静電気学会誌，37,
静電気学会誌，27, 11（2013）(2003) 28-33
00-00

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

論

文

文

高電圧パルス電界を用いたタンパク質インクルージョンボディ
の可溶化とリフォールディング
谷 野 孝 徳＊, 坂 井 一 貴＊，大 嶋 孝 之＊,1
(2012 年 9 月 13 日受付；2012 年 12 月 25 日受理)

Solubilization and Refolding of Inclusion Body Proteins by Pulsed
Electric Field Treatment
Takanori TANINO,* Kazuki SAKAI,* Takayuki OHSHIMA*,1,(Received September 13, 2012; Accepted December 25, 2012)

Solubilization and refolding profiles of inclusion body proteins by pulsed electric field (PEF) treatment were
investigated. Enhanced green fluorescence protein (EGFP) and Candida antarctica lipase B (CALB) were used as
the model proteins. EGFP inclusion body was successfully solubilized by PEF treatment and the percentage
solubilization was increased with the increase of the initial insoluble protein concentration. The soluble protein
concentration 269 mg/ml and percentage solibilization 5.5% were obtained by the 20 min PEF treatment in 3 mg/ml
initial insoluble protein suspension. Fluorescence of EGFP, which is indicating refolding of EGFP protein, wasdetected in the solubilized protein fraction. CALB inclusion body was also solubilized by PEF treatment and additionof surfactant (0.1% triton-X100) synergistically increased percentage solubilization by PEF treatment. The
percentage solubilization 7.4% was obtained, and lipase activity was also detected in the solubilized protein solution.
Increase of the PEF applied voltage increased percentage solubilization slightly and shorten the treatment time toobtain maximum solubilization percentage. Although further knowledge accumulation of protein behavior in PEF isnecessary, PEF treatment could be widely applicable to the inclusion body protein solubilization and refolding.
1.

はじめに

ディとなってしまった目的タンパク質を本来の機能を有する

様々な機能を有する生体高分子であるタンパク質は，2003

状態へと回復させるためには，可溶化し本来の立体構造へと年のヒトゲノム解読完了の宣言以降その機能解析がますます

再度折り畳む（リフォールディング）操作が必要となる 3,4)．

盛んになっており，産業分野では医療・食品・化粧品分野な

現在広く用いられている手法は高濃度の尿素・界面活性剤などでの需要が増加の一途をたどっている．タンパク質の生産

どの可溶化剤を用いインクルージョンボディを可溶化した後，技術としては目的タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌,昆数十から数百倍に希釈することでリフォールディングを起こ

虫細胞，哺乳動物細胞などのタンパク質生産系に組み込み生させる希釈法である．希釈法は簡便ではあるが，タンパク質産する技術が一般的であり，これらのタンパク質生産系の中によっては再凝集が起こりやすく，工業規模では希釈溶液がでも大腸菌は遺伝子組換えが容易であり多量のタンパク質が莫大な量となるため設備・濃縮コストが掛かるなどの問題点得られるため広く用いられている生産系である．しかしなががあり，希釈法に変わる効率的かつ安価なタンパク質のリフ

ら，大腸菌生産系では異種由来タンパク質を生産した場合にォールディング技術開発の需要は大きい．

生産された目的タンパク質分子が本来の立体構造に折り畳ま

筆者らはタンパク質分子への静電気技術の応用として，高れる（フォールディング）ことなく，複雑に絡み合い本来の電圧パルス電界（Pulsed Electric Field : PEF）を印加することで機能を有しないインクルージョンボディと呼ばれる不溶性の熱変性させたパーオキシダーゼの酵素活性の回復ならびにリ状態でしばしば細胞内へ蓄積される

1,2)．インクルージョンボ

ゾチームの熱変性抑制が可能であることを見出しており 5)，
PEF はタンパク質のリフォールディング促進効果を有するこ

キーワード：高電圧パルス電界，インクルージョンボデ
ィ，タンパク質，可溶化，リフォールディング* 群馬大学大学院工学研究科環境プロセス工学専攻（376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1）
Department of Chemical and Environmental Engineering,
Graduated School of Engineering, Gunma University,
1-5-1, Tenjin-cho, Kiryu city, Gunma, 376-8515, Japan1
tohshima@cee.gunma-u.ac.jpとを報告している．インクルージョンボディとして生産されたタンパク質に対し PEF によるタンパク質の可溶化・リフォ
ールディングが可能であるならば，高濃度の可溶化試薬・希釈操作を必要としない新規タンパク質リフォールディング技- 1 -高電圧パルス電界を用いたタンパク質インクルージョンボディの可溶化とリフォールディング（谷野孝徳ら）
ランニングタイトル（著者名，ただし複数の場合先頭著者＋ら）

29

術の開発できると考えられる．本研究では，オワンクラゲ由

3.6%, 2-メルカプトエタノール 5×10-5%）と当量混合し可溶

来緑色蛍光タンパク質(EGFP)と Candida antarctica 由来脂質加化した後に濃度測定を行った． また，目的タンパク質の可水分解酵素リパーゼ B (CALB)をモデルタンパク質とした検溶化を SDS-PAGE 電気泳動・銀染色により確認した．
EGFP の蛍光強度は励起波長 489 nm，蛍光波長 508 nm

討を行ったので報告する．
2.

の波長にて蛍光分光光度計 RF-1500（島津製作所）で測定

実験方法・手順

2.1

EGFP ならびに CALB 生産大腸菌の作成した．

EGFP ならびに CALB をコードする DNA 断片をそれぞれ

CALB の活性は p-ニトロフェニルブチレイトを基質にプ ラ ス ミ ド pEGFP (Clontech Laboratories Inc.)な ら び に用い，分解によって生じる p-ニトロフェノールを定量する

6)

pUC19-ProCALB CBS6678 を鋳型として polymerase chain

ことで 30℃にて測定した．酵素活性は 1 min に p-ニトロフ

reaction にて増幅した．増幅した DNA 断片をプラスミド

ェノールを 1mol 生成する酵素量を 1 U と定義した．

pET16-b 中の T7 プロモーター下流にそれぞれ挿入し EGFP
ならびに CALB 発現プラスミドを作製した．これらを大腸菌(Escherichia coli BL21(DE3)pLysS)にそれぞれ導入することで EGFP ならびに CALB 生産大腸菌を作製した．
2.2

EGFP ならびに CALB インクルージョンボディの調整
EGFP または CALB 生産大腸菌をアンピシリン(100 l/ml)
を含む LB 培地（ペプトン 1% (w/v)，酵母エキス 0.5%，
NaCl 1%）を用い 37�で OD660=0.7〜0.8 程度まで培養後，遺伝子発現誘導剤としてイソプロピル--チオガラクトピ
ラノシドを添加(終濃度 0.8 mM)し，27�で 4 h EGFP またはCALB 生産を行わせた．菌体を遠心分離(8,000×g, 10 min,
図 1 PEF 処理槽の概略図
Fig. 1 Schematic illustration of PEF react4�)により回収，蒸留水で洗浄後，蒸留水に再懸濁した．
菌体を超音波破砕し遠心分離(10,000×g, 10 min, 4℃)により分離・蒸留水で洗浄することで得られた不溶性画分を蒸留

3.

水に懸濁し EGFP ならびに CALB インクルージョンボディ

3.1

PEF による EGFP インクルージョンボディを含む

不溶性タンパク質の可溶化を含む不溶性タンパク質とした．
2.3

実験結果および考察

高電圧パルス発生装置および PEF 処理槽

高電圧パルス発生装置は前報 5)と同じ装置を用い，ピーク電圧 5, 7 kV，周波数 50 Hz にて処理槽に PEF を印加した．PEF 処理槽は円盤型のステンレス (30 mm，厚さ 3 mm)を用いた平板対平板電極，電極間距離 5 mm，処理容量 4.8
ml の処理槽を用いた（図１）．
2.4

PEF による可溶化・リフォールディング試験

EGFP または CALB のインクルージョンボディを含む
不溶性タンパク質を蒸留水中に 1, 2, 3mg/ml となるように
懸濁し，処理槽内へ注入した後 PEF を印加した．経時的にサンプリングを行い遠心分離(10,000×g, 10 min, 4℃)により得られた上清中に含まれるタンパク質について分析を行った．
2.5●: 3 mg/ml, ▲: 2 mg/ml, ◯: 1mg/ml
図２ 可溶性タンパク質濃度の経時変化
Fig. 2 Time courses of soluble protein concentration

タンパク質濃度・蛍光強度・リパーゼ活性の測定

タンパク質濃度測定には Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.)を用い，不溶性タンパク質につEGFP インクルージョンボディを含む不溶性タンパク質にいては懸濁液を可溶化剤（ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)

対し PEF による可溶化効果を確認した（図２）．実験は印加電- 2 -静電気学会誌 第37巻 第 1 号（2013）30

圧 5 kV，EGFP への露光を防ぐため暗所にて行った．EGFP

EGFP インクルージョンボディを含む不溶性タンパク質にインクルージョンボディを含む不溶性タンパク質に PEF を印

は大腸菌由来タンパク質も含まれるため，EGFP インクルージ

加することで，処理時間の経過と共に可溶性タンパク質濃度ョンボディの可溶化が起きていることを確認するため可溶性が増加することが確認された．いずれの初発不溶性タンパク

画分を用いた SDS-PAGE 電気泳動を行った（図４）．PEF 処理

質濃度においても 20 min の処理で可溶性タンパク質濃度は時間の増加に伴い EGFP の存在を示す 29.5 kDa 付近のバンド最大となり，初発不溶性タンパク質濃度 1, 2, 3mg/ml におい

強度の増加がみられ，PEF 処理によりインクルージョンボデてそれぞれ可溶性タンパク質濃度は 102, 174, 269 g/ml となィとなった EGFP が可溶化していることが確認された．
また Eった．また，20 min 以上の処理では可溶性タンパク質濃度は

GFP に比べればわずかではあるが，PEF 処理時間の増加と共低下することが確認された．処理 24 min 後の処理液温度は 6に大腸菌由来と考えられる他の夾雑タンパク質のバンド強度

6℃に達しており、PEF の印加による処理液温度の上昇によりも増加しており，PEF 処理は EGFP インクルージョンボディ

一度可溶化したタンパク質が変性し再び不溶性となったためのみを選択的に可溶化しているわけではないことが確認されであると考えられる．

た．

初発不溶性タンパク質濃度が PEF による可溶化率に与える0

影響を明らかとするため，不溶性画分を蒸留水に懸濁した際

Treatment time (min)
4 8 12 16 20 24に可溶化したタンパク質量を差し引き「PEF 処理により」可溶化した EGFP インクルージョンボディを含む不溶性タンパ

42.7 kDa

ク質の可溶化率を求めた（図３）．可溶化率は初発タンパク質濃度に対する PEF 処理により可溶化したタンパク質の百分率

34.6 kDa
EGFPと定義する．

27.0 kDa
図４ 可溶性画分の SDS-PAGE 電気泳動結果
Fig. 4 SDS-PAGE electrophoresis analysis of soluble
protein fractions
3.2

PEF 処理による EGFP インクルージョンボディのリフォールディング●: 3 mg/ml▲: 2 mg/ml◯: 1 mg/ml

PEF 処理により EGFP インクルージョンボディから可溶化された EGFP タンパク質は，可溶化のみならずリフォー
ルディングされていることをタンパク質可溶性画分の蛍光強度の測定を行い確認した（図５）．

図３ PEF処理によるEGFPインクルージョンボデ
ィを含む不溶性タンパク質の可溶化率経時変化
Fig. 3 Time courses of percentage solubilization
by PEF treatment of insoluble protein containing
EGFP inclusion body●: 3 mg/ml▲: 2 mg/ml◯: 1 mg/ml

可溶化率の増加傾向は初発タンパク質濃度によらず一定であり，初発不溶性タンパク質濃度が増加するに従いわずかに増加が見られ初発不溶性タンパク質濃度 3 mg/ml で最も高い
可溶化率 5.5%となった．これらの結果より，本実験で検討した EGFP インクルージョンを含む不溶性タンパク質濃度範囲においては，初発タンパク質濃度が高い方が一回の処理で得
図５ 可溶性画分の蛍光強度経時変化
Fig. 5 Time courses of fluorescence intensity ofsoluble protein fraction

られる可溶性タンパク質量が多く可溶化率も高いため， PEF
処理により高効率の可溶化が行えることが明らかとなった．
- 3 -ランニングタイトル（著者名，ただし複数の場合先頭著者＋ら）

高電圧パルス電界を用いたタンパク質インクルージョンボディの可溶化とリフォールディング（谷野孝徳ら）

31

PEF 処理時間の増加に伴う可溶性画分の蛍光強度の増大がPEF を CALB インクルージョンボディを含む不溶性タンパ

確認され，PEF 処理によって可溶化した EGFP は蛍光を発色

クに印加した場合にも処理時間の経過と共に不溶性タンパク

する本来の立体構造にリフォールディングさることが確認さ質の可溶化が確認された．しかしながら，得られた最大の可れた．初発不溶性タンパク質濃度 1 mg/ml では可溶性画分の溶化率は初発不溶性タンパク質濃度 1%，PEF 処理時間 12 mi

蛍光強度の増加は微量であったが，初発不溶性タンパク質濃n の時に 4.0%であった．CALB インクルージョンボディを含度を上げることで蛍光強度は増加し，初発不溶性タンパク質

む不溶性タンパク質に PEF を印加した場合では，EGFP イン

濃度 3 mg/ml では可溶性画分の蛍光強度に大きな増加がみら

クルージョンボディを含む不溶性タンパク質に同条件の PEFれた．PEF 処理 20 min 後の初発不溶性タンパク質濃度 1, 2,を印加した場合（図３）に比べ可溶化率は低く，初発不溶性

3 mg/ml 溶液における可溶性画分の蛍光強度は 45.1, 776, 294

タンパク質濃度の増加にともない可溶化率も低下した．EGFP

0 [-]であり可溶化したタンパク質量（102, 174, 269 g/ml）と CALB では最大の可溶化率を得られるまでに必要となる Pとは比例しておらず，この結果から可溶化したタンパク中にEF 処理時間も異なり，タンパク質ごとに可溶化に最適な PEF

含まれる蛍光を発色できるまでに正しくリフォールディング

処理時間は異なることが明らかとなった．また、可溶化率のされる EGFP 量は初発不溶性タンパク質濃度に影響されるこ増加は確認されたが可溶性画分のリパーゼ活性の上昇も確認とが明らかとなった．一般的にタンパク質は濃度が低い場合されなかった．これらの原因として，CALB と EGFP のタンにはウシ血清アルブミン(BSA)などを夾雑タンパク質として

パク質分子量はそれぞれ 34，29.5 kDa であり，EGFP に比べタンパク質溶液に添加することで安定化することが知られて

CALB の分子量は大きいためインクルージョンボディ同士がいる．初発不溶性タンパク質濃度が高い場合には，多くのタより複雑に絡み合っているため，PEF によるタンパク質の立

ンパク質が可溶化しすることでリフォールディングされた E

体構造変化にともなう可溶化が起こりにくく，タンパク質濃GFP を安定化し蛍光強度が大きく増加したものと推察される．

度が増加した場合には分子間の影響がより大きくなったので

3.3

PEF による CALB インクルージョンボディを含むはないかと考えられる．また、EGFP の立体構造は二次構造で不溶性タンパク質の可溶化

ある-シート構造が円筒を形成するように規則的に配向した

CALB インクルージョンボディを含む不溶性タンパク質

バレル構造と呼ばれるタンパク質の中でも比較的単純で安定に対し PEF による可溶化効果の検討を印加電圧 5 kV で行な立体構造であり，蛍光を発するための発色団を形成するアった．PEF 処理により可溶化した CALB インクルージョン

ミノ酸残基は Ser65，Tyr66，Gly67 と隣接している 7,8)．一方

ボディを含む不溶性タンパク質の可溶化率の経時変化を図で CALB は二次構造である-ヘリクスとシートが活性中心６に示す．

の周りに複雑に配向した立体構造を有し，活性中心を形成す
るアミノ酸残基 Ser105，Asp187，His224 はタンパク質内で離れた位置に存在する 9,10)．
このように EGFP と CALB の立体構
造は大きく異なり，複雑な立体構造を有する CALB ではリフォールディングが起こりにくかったのではないかと推察され
る．
3.4

界面活性剤が CALB インクルージョンボディの可溶化とリフォールディングに及ぼす影響
水中ではタンパク質の親水性のアミノ酸残基は分子表面に，疎水性のアミノ酸残基は分子内部に配向しており，不溶性となっているタンパク質では分子間で疎水性部分が凝集を起こしている．界面活性剤は疎水性アミノ酸残基と結びつき疎水性部分の水中への分散を容易とすることでタン●: 3 mg/ml, ▲: 2 mg/ml, ◯: 1mg/ml

パク質の凝集を緩め可溶化する働きがある．本研究では界図６ PEF 処理による CALB インクルージョンボ
ディを含む不溶性タンパク質の可溶化率経時変化
Fig. 6 Time courses of percentage solubilization
by PEF treatment of insoluble protein containing
CALB inclusion body

面活性剤として非イオン性界面活性剤である Triton-X100
を用い，処理溶液中への界面活性剤の添加が PEF 印加による CALB インクルージョンボディの可溶化に及ぼす影響を- 4 -静電気学会誌 第37巻 第 1 号（2013）32

検討した．初発不溶性タンパク質濃度 1 mg/ml，Triton-X100
濃度 0.1%の懸濁液へ印加電圧 5 kV にて PEF 処理を行った（図７）．Triton-X100 を 0.1 %となるように CALB インクルージョンボディを含む不溶性タンパク質懸濁液へ添加するのみでタンパク質の溶化が確認され， PEF のみを印加する
場合とほぼ同等の可溶化効果が確認された．しかしながら
その後 PEF を印加せずにインキュベートしたのみでは可溶性タンパク質濃度の変化は確認されなかった．一方，TritonX-100 を添加した不溶性タンパク質懸濁液に PEF を印加することで処理時間の経過と共に可溶性タンパク質量の大幅な増加が確認され，8 min の処理で最大となり可溶性タンパク質濃度 117 mg/ml，可溶化率 7.4%となった．この結果より，Triton-X100 を添加し PEF を印加した場合には，◯: PEF, △: 0.1% TritonX-100, ◆: PEF+0.1% TritonX-100

それぞれの効果を足し合わせたよりも大きな効果が得られ，

図８ 可溶性画分のリパーゼ活性経時変化
Fig. 8 Time courses of Lipase activity of soluble protein
fraction

PEF と界面活性剤の組み合わせではタンパク質可溶化において相乗効果が得られることが示された．
3.5

印加電圧が CALB インクルージョンボディの可溶化とリフォールディングに及ぼす影響
PEF 印加電圧が CALB インクルージョンボディの可溶化に及ぼす影響を検討した．初発不溶性タンパク質濃度 1mg/ml，Triton-X100 濃度 0.1%の不溶性タンパク質懸濁液への PEF 処理を印加電圧 5, 7kV にて行った（図９）．印加電
圧 7 kV では処理時間 4 min で可溶性タンパク質濃度は最大となり可溶性タンパク質濃度 127 mg/ml，可溶化率 8.7%となった．印加電圧 7 kV では 5 kV に比べ可溶化率はわずかしか上昇しなかったが，最大の可溶化率を得るために必要な時間が短くなることが確認された．これは印加する電圧が大きくなることで不溶性タンパク質凝集体内で分子が大きく動くことで迅速に可溶化したためだと考えられる．
◯: PEF, △: 0.1% TritonX-100, ◆: PEF+0.1% TritonX-100
図７ 界面活性剤が CALB インクルージョンボディを含む不溶性タンパク質の可溶化に及ぼす影響
Fig. 7 Effect of surfactant on time courses of solubilized
protein concentration by PEF
また，可溶化したタンパク質についてリパーゼ活性の測定を行った（図８）．PEF 単独で可溶化したタンパク質とは異なり，Triton-X100 の添加のみにより可溶化したタンパク●: 5 kV▽: 7 kV

質ではわずかながら活性を示すことが明らかとなった．
Triton-X100 を添加した不溶性タンパク質懸濁液に PEF を印加した場合では可溶性タンパク質濃度の増加に伴いリパーゼ活性が増加し，CALB のリフォールディングが起きていることが確認された．これらの結果より界面活性剤を併

図９ 印加電圧が CALB インクルージョンボディを含む
不溶性タンパク質の可溶化に及ぼす影響
Fig. 9 Effect of applied voltage on time courses ofsolubilized protein concentration by PEF

用することで PEF のみでは可溶化・リフォールディングを起こしにくいタンパク質であっても可溶化・リフォールデ
ィングが可能となることが示された．
- 5 -高電圧パルス電界を用いたタンパク質インクルージョンボディの可溶化とリフォールディング（谷野孝徳ら）
ランニングタイトル（著者名，ただし複数の場合先頭著者＋ら）（１）

また可溶化したタンパク質についてリパーゼ活性の測定を

33

PEF 処理により EGFP インクルージョンボディを含行った（図１０）．印加電圧 7 kV でもタンパク質濃度の増加

む不溶性タンパク質を可溶化可能であり， 初発不溶に伴うリパーゼ活性の増加が確認され，迅速に可溶化が起こ

性タンパク質濃度が高いほうが可溶化率は高くなるっていても 5 kV の場合と同様にリフォールディングも起きことが示された．
（２）ていることが確認された． これらの結果から印加電圧を高く可溶化された EGFP は蛍光を発することからリフォールディングが起きていることが示された．

することで迅速に高いタンパク質の可溶化・リフォールディ
（３）

ングが行える可能性が示唆された．

PEF 処理により CALB インクルージョンボディを含む不溶性たんぱく質を可溶化可能であったが可溶化率は低く，初発不溶性タンパク質濃度が高くなると可溶化率が低下することが明らかとなった．また、可溶化したCALB は活性を有するまでリフォールディングされなかった．

（４）

PEF と界面活性剤の併用により可溶化率が相乗的に向上することが明らかとなった．また、CALB の活性が確認されリフォールディングが起きていることが
示された．

（５）

●: 5 kV▽: 7 kVPEF 印加電圧を高くすることで可溶化率が向上し，可溶化率が最大に達するまでに必要な時間が短くなることが明らかとなった．

謝辞
本研究の一部は科学研究費補助金、基盤研究 C（22510082）

図１０ 印加電圧が可溶性画分のリパーゼ活性に与える
影響
Fig. 10 Effect of applied voltage on time courses oflipase activity of soluble protein fraction

を受けて行われたものであり、深く感謝いたします。

参考文献
J.F. Kane, D.L. Hartley: Formation of recombinant protein
inclusion bodies in Escherichia coli. Trends Biotechnol., 6(1988) 95
2) B. Fahnert, H. Lile, P. Neubauer: Inclusion bodies: formation
and utilization. Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 89 (2004) 93
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lipase B and their application to ester synthesis reaction. Appl.
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7) F. Yang, L.G. Moss and G. N. Jr. Phillips: The molecular
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ID: 1GFL
9) J. Uppenberg, M.T. Hansen, S Patker and T.A. Jones: The
sequence, crystal structure determination and refinement of two
crystal forms of lipase B from Candida antarctica. Structure, 2(1994) 293
10) Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)
ID: 1TCA
1)

本研究では EGFP および CALB の二種類のタンパク質について PEF 処理によるインクルージョンボディの可溶化・リフォールディングを試みた．EGFP は PEF 処理のみで 10%前後のリフォールディングが 20 min 程度の短時間の処理で可能であった．また CALB に関しても界面活性剤（Triton-X100）と併用することにより有意なリフォールディング促進効果が確認できた．これらの結果から溶液環境を含めた処理条件の最適化により，PEF 処理によるインクルージョンボディの迅
速なリフォールディングの可能性が示された．タンパク質の種類と PEF リフォールディング促進効果の関係を明らかとするためには，今後種々のタンパク質に対しての知見を集積する必要があるが，PEF 処理は広くリフォールディングに利用できる技術であり，タンパク質生産における新たな可溶化・
リフォールディング技術として更なる研究の価値があるものと考えられる．
4.

結言

PEF によるインクルージョンボディタンパク質のリフォールディングの検討を行い，以下の結果を得た．

- 6 -