静電気学会誌，40, 1（2016）20-25

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

DNA結合に伴う誘電体微粒子の誘電泳動特性変化の測定
中野 道彦 ，笠原 弘道 ，丁 震昊 ，末廣 純也
＊, 1

＊

＊

＊

（2015年9月24日受付；2015年12月17日受理）

Study of Dielectrophoretic Property of DNA-labeled Dielectric Microbeads
for DNA Detection
＊, 1

＊

＊

＊

Michihiko NAKANO , Hiromichi KASAHARA , Zhenhao DING and Junya SUEHIRO（Received September 24, 2015; Accepted December 17, 2015)
New DNA detection method using dielectrophoresis（ DEP ）of dielectric microbeads was proposed. The method is based on
dynamic change of microbeads DEP by attaching DNA. Dielectric microbeads having natively negative DEP property become
behaving positive DEP when they are labeled with DNA. The DNA-labeled microbeads can be collected on a microelectrodeby positive DEP. DEP collection of the DNA-labeled microbeads causes the impedance change of the microelectrode. Bymeasuring the impedance change, DNA-labeled microbeads are detected. The aim of this study is to investigate influence of
DNA on the dielectrophoretic property of the dielectric microbeads. The crossover frequency of DEP and zeta potential of the
microbeads were investigated. Three kinds of DNA and two kinds of microbeads were used. From the results, it was suggested
that not only the conductance of DNA but also permittivity of DNA could affect DEP of the microbeads. Moreover, it isdemonstrated that quantitative detection of DNA.

1．はじめにスが変化するので，これをリアルタイムで計測し，DNA

PCR（ polymerase chain reaction ）は，DNA を特異的か

結合微粒子を検出する．ここでは，誘電体微粒子の誘電つ指数関数的に増幅する技術で，分子生物学ではなくて泳動特性がその表面コンダクタンスに依存して変化するはならない．そして，その特徴から，感染性の細菌やウという性質を利用している．即ち，負電荷を有する DNA

イルスの高感度検出法としても利用されている．

が微粒子に結合することで，誘電泳動特性が負の誘電泳

ウイルス検出において PCR は，対象であるウイルス

動（反発）から正の誘電泳動（捕集）に変化する．これの核酸（ DNA や RNA ）から特異的に DNA を増幅する．

により，DNA が結合した微粒子のみを選択的に検出する．

そして，この増幅された DNA を何らかの方法で検出す

本研究では，DNA 結合に伴う微粒子の誘電泳動特性

る．一般的には，ゲル電気泳動が用いられるが，煩雑での変化に関して，その詳細を調べた．

長時間の工程が必要である．また，PCR の増幅反応を
リアルタイムでモニタリングするリアルタイム PCR 法

2．検出原理では，PCR 後の DNA 検出が不要である．しかし，その2.1 誘電泳動ために必要な装置は非常に高額である．そこで，増幅

誘電泳動力は不平等電界中に置かれた誘電体粒子に働DNA を簡便・迅速・安価に検出するために，新しいく力である．水溶液中の球形誘電体粒子に働く誘電泳動

DNA 検出法を考案した ．

力は次式で表される ．

1）

2）

その方法は，まず増幅 DNA を誘電体微粒子に結合し，



その DNA 結合微粒子を誘電泳動によって微細電極に捕集する．微粒子の捕集に伴って微細電極のインピーダン（1）

ここで，r，ε m，E はそれぞれ粒子半径，溶媒の誘電率，
印 加 電 界 強 度 で あ る．Re［K（ω ）］は Clausius-Mossotti

キーワード：誘電泳動，DNA 検出，核酸増幅検査，微粒子誘電泳動＊九州大学システム情報科学研究院（〒819-0395 福岡県福岡市西区元岡 744）
Department of Electrical and Electronic Engineering,
Kyushu University, 744 Motooka, Nishi-ku, Fukuoka, 8190395, Japan1nakano@ees.kyushu-u.ac.jp（ CM ）factor と呼ばれる誘電泳動特性を表す係数で，で表される．ここで， ，（2）はそれぞれ粒子と溶媒の複素誘電率である．CM factor が正であれば，粒子は電界の強い方向に移動し，負であれば電界の弱い方向に移動する．前者を正の誘電泳動，後者を負の誘電泳動と呼DNA結合に伴う誘電体微粒子の誘電泳動特性変化の測定（中野 道彦ら）

21

び誘電率によって変化する．式（4）および（5）より，微粒

ぶ．複素誘電率は，（3）子の導電率は微粒子の表面電荷密度に比例する．微粒子
上の DNA 量の変化に対するゼータ電位とクロスオーバで表される．ここで，ε ，σ ，ω はそれぞれ誘電率，導電ー周波数の変化を比較することで，DNA の電荷および率，印加電界の角周波数である．

その誘電率の微粒子の電気特性への影響を検討する．

微小粒子の導電率 σ p は次式で与えられることが知ら

2.3 DNA結合に伴う微粒子の誘電泳動変化を利用したDNA検出法れている ．
3）

（4）

PCR 増幅 DNA を迅速に検出するために，微粒子の誘電泳動を利用する方法を考案した．これは，微粒子の誘ここで，σ pbulk は粒子材料の導電率で，KStern と KDiff は粒子電泳動がその表面コンダクタンスに依存して変化すると表面の Stern 層内および拡散層内のコンダクタンスであいう性質を利用する．Fig. 1 に誘電体微粒子の Re
［K
（ω ）
］

る．式
（4）の 2 項および 3 項は粒子の半径の逆数に依存の粒子表面コンダクタンス依存性を示す．表面コンダク

しており，粒子の大きさが小さくなると表面コンダクタ

タンスの増加に伴って，Re［K（ω ）］が負から正に変化す

ンスの影響が大きくなることを示している．KStern と KDiff

る．この性質を利用して，Fig. 2 に示す手法を考案した．

はそれぞれ次の式で表される

PCR 増幅 DNA を誘電体微粒子に結合し，その DNA 結

．

3, 4）

（5）

合微粒子を誘電泳動によって微細電極に捕集する．PCR
増幅 DNA が誘電体微粒子に結合することで微粒子の表

（6）
ここで，
式
（5）中の ρ q,Stern と μ Stern はそれぞれ Stern 層内の等価的表
面電荷密度とイオン移動度である．式（6）中の記号はそ
れぞれ，ζ ：ゼータ電位，D：拡散層内の自由電荷の拡
散係数，z：対イオン価数，F：ファラデー係数，R：ガス定数，q：素電荷量，T：温度，c：電解質濃度，η ：粘度，κ ：デバイ長，m：電気浸透によるイオンフラック-1

スの拡散層表面コンダクタンスへの寄与を表す無次元数
パラメータ，を表す．水溶液中で負電荷を有する DNA
が微粒子に結合すると，ρ q,Stern や ζ が大きく変化すると考えられる．

2.2 誘電泳動のクロスオーバー周波数
上述のように誘電泳動力の向きは Re
［K
（ω ）
］によって
決まる．球形粒子の場合，その大きさは -0.5～1 である．

図 1 誘電体粒子の表面コンダクタンスと Re
［K
（ω）
］
の関係
Fig. 1 Results of theoretical calculation of dependence of Re［K］of a dielectric particle with various diameter on the（ω ）surface conductance. The parameter values are: ε p = 2.4 ×-12
ε o F/m, ε m = 78 × ε 0 F/m, ε 0 = 8.854 × 10 F/m, σ m = 2 ×-3
5
10 S/m, and ω = 2π × 10 rad/s. Surface conductance is4）typically 1 nS for latex particles .

誘電泳動のクロスオーバー周波数とは，Re
［K
（ω ）
］= 0
となる印加電界の周波数のことで，これを測定すること
で誘電体粒子の誘電特性を見積もることができる ．ク
3）

ロスオーバー周波数は，式
（1）
～
（3）
より次式で表される．
（7）
微粒子の動きから誘電泳動力を定量的に測定することは難しいが，誘電泳動力が働かなくなる（ fx = 0）周波数を測定することは簡単である．
微粒子のゼータ電位が表面電荷密度に比例して変化する一方で，クロスオーバー周波数は微粒子の導電率およ

図 2 微粒子の誘電泳動を用いた DNA 検出法
Fig. 2 S c h e m a t i c d i a g r a m o f D N A d e t e c t i o n b a s e d o ndielectrophoresis of microbeads.

静電気学会誌 第40巻 第 1 号（2016）22

製した．PCR で使用したプライマーのひとつに 5＇ 末端がビオチンで修飾されたものを用いた．そのため，これらの DNA の片端にはビオチンが結合している．微粒子には，ストレプトアビジン修飾粒子を用いた．微粒子は直径 2.8 µm と 1 µm のものを用いた．ビオチンとストレ
プトアビジンは特異的に結合する性質があり，この性質を利用して，DNA を微粒子に結合させる．PCR 増幅後の DNA は，エタノール沈殿により精製した．DNA 濃度
図 3 微粒子の誘電泳動．
（a）
DNA 未結合，（b）
DNA 結合微粒子．
Fig. 3 Dielectrophoresis of microbeads without（ a ）and with（ b ）DNAを測定した後で，DNA 溶液と微粒子とを結合溶液（5mM Tris-HCl（ pH7.5），0.5 mM EDTA，1 M NaCl ）に懸
濁し，15 分間室温で反応させた．微粒子と DNA の個数はそれぞれマニュアル記載の微粒子濃度および測定した
DNA 濃度から計算して調製した．結合反応時の微粒子の濃度は，2.8x10 個 /µl とした．結合反応後，微粒子を5洗浄し，Milli-Q 水に懸濁した．

3.2 クロスオーバー周波数の測定
微細電極にキャッスルウォール型電極（最短ギャップ
長：5 µm ）を用いた．DNA 結合微粒子懸濁液の導電率
を NaCl で調製した．電極上に DNA 結合微粒子懸濁液を滴下した後，カバーガラスをのせた．20 VPP の正弦波
電圧を印加し，印加電圧の周波数を変化させてクロスオ
ーバー周波数を測定した．周波数は，負の誘電泳動が発
図 4 DNA 結合微粒子の検出例
Fig. 4 Typical example of DNA labeled microbeads detection.

生する高い周波数から減少させて，正の誘電泳動が発生した周波数をクロスオーバー周波数とした．

3.3 ゼータ電位の測定
面コンダクタンスが上昇し，微粒子誘電泳動が負から正

ゼータ電位測定装置 ZEECOM（マイクロテック・ニチに変化する．そして，捕集に伴う電極間のインピーダン

オン）を用いて，Milli-Q 水に懸濁した DNA 結合微粒子のス変化をリアルタイムで計測することで，DNA 結合微粒

ゼータ電位を測定した．このゼータ電位測定装置は，電気子を検出する．誘電泳動による対象物の捕集とその捕集

泳動法によるゼータ電位測定装置で，個々の微粒子の直流に伴う電極間のインピーダンス変化の計測を同時に行う

電界下での挙動を計測することで，ゼータ電位を求める．

手法を DEPIM（ dielectrophoretic impedance measurement ）3.4 DNAの定量検出という ．Fig. 3 に DNA 結合の有無によって微粒子の誘鋳型 DNA 量を変化させて PCR を行い，それぞれの増電 泳 動 が 変 化 す る 様 子 を，Fig. 4 に DEPIM に よ っ て

幅 DNA に対して微粒子を結合し，DNA 結合微粒子のDNA 結合微粒子を検出した結果の例を示す ．

DEPIM 応答がどのように変化するかを調べた．

6）5）

鋳 型 DNA（ pUC19 DNA ） 量 を 10 ～10 copy と し て
7

3

3．実験

391 bp DNA を 対 象 に PCR を 行 い， ゲ ル 濾 過 カ ラ ム

DNA 結合微粒子の誘電泳動特性を詳細に調べるため（ MicroSpin S-400 HR Columns，GE Healthcare ）を用いてに，本研究では，微粒子誘電泳動のクロスオーバー周波

精製し，余剰のプライマーを取り除いた．PCR 産物は数および DNA 結合微粒子のゼータ電位を測定した．まア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 確 認 し た．PCR 後 のた，鋳型 DNA 量を変化させて PCR を行い，増幅 DNA

DNA 濃 度 を Qubit 3.0 Fluorometer（ life technologies ） にを定量的に検出できるかどうか検討した．

より計測した．微粒子の濃度を 1.3x10 個 /µl とし，微4

3.1 DNAと微粒子の結合

粒子と 391bp DNA を結合溶液に懸濁して，15 分室温で204 bp，391 bp，796 bp の二本鎖 DNA（以下，それぞ反応させた後，Milli-Q 水に懸濁した．キャッスルウォ

れ 204 bp DNA，391 bp DNA，796 bp DNA と呼ぶ）を用

ール型電極上に懸濁液を滴下し 1 分間静置した後，2 VPP，

いた．これらは，pUC19 DNA を鋳型に PCR によって作

100 kHz の正弦波電圧を印加し DEPIM 応答を取得した．

DNA結合に伴う誘電体微粒子の誘電泳動特性変化の測定（中野 道彦ら）

23

DEPIM 応答の測定には，ロックインアンプを用いて回路

式（4），（5）および（7）から，微粒子の表面コンダクタに挿入したシャント抵抗（100 kΩ ）を介して電流を測定し，ンスおよび直径と微粒子の導電率には，それぞれ比例関

その結果からインピーダンスを計算した ．

係と反比例関係がある．DNA は一塩基あたり一個の負6）電荷を持っており，DNA 全体の電荷量はその大きさに

4．実験結果比例すると考えてよい．Fig. 7 で示された結果はこれら

4.1 クロスオーバー周波数の測定結果を反映したものであるといえる．

直径 2.8 µm の微粒子に対して，1:10 の割合で DNA
6を結合したときのクロスオーバー周波数を Fig. 5 に示
す．DNA 未結合の微粒子は，測定した周波数範囲（100kHz 以上）で負の誘電泳動を示した．DNA 結合微粒子
では，いずれの大きさの DNA を結合した場合でも，溶媒導電率 5.8x10 S/m 以上になるとクロスオーバー周波-3

数は減少した．このような溶媒導電率に伴うクロスオー
バー周波数の変化は，過去に報告された微粒子のクロス
オーバー周波数と同様である ．本研究では，DNA 長
4）が大きくなるにつれて，クロスオーバー周波数が高くなる傾向にあった．
Fig. 6 は，溶媒導電率 2x10 S/m のときのクロスオーバ-4ー周波数を DNA の大きさに対してプロットしたものである．クロスオーバー周波数と DNA の大きさは，両対数

図 5 溶媒導電率に対する DNA 結合微粒子のクロスオーバー
周波数Fig. 5 Crossover frequency of DNA-labeled microbeads plottedagainst the conductivity of the medium.

グラフ上でほぼ線形関係であった．この関係は，2x10 ～-4

1.2x10 S/m の範囲で同様であった．一方，溶媒導電率が-32.8x10 S/m 以上になると，391 bp DNA を結合した場合-3に比べて 204 bp DNA を結合した場合のクロスオーバー
周波数が大きくなった．その原因は不明であるが，溶媒導電率が高い領域はクロスオーバー周波数が急激に変化する領域であり，そのために測定誤差が大きくなったと考えている．なお，ビオチン－ストレプトアビジンの相互作用は，実験を行った NaCl 濃度範囲内ではほとんど影響を受けないため，懸濁溶液の違いによる DNA －微粒子間の結合への影響はほとんどないと考えられる ．
7）

Fig. 7 は 391 bp DNA を用いて，結合 DNA 量によるク

図 6 DNA 結合微粒子のクロスオーバー周波数の DNA 長依存性
Fig. 6 Dependence of the crossover frequency on the labeled DNA-4length. The conductivity of the medium was 2x10 S/m.

ロスオーバー周波数の変化をプロットしたものである．
微粒子直径 2.8 µm および 1 µm に対して計測した．DNA
結合量が減少するにつれてクロスオーバー周波数が小さくなった．また，粒子径 1 µm では 2.8 µm に比べてクロスオーバー周波数が大きくなった．DNA 量が少なくなるにつれて，測定値の標準偏差が大きくなった．微粒子
直径 2.8 µm では，微粒子に対する DNA の量が 10 倍の4

ときに，1 µm では 10 倍のときにクロスオーバー周波数3は観察されなかった．
以上の結果から，微粒子誘電泳動は DNA 長およびその量に依存して変化することが示された．DNA 長が長くなったり，量が多くなったりすると，DNA 結合微粒子のクロスオーバー周波数が高くなることが示された．

図 7 DNA 結合微粒子のクロスオーバー周波数と DNA 結合量との関係
Fig. 7 Influence of the microbeads size on the crossover frequency
against amount of DNA. The conductivity of the medium-4
was 2x10 S/m.

静電気学会誌 第40巻 第 1 号（2016）24

4.2 ゼータ電位の測定結果

る一方で，クロスオーバー周波数は粒子の導電率およびDNA 未結合の微粒子は 14.6 ± 10.6 mV を示した．直誘電率の両方に影響される．DNA 量の変化に対するゼ

径 2.8 µm の微粒子に対して，1:10 の割合で DNA を結合

ータ電位の変化と比べて，クロスオーバー周波数の変化したときのゼータ電位を Fig. 8 に示す．DNA が結合するが大きいのは DNA の電荷のみならず DNA の誘電率がことで，ゼータ電位は負の値になった．そして DNA 長

粒子全体の誘電率に影響を及ぼしているからではないか

に対して大きな変化を示さなかった．391 bp DNA を用と考えている．

6

いて，結合 DNA 量とゼータ電位の関係を Fig. 9 に示す．

4.3 DNAの定量検出

微粒子に対して DNA が 10 倍以上では，粒子径の影響

鋳 型 DNA 量（ pUC19 DNA ） を 10 ～10 copy と 変 化

は小さく，ゼータ電位はほぼ同じであった．DNA 量 10

4させて，319 bp DNA を対象に PCR を行った．ここでは，倍では粒径 2.8 µm の場合にゼータ電位の絶対値が小さ

本手法を細菌・ウイルス検査に応用することを想定し，くなった．10 倍では DNA 未結合の場合とほぼ同じゼー

鋳型 DNA 量を変化させて，そこから増幅された DNA

タ電位となった．

を定量的に検出できるかどうかを検討した．実際の検査

5

3

7

3

Fig. 10 は， 粒 子 径 2.8 µm の 微 粒 子 に 対 し て 391 bp

では，検出対象となる細菌やウイルスから核酸を抽出し，DNA を結合したときのクロスオーバー周波数とゼータ

それを PCR によって増幅する．鋳型 DNA 量を変化させ電位を比較したものである．クロスオーバー周波数の変ることは，対象細菌やウイルスの量を変化させることに化に比べて，ゼータ電位の変化が緩やかであった．これ相当する．

は，粒子径 1 µm の微粒子でも同様であった．ゼータ電Fig. 11 に増幅 DNA のアガロースゲル電気泳動を，表位は，粒子の表面電荷量に依存して変化すると考えられ

1 にそのときの DNA 濃度を示す．本研究の PCR 条件の

図 8 DNA 結合微粒子のゼータ電位と DNA 長の関係
Fig. 8 Zeta potential of DNA-labeled microbeads plotted against
the attached DNA length.

図 9 DNA 結合微粒子のゼータ電位と結合 DNA 量の関係
Fig. 9 Influence of the microbeads size on the zeta potential
against amount of DNA.

図 10 DNA 結合微粒子のクロスオーバー周波数とゼータ電位の比較（粒子径 2.8 µm ）Fig. 10 Comparison of the crossover frequency and zeta potentialof DNA-labeled microbeads（ diameter: 2.8 µm ）．

図 11 段階希釈した鋳型 DNA からの PCR 増幅産物の電気泳
動像
Fig. 11 Gel electrophoresis image of the amplified DNA fromserial dilutions of the template.

DNA結合に伴う誘電体微粒子の誘電泳動特性変化の測定（中野 道彦ら）に DNA が結合することで，微粒子の誘電泳動特性が大

表 1 増幅 DNA の濃度
Table 1 Concentration of amplified DNA

Template DNA［ copies/reaction ］

25

きく変化することを利用している．その詳細を調べるた

Amplified DNA［ ng/µl ］

10

7

34.8

10

6

14.6

10

5

2.63

10

4

1.32

10

3

N.D.

0

N.D.

N.D.: not detected

めに，微粒子誘電泳動のクロスオーバー周波数及び微粒子のゼータ電位について，DNA 長，DNA 量，粒子径を変化させてその影響を調べた．その結果，ゼータ電位が粒子径や DNA 長の変化に対して受ける影響は小さく，クロスオーバー周波数はその影響が大きかった．このことから，微粒子誘電泳動の変化には，DNA の電荷だけではなく誘電率も影響していることが示唆された．
また，本 DNA 検出法に関してその定量性を調べた．
その結果，鋳型 DNA 量の増加に応じて応答値が上昇することが示され，定量的に検出できることが示された．
謝辞
本研究の一部は，日本学術振興会科学研究費補助金（ No.26289125, No. 15K06111），豊田理研スカラー（豊田理化学研究所）の援助により行われた．記して謝意を
表す．
参考文献

図 12 DNA 結合微粒子の DEPIM 結果
Fig. 12 DEPIM of the DNA-labeled microbeads. After PCR using
each of initial copies of template DNA, the amplified
DNA was attached on the microbeads. Then, the DNAlabeled microbeads was detected by DEPIM.

1） M. Nakano, Z. Ding, H. Kasahara and J. Suehiro: Rapid
microbead-based DNA detection using dielectrophoresis and
impedance measurement. Europhys. Lett., 108（2014）28003
2） H. A. Pohl: Dielectrophoresis: the behavior of neutral matter innonuniform electric fields, Cambridge University Press

増幅可能鋳型 DNA 量の最小値は 10 copy であった．こ
4のときの増幅 DNA 濃度は 1.32 ng/µl であった．
PCR 産 物 を 粒 子 径 2.8 µm の 微 粒 子 に 結 合 し， そ のDNA 結合微粒子を DEPIM によって計測した結果を Fig.

（1978）
3） M. P. Hughes, H. Morgan and F. J. Rixon: Dielectrophoretic
manipulation and characterization of herpes simplex virus-1
capsids. Eur. Biophys. J., 30（2001）268

12 に示す．鋳型 DNA 量によって増幅 DNA 量も変化し，

4） I. Ermolina and H. Morgan: The electrokinetic properties of

その変化に応じて DEPIM 応答も変化した．鋳型 DNA

latex particles: comparison of electrophoresis and

量 10 ～10 copy の範囲で，鋳型 DNA 量が多くなるにつ

dielectrophoresis. J. Colloid Interface Sci., 285（2005）419

れて DEPIM 応答量（コンダクタンスの上昇値）も大き5） 中野道彦，丁震昊，笠原弘道，末廣純也：DNA 結合にくなった．これは，微粒子に結合した DNA 量によって伴う微粒子の誘電泳動変化を利用した DNA 検出．静電誘電泳動特性が変化することに起因する．一方で，増幅気学会講演論文集 '14, p. 141，静電気学会（2014）

DNA が確認されなかった 10 copy およびネガティブコ

6） J. Suehiro, R. Yatusnami, R. Hamada and M. Hara:

ントロールでは，DEPIM 応答は 0 よりも小さくなった．

Quantitative estimation of biological cell concentration

これは，負の誘電泳動によって電極間から微粒子が排除

suspended in aqueous medium by using dielectrophoreticされたためであると考えている．この結果から，微粒子

impedance measurement method. J. Phys. D. Appl. Phys., 32

4

7

3

誘電泳動を利用した DNA 検出法は，定量的に鋳型 DNA
量を計測できることが示された．

（1999）2814
7） A. Holmberg, A. Blomstergren, O. Nord, M. Lukacs, J.
Lundeberg, M. Uhlén: The biotin-streptavidin interaction can

5．まとめ

be reversibly broken using water at elevated tempertures.

微粒子誘電泳動を用いた DNA 検出法に関して，そのElectrophoresis, 26（2005）501

原理を詳細に調べた．本 DNA 検出法は，誘電体微粒子