内殻励起による DNA 塩基ラジカル生成機構
横谷明徳

日本原子力研究所先端基礎研究センター放射線 DNA 損傷機構研究グループ〒3191195 茨城県那珂郡東海村白方白根 24

要旨
放射線により DNA 分子中に生じる塩基の酸化的損傷の前駆体を明らかにするため，我々は SPring-8 の軟 X 線ビームライン（BL23SU）に設置された電子常磁性共鳴（EPR ）装置を用いて，酸素及び窒素吸収端領域における DNA 塩基ラジカルの生成機構について調べている。DNA 塩基のひとつであるグアニン塩基に対する EPR の“その場”測定から，ビーム照射時にのみ現れる短寿命のラジカルが生成することが見出された。このラジカルはグアニン中にただひとつ共鳴によりその収率が顕著に増えた。一方ビーム照射を停止しても残存するしかない酸素（カルボニル酸素）の 1s→s
安定なラジカルも生成し，これは g 線照射などで既に報告されているグアニンカチオンラジカルと推定された。このカチオンラジカルは短寿命ラジカルとは異なり、酸素の 1s→s共鳴により逆に収率が減少した。以上の結果から，オージェ終状態からさらに競争的にこれら二つのラジカル過程を経て化学的に安定なグアニン損傷に至ることが示された。

.

はじめに私たち生体は，宇宙線や地上の放射性同位元素の崩壊による放射線など，環境から絶えず微量の放射線を浴びている。このため，細胞内の遺伝子（DNA 分子）に不可逆的な化学変化（損傷，Fig. 1）が生じるが，生命が進化の過程で獲得した DNA 損傷の修復機能という防御システムによりこれら損傷が極めて効率よく無害化されることが知られている。修復は DNA 修復酵素と呼ばれる，一群のタンパク質によって行われている。しかしごくまれに，この生体の防御システムでも除去できない DNA 損傷があり，これが原因で突然変異や発ガンといった重大な遺伝的影響が起こると推測される。遺伝的影響の度合いを正確に予測することは，前述した環境からの低線量放射線の影響，あるいは放射線医療の最適化という観点から，最近その重要性が特に指摘されている。
正確に放射線影響の度合いを知るためには，どのようなFigure 1.

DNA damages induced by ionizing radiation.

DNA 損傷が酵素的に修復され，あるいは修復を受け難いかをまず明らかにする必要がある。これまでの研究では，DNA の鎖が完全に切れてしまう，いわゆる DNA 1 本鎖“修復され得るかと 2 本鎖切断（SSB; Singl strand Break と DSB; Double

損傷の化学構造及び安定な損傷に至るまでの反応を明らか

strand break）が最も重要な損傷とされ，細胞致死作用とにすることが重要である。

され難いか”の境界を決める DNAの因果関係などについて一定の知見が得られてきた。しか1980 年代以降，DNA 分子上に近接して（数 nm 以内）し致死に至った細胞はそこで寿命が尽きるため，我々のよ複数の損傷がクラスター化して生じるた不可逆的な化学変

うな多細胞生物の場合，失われた細胞があっても生き残っ化（以下クラスター DNA 損傷）が修復されにくい損傷とている細胞が細胞分裂してその数を回復すれば，個体そのして提案されてきた1,2)。しかし，その化学構造などの実ものに対するその後の影響はほとんどないと考えられる。

体はほとんど明らかにされてこなかった。我々の最近の研また最近の研究から， DSB が生じても DNA の切断端を究により，DNA を取り囲む水和水を制御しながら OH ラ効率よく再結合させる修復経路（非相同的末端結合や相同ジカルなどの間接効果を抑制した条件下で DNA に a 線や的組換え等）があることが急速に明らかになりつつある。

g 線などの放射線照射すると，8oxoグアニンなどの酸化突然変異や細胞のガン化は，むしろ生き残った細胞の遺伝的塩基損傷とこれを含むクラスター DNA 損傷が高い収率的な性質の変化が問題となるのである。突然変異や細胞ので生じることが，グリコシレースと呼ばれる酸化的塩基損ガン化のメカニズムを解明するための第一歩としては，傷の修復酵素タンパク質（Fpg, EndoIII）をプローブとしMay 2004 Vol.17 No.3 ● 111(C) 2004 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

て用いる研究によって突き止められた3,4) 。これまで塩基損傷は， DNA の鎖切断（ SSB や DSB ）に比べて注目の度合い少なかったが，実際には放射線の直接作用によりSSB の 3 倍もの量が生じていることも明らかになった。
現在，人工的に合成した塩基損傷を含むオリゴヌクレオチドに対する修復度合いを調べるための生化学的な研究が盛んに行われているが57) ，損傷生成に至る物理化学的なプロセスに関しては，OH ラジカルなど一部の活性酸素による反応8)を除けばほとんど明らかにされていない。我々のグループでは DNA 損傷の生成メカニズムを解明するた
め，軟 X 線領域の放射光を用いて DNA 関連分子のラジカルやイオンを測定する分光学的な研究を行っている。

DNA からの脱離イオンの測定及び鎖切断機構について
は，共同研 究者の藤井 が本誌です でに紹介し ているのFigure 2. Schematic diagram of oscillator strength distribution of
DNA molecule and virtual photon spectrum by irradiating with 3.3
MeV a-particles.

で9)，興味のある方はそちらを参照されたい。本稿では，SPring-8 の軟 X 線ビームライン（ BL23SU ）に設置された電子常磁性共鳴（ EPR ）装置を用いて我々が最近行ってきた，DNA 塩基ラジカルの“その場”測定により得らN(E)∞れた知見について紹介する。
.

放射光軟 X 線を利用した DNA 損傷過程の研究(df/dE)E(4 )となり，これらの考え方は光学近似（ optical approxima-

一般に我々が日常浴びる可能性がある放射線は，環境やtion ） と 呼 ば れ る10) 。 こ の よ う な 光 学 近 似 に 基 づ き ，医療（診断治療）に用いられる a 線などの高エネルギー

DNA の振動子強度分布と3.3 MeV の a 線が衝突した場合の粒子線や硬 X 線であり，数 keV 以下の軟 X 線を浴びるの仮想光子のスペクトルを概念的に表したのが Fig. 2 で可能性はほとんどない。我々がなぜ DNA 損傷の研究に軟ある。振動子強度分布は主に VUV 領域に極大を持ち，こX 線領域の単色放射光を用いているのかについて，まずの領域では主に分子の価電子励起電離が生じる。 DNA

簡単に説明する。

鎖 切 断 の 量 子 効 率 の 測 定11) な ど 多 く の VUV 領 域 で の荷電粒子などのイオン化放射線と分子の相互作用は，電磁気的な現象である。 DNA などの分子のごく近傍を，ガDNA 損傷研究が，第 1 ，第 2 世代の放射光を利用し数多くなされて来た。

ンの放射線治療などで用いるような高いエネルギーのイオ

しかし，100 eV 以上の軟 X 線領域での研究は極めて少ンが通過（衝突）すると，そのエネルギーは分子内の電子ない。この領域では VUV に比べ， DNA の振動子強度も励起や振動，回転励起に使われる。実際の分子の励起はとだいぶ小さくその結果励起分子数，N(E) も少ないと考えても複雑である。そこでこれを数学的に取り扱えるようにられるが， DNA を構成する主要な元素である炭素，窒するため， Platzman は特定の励起を考える代わりに振動素，酸素及びリンの内殻レベルの吸収帯（ K 吸収端）が子 s （振動数 ns に対してそのエネルギーは E ＝ hns ）の励存在することが大きな特徴である。この励起に伴う内殻正起を考え，各振動子の励起確率の総和が分子内の全電子数

孔は Auger 緩和するが，分子の解離と競合して起こる場に等しくなるように規格化された振動子強度 fs という概合もある。さらには，放出された Auger 電子やイオンな念を導入した10) 。一方荷電粒子の通過に伴う電場の時間どによる隣接官能基の損傷といった複雑な過程を経るた変化には主に粒子の進行方向に対する垂直成分が寄与し，め， VUV 領域での価電子励起とは異なる，クラスター

この振動数分布は最大振動数（荷電粒子の運動エネルギー）

DNA 損傷（＝修復され難い損傷）が生じると予想される。に至るまで，全ての区間でほとんど一定となる。これは振動数区間内のエネルギーの総和が等しくなるように，荷電粒子と分子の間で「仮想光子（virtual photon）」がやりと.

アン ジュレータ軟 X 線ビームラ インに設置 されたEPR 装置りされると考えることができ，その光子数 nn は 1 / hn に一般に放射線が照射された DNA 分子は，不対電子を持比例する。言い換えると DNA 近傍を通過する荷電粒子のつ非常に化学的に活性の強い DNA ラジカルを経て安定な作用は，振動数分布が 1/hns＝1/Es に比例する「白色光」

損傷に至ることが知られている8) 。このようなラジカルの照射と近似的に見なせることを意味する。粒子の通過には，電子常磁性共鳴（ EPR ）装置を用いることで観測で伴い状態 s に励起される分子の数 Ns は，振動子強度分布きる。 EPR 装置はラジカルが持つ常磁性を利用するもの

が連続分布の場合，で，外部磁場により生じたエネルギー準位の差（Zeeman112 ● May 2004 Vol.17 No.3

生命科学特集 ■ 内殻励起による DNA 塩基のラジカル生成機構

Figure 3. Illustration of the EPR apparatus installed in BL23SU in SPring-8. The vacuum chamber, in which the microwave cavity is installed, is mounted at the center of the magnet gap (see top view). The chamber is connected to the beamline vacuum pipe at both the front and the rear.

分裂）に相当するマイクロ波の吸収スペクトルを測定す

Table 1.

る。試料は通常，マイクロ波空洞共振器の内部に設置されLight source

Variably polarizing undulator

るため，試料に放射線を照射しようとすると照射用の窓を

Monochromator

Varied-line-spacing plane gratings(600 and 1000 lines/mm )a＋b＝176 and 174°るためには，共振器にあける窓はなるべく小さくすること

Photon ‰ux－1011 photon/sec at 0.5 keVが望ましいが，一般の X 線源のような発散が大きいビー

Photon energy
E/DE0.4～1.8 keV～104 at 0.5 keVX-band, 8.89.6 GHz

Parameters of BL23SU and the EPR apparatus

空洞共振器に設ける必要がある。マイクロ波の損失を抑えムでは技術的に非常に困難である。これまでの EPR を使う研究では，液体窒素ヘリウム温度で試料に放射線を試料に照射し，その後低温に保ちながら EPR 室まで運搬し測定を行うのが通常の方法であった。しかしこの方法では，低温でも寿命の短いラジカルは，運搬の途中で消滅しMicrowave
Maximum magnetic ˆeld
Temperature control
Pressure in vacuum chamber

1.4 T
10300 K by a closed-circularcryogenic system～10－ 6 Paてしまい，検出にかからない可能性がある。
我々は，窒素及び酸素 K 吸収端付近の軟 X 線放射光を仮想光子を供給するためのモデル光源として用い，世界でmm ），測定中のマイクロ波の損失を極力抑えることがでも初めての試みとして，放射光ビームラインに直接接続しきた。軟 X 線は空気中で極めて早く減衰してしまうた

た EPR 装置を開発した（ Fig. 3 )12) 。これは SPring-8 のめ，マイクロ波共振器全体が真空チェンバーに挿入され，ような第 3 世代の放射光光源により，極めて小さい光源ビームラインの真空と接続されている。1 mm (v)× 2 mm

サイズ及びビームサイズ特性が実現されたことで初めて可(h) に細く絞られたビームは，共振器に開けられた直径10能になったものである。本装置では，その心臓部であるマmm の窓を通して真空中で試料に照射される。He 循環にイクロ波キャビティーの側面に設けるビーム導入のためのよる温度制御装置で，試料の温度は 10 K まで低温にする窓や磁場にモジュレーションをかけるためのコイルの間隙ことができる。

を十分に小さくすることができるため（一番狭い場所で 7EPR 装置は，日本原子力研究所の専用軟 X 線ビームラ

May 2004 Vol.17 No.3 ● 113

イン（BL23SU ）に挿入された。このビームラインは，偏DNA 分子内の他の部位で正孔が生じた場合でもグアニン光可変のアンジュレータを挿入光源とし，不等刻線間隔平まで移動し，最終的にグアニン損傷を形成することが最近面回折格子を分光器として備え，極めて高いエネルギー分報告され，注目を集めている14) 。我々はまず，直接放射解能と明るさを両立させたビームラインである13) 。この線のエネルギーがグアニン分子内にただ 1 つあるカルボ

EPR 装 置 及 び 試 料 位 置 で の ビ ー ム の 基 本 的 な 特 性 をニル酸素に付与された場合のラジカル過程に着目した。軟

Table 1 に示した。

X 線照射により初めて観測された，グアニンのペレット.

酸素及び窒素の K 殻励起による短寿命のグアニン

空中及び77 K の条件で軟 X 線を照射した場合，照射時に塩基ラジカルのみ観測される極めて短寿命のラジカルが現われた（Fig.

を試料としたときの EPR スペクトルを Fig. 4 に示す。真

この装置を使って，DNA 塩基のうちの 1 つであるグア4 中の矢印）。この短寿命のラジカルのスペクトルを拡大ニンのラジカルの“その場観測”を行った。グアニンは，すると（Fig. 5 ），EPR のマイクロ波飽和特性が異なる 2

A, T, G 及び C の 4 塩基の中で最もイオン化エネルギーつのコンポーネントからなり（Fig. 5 中の a 及び b），ビーが 低 い 。 こ の た め DNA 分 子 中 で 酸 化 を 受 け や す く ，Figure 4. EPR spectra of guanine during irradiation with ultrasoft
X-rays (539 eV) at 77 K (a), and just after exposure (b). The
microwave power was 200 mW and the width of the magnetic ˆeldmodulation of 100 kHz was 0.5 mT.

Figure 5. EPR spectra of guanine obtained during irradiation withultrasoft X-rays around the oxygen K-edge (525, 539 and 550 eV) at
77 K. The microwave power was 200 mW and the width of the magnetic ˆeld modulation of 100 kHz was 0.07 mT.

Figure 6. Ultrasoft X-ray energy dependence of the yield of the short-lived guanine radical. The intensity of peak a (seeFigure 5) is plotted against the photon energy around (a) the oxygen and (b) the nitrogen K-edge region (solid line). The
intensity was normalized by the incident photon ‰ux. The X-ray absorption near edge structure (XANES) shown by a
dot line is reproduced from Fujii et al.

114 ● May 2004 Vol.17 No.3

生命科学特集 ■ 内殻励起による DNA 塩基のラジカル生成機構

Figure 7.
oxygen.

Schematic illustration of the participant, spectator and normal Auger processes in the guanine carbonylFigure 8.

Schematic illustration of the short-lived guanine radical formation after resonant Auger process.

ムを切っても残る安定なラジカルのそれ（ Fig. 4, b ）と子軌道へ共鳴励起する様子を Fig. 7 に模式的に示す。軟は明らかに区別された。

X 線のエネルギーを変えると，励起先及び Auger 緩和に

次に軟 X 線のエネルギーを少しずつ変えながら，短寿よる終状態も変わる。p, s及びイオン化閾値以上のエネ命のラジカルの強度を測定した。酸素の K 殻を励起するルギーで，それぞれ Participant ， Spectator 及び Normal

539 eV の照射により短寿命ラジカルの信号強度は大幅にと呼ばれる Auger 緩和が起こると考えられる。 s電子は増感し， K 吸収端低エネルギー側（ 524 eV ）の場合のそ時間の経過とともに自動電離すると予想される。しかし不れの 5 倍以上であった（ Fig. 6, a )15) 。 539 eV の軟 X 線

対電子として EPR で観測されるためには，価数は 1 価で照射では分子中にただ 1 つあるカルボニル酸素の 1s 電子なければならない。今回観測されたグアニンの短寿命ラジの O ＝ C 結合を構成する s反結合軌道への励起と，これカルは，自動電離したほとんど運動エネルギーがゼロに近に続く Auger 緩和が起きることが予想される16)。一方 p

いような電子が，元の分子イオンに再捕獲された結果生じへの励起が起こると考えられる 531 eV では，大変に興味たラジカルであると推測される（Fig. 8）。

深い事に EPR シグナルの増感はほとんど起こらなかった。さらに，窒素原子はグアニン分子環中に 5 つあるの.

安定なグアニンカチオンラジカルにも関わらず，窒素の K 吸収端（ 401 eV ）の近傍では短ビーム照射を停止しても観測される安定なラジカルに由

寿命ラジカルの EPR 信号強度は酸素 s励起した場合のそ来するスペクトル（Fig. 4, b）は，既に報告されている gれに比べ全体に小さいことも明らかになった（吸収断面積線を照射した時に観測されるスペクトル17) と似ているこで規格化すると～1/10以下である）（Fig. 6, b）。
以上の結果から，グアニン損傷のラジカル過程にカルボとから，グアニンカチオンラジカル（Fig. 9）と推測された。このラジカルについて，酸素の 1s→s励起（539 eV）

ニル酸素の K 殻共鳴励起が大きな役割を果たしている可及び K 吸収端低エネルギー側（524 eV ）の二つのエネル能性が示された。酸素 1s 電子が O ＝ C 結合を形成する分ギーを照射した際の，照射時間に対する収量の増加を調べ

May 2004 Vol.17 No.3 ● 115

あるグアニンの軟 X 線照射により生成するラジカルを“その場”測定により調べた。その結果，これまで観測されたことのないビーム照射中にのみ現れる短寿命のラジカルが生成することを見出した。さらにこのラジカルは，グアニン分子中のカルボニル酸素の 1s → s励起によりその収量が増大することもわかった。一方，ビーム照射により次第に蓄積して行くカチオンラジカルは，逆に酸素の 1s
Figure 9.
radical.

Schematic illustration of the long-lived guanine cation→ s励起により収率が減少した。これらの知見の集積により，DNA の酸化的塩基損傷生成メカニズム解明の端緒が拓かれると期待される。
謝辞

SPring-8 ， BL23SU 担当の原研の吉越章隆博士，藤森伸一博士，光学系の調整では斎藤祐児博士にお世話になりました。また，東京農工大学の鵜飼正敏博士及び原研の馬場祐治博士には，内殻励起分子とその Auger 緩和過程に関する助言議論をして頂きました。最後に，本研究は原研の赤松憲博士，藤井健太郎博士と共に行ったものです。
以上の方々に，心より感謝いたします。
参考文献

Figure 10.
radical.

Dose response curves of the long-lived guanine cation

1)
2)
3)
4)

た。得られた結果を， Fig. 10 に示した。どちらのエネルギーを照射した場合でも，ラジカル収量は照射時間（照射線量）に比例せずに次第に飽和して行く様子が観測された。これは試料表面近くで生成したカチオンラジカルが，照射により二次的に壊れてしまうためであると推測される。また興味深いことに，上述した短寿命ラジカル収量は酸素の 1s → s励起で顕著な増大を示したのに対して，カチオンラジカルは逆に酸素の 1s→s励起で K 吸収端低エネルギー側に比べて 30 ほど減少してしまう。これらの結果から，短寿命及び長寿命の二つのラジカル過程は，お互いに競争関係にある別経路で生成していることを示して

5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)いると考えられる。現在，窒素 K 吸収端近傍での収量の測定実験も進めている。

14)

分析化学的な手法以外にも，酸化的塩基損傷を認識し切り出す修復酵素（ Fpg などのグリコシレース）をプロー

15)

ブとして利用し，実際の DNA 試料中ではどちらのラジカ16)

ル経路が最終的な 8-oxo-G などの最終的なグアニン損傷に結びつくかを今後明らかにして行く予定である。
.

まとめ

DNA の放射線損傷のメカニズムを解明する目的で，高輝度軟 X 線ビームラインに直接接続した EPR 装置の開発を行って来た。この装置を用いて， DNA 塩基のひとつで

116 ● May 2004 Vol.17 No.3

17)

D. T. Goodhead: Int. J. Radiat. Biol. 65, 7 (1994).
J. F. Ward: Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 35, 95 (1980).
A. Yokoya, S. M. T. CunniŠe and P. O'Neill: J. Am. Chem.
Soc. 124, 8859 (2002).
A. Yokoya, S. M. T. CunniŠe, D. Stevens and P. O'Neill: J.
Phys. Chen B 107, 832 (2003).
M. A. Chaudhry and M. J. Weinfeld: J. Mol. Biol. 249, 914(1995).
M. H. David-Cordonnier, J. Laval and P. O'Neill: J. Biol.
Chem. 275, 11865 (2000).
L. Harrison, Z. Hatahet, A. A. Purmal and S. S. Wallace:
Nucleic Acid Res. 26, 932 (1998).
C. von Sonntaq: Chemical basis of Radiation Biology, Taylor& Fracsis, London. (1987).
藤井健太郎放射光 16, 151 (2003).
R. L. Platzman: Vortex 23, 372 (1962).
K. Hieda, Y. Hayakawa, A. Ito K. Kobayashi and T. Ito:
Photochem. Photobiol. 44, 379 (1986).
A. Yokoya and K. Akamatsu: Nucl. Instr. Meth. A 467
468,1333 (2001).
Y. Saito, T. Nakatani, T. Matsushita, A. Agui, A. Yoshigoe,
Y. Teraoka and A. Yokoya: Nucl. Instr. Meth. A 474, 253(2001).
T. Melvin, S. M. T. CunniŠe, P. O'Neill, A. W. Parker andT. Roldan-Arjona: Nucleic Acid Res. 26, 4935 (1998).
A. Yokoya, K. Akamatsu and K. Fujii: Int. J. Radiat. Biol. tobe published.
K. Fujii, K. Akamatsu and A. Yokoya: Nucl. Instr. Meth. B
199, 249 (2003).
D. M. Close, E. Sagstuen and W. Nelson: J. Chem. Phys. 32,4386 (1985).

生命科学特集 ■ 内殻励起による DNA 塩基のラジカル生成機構（SPring-8 共同チーム）

著者紹介

横谷明徳

1992年 1 月

博士（理学）（筑波大学）

日本原子力研究所先端基礎研究セン

2000年 3 月

英国 Medical Research Council 客員研究員

タ ー  放 射 線 DNA 損 傷 機 構 研 究 グ

2001 年 4 月

日本原子力研究所放射光科学研究センター

ループ（放射光科学研究センター兼務）
主任研究員
E-mail: yokoya＠popsvr.tokai.jaeri.go.jp
専門放射線生物物理学
略歴1991 年 3 月
1991年 4 月

副主任研究員2004 年 4 月

日本原子力研究所先端基礎研究センター（放射光科学研究センター兼務）主任研究員

SPring-8 の軟 X 線ビームライン（ BL23SU ）の建設立ち上げを行うと同時に，生体分子に関する分光実験を続け筑波大学大学大学院生物科学研究科博士課ている。 2004 年 4 月から新たに，“修復され難い DNA 損

程後期単位取得退学

傷”の実体の解明に向けたプロジェクトを開始し，新しい日本原子力研究所大型放射光計画推進室展開を図る予定である。

Production Mechanism of DNA Bases Radical Induced by Inner-shell
Excitation
Akinari YOKOYA

Advanced Science Research Center, Japan Atomic Energy Research Institute24, Shirakatashirane, Tokai, Naka, Ibaraki, 3191195, Japan

Abstract
To reveal the precursor of oxidative nucleobase damages, such as 8-oxo-G in a DNA molecule, induced by ionizing radiation, DNA base radicals were examined around oxygen and nitrogen K-edge region using an EPR spectrometer installed in a synchrotron soft X-ray beamline (BL23SU) in SPring-8. In situ measurements of EPR spectrum ofguanine base revealed that short-lived transient radical species are speciˆcally induced by photoexcitation of a 1selectron to santibonding orbital at the carbonyl oxygen atom. They promptly disappear by ``beam-oŠ''. On theother hand, a long-lived radical whose EPR spectrum is consistent with previous reports for guanine cation radicalwas accumulated during the irradiation. The stable radical shows a smaller yield by the oxygen sresonance thanthat by irradiation at oŠ-resonance energy. These results indicate that these two radical processes would be induced competitively after decay from the Auger ˆnal state.

May 2004 Vol.17 No.3 ● 117