〔生物工学会誌

第 90 巻第2号

72–77．2012〕2011 年度 生物工学奨励賞（斎藤賞）受賞

酵母のメタノール代謝制御の分子メカニズムの解明とその応用
中川

智行

Regulation mechanism of methanol metabolism in the methylotrophic yeast
Tomoyuki Nakagawa (Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University, 1-1 Yanagido,
Gifu 501-1193) Seibutsu-kogaku 90: 72–77, 2012.

現在，さまざまな地球規模での環境問題が取り上げられ，その問題解決に向けた多くの方策が提案されてきた．
特に，地球温暖化対策は国家レベルでの対応が迫られており，CO2 や CH4 をはじめとする温室効果ガスの排出削減を目指した新たな社会構造への移行が求められているのが現状である．これらのことから，現在，持続可能でかつ再生可能なバイオマス資源を効率よく活用する「カーボンニュートラルな物質循環系」の構築に向けた多様なプロジェクトが進行中である．
一方，メタノールは植物バイオマスや温暖化ガスであ

図 1．カーボンニュートラルな物質循環系の中間体としてのメタノールの位置付け

る CH4 または CO2 を原料に直接合成できる C1 化合物である．また，メタノールは燃焼の際，水と CO2 にまで完全酸化される特徴を持ち合わせることから，現在，もっる技術の開発が，今後，生物工学分野における大きな柱とも環境負荷の少ない次世代型エネルギー源・炭素源ののひとつになるものと考えられる．

ひとつに数えられている．これらの性質からメタノール

このような背景から，筆者らはメチロトローフの中では，図 1 に示すように「カーボンニュートラルな物質循も特に「メチロトローフ酵母」の持つメタノール代謝能環系」の中間体としてもっとも優れたクリーンな化合物力を「環境に配慮した次世代型発酵生産系」に活用するであると言える．さらにメタノールは安価でかつ水に可ための分子基盤の構築を目指して，本酵母のメタノール溶な炭素源でもあることから，さまざまな発酵生産系の代謝の制御メカニズムを詳細に解析してきた．本稿では，出発原料としてメタノールを利用することは可能であ

これまで筆者らが証明してきたメチロトローフ酵母のり，メタノールを用いた高効率・高収率な発酵生産系は「細胞内ホルムアルデヒド（FA）毒性管理」と「細胞の「環境に配慮した次世代型発酵生産系」としての役割が酸素認識と酸素代謝バランス」に立脚したメタノール代大いに期待できる．よって，発酵生産系の出発原料とな謝制御の分子メカニズムについて解説したい．

るメタノールを唯一の炭素源・エネルギー源として利用できるメチロトローフは，低環境負荷型発酵生産系の構築に向けた極めて重要な鍵微生物であり，メチロトロー
フの持つメタノール代謝能力を最大限に引出し，活用す
著者紹介

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メチロトローフ酵母の細胞内ホルムアルデヒド（FA）
毒性管理に立脚したメタノール代謝の制御機構
メチロトローフ酵母のメタノール代謝は，アルコール

岐阜大学応用生物科学部応用生命科学課程（准教授） E-mail: t_nakaga@gifu-u.ac.jp

生物工学

第90巻

図 2．メチロトローフ酵母のメタノール代謝経路．AOD，アルコール酸化酵素；DAS，ジヒドロキシアセトン合成酵素；FLD，FA 脱水素酵素；FDH，ギ酸脱水素酵素．

酸化酵素（AOD）によるメタノールの酸化により開始1)

図 3．メタノール生育環境下の培地への FA 蓄積．メチロトロー
フ酵母は培地中に FA を蓄積し，その後，生育を開始する．しかし，5% メタノール環境下では，細胞はメタノールレベルをコントロールできず，培地中に FA を蓄積してしまい，生育阻害を示していた．ていた．一方，5% メタノール培地でも酵母は FA の蓄される（図 2） ．この反応により生じるホルムアルデヒ積と共に細胞増殖を開始するものの，細胞は FA レベルド（FA）はジヒドロキシアセトンシンターゼ（DAS）を完全に制御しきれず，過剰の FA 蓄積に伴う生育阻害によりキシルロース 5-リン酸に固定され，解糖系を経由が観察された（図 3）．

して細胞構成成分に導かれる資化経路と，細胞質にてグ

さらには，メチロトローフ酵母ではメタノール資化にルタチオン依存型 FA 脱水素酵素（FLD）とギ酸脱水素は直接関与しない FA 脱水素酵素である FLD を欠損させる酵素（FDH）により CO2 にまで酸化される酸化経路にとメタノール生育能を完全に失うことが報告されている 4)．

より代謝される 2)．

これらの事実は，メチロトローフ酵母のメタノール代

筆者らは，メチロトローフ酵母の持つ特異な細胞機能

謝における最重要課題はメタノールの毒性ではなく，よの有効活用に向けて，本酵母の持つ巧妙なメタノール代

り強い毒性を持つ代謝中間体である FA の細胞内レベル謝制御機構に着目し，その解明と応用を目指すことにしの管理にあるものと結論づけた．

た．
メタノール代謝における細胞内 FA 管理の重要性

AOD アイソザイムによるメタノール酸化調節とそれによる細胞内 FA レベルの制御

筆者らは，いくつかメタノールは「目散るアルコール」とも呼ばれ，ヒトののメチロトローフ酵母種が AOD を native PAGE で分離場合，視神経炎，視神経萎縮による失明を起こし，子供可能な 9 種のアイソザイムとして持つことを見いだしてならわずか 30 g，大人なら 50 g から 200 g で死に至るきた（図 4 左）5)．筆者らは本アイソザイムに興味を持ち，化合物である．メチロトローフ酵母は 3% のメタノール濃度までは良好に生育できるが，それを越えると生育阻害を示し始める．これらのことから，メチロトローフ酵母のメタノール生育におけるもっとも大きな障害はメタノールの持つ細胞毒性であると思われがちである．しかし，出芽酵母を用いてメタノールの毒性試験を行ったところ，10 M を越えるメタノール濃度においても酵母はまったく生育阻害を示さなかった．一方，メタノール代謝の中間体である FA を用いて出芽酵母の毒性試験を行ったところ，酵母は 4 mM の FA ですでに強い生育阻害を示した 3)．
また，メチロトローフ酵母 Pichia methanolica のメタノール生育中の培地の FA の挙動を観察したところ，1%から 3% のメタノール生育では培地中に 0.3 mM 程度のFA を蓄積の後，酵母は良好なメタノール生育を開始し2012年 第2号

図 4．AOD アイソザイムの形成機構

73その生理的役割を理解するため，まずメチロトローフ酵

タノールに対する Vmax は Mod2p の約 10 倍で，Km は約母 P. methanolica の AOD アイソザイムの形成における1/10 であった 6)．つまり，P. methanolica は，低メタノー
ル濃度下では高 Vmax 低 Km 型サブユニットである Mod1p分子機構を証明することにした．
筆者らは，遺伝子欠損株を用いた in vivo 解析，さらにをメインに誘導し，貴重なメタノールを効率よく利用すは in vitro での再構成実験を通して，9 種の AOD アイソることでメタノール生育をより有利に進めようとしていザイムが異なる遺伝子にコードされる 2 種類のサブユる．一方，高メタノール環境下では低 Vmax 高 Km 型サブ

ニット Mod1p と Mod2p のみで構成され6,7)，これら 9 種ユニットである Mod2p を支配的に発現させることでのアイソザイムは Mod1p と Mod2p のホモ 8 量体と両サブユニットがランダムに 8 量体に会合することで生じるAOD 活性を意図的に抑え，メタノールの過剰酸化による FA の余剰な蓄積を抑制する戦略をとっていると解釈

ハイブリット型 8 量体で構成されていることを突き止めできる．

7,8)

た（図 4 右） ．

さらには，AOD アイソザイムのうちハイブリット型

また，P. methanolica の AOD アイソザイムのザイモ

分子は両サブユニットの構成比率に応じて，酵素分子あグラムパターンは生育環境のメタノール濃度に応じて変たりの Km・Vmax を変化させることができる．低メタノー化する．細胞は，低メタノール濃度下では Mod1p を主ル条件下で構築される Mod1p の比率が高いハイブリッに誘導し，メタノール濃度が上昇するに応じて Mod2pト型分子は高 Vmax 低 Km であるが，Mod2p の割合が多くの誘導が徐々に増加しはじめ，高メタノール濃度ではKm が増加していく 9,10)．
なるにつれて Vmax が徐々に低下し，Mod2p を支配的なサブユニットとして誘導していた
9)．また，AOD アイソザイムのメタノール濃度に（図 5）

つまり，P. methanolica は 2 種類のサブユニットの組み合せで，より多様な基質親和性を持つ AOD 分子種を作対するザイモグラム変化は，両サブユニットをコードすり出すことが可能であり，両サブユニットの存在比を厳る遺伝子 MOD1 と MOD2 の遺伝子発現と完全に連動し密に調節するとことでどのようなメタノール条件にも対ており，低メタノール濃度下では MOD1 が主に発現し，応できる AOD アイソザイムを作り出しているものと推9)高濃度下では MOD2 の発現が支配的であった ．つまり，測できる．

P. methanolica は生育環境下のメタノール濃度を的確に言い換えれば，AOD アイソザイムは FA の生成量を認識する能力を持っており，それぞれの環境に応じて外環境のメタノール濃度に合わせて調節し，どのようなMOD1 と MOD2 の発現を調節することで，AOD アイソザイムの構成を MOD 遺伝子の転写レベルで制御してい生育環境でもメタノール酸化を一定にできる非常に優れることが示された．

える．

では，P. methanolica はどうして外環境のメタノール濃度に応じて AOD アイソザイムの構成パターンを変化させる必要があるのだろうか？ その答えは，Mod1p とMod2p の性質にあった．両サブユニットのメタノールに対する Vmax と親和性はまったく異なり，Mod1p のメた「細胞内 FA レベル調節システム」の一つであると言AOD アイソザイムの細胞内局在による活性発現制御に よ る 細 胞 内 FA 管 理
AOD は DAS や カ タ ラ ー ゼ（CTA）と共にメタノール誘導性のオルガネラであるペルオキシソーム（Ps）に局在するマトリックス酵素であり 11)，その Ps 局在は Ps 輸送シグナル（PTS）レセプター
1 である Pex5p に依存することが知られている 12)．また，
DAS や CTA は細胞質で 2 量体や 4 量体を形成した後にPs 輸送されるが 13,14)，AOD はサブユニットのまま Ps に運ばれ，その後，折りたたまれてオクタマーを形成する 1)．

P. methanolica の AOD ア イ ソ ザ イ ム も 例 外 で は な く
DAS，CTA と共に Ps に局在し 15–17)，Pex5p や Ps 膜における Pex5p との結合因子である Pex14p の遺伝子欠損株
では，AOD アイソザイムは Ps に輸送されないどころか，まったく活性型にも移行できない 15,18)．これらの事実は，
メチロトローフ酵母は AOD を決して細胞質では活性型にせず，AOD の活性発現を単膜のオルガネラである Ps内のみに限定し，FA・H2O2 の生産系を DAS や CTA な
どの FA・H2O2 代謝系と共に Ps 内に封じ込めているこ
図 5．メタノール濃度に対する AOD アイソザイムの誘導パターン74とを意味する．これによりメチロトローフ酵母は FA の生物工学

第90巻

外環境のメタノール濃度の上昇に応じて発現を増加させ，AOD により生産される FA の毒性対策に対応している 19)．さらには，メタノール代謝酵素群を発現させる順序にも秘密があった．メチロトローフ酵母はメタノー
ル生育時には FA を生産する AOD の発現誘導よりも，FA 代謝酵素や Ps 形成因子を優先的に発現させ，細胞のFA 対策を完成させた後に，満を持して AOD を発現させることで細胞内の FA の蓄積を防いでいた 20,21)．
このように，メチロトローフ酵母は外環境のメタノール状況を確認しながら，メタノール代謝に関与するさまざまな因子をそれぞれの機能に応じて個々に活性発現の時期，場所および順序を統括的に制御するシステムを持ち合わせていると考えられる（図 6）．これら協調的な活性発現制御システムによって細胞内 FA レベルを巧妙に図 6．P. methanolica のメタノール代謝における FA 毒性回避の概念図管理することで，メチロトローフ酵母は円滑なメタノール代謝を行っているものと結論づけた．
メチロトローフ酵母の酸素認識に立脚したメタノール代謝の制御機構

細胞に対する毒性を最小限に抑えているものと推察でき

AOD アイソザイムと呼吸鎖の酸素消費バランスの制る．つまり，AOD アイソザイムの Ps への輸送過程は御による円滑なメタノール代謝

FA に対する毒性対策において非常に重要なステップの一つであり，Ps 局在による活性発現の制御はメタノール代謝における「細胞内 FA 管理システム」としても大．
きな意味を持つことが容易に想像することできる（図 6）
しかし，現在のところ AOD アイソザイムの Ps 輸送と活

ローフ酵母のメタノール代謝では細胞内の FA の毒性対

ここまで，メチロト策が肝心であると説明をしてきたが，本代謝を制御する上でもう一つの重要な問題が存在する．それは，AODをはじめとしたメタノール代謝酵素群の発現制御がメタノールのみならず，酸素によっても厳密に制御されてい性型への移行システムの詳細はほとんど証明できていなることである 22)．P. methanolica を例に挙げると，すべいのが現状であり，今後，AOD アイソザイムによるメてのメタノール代謝酵素群は酸素依存的に発現し，嫌気タノール代謝制御のメカニズムを明らかにする上で解明

条件下ではこれら酵素の発現は完全に抑制されている 22)．

しなければいけない最重要課題の一つであると言える．

また，AOD アイソザイムの発現は生育環境下の酸素濃メタノール代謝酵素群の統括的な活性発現制御による度に依存し，低酸素下では Mod1p を，高酸素下ではMod2p を支配的に誘導する（図 7 左）23)．AOD アイソザ
イ ム の 酸 素 に 対 す る Km 値 は，Mod1p は 低 Km を，細胞内 FA 管理

ここまで AOD アイソザイムの機能と活性発現制御が優れた細胞内 FA レベル調節システムであることを示してきた．しかし，自然界には AOD アイソザイムを持たないメチロトローフ酵母株も多数存在することから，これら酵母群は AOD アイソザイム以外にもあの手この手で FA の細胞毒性に対する対策を取っていることが容易に想像できる．筆者らは，その一つにAOD を含めたメタノール代謝酵素群の統括的な活性発現制御の存在を見いだしてきた．
これまでメタノール代謝酵素群の発現誘導に関する研究は，ただ単にメタノール誘導性遺伝子群のメタノールによる発現の ON とグルコースによる OFF の分子機構を中心に進められてきたが，メチロトローフ酵母では，これら遺伝子群の発現はもっと繊細かつ協調的に制御されていた．たとえば，FLD は AOD アイソザイム同様，2012年 第2号

図 7．酸素濃度と呼吸鎖阻害剤（NaN3）に対する AOD アイソザイムの誘導パターン75

Mod2p は高 Km を示す 22)．つまり，P. methanolica はメタノールと同様に生育環境下の酸素濃度を的確に認識し，生育環境に合わせた AOD アイソザイムを構築していることが伺える．
実は，この AOD アイソザイムの酸素に対する発現制御がメタノール代謝において非常に重要な意味を持つ．
メチロトローフ酵母のメタノール代謝では，少なくとも2 つの重要な酸素依存的段階を経なければならない．一方は AOD によるメタノール酸化であり，他方はメタノール代謝の最終段階である呼吸鎖である．つまり，メタノール代謝では AOD と呼吸鎖の間で酸素の消費が競合し，もし酸素消費が一方に偏ってしまうと代謝が滞ってしまう．よって， メ タ ノ ー ル 代 謝 を 円 滑 に 保 つ た めには

図 8．メタノール代謝における「オルガネラクロストーク」

AOD と呼吸鎖の酸素消費バランスの制御が必要不可欠である．実際，ミトコンドリア遺伝子欠損株 U0 株では，AOD の発現は見られなくなる．さらには，呼吸鎖阻害剤アジ化ナトリウムで呼吸鎖を阻害すると，高阻害条件下では Mod1p が支配的に誘導され，その阻害率を下げる
22)

ローフ酵母」の分子育種が可能であると考えている．
現在，メチロトローフ酵母は AOD をはじめとした強につれて Mod2p の発現比率が高くなってくる（図 7 右） ．

力なメタノール誘導性遺伝子プロモーターを利用した

この AOD アイソザイムの発現パターンは酸素濃度に対異種遺伝子発現系が Pichia pastoris，Hansenula poly-する挙動と非常に類似していることから，細胞は呼吸鎖morpha，Candida boidinii，P. methanolica などにおいてで酸素濃度を感知し，自身の活性に合わせて AOD アイ開発され，たくさんの研究者に利用されている 24,25)．まソザイムの発現を制御することで両者の酸素消費バラン

た，メチロトローフ酵母は脂肪酸生合成や AOD を活用しスを調節し，メタノール代謝を巧妙に制御しているもの

たバイオセンサーの開発などに用いられているのみならと思われる．また，呼吸鎖因子シトクロム c の発現もず 26,27)，Ps をはじめとしたオルガネラダイナミクスの解AOD 活性に応じて制御されていることが分かっている（未発表）．つまり，AOD と呼吸鎖がそれぞれ局在するオルガネラである Ps とミトコンドリアは互いに酸素代

析やプリオンの研究など，分子生物学の基礎的研究にお謝状態を確認しあい，両者の間でメタノール代謝の酸素おり，その細胞機能を強化することは本酵母の産業利用消費バランスを巧妙に制御するための，いわゆる「オルをより推進していく上で，非常に大きな意味合いを持つガネラクロストーク」が行なわれていることが推測されものと考えている．

けるモデル生物としても広く用いられている．今後もメチロトローフ酵母の利用は広がりを見せるものと考えてる（図 8）．今後，この「オルガネラクロストーク」の分序論でも述べたが，メタノールが最も環境負荷の少な子メカニズムを解明し，その知見を酵母の分子育種に応いエネルギー源・炭素源のひとつに数えられていること用することで，酸素環境に依存しない酵母の発酵生産系から，メチロトローフ酵母の有効活用は「環境に配慮しの構築を目指したいと考えている．

た次世代型発酵生産系」への寄与が期待できる．近い将おわりに
本研究では，メチロトローフ酵母のメタノール代謝制御に焦点を絞り，AOD アイソザイムの役割を中心に「細来，次世代型メチロトローフ酵母がその能力を十二分に発揮できるよう，今後，その分子基盤の構築と産業への応用を見据えた技術の開発を目指して研究を行っていきたい．

胞内 FA 毒性管理」と「細胞の酸素認識と酸素代謝バランス」に立脚したメタノール代謝制御の分子メカニズムを解析してきた．本稿で示したように，メチロトローフ
酵母のメタノール代謝の制御は巧妙かつ複雑ではあるが，その詳細をひとつひとつ繙き，得られた知見をメチロトローフ酵母自身に反映させていくことで，今後，本酵母特有の細胞機能をより強化した「次世代型メチロト76

本研究は，東京農業大学応用生物科学部（旧農学部）応用微生物学研究室で開始し，京都大学大学院農学研究科 制御発酵学研究室，東京農業大学生物産業学部 食品微生物学研究室
および現在の岐阜大学応用生物科学部 食品栄養学研究室で行われたものであり，多大なるご指導，ご鞭撻を賜りました駒
形和男先生，加藤暢夫先生，阪井康能先生，由里本博也先生，冨塚登先生，早川享志先生に心からお礼申し上げます．また，生物工学

第90巻

さまざまな場面でご指導いただいた先生方，共に研究を行った向山博幸博士，伊藤尚志博士，藤村朱喜博士，松藤淑美博士をはじめとした，数多くの学生の皆様に感謝申し上げます．
本研究の一部は，科学研究費補助金，公益財団法人 発酵研究所，秋山記念生命科学振興財団，野田産業科学研究所などからの助成を受けて実施されました．

文献

1) Ozimek, P., Veenhuis, M., and van der Klei, I. J.: FEMS
Yeast Res., 5, 975–83 (2005).
2) van der Klei, I. J., Yurimoto, H., Sakai, Y., and Veenhuis,M.: Biochim. Biophys. Acta, 1763, 1453–1462 (2006).
3) 佐藤正憲，松藤淑美，藤村朱喜，中川純一，谷 明生，
早川享志，中川智行：日本生物工学会大会講演要旨集，p.19 (2009).
4) Lee, B., Yurimoto, H., Sakai, Y., and Kato, N.:
Microbiology, 148, 2697–2704 (2002).
5) Ito, T., Fujimura, S., Uchino, M., Tanaka, N., Matsufuji,Y., Miyaji, T., Takano, K., Nakagawa, T., and Tomizuka,
N.: Yeast, 24, 523–532 (2007).
6) Nakagawa, T., Uchimura, T., and Komagata K.: J.
Ferment. Bioeng., 81, 498–503 (1996).
7) Nakagawa, T., Mukaiyama, H., Yurimoto, H., Sakai, Y.,
and Kato, N.: Yeast, 15, 1223–1230 (1999).
8) Nakagawa, T., Sakai, Y., Mukaiyama, H., Mizumura, T.,
Miyaji, T., Yurimoto, H., Kato, N., and Tomizuka N.: J.
Biosci. Bioeng., 91, 225–227 (2001).
9) Nakagawa, T., Mizumura, T., Mukaiyama, H., Miyaji, T.,
Yurimoto, H., Kato, N., Sakai, Y., and Tomizuka, N.:
Yeast, 19, 1067–1073 (2002).
10) Gruzman, M. B., Titorenko, V. I., Ashin, V. V., Lusta, K.
A., and Trotsenko, Y. A.: Biochemistry (Moscow), 61,1537–1544 (1996).
11) Roggenkamp, R., Sahm, H., Hinkelmann, W., and Wagner,F.: Eur. J. Biochem., 59, 231–236 (1975).
12) van der Klei, I. J. and Veenhuis, M.: Biochim. Biophys.
Acta, 1763, 1794–1800 (2006).
13) Stewart, M. Q., Esposito, R. D., Gowani, J., and Goodman,
J. M.: J. Cell Sci., 114, 2863–2868 (2001).

2012年 第2号

14) Horiguchi, H., Yurimoto, H., Goh, T., Nakagawa, T.,Kato, N., and Sakai, Y.: J. Bacteriol., 183, 6372–6383(2001).
15) Ito, T., Fujimura, S., Matsufuji, Y., Miyaji, T., Nakagawa,T., and Tomizuka, N.: Yeast, 24, 589–597 (2007).
16) Nakagawa, T., Fujimura, S., Ito, T., Matsufuji, Y., Ozawa,S., Miyaji, T., Nakagawa J, Tomizuka, N., Yurimoto, H.,
Sakai, Y., and Hayakawa, T.: Biosci. Biotechnol. Biochem.,
74, 1491–1493 (2010).
17) Nakagawa, T., Yoshida, K., Takeuchi, A., Ito, T.,
Fujimura, S., Matsufuji, Y., Tomizuka, N., Yurimoto, H.,
Sakai, Y., and Hayakawa, T.: Biosci. Biotechnol. Biochem.,
74, 1733–1735 (2010).
18) Ito, T., Ito, D., Ozawa, S., Fujimura, S., Matsufuji, Y.,
Nakagawa, J., Tomizuka, N., Hayakawa, T., andNakagawa, T.: J. Biosci. Bioeng., 111, 624–627 (2011).
19) Nakagawa, T., Ito, T., Fujimura, S., Chikui, M.,
Mizumura, T., Miyaji, T., Yurimoto, H., Kato, N., Sakai,Y., and Tomizuka, N.: Yeast, 21, 445–453 (2004).
20) Yurimoto, H., Komeda, T., Lim, C. R., Nakagawa, T.,
Kondo, K., Kato, N., and Sakai, Y.: Biochim. Biophys.
Acta, 1493, 56–63 (2000).
21) Sakai, Y., Saiganji, A., Yurimoto, H., Takabe, K., Saiki,H., and Kato, N.: J. Cell Biol., 134, 37–51 (1996).
22) Fujimura, S., Nakagawa, T., Ito, T., Matsufuji, Y., Miyaji,T., and Tomizuka, N.: Yeast, 24, 491–498 (2007).
23) Nakagawa, T., Inagaki, A., Ito, T., Fujimura, S., Miyaji,T., Yurimoto, H., Kato, N., Sakai, Y., and Tomizuka, N.:Yeast, 23, 15–22 (2006).
24) Yurimoto, H.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 793–800 (2009).
25) Gellissen, G.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 741–50(2000).
26) Aoki, H., Miyamoto, N., Furuya, Y., Mankura, M., Endo,Y., and Fujimoto, K.: Biosci. Biotechnol. Biochem., 66,2632–2638 (2002).
27) Reshetilov, A. N., Trotsenko J. A., Morozova, N. O.,
Iliasov, P. V., and Ashin, V. V.: Process Biochem.: 36,
1015–1020 (2001).

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