10 号（10 月）2021〕

トピックス

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アスコルビン酸生合成機構の多機能化と効率化〜植物のアスコルビン酸生合成酵素群は細胞質と核に局在し，巨大な複合体を形成しているかもしれない〜
Optimization and multi-functionalization of the mechanism of ascorbate
biosynthesis: enzymes involved in the ascorbate biosynthesis in plants might localize
to cytosol and nucleus, and form a large complex

アスコルビン酸（AsA）は動植物において必須の分子であるが，ヒトを含む一部の動物は合成能を欠いているため食事により野菜や果物などから摂取する必要がをコードする遺伝子は遺伝学的スクリーニングにより単離されたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）変異ある．一方，植物は AsA を豊富に含んでおり，水溶性株の表現型に由来して VTC2 と名付けられているが，本稿では混乱を防ぐため，以降 GGP 遺伝子と表記する．の酸化還元物質として補酵素や電子伝達など様々な役一部の報告を除いて，GGP 遺伝子の発現のみが環境の割を担っていることに加え，抗酸化物質として環境ス変化にダイナミックに応答し，それに伴い AsA 量も増トレスに対する応答や耐性に重要な役割を果たしてい減することが明らかになっている 8）．さらに，GGP 遺．そのため，植物細胞内の AsA 濃度やその酸化還元比は周囲の環境条件の変化，例えば光照射の有無

伝子の翻訳は AsA によりフィードバック抑制されている 9）．すなわち，植物の AsA 生合成能は GGP の転写やその強度に合わせてダイナミックに変化する．当然と翻訳段階の両方で制御されていることになる .

る

1）2）

ながら，それらは生合成や分解の速度，および細胞内最近，GGP の重要性は Complex Pathway Simulator をの酸化還元状態などのバランスにより決定されている．

用いたバイオインフォマティックスの手法でも確認さ

植 物 に お い て，AsA 生 合 成 の 主 要 な 経 路 で あ るれた 10）．すなわち，AsA 生合成経路の速度モデルを構

Smirnoff-Wheeler 経路では，光合成産物である D-フル築したところ，AsA によるフィードバック抑制が十分クトースから，D-マンノース（D-Man）および L-ガラクに強い場合，D-Man/L-Gal 経路を構成する酵素の中で，トース（L-Gal）の誘導体を代謝中間体として AsA が合GGP のみが経路の流量と合成される AsA 量に大きな

D-Man/L-Gal 経路とも呼ばれる （図 1）．
成されるため，影響を及ぼすことが示された．しかし，その転写や翻そのうち，L-ガラクトノ-1,4-ラクトン（L-GalL）までの訳の制御に本質的に関与する因子は未同定であり，制反応を触媒する酵素は細胞質に局在しているが，L-御機構の詳細は不明なままである．

3）

GalL から AsA への最終段階の反応はミトコンドリア

また，AsA 生合成経路を構成する酵素遺伝子が AsA

内膜の膜間腔側に局在する酵素，L-GalL デヒドロゲ生合成とは別の役割を果たしている可能性も示されてナーゼ（GLDH）により行われている．また，代謝中間いる．すなわち，GDP-Man ピロホスホリラーゼ（GMP）

体の GDP-D-Man や GDP-L-Gal は細胞壁の多糖類の合遺伝子および GDP-Man-3,5-エピメラーゼ（GME）遺伝成やタンパク質のグリコシル化にも利用されるため，子をホモ型にノックアウトしたシロイヌナズナ株

GDP-L-Gal から L-Gal-1-リン酸への反応以降が AsA 合成に特異的な（コミットされた）反応となる．事実，（cyt1-1 および gme-1）はどちらも致死性の表現型を，GME 遺伝子をヘテロ型にノックアウトした株は葉がGDP-L-Gal ホスホリラーゼ（GGP）により触媒される上薄い緑色になる表現型を示すことが明らかになってい記の反応（AsA 生合成にコミットされた経路の初発段る 11）12）．同様に，GLDH および L-Gal デヒドロゲナー階）が D-Man/L-Gal 経路の律速段階となっている 4）-7）．

ゼ（L-GalDH）遺伝子のノックアウト株や，GGP 遺伝子

本経路の制御と重要性については，最近の本誌 8）にてとそのパラログである VTC5 遺伝子の二重ノックアウ

詳しく解説されているので参照されたい．なお，GGP

ト株も生長が著しく阻害される表現型を示すが，培地トピックス454〔ビタミン 95 巻に AsA を 添 加 す る こ と で 回 復 す る 4）13）14）． し か し，GMP や GME 遺伝子をホモ型に，および GME 遺伝子に形質転換した．得られたタバコから粗抽出液を調整し，ゲルろ過クロマトグラフィーで分画した後に，抗 GFPをヘテロ型にノックアウトした株の表現型は AsA を添抗体および抗 HA 抗体を用いたイムノブロット解析を加しても回復しなかった．これらの結果，特に GME行った．その結果，L-GalDH（+HA = 40.9 kDa）は推定分遺伝子のヘテロ型の表現型は，上述したように GMP子量に相当する画分で検出された．また，GLDH（+HAや GME による反応の生成物が細胞壁の合成やタンパ= 75 kDa）は 233 kDa 以上の画分で検出された．これは，ク質のグリコシル化に影響することのみでは説明できGLDH がミトコンドリアの複合体 I と相互作用しているず，疑問は残されたままである．しかし最近，その疑ためと考えられた 17）．一方，GMP（+GFP = 68.6 kDa），

問を解決するヒントとして，AsA 生合成関連酵素の多GME（+HA = 49.2 kDa），GGP（+GFP = 78 kDa）お よ び

くが核に局在すること，および細胞内で複合体を形成GPP（+GFP = 58.2 kDa）はすべて 63 から 233 kDa の間のしていることが報告されたので紹介したい．

10）

これまでに，GMP および GGP は細胞質と核の二重局在性を示すことが報告されている．そこで，そ15）16）

れら以外の AsA 生合成関連酵素の細胞内局在性を検証するために，タバコ（Nicotiana benthamiana）の葉で C末端に GFP を融合させた酵素遺伝子を一過的に過剰発現させ，蛍光を観察した．その結果，GMP や GGP 遺画分に渡って検出された．これらの結果から，GMP，GME，GGP および GPP は細胞内で巨大な複合体を形成していると考えられた（図 1）．
しかし，それら酵素間の相互作用は酵母ツーハイブリッド法では確認できなかった．すなわち，GMP，GME および GPP は他の酵素とではなく，それら自身が多量体を形成していることを示唆する自身との相互伝子と同様に，L-Gal-1-リン酸ホスファターゼ（GPP）作用のみが認められた．酵母ツーハイブリッド法でのおよび L-GalDH 遺伝子を用いた場合，核と細胞質の両転写活性化ドメインや結合ドメインとの融合が本来の方で GFP 蛍光が検出された．一方で，GME 遺伝子を相互作用を阻害した可能性は除外できないが，上述し用いた場合は細胞質および核の周辺に GFP 蛍光が検出たゲルろ過クロマトグラフィーでの結果も考慮するされた．過剰発現により細胞内局在性が変化した可能と，単純に 2 つの酵素が結合しているわけではなく，性を考慮して，GFP と融合させた酵素遺伝子を，5’ 非複数の酵素が複雑に相互作用して複合体を形成してい翻訳領域を含む自身のプロモーターにより発現させたる可能性が高い．

シロイヌナズナの子葉，胚軸および根での GFP 蛍光を以上より，AsA 生合成経路の一部の酵素は細胞質で調べた．その結果，GME 遺伝子を用いた場合はどの巨大な複合体を形成し，AsA 生合成中間体を効率よく組織においても細胞質でのみ GFP 蛍光が検出された

連続して反応させることで AsA 生合成の代謝フラックが，GPP および L-GalDH 遺伝子を用いた場合は細胞スを増加させていると考えられる．それにより，律速質と核の両方で蛍光が検出された．これらの結果から，酵素である GGP による制御を効率化しているのかも

GMP および GGP に加え，GPP および L-GalDH も核としれない．また，それらの酵素は核内でも複合体を形細胞質の二重局在であることが示された（図 1）．また，
GPP および L-GalDH 遺伝子を用いた場合，根では核成し，AsA 生合成以外の役割を果たしている可能性がある．さらに，複合体の形成には複数の生合成関連酵内で点状に蛍光がみられ，核小体に局在していること素の存在が必須であるため，GME 遺伝子のホモ型やが示唆された．

ヘテロ型のノックアウト株の表現型が培地への AsA 添

続いて，シロイヌナズナの AsA 生合成関連酵素遺伝加により回復しないのは，GME の欠損や減少が核で子の C 末端に GFP もしくは HA タグを付加した遺伝子をタバコ（N. benthamiana）で過剰発現させ，共免疫の複合体形成を抑制したためかもしれない．しかし，沈降法による相互作用の解析を行った．その結果，果たしているのかなどの詳細は不明であり，今後の研GMP と GME，GME と GGP，GGP と GPP，GPP と L-究課題となっている．また今回得られた結果は，複数

GalDH および GMP と L-GalDH の組み合わせで相互作の AsA 生合成関連酵素を形質転換により過剰発現させ用が確認された．

た植物から得られたものであることにも注意を払う必

複合体がどのようにして形成され，どのような機能をそこで，それらが一対のペアで相互作用しているので要がある．すなわち，実際に植物細胞内の native 酵素はなく，巨大な複合体を形成している可能性を検証する

が複合体を形成しているのかについてはさらなる検証

た め に，GMP，GME，GGP，GPP，L-GalDH お よ び
GLDH 遺伝子のすべてに GFP もしくは HA タグのいずが必要である .

れかを付加した遺伝子を同時にタバコ（N. benthamiana）

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トピックス

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D-Fru-6-P

Cytosol

D-Man-6-P

Protein glycosylation
Cell wall biosynthesis

PMIPMM

D-Man-1-P

GDP-D-Man

GMP GME

L-GalDH

L-GalL

L-Gal

GPP

GGP

GDP-L-Gal

L-Gal-1-P

Nucleus
Nucleolus
L-GalDH

Mitochondrion

GPP

L-GalL

GLDH

?

GMP
GGP

AsA

図1

シロイヌナズナの AsA 生合成酵素群の細胞内局在と複合体の形成

AsA 生合成の主要な経路である D-Man/L-Gal 経路を構成する一部の酵素（GMP，GME，GGPおよび GPP）は細胞質で巨大な複合体を形成し，AsA 生合成中間体を効率よく連続して反応させることで AsA 生合成の代謝フラックスを増加させていると考えられる．また，一部の酵素は核内にも局在し，AsA 生合成以外の役割を果たしている可能性がある．AsA：アスコルビン酸，D-Fru：D-フルクトース，D-Man：D-マンノース，L-Gal：L-ガラクトース，
L-GalL：L-ガラクトノ-1,4-ラクトン，P：リン酸，PMI：Man リン酸イソメラーゼ，PMM：
Man リン酸ムターゼ，GMP：GDP-Man ピロホスホリラーゼ，GME：GDP-Man-3,5-エピメラー
ゼ，GGP：GDP-L-Gal ホスホリラーゼ，GPP：L-Gal-1-リン酸ホスファターゼ，L-GalDH：
L-Gal デヒドロゲナーゼ，GLDH：L-GalL デヒドロゲナーゼ

Key words :vitamin C, ascorbic acid, VTC2, GDP-L-galactose
phosphorylase

ascorbic acid in plants. In: Ascorbic Acid in Plant Growth, Development and Stress Tolerance. Springer International Publishing,Department of Food and Nutritional Science, College ofBioscience and Biotechnology, Chubu University, 1200
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利益相反自己申告：申告すべきものなし（2021.7.1 受付）

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トピックス

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