24トピックス〔ビタミン 97 巻トピックス

植物の葉緑体型アスコルビン酸ペルオキシダーゼの選択的スプライシング制御機構の解明に向けて
Toward elucidating the mechanisms that regulate the alternative splicing events
producing chloroplastic ascorbate peroxidase isoforms in plants

植物の葉緑体は光合成を行う場であるとともに，主sAPX-I，sAPX-II，および sAPX-III mRNA と tAPX をコー要な活性酸素種（ROS）の発生源でもある．光合成明反ドする tAPX-I mRNA を生成していることが明らかに応の光化学系装置や暗反応（CO2 固定）に関わる酵素のなっている（図 1）3）6）．一般的に，AS は前駆体 mRNA

いくつかは低濃度の ROS により容易に酸化 / 失活する．

上に存在するシス配列に，トランス因子が特異的に結そのため，アスコルビン酸を電子供与体として，ROS合することによって制御される 7）8）．APXII 遺伝子のの一種である過酸化水素（H2O2）を無毒化する反応を触AS においても，イントロン 12 の 3’ 側に存在する AT リッ媒する酵素，アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（APX）チな配列である splicing regulatory element（SRE）と名付を中心とした ROS 代謝系が発達している．すなわち，けたシス配列の存在が明らかになった．つまり，この光合成電子伝達系において H2O の酸化により生じた電SRE にトランス因子が結合することで，イントロン 11子の一部は O2 を還元し、スーパーオキシドラジカル

よ り も イ ン ト ロ ン 12 の AS 効 率 が 上 昇 し，tAPX-I（O2−）が発生する．O2−はチラコイド膜に局在するスーmRNA の生成量が増加する 3）．

パーオキシドディスムターゼ（SOD）により O2 と H2O2

近年の大規模 DNA シークエンス技術の発達により，に不均化され，続いてチラコイド膜結合型 APX（tAPX）

多様な生物種における AS 産物の存在が明らかになっにより H2O2 は H2O へと無毒化される．また，チラコているが，植物の AS は他生物種と比べてかなりの相イド膜から逃れた O2−はストロマに局在する SOD およ違があり，様々な環境に応答するために AS を独自にびストロマ型 APX（sAPX）により H2O へと無毒化され進化させ，利用してきていると考えられている 9）–11）．

1）–5）．このように，葉緑体内ではチラコイド膜上としかし，その相違のため，動物での研究結果を単純にストロマで，ROS に対する二重の防御システムが構成されている．また，APX の反応により生成する酸化型植物に反映できず，逆遺伝学的な手法が難しい．さらに，植物では in vitro でのスプライシング解析系が確

アスコルビン酸はアスコルビン酸再還元酵素群などに立されていない．そのため，植物特有のトランス因子るより，H2O 由来の電子を用いて再還元される．これらについてはほとんど明らかになっておらず，APXII 遺一連の反応により，H2O から生じた電子は H2O へと戻伝子の SRE に結合して AS 制御に関わるトランス因子ることになり，電子の収支はゼロである．したがって，も不明なままであった．そのような状況下で最近筆者

これらの代謝経路は Water-Water サイクルと呼ばれ，余らのグループは，独自に工夫した遺伝学的スクリーニ

剰還元力の安全な消去にも働いている 1）．すなわち，ング手法を確立し，葉緑体型 APX の AS 制御因子の同葉緑体内における高濃度（mM オーダー）のアスコルビ定を試みたので紹介したい 12）.

ン酸および tAPX と sAPX の存在が光合成の健全性維データベース解析の結果，ホウレンソウ葉緑体型APXII 遺伝子と同様の AS 機構はカボチャ，アイスプ持や，適切な ROS シグナルの発信を通した環境ストレス応答の根幹である．
これまでに，ホウレンソウにおいて葉緑体型 APX

ラント，タバコ，ダイズなどの多様な真正双子葉植物にも認められた．一方，バナナ，トウモロコシ，セイアイソフォームはひとつの遺伝子（APXII）にコードさヨウアブラナ，ジャガイモなどに加え，モデル植物とれ，選択的スプライシング（AS）によって合計 4 種類して利用され，遺伝子情報や実験系が豊富なイネ，シの成熟型 mRNA 産物，すなわち sAPX をコードする

ロイヌナズナ，トマトは葉緑体型 APX アイソフォー

1 号（1 月）2023〕

25

トピックス

?
Intron11?

?

C-terminus of sAPX

APSI1

exon12exon13poly(A)

Intron12poly(A)SRE

Splicing or retention of intron11

Thylakoid membrane-binding domain of tAPX

Activation of intron12 splicing

mRNA variants





12

図1aaaaaaa

1213aaaaaaa

1213aaaaaaa



13aaaaaaa



APXII 遺伝子の AS 機構と APSI1 による AS 制御のモデル

ホウレンソウの葉緑体型 APXII 遺伝子の 3’ 末端領域（エキソン 11-13）の構造と AS により生成する成熟型
mRNA の構造を示す．葉緑体型 APXII 遺伝子のイントロン 1 〜 10 は構成的にスプライシングされるが，イントロン 11 もしくは 12 の AS とエキソン 12 もしくは 13 末端の選択的ポリアデニル化により，3 種類の sAPX およびチラコイド膜結合ドメインを翻訳領域とする 1 種類の tAPX mRNA が生成する．APSI がSRE 配列に結合することで，イントロン 12 の AS 効率が促進し，tAPX-I mRNA の生成量が増加する．四角：
エキソン，線：イントロン，*：終止コドン，poly（A）：ポリ A シグナル，白：非翻訳領域．

ムを個別の遺伝子領域から生成していた．しかし , 恒
常的プロモーターの下流にホウレンソウ APXII 遺伝子発光量を指標にスクリーニングを行った 12）．その結果，の AS 領域であるエキソン 11 から 13 を連結した遺伝

約 20,000 株の M2 株から発光抑制株を 9 株（apsi1，3〜 9）単離した．APXII-Fluc 株と戻し交配した F2 株の子をシロイヌナズナに形質転換したところ，ホウレン表現型から，apsi1 株は単一の劣性変異を有している

ソウと同じように 4 種類全ての成熟型 mRNA の生成が確認できた 12）．この結果は，SRE を介した AS 機構ことが示唆された．次世代シークエンス解析の結果，
apsi1 株では第 5 染色体の 17 Mbp 付近に多数の変異がが植物間で広く保存されていることを示唆しており，検出され，そのうちひとつの遺伝子（APSI1）のエキソシロイヌナズナが葉緑体型 APX の AS 機構の解析に利ン 1 末端付近に，ナンセンス変異の原因となる C からT への置換が認められた．apsi1 株に未変異の APSI1 遺用できることを意味していた .
そこで，ホタルルシフェラーゼをコードする Fluc伝子を導入した結果，表現型が回復した．そこで，ホcDNA を分断する形でホウレンソウ APXII 遺伝子のイントロン 11 から SRE までを挿入したキメラ遺伝子をウレンソウ APXII 遺伝子のエキソン 11 から 13 を導入したシロイヌナズナ野生株（WT/APXII）および APSI1構築し，シロイヌナズナに形質転換した（APXII-Fluc

遺伝子破壊株（KO-apsi1/APXII 株）における各 AS 産物株）．本遺伝子から生成する前駆体 mRNA はホウレンソウ APXII 遺伝子と同様に AS され，3 種類の成熟型mRNA（sAPX-II，sAPX-III および tAPX-I 型）を生成す量を解析した．その結果，KO-apsi1/APXII 株では WT/APXII 株よりも tAPX-I mRNA 量が低下していた．一方で，APSI1 を過剰発現するシロイヌナズナ株に APXIIるが，それらの中で tAPX-I 型に AS された mRNA の遺 伝 子 を 導 入 し た（APSI1ox/APXII 株 ）結 果，tAPX-I

みが，完全長の Fluc タンパク質をコードしている．すなわち，本株では tAPX-I 型の AS 効率をルシフェラー

mRNA 量が増加していた．これらの結果から，APSI1遺伝子の変異が apsi1 株の表現型の原因であり，APSI1

ゼの発光量として非破壊的にモニタリングすることがは tAPX-I mRNA 生成のためのイントロン 12 の AS のできる．そこで，APXII-Fluc 株をエチルメタンスルホ促進因子であることが明らかになった（図 1）12）.
APSI1 は Oligonucleotide/Oligosaccharide-Binding（OB）-ン酸処理することで変異株を作製し，ルシフェラーゼ

26〔ビタミン 97 巻トピックス

fold protein をコードしている．これまでに，OB-fold減少していた．以上より，APSI1 は植物界に広く分布

protein に含まれる OB-fold ドメインはタンパク質間おしており，葉緑体型 APX 遺伝子の SRE を介した ASよびタンパク質と DNA または RNA との相互作用に関の制御因子のひとつであることが明らかになった．

与すること，および本ドメインを含むタンパク質はスーパーファミリーを構成し，DNA の複製および修復，これまでに，ホウレンソウおよびタバコにおけるAPXII 遺伝子の AS は組織特異的に制御されることが転写，翻訳，低温ストレス応答，またはテロメアの維報告されている 3）．すなわち，チラコイド膜がないア13）14）．また最ミロプラストを有する根ではイントロン 12 より 11 の近，本ドメインを有する RNA ヘリカーゼ A がウイル

ス プ ラ イ シ ン グ が 優 先 さ れ，sAPX（sAPX-I 〜 III）

スの RNA スプライシングの制御に関与していることが報告された 15）16）．したがって，APSI1 は APXII 遺伝

mRNA が生成するが，葉では SRE にトランス因子が持などに関与することが報告されている子の AS 制御に直接関与している可能性がある .

結合することで，イントロン 12 の AS 効率が促進し，tAPX-I mRNA の生成効率が上がる．しかし，APSI1 の上述のように，APXII 遺伝子の AS は SRE によって発現量はシロイヌナズナやタバコの葉と根において同制御されており，そこに特異的に結合する核タンパク程度であり，tAPX-I mRNA の AS 効率の変化と一致しなかった 12）．これらの結果から，APSI1 は APXII 遺伝質の存在が示唆されている 3）．そこで，APSI1 組換えタンパク質と SRE 配列を含む合成 RNA を用いて，invitro でのゲルシフトアッセイを行った 12）．その結果，
APSI1 は SRE と特異的に複合体を形成したが，変異し子の AS の組織特異的な制御に関与しないことが示され た． ま た， シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ や タ バ コ に お い て，
APSI1 遺伝子を完全に破壊しても tAPX-I mRNA の生

APSI1 は SRE に配列特異的に結合することが明らかに成が完全に抑制されなかった 12）．これらの結果は，
APSI1 が APXII 遺伝子の AS 制御における決定的な因なった（図 1）．
APSI1 が APXII 遺伝子の AS 制御に関与している場合，子ではないことを示唆している．すなわち，葉でのAPXII 遺伝子の AS 効率の維持には APSI1 が必要であ

他のスプライシング因子と共に核に局在すると考えらるが，APSI1 以外にも tAPX-I mRNA 生成の AS 効率促

た SRE と は 結 合 し な か っ た． こ れ ら の こ と か ら，れる．そこで，APSI1 と GFP との融合タンパク質を発進に働く因子の存在が示唆され，根では APSI1 の作用現させたシロイヌナズナを用いて，細胞内局在性を解を競合的に阻害する因子が存在すると考えられた（図析した 12）．その結果，融合タンパク質由来の蛍光シグ1）．これらの結果は植物の AS 制御の複雑性を暗示す

ナルは核内に，特に核小体様の領域に強く検出された．

るものである．今後，APSI1 のシロイヌナズナやタバ

これまでに，RNA や DNA の代謝に関わる複数の因子

コの他の遺伝子の AS への役割や，apsi1 株以外の変異が核小体に局在することが明らかになっている17）–19）．

また，核小体は様々な酵素が核内で機能する必要が生株の原因遺伝子の機能を明らかにすることにより，APXII 遺伝子の AS 制御メカニズムの全容のみならず，じるまでの貯蔵場所であると報告されている 20）．これ

植物界における AS 制御機構の普遍性や進化過程を明らのことから，APSI1 の核内局在性は AS 制御機構の要らかにすることができると考えられる .

求に応答して変化している可能性があると考えられた．
ここまでの実験に用いたシロイヌナズナは sAPX とKey words :vitamin C, ascorbic acid, ascorbate peroxidase,tAPX を個別の遺伝子領域から生成するため，APXII 遺alternative splicing, oligonucleotide/oligosac-

伝子の AS 制御における APSI1 本来の役割を明らかにcharide-binding-fold proteinすることができない．そこで以降では，ホウレンソウと同様に葉緑体型 APX を AS によって生成するモデル

Department of Food and Nutritional Science, College of

植物のタバコを実験材料に用いた．データベース検索の結果，タバコには APSI1 と相同性の高い 2 つの遺伝

Bioscience and Biotechnology, Chubu University, 1200子（NtAPSI1-1，NtAPSI1-2）が認められた

12）．タバコはMatsumoto-cho, Kasugai, Aichi 487-8501, Japan
Kanako Su]uki, Ka]uya Yoshimura

複二倍体であるため，両者は遺伝子重複により生じた

中部大学応用生物学部食品栄養科学科と考えられた．そこで，CRISPR/Cas9 を用いたゲノム鈴木

編集によって，NtAPSI1-1 および NtAPSI1-2 を同時に機能欠損させたタバコ株を作出し，内在性の APXII 遺利益相反自己申告：申告すべきものなし

花奈子，吉村和也

伝子の AS に及ぼす影響を解析した 12）．その結果，野生株と比較してゲノム編集株では tAPX-I mRNA 量が（2022.9.30 受付）1 号（1 月）2023〕

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トピックス

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