Measurements	  for	  the	  ENCODE	  common	  cell	  types	  	  The	  ENCODE	  Consortium	  has	  designated	  common	  cell	  types	  that	  will	  be	  used	  by	  all	  investigators	  to	  aid	  in	  the	  integration	  and	  comparison	  of	  data	  produced	  using	  different	  technologies	  and	  platforms.	  To	  ensure	  consistency	  in	  cell	  cultures	  prepared	  in	  different	  laboratories,	  investigators	  should	  take	  the	  measurements	  below	  for	  each	  cell	  harvest.	  	  Required	  Measurements	  	  §§§Growth	  time/passage	  number.	  The	  growth	  time	  of	  cell	  lines	  should	  be	  determined	  by	  recording	  the	  date	  when	  cells	  were	  put	  into	  culture	  and	  when	  they	  were	  harvested.	  Investigators	  should	  go	  back	  to	  the	  original	  stock	  after	  growing	  a	  culture	  for	  one	  month.	  Passage	  number	  should	  be	  assessed	  for	  primary	  cells.	  The	  passage	  number	  for	  primary	  cells	  should	  not	  exceed	  3-­‐4	  passages.	  
Cell	  density.	  Cell	  density	  should	  be	  assessed	  for	  each	  cell	  culture.	  
§ The	  density	  of	  GM12878	  cells	  should	  be	  maintained	  between	  2.0	  x	  10^5	  cells/ml	  and	  1.0	  x	  10^6	  cells/ml.	  
§ K562	  cells	  should	  be	  grown	  to	  a	  maximal	  density	  of	  7.5	  x	  10^5	  cells/ml.	  
§ HepG2	  cells	  should	  be	  grown	  to	  a	  maximum	  of	  75%	  confluence.	  
§ HeLa-­‐S3	  should	  be	  grown	  to	  a	  maximal	  density	  of	  5	  x	  10^5	  cells/ml.	  	  Cell	  cycle	  state.	  Cell	  cycle	  state	  should	  be	  measured	  by	  FACS	  analysis	  within	  2	  weeks	  of	  the	  time	  of	  harvest.	  Samples	  can	  be	  prepared	  at	  the	  time	  of	  harvest	  for	  later	  analysis.	  Staining	  should	  be	  done	  immediately	  before	  FACS	  analysis.	  A	  protocol	  for	  performing	  FACS	  analysis	  is	  available	  below.	  Sample	  FACS	  profiles	  for	  K562	  and	  HeLa-­‐S3	  are	  available	  at	  the	  end	  of	  this	  document.	  	  	  	  Other	  Issues	  to	  Consider	  	  Presence	  of	  mycoplasma.	  Cell	  cultures	  should	  be	  tested	  at	  monthly	  for	  the	  presence	  of	  mycoplasma.	  
The	  mycoplasma	  testing	  protocol	  used	  by	  Bionique,	  which	  does	  mycoplasma	  testing	  for	  ATCC,	  is	  available	  below.	  	  	  Freezing	  Cell	  Aliquots	  	  As	  Tier	  1,	  2,	  or	  3	  cells	  are	  grown,	  each	  ENCODE	  group	  should	  freeze	  an	  aliquot	  of	  cells	  for	  potential	  future	  phenotyping.	  	  	  Cell	  Culture	  Guidelines	  	  1	  	  Preparation	  of	  cells	  for	  FACS	  analysis:	  	  Farnham	  lab	  protocol	  	  2008,	  February	  26	  	  Prepare	  cells	  (this	  can	  be	  done	  up	  to	  two	  weeks	  in	  advance)	  1.	  Trypsinize	  adherent	  cells	  using	  standard	  protocol	  (non-­‐adherent	  cells	  can	  be	  counted	  directly).	  
2.	  	  Determine	  cell	  number.	  Use	  105-­‐106	  cells/sample.	  	  3.	  	  Add	  appropriate	  volume	  of	  cells	  to	  a	  conical	  tube	  and	  spin	  them	  down	  at	  1000	  rpm	  for	  3	  min.	  
Aspirate	  off	  the	  media.	  
4.	  	  Vortex	  pellet	  at	  low	  speed,	  add	  0.5	  ml	  of	  cold	  PBS,	  vortex	  again	  for	  2-­‐3	  seconds.	  It	  is	  very	  important	  to	  achieve	  a	  single	  cell	  suspension.	  If	  cell	  clumping	  is	  a	  problem,	  you	  can	  use	  calcium-­‐	  and	  magnesium-­‐free	  PBS.	  
5.	  	  Resuspend	  the	  pellet	  in	  5	  ml	  of	  cold	  PBS.	  Centrifuge	  cells	  for	  6	  min	  at	  1000	  rpm.	  	  6.	  	  Aspirate	  off	  the	  PBS.	  	  7.	  	  Add	  0.5	  ml	  cold	  PBS	  and	  pipette	  up	  and	  down	  to	  achieve	  a	  single	  cell	  suspension.	  	  8.	  	  Prepare	  a	  tube	  with	  4.5	  ml	  ice-­‐cold	  100%	  ethanol.	  	  Begin	  vortexing	  the	  tube	  with	  ethanol	  as	  you	  slowly	  add	  0.5	  ml	  of	  cells	  in	  PBS,	  dropwise.	  
9.	  	  Incubate	  on	  ice	  or	  at	  4°C	  for	  at	  least	  30	  minutes.	  At	  this	  point,	  samples	  can	  be	  stored	  in	  the	  refrigerator	  for	  up	  to	  two	  weeks.	  
10.	  	  Make	  an	  appointment	  with	  the	  Flow	  Cytometry	  Facility!	  	  Stain	  cells	  (this	  is	  done	  immediately	  before	  FACS	  analysis)	  1.	  	  Prepare	  propidium	  iodide	  (PI)/Triton	  staining	  solution	  with	  RNAse	  A.	  	  	  Recipe:	  10	  ml	  of	  0.1%	  (v/v)	  Triton	  X-­‐100	  (Sigma)	  of	  PBS	  (Triton	  is	  a	  viscous	  liquid),	  2	  mg	  DNAse-­‐free	  RNAse	  A	  (Sigma),	  200	  microliters	  of	  1	  mg/ml	  PI	  (Molecular	  Probes).	  Prepare	  fresh!	  

2.	  	  Warm	  tubes	  to	  37°C	  for	  5-­‐10	  minutes	  (otherwise	  ice	  crystals	  can	  tear	  apart	  your	  cells).	  
3.	  	  Centrifuge	  the	  ethanol-­‐suspended	  cell	  for	  5	  min	  at	  200	  g	  (=1000	  rpm).	  Decant	  ethanol	  thoroughly.	  

Cell	  Culture	  Guidelines	  	  2	  	  4.	  	  Suspend	  cell	  pellet	  in	  5	  ml	  of	  PBS,	  wait	  about	  1	  min,	  centrifuge	  5	  min	  at	  200	  g	  (=1000	  rpm)	  for	  5	  min.	  Discard	  the	  supernatant.	  	  5.	  	  Suspend	  cell	  pellet	  in	  1	  ml	  PI/Triton	  X-­‐100	  staining	  solution	  with	  RNAse	  A.	  Keep	  in	  the	  dark	  at	  RT	  for	  30	  min	  or	  at	  37oC	  for	  15	  min.	  	  6.	  	  Immediately	  before	  analysis,	  vortex	  each	  sample	  and	  filter	  using	  a	  5	  ml	  polystyrene	  round-­‐bottom	  tube	  with	  cell-­‐strainer	  cap	  (Becton	  Dickinson,	  cat#	  352235).	  Pour	  cell	  suspension	  onto	  the	  cap	  and	  centrifuge	  the	  tubes	  for	  a	  short	  period	  of	  time	  at	  1000	  rpm.	  
7.	  	  You	  are	  ready	  to	  do	  the	  FACS	  analysis.	  	  Cell	  Culture	  Guidelines	  	  3	  	  K562	  cell	  FACS,	  example	  1	  	  Cell	  Culture	  Guidelines	  	  4	  	  K562	  cell	  FACS,	  example	  2	  	  Cell	  Culture	  Guidelines	  	  5	  	  HeLaS3	  FACS	  example	  	  Cell	  Culture	  Guidelines	  	  6	  	  Bionique	  Mycoplasma	  Testing	  Protocol	  Bionique® Testing Laboratories, Inc.
156 Fay Brook Drive
Saranac Lake, NY 12983
Phone: 518-891-2356
Fax: 518-891-5753

Catalog ID: M-250 Multi-media Direct Culture and DNA Fluorochrome Test	  The	  purpose	  of	  this	  test	  is	  to	  determine	  whether	  or	  not	  mycoplasmal	  contaminants	  are	  present	  in	  a	  cell	  culture	  sample,	  be	  it	  a	  primary	  culture,	  hybridoma	  or	  continuous	  cell	  line.	  	  	  Cells	  should	  be	  cultured	  at	  least	  once,	  preferably	  3	  passages	  without	  antibiotics	  &/or	  selective	  agents	  to	  increase	  sensitivity.	  This	  procedure	  combines	  an	  indirect	  DNA	  fluorochrome	  assay	  (see	  M-­‐150)	  to	  detect	  non-­‐cultivable	  mycoplasmas	  with	  a	  direct	  culture	  assay	  utilizing	  three	  mycoplasmal	  media	  formulations.	  
The	  DNA	  fluorochrome	  procedure	  is	  a	  non-­‐selective	  indirect	  DNA	  fluorochrome	  assay	  which	  involves	  the	  inoculation	  of	  a	  1.0	  ml	  sample	  into	  a	  mycoplasmal	  free	  indicator	  cell	  culture	  (VERO),	  incubation	  for	  3	  to	  5	  days,	  then	  performance	  of	  a	  DNA	  fluorochrome	  (Hoechst)	  staining	  assay	  on	  a	  slide	  prepared	  from	  the	  co-­‐incubated	  sample/Vero	  cell	  culture	  (see	  M-­‐100	  CellShipper®).	  This	  assay	  is	  designed	  to	  enhance	  the	  level	  of	  sensitivity	  by	  reducing	  background	  from	  genetically	  unstable	  cell	  lines	  (e.g.	  hybridomas,	  etc.)	  and	  amplifying	  the	  titer	  of	  mycoplasmal	  contaminants.	  Appropriate	  positive	  (<103	  CFU/ml)	  and	  negative	  controls	  are	  processed	  with	  each	  sample.	  	  	  The	  direct	  culture	  procedure	  utilizes	  three	  mycoplasmal	  media	  formulations:	  Fortified	  Commercial	  (FC),	  Modified	  Hayflick	  (MH),	  and	  Heart	  infusion	  (HI)	  broth	  and	  agar	  formulations.	  A	  0.5	  ml	  sample	  is	  inoculated	  into	  6	  ml	  of	  each	  broth	  (FC,	  MH,	  &	  HI).	  A	  0.1	  ml	  sample	  is	  inoculated	  onto	  duplicate	  plates	  for	  each	  agar	  formulation.	  Each	  broth	  is	  subcultured	  onto	  like	  agar	  plates	  on	  Day	  7	  post	  setup.	  The	  agar	  plates	  are	  incubated	  aerobically	  and	  microaerophilically	  and	  examined	  microscopically	  at	  7	  day	  intervals.	  
Appropriate	  positive	  (<	  100	  CFU)	  and	  negative	  controls	  are	  processed	  with	  each	  sample.	  The	  theoretical	  sensitivity	  is	  approximately	  50	  CFU.	  The	  accuracy	  of	  the	  combined	  test	  is	  approximately	  99%.	  Total	  testing	  time	  is	  28	  days.	  	  Cell	  Culture	  Guidelines	  	  7