〔生物工学会誌

第 88 巻第2号

54–59．2010〕2009 年 生物工学奨励賞（斎藤賞）受賞

出芽酵母におけるゲノム工学技術の
開発と応用
杉山

峰崇

Development of genome-engineering technology and its application
to genome science and biotechnology in Saccharomyces cerevisiae
Minetaka Sugiyama (Department of Biotechnology, Graduate school of Engineering, Osaka University,
2-1 Yamadaoka, Suita, Osaka 565-0871) Seibutsu-kogaku 88: 54–59, 2010.

20世紀後半に組換えDNA技術が確立されて以来，個々術の開発が，ますます必要となってきている．

の遺伝子を操作するためのさまざまな手法が開発されて著者らは，染色体を任意の位置で物理的に分断するときた．
そのおかげで，遺伝子の機能は急速に明らかとなっいうシンプルな操作がゲノム工学のキーテクノロジーにてきており，それらを通じて生命を工学することが可能なると考えた．染色体の分断は，任意の部位で染色体をとなったのは周知のごとくである．しかし，遺伝子を操2 つに切断するが，切断後もどちらとも染色体として機作する時代からゲノムを操作する時代へと移りつつある能させる技術である．分断後は，特定領域の削除だけで今，著者らは，生命を工学するための次世代基盤技術となく，他の染色体との融合や他細胞への移植などさまざ

して，ゲノムを自在に操作・改変するゲノム工学技術がまな操作を容易にする．さらに，染色体の分断技術は，重要になろうと考えた．そこで，産業上も重要であり，

酵母人工染色体（YAC）にクローン化された動・植物染

真核細胞のモデルでもある出芽酵母を材料に，数年前か色体にも適用可能である．したがって，酵母を細胞工場

らその開発に力を注いできた．

とした高等生物染色体の自在な操作も可能となる．

本稿では，はじめに新しいゲノム工学技術の開発とし一方，著者らは，染色体の分断技術を用いると，これて，著者らが独自に発展させてきた染色体の分断技術にまでのゲノム工学技術では難しかった大規模なゲノムのついてそのアイデアとともに解説する．そして，染色体再編，すなわち一挙に多様なゲノム組成を持つ細胞を作分断技術を用いたゲノムサイエンスとバイオテクノロ

り出すことも可能ではないかと考えた．

ジーへのアプローチとして，著者らが取り組んできた４つの研究について紹介したい 1–14)．
ゲノム工学のキーテクノロジー：染色体の分断技術

生命を形作るにはどのような遺伝子が必要であるかは，しばしば最少ゲノムという言葉で表現されるバイオサイエンスにおける最も根源的な問いの 1 つである．一方，特定の物質生産に最適な株をどのように育種するか

ゲノム工学は，染色体の大領域の欠失や置換などさまということは，バイオテクノロジーにおける基本的な課

ざまな操作を可能とすることから，特に全塩基配列が先

題の 1 つとして挙げられる．たとえば，生産性向上のた

行して明らかとなっているポストゲノム時代において，め，酵母の場合，変異処理，交雑，細胞融合や遺伝子導ゲノムの機能解析に強力かつ有効なアプローチを提供す入などさまざまな方法が用いられてきた．しかし，ゲノる 15–17)．それゆえ，シンプルかつ効果的なゲノム工学技

ムを大規模に操作する時代に移りつつある今，ゲノム工

著者紹介

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大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻（助教） E-mail: sugi2@bio.eng.osaka-u.ac.jp

生物工学 第88巻

図1．染色体の分断技術を利用したゲノムの再構成．本文参照．

学的手法により，物質生産により適したゲノム組成や最少ゲノムに対する答えを導くことも，今までにない新たPCR-mediated Chromosome Splitting（PCS）法

な可能性をもたらすのではないだろうか．つまり，著者

染色体には，染色体として機能するために 3 つの配列

らのアイデアは以下のようなことである（図 1）．16本のが必要である．1 つ目は，染色体を複製させるための自染色体に合計約 6200 個の遺伝子を持っている一倍体の立複製配列（ARS），2つ目は，複製された姉妹染色体を酵母細胞を対象にして，染色体の分断を行い，多数のミ均等に分配するためにスピンドルが結合するためのセンニ染色体を作製する．非常に興味深いことに，酵母では，

トロメア，そして，3 つ目は，染色体の末端複製の問題

50 kb 以下のミニ染色体は不安定であり，細胞分裂時にを解決するためのテロメア配列である．したがって，染高頻度で脱落してしまうことが報告されている 18–20)．し色体の分断によって新しく生成した染色体もこれら 3 つたがって，分断後培養を行えば，さまざまな組み合わせの配列を具備していなければならない．これら 3 つの配でのミニ染色体の脱落が誘導され，多様なゲノム組成を列を導入し，さらに簡便で効率の良い染色体分断法を確持つ細胞の導出が期待される．たとえば，たった 20個の立するために，さまざまな経緯や困難があったが，紙面脱落可能なミニ染色体でも，その脱落の組み合わせは，が限られているので，ここでは割愛させていただき，最約 100 万通りにもなり，これまでの育種技術によっては終バージョンのみ解説させていただくことにする．

なし得なかった多様な組み合わせの多重変異株を創製で

上記の 3 つの配列の必要性を念頭におきつつ，操作がきる道が拓けることになる．物質の生産性でスクリーニ

シンプルで非常に効率が良く，しかも何度でも繰り返しングすることができれば，より高い生産性を示すゲノム分断を可能とする新しい染色体分断方法 PCR-mediated

組成を見いだすことも可能となる．また，ミニ染色体のchromosome splitting（PCS）法を確立した（図 2）7)．PCS

脱落により，培養した条件での最少ゲノム組成について

法は，セントロメアおよび分断株を選択するための選択

重要な知見を与えることも可能となろう．

マーカーを 2 ステップの PCR で調製し，酵母に導入する

このようなゲノム工学技術は，少なくともこれまでになかった技術であるので，革新的な育種技術という観点

簡単な方法である．操作はこれだけであるが，分断効率
は 80％以上を達成した．

からだけでなく，ゲノムの機能解析においても新しい事

操作を簡単に説明すると，1 回目の PCR で，分断のた実を発見できるのではないかと考えた．そこで，ゲノムめの標的配列となる約 400 bp の DNA 断片を 2 つ調製すを自在に改変するためのキーとなる技術として，操作がる．次に，2 回目の PCR で，テトラヒメナ由来の 36 bp

容易で効率の良い染色体分断技術の確立に取りかかっのテロメア配列（5'-(CCCCAA)6-3'）と選択マーカーからた．

なる DNA 断片，あるいは，5'-(CCCCAA)6-3' とセントロ
メアからなるDNA断片と1回目のPCRで調製した標的配

2010年 第2号

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図 3．パルスフィールドゲル電気泳動解析．レーン番号は生成された分断染色体の数を示す．
（a）第1 番染色体（Chr. I）の 5
回連続分断．第 1 番染色体が左端から順番に，2 つ，3 つ，4 つ，
5 つの染色体に改変されていることがわかる．レーン 5 では，2
つの 45 kb 分断染色体が重なっている．
（b）第5 番染色体（Chr.
V）の9 回連続分断．矢印は新しく生成した分断染色体を示す．
図2．PCS法．プライマー P1（20 mer）
，P2（オーバーラップ
配列 30 mer + 20 mer）
，P3（オーバーラップ配列 30 mer + 20
mer）
，P4（20 mer）を用いて1 回目のPCRで30 bp のオーバー
ラップ配列（黒塗り四角）が付与された標的配列（TARGET，
400 bp）をそれぞれ増幅する．次に，あらかじめ調製しておいた，5'-(CCCCAA)6-3'（黒塗り矢印）とオーバーラップ配列（黒塗り四角）を両端に持つ選択マーカー（loxP-MARKER-loxP，灰色長方形）およびセントロメア（CEN，灰色丸）と，1 回目に増幅した標的配列を用いてオーバーラップ PCRを行い，染色体分断に必要な 2 つの断片（fragment I と II）を調製する．その後，調製した 2 つの断片を同時に酵母細胞に導入すると，標的配列で相同組換えが起こり，染色体が分断される．

い分断効率を維持したまま，選択マーカーを再利用しつつ連続的に分断することが可能であった（図 3b）．これ
らの結果から，PCS 法では分断後も新しい染色体として正常に挙動できること，分断効率が高いこと，分断を繰返し行えることがわかり，PCS 法はシンプルかつ高効率の染色体分断方法であることがわかった．
さらに，ARS 配列が存在しない染色体領域を分断によって操作できるように，ARS 配列を PCS 法に取り込ん

列をオーバーラップ PCR で融合し，図 2 中の fragment I

だ方法も開発した 3,4)．YAC にクローン化された動・植物とII を調製する．5'-(CCCCAA)6-3'は，酵母細胞内でテロ染色体は，通常，酵母細胞内で ARS 活性を示す配列を含メア形成の核となりうるので 21)，テロメア配列を in vitro

んでいない．したがって，この方法は，YAC にクローンで調製することなしに，この 36 bp の配列を利用して分化された動・植物染色体の詳細なマッピングや機能解析

断部位での新規のテロメア形成が可能となった．そして，に向けた操作にも有効であり，実際，シロイヌナズナ

得られたfragment IとIIを同時に酵母細胞に導入し，マーDNA を含む YAC のどのような領域でも，染色体分断にカーで形質転換体を選択すると，標的配列で相同組換え

よって新しく YAC として機能させることを示すことがが起こり，期待通りに任意の部位で染色体の分断が起できた．

こった株が得られるという算段である．また，繰り返し

染色体分断技術のゲノムサイエンスと分断可能となるように，選択マーカーに Cre/loxP システ

バイオテクノロジーへの応用

ムを導入した 22)．loxP 配列に挟まれた選択マーカーは，
Cre 組換え酵素を発現させることによって分断染色体か

次に，開発した染色体分断法を用いたゲノムサイエン

ら除去できる．こうして，選択マーカーを再利用するこスとバイオテクノロジーへの応用の取り組みとして，1）とにより何度でも分断可能となった．

有用形質の遺伝的基盤解析への染色体分断技術の応用：

実際，PCS法を用いて 230 kb と出芽酵母の中で最も短

Chromosome shuffling，2）染色体の分断によるゲノム

い染色体である第 1 番染色体を 5 つの染色体に連続的にの再構成への展開，3）染色体構造と細胞生理の解析：リ

分断し，巨大な染色体を電気泳動で分離できるパルス

ボソーム DNA クラスターのみからなる染色体の構築，

フィールドゲル電気泳動解析で確認した結果（図 3a），第4）ワンステップ染色体欠失導入への応用について紹介

1 番染色体が合計 5 つの染色体に分断されており，分断さしたい．

れた染色体は染色体として機能していることがわかっ

1）有用形質の遺伝的基盤解析への染色体分断技術のた．また，PCS 法を用いて 575 kb の第 5 番染色体を 9 つ

応用：Chromosome shufflingの染色体に分断することを試みたが，平均 90％程度の高温耐性など酵母の有用形質の多くは，多数の遺伝子に

56

エタノール耐性や高生物工学 第88巻

通り考えられる．そこで，この株を栄養培地で培養した
後，平板培地に塗布して 128コロニーをピックアップし，
これら 7 つのミニ染色体が脱落しているかどうかを解析した（論文準備中）．
その結果，まったく新しい 19 種のゲノム組成を持つ株が得られた．一方，理論値よりも得られたゲノム組成の種類が少なかった理由として，脱落が観察されないミニ染色体も存在した．したがって，それらのミニ染色体の脱落は致死となることが疑われ，単独欠失では致死とはならないが，多重欠失で致死性を示す合成致死遺伝子の図4．Chromosome shuffling 法．本文参照．

存在も示唆された．いずれにしても，染色体の分断と脱落により，予想したような多様なゲノム組成を創りうることが実際に証明できた．したがって，PCS 法による迅

よって支配されていることが知られているが，このよう

速かつ高効率な染色体の分断とミニ染色体の脱落によっ

な多因子形質を解析するためのゲノム工学的アプローチて，これまでの育種技術によってはなし得なかった多様は限られている 23)．そこで，多因子によって支配されてなゲノム組成，つまり多様な特徴を持つ細胞を一挙に創いる有用形質について，相反する形質を示す 2 つの酵母製する道が拓けた．これらの株をスクリーニングに供す

株の特定の（同一の）染色体領域の置換を行った後，表ることによって，さまざまな目的に合わせてゲノムの再現型を解析することにより，有用形質の遺伝的基盤を染構成や進化を促進できることが示唆された．

色体のレベルで効率良く解析することができる chromo-

3）染色体構造と細胞生理の解析：リボソーム DNA ク

some shuffling という方法を考案した（図 4）11)．簡単に

ラスター染色体の構築

説明すると，形質の違う a 型と α 型酵母の同一の染色体や構造の染色体を持つ酵母細胞を自在に作り出せること

PCS 法は，さまざまな大きさ

部位を分断して，URA3 や TRP1 などでマークしておく．

から，染色体の構造が細胞生理に及ぼす影響を系統的にその後，これらを交雑し，得られた二倍体を培養するこ調べることが容易となった．出芽酵母のリボソーム DNAとによって，どちらかのミニ染色体の脱落を誘導する．

（rDNA）は，第 12 番染色体の左端から 450 kb，右端か興味深いことに，この段階で，ミニ染色体について，ヘら 610 kb の位置に存在するが，約 9 kb のユニットが 150

ミザイガスな状態からホモザイガスな状態に自発的に回コピータンデムに並んだ巨大なクラスターを構成してお復する細胞が出現してくることを見いだしており，このり，第 12番染色体の半分以上が rDNA クラスターである

ような株は，四分子分析やサザン解析で見分けることがという特異な構造を示す．このようなタンデムリピート

可能である．このような株は，特定の染色体領域だけが配列は，組換えによる構造変化の危機に絶えずさらされ片親由来のものだけから成るハイブリッドであるので，ており，ゲノムの恒常性維持という観点からも興味が持

このハイブリッドの表現型を評価・解析することにより，たれる．

形質に重要な遺伝子の絞り込みが可能となる．したがっそこで，PCS 法を用いて，第 12 番染色体を rDNA クラて，この方法により，有用形質の遺伝的基盤をサブクロ

スターの両端で分断して，rDNA クラスターのみからな

モソーマルレベルで解析することが可能となった．

る特異的な染色体を構築し，rDNA が関与する細胞生理

2）染色体の分断によるゲノムの再構成への展開

における第 12 番染色体の構造の重要性を解析した 1)．そ

，染色体
次に，前述したゲノムの再構成について（図 1）の結果，rDNA クラスター染色体では，野生型株では維の分断とその後のミニ染色体の脱落により，本当に多様持されている rDNA のコピー数が半分以下に減少し，なゲノム組成を持つ細胞が一挙に創出できるかどうかを

rDNA が局在する核小体の形態が異常となること，およモデル実験で調べた．

び，老化を引き起こすと考えられている extra chromo-

一倍体酵母細胞において，大きさが 50 kb 以下の 7 つのsomal rDNA circles が蓄積し寿命も低下した．これらのミニ染色体を PCS 法で作製した．この 7 つのミニ染色体ことから，第 12番染色体上における rDNA クラスターのは，遺伝子をそれぞれ 20 個弱含んでいるが，それらの中左右の構造が rDNA の正常な機能発現に重要であることには単独遺伝子破壊で致死性を示す必須遺伝子は含まれが明らかとなった．

ていないことから脱落可能と予想される．これら 7 つのミニ染色体の脱落可能な組み合わせは，理論的には 128
2010年 第2号

4）ワンステップ染色体欠失導入への応用

出芽酵

母は単細胞の真核生物であり，ゲノムの全塩基配列も決57

うと考えた．
このアイデアを確かめるために，40 kb 程度までの大きさで，それぞれ遺伝子を 10 個から 19 個含むが，必須遺伝子を含まない 4 つの内部領域と 2 つの末端領域を一倍体細胞で欠失させた．形質転換体を取得後，それぞれ7 株以上についてパルスフィールドゲル電気泳動と欠失領域をプローブとしたサザン解析を行った結果，6 つの領域中，5 つの領域において 70％以上の効率で期待通りの欠失を導入できることがわかった．欠失を導入できな
かった 1 つの領域（14 個の非必須遺伝子を含む第 13 番染色体の中央領域 31 kb）についても，その後の解析から，一倍体酵母の生存に必須な領域であることが明らかとなった 8)．一倍体細胞において，このようにワンステップで効率良く染色体の内部に大きな欠失を導入できる方
法はこれまでに報告されていない．
次に，このようにして作製した欠失株の生育を調べた
ところ（図 5c）
，大変興味深いことに，19 個の遺伝子が削除された株を除いて，栄養培地（YPDA）で野生型株と遜色のない生育を示した．このことから，欠失した遺伝子群は少なくとも研究室条件下では生存にまったく必要ないことが明らかとなった．一方，12個の遺伝子が削
図 5．PCD 法．
（a）染色体の内部領域への欠失導入．（b）染色体の末端領域への欠失導入．本文参照．（c）欠失株の生育．栄養培地（YPDA）とハイグロマイシン添加培地（100 µg/ml）に左端から 106 個の細胞を順次 10 倍希釈してスポットし，30°Cで生育させた．WT，野生型株；以下，それぞれの株名は欠失した遺伝子数を示す．Δ 23 genesは，Δ 13 genes とΔ 10 genesの欠失領域を併せ持つ株として作製された．

除された株はタンパク質合成の阻害剤であるハイグロマ
イシンに強い感受性を示した．しかし，この感受性は，
これら 12 個の遺伝子の単独破壊株では見られなかったことから，欠失した 12 個の遺伝子の中に機能重複した遺伝子の存在が明らかとなった．これらのことから，PCD
法は，最少ゲノムへ向けたゲノムの特定領域の要不要，
および，その領域に含まれる遺伝子群の機能重複や合成定されていることから，細胞が生命を維持していくため致死などの遺伝学的相互作用を迅速にサーべイできる有の必要な最少遺伝子セットを調べるモデル生物として非用なツールとなることが示された．

常に魅力的である．一倍体出芽酵母は約 6200個の遺伝子を持つが，その 80％以上は非必須遺伝子であることか

おわりにら，少なくとも研究室の環境下において，生命維持機能

本研究では，出芽酵母における染色体の分断技術 PCSとは切り離すことが可能な遺伝子が多数存在することが法を開発し，それを基盤として，これまでは困難であっ示唆される 24)．そこで，簡便に染色体に大きな欠失を導たサブクロモソーマルレベルでの有用形質の遺伝的基盤

入することができれば，最少ゲノムの研究やゲノムの機解析，ゲノムの大規模な再構成，染色体構造と細胞生理能解析をさらに促進できるのではと考え，PCS 法を応用の解析，および染色体への簡便な欠失導入などを可能とすることによって，染色体の任意の領域にワンステップ

する新しいゲノム工学技術への道を拓いた．さらに，PCSで大規模欠失を導入できる PCR-mediated chromosomal

法は YAC にクローン化された動・植物染色体にも適用

deletion（PCD）法を開発した 8)．

できることから，酵母を細胞工場として，高等生物染色染色体の内部領域の場合，PCS 法と同様の 2 つの DNA

体の機能解析にも貢献することも可能となった．特に，断片を PCR で調製し，図 5aのように欠失させたい領域の染色体の分断とミニ染色体の脱落を利用すると，これま外側に導入すれば，その内部領域はテロメアもセントロでの育種技術によってはなし得なかった多様なゲノム組メアも持たないことから欠失できるであろうと考えた．

成，すなわち多様な特徴を持つ多重欠失株を一挙に作りまた，染色体の末端領域の場合，図 5b のように選択マー出すことが可能となった．実際，著者らは PCS法を用いカーを持つ1つのDNA断片のみの導入で欠失可能であろたゲノムの大規模改変によってエタノールやグリセロー

58

生物工学 第88巻

ルの生産量が向上した株を見いだしていることから 6)，染色体の分断技術を用いたゲノム工学的手法から得られる情報は，今後，育種における最適なゲノムの構築に重要な貢献をするであろう．
一方，ミニ染色体の脱落を人為的に制御することが可能となれば，さらに染色体分断技術の利用範囲は広がる．
ミニ染色体を安定化させる方法として，ヘテロクロマチン形成に関与する Sir タンパク質と相互作用のある Zds1p
や Zds2p を過剰発現する方法が報告されているが 25)，著者らも独自に，ミニ染色体の安定性を強化する遺伝子を見いだしており（論文準備中），その機構解明とミニ染色体の安定化制御への応用に興味が持たれる．加えて，なぜミニ染色体が不安定なのかは未だ明らかとなっておらず，ミニ染色体の脱落制御技術の開発を目指して，その機構の解明にも挑戦している．
科学の飛躍的な進展には，必ず基盤的な技術の発展があったと言っても過言ではない．著者らはゲノムの自在な操作技術が，今後のバイオサイエンス，バイオテクノ
ロジーにおける基盤技術のひとつになるものと考えており，その発展に努力していきたい．
本研究は，大阪大学大学院工学研究科 生命先端工学専攻（旧 応用生物工学専攻）ゲノム機能工学領域で行われた研究であり，多大なるご指導，ご鞭撻を賜りました原島 俊教授に心よりお礼申し上げます．同時に，本研究を行うにあたりご助
言，ご助力くださいました同研究室の金子嘉信准教授，慶應義塾大学医学部の西沢正文先生に深謝致します．また，一緒に研究を行った KimYeon Hee 先生（現・韓国 Dong-Eui 大学），山
岸一雄さん（現・味の素），生嶋茂仁さん（現・キリンホール
ディングス），中澤利雅さん（現・白鶴酒造），技術員であった
池田真知子さん，および，谷河真理映さん（現・森永乳業）に感謝申し上げます．彼らと出会うことがなければ，このような賞は到底頂くことができなかったと思います．この他にも，向
由起夫先生（現・長浜バイオ大学），中村 純先生（広島大学），
隅谷孝洋先生（広島大学），村上紀里子さん（現・ネオモルガン研究所），および，原島研究室の学生諸氏に感謝の意を表します．
本研究の一部は，新エネルギー・産業技術総合開発機構，文部科学省，および千里ライフサイエンス振興財団から助成を受けて行われました．

文

献1) Kim, Y. H., Ishikawa, D., Ha, H. P., Sugiyama, M.,
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