静電気学会誌，41, 1（2017）39-44

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

マイクロ流路型誘電泳動分離装置を用いたiPS細胞とフィーダー細胞の連続分離
小林 研斗 ，古澤 尚也 ，脇坂 嘉一 ，中島 崇仁
＊

＊

＊＊

，箱田 優

＊＊＊

＊, 1

（2016年9月29日受付；2016年12月7日受理）

Continuous Separation of MEF and iPS Cells Using a Dielectrophoresis
Device with an Inclined Comb-shaped Electrode＊＊

Kento KOBAYASHI , Naoya FURUSAWA ,
＊＊
＊＊＊
＊, 1
Yoshikazu WAKIZAKA , Takahito NAKAJIMA
and Masaru HAKODA（Received September 29, 2016; Accepted December 7, 2016）
In this study, we examined the development of a cell separation device using a dielectrophoresis（ DEP ）phenomenon and the
optimum conditions of the separation device were considered. DEP has two types of N-DEP and P-DEP, it can be controlled
by the frequency of the AC voltage. The advantages of the DEP device are that the device is inexpensive and that a sample canbe used without a label, such as fluorescence. The used DEP device consists of inclined comb-shaped electrodes and a microflow channel. The influences of the applied voltage, frequency and flow rate on the separation were considered. In thisexperiment, the mouse iPS cells and feeder cells（ MEF ）as sample cells were used. As a result of the experiment, themaximum difference of the recovery rate of two kinds of cells was 0.5.

1．はじめに術として近年，注目されている技術である．誘電泳動現

近年，山中らによる iPS 細胞を用いた再生医療などを象を利用した細胞分離では細胞を非染色，非侵襲で分離始め，医療分野の発展が進んでいる．また，医療の発展が可能であること，装置コストが安価といった利点があに伴って，細胞培養や分離・分析操作には高い安全性がる．しかし，分離性能の低さが問題となっている．著者

求められている．

らは，誘電泳動現象を利用した誘電泳動浮揚法を用いて，細胞や生体分子を対象とする従来の分離・分析には，細胞の同定および活性の評価を行った．さらに，誘2-6）レーザーと蛍光標識を利用したセルソータなどの自動細電泳動を利用した分離装置を考案し，異種細胞の分離や胞分析装置が広く使用されている ．セルソータは分離・生死細胞の分離の有効性を明らかにしている

1）

．

7-14）

分析精度が高く，細胞処理速度が非常に速い利点を有し

他の研究者による誘電泳動の分離研究では，サンプルている．しかし，これらの分析装置には，①装置の操作を電極に捕捉する方法であるため，比較的高い分離性能が複雑である ②装置コストが高い ③細胞の染色が必要を達成できるが，連続的な分離操作は不可能であった．

である，などの問題点が挙げられる．

連続操作の研究例としては，供給流量を操作因子として

一方で，誘電泳動現象は細胞の特性評価や細胞分離技

マイクロサイズの粒子の位置を制御するといった研究例が報告されている ．また，本報で使用した装置と類似
15）

キーワード：誘電泳動，マウス iPS 細胞，MEF 細胞＊
群馬大学大学院理工学府（〒376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1）
Graduated School of Science and Technology, Gunma
University, 1-5-1, Tenjin-cho, Kiryu, Gunma, 376-8515,
Japan＊＊
株式会社 AFI テクノロジー（〒602-0841 京都市上京区梶井町 448-5）
AFI Technology Co. Ltd., 448-5, Kajii-cho Kamigyo-ku,
Kyoto, 602-0841, Japan＊＊＊
群馬大学大学院医学研究科（〒371-8511 前橋市昭和町 3-39-22）
Graduated School of Medicine, Gunma University, 3-3922, Showa, Maebashi, Gunma 371-8511, Japan1
hakoda@gunma-u.ac.jp

した櫛歯状電極を用いた研究では，細胞の分離よりも分析に特化した研究が多い．

16-19）

そこで，本報では，傾斜櫛歯状電極を有した誘電泳動分離装置を用いて連続的な分離を行い，分離性能を向上させる実験条件の検討と将来の医療分野で使用可能な装置であるかの検討を行った．iPS 細胞は将来の再生医療において，様々な細胞への分化が可能なことから注目されている．しかし，iPS 細胞の培養にはフィーダー細胞と共培養することが必要である．そこで，マウス iPS 細胞とフィーダー細胞である MEF 細胞との 2 細胞を実用的なサンプルとして検討を行った．

静電気学会誌 第41巻 第 1 号（2017）40

2．誘電泳動現象の原理

3.2 傾斜櫛歯状誘電泳動分離装置

誘電泳動現象（ DEP ）とは，不均一電場における粒子

本実験では傾斜櫛歯状電極を設置した誘電泳動分離デと周囲媒質の誘電率，電場勾配により粒子が泳動する現バイス（㈱ AFI テクロノジー）を用いた．使用したデ象のことである．誘電泳動力は印加する電場の大きさとバイスのイラスト図を図 （2 a）に，実際のデバイスを（b）

周波数および粒子と周囲媒質の誘電率に依存する．

に示す．本デバイスは表 1 に示された 2 つのタイプのデ媒質より粒子の誘電率が大きいとき，粒子は強電場側に泳動し（正の誘電泳動；P-DEP ），粒子より媒質の誘バイスを用いて実験を行った．いずれも合流部分の流路
幅は 1.5 mm である．

電率が大きいとき，粒子は弱電場側へ泳動する（負の誘電泳動；N- DEP ）．
誘電泳動を受ける力 FDEP は以下の（1）式から求めることができる．
（1）
ここで，r は粒子半径 ，ε m は周囲媒質の誘電率，Re［K（ω ）］は Clasuius-Mossotti 関数の実部，∇E は電場勾配で2ある．
粒子の挙動を示す電極断面図を図 1 に示す．薄膜電極
間に交流電圧を作用させると，粒子は N-DEP あるいはP-DEP を受けて泳動する．

図 2 （ a ）傾斜櫛歯状電極デバイスのイラスト図（ b ）傾斜櫛歯電極デバイス
Fig.2 （ a ）Illustration of the inclined comb-shaped electrodedevice.
（ b ）Actual view of inclined comb-shaped electrode device.
表 1 2 つのデバイスの各パラメーター
Table 1 Each parameter of the two devices.

図 1 電極断面図
Fig.1 Electrode cross-sectional view.

3．実験方法と手順
3.1 各細胞の培養
本実験ではサンプル細胞としてマウス iPS 細胞とフィEach parameter
Distance between electrodes［ µm ］
Electrodes width［ µm ］
Angle of inclination［°］
Electrodes thickness［ nm ］
Channel height［ µm ］
Number of electrodes［ - ］

Device Ⅰ
50
100
15.26
100
25
16

Device Ⅱ
25
100
15.26
100
50
16

ーダー細胞であるマウス胎児線維芽細胞（ MEF 細胞）を用いた．フィーダー細胞とは増殖や分化を起こさせよ

3.3 実験装置および評価方法

うとする目的の細胞の培養条件を整えるために用いら実験装置全体図は図 3 の構成で実験を行った．本実験

れ，補助役を果たす細胞を指す． MEF 細胞の培養には，

方法は，まずシリンジポンプ（780100J，KD SCIENTIFIC ）DMEM（ RNBF2905，SIGMA ）に 10％ FBS と硫酸ストを用いて流量設定を行う．そして一定流量で細胞懸濁液，

レプトマイシン（ PGLD，Meiji Seika ファルマ株式会社）

周囲媒質をデバイス内へと供給した．デバイス電極部に100 mg/l およびペニシリン G カリウム（ SSDN，Meiji

フ ァ ン ク シ ョ ン ジ ェ ネ レ ー タ ー（33220A，Agilent

Seika ファルマ株式会社）100 U/ml を 1％添加した培地を使用した． マウス iPS 細胞の培養には，MEF 細胞と同様の 500 ml 培地に細胞の増殖や生命活動の補助剤として NEAA（ RNBF1070，SIGMA ） を 5 ml， モ ノ チ オ グ
リセロール 0.5 ml ，未分化の状態に保持するための分化抑制剤として LIF（199-16051，Wako ）0.5 ml 添加した培地を使用した． いずれの細胞も培養は 3 日間とし，毎日培地交換を行い，コンフルエントとなった状態で実験に使用した．また，37℃，5％ CO2 インキュベーターで培養を行い，細胞は群馬大学医学部より提供された．

図 3 実験装置全体図
Fig.3 Experimental apparatus overall view.

マイクロ流路型誘電泳動分離装置を用いたiPS細胞とフィーダー細胞の連続分離（小林 研斗ら）

41

Technologies ）によって設定した周波数，交流電圧を印ス iPS 細胞とフィーダー細胞（ MEF ）の誘電泳動力と加した．電極部分で細胞が誘電泳動を受けている様子は

周波数の関係を測定し，誘電泳動力に及ぼす周波数の影

CCD カメラ（ Inf-500SG，Moritex Co. ）を用いて観察し，

響を図 5 に示す．
図 5 より，マウス iPS 細胞と MEF 細胞の誘電泳動力

同時にパソコンで動画を保存した．
傾斜櫛歯状電極部に交流電圧を印加することで細胞にの 差 が 最 も 大 き い の は 300 kHz で あ っ た．300 kHz は

誘電泳動を与え，細胞の偏向を行った．まず，実験装置

P-DEP の領域内であり，N-DEP の働く領域として 10 kHz

Ⅰで周波数を変化させた場合の実験を行った．誘電泳動を設定して実験を行った．細胞種によって周波数特性が現象には強電場側へ引きつけられる正の誘電泳動

異なる理由は，形状や細胞膜や細胞質などの組成が異な（P-DEP）と弱電場側へ反発する負の誘電泳動（ N-DEP）

り，誘電率に差があるためである．

の 2 種類があり，周波数によって制御することが可能である．
実験に使用した細胞の調整方法は，iPS 細胞と MEF のいずれにおいても付着しているディッシュから 0.05％ト
リプシン処理を施し，細胞を取り出し，細胞濃度 0.5 ×
10 cells / ml となるように濃度調整を行った．
6

また，本実験の評価方法としては，パソコンによって保存した動画から各出口（ A，B，C ）の細胞をカウントした．
そして各出口での回収率は以下の式を用いて算出した．
測定位置は傾斜櫛歯電極の終点を測定領域と設定した．
回収率 =（各出口の細胞数）/（全出口の細胞数） （2）
図 5 マウス iPS 細胞と MEF 細胞の誘電泳動力に及ぼす周波数の影響
Fig.5 Effect of dielectrophoretic force on frequency of mouse iPS
cells and MEF cells.

4．実験結果及び考察
4.1 電場印加時の粒子の挙動
本装置において粒子が誘電泳動を受ける様子を図 （
4 a）
および（b）に示す．粒子挙動の観察には 10 µm ポリスチ
レンビーズを使用した．実験条件は周波数 1kHz ，印加
電圧 6 Vpp である．

4.3 マウスiPS細胞とMEFの回収率に及ぼすP-DEP，
N-DEPへの影響
誘電泳動による分離の最適操作条件を明らかにするた

図（4 a）
は電圧印加前，（b）は印加後であり，電圧を印

め，P-DEP と N-DEP によるマウス iPS 細胞と MEF 細胞

加する前の細胞は流路を分散して流れているが，電圧をの分離実験に関してデバイスⅠを用いて行った．周波数

印加することにより誘電泳動を受ける細胞は傾斜櫛歯状

300 kHz，細胞懸濁液側流量 1.5 µl/min の実験条件におけ電極に沿って矢印の方向へ泳動している．

る P-DEP の分離結果を図 6 に示す．
図（6 a）はマウス iPS 細胞と MEF 細胞の各 Outlet の回収率に及ぼす印加電圧の影響を示す．マウス iPS 細胞とMEF 細胞の Outlet A での回収率は太線でプロットした．
図（6 a）の結果より，電圧を印加しない場合（0 V ）ではデバイスに入った細胞の大部分は Outlet C から流出している．また，印加電圧を高くすることで，Outlet A および Outlet B での回収率が増加する結果となった．印加電
圧 6 Vpp では iPS 細胞と MEF 細胞の両細胞の回収率がピ

図 4 電圧印加（ a ）前，（ b ）後
Fig.4 （ a ）before applied voltage,（ b ）after applied voltage.

ークとなった．また，図 （6 b）は Outlet A と B の合計をグラフに示した結果である．図 （6 a），（ b）より，マウス
iPS 細胞と MEF 細胞のいずれも誘電泳動を受け泳動方

4.2 iPS細胞とMEF細胞の誘電泳動力に及ぼす周波数の影響実験を行うにあたり，誘電泳動浮揚法

向が変化する結果を得た．しかし，両者が誘電泳動を受けているために，2 細胞の回収率の差は小さい結果とな

6）を用いてマウっ た．P-DEP を 用 い た 結 果 よ り， マ ウ ス iPS 細 胞 と静電気学会誌 第41巻 第 1 号（2017）42

図 6 P-DEP（300 kHz ）における回収率（ a ）各 Outlet（ b ）Outlet A+B に及ぼす印加電圧の影響
Fig.6 Effect of applied voltage on recovery ratio（ a ）each Outlet（ b ）Outlet A+B in P-DEP.

図 7 N-DEP（10 kHz ）における回収率（ a ）各 Outlet（ b ）Outlet A+B に及ぼす印加電圧の影響
Fig.7 Effect of applied voltage on recovery ratio（ a ）each Outlet（ b ）Outlet A+B in N-DEP.

MEF の回収率の差が低いこと，MEF は電極部での細胞け難く，多くの細胞が Outlet C へ回収することを目的と付着が生じることが明らかとなった．

して，デバイスⅡでは流路高さを高く改良した．

次に N-DEP となる周波数 10 kHz における実験結果をまた，細胞懸濁液側，周囲媒質側の流量は同量に設定

図 7 に示す．実験条件は周波数 10 kHz，細胞懸濁液側流した．流量における MEF の回収率に及ぼす流量の影響

量 1.0 µl/min である．

を図 8 に示す．実験条件は周波数 10 kHz，図（a）は流量図（7 a）
はマウス iPS 細胞と MEF 細胞の各 Outlet の回

1.5 µl/min，（ b）は 2.0 µl/min，（ c）は 2.5 µl/min で あ る．

収率に及ぼす印加電圧の影響を示す．印加電圧 9 Vpp で

この流量は，細胞懸濁液側，周囲媒質側の片側の流量をは iPS 細胞と MEF 細胞の両方で回収率がピークになっ記述した．

た．また，図 （7 b）は Outlet A と B の合計をグラフに示

図 8 の結果から，流量 2.0 µl/min の条件で最も Outlet A

した結果である．図 （7 a）および（b）より，N-DEP を用いでの回収率が高い結果を得た．図 （8 b）の 2.0 µl/min の条

た場合も P-DEP と同様に，マウス iPS 細胞の方が MEF

件では印加電圧 6 Vpp でピークとなり，約半数の MEF がと比較すると Outlet A および B で回収される割合が高い

Outlet A 側 へ 誘 電 泳 動 を 受 け た こ と が わ か る． ま た，

結果となった．

7 Vpp 印加時で Outlet C が急激に増加した理由は，負の誘

N-DEP を用いた場合，電極部での細胞付着を抑え，マ電泳動を使用した場合でも入口付近の電極部で細胞付着

ウス iPS 細胞と MEF の回収率の差を大きくできることが顕著に見られ，初期段階において高電場により死細胞が示された．

もしくは活性が低下した細胞が誘電泳動を受けずに

4.4 MEF細胞の回収率に及ぼす流量の影響

Outlet C で回収されたためと考えられる．

MEF 細胞の回収率に及ぼす流量の影響についてデバ

流量が遅い場合では，細胞が誘電泳動を受ける時間が

イスⅡを用いて検討を行った．なお，デバイスⅡでは電長くなるために，Outlet A での回収率が増大すると考え極間距離を 50 µm から 25 µm に，流路高さを 25 µm かたが，図 （8 a）のように流量を遅く設定した場合でも回

ら 50 µm へ改良した．デバイスⅠでは iPS 細胞，MEF

収率の増加は認められなかった．これは，N-DEP を用の両者に誘電泳動が働いており，2 細胞の回収率の差をいた場合でも少なからず細胞付着が生じてしまうためで大きくするためには片方の細胞が誘電泳動を受け難い装あった．

置形状にする必要があるため，iPS 細胞が誘電泳動を受

図（8 c）のように流量を大きくした場合では細胞の誘マイクロ流路型誘電泳動分離装置を用いたiPS細胞とフィーダー細胞の連続分離（小林 研斗ら）

43

図 9 印加電圧と回収率の（ a ）各 Outlet（ b ）Outlet A+B での関係
Fig.9 Relationship between applied voltage and recovery ratio（ a ）each Outlet（ b ）Outlet A+B .

4.5 MEF細胞の回収率に及ぼす流量比の影響
前述の結果は，細胞懸濁液と周囲媒質の流量比が 1：1 で
図 8 MEF の回収率に及ぼす流量の影響
Fig.8 Effect of flow rate on recovery ratio of MEF.

あったが，本条件は流れをより制御するために周囲媒質側と細胞懸濁液側の流量比を 2：1 に設定した．媒質側流量を細胞懸濁液側流量の 2倍にすることにより，誘電泳動が作

電泳動力よりもデバイス内の流れの力が勝ったために A

用しない場合では細胞懸濁液は Outlet C で回収され，Outletと B の回収率が低い結果であったと考察した．

A および B には回収されないことが推測され，誘電泳動の供給流量に対して印加電圧が大きすぎると，細胞への効果が顕著に現れることを想定して流量比を変更した．

ストレスや電極付着を生じてしまい，供給流量が大きす

回収率に及ぼす結果を図 10 に示す．実験条件は周波ぎると，細胞は誘電泳動を受けずに流れてしまうことが数 10 kHz，細胞懸濁液側の流量 1.5 µl/min，周囲媒質側

明らかとなった．以上の結果より，細胞が誘電泳動力との流量は 3.0 µl/min である．

流体から受ける力とのバランスの取れる条件が存在し，回収率が高くなることが示唆された．

図 10（a）の結果より，6 Vpp 印加時が Outlet A および B
において MEF 細胞と iPS 細胞の回収率の差が最も大き

次に，MEF およびマウス iPS 細胞の 2.0 µl/min におけい結果となった．また，流量比を変化させることで図 9る実験結果を図 9 に示す．周波数は 10 kHz を設定した．

の結果と比較し，より多くの MEF 細胞が Outlet A で回図（9 a）の結果より，6 Vpp 印加時が Outlet A および B で収される結果となった．これは流量比を変化させたことの回収率の差が最も大きい結果となった．また，マウス

で入口では，細胞懸濁液が Outlet C 側を流れるため，誘iPS 細胞の Outlet A での回収率は低い結果となり，印加電泳動を受けにくい iPS 細胞が Outlet A，B に泳動しな電圧を変えてもほとんど回収率に差はみられなかった．

かった．そのため，MEF は誘電泳動を受け，Outlet A 側

MEF の回収率に及ぼす流量の影響で明らかとなったよへ泳動したためであると考察した．図 10（a）のOutlet A

うに，誘電泳動力と流体から受ける力とのバランスを取のみの結果では 2 細胞の回収率の差は，約 0.5 であり最るような条件が存在し，その条件では回収率の向上が見大であった．この結果から，流量比の影響も分離に影響込めることが明らかになった．

を与え，分離性能の向上が見られた．

静電気学会誌 第41巻 第 1 号（2017）44

for Stem Cells. Key Engineering Materials, 459（2011）84
5） M. Hakoda, Y. Hirota: Correlation between Dielectric Property
by Dielectrophoretic Levitation and Growth Activity of Cells
Exposed to Electric Field, Bioprocess. Biosyst. Eng., 36（2013）1219
6） O. Kobayashi, Y. Umezawa, S. Kanai and M. Hakoda:
Analysis of electrical property of the animal cell using
dielectrophoresis levitation. Key Engineering Materials, 534

図 10 印 加 電 圧 と 回 収 率 の（ a ） 各 Outlet（ b ）Outlet A+B
での関係
Fig.10 Relationship between applied voltage and recovery ratio（ a ）each Outlet（ b ）Outlet A+B.

5．結言
傾斜櫛歯状電極を有した誘電泳動分離装置におけるマ
ウス iPS 細胞と MEF の実験から以下の知見が得られた．
（1）P-DEP と N-DEP の結果の比較より，N-DEP を使用することにより電極部での細胞の付着を抑えられることが明らかとなった．
（2）細胞の連続分離においては誘電泳動力と流体から受ける力とのバランスを取る条件が存在し，電極部に付着することなく，分離が行える最適条件が明らかとなった．
（3）流量比などのパラメーターを変化させることで異種細胞の誘電泳動力に影響を与え，分離性能を上げることができた．
参考文献
1） 静電気ハンドブック：静電気学会編 p.841，オーム社，（1988）
2） M. Hakoda, T.Hachisu, Y.Wakizaka, S.Mii, N.Kitajima :Development of a method to analyze single cell activity byusing dielectrophoretic levitation. Biotechnology progress, 21（2005）1748
3） 廣田祐輔，箱田 優：ラット間葉系幹細胞の分化活性と誘電泳動浮揚法による誘電特性の関係．静電気学会誌，
34［1］（2010）84） Y.Hirota, M. Hakoda: Relationship between Dielectriccharacteristic by DEP Levitation and Differentiation Activity（2013）93
7） Y. Wakizaka, M. Hakoda, N. Shiragami: Effect of Electrode
Geometry on Dielectrophoretic Separation of Cells. Biochem.
Eng. J., 20［1］（2004）13
8） Y. Wakizaka, M. Hakoda, N. Shiragami: Numerical Simulationof Electrode Geometry and Its Arrangement ofDielectrophoretic Filter for Separation of Cells. J. Chem. Eng.
Japan, 37［7］（2004）908
9） 箱田 優，脇坂 嘉一，三井 信一，北島 信義：生死細胞分離のための誘電泳動フィルターの開発．静電気学会誌，29［1］（2005）8
10）箱田 優，十枝内 元子，脇坂 嘉一：“細孔絶縁膜付
き誘電泳動デバイスによる細胞の連続分離”，静電気学
会誌．30［3］（2005）140
11） Y. Hirota, M. Hakoda, K. Wakizaka: Separation characteristicof animal cells using a dielectrophoretic filter. Bioprocess andBiosystem Eng., 33（2010）607
12）M. Hakoda, Y. Wakizaka, Y. Hirota, N. Kitajima: Separation of
viable cells and nonviable cells using dielectrophoretic filter.
Biotechnology Progress, 26［4］（2010）1062
13）M . H a k o d a , T. O t a k i : A n a l y t i c a l C h a r a c t e r i s t i c o f
Chromatography Device Using Dielectrophoresis Phenomenon.
Key Engineering Materials, 497（2012）87
14）Y. Umezawa, O. Kobayashi, S. Kanai and M. Hakoda:
Development of particle packed bed type chromatographyusing Dielectrophoresis. Key Engineering Materials, 534（2013）8815）B. Mathew, A. Alazzam, G. destgeer and H. J.Sung:
Dielectrophoresis based cell switching in continuous flow
microfluidic devices. Journal of Electrostatics, 8（2016）463
16）W. Zewen, L. Xueming, Z. Deyao, Y. Hao, H. Zhiyuan, L.
Zicai, L. Zhihong: Flow through cell electroporation microchip
integrating dielectrophoretic viable cell sorting, Anal. Chem,
86（2014）10215
17）T. Horii, M. Yamamoto, T. Yasukawa, F. Mizutani :Rapid
formation of cell particle complexes via dielectrophoretic
manipulation for the detection of surface antigens. Biosensors
and Bioelectronics, 6（2014）215
18）C.J. Maria, H. Mario, M.A. Juan, H.C. Antomi, S. Josep, T.
Eduard, J. Antonio: Dielectrophoresis chips improve PCR
detection of the food-spoiling yeast. Electrophoresis, 36（2015）1471
19）K. Myonggon, J. Taekeon, K. Youngjin, L. Changgeun, W.
Kyungchul, H. Jae, Y. Sung: A microfluidic device for labelfree detection of Escherichia coli in drinking water using
positive dielectrophoretic focusing, capturing, and impedance
measurement. Biosensors and Bioelectronicd, 74（2015）1011