環電力中央研究所報告

中型哺乳類を典型性注目種とした生態系アセスメント手法の開発−DNA情報を利用したタヌキ・アナグマの個体数推定−

研究報告 : Ｖ08043

平成21 年 6 月

財団法人

電力中央研究所境環境科学研究所

中型哺乳類を典型性注目種とした生態系アセスメント手法の開発－DNA 情報を利用したタヌキ・アナグマの個体数推定－

松木 吏弓*1
竹内 亨*2
梨本 真*3
平田 智隆*4
田崎 耕一*5

阿部
上野

聖哉*2
智利*5

Key Words：Environmental impact assessment
Individual identification
Population size estimation
Feces
Microsatellite DNA

キーワード：環境アセスメント
個体識別
個体数推定
糞
マイクロサテライト DNA

Development of ecosystem impact assessment methods for middle-sized mammals
as the representative species- Population size estimation of raccoon dog and badger by fecal DNA typing Rikyu Matsuki, Toru Takeuchi, Seiya Abe, Makoto Nashimoto
Tomotaka Hirata, Chitoshi Ueno and Kouichi Tasaki
Abstract
Raccoon dog and badger distribute widely in Japan, and inhabit mainly country-side forest. They are considered to bechosen as representative species for ecosystem impact assessments. In this study, we performed field research to estimate
population size, distribution and the social structure of these animals based on the genetic information obtained from fecal
DNA analysis. We collected raccoon dog feces regulary for 12 weeks from the study area in Abiko, Chiba prefecture toestimate the number and genetic relationship of individuals using their latrines. Seven raccoon dogs were identified and 6 ofthem constructed same family relationship. Badger feces were collected from the 165 ha study area in Satsumasendai,
Kagoshima prefecture to examine population size and distribution of individuals. Total 68 feces were successfully genotyped
and 30 badgers were identified. Population size in this study area estimated by the rarefaction method using genotyped data,
was 38 individuals (95%CI= 31-69). These results indicated that the research method using fecal DNA analysis is effective toestimate population size, behavioral and population genetics for racoon dog and badger.
（Environmental Science Research Laboratory Rep.No.V08043）（平成 21 年 3 月 12 日 承認）*1
環境科学研究所 生物環境領域*2
環境科学研究所 生物環境領域*3
環境科学研究所*4
西日本技術開発株式会社*5
九州電力株式会社

上席研究員
主任研究員
上席研究員・スタッフ
環境部
環境部

i

©CRIEPI背景

発電所の環境影響評価では，事業が生態系に及ぼす影響を予測評価することが求められている。予測評価に際しては，地域の生態系を特徴づける種を上位性，典型性，特殊性の視点から注目種として選定し，行動圏や生息環境，餌生物などを調査することによって，生態系への影響を可能な限り定量的に把握することとされている。タヌキやアナグマなどの中型哺乳類は，火力・原子力発電所が立地する里山環境の代表的な典型性注目種の候補であるが，夜行性で森林や薮などを主な生息場所としているため，個体数や分布状況を把握することは困難な場合も多い。近年，野生動物の糞や体毛の DNA から個体情報が取得できるようになり 1)，この技術を利用した個体数推定法の開発や生態系アセスメントへの適用が期待されている。

目的

タヌキおよびアナグマを対象として野外に排泄された糞から DNA 情報を収集し，個体の識別および個体数の推定を行い，生態系アセスメントへの適用性について評
価する。

主な成果
１．タヌキのため糞場利用個体の推定と血縁関係
タヌキには決まった場所に集中的に糞をする「ため糞」という習性があり，複数の個体が共同で利用する。ため糞場を利用している個体数やその個体間の関係を明らかにすることを目的に，千葉県我孫子市で確認したため糞場を利用するタヌキを対象として調査を行った。2005 年 11 月から翌年 2 月にかけて毎週定期的にため糞場を調査し，新規に追加された糞を採取した。糞から DNA を抽出し，個体識別した
結果，7 個体のタヌキがため糞場を利用していたことが明らかになった。このうち 6
個体が，血縁関係の解析から家族集団（父，母，仔 4）を構成することが判明し，
この家族集団が共有してため糞場を利用していると考えられた。
２．アナグマの生息分布と個体数推定
鹿児島県薩摩川内市において，クロマツ植林が大部分の低地（S1 区：84.8ha）および常緑広葉樹林とスギ・ヒノキ植林が混在する山地（S2 区：80.8ha）の 2 つの隣接する調査区を設定し，糞 DNA による個体識別結果からアナグマの生息個体数を推定することを目的に，2006 年 11 月に網羅的な踏査による糞場確認調査を行った。
採取した糞から個体識別した結果，S1 区で 12 個体，S2 区で 18 個体が確認できた。

ii©CRIEPIこの調査では各調査区を利用する全ての個体の糞を特定できていないと推測されるため，累積曲線を用いた個体数の推定(注 1)を試みた。その結果，S1 区では 15 個体（95%信頼区間：12-45），S2 区は 24 個体（95%信頼区間：18-49）と推定され，個体数密度はそれぞれ 0.18 個体/ha， 0.30 個体/ha と推定された。本調査地で並行して実施したアナグマの餌資源 2)や巣穴 3)の好適性評価においても，常緑広葉樹林の多い山
地の S2 区が高い評価であり，S2 区での個体数密度の高さはアナグマにとって好適な生息環境を反映していることが示唆された。
3. 生態系アセスメント調査への適用性の評価
本研究で示した糞 DNA 解析に基づく調査手法は，個体数推定や社会構造の解析だ
けでなく，糞の分布から各個体の行動範囲も推測できる。本手法を用いれば，開発により生息地の改変がある場合に，その影響を直接受ける個体の数や行動範囲も把握可能であり，生態系アセスメントにおいて事業の影響を評価する上で有効な調査手法であると考えられた。

今後の展開
糞 DNA 解析を用いて野生動物の遺伝的多様性を評価する手法について検討し，環境アセスメント調査や野生動物の保全管理等に活用を図る。
(注 1)：一定の範囲内で糞の排泄個体を特定する調査を続けた場合，最終的にはすべての個体の糞が確認できると予想される。このとき，調査試料数に対する新規確認個体数の累積曲線は漸近線に収束するが，その漸近値は全個体数と一致する。この漸近線を推測し，個体数の推定を行った。
関連報告書・論文
1) 「DNA 情報を利用した新しい野生動物調査法の開発 ―タヌキの個体識別と未知生物試料からの種同定―」
V05017.
2) 「中型哺乳類を典型性注目種とした生態系アセスメント手法の開発 ―タヌキ・アナグマの餌資源分布の評価―」V08044．
3) 「中型哺乳類を典型性注目種とした生態系アセスメント手法の開発 ―影響予測・評価のための生息好適性解析―」V08045．

iii©CRIEPI目次

１．はじめに ···················································································································· 1２．材料と方法 ················································································································· 1
2.1 試料······················································································································ 1
2.1.1 我孫子調査地でのサンプリング ············································································ 1
2.1.2 川内調査地でのサンプリング ··············································································· 2
2.2 DNA 抽出 ·············································································································· 32.3 種判定··················································································································· 3
2.4 個体識別················································································································ 3
2.5 雌雄判定················································································································ 4
2.6 生息数推定············································································································· 4３．結果 ·························································································································· 4
3.1

我孫子調査地におけるタヌキため糞場の定点調査 ·························································· 4

3.2

川内調査地におけるアナグマ・タヌキの生息分布調査 ···················································· 6

４．考察 ·························································································································· 9
4.1

タヌキの糞場利用個体数··························································································· 9

4.2

タヌキの糞場利用と活動記録との比較 ········································································· 9

4.3

タヌキの家族集団の糞場利用 ····················································································· 94.4

川内調査地におけるアナグマの生息環境と個体数密度 ···················································11

4.5 DNA 解析の環境アセスメント調査への活用·································································11

謝辞 ·······························································································································13
参考文献 ·························································································································13

iv©CRIEPI１．はじめに

型性の視点から選定されうる代表的な注目種であるといえる。

1999 年に施行された環境影響評価法では，新事業が注目種におよぼす影響を評価する上で，たに「生態系」が評価項目として取り上げられその対象動物が調査地にどのくらい生息していた。上位性（生態系の食物連鎖の上位に位置す

るのかを把握することは，最も基本的かつ重要る性質），典型性（地域の生態系の特徴を典型的なことである。しかし，タヌキやアナグマは夜に表す性質），特殊性（特殊な環境の指標となる

行性であり，森林や薮などを主な生息場所とし性質）の視点から注目種・群集を選定し，科学ているため，観察による個体数推定は非常に困的かつ定量的に影響予測・評価することが求め難である。タヌキとアナグマはどちらも「ためられているが（環境庁企画調整局 2000），具体

糞」と呼ばれる決まった場所に集中的に糞をす的な調査解析手法は確立していない。このため，る習性があり，行動範囲内に複数ヶ所のため糞これまでに実施された生態系アセスメントにお場を利用する（芝田 1996， 金子 1996）。そこ

いて，必ずしも十分な影響評価がなされていなで本研究では，タヌキとアナグマの糞に着目し，いのが現状である。2005 年には本法の基本的事

糞に含まれる DNA 情報を利用して，排泄個体

項に関して点検が行われたが（環境影響評価のの識別および個体数の推定を試みた。

基本的事項に関する技術検討委員会 2005），特

本研究は 2 ヶ所の調査地で実施した。我孫子に「生態系」の分野については，より一層の技

調査地においては，タヌキのため糞場を約 80

術手法の開発が求められており，適切な環境影

日にわたって定点調査し，ため糞場の利用状況

響評価を行う上で有効な技術手法の開発が強くと個体数さらに利用個体の血縁関係を糞 DNA

望まれている。

から明らかにした。川内調査地では，タヌキと生態系アセスメントにおいては，選定した注

アナグマが同所的に生息する調査地において，目種の行動圏や生息環境，餌生物を調査するこ

網羅的な糞場確認調査を実施し，採取した糞のとが基本であり，これらに関してできるだけ詳

個体識別結果から調査地の生息数を推定した。

細な情報を得ることが望ましい。一方で，現実

なお，川内調査地における調査・解析は，九州のアセスメント調査を考えた場合，調査期間や電力株式会社川内原子力発電所 3 号機増設計画

調査コストといった視点も重要である。また，に伴う環境影響評価の一環として行われたもの

調査自体が対象地域の生態系におよぼす影響もである。

考慮する必要がある。このような観点から我々

２．材料と方法はより効率的で精度の高い生態系調査手法を提案することを目指し，DNA 情報を活用した調査

2.1

手法の開発・研究を進めている。

試料

雑食性の中型哺乳類であるタヌキやアナグマ

2.1.1

は，国内に広く分布しており，人間の生活圏に

我孫子調査地でのサンプリング

近い里地，里山に生息している（芝田 1996， 金

自動撮影カメラを用いた予備調査から，千葉

子 1996）。様々な環境を利用し、雑食性である

県我孫子市にある電力中央研究所構内の林内でため、森林の伐採や土地利用の変化、構造物のタヌキの活動が確認されていたことから，電力設置などの複合的な影響を予測するのに適して

中央研究所構内およびその周辺に生息するタヌ

いることから，生態系アセスメントにおいて典キを調査の対象とした。2005 年 11 月に電力中－1－©CRIEPI央研究所構内およびその周辺において，タヌキの隣接する調査区を設定した（図 3）。2006 年のため糞場を探索し，利用が認められる 3 ヶ所

11 月 13 日～16 日に各調査区において，タヌキのため糞場を確認した（図 1）。これらのため糞およびアナグマのため糞や巣穴等を確認するフ場について，週に 1 回の頻度で調査を行い，糞ィールドサイン調査を実施した。事前に調査区の採取を行った。調査は 11 月 15 日，25 日，12全域を網羅するように約 50m 間隔に調査ルー

月 1 日，8 日，15 日，22 日，27 日，2006 年 1

トを設定し，このルートを基準に安全性に配慮

月 6 日，13 日，19 日，27 日，2 月 3 日の計 12

しながらフィールドサインの探索を行った。実回実施し，糞を繰り返し採取した。糞は前週以際に踏査したルートおよび確認したフィールド

降に排泄された新しいものだけを採取し，新し

サイン地点の位置は，携帯型 GPS 機を用いて記い糞が確認できない場合には採取しなかった。

録した。発見した糞のうち，新鮮な糞のみを採採取した糞は保冷材入りのクーラーボックスに取した。新鮮な糞が複数あった場合には糞塊ご移した後，速やかに実験室に持ち帰り，DNA 抽とに別々に採取した。また 5m 以内の近接した出まで冷凍庫（-20℃）で保存した。

糞については，まとめて 1 ヶ所の糞場位置として記録した。新鮮な糞が確認された糞場や規模

2.1.2

川内調査地でのサンプリングの大きい糞場については，11 月 17 日および 11

鹿児島県薩摩川内市のアナグマおよびタヌキ

月 20 日～22 日に 2 回以上調査し，新規に追加が生息する地域に，クロマツ植林が大部分であされた糞を採取した。採取した糞は，調査中にる海岸沿いの低地（S1 調査区：84.8ha）とスダ

は保冷材入りのクーラーボックスで一時保管し，ジイが優占する常緑広葉樹林とスギ・ヒノキ植調査終了後速やかに-20℃で冷凍保存した。

林が混在する山地（S2 調査区：80.8ha）の 2 つ

水田（冬期乾田）
市街地・住宅地
常緑広葉樹林
竹林
畑地

L-1

芝地・草地

L-2

0

L-3

500m

図1

我孫子調査地の現存植生図とタヌキため糞場位置
赤丸はため糞場の位置を示す。

－2－©CRIEPI

2.2

DNA 抽出2.4

個体識別

タヌキあるいはアナグマの糞は約 1～2g をチ

タヌキの個体識別には種判定で使用した

ャック付きポリ袋にとり，QIAamp DNA stool

D-loop 領域のハプロタイプと 8 種のマイクロサ

mini kit (QIAGEN) の 抽 出 バ ッ フ ァ ー (ASL

テ ラ イ ト DNA（ Npr02, Npr04, Npr05, Npr06,

buffer) 5 ml を加え，ポリ袋の外から糞をこすり

Npr07, Npr09, Npr11, Npr14：松木ら 2006）を利懸濁させた。ポリ袋を 65℃の恒温器で 3 時間イ用した。

ンキュベートし，途中約 1 時間に 1 回ポリ袋のアナグマの個体識別には，タヌキと同様に種外から糞を摩擦し，よく懸濁させた。ポリ袋か判定で使用した D-loop 領域のハプロタイプとら抽出液 2ml を取り，その後はキット添付のマ

Frantz らのマイクロサテライト DNA（Frantz et al.

ニュアルにしたがって DNA 抽出を行った。抽2003）のうち，日本産アナグマで多型を検出し

出 後 さ ら に ， QIAquick PCR Purification Kit

た 6 種のマイクロサテライト DNA（Mel-102,(QIAGEN)を用いて DNA を精製した。

Mel-105, Mel-106, Mel-109, Mel-111, Mel-117：松木ら 2008）を利用した。

2.3

種判定

PCR 反応はタヌキおよびアナグマのマイクロサテライト DNA ともに，種判定の D-loop と同

川内調査地ではアナグマとタヌキが同所的に様の条件で行い，反応後，Genetic Analyzer によ生息するが，両者の糞は判別しにくいため，採って分離・検出し，Gene Mapper ソフトウェア

取した糞はすべて DNA 分析による種判定を実

v.3.0 (PE Biosystems)によって解析した。
型判定では，まず全ての座位について 2 回施した。
種判定には，mtDNA の D-loop 領域の配列を利PCR 増幅および解析を実施した。ヘテロの場合，用し，プライマーとして tanaD-F(5'-ACCATCAGC

2 回とも同一の DNA 型を示すものをその座位

ACCCAAAGCTG-3')および tanaD-R(5'-GGGCTGATTの DNA 型とした。ホモの可能性がある場合に

AGTCATTAGTCCATC-3') を 使 用 し た （ 松 木 らは，さらに実験を実施し，3 回以上 1 種類の対2008）。PCR 反応は，テンプレートとして 2μl

立遺伝子のみを検出した場合にホモとした。

の DNA 溶液を使用し，1μg BSA，4% DMSO，

Allelic dropout や False allele などにより 2 回の実

0.5 unit ExTaq Hot Start Version を含む 10μl の反験では判定できなかったものは，さらに実験を応液で行い，98℃ 60 秒の予備加熱後，98℃ 10

繰り返し（最高 9 回），少なくとも 2 回同一対立

秒，60℃ 1 分 30 秒，72℃ 30 秒のサイクルを 10遺伝子の検出が認められたものについてのみ

回繰り返し，続いて 90℃ 10 秒，60℃ 1 分 30 秒，

DNA 型の判定を行った。ヘテロの可能性がある

72℃ 30 秒のサイクルを 35 回繰り返し，最後にものの Allelic dropout のため，一方の対立遺伝

60℃ 30 分の最終伸長させる温度条件で行った。

子しか 2 回以上検出できなかった場合には，片PCR 増幅後，PCR と同じプライマーでダイレク方の対立遺伝子のみ DNA 型を決定した。以上

トシークエンスを行い，Genetic Analyzer (PEのような型判定をした結果，タヌキでは 6 座位

Biosystems)で塩基配列を決定した。

以上，アナグマでは 5 座位以上 DNA 型が決定できたものについてのみ，個体識別用の試料とした。これらマイクロサテライト DNA の判定
結果と D-loop 領域の配列から決定したハプロ－3－©CRIEPI

タイプとを各試料間で比較し，DNA 型が一致し無作為に変更した累積曲線の作成を 1000 回反た試料あるいは Allelic dropout を考慮して矛盾復し，推定された漸近値の中央値より推定個体が認められない試料を同一個体が排泄した糞と数を求めた。なお，推定された漸近値の 2.5%か判定した。

ら 97.5%の範囲を 95%信頼区間とした。

2.5

３．結果

雌雄判定

3.1

タヌキおよびアナグマの雌雄判定には我孫子調査地におけるタヌキため
糞場の定点調査

ZFX/ZFY 遺伝子の P1-5EZ:ATAATCACATGGAGAGCCACAAGCT / P2-3EZ5:GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAGT (Aasen and Medrano 1990）

タヌキの利用が確認できた 3 ヶ所のため糞場

プライマーセットを用いて PCR を行い，タヌキ（図 1）について，2005 年 11 月から 2006 年 2

では ZFX 中に存在する ScaI サイト（松木ら

月まで毎週定期的に調査し，新規に追加した糞2006），アナグマでは ZFY 中に存在する BcnI サの採取を行った。この期間中に 12 回の調査を実

イト（松木ら 2008）を利用して雌雄の判定を行施し，合計 51 ヶ（L-1：18 ヶ，L-2：19 ヶ，L-3：

った。

14 ヶ）のタヌキ糞が採取できた。これらの糞について DNA を抽出し， 8 種のマイクロサテラ

2.6

生息数推定

イト DNA について分析したところ，45 サンプ
ル（88 %）で個体を識別することができ，DNA型から 7 個体（A～G）のタヌキがため糞場を利ある範囲内の個体群について，糞を排泄した用していたことが示された（表 1）。

個体を特定する調査を続けた場合，最終的には生息するすべての個体の糞を確認し，生息個体

識別した個体のため糞場の利用を調査日毎に数を把握できると予想される。このとき，調査

みてみると（図 2），個体 B を除きいずれも異な試料数に対する新規確認個体数の累積曲線は漸る調査日で 4 回以上確認され，これらのため糞近線に収束するが，その漸近値は個体群の全個場を頻繁に利用していることが示された。また

体数と一致する。この漸近線を推測し個体数を個体毎のため糞場の利用については，B，C，D

推定する方法は，糞や体毛などの DNA 個体識

では 1 ヶ所でしか確認できなかったが，F はた

別を利用した個体数推定に用いられている

め糞場 L-2 と L-3 で，A，E，G ではすべてのた（Kohn et al. 1999, Eggert et al. 2003, Frantz et al.

め糞場で確認され，複数のため糞場を同時期に2004）。

利用していることが示された（図 2）。

川内調査地のアナグマについて，各調査地区

確認された 7 個体のミトコンドリア DNA ので個体識別した結果から個体数を推定した。デ

ハプロタイプは，D-loop 領域の配列から 2 種類

ー タ は DNA 多 型 解 析 ソ フ ト Gimlet v1.3.3に分けられ，個体 C と E はハプロタイプ B 型，

(Valière 2002)により解析した後，統計解析ソフ

A，B，D，F，G はハプロタイプ D 型であった

ト R を用い，累積曲線として Eggert et al. (2003)（表 1）。また，ZFX/Y 遺伝子を用いた雌雄判定

bxが用いている数式 y=a(1-e )に当てはめ，漸近値

から，Ｂ，D，E，F が雄，A，C，G は雌である

a を推定した。累積曲線は型判定した調査試料

ことが示された（表 1）。これら 7 個体について，の順番に影響を受けるため，調査試料の順番をハプロタイプ，雌雄判定および 8 種のマイクロ－4－©CRIEPI

表1

タヌキ糞からの DNA 解析結果

各座位の列の値は対立遺伝子サイズ(bp)，ハイフンは型判定できなかったことを示す。なお，
片一方の数値のみ記載されている座位は，少なくとも一方の対立遺伝子が決定できたことを示す。

個体 ID

Npr05

Npr06

Npr09

A

182/182

118/122154/162B

174/

118/122-C

174/182

118/118

D

166/174

E

Npr11

Npr02

Npr04

Npr07

Npr14

ハプロ

推定血縁

タイプ型

関係

性別

211/223232/244272/278

146/154

159/159

♀

D

仔

219/

228/

286/286

146/154

159/159♂

D仔

154/162219/223232/236

278/282

146/150

159/163♀

B

E の母・姉妹

118/122

162/166

211/223

228/244272/286

146/150

159/159♂

D仔

174/182

118/118

154/166

211/219228/232

278/286

150/154

159/159

♂

B

父

F

182/182

118/122

162/166

219/223

228/244272/286

146/150

159/159

♂

D

仔

G

166/182

122/122

162/166

223/223240/244272/286

146/146

159/163♀

D

母

A 11/15

B 11/25

C D

E

A B

D 12/8C

A F

EFG 12/27C

図2

F 12/22

DEF AF

I 1/13DG

A F

J 1/19
A

E

F

H 1/6

E D

F

AC

F

E 12/15AG

C 12/3

DF

K 1/27

EG
G

G

G

E

L 2/3
EG

糞 DNA より識別したタヌキ個体の調査期間におけるため糞場利用

赤丸はため糞場の位置を示す。

－5－©CRIEPIサテライト DNA の DNA 型から，血縁関係の解の新しい糞が見られる糞場を発見し，それらの析を行った。その結果，E と G が両親で A，B，糞場より合計 192 ヶの糞を採取した（図 4，表 2）。

D，F が仔の関係であることに矛盾がなく，こ確認された糞場は，常緑広葉樹林内および林縁

れら 6 個体が親子関係にあることが推測された。

に多い傾向があり，スギ・ヒノキ植林にはほと

また，C は G とハプロタイプが異なることから，

んど認められなかった。

G の仔でも G と共通の母系でもなかった。しかアナグマとタヌキは体格や食性が近く，またし，E とはハプロタイプが同じであり，DNA 型

どちらもため糞をする習性があるため，同所的の比較から E の母あるいは姉妹の可能性が確認に生息している場合，糞の種判定は困難であるできた。このように，今回調査した近接した 3（松木ら 2007）。そこで，採取したすべての糞ヶ所のため糞場は，一つの家族もしくは非常にについて，mtDNA の D-loop 領域を利用した種血縁の高い集団が共有して利用していることが判定を行った。採取した 192 サンプルのうち 177

示唆された。

サンプル（92.2%）で種を判定することができ，
このうち 152 サンプルがアナグマ，25 サンプル

3.2

川内調査地におけるアナグマ・タがタヌキの糞であった（図 4，表 2）。興味深い

ヌキの生息分布調査

ことに 9 ヶ所の糞場地点でアナグマとタヌキ両方の糞が確認された。これは一つの糞場もしく

2006 年 11 月に S1 調査区および S2 調査区にはごく近傍でアナグマとタヌキがそれぞれ糞をおいてアナグマ・タヌキの糞のサンプリングを排泄したことを示しており，同じ時期に非常に行った（図 3）。10 日間の調査期間中に 91 ヶ所

近接した場所をアナグマとタヌキが糞場として

S1

図3

S2

川内調査地の現存植生図

破線は各調査区（S1 調査区，S2 調査区）の範囲を示す。

－6－©CRIEPI

A

B

図4

糞 DNA から種判定したアナグマとタヌキの糞場の位置

A:アナグマの糞場位置，B:タヌキの糞場位置。赤丸線でかこった地点は近接してアナグマとタヌキ両方の糞が確認された糞場。

表2

川内調査地の各調査区における種判定，個体識別結果
種判定

面積
調査区

糞場数

アナグマ個体識別

タヌキ個体識別

採取糞数

(ha)

アナグマ

タヌキ

不明

識別糞数

個体数

識別糞数

個体数

S1

84.8

39

75

50

17

8

34

12

15

7

S2

80.8

52

117

102

8

7

34

18

4

3＊

計

165.6

91

192

152

25

15

68

30

19

10

＊ ハプロタイプの違いにより識別した 1 個体を含む

利用していたと考えられる。

調査区を利用していると考えられる。タヌキに種判定できたサンプルについて，アナグマ，

ついては 4 個体が複数の糞場を利用していたが，タヌキそれぞれのマイクロサテライト DNA マ

個体 T08 の 684m が最も糞場が離れており，糞ーカーを用いて個体識別を行った。アナグマで場の最外殻面積の最大は T01 の 6.4ha だった。

は，DNA 型の比較から S1 調査区で 12 個体，S2

多数の糞サンプルから個体識別できたアナグ調査区で 18 個体の計 30 個体を確認できた（表マについて，累積曲線を用いた個体数の推定を

2，図 5A）。複数地点の糞場を利用していた個体試みた（表 3）。S1 調査区では，推定個体数がは 10 個体であったが，同一個体が利用した糞場

15 個体（95%信頼区間：12-45 個体）であり，間の最長距離は 486m（個体 22）であり，糞場

S2 調査区は 24 個体（95%信頼区間：18-49 個体）の最外殻面積が最大だったのは個体 02 の 7.6haの生息が推定された。各調査区の個体数密度はであった。一方，タヌキは S1 調査区で 7 個体，

S1 調査区で 0.18 個体/ha，S2 調査区で 0.30 個体

S2 調査区で 2 個体の計 9 個体が DNA 型から識/ha と推定され，クロマツ植林が大部分の低地よ

別できた（表 2，図 5B）。S2 調査区ではマイクり，常緑広葉樹林が多い山地にアナグマが多く

ロサテライト DNA で識別した 2 個体とは異な生息することが示唆された。

るハプロタイプをもつ個体（T10）が北東部に確認されているため，少なくとも 3 個体は S2－7－©CRIEPI

A

B

図5

糞 DNA から識別したアナグマとタヌキの個体の分布

A:アナグマ，B:タヌキ。数字は個体番号，実線は同一個体の最外殻を示す。

－8－©CRIEPI

表3

調査区ごとのアナグマの推定個体数

面積
調査区

確認個体数

推定個体数の推定個体数密度95％信頼区間(個体/ha）

推定個体数

(ha)
S1

84.8

12

15

12 ～ 45

0.18

S2

80.8

18

24

18 ～ 49

0.30

計

165.6

30

38

31 ～ 69

0.23

４．考察

識別を行った結果，D，F，G と同一の個体であることが判明した。3 個体については，携帯網

4.1

タヌキの糞場利用個体数を利用した GPS 首輪を装着し，放逐後数日間の詳細な位置情報を記録している（図 6）。個体 G

我孫子調査地のタヌキため糞場において，約は 3 ヶ所のため糞場を利用していたが，GPS 位

80 日間の定点調査で得られた糞サンプルから，

置情報に基づく行動範囲も 3 ヶ所のため糞場をDNA 個体識別により，ため糞場の利用個体を把含んでおり，3 ヶ所のため糞場を行き来してい握することが可能であった。確認された 7 個体ることが示唆された。同様に個体 D は L-1 のみ，のうち 6 個体は頻繁にため糞場を利用していた個体 F は L-2 と L-3 のため糞場の利用が確認さ（図 2）。累積曲線による個体数推定を行ったが，れていたが，各個体の行動範囲はそれぞれ利用

漸近値がほぼ 7 個体となることから，ため糞場していたため糞場を含む範囲にあった。しかし，の利用個体は全て確認できたと考えられる。

その行動範囲は個体 D はため糞場より南西方向，

今回の調査では，2 回目（11 月 25 日）で 6

個体 F は北東方向に広がっており，利用が認め個体，5 回目（12 月 15 日）で全 7 個体が確認でられなかったため糞場は行動範囲に含まれておきた。また，1 回しか確認できなかった個体 B

らず，またお互いの行動範囲も重なっていなかを除けば，調査期間中のどの連続した 5 回の調った。このように糞 DNA を用いたため糞場の査においても，残り 6 個体すべてを確認するこ

利用状況の結果は，GPS 位置情報による捕獲個とが可能であった。個体識別に用いる糞は新鮮

体の行動範囲と矛盾はしていなかった。今回のなものに限られるため，1 回のサンプリングで調査では比較的規模の大きい 3 ヶ所のため糞場全ての個体を特定することは難しい。ため糞場を対象としたが，調査範囲を拡大し，小さな糞を利用している主な個体を把握するためには，5場も含め多数地点より糞をサンプリングできれ回程度反復してサンプリングする必要があるとば，個体毎の主な行動範囲を把握できるものと

思われる。

思われる。

4.2

4.3

タヌキの糞場利用と活動記録とのタヌキの家族集団の糞場利用

比較
タヌキは春に繁殖し，仔が成長する初秋くら本研究と同時期に捕獲調査も実施しており，3

いまでは親子で行動をともにするが，その後親個体のタヌキを捕獲している（竹内ら 2009A）。

の行動圏を出て分散を始める仔がでてくる

これらの個体の血液より DNA を抽出し，個体（Ikeda 1983）。分散がはじまるころから，親と－9－©CRIEPI図6

捕獲個体の行動範囲と利用したため糞場

緑，青，赤の丸印はそれぞれ個体 D，F，G に装着した GPS 首輪による計測位置，星印はねぐらの位置，実線は各個体の確認位置の最外殻を示す。

仔の関係は次第に弱くなり，冬には仔同士の関（雄）はそれ以降出現することがなく，11 月 15

係も弱まり，互いに独立して行動するようにな

日以降は他地域への分散あるいは死亡したものる（Ikeda 1983）。分散期を過ぎても，単独行動と推測される。雄の仔 D および F は 11 月 25 日

をとりながら，親の近辺に残ったり，時々餌場

から 1 月 13 日まで確認されたが，それぞれためなどに帰ってきたりする仔もいるようである

糞場の利用が重なることはなく，仔同士のつな（野柴木 1987， Saeki 2001）。一方，子育てをがりが弱まっているものと考えられた。仔 D の終えたペアは，仔の分散後も行動を共にし，翌

休息場はため糞場より離れた場所で確認された春にはまた同じペアで繁殖を行う（谷地森 1997，

が，仔 F はため糞場のすぐそばを休息場としてSaeki 2001）。このようなタヌキの年周行動・社

おり，この時期には完全に親ペアの行動圏から会構造をふまえ，本調査で確認されたタヌキの離れていったわけではなかった（図 6）。一方，家族集団の活動（図 2，6）をみてみる。調査期

雌の仔 A は，11 月 15 日から 1 月 19 日までの間間の 11 月 15 日から 2 月 3 日は分散期の後期かで 3 ヶ所のため糞場を利用していた。また，父ら繁殖期前に相当する。この家族集団の親ペア

親の E は調査期間を通して確認されているが，は父 E と母 G であり，この 2 個体は調査した 3

母親の G は後半に集中していた。1 月 27 日と 2

ヶ所すべてのため糞場を頻繁に利用しているこ

月 3 日には E と G の同一の糞場利用が確認されとから，基本的にこの親ペア集団のため糞場でており，繁殖期を前に親ペアの結びつきが強くあると考えられる。11 月 15 日に確認された仔 Bなっていることが推測された。

－10－©CRIEPIこれまでのタヌキの社会行動の研究では，長では，同時に巣穴も探索しており，本調査地お時間にわたる観察や，標識を入れた餌を用いたよび周辺地域で発見した巣穴の分布について解

餌場・糞場利用に基づいて分析されてきた析を行っている（竹内ら 2009B）。その結果，常（Ikeda 1982，野柴木 1987，Saeki 2007）。しか緑広葉樹林が選好され，ある程度の傾斜度が好し，これらの調査は労力が多大であり，また家まれるが，スギ・ヒノキ植林や裸地・草地など

族集団の関係も観察による推定の域を出ないの

オープンな環境は忌避される傾向にあった。まが現状である。糞 DNA を利用した直接的な血た，アナグマの主要な餌資源であるミミズ類や縁関係の推定と糞場利用の分布を把握する調査

甲虫類，サツマゴキブリなどの土壌動物につい手法は，タヌキの社会行動を明らかにする上でて，本調査地および周辺地域で餌資源量調査も極めて有効であると考える。

同時期に実施している（阿部ら 2009）。これらの餌資源は常緑広葉樹林およびスギ・ヒノキ植4.4

川内調査地におけるアナグマの生林に多く，クロマツ植林で少ない傾向にあった。

息環境と個体数密度

これらの解析結果を総合すると，クロマツ植林が大部分を占め，草地，裸地，常緑広葉樹林がアナグマとタヌキが同所的に生息する川内調

パッチ状に存在する S1 調査区と比べ，常緑広査地において，フィールドサイン調査で発見し葉樹林の多い山地である S2 調査区はアナグマ

た糞場より回収した糞サンプルからアナグマ，の生息環境としてより好適であるといえる。アタヌキ両方を個体識別することが可能であった。

ナグマの推定個体数密度も S2 調査区で高かっ種判定できた糞のうち，約 85%がアナグマの糞たが，このようなアナグマにとって好適な生息であり，また個体数もアナグマはタヌキの 3 倍

環境を反映しているためと思われる。

の 30 個体が識別されていることから（表 2），

ヨーロッパのアナグマは地域によって生息密

この調査地ではタヌキと比べアナグマの個体数

度が 0.001 個体/ha～0.38 個体/ha（ Kowalczyk et al.

密度がかなり高いと思われる。興味深いことに

2000，Johnson et al. 2002）とかなり異なること

タヌキの糞が確認された 19 ヶ所の糞場地点のが知られている。おおむね 0.15 個体/ ha 以上がうち，約半数の 9 ヶ所で非常に近接した場所に高密度個体群（Johnson et al. 2002, Rogers et al.

アナグマの糞が確認されている（図 4B）。この

1997）として低密度の個体群とは区別して研究

うち 6 ヶ所はけもの道あるいは尾根のそばにでがすすめられているが，この基準からすると本きた糞場であり，同じ移動環境も利用している研究の調査地では S1 調査区，S2 調査区ともにと推測される。アナグマとタヌキは食性が似て高密度個体群といえる。S2 調査区と比較するとおり（阿部ら 2009），餌資源からみると競合関S1 調査区は生息環境は劣るが，高密度個体群と係にあるが，この調査地においては排他的ではして維持できるだけの餌資源や巣穴資源などがなく，共存しているようである。

豊富に存在するものと思われる。

アナグマについては個体識別データをもとに4.5

生息数を推定することができた。推定個体数密

DNA 解析の環境アセスメント調査
への活用

度は，クロマツ植林が大部分の低地である S1
調査区で 0.18 個体/ha，常緑広葉樹林とスギ・ヒノキ植林が混在する山地の S2 調査区で 0.30 個

野生動物の調査・研究において，糞や足跡，体/ha であった。本研究のフィールドサイン調査

食痕などのフィールドサイン確認調査は最も基－11－©CRIEPI本的な調査である。このうち糞は，対象動物に能であり（松木 未発表），ヒトを除くかなり幅もよるが比較的確認しやすく，また内容物から広い哺乳類で利用できると思われる。

餌の推測もできるため，生息や生態を把握する

環境アセスメントの動物相調査では，フィー上で重要なフィールドサインとなる。一般に糞ルドサイン調査は必須であるが，種が不明な糞の種判定では，形状やサイズ，内容物や排泄環や混同しやすい糞，特に希少種や重要種の可能境などから総合的に判断することになるが，図性がある場合には，本 DNA マーカーを適用し，鑑や文献などの記載と異なることも多いため，正確に種判定することが望ましい。たとえば，経験にたよる部分が大きい。また，最近では誤

西日本では外来種であるチョウセンイタチがイ判定が課題として指摘されている（黒瀬 2006，

タチを圧迫しており，地域によってはイタチは

松木 2006）。本研究で実施したように DNA を用レッドリストに指定されている。しかし，イタ

いた種判定は，調査者のスキルによらず，新鮮チとチョウセンイタチは糞からの識別が極めてな糞であれば正確に種判定をすることが可能で困難であるため，環境影響評価書では「イタチある。本研究で用いた哺乳類の種判定用 DNA属の一種」と記載されるケースが見受けられる。

マーカーは，実際のフィールドサイン調査のサ

こうした場合，もし糞がイタチのものであった

ンプルを利用することを想定し，種判定用のなら，適切な影響評価・対策をする機会が失わ

PCR プライマーは以下のポイントをもとに設計れる恐れがあり，チョウセンイタチであった場している（松木ら 2008）。まず，1)アナグマや合には，追加確認調査などに無駄な労力やコスタヌキなど中型哺乳類は明確に判別できるが，トをかけてしまうこととなる。このような懸念

2) DNA 分析用サンプルに不慣れな調査者のコを払拭し，適切で効率的な影響評価を実施する

ンタミを配慮して，ヒト DNA は増幅しないこために，糞 DNA による種判定は，今後不可欠と。また，3)餌となる小動物（カエル，甲虫，な調査手法になると考える。

鳥など）にもできるだけ反応しないようにし，

糞 DNA からの個体識別では，糞の新鮮さやさらに 4) mtDNA のハプロタイプ情報も同時に保存状態が重要である。個体識別の成功率も排取得できるようにした。本研究においてこのよ泄した個体の DNA ができるだけ分解されずにうな考えで設計した DNA マーカーを利用して残っているかが鍵となる。川内調査地では，本糞から種判定した結果，ヒトや餌動物の増幅に研究と同様の調査を春期（5 月）および夏期（7，悩まされることもなく，9 割以上の糞について

8 月）にも実施したが，mtDNA に基づく種判定

種判定することが可能であった（表 2）。また，

は 9 割以上の糞について可能であったのに対し，同時に取得したハプロタイプ情報は個体識別に

個体識別はいずれも 1 割以下しかできなかった活用できたが，母系集団の範囲の推定や遺伝的（データ示さず）。調査期間中の平均気温は，本多様度の診断などにも利用可能と思われる。本

研究の 11 月では 13.6℃であったが，5 月の調査

DNA マーカーはイタチ科やイヌ科動物だけで期間は 18.0℃，7，8 月は 28.0℃であり（気温デなく，ネコやハクビシン，イノシシ，ノウサギ，

ータは気象庁ホームページに基づく），春期およ

カイウサギでも種判定できることを確認していび夏期の成功率の低さは，11 月よりも高い気温

る（松木ら 2008）。さらに，海外のサンプルでの環境下で，腐敗などにより DNA の分解が早あるが，パームシベット，マングース，ベンガ

く進行してしまったためと考えられる。温暖な

ルヤマネコ，コツメカワウソ，マレーグマ，ジ

時期における糞からの個体識別には，糞のサン

ムヌラ，ブタオザルなどの糞からも種判定が可

プリングや DNA 抽出・分析等についてさらな－12－©CRIEPI

る検討が必要であるが，調査地域における個体

中立遺伝子であり，集団の遺伝的多様性の評価の数や分布をより正確に把握するためには，成にも利用できる。従来このような解析は，捕獲功率が高い DNA 分析結果に基づいて個体識別

個体を用いて行われてきたが，糞サンプルを利することが望ましく，そのためにはできるだけ用することで，効率良くかつ対象動物にストレDNA 分解が少ない寒冷な時期に調査するべきスを与えることなく解析することが可能となる。

だろう。特に，実際の生態系アセスメント調査

糞からの DNA 解析手法は，野生動物の研究やでは，限られた期間内に効率的に結果を得るこ

環境アセスメント調査，保全管理などさまざまとが求められるため，本手法を用いる場合には，な分野において，今後ますます活用されていく

対象動物の生態を考慮した上で（例えば冬眠なと考えている。

ど不活動の時期をはずすなど），可能な限り寒冷謝辞な時期に集中的に調査することが現実的であると思われる。
生態系アセスメントの注目種として選定され本研究を実施するにあたり，現地調査でご協ることの多いタヌキなどの国内に生息する中型

力いただいた九州電力株式会社川内調査所の皆哺乳類は，一般に個体数を把握することが困難

さま，ならびに西日本技術開発株式会社の阪田である。これまで種の生態や行動，生息環境を

和弘氏，金尾充浩氏をはじめ多くの方々に感謝

ふまえて様々な個体数推定法が開発されてきたいたします。また，調査の立案から結果の取りが，推定の精度や信頼性，頑健性などには長短まとめにいたるまでご協力いただきました九州があり，時代とともに進展する新しい技術や知電力株式会社環境部の皆さまに厚く御礼申し上見を導入した個体数推定法の開発が強く求めらげます。

れている（三浦・岡 2004）。本研究では，糞 DNA

試料の収集にご協力いただいた株式会社セレを利用して排泄個体を識別し，複数の糞の解析

スの矢竹一穂氏，秋田毅氏，古川淳氏に深謝の結果から個体数の推定を行った（表 3）。これま意を表するとともに，DNA 解析に多大なご協力

での糞や足跡，断片的な確認情報の数や量などをいただいた小島恭子氏ならびに石山知波氏に調査地の利用頻度に基づく個体数推定法と比べ，感謝いたします。

糞 DNA を利用した手法は調査地を利用した個

参考文献

体を特定していることから個体数推定の信頼性は高い。また，DNA 解析に用いた糞の分布から，各個体のおおまかな行動範囲も推測することが阿部聖哉，松木吏弓，竹内 亨，梨本 真，平田

可能であった（図 5）。調査範囲内で地形の改変

智隆，上野智利，田崎耕一 (2009) 中型哺乳や構造物の設置などの開発がある場合，本手法

類を典型性注目種とした生態系アセスメン

を用いれば，実際に直接開発の影響を受ける個

ト手法の開発 ―タヌキ・アナグマの餌資源

体の数や行動範囲との関連性を把握することも分布の評価―. 電力中央研究所研究報告可能であり，開発の影響を評価する上で非常にV08044
Aasen E., Medrano J.F. (1990)

有効な手法として期待できる。

Amplification of

糞からの DNA 解析では，さらに性別や血縁

the ZFY and ZFX genes for sex identification in

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