平成31年（2019年）2月15日

定年退職記念講演

カルシウム結合蛋白質の構造と機能を探る

私の教育・研究者人生を振り返って名古屋大学大学院生命農学研究科
応用生命科学専攻
牧 正敏

平成31年（2019年）2月15日

定年退職記念講演

カルシウム結合蛋白質の構造と機能を探る

私の教育・研究者人生を振り返って
1970
1972.4

1980

1990

2000

2010

京大農・院農1983.4（米国）Vanderbilt 大・医1985.10助手

助教授

京大ウイルス研究所

1994.12

教授

名大農・院生命農

2020

成人T細胞白血病ウイルス（HTLV-I） による発がん機構（畑中正一教授研究室）

胞株
染
細非感

感
染

細胞

株

HTLV-I 感染T細胞

HTLV-I感染T細胞株で発現が亢進している遺伝子

calpain:カルシウム依存性プロテアーゼ、基質を限定分解： 例、 PKC

calpastatin:
calpainの内因性阻害蛋白質

安達博士

がん化

Y.Adachi et al.(1992) Phosphorylation of theRex Protein of Human T-cell Leukemia Virus
Type Ⅰ The Journal of Biological Chemistryvol.267 No,30 25PP

畑中教授

カルパスタチンの構造とカルパイン阻害機構の解明
３部位結合モデルの提唱
カルシウム結合ドメイン

プロテアーゼドメイン
I
II～1994年

IIIIVcalpain

80 K
30 KVcalpastatin

VIA B C A B C A B C A B C~ 80K

生化学的解析
cDNA クローニング
各種変異組換体発現
合成ペプチド酵素阻害解析
阻害中心決定
結合解析

L

1

2

34

幸運の女神との出会い： 新しいカルシウム結合蛋白質構造の発見
Crystal structure of calcium bound domain VI ofcalpain at 1.9 Å resolution and its role in enzyme
assembly, regulation, and inhibitor binding.
Lin GD, Chattopadhyay D, Maki M, Wang KK,Carson M, Jin L, Yuen PW, Takano E, Hatanaka M,
DeLucas LJ, Narayana SV.
Nat Struct Biol.
1997 Jul;4(7):539-547.

Nature structural biology 1997 表紙（著作権上の理由により削除されました）
Structure of a calpain Ca2+-binding domain reveals
a novel EF-hand and Ca2+-induced conformationalchanges.
Blanchard H, Grochulski P, Li Y, Arthur JS, Davies
PL, Elce JS, Cygler M.
Nat Struct Biol. 1997 Jul;4(7):532-548.

予想に反して５つのEF-hand

EF1
ahEF1

EF2

EF3

EF4

EF2

EF3

EF4

EF5

EF-hand: Helix-loophelix Ca2+-binding motif
Helix E
Helix F12 345 678Yanyi Chen et al. （2010） Calciomics: prediction and analysis
of EF-hand calcium binding proteins by protein engineering

calmodulincalpain small subunit domain VIA

PDB code: 1cllより本人作成

PDB code: 1alvより本人作成

B
EF5: a dimerization module
Narayana SV作成

見落とされていたEF1： １残基欠損とアミノ酸置換
EF1

EF1

EF2

EF3

EF2

EF3

EF4

EF4
EF5

カルシウム結合ドメイン

calpain 30 K
µ 80 K

sorcingrancalcincalmodulin

QFRRLFAQLAGD-DMEVSATELMNILNKVNFKALFRQLAGE-DMEISVKELRTILNRI
PLYGYFAAVAGQ-DGQIDADELQRCLTQS
SVYTYFSAVAGQ-DGEVDAEELQRCLTQS
EFKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLxyz-y-x-z

Ca2+-binding loop

EF1

新メンバー登場
このドメインに名前をつけよう！
EF1

EF2

EF3

EF4

EF5

カルシウム結合ドメイン

calpain 30 K
µ 80 Ksorcin
grancalcin
ALG-2

calmodulin

QFRRLFAQLAGD-DMEVSATELMNILNKVNFKALFRQLAGE-DMEISVKELRTILNRI
PLYGYFAAVAGQ-DGQIDADELQRCLTQS
SVYTYFSAVAGQ-DGEVDAEELQRCLTQSFLWNVFQRVDKDRSGVISDTELQQALSNGEFKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLxyz-y -x-z

Ca2+-binding loop
Interfering with apoptosis: Ca2+-binding protein ALG-2 and Alzheimer‘s disease gene ALG-3.
Vito P, Lacanà E, D’Adamio L. (1996) Science （米国NIHのグループ）

A growing family of the Ca2+-binding proteins with five EFhand motifs.
Maki M, Narayana SV, Hitomi K.

Biochem J. 1997 Dec 1; 328 (Pt 2):718-720.

penta-EF-hand (PEF)

Maki M et al.（1992）. The Journal of Biochemistry 124:1170-7 Oxford
university Press

Kitaura Y et al.（2001）.JBC 276:14053-8. The American Society for
Biochemistry and Molecular Biology, Incカルパインファミリー と PEF ファミリーは一部重複Calpain family

Penta-EF-hand (PEF) family
EF5が一対となり2量体形成

CAPN567101516
非典型的カルパイン(atypical calpains)1238911121314EF5CAPNS1CAPNS2
grancalcinsorcinpeflin
ALG-2268 aa
248 aa
217 aa198 aa284 aa
191 aaS.Hiroyuki （2011） The Journal of Biochemistry 153-1 23-27pp
Oxford University（医学研, 故・反町洋之博士より、2018年1月没）

アポトーシス関連因子ALG-2の相互作用因子探索
酵母Two-Hybrid法

考える事は皆同じだった！
AIP1 = ALIX ： PDCD6IP（ALG-2の遺伝子記号：PDCD6）

ALG-2 interacting protein 1 (AIP1). (1999) JBC
Vito P, Pellegrini L, Guiet C, D'Adamio L.
ALG-2を発見したグループ （米国 NIH)
ALG-2 interacting protein X (Alix). (1999) Cell Death Differ
Missotten M, Nichols A, Rieger K, Sadoul R.
神経細胞死に興味のあるグループ

技術力不足で出遅れ
l 酵母Two-Hybrid法
l ALG-2 結合モチーフ検索
l biotin-ALG-2 Far-Westernl Co-IP & LC-MS/MS

初志貫徹！
徹底して新規相互作用因子探索へ
2000年7月（柴田秀樹助手着任，現，准教授）
2013年4月（高原照直助教着任，現，講師）

ALG-2相互作用因子
Annexin XI Satoh et al. (2002) BBRC
Annexin VII Satoh et al. (2002) BBA
TSG101
Katoh et al. (2005) Biochem JHD-PTP
Ichioka et al. (2007) ABB
Sec31A
Shibata et al. (2007) BBRCPLSCR3
Shibata et al. (2008) JBC
PATL1
Osugi et al. (2012) J Biochem
VPS37B/C
Okumura et al. (2013) BBB
IST1
Okumura et al. (2013) BBB
CHERP
Sasaki-Osugi et al. (2013) JBC
TFG
Kanadome et al. (2017) FEBS JMISSL & MAP1B Takahara et al. (2017) JBC

ALIX相互作用因子
CHMP4b, 4a Katoh et al. (2003) JBC
CHMP4c Katoh et al. (2004) ABB

ALG-2相互作用因子

赤字 ESCRT システム

Annexin XI Satoh et al. (2002) BBRC
Annexin VII Satoh et al. (2002) BBA
TSG101
Katoh et al. (2005) Biochem J
HD-PTP
Ichioka et al. (2007) ABB
Sec31A
Shibata et al. (2007) BBRCPLSCR3
Shibata et al. (2008) JBC
PATL1Osugi et al. (2012) J Biochem
VPS37B/C
Okumura et al. (2013) BBB
IST1
Okumura et al. (2013) BBB
CHERP
Sasaki-Osugi et al. (2013) JBC
TFG
Kanadome et al. (2017) FEBS JMISSL & MAP1B Takahara et al. (2017) JBC

青字 ER-Golgi 間小胞輸送調節

ALIX相互作用因子
CHMP4b, 4a Katoh et al. (2003) JBC
CHMP4c Katoh et al. (2004) ABB

新たな展開：強力なライバルたちの出現
CHMP4A, 4B, 4C, TSG101, HIV-1 p6, EIAV p9
von Schwedler et al. & Sundquist (2003) CellStrack et al. (2003) Cell
Martin-Serrano et al. (2003) PNAS

紫字 RNAプロセシング

レトロウイルス粒子
HIV-1
細胞膜
ESCRT因子群
M.Maki（2016） IJMS 17-9 Multifaceted Roles of ALG-2 in Ca2+-Regulated
Membrane Trafficking MDPI AG（エンドソーム選別輸送複合体）

高等動物細胞における ESCRT システム
A

ウイルス出芽リガンド

EGF

下方制御（down-regulation)

エクトソームシェディングエクソソーム受容体
初期エンドソーム

核膜再形成と再シール
細胞質分裂

Endosomal
Sorting
Complex
Required forTransport

多胞体形成
リソソーム
Ca2+Ca2+ 傷害膜修復

ミッドボディ
核リソソーム
神経突起除去B

VPS4ESCRT-III

細胞外スペース

ESCRT作用場所

ALIXCa2+ALG-2

ALG-2による
ALIX / ESCRT-I
複合体の安定化（オルガネラ内腔）
切断~mM

Ca2+出芽III III ALIX
0 I II
細胞質（サイトソル） ESCRT VPS4

M.Maki（2016） IJMS 17-9 Multifaceted Roles of ALG-2 in Ca2+-Regulated Membrane
Trafficking MDPI AG

2+依存性アダプター」 仮説の提唱
ALG-2の作用メカニズム「Ca2+Ca /ALG-2 stabilizes a weakly interacting complex

１） 複合体の安定化
ALG-2
ALIX / ESCRT-I(TSG101, VPS37B/C)+Ca2+不安定安定2） 複合体形成による共局在
ALG-2

ALG-2

Sec31A / AnxA11
MISSL / MAP1B(Ca2+)
Ca2+膜、足場３） オリゴマー化

ALG-2
TFGCa2+
M.Maki Structure（2011） and function of ALG-2, a penta-EF-hand calcium-dependent adaptor protein
Science in China Sciences 54-8 770-779pp Science China Press

ESCRT と カルパイン

予想もしなかった巡り合わせ！
HeLa cells

典型的カルパイン
CHN

PC1PC280 kDa

PEF
CBSW

anti-calpain 7

CHMP1B-mGFP

merge

30 kDa
ALG-2（ESCRT-0)

ESCRTシステム

20 µm

Ca2+
CHMP4A/4B/4C(ESCRT-III)
CHMP1A/1B/2A etc.
(MIM)

TSG101VPS37B/C(ESCRT-I)

ALIX

CHMP
コアドメイン

C. Yorikawa（2008）Human Calpain 7/PalBH Associates with a Subset of ESCRT-III-related Proteins in its N-terminal
Region and Partly Localizes to Endocytic Membrane Compartments
The Journal of Biochemistry 143-6 731-745pp Oxford University

CHMP1BmGFPCAPN7C290S

MPMIM

anti-IST1

anti-EGFR

merge

IST1
MIM

calpain-7(CAPN7)

PC1

MIT C

非典型的カルパイン

PC2

CBSW

EGF (-)CBSW

HN

EGF (+)

10 min after EGF addition
Y.Maemoto（2014）Involvement of calpain-7 in epidermal growth factor receptor degradation via theendosomal sorting pathway
FEBS Journal 281−16 FEBS PRESScalpain-7 はEGF受容体の下方制御に作用
Capn7 ノックアウトマウス由来ＭＥＦ細胞(kDa)

0 10 20 30 60: MEF cells

Capn7-/-

Capn7+/+
0 10 20 30 60

calpain-7
0 10 20 30 60

calpain-7C290S : expression
0 10 20 30 60: min

WB: anti-170-

EGFR

97-calpain-7

GAPDH
私MEF: マウス胚性線維芽細胞
Y.Maemoto（2014）Involvement of calpain-7 in epidermal growth factor receptor degradation via theendosomal sorting pathway
FEBS Journal 281−16 FEBS PRESS（医学研 反町博士らとの共同研究）

典型的カルパインの誕生【仮説】
PEFドメインの獲得
ESCRT系からCa2+による制御系へと機能の多様化
MITPC1

CPC2

CBSW

CBSW

ESCRT系による制御

HN

CBSW

CHN

PC1

PC2PEF
CBSW

Ca2+による制御

教育者としての貴重な体験
l 学部教育•講義/定期試験 ー 監督・採点・成績•

学生実験実習指導

l 大学院教育•講義

l G30学部講義（英語）•Cell Biology IVl 各種教育プログラム•高校生指導（SSHなど）、出前講義（高校、河合塾）•インターンシップ

国際教育セミナー＆研修報告会（英語による発表）
2006年

2008年

The 2006 Nagoya Workshop on UK – Japan Animal
Biotechnology Partnership and Internship
March 6-7, 2006
Sakae Mulberry Hotel, Nagoya, Japan
March 6 (Monday)
March 7 (Tuesday)

Part I:

6 pm – 8 pm
9 am – 6 pm

Reception
Lectures, Reports and Discussion

Animal biotechnology from the basics to application

Ronald G. Bardsley (School of Biosciences University of Nottingham)
A biotechnological approach to muscle growth and meat quality
in livestock at Nottingham
Jiro Takano (RIKEN, Japan)
Gene manipulation of calpain-calpastatin system in mouse
Charles W. Archer (Cardiff University, UK)
Connective Tissue Stem Cells - potential in Orthopaedic Repair
Yasuo Kitagawa (Nagoya University)
Human adipose-derived stem cells
Nicholas J. Lench (Wales Gene Park / Cardiff University, UK)
The Wales Gene Park – Development and characterisation of mouse models ofhuman disease; a route to effective translational research
Vladimir L. Buchman, (Cardiff University, UK)
Studies of molecular mechanisms of synucleinopathies using transgenic
mouse models
Shin-Ichiro Takahashi (University of Tokyo)
The novel mechanisms for the modulation of insulin/IGF signals
Tetsuya Okajima (Nagoya University)
Control of Notch receptor function and structure by glycosyltransferases

Part II: Student reports on training in UK and free discussion
Masatoshi Maki (Nagoya University)
Internship programs for PhD course students
Chiharu Yorikawa (Nagoya University)
Hannah Research Institute (Ayr, UK)
Masayasu Imaizumi (Nagoya University)
Hannah Interactions, Ltd (Ayr, UK)
Fumitaka Ichioka (Nagoya University)
Wales Gene Park / Cardiff University (Cardiff, UK)
UK guests and internship project members
Internship programs in UK and future directions
18:00-20:00

Supported by MEXT internshipproject and Nagoya University

Free discussion & Banquet

2007年

2009年

2010年

文科省提出資料

動物バイオテクノロジー分野における大学院生の国際的キャリア開発
産学連携による実践型人材育成事業 （派遣型高度人材育成協同プラン）

総計２７名、３３回、英米仏独、１３企業・研究所等

長期インターンシップ

平成17年度-21年度

海外派遣学生一覧

総計 27名、33回、４ヶ国、13企業・研究所

氏名
所属
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
2122232425
2627

派遣時学年 派遣年度

中谷
名古屋大学
肇
D2
寄川千晴
名古屋大学 D 1
市岡史高
名古屋大学 M 2, D 1, D 2
今泉正恭名古屋大学 B 4村上耕介
名古屋大学 D 1, D 2
岡嶋裕志
東京大学
D2
堀井美緒
名古屋大学 D 1
松島名古屋大学
梓
M 1, M 2海老原瑞貴
名古屋大学 M 1, M 2
山中東京大学大介
D1
平野可奈
名古屋大学 M 1
矢野皓一
名古屋大学 B 4杉村禎昭
名古屋大学 D 2
長谷川東京大学高士 D 2
野坂名古屋大学
実鈴
M2
大迫洋平
名古屋大学 M 1, M 2
北村三矢子
名古屋大学 M 2眞海喬生
名古屋大学 M 1
長尾伸人
名古屋大学 M 1
鈴木博紀
名古屋大学 D 2
犬塚達俊
名古屋大学 M 2奥村真弓
名古屋大学 M 2
大杉桂奈江
名古屋大学 M 1
白井伸太郎
名古屋大学 M 1
山根亜沙佳
名古屋大学 M 1
本多弘樹
名古屋大学 M 2
秦三重大学
健敏
M2

派遣先

H 17
H annah Research Institute (U K)
H 17
H annah Research Institute (U K)
H 17, 18, 19 W ales G ene Park / C ardiff U niv. (U K)
H 17
H annah InterActions Ltd (U K)
H 17, 18
H annah Research Institute (U K)
H 17
H annah Research Institute (U K)
H 18
W ales G ene Park / C ardiff U niv. (U K)
H 18, H 19
W ales G ene Park / C ardiff U niv. (U K)
H 18, H 19
Abcam (U K)
H 18
Strathclyde Institute PB S (U K)
H 18
AvantiC ell Science Ltd (U K)
H 18
ReN euron (U K)
H 19
X-Link (U K)
H 19Strathclyde Institute PB S (U K)
H 19
Abcam (U K)
H 19, H 20
Senju Pharm aceuticals / O H SU (U SA)
H 20
C ovalAb (France)
H 20
X-Link (U K)
H 20
B RAIN AG (G erm any)
H 20
U VH C I/EM B L-G renoble (France)
H 21
M yriad Pharm aceuticals/ U niv U tah (U SA)
H 21
M yriad Pharm aceuticals/ U niv U tah (U SA)
H 21
B anyan B iom arkers Inc (U SA)
H 21
B anyan B iom arkers Inc (U SA)
H 21
C ovalAb (France)
H 21
AvantiC ell Science Ltd (U K)
H 21
AvantiC ell Science Ltd (U K)

H annah R esearch Institute 、H annah InterA ctions Ltd、A vantiC ell S cience Ltd は同一系列
色付き：異なる学生を複数年度派遣

H 23年4月予定
卒業年度 就職・進路
H 18 D C 公的研究機関
H 19 D C 民間企業
H 20 D C 民間企業
H 19 M C 民間企業
H 19 D C 公的研究機関
H 18 D C 民間企業
H 19*D C 地方公務員
H 19 ＭC 民間企業
H 19 ＭC 民間企業
H 20 D C ポスドク
H 22 D C 大学教員
H 20 M C 民間企業
H 20 D C 民間企業
H 20 D C 民間企業
H 22 D C ポスドク
D C 在学中
H 20 M C 民間企業
H 21 M C 民間企業
H 21 M C 民間企業
H 21 D C 公的研究機関
D C 在学中
D C 在学中
D C 進学H 22 M CH 22 M C
H 21 M C
H 21 M C
* 中退

民間企業
民間企業
民間企業
民間企業

H 23年4月予定
派遣企業・機関数と研修期間（単年度ごとの集計）

年度

派遣先数

平成17年度
平成18年度
平成19年度
平成20年度
平成21年度2555
4

研修期間（学生数）
60日未満

60日－90日

42
4003
63
5
7

60日未満の学生のうち、5名は年度を改め再派遣

インターンシップ経験者の就職・進路先（2011年4月予定を含む）

就職・進路先民間企業
大学
公的研究機関
公務員
ポスドク
進学（DC在学中）
計MC
修了者
11000―
11DC
修了者*
513
1
2
416
*中退含む

ＤＣ１６名の内訳
ＭＣで研修後ＤＣへ進学した者
ＤＣで初めて研修したもの

7名
9名

研究者としてささやかな喜び －１l 提唱した仮説の正しいことが後になって証明されたとき
Ø 自分で証明できれば最高Ø 他のグループが証明したときは悔しいが、それでも嬉しい
３部位結合モデル

正しい結果でホッとした！

calpastatin
A region

IVVI
calpastatin
C region
IIaIIb

Ma H et al. (1993) J Biochem
Yang HQ et al. (1994) JBC
Ma H et al. (1994) JBC
Takano E et al. (1995) FEBS Lettcalpastatin
B region

PDB ID: 3BOW

Hanna et al. (2008) Nature
Moldoveanu et al. (2008) Nature

研究者としてささやかな喜び －２l 命名した名前が普及したとき
Ø 命名成功例

Google Scholar検索 出現回数

• Penta-EF-hand: 1060回 ドメイン名（PEF)• Peflin: 280回 （遺伝子記号： PEF1)• Brox: 18,700回?? （遺伝子記号： BROX)（Alix と一部類似）

半分失敗！ 人名！

Brox さん、 ごめんなさい！

Alix も人名！

研究者としてささやかな喜び －２
l 命名した名前が普及したとき
Ø 命名失敗例

Shax1, Shax2： Editorに名称変更要求されてCHMP4b, CHMP4a に改名
Katoh et al. (2003) JBC
CHMP4 “Chromatin modifying protein”
既に登録されていた（CHMP4 は Shax2 に相当）
同時期に Cell に論文発表したグループが CHMP4A, CHMP4B を使用していたことが後で判明； 混乱発生： CHMP4b = CHMP4A; CHMP4a = CHMP4B

現在：CHMP4b = CHMP4B; CHMP4a = CHMP4A が通用(DDBJ/GenBank/EMBLに Shax1/Shax2 として登録していた配列が UniProtデータベース に採用）

UniProt
https://www.uniprot.org/2019/8/28

分子細胞制御学研究室 あれこれ（旧細胞シグナル研究室含む）

学位取得者人数1995年度～2018年度 （含見込）

学士
修士
博士

スタッフ

111
92 (7)
21 (5)

2000年7月
教授 牧 正敏

教授 牧 正敏

助教授 人見清隆

准教授 柴田秀樹

助手 柴田秀樹

講師 高原照直

事務補佐 小島広子

事務補佐 吉川恵里(括弧内，他研究室出身者）

学術振興会特別研究員
DC1
DC2

10
5

留学生

5G30（学部） 1

2019年2月

引越３回： 主な実験室
A676 → B427 → A161 → A501

私の人生訓l 失敗してもめげるな！
失敗した分だけ経験豊かになったと思えばよい！
l ネガティブ思考はやめて、ポジティブ思考をしよう！
l ボスの言うことは鵜呑みにしてはいけない！
l 昔はよくても、今は通用しないこともある！

二宮金次郎

https://jpnculture.net/ninomiya-kinjirou/ 2019/3/15

やめよう、歩きスマホ！
http://sozai.kingyomon.com/jinbutu/742/ 2019/3/15

ご清聴有難うございました。
そして、⻑い間、本当にお世話になりました。