日緑工誌，J. Jpn. Soc. Reveget. Tech., 44（3）, 524―527,（2019）

特集「ラン科など移植困難植物の野外播種試験を用いた保全」

移植適地判定のためのシードパケット法による野外播種試験〜ラン科植物「オオバノトンボソウ」を例として〜
大和政秀 1）・荒井麻希 2）・久保田純平 3）・藤原亮太 4）1）千葉大学教育学部
2）千葉大学教育学部（現：宇都宮市立石井小学校）
3）西日本技術開発株式会社 環境部
4）九州電力株式会社 総合研究所 生物資源研究センター
摘要：ラン科植物は菌根共生への依存度が高く，さらに共生関係において宿主特異性が存在するため，パートナーとなりうる菌根菌が存在する環境でないと生育することができない。このため，やむを得ずラン科植物の移植を行う際には菌根菌が定着している環境に移植する必要がある。筆者らは鹿児島県に自生するオオバノトンボソウについて，シードパケット法を適用した種子発芽個体の解析に基づく，移植適地の判定に取り組んでおり，本稿ではオオバノトンボソウの種子発芽生態とともにその経過について報告する。
キーワード：菌根菌，ツノタンシキン科，プロトコーム，ITS
rDNA，移植，ボイド管

1. はじめにラン科植物の種子は非常に小さく胚乳を持たないため，通常の植物種子とは異なり，貯蔵養分をほとんどもたない。種子発芽の際には胚の細胞内に菌根菌が侵入し，菌糸コイルが形成されるが，この菌根菌から植物への炭素化合物の供給，すなわち菌従属栄養によって胚は幼植物体（プロトコーム）へと成長する。プロトコームの発達とともにシュートと根が分化するが，根の皮層細胞や根茎（リゾーム）にも菌糸コイルが形成される。菌根菌は DNA を解析することで容易に同定でき，ラン科植物全体としてみると，多くの担子菌類や一部の子のう菌類がラン科植物の菌根菌として報告されている。しかし，ラン科植物の個々の分類群レベルでは，特定の系統群の菌類との間に宿主特異性が存在することが多くの研究で明らかになっている10）。
緑色葉をもつ多くのラン科植物種ではツノタンシキン科（Ceratobasidiaceae），ツ ラ ス ネ ラ 科（Tulasnellaceae）な
どの腐生性担子菌類（リゾクトニア菌）との共生が知られており，これらの光合成ランの多くでは，地上部に葉を展開した後は，炭素源のほとんどを自前の光合成で賄う独立栄養性が示唆されている2）。一方，キンラン属（Cephalanthera），カキラン属（Epipactis），シュンラン属（Cymbidium）など

で は ベ ニ タ ケ 科（Russulaceae），イ ボ タ ケ 科（Thelephoraceae），ロウタケ科（Sebacinaceae）などの樹木に外生菌根を形成する菌との共生がみられ，これらの共生系では光合成と菌従属栄養性を併せ持つ部分的菌従属栄養性が明らかとなっている10）。また，種子発芽，プロトコーム，開花個体などの生育ステージによって，異なる宿主特異性を呈する例なども報告されており，複雑に進化したラン科植物と菌類の関係性が次第に明らかになっている10）。
ラン科植物の菌根共生系における宿主特異性は，ランの繁殖と成長のためにはパートナーとなりうる菌類の存在が必須であることを意味する。ラン科植物には絶滅危惧種に指定されている種が多く存在するが，これには菌根菌の存在が分布の制限因子となることが強く影響しているのだろう。土地開発などに伴う環境アセスメントでは希少植物の保全対策が必要となるが，ラン科植物では移植・ポット栽培が難しい種が多い。このような植物の保全のためには自生地の保護が望ましいことは云うまでもないが，土地改変が避けられないなどやむを得ない場合には，菌根菌が定着している環境に移植する必要がある。菌根菌の子実体（キノコ）の発生がみられる場合などは，地下部の菌の存在を推定することが可能だが，一般にキノコの発生は不定期かつ短期間であり，さらに菌根菌にはキノコをあまり形成しない種が多いことも知られている。
ラン科植物などの種子をナイロンメッシュに挟み，これをスライド用マウントに設置したものを「シードパケット」という7，8）。シードパケットを土壌中に埋設すると，共生菌がいる環境ではメッシュの穴から侵入した菌糸によって共生発芽が行われるため，回収したパケットから発芽種子やプロトコームを得ることができる。このシードパケット法と DNA解析による菌根菌の分子同定を組み合わせることで，自生地や移植予定地などにおいて，菌根菌が存在する箇所を特定することが可能である。
ラン科ツレサギソウ属のオオバノトンボソウ（Platanthera＊連絡先著者（Corresponding author）：〒263―8522 千葉県千葉市稲毛区弥生町 1―33

E-mail：myamato@chiba-u.jp

特集「ラン科など移植困難植物の野外播種試験を用いた保全」 525

minor (Miq.) Rchb. f.）は，本州，四国，九州に自生する。
環境省レッドリストでは絶滅危惧種としての指定はないが，群馬県，東京都のレッドデータカテゴリでは絶滅危惧Ⅰ類に，岩手県，宮城県では絶滅危惧Ⅱ類に，埼玉県，長野県，奈良県，鹿児島県では準絶滅危惧にそれぞれ指定されている。Yagame ら9）は本種とツノタンシキン科菌類との共生関係を明らかにし，さらに，この菌類がアカマツ（Pinus densiflira Siebold et Zucc.）に外生菌根を形成することを示した。
ツノタンシキン科はリゾクトニア菌の一群であり，従来は腐生菌と考えられてきたが，この研究により，菌従属栄養性のヒメノヤガラ（Chamaegastrodia sikokiana Makino et F.
Maek.）やオーストラリアの地下生ラン（Rhizanthella gardneri R.S. Rogers）などの菌根菌を含む外生菌根性の系統群が存在することが明らかとなった。
筆者らは鹿児島県薩摩川内市のオオバノトンボソウ自生地を対象として，シードパケット法を適用した種子発芽個体の菌根菌分子同定と移植の適地判定に取り組んでおり，本稿ではその経過について報告する。
2. 材料ならびに方法
2.1 自生地播種試験
鹿児島県薩摩川内市のオオバノトンボソウ自生地を対象として，2013〜2016 年にシードパケットの埋設を行なった。
各年とも，6 月中旬にオオバノトンボソウ開花個体に対して人工他花授粉を行い，袋掛け処理を行った。8 月下旬に種子を採取し，目開き 50μm のナイロンメッシュを用いたシードパケット（種子約 100 個／枚）を作成した。調査期間は，表―1 の通りである。
シードパケットから得られた発芽個体について，発芽（胚の肥大と仮根の形成），プロトコーム（胚の直径 300―1000μ

表―1 シードパケット試験の調査期間
埋設年（枚数）

2013

2014

2015

2016

2017

2013 年（53 枚）

●〇〇〇

―

2014 年（36 枚）

―

●〇〇

〇

2015 年（58 枚）

――

●

〇〇

2016 年（28 枚）

―――

●〇

※ ●：シードパケット埋設，〇：シードパケット回収m），出芽（胚の直径 1000μm 以上で出芽あり），および発根の 4 ステージに区分し（図―1），シードパケットごとに計数した。
2.2 菌根菌の分子同定
発芽個体とプロトコームは全体を，発根個体は切り出した
菌根形成部位の根を対象として，DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて DNA を抽出した。
プライマーセット ITS 1 F／ITS 41）を用いて，ITS rDNA を対象とした PCR を TaKaRa Ex Taq, Hot Start Version（TakaraBio, Otsu）により行い，PCR 産物を HiYield Gel／PCR DNA
Fragments Extraction Kit（RBC Bioscience, Taipei, Taiwan）を用いて精製した。精製された PCR 産物に対して pGEM-T
Easy Vector System I（Promega, Madison, WI, USA）を用いたクローニングを行い，1 サンプルあたり 4 コロニーを対象としてプライマーセット T 7／SP 6 を用いたコロニー PCRを行った。PCR 産物を精製後，タカラバイオの塩基配列解析受託（プレミックスシーケンス解析）を利用して DNA シーケンスを行い，得られた配列を GenBank データベースに照合して既知配列との相同性から分類群の特定を行った。また，ツノタンシキン科の DNA 塩基配列については，Gen-図―1 成長ステージ（種子発芽，プロトコーム，出芽，発根）に区分したオオバノトンボソウ発芽個体

526

大和・荒井・久保田・藤原Bank から ダ ウ ン ロ ー ド し た DNA 塩 基 配 列 と と も に，MEGA 75）を用いた近隣結合法により，分子系統樹を作成した。
2.3 移植とモニタリング
2016 年 12 月に 18 個体，2018 年 2 月に 33 個体のオオバ
ノトンボソウを，ツノタンシキン科の菌根菌が検出された箇所の周辺に移植した。移植の際にはボイド管を用いた方法4）を適用した。移植後のシュートの発生については，2017，2018 年にモニタリングを実施した。
3. 結果と考察

図―2 発芽個体の各成長ステージにおいて検出した菌根菌

3.1 自生地播種試験と菌根菌同定埋設した計 175 枚のシードパケットのうち，51 枚のシードパケットで種子発芽がみられ，種子発芽 123 個体，プロトコーム 11 個体，出芽 19 個体，発根 10 個体が得られた。
種子発芽 25 個体，プロトコーム 6 個体，出芽 10 個体，発根 8 個体について菌根菌を同定したところ，発芽個体からはベニタケ科，ツノタンシキン科，イボタケ科，ピロネマ科（Pyronemataceae）などの多様な菌類が同定されたのに対し，プロトコーム以降の生育ステージでは外生菌根性のツノタンシキン科の菌類が優占し（図―2），さらに発根個体では，菌根菌を同定した 8 個体のうち 7 個体でツノタンシキン科

図―3 ツノタンシキン科菌類の ITS rDNA の塩基配列に基づいて近隣結合法によって作成した分子系統樹

特集「ラン科など移植困難植物の野外播種試験を用いた保全」 527

表―2 移植後に地上部発生がみられた個体数
調査年
移植時期

2017

移植個体数

2018

展葉開花

展葉開花

2016 年 12 月

1861602018 年 2 月

33――91が検出された。ITS rDNA の塩基配列に基づく分子系統解析の結果，これらの菌はほとんどがオオバノトンボソウの展葉・開花個体から検出された菌根菌9）と同一クレイドを形成しており（図―3），プロトコーム形成から開花結実までをこれらの系統群の菌類との共生によって達成することが明らかとなった。このため，シードパケット試験で発根個体がみられた場合には，菌根菌の同定を行わなくとも当該箇所における共生菌（外生菌根性のツノタンシキン科）の存在を確定し，移植適地とみなして差し支えないものと考えられた。
3.2 移植とモニタリング
2016 年 12 月に移植した 18 個体のうち 6 個体，2018 年 2月に移植した 33 個体のうち 10 個体が，それぞれ 2018 年に地上部を発生させた（表―2）。移植個体の 1／3 程度と，結果は芳しくないが，オオバノトンボソウのシュート発生は移植を行わなくとも休眠を挟み間断的であることが多い。このため，地上部の発生が見られないことが移植個体の枯死に直結しないとも考えられ，長期的なモニタリングが必要である。
部分的菌従属栄養植物の移植では，移植後の活着率が 100％以上を維持する事例と移植個体が確認されなくなる事例に 2分化されることが報告されており3），移植適地判定の効果については，今後これらの結果との比較とともに評価していく必要がある。
3.3 今後の展開
ラン科植物のうち外生菌根菌と共生することが知られている種では，菌根菌に炭素源を依存する割合が高く，さらに菌根菌に対する宿主特異性が顕著である場合が多い10）。このような（部分的）菌従属栄養植物種では菌根菌の存在の有無が分布の制限因子の一つとなるため，多くの種が絶滅危惧種としてリストされている10）。このような植物種の移植の際には，菌根共生系を考慮して外生菌根性樹種の周囲に移植するなどの対策がとられているが10），地下部の外生菌根菌群集は極めて多様であり，外生菌根菌は存在するものの，当該ラン科植物の菌根菌がそこにはいなかったという事例も多いものと推察される。本稿で紹介したシードパケット法を用いた野外播種試験による移植適地の判定は，この問題を解決しうる方策であり，実際に菌根菌の存在を確認した箇所に移植することでどの程度定着を図ることができるのか，今後様々な事例による検証が必要である。
ラン科植物以外にも，ツツジ科（Ericaceae）やヒナノシャ
クジョウ科（Burmanniaceae），ホンゴウソウ科（Triurida-ceae），サクライソウ科 （Petrosaviaceae） などで （部分的）菌従属栄養植物が知られている6）。このような植物の保全対策として，野外播種による自生地復元などが検討されており11），移植の難しい菌従属栄養植物などでは特に有効と考えられる。このような野外播種に対しても先行的に行うシードパケット試験を組み合わせることによって，播種適地の判定とともに効率的な実施を図ることが可能と考えられる。
謝辞：本研究は九州電力株式会社との共同研究「オオバノト
ンボソウの保全に関する研究」により実施されました。九州電力株式会社，九州林産株式会社の皆様には移植作業にご協力いただきました。また，株式会社緑生研究所には本集会の準備にあたりご協力いただきました。ここに記して感謝いたします。
引用文献1）Gardes, M. and Bruns, T.D. (1993) ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes: application to theidentification of mycorrhizae and susts. Mol. Ecol., 2: 113―
118.
2）Gebauer, G. and Meyer, M. (2003) 15N and 13C naturalabundance of autotrophic and myco-heterotrophic orchids
provides insight into nitrogen and carbon gain from fungal
association. New Phytol., 160: 209―223.
3）長谷川啓一・上野裕介・大城温・神田真由美・井上隆司・
西廣淳（2016）全国の道路事業における希少植物の保全対策としての移植の現状と工夫：移植困難植物（着生・混合栄養・菌従属栄養）に着目して.応用生態工学，19: 79―90.
4）木村研一・山﨑旬・遊川知久・倉本宣（2012）東京都内の雑木林におけるキンラン移植株のモニタリング結果と知見．日本緑化工学会誌，38: 212―215.
5）Kumar, S., Stecher, G. and Tamura, K. (2016) MEGA 7:
Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 forbigger datasets. Mol. Biol. Evol., 33: 1870―1874.
6）Leake J.R. (1994) Tansley review No. 69. The biology ofmycoheterotrophic ( saprotrophic ) plants. New Phytol.,
127: 171―216
7）Rasmussen, H.N. and Whigham, D.F. (1993) Seed ecologyof dust seeds in situ: a new technique and its application interrestrial orchids. Ame. J. Bot., 80: 1374―1378.
8）辻田有紀・遊川知久（2008）ラン科植物の野外播種試験法：土壌中における共生菌相の探索を目的として（実践報告）．
保全生態学研究，13: 121―127.
9）Yagame, T., Orihara, T., Selosse, M.A, Yamato, M. andIwase, K. (2012) Mixotrophy of Platanthera minor, an orchid associated with ectomycorrhiza-forming Ceratobasidiaceae fungi. New Phytol., 193: 178―187.
10）大和政秀・谷亀高広（2009）ラン科植物と菌類の共生．日
本菌学会会報，50: 21―42.
11）山﨑旬・庄司顕則・伊藤彩乃・松本竹吾・中沢優太・内野はるか（2018）自生地復元を目的としたラン科植物の種子繁殖法の検討―種子スティックによるキンラン（Cephalanthera falcata：ラン科）の野外播種の効果．日本緑化工学
会誌，44（1）: 194―196.