〔生物工学会誌

第 97 巻

第5号

246–252．2019〕

DNA 解析からのゴチュジャン膨れ事故原因解明
白至桓 1・鈴木市郎 2,3*・武田穣 2・小泉淳一 2

1 横浜国立大学大学院工学府機能発現工学専攻・2 横浜国立大学大学院工学研究院機能の創成部門
3 横浜国立大学リスク共生社会創造センター（2018 年 10 月 19 日受付

2019 年 3 月 4 日受理）

0LFURELDO'1$SUR¿OHRIJRFKXMDQJLQYROYHGLQVZHOOLQJLQFLGHQW-L+ZDQ%DFN1, Ichiro Suzuki2,3 0LQRUX7DNHGD2, Jun-ichi Koizumi2 (Division of Chemical
and Energy Engineering, Graduate School of Engineering, Yokohama National University1,
Faculty of Engineering, Yokohama National University2, Center for Creation of Symbiosis
Society with Risk, Yokohama National University3, 79-5 Tokiwadai, Hodogaya, Yokohama,
Kanagawa 240-8501, Japan1–3) Seibutsu-kogaku 97: 246–252, 2019.
*RFKXMDQJLVW\SLFDOIHUPHQWHGIRRGLQ.RUHDDQGZKHQSURGXFHGZLWKRXWSUHVHUYDWLYHVVRPHWLPHVLWVZHOOVDIWHUVKLSSLQJ7KLVVWXG\UHSRUWVWKHPLFURELDOFDXVHVRIJRFKXMDQJ“VZHOOLQJ”DQGVZHOOLQJ“inciGHQWV”WKURXJKERWK'**(DQG1*6DQDO\VHVRIWKH6U51$JHQHIUDJPHQWVRIPLFURELDOVDPSOHVREWDLQHGIURPJRFKXMDQJSURGXFWVDQGPDWXUHGPDVKHVBacillus amyloliquefaciens is a microbe that causes
VZHOOLQJLWLVSUHVHQWLQWKHUHGSHSSHUSRZGHUDGGHGWRWKHJRFKXMDQJMXVWEHIRUHWKHSDVWHXUL]DWLRQSURFHVV0HDQZKLOHWKHEDFWHULDOSUR¿OHVREWDLQHGIURP1*6DQDO\VLVUHYHDOHGWKDWWKHVZHOOLQJ“LQFLGHQW”
RIWKHSURGXFWRFFXUVZKHQWKHIUDFWLRQRIODFWLFDFLGEDFWHULDHVSHFLDOO\WKDWRILactobacillus, in the miFURELDOFRPSRVLWLRQLVH[WUHPHO\ORZ
［Key words:0LFURELDO3UR¿OH*RFKXMDQJ6ZHOOLQJ,QFLGHQW］

緒

この 膨れ事故 は，前報での調査対象製造所（韓州社：

言+$1-8 &R /WG .ZDQJMX .RUHD）の 1 月に製造を開ゴチュジャン（Gochujang）は唐辛子の辛味のみなら始した製品で発生し，他の製造期の製品では発生の記録

ず，発酵・熟成による独特の風味を有している発酵食品がないという特徴があることから，製造期により微生物である．最近の添加物に対する消費者の忌避感の高ま叢に違いがあると推定できる．本研究の目的は，細菌

1,2)

ジャンでは加熱と酒精添加で保蔵期間を保証するように

16S rRNA 遺伝子を指標とした変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）8) と次世代シーケンス（NGS）9–13) の二つなった．しかしながら，常温流通が一般であるため，製の手法で製造期が異なるゴチュジャンを解析し， 膨れ

品からガスが発生する 膨れ事故

事故

り

た

から，食品工業製品として製造されているゴチュ

3–6)が起きるようになっ．これまで，ゴチュジャンの 膨れ事故

耐塩性酵母

3–6)

の原因は，

に至る微生物叢と至らない微生物叢の差異を明らかにすることである．

であると報告されていたが，低温殺菌後

実験方法の製品に残存する Bacillus amyloliquefaciens や Bacillus

licheniformis などの Bacillus 属細菌が 膨れ事故 の原7)

因であったことを前報 で報告した．

試料

ゴチュジャンの製造工程は大きく分けると，

発酵・熟成工程と調合・低温殺菌工程の二つから成り，* 連絡先 (PDLOVX]XNLLFKLURGE#\QXDFMS

246

生物工学

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第5号（2019）

瓶詰めを経て最終製品となる．蒸麦（5 t：数値は実際量の測定を依頼した．M-Sep，M-Jan，M-Mar を得たの仕込みでの実数）と麴菌（4 kg）から麦麴を製麴し（約熟成工程では，諸味表面から 1 m の深さの温度を，熟成

30°C，2 日），この麦麴全量に水（2 t）と塩（700 kg）

開始 14 日目，28 日目，42 日目に測定し，それらの平均を加え，諸味とし，高さ 3.5 m の槽で温度が 30°C 以上

を熟成期間の代表値とした．

とならないよう制御し，発酵を開始する．4 週間の発酵

結果と考察の後，全量を同じ形状の槽に擂砕しながら移し，6 週間

しながら 75°C まで加熱する．75°C となった時点で唐辛DGGE による製造期の異なるゴチュジャンの細菌叢
9 月，1 月，3 月に製造を開始したゴチュジャンの製品（P-Sep，P-Jan，P-Mar）から調製した 16S rRNA

子粉（240 kg）を加え，75°C の低温殺菌を 30 分続ける．

遺伝子のアンプリコンと， 膨れ事故

熟成させる．調合・低温殺菌工程は，熟成後の諸味を分け取り（1,030 kg），それに水飴（100 L）を加え，攪拌

解析を起こした製品

冷却ののち，水飴（60°C，350 L）を加え，保存期間のから単離した 膨れ事故 の原因微生物，B. licheniformis

延長を目的とした酒精（室温，30 L）を添加し，瓶詰（strain A2，A9）および B. amyloliquefaciens（strain B3，

めし，製品となる．上述した製造所において 9 月，1 月，

B8）7) の DNA を鋳型とした 16S rRNA 遺伝子アンプリコ
ンの DGGE の結果を Fig. 1 に示す．P-Jan（レーン Jan）には B. amyloliquefaciens（レーン B3，B8）のメジャー

3 月のそれぞれに製造を開始し，4 週間の発酵工程に続
く 6 週間の熟成工程終了時に表面から 1 m の深さから採取した諸味（M-Sep，M-Jan，M-Mar）と調合・低温殺菌・瓶詰め後の製品（P-Sep，P-Jan，P-Mar）とを試料とした．

DNA 抽出と変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）
試料 0.5 g から Fast DNA SPIN Kit for Soil （ MP

%LRPHGLFDOV6DQWD$QD&$86$）で DNA を抽出した．
抽出した DNA より，Thapa Chettri ら 14) と同じ方法で，プライマー対 GC-341F/534R8) を用い，16S rRNA 遺伝
子の高度可変領域 V3 を含む約 190 bp を増幅した．増幅
した V3 領域を含む DNA 断片を 30 〜 60％の変性濃度勾配ゲルで mini-DGGE system NB-1490（日本エイドー，東京）で泳動した（50 V，60°C，3 h）．
次世代シーケンス（NGS） 試料から上記と同様に抽出した DNA よりプライマー対 515F/806R15) を用い 16S
rRNA の高度可変領域 V4 領域を PCR にて増幅した．一つの試料に対し，独立に PCR 増幅した二つの増幅断片それぞれについて，次世代シーケンサー MiSeq（Illumina,
San Diego, CA, USA）での Target Sequencing 法による解．
バンドと同じ移動度のバンドが観察された（図中 ◁）P-Sep と P-Mar（レーン Sep，Mar）では，P-Jan ほどには明瞭には観察されず，1 月の製品の 膨れ事故 と B.
amyloliquefaciens との関連が示唆された．
製品の試料（P-Mar）と調合・低温殺菌工程を行う前の発酵・熟成工程終了時の試料（M-Mar）の 16S rRNA

析を，ファスマック社（厚木，神奈川）に依頼した．得られた 16S rRNA 遺伝子アンプリコン（約 250 bp）の塩基配列より，97％の配列類似性を評価基準として菌叢解析パイプライン（QIIME-ver1.9.1）16) 上で Greengenes

13_8_99 を参照データベースとした UCLUST17) を用いて 53,323 個の操作的分類単位（operational taxonomic
units: OTUs）と各 OTU の推定系統，出現頻度（リード数）を得た．

pH，乳酸含量，熟成温度
試料，M-Sep，M-Jan，
M-Mar，P-Sep，P-Jan，P-MarのpHはpHメータ（HI83141,
Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA）で測定した．
また，P-Sep，P-Jan，P-Mar については，それぞれ 3 gを日本食品分析センター（渋谷，東京）に送付し，乳酸
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第5号（2019）)LJ'**(JHOLPDJHRIWKH3&5DPSOL¿HG6U51$JHQHIUDJPHQWV DPSOL¿HG IURP WRWDO '1$ RI JRFKXMDQJ SURGXFWV
DQG FDXVDWLYH EDFWHULD RI VZHOOLQJ LQFLGHQW $ $ % %Bacillus VWUDLQV $ $ % DQG % LVRODWHG IURP VZHOOLQJJRFKXMDQJ SURGXFW UHVSHFWLYHO\ 6HS -DQ 0DU SURGXFWV RIZKLFK PDQXIDFWXUH EHJDQ LQ 6HSWHPEHU 36HS  -DQXDU\3-DQ  DQG 0DUFK 30DU  UHVSHFWLYHO\ 0 '**( PDNHU
1LSSRQ *HQH7RN\R  6HYHUDO PLQRU VLJQDOV REVHUYHG LQ WKHODQHV $ $ % DQG % ZRXOG EH QRQ6 U51$ JHQH
VSHFL¿F3&5SURGXFWVGHULYHGIURPWKHJHQRPLF'1$RIHDFKBacillus isolate.

247

レーン 4：図中 ◁）．すなわち 膨れ事故の原因微生物は，調合に用いられる唐辛子粉に随伴して製品に混入したと結論できた．
調べた唐辛子粉は 3 月期製造に用いた唐辛子粉であり，唐辛子粉からの混入は通年の現象と推定できる．そこで，特定の製造期のみ，唐辛子粉からの原因微生物混入が 膨れ事故にまで至ることについて，さらに分析と解析を続けた．Fig. 1 および 2 で ◁ で示したバンドよりも製品（P-Sep，P-Jan，P-Mar）と唐辛子粉で観察される移動度が大きく，強度が高いバンドについては，続く NGS の結果を参照し，後述する．
製 品 の pH と 乳 酸 濃 度

製 品（P-Sep，P-Jan，P-Mar）の pH とそこに含まれる乳酸の測定値を Table 1にまとめた．P-Jan の pH は 4.69 と Baciilus 属細菌の胞
子発芽を抑制するとされる 4.518) を超えており，他の製品，P-Sep と P-Mar では 4.5 よりも低く，特に P-Sep は他の製造時期より低い pH を示した．また，乳酸濃度は
pH の値と負の相関を示し，製品の pH は乳酸によって)LJ'**(JHOLPDJHRI6U51$JHQHIUDJPHQWVDPSOL¿HG
IURP WRWDO '1$ RI JRFKXMDQJV DQG JRFKXMDQJ DGGLWLYHV 
JRFKXMDQJ PDVK VDPSOHG IURP WKH HQG RI PDWXUDWLRQ SURFHVV
00DU   JRFKXMDQJ SURGXFW 30DU   PL[WXUH RI
DPSOL¿HG6U51$JHQHIUDJPHQWVIURPB. amyloliquefaciens
DQG B. licheniformis  DQG  UHG SHSSHU DQG VXJDU V\UXSHPSOR\HGLQWKHPDQXIDFWXULQJVLWHUHVSHFWLYHO\

規定されていると推定できた．

NGS データからの推定系統

NGS で各試料より 2回ずつ解析を行い，総リード数が多い方の解析結果を選抜して集計した OTU 全数は 53,323 であり，ゴチュジャ
遺伝子アンプリコンを DGGE で比較したところ（Fig. 2，ンの原材料が植物（麦，唐辛子）と黄麹であるためクロ

原因の B. licheniformis と B.

ロプラストとミトコンドリアの 16S rRNA 遺伝子の V4amyloliquefaciens の 16S rRNA 遺伝子の PCR 産物を混合した試料（Fig. 2，レーン 3）と同じ移動度のバンドは観察されなかった．さらに，この M-Mar の DGGE バンド
パターン（Fig. 2，レーン 1）は，製品（P-Mar）のバン
ドパターン（Fig. 2，レーン 2 および Fig. 1，レーン Mar）とも異なっていた．調合・低温殺菌工程が M-Mar から
P-Mar の間にあり，ここで唐辛子と水飴が発酵・熟成工
程終了後の M-Mar に加えられる．そこで，調合時に添加される唐辛子粉と水飴から同様に 16S rRNA 遺伝子のPCR による増幅を行い，DGGE で比較したところ，水飴からは 16S rRNA 遺伝子の増幅は確認できなかったが（Fig. 2，レーン 5），唐辛子粉からは 膨れ事故 の原因
微生物群と同じ移動度のバンドが観察された（Fig. 2，

領域も検出された 19,20)．特にクロロプラストのリード数

レーン 1，2）， 膨れ事故

は全体の約 70％であった．したがって，Fig. 1 および 2で ◁ で示したバンドよりも移動度が大きく，強度が高い，製品（P-Sep，P-Jan，P-Mar）と唐辛子粉で観察されたバンドはクロロプラスト由来と考えられる．

OTU 全数 53,323 からクロロプラストとミトコンドリ
ア由来の OTU を除くと 35,737 であり，さらに，そのう
ち の 97 OTUs だ け で 35,737 OTUs の リ ー ド 数 累 積 の95％を占めていた．この 97 OTUs の各 DNA 塩基配列をそれぞれ BLAST21) に供し，VHTXHQFH LGHQWLW\ ％以上を基準として，門，目，科，属および種名に関する菌叢解析パイプライン（QIIME-ver1.9.1）上で行った簡易分類の結果を検証した．検証した系統を属レベル以上で7DEOHS+ODFWLFDFLGDQGW\SLFDOWHPSHUDWXUHRIVDPSOHVRXUFHVRIJRFKXMDQJ
Source

P-Sep

P-Mar

P-Jan

M-Sep

M-Mar

M-Jan

pH

4.34

4.49

4.69

4.21

4.54

4.84

/DFWLFDFLGPJODFWLFDFLGJJRFKXMDQJ

1.08

1.02

0.77

ND

ND

ND

Typical temperature (°C)

RT

RT

RT

24.7

18.6

11.0

575RRP7HPSHUDWXUH1'1RW'HWHUPLQHG

248

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整理した．ただし，前報 7) で 膨れ事故

原因微生物とこの Bacillus 属のほとんどが B. amyloliquefaciens であして取得した B. amyloliquefaciens および B. licheniformis

り，B. licheniformis などは B. amyloliquefaciens の割合に該当したものは種レベルで整理した．Bacillus 属のうの 1/50 から 1/100 程度であった．B. amyloliquefaciens は，

ち二つの OTU が，B. amyloliquefaciens に該当する配列

ゴチュジャンの 膨れ事故 を再現させた実験 7) において，を有していた．また，Bacillus 属の別の一つの OTU が，に該当する配列を有していた．それぞれについてのリー

B. licheniformis が P/ZHHN のガス発生であったのに対し，P/ZHHN のガス発生を示した種でもあり，膨れ事故 の主たる原因微生物は B. amyloliquefaciens

ド数割合を Table 2 にまとめた．

のほうであると考えられる．

もう一方の 膨れ事故 原因微生物である B. licheniformis

製品（P-Sep，

一方，B. subtilis などの Bacillus 属細菌がゴチュジャ

P-Mar，P-Jan）の Bacillus 属についての NGS 解析結果
（Table 2）は，P-Sep と P-Mar では 20％以下であったが，
P-Jan は約 40％と，他の製造時期より高く，1 月の微生

ンの発酵・熟成に関与する主な微生物群であるとする報製造期の異なるゴチュジャンの NGS

告 22–24) があるが，熟成終了時の試料，M-Sep，M-Mar，

M-Jan をみると，M-Sep では微生物叢の約 30％を占めてはいるものの，M-Jan と M-Mar では 1％以下であった物叢の全体でもかなりのリード数を占めていた．そして

7DEOH%DFWHULDOSUR¿OHVRIVDPSOHVRXUFHVRIJRFKXMDQJ
Phylum Class

Taxon names
2UGHU Family Genus

Species

P-Sep P-Mar

Samples
5HG
P-Jan M-Sep M-Mar M-Jan Pepper

Firmicutes (44)
Bacilli (44)
Bacillales (26)
Bacillaceae (14)Bacillus(6)19.0% 14.0% 44.2% 29.3%

0.3%

0.4% 77.9%

18.6% 13.7% 43.8% 28.1%

0.3%

0.3% 77.9%

licheniformis (1)

0.0%

0.1%

0.4%

1.2%

0.0%

0.1%

0.0%

Others (3)

0.4%

0.2%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

0.0%

1.3%

1.6%

1.3%

0.1%

0.0%

0.1%

0.0%

8.1% 30.4% 42.2% 52.0% 78.1% 97.8%

0.0%

0.1%

a)

amyloliquefaciens (2)b)

Others (8)Staphylococcaceae (8)Staphylococcus (8)Others (4)

0.0%

0.1%

0.0%

3.8% 15.3%

3.2% 15.2% 21.4%

1.2%

4.9%

1.8%

0.8%

0.2% 12.2%

0.9%

0.2%

0.0%

Weissella (4)

0.5%

7.7%

2.2%

1.0% 18.9%

0.5%

2.2%

Others (8)

1.5%

6.8%

0.8%

2.0%

1.6%

0.5%

2.7%

56.4% 37.7%

5.0%

0.1%

0.1%

0.0% 17.0%

Gammaproteobacteria (24)

52.6% 32.5%

4.3%

0.1%

0.0%

0.0% 16.7%

Others (11)

3.8%

5.2%

0.7%

0.0%

0.0%

0.0%

0.3%

Others (14)

11.3%

0.2%

3.8%

0.4%

0.1%

0.4%

0.0%

8QDVVLJQHG 

0.0%

0.3%

0.0%

2.8%

0.0%

0.0%

0.2%

Lactobacillales (18)

0.5%

0.3%

0.1%

Lactobacillaceae (6)Lactobacillus (6)Leuconostocaceae (4)Proteobacteria (35) 1XPEHURIREVHUYHG278VLQYROYHGZLWKUHVSHFWLYHWD[RQRPLFJURXSVD 278VDUHFORVHO\UHODWHGWRB. amyloliquefaciens1%5&>DFFHVVLRQQR$%@ VHTXHQFHVLPLODULWLHVDQG
98.4%), the same as to B. velezensis)=%>15B@  DQGWRB. subtilis 168 [NR_102783] (100%, 98.4%).
E &ORVHO\UHODWHGWRB. licheniformis AK39422 [HQ234338] (98.4%), the same as to B. sonorensis F3-49 [KT735226] (98.4%).
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（Table 2）．Bacillus 属細菌の発酵・熟成に対する役割は，という報告 7,24–27) は，それらの検出法が NGS よりも鋭あったとしても，限定的であり，普遍的とは言えないと敏でなかったことに起因したものと考えられる．

判断できた．

ゴチュジャンの微生物叢

熟成工程終了時においまた，製品 P-Jan では B. amyloliquefaciens の割合がて，M-Jan の LAB の 割 合 は M-Sep と M-Mar の 1/10 以

40％以上であるにもかかわらず，調合・低温殺菌工程
前の M-Jan での B. amyloliquefaciens は 0.3％にすぎな
かった．一方，M-Mar の B. amyloliquefaciens の割合
は M-Jan と 同 程 度 で あ り な が ら， 製 品 P-Mar で は B.
amyloliquefaciens の割合は P-Jan の 1/3 にとどまってい
た．調合・低温殺菌工程で添加する唐辛子粉の Bacillus
属細菌のほとんどは B. amyloliquefaciens であり，その割合は約 80％であり（Table 2），これが製品にみられる B.
amyloliquefaciens の 源 の ほ と ん ど と 考 え ら れ る が，
P-Mar では P-Jan の 1/3 に，そして M-Sep は 30％でありながら，製品 P-Sep では 20％程度に低減している．低温殺菌工程後に観察された Bacillus 属細菌の微生物叢で下と，非常に低い割合であり，pH の結果と矛盾はなかった．一方，LAB の割合の高かった M-Sep では LAB の約80％が Lactobacillus 属細菌であり，Weisella 属細菌他は低かった．これに対し，M-Mar では LAB の大半をWeisella 属 細 菌 が 占 め て お り， こ の LAB の 大 半 をWeisella 属細菌が占めているという結果は M-Jan においても同様であった（Table 2）．
た だ し， 製 品 に お い て は，P-Jan の LAB 割 合 は，P-Sep のそれと，ほぼ同じ割合を示し，また P-Mar のLAB 割合は M-Mar よりも高くなっていた．NGS に供した試料の DNA 濃度は揃えられているため，これらの変動は熟成工程終了に続く調合・低温殺菌工程，瓶詰，保の割合は，低温殺菌工程での昇温をトリガーとして胞子存の過程での微生物叢変化である．そして，LAB の構化した胞子に由来するものと考えられ，NGS から得た成については，P-Sep では M-Sep と同様に Lactobacillus

微生物叢割合が高い数値であっても，P-Sep と P-Mar で属細菌が多くを占め，一方，製品での LAB 全体の割合

は低 pH で発芽が抑制され， 膨れ事故にいたらなかっで は P-Sep と 同 等 か そ れ 以 上 の P-Jan と P-Mar で は

この考察と前述の pH と乳酸含量の結果を併せ考える

Lactobacillus 属細菌よりも Weisella 属他の細菌群の割合が高い状態が維持されており，LAB 構成は調合・低たものと考えられる．
と，発酵から熟成工程における Bacillus 属細菌以外の，

温殺菌，瓶詰，保存の過程で，おおよそ保持されたとい

特に乳酸菌（ODFWLFDFLGEDFWHULD/$%）の役割を考慮す

える．熟成工程終了時および製品での LAB 構成の結果る必要があると言える．しかしながら，これまでゴチュ

から，ゴチュジャンの乳酸含量そして pH を決定していジャンから LAB は検出されないと報告

24–26)

されており，

るのは Lactobacillus 属細菌と帰結できるであろう．

また本研究の試料ゴチュジャンと同じ食塩濃度（7 およまた，すべての試料について Staphylococcus 属細菌

び 10％ NaCl）に調整した MRS 培地でのコロニー形成の微生物叢全体における割合は高く，特に熟成工程終了は観察できていなかった 7)．

時での割合は微生物叢全体の約半数以上であった（TableNGS での乳酸菌（LAB）検出NGS による分析（Table 2）で，熟成工程終了時の試料のみならず製品か
らも Lactobacillus 属細菌 6 種（L. sakei，L. acidipiscis，L.
brevis，L. fermentum，L. guizhouensis，L. halophilus）の 6 OTUs，Weissella 属細菌 3 種（W. paramesenteroides，(2)，W. thailandensis，W. ghanensis：複数の OTU が相当した種については，その OTU 数を ( ) 内に記した）の 4 OTUs が，また他に LAB と分類される Lactococcus（Lactococcus lactis；後述），Leuconostoc，Pediococcus，Enterococcus，Vagococcus，Trichococcus，Atopostipes，
Tetragenococcus 属細菌 27,28) それぞれ 1 種の計 8 OTUsが検知された．NGS は試料中に存在する DNA に基づいて微生物叢の構成を示しているため，これらの LAB がDNA 抽出時に生存し，活動していたことは保証できな
いが，DNA 抽出時までの活動の累積を示しており，製

2）．Lee ら 24) は ゴ チ ュ ジ ャ ン に つ い て 培 養 法 に よ り
Staphylococcus 属は Bacillus 属細菌より少なかったと報告しているが，本研究結果との相違は手法の違いによるものと考えられる．
熟成工程の温度と LAB

一般的な LAB の生育温度は 25 〜 37°C であり，下限でも 15°C と報告されている 27–29)．9 月，1 月，3 月の熟成工程の 14，28 そして 48
日目に，表面から 1 m の深さの温度を測定した．熟成工
程では諸味の切り返しがあり，切り返しによる外気の影
響が大きかったため，上述の平均温度を代表温度としてTable 1 に示している．瓶詰後の製品については常温保存であるため RT と記した．
熟成工程の前段の発酵工程の温度は，発酵による温度上昇が 30°C 以上にならないように制御されていたが，熟成工程の温度は外気温による季節変動を示していた．

品の乳酸含量は，これらのいずれかの活動の結果と言え微生物叢における LAB 全体の割合が高く，またその構る．また，これまでのゴチュジャンには LAB がいない成において Lactobacillus 属が多数を占めていた M-Sep

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生物工学

第97巻

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の平均温度は 24.7°C であり，Weisella 属細菌が多数を技術を用い，コチュジャン占めていた M-Mar は 18°C であった．これに対し，生育

た 結 果 を 報 告 し て い る． DGGE と NGS の 双 方 か らの下限とされる温度よりも低い温度が観察された M-Jan

膨 れ 事 故 そ の も の の 原 因 微 生 物 は 主 に Bacillus
amyloliquefaciens であったことを示し，そして，この B.
amyloliquefaciens は諸味の熟成後に添加，調合する唐で は，LAB 全 体 の 割 合 も 低 く， そ の 中 の 構 成 で もLactobacillus 属の構成割合は非常に低かった．
これらから，発酵・熟成工程を通してゴチュジャンの膨れ事故の原因を追究し辛子粉由来であることを明らかにした．また，添加した

乳酸含量を高め，pH を低下させているのは Weisella

唐辛子粉に随伴する B. amyloliquefaciens による 膨れ属よりも Lactobacillus 属細菌の方が乳酸発酵の効率

事故が高いためと言える．そして唐辛子粉に随伴する B.

の割合が低く，さらに LAB を構成する Lactobacillus 属

amyloliquefaciens の発芽を防腐剤などの添加ではなく低い pH で抑制するためには，これまで温度制御を施し細菌の割合が低い製造で発生することを，初めて明らかていなかった熟成工程においても，適切な温度管理が必要であることを示唆している．製造所では，これまでゴチュジャン製造工程において，発酵温度上限（30°C）と低温殺菌温度（75°C）が管理点として採用されてきたが， 膨れ事故防止の観点からは，熟成工程，特に冬季の基準温度設定と熟成槽の温度管理が必要であることが，NGS を用いた微生物叢の解析から初めて判明したといえる．
結論

防腐剤無添加のゴチュジャンでは，冬季の製造製品で膨れ事故が発生することがある．16S rRNA 遺伝子

をマーカーとして DGGE と NGS の Target Sequencing
法を併用し 膨れ事故の原因微生物と 膨れ事故に関与する微生物叢を解析した．
ゴ チ ュ ジ ャ ン の 微 生 物 叢 は 主 に Bacillus 属 細 菌，
Staphylococcus 属細菌そして LAB に分類される細菌から構成されていた．また，Bacillus 属細菌のほとん
ど は ゴ チ ュ ジ ャ ン の 膨 れ 事 故 の 原 因 微 生 物 B.
amyloliquefaciens であり，最後の調合・低温殺菌工程
で添加する唐辛子粉に随伴して製品に混入することが初めて判明した．
冬季製造製品では，熟成工程終了時に LAB の割合が低く，また LAB の構成において Weisella 属細菌よりもLactobacillus 属細菌が少ないという特徴があった．これを原因として熟成工程終了時に乳酸の含量が低く，pH が 4.5 以上となり，結果として低温殺菌工程で，B.
amyloliquefaciensの発芽が抑制できないため 膨れ事故に至ったと考えられる．
要約

ゴチュジャンは韓国の代表的な発酵食品であるが，時として流通過程で 膨れ事故を発生する．本研究は，

16S rRNA 遺伝子をマーカーとして変性剤濃度勾配ゲル
電気泳動（DGGE）と次世代シーケンシング（NGS）
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は，熟成工程の微生物叢において乳酸菌（LAB）にしている．
謝辞

本研究におけるコチュジャン細菌叢の NGS 解析は，
「公益財
団法人 高橋産業経済研究財団」の助成を受けて実施しました．ここに記して謝意を表します．

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