静電気学会誌，38, 1（2014）40-45

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

電界集中型細胞融合法による抗体産生細胞の高収率取得
オケヨ・ケネディ・オモンディ ，西垣内 康宏 ，近藤 武宏 ，黒澤 修 ，
＊, 1

＊＊

小穴 英廣 ，小寺 秀俊
＊

＊

＊＊

，鷲津 正夫＊＊＊＊＊（2013年9月10日受付；2013年12月10日受理）

Electrofusion Employing Electric Field Constriction for High Yield Generation of
Hybrodomas for Monoclonal Antibody Production
＊, 1

＊＊

＊

＊＊

Kennedy O. OKEYO , Yasuhiro NISHIGAICHI , Takehiro KONDO , Osamu KUROSAWA ,＊＊＊＊＊＊Hidehiro OANA , Hidetoshi KOTERA , and Masao WASHIZU(Received September 10, 2013; Accepted December 10, 2013)
A high-yield electrofusion method has been developed that enables one-to-one fusion of single cells and is cell-size
independent. The method utilizes dielectrophoretic force (DEP force) resulting from electric-field constriction at microorifices on a thin insulating sheet (orifice sheet) sandwiched between two electrodes to manipulate and pair up single B cells
and myeloma cells for fusion by pulsation. Cells were individually aligned and brought into contact at micro-orifices byapplying a 5V DEP voltage at 1MHz. Application of a 5V pulse for 100 μs resulted in electrofusion of paired single B cells
and myeloma cells, and a fusion efficiency of over 70％ was realized. Fusants were harvested and cultured for 3 days,
resulting in the formation of multiple hybdridoma colonies. Using this method, a 2％ yield rate was achieved, which is 202000-fold higher than that obtained by the typical PEG fusion. Thus, this method is applicable to the generation of hybridomas
6
using the relatively few (~10 cells) B cells harvested from the lymph, enabling faster and less costly monoclonal antibody
production.

1．はじめに検出するための実験用試薬としてのみならず，がん治療

細菌などの異物（抗原）が体内に侵入すると，脾臓やのための抗体医薬品や免疫診断薬の中核材料としても利リンパ節に存在する B 細胞が刺激され，分裂や分化が活用されており，その応用範囲が急速に拡大している ．
2）発になる．この状態の B 細胞は，抗原と結合することのしかし，B 細胞は寿命が短くかつ増殖能力が低いとのできる抗体を産生するようになる ．複数種類の B 細胞

性質を持っている．そのため，従来では，モノクローナが存在するが，そのうち，一種類の B 細胞（クローン）

ル抗体取得には PEG（ polyethylene glycol ）融合法により，から産生された，分子構造の均一な抗体がモノクローナ

抗体産生 B 細胞と，増殖力の高いミエローマを融合させ，

ル抗体と呼ばれる．モノクローナル抗体は特異性が高く，

ハイブリドーマを作製する方法がとられている．

1）

特定の抗原としか反応しない．そのため，特定の抗原をPEG 融合法では，B 細胞とミエローマが混在する状態
で PEG を加えて融合させるが，接し合う細胞同士がラキーワード：オリフィスシート，電界集中，細胞融合，抗ンダムに融合するため，B 細胞とミエローマが 1 対 1 融

体産生，ハイブリドーマ，モノクローナル抗体

合する確率は極めて低い（10 ～10 ）．一匹のマウスの東京大学機械工学専攻（〒113-8656 東京都文京区本郷 7-3-1）
Department of Mechanical Engineering, University ofTokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656, Japan＊＊
東京大学バイオエンジニアリング専攻（〒113-8656 東京都文京区本郷 7-3-1）
Department of Bioengineering, University of Tokyo, 7-3-1
Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8656, Japan＊＊＊
京都大学マイクロエンジニアリング専攻（〒606-8501 京都府京都市吉田本町）
Department of Microengineering, Kyoto University,
Yoshidahonmachi, Sakyo-ku, Kyoto 606-8501, Japan1
okeyo@washizu.t.u-tokyo.ac.jp
＊

⊖6

⊖4

脾臓から得られる細胞数は約 10 個でるが，この中には8B 細胞の他にリンパ球の一種である T 細胞も多く含まれている．B 細胞と同様に，T 細胞もミエローマと融合し，コロニーを形成するので，融合効率が 1 ×10 ～1 ×10⊖6⊖4である PEG 融合法では，10 個の B 細胞からは多種類の8B 細胞由来のハイブリドーマが 10 個程度得られる．こ3の中で，目的の抗体を産生するハイブリドーマの数は，10 個中わずかに数個から数十個しかない．従って，融3合効率の向上が課題となっている．
効率が向上すれば，脾臓の代わりにリンパ節に存在す

電界集中型細胞融合法による抗体産生細胞の高収率取得（オケヨ・ケネディ・オモンディら）

41

る 10 ～10 個の少量のＢ細胞を用いてハイブリドーマを5

6作製することが可能となる．リンパ節は呼吸系の近くに存在するため，口や鼻から侵入してきた抗原に一番早く反応して抗体を産生するため，少量の抗原で短時間での抗体作製が可能であり，抗体産生の低コスト化が図れる．
そこで，本研究では，1 対 1 の細胞融合を可能にする
電界集中型電気細胞融合法を用い，B 細胞とミエローマ
を 1 対 1 に融合させることにより，B 細胞１個からなる
ハイブリドーマコロニーを高効率で作製し，モノクロー
ナル抗体取得効率の向上を図ることを目的とした．

2．電気細胞融合の原理
2.1 可逆的膜破壊と電気的細胞融合の関係
図（1 a）に示すように，外部電界 E0 中に半径 a の細胞を置くと，膜電圧 Vm が細胞膜に生じる．電界方向を θ

図 1 細胞膜の可逆的破壊と自己再生による融合
Fig. 1 Voltage induced membrane breakdown and recovery during
cell fusion.

= 0 としたときの極座標の天頂角 θ の位置における V（θ）
m

破壊を起こすには約 2 Vb が必要であるのに対し，点 Pt およの時間発展は式（1）で与えられる ．

び点 Pb では膜が 1 枚で，Vb ≈ 1 V で膜破壊が起きる．

3）

=
V（θ）
m

3
aE｛1
⊖ exp
（⊖ t/τ）｝cosθ
02

τ = aC（μmi + μo /2）
⊖1

（1）
（2）

⊖1

このように，通常の電気的細胞融合法では，接触点で膜破壊電圧（約 2 V ）に達する前に，接触細胞の両端（点Pt，Pb ）で先に不可逆的膜破壊が生じ，細胞が破裂して

ただし，t は印加時間，τ は時定数，Cm は細胞膜の静電しまう．そのため，この方法の融合効率が悪い（0.1％）．

容量，μi と μo は細胞内外の導電率である．細胞膜の電気また，式（1）に表すように，膜電圧は細胞サイズに依容量 Cm は約 1 μF ⁄ cm であることが知られており , a = 15存するため，同じ電界 E0 であっても，小さい細胞よりμm, μi = 3000 μS/cm，μo = 100 μS/cm とすると，時定数 τ =も大きい細胞の方が先に膜電圧が膜破壊電圧に達するた

8 μs となる．また，式（1）より，膜電圧は θ = 0，θ = π のめ，サイズの異なる細胞同士の融合が難しい．さらに，位置で最大となり，細胞サイズに依存することが分かる．

この方法では，電界中の細胞がランダムにパールチェイ

細胞膜が破壊する膜破壊電圧 Vb は細胞種によらず，ンを形成するため，融合する細胞の数および種類を制御

3）

約 1V であるとされている ．従って，印加電圧が高すすることができない．次項で説明する電界集中型細胞融ぎる（ Vm ≫ Vb ）と不可逆的膜破壊が生じ，細胞が死に

合法はこれらの短所を克服した，1 対 1 細胞融合を可能

至る．逆に印加電圧が低すぎる（ Vm ≪ Vb ）と，脂質 2にする画期的な方法である．

2重膜（図 1b ）である細胞膜はコンデンサのように振る

2.2 電界集中型1対1細胞融合法

舞い，充電されるだけで膜破壊は起きない．一方，Vm

電界集中型 1 対 1 細胞融合法とは，電界中の絶縁体に

Vb の条件では，一時的な膜破壊が生じるが，電界の作設けた微細なオリフィスで生じる電界集中により発生す

用がなくなると膜が自己修復する．この可逆的膜破壊がる正の誘電泳動を利用し，オリフィスを介して 1 対 1 の起きる電圧条件（ Vm

Vb ）で隣り合う 2 つ以上の細胞

細胞ペアを作った後，パルス電圧を印加して融合させるに対してパルス電圧を印加すると，細胞同士の接触点で方法である（図 2）．この方法では，オリフィスを介し一時的な膜破壊が生じ（図 1c ），その後の膜回復過程でて目的の細胞同士を確実に 1 対 1 にペアリングできる．

細胞結合が起きる（図 1d ）．

また，この状態でパルスを印加すると，印加電圧のほと

図（1 b）に示すように，一般的な電気的細胞融合法では，んどがオリフィス近傍の細胞膜にかかることが数値シミ細胞懸濁液中の細胞に対して，誘電泳動により細胞同士をュレーションの研究から分かっている ．そのため，細4）接触させ，次にパルス電圧を印加して融合させる．電界中

胞のサイズに依存することなく，2 枚の細胞膜の破壊にに細胞 2 個以上が接している場合においては，θ = 0，θ = π

必要な電圧（約 2 V ）を印加すれば細胞融合を行うこと

で Vm が最大となるため，接触点 P0 の他に，接触細胞の両ができる．オリフィス近傍で複数個の細胞でパールチェ

端（点 Pt，
点 Pb ）でも膜破壊が生じうる（図 （
1 c）
）
．ただし，

インが形成される場合もあるが，膜破壊が生じるのは電接触点 P0 では細胞膜が 2 枚接触しているため，可逆的膜

界集中の生じるオリフィス部のみであるため，オリフィ

静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）

42

付近ではオリフィスの直径が 20 μm で，穴が最も狭い央部分では直径が 5 μm である．このオリフィスシートは株式会社三陽より購入した．図 （3 c）および（d）にデバイス全体の構成を示す．

3.2 実験材料および方法
3.2.1 実験に用いた細胞および培養方法
本実験では，ヒト T リンパ腫由来の浮遊性細胞である
Jurkat 細胞を融合電圧条件の検討に用いた．また，ハイ

図 2 電界集中型細胞融合技術の原理
Fig. 2 Electrofusion employing electric field concentration for cellalignment and fusion

ブリドーマ作製には，マウスミエローマ細胞（ NS-1 株），

スを介して接触している融合のみが融合する ．

ス 脾 臓 か ら 採 取 さ れ た プ ラ イ マ リ B 細 胞 を 用 い た．

5）

株化された B 細胞（ BCL1 Clone CW13.20）およびマウ

電界集中型細胞融合においては，正の誘電泳動を用いJurkat 細胞とミエローマ細胞は，FBS（牛胎児血清）10％て細胞のペアを形成するため，周囲の溶液の導電率を細および抗生物質 1％を添加した RPMI 1640 培地を用いて胞の導電率よりも十分低い 100 μS/cm とし，印加周波数培養した．B 細胞は，FBS 10％および抗生物質 1％を添

は，Clausius-Mossotti 関数の値が正で，電極反応による加した DMEM 培地を用いて培養した気泡や溶液の対流を生じさせない 1MHz を用いる．また，細胞融合後のハイブリドーマを含む細胞は，HAT 培地

融合のためのパルスは，波高値 2V 以上，持続長は本実（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む動物

験条件における理論的膜電圧の時定数 τ ≈ 10 μs より十細胞用の培養液）で培養した．ヌクレオチドの de novo

分長い 100 μs の矩形波パルスを用いる．

合成をブロックする成分を含む HAT 培地では，ヌクレオチドのサルベージ合成のできる B 細胞とこの性質を B 細3．デバイス構成および実験方法

胞から受け継いだハイブリドーマのみが生きられるが，3.1 融合デバイスの構成

ヌクレオチドのサルベージ合成に必要な酵素，ヒポキサ

図 3 に本研究で用いた 1 対 1 細胞融合デバイスの構成

ンチン-グアニンホスホリボ シルトランスフェラーゼ

要素を示す．このデバイスは，顕微鏡観察が可能な ITO（ HGPRT ）を欠くミエローマは生きられない．また，B

電極 2 枚と，シリコンゴムに囲まれたチャンバーの中央細胞は寿命が短く，数日でほとんど死んでしまうので，に配置するオリフィスシートからなる．上下チャンバー

結局 HAT 培地に残るのはハイブリドーマのみである．

内は細胞を含む細胞懸濁液で満たし，デバイスを密閉し3.2.2 融合バッファの調整た状態で融合操作を行う．

正の誘電泳動を発生させるためには，融合バッファの図（
3 a）にオリフィスシートの SEM 画像を示している．

導電率を細胞の導電率（1～10 mS/cm ）より十分に低く

本実験では，
オリフィスが 50 μm 間隔で格子上に並んだ，する必要がある．本実験では，先行研究

径 2.5 mm のオリフィスシート
（オリフィス数が 2,500 個）

100 mM のソルビトール溶液に，0.5 mM の酢酸マグネシを用いた．図 （3 b）に示すように，オリフィスの形状はウムと 0.1 mM の酢酸カルシウムを加え，融合バッファ

中央絞りのテーパ形状となっており，穴の最も広い表面の導電率が 100 μS/cm 程度となるよう調整した．この融

4）

を参考に，

合バッファは動物細胞にとっては低張液であり，このバッファにおける Jurkat 細胞と株化 B 細胞の直径は約 15
μm であり，ミエローマは約 18 μm，プライマリ B 細胞
は約 10 μm であった．また，融合バッファの浸透圧を変更させた実験では，ソルビトール濃度 150 mM の融合バ
ッファを用いた．このバッファ中では，Jurkat 細胞および株価 B 細胞の直径が約 13 μm，プライマリ B 細胞が 7μm, ミエローマが 15 μm であった．

3.2.3 細胞融合の手順
まず，融合確認のため，実験に用いる 2 種類の細胞を図 3 デバイスの構成
Fig. 3 Device configuration

それぞれ緑色と赤色の蛍光色素 calcein AM（使用濃度 5μM ）を添加した培地で 30 分培養して染色した．特に B

電界集中型細胞融合法による抗体産生細胞の高収率取得（オケヨ・ケネディ・オモンディら）
細胞とミエローマの融合実験では，calcein AM よりも細43

これを指標に融合を判定した．

胞内での滞在時間が長い赤色蛍光色素 DiI（使用濃度 5

なお，オリフィスアレイに固定された細胞の蛍光は配μM ）を用いた．このとき，ミエローマは DiI で染色し，列化された輝点として画像に現れる．画像に見えるそれ

B 細胞は無染色のままにした．

以外の輝点は，オリフィスに固定できなかった細胞か，融合の具体的な手順を図 （4 a～d）に示す．まず，
図（4 a）

細胞以外のゴミとみなされる．

に示すように，下部チャンバーに細胞（約 5000 個，緑色蛍光染色）とスターラーバーを入れてからオリフィス

4．実験結果および考察シートを設置し，次に，図 （4 b）に示すように，上部チ4.1 融合条件の検討結果

ャンバーに細胞（約 5000 個，赤色蛍光染色）を導入し，2.2 項で述べたように，
電界集中型 1 対 1 細胞融合では，

DEP 電圧（5 V, 1 MHz ）を印加することにより細胞をオ

理論的には，細胞同士の接触点において細胞膜 2 枚を破

リフィス部に配置させた．その後，DEP 電圧を印加した

壊するのにパルス電圧 2 V を印加すれば十分である．しままデバイスを逆さまにし，図 （4 c）に示すように，回かし，実際はチャンバー内の溶液やオリフィスシート等

転磁石によりスターラーバーを回し，電極面に付着してで電圧降下が生じるため，2 V よりも大きなパルス電圧

いた細胞をオリフィスシート上に落としながら誘電泳動が必要になることを予想できる．

によりオリフィス部に配置させた．なお，B 細胞とミエ

そこで，本実験では，Jurkat 細胞を用い，まず理論的

ローマの融合実験では，サイズの小さい B 細胞がオリフに融合が起きるパルス電圧 2V から段階的に電圧を上げ

ィスをすり抜けないようにするため，まずミエローマ細胞

ながら細胞融合の様子を観察した．

をオリフィス部に配置させてから B 細胞を導入した．

3.2.4

細胞融合の観察および評価

パルス電圧の検討結果を図 5 に示す．図 5A および図5B はパルス電圧（2V, 100 μs ）の印加前後の様子を示す

上記の手順でオリフィスシートの上下面に細胞を配置

が，両方の画像の比較より明らかなように，輝点には特させた後，DEP 電圧（5 V, 1 MHz ）を印加したまま，パに明確な変化はなく，この電圧条件では細胞融合が認め

ルス電圧を印加し，オリフィス部の細胞ペアを融合させられなかった．図 5C および図 5D に示すように，パル

た（図 （
4 d）
）
．この際，融合確認のため，図 （4 e）に示す

ス電圧が大きくなるにつれ，輝点の増加がみられ，融合

ように，下側のチャンバーの細胞に顕微鏡の焦点を合わする細胞数が増加した．パルス電圧 5 V では，Jurkat 細せ，励起フィルターを上側の細胞の蛍光色素に合わせた．

胞ペアのうち 85％が融合した（図 5D ）．パルス電圧を 6細胞融合が起き，上側の細胞の蛍光色素が下側の細胞に

V に上げても融合する細胞数の増加が見られず，逆に既流入したとき，観察視野内の細胞の輝度が上昇するので，に融合細胞のうち破裂するものが出てきた．従って，パルス電圧の条件（5 V, 100 μs ）とし，同様の電圧条件に次項で説明する B 細胞とミエローマの融合を行った．
なお，DEP 電圧（5 V, 1 MHz ）によりオリフィス部に細胞を配置したが，ゴミがオリフィスを塞いでしまう問

図 4 細胞融合の操作手順および観察方法
Fig. 4 Procedures for cell fusion and observation

図 5 パルス電圧と融合細胞数の変化．格子上に並んでいる
蛍光点（白い点）が融合細胞の位置を示す．A：電圧
印加前，B：印加パルス電圧 2 V，C：印加電圧 3 V，D：
印加電圧 5 V．パルス幅は 100 μs である．
Fig. 5 The effect of applied voltage on cell fusion efficiency. A:
Before pulse, B: after 2 V pulse, C: after 3 V pulse, (D)after 5 V pulse, all applied for 100 μs.

静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）44

題などから，すべてのオリフィス（2,500 個）に細胞のmM から 150 mM に上げ，浸透圧を大きくした．その結果ペアを形成することは難しく，実際の細胞のオリフィス

を図 6C（融合前）および図 6D（融合後）に示す．これら占有率は約 80％であった．つまり，導入細胞数に関係の図の比較より，細胞ペアのうち 16％が融合し，わずかでなく，実際に得られた細胞ペア数は約 2,000 個であった．

はあるが，浸透圧の変化により融合効率に改善が見られた．

4.2 B細胞とミエローマの1対1電気融合

次に，ミエローマ同士の融合効率が低いことに着目し，4.1 項で示したパルス電圧条件で株化 B 細胞とミエロ

膜上タンパク質の酵素分解によりさらに融合効率を上げーマを融合させた結果を図 6 に示す．図中の白丸は，パられるか，検討を行った．実際，融合する細胞をトリプ

ルス電圧印加前後で輝度変化（融合を意味する）が確認

シン等のプロテアーゼで処理すると融合効率が向上するされたオリフィス部を示す．図 6A と図 6B の比較より，という報告がある ．融合前にミエローマを濃度 0.05％

オリフィス部で形成された細胞ペア 2,000 個のうち 10％のトリプシン溶液に入れて 5 分間培養し，その後，融合のペアしか融合しなかったことがわかり，Jurkat 細胞のバッファ150 mM で融合を行った結果，融合効率が約 41

場合の 85％と比較してかなり融合効率が低かった．こ％に上昇した．また，図 6E および図 6F に示すように，の結果を受け，ミエローマ同士の融合を行った．その結処理時間をさらに長くして 15 分にしたところ，融合効

果，同種細胞同士の融合であるにも関わらず約 10％と率が約 73％にまで上がった．この結果より，膜上タン

低い値であることがわかった．

パク質が B 細胞とミエローマの融合効率が低かった原7）

オリフィスシートを用いた場合は，細胞サイズに関係因の一つと言える．従って，融合パルス電圧に加え，膜なく融合ができることを理論的にも実験的にも知られて上タンパク質や糖鎖，さらに，融合バッファの浸透圧がいる

融合効率を左右する主なファクターであると言える．

．従って，ミエローマ同士の融合効率が低かっ4, 5）たことに焦点を当て，B 細胞とミエローマの低い融合効

4.3 ハイブリドーマの回収および培養率について次の 2 つの可能性を考えた．1 つ目は，融合

株化 B 細胞とミエローマの融合後，融合デバイスを培

バッファの浸透圧の影響である．モル濃度 100 mM の融地中に開放しオリフィスシートを取り出した後，まず，合バッファは動物細胞にとって低張液であるため，細胞B 細胞側を下側にして培地中でオリフィスシートを軽く膜が張った状態にある．そのため，オリフィス内部での揺さぶり，未融合の B 細胞を洗い出した．このとき，

膜変形が生じず，細胞ペアの接触が起きにくいと考えた．

オリフィスシートの上側にあるミエローマはオリフィス

2 つ目は，細胞膜上のタンパク質や糖鎖の影響であり，よりも大きいため，ハイブリドーマは落ちない．この操これらが融合時における膜破壊や膜の再構築を妨げ，融作の後，ミエローマ側を上にしたままオリフィスシート

合が起きにくくすると考えた．

を新しい DMEM 培地中に設置してから裏返し，ミエロ

まず，浸透圧について検討を行った．細胞がより変形し易くなることを期待して，融合バッファのモル濃度を 100

ーマ側を下にした状態で 3 日間培養を行った．
プライマリ B 細胞を用いた融合実験でも同様の操作を行ったが，DMEM 培地で 1 日培養を行った後，HAT 培
地に切りかえ，続けて培養を行った．また，ハイブリド
ーマコロニーの増殖を促進させるため，フィーダー細胞として，融合に使っていないプライマリ B 細胞と一緒に培養した．未融合のミエローマは HAT 培地中で生きられないので，ほとんど排除される．
図 7A に DMEM 培地中に回収した株化 B 細胞由来の図 6 B 細胞とミエローマの融合結果．A, B：融合バッファ
100 mM を用いた場合のパルス印加前と後，C, D：融合
バッファ150 mM を用いた場合のパルス印加前と後．円で囲んだ箇所は融合前と後とで輝度変化が確認れたオ
リフィスを示す．E, F：15 min トリプシン処理された B細胞を用いた場合で，150 mM においてパルス印加前（ E ）と印加後（ F ）Fig. 6 Fusion of B cells with myeloma cells. A, B: Before andafter pulsation using a 100 mM fusion buffer, C, D: Before
and after pulsation using a 150 mM fusion buffer. E,F:
Before and after pulsation for the case where B cells（ cellline ）were perfused with trypsin for 15 min and fusion
performed in 150 mM buffer.

ハイブリドーマの培養結果を示す．ハイブリドーマが複数のコロニーを形成している様子が確認できる（図 7A
中，拡大部分）．また，図 7B より，これらのコロニーが接着性であり，またミエローマの染色に用いた DiI 色
素の蛍光を発していることから，ハイブリドーマであると言える．比較のため，
ミエローマの画像を図 7C に示す．
さらに，図 7D にはプライマリ B 細胞由来のハイブリ
ドーマを 3 日間 HAT 培地中に培養した結果を示している．白い点線で囲んだ領域では細胞が接着して比較的密電界集中型細胞融合法による抗体産生細胞の高収率取得（オケヨ・ケネディ・オモンディら）

45

により，73％以上の融合効率を実現できた．
さらに，B 細胞とミエローマの融合で得られたハイブ
リドーマを回収して培養した結果，デバイスに導入した
5,000 個の B 細胞に対して 100 個以上のハイブリドーマ
コロニーを確認できた．
以上より，電界集中型電気融合を利用した 1 対 1 細胞融合法の収率は 2％であり，PEG 融合の 20～2,000 倍である．
以上，電界集中型 1 対 1 細胞融合法を用いれば，膵臓からの B 細胞のみならず，リンパ節からの B 細胞をモノクロー

図 7 ハイブリドーマの培養とコロニー形成．A：培養ディッシュ底面におけるハイブリドーマコロニーの形成（株化 B 細胞使用の場合），白枠は拡大部分を示す．B：
形成コロニーの蛍光画像，C：ミエローマの顕微鏡画
像，D：プライマリ B 細胞由来のハイブリドーマコロ
ニー形成の様子．白丸がコロニー，周りはフィーダー細胞
Fig. 7 Hybridoma culture and colony formation. A: Hybridoma
colony formed at the bottom of culture dish, B: Hybridoma
colony expressing DiI fluorescent dye used to stain only
myeloma cells, C: Image of non-adherent myeloma cells,
D: Hybridoma derived from primary B cells in a HAT
culture medium.

ナル抗体産生に使用することができ，必要な抗原の量の削集になっていることから，これらがハイブリドーマのコー分子生物医学浜窪先生よりプライマリ B 細胞をご提供

ロニーと考えられる．

いただいた．この場をお借りして感謝を申し上げたい．

減や抗体産生までの時間短縮等のメリットが期待できる．
今後，融合効率と回収効率の両方をさらに向上させると同時に，得られたハイブリドーマのコロニーが実際に抗体産生能力を持っているかどうかの検討を行う．
謝辞
本研究は，科研費（12808552, 25790034）の助成を受けたものである．また，東京大学先端科学技術研究センタ

デバイスに導入したプライマリ B 細胞 5,000 個に対し，形成された細胞ペア数が 2,000 個であり，得られたコロニ

参考文献

ー数が 100 個程度であった．よって，収率（生成コロニー

1） G. Kohler and C. Milstein: Continuous cultures of fused cells

数と融合に参加した B 細胞数の割合）は 2％となる．このsecreting antibody of predefined specificity. Nature, 256

収率では，リンパ節からの B 細胞 10 ～10 個を用いても十（1975）495-497

56

分なハイブリドーマのコロニーが得られる．よって，本研

2） 松葉隆雄, 三苫惠民, 田中千代, 井上益男：高親和性ウサ

究で提案した融合法を用いれば，リンパ節からの B 細胞

ギモノクローナル抗体の創製（高感度エストラジオールを使ったモノクローナル抗体の産生が可能となる．

測定系への応用）. 東ソー研究・技術報告, 52（2008）
3） U . Z i m m e r m a n n a n d W. M . A r n o l d : B i o p h y s i c s o f

5．結論
本研究では，従来の PEG よりも高収率でハイブリドーマを作製できる方法として，電界集中型 1 対 1 細胞融合法について検討を行った．
この方法では，微細なオリフィス（有効径 5 μm ）を有する薄膜ポリマーシートを電極間に設置し，DEP 電

Electroinjection and Electrofusion. Journal of Electrostatics,
21（1988）309-345
4） B. Techaumnat and M. Washizu: Analysis of the effects of anorifice plate on the membrane potential in electroporation andelectrofusion of cells. Journal of Physics D:Applied Physics,
40（2007）: 1831-1837

圧（5 V, 1 MHz ）を印加することにより，オリフィス部

5） Y. Kimura, M. Gel, B. Techaumnat, K. Tsuda, H. Oana, H.

で生じる電界集中を利用して細胞を誘導し，オリフィス

Kotera, T. Tsuda and M. Washizu: High-yield parallel electro-部の両側に 1 対 1 の細胞ベアを形成した．そして，パルfusion device based on field constriction at an orifice array,

ス電圧（5 V, 100 μs ）を印加することにより，細胞サイ

MicroTAS 2008, San Diego, California, USA.

ズによらず，細胞ペアを電気融合させた．その結果，Jurkat 細胞同士を用いた同種細胞融合では，85％の高い融合効率を達成できた．

6） G. A. Neil and U. Zimmermann: Electrofusion. Methods in
Enzymology, 220（1993）174-196
7） T. Ohno-Shosaku and Y. Okada: Facilitation of electrofusion

B 細胞とミエローマを用いた異種細胞融合の場合は融of mouse lymphoma cells by the proteolytic action of

合効率が 10％と比較的低かったが，融合バッファの浸proteases. Biochemical Biophysical Research Communications,

透圧調整やミエローマのトリプシン処理を予め施すこと

120（1984）138-143