J. Inst. Electrostat. Jpn.

静電気学会誌，36, 4 (2012) 235-240

マイクロスポットプラズマ源による血管新生の促進
筒井 千尋*,1，平田 孝道*,**，横井 由貴子**，小町 俊文**，岸本 拓巳**，村田 茂**，森 晃**，秋谷 昌宏*,**，山本 俊昭***，田口 亮*,**（2011 年 9 月 12 日受付；2012 年 6 月 7 日受理）

Effect of Neoangiogenesis Using Micro-spot Plasma
Chihiro TSUTSUI,*,1 Takamichi HIRATA,*,** Yukiko YOKOI,**Toshifumi KOMACHI,** Takumi KISHIMOTO,** Shigeru MURATA,**Akira MORI,** Masahiro AKIYA,*,** Toshiaki YAMAMOTO*** and Akira TAGUCHI*,**(Received September 12, 2011; Accepted June 7, 2012)

Using an in vivo and in vitro model, we investigated the effect of the atmospheric pressure plasma
irradiation to endothelial cells and burn wounds of rat. In the plasma exposure experiment using
endothelial cell proliferation was inhibited in proportion to processing time. However, it was found that
this inhibitory effect was suppressed by plasma irradiation and cells are rather on an increase trend. And,in comparison with the cell growth curve for the He gas flow group , the curve for the plasma irradiationgroup was shifted to the left. Doubling time calculated from the multiplication curves were 28.8 h for theflow group and 24.0 h for the plasma irradiation group. We investigated expression analysis in thesubsequent experiment with focus on factors related to angiogenesis, it was found that the transient
overexpression of VEGF are observed in 24 h from the plasma irradiation. Plasma irradiation was used tocure the burn back dermis of rats, and we devoted attention to angiogenesis, which is a key component of
the healing mechanism. We performed an intravenous injection of tomato-lectin, which merges
specifically with neovascular endothelial cells. plasma irradiation promoted angiogenesis in the woundtissues. This proliferative effect is likely related to several growth factor release due to plasma-induced
reactive ion/radical interaction.
1.

照射により，血液凝固作用や，火傷，糖尿病性壊死などによ

はじめに大規模な真空排気装置が必要無く，大気中にてプラズマをる皮膚創傷の治癒が見られるだけではなく，正常細胞には影発生させることが可能である大気圧放電プラズマは，滅菌・響を与えずに，ガン細胞（メラノーマ細胞）の増殖を抑制す

1-4)5)や細胞への遺伝子導入 などに応用するべく各所でるといった効果も示されている．しかし，短期間のプラズマ盛んな研究が行われている．一方，これらの応用研究に追従の照射によって，なぜ表皮を再生させることが出来るのかとする形で，近年，パルス・プラズマを用いた皮膚の改質，再いうメカニズムや生体のどのような経路を辿っているのかに

殺菌6)

生治療に関する報告がある ．この報告によると，プラズマ
キーワード：大気圧プラズマ，再生医療，血管新生* 東京都市大学ナノカーボンバイオデバイス研究センター（158-0082 東京都世田谷区等々力 8-15-1）
Nano Carbon Bio Device Research Center, Tokyo City University,
8-15-1 Todoroki, Setagaya-ku, Tokyo 158-0082, Japan***東京都市大学工学部生体医工学科 （158-8557 東京都世田谷区玉堤 1-28-1）
Department of Biomedical Engineering, Tokyo City University,
1-28-1 Tamazutsumi, Setagaya-ku, Tokyo 158-8557, Japan** 東京都市大学工学部電気電子工学科 （158-8557 東京都世田谷区玉堤 1-28-1）
Department of Electrical and Electronic Engineering, Tokyo City
University, 1-28-1 Tamazutsumi, Setagaya-ku, Tokyo 158-8557,
Japan1
ctsutsui@tcu.ac.jp

ついては，一酸化窒素6)や活性酸素種7)の影響などが示唆されているものの，未だ明確な答えが無いのが現状である．
このように，実用化が先行しているにもかかわらず，メカニズムが未解明という状況を解決する手段として，プラズマ理工学，分子生物学，生化学などの多方面な観点からの解析が重要なキーポイントと成り得る．以上の背景から，我々は生体への熱的かつ電磁的ダメージが極めて低いマイクロスポット大気圧プラズマ（マイクロスポットプラズマ）源を用いた生体組織・細胞への直接照射に関する基礎実験及び評価・分析を行っている．これまでに我々は(1) 培養細胞に対するプラズマイオン照射処理により，細胞倍加時間が短縮される．
(2)

ラット体表面に形成した火傷に対してプラズマイオ236(72)

静電気学会誌

第 36 巻

第 4 号 (2012)

ン照射を行うことにより，非照射火傷と比較して早期均値を取っている．まずは，無処理（control），1 秒，10 秒，の治癒が見られる．

30 秒，60 秒，90 秒，120 秒，180 秒の処理時間にて最適照射8)という 2 点について明らかにしてきた ．

時間の検討を行った．プラズマ処理および He ガスフロー処

これらの結果から，我々は，血管新生に着目した．血管新理後 CO2 インキュベーター内にてさらに 24 時間培養し，細生とは，組織や細胞がダメージを受けた際に，それを回復す胞形態を光学顕微鏡により目視観察した．その後，培養容器るために起こす一連の生体反応である．これが起こる際に発の底面に張り付いている POAEC の生細胞のみを，トリプシ現が上昇する成長因子（繊維芽細胞増殖因子：FGF-2，血管ン処理により剥離させ，各条件における細胞数を計数した．

9,10)に着目し，ブタ大動脈内皮細胞

さらに，この実験により，最も増殖率が高かった 60 秒の照射（POAEC）におけるプラズマ照射時の発現変化を調べた．さ（および He ガスフロー処理）を 1 日 1 回行いながら 7 日間らに，背部に電気メスで火傷を形成したラットに対するプラ継続培養し，プラズマ処理あるいは He ガスフロー処理各条

ズマ照射時の新生血管を観察するために，血管内皮細胞特異件下での細胞増殖曲線を作成した．図 2 に POAEC に対する的に結合能を有するトマトレクチンを用いて染色を行った．

プラズマ照射時の写真を示す．

内皮増殖因子：VEGF）

これらの実験を通して，プラズマによる組織再生がどのような生体反応に由来するものなのかを調査・検討した．

2.2

生体に対するプラズマ照射実験

生体組織へのプラズマ照射実験にはラット（Wistar，♂，SPF）を用い，ガス麻酔下にて実験を行った．12 匹のラット

2.

背面に電気メス（Metran, SL-5）を用いて 5 × 5 mm2 の面積に実験装置および方法実験装置の概要図を図 1 に示す．なお，実際の実験時は，て火傷を形成し，6 匹について 1 日 1 回 90 秒間のプラズマイ

感電防止のためこの装置の外側にシールドを設置して実験をオン照射を施した．これを He ガスフローのみ照射の対象群 6行っている．ガラスキャピラリー（プラズマ発生部の内径：8匹とともに，30 日間に亘って継続的に暴露させ，火傷の治癒mm，先端部の内径：1 mm）内にタングステン電極（直径：1の様子を目視にて観察・記録した．さらに，ラット頚静脈よmm）を導入し，外部に筒状グランド電極を設置した同軸状り FITC 標識トマトレクチン（Sigma-Aldrich, L0401）を投与構造である．プラズマを発生させるための高電圧は，外部制し，全身を灌流固定後，火傷を施した部位の皮膚薄切切片を御型高電圧電源装置により発生させる．
プラズマ発生条件は，作製，新生血管の様子を共焦点レーザー顕微鏡（Olympus,印加電圧：8 kVpp，周波数：3 kHz（矩形波），ヘリウム（He）

FLUOVIEW BX61W1, FV1000-D フィルタセット内 NIBA 使

ガス流量：1 L/min，プラズマ照射時間：60 s である．

用）にて観察した．なお，火傷形成時の電気メスの設定は，

2.1

大動脈内皮細胞に対するプラズマ照射実験

実験は，培養容器（ポリプロピレン製）上にブタ大動脈内
4出力電圧 30 W，周波数 500 kHz で行い，火傷の深度は皮フの炭化が確認される深度三（真皮全層・皮下組織傷害）とする皮細胞（POAEC）を 6 × 10 個含有した培地を展開し，CO2ようにコントロールした．図 3 にラットに対するプラズマ照インキュベーター（37℃，5%CO2）内にて 24 時間培養後，射時の写真を示す．

無血清培地への培地交換を行った後，プラズマ照射処理および He ガスフロー処理を施した場合と未処理（コントロール）の場合について細胞数を比較した．各条件とも 3 ウェルの平図 2 細胞に対するプラズマ照射実験の様子
図 1 マイクロスポット大気圧プラズマ源の概略図
Fig. 1

Schematic of the experimental set-up.

Fig. 2 Visualization of the plasma irradiation for porcine
endothelial cell (POAEC).

マイクロスポットプラズマ源による血管新生の促進（筒井千尋ら）

237(73)図 3 ラットに対するプラズマ照射実験の様子
Fig. 3 Visualization of the plasma irradiation for Male Wistarrat.

図 4 細胞増殖のプラズマ照射時間依存性
Fig. 4 Dependency of cell number against He gas flowtime.

2.3 FGF-2，VEGF の発現解析
ISOGEN（日本ジーン）を用いてプラズマ照射前およびプ
ラズマ処理後 12，24，36，48 時間後の POAEC より total RNAを抽出し，DNaseⅠ（プロメガ）処理した．その後 total RNA
1g を用い，Super ScriptⅢ RTase (Invitrogen)を用いて RT を行い，cDNA を合成した．合成した cDNA をテンプレートとして用い，FGF-2 および VEGF の PCR 増幅を行った．PCR 反応を行った後，臭化エチジウムを含む 2%アガロースゲルを用いた電気泳動により PCR 産物を確認した．
3.

実験結果及び考察

3.1

大動脈内皮細胞に対するプラズマ照射実験

大動脈内皮細胞に対するプラズマイオン照射実験の結果，株化細胞（NIH3T3 細胞株）における同様の実験 6)と同じく，He ガスをフローさせた場合，培地がガス撹拌されることによ

図 5 POAEC に対するプラズマ照射時の細胞増殖曲線

り細胞が培養ディッシュ底面から剥離し，細胞増殖が処理時

Fig. 5Cell growth curve of plasma irradiation for POAEC.

間に比例して阻害されている．しかし，He ガスフローと共にプラズマを発生・照射することにより，この阻害効果は抑制ことが判明した．この増殖曲線より算出した各条件の倍加時され，むしろ細胞は増殖傾向を示した（図 4）．これらの結果

間はそれぞれ，He プラズマ処理細胞：24.0 時間，He ガスフから，プラズマイオンの照射は，株化細胞のみならず，単離ロー処理細胞：28.8 時間であった．本施設で通常培養してい細胞に対しても増殖促進効果を及ぼすことが示唆された．

るブタ大動脈内皮細胞の倍加時間は約 27 時間であり，プラズ

ブタ大動脈内皮細胞に対してプラズマ照射および He ガスフロー処理を 1 日 60 秒間行い，各条件の細胞数の増加を 1週間プロットすることにより，細胞増殖曲線を作成した（図5）．He プラズマ処理細胞（plasma exp.），He ガスフロー処理マ照射を行うことで，細胞の倍加時間は明らかに早くなっていると言える．
3.2

プラズマ照射処理後のブタ大動脈内皮細胞における FGF-2，VEGF の発現解析細胞（flow cont.）それぞれの増殖曲線を比較したところ，Heプラズマ照射による細胞の増殖促進メカニズム，および，プラズマ処理細胞の増殖曲線が明らかに左側へシフトしてお

細胞生物学的意味は本実験の結果のみでは不明であるが，プり，ブタ大動脈内皮細胞が細胞増殖促進という変化を細胞集ラズマ電界あるいは培地表面へのイオン・ラジカルの衝突な団単位で起こしていることを表しており，本装置が株化細胞どによる相互作用が細胞内の増殖因子や成長因子へ影響を及のみならず，単離細胞に対しても有意な増殖促進効果を示すぼしていると予想される 8)．そこで，我々は，血管新生を惹238(74)

静電気学会誌

第 36 巻

第 4 号 (2012)

起する代表的な成長因子である血管内皮成長因子（VascularEndothelial Growth Factor: VEGF）および繊維芽細胞成長因子2（Fibroblast Growth Factor-2: FGF-2）に着目し，この二つの成長因子のプラズマ照射前と照射後の発現量変化について調べた．その結果，FGF-2 には明らかな変化は認められなかったが，プラズマ照射 24 時間後，一過性に VEGF の発現が上昇した（図 6）．
血管新生の機序は，はじめに FGF-2 の発現が上昇し，その後 VEGF の発現が上昇するというカスケードをたどる．今回の実験では VEGF の発現上昇は確認できたが，FGF-2 については捉えることが出来なかった．しかし，FGF-2 は血管新生以外にも様々な生理作用を調節する遺伝子であり，ホメオスタシス維持の観点から，長時間に渡って発現が維持されることは殆ど無い 10, 11)．従って，本実験では血管新生を直接刺激する下流遺伝子である VEGF の発現のみが捉えられたという可能性が高い．今後は，DNA マイクロアレイなどの，遺伝子発現を網羅的に解析することが可能な手法を用いて，同様の検討を行う必要性がある．それにより，血管新生以外にも細胞内で生じている生理学的変化を捉えることが可能となり，より詳細な検討が出来ると考えられる．
3.3

ラット火傷に対するプラズマ照射実験

培養細胞への He プラズマ処理の際は，最適処理時間は 60秒であったが，生体に対するプラズマ照射の場合，各条件における個体数 1 で行ったプレ実験において 60 秒よりも 90 秒照射の方がコントロールとの有意な差が見られたことから，ラットへの照射時間は 90 秒とした．
ラットへ背部に形成した

図 7 ラット背面火傷に対するプラズマ照射の影響

図 6 POAEC に対するプラズマ照射後の VEGF/FGF-2 発現変化
Fig. 6 Expression changes of VEGF/FGF-2 after the plasma
irradiation for POAEC.

(a) He ガスフローのみ, (b) プラズマ照射.

Fig. 7 Effect of plasma irradiation for rat dorsal burning. (a) He gas flow only, (b) plasma irradiation.

マイクロスポットプラズマ源による血管新生の促進（筒井千尋ら）

239(75)

図 8 ラット皮膚のトマトレクチン染色像
He ガスフロー処理（× 40）：A, 明視野; B, 暗視野; C, 明暗合成像．プラズマイオン処理（× 40）：D, 明視野; E, 暗視野; F, 明暗合成像．
Fig. 8 Tomato lectin staining of rat skin.
He gas flow only (× 40) : A, light vision; B, dark vision; C, merge. Plasma irradiation (× 40): D,light vision; E, dark vision; F, merge.
火傷へのプラズマ照射を 1 日 90 秒間行い，30 日間に亘り創傷面の観察を行った結果の代表例を図 7 に示す．観察開始直後には，炭化した皮フとその周辺が赤みを帯び，典型的な第三度火傷の様相を呈していたが，4 日目から表面に瘡蓋（かさぶた）が生じ始めた．2 週間ほど経過した段階では，プラズマ照射を行った創傷部は全面に渡って完全な瘡蓋に覆われた．一方，コントロール側は部分的に瘡蓋が形成し始めているものの，プラズマ照射を行った創傷面と比較して明らかに治癒が遅れている．さらに，21 日経過後には，プラズマ照射創傷部は瘡蓋も殆どが剥離し，その下に新たな表皮が再生していることが見て取れる（図 7）．

図 9 ラット皮膚のトマトレクチン陽性細胞数

なお，図中に示したラットは代表的な一例であるが，他のFig. 9 Tomato lectin positive cells of rat skin.

五例においても同様の結果を得ており，プラズマ照射条件下
では早くて 20 日，遅くとも 30 日程で治癒するのに対して，我々の実験もそれを踏襲した結果となった．この報告では，プラコントロールでは全ての個体で治癒に 30 日以上を必要としズマの発生に伴って生じる一酸化窒素（NO）が血流の回復や血た．Fridman らは我々と同じく大気圧プラズマ発生装置を用管の弛緩に寄与することで創傷を治癒させると予想していた．し6)

かし，我々の実験では，この結果以外にも血管内皮細胞の増殖いて糖尿病性壊死の回復という臨床応用研究を報告しており ，

240(76)

静電気学会誌

第 36 巻

第 4 号 (2012)

促進および遺伝子発現の変化を捉えていることから，単純な血の活性化｣，
並びに文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支

管拡張効果にとどまらない細胞レベルでの変化が起こっていると

援事業「生体インターフェース用ナノカーボン／量子デバイ考えられる．

ス複合型バイオチップの開発」の一環として行われた．

そこで，我々は，このラット皮膚に対して新生血管内皮特異的に結合するトマトレクチンを用いて蛍光染色を行った．その結果，未照射のラットと比較して，プラズマ照射群のラット皮膚において

参考文献
1)

M. Laroussi: Low temperature plasma-based sterilization:

より多くの新生血管が観察された（図 8）．この結果について，独

overview and state-of-the-art. Plasma Process. Polym., 2 (2005)

立した非連続切片からのランダムサンプリングにより，総血管数391.

における新生血管の割合をグラフ化したところ，図9に示すように，

2)Mizuno: States of biological components in bacteria andプラズマ照射群のラットでは，非照射群ラットと比較して有意に新bacteriophages during inactivation by atmospheric dielectric

生血管が増加していることが判明した．
これらの結果から，大気圧プラズマ照射により生じる「細胞増H. Yasuda, M. Hashimoto, M.M. Rahman, K. Takashima and A.

barrier discharges. Plasma Process. Polym., 5 (2008) 6153)S. Ikawa, K. Kitano and S. Hamaguchi: Effects of pH on bacterial

殖活性化」や「創傷治癒促進」は，単純な NO による血流改善やinactivation in aqueous solutions due to low-temperature

血管拡張効果のみに由来するものではなく，よりミクロな細胞レ

atmospheric pressure plasma application. Plasma Process. Polym.,

ベルでの遺伝子発現変化を引き金として「血管新生」という積極

7 (2010) 33的な組織回復を行っていることが示唆された．

4)

J. Ehlbeck, U. Schnabel, M. Polak, J. Winter, Th. von Woedtke,
R. Brandenburg, T. von dem Hagen and K-D. Weltmann: Low

4.

temperature atmospheric pressure plasma sources forまとめ

microbial decontamination. J. Phys. D: Appl. Phys., 44 (2011)

本研究は，マイクロスポットプラズマ発生装置を用い
1. 血管内皮細胞の増殖への影響

0130025)

2. 損傷した生体組織の再生

Hara: A novel transfection method for mammalian cells using gasplasma. J. Biotechnol., 121 (2006) 299を検討したものであり，その結果，以下の事柄を明らかにし
6)た．

(2) ラット体表面に形成した火傷に対してプラズマイオ

Polym., 5 (2008) 503
7)

non-thermal plasma through fibroblast. growth factor-2 release.の治癒が見られる．

Ann. Biomed. Eng., 38 (2010) 748
8)晃，秋

ラズマ源による細胞および生体組織の活性化．静電気学会

これらの効果が発現するメカニズムについては不明であや組織表面へ衝突することにより，その刺激によって細胞内

筒井千尋，平田孝道，小町俊文，岸本拓巳，森谷昌宏，山本俊昭，田口 亮：マイクロスポット大気圧プる血管新生作用である可能性が示唆された．

るが，大気圧プラズマにより生じたイオンやラジカルが細胞S. Kalghatgi, G. Friedman, A. Fridman and A.M. Clyne:
Endothelial cell. proliferation is enhanced by low dose

ン照射を行うことにより，非照射火傷と比較して早期(3) これらの現象は，
FGF-2/VEGF 系によって引き起こされ

G. Fridman, G. Friedman, A. Gutsol, A.B. Shekhter, V.N. Vasilets
and A. Fridman: Applied Plasma Medicine. Plasma Process.

(1) 血管内皮細胞に対するプラズマ照射処理により，細胞倍加時間が短縮される．

Y. Sakai, V. Khajoee, Y. Ogawa, K. Kusuhara, Y. Katayama and T.

誌, 35 (2011) 209)

N. Ferrara and T. Davis-Smyth: The biology of vascularendothelial growth factor. Endocr. Rev., 18 (1997) 4の遺伝子が発現し，これらの因子が細胞増殖の活性化や内因

10) G. Seghezzi, S. Patel, C.J. Ren, A. Gualandris, G. Pintucci, E.S.

性一酸化窒素合成酵素などの産生を促しているという説が考Robbins, R.L. Shapiro, A.C. Galloway, D.B. Rifkin and P.

えられる 11, 12)．このことは，単純に大気圧プラズマ源によっ

Mignatti: Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) induces vascularて発生した一酸化窒素を作用させることとは異なり，生体あ

endothelial growth factor (VEGF) expression in the endothelial

るいは細胞自らの生理作用を変化させているということであcells of forming capillaries: an autocrine mechanism contributing

る．今後は，プラズマ源の何が生体に作用しているのかを調査し，治癒メカニズムを明らかにしていくことを目標とする．
これらのことが明らかになれば，これまでの薬剤による「不足を補う」療法とは一線を画する「自己治癒力を高める」新しい治療法を生み出すことも可能になるだろう．
なお，本研究は文部科学省科学研究費基盤研究（B）｢低侵襲型マイクロスポット大気圧プラズマ源による神経細胞組織

to angiogenesis. J. Cell Biol., 141 (1998) 1659
11) D.S. Gelinas, P.N. Bernatchez, S. Rollin, N.G. Bazan and M.G.
Sirois: Immediate and delayed VEGF-mediated NO synthesis inendothelial cells: role of PI3K, PKC and PLC pathways. Br. J.
Pharmacol., 137 (2002) 102112) J.D. Hood, C.J. Meininger, M. Ziche and H.J. Granger: VEGF
upregulates ecNOS message, protein, and NO production inhuman endothelial cells. Am. J. Physiol., 274 (1998) H1054