静電気学会誌，33, 1 (2009) 14-19
J. Inst. Electrostat. Jpn.

水中パルス放電による可溶性タンパク質の分解
大 嶋 孝 之＊,1，堀 野 太 希＊，柴 田 義 幸＊，長谷川 優 子＊，佐 藤 正 之＊（2008 年 8 月 20 日受付; 2008 年 12 月 15 日受理）

Protein Decomposition by Pulsed Discharge Plasma in Water
Takayuki OHSHIMA,＊,1 Taiki HIRINO,＊ Yoshiyuki SHIBATA,＊Yuko HASEGAWA＊ and Masayuki SATO＊(Received August 20, 2008; Accepted December 15, 2008)

Domestic wastewaters from our home are one of the pollutants in our circumstance. These wastewaters consist ofvarious organic compounds such as lipid, protein, and detergent, and these compounds should be decomposed inwastewater treatment. We have studied the generation of pulsed discharge plasma in water and some AOPs for
wastewater treatment. In this study, we demonstrated the decomposition of soluble proteins by pulsed discharge
plasma in water. The microbubbles generated by SPG (Shirasu Porous Glass) filter was introduced into the plasma
reactor to facilitate the discharge plasma generation. When albumin solution (0.1 mg/mL) was used as the modelprotein, 90 % decomposition was achieved within the treatment time of 60 min with the applied voltage of 14 kV.
We also tried to decompose milk protein with the same system. Although the significant decomposition of theproteins in non-diluted milk was not confirmed, apparent decomposition of milk protein in 250 times of dilution ofsample milk was observed by SDS-PAGE analysis. The applied voltage, which affected the frequency of plasma
generation, also influenced the decomposition ratio of milk proteins, and higher voltage resulted in the higher
decomposition ratio. These results confirmed that the soluble protein could be decomposed by pulsed discharge
plasma in water.
1.

はじめにAOPs（Advanced Oxidation Processes）が注目されている．AOPs

水質汚染の主な原因物質は，有機物や窒素，リンなどの栄は主に何らかの方法でラジカル種を発生させ，ラジカルによ

養塩類，その他カドミウム，有機水銀などの重金属や揮発性り対象物質を酸化，分解，除去するといったものが主であり有機化合物（VOC）などの物質である．産業排水，生活排水，

オゾン酸化 1），過酸化水素 2-4），過酸化水素-紫外線照射 5,6），自然排水からなるものだが，現在の水質汚染の原因の７割近またはこれらの組み合わせ 7-9）などの方法が検討されている．

くが生活排水によるものとされている．生活排水中には洗剤，また，AOPs の新たな方法として高電圧パルス放電処理があ

油，汚れ成分等が含まれているが，タンパク性の汚れもそのる．これは，様々な酸化力の高い物質を放電チャンネルから内の一つとされ，これらの除去により，生活排水による水質直接的に水中に生成することができる点から，対象となる処汚染の防止が期待される．

理液体を選ばないと考えられている．

現在，有機化合物などを含む一般排水や生活排水は主に活放電プラズマを利用した AOPs としてはフェノール 10,11)，性汚泥法（生物処理）が用いられているが，有機塩素系化合トリニトロトルエン，3,4-ジクロロアニリン 12)など多くの有物等，生物にとって難分解性の化学物質を多く含む排水など機物質の分解が報告されている．放電プラズマは従来の活性は，活性汚泥の機能障害を生じやすく，処理が困難である．

汚泥法では難分解性の物質を分解できるため，これらの組みさらに，活性汚泥法で処理されずに環境中に放出された化学合わせによる高度排水処理が有望視されている 13,14）．特に活物質により，新たな環境汚染や生態系への影響が懸念される．

性汚泥法で生じる余剰汚泥の処理に放電プラズマを応用す

生物学的な処理法以外には，物理・化学的な処理法としてる場合，微生物群破壊能力とともにタンパク質の分解に関する知見が必要であるが，現在までのところ，放電プラズマにキーワード：high voltage pulse, albumin, milk, microbubble,
decomposition* 群馬大学大学院工学研究科（376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1）
Department of Chemical and Environmental Engineering,
Gunma University, 1-5-1, tenjin-cho, Kiryu 376-8515, Japan1
tohshima@cee.gunma-u.ac.jp

よるタンパク質の分解に関する報告はない．
そこで本研究では，水中プラズマ技術を利用し，可溶性タンパク質がどの程度分解されるのかを確認することを目的とする．モデルタンパク質として，牛血清アルブミン，牛乳由来タンパク質を用いて実験を行った．

水中パルス放電による可溶性タンパク質の分解（大嶋孝之ら）

2.
2.1

15

実験方法・手順
高電圧パルス発生装置

高電圧パルス発生装置の回路図を図１に示す 15）．交流電源（AC 100 V）より供給された電気エネルギーはスライドトラ
ンスフォーマー（ST），高電圧変圧器（HT），高電圧抵抗（R）を通してコンデンサー（C）に充電され，ロータリースパークギャップ（RSG）が処理槽側の回路に短絡したとき，瞬時にコンデンサーより放電され高電圧パルスを形成して処理槽（TC）に印加される．高電圧抵抗（R）の抵抗値は 47 kΩ，コンデンサー容量（C）は 8 nF，周波数は 50 Hz であり，印加電圧はそれぞれの実験で変化させた．
2.2

同心円筒型二重らせん型プラズマリアクターおよび実験システム
本実験で使用した，二重らせん型プラズマリアクターおよび実験システムを図 2 に示す．
リアクターの内外径は 11 mm，外内径は 24 mm，長さ 100 mm，容量 12 mL となっており，内側に高電圧電極と外側にアース電極が巻かれている．電極はステンレススチール製（高電圧側の直径：0.5 mm，アース側の直径 1.2 mm），電極間距離は 5 mm である．これら二種類のワイヤー電極はそれぞれ 20 巻きされており，そのうち15 巻き程度が対向した構造になっている．試料はリアクター下部に設けられた流入口より入り，内外形と外内径の間を通って，リアクター上部より流出させた．流量は 200，または900 mL/min で循環させた．放電プラズマを発生させやすくするための SPG 膜式マイクロバブル発生装置はリアクターの直前に設置した．循環ポンプにより試料は SPG モジュールにセットされた SPG 膜管（平均細孔孔径 10 m）に流入する．
そこでエアーポンプにより加圧された空気がレギュレーターを通して SPG 膜管の外側から内側を流れる試料へ流入させ，マイクロバブルとした．空気圧はマイクロバブル水の状態を確認しながら調整し，充分に白濁した状態（ミルキィーウォーター）とした．処理量は全体で 250 mL で，図 2 のビーカーとリアクターを循環させた．

図 2 プラズマリアクターおよび実験システム
Fig. 2 Schematic of plasma reactor and experimentalsystem.
また図 3 に放電時の典型的な電圧および電流波形を示す．
波形は常に一定ではないが，パルス状電圧印加直後にスパーク様放電が発生する場合（図 3(A)）と数マイクロ秒後にスパーク様放電が発生する場合（図 3(B)）が混在していた．
2.3

実験試料と評価方法

モデルタンパク質として，牛血清アルブミン（和光純薬），および市販の無調整牛乳を使用した．アルブミンは 0.1
mg/mL となるように蒸留水に溶解し，使用した．また牛乳はそのまま使用するか，蒸留水で希釈してサンプルとした．牛乳の希釈率は 5 倍，125 倍，および 250 倍で行った．
プラズマ処理後のサンプルは図 2 のビーカー部より 10 分毎にサンプリングし，分析した．分析は最低 3 回行い，測定値は平均値とした．分析方法は SDS-PAGE（SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動）とブラッドフォード法を用いた．
SDS-PAGE はミニスラブゲル電気泳動装置（ATTO Co.）を使用し，手順やサンプル調整は市販の実験書 16）に従った．初期サンプル量は 1 レーンあたり 20 L（タンパク質量はおよそ 20 g）で調整した。またブラッドフォード法は Bradford
Reagent (SIGMA-ALDRICH Co.)を使用し，サンプル 0.5 mL にBradford Reagent 2 mL を混合させ，10 分後に 595 nm の吸光度を測定し，検量線からタンパク質濃度を決定した．検量線
は 0.1 mg/mL までの濃度の牛血清アルブミンを用いて作成し，これ以上の濃度のサンプルの測定の場合には，サンプルを事前に希釈して測定可能範囲にした後にブラッドフォード法

図 1 パルス電圧発生回路
Fig. 1 Circuit diagram of pulse generater.

を行った．分光光度計は UV-1240（島津製作所）を使用した．

16

静電気学会誌

第 33 巻

第 1 号（2009）

図 4 アルブミンの SDS-PAGE (A)マイクロバブルなし，(B)マイクロバブルあり
Fig. 4 SDS-PAGE of albumin without microbubbles (A),and with microbubbles (B).
図 3 典型的な電圧電流波形．遅れがない場合（A）とある場合（B）
Fig. 3 Typical voltage and current wave forms with delay (B)and without delay (A).

殺菌効果を確認している（Data not shown）．しかしこのよう

3.

実験結果および考察質の切断は認められなかったとしている 15）．今回の結果から

3.1

アルブミンの分解なパルス電界はタンパク質のペプチド結合を切断するような効果はないと考えられる．筆者らの前報でもパルス電界がタンパク質に与える影響について報告しているが，タンパクもこのことが確認された．

まず，反応器に空気（マイクロバブル）を加えない条件で一方，図 4（B）はマイクロバブルを入れて放電プラズマを実験を行った．循環液流量は 200 mL/min，印加電圧は 11 kV

断続的に発生させたときのアルブミンの SDS-PAGE 結果をで行った．この実験の SDS-PAGE 結果を図 4（A）に示す．

示している．Locke らによる水中放電に関する総説 20）で，水処理時間 0 mim（無処理）では 66 ｋDa 程度のアルブミンと中における放電プラズマの発生は気泡が関与していること思われるメジャーバンドが確認できるが，処理時間に伴うバを強く示唆している．本実験においては放電プラズマの発生ンドの変化は確認できなかった．この実験条件では放電はほを誘導するためにマイクロバブルを導入した．これにより放とんど発生せず，パルス電界効果が期待できる条件である．

電プラズマの発生を容易かつ連続的にすることが可能とな水中にパルス電圧を印加し，電界効果を利用してバクテリアった．したがって本研究で提案した，二重らせん型リアクタを殺菌する方法（パルス殺菌）は様々な研究者により研究さーとマイクロバブルの組み合わせは水を処理するための放れている 17,18）．このパルス殺菌の原理は細胞膜の圧縮と続い電プラズマリアクターとして有望であると考えられる．循環て起こる電気穿孔であると言われている19）．実際，我々もこ液流量は 200 mL/min，印加電圧は 14 kV で行ったが，処理時の実験条件で大腸菌の殺菌を試み，60 分の処理で 3 桁以上の間とともにアルブミンのバンドが薄くなっているのが確認水中パルス放電による可溶性タンパク質の分解（大嶋孝之ら）

図 5 マイクロバブルを導入した場合としなかった場合のアルブミン濃度の経時変化
Fig. 5 Time courses of albumin concentrations with andwithout microbubbles.

17

図 7 牛乳希釈サンプルの分解率の経時変化
Fig. 7 Effect of the milk dilution times on the decompositionrate.

た．またマイクロバブル単独ではタンパク質の分解は本研究の実験時間では確認できなかったことから，水中のタンパク質を分解するためには放電プラズマを発生させることが必要であると考えられる．また本法によるタンパク質の分解はランダムに起こり，様々な長さのペプチドが中間生成物として発生していると考えられるが，本研究では SDS-PAGE 上でマイナーな低分子シグナルの検出などによる確証を得るまでには至っていない．分解メカニズムについては今後詳細に検討していく予定である．
3.2

牛乳由来タンパク質の分解

アルブミンの放電プラズマ分解が確認されたため，次に牛乳由来のタンパク質の分解を試みた．実験は牛乳をそのまま原液で使用した場合，蒸留水で 5，125，250 倍と希釈した場
合をサンプルとし，それぞれ SDS-PAGE とブラッドフォード法で分析した．サンプルの循環液流量は 932 mL/min，印加電圧は 14 kV で行い，断続的な放電プラズマの発生が目視できたが，発生頻度は希釈により変化していなかった．また電圧電流波形に違いも観察されなかった．図 6 は 5 倍希釈，250
図 6 牛乳を 5 倍希釈（A）および 250 倍希釈(B)した場合の SDS-PAGE
Fig. 6 SDS-PAGE of milk proteins with 5 times (A) and 250times dilution (B).

倍希釈のサンプルの SDS-PAGE を示している．牛乳の主要なタンパク質はカゼインであるが，SDS-PAGE 上では約 30 kDaと 25 kDa の二本のメジャーバンドが観察できた．5 倍希釈の場合（図 6（A）），SDS-PAGE 上では明確なバンドの変化を観察することができなかった．しかし 250 倍希釈の場合（図できる．また図 5 には図 4（A）
（B）で行った実験のブラッ6（B））には処理時間とともに二本のバンドが薄くなっていドフォード法によるタンパク質濃度変化を示している．

くのが観察されたため，牛乳由来タンパク質も放電プラズマ

SDS-PAGE の結果と同様に，パルス電界によるアルブミンのにより分解できることが確認された．図 7 は四種類のサンプ分解は確認できないが，マイクロバブルを導入して放電プラ

ルのブラッドフォード法によるタンパク質濃度変化を分解ズマを発生させることにより処理時間とともにアルブミン率として水準化したグラフである．SDS-PAGE 上では確認すが分解され，溶存タンパク質が減少していることが確認できることができなかったが，原液の場合にも60 分の処理で20％

18

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第 33 巻

第 1 号（2009）

図 9 牛乳由来タンパク質の分解率における印加電圧の影響
Fig. 9 Effect of applied voltage on the decomposition rateof milk proteins.とがわかった（図 9）．14 kV，20 kV と印加電圧を高くするにしたがい，分解は SDS-PAGE 上で顕著になっており，14 kVの時には 60 分後，20 kV の時には 40 分後にはほとんどバンドがなくなっていた（図 8（B），（C））．またブラッドフォー
ドの結果はデータのバラつきがあり，処理時間が 30 分未満の時には分解率が逆転しているものの，最終的には 20 kV の場合のほうが分解率が高くなっており，50 分後には 95％程度分解できていた．したがって印加電圧は高いほうが本シス
テムにおいては放電頻度，強度が増大し，結果として高い分解率を得ることができると考えられる．
本研究ではマイクロバブルを併用した水処理のための放図 8 7.5 kV（A），14 kV（B），および 20 kV(C)印加した
場合の 250 倍希釈牛乳由来タンパク質の SDS-PAGE
Fig. 8 SDS-PAGE of milk proteins (250 times dilution) with
7.5 kV (A), 14 kV (B), and 20 kV (C) of applied voltage.

電プラズマリアクターを提案し，溶存タンパク質の分解を実証した．しかし分解のメカニズムについては明らかではない．
ペプチドの低分子化が確認されなかったことから，放電プラズマに接したタンパク質は急激な分解が起こっているものと推定される．したがっていかに効率よくかつ広範囲に放電弱分解できていることがわかる．また希釈率とともに分解率プラズマを発生させ，水中のタンパク質と接触させるかが放も上昇しており，250 倍に希釈した牛乳由来タンパク質はお電リアクターの設計上必要である．本研究で提案した同心円

よそ 30 分で 80％程度の分解率を達成している．

筒型二重らせん型プラズマリアクターとマイクロバブルのまた250 倍希釈の牛乳サンプルで印加電圧の影響を調べた．

組み合わせの有効性は実証されたが，さらに改良が必要であ

図 8 は印加電圧を 7.5 kV，14 kV，および 20 kV で処理したとると思われる．また消費エネルギーに関しては本研究では検きの SDS-PAGE 結果を示している．また図 9 にはこの実験の討してこなかったが，投入電力を少なくする方策も必要であブラッドフォード法による分析結果を示している．観察したる．しかし放電プラズマを利用した排水処理技術は，本研究結果では印加電圧が高くなるにしたがい，放電の頻度，強度で実証したタンパク質の分解も含め，非常に複合的な分解処が高まることが視覚的に確認された．印加電圧が 7.5 kV の時，理を同時に行うことが可能と考えられるため，既存の活性汚わずかであるが，バンドが少しずつ薄くなっていることが確泥法などの生物学的排水処理技術と併用することにより，高認できる（図 8（A））．またブラッドフォード法による測定度の排水処理が可能になるものと期待される．

からも 7.5 kV の場合には 60 分で 20％程度の分解ができるこ水中パルス放電による可溶性タンパク質の分解（大嶋孝之ら）

4.

結言

排水処理用の放電プラズマリアクターを提案するとともに，溶存タンパク質の分解について実験的検証を行った．得
られた結果を以下にまとめる．
(1)同心円筒型二重らせん型プラズマリアクターとマイクロバブルを組み合わせることで，パルス高電圧を印加することで比較的安定した水中放電プラズマを発生させることが可能であることを明らかにした．
(2)アルブミンをモデルタンパク質として使用した実験では，マイクロバブルを導入しない場合にはほとんど放電プラズマは発生せず，アルブミンの分解も起こらないことを確認した．またマイクロバブルを導入した場合には放電プラズマが断続的に発生し，これに伴いアルブミンの分解が起こることを SDS-PAGE およびブラッドフォード法により確認した．
(3)牛乳および牛乳を希釈したものをサンプルとした場合，アルブミンの場合と同様にタンパク質の分解が確認された．
特に 250 倍希釈牛乳を用いた場合には SDS-PAGE 上で顕著な分解が確認され，20 kV を印加した場合，50 分で 95％程度分解できることを証明した．

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