ペプチドビーズを用いた反応速度論による迅速・詳細なアレルギー感作試験法の開発
甲南大学フロンティアサイエンス学部

臼井健二

The direct peptide reactivity assay (DPRA) detects binding of test chemical samples to lysine or cysteine of the testpeptides as a prominent alternative to animal testing for sensitization. However, DPRA cannot measure binding of poorly
water-soluble samples to the test peptides, and the HPLC step in DPRA is time-consuming and technical in comparison withother general measurements. Recently, we had constructed the chromophore solid phase peptide reaction assay (C-SPRA) as
an alternative skin sensitization assay system to solve these problems. In this study, we further improved C-SPRA system fordetecting various and numerous samples in a short period of time (a few hours).
At first, we selected a microbead for immobilization of the test peptides, PEGA (Poly[acryloyl-bis(aminopropyl)
polyethylene glycol]) resin was selected as much more suitable for the quick reaction. Then we optimized the protocol.
Especially, the preparation of the peptide-microbeads before the assay was simplified. Using PEGA resin we found that in thepreparation we could skip the swelling step every time. These studies effectively modified the conventional C-SPRA. Our
method allows a next-generation high-throughput alternative measurement to animal testing for in vitro skin sensitization
rapid assessment with easy handling in a few hours.

１．緒ーズ上に固定する。本ビーズは、有機溶媒中・水中どちら言にもなじみ、膨潤するものを使用する。特に難水溶性試験

化粧品およびその関連物質によるアレルギー発症や、悪物質を有機溶媒中に溶かしこみ、そこに本ビーズを投与す

化リスクの防止は、コスメトロジー、化粧品開発においてれば、ビーズに固定したペプチドが試験物質と容易に接触重大な課題となる。開発段階における感作試験においては、できるようになる。これにより感作性試験が可能となり、実際にヒトへのテストは現実的ではなく、動物実験に頼ら試験終了後は、ビーズをとどめることができるフィルターざるを得ないのが現状である。しかしながら、近年、倫理付きカラムを用いることで、試験溶液を洗い流すことがで的観点、コストの問題などから動物実験や臨床試験に頼らきる。さらに NH 2 基・SH 基指示薬を組み合わせることで、ない、代替法が求められている。皮膚感作性試験代替法の分光法で検出可能な極めて簡便な試験法である。しかしな

1）

一つである、Direct Peptide Reactivity Assay（DPRA）

がら、依然として測定に時間がかかること、また感作性のは有効な手法であると考えられている。DPRA は生体内有無の定性的結果のみを採用しているため詳細解析が行えの感作反応を模倣し、ペプチドと被験物質とを反応させたないことなどが欠点として挙げられる。そこで、本研究で後に HPLC を用いて未反応ペプチドを測定し、その減少率は 24 時間反応ではなく、1 時間程度の短い反応時間で指から感作性を予測する試験法である。DPRA は現状の代示薬の結合度合いを算出し、反応速度論的解析を試みるこ替法の中でも有効な手法ではあるが、油性物質などの難水とにより、従来法よりも迅速かつ詳細な解析が可能な手法

溶性物質を評価できない、操作が煩雑、効率性が悪いなどへと改良することを目的とした。の問題点も多い。我々はこれまで、分析化学とペプチド工

２．方学を融合させた新手法（C-SPRA）2 , 3）の構築を行ってきた（図 1）。C-SPRA は DPRA を基礎としているものの、従来法①ビーズ・指示薬の選択からの最大の懸念であった、非水溶性・疎水性の物質、界これまで C-SPRA で用いていた NH 2 基指示薬であるピ面活性剤などの両親媒性物質ともに試験が可能となる、試クリン酸 4）と SH 基指示薬であるエルマン試薬 5）を用いて、験物質の守備範囲が広い方法であり、また操作も簡便な手研究を進めていくことにした。さらに、ビーズについては、法である。具体的には、DPRA で使用するペプチドを、ビこれまで使用していたポリスチレン系のビーズでは、反応

Development of the rapid chromophore
solid phase peptide reaction assay(C-SPRA) for sensitization assessment
as alternatives to animal testing
Kenji Usui
Faculty of Frontiers of Innovative Resea rch in Science a nd Technolog y(FIRST), Konan University

場がビーズ奥深くまであるため、試験物質や指示薬が、到達しなかったり、吸着したりといった懸念もあるので、そのような心配のないビーズ（アクリルアミド系のビーズ：PEGA ビーズ）を検討した。

②操作法の確立− 90 −

実際に１時間以内といった短時間でのテスト物質との反ペプチドビーズを用いた反応速度論による迅速・詳細なアレルギー感作試験法の開発

図1

C-SPRA 法の概要応を行った後に、指示薬の結合に有意な差が出るのかにつ可能となる結果が得られた（図２）。すなわち、感作性がいて検討を行い、反応時間の短縮化・最適化を行った。

あるといわれている BQ、FITC、MPH、ACA においては、OECD プロトコルと同じ判定方法を用いれば、K 含有ペプ③本システムの有用性の検証実験

チド（Kpep）、C 含有ペプチド（Cpep）のいずれか一方が簡便さを求めるために操作に慣れていない専門性の低い感作性あり（P）と検出されれば、判定は P となり、IPA や学部１、２年生の学生に試験を行ってもらった。また、代試験物質なしのネガコンでは、どちらのペプチドを用い表的な化粧品材料となる天然物や、よく知られる感作性物た場合でも感作性なし（N）と検出され、判定は N となり、質数十種類を用い、実際の感作性試験を行い、その有用性従来法と同様の判定結果となった。
残念ながら当初の予定であった反応速度を求めて詳細解の検証を行った。

析を行う計画は、PEGA においても樹脂内部への試験物質３．結果と考察などの拡散速度や、固定化ペプチドの溶液中のような拡散①についてがみられないことを考慮に入れて解析しなければならず、

まず、ビーズの検討においては PEGA ビーズを用いた簡便・迅速計測には向かないことが分かった。そこで、よ検討を行った。ペプチド合成においては、従来から用いてり簡便さや迅速さを追求した改良や検証、弱い感作性物いる Lysine（Lys, K）含有ペプチドと Cysteine（Cys, C）含質の簡便検出についての確立を行った。その結果、まず操有ペプチドを、β アラニンを介してビーズと結合させた配作方法などの最適化を行った結果、本試験は学部１、２年列を、これまでに確立した最適化された Fmoc 固相合成法

生が行っても、良好な結果が得られることがわかり、汎用により高純度のペプチド固定化ビーズを得ることに成功し性が高いことが分かった。さらに、弱い感作性物質の検出た。またこのビーズは、常に膨潤状態で取り扱うため、試においては、通常のプロトコルよりも、濃度を濃くした条験前に膨潤させる必要がないため、準備操作が簡便となる

件で、ネガコンと比べて有意な減少率が得られたことから、ことがわかった。

弱い感作性を検出・判定する手法が確立できた。

４．総②と③について

括

反応時間においては 24 時間反応が従来のポリスチレン以上のように、従来使用していたビーズの材質を変更すとほぼ同じ結果となることを確認したのちに、反応時間をることにより、本研究では当初の計画の 1 時間程度よりも徐々に減らしていき、最終的に、30 分反応、10 分反応でさらに短い、10 分という反応時間で指示薬の結合度合いの感作性有無の判定までもが、数種類の試験物質においてを算出してアレルギー感作性の判定が可能な手法へと改− 91 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 32, 2024

図２ PEGA ビーズに固定化した Kpep、Cpep を用いた 30 分反応、10 分反応のアレルギー感作試験

H. Ikeda, H. Mekata, M. Takaishi, K. Yamashita, K.

良することに成功した。現在、これまでの結果をまとめた
6）

Usui, Development of a Chromophore-Solid Phase

ものを論文投稿中であり、近日中の発行を目指す 。また
7）

C-SPRA に関する解説記事も発行された 。本法が開発でPeptide Reaction Assay（C-SPRA）for Assessing Skin

きれば、誰でも簡単に動物実験も使わずに感作性試験を行

Sensitization In Vitro, Analyst, 145, 3211-3216（2020）

うことができ、化粧品をはじめとする有用物質の探索・開3） H. Miyazaki, H. Takaishi, H. Ikeda, H. Ariumi, Y.

発に大いに貢献できると考えられる。これにより、日本のHamada, K. Yamashita, K. Usui, Synthesis of Peptide-

コスメトロジー、化粧品業界のみならず、世界においてもImmobilized Magnetic Beads, and Peptide Reactivity

本法は、スタンダードとなる有力な手法となることが期待

Assay for Assessing Skin Sensitization Utilizing

できる。

Chromophore, Processes, 8, 1257（2020）4） B.F. Gisin, The Monitoring of Reactions in Solid-謝辞

Phase Peptide Synthesis with Picric Acid, Anal. Chim.
Acta., 58, 248‒249（1972）

本研究の遂行にご協力いただきました共同研究者の皆様、
特に浜田芳男博士，栢森史浩博士（甲南大学）、有海秀人

5） G. L. Ellman, Tissue Sulfhydryl Groups, Arch.
Biochem. Biophys., 82, 70-77（1959）

博士（山口東京理科大学）、そして甲南大学・山口東京理

6） K. Usui, H. Miyazaki, M. Fukuda, A. Nishimura,科大学にて携われた学生の皆様に感謝申し上げます。
最後に本研究の遂行にあたり、多大なるご支援をいただ

M. Maeda, S. Yamaguchi, H. Ikeda, Y. Hamada, K.

きました公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に

Yamashita, F. Kayamori, H. Ariumi, Fast and User-

心より感謝申し上げます。

Friendly Chromophore-Solid Phase Peptide ReactionAssay（FC-SPRA）for Assessing Skin Sensitization,（引用文献）

Submitted.

1） OECD Test Guideline 4 4 2C, In Chemico Skin

7） 臼井健二 , 宮﨑 洋 , 山下 邦彦 , 栢森 史浩 , 有海秀人 ,Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay（DPRA）

様々な分野に適用可能な皮膚感作性試験法の開発 , アレ（2015）.

ルギーの臨床 , 2023 年 11 月号 , 75-79（2023）

2） H. Miyazaki, Y. Hamada, H. Takaishi, Y. Minamino,− 92 −