を試みてきた．
一方で，世界随一の生物多様性ホットスポットたる日本近海には優れた生物資源が埋もれている．豊かな日本の「海を耕し」世界へ輸出するためには，MSC/
ASC の国際認証をクリアし得る環境低負荷型水産が必須である．従って生態系評価技術や，海外輸入の魚粉に頼らない飼料開発が必要とされる[12]．ここで「海を耕す」とは言え，陸上養殖にも高い期待が寄せられており，残餌や糞便の飼育水汚濁が問題になり得ることから[13]，やはり排水・廃棄物処理能力の高い環境微生物叢の評価技術が期待される[14, 15]．我々が着手してきた評価手法
は，環境試料の各種分析情報の分類，関係性，マーカー情報の同定を可能にし得る[16]．これらの手法を用いて，養殖場付近の生態系の恒常性維持に関わるルールと重要な鍵因子の抽出も可能となり得る[17]．また一連の環境予測技術を用いて，鍵因子の変動から生態系のバランスが崩れる前に，環境の変動を予測・早期警告をすることが期待できる．当該研究は理研 CSRS/名大院生命農/横市院生命の研究室員，ならびに水産研究・教育機構の共同研究者らと共に遂行された．

For the susutainable society ~ action to SDGs in Mitsubishi Chemical

Ecoinformatics approach of fish gut and aqueous ecosystem○Wataru Mizunashi(Mitsubishi Chemical Corporation)

Key words

SDGs, bio-base plastics, wastewater treatment, plant factry system＜参考文献＞[1] Date & Kikuchi, Anal. Chem. 90, 1805 (2018); [2] Asakura et al. Anal. Chim. Acta(in press); [3] Ogawa et al. PLoS One 9, e110723 (2014) ; [4] Oita et al. Sci. Total
Environ. 636, 12 (2018); [5] Asakura et al., Anal. Chem. 86, 5425 (2014); [6] Ito et al.,(Anal. Chem. 86, 1098 (2014); [7] Wei et al., Anal. Chem. 87, 2819 (2015): [8]Yoshida et al., Sci. Rep. 4, 7005 (2014); [9] Misawa et al., Anal. Chem. 88, 6130
(2016); [10] Wei et al., Sci. Rep. 8, 3478 (2018); [11] Asakura et al., Anal. Method 17,
16 (2018); [12] Mekuchi et al., Sci. Rep. 7, 9372 (2017); [13] Mekuchi et al., PLoS
One (in press); [14] Yamazawa et al. Molecules 18, 9021 (2013); [15] Yamazawa et al.
Metabolites 4, 36 (2014); [16] Kikuchi & Yamada, Analyst 142, 4161 (2017); [17]Kikuchi et al., Prog. NMR Spectrosc. 104, 56 (2018).

○Jun Kikuchi1,2,3(1RIKEN CSRS, 2Grad. Sch. Bioagri. Sci., Nagoya Univ., 3Grad. Sch. Med. Life
Sci., Yokohama City Univ.)

Key words

microbial flora, fish diversity, environmental analysis, data science

216

S3Db01

味噌の多様化における麹菌の可能性○今野 宏（秋田今野商店）
h-konno@akita-konno.co.jp

S3Db02鹿児島の壺造り黒酢の発酵と機能性○長野 正信（坂元醸造）
nagano@kurozu.co.jp

弊社では秋田県総合食品研究センターとの共同研究で味噌の高付加価値化を目
指し，α グルコシダーゼ高生産麹菌を用いた米味噌のイソマルトース増加効果
や「抗変異原性」の高い麹菌の開発を行ってきた．ここでは，その開発の一端を紹介する．
（抗変異原性を指標とした麹菌株の探索）味噌には様々な生理機能性があることが報告されている．その中でも発癌と密接な関係がある抗変異原物質は味噌に複数見出されている．脂肪酸エステル，不飽和脂肪酸，イソフラボン類がそれである．これらの抗変異原物質の生成や構造変化には麹菌の生成する酵素が密接に関与する．しかし，麹菌の菌株の違いにより味噌の生理機能性の違いを調べた例は少ない．そこで味噌の抗変異原性を増強できる可能性のある麹菌株の探索を行った．味噌の試醸には Aspergillus oryzae 21 株を用いた．味噌の抗変異
原性は Salmonella typhimurium TA98 を用い，Ams 試験のプレインキュベーショ
ン法により測定した．味噌の抽出液の抗変異原性は AOK139 が 97％と対照の味
噌用種麹菌より高かった．対照の IC50 は抽出液量の 1/3 程度であり有意な差が確認された．抗変異原性について味噌の脂質が関与している可能性が高いものと考え，脂肪酸エチルエステル及び遊離脂肪酸を分析したところ，遊離脂肪酸は対照味噌と比較して 3.5 倍高かった．そこで脂質分解に関与すると考えられ
る米麹のリパーゼ活性を比較したところ，対照区よりも 2.1 倍高かった．AOK139
株はリパーゼのみならずセルラーゼ，ヘミセルラーゼ，ペクチンリアーゼ活性も全て対照よりも高かった．以上の結果から脂質分解関連の酵素力価が高く，味噌の遊離脂肪酸を多く生産する AOK139 株は味噌の抗変異原性向上に有望な菌株として選択された．従来から脂肪酸エチルエステルの増加により味噌の香
気を増強する方法としてリパーゼ製剤の添加が行われている．AOK139 株を使用した味噌では対照の味噌用種麹にリパーゼ製剤 0.3U/g 添加した際と同等の脂肪酸エチルエステル含量を示した．官能評価では AOK139 味噌は特徴的な華やかな香りを有していて，かつ抗変異原性が高い味噌として高い評価を得た．
イソフラボン類にも抗変異原性は認められている．大豆イソフラボンには官能基の違いによってダイゼイン，グリシテイン，ゲニステインとそれぞれの配糖体ダイジン，グリシチン，ゲニスチンが知られている．分子内に OH 基が 2 個以上含まれていて，金属をキレートする作用を有し，いろいろの生理機能を持っている．これら大豆イソフラボノイド化合物は動物のホルモンであるエストロ
ゲンと類似の構造部分を有するためのホルモン様の生理作用を示す．乳癌発生率は西洋諸国が東洋諸国よりも高いことが病学的調査から明らかになり，それは遺伝的なものではなく，菜食主義者や大豆を多く食べる人々は植物由来のエ
ストロゲンの尿中濃度が高く乳癌罹患率が低く環境，食物が関与していることが明らかになっている．非発酵大豆（生大豆，豆乳，豆腐，おから）や発酵大豆（納豆，醤油）では抗変異原活性が低く，同じ発酵大豆（味噌，テンペ）では高い傾向が認められている．一方 HPLC の測定によると発酵大豆食品には大豆イソフラボン含量が多く，非発酵大豆食品には少ない傾向が見られることか
ら大豆食品における抗変異原性の発現には大豆イソフラボンが関与していることが推察された．さらにイソフラボンの形態について見ると，この作用には配糖体では弱く，アグリコン型になると強いことが明らかになっており，発酵食品にこの作用が強いのは，発酵中に麹菌の産生する β-グルコシターゼにより配糖体がアグリコンに変化するからで，発酵食品でも β-グルコシターゼの活性が異なり，納豆ではこの作用が弱いため，また醤油では一度生成したアグリコン
がさらに変化しているものと考えられる．
（α グルコシダーゼ高生産麹菌を用いた米味噌のイソマルトース増加効果）米味
噌の糖類はグルコースが大部分を占め，他にイソマルトース，フルクトース，
ガラクトース，マンノースなどが知られている．イソマルトースの甘味度は砂糖の半分程度で，まろやかな甘味を有することから，その含有量が味噌の甘味に影響すると考えられている．麹菌の違いにより味噌中のグルコース量とイソ
マルトース量の比（1M/G 比）が味噌で大きく異なり，それは使用麹菌の違いによる．デンプンからグルコースに分解される過程でマルトースを生成し，マルトースへの α グルコシダーゼの転移作用によりイソマルトース等のオリゴ糖が生成される．このイソマルトースの生成には α グルコシダーゼの転移活性が重要であり，またマルトースの生成に寄与する α アミラーゼ等のアミラーゼ活性も重要であると考えられる．前述した AOK139 株は対照の味噌用種こうじより α グルコシダーゼ活性が 2.6 倍高く，イソマルトースの生成に影響を与えている．AOK139 株を用いた味噌の官能評価は色，味，総合について有意に評価が高く，味については「マイルド」「はちみつ様な味」香りについては「砂糖醤油のような香り」「みたらし団子の様な香り」とコメントが得られた．味については AOK139 株を用いた味噌中イソマルトース量の増加がプラスに働いたもの
要因と考えられた．

鹿児島の壺造り黒酢（以下黒酢）は約 200 年前から鹿児島県霧島市福山町に伝
わる米だけを原料とした伝統的な米酢であり，野天に並べた壺で発酵・熟成を行う世界でも珍しい製法で製造されている．霧島市福山町は錦江湾（鹿児島湾）の北端に位置し，三方を山に囲まれ南側は海に面しており，冬は暖かく 夏は海風で気温がそれほど高くならないので微生物による発酵に適した土地柄である．
また三方を囲む山は約 25000 年前にできた姶良カルデラであり，中腹から出る豊富な湧き水は薩摩藩時代「廻(めぐり)の水」と呼ばれ藩内随一の水として折紙つきのものであった．更に霧島市福山町は薩摩藩時代には原料となる米が宮崎県都城盆地や大隅半島から集まり，鹿児島城下に上納米を搬送する港町として栄え，黒酢の製造に欠くことができない米と薩摩焼の壺を容易に入手することができたのである．これら黒酢造りに必要な米，地下水，壺そして発酵に適した気候であったことが江戸時代にマニファクチャーとして酢の製造が始まっ
た大きな理由と考えられる．黒酢は陶製の壺（胴径 43 ｃｍ，高さ 62 ｃｍ，内
容量 54L）に蒸し米・米麹・地下水を加え，水面を覆うように米麹を粒一層の厚さで振り撒き（振り麹），屋外で発酵を 3～6 ヶ月，熟成に 6 ヶ月以上かける
ので仕込みから収穫まで 1 年以上の時間をかけて製造される．使用される麹は黄麹菌であり，一般の醸造酢は，原料を糖化・アルコール発酵した後，種酢を加えて酢酸発酵を行い製造されるが，黒酢は酵母・酢酸菌の添加が一切行われない伝統的な製法で製造される．特筆すべき点は振り麹が発酵の前期（糖化・アルコール発酵）では蓋となり外界からの微生物の侵入を防ぎ，後期（酢酸発酵）ではこれが液中に沈み，空気が必要な酢酸菌の菌膜が水面に張ることができる状況を作り出すことである．この結果，黒酢の製法は糖化・アルコール発
酵・酢酸発酵が一つの壺で連続して行われる世界でも稀なものになっている．
なお，仕込みは春仕込み（4 月～6 月）と秋仕込み（9 月～10 月）の 2 シーズンに行なわれる．仕込み直後より発酵過程を解析すると，麹菌による糖化が始まると生成したブドウ糖を乳酸菌が乳酸発酵する．そして発酵液の pH は乳酸濃度の上昇により急激に低下する．このため，多くの有害微生物の生育が抑えられ，壺を屋外に設置していても発酵が安定的に進行し得ると考えられる．エタ
ノール濃度は発酵開始 7 日目で 5.5％となり，その後徐々に減少していき，エタ
ノール濃度の減少に対応するように酢酸濃度が直線的に増加する．最終的な酢
酸濃度は 6％程度に達する．このことから，壺の中で糖化，乳酸発酵，アルコー
ル発酵，酢酸発酵が順に生じていることが確認される．微生物叢の変遷を微生物を単離することなく壺から直接微生物の DNA を抽出し同定する DGGE 法（denaturing gradient gel electrophoresis,変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）で 16SrRNA
遺伝子を調べると，発酵開始直後は Lactobacillus fermentum，Lactococcus lactis，
Pediococcus acidilactici が検出され，乳酸菌が主要になっている．その後乳酸菌
は自分自身が産生する乳酸の酸性により死滅していくが，唯一耐酸性の乳酸菌である Lactobacillus acetotolerans だけが熟成期まで生存し続けていることが判明している．酢酸菌については Acetobacter pasteurianus が検出され，酢酸濃度が直線的に上昇し始める時期と検出時期が重なっており，酢酸生成に主として寄与していると考えられる．また，黒酢製造に関わる微生物の由来について解析 す る と ， 発 酵 初 期 で 主 要 な Lactobacillus fermentum ， Lactococcus lactis ，Pediococcus acidilactici は 米 麹 か ら 検 出 さ れ ， ま た ， ア ル コ ー ル 発 酵 酵 母
Saccharomyces cerevisiae も米麹から検出される．しかしながら耐酸性乳酸菌
Lactobacillus acetotolerans と酢酸菌 Acetobacter pasteurianus は醸造に使用する壺の内壁から検出されるので壺がバイオリアクターとして働いている．食酢に含有されている酢酸の機能性として静菌・殺菌作用，食欲増進作用，減塩効果，
疲労回復効果などが知られているが，これらの作用以外に黒酢は ○赤血球変形能改善作用 ○脂質代謝改善作用 ○抗酸化作用 ○血圧調節作用 ○血糖値改善作用○肝機能改善作用 ○免疫力増強作用 ○潰瘍性大腸炎抑制作用などの機能性が確認されている．これらの機能性が主成分である酢酸の効果ではなく，乳酸菌を含む複雑な微生物の働きによって産生された機能性物質の効果であることが証明されてきており，黒酢の独特な製造法が大きく関与していることは非常に興味深いものである．様々な作用を有する黒酢はメタボリック・シンドローム対策に有効な食品であることは間違いないと確信しているが，最近になり美容ア
ミノ酸である D-アミノ酸が食品としては豊富に含有されていることが判明し注目を浴びるだけでなく，新しい効果として痴呆や長寿遺伝子にも良い影響を与えることが報告されている．

Possibility of koji fungus in diversification of Miso

Fermentation and Functionality of Kagoshima Jar-fermented Amber Rice
Vinegar○Hiroshi Konno(Akita Konno Co., Ltd.)Key words

Aspergillus oryzae, Anti - mutagenicity, lipase, isomaltose○Masanobu Nagano(Sakamoto Kurozu,Inc.)

Key words

vinegar fermentation, DGGE, functionality

217

S3Db03

樽酒が食品の味わいに与える影響○高尾 佳史（菊正宗酒造）y-takao@kikumasamune.co.jp

S3Db04

生活者のすこやかな暮らしに貢献する味噌と米糀甘酒の
可能性
○北川 学
（マルコメ）
manabu_kitagawa@marukome.co.jp

1. 背景・目的
樽酒は清酒の一種であり，杉（Cryptomeria japonica）でできた樽に貯蔵することで付与される杉のさわやかな香りを特徴としている．清酒がビンやパックに詰められて流通している現在では，お祝いの席での鏡開きぐらいしか杉樽を見ることはないため，杉樽にわざわざ清酒を貯蔵することが不思議に思われるかもしれないが，昭和のはじめに一升瓶が普及し始めるまではほとんどの清酒が杉樽に詰められて輸送されていたため，結果的にほとんどの清酒が樽酒であったことになる．
前述のとおり，樽酒の最大の特徴は杉樽由来のさわやかな香りであり，これま
でに樽酒に含まれる杉由来の香気成分としてセスキテルペンアルコール類などが報告されている．一方，樽酒はそのさわやかな香りのためか，多くの酒造業者がうなぎなどの油っこい食品との相性が良いとしてきたが，これは科学的根拠に基づいたものではなかった．そこで，樽酒と油脂を多く含む食品との関係について調べるとともに，清酒と合わせることが多い和食にとって重要な要素の一つである旨味に樽酒が与える影響についても検討した．
2. 樽酒が油脂を多く含む食品に与える影響
樽酒と油脂を多く含む食品との関係を調べるために，まずは官能評価を行った．
清酒サンプルとして，アルコール度数 15%の本醸造酒（以下，対照酒）とこれを杉樽に貯蔵した樽酒を，食品サンプルとしてマヨネーズを用いた．マヨネーズを口にした 30 秒後に清酒を飲んでもらい，清酒飲用 30 秒後の感覚強度を 5段階で評価してもらったところ，対照酒に比べて樽酒では「マヨネーズの味」
や「油が残っている感じ」が低減する傾向にあることが明らかになった．樽酒
で口中の油感が低減したのは，対照酒に比べて樽酒は油脂との親和性が高いた
めに，油脂が口中から洗い流されやすい状態になっていたためではないかと考え，清酒と油脂の間の界面張力を調べた．その結果，試験に用いたすべての食用油，精製魚油において，対照酒に比べて樽酒では有意に界面張力が低下していた．この結果から，樽酒は対照酒に比べて油脂との間の親和性が高いために口中の油脂を洗い流しやすく，このために油っこい料理をさっぱりと食べさせる効果があると考えられた．
3. 樽酒が食品の旨味に与える影響
樽酒と食品の旨味の関係について調べるため，これまで同様の清酒サンプルと，旨味が強く感じられる食品としてあさりの酒蒸しの汁を用いて官能評価を行った．あさりの酒蒸しの汁を口にして 5 秒後に清酒を飲み，清酒飲用後 0，5，10
秒での旨味強度を 5 段階で評価してもらったところ，樽酒では，5，10 秒後で対照酒に比べて有意に旨味が強くなっていた．この結果から，樽酒には食品の旨味を強く，長く感じさせる効果があると考えられた．この効果について，さらに様々な食品を対象とした検討を行うために，味認識装置（インテリジェン
トセンサーテクノロジー社製 SA-402B）を用いた試験を行った．試験は旨味センサーを食品サンプルに浸したのちに清酒中で洗浄し，その後に残った旨味を測定することで行った．あさりの酒蒸しの汁を用いて試験を行ったところ，官能評価の結果と同様に，樽酒では対照酒に比べて旨味が強かった．さらに様々な食品を用いて試験を行ったところ，そばつゆ，うなぎのかば焼き，まぐろの刺身はあさりの酒蒸し同様に樽酒で旨味が強くなっていたが，一方で醤油や牛ステーキでは樽酒と対照酒の間に差が見られなかった．これらの結果から，樽酒には魚介類由来の旨味を増す働きがあると考えられた．さらに，樽酒中に含まれる旨味を強くする成分についても検討を行ったところ，杉樽由来の比較的極性が高く，揮発性が低い成分が寄与していることが示唆された．

1.背景・目的
日本に古くから伝わる麹菌を利用した発酵食品は，味噌，醤油，清酒，甘酒，
塩糀などバラエティーに富んでいる．古来より発酵食品は生活必需品であるが，現代ではすこやかな身体を育むエネルギーとして，その価値が再認識されている．和食という世界が認めた価値を発酵食品という魅力を通じて世界トップレ
ベルの長寿県・長野から国内外に発信するため，当社の研究開発について，今
回は味噌，米糀甘酒を中心に紹介したい．
2.味噌摂取が血圧に与える影響
ユネスコ無形文化遺産に登録された和食は一汁三菜が基本型である．その一汁を担うのが味噌汁である．日本の食文化に深く溶け込み，毎日の食事にはなくてはならない食材となっている．しかし，味噌，味噌汁には食塩が含まれるため，その健康への効果が過小評価される傾向にある．そこで，成分分析，動物試験やヒト試験を実施した結果，「味噌が血圧を上げる」という一説は事実とは異なっている可能性を報告する．
まず，味噌・味噌汁は「塩分が多く，血圧が上がりそう」と思われているが，実際，味噌汁 1 杯の食塩量は約 1.5～1.9g と他の食品と比較して食塩は多くない．更に，味噌には降圧物質が複数存在することが報告されている．低分子領域のアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害活性成分の他，分子量 3～5kDa にも降圧特性の異なる複数の物質の存在が報告されている．当社では ACE 阻害活性の測定と LCMS による成分分析を実施したところ，味噌には ACE 阻害活性があり，血圧上昇抑制効果のあるペプチドや未同定の新規降圧成分が含まれていることを確認した．
また，当社では味噌製造工程を変更し ACE 阻害活性を高めた新規開発味噌の製造に成功している．
味噌の降圧特性を検討するため，高血圧自然発症ラット(SHRsp/Izm)を用いて一
般味噌と新規開発味噌の比較検討を実施した．対照群には味噌水と同濃度の食塩水を与えた．餌は通常食を自由摂取させた．いずれの味噌摂取群でも対照群と比較して，1 週目から全期間中，血圧上昇を有意に抑制した．2，3 週目では新規開発味噌群の血圧が一般味噌群の血圧よりも低くなったことから，一般味噌よりも強い降圧効果を示した．
これまで長期の味噌摂取がヒトの血圧に与える影響は，疫学調査を除き検討されていない．そこで，長期の味噌摂取がヒトの血圧に与える影響について明らかにするため，正常血圧からステージＩ高血圧者を対象に二重盲検並行群間比較試験を実施した．試験食は，一般味噌または新規開発味噌を用いた．対象者39 名を一般味噌群と新規開発味噌群との 2 群に分け，1 日 2 杯の味噌汁（味噌32g/日，食塩量 3.8g/日に相当）を普段の食事に加えて，12 週間毎日摂取させ，この間の血圧に及ぼす影響を調べた．全被験者でみると，摂取前と比較し，新規開発味噌では 8 週目に収縮期血圧が低下傾向，一般味噌では 12 週目に拡張期血圧が有意に低下した．一般味噌では hANP が正常範囲内で有意に増加した．
この hANP の増加は味噌摂取時のナトリウム・水利尿作用の少なくとも一部に関与する可能性が考えられる．新規開発味噌は ACE 阻害活性を指標に開発されたことから，レニン・アンジオテンシン系および交感神経活性に依存する血圧調節への作用が期待される．全被験者を，正常～正常高値（正常群）とステー
ジＩ高血圧（高血圧群）の 2 群に層別化した解析結果でも血圧上昇はなかった．
以上より，味噌摂取により血圧は低下または不変と食塩増の影響を受けなかった．正常血圧のみならず I 度高血圧者においても 1 日 2 杯程度の味噌汁摂取の安全性は実証された．
以上の結果より，これまで最も懸念されていた味噌摂取と血圧上昇との関連性が本研究により否定され，通常の味噌摂取の安全性が示された．今後は，味噌の健康機能性を実証するさらなる研究の進展が期待される．
3.米糀甘酒摂取による皮膚バリア機能改善効果
これまでに，当社ではヒトの味噌摂取による肌状態への影響を確認している．
味噌汁を 2 週間毎日摂取することで肌の保湿状態が改善された．そのメカニズ
ムの一端は味噌に含まれる成分(大豆，米糀または発酵物)による角層セラミドの増加作用が考えられた．今回，味噌の原料である米糀に着目し，米糀甘酒摂取による肌水分量およびバリア機能への影響を検討するため，肌の乾燥を自覚し，角層水分量の低い健常女性 64 名を対象に無作為化二重盲検プラセボ対照並
行群間比較試験を実施した．試験食は，米糀甘酒または米糀を含まないプラセ
ボ飲料とし，8 週間摂取させた．40 歳以上で皮膚バリア機能が低下している 19名を対象に解析した結果，米糀甘酒摂取による水分蒸散抑制効果（保湿効果）が認められた．本研究により，肌のバリア機能改善が示唆されたことから，米糀甘酒は，肌保湿効果を有する健康食品としての利用が期待される．
4.日本古来の発酵技術を通じて生活者のすこやかな暮らしに貢献する
いつまでもすこやかで美しくありたいという人々の思いが発酵食品の未来を変えようとしている．これまでの研究により，味噌，米糀甘酒のもつ健康機能性が解明されつつある．今後は更に詳細な検討を進め，発酵食品を通じて人々の暮らしに貢献したい．

Effect of taru-sake on tastes of foods

Potential of Miso and Amazake contributing to healthy lifestyle○Yoshifumi Takao(Kiku-Masamune Sake Brewing Co., Ltd.)Key words

sake, taru, Cryptomeria japonica, food pairing○Manabu Kitagawa(Marukome Co.,Ltd.)Key words

miso, amazake, blood pressure, skin condition

218

S3Eb01

プロトン駆動力による光合成のフィードバック制御○皆川 純（基生研・環境光生物）
minagawa@nibb.ac.jp

光合成反応は駆動に光エネルギーを必要とする以上，その光エネルギーを消化しきれない場合に反応の場に傷害（光阻害）が起こることは不可避である．この光阻害に備える防御機構は光合成生物の生存にことさら重要であり，広く保存されている．一連の光合成反応の中でもその根幹となる光化学反応を担う部
分は，今から 30 億年近く前にはすでに完成されていたとされるが，その後の光合成生物の進化は，おもにこうした光阻害への防御機構など環境適応機構の進化にあったと言っても過言ではない．しかし，現在の栽培環境の作物などは必
ずしも光合成と光防御のバランスが最適化された状態にあるとは限らない．なぜなら，それらの植物は，進化した環境とは異なる環境で人為的に育てられているからである．というわけで，現存する植物の光合成機能を向上させようとする場合，その環境ごとの光エネルギーの「利用」と「散逸」を再調節し，光合成と光防御のバランスを再最適化することが重要である．
平成 28 年度より，新学術領域「新光合成・光エネルギー変換システムの再最適化」が発足した．この新学術領域は，植物生理学，生化学，遺伝学，構造生物学，電気生理学などの専門家が，光合成を再最適化するために力をあわせ，葉緑体チラコイド膜を介したプロトン駆動力（膜電位およびプロトン濃度勾配）がいかに制御されているか，そしてその制御によって，光エネルギーの「利用」と「散逸」のバランスがいかに最適化されうるのか解明に取り組んでいる．本
講演では，新学術領域「新光合成」の理念 1)とともに，我々の研究グループが近年迫りつつある過剰エネルギー散逸の仕組み，特に緑藻におけるエネルギー
散逸に必要な LHCSR3 タンパク質の発現誘導機構 2) ，LHCSR3 タンパク質が実際にエネルギー散逸を引き起こす分子メカニズム 3,4) ，LHCSR1 タンパク質によるエネルギー散逸機構 5) について解説する．
1) 皆川純 (2016)「光合成を自在に最適化する」実験医学 34: 2747.
2) Petroutsos et al. (2016) Nature 537: 563-566.
3) Tokutsu, R. and Minagawa, J. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110:
10016-10021.
4) Kim et al. (2017) J. Biol. Chem., 292: 18951-18960.
5) Kosuge et al. (2018) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 115: 3722-3727.

Feedback regulation of photosynthesis by proton motive force○Jun Minagawa(Div. Env. Photobiol., NIBB)

Key words

photosystem II, light harvesting

S3Eb02

代謝工学による光合成の統合解析と工学応用
豊島 正和, 戸谷 吉博, 松田 史生, ○清水 浩（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp

循環型社会の創成に向けて，藻類の利用は生物工学において重要なテーマである．最近の光合成研究の進展によりの光合成生物は，局所環境に適応し，「光エ
ネルギーの効率的利用」と「過剰光からの防御」のバランスを調節していることが分かってきた(Nature 2016)．二酸化炭素と光エネルギーからバイオマスや物質生産を行う方法の開発は次世代生物生産の重要な技術になると期待されているが，2 つの機能のバランスとその変化が中枢代謝に及ぼす影響など，シス
テムとしての理解は十分ではない．
我々の研究グループでは，これまでに，生物工学で用いる様々な微生物に適用可能なゲノムスケール代謝モデル（GMM）を用いたシミュレーション法を用いて代謝を統一的に解析する方法を開発してきた．また，細胞を培養系において，
13
C 標識炭素源を栄養源として取り込ませ，その標識炭素がどの代謝物質に含まれているかを質量分析法を用いて定量分析することで，中枢代謝の反応速度（代謝フラックス）を定量解析する 13C 代謝フラックス解析システムを開発し，代謝状態を実験的に解析，評価する手法を同時に開発してきた(BioMed Res Int.
2014) ． 本 研 究 で は ， こ れ ら の 代 謝 工 学 手 法 を 光 合 成 シ ア ノ バ ク テ リ ア
Synechocystis sp. PCC6803（GT）株（以下，Syn 株）に展開し，光化学系と中枢代謝を統一的に扱うことで，システムとしての理解を深めることを目的とし研究を行った．ゲノムスケールの代謝モデル（GMM）を開発し(Appl Microb
Biotechnol.2011)，シミュレーションによって異なる栄養条件での光化学系の活性と中枢代謝の状態をとらえることに成功した．また，13C 代謝フラックス解析システムを用いて実際の代謝状態を決定し，シミュレーションによって代謝状態を予測可能であることを示した．
このゲノムスケールモデルを利用して，エタノール合成経路を付与した Syn 株
において，エタノー生成を増加させることが可能な遺伝子破壊をシミュレーショ
ンにより網羅的に探索したところ，ndh を破壊することでエタノール生産量増加につながることが見いだされ，実際に ndhF1 破壊株においてエタノール生成を確認したところ生成量が増加することが確認された(Bioprocess Biosystems Eng2017)．そこで，より詳細に光化学系の電子伝達フローを解析することを目的として光化学系の反応を素反応レベルに分解し，それぞれの素反応の電子伝達，
NADPH や ATP 生成フラックスを議論できるレベルのモデルとして再構築した．
この詳細なモデルのより各光受容体で受け取った光エネルギーと電子伝達，
PSII，PSI への電子フラックスの分配，サイクリックエレクトロンフロー，非光化学的消光（NPQ）などと細胞の増殖の関連を議論することが可能となってきている．また，各波長の光の利用の仕方についてもシミュレーションができるモデルとして改良している．
さらに，光強度など，環境状態が変化した際の光化学系，代謝系のタンパク質
量と代謝状態を定量的に解析することを目的として，定量プロテオーム解析，
定量メタボローム解析，同位体標識培養実験を行った際の代謝物内の標識量の解析のシステムを開発した．開発した手法を用いて，光条件，窒素源濃度などの環境条件，細胞をグローバルに制御する転写制御因子の発現量が異なる株の光化学系と代謝の状態を解析し環境変動と各代謝経路の活性化状態をとらえることが可能となった(J Biosci Bioeng 2018，Plant Cell Phsiol 2017)．これらの実験で得られた知見とゲノムスケールモデルによる包括的代謝シミュレーションを基盤として議論し，光合成を新たに最適化していく戦略を提案していきたいと考えている．

Systems Analysis and Metabolic Engineering of Photosynthetic Organisms
Masakazu Toyoshima, Yoshihiro Toya, Fumio Matsuda, ○Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Key words
Synechocystis sp. PCC6803, genome scale model (GMM), 13C
metabolic flux analysis, metabolic engineering

219

S3Eb03

中枢代謝を利用した物質生産と光合成能の改変○小俣 達男 1, 高谷 信之 1, 池田 和貴 2, 愛知 真木子 3, 西山 佳孝 4（1名大院・生命農学, 2理研・統合生命医科学研究セ, 3中部大・応生, 4埼大院・理工学）
omata@agr.nagoya-u.ac.jp

1. 研究の背景
人類は古くから食糧・食品としてだけでなく，薬品，燃料，建築・工業素材の主たる供給源として植物を利用してきた．近代に入ってエネルギーと化学工業分野で化石燃料への依存を強めたが，今日，化石燃料の消費削減のため，再び光合成による物質生産の活用を図っている状況である．しかし，今日の課題は，(1)以前に比べて桁違いに増大したエネルギー需要に対し，(2)農業生産や食糧需給に干渉することなく，(3)生態系への影響を最小限に抑制しつつ対応することであり，その達成は容易でない．2,000 年代に実用化された植物由来バイオエタ
ノールは(2)の要件を満たせず，2,000 年代後半からは微細藻類を用いたバイオ
燃料生産の研究が進められているが，今日に至るまで実用化の目処が立っていない．本講演ではこの原因を検討し，光合成微生物を用いたバイオ燃料生産の実用化のための新たな方策を提案する．
2. 問題点とその解決のための方策
真核微細藻類は，栄養欠乏時にトリアシルグリセリド（TAG）を細胞内に蓄積し，その量は乾燥重量の 50％にも達する（生産物/細胞比＝ 1）ので，バイオ燃料生産の研究に広く用いられている．しかし，TAG の効率的抽出のためには細胞を乾燥させる必要があり，そのための熱エネルギーを考慮するとエネルギー収支比(EPR, 燃料のエネルギーをその生産に要したエネルギーで割った比)が 1に達しない 1）．さらに，TAG を完全に抽出してもこれと等量の細胞残渣が発生するので，化石燃料消費（年間 100 億トン C 相当）の 10％を TAG 由来のバイ
オ燃料で代替すると年間約 10 億トンの細胞残渣が生じることとなり，上記(3)の要件を満たすのはむずかしい．これらの問題を包括的に解決する唯一の方法として，我々は光合成産物を細胞外に放出させることを提案している．生産物/
細胞比＝ 1 程度であっても，細胞を乾燥せずにすべての油脂を抽出できればEPR = 1.3 と推計されるので 1)，細胞と当量の脂質を細胞外に放出させればこの値を達成できる．さらに生産物/細胞比を 4 まで上げることができれば，実用的な燃料のもつべき EPR 値とされる 5 にも迫ることが可能である．光合成微生物の細胞は本来，光合成産物を外に漏らすことはない．一方，植物の葉肉細胞は光合成産物のほとんどを細胞外へ排出する．本来は自身の細胞分裂に利用する有機物質を細胞外へと導く点で，我々が提案するアプローチは，光合成微生物の光合成を「植物型」の光合成に変換するものと位置づけることができる．
3. 研究の現状と将来の見通し
光合成微生物の中枢代謝経路からは，様々な物質を取り出すことが理論的に可能である．実際，ラン藻を用いた代謝工学的研究によって糖・アルコール，アルデヒド，有機酸，炭化水素など多種多様の物質の生産が報告されている．これらの物質の多くは細胞外に放出されるので，いずれの物質をターゲットとしても大量生産系実現の可能性があるが，屋外の開放系での大量生産を考えた場
合には引火性，毒性，揮発性を持たないことが重要なので，我々は遊離脂肪酸（FFA）の生産系の改良に取り組んでいる．Synechocystis sp. PCC 6803 を用いたラン藻での FFA 生産の最初の報告 2)では生産物/細胞比は 0.13 と低く，また生産速度も 0.44 mg L-1 h-1 で TAG 生産系の数分の一程度であった．我々は，まずSynechococcus elongatus PCC 7942 がきわめて高い潜在的 FFA 生産能力をもつことを見出し，この株を材料として用いることとした．ただし，この株から初めに作製した生産株は細胞内に FFA を過剰蓄積し，光に対して超感受性を示した
結果，生産性がきわめて低かった．そこで，細胞外への FFA の能動的排出能力の強化 3)，FFA の受動的放出の強化 4)，培地からの FFA の速やかな除去 5)によって増殖を安定化し生産性を向上させた．さらに，細胞当たり生産量を増やすた
めに細胞の増殖を制限することにより，当初の生産物/細胞比 0.1，生産速度 0.35
mg L-1 h-1，FFA 収量 0.08 g L-1 の数値をそれぞれ，0.9，1.8 mg L-1 h-1，0.43 g L-1に高めることに成功した（Kato et al. 投稿準備中）．ラン藻を含めて光合成微生物は一般的に弱光条件を好む傾向があり，太陽光下では光阻害を受けやすいた
め，我々も現在は屋外光の数分の一以下の光条件で研究を行っている．今後は，より強い光の下で，より多くの光エネルギーを FFA 生産に結びつけることが，さらなる生産性向上の鍵となると考えて研究を進めている．
引用文献
1) Lardon et al. (2009) Environ. Sci. Technol. 43: 6475-6481
2) Liu et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 6899-6904
3) Kato et al. (2015) Plant Cell Physiol. 56: 2467-2477
4) Kato et al. (2016) Biotechnol. Biofuels 9: 91
5) Kato et al. (2017) Biotechnol. Biofuels 10: 141

Secretion of the product is essential for exploitation of the central metabolic
pathway of photosynthetic microorganisms for sustainable production of
biofuels○Tatsuo Omata1, Nobuyuki Takatani1, Kazutaka Ikeda2, Makiko Archie3,
Yoshitaka Nishiyama4(1Grad. Sch. Bioagric., Sci., Nagoya Univ., 2IMS, RIKEN, 3Coll. Biosci. Biotechnol.,
Chubu Univ., 4Grad. School. Sci. Eng., Saitama Univ.)
Key words
biodiesel fuel, Synechococcus, fatty acid, photosynthesis

S3Eb04

駆動力形成を担うイオン輸送による光合成調節○魚住 信之, 辻井 雅, 狩野 文香, 解良 康太, 浜本 晋, 斉藤 俊也（東北大院・工）uozumi@biophy.che.tohoku.ac.jp

光合成明反応は，光エネルギーをチラコイド膜に電気化学的ポテンシャルとして蓄える反応である．これにより，チラコイド膜にプロトン駆動力(PMF)が形成される．プロトン駆動力はチラコイド膜を隔てた H+濃度差（ΔpH）と膜電位（Δψ）の二つの成分で構成される．チラコイド膜の H+輸送体は電子伝達系の膜タンパク質であり，光合成伝達系の本体は H+輸送体である．一方，チラコイド
膜の膜電位を形成するイオン輸送体の情報は限られている．膜電位を決定する
主要な成分の一つは K+輸送である．これまでに，シロイヌナズナの葉緑体や藍藻のチラコイド膜，葉緑体包膜や藍藻の K+輸送体が同定されている．藍藻や植物の葉緑体は強光を受けると光リン酸化反応によりチラコイドルーメン側に過剰に H+が蓄積する．炭素同化反応に利用されない過剰のエネルギーは光阻害を引き起こす．
ストロマの K+濃度の調節に関わる輸送体
チラコイド膜の膜電位は，ストロマ側とルーメン側のイオンによって決定される．藍藻の細胞膜には，Ktr(Trk/Ktr/HKT 系)と Kdp の 2 種類の K+トランスポー
ターが機能している．この 2 つのトランスポーターは原核・真核生物に広く存在する．藍藻 Synechocystis sp. PCC680 の KtrABE は，Na+で活性化される K+取込み系であり，HCO3-を細胞内に取込む SbtA トランスポーターの活性に必要である(JBC 2005, J Bacteriol 2006, 2010)．また，Kdp は，低濃度の K+環境になると二成分系によって誘導され，細胞内 K+の恒常性の維持を担う(J Bacteriol 2015)．
Ktr と Kdp の発現は概日性を示し，光合成に合わせるように日が昇る時期に発現量は上昇する．一方，水チャネル AqpZ と機械受容性チャネル MscL は宵の口に発現が上昇する(JBC 2011，J Bacteriol 2012, Channels 2013）．光合成産物の増減にともなって変動すると考えられている．
葉緑体・藍藻のチラコイド膜の陽イオン/H+対向輸送体
シロイヌナズナ KEA3 はチラコイド内からストロマに H+を輸送することによって，過剰な PMF を抑制すると複数のグループから報告されている．KEA1-KEA6の輸送活性を直接に実測した報告なく，K+/H+アンチポーター活性の証明はない．我々は 6 つの KEA1-KEA6 を発現した大腸菌から反転膜を調製後，アンチポーター活性測定を行ったが，KEA1-KEA6 のアンチポーター輸送活性は検出できなかった．KEA3 のスプライスバリアントや Na+/K+選択性に関与するアミノ酸の置換体においても，野生型と比べてアンチポーター活性に変化は見られなかった．一方，KEA1-KEA6 で K+の内向き輸送活性は検出された．また，K+の排出輸送活性もいくつかで検出された．上記の結果は，KEA1-KEA6 は K+輸送体として機能することを示している．
葉緑体の先祖の藍藻は葉緑体の機能や光合成機能の解明と考察にとって重要である．Synechocystis sp. PCC680 には KEA3 のホモログ蛋白質の NhaS1-NhaS6 がある．その中でも NhaS3 は KEA3 と最も相同性が高い．NhaS3 は Na+/H+アンチポーター活性をもつ(JBC 2009)．一方，K+/H+ アンチポーター活性はみられな
い．抗体を作製して局在性を調べると，チラコイド膜に強いシグナルが現れ，原形質膜にも弱いシグナルが検出された．これを確認するため，GFP を付与した NhaS3 を藍藻に発現させて，フレンチプレス破砕，ショ糖密度勾配遠心分離法による原形質膜とチラコイド膜の分画後，Western Blotting 法により NhaS3 の局在性を解析した．この結果，NhaS3 はチラコイド膜に局在することが確認された．nhaS3 は null 変異株を取得できないことから NhaS3 は生存に必須の機能を持つことが予想される．knock-down 株では，塩感受性を示すことから耐塩性に必要であることが分かっているが，光合成への関与は明らかではない．
気孔開閉の調節を担う輸送体を調節する Ca2+センサー蛋白質と細胞膜移行
光合成に必要な二酸化炭素は気孔を通って供給される．気孔開閉はイオン輸送体によって調節されている．数々の輸送体は，連動して気孔開閉に向けて活性化または不活化する必要があるが，それを統御する因子は細胞内調節因子である．植物には水溶性 Ca2+センサータンパク質の Calcium-dependent protein kinase(CPK) と Calcineurin B-like protein (CBL)が輸送体の調節を担っていることが知られている．気孔閉鎖時には孔辺細胞はしぼむ必要があり，陰イオンの排出が盛んになる．SLAC1 陰イオンチャネルは，CPK6 によってリン酸化を受けて活性化する．陰イオンは陽イオンと同様に膜電位調節に関与する．CPK6 は細胞膜に移行して SLAC1 に近づく必要がある．CPK6 は 2 種類の脂肪酸修飾を細胞質（ミリストイル化）とゴルジ体（パルミトイル化）で受けて原形質膜への移行が可能となる．また，CBL5 と CIPK11（CBL-interacting protein kinase）は相互作用する．CBL5 にも 2 種類の脂肪酸修飾部位が存在しており細胞膜に移行する．
CBL5 はリン酸化酵素の CIPK11 を細胞膜へ引き連れて SLAC1 をリン酸化する．
輸送体を調節する Ca2+センサータンパク質も N-ミリストイルトランスフェラー
ゼ（NMT）やパルミトイル化を触媒する酵素であるプロテインアシルトランス
フェラーゼ（PAT）により調節される（New Phytol 2018)．膜輸送体と細胞内因子によって協奏的に調節されている．

Photosynthesis regulation by ion transport system responsible for proton
motive force formation○Nobuyuki Uozumi, Masaru Tsujii, Ayaka Kano, Kota Kera, Shin Hamamoto,
Shunya Saito(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

membrane potential, transporter

220

S3Fb01

ケイ素を胞子表面に蓄積する Bacillus 属細菌の解析と界面バイオテクノロジーへの応用

S3Fb02○池田 丈, 廣田 隆一, 黒田 章夫（広島大院・先端物質）
ikedatakeshi@hiroshima-u.ac.jp

ケイ素（シリコン，Si）は酸素に次いで地殻上に二番目に多く存在する元素であり，産業的にも広く利用されている．特に，単体のケイ素は主要な半導体材料であり，現在の情報化社会を支える基盤となっている．多くの生物にとっては関わりの薄い元素だと言えるが，一部の真核生物（珪藻や放散虫，一部の海綿や一部の高等植物など）は可溶性のケイ酸（Si[OH]4）の形でケイ素を積極的に取り込み，その重合体である固体のシリカ（SiO2）を骨格や殻などとして利用することが古くから知られている．その一方で，原核生物とケイ素の関わりについてはこれまでほとんど報告がなかった．多様な代謝系を有する原核生物の中には，環境中に豊富に存在するケイ素を積極的に利用するものもいるのではないか，という考えのもと，当研究室ではケイ素を利用する細菌の探索を行った．培地に添加したケイ酸の取り込みを指標にスクリーニングを行ったところ，
土壌より単離した 240 株のうち約 1 割という意外なほどの高頻度でケイ酸の取り込みが認められた．16S rRNA 配列に基づく系統解析の結果，ケイ酸の取り込みを示した株は全て Bacillus 属に属し，特に B. cereus に近縁なものが多かった．
B. cereus をモデルとして解析を行った結果，本菌が胞子を形成する時期にケイ酸が細胞内に取り込まれ，細胞内で重合されてシリカとして胞子表面に蓄積されることを発見した．蓄積されたシリカは，胞子殻（spore coat）と呼ばれる多数のタンパク質で構成される層とその近傍に局在し，胞子の酸耐性を向上させることも明らかとなった．胞子を酸処理に供して有機物を分解した後，残存するシリカを電子顕微鏡で観察したところ，胞子サイズの殻状の構造体が認められた．これらのことから，胞子を覆う形でコーティングしているシリカ層が，酸に対する防壁として機能していることが示唆された．ケイ素を利用すること
で酸性条件下における自身の生存率を高めるという独自の生存戦略だと考えられる．
本菌のシリカ蓄積メカニズムを解析する過程で，胞子殻に存在するタンパク質のひとつである CotB1 がシリカ蓄積に関与していることを発見した．また，本タンパク質の機能領域がシリカに対する親和性を発揮することを見出し，この配列を基に新規のシリカ結合ペプチドを開発した．本ペプチドをタグ配列として遺伝子工学的に融合することで，シリカに対する結合能を任意のタンパク質に付与することができる．本技術を利用することで，可溶性の生体分子である
タンパク質と無機固体であるシリカ（および半導体である単体のケイ素）という異種材料を融合した新たなテクノロジー開発が可能となる．実際に，半導体デバイスをベースとしたバイオセンサーの開発や，安価なシリカ粒子を担体としたタンパク質のアフィニティー精製法の開発などを進めており，本発表ではこれらの応用展開についても紹介したい．

Silicon accumulation on the spore of Bacillus species and its application tosilicon-based biotechnology○Takeshi Ikeda, Ryuichi Hirota, Akio Kuroda(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

Bacillus cereus, biomineralization, semiconductor, silica

微生物を用いた土壌からのヒ素可溶化：知られざる発酵
細菌の重要性○天知 誠吾 1, 堀 知行 2, 山村 茂樹 3
（1千葉大・園芸, 2産総研, 3国環研）
amachi@faculty.chiba-u.jp

ヒ素汚染には，東南アジアの地下水汚染に代表される自然作用によるものと，工場跡地の土壌汚染など人為由来のものがある．我が国においても，ヒ素は検出頻度の高い汚染物質の 1 つであり，土壌汚染対策法の基準超過事例数に占める割合も高い．現在，ヒ素汚染土壌の処理法として封じ込めや掘削除去が一般的だが，高コストのため処理に至らず，低・未利用地となる問題も生じている．
これに対し近年，微生物のヒ素酸化還元能や，ヒ素高度蓄積植物（モエジマシダ）を用いたヒ素汚染修復法が注目されている．
土壌中のヒ酸 As(V)を異化的に還元する細菌（異化的ヒ酸還元細菌）は，鉄やアルミニウム鉱物に吸着しているヒ酸を，吸着性の低い亜ヒ酸 As(III)に還元し液相に溶出させる性質を持つため，土壌中ヒ素の可溶化・除去技術への応用が期待されている．このような細菌は，ゲノム中に異化的ヒ酸還元遺伝子（arrAB）
を有しており，ヒ素の存在下でその発現が顕著に上昇する．また解毒的ヒ酸還元酵素遺伝子（arsC）を中心とする遺伝子群も存在し，ゲノム上でヒ素代謝酵
素遺伝子群（arsenic island）を形成する．転写解析や発現タンパクの質量分析により，ヒ素存在下ではこれらヒ素代謝酵素のみならず，抗酸化酵素，ストレス応答タンパク，folding 関連タンパク，分子シャペロンなどが協調的に発現上昇
し，ヒ素耐性を獲得することがわかってきた．一方これまでに，ゲノム上にarrAB を有していない異化的ヒ酸還元細菌も複数分離されているが，これら細菌におけるヒ酸還元メカニズムの解明も興味深い課題である．
最近我々は，ヒ素汚染土壌の biostimulation を念頭に，ヒ素汚染土壌またはヒ酸と鉱物の共沈殿物から土壌微生物群がヒ素を溶出できるか調査を進めている．
その過程で，乳酸が炭素源として適当であること，リボフラビンのような電子シャトル物質の存在下でヒ素溶出が促進されることが明らかになってきた．また Miseq を用いた 16S rRNA 遺伝子増幅産物のシークエンス解析により，ヒ素
溶出には Firmicutes 門に属する細菌群集が重要な役割を演じる可能性が示唆されている．この中には，既知の異化的ヒ酸還元細菌と近縁な Desulfitobacterium
属細菌のみならず，これまでヒ酸還元能に関する報告のない Sporomusaceae 科の嫌気性発酵細菌も含まれていた．本講演では，新たに分離された Sporomusaceae
科細菌のヒ酸還元能について，培養試験とドラフトゲノム解析から見えてきた
予想メカニズムも含めて紹介する．

Soil microbial community involved in reductive dissolution of arsenic fromarsenate-laden minerals○Seigo Amachi1, Tomoyuki Hori2, Shigeki Yamamura3(1Fac. Horticul., Chiba Univ., 2AIST, 3NIES)

Key words

arsenic reduction, bioremediation, soil bacteria, microbial community

221

S3Fb03Pseudomonas 属細菌のセレン・テルル代謝の解析と半導体ナノ粒子合成への応用○黒田 真史 1, 惣田 訓 2, 池 道彦 1
（1阪大院・工, 2立命館大・理工）
kuroda@see.eng.osaka-u.ac.jp

S3Fb04

アンチモン酸還元細菌を用いた水中からのアンチモン除去・回収○山村 茂樹 1, 飯田 千里 2, 小林 弥生 1, 天知 誠吾 2（1国立環境研, 2千葉大院・園芸）
yshige@nies.go.jp

セレン・テルル等の第 16 族元素（カルコゲン）は，様々な金属と半導体性を示す化合物（カルコゲナイド半導体）を形成する性質を持つ．さらに，カルコゲ
ナイド半導体はナノ粒子化することにより粒径に応じて異なる特性を示すため，カルコゲナイド半導体ナノ粒子を活用した高性能な太陽電池（CuInxGa(1-x)Se2，
CdTe 等），量子ドット（CdSe 等），熱電素子（Bi2Se3，Bi2Te3 等）等の開発が進められている．しかし，これら材料の化学的な合成には，高温・高圧条件や有害な溶媒の利用が必須であり，製造時の環境負荷が高いという課題を抱えている．
一方，セレンは水相では主にセレン酸（SeO42-）や亜セレン酸（SeO32-）として存在しているが，これらは高い毒性を持つことから水環境の汚染物質としても知られており，我々の研究グループでは，細菌の代謝を活用してセレンを水相から除去・回収する技術の開発を進めてきた．この過程で我々が単離した細菌
Pseudomonas stutzeri NT-I は，異化的・同化的代謝により，水相のセレンを水に不溶な元素態セレンや揮発性のセレン化メチル化合物にまで還元し，水から除去する高いセレン代謝活性を持つ．この NT-I 株の培養過程において，亜セレン酸およびニトリロ三酢酸によりキレート化したビスマス（III）イオンを共存させると，セレンとビスマス（III）は同調的に水相から除去されることを新たに見出した．沈殿物を透過型電子顕微鏡（TEM）により観察すると，細胞の周囲に粒径 10-50 nm の粒子が形成されており，エネルギー分散型 X 線分析（EDX）
により，これらの粒子は Bi2Se3 に近似した元素組成を持つことが示されたことから，NT-I 株は Bi2Se3 ナノ粒子の合成に利用可能であることが明らかとなった．また，細菌代謝を利用した CdSe の合成を目指し，土壌から亜セレン酸とカドミウム（II）を含む培地を用いて集積培養することにより単離した細菌 P.
aeruginosa RB は，NT-I 株と同様の高いセレン代謝活性に加えてカドミウム（II）
耐性を持ち，亜セレン酸およびニトリロ三酢酸によりキレート化したカドミウ
ム（II）を含む培地中で，セレンとカドミウム（II）を同調的に水相から除去した．SEM 観察により，細胞の表面または内部には粒径 10-20 nm の粒子，細胞
外部には粒径約 100 nm の粒子が生成しており，EDX により，それらは CdSe であることが確認された．
これら細菌による半導体ナノ粒子合成は，環境負荷の低い新たな合成技術となり得ると期待される．本発表では，上記の取り組みに加えて，ナノ粒子の合成に関わると考えられる Pseudomonas 属細菌のセレン代謝機構についても紹介する．また，明らかになりつつある Pseudomonas 属細菌のテルル代謝についても紹介し，経験的に生物学的合成がより難しいテルル系半導体ナノ粒子合成の可能性についても論じたい．

アンチモン(Sb)は，周期表上でヒ素と同じく 15 属に位置する半金属元素であり，レアメタルの 1 つとしても知られている．各種プラスチック・ゴムなどの難燃助剤として，OA 機器や家電，自動車など，数多くの身近な製品に利用されている他，ポリエステルの重合触媒，ガラス清澄剤など，幅広い産業分野で用いられている．また近年では，そのユニークな光電子化学的性質から，半導体やナノ電子機器材料としても注目されている．一方で，急性・慢性毒性を有する有害物質であることから，WHO の飲料水質ガイドラインで基準値（0.01
mg L-1）が定められており，わが国でも水質環境基準の要監視項目として指針
値（0.02 mg L-1）が示されている．また，世界最大の Sb 産出国である中国では，鉱山や製錬所周辺の土壌や河川・湖沼の底泥より高濃度で検出されるなど，
Sb による環境汚染も大きな問題となりつつある．さらに，北極圏やヒマラヤ氷床コア中の Sb 濃度が 1970 年代頃から急上昇しており，近年の人為利用によって，Sb が地球規模で拡散しているという指摘もある．現在，産業活動に伴って生じた Sb 廃水は，凝集沈殿法や吸着法などの物理化学的手法により処理されているが，概して高コストであり，また Sb に対する特異性も低い．特に Sb のほとんどを輸入に頼っている我が国では，低コストかつレアメタル資源として回収可能な廃水処理技術の開発が，喫緊の課題であると言える．
自然環境中での Sb の動態は不明な部分が多いが，ヒ素と同様に 5 価および 3価の無機態[アンチモン酸：Sb(V)，亜アンチモン酸：Sb(III)]が主な存在形態であると考えられている．また，その形態変化には微生物の関わりが指摘されており，Sb(III)酸化細菌は，プロテオバクテリアを中心にこれまで 65 種程度が報告されている．一方，廃水処理という観点から，近年では，Sb(V)還元細菌に注目が集まりつつあり，これまでに 2 種が報告されている．これらの Sb(V)還元細菌は，水溶性の Sb(V)を還元し Sb2O3 様の沈殿を生成することが報告されているが，Sb2O3 は工業的需要の大部分を占めていることから，資源回収面からも有用と考えられている．しかし，単離例の少なさから，詳細な Sb 代謝並びに沈殿形成機構は，ほとんど明らかとなっていない．
本講演では，Sb(V)還元細菌に関する演者らの研究成果を紹介し，新たな資源回収型廃水処理技術の開発に向けた知見・情報を提供する．演者らの研究グルー
プは最近，新たな Sb(V)還元細菌 SbR 株の単離に成功した．SbR 株は，5mM のSb(V)を 4 日間でほぼ液相から除去するという，これまで報告されている 2 種に比べ，高い Sb(V)還元能力を持つことが明らかとなっている．還元に伴い，白色沈殿の生成が確認され，初期には Sb と O を主成分とするアモルファス様の沈殿物が見られたが，培養 14 日後にはほぼ全てが結晶化し，斜方晶の Sb2O3 鉱物であるバレンチナイトが形成された．また，SbR 株は，Sb(V)を嫌気呼吸の最終電子受容体として利用する異化的 Sb(V)還元細菌であることが強く示唆されている．ドラフトゲノム解析の結果からは，ヒ素耐性に関連する ars 遺伝子群は保持しているが，異化的 As(V)還元酵素遺伝子(arr)は確認されず，Sb(V)に特異的な未知の還元酵素の存在が示唆されている．

Selenium and tellurium metabolism of Pseudomonas spp. and its application
to semicondustor nanoparticle synthesis

Removal and recovery of antimony from aqueous phase using a Sb(V)reducing bacterium○Masashi Kuroda1, Satoshi Soda2, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Coll. Sci. Eng., Ritsumeikan Univ.)

Key words

Pseudomonas sp., selenium, tellurium, semiconductor nanoparticle○Shigeki Yamamura1, Chisato Iida2, Yayoi Kobayashi1, Seigo Amachi2(1NIES, 2Grad. Sch. Horticul., Chiba Univ.)

Key words
antimonate reduction, antimony trioxide, anaerobic respiration,
wastewater treatment

222

S3Gb01

デジタルとの融合による新たなバイオ戦略の取組み○水無 渉（三菱ケミカル株式会社）mizunashi.wataru.mv@m-chemical.co.jp

S3Gb02

分子動力学シミュレーションを用いたタンパク質高機能化法の開発○亀田 倫史, 池部 仁善（産総研・人工知能）
kameda-tomoshi@aist.go.jp

国連は，2015 年に開催した「国連持続可能な開発サミット」において，持続可能な開発目標（SDGs）を掲げた．これは，「極度の貧困解消」と「持続可能な社会」の実現の二本柱であり，全ての国が達成する目標としている．
また，日本政府も第 5 期科学技術基本計画で，目指すべき国の姿として，①持続的な成長と地域社会の自律的発展，②国及び国民の安全・安心の確保と豊かで質の高い生活の実現，③地球規模課題への対応と世界の発展への貢献，④知の資産の持続的創出を上げている．そして，その実現のために新しい価値やサービスが次々と創出される「超スマート社会」を世界に先駆けて実現するための一連の取組みをさらに深化させつつ「Society5.0」として強力に推進するとしている．さらに，未来投資戦略 2017 では，健康寿命の延伸をはじめとした具体的な戦略分野を設定している．
このような目指すべき姿や戦略分野の中で，『循環型社会の実現』や『快適健康社会の実現（QOL の向上）』という社会的課題に対して，バイオテクノロジー
は有効な解決手段の一つとなり得る．さらにこのような社会課題への取り組み
は，国連が目標とする持続可能な開発目標（SDGs）の多くに合致するものである．
我が国は，伝統的な醸造・発酵技術を強みとして，医薬品事業（抗生物質，バイオ医薬品），食品関連事業（アミノ酸，有機酸）などで世界をリードしてきた．しかし，近年は，圧倒的な研究開発資金を投入する米国や国際規格等の仕組みで攻める欧米などに押されている状況が続いている．OECD は，2030 年の世界のバイオ市場は，GDP の 2.7%（約 200 兆円）に成長すると予測しており，
この市場で競争力優位に立つことが，産業振興や雇用創出の観点からも重要である．
さらに，近年，著しい量のバイオ関連データが蓄積してきている．これは，遺伝子配列などのバイオデータを解析する次世代シーケンサー（遺伝子配列を高速で読み取る装置）などの技術革新により格段に解析コスト等が下がったことによる．しかしながらこれらのデータは分散・偏在化していたり，データ品質が不明確であったりするために十分使いこなされているとは言えない状況である．
現有する莫大なデータ及びこれから発生してくる膨大なデータ（ドライ：サイバー）とバイオテクノロジー（ウエット：フィジカル）を有効に繋ぐことにより，化学品，食品やその他の新機能材創出が，これまでにない期間，コスト，性能で開発できることが期待される．
この点について，単に技術論のみならず，産業化への仕組み（規制緩和，規制化，国際規格化，標準化，促進政策など）の観点から課題を整理して具体的な施策を提言・実行していくことが重要である．このような視点から産業競争力懇談会（COCN）の推進テーマとして，デジタルを融合したバイオ産業戦略を立上げ，化学，食品，電機，建設など様々な業界から 30 社を超える民間企業，
多くの国研・大学に参集いただき，バイオとデジタルを融合したバイオ産業戦
略の議論を行い，提言としてまとめた．
2017 年度報告書 http://www.cocn.jp/theme104-L.pdf
本シンポジウムでは，推進テーマでの議論や政策提言について紹介するとともに，具体的にバイオ素材及びバイオテクノロジーを用いて成長が期待される産業分野・領域を攻める方策について，課題とともに紹介して，議論をさせていただけたらと考えている．

蛋白質や核酸の機能を立体構造の観点から理解することは，理学としてのみな
らず，工学の観点からも重要である．X 線結晶解析，NMR，電子顕微鏡などの手法によって，生体高分子の立体構造が解かれており，それを元にした機能の理解が進んできた．一方で，それらの立体構造を元にした，分子シミュレーショ
ンを用いた研究は，あまり進んでこなかった．厳密にいえば，理学的な意味での生体高分子の機能解明に用いられる例はあっても，応用面，例えば，酵素と基質の相互作用様式の解明，酵素の機能改変，耐熱性設計など，蛋白質の高機能化に用いられることは，少なかったと思われる．
その原因は，これまでのスーパーコンピューターでは，計算機資源が乏しいた
め，分子の動きを調べるために十分な時間を取ることができず，多数の変異体の計算などを行うことができなかったことが大きいと考えられる．また，計算に用いるエネルギー関数の精度に問題がある可能性が指摘されてきた．
しかし，最新の研究によると，エネルギー関数の精度は十分高いことを示している．David Shaw らは，Anton という世界最速の計算機を開発し，それを用いて，12 個の蛋白質を変性構造から天然構造に巻き戻らせることに成功している
し[1]，蛋白質と薬物分子を混ぜた状態からシミュレーションを行ったところ，
正しい位置に薬物分子が結合することを示した[2]．つまり，エネルギー関数の精度には問題がなく，あとは計算資源さえ確保できれば，生体高分子の機能をシミュレーションから予言できる可能性を示したわけである．それを受けて，我々は，RNA 二重らせん構造の熱安定性（ΔG）をシミュレーションから求めたところ，計算値と実験値との相関が 0.98，絶対誤差が~0.55kcal/mol と，計算で得られる値は，実験で得られる値とほぼ同等の精度を持つことを示している[3]
本発表では，まずシミュレーションに関して，その手法と現状を概観する．その後に，これまで，我々が取り組んできた分子動力学シミュレーションを用いた研究を紹介する．最後に，現在取り組んでいる蛋白質の高機能化法の開発について紹介する．

Strategy of Bio-industry through the integration of digital technology

improvement of protein by molecular dynamics simulation○Wataru Mizunashi(Mitsubishi Chemical Corporation)

Key words

biotechnology, big data, synthetic biology[1] Kresten Lindorff-Larsen et al., Science 28 Oct 2011:334, 6055,517-520[2]Shan Y et al., J.Am.Chem.Soc., 2011, 133 (24), pp 9181-9183[3]Sakuraba S et al., J Phys Chem Lett (2015) Nov 5;6(21):4348-51○Tomoshi Kameda, Jinzen Ikebe(AIRC, AIST)

Key words

molecular dynamics simulation, protein

223

S3Gb03

DNA 分子バーコード法を利用した長鎖 DNA 合成○谷内江 望（東大・先端研）
yachie@synbiol.rcast.u-tokyo.ac.jp

S3Gb04

スマートセル創出プラットフォームに資するメタボロー
ム解析技術の開発○蓮沼 誠久
（神戸大院・科技イノベ）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp

染色体のような巨大 DNA の合成を考える場合，DNA の化学合成には限界がある．合成長に従って累乗的にエラー蓄積されるため，どのように高度な精製過程を経たとしても，合成反応産物からの目的産物の単離はある DNA 長を超えた時点で不可能となる．したがって，化学合成された短鎖 DNA のアセンブリが鍵となり，これまでに試験管内アセンブリをはじめとして，大腸菌や酵母，
枯草菌をもちいた様々な優れた手法が開発されてきた．より高性能の DNA ア
センブリ手法の開発が重要である一方で，どのような DNA アセンブリ手法においても避けることができず，工程のボトルネックとなっているのが，アセン
ブリ産物のクローン化と評価である．DNA アセンブリ反応は当然完全でないため，アセンブリ反応産物中には，目的の分子とそうでないものが混在する．このため，通常はこれを大腸菌などの細胞に導入し，細胞クローンを得ることで各アセンブリ反応産物由来の DNA を複数単離し，それぞれを DNA シークエン
シングなどによって評価することによって，目的のクローンを得るというプロセスが必要となる．長鎖 DNA やリピート配列などアセンブリ効率の高くない反応については，特に多くのクローンの単離と評価が求められる．これまでに我々の研究チームでは，高効率に DNA をアセンブリする手法，アセンブリ反応産物のクローン化を経ずに目的の DNA アセンブリ産物を得る手法を DNA 分
子バーコード法，長鎖 DNA シークエンシングとゲノム編集を組み合わせて開発してきた．本会ではこれらの成果について紹介する．

次世代シーケンサーの開発，分析装置の高解像度・高感度化，遺伝子・タンパ
ク質配列解析等の情報解析技術の進展により，バイオ関連データ（ゲノム配列
情報，遺伝子発現情報，タンパク質情報，代謝物情報，生体機能に関わる各種情報等）が爆発的に増加している．他方，ゲノム編集や DNA 合成に代表される遺伝子工学ツールに革新が起こり，バイオ操作を自動で行うラボオートメー
ションが実装されつつある．そこで，ビッグデータから抽出した有用情報を活用し，先端的な遺伝子工学で生物代謝を改変する「Engineering Biology」の社会実装が世界的に進んでいる．
我が国では，サイバー空間とフィジカル空間が高度に融合した「超スマート社
会」を未来の姿として共有し，これを世界に先駆けて実現するための取り組み
を「Society 5.0」として強力な推進をかけている．バイオモノづくり分野では爆発的に増加するバイオデータ（サイバー）とバイオテクノロジー（フィジカル）を有効に繋ぐことにより，化学品，食品，その他の新機能材の創出がこれまでにない期間，コスト，性能で開発できることが期待されている．このような背景の下，2016 年度から NEDO「植物等を用いた高機能品生産技術の開発（スマートセルプロジェクト）」が実施されている．「高度に機能がデザインされ，機能の発現が制御された生物細胞」をスマートセルと定義し，スマートセルを用いた次世代産業「スマートセルインダストリー」の構築が推進されている．
微生物は代謝系の中で多くの化合物を作り出すことができることから，その機能を最大限活用することで，高効率な物質製造プロセスを構築することができる．しかしながら，細胞の代謝システムは複雑に制御されており，従来の手法
では生産性の向上に限界があった．代謝フラックスを改変する意図をもって代謝系酵素の遺伝子導入を試みても，内性の調節機構に阻まれ，目論見通りに代謝改変を実現できる例は多くない．代謝工学では，過去の知見に基づいて，遺伝子の発現量を変化させて代謝経路を改変するが，研究者の知識は効果的な代謝改変の戦略構築に必ずしも十分でなく，成功例は限定的である．すわなち，
試行錯誤の要素が大きく，物質生産技術の開発に時間がかかり，期待する生産を実現できないケースも多かった．
スマートセルプロジェクトでは生産性の高い微生物を短期間で育種するための高度な情報解析技術や計測技術と先進バイオ技術の統合，最適な自動化を目指
し，これまでに開発してきたエッジ要素技術（バイオインフォマティクスによる代謝経路設計技術・分子動力学シミュレーション・遺伝子発現ネットワーク
解析技術・遺伝子配列設計技術，長鎖 DNA 合成技術，マルチターゲットゲノ
ム編集技術，動的メタボローム解析，定量ターゲットプロテオーム解析等）を
有機的に連携させた独自の Design/Build/Test/Learn（DBTL）システムとして「スマートセル創出プラットフォーム」の開発に取り組んでいる．
Test では，メタボロミクスを中心に，多様な微生物に対して大量のオミクスデー
タセットを精度良く，高い再現性で提供する計測技術の開発に取り組んでいる．
メタボロミクスは，細胞内の代謝物蓄積量をスナップショット的に俯瞰できる技術として有効であるが，安定同位体炭素を用いた in vivo 13C 標識技術を組合せることにより，化合物のターンオーバーも観測することが可能となり，代謝物の蓄積量と動的変動（時間変化）を同時に俯瞰することが可能になる．これにより，細胞内における炭素原子の分配が分かり，代謝経路中のボトルネック
反応の特定が進んでいる．
一方，高度な情報解析技術を有効に活用するためには，大規模で多様性に富んだデータセットを体系的に取得する必要がある．しかしながら，現状のメタボ
ローム解析は必ずしもハイスループットとは言えない．また，スループットを優先してデータの精度を落とすこともできない．高精度かつハイスループット
なメタボローム解析技術の開発は，微生物育種戦略の立案に要する時間を短縮
し，代謝メカニズムを反映した現実性の高いスマートセルの設計図の構築に寄与することが期待されている．本講演ではスマートセル創出プラットフォームに資するメタボローム解析の課題と展望について述べたい．

Long DNA synthesis using DNA barcodes

Development of metabolome analysis technology contributing to smart cell
creation platform○Nozomu Yachie(RCAST, Univ. Tokyo)

Key words

DNA barcode, DNA synthesis, genome editing○Tomohisa Hasunuma(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

metabolic analysis, microorganisms, metabolic engineering

224

S3Gb05

スマートセル開発を加速する AI の開発に向けた取組み○武田 志津 1, 伊藤 潔人 1, 荒木 通啓 2
（1日立・研究開発, 2京大院・医）shizu.takeda.me@hitachi.com

S3Hb01

物質生産宿主・麹菌で自在にかつ無限に遺伝子を改変する～ゲノム編集技術の進展○丸山 潤一（東大院・農生科・応生工）
amarujun@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

スマートセルの開発は，医療，食品，環境，エネルギー等の分野における物質生産に変革をもたらし，バイオエコノミーの活性化や地球規模で懸念される各種課題を解決可能な技術として注目されている．特に，バイオ計測技術の飛躍的な発展にともなうゲノム情報の解読やオミックス解析により膨大なデータが蓄積してきているが，これらのバイオビッグデータを活用して革新的な物質生産技術を確立する動きが活発化している．こうしたバイオビッグデータの更なる活用によりスマートセルの開発を加速するため，近年急速に進歩した人工知能（AI）技術に期待が寄せられている．
従来，合成バイオ分野の研究者は自らの実験により取得したデータと，論文や各種データベースなどの外部情報を統合的に解釈し，物質生産に資する遺伝子
組み換え生物を設計してきた．生物学として一般的な情報取得・解析には，バイオインフォマティクスツールが活用できるが，スマートセル開発においては特有の課題とニーズに応える AI の開発が望まれる．すなわち，生物のゲノム
改変とそれにともなう物質生産性の関係性を示すデータを収集し，それを基に生物ゲノムの設計を高効率で最適化する AI の開発が，合成バイオ分野では求められる．スマートセル開発の将来像においては，研究者の知識や経験だけに依存せず，AI が有用なデータを網羅的に集約して知識基盤として体系化し，それを活用して研究者がスマートセルを効率的に設計する，または，設計自体をAI が行うことが望まれる．これによりスマートセルの開発がこれまで以上に加速され低コスト化することが期待できる．
しかし，現状のスマートセル開発においては，AI 技術が十分に浸透しているとは言い難い．その理由として，これまで整理・蓄積されたデータは，バイオ研
究者向けのデータが中心であり，AI 技術のために適切に整理されているとは言えないからである．AI の主要な構成要素である機械学習は，与えられた入力に対し，適切な出力を返すように，事例毎に集められた大量のデータを用いて学習させる必要がある．一方，バイオ分野では，一見して文献等で大量のデータが蓄積されているようにみられるが，その実態としては少数データの事例の集合体である．そのため，AI 技術一般に直接的には適用し難い状況にある．
更に，実課題において AI 技術を活用するためには，「コンディション(条件のデータ）」「アクション(制御可能なデータ）」「アウトカム（目的のデータ）」という 3 種類のデータを人間が定義することが重要である．すなわち，AI は，接続されたシステム(細胞内の代謝系などから生産プロセス全体まで，広義のシステム）に対して，アウトカムを高めるため，コンディションにあわせ，どんなアクションをとればよいか，自動的に判断するアルゴリズムといえる．スマー
トセルの創製においては，アウトカムは物質生産量最大化であるが，そのためのコンディションやアクションのデータとしては，菌株，人工遺伝子，遺伝子発現情報，菌体密度などの実験結果，培地組成や温度などの培養条件など多岐に渡る．コンディション・アクションは，それぞれが膨大な自由度を持つことに加え，それらの組み合わせは無数に考えられる．したがって，これらのデー
タを適切に整理して AI 技術を適用しなければ，有意なアウトカムを達成することは困難である．
こうした点を踏まえると，スマートセル開発において AI 技術を活用するために，バイオとデジタルの融合領域の重要性がますます高まると考えられる．すなわち，スマートセル開発における DBTL(設計: Design－合成: Build－計測: Test
－学習: Learn）サイクル全体を俯瞰しながら，適切にアクション・コンディショ
ンを見極めて AI 技術を適用する必要がある．個々のデータの本質を理解した
うえで，バイオビッグデータを適切に整理，活用することにより，所望の物質を高効率に合成するスマートセルを，AI による自律的な最適化で設計し開発することが期待される．
本講演では，バイオとデジタルを高度に融合させスマートセル開発を飛躍的に加速することをめざし，スマートセル開発に資する AI 基盤技術について述べる．特に，合成バイオに特有のデータ活用などの観点からその必要とする機能等を中心に議論する．

麹菌 Aspergillus oryzae は日本の伝統的醸造産業に使用されてきた糸状菌であり，酵素生産や組換えによる異種有用タンパク質生産に用いられている．最近になり，麹菌は天然物，特に糸状菌由来の 2 次代謝産物の異種生産に利用されるよ
うになってきている．この利点として，宿主である麹菌が 2 次代謝産物をほとんど生産しないため，異種 2 次代謝産物の生産が検出されやすく，しかも生産性が高いことが挙げられる．
一方で，産業的に必要とされる生産性を実現するには複数の遺伝子の機能を改変する必要がある．たとえば，生産する 2 次代謝産物の種類に応じて宿主の代謝フラックスを設計し，複数の経路を同一の株で改変するのはもちろんのこと，
糸状菌では有性生殖や無性生殖のような分化についても代謝に大きく影響するものとして考慮する必要がある．しかし，使用可能な形質転換マーカーを増やすのは限界があり，他に生産能が優れた株が存在した場合に，これを対象に多重の遺伝子改変を行うのは容易ではない．
我々は，麹菌を用いた物質生産での自由自在な遺伝子改変を可能とするため，
CRISPR/Cas9 システムによるゲノム編集技術を確立した 1)．CRISPR/Cas9 シス
テムはヌクレアーゼである Cas9 とガイド RNA を利用して，ゲノム上の任意の部位に対し変異を導入する方法である．ゲノム編集のなかでも，低コストで簡便な技術として特に注目され，動物・植物など多くの生物において劇的な遺伝
子改変効率の改善をもたらすことで次世代の育種技術として注目を集めている．
我々はゲノム編集用プラスミドを自律複製型にすることにより，麹菌の様々な株において 50~100%の高い変異導入効率を得ることに成功した 2)．そして，多重遺伝子改変を同一の株を繰り返し行うことを目的として，自律複製型ゲノム
編集用プラスミドのリサイクリング技術を確立した 2)．具体的には，一度形質転換したゲノム編集用プラスミドを脱落させるため，過剰発現により生育阻害を示す転写因子 AoAce2 を使用し，誘導性のプロモーター制御下で発現するようにした．その結果，ゲノム編集用プラスミドの脱落に成功し，このプラスミ
ドの導入・脱落の操作を繰り返すことにより多重変異導入を可能とした．
さらに，ゲノム編集用プラスミドとともにドナー DNA を同時に導入すること
で，標的の遺伝子を破壊するノックアウト，標的とする遺伝子座に DNA 断片を導入するノックインをほぼ 100%の効率で行うことに成功した．ここで標的とする遺伝子座には形質転換マーカーを導入しないノックアウト・ノックインであるため，ゲノム編集用プラスミドをリサイクリングすることにより，遺伝
子破壊や遺伝子導入を繰り返すことが可能になった．
以上のように，ゲノム編集技術を発展させることで，麹菌の様々な株を対象として自由自在な遺伝子改変が効率よくかつ無限にできるようになった．これまで遺伝的に扱いやすい大腸菌や酵母を中心に代謝経路の大規模な改変が行われてきたが，今後は，高効率のゲノム編集技術により麹菌においても代謝工学が異種 2 次代謝産物の高生産に適用されることが期待される．
1) Katayama et al. (2016) Biotechnol. Lett. 38, 637-642.
2) 片山琢也ら，2017 年日本農芸化学会大会，2C18p06.

Towards the development of AI to accelerate smart cell development

Genome editing technology enables a versatile gene modification in
Aspergillus oryzae as a microbial production host

○Shizu Takeda1, Kiyoto Ito1, Michihiro Araki2(1R&D Gr., Hitachi, 2Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.)

Key words

biosynthesis, smart cell, AI○Jun-ichi Maruyama(Dept. Biotechnol., Univ. Tokyo)

Key words
product

Aspergillus oryzae, genome editing, microbial production, natural

225

S3Hb02

大規模な代謝経路をデザインすることへの挑戦○柘植 謙爾（神戸大院・科技イノベ）
ktsuge@port.kobe-u.ac.jp

ゲノム DNA をデザインすることで，有用物質の生産を環境負荷が少なく低コストに行う，あるいは今まで生産することが困難な物質や新規物質の生産を行うことは，遺伝子工学，あるいは代謝工学の究極の目標と言える．90 年代に始まるゲノムプロジェクトにより，ゲノム中に存在する遺伝子（そしてその裏返しとして，存在しない遺伝子）が明確に定義されることにより，生物の代謝経路を成り立たせるのに必要な遺伝子回路の全体像を俯瞰できるようになった．
これにより，有用物質生産に対して宿主生物が持ち合わせていない遺伝子回路を足すということや，生産量増大に対しインパクトの大きい遺伝子（いわゆる鍵遺伝子）を破壊あるいは増強するといった，ピンポイントの改変が可能となった．特に近年の次世代シーケンサー，メタボローム，プロテオームといったいわゆるオミクス解析技術の急速な発達により，全体を俯瞰しピンポイントに改変する手法は広く一般に行われるところとなっており，現時点では最も現実的な方法と言える．一方，この手法で到達される結果に満足せず，さらなる効率的な生産を目指す将来技術を考えた場合，ゲノムレベルの大規模な遺伝子回路のデザインし構築することは主要な方向性であることは間違いないであろう．
00 年代後半により米国ベンター研究所で行われたマイコプラズマを題材とした一連のゲノム合成実験，即ち化学合成ゲノムからの複製可能な生物の創生，それに続く最小のゲノムを持つ生物の人工的な創出は，ゲノム DNA が遺伝子回路として完全な形にプログラムされているのであれば，それを人工的に構築し，起動させることが可能であることを示した．この例では，細胞分裂ができるかどうかと，そのスピード（すなわち増殖速度）に主眼が置かれており，物質生産という観点では議論されていないが，ここで得られた知見が物質生産に応用されることは間違いない．
このような世界情勢の中，演者らはゲノムレベルの大規模な遺伝子回路デザイ
ンによる物質生産の重要性を早期に認識し，まずこれを実現するために不可欠な長鎖 DNA を自在に構築する技術の開発を行ってきた．枯草菌のプラスミド
形質転換系を利用した多数遺伝子断片の集積技術である OGAB 法は，一度に15 個程度の遺伝子断片を指定した順序や向きに連結することが可能で，これにより長鎖 DNA 構築に道を開いた．さらにこれを高度化した第二世代 OGAB 法により，50 個以上の DNA 断片を一度連結することを可能とし，100 kb までの
長鎖 DNA を自在に構築する技術を開発した．さらにこれを自動的に行うトー
タルシステムを開発し，長鎖 DNA をハイスループットに構築する環境を整えた．本システムを利用することで，多様な遺伝子回路構築可能となった．初め
は，抗生物質生産遺伝子群，色素生産遺伝子群などといった，二次代謝経路の遺伝子回路をデザインし構築した．その後一次代謝経路遺伝子群についても遺伝子回路をデザインし構築した．特に，ここでは，多数の遺伝子を協調的に働かせる仕組みとして人工オペロンをデザインした．これらの代謝経路ごとに設計した人工オペロンを組み合わせることにより，数十個の遺伝子からなる大規
模な遺伝子回路をデザインし，大腸菌に導入すること増殖速度や生産量を指標にこれらのオペロンのパフォーマンスを評価してきた．当日は，演者らの大規模代謝経路のデザインと構築技術の現状について紹介し，本技術の今後の活用方法について議論したい．

An attempt of designing for large-scale metabolic pathway○Kenji Tsuge(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

genome design, metabolic engineering, synthetic biology

S3Hb03芳香族化合物合成プラットホームの開発～芳香族モノ
マー合成に理想的な大腸菌代謝デザイン～○野田 修平, 白井 智量, 近藤 昭彦（理研・環境資源）
shuhei.noda@riken.jp

近年，地球温暖化や化石資源の枯渇への対策など，持続可能な社会の構築に向けて取り組むべき様々な事柄が社会問題となっている．2015 年に COP21 で締結されたパリ協定では，2030 年度までに空気中の二酸化炭素の 26%（2013 年度比）を削減することが求められており，低炭素循環型社会の構築はこれまで
以上にその必要性が求められている．化石資源への依存から脱し，環境負荷の少ない社会を構築するため，バイオマスや二酸化炭素などの再生可能資源を原料に用いた微生物プロセスの開発は重点的に取り組むべき研究分野であるといえる．ブタノール等の燃料生産，生分解性プラスチック原料生産に関する研究が行われている一方，発表者らのグループは現状その生産を石油資源に依存している芳香族化合物やその誘導体の生産に注目した．そして，様々な芳香族化合物やその誘導体を高生産量，高収率で生産可能な汎用性のあるプラットホーム株の創製を試みた．
微生物で芳香族化合物を生産する際，いくつかの芳香族化合物が生成する最終反応においてピルビン酸の放出を伴う．本プラットホームにおいては大腸菌を宿主に用い，芳香族化合物生産の最終反応においてピルビン酸を放出するという特徴を最大限生かすための代謝改変を行った．7 種類の化合物において，単純に経路を導入した株と比較して生産量，収率をそれぞれ 5～50 倍程度，大幅に引き上げることに成功した 1) ．また，このプラットホームで生産可能な化合物である 3－ヒドロキシ安息香酸を起点とし，放線菌の芳香環形成経路と芳香族化合物分解菌の芳香環分解経路を組み合わせることにより，これまで微生物を用いての生産報告の例がないマレイン酸の微生物生産に成功した 2) ．
1) Noda S, et al., Metab Eng, 2016. 33,119-29.
2) Noda S, et al., Nat Commun, 2017. 8, 1153-1165.

Microbial platform to produce aromatic chemicals and the derivatives○Shuhei Noda, Tomokazu Shirai, Akihiko Kondo(CSRS, RIKEN)

Key words

Escherichia coli, aromatic chemicals, dicarboxylic acids, pyruvate

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S3Hb04

物質生産宿主としての酵母の代謝経路改変とゲノム改変に向けた合成生物工学的手法開発

S3Hb05○石井 純（神戸大院・科技イノベ）
junjun@port.kobe-u.ac.jp

大腸菌中心炭素代謝システムの動力学モデル開発と有用物質生産の合理的設計○倉田 博之（九工大）
kurata@bio.kyutech.ac.jp

酵母は，生物学のモデルとして生化学，遺伝学，分子生物学，システム生物学など多岐にわたる学問分野の発展に大きく貢献してきた．また，古くはルイ・パストゥール氏によるアルコール発酵菌としての発見から始まり，ビールやワインなどの醸造やバイオエタノール生産など産業界においても広く研究が行われている．さらに，酵母は Yeast Two-Hybrid（Y2H）法による蛋白質間相互作用解析や遺伝子発現解析などのゲノムワイドな解析データに加え，遺伝子破壊
株・過剰発現株などのライブラリーセットを用いた網羅的な表現型解析データも豊富で，遺伝子・蛋白質レベルでのダイナミクスや制御ネットワークの解明をめざすシステム生物学も盛んに行われている．こうしたモデル生物としての研究を背景として，酵母は遺伝情報を操作するための様々なツールが開発されてきた．たとえば，アミノ酸や核酸の生合成を利用した選択マーカーが充実しており，自律複製型のプラスミドを利用できるため遺伝子発現を容易に行うことができる．さらに，相同組換え能が高いことから遺伝子破壊や遺伝子挿入等のゲノムの書き換えも自在に行うことが可能である．このように，酵母は大腸菌などの微生物とともに複雑な遺伝子組換えが可能な宿主の 1 つであり，とりわけ真核生物の中では生育が早く最も扱いに優れた宿主である．
近年の代謝工学の発展により，エタノール以外にもプラスチックや繊維などの生産に必要となるモノマー原料を微生物で大量に生産させるための代謝改変の研究が活発化しており，こうした代謝工学の研究は大腸菌などの原核生物を宿主とした研究が盛んである．しかし，商業化に向けた大規模スケールでの発酵生産では様々な障壁が存在し，なかなか実用化にまで至らないのが現状である．
そのため，pH 耐性が強い（コンタミネーションに強い），ストレス耐性に強い（バイオマス加水分解物に含まれる発酵阻害物などに強い），溶菌しにくく繰返し発酵が容易，バイオエタノール生産におけるプラントやノウハウが転用可能，などの利点をもつ酵母の利用が産業応用上，大きく期待されている．こうした背景から，我々はエタノール以外の化学品原料を酵母で生産させることを目的として，工学的な観点から細胞代謝のエンジニアリングや大規模遺伝子改変に向けた手法，合成生物学的なツールなどの開発を行っており，その取組みを紹介する．

バイオ燃料や医薬品の代謝中間体を含む有用物質を効率的に生産する微生物細胞の合理的設計（細胞工場，スマートセル）が注目されている．増殖が速く，
遺伝子組換が容易な大腸菌は，細胞工場の最も有望な微生物である．一般に，有用物質生産は，酸素制限下で行われることから，（1）目的物質の生産能力を遺伝子レベルから合理的に設計するために，遺伝子組換株の代謝変化を予測できる数学モデル，（2）溶存酸素濃度の変化が細胞代謝に与える影響を理解し，発酵性能を評価することができる数学モデルが必要である．そのような観点から，我々は，細胞全代謝モデルの構築を目指し，大腸菌の中心炭素代謝ネット
ワークの動力学モデルを開発している．
最初に，大腸菌の中心炭素代謝反応系ネットワークマップを構築した．解糖系，ペントースリン酸経路，TCA 回路，糖新生経路，補充反応，グリオキシル酸回路，呼吸鎖を含む大規模なシステムである．細胞の比増殖速度は ATP 比生成速度の関数として表した．溶存酸素（ＤＯ）濃度やグルコース等の基質濃度変化に応答し，代謝酵素活性を調節する ArcA/B，Fnr，Crp， Cra を含む 6 種類の転写因子を導入した．回分培養と連続培養のモデルを構築した．微分方程式で記述した数学モデルの動力学パラメータは，制約条件付遺伝的アルゴリズムを用いて推定した．シミュレーションは，東京大学ヒューマンゲノムセンターのスー
パコンピュータを用いて行った．
動力学モデルが遺伝子組換え株の実験データを再現できることを調べるために，
野生株，pykF ノックアウト突然変異株（ΔpykF），pgi ノックアウト突然変異株（Δpgi），ppc ノックアウト突然変異株（Δppc）の回分培養におけるシミュレー
ション結果を，細胞濃度，細胞外グルコース濃度，酢酸濃度に関する実験デー
タと比較した．Pyk は解糖系の最終ステップで PEP を PYR に変換し，Pgi は解糖系の最初のステップで G6P を F6P に変換し，Ppc は PEP を OAA に変換する
補充反応を触媒する．細胞内の代謝物濃度，酵素濃度，代謝流束（酵素の反応速度）の時間変化をシミュレーションした結果，動力学モデルは，回分培養における pgi 欠損株， ppc 欠損株， pyk 欠損株の代謝流束分布，連続培養における 18 の遺伝子欠損株の代謝流束分布を正確に再現した．
開発した数学モデルを用いて，DO 濃度が変化した場合の野生株の発酵生成物
パターンの変化をシミュレーションした．DO 濃度が高い好気条件のとき，酢酸が主な生成物であった．オーバーフローよばれるこの代謝変化は，増殖速度の速い大腸菌においてよく見られる．DO 濃度が減少する微好気条件においては，ギ酸，乳酸，エタノール，コハク酸濃度が増加した．嫌気条件では乳酸濃度が減少した．好気，微好気，嫌気培養条件のシミュレーション結果は，実験
データと一致した．数学モデルは，遺伝子変異株 arcA 欠損株，fnr 欠損株の発酵物質生産の DO による変化を正確に再現した．最後に，好気条件と嫌気条件を組合せた 2 段培養において，乳酸生産を最大化する遺伝子組換株を設計した．
代謝調節メカニズムを組み込んだ中心炭素代謝反応モデルは，細胞工場設計のコアモデルとして，細胞を遺伝子レベルから合理的に設計する基盤を与える．
大腸菌の中心代謝システムの動力学モデルは，特殊な個別モデルではなく，ほかの細菌，酵母，マウス，ヒト等へ拡張できる標準モデル，あるいはテンプレー
トモデルである．中心代謝は，炭素，酸素，窒素，リンなどの基質を取込み，
エネルギーと物質の変換を行う主たるシステムであり，すべての生物間で非常によく保存されている．代謝標準モデルの開発は，医薬品中間代謝物の生産性向上，病原菌を含む微生物間の共生関係の研究，ヒトの代謝に係る疾病研究に貢献する．
バイオインフォマティクス，システム生物学，合成生物学の発展によって，数学モデリングは生物学の方法論として確立しつつある．細胞内で起こる複雑な反応系の仕組みや機能を思考実験（頭の中でイメージすること）で理解することには限界がある．振動系や双安定性を頭の中で正確にシミュレーションできる研究者はほとんどいないであろう．研究者ごとに思考実験結果が異なることはしばしばである．数学モデリングは，生体分子ネットワークを正確に定義し，シミュレーション結果を視覚化することによって，複雑な生物のメカニズムや機能に関して研究者間で共通の理解を与えることができる．コンピュータシミュ
レーションによって，環境条件や遺伝的条件の変化に対するシステム挙動の変化を予測できれば，仮説を作ったり，生物実験を計画したりする作業を効率化できる．

Metabolic pathway engineering of yeast as a chemical production host anddeveloping synthetic bioengineering approaches for genome modifications

Development of the kinetic model of Escherichia coli central carbon
metabolism toward rational design of microbial cell factories

Key words
synthetic biology, metabolic engineering, Saccharomyces cerevisiae,
chemical production

Key words○Jun Ishii(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)○Hiroyuki Kurata(Kyushu Inst. Technol.)kinetics, mathematical model, metabolic engineering

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S3Kb01

バイオテクノロジーが拓くバイオエコノミーー新たなバイオ戦略についてー

S3Kb02○上村 昌博（経済産業省生物化学産業課）
uemura-masahiro@meti.go.jp

生物工学を通じたイノベーションの創出と地域貢献の可能性○仲嶋 翼（三菱UFJリサーチ&コンサルティング）
tsubasa.nakajima@murc.jp

バイオテクノロジーは，健康医療の分野はもとより，環境・エネルギー，ものづくり，食品など，様々なバイオ産業分野で利用されている．経済協力開発機
構(OECD)の報告によれば，2030 年には，OECD 加盟国におけるバイオ関連産業の市場規模が約 1.6 兆ドルに達すると予測しており，その内訳は，健康関連分野が 25%，工業関連分野が 39%，農業関連分野が 36%を占めるとしている．
OECD では，このバイオテクノロジーが貢献する市場（産業群）に対して“バイオエコノミー”という概念を提唱しており，炭素循環社会の実現を含めた持続可能な開発目標（SDGs）の達成に向けて，世界的にバイオエコノミーの潮流への期待が醸成されつつある．
近年，DNA シークエンシグ技術やゲノム編集技術等，バイオ分野の基盤技術の革新が進み，極めて簡便かつ低コスト，短時間で生物のゲノムを解読し，またそのゲノムを編集することが可能になってきた．実際に，2005 年以降のわずか7 年間で，単位解読塩基長当たりの DNA 解読コストは 1 万分の 1 に低下している．今日では，ヒトのゲノムがわずか 1 日，1000 ドルで解読できるほどで，生物に由来するゲノム配列等の塩基配列情報が短時間で大量に取得することが可能となり，そのデジタル化された生物情報が急速に蓄積されつつある．また，
生物情報解析にディープラーニング等の AI 技術を積極的に活用する試みもなされてきており，蓄積された膨大なバイオビッグデータ等を解析するための情報解析技術も成熟しつつある．さらに，ゲノム編集技術においても，CRISPRCas9 による次世代ゲノム編集技術が開発されたことで，従来技術の 1/100 以下のコストで短時間に狙ったゲノム部位を標的とした正確なゲノム編集が可能となった．また，細胞に新たな機能を付与する上で必要な安価でハイスループッ
トな長鎖 DNA 合成技術の開発も急速に進んでいる．
こうした技術革新を受けて，現在，我が国では，バイオとデジタル技術の融合により「スマートセルインダストリー」の実現に向けた取組みを推進している．
スマートセルとは，特定の機能や性質を高度に発揮するようデザインされた“賢い”生物細胞のことであり，これを，（1）生物の情報を網羅的に取得，（2）取得
した情報を解析し，自在に生物機能をデザイン，（3）設計した生物機能をゲノム改変等により発現させるといった一連の合成生物学的アプローチにより創成することが可能になりつつある．またこのプロセスを繰り返し，生物機能をファ
インチューニングすることにより，得たい機能を発現する上で最適な生物細胞を，これまでにないスピードで改変，取得することも可能になってきている．
また，他の生物種が持つ有用機能を栽培，培養が容易な生物種に導入し，有用物質等を容易に生産できるポテンシャルも示されている．これらの技術革新の波及効果が及ぶ範囲は，医療・健康，物質生産，エネルギー・環境，農畜水産
分野など多岐にわたり，バイオとデジタルの融合による技術革新は，今後ものづくり産業の構造を大きく変える可能を秘めている．
欧米各国は，既にバイオエコノミーに関する戦略を検討，発表し，重点的な取り組みを開始している．昨年，我が国でも，政府の成長戦略である「未来投資戦略 2017」（2017 年 6 月 9 日に閣議決定）において，「バイオ・ マテリアル革命」として，「生物を活用した機能性物質生産のための産学官による技術開発を推進するとともに，革新的なバイオ素材等による炭素循環型社会や食による健康増進・未病社会の実現等に向け，本年度中を目途に我が国のバイオ産業の新
たな市場形成を目指した戦略を策定し，制度整備も含めた総合的な施策を推進する．」ことが盛り込まれた．これを受け，同年 10 月 12 日に，内閣府の総合科
学技術・イノベーション会議において， 政策討議「バイオ戦略策定に向けて」（バイオテクロジーによるイノベーションを促進する上での課題及び戦略策定について）が開催され，バイオ戦略検討ワーキンググループが設置される等，内閣府の下，民間有識者らや関係省庁が一丸となって新たな戦略策定に向けた検討が鋭意進められている．バイオテクノロジーによるイノベーションがもたらす新たな経済社会像（ビジョン）とバイオ産業の在り方， そのビジョンを実現するための研究開発促進のための環境整備（産学官連携，人材育成，ベンチャー振興， 知的財産， 国際協力等）， 各分野で重点的に取り組むべき研究開発課
題， 産業化促進のための課題を提示する新たなバイオ戦略を，今後取り纏めていくこととしている．
本講演では，バイオ技術とデジタル技術の融合によって実現される「スマートセル」による新たな産業創出の可能性や，その実現の加速に向けた新バイオ戦略の検討状況ならびに今後の政策展開についてお話したい．

バイオテクノロジーの進展により，生物資源の機能をこれまでよりも自由にデザインできる時代が訪れている．既に実験室では当たり前となったこの変化も，
今後は社会への実装に向けて加速していくものと考えられる．バイオ分野のこのような大きな変化は，産業構造を大きく変える契機となることも予想され，実際に，社会におけるバイオ分野の捉え方が近年大きく変わってきている．欧
米では 2000 年代よりバイオ分野の経済産業的広がりを「バイオエコノミー」として考える動きがみられ，以来，バイオ分野の取組を政策的に推進する気運は高まりを保っている．各国ではバイオ分野における国家戦略等を策定し，自国産業の振興と持続可能な社会構築を見据えて戦略的な取組を進めているところである．我が国においても，成長戦略（未来投資戦略 2017）にて，バイオ産業の新たな市場形成を目指す戦略を策定することが示され，現在，省庁横断的な議論を経て取りまとめ作業が進められているものと思われる（2018 年 4 月現在）．今後は我が国でも，政府を挙げてバイオ分野の取組を活性化し，技術開発の深化や，制度の整備等も伴いながら技術の社会実装が推進されていくものと期待される．
一方，近年我が国の政策では「地方創生」が重要なキーワードとなっている．
地方創生とは，総人口の減少と首都圏への人口一極集中が進むなかで，「地方」を活性化し多様な地域からなる我が国の活力を維持していくことを目指す取組
である．2014 年より安部政権により重要課題として掲げられ，
「まち」，
「ひと」，
「しごと」の観点から地域の活性化を目指す施策パッケージが積極的に推進されてきた．そのなかで，地域の稼ぐ力の向上を目指して，ローカル・イノベーショ
ンを後押しし産業を振興する施策が展開されている．先に述べたバイオ産業の変化は，このような地域の取組とも親和性が高く，地方創生に対しても貢献するポテンシャルが大きいものと考えられる．
我が国は周囲を海に囲まれた島国であり，多様な気候・風土に恵まれた土地柄
から，各地に様々な生物資源が存在している．このような地域固有の生物資源を活用することや，地域産業の歴史的経緯を基にして，地域の様々なステーク
ホルダーが協働してバイオ産業の振興に取り組む事例が見られるようになっている．例えば，作物が持つ機能性の検証，作物・製品の品質・供給量の安定化，育種・改良による高機能化，有用物質の生産，環境浄化・資源回収，廃棄物の有効利用などを目指す取組が多数進められているが，これらは地域の課題を解決しつつ新たな事業・産業として育成が図られうるものである．各地で進められている事業は，産学連携による研究プロジェクト，地域への技術の実証・実装事業や，産業集積を目指す産業クラスターの形成事業など，様々な形態・規模感で取組が進められている．また，明確に地方創生の取組として，国からの交付金も活用してバイオ関連プロジェクトを推進する地方自治体も多くみられる．しかしながら，バイオ産業が多様な産業分野を包含していることや，省庁間をまたぐ政策分野であることもあり，これまでの地域での取組について，全体を俯瞰した整理は十分になされていない．
今後，さらに地域におけるバイオ分野の取組が活発化すると考えられるなか，これまでの各地での取組内容や，その成否のポイント，課題点を整理しておくことは有用と考えられる．バイオ産業は地域に根差す一次産業や製造業，消費者等多様な関係者が関わるものである．新しい技術についての正確な理解をもとに，より価値のある事業を構想し，制度面の対応や社会とのコミュニケーショ
ンも進めながら事業が進められるべきものであろう．本発表では，これまでの取組を整理し直すことで，付加価値の高い地域発の事業・産業を創出するためのポイントや，今後どのような展開が期待されるかについてご紹介したい．

New Biotechnology Policy for a Sustainable Bioeconomy

Potential of regional contribution through innovations with biotechnology○Masahiro Uemura(Director of Bio-Industry Division, Ministry of Economy, Trade and Industry(METI))

Key words

Bioeconomy, Biotechnology, Bio-digital, Smart cell industry○Tsubasa Nakajima(Mitsubishi UFJ Research and Consulting)

Key words

bioindustry, bioeconomy, industrial development

228

S3Kb03

さまざまな生物資源から単離された微生物の活用○櫻谷 英治（徳島大・生物資源）
sakuradani.eiji@tokushima-u.ac.jp

S3Kb04

地域発！世界へはばたく事業の創出～科学技術の「種」
を地域で育てる～○髙橋 修一郎（リバネス）
takahashi@lne.st

我々は，さまざまな生物資源から微生物を単離し，カルチャーストックとしてだけでなく，微生物スクリーニングへと利用している．土壌や河川だから単離するだけでなく，キノコ，植物病原菌，海洋性微生物，海洋生物共生菌なども収集した．ここでは，主に「廃グリセロールを利用した微生物油脂生産の可能性」と「徳島大学ブランドのクラフトビール開発」について紹介する．
廃グリセロールは，バイオディーゼル燃料（脂肪酸メチルエステル）の製造過
程で副産物として廃油の 10-20％程度生成される．副産物としての廃グリセロー
ルには，グリセロールだけでなく，メタノールやアルカリ触媒塩，廃植物油由来の脂肪酸などが含まれる．多くのバイオディーゼル燃料施設では副産物としての廃グリセロールを産業廃棄物として処理しており，焼却による二酸化炭素の発生が問題となっている．一方，この初期廃グリセロールを堆肥に混ぜることで発酵熱を上げ植物病原菌や雑草種の殺菌に利用した例が報告されている．
また，廃グリセロールを微生物培養の炭素源として，1,3-プロパンジオールやバクテリアセルロースの生産に応用した例も報告されている．初期廃グリセロー
ルには微生物の生育阻害物質が含まれているため，多くの微生物は生育することができない．我々は，京都市廃食用油燃料化施設より分譲された初期廃グリセロールで生育可能な糸状菌を単離し，微生物油脂生産への研究を行ってきた．
4％の初期廃グリセロールを含む培地で単離株を培養すると培養 4 日目にはグリセロールが完全に消費される．これら微生物油脂は一般的な植物油脂と同様の脂肪酸組成を示し，オレイン酸やリノール酸が多く含まれている．また，単離株の中には，水酸化脂肪酸やオキソ脂肪酸を生産するものも見いだしている．
これら脂肪酸誘導体は，ポリマー原料へと変換される可能性が期待される．
日本でもクラフトビールの人気は高く，多種多様な味わい・香りのクラフトビー
ルがつくられている．200 社程度のクラフトビールメーカーが独自の商品を販売している．一般的に飲まれているラガービールではなく，エールビールが多くつくられているのも特徴といえる．多くのクラフトビールメーカーは市販のビール酵母を利用して醸造を行っている．そこで，我々は，徳島県の花や果実の生物資源から酵母を単離し，エタノール生産性，凝集性，同定などにより候
補株を選抜し，試験醸造することで特徴的な味わいのあるビールの製造を行ったので紹介する．

株式会社リバネスは，理科離れやポスドク問題を背景に 2002 年に理系大学院生
15 名によって設立された．現在では，修士号または博士号を取得した社員 76
名で構成されており，その半分以上が博士号取得者である．
科学教育により次世代の科学人材を育成する教育応援事業から，民間企業による研究費の設立を行うなどの研究応援事業，企業・大学で研修の企画や人材獲得の支援を行う人材応援事業，そして研究成果の社会実装を支援する創業応援
事業を展開している．
研究成果の事業化を狙う創業応援事業では，2013 年より研究成果を社会に還元したいという意欲的な個人・ベンチャー企業の発掘から育成までを行う TECHPLANTER（テックプランター）と呼ばれる取り組みを実施している．IT 分野のようにオンライン上で完結せず，事業化まで時間のかかるものづくり要素のある課題解決型の技術シーズに対しては，企業支援環境が乏しいのが現状である．そこでテックプランターでは，ビジネスプランコンテスト形式のイベントを開催し，イベントの前後でリバネスのコミュニケータによるプランのブラッシュアップやプレゼンテーションのサポートだけでなく，実用化目線での共同研究の提案や投資の機会創出，事業会社とのパートナーシップ締結なども行っている．対象となる技術領域は，ものづくりの要素が介在し，かつ，社会課題の解決の原動力となるような領域とし，テックプランター本大会として「もの
づくり」
「アグリ」
「バイオ」
「海洋」といった 4 つの分野のグランプリを東京で開催している．
一方，新産業の種を見つけてそれを育成することは，大都市に限らず日本国内
外の地域にとっても重要である．リバネスでは地方大学に眠る技術シーズを発掘し，自治体，地方銀行，産業界などが一体となってネットワークを形成し，これを支援することでチャンスを見出そうとしている．2016 年から熊本，滋賀，徳島でテックプランターを開催し，2017 年には熊本，滋賀，徳島に加えて
沖縄，茨城，宮崎でも地域テックプランターに取り組んできた．最も取り組みの進んでいる熊本テックプランターでは，2016 年 2 月に熊本県と肥後銀行，熊本産業連合会と共に熊本県における次世代ベンチャーの発掘と育成に向けた連携協定を締結し，コンソーシアムを構築してエントリーチームへの創業支援を行ってきた．2 年間の取り組みを通じて，合計 55 チーム（企業 22 チーム，研究者・学生 33 チーム）のエントリーがあり，この中から熊大発ベンチャー 3 社
を含むベンチャー 6 社の起業，8 社が委託事業や出資・融資などを通じて合計
3 億 4271 万円の資金調達を実現している．
今回の講演では，これらの地域での取り組みを紹介し，地域に眠る技術シーズをいかにして育て，地方発の事業として社会実装を行い，世界へ広げるのかをご紹介いたします．地方の事業創出に向けて，どのような事業エコシステムが成り立っていくのか，闊達な議論につながれば幸いです．

Utilization of microorganisms isolated from various biological resources

Creation of a new business for the world - development of "seeds" of scienceand technology in local region -○Eiji Sakuradani(Fac. Biosci. Bioind., Tokushima Univ.)

Key words

microorganisms, crude glycerol, craft beer

○Shuichirou Takahashi(Leave a nest Co., Ltd.)Key words
marine technology, biotechnology, manufacturing technology,
agricultural technology

229

S3Lb01細胞シートを基盤とした機能的立体組織構築の現状と展望

S3Lb02○清水 達也（東京女子医科大学 先端生命医科学研究所）
shimizu.tatsuya@twmu.ac.jp

3 次元組織モデルの足りていること，足りていないこと○松崎 典弥 1,2（1阪大院・工, 2JST-さきがけ）
m-matsus@chem.eng.osaka-u.ac.jp

ティッシュエンジニアリングの技術を用いて生体外で細胞から構築した組織を基礎研究あるいは創薬モデルとして使用したり，病変部に移植する再生医療が追究されている．世界的には細胞の足場として生体吸収性の高分子を用い，その生体吸収性支持体に細胞を播種・培養して 3 次元組織を構築する技術が一般に用いられている．さらに，3 Ｄプリンターの技術を利用し，細胞を少量のマ
トリクス成分とともにひとつずつ設計通りに並べて組織を作ろうとする試みも盛んに行われている（バイオプリンティング）． 一方，当研究所では 2 次元の細胞集団である「細胞シート」を積層化し 3 次元的な組織を作製するという独自の手法を展開してきた．細胞シートの回収には「温度応答性培養皿」を用い，
温度降下処理（32℃以下）により細胞が培養皿表面からシート状が脱着する．
既に細胞シート治療を実現すると共に，細胞シートを積層化することで高細胞密度の三次元組織の作製が可能である．このように様々の技術により 3 次元組
織の構築は可能となるなか，より複雑で機能的な組織の構築においては十分な
血管網の付与による酸素・栄養の供給，老廃物の除去，さらに生体外における培養環境をどこまで生体内の環境に近づけることができるかが課題となっている．我々は血管構成細胞との共培養，細胞シートの段階的積層化さらに生体同様の環境を実現する種々のバイオリアクターの開発により生体外において培地
灌流可能な血管網を有した収縮弛緩可能な立体心筋組織の構築を実現してきた．
機能的立体組織構築のこれまでの研究成果を紹介するとともに組織から臓器作製に向けた研究開発を展望する．

医療・創薬研究において，動物愛護や 3R（Replacement（代替），Reduction（削減），Refinement（改善））の観点から実験動物代替法が盛んに研究されている．
期待されているのが，ヒト人工多能性幹細胞（iPS 細胞）から分化誘導して得られる様々な正常および疾患細胞である．特に，患者由来 iPS 細胞から分化誘導した疾患細胞は，ヒトと動物の種差の課題を解決し，候補化合物の薬効や毒性を評価できると期待されている．しかし，生体組織は複数種類の細胞で構成され，種々の細胞が相互作用することで組織としての機能を発現しているため，
細胞単体では生体組織と同じ薬剤応答が得られない場合がある．そこで，生体組織を構成する様々な細胞とタンパク質を 3 次元で統合し，生体組織類似の機能を有する 3 次元組織を構築できれば，生体組織に近い薬効・毒性応答が得られると期待される．
3 次元組織構築に関する国際競争は激化している．米国では，国防高等研究計画局（DARPA）と国立衛生研究所（NIH）の巨額の研究費が投じられ，動物実験に代わるヒト細胞の「Organ on a chip」を用いた医薬品評価を実現するプロ
ジェクトが進行している．また，欧州連合（EU）では，第 7 次フレームワーク
プログラム（FP7）にて「The Body-on-a-chip」プロジェクトが開始されている．
iPS 細胞で優位に立った日本がそのリードを維持して激しい国際競争に勝つた
めには，普遍性の高い 3 次元組織モデルの開発が急務である．
これまで，スフェロイドに代表される様々な in vitro3 次元組織モデルが報告されてきた．それぞれ多種多様であるが，共通して言えることは，モデルとして完全に満足いくものはできていないことである．本講演では，何が足りていて何が足りないのか議論し，3 次元組織モデルの今後の方向性を考えたい．

Recent advances in cell sheet-based functional tissue and organ engineering.

Satisfaction and Unsatisfaction of 3D-Tissue Models○Tatsuya Shimizu(Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women’s
Medical University)

Key words

cell sheet, heart, vascularization, organ engineering○Michiya Matsusaki1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2JST-PRESTO)

Key words

tissue engineering, 3D culture, animal alternative, toxicity

230

S3Lb03

細胞製造性について考える○紀ノ岡 正博（阪工大院・工）kino-oka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

S3Lb04血管を含む立体組織をつくるアプローチ○福田 淳二（横国大院・工）fukuda@ynu.ac.jp

再生医療に資する細胞製造において，製品を安価に安定して製造することが必須であり，大量の製品を製造する技術（スケールアップ）と患者固有の製品を製造する技術（スケールアウト）の概念構築が，製造安定性につながるものと考えている．特に，スケールアップにおいては，細胞増幅させる上工程技術の重要性はもちろんのこと，細胞を分離・精製，梱包・凍結する下工程技術が律速段階であることが明らかとなってきた．一方，スケールアウト技術においては，3D プリンティングなど一品ものつくりに欠かせない技術が発展してきている ． 本 講 で は ， 細 胞 製 造 を 行 う に あ た っ て ， 我 々 は ， 細 胞 製 造 性 (Cellmanufacturability)を提唱している．細胞製造性は，「最低限のコストと最大限の信頼性にて比較的簡易に製造がおこなわれること」を意味する．ここで，「信頼性」は，前もって設計されたプロダクトの品質レベルに達するように細胞加工の安全性や安定性を含んでいる．ここでは，細胞特性を加味した，スケールアップにおける問題点，コストに対する考え方，スケールアウトの技術動向について，最新の情報を取り入れながら紹介し，今後の展開について示したい．

複雑な構造を有する組織・臓器を生体外で構築するために，これまで様々なアプローチが報告されてきたが，有望な方法の 1 つは，細胞の自己組織化を利用するオルガノイド培養法である．複数の細胞種や培養液，細胞外マトリックスの組成などを適切に設定することで，生体の発生プロセスを部分的に模倣し，少なくとも発生初期の立体的な構造を作り出すことに成功している．例えば，
iPS 細胞由来の肝前駆細胞と血管内皮細胞，間葉系幹細胞をゲル中に包埋すると血管ネットワークを備えた肝原基が作製できることが報告されている (T.
Takebe, et al., Nature, 2013)．肝以外にも，幹細胞を適切な成長因子を含むゲルに包埋することで，肺，腎，脳，眼杯，腸オルガノイドの誘導も実現されている(T. Takebe, et al., Cell Stem Cell, 2015)．さらには，患者由来の腫瘍組織からがん
オルガノイドを作り出し，抗がん剤の創薬スクリーニングに利用するアプロー
チも考案されている (J. Kondo, et al., PNAS, 2011)．ただし，これらの組織は生体に類似した複雑な構造を部分的に有しているものの，生体の組織・臓器が cmスケールであるのに対して，それよりも 1，2 桁小さいサイズに留まっており，
さらなる工夫が必要である．
我々の研究グループでは，単純なスフェロイドの培養から細胞の自己組織化を利用した組織構築，さらにスケールアップのための血管構造の導入技術の開発に取り組んできた．特に，作製する組織のサイズ，培養器内での酸素濃度分布，組織形成に要する時間などが構成細胞の遺伝子発現や機能に重大な影響を及ぼすと考え，微細加工技術などを用いてこれらを制御できる組織培養デバイスを開発してきた．具体的には，酸素透過性の高いシリコーンゴム（PDMS）を利用してマイクロウェルアレイ培養器を作製した．この培養器では，肝細胞や膵β 細胞が粒径の均一なスフェロイドを形成し，細胞間相互作用，細胞の立体的な構造に加え，酸素供給の改善により高い代謝機能を発現することを示した (T.
Anada, et al., Biomaterials, 2012)．さらに，同様のマイクロウェルアレイ培養器を用いて，毛髪の再生医療にも取り組んでいる．毛髪を生み出す毛包は，発生期に毛包原基と呼ばれる特殊な構造を形成し，形態形成が進行する．毛包原基は，上皮系細胞と間葉系細胞の集合体が結合した構造を有し，異種および同種細胞間の相互作用により形態形成のスイッチが入ると考えられている．我々は，上皮系細胞と間葉系細胞を混合した細胞懸濁液をスフェロイド培養器に播種すると，培養 1 日目は 2 種類の細胞がランダムに分布したスフェロイドを形成する
ものの，培養 3 日目までにそれぞれの細胞が自発的に分離し，毛包原基様の構造を形成する現象を発見した (T. Kageyama, et al., Biomaterials, 2018)．この毛包原基は，ヌードマウスに移植すると効率的に毛包を再生し，毛幹が伸長した．
また，規則的な毛周期も観察された．ここにさらに血管内皮細胞を混合したと
ころ，間葉系細胞の集塊内に血管ネットワーク構造が自発的に形成されること，マウスに移植すると再生される毛幹の本数が血管内皮細胞を加えない場合と比較して多くなることが示された．このことは，血管内皮細胞を加えることで，移植後に生体の血管との結合により生着率が向上し，毛包形成が促進されたことを示唆しており，自己組織化を利用した組織再生法と考えている．
さらに大きな肝組織，膵組織，毛包を含む皮膚組織を生体外で構築するためには，組織全体に酸素・栄養素を供給することが不可欠であり，ポンプに接続できるような血管構造を導入した組織構築法が必要である．しかも，酸素枯渇の生じる数十分の時間内で血管構造を構築し送液を開始する方法が必要である．
我々は，電気化学的に素早く細胞を培養表面から脱離させる方法を考案し，これを血管構造の構築に応用してきた（T. Osaki, et al., PLoS ONE, 2015, Y. Kang, etal., Acta Biomaterialia, 2015）．すなわち，金電極表面にオリゴペプチド分子層を形成し，これを介して細胞を接着させ，電気化学反応によってこのオリゴペプ
チド層を脱離させることで細胞も脱離させるという方法である．これをニード
ル表面に応用することで，血管内皮細胞に覆われた流路構造を素早くかつ規則
的に導入する手法を考案した．この血管構造の周囲に iPS 細胞由来の肝細胞ス
フェロイドを導入しておくことで，血管構造を有する肝組織が作製できる可能性を示した．細胞源，分化誘導の方法，生体との接続など，未だに解決すべき課題は多くあるものの，送液可能な血管構造を備えた複雑組織の作製法として有用であると思われる．

Cell Manufacturability

Engineering vascularized three-dimensional thick tissues○Masahiro Kino-oka(Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words
medicine

cell manufacurability, cell proecssing, automation, regenerative○Junji Fukuda(Grad. Sch. Eng., Yokohama Natl. Univ.)

Key words

tissue engineering

231

S3Lb05

3D バイオプリンティング○境 慎司（阪大院・基礎工）
sakai@cheng.es.osaka-u.ac.jp

S3Mb01

ストレス耐性や寿命延長におけるメチオニン代謝の役割○水沼 正樹（広島大院・先端物質）
mmizu49120@hiroshima-u.ac.jp

3D バイオプリンティングは，細胞そのものや，生体材料などから，最終的には創薬や再生医療に利用可能な生体の組織と類似の機能を持った組織体を作り出すことを目的とする技術である．近年，急速に発展を続けている一方で，チャレンジされなければならない課題も多く存在する．本講演では，3D バイオプリ
ンティングを用いた複雑組織製造に必要な課題などを自身の研究を絡めながら紹介し，今後の当該技術の可能性や方向性を議論したい．

世界に類を見ない超高齢社会に突入した我が国において，健康的に老いる“健康寿命”の延長は喫緊の課題である．老化過程は非常に複雑なプロセスであるが，その謎が遺伝子レベルで理解されつつある．老化・寿命研究において，酵母，
線虫，ショウジョウバエ，マウスなどのいわゆる真核モデル生物を用いて世界中で研究が活発に行われている．実際，これらモデル生物を用いた研究によって，多くの寿命制御因子が同定され，老化の基本的な仕組みには共通点が多い
ことが明らかになった．カロリー制限は生活習慣病など老化に伴う疾患の予防や遅延効果のみならずモデル生物では寿命延長も認められ，科学的根拠に基づいたアンチエイジング法である．モデル生物で保存された寿命制御経路として，
TORC1(Target of Rapamycin Complex 1) や AMP 依 存 性 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ(AMPK)経路が著名である．
また，加齢に伴う生体機能調節機構の低下-とりわけ代謝恒常性維持の破綻は，
生活習慣病など多様な病態発現を惹起する．近年，α-ケトグルタル酸や硫化水素(H2S)などの代謝産物が TORC1 を阻害し寿命が延長したことから，代謝産物が関与する寿命制御機構が注目されている．
私達は，Ca2+恒常性維持機構の解明のため，出芽酵母を用いて解析を行なってきた．その過程で，メチオニン代謝系酵素の S-アデノシルホモシステイン(SAH)
水解酵素をコードしている SAH1(必須遺伝子)における変異株を取得した．興味深いことに，sah1 変異株は顕著に短命となり，かつテロメア長の短縮も観察された．そこで，sah1 変異株の短命を抑圧する変異株をスクリーニングすることにより，新規長寿遺伝子の取得を試みた．その結果，野生株よりも寿命が延長した変異株の取得に成功した(優性変異株を SSG1 と命名)．SSG1 変異は sah1 変異株が示すテロメア長の短縮も抑圧した．そこで，SSG1 変異株の長寿メカニズ
ムを解析したところ，SSG1 変異株では S-アデノシルメチオニン(SAM)合成が促
進され，酵母 AMPK である Snf1 の高活性が観察された．また，SAM 合成酵素
過剰発現株においても Snf1 が活性化され，SSG1 変異株と同様，寿命延長には
Snf1 が重要であった．以上のように，SAM 合成促進及び関連するシグナル伝達経路の活性が寿命延長を導く重要な発見をした．
古くから清酒酵母は SAM を高蓄積することが知られていたがこの原因や意義は不明であった．最近の研究から，清酒酵母では，SSG1 が SAM 高蓄積の一要因であることが判明した．また，実験室酵母では SSG1 変異を持つと酸化スト
レスや高温ストレスに対して耐性を獲得したことから，清酒酵母は SAM 合成
活性化とカップルした形で清酒醸造中の過酷なストレス環境下に適応していると想像される．即ち，メチオニン代謝は寿命やストレス応答制御に重要な役割を果たすことが示唆された．そこで，このメカニズムを詳細に明らかにすることを目的に，SSG1 の機能解明に取り組んだ．
本シンポジウムでは，メチオニン代謝及び関連するシグナル伝達による寿命やストレス耐性メカニズム，さらには SSG1 自身の機能について紹介したい．また，酵母の生き様(基礎的研究)の解析から，清酒酵母の SAM 高蓄積の意義及びアルコール生産能力向上などの応用研究への展開についても議論したい．

3D bioprinting

Role of methionine metabolism in stress tolerance and lifespan extension○Shinji Sakai(Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ.)

Key words

tissue engineering○Masaki Mizunuma(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

yeast, metabolism, stress response

232

S3Mb02

細胞表層の傷による出芽酵母の運命決定○河野 恵子, 森山 陽介（沖縄科技大院・膜生物）
keiko.kono@oist.jp

S3Mb03糸状菌の菌糸生長の分子機構○竹下 典男（筑波大院・生命環境）
takeshita.norio.gf@u.tsukuba.ac.jp

酵母は醸造を始めとする様々なプロセスの中で環境ストレスを受け，その結果として細胞膜や細胞壁に微小な傷を受ける．このような傷を修復する細胞創傷
治癒は進化的に保存された機構だが，その全貌を俯瞰するには至っていない．
本研究では出芽酵母実験室株を用いて細胞創傷治癒機構に関与する遺伝子の網羅的同定を行った．その結果，これらの遺伝子群は(1)損傷直後に緊急避難的修
復を行う因子，(2)細胞周期停止を誘導する因子，(3)細胞周期停止後に本格的修復を行う因子，(4)修復完了後に増殖を再開させる因子，に分類できた．このような解析の過程で，酵母は傷の程度に応じて増殖の可逆的停止，不可逆的停止，死といった異なる運命をたどることが明らかになってきた．これらの分子機構に関する最新の知見を報告するとともに，「傷の程度」という連続的な変化が「酵母の運命決定」という all-or-none の事象に変換されるしくみを考察する．

糸状菌は，菌糸と呼ばれる管状の細胞の先端を伸ばして生育する．菌糸の先端を伸ばす際に，多種多様な分解酵素を菌体外に分泌することで環境中の有機物を分解し，栄養を吸収し増殖する．分解者として重要な役割を果たし，生態系の物質循環に必要である．古くからコウジカビのように伝統的な醗酵食品の生産に利用され，近年では有用酵素生産などバイオ産業で利用されている．一方で，動植物細胞に侵入し病原性を示すものもおり，医学・農業分野で大きな問題となっている．このような糸状菌の有用性と病原性は，菌糸による生長様式と密接に関連している．糸状菌を特徴付ける菌糸生長の分子機構が，最新の蛍光イメージング技術により明らかになってきたので，紹介したい．
菌糸の先端生長に必要な膜とタンパク質は，分泌小胞の輸送とエキソサイトー
シス（分泌小胞と形質膜との融合）により菌糸先端に供給される．分泌小胞の輸送には，微小管とアクチン細胞骨格，そしてそれらに対応したモータータン
パク質が，中心的な役割を担っている．微小管は，その配置から菌糸後方から先端に向かう長距離の輸送に利用され，対照的にアクチンケーブルは菌糸先端の形質膜近傍にのみ局在し，菌糸先端でのエキソサイトーシスに関わる．また，
極性マーカーと呼ばれるタンパク質が，菌糸先端に局在し，菌糸の伸長方向を制御する．糸状菌が真っ直ぐに伸長する微小管の特性を利用して，位置情報を
菌糸先端の極性マーカーに伝達し， 菌糸の伸長方向を制御するという機構が示されている．
糸状菌の高い酵素分泌能は，菌糸先端での活発なエキソサイトーシスに依存する．エキソサイトーシスによって菌糸先端の形質膜に新たな膜が大量に供給されるにもかかわらず，膜結合性の極性マーカーが拡散せずに極性部位に維持される機構を，超解像顕微鏡を用いた解析で見出した．その結果，約 2 マイクロメートルの幅の菌糸先端で，極性マーカーの一時的な集合 （120 ナノメートル）と形質膜上での拡散, それに伴う形質膜の局所的な伸長が観察された．この結果
は，微小管に依存した極性マーカーの集合 （極性部位の確立）と，アクチン
ケーブルに依存したエキソサイトーシスが交互に繰り返して起こる機構を示唆している．
実際に，菌糸の生長速度が一定ではなく，早い時と遅い時を繰り返していることが判明した．そして，菌糸が先端を伸ばす際，菌糸先端でのアクチンの重合・脱重合とエキソサイトーシス活性が周期的（約 20-30 秒間隔）に変化することが明らかになった．さらに，細胞内への Ca2+の流入も周期的に変化し，これらを同調させて制御していることが示唆された．このような時空間的に制御された細胞生長の生物学的意義として，環境シグナルに素早く応答し，菌糸生長の速度や方向を制御することで，糸状菌にとってより良い環境を選択し生長するという利点が考えられる．

Cell surface damage determines yeast's cell fate

Molecular mechanism of hyphal tip growth in filamentous fungi○Keiko Kono, Yohsuke Moriyama(Membranology Unit, OIST)Key words

stress response, Saccharomyces cerevisiae, membrane lipids, cell wall

○Norio Takeshita(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

fungus, calcium, cell membrane, cell morphology

233

S3Mb04グルコースによる麹菌アミラーゼ生産の抑制機構○田中 瑞己（静県大・食栄）mizuki.tanaka@u-shizuoka-ken.ac.jp

麹菌 Aspergillus oryzae は，アミラーゼを高生産する糸状菌であり，日本酒・醤
油・味噌などの醸造に用いられている．麹菌のアミラーゼの生産は，マルトー
スが菌体内に取り込まれることで誘導されるが，グルコースが存在するとカーボンカタボライト抑制（CCR）によりアミラーゼ遺伝子の発現が強く抑制される．糸状菌の CCR は転写因子 CreA によって制御されるが，他の制御因子としてユビキチンプロテアーゼ複合体を形成する CreB と CreC，そしてユビキチン
リガーゼのアダプターとして機能すると推定される CreD が同定されている．
麹菌の creA と creB を二重破壊することでアミラーゼやキシラナーゼの生産量
が野生株の 5 倍以上に増加することから (1, 2)，CCR の解除は酵素タンパク質の生産量増加の手段として非常に有効である．しかし，糸状菌における CCR制御の詳細な分子機構についてはほとんど明らかとなっていないのが現状である．本発表では，我々が最近明らかとした局在変化に伴う CreA の分解機構とグルコース誘導性のマルトーストランスポーターの分解機構，そして，それらにおける CreB, CreC, CreD の関与について紹介する．
1. 局在変化に伴う CreA の分解機構
モデル糸状菌 Aspergillus nidulans において，CCR の制御因子としてユビキチン化および脱ユビキチン化に関わると推定される因子が同定されたことから，ユビキチン化依存的な CreA 分解機構の存在が長年提唱されていた．しかし，CreAの分解についてはこれまでほとんど解析がされておらず，積極的な CreA 分解機構の有無は明らかとなっていなかった．また，出芽酵母においては，CCR を制御する転写因子 Mig1 がグルコース存在下では核内に局在し，グルコース欠
乏条件では核内から細胞質に排出される．そこで我々は，麹菌において炭素源が CreA の細胞内局在と安定性に与える影響について解析を行った (3)．麹菌において GFP 融合 CreA の細胞内局在を調べた結果，グルコース存在条件では核内に局在したのに対し，マルトース存在条件下では核内の蛍光が消失した．さらに，CreA タンパク質の安定性を調べたところ，グルコース存在条件下と比較してマルトース存在条件下では半減期が著しく短くなっており，CreA が不安定化することが示された．また，CreA の核外への排出を阻害することで CreA が安定化したことから，CCR 非誘導条件では CreA が核内から細胞質に排出されて速やかに分解されることが示唆された．さらに，C 末端近傍の 20 アミノ酸を欠失させることで CreA が著しく安定化したことから，この領域が CreA の分解に重要であることが示唆された．また，creB や creC を破壊することで細胞内の CreA 存在量が著しく減少したことから，CreB と CreC が直接的あるいは間接的に細胞内 CreA 存在量の制御に関わっていることが示唆された．一方で，creD を破壊しても CreA の安定性は変化しなかったことから，CreD は CreA の分解に関与していないことが示唆された．
2. グルコース誘導性のマルトーストランスポーター分解機構
トランスポーターをはじめとする細胞膜上のタンパク質は，外部環境の変化に応じて発現量が厳密に制御されている．麹菌においては，CCR を誘導するグルコースやマンノースが存在すると，アミラーゼ遺伝子の発現誘導基質であるマ
ルトースを取り込むトランスポーター (MalP) がエンドサイトーシス依存的に細胞膜から液胞に輸送されて分解されることが明らかになった (4)．この MalP の分解が，ユビキチンリガーゼ HulA （出芽酵母 Rsp5 のオーソログ）の発現抑制と creD の破壊により抑制され，HulA と CreD が相互作用していたことから，
CreD は MalP と HulA のアダプターとして働くことで MalP のエンドサイトーシスに関与していることが示された (5)．また，CreD は CCR 誘導条件で速やかに脱リン酸化されることが明らかになったが，CreD への脱リン酸化変異および擬
リン酸化変異導入は HulA との相互作用と MalP のエンドサイトーシスに大きな影響は与えなかった．一方で，creB を破壊すると CCR が解除されるが，creB
破壊株において creD の破壊または擬リン酸化変異導入を行うと CCR の解除が抑制されることが明らかになった．さらに，creB 破壊株に CreD の非リン酸化
変異を導入したところ，アミラーゼの生産が促進された (5)．以上の結果から，CreD は MalP エンドシトーシスと CCR の両方の制御に関与しており，CreD の非リン酸化変異導入と他の CCR 制御因子の破壊を組み合わせることで酵素タ
ンパク質の高生産化が可能となることが示された．

S3Mb05

清酒酵母のリンゴ酸高生産株に見出した遺伝子変異と代謝変化○根来 宏明, 小高 敦史, 松村 憲吾, 堤 浩子, 秦 洋二
（月桂冠・総研）
negoro@gekkeikan.co.jp

1 リンゴ酸を高生産する清酒酵母
清酒の香味には，アルコール，糖，有機酸，アミノ酸，エステルといった非常に多くの成分が関与している．このうち，味わいに影響する有機酸としてコハク酸，リンゴ酸，乳酸，クエン酸などが挙げられる．中でもリンゴ酸はさわやかな酸味を持ち，酸味に特徴をもたせた清酒を造る場合はリンゴ酸含有量を高くすると好ましい味となるため，これまでにリンゴ酸を高生産する清酒酵母が数多く育種・利用されてきた．一方で，高生産する機構については未解明な点が残されており，表現型に寄与する変異遺伝子は同定されていなかった．そのため，リンゴ酸高生産酵母を新たに取得したい場合には，生化学的な機構を把握しないまま，表現型のみを指標として育種を行っているのが現状であった．
そこで，いくつかのリンゴ酸高生産酵母について変異遺伝子の同定を試み，どのような代謝の変化が起こっているか解析を行った．
2 GID 複合体関連遺伝子の変異によるリンゴ酸生産能の上昇
きょうかい酵母 K-901 を親株として，リンゴ酸高生産株 K-901H を取得した．
全ゲノム比較解析により原因となる遺伝子の特定に取り組んだ結果，VID24 遺伝子のヘテロ接合型ミスセンス変異が K-901H のリンゴ酸高生産に寄与していることが分かった．Vid24 は GID（Glucose Induced degradation Deficient）複合体の構成要素であり，GID 複合体はグルコースの存在に応答して糖新生酵素を分解する役割を持つ．糖新生酵素が代謝の変化に影響していると推察して検討を進めると，Mdh2（細胞質局在リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）がリンゴ酸高生産に関与することが明らかになった．これより，K-901H は Vid24 機能欠損のためMdh2 が細胞質に蓄積し，オキサロ酢酸をリンゴ酸に変換する経路が促進されたと推察した．
3 ペルオキシン関連遺伝子の変異によるリンゴ酸生産能の上昇
きょうかい酵母 K-701 を親株として，リンゴ酸高生産株 F-701H を取得した．
先と同様に全ゲノム比較解析による解析を行うと，F-701H では PEX22 遺伝子にホモ接合型ナンセンス変異が導入されたため，リンゴ酸高生産となったと判明した．Pex22 はペルオキシソームの恒常性に関与するペルオキシンの一つである．Pex22 を含む数種のペルオキシンは，ペルオキシソーム内へタンパク質を輸送する役割を持つ．この輸送システムを担うペルオキシンの欠損株を用いるといずれの株でもリンゴ酸生産能が上昇したことから，ペルオキシソーム局
在タンパク質の関与が示唆された．解析を進めると，F-701H 株では Mdh3（ペルオキシソーム局在リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）がペルオキシソームへ輸送されなくなり，細胞質へ局在が変化することでリンゴ酸高生産となったことが分かった．
4 清酒もろみにおけるリンゴ酸の生成
清酒醸造においてリンゴ酸デヒドロゲナーゼがリンゴ酸生産に関わることは過去の報告からも示唆されていたが，本研究はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ制御因
子の変異が高生産に寄与するという機構を初めて明らかにした．嫌気的な環境である清酒もろみにおいては，リンゴ酸は酵母の細胞質でオキサロ酢酸からの還元的経路により生成すると報告されており，我々の提唱する機構と合致している．具体的な変異遺伝子を同定したことで，酵母の有機酸生成に対する理解をより深めることができたであろう．
また，得られた知見を利用して，VID24 変異の接合型を指標とする新たなリンゴ酸高生産酵母の育種法を構築した．非遺伝子組換えによってリンゴ酸生産能が更に上昇した株を取得し，実際の生産現場にて清酒の酸味をコントロールするための有効なツールとして役立っている．ゲノム解析を元に産まれた酵母が発酵タンクの中で活動していると思うと，少し不思議な感覚である．

(1) Ichinose, Tanaka et al. 2014, Appl. Microbiol. Biotechnol.
(2) Ichinose et al. 2018, J. Biosci. Bioeng.
(3) Tanaka et al. Conditional acceptance, Mol. Microbiol.
(4) Hiramoto, Tanaka et al. 2015, Fungal Genet. Biol.
(5) Tanaka et al. 2017, Appl. Environ. Microbiol.

Glucose repression of Aspergillus oryzae amylase production○Mizuki Tanaka(Sch. Food Nutr. Sci., Univ. Shizuoka.)

Key words

Aspergillus oryzae, gene expression, amylase gene, transporter

The identification of gene mutations and its effect on metabolism in highmalate-producing sake yeasts○Hiroaki Negoro, Atsushi Kotaka, Kengo Matsumura, Hiroko Tsutsumi, Yoji Hata
(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., Ltd.)Key words

Saccharomyces cerevisiae, malic acid, GID complex, peroxin

234

S3Mb06

NAD+-依存性デアセチラーゼ欠損を中心とした解糖系の代謝リプログラミング

S3Mb07○増本 博司 1, 松山 茂 2（1長崎大・医, 2筑波大院・生命環境）
himasumo@nagasaki-u.ac.jp

解糖系は糖代謝の中心に位置し，その代謝中間産物はクエン酸回路，発酵経路，
ペントースリン酸経路などの二次代謝経路に供給され，細胞内エネルギー通貨であるアデノシン三リン酸(ATP)，核酸，アミノ酸，脂質の合成に利用される．
細胞／生体の生命維持に必須である解糖系は，炭素源の供給量あるいはその種類の変化に柔軟に対応し，中間代謝産物の供給量を一定に保っている．解糖系の制御機構を人工的にコントロールすることは，解糖系およびその二次代謝経路の代謝産物量を制御できることを意味している．
出芽酵母はその優れた発酵能力により古来より様々な発酵食品の製造に利用されてきた．また遺伝子改変が容易であることから，真核単細胞生物のモデル生物として細胞周期制御機構，DNA 損傷修復や染色体 DNA 複製などの核機能機構の研究などの基礎研究へ貢献するだけでなく，発酵経路を含め解糖系の活性が高いことから代謝物の生産プラットフォームとして，製薬やバイオエネルギーの産生生物としても利用されている．
NAD+ -依存性デアセチラーゼ （通称サーテュイン） は原核生物から真核生物にいたるまで広く保存されている．その細胞内機能は，エネルギー代謝，DNA
損傷修復，クロマチン構造形成，遺伝子サイレンシングおよび細胞の寿命と幅広く関与している．クロマチンタンパクであるヒストン分子を中心としたタン
パクの脱アセチル化反応に関与し，その脱アセチル化反応には NAD+を補酵素として利用する．出芽酵母内には老化制御因子として知られる Sir2 と，Sir2 のホモログである Hst1/2/3/4 の計 5 種類のサーテュインが知られている．出芽酵
母サーテュインのうち Sir2, Hst3 および Hst4 の三種類はエネルギー代謝に関与している．相補的に機能する Hst3 および Hst4 は解糖系に関与しており，その二重遺伝子欠損は解糖系のほぼ逆反応である糖新生経路の亢進を引き起こし，解糖系の代謝産物量を著しく増加させる．sir2 遺伝子欠損も糖新生経路の亢進を引き起こすことが知られている．
我々はサーテュイン欠損 (hst3 hst4 sir2)による糖新生経路の異常な活性化が，既に活性化されている解糖系とコンフリクションを起こした結果，解糖系代謝物の蓄積を起こすのではないかと予想した．従って，糖新生経路を遮断すれば，蓄積された解糖系代謝産物を二次代謝経路に流入させるように代謝 flux が変化
し，様々な二次代謝産物の増産へと結びつけられないかと考えた．この仮説を実証するために糖新生経路が亢進する hst3 hst4 sir2 欠損株に fbp1 遺伝子を欠損させることで，糖代謝系への影響を調べた．Fructose 1,6-bisphosphatase をコードする FBP1 遺伝子は糖新生経路のみに関与し，その遺伝子欠損によって糖新生経路の遮断が起こる．hst3 hst4 sir2 fbp1 欠損株はグルコース消費量の増加，
発酵代謝物であるエタノールの生産能力の上昇を示すにも関わらず，細胞増殖が早い段階で停止してしまう．次に Capillary electrophoresis time-of-flight mass
spectrometry (CE-TOF/MS)を用いて細胞内の代謝産物を網羅的に定量・比較した．野生株では解糖系代謝物や糖新生経路の代謝産物(核酸類)は少なく，逆にアミノ酸類が多く蓄積していた．サーテュイン欠損 (hst3 hst4 sir2)株では，逆に解糖系代謝物，核酸類が蓄積し，アミノ酸代謝物は減少した．hst3 hst4 sir2 fbp1
欠損株では hst3 hst4 sir2 欠損株と比較して，アミノ酸量は低いままであるが，解糖系代謝物および核酸の蓄積量の更なる増加に加え，クエン酸回路の代謝物も増加していた．核酸の増加が解糖系からペントースリン酸経路への代謝 fluxの増加に依存するのか調べるために，安定同位体を使った代謝 flux 解析を行なった．その結果，hst3 hst4 sir2 fbp1 欠損株では解糖系からペントースリン酸経路へとつながる代謝経路のうちメジャーおよびマイナーな経路を問わず解糖系からペントースリン酸経路へ流れる flux のみが検出された．このように hst3
hst4 sir2 fbp1 欠損株では解糖系からアミノ酸代謝を除くいくつかの二次代謝経路（ペントースリン酸経路，発酵回路，TCA 回路など）への代謝 flux の増加と代謝物生産が増加していることがわかった．これらの結果はサーテュイン欠損と他の代謝酵素遺伝子の欠損の組み合せは，解糖系の代謝リプログラミングを起こし，特定の二次代謝経路産物の増産を起こすことを示唆している．
・参考文献：Masumoto, H. and Mastuyama, S., The combination of NAD+-dependent
deacetylase gene deletion and the interruption of gluconeogenesis causes increased
glucose metabolism in budding yeast. PLoS One (2018) (https://doi.org/10.1371/
journal.pone.0194942)
・特許：遺伝子欠損エタノール生産菌，特願 2014-051675

酵母栄養源飢餓ストレスと発酵制御○善本 裕之（キリン・酒類研）
hyoshimoto@kirin.co.jp

ビールは，麦芽とホップを主な原料として，酵母の働きにより造られる．自然の力を最大限引き出すことで，美味しいビールが生まれるが，その美味しさは，発酵工程で主役となる“酵母”の活躍で決まる．その働きが適度であれば人に好ましい香りや味が生まれるが，酵母の働きの中には，人にとって好ましくない
味やオフフレーバーを生じるものもある．そのバランスが難しい．安定して高品質のおいしいビールをつくり続けるためには，酵母による発酵制御が大切となる．発泡酒や新ジャンルの製造では，麦芽使用比率が少ないために液糖で糖源を補う．そのために，糖類と糖類以外の栄養源のバランスがビールと異なる．
糖類以外の栄養源が少ない中で，酵母が栄養飢餓ストレスを受けて発酵を続けることになり，ビール製造では想定できなかった発酵遅延やオフフレーバー等の課題が発生した．そこで，酵母が正常な発酵制御を行なうために，糖類と糖類以外の栄養源のバランスが及ぼす影響について，研究を行った．酵母では，栄養源のバランスを崩すと細胞死することが知られている．YPD10(1% 酵母エ
キス，2% ペプトン，10% グルコース)，10%グルコース，酵母エキス，ペプトンの培地で，それぞれ下面発酵酵母 KBY011 を 20℃で発酵させると，酵母エキス，ペプトンの培地では発酵が進まないが，YPD10 とグルコース培地で炭酸ガスを発生し，発酵が進んだ．しかしながら，酵母は YPD10 培地で死滅しないが，グルコース培地では死滅した．栄養源をグルコースだけにして発酵させると酵母は死滅した．この現象は，Granot らにより SICD (Sugar-Induced Cell
Death)，つまり，糖誘導による細胞死(＝糖以外の栄養源欠乏による死滅率増大)と報告されている 1)．次に，糖類濃度を一定として，糖類以外の栄養源(アミノ酸等)濃度を段階的に減少させた培地を作製し，酵母の死滅への影響を調べた．その結果，糖類以外の栄養源濃度が段階的に減少するにつれて，酵母の死滅率は増大した．つまり，正常な発酵を行うためには，糖類以外の栄養源の濃度が重要であることを示唆された 2)．一方，Lin らにより，糖類以外の栄養源を一定として，糖類(グルコース)濃度を 2%から 0.5%に減少させて酵母を培養した場合(カロリー制限)，寿命を約 30％も延ばせることが報告されている 3)．糖類と糖類以外の栄養源のバランスは，酵母の細胞死や寿命を決定していることが示唆される．健全な発酵のためには，栄養源のバランスを考えて発酵を制御することが重要である．ヒトの場合，適度なカロリー制限，バランスの取れた
食事，食べ過ぎないことにより，動脈硬化や高血糖の抑制，糖尿病の予防，ガンの抑制等の老化要因を抑えることができる．同じように，酵母においても，糖類以外の栄養源の濃度が少ない場合，酵母活性が低下して，発酵不良を発生する．糖類以外の栄養源が多い場合には，酵母活性が高い状態を維持され，健全な発酵を行なうことができる．つまり，ヒトも酵母も糖類と糖類以外の栄養源のバランスをしっかりと取ることが，それぞれ健全な発酵や生活習慣病を防止することに繋がることが示唆されている 4)．発酵工程における酵母の営みが自然の一部であることを念頭において，様々な機能や働き(栄養源飢餓ストレス対応等)を理解するためにブラックボックスの解明を行いつつ，お客様に酵母の魅力を感じて頂ける，美味しいビールの製造に繋げて行きたい．
1) Granot D., Levine A. and Dor-Hefetz E. (2003). Sugar-induced apoptosis in yeast
cells. FEMS Yeast Research. 4:7-13.
2) Yoshida, S. and Yoshimoto, H. (2015) Nutrient stress responses of the bottomfermenting yeast, in "Stress Biology of Yeasts and Fungi: Applications for Industrial
Brewing and Fermentation" ed. by H. Takagi and H. Kitagaki, Springer. pp 123-136.
3) Lin S. J., Kaeberlein, M., Andalis, A. A., Sturtz, L. A., Defossez P. A., Culotta, V.
C., Fink, G. R., Guarente, L. (2002) Calorie restriction extends Saccharomyces
cerevisiae lifespan by increasing respiration. Nature. 418(6895):344-348.
4) Rockenfeller, P., and Madeo, F. (2010) Ageing and eating, Biochim. Biophys. Acta.
1803(4):499-506.

The gene deletions of NAD+-dependent deacetylases can trigger the
metabolic reprogramming of grycolysis

Nutrient starvation stress responses in yeast and fermentation control

Key words
Saccharomyces cerevisiae, metabolic engineering, metabolic flux
analysis, gene disruption

Key words
death○Hiroshi Masumoto1, Shigeru Matsuyama2(1Sch. Med., Nagasaki Univ., 2Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)○Hiroyuki Yoshimoto(Res. Lab. for Alcoholic Beverage Technol., Kirin Co., Ltd.)yeast, Saccharomyces, nutrient starvation stress, sugar-induced cell

235

S3Mb08

酵母は何を感知してアルコール発酵を調節しているのか？

S3Bc01 〈招待講演（韓国生物工学会）〉
Biomimetic membrane technology and its engineered
applications○渡辺 大輔, 高木 博史（奈良先端大・バイオ）d-watanabe@bs.naist.jp

酵母 Saccharomyces cerevisiae によるアルコール発酵は，最も古くから人類に活用されてきた重要な微生物機能の一つであり，微生物学および生化学の黎明期から研究が進められてきた．現在，アルコール発酵の全ての代謝ステップが解明されており，それぞれに関わる酵素・遺伝子が解析され尽くしている．しかしながら，そのような酵素・遺伝子の改変だけではアルコール発酵力を自在に操ることは困難である．そのため，現代に至っても，目的のアルコール発酵力を有する菌株を得るためには，その菌株に由来する変異株などを用いて発酵試
験を繰り返し，最適な菌株を探索し続けなければならない．このような現状を打破するためには，アルコール発酵のマシーナリーを統率しているマスターレ
ギュレーターの解明と，その改変による「発酵デザイン技術」の開発が望まれる．
演者らは，現在までに，S. cerevisiae の中でもきわめて高いアルコール発酵力を有する清酒酵母と呼ばれる菌株群に着目し，その原因のゲノムワイドな探索を進めてきた．その結果，代表的な清酒酵母として知られるきょうかい 7 号や近縁な菌株では，真核生物に広く保存された Greatwall ファミリープロテインキ
ナーゼ Rim15p が欠損しており，そのことが高いアルコール発酵力を生み出す一因であることを明らかにした．つまり，Rim15p は，アルコール発酵のブレー
キとして機能していると考えられるのだが，細胞内外の何を感知し，どのような機能を果たすことでアルコール発酵を調節しているのだろうか？その謎に迫るため，Rim15p の既知の上流因子のうち，栄養シグナリングの鍵因子として知られるプロテインキナーゼ複合体 TORC1 に着目し，アルコール発酵における影響を解析した．まず，発酵過程における酵母の TORC1 活性の解析を行った
ところ，アルコール発酵力が高い菌株や時期において，高い TORC1 活性が認められた．一方，TORC1 活性を改変するための変異を実験室酵母に導入して発酵試験に供した結果，TORC1 活性と連動してアルコール発酵力が変化した．以上の結果から，酵母は，環境中の栄養源を感知し TORC1 を活性化させることで，高いアルコール発酵力を発揮できるようになると考えられる．

○Tae-Joon Jeon
(Dept. Biol. Eng., Inha Univ., Korea)
tjjeon@inha.ac.kr

Biomimetic membranes and their analogs are used in a variety of scientific andengineered applications and have also been explored as a platform for highly sensitiveand rapid single molecule sensing. Furthermore, a number of functional membraneproteins and ion channels incorporated into such biomimetic membrane have provided
many applications and potential uses including water purification, biosensors, drug
screening, and biophysical studies. However, these uses are inhibited by the fragility
and short lifetime of the membrane that supports the functional proteins andbiomimetic membrane technologies have historically been the purview of experts. In
order to address those shortcomings, we are developing an easy-to-use, robust, andinexpensive technological platform for membrane formation and membrane protein
based technology. In this presentation, with our biomimetic membranes, I will present
two representative technologies including aquaporin based water purification systemand biosensing application. Membrane based water purification technologies haveplayed a most important role in water purification to date. However, conventional
technologies reached their performance limit and further enhancement in performanceis needed by developing new materials for their membranes. Of particular interest, anaquaporin embedded biomimetic membranes are considered as an alternative to replace
the conventional membranes. Our work shows biomimetic membrane platforms forwater purification and improved performance of the membranes by employing a novel
substrate and chemical conjugation techniques. The other application with biomimetic
membrane for biosensing applications will be also shown as a potential use as
biosensors with rapid and accurate detection of biomolecules.

TORC1 の下流では，Rim15p などの Greatwall ファミリープロテインキナーゼ
が，プロテインフォスファターゼ 2A の一種である PP2AB55δ の阻害を介して細胞周期の調節に関与することが，近年報告された．演者らは，この高度に保存されたシグナル伝達経路が酵母のアルコール発酵の調節にも関与しており，
PP2AB55δ がアルコール発酵にとっての主要なエンジンであることを新たに見出した．したがって，PP2AB55δ は，細胞周期の進行とアルコール発酵の両方を正に制御することで，酵母がエネルギーを獲得しながら効率良く増殖するための中心的な役割を担っていると考えられる．今後，PP2AB55δ による脱リン酸化の標的因子を解析することで，さらに詳細なアルコール発酵調節メカニズムを理解していきたい．一方，TORC1 は，Rim15p 経路とは独立して，細胞内のアミノ酸レベルの調節にも関与している．そこで，酵母細胞内での主要なアミノ酸の一つであるグルタミン酸の合成や取込みに関連する遺伝子を改変し，細胞内のグルタミン酸レベルを低下させたところ，アルコール発酵力が上昇することを明らかにした．このことから，アルコール発酵がアミノ酸によって制御されるという，新規な炭素-窒素代謝クロストーク制御の存在が示唆された．以上の研究を通して，TORC1 が Rim15p-PP2AB55δ 経路と細胞内アミノ酸レベルの両方の調節を介してアルコール発酵を促進する全体像が垣間見えてきた．
話は変わるが，近年，酵母とバクテリアの共培養により，酵母内に[GAR+]という推定上のプリオンが形成され，その結果アルコール発酵が抑制される，という興味深い報告がなされた．伝統的な清酒醸造法である生酛（きもと）造りにおいては，酵母のアルコール発酵に先立って乳酸菌による乳酸発酵が行われ，酒母の中で酵母と乳酸菌が共存する．演者らの研究により，生酛造りに用いられる乳酸菌の Leuconostoc mesenteroides や Lactobacillus sakei が，清酒酵母における[GAR+]プリオンの形成促進能を有することを示唆する結果が得られた．従来，生酛造りにおける乳酸菌の意義として，(1)乳酸の生産により醸造環境を酸性に保ち，雑菌の繁殖を防ぐことや，(2)乳酸菌が生産する D-アミノ酸などの成分により，独特の風味を付与すること，などが考えられてきたが，もし生酛造りの酒母において[GAR+]プリオンが形成されるとすれば，(3)急激なアルコール
発酵の進行に伴う酵母の死滅を防ぐ，という新たな意義を提唱することも可能になるだろう．
いずれも詳細なメカニズムについては今後の解析が待たれるが，酵母は，環境中の栄養源に加え他の微生物の存在までも感知しながら，アルコール発酵を緻密に制御し，自らにとってのエネルギー生産と他者にとっての生育環境のバラ
ンスを最適化しているのかもしれない．このように，酵母が何を感知してアルコール発酵を調節するのかについては未だに多くの謎が残されており，アルコー
ル発酵の研究が新たな局面を迎えつつあると感じる．

What do yeast cells sense for the control of alcoholic fermentation?
○Daisuke Watanabe, Hiroshi Takagi(Div. Biol. Sci., NAIST)

Key words

Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation, sake yeast, TORC1

Biomimetic membrane technology and its engineered applications○Tae-Joon Jeon
(Dept. Biol. Eng., Inha Univ., Korea)

Key words
biosensor

biomimetic membrane, membrane prtotein, nanobiotechnology,

236

S3Bc02耐熱性酸性コラゲナコーゼ Kumamorisin-As：構造機能
解析と反応最適 pH の変換○中山 亨（東北大院・工）nakayama@seika.che.tohoku.ac.jp

S3Bc03

モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素の
熱安定性の向上と新しい核酸増幅法の開発○滝田 禎亮, 馬場 美聡, 片野 裕太, 岡野 啓志, 兒島 憲二, 保川 清
（京大院・農）takita@kais.kyoto-u.ac.jp

好熱好酸性細菌 Alicyclobacillus sendaiensis NTAP-1 株の生産する耐熱性コラゲ
ナーゼ Kumamolisin-As（kuma-As）は MEROPS S53 ファミリーに属するセリン
プロテアーゼであり，pH 4.0 付近で最も高い酵素活性を示す．同酵素の主な触媒装置は，Ser278/Glu78/Asp82 からなる触媒トライアドと，遷移状態（オキシアニオン）の安定化に関わる Asp164 である．これらの触媒装置は，中性～弱アルカリ性領域において最大活性を示す subtilisin（MEROPS S8）の触媒トライアド（Ser221/His64/Asp32）ならびにオキシアニオンホール形成アミノ酸 Asn155にそれぞれ対応している．kuma-As と sutilisin の反応最適 pH の違いを触媒装置の違いに基づいて説明できるか否かを確かめるため，kuma-As の触媒装置
Subtilisin のものに模した二重変異体 Glu78His/Asp164Asn を調製し，その立体構造と酵素活性の pH 依存性を野生型のものと比較した．同変異体の X 線結晶構
造解析の結果，同変異体の触媒装置近傍の構造は野生型のものとは異なり，
Ser278, Glu78, Asp82 を介する水素結合ネットワークは存在しないことがわかった ． 同 変 異 体 は き わ め て 微 弱 な 酵 素 活 性 （ 相 対 kcat ， 野 生 型 酵 素 の 値 の0.0001%）を示し，この活性は pH 8 以上で最大となった．また同変異体の自己
触媒的プロセッシングの最適 pH も野生型の pH 4.0 から pH 7.0-7.5 付近にシフトした．これらの結果は，酸性アミノ酸残基（Asp164）によるオキシアニオンの安定化と Glu78 を介する触媒トライアドが酵素活性の好酸性に重要な役割を果たしていることを支持している． 得られた知見をベースにして，別のセリン
ヒドロラーゼであるエステラーゼについて同様な解析を行った結果についても紹介する．

モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Moloney murine leukemia virus reverse
transcriptase, MMLV RT）は DNA ポリメラーゼ活性とリボヌクレアーゼ H（RNase
H）活性をもつ．MMLV RT（Thr24-Leu671）は cDNA 合成酵素として分子生物学的研究や臨床診断に広く用いられている．cDNA 合成反応の効率は，RNA の二次構造が解消すると上がる．RNA の二次構造を解消させるために，高温（約65℃）での反応が望まれるが，逆転写酵素の耐熱性が低いため，高温で反応を行えない．我々は下記の 2 種類のタンパク質工学的手法を用いて，MMLV RTの熱安定性の向上を試みた．
部位特異的変異導入法：鋳型プライマー（template-primer, T/P）はリン酸基を有するため負電荷を帯びている．我々は，MMLV RT 分子内で T/P と結合する領域に部位特異的変異により正電荷を有する残基を導入すると，MMLV RT のT/P との親和性が高くなり，熱安定性が向上すると考えた．12 残基をそれぞれ
Lys，Arg，Ala に置換した単変異型酵素 36 種を作製し，熱安定性を評価した．
そして，熱安定性を上げた 3 種類の変異を組み合わせた 3 重変異型酵素 MM3（E286R/E302K/L435R）およびこれにさらに RNase H 活性を消失させる変異（D524→A）を組み合わせた 4 重変異型酵素 MM4 を作製した．モデル RNA を用いた RT-PCR において，野生型酵素（WT）では cDNA 合成の反応温度の上限は 54℃であったが，MM3 では 58℃，MM4 では 60℃であった 1）．我々はさらに，分子表面の電荷の増加，疎水性コアの安定化，塩橋の導入あるいは分子間ジスルフィド結合の回避を意図した単変異型酵素 29 種を作製した．そして，
熱安定性を上げた 6 種類の変異のうち 1～4 個を MM3 に導入した結果，最終的に MM3 よりも熱安定性が向上した MM3.14（A32V/L72R/E286R/E302K/W388R/
L435R）を作製した 2）．
ランダム変異導入法：全アミノ酸スキャニング変異導入法と無細胞タンパク質合成系を用いて MMLV RT の耐熱化を試みた．MMLV RT をコードする遺伝子が挿入された発現プラスミドを鋳型として，Ala70 から Arg469 までの 400 アミノ酸残基の各々のアミノ酸残基のコドンを他の 19 種類のアミノ酸残基のコドンに置換したライブラリーを作製した．これを無細胞タンパク質合成反応により発現させた．この反応液を一定温度で熱処理後，モデル RNA を用いた RT-PCRを行い，熱安定性を評価した．768 クローンをスクリーニングした結果，耐熱型変異体 D200C を得た 3）．
One-step RT-PCR は RNA を迅速に検出する手法であり，two-step RT-PCR と比較して DNA のコンタミリスクが低いという長所を持つ．我々は，MM4 およびLeu329→Ala により RT 活性を獲得した好熱性細菌 Thermotoga petrophila K4 株
由来ファミリー A DNA ポリメラーゼ変異体（K4polL329A）を用いた one-step RTPCR の構築を試みた．MgCl2 と Mn(OCOCH3)2 の至適濃度条件の組み合わせはそれぞれ 3 mM，0.5 mM であった．最適化された one-step RT-PCR は，MMLV
RT による cDNA 合成反応と Taq ポリメラーゼを用いた PCR 反応を組み合わせ
た two-step RT-PCR と同程度の検出感度を有した 4）．我々はさらに，K4polL329A
だけを用いた one-step RT-PCR の構築を試みた．酵素濃度，MgCl2 濃度およびMn(OCOCH3)2 濃度を最適化した結果，上記と同程度の検出感度を達成した 5）．
1. K. Yasukawa et al. J. Biotechnol. 150, 299-306 (2010)
2. M. Baba et al. Protein Eng. Des. Sel. 30, 551-557 (2017)
3. Y. Katano et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 81, 2339-2345 (2017)
4. H. Okano et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 487, 128-133 (2017)
5. H. Okano et al. J. Biosci. Bioeng. 125, 275-281 (2018)

Thermostable acid collagenase kumamolisin-As: structure, function, andprotein engineering to alter its pH optima

Increase in the thermostability of Moloney murine leukemia virus (MMLV)
reverse transcriptase and development novel nucleic acid amplification○Toru Nakayama(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

serine protease, serine enzyme, acidphilic activity, catalytic triad○Teisuke Takita, Misato Baba, Yuta Katano, Hiroyuki Okano, Kenji Kojima,
Kiyoshi Yasukawa(Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)

Key words
thermostability, moloney murine leukemia virus, nucleic acidamplification, reverse transcriptase

237

S3Bc04D-アミノ酸脱水素酵素の構造情報に基づく基質特異性の改変

S3Bc05○天尾 豊（大阪市大・複合先端研）
amao@ocarina.osaka-cu.ac.jp○櫻庭 春彦 1, 林 順司 2, 秋田 紘長 3, 大森 勇門 4, 大島 敏久 4（1香川大・農, 2立命館大・生命科学, 3産総研, 4大阪工大・工）sakuraba@ag.kagawa-u.ac.jp

近年，D-アミノ酸の重要な生理機能が明らかになるとともに医薬品や抗生剤，農薬などへの新たな利用が進められている．D-アミノ酸の酵素合成法としては，D-ヒダントイナーゼ，D-N-カルバモイラーゼや D-アミノアシラーゼなどを利用した方法が知られているが，合成工程が複雑で合成可能な D-アミノ酸が限られるなどの問題があり，より有用性の高い酵素生産法の開発が望まれている．
meso-ジアミノピメリン酸脱水素酵素（DAPDH）は，NADP 依存的に meso-ジア
ミノピメリン酸（meso-DAP）の酸化的脱アミノ反応を触媒し，L-2-アミノ-6-オ
キソピメリン酸を生成する．この生成物は非酵素的に分子内脱水環化するため試験管中では逆反応が進まないが，生体内での反応は可逆的で，Bacillus
sphaericus や Corynebacterium glutamicum では L-リジンの生合成系において機能する．本酵素は，D-アミノ酸の NAD(P)依存性の脱アミノ反応を触媒する唯一の脱水素酵素として知られており，各種オキソ酸とアンモニアからの D-アミノ酸一段階合成への利用が期待される．しかし DAPDH は一般に基質特異性が高
く meso-DAP に特異的に作用するため，その応用開発が阻まれてきた．そのなかで，C. glutamicum 由来の DAPDH に部位特異的変異を加えて基質特異性を低めた D-アミノ酸脱水素酵素（DAADH）が調製されたが，常温菌由来の変異酵素であるため安定性が低いという問題があった．大島らは，好熱菌 Ureibacillus
thermosphaericus に 60℃，30 分間の処理でも失活しない NADP 依存性 DAPDHを見出し，これに同様の変異を加えて耐熱性 DAADH の調製に成功している．
この DAADH は，本来の基質である meso-DAP には活性を示さず，新たに D-シクロヘキシルアラニン，D-イソロイシン，D-リジンなどに活性を示した．また
常温菌由来 DAADH に比べ高い耐熱性を示した． U. thermosphaericus DAPDHの結晶構造解析を行ったところ，C-末端に His-tag が存在すると C-末端領域のイオンペア相互作用が形成されず，酵素活性に影響することが示唆された 1）．
そこで His-tag を付加しない DAADH を調製したところ，正逆両反応で活性の大幅な上昇が認められた．この DAADH を出発材料の親酵素として構造解析を行い，活性中心の構造情報に基づき，基質特異性の異なる新たな DAADH の作製を試みた．
基質結合ポケットを形成するアミノ酸残基の中で，Tyr224 および Asp94 は D アミノ酸センター近傍に存在しており，基質結合部位の一部を形成する可能性が示された．しかし，これまでこの二つのアミノ酸残基は変異実験の対象とはされていなかった．変異実験の結果，Tyr224 をフェニルアラニンに置換した
Y224F は基質特異性の大きな変化は無く全体的に活性が低下した．一方興味深いことに，Asp94 をアラニンに変異させた D94A は基質特異性が劇的に変化し，親酵素の DAADH と比較して D-フェニルアラニンに対する反応性が約 50 倍と大きく上昇した．逆反応では，フェニルピルビン酸に対して極めて高い触媒活性（92.5 μmol/min/mg）が認められ，医薬品原料として需要の高い D-フェニルアラニンの 1 段階合成への有用性が示された．また D-2-アミノオクタン酸，Dノルロイシンや D-メチオニンについても高い合成活性を示した．次に D-リジンに対して非常に低い反応性を示す D94A/Y224F ダブルミュータントを用いて，D-リジンと NADP の存在下で結晶化を行い，NADP・酵素の二者複合体とNADPH・2-keto-6-aminocapronic acid（KACA，リジンのケト酸）・酵素の三者複合体の構造解析に成功した．構造比較の結果，KACA の結合に伴い活性中心近傍のループの位置が大きく変化し基質結合部位を形成することが明らかとなった．KACA の構造に基づきフェニルピルビン酸の結合モデルを作成したとこ
ろ，D94A の変異によって基質結合ポケットが拡張され立体障害が消失し，さらに基質側鎖周辺の疎水性が増大したことが，かさ高い側鎖を持つ D-フェニル
アラニンなどの疎水性アミノ酸に対する反応性を増加させた要因であることが示唆された 2)．

人工補酵素-ギ酸脱水素酵素系による炭酸ガスからのギ酸合成

二酸化炭素を原料として様々な有機分子に変換するための触媒として反応基質
特異性に優れている二酸化炭素をギ酸に還元する反応を触媒するギ酸脱水素酵素に着目し，従来光レドックス系等で単なる電子メディエータとしか見られてこなかったビオローゲン構造を基本骨格とした人工補酵素を用いたギ酸脱水素
酵素の二酸化炭素還元活性の制御について紹介する．ギ酸脱水素酵素を二酸化炭素の還元触媒として用いた系において，ビオローゲンの化学構造を工夫する
ことにより，天然補酵素 NADH では達成し得えなかった必要な反応のみをギ酸
脱水素酵素の構造を改変せず制御でき，二酸化炭素還元触媒効率化が達成できた．まず,ビオローゲン誘導体の中で最も広く用いられている，メチルビオロー
ゲンとギ酸脱水素酵素との相互作用に付いて調べた．具体的には，還元剤であるジチオン酸ナトリウムを用いてメチルビオローゲン一電子還元体を調製し，二酸化炭素を飽和させたピロリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）中，ギ酸脱水
素酵素存在下で反応させ，ギ酸生成初速度とメチルビオローゲン一電子還元体
濃度との関係を調べた結果，ギ酸脱水素酵素との親和性を表すミカエリス定数(Km)を比較してみるとメチルビオローゲン一電子還元体よりも NADH の方が約10 倍大きいことがわかる．これは NADH を用いてギ酸脱水素酵素の二酸化炭
素還元触媒機能を利用するためには，メチルビオローゲン一電子還元体（Km=213μM）よりも約 10 倍の NADH（Km=2087 μM）が必要となることを示している．
また，見かけの触媒定数（kcat：1 分間での触媒回転数）を比較しても，メチル
ビオローゲン一電子還元体の 1.02 min-1 に対して NADH は 0.39 min-1 であり，さらに触媒反応効率 kcat/Km（見かけの触媒定数をミカエリス定数で除算した値）を比較してもメチルビオローゲン一電子還元体の方が NADH よりも約 25 倍も大きいことがわかった． メチルビオローゲン一電子還元体を用いることでギ酸脱水素酵素の二酸化炭素還元触媒機能を有効利用が可能となった．さらにビオ
ローゲンに様々なイオン性置換基を導入した人工補酵素によりギ酸脱水素酵素の二酸化炭素還元触媒活性を制御することが可能となることが期待される． ビ
オローゲンに陽イオン性置換基であるアミノ基を導入した人工補酵素を設計・合成し，これらの一電子還元体によるギ酸脱水素酵素の二酸化炭素還元触媒活性の制御について，酵素反応速度論に基づき解析した．その結果， 2 つのアミノ基を導入したビオローゲンの一電子還元体を用いることで，ギ酸脱水素酵素の二酸化炭素還元触媒活性が飛躍的に向上した．アミノ基，メチル基を 1 つず
つ導入したビオローゲンの一電子還元体を用いても，ギ酸脱水素酵素の二酸化
炭素還元触媒活性は NADH と比較して大きく向上することを見出した．以上のことからビオローゲンに簡単な置換基導入だけで，ギ酸脱水素酵素の二酸化炭
素還元触媒活性を自在に変化させることが可能となる．特にアミノ基を 2 つ導入しただけのビオローゲンの一電子還元体を補酵素として用いると，NADH を用いた場合に比べ，ギ酸脱水素酵素の二酸化炭素還元触媒活性効率（kcat/Km ）を 560 倍も向上させることができており，おそらくは遺伝工学的にギ酸脱水素
酵素の触媒活性中心を変えてもこのような劇的な触媒活性向上はできないであろう．

1)H. Akita et al.: Structural insight into the thermostable NADP+-dependent mesodiaminopimelate dehydrogenase from Ureibacillus thermosphaericus. Acta. Cryst.
D71, 1136-1146 (2015)2)J. Hayashi et al.: Structure-based engineering of an artificially generated NADP+dependent D-amino acid dehydrogenase. Appl. Env. Microbiol., 83, e00491-17 (2017)

Structure-based modification of substrate specificity of D-amino aciddehydrogenase○Haruhiko Sakuraba1, Junji Hayashi2, Hironaga Akita3, Taketo Ohmori4,
Toshihisa Ohshima4(1Fac. Agric., Kagawa Univ., 2Coll. Life Sci., Ritsumeikan Univ., 3AIST, 4Eng.,
Osaka Inst. Technol.)Key words

D-amino acid, enzymatic synthesis, dehydrogenase, crystal structure

CO2 reduction to formate with artificial co-enzyme and formate
dehydrogenase○Yutaka Amao
(Adv. Res. Inst. Nat. Sci. Technol., Osaka City Univ.)

Key words

CO2 fixation, formate dehydrogenase, viologen, coenzyme

238

S3Bc06架橋触媒機能を有する微生物由来トランスグルタミナー
ゼ前駆体の設計

S3Cc01○神谷 典穂 1,2, 松崎 隆 1, 林 浩之輔 1, 南畑 孝介 1,3（1九大院・工, 2九大・未来化セ, 3KAICO）
kamiya.noriho.367@m.kyushu-u.ac.jp

木質バイオマスの質と量：オーダーメイド改変に向けて○出村 拓（奈良先端大・先端科学技術）
demura@bs.naist.jp

タンパク質の特定部位を外来分子で修飾する技術は，被修飾タンパク質に新たな機能性を付与し，その応用範囲を格段に拡げることが可能なことから，新たな方法論の探索が続いている．なかでも酵素反応を用いるタンパク質修飾法は，用いる酵素の触媒特性に応じた部位特異性を担保できることから，多様な技術ツールが提案されている [1]．微生物由来トランスグルタミナーゼ (microbial
transglutaminase, MTG) は，Gln 残基と Lys 残基の側鎖間架橋を通してタンパク質を連結する酵素として食品分野で広く活用されてきた産業用酵素 [2] であるが，そのハンドリングの容易さと強力な架橋活性から，多様なバイオコンジュ
ゲートの調製のための触媒として，生物工学分野においても広くその利用が検討されてきた [3]．特に近年，薬理活性を有するタンパク質と合成高分子とのコ
ンジュゲートや antibody drug conjugates (ADCs) の調製における有用性が報告され，新たな展開の兆しが見える．しかしながら，MTG の基質特異性は比較的広く，厳密な反応選択性・部位特異性が要求される系への応用に対しては改善の余地があるとされ，大手製薬企業による新たな微生物由来トランスグルタミナー
ゼの探索も試みられている [4]．このような背景の下，本研究では，MTG の前駆体に着目することで，新たな架橋触媒の設計を試みた．
MTG は，プロペプチドが付加した前駆体として発現した後，限定分解を経て，活性を有する成熟型酵素となる．この際，プロペプチドは分子内シャペロンとして機能することから，微生物宿主において組換えタンパク質として可溶性発現する際に必須の部分構造となる．一方，活性型酵素の取得に際しては，プロペプチド部位の限定分解の過程を単離精製プロセスに組み込む必要がある．そこで，プロペプチド部位に変異を導入することで，限定分解を必要としない活性型 MTG 前駆体の取得を試みることとした．まず，MTG 前駆体立体構造の解析情報 [5] に基づき，活性部位と強く相互作用している Tyr 残基（Y12）を選択し，これを Ala 残基へ置換した変異体を調製した．また，基礎検討の過程において，MTG によって認識されることが明らかとなった Lys 残基（K10）を幾つかの異なるアミノ酸に置換した K10X/Y12A 二重変異体を作製し，触媒活性の評価に供した．MTG の標準アッセイ法として汎用されている Z-QG とヒドロキ
シルアミンを用いた評価において，ほとんど全ての前駆体は架橋活性を示さなかったが，二重変異体の中には僅かながら架橋活性を示すものが存在した．興味深いことに，反応性の高い基質ペプチド配列と小分子基質を用いた架橋反応による評価においては，全ての二重変異体が活性を示すことが明らかとなり，
プロペプチド部位への適切な変異の導入が MTG 前駆体の活性化に寄与することが強く示唆された．以上のことから，MTG をモデル酵素として，その前駆体のタンパク質工学を通した新規活性型変異体の設計と取得に成功した．
References[1] E. M. Milczek, Chem. Rev., 2018, 118, 119-141.
[2] K. Yokoyama et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 64, 447-454.
[3] M. Takahara et al., Bioconj. Chem., 2017, 28, 2954-2961.
[4] W. Steffen et al., J. Biol. Chem., 2017, 292, 15622-15635.
[5] M.-T. Yang et al., J. Biol. Chem., 2011, 286, 7301-7307.

木質バイオマスとは木本植物（樹木）の材（木材）を由来とするバイオマスの総称である．木材は，セルロースやヘミセルロースなどの多糖とフェノール性ポリマーであるリグニンからなる厚い細胞壁（二次細胞壁）をもつ木質細胞（道管，仮道管，繊維細胞）の複合組織であり，木質バイオマスの質と量を変える
ためには，二次細胞壁の形成メカニズムの理解が必要である．私たちはかつてから，通水細胞である道管の二次細胞壁形成について，多角的な研究を進めてきた．とくに，モデル植物であるシロイヌナズナを用いた研究から，二次細胞壁形成のマスター調節因子として NAC 型転写因子である VNS ファミリー（VND1～VND7，SND1，他）や MYB 転写因子群（MYB46，MYB83，他）を見いだし，これらの発見をもとに，二次細胞壁形成の詳細メカニズムの解明に取り組んできた．これらマスター調節因子のなかで，VND7 は最も高い二次細胞壁形成の誘導能をもっており，ヘルペスウィルスの転写活性化ドメイン VP16とラットのグルココルチコイド受容体 GR との融合タンパク質として，シロイ
ヌナズナやポプラ，タバコ培養細胞 BY-2，シロイヌナズナ培養細胞 T-87 など
で人為的に転写活性化を誘導することで，高頻度（培養細胞では約 80％）で二次細胞壁形成を引き起こすことが可能となった．これまでに，これらの二次細胞壁形成誘導系を用いて，オミクス解析（トランスクリプトーム，プロテオー
ム，メタボローム）や分子遺伝学解析，ケミカルスクリーニングなどを行うことで，二次細胞壁の質と量の改変につながるいくつかの重要な因子の同定に成功している．私たちは，こうして得た知見を，実際の木質バイオマス植物の改変につなげたいと考え，早生広葉樹であるポプラ（Populus）をモデルとして用いた研究にも取り組んでいる．木質バイオマスの増産に向けては，乾燥などの環境ストレスに耐性を付与することが考えられる．そこで，シロイヌナズナにおいて乾燥・塩耐性に寄与することが示されている AtSRK2C と AtGolS2 を導入したポプラを作出した．これらの形質転換ポプラでは野生型ポプラと比較して高い乾燥・塩耐性が付与されたことから，ポプラにおいても環境ストレス耐性の付与による木質バイオマス増産の可能性が示された．現在，これら遺伝子
組換えポプラについて，南京林業大学（中国）との国際共同研究として，南京
市近郊の野外試験場でのフィールド試験を行っている．さらに，筑波大学との共同研究で，筑波大学の隔離圃場でのテストにも着手した．一方で，木質バイ
オマスの質の改変に向けては，マスター調節因子（MYB46，SND1，VND7）とVP16 の融合タンパク質をポプラで発現させることで，一部の遺伝子組換えポプラで劇的な二次細胞壁形成の亢進が起こることを示した．本講演ではこれらの結果をもとに，木本植物における木質バイオマスの量と質の改変の可能性について議論したい．

Molecular design of engineered active zymogen of microbial
transglutaminase

Toward castom-made modification of quality and quantity of wood biomass○Noriho Kamiya1,2, Takashi Matsuzaki1, Kounosuke Hayashi1,
Kosuke Minamihata1,3(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2CFC, Kyushu Univ., 3KAICO Ltd.)Key words

enzyme reaction, cross-linking, zymogen, bioconjugate○Taku Demura(Grad. Sch. Sci. Technol., NAIST)

Key words

Populus spp, seconday cell wall, VND transcription factors, field test

239

S3Cc02

食糧・バイオリファイナリー共用イネの開発を目指した
稲わらの糖化性向上○伊藤 幸博（東北大院・農）yukito@tohoku.ac.jp

コメは人類の最も重要な食糧であり，毎年大量に生産されている．それに伴い稲わらも大量に生産されているが，その多くは有効利用されていない．そこで，稲わらをバイオリファイナリーの有用な原料とすることを目的に，稲わらの糖化性を高める技術の開発を行っている．それにより，コメは食糧として利用し，残った未利用稲わらをバイオリファイナリーの有用な原料として利用できる「dual-use rice」の開発を目指している．
私たちは 2 つの手法を用いて稲わらの糖化性の向上を目指している．1 つは遺伝子工学的方法である．この方法では，イネにセルラーゼ遺伝子を導入し，イネの生育中にセルラーゼを発現させることにより予め細胞壁に「ひび」を導入し，収穫後の糖化反応時に酵素が作用しやすくなるのを狙った方法である．これまでに恒常的にエキソグルカナーゼを発現させると稲わらの糖化性が向上す
るが不稔になること（Nigorikawa et al 2012），老化誘導プロモーターを用いて発現させると不稔を回避しながら糖化性を向上させることができることを示してきた（Furukawa et al 2013）．もう 1 つの手法は，稲わらの糖化性を決める遺伝子の同定とその利用である．これまでに稲わらの糖化性には品種間差があり，
カサラス（分子遺伝学実験によく用いられるインディカ品種）の糖化性は高く
コシヒカリの糖化性は低いことを見出した（Abe et al 2016）．現在，カサラスとコシヒカリの糖化性の差をもたらす遺伝子の同定を目指し，遺伝子マッピングを進めている．この遺伝子が同定されれば，市場価値の高い品種（例えばコシヒカリ）に高糖化性遺伝子を交配により導入することができ，コメの味はそのままで，稲わらは利用しやすくなったイネ品種が作出可能になると期待される．
これらの研究を行う過程で，稲わらの糖化性はその部位（葉身，葉鞘，茎）や生育ステージによって大きく異なり，茎の糖化性は高く，葉身の糖化性は低い
ことがわかった（Abe et al 2016）．また，葉身，葉鞘，茎のいずれにおいても出
穂後に糖化性が大きく低下することもわかった．実際のバイオマス利用では，
このような特徴を持った植物バイオマスが利用されるはずである．これらのことから考えられるのは，稲わらやその他の植物バイオマスを用いた発酵実験を行う場合，品種，部位，生育ステージなどを揃えないと，再現性のある安定したデータを得るのが困難であり，発酵微生物や発酵手法の正確な評価が困難であるということである．この問題の解決には植物研究者の協力が有用であろう．
また，私たちが行う糖化性試験は，乾燥，粉砕した稲わらに市販のセルラーゼを作用させて，反応液中に遊離される還元糖の濃度を測定することによって行っている．しかし，実際の稲わらの利用では発酵微生物が使われることを考えると，酵素糖化性だけでなく発酵微生物の特性や発酵能を考慮する必要もある．
これは，応用微生物・発酵工学の研究者の協力なしには，なし得ないことである．応用微生物学・発酵工学を専門とする研究者と植物育種学を専門とする研究者が連携し，全体を俯瞰した研究を進めることが，今後のこの分野の発展の鍵となろう．
本講演では，稲わらの糖化性の向上に関する発表をするが，このような観点を念頭に置いた議論ができればと思う．

S3Cc03

培地・基質及びダウンストリームから考える発酵生産○園元 謙二（九大院・農）sonomoto@agr.kyushu-u.ac.jp

バイオマスからの効率的な発酵生産では，発酵プロセスそのものを中心に置くと，その上流プロセスは発酵原料の調達・加工（資源作物デザイン・生産，バ
イオマスの前処理・糖化など），優れた微生物の獲得・育種，などで構成されている．一方，下流プロセスは目的物の低コスト・効率的な分離・精製が求められ，さらには目的物を発酵生産と同時に分離できれば生産物阻害の軽減などで発酵プロセスの向上にも繋がる．バイオマスから発酵を通して有価物を得るた
めには，構成される各フローを俯瞰し，ボトルネックを生じさせず，かつ相乗効果を生むようなトータルシステムを組み立てるプロセス研究戦略が求められる．また，各フローを理解し，かつトータルシステムとして俯瞰できる視点・感性を持つ人材の育成が望まれている．
我々は，優れた発酵微生物の能力を最大限発揮させるために，微生物に適した基質をバイオマスから調製するデザインドバイオマス研究を展開してきた．す
なわち，それらデザインドバイオマスを用いて，バイオマス由来基質を利用する際の様々な共通課題（1. 原料となるバイオマスの選択と前処理，2. 糖化阻害，
3. 発酵阻害，4. 発酵生産性，5. 省エネ・省工程・低コストの発酵と生産物の分離，など）に対処できる適応型発酵プロセスを構築してきた（1）．具体的には，中間代謝物の有機酸を用いたブタノールのサルベージ合成（1），混合糖利用の際のカタボライト抑制（CCR）を回避したブタノール（1）や光学活性乳酸（1,2）の発酵生産などである．
本講演では，これまでのモデル糖を用いたデザインドバイオマス研究を実バイ
オマスで検証した研究，下流プロセスを考慮した生産性向上研究，上流―発酵―下流の 3 つのプロセスを俯瞰した統合研究について，次の新たなパラメーターを提示しながら最新の研究成果の概要を紹介したい．
『プロセスを跨ぐ評価パラメーター（New parameters for comprehensive evaluation
across the processes composing total system of production）』A) バイオマス糖化酵素当たりの最終目的産物の収率（g/U-enzyme）；Product yieldto enzyme loadingB) プロセスを跨ぐ（overall）最終目的産物の生産性（g/L/h-overall process）；
Overall productivityC) 使用培地当たりの最終目的産物の収率（g/L-broth）；Total product concentration
1．上流プロセス（バイオマスの前処理・糖化）と発酵プロセスを考える【糖化酵素の低負荷による Semi-hydrolysis が費用対効果の高いブタノール発酵をもたらす】（3）◆ソフトバイオマスの稲ワラからの高効率ブタノール生産◆稲ワラの Semi-hydrolysate は従来の glucose-oriented hydrolysis で生じる CCR
を回避◆Semi-hydrolysis を可能とする糖化酵素の繰り返し使用は，酵素当たりのブタ
ノール収率や overall ブタノール生産性を高めた
2．下流プロセス（目的物の低コスト・効率的な分離）と発酵プロセスを考える【酸耐性乳酸菌が非解離乳酸の費用対効果の高い in situ 発酵・抽出回収を可能にする】（4）◆酸耐性乳酸菌は中和剤なしで非解離型の乳酸を生産できる◆in situ 乳酸抽出流加発酵はより経済的で環境に優しい乳酸回収プロセス◆使用培地あたりの乳酸収率が向上【大量抽出剤・限定量培地は優れたブタノール抽出発酵を導く】◆生成するブタノールとアセトンを同時に生産菌から遠ざけ，毒性効果を和らげる◆大量抽出剤と制限された栄養培地で高ブタノール生産を確立◆使用培地あたりのブタノール収率が向上
3．上流―発酵―下流の 3 つのプロセスを俯瞰するスマート発酵工学【デザインドパルプを用いたスマートブタノール発酵プロセスは優れたトータルシステムである】◆繰り返し加水分解とブタノール発酵を組み合わせた新プロセス（NSSF）の提唱 － Non-isothermal Simultaneous Saccharification and Fermention with in situ
extraction－◆NSSF は糖化酵素や菌体，培地の利用性を向上◆NSSF は糖化処理によって生成したオリゴ糖や発酵で残存する有機酸の利用
性を向上◆パルプあたりのブタノール収率だけでなく，酵素当たりのブタノール収率，overall ブタノール生産性，使用培地あたりのブタノール収率が向上(1) 園元, 生物工学, 95, 2-13, 2017; (2) Tan et al., RSC Adv., 7, 24233-24241, 2017;(3) Zhao et al., Bioresour. Technol., accepted, 2018; (4) Singhvi et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol., in press, 2018.

Enhancement of saccharification yields from rice straw toward breeding offood-biorefinery dual-use rice plants○Yukihiro Ito(Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

Key words

saccharification, cellulase, plant breeding, rice

Fermentation production: Designed biomass study and subsequent
downstream process○Kenji Sonomoto(Fac. Agric., Kyushu Univ.)

Key words
designed biomass, downstream process, semi-hydrolysis, in situ
extractive fermentation

240

S3Cc04

発酵微生物のスクリーニングを考える○青柳 秀紀 1, 高橋 将人 1, 松﨑 大典 2, 長谷川 智弘 1
（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【はじめに】 約 100 年前にパスツールやコッホにより確立された微生物純粋培
養法により，多くの有用微生物が自然界から探索，単離，培養され，微生物関
連産業は大きく発展してきた．しかしながら近年，従来の微生物培養法の問題
点や限界が指摘され，微生物の集積，分離，培養に関連した新たな方法論や培養法の開発が，様々な微生物関連分野（学術，産業面）で強く求められている．
また，従来の法では培養化できていない，自然界に残された 99%の未培養微生物（微生物ダークマター）の利活用が国内外で期待されている [本学会でも未培養微生物（微生物ダークマター）資源工学研究部会*が活動中である]．この様な状況は，「発酵微生物のスクリーニング」においても共通性があると思われる．
この現状を踏まえ演者は，新たな方法論や培養法の開発にあたり，国内外で広く一般的に使用されている「振盪フラスコ培養法」と「寒天平板培養法」の実態を知り，それを踏まえ，見直すことで，新たな培養法や方法論が提案できるのではないかと考え，研究を推進している．以上の点を踏まえ，本講演では，演者の研究室で実施してきた研究を中心に紹介する．
*https://www.sbj.or.jp/division/division_mdarkmatter.html

S3Cc05複合微生物系から考える発酵生産○田代 幸寛 1, 宮本 浩邦 2,3, 酒井 謙二 1
（1九大院・農, 2（株）サーマス, 3千葉大・園芸）
tashiro@agr.kyushu-u.ac.jp

謝辞：本研究の一部は科研費，（公財）住友電工グループ社会貢献基金，科研費特別研究員奨励費 16J00800 の助成を受けて実施されました．また，村山晃一（フタムラ化学），澤田宜介（いわしやバイオサイエンス）にご協力いただきました．

再生可能資源を原料とした発酵による有価物生産プロセスは資源の循環利用性・持続性などを有している．本プロセスは，前処理（資源作物の改変・創製を含む），糖化，発酵，精製に大別されており，各プロセスの要素研究が広範な領域で精力的に展開されている．しかし，本シンポジウムの趣旨に述べられているように，異なる領域研究者の連携は不可欠であり，各領域の非専門性を補完しながら専門性を推進するのが喫緊の課題である．例えば，植物育種研究者
は糖化され易い資源作物や発酵微生物の基質利用能力に適した資源作物をデザインする必要がある．一方，発酵工学研究者や合成生物学研究者は前処理・糖化処理で得られた原料を効率的に有価物に変換する発酵法を開発したり，最大限に有価物を生産できる微生物を育種したりする必要がある．さらに，発酵液から高収率に有価物を回収できる精製法も考慮しなければならない．
従来では，19 世紀にコッホが確立した純粋培養法による単一微生物を用いた発酵研究が中心であった．近年，我々は複合微生物系による有価物生産のための発酵法として『メタ発酵』を提唱している 1)．単一微生物が資化できない複合
基質（廃棄物など）を複合微生物系では資化できる，殺菌が不要，雑菌混入に対して強い，設備やエネルギーコストが低いなどがメリットに挙げられる．一方，デメリットとしては，単一基質の変換が非効率（基質の奪い合いが生じる），
生成物が複雑（ヘテロ発酵となりやすい），微生物解析が複雑，発酵制御が困難，などがある．単一微生物を対象とする多数の発酵プロセスにおける種々のファクター（pH，温度，炭素源，溶存酸素，酸化還元電位，電子キャリヤー物質など）の最適化に関する知見は長年の研究成果により蓄積されている．一方，複合微生物系によるメタ発酵プロセスでも，それらのファクターが生産物挙動にも微生物群集構造にも劇的に変化させるという知見が得られつつあるが，まだ学問分野における理論体系の構築は端緒についたばかりである．しかしながら，複合微生物系を制御できれば，単一微生物のみでは利用できない原料から
単一微生物が生産できない有価物に変換することも可能であり，前処理・糖化
処理の簡略・省略も期待できる．本講演では，グリーンケミカルとして注目されている L-乳酸・酪酸のメタ発酵プロセスに関する演者らの研究成果を紹介
し，複合微生物系からトータルシステムとしての発酵生産プロセスを議論したい．
[1] 温度による主生産物の制御 2)
発酵温度に着目し，糖化・殺菌標準生ゴミ培地およびコンポストを用いて，pHを 24 h 毎に 7.0 に振動制御しながら，温度 30℃-65℃でメタ発酵を行った．30℃と 37℃では，酪酸生産が主となる一方，45℃-55℃では，L-乳酸生産が主となった．特に，温度 50℃では，光学純度 100%で L-乳酸生産にメタ発酵で初めて成功し，Bacillus coagulans が優占菌であった．本成果は，発酵温度が微生物群集
構造を変化させる重要因子であり，温度により有価物を選択できる可能性を示
唆した．
[2] 新規 pH 制御法による L-乳酸生産の効率化 3)
糖化・未殺菌標準生ゴミ培地および[1]と同じ複合種菌を用いて，温度 50℃で，pH7.0 における制御法を検討した．発酵初期より一定制御した場合，発酵終了
時間は約 3 分の 1 に短縮されたが，L-乳酸蓄積濃度および選択性は大幅に減少
し，優占菌が Bacillus thermoamylovorans へ変化した．一方，発酵初期に pH を振動制御後，24 h 以降に一定制御してメタ発酵を行ったところ，発酵時間をさらに短縮でき，高い L-乳酸蓄積濃度，選択性，生産性，光学純度を得た．本成果は，単一微生物とは異なる pH 制御法で L-乳酸生産を効率化および制御できる一例である．
[3]未糖化原料からの L-乳酸生産
未糖化標準生ゴミ培地および[1]と同じ複合種菌を用いて，pH を 24 h 毎に 7.0に振動制御しながら，温度 50℃でメタ発酵を行ったところ，糖化標準生ゴミ培地と同等の L-乳酸が蓄積された．さらに，細菌群集構造を解析した結果，乳酸生産菌である B. coagulans に加えて，Bacillus hisashii 類縁菌が優占種であり，生ゴミ中の多糖類の分解に寄与することが示唆された．さらに，体系的フィー
ドバック分離法 4)により分離した 3 種 14 株の細菌を用いてメタ発酵を検討した
結果，属・株レベルでメタ発酵を制御できる可能性が示唆された．
1) 田代，酒井, バイオインダストリー, 72, 486-487, 2014. (2) Tashiro et al.,Bioresour. Technol., 146, 672-681, 2013. (3) Tashiro et al., Bioresour. Technol., 122,606-612, 2016. (4) Poudel et al., J. Biosci. Bioeng., 123, 63-70, 2017.

Considerations for the screening of microbes involved in fermentation

Fermentative productions by mixed culture systems[振盪フラスコ培養法 1-4] 振盪フラスコ培養法は約 85 年前に考案され，回分式の液体培養法として，現在も国内外で広く微生物の培養に使用されている．しかしながら振盪フラスコ培養法は，現在に至るまでほとんど変化していない面もある（あまり進歩していない？）．また，振盪フラスコ培養の詳細は十分に明らかにされているとは言い難い．例えば，(A) サンプリング操作はフラスコ内の培養環境や微生物の培養にどのような影響を及ぼすのだろうか？，(B) 三角フ
ラスコと坂口フラスコは広く使用されているが，両者の特性の違いは？，といった点については不明瞭な部分が多い．演者は，“振盪フラスコ培養中の短時間の間歇的な培養栓の開封が集積される培養微生物群集に影響を及ぼす”という新奇な現象を実験の過程で独自に見出した．そこで，培養栓の開封操作の再現性の向上と煩雑さを解消するために，間歇的な通気が可能な Automatic Aeration Flask
System（AAFS）を開発した．AAFS を用い，培養期間中に任意の条件で間歇的に空気を通気した（培養栓の開封を模倣）結果，異なる培養微生物群集が形成された．さらに，演者は，フラスコ振盪培養中の気相部と液相部（培養液）のCO2 と O2 濃度をリアルタイムにモニタリングできる Circulation Direct Monitoringand Sampling System（CDMSS：フラスコの振盪を中断することなく培養液と気相部の CO2 と O2 濃度の測定やサンプリングが可能）を開発した．CDMSS を用いることで，大腸菌やパン酵母などの振盪フラスコ培養における CO2 と O2 の経時的な濃度変化を解析し，上述の(A), (B)の疑問を明らかにした．以上の結果を統合することにより新規な微生物スクリーニング法が提案できる．
1. Takahashi et al. AMB express, 7, 163 (2017).
2. Takahashi, Aoyagi. J ＢＢ, doi:10.1016/j.jbiosc.2018.01.009.
3. Takahashi, Aoyagi. AMB, doi:10.1007/s00253-018-8922-8. (2018).
4. Takahashi, Aoyagi. Monitoring of CO2 and O2 concentrations in the headspace of
Sakaguchi flasks during liquid culture of microorganism.AMB, in press (2018).
[寒天平板培養法] 約 100 年にわたり，自然界から微生物を単離培養する際，国内外で寒天平板培養法が広く用いられている．しかしながら寒天平板培養法は現在に至るまでほとんど変化していない（あまり進歩していない？）．近年，従来の寒天平板培養法では自然界に存在する全微生物の 1%程度しか培養できないことが明らかとなり，限界が指摘されている．この現状を打破するために，演者は，Specialized Cellulose Film を用いた培養法（SCF 法）を開発した．また演者は，培養初期に優占化する微生物が様々な面で他の微生物の生育を阻害していることを見出し，試料中や培養系からあらかじめ増殖の速い微生物を排除する方法を考案した．さらに，種々の試料前処理法や従来法の問題点を排除した培養法についても研究中である．以上の方法は未培養微生物の培養化に有効であることが示唆されている．

○Hideki Aoyagi1, Masato Takahashi1, Daisuke Matsuzaki2, Tomohiro Hasegawa1(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Coll. Agro-bio. Resour. Sci., Univ.
Tsukuba)

Key words

Agar plate culture, Erlenmeyer flask, headspace, Sakaguchi flask○Yukihiro Tashiro1, Hirokuni Miyamoto2,3, Kenji Sakai1(1Fac. Agric., Kyushu Univ., 2Sermas, 3Fac. Horticul., Chiba Univ.)

Key words

mixed culture, meta-fermentation, L-lactic acid, control process

241

S3Cc06

発酵生産のための人工代謝経路デザインの合理化と制約○本田 孝祐（阪大院・工）honda@bio.eng.osaka-u.ac.jp

S3Dc01

黒麴菌の学名は Aspergillus luchuensis です
○山田 修
（酒総研）
yamada@nrib.go.jp

デンプンやショ糖を原料とした第 1 世代バイオ燃料生産が一定の成熟期を迎え，当該分野における技術開発の焦点は，非可食バイオマスや食品残さなどを原料とした第 2 世代バイオ燃料，あるいは光合成生物等を利用した炭酸ガスからの第 3 世代バイオ燃料生産へとシフトしている．また，燃料性物質だけでなく，機能性化学品や医薬品（およびその合成前駆体）などの高付加価値物質の製造に発酵生産技術を適用させようという試みも活発化している．このように対象となる原料・生産物のレパートリーが拡大するにつれ，発酵生産の分野ではより多様な生産株をより短期間に育種することが求められつつある．
演者らは細胞外に取り出した複数の酵素を組みあわせ，代謝反応を模したカスケード反応を in vitro で構築する「in vitro 代謝工学」を用いた有用化学品生産に取り組んできた．生きた細胞を用いない本法では，原理上，あらゆる酵素を
任意の量比で組み合わせた人工代謝経路の構築が可能となる．この特性により，in vitro 代謝工学は，有用化学品生産のためのプラットフォームとして直接的に利用可能なだけでなく，一般的な（= 生きた細胞を用いる）発酵生産における生産株育種のための代謝経路最適化ツールとしても有益である．例えば，Jewett
らは，目的の代謝経路を構成する酵素遺伝子群を様々な組み合わせで無細胞翻訳システムに投入することで，バラエティに富んだ in vitro 代謝経路ライブラ
リーを創出する技術を開発している（Karim & Jewett, 2016, Metab Eng, 36:
116-126）．本技術により得られた代謝経路ライブラリーから，所望の変換反応を最も高速で触媒可能なものをスクリーニングすることにより，経路構築に最適な酵素セットを短期間で選定することが可能である．一方，演者らのグルー
プでは，ターゲットとする化学品の生産速度（= in vitro 代謝経路のフラックス）
を最大化させることを目的に，経路を構成する各酵素の添加量比を最適化する
方法論の開発に努めてきた．本法ではまず，それぞれの酵素反応を基質・酵素・
補酵素濃度を変化させた条件下で測定し，フィッティングにより適切な速度式を導き出す．これらの速度式を用いることで各酵素の添加量を入力値として目的の化学品の生産速度が算出可能な連立方程式が得られる．ランダムに発生させた酵素添加量のデータセットをこの連立方程式に導入，共益勾配法などの最適化計算プログラムで処理することで，最適酵素濃度比を合理的に求めることができる．グルコースからの L-システイン生産経路を対象とした最適化試験では，上記のプログラムで予測された生産プロファイルと実験的に求めたプロファ
イルが高い一致性を示すことが確認されており，開発した方法が期待どおりに機能することが示されている（花谷ら, 2017 年度日本生物工学会大会, 3PE045）．また本法は，一連の代謝反応における律速段階を同定し，律速解消に必要となる酵素の特性を明らかにする上でも有益である．
講演では，代謝デザインの合理化に向けた上述の取り組みを演者らの成果を中心に解説する．また，これらの取り組みを通じて現在顕在化しつつある課題とその解消に向けた展望についても述べたい．

黒麴菌やそのアルビノ変異株の白麴菌は，泡盛や焼酎の製造に利用されている
有用糸状菌＝国菌です．黄麴菌と同じように原料穀物のでんぷん質を分解する
酵素の供給源ですが，大きな特徴として製麴中に大量のクエン酸を生産することが知られています．このクエン酸により泡盛や焼酎もろみは酸性に保たれ，暖かい沖縄や九州での醸造に適しているとされています．九州でも始めは黄麴菌を利用した焼酎製造が行われていましたが，沖縄から黒麴菌が導入されると「其の製品は俗に『ハイカラ』焼酎なる名称の下に市場に歓迎せられ」と広く使われるようになりました．その後，黒い色が嫌われたためかアルビノ変異株である白麴菌が焼酎製造では広く使われていましたが，最近では，黒麴菌も再び使われるようになり「黒なんとか」の製品名で販売されています．
黒麴菌は，1901 年乾により Aspergillus luchuensis として初めて報告されました．
ところが，10 年後には中澤が泡盛麴から分離した糸状菌を乾の株とは別種のAspergillus awamori と報告するなど，初期からその分類に混乱が見られていました．また，海外では黒麴菌は，欧州でクエン酸生産に利用されている Aspergillus
niger の 1 種とされていました．そこで，当研究所保存の 37 株，醸造現場由来
黒麴菌などについて塩基配列による系統解析を行ったところ，黒麴菌は，A.
niger とは別のクラスタを形成し，黒麴菌は A. niger とは違う生物種であるが示されました．現在では，黒麴菌の学名は A. luchueinsis がふさわしいと国際的に認められています．
2016 年，黄麴菌から遅れること 11 年，黒麴菌ゲノム解析の論文が公開されました．これにより，黒麴菌と A. niger とのゲノムレベルでの相同性は 89%と推定され，黒麴菌と A. niger とが別々の生物種であることが確認されました．また，A. niger が生産するとされている 2 種類のカビ毒，オクラトキシン A とフモニシン B2 も黒麴菌ゲノム配列中には生合成クラスタが確認されず，黒麴菌はこれらのカビ毒を非生産性であることが示されています．
黒麴菌は，有性世代の見つかっていない不完全菌とされています．ところが黒麴菌ゲノムを解析したところ，黒麴菌はヘテロタリック株であることが示唆されました．そこで，黒麴菌の有性生殖の可能性について，現在解析を行っているところです．

Rational optimization of artificial synthetic pathway using in vitro metabolicengineering technology -its impact and limitation-

Black koji mold is Aspergillus luchuensis○Kohsuke Honda(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
engineering

syntetic biology, pathway design, optimiztion, in vitro metabolic1) Hong, S. et al., PLOS ONE, 8, e63769 (2013)
2) Yamada, O. et al., DNA Research, 23, p507-515 (2016)○Osamu Yamada(NRIB)

Key words

Aspergillus luchuenss, Black koji mold, genome

242

S3Dc02

全ゲノム情報を用いた泡盛黒麹菌を含む Aspergillus
luchuensis の系統解析

S3Dc03○塚原 正俊（バイオジェット）tsuka@biojet.jp

沖縄県の伝統的酒類「泡盛」の醸造に用いられている黒麹菌は，分生子が黒色を呈する Aspergillus 属の糸状菌である．この黒麹菌の定義や学名については，
形態や生化学的な特性などから多くの整理が試みられてきたものの，規定することができない時期が長く続いていた．その後，山田氏らの分子生物学的手法を用いた取り組みにより，黒麹菌は Aspergillus luchuensis として再定義された．
さらに，A. luchuensis NBRC4314 株の全ゲノム解析結果から，全長は約 34.7
Mb，約 12,000 の遺伝子をコードしていること，および機能性に関連した各遺伝子群の様態や他の種との違いなどが明らかとなっている．
一方，黒麹菌の個々の株は異なる産業特性を有することが知られており，一般的な泡盛醸造では異なる 2 株を混合した複菌麹が用いられている．これらのことから，A. luchuensis における種内の系統解析の情報を得ることは，学術的のみならず産業的に重要な情報となり得ると共に，沖縄県の歴史や文化を理解する上で大きな意義がある．そこで我々は，複数の A. luchuensis およびその近縁種を対象とした全ゲノム情報を用いた詳細な系統解析を行った．
次世代シーケンサーを用いて複数の黒麹菌および近縁種の全ゲノム情報を取得した．解析には，菌株寄託機関から入手した株あるいは沖縄県内の自然界より採取した株から得られた情報，およびデータベース上の公開情報を用いた．まず，得られた各株の配列情報から，各株における約 31 kb のミトコンドリア
DNA （mtDNA） 全長の配列を取得し系統解析を行ったところ A. luchuensis 種
内の差異は数塩基であり，目的とする種内の系統解析には不十分であった．次に，対象領域を広げるために参照配列である A. luchuensis NBRC4314 へのマッ
ピングを行い，その結果から得られた変異情報のうち，Single Nucleotide Variants(SNV) を抽出した．各株の SNV データを用いて系統樹を作成したところ，A.
luchuensis と A. tubingensis，A. niger とが明確に分離することが確認された．また，A. luchuensis と A. tubingensis の距離と比較して，A. tubingensis と A. luchuensis
は大きく離れているなど相対的な種間距離の詳細が明らかになった．これまでのゲノム解析では，A. luchuensis および A. tubingensis の差異は必ずしも明瞭でなかったものの，今回の全ゲノム領域を用いた解析結果から A. luchuensis および A. tubingensis は共に種として明確に独立していることを示す結果が得られた．さらに，A. luchuensis の種内系統解析を行ったところ，多くの泡盛酒造所
で用いられている泡盛黒麹菌株である ISH1（アワモリ株）を含むグループ（Aグループ），および ISH2（サイトイ株）および白麹（カワチ株）を含むグループ（SK グループ）の 2 つに大別できることがわかった． 現在，これらの A.
luchuensis の詳細な系統解析結果を用いて，商業的に用いられている実用株と離れた系統的位置の株を候補株として特性解析を進めている．
さらに，これら詳細な系統解析の結果を用いて A. luchuensis の分岐年代の推定を試みた．本解析に用いた菌株のうち A. luchuensis mut. kawathii RIB SC60 は分離年が明確（1918 年）であり，白色という顕著な形態的特徴を有することか
ら，本株は分離された 1918 年に極めて近い時期に確立した株であると推測される．このことから，本株が有する変異を 100 年間の進化の指標とした．その結果，A. luchuensis と A. tubingensis の共通祖先は約 15,000 年前に分岐し，A.
luchuensis の 2 グループへは約 400 年前に分岐したと推定された．泡盛醸造は600 年以上の歴史があるという史実と今回の結果を合わせて考えると，泡盛醸造が数百年間に渡り繰り返される中で黒麹菌が積極的に選抜されることで多数の A. luchuensis の系統が分化したと考えられた．これまでの結果では，明確なA. luchuensis のグループには海外由来の株が含まれていなかったこと，沖縄からは，A. niger，A. tubingensis，A. luchuensis の全ての種および多数の A. luchuensisが確認されたことなどから，黒麹菌は沖縄県，特に泡盛酒造所に源流を有する微生物であると考えられる結果が得られた．

Aspergillus luchuensis の遺伝子破壊株の造成方法と応用○水谷 治 1, 渡嘉敷 直杏 2, 高橋 徹 3, 山田 修 3, 外山 博英 1
（1琉球大・農, 2鹿児島大院・連農, 3酒総研）
mizutani@agr.u-ryukyu.ac.jp

黒麹菌 (Aspergillus luchuensis) は，沖縄の伝統的な蒸留酒である泡盛醸造に必要な産業微生物である．A. luchuensis は，醤油や味噌，清酒の製造で用いられる
黄麹菌 Aspergillus oryzae と共に，日本醸造協会より国菌として認定されている．
しかしながら，黒麹菌は黄麹菌と比較して分子生物学を含む多くの研究が遅れている．その背景には，ゲノム解析の遅れや研究者数の少なさもあるが，黒麹菌では市販されている細胞壁溶解酵素によるプロトプラスト化が困難であり，Aspergillus 属で一般的に用いられているプロトプラスト-PEG 法による形質転換が行えず，遺伝子機能解析が困難な点も大きな理由の一つになっていると思われる．本シンポジウムでは，プロトプラスト-PEG 法による代替え法として，アグロバクテリウムを介した形質転換法 (Agrobacterium-mediated transformation :AMT) の紹介，この手法を利用した破壊株の造成，及び細胞壁 α-1,3-グルカンに着目した黒麹菌のプロトプラスト作製とそれを利用した形質転換について紹介
したい．
AMT は，土壌細菌であるアグロバクテリウムが持つプラスミドの一部を植物細胞に入れ，自身が感染しやすいように植物細胞の DNA を組換える働きを応用して，目的の遺伝子を導入する形質転換法である．植物のみならず，Aspergillus
属を含む糸状菌においてもアグロバクテリウムが DNA を導入することが明らかとなり，Aspergillus 属でも形質転換法の一つとして，利用されている (1)．黒麹菌での AMT 法は，まずアグロバクテリウムと大腸菌とで保持できるバイナ
リーベクターに目的の遺伝子を搭載させた後，そのプラスミドをアグロバクテ
リウムに保持させる．その後，アセトシリンゴンを含む感染誘導液体培地でアグロバクテリウムを培養し，宿主となる黒麹菌分生子と混合後，メンブランをひいた感染誘導培地プレートに播種し，20 ~ 25℃ で 2, 3 日間培養する．続いて，選択圧をかけた糸状菌用のプレートにメンブランを移し，コロニーが形成されるまで培養する (2)．我々は，本手法を用いて非相同末端結合反応に関与する ligD 遺伝子の破壊を試みた．本遺伝子の破壊は，相同組み換え効率の劇的上昇を引き起こす事が報告されており，黒麹菌でも同様に相同組換え効率が上昇することを確認した (3)．本シンポジウムでは，この ligD 破壊株を宿主に，黒麹菌のメタノール低減化に関与する遺伝子破壊株株の造成についても報告する．
また，AMT 法は，プロトプラスト-PEG 法と比較して，形質転換体が得られるまで時間が掛かるが，基本的に分生子とアグロバクテリウムを混合するのみで，操作としては簡便であり，多検体の遺伝子破壊等に向いていると言える．そこで我々は，AMT 法を用いて主要転写因子破壊ライブラリの造成を行っており，
その進捗状況についてもお話したい．
一方，AMT 法のデメリットとして，セルフクリーニングとして受け入れられづらいことや，マルチに遺伝子を導入すること，Cre 酵素や Cas9 及び guide RNAの細胞内直接導入による Cre-loxP システムや CRISPR/Cas9 の利用 (4, 5) ができない点が挙げられる．そのため，黒麹菌のプロトプラスト化問題の解決も，必要な状態のままであった．そこで，我々はプロトプラスト化の前培養条件及び細胞壁溶解酵素の検討を行い，プロトプラスト化が可能な条件検討を行った．その結果，貧栄養培地及び静置培養で得られた菌糸に対して，市販細胞壁溶解酵
素 Yatalase に加え，α-1,3-glucanase を使用することで，プロトプラストが得られることを発見した．α-1,3-glucanase の効果が認められたので，その基質となる
細胞壁 α-1,3-glucan 合成酵素を欠損させれば，Yatalase のみで高収量なプロトプ
ラストが得られるのではと考えられた．そこで，黒麹菌ゲノム上にコードされている 5 つの α-1,3-glucan 合成酵素遺伝子のうち，Aspergillus nidulans の主要な
α-1,3-glucan 合成遺伝子である agsB のホモログにあたる遺伝子 agsE をアグロバ
クテリウム法によって欠損させた黒麹菌 ΔagsE 株を造成し，Yatalase を用いてプロトプラスト化を行った．その結果，ΔagsE 株において黄麹菌と同程度のプ
ロトプラスト化が可能であった．また，これらプロトプラストを用いてプロト
プラスト-PEG 法による形質転換を行った所，問題なく形質転換が可能であることを確認した．以上のように，プロトプラスト形成が難しいと思われていた黒麹菌において，agsE 遺伝子を破壊することで，Aspergillus 属において一般的な形質転換法が利用可能となった．今後は，AMT 法，プロトプラスト-PEG 法の良い点を活用しつつ，黒麹菌の遺伝子機能解析を行っていきたい．
【参考文献】(1) Michielse CB. et al., J. Bacteriol. (2004), (2) Michielse CB. et al., Nat. Protoc.
(2008), (3) Takahashi T. et al., J. Biosci. Bioeng. (2011), (4) Mizutani O. et al., Appl
Environ Microbiol (2012), (5) Pohl C. et al., ACS Synth. Biol. (2016)

Detailed phylogeny of Aspergillus luchuensis with whole genome
comparison

Construction and application of gene disruptant in Aspergillus luchuensis

Key words
Aspergillus luchuensis, phylogenetic analysis, Next generation
sequencer, Awamori

Key words○Masatoshi Tsukahara(Biojet)○Osamu Mizutani1, Jikian Tokashiki2, Toru Takahashi3, Osamau Yamada3,
Toyama Hirohide1(1Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 2United. Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ.,
3
NRIB)

Aspergillus luchuensis, transformation, protoplast, alpha-1, 3-glucan

243

S3Dc04

黒麹菌による泡盛古酒香バニリン前駆体の生成～古酒と老麹～

S3Dc05○二神 泰基 1, 門岡 千尋 1, 後藤 正利 2, 玉置 尚徳 1（1鹿児島大院・連農, 2佐賀大・農）futagami@chem.agri.kagoshima-u.ac.jp

眞榮田 麻友美 1, 渡嘉敷 正司 2, 渡嘉敷 みどり 2, 後藤 正利 3,
伊藤 進 1, 上地 敬子 1, ○平良 東紀 1
（1琉球大・農, 2石川種麹店, 3佐賀大・農）tokey@agr.u-ryukyu.ac.jp

泡盛とは，蒸米に黒麹菌 Aspergillus luchuensis を生やして造った麹を唯一の原料とし，そこに水と酵母を添加し発酵させ，得られたもろみを蒸留して製造される沖縄の伝統的な蒸留酒である．泡盛の最大の特徴は黒麹菌を用いた全麹仕込みである．そして，もう 1 つの大きな特徴は 3 年以上熟成させると芳醇な香味を持った古酒になるところである．
泡盛古酒の香味成分の中でも最も特徴的なのがバニリンである．バニリンは，原料米中の細胞壁多糖にエステル結合しているフェルラ酸（FA）に由来する．
黒麹菌の有するフェルラ酸エステラーゼによって米細胞壁多糖より遊離されたFA が脱炭酸され，4-ビニルグアヤコール（4-VG）に変換され，貯蔵中に非酵
素的酸化によってバニリンになると考えられている． FA の脱炭酸反応による
4-VG への変換がどのように起こっているのかは様々な議論がある．Koseki ら（J Ferment Bioeng, 1996）は，もろみ発酵中の酸と蒸留の熱によって FA が 4-VG
へ変換されるとしている．Mukai ら（J Biosci Bioeng, 2010）は，酵母（Saccharomyces
cerevisiae ） 中 の フ ェ ニ ル ア ク リ ル 酸 脱 炭 酸 酵 素 （ Phenylacrylic Acid
Decarboxylase：PAD1）とフェルラ酸脱炭酸酵素（Ferulic acid decarboxylase：
FDC）が共同して FA を脱炭酸し 4-VG に変換すると報告している．その他，
フェノール酸脱炭酸酵素（Phenolic acid decarboxylase：Pad）を有する細菌類が発酵中のもろみに混入し，FA を 4-VG へ変換している可能性が示唆されている．このように，バニリン生成に重要な FA の脱炭酸反応による 4-VG への変換
が化学反応もしくは，どの微生物のどの酵素によって行われているのかは明ら
かではなかった．
本研究室においても，泡盛醸造工程における 4-VG 生成についてその要因を検討して来たが，酵母やもろみから分離される細菌類の寄与は低くかった．そこで，我々は A. luchuensis のゲノム配列中の細菌類の Pad と相同性を有する配列「A. luchuensis 由来フェノール酸脱炭酸酵素候補遺伝子（Alpad）」が主要因であるという仮説を立てた．本研究では，Alpad 候補遺伝子が実際に発現し，フェ
ノール酸脱炭酸酵素（AlPad）として泡盛醸造中の FA を 4-VG に変換する活性（Ferulic Acid Decarboxylation：FAD 活性）に寄与しているのかを明らかにすることを目的とした．
本研究には，実用菌株である A. luchuensis var. awamori ISH1 株を用いた．ISH1株より得られた AlPad cDNA を大腸菌で発現させ，得られたリコンビナント体
はホモダイマー（SDS-PAGE で 19.4 kDa，ゲルろ過で 35.6 kDa）であり，明確な FAD 活性を示した．最適温度は 40℃付近，最適 pH は pH 5.7 付近であり，泡盛醸造中の温度や黒麹菌の細胞内 pH で活性があることを明らかにした．FAを含む液体培地で培養した A. luchuensis を用いた静止菌体反応により，AlPadは FA により誘導される菌体内酵素であることが分かった．製麹中に AlPad が発現しているかどうかを調べた．製麹時間の異なる麹から得られた無細胞抽出
液の FAD 活性量（菌体量を揃えて測定）と，ウエスタンブロッティングによる
AlPad の検出量には強い相関があった．また，AlPad の発現量は製麹時間が長くなるにつれて増大することが分かった．これらの結果から，泡盛醸造中の FAから 4-VG の変換の主体は黒麹菌の生産する AlPad であることが示唆された（Maeda et al., J Biosci Bioeng, 2018）．麹中での AlPad の発現量と，もろみおよび蒸留液中の 4-VG 量に正の相関があることも確かめられた（眞榮田ら，第 70 回
日本生物工学会大会, 2018）．
多くの泡盛酒造所では古酒用の泡盛原酒を造る際，経験上製麹時間の長い麹（老麹）を用いており，このことは製麹時間が長いほどＡｌＰａｄ量が増大し 4-VG
量が増大するという我々の研究成果と良く一致する．これらのことから，本研究で得られた成果は，バニリン香に富む付加価値の高い古酒の製造技術の確立に貢献することが期待される．清酒や焼酎などにおいては 4-VG はオフ・フレー
バーとなるため，本研究成果は 4-VG を減らす技術開発への寄与も期待される．
現在，各種オミックス解析により，バニリンだけではなく，麹菌による他の香味成分の生成過程やメカニズムに関係するデータ収集・解析を行っている．これらの研究によって得られる成果は米麹を用いる酒類，その他の醸造食品の品質管理や新製品の開発に繋がることが期待される．
黄麹菌が清酒だけでは無く，味噌，醤油，甘酒，麹漬け等様々な食品に使用されている一方で，黒麹・白麹菌の焼酎・泡盛以外での用途は極めて少ない．発
表者らは，地元企業との共同研究により，黒麹を主とする酒種を用いたパンや
泡盛蒸留粕より得られる「もろみ酢」を原料とした乳酸発酵飲料などを商品化した．また沖縄県内唯一の種麹店である石川種麹店は全麹仕込みで作った「黒麹玄米ドリンク」を発売している．これらの商品のブラッシュアップや今後の黒麹・白麹を用いた新商品の開発に我々の基礎研究の成果を役に立てて行きた
い．また，これらを推進するために，黒麹・白麹研究者によるネットワークを造って共同研究を行い，Aspergillus luchuensis の研究を世界に発信するとともに，地域の産業振興に繋げて行きたいと考えている．

Production of a precursor of vanillin, a specific flavor of old awamori‘kusu’, by Aspergillus luchuensis
Mayumi Maeda1, Masashi Tokashiki2, Midori Tokashiki2, Masatoshi Goto3,
Susumu Ito1, Keiko Uechi1, ○Toki Taira1(1Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 2Ishikawa Tanekouji, 3Fac. Agric., Saga Univ.)
Key words
Aspergillus luchuensis, phenolic acid decarboxylase, awamori, 4vinylguaiacol

白麹菌のクエン酸高分泌生産機構に関する研究～トランスクリプトームを手掛かりとしてわかってきたこと～

白麹菌（Aspergillus luchuensis mut. kawachii）は黒麹菌（Aspergillus luchuensis）の白色変異株であり，主に焼酎の製造に用いられている．その性質として，白麹菌は黒麹菌と同様に，クエン酸を高度に分泌生産するという特徴をもつ．ク
エン酸には，もろみの pH を低く保つことで雑菌の増殖を防ぐという重要な役割があり，温暖な気候での安定した焼酎造りを可能にしている．演者らは，麹の製造過程における白麹菌のトランスクリプトームを手掛かりとしてクエン酸生産機構の解明に取り組んでおり，現在までに分かってきたことについて紹介する．
1. 麹の温度管理の意味
焼酎用の麹造りでは，発酵熱により上昇する温度を強制的に下げることが行われており，温度を下げた後にクエン酸生産が活発化する．この温度管理が白麹菌の遺伝子発現にどのような影響をもたらしているのかを捉えるためにマイク
ロアレイにより解析した 1)．その結果，温度を下げた際に発現上昇する 566 遺伝子と発現減少する 548 遺伝子を同定した．温度を上げた状態では，解糖系から分岐するグリセロール合成経路，トレハロース合成経路，ペントースリン酸経路の関連遺伝子の発現が上昇しており，クエン酸が生じる TCA 回路へのカー
ボンフローが抑制されているためにクエン酸を高生産できないことが示唆された．また，温度を下げることにより分子シャペロンの発現が減少しており，一方で，アミノ酸，有機酸輸送体などの輸送体関連遺伝子が高発現していたことから，白麹菌が高温ストレスから解放されることによってクエン酸の高生産がはじまることが示唆された．
2. ミトコンドリア局在クエン酸輸送体
クエン酸がミトコンドリアから，細胞質，菌体外へと効率よく排出されることが長年，クエン酸高生産のために重要だと考えられてきた．マイクロアレイの結果，クエン酸の高生産がはじまる麹の温度低下によりミトコンドリア局在型の推定クエン酸輸送体をコードする ctpA と yhmA の遺伝子発現が上昇していた．白麹菌から CtpA と YhmA を精製し，これらにクエン酸輸送体活性があることを確認した．また，ctpA と yhmA のそれぞれを単独破壊すると，菌体あたりのクエン酸生産量が減少した．以上のことから，CtpA と YhmA が白麹菌のクエン酸生産に重要なクエン酸輸送体であることが明らかになった．さらに，
ctpA と yhmA の役割を調べるために二重破壊株の構築を試みたが取得できなかったため，Tet-On システムにより ctpA を発現制御できる株において，yhmA を破壊した．同株を解析した結果，ctpA と yhmA の機能不全により最小培地でリジン要求性となることが明らかになった．このことから CtpA と YhmA によりミトコンドリアから細胞質に排出されるクエン酸の一部はリジン合成の前駆体として生育に必須な役割をもつ可能性があると考えている．
3. クエン酸生産を制御する転写制御因子
麹造りにおける白麹菌の遺伝子の発現変動を制御する因子として転写制御因子に着目したところ，クエン酸の高生産がはじまる温度低下時に推定転写制御因子をコードする nosA と rosA の遺伝子発現が上昇していた．nosA と rosA は，モデル糸状菌 Aspergillus nidulans では有性生殖に関与することが報告されていたが 2,3)，白麹菌には有性世代が見出されていない．遺伝子破壊株，過剰発現株を解析した結果，野生株と比較して nosA 破壊株のクエン酸生産量は約 2 倍に上昇
し，nosA 過剰発現株では 0.2 倍に減少した．このことから，白麹菌において，
推定転写制御因子である nosA はクエン酸高生産に関与することが明らかになった．
(1) Futagami, T., et al. Appl. Environ. Microbiol. 81:1353-1363, 2015; (2) Vienken, K.,
et al. Genetics. 169:619-630, 2005; (3) Vienken, K., Fisher, R. Mol. Microbiol.
61:544-554, 2006.

Studies on high citric acid production mechanism of white koji fungus What has been learned from the transcriptome data of white koji ○Taiki Futagami1, Chihiro Kadooka1, Masatoshi Goto2, Hisanori Tamaki1(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Fac. Agric., Saga Univ.)

Key words
regulation

Aspergillus kawachii, transcriptome, transporter, transcriptional

244

S3Ec01

環境の酸化還元電位，水溶液や付着物の電気抵抗，電気的中性条件について考慮しましたか？
○伊藤 公夫（新日鐵住金・先端研）
ito.9t6.kimio@jp.nssmc.com

S3Ec02微生物鉄腐食研究が与える異分野融合のチャンス○岡本 章玄（物材研・国際ナノアーキテクトニクス研究拠点）
okamoto.akihiro@nims.go.jp

鉄の腐食は電気化学現象であり，微生物腐食も例外ではない．鉄が Fe2+にイオン化して溶出する部位では鉄から外向きに電流が流れる．この電流をアノード
電流という．アノード電流を測れば鉄の腐食速度がわかる．オームの法則から電流に影響を及ぼすのは電位差と電気抵抗であるので，以下，電位，電気抵抗の順に概説する．
1.平衡電位鉄の酸化反応（アノード反応） Fe → Fe2+ + 2e－ の 25℃における平衡電位 E を
Nernst の式により求めてみる．
E = E0 + RT /2F ln [Fe2+]/[Fe] = E0 + 0.0295 log [Fe2+] に標準電極電位 E0 =－0.44V，[Fe2+]=10－6mol/L を代入すると，E = －0.62V となる．25℃，pH7 における酸素の還元反応（カソード反応）O2 + 2H2O + 4e－ → 4OH－ の平衡電位は，E= +0.81V ，水素発生反応（カソード反応）2H+ + 2e － → H2 の平衡電位は，E =－0.41V となる．平衡電位は微生物反応も含めた酸化還元反応が起きるか否かの目安になる．嫌気性の水中で金属鉄が腐食すればカソード反応で水素が発生するが，負電荷の電子は－0.62V の金属鉄の酸化反応から－0.41V の水素発生反応へと，より正の電位の反応へ移動する．25℃，pH7 における硫酸塩還元反応の平衡電位は －0.22V，メタン生成反応の平衡電位は －0.24V であり，水素を電子供与体として用いるよりも，金属鉄を電子供与体として用いた方がエネル
ギー的に有利なことがわかる．鉄腐食性の硫酸塩還元細菌やメタン生成古細菌を見つけるために，電子供与体として水素でなく金属鉄を用いることは理にかなった方法と考えられる．実環境で酸化還元電位は金電極や白金電極を用いて測定される．微生物が棲息している周囲の水や土壌の酸化還元電位を測定することで，どのような酸化還元反応が微生物と周囲の環境の間で起こり得るか，
ある程度予想できる．水中での金属の化学形態は電位と pH の影響を強く受ける．電位－pH 状態図として Pourbaix Diagram が利用でき，参考になる．
2.水溶液や付着物の電気抵抗
電流は回路を形成する．鉄の腐食の場合，Fe2+ の溶出で流れるアノード電流と，アノード，カソード間の鉄外部を流れる電流と，酸素や水素イオンが金属鉄表面で電子を受容するカソード電流と，カソード，アノード間の金属鉄内部を流れる電流は，等しい電流量になる．この電流を腐食電流とも呼ぶ．金属外部の電気抵抗が大きければ腐食電流は大きくなれず腐食は進まない．水溶液の電気伝導はイオンが担う．モル伝導率の値が大きい H+ や OH－，海水では Na+ や Cl－が電気伝導を担うと考えられる．水溶液の電気伝導率は電気伝導率計により測定できる．付着物の電気抵抗も考慮する必要がある．淡水でもバイオフィル
ムが付着することで金属外部を流れる電流量が増加することが報告されている．
鉄腐食生成物の Fe3O4，FenSm，FeS2 なども電気伝導性があり，電流経路になる可能性がある．
3.電気的中性条件
電気的中性条件（電気的中性の原理，電気的中性の法則ともいわれる．）は，ある程度の空間を占める電解質水溶液の正電荷と負電荷の量は等しいとするものである．ある程度の空間とは曖昧であるが，細胞膜に囲まれた細胞内液を例に説明する．細胞膜の電気抵抗率は 106～109Ωm であり，電気を通しにくい．細
胞膜は大部分がリン脂質二重膜で構成されており，細胞膜を貫通する膜蛋白質のイオンポンプやイオンチャネルを H+，K+などのイオンが移動することにより電流が流れる．植物細胞の細胞膜の膜電位は膜の外側に対する内側の電位が－100mV 程度である．微生物では例えば大腸菌の膜電位が外液 pH5.0 で－85mV，
外液 pH8.0 で－142mV と報告されている．細胞膜の厚さを 7nm，膜電位を－100mV と仮定して細胞膜にかかる電界を計算すると，細胞膜の外側から内側に向かって 14 万 V/cm もの強電界がかかっている．植物細胞膜に存在する起電性
H+ポンプは ATP を加水分解して得られるエネルギーを使って，上記電界（正確には H+の電気化学ポテンシャルの勾配）に逆らって，H+を細胞外に排出する．
電気的中性条件により，H+排出と同時に交換で K+がイオンチャンネルを通して細胞内に吸収される．K+は植物に必須なイオンであり，細胞の浸透圧調節や生長の駆動力に用いられる．起電性 H+ポンプは植物，カビ，原生生物，原核生物などで確認されている．植物細胞について説明したが，微生物の電気化学現象においても，電気的中性条件に留意する必要がある．
4.結言
実環境ではさまざまな酸化還元反応，さまざまな微生物が混在しており，微生物に起因する電気化学現象と非生物的におこる電気化学現象を明確に分けて解析することが難しい．電気化学現象（例えば微生物腐食）に関わる微生物を単離して（複数種類の微生物の単離が必要な場合もある），微生物がいる条件と，無生物条件で必ず比較しながら，電気化学現象を解析することが基本であると考える．

細菌による嫌気鉄腐食はパイプライン事故などに繋がる重大な問題であり，その損害は米国内だけでも年間 300~500 億ドルとも言われています．これまで嫌気鉄腐食は硫酸還元細菌がつくる腐食性の硫化水素によって進行・悪化すると考えられてきましたが，近年，固体表面から直接電子を引き抜く「電気細菌」の存在が提案されており，古典的な腐食電気化学と微生物学，分子生物学，生化学などの知識が横断的に必要となる「微生物腐食学」とでも言うような新融合領域が創造されつつあります．本講演では，現在微生物腐食学に身を置く講
演者のこれまでの経験や苦労話をご紹介しつつ，どのように異分野へ参入しながら，自分の研究を展開するかと言った重要な問題に対して考えを深めていきたいと思います．

Did you check oxidation-reduction potential of environments, electricalresistance of solution and adherents and principle of electric neutrality insolution ?

Biological iron corrosion fuses electrochemistry and microbiology○Kimio Ito(Adv.Tech.Res.Labs.,Nippon Steel & Sumitomo Metal Corp.)

Key words

corrosion, iron, steel, mic○akihiro okamoto(NIMS, MANA)

Key words
iron respiration, sulfate-reducing bacteria, outer membrane protein,
extracellular electron transport

245

S3Ec03

医療用金属材料開発における電気化学の基礎と応用○堤 祐介（医科歯科大・生材研・金属）
tsutsumi.met@tmd.ac.jp【緒言】生体材料は一般の工業材料と同様に，金属材料，有機材料，無機材料の3 種類に分類され，それぞれの特性を活用した医療デバイスに応用され，またその開発が進められてきた．金属材料の最大の利点は，高い強度と大きな延性とのバランスによる優れた靱性にあり，力学的信頼性が高いことから，耐荷重が必要な体内埋入型のデバイスにおいて，特に非常に重要な役割を担っている．
一方，金属は化合物やイオン，有機錯体を除外すると，単体では生体中には存在しない物質であるため本来生体機能性に乏しく，有機材料や無機材料のように，生体内物質を模倣あるいは再現することで生体機能を獲得することは不可能である．体内に埋入された材料と生体との相互反応は，常にその界面で生じることを考えると，表面処理により金属材料と生体との界面に生体機能を示す層を形成することが，優れた機械的性質と生体機能性の両立を可能とする，合理的な手段となる．講演者はこれまでに，電気化学的な手法により，医療用金属材料の表面を改質し，さまざまな生体機能性を付与するための研究に取り組んできた．本講演では，これら医療用金属生体材料の表面改質に関する動向や
医療デバイスへの実用化例について，また，生体材料を取り扱う上で，必要とされる電気化学の基礎的な知識と，生物学系の研究者と工学系の研究者の差異やそれにより生じる問題等，研究以外の面においてもレビューする．
【方法】金属材料の表面改質は大気中あるいは真空中で行うドライプロセスと水溶液や有機溶媒あるいはこれらの混合物で行うウェットプロセスに大別される．
著者らはウェットプロセスの中でも電源に接続して通電を行う電気化学的表面処理に着目して研究を行ってきた．電気化学的処理は単純な構成ながら通電条
件，溶液の選定の組み合わせにより自在に表面の制御が可能となっている．例
えば，生体機能分子に特定の官能基を修飾し，水溶液中に溶解し通電すること
で，通常の非特異的吸着よりもはるかに強固な固定化が可能となる．また，陽極酸化では金属材料そのものを，生体機能性をもった酸化物や独特な表面構造を有する層に変質させ，表面を被覆することが可能である．
【結果】ポリエチレングリコール(PEG)，I 型コラーゲン，リン脂質極性基を有するポリマー(MPC ポリマー)にアミノ基を修飾することで，水溶液中での電着処理が可能であることを確認した．チタン表面にこれらの分子をカソード処理
により固定化した試料は，タンパク質吸着抑制，血小板粘着抑制，抗菌性や硬組織適合性を示すことが確認された．一方，チタンやジルコニウムに対して放電反応が生じる程度の電位域にてアノード処理を施すことで，表面に多孔質な酸化皮膜を容易に形成することができ，硬組織適合性の向上や抗菌性の付与に有用であることが確認された．これらの結果から，電気化学的表面処理は，次世代の医療デバイス開発に有益な手法であるといえる．

S3Ec04光合成を電気化学で測る，操る○中西 周次 1,2（1阪大・太陽エネ化学研究セ, 2阪大院・基礎工）
nakanishi@chem.es.osaka-u.ac.jp

光合成では，可視光エネルギーにより，水を電子源として二酸化炭素が還元固定化される．現在，私たちが暮らす大気圏環境を光合成が形成してきたことを考えると，光合成における光エネルギー変換プロセスは，環境エネルギー問題の解決法を考える上で大変参考になる．実際，化学の分野では，こうした光合
成機能の人工化を目指した，いわゆる人工光合成研究が活発に行われている．
一方，天然の光合成には，もう一つの特筆すべき機能として，変動する太陽光エネルギーに対するレドックス恒常性が備わっている．変動する太陽光への適
応は，光合成生物がその生命を支える上で本質的に重要である．こうした光適
応が全ての光合成生物に備わることを考えると，その光適応能の理解と制御は光合成を利用した生物工学プロセスを考える際にも重要であると言える．
自然界における太陽光強度は，地球の自転に伴って 24 時間周期で変化する．一方，太陽光強度は，雲や木の葉の動きにより，短周期かつ予測不可能なかたち
でも変化する．こうした規則的あるいは不規則的な太陽光強度の変化に適応するためには，光強度の強弱を検知する仕組みが必要であり，多くの場合，細胞内レドックス状態がその役割を担っている．例えば強光条件下では，系外への電子排出（還元反応）に比べ，系内への電子の流入（酸化反応）が速く，細胞内は過剰な還元状態となる．過剰還元状態で生成する活性酸素種は細胞にダメー
ジを与え得るので，強光条件では，新しい電子排出経路の開設や電子排出フラックスの増強などが起こり，細胞内レドックスの恒常性が保たれる．
我々の研究グループでは，電気化学的手法が「分子集合系の酸化・還元反応を操るのに長けている」ことに着目し，光合成のレドックス恒常性の起源と機構，
およびそれがミクロ生態系に及ぼす影響に興味を持って研究を進めてきた．これまでに，光合成細菌の細胞内レドックスを電気化学的に制御および検出する方法を開発している．これらの手法を駆使し，最近は特に，外的要因によるレドックス変動と内因性の自発的なレドックス変動との間の相互関係に注目した研究を展開している．光強度を変化させながら，シアノバクテリア Synechococcus
elongates PCC7942 を含む培地の開回路電位（OCP）を測定した結果，光強度の増大と共に OCP は負にシフトするが認められた．一方，一定の光強度条件（恒明条件）においても OCP が 24 時間周期で自発振動することも見出された．時計遺伝子のノックアウト変異株ではこうした OCP の振動（リズム）は得られなかったことから，この OCP 振動が内因性の概日時計により誘起されていることが明らかになった．重要なことに，シアノバクテリアの内因性のレドックス変動は，環境の明暗変化による外因性レドックス変動に匹敵するレベルで変化していた．
このように，電気化学的手法を駆使することで，これまでに知られていなかった内因性レドックスリズムの存在，およびその外因性レドックス変動との定量的相関を把握することができた．この手法は，他の遺伝子操作等の手法との干渉が少なく，実際，レドックスリズムと遺伝子導入に基づく生物発光リズムとの同時検出も可能であることが示されている．これらの結果は，電気化学的手法の有用性を示す一つの例と言えよう．一方で，現状では，OCP が細胞内のどのレドックス種に関する情報を反映しているのかは明確になっていない．また，
OCP には電気化学セル内で並行して進む他の非生物学的プロセスの影響も反映されうる．これらの問題の中には電気化学的手法の原理的な限界に基づくものも含まれる．本講演では，上記の我々の取り組みを例に，生物工学的プロセス
観点から電気化学的手法の可能性と限界について議論したい．

Basics and applications of electrochemistry for development of metallic
biomaterials

Electrochemical detection and regulation of intracellular redox ofphotosynthetic microbes

Key words
metallic biomaterials, electrochemistry, surface treatment,
biofunctional property

Key words○Yusuke Tsutsumi(Inst. Biomater. Bioeng., Tokyo Med. Dent. Univ. (TMDU))○Shuji Nakanishi1,2(1RCSEC, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ.)

electrochemical cultivation, photosynthetic bacteria, cyanobacteria

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S3Fc01

工学システムの進展から見る窒素マネジメントの現状と課題

S3Fc02○寺田 昭彦
（農工大院・工）akte@cc.tuat.ac.jp

産業革命以後の爆発的な人口増加に伴う食糧生産需要の増大に対応するため，
ハーバー・ボッシュ法による不活性窒素化合物である窒素ガスの固定化が行われてきた．ハーバー・ボッシュ法の発明・実用化により，肥料の効率的な大量生産が可能となり，食糧生産量を飛躍的に向上させた．一方で，過剰に投与された肥料により，反応性窒素が自然環境に残存し，地球環境には窒素が過多に存在することになった．このような状況により，沿岸部における富栄養化や貧酸素水塊，地下水の硝酸性窒素汚染などの水環境問題が顕在化した．2100 年に地球環境に存在する反応性窒素は 2010 年と比較して約 30%増大することが予想されており（Fowler et al. 2015 Atoms. Chem. Phys. 15(24):13849-13893），窒素は 21 世紀における大きな地球環境問題として立ちはだかっている．
窒素のよる地球環境・水環境汚染問題を論じる際，常にトレードオフが存在す
る．上述した地表に存在する窒素化合物には，食糧生産と環境問題のトレード
オフが生じる． 排水処理などの工学システムにおける窒素除去にもトレードオ
フが存在する．排水中の窒素除去には生物学的窒素除去である硝化・脱窒法が用いられているものの，運転コストが高く，窒素除去と運転コストのトレード
オフが生じる．このトレードオフの解消のため，嫌気性アンモニア酸化（アナモックス）細菌を利用した，硝化・脱窒法よりも低コスト・省エネで運転可能な部分硝化－アナモックス法が開発され，実用化が世界各地で急激に進んでいる．一方で，部分硝化では温室効果ガスおよびオゾン層破壊物質として知られる亜酸化窒素（N2O）の生成量増大を引き起こす．ここに窒素除去の低コスト化と高い温室効果能を有する N2O 排出という，別のトレードオフが生じる．
窒素問題を議論する上で生じるトレードオフを解決する革新的技術開発が今後必要となる．上述した省エネ化と N2O 排出のトレードオフは，供給する酸素を窒素化合物と対抗する方向から供給する対抗拡散型バイオフィルムの利用が効果的である．講演者らは，ガス透過膜を用いた対抗拡散型バイオフィルム法による窒素除去法を提案している（Kinh et al. 2017 Water Res. 124:363-371）．ガス
透過膜を介する精密な酸素供給と，バイオフィルム内の好気部位がバイオフィ
ルムの底部に形成されるユニークな構造により，N2O を窒素ガスに変換する細菌群の活性を高めることが可能である．さらに，ガス透過膜を酸供給素材として用いることにより，曝気コストが削減可能であり，省エネ化と N2O の排出抑制の双方を達成できるシステムとして，実用化が期待されている．
窒素除去と運転コストのトレードオフは，排水中に存在する窒素化合物を資源として見立てることにより，解決できる可能性がある．水素酸化細菌やメタン酸化細菌の一部は，有機態窒素を取り込んで高密度な微生物タンパク質を細胞内に蓄積することが可能である（Matassa et al. 2016 Water Res. 101:137-146）．これらの細菌群の機能は，窒素化合物を「処理」の対象から「回収」の対象へと発想の転換を可能にする．キーとなる細菌群の包括的な生理生態解析による最適な条件の解明と，システム開発が今後の課題といえる．
工学システムにおける新規細菌群の機能特性の解明と，それらを用いた利用可能技術の開発といった，双方の進展が，過多に存在する窒素化合物の適切なマ
ネジメントにつながることを期待したい．

硫化カルボニルの生物地球化学循環と安定同位体比を用いた動態解析
○服部 祥平 1, 亀崎 和輝 1, 小川 貴弘 2, 片山 葉子 2, 吉田 尚弘 1
（1東工大, 2農工大）hattori.s.ab@m.titech.ac.jp

地球温暖化は人類が直面している喫緊な課題である．地球温暖化の将来予測を行うためには，温室効果ガスによる地球を温暖化する効果だけでなく地球を冷却する効果を正確に見積もることが重要である．硫酸エアロゾルは自身が太陽光の散乱によって冷却効果を有するだけでなく，雲核として働くことで水滴(雲)を形成することで間接的な冷却効果を有する．エアロゾルは気候変動に大きな影響を及ぼすにも関わらず，その科学的理解度は低く ，Intergovernmental Panelon Climate Change (IPCC)の報告書でも信頼度が低い(L)要素として報告されている[IPCC AR5, 2013]．このため，硫酸エアロゾルの起源や生成過程を理解することは重要である．
硫化カルボニル(COS または OCS)は清浄大気中で最も多く存在する硫黄化合物である(約 500 ppt) [Chin, M. and Davis, D. D., 1995 JGR.]．COS は対流圏において安定であるため，成層圏へ輸送され光化学反応によって成層圏硫酸エアロゾルを形成する[Crutzen, 1976 GRL.]．この成層圏硫酸エアロゾルは地球の放射収支に負の影響を与え，オゾン層破壊に関与するが，その動態に不確実性が高い．
このため，成層圏硫酸エアロゾルの主たる前駆体である COS の環境動態の詳細な理解は地球の気候変動を理解・予測する上で重要である．それにも関わらず，
COS の研究例は CO2, CO2, CH4, N2O などの温室効果ガスに比べ少なく，生成および消失過程に不明点が多い．
土壌を含む生物圏は COS の主要な消失源の一つである．気温や水分量に対する応答から，土壌における COS の分解は土壌微生物によるものだと考えられている．事実，土壌から COS 分解能をもつ微生物が単離されている[Kato et al., 2008
Microbiology]．しかし，その大気中 COS への微生物の寄与や微生物による COSの分解メカニズムは不明である．そこで，発表者が開発した COS の硫黄同位体
組成測定装置[Hattori et al., 2015 Anal. Chem.]を用いて微生物による COS 分解時の硫黄同位体分別係数の決定と COS 分解酵素と微生物の同位体分別係数をから微生物が COS を分解する際のメカニズムの解析を行ってきた．これまで，試験管内に作成した寒天培地に土壌から単離した微生物を Mycobacterium spp.
Williamsia sp. 及び Cupriavidus spp. 培養し，微生物が COS を分解する際の濃度と硫黄同位体組成の変動を観測した．さらに，活性汚泥から単離された
Thiobacillus thioparus THI115 と THI115 から抽出・精製された酵素 COSase についても COS 分解時の濃度と硫黄同位体組成の変動を観測した．
得られた結果は全ての微生物において OC32S の取り込みが OC33S および
OC34S の取り込みよりも速いく，同位体分別係数は－2 から－4‰であった．微生物による COS 分解時における硫黄同位体分別係数は COS の分解速度が異なるにも関わらず微生物の属ごとに同じ値をとった．このことから微生物による
COS 分解時の同位体分別係数は分解速度でなく，微生物の構造に依存することがわかった．そこで，微生物と酵素による同位体分別係数の違いから微生物による COS 分解メカニズムの推定を行った．Thiobacillus thioparus THI115 とTHI115 から抽出された硫化カルボニル分解酵素 COSase による同位体分別係数はそれぞれ－3.7 から－2.2‰であった．THI115 が COS を分解する際の同位体
分別係数-3.7‰は生体膜を拡散する COS の同位体分別係数に等しく，微生物がCOS を取り込む際の律速段階は生体膜の通過であり酵素による COS の分解は早いことが示唆された．
COS は成層圏硫酸エアロゾルの前駆体としてだけでなく，一次生産量のトレーサーとして有用であることが知られている [Campbell et al., 2008 Science]．このように生物は COS の動態に密接に関わっており，生物は COS を通じて間接的に大気環境に影響を与えている．このため，発表者のグループは大気中の 500pptの COS を濃縮し，同位体計測を大気観測レベルで可能にする大容量大気濃縮捕集装置を近年開発した(Kamezaki et al. in prep)．発表では，この可能性と同位体を用いた COS の生物地球化学循環研究，特に生物の寄与を明らかにする研究の方向性に関して議論する．
引用文献
・Chin, M.; Davis, D. D. J. Geophys. Res. 1995, 100 (D5), 8993－9005.
・Crutzen, P. J. Geophys. Res. Lett. 1976, 3 (2), 73－76.
・Kato, H.; Saito, M.; Nagahata, Y.; Katayama, Y. Microbiology 2008, 154, 249－255.
・Hattori, S.; Toyoda, A.; Toyoda, S.; Ishino, S.; Ueno, Y.; Yoshida, N. Anal. Chem.
2015, 87 (1), 477－484.
・Campbell, J. E.; Carmichael, G. R.; Chai, T; Mena-Carrasco, M.; Tang, Y.; Blake, D.
R.; Blake, N. J.; Vay, S. A.; Collatz, G. J.; Baker, I.; Berry, J. A.; Montzka, S. A.;
Sweeney, C.; Schnoor, J. L.; Stanier, C. O. 2008. Science 322: 1085-1088.

Current status and challenges of nitrogen management: Lessons fromadvancements of engineered systems○Akihiko Terada(Grad. Sch. Eng., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

nitrogen removal, nitrification, denitrification, nitrous oxide

Biogeochemical cycle of carbonyl sulfide elucidated by stable isotopic
analysis○Shohei Hattori1, Kamezaki Kazuki1, Ogawa Takahiro2, Katayama Yoko2,
Yoshida Naohiro1(1Tokyo Tech, 2Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

carbon dioxide, carbonyl sulfide, sulfate aerosol

247

S3Fc03結晶性酸化鉄の微生物還元とその地球炭素循環との関わり

S3Fc04○堀 知行（産総研）
hori-tomo@aist.go.jp

鉄は，地球上第四位の構成元素であり，その多くは結晶性鉄鉱物として陸上土壌圏および海底地下圏に広く分布している．鉱物などの配位化合物を形成する
際，鉄は二価または三価の陽イオンの形態をとっており，両者の安定性の差は極めて小さい．この事は，鉄原子が電子を他から受け取りやすく，かつ他へ渡しやすいという重要な性質を生み出している．鉄化合物は，生物学的および化
学的な酸化還元を受ける事で二価と三価の形態を行き来し，それにより地球上の炭素・エネルギー循環に重要な役割を担っている．我々は，嫌気有機物分解の中心中間代謝産物である酢酸が，嫌気土壌においてメタン生成菌に利用されるだけでなく，結晶性酸化鉄の存在依存的に新規な鉄還元菌に取り込まれることを明らかにした 1)．これまでに難利用性と考えられてきた結晶性酸化鉄の微
生物還元を示した初めての事例である．結晶性酸化鉄の還元はメタン生成と並行して僅かに起こるマイナーな反応であるものの，地球上における嫌気土壌圏の広がりと鉄の膨大な存在量を考えると，その総和は極めて大きいことが予想される．そこで，鉄還元菌の実体を探るべく，様々な自然環境試料（水田土壌，
森林土壌，湿地土壌，用水路底泥，海底コア堆積物）を微生物接種源に用い，結晶性酸化鉄（Goethite, Lepidocrocite, Hematite, Magnetite）と酢酸を基質として長期培養を行った 2)．16S rRNA 遺伝子を標的とした次世代シークエンスにより培養系の構成種を綿密に解析した結果，Deltaproteobacteria 綱細菌群が優占化するものの多種多様な微生物の集積が観察され，分類群ごとに鉄利用性が異なる
ことが示された．加えて，電子受容体を溶解性 Fe(III)に置き換える二段目培養に供することで，Geobacter 属細菌 5 種，Pelobacter 属細菌 1 種の新規な鉄還元菌の分離培養に成功し，そのうち 1 種は既知の鉄還元菌に比べて高い結晶性酸化鉄の還元活性を示した．これにより，結晶性酸化鉄の還元を担う多種多様な微生物が自然環境中で普遍的に存在していることが見出され，それぞれユニー
クな代謝様式を有していることが強く示唆された．さらに，鉄鉱物が豊富な海底地下圏における鉄還元菌を探索すべく，国際深海掘削計画（IODP）第 337 次
研究航海「下北八戸沖石炭層生命圏探査」に参加した．海底下約 2.5km までの地球深部で有機物が微生物群により分解され，さらにメタン生成が最終電子受容プロセスである証拠が複数示されているが 3)，ある特定の深度において生物
学的鉄還元が起こっているという地球化学的データが近年報告された 4)．我々
は，深度の異なる 15 の海底コア堆積物試料を微生物接種源に用い，結晶性酸化鉄と酢酸を基質とした長期集積培養過程を次世代シークエンスにより網羅的に明らかにするとともに，上述の二段培養法を用いることで鉄還元が見込まれる
深度付近から Firmicutes 門に属する 2 種の鉄還元菌の分離培養に成功した．これらの事は，海底下深部の炭素循環に鉄還元菌が密接に関与していることを強く示唆するものである．現在，鉄還元のより直接的な証拠を得るため，海底コ
ア堆積物自体に 13C-酢酸と結晶性酸化鉄を投入し，内在する微生物群による 13C
取り込みの高感度検出を試みている．一方で我々は，酢酸に加え，メタンを電子供与体とした培養系を構築しており，その中で ANME-2d や Nitrospirae 門に属する新規微生物群の高度集積化を確認している．結晶性酸化鉄の還元と地球炭素循環の関わりは，まだほんの一端しか分かっていないが，未知微生物の分離培養や機能解明，地球化学との融合を通して，その全貌が明らかにされていくと考えられる．
1) Hori et al., ISME J, 4:267-278, 20102) Hori et al., Front Microbiol, 6:386, 2015
3) Inagaki et al., Science, 349:420-424, 20154) Phillips et al., Geochem Geophy Geosy, 18:2076-2098, 2017

Microbial reduction of crystalline iron(III) oxides and its impact on global
carbon cycle○Tomoyuki Hori
(AIST)

Key words
sequencing

Fe(III) reduction, deep biosphere, isolation, high-throughput

リン最前線－Ｐイノベーションとリン循環産業ビジョン－○大竹 久夫 1, 常田 聡 2（1早大・総合研究機構, 2早大・先進理工）
hohtake@bio.eng.osaka-u.ac.jp

人体を構成する 6 つの多量元素(重量比率 1％以上)の中で，リンだけが日本に資源がない．健康な人は一日に約 1 グラムのリンを必要とするから，約 1.27 億人の日本人が生きるには毎年約 4.6 万トンものリンを必要とする．「リンのない」
日本は，国民の生命を維持するためだけでも，毎年少なくとも約 4.6 万トンのリンを海外から輸入し続けなければならない．経済的にみても，海外から持ち込まれるリンがなければ，年間約 80 兆円の飲食料の最終消費が成り立たないば
かりか，300 兆円近いわが国の工業生産にも影響を及ぼす．経済はともかく国民の生命を維持するためだけでも，少なくとも毎年約 4.6 万トンのリンを海外から入手し続けなければならないという事実は，日本にとりリンの確保がいかに根源的で避けて通れない問題であるかを物語る．今日，人間はほとんどのリンを，地下資源のリン鉱石から得ている．自然界でリン鉱石が生成するには何千万年もの長い年月が必要であるから，人間のライフスパンからみれば，リン鉱石は枯渇する天然資源と言わざるをえない．地球が 46 億年という悠久の時間をかけて育んできたリン鉱石を，いま人間はたった 450 年(残り 270 年)ほどで使い尽くそうとしている．かって世界最大のリン鉱石輸出国であった米国は1995 年より輸入国に転落し，中国のリン鉱石輸出力もすでに最盛期の約 1/20まで低下している．さらに厄介なことには，世界の約 75％の埋蔵量を誇るモ
ロッコのリン鉱石が，カドミウムやウランなどの有害物質を多く含んでいることがある．日本同様に「リンのない」欧州は，有害物質を多く含むモロッコのリン鉱石への輸入依存から抜け出すため，欧州内で二次リン資源(リン含有廃棄物や副産物)のリサイクルを促進する EU 肥料法の大改正を行っている．リンはまた多くの製造業分野で使われており，「産業の栄養素」とも呼ぶべき重要な役割をになっている．高純度のリン素材は，半導体，液晶パネル，高機能性レン
ズ，自動車，二次電池，医薬品，食品(ハム，チーズ，サラダ油，ポテトチップ
スなど)や難燃性プラスチックスなどの広範な製造分野で使われている．リンほど工業用素材としての重要性が理解されてこなかった元素は珍しい．
「リン＝肥料」といった短絡的な見方は改めなければならない．高純度リン素材は，リン元素の単体である黄リンから製造される．黄リンは自然界には存在せず，リン鉱石を高温(1,400 度 C)の電気炉内で炭素熱還元して製造される．1 トンの黄リンの生産には約 14,000 kWh もの電力が必要となるため，世界で約 80 万トンの黄リンを生産するだけで年間約 112 億 kWh (電気自動車約 650 万台分)の電力を消費している．加えて，リン鉱石に含まれる天然放射性物質による環境汚染の問題もあり，世界の黄リン生産はいま存続の危機にある．日本の黄リン生産はすでに第二次オイルショックの時代に終焉し，現在年間約 2 万トンの黄リンのすべてを海外から輸入している．黄リンの世界の需給バランスが崩れる可能性
は，リン鉱石よりも遥かに高い．
「リンのない」日本は世界屈指(第 7 位)のリン消費大国であり，年間約 52 万トンものリンが持ち込まれている．この内，食飼料や鉄鉱石などに含まれて国内に持ち込まれるリンが約 29 万トン，肥料を含む
リン製品として輸入されるリンが約 23 万トンある．日本国内で発生する二次リン資源には，製鋼スラグ，食品廃棄物，畜産廃棄物や下水汚泥などがある．家
畜ふん尿がほぼ全量農業に利用されていると信じれば，国内におけるリンリサ
イクル率は約 23％になる．リンを全面的に海外からの輸入に頼ってきた日本には，持続可能なリンのバリューチェーンは存在しない．日本がリンの過度な輸入依存から脱却するには，(1)国内の二次リン資源から効率よくリンを回収し，(2)回収リンから省電力で黄リンを製造して，(3)黄リンを出発原料に高機能性リン化合物を製造できる技術イノベーション(P イノベーションと呼ぶ)が必要である．P イノベーションは，二次リン資源からのリン回収事業に経済的なインセ
ンティブを与え，わが国におけるリン循環産業の振興に貢献することが期待される．深刻なリン資源問題が突如発生した時に，いまの日本ではなすすべがな
いことは，2008 年のリンショック(供給不足による争奪戦の激化)の経験から明らかである．欧州ではリンショック以降，持続的なリン利用の実現が重要な政策課題の一つとなり，リン鉱石と黄リンが EU の戦略物資に指定され，多様な利害関係者による分野を越えた総合的な取組みが行われている．しかし日本では，リンショックの教訓はほとんど活かされておらず，未だにリン問題を俯瞰して総合的に政策を立案している国の部署もなければ，リンの科学と技術について専門的に研究している公的な機関もない．リン問題については，リンに関するあらゆる情報を収集し「知のイノベーション」の先頭に立つことのできる専門機関が必要である．早稲田大学リンアトラス研究所は，リンに関するわが国唯一のシンクタンクとして，この「知の空白」を埋める作業に取組んでいる．

The cutting edge of P management－P innovation and circular industry
vision○Hisao Ohtake1, Satoshi Tsuneda2(1Comp. Res. Org., Waseda Univ., 2Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

phosphate, innovation, circular industry

248

S3Gc01 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

S3Gc02Analysis of carbohydrate-protein interaction

進化工学からみた材料結合性ペプチド・タンパク質の雰
囲気○梅津 光央（東北大院・工）mitsuo@tohoku.ac.jp○Jeong Hyun Seo(Sch. Chem. Eng., Yeungnam Univ., Republic of Korea)
jhseo78@yu.ac.kr

Understanding of the molecular relationships in carbohydrate-protein interaction isable to provide useful information about biological processes in living organisms andalso helpful for development of potent biomedical agents. Herein, we developed facileand rapid carbohydrate modification methods to immobilize various carbohydrate
types on substrates, in which carbohydrates were coupled with amine(NH2-) or
thiol(SH-) group and modified carbohydrates were immobilized directly and asoriented formation on glass or gold surface, respectively. The interaction for Vibrio
cholera toxin protein-GM1 pentasaccharide was investigated through various nano-bio
analytical tools, such as atomic force microscopy (AFM), electrochemical (EC)detection system, surface plasmon resonance (SPR), and carbohydrate microarray. We
evaluated and compared the interactions of toxin proteins with GM1 and its analogues(asialo GM1, GM3, Lsta, Lstb, and lactose). We had different information from eachtool, briefly, effects of structural and binding position differences from AFM unbinding
force, sensitivity from EC potential shift, and relative kinetics from SPR evaluation. In
addition, we investigated role of ctxA toxin subunit and concluded that complexationof ctxAB (whole toxin) enhanced binding affinity and specificity. Collectively, in thesestudies, we measured the interaction unbinding force, electrochemical signal, andkinetic constants, and these evaluations made it possible to obtain contribution of eachsugar moiety and broaden the interactive mechanism during the interaction.

20 種類のアミノ酸で表現されるタンパク質は，酵素や抗体に代表されるように他の分子では難しい高い分子特異性と親和性をもつ分子認識機能を設計できる分子である．そして，現在では，自然界で行われてきた「圧倒的な規模の核酸群から，環境外圧によって特定の核酸情報群が選択される」という進化を試験管の中で模倣した進化工学的操作を用いて，有機分子やタンパク質などの「分子」を標的対象とせず，プラスチックスの分子集合体や無機材料表面などの非分子系材料をも分子認識対象としたペプチドや抗体分子が取得され始めている．
無機材料に結合するバイオ分子として，2000 年に材料表面に結合するペプチドが報告がされている．こういうペプチドはおおむねアミノ酸 10 残基くらいの長さで機能をうみだすことができる．我々も様々な無機材料表面に親和性をもつペプチドを取得してきたが，興味深いことに無機材料表面と同じような等電点をもつペプチドが取得されることが多い．単純に考えると，標的材料と反対の電荷をもつ方が結合に優位なように思われるが，そうなるのはまれであった．
また，ペリレンのような芳香族系の平面構造をもち水に溶けにくい有機分子が水中で形成する分子結晶粒子の表面に結合するペプチドにつも取得しているが，意外にも疎水的なペプチドではなく水に可溶な特性をもっていた．計算化学的な手法とアラニンスキャン法で結合に関与する相互作用を解析したところ，このペプチドは，σ-π 相互作用のような静電的相互作用をもちいて結合していることが示唆され，分子特異性を出すためには，静電的相互作用を用いる必要があるのではないかと推察している．
ペプチドは様々な利点はあるが，低分子であるがゆえ結合する力を強くすることが困難な時がある．また，いろいろな材料の表面の違いをどこまで認識できるかという可能性もある．そこで，我々は，ペプチドと比較し，標的を認識す
る表面積が大きい抗体を使って無機材料表面を認識して結合できる分子を創出することを行ってきた．抗体をつくるに際しては，ラクダ由来の抗体分子から抗原を認識するドメインだけを使っている．ラクダ抗体はヒト抗体と違い単量体で認識機能をもつ．ラクダ抗体では CDR1～3 の 3 つのループ構造が，抗原をキャッチするために使われるアミノ酸配列の部分であるが，この 1 つの部分
（CDR1）を材料に結合するペプチドの配列に変える．そうすると，ペプチドと同じレベルの結合力をもつ抗体をつくることができる．その後に，結合に使われている他の部分（CDR3）のアミノ酸配列をランダム化して，その中で材料により強く結合するものをとってくると，2 つの指で材料に結合することになるので，より強く結合することができる．そのような方法を提案し，実際にこれを使っていろいろ材料に結合する抗体をつくってきた．
興味深いことに，CDR3 をランダム化して標的材料へ親和性をもつ配列を取得するのではなく，CDR1 に移植した配列を CDR3 に移植した場合は，CDR3 へ移植前の抗体から親和性はまったく向上しなかった．これは，移植したペプチド配列が原子組成を認識しているのではなく，何かしらの表面構造を認識し，その構造は表面に均一に存在しているのではないことを示す．また，CDR3 のランダムライブラリーから選択されてくる配列をみると，材料によってヒスチジンが多く選択されてくる系とアルギニンが選択されてくる系が存在することも分かった．この系に分かれる理由は不明であるが，無機材料に対する表面構造に関して何かしら新しい知見を与える可能性があると考えている．
こういった抗体の結合メカニズムについては，熱力学的な解析も行っている．
いろいろな温度で解離平衡定数を測定することによって自由エネルギー変化を評価した結果，基本的にはエンタルピーの寄与で結合していることがわかった．
エンタルピー寄与とは何かというと，静電的な相互作用で，エントロピーは疎水的な相互作用の寄与といわれている．したがって，エンタルピーの寄与であるということは，水素結合やイオン結合，配位結合のような積極的な静電的な結合で表面を認識していることがわかる．この抗体は疎水的相互作用のような非特異的に吸着するのではなく，積極的に材料表面に存在している OH 基や酸化亜鉛などを認識して結合しているのではないかと考えている．

Analysis of carbohydrate-protein interaction

What property of material surface artificial material-binding peptide/protein emerges○Jeong Hyun Seo(Sch. Chem. Eng., Yeungnam Univ., Republic of Korea)

Key words
carbohydrate-protein interaction, atomic force microscopy,
electrochemical detection, Vibrio cholera toxin○Mitsuo Umetsu(Grad. Sch. Eng., Tohoku Univ.)

Key words

antibody, molecular evolution, peptide

249

S3Gc03

水中強接着性細菌タンパク質 AtaA の非特異的相互作用の謎に迫る

S3Gc04○堀 克敏（名大院・工）khori@chembio.nagoya-u.ac.jp

動物細胞であれ微生物細胞であれ，細胞接着は，生理活性，増殖，分化，感染，情報伝達など様々な細胞機能を決定づける重要なプロセスである．いずれの場
合も，細胞表層に存在する分子，特にタンパク質が接着の役割を担っている．
細胞接着の典型的な相手として，同種・異種の細胞（細胞間接着），ECM，人
工材料表面が考えられる．
細胞間接着の例として，動物細胞のカドヘリンは同じ分子同士で結合し細胞集合体を形成する．大腸菌やサルモネラ菌のピリ先端に存在するレクチンサブユ
ニットは細胞表層の糖鎖に結合し，宿主への感染を媒介する．ECM への接着に関しては，動物細胞のインテグリンがフィブロネクチンの RDG 配列を特異的に認識して結合する例が有名である．近年，認識機構は様々であるが，感染のためにフィブロネクチンをターゲットとする沢山のタンパク質（FnBPs）が様々なバクテリアから見つかってきている．人工材料表面に対しては，動物細胞の接着分子は，血栓など厄介な非特異的吸着を引き起こすこともあるが，一般に吸着力は弱く，足場依存性細胞の培養では，通常，培養器表面を ECM でコー
ティングすることが行われる．しかし，微生物細胞に目を転じると，Candida
albicans の Als や Enterobacteriaceae の Curli，多くの病原菌のピリやべん毛が比較的強く材料表面に接着し，その後のバイオフィルム形成に働く．
このように，細胞はその表層に様々な接着性タンパク質を有するが，接着メカ
ニズムは多様であり，特異性も厳密なものから，非常に幅広くて非特異的吸着に近いものまで存在する．タンパク質の接着機構の解明は，これを制御して再生医療や感染制御に応用するためにも，細胞生物学の重要課題である．しかし，「鍵と鍵穴」に例えられる生体分子同士の特異的相互作用と比べると，人工材料
表面に対するタンパク質の非特異接着機構に関しては不明なところが多い．非特異的ながら強固に接着する場合もあり，次のようなメカニズムが提唱されてきた．①多点吸着による弱い相互作用の積算，②各ドメインが異なる対象に特異的に結合，③やわらかい分子構造で様々な表面にフィットする．
グラム陰性病原性細菌が感染に使う三量体型オートトランスポーターアドヘシン（TAA）は，細胞間接着，ECM への結合，人工材料表面への結合の全てを一つのタンパク質で担う興味深い接着タンパク質である．ECM への接着に関して
は，インテグリンと異なり配列認識ではなく，構造上の特徴を認識しており，
タンパク質とリガンドとの通常の相互作用の概念とは異なる．また，カドヘリンのように同種タンパク質同士の分子間結合による細胞自己凝集も引き起こす
一方で，人工材料表面にも非特異的に接着しバイオフィルム形成に働くとの報告もある．TAA はホモ三量体を形成し，細胞表層に提示される N 末端側パッセ
ンジャードメインと，その分泌と膜アンカリングに必要な C 末端膜貫通ドメインから成り，接着機能はパッセンジャードメインが担う．
我々は以前に，疎水性のプラスチックやポリウレタン，親水性のガラス，さらには金属など様々な非生物表面に対し高い接着性を有する Acinetobacter 属細菌
の TAA を発見し，AtaA と名付けた．AtaA は，3630 アミノ酸からなるポリペ
プチド鎖で構成される TAA の中でも大きいタンパク質である．本発表では，まず，AtaA が一般にタンパク質が吸着しにくい材料表面にも接着するなど，他のTAA とは異なる接着性を示す興味深いタンパク質であることを示す．そしてそのユニークな接着機構の解明のため，AtaA の接着部位を特定し，その結晶構造を決定した．AtaA のパッセンジャードメインは多種類のドメインの反復構造から成り，これらの多数のドメインを介する多点吸着が，AtaA の様々な表面に対する強い接着性をもたらすと推測された．しかし，本研究により，AtaA のユ
ニークな接着性は N 末の head domain 上に存在するループ領域のみが担うこと，
このループがファイバーの軸にしっかりと固定された硬い構造であることがわ
かった．したがって，その接着様式は，上述したタンパク質の非特異接着様式
では説明できない新たな接着機構に基づくものである．

Approaching the puzzle of nonspecific interaction of strongly adhesivebacterial protein AtaA in water○Katsutoshi Hori
(Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)

Key words

Acinetobacter , adhesion, protein, autotransporter

タンパク質の天然変性領域が関与する材料との相互作用○黒田 章夫, 池田 丈
（広島大院・先端物質）
akuroda@hiroshima-u.ac.jp

半導体デバイスをバイオセンサーとして利用するためには標的物質を特異的に認識して捕捉する生体分子（レセプター）を表面上に固定化する必要がある．
半導体デバイスの表面は，絶縁膜として熱酸化による酸化膜(SiO2 膜)の形成や，CVD (chemical vapor deposition)法による窒化膜(Si3N4 膜)の形成が行われている．
我々は，天然のタンパク質より，シリコン表面の酸化膜やシリカに強固（解離定数は 10-10M 程度）に結合するタンパク質を選抜し，「Si-tag」と命名した．タンパク質の同定を行ったところ，細菌由来のリボソームタンパク質 L2 であることが判明した 1)．
273 残基の L2 のうち N 末端 60 残基と C 末端 71 残基が特にシリカとの結合に関わっていた 1)．ちょうどこれらの N 末端，C 末端領域を除いた中央ドメインの結晶構造は決定されているものの，全長の L2 は結晶化できなかったという
過去の報告から，これらの領域は特定の立体構造をとらないと予想された．ア
ミノ酸配列を詳細に解析したところ，予想通りこれらの領域は溶液中で特定の立体構造をとらない「天然変性（あるいは不定形）」と呼ばれる領域であることが判明した 2)．事実，タンパク質変性剤（8 M 尿素）存在下においても Si-tagとシリカの結合は阻害されないことから，ポリペプチド鎖がほどけた状態で存在していることこそが結合に重要であることが示された．
Si-tag がシリコン酸化膜やシリカに強く結合する理由：一般的な球状タンパク
質は，固体表面に吸着後，固体表面との相互作用によって立体構造が一部崩壊（変性）する．この変性過程で固体表面との相互作用が強まり，より強固な結合状態に移行することが知られている．もともと熱で変性させたタンパク質が固体表面上に付着しやすいことが知られている．Si-tag の N 末端，C 末端領域は最初から変性したような「柔らかい」状態であるため，吸着の際に表面の形状に合わせて自身の形状を柔軟に変形することで，相互作用が最適化され速やかに強固な結合状態に遷移するのではないかと予想できる．さらにこの変性領域
は，正に帯電するアルギニン・リジン残基が特に集中しているため，シリカ表面のシラノール基と多点で結合していることがシミュレーションで示された 3)．
実際，結合時の Si-tag の構造はシリカの表面状態によって異なる形状を示したことから，固体表面に合わせて自身の形状を変化させることで相互作用を強めているというモデルが支持された．一方で，Si-tag の結合強度は強いものの結合選択性は低く，シリカの他にも窒化ケイ素（Si3N4）や多くの金属酸化物（シリカと同様に溶液中では表面に―OH 基が存在する）にも強く結合することが分かっている．これについても Si-tag が固体表面に合わせて変形するという性質に起因すると考えられる．Si-tag による固定化技術は，分子内にもともと持つとても柔らかい領域（変性領域）を起点として配向性よく固定化する技術と言える．
この Si-tag を遺伝子レベルで付加することで，任意のタンパク質をシリコンデバイス上に固定できる．また，ProteinA との融合タンパク質を使えば，抗体を容易に固定化することができる．Si-tag を利用したタンパク質固定化法は，固体表面の化学的前処理を必要とせず，迅速・簡便かつ安定なタンパク質固定化を実現できた．Si-tag を使った半導体センサーが開発されている 4)．
1) Taniguchi, K. et al.: The Si-tag for immobilizing proteins on a silica surface,
Biotechnol. Bioeng., 96, 1023-1029 (2007)
2) Ikeda, T. and Kuroda, A.: Why does the silica-binding protein Si-tag bind strongly
to silica surfaces?, Colloids Surf. B: Biointerfaces, 86, 359-363 (2011)
3) Tosaka, R. et al.: Adsorption mechanism of ribosomal protein L2 onto a silica
surface: a molecular dynamics simulation study, Langmuir, 26, 9950-9955 (2010)
4) Taniguchi T. et al.: Detection of antibody-antigen reaction by silicon nitride slot-ringbiosensors using protein G, Opt. Commun. 365, 16-23 (2016)

The interaction of disordered proteins to material surfaces○Akio Kuroda, Takeshi Ikeda(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)

Key words

disordered protein, immobilization, biosensor, silicon

250

S3Gc05

フラグメント分子軌道(FMO)法のナノバイオ系への応用
事例

S3Gc06材料のナノ構造が誘起するタンパク質吸着および細胞接着○望月 祐志 1,2, 加藤 幸一郎 3, 福澤 薫 2,4（1立教大・理, 2東大・生産研, 3みずほ情報総研, 4星薬科大・薬）
fullmoon@rikkyo.ac.jp○高井 まどか 1, 平口 侑香里 1, 荒木 保幸 2, 和田 健彦 2
（1東大院・工, 2東北大・多元研）
Y. Hiraguchi, K. Kushiro, M. Takai, Acta Biomaterial, 10,2988-95(2014).

【序】 フラグメント分子軌道(FMO)法[1-3]は，タンパク質などの巨大分子系を適当なフラグメント単位に分割し，環境静電ポテンシャル印加の下で並列処理を駆使して電子状態計算を実用的に行える手法です．FMO 計算からはフラグメ
ント間相互作用エネルギー(IFIE)などの解析に有用な情報が得られるので，タン
パク質とリガンドの複合系などを対象に創薬や生物物理のバイオ系の分野で使
われてきました．しかし，ナノバイオ系でも FMO 法が利用されつつあります[2,3]．私たちのグループでは独自の FMO プログラム ABINIT-MP を開発し，先導的な応用計算を多数行ってきました[3]．今回の講演では，ABINIT-MP による
FMO 計算の概要と IFIE の有用性をお示しした後，固体表面と人造ペプチドを組み合わせたナノバイオ系への適用事例として，シリカ表面[4]と RKLPDA，ヒドロキシアパタイトと ESQES[5]のケースなどをご紹介します．

医療用デバイスの開発において，生体とデバイスを構成する材料との界面に，適合性を付与することが重要な課題となる．我々は，ナノスケールで精密に制御したナノ構造を材料表面に構築し，ナノ構造がタンパク質吸着，さらに細胞接着との相関を研究している．しかし，ナノ/マイクロ構造がタンパク質吸着にどのように影響を与えているか，巨視的な解析しか行われておらず，タンパク質のサイズに合わせたナノスケールでの解析が必要である．ここでは，ポリマー
ブラシをナノ構造界面として創製し，そのナノ構造がタンパク質吸着，細胞接着に及ぼす効果について，また，ナノ構造体がタンパク質吸着，引き続き起こる細胞接着にどのように影響を与えるか検討を行った結果について紹介する．
1. ポリマーブラシへのタンパク質吸着 1)
材料界面へのタンパク質吸着は，濡れ性，表面電位，ミクロな表面構造など様々な表面の性質により影響を受けることが知られている．しかしこれらの要因が，それぞれタンパク質吸着とどのような関連をもっているかについて明確な議論はされていない．これは，タンパク質とマテリアル表面との間には疎水性相互作用や静電的相互作用，水素結合などの様々な相互作用がはたらくため，非常に複雑となり理解が困難であることによる．しかし，これらマテリアルとタン
パク質との相互作用は水を媒体としてはたらくため，界面に存在する水分子が非常に重要な役割を果たしていると考えられる．そこで，まず化学的性質の異なるポリマーブラシを作製し，界面水分子の構造の評価およびタンパク質吸着量の評価を行うことで，タンパク質吸着メカニズムを解明することを，和周波発生(SFG)分光法と水晶振動子マイクロバランス(QCM-D)を用いて行った．SFG
分光法により双性イオン性ポリマーブラシは強い水素結合を形成することわかり，タンパク質吸着量の実験結果をあわせて考察すると，この強い水素結合ネッ
トワークをもつ界面水分子が存在することでタンパク質吸着を抑制することが示唆された．
2. ナノ相分離構造体表面へのタンパク質吸着・細胞接着 2,3)
これまでに Spatz らは，Au ナノ粒子上に固定化した RGD ペプチドの距離により細胞の接着性が異なるという報告をしており，ナノスケールでのタンパク質の吸着分布状態は細胞接着に影響を与えることを示唆している．しかし，ナノスケールでタンパク質の吸着を精密に制御することや吸着したタンパク質の構造解析が困難であるため，細胞接着との関係が未だに明らかにさていない．本
研究では，親水性部位に poly(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) (MPC)，
疎 水 性 部 位 に poly(3-(methacryloyloxy)propyltris(trimethylsilyloxy)silane)(PMPTSSi)をほぼ等しい組成比(PMPC/PMPTSSi = 7/3)で有する両親媒性ブロッ
ク コ ポ リ マ ー poly(MPTSSi-block-MPC) と poly(MPTSSi-block-MPC-blockMPTSSi)をそれぞれ可逆的付加開裂連鎖移動重合によって合成し，海島構造を有する相分離構造表面を作製し，この表面上でのタンパク質吸着と細胞接着挙動について検討を行った．海島のドットサイズを変えるため，鎖長の異なるpoly(MPTSSi-block-MPC-block-MPTSSi)を 4 種類作製した．以下 poly(MPTSSiblock-MPC)を BP1，poly(MPTSSi-block-MPC-block-MPTSSi)の鎖長の短いポリ
マーから順に BP2， BP3， BP4， BP5 と表す．
ドット状の直径が， BP1 から BP5 で，23nm, 10nm, 19nm, 27nm, 52nm と鎖長が長くなると，大きくなることが確かめられた．BP1 と BP4 では親疎水領域が反転した相反転構造が形成されていることが TEM から確かめられた．この両者のパターンが異なる表面でのタンパク質の吸着状態と細胞接着の解析を，RGD
モチーフの露出量を QCM により測定したフィブロネクチン吸着量で割ること
により，一分子当たりの構造変化度を算出した．BP1， BP4 に比べ PMPTSSi のホモポリマー表面では構造変化が小さい傾向にあり，ナノ相分離構造によってフィブロネクチンの構造変化がより誘起されたことがわかった．現在，フィブ
ロネクチンの構造，特に細胞接着因子となる RGD ペプチド露出量と，吸着タ
ンパク質の変性状態を，円偏光二色性スペクトル等を用いて解析を行っている．
一方細胞に関しては，L929 マウス線維芽細胞 (3.0 × 104 cells/mL)を無血清培地
で播種し，播種後 1， 2， 3 h の接着形態を観察した．播種 1~2 時間後から BP1
では異方性な伸展が見られたが，BP4 では等方的に接着していた．BP4 では十分に RGD ペプチドが露出しているため，細胞のインテグリンとの結合により細胞接着が誘起された．しかし，ナノ相分離構造によりインテグリンの凝集が阻害され，強い焦点接着の形成ができなかったと考えられる．ナノ相分離構造
上では，一様に均質な表面とは異なる細胞接着挙動が観察されたが，これはタンパク質の吸着状態に起因していると考察している．

【FMO プログラム ABINIT-MP の特徴】 FMO 計算のためのプログラムとしては，GAMESS-US[2]や PAICS[6]と共に ABINIT-MP[3]が使われています．ABINITMP は，MPI 並列と OpenMP/MPI 混成並列により，PC クラスターから「京」のようなスパコン/HPCI 資源にまで広く対応しています．実用的には，クラスター型のサーバでも数十コアあれば，標準的な 2 体フラグメント展開で 2 次摂動論レベルの FMO2-MP2 の FMO 計算が数百残基のタンパク質に対してもルーチン的に行えます．
現在，ABINIT-MP の研究開発・整備は文科省ポスト「京」プロジェクト-重点
課題 6 の中で続けられています(取り纏め役は望月)[7]．ライブラリとしては「京」などに納品している他，個別にバイナリ形態での提供も行っています．特に，「京」の産業利用枠を利用した「FMO 創薬コンソーシアム」(リーダーは福澤)[8]の活動では，ABINIT-MP を用いて創薬ターゲットとなるタンパク質とリガンドの膨大な IFIE データが蓄積されつつあり，昨今のビッグデータ・AI ベースの創薬の文脈からも注目を集めています．
【シリカと RKLPDA の FMO4 計算】 ABINIT-MP[3]ではフラグメント展開を 4体まで含めた FMO4 計算が行えるため，（有バンドギャップの）固体を含めた，
表面/生体関係分子から成るナノバイオ系をモデル化することが出来ます．初めての適用事例としたのは，RKLPDA ペプチド[9]のシリカ表面への特異的吸着です[4]．実験的[9]には，荷電した R と D が表面側と静電的に相互作用することが鍵とされていましたが，詳細は不明のままでした．私達は，シリカ側を 257
個の Si 原子を含むクラスターで構成し，85 個のフラグメントに分割しました．
また，ペプチド側を主鎖と側鎖に分けて 11 個のフラグメントとし，吸着サイト
周囲の水分子も含めて FMO4-MP2 計算を行いました(単一構造での解析)．その結果，R と D と表面側との静電相互作用が重要であることが確認されましたが，相互作用によって誘起されたシリカ側の分極，さらにシリカ-ペプチド-水の間での電荷移動も無視し得ない寄与を持つことが示されました．
【ヒドロキシアパタイトと EQSES の FMO4 計算】 次に，骨や歯の成分としても重要なヒドロキシアパタイトと ESQES ペプチド[10]について FMO4 解析を行いました[5]．その際，水中でのペプチド構造のゆらぎを考慮するため 30 個のサンプルを用いました(分子動力学シミュレーションで生成)．また，結晶側は4x4x2 の超格子とし，総原子数は 1408 個に達しました．FMO4 計算の結果，末端の S が吸着に対して最も重要な役割を担い，最近接のリン酸ユニットからOH 部への電荷移動が効いていることが分かりました．また，2 個の E はカル
シウムイオンとの静電相互作用によって安定化に寄与していることも見てとれました．シリカの場合と同様ですが，電荷移動と随伴する分極の効果を取り込める点は，量子計算手法である FMO 法の強みと言えます．現在，アパタイト
同様にイオン性の高い結晶であるカルサイトの吸着系についても同様の FMO
解析を進めており，講演では結果をお見せ出来るはずです．
【謝辞】 ABINIT-MP プログラムの研究開発と応用計算は，東京大学の生産技術研究所における複数の文科省プロジェクト(リーダー：加藤千幸先生)，JSTCREST プロジェクト(リーダー：田中成典先生/神戸大学)などのご支援の下で長年行われ，現在では東京大学工学部を拠点とするポスト「京」プロジェクト重点課題 6(リーダー：吉村忍先生)で推進されています．カルサイトの応用計算は科研費(16H04635：望月)の関係で実施しています．
【文献】 [1] "The Fragment Molecular Orbital Method: Practical Applications to Large
Molecular Systems", (2009, CRC). [2] D. G. Fedorov et al., Phys. Chem. Chem. Phys.
14 (2012) 7562. [3] S. Tanaka et al., Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (2014) 10310. [4] Y.
Okiyama et al., Chem. Phys. Lett. 566 (2013) 25. [5] K. Kato et al., Chem. Phys. Lett.
629 (2015) 58. [6] T. Ishikawa et al., J. Comp. Chem. 30 (2009) 2594. [7] http://
www.cenav.org/abinit-mp-open_ver-1-rev-10/ [8] http://eniac.scitec.kobe-u.ac.jp/
fmodd/ [9] K. Sano et al., J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 14234. [10] G. He et al.,Nature Mat. 2 (2003) 552.

Applications of fragment molecular orbital (FMO) method to nano-bio
systems○Yuji Mochizuki1,2, Koichiro Kato3, Kaori Fukuzawa2,4(1Faculty of Science, Rikkyo Univ., 2IIS, Univ. of Tokyo, 3MHIR, 4Faculuty of
Pharm. Sci., Hoshi Univ.)

Key words
systemFragment molecular orbital, FMO, Interaction analysis, Nano-bio

1)D. Nagasawa, T. Azuma, H. Noguchi, K. Uosaki, M. Takai, J. Phys. Chem. C, 119,
17193(2015)
2)

Protein adsorption and cell Adhesion induced by nanostructure of polymeric
Materials○Madoka Takai1, Yukari Hiraguchi1, Yasuyuki Araki2, Takehiko Wada2(1Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo, 2IMRAM, Tohoku Univ.)

Key words
3)

Y. Hiraguchi, K. Kushiro, M. Takai, Polymer, 99, 166-172(2016).

251

S3Hc01 〈招待講演（韓国生物工学会）〉

S3Hc02

Nanometer scale biological particle separation with flow
controls and electrical field controls

耐熱性を保ったまま好熱菌酵素の触媒特性を常温菌型に変える○赤沼 哲史（早大・人科）akanuma@waseda.jp○Jong Wook Hong
(1Grad. Sch. Dept. Bionano Technol., Hanyang Univ., Korea, 2Grad.
Sch. Dept. Bionano Eng., Hanyang Univ., Korea)
jwh@hanyang.ac.kr
1,2

Nanometer scale particles especially for biological particles are getting great attention
because of their importance in personalized medicine and future medicine as well as
bioprocess applications. In this lecture, in addition to separation of nanometer scale
biological particles with pneumatically driven flow in microsystems, electrical control
and separation of nanometer scale particles with ion concentration polarization or ICP
will be introduced. ICP is a phenomenon that uses an electric field and a cation channel
to separate ions inside the electrolyte and forms an ion depletion region that pushes
particles having a surface charge by an electrical force due to the separated ions. In thisdepletion region, only solvent passes through and the particles having a surface charge
can not pass through by the electric force. Since the particles are stopped at theequilibrium state of the solvent movement by the electric force and the electricosmosis, the position where the particles are stopped is determined by the amount ofcharge on the surface and the size of the particles. Using this ion concentration
polarization, we separated nanoscale polymer particles and liposomes for the first time.
It is expected that ICP can be applied to separate exosomes with different sizes insimilar contents and removal of impurities in solutions

好熱菌酵素は優れた耐熱性を持ち，高温で高い触媒活性を示すが，常温では著しく活性が低下する．我々は，進化分子工学手法により多くの好熱菌由来イソ
プロピルリンゴ酸脱水素酵素（以下 IPMDH）の低温高活性化変異体を獲得した．しかし，どの変異体の 25℃の比活性も，常温生物が持つ IPMDH と比べるとまだまだ小さかった．複数のアミノ酸置換を導入した多重アミノ酸置換体も作製したが，低温活性の更なる改善は見られなかった．一方で，私たちは古代生物が有したと思われる遺伝子を復元し，その遺伝子から古代タンパク質を合成，その性質を調べた．その結果，祖先生物は超好熱菌であり，現存の常温生
物，好冷生物は，地球の表面温度の低下に伴い，低い温度に適応した生物へと進化したことを連想させた．したがって，好熱菌酵素に効率的な低温高活性化
は，天然の低温適応進化に倣うべきであると考えた．そこで，好熱菌 IPMDHに常温菌型のアミノ酸をアミノ酸置換によって導入した 29 変異体を作製し，解析したところ，約半分の変異体の 25℃の比活性が向上した．さらに，アミノ酸置換の組み合わせを検討したところ，3 アミノ酸置換によって，25℃の比活性が好熱菌野生型 IPMDH の 14 倍に向上した変異体が得られた．反応速度論解析
および熱力学解析から，変異体は常温菌 IPMDH と類似した触媒特性を示した．
一方，変異体の変性温度は好熱菌野生型酵素からわずかに 2℃低下しただけであった．したがって，この変異体では天然酵素に見られる低温活性と耐熱性のトレードオフを伴うことなく，低温高活性化が達成されたことが明らかとなった．さらに，変異部位の元のアミノ酸と共通祖先アミノ残基を比較したところ，共通祖先配列のアミノ酸と一致する好熱菌酵素のアミノ酸を置換した場合，25℃の比活性が 2 倍以上向上する確率が高かった．本研究で得られた実証デー
タは，今後の好熱菌酵素の低温高活性化のための理論化につながる可能性がある．

Nanometer scale biological particle separation with flow controls andelectrical field controls

Establishment of mesophilic-like catalytic property on a thermophilic
enzyme without loss of thermostability○Jong Wook Hong1,2(1Grad. Sch. Dept. Bionano Technol., Hanyang Univ., Korea, 2Grad. Sch. Dept.
Bionano Eng., Hanyang Univ., Korea)

Key words

nanometer scale particles, esoxomes, ICP, pneumatic○Satoshi Akanuma(Sch. Hum. Sci., Waseda Univ.)

Key words

enzyme activity, thermostable enzyme, mutagenesis

252

S3Hc03

人工知能を用いたタンパク質高機能化○亀田 倫史 1, 齋藤 裕 1, 津田 宏治 2, 梅津 光央 3
（1産総研・人工知能, 2東大院・新領域, 3東北大院・工）kameda-tomoshi@aist.go.jp

我々は，人工知能（機械学習）と分子進化を組み合わせた手法を用いて，蛋白質の高機能化を行っている．最近，この手法を GFP の改変（緑色→黄色発色に変更）に適用した．改変は 4 か所のアミノ酸置換からなり，全変異体は 204=16
万通り存在するが，ランダムに生成した 150 変異体（ライブラリーサイズの約0.09%）の実験結果に基づき，機械学習を行い，78 候補を選出し改めて実験を行ったところ，波長変化，発色強度ともに良好な変異体を得ることに成功した（論文投稿中，論文本文は[1]から取得できる）．本講演では，用いた人工知能の手法について概説した後に，研究内容を紹介する．
参考までに，投稿論文の abstract を引用する．
Molecular evolution based on mutagenesis is widely used in protein engineering.
However, optimal proteins are often difficult to obtain due to a large sequence spacethat requires high costs for screening experiments. Here, we propose a novel approachthat combines molecular evolution with machine learning. In this approach, we
conduct two rounds of mutagenesis where an initial library of protein variants is used
to train a machine-learning model to guide mutagenesis for the second-round library.
This enables to prepare a small library suited for screening experiments with highenrichment of functional proteins. We demonstrated a proof-of-concept of ourapproach by altering the reference green fluorescent protein (GFP) so that its
fluorescence is changed to yellow while improving its fluorescence intensity. Using
155 and 78 variants for the initial and the second-round libraries, respectively, we
successfully obtained a number of proteins showing yellow fluorescence, 12 of which
had better fluorescence performance than the reference yellow fluorescent protein(YFP). These results show the potential of our approach as a powerful platform foraccelerated discovery of functional proteins.
[1]https://www.biorxiv.org/content/early/2018/03/16/282996

improvement of protein by artificial intelligence○Tomoshi Kameda1, Yutaka Saito1, Koji Tsuda2, Mitsuo Umetsu3(1AIRC, AIST, 2Grad. Sch. Frontier Sci., Univ of Tokyo, 3Grad. Sch. Eng., Tohoku
Univ.)

Key words

bioinformatics, protein, machine learing, molecular evolution

S3Hc04バイオ分子の自己集合化に潜む機能○池添 泰弘（日工大・基幹工・応化）
y.ikezoe@nit.ac.jp【緒言】
ウイルスやタンパク質分子のような生体物質が，特定の物質に対する優れた選
択性や特定の機能を有する理由は，これらがアミノ酸のような小さな分子の高精度な集合体から形成されていることにある．したがって，このような分子集合体の構造や機能の解析，形成機構の解明は，新しい原理に基づいたデバイス
や医薬品の開発へつながると期待できる．ここでは，主に 2 種類の生体関連物
質を用いて，1）分子集合体の形成手法と，そこから得られた構造や機能，また，2）分子集合体を破壊することで改めて認識できる集合体の潜在能力，さらに，3）分子集合体形成の機構の理解のための装置開発，について議論し，これまでの分子集合体に関する包括的な研究を紹介する．
【分子集合体の形成手法の開発と構造解析】
金属などの微粒子の配列構造（集合体）は，極微細な電子・光応答素子への応用が期待されるが，10 nm 程度のスケールで微細構造を作るには，電子ビーム
リソグラフィーのような高価な装置を用いて長時間かけて作製する必要があり，多大なコストを必要とする．そこで，低コスト化を実現する方法の一つとして，ナノ粒子の自己集合能力を活用して Si 基板上にナノ構造を作製する手法が挙げられる．我々は，金属ナノ粒子を内包するタンパク質として知られるフェリチ
ン分子を用い，分子集合体を形成するための新手法を開発した．ここでは，Si
基板上に形成したフェリチン水溶液滴の縁に相当する三相接触線上において分子集合体の核が発生し，集合体は結晶のような周期性を保って，液体表面上で三相接触線に対して垂直に成長する．我々の方法の利点は，核が発生する場所を決められることと，集合体の成長方向が決まっていることである．このことが，電子顕微鏡による構造解析の際に，1 分子レベルでの集合体成長過程の解析を可能とし，ドメインの融合や成長機構を明らかにした．また，インジウム
ナノ粒子を内包した分子と内包していない分子を混ぜて集合体を作ると，結晶のような規則構造を保持しながら，両者が乱雑に配置されたような不思議な集合体が形成され，ナノ乱数発生装置となることが見いだされた．[1]【分子集合体の破壊】
金属イオンと，それに配位した有機分子が秩序正しく三次元的につながった結
晶性の多孔性物質である有機金属錯体（Metal Organic Frameworks, MOF）は，その特徴的な構造から，物質の貯蔵や分離，反応，触媒などの様々な分野での応用が期待されている．我々は，MOF と自己集合性の強いペプチドであるジフェニルアラニン(Diphenylalanine, DPA) の複合体を作製し，その複合体が水面で運動する様子を解析したところ，非常にエネルギー変換効率の高い化学モーターとなりうることを見出した．複合体の運動は表面張力の不均衡（マランゴ
ニ効果）によって説明でき，そこに目新しさはない．しかし，複合体が運動している時間が異常に長い．ここでは，DPA 分子がバラバラの状態（エネルギーが高い状態）で MOF 細孔中に存在していたが，水面に放出されて集合体（エネルギーがより低い状態）を形成し，その余剰エネルギーを利用して複合体は運動を持続していることが明らかになった．この能力を利用してマイクロ発電機を作製したところ，小型医療機器にも応用できるレベルの発電能力を有することも明らかになった．さらに，水面で走行中に，水中に固定された PbSe 粉末を発見し，直上の水面で静止する性質（走化性）を与えることにも成功した．
従来，走化性または自律運動のどちらかを示す化学物質の研究は数多く行われているが，今回，我々が開発した系は，相反する二つの性質，すなわち自律運
動と走化性を同時に有するもので，まさに生体の運動を模倣した系となっており，将来的にはドラッグデリバリーシステムへの応用も期待される．[2]【分子集合体の形成メカニズム】
分子集合体は，電子顕微鏡（SEM）や原子間力顕微鏡（AFM）等で観察できる
が，SEM や AFM で水面のナノ構造をリアルタイムで観測することは不可能である．我々は，液体表面からのレーザー散乱光を計測して表面張力を算出でき
る準弾性レーザー散乱法を応用し，水溶液中にあるタンパク質分子が水面に徐々に吸着する過程をリアルタイムで計測できる装置を作製した．その結果，タン
パク質分子の水面への吸着に伴う表面張力の低下を観測できた．また，同じ装置で同時に計測できる表面の粘性については，分子が吸着し始めた直後は一旦上昇し，しばらくすると下降に転ずることがわかった．水面に吸着した分子をTEM グリッドに転写して透過型電子顕微鏡で観察したところ，粘性がピークを迎え後では分子の集合体が観察された．この結果は，レーザー散乱光を追跡するだけで，水面での分子集合体形成への相転移を検知できる可能性を示唆する
非常に興味深い結果であり，現在，メカニズムの詳細を解析中である．
[1] Y. Ikezoe et al., Langmuir (2008 & 2009), J. Nanosci. Nanotech. (2012)[2] Y. Ikezoe et al., Nature Mater. (2012), Adv. Mater. (2015), Nano Lett. (2015)

Underlying Functions behind the Self-assemblies of Biomolecules○Yasuhiro Ikezoe(Dept. Appl. Chem., Nippon Inst. Tech.)

Key words

self-assembly, peptide, MOF, surface

253

S3Hc05クモ糸の階層構造の解明と人工的再構築○沼田 圭司（理研）
Keiji.Numata@riken.jp

S3Hc06

オリゴ DNA の腸管送達系の構築と経口用素材への展開○下里 剛士（信州大・菌類微生物セ）
shimot@shinshu-u.ac.jp

クモなどの一部の生物種が生産するシルクと呼ばれる構造タンパク質は，ベー
タシート構造を周期的に形成することで，特異的な物性を達成することに成功している．このクモ糸に代表される構造タンパク質を，構造材料として利用しようという試みは，古くから行われてきた．しかしながら，その合成手法や加工技術の欠落により，人工的なクモ糸の商業化には成功していない．水系の環境で紡糸されるクモ糸は，自由水と結合水を上手く局在させることで，特異的な物性を達成していると考えられている．一方で，その紡糸機構は未だ明らかになっておらず，シルクを人工的に紡糸する技術が効率的に開発されない要因の一つに挙げられている．我々は，クモの牽引糸の紡糸過程における，シルク
タンパク質の構造変化を高分子科学のアプローチから明らかにすることで，ク
モ糸の紡糸機構を解明することを目指している．
現在，クモの大瓶状腺内のシルク（紡糸前のシルク）の構造は，液晶だという説と高濃度ミセル溶液であるという説が提唱されている．高分子構造の観点から，この論争に結論を出すと共に，シルクの紡糸機構を解明し，構造タンパク質の成型加工に関する新たな技術を確立することは，構造タンパク質の材料設計において非常に重要である．本研究では，ジョロウグモの紡糸機構を，顕微鏡観察を中心とした形態観察，および複屈折測定，X 線散乱を用いた構造解析から，高濃度ミセルを介して紡糸されるという機構は否定された．一方で，液晶状態を経由して紡糸されている可能性が高く，その液晶性を発現する因子はタンパク質ベースのグラニュールであることが示唆された．大瓶状線において形成されたグラニュール構造が，紡糸された牽引糸内部においても主成分として確認された点は特筆すべき発見である．この現象は，グラニュールを基本骨格として紡糸が為されていることを示す，はじめての報告であった．牽引糸において確認されたグラニュール構造が，繊維の機械的物性へ与える影響を評価するために，延伸過程におけるグラニュールの評価を行った．20%延伸した牽
引糸の内部を AFM により観察した結果，グラニュール構造およびミクロフィ
ブリル構造が延伸されることが確認できた．また，局所的に観察された螺旋状のグラニュール構造が延伸されていることも確認された．延伸過程の複屈折測定からも，グラニュールの変形に対応した配向が認められた．以上の結果を総合的に判断すると，構成成分であるグラニュールが繊維の変形過程に寄与していると考えられる．同時に，グラニュールを利用した紡糸過程が，クモ糸の特
殊な機械的特性を実現している可能性が示唆された．グラニュール内部の分子機構についても，新たな知見が判明してきており，人工紡糸システムと共に，併せて報告する．

微生物由来のゲノム DNA や，その配列に基づき化学合成されたオリゴ DNA（ODN）は，感染症・ガン・アレルギー・炎症性疾患の予防や治療を目的とす
る機能性核酸分子として研究が進められてきた．私は，乳酸菌やビフィズス菌に代表されるプロバイオティクスの腸管免疫調節作用に注目し，プロバイオティ
クス由来のイムノジェニクス（immunogenics, 免疫調節因子）の化学構造や免疫活性発現機序の解明を目指し，研究を行ってきた（1）．とくに，プロバイオティ
クス由来のゲノム DNA や，DNA 断片の化学合成配列を用いた免疫活性試験により，免疫増強効果を有する ODN の同定に成功している（1）．また，ODN 特
有の免疫活性や，その活性阻害配列の探索を行うことで，優れた免疫機能を有する ODN の構造に興味深い知見を得ている（1）．
ODN は，これまでに様々な動物試験を経て，多くの知見が積み上げられてきた．一部，臨床試験にまで進んでいる ODN も存在する．マウスの系におけるODN の投与方法として，腹腔内投与，皮内・筋注投与，静脈投与など，注射器を用いる手法が一般的である．しかしながら，ODN は，経口的に摂取すると，胃液や消化酵素の影響により分解されてしまうという弱点があり，経口投与による実績はほとんど無い．一部，大容量での経口投与例は存在するが，コストの面から，ODN を有効成分とする経口機能性素材としての価値を見出せずにいた．
2011 年，私の研究グループは，注射に頼らない「食べる ODN」の実現を目指
し，研究に着手した．そして 2015 年，Chowndhury らの開発した炭酸アパタイ
ト粒子を用いた細胞への遺伝子導入手法を，in vivo スケールに改良した手法を確立し，ODN を包摂・包埋した「DNA ナノカプセル」の開発に成功した（2）．
DNA ナノカプセルとは，ODN をカルシウムイオンに吸着させ，ナノサイズにまで成長させたものである．さらに，DNA ナノカプセルは，人工胃液，DNA分解酵素に対して，優れた DNA 保護作用を示した．とくに，胃液を想定した強酸による人工胃液耐性試験では，完全に分解が進んだフリーの ODN と比較して，DNA ナノカプセルでは ODN の存在を示す強いシグナルが検出された．
このことは，DNA ナノカプセルは胃液による消化に耐え，十二指腸，小腸へと到達する可能性が高まったことを示している．その後の研究により，DNA ナノ
カプセルが，細胞培養系における試験において，免疫機能性を有することが証明された．
私の研究グループでは，乳酸菌 Streptococcus thermophilus ゲノム配列中より同定した CpG-ODN（MsST と命名）が，マウスの脾臓細胞培養系において IFNγ
および IL-33 を強く誘導することを発見している．そこで，アレルゲン感作マ
ウスへの MsST カプセルの投与試験を実施し，腸管パイエル板における局在性，
免疫賦活作用，さらに採取した脾臓および脾臓細胞を用いて全身免疫への影響を調べた．その結果，MsST カプセルは，胃酸による消化に耐え，小腸粘膜に到達し，パイエル板に取り込まれることが明らかとなった．また，パイエル板
組織において IFNγ を誘導したことから，免疫機能性を保持していることが示された．さらに，4 週間にわたる連続投与試験を実施した結果，脾臓が著しく肥大し，脾臓細胞における IL-33 陽性細胞の上昇も見られた．すなわち，経口投与した MsST カプセルは腸管粘膜を介して，全身免疫系における IL-33 産生を誘導していると考えられる．以上のことから DNA ナノカプセルは，パイエル板上皮に到達後，すみやかに濾胞内部に取り込まれ，免疫細胞を刺激・活性化することで，免疫機能性を発揮することが証明された．さらに免疫抑制型
ODN を有効成分とする DNA ナノカプセルの経口投与により，マウスにおけるアトピー性皮膚炎の発症を予防することを発見した（2）．以上のことは，腸管に到達した ODN により，全身免疫系が活性化されたことを初めて示したものである．
粘膜免疫システムを介した抗原の経口投与は，粘膜局所のみならず，全身の免
疫応答を誘導できる．さらに，注射投与に比べて簡単で，安全性および経済的にも優れている．しかし，ワクチンやアジュバント分子の，腸管粘膜上皮および免疫細胞における作用機序の解明と，腸管送達系の構築が課題となっている．
DNA ナノカプセルを応用し，ODN が胃や腸管など消化管を介して安定的に腸管粘膜に届けられれば，様々な疾病の予防・軽減に寄与する機能性サプリメン
トなどの創製が期待できる．また，ヒト腸内に豊富に存在する乳酸菌やビフィズス菌など，プロバイオティクスに由来する ODN を用いれば，消費者意識に配慮した新素材として提案できる可能性が高い．本研究は，ODN の腸管送達系の構築により，農学分野から健康維持・増進のための新たなワクチンアジュバ
ントや機能性食品・家畜飼料素材の創製を目指す基礎研究として位置づけられる．
1.Shimosato and Kitazawa, Probiotics: Immunobiotics and Immunobiotics,
Immunogenics: Immunostimulatory oligodeoxynucleotides from probiotics, CRC
Press, 336-353 (2013)
2.Wang et al, Mol Ther., 23, 297-309 (2015)

Hierarchical structure of spider silk fibers is necessary for artificial silk
fiber development

Oral delivery of oligodeoxynucleotides and future perspectives○Keiji Numata(RIKEN)Key words

silk○Takeshi Shimosato(CFMD, Shinshu Univ.)

Key words

oral delivery, oligodeoxynucleotides, DNanocap

254

S3Kc01

生物資源管理に関する世界動向を踏まえた ASEAN と日本の連携によるバイオ科学技術の発展を目指して

S3Kc02○川﨑 浩子
（製品評価技術基盤機構・NBRC）
kawasaki-hiroko@nite.go.jp

NITE バイオテクノロジーセンター（NBRC）は，微生物約 9 万株を管理する微生物保存機関（BRC）である．また，各種法令に基づく微生物管理に関する行政支援を実施し，特許法に基づき指定された国内唯一の特許生物寄託センター
であり，生物多様性条約に関連するカルタヘナ法の支援事業，ABS 指針に基づ
く国内取得書の発給業務を実施している．加えて，微生物の利用促進に向けて，
微生物情報収集と，アジア諸国とのネットワーク構築を行っている．本講演では，特に微生物の管理に注目し，国際及び国内規制，安全管理，生物の多様性，
国際標準化，情報管理の世界動向を踏まえて，バイオ関連の先端技術の発展のための ASEAN と日本の連携について，NBRC の活動を通じた話題提供をしたい．
1．国際・国内ルール
生物資源管理に関する国際ルールとして，ここでは，生物多様性条約とブタペスト条約があげられる．生物多様性条約には，バイオセーフティに関するカル
タヘナ議定書と遺伝資源の取得の機会及びその利用から生ずる利益の公正かつ衡平な配分（ABS）に関する名古屋議定書で，それぞれに対応して国内では，
遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘナ法），遺伝資源の取得の機会及びその利用から生ずる利益の公正かつ衡平な配分に関する指針（ABS 指針）が公布されている．すべてが国内で完結する場合を除き，条約の遵守は不可欠であり，関係国との連携なくしては目的を達することはできない．
国内ルールでは，例えば安全という視点で考えてみると，海外の生物資源を国内に持ち込む場合は，感染症法，家畜伝染予防法，カルタヘナ法，外国為替及び外国貿易法植物防疫法，植物防疫法などの遵守が必要である．また，海外へ持ち出す場合は，相手国法令にも注意が必要である．微生物・病原体をその危険度に応じて 4 段階（BSL1～BSL4）に分類できるが，微生物学名と BSL の対応は各種法令，機関や各国の見解によって差違があるのも事実である．共同研
究を実施する ASEAN と日本の共通した基準があることが望ましい．
2．生物学的多様性の魅力
地球上の微生物は，その 99％が未知と言われていたが，最近の研究ではその割合はさらに高いという報告もある．そ生物学的に多様な微生物資源は魅力的なのか？さらに言えば他国の生物資源に魅力はあるのか？多様な微生物資源は確
実に学術上の魅力は高い．新規微生物は新規機能を有する．ASEAN には生物多様性に富んでおり，新規生物の発見は今後も期待されるところである．一方
で，利用しやすさという点での魅力も考えなければいけない．1．の国際・国内
ルールの中で，利用しやすい形になることが望ましく，そのためには関係国の協力は不可欠である．
多様な微生物と比較するからこそ，特定の生物集団の法則も見いだすことができる．例えば，最近注目されているヒトマイクロバイオームは，海外と比較することで，日本人の微生物叢の特徴を認識することができる．情報の共有も不可欠であり，こちらは研究者間の研究協力の推進が必要であろう．現在，微生物の分類学的基準株のゲノム情報整備について国際プロジェクトが動きつつあり，利用しやすい形での公開に向けて働きかけているところである．
3．国際・国内ルールの中で，多様な生物資源を利用する方策
生物資源を扱う中で，国際・国内ルールは遵守しなければならない．ルールの把握だけでも負担と思う研究者は少なくないはずだ．一つの方策として，多様な生物資源を保存・管理している生物資源保存機関の利用がある．多様な生物資源がそこにあり，利用に関するルールもあらかじめ決まっていて，面倒な交渉無く利用できる．NITE・NBRC は ASEAN 諸国の微生物コレクションの利用促進に協力しており，アジア地域における微生物資源管理に関するアジア・コ
ンソーシアム(ACM)や，インドネシアでの国際標準に合わせた微生物保存機関の設立にも携わってきた．これら ASEAN 諸国の微生物保存の情報は，国際微生物データセンター(WDCM)から入手することができる．
4．特許戦略と標準化戦略
バイオ科学技術の発展を考えた時，特許戦略と標準化戦略がある．後者は，日本をはじめアジアではあまり得意としていない戦略であろう．演者は，ISO/TC276 Biotechnology に Expert として国際標準化議論に参加する中で，国際標準戦略の重要性を実感しているところである．長年の ASEAN と日本のバイオテ
クノロジー研究協力の中で見いだされた分析技術，機器開発，生産プロセス開発等，数多くの新技術を国際標準化することにより，さらなる発展が期待できる．国際標準規格である ISO 規格には，参加国が 1 票を有しており，議論を重ねた上で，数回の投票によって規格化が成立する．ASEAN 諸国と日本のバイオ技術の発展にも関係国の協力は不可欠であることは言うまでもない．特許戦
略と標準化戦略の両刀使いで，バイオ科学技術の発展を目指していただきたい
し，NITE・NBRC もそのための支援に努めて参りたい．

Aiming towards the development of bioscience and biotechnology throughcollaboration between ASEAN and Japan based on world trends on
biological resource management○Hiroko Kawasaki(NBRC, NITE)

Key words

bioresources, microorganisms, international cooperation, BRC

ASEAN Network for microbial utilization (ANmicro): A
step forward to the global ASEAN○Lily Eurwilaichitr(TBRC, BIOTEC, Thailand)
lily@biotec.or.th

With more insights into the microbial world and the increase knowledge of benefits
from microbes, the exploitation of microorganisms has been increasingly achieved inseveral areas, including health and medicine, industrial and environment and food andagriculture. Southeast Asia abounds with rich and diverse microorganisms that serve as
biotechnological resources for industries related to drugs/medicines, food, andindustrial bioproducts. Recognizing the potential application of microorganisms, every
ASEAN member country is engaging in research into microbial utilization in various
degree.
To strengthen ASEAN research community towards sustainable use of microbial
resources, the ASEAN Network on Microbial Utilization (AnMicro) has been
established since 2014. AnMicro aims to serve as a platform for knowledge sharing of
the efficient management of microbial resources and research on microbial utilization
among the ASEAN research community. At present, AnMicro consists of members
from 15 research and academic institutes across six countries, namely Indonesia,
Malaysia, Myanmar, the Philippines, Thailand and Vietnam, with Thailand’s BIOTEC
serving as the secretariat of the network. AnMicro empowers ASEAN research
institutions and their members by promoting capacity building on bioresource
utilization and management through international conferences, workshops and training
courses. The ASEAN Microbial Biotechnology Conference (AMBC), organized by
AnMicro members, is a biennial event that has been successfully assembling
participants from the world of science and industry for discussions on microbial
utilization since its inaugural meeting in Bangkok in 2014. Moreover, more than ten
joint workshops and training courses have been organized by AnMicro members tofurther establish research cooperation and intensify scientific exchange among
microbiologists in ASEAN.
One of our highlight activities, marked as an important milestone, is the collaborative
project with ASEAN Center for Biodiversity (ACB), supported by the ASEAN
Science, Technology and Innovation Fund (ASTIF). The project entitled“Establishment and Maintenance of an ASEAN Microbial Database” aimed to raiseawareness of the existence of microbial resources in the region and improve theavailability and accessibility of information resources, thereby facilitating their study
and potential application from both academics and bioindustry.
Beyond the accessibility of microbial resource, networking of researchers fromacademic and research institutions will also help increase their capability in converting
microbiological resources into economically significant innovations. Each AnMicromember also acts as an “AnMicro collaborating center” to connect with local andinternational partners through existing networks of research laboratories and centers of
excellence in microbiology. Through these various efforts, AnMicro has been building“a network of networks”, regionally and internationally, fostering cooperation andaccess to knowledge and expertise and in turn, enhancing of physical, institutional andpeople-to-people connectivity within ASEAN and between ASEAN and other regions
across the globe, leading to the “Global ASEAN” in biotechnology and bioeconomy.

ASEAN Network for microbial utilization (ANmicro): A step forward to theglobal ASEAN○Lily Eurwilaichitr(TBRC, BIOTEC, Thailand)

Key words

AnMicro, ASEAN, microbial biotechnology

255

S3Kc03

The role of PSM in enhancing academe-industry
partnership for the utilization of indigenous bioresourcesin the Philippines

S3Kc04

A case study on cooperative development on utilization of
microbial bioresource between Vietnam and Japan○Duong Van Hop, Nu Nguyen Kim Nu(Inst. Microbiol. Biotechnol., Vietnam National Univ., Hanoi)
hopdv@vnu.edu.vn○Leslie Michelle Dalmacio(Dept. Biochem. Mol. Bio., Coll. Med., Univ. of the Philippines
Manila)lmdalmacio@up.edu.ph
The Philippine Society for Microbiology (PSM) has been in existence for almost half acentury now. Its membership spans the academe, research institutions and industry.
Since its establishment, the society has annually brought together the three sectors fordissemination and discourse of researches in microbiology and biotechnology. The
PSM has formed partnerships with industry to be able to facilitate the annual
dissemination and discourse of researches involving microbial resources and topromote the value of microbiology in every day life. The society also provides
financial support to undergraduate and graduate theses of its members and awards
grants to young researchers with excellent research. Although varied in approaches andapplications, the researches of PSM members and affiliates focus on the utilization of
microorganisms in food, agriculture, medical applications, and environmental
sustainability. PSM supports and works with Philippine institutions with microbial
culture collections to inform the public of microbial bioresource availability. The
sources of microorganisms in the biorepositories are indigenous plants, food, healthy
and ill individuals, and the natural environment. Philippine plant and animal diversity
and geography provide a rich source of materials and microorganisms for medical,
industrial and environmental use. Philippine plant diversity has provided an array of
herbal medicine and various fermented foods. A number of indigenous microbial
isolates come from Philippine fermented foods. Bacteria from these foods have beenstudied for probiotic and antibiotic properties. Functional foods are being developed
using these bacterial bioresource. Philippine fungal biodiversity also provides a richsource of natural products and bioactive compounds. Microbial isolates from uniqueand extreme environments are being studied for bioremediation and as sources ofindustrially important enzymes. New technologies in genomics and metabolomics haveenabled Philippine microbiologists to better elucidate genetic varieties of bioresources,
as well as microbial diversity and function in various environments and conditions.
The Philippine medicinal plants are being studied for their components and effect on
the microbiome and certain pathogens. Elucidating the biofunctional activities of these
medicinal plants warrant their cultivation in agriculture farms to meet the demand of
the local herbal industry. Since Philippine universities and research institutions havethe capability to do the lab scale and pilot scale processing of bioresources, PSM
provides a network and venue for stakeholders to meet and develop or form
collaborations to translate the aforementioned basic researches to what will be useful tosociety.

ACM: The Asian Consortium for the Conservation and Sustainable Use of Microbial
Resources is a collaborations among mBRCs were established in 2004 byrepresentatives of 12 Asian countries. One of main task force is establishment ofinternational standards for biological material transfer and benefit-sharing and increase
the capacities of ACM members in mBRC management, manpower development andbiotechnology. Collaboration project on taxonomic and ecological studies of microbes
in Vietnam and utilization between Institute of Microbiology& Biotechnology (IMBT),
Vietnam National University, Hanoi (VNU) and Japan National Institute of Technology
and Evaluation (NITE) in the period 2004-2015- as a case study on cooperative
development on Bioresource in ACM members. After implementation period, theproject was fruitful for both parties. The benefits to the IMBT from the collaboration
included a great improvement in the capacity to study and manage microbial resources.
This is illustrated by the following points: (i) The VTCC is a national mBRC, holding~10,000 microbial cultures, and 3,600 strains are available from an online catalogue(http://vtcc.imbt.vnu.edu.vn/). (ii) Technology transfer and the training of young
Vietnamese scientists (iii) Improved capacity of the VTCC. By implementing the
project, the capacity of the VTCC is much improved. Now, the VTCC can extend it
activities beyond preservation to the identification and taxonomic study of microbial
isolates.The benefits to NITE from the collaboration were as follows: (i) NITE
scientists gained a better understanding of the diversity of tropical microorganisms andtheir roles in diverse fermented food processes in Vietnam. (ii) by implementing the
Network of International Exchange of Microbes under ACM mechanisms, NITE
enriched it stored isolates with tropical microbes from Vietnam, which are potential
genetic sources for R & D and third party accession.
In this presentation, some information relating to new Vietnamese act No59 on
biodiversity and the regulations for International collaboration, access and benefit
sharing genetic resources from Vietnam under the CBD and Nagoya Protocols on ABS
is mentioned also.

The role of PSM in enhancing academe-industry partnership for theutilization of indigenous bioresources in the Philippines

A case study on cooperative development on utilization of microbial
bioresource between Vietnam and Japan○Leslie Michelle Dalmacio(Dept. Biochem. Mol. Bio., Coll. Med., Univ. of the Philippines Manila)

Key words

bioresources, microorganisms, Philippines○Duong Van Hop, Nu Nguyen Kim Nu(Inst. Microbiol. Biotechnol., Vietnam National Univ., Hanoi)

Key words

collaboration, benefit, diversity, tropical microbes

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S3Kc05Indonesian bioresource utilization for health and beauty○Irmanida Batubara(Trop BRC IPB, Indonesia)
ime@apps.ipb.ac.id

S3Lc01

動物細胞培養の産業応用の変遷 －テクノロジーからエンジニアリングへ－○大政 健史 1,2（1阪大院・工, 2MAB組合）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Indonesia is mega-diversity country that has many bio-resources. Among this only
limited number had been utilized for human health and beauty. Screening theIndonesian bio-resources such as from plant especially Indonesian medicinal plant had
been conducted. Indonesian traditional medicine that used bio-resources known as
Jamu. This paper introduce the utilization of Indonesian bio-resources especially thejamu ingredient as antibacterial, antioxidant, anti-glycation, and inhibitor of someenzyme such as α-glucosidase, tyrosinase, and lipase. Sappan wood (Caesalpinia
sappan), Merbau (Intsia palembanica), Xylocarpus granatum, turmeric (Curcuma
longa), temulawak (Curcuma xanthorrhiza), salam (Syzygium polyanthum), andStelechocarpus burahol and their responsible active component are discuss in thispaper.

今でこそ当たり前に用いられている動物細胞培養技術であるが，細胞培養の黎明期においては，生体外において細胞を培養するということ自体が，特別な技術として取り扱われていた．講演者が初めて細胞培養技術に触れたのは，今を去ること 30 年以上前の 1987 年のことになる．博士課程に進学するにあたって，
アミノ酸発酵の培養工学のテーマから，動物細胞を対象とした培養工学にテーマを変更したわけであるが，当時は，動物細胞の培養技術については，どちらかというと職人芸的なテクノロジーであり，まだまだ工学的に体系化された領域とはお世辞にも言えない状態であった．当時はモノクローナル抗体の産業利用への大きな期待が高まっており，さらには，当時実施されていた通産省の次世代産業基盤技術開発において，細胞大量培養がとりあげられ，研究開発が進められており，研究分野全体のすそ野が広がり，様々な企業・アカデミアにおいても細胞培養研究が盛んに行われていた．特に，この時期に発達したのが無血清培地の開発である．この開発は，G.H.Sato による血清の主要な機能は成長因子(growth factor)の供給にあるという考えに基づいて，長足の進歩をとげた．
特に本分野での研究を推進したのは，浮遊細胞であるハイブリドーマの培養をモデル系とした無血清培養の発達である．培地の発達に伴って，細胞培養技術が一般化し，細胞培養そのもののエンジニアリングも，同時期に大きな発展があった．細胞培養によるワクチン生産という特別な例は存在してはいたが，基本的には，実験室内での研究者個々人の創意工夫，経験と勘で行われていたテクノロジーがエンジニアリングの一歩を踏み出したと言える．勿論，これらの背景には，微生物で培われた生物化学「工学」の考え方が導入され，微生物の完全混合槽での深部培養（攪拌培養）としての取り扱いが動物細胞培養において応用され，体系化されるようになってきたことも大きい．
現在は，10g/L を超える抗体生産が普通に報告されるようになってきたが，この様な技術発展に欠かせないもう一つの点は，1990 年代から 2000 年代にかけての組換えチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（CHO 細胞）による抗体生産の隆盛である．残念ながら我が国における研究開発は，先ほど述べた次世代産
業基盤技術開発の後，動物細胞を対象としたプロジェクトが継続されず，それにあいまって，企業での持続的な研究もあまりなされず，1990 年代には大きな停滞期を迎えたが，一方，欧米においては，実用化されていた CHO 細胞を用いたエリスロポエチンや，G-CSF に引き続き，抗体医薬生産をターゲットとして，培養のスケールアップ・スケールダウンやダウンストリーム工程において，様々な技術的集積が積み重ねられていった．一方，これらの研究開発は産業界主導で行われ，アカデミア側において研究が盛り上がることがあまり無かったのも実情である．
21 世紀もしばらく過ぎた現在，世界の医薬品の売上ベスト 10 のうち，6 品目が動物細胞にて生産されており，欧米で発売されているバイオ医薬品の品目数にして 30%を超えるものが CHO 細胞を用いて生産されている．また，動物細胞そのものを利用する分野も 1990 年代から飛躍的な発展を遂げており，その用途
は治療用細胞や，細胞を用いた評価系など，幅広い分野での応用が期待されている．しかし，特に複雑な高等生物から構築された細胞株を用いる生産系そのものの解明は依然として明確にはなされてはいない．望むべき生産系を自在に構築して目的物を自在に生産するためには，この複雑な生物そのものとも呼べる細胞株の解明と制御が必要である．ある意味ではこれは人工生命を構築し，利用することに等しく，簡単に解決できる問題ではない．さらに，バイオ医薬品製造プロセスは細胞株構築・培養・精製・レギュレーション等といった様々な分野の高度な科学技術を総合して初めて可能となるプロセスであり，これら
各ステップやその複雑な相互関係の解析と利用は基盤的技術として必要とされる．そこで，本講演では，動物細胞培養の産業応用に関わる歴史的経緯を踏まえ，今後の新しい展開についても考察したい．

Indonesian bioresource utilization for health and beauty

Mammalian cell cultivation - from laboratory to industry: from technology
to engineering○Irmanida Batubara(Trop BRC IPB, Indonesia)

Key words

Jamu, antibacterial, active components, enzyme inhibitors○Takeshi Omasa1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2MAB)

Key words

mammalian cell, biologics, regenerative medicine, therapeutic protein

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S3Lc02

新規 CHO 細胞による抗体医薬品生産 － 5 g/L/6days の高いポテンシャルと工業化への課題 －S3Lc03○堀内 貴之（株式会社ちとせ研究所）
takayuki.horiuchi@chitose-bio.com

抗体医薬品は，遺伝子組換え技術などを応用し，細胞がタンパク質を作る力を利用して製造されている．我々は，生産細胞であるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞の育種改良および培養プロセスの最適化によって，わずか 6 日間の培養で 5 g/L 以上の抗体を産生する超高発現細胞株の樹立システムを完成した．本講演では，開発の詳細について述べるとともに，細胞の能力を最大に引き出すための培養プロセス上の課題について言及したい．なお本研究は，次世代バイオ医薬品製造技術研究組合において，第一三共株式会社をはじめとする組合員企業，組合員研究機関との協力のもとに行われた．
抗体医薬品は，副作用の少ない効果的な治療薬として期待されている．その一方で薬価の高騰が課題ともなっている．薬価高騰の一因は，その高い製造コストにある．抗体医薬品は生産細胞の培養等のアップストリーム工程および精製分離等のダウンストリーム工程からなる多段階プロセスを経て製造されるため，洗練された高い技術が必要であり，どうしても高いコストが要求されてしまう．
したがって製造コストを削減して薬価抑制の一助とするためには，アップスト
リーム・ダウンストリーム工程の効率化ならびに簡略化を求める更なるイノベー
ティブな技術開発が鍵となる．我々は，抗体医薬品製造の根幹ともいえる生産細胞の高機能化ならびに高機能化した細胞の能力を最大に引き出すことを可能とする培養プロセスの開発にターゲットを置いて技術開発を進めている．
抗体医薬品の主要な生産細胞は，CHO 細胞である．現在広く用いられている
CHO 細胞は，およそ 60 年前に米国コロラド大学の T. Puck 博士らが学術的な研究目的のために樹立した細胞株を起源としている．その後，主に欧米の製薬企業やバイオ製造企業において細胞育種を含めた培養プロセスの開発が重ねられ，抗体医薬品の工業製造に利用されてきた．我々は，生産細胞としての CHO 細胞の更なるポテンシャルを引き出すことを目的として，チャイニーズハムスター
卵巣の初代培養まで遡り，新規の CHO 細胞を樹立し，無限増殖化の当初から
工業用途目的で育種を施すことを試みている．
これまでに，チャイニーズハムスター卵巣の初代培養から無限増殖化した上皮様細胞を樹立することに成功し，CHO-MK と命名した．独立の 8 個体から 8 系
統の無限増殖化細胞を樹立し，いずれも 200 日間以上継代培養可能であることを確認している．その後，無血清培地における浮遊培養条件を確立し，完全無血清化／浮遊化後の特定の PDL （Population Doubling Level） においてホスト
セルバンクを作製した．現在，ICH ガイドライン Q5A/D に準じて純度試験などの各種特性解析試験の実施を進めている．これまでに実施した試験においては，
タンパク医薬品製造用の細胞基材として用いるうえで問題となるような結果は得られていない．
CHO-MK 細胞は，既存の CHO 細胞（CHO-K1，CHO DG44 など）と比較して非常に高い代謝活性を有している．とくに増殖性に優れており，浮遊継代培養
時の増殖速度は既存の CHO 細胞の 2 倍以上に達し，倍加時間は 10 時間よりも短いことが大きな特長の一つである．さらに，不均衡変異導入法（ちとせ研究
所の独自の細胞育種技術）による細胞育種によって，高い増殖特性を維持した
まま，細胞あたりの生産性を 10 倍以上に向上することに成功した．細胞育種によって増殖性・生産性が飛躍的に向上した CHO-MK 細胞のホストセルバンクを作製し，抗体発現クローンの樹立システムを完成した．CHO-MK 細胞に抗体
発現ベクターをランダム導入して高発現クローンを選別した後，高い生産性と増殖性を引き出すための流加培養プロセスの最適化，生産培地の選定を行うことで，わずか 6 日間の培養で 5 g/L 以上の抗体を産生することができる．また，抗体産物の凝集体，断片化，電荷異性体などの分子変化体および糖鎖構造について，とくに問題になるような逸脱した結果は得られていない．なお，CHOMK 細胞は医薬品生産への適用実績がない新規の生産細胞として取り扱う必要がある．そのため，規制対応として，卵巣の初代培養から発現クローン取得までの細胞取扱履歴（細胞選択の経緯，樹立方法等の情報），使用した原材料に関する CoA/CoO を含む関連資料の完備も徹底的に行っている．
我々の最終的な目標は，新規 CHO 細胞の高いポテンシャルを活用した培養プロセスを開発し，抗体医薬品をはじめとするタンパク医薬品の製造コストの削減に貢献することである．これまでに，スモールスケールの培養系においては上述したとおりの高い生産性を達成できているが，今後あるいは目下の課題は，いかにして高い生産性を維持したまま大きな培養系にスケールアップできるかということにある．我々は，CHO-MK 細胞という極めて生産能力の高い細胞を創出することに成功した．次は，その細胞がもてるポテンシャルを最大限に引き出すための培養プロセスを完成することである．そのためには，本シンポジ
ウムのテーマがうたうそのままに，高度な培養を実現する工学的飛躍がまさに求められているのだ．

Nobel CHO cells produce more than 5 g/L antibody within 6 days
○Takayuki HORIUCHI(Chitose Laboratory Corp.)

Key words

CHO cells, antibody, biopharmaceutical

DNA バーコードとゲノム編集による分子・細胞動態計測○谷内江 望（東大・先端研）
yachie@synbiol.rcast.u-tokyo.ac.jp

超並列 DNA シークエンシングはゲノム，エピゲノム，トランスクリプトーム
計測の他に，DNA バーコードという考え方によって様々な実験の超多重並列化を実現した．今回の発表の前半では，最近の高速スクリーニングにおける DNA
バーコードの様々な利用に触れた後，タンパク質間相互作用等の複数の因子が関わる細胞形質の計測を高速化するために私達が開発した Barcode Fusion
Genetics (BFG)法を紹介する．BFG 法を酵母ツーハイブリッド (Y2H) 法と組み合わせることによって (BFG-Y2H)，最低でも 250 万のタンパク質ペアについて
タンパク質間相互作用ネットワークを一人の研究者が 2-3 週間程度で計測することが可能になった．後半では，DNA バーコードとゲノム編集を利用して細胞分化，発生に関わる哺乳動物の細胞系譜を丸ごと同定するプロジェクトについて紹介する．

Chasing molecular and cellular dynamics using DNA barcodes and genome
editing○Nozomu Yachie(RCAST, Univ. Tokyo)

Key words

protein interaction, development, dna barcode, genome editing

258

S3Lc04

塩基編集技術 Target-AID の工学的応用○西田 敬二（神戸大院・科技イノベ）
keiji_nishida@people.kobe-u.ac.jp

S3Lc05細胞培養における代謝解析ツールとしてのメタボロミ
クス○馬場 健史, 和泉 自泰（九大・生医研）
bamba@bioreg.kyushu-u.ac.jp

ゲノム編集技術としてこれまで ZFN，TALEN，CRISPR などのプログラム可能なヌクレアーゼによる DNA 切断が主流であり，基本的には標的部位において
DNA 二重鎖切断を引き起こした後に宿主細胞が修復する過程で配列の変換を期待するものである．これまで遺伝子操作が困難であった材料においても非常に有効であること，また外来 DNA 断片を残さないために遺伝子組み換えの規制が適用されない可能性があることから，医療分野から農業分野に至る応用化に向けて急速に導入が進められている．一方，課題として，改変配列あるいは相同組み換えの不確実性や，また細胞毒性によって適用が困難な細胞もあった．
ヌクレアーゼに代わるエフェクターを用いることによってより多様なアプリケー
ションの開発も進んでおり転写制御やエピゲノム操作なども開発されてきたが，特にゲノム配列の改変においてヌクレアーゼの課題を補完しうる，DNA 脱アミノ化反応を触媒するデアミナーゼ等を用いる Base editing（塩基編集）の技術開
発と応用展開が広がってきている．
現状，塩基編集は主にヌクレアーゼ失活型の CRISPR/Cas9 に脱アミノ化酵素を結合させることで DNA 塩基の変換反応を行い点変異を実現する．これによってこれまで DNA 切断に関わる不確実性や毒性を回避することができ，またドナー DNA の挿入なしに精密な配列改変が可能となるため，遺伝子治療から細胞工学用途にまでの幅広い応用可能性が期待されている．また変換できる塩基の種類や，標的とできる領域の幅などについての制約を克服すべく技術開発が競われている状況になっている．本講演では塩基変換技術について，開発の過程や動作原理を解説しつつ，直近の技術進歩や派生技術，また様々な応用展開とその可能性について概説したい．

代謝物の包括的な解析を行うメタボロミクス（メタボローム解析）は，俯瞰的視点から代謝とそれに関連する生体分子を広く見出せることから，近年様々な分野において利用されるようになってきている．生体内の複数の代謝物の量比
バランスを組み合わせたプロファイルは，高解像度の表現型として用いることができことから，病気の診断や病態発症メカニズムの解析，医薬品の薬効・毒性評価のほか，植物，微生物，動物などの種々の生物における代謝解析，食品や生薬の品質評価など，幅広い分野でメタボロミクスの有用性が示されている．
メタボロミクスは多岐にわたる分野から構成される学際領域研究であるために，それぞれの技術を理解し総合的に運用することは容易ではない．これが，当初メタボロミクスが一般的な技術として定着しなかった要因の一つである．また，様々な技術が開発されメタボロミクスの認知度が高くなった現在においても，その技術に関する十分な理解がないために実際の運用において種々の問題が生じ，結果としてメタボロミクスの有用性が認知されていないところがある．
サンプル調製，機器分析，データ解析がメタボロミクスにおける重要工程であるが，解析対象の代謝物が多岐にわたる多成分の一斉分析であるために，その技術は複雑なものとなっている．メタボロミクスを有効活用し，信頼性の高い解析を行うためには，メタボロミクスのそれぞれの技術の特性を十分に理解し，目的やサンプルにあわせて好適な手法を選択する必要がある．本シンポジウムの主役である細胞培養においても，成長過程における細胞内の代謝の変化やそれに伴う培地成分の変動など代謝解析の必要性からメタボロミクスの適用が試みられているが，実際にメタボロミクスを実施するためには，同様に検討が必要である．培養細胞サンプルの分析を行う際にどのように培地成分のコンタミを防ぐか，培地サンプルの分析を行う際に培地中に大量に存在する塩などの影
響をいかに少なくするかなど，試料調製，分析方法における様々な課題を抱えており，それらの解決に向けた技術開発が必要な状況にある．
そこで，本講演では，細胞培養のメタボロミクスに利用可能な最新の技術やその応用例について紹介し，細胞培養における代謝解析ツールとしてメタボロミ
クスの有用性をご理解いただくとともに，メタボロミクスをどのように利用したら良いか，また，メタボロミクスの有効活用に向けた課題についても議論したい．

Base editing technology Target-AID and its application

Metabolomics in cell culture○Keiji Nishida(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

genome engineering○Takeshi Bamba, Yoshihiro Izumi(Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ.)

Key words

Metabolomics, Metabolome, Chromatography, , Mass spectrometry

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S3Lc06受容体ライブラリーによる機能性細胞の創製○河原 正浩（東大院・工）kawahara@chembio.t.u-tokyo.ac.jp

S3Lc07細胞形態計測による細胞フェノミクス解析○加藤 竜司（名大院・創薬）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

再生医療の産業応用においては，目的細胞をいかに均質に，再現性よく，安価
かつ大量に調製するかが大きなボトルネックであり，種々の機能性細胞を自在に創製するための技術革新が必要とされている．
演者らは，細胞運命を制御するサイトカイン受容体に着目し，その機能を蛋白
質工学的に改変することで，機能性細胞創製のためのプラットフォーム技術の開発を目指している．受容体は大きく分けてリガンド認識ドメインとシグナル伝達ドメインからなるが，この双方を改変すれば，望みのリガンドを認識し，望みのシグナル伝達特性を有する人工受容体が創製できる可能性がある．このような人工受容体のライブラリーを用意しておき，目的細胞に応じてその運命に誘導できる受容体を選んで利用すれば，機能性細胞創製技術として有用であると考えられる．
これまでに，リガンド認識ドメインとして抗体可変領域や合成小分子認識蛋白質を組み込んだ人工受容体の構築に成功した．また，シグナル伝達ドメインとして，天然型受容体のみならず，シグナル伝達分子の結合特性に関わるチロシ
ンモチーフ配列をボトムアップ的に配置し，天然にないシグナル伝達特性を持
つ人工受容体を創製することにも成功した．さらに，チロシンモチーフ配列自体をランダム化し，様々なシグナル伝達特性を持つ人工受容体ライブラリーも構築できた．本発表ではこれらの技術による細胞運命制御の実例を紹介し，種々の機能性細胞創製への応用可能性について議論したい．

細胞培養テクノロジーの発展に伴い，細胞を利用して製造されるバイオ医薬品
は「次世代の医薬」として革新的な成果と新しい市場を拡大しつつある．特に国内においては，細胞そのものを医薬品として取り扱う再生医療等製品という新しい枠組みや法改正に牽引され，細胞加工物の医薬品レベルでの製造を通じた新しい産業発展への期待が大きくなりつつある．しかし，製造業として細胞や細胞を利用した製品を製造するには，そこにはまだ細胞培養の歴史的に定量的・理論的に理解しきれていなかった現象がまだ数多く存在しており，「完全に同一な製品」として扱うことができない細胞独特の複雑性と難しさが実際の製造現場では課題となっている．
特に細胞を生きたままで「治療用の製品として」製造することを考えるとき，その品質管理は極めて重要な課題の一つである．細胞培養は，極めて複雑かつ長時間におよぶ工程であるが，工程における途中過程を定量的かつ経時的に計測する技術として，まだ有効な技術が少ない．現在の医療用細胞の培養工程においてこれを担うのは，熟練者による細胞形態の顕微鏡観察と，その観察結果
に対する目利きである．様々な工業製品製造の現場においても，熟練者の視覚情報に基づく経験的判断は極めて高度な判断をしているケースは多いが，細胞培養工程のインプロセス計測の対象として細胞の画像情報は有用な情報源の一つであると考えられる．
近年，このような考えのもとで細胞の培養状態を数量化すべく様々なイメージング装置や解析ソフトウェアなどが開発されつつある．筆者らのグループもこれまで細胞培養途中の画像解析による「形態情報解析」の有効性を示しつつある．このような細胞の形が与える情報は「表現型（フェノタイプ）」として細胞応答の結果でもあり，我々の解析においても培養下の細胞を定量評価可能な様々な情報を有していることがわかりつつある．しかし，言い換えれば「最終結果でしかない細胞の見た目」を，どれほどの情報量で取得することが必要なのか，どこまでのバイオロジーを評価・表現することが可能なのか，実際に工程改善に活用することが可能なのかを議論しているものは少ない．本講演では，細胞形態情報を用いたフェノミクス評価の可能性と共に，製造プロセスそのものの理解や定量化の可能性についてご紹介すると共に，その課題についても議論したい．

Creation of functional cells using receptor libraries

Cellular Phenomics Analysis based on Morphology-based In-process
Measurement○Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

synthetic receptor, cell fate control, protein engineering○Ryuji Kato
(Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

Key words
image-based analysis, cell morphology, in-process measurement,
quality control

260

S3Mc01糖転移酵素を用いた糖ペプチド合成と糖鎖創薬への応用
展開

S3Mc02○千葉 靖典 1, 吉村 弥生 1,2, 高橋 佳江 1, 横尾 岳彦 1, 清水 弘樹 3
（1産総研・創薬基盤, 2バイオインダストリー協会, 3産総研・生物プロセス）
y-chiba@aist.go.jp

はじめに
今般，抗体医薬，ペプチド医薬，核酸医薬といったバイオ医薬品の技術開発が盛んに行われている．糖鎖は生命における重要な構成成分の一つであるが，糖鎖を活用したバイオ医薬品の開発が近年進んできた．糖タンパク質性のバイオ
医薬品において糖鎖構造が重要であることは，エリスロポエチンの体内動態や，抗体医薬品の抗体依存性細胞傷害活性に影響することで既に示されている．またシアル酸の構造を模倣したインフルエンザ治療薬や，シアリルルイス X 構造を模倣した鎌形赤血球症に伴う血管閉塞性発作の治療薬などが糖鎖ミメティク
スとして創薬に利用されてきた．近年ではさらに，血中の糖タンパク質をマーカーとして肝線維化の進行度を測定する診断薬も開発され，糖鎖のみならず，
糖鎖とタンパク質の複合体を創薬開発に利用しようという試みが行われている．
このような開発のためには，候補となる疾患特異的な糖タンパク質分子を精密に合成する必要がある．その方法として，一つには様々な宿主の糖鎖関連遺伝
子を欠損，または過剰発現させ，目的の組換えタンパク質を発現することで特徴的な糖鎖構造を有する糖タンパク質を合成する方法がある．また N-型糖鎖については，酵素的に糖鎖を変換するトランスグリコシレーション法に関する一連の技術が開発され，抗体糖鎖を均一化した例が報告されている．これらの方法とは別に，糖鎖が付加したアミノ酸（糖アミノ酸）を材料とし，化学法により糖ペプチドを合成，ケミカルライゲーション法を用いてペプチドを連結し糖タンパク質を調製する方法が開発されている．この方法は最も効率よく均一な糖鎖構造を有する糖タンパク質を作製できると考えられるが，原料の糖アミノ酸として特に O-型糖鎖の種類が不足している．今回我々は糖転移酵素を利用して，特にがん抗原として知られている様々な O-型糖鎖を有する糖ペプチドの合成法を検討したので報告する．
酵母による糖転移酵素の発現と基質特異性解析
産総研が民間企業と開発したメタノール資化性酵母 Ogataea minuta 株，または出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae 株を用いて，43 種類のヒト糖転移酵素を発現した．これまでに最も高い発現量を示した糖転移酵素は α2,3 シアル酸転移酵素（ST3Gal1）であり，1 L の培養液中に約 40 mg 程度の発現を確認している．一方，酵素によってはサブミリグラムオーダーの場合もあるが，発現量の向上について検討した結果について報告する．
さらに今回，特に O-型糖鎖のコア 2 構造（GlcNAcβ1,6[Galβ1,3]GalNAcα1-O-Ser/Thr）やコア 3 構造（GlcNAcβ1,3GalNAcα1-O-Ser/Thr）），がん抗原として知られている Tn 抗原（GalNAcα1-O-Ser/Thr），STn 抗原（NeuAcα2,6GalNAcα1-O-Ser/
Thr ）， T 抗 原 （ コ ア 1 構 造 ： Galβ1,3GalNAcα1-O-Ser/Thr ）， ST 抗 原（NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcα1-O-Ser/Thr）などを合成する糖転移酵素群について発現を行ない，その基質特異性を解析した．糖アミノ酸である GalNAcα1-O-Ser/
Thr を基質とした場合，コア 1 合成酵素（Drosophila 属由来 C1GalT）はアミノ酸残基として Ser を好み，Thr は 1/20 程度の反応性であった．一方，糖ペプチドとして，5 つの Ser/Thr 残基の側鎖のそれぞれに GalNAc を有する 5 種類の糖ペプチドを化学合成により準備し，C1GalT を反応させたところ，特定の Ser 残基への転移反応効率が明らかに低いことが確認された．よって，C1GalT はアミノ酸側鎖の構造だけでなく，アミノ酸配列および周辺構造を認識してガラクトー
ス残基を転移していることが示唆された．また同じ糖ペプチドに対し，α2,6 シアル酸転移酵素（ST6GalNAc1）を作用させ STn 構造を合成させた場合，Thr 残基の側鎖に付加した GalNAc にシアル酸を転移するものの，Ser 残基の側鎖上への GalNAc 転移効率はほとんど確認できなかった．一方，コア 1 構造を有する
同じペプチドを基質とした場合には，Ser 残基の側鎖上の GalNAc へシアル酸を転移した．このことから，ST6GalNAc1 は GalNAcα1-O-Ser よりもコア 1 構造
（Galβ1,3GalNAcα1-O-Ser）を好むことが確認された．このような基質特異性が，生体内において不均一で複雑な糖タンパク質を合成する原因と考えられた．

糖タンパク質の精密化学合成○梶原 康宏（阪大院・理）kajihara@chem.sci.osaka-u.ac.jp

近年，糖鎖が結合したタンパク質，すなわち糖タンパク質が薬として広く利用されるようになった．しかし，タンパク質上の糖鎖は常に不均一で，どのような構造の糖鎖がタンパク質の活性を高めることができるのか理解は進んでいない．
糖タンパク質の生合成は，小胞体で開始される．リボソームから生産されるペプチドにグルコースが 3 つ，マンノースが 9 つ結合したハイマンノース型糖鎖が付加し，そしてこの糖鎖が多数の酵素，シャペロンにより構成される糖タン
パク質品質管理機構のタグとして利用されることで，タンパク質部分が正しく
フォールディングする．
この過程で，正しくフォールディングした糖タンパク質は，ゴルジ体に送られ，ハイマンノース型糖鎖のプロセッシングおよび酸性のシアリル糖鎖への再構築を経て完成品となり，細胞膜や細胞外へと分泌されていく．特に，糖タンパク
質が，酸性のシアリル糖鎖を持つことで，血中に分泌された後，その水溶性の向上や糖タンパク質の凝集の防止，血中寿命，抗原性が制御される．
しかしながら，糖鎖構造が，糖タンパク質の生合成経路ならびに生理活性発現に与える影響を化学的視点で緻密に調べることは困難であった．これは，糖タ
ンパク質分子がバイオテクノロジー法でしか調製できなかったことと，その際，糖鎖構造を自在に制御して，任意の糖鎖を持つ糖タンパク質を得ることができなかったことが原因である．
我々は，アミノ酸 166 残基からなるエリスロポエチン（EPO）を選び，ハイマ
ンノース型糖鎖が小胞体での糖タンパク質の品質管理機構においてどのように利用されているのか，さらにはシアリル糖鎖が血中で EPO の赤血球増殖活性をどのように制御しているのか，糖タンパク質の精密化学合成を利用して糖タン
パク質の糖鎖の機能を包括的に理解することを検討してきた．
本発表では，これら成果ならびに糖タンパク質の化学合成を用いる創薬等へ応用について紹介する．

糖鎖創薬への応用展開生産した糖転移酵素を利用し，各種糖ペプチドの合成を行った．前述の 5 つのSer/Thr 残基の側鎖のそれぞれに GalNAc を有する 5 種類の糖ペプチドに対し，糖転移酵素を作用させ，STn 抗原，T 抗原，ST 抗原の構造等を有する糖ペプチ
ドを 20 種類以上作製した．また隣り合った Ser/Thr 残基にジシアリルコア 1 構造（NeuAcα2,6[NeuAcα2,3Galβ1,3]GalNAcα1-O-）を連続して有する糖ペプチドの合成にも成功している．これらの糖ペプチドの利用法としては，ペプチド薬の安定化や，ケミカルライゲーション法を用いた糖タンパク質調製によるバイオ医薬品への展開が期待される．また最近では糖鎖とペプチドの両部分をエピトープとする新規抗体が取得されており，このような特殊な抗体を取得するための免疫原としても利用可能と考えている．

Glycopeptide synthesis with glycosyltransferase reactions and its application
for glycan-based drug discovery○Yasunori Chiba1, Yayoi Yoshimura1,2, Yoshie Takahashi1, Takehiko Yoko-o1,
Hiroki Shimizu3(1BRD, AIST, 2JBA, 3BRI. AIST)

Key words

glycosyltransferase, glycopeptide synthesis, biologics, yeast

Chemical Synthesis of Glycoproteins○Yasuhiro Kajihara(Grad. Sch. Sci., Osaka Univ.)

Key words

protein, protein folding, oligosaccharide, glycosylated peptide

261

S3Mc03糖タンパク質合成の制御とバイオ医薬品への機能付与○朝井 洋明（糖鎖工学研究所）
hiroaki-asai@glytech.jp

S3Mc04糖アナログを利用した糖鎖機能の追跡と改変○木塚 康彦（岐阜大・G-CHAIN）
kizuka@gifu-u.ac.jp

バイオ医薬品は，低分子医薬品では対応できない病態へ適応できる分子も多く，医療用医薬品で重要な役割を果たすことが期待されている．そのため研究開発も盛んに行われている．一方でバイオ医薬品は，高分子量で構造も複雑である
ので，低分子医薬品に比べて取り扱いや管理が難しい．複雑な構造を持つバイオ医薬品では，原薬の明確な品質規格の分子構造による規定が困難である．従って純度・含量の規定も極めて困難である．特に糖タンパク質性医薬品は，複雑で不安定な分子である場合が多く，製品の品質制御や精密な含量測定等には高度な技術やノウハウが必要となる．更に糖タンパク質性医薬品原薬は，動物細胞でしか生産できず，品質管理の煩雑さ，生産ロット間差の問題，製造コストの高さなどの多くの課題も抱えている．これら課題は，動物細胞の低生産性や細胞培養管理の困難さに起因する．
バイオ医薬品の中の糖タンパク質性医薬品は，抗体医薬の IgG 型抗体や腎性貧血症治療薬のエリスロポエチン（EPO）などのサイトカイン系医薬品や，ゴー
シュ病治療薬のイミグルセラーゼなどの酵素補充療法用医薬に多い．糖タンパ
クの糖鎖の役割は，まだ解明途上であるが，その重要性はいくつかの例で既に明らかになっている．第二世代 EPO であるアラネスプ TM は，ネイティブな EPOに 3 本しかない N 型糖鎖をアミノ酸改変により 2 本増やして 5 本にすることで血中半減期を 3 倍に延ばすことが出来た．また酵素補充療法に使われている糖タンパク酵素も含糖鎖構造に生体内活性が依存していることが明らかになっている．この様に，糖タンパク中の糖鎖構造や糖鎖本数が生体内活性に大きな影響を与えることより，糖鎖構造の制御や品質管理がさらに重要になると思われる．遺伝子工学の進展によりタンパク部分のアミノ酸配列構造の制御は，正確で日々効率化され，同時にバイオ医薬品も大きく発展してきた．しかしながら，動物細胞による糖タンパク発現において，タンパク上の糖鎖合成は，翻訳後修飾の過程で行われるので，糖鎖制御を高度に行うことは現在も困難である．
梶原らは，これらの課題を解決したヒト N‐結合型糖鎖の調製技術を見出しヒ
ト型糖鎖ライブラリーの大量合成を可能にした．我々は，梶原らが開発した糖鎖調製技術を基に，工業レベルでかつ医薬品原料として使用可能な純度で，50種類以上の糖鎖ライブラリーを構築した．
我々は，バイオ医薬品として大きな市場を形成しているヒトインターフェロン
β（ｈＩＦＮ‐β）の全化学合成に挑戦し，このｈＩＦＮ－β の全化学合成と言う試みは完全に成功した．全化学合成されたｈＩＦＮ‐β は，既に上市されているものと比較して薬効，動態，品質に関して同等以上であることが確認された．また，糖鎖構造も含めて高純度な均一構造を有する糖タンパクであった．
更に我々は，EPO とアラネスプの様にｈＩＦＮ‐β の高機能化にも挑戦した．
糖タンパク合成法により，糖鎖の付加位置，糖鎖の本数，それぞれの糖鎖構造を任意に設計された通りの糖タンパクを合成した．我々は 100 種類以上の糖タ
ンパクを化学合成し，高機能化ｈＩＦＮ‐β を創生するに至った．近年脚光を浴びている中分子医薬品のペプチド医薬においても糖鎖利用した創薬を行っているので代表的事例を紹介する．

糖鎖は最も豊富な翻訳後修飾であり，糖鎖の変化が糖タンパク質の機能調節や疾患に深く関わることは言うまでもない．実際にがんなどにおいては，特異的な糖鎖変化がバイオマーカーとして臨床の場で使われている．さらに，これまでの糖鎖合成酵素のノックアウトマウスの解析などから，特定の糖鎖が特定の疾患の創薬ターゲットになる可能性が多く指摘されている．
一方で，そうした基礎研究による糖鎖生物学的知見の多くはまだ臨床応用されていないのが現状である．その理由の一つとして，扱いの容易な化合物ツールの不足が挙げられる．糖鎖の解析や医療応用においては，糖鎖の挙動を特異的に検出し，またその機能を自在に変化させる化合物の存在が重要となってくる．
ところが現在では，糖鎖の検出においてはレクチンが，機能改変については糖鎖合成酵素の遺伝子の制御が主流であり，簡便さや応用という点においてはまだ不十分である．すなわち，こうした目的にかなう扱いの容易な低分子化合物の開発が重要である．
そうした中，糖のアナログが糖鎖の追跡や機能改変に有用であることがわかってきた．Bertozzi らの先駆的な研究を皮切りに，糖のアナログ（アジド体やアルキン体）をクリックケミストリーと組み合わせることで糖鎖の検出プローブ
として使えることが明らかになった．また，天然の糖との構造類似性から，糖アナログは糖鎖合成酵素などの阻害剤として機能するケースが報告されている．
これらの背景をふまえ，本発表では，著者らが最近行った二つのフコースアナ
ログを用いた糖鎖研究を紹介したい．
フコースは糖鎖の末端に位置する糖で，特徴的な糖鎖構造エピトープの一部となっていることが多く，糖鎖-糖鎖認識分子間の結合にしばしば直接関わる．また，がん・炎症などの疾患から，発生，免疫などの生体機能，腸内細菌との共生など，様々な場で必須の役割を果たす糖鎖の一部となっている糖である．これらのことから，フコースの存在を検出して追跡できるプローブや，特定のフコシル化糖鎖の合成阻害剤などの開発は，さらなる糖鎖機能の解明と医療応用において重要である．実際これまで，いくつかのフコースアナログがプローブや阻害剤として有効である報告がなされていたが，一方その感度・特異性・毒性などの点においてはまだ改良すべ点が多く残されているのが現状である．
そこで著者らは，有機化学者との共同により，新たなフコースアナログの合成を行った．アジドフコースが原因不明の細胞毒性を示すことから，置換基の長さを改変したアルキン型フコースアナログを数種合成し，糖鎖プローブとしての適性を検証した．まず，フコース転移酵素の基質としての適性を in vitro の酵
素アッセイによって調べたところ，新たに合成した 7-アルキニルフコースと呼ばれる化合物が，これまで作られたフコースアナログの中で最も良い基質とな
ることがわかった．このことから，7-アルキニルフコースはこれまでのアナロ
グよりも糖鎖中に取り込まれやすく，感度の高いプローブとなることが示唆された．実際に，この糖アナログを細胞に添加し，取込まれた糖鎖をクリックケ
ミストリーによって検出したところ，従来のフコースアナログよりも高感度に糖鎖を検出できることがわかった．さらにグライコミクス解析により，7-アルキニルフコースは，コアフコースと呼ばれる N 型糖鎖の根元の位置にほとんど取り込まれることもわかった．また，アジドフコースのような顕著な細胞毒性は示さなかった．これらのことから，新たに合成した 7-アルキニルフコース
は，高感度なフコシル化糖鎖のプローブとなることが示された(Kizuka et al., Cell
Chem. Biol., 2016)．
一方，置換基の炭素鎖が 1 つ短い 6-アルキニルフコースを細胞に添加すると，プローブとしてよりも，むしろ内在性のフコシル化糖鎖を激減させる効果があ
ることがわかった．代わりにフコシル化されていない糖鎖が増加していたことから，この化合物はフコシル化を阻害していることがわかった．またその阻害効果は，既存のフコシル化阻害剤である 2-フルオロフコースよりも著しく高い
ことが明らかになった．6-アルキニルフコースによる阻害のメカニズムを明らかにするため，糖ヌクレオチドに着目した解析を行ったところ，この化合物の添加によって，内在性の GDP-フコースがほぼなくなり，その代わりに前駆体である GDP-マンノースが貯留することがわかった．このことから，6-アルキニ
ルフコースは GDP-フコースの生合成を阻害している可能性が強く示唆された．
実際に酵素アッセイに化合物を添加したところ，GDP-フコース生合成酵素の一つである，FX (TSTA3)の活性が特異的に阻害されることがわかった．さらに，
肝がん細胞に 6-アルキニルフコースを添加したところ，細胞増殖は影響を受けなかったが，浸潤は強く抑制された．以上のことから，6-アルキニルフコース
は，GDP-フコース合成酵素をブロックしてフコシル化を阻害し，それはがん転移抑制などの効果を有することがわかった(Kizuka et al., Cell Chem. Biol., 2017)．

New functional biopharmaceuticals via organic synthetic structural control

Tracing and functional modulation of glycans using sugar analogs○Hiroaki Asai
(GlyTech,Inc.)

Key words

glycosylated peptide, glycosylation, protein, chemical modification○Yasuhiko Kizuka(G-CHAIN, Gifu Univ.)

Key words

glycosylation, glycosyltransferase, sugar analog, click chemistry262

S3Mc05

バイオ医薬品開発を指向した化学合成糖鎖からのアプローチ○松崎 祐二（東京化成工業 糖鎖技術部）
Yuji.Matsuzaki@TCIchemicals.com

東京化成工業は試薬メーカーとして有機合成化学・材料科学・ライフサイエン
ス・糖鎖・分析化学など 28000 品目を超える研究用試薬をラインナップしており，1/3 は独自の製品として製造販売している．またその一部はバルク品として大量製造を行い ton レベルで供給している．
我々は，糖鎖科学のダイナミックな進展には安価な糖鎖の安定供給が必要であるとの想いから，有機化学試薬で培った量産化技術や大型製造設備を活用した
有機化学的な手法による糖鎖合成を進めている．また天然物抽出のヒト型糖鎖，
糖鎖転移酵素，レクチン，および抗糖鎖抗体などの関連試薬についても実用的に使用可能なスケールでの製造を目指している（下記 URL 参照）．

S3Mc06

エンドグリコシダーゼと機能性合成 N 型糖鎖を利用するネオ糖タンパク質医薬品の開発を目指して○伊藤 孝司 1,6, 西岡 宗一郎 1,6, 小林 功 2,6, 笠嶋 めぐみ 2,6,
立松 謙一郎 2,6, 瀬筒 秀樹 2,6, 松崎 祐二 3, 飯野 健太 3, 木下 崇司 4,
堂崎 雅仁 4, 灘中 里美 5, 北川 裕之 5（1徳島大院・医歯薬学研・創薬生命工, 2農研機構・カイコ機能
改変技術開発ユニット, 3東京化成工業, 4伏見製薬所, 5神戸薬科大・生化学, 6SERIREVO）
kitoh@tokushima-u.ac.jp

2AB 標識化糖鎖の一部は，経済産業省・国立研究開発法人日本医療研究開発機
構（AMED）の支援による次世代バイオ医薬品製造技術研究組合の組合員として，産業技術実用化開発事業費補助金・委託事業「国際基準に適合した次世代抗体医薬等の製造技術」により行われた．

近年，アスパラギン(N)結合型糖鎖の還元末端キトビオース構造を加水分解（切断）する，微生物由来エンドグリコシダーゼ（endo-M 及び endo-CC 等）は，N型糖鎖転移（トランスグリコシレーション）活性を併せもつことが，山本憲二
や竹川薫博士らにより解明された．また糖鎖転移活性が増強されたアミノ酸置
換型変異体 endo-M(N175Q)及び endo-CC(N180H)が開発され，各々東京化成工業（株）及び（株）伏見製薬所により製造・販売されている．さらに，これらのグ
ライコシンターゼと機能性糖鎖ドナー誘導体を利用し，アクセプター糖タンパ
ク質に付加された N 型糖鎖を機能性糖鎖と挿げ替えるという，日本発の糖鎖改変技術に基く，新規の糖タンパク質医薬品（ネオグライコバイオロジクス）開発への応用が期待されている．
リソソーム病（ライソゾーム病）は，リソソーム酵素の遺伝的欠損に基づき，
本来リソソーム内で分解されるべき基質の過剰蓄積と多様な全身症状を伴って発症する，一群の先天性代謝異常症（40 種余り存在）である．近年，正常なヒトリソソーム酵素遺伝子を導入した哺乳類培養細胞株（CHO や HT1080）により製造する組換えヒト酵素の，患者への補充療法が開発され，現在 10 種の疾患に対する酵素製剤が臨床応用されている．しかし哺乳類培養細胞株で製造される酵素製剤は高コストで，患者一人（40kg 体重）に対し，年間必要な酵素製剤（約 1g）を用いた治療にかかる医療費は 3 千万円以上/年といわれ，一回有効投
与量や投与回数を低減できることが望まれている．哺乳類細胞内では，他の N型糖タンパク質とは異なり，リソソームマトリクス酵素には，末端マンノース
6-リン酸（M6P）含有 N 型糖鎖が付加されることが生理的な特徴で，この特殊な末端 M6P 含有糖鎖構造が，ゴルジ体とエンドソーム間のシャトルとして働く
細胞内カチオン依存性 M6P レセプター（CD-M6PR）と結合した後，細胞内に取り込まれ，リソソーム内に輸送される．一方，細胞膜表面にも，この末端M6P 含有糖鎖を認識して結合するカチオン非依存性 M6P レセプター（CIM6PR）が存在するため，細胞外から末端 M6P 含有糖鎖をもつ組換えリソソー
ム酵素が投与されると，CI-M6PR との結合後，エンドサイトーシスにより取り込まれ，リソソームへと輸送され，蓄積基質を分解するという治療効果が現れる．
我々は，組換えヒト酵素原薬を低コストで大量生産するための新規生産基材として組換え（TG）カイコに着目し，農研機構・カイコ機能改変技術開発ユニットとの共同で，ヒト alpha-イズロニダーゼ（IDUA）やカテプシン A(CTSA)遺伝
子を絹糸腺で高発現する TG カイコ系統を樹立し，摘出絹糸腺または繭から，酵素活性や生物機能を保持した組換え IDUA や CTSA 前駆体タンパク質を簡便に抽出・精製することに成功してきた．また絹糸腺/繭由来の精製ヒト酵素に付加された N 型糖鎖は，昆虫特異的な糖残基を含まず，ヒト N 型糖鎖の部分構造をもつことが明らかになり，患者に対する糖鎖抗原性は低いと考えられる．しかしカイコ絹糸腺内で発現したヒト酵素には，末端 M6P 含有糖鎖は付加されなかった．従って精製酵素をそのまま患者体内に投与しても，CI-M6PR との結合を介した患者細胞内への取り込みとリソソームへの輸送は期待できなかった．
そこで我々は，東京化成工業（株）に，末端 M6P 含有高マンノース型糖鎖ドナー誘導体の合成を委託し，同社の改変型 endo-M(N175Q)を用い，アクセプ
ターとしての TG カイコ絹糸腺/繭由来の精製 IDUA（分子量 78kDa, 6 本の付加
N 型糖鎖をもつ）に対し，液相反応系で，末端 M6P 含有糖鎖への挿げ替えを試みた．末端 M6P 含有糖鎖ドナーと IDUA の分子比は 1,000：1 で行い，過剰な合成糖鎖ドナーが必要であるという改善すべき課題はあるものの，6 本存在す
る N 型糖鎖のうち，少なくとも 1 本を末端 M6P 含有糖鎖に挿げ替えることに成功した．また得られたネオグライコ IDUA を，IDUA 欠損症（ムコ多糖症 1型）患者由来培養線維芽細胞の培養系に投与したところ，CI-M6PR を介して取り込まれ，リソソームまで輸送され，欠損酵素活性を正常値以上に回復させるとともに，蓄積基質であるヘパラン硫酸等を減少させるという有効性を示し，
人工的な IDUA の高機能化が期待された．
さらに我々は，（株）伏見製薬所との共同で，同社の endo-CC(N180H)とシアリ
ルグライコペプチド（SGP）誘導体をドナー糖鎖として用い，アクセプター N
型糖タンパク質としての TG カイコ由来精製 IDUA への SG 転移反応条件を検討した．興味深いことに，endo-CC(N180H)による，SGP からの IDUA への SG転移反応は，酸性 pH 条件でも進行することが明らかになった．酸性 pH で安定に活性を示すリソソーム酵素に対し，失活を抑制しながら糖鎖転移反応を invitro で実施できる可能性が示唆された．
本講演では，まだ実施例が少ない，エンドグリコシダーゼ（グライコシンター
ゼ）による比較的高分子量の有用糖タンパク質の糖鎖改変技術に関して，TG
カイコで生産したヒトリソソーム酵素の例を紹介し，endo-M(N175Q）や endoCC(N180H)を用いる，ネオ N 型糖タンパク質の創製と医薬品開発への応用の可能性について議論したい．

Approaches of Chemical Synthetic Oligosaccharide Aiming for
Biopharmaceutical Development

Development of “Neoglycobiologics” produced by endoglycosidases withtransglycosylating activity and biofunctional synthetic N-glycans

バイオ医薬品は環境の変化に敏感な生物の生合成過程を経てつくられるため，製造工程において多様な影響を受けるなどバイオ医薬品製造におけるハードル
は高い．大きな影響を受ける要因の 1 つとしてタンパク質であるバイオ医薬品
が受ける遺伝子翻訳後の糖鎖修飾が挙げられる．医薬品規制に関する ICH（医薬品規制調和国際会議）ガイドラインにおいても糖鎖に関する記述があるように，現状ではバイオ医薬品の製造工程を厳密に管理することで糖鎖構造およびプロファイルが大きく変化しないように調整しているといえる．一定品質の糖タンパク質の製造には，タンパク質の特定の部位に特定の糖鎖を発現する技術開発が必要とされるが未だこの技術は確立されていない．
翻訳後修飾によって付加される糖鎖の不均一性は必然であり，糖タンパク質を分離精製することも極めて困難であることから，微細な糖鎖構造の違いによる機能の解析は実現されていない．遺伝子工学技術により改変された異種細胞から入手される糖タンパク質の糖鎖を，厳密に構造が制御された均一糖鎖に[後から載せ替える]糖鎖工学が確立されれば，遺伝子工学やタンパク質工学だけでは解決されないことが可能となり相補的に有効な方法といえる．ここでは，抗体Fc 領域などに存在する代表的なＮ型糖鎖の系統的合成，と糖タンパク質の糖鎖を[後から載せ替える]糖鎖改変について紹介する．
Ｎ型糖鎖の化学合成
糖鎖の化学合成は，位置及び立体選択的に制御が可能な単糖～3 糖程度のビル
ディングブロックを予め準備することで合成に要する全工程の約 80%が軽減できる．我々は多様な糖鎖構造に対応できるブロック原料について数百 L 規模の反応設備での合成を実現し，数 Kg レベルでの合成を可能としている．また，これらの合成は殆どの工程でカラムクロマト精製を必要としないことから更なる大規模製造も可能となっている．ここでは，ブロック原料を用いて天然からは極微量にしか得られない alpha1-3Gal や NeuGc を含む異種抗原糖鎖や，G1 と呼ばれる分子量や化学組成が同一の位置異性体など抗体医薬品に含まれる代表的なＮ型糖鎖の合成を行った．得られた糖鎖は HPLC，キャピラリー電気泳動(CE)，および MS での分析スタンダードとして還元末端を還元アミノ化法により 2-アミノベンズアミド(2AB)で標識した糖鎖を優先して合成した．
糖タンパク質の糖鎖を[後から載せ替える]糖鎖改変
山本らの開発したエンドグリコシダーゼ(Endo-M, Endo-M-N175Q)は，Ｎ型糖鎖の GlcNAc-GlcNAc 部分を切断して「糖鎖をまるごと他の化合物に付加できる」
酵素である．我々は，抗体医薬品の Fc 領域に存在する不均一な糖鎖を Endo-M
で切断して GlcNAc を露出させた後に，構造の明確な糖鎖を Endo-M-N175Q により位置選択的に導入することで，糖鎖の均一化された IgG 抗体を入手する事ができた．糖鎖改変反応は CE および TOF-MS で追跡し，糖鎖ドナーとしてキトビオースタイプを用いることで，タンパク質中アミノ基への非特異的な糖鎖付加も回避された．また抗体薬物複合体(Antibody-Drug Conjugate:ADC)開発への応用も想定し，薬物の連結可能な糖鎖を合成し IgG 抗体に導入を行った．糖鎖の改変技術は，目的に応じた構造の糖鎖を後から導入することで，既存の糖タンパク質に新たな機能を付与できる方法である．現状では糖鎖構造の違いにより転移効率が十分でない場合もあることから，効率性を補完する目的でレクチンを用いた糖鎖構造の違いによる糖タンパク質の精製法を検討している．また，保有する異種抗原糖鎖を活用し，alpha1-3Gal や NeuGc を含む異種抗原糖鎖を検出可能な抗糖鎖抗体も作製したのであわせて紹介する．
このような技術開発は，多くのアカデミアの協力を得て進められたものである．
基礎研究から医薬，医療研究の実用的な展開の一助となれば幸いである．
（
http://www.tcichemicals.com/ja/jp/support-download/brochure/categorized_pamphlets_4.html）○Yuji Matsuzaki(Dept. Glycotechnol., TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.)

Key words

glycoprotein, glycosylation, endoglycosidase, antibody○Kohji Itoh1,6, So-ichiro Nishioka1,6, Isao Kobayashi2,6, Megumi Kasashima2,6,
Ken-ichiro Tatematsu2,6, Hideki Sezutsu2,6, Yuji Matsuzaki3, Kenta Iino3,
Takashi Kinoshita4, Masahito Dozaki4, Satomi Nadanaka5, Hiroshi Kitagawa5(1Grad. Sch. Biomed. Sci., Tokushima Univ., 2Inst. Agribiol. Sci, Naro., 3Tokyo
Chem. Indust., Co. Ltd., 4Fushimi Pharmaceut., Co. Ltd., 5Dept. Biochem., Kobe
Pharmaceut. Univ., 6SERIREVO)
Key words
endoglycosidases, transglycosylation, lysosomal diseases, transgenic
silkworm

263

3Ca01

白麹菌における推定 RNA 結合タンパク質 NrdA の機能
解析

3Ca03

○門岡 千尋 1, 泉津 弘佑 2, 浅井 禎吾 3, 奥津 果優 1, 吉﨑 由美子 1,髙峯 和則 1, 後藤 正利 4, 玉置 尚徳 1, 二神 泰基 1
（1鹿児島大・農, 2滋賀県立大・環境科学, 3東大院・総合文化, 4佐賀大・農）futagami@chem.agri.kagoshima-u.ac.jp

黒麹菌における 1-octen-3-ol 生合成遺伝子の解析○片岡 涼輔 1, 植松 千暁 2, 長谷川 泰子 2, 渡邉 泰祐 1,2, 荻原 淳 1,2（1日大院・生資科, 2日大・生資科）
j-ogihara@brs.nihon-u.ac.jp【目的】白麹菌 Aspergillus luchuensis mut. kawachii は焼酎製造に用いられる麹菌であり，菌体外に多量のクエン酸を分泌生産する特徴をもつ．本研究では，クエン酸合成酵素遺伝子 citA の上流に高度に保存された推定 RNA 結合タンパク質をコードする nrdA 遺伝子に着目し，クエン酸高生産機構との関連を明らかにすることを目的として行った．
【方法・結果】まず，nrdA 遺伝子の破壊株の構築を試みたが，破壊株を取得できなかったため，Tet-On システムにより nrdA の発現を制御できる株を構築した．この Tet-nrdA 株は nrdA の発現誘導時のみコロニーを形成したことから，
白麹菌において nrdA は必須遺伝子であることが示唆された．Tet-nrdA 株は nrdAの発現誘導時においても，最小培地上で野生株と比較して生育が遅延し，菌糸に茶色い色素の沈着がみられた．また，菌体量あたりのクエン酸生産量を測定したところ，野生株と比較して約 10%に低下した．次に，N 末端に GFP を融合した GFP-NrdA の局在観察を行ったところ，GFP-NrdA は核に局在することが示唆された．以上の結果より，NrdA は白麹菌において生育に必須であるだけ
でなく，クエン酸生産や色素合成などをグローバルに制御する因子であることが示唆された．出芽酵母と分裂酵母におけるホモログである Nrd1 および Seb1
を Tet-nrdA 株において発現させたが，nrdA の発現非誘導時ではコロニーを形成できなかったため，Nrd1 および Seb1 は NrdA の機能を相補できないことが示唆された．

【背景と目的】沖縄県を代表する蒸留酒である泡盛に含まれる代表的な香気物質の 1 つとして 1-octen-3-ol が知られている．本化合物は不飽和アルコールの一種であり，Aspergillus 属糸状菌を含む真菌による生成に関する報告があるが，その生合成経路については明らかではない．泡盛醸造に使用される黒麹菌はAspergillus 属に属していることから，泡盛中に含まれる 1-octen-3-ol は黒麹菌によって生産されていると考えられる．そこで本研究では，黒麹菌において 1octen-3-ol 生合成に関与すると予想される脂肪酸オキシゲナーゼ ppoC の遺伝子破壊株を取得した．さらに，SPME-GCMS 法により，この遺伝子破壊株を用いて調製した麹における 1-octen-3-ol 生産性を確認した．
【方法および結果】Aspergillus luchuensis のゲノムデータベース上に，Aspergillus
nidulans において 1-octen-3-ol の生合成に関与すると予想されている ppoC 遺伝
子と相同性が高い遺伝子を見出した．得られた配列情報に基づいてドメイン解析を行った結果，本遺伝子は A. nidulans の ppoC 遺伝子と同様に N 末端にヘム
ペルオキシダーゼドメイン，C 末端側にシトクロム P450 ドメインを有することが明らかとなった．一方，形質転換の選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を選抜し，その両側に上記候補遺伝子の上流および下流域を 1.5 kb ず
つ連結した ppoC 遺伝子破壊用カセットを構築した．プロトプラスト-PEG 法による形質転換を実施し，得られた形質転換体について，ゲノム PCR により遺伝子破壊を確認した．また，得られた遺伝子破壊株を用いて調製した麹について，
SPME-GCMS 法による香気物質の分析を行った．その結果，ppoC 破壊株で製麴した麹に含まれる 1-octen-3-ol 量は，親株の麹と比較して明らかに低下していたことから，本遺伝子が A. luchuensis の 1-octen-3-ol 生合成に関与していることが示された．

Characterization of putative RNA binding protein NrdA in Aspergillus
kawachii.

Analysis of 1-octen-3-ol biosynthetic gene in Aspergillus luchuensis○Ryousuke Kataoka1, Chiaki Uematsu2, Taiko Hasegawa2, Taisuke Watanabe1,2,
Jun Ogihara1,2(1Dept. Grad. Sch. Biores. Sci., Nihon Univ., 2Coll. Bioresour. Sci., Nihon Univ.)○Chihiro Kadooka1, Kosuke Izumitsu2, Teigo Asai3, Kayu Okutsu1,
Yumiko Yoshizaki1, Kazunori Takamine1, Masatoshi Goto4, Hisanori Tamaki1,
Taiki Futagami1(1Fac. Agric., Kagoshima Univ., 2Grad. Sch. of Env. Sci., Univ. of Shiga Pref.,,3Grad. Sch. Arts Sci., Univ. Tokyo, 4Fac. Agric., Saga Univ.)
Key words
Aspergillus kawachii, citric acid, RNA binding protein, gene regulation

Key words

Aspergillus luchuensis, 1-octen-3-ol, volatile, SPME-GCMS

3Ca02

3Ca04

泡盛黒麹菌 Aspergillus luchuensis の系統解析と毒素関連遺伝子の解析

プロテアーゼを高生産する黒麹菌の育種と芋焼酎醸造試
験による評価○瀬戸口 翔 1,2, 益留 綾菜 2, 一谷 勝之 3, 橋本 文雄 3,
吉田 理一郎 3, 岡本 繁久 3, 内海 俊樹 4, 尾上 昌平 5, 岩井 謙一 2,
髙瀬 良和 2, 二神 泰基 3, 玉置 尚徳 3（1鹿児島大院・連農, 2霧島酒造, 3鹿児島大・農, 4鹿児島大院・理工, 5鹿児島大・RI）
s-setoguti@kirishima.co.jp

阿部 峻之 1, 東 春奈 1, 外山 博英 2, 水谷 治 2, 山田 修 3,
○塚原 正俊 1（1バイオジェット, 2琉球大・農, 3酒総研）
tsuka@biojet.jp【背景・目的】
我々は以前，黒麹菌のプロテアーゼ遺伝子 pepA 破壊株および高発現株を用いて芋焼酎醸造試験を行い，プロテアーゼ活性と芋焼酎の香気成分（高級アルコー
ル類・エステル類）に相関があることを報告している．以上の結果から，プロ
テアーゼ活性は焼酎麹菌の育種指標として有望と考えられたため，本研究では遺伝子組換えを用いない方法でプロテアーゼ高生産黒麹菌を取得し，芋焼酎醸
造試験により育種株の醸造特性を評価した．
【方法・結果】
黒麹菌 Aspergillus luchuensis J7-2 株に日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研
究所イオンビーム照射研究施設（TIARA）に設置されている AVF サイクロトロンの深度制御種子照射装置によって 220 MeV 炭素イオンビーム（12C5+）を照射し，1％カゼインを含む CD 培地でハローの大きさを指標に選抜した．次に，ハローが最も大きかった CSH-1 株を用いて米麹を作製し，酵素活性を測定した．その結果，酸性プロテアーゼ活性が親株の 4.8 倍，酸性カルボキシペプチ
ダーゼ活性が親株の 2.5 倍と高かったが，β-グルコシダーゼ活性は親株の 4 分の 1 と低かった．最後に得られた米麹を用いて芋焼酎の醸造試験を行った．二次もろみ中のアミノ酸濃度は親株のものと比較して 2 倍程度高くなった．また，親株製の焼酎と比較して高級アルコール類やエステル類が減少する傾向が確認され，この結果は以前の pepA 高発現株を用いた試験結果と一致した．さらに，
CSH-1 株を用いた二次もろみはアルコール濃度が高く，原料あたりのアルコー
ル収得量も高くなった．
【謝辞】
本研究は原子力機構施設利用共同研究制度の支援を受けて行われた．

黒麹菌は，沖縄県の伝統的酒類である「泡盛」の醸造に用いられる麹菌である．
黒麹菌は，複数の遺伝子配列を対象とした系統解析により，系統学的に独立した群を形成していることが確認されたことから Aspergillus luchuensis として再定義された．一方，泡盛醸造には異なる A. luchuensis 株を混合した複菌麹が用いられており，個々の株が異なる特性を有することが経験的に知られると共に，それぞれの株の特性を効果的に活用している．本研究では，A. luchuensis を含む多数の系統を対象として遺伝子情報を取得し，近縁種間の系統関係，あるいは A. luchuensis での種内系統関係を明らかにすることを目的とした．解析対象の菌株は，琉球大学に保存されている沖縄由来の株（酒造所あるいは自然環境から採取）および公共機関・研究所の供託菌株を用いた．各株のゲノム情報を次世代シーケンサー Miseq により取得し，A. luchuensis NBRC4314 にマッピン
グすることで得られた変異情報を比較することで系統解析を行った．その結果，解析に供した黒アスペルギルス全体は，大きく 3 つの群 A. luchuensis，A.
tubingensis，A. niger に分かれた．さらに，今回の手法によりそれぞれの種間の詳細な距離や種内の相互関係など詳細な情報が得られることがわかった．一方，A. luchuensis の種内の系統解析結果から，A. luchuensis は大別して 2 グループに分かれること，およびこれらのグループの分岐は約 400 年前と推定された．さらに，シーケンスによって得られたリードの情報から，カビ毒関連遺伝子（オクラトキシン，フミノシン）が完全に欠落していること，種によりその欠落様式が異なることが明らかになった．

Breeding of black koji mold which produces high levels of protease andevaluation by sweet potato shochu brewing test

Detailed phylogeny of Aspergillus luchuensis with whole genome
comparison○Sho Setoguchi1,2, Ayana Masudome2, Katsuyuki Ichitani3, Fumio Hashimoto3,
Riichiro Yoshida3, Shigehisa Okamoto3, Toshiki Uchiumi4, Masahira Onoue5,
kenichi Iwai2, Yoshikazu Takase2, Taiki Futagami3, Hisanori Tamaki3(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Kagoshima Univ., 2Kirishima Shuzo, 3Fac. Agric.,
Kagoshima Univ., 4Grad. Sch. Sci. Eng., Kagoshima Univ., 5RI., Kagoshima Univ.)
Key words
Aspergillus luchuensis, protease, sweet potato shochu

Takayuki Abe1, Haruna Azuma1, Hirohide Toyama2, Osamu Mizutani2,
Osamu Yamada3, ○Masatoshi Tsukahara1(1Biojet, 2Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 3NRIB)
Key words
Aspergillus luchuensis, Awamori, phylogenetic analysis, Next
generation sequencer

264

3Ca05

Aspergillus luchuensis 由来フェノール酸脱炭酸酵素の各
種米麹中の発現量と泡盛もろみおよび蒸留液中の 4-VG
量の相関

3Ca07

Visualizing metabolites in rice koji using MALDI
imaging mass spectrometry○Adinda Putri Wisman1, Yoshihiro Tamada2, Takahiro Akashi2,
Katsuya Gomi3, Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd.,
3
Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp○眞榮田 麻友美 1, 渡嘉敷 正司 2, 渡嘉敷 みどり 2, 上地 敬子 1,
平良 東紀 1
（1琉球大・農, 2石川種麹店）
tokey@agr.u-ryukyu.ac.jp【目的】泡盛とは，米を原料として Aspergillus luchuensis を用いて造った麹を酵母によって発酵させ，得られたもろみを蒸留し製造される沖縄の伝統的な蒸留酒である．3 年以上貯蔵された泡盛は古酒と呼ばれる．泡盛古酒の特徴香の 1つであるバニリンは，米から遊離されたフェルラ酸（FA）が醸造中に 4-ビニル
グアヤコール（4-VG）へ変換され，貯蔵中に非酵素的酸化によって生成されると考えられている．我々は，これまでに A. luchuensis var. awamori ISH1 株由来
フェノール酸脱炭酸酵素（AlPAD）が FA を 4-VG に変換する活性（FAD 活性）を有し，製麹中に発現していることを確認している．本研究では，製麹時間及び原料米の違いによる麹中の FAD 活性と AlPAD の発現量を調べると共に，これらの量ともろみ及び蒸留液中の 4-VG 量に相関があるかどうかを検討した．
【方法及び結果】ジャポニカ米の精白米（JW），ジャポニカ米の二分搗き玄米（JB）またはインディカ米の精白米（IW）を用いて製麹を行い，一定時間毎にサンプリングを行った．製麹時間の異なる麹の無細胞抽出液の FAD 活性測定と，ウエスタンブロッティングによる AlPAD の発現量を定量した．その結果，
どの原料米においても製麹時間が長い程，FAD 活性と AlPAD の発現量が増大することが分かった．その中でも，JB の FAD 活性と AlPAD の発現量が最も高かった．製麹時間の異なる麹を仕込み，もろみ中の FA と 4-VG を定量した結果，製麹時間が長くなると FA は減少し，4-VG は増大していることが確認された．蒸留液中の 4-VG 濃度はもろみ中の濃度と正の相関があり，その濃度は JBが最も高く，次に IW が高かった．以上の結果より，麹中の AlPAD の発現量と，もろみ及び蒸留液中の 4-VG 量には正の相関があることから，麹中でのAlPAD の発現量を増やすことによって，バニリン香に富む泡盛古酒の原酒の製造が可能となることが示唆された．

Rice koji, which is made by inoculating Aspergillus oryzae on steamed rice, is one of
the most important materials for Japanese sake. As the first step in production, koji
condition is thought to considerably influence sake quality. Koji quality check during
sake production is usually done by experienced sake brewers through observation of
hazekomi, or how the mold penetrate the steamed rice. Visualization of compound
distribution inside rice koji is required to understand the correlation between koji
quality and its physical properties. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging
mass spectrometry (MALDI-IMS) is considered to be a powerful technique for directly
observing target compounds without labeling, making it suitable to investigate theproperties of rice koji.
In our study, we first developed a method to section rice koji, as it is fragile and hard tomaintain the morphology during sectioning process. We also considered the choice of
matrix application method to obtain comprehensible compound distribution
information. The optimized sectioning and matrix application method were thenapplied to analyze rice koji and several compounds with interesting distribution were
found. A specially developed rice koji inoculated with Aspergillus oryzae strain
inserted with green fluorescence protein (GFP) was used to map the mycelia growth
inside rice koji, making it possible to link between compound distribution and physicalproperties of rice koji affected by the penetration of the mold.

Correlation between the amounts of Aspergillus luchuensis phenolic aciddecarboxylase in several rice koji and the amounts of 4-vinylguaiacol in
Awamori moromi and distillate

Visualizing metabolites in rice koji using MALDI imaging mass
spectrometry

Key words
Aspergillus luchuensis, phenolic acid decarboxylase, Awamori, 4vinylguaiacol

Key words

rice koji, imaging mass spectrometry, MALDI-IMS

3Ca06

3Ca08

イメージング質量分析を用いた清酒における麹米品種の特性解析○Mayumi Maeda1, Masashi Tokashiki2, Midori Tokashiki2, Keiko Uechi1,
Toki Taira1(1Fac. Agric., Univ. Ryukyus, 2Ishikawa Tanekouji)

黄麴菌 Aspergillus oryzae におけるペプチダーゼ遺伝子の転写に窒素源が与える影響○Adinda Putri Wisman1, Yoshihiro Tamada2, Takahiro Akashi2, Katsuya Gomi3,
Eiichiro Fukusaki1, Shuichi Shimma1(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd., 3Grad. Sch.
Agric. Sci., Tohoku Univ.)○白石 敦士, 前田 浩, 山形 洋平（農工大院・農）y-yama@cc.tuat.ac.jp○玉田 佳大 1, Wisman Adinda Putri 2, 窪寺 隆文 1, 明石 貴裕 1,
福﨑 英一郎 2, 新間 秀一 2
（1白鶴酒造, 2阪大院・工）yoshihiro-tamada@hakutsuru.co.jp【背景と目的】黄麴菌 Aspergillus oryzae は，硝酸イオンやアミノ酸など様々な窒素源を利用して生育することができる．菌体外に分泌されるジぺプチジルペプ
チダーゼをコードする遺伝子 dppB の転写がタンパク質基質によって誘導され，無機窒素源の添加で抑制されることなどから，周囲の窒素源の状態に応答してペプチダーゼ遺伝子が制御されている可能性が示唆された 1)．そこで A. oryzae
における窒素源に対するペプチダーゼ遺伝子の転写応答制御機構を解明することが本研究の目的である．
【方法と結果】 A. oryzae RIB40 株を硝酸ナトリウムを窒素源として 48 時間培養した後，窒素源を切り替えて 4 時間培養した．切り替え後の窒素源として硝酸ナトリウム，硫酸アンモニウムなどの無機化合物， L- グルタミン酸，L- ロイ
シン，L- アルギニン などのアミノ酸，牛血清アルブミン，大豆タンパクなどのタンパク質をそれぞれ用いた．この条件下でペプチダーゼ遺伝子の転写量を定量 PCR によって調べたところ，ほとんどのペプチダーゼ遺伝子の転写は硝酸ナ
トリウムからアンモニアや L-グルタミン酸，L- アルギニンに切り替えた場合には大きな変動が見られなかった．一方，タンパク質を窒素源とした場合には多くのペプチダーゼ遺伝子の転写量が上昇し，L-ロイシンでも同様な転写量の変化がみられた．以上のことから麹菌でのペプチダーゼ遺伝子の転写はアミノ酸の種類やタンパク質の種類によって異なっていることが明らかになった．その他のアミノ酸によるペプチダーゼ遺伝子の転写変動についても報告する予定である．
1)Maeda H, et al., App. Microbiol. Biotech., 100 (11), 4947-4958 (2016)【背景と目的】白鶴錦は，山田穂と渡船 2 号を交配・育種した山田錦の兄弟酒米品種である．我々はこれまでに，精米歩合 38%の大吟醸酒において，白鶴錦製
成酒は山田錦とは異なる官能特性を持ち，グリセロール，エリスリトールといった糖アルコール量の多さがその一因である可能性を明らかにした 1)．また，この成分的特性は白鶴錦の麹米としての特性に由来することを確認した 2)．麹菌
は固体培養において，低水分活性時に糖アルコールを多く生成することが報告されている 3)．米麹内の水分活性の分布はグルコース濃度の分布と逆相関すると考えられる 4)ことから，両品種では米麹中のグルコース分布に違いがあると推察した．そこで本研究では，イメージング質量分析を用いて両品種の米麹中のグルコース分布を比較し，麹米品種としての特性の違いの解析を試みた．
【方法と結果】精米歩合 38%の浸漬米の電子顕微鏡観察により，白鶴錦は山田錦とは異なる米粒構造を有しており，米の外側が軟質である傾向を確認した．
また，主要酵素活性が揃った米麹の電子顕微鏡観察の結果，白鶴錦の方が米の外側がよく分解されている傾向があった．続いて，イメージング質量分析を行い，麹菌の破精込みが集中していると考えられる外周部において，白鶴錦の方がグルコース濃度が高い傾向を確認した．本研究により，麹米品種による米粒構造の違いと麹菌代謝物，ひいては清酒成分の違いを紐付けることができた．
これまでに，米粒構造と清酒の酒質の関連性の詳細な解析を試みた報告はなく，こうした知見は酒米品種の特性を活かした醸造方法の開発に繋がると期待される．
1) 玉田ら：日本醸造協会誌，112，827-835 (2017)2) 玉田ら：日本醸造協会誌，110，786 (2015)3) Ruijter G. J. et al.: Microbiology.，150，1095-101 (2004)
4) 小林：日本醸造協会誌，104，726-742 (2009)

Effect of nitrogen sorce on peptidase gene transcription in Aspergillus

Characteristic analysis of rice varieties in koji making using imaging mass
spectrometry

oryzae○Atsushi Shiraishi, Hiroshi Maeda, Yohei Yamagata(Grad. Sch. Agric., Tokyo Univ. Agric. Technol.)Key words

Aspergillus oryzae, nitrogen metabolism, transcriptome○Yoshihiro Tamada1, Adinda Putri Wisman2, Takafumi Kubodera1,
Takahiro Akashi1, Eiichiro Fukusaki2, Shuichi Shimma2(1Hakutsuru Sake Brewing Co., Ltd., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

sake, rice koji, imaging mass spectrometry

265

3Ca09

生もと系酒母製造工程において各種微生物が呈味成分に
与える影響

3Ca11

○高橋 正之, 喜多 靖子, 向井 伸彦（酒総研）
m.takahashi@nrib.go.jp

濃縮果汁を用いたワイン発酵における発酵遅延の原因成分の同定と改善法の開発○菊地 のぞみ 1, 稲留 弘乃 2, 高橋 沙織 2, 篠原 裕之 3, 鈴木 克彦 1,
吉田 聡 1, 高田 良二 1
（1キリン・ワイン技術研, 2キリン・酒類技術研, 3キリン・基盤技術研）
Nozomi_Kikuchi@kirin.co.jp【目的】生もとや山廃酒母造り（以下，「生もと系酒母」）では，乳酸菌の生育誘導により低 pH 環境を作り，好ましくない微生物の生育を抑制することで清酒醸造に適した醸造環境を造り出している．一方で，製造場毎に初期の細菌叢は多様性があり，乳酸菌が生育誘導されるまでのプロセスも異なることから，その製造工程において多くの微生物が関与していると考えられており，その成分変化も多様である可能性が高い．本研究では複数の製造場の生もと系酒母の製造工程における成分変化を解析し，製造場間で違いのあった成分について差異の原因となる細菌を特定することを目的とした．
【方法】東日本から 2 場，西日本から 3 場の計 5 場の清酒製造場から提供を受けた生もと系酒母の経時サンプルを解析した．細菌叢は，酒母試料からリン酸緩衝生理食塩水で菌体を回収し，ハイスループットシーケンサー及び定量 PCR 法
を用いて網羅的に定量した．成分については，有機酸，アミノ酸，アミン及び糖類を対象とし，液体クロマトグラフで定量した．
【結果と考察】今回定量した多くの成分で製造場毎に違いが見られたが，特にアルギニンで含有量に大きな差があった．アルギニンを基質とした代謝物としてはアグマチンかシトルリン及びオルニチンが考えられたため，それらの定量結果と比較したところ，原料米から溶出したアルギニンはオルニチンあるいはアグマチンに変換されていることが示唆された．これらの代謝を行っている細菌を推定したところ，オルニチンへの変換には Lactobacillus 属細菌などが，アグマチンへの変換には Pantoea 属などいくつかの細菌が関与していることが示唆された．したがって，生もと系酒母では生育する細菌叢の違いが，味の多様性の一因になっていると考えられた．

【目的】わが国では，濃縮還元果汁をワイン用原料として使用するケースがある．しかしながら，これらの濃縮果汁は製造時に使用するブドウの品種，ブド
ウの産地，サプライヤーなどの違いによって品質が異なり，使用する果汁によっては発酵が遅延する場合もみられる．本発表では，これらの中で特に白ワイン
醸造における発酵遅延に注目し，発酵遅延に影響を及ぼす成分の同定と発酵遅延改善を検討した結果について報告する．
【方法】産地やサプライヤーの異なる数種類の白濃縮果汁について網羅的な成分分析を行った．分析結果から発酵遅延の原因になっていると推察された成分を同定し，それらを発酵時に追加添加することで発酵改善がみられるか検証した．
最後に，発酵改善に効果のみられた成分についてはその成分を多く含む発酵助
成剤を探索し，添加効果を検証した．
【結果】今回調査した白濃縮果汁の成分分析から，発酵性の良い果汁と悪い果汁の間には特にビタミン B 類の含有量に差があることが明らかとなった．そこ
で，各種ビタミン B 類の添加試験，オミッション試験を行ったところ，ニコチン酸が顕著な発酵改善効果を示した．続いて発酵助成剤の中でニコチン酸含量の高い助成剤を探索し，添加，発酵試験を行った結果，ニコチン酸を添加した
際と同様に発酵が改善された．以上のことから，今回の白濃縮果汁の発酵遅延の原因の一つはニコチン酸含有量であることが示された．
【考察】ニコチン酸は NAD や NADP のような補酵素の前駆体であり，発酵中の代謝で重要な役割を担う成分である．本研究において，栄養成分が不足しがちな濃縮果汁に関しては，ニコチン酸の不足が発酵遅延を引き起こすファクターとなっていることが考えられた．

Effect of microbiota on taste components composition during kimoto starter
culture making.

Investigation and improvement of fermentation delay in wine making fromconcentrated juice○Masayuki Takahashi, Yasuko Kita, Nobuhiko Mukai(NRIB)○Nozomi Kikuchi1, Hironori Inadome2, Saori Takahashi2, Hiroyuki Shinohara3,
Katsuhiko Suzuki1, Satoshi Yoshida1, Ryoji Takata1(1Res. Lab. Wine Technol., Kirin Co., Ltd., 2Res. Lab. Alc. Bev. Technol., Kirin Co.,
Ltd., 3Cent. Lab. Key Technol., Kirin Co., Ltd.)Key words

kimoto, bacterial diversity, arginine, ornithine

Key words

fermentation, Concentrated juice, wine, Nicotinic acid

3Ca10

清酒酵母のアルギニン取込能の差に起因するタンパク質
解析

3Ea01

抗菌性物質が皮膚常在菌の生理活性に及ぼす影響の解析○清野 珠美, 和田 潤, 廣岡 青央（京産技研）
kiyono@tc-kyoto.or.jp○菊田 実花, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【背景・目的】きょうかい酵母を麹汁培地で培養した時の，アミノ酸取込能を調べたところ，酵母によってアルギニンの取込能に差があることを見出した 1)．
アルギニンは清酒の苦味に大きく寄与するアミノ酸であるため，酵母のアルギ
ニン取込能の差の原因を解明し，この機能を制御することができれば，清酒の苦味の制御につながることが期待できる．そこで，窒素源をアルギニンのみにした合成培地で清酒酵母を培養した時の，酵母のタンパク質発現解析を行い，アルギニン取込能の差との関連を調べることを試みた．
【方法】5%グルコース-500 ppm アルギニン-YNB 培地（硫酸アンモニウム，ア
ミノ酸不含）を用いて，きょうかい酵母 701 号と 901 号を，15℃，5 日間培養
した．培養 2 日目から 5 日目までの濁度と培地アルギニン濃度を分析し，同時に酵母菌体のタンパク質発現解析を，二次元電気泳動法を用いて行った．
【結果】培養中の濁度は両酵母で大きな差はなかった．培地アルギニン濃度は培
養 3 日目から 701 号よりも 901 号の方がより減少し始めたことから，901 号の方がよりアルギニンを取り込んでいることが示唆された．タンパク質解析の結果，特徴あるタンパク質として，901 号の方が発現量が大きい Spot 1，2 が見出され，PMF 解析によりタンパク質を同定した．
1) 清野ら，第 68 回日本生物工学会大会要旨集, p.187 (2016)[目的] 私たちの皮膚は日常的に，抗菌性物質（防腐剤，抗菌剤，抗生物質等）と接触する機会が数多くある．品質管理などの観点から製品中の微生物の防除（静菌や殺菌など）を目的に抗菌性物質が使用されているが，これらの抗菌性物
質が皮膚常在菌に及ぼす影響は十分に解析されているとは言い難い．皮膚常在菌は，侵入する微生物から肌を守るバリア機能や肌の保湿などの様々な役割を果たしている．そのため，抗菌性物質が皮膚常在菌に与える影響の解析は，抗菌性物質を安全に使用するために必要である．抗菌剤であるトリクロサンは，数多くの製品に使用されている．しかし，近年では EU や USA を始め，日本でもその安全性が疑問視されている．本研究では，抗菌性物質のモデルとしてト
リクロサンを対象に，皮膚常在菌の生理活性に及ぼす影響の解析を試みた．
[方法と結果] 任意の濃度のトリクロサンを添加した培地を用いて，皮膚常在菌（Staphylococcus epidermidis や Staphylococcus aureus）を培養したところ，トリク
ロサン濃度が高くなると，両菌の誘導期の時間が長くなる現象が見られた．日
常的なトリクロサンの使用を模倣した系として，任意の濃度のトリクロサンを添加した新鮮培地を用いて，両菌を継代培養したところ，誘導期の時間が約 24h から 3 h に大幅に短縮した．種々検討した結果，皮膚常在菌がトリクロサンに耐性を示すようになった可能性が示唆された．さらに，トリクロサン耐性の獲得により，増殖の挙動や抗生物質に対する応答の変化が認められた．以上の結果から，トリクロサンの使用にあたっては皮膚常在菌への影響を配慮する必要性が示唆された．現在，トリクロサン耐性を獲得した皮膚常在菌の生理活性の変化，他の皮膚常在菌や抗菌性物質の系についても検討中である．

Protein analysis of sake yeast for difference of arginine uptake

Influence of antibacterial substances on the physiological activities ofindigenous skin bacteria○Tamami Kiyono, Jun Wada, Kiyoo Hirooka(KITC)

Key words

sake yeast, 2D electrophoresis, arginine uptake○Mika Kikuta, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

antibacterial substances, indigenous skin bacteria, resistance, triclosan

266

3Ea02

抗菌性食品添加物が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響
の解析

3Ea04

○箱田 優奈, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

増殖の速い微生物が環境試料からの微生物の培養化に及ぼす影響の解析と利用
長谷川 智弘 1, ○原田 玲奈 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp[目的] 抗生物質の摂取は，耐性菌の出現やヒト腸内細菌叢の変化を生じさせると共に，その影響が肥満やアレルギー及び自閉症等の現代病と関連がある可能性が示唆されている．しかし，食を通じて日常的に摂取される保存料などの抗菌性食品添加物が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響は十分に検討されておらず，
未解明である．本研究では，抗菌性食品添加物が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響の解析を試みた．
[方法と結果] モデル腸内細菌として，乳酸菌（Lactobacillus gasseri JCM1130）と大腸菌（Escherichia coli K12）を，抗菌性食品添加物のモデルとして安息香酸（BeA）とソルビン酸（SoA）を実験に用いた．BeA と SoA をそれぞれ添加した培地と両菌を用いて種々，比較培養をおこなった．L. gasseri に対して BeA とSoA は同様に高い抗菌性を示した一方，E. coli に対し，BeA は L. gasseri と比べて抗菌性が低く，SoA の方が BeA に比べて高い抗菌性を示した（L. gasseri とE. coli で BeA と SoA に対する感受性が異なった）．BeA あるいは SoA を添加した培地で L. gasseri を継代培養した結果，いずれも増殖速度に変化は認められなかった．同様に E. coli を継代培養した結果，SoA 添加培地では増殖速度に変化は認められなかったが，BeA 添加培地では比増殖速度が継代前の約 0.78 倍に低下した．また，LAL 固定化ビーズ法 1, 2)を用いて，BeA 添加培地で培養した E.
coli の，菌体内と培養液中のエンドトキシン（ET）濃度を測定した結果，コントロールに比べて ET 量が変化した．現在，他の食品添加物や腸内細菌などについても検討中である． 1, 2) H29 日本生物工学会大会要旨集 p. 242, 243【目的】 寒天平板培養法は微生物の単離培養に広く用いられてきたが，これまでに単離培養された微生物は自然界に存在する微生物の 1％程度であり，その限界が指摘されている．現在，残された 99％の未培養微生物（microbial dark
matter）の培養化，利用が国内外の学術，産業界で求められている．我々は，未培養微生物の培養化を目指し検討する中で，環境試料に含まれるサイズが大きい微生物を除去すると，培養化する微生物の多様性が拡大することを見出した．
本研究では，更なる未培養微生物の培養化を目指し，これまでの知見に加え，増殖の速い微生物に着目し，検討をおこなった．
【方法と結果】 フィルター濾過した土壌試料を，R2A 寒天培地で培養し，増殖の速い微生物による培地成分（グルコース）の消費挙動を調べた結果，培養開
始から数日で寒天培地上のグルコースを広範囲で枯渇させることが明らかとなった．さらに，種々検討した結果，培養初期に優占化する微生物が他の微生物の生育を阻害（増殖の速い微生物の代謝産物が他の微生物の培養化を阻害）している可能性が示唆された．増殖の速い微生物を排除して培養をおこなうために，
コロニー切除法を考案，開発した．環境試料からサイズが大きい微生物を排除し，コロニー切除法を適切に使用することで，特異的に培養化する微生物が見られた．以上の結果より，増殖の速い微生物を排除することは未培養微生物の培養化に有効であることが示唆された．

Analysis of influence of antimicrobial food additives on the physiologicalactivities of intestinal bacteria

Influence of fast-growing microbes on culturing microbes in environmental
samples and it’s application○Yuna Hakoda, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

3Ea03

Tomohiro Hasegawa1, ○Reina Harada2, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Coll. Agro-bio. Resour. Sci., Univ.
Tsukuba)endotoxin, Escherichia coli, food additives, Lactobacillus gasseri

Key words

agar plate, microbial dark matter, pretreatment, fast-growing microbes

皮膚常在菌の増殖に対する化粧品添加の影響

3Ea05

植物試料の凍結前処理が培養微生物群集に与える影響の解析○多賀 直彦, 今村 香乃, 大場 輝, 川上 茅咲（東海大・農）ntaga@agri.u-tokai.ac.jp○小林 和輝, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp【目的】ヒトの皮膚には，皮膚腺や汗腺などに一定の細菌群が定着しており，これらの皮膚常在菌は，皮脂，pH，および温度などの影響を受けつつ常に皮膚上に存在している．皮膚常在菌は，宿主と共生状態にあり，外来性の微生物の侵入や定着を防御し感染を防ぐ役割をしている．本研究は，皮膚常在菌に化粧品が与える影響を調べるため，皮膚常在菌 3 菌株について，培養特性，培養における市販化粧水添加の影響および混合培養について検討した．
【方法】使用菌株は，Staphylococcus epidermidis NBRC 100911，Staphylococcus
aureus NBRC 102135,および Corynebacterium amycolatum NBRC 15207 を用いた．
使用培地は，702 液体培地を用いた．培養分析は，検鏡，培養液 pH，培養液濁度，および CFU と全菌数を分析した．
【結果】培養試験により 3 菌株それぞれの培養特性が得られ，最大培養液濁度はほぼ同じだったが生菌数に違いがあった．化粧水添加での増殖は，S. epidermidis
は増殖阻害，S. aureus は増殖亢進，C. amycolatum は影響無しだった．化粧品添
加濃度により培養液 pH の変化が異なった．S. epidermidis と S. aureus の混合培養の結果，培養液濁度はそれぞれの単独培養より高く，CFU は S. epidermidis の方が S. aureus よりも高かった．培養液濁度および CFU は最大値に到達した後にともに減少したが，培養終了時の CFU は S. aureus の方が S. epidermidis より高くなった．混合培養での増殖期による 2 菌種の増殖の違いが示された．

【緒言】 一般的に植物から微生物を分離培養する際，破砕などの物理的前処理が行われることが多い．しかしながら，植物細胞の損傷により，ファイトアレ
キシン，活性酸素種（ROS），揮発性抗菌物質などが急速に生成されることが知られている．我々は植物の防御反応が微生物を分離培養する際に影響を与えている可能性を考え，凍結処理などの適切な前処理により，植物の防御反応を停止し，その影響を排除すれば，従来とは異なる新規微生物を分離培養できるのではないかと発案した．本研究では，植物試料の凍結前処理が培養微生物群集に与える影響の解析とその利用について検討をおこなった．
【方法と結果】 モデル植物試料としてニチニチ草の葉を用いて実験を行った．
試料の前処理として，(1): 液体窒素による試料の凍結，(2): ROS の除去を目的とし，カタラーゼ溶液中で試料を液体窒素で凍結，(3): (1) と (2)で試料を凍結しない条件，を設定した．それぞれの前処理後，葉を破砕し，R2A 培地で 1 週間培養し，CFU の計数と，変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）法による培養微生物群集の比較解析を行った．各条件において，液体窒素を用いた凍結により CFU の減少が認められ，凍結によりダメージを受ける微生物の存在が示唆された．一方，DGGE 法による解析の結果，凍結処理を行った条件で特異的に培養化する微生物の存在が示唆された（特に，(2) の条件で多数認められた）．
クロマツの葉を用い同様の実験をおこなった結果，(2)の条件で特異的に培養化する微生物（Acidobacteria 門と推定）の存在が示唆された．現在，凍結により微生物が受ける影響の解析，カタラーゼ以外の抗酸化剤の利用，等について検討中である．

Effect of cosmetic addition on the proliferation of skin indigenous bacteria

Effect of freezing pretreatment of plant samples on cultured microbialcommunity○Naohiko Taga, Yoshino Imamura, Hikaru Ooba, Chisa Kawakami(Sch. Agric., Tokai Univ.)

Key words

cosmetic, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus○Kazuki Kobayashi, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

liquid nitrogen, microbial community, PCR-DGGE, plant sample

267

3Ea06

模擬微小重力培養が腸内細菌の生理活性に及ぼす影響の解析(第 3 報)

3Ea08

長谷川 文香 1, ○増田 亜理沙 2, 青柳 秀紀 1,2（1筑波大院・生命環境, 2筑波大・生物資源）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp

Streptomyces 属放線菌由来の Poly(ε-L-lysine) が示す抗真菌作用機構の解析○松井 旺大 1, 星山 貴文 1, 永田 智 1, 竹原 宗範 1, 野村 亘 2,
井上 善晴 2
（1滋県大院・工・材料科学, 2京大院・農・応用生命）
takehara@mat.usp.ac.jp[緒言] 従来法で培養可能な微生物は，自然界に存在する微生物の 1％前後であることが示唆され，新たな培養法が求められている．我々は微小重力場を形成し，優れた拡散や低剪断力環境を有する模擬微小重力（LSMMG）培養に着目し，ヒトと綿密な相互作用がある種々の腸内細菌の生理活性に及ぼす影響を解析した．その結果，通常重力（NG）培養とは異なる挙動が認められた 1)．今回
は，LSMMG が乳酸菌の増殖，耐酸性，諸特性に及ぼす影響について解析を試みた．
[方法と解析] HARV bioreactor を用いて，LSMMG が種々の乳酸菌の増殖（U.O.D.
680 ）に及ぼす影響を比較した結果，NG 培養に比べて，LSMMG 培養ではLactobacillus acidophilus JCM 1028 は 2.2 倍高い値を示し，増殖の促進が認められた（菌株により LSMMG に対する応答性は異なった）．L. acidophilus は，NG
培養と比較して LSMMG 培養で培養液の pH が低下し，培養液中の乳酸は約 2.2倍高い値を示した（NG と LSMMG 培養の単位菌体あたりの乳酸量はほぼ同等であった）．L. acidophilus の耐酸性を種々検討した結果，(A) NG 培養に比べてLSMMG 培養した L. acidophilus の方が耐酸性を示す傾向がみられた，(B) NG とLSMMG の条件で耐酸性評価を実施したところ，LSMMG 条件で高い生存率を示した（現象の普遍性は検討中），が明らかとなった．現在，LSMMG が乳酸菌
等の微生物の諸特性に及ぼす影響について検討中である．
1）H28 日本生物工学会要旨集 p. 315【背景と目的】Streptomyces 属放線菌が生産するカチオン性ポリマー Poly(ε-Llysine) (ε-PL) は，グラム陰性菌，グラム陽性菌や真菌など，幅広い抗菌スペク
トルを有しながらヒトに毒性を示さないことから，天然の食品保存料や抗菌剤として利用されている．また我々は，低重合度 ε-PL (n=5-20) が中重合度体(n=22-36) より Saccharomyces cerevisiae に対し高い抗真菌活性を示すことを見出した．ε-PL の抗真菌作用機構の解明を目指し，本研究では，ε-PL が S. cerevisiaeの細胞壁合成と維持に関わる cell wall integrity (CWI) 経路，および細胞表層に与える影響を検討した．
【方法】S. cerevisiae BY4741 株の野生型 (WT) および CWI 経路を構成する遺伝
子欠損株 (mpk1Δ, cnc1Δ, rlm1Δ, chs3Δ, swi6Δ) を所定量の中重合度および低重合
度 ε-PL を含む YPD 培地またはリン酸バッファー中 (pH 5.0-8.0) でインキュベー
トした．1 時間後，回収・洗浄した菌体について CFU (/mL) を計測し生存率を求めた．また，リン酸バッファー中で同様に ε-PL 処理した BY4741 (WT) および Escherichia coli NBRC3301 株についてクリスタルバイオレット (CV) 取込み試験および ζ-電位測定を行い，細胞表層への影響を検討した．
【結果と考察】中重合度および低重合度体にかかわらず ε-PL に暴露した S.
cerevisiae の CWI 経路に関わる各欠損株は，野生株と比べいずれも耐性を示し
た．ε-PL が Pkc1-Mpk1 経路の過剰な活性化を介して細胞死を引き起こしていることが考えられた．ε-PL 処理後の E. coli では，CV の取込みの上昇と ζ-電位の中性シフトが見られ膜構造の破壊が示唆された．一方，S. cerevisiae では，CVの取込みおよび ζ-電位とも有意な変化が見られず，異なる作用機構の関与が考えられた．

Analysis of the effect of low shear and modeled-microgravity culture on thephysiological activities of enteric bacteria (part 3)

Analysis of antifungal action of poly(ε-L-lysine) derived from Streptomyces
spp.

Key words
acid tolerance, lactic acid bacteria, Lactobacillus acidophilus, low
shear and modeled-microgravity culture

Key words
membranepoly(epsilon-L-lysine), antifungal activity, cell wall integrity, cell

3Ea07

3Ea09

Poly(ε-L-lysine) の生分解可能なカチオン性分散剤への利用研究

Fumika Hasegawa1, ○Arisa Masuda2, Hideki Aoyagi1,2(1Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba, 2Coll. Agro-bio. Resour. Sci., Univ.
Tsukuba)

放線菌由来の新規塩基性ポリアミノ酸：
Poly(diaminopropanoic acid) の単離とキャラクタリゼー
ション○Akihiro Matsui1, Takafumi Hoshiyama1, Satoshi Nagata1, Munenori Takehara1,
Wataru Nomura2, Yoshiharu Inoue2(1Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Shiga Pref., 2Div. Appl. Life Sci., Grad.
Sch. Agric., Kyoto Univ.)○武内 正輝, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）
takehara@mat.usp.ac.jp○加藤 芳尚, 稲葉 悠, 室 尚吾, 竹原 宗範（滋県大院・工・材料科学）
takehara@mat.usp.ac.jp【背景と目的】塩基性ポリアミノ酸である Poly(ε-L-lysine)（ε-PL）は Streptomyces
属放線菌により二次代謝産物として分泌生産され，幅広い抗菌スペクトルを示すことから，天然の食品保存剤として利用されている．当研究室では，いくつかの ε-PL 生産株が Poly(γ-L-diaminobutanoic acid) を併産することを見出し，εPL と類似の機能を有することを示してきた．さらに，Streptomyces sp. USE-33
株が ε-PL とともに新規な塩基性ポリアミノ酸を生産していることを発見した．
そこで，本研究ではこの塩基性ポリアミノ酸の構造解析とその機能解析を試みた．
【方法】放線菌 Streptomyces sp. USE-33 の培養ろ液から有機溶媒沈殿法により塩基性ポリアミノ酸を精製した．当該ポリアミノ酸の酸加水分解物について，HPLC を用いたアミノ酸分析と NMR 分光法による帰属を行った．また，MALDITOF MS によりポリアミノ酸の重合度を解析した．さらに，二次元 NMR 測定
によりペプチドの結合様式を決定するとともに，1H NMR 滴定によりポリアミノ酸の pKa 値を決定した．種々の真正細菌および真菌類に対する抗菌活性を
IC50 で評価した．
【結果と考察】分離精製したポリアミノ酸は，Diaminopropanoic acid（DAP）を唯一の構成アミノ酸とする Poly(diaminopropanoic acid)（PAP）であることが明らかとなった．PAP は 6-16 個の DAP 単位から構成され，また DAP の α 位のカルボキシル基と β 位のアミノ基がイソペプチド結合により主鎖を形成し，それぞれの側鎖に対し DAP が一つずつグラフト化した構造であることがわかった．
PAP の α 位と β 位のアンモニウムイオン基の pKa はそれぞれ 4.8 と 8.7 を示した．PAP はいくつかの真正細菌に抗菌性を示すだけでなく，酵母に対しても抗真菌作用（IC50 = 0.30 mg/mL）を有した．

【背景と目的】広範な産業分野で利用されている分散剤の多くは非生分解性であり，環境負荷や生成微粒子表面の汚染といった問題を克服するため，生分解性の分散剤の開発が望まれている．Streptomyces 属放線菌が生産する Poly(ε-Llysine) (ε-PL) は抗菌活性，生体適合性，凝集活性等を示す多機能の生分解性ポ
リマーである．ポリカチオンである ε-PL は静電反発力により分散能を示す可能性が考えられる．そこで本研究では，ε-PL の生分解可能なカチオン性分散剤への利用を目指し，塗料や接着剤，化粧品にも利用されるカオリン粒子に対する分散能を評価した．
【方法】カオリン (結晶質の含水ケイ酸アルミニウムを主成分とする天然粘土鉱物) 懸濁液に所定の濃度になるよう中重合度 ε-PL (M-ε-PL, n = 22-36) または低重合度 ε-PL (S-ε-PL, n = 5-20) を加え，遠心分離した上層の残留濁度 (550 nm) を測定し ODε-PL とした．ε-PL 無添加区を ODblank とし，ε-PL の分散活性 (ODε-PL －ODblank) / ODblank を算出した．また，粒子の荷電の状態の指標となるゼータ電位を測定し (大塚電子 ELSZ-2000ZS)，粒子の分散安定性を評価した．
【結果と考察】M-ε-PL 濃度の増大に伴い懸濁液の残留濁度が上昇し，分散が確認された．この時，ゼータ電位の符号が負から正に転じ，その絶対値は微粒子の分散安定化の基準となる 30 mV を上回ったことから，M-ε-PL が粒子に吸着
し静電反発力を増大させることで粒子を分散させたことが示された．この分散安定化の効果は，懸濁液の pH が中性-酸性域で顕著になった．また，M-ε-PL よりも S-ε-PL の方が分散安定化した．主鎖の長い中重合度体の立体障害による寄与より，静電反発力の方が分散に支配的に影響したことが確認できた．また，市販の界面活性剤とも分散能の比較を行った．

Novel basic poly(amino acid) derived from a strain of Streptomyces sp.:
isolation and characterization of poly(diaminopropanoic acid)

Investigation on the application of poly(ε-L-lysine) as a biodegradable
cationic dispersant

Key words
Streptomyces, poly(epsilon-L-lysine), poly(diaminopropanoic acid),
antimicrobial activity

Key words○Yoshinao Kato, Haruka Inaba, Shogo Muro, Munenori Takehara(Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Shiga Pref.)○Masateru Takeuchi, Munenori Takehara(Dept. Mater. Sci., Grad. Sch. Eng., Univ. Shiga Pref.)poly(epsilon-L-lysine), biodegradable dispersant, kaolin, zeta potential

268

3Ea10

好熱性放線菌 Streptomyces thermoviolaceus の培養特性
解析

3Fa01

○三原 笑 1, 竹中 武藏 2, 柏木 紀賢 2, 曽田 匡洋 3, 荻野 千秋 1,
近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ, 3長瀬産業）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

海洋性細菌が形成する CdS ナノ粒子のキャラクタリゼー
ション○佐坂 文武, 高橋 宏和, 富永 依里子, 岡村 好子（広島大院・先端物質）
okamuray@hiroshima-u.ac.jp

放線菌は様々な二次代謝物や酵素を合成・分泌することが特徴であるが，一方で放線菌はそれらを工業生産する宿主としても着目されている．好熱性放線菌
は耐熱性酵素を生産することから産業への応用が期待されるが，雑菌繁殖防止や化学反応の効率化などの観点から化成品の物質生産宿主として応用利用が見込める可能性もある．本研究では，好熱性放線菌の一種である Streptomyces
thermoviolaceus (S. thermoviolaceus) に着目し，培養特性解析を行い，外来遺伝子導入による物質生産への応用を試みた．
培養特性解析にあたり，第一に，様々な温度で S. thermoviolaceus の培養を行い，OD600 を測定することで生育最適温度の探索を行った．その結果，28～55℃の幅広い温度で生育可能で，増殖最適温度は 45℃であることを見出した．また，S. thermoviolaceus の増殖速度を知るために，45℃培養時の比増殖速度を算出し，この数値を研究対象としてよく用いられる放線菌 Streptomyces lividans やStreptomyces albus と比較した．その結果，それぞれ比増殖速度は 1.82 [h-1]，0.277 [h-1]，0.299 [h-1]であり，S. thermoviolaceus は Streptomyces 宿主の中では増殖速度が速いということが確認できた．一般的に Streptomyces 宿主は，大腸菌や分裂酵母と比較すると増殖速度が遅いことが欠点とされているため，これは，化成品の物質生産において有利な特性であるといえる．第二に，資化可能な糖の探索を行い，グルコース，グリセロール，キシロースやスクロースを資化することを確認した．その後，プロトプラスト法と接合伝達法によって様々な放線菌ベクターの導入を試みることで遺伝子組み換え法の確立を行い，外来遺伝子導入に成功した．現在はこれらの知見を踏まえ，外来遺伝子を導入する
ことにより，有用化成品の生産を検討している．

【背景と目的】CdS，CdTe は II 族元素と VI 族元素を用いた半導体である．CdS
は太陽電池や街路灯の自動点滅制御に用いられており，CdTe は太陽電池デバイ
スとして有名である．これらの II-VI 族化合物半導体太陽電池は，光電変換効率の高さ，製造コストの低さ，耐久性の良さなどが挙げられる．しかし重金属
で毒性の強いカドミウムやレアメタルの一種であるテルルを原料としているため原料金属のリサイクルが課題となっている．テルルについては，当研究室では既に Te(0)結晶を形成する光合成細菌を分離しテルルを高効率回収できることを報告している．そこで本研究では，カドミウムを回収する海洋性細菌をスク
リーニングし，形成された CdS のキャラクタリゼーションを行った．
【方法】海洋サンプルを RCVBN 培地に接種し，Cd2+を終濃度 500 μM になるよ
うに添加して集積を行い，外観が鉱物の色調と一致する菌叢を得た．金属回収
能を ICP，鉱物の観察および元素分析を TEM/EDS，鉱物の結晶面を XRD により測定した．
【結果と考察】CdS の鉱物色である黄色沈殿を形成する菌叢を得た．単菌分離を目的として寒天平板で培養したが，コロニーを形成することはできなかった．
しかしほぼ単菌であることが示唆された．Cd2+イオンは集菌画分に取り込まれていることが ICP 測定によって示され，TEM 観察の結果からも細胞外で CdSを形成していることがわかった．またそのサイズは約 7 nm の球状粒子であり，結晶格子がはっきりと見られた．立方晶系を示す（1,1,1），（2,2,0）の他に(2,0,2)，(3,0,5)も観察され，無機結晶とは異なる結晶面を持つことから球状形態に特有の結晶面であることが示唆された．

Culture characteristics of thermophilic actinomycete, Streptomyces
thermoviolaceus

Characterization of CdS nanoparticles formed by marine bacteria

Key words
Streptomyces, Thermophilic actinomycetes, Streptomyces
thermoviolaceus

Key words

bioremediation, biomineralization, heavy metals

3Ea11

3Fa02

バイオミネラリゼーションによるシリカナノシートの構築○Emi Mihara1, Musashi Takenaka2, Norimasa Kashiwagi2, Masahiro Sota3,
Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Nagase& Co., Ltd)

深海細菌 Aneurinibacillus sp.YR247 の抗真菌ペプチドの特性の解明○Fumitake Sasaka, Hirokazu Takahashi, Yoriko Tominaga, Yoshiko Okamura(Grad. Sch. Adv. Sci. Mat., Hiroshima Univ.)○福井 瑞季 1, 山浦 由登 1, 倉田 淳志 2, 岸本 憲明 2, 上垣 浩一 2
（1近畿大院・農, 2近畿大・農）kurata090401@nara.kindai.ac.jp○畠中 孝彰, 大橋 雅卓, 石田 亘広（豊田中研）
n-ishida@mosk.tytlabs.co.jp【背景と目的】Aspergillus 属真菌による汚染を抑制するため多くの手法が用いられており，微生物によって生産される抗真菌剤は生物防除剤として注目されている．深海環境は，生物防除剤を生産する微生物の探索源として期待できる．
しかし抗真菌活性を示す深海由来の微生物はほとんど知られていない．本研究では，日本海溝（深度 5352m）と相模トラフ（深度 1171m）の深海底泥から抗真菌物質生産菌を探索し，抗真菌物質の特性の解明を目的とした．
【方法】日本海溝と相模トラフのシロウリガイ群集地帯深海底泥を用いて，抗真菌物質生産菌の探索を試みた．さらに菌体抽出画分から抗真菌物質の精製を行い，性質の解明を試みた．
【結果と考察】日本海溝から Bacillus sp. WS-147，相模トラフから Aneurinibacillus
sp.YR247 を見いだし，YR247 株の菌体抽出画分において抗真菌活性を検出した．また，YR247 株は培養液上清中にベシクル様構造体を生産した．YR247 株
由来の抗真菌物質は，4-70℃で安定であり，pH 2.0-12.0 で抗真菌活性を示した．
プロテイナーゼ K 処理により，抗真菌活性を検出できなかったことから，本抗真菌物質は分子量 1167.9 のペプチド性化合物であることが示唆された．本抗真菌 物 質 は ， Aspergillus brasiliensis NBRC9455 ， Saccharomyces cerevisiae
NBRC1014，Staphylococcus aureus NBRC12732T，Bacillus subtilis NBRC3134，
Escherichia coli NBRC3301T に対して抗菌活性を示した．
しかし，Candida albicans
NBRC1594 には抗菌活性を示さなかった．近縁種の細菌によって生産される
gramicidin 類や tyrocidine 類と同様に，本抗菌物質はグラム陽性・陰性細菌に作用した．さらに YR247 株由来の抗菌物質は，糸状菌に作用した．分子量が異なったことから，本菌株の抗菌物質は gramicidin 類や tyrocidine 類とは異なる化合物であることが示唆された．

【背景と目的】
生物は環境中の金属・金属化合物を利用して，様々な物質を造る．本反応はバイオミネラリゼーションと呼ばれ，常温常圧の低エネルギー下で進むことから
新たな材料創製技術として注目されている．我々も，レアアースをターゲットとしたバイオミネラリゼーションについて先に報告しており(1)，また現在，シリカ（SiO2）を標的にした研究も進めている．
シリカは地球上で最も豊富に存在する材料であり加工性も高いことから，半導体や樹脂など様々な用途に使用される我々の生活に欠かせない材料である．微細三次元構造を持つシリカを容易に造ることが可能となれば，極小の三次元半導体やメタマテリアルなどへと用途はさらに広がるが，現在の加工技術では大きなエネルギーを必要とする．本発表では，ペプチドによるバイオミネラリゼー
ショをベースとした低エネルギーでのシリカ構造体の形成とそのメカニズムについて議論したい(2)．
【方法】
ファージディスプレイシステムを利用して，シリコンナノシート（SiN）に結合するペプチドを単離した．得られたペプチドを化学合成し，各種シリコン材料への結合を確認するとともに，テトラメチルケイ素酸（TMOS）と反応させ，鉱物化能力を評価した．得られた鉱物は，電子顕微鏡，原子間力顕微鏡でその構造を評価した．
【結果と考察】ペプチドライブラリを用いたスクリーニングにより，5 種類のペプチドを得た．
これらの内塩基性の高いペプチドは，TMOS と反応してシリカを生成する能力を有していた．また，得られるシリカの構造は，反応条件により異なり，球状，
シート状の物質が得られた．反応系中のペプチドの局在や反応速度が，生成物の構造に影響していると考えられる．

Characterization of an antifungal peptidic compound from the deep-sea
bacterium Aneurinibacillus sp. YR247

Construction of silica nanosheet based on biomineralization.

Key words
Deep sea bacterium Aneurinibacillus sp. YR247, Antifungal activity,
Peptidic compound, Calyptogena community

Key words○Miuki Fukui1, Yuto Yamaura1, Atsushi Kurata2, Noriaki Kishimoto2,
Ko-ichi Uegaki2(1Grad. Sch. Agric. Kinki Univ., 2Fac. Agric., Kinki Univ.)

1)Hatanaka et.al, Nature Communications, 8:15670, 2017.
2)Hatanaka et.al, Biomaterials Science, submitted.
○Takaaki Hatanaka, Masataka Ohashi, Nobuhiro Ishida(Toyota Cent. R&D Labs. Inc.)

biomineralization, peptide, silica

269

3Fa03

外膜表層に金属結合ペプチドを提示した微生物の無機固体表面に対する選択的な吸着特性

3Fa05○岩田 至叡, 中島 一紀, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp

Preparation and characterisation of robust whole cellbiocatalyst from Aspergillus oryzae expressing Fusarium
heterosporum lipase immobilized onto activated carbon
for biodiesel synthesis○Emmanuel Quayson1, Jerome Amoah1, Akihiko Kondo2,
Shinji Hama3, Ayumi Yoshida3, Chiaki Ogino1(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov.,
Kobe Univ., 3Res. Dev. Lab., Bioenergy Corpo.)
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp【背景と目的】
バクテリアを無機固体表面に選択的に固定化することができれば，汚染水浄化やレアメタルの回収等，地球資源への応用が期待できる．そこで本研究では，
微生物表面にチタン結合ペプチドを表層提示することにより，チタンに選択的に結合する微生物を作製し，その吸着特性を検討した．
【方法】
E.coli の Outer membrane protein A（OmpA）の膜外突出部分（Loop1，およびLoop1+Loop3）に 12 残基からなるチタン結合ペプチドをそれぞれ組み込んだ融合遺伝子を作製した．また，ペリプラズム部分を欠損させた OmpA をベースとして同様の融合遺伝子を構築した．これらの遺伝子を pET-22b(+)ベクターに挿入し，大腸菌 BL21(DE3)株を形質転換した．融合タンパク質を発現した大腸菌を用いて金属プレート（チタン，銅）への吸着実験を行った．固定化処理を施した後，SEM 観察を行い，菌体数をカウントすることにより吸着能を評価した．また，同様の吸着実験を pH および塩濃度を変更して行い，その影響を調
査した．
【結果】
SDS-PAGE により，各融合タンパク質の発現が確認された．金属プレートへの吸着実験では，チタンプレートにより選択的に吸着することが明らかとなった．
また，OmpA とチタン結合ペプチドの融合形式により吸着能に変化が見られ，
OmpA のペリプラズム部分を欠損させたものの吸着能が強くなる傾向が見られた．また，塩濃度を変更した吸着実験では，塩濃度の上昇に伴い吸着能が低下した．

The cost of lipase in enzymatic biodiesel production hinders its pluses ofenvironmental friendliness and lower operating conditions for large scale applications.
Activated carbon from the stream of agricultural and forestry wastes presents a
tremendous potential for its use as a matrix for the immobilization of enzymes.
Recombinant whole cell lipases are however preferred in enzymatic biodiesel
production due to their versatility and reusability. It is of interest to study whether
physical adsorption and deposition of whole cell lipases can occur on support matrices
without protein cross-linkers. Thus, in this study, we present a cost-effective
immobilization strategy to produce robust Aspergillus oryzae expressing Fusarium
heterosporum lipase on activated carbon (rFHL@IAC) with high affinity and stability
for use in biodiesel synthesis from sustainable next generational feedstocks. The
produced fatty acid methyl ester yield (FAME) of 98±0.8% from our engineered lipase
surpasses ASTM and EN requirements even at mild temperatures and minimum lipase
requirement (3.75%). A substantial value drive from this rFHL@IAC is that, it does
not require cross-linking regents, thereby, ensuring lower toxicity in biodiesel waste
streams. At the centre of this study is the characterization of the produced biocatalyst
with XPS, FE-SEM and FT-IR analysis to inform on the functional groups and thechemo-biological changes for prospective development into economically viable andsustainable bio-refineries.

Adsorption properties of microorganisms bearing metal-binding peptides toinorganic solid surfaces

Preparation and characterisation of robust whole cell biocatalyst from
Aspergillus oryzae expressing Fusarium heterosporum lipase immobilized
onto activated carbon for biodiesel synthesis○Yoshiaki Iwata, Kazunori Nakashima, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words

transformation, peptide, cell surface display, biosorption

3Fa04

気生微細藻類と窒素固定菌の共生系を利用した壁面培
養法○Emmanuel Quayson1, Jerome Amoah1, Akihiko Kondo2, Shinji Hama3,
Ayumi Yoshida3, Chiaki Ogino1(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 3Res.
Dev. Lab., Bioenergy Corpo.)
Key words
whole cell biocatalyst, Aspergillus oryzae, activated carbon, biodiesel
fuel

3Fa06

○塚越 崇之, 油井 信弘, 菅原 康里, 今村 保忠, 阿部 克也（工学院大・先進工・生化）
bt13347@ns.kogakuin.ac.jp

ナノファイバータンパク質 AtaA の塩濃度依存的な接着性を利用した細菌の可逆的固定化○吉本 将悟 1,2, 小原 優季 1, 中谷 肇 1, 堀 克敏 1
（1名大院・工, 2名大・VBL）
khori@chembio.nagoya-u.ac.jp【目的】市街地などのスチール看板上において光合成微生物の緑色コロニーがよく見られ，当研究室では，その様な基物表面上から気生微細藻類と窒素固定菌を単離した．その場所では，これらの微生物が炭素源や窒素源を固定し，共に生活していると考えられる．このような限られた栄養下での共生系を模した新
規壁面培養法の開発を目指すため，本報告では，液相および気相条件における気生微細藻類と窒素固定菌の炭素源および窒素源の供給について検討した．
【方法】気生微細藻類は八王子キャンパス内のスチール看板から単離した
Coelastrella sp. KGU-HN001 を，窒素固定菌は Rhodobacter sphaeroides (NBRC
12203)を用いた．両微生物は，C・N フリー BB 培地において光照射下で通気し，扁平フラスコ内で共培養を行った(液相条件)．また，両微生物をメンブレ
ンフィルターに吸着させ，C・N フリー BB 培地を含ませた綿上に静置し，シャーレ内で共培養を行った(気相条件)．気相条件における細胞懸濁液は，フィルター上の細胞を滅菌水に懸濁させて得た．細胞懸濁液と細胞を除いたろ液の全有機
炭素量(TOC)と全窒素量(TN)は TOC・TN 計で測定した．気生微細藻類の細胞数は血球計算盤を用いて測定した．
【結果・考察】液相条件において気生微細藻類と窒素固定菌を共培養すると，培養 5 日間で細胞の TOC は 2.9 倍，TN は 1.1 倍，藻細胞の数は 1.3 倍増加した．
一方，気相条件において，培養 5 日間で細胞の TOC は 3.5 倍，TN は 1.9 倍，
藻細胞の数は 2.5 倍増加した．これらの結果から，気相条件では，より効率的に窒素固定が行われ，気生微細藻類が生育することが分かった．すなわち，栄養制限下の共培養において，炭素固定および窒素固定が行われ，不足する栄養源を微生物は互いに供給していることが示唆された．今後は，気相条件における基物材料および効率的なガスの取り込みについて検討する．

【背景・目的】
微生物細胞の担体への固定化は，生産物の容易な分離，生体触媒濃度の向上，
繰り返しまたは連続的な生体触媒反応を可能にするため，微生物細胞を全細胞触媒として効率的に利用するうえで重要な戦略である．しかし固定化した全細
胞触媒が失活した際には，多くの場合担体ごと廃棄しなければならなかった．
我々はこれまでに，アシネトバクター属細菌 Tol 5 由来のナノファイバータン
パク質 AtaA を用いた新しい菌体固定化方法を確立し，物質生産に応用できる
ことを示した．本研究では AtaA の接着性が塩濃度に依存するという知見に基づき，担体への菌体の可逆的な固定化と，担体の再利用を試みた．
【方法】
菌体の接着性は Tol 5 株とその ΔataA 株，さらにアシネトバクター属細菌 ADP1
株に ataA 遺伝子を導入し接着性を付与した ADP1(pAtaA)株について調べた．培
養した菌株を塩溶液に懸濁して増殖のできない休止菌体とし，96 ウェルプレー
トに加えて 2 時間静置した後クリスタルバイオレット染色により接着した菌体量を定量化した．また担体の再利用性については，ポリウレタン担体に菌体を固定化してエステラーゼ反応を行った後担体を純水洗浄し，そこに別種の菌体を固定化しインディゴ生産量を定量することで評価した．
【結果】
AtaA を細胞表層に有する菌体は塩溶液中で高い接着性を示したが，純水中ではどの表面に対してもほとんど接着しなかった．一度接着した菌体は純水ですすぐことにより表面から剥離し，剥離した菌体は再度塩溶液に懸濁すると接着性を取り戻した．さらに，ポリウレタン担体に固定した菌体も純水洗浄により剥離することができ，その担体に別の菌体を固定化することで担体を異なる反応に用いることができた．本研究で示された菌体の可逆的固定化は，固定化全細胞触媒を用いたプロセスの効率および生産性を高めるために役立つだろう．

Wall biotechnology for mass culture applied by symbiosis of aerial
microalgae and nitrogen-fixing bacteria

Reversible bacterial immobilization based on the salt-dependent adhesion of
the bacterionanofiber protein AtaA

Key words
aerial microalgae, nitrogen-fixing bacteria, symbiosis, wallbiotechnology

Key words○Takayuki Tsukagoshi, Nobuhiro Aburai, Yasusato Sugahara, Yasutada Imamura,
Katsuya Abe(Dept. Chem. Life Sci., Sch. Adv. Eng., Kogakuin Univ.)○Shogo Yoshimoto1,2, Yuki Ohara1, Hajime Nakatani1, Katsutoshi Hori1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2VBL, Nagoya Univ.)

immobilization, Acinetobacter , adhesion

270

3Fa07

Acinetobacter sp. Tol 5 の難付着材料に対する付着性の
評価

3Fa09

○川尻 彩音 1, 飯尾 魁 1, 吉本 将悟 1,2, 堀 克敏 1
（1名大院・工, 2名大・VBL）
katsutoshihori@gmail.com

培地成分が大腸菌フロック形成に与える影響○本間 裕章, 大塚 未音, 尾島 由紘, 東 雅之
（阪市大院・工）ojima@bioa.eng.osaka-cu.ac.jp【背景と目的】Acinetobacter sp. Tol 5 は疎水性のプラスチックから親水性のガラス，さらには金属といった様々な材料表面に対し高い付着性を示す．この付着性は細胞表層に存在する三量体型オートトランスポーターアドヘシン (TAA) ファミリーに属するタンパク質 AtaA を介してもたらされる．Tol 5 はどのような材料に対しても非特異的に付着すると考えられていたが，生体分子が付着しにくい表面に対しても付着できるかどうかは調べられていなかった．そこで本研究では，平坦な表面を有するマイカや表面自由エネルギーの低いポリテトラフルオロエチレンといった難付着材料に対する Tol 5 の付着性を評価した．
【方法】
Tol 5，Tol 5 ΔataA，TAA を有し材料表面に対し付着性を示すことが報告されている Bartonella henselae Marseille と Yersinia enterocolitica，その他に Escherichia
coli，Pseudomonas aeruginosa PAO1 の 6 種の菌株を用いて，それぞれの材料表面への付着を評価した．様々な材料表面への付着性を調べるため，ポリ塩化ビ
ニルテープを 4 枚重ねてパンチで穴を開けたものを対象材料表面に貼り付けることでウェルを作製した．ウェルに OD660=0.5 に調整した休止菌体の懸濁液を添加し，120 分間静置した後菌液を取り除き無機塩バッファーで洗浄した．風乾後，ウェルに付着した菌体をクリスタルバイオレットで染色し，エタノールで溶出した際の吸光度を測定することで菌体の付着量を評価した．
【結果と考察】Tol 5 は難付着材料に対しても付着性を示すことが明らかになった．その付着量
は他の付着性が報告されている菌と比較して高いものであった．この結果から
Tol 5 は他の菌とは全く異なるメカニズムで材料非特異的な付着を達成していることが示唆された．

【背景と目的】環境中の微生物の中には，自身が産生する細胞外ポリマーとの共凝集により，フロックと呼ばれる浮遊性の塊を形成するものが存在する．本研
究グループは，通常フロックを形成しない大腸菌が，セルロース生合成に関連する遺伝子である bcsB を過剰発現，またはペリプラズムに局在するプロテアー
ゼの遺伝子 degP を欠損させた変異株ではフロックを形成することを報告している．本研究では，培養中の培地の組成がこれらの変異株によるフロック形成に与える影響について検討した．
【方法】グリセロールを最大 1.5 M まで加えた LB 培地で bcsB 過剰発現株，degP
欠損株を培養し，フロックを形成させた(以下，(+)bcsB フロックと ΔdegP フロッ
クと表記)．フロック形成量は，生理食塩水で洗浄したフロックに含まれるタン
パク質を BCA 法で定量することにより評価した．また，培地に粘性を与える
カルボキシメチルセルロース(CMC)やポリオール類であるエチレングリコール
を LB 培地に添加し，フロック形成に与える影響を評価した．
【結果と考察】(+)bcsB フロックではグリセロール添加の影響は見られなかったが，ΔdegP フロックではグリセロール濃度と形成量の間で正の相関が見られ，その量はグリセロール濃度が 1.5 M のときに最大となった．CMC をグリセロー
ル 1.5 M 添加時と同じ粘度になるように添加した培地では，形成量の増加は見られなかった．一方，エチレングリコールを添加した培地ではグリセロール添加と同様に形成量が増加した．以上の結果から，大腸菌の ΔdegP 株では，ポリオールの作用により凝集能が向上し，フロック形成を促進することが分かった．
これらの作用の解析から，微生物のフロック形成の理解が進むことが強く期待される．

Adhesion of Acinetobacter sp. Tol 5 onto anti-adhesive materials.

Effect of medium components on the floc formation of Escherichia coli

○Ayane Kawashiri1, Kai Iio1, Shogo Yoshimoto1,2, Katsutoshi Hori1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2VBL, Nagoya Univ.)○Hiroaki Honma, Mio Otsuka, Yoshihiro Ojima, Masayuki Azuma(Grad. Sch. Eng., Osaka City Univ.)

Key words

Acinetobacter, adhesion, Autotransporter

Key words

floc formation, glycerol, Escherichia coli

3Fa08

固定化細胞培養法を活用した生物細胞の選択的取得法
の開発

3Ga01

生分解性プラスチックの海水，河川水での生分解○吉田 真梨, 青柳 秀紀（筑波大院・生命環境）
aoyagi.hideki.ge@u.tsukuba.ac.jp○中山 敦好, 川崎 典起, 山野 尚子（産総研・バイオメディカル）
a.nakayama@aist.go.jp【緒言】 アルギン酸ゲル等で細胞を包括して培養する固定化細胞培養法は，(a)固定化担体（ゲル）内に細胞を高密度で培養できる，（b）固定化細胞と培養液の分離が容易で，培地の交換や供給を簡便に実施できる，など優れた特徴があり，有用物質の効率的な生産に利用されている．しかしながら，培養の進行に伴い，固定化担体内で細胞が増殖し，担体から漏出し，培養液中で細胞が増殖すると，上述のメリットが消失してしまう．
本研究では培養に伴い細胞が固定化担体より漏出する現象に着目し，この現象を活用した生物細胞の選択的取得法の開発を試みた．
【方法と結果】 モデル微生物として酵母（Saccharomyces cerevisiae）や酢酸菌（Acetobacter pasteurianus）を固定化した 2% (w/v)アルギン酸カルシウムゲルビー
ズを作成し，三角フラスコを用いて振盪培養し，経時的にゲルビーズから漏出した菌の挙動を解析したところ，コントロール（液体懸濁培養）と比べて増殖活性が高いことが示唆された．モデル植物細胞としてニチニチ草（Catharanthus
roseus）培養細胞を用い，2% (w/v)アルギン酸カルシウムゲルビーズで固定化して培養した結果，ゲルビーズから単細胞や 2~5 の細胞で構成された小細胞集塊が漏出し，培養液中で活発に増殖した（マセレーション酵素などを使用しないで，増殖活性が高い単細胞や小細胞集塊を取得できた）．以上の結果から，固定化細胞培養法は生物細胞の選択的取得に活用できることが示唆された．現在，取得した細胞の特性の解析や他の選択的な細胞取得系について検討中である．

（はじめに）
マイクロプラスチックの海洋汚染が指摘される中で生分解性プラスチックの活用が期待されているが，その分解性について活性汚泥や土壌分解については多くの報告があるが水環境での報告例は少なく，その有効性が疑問視されている．
そこでどのような生分解性プラスチックが水環境で良好な生分解性を示すかについて調べた．
（実験）
生分解試験は主として各地の水試料を採取し，密閉型撹拌容器に環境水と樹脂粉末を入れたラボ試験にて行い，遮光下 27℃で連続撹拌し，生分解に伴う酸素消費量の測定により評価した．
（結果と考察）海水は大阪湾内複数箇所で採取したものを用いた．その結果，合成系樹脂では
PCL が良好な生分解性を示し，PBSA は採取する海水によってばらつきが出た．
4 週間の試験では PBS や PBAT，PLA は明確な生分解性が認められなかった．
生合成系樹脂では PHB やそのコポリマーは良好な生分解性を示した．海に直接樹脂フィルムを浸漬させる実環境試験では PBSA も確実に生分解された．ラボ
試験より実環境試験の方が生分解速度は速いが，これはラボ試験では微生物分解のみを観測しているのに対し，実環境では多様な生物，物理・化学的因子が関与しているためと考えられる．大阪湾につながる大和川では下流域では海水中よりも大きな生分解活性を示したが，上流では生分解は遅かった．この生分解活性の違いは試験水の汚濁度と関係があると思われる．

Selective acquisition of cells using immobilized cell culture

Biodegradation of aliphatic polyesters in sea water and fresh water○Mari Yoshida, Hideki Aoyagi(Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba)

Key words

alginate, callus, immobilized cell culture, leakage○Atsuyoshi Nakayama, Norioki Kawasaki, Naoko Yamano(Biomed. Res. Inst., AIST)

Key words
polyester

biodegradation, biodegradable plastic, poly(3-hydroxybutyrate),

271

3Ga02

発酵(R)-3-ヒドロキシ酪酸と α-ヒドロキシ酸の共重合体の化学合成と生分解

3Ga04○常盤 豊 1,4, 中山 敦好 1, 川崎 典起 1, 山野 尚子 1, 伊田 小百合 1,
楽 隆生 2, 世嘉良 宏斗 3
（1産総研, 2甲南化工, 3沖縄県工技セ, 4トロピカルテクノプラス）
y.tokiwa@aist.go.jp

酸性溶液による変性 PET の加水分解と分子量変化○廣田 泰志 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【背景】最近，マイクロプラスチック汚染が海洋生態系への脅威だとして注目されている．微生物が作るポリ-3-ヒドロキシ酪酸（PHB）は，海洋でも分解しやすい生分解性プラスチックとして知られている．しかし，微生物が作る PHB やその共重合体は，微生物由来の不純物を含むなどの問題があり，未だ広く普及していない．
私たちは，Halomonas sp. OITC1261 株 1)が菌体外に生産する(R)-3-ヒドロキシ酪酸（R3HB）を用いて，すでに，グリコール酸および L-乳酸との共重合体を化学合成して，その生分解性について解明してきた．今回，R3HB を用いて，Lマンデル酸，L-フェニル乳酸，インドール-3-乳酸等の α-ヒドロキシ酸との共重合体の化学合成を行い，それらの特性と生分解性について検討した．
【方法】光学純度 99％ee の発酵 R3HB と種々の α-ヒドロキシ酸を p-トルエンス
ルホン酸を触媒に用いて，トルエン中で脱水重合することにより重合体を得た．
重合体の生分解性は，Streptomyces sp. MG 株の PHB 分解酵素 2），プロテイン
ネース K および BOD テスターを用いて海水により評価した．
【結果】R3HB と L-マンデル酸をモル仕込み比 90:10 で反応させた場合，組成比95.2：4.8，分子量 Mw 8610 の共重合体が得られた．R3HB と L-フェニル乳酸，
R3HB とインドール-3-乳酸を同様に反応させた場合，Mw がそれぞれ 3600，
2880 の共重合体が得られた．PHB 分解酵素は，モル仕込み比 90:10 のそれぞれの共重合体に対して，高い分解性を示した．しかし，プロテインネース K は，共重合体をほとんど分解しなかった．さらに，海水による分解性試験では，
R3HB と L-マンデル酸の共重合体は，ポリカプロラクトンと同等の生分解性を示した．
1. H. Yokaryo et. al, Biotechnol. J. 13(2). Doi: 10.1002/biot.20170343 (2018)
2. B.P. Calabia and Y. Tokiwa, Biotechnol. Lett., 28, 383-388 (2006).

【背景】日本には，黒ボク土などの酸性土壌が広く存在する．APEXA®はポリエ
チレンテレフタラート (PET) に類似した物性を持つ共重合ポリエステルで，ア
ルカリ性堆肥下における生分解が確認されている．その一方で，酸性条件下での加水分解挙動および分子量変化についてはほとんど知られていない．本実験
では，酸性溶液中における APEXA®の加水分解挙動を確認した．
【実験方法】繊維状の APEXA®4027 を 1 g 秤量し，30 mL の希硫酸 (pH 3.0) に含浸させた．比較として，0.1 M リン酸緩衝液 (pH 8.4)，0.1 M 炭酸緩衝液 (pH10.5)，蒸留水を用いた．インキュベーターを使用して，試料を加水分解 (80°C,
160 rpm, 4 weeks) した．反応後の溶液は，加水分解から生じたモノマー量を知るため，HPLC 分析に供した．反応後の樹脂試料は，0.1% (v/v) Triton X-100 溶液で洗浄 (37°C, 30 min) し，乾燥 (50°C, 3 days) させた．樹脂の分子量を知るた
め，JIS (K 7367-5) に則って，希薄ポリマー溶液の粘度数を測定した．試料をフェノール/テトラクロロエタン (60/40) 溶液に溶解させ，25°C における流下時
間をウベローデ粘度計によって測定し，分子量を算出した．SEM 観察は，試料を金パラジウム合金でスパッタした後，FE-SEM (S-4500, 日立) を使用して行った．
【結果と考察】モノマー生成量はアルカリ性の炭酸緩衝液より小さかったものの，分子量は酸性の希硫酸において著しく低下し，1 週間で反応前の 22.9%まで低下した．SEM 観察では，希硫酸サンプルにおいて繊維の断裂が確認された．蒸留水サンプルでは，加水分解によって生じたテレフタル酸が酸性触媒として働き，結果として希硫酸サンプルと類似した分解挙動を示した．酸性溶液
中の加水分解によって APEXA®の物性は大きく低下しているといえ，酸性土壌下で速やかに生分解する可能性が示唆された．

Chemical synthesis and biodegradation of copolymers of fermented (R)-3hydroxybutyric acid and α-hydroxy acid

Hydrolysis of modified PET with acidic solution and molecular weightchange○Yutaka Tokiwa1,4, Atsuyoshi Nakayama1, Norioki Kawasaki1, Naoko Yamano1,
Sayuri Ida1, Takao Raku2, Hiroto Yokaryo3(1AIST, 2Konan Chemical Ind. Co., Ltd., 3Okinawa Ind. Technol. Center, 4TropicalTechnology Plus)○Yasushi Hirota1, Takuya Kawanishi1,2, Noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)

Key words

hydroxybutylic acid, biodegradable plastic, mandelic acid, microplastic

Key words

biodegradable plastic, hydrolysis, molecular weight

3Ga03(R)-3-ヒドロキシ酪酸生産菌の代謝制御に関わる無機
塩類

3Ga05

Thiol-ene 反応を用いたビニル化合物生産菌の分離技術の開発○世嘉良 宏斗 1, 花城 隆二 1, 合田 雅浩 1, 常盤 豊 2,3（1沖縄県工技セ, 2トロピカルテクノプラス, 3産総研）
yokryouh@pref.okinawa.lg.jp○佐野 芽生 1, 黒田 ひかり 1, 小原 仁実 1, 安藤 寛 2, 松本 圭司 2,
麻生 祐司 1
（1京都工繊大院・工芸科学, 2(株)カネカ・R&D企画部）
d6861001@edu.kit.ac.jp(R)-3-ヒドロキシ酪酸（R3HB）は微生物による発酵生産が可能な光学活性有機酸で，生分解性樹脂等の原料として注目されている．また，ヒトの体内で脳や筋肉の効率的なエネルギー源として生産・利用されていることから，食品素材としての機能も注目されている．我々はこれまでに沖縄で分離された Halomonas
sp. OITC1261 を用いてパイロットスケールで R3HB の発酵生産を行い，生産効率の優位性を示した（第 69 回日本生物工学会大会講演要旨集，2P-J197，2017）．
さらに，発酵液中から高純度結晶として精製した R3HB は，共同研究機関と連携しながら，樹脂や食品等の開発のために利用されている．
R3HB の発酵生産では，菌体内に蓄積させた R3HB の重合体（ポリ-(R)-3-ヒド
ロキシ酪酸，PHB）を加水分解して得る方法が一般的だが，OITC1261 株は PHB
分解しなくても R3HB を菌体外へ生産する．OITC1261 株の好気的 R3HB 合成
経路はまだ明らかではないが，好気条件下で PHB を蓄積・維持したまま R3HBを菌体外へ生産することから，R3HB は PHB 分解とは異なる経路で生産されていると推定される．これらの代謝経路を制御できれば，R3HB と PHB の生産性を調節できる可能性がある．そこで本研究では，R3HB と PHB の生産が培地中の無機塩類によってどのような影響を受けるのか調べた．
発酵試験では，無機塩類の培地中濃度を変えて生産量を比較した．基本培地での生産量（R3HB：43 g/L，PHB：35 g/L）と比較して，K2HPO4 強化培地では
R3HB が減少（14 g/L）して PHB が増加（49 g/L）した．K2SO4 強化培地では
R3HB と PHB の割合は基本培地のときと比べてほとんど変化しなかったが，FeSO4 を同時に強化すると R3HB は増加（77 g/L）して PHB は減少（28 g/L）
した．今回の結果から，好気条件下における R3HB と PHB の生産量は培地中の無機塩類による影響で変化し，その比率を制御できることが示唆された．

【背景・目的】微生物はイタコン酸(IA)などのビニル化合物を生産する．これらは再生可能なポリビニル原料として有用であるが，自然界からビニル化合物生産菌を選択的に分離する方法はない．そこで本研究では，チオールのアルケンへの付加反応である Thiol-ene 反応に基づく生産菌分離技術の開発を行った．原
理は次の通りである．まず，抗菌性を示す α-チオグリセロール(TG)とラジカル開始剤 VA-044(VA)を含む寒天培地に生産菌を含む分離源を塗布する．培養中に生産菌由来のビニル化合物が TG と反応し TG の濃度が低下することで生産菌
はコロニーを優先的に形成することができる．
【方法・結果】5 mM VA，50 mM TG，100 mM IA を窒素下で 30℃，120 h，Thiolene 反応に供し，Ellman 試薬を用いて残存 TG 濃度を測定した結果，反応率は約 40%であった．また，LC-MS 解析より TG と IA の反応物が確認されたことから，Thiol-ene 反応の進行が確認された．また，種々の微生物に対する TG お
よび TG と IA の反応物の最小生育阻止濃度を調べたところ，それぞれ TG では
12.5-100 mM，反応物では 200 mM 以上であった．よって，Thiol-ene 反応により TG の抗菌性失活が確認された．次に，VA と TG を含むポテトデキストロー
ス寒天培地にて Aspergillus terreus NBRC 6123(IA 生産菌)，Aspergillus niger
NBRC 33023，Aspergillus oryzae NBRC 30113(両株とも IA 非生産菌)を培養した
結果，NBRC 6123 は優先的にコロニーを形成した．さらに，同寒天培地にて
NBRC 6123 の胞子を含む土壌を塗布培養し同株の再分離を試みたところ，約100%の効率で土壌から再分離できた．よって，本手法はビニル化合物生産菌の分離に有効であることが示唆された．

Some minerals affect the metabolism of (R)-3-hydroxybutyric acid and its
polymer by Halomonas sp. OITC1261

Development of the method for screening of microbes producing vinyl
compounds using thiol-ene reaction○Hiroto Yokaryo1, Ryuji Hanashiro1, Masahiro Goda1, Yutaka Tokiwa2,3(1Okinawa pref. Ind. Tech. Cent., 2Tropical Technology Plus, 3AIST)

Key words

3-hydroxybutyric acid, PHB, Halomonas, mineral○Mei Sano1, Hikari Kuroda1, Hitomi Ohara1, Hiroshi Ando2, Keiji Matsumoto2,
Yuji Aso1(1Kyoto Inst. Tech, 2Kaneka Corp.)

Key words

Aspergillus terreus, screening, Thiol-ene reaction, vinyl compounds

272

3Ga06

Heck 反応を用いたビニル化合物生産菌の分離技術の
開発

3Ha02

○矢田 椋己 1, 佐野 芽生 1, 小原 仁実 1, 安藤 寛 2, 松本 圭司 2,
麻生 祐司 1
（1京工繊大院・工芸科学, 2カネカ・R＆D企画部）
aso@kit.jp

酵素の生産・放出を行う大腸菌と物質生産を行う大腸菌の共培養による有用物質生産○岩崎 建史朗 1, 本庄 宏 2, 相馬 悠希 3, 盧 鎮栄 2, 鶴野 圭悟 2,
濱田 浩幸 1, 花井 泰三 1
（1九大院・生資環, 2九大院・シス生科, 3九大・生医研）
taizo@brs.kyushu-u.ac.jp【目的】ある種の微生物はビニル化合物を生産する．それらは炭素-炭素二重結合を持ち容易にポリマー化する．よって，新たなビニル化合物生産菌が分離できればバイオプラスチック開発に有用である．しかし，ビニル化合物生産菌を
自然界からハイスループットで選択的に分離するための手法はなく，これまでに報告されているビニル化合物は Aspergillus terreus によって生産されるイタコン酸など数種類にとどまる．そこで本研究では，イタコン酸をビニル化合物のモデルとして利用し，アルケンとハロゲン化アルキルの付加反応である Heck 反応を用いたビニル化合物生産菌の分離技術の開発を行うとともに，土壌からイタコン酸生産菌の分離を試みた．
【方法・結果】イタコン酸水溶液に Pd(OAc)2，K2CO2，ヨードベンゼンを加えて 80°C で 1 h 撹拌し Heck 反応を行った．HPLC 解析によりイタコン酸とヨー
ドベンゼンの付加反応物の生成を確認した．反応液に濃 HCl を添加し反応を停止させた後，亜硝酸ナトリウム水溶液と可溶性デンプン水溶液を加えた．Heck
反応により生じたヨウ素イオンをヨウ素デンプン反応により検出することでHeck 反応の進行を確認することができた．次に，グルコース無機塩培地を用いて土壌より分離した 500 株を培養し培養液を用いて同条件で Heck 反応を行った．その結果，ビニル化合物を生産すると思われる 1 株を得た．LC-MS 解析の結果，反応物の分子量は 206.058，化学式は C11H10O4 であった．これらはイ
タコン酸とヨードベンゼンの付加反応物であるベンジリデンコハク酸のそれらと一致した．よって，分離株はイタコン酸生産菌であることが示された．以上の結果から，本手法はビニル化合物生産菌を自然界からハイスループットで選択的に分離するために有効な手法であることが示された．

【背景・目的】
合成生物学的な手法により構築した二種類の大腸菌を用いて，セロビオースからモデル有用物質である Isopropanol（IPA）の直接生産を行った．大腸菌は，
セロビオースを直接利用できないので，セロビオースを糖化酵素によってグルコースに分解する必要がある．そこで，設定した菌体密度に到達すると溶菌し，糖化酵素を放出する人工遺伝子回路を導入した大腸菌（糖化・溶菌株）と，グ
ルコースから IPA 生産を行う合成代謝経路を組み込んだ大腸菌（生産株）を，共培養することによってセロビオースから IPA の直接生産を試みた．
【方法・結果】
E.coli BW25113 を，ホスト株として使用し，糖化・溶菌株と生産株を構築した．
糖化・溶菌株は，クオラムセンシングシステムを用いて，菌体密度をセンシン
グできるように設計した．また，クオラムセンシングのプロモータを改良し，IPTG 添加量に応じて，センシングの感度を変更できるようにした．溶菌遺伝子には T4 phage 由来のものを用いた．一方，生産株にはアセチル CoA を起点とした IPA 生産合成代謝経路を導入した．まず，糖化・溶菌株を用いて，セロビ
オースの分解を試みた．その結果，IPTG の添加量を変更することで，任意のタイミングで大腸菌を溶菌させて，セルビオースが分解されることが，確認できた．次に，糖化・溶菌株と生産株の共培養を行い，セロビオースから IPA を直接生産する実験を行った．その結果，糖化・溶菌株の溶菌とそれに伴うセルビ
オースの急激な減少，グルコースの急激な増加が観察された．培養開始 24 時間
後，培地中のグルコースは消費され，最大約 12mM の IPA 生産が確認された．

Development of the method for screening of microbes producing vinyl
compounds using Heck reaction

IPA production from cellobiose by engineered Escherichia coli strains withsynthetic genetic circuit and synthetic metabolic pathway.

○Ryoki Yada1, Mei Sano1, Hitomi Ohara1, Hiroshi Ando2, Keiji Matsumoto2,
Yuji Aso1(1Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol., 2Kaneka Corp.)○Kenshiro Iwasaki1, Hiroshi Honjo2, Yuki Soma3, Jinyeoung Rho2, Keigo Tsuruno2,
Hiroyuki Hamada1, Taizo Hanai1(1Grad. Sch. Bioresour. Bioenviron. Sci., Kyushu Univ., 2Grad. Sch. Syst. Life Sci.,
Kyushu Univ., 3Medical Institute of Bioregulation , Kyushu Univ.)

Key words

Heck reaction, itaconic acid, screening, vinyl compounds

Key words

cellobiose, coculture, production, Escherichia coli

3Ha01

Bio-alcohol production in engineered Bacillus subtilis
through restoration of nutritional depletion stress

3Ha03

グルコース／キシロース切替え流加法による乳酸ベース
ポリマー生産組換え大腸菌の高密度培養
山崎 貴史 1, Ribordy Greg 2, 堀 千明 1,3, ○松本 謙一郎 1,3,
大井 俊彦 1,3, Zinn Manfred 2, 田口 精一 3,4（1北大院・工, 2Hes-SO Walais Wallis, 3JST・CREST, 4t東農大・生
命科学）
mken@eng.hokudai.ac.jp

Kim Eunjoo1, Seo Dahee1, Yang Yung-Hun2, ○Choi Kwon-Young1(1Dept. Environ. Eng. Ajou University, 2Dept. Microbial Eng.
Konkuk University)
kychoi@ajou.ac.kr

The chemical composition of biomass is an important factor in the biochemical
productivity of the biorefinery processes. The demand for sustainable biomass is basedon securing a homogeneous biomass composition. Recently we have reported
consolidated conversion of proteolytic biomass into bio-alcohols by engineering
Bacillus subtilis strain. Here, we report that one of the most affecting factors onproteolytic waste conversion is nutritional stress resulted from the amino acids
depletion consumed in the early phase of incubation, which caused severe low
productivity. In order to overcome this nutritional stress, the critical amino acids inproteolytic biomass conversion process were identified and three overcoming
strategies of Nisin treatment, which was known as a sporulation inhibitor, introductionof sporulation deficiency by inactivating SpoA0 regulator, and nutritional stressrestoration by inactivating RelA regulatory protein, were attempted. Amongst,
engineered B. subtilis KY11 ΔcodYΔbkdBΔrelA mutant showed the highest bioalcohol yields of 1.83 ± 0.16 g/L and approximately 54.82 mg/L/hr of highest
productivity.

【背景】
Poly(lactate-co-3-hydroxybutyrate) は乳酸重合酵素を発現する組換え大腸菌によって生合成可能なバイオベースポリマーである．本菌のフラスコ培養実験により，リグノセルロースの第二主要構成糖であるキシロースを炭素源とすることにより，グルコースの場合と比較して良好なポリマー生産性及び乳酸分率が得られることが示されていた．本研究では，本生産系を，ジャーファーメンター
を利用した流加培養法により高密度化することを目的とした．
【実験方法】
ポリマー合成系遺伝子群が lac プロモーターの下流に挿入されたプラスミドを導入した組換え大腸菌を用いた．2 L のジャーファーメンターに，2%グルコー
スまたはキシロースを含む合成培地（MR）を調整し，12 時間の前培養を行った組換え大腸菌を 1%（v/v）植菌し，培養温度 30℃で通気攪拌培養を開始した．培養開始 24 時間後から糖の流加を開始し，培地中の糖濃度が 40 g/L を超
えない範囲で流加速度を段階的に増加させた．
【結果と考察】グルコースのみを炭素源とした場合，61 g/L の良好な菌体生育が確認されたがポリマーの蓄積率は 7%であった．一方でキシロースのみを炭素源とした場合，ポリマーの蓄積率が 21%と高くなったが，菌体の成長は 30 g/L と低くなった．
この成長阻害を取り除き，ポリマー生産量を増加させるため，グルコースを初発糖として菌体増殖させた後，キシロースを流加してポリマー生産させる方法を試みた．その結果，各単糖を流加した条件と比べ菌体量（67 g/L）及びポリマー量（25 g/L）共に増加した．これは，糖の切り替えによってポリマー生産
遺伝子群の発現が上昇したと推測された．

Bio-alcohol production in engineered Bacillus subtilis through restoration ofnutritional depletion stress

Efficient Production of P(lactate-co-3-hydroxybutyrate) using dual carbon
sourses with fed-batch fermentation

Kim Eunjoo1, Seo Dahee1, Yang Yung-Hun2, ○Choi Kwon-Young1(1Dept. Environ. Eng. Ajou University, 2Dept. Microbial Eng. Konkuk University)

Key words

Protein Conversion, Bacillus subtilis, RelA, Spo0A

Takashi Yamazaki1, Greg Ribordy2, Chiaki Hori1,3, ○Ken'ichiro Matsumoto1,3,
Toshihiko Ooi1,3, Manfred Zinn2, Seiichi Taguchi3,4(1Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 2Hes-SO Walais Wallis, 3CREST, JST, 4Dept.
Life Sci., Tokyo Univ. Agric)

Key words

biodegradable plastic, biomass, fed-batch culture, xylose

273

3Ha04

Clostridium beijerinckii を宿主としたタンパク質発現系の開発 ―プロモーターの検討―

3Ha06○須江 夏希, 平松 愛子, 三宅 英雄（三重大院・生資）
miyake@bio.mie-u.ac.jp

キシローストランスポーター GAL2 の脱ユビキチン化によるグルコース・キシロース同時消費酵母の作成○藤森 一浩 1, 小林 洋介 1,2, 佐原 健彦 1, 扇谷 悟 1, 鎌形 洋一 1（1産総研・生物プロセス, 2Biomaterial in Tokyo）
k-fujimori@aist.go.jp【背景と目的】Clostridium beijerinckii はアミラーゼを分泌することでデンプンを加水分解し，ブタノールを生産する．これまで C. beijerinckii を宿主とした異種タンパク質発現についていくつか報告はあるが，いずれも発現量が少なく，目的遺伝子によって発現量も異なるためプロモーターの選択は重要である．本研
究では Clostridium 属由来の 4 つのプロモーターを用いた C. beijerinckii を宿主としたタンパク質発現系を構築することを目的とした．
【方法・結果】C. acetobutylicum 由来の thiolase 遺伝子，C. beijerinckii 由来のamylase 遺伝子，C. cellulovorans 由来の cellulose binding protein A 遺伝子，C.
saccharobutylicum 由来の endglucanase A 遺伝子のプロモーターとターミネーター
領域をそれぞれクローニングした．プロモーターの下流にレポーター遺伝子として C. cellulovorans 由来のセルラーゼである endoglucanase O (engO) を連結し，E. coli-Clostridium のシャトルベクターである pMTL500E に導入することで engO
発現プラスミドを構築した．これらのプラスミドを嫌気条件下において，エレクトロポレーション法を用いて C. beijerinckii に形質転換した．得られた形質転換体を 1 %カルボキシメチルセルロースを含む寒天培地に植菌し，嫌気条件下で培養した．その後，このプレートについてコンゴーレッド染色を行った結果，
thiolase プロモーター以外の 3 つについてセルラーゼ活性が観測された．このことから 3 つのプロモーターを用いたタンパク質発現系を構築することができた．

【背景】
セルロース系エタノール生産の実用化には，Xylose の消費速度を向上するとともに，発酵期間の短縮が重要な課題となっている．しかし，カタボライト抑制によって Xylose 消費は Glucose 消費よりも遅れて開始するため，発酵に無駄な時間を要することになっていた．出芽酵母では，Xylose を取り込む能力がある
内 在 性 Hexose transporter と し て HXT4, HXT7, GAL2 等 が 報 告 さ れ て い る（Hamacher et al., 2002）．また，Glucose 取込み速度が低下し Xylose 取込み速度が向上する変異として，Hxt7p(N370S)や Gal2p(N376F)が発見された（Farwick etal., 2014）．しかし，これらの変異体は Xylose 単独で生育可能になるものの，
Glucose/Xylose 共存在下でのエタノール発酵性能に及ぼす効果については，これまで十分調べられていなかった．
【方法・結果】
我々は，Glucose/Xylose の同時消費を実現するためには，上記変異に加えて，
Xylose transporter の細胞膜における安定性を改善する必要があると考え，Hexose
transporter のユビキチン化に着目した．Gal2p は，12 回膜貫通型の内在性 Hexose
transporter で，N 末, 4 番目の細胞内ドメイン，C 末の 3 か所がユビキチン化される可能性が示唆された．そこで，ユビキチン化候補サイトを単独あるいは複数組み合わせで破壊した GAL2 変異体をそれぞれ作成し，導入した株の自然発酵法によるエタノール発酵試験を行った．培地の糖濃度は，実バイオマス糖化液を想定し D-glucose 85 g/L, D-xylose 35 g/L を用いた．その結果，Xylose 消費
速度は，48 h から 24 h と約半分に短縮され，Glucose よりも先に全量の Xyloseを資化しうる性能を持つことが明らかになった．
※本研究は，バイオマスエネルギー技術研究開発/バイオ燃料製造の有用要素技術開発事業/有用微生物を用いた発酵生産技術の研究開発/C5C6 糖同時発酵微生物の開発 (NEDO)において行った．

Development of protein expression system in Clostridium beijerinckii Investigation of promoter-

Development of glucose/xylose co-fermentable yeast strains bydeubiquitination of xylose transporter GAL2.

○Natsuki Sue, Aiko Hiramatsu, Hideo Miyake(Grad. Sch. Bioresour., Mie Univ.)○Kazuhiro E. Fujimori1, Yosuke Kobayashi1,2, Takehiko Sahara1, Satoru Ohgiya1,
Youichi Kamagata1(1BRI. AIST, 2Biomaterial in Tokyo Co., Ltd.)Key words

Clostridium beijerinckii, protein expression, cellulase, promoter

Key words

Saccharomyces cerevisiae, xylose, transporter, deubiquitination

3Ha05

発酵阻害物質耐性酵母 KS47-1 株の特徴づけと 1 倍体の
取得

3Ha07

酵母 Scheffersomyces stipitis を宿主とした新規細胞表層
提示システムの開発○竹内 健人 1, 加藤 勇太 1, 荒川 知子 1, 堀内 淳一 2, 小西 正朗 1
（1北見工大, 2京工繊大院・工芸科学）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp○猪熊 健太郎, 小林 優真, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
akondo@kobe-u.ac.jp【 背 景 と 目 的 】 木 質 バ イ オ マ ス 中 の 発 酵 阻 害 物 質 （ furfural (FL), 5hydroxymethylfurfural(5-HMF), vanillin (VA), ギ酸,酢酸など）はバイオエタノール生産やバイオリファイナリープロセスに使用する微生物の増殖を阻害するとこが知られている．それぞれの物質に対応する微生物の耐性機構は複数存在し,多数の関連遺伝子が存在するため,既知の出芽酵母などを遺伝子改変して耐性を付与することは難しい．そこで,我々は発酵阻害物質に強い耐性を持つ次世代酵母
ホストの候補として,通常の酵母が増殖できないトウモロコシの芯(corncob)糖化
液中で良好に増殖する酵母 Pichia membranifaciens KS47-1 株を分離した．本菌株を組換え宿主として利用するため,この酵母の詳細な性格付けと栄養要求性 1倍体の獲得を試みた．
【方法】単一の阻害物質に対する増殖特性を観察するため,VA,酢酸,FL,5-HMF,ギ酸,レブリン酸を含む最少寒天培地に段階希釈した培養液を 10 μl 播種し,28℃で3 日間培養した．1 倍体を取得するため,YM 培地で 10 日間以上培養し胞子を形成させた細胞に Lysing Enzymes 処理を施し,再度 YM 培地に播種した．1 倍体候補を阻害物質含有培地で同様に耐性試験した．
【結果と考察】2 倍体と思われる野性株は 200 mM 酢酸,10 mM ギ酸,10 mM FL,
10 mM 5-HMF, 5 mM VA 存在下でも良好な増殖を示した．近縁種は酢酸,ギ酸,VA
に対して感受性を示した．酢酸に対して高い耐性が認められたため,酢酸耐性酵
母として知られる Zygosaccharomyces bailii と耐性を比較したところ,酢酸への耐性は同等であった．Z. bailii は酢酸やギ酸,5-HMF に十分な耐性を示したもののFL と VA に感受性を示した．1 倍体を分離したところ元株が持つ茶色の色素合
成能力が消失したが,高い阻害物質耐性は保持された．さらに,薬剤突然変異法による栄養要求性株の取得を試みたところウラシル要求性株を取得した．

【目的】近年，低炭素循環型社会実現の観点から，再生可能なバイオマス資源から微生物を用いて燃料や化学品を製造する技術の導入が望まれている．そのための微生物育種に有効なのが，GPI アンカーと呼ばれる構造を介して酵母の細胞表層に酵素などを提示する細胞表層工学技術である．我々はこれまで，主に
酵母 Saccharomyces cerevisiae を宿主としてセルラーゼなどの酵素を細胞表層に提示しバイオマス分解能を付与する研究を進めてきた．一方，近年では物質生産に有益な特性を持つ S. cerevisiae 以外の酵母も報告されており，その中でもScheffersomyces (Pichia) stipitis は，セルロースの構成単糖であるグルコースに加えて，ヘミセルロースの構成単糖であるキシロースやキチンの構成単糖である
N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）に対しても高い資化能力を持つことから，様々な未利用資源からの物質生産を可能にする酵母として期待されている．しかしながら，これまで S. stipitis の細胞表層に酵素を提示した報告は無い．本研究では，S. stipitis の細胞表層に酵素を安定的に提示する技術の開発を試みた．
【結果】S. stipitis の細胞表層に酵素を提示するために，S. stipitis 自身の細胞壁タ
ンパク質の一種である Spi1 をコードする遺伝子（SsSPI1）に由来するプロモー
ター，分泌シグナル，GPI アンカーリング領域，およびターミネーターの配列を用いて新規表層提示用遺伝子カセットを構築した．そして，この遺伝子カセッ
トを用いてセルラーゼの一種である β-グルコシダーゼ（BGL）を発現させた S.
stipitis を培養し，細胞表層の BGL 活性を測定した．その結果，この酵母は培養開始から 24 時間で 544 U/g dry cells，96 時間で 729 U/g dry cells の BGL 活性を示し，今回開発した表層提示用遺伝子カセットを用いることで S. stipitis に酵素を安定的に提示できることが示された．

Characterization of an inhibitor tolerant yeast, Pichia membranifaciens
KS47-1, and preparation its haploid as a host cell for gene manupulation.

Development of novel yeast cell-surface display system for Scheffersomyces
stipitis○Kento Takeuchi1, Yuta Kato1, Tomoko Arakawa1, Junichi Horiuchi2,
Masaaki Konishi1(1Kitami Inst. Technol., 2Grad. Sch. Sci. Technol., Kyoto Inst. Technol.)Key words

biorefinery, inhibitor, Pichia membranifaciens, yeast○Kentaro Inokuma, Yuma Kobayashi, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

cell surface display, yeast, Scheffersomyces stipitis, Pichia

274

3Ha08

接合型変換を利用したセルラーゼ群表層提示酵母の糖化活性及び発酵阻害物耐性向上

3Ha10○北田 雄基, 猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
akondo@kobe-u.ac.jp

人工知能や統計的手法による天然培地成分からの発酵
生産量予測○渡辺 一樹 1, 小西 正朗 2
（1北見工大院・工・バイオ環境, 2北見工大）
konishim@mail.kitami-it.ac.jp【背景・目的】 リグノセルロース系バイオマスからの燃料生産は，環境負荷の軽減などの理由から近年注目されているが，多段階のプロセスの為の高い設備費や添加する酵素剤の費用が実用化の妨げになっている．この問題の解決策として我々は，細胞表層にセルラーゼを提示した酵母（セルラーゼ表層提示酵母）を用いてセルラーゼの生産，バイオマスの糖化，発酵を同時に行う「統合型バ
イオプロセス」の開発を行っている．セルラーゼ表層提示酵母を用いたリグノ
セルロース系バイオマス前処理物からのエタノール生産においては，酵母のセルロース分解能力のみならず，発酵阻害物耐性の向上も不可欠である．そこで
本研究では，この酵母の発酵阻害物存在下での増殖能力，エタノール生産能力の強化を試みた．
【方法・結果】 4 種類のセルラーゼ（BGL, EG, CBH1, CBH2）を提示した a 型の一倍体セルラーゼ表層提示酵母に HO 遺伝子を導入することで α 型への接合型変換を誘導し，その後 a 型と α 型のセルラーゼ表層提示酵母同士の接合によって二倍体セルラーゼ表層提示酵母を作製した．発酵阻害物である酢酸とギ酸を各々濃度 15 mM になるように添加した条件下でグルコースを基質とした発酵試験を行ったところ，発酵開始 4 時間時点で二倍体酵母のエタノール生産速度は一倍体酵母に比べ 30%向上した．さらに，各発酵阻害物存在下において，二倍体酵母と一倍体酵母の菌体増殖の評価を行ったところ，酢酸 40 mM 存在下において非増殖速度が 16%向上した．ギ酸 40 mM において誘導期が約 2.5 時間減少
すると共に非増殖速度が 17%向上した．ヒドロキシメチルフルフラール 20 mM
存在下において誘導期が約 6 時間減 少すると共に非増殖速度が 19%向上した．
現在，酵母の細胞壁に関与する遺伝子の組換えによる細胞表層セルラーゼ活性の向上を目指し，ゲノム編集技術を用いた代謝改変を行っている．

工業規模の微生物培養において，費用対効果の観点から，食品廃棄物等を活用した天然培地を用いることが多い．しかし，天然物は無数の成分を含み，原料間の成分変動も大きく，収率を不安定化させる．これに対し普遍的な解決策は無く，収率の安定化に貢献するための新しいバイオプロセス管理技術が求められている．そこで，当研究室では，人工知能や統計的手法による培地成分情報
からの培養結果予測システムを考案した．本報告では，スイートコーン残渣からの糖化液を用いた酵母によるエタノール生産系をモデルとして，予測した．
3 種のコーンコブ(中国・ベトナム・インドネシア産)と，自家製スイートコーンのストーバーを 60 g ずつ取り，1-3%希硫酸溶液を 300 ml 加え，121℃，60 分加熱した．一部は活性炭吸着処理した．次に 0.6 g のメイセラーゼ(明治製菓ファルマ製)を加え，40℃，100 rpm で 3 日間振盪し，pH5.00 に調整後フィルター滅
菌し，糖化液とした．次に，Saccharomyces cerevisiae S288C 株を YM 培地で 2
日間前培養し，滅菌済み 500 ml 容量フラスコに 50 ml の糖化液を加え，前培養液を 1 ml 植菌し，70 rpm，30℃で 72 h 本培養した．菌体濁度は分光光度計で，エタノール濃度を HPLC で測定した．更に，糖化液中の揮発性成分をジクロロ
メタン抽出し，GC-MS で分析した．得られた培養結果を従属変数，糖化液の成分情報を独立変数としたデータマトリクスを作成し，部分最小二乗回帰(PLS-R)と，ニューラルネットワーク(ANN)への学習を行い，それぞれ増殖，エタノー
ル生産の予測モデルを作成した．その結果，一部解析で PLS-R における Q2 値
は 0.8 を超え，ANN における総平方和は最低で 0.35 程度と，高精度の予測が可能であった．更に，予測に対する各種独立変数の重要度を比較することで，培養に強く影響する成分情報の抽出に成功した．

Improvement of saccharification ability and fermentation inhibitor
tolerance of cellulase-displaying yeast using mating-type switching

Application of Artificial Neural Network(ANN) and Partial Least-Squares
Regression(PLS-R) to predict the bioethanol production from corncob
hydrolysates○Yuki Kitada, Kentaro Inokuma, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)○Kazuki Watanabe1, Masaaki Konishi2(1Kitami Inst. Technol., Grad. Sch. Eng. Biotech. Environ. Chem., 2Kitami Inst.
Technol.)

Key words
Saccharomyces cerevisiae, cell surface display, diploidization,
fermentation inhibitor

Key words
fermentation

artificial neural network, statistical analysis, biomass, ethanol

3Ha09

3Ha11

潜性形質に注目したレアメーティングによる非遺伝子組換え酵母の育種

Repeated ethanol fermentation from membraneconcentrated sweet sorghum juice by flocculating yeast
Saccharomyces cerevisiae○海道 直生 1, 金子 嘉信 2, 山崎 思乃 3, 片倉 啓雄 3
（1関西大院・理工, 2阪大院・工, 3関西大・化生工）
katakura@kansai-u.ac.jp○Hans Wijaya1,2, Kengo Sasaki3, Prihardi Kahar1, Yopi2,
Chiaki Ogino1, Bambang Prasetya4, Akihiko Kondo3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2LIPI, 3Grad. Sch. Sci. Technol.
Innov., Kobe Univ., 4BSN)
hanswijayalipi2014@gmail.com
The sorghum accumulates the sugar-containing juice in the stalks and the juice can beused for biofuel production. Membrane separation technology can concentrate thesugars and amino acids in the juice, to increase biofuel production. However, theproblem is high osmotic stress in the concentrated juice, due to high sugarconcentration. To overcome this, we utilize the flocculent Saccharomyces cerevisiae
strain F118 in this experiment. The aim of this study was to construct the cost-effective
method of repeated bioethanol production from the membrane (ultrafiltration
permeation and nanofiltration concentration)-concentrated sweet sorghum juice byusing strain F118. With low initial dry cell concentrations at around 0.28-0.35 g L-1, thestrain F118 provided higher ethanol titer of 88.1 g L-1 (theoretical ethanol yield of
70.77%) than non-flocculent S. cerevisiae strain BY4741 strain that of 36.1 g L-1 after
24 h fermentation, indicating that strain F118 possesses high tolerance against osmotic
stress. This result was correlated with higher gene expressions regarding sucrosehydrolyzing enzyme, invertase, sugar phosphorylation, pyruvate to ethanol pathways instrain F118 compared to strain BY4741. Sequential fed-batch fermentation was
conducted and strain F118 was easily separated from the fermentation broth byforming flocs and sediment. At 5th cycle of fermentation by strain F118, ethanol
concentration reached to 100.4 g L-1.

【緒言】
Saccharomyces cerevisiae には性があり，2 倍体は減数分裂して胞子を形成する
が，実用株の多くは胞子を形成しないため，交雑による育種は難しい．しかし，2 倍体は 10-6～10-7 程度の低頻度でホモ接合の接合型になり，異なる接合型の 1倍体と接合（レアメーティング）することが知られているので，交配する 1 倍体が正常な胞子形成能を保持していれば，このレアメーティング法での育種が可能となる．さらに，3 倍体より 4 倍体の方が胞子生存率が高いので，レアメー
ティングを 2 回行えば，減数分裂を経て潜性形質をもつ株の育種も効率よく行える．本研究では，rim15 欠損により高いエタノール濃度までエタノール生産が抑制されなくなる形質に注目し，この性質と耐熱性を合わせ持つバイオエタ
ノール生産に適した酵母の育種を行った．
【方法と結果】
研究室保有菌株 141 株から，耐熱性株として 42℃で生育する PS28 株，エタノー
ル耐性株として高濃度のエタノール存在下で比生産速度が最も高い協会 6 号（K6 株）をそれぞれ選択した．まず，PS28 株から胞子を単離し，40℃で生育す
る 1 倍体を選抜した．これと，エチジウムブロマイド含有 YPD 培地で培養して呼吸欠損とした K6 株を 1：10 の割合で YPD 培地に植菌し，一晩静置培養した
後，グリセリンを炭素源とする YPG 培地で継代して 3 倍体株を濃縮・単離した．この 3 倍体にさらに耐熱性の 1 倍体を交配して 4 倍体を取得し，胞子を形成させて多様な遺伝子型をもつ 2 倍体を得た．この 2 倍体から rim15 をホモ接合でもち，かつ，高い耐熱性をもつ株を選択し，育種に用いた親株である K6
株と PS28 株を対照として，得られた 2 倍体のエタノール耐性及び耐熱性を評価している．

Repeated ethanol fermentation from membrane-concentrated sweetsorghum juice by flocculating yeast Saccharomyces cerevisiae

Non-recombinant breeding of yeast by rare mating focusing on recessivetrait

Key words
Sweet sorghum juice, membrane technology, flocculent Saccharomyces
cerevisiae, gene expression

Key words
breeding○Hans Wijaya1,2, Kengo Sasaki3, Prihardi Kahar1, Yopi2, Chiaki Ogino1,
Bambang Prasetya4, Akihiko Kondo3(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2LIPI, 3Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.,
4
BSN)○Naoki Kaido1, Yoshinobu Kaneko2, Shino Yamasaki3, Yoshio Katakura3(1Grad. Sch. Sci. Eng., Kansai Univ., 2Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 3Fac. Chem.
Mater. Bioeng., Kansai Univ.)
Saccharomyces cerevisiae, rare mating, RIM15, Non-recombinant

275

3Ia01

バイアスドランダム化と DNA バーコード付加によるプ
ロモーター変異体のハイスループット解析

3Ia03

環境中難培養微生物のゲノム解析に向けた高精度シング
ルセルゲノムアセンブリツールの開発○小川 雅人 1,2, 西川 洋平 1, 森 一樹 2, 細川 正人 3,4, 竹山 春子 1,2,3（1早大・先進理工, 2産総研・早大CBBD-OIL, 3早大ナノライフ
創研, 4JST・さきがけ）
haruko-takeyama@waseda.jp○青木 航 1,2, 古村 崚 1, 元根 啓佑 1,3, 植田 充美 1
（1京大院・農, 2JSTさきがけ, 3日本学術振興会）
miueda@kais.kyoto-u.ac.jp【背景】
タンパク質の生産や遺伝子回路のデザインにおいて，遺伝子発現レベルを精密にコントロールすることが重要である．しかし，既存のプロモーターやエンハ
ンサーなどのシスエレメント（cis-regulatory element, CRE）だけでは，目的の遺伝子発現プロファイルを実現できないことも多い．そこで本研究では，ある特定の CRE に対し，バイアスドランダム化と DNA バーコード付加を用いて，さまざまな転写プロファイルを示す変異体を高速に取得する方法論の確立を試みた．
【内容】
本論文では，研究対象として遺伝子発現制御ツールとして頻用される T7 プロ
モーターを選択した．まず，T7 プロモーターのそれぞれの塩基が一定の確率で置換されるように変異を導入した．同時に，それぞれの変異体に DNA バーコードを付与し，T7 DNA ライブラリを取得した．このライブラリに対して in vitrotranscription assay を行い，T7 mRNA ライブラリを取得した．次に，DNA ライ
ブラリと mRNA ライブラリを NGS で解析し，それぞれの T7 変異体の転写プロ
ファイルを評価した．本手法により，104 以上の変異体を一度に評価し，野生型の T7 プロモーターに対して同程度から 1/1000 程度までの発現強度を持つ T7
プロモーター群を網羅的に作製することに成功した（1）．この成果は，合成生物学においてスマートセルファクトリーの構築に貢献すると期待される．

培養手法が確立されていない環境中の難培養微生物を研究する上で，シングル
セルゲノム解析は有用な手法となっている．しかしシングルセル解析には，多数のデータを取得するための実験のスループットや，MDA (Multiple Displacement
Amplification)法を主とするゲノム増幅時のエラーに起因する取得配列情報の低質化，といった問題が存在する．
そこで当研究室では，ピコリットル容量の微小液滴に単一細胞を封入して，各液滴内で超並列的にシングルセルゲノムを増幅する技術，sd-MDA (single droplet
MDA)を開発してきた(Scientific Reports, 2017)．当技術では，秒間 1000 個と高速生成される液滴を用いることによるシングルセルゲノム増幅のスループットの改善，および，極小空間でのゲノム増幅によるコンタミネーションの少ない
ゲノム増幅が達成された．しかし本技術を用いても，MDA で生じたキメラ配列に起因するゲノム情報の低質化が起こってしまう．そこで本研究では，複数のシングルセル情報の比較によるエラー配列除去を伴うゲノムアセンブリツー
ル ccSAG を開発し，より高精度なゲノム配列の取得を目指した(Scientific
Reports, 2018)．
まず初めに，枯草菌シングルセル情報をモデルとして ccSAG 解析の評価を行ったところ，エラー配列の減少に伴ってゲノムアセンブリの向上が見られた．さらに 8 サンプル以上のシングルセル情報を用いて，培養菌体を用いた従来のゲノム解析手法と同等以上の高質なゲノム情報が取得された．続いて，実際に sdMDA を用いてマウス腸内細菌シングルセル情報を取得し，ccSAG 解析を行う
ことで，バクテロイデス門に属する 2 種類の高精度な新規ゲノムが取得された．
ccSAG と sd-MDA を組み合わせることで，細菌叢の網羅的なシングルセルゲノ
ム解析への応用が期待される．

High-throughput evaluation of promoter variants using biased
randomization and DNA barcoding

Co-assembly of single bacterial genomic data to acquire accurate draft
sequences○Wataru Aoki1,2, Ryo Komura1, Keisuke Motone1,3, Mitsuyoshi Ueda1(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2JST PREST, 3Japan Soc. Prom. Sci.)○Masato Kogawa1,2, Yohei Nishikawa1, Kazuki Mori2, Masahito Hosokawa3,4,
Haruko Takeyama1,2,3(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2CBBD-OIL, AIST., 3Res. Org. for Nano &Life Innovation, Waseda Univ., 4PRESTO, JST)Key words

NGS, DNA barcode, biased-randomization, synthetic biology

Key words

single cell, bioinformatics, microfluidic device

3Ia02

サンゴ共在細菌の機能予測に向けた環境因子応答
Endozoicomonas 属の系統解析

3Ia04

DNA 塩基配列の人工知能による生物分類・進化・機能の解析○井手 圭吾 1,4, 伊藤 通浩 2, 藤村 弘行 3, 須田 彰一郎 3,
中野 義勝 2, 細川 正人 5,6, 竹山 春子 1,4,5（1早大・先進理工, 2琉球大・熱生研, 3琉球大・理, 4産総研・早大CBBD-OIL, 5早大ナノライフ創研, 6JST・さきがけ）
haruko-takeyama@waseda.jp○三宅 淳 1, 馬場 俊輔 1, 山本 修也 2, 島林 真人 2, 田川 聖一 3,
新岡 宏彦 4（1阪大国際医工情報センター, 2阪大院・基礎工, 3阪大先導的学
際研究機構, 4阪大データビリティーフロンティア機構）
jun_miyake@bpe.es.osaka-u.ac.jp

近年，サンゴ礁の白化が世界的な問題となっており，サンゴ共在微生物の働きが注目されている．特にサンゴ共在細菌叢の大部分を占める Endozoicomonas 属
はサンゴの生存において重要な働きをすることが報告されている．本研究では，サンゴ共在 Endozoicomonas 属の環境因子に対する応答とサンゴに対する関連を明らかにするために，情報解析を適用し Endozoicomonas 属の系統ごとの環境への応答の解析を行った．
沖縄県瀬底島の特定サンゴ群体から，定期的に採取したサンゴ（Acropora
tenuis）の枝よりサンゴ組織を採取し，メタゲノム抽出を行った．また，8 種の環境因子を経時的に計測した．メタゲノム抽出物に対して微生物の 16S rRNA
遺伝子塩基配列を対象としたアンプリコンシーケンスおよびデジタルドロップ
レット PCR を行い，共在細菌叢の定量データを獲得した．得られた共在細菌叢
データに対し共相関ネットワーク解析を適用し，サンプル間で同様の挙動を示
すモジュールを推定した．推定したモジュール中で Endozoicomonas 属が有意に優占し，かつ，環境因子と関連の深いモジュールの抽出および Endozoicomonas属の系統の関連を統合的に解析した．
共相関ネットワーク解析の結果，30 個のモジュールが推定された．そのうち，Endozoicomonas 属が優占したモジュールは 7 個であり，これらのモジュールはpH および溶存酸素に関連するモジュールと海水温に関連するモジュールに分けられた．また，これらのモジュールに含まれる Endozoicomonas 属の系統と環境因子で分けられたモジュールが強く関連していることが示唆された．
先行研究により，Endozoicomonas 属は海水温と関連して増減することが報告されていたが，他の環境因子と関連して増減する系統が存在することが示唆された．また，どのような環境因子に対して反応するかは系統特異的に獲得した機能であることが示唆された．

DNA シークエンスの意味と情報の構造について検討した．DNA は構造遺伝子としてだけでなく，遺伝子の所属，進化上の位置づけなどについても記していると考えられる（シークエンスの上位階層にかかわる情報）．これらの情報がどのように DNA に書き込まれているか，完全には把握されていない．一般にはSNP を用いて分類されるが，SNP が自然分類ではないことに留意すべきである．我々は，自然分類に近い方法として，DNA シークエンスをディープラーニ
ングを用いて解析し，高次な階層における構造について調べた．
DNA は NCBI など各種のデータベースより用い，一つの生物種について数百例の DNA を用いて解析した．各種生物のミトコンドリア DNA，ウイルス DNA/RNA，細菌の DNA のシークエンスについて Stacked Autoencoder を用いて圧縮し，2 次元もしくは 3 次元プロットを行った．その結果，いずれの生物に於いても，属の中のサブクラス毎のカテゴリーがクラスターとして明瞭に認識された．例えば，フラビウイルス属のジカウイルスや日本脳炎ウイルスなどが，独立のクラスターとして描写された．これは，ディープラーニングによって，DNA シークエンスに内在されている情報が顕在化されたためと考えられる．また，クラスターの空間位置関係は進化にかかわる情報を提示していることも示された．
DNA においては高度な編集によってシークエンス上の特定の位置に限定せず進化・分類などの情報を記していると考えられる．統計に基づいて学習された決
定木的分類ではなく，自然分類的な情報が提示されたことの意味は大きい．カ
テゴリー形成による「認識」が，人間の知的機能を介してではなく，分子上に記されている情報から自動的に形成可能であることは，新たな生命解釈を与えるものになると考えられる．

Phylogenetic analysis of genus Endozoicomonas in response toenvironmental factors for function prediction of coral co-localized bacteria

DNA sequence analysis by artificial intelligence○Keigo Ide1,4, Michihiro Ito2, Hiroyuki Fujimura3, Shoichiro Suda3,
Yoshikatsu Nakano2, Masahito Hosokawa5,6, Haruko Takeyama1,4,5(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Tropical. Biosphere. Res. Ctr., Univ. Ryukyus,
3Fac. Sci., Univ. Ryukyus, 4CBBD-OIL, AIST., 5Res. Org. for Nano & Life
Innovation, Waseda Univ., 6PRESTO, JST)Key words
system biology, marine microbiology, coral, symbiotic bacteria○Jun Miyake1, Shunsuke Baba1, Shuya Yamamoto2, Masato Shimabayashi2,
Seiichi Tagawa3, Hirohiko Niioka4(1MEI Center, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Eng. Sci., Osaka Univ., 3OTRI, Osaka Univ.,
4Inst. Datability Sci., Osaka Univ.)

Key words

artificial inteligence, deeplearning, autoencoder, DNA sequence

276

3Ia05

大規模実験室進化を用いた転写因子の破壊による大腸菌の薬剤耐性化の制御

3Ia08○堀之内 貴明 1, 前田 智也 1, 小谷 葉月 1, 酒井 亜希 1, 古澤 力 1,2（1理研・生命機能, 2東大院・理）takaaki_horinouchi@riken.jp

生物システムは厳しい環境条件に対しても長期間かけて適応進化する能力を有することが知られている．生物工学分野ではこれを進化工学として利用し，有用微生物の育種などに適用している一方で，近年社会問題化している薬剤耐性菌の出現は，抗菌剤に対する細菌の適応進化とみなすことができる．生物シス
テムの適応進化を自在に制御できれば，こうした生物工学や医学分野の諸問題に大きく貢献することができる．
実験室内で長い世代を経させる実験室進化は，次世代シーケンサーなどの解析技術と組み合わせることで，適応進化過程の直接的な解析を可能とする手法として近年注目を浴びている．我々の研究グループではこれまでに，こうした実験室進化を全自動で大規模に実施できる全自動培養装置を開発してきた(Ref.)．
本研究ではこのシステムを用い，細胞への様々な摂動が適応進化過程にどのような影響を及ぼすのかを解析するために，大腸菌の一遺伝子破壊株（Keiocollection）を用いて抗菌剤存在下における実験室進化を行った．大腸菌の主要な転写因子約 170 遺伝子を題材とし，各破壊株を抗菌剤の存在下で継代培養し，それぞれの株の薬剤耐性化過程を観察したところ，薬剤耐性化が阻害される株を多数スクリーニングすることに成功した．さらなる解析により，薬剤耐性化が阻害される原因の一端として，薬剤耐性化因子（多剤排出ポンプなど）と他の遺伝子との間の負の相互作用が関係していることが示唆された．現在，そのメカニズムの詳細な解析を進めており，本発表ではその内容について報告する．
(Ref.) Horinouchi et al., Sci. Rep., 7, 14009, 2017.

Control of Escherichia coli antibacterial resistance by deletion oftranscription factor using high-throughput experimental evolution○Takaaki Horinouchi1, Tomoya Maeda1, Hazuki Kotani1, Aki Sakai1,
Chikara Furusawa1,2(1BDR, RIKEN, 2Grad. Sch. Sci., Univ. Tokyo)

Key words
coli

3Ia07

細胞形態情報解析における情報コンテントの重要性○加藤 寛之, 藤谷 将也, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp

創薬研究において，化合物ライブラリから標的分子に効果がありそうな化合物を選別し，リード化合物を探索する過程を創薬スクリーニングと呼ぶ．近年，スクリーニング系の中で，細胞の表現型に着目した Phenotype-based screening が非常に注目されている．Phenotype-based screening は細胞の挙動に基づいて化合物を評価することで生体内に近い情報が得られ，これまでに画期的な新薬が数多く得られている．しかし，こうした手法の多くは簡易的なアッセイ法から得られる情報が用いられていることや，細胞破壊的評価から得られる情報を用いるため，遅延毒性や長期の薬剤効果といった化合物の経時的効果を検出できな
いといった課題があった．
本研究室では，位相差画像を用いて経時的に撮影を行うことで，非破壊的かつリアルタイムに細胞形態情報を取得し，そこから得られる高次元形態情報を用いて，抗がん剤の作用機序をプロファイリングする技術を開発してきた．創薬探索の評価において，手法としての堅牢性の獲得は重要であるが，これまで細胞画像から得られる「形態情報」がどれだけの情報量を有しており，どれだけの情報コンテントを有しているかを定量的に評価した例は少ない．本研究では，様々な撮影条件などで変化する細胞形態情報の情報コンテントについて分析を行い，より堅牢な薬剤評価を行うための細胞形態情報の活用方法について報告を行う．

Analysis of information content of cellular morphological information○Hiroyuki Kato, Masaya Fujitani, Kei Knie, Ryuji Kato
(Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

evolutionary engeneering, antibacterial, Keio collection, Escherichia

Key words
information content, cell morphology, phenotype-based screening,
image analysis

機械学習を用いた機能性ペプチド探索手法の開発

3Ia09○山下 春来 1, 藤谷 将也 2, 清水 一憲 1, 蟹江 慧 2, 加藤 竜司 2,
本多 裕之 1,3
（1名大院・工, 2名大院・創薬, 3名大予防早期医療創成セ）
honda@chembio.nagoya-u.ac.jp

細胞形態情報解析を応用した神経系細胞の非侵襲的評価○今井 祐太, 藤谷 将也, 寺澤 摩周, 岡田 真衣, 蟹江 慧, 加藤 竜司（名大院・創薬）
kato-r@ps.nagoya-u.ac.jp【背景・目的】
ペプチドは機能性食品，医薬品などの有効成分として注目されている．しかし，20 種類の天然アミノ酸の組み合わせから成るペプチドは，例えば 8 残基で 208＝ 256 億種類と莫大な多様性を持つため，網羅探索が非常に難しい．このため，機能性を持つペプチドを効率よく探索できる方法論の確立が強く求められている．本研究では，ペプチド中のアミノ酸の特徴量(電荷，疎水度など)を変数とする機械学習を用いて機能性ペプチドの探索手法の開発を試みた．
【方法】
本研究では，アミラーゼ・グルコシダーゼの両方を阻害する「食後高血糖改善
ペプチド:GHWYYRCW」を対象とした．このペプチドの 1 残基置換体 153 種のアミラーゼ・グルコシダーゼ阻害活性を教師データとして，24 種のアミノ酸物
性値(電荷，疎水度など)と 5 つのペプチド物性値を合わせた 120 の変数を用いた機械学習を行った．その後，10108 種類の GHWYYRYW2 残基置換ペプチドの中で高活性と予測された配列，ランダムに抽出した配列各 30 個を「ペプチドアレイ技術」を用いて合成し，アミラーゼ・グルコシダーゼ阻害活性を評価した．
【結果】
両酵素の活性が，GHWYYRYW 添加よりも有意に低下する（0.8 倍以下）ペプ
チドを高活性配列と定義した．ランダム抽出では高活性ペプチドが 1 つしか得られなかった．それに対して，機械学習で高活性ペプチドを予測した場合では29 個の高活性ペプチドを取得することに成功し，その精度は 97％（=29/30）に達した．よって，アミノ酸物性値を変数とした機械学習を用いる今回の方法は，高活性ペプチドの探索に非常に有効である．

近年の細胞培養技術の発展から，様々なヒト細胞が創薬開発の現場で広く応用されるようになってきている．特に創薬探索において，ヒト細胞の表現型に着目したスクリーニング法は，標的などの分子のみに着目したスクリーニング法に比べて First-in-class の医薬品開発成功率が高いとされ，注目を集めている．
また創薬開発の対象としてアルツハイマー病などに代表される神経疾患は，アンメット・メディカル・ニーズの重要な対象の一つであり，神経系の細胞を用いた有効な評価系の構築が求められている．
神経系の細胞は培養環境にデリケートであり，集団内のヘテロ性が高く集団全体の分化効率が低い．即ち，細胞集団としての薬剤応答にバラツキが大きく，
集団全体のバルク評価結果を用いては薬剤感受性などの評価が難しいという課題がある．また，神経疾患の治療薬における副作用の評価などには，長期曝露における応答性評価が重要であるが，マーカー染色などによる侵襲的なエンド
ポイントアッセイでは，その評価が一面的になってしまうという課題もあった．
これまで我々のグループでは，細胞形態の経時変化情報を顕微鏡画像から抽出
し，高次元のリアルタイム計測データとして情報解析することで，リアルタイ
ムかつ早期に薬剤応答性を評価できる非侵襲的細胞評価技術を提案してきている．画像解析では，ヘテロ性の高い集団内の「特徴的な形態を示す細胞」などの部分的集団の定量評価や，長期間の経時的応答の数値化を行えることが強みである．本研究では，この細胞画像情報解析技術を応用し，神経系細胞の保護機能を持つ天然物由来化合物分子の評価を行い，細胞形態情報からヘテロ性の高い細胞集団の評価を行う手法の開発を行ったのでこれを報告する．

Development of functional peptide search method using machine learning

Morphology-based non-invasive analysis for neural cell-based assays○Haruki Yamashita1, Masaya Fujitani2, Kazunori Shimizu1, Kei Kanie2,
Ryuji Kato2, Hiroyuki Honda1,3(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ., 3PME.
Nagoya Univ.)

Key words

peptide, amino acid, bioinformatics○Yuta Imai, Masaya Fujitani, Mashu Terasawa, Mai Okada, Kei Kanie, Ryuji Kato
(Grad. Sch. Pharm. Sci., Nagoya Univ.)

Key words
screeningamyloid, drug delivery system, neural stem cell, high-throughput

277

3Ia10

ファンクショナルセロミクスによる神経ネットワークのハイスループットアノテーション

3Ka01○幅田 亜香莉 1, 由里本 博也 1, 山本 恭士 2, 湯村 秀一 2,
阪井 康能 1
（1京大院・農, 2三菱ケミカル）
ysakai@kais.kyoto-u.ac.jp○山内 悠至 1, 松倉 秀典 1, 青木 航 1,2, 植田 充美 1
（1京大院・農, 2JST・さきがけ）
miueda@kais.kyoto-u.ac.jp

記憶や学習といった生物の高次生命現象は，神経ネットワークによって生み出されており，そのメカニズムの解明と応用へのチャレンジが必要である．
オプトジェネティクスにより神経活動と高次生命現象との関連性を検証することは可能になったが，解析対象となるニューロンを予め決定しなければならず，
実験に仮説を必要とし，完全に新規な発見が得られにくいという欠点がある．
また，仮説毎に異なる変異体も作成しなければならないためロースループット
であるという問題も存在する．
そこで我々は，従来のオプトジェネティクスとは相補的な Functional cellomicsの開発を行った．本新規手法では，仮説を必要とせず，ハイスループットで神経ネットワークの機能解析を行うことができるという利点がある．重要な点は，
神経ネットワークを構成する各シングルセルのニューロンにおいて，オプシンを確率的に発現させることである．具体的には，Cre/lox システムを応用することで，おプシンの発現パターンがランダム化された線虫 Caenorhabditis elegansの生物集団を取得できる．この集団に対して光操作を行うことで一度に様々な表現型を示す個体が得られる．特徴的な表現型を示した個体に対し，どのニューロンがオプシンでラベリングされていたかどうかを後から調べることで，表現型とニューロンの関係を網羅的に探索することができる[1]．
そこで，線虫 C. elegans に，オプシンをまずランダムに発現させ，更に，ランダム化集団を用いて，産卵行動を司るニューロンとされている HSN ニューロンの機能をハイスループットに同定することに成功したので，それらをまとめて報告する．

メタノール資化性酵母 Candida boidinii 合成生物学によるグルカル酸の高発酵生産【目的】グルカル酸は果物や野菜に含まれている酸性糖質であり，機能性食品素材として利用されるだけでなく，2004 年には米国エネルギー省によってバイオ
リファイナリー基幹物質に定められ，新規ポリマー原料や化成品中間体としての大型用途が期待される化合物である．本研究では，酸耐性を有するメタノー
ル資化性酵母 Candida boidinii myo-イノシトール高生産性変異株による合成生物学的手法によるグルカル酸のグルコースからの直接発酵生産を目的とした．
【方法・結果】myo-イノシトールからグルカル酸への変換反応を触媒する 2 種の酵素，myo-イノシトールオキシゲナーゼ（MIOX）およびウロン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Udh）をそれぞれ His タグを付加して C. boidinii で発現させたところ，
Udh 活性は認められたものの，MIOX 活性は検出できず，ウエスタンブロット
解析により MIOX が不溶化していることが示唆された．MIOX の可溶性発現のために，MIOX を Udh との融合タンパク質として発現させることにより，融合タンパク質の可溶性発現に成功した．MIOX-Udh 発現株をグルコース培養した
ところ，培養上清中に著量のグルカル酸生産を確認した．グルカル酸生産能の高い形質転換株を選抜するため，His タグを付加していない Udh-MIOX 融合タ
ンパク質の発現株について培地中グルカル酸量を定量し，特に高いグルカル酸生産能を示す株を取得し，さらにこれを親株としてゲノムへのランダム挿入変異を導入し，グルカル酸高生産株（AHC006-16 株）を取得した．AHC006-16 株を用いたミニジャー培養により，グルコースを原料としたグルカル酸の数 g/L
レベルでの高生産に成功した．

[1] Aoki et.al submitted

High-throughput annotation of neural networks by development offunctional cellomics○Yuji Yamauchi1, Hidenori Matsukura1, Wataru Aoki1,2, Mitsuyoshi Ueda1(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2PRESTO, JST)

High-level production of glucaric acid by synthetic biology in the
methylotrophic yeast Candida boidinii○Akari Habata1, Hiroya Yurimoto1, Yasuhito Yamamoto2, Shuichi Yunomura2,
Yasuyoshi Sakai1(1Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ., 2Mitsubishi Chemical)

Key words
Optogrnrtics

Caenorhabditis elegans, neural network, single-cell analysis,

Key words
methylotrophic yeast, heterologous production, metabolic engineering,
Candida boidinii

3Ia11

マウスのにおい学習実験における引き返し行動とおよび自発的不正解選択の関係

3Ka02○滝口 昇 1,2, 矢野 達也 3
（1金沢大・理工, 2金沢大院・自科, 3松本工業高等学校）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp【背景と目的】Y 字迷路を用いたマウスのにおい学習・識別行動の解析から，難易度の高い課題ほど識別能に多様性が表出する事がわかってきており，これまで人工的なノイズとして解析から除外される傾向にあった個体差が，単なるノイズと考えるべきではないことが示唆されている．本研究では，マウスのにおい学習行動のビデオイメージング解析をおこない，引き返しおよび自発的な不正解選択行動が，においの学習効率に与える影響について検討を試みた．
【実験方法】におい学習データとして，Y-maze Assay による Isoamyl Acetate（以下 IA）の学習時データを用いた．オペラント条件付けの実験手続きにより，23
時間絶水条件下で，水を報酬として IA のにおいを学習させた．学習中のマウスの行動はビデオカメラで撮影し，自家製の解析ソフト(Image Processing Creator)を用いて 1/30 sec 間隔でマウスの位置を取得し，引き返しおよび自発的と思われる不正解選択についてパラメータを抽出した．
【結果と考察】連続した 24 試行からなるセッションを 1 日 1 回行ったところ，正答率は徐々に向上し，マウスは約 3 週間で 80%以上の正答率を示すようになった．第 1,5,10,17,20 セッション（S）のビデオデータを用いて引き返し回数をカウントしたところ，5S から 17S にかけて，引き返し回数が 1S の 2 倍以上になった．一方，学習が完了した 20S では 1S よりも低下していた．各セッションにおける”引き返して正解”と”引き返して不正解”の割合を見てみると，5S まではほぼ同数であったが，10S 以降”引き返して正解”が多くなっていった．以
上の結果から，マウスは学習が進むに従って自発的に不正解を選択する傾向があること，また，このことが学習効率を向上させている可能性が示唆された．

Combinatorial biosynthesis in engineered yeast ofmorolic acid: a promising lead compound for anti-HIV
drug development○Pisanee Srisawat, Ery Odette Fukushima, Shuhei Yasumoto,Hikaru Seki, Toshiya Muranaka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
muranaka@bio.eng.osaka-u.ac.jp

Morolic acid derivatives show promising anti-HIV activities. Large amount of morolicacid is required for further drug development, however, chemical synthesis of morolicacid requires 11 steps from betulin, a plant-derived triterpenoid, with a total yield of
24%. Recently, morolic acid biosynthesis was reported in apple (Malus domestica).
Oxidosqualene cyclase (OSC) MdOSC4 produces germanicol, which is oxidized by
C-28 oxidase CYP716A175 to produce morolic acid. MdOSC4 is a multifunctional
OSC that besides germanicol produces β-amyrin and lupeol at a ratio of 82:14:4. When
MdOSC4 is co-expressed with CYP716A175 in a heterologous system, they produced
small amount of morolic acid and several side-products. Therefore, a specificgermanicol synthase may enhance morolic acid production in heterologous systems.
We found that Bauhinia forficata (Brazillian orchid tree) accumulates germanicol andmorolic acid in its leaves. We cloned several B. forficata OSCs, and found that
BfOSC2 produced germanicol and β-amyrin at a ratio of 95:5. We co-expressed
BfOSC2 with sugar beet CYP716A49, a previously identified C-28 oxidase with highcatalytic activity, in engineered yeast and successfully produced morolic acid. These
results strongly suggest that morolic acid can be simply produced by combinatorial
biosynthesis in engineered yeast. This production method would facilitate further
development of morolic acid based anti-HIV drugs.

本研究は H29 年度 JST グローバルサイエンスキャンパス事業の支援により実施されました．

Effects of the return behavior and the intentional selection of incorrect
answer on the odor learning of mice

○Noboru Takiguchi1,2, Tatsuya Yano3(1Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ., 2Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ.,
3
Matsumoto Technical High School)

Key words

olfactory processing, odor learning, learning efficiency, mouse

Combinatorial biosynthesis in engineered yeast of morolic acid: a promisinglead compound for anti-HIV drug development○Pisanee Srisawat, Ery Odette Fukushima, Shuhei Yasumoto, Hikaru Seki,
Toshiya Muranaka(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words
Combinatorial biosynthesis, Morolic acid, Oxidosqualene cyclase,
Engineered yeast

278

3Ka03

脂質生産酵母 Lipomyces を利用した再生可能資源からのバイオディーゼル用脂質生産における実験上の問題点
とその解決

3Ka05

酵母 Scheffersomyces stipitis を用いたレスベラトロール
生産プロセスの開発○小林 優真, 猪熊 健太郎, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
hasunuma@port.kobe-u.ac.jp○柳場 まな, 松本 美穂, 長沼 孝文（山梨大院・医工総）tnaganuma@yamanashi.ac.jp【背景と目的】 脂質生産酵母 Lipomyces は，菌体内脂肪球として中性脂質を蓄積する特長があり，その脂質は二酸化炭素の蓄積抑制が可能なバイオディーゼ
ルの原料として利用できる．我々は再生可能資源を用いて本酵母による燃料用
脂質の実用生産を目指して，以下のテーマを設定して研究を開始した．
「再生可能資源に対応した脂質高蓄積能力株の取得，液体培養法で脂質高蓄積能力が発揮できる培養条件の確立，菌体内脂肪球中の脂質が効率良く回収できる方法の開発」
本報告では，実験を行っていく際に発生した問題点とその解決について検討した結果を発表する．
【結果と考察】再生可能資源と菌株数および培養温度を組み合わせると約 15,000
通りのスクリーニング系列となった．そのため，脂質蓄積能力を効率良く判定
したり，それ用の培養方法についての開発が必要であった．今回利用した顕微
鏡写真による脂肪球の大きさを測定する方法は，低コストで簡便に脂質蓄積能力を判定することができた．また，プレート培養法は 1 プレート当たり 6 菌株
が小スペース下で培養できる良い方法であったが，大量培養のための液体培養法に移行するには培地成分濃度の変更が必要であることが分かった．
再生可能資源として想定したものは，入手困難や培地化に問題があった．デン
プンを含むものでは，糊化が液体培地化を困難にしたがデンプン変性と滅菌状態について詳細に検討することで培地化が可能になった．
菌体内脂肪球中の脂質回収においては，脂肪球直径が 10μm 程度しかないこと，
膜が強固であること，抽出有機溶媒量を低減することなどを考慮することが要求された．顕微鏡下で観察された大型脂肪球からは，簡単な圧力で脂質が漏出し易い現象をもとに新たな脂質漏出回収法について検討を行っている．

【背景および目的】レスベラトロールはポリフェノールの一種で，高い抗酸化力や細胞の老化抑制効果をもち，サプリメントや食品添加物として利用されている．現在，その生産は植物からの抽出に依存しているが，近年の需要拡大に伴い，収量の不安定な植物資源に依存しないより安価で安定した生産方法として，組換え大腸菌や組換え酵母 Saccharomyces cerevisiae などの微生物を用いてレス
ベラトロールを生産する研究が報告されている．我々はレスベラトロール生産の新たな宿主として酵母 Scheffersomyces (Pichia) stipitis に着目した．この酵母は，幅広い糖類に対する資化能を持ち，S. cerevisiae が利用できないキシロース
や N -アセチルグルコサミン（GlcNAc）を炭素源として利用できる．キシロー
スや GlcNAc は未利用資源である木質系バイオマスやキチン系廃棄物の構成成分で，その有用な利用方法の開発が求められている．本研究では，これら未利用資源の新規価値創造を目指した S. stipitis による未利用資源由来単糖からのレ
スベラトロール生産プロセスの開発を行った．
【方法および結果】S. stipitis にレスベラトロール生産能を付与するため，
Herpetosiphon aurantiacus 由来 Tyrosine ammonia-lyase，Arabidopsis thaliana 由来
4-coumaroyl-CoA ligase，Vitis vinifera 由来 resveratrol synthase をコードする遺伝
子を S. stipitis NBRC10063 URA5 欠損株に導入した Ss003 株を構築した．Ss003
株を用いて 50 g/L グルコースを単一炭素源とし，30℃にて微好気発酵をおこなったところ，96 時間後に 42 mg/L のレスベラトロールを生産した．次に 50 g/
L GlcNAc を単一炭素源とし，30℃にて微好気発酵を行ったところ，48 時間後に 6 mg/L 検出されたレスベラトロールは 96 時間後には検出されなかった．炭素源の違いがレスベラトロール生産に影響を及ぼすことを明らかにした．

Examination of method and material for lipid accumulation of yeast
Lipomyces

Development of resveratrol production process using a recombinant
Scheffersomyces stipitis strain○Mana Yanagiba, Miho Matsumoto, Takafumi Naganuma(Grad. Sch. Med. Eng., Univ. Yamanashi)○Yuma Kobayashi, Kentaro Inokuma, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words

Lipomyces, screening method, lipid accumulation, renewable resource

Key words
stipitisyeast, Aromatic compound, Resveratrol, Scheffersomyces (Pichia)

3Ka04

鉄硫黄タンパク質高活性化に基づくキシロースからの1,2,4-ブタントリオール生産技術の開発

3Ka06

出芽酵母 2,3-ブタンジオール生産に向けた不活性型
Cas9 によるエタノール生合成経路の抑制○森田 啓介 1, 松田 史生 1, 石井 純 2, 近藤 昭彦 2, 清水 浩 1（1阪大院・情報, 2神戸大院・科技イノベ）
shimizu@ist.osaka-u.ac.jp○湯川 貴弘, 番場 崇弘, 蓮沼 誠久, 近藤 昭彦（神戸大院・科技イノベ）
akondo@kobe-u.ac.jp

1,2,4-ブタントリオール (BT) は，様々な医薬品や化成品の原料として利用できる．また，BT をニトロ化することで得られる 1,2,4-ブタントリオールトリナイ
トレートは，ロケットの推進剤としての利用や，ニトログリセリンの代替品として利用することができる．本研究では酵母 Saccharomyces cerevisiae を用いてBT 生産を試みた．S. cerevisiae は，細胞構造が頑強で種々の発酵ストレスに対する耐性が高く，工業スケールでの物質生産に適していると考えられる．
BT はキシロースから 5 段階の反応によって変換され，我々は既に BT 生産経路
を S. cerevisiae に導入することにより，BT を生産できること確認している．しかしながら，S. cerevisiae における BT 生産の大きな課題として，中間生成物であるキシロネートが多量に蓄積することが挙げられる．原因として，キシロネー
トを BT 生産経路の次の化合物 2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへと変換する酵素であるバクテリア Caulobacter crescentus 由来の鉄硫黄タンパク質 XylD の活性が十分でないことが考えられる．酵母内ではバクテリア由来の鉄硫黄タンパ
ク質の多くは活性が非常に低いことが報告されている．本研究では酵母の鉄硫
黄クラスターの合成，および鉄の取り込みや代謝に関わる遺伝子の破壊や過剰発現を行うことで，XylD の活性強化を試みた．その結果，鉄硫黄クラスターを小胞体の表層に隔離するタンパク質である Tyw1，あるいは鉄の取り込みを制御するタンパク質である Bol2 が XylD の活性に大きく関わっていることが明らかとなった．特に BOL2 を破壊した株では，破壊する前の株と比較して XylDの活性は 2.6 倍に向上し，10 g/L のキシロースから 1.71 g/L の BT を生産することに成功した（対糖収率 24.1 %）．また，この株を用いて稲わらの水熱処理物を原料に同時糖化発酵を行ったところ，BT を 1.27 g/L 生産することに成功した．

【目的】出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae の代謝を改変し，様々な有用物質を高効率に生産するには，活発なエタノール発酵を抑制する必要がある．しかし，エタノール生合成経路のアルコール脱水素酵素遺伝子やピルビン酸脱炭酸酵素(PDC) 遺伝子を多重破壊した株では，増殖能とグルコース資化能が低下する課題がある．そこで本研究では，不活性型 Cas9 (dCas9) を用いた PDC1 遺伝子の発現抑制系を構築し，エタノール発酵の抑制と，2,3 ブタンジオール (23BD) 生
産能力向上を目指した．
【方法】形質転換体は出芽酵母 BY4742 野生株および YPH499 株の PDC5，PDC6の 2 重欠損株に酢酸リチウム法でベクターを導入し，形質転換体を構築した．
培養は 20 g/L グルコース SD 培地で行い，培溶液中の 23BD 濃度をガスクロマ
トグラフィーで測定して発酵能を評価した．
【結果】出芽酵母のアルコール発酵に関わる PDC1 の発現を dCas9 によって阻害する遺伝子発現系の構築を試みた．まずは PDC1 プロモーター (PPDC1) 上への
dCas9 の最適な結合箇所を特定するため，PPDC1 と赤色蛍光タンパク (RFP) 遺伝
子を組み合わせた発現カセットを構築し，出芽酵母 BY4742 株に導入した．
dCas9 と 9 種類のガイド RNA をそれぞれ発現させた株の RFP 蛍光強度を比較した結果，開始コドンから 300bp 付近に dCas9 を結合させた株で RFP 蛍光強度が最も減少した．そこで，3 つの PDC 遺伝子 (PDC1，PDC5，PDC6) のうち
PDC5 および PDC6 を欠損させた出芽酵母 YPH499 株にこの遺伝子発現カセッ
トと，23BD 生産経路関連遺伝子を導入した株を構築した．発酵性試験の結果，
dCas9 の発現系を導入していないコントロール株では 23BD をほとんど生産しなかったのに対し，発現系を導入した株では 197.4±14.7 mg/L の 23BD 生産を達成した．

Development of a 1,2,4-butanetriol production process from xylose based on
improvement of an iron-sulfur protein

Regulation of ethanol biosynthetic pathway in yeast for 2,3-butandiol
production by inactive Cas9 system○Takahiro Yukawa, Takahiro Bamba, Tomohisa Hasunuma, Akihiko Kondo(Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
xyloseSaccharomyces cerevisiae, Iron-sulfur protein, 1, 2, 4-Butanetriol, D-○Keisuke Morita1, Fumio Matsuda1, Jun Ishii2, Akihiko Kondo2, Hiroshi Shimizu1(1Grad. Sch. IST, Osaka Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
Cas9 system

Saccharomyces cerevisiae, ethanol production, 2, 3-butanediol, inactive

279

3Ka07

T7 発現系を応用したプラスミドフリーで誘導剤が不要なフェニルアラニン高生産菌の開発

3Ka09

Rhodococcus erythropolis N9T-4 株の低栄養生育に関与する推定トランスポーター遺伝子の機能解析○松岡 友洋, 吉田 信行（静大院・総合科技）yoshida.nobuyuki@shizuoka.ac.jp○岸田 隆寛 1, 駒 大輔 2, 大橋 博之 2, 山中 勇人 2, 森芳 邦彦 2,
長森 英二 1, 大本 貴士 2
（1大工大・工・生命, 2阪技術研）
koma@omtri.or.jp【背景】代謝工学や合成生物学を基盤とする菌株育種では，プラスミドにより宿主に遺伝子を導入して高発現させる手法がよく用いられる．しかし，プラスミ
ド維持に使われる抗生物質は培養コスト増加の原因となる．そこで，遺伝子を染色体 DNA に直接導入して高発現させることに取り組んできた（プラスミド
フリー化）．染色体への遺伝子導入では，プラスミドと比較してコピー数が少な
いために，高活性な T7 発現系を利用してきた．しかし，発現誘導剤として用いられるイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド (IPTG) は非常に高価であり，実生産での使用には適していない．そこで，本研究では IPTG を必要としない T7 発現系を構築した．さらに構築した発現系を応用し，IPTG 誘導型のフェニルアラニン（Phe）高生産菌を IPTG を必要としない Phe 高生産菌へと改変することを試みた．
【方法および結果】構成性の tyrR プロモーターに T7RNA ポリメラーゼ（T7RP）
遺伝子を連結し，大腸菌 BW25113 株 (lacZ 欠失株) の染色体 DNA に導入することで，構成的に T7RP を発現する菌株を作製した．つぎに，T7lac プロモーターに連結した lacZ を染色体に導入し，さらに lacI 遺伝子を欠失させたところ，構成的な lacZ 遺伝子の高発現が確認された．
大腸菌 MG1655 株を宿主として作製した Phe 高生産菌 M-PAR-116 株（IPTG 誘導下でシキミ酸経路の 8 種類の遺伝子を高発現する株）に構築した発現系を応用したところ，IPTG 無添加条件でも Phe が高生産された．リアルタイム PCRによる転写解析の結果から，8 種類の遺伝子は IPTG 無添加条件でも MG1655
株の数十倍転写されていた．また，Phe の収率および比生産速度は IPTG 誘導型の M-PAR-116 株よりも高かった．

【緒言】Rhodococcus erythropolis N9T-4 株(以下，N9T-4)は，炭素源無添加の無機塩固体培地(BM 培地)上でも良好な生育を示す超低栄養性細菌である．本菌は生育に大気中の CO2 を要求し，その際に光などの特別なエネルギーの添加を必要としないという非常にユニークな性質を持っている．CO2 固定経路およびエネルギー獲得機構については有効な手がかりが見つかっておらず，未だ詳細の解明には至っていない．培地成分や光をエネルギーとしないことは明らかである
ため，我々は，本菌が低栄養条件下において，培養環境中に微量に存在している化合物からエネルギーを獲得していると予想した．本研究では，本菌のゲノム上に存在する機能未知の推定トランスポーター遺伝子の機能解析を行った．
【方法と結果】N9T-4 を低栄養条件(BM 培地)で培養した際，3 つの推定糖 ABC
トランスポーター遺伝子が低栄養条件で特異的に高発現することが分かっている．そこで，それぞれの基質結合タンパク質をコードする遺伝子(sbp1，sbp2，sbp3)の欠損株を作製し，BM 培地を用いて，親株と遺伝子欠損株の生育試験を行った結果，1 つの遺伝子欠損株(Δsbp1)で，親株と比較して顕著な生育の低下が認められた．この結果から，sbp1 は本菌の低栄養条件下での生育に重要な遺伝子であることが示唆された．さらに，それぞれの欠損株の細胞内トレハロー
ス含量，トレハロース資化性の検討から，これらのトランスポーターはいずれもトレハロースの輸送に関与している可能性が示された．Mycobacterium 属細菌 においては，トレハロースは細胞質で生合成された細胞膜の構成成分を細胞外に放出する際のキャリアとして機能し，このとき細胞外に放出されるトレハ
ロースのリサイクルシステムとしてトランスポーターが機能すると報告されて
おり， N9T-4 においても同様の機構を持つことが示唆された．

Generation of plasmid-free and inducer-free phenylalanine producing
Escherichia coli by application of T7 expression system

Functional analysis of putative transporter genes involved in oligotrophic
growth of Rhodococcus erythropolis N9T-4○Takahiro Kishida1, Daisuke Koma2, Hiroyuki Ohashi2, Hayato Yamanaka2,
Kunihiko Moriyoshi2, Eiji Nagamori1, Takashi Ohmoto2(1Dept. Biomed. Eng. Osaka Inst. Technol., 2Osaka Res. Inst. Ind. Sci. Tech.)○Tomohiro Matsuoka, Nobuyuki Yoshida(Grad. Sch. Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ.)

Key words

plasmid, IPTG, phenylalanine, T7

Key words

Rhodococcus, oligotroph, transporter, trehalose

3Ka08

大腸菌の NADH 脱水素酵素 I とシトクロム bo3 オキシ
ダーゼ両欠損株における NDH-II 過剰発現が中枢代謝に
与える影響

3Ka10

フェノールが大腸菌の中枢代謝に及ぼす影響の解析○濱田 和宏, 瀬島 祐大, 吹谷 智, 和田 大, 横田 篤
（北大院・農）wada@chem.agr.hokudai.ac.jp○北村 さや香, 戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp【研究背景】 大腸菌の呼吸鎖は酸化的リン酸化による ATP の合成や NADH の再酸化に関与し，細胞内のエネルギーレベル（ATP/ADP）や酸化還元バランス（NAD+/NADH）を通じて中枢代謝に影響を与えている．しかし，呼吸鎖と中枢
代謝の相互関係は不明な部分が多く，発酵生産菌育種のための基盤知見として更なる理解が求められている．当研究室では，呼吸鎖酵素のうちプロトン駆動
力形成能が高い NADH 脱水素酵素 I（NDH-I）とシトクロム bo3 オキシダーゼ（Cytbo）の二重欠損株（ΔΔ 株）を用いて ATP 形成効率の低下が中枢代謝に与える影響を調べた．その結果，エネルギーレベルの低下と NADH の蓄積による菌体内の還元化が観察され，50 g/L のグルコースを含む無機塩発酵培地で，7 g/
L ものグルタミン酸（Glu）が生成していた．この Glu の生成に関するメカニズ
ムは未だ明らかとなっていない．そこで，本研究では酸化還元バランスに着目し，その変化による Glu 生成などの代謝変化を解析して，呼吸鎖と中枢代謝の関連についての基盤知見の獲得を目的とした．
【方法と結果】 NADH 酸化能を強化するため，プロトン駆動力形成能をもたな
い NDH-II のプラスミドによる過剰発現株（NDH+株）を構築した．Escherichia
coli W1485（野生株）と ΔΔ 株，NDH+株についてジャーファーメンターによるバッチ培養を行った． IPTG を添加し，NDH-II の発現を誘導した NDH+株はIPTG 無添加に比べて生育と糖消費が増加した．細胞外代謝産物ではピルビン酸や酢酸の生成量が減少し，2-オキソグルタル酸の生成量が増加した．一方で，
Glu の生成は変わらず見られたため，Glu 生成には NAD+/NADH だけでなく，別の要因も影響していると考えられた．今後は IPTG 添加のタイミングや濃度を変えて比較することで，呼吸鎖や酸化還元バランスと中枢代謝の関係についてさらに詳細に検討する予定である．

【背景と目的】フェノールは樹脂等の原料に利用される有用化合物であり，微生物による発酵生産が望まれる．しかし，大腸菌などの汎用宿主微生物ではフェノールの毒性により細胞増殖が抑制されるため生産性が低いという課題がある．
また，フェノールは有害な環境汚染物質であり，微生物を利用した環境浄化が注目されている．フェノール生産微生物創製や環境浄化に向けた微生物利用においても，耐性能の強化は重要な課題である．本研究ではモデル微生物の大腸菌について，フェノールが代謝に及ぼす影響を解析し，増殖抑制の原因を調べた．
【方法】大腸菌野生株 BW25113 を[1-13C]グルコースを炭素源とする合成培地を用いて回分培養した．培養液には 0%, 0.1%, 0.15%のフェノールを添加した．培養液の代謝物濃度とアミノ酸の 13C 濃縮度は HPLC と GC/MS を用いて測定した．代謝経路の数理モデルを用いて，実測した 13C 濃縮度を説明するフラックスを推定した．
【結果と考察】大腸菌野生株を異なるフェノール濃度で培養したところ，比増殖
速度は 0.1%と 0.15%フェノール存在下において，各々 22％と 42％低下した．
フェノール濃度の増加につれて，酢酸合成フラックスが増加し，0.15%フェノー
ル添加時は無添加時の約 1.8 培であった．一方，0.15%フェノール添加時の TCA
回路のフラックスは無添加時の約 3 割に低下した．フェノール添加時にエタノー
ルや乳酸が生産されなかったことから，フェノール存在時にも呼吸は働いていると考えられた．また，酢酸合成経路の遺伝子を破壊したところ，フェノール
濃度 0.15%で増殖できないことが確認された．これらの結果から，フェノール
はアセチル CoA から α ケトグルタル酸の間の反応を阻害し，余剰なアセチル
CoA が酢酸として排出されたと推察された．

Effects of NADH dehydrogenase-II overexpression on central metabolism inan Escherichia coli mutant ΔNDH-IΔCytbo defective in both NADH
dehydrogenase-I and cytochrome bo3 oxidase

Effect of phenol on the central carbon metabolism in Escherichia coli

Key words
central metabolism, respiratory chain, redox balance, NADH
dehydrogenase-II overexpression

Key words○Kazuhiro Hamada, Yudai Sejima, Satoru Fukiya, Masaru Wada, Atsushi Yokota(Grad. Sch. Agric., Hokkaido Univ.)○Sayaka Kitamura, Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

Escherichia coli, phenol, 13C-Metabolic Flux Analysis, TCA cycle

280

3Ka11

大腸菌の ArcA による酸素消費速度の感知システム
後野 直哉, ○戸谷 吉博, 清水 浩
（阪大院・情報）shimizu@ist.osaka-u.ac.jp【背景と目的】
酸素は微生物における様々な有用物質の生産性に影響を与える要因である．大腸菌は酸素レベルを二成分制御系の ArcA/ArcB や Fnr を介して感知し，多数の酵素の発現量を調節する．培養液の溶存酸素濃度が同じでも，細胞の酸素消費
速度は，気泡からの酸素移動速度によって左右される．このような状況において，細胞が検知する酸素レベルは同じであろうか？本研究では，ArcA に着目
し，酸素消費速度と ArcA 活性の関係を評価した．
【方法】
大腸菌 BW25113 株を使用した．ArcA による発現制御を受ける icd 遺伝子のプ
ロモーター下流に GFP 遺伝子を挿入し，プロモーター活性 ArcA(+) を測定するためのプラスミドを構築した．また，icd プロモーターの ArcA 結合部位に変異を導入し，ArcA が結合しない場合のプロモーター活性 ArcA(-) を測定し，ArcA(+)と ArcA(-)の比から転写因子活性を求めた．上記プラスミドを導入した大腸菌株
を様々な酸素供給条件において連続培養し，溶存酸素濃度や酸素供給速度とArcA 活性の関係を調べた．GFP 生産量は励起波長 485 nm，蛍光波長 535 nm における蛍光強度として測定した．
【結果と考察】酸素供給速度の異なる連続培養の結果から，ArcA 活性と溶存酸素濃度には相関がなかったが，ArcA 活性と酸素供給速度の間に強い負の相関が見られた．ArcAのリン酸化は ArcB のリン酸化によって調節され，ArcB のリン酸化はキノンによって阻害される．すなわち，酸素消費速度に応じてキノン濃度が変化し，それを ArcA 活性に反映させることで，大腸菌は酸素消費速度を感知していると考えられる．ArcA 活性と酸素供給速度の関係は，転写制御を考慮した代謝シス
テムのモデリングの有益な知見となるであろう．

Sensing system of oxygen consumption rate in Escherichia coli by ArcA
Naoya Nochino, ○Yoshihiro Toya, Hiroshi Shimizu(Grad. Sch. IST, Osaka Univ.)

3La02

PHA 重合酵素への親水化タグ付与がポリマー重合能へ与える影響○原田 憲, 柘植 丈治（東工大・物質理工）
tsuge.t.aa@m.titech.ac.jp【背景と目的】近年，石油から合成されるプラスチックに代わり，糖や植物油などのバイオマ
ス資源から微生物によって生合成が可能なプラスチックである，ポリヒドロキ
シアルカン酸（PHA）に注目が集まっている．PHA は熱可塑性のほか，生分解性および生体適合性といった性質を備えており，環境調和型材料または医療用材料として利用することができる．PHA 重合酵素（PhaC）により触媒される重合機構の理解は，PHA の高効率生産のみならず，高性能な重合触媒の開発に関して示唆に富んだ情報となり得る．本研究では PHA 生合成の鍵酵素である PhaCに関して，親水化タグを付与することによりポリマー重合能にどのような影響を与えるのかについて検証した．
【手法】
本研究では，Ralstonia eutropha 由来 PHA 重合酵素（PhaCRe）に親水化タグ（GSTタグ）を付与し，遺伝子組換え大腸菌を用いた発現系及びアフィニティークロ
マトグラフィーにより GST-PhaCRe を調製した．化学合成した基質（R-3-ヒドロ
キシブチル CoA）と精製した酵素を用いた細胞外（in vitro）の解析と，大腸菌に GST-PhaCRe 遺伝子と PHA モノマー供給遺伝子を導入して PHA 合成を行う細胞内（in vivo）の解析を行ない，親水化タグが PhaCRe に与える影響を多角的に評価した．
【結果と考察】In vitro 解析から，GST-PhaCRe は長い誘導期の後に，通常の PhaCRe と同等の重合活性を示すことが分かった．また，in vivo 実験においては，PhaCRe に GST を付加しても PHA 合成量および分子量に差異は見られなかった．これらの結果から PhaCRe への親水化タグの付与は，重合反応の初期に存在する PhaC サブユニットの二量体形成にのみ影響すると考えられる．

Polymerization ability of GST-tagged polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase○Ken Harada, Takeharu Tsuge(Dept. of Materials Sci. and Eng.,TokyoTech)

Key words

Escherichia coli, oxygen sensing, transcriptional regulation

Key words

PHA synthase, GST-tag, dimerization

3La01

PET 分解酵素クチナーゼの Ca2+結合に伴う熱安定性及び構造機能解析

3La03

Citrobacter sp. S-77 由来の新規[NiFe]ヒドロゲナーゼの構造遺伝子と水素活性化機構

山上 由莉 1, 千賀 明香音 1, 沼本 修孝 2, 織田 昌幸 1,○河合 富佐子 3（1京府大院・生命環境, 2医科歯科大・難研, 3京都工繊大・繊科セ）
fkawai@kit.ac.jp○尹 基石 1,2,3, 小江 誠司 1,2,3（1九大・WPI-I2CNER, 2九大院・工・応化, 3九大・小分子エネル
ギーセ）
yoon@i2cner.kyushu-u.ac.jp【背景と目的】 PET はプラスチック全体の 80％以上を占める汎用プラスチックの一角を占め，環境プラスチックゴミの主要因の一つである．酵素分解はゴミ処理及びリサイクルのための省エネルギー技術として期待される．
Saccharomonospora viridis AHK190 よりクローン化したクチナーゼ Cut190_S226/
R228S (Cut190*)は amorphous PET film を 65 度で分解可能であるが，さらなる耐熱性が効率的な分解には望ましい．
【方法】 Cut190*を鋳型として Ca2+ 結合部位変異体を作成し，大腸菌発現系により発現精製した．酵素活性は polyethylene succinate-co-adipate (PBSA)を基質として測定した．熱安定性は円偏光二色性(CD)スペクトル及び蛍光分析により，変性中点温度(Tm)を算出した．また，Cut190*及び変異体を用いて各種 PET film の分解を確認した．
【結果と考察】Cut190*の結晶構造(PDB ID: 5ZNO)で 3 つの Ca2+結合の認められた部位をそれぞれ sites 1-3 とした．これらの Ca2+結合に関与するアミノ酸変異体の解析により，活性化及び熱安定性との関連性を結論づけた．また，site2 への S-S 結合は顕著な Tm 増加をもたらした．他方，deamination による不安定化の原因になる Gln 及び Asn を Glu, Asp, His に変異することで Tm が増加した．
これらの変異を組み合わせた Cut190*M は 70 度でも数日間安定で各種 PET film
を効率的に分解した．

【背景と目的】 ヒドロゲナーゼは，水素分子をプロトンと電子への分解反応とその逆反応の水素生成を触媒する金属酵素であり，その優れた触媒反応は燃料電池の水素極触媒等として応用が期待される．しかし，「標準型 NiFe ヒドロゲ
ナーゼ」は高い活性を示すが，酸素に不安定である．一方で，「酸素耐性型[NiFe]
ヒドロゲナーゼ」は高い酸素安定性を示すが酵素活性が低い欠点がある．発表者らは，阿蘇くじゅう国立公園から Citrobacter sp. S-77 を単離し，高い水素酸
化活性と酸素安定性を示す新規ヒドロゲナーゼ（[NiFe]S77）を精製し，その特性解析を行っている．本研究では，[NiFe]S77 の水素活性化機構とその新規電子伝達系の解明を目指した．
【方法と結果】 Citrobacter sp. S-77 株から高い触媒活性と酸素耐性を示す[NiFe]S77 を精製し，その特性解析を行った．本酵素は，酸素耐性酵素として研究されている HYD1 と類似した生化学的な特性を示す．しかし，ゲノム解析の結果，本酵素は酸素感受性の HYD2 と同様な 4 量体の構造遺伝子（HybC とHybO に HybB と HydA）によって構成されている．我々は，これまでにヘテロ2 量体酵素（NiFe 活性大サブユニットと電子伝達の小サブユニット）のタンパ
ク質結晶化に成功し，その詳細な X―線構造解析と触媒反応機構の解明を進めている．本発表では，これまでに得られた知見を基に，生物の進化的な観点か
らヒドロゲナーゼの水素活性化機構を考察する．

Thermostability and structural analysis of PET-hydrolyzing enzyme Cut190
induced upon Ca2+binding

Structural genes and hydrogen activation of [NiFe]hydrogenase from
Citrobacter sp. S-77

Yuri Yamagami1, Akane Senga1, Nobutaka Numoto2, Masayuki Oda1,○Fusako Kawai3(1Grad. Sch., Life Environ. Sci., Kyoto Pref. Univ., 2Med. Res. Inst., Tokyo Med.
Dent. Univ., 3Center Fiber Textile Sci., Kyoto Inst. Technol.)Key words

PET-hydolyzing cutinase, Ca2+-binding sites, thermostabilization○Ki-Seok Yoon1,2,3, Seiji Ogo1,2,3(11WPI-I2CNER, Kyushu Univ., 2Dept. Chem. Biochem., Grd. Sch. Eng., Kyushu
Univ., 3sMol, Kyushu Univ.)

Key words[NiFe]hydrogenase, hydrogen activation, hydrogenase structural genes,
phylogenetic analysis

281

3La04

ケッチェンブラックを用いた高性能バイオ電池の構築○渡邉 好一 1, 坂元 博昭 1,3, 里村 武範 2,3, 櫻庭 春彦 4, 大島 敏久 5,
末 信一朗 1,2,3（1福井大院・工・繊維, 2福井大院・工・生物応用化, 3福井大・
ライフセ, 4香川大・農, 5阪工大）
suyeb10@u-fukui.ac.jp

3La06

電極－酵素界面における異種間電子移動の距離依存性解析○高村 映一郎 1, 鈴木 治人 2, 中村 卓登 2, 坂元 博昭 2,4,
里村 武範 3,4, 櫻庭 春彦 5, 大島 敏久 6, 末 信一朗 2,3,4（1福井大学院・工・総合, 2福井大学院・工・繊維, 3福井大学院・工・生物応用化, 4福井大学・ライフセ, 5香川大・農, 6大阪工大）
suyeb10@u-fukui.ac.jp[緒言]酵素の触媒反応により有機資源から電気エネルギーを得るバイオ電池は，バイオマスの有用な利用法として注目されているが，実用化に向けて出力の向上が求められている．バイオ電池の出力向上のためには，電極上の酵素修飾量の増加を達成できる電極表面積の増加が必要とされている．本研究では，高い比表面積を有するカーボンナノ材料を用いた高性能バイオ電池の構築を目指した．カーボンナノ材料の中でも高い比表面積を有するケッチェンブラック (KB)に着目し，カソードに超好熱性アーキア Pyrobaculum aerophilum 由来のマルチ
銅オキシターゼ (McoP)，アノードに超好熱性アーキア Aeropyrum pernix 由来 Lproline 脱水素酵素 (LPDH)を用いてバイオ電池を作製し，電気化学特性の評価を行った．
[方法]LPDH および McoP をコードするプラスミドを用いて，大腸菌を形質転換
し，組み換えタンパク質を得た．
カーボンペーパーにポリフッ化ビニリデン溶液に懸濁した KB を塗り，70℃で20 時間乾燥後，プラズマ処理により親水化した後 LPDH 溶液を 100 μl 滴下し，室温にて 2 時間静置し，50 mM リン酸ナトリウムバッファー (pH 6.5)で洗浄し，KB と LPDH を固定化したアノードを作製した．同様にカソードを McoP を用いて作製した．作製した電極を用いて，サイクリックボルタンメトリー (CV)およびリニアスイープボルタンメトリー (LSV)にて電気化学的特性を評価した．
[結果]アノード，カソード両者について酵素電気化学反応を行い CV を検討したところ，アノードではメディエータであるフェロセンカルボン酸の酸化還元
波が+0.28 V 付近に確認され，ピーク電流密度は 1.13 mA/cm2，カソードでは 0
V で酸素の還元波が確認され，ピーク電流密度は-0.360 mA/cm2 であった．両デバイスを用いて電池を構築し LSV を検討したところ，開回路電位 0.28 V，最大
出力 4.6 μW/cm2 であった．

酵素をエネルギー変換素子とするバイオ電池（Biofuel cell:BFC）は再生可能エ
ネルギーの一つとして注目されている．しかし，酵素の長期安定性や電池電圧が低く，未だ実用化には至っていない．電池電圧が低いことの原因として，酵
素の酸化還元部位と電極間の電子移動効率の低さに起因する過電圧が挙げられ
る．電子移動効率の向上には酵素の酸化還元部位と電極間距離の短縮が必要である．本研究では長期安定性を有する超好熱菌 Pyrobaculum aerophilum 由来マ
ルチ銅オキシダーゼ (McoP) をカソード触媒として用いた．これまでに，McoPの酸化還元部位（T1Cu）に近い C 末端へ導入した His-tag（McoP His）と電極に修飾したニトリロ三酢酸に配位させた Ni（NTA-Ni）との親和性を利用してMcoP を配向固定することで，N 末端 His-tag で固定化した電極よりも過電圧が減少するという結果を得ている．本研究では，McoP His の C 末端へ導入した
Cys 残基（McoP Cys）と金との Au-S 結合を利用し，McoP を電極上に直接配向固定することで NTA-Ni を用いた際より T1Cu‐電極間の距離が近い電極を作製し，電子移動効率の向上による過電圧の減少について評価した．
[方法]McoP の His-tag 末端に Cys を導入した McoP（Cys）は組換体より精製した．金電極上に McoP（Cys）溶液を滴下し，室温で 1 時間静置し，McoP（Cys）
配向固定電極を作製した．各 McoP 修飾電極について，3 電極方式でサイクリッ
クボルタンメトリー（CV）を行い電気化学特性を評価した．
[結果・考察]McoP His 及び McoP Cys を各方法で固定化した McoP 修飾電極のCV 測定を行ったところ，McoP Cys 電極では McoP His 電極に比べて酸素還元開始電位が+0.1 V シフトした．これは McoP Cys を金電極に直接配向固定し
NTA-Ni が不要になることで，T1Cu‐電極間の距離がより縮まり，電子移動効率が向上したためだと考えられる．

Construction of high performance biofuel cell using ketjenblack

Distance dependence analysis of electron transfer between an electrode andenzyme○Koichi Watanabe1, Hiroaki Sakamoto1,3, Takenori Satomura2,3,Haruhiko Sakuraba4, Toshihisa Ohshima5, Shin-ichiro Suye1,2,3(1Grad. Sch. Eng. Fib. Fukui Univ., 2Bio. Fukui Univ, 3Grad. Sch. Eng. Bio. Fukui
Univ., 4Fac. Agric., Kagawa Univ., 5Osaka Inst. Technol.)Key words

biofuel cell, carbon nanomaterial

3La05

分子揺動性を考慮した耐熱性酵素の配向固定による高性能バイオアノードの構築○Eiichiro Takamura1, Haruto Suzuki2, Takuto Nakamura2, Hiroaki Sakamoto2,4,Takenori Satomura3,4, Haruhiko Sakuraba5, Toshihisa Ohshima6, Shin-ichiro Suye2,3,4(1Dept. Adv. Interdiscip. Sci. Technol., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui, 2Dept. Front.
Fib., Grad. Sch. Eng., Univ. Fukui, 3Dept. Appl. Chem. Biotechnol., Grad. Sch.
Eng., Univ. Fukui, 4Res. Edu. Prog. Life Sci., Univ. Fukui, 5Fac. Agric., Kagawa
Univ., 6Osaka Inst. Tech.)
Key words
biofuel cell, direct electron transfer, multicopper oxidase, oriented
immobilization

3La07○鈴木 治人 1, 高村 映一郎 2, 坂元 博昭 1,3, 里村 武範 3,4,
櫻庭 春彦 5, 大島 敏久 6, 末 信一朗 1,3,4（1福井大院・工・繊維, 2福井大院・工・総合, 3福井大学・ライフセ, 4福井大学院・工・生物応用化, 5香川大・農, 6大阪工大）
suyeb@u-fukui.ac.jp

GFP を融合したシリカ重合酵素の機能解析○竹田 雄大, 小栗 秀俊, 中島 一紀, 川﨑 了
（北大院・工）nakashima@geo-er.eng.hokudai.ac.jp[緒言]
酵素を触媒とするバイオ電池は環境負荷が小さい等の利点から，バイオマスの有用な利用法として注目されている．しかし，酵素の長期安定性や出力密度の問題から，実用化には至っていない．本研究室では，長期安定性を有する超高熱性アーキア Pyrobaculum aerophilum 由来の PQQ 依存性グルコース脱水素酵素（PQQ-GDH）に着目してアノード電極を作製してきた．これまでに N 末端に
His-tag を付加した PQQ-GDH を用いて，酵素反応に伴う電子伝達が酵素分子内で円滑となる様に本酵素を配向固定することで無配向固定電極の 90 倍の電流密度を得ることに成功している．本研究ではさらにデバイス上での酵素の揺動に着目し，His-tag の N 末端側に Cys 残基を導入（PQQ-GDH Cys）して金電極へ
酵素分子を配向固定しつつ酵素を揺動させ，デバイス上の酵素と基質との接触性を高めることで電子伝達の向上を目指した．
[方法]
Inverse PCR により His-tag の末端にシステインを導入したプラスミドを構築し，大腸菌を形質転換し，組み換えタンパク質を得た．
金電極を PQQ-GDH Cys 溶液に浸漬し，24 時間静置することで，PQQ-GDH Cys
配向固定化電極を作製した．作製した電極の評価は，3 電極方式にてサイクリッ
クボルタンメトリー(CV)にて行った．
[結果]
PQQ-GDH 固定化電極の CV 測定を行ったところ，酵素を物理吸着させた電極
では基質存在下でのメディエータであるフェロセンカルボン酸由来のピーク電流の増大は 0.0845 μA/cm2 であったが，PQQ-GDH Cys 電極では 2.04 μA/cm2 の増大が確認された．これは SH 基と金電極間の Au-S 結合により，金電極上に直接 PQQ-GDH を配向固定化することで酵素の触媒活性部位が基質との反応に有利な位置に配位し，さらにペプチドタグを介して酵素が電極上で揺動することで基質との接触性が高まったためと考えられる．

【背景と目的】シリカテインは海綿動物のガラス骨格に存在するシリカの重合反応を触媒する酵素である．この反応は温和な条件（常温，中性 pH）で進行するため，様々な工業分野への応用が期待されており，機構の解明が急務である．本研究では，
シリカテインの挙動を可視化し，生成シリカを追跡するために，GFP と Suberites
domuncula 由来シリカテインの融合タンパク質（GFP-Sil）遺伝子を作製し，大腸菌を用いた異種発現を試みた．また，作製した GFP-Sil の可溶性とモリブデ
ンブルー法による活性評価を検討した．
【方法】
GFP-Sil 遺伝子を挿入した pCold 発現ベクターを用いて大腸菌 BL21(DE3)株を形質転換し，低温発現誘導（15°C）により，発現を行った．菌体破砕を行い，緑色蛍光を帯びた封入体を回収した．変性条件下で His タグ精製を行った後，透析法（4℃，24h）により，GFP-Sil のリフォールディングを行った．精製 GFPSil をシリカ前駆体のテトラエトキシシラン（TEOS）と接触させ，20℃で 24h
振盪することでシリカの重合を行った．回収・凍結乾燥したシリカに，1M NaOH
を添加し，ケイ酸に加水分解した後，濃度をモリブデンブルー法で測定することで活性を定量的に評価した．
【結果と考察】異種発現の後，SDS-PAGE を行った結果，GFP-Sil の大部分は不溶性の封入体として発現していることが分かった．変性条件下での His タグ精製及び透析法によるリフォールディングを行ったところ，GFP-Sil は可溶性画分に得られ，また水溶液中で安定に存在することが確認された．精製した GFP-Sil と TEOS を混合し，重合反応を行ったところ，薄緑色の沈殿が確認され，GFP-Sil がシリ
カ重合活性を有することが示唆された．生成した沈殿をモリブデンブルー法により測定したところシリカの存在が確認され，リフォールディング後の GFP-Sil
はシリカ重合活性を有していることが分かった．

Construction of high performance bioanode by orientated immobilization ofthermostable enzyme in consideration of molecular fluctuation

Function analysis of silica polymerizing enzyme fused with green fluorescentprotein○Haruto Suzuki1, Eiichiro Takamura2, Hiroaki Sakamoto1,3, Takenori Satomura3,4,Haruhiko Sakuraba5, Toshihisa Ohsima6, Shin-ichiro Suye1,3,4(1Dept. Front. Fib. Tech. Sci. Eng., Grad. Sch. Eng., Fukui Univ., 2Dept. Syn., Grad.
Sch. Eng., Fukui Univ., 3Life Sci. Innov., Fukui Univ., 4Dept. Appl. Chem. Biotech.,
Grad. Sch. Eng., Fukui Univ., 5Fac. Agric., Kagawa Univ., 6Osaka Inst. Tech.)
Key words
biofuel cell, hyperthermophilic archaeon, fluctuation, oriented
immobilization○Yudai Takeda, Hidetoshi Oguri, Kazunori Nakashima, Satoru Kawasaki(Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ.)

Key words
Modification

biosilica, biomineralization, molybdenum blue method, Genetic

282

3La08

Development of cellulose hydrogel microsphere for lipase
immobilization

3La10

大腸菌包括菌体によるバニリンの効率的生産プロセスの開発○Soyeon Jo, Sae Rom Park, Sang Hyun Lee(Dept. Biol. Engn., Konkuk Univ., South Korea)
josoyeon12@naver.com○齋藤 翼 1, 青野 陸 1, 古屋 俊樹 2, 木野 邦器 1,2（1早大院・先進理工・応化, 2早大・理工総研）
kkino@waseda.jp

Hydrogel microspheres are micro-sized hydrogels that have high specific surface area,
so they are efficient to immobilize enzymes. In this study, cellulose hydrogel
microspheres were prepared by sol-gel transition method using ionic liquid as a solvent
to dissolve cellulose. Prepared microspheres were used to immobilize Candida rugosa
lipase by physical adsorption. To optimize the condition of microsphere formation,
protein loading and specific activity of immobilized lipase were studied. Size
distribution, shape regularity, and surface morphology of microspheres werecharacterized by optical microscopy and SEM. In order to investigate the efficiency of
microsphere as enzyme support, microcrystalline cellulose powder and millimetersized hydrogel bead were also used for comparison. The lipase immobilized on
microsphere showed the highest immobilization yield and specific activity. The kinetic
constants of immobilized lipases were obtained to understand the high efficiency of
microsphere. In particular, the lipase immobilized on microsphere showed significantly
enhanced thermal and pH stability, compared with free lipase. To increase thereusability of microsphere as an enzyme support, cellulose/Fe3O4 hydrogel
microsphere was also prepared. The lipase immobilized on cellulose/Fe3O4
microsphere could retain 70% of initial activity after 5 times reuse by the separation
with magnet. This study suggests that cellulose hydrogel microspheres would have
many potential applications in the biomedical, biocatalytic fields.

【目的】バニリンは産業上有用な香料化合物であり，バニラビーンズからの抽出法と化石資源からの化学合成法により専ら生産されているが，香料製品の規格であるナチュラルステータスを獲得する工業的生産法として，バイオマスを原料とするバイオプロセスの開発が期待されている．我々はこれまでに補酵素非依存型の新規酸化酵素 Cso2 を見出し，4-vinylguaiacol (4VG) を原料として当該酵素の酸化反応によるバニリン生産を報告している 1)．本研究では，Cso2 高発
現大腸菌を利用したバニリンの効率的生産プロセスの開発を目指し検討を行った．
【方法・結果】これまでの検討で Cso2 の不安定性が律速であることが示されている．諸条件検討中に，精製酵素反応系にカタラーゼを添加するとバニリン合成量が向上することを見出した．過酸化水素を分解するカタラーゼの添加効果
は，酸化反応で生成する活性酸素種による Cso2 への悪影響を示唆する結果と考えた．一方，Cso2 発現大腸菌の細胞破砕液を用いたバニリン合成において，カタラーゼを添加しても大きな変化は見られなかった．これは大腸菌に内在するカタラーゼが機能しているためと考え，Cso2 を利用するバニリンの生産には菌体反応系が適していると判断した．また，Cso2 発現大腸菌の繰り返し利用や連続生産系を想定して，アルギン酸カルシウムゲルによる包括菌体の利用を考えた．その結果，包括菌体系では活性がより安定的に維持され，繰り返し利用によるバニリン生産も高活性を維持することができた．さらに，当該包括菌体を用いて，反応系内を均一に維持できる連続生産プロセスを検討したところ，大幅な生産性向上の可能性を確認した．
1)
T. Furuya, et al., N. Biotechnol., 32, 335-339 (2015).

Development of cellulose hydrogel microsphere for lipase immobilization

Development of efficient vanillin production system using the entrappedwhole cells of the recombinant Escherichia coli

○Soyeon Jo, Sae Rom Park, Sang Hyun Lee(Dept. Biol. Engn., Konkuk Univ., South Korea)○Tsubasa Saito1, Riku Aono1, Toshiki Furuya2, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words

cellulose, microsphere, lipase, immobilization

Key words
vanillin, coenzyme-independent dioxygenase, whole cell reaction,
calcium alginate beads

3La09

Preparation of biopolymer-based hybrid hydrogel beads
for enzyme immobilization

3La11○Saerom Park, Sang Hyun Lee(Dept. Biol. Engn., Konkuk Univ.)
sanghlee@konkuk.ac.kr

ポリニュートラルレッド修飾電極を用いたリンゴ酸酵素による CO2 固定化システムの構築○大田 竹留 1, 坂元 博昭 1,2, 里村 武範 1,2, 末 信一朗 1,2（1福井大院・工, 2福井大学ライフイノベセ）
suyeb10@u-fukui.ac.jp

Biopolymers-based materials have inexhaustible potential in biological, environmental,
and pharmaceutical fields, due to their biodegradability and biocompatibility. In thiswork, ionic liquid was used as a solvent for the co-dissolution of biopolymers
including cellulose, chitosan, carrageenan, lignin, xylan and starch. Millimeter- andmicro-sized biopolymer-based hybrid hydrogel beads were prepared by sol-gel
transition. Lipase was immobilized on various millimeter-sized hydrogel beads
prepared by extrusion method. The immobilized lipase showed significantly enhanced
thermal and pH stability, compared with free lipase. In particular, the lipase entrappedin cellulose/xylan/lignin beads showed higher stability than the lipase adsorbed on thebeads. The cellulose/biopolymer/Fe3O4 hydrogel microbeads were also prepared byemulsion-based method. Average diameters of microbeads were ranging from 30 to 50
μm. Lipase could be successfully immobilized on various biopolymer microbeads withhigher protein loading and immobilization yield than millimeter-sized beads.
Immobilization yields were ranging from 110% to 140%. Especially, the lipase
immobilized on cellulose/starch/ Fe3O4 showed 56-folds enhanced half-life time during
incubation at 50℃, compared with free lipase. Moreover, the lipase immobilized on
microbeads could be easily collected by using magnet and reused with high residual
activity. The biopolymer-based beads can be used to various biotechnological fields,
owing to their controllable properties.

【目的】 CO2 固定化システムに用いられる酵素として，CO2 をギ酸に変換する
NAD ＋依存型ギ酸脱水素酵素（CbFDH）やリンゴ酸酵素が挙げられる．これらの酵素反応では NADH が補酵素として必須であり，反応を効率よく進行させるためには NADH の循環再生系を同時に組み込む必要がある．NADH の再生には，電気化学的方法，酵素反応を用いる方法などが報告されている．しかし，酵素反応では高価な犠牲基質を必要とする等の問題がある．一方，電気化学的方法ではメディエータを反応系内に閉じ込める必要や電子伝達の効率等の問題がある．そこで，本研究ではニュートラルレッドを電解重合したポリニュート
ラルレッド (Poly-NR)修飾電極をメディエータとして NADH を循環再生させながらリンゴ酸酵素反応の逆反応を行うことで CO2 の固定化を検討した．
【方法】CO2 固定化システムのための Brevundimonas diminuta 由来 NAD(P)依存型リンゴ酸酵素の精製をし，CO2 固定化反応システムに用いた．さらに，電解重合によってカーボンペーパー (CP)電極上に Poly-NR を電析させた．その後，作製した電極を CO2 固定化用反応液に浸漬し，-0.6 V (vs. Ag/AgCl）の印可電圧
で NADH の再生をしながら CO2 固定化反応を 24 時間行った．HPLC によって生成した L-リンゴ酸を定量した．
【結果・考察】-0.6 V(vs. Ag/AgCl)で NADH の再生を行いながら CO2 固定化反応を行った結果，基質であるピルビン酸から約 17 mM のリンゴ酸の生成が見られ，等量の CO2 の固定化が確認された．Poly-NR 修飾電極を用いることで，メディエータを系内に閉じ込めた電気化学的補酵素再生による CO2 固定化が可能となった．現在，高分子化 NAD ＋を併用した反応系について検討を行っている．

Preparation of biopolymer-based hybrid hydrogel beads for enzyme
immobilization

Construction of CO2 immobilization system with malic enzyme using polyneutral red modified electrode○Saerom Park, Sang Hyun Lee(Dept. Biol. Engn., Konkuk Univ.)

Key words

ionic liquid, biopolymer, hybrid hydrogel bead, enzyme immobilization○Takeru Ota1, Hiroaki Sakamoto1,2, Takenori Satomura1,2, Shin-ichiro Suye1,2(1Grad. Sch. Eng. Fukui Univ., 2Life Sci. Innov. Center, Univ. Fukui)

Key words

CO2 fixation, mediator, malic enzyme

283

3Ma01

エリンギ由来セリンアミノペプチダーゼの基質取り込み
経路の酸化が及ぼすペプチド結合形成反応への影響

3Ma03○東海 彰太 1, 美藤 友博 2, 清水 克彦 3, 有馬 二朗 2
（1鳥取大院・連農, 2鳥取大・農, 3鳥取大・CoRE）
arima@muses.tottori-u.ac.jp

菌体反応系によるイミダゾールジペプチドの効率的生産法の開発○駒林 卓磨 1, 倉本 歩 2,3, 木野 邦器 1,2（1早大院・先進理工・応化, 2早大・理工総研, 3東海物産）
kkino@waseda.jp【目的】エリンギから見出されたセリンアミノペプチダーゼは，加水分解と拮抗
してペプチド結合を形成するアミノリシス反応を触媒し，酸化処理により基質特異性が変化する性質を持つ．これまでの研究により，本酵素の基質の取り込
み経路を形成する Met 残基の酸化が，基質認識に大きく影響することが予測された．このような基質認識の変化は，アミノリシス反応にどのような効果をもたらすかは未解明である．本研究では，本酵素の基質認識機構の解明と特異性の制御を目指し，酸化に伴うアミノリシス活性への影響を評価した．
【方法及び結果】本酵素の pNA 遊離活性は，酸化により，芳香族アミノ酸-pNA
に対して維持されるが，その他のアミノ酸-pNA に対して大きく低下する．そこで，酸化処理した本酵素を使用し，L-Phe-OMe 及び L-Leu-OMe それぞれを基質とした酵素反応液を調製した後，アミノリシス反応で生じた生成物（L-PheL-Phe-OMe 及び L-Leu-L-Leu-OMe）を ESI-MS で解析した．その結果，未処理の酵素よりも酸化処理後の酵素でジペプチド誘導体生産の増加が確認された．
一方で，その反応速度は，L-Phe-L-Phe-OMe 合成では上昇したのに対して，LLeu-L-Leu-OMe 合成では低下した．以上の結果から，本酵素は酸化されること
で，水よりもアミノ酸誘導体を認識するように基質特異性が変化し，基質に対する反応性は芳香族アミノ酸誘導体に対して厳格になったと考えられる．続いて，酸化処理した本酵素を使用して L-Tyr-NH2 と L-Arg-OMe を材料として鎮痛ジペプチド L-Tyr-L-Arg-OMe の生産を評価すると，当該ジペプチドの生産量の増加も観察された．これらの結果から，本酵素の基質取り込み経路の改変が，生成ペプチドへの加水分解を抑える一つの手段になりうる可能性が示された．

【目的】イミダゾールジペプチドは，抗酸化作用や抗疲労効果等の多様な生理機能を有する化合物として注目されている．現在は鶏肉などからの抽出による生産が主流であるが，低収率，高コストなどの点から新たな生産法の開発が求められている．我々は L-アミノ酸リガーゼに着目し，その改変酵素によるイミダ
ゾールジペプチドの高収率生産を報告している 1)．但し，本酵素反応では等モルの ATP が必要なため，その削減が課題となっている．本研究では，糖代謝系による ATP 再生が期待できる菌体反応系でのイミダゾールジペプチドの効率的生産法の開発を目指し，ペプチダーゼの影響も考慮しつつ検討を行った．
【方法・結果】菌体反応系でのイミダゾールジペプチド分解に関与すると推測したペプチダーゼを欠損させた大腸菌 E. coli BL21(DE3)を作製し，ジペプチドの分解性を野生株と比較した．その結果，カルノシンやアンセリンは野生株においても分解活性は低く，pepD 欠損株においてさらに分解が抑制されることが判明した．このことはイミダゾールジペプチドの発酵生産の可能性を示唆する結果である．そこで，糖代謝による ATP 再生系を期待してグルコース添加による菌体反応系でのイミダゾールジペプチドの生産を検討した．予想通り，ATP 無添加系でもカルノシンおよびアンセリンの高収率合成が可能であった．最適反応条件を検討中であるが，イミダゾールジペプチドの発酵生産への可能性を強く示唆する結果であり，安価なイミダゾールジペプチドの提供による健康社会増進への貢献が期待できる．

Effect of oxidation of substrate pathway of serine aminopeptidase from
Pleurotus eryngii on its peptide bond formation

Efficient production of imidazole dipeptides by whole cell reaction○Shota Tokai1, Tomohiro Bito2, Katsuhiko Shimizu3, Jiro Arima2(1United. Grad. Sch. Agric. Sci., Tottori Univ., 2Fac. Agric., Tottori Univ., 3CoRE,
Tottori Univ.)

1) 駒林ら, 日本農芸化学会 2017 年度大会講演要旨集, 2C26p08.
○Takuma Komabayashi1, Ayumu Kuramoto2,3, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ., 3Tokaibussan Co., Ltd.)Key words
formationaminopeptidase, oxidation, substrate specificity, peptide bond

Key words
peptidase

imidazole dipeptide, L-amino acid ligase, whole cell reaction,

3Ma02

D-アミノ酸含有ジペプチドの汎用的な酵素合成法の開発

3Ma04

アミノペプチダーゼによるアレルゲンペプチドの分解○賀野 壮一朗 1, 鈴木 伸 1, 原 良太郎 2, 木野 邦器 1,2（1早大・先進理工, 2早大・理工総研）
kkino@waseda.jp○畑中 唯史 1, 万 クン 2, 裏地 美杉 3, 東海 彰太 1, 中東 良太 4（1岡山生物研, 2中国西南大学, 3神戸大院・科技イノベ, 4ナガセ
ケムテックス(株)）hatanaka@bio-ribs.com【目的】D-アミノ酸含有ペプチドでは，L-アミノ酸のみで構成されるペプチドに比べ，活性増強や新規活性を発現する可能性が示されているが，効率的な合成法は開発されていない．我々は，非リボソーム型ペプチド合成酵素のアデニル化ドメイン（A ドメイン）によるアミノ酸のアデニル化と，それに続く求核置
換反応により，多様なジペプチドの合成が可能であることを報告している 1）．
本方法では，ジペプチドの N 末端側基質は A ドメインの基質特異性による制限を受けるが，C 末端側は求核活性を有する任意のアミノ酸が導入可能になる．
本研究では，合成可能なジペプチドの種類の拡張を目的とし，とくに N 末端側に D-アミノ酸を含有する新規ジペプチド合成法の開発を検討した．
【方法・結果】我々は，Brevibacillus parabrevis IAM1031 由来 tyrocidine synthetase
A の A ドメイン（TycA-A）が N 末端側基質となるアミノ酸として，L-体だけでなく D-体も認識することを明らかにしており，C 末端側を Pro とした DD-，
DL-，LD-，LL-のキメラジペプチドの合成を報告した 2）．そこで TycA-A の N
末端基質を D-Trp とした場合の C 末端側基質となるアミノ酸を検証した．20 種
類の D-アミノ酸を求核剤として酵素反応を行ったところ，D-Trp-D-Ala など予想されるジペプチドの合成を確認することができた．そこで，キメラジペプチ
ドの汎用的な酵素合成法の開発を目指して，TycA-A と同様に D-アミノ酸も基質とする A ドメインの探索を検討したところ，Bacillus licheniformis NBRC 12199
由来 bacitracin synthetase を構成する BacB2-A を見出した．N 末端側基質を DLys とし同様に酵素反応を行ったところ，D-Lys-D-Xaa（Xaa:任意のアミノ酸）の合成を確認することができた．
1) R.Hara, et al., Scientific Reports, 8:2950 (2018).
2) 賀野ら, 日本生物工学会 2017 年度大会講演要旨集, 2P-G038.

【背景および目的】放線菌は，様々なタンパク質を菌体外に分泌することが知ら
れ，タンパク質生産の有用宿主として，近年注目を集めている．我々は，従来から放線菌由来ペプチダーゼの研究を行っており，ホスホリパーゼ D やアミノ
ペプチダーゼなどの有用酵素を分泌する放線菌 Streptomyces cinnamonues TH-2株を独自に取得している．これまで，TH-2 株由来 M28 ファミリーアミノペプ
チダーゼ（M28AP）の解析に取り組んだところ，カゼイン由来アレルゲンペプ
チドに対して，分解能力が低いことが示された．そこで，本発表では，TH-2 株
由来 M28 アミノペプチダーゼと，放線菌由来 M24 ファミリーアミノペプチダー
ゼ（M24AP, ナガセケムテックス(株)製, デナチーム XPO DUET）を組み合わせ，
アレルゲンペプチドに対する分解能力を評価した結果について報告する．
【方法および結果】ウシ由来カゼインのトリプシン・キモトリプシン消化物のア
レルゲンペプチド（VLPVPQK, FFVAPFPEVFGK, VAPFPEVFGK, APFPEVFGK,PEVFGK, VFGK）に対する分解能を，イオントラップ型 LC-MS を用いて評価した．その結果，XPO DUET は，いずれのペプチドに対しても，分解能を示
し，VFGK に対しては，M28AP と組み合わせることで，分解が促進された．
M24 ファミリーに属するアミノペプチダーゼ（M24AP）は，亜鉛を活性中心にもち，Xaa-Pro ペプチド特異的に作用し，N 末端からアミノ酸を遊離させる活性をもつと報告されてきたが，今回のアレルゲンペプチドを用いた解析によって，幅広い基質特異性をもつことが示唆された．

Development of an enzymatic method for production of D-amino acidcontaining dipeptides

Enzymatic degradation of allergen peptides from bovine casein bycombination of aminopeptidases○Soichiro Kano1, Shin Suzuki1, Ryotaro Hara2, Kuniki Kino1,2(1Sch. Adv. Sci. Eng., Waseda Univ., 2Res. Inst. Sci. Eng., Waseda Univ.)

Key words
dipeptide

adenylation domain, nonribosomal peptide synthetase, D-amino acid,○Tadashi Hatanaka1, Kun Wan2, Misugi Uraji3, Shota Tokai1, Ryota Nakahigasi4(1RIBS, Okayama, 2Dept. Food Sci., College of Animal Sci., Southwest Univ.,
3
Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ., 4NagaseChemtex. Co.)

Key words

aminopeptidase, Streptomyces

284

3Ma05

Split intein の protein trans-splicing を利用した耐熱性プ
ロテアーゼ再構成の検討

3Ma07○巽 祐介, 足立 航平, 山野 範子, 大政 健史, 古賀 雄一（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp

環状イミノ酸に対する反応性が向上したサルコシンオキ
シダーゼ変異体○黒部 督惠, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）nishiya@lif.setsunan.ac.jp【背景・目的】Tk-SP は超好熱古細菌 (始原菌) T. kodakarensis KOD1 のゲノム上にコードされた至適温度 100℃, 100℃における半減期が 100 分の耐熱性が非常に優れた subtilisin-like serine protease である. この酵素は通常の酵素が変性, 失活してしまう条件下で安定性を維持できるため, 医療用酵素洗浄剤などへの応用が期待されている. しかし, Tk-SP を大腸菌で発現させると, そのタンパク質分解活性により増殖が妨げられ, 大量調製が困難である. そこで, 2 つのポリペプチド鎖を 1 つにつなげる, protein trans-splicing (PTS) を触媒する split intein を用いた発現系を構築した. Tk-SP を二つに分割して, 一方に N-intein, もう一方に C-inteinを付与したベクターを構築し, 発現後, それらの断片を混ぜ合わせることで split
intein の PTS を誘導して Tk-SP を生産することを目的とした.
【実験方法・結果】Nostoc punctiforme 由来の Npu-PCC73102 DnaE intein は, 極めて高い PTS 効率と反応速度 (t1/2 = 60 sec at 37℃ ) を持つ split intein である. また挿入するアミノ酸配列の前後三つのアミノ酸残基 (隣接配列) によってスプライ
シング効率が変化することが知られている. Tk-SP の立体構造から, N 末端側タ
ンパク質, C 末端側タンパク質で分割して発現するときにフォールディングがうまく行われるように, 表面のループ部分にある Y239 を Npu DnaE intein の挿入箇所として設定してベクター構築を行った. その後, 発現を行ったところ増殖阻害が起こることなく, N 末端側と C 末端側の断片のどちらも可溶性発現した.
Y239 が Npu DnaE intein を利用した PTS に適した位置である可能性がある. これらの断片について on-column PTS によって確認を行ったところ, PTS は完全には進行しなかったが, Npu DnaE intein の相互作用は確認できた. 本発表では, oncolumn PTS について報告する.

【背景および目的】 サルコシンオキシダーゼ（Sox; EC 1.5.3.1）はサルコシンの酸化的脱メチル化を触媒する酵素であり，さらにサルコシンと構造的に類似性のある L-プロリンに対しても非常に微弱な反応性を有する．当研究室では，Soxの立体構造に基づく酵素機能の改変，特に基質特異性に関与する残基の特定を進めている．今回，合理的な変異デザインにより，環状イミノ酸に対する反応性が向上した Sox 変異体を作成することに成功した．さらに，その変異酵素のさまざまな環状イミノ酸に対する反応性を詳細に調べたので報告したい．
【実験方法および結果】 はじめに，ソフトウェア MOE を用いて Sox と基質の結合モデルを作成し，Sox の活性中心近傍を構成するアミノ酸のうち Y254 が環状イミノ酸との反応性に関与していると推察した．そこで，Y254 をより小さいアミノ酸へと置換することで環状イミノ酸に対する反応性が向上すると予測
し，実験的に検証したところ，Y254A と Y254G がサルコシンよりも環状イミノ酸に対して高い反応性を示した．各種環状イミノ酸，特に D-プロリンに対し
Y254G ではサルコシンの約 15 倍，Y254A では約 4.3 倍の比活性が，L-ピペコ
リン酸に対し Y254G ではサルコシンの約 2.0 倍，Y254A では約 0.39 倍の比活性を示した．よって，変異体の構造と基質特異性との相関について考察を行った．
【結論】 ドッキングシュミレーションにより，環状イミノ酸と反応性の高い Sox
変異体を予測し，そのことを実験的に確認した．本酵素の構造と基質特異性との相関について，引き続き検討したい．

The reconstruction of a highly thermostable enzyme by the using proteintrans-splicing of split intein

Mutants of Sarcosine oxidase with high reactivities for cyclic imino acid

○Yusuke Tatsumi, Kohei Adachi, Noriko Yamano, Takeshi Omasa, Yuichi Koga
(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Masae Kurobe, Yoshiaki Nishiya(Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)

Key words

split intein, subtilisin, thermostable enzyme

Key words

sarcosine oxidase, substrate specificity, cyclic imino acid, proline

3Ma06

Tk-subtilisin の有機溶媒耐性の解析

3Ma08

Chloroflexus aurantiacus 由来のサルコシンオキシダーゼの N-メチルアミノ酸に対する反応性○宮田 大暉, 大政 健史, 山野 範子, 古賀 雄一（阪大院・工）kogay@mls.eng.osaka-u.ac.jp○松本 美徳, 西矢 芳昭（摂南大院・理工）nishiya@lif.setsunan.ac.jp【背景・目的】Tk-subtilisin は超好熱古細菌（始原菌）Thermococcus kodakarensis
由来サチライシン様セリンプロテアーゼである．Tk-subtilisin は極めて高い熱安定性を示し，化学変性剤に対しても安定であるという特徴を有する．Subtilisinには有機溶媒中で加水分解逆反応を触媒することも報告されており，本酵素に於いてもその可能性が期待されている．Tk-subtilisin に有機溶媒に対する耐性があるかどうかは解明されていないため，本研究では Tk-subtilisin の有機溶媒による変性に関する基本的な知見を得ることを目的とした．
【方法・結果】 Tk-subtilisin は Pro 配列と活性ドメイン（成熟化ドメイン）から構成される．大腸菌発現系から成熟化前の Pro 配列を保持した Pro 体 Tksubtilisin（複合体）として Tk-subtilisin を調製した．Pro 体は 80℃30 分の加熱により活性型 Tk-subtilisin に成熟化する．本研究では，Pro 体（複合体）と活性型
Tk-subtilisin それぞれについて，有機溶媒中での酵素活性を測定し，各溶媒に対する耐性の比較を行った．有機溶媒は 2-プロパノール，t-ブタノール，1,4-ジオ
キサン，エチレングリコール，DMF，DMSO，エタノール，メタノールを選択した．成熟化及び酵素反応温度は各有機溶媒の沸点を考慮し，エタノールは70℃，メタノールは 60℃，他の 6 種類は 80℃に設定した．
Pro 体（複合体）については，50%濃度のすべての有機溶媒に対して 60％以上の残存活性を示した．分子内シャペロン活性を持つ Pro 配列の存在により一度
有機溶媒で変性した構造が巻き戻ったと考えられる．活性型 Tk-subtilisin は，
2-プロパノールや t-ブタノールなどに対して残存活性は 40％以下となり，一方でエチレングリコールは，約 80％の残留活性を示し，耐性があることが示唆された．
本発表では Tk-subtilisin の溶媒中での安定性の詳細と，逆反応活性について報告する．

[背景および目的]サルコシンオキシダーゼ(Sox, EC1.5.3.1)は腎機能の評価マーカーであるクレアチニンの酵素法測定に使われる追随酵素の 1 つである．当研究室では，好熱性光合成細菌 Chloroflexus aurantiacus 由来サルコシンオキシダー
ゼ（SoxCa）が他起源の Sox より高基質親和性を有していることを見出し，構造比較より SoxCa に存在する Q255 が影響していると予想した．そこで，Q255
変異体を作成し基質親和性を見たところ，変異体側鎖が小さくなるほど Km 値が大きくなった．このことから Q255 はサルコシンに対する酵素反応，特に基質親和性において重要な残基であることが分かった．今回はサルコシンの類似物質である N-メチルアミノ酸，特に N-メチル-L-ノルロイシン（NMLN）に対する反応性を野生型と Q255 変異体で比較し，興味深い知見を得たので報告する．
[実験方法]野生型および変異体は His-tag 融合タンパク質として発現させアフィ
ニティー精製を行った．構造的考察を行うため，ソフトウェア MOE により立体構造が既知である SoxB を基にホモロジーモデリングを行い，構造モデルを構築した．
[結果および考察] 各種の N-メチルアミノ酸に対する反応性を見たところ，SoxCa
は NMLN に最も高い反応性を示すことが分かった．そこで Q255 変異体のNMLN への反応性を見たところ，側鎖を小さくすると Km 値が小さくなり，さらに欠失させたものは野生型に比べ最も基質親和性が高くなった．Q255 は
NMLN では結合を阻害していると考えられる．すなわち，Q255 は本酵素において基質特異性にも重要な残基であると思われる．基質構造のフィッティング
解析から，Q255 が存在することでサルコシンは活性部位にフィットしやすいが，側鎖の大きい NMLN はフィットしづらくなると予想された．

Analysis of organic solvent tolerance of Tk-subtilisin

Reactivity of the sarcosine oxidase from Chloroflexus aurantiacus to Nmethyl amino acids.

○Hiroki Miyata, Takeshi Omasa, Noriko Yamano, Yuichi Koga
(Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)

Key words

subtilisin, organic solvent, thermostable enzyme○Minori Matsumoto, Yoshiaki Nishiya(Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ.)

Key words
amino asidsarcosine oxidase, substrate affinity, active site structure, N-methyl

285

3Ma09

Pyrococcus horikoshii 由来馬尿酸加水分解酵素の機能

改変

3Ma11

○今井 皐 1, 名越 健太郎 1, 新木 翔太 1, 馬場 利明 2, 西矢 芳昭 1
（1摂南大院・理工, 2ニプロ 総研 第三研究開発）
nishiya@life.setsunan.ac.jp

Pseudomonas aeruginosa PAO1 株由来アセチルコリンエ
ステラーゼによるアミノ酸のアセチル化反応○井上 尚 1, 美藤 友博 2, 清水 克彦 3, 有馬 二朗 2
（1鳥取大院・農, 2鳥取大・農, 3鳥取大・CoRE）
arima@muses.tottori-u.ac.jp【背景および目的】有機溶剤であるトルエンやキシレンは塗装業などで大量に取扱われており，これらの体内への蓄積は肝機能障害を引き起こすとされている．
このような健康被害を未然に防ぐため，有機溶剤取扱い作業者には，尿中の有機溶剤代謝物量の測定などを含む特殊健康診断の受診が義務付けられている．
現在の診断では HPLC を用いた測定が行われているが，操作が煩雑で時間がか
かり，さらには高額であるといった欠点がある．酵素的測定法が開発できれば，有機溶剤代謝物量の簡便かつ多検体迅速測定が可能となる．
そこで我々は，トルエンとキシレンの代謝産物である馬尿酸とメチル馬尿酸の総濃度測定法に供するための酵素を探索し，タンパク質工学的改良を試みた．
【結果および考察】馬尿酸およびメチル馬尿酸に反応する酵素をスクリーニング
した結果，Pyrococcus horikoshii 由来の馬尿酸とメチル馬尿酸を加水分解するア
ミノアシラーゼを見出した．しかしながら，本酵素は超好熱菌由来のため，通常の分析温度（37℃）では極めて低活性であった．そこで，タンパク質工学的手法を用いて本酵素の 37℃における活性向上を試みた．本酵素と配列相同性の高い加水分解酵素をベースに立体構造モデルを作成し，フレキシブルな領域を中心に変異箇所を決めてサチュレーションミュータジェネシスを行った．
変異体スクリーニングの結果，K193，P200，N307 をより小さなアミノ酸残基とした変異酵素で 37℃における活性向上が確認された．N307 は触媒ドメイン，
K193，P200 はサテライトドメインのアミノ酸残基であり，側鎖を小さくする
ことで酵素のフレキシビリティが高まったと考えられる．
今後は，反応性向上が確認された変異を組み合わせた多重変異体を作成し，相加効果を確認する．

【目的】アセチルコリンエステラーゼ（AChE）は Ser を活性中心に持ち，アセ
チルコリンをコリンと酢酸に加水分解する反応を触媒する．我々はこれまで，
Pseudomonas aeruginosa PAO1 株由来の AChE（Pa-AChE）の利用に向けた検討を行ってきた．組換え Pa-AChE は酢酸エチルに対する加水分解活性を持ち，副反応としてアミノ基や水酸基のアセチル化反応も触媒することが明らかとなった．本研究では，本酵素でアセチル化が可能なアミノ酸やアミノ酸誘導体の探索を行うと共に，Pa-AChE の性質や光学異性の認識について評価した．
【方法】Pa-AChE を使用したアミノ酸のアセチル化反応は，酢酸エチル（終濃度 0.2M）をアセチル供与体として使用し，pH 9.0（Tris-HCl 緩衝液），TritonX-100の存在下で行った．アセチル化された化合物は，TLC もしくは LC/MS を用いて解析した．
【結果】L-アミノ酸と L-アミノ酸-メチルエステル（-OMe）を対象にアセチル化反応を行うと，L-アミノ酸ではアセチル化反応が確認されなかったが，L-アミノ酸-OMe ではいくつかの疎水性アミノ酸（L-Leu-OMe，L-Phe-OMe，L-ProOMe，etc）や塩基性アミノ酸（L-Lys-OMe，L-Arg-OMe）でアセチル化生成物が見られた．しかし，同じ疎水性アミノ酸や塩基性アミノ酸でも L-Ala-OMe や
L-His-OMe ではアセチル化反応が確認されなかったため，Pa-AChE は物性に加えて大きさや構造も識別してアセチル受容体に利用していることが考えられた．
続いて Pa-AChE の反応によってアセチル化が確認された L-アミノ酸-OMe の D
体に対してアセチル化反応が進むかどうかを評価した結果，D 体ではアセチル化反応が確認されなかった．従って，本酵素は光学異性体を認識してアセチル受容体として利用することが明らかとなった．

Protein engineering of a hippurate hydrolase from Pyrococcus horikoshii

Acetylation reaction against amino acids using acetylcholine esterase from
Pseudomonas aeruginosa PAO1

○Satsuki Imai1, Kentaro Nagoshi1, Shota Shinki1, Toshiaki Baba2,
Yoshiaki Nishiya1(1Grad. Sch. Sci. Eng., Setsunan Univ., 2NIPRO R&D Lab.)○Hisashi Inoue1, Tomohiro Bito2, Katsuhiko Shimizu3, Jiro Arima2(1Grad. Sch. Agric., Tottori Univ., 2Fac. Agric, Tottori Univ., 3CoRE., Tottori Univ.)

Key words

toluene, xylene, hippuric acid, aminoacylase

Key words
Pseudomonas aeruginosa, acetylcholine esterase, amino acid methyl
ester, acetylation

3Ma10

高基質特異性 L-アミノ酸オキシダーゼの 1 種 L-リシン
α-オキシダーゼから部位特異的変異により作成した 新規な芳香族アミノ酸オキシターゼの性質

3Na01

六価クロム還元細菌 Flexivirga alba ST13 株のフラグメ
ント解析を利用した追跡法○桶田 凜, 池上 健仁, 杉山 友康（東京工科大院・バイオニクス）
tsugiyama@stf.teu.ac.jp○松本 侑也 1, 北川 雄輝 2, 今田 勝巳 2, 根本 理子 1, 田村 隆 1,
日下部 均 3, 稲垣 賢二 1
（1岡山大院・環境生命, 2阪府大院・理, 3エンザイムセンサ）
kinagaki@okayama-u.ac.jp【目的】L-リシン α-オキシダーゼ（LysOX）は L-Lys の酸化的脱アミノ化反応を触媒する L-アミノ酸オキシダーゼ（LAO）の一種である．本酵素は基質特異性が厳格な為 L-Lys の微量定量に有用で，強力な抗腫瘍性も有する為がん治療への応用も期待されている．我々はこれまでに LysOX の大腸菌による異種発現系構築および X 線結晶構造解析に成功しており，基質と相互作用している残基(Asp212 及び Asp315)を明らかにしている．今回は LysOX の基質認識機構解析を目的として上記の 2 残基に部位特異的突然変異を導入した変異酵素が芳香族
アミノ酸への特異性を示した為，均一精製を行って変異酵素の性質を解析を進めた．
【方法】部位特異的突然変異導入は，発現ベクター pColdIV-LysOX を鋳型として Asp212 および Asp315 を置換した変異導入プライマーを用いてクイックチェ
ンジ法で行った．酵素精製は菌体破砕後，熱処理，硫安分画，疎水性カラムと陰イオン交換カラムクロマトを用いて行った．活性測定は反応産物 H2O2 の定量によって測定した．
【結果】Asp212 および Asp315 両残基を Ala に置換した二重変異酵素は元のLysOX と比較して顕著に活性や kcat/Km 値が減少し，元酵素と異なり芳香族や疎水性のアミノ酸にも反応する低基質特異性化が認められた．また，Asp212 残基を Arg に置換した D212R 変異体においても同様に芳香族アミノ酸を主な基質とするように変化した．これらの結果から Asp212，Asp315 両残基は LysOX の基
質認識に密接に関与していると言え，突然変異導入により LysOX の基質特異性を改変出来ると示唆された．また，速度論等の解析結果から二重変異酵素は新規芳香族アミノ酸オキシターゼとしての性質を有していると言え，新規 LAO
開発に新たな知見をもたらした．現在は基質特異性が変化した理由を明らかにする為，均一精製した変異酵素を用いて結晶構造解析等を進めている．

【背景と目的】六価クロムは発癌性がある．そこでこの六価クロムよる土壌汚染を安価で安全に除去する方法が必要とされている．一方我々が発見した新属新種の放線菌 Flexivirga alba ST13 株は六価クロムを還元して無害な三価クロムにする性質が存在した．この菌を用いたバイオレメディエーションには菌の追跡法が必要である．我々は PCR 解析法である RISA (Ribosomal intergenic spacer
analysis) を応用して ST13 株を特定する方法には成功したが，PAGE (Poly
Acrylamide Gel Electrophoresis) を必要とし，操作性に課題があった．そこで本研
究ではキャピラリーシーケンサーのフラグメント解析を応用して RISA-PCR 解
析する方法の開発を目的とした．さらに ST13 株は pH の高い環境では増殖できないことを利用して，pH の違う環境で培養した ST13 株の検出の定量性を検討した．
【方法と結果】ST13 株の DNA 抽出には破砕法である ISOIL for Beads Beating(ニッポンジーン社製) を使用し，土を混ぜずに DNA 抽出を行い，鋳型 DNA(0.0044 pg/μl~44 pg/μl) の RISA-PCR を行った．RISA-PCR のプライマーは 1392f/
23Sr (forward/reverse) 使用して PCR 条件を 94 ℃,5 min 35 cycle (94 ℃,1 min
52 ℃,1 min 72 ℃,2 min) 4 ℃,∞に設定して行った．フラグメント解析の結果，鋳型 DNA 濃度が濃いサンプルほどピークが大きく，濃度が薄いサンプルほどピー
クが小さく現れた．加えてすべてのピークが 675 bp 付近に現れたことから鋳型
DNA の濃度に相関した結果が現れたと判断した．現在は pH を変えていない培地と pH10 と pH13 の培地で培養した複数の ST13 株のサンプルの DNA 抽出とRISA-PCR を行い，それらの増幅される DNA をキャピラリーシーケンサーのフラグメント解析で確認を行っている．

Characterization of novel aromatic amino acid oxidase made from L-lysineoxidase with high substrate soecificity

Tracking Flexivirga alba ST13 using RISA-PCR DNA fragment analysis

Key words
aromatic amino acid, L-lysine alpha oxidase, substrate specificity, sitedirected mutagenesis

Key words
chromium○Yuya Matsumoto1, Yuki Kitagawa2, Katsumi Imada2, Michiko Nemoto1,
Takashi Tamura1, Hitoshi Kusakabe3, Kenji Inagaki1(1Grad. Sch. Environ. Life Sci., Okyama Univ., 2Grad. Sch. Sci., Osaka Pref. Univ.,
3
Enzyme Sensor Co., Ltd.)○Rin Oketa, Kento Ikegami, Tomoyasu Sugiyama(Grad. Sch. Bionics., Tokyo Univ. Technol.)Flexivirga alba ST13, RISA-PCR, DNA fragment analysis, hexavalent

286

3Na02

メタン発酵消化液中のリンの再資源化方法の検討○下出 崇樹 1, 川西 琢也 1,2, 滝口 昇 1,2（1金沢大院・自科, 2金沢大・理工）
tackey@se.kanazawa-u.ac.jp

3Na04

水中からアンチモンを除去する微生物集積系の特徴付け○細川 久顕 1, 森 健太朗 1, 黒田 真史 1, 惣田 訓 2, 井上 大介 1,
池 道彦 1（1阪大院・工, 2立命館大・理工）
ike@see.eng.osaka-u.ac.jp【背景と目的】リンは肥料，半導体製造等で必須とされる物質だが，近年リンの需要増加に伴い，原料であるリン鉱石の枯渇が懸念されている．特に，リン資
源のほとんどを輸入に依存する日本は国内でのリン資源の確保は重要な課題である．そこで，国内リン資源の 1 つとして検討されているのが，下水処理の行程で発生するメタン発酵消化液である．メタン発酵消化液を含む下水中のリン回収方法としては MAP 法，HAP 法などが有効な手段とされているが，これらは pH，濃度の操作によるプロセスの複雑化や薬品の添加が避けられない．一方，吸着法は簡単な操作で目的物質を回収できる．そこで，本研究ではハイド
ロタルサイトを用いた吸着法によるメタン発酵消化液中のリン酸の回収方法について検討することを目的とした．
【方法】ハイドロタルサイトを用いてメタン発酵消化液から直接リン酸の回収が可能か検討するため，以下の方法で実験を行った．まず，電気炉を用いてハイ
ドロタルサイトを 250℃で 2 時間焼成した．メタン発酵消化液 500 mL あたり 1
g になるように焼成したハイドロタルサイトを加え，120 rpm で 1 時間振盪撹拌し，リン酸を吸着した．その後，ハイドロタルサイトをカラムに充填し，ペリ
スタポンプを用いて純水を 5 分（洗浄），0.5 M NaOH 水溶液（脱着）を 10 分，
再度純水を 5 分（洗浄）流入させた．流速は全て 10 mL/分に設定した．流出液
は 1 分毎に 10 mL ずつ採取し，リン酸濃度を測定した．なお，このサイクルを
3 回繰り返し行った．
【結果と考察】3 サイクル繰り返した場合でもハイドロタルサイトのリン酸吸着
量は約 3 mol-PO4/g-ads，脱着率は約 70～80％と吸脱着能力の大きな減少は見られなかった．また，0.5 M NaOH 水溶液流入後は開始 10 分でほとんどのリン酸の脱着が完了していた．このことから，吸着したリン酸を容易に濃縮した状態で回収することが期待できる．

【背景・目的】アンチモン(Sb)は，半導体材料や難燃助剤など産業に広く用いられている一方で，生体への毒性を有するレアメタルである．その毒性から，日本では水質環境基準の要監視項目として指針値が 20 μg/L に設定されていることから，廃水からの除去技術の確立が求められている．本研究では，生物学的Sb 除去技術の確立を目指して，Sb 除去が可能な微生物集積系を構築し，その特性を評価した．
【実験方法・結果】十三干潟(大阪)から採取した底質土壌 1 g-wet を，1 mM のK[Sb(OH)6]，2 mM の MgSO4・7H2O，5 mM の乳酸を含む無機塩培地に加え，嫌気条件下で回転振盪培養(28 ゜ C，120 rpm)した．橙色の沈殿物(Sb2S3)の生成を確認したあと，新たな無機塩培地へ 1%容量の継代を繰り返すことで Sb 除去
微生物集積系を構築した．Terminal fragment length polymorphism (T-RFLP)解析により，112 バッチ目以降，集積系に含まれる微生物群集の組成が安定したことが確認された．SO42-の有無による集積系の挙動の変化を分析すると，SO42-の存
在下ではほぼ全ての Sb を還元・除去できたが，SO42-を添加しなかった実験系
では Sb 還元・除去量が著しく低下した．また，16S rRNA 遺伝子の V4 領域を標的としたアンプリコンシーケンス解析の結果から，集積系内では硫酸還元菌
である Desulfovibrionaceae 科細菌が最も優占しており(75%)，また，Sb と同族元素の As の酸化・還元能が確認されている Sedimentibacter 属細菌も確認された(5%)．これらより，本集積系では，硫酸還元菌によって生成された S2-による
Sb(V)の化学的還元と，Sb(V)還元細菌による生物学的還元の 2 種の還元機構がSb2S3 生成に関わっているものと推測された．

Study on phosphorus recycling from anaerobic digested liquor byhydrotalcite

Charactarization of enrichment culture removing antimony from waterphase.

○Takaki Shimode1, Takuya Kawanisi1,2, noboru Takiguchi1,2(1Grad. Sch. Nat. Sci. Technol., Kanazawa Univ., 2Coll. Sci. Eng., Kanazawa Univ.)

Key words

3Na03○Hisaaki Hosokawa1, Kentaro Mori1, Masashi Kuroda1, Satoshi Souda2,
Daisuke Inoue1, Michihiko Ike1
(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2Dept. Sci. Eng., Ritsumeikan Univ.)

phosphate, wastewater, adsorption

Key words

antimony, enrichment culture, sulfate reduction, wastewater treatment

Pseudomonas stutzeri NT-I による水相からのテルルの揮

3Na05

セレン酸還元細菌内包ポリマーカプセルによる新たなセ
レン廃水の浄化と資源化

発化除去と回収

○黒田 真史, 畠中 玄彦, 井上 大介, 池 道彦
（阪工大院・工）kuroda@see.eng.osaka-u.ac.jp○平谷 朋之 1, 小竹 史哉 1, 永 直文 1, 大塚 治 2, 山下 光雄 1,2（1芝工大院・理工・応化, 2芝工大・SIT総研）
mc18028@shibaura-it.ac.jp【背景・目的】原子番号 52 の元素であるテルル(Te)は，太陽電池等に用いられる半導体の原料となるレアメタルであり，近年の需要の高まりから将来的な資源枯渇が懸念されている．一方，Te の水相での主な形態である亜テルル酸（Te(IV)）は毒性が高く，Te の産業利用に伴う水環境汚染の発生が危惧されている．本研究では，テルルの同族元素であるセレンを揮発性のセレン化メチル化合物に変換する極めて活発なセレン代謝活性を持つ細菌である Pseudomonas
stutzeri NT-I を用い，水相からの Te の除去と回収を同時に達成しうる生物学的プロセスの構築を目指し，NT-I 株の Te 揮発化特性を評価した．
【結果・考察】1 L 容ジャーファーメンターに 0.1 mM の Te (IV)を含む TSB 培地を添加し，好気的に培養した．排気をガス洗浄瓶中の濃硝酸トラップに通気し，Te の回収を試みた．培養開始 4 時間後より水相の Te 量が急激に減少し，14 時
間でほぼ全量が水相から消失した．同時に，固相および濃硝酸トラップ中の Te量が増加した．また，固相中の Te は培養開始 24 時間以降に減少し始め，168
時間にかけてほぼ全量が消失した．168 時間の培養によって，初期添加量の 57%に相当する Te が濃硝酸中に回収された．これまでに報告されている Te 揮発化
微生物の中で最も優れたものでも初期添加量の数%が揮発するのみであり，本研究で見いだされた NT-I 株の Te 揮発化能力は極めて優れたものであると言える．

[背景と目的] セレンは水中ではセレン酸や亜セレン酸の形状で毒性を示すこと
から排水基準を満たねばならない．そこで新たにセレン酸を無害な元素態セレンに還元できる Pseudomonas stutzeriNT-I 株によるセレン汚染廃水浄化技術を開発してきた．実用化を目指して微生物の反応効率や強度の安定化を目的として固定化生体触媒を試行している．固定化用ポリマーとしては，アルギン酸塩を用いたが，強度が弱く，排水中に分解されてしまった．そこで，本研究では二重構造のヒドロゲルカプセルを作製し，強度問題の解決を試みた．内層に NT-I
株と培地を封じ込めたアルギン酸ビーズを作製し，外層に単一のポリアクリル
アミドからなる二層構造カプセルを複数種合成した．NT-I 株を固定化した多様な合成ポリマーカプセルを用いてセレン模擬廃水の浄化を検討した．
[実験方法] NT-I 株含有 TSB 培養液に sodium alginate(SA)を加え SA 溶液を調製後，CaCl2 水溶液中に滴下した．生成した NT-I 含有担体を Alginate beads（AB）とした．次に，アクリルアミドモノマーのうちのいずれか 1 種類, 架橋剤, 光ラ
ジカル開始剤, SA, AB, TSB 培地を混合し，CaCl2 水溶液中に滴下した．その後，
UV 光を室温で照射し，合成終了した．合成した担体をすべて Polyacrylamide
capsule (PAC)と称した．これをセレン模擬廃水に加えセレン濃度を ICP-AES を用いて定量化した．
[ 結 果 ] [3-acrylamidopropyl] trimethylammonium chloride (APTAC)-PAC, N-2hydroxyethylacrylamide (HEAA)-PAC をセレン模擬廃水に添加したところ，一週間後それぞれ約 75wt％,97wt％セレン濃度が減少した．HEAA-PAC の外側に全還元量の 73wt%の元素態セレンが確認され，APTAC-PAC の外側に元素態セレンが確認されなかった．以上より APTAC-PAC はセレン酸廃水処理への新たな浄化・資源化方法として期待される．

Removal and recovery of tellurium from water phase throughbiovolatilazation by Pseudomonas stutzeri NT-I

Purification and recycling of selenium waste using polyacrylamide capsulecontaining selenate-reducing bacterium○Masashi Kuroda, Haruhiko Hatanaka, Daisuke Inoue, Michihiko Ike(Grad. Sch. Eng., Osaka Inst. Technol.)Key words

Pseudomonas stutzeri, tellurium, biovolatilization, resource recovery○Tomoyuki Hiratani1, Fumiya Kotake1, Naofumi Naga1, Osamu Otsuka2,
Mitsuo Yamashita1,2(1Grad. Sch. Eng. Sci. Shibaura Inst. Technol., 2R.O.A.E. Shibaura Inst. Technol)

Key words
selenium, Pseudomonas stutzeri NT-I, immobilized carrier,polyacrylamide capsule

287

3Na06

バイオレメディエーションによるセレン汚染土壌浄化○山下 光雄 1, 小竹 史哉 1, 大塚 治 2, 西里 亮 3, 奥野 稔 3,
武藤 宏行 3（1芝浦工大院・理工・応化, 2芝浦工大・総研, 3ケー・エフ・シー）
yamashi@sic.shibaura-it.ac.jp

3Na08

淡水域におけるバイオフィルム形成を介した生分解性プ
ラスチック分解機構の解析○大井 太士郎 1, 佐藤 俊輔 2, 諸星 知広 1
（1宇都宮大院・工, 2(株)カネカ）
morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp[目的] セレン（Se）は高濃度で局所的に産出する鉱物が存在せず，低濃度で自然中に広く分布している．土壌中での Se は毒性の高い可溶性のセレン酸や亜セ
レン酸として混在しているので，Se は排水基準値や土壌汚染対策法に基づき，環境省告示第 18 号により土壌溶出量 0.01 mg/L，環境省告示第 19 号（含有量基準）により 150mg/kg 以下の厳しい基準が定められている．改正土壌汚染対策
法により，自然由来の Se 汚染であっても浄化処理が必要である．亜セレン酸汚染土壌は鉄系薬剤を混合して不溶化処理が行われているが，セレン酸は鉄系薬剤との反応性が低いため，不溶化処理による浄化は困難である．そこで新たなセレン酸汚染浄化が望まれている．セレン酸化物を不溶性の元素態セレンに還元する Pseudomonas stutzeri NT-I 株が単離された．本研究では NT-I 株を利用したセレン酸汚染土壌での環境基準値達成を目指し，新たな不溶化処理方法の開発を目的とした．
[実験方法] 一般的な土壌にセレン酸または亜セレン酸を添加した模擬汚染土壌を作製した．模擬汚染土壌に滅菌済みの培地もしくは OD600=1.0 に調製した
NT-I 株培養液を添加し，適温で静置培養した．NT-I 株培養液添加 0 時間目から
適宜土壌の一部をサンプリングした．サンプリング土を 50℃の恒温器にて 2 時間乾燥した．乾燥した土壌を定法通りに検液を調製した．検液中の可溶性全 Se
濃度を ICP-AES にて定量分析した．
[結果] NT-I 株培養液を添加した模擬セレン酸，亜セレン酸汚染土壌の各々の初期値 159 mg/kgと 165 mg/kg は 24h 後 70 mg/kg と 95 mg/kg になった．NT-I 株培養液を添加することで土壌含有量基準値を達成した．模擬セレン酸汚染土壌に NT-I 株を添加した場合，Se 土壌溶出量は 72h 後で 0.01 mg/L 以下になった．以上の結果から
NT-I 株による汚染土壌中のセレンの浄化に有効であることが示された．

【目的】水圏に廃棄され，微細化したマイクロプラスチックが大きな環境問題となっている．本問題の解決策として，生分解性プラスチックの使用が注目を集めているが，本研究グループでは，ある種の生分解性プラスチックが，海水中でバイオフィルム形成を伴いながら分解されることを報告している．本研究では，淡水サンプル中における生分解性プラスチック分解挙動を観察するとともに，分解に関わる細菌の単離，同定を行うことを目的とした．
【方法】5 カ所の淡水域（鬼怒川，霞ケ浦，北浦，河口湖，山中湖）からサンプ
リングした水に 6 種類の生分解性プラスチックフィルムを浸漬してインキュベー
トし，バイオフィルムを形成させた．最もバイオフィルム形成量が多かったポ
リ 3－ヒドロキシブチレート-co-3-ヒドロキシヘキサノエート（PHBH）については，バイオフィルムからランダムに細菌を単離し，PHBH パウダーを混合した R2A 寒天培地にコロニーを接種し，周辺に透明帯を形成したコロニーを PHBH
分解細菌として単離した．PHBH 分解細菌の 16S rRNA 遺伝子を PCR により増幅して塩基配列を決定し，菌種の同定を行った．
【結果及び考察】6 種類の生分解性プラスチックを淡水域から採取したサンプルに浸漬したところ，特に PHBH を浸漬した場合にバイオフィルム形成量が多い
ことから，PHBH 分解活性を有する菌株のスクリーニングを行ったところ，
PHBH 混合プレート上で透明帯を形成する菌株を多数単離することに成功した．
コロニー形状や活性の強さを指標に各サンプルからそれぞれ 5～6 株を選択し，
16S rRNA 塩基配列を基に系統樹を作成したところ，全 28 株が Burkholderia 目細菌であり，さらに 5 株が Acidovorax 属細菌であり，16S rRNA 塩基配列の相同性を指標に 3 つのグループに分類可能であることが明らかとなった．

Selenium contaminated soil treatment through bioremediation

Biofilm formation and degradation of commercially available biodegradable
plastic films by bacterial consortium in the freshwater environments○Mitsuo Yamashita1, Fumiya Kotake1, Osamu Otsuka2, Ryo Nishizato3,
Minoru Okuno3, Hiroyuki Mutou3(1Grad. Sch. Eng.Sci. Shibaura Inst. Technol, 2R.O.A.E. Shibaura Inst. Technol.,
3
KFC Ltd.)○Taishiro Oi1, Shunsuke Sato2, Tomohiro Morohoshi1(1Grad. Sch. Eng., Utsunomiya Univ., 2Kaneka Corp.)

Key words

selenium, bioremediation, biomineralization

Key words

biodegradable plastic, biofilm, degradation, PHA

3Na07

Visualization of metabolites in Pseudomonas putida
biofilms using imaging mass spectrometry

3Na09

工場冷却水由来 Sphingopyxis 属細菌によるアシル化ホ
モセリンラクトン分解機構の解析○Pitchapa Rattanaburi, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
sshimma@bio.eng.osaka-u.ac.jp○佐藤 新菜 1, 上村 哉生樹 1, 飯泉 太郎 2, 諸星 知広 1
（1宇都宮大・工, 2栗田工業(株)）morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp

Biofilms are multicellular microbial communities controlled by changes ofheterogeneous cell-to-cell signaling metabolites known in the event of quorum sensing.
Understanding the heterogeneity of quorum sensing metabolites in biofilms isimportant as many infections caused by biofilms arising from pathogens. Generally,
the presence of quorum sensing metabolites is indicated by phenotypic assays.
However, imaging mass spectrometry (IMS) now allows researchers to directly
visualize the existence of metabolites from microbial biofilms. In this study, matrixassisted laser desorption/ionization (MALDI)-IMS was conducted for observation of
the metabolites distribution in Pseudomonas putida biofilms. We present the
optimization of cell cultivation and biofilm formation to process the biofilms for agarbased microbial MALDI-IMS. Using sublimation with 2,5-dihydroxybenzoic acidsolution for matrix application of freeze dried samples, the distributions of acyl
homoserine lactones quorum sensing metabolites were firstly visualized from P. putida
biofilms. This approach provides a homogeneous, relatively dry coating on hydrated
samples, and is easily adapted for imaging a range of agar-based biofilms.

【目的】工場冷却水システムで発生するスライムは，熱交換器や配管の劣化，熱効率の低下を引き起こすなど，様々な問題の原因となっている．スライム形成には微生物によるバイオフィルム形成が関与しているが，特にグラム陰性細菌のバイオフィルム形成においては，アシル化ホモセリンラクトン（AHL）をシ
グナル物質とした Quorum Sensing が関与していることが明らかになっている．
AHL の分解により Quorum Sensing を阻害することで，バイオフィルムの形成が抑制可能であることから，冷却水中に生息する細菌による AHL 分解が，ス
ライム発生抑制技術に有効である可能性が考えられる．本研究では，工場冷却水から細菌を単離するとともに，これらの細菌の中から AHL 分解細菌をスク
リーニングし，AHL 分解機構を遺伝子レベルで解析する事を目的とした．
【方法および結果】工場冷却水から，高い AHL 分解活性を有する菌株をスク
リーニングしたところ，EG6 及び FD7 と命名した菌株を取得することに成功
し，16S rRNA の相同性から，両株共に Sphingopyxis 属細菌であることが明らかとなった．EG6 株及び FD7 株は，様々な構造の AHL を短時間で分解し，培養
上清中にも高い酵素活性が存在していたことから，菌体外酵素として分泌していることが明らかとなった．次に，これらの菌株の完全ゲノムを決定したところ，既知の AHL 分解遺伝子と相同性を示す遺伝子（qsdS）が存在していたことから，クローニングして AHL 分解活性を調べたところ，高い AHL 分解活性を有することが明らかとなった．さらに，QsdS を精製し，様々な温度条件下における比活性を調べたところ，至適温度は 60℃付近と比較的高く，様々な温度で10 分間プレインキュベートしても 50℃付近までは活性が大きく減少しなかったことから，一般的な AHL 分解酵素と比較して熱安定性も高いことが明らかとなった．

Visualization of metabolites in Pseudomonas putida biofilms using imaging
mass spectrometry

Identification and characterization of a novel N-acylhomoserine lactonasegene in Sphingopyxis sp. isolated from industrial cooling water systems

Key words
imaging mass spectrometry, quorum sensing metabolites, Pseudomonas
putida, biofilms

Key words
system○Pitchapa Rattanaburi, Eiichiro Fukusaki, Shuichi Shimma(Dept. Biotechnol., Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)○Niina Sato1, Yaoki Kamimura1, Taro Iizumi2, Tomohiro Morohoshi1(1Fac. Eng., Utsunomiya Univ., 2Kurita Water Industries Ltd.)quorum sensing, acyl homoserine lactone, Sphingopyxis, cooling water

288

3Na10

Sphingopyxis 属細菌おけるアシル化ホモセリンラクトン
分解遺伝子の多様性解析

3Oa02○上村 哉生樹 1, 佐藤 新菜 1, 飯泉 太郎 2, 諸星 知広 1
（1宇都宮大院・工, 2栗田工業(株)）morohosi@cc.utsunomiya-u.ac.jp

受容体モチーフライブラリのスクリーニングによる効率
的な細胞増殖誘導の実現○梅根 輝来人, 河原 正浩（東大院・工）kawahara@chembio.t.u-tokyo.ac.jp【目的】多くのグラム陰性細菌において，配管の目詰まりやスライム形成の原因となるバイオフィルム形成機構には，アシル化ホモセリンラクトン（AHL）を
シグナル物質とした Quorum Sensing が関与していることが明らかになっている．AHL を人為的に分解して Quorum Sensing を抑制する技術は，バイオフィ
ルム形成の抑制技術として注目されている．本研究グループでは，工場冷却水から単離した Sphingopyxis 属細菌が高い AHL 分解活性を有することを明らかにし，新規 AHL 分解遺伝子（qsdS）をクローニングすることに成功している．本
研究では，様々な保存機関から入手した Sphingopyxis 属基準株を対象とし，AHL
分解活性を調査するとともに，qsdS 遺伝子の分布を明らかにすることを目的とした．
【方法及び結果】工場冷却水から単離した Sphingopyxis sp. EG6 株及び FD7 株，
DSM 及び NBRC から入手した 8 株を用い，AHL 分解活性を調査したところ，
EG6 株，FD7 株，S. alaskensis DSM 13593 株及び S. bauzanensis DSM 22271 株が高い AHL 分解活性を示した．次に，各菌株の染色体から qsdS の存在を調べた
ところ，高い AHL 分解活性を有する 4 株には qsdS 遺伝子が存在し，qsdS 遺伝子の周辺にはトランスポゾン様遺伝子は存在しなかった．さらに，他の AHL
分解活性がほとんど存在しない株は qsdS 遺伝子を有しないことが明らかとなり，一部の Sphingopyxis 属細菌の高い AHL 分解活性は，qsdS 遺伝子の存在が主な要因である可能性が示唆された．

再生医療や細胞治療では，目的の細胞を生体外で人為的に増殖・分化させる必要がある．このための手法の一つとして，サイトカインや足場材料などの開発が挙げられる．これらは受容体を介したシグナル伝達機構を制御する手法であり，受容体を活性化させるためのリガンドを開発するアプローチであるが，多くの細胞種において高い運命誘導効率を実現することが課題である．これに対し我々は，シグナル伝達を誘導する受容体を人工的に作製し，シグナル伝達のパターンや強度を変えることで，従来のように天然型の受容体に依存した系では無し得なかった高効率な細胞運命誘導を実現することを目的としている．
今回着目したのは，受容体が細胞内のシグナル伝達分子と相互作用する部位であるチロシンモチーフである．チロシンモチーフは受容体の活性化によりリン酸化を受け，リン酸化チロシンを含む周辺のアミノ酸残基まで含めてその相互作用に関与することが知られている．我々はこれまでに，天然受容体由来のモチーフを人為的に配置することで様々なシグナル伝達のパターンを得ることに成功しているが，より直接的に目的の細胞運命を効率的に誘導できる受容体を得るため，新たにモチーフスクリーニングという手法を採った．具体的には，モチーフと各シグナル伝達分子の相互作用がモチーフ配列依存的であることに着目し，モチーフ配列をランダム化したライブラリを作製し，シグナル伝達分子の活性化パターンを網羅的にカバーすることで，細胞の増殖を効率的に誘導できるモチーフをスクリーニングした．このように，モチーフに着目したフェノタイプスクリーニングはこれまでに無い系である．
これまでの実験により，Ba/F3 細胞の増殖を誘導するモチーフのスクリーニン
グに成功している．本発表では適応する細胞を増やし，系の応用性を拡張した試みに関して報告する．

Diversity and characterization of N-acylhomoserine lactonase gene from
Sphingopyxis sp.

Realization of efficient cell proliferation by screening of motif library○Yaoki Kamimura1, Niina Sato1, Taro Iizumi2, Tomohiro Morohoshi1(1Grad. Sch. Eng., Utsunomiya Univ., 2Kurita Water Industries Ltd.)○Kirato Umene, Masahiro Kawahara(Grad. Sch. Eng., Univ. Tokyo)

Key words

quorum sensing, acyl homoserine lactone, Sphingopyxis, lactonase

Key words

signal transduction, tyrosine phosphorylation, screening, proliferation

3Oa01

CRISPR/Cas9 システムによる eGFP ノックインニワト
リの作製

3Oa03

時計遺伝子 Per2 発現の再振動とグルコース添加条件との関係
深浦 恵梨 1, ○藤原 政司 1, 西出 真也 2, 本間 さと 2, 本間 研一 2,
高木 睦 1（1北大院・工, 2北大院・医）takagi-m@eng.hokudai.ac.jp

萩原 遥太 1, 奥嵜 雄也 1, 飯島 信司 1,2, ○金岡 英徳 1, 西島 謙一 1（1名大院・工, 2現愛工大・工・応化）
kaneoka@chembio.nagoya-u.ac.jp【背景と目的】近年の目覚ましいバイオ医薬品市場の拡大により，治療用抗体をはじめとしたタンパク質性医薬品の需要が増加している．それに伴い，有用タンパク質を安価に大量に生産できる技術の開発が必要とされている．我々はその需要に応えるため，トランスジェニックニワトリの卵中に有用タンパク質を生産させ，生きたバイオリアクターとして利用する技術開発を進めてきた．本発表ではトランスジェニック後代取得効率を向上させるため，従来のウイルスベクターによる遺伝子導入に代わり，ニワトリ始原生殖細胞（PGC: Primordial Germ Cell）へ
CRISPR/Cas9 によるゲノム編集を行った後，レシピエント胚へと移植する方法の検討を行った．
【方法・結果】
我々が樹立したニワトリ PGC 株に CRISPR/Cas9 システムを用いて，eGFP 遺伝
子のノックインを行なった．PGC で強く発現している遺伝子座をターゲットとしてノックインを行なった結果，内在性のプロモーター活性により eGFP を安定的に発現するニワトリ PGC 株を樹立に成功した．この PGC 株をレシピエント胚に移植し，5.5 日胚で解析を行なった結果，最大で 84%の効率で移植した
PGC がレシピエントの生殖腺へ定着していた．そこで移植を行なったレシピエ
ント胚を孵化させ，生殖細胞キメラニワトリを作製した．性成熟後，これらのニワトリの精子を解析したところ，最大で約 0.6 コピーの導入遺伝子が確認できた．このキメラニワトリの精子を人工授精に用いて交配を行なった結果，90
羽中 27 羽（30%）という高効率でトランスジェニックニワトリの取得に成功した．これらの結果より，我々の樹立したニワトリ PGC 株は生殖細胞への分化が可能であり，この細胞を用いて様々な遺伝子改変ニワトリを作製することが可能になると考えられる．

【目的】約 24 時間周期の時計遺伝子の発現は細胞分裂やエネルギー代謝関連遺伝子の発現に関わっているとの報告がある．一方，動物細胞の培養中にグルコースを添加すると，時計遺伝子発現の再振動が細胞集団内で観察される．すなわ
ち，グルコース添加操作による時計遺伝子発現の調節を通して，培養細胞集団の機能発現を制御することが期待された．そこで，その端緒として時計遺伝子
Per2 遺伝子の発現再振動とグルコース添加条件との関係を調べた．

Generating eGFP knock-in chicken using CRISPR/Cas9-mediated genome
engineering

Re-oscillation of clock gene Per2 expression by glucose addition

Yota Hagihara1, Yuya Okuzaki1, Shinji Iijima1,2, ○Hidenori Kaneoka1,
Ken-ichi Nishijima1(1Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ., 2Fuculty Eng., Aichi Inst. Tech.)

Key words

CRISPR/Cas9, transgenic chicken, genome engineering【材料と方法】Per2 プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたラット間葉系幹細胞（MSC）様細胞をディッシュ内で増殖させた後，ルシ
フェリン及び 10% FCS 含有 DMEM-LG 培地（基本グルコース濃度 0.9 g/l）に培地交換し，すぐにルシフェラーゼ発光強度測定を開始した．発光振動が減衰する測定開始 5 日後に所定濃度のグルコースを培養液に添加し，発光強度の再振動を観測した．測定された振動曲線のグルコース添加前の振幅 l1 に対する添加後の振幅 l2 の比（l2/l1）を振幅増幅率 A2/1 として再振動の指標とした．
【結果と考察 】測定開始 5 日後に異なる添加濃度（終濃度 0.012～0.9 g/l）でグ
ルコースを添加した結果，添加グルコース濃度に比例して，振幅増幅率 A2/1 が大きくなる傾向にあった．次に，測定開始 5 日後の残存グルコース濃度が異なる（0.006～0.77 g/l）ようにしてからグルコース（0.9 g/l）を添加した結果，残存グルコース濃度が低い方が，振幅増幅率 A2/1 が大きくなる傾向にあった．以上から，グルコース濃度の操作により時計遺伝子 Per2 の発現再振動を調節できる可能性が示された．
Eri Fukaura1, ○Masashi Fujiwara1, Shin-ya Nishide2, Sato Honma2,
Ken-ichi Honma2, Mutsumi Takagi1(1Grad. Sch. Eng., Hokkaido Univ., 2Grad. Sch. Med., Hokkaido Univ.)

Key words

circadian oscillation, clock gene, luciferase, glucose

289

3Oa04

長期的に安定な組換えタンパク質高生産株の構築に向けたＣＨＯ細胞における染色体多様性の解析

3Oa07

レトロトランスポゾンベクターにおけるレトロ転位のための構成要素の解析○村上 舞 1, 高橋 真美加 2, 河邉 佳典 2, 井藤 彰 2, 上平 正道 1,2（1九大院・シス生科, 2九大院・工）kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp○北 一真 1, 山野 範子 1,2, 古賀 雄一 1, 大政 健史 1,2（1阪大院・工, 2MAB組合）
omasa@bio.eng.osaka-u.ac.jp[背景・目的]バイオ医薬品生産で汎用される CHO 細胞は，染色体に不安定性をもつことが知られており，その性質が生産性に影響する．安定な抗体高生産 CHO 細胞株を構築するためには，ターゲットとなる適切な染色体の選択と効率的な遺伝子導入が重要である．本研究では染色体数の異なる CHO 細胞株の染色体多様性解析を行い，より高い比生産速度を示した通常より多い染色体数を持つ細胞において，安定した染色体や，抗体高発現に繋がる染色体の候補を特定することを目的とした．
[実験材料・方法]
核型解析には，単離した染色体数が 20 本，及び 39 本の CHO-DG44 細胞，及びそれらを宿主としたヒト化 IgG3 抗体生産細胞を用いた．各細胞の metaphase の細胞を回収し，カルノア液で細胞を固定後，mFISH 法による染色を行い染色体画像を得た．さらに，単離した染色体数が 20 本，及び 39 本の CHO-DG44 細胞を宿主とし，ヒト化 IgG1 抗体を生産する細胞を構築した．
[実験結果・考察]
各細胞約 50 細胞の核型画像から各細胞の 1～10 番及び X 染色体の平均本数と変動係数を算出した結果，通常より染色体数が多い IgG3 抗体高生産細胞にて，染色体数に関して 2 番，3 番，5～7 番，10 番染色体の本数が特に多いことが分かった．更に，染色体数の安定性に関して 1～6 番，8 番染色体の変動係数が平均よりも小さな値を示し，比較的本数が安定していることが分かった．両結果
から，2 番，3 番，5 番，6 番染色体のような安定して本数の多い染色体が，安定な抗体高生産株の構築に繋がる効率的な遺伝子導入のターゲット候補になるのではないかと考えた．また，染色体数の多い細胞を宿主として IgG1 生産細胞を構築したところ，IgG3 の場合と同様，IgG1 においても高い比生産速度を示した．今後，IgG1 生産細胞に対しても染色体多様性解析を行う予定である．

【背景と目的】我々はこれまでに，レトロトランスポゾン LINE-1 の転位メカニズムに着目し，目的遺伝子の増幅・導入が制御可能なレトロトランスポゾンベ
クターの開発を行ってきた．本発表では，レトロトランスポゾンベクターにおけるレトロ転位に必要な遺伝子構成要素の調査を目的とした．
【方法と結果】ネオマイシン耐性遺伝子 (Neo) 発現ユニットをレトロトランスポ
ゾンの転写方向と逆方向に配置した．scFv-Fc 遺伝子は，CMV プロモーターで発現制御可能なユニットとした．これらの遺伝子を LINE-1 の 3’UTR 内に挿入
し，レトロトランスポゾンベクター pCEP4/mL12-sc を作製した．ORF2 欠損型
レトロトランスポゾンベクター pCEP4/mL1-sc の ORF1 に変異をいれた pCEP4/
mL1M-sc と，ORF1 および ORF2 を欠損させた pCEP4/mL-sc を作製し，レトロ
転位能を評価した．レトロ転位能は，Neo 内部にイントロンをレトロトランス
ポゾンと同じ転写方向で挿入することで，レトロ転位した細胞を薬剤 G418 で選抜できるシステムを用いた．pCEP4/mL1M-sc または pCEP4/mL-sc と対応する
ORF 発現ベクターを CHO 細胞に一過性導入し，薬剤選抜した．その結果，G418
耐性コロニーが出現しなかったことから，レトロ転位にはレトロトランスポゾ
ンベクター内部に完全な ORF1 の存在が必要であることがわかった．一方，
pCEP4/mL12-sc ベクターからポリ A 領域を削除した pCEP4/mL12-scA-を用いた
場合，レトロ転位効率が上昇した．出現したコロニーをクローン化し，ゲノム
PCR 解析したところ，レトロ転位を示すゲノム構造であるとともに，抗体生産能を有していることがわかった．

Analysis of chromosomal diversity in CHO cell lines for establishment of
stable high-productive cell line in the long term recombinant therapeutics
production

Invesitgation of vector design required for retrotransposition in
retrotransposon vectors

Key words
Chinese hamuster ovary cells, chromosome aneuproidy, multicolor
fluorescent in situ hybridisation method

Key words

retrotransposons, gene transfer, CHO cells, LINE-1

3Oa05

3Oa08

M2 型腫瘍随伴マクロファージ標的化バイオナノカプセ
ルの開発○Kazuma Kita1, Noriko Yamano1,2, Yuichi Koga1, Takeshi Omasa1,2(1Grad. Sch. Eng., Osaka Univ., 2MAB)

ミニサークル DNA ベクターを用いた CHO 細胞への逐
次遺伝子組込み○Mai Murakami1, Mamika Takahashi2, Yoshinori Kawabe2, Akira Ito2,
Masamichi Kamihira1,2(1Grad. Sch. Syst. Life Sci., Kyushu Univ., 2Fac. Eng., Kyushu Univ.)○河邉 佳典 1,2, 汪 雪 1, 羽田 毅 1, 井藤 彰 1, 上平 正道 1,2（1九大院・工, 2次世代バイオ医薬品製造技術研究組合）
kamihira@chem-eng.kyushu-u.ac.jp○李 昊 1,2, 曽宮 正晴 1,2, 黒田 俊一 1,2（1阪大・産研, 2阪大院・生命機能）
haoli44@sanken.osaka-u.ac.jp【背景と目的】我々はこれまでにバクテリア由来のバックボーン配列を削除した
ミニサークル（MC）ベクターをドナーベクターとして用いることで，Cre-loxPシステムをベースとした遺伝子組込み方法で，目的の抗体遺伝子を特定染色体に組み込んだ生産細胞を効率的に取得することに成功している．本発表では，
MC ベクターを用いて逐次遺伝子組込みした際の目的細胞の取得効率および抗体生産性を評価した．
【方法と結果】目的遺伝子である scFv-Fc 発現ユニットを，対応する変異 loxP
で挟んだドナーベクター（R2）を作製した．R2 内の目的遺伝子部分を MC 作
製用プラスミドに組み入れた後，専用の大腸菌株へ形質転換し，R2 を MC 化した（mcR2）．また scFv-Fc 発現ユニットと GFP 遺伝子が対応する変異 loxP で挟まれた R3-Green プラスミドを作製した．ファウンダー細胞として DsRed と変
異 loxP があらかじめゲノムに組込まれたファウンダー細胞（CHO/R1）を用い，
R2 または mcR2 を R3-Green および Cre 発現ベクターとともに遺伝子導入した．
FACS にて解析したところ，mcR2 を用いた場合，R2 と比較して 2-3 倍高くなった．GFP ＋細胞を単離後，取得した細胞株のゲノム PCR 解析および抗体生産を確認したところ，mcR2 を用いたときに目的細胞の獲得率が約 2 倍向上した．
定量 PCR で解析したところ期待される遺伝子組込み数を有しており，比生産速度を測定したところ，mcR2 を用いて樹立した細胞でも，同等の生産性を示した．
【謝辞】本研究の一部は，国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の「次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の支援によって行われた．

マクロファージは白血球の一種であり，死細胞や外来異物を貪食し，抗原提示の機能を司る一方，多くの疾患と密接に関係する細胞である．がんにおいては，
腫瘍随伴マクロファージ（tumor-associated macrophage: TAM）が，がん組織周辺の微小環境に多数存在する．TAM は大別して M1 と M2 の二種類があり，M1は抗腫瘍免疫を増強するのに対し，M2 は抗腫瘍免疫を抑制して，がん細胞の増殖や転移に好都合な環境を形成する．このように M2 型 TAM は，がんの進展に関与するため，治療標的として非常に重要な細胞と考えられている．我々が開発したバイオナノカプセル（BNC）は，B 型肝炎ウイルスの外皮 L タンパ
ク質を出芽酵母で発現することにより得られる直径約 30 nm の中空ナノ粒子である（Yamada ら，Nat. Biotech. 2003）．これまでに，BNC の表面にプロテイン
G 由来の抗体 Fc 結合ドメインとプロテイン L 由来の抗体 Fab 結合ドメインのタンデム分子を提示させた GL-BNC や GL-BNC 融合リポソーム（GL-virosome）
が，抗体の存在下で凝集し，ファゴサイトーシス経路によってマクロファージに積極的に取り込まれることを見出し，マクロファージ標的化ドラッグデリバ
リーシステム（DDS）として有望であることを示した（Li ら，Acta. Biomater.
2018）．本研究では TAM モデルとしてマウスマクロファージ RAW264.7 をヒト上皮がん細胞 A431 と共培養し，抗体を提示させた GL-BNC の細胞内取り込み量を測定した．その結果，RAW264.7 細胞は A431 細胞と比較して 15 倍以上のGL-BNC を取り込むことが明らかとなった．また，ヒト単球細胞株 THP-1 をM1 および M2 様細胞へ誘導し，それぞれの抗体提示型 GL-BNC 取り込み量を測定したところ，主に M2 型マクロファージに取り込まれていた．以上から，
抗体提示型 GL-BNC は M2 型 TAM を選択的に標的可能な DDS ナノキャリアであることが示唆された．

Accumulative targeted transgene integration into CHO cell genome using
minicircle DNA vectors

Targeting of M2-type tumor-associated macrophages by antibody-displaying
bio-nanocapsule○Yoshinori Kawabe1,2, Xue Wang1, Takeshi Hada1, Akira Ito1,
Masamichi Kamihira1,2(1Fac. Eng., Kyushu Univ., 2MAB)

Key words
Cre-loxP

Minicircle DNA vectors, Targeted transgene integration, CHO cells,○Hao Li1,2, Masaharu Somiya1,2, Shun'ichi Kuroda1,2(1Inst. Sci. Ind. Res., Osaka Univ., 2Grad. Sch. Frontier Biosci., Osaka Univ.)

Key words
nanocapsuledrug delivery system, antibody, tumor-associated-macrophage, bio-

290

3Oa09

網羅的匂い分子解析のリアルタイム定量化を目指したヒト嗅覚受容体発現細胞の樹立○中村 実世 1, 立松 健司 1, 山﨑 智子 2, 黒田 俊一 1,2（1阪大産研, 2香味醗酵）
skuroda@sanken.osaka-u.ac.jp【背景】哺乳動物は数十万種類の匂い分子を嗅ぎ分ける能力を有するが，嗅覚受容体（OR）はヒトで約 400 種類と限られている．匂い分子 1 種類が複数の ORを異なる強度で活性化し，その匂い情報は 1 次嗅覚中枢である嗅球を経て，2
次神経，3 次神経を経て大脳皮質内前頭皮質嗅覚野へと伝播され，その活性化パターン（OR レパートリー）により匂い分子を識別すると考えられている．
一方，特定の匂い分子に対する OR レパートリーの網羅的解析は，近年，我々がマウス嗅神経細胞で全自動 1 細胞解析単離装置により可能にしたが（鈴木ら，Sci. Rep. 2016），ヒト嗅神経細胞の取得が困難であるためヒト OR レパートリーの網羅的解析は依然困難である．他方，ヒト OR シグナル伝達系を培養細胞で再構成する試みは多数あるが，OR 機能の完全な再現が達成されておらず，またリアルタイム解析に不向きなルシフェラーゼアッセイに依存することが多い．
【目的】網羅的匂い分子解析をリアルタイムかつ定量的に行うのに適したヒト
OR 発現細胞株の樹立を目指した．
【方法と結果】哺乳類 OR は匂い分子に結合すると，G タンパク質 Gαolf を介してアデニレートシクラーゼを活性化して細胞内 cAMP 濃度を上昇させる．次に，環状ヌクレオチド感受性チャネル（CNG）を開口させ，細胞外からの Ca
イオンを流入させる．本研究では，ヒト胎児腎臓由来 293 細胞に CNG を構成するサブユニット群，OR 及び Gαolf の発現を促進するシャペロン群を安定発現させ，各種 Ca イオン指示薬を導入した．そして，Deorphanize 済のヒト OR 群
を用いて，その匂い分子に対する応答性を指標に細胞株の最適化を行ったので報告する．

Establishment of human olfactory receptor-expressing cells forcomprehensive, realtime, and quantitative analysis of odor

○Miyo Nakamura1, Kenji Tatematsu1, Tomoko yamazaki2, Shun’ichi Kuroda1,2(1ISIR, Osaka Univ., 2Komihakko Corp.)

Key words
odorant response, cyclic nucleotide-gated channel, biosensor, highthroughput screening

3Oa10

免疫クリアランスを回避する生体膜由来ドラッグデリバ
リーキャリアの開発○赤嶺 藍 1, 西村 勇哉 2, 荻野 千秋 1, 近藤 昭彦 2
（1神戸大院・工, 2神戸大院・科技イノベ）
ochiaki@port.kobe-u.ac.jp

現在のがん治療では外科的手術や抗癌剤の副作用等によって患者にかかる負担が大きい場合が多い．そこで新たな治療法として，標的のがん組織のみに薬剤を送達するドラッグデリバリーシステム（DDS）の研究が活発に行われている．静脈から投与する DDS キャリアの場合，標的の腫瘍に到達するまでに異物として認識されてしまうと免疫細胞に捕獲されて最終的に排除されてしまう．
そこで，このような免疫クリアランスを回避するキャリアの開発が必要である．
本研究では，異物として認識されない自己細胞由来の微小粒子であるエクソソー
ムに着目した．また，エクソソームを DDS キャリアとして利用するために，細胞標的能力の付与も行った．具体的には，エクソソームが本来持つ細胞認識能
力をがん細胞標的能力に変更するため，多くのがん細胞に発現している
Epidermal Growth Factor Receptor（EGFR）を標的とする single chain Fv（scFv）
をエクソソーム表面に提示することを試みた．つまり，自己細胞由来のエクソ
ソーム膜によって免疫クリアランスを回避し，表層提示した scFv によってがん細胞を標的可能なキャリアとする．実験方法としては，エクソソームの構成タ
ンパク質である LAMP-2B の表層側の遺伝子を anti-EGFR scFv に遺伝子工学的に置換した膜タンパク質を構築した．これを HEK293T 細胞に形質転換し，antiEGFR scFv 提示エクソソームを分泌発現させた．培養上清を回収し Western
blotting を行った結果，目的のバンドが確認されたため，anti-EGFR scFv 提示膜タンパク質の分泌発現が示された．また，NanoSight による粒子径測定によってエクソソームとして粒子構造を形成している様子が観察された．さらに，共焦点レーザー顕微鏡やフローサイトメーターを用いて，標的のがん細胞への結合能力も確認された．

Development of biomembrane-derived drug delivery carrier for immune
escape○Ran Akamine1, Yuya Nishimura2, Chiaki Ogino1, Akihiko Kondo2(1Grad. Sch. Eng, Kobe Univ., 2Grad. Sch. Sci. Technol. Innov., Kobe Univ.)

Key words
Exosomedrug delivery system, antibody, Epidermal Growth Factor Receptor,

291

人名索引

Eurwilaichitr LilyA
Adegoke Oluwasesan
Adhitama Nikko
Adi Deddy Triyono Nugroho

1Lp06
1Gp13
1Fp06,
1Hp01
Adinda Putri Wisman
3Ca07
Aditiawati Pingkan
2Ca05
Ahmadi Hannaneh
1Ip03
Akasaka Naoki
1Ip16
Akashi Takahiro
3Ca07
Akhtar Mahmuda
2Fa02
Aki Tsunehiro
1Kp08
Alfaro Sayes Daniel Alejandro 2Hp05
Amaliyah Rohsari Indah Utami 1Hp05
Amoah Jerome 1Fp02, 2Hp05, 3Fa05
Amza Rezky Lastinov 1Fp03, 1Fp04
Anand Ajeeta
2Np05
Aoki Masahiro
2Op01
Aoyagi Hideki
1Fp18, 2Np05
Aslam Mehwish
1Gp03
Astawan Made
2Ca05
Aziz Amin ABD
2Na07

B
Baek Seong Yeol
Baranwal Priyanka
Batubara Irmanida
Bhatnagar Sharad

2Gp08
2Ja02
S3Kc05
1Fp18

CChampreda Verawat
Chang Te-Sheng
Choi Yong-Keun
Choi Yu Bin
Chowdhury Ankan Dutta
Chuang Derrick

A2Hp01
2Ca07
1Lp13
1Mp12
1Lp06
2Jp03

D
Dahee Seo
3Ha01
Dalmacio Leslie Michelle
S3Kc03Dalsgaard Tage
1Ep12
Dang Tu
2Np06
Deo Vipin Kumar 1Ip08, 1Lp03, 1Lp06
Do Tuan Anh
2Np06
Dolgormaa Bataa
2Hp10
Du Zhi-Qiang
2Ka03
Duong Van Hop
S3Kc04
Dutta Chowdhury Ankan
1Lp02
Dwivany Fenny
2Ca02
Dwivany Fenny Martha
2Ca03

E
Eltigani Sara
Eunjoo Kim

2La03
3Ha01

S3Kc02

F
Fahmida Nasrin
1Lp02
Fanani Much Zaenal
2Lp11
Fathima Artnice Mega
2Jp03
Felicia Irene Saputra
2Ca06
Fujimoto Akari
1Ip07
Fujiwara Ryosuke
1Jp12
Fujiwara Shinsuke
1Ip16
Fujiyama Kazuhito
1Ep13, 1Ep14,
2Hp10, 2Hp11
Fukuda Wakao
1Ip16
Fukui Toshiaki
2Ja04
Fukusaki Eiichiro
2Ca03, 2Ca04,
2Ca05, 2Ca06, 2Jp03, 2Kp08, 2Kp09,
2Op01, 3Ca07, 3Na07
Fukushima Ery Odette 2Lp11, 3Ka02
Furuta Masakazu
2Np06

GGede Suantika
Gim Geun Ho
Goffar Muzajjad Gozal
Gomi Katsuya

2Ca06
S3Da01
1Ip08
3Ca07

H
Hama Shinji
1Fp02, 2Hp05, 3Fa05
Hecht Michael
2Ia03
Heida Naohiko
1Kp18
Hermiati Euis
1Hp01
Herrera Steven
2Ja08
Hiramatsu Rikito
1Ip07
Hirotani Ran
1Kp08
Honda Kazuki
2Np06
Hong Jong Wook
S3Hc01I
Ike Kazunori
Inagaki Kenji
Irifune Tomoya
Ishii Yuri

1Ip07
2Ja08
2Ca04
1Ip16

J
Jaewook Lee
1Lp01
Jang WonJe
1Mp12
Jeon Hyeon Jin
1Op06
Jeon Tae-Joon
S3Bc01Jeong David Wu-Young
1Op06
Jeong Wu-Young
1Lp13, 1Np17
Jo Soyeon
3La08
Juanssilfero Ario Betha 1Fp03, 1Fp04

K
Kabayashi Mayuko

1Ip07

Kadar Adinda Darwati
2Ca05
Kahar Prihardi
1Fp03, 1Fp04,
1Kp04, 3Ha09
Kanao Keita
2Ja02
Kato Tatsuya
1Ip07, 1Ip08
Kato Yasuhiko
1Gp13
Kazuhiro Mizuta
2Fa02
Ke An-Ni
2Ca07
Khin Thandar Myint
1Fp13
Khoris Indra M.
1Lp02, 1Lp03
Kihira Chie
1Fp03
Kim Hyung Joo 1Lp13, 1Np17, 1Op06
Kim Ji Eun
1Lp13, 1Np17, 1Op06
Kim Kwang Jin
1Lp13, 1Np17
Kim Si Wouk
S3Da01
Kim Soyoung
2Gp08
Kim Sung Hee
1Fp01
Kimura Kazuyuki
2Ja02
Kisailus David
2Ja08
Kishida Masao
2Np06
Kojima Yasushi
2Op01
Kondo Akihiko 1Fp02, 1Fp03, 1Fp04,
1Fp06, 1Hp01, 1Jp12,
2Hp05, 3Fa05, 3Ha09
Kong In-Soo
1Mp12
Kusumah Dewi
2Kp06
Kwon-Young Choi
3Ha01

L
Lee Jae Min
Lee Jaewook

1Mp16
1Lp02, 1Lp03,
1Lp04, 1Lp06
Lee Sang Hyun
1Fp01, 1Lp13,
1Np17, 1Op06, 3La08, 3La09
Lee Woo Sung
1Op06
Le Thi Thanh Thu
1Np11
Liao James
2Jp03
Liao James C.
2Kp09
Limtong Savitree2Hp10, 2Hp11
Liu Chi-Hsien
2Fa12
Liu Yi-Xin
2Fa12

M
Maeda Isamu
2Kp06
Matsuura Tomoaki
1Gp13
Meijer Wilfried J. J.
1Gp09
Meslhi Alaaeldin
1Np10
Miguel-Arribas Andres
1Gp09
Minkner Robert
1Ip09
Minoru Maeda
2Fa02
Misaki Ryo
1Ep13, 1Ep14,
2Hp10, 2Hp11
Mukti Yayon Pamula
1Ep13
Mun Ji-Young
2Gp08
Muranaka Toshiya
2Lp11, 3Ka02

292

Murhandarwati Elsa Heridiana

1Ip06

N
Nakajima - Kambe Toshiaki
Nakamura Satoshi
Nakashimada Yutaka
Nasrin Fahmida
Negoro Seiji
Nemoto MichikoNguyen Trinh
Nguyen Kim Nu Nu
Noda Shuhei

1Fp13
2Ja04
1Kp08
1Lp06
2Ja02
2Ja08
2Ha05
S3Kc04
1Jp12

OOdagaki Shin
2Ja02
Ogino Chiaki 1Fp02, 1Fp03, 1Fp04,
1Fp06, 1Hp01, 2Hp05, 3Fa05, 3Ha09
Oh Yujin
1Fp01
Ohashi Takao
1Ep13, 1Ep14,
2Hp10, 2Hp11
Ohyama Kiyoshi
2Lp11
Okamura Yoshiko
1Kp08
Okano Keiichi
2Op01
Okochi Mina
1Ep03
Oluwasesan Adegoke
1Lp01
Orita Izumi
2Ja04
Otsuka Hiromi
1Fp03
Otsuka Mitsuo
1Fp13

PPamella Apriliana
1Mp16
Parijadi Anjaritha Aulia Rizky 2Ca03
Park Enoch Y.
1Ip07, 1Ip09, 1Lp02,
1Lp03, 1Lp04, 1Lp06
Park Hae Dae
1Mp12
Park Sae Rom
3La08
Park Saerom
3La09
Park Y.Enoch
1Ip08
Pedersen Ole
1Ep12Perez Charose Marie Ting
1Kp08
Pham Khanh Dung
1Kp01
Pham Thi Kim Dung
1Np11
Phang Siew Thing
1Jp05
Pontrelli Sammy
2Kp09
Porchetta Alessandro
1Ep08
Pradipta Ambara R.
2Ia04
Prasetya Bambang
1Fp04, 3Ha09
Prihardi Kahar
1Mp16
Puti Wanguyun Aken
1Gp06
Putra Filemon Jalu N
2Kp08
Putri Azalea
2Ma09
Putri Saﬁra Latifa Erlangga
2Ca06
Putri Sastia
2Ca02, 2Ca04,
2Jp03, 2Ka04
Putri Sastia Prama
2Ca03, 2Ca05,
2Ca06, 2Kp08, 2Kp09

Rabemanolontsoa Harifara
Rachmadona Nova
Rattanaburi Pitchapa
Ren Dongni
Ribordy Greg
Ricci Francesco
Risanto Lucky

1Jp05,
2Jp04
1Fp02
3Na07
2Ja08
3Ha03
1Ep08
1Hp01

S
Saito Kazuki
2Lp11
Saka Shiro
1Jp05, 2Jp04
Sakuntala Saijai
2Ja07
Sakurai Sana Subhan Memon 2Kp09
Salpeter Ron
S3Da04
Sasaki Kengo
3Ha09
Sawai Satoru
2Lp11
Seki Hikaru
2Lp11, 3Ka02
Seo Jeong Hyun
S3Gc01
Shai Iris
S3Da04
Shige Yuki
1Ip16
Shim Sok Young
1Op06
Shimma Shuichi
2Op01, 3Ca07,
3Na07
Shinya Ikeno
2Fa02
Soga Tomoyoshi
2Op01
Song Hak Jin 1Lp13, 1Np17, 1Op06
Srisawat Pisanee
3Ka02
Steven Nathanael
2Op01
Subagyo Dyah Candra Hapsari 2Ja04
Suhaimi Hamizah
1Ip07
Sumirat Ucu
2Ca04
Suwatthanarak Thanawat
1Ep03
Suzuki Tetsuro
1Lp06
Suzuki Tetsurou
1Lp03

T
Takano Eriko
Takemura Kenshin

2Ka04
1Lp02, 1Lp03,
1Lp04, 1Lp06
Tamada Yoshihiro
3Ca07
Tamura Takashi
2Ja08
Tan Marselina I.
2Op01
Tanaka Masayoshi
1Ep03
Tanaka Tsutomu
1Jp12
Teramura Hiroshi
1Hp01
Tomoko Shimokawa
2Fa02
Trinugraha Aﬁ Candra
1Ip16
Triwahyuni Eka
2Jp04
Triyani
1Hp01
Tsai You-Shan
2Ja07
Tsai Yung Yu
2Hp11
Tsai Yung-Yu
2Hp10
Tu Phuong Trang
2Na09

Q
Quayson EmmanuelUthailak Naphatsamon

R

U
3Fa05

Ueno Takashi

1Fp18

1Ep14

V
Vipin Kumar Deo
Vipin Kumar Deo
Vogel Viola

1Lp05
1Ip06
2Op06

W
Watanabe Hajime
Watanabe Kenshi
Widya Asmara
Wijaya Hans
Wisman Adinda Putri
Wu Chih Chan
Wu Chih-Chan
Wu Jiumn-Yih

1Gp13
1Kp08
1Ip06
3Ha09
3Ca08
2Hp11
2Hp10
2Ca07

X
Xu Jian

1Ip07

YYang Yung-Hun

1Lp13, 1Np17,
1Op06
Yasumoto Shuhei
3Ka02
Yeo Soo-Hwan
2Gp08
Yin Xuan
2Cp05
Yoon Tae Hang 1Lp13, 1Np17, 1Op06
Yopi
3Ha09
Yopi Yopi
1Fp04
Yoshida Ayumi 1Fp02, 2Hp05, 3Fa05
Yung-Hun Yang
3Ha01
Yusianto
2Ca04

Z
Zhong Jian-Jiang
Zinn Manfred

2Ka03
3Ha03

あ
藍川 晋平
相田 涼介
愛知 真木子
青井 真人
葵 理恵
青木 茂久
青木 壮太
青木 直大
青木 裕史
青木 好辰
青木 航
青野 陸
青柳 秀紀

赤尾
赤坂
赤澤
明石
赤田
赤沼

2Gp09, 2Gp10
1Ep01
S3Eb03
1Kp07
1Mp01
1Op11
1Ip14
1Hp09
2Fp03
1Np15
3Ia01, 3Ia10
3La10
2Ep01, 2Ep10, 2Fp11,
2Np04, 3Ea01, 3Ea02, 3Ea04,
3Ea05, 3Ea06, 3Fa08, S3Cc04
健
2Da11, 2Ka07
直紀
1Gp05
陽子
1Dp08
貴裕
2Da12, 3Ca08
倫治
1Kp02, 2Ga11
哲史
S3Hc02

293

赤嶺 藍
秋 庸裕

3Oa10
1Gp17, 1Kp07,
2Hp07, 2Hp08
秋田 紘長
S3Bc04
秋野 順治
2La01
秋山 佳丈
2Oa03, 2Oa06
秋好 陽香梨
2Ga01
秋吉 裕子
1Dp11
浅井 禎吾
3Ca01
朝井 洋明
S3Mc03朝倉 大河
2Ja10, 2Ja11
淺田 元子
1Hp02, 1Hp03
浅野 静
A2Cp01浅野 泰久
1Mp02, 1Mp06,
A1Aa02, 2Lp03
浅野 悠太
1Gp18
浅見 忠男
S3Da03
浅見 優月
1Op10
朝山 宗彦
2Hp04
芦内 誠
2Ep11
芦田 久
2Ca08
小豆澤 友希
2Ep07
東 春奈
3Ca04
東 秀隆
2Ip03
東 雅之
1Cp04, 2Ha09, 2Ja03,
2Ka08, 2Kp05, 2Np03, 3Fa09
麻生 祐司
3Ga05, 3Ga06
足立 航平
3Ma05
足立 遥華
2Ip06
新 裕太
2Fa07
跡見 晴幸
1Gp03, 2Ma11
阿野 貴司
2Ha04, 2Ha07, 2Ha08,
2La11
阿野 嘉孝
2Jp05, 2Jp10
油井 信弘
1Fp09, 2Hp09,
2La06, 3Fa04
油谷 幸代
2Kp07
阿部 歩
1Mp09
阿部 勝正
1Mp07, 1Mp08, 2Gp03
阿部 克也
1Fp09, 2Hp09,
2La06, 3Fa04
阿部 敬悦
1Ip13, 2Fa05, 2Fa06
阿部 啓子
2Ca08
阿部 峻之
2Da07, 2Da08, 3Ca04
阿部 拓哉
1Kp02
阿部 匡史
1Mp04
安部 菜月
1Op10
阿部 文明
1Lp17
天尾 豊
S3Bc05
天知 誠吾
S3Fb02, S3Fb04
天羽 宏枝
2Fa09
鮎川 翔太朗
2Ia07
荒 学志
1Kp01
荒井 滋
2La01
荒井 進
2Ha06
新井 隆
1Kp06
新井 智博
2Na09
荒井 啓
2Ga04, 2Ga05
新井 宗仁
1Mp17, 2Lp09, 2Lp10

荒井
新井
荒井
荒岡
新川
荒川
荒木

良仁
亮一
渉
亮祐
翔也
知子
希和子

荒木
荒木
荒木
荒木
嵐田
有川
有田
有馬
有馬

千絵
優大
通啓
保幸
遥
尚志
稔彦
一成
二朗

有本
粟谷
安藤
安藤
安藤

圭吾
晃也
晃規
翔太
寛

2Mp01
2Ia03
2Mp05
1Jp02
1Lp16
3Ha05
1Hp16, 1Hp17, 1Hp18,
2Na07, 2Na08
2Op04
2Lp01
2Ip08, 2Ip11, S3Gb05
S3Gc06
2Ha01
A1Aa04
1Ip13
1Dp08
1Ip10, 2La03,
3Ma01, 3Ma11
2Da10
2Mp03
2Ja07
2Ha10, 2Ha11
3Ga05, 3Ga06

い
飯尾 魁
3Fa07
飯郷 雅之
2Ha01
飯島 信司
2Op11, 3Oa01
飯嶋 益巳
1Lp09
飯泉 太郎
3Na09, 3Na10
飯田 順子
1Kp16
飯田 千里
S3Fb04
飯野 健太
S3Mc06
五十嵐 圭日子
1Hp10
井川 聡
2Ep07
生田 宗一郎
2Gp05
生田 直子
1Cp10, 1Cp11
井口 晃徳
2Cp03
井口 博之
1Np06
池 道彦
1Hp13, 1Hp14, 2Na03,
池内
池上
池川
池添
池田
池田
池田
池田
池田
池永
池野
池袋
池部
井沢
石井
石井

3Na03, 3Na04, S3Fb03
1Op12
3Na01
2Ca01
S3Hc04
1Ep05
S3Eb03
1Jp13, 1Jp14, 1Jp15,
1Lp10, S3Fb01, S3Gc04
光
2Mp07, 2Mp08
富貴子
2Hp03
誠
2Cp05
慎也
1Ep06
一典
1Ep08, 1Ep09
仁善
S3Gb02
真吾
2Ha05
沙弥
1Np06
純
1Jp07, 1Lp12, 2Gp09,
2Gp10, 2Gp11, 3Ka06, S3Hb04
真志
健仁
繁男
泰弘
彩
和貴
丈

石井
石井
石井
石井
石井
石垣
石川
石川
石川
石澤
石島
石田
石田

伸佳
正治
もも子
友理
義孝
友理
周
孝博
聖人
秀紘
智子
圭
丈典

石田 尚之
石田 亘広
石田 裕幸
石原 真以
石原 真奈
井嶋 浩一朗
泉田 智史
和泉 自泰
泉 可也
泉津 弘佑
磯﨑 勇志
礒部 公安
伊田 小百合伊田 寛之
板谷 かえで市川 響太郎
市川 暉
市毛 栄太
一谷 勝之
一瀬 博文
市橋 伯一
市橋 泰範
市村 栄諭
市村 武文
井手 圭吾
井出 曜子
井出口 浩迪
井藤 彰
伊藤
伊藤
伊藤
伊藤
伊東
伊藤
伊藤
伊藤
伊藤
伊藤
井藤
伊藤
伊藤
伊藤
伊藤
伊藤

あずさ
公夫
潔人
圭祐
謙吾
孝司
進
成輝
創平
俊彦
俊行
智之
伸哉
紀幸
遼
英晃

2Ep04
2Ep05
2Ca10
1Gp05
2Lp01, 2Mp10
2Ia10
1Gp09
2Hp02
1Gp04, 1Ip14
1Hp13, 1Hp14
2Ca08
2Gp08
1Jp13, 1Jp14,
1Jp15, 1Lp10
2Ip03
3Fa02
1Mp06
1Hp12
2Lp01
2Ep03, 2Fa11
1Ep11
1Jp09, 1Kp17, S3Lc05
2Ha06
3Ca01
1Dp05
1Mp06
3Ga02
2Oa12
1Jp03
2Ma05
2Fa06
1Jp04
3Ca02
2La09
2Ia08
S3Cb02
1Np15
2Jp11
3Ia02
2Hp03
2Gp05
1Op14, A2Fp01,
3Oa05, 3Oa07
2Ca08
S3Ec01
S3Gb052Ga06
2Ep09
S3Mc06
S3Dc04
2Cp10
1Mp02
2Mp06
1Hp15, 1Jp02
2Ip01
2Ip05, 2Mp03
2Lp04
1Lp08, 2Ja09
1Hp10

294

伊藤 栄紘
伊藤 昌文
伊藤 麻里
伊藤 みさご
伊藤 通浩
伊東 祐二
伊藤 幸博
伊藤 弓弦
伊藤 洋一郎
稲垣 慶一
稲垣 賢二
稲垣 裕
稲留 弘乃
稲野 紘一
稲葉 悠
乾 博
乾 将行
犬伏
猪野
井上
井上
井上
井上
井上
井上
井上

祐作
椋太
暁人
順允
加奈子
謙吾
潤
翔太
大介

井上
井上
井上
井上
井上
井上
猪熊
井原
今井
今井
今井
今井
今井
今田
今中
今村
今村

貴行
尚
宏之
諭宜
善晴
梨沙
健太郎
邦夫
健人
皐
俊宏
史規
祐太
勝巳
洋行
維克
保忠

今村
岩井
岩井
岩木
岩倉
岩崎
岩崎
岩田
岩田
岩本
岩本

香乃
謙一
良輔
宏明
遼
建史朗
裕樹
悠志
至叡
孝信
七虹

1Mp14
2Ma02
2Ca01
2Np01
3Ia02
1Dp08
S3Cc022Oa07
2Gp09, 2Gp10, 2Gp11
1Op07
3Ma10
1Ip06
3Ca11
2Ia03
3Ea07
2Hp02
1Np03, 1Np04,
1Np05, 2Ka05
2Oa12
1Np18
1Dp09
1Fp14
1Hp14
1Gp12
1Cp12
2Kp10
1Hp13, 1Hp14, 2Na03,
3Na03, 3Na04
1Ep12
3Ma11
2Ma06
2Ka07
3Ea08
2Lp03
3Ha07, 3Ha08, 3Ka05
2Kp01
1Ep04, 1Ep05
3Ma09
1Mp07
2Ha06
2Oa08, 3Ia09
3Ma10
2Ip02, 2Ip03
2Ip03
1Fp09, 2Hp09,
2La06, 3Fa04
3Ea03
3Ca02
1Op10
1Np14
2Kp02
3Ha02
2Jp06
1Kp06
3Fa03
1Kp01
2Ca09

う
魏 菲菲
1Lp15
上垣 浩一
3Ea11
上江田 真衣
2Na01
上田 朋美
1Gp11
上田 宏
1Dp09, 2Ia01
上田 茉奈
2Ka08
植田 愛美
2Cp10
上田 光宏
2Hp02
植田 充美
1Mp18, 3Ia01, 3Ia10
上地 敬子
3Ca05, S3Dc04
上野 絹子
1Ep08
上野 大心
1Ep16
上原 千央
2Ka10
上原 ひかる
2Op04
植松 千暁
3Ca03
上村 昌博
S3Kb01上村 侑太郎
1Lp11
魚住 奎太
2Ma09
魚住 昇平
1Gp02
魚住 信之
2Ka10, S3Eb04
鵜飼 文広
2Lp06
筌場 将太
2La09
氏家 沙織里2Cp03
宇田 泰三
1Dp04, 1Dp10, 1Dp11
内海 俊樹
3Ca02
内田 由乃
1Dp03
内野 佳仁
1Cp07
内堀 孝博
1Np16
内山 進
2Gp08
内山 友香
1Fp08
宇都宮 大貴
2Jp05
宇野 紘平
2Ma08
宇野 貴裕
1Hp17
馬越 泰
1Kp15
梅田 茉奈
2Mp05
梅津 光央 2Ia10, 2Ia11, 2Ia12, 2Ip01,
梅根
梅野
梅山
裏地
浦田
卜部
上井
海野

輝来人
太輔
幸子
美杉
智宇
喬史
幸司
源人

2Ip02, S3Gc02, S3Hc03
3Oa02
2Ia02, 2Lp08
1Ep15
3Ma04
2Na11
1Kp11
1Ip12
2Ja05

え
江口
江田
榎本
榎本
江邉
江本
遠藤
遠藤
遠藤

真央
智一
利彦
陽介
正平
慎
亮
佳純
輪

1Hp06
2Ep02
2Ia07
1Kp14
2Ha04, 2Ha07, 2Ha08
2Ma07
2Gp06
2Cp08
2Np04

お
及川 大樹
及川 未早来
生出 伸一
王 悦
オウ カン
呉 準席
扇谷 悟
大井 太士郎
大井 俊彦
大池 達矢
大池 智明
大泉 太於
大江 史花
大川内 雅彦
大久保 忠相大熊 盛也
大河内 美奈
大澤 果穂
大澤 朗
大島 敏久
大島
大城
大城
大隅
大園
大薗
太田
大田
太田
大田
大竹
大谷
大津
大塚
大塚
大音
大取
大西
大西
大西
大貫
大野
大野
大野
大場
大場
大箸
大橋
大橋
大橋
大橋
大東
大堀
大政

遼太郎
隆
麦人
早紀
昂貴
まみ
大策
竹留
愛美
悠里
久夫
千晶
誠太郎
治
未音
徳
靖秀
菜月
康夫
優
喜嗣
翔登
遥
博司
慶司
輝
信一
貴生
博之
雅卓
正孝
夏海
紗貴子
健史

1Mp11
2Ia11
1Np04
1Op01
2Cp01
2Ma02
3Ha06
3Na08
3Ha03
2Ha04, 2Ha07,
2Ha08, 2La11
1Lp14
2Kp03
2Lp05
1Gp17
2Na03
1Cp03, 1Np12
2Fp09
1Kp09
1Cp10, 1Cp11, 1Cp12
2Ma07, 2Ma08, 3La04,
3La05, 3La06, S3Bc04
1Mp06
1Gp07, 1Gp08, 2Mp01
2Ca11
2Op09
2La09
1Cp05
1Ep11
3La11
1Dp07
1Mp01, 2Fp07
S3Fc04
1Gp07
1Kp13
3Na05, 3Na06
3Fa09
1Hp09
2Op10
2Ga08
1Fp11
2La03
1Op13
1Jp11
2Na10
1Jp01, S3Cb01
1Ip12
3Ea03
2Cp08
2La05
3Ka07
3Fa02
2Da09
2Ca08
2Ma03
2Ip04, 3Ma05, 3Ma06,
3Oa04, S3Lc01

295

大室 有紀
大本 貴士
大森 勇門
大山 彰
岡 知里
岡 大椰
岡﨑 文美
岡澤 敦司
小笠原 真也
小笠原 渉
岡田 憲典
岡田 丈
岡田 晋治
岡田 真衣
岡田 若子
緒方 藍歌
岡南 政宏

1Dp09
2Ha09, 3Ka07
S3Bc042Ip08
1Dp07
1Kp12, 2Kp01
1Dp06
1Ep11
2Fa08
1Kp01, 2Fp08
1Gp11, 1Gp12
2Na11
2Ca08
3Ia09
2Ja07
1Op01
2Ha04, 2Ha07,
2Ha08, 2La11
岡野 憲司
1Fp12, 2Kp10, 2Kp11
岡野 健太郎2Oa01
岡野 啓志
S3Bc03
岡野 凌一
2Np02
岡橋 伸幸
1Kp16, 2Op04
岡村 匡浩
1Np16
岡村 佳樹
2Lp05
岡村 好子
1Gp17, 1Kp07, 2Hp07,
2Hp08, 3Fa01
岡本 章玄
S3Ec02岡本 繁久
3Ca02
岡本 淳之介
2Fa03
岡本 園子
2Fp10
小川 愛未
2Ep06
小川 広大
1Ip11
小川 順
2Ja07
小川 純平
2Ha02
小川 祥二郎
2Ca01
小川 貴弘
S3Fc02
小川 拓哉
1Gp06
小川 信明
1Hp10, 2Ia06, 2Lp02
小川 光輝
1Ep04, 1Ep05
沖 嘉尚
2Op05
荻田 亮
1Cp15, 2Ca09, 2La02
荻野 千秋
1Fp11, 1Hp04, 1Hp05,
1Kp04, 1Kp10, 1Mp16, 2Fa04,
2Ga03, 2Ip11, 2Kp07, 2Op02,
2Op10, 3Ea10, 3Oa10
荻原 淳
1Kp06, 3Ca03
奥嵜 雄也
3Oa01
奥津 果優
2Cp04, 2Cp05, 3Ca01
奥野 稔
3Na06
奥村 一仁
2Np03
奥村 友太
1Gp07, 1Gp08
小椋 義俊
1Gp15
小栗 一将
2Mp05
小栗 秀俊
2Fa03, 3La07
小栗 莉奈
2Ma03
桶田 凜
3Na01
小江 誠司
3La03
長田 裕之
S3Da03

小山内 崇
小澤 裕介
尾島 由紘

2Jp01, 2Jp02, 2Lp07
1Jp01
1Cp04, 2Ha09, 2Ja03,
2Ka08, 2Kp05, 2Np03, 3Fa09
尾瀬 農之
1Mp09
尾関 健二
1Kp11, 2Cp08, 2Cp09
小田 彰恭
2Op03
小田 忍
1Kp09, 2Kp04
小田 達也
2La07
織田 昌幸
3La01
小田 祐之亮
2Mp09
尾高 雅文
1Hp10, 1Ip18,
2Ia06, 2Lp02
小田巻 俊孝1Gp15
越智 健太郎
1Np12
越智 匠
2Hp08
越智 浩
1Lp17
落合 秋人
1Ep01, 1Ep02, 1Ip11
乙黒 美彩
1Np01
鬼塚 正義
2Fa09
小沼 泰子
2Oa07
小埜 栄一郎
1Mp11
小野 聡子
2Ep06
尾上 昌平
3Ca02
小原 仁実
3Ga05, 3Ga06
小原 優季
3Fa06
小俣 達男
S3Eb03
小山 貴之
2Mp04
尾山 昌弘
2La02
折田 和泉
2Ja05, 2Ja06
恩田 岳英
1Fp09
恩田 裕
2Mp10

か
海道 直生
嘉悦 佳子
垣見 和宏
景山 達斗
笠井 尚哉
笠井 由紀
笠倉 理紗
笠嶋 めぐみ
笠原 紳
梶原 康宏
梶本 真由
梶山 慎一郎
柏 雅美
柏木 紀賢
柏原 大輔
数岡 孝幸
春見 隆文
糟谷 まり
風 友稀
片岡 ちひろ
片岡 涼輔
片倉 啓雄
片野
片平

裕太
正人

3Ha11
2Ka02
1Ip04
1Op15
1Cp16, 1Cp17, 1Cp18
2Hp03
2Na12
S3Mc062Ka10
S3Mc02
1Hp11
2La01, 2La11
2Ja01
1Mp16, 3Ea10
2La08
2Na04
1Kp06
2Hp06
2Cp08
2Cp03
3Ca03
1Cp06, 1Cp09, 2Ep06,
2Jp07, 2Jp08, 3Ha11
S3Bc03
2La08

片山
片山
片山
片山
片山
片山
勝河
勝田
加藤
加藤
加藤
加藤

周平
淳子
翔太
琢也
徳賢
葉子
祐希
知尚
悦子
晃
幸一郎
純一

2Fa04
2Fa07
2Ga09
1Kp12
2Lp07
S3Fc02
1Ip03
2Fa10
2Gp06
1Ep16
S3Gc05
1Fp16, 1Ip17,
1Np02, 2Hp08
加藤 節
2Hp08
加藤 創一郎
1Gp04
加藤 太一郎
1Dp08
加藤 完
1Jp01
加藤 晃代
1Dp01, 1Dp02, 1Dp03
加藤 寛子
1Lp12
加藤 寛人
2Oa10
加藤 寛之
3Ia08
加藤 雅士
1Np09, 2Ma01, 2Ma02,
2Ma03
加藤 康夫
1Mp06, 2Ja07, 2La04
加藤 泰彦
2Ga10
加藤 勇太
3Ha05
加藤 芳尚
3Ea07
加藤 りさ
2Ja05
加藤 竜司
1Op01, 2Oa07, 2Oa08,
2Oa09, 2Oa10, 2Oa11, 3Ia07,
3Ia08, 3Ia09, S3Bb04, S3Lc07
門岡 千尋
3Ca01, S3Dc05
金井 保
1Gp03
金尾 圭太
2Ja01
金ヶ崎 三千翔
1Np06
金森 拓
1Np16
金森 敏幸
2Oa10, S3Bb04
金山 直樹
1Dp07
蟹江 慧
1Op01, 2Oa07, 2Oa08,
2Oa09, 2Oa10, 2Oa11,
3Ia07, 3Ia08, 3Ia09, S3Bb04
金岡 英徳
2Op11, 3Oa01
金子 喬士郎
1Op01
金子 恒太郎
1Mp05
金子 直恵
2Ia05
金子 由喜
1Hp15
金子 嘉信
3Ha11
金子 凜
2Op03
金松 雅俊
2Ha06
加野 浩一郎2Op05
賀野 壮一朗
3Ma02
狩野 文香
S3Eb04鎌形 洋一
3Ha06
鎌田 健太郎
1Jp08
蒲池 利章
1Mp14
上條 順也
2Ma02
上平 正道
1Op14, 3Oa05, 3Oa07
上村 直史
2Ha03
上村 光浩
1Ep04, 1Ep05

296

上村
神谷
亀崎
亀田

哉生樹
典穂
和輝
倫史

鴨木 明子
唐澤 昌之
河合 功治
河合 繁子
河合 総一郎河合 富佐子
河合 美桜
川上 茅咲
河岸 洋和
川口 太一
川口 剛司
川口 秀夫
川﨑 了
川崎 健
川崎 典起
川﨑 はるか
川﨑 浩子
河﨑 雄太
川島 成貴
川島 万凜
川尻 彩音
川名 修一
川西 琢也
河野 響
川端 潤
河原 あい
河原 光希
河原 正浩
河邉 佳典
川村 出
川村 美帆
川本 純
河本 正次
河原崎 泰昌
諫田 康成
神並 美華
菅野 学
神原 亮大

3Na09, 3Na10
S3Bc06
S3Fc02
2Ia11, 2Ip01,
S3Gb02, S3Hc03
1Np02
1Mp10
1Mp05
2Ia02, 2Lp08
1Gp06
3La01
2Jp07, 2Jp08
3Ea03
1Fp15, 1Hp08, 2Na10
2Ha09
1Hp11
1Fp11, 2Kp07
2Fa03, 3Fa03, 3La07
1Np10
3Ga01, 3Ga02
2Ep02
1Cp07, 2Ip10, S3Kc01
2La08
2Hp09
2Fp06
3Fa07
1Kp16
2Na01, 3Ga04, 3Na02
1Gp11
2Lp06
1Cp13
2Mp04
3Oa02, S3Lc06
1Op14, 3Oa05, 3Oa07
2La08
2Na05
1Gp06
1Dp12
2Ga06
2Oa03
1Op09
2Ka01
1Jp13, 1Jp14, 1Jp15

き
木賀 大介
2Ia07
菊川 寛史
2Lp04, 2Lp05, 2Lp06
菊田 実花
3Ea01
菊地 淳 1Lp15, 2Ja10, 2Ja11, S3Cb05
菊地 のぞみ
3Ca11
菊地 真裕
2Ip02
菊池 亮太
2Ha09
来住 秀憲
2Ip04
岸田 隆寛
3Ka07
木島 尚輝
2Ma03
岸本 憲明
3Ea11
喜多 晃久
2Hp08, 2Jp06, 2Na02
北 一真
3Oa04
北 伸二
1Gp01

喜多
喜田
北岡
北岡
北垣

靖子
直孝
卓也
直樹
浩志

北川 裕之
北川 学
北川 雄輝
北川 諒治
北口 哲也
北里 洋
北島 悠花
北田 雄基
北出 幸広
北野 勝久
北原 知恵
北堀 智希
北村 岳
北村 さや香
北村 純一
北本 宏子
木塚 康彦
吉川 真広
木戸 ゆかり木野 邦器
紀ノ岡 正博
木下 崇司
木下 理恵
木原 摩耶
金 賢徹
金 美海
木村 和幸
木村 勝紀
木村 信忠
木村 将弘
木村 友紀
清野 珠美
桐村 光太郎
金城 浩二
金原 和秀

3Ca09
2Ka12
2La09
2La04
1Cp08, 2Ca10, 2Ca12,
2Da11, 2Jp09
S3Mc06
2Cp10, S3Db04
3Ma10
2Ga07
1Dp09, 2Ia01
2Mp05
1Cp08
3Ha08
2Ka05
2Ep07
2Ia09
1Kp07
2Na05
3Ka10
1Mp13
2Gp06, 2Gp07
S3Mc04
1Hp12
2Mp05
3La10, 3Ma02, 3Ma03
2Oa01, 2Oa02, S3Lb03
S3Mc06
1Ip01, 1Ip02
2Np03
1Op04
2Oa01
2Ja01
2Jp11
2Ga01, 2Ka01
2Fp04
2Ia02
3Ca10
2Lp01, 2Mp09, 2Mp10
1Lp08, 2Ja09
1Np11, 1Np12, 2Na11

く
草加 直幸
日下部 均
日下部 涼子
草場 裕貴
工藤 恒
工藤 優輝
國澤 純
國武 絵美
國富 理紗子
久原 哲
久保 研二
久保 智里
久保 幹
久保 勇貴
久保田 瞳

1Op10
3Ma10
2Oa10
2Jp09
2Lp09
2Ha10, 2Ha11
1Cp06
2Gp06
2Ia04
2Fp06
1Ip12
1Lp17
1Hp16, 1Hp17, 1Hp18,
2Na07, 2Na08
1Gp15
1Mp02

窪寺
窪村
熊谷
熊谷
熊澤
熊田

隆文
有紗
和晃
孝則
皆
陽一

2Da12, 3Ca08
2La05
2Ep02
2Ga02
2Ip06
1Fp07, 1Fp12, 1Fp14,
2Ep03, 2Fa07, 2Fa08, 2Fa11, 2Fp02
熊野 舞香
2Ka11
倉敷 凌太
1Gp08
倉田 淳志
3Ea11
倉田 博之
S3Hb05
倉橋 敦
2Cp11
倉橋 健介
2Np01, 2Np02
倉光 香奈
1Cp09
倉本 歩
3Ma03
栗岡 純平
1Np18
栗林 喬
2Da10
栗原 達夫
1Gp06
栗本 昌樹
1Lp17
栗本 祐樹
2Ha03
厨 祐喜
2Ip08
黒木 洋明
2Ja10
黒沢 則夫
2Ma07, 2Ma08
黒澤 尋
1Op13
黒田 章夫
1Jp13, 1Jp14, 1Jp15,
1Lp10, S3Fb01, S3Gc04
黒田 俊一
1Lp09, 3Oa08, 3Oa09
黒田 照夫
2Ga02
黒田 ひかり3Ga05
黒田 真史
1Hp13, 1Hp14, 2Na03,
3Na03, 3Na04, S3Fb03
黒部 督惠
3Ma07

け
解良
解良

康太
芳夫

S3Eb04
1Mp07, 1Mp08, 2Gp03

こ
小池 英明
小岩 雅和
小祝 敬一郎
高 暁冬
幸崎 涼
糀谷 紗季
幸田 明生
合田 雅浩
合田 亮
河野 恵子
鴻池 史憲
古賀 雄一
小川 雅人
後閑 俊哉
小木戸 謙
越田 一朗
小柴 佑介
兒島 憲二
兒島 孝明

2Gp07
2Fp04
1Gp14
2Gp01
1Mp15
2Ma02, 2Ma03
2Ia10
3Ga03
2Np01
S3Mb022Fp01
2Ip04, 3Ma05,
3Ma06, 3Oa04
1Lp08, 3Ia03
2Mp08
2Fp03
2Oa02
2Na12
S3Bc03
1Dp02, 1Dp03,
1Kp12, 2Kp01

297

児島
小島
小島
小関
小高
小竹
小谷
小谷
児玉

智樹
伸彦
基
卓也
敦史
史哉
葉月
真也
浩明

2Ia01
1Op11
1Fp10
2Ma05
S3Mb05
3Na05, 3Na06
3Ia05
1Ep07
1Ep15, 1Hp15, 1Jp01,
1Jp02, 1Jp03, S3Cb01
小寺 智博
1Kp03
後藤 綺花
2Ca01
後藤 猛
2Fa01, 2Fp10
五島 徹也
2Da11
後藤 正利
2Ga01, 3Ca01,
S3Dc04, S3Dc05
児波 克哉
1Cp04
小西 正朗
1Np02, 2Cp02, 2Ep02,
3Ha05, 3Ha10
小濱 可奈絵2Ca12
小林 功
S3Mc06
小林 一幾
2Ia02
小林 和輝
3Ea05
小林 淳平
1Kp05
小林 誠治
2Ja03
小林 新吾
A1Aa04
小林 巧
2Fa07
小林 剛
2Na05
小林 哲夫
2Kp01
小林 稔真
2Na12
小林 直也
2Ia03
小林 日花梨
2Ka09
小林 英城
2Mp05
小林 大起
1Ip10
小林 弥生
S3Fb04小林 優真
3Ha07, 3Ka05
小林 洋介
2Ha06, 3Ha06
小堀 俊郎
1Gp17
駒 大輔
2Ha09, 3Ka07
小松崎 亜紀子
2Gp01
駒林 卓磨
3Ma03
五味 勝也
2Ga04, 2Ga05,
2Ga06, 2Ma05
古村 崚
3Ia01
古明地 敬介2Fa05, 2Fa06
米野 雅大
2Ca08
小森 彩
1Fp10
小森 有華
1Dp03
是常 友紀
1Cp16
権平 文夫
2Fa08
近藤 昭彦
1Cp11, 1Cp12, 1Fp11,
1Fp12, 1Jp04, 1Jp16, 1Kp04,
1Kp05, 1Kp10, 1Lp12, 1Mp16,
2Fa04, 2Ga03, 2Gp09, 2Gp10,
2Gp11, 2Ip11, 2Op02, 2Op10,
3Ea10, 3Ha07, 3Ha08, 3Ka04,
3Ka05, 3Ka06, 3Oa10, S3Hb03
近藤 敬子
2La08
近藤 聡
1Hp09

近藤
近堂
近藤
近藤
今野
今野

澄夫
菜月
秀裕
龍一
聖矢
宏

2Cp10
2La04
1Gp14
1Mp14
1Mp07
S3Db01

さ斉藤 寿槻
斉藤 加奈子
斎藤 恭一
斉藤 俊也
齋藤 大輝
齋藤 貴広
齊藤 隆行
齊藤 太郎
齋藤 翼
齊藤 三希子
齋藤 裕
佐賀 清崇
酒井 亜希
酒井 杏匠
酒井 謙二
境 慎司
酒井 徹平
阪井 康能
酒井 優
坂上 寛敏
榊原 早津季坂口 由希菜酒瀬川 信一酒瀬川 世瑠
坂田 研二
阪田 真澄
酒谷 佳寛
阪中 幹祥
坂本 康二
坂元 仁
阪本 龍司
坂本 憲広
坂元 博昭
阪本 真由子
坂本 祐一朗
鷺 陽香
櫻谷 英治
櫻庭 春彦
提箸 祥幸
座古 保
佐古田 久雄
佐坂 文武
笹川 洋平
佐々木 海
佐々木 克仁佐々木 建吾佐々木 智子
佐々木 大作佐々木 大介1Ep01, 1Ep02
2Fp07
2Ia02, 2Lp08
S3Eb04
2Ka08
1Mp02
2Ka07
1Ep09
3La10
S3Da05
2Ia11, S3Hc03
2Ha06
3Ia05
2Ma01, 2Ma02, 2Ma03
2Na09, S3Cb03, S3Cc05
S3Lb05
2Oa08
3Ka01
2Ma01
1Np02
2Ma10
1Gp08
1Mp02, 2Mp04
1Cp15
1Lp15, 2Ja10, 2Ja11
2Ip07
2Ia08
1Gp15
2Lp08
1Gp10
2Hp02
1Cp10
1Lp14, 3La04, 3La05,
3La06, 3La11
1Cp08, 2Ca12
2Ep03, 2Fa11
1Jp01
S3Kb032Ma07, 2Ma08, 3La04,
3La05, 3La06, S3Bc04
1Ip11
2Ep07, 2Ia04, 2Ia05
1Gp05
3Fa01
2Mp05
1Mp09
2Ma05
1Cp10, 1Cp11, 1Cp12
2Hp04
2Hp04
1Cp10, 1Cp11,

佐々木 千鶴佐々木 美月篠笥 光慶
佐々木 陽介笹野 佑
佐々野 僚一
笹原 健嗣
笹渕 優衣
佐藤 麻子
佐藤 俊輔
佐藤 伸
佐藤 喬章
佐藤 高彰
佐藤 琢
佐藤 友哉
佐藤 新菜
佐藤 道夫
里村 武範
佐野
佐野
佐野
佐野
佐原
鮫島
澤川
澤邊

杏奈
公亮
芽生
元昭
健彦
正浩
史明
朋美

1Cp12, 1Kp05
1Hp02, 1Hp03
2Hp04
1Cp14
1Cp02
2Gp05
1Lp16
2Ia03
2Mp06
2Op06
A1Aa04, 3Na08
1Hp07
2Ma11
2Ia03
S3Bb04
1Cp08
3Na09, 3Na10
2La08
2Ma07, 2Ma08, 3La04,
3La05, 3La06, 3La11
2Jp07
1Jp14
3Ga05, 3Ga06
2Fa05, 2Fa06
3Ha06
1Hp10
2Oa02
1Cp04

し
椎名 一樹
塩谷 侑子
塩野 義人
塩見 尚史
塩屋 健一
繁 宥樹
重松 亨
志田 洋介
七田 沙耶香
篠崎 一雄
篠田 優
篠原 玉樹
篠原 裕之
篠原 信
篠原 涼平
柴田 晃
柴田 敏行
渋田 真結
嶋田 礼迪
嶋津 敦子
島林 真人
島村 麻美子
清水 一憲

2Kp04
2Cp08
2Ma05
2Oa05
2Ga12
1Gp05
2Cp03
1Kp01, 2Fp08
1Mp06
S3Da03
2Lp03
1Jp09
3Ca11
2Ja07, S3Da02
1Cp10
1Cp17
1Mp18
2Oa10, 2Oa11, S3Bb04
1Fp05
2Fa09
3Ia04
1Cp07
1Ep04, 1Ep05, 1Hp12,
1Lp17, 2Op09, 3Ia07
清水 克彦
1Ip10, 2La03,
3Ma01, 3Ma11
清水 （肖）金忠
1Gp15
清水 慈
2Lp04
清水 孝彦
1Jp01

298

清水
清水
清水
清水

達也
S3Lb01
智子
1Lp15
弘樹
S3Mc01浩 1Jp08, 1Jp17, 1Jp18, 1Kp16,

A1Aa03, 2Ip07, 2Op04, 3Ka06,
3Ka10, 3Ka11, S3Eb02
清水 美里
1Dp04
志水 元亨
1Np09, 2Ma01,
2Ma02, 2Ma03
清水 友佑
2Ep02
清水 裕
1Ep09
志村 芙美
2Fp04
下飯 仁
2Ka07
下川 直史
1Cp01, 1Cp02, 2Fp05
下川 麻優子1Ep15
下里 剛士
S3Hc06
下澤 勇弥
1Mp03
下出 崇樹
3Na02
シャヒル アミル
1Ep06
張 鈺爽
2Ia10
許 志豪
1Cp08
胥 欣欣
2Gp01
城 斗志夫
2Da10
城 宜嗣
2Lp02
荘司 長三
1Mp10
白井 智量
2Ip10, S3Hb03
白井 裕貴
2Mp11
白石 慧
1Mp11
白石 敦士
3Ca06
進 和美
S3Bb04
新海 佑介
1Dp02
新木 翔太
3Ma09
新谷 尚弘
2Ga04, 2Ga05
新谷 智子
2Ma05
新谷 政己
1Cp03, 1Np11,
1Np12, 2Na11
神藤 定生
1Fp08, 2Ma01
新間 秀一
1Kp13, 1Kp14, 3Ca08
新名 俊仁
1Jp03

杉山
杉山
杉山
杉山
須崎
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
鈴木
須田
須田
角田
炭谷

友康
政則
峰崇
友亮
萌
昭浩
淳巨
市郎
克彦
健吾
康太
伸
琢磨
健裕
哲朗
利雄
尚幸
菜月
隼人
治人
宏昭
宏和
寛人
宗典
義之
彰一郎
雅子
一真
順一

せ
関 実
関口 はつ美
関口 拓史
瀬島 祐大
瀬筒 秀樹
瀬戸口 翔
千賀 明香音
善藤 威史

す
鄒
末
須江
末田
菅原

子燕
信一朗

菅原
杉浦
鋤先
杉田
杉野
杉村
杉本
杉本
杉本
杉本
杉森

2Ha02
1Lp14, 2Ma07, 2Ma08,
3La04, 3La05, 3La06, 3La11
夏希
3Ha04
慎二
1Lp11
康里
1Fp09, 2Hp09,
2La06, 3Fa04
誠吾
1Kp03
慎治
2Oa10, S3Bb04
まゆ子
2Ip10
晴佳
2Ha03
雄規
1Hp04, 1Hp06
康司
1Ip12
恭子
1Kp09
直久
2Ha06
幸子
2Da08, 2Ka11, 2Ka12
良太
2Ca12
大助
1Mp02, 2Mp04

3Na01
2Ga02
2Gp08
2Fp02
2Op08
1Hp02
2Ia09
2La08, 2Na05, 2Na12
3Ca11
2Ca12, 2Jp02
2Na12
3Ma02
2Mp07, 2Mp08
2Fp10
1Lp05
2Ca08
2Ja06
2La03
1Ep10
3La05, 3La06
1Hp12
1Gp07, 1Gp08, 2Mp01
2Ga11
1Fp10
2Fp08
3Ia02
2Ka05
1Jp09
1Hp11
2Oa04
2Op03
2Ka12
3Ka08
S3Mc06
3Ca02
3La01
1Cp13

そ
曾 伝濤
惣田 訓
相馬 智史
相馬 悠希
曽我 亜由美
曽田 匡洋
曾根 輝雄
園木 和典
園元 謙二
曽宮 正晴
宋 致 &#23446;

2Cp04
3Na04, S3Fb03
2Ja11
1Jp09, 3Ha02
1Fp15
2Ka02, 3Ea10
1Mp09
2Ha03
S3Cc03
3Oa08
2Ia03

た
ターナー ピーター
平良 東紀
田尾 文哉
多賀 直彦
高井 まどか1Ep12
3Ca05, S3Dc04
1Op11
3Ea03
S3Gc06

高尾
高尾
高木
高木
高木
髙木
高木
高木

美月
佳史
航太郎
康裕
佑希子
妙子
俊之
博史

1Jp10
S3Db03
1Cp03
2Ca10
2Gp05
2Fp07
S3Bb04
2Da07, 2Da08, 2Da09,
2Ka11, 2Ka12, S3Mb08
高木 昌宏
1Cp01, 1Cp02, 2Fp05
高木 睦
1Op05, 3Oa03
高久 洋暁
1Kp01
高島 英造
1Mp04
高島 匠平
2Gp08
高須賀 太一
2Ma03
髙瀬 良和
3Ca02
高田 和真
2Gp05
高田 良二
3Ca11
高谷 信之
S3Eb03
高塚 由美子
2Na06
高野 力
2Fp11
高野 真希
1Fp17, 2Kp02
高橋 海
1Lp08
高橋 慶太郎
1Np08
髙橋 憲司
1Hp04, 1Hp05, 1Hp06
高橋 憲司
1Op07, 1Op08, 1Op09,
2Ep08
高橋 浩一
2Fa08
髙橋 沙綾
1Fp15
高橋 沙織
3Ca11
髙橋 修一郎S3Kb04高橋 祥司
1Mp07, 1Mp08, 2Gp03
髙橋 智聡
2Op04
高橋 徹
1Ip13, S3Dc03
高橋 奈津美
1Kp11
高橋 宏和
1Gp17, 1Kp07, 2Hp07,
3Fa01
高橋 昌樹
2Ia01
高橋 将人
2Ep01, S3Cc04
高橋 雅弥
2Cp09
高橋 正之
3Ca09
高橋 真美加
3Oa07
高橋 祐菜
1Cp01
高橋 佳江
S3Mc01
高見 英人
2Mp05
高見沢 健留
1Kp01
髙峯 和則
2Cp04, 2Cp05, 3Ca01
高宮 良太
2Op03
高村 映一郎3La05, 3La06
高谷 直樹
2Kp03, 2La10
田川 聖一
3Ia04
瀧上 和也
2Mp02
瀧川 義浩
2La01
滝口 有沙
2Mp09
滝口 昇 2Na01, 3Ga04, 3Ia11, 3Na02
滝澤 昇
A1Aa01
瀧澤 秀世
2Oa03, 2Oa06
滝田 禎亮
S3Bc03
武生 みのり
1Mp09

299

田口
田口
田口
田口
竹居
武内
竹内
武内
武尾
竹澤
竹下
武田
竹田
武田
武田
竹田
竹中
竹中
竹原
竹原
竹村
竹村
竹屋
竹山
田島

和真
1Np06
精一
3Ha03
久貴
2Gp05
博明
1Dp10, 1Dp11
孝二
1Mp04
章
2Ep06
健人
3Ha05
正輝
3Ea09
正弘
1Np18, 2Ja01, 2Ka06
俊明
1Op01
典男
S3Mb03志津S3Gb05
哲也
1Mp04
真由子
1Fp07
穣
2La08, 2Na12
雄大
3La07
慎治
2Ma04
武藏
1Mp16, 2Op02, 3Ea10
一起
2Ka06
宗範
3Ea07, 3Ea08, 3Ea09
海生
2Jp06
謙信
1Lp05
壮浩
2Jp01
春子 1Lp08, 2Ja09, 3Ia02, 3Ia03
誉久
1Fp16, 1Ip17,

1Np02, 2Hp08
田代 康介
2Fp06
田代 幸寛
2Na09, S3Cb03, S3Cc05
田代 陽介
1Cp03, 2Ha10, 2Ha11
多田 和樹
2Lp08
多田 三菜美
1Hp13
舘 博
2Na04
立花 亮
1Gp16, 2Oa12
巽 祐介
3Ma05
楯 芳樹
1Op15
伊達 康博
1Lp15, 2Ja10, 2Ja11
館野 浩章
2Oa07
立松 謙一郎S3Mc06
立松 健司
3Oa09
田中 克典
2Ia04
田中 賢二
2Ep09, 2Ja06
田中 孝明
1Ep01, 1Ep02, 1Ip11
田中 拓未
1Ip13, 2Gp06, 2Gp07
田中 勉
1Fp12, 1Jp04
田中 剛
1Fp05, 1Lp07
田中 俊雄
1Cp15, 2Ca09, 2La02
田中 成美
1Mp08
田中 信行
2Op06
田中 眞人
2Ip06
田中 祐圭
2Fp09
田中 優
2Ca11
田中 瑞己
2Ga04, 2Ga06, S3Mb04
田中 靖浩
1Np15, 2Hp06
田中 悠二
1Np01
田中 裕也
1Np03
田中 陽
2Op06
田中 淳和
2La12
田中 礼士
1Mp18
田邊 弘毅
1Ip13

谷 明生
谷 修治
谷内 達彦
谷口 博範
谷口 正之
谷口 茉莉亜
谷畑 友基
谷端 玲奈
田畑 和彦
田畑 琢也
田畑 風華
田原 悠平
玉井 雅也
玉置 尚徳
玉田
田丸
田村
田村
田村
田村
田村

佳大
浩
隆
武幸
具博
廣人
磨聖

1Mp13
1Hp11
1Op08
2Kp11
1Ep01, 1Ep02, 1Ip11
1Cp09
2Kp05
2Fa08
1Jp11
1Lp12
2Fa05
1Cp03
2Gp11
2Cp04, 2Cp05, 3Ca01,
3Ca02, S3Dc05
3Ca08
1Dp06
3Ma10
2Ip09
2Ka01
1Dp01, 1Fp08
2Oa10, S3Bb04

ち
近成 直斗
地白 和樹
千葉 靖典
チュンチャイ
張 斯来

1Np18
1Gp16
2Gp01, S3Mc01
マッタナ
1Ip17
1Kp10, 2Fa04

つ
塚越
塚越
塚原
塚原

かおり
崇之
拓也
正俊

柘植 圭介
柘植 謙爾
柘植 丈治
柘植 陽太
辻 史忠
辻 雅晴
辻 敬典
辻井 雅
辻上 誠也
辻塚 誠一郎
辻野 義雄
津田 宏治
津田 佑介
土金 恵子
土戸 哲明
土屋 麻美
土屋 智顕
堤 浩子
堤 祐介
常田 聡
角岡 良亮
津吹 澄

1Ep08, 1Ep09
3Fa04
2Hp03
2Da07, 2Da08,
3Ca04, S3Dc02
2Ca10, 2Ca12, 2Jp09
1Jp07, S3Hb02
3La02
1Hp04, 1Hp05, 1Hp06
1Kp03
2Cp06
2Ga08
S3Eb04
1Np09
2Ep09
1Cp01, 1Cp02
2Ia11, S3Hc03
2La10
2Ip10
1Gp10
2Jp07, 2Jp08
1Ep17
1Kp10, 2Fa04,
2Ga03, S3Mb05
S3Ec03
1Mp01, 2Fp07, S3Fc04
2Ip05
2Ca01

坪井
坪井
湊元
鶴田
鶴田
鶴野
鶴本

宏和
裕理
幹太
篤弘
開生
圭悟
智大

2Ia10
1Lp15
1Dp05
1Dp08
2Ga12
3Ha02
1Ep11

て
出村 拓
寺内 裕貴
寺尾 拓馬
寺澤 摩周
寺田 昭彦
寺西 綾香
田 小維

1Ep16, S3Cc01
1Ip13
2Ip10
3Ia09
S3Fc01
1Kp09
2Na05

と
土居 克実
土居 幹治
土居 友梨子
東海 彰太
堂崎 雅仁
東條 元昭
東田 英毅
堂前 直
道羅 英夫
遠山 忠
渡嘉敷 直杏渡嘉敷 正司渡嘉敷 みどり
常盤 豊
徳田 耕二
徳田 宏晴
徳光 浩
徳本 勇人
徳樂 清孝
當舎 武彦
戸田 清
戸田 年彦
戸田 成美
戸田 弘
轟木 堅一郎
飛野 智宏
冨田 昌弘
富田 因則
冨田 結芙子
富永 大介
富永 依里子
戸谷 吉博
外山
豊川
豊島
豊田
豊田

博英
洋一
正和
晃一
一

2Fp06
2Ma04
1Hp10
3Ma01, 3Ma04
S3Mc06
2La12
1Kp06
2Fp10
1Np11
1Np15, 2Hp06
S3Dc03
3Ca05, S3Dc04
3Ca05, S3Dc04
3Ga02, 3Ga03
2Cp08, 2Cp09
2Na04
1Dp07
2Np01, 2Np02
1Ip12
2Lp02
2Ep05
1Jp01
1Jp13
2Mp03
1Ep09
2Na12
1Dp05
1Ep17
2Jp02
2Kp07
3Fa01
1Jp07, 1Jp08, 2Ip07,
3Ka10, 3Ka11, S3Eb02
3Ca04, S3Dc03
2Da08
1Jp18, 2Ip07, S3Eb02
1Np05
2Oa04

な
内藤

秋花

1Fp12

300

永 直文
永井 宏平
長井 敏
永井 暉
中尾 貴一
長尾 達彦
中川 明
中川 克彦
中川 恵蔵
中川 そらみ中川 智行
中川 洋史
中川路 伸吾
中口 雄貴
長坂 理紗子
中里 美穂
中澤 奈美
中沢 伸重
中澤 光
中澤 昌美
長澤 淳
中島 綾香
中島 一紀
仲島 菜々実
中島 凌
中島 健介
中島 森
中島 鈴佳
仲嶋 翼
中島 敏明
中嶋 優里
中嶋 義隆
中島 芳浩
中島田 豊
中瀬
中田
永田
永田
仲谷
中谷
長谷
中西
中西
中西
長沼
中野
中野
中野
中野
中野

舞
菜月
智
悠
豪
肇
洸輝
文香
周次
裕美子
孝文
翔
祥吾
翔太
雄司
秀雄

中野
中野
中野
長野
長濱
長濱

雄揮
洋介
義勝
正信
一弘
統彦

3Na05
2Ca08
2Ja10
1Jp17
2Fa08
2Mp01
1Jp10
2Na02
2La04
1Ip01
1Mp13
2Ka09
1Gp15
1Ip18
2Oa07
2Mp10
2Kp03
1Np08
2Ia10, 2Ia11, 2Ia12,
2Ip01, 2Ip02
2Hp02
2Ka12
2Ca12
2Fa03, 3Fa03, 3La07
2Ka02
2La03
2Ga08
1Gp15
1Np16
S3Kb02
1Np16
1Cp18
2Mp11
1Dp08
1Gp17, 1Np02, 2Hp07,
2Hp08, 2Jp06
2Da12
1Gp03
3Ea08
2Kp10
2Ka02
3Fa06
1Op17
2Ia05
S3Ec04
1Jp01
3Ka03
1Fp16
1Mp02, 2Lp03
2Oa06
S3Da03
1Dp01, 1Dp02, 1Dp03,
1Kp12, 2Kp01
2Jp09
1Kp15
1Lp08, 2Ja09, 3Ia02
S3Db02
1Gp02, 1Kp17, 2Ga12
2Mp05

中東
中道
永峰
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村
中村

良太
優介
賢
彰宏
明日香
和音
克哉
佳祐
聡
匠汰
泰斗
貴子
卓登
史
実世
泰之

中村 嘉利
中村 隆太郎
仲本 準
長森 英二
中山 敦好
中山 沢水
中山 二郎
中山 亨
中山 知哉
仲山 英樹
中山 泰宗
永山 恵美
名越 健太郎
那須野 亮
灘中 里美
生井 智仁
生江 俊樹
成田 琴美
成田 裕司

3Ma04
2Ma06
2La12
2Fp08
2Na08
2Ga02
1Fp10
1Cp05
2Ja05
2Ip06
1Op02
2Cp07
3La06
1Op04, 2Op08
3Oa09
1Lp12, 2Gp09,
2Gp10, 2Gp11
1Hp02, 1Hp03
1Ip18
1Ip15
1Op17, 1Op18, 3Ka07
3Ga01, 3Ga02
2Ep11
1Cp08, 2Ca11
1Mp11, S3Bc02
1Cp06
2Ha02
1Gp02, 1Kp17, 2Ga12
1Ip13
3Ma09
2Da08
S3Mc06
2La10
1Ep02
2Ep06
1Op01

に
新岡 宏彦
二井手 哲平
二階堂 愛
西 輝之
西 羽美
西 美智佳
西江 百加
西岡 宗一郎
西川 洋平
西口 大貴
西里 亮
西島 謙一
西島 拓人
西田 敬二
西田 真一朗
西出 真也
西野 泰斗
西野 智彦
西八條 正克西村 勇哉

3Ia04
2Ia11, 2Ia12,
2Ip01, 2Ip02
2Mp05
2Gp09, 2Gp10, 2Gp11
2Ip01
1Ip10
2Jp05
S3Mc06
1Lp08, 3Ia03
1Jp17, 1Jp18
3Na06
2Op11, 3Oa01
2Ha06
1Jp04, S3Lc04
2Op02
3Oa03
1Op10
2Cp01
2Fp01
2Op02, 2Op10, 3Oa10

西本
西矢

歩紗
芳昭

2Hp02
1Mp03, 2Mp11, 3Ma07,
3Ma08, 3Ma09
西山 陶三
2Gp09, 2Gp10, 2Gp11
西山 由美子
1Dp07
西山 佳孝
S3Eb03
新田 克章
2Ka04
新田見 匡
2La08, 2Na12
仁宮 一章
1Hp04, 1Hp05, 1Hp06,
1Op07, 1Op08, 1Op09, 2Ep08

ぬ
額田
沼田
沼本
沼本

夏生
圭司
穂
修孝

1Dp06
2Hp01, S3Hc05
2Cp07
3La01

ね
根岸 諒
根来 誠司
根来 宏明
根本 理子
根路銘 伸介

1Lp07
1Np18, 2Ja01, 2Ka06
S3Mb05
3Ma10
2Kp05

の
盧 鎮栄
野口 恵一
野口 祐司
野口 理紗
野島 大佑
野尻 秀昭
野田 修平
野田 尚宏

3Ha02
1Ip18, 2Lp02
2Ka02
2Gp10
1Fp05
1Gp11, 1Gp12
S3Hb03
1Mp01, 2Fp07,
2Fp08, 2Ka01
3Ka11
2Ia06
2Op03
2Hp07
2Cp03
2Lp02
2La04
2Lp09
3Ea08

後野 直哉
野中 衛
野辺 善仁
登 祐介
野村 一樹
野村 高志
野村 泰治
野村 匡志
野村 亘

は
萩原 遥太
3Oa01
萩原 玲子
2Op05
朴 龍洙
1Ip06, 1Lp01, 1Lp05
白米 優一
2Ep11
箱田 優奈
3Ea02
パサック ニシット
1Ep06
端 瞭太
1Fp07
橋口 周平
1Cp05
橋爪 克己
2Mp06
橋本 和紀
1Hp03
橋本 文雄
3Ca02
橋本 雅仁
1Cp05
橋本 悠
2Ka06
橋本 龍馬
2Ka05

301

橋本
蓮沼

渉
誠久

2Ga05
1Jp16, 1Kp05, 2Gp09,
2Gp10, 2Kp07, 3Ha07,
3Ha08, 3Ka04, 3Ka05, S3Gb04
長谷川 泰子3Ca03
長谷川 大介2Ja10
長谷川 智弘3Ea04, S3Cc04
長谷川 文香
3Ea06
長谷川 真梨菜
1Cp15
長谷川 雄将
1Cp03
長谷川 友香
2La05
長谷川 喜衛
1Np14
秦 康祐
1Jp09
畑 浩介
1Kp07
秦 洋二
1Kp10, 2Fa04,
2Ga03, S3Mb05
羽田 彩夏
1Ip01
羽田 毅
3Oa05
畠山 明
2Da10
畠中 孝彰
3Fa02
畑中 唯史
2La03, 3Ma04
畠中 玄彦
3Na03
秦野 琢之
2Gp04
畠平 智子
2Fp04
八久保 晶弘
1Np02
蜂須賀 真一
2Ma11
服部 修平
2Ia12
服部 祥平
S3Fc02
初野 優花
2Ip06
花井 泰三
1Fp07, 3Ha02
花崎 麻由
1Cp18
花城 隆二
3Ga03
馬場 俊輔
3Ia04
馬場 利明
3Ma09
馬場 美聡
S3Bc03
幅田 亜香莉
3Ka01
濱田 和宏
3Ka08
濱田 浩幸
2Op07, 3Ha02
浜地 格
S3Bb01
濱地 野乃香
1Mp18
濵野 樹
2Np02
浜本 晋
2Ka10, S3Eb04
早川 正幸
2Ka09
林 浩之輔
S3Bc06
林 順司
S3Bc04
林 哲太郎
2Mp05
林 哲也
1Gp15
林 英輝
2Lp02
林 秀謙
2Mp02
林 真人
1Fp17
林 幹朗
1Jp11
林 優花
1Mp02
林 勇樹
1Mp17, 2Lp09, 2Lp10
林谷 美貴子
1Ip06
早瀬 伸樹
2Hp08, 2Na02
原 清敬
1Jp07, 1Jp08
原 駿平
2Op11
原 崇
2Da10
原 富次郎
2Na06

原 正之
原 良太郎
原口 典久
原田 憲
原田 尚志
原田 玲奈
原山 重明
バランワル
番場 崇弘
馬場 健史

1Op02, 1Op03
3Ma02
2Ga12
3La02
2Ga07
3Ea04
2Hp03
プリヤンカ
2Ja01
1Kp05, 3Ka04
1Jp09, 1Kp17, S3Lc05

ひ
東 達也
東 恒仁
東内 遥菜
東久保 遥
東山 明広
引地 啓太
樋口 剛志
樋口 美栄子
緋田 安希子
秀瀬 涼太
美藤 友博
一二三 恵美
平井 英明
平井 浩文
平岡 潔
平賀 和三
平口 侑香里平島 宗一郎平谷 朋之
平野 竜行
平野 美佳子
平松 愛子
広井 佳臣
廣岡 青央
広川 安孝
廣瀬 竜郎
廣田 潤哉
廣田 泰志
廣田 隆一
廣野
弘埜
廣部

育生
陽子
綾乃

2Ca01
1Op16
2Ep11
1Gp05
2Na02
2Fp05
1Ip13
2Hp01
1Ip17
1Gp05, 2Ma10
1Ip10, 2La03,
3Ma01, 3Ma11
1Dp04, 1Dp10, 1Dp11
2Ha01
1Fp15, 1Hp08, 2Na10
1Gp14
2Ka05
S3Gc06
2Gp04
3Na05
2Na06
2Jp09
3Ha04
1Op10
3Ca10
1Fp07
1Hp09
1Kp02
3Ga04
1Jp13, 1Jp14,
1Jp15, 1Lp10, S3Fb01
1Gp14
1Jp07, 1Jp08
2Ep08

ふ
傅 博
深浦 恵梨
深谷 愛衣
深谷 健
吹谷 智
福居 俊昭
福井 瑞季
福﨑 英一郎

1Op05
3Oa03
1Gp12
2Gp08
1Gp15, 3Ka08
2Ja05, 2Ja06
3Ea11
1Kp13, 1Kp14, 1Kp15,
1Lp16, 2Ca02, 2Ka04, 3Ca08
福澤 薫
S3Gc05福島 エリ オデット
1Ep10

福田
福田
福田
福田
福田
福田

伊津子
淳二
展雄
寛史
美南海
青郎

1Cp10, 1Cp11, 1Cp12
1Op15, 2Na12, S3Lb04
2Gp02
2Hp04
1Ip11
1Gp05, 2Ga09,
2Ma09, 2Ma10
福谷 洋介
1Ip18
福永 隼大
2Ia04
福間 剛士
2Ia03
福本 悠地
2Ha08
藤井 達也
2Ma06
藤井 翼
2Ka06
藤井 陽平
1Kp12
藤江 秀斗
2Ha12
藤岡 勘太郎
2Mp05
藤川 彩美
2Ca12
藤川 康夫
1Ep11
藤木 哲也
A1Aa04
藤澤 瑞希
2La01
藤田 憲一
1Cp15, 2Ca09, 2La02
藤田 直子
2Mp06
藤田 英明
1Op17, 1Op18
藤谷 将也 2Oa09, 3Ia07, 3Ia08, 3Ia09
藤野 尚人
2Ha06
藤丸 裕貴
2Da11
藤村 孝志
1Dp12
藤村 弘行
2Ja09, 3Ia02
藤本 舜
2Oa01
藤本 尚志
2Na04
藤本 遼
2Na09
藤森 一浩
2Ha06, 3Ha06
藤山 和仁
2La05
藤原 篤男
2La08
藤原 郁也
1Lp14
藤原 伸介
1Gp05, 2Ga09,
2Ma09, 2Ma10
藤原 卓人
2Mp01
藤原 政司
1Op05, 3Oa03
藤原 祐気
2Gp04
冨士原 由貴
2Oa05
藤原 由梨
1Jp09
二神 泰基
2Cp04, 2Cp05, 2Ga01,
3Ca01, 3Ca02, S3Dc05
二又 裕之
1Cp03, 2Ha10, 2Ha11
二見 淳一郎1Ip01, 1Ip02,
1Ip03, 1Ip04
舟橋 久景
1Jp13, 1Jp14,
1Jp15, 1Lp10
古川 雅崇
1Cp07
古澤 力
3Ia05
古瀬 久幹
2Ep05
古田 雅一
1Gp10
古根 隆広
1Cp10
古野 正浩
1Lp16
古屋 俊樹
3La10
不破 啓貴
1Ep07
フワイジ アラー
1Ep06

302

ほ
北條 晴佳
星 直美
星 奈美子
星 英之
星子 裕貴
星田 尚司
星野 一宏
星野 保
星山 貴文
細井 啓貴
細川 久顕
細川 正人
細田 晃文
細山 哲
堀 采音
堀 克敏
堀 玄澄
堀 千明
堀 知行
堀 勝
堀 雄一
堀 良美
堀内 淳一

堀内 貴之
堀江 正信
堀江 裕紀子
堀尾 京平
堀川 学
堀川 凌平
堀口 一樹
堀越 智
堀之内 貴明本莊 知子
本庄 宏
本田 亜由美
本田 孝祐
本田
本多

真也
裕之

本多
本間
本間
本間
本間
本間
本間

裕基
研一
さと
宣行
陽名
裕章
裕人

2Lp02
2Ka10
1Cp12
2Np01
2Ha12
1Kp02, 2Ga11
1Fp17, 2Kp02
2Cp06
3Ea08
2Ep08
3Na04
1Lp08, 3Ia02, 3Ia03
1Fp08
2Ip10
1Dp12
1Gp04, 1Ip14, 2Ia09,
3Fa06, 3Fa07, S3Gc03
2Mp07
2Ma03, 3Ha03
S3Fb02, S3Fc03
2Ma02
1Ip17
2Kp07
1Fp07, 1Fp12, 1Fp14,
2Ep03, 2Fa07, 2Fa08,
2Fa11, 2Fp02, 3Ha05
S3Lc02
1Op17, 1Op18
2Ca01
1Gp17
1Mp11
1Jp13, 1Jp15
2Oa02
2Ep10
3Ia05
1Ip02, 1Ip03
3Ha02
2Ia12
2Kp10, 2Kp11,
A2Mp01, S3Cc06
2Gp02
1Ep04, 1Ep05, 1Hp12,
1Lp17, 2Op09, 3Ia07
1Op04
3Oa03
3Oa03
2Fp08
1Hp10
3Fa09
2Na04

ま
眞井 洋輔
前 佳佑
前田 勇
前田 憲慶
前田 昂亮

1Op16
1Op18
2Ha01
1Hp18
1Kp16, 2Op04

前田 憲成
前田 智也
前田 浩
眞榮田 麻友美
前田 みのり
前田 義昌
前林 正弘
茅 逸皓
曲 正樹
牧野 祥嗣
政井 英司
真崎 雄一
桝尾 俊介
増田 茜
増田 亜理沙
益留 綾菜
増見 恭子
増村 威宏
増本 純也
増本 博司
町田 雅之
松井 旺大
松井 裕史
松浦 昌平
松浦 友亮
松岡 友洋
松岡 正佳
松川 哲也
松倉 智子
松倉 秀典
松崎 弘美
松崎 典弥
松崎 祥平
松﨑 大典
松崎 隆
松崎 浩明
松崎 祐二
松鹿 昭則
松下 青葉
松下 貴子
松田 史生

松田
松田
松野
松村
松村
松村
松村
松村
松本
松本
松元
松本
松本
松本
松本

2Ha12
1Np03, 3Ia05
3Ca06
3Ca05, S3Dc04
2La11
1Fp05
2Ma02
1Lp07
1Dp07
2Ip05
2Ha03
1Op16
2La10
1Hp08
3Ea06
3Ca02
2Fa10
2Cp07
2Ia05
S3Mb062Cp08
3Ea08
2Oa10, S3Bb04
2La12
2Ga10
3Ka09
1Gp02, 1Kp17, 2Ga12
2La01, 2La11
2Fp07
3Ia10
1Cp13
S3Lb02
1Lp14
S3Cc04
S3Bc062Gp04
S3Mc05, S3Mc06
2Ma06
2Gp08
2La12
1Jp07, 1Jp08, 1Jp17,
1Jp18, 1Kp16, 2Ia08,
2Ip07, 2Op04, 3Ka06, S3Eb02
将典
2Ep10
祐介
2Ga08, 2Ga09
善治
1Cp17
栄太郎
1Jp10
憲吾
S3Mb05
洋寿
1Hp10, 1Ip18,
2Ia06, 2Lp02
幸彦
1Gp17, 2Hp07, 2Hp08
吉信
1Np13
圭司
A1Aa04, 3Ga05, 3Ga06
謙一郎
3Ha03
太一
1Cp05
光史
1Fp05
美徳
3Ma08
美穂
3Ka03
侑也
3Ma10

松山 彰収
松山 恵介
松山 茂
的場 一隆
黛 新造
丸田 秀平
丸山 潤一
丸山 悠
丸山 正晴
万 クン

1Cp16
1Kp07
S3Mb06
2Fa07
1Kp07
2Fp03
1Kp12, S3Hb01
1Ip03
1Jp18
3Ma04

み
見市 絢香
三浦 隆匡
三浦 豊和
三上 達也
三木 健夫
三木 智寛
三﨑 亮
三島 俊介
水澤 愛衣
水谷 治
水無 渉
水沼 正樹
溝手 結
三田 一至
三谷 恭雄
三井 雅貴
三井 亮司
満倉 浩一
皆川 純
水口 和信
水口 千穂
南 尚嗣
南 博道
南畑 孝介
峯苫 智晴
三原 笑
宮尾 寛樹
宮川 幸
三宅 淳
三宅 英雄
三宅 良磨
宮崎 翔子
宮崎 つぐみ宮澤 佳甫
宮澤 拳
宮澤 せいは
宮下 夏美
宮田 大暉
宮田 真人
宮野 恵
宮本 昭弘
宮本 憲二
宮本 弘毅
宮本 樹里
宮本 龍樹
宮本 捺央
宮本 浩邦

1Jp16
1Cp07
2Hp08
1Ep15
1Cp14
1Ip18
2La05
1Ep11
2Op08
2Ga05, 3Ca04, S3Dc03
S3Cb04, S3Gb01
S3Mb01
2Fa10
2La06
2Ka01
2Cp08
1Mp13
2Lp04, 2Lp05, 2Lp06
S3Eb01
2Fp01
1Gp11, 1Gp12
1Np02
1Jp10
S3Bc06
1Ip04
3Ea10
1Lp11
1Cp08, 2Ca12
3Ia04
1Mp15, 1Mp18, 3Ha04
2Lp06
1Fp11
2Kp03
2Ia03
2Fa05, 2Fa06
2Ip10
2Gp08
3Ma06
1Cp03
1Gp09
2Gp04
2Ja07
2Ja01
2Ep09
1Mp01
1Kp04
1Hp15, 1Jp01, 1Jp02,

303

宮本
三好
三好

義孝
佑奈
柚紀

1Jp03, S3Cb01, S3Cc05
1Op12
2Na11
1Cp06

む
穆 廷林
2Oa04
向井 克之
1Cp16
向井 伸彦
3Ca09
向山 正治
1Jp04
ムスタファ ヌルル・アシファ 2Ha12
俗多 秀美
2Ep09
武藤 宏行
3Na06
村井 雄大
2Fp06
村上 明男
1Fp07
村上 紀里子
1Kp06
村上 達也
S3Bb03
村上 舞
3Oa07
村上 将和
1Np13
村上 陽亮
2Lp06
村澤 友紀恵
1Np13
連 綾香
1Hp16
村瀬 祥光
1Mp18
村田 和義
2Ia03
村田 純
1Mp11
村田 俊輔
1Np09
村田 大
2Fp01
村田 昌浩
2Ip11
村田 和加惠
1Cp15
村中 俊哉
1Ep10
村松 和明
2Op03
村山 和隆
2Mp04
村山 晃一
2Fp11
村山 亮太
2Gp08
室 尚吾
3Ea07

め
馬久地

みゆき

2Ja11

も
望月 祐志
元島 史博
元根 啓佑
本村 圭
百瀬 直樹
百田 理恵
森 一樹
森 一博
森 健太朗
森 瞬也
モリ テツシ
森 智夫
森 利明
森 英樹
森 史也
森内 良太
森川 正章
森崎 久美子
森下 しおみS3Gc05
1Mp06
3Ia01
1Jp13, 1Jp14, 1Jp15
1Dp06
2Ca11
3Ia03
1Np15, 2Hp06
3Na04
2Ja06
1Mp18
1Fp15, 1Hp08, 2Na10
1Mp06
1Op02, 1Op03
1Mp14
1Np11
1Hp13, 1Hp14, 2Hp06
2Hp01
1Dp02

森田
森田
森田
森田
森田
森田
森田
森田
森田
森田
森本
森本
森山
森芳
森脇
諸星

暁人
啓介
健太
大地
友岳
直樹
真広
雅宗
将之
涼斗
一輝
兼司
陽介
邦彦
脩一郎
知広

2Ga01
3Ka06
2Op10
2Ga02
2Gp07
2Fp06
1Lp01
2Fp07
1Mp04
2Na08
2Cp02
2Mp07, 2Mp08
S3Mb02
3Ka07
2Op11
3Na08, 3Na09, 3Na10

や
八木 寿梓
八木 秀郁
八島 悠里乃
安池 一貴
保川 清
安田 直子
安本 玖太郎
八十原 良彦矢田 椋己
谷内江 望
矢内 健太郎
柳川 綾
柳澤 颯太
柳沢 真澄
柳田 湧太
柳田 藤寿
柳場 まな
柳谷 洸輔
柳本 敏彰
矢野 嵩典
矢野 達也
藪 浩
山内 隆寛
山内 悠至
山浦 由登
山形 雄一郎
山形 洋平
山上 あゆみ
山上 由莉
山岸 彩奈
山岸 一雄
山口 愛彩
山口 和真
山口 健一
山口 翔太
山口 政光
山口 湧己
山口 良弘
山崎 思乃

2Mp01
1Op03
1Jp10
2Ha10, 2Ha11
S3Bc032Ja09
1Gp14
2Gp09, 2Gp10,
2Gp11, 2Lp04
3Ga06
S3Gb03, S3Lc03
2Fp09
2La01
1Mp10
2Oa10, S3Bb04
2Op03
1Np01
3Ka03
1Np12
2Gp04
1Mp13
3Ia11
1Ip13
2Da12
3Ia10
3Ea11
1Kp11
3Ca06
S3Da03
3La01
1Op04, 2Op08
1Kp03
2Ma03
2Na04
2La07
2Ja01
1Kp13, 1Kp14
1Ip15
2Ca09, 2La02
1Cp06, 1Cp09, 2Ep06,
2Jp07, 2Jp08, 3Ha11

山崎
山崎
山崎
山﨑
山崎
山﨑
山崎
山路
山地
山下
山下
山下
山下
山下
山副
山田
山田

将太朗
敦史
貴史
智子
晴丈
祐二
勇人
大樹
秀樹
聡
忠紘
春来
光雄
美春
敦司
映未
修

山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山田
山中
山野
山野

憲治
茂
隆
朋宏
浩司
浩之
将大
真澄
みなみ
美和
芽生
佑樹
裕紀
勇人
尚子
範子

山平
山村
山村
山村
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山本
山脇
遣水
鎗水

真也
栄虎
茂樹
英樹
恵理
佳奈
航平
修也
哲郎
哲史
英樹
美也子
恭士
裕貴
耀吾
涼平
千佳
潤
透

1Ep16
1Np07
3Ha03
3Oa09
1Kp01
2Na05
2Ga10
2Gp11
2Fa10
1Np02
2Op06
3Ia07
3Na05, 3Na06
1Np09
1Cp07
1Dp09
2Ga05, 3Ca04,
S3Dc01, S3Dc03
2Ha06
2Oa03
1Np10
1Ep09
1Mp04
2Ia10
1Gp03
2Oa04
1Cp17
2Ka07
2Ma09
2Ka02
1Lp09
3Ka07
3Ga01, 3Ga02
2Ip04, 3Ma05,
3Ma06, 3Oa04
S3Bb04
1Gp01
S3Fb02, S3Fb04
2Ka09
2Jp11
2Ca02
2Oa02
3Ia04
2Cp10
2Na03
1Kp03
2Ga02
3Ka01
2Da11
2Fp05
2Oa11
2La02
2Da10
2Gp06, 2Gp07

ゆ
湯川
雪本
湯村

貴弘
寛
秀一

3Ka04
2Ha07, 2Ha08
3Ka01

304

由里本 博也
尹 基石

3Ka01
3La03

よ
叶 暁亭
養王田 正文世嘉良 宏斗横江 奨
横尾 岳彦
横田 亜紀子
横田 篤
横田 早希
横田 大輝
横山 佐一郎横山 春花
吉岡 育哲
吉岡 貫太郎
吉岡 実咲
吉川 秀一
吉川 翔太
吉川 千晶
吉川 友理
吉﨑 由美子
吉田 磨仁
吉田 啓
吉田 圭佑
吉田 健一
吉田 浩爾
吉田 聡
吉田 慎一
吉田 琢哉
吉田 知華
吉田 知哲
吉田 豊和
吉田 尚弘
吉田 信行
吉田 春菜
吉田 真梨
吉田 理一郎
吉野 知子
吉原 賢
吉原 静恵
吉原 侑希
吉見 啓
吉村 緑
吉村 弥生
吉本 将悟
吉本 真
善本 裕之
依田 聖未
依田 伸生
米井 嘉一
米倉 円佳

1Jp07
1Ip18, 2Lp02
3Ga02, 3Ga03
1Gp04
2Gp01, S3Mc01
1Mp01
1Gp15, 3Ka08
2Fa01, 2Fp10
2Cp08
2Ja11
2Cp09
2Mp09
1Op14
1Ip02
2Ca10
1Jp02, 1Jp03
1Mp06
1Mp13
2Cp04, 2Cp05, 3Ca01
2La12
2Oa07, 2Oa08
1Gp15
1Gp09
2Ha06
3Ca11
2Fp01
2Op11
2Cp09
1Lp10
2Lp04, 2Lp05, 2Lp06
S3Fc02
3Ka09
2Op03
3Fa08
3Ca02
1Fp05, 1Lp07, S3Bb02
2Op09
2Np01, 2Np02
2Ca08
2Fa05, 2Fa06
2Ga04
S3Mc01
1Ip14, 3Fa06, 3Fa07
1Gp15
S3Mb07
1Op13
2Jp07, 2Jp08
2Cp11
1Hp09

ら
羅
楽

宮臨風
隆生

1Fp16
3Ga02

り
李
李
李
李
劉
劉
劉
林

文成
歓
昊
在郁
暁麗
涛
雅軒
理希

2La07
2Fa11
3Oa08
1Lp05
2Ka02
2Ja03
1Np14
2Ma04

わ
ワイズ 里沙2Ma01
ワイナンス マシュー
2Da11
若井 暁
1Kp10, 2Fa04, 2Ga03
和氣 駿之
1Mp11
分部 友紀
2Ha10, 2Ha11
和田 潤
3Ca10
和田 征太郎
2Jp10
和田 健彦
S3Gc06
和田 大
3Ka08
和田 愛未
1Mp17
和田 竜之介
1Kp11
渡部 昭
2Ma05
渡辺 一樹
3Ha10
渡邊 桂子
2Oa05
渡邉 研志
1Kp07
渡邉 好一
3La04
渡辺 智
1Jp14
渡邉 荘爾
2Ia02
渡邉 泰祐
1Kp06, 3Ca03
渡辺 大輔
2Da07, 2Da08, 2Da09,
渡辺 隆司
渡邊 崇人
渡邉 徹
渡邉 直暉
渡邉 肇
渡邉 輝
渡部 広機
渡部 裕美
渡辺 万由子
渡辺 芳人
渡邉 理沙
渡邉 凌
渡部 玲子
渡部 裕介
汪 雪

2Ka11, 2Ka12, S3Mb08
2Ga01
2Ga01
2Gp09, 2Gp10, 2Gp11
2Ip11
2Ga10
1Ip12
2Oa03
2Mp05
1Dp11
1Mp10
2Mp10
1Hp15
2Jp11
2Gp03
3Oa05

305

キーワード索引A
A functional amino acid accumulation
2Da09
2A peptide
2Fa10
A-fuel-oil
2Na11
A.kawachii
1Kp11
abiotech stress
1Ep06
absolute quantitation
1Jp17
Accessary enzyme
1Mp16
accreditation
A1Aa01
Acetate
1Kp08
acetic acid
1Cp05, 1Jp05
acetic acid bacteria
1Gp05, 1Ip16,
2Jp04, 2Jp05
acetylation
2Ia02, 3Ma11
acetylcholine esterase
3Ma11
acetylome
2Ia02
2Cp01, 2Fp11, 3Ea06
acid tolerance
Acidomonas methanolica
2Jp05
acidophiles
1Ip16
acidphilic activity
S3Bc02Acinetobacter
1Ip14, 3Fa06,
3Fa07, S3Gc03
aconitate isomerase
2Mp09
acrolein
2Ia04
actin
1Mp04
actinomycetes
1Mp16, 2Ka03, 2La11
activated carbon
3Fa05
activated sludge 1Np15, 1Np16, 2Na12
active components
S3Kc05
active site structure
3Ma08acyl homoserine lactone 3Na09, 3Na10acyl-ACP reductase
2Lp09
adaptive laboratory evolution
2Kp09
adenylation domain
3Ma02
adhesion
1Cp09, 1Ip14, 3Fa06,
3Fa07, S3Gc03
adipose-derived stem cells
1Op09
adsorption
3Na02
1Fp09
aerial culture condition
aerial microalgae
1Fp09, 2Hp09,
2La06, 3Fa04
aerobic hydrogen production
1Fp15
afﬁnity chromatography
2Fp01
afﬁnity selection
2Ip04, 2Ip05
AFM
2Op08
agar plate
3Ea04
Agar plate culture
S3Cc04
agarose2Op06
aggregation
A1Aa02
agmatine
2Ga09
agricultural technology
S3Kb04
agricultural waste
S3Da05
Agrochemicals
2Na08

Agromyces sp.
2Lp04
AI
S3Gb05
air quality control
1Np17
airlift bioreactor
1Fp07
Alcohol acyltransferase
1Mp06
alcohol dehydrogenase
2Mp03
alcoholic fermentation 2Ka11, S3Mb08
aldoxime-nitrile pathway
A1Aa02algae
2Mp01
alginate 1Jp05, 1Mp18, 2Hp08, 3Fa08
Alginate beads
2Hp05
alginate lyase
1Mp18
alkaline phytase
1Mp12
alkane biosynthesis
2Lp09, 2Lp10
Alkanediols
2Lp04
alkyl alpha-glucoside
2Mp10
alpaca VHH antibody
1Dp08
alpha-1,3-glucan
S3Dc03alpha-EG
2Cp08
alpha-glucosidase
2Mp06, 2Mp10
alpha-isopropylmalate synthase 2Da08
alternative oxidaze
2Kp03
Alzheimerʼs disease
1Ip12
Alzheimerʼs diseases
2Ia05
amazake
2Cp10, 2Cp11, S3Db04
amino acid
1Np02, 2Jp02, 3Ia07
amino acid methyl ester
3Ma11amino acids
S3Da043-amino-4-hydroxybenzoic acid 1Fp11
aminoacylase
3Ma09
6-aminohexanoate
2Ka06
aminopeptidase
3Ma01, 3Ma04
aminotransferase
1Jp11, 2Ka06
amylase gene
2Ga05, S3Mb04
amyloid
1Dp10, 2Ia04, 2Ia05, 3Ia09
Amyloid-beta
1Ip12, 2Ia05
amyloidgenic proteins
2Ia04
anaerobes
1Gp12
anaerobic bioremediation 2Na06, 2Np02
anaerobic condition
1Np12
anaerobic respiration
2Hp02, S3Fb04
anchor shape
1Fp06
angiogenesis
1Ep02
angiogenic activity
1Ep01
animal alternative
S3Lb02
AnMicroS3Kc02anthocyanidin
2Ca10anthocyanin
1Ep11, 2Ca10
Anti - mutagenicity
S3Db01anti-idiotype
1Ep09
antibacterial
2Ep09, 2Kp06,
3Ia05, S3Kc05
antibacterial chlorophylls
2La06
antibacterial substances
3Ea01
antibiotics
2Gp03, 2Ha08, 2Ka03

antibody

1Dp01, 1Dp06, 1Dp07,
1Dp09, 1Gp14, 1Ip02, 1Ip03,
2Fa12, 2Ia12, 3Oa08, 3Oa10,
S3Gc02, S3Lc02, S3Mc05
antibody drug
1Ep09
antibody fragments
2Fp01
antibody glycosylation
2Fa09
antibody mimetics
2Ip01
antibody-binding protein
1Lp11
antifungal activity 1Ip11, 3Ea08, 3Ea11
antifungal agents
2Kp05
antigen
1Ip04, 2Ia01
antigenase
1Dp04, 1Dp11
antimicrobial
S3Da02antimicrobial activity
2La04, 3Ea07
antimicrobial materials
2Ep11
antimicrobial substances
2La11
antimonate reduction
S3Fb04antimony
3Na04
antimony trioxide
S3Fb04
antioxidant
2Ca10
apoptosis
1Ip11
apple
1Cp16
aptamer
1Ep08, 1Ep09
Arabidopsis thaliana
1Ep16
archaea
2Ma09, 2Ma10, 2Ma11
arginine
3Ca09
arginine uptake
3Ca10
aromatic amino acid
3Ma10
aromatic chemicals
S3Hb03aromatic compound
2Ka05, 3Ka05
aromatic ring compound
1Jp12
arsenic reduction
S3Fb02Arthrobacter
2Ka06
artiﬁcial inteligence
3Ia04
artiﬁcial intelligence
2Ia11
artiﬁcial neural network
3Ha10
artiﬁcial protein design
1Mp02
ASEAN
S3Kc02
aspartic protease
2Ma04
Aspergillus aculeatus
1Hp11
Aspergillus glaucus
2Ma04
Aspergillus kawachii
3Ca01, S3Dc05
Aspergillus luchuensis 2Ga05, 3Ca02,
3Ca03, 3Ca04, 3Ca05,
S3Dc02, S3Dc03, S3Dc04
Aspergillus luchuenss
S3Dc01Aspergillus nidulans
1Np09, 2Kp03,
2Ma03
Aspergillus oryzae
1Kp10, 1Kp11,
1Kp12, 2Ca01, 2Fa04, 2Fa05, 2Fa06,
2Ga03, 2Ga04, 2Ga06, 2Ia10, 2Kp01,
2Ma05, 3Ca06, 3Fa05, S3Db01,
S3Hb01, S3Mb04
Aspergillus terreus
3Ga05

306

astaxanthin
1Fp14
asymmetric hydrolysis
2Lp06
Asymmetric oxidation
2Lp04
atmospheric pressure plasma
2Ma02
atomic force microscopy 1Ip13, S3Gc01
Atomic Force Microscopy(AFM) 2Op02
ATP
1Jp07
ATP regeneration
1Jp08
atrophy
2Op09
AuNP
1Lp02
AuNP/MNP
1Lp05
Aurantiochytrium
1Kp07
autoencoder
3Ia04
automation
S3Lb03Autonomously replicating plasmid
2Gp10, 2Gp11
autothermal aerobic digestion S3Cb03
autothermal thermophilic aerobic digestion
2Na09
autotransporter
3Fa07, S3Gc03
auxin
1Hp15
Awamori
2Da07, 3Ca04, 3Ca05,
S3Dc02, S3Dc04

B
B cells
1Dp12
B-cell receptor
1Dp05
Bacillus
2Ha04
Bacillus cereus
S3Fb01
Bacillus licheniformis
2Ja03
Bacillus subtilis
1Gp09, 1Gp10,
2Ca09, 2Ha08, 3Ha01
Bacillus subtilis natto
2Mp08
Bacillus thuringiensis
2Fa02
bacteria
2Na03
bacterial conjugation
1Gp09
bacterial consortium
2Hp08, S3Cb03
bacterial cultivation
2Fp07
bacterial detection
2Fp07
bacterial diversity
3Ca09
bacterial growth enhancement
2Ha04
bacterial microﬂora
1Hp18
bacteriocin
1Cp13
Bacteroides
1Cp10
baculovirus
1Ip07, 2Fp10
bakerʼs yeast
2Ka12banana2Ca02, 2Ca03
basidiomycetes
2Gp06, 2Na04
beauty materials
2Cp08
beer-spoilage
A2Cp01
beige adipocytes
2Oa05
benchtop NMR
1Lp15
beneﬁt
S3Kc04benzene
1Mp10
beta hairpin peptide
2Ip02
beta-propeller phytase
1Mp12
biased-randomization
3Ia01
biﬁdobacteria
1Gp15
big data
S3Gb01

Bile acid
1Cp08, 1Ep04
bio-3D printer
1Op08, 1Op09
bio-base plastics
S3Cb04
bio-based monomer
2Ha03
Bio-digital
S3Kb01
bio-nanocapsule
1Lp09, 3Oa08
bio-polymer
2Ep05
bio-production
1Gp05
bioactuator
2Oa06
bioaugmentation
2Na11
bioconjugate
S3Bc06
bioconversion
1Fp10
biodegradable dispersant
3Ea09
biodegradable plastic A1Aa04, 3Ga01,
3Ga02, 3Ga04, 3Ha03, 3Na08
biodegradation 1Hp07, 1Np13, 1Np18,
2Na02, 2Na03, 3Ga01
biodevices
1Lp14
biodiesel
2Hp10
biodiesel fuel1Fp02, 2Hp07, 3Fa05,
S3Eb03
bioeconomy
S3Kb01, S3Kb02
bioenergy
2Lp08
bioethanol
2Ha05
bioﬁlm 2Ha08, 2Hp09, 3Na08, S3Da02
bioﬁlms
3Na07
biofuel
1Hp09, 2Hp04, 2Ja04
biofuel cell
3La04, 3La05, 3La06
biofunctional property
S3Ec03
bioimaging
S3Bb01bioindustry
S3Kb02bioinformatics A1Aa02, 2Ip09, 2Ip11,
2Jp01, 2Kp01, 3Ia03, 3Ia07, S3Hc03
biological containment
1Jp14
biologics
S3Lc01, S3Mc01
bioluminescence
1Dp08, 2Lp10
biomass 1Fp12, 1Hp02, 1Hp10, 1Hp11,
1Hp14, 2Hp06, 2Hp07, A2Hp01,
3Ha03, 3Ha10, S3Da01, S3Da03
Biomass degrading enzyme
1Mp16
bioMEMS
2Oa06
biomimetic membrane
S3Bc01
biomineralization 1Ip10, 2Ja08, 3Fa01,
3Fa02, 3La07, 3Na06, S3Fb01
biopharmaceutical
S3Lc02
biopolymer
3La09
bioproducts
1Hp09
bioreactor
2Fa12, 2Na04
bioreﬁnery
1Hp05, 2Ma02, 3Ha05
bioremediation 1Gp12, 2Na05, 2Na10,
2Np01, 2Np04, 2Np06,
3Fa01, 3Na06, S3Fb02
bioresources
A2Hp01, S3Kc01,
S3Kc03
biosafety
1Jp14
biosensing
2Ip03
biosensor 1Gp13, 1Lp06, 1Lp09, 1Lp10,
2Ia01, 2Ia02, 3Oa09, S3Bc01, S3Gc04
biosilica
2Fa03, 3La07

biosorption

1Np15, 2Np03,
2Np04, 3Fa03
biosurfactant
1Fp17, 2Ka08
biosynthesis
2Ha02, 2La10, S3Gb05
biosynthetic pathway
2Ip10
biotechnology
S3Gb01, S3Kb01,
S3Kb04
Biotherapeutics
1Kp18
biotin ligase
1Lp11
biotinylation
1Ip04
biovolatilization
3Na03
bisphenol A
1Np13, 1Np15
bisphenol S
1Np18
bitter peptide
1Ep05
Black koji mold
S3Dc01
blood pressure
S3Db04BRC
S3Kc01
Brevundimonas vesicularis
1Ep07
brown rice
2Ca01
bulking
2Na12bulky ketone reduction
2Mp03
2,3-butanediol
3Ka06
1,2,4-Butanetriol
3Ka04
butanol
1Jp04, 2Jp03

C
C metabolic ﬂux analysis

A1Aa03,S3Eb0213C-Isotope labeling
2Ja11
13C-metabolic ﬂux analysis
1Kp16,
2Op04, 3Ka10
C2C12
1Op18
C4 chemicals
1Kp06
Ca2+-binding sites
3La01
Caenorhabditis elegans 2Np01, 3Ia10
calcium
S3Mb03
calcium alginate beads
3La10
callus
3Fa08
Calvin cycle
1Jp18
Calyptogena community
3Ea11
cAMP
2Kp02
cancer biomarker
1Ip02
cancer cell
1Ep03
cancer cells
1Op08
Cancer heterogeneity
2Oa10
cancer immunotherapy
1Ip01
Cancer metabolism
2Op04
cancer metastasis
2Op08
Candida albicans
1Ip11, 2Kp05
Candida boidinii
3Ka01
caprylic acid
2Da10
carbohydrate-protein interaction
S3Gc01
carbon dioxide 2Ep01, 2Jp06, S3Fc02
carbon nanomaterial
3La04carbon nanotube
1Lp14
carbon source
1Kp01
carbon/nitrogen ratio
2Hp09
carbonyl sulﬁdeS3Fc0213

307

Cardiomyocyte beating
2Op07
cardiomyocyte differentiation
1Op13
carotenoid
1Kp01, 1Kp07
carotenoids
1Fp09, 2Gp03
catalytic antibody
1Dp04, 1Dp10,
1Dp11
catalytic triad
S3Bc02
cationic peptide
1Ep01, 1Ep02
CBM
1Hp11
CD90
1Op05
cell
S3Gc06
Cell and lipid production
1Fp03
cell death
2Gp04
cell diversity
1Np13
cell fate control
S3Lc06
Cell free expression system
1Dp02
cell manufacurability
S3Lb03cell membrane
3Ea08, S3Mb03
cell migration promotion
1Ep02
cell morphology 2Oa08, 2Oa09, 3Ia08,
S3Lc07, S3Mb03
cell processing
2Oa04
cell proecssing
S3Lb03cell quality control
2Oa11
cell sheet
S3Lb01cell sorter
S3Bb04cell stiffness
2Op08
cell surface display
3Fa03, 3Ha07,
3Ha08
cell wall
2Fa05, 2Fa06,
2Ka10, S3Mb02
cell wall degradation
1Cp16, 1Cp17
cell wall integrity
3Ea08
cell-cell interactions
2Oa12cell-free protein synthesis
1Dp01,
1Dp03
cellobiohydrolase
2Ia10
cellobiose
1Kp02, 3Ha02
cellobiose dehydrogenase
1Hp10
cellulase
1Cp16, 1Cp17, 1Cp18,
1Mp15, 1Mp16, 2Mp05,
3Ha04, S3Cc02
cellulose
1Cp09, 1Hp02,
2Ma02, 3La08
cellulose degradation
1Hp08
cellulose nanoﬁber
1Hp03
cellulose-binding domain
2Ia10
cellulosome
1Fp08
central metabolism
3Ka08
centromere
2Gp04, 2Gp10
ceramide
1Cp16
Ceriporiopsis subvermispora
2Ga01
Cesium2Np01
chamber assay
1Op15
chaperonin
2Ma09chemical biology
S3Bb01chemical modiﬁcation
S3Mc03chemical production
S3Hb04chemosensory protein
1Ip17

chemotaxis
1Ip17, 1Np01
chemotaxonomy
2La01
chicken
2Op11
chimeric receptor
1Ip17
Chinese hamuster ovary cells
3Oa04
Chinese spirits
2Cp05
CHIR99021
1Op13
chiral alcohol
2Mp03
chitin1Cp09, 1Gp03
chiton2Ja08
chitosan
2Ca02, 2Ja01, 2Ja02
Chlorella sorokiniana
2Hp05
CHO cells
2Fa09, 3Oa05,
3Oa07, S3Lc02
chondrocytes
2Op03
Chromatography
1Ip09, 2Fp03,
S3Lc05chromosome aneuproidy
3Oa04
Chromosome engineering
2Gp05
chronological lifespan1Cp15
circadian oscillation
3Oa03
circRNA
1Gp18
Circular Dichroism
1Ip17
circular industry
S3Fc04circular RNA
1Gp16
circulating tumor cell
S3Bb02
cis,cis-muconic acid
2Ha03
citric acid
3Ca01
Citrobacter
2Ja01, 2Ja02
cleavage equivalence
1Lp17
cleavage sites
1Ep16
click chemistry
S3Mc04clock gene
3Oa03
cloning
2Oa07
closest species to Heliorestis baculataT
2Na09
Clostridium
1Jp05
Clostridium beijerinckii
3Ha04
Clostridium cellulovorans
1Mp15
Clostridium clariflavum
2Jp04
Clostridium saccharoperbutylacetonicum
1Jp04
Clostridium thermocellum
2Jp04
Co-expression
1Ip08
2Ja06, 3La11, S3Bc05
CO2 ﬁxation
Coccomyxa
2Hp03
coculture
2Na10, 3Ha02
coenzyme
S3Bc05coenzyme-independent dioxygenase
3La10
coffee
1Cp17
Coiled-Coil
2Ia09
cold-adapted microorganism
1Gp06
collaboration
S3Kc04
collagen score
2Cp08
Collagen synthesis stimulation 1Op06
colony morphological analysis
2Oa07
Color changes
2Ca03
Colorimetric bioassay
1Lp03

Combinatorial biosynthesis
3Ka02
composite
1Hp03
compost
1Hp15, 1Jp03
comprehensive analysis
1Ep16
Concentrated juice
3Ca11
consensus motif
1Np05
contamination
1Jp13
continuous culture
2Fp04
control process
S3Cc05
controlled release
1Op04
cooling water system
3Na09
coral
2Ja09, 3Ia02
corn cob
1Fp12
corrosion
S3Ec01
Corynebacterium glutamicum
1Fp11,
1Np03, 1Np04, 1Np05, 2Ka05
cosmetic
3Ea03
counterselection
1Gp04
craft beer
S3Kb03Cre-loxP
3Oa05
Cre/LoxP system
2Hp03
CRISPR-Cas9
1Kp07
CRISPR-PCD
2Gp05
CRISPR/Cas9
2Gp06, 3Oa01
Critical Quality Attributes
1Kp18
cross-linking
S3Bc06CRP
2Fa08
crude glycerol
S3Kb03Cryopreservation
2Oa03
Cryptomeria japonica
S3Db03
Crystal protein
2Fa02
crystal structure
S3Bc04
crystallographic study
2Ia09
cultivation
2Fp08
culture collection
2Ip10
culture condition
S3Da01
culture ﬂuid
2Ep05
Culturomics
1Cp07
CutA1
2Ip03
cyanobacteria
1Fp07, 1Fp08, 1Ip15,
1Jp13, 1Jp14, 1Jp15,
1Jp16, 2Ga12, 2Ip07, 2Jp01,
2Jp03, 2Lp07, 2Lp09, S3Ec04
cyclic imino acid
3Ma07
cyclic nucleotide-gated channel 3Oa09
CYP505D6
2Ma01
Cys-SO2Lp02
Cystathiine beta-synthase
1Kp03
cytochrome P450
1Fp10, 2La09
cytochrome p450 monooxygenase 2Lp11
cytoskeleton
1Mp04

D
3D culture

1Op12, 2Oa10, 2Oa11,
2Oa12, S3Lb02
2D electrophoresis
3Ca10
3D image analysis
1Op07
3D tissue
1Op08, 1Op09
D-amino acid 1Kp15, 2Ma07, 3Ma02,

308

S3Bc04D-lactic acid
1Fp12
D-xylose
3Ka04
Daphnia magna
1Gp13, 2Ga10
data integration
2Ip08
data science
S3Cb05
database
2Ia12
de-differentiated fat cells
2Op05
decarboxylase
2Lp05
deep biosphere
S3Fc03
deep eutectic solvents
1Fp01
Deep sea bacterium Aneurinibacillus
sp. YR247
3Ea11
deep-sea organism
2Mp05
deeplearning
3Ia04
degradation
1Np14, 3Na08
Dehalococcoides
2Na05
dehalogenation
2Na06
dehydrogenase
S3Bc04dehydrozingerone
2La02
dengue virus detection
1Lp02
denitriﬁcation
S3Fc01
Designed antibody
2Ip06
designed biomass
S3Cc03
destabilization
1Mp03
detection
1Gp17, 1Lp05, A2Cp01
deubiquitination
3Ha06
development
S3Lc03deviated cell state
2Oa07
DGGE
S3Db02
diatom
1Fp05, 2Ga08
dicarboxylic acids
S3Hb03
Diester
2Lp06
dietary ﬁber
1Cp10
differentiation
1Op03, 2Op06
differentiation potential
2Oa01
dimerization
3La02
dimorphism
2Kp02
1,4-dioxane
2Na03
dipeptide
2Ga06, 3Ma02
diploidization
3Ha08
Dipodascopsis
1Np07
direct electron transfer
3La06
direct fermentation
1Jp11
directed evolution
2Lp10
Disinfectant
2Ep07
disinfection
2Ep08
disordered protein
S3Gc04dissociation
2Oa02
diversity
S3Kc04DNA
1Ep09
DNA aptamer
1Lp09
DNA assemble
2Gp11
DNA barcode 3Ia01, S3Gb03, S3Lc03
DNA fragment analysis
3Na01
DNA ligase IV
2Gp09
DNA polymerase
2Ia08
DNA sensor
1Lp10
DNA sequence
3Ia04

DNA synthesis
S3Gb03
DNanocap
S3Hc06
DO-stat2Ep03, 2Fa11
dockerin
1Fp08
dough fermentation
2Ka12
downstream process
S3Cc03droplet microﬂuidics
2Fp07
Drosophila melanogaster
1Kp13,
1Kp14
drug delivery system
3Ia09, 3Oa08,
3Oa10, S3Bb03
drug resistance
2La02
DT40 cells
1Dp07
duckweed
1Hp13, 1Hp14
dye-linkd dehydrogenase
2Ma07
dye-linked dehydrogenase
2Ma08
dynamical analysis
2Kp07

E
earthworm
2Ha07
ecdysteroid
1Gp13
eicosapentaenoic acid
2La12electrochemical cultivation
S3Ec04
electrochemical detection
S3Gc01electrochemistry
S3Ec03
electron
2Ha10
electron transfer ﬂavoprotein
2Hp02
Electrophysiology
2Op07electrospinning
1Lp14
elongation
2La08
embryoid body
1Op13
emulsiﬁcation
2Ka08, 2Kp05
emulsion
2Fp07, 2Fp08
emulsion droplet
2Fp06
enantioseparation
1Kp15
encapsulation
2Ia06
endocrine disrupting chemicals 1Np18,
2Ga10
endoglucanase
1Mp15
endoglycosidase
S3Mc05endoglycosidases
S3Mc06
endonuclease
2Gp02
endotoxin
3Ea02
Engineered yeast
3Ka02engineering education
A1Aa01enrichment culture
3Na04
environmental analysis
S3Cb05environmental microorganisms 1Lp07
enzymatic conversion
A1Aa02
enzymatic residue
1Hp06
enzymatic synthesis
S3Bc04
enzymatic transesteriﬁcation
1Fp02
enzyme1Mp05, 2Ip11, A2Hp01
enzyme activity
2Lp07, S3Hc02
enzyme engineering
2Lp09
enzyme immobilization
3La09
enzyme inhibitors
S3Kc05enzyme production 1Fp16, 2Fa05, 2Fa06
enzyme reaction
1Jp10, S3Bc06

Epidermal Growth Factor Receptor
3Oa10
epigenetics
1Ip03
epitope mapping
2Ip06
ergothioneine
2Ka02
Erlenmeyer ﬂask
S3Cc04
Erythritol
1Kp06
Escherichia coli
1Cp04, 1Dp01,
1Dp03, 1Ep06, 1Gp01, 1Jp08, 1Jp10,
1Jp11, 1Jp12, 1Mp10, 2Ep03, 2Ep10,
2Fa11, 2Ha09, 2Kp07, 2Kp09,
2Kp10, 3Ea02, 3Fa09, 3Ha02,
3Ia05, 3Ka10, 3Ka11, S3Hb03
esoxomes
S3Hc01
esteriﬁcation
1Fp09
ethanol
1Kp02
ethanol fermentation
1Hp08, 3Ha10
ethanol production
1Jp17, 2Ha06,
2Jp06, 3Ka06
ethanol stress
2Gp08
ethyl alpha-D-glucoside (alpha-EG)
2Cp09
2-Ethyl-2-methyl-1,3-propanediol
2Lp04
ethylene
1Fp08, 1Gp02
Euglena
2Hp02
Euglena gracillis
2Ca12
Euplectella
1Ip10
evolution
2Ia07, 2Ia11
evolutionary engeneering
3Ia05
ex vivo glycosylation
2Fa09
exosome 1Ep03, 1Gp18, 2Fa07, 3Oa10
expression
2Op11
expression system
1Gp05, 1Gp07
extracellular matrix
1Op02, 1Op05
extracellular electron transfer
2Ha11
extracellular electron transport S3Ec02

F
Fab fragment
FAS2
fast-growing microbes
fatty acid
Fe(III) reduction
fed-batch culture

2Fa10
2Da10
3Ea04
2Kp06, S3Eb03
S3Fc03
2Ep03, 2Fa11,
2Jp08, 3Ha03
feed development
2Ja10
feedback
1Np04
Feline calicivirus
2Ep07
fermentation
2Ca01, 2Ca11, 2Cp06,
2Ha06, 2Jp02, 2Ka03,
2Ka07, 2Kp04, 2Kp06, 3Ca11
fermentation control
2Cp03
fermentation inhibitor
3Ha08
fermented plant extract
2Ca10
fermentor
2Ep04
Fetal bovine serum
1Op17
ﬁeld omics
S3Cb02ﬁeld test
S3Cc01

309

ﬁlamentous bacteria
2Na12
ﬁlamentous fungi
1Kp12, 2Fa05,
2Fa06, 2La09, 2La12
ﬁreﬂy luciferase
1Dp08
FISH
2Na09
ﬁsh diversity
S3Cb05ﬁtness1Np11
ﬁtness cost
1Gp11
Flavonoid
2La05
ﬂavoprotein
1Gp12, 2Ma07,
2Ma08, 2Mp11
FlbC
2Ga04
Flexivirga alba ST13
3Na01
ﬂoc formation
3Fa09
Flocculant
2Ja03
ﬂocculent Saccharomyces cerevisiae
3Ha09
ﬂoral
2La01
ﬂour
2Ca11
ﬂow cytometry
1Gp12, 2Oa01
ﬂower yeast
1Fp13
ﬂuctuation
3La05
ﬂuorescence
2Ia01
ﬂuorescence spectra
1Dp09
ﬂuorescent aptamer
1Ep08
ﬂuorescent microscopy
1Dp09
ﬂuorescent protein
2Ga11
ﬂuorometric biosensor
1Lp02
ﬂux balance analysis
2Ip08
FMO
S3Gc05food additives
3Ea02
food microbiology
2Ca11
food pairing
S3Db03
forest biomass
1Hp16
formate dehydrogenase 1Fp15, S3Bc05
fouling
2Fp04
Fragment molecular orbital
S3Gc05freeze tolerant
2Cp02
freeze-thaw stress
2Ka12
fucoidan
2Mp01
full consensus design
1Mp02
full-length cDNA synthesis
2Ka01
fumarase
2Lp07
functional food
1Ep04
functional property
2Kp06
functionality
S3Db02
fungus
S3Mb03
furfural
2Ha05
fusion protein
1Fp16, 2Fa03

G
G-protein-coupled receptor
G-quadruplex
GABA
gag protein
gallic acid
[GAR+]
garlicgas ﬁlm

1Lp12
1Ep08
2Ha02
1Ip08
2Lp05
2Ka11
1Kp03
1Ep12

GC-MS
1Kp16
GC/MS 1Lp16, 2Ca04, 2Ca06, 2La01
gelatin
2Oa12
gene
1Ep17
gene disruption 2Ja01, 2Ja02, S3Mb06
gene expression
1Gp01, 2Ca02,
3Ha09, S3Bb03, S3Mb04
gene expression analysis 2Gp07, 2Op05
gene knockout
1Gp03
gene regulation
3Ca01
gene silencing
1Ep15
gene transfer
1Np12, 1Op04, 3Oa07
generate electricity
2Ha07
genetic circuit
1Jp09
genetic code
2Ia07
Genetic Modiﬁcation
3La07
genome1Lp08, 2Ga03, S3Dc01
genome analysis
2Ga02
genome design
S3Hb02
genome editing
1Jp04, S3Gb03,
S3Hb01, S3Lc03
genome engineering
2Ga07, 3Oa01,
S3Lc04genome integration
1Gp13, 2Ga10
genome mining
2Ga02
genome scale model (GMM) A1Aa03,
S3Eb02
Geobacillus
1Gp07, 1Gp08
germination
1Gp10
GFP
2Ga11
GID complex
S3Mb05glaB
2Ga04
glucan2Fp04
Gluconobacter
2Jp10
glucose
3Oa03
glucose dehydrogenase
2Mp11
glucose repression
2Jp08, 2Ka11
Glucosyltransferase
1Mp11
glucuronoxylanase
2Ma06
glutamate fermentation
2Jp02
glutathione
1Kp05
glycemic control
S3Da04glycerol3Fa09
glycopeptide synthesis
S3Mc01glycoprotein
S3Mc05Glycoside hydrolase family 30 2Ma06
glycosylated peptide
S3Mc02,
S3Mc03glycosylation
2Ma04, S3Mc03,
S3Mc04, S3Mc05
Glycosylceramide
1Cp08
glycosyltransferase
2La05, S3Mc01,
S3Mc04gold colloid
S3Bb03gold nanoparticle
1Lp01
gold@silver nanohybrids
1Lp03
goldﬁsh
1Dp06
GP64
2Fp10
GPCR
1Dp05

GPI anchor
grainGreen chemistry
green ﬂuorescent protein
gSELEXgSELEX-Seq
GST-tag
GTPasegut
gut microbiome
gut microbiota

2Gp01
1Ep17
1Mp06
2Ia11
1Kp12
2Kp01
3La02
1Mp04
S3Cb01
1Cp07
1Jp03

H
hair follicle
1Op15
halo assay
1Hp12
Halomonas
3Ga03
Halomonas elongata
2Ha02
hazardous chemical
2Ha12
HBsAg
2Fp03
headspace
2Ep01, S3Cc04
headspace GC-MS
2Ip10
heart
S3Lb01heat shock protein
1Ip15
heavy metal pollution
2Np02
heavy metals
3Fa01
Heck reaction
3Ga06
Hemagglutinin
1Ip08, 2La03
heme containing membrane protein
1Hp10
hemicellulose
1Kp11
Hemodialysis
2Op07
Hepatitis B virus(HBV)
2Op02
hepatocyte
1Op11, 2Op05
heterologous production 1Ep07, 3Ka01
hexavalent chromium
3Na01
High cell density culture
1Fp03
high pressure
2Cp03
high solid state scariﬁcation
1Fp06
high-throughput screening
2Lp10,
2Op09, 3Ia09, 3Oa09
high-throughput sequencing
S3Fc03hippuric acid
3Ma09
hiPS cells
2Oa03
histidine
2Ka02
histidine rich protein
1Ip10
homologous recombination
2Gp06,
2Gp09
human colon
1Cp11, 1Cp12
human excreta
S3Cb03
Human glucocerebrosidase
1Ep14
human induced pluripotent stem cell
2Oa01, 2Oa02, 2Oa07
human iPS cells
1Op13
human lymphocyte
1Op04
human monoclonal antibody
1Dp03
human skeletal muscle cells
2Op09
humic acid2Kp03
hyaluronic acid
2Ep06
hybrid hydrogel bead
3La09

310

hybrid vigor
2Da11
Hybridoma technology
1Dp05
hydrodynamic ﬁltration
2Oa04hydrogel
S3Bb02, S3Bb04
hydrogen activation
3La03hydrogen peroxide
2Ka09, 2Op10hydrogen-oxidizing bacteria
2Ja06
hydrogenase
1Fp15hydrogenase structural genes
3La03hydrolase
1Mp08, 1Mp17, 2Lp06
hydrolysis
3Ga04hydrophobin
1Ip13
hydroponics
1Ep10
Hydroxyapatite
2Fp02
4-hydroxybenzoate
2Ka05hydroxybutylic acid
3Ga02
3-hydroxybutyric acid
3Ga03
3ʼ-hydroxygenistein
2Ca07hydroxylation
1Jp10, 1Mp10
hyperphosphatemia
2Np05
hyperthermia
A2Fp01
hyperthermophile
2Ma11
hyperthermophilic
2Ia06
hyperthermophilic archaeon
1Gp03,
3La05
hypothetical proteins
2Ma03

I
ICP
S3Hc01IgA-enhancing effect
1Cp06
image analysis
2Oa10, 2Oa11, 3Ia08
image-based analysis
S3Lc07
image-based assesment
2Oa08
image-based evaluation
2Oa09
imaging analysis
1Lp10
imaging mass spectrometry
1Kp14,
2Op01, 3Ca07, 3Ca08, 3Na07
Imidacloprid
1Kp13
imidazole dipeptide
3Ma03
immobilization 1Fp16, 1Lp11, 2Ga08,
2Ga09, 2Ip03, 3Fa06, 3La08, S3Gc04
immobilized bacteria
1Jp05
immobilized carrier
3Na05
immobilized cell
2Hp05
immobilized cell culture
3Fa08
immunosensor
1Lp11
immunosuppression
1Dp12
immunotherapy
1Ip03
in silico screening
2Lp03
in siloco screening
1Ep04
in situ extractive fermentation S3Cc03
in vitro coupled transcription/translation
2Ia08
in vitro metabolic engineering 2Kp11,
A2Mp01, S3Cc06
in vitro model
1Cp11, 1Cp12
in vitro molecular evolutionary
engineering
2Ia08
in-process measurement
S3Lc07

inactive Cas9 system
3Ka06
indigenous skin bacteria
3Ea01
indigestible dietary ﬁber
1Cp11
Indonesian tempe
2Ca05
industrial development
S3Kb02
inertial force
2Oa02
inﬂammasome
2Ia05
information content
3Ia08
inhibitor
3Ha05
Inhibitory Chemical Complexes 1Fp04
Ink jet printing
2Oa03
innovation
S3Fc04
inositol
1Mp09
insect cell
2Fa10
Insecticide
1Kp13
insertion-sequencing
1Gp15
Interaction analysis
S3Gc05interface cultivation
1Kp09
intermediate ﬁlament
2Op08
international cooperation
S3Kc01interspeciﬁc cross
2Da11
intestinal bacteria
1Cp09, 2Np05
intestinal colonization
1Gp15
intestinal microbiota
1Cp10, 1Jp01
INTMSAlign_Angler
2Lp03
intracellular pH
1Ip16
intravenous immunoglobulin
1Dp12
ion characteristics
2Np04
ionic liquid
1Hp04, 1Hp05, 1Hp06,
1Mp05, 3La09
iPS cell
1Op14, 2Oa08
IPTG
3Ka07
iron
S3Ec01iron homeostasis
1Np09
iron respiration
S3Ec02iron sulfur cluster
1Np09
Iron-sulfur protein
3Ka04
irritation
1Cp02
isolation
1Cp07, 2Na09,
2Op03, S3Fc03
isomaltose
S3Db01
isoprenoid
2Lp08
itaconic acid
3Ga06

J
JABEE
Jamu
Japanese eel
Japanese sake yeast
Jeotgalicoccus
jumbo phage

A1Aa01
S3Kc05
2Ja10
2Da09
2Kp08
1Np10

K
kaolinKeio collection
5-keto-D-gluconate
ketose 3-epimerase
kifunensine
killer gene

3Ea09
3Ia05
2Jp10
2Mp07
1Ep13
1Cp14

kimoto3Ca09kinetic model
1Jp17
kinetics
1Mp15, 2Fp02, S3Hb05
Kluyveromyces marxianus
1Kp02
koji
2Cp11
Komagataeibacter europaeus
1Gp05
Kouleothrix
2Na12
kraft pulp
1Fp06
Kynureninase
2Fp02

L
L-amino acid ligase
3Ma03
L-glutamate
2Ha02
L-glutamate oxidase
1Mp02
L-lactic acid2Kp11, 2Ma08, S3Cc05
L-Leucine
2Da08
L-lysine alpha oxidase
3Ma10
L-rhamnose isomerase
2Mp08
L-theanine
1Jp11
lactate dehydrogenase
1Kp10
lactate-utilizing bacteria 1Jp02, 1Jp03
lactic acid bacteria
1Cp06, 1Cp13,
1Np01, 2Cp01, 2Jp07, 2Jp08,
2Jp09, 2Np04, A2Cp01, 3Ea06
lactic acid bacterial diversity
1Np01
lactic acid fermentation
2Jp11
Lactobacillus acidophilus
3Ea06
Lactobacillus bulgaricus
2Jp11
Lactobacillus gasseri
3Ea02
Lactobacillus plantarum 1Cp13, 1Fp12
Lactobacillus sakei
1Cp06
lactonase
3Na10
lactose1Kp02
laminin
2Fa04
Lanthanides
1Mp13
lasso peptide
1Ep07
Late Embryogenesis Abundant
2Fa02
latex
2Fa08
latex turbidimertic
2Fa08
LC-MS/MS
1Kp15
LC/MS
1Lp17
LEA peptide
1Ep06
leaf bacteria
1Np06
leakage
3Fa08
learning efﬁciency
3Ia11
LED
1Ep11
legume1Ep10leucine-responsive regulatory protein
1Ip16
light harvesting
S3Eb01light response
1Np06
light/dark transition
1Jp18
Lignan1Mp11
lignin1Hp02, 1Hp06, 2Ga01, 2Ha03
lignocellulosic biomass
1Hp04
lignocellulosic materials
1Hp05
Lilium japonicum
2La01
LINE-1
3Oa07
lipase1Fp01, 3La08, S3Db01

311

lipid
1Kp01, 2Ca08, 2Hp04, S3Da01
lipid accumulation
2Hp09, 3Ka03
Lipid droplet
2Fa01
lipid production
1Kp07, 1Kp08
lipid remodeling
2Gp01
lipid vesicle
1Cp02, 2Fp05
Lipid yield
1Fp04
Lipomyces
1Fp04, 3Ka03
Lipomyces starkeyi
1Kp04
Lipomyces starkeyii D35
1Fp03
Lipomycetaceae
1Np07
lipopolysaccharide
1Cp05
liposome
1Cp01
liquid chromatography
1Kp17
liquid culture
2Ep01liquid fertilizer
S3Cb03liquid nitrogen
3Ea05
liquor
2Da07
Litopenaeus vannamei
2Ca06
Livestock
S3Cb01
localized surface plasmon resonance
1Lp06
long chain fatty acids
1Fp05, 1Kp04
long tandem repeat
2Ga03
long-term stability
1Mp05
longevity
1Np08
Lotus japonicus
1Ep10
low shear and modeled-microgravity
culture3Ea06
low temparature
2Oa05
low temperature optimization
1Mp03
LPS-neutralizing activity
1Ep01
LSPR
1Lp02
luciferase
3Oa03
LysoPlasmalogen
2Mp04
lysosomal diseases
S3Mc06Mmachine learing
S3Hc03
Machine learning 1Lp15, 2Ip11, 2Ja11
Macrophage
2Ka08
magnetic nanoparticle
A2Fp01magnetic patterning
1Hp12
Magnetoﬂuoro immunosensing 1Lp04
major hitocompatibility complex 1Ip04
malate dehydrogenase
1Mp03
MALDI-Imaging Mass Spectrometry
1Kp13
MALDI-IMS
3Ca07
MALDI-TOF MS
1Cp07
maleic acid
1Hp01
malic acidS3Mb05malic enzyme
3La11
mammalian cell
S3Lc01
mandelic acid
3Ga02
manganese
2Np06
mannanase
2Mp02
manufacturing technology
S3Kb04
Maralia
1Ip06

marinemarine microalgae
marine microbiology
marine snow
marine technology
marker recycling
Mass spectrometry

2La07, 2Mp05
2Ga07, 2Hp05
3Ia02
2Ja10
S3Kb04
2Gp09
1Kp17, 1Kp18,
S3Lc05Mathematical analysis
2Op07
mathematical model2Kp07, S3Hb05
mating
2Gp02
Max-Blend
1Fp06
MazF
1Mp01
mechanobiology
2Op06
mediator
3La11
Medicago truncatula
2Lp11
medical device
1Op12
medium chain fatty acids
1Fp05
Megasphaera elsdenii
1Jp02
Megasphaera elsdnii
1Jp03
membrane curvature-sensing protein
2Fp09
membrane lipids
1Cp02, 2Fp09,
S3Mb02
membrane potential
S3Eb04
membrane prtotein
S3Bc01
membrane reactor
2Fp04
membrane technology
3Ha09
membrane vesicle
1Cp06
membrane vesicles
1Cp03
Merozoite surface protein 1-19
1Ip06
Merozoite surface protein 3
1Ip06
mesenchymal stem cell 1Op03, 1Op05,
2Oa09
meta-fermentation
S3Cc05
metabolic analysis
1Jp01, 1Jp09,
1Lp16, 2Jp03, 2Ka04, S3Gb04
metabolic control analysis
A1Aa03
metabolic engineering
1Fp05, 1Fp11,
1Jp08, 1Jp09, 1Jp12, 1Jp16, A1Aa03,
2Ip09, 2Jp01, 2Jp03, 2Jp06, 2Ka02,
2Ka03, 2Ka04, 3Ka01, S3Eb02,
S3Gb04, S3Hb02, S3Hb04,
S3Hb05, S3Mb06
metabolic ﬂux
1Kp10
metabolic ﬂux analysis 2Ip09, S3Mb06
metabolic model
2Ip08
Metabolic proﬁling
2Ca03, 2Ja11
metabolic response
1Jp18
metabolism
1Jp16, 2Ca08, 2Ca11,
2Ha09, 2Ha10, 2Jp07,
2Ka06, S3Mb01
Metabolite proﬁle2Ca05
metabolite sensor
1Lp12
Metabolome
2Jp09, S3Lc05
Metabolomics
1Kp17, 1Lp15, 2Ca04,
2Ca05, 2Ca06, 2Kp08,
2Kp09, S3Lc05
metagenome
2Mp03

metagenomic libraries 1Np10, A2Hp01
metal absorption
2Np06
metal recovery
2Np03
metallic biomaterials
S3Ec03methane fermentation
2Ha12
methane monooxygenase
1Mp14
methanol
2Ja05, 2Kp10
methanotroph
1Gp04
8-methoxydaidzein
2Ca07
Methyl methacrylate
1Mp06
methylation index
2Op01
methylation reaction
2Kp10
Methylobacterium
1Mp13
methylotroph
1Mp13, 2Ja05
methylotrophic yeast
2Gp01, 3Ka01
MFC
2Ha09
mic
S3Ec01
micro vascular structure
1Op07
microalgae
2Hp04, 2Hp06, S3Da01
microalgae growth-promoting bacteria
2Hp06
microbial biotechnology
S3Kc02
microbial cell array
1Hp12
microbial community
2Ha12, 2Ja09,
2Np02, 3Ea05, S3Fb02
microbial dark matter
2Fp11, 3Ea04
microbial ﬂora
1Cp10, 1Cp12,
2Ca08, S3Cb05
microbial fuel cell
2Ha07, 2Ha08,
2Ha09
microbial production
S3Hb01
microﬂora
1Cp11
microﬂuidic device
1Lp08, 2Fp06,
2Oa04, 2Op06, 3Ia03
microorganisms 1Cp08, 2Fp06, 2La07,
2Na08, S3Gb04, S3Kb03,
S3Kc01, S3Kc03
microplastic
3Ga02
microRNA
1Gp16
microsensor
1Ep12
microsphere
3La08
microtube
2La08
microwave
2Ep10
milk
1Fp13
mineral
3Ga03
Minicircle DNA vectors
3Oa05
minimal media
2Kp09
MinION
2Ga03
MinION nanopore sequencing
2Ka01
miso
S3Db04
mitochondrial pyruvate carrier protein
1Kp10
mixed culture
S3Cc05model validation
2Ip08
MOF
S3Hc04molecular chaperone
1Ip15
molecular design
2Ip04
molecular dynamics simulation S3Gb02
molecular evolution
1Ip15, S3Gc02,

312

S3Hc03molecular weight
3Ga04
moloney murine leukemia virus S3Bc03
molybdenum blue method
3La07monascus anka
2Cp04
Monitored Natural Attenuation 2Na06
monitoring device
2Ep01
monoclonal antibody
1Dp02, 2Ip06
monolith
2Fp03
monoterpenoid
1Fp10
Moorella thermoacetica
2Jp04
Morolic acid
3Ka02
motility
1Np01
Motor neuron
1Op14
mouse
3Ia11
mRNA
1Gp17
mRNA degradation
1Ep16
mucin
2Op11
Mucor circinelloides
2Kp02
muiltistress tolerance
2Ka09
multi-subunit protein
2Fa04
multicolor ﬂuorescent in situ
hybridisation method
3Oa04
multicopper oxidase
3La06
multilamellar vesicles
1Cp03
multiple attribute methods
1Kp18
Musa acuminata cv. AAA
2Ca03
mutagenesis
2Ia12, S3Hc02
mutant2Ka09
mutational analysis
1Ep08
Myxozyma
1Np07

N
n-dodecanol
2La02
N-glycan
1Ep13
N-methyl amino asid
3Ma08
NAD(P)H
2Ma11
2Kp11
NAD+ salvage synthesis
NAD+/NADH balance
2Jp08
NAD/NADH balance
2Jp07
NADH dehydrogenase-II
overexpression
3Ka08
nano particle
2Op10
Nano-bio system
S3Gc05
nanobiotechnology
S3Bc01
nanobubble
2Ep08
nanocapsules
2Ia06
nanometer scale particles
S3Hc01
nanoneedle array
1Op04
Nanoparticle
2Ia10
nanoparticles
1Fp18
nanostructure
2Ia03, S3Gc06
Narazuke
2Cp07
natto extract
1Ep01
natural antibody
1Gp14
natural product
S3Hb01Natural rubber
2Fa01
negative chemical ionization
1Kp16
nematodes
2Np02

neonicotinoid
2Na10
Neospora caninum
1Ip07
nerve cells
1Op12
neural network
3Ia10
neural stem cell
1Op02, 3Ia09
Neuromuscular junction
1Op14
neurotransmitter
1Kp14
Next generation sequencer
3Ca04,
S3Dc02next generation sequencing
2Ip05,
2Na05
NGS
3Ia01
Nicotiana benthamiana 1Ep13, 1Ep14
Nicotiana tabacum
1Ep15
Nicotinic acid
3Ca11
[NiFe]hydrogenase
3La03
nitriﬁcation
2Ja07, S3Da02, S3Fc01
nitrifying bacteria
1Mp01, 2Ja07
nitrilase
2Lp03
nitrile2Lp03
nitrile hydratase
2Lp02
nitrogen ﬁxation
2Ha01, 2Hp01
nitrogen metabolism
1Jp16, 3Ca06
nitrogen removal
S3Fc01nitrogen-ﬁxing bacteria
3Fa04
nitrophenol
1Np14
nitrous oxide
S3Fc01NMR
2Ja10, 2Ja11
Non-recombinant breeding
3Ha11
non-thermal effect
2Ep10
non-woven fabric
1Op05
nonribosomal peptide synthetase 3Ma02
Nonylphenol monooxygenase
1Np18
Noro virus
1Lp05
norovirus detection
1Lp06
Norovirus model
2Ep07
Norovirus RNA detection
1Lp01
norovirus-like particles
1Lp03
nucleic acid ampliﬁcation
S3Bc03nutrient starvation stress
S3Mb07nylon-6
2Na01

O
OaAFP1
1Ip11
1-octen-3-ol
3Ca03odor learning
3Ia11
odorant response
3Oa09
Ogataea minuta
2Gp01
oil degrading bacteria
2Na11
oil palm empty fruit bunch
1Hp01
Oleaginous yeast
1Fp03, 1Fp04
oleaginous yeasts
1Kp04
oleic acid2Hp10
olfactory processing
3Ia11
oligodeoxynucleotides
S3Hc06oligosaccharide
S3Mc02oligotroph
3Ka09
on site coating
2Ep11
oncomiR
1Gp16

one-dimensional alignment
1Lp14
one-pot conversion
1Hp04
open circuit voltage
1Lp13
optimiztion
S3Cc06
Optogrnrtics
3Ia10
oral delivery
S3Hc06organ engineering
S3Lb01organic cultivation
1Hp18
organic matter
2Na07
organic soil
1Hp17
organic solvent
3Ma06
Organophosphorus compounds 1Mp08
organophosphorus hydrolase
1Mp07
oriented immobilization
1Lp09,
3La05, 3La06
ornithine
3Ca09
outdoor cultivation
2Hp04
outer membrane protein 1Ip14, S3Ec02
outer membrane vesicles 1Cp04, 1Cp05
oxidase2Jp11
oxidation
3Ma01
oxidative stress
1Op18, 2Hp11
Oxidosqualene cyclase
3Ka02
oxygen1Ep12oxygen limitation
1Fp11
oxygen sensing
3Ka11
oxygen transfer performance
2Ep02
oxygen transfer rate
2Ep04
oxygen-radical pretreatment
2Ma02

P
P450
1Mp10
paddy ﬁeld
2Na07
Paenibacillus
1Hp15
palm oil mill efﬂuent
1Fp02
pancreatic cancer
2Op10
pathway design
S3Cc06PCA
2Da11
PCL nanoparticle
1Op06
PCR
A2Cp01
PCR-DGGE
2Ep10, 3Ea05
1,3-PDO
1Fp07
pear
1Cp15
pectinolytic
1Hp12
6-pentyl-alpha-pyrone
1Kp09
peptidase
2Fp08, 3Ma03
peptide
1Ep03, 1Ep04, 1Gp18,
1Op01, 2Fa02, 3Fa02,
3Fa03, 3Ia07, S3Gc02, S3Hc04
peptide array
1Ep03
peptide bond formation
3Ma01
Peptidic compound
3Ea11
Periodontal disease
2La03
peroxidase-like activity
1Lp03
peroxide
1Cp01
peroxin
S3Mb05
Peroxynitric acid
2Ep07
PET-hydolyzing cutinase
3La01
PGPB
1Hp15

313

pH slide culture
PHA
PHA synthase
phage
phage display

2Fp11
2Ja05, 2Ja06, 3Na08
3La02
1Np10
1Dp08, 2Ip01, 2Ip02,
2Ip04, 2Ip05
Phanerochaete chrysosporium 2Ma01
PHB
3Ga03
phenol3Ka10phenolic acid decarboxylase
3Ca05,
S3Dc04
phenotype-based screening
3Ia08
phenylalanine
2Ep06, 3Ka07
pheS
1Gp04
Philippines
S3Kc03
phosphatase
1Mp09
phosphate
3Na02, S3Fc04
phosphate compound
1Mp17
phosphate estimation
2Np05
phosphate metabolism
1Jp15
phosphite
1Jp13, 1Jp14, 1Jp15
phospholipase D
2Mp04
phospholipid
2Ca12
photo-cleavable peptide array
1Lp17
photoconducter
2Ep09
photodynamic reaction
1Op03
photosynthesis
2Ip07, S3Eb03
photosynthetic bacteria 2Hp01, S3Ec04
photosystem II 1Mp14, 2Ga12, S3Eb01
phylogenetic analysis
2Ka07, 3Ca04,
3La03, S3Dc02
phytase
1Mp09, 1Mp17
phytate1Mp12
phytic acid
1Mp09
phytohormone
S3Da03phytopathogens
2La11
Pichia
3Ha07
Pichia kudriavzevii
2Gp08
Pichia membranifaciens
3Ha05
Pichia pastoris
2Gp09, 2Gp10,
2Gp11, 2Ma04
pigment 1Fp18, 1Np06, 2Cp04, 2La07
plant breeding
S3Cc02plant cell culture
2La07
plant chemical biology
S3Da03plant factry system
S3Cb04
plant growth
1Hp18
plant growth regulator
S3Da03
Plant Growth-Promoting Bacteria
1Hp13, 1Hp14
plant microbial fuel cell
1Lp13
plant monitoring system
1Lp13
plant sample
3Ea05
Plant symbiotic bacteria
1Mp13
Plant-made pharmaceuticals
1Ep14
plasma1Lp16
plasmid 1Gp11, 1Np11, 1Np12, 3Ka07
plasmid retention
2Gp10
Plasmon resonance
1Lp01

Plasmonic-magnetic graphene
1Lp04
plastic degrading bacteria
2Na01
PMMA-tag
2Fa07
pneumatic
S3Hc01poly(3-hydroxybutyrate)
3Ga01
poly(diaminopropanoic acid)3Ea07
poly(epsilon-L-lysine)
3Ea07, 3Ea08,
3Ea09
poly-gamma-glutamate
2Ep11
Poly-gamma-glutamic acid 2Ca09, 2Ja03
polyacrylamide capsule
3Na05
polyamine
2Ca01, 2Ia04
Polycaprolactone
1Op06
Polychlorinated biphenyls
2Na06
polyester
3Ga01
polyhydroxyalkanoate
2Ja05
polymer
1Op01, 2Ca09
polyphenol
1Ep11
polysaccharide
1Op01
polysaccharide-degrading enzyme
2Mp01, 2Mp05
polyunsaturated fatty acid
2La12
Populus spp
S3Cc01Porphyromonas gingivalis
2La03
post-tlanslational modiﬁcation
2Ia02
poultry
S3Cb01Pre-treatment optimization
2Ka04
pretreatment
1Lp16, 3Ea04
pRING
1Gp16
process engineering
2Ia11
product regioselectivity
2Lp11
production
1Jp12, 2Ja01, 3Ha02
prolamin
2Cp07
Prolamine
2Cp09
proliferation
3Oa02
proline
3Ma07
promoter
1Gp06, 1Gp08,
1Np05, 2Gp07, 3Ha04
2-propanol
2Ja04
prophage
1Np11
protamine
2Ga08
protease 1Cp17, 1Cp18, 1Lp17, 3Ca02
proteasome
2Ka12
protein
1Gp01, 1Ip18, S3Gb02,
S3Gc03, S3Gc06, S3Hc03,
S3Mc02, S3Mc03
Protein Conversion
3Ha01
protein data bank
2Ip01
protein engineering
1Ip01, 1Ip02,
1Ip03, 1Ip04, 1Mp03,
2Ia03, 2Ip01, 2Ip02, S3Lc06
protein expression
1Gp06, 2Ga12,
2Gp07, 3Ha04
protein folding
S3Mc02
Protein G
2Fp01
protein hydrolysates
1Ep05
protein interaction
S3Lc03protein kinase C
1Op16
Protein L
2Fp01

protein labeling
S3Bb01protein nanobuilding block
2Ia03
protein production
1Cp04
protocatechuic acid
1Np16
protoplast
S3Dc03Pseudoalteromonas
1Np02
Pseudomonas
1Gp11, 1Np14,
1Np16, 2Mp09
Pseudomonas aeruginosa
3Ma11
Pseudomonas fluorescens
2La10
Pseudomonas putida
1Np17, 2Ha03,
3Na07
Pseudomonas sp.
1Mp12, S3Fb03
Pseudomonas stutzeri
3Na03
Pseudomonas stutzeri NT-I
3Na05
Pseudozyma antarctica 2Gp06, 2Gp07
psychrophile
1Np02
psychrotroph
1Fp16
puriﬁcation
1Ip09, 2Fp02
PVA
1Op02
pyrazine
2La10
Pyrococcus chitonophagus
1Gp03
pyrogallol
2Lp05
pyruvate
S3Hb03
Pythium
2La12

Q
Qdot
1Ip12
quality control
2Oa08, S3Lc07
quantum dot
1Lp01, 1Lp05
quantum dots
1Lp06
Quartz Crystal Microbalance
1Ip13
Quenchbody
1Dp09
quorum sensing
3Na09, 3Na10
quorum sensing metabolites
3Na07

R
Rabbit1Dp02
Radioactive substances
2Np01
Rahnella sp.
2Lp05
Ralstonia eutropha
2Ja04, 2Ja06
randomized controlled trials
S3Da04
rare earth
2Np03
rare mating
3Ha11
rare sugar
1Mp18
RDR6
1Ep15
reactive oxygen species
1Op03
receptor
1Gp10
receptor protein
2Fp10
Rechargeable bio-mineral
2Ha10
recombinant antibody
2Ip06
redox balance
3Ka08
reductase
1Mp18
regenerative medicine
1Op10,
S3Lb03, S3Lc01
RelA
3Ha01
relaxation time
1Lp15
renewable resource
3Ka03
repeated fermentation
1Kp04

314

replication
2Ia08
resistance
3Ea01
resistant starch
2Mp06
Resistantprotein
2Cp09
resource recovery
3Na03
respiration
2Kp03
respiratory chain
3Ka08
Resveratrol
3Ka05
retrotransposons
3Oa07
reverse transcriptase
S3Bc03reversible decarboxylase
2Lp01
RFP
2Ga11
rhizobacteria
1Lp13
Rhizopus sp.
2Cp05
Rhodococcus
2Ga01, 2Lp06, 3Ka09
rhodopsin
1Jp07, 1Jp08
Rhodosporidium toruloides
1Kp01,
2Hp10, 2Hp11
Rhodotorula gracilis
2Gp03
rice
1Ep12, 1Ep17, S3Cc02
rice blast fungus
1Hp10
rice husk biochar
2Ha04
rice koji
2Cp10, 3Ca07, 3Ca08
RIM15
3Ha11
RISA-PCR
3Na01
RNA binding protein
3Ca01
RNA-seq
1Gp08, 2Ja08
RNase III
1Np03
Root culture
1Ep14
rotated slurry bioreactor
2Na11
Rubber particle protein
2Fa01

S
16S rDNA
2Ja09
16S rRNA
1Np02
S-adenosylhomocysteine
2Op01
S-adenosylmethionine
2Kp10, 2Op01
S-Allyl-L-cysteine
1Kp03
S-system
2Kp07
sacchariﬁcation 1Hp01, 2Ha06, S3Cc02
Saccharomyces
S3Mb07
Saccharomyces arboricola
2Da11
Saccharomyces cerevisiae
1Cp14,
1Cp15, 1Kp03, 1Kp05, 1Lp12,
1Np08, 2Cp03, 2Da07, 2Da08,
2Da12, 2Fa01, 2Ga06, 2Ga11,
2Gp04, 2Gp05, 2Ha06, 2Ka07,
2Ka08, 2Ka09, 2Ka10, 2La02,
2Np06, 3Ha06, 3Ha08, 3Ha11,
3Ka04, 3Ka06, S3Hb04, S3Mb02,
S3Mb05, S3Mb06, S3Mb08
safety evaluation
2Cp11
Sakaguchi ﬂask
S3Cc04sake
2Cp06, 2Da12, 3Ca08, S3Db03
sake lees
2Cp07
sake yeast
2Cp03, 2Da10,
2Da12, 3Ca10, S3Mb08
salicylate decarboxylase
2Lp01
sarcosine oxidase
3Ma07, 3Ma08

sarfactant
scaffold
scaffold protein
scale-up
scFv

1Cp01
2Ip03
2Ip04
2Ep04
1Dp06, 2Ep03,
2Fa07, 2Fa08, 2Fa11
Scheffersomyces (Pichia) stipitis 3Ka05
Scheffersomyces stipitis
3Ha07
Schizosaccharomyces pombe
2La05
screening 1Gp07, 2Fp09, 2Ip10, 2Kp05,
2Na01, 3Ga05, 3Ga06, 3Oa02
screening method
3Ka03
SDGs
S3Cb04seawater
1Jp13
secondary metabolism
2Ga02
secondary metabolite
2Kp04
seconday cell wall
S3Cc01secreted protein
1Gp06
secretion
2Ja02
secretome
2Ma03
secretory expression
1Cp04
selective cultivation
1Jp15
selenium
3Na05, 3Na06, S3Fb03
self assembly
2Fa03
Self-assembed monolayer
1Ip13
self-assembly
S3Hc04self-cloning
2Hp03
self-sufﬁcient P450
2Ma01
semi-hydrolysis
S3Cc03
semiconductor
S3Fb01
semiconductor nanoparticle
S3Fb03sensor
1Lp04
sensory evaluation
2Ca06
separation
1Ip09
Sequence-speciﬁc cleavage
1Mp01
serine enzyme
S3Bc02
serine protease
S3Bc02
Sesaminol
1Mp11
Sesamum indicum
1Mp11
sewage sludge
2Ha12
Sf9 cell
2Fp10
SFX
2Lp02
Shinella sp. NN-6
2Mp07
Shirakami kodama yeast
1Np08
Shiranuka
1Ip12
short-chain fatty acids
1Jp02
shuttle vector
1Ep07
sigma factor
1Np05
signal peptide
1Mp07
signal transduction
1Lp12, 3Oa02
silica2Ga08, 3Fa02, S3Fb01
silica gel
1Ep05
silica particle formation
1Ip10
silicon
S3Gc04
silicon dioxide
2Ha04
silk
S3Hc05silkworm
1Ip07
silkworm haemolymph
1Ip09
silver nanoplate
2Ep09

simulation
single cell
single cell protein
single-cell analysis

2Ep04
3Ia03
1Fp13
1Lp07, 1Lp08,
3Ia10, S3Bb02
site-directed mutagenesis 1Mp17, 3Ma10
site-speciﬁc recombination
2Gp04
Skeletal muscle
1Op17, 1Op18
Skeletal muscle tissue engineering
1Op14
skin barrier function
2Cp10
skin condition
2Cp10, S3Db04
skin tissue engineering
1Op15
skin-whitening
2Ca07
smart cell
1Jp07, S3Gb05
Smart cell industry
S3Kb01
Snf1
1Np08
SOD
1Jp01
soil
2Na08
soil amendment
1Hp16
soil bacteria
1Hp17, 2Ha01, 2Na07,
S3Da02, S3Fb02
soil ecosystem
2Ha07
soil environment
1Hp18, 2Na07
soil microbe
1Hp16
soil temperature
1Hp17
soil water content
1Hp17
Solanum lycopersicum
1Np17
solid-liquid interface
2Kp04
Solid-state culture
2Ga04
Solid-state sacchariﬁcation
2Cp05
soluble expression
2Fa03
solvatochromic parameters
1Fp01
somatic hypermutation
1Dp07
specialized cellulose ﬁlm
2Fp11
Specialty coffee
2Ca04
speciﬁc isolation
2Fa07
speciﬁc production rate
2Ep06
Sphaerotilus montanus
2La08
spheroid 1Op10, 1Op12, 2Oa11, 2Oa12
Spheroid morphology
2Oa10
sphingolipid
2Ca12Sphingomonas
1Mp08, 1Np13
Sphingopyxis
3Na09, 3Na10
Spiculisporic acid
1Fp17
split intein
3Ma05
splitGFP
1Gp18
SPME-GCMS
3Ca03
Spo0A
3Ha01
spore
1Gp10
sRNA
1Np03
stability
1Fp01
Staphylococcus aureus
3Ea03
Staphylococcus epidermidis
3Ea03
starch-free wheat bran
1Kp11
statistical analysis
3Ha10
statistical design
1Fp18
steel
S3Ec01
Stereospeciﬁc monoclonal antibody

315

1Dp05
stiffness
1Op02
storage protein
2Cp07
Strain development
1Kp06
streptococcus thermophilus
2Jp11
Streptococcus zooepidemicus
2Ep06
Streptomyces
2Ka02, 2Ka04, 3Ea07,
3Ea10, 3Ma04
Streptomyces coelicolor A3(2)2Ka01
Streptomyces thermoviolaceus
3Ea10
streptozotocin
2Ga02
stress factor
1Hp13
stress resistance
2Cp02
stress response
1Np06, 2Ka10,
S3Mb01, S3Mb02
stress tolerance
2Hp11
structural analysis
2La08
sturgeon
1Gp14
Subgroup I
1Dp11
Subgroup II
1Dp04
substrate afﬁnity
3Ma08
substrate speciﬁcity
2Mp04, 3Ma01,
3Ma07, 3Ma10
subtilisin
3Ma05, 3Ma06
sucrose2Jp07
sugar analog
S3Mc04sugar extraction
1Hp09
sugar phosphate
1Kp16
sugar-induced cell death
S3Mb07sugarcane bagasse
1Hp01
sulfanilic acid
2Na02
sulfate aerosol
S3Fc02
sulfate reduction
3Na04
sulfate-reducing bacteria
2Ha10,
2Ha11, S3Ec02
sulfate-respiration
2Ha11
sulﬁte ion
2Na02
Sulfolobus acidocaldarius
2Ma09
sulfur transfer
2Ma10superoxide dismutase
2Op10
supramolecular complex
2Ia03
surface
S3Hc04surface treatment
S3Ec03surfactant
1Cp02, S3Bb03
suspension cell culture
1Ep13
sustainable
S3Da05
svm
2Ip11
SWEET
1Hp09
sweet potato shochu
3Ca02
Sweet sorghum juice
3Ha09
symbiosis
2Hp08, 3Fa04
symbiotic bacteria
3Ia02
synchronous expression
2Fa04
Synechococcus
S3Eb03
Synechocystis
2Lp07
Synechocystis sp. PCC 6803
1Jp18
Synechocystis sp. PCC6803
S3Eb02
Synechocystis sp. PCC 6803
1Jp17
syntetic biology
S3Cc06synthetic bioengineering
A2Mp01synthetic biology 1Jp07, 1Jp09, 2Gp05,
2Gp11, 2Ia01, 2Ia07, 2Lp08,
3Ia01, S3Gb01, S3Hb02, S3Hb04
synthetic genomics
1Gp09
synthetic receptor
S3Lc06system biology
3Ia02

T
T cells
1Dp12
T7
3Ka07
Talaromyces cellulolyticus
2Ma06
Talaromyces purpurogenus
1Fp18
Talaromyces trachyspermus
1Fp17
tannase
2Ma05
tanscriptional regulator
2Jp10
tapping
2Oa02
Target-AID
1Jp04
Targeted transgene integration
3Oa05
taru
S3Db03taste
1Ep05
taxonomy
1Np07
TCA cycle
3Ka10
tea leaf
1Cp18
tellurium
3Na03, S3Fb03
Terbium binding protein
2Ia09
terephthalic acid
1Np16
terminal alkene
2Kp08
terpenoid
2La09
TGF beta
1Ip01
Thalassiosira pseudonana
2Ga09
therapeutic protein
S3Lc01
thermal stability
2Ia12
thermo stability
1Mp05
thermoachidophiles
2Ma09
Thermoanaerobacterium
thermosaccharolyticum
2Mp02
Thermococcus kodakarensis
2Ga09
Thermomyces lanuginosus
1Fp02
thermophile
1Gp02, 2Ma10,
A2Mp01, S3Cb01
Thermophilic actinomycetes
3Ea10
thermostability 1Gp07, 2Ga12, S3Bc03
thermostability enhancement
1Mp02
thermostabilization
3La01
thermostable enzyme
1Gp02, 2Kp11,
2Ma07, 2Ma08,
3Ma05, 3Ma06, S3Hc02
thermotolerant mutant
2Hp11
Thiol-ene reaction
3Ga05
Thraustochytrid
1Kp08
three dimension
S3Bb04
Tissue culture
1Op17
tissue engineering
1Op07, 1Op10,
1Op11, 2Oa06, A2Fp01,
S3Lb02, S3Lb04, S3Lb05
TNF-alpha
2Jp09
TNFalpha
2Ip05
tolB
1Cp03

toluene1Np17, 3Ma09
toluidine blue o
2Np05
TORC1
S3Mb08
toxicity
1Op16, S3Lb02
toxin-antitoxin
1Mp01, 1Np03
trans-aconitic acid2Mp09
transcription factor
1Kp12
transcriptional factor
1Np09
transcriptional regulation
2Ga05,
3Ka11, S3Dc05
transcriptional regulator gene
2Ga05,
2Jp01
transcriptome
2Ca02, 2Ka01, 2Kp01,
2Oa09, 3Ca06, S3Dc05
transformation 2Hp01, 3Fa03, S3Dc03
transgenic chicken
3Oa01
transgenic silkworm
S3Mc06transglycosylation
S3Mc06transient expression system
2Fa09
translation
1Dp01
transporter
2Ga06, 2Ka10, 3Ha06,
3Ka09, S3Dc05, S3Eb04, S3Mb04
transposon mutagenesis
1Gp15
traveling force
2Ep05
trehalose
1Np04, 3Ka09
trehalose-6-phosphate synthase 1Np04
triad
1Dp10
Trichoderma sp.
1Kp09
Trichosporon moniliiforme
2Lp01
Triclosan
2Na04, 3Ea01
5ʼ, 5ʼ, 5ʼ-triﬂuoro-DL-leucine resistance
2Da08
triglyceride
2Ca08, 2Hp03
Trimeric autotransporter adhesin 2Ia09
triterpene2Lp11
Triterpenoid
1Ep10, 2Lp08
tropical microbes
S3Kc04tubulin
2Kp02
tulipalin
2La04
tuliposide
2La04
tumor associated antigen
1Ip02
tumor-associated-macrophage
3Oa08
Two-Hybrid System
2Ga10tyrosine phosphorylation
3Oa02

U
UbiC
2Ka05
ubiquitin-like
2Ma10
UCP1
2Oa05
UDP-rhamnose
2La05
ulcerative colitis
1Cp12
ultraﬁne babble
2Ep02
ultrasound
2Ep08
uncultured bacteria
2Fp06
unsaturated carbonyl compounds 1Op16
Untargeted metabolomics
2Ca05
UV irritation
1Cp01
UV-B
1Ep11
UV-radiation
1Ep06

316

V
valetate
1Jp02
vanillin
2Ha05, 3La10
vascularization
S3Lb01vector
1Gp11
venus
1Gp08
VHH
2Ip02
Vibrio cholera toxin
S3Gc01
vinegar fermentation
S3Db02vinyl compounds
3Ga05, 3Ga06
4-vinylguaiacol
3Ca05, S3Dc04
viologen
S3Bc05
Virus separation and detection
1Lp04
virus-like particle
1Ip07
Virus-like particles
1Ip08, 2Fp03
viscosity measurement
2Ep05
VND transcription factors
S3Cc01
volatile
3Ca03
volatile fatty acids
2Hp07, 2Hp08
volatile organic compound
2Na05
vulcanized natural rubber
1Hp07

W
wall biotechnology
waste
waste glycerol
waste water treatment
wastewater
wastewater treatment

3Fa04
1Cp18
1Kp06, 2Jp05
1Fp13
3Na02
2Na03, 3Na04,
S3Cb04, S3Fb04
water soaking
2Cp04
wax ester fermentation
2Hp02
96 well plate format
2Op09
white-rot fungi 1Fp15, 1Hp08, 2Na10
white-rot fungus
2Ga01
whole cell biocatalyst
3Fa05
whole cell reaction
3La10, 3Ma03
whole genome ampliﬁcation
1Lp07
wine
3Ca11
Wolffia
S3Da04
wood decay
1Hp08
Wood rotting fungi
1Hp07
wound healing
1Ep02

X
Xanthomonas campestris WU-9701
2Mp10
Xanthophyllomyces dendrorhous 1Fp14
Xiaoqu-Mijiu
2Cp05
xylanase
1Hp11
xylene3Ma09
xylitol
1Fp14xylooligosaccharide
2Ma06
xylose1Kp05, 3Ha03, 3Ha06

Y
yeast

1Kp05, 1Kp17, 2Cp02, 2Cp06,
2Ep02, 2Gp02, 2Gp08, 2Ha05,

2Ka07, 2Ka11, 2Np03, 3Ha05,
3Ha07, 3Ka05, S3Mb01,
S3Mb07, S3Mc01
Yellow chive
2La03

Z
zebraﬁshzeta potential
zymogen

2Ca07
3Ea09
S3Bc06

317

ランチョンセミナー
本大会でのランチョンセミナーは事前予約制で行います．申し込み締め切りは，8 月 27 日（月）です．あらかじめ大会ホームページより希望するセミナーを予約してください（定員になり次第締切ります）．事前登録をされた方は，登録後に送られる通知メールを印刷してご持参ください．当日は，10:30 までに大会受付で通知メー
ルをご呈示の上，整理券をお受け取りください．混乱を避けるためセミナー開始時刻の 5 分前までにはランチョ
ンセミナー会場へお越しください．10:30 までに整理券の引き換えを行われなかった場合，事前予約されたラン
チョンセミナーに参加できなくなる可能性がありますのでご注意ください．なお，当日空席がある場合は，事前予約なしでもご入場いただけます．10:30 〜 11:30 までは大会受付（大会 3 日目は 11:20 まで），これ以降は直接講演会場にお越しください．

9 月 5 日（水）（11：45 ～ 12：45）
1LS1
株式会社島津製作所

第 4 学舎 4 号館 2 階

LS1 会場

野生動物の腸内細菌叢解析と糞便メタボローム解析

1LS2

エッペンドルフ株式会社
装置からみた培養手技 - 大量に、安全に、簡単に -第 4 学舎 4 号館 2 階

LS2 会場

1LS3

ノバ・バイオメディカル株式会社

第 4 学舎 2 号館 5 階

LS3 会場

培養プロセス中の成分分析の重要性 −回分、流加から連続製造に向けて−

9 月 6 日（木）（11：45 ～ 12：45）
2LS1
タカラバイオ株式会社

第 4 学舎 4 号館 2 階

LS1 会場−タンパク質実験効率化のご提案−独自膜技術を用いた製品ラインナップのご紹介

2LS2

三洋貿易株式会社

第 4 学舎 4 号館 2 階

LS2 会場

動物細胞・微生物の培養経過を非侵襲リアルタイムセンシングする技術他

2LS3

宇宙航空研究開発機構 (JAXA)

第 4 学舎 2 号館 5 階

LS3 会場

国際宇宙ステーション「きぼう」日本実験棟を利用した高品質タンパク質結晶生成実験の新しい展開

9 月 7 日（金）（11：35 ～ 12：35）
3LS1
ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社

第 4 学舎 4 号館 2 階

LS1 会場

第 4 学舎 4 号館 2 階

LS2 会場

第 4 学舎 2 号館 5 階

LS3 会場

メタボローム解析による吟醸酒成分と品質との相関解析

3LS2

東ソー株式会社
動物細胞培養から考える抗体医薬品の分子不均一性

3LS3

P&G イノベーション合同会社

酵母の代謝解析の最新知見と化粧品原料への応用〜代謝物網羅解析とビッグデータ解析による機能性物質の発見〜

319

ランチョンセミナー

月

9

日（水）

5

320

ランチョンセミナー

月
9

日（水）
5

321

ランチョンセミナー

第 70 回日本生物工学会大会
ノバ・バイオメディカル株式会社共催 ランチョンセミナー1LS3
日時：9 月 5 日（水曜・大会 1 日目） 11：45-12：45
会場：LS3（第 4 学舎 2 号館）

月

9

演者： 大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学専攻
教授 大政健史先生
要要旨
21 世紀に入って動物細胞を用いた生産技術は長足の進歩を遂げ、さらに周辺技術も格段に発展し、10g/L を超える生産例もいくつも報告されている。
これらの長足の進歩は、特に 2005 年に世界の医薬品売上高ランキングベスト
10に抗体医薬がランクインしてから顕著になった。
特に、
Chinese hamster ovary
卵巣由来細胞（CHO 細胞）を用いた抗体医薬生産は、2010 年ごろを境に、急速に CHO 細胞を用いて生産される抗体医薬の上市数が増加し、現在では、48 品目（米国市場）となっている。これらの高生産や、多数の上市が実現された背景には、高生産細胞の開発のみならず、培地を含めた培養プロセスの改良が大きな貢献をしている。
本講演では、動物細胞、特に CHO 細胞を用いた抗体生産を例に取り上げ、最近の進歩ならびに、今後予測される連続生産における培養プロセスについて、培地成分分析の重要性の観点から解説する。

その他、ノバ・バイオメディカル株式会社より、
細胞培養液分析装置のご紹介をさせて頂きます。

5

日（水）

培養プロセス中の成分分析の重要性－回分、流加から連続製造に向けて－

322

ランチョンセミナー
月

9

日（木）

6

第70回⽇本⽣物⼯学会⼤会

2LS1-タンパク質実験効率化のご提案-

独⾃膜技術を⽤いた製品ラインナップのご紹介
本セミナーでは、タカラバイオがご提供する独⾃の膜技術をベースにしたタン
パク質実験に関連する製品（Capturem™シリーズ）をご紹介します。独⾃の膜技術とは、独⾃ポリマー構造のことで、これにより膜表⾯積の最⼤化が可能となり、レジンカラムに⽐べ、圧倒的に⼩さいBed volumeを実現しています。
これにより、洗浄効果の最⼤化と溶出時の洗浄バッファーの残存を極⼒抑えた
⾼純度精製が可能です。本技術を有する関連製品の基本コンセプトは、“迅速・簡便を極限まで追求した実験ワークフローの実現”です。本技術を⽤いた製品である Hisタグ融合タンパク質の精製・濃縮⽤カラムにより、EDTAや還元剤（DTTやTCEPなど）を含む幅広い条件下において、5分~15分でタンパク質精製が完了します。免疫沈降や共免疫沈降実験に最適化したキットでは、サンプルと免疫沈降⽤抗体を10分間インキュベートした後、5分間のカラム操作で実験が完了するワークフローをご紹介します。また、トリプシンを固定化したカラムでは、標的タンパク質を2分間の遠⼼操作で完全消化し、MS解析⽤サンプルを迅速・簡便に調製することが可能です。ストレプトアビジンの固定化
カラムでは、ビオチン化ターゲットの濃縮・精製を15分以内に完了します。
この独⾃の膜技術により、タンパク質実験の⼤幅な時間短縮が可能になります。
本セミナーでは、データを交えながら、皆様の実験の効率化にお役に⽴つ情報をお届けします。

⽇ 時︓9⽉6⽇（⽊）11︓45-12︓45

会 場︓関⻄⼤学 千⾥⼭キャンパス（第4学舎4号館4201教室）
演 者︓井上 晃⼀（タカラバイオ株式会社 営業企画部）

323

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ランチョンセミナー

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第70回 日本生物工学会大会

Sponsored Seminar

ランチョンセミナー

9 月 7日（金）11：35－12：35

ランチョンセミナー

The Society for Biotechnology, Japan/Annual Meeting 2018 at Osaka

9

月

LS3会場（第4学舎2号館5階）セミナー番号：3LS3

日（金）

7

酵母の代謝解析の最新知見と化粧品原料への応用

グ ータ解 析による機 能 性 物 質 の 発 見 ～～ 代 謝 物 網 羅 解 析とビックデ

Latest review on yeast metabolic proﬁling

and its application for skin care ingredient~Metabolomics and big data analysis to identify functional molecules~

酵母は古くから様々な有用物質（アルコール、アミノ酸、抗生物質など）の生産に用いられてきました。
近年、バイオテクノロジーのさまざまな要素技術においてイノベーションが起こり、微生物をつかった物質生産プロセスを合理的にデザインすることが可能になりました。
これによって、狙った機能性物質を安定して製造できる「スマートセル」として、酵母をつかった物質生産にも革新がおこっています。それを可能にしているのが様々な最新の代謝解析技術です。
今回そうした技術を、はじめて化粧品原料に用い、ガラクトミセス酵母にユニークな機能性物質と、その特徴的な生産プロセスを検討しました。また、細胞内だけでなく細胞外の代謝物の経時変化を分析し、さらに電顕による形態観察を同時に行うことで、本 酵 母の代 謝メカニズムを物 質 動 態や形 態レベルまで包 括 的に理 解することをはじめて試みました。こうした代謝解析への新たなアプローチを紹介します。｠
Yeast has been historically used to produce various useful metabolic materials such as alcohol , amino acid , andanti-biotics.｠ Recently various innovations occurring in biotechnology, enables us to consistently produce targetedcompound from microbes as we design.｠ We named this evolutional metabolic engineering standing on yeast as “Smartcell”. ｠This innovative engineering has been enabled by advancement on comprehensive metabolic proﬁling technique.
This time, we ﬁrst time applied this latest technique to skin care ingredient, metabolites of Galactomyces yeast, andconﬁrmed its unique functional compounds under certain unique production process.｠
At the same time, conducting time course proﬁling of range offunctional compounds in a cell as well as ex tracellular region,
combined with electronic microscope observation, ﬁrst time wet r i e d t o g e t a h o l i s t i c v i ew a b o u t m e t a b o l i c p r o c e s s f r o mmolecular dynamics to morphology.｠
We introduce this new approach.
〈ガラクトミセス酵 母 〉
Galactomyces yeast

演 者

presenters

蓮沼 誠久先生 神戸大学大学院科学技術イノベーション研究科 教授

Tomohisa Hasunuma, professor, Kobe University Graduate School of Science. Technology and Innovation

大隅 正子先生 綜合画像研究支援 理事長

Masako Osumi, president, Integrated Imaging Research Support

お問い合わせ：P&G イノベーション合同会社 SK‐Ⅱ グローバル テクニカルマーケティング 宗 千栄子
Tel 078-336-6265/ E-mail soh.c@pg.com

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ワークショップ
生物工学系の研究・開発の安全のために―基本的な考え方と実践例―
主催：生物工学会生物工学教育委員会
協力：株式会社 化学同人
生物工学教育委員会では，大学・高専・企業等の研究における安全のために「バイオ実験を安全に行うために（仮）」の編集に協力しました．本書をより有効にお使い頂くため，安全・安心を実現するための基本的な考え方と実践例を紹介します．また，本書各章の主担当者によるパネルディスカッションを行います．
日

時 9 月 6 日（木）16:40 〜 17:40

会場

D 会場（第 4 学舎 3 号館 1 階）

プログラム

16:40

はじめに

青柳秀紀（生物工学教育委員会委員長，筑波大院・生命環境）

16:45 〜 17:20

生物工学系の研究・開発の安全のために

片倉啓雄（関西大・化生工）

・安全検出思想と危険検出思想
・危険予知のツボ（逆・裏・対偶，外挿，連想術）
・フォルトツリーとイベントツリー
・危険源と危険状態
・本質安全と制御安全
・元気が出る安全巡視（参考：生物工学会誌 91, 346–349 (2013)）

17:20 〜 17:40

パネルディスカッション

司会：

中山亨（東北大院・工）パネラー：

青柳秀紀（筑波大院・生命環境），片倉啓雄（関西大・化生工），杉森大助（福島大・理工），福井希一（阪大院・薬），岡本賢治（鳥取大院・工）テーマ：・組織の構成員の安全に対する意識を如何にして高めるか・ルールに従うだけでなく，ルールを提案できる人材を育てるには・危険源を見つける（気づく）感性を高めるには
当日は本書を特別価格で販売する予定です．

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生物工学若手研究者の集い（若手会）
例年開催している若手会総会・交流会に加え，日本生物工学会関西支部若手企画委員と共催で「ものづくり交流
サロン～学生・若手研究者×企業・公設試～」を開催します．

日時

9 月 6 日（木）17：00 〜 20：00

会場

関西大学 千里山キャンパス 凜風館 2 階食堂・ディノア

プログラム

17:00 〜 17:10 若手会総会（会長挨拶，会計報告）
17:10 〜 20:00 ものづくり交流サロン（企業・公設試によるポスターセッション）
18:10 〜 20:00 若手会交流会

会

費

申

込

一般 3,000 円，学生 1,000 円（すべて税込み）※会費は当日の若手交流会の受付でお支払い下さい．

8 月 17 日（金）までに，大会ホームページ（https://www.sbj.or.jp/2018/）の申込フォームよりお申
し込みください．事前登録にご協力ください．

定員

150 名 ※当会の参加に年齢制限はございません．皆様どうぞご参加ください．

ものづくり交流サロン～学生・若手研究者×企業・公設試～

日本生物工学会は，生物工学に関する研究の進歩普及，人材育成の推進，人的交流の促進，産学連携の促進，国際協力の促進を図り，我が国の学術および科学技術の振興，福祉の発展に寄与することを目指している団体です．
これらを達成するために様々な企画を推進しており，本年度大会期間中にその一環として，関西支部若手企画委員と若手会の共催で「ものづくり交流サロン」を開催する運びとなりました．
「ものづくり交流サロン」では，文章では伝わりにくい知識やものづくりの心を発展的に継承するため，実学に携わる企業や公設試験研究機関の研究者・技術者と，次の世代を担う若い研究者・学生の皆さんが対話する場を提供します．気軽に参加できるサロン風のポスターセッションです．企業や公設試験研究機関が開発した技術や製品について，やりがい，こだわり，苦労話，こぼれ話をじかに聞くことができる貴重な機会ですので，是非ご参加ください．
出展企業・機関などの情報は大会ホームページ（https://www.sbj.or.jp/2018/）に掲載しますので，是非ご覧ください．

第第 70 回（平成30年）

回

70

日本生物工学会大会講演要旨集

日本生物工学会大会
講演要旨集
会

期

2018 年 9 月 5 日（水）～ 7 日（金）

会

場

関西大学

千里山キャンパス

二〇一八（平成

第 70 回日本生物工学会大会講演要旨集
2018 年 8 月 7 日発行
発行所

日本生物工学会

公益社団法人 日本生物工学会〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 2-1
大阪大学工学部内
TEL. 06-6876-2731 FAX. 06-6879-2034
E-mail: info@sbj.or.jp
https://www.sbj.or.jp

年度）

30

公益社団法人 日本生物工学会