静電気学会誌，39, 6（2015）258-262

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論文

高電界パルスを用いた液体培地中の大腸菌殺菌に及ぼすパルス間隔と液体温度の影響
村上 祐一 ，村本 裕二 ，清水 教之
＊, 1

＊

＊

（2015年7月13日受付；2015年9月11日受理）

Effect of Pulse Interval and Temperature on Sterilization ofEscherichia coli in Liquid Medium by High Electric Field Pulse
＊, 1

＊

＊

Yuichi MURAKAMI , Yuji MURAMOTO and Noriyuki SHIMIZU（Received July 13, 2015; Accepted September 11, 2015)

We have been investigating the sterilization of liquid food by high electric field pulse. The sample was Escherichia coli（ JM103）in liquid medium. High voltage pulse（－5.32 kV ）was applied to the sample varying pulse interval 60 seconds,
120 seconds, or 180 seconds. Experiments were carried out at room temperature region（＋17.3 ℃～＋25.7 ℃）and at low
temperature region（－1.2 ℃～＋3.0 ℃）. As a result, the survival rates for all samples decrease with increase in the numberof pulses. The survival rate at low temperature region is higher than that at room temperature region. At low temperatureregion, the survival rate for 60 seconds interval is lower than that for 120 and 180 seconds interval. On the other hands, atroom temperature region, the pulse intervals of 60 and 120 seconds show almost the same survival rate.

1．はじめに分子の二重層から構成される．液体試料の温度が高いと加熱殺菌は，比較的簡単に高い殺菌効果が得られるこき，リン脂質分子は動き易くなり，細胞膜の流動性は高とから，食品の殺菌方法として広く使われてきた．一方，くなる．よって，パルス電界印加により，二重層の配列

加熱殺菌には，食品の品質劣化，ビタミン類や栄養成分は容易に乱され，細胞膜は破壊され易くなる．また，パの破壊，食品の香りや色調の変化を引き起こす問題があ

ルス電界印加により殺菌されなかった細胞は，穿孔を免る．非加熱殺菌は，これらの加熱殺菌の欠点を解決するれたか，あるいは細胞膜に形成された孔を修復できたもため，あるいは加熱殺菌が出来ない食品を殺菌するためのと考えられているに提案されてきた ．高電界パルス殺菌法は，非加熱殺質分子の移動によるものであり，修復時間は，細胞膜の菌法の 1 つであり，主に液体食品の非加熱殺菌法として流動性に依存することが予想される．これまでに，高電研究されている．高電界パルス殺菌法は，液体中の細胞界パルス殺菌は，印加電界強度 ，印加回数にパルス電界を印加することで，マクスウェル応力によ

液体試料の pH など，さまざまな要因に影響されるとり細胞膜を機械的に圧縮し，それにより形成される孔か報告されている．本研究では，温度とパルス電圧の印加ら，細胞内容物（ DNA やタンパク質等）が細胞外へ漏間隔がパルス殺菌に及ぼす影響について検討し，細胞膜出することで，殺菌すると考えられているの修復の観点から考察した．

1）

．パルス殺

2-3）

．この修復機構は，主にリン脂

8-9）

10）

10-11）

および

7）

菌処理の殺菌効果は，液体試料の温度に強く依存し，温度が高くなると殺菌され易くなると報告されている．

4-7）

2．実験方法その理由の 1 つとして，細胞膜の流動性が高温で上昇す

2.1 実験試料るからだと考えられている．一般的な細胞膜はリン脂質

殺菌対象は，Escherichia coli JM103 である．この菌をキーワード：高電界パルス，大腸菌，パルス間隔，温度＊
名城大学大学院理工学研究科電気電子・情報・材料工学専攻（〒468-8502 名古屋市天白区塩釜口 1-501）
Division of Electrical and Electronic, Information, andMaterials Engineering, Graduate School of Science andTechnology, Meijo University, Shiogamaguchi 1-501,
Tempaku-ku, Nagoya 468-8502, Japan1143441504@ccalumni.meijo-u.ac.jp

液体培地（1 wt％ Tryptone，0.5 wt％ Yeast Extract，0.5 wt％ NaCl，98 wt％ 蒸留水）中で振とう培養（37℃，24 時間）させた．実験試料は，培養した液体培地から 1 mLを採取し，これに滅菌した蒸留水 9 mL を入れたものである．実験試料の初期菌数は 10 CFU/mL である．この
7

試料を殺菌槽内に 6 mL 入れた．また，実験試料の pHおよび導電率を pH 計（ HM-30R 型：TOADKK ）および電気伝導率計（ CM-30R 型：TOADKK ）を用いて測定

高電界パルスを用いた液体培地中の大腸菌殺菌に及ぼすパルス間隔と液体温度の影響（村上 祐一ら） 259（37）したところ，室温で試料の pH は約 6.5 であり，導電率は約 130 mS/m だった．

2.2 殺菌槽
図 1 に同軸円筒電極型殺菌槽の断面図を示す．電極はステンレスを用い，電極の固定には EPDM ゴムを使用した．内部電極直径は 5 mm で，電極間距離は 3 mm，深さは 80 mm である．円筒槽内の電界 E（r）は，半径 rの関数として式（1）で与えられる．
（1）図 2 実験回路
Fig.2 Experimental set up.

こ こ で，V は 印 加 電 圧，R1 は 内 部 電 極 の 半 径（2.5mm ），R2 は外部電極の内半径（5.5 mm ），r は半径を示す．

図 3 印加電圧波形
Fig.3 The waveform of applied pulse voltage.

えた．このとき，室温領域と低温領域の試料の導電率は異なっているため，殺菌槽のインピーダンスが変化し，同じ充電電圧では殺菌槽にかかる電圧の波高値が変化した．そのため，室温領域の試料では，60 kV を，低温領
図 1 同軸円筒電極型殺菌槽
Fig.1 The coaxial cylindrical electrodes tank.

域の試料では 40 kV をそれぞれ充電し，殺菌槽にかかる電圧の波高値が同じ値になるよう調整した．殺菌槽にかかる電圧波形は分圧器（ IWATSU ELECTRIC CO. LTD，HV-2.3 実験手順P30）を通してオシロスコープ（ Tektronix DPO4034）を

図 2 に実験回路を示す．パルス電圧印加には，インパ用いて観測した．図 3 に印加電圧波形を示す．図 3 から，ルス電圧発生器（東京変圧器（株）898101）を使用した．

室温領域と低温領域の試料の印加電圧値はほとんど同じ

このインパルス電圧発生器は 4 段のマルクス回路構造でであることがわかる．波形についても，室温領域の試料あり，4 つのコンデンサにそれぞれ充電し，球ギャップの印加電圧波形の波頭長は，5.1 μs で，波尾長は 11.1 μsを放電により短絡させることでインパルス電圧を得る．

であり，低温領域では，それぞれ 5.5 μs，11.5 μs とほぼ

実験試料 6 ml を殺菌槽内に入れた．実験試料の温度を，同じ値とみてよい．式（1）から殺菌槽内の電界強度は，+ 17.3 ℃～＋25.7 ℃（室温）領域と－1.2 ℃～＋3.0 ℃（低内部電極付近で最大電界 2.67 kV/mm であり，外部電極温）領域とし，殺菌槽の内部電極にインパルス電圧発生付近で最小電界 1.22 kV/mm だと計算される．パルス電器を接続し，波高値－5.32 kV のパルス電圧を 30 回印加

圧 1 回印加毎に，殺菌槽をよく振り撹拌させ，パルス電した．また，パルス電圧印加から次の印加までの時間間

圧印加 10 回毎に大腸菌の生菌数をコロニー計数法によ

隔をパルス間隔とし，60 秒，120 秒，および 180 秒と変り測定した．

260（38）

静電気学会誌 第39巻 第 6 号（2015）

3．実験結果および考察
3.1 試料の温度変化
図 4 にパルス間隔 60 秒における低温および室温領域の試料の温度変化を示す．図中の実線は，パルス電圧無印加時における試料の温度―時間特性を示している．図4 から，無印加時において試料の温度はほとんど変化しないことがわかる．一方，破線はパルス印加時（60 秒間隔）の試料の温度―パルス印加回数特性を示しており，試料の温度は印加回数の増加とともに上昇している．パルス間隔 120 および 180 秒の場合も同様で，室温領域では最大約 5 ℃上昇し，低温領域では最大約 3 ℃上昇した．
図 5 無印加時の生菌率―時間特性
Fig.5 The survival rate as a function of the time with the no pulseapplication.

図 4 試料の温度―パルス印加回数（時間特性）
Fig.4 The temperature of sample as a function of the number ofpulses（ time）.

3.2 生菌率―パルス印加回数特性
生菌率 rx を nx／no にて求めた．ここで，n0 はパルス電

図 6 室温領域の生菌率―パルス印加回数特性
Fig.6 The survival rate as a function of the number of pulses atroom temperature region（＋17.3 ℃～＋25.7 ℃）.

圧を印加する前の生菌数，nx はｘ回のパルス電圧印加後の生菌数，ｘは印加回数である．
図 5 に無印加時の生菌率―時間特性を，図 6 および 7に室温領域および低温領域の生菌率―パルス印加回数特性を示す．図中のマークは平均生菌率を，括弧内の数字は実験回数を，エラーバーは最小値と最大値を示す . なお，図 6 および 7 では，パルス間隔を変化させた結果も示してある．
図 5 は，パルス電圧を印加せず 30 分間（パルス電圧印加 30 回に必要な時間）放置した時の生菌率を示している．図 5 で，無印加時では各試料の生菌率は減少していないが，図 6，7 では，印加回数とともに生菌率が減少していることから，高電界パルス印加が大腸菌殺菌に有効であることが確認できた．

図 7 低温領域の生菌率―パルス印加回数特性
Fig.7 The survival rate as a function of the number of pulses at
low temperature region（－1.2 ℃～＋3.0 ℃）.

また，図 6，7 における生菌率の減少は，ある印加回数を超えると緩やかになっているようにみえる．パルス

細胞膜に電位差を生じさせる．このとき，電位差が大き殺菌では，菌を含む液体にパルス電界を印加することで，ければ大きいほど，細胞膜は破壊されやすくなり，菌は高電界パルスを用いた液体培地中の大腸菌殺菌に及ぼすパルス間隔と液体温度の影響（村上 祐一ら） 261（39）
殺菌されやすくなる．電位差は菌の長さが長くなるほど大きくなると報告されている ．また，本試料中の大腸12）

菌 500 個の長さを光学顕微鏡写真から測定したところ，大腸菌の長さは，0.50～4.5 μm に分布していた．これらのことから，パルス印加回数の増加とともに，殺菌されやすい長い大腸菌の数は減り，生菌率の減少幅は小さくなることが考えられる．

3.3 温度の影響
図 6 および図 7 で同じパルス間隔のデータを比較すると，室温領域（＋17.3 ℃～＋25.7 ℃）における大腸菌の図 8 細胞膜の構造
Fig.8 The structure of cell membrane.

生菌率は低温領域（－1.2 ℃～＋3.0 ℃）のものより低い
ことがわかる．温度がパルス殺菌に及ぼす影響は，多く細胞膜に生じる電界は高くなり，式（2）からマクスウェの研究者により検討されている

ル応力が大きくなることがわかる．よって，試料温度が．大嶋氏らは，5～504-7）℃の実験試料中の大腸菌にパルス電界（16 kV/mm：50高くなるほど，殺菌効果が高くなると考えられる．

Hz ）を印加し，試料温度が高くなると，生菌率は低くな

一方，低温領域では，リン脂質は動き難くなり，細胞ると報告している ．多くの研究者が，温度が高いほど膜の流動性は低くなる．すなわち，低温領域におけるゲ殺菌効果が高いということを支持している．この原因

ル状態の細胞膜は，パルス印加で生じるマクスウェル応として，Marquez 氏らは，温度が高くなるほど溶液の導力の圧縮力に対して高い抵抗力を持つ．また，低温では，電率が増加し，導電率が高くなったから殺菌効果が高く細胞膜は厚くなると報告されており ，式（2）および（3）なったと考えている ．一方，大嶋氏らは，温度によりから，マクスウェル応力が小さくなることがわかる．従っ

細胞膜の流動性が変化するからだと報告しているて，低温領域では大腸菌は殺菌されにくいと考えられる．

4）

4-7）

5）

．図

4, 7）

15）

8 に細胞膜の構造を示す．リン脂質から構成される細胞

3.4 パルス間隔の影響膜には流動性がある．細胞膜の構造は，低温ではゲル状

図 6 の室温領域では，パルス間隔が 60 秒の生菌率と態，高温では液晶状態になり，その転移温度は＋20 ℃

120 秒のそれは，ほぼ同じ特性を示す．これに対し，図～＋40 ℃と報告されている．パルス殺菌の機構は，7 に示す低温領域では，パルス間隔 60 秒の生菌率は，細胞膜の破壊を利用したものであり，高電界パルス印加120 秒のそれより低い．180 秒の生菌率は 120 秒とほぼにより生じるマクスウェル応力が，細胞膜を圧縮し，不同じである．以下にパルス間隔の効果の温度領域による可逆的に破壊することで殺菌すると考えられている．マ違いについて考察する．

13）

クスウェル応力は，式（2）から求めることができ ，大14）

く，細胞内容物の流出量が少量であり，膜の修復が可能きくなるほど殺菌し易くなる．
（2）

ここで，εm は細胞膜の誘電率を，Em は細胞膜に生じな場合，大腸菌はその孔を修復し，生き続ける．この場
合，パルス間隔が長くなるほど，細胞膜は修復されやす
く，従って大腸菌は殺菌されにくくなることが予想される．この細胞膜の修復機構は，主に膜の流動性によるもる電界を示す．また，Em は式（3）から与えられる．
（3）



高電界パルス印加により細胞膜に形成された孔が小さ

ここで，Vm は細胞膜に生じる電位差を，d は細胞膜ののであり，脂質分子の移動により修復されると考えられている ．パルス電界印加により形成された孔は，印加16）が終了し電界が無くなると，リン脂質が移動することで修復が開始される．細胞膜の修復時間は，温度，膜の組厚さを示す．
温度が高くなるほど，細胞膜を構成しているリン脂質成および塩環境などに影響され，酵母の細胞膜の修復時は動き易くなる．細胞膜の流動性は高くなることから，間パルス電界印加により二重層の配列は容易に乱され，細10 マイクロ秒，赤血球胞膜は破壊され易くなる．つまり，大腸菌は殺菌されや4 ℃では数時間程度とそれぞれ報告されている．

17）は，約 180 秒，イカ巨大神経8）

8）

や人工膜

8）

では約

では，室温では数分程度，0～すくなることが予想される． また，温度が高くなるほど，＋20 ℃以下では，細胞膜はゲル状態になり，流動性が細胞膜は無秩序な構造となるため，細胞膜は薄くなると低くなる．つまり，リン脂質が動きにくくなり，細胞膜報告されているは低温領域では修復されにくいことが考えられる．細孔．式（3）から，細胞膜が薄くなると，

15）

262（40）

静電気学会誌 第39巻 第 6 号（2015）

を閉じることに対する必要な時間がパルス印加の時間間

食衛誌，41（2000）163

隔より短いなら，高い生菌率を与える．一方，短い間隔，

2） U. Zimmermann, G. Pilwat and F. Riemann： DIELECTRIC

つまり次のパルスが修復し終えるまえに印加されたなら，

BREAKDOWN OF CELL MEMBRANES. Biophysical

形成された孔を通して電流が流れることで孔が拡大し ，Journal, 14（1974）881

8）

菌は殺菌されやすくなることが考えられる．図 7 の結果
から，低温領域において，120 秒と 180 秒間隔の生菌率3） 大嶋孝之，谷野孝徳：水中における高電圧パルス電界・放電の発生と利用．静電気学会誌，35（2011）114が同程度であり，60 秒間隔の生菌率が 120 秒あるいは4） Takayuki Ohshima, Kanako Okuyama, and Masayuki Sato：

180 秒間隔の生菌率より低いことは，大腸菌の細胞膜のEffect of culture temperature on high-voltage pulse sterilization

低温（－1.2 ℃～＋3.0 ℃）における修復時間が，60 秒～

of Escherichia coli. Journal of Electrostatics, 55（2002）227

120 秒の間にあることを示していると考えられる．
室温領域の細胞膜は，低温領域より流動性が高いこと

5） V. O. Marquez, G. S. Mittal, and M.W. Griffiths： Destructionand Inhibition of Bacterial Spores by High Voltage Pulsed

から，修復時間は短くなることが考えられる．低温領域

Electric Field. Journal of Food Science, 62（1997）399

では，60 秒間隔の生菌率は 120 秒間隔のものより低か

6） H.Hülsheger, J.Potel, E.-G. Niemann: Killing of Bacteria with

ったが，図 6 から，室温領域において，60 秒と 120 秒

electric Pulses of High Field Strength. Radiat Environ

間隔の生菌率は同程度であることがわかる．これは，細Biophys, 20（1981）53-65

胞膜の流動性が高くなったことで，細孔を閉じるのに必

7） Kristina Aronsson, Ulf Rönner： Influence of pH, water

要な時間が 60 秒より短くなったからだと考えられる．

activity and temperature on the inactivation of Escherichia coli

これから，大腸菌の細胞膜の室温（＋17.3 ℃～＋25.7 ℃）

and Saccharomyces cerevisiae by pulsed electric fields.

における修復時間は 60 秒より短いことが示唆された．

Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2（2001）105

4．まとめ
低温（－1.2 ℃～＋3.0 ℃）あるいは室温（＋17.3 ℃～＋25.7 ℃）の大腸菌を含む液体培地に－5.32 kV のパル
ス電圧を 60 秒，120 秒，あるいは 180 秒間隔で 30 回印加し，以下の結果を得た．

8） 葛西道生，稲葉浩子：高電圧パルスによる細胞穿孔のメカニズム－遺伝子導入法の基礎－．蛋白質核酸酵素，31（1986）1591
9） 杉村厚，清水伸：電気穿孔法．化学と生物，29（1991）
54（1）全ての実験試料の生菌率は，パルス印加回数の増加

10）H.Hülsheger, J.Potel, E.-G. Niemann: Electric Field Effects onとともに減少した．しかし，ある印加回数を超える

Bacteria and Yeast Cells. Radiat Environ Biophys, 22（1983）と，生菌率の減少は緩やかになった．

149-162（2）低温領域の生菌率は室温領域のものより高かった．

11） 村本裕二，岡洋佑，村上祐一，清水教之，市原茂幸：高細胞膜の流動性が，室温領域よりも低温領域で低い

電界パルス印加による大腸菌の伸長．静電気学会誌，38

ことが原因と考えられる．
（3）低温領域では，60 秒間隔の生菌率は 120 秒あるいは 180 秒間隔のものより低い．一方，室温領域では，（2014）108
12）佐藤正之：高電圧パルスによる微生物制御．日本食品工学会誌，8（2007）191

60 秒および 120 秒のパルス間隔ではほぼ同じ生菌

13）David L Nelson, and Michael M Cox: Lehninger PRINCIOLES率を示した．これらから，細胞膜の修復時間として，

OF BIOCHEMISTRY, 4th edition, pp. 380-381, W.H. Freeman

低温領域では 60～120 秒，室温領域では 60 秒以下

and Companyであることが示唆された．

14）秋山秀典：高電圧パルスパワー工学，pp. 33-36，オーム社（2011）

謝辞
本研究を進めるにあたり，数々の技術的御指導および御助言を頂きました名城大学農学部加藤雅士教授および同大学農学部志水元亨助教に深く感謝致します．

15）小澤美奈子：分子細胞生物学

第 5 版，pp. 127-133，東京化学同人（2005）16）市川厚：マッキー生化学―分子から解き明かす生命（第 4 版）
，pp. 363-365，化学同人（2010）17）村治雅文，建部渉：酵母のエレクトロポレーションにつ

参考文献
1） 松田敏生：非加熱殺菌技術による食品の殺菌と保存．

いて．醸協，91（1996）867