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トピックス

ピリドキサール酵素と光3\ULGR[DO(Q]\PHVDQG/LJKWは生理的には 4-アミノ酪酸とピルビン酸のアミノ基転移

従来からピリドキサール酵素を扱う際には完全な遮光とまでは行かなくとも，不必要に光を当てることがをつかさどっているが，1-フェニルエチルアミンとピルないようにということが言われてきた．これは光を当ビン酸のアミノ基転移も良好に触媒することから，非常て る こ と に よ っ て 補 酵 素 ピ リ ド キ サ ー ル 5ƍ-リ ン 酸に基質特異性が広く，物質生産への応用が期待される 3）．

（PLP）あるいは酵素タンパク質に不可逆的な変化が生

このことから，Berglund らのグループはさまざまな条件じ，酵素が生理的な状態ではなくなるため，その酵素下での SpATA への光照射の影響について調べた 4）．まの機能解析に障害をきたすことが考えられるからであず暗所 22°C，pH 9 で PLP を緩衝液に加えずに温置するる．
PLP の光による影響は 1950 年代から知られており，と，活性低下の半減期は 100 mM CHES では 28 h，100mM Tris で は 23 h で あ っ た． 類 縁 酵 素 で あ る Vibrio

光照射によって PLP は 3 種類の化合物に変化することÀXYLDOLV 5）や Chromobacterium violaceum 6）のアミンアミノが示された 1）．それらはピリジル（1），ピリドイン（2），基転移酵素においても同様の失活が起こり，その解析のそしてピリドキシン酸（3）である（図 1）．最初に光反応によって生成するのは 2 であり，それが酸化を受け結果，この温置による失活は二量体酵素の単量体への解離によるものであると考えられた．活性部位が二量体のて 1 になる 1）2）．

界面にあること，また単量体への解離によって PLP のリ

ピリドキサール酵素は既存・新規のアミノ酸やその誘ン酸基を受け入れる構造が開き，PLP が外れるために失導体の生産などで有用な酵素群であるため，その安定性活が起こることが考えられた 6）．このことは逆に PLPの 確 保 は 重 要 な 課 題 で あ る．KTH Royal Institute ofが二量体構造を維持することをも意味する．確かに 10Technology の Berglund ら の グ ル ー プ が 見 い だ し た
Silicobacter pomeroyi のアミンアミノ基転移酵素（SpATA）

mM の PLP の存在下，SpATA の活性の半減期は 720 h（CHES）および 140 h（Tris）に延長した．論文 4）には書

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図1

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PLP への光照射によって生じる化合物9 号（9 月）2023〕

トピックス

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かれていないが，よく知られているように Tris は PLP

た 1 や 2 がカルボニル基の部分で酵素の活性部位に共とシッフ塩基を形成することから，Tris 緩衝液中では有結合し，それによって酵素が失活するためと考えら

実質的な PLP の濃度が低下したために酵素の失活がれる．

CHES 緩衝液中に比べて早いと解釈することができる．

各種ピリドキサール酵素の活性に対する光の影響は少確かに 100 mM Tris 緩衝液に 1 mM PLP が存在するときの吸収スペクトルは 410 nm のピークのみが観察さし前に Rother らのグループによっても調べられている 8）．
興味深いことに，Bacillus megaterium の ATA は SpATA

れ，遊離の PLP の吸収極大である 388 nm の箇所にピーと同様に光照射による失活が起こるが，9LEULR ÀXYLDOLVクや肩が観察されなかった．このことは，100 mM Trisの ATA は光照射による失活が起こらず，また抗糖尿病薬 sitagliptin 生産のために改変された Arthrobacter sp. の緩衝液中では添加する PLP が 1 mM までは PLP を添加しても失活の半減期の延長が観察されず，10 mM の添ATA（AsATAmut11）では逆に光照射によって 50％程度の加によって初めて半減期の延長が現れ始めたことと符活 性 の 上 昇 が 認 め ら れ た． ま た，Selenomonas
ruminantium および大腸菌のリシン脱炭酸酵素はいずれ合する．
引き続き，光照射の実験が行われた 4）．1000 lx の昼も光照射によって顕著に失活が起こった．これらの理由

光に曝露することによる経時的な失活を調べたとこについては論文 8）では考察されていないが，リシン脱炭ろ，PLP 非存在下では CHES，Tris いずれの緩衝液中酸酵素の失活については以下のような議論が可能であろでも PLP を加えない場合，活性の半減期が 10–12 h とう．Selenomonas のリシン脱炭酸酵素はピリドキサール失活速度が 2 倍になった．ところが，添加する PLP の酵素のフォールドタイプ III，大腸菌の酵素はフォールド濃度を増加させていくと，活性の半減期が延長し，特タイプ I と全体構造は異なるものの，いずれも PLP のピに 10 mM PLP を含む Tris 緩衝液中では 138 h と顕著にリジン環とスタッキングする位置にヒスチジン残基のイ延長した．

ミダゾール環が存在している（Selenomonas 酵素は PDB

この実験系では光照射によって緩衝液中に存在するPLP が図 1 のいずれかの化合物になると考えられる．

5GJM，大腸菌酵素は PLP を結合した構造がないが，類縁の Pseudomonas aeruginosa 酵素の構造 PDB 6Q6I を参そこで光照射による吸収スペクトルの継時変化を観察照）．PLP はヒスチジン残基やシステイン残基の光酸化したところ，100 mM CHES 緩衝液中の 1 mM PLP は経を仲介している 7）ことから，このヒスチジン残基がこれ時的に 388 nm の吸収が減少し，それに伴って 300 nmに新たな吸収帯が出現した．これは 1 あるいは 2 の構らのリシン脱炭酸酵素が光による失活を受けやすいことの理由となっている可能性がある．このように光による

1）造のものであり，文献値 の 288 nm よりも長波長に失活はそれぞれのピリドキサール酵素によって起こりやシフトしているのは pH が異なるためと考えられた．

すさや機構が異なっており，各酵素の構造的，機能的特一方，100 mM Tris 緩衝液中の 1 mM PLP では吸収ス徴に依存していると言うことができる．

ペクトルの変化が観察されなかった．これは PLP が最後に，PLP が光によって図 1 に示す化合物を生成

Tris とシッフ塩基を形成することによって光による反する理由について考察したい．2 は 2 分子の PLP がベ応を受けなくなることを示している．Tris 緩衝液中でンゾイン縮合したものであり，1 はそれが酸化されたは PLP が光の影響から保護され，しかも 10 mM の高も の で あ る． こ の 酸 化 は， ピ リ ジ ン 環 に 挟 ま れ た

濃度の PLP 存在下ではわずかに存在する遊離の PLP−（C=O）−CHOH−の CH が容易に脱プロトン化を受が酵素の活性を維持するように働くことが，100 mMけるため，生じたカルボアニオンが O2 と反応するこTris 緩衝液，10 mM PLP の条件で光による失活が顕著とによって容易に進行すると思われる．ベンゾイン縮に抑えられる理由と考えられる．

合は通常は芳香族アルデヒドと HCN とのシアノヒド

光照射による酵素の失活の原因として第一に，PLPリンの形成を通じて行われる 9）が，HCN やチアミンのの濃度が減少し，それによって酵素の単量体化が促進

ような触媒がなくても，光照射によって行われることされる可能性が考えられる．ところが，失活した酵素が知られている．その機構は図 2（A）に示すとおりでに PLP を添加しても活性の回復はほとんど起こらなある 10）．この機構では光によって励起されたベンズア

かった 4）．これは単量化に伴って酵素タンパク質の構ルデヒドから水素ラジカルがもう 1 分子のベンズアル造が不可逆的に変化したためと解釈することもできる

デヒドに移動してラジカルのペアを形成し，それが結が，PLP を含む緩衝液に 24 h 光照射を行って完全にPLP が消失したものを酵素溶液に加えると経時的に酵合してベンゾインを形成する．PLP でも同様の機構で反応が進行し，ピリドイン 1 が形成されると考えられ素の失活が起こった 4）ことから，光照射の結果生成しる．一方，PLP–Tris シッフ塩基は水溶液中で図 2（B）

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図 2 （A）光反応によるベンゾイン縮合の反応機構．
（B）中性水溶液中の PLP および PLP–Tris シッフ塩基に示すような分子内水素結合を形成するため，ピリド

Professor Emeritus, Osaka Medical and Pharmaceutical

イン様の構造を形成する際に立体障害が発生することUniversityが考えられる．また，励起状態分子から基底状態分子

Hideyuki Hayashi

への水素ラジカルの移動が基底状態分子の非共有電子

大阪医科薬科大学名誉教授

対においてなされるのであれば，非共有電子対を持た林秀行

ないプロトン化シッフ塩基では水素ラジカルの移動が行われないことになる．もしもそうであれば，Tris 緩

利益相反自己申告：申告すべきものなし

衝液中では光によるピリドインの形成が抑えられるこ（2023.6.15 受付）とを説明できることになる．
また，ラジカルペアのそれぞれの構造は O2 と反応しやすいため，ペルオキシラジカルを形成したのちに一連の反応を経てカルボキシ基を形成することが期待される．これが起こっているとすれば，光による 3 の生成を説明することになる．
上述のようにピリドキサール酵素はそれぞれの特性により光感受性に大きな差がある．いま一度，研究対象のピリドキサール酵素の光による失活や吸収スペクトルの変化を調べておくことは重要と考えられる．

文献1）Morrison, A. L., and Long, R. F. (1958) 45. The photolysis ofpyridoxal phosphate. J Chem Soc, 211–215
2）Reiber, H. (1972) Photochemical reactions of vitamin B6compounds, isolation and properties of products. Biochim Biophys
Acta - Gen Subj 279, 310–315
3）Steffen-Munsberg, F., Vickers, C., Thontowi, A., Schätzle, S.,
Meinhardt, T., Svedendahl Humble, M., Land, H., Berglund, P.,

Key words :pyridoxal 5ƍ-phosphate, pyridoxal enzymes,light, benzoin condensation, oxidation

Bornscheuer, U. T., and Höhne, M. (2013) Revealing the structural
basis of promiscuous amine transaminase activity. ChemCatChem5, 154–157

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トピックス4）Merz, L. M., van Langen, L. M., and Berglund, P. (2023) The role

speci¿c photosensitizer for histidine residue at the active site ofof bu൵er, pyridoxal 5ƍ-phosphate and light on the stability of the6-phosphogluconate dehydrogenase. Arch Biochem Biophys 133,

Silicibacter pomeroyi transaminase. ChemCatChem 15,
e202201174
5）Chen, S., Campillo-Brocal, J. C., Berglund, P., and Humble, M. S.
(2018) Characterization of the stability of Vibrio fluvialis JS17
amine transaminase. J Biotechnol 282, 10–176）Chen, S., Land, H., Berglund, P., and Humble, M. S. (2016)
Stabilization of an amine transaminase for biocatalysis. J MolCatal B Enzym 124, 20–28
7）Rippa, M., and Pontremoli, S. (1969) Pyridoxal 5ƍ-phosphate as a

112–118
8）Gerlach, T., Nugroho, D. L., and Rother, D. (2021) The e൵ect ofvisible light on the catalytic activity of PLP-dependent enzymes.
ChemCatChem 13, 2398–24069）Nagendrappa, G. (2008) Benzoin condensation. Resonance 13,355–368
10）Theodoropoulou, M. A., Nikitas, N. F., and Kokotos, C. G. (2020)
Aldehydes as powerful initiators for photochemical transformations.
Beilstein J Org Chem 16, 833–857