ダイオキシン類に係る生物検定法マニュアル（排出ガス、ばいじん及び燃え殻）

平成 20 年 3 月

環 境 省 水 ･大 気 環 境 局
総務課ダイオキシン対策室

マニュアル制定にあたって

ダイオキシン類の測定については、環境中の超微量なダイオキシン類を測定するため、これまでの高分解能ガスクロマトグラフ質量分析計による測定方法では測定に多大な時間と費用が必要となっており、迅速で低廉な、いわゆる簡易測定法の開発・導入が期待されている。
このため、環境省では、平成 16 年 12 月 27 日にダイオキシン類対策特別措置法施行規則(平成11 年総理府令第 67 号)の一部を改正し、廃棄物焼却炉からの排出ガス、ばいじん及び焼却灰その他の燃え殻(以下「ばいじん及び燃え殻」という。)に含まれるダイオキシン類の測定の一部に生物検定法による簡易測定法の追加等を行った。規則において環境大臣が定めることとされている
具体的な測定方法について、技術評価を踏まえて、平成 17 年 9 月 14 日に告示を行い、本マニュアルの対象となっている４種類の方法を指定した。
本マニュアルは、ダイオキシン類生物検定法等簡易測定法検討会並びに作業部会の委員のご助力をいただき、作成したものである。本マニュアルが、ダイオキシン類の測定やモニタリングが一層、効果的、効率的に行われ、ダイオキシン類の削減に寄与することに期待する。

平成 17 年 9 月 14 日
平成 18 年 3 月 23 日改訂
平成 20 年 3 月 17 日改訂

環境省水・大気環境局
総務課ダイオキシン対策室

ダイオキシン類生物検定法等簡易測定法検討会委員名簿（〜平成 17 年度）(敬称略、五十音順)
伊藤裕康

独立行政法人国立環境研究所化学環境研究領域計測管理研究室

小森行也

独立行政法人土木研究所水循環研究グループ

酒井伸一

京都大学環境保全センター

滝上英孝

独立行政法人国立環境研究所循環型社会形成推進・廃棄物研究センター有害廃棄物管理研究室半野勝正

独立行政法人千葉県環境研究センター廃棄物・化学物質部化学物質研究室

細見正明

東京農工大学大学院

宮田秀明

摂南大学薬学部○森田昌敏

独立行政法人国立環境研究所

渡邉肇

自然科学研究機構岡崎統合バイオサイエンスセンター

ダイオキシン類生物検定法等簡易測定法検討会委員名簿（平成 19 年度）(敬称略、五十音順)
伊藤裕康

独立行政法人国立環境研究所化学環境研究領域有機環境計測研究室

太田壮一

摂南大学薬学部衛生薬学科

鈴木規之

独立行政法人国立環境研究所環境リスク研究センター曝露評価研究室

滝上英孝

独立行政法人国立環境研究所循環型社会・廃棄物研究センター物質管理研究室

半野勝正

千葉県環境研究センター廃棄物・化学物質部化学物質研究室

○森田

昌敏

国立大学法人愛媛大学農学部生物資源学科（生物検定法検討作業部会）

鈴木規之

独立行政法人国立環境研究所環境リスク研究センター曝露評価研究室

滝上英孝

独立行政法人国立環境研究所循環型社会・廃棄物研究センター物質管理研究室

鑪迫典久

独立行政法人国立環境研究所環境リスク研究センター環境曝露計測研究室中村朋之

宮城県保健環境センター環境化学部

半野勝正

千葉県環境研究センター廃棄物・化学物質部化学物質研究室

○：座長

目

次

第１章 概論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

1

第１節

対象物質・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

第２節

引用規格・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

第３節

用語の定義・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

第４節

測定方法の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 3

第２章 各論（生物検定法に共通する事項) ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5
第１節

試料採取方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 5

第２節

測定結果の報告・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 9

第３節

測定データの精度管理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 13

第３章 各論(ダイオキシン類がアリール炭化水素受容体に結合することを利用した方法)
その１

前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性

組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 25
第１節

測定方法の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 25

第２節

用語の定義・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 25

第３節

試料採取方法に関する特記事項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 26

第４節

試料の前処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 27

第５節

測定・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 35

第６節

参考資料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 54

その２

前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性

組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する
方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 55
第１節

測定方法の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 55

第２節

用語の定義・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 55

第３節

試料採取方法に関する特記事項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 56

第４節

試料の前処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 57

第５節

測定・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 63

第６節

参考資料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 73

その３

前処理に、多層カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法・・・・・・・・・ 74
第１節

測定方法の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 74

第２節

用語の定義・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 74

i

第３節

試料採取方法に関する特記事項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 75

第４節

試料の前処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 76

第５節

測定・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 82

第６節

参考資料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 92

第４章

各論(ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用した方法)

前処理に、多層シリカゲルカラム及びカーボンカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノクロー
ナル抗体と、検量線作成用標準品及びプレート固相抗原を用いた抗原固相化-酵素免疫反応を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 93
第１節

測定方法の概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 93

第２節

用語の定義・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 93

第３節

試料採取方法に関する特記事項・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 94

第４節

試料の前処理・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 96

第５節

測定・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・102

第６節

参考資料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・115

ii

第1章

概論

本マニュアルに記載する各測定方法は、廃棄物焼却炉のうち、焼却能力が 1 時間当たり、2,000 キロ
グラム未満の施設において、当該施設設置者が排出ガスを測定する場合及び廃棄物焼却炉において当該施設設置者がばいじん等を測定する場合に、十分な精度を有するものとして用いることができるものとする。なお、今後の測定技術の進歩や科学的知見の集積等により、本測定法の改定があり得るものである。
また、本マニュアルに記載する各測定方法を罰則に係る測定で用いることはできない。
第１節

対象物質

本マニュアルに記載する各測定方法では、毒性等価係数を有するダイオキシン類(PCDDs、PCDFs 及びコプラナーPCBs)を測定対象とし、各測定法による実測濃度に所定の係数を乗じて測定量(毒性等量)を
算出する。
第２節

引用規格

次に掲げる規格は、本マニュアルに引用されることによって、各測定方法の一部を構成する。これらの引用規格は、その最新版(追補を含む)を適用する。
JIS K0095 排ガス試料採取方法
JIS K0211 化学分析用語(基礎部門)
JIS K0215 化学分析用語(分析機器部門)
JIS K0301 排ガス中の酸素分析方法
JIS K0311 排ガス中のダイオキシン類の測定方法
JIS K0901 気体中のダスト試料捕集用ろ過材の形状、寸法並びに性能試験法
JIS R3503 化学分析用ガラス器具
JIS R3505 ガラス製体積計
JIS Z8808 排ガス中のダスト濃度の測定方法
JIS Z9020 管理図−一般指針
JIS Z9021 シューハート管理図
なお、精度管理については、環境省において公表している「ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理の手引き（生物検定法）」を参照するとともに、高分離能ガスクロマトグラフ/高分解能質量分析計を用いる場合にあっては、「ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理指針」及び「ダイオキシン類の環境測定を外部に委託する場合の信頼性の確保に関する指針」を参照する。
第３節

用語の定義

本マニュアルで用いられる用語の定義を以下に説明する。なお、各測定方法に固有の単語については、
第 3 章及び第 4 章各論において、説明する。
1) TEF

毒性等価係数 (2,3,7,8-TeCDD Toxicity Equivalency Factor)

2) TEQ

毒性等量(2,3,7,8-TeCDD Toxicity Equivalency Quantity)、PCDDs/PCDFs 及び Co-PCBs の量をダイオキシン類の中で最も強い毒性を有する 2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-パラ-ジオキシ
ンの量に換算した量として表していることを示す記号

13) WHO-TEF

WHO/IPCS(2006)の TEF

4) HRGC/HRMS

高分離能ガスクロマトグラフ/高分解能質量分析計、ガスクロマトグラフのカラムとしてキャピラリーカラムを用い、分解能が 10,000 以上の二重収束形質量分析計を組み合わせたもの
5) 2,3,7,8-TeCDD

2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-パラ-ジオキシン6) PCDD

ポリクロロジベンゾ-パラ-ジオキシン7) PCDF

ポリクロロジベンゾフラン

8) 生物検定法

バイオアッセイ(生物学的定量法)ともいう。物質の量や構成成分、効力を、その物質を与えられた生物の反応から推定する方法
9) コプラナーPCBs

共平面構造型クロロビフェニルで、オルト位に塩素が配位していないもの、及び 1 つ配位している化合物のうち、12 種を規定する。ダイオキシン様 PCBs、DL-PCBs とも言われる
10) 抗原

抗原抗体反応又は免疫応答を誘発しうる物質の総称。免疫原性をもつ完全抗原に対して、比較的小さな分子で免疫原性をもたない抗原をハプテンという。ダイオキシン類はハプテンであり、適当な担体と結合させることで抗原性がでてくる
11) 抗体免疫反応において、抗原の刺激によって生体内に作られ、その抗原と特異的に結合するたん白質の総称12) レポータージーンアッセイ

ダイオキシン類による生体内での遺伝子発現誘導メカニズムを活用

し、ホタル等の発光酵素であるルシフェラーゼ等を発現させるレポーター遺伝子を導入した組換
え細胞を用いて、試料中のダイオキシン類に応答した遺伝子により生成されるルシフェラーゼ等の活性(発光量)をルミノメーターで測定することにより、ダイオキシン類の量を定量する方法
13) 抗原抗体反応

抗原とそれに対応する抗体との特異的な結合によって起こる反応

14) 酵素免疫測定法

ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)、酵素抗体法、エンザイムイムノ

アッセイともいう。本マニュアルに記載されている方法は、抗原認識部位(ダイオキシン類)と特異的に結合する抗体を反応させ、未反応の抗体を酵素標識抗体を用いて検出することによって、間接的に試料中のダイオキシン類濃度を測定する方法である
15) 実測濃度

各生物検定法において定められた標準物質を用いて検量線を作成し、それに基づいて得られた、試料中ダイオキシン類の標準物質に相当する濃度16）測定量(毒性等量)

生物検定法においては、実測濃度について対象測定媒体別に定められる方式

により換算を行って得られた値
17) RLU

Relative Light Unit、発光量ともいう。本マニュアルでは、レポータージーンアッセイにおいてルシフェラーゼが基質と作用する際に生じる発光の強さを指す
18) 吸光度

物質が光を吸収する度合いを透過率の逆数の常用対数で表した数値

19) HRGC/HRMS 法
3

高分解能ガスクロマトグラフ質量分析法

20) m N

20℃ 、101.3kPa(760mmHg)における気体の体積(立方メートル)21) μgマイクログラム(Microgram：100 万分の1g：10−6g)

22) ng

ナノグラム(Nanogram：10 億分の1g：10−9g)

23) pg

ピコグラム(Picogram：1 兆分の1g：10−12g)24) 試料における検出下限

検出できる試料中の最小濃度。本マニュアルでは、標準物質における検2

出下限から理論的に算出する
25) 試料における定量下限

定量が可能な試料中の最小濃度。本マニュアルでは、標準物質における定量下限から理論的に算出する
26) 標準物質における検出下限 分析方法（生物検定法）において検量線作成用標準物質から求めた、検出が可能な標準物質の最小濃度
27) 標準物質における定量下限 分析方法（生物検定法）において検量線作成用標準物質から求めた、定量が可能な標準物質の最小濃度
第４節

測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、以下に列挙する 4
つの生物検定法のいずれかにより定量する。生物検定法を用いた測定のフローを図 1-1 に示す。
1) ダイオキシン類がアリール炭化水素受容体に結合することを利用した方法(1) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 1)
(2) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 2)
(3) 前処理に、多層カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年
告示第 92 号第 1 の 3)
2) ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用した方法
前処理に、多層シリカゲルカラム及びカーボンカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノク
ローナル抗体と、検量線作成用標準品及びプレート固相抗原を用いた抗原固相化-酵素免疫反応を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 2)(注意) ダイオキシン類を取り扱う場合は、吸入、誤飲、直接皮膚への接触等を避け、前処理室及び分析室の換気並びに廃液や廃棄物の管理は十分に行うこと。また、その他の薬品、溶媒等でも吸入や誤飲によって測定者の健康を損なうものがあるので、取り扱いはできるだけ慎重に行い、実験室の十分な換気に注意する。

3

目的の明確化，計画の立案

代表試料の採取

試料採取

第 2 章第 1 節

試料採取の準備，採取器具類の洗浄

試料からの抽出抽出液

試料前処理
ダイオキシン類の回収率の事前確認

クリーンアップ

生物検定法による測定

第 3 章及び第 4 章第 4 節

試料保存･運搬使用細胞あるいはキットの品質管理

標準液の測定検出下限及び定量下限の確認
ブランク試験値確認

実試料の測定既知濃度試料を用いた正確度確認
妨害成分，ばらつき確認

ダイオキシン類(実測濃度)の定量

換算係数による測定量(毒性等量)への換算
適切な換算係数の使用
HRGC/HRMS 測定値との比較

測定値確定
図 1-1 生物検定法によるダイオキシン類測定のフロー

4

第 3 章及び第 4 章第 5 節

検量線の回帰性第２章

各論(生物検定法に共通する事項)

本章では、第 3 章にて掲げる各生物検定法に共通する事項として、試料採取方法、測定結果の報告及び測定データの精度管理について説明する。
第1節

試料採取方法

１．排出ガス
試料ガス採取の一般的事項は JIS K0095 による。また、ダイオキシン類測定のための試料ガス採取方
法は JIS K0311「5. 試料ガスの採取」に規定するものとする。
1.1

試料採取の概要

排出ガス試料の採取手順の概略を図 2-1 に示す。

排出ガスの性状
吸着剤の精製･充てん

事 前 調 査測定孔の状況
設備稼働状況

採取器具類の洗浄

試料ガス採取装置の組立
等速吸引条件の設定
温度，ガス組成，水分，
全圧・静圧(流速)採取装置の漏れ試験
その他 CO，O2 連続測定等

ろ紙準備
吸収液準備

試料ガスの採取等速吸引条件の設定
流速･流量の確認採取装置の漏れ試験

吸引ノズル･導管の洗浄
吸収液の集約
ろ紙の保管

試料輸送･保存

前処理及び測定

図 2-1 試料ガスの採取の作業手順

5

1.2

試薬

JIS K0311「5.3 試薬」に準拠したもの。
1.3

試料採取装置JIS K0311「5.2 試料ガス採取装置」に準拠したもの。本マニュアルでは、JIS K0311 の付属書 1 のJIS I 型採取装置を原則用いることとし、II 型又は III 型を用いる場合は、JIS K0311 の 5.2 に従い採取装置の妥当性を確認し、記録を作成する。
1.4

試料ガスの採取の準備

JIS K0311「5.4 試料ガスの採取の準備」に準拠した方法。ただし、5.4.3 の内標準物質の添加は行わない。
1.5

試料ガスの採取量

試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。排出ガスの採取に当たっては、通常の操業状態において(燃焼状態が安定した時点から約一時間以上経過した後を目途とする)、原則 4 時間以上採取する。なお、採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。各方法の具体的な算出方法については、第 3 章及び第 4 章に
記載する。

V =

QDL × v × k VE
1
×
×
1000
VE′ C DL

ここに、 V： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg-TEQ/mL)v： 測定用試料の液量(mL)k： 測定量(毒性等量)への換算係数(各方法固有の排出ガスの換算係数)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)
また、本数式については代表的な例であり、各方法により数式が異なることから、詳しくは第３章及び第４章に記載する各方法に記載する数式により算出することとする。なお、標準物質における検出下限は、各方法により反応溶液(培地あるいは緩衝液と標準物質を含む DMSO 溶液の混合液)の標準物質の濃度か、添加した標準物質(DMSO 溶液中)の濃度かが異なることに留意する必要がある。
1.6

採取操作

JIS K0311「5.6 採取操作」に準拠した方法。
1.7

試料の回収及び保存

JIS K0311「5.7 試料の回収及び保存」に準拠した方法。
1.8

試料採取量の算出

JIS K0311「5.8 試料ガスの採取量の算出」に準拠した方法。
1.9

試料ガスの採取の記録

JIS K0311「5.9 試料ガスの採取の記録」に準拠した方法。

6

２．ばいじん及び燃え殻
2.1

試料採取の概要

ばいじん及び燃え殻、それらの処理物の採取方法は、厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号
関係)(1)に規定するものとする。
2.2

試薬及び器具厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠したもの。
2.3

採取の準備

厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠した方法。
2.4

ばいじん及び燃え殻試料の採取量

ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。各方法の具体的な算出方法については、第３章及び第４章に記載する。

V =QDL × v × k VE
1
×
×
1000
VE′ C DL

ここに、 V： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg-TEQ/mL)v： 測定用試料の液量(mL)k： 測定量(毒性等量)への換算係数(各方法固有のばいじん及び燃え殻の換算係数)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液量分取量(mL)
CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)
また、本数式については代表的な例であり、各方法により数式が異なることから、詳しくは第３章及び第４章に記載する各方法に記載する数式により算出することとする。なお、標準物質における検出下限は、各方法により反応溶液(培地あるいは緩衝液と標準物質を含む DMSO 溶液の混合液)の標準物質の濃度か、添加した標準物質(DMSO 溶液中)の濃度かが異なることに留意する必要がある。
2.5

採取操作

厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠した方法。
2.6

試料の回収及び保存

厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に準拠した方法。
2.7

分析試料の調製

厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法。ただし、同表ウ(イ)の内標
準物質の添加の操作は行わない。
2.8

含水率

厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法。

7

参考

厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1) 試料採取
焼却施設から排出される試料として代表的な試料を採取する。ばいじん及び燃え殻が分離して排出される焼却施設においては、ばいじん及び燃え殻をそれぞれ採取する。この場合において、焼却施設内でばいじん
又は燃え殻を処理するときは、ばいじん又は燃え殻を処理したものを採取する。
ア

排出ピット等から、シャベル、スコップ等の採取具を用いて数箇所から採取し、容器(アルミ製バッ
ト等のダイオキシン類の吸着のない材質製のものに限る。)に移し入れ、不燃物等の異物を取り除き、十分に均一化する。

イ

均一化した試料を保存容器(ガラス製等のダイオキシン類の吸着のない材質製のものであって、密封できるものに限る。)に入れる。採取量は、試料の調製後に 150g 程度の試料を確保できる量とする。

ウ

保存容器を密封し、遮光された容器に収納する。

(2) 試料の前処理
ア

試薬
日本工業規格 K0311 の 6.2 に規定するものを用いる。

イ

器具及び装置日本工業規格 K0311 の 6.3 に規定するものを用いる。

ウ

試料の調製等(ア) 試料の調製① 灰試料の場合は、5mm の目のふるいを用いてふるい分けし、風乾後、乳鉢中で均一にすりつぶして混合する。
② 固化物試料の場合は、試料を粒径 2mm 程度以下まで粉砕する。
③

汚泥の場合は、試料を湿状のまま秤量する。この場合において、汚泥に含まれる固型分の重量比
は、当該汚泥 20g 以上 100g 以下(Ag)を平型量り瓶(容量 50mL 以上のもので、あらかじめ乾燥したものに限る。)又は蒸発皿(容量 100mL 以上のもので、あらかじめ乾燥したものに限る。)に正確に計り取り、沸騰しないように注意して水分を蒸発させ、105℃以上 110℃以下で 2 時間程度乾燥させ、デシケーター中で 30 分間程度放冷させた後、当該平型量り瓶又は蒸発皿に残留した物質の重量(Bg)を正確に求め、これを固型分の重量とし、次に掲げる式により求める。
固型分の重量比(%)＝B／A×100(イ) 内標準物質の添加(ア)の操作により調製した試料 20g 以上 100g 以下をビーカーに秤取し、日本工業規格 K0311 の 6.4.1に規定する方法により、ダイオキシン類内標準物質を加える。
エ抽出(ア) ウの操作で得られた試料について、日本工業規格 K0311 の 6.4.2a)に規定する方法により塩酸処
理及び洗浄を行い、ソックスレー抽出を行う。
(イ)(ア)の操作で得られた塩酸溶液及びメタノール又はアセトン洗浄液を分液漏斗に入れ、溶液 1l

当たりジクロロメタン 50mL で 3 回、液―液振とう抽出を行い、硫酸ナトリウムを用いて脱水する。
(ウ) (ア)及び(イ)の操作で得られた抽出液を合わせて溶媒を加え、一定量とし、抽出液とする。
(以下、省略)8第２節

測定結果の報告

本マニュアルに定める方法により測定を行った結果は、ダイオキシン類対策特別措置法施行規則(以下、規則という)様式第 6(図 2-2)の表 1 から 3 の該当する事項及び別紙 2(図 2-4)に記載する。このとき、規則様式第 6 の表 1 から 3 の備考欄に対応が分かるように簡易測定法と明記し、別紙 2 を添付する。
別紙 2 の測定方法の欄には、測定法の告示中の番号(例：第 1 の 3）を記載しても差し支えない。
実測濃度の欄には、毒性等量に補正する前の濃度(つまり、各測定方法で規定される検量線より求められる測定値であり、媒体ごとに換算されていない値)を記載することとする。
測定量の欄には、毒性等量に換算後の値を記載することとする。
また、実測濃度及び測定量とも従来の測定方法と同様に、標準酸素補正後の値を記入する。標準酸素補正の方法は、JIS K0311 に記載されている方法と同様であり、本マニュアルの第 3 章又は第 4 章にも記載する。
検出下限及び定量下限については、原則として実測濃度を記載することとするが、誤解のないよう単位についても併せて記載すること。
このほか、別紙 2 の備考欄には、基準値近傍の値である場合はその旨を、及び再測定を行った場合は別紙 1(図 2-3)に記載された当該再測定結果との対応等を明記する。

9

様式第６（第８条関係）
ダイオキシン類測定結果報告書
年月日

都道府県知事 殿
市長
氏名又は名称及び住所並び報告者 に法人にあってはその代表 印者の氏
名ダイオキシン類による汚染の状況について測定したので、ダイオキシン類対策特別措置法第２８条第３項の規定により、次のとおり報告します。
表１ 排出ガス
採取年月
日及び時
刻(開始時
刻〜終了
時刻)

表2

排 出
ガス量( m 3
N／日)

測名

特定施設の名称及び使用状況

分析年月
日

測定結果
(ng―TEQ
／m3N)

試料採
取者

分析者

備考

定
称

場

特定施設の名称及び使用状況

分析年月
日

測定結果
(pg―TEQ
／L)

採水者

分析者

備考

測 定 結 果 ( ng

試料採

分析者

備考

―TEQ/g)

取者

所
排 水 量
(m3／日)

ばいじん等

採 取 年月 日

試料の種

及び時刻

別

備考

測定箇
所

排出水

採取年月日
及び時刻

表３

排出ガス
中の酸素
濃度(％)

採取箇所

特定施設の名称

分析年月日

及び使用状況

１ 報告書及び別紙の大きさは、日本工業規格Ａ４とすること。
２ ダイオキシン類対策特別措置法施行規則（以下「規則」という。）第３条第１項に基づき換算した測定結果については、別紙１を添付するものとする。
３ 規則第３条第２項に基づき換算した測定結果については、別紙２を添付するものとする。
４ ２以上の測定結果がある場合は、添付する別紙１又は２のそれぞれとの対応関係がわかるように備考欄に記載すること。
５ 排出ガスにあっては表１、排出水にあっては表２、ばいじん及び焼却灰その他の燃え殻（以下「ばいじん等」という。）にあっては表３に記載すること。なお、同一届出者が大気基準適用施設及び水質基準対象施設をともに設置している場合には、併せて１葉の様式に記載すること。
６ 排出ガス量については、温度が零度であって圧力が１気圧の状態(以下「標準状態」という。)における量に、測定結果については、標準状態における排出ガス１立方メートル中の量に、それぞれ換算したものとする。
７ ２以上の水質基準対象施設を設置し、異なる排水系統を有する水質基準適用事業場にあっては、それぞれの排水系統の排水口ごとに測定を行い、結果を記載すること。
８ 表３の試料の種別として、ばいじん、焼却灰、混合灰又はこれらの処理物（処理方法）の別を記載すること。
９ 氏名(法人にあってはその代表者の氏名)を記載し、押印することに代えて、本人(法人にあってはその代表者)が署名することができる。

図 2-2 規則様式第 610図 2-3 規則別紙 1

11

別紙２

整理番号

規則第３条第２項に基づき換算したダイオキシン類の測定方法
測定量
測定方法 実測濃度 試料における 試料における
備 考
定量下限

検出下限

（毒性等量）

備考 １ 排出ガスの測定結果を記入する場合にあっては、単位をng／m3N（毒性等量にあっては、ng―TEQ／m3N。
）とし、ばいじん等の測定結果を記入する場合にあっては、ng／g（毒性等量にあっては、ng―TEQ／g。
）とする。
２ 測定方法の項においては、規則第２条第１項第４号の規定に基づき環境大臣が定める方法のうち、測定に用いた方法を記載すること。
３ 実測濃度の項においては、２の測定方法により測定された標準溶液相当濃度を記載すること。
４ 実測濃度の項において、検出下限以上定量下限未満の濃度は括弧付きの数字を記載すること。
５ 実測濃度の項において、検出下限未満のものは“ＮＤ”と記載すること。
６ 定量下限未満の実測濃度の測定量（毒性等量）は、零とすること。
７ 用語の定義は、規則第２条第１項第４号の規定に基づき環境大臣が定める方法によること。
８ 整理番号は、測定結果が複数の場合に記入すること。

図 2-4 規則別紙 2

12

第３節

測定データの精度管理

ダイオキシン類の測定は、極めて低濃度の測定であるため、測定精度の管理を十分に行う必要がある。
このため、分析操作の際には次のような作業を行う。これらの頻度等の詳細については、本節 1〜5 にて説明する。
1) 検出下限及び定量範囲の確認(標準物質における検出下限及び定量範囲の確認並びに試料における検出下限及び定量下限)
2) ブランク試験(試料採取、前処理時に使用する試薬等の汚染のレベルを確認するブランク試験(以後、操作ブランク試験という)並びに試料採取及び試料運搬における汚染を確認するためのブラン
ク試験(以下、トラベルブランク試験という))
3) 二重測定
4) 既知濃度試料の測定
5) 換算係数の確認
6) 検量線の確認及び感度変動の管理図による確認
また、各操作工程において、本節 1〜5 に掲げる事項について適切に行うことが望ましい。なお、精度管理については、本マニュアルに加え、ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理の手引き(生物検定法)も参照されたい。
１. 試薬等、器具、装置及び施設の管理
以下の事項について記録等を作成・保存する。
1.1 試薬等使用する試薬について、使用目的に応じて整理した上で、測定方法に定められたものであることを確認し、メーカー、製品名、ロット番号、購入日、購入量、開封日、有効期限及び保存方法等を記録する。
なお、有効期限の定められていないものについては、開封又は調製後の使用有効な期間を定め、それを記録する。
キット化されている試薬等については、そのキットに同梱されている試薬等をキット間で流用せず、使い切ること。
購入した試薬から精製・洗浄、その他の調製を行った二次的な調製試薬については、調製作業を行った者、作業日及び作業の内容、使用期限、保存方法及び調製等に使用した試薬のトレーサビリティを確実にする情報を記録する。
また、細胞又はキットを入手した場合、入手の情報(納入業者、担当者名、納入温度、時間及び梱包の破損の有無等)及び細胞については品質保証書について整理、保存する。細胞又はキットを保存する
場合は、必要に応じ、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度等の情報を記録、保存する。なお、細胞又はキットについては、停電や細胞保存容器からの液体窒素漏れといった万が一の事態に備えて、分散保管する等の対策を講じることが望ましい。
1.2

標準物質（溶液）

標準物質（溶液）については、1.1 の使用する試薬における記録に加え、使用日及び使用量を記録する。なお、標準溶液を購入した場合には、購入時の濃度（複数の標準物質を含むものにあっては各々の濃度）を記録する。

13

1.3

器具

使用する器具について、使用目的に応じて整理した上で、測定方法に定められたものであることを確認し、メーカー、製品名及び洗浄等の処理（作業を行った者、作業日及びその内容）、保管方法を記録する。また、マイクロピペットの吸い込みによるピペット本体内部汚染防止等、器具の汚染防止に関する記録を作成する。なお、必要に応じて高濃度試料測定用器具と低濃度試料測定用器具とを区別し、両者が明確に識別できるように措置し、その内容を記録する。点検及び校正が必要な器具については、定期的にそれらの実施に関する記録を作成する。
1.4

装置

使用する装置について、使用目的に応じて整理した上で、測定方法に定められたものであることを確認し、メーカー、製品名、点検及び校正の実施状況並びに日常の測定における管理状況を記録する。装置の修理等を行った場合には、修理伝票の保存とともに修理等の状況を記録する。
細胞を使用する場合は、雑菌汚染やインキュベーターの故障等のトラブルに備えて、予備のインキュベーターを保有する等の対策を講じ、また、定期的にインキュベーターを清掃する等、適切な細胞培養
環境の維持管理を行う。
1.5

施設

試料搬入後の一連の業務がどのような作業環境で実施されているかを判断できる文書を作成する。
特に試料の前処理及び生物検定法による測定の作業環境については、品質管理の観点からどのような配慮がなされているかを記述する。例えば、定期的に温度、湿度及び差圧等の条件について記録を取っておく。
また、前処理と測定に関しては施設が独立していることが望ましい。
同一施設で高分解能ガスクロマトグラフ/質量分析計を用いた方法（以下、「HRGC/HRMS 法」）によるダ
イオキシン類分析を行っている場合は、内標準物質による汚染が生じないような対策を講じる。
なお、作業環境については、以下の要件を満たす施設を有することとし、精度（品質）管理の観点からどのような配慮がなされているかを記述する。
1) 遺伝子組換え培養細胞を用いたレポータージーンアッセイによる試験実施施設(1) 試験施設は、培養細胞の保存、継代培養及び試験操作等を行うため、必要に応じ分離された区域を有し、試験実施中に使用される試薬の調製並びに保管、また、器具及び機器の滅菌、維持管理並びに保管等が可能であること。
(2) 当該施設は、雑菌汚染等により培養細胞に与える影響が最小限に抑制されていること。
(3) 自治体等によって、遺伝子組み換え培養細胞の使用に当たっての運用規則等が定められていることがありうるため、その場合は該当する規則を遵守すること。
2) 抗原抗体反応を利用したキットによる試験実施施設
試料搬入後の一連の業務がどのような作業環境で実施されているかを判断できる文書を作成する。
特に試料の前処理及びキットに対するピペッティング操作やプレートリーダー等による測定の作業
環境については、精度（品質）管理の観点からどのような配慮がなされているかを記述する。
1.6

環境汚染の防止及び作業者暴露の防止

分析環境については、環境へ漏洩防止及び廃棄物処理等の環境汚染の防止並びに作業者暴露の防止についても関連法規等を遵守の上、十分な対策を講じる。

14

1.6.1

廃棄物処理

実験施設で発生した廃液及び廃棄物は汚染区分を設け、区分ごとに処理方法を明確にし、処分する。
このうち、廃棄するものは、廃棄物処理業者に委託する等適正に処理されることとなるまで密閉容器に保管し、廃棄物保管室に保管することとする。
1.6.2

安全性確保

生物検定法によるダイオキシン類分析施設は、試料採取や分析を行う作業従事者の安全及び健康を確保するとともに、施設周辺環境への汚染を防止することを第一とし、これを達成するための施設の構造、設備等を備えることとする。
1) 分析室
前処理室、生物検定法による測定室、標準試料室及び廃棄物保管室といった各ダイオキシン類の分析関連室への出入りは関係者に限定し、分析室のドア等に「関係者以外立入禁止」の表示を掲げる等
して管理を行うこと。また、各分析室は、機密性を確保するとともに負圧にし、ダイオキシン類の流出を防止すること。また、排気及び排水設備の出口には、活性炭フィルターや活性炭槽を設置する等して、環境へのダイオキシン類放出を防止すること。
2) 試料採取現場での安全管理試料採取現場内での作業中は、安全用保護具を着用すること。特に飛灰の採取時は、防じんマスク・
防じんメガネ等を使用すること。
作業終了後、手洗い、うがいを行い空気中浮遊粉じんを摂取しないよう注意すること。また、試料採取に使用した機器類を測定場所から持ち帰る時は、測定作業中に堆積した粉じんの払い落としを行う等、ダイオキシン類汚染粉じん等による環境汚染に留意すること。
3) 前処理工程での安全管理
標準試料の取り扱いに際しては、危険性の程度に応じて、ドラフト(安全キャビネット)、グローブボックス等を適宜用いる。前処理工程時は、排気ファンを運転した状態で作業を行うこと。また、飛散する可能性の高い試料を取り扱う場合は、飛散しないよう注意して取り扱うと共に、防じんメガネ、
防じんマスク及び使い捨てゴム手袋等を着用し、試料の吸引及び皮膚への直接接触を避けること。
4) 生物検定法による測定時の安全管理
培養細胞を用いるレポータージーンアッセイを行う場合、標準試料及び測定試料を曝露する際には、無菌状態の確保、ダイオキシン類による汚染防止の観点から安全キャビネット(例えば、JIS K3800 に規定するバイオハザード対策用クラス II キャビネット等）を使用することが望ましい。また、抗原抗体反応を利用した方法では、無菌状態を確保する必要はないが、ドラフト等ダイオキシン類による実験室の汚染を防止できる設備を使用することが望ましい。
5) 緊急時の対応
ダイオキシン類による汚染、被曝、漏洩、標準物質の紛失等、あるいはそれらのおそれがある場合、速やかに関係者に連絡、対処をしなければならない。このため、事故発生時等の緊急時の警報等の連絡システム、緊急処置設備等を整備しておくこと。
6) 健康管理作業従事者には労働安全衛生法による健康診断を実施するとともに、必要に応じ検査項目を追加することができるものとする。健康診断の結果、異常が認められた場合には速やかに措置を講ずるもの
とする。

15

7) 安全教育
安全管理指針(規定)を作成するとともに、作業従事者に対して分析施設、設備の周知を図り、ダイ
オキシン類の取り扱い、廃棄物の取り扱い等の教育訓練を実施する。
２. 試料採取
排出ガスについては、定期的に JIS K0311 に基づく測定を行い、サンプリングスパイクの回収率が 70〜130%の範囲内であることを確認することが望ましい。操作に当たっては、本マニュアル及び JIS K0311「附属書 1(規定)試料ガス採取装置」に記載の「操作上の注意」に従って試料採取を行う。
ばいじん及び燃え殻の操作に当たっては、本マニュアル及び厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)に従って試料採取を行う。
この他、下記について留意して試料採取を行う。
2.1

試料採取計画

1) 事前調査
事前調査の必要性について検討し、必要と認める時は事前調査を行う。また、事前調査結果を 2)の試料採取計画に反映させる。
2) 試料採取計画
試料の採取に際して、試料採取計画を作成する。
2.2

試料採取の実行に係る判断前日及び当日の天候（項目によっては数日前の天候についても考慮する。）その他の状況を踏まえ、試料採取の実行の可否について判断し、可とした場合には試料採取を実施し、不可とした場合には、その経過を記録する。
2.3

試料採取の記録

試料採取計画に基づき、試料採取を実施し、以下の記録を作成・保存する。なお、特殊事情により本マニュアルに記載していない方法を講じた場合には、その理由、内容及び妥当性（比較検討結果及び引用文献等）を試料採取計画に記録する。
1) 共通的事項(1) 試料の名称(2) 試料採取者(3) 試料採取日時(4) 試料採取地点名(5) 採取地点及び場所に係る地図及びその状況に関する記述（必要に応じて、全地球測位システム（GPS）等により求めた試料採取地点の緯度及び経度）(6) 試料採取の実行に係る判断等(7) 採取期間内の天候(8) 試料採取時の写真（周辺の状況がわかる遠景写真及び試料採取状況がわかる近景写真の 2 種類。
ただし、写真撮影が不可の場合には、必要としない。）(9) 試料に影響を与えている可能性のある事項(10) 試料採取量(11) 試料採取後の輸送方法

162) 測定項目別の特記事項(1) 試料採取器具及び装置並びに使用した試薬等(2) 試料採取操作(3) 試料容器
2.4

トラベルブランク試験及び二重測定

試料採取に当たって、トラベルブランク試験のための操作及び二重測定のための試料採取を行い、その実施状況を記録する。
トラベルブランク試験は、移送中に汚染が考えられる場合(電気集じん機で集められた灰等による汚染)には必ず測定し、十分に低値であることを確認しなければならないが、それ以外の場合には、その管理を十分しておけば毎回測定しなくてもよい。二重測定についても、二重測定の実施が困難である場
合を除き、測定試料数の 10%程度の頻度で行い、同一の生物検定法における定量下限以上の測定量（毒性等量）について、±30%以内であることを確認する。3 つ以上の試料の場合は、同一の生物検定法における定量下限以上の測定値について、その平均値(測定量(毒性等量))を求め、個々の測定量（毒性等量）
が平均値の±30%以内であることを確認する。
なお、二重測定用の試料採取を行わない場合には、試料採取の操作について十分な管理を行うことが必要である。
トラベルブランク試験又は二重測定を行わない場合には、試料採取における信頼性について十分検討しておき、必要があればそのデータが提示できるようにしておく。
３. 試料の前処理
3.1

試料前処理計画

試料の前処理に際して、試料前処理計画を作成する。
3.2

試料の前処理に係る共通的事項

試料前処理計画に基づき次の作業を実施し、記録を作成・保存する。
1) 試料の受入検査採取された試料が測定機関に搬入された段階で試料の状態等に関する受入検査を実施し、以下の事項について記録を作成する。
(1) 試料が搬入された日時及び受入検査を実施した日時(2) 受入検査の実施者(3) 試料搬入の手段及び状態(4) 試料容器の種類及び大きさ(5) 試料の性状(6) その他特記事項
2) 抽出操作を行うまでの試料の保存及び管理
受入検査を行った試料について、3)の抽出操作を行うまでの間、以下の記録を作成した上で適切な保存及び管理を行う。
(1) 試料の管理番号(2) 試料の保存及び管理の場所、方法並びに期間

173) 試料からの抽出
試料からの抽出操作を行い、以下の記録を作成し、その内容が測定方法に定められた方法及び条件により行われたことを確認する。なお、特殊事情により本マニュアルに記載していない方法を講じた
場合には、その理由、内容及び妥当性（比較検討結果及び引用文献等）を記録する。
また、抽出操作時の他試料による汚染を判断するための参考資料として、同時期に処理を行った試料のリストを作成する。
(1) 操作を行った者(2) 操作を行った日時(3) 抽出に供した試料の性状及び量(4) 抽出のために使用した器具並びにその洗浄の実施状況及び使用するまでの保管の状況(5) 抽出操作の方法及び条件（溶媒の種類、量及び抽出時間等）
4) 試料抽出液のクリーンアップ
試料抽出液のクリーンアップ操作を行い、以下の記録を作成し、その内容が測定方法に定められた方法及び条件により行われたことを確認する。なお、特殊事情により本マニュアルに記載していない
方法を講じた場合には、その理由、内容及び妥当性（比較検討結果及び引用文献等）を記録する。
また、クリーンアップ操作時の他試料による汚染を判断するための参考資料として、同時期に処理を行った試料のリストを作成する。
(1) 操作を行った者(2) 操作を行った日時(3) 操作のために使用した試料抽出液の量(4) 操作の方法及び条件(5) 使用試薬の種類a) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等
量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 1)
① 硫酸シリカゲル/活性炭カラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・活性炭の材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量b) 前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性
組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 2)
① 硫酸シリカゲル/活性炭カラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・活性炭の材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量c) 前処理に、多層カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17年告示第 92 号第 1 の 3)

18

① 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量② アルミナカラムクロマトグラフ操作の場合
・アルミナの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量d) 前処理に、多層シリカゲルカラム及びカーボンカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モ
ノクローナル抗体と、検量線作成用標準品及びプレート固相抗原を用いた抗原固相化-酵素免
疫反応を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第2)① 硫酸処理・ヘキサンの使用量
・硫酸の添加量及び添加回数② 多層シリカゲル/活性炭カラムクロマトグラフ操作
・シリカゲルの材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・活性炭の材質及び商品名、活性化条件並びに充填量
・溶出のために使用した溶媒の種類及び溶出液の量
3.3

試料の前処理に係る測定項目別の特記事項

試料の前処理に係る測定項目別の特記事項については、必要に応じ、記録をする。
3.4

測定用試料に併せて測定を行う試料の調製

ダイオキシン類の測定に係る品質が確保されていることの確認等を行うため、以下の試料について必
要な前処理等を行い、4.5 において測定を行う試料として調製するとともに、調製を行った測定担当者の氏名、調製の日時及び調製操作の概要を記録する。
1) 操作ブランク試験のための試料
一連の測定業務において用意する試料である。操作時の汚染に対して十分な管理がなされており、その値が十分低値であれば毎回行わなくてもよいが、前処理操作に大きな変更があった場合、試料間汚染が予想されるような高濃度試料を測定した場合にも試料を調製する。
なお、操作ブランク試験は、測定用試料の調整等に起因する汚染を確認し、試料の測定に支障のない測定環境を設定するために行うものである。試料の採取及び前処理に用いるのと同じ試薬等を用いて試料と同様に行う。ブランク値が高い場合等は、試料測定値の補正に操作ブランク測定値を用いる必要があるが、ブランク試験の値が大きいと測定感度が悪くなるばかりでなく、測定値の信頼性が低下するため、ブランク試験値は極力低減を図らなければならない。そのためには、クリーンドラフト
内で前処理操作等を行うこと。
2) トラベルブランク試験のための試料
2.4 に基づきトラベル試験のための操作を行った試料について、前処理操作を行い調製した試料である。
なお、トラベルブランク試験は、試料について、試料採取準備時から試料分析時までの汚染の有無を確認するためのものである。試料採取操作以外は試料と全く同様に扱い持ち運んだものについて、試料と同様の前処理操作を行う。なお、ブランク試験の値が大きいと測定感度が悪くなるばかりでな

19

く、測定値の信頼性が低下するため、ブランク試験値は極力低減を図らなければならない。
3) 二重測定のための試料
2.4 に基づき試料採取を行った二重測定用の試料について、前処理操作を行い調製した試料である。
なお、二重測定用試料は、試料採取、前処理操作及び測定操作における総合的な信頼性を確保するために、同一試料から 2 点以上採取し、測定に供する。
排出ガスについては、同一の試料を同時に 2 台以上の装置で採取する。ばいじん及び燃え殻については、試料採取、前処理操作及び測定操作における総合的な信頼性を確保するために、同一試料から2 つ以上の測定試料について採取する。
4) 濃度既知試料
標準的な濃度既知試料であり、適切な頻度（例えば、一連の分析操作ごと）において、前処理から測定までの工程に品質管理上の問題が発生していないことを定期的に確認するために使用する試料である。問題が発生していると認められる場合は、さらに前処理及び測定操作等工程ごとに濃度既知試料を用いて確認し、原因の究明を行う。なお、前処理から測定までの確認は、適切な頻度で行われていれば、下記 5) 換算係数の確認のための試料の分析をもって代えることができる。
5) 換算係数の確認のための試料
換算係数の確認のために調製する試料であり、片方は HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りは生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
４. 生物検定法による測定
4.1

生物検定法による試料の測定計画

測定に際し、生物検定法による試料の測定計画を作成する
4.2

計測機器の点検

計測機器の点検に関する実施基準を作成し、この基準に基づき点検等を行い以下の記録を作成する。
また、停電や故障等の問題が発生した場合には、どのような処置を講じたかを記録する。
1) 日常点検(1) 点検を行った者及び点検を行った日時(2) 各種消耗品に関する基本的な事項
2) 定期点検(1) 点検を行った者及び点検を行った日時(2) 点検の実施状況
3) メンテナンス(1) 光源等の点検及び交換(2) インキュベーター等の温度制御機能の点検及び修理(3) その他
4) 問題が発生した時の処置(1) 問題の内容及び講じた処置
4.3

測定系の準備

以下の 4.4〜4.7 の操作を行うに当たり、培養細胞又はキットの準備を行い、これらの測定系が使用可能であることを確認した上で以下の記録を作成する。

20

また、遺伝子組み換え培養細胞ならびに抗ダイオキシン類抗体の活性がダイオキシン類の測定に必要とされる状態にあることについても確認する。
1) 凍結保存されているもの(1) 解凍作業を行った者及び日時(2) 凍結保存されている培養細胞又はキットの解凍操作(3) 操作が測定に使用する上で問題がないことの確認記録（測定使用前の活性確認を含む）
2) 冷蔵保存されているもの(1) 開封等作業を行った者及び日時(2) 開封等の操作(3) 測定に使用する上で問題がないことの確認記録
3) 常温保存されているもの(1) 開封等作業を行った者及び日時(2) 開封等の操作(3) 測定に使用する上で問題がないことの確認記録
4) 細胞の管理状況
遺伝子組換え培養細胞を用いたレポータージーンアッセイにおいては、下記に示す細胞の管理状況についても確認及び記録を作成する。なお、細胞についてはその継代回数が品質管理上問題ない範囲
内で試験に使用すること。
(1) 継代等の操作記録(2) 培養条件の確認及び雑菌汚染等の有無の確認(3) 細胞活性が維持されていることの確認
4.4

検量線の作成検量線作成用標準液について、測定時の同一ロット内において測定を行い、必要なデータを求める。
得られたデータが測定方法に定められた条件に合致していることを確認し、以下の記録を作成する。
(1) 検量線の作成者(2) 検量線の作成日(3) 測定条件(4) 計測値（発光、吸光又は蛍光等の強度）(5) 測定方法で定められている近似式及びその算出過程
4.5

試料の測定

生物検定法による試料の測定計画に基づき、検量線作成用標準液、測定用試料及び 3.4 で調製した試料について測定操作を実施し、必要なデータを集め、以下の記録を作成する。
(1) 測定操作を行った者(2) 測定を行った日(3) 測定条件(4) 測定の順番(5) 測定に供した試料量(6) 計測値（発光、吸光又は蛍光等の強度）

21

4.6

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、本マニュアルに従い、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準は、管理限界（μ±2σ）からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記の通りとする。（μ:工程平均、σ:測定量（毒性等量）の標準偏差）
なお、管理限界は十分なサンプル数からσを導出することとし、変動係数（CV%）で 20%以内に収まることが望ましい。
1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
管理図より明らかとなる原因についての考察を例示する。
1) 良好な結果(1) 管理限界内
2) 注意を要する結果(管理限界内)(1) 中心線より下又は上に偏在傾向a) 発色基質の劣化や酵素活性の低下等の発色感度低下b) プラスミドの欠落等の細胞劣化c) 試薬の汚染(2) 一定の増加又は減少傾向
a) 発色基質の劣化や酵素活性の低下等の発色感度低下b) プラスミドの欠落等の細胞劣化c) 試薬の汚染
3) 改善を要する結果(1) 1 点以上が管理限界超過a) ピペッティング操作の不備（不良なチップ使用又はチップ取り付け不備によるリーク等）
b) 添加忘れ等の操作ミス(2) 全ての点が管理限界超過a) ピペッティング操作の不備（不良なチップ使用又はチップ取り付け不備によるリーク等）
b) 試薬や試料の混合不良c) 反応温度不適・反応時間間違い
なお、JIS Z9021

シューハート管理図には、μ±2σを警戒限界、μ±3σを管理限界とする考え方も掲載されているが、本マニュアルでは、μ±2σを管理限界とする。
4.7

検出下限等算出用検量線の作成

測定担当者は、少なくとも 6 ヶ月に 1 回、検出下限及び定量範囲を求めるために、標準液について検量線を作成する。得られたデータが測定方法に定められた条件に合致していることを確認し、以下の記録を作成する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行い、記録を作成する。
(1) 検出下限等算出用検量線の作成者

22

(2) 検出下限等算出用検量線の作成日(3) 測定条件(4) 計測値（発光、吸光又は蛍光等の強度）(5) 測定方法で定められている近似式及びその算出過程
５. 生物検定法における定量結果の確定と結果の報告
以下の 5.1〜5.4 の作業を行い、作成した記録及び 4.4〜4.7 の記録を整理し、問題がないことを確認する。問題を認めた場合には、適切な措置を講じる。
以下の 5.3 で算出された測定量（毒性等量）の精度（品質）に問題がない場合は、以下の 5.5〜5.11の作業を行い、問題がないと認める場合には、測定用試料の定量結果を確定する。
5.1

検出下限及び定量範囲

1) 標準物質における検出下限及び定量範囲の算出
原則として、検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量（毒性等量）の定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限、20%以下となる点を定量下限とし、この定量下限と本マ
ニュアル第３章及び第４章に記載されている方法により算出された定量上限の間を定量範囲とする方法で算出し、結果を記録しておく。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、少なくとも 6 ヶ月に 1 回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
2) 試料における検出下限及び定量下限
基本的には試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、本マニュアルに従い試料ごとに求める。
5.2

実測濃度の算出

本マニュアルに定められた方法により、実測濃度を算出し、その結果を記録する。また、実測濃度の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
5.3

測定量（毒性等量）の算出

本マニュアルに定められた方法により、測定量（毒性等量）を算出し、その結果を記録する。また、使用した換算係数等も含め、測定量（毒性等量）の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
5.4

再測定

記録の不備、操作ミス及び定量範囲の逸脱等、再測定の必要が生じた場合、その理由を記して再測定を行うとともに、その原因を追究して理由を明確にする。
5.5

操作ブランク試験

操作ブランク値を求め、結果が十分に低値であることを確認し、記録する。なお、操作ブランク試験の値が高い場合は、その原因を追及して理由を明確にする。
5.6

トラベルブランク試験

トラベルブランク値を求め、結果が十分に低値であることを確認し、記録する。なお、トラベルブラ
ンク試験の値が高い場合は、その原因を追及して理由を明確にする。

23

5.7

二重測定

二重測定用試料の測定量（毒性等量）を求め、結果を比較検討し、記録する。なお、二重測定の値が高い場合は、その原因を追及して理由を明確にする。
5.8

濃度既知試料の測定

濃度既知試料の測定量（毒性等量）を求め、これまでに同一試料について測定した結果と比較検討し、記録する。なお、濃度既知試料を測定した結果が一定の範囲（例えば、当該濃度の±30%以内、又は標準偏差の 2 倍以内）を逸脱していた場合は、濃度既知試料を用いて、前処理及び測定操作等工程ごとに濃度既知試料を用いて確認し、原因の究明を行う。
5.9

換算係数の確認

少なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、本マニュアル記載の換算係数と比較し記録する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認を行い、比較結果を記録する。
本マニュアル記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
なお、HRGC/HRMS 法を用いる場合は、「ダイオキシン類の環境測定に係る精度管理指針」及び「ダイオキシン類の環境測定を外部に委託する場合の信頼性の確保に関する指針」に留意することとする。
5.10

異常値及び欠測値の発生原因等

5.1〜5.9 でデータの確定ができなかった異常値及び欠測値については、その原因等を検討し、その結果を記録する。また、異常値及び欠測値について、問題がある場合については、必要な措置を講じる。
5.11

試料等の保存再測定に備えた試料等の保存及び管理を行い、その管理番号、保存及び管理の方法並びに期間を記録する。

24

第３章 各論(ダイオキシン類がアリール炭化水素受容体に結合することを利用した方法)
その１

前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性

組換え細胞 H1L6.1c2 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 1)第１節

測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応
答性組換え細胞 H1L6.1c2 を用いた測定により定量する。測定方法のフローを図 3-1-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 H1L6.1c2 を用いた測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-1-1 測定方法のフロー
第２節

用語の定義

1) 細胞株 Cell Line、培養により増殖できる植物や動物起源の細胞集団
2) 遺伝子組換え細胞 組換え DNA 技術を用いて作製された細胞
3) 組換え DNA 技術
4) 外来遺伝子組換え DNA を作製し、それを生細胞(宿主)に移入し、増殖させる技術

Exogenous Gene、遺伝子工学的手法等により外部から細胞内に導入された遺伝子

5) ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene、生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子6) DRE

Dioxin Responsive Element、ダイオキシン応答配列、ダイオキシン類が特異的に結合する

遺伝子の塩基配列部分
7) ベクター

Vector、DNA 組換え技術において、目的とする遺伝子を宿主細胞に運ぶ自己複製 DNA

分子8) リガンド

Ligand、タンパク質又は他の分子の特異的部位に結合する分子の総称。受容体が鍵穴

でリガンドが鍵の関係。両者が結合すると、両者の関係に特異的な信号が発生し生理反応が引き
起こされる

25

9) Ah 受容体

Arylhydrocarbon Receptor、アリール炭化水素受容体、特異的な細胞外シグナル伝達

分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影
響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる
10) 遺伝子転写Gene Transcription、ポリメラーゼという酵素により、DNA の一方の鎖から相補的な配列をもつ RNA をコピーすること
11) CYP1A1

Cytochrome P450、薬物代謝酵素シトクロム P450 類に属する薬物代謝酵素。CYP1A1 は、

ダイオキシン類により誘導されることが知られている
12) 継代培養

Subculture、保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え継ぎ、再び培養したもの
13) コンフルエント
14) プラスミド
15) 発光基質

Confluent、培養細胞の密集生育状態

Plasmid、小型の環状 DNA 分子のこと

生物発光反応の基質

16) 精度プロファイル 精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図
第３節

試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量
試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

V =QDL × k × v VE
1
×
×
1000
VE′ C DL

ここに、V

： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中)k： 測定量(毒性等量)への換算係数 6.1 の 2)検出下限及び定量範囲の算出例の通りに精度プロファイルより求められた検出下限の標準物質濃度v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出
下限は 0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 4mLの測定用試料溶液に調製する場合の試料ガス採取量を次に示す。

26

V =

0.977×0.253×4
50
1
××= 0.029
1000
10
0.2

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量
ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

W =

Q DL × k × v VE
1
×
×
1000
VE′ C DL

ここに、W

： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中) 6.1 の 2)検出下限及び定量
範囲の算出例の通りに精度プロファイルより求められた検出下限の標準物質濃度

K： 測定量(毒性等量)への換算係数

V： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料における検出下限は0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液から 25mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 4mLの測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を下記に示す。

W =

第４節

0.977×0.345×4
50
1××= 0.026
1000
25
0.1

試料の前処理１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-1-2に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

27

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-1-2 試料の前処理から測定までのフローの例
２．試薬
試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等の品質のもの

2) メタノール

JIS K8891 に規定するもの又は同等の品質のもの

3) アセトン JIS K8040 に規定するもの又は同等の品質のもの
4) トルエン JIS K 8680 に規定するもの又は同等の品質のもの
5) ジクロロメタン

JIS K8117 に規定するもの又は同等の品質のもの

6) ヘキサン JIS K8825 に規定するもの又は同等の品質のもの
7) 酢酸エチル

JIS K8361 に規定するもの又は同等の品質のもの

8) ノナン 測定に支障のない品質のもの
9) 硫酸ナトリウム10) セライト 545

JIS K8987 に規定するもの

測定に支障のない品質のもの

11) 塩酸JIS K8180 に規定する特級又は同等の品質のもの

12) 硫酸JIS K8951 に規定するもの又は同等の品質のもの

13) ヘキサン洗浄水
14) シリカゲル

1)の水を 6)のヘキサンで十分洗浄したもの

カラムクロマト用シリカゲル(粒径 70〜230μm)をビーカーに入れて 180℃で約 48 時

間加熱した後、デシケーター中で約 30 分間放冷する。調製後、密栓できる試薬瓶に入れ、デシケ
ーター中で保存する
15) 硫酸(33.3%質量分率)シリカゲル

14)のシリカゲル 100g に対して 12)の硫酸 50.0g を添加後、十分振とうし、粉末状にする。調製後、密栓できる試薬瓶に入れデシケーター中に保存する
16) XCARB

活性炭を分散させたセライト(1%XCARB/セライト、又はそれと同等以上の性能を有するもの)17) ガラス繊維ろ紙 孔径 0.5μm 程度のもの、ブフナー漏斗に用いる

28

３．器具及び装置
試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ又は遠心エバポレータ。接続部にグリースを使用してはならない
3.4

硫酸シリカゲルカラムクロマトグラフ管(小)内径 7mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.5

硫酸シリカゲルカラムクロマトグラフ管(大)内径 13mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.6

活性炭カラムクロマトグラフ管

内径 6mm、長さ 300mm のガラス製カラムクロマトグラフ管
3.7

漏斗

ブフナー漏斗又はこれと同等の品質のもの
４．前処理操作
4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-1-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

29

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理

ろ液

試料 1g に対して 20mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液−液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-1-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例
2) ばいじん及び燃え殻
厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。
試料の適量を用いて、ダイオキシン類分析及び水分測定を行う。図 3-1-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

30

試料

含水率測定

HCl(2mol/l)処理

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液−液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水
濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-1-4 ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例
4.3

クリーンアップ

図 3-1-5 にクリーンアップのフロー例を示す(注 1)。

(注 1) 本クリーンアップの手法は、下記の特許によるもの
引 用 文 献 ： M.Chu,et al.,Methods and apparatus for separating and detecting specific polyhalogenated diaromatichydrocarbons,US Patent #6,720,431(2004)

31

抽出液

：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業：物又は試料

濃縮
夾雑物の少ない場合
硫酸シリカゲル(小)／活性炭
カラムクロマトグラフ操作
グ
酢酸ｴﾁﾙ：ﾄﾙｴﾝ：ﾍｷｻﾝ(１：１：８)

夾雑物の多い場合
硫酸シリカゲル(大)／活性炭
カラムクロマトグラフ操作
グ
酢酸ｴﾁﾙ：ﾄﾙｴﾝ：ﾍｷｻﾝ(１：１：８)ﾄﾙｴﾝ
第 1 画分

ﾄﾙｴﾝ

第 2 画分

第 1 画分

第 2 画分

濃縮

濃縮

測定用試料

測定用試料

図 3-1-5 クリーンアップのフローの例
1) 抽出液の分取(1) 抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。
(2) あらかじめ、ノナン 20μL を入れた受器に適量の抽出液を入れ、遠心エバポレータで乾固寸前まで濃縮し、この濃縮液を室温中でトルエンを除去する。その後、次に示す硫酸シリカゲル-活性炭カラムクロマトグラフ操作によってクリーンアップを行う。
2) 精製カラムの作成(1) 硫酸シリカゲルカラム(小)a) 3.4 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、硫酸ナトリウム 1.7g、硫酸(33.3%質量分率)シリカゲル 3.0g、及び硫酸ナトリウム 1.7g を順次充てんする。このカラムを図 3-1-6に示す。
b) ヘキサン 30mL を流下させる。

32

硫酸ナトリウム

1.7g

硫酸(33.3%質量分率）

シリカゲル（大） 7.1g
シリカゲル（小） 3.0g

ガラスウール

図 3-1-6 硫酸シリカゲルカラムの例(2) 硫酸シリカゲルカラム(大)a) 3.5 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、硫酸ナトリウム 1.7g、硫酸(33.3%質量分率)シリカゲル 7.1g、及び硫酸ナトリウム 1.7g を順次充てんする。このカラムを図 3-1-6に示す。
b) ヘキサン 50mL を流下させる。
(3) 活性炭カラム(注 2)a) 3.6 のカラムクロマトグラフ管の底部にガラスウールを詰め、硫酸ナトリウム 0.5g、1%XCARB/
セライト 0.3g(注 3)、及び硫酸ナトリウム 1.0g を順次充てんする。このカラムを図 3-1-7 に示す。
b) アセトン 5mL、トルエン 20mL、ヘキサン 10mL を流下させる。

(注 2) 活性炭は製造ロットによって、品質変動が考えられるため、内標準物質(クリーンアップスパイク)を用いて、ロットが変わるたび、添加回収を HRGC/HRMS 法により確認しておくことが望ましい。
(注 3) 定規を使用し 1%XCARB/セライト層が 3cm の厚みになっていることを確認する。なっていない場合、3cm になるよう調整する。

硫酸ナトリウム 1.0g
活性炭 0.3g(3cm)
硫酸ナトリウム 0.5g
ガラスウール

図 3-1-7 活性炭カラムの例

33

3) 硫酸シリカゲル(小)-活性炭カラムクロマトグラフ操作(夾雑物の少ない場合)(注 4)(1) 上部に硫酸シリカゲルカラム(小)と下部に活性炭カラムを連結させる。
(2) 濃縮液に、ヘキサン 2mL を加え、超音波照射後、カラムに静かに注ぎ入れる。
(3) ヘキサン 2mL で超音波照射を行いながら、抽出液の容器を洗浄し、洗液はカラム内壁を洗いながら入れる。
(4) ヘキサン 1mL で同様の操作を行う。
(5) ヘキサン 10mL を流下させる。
(6) 硫酸シリカゲルカラムを外す。
(7) 活性炭カラムにヘキサン 10mL を流下させ、活性炭カラムを洗浄する。
(8) PCBs 溶出液(酢酸エチル/トルエン/ヘキサン(10%/10%/80%体積分率)15mL を流下させる(コプラナーPCBs 画分)。
(9) トルエン 20mL を流下させる(PCDDs 及び PCDFs 画分)。

(注 4) コプラナーPCBs 画分＋PCDDs 及び PCDFs 画分を混合液として測定操作に用いる。

4) 硫酸シリカゲル(大)-活性炭カラムクロマトグラフ操作(夾雑物の多い場合)(注 4)(注 5)(1) 濃縮液に、ヘキサン 5mL を加え、超音波照射後、硫酸シリカゲルカラム(大)に静かに注ぎ入れる。
(2) ヘキサン 3mL で超音波照射を行いながら、抽出液の容器を洗浄し、洗液はカラム内壁を洗いながら入れる。
(3) ヘキサン 2mL で同様の操作を行う。ヘキサン 25mL を流下させる。
(4) 遠心エバポレータでヘキサン 2mL まで濃縮する。
(5) 濃縮液を、活性炭カラムに静かに注ぎ入れる。
(6) ヘキサン 2mL で超音波照射を行いながら、抽出液の容器を洗浄し、洗液はカラム内壁を洗いながら入れる。
(7) ヘキサン 1mL で同様の操作を行う。
(8) ヘキサン 10mL を流下させ、活性炭カラムを洗浄する。
(9) PCBs 溶出液(酢酸エチル/トルエン/ヘキサン(10%/10%/80%体積分率)15mL を流下させる(コプラナーPCBs 画分)。
(10) トルエン 20mL を流下させる(PCDDs 及び PCDFs 画分)。

(注 5) シリカゲル(大)-活性炭カラムクロマトグラフ操作を行なう目安としては、
硫酸シリカゲル(小)で処理した場合に黄色もしくは、黒色のバンドが下部の硫酸ナトリウム層まで達した場合とする。この場合は、抽出液の分取からやり直し、硫酸シリカゲル(大)での処理を行う。

5) 測定用試料の保存(1) 3)又は 4)の操作によって得られた溶液(PCDDs 及び PCDFs＋コプラナーPCBs 混合液)は遠心エバポレータで溶媒が完全になくなるまで濃縮する。
(2) 濃縮液を乾固させた遠沈管にヘキサン 4mL を加える。

34

(3) 遠沈管を 10 分間超音波照射する。
(4) 遠沈管の内壁を 2、3 回洗いながら、ヘキサンを 4mL 容のバイアル瓶へ移す。
(5) バイアル保管用の容器に入れ、冷蔵庫(5℃)で保存する。
第５節

測定

１．測定の概要
哺乳類細胞株(マウス肝がん細胞)に、外来遺伝子であるホタルルシフェラーゼ遺伝子に DRE をつないだベクターを細胞内に安定的に挿入した組み換え細胞が用いられる。ダイオキシン類がリガンドとして、
Ah 受容体と結合し、生じた Ah 受容体−リガンド複合体が DRE に結合し、下流遺伝子転写の結果、発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光を発光光度計(ルミノメーター)で測定することによりダイオキシン類の定量を行う。
2,3,7,8-TeCDD により検量線を作成し、試料の発光量(RLU)から実測濃度を算出する。排出ガス並びにばいじん及び燃え殻について定められた換算係数を実測濃度に乗じることにより、測定量(毒性等量)を算出する。
２．試薬、器具及び装置
2.1

使用細胞

ダイオキシン類応答性組換え細胞 H1L6.1c2：ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流域に 4 個のダイオキ
シン応答配列 DRE を含むシトクロム P450(CYP1A1)プロモーターを持つプラスミド pGudLuc6.1 を、マウ
ス肝ガン細胞 Hepa1c1c7 に導入したもの(注 6)(注 6) 引用文献 1：M.S.Denison,et al.,Bioassay for detecting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioxin and TCDD-like compounds
and novel recombinant cell line useful therefor,US Patent#5,854,010(1998),引用文献 2：Dalhp Han,Scott R.Nagy and Michael
S Denison,Comparison of recombinant cell bioassays for the detection of Ah receptor agonists,BioFactors 20(2004)11-22

2.2

試薬

測定に用いる試薬は、次による。
1) 培地(RPMI1640 培地、FBS(+8%体積分率)、ペニシリン/ストレプトマイシン混合溶液(+1%体積分率))

RPMI1640 with L-Glutamine 500mL に FBS 44mL、ペニシリン/ストレプトマイシン 5mL を混合したもの
2) RPMI1640 with L-Glutamine
3) ペニシリン/ストレプトマイシン混合溶液

5000units/mL ペニシリン・5mg/mL ストレプトマイシ

ン、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、0℃以下凍結保存
4) Fetal Bovine Serum(FBS)
5) トリプシン溶液

56℃、30 分間非働化処理済、-20℃凍結保存

0.25%、0℃以下凍結保存

6) リン酸緩衝生理食塩液(PBS)

マグネシウム及びカルシウム不含

7) ジメチルスルホキシド(DMSO)JIS K9702 に規定するもの又は同等の品質のもの(注 7)8) 細胞凍結用保存液 培地 34mL に DMSO 6mL 加え、シリンジフィルタ(孔径 0.2μm)を用い、ろ過滅菌を行ったもの35

9) 標準物質(1)2,3,7,8-TeCDD(50μg/mL Toluene)10) 保管用標準液(1-1)(Conc. TeCDD 5μg/mL DMSO)

9)の標準物質を DMSO で 10 倍希釈する

11) 保管用標準液(1-2)(internal TeCDD 250ng/mL DMSO)

10)の保管用標準液(1-1)を DMSO で 20 倍希

釈する
12) 検量線作成用標準液(2,3,7,8-TeCDD DMSO 溶液)

11)の保管用標準液(1-2)を DMSO で希釈して調製する(表 3-1-1)
13) 標準物質(2)PCDDs/PCDFs 混合溶液(4111ng-TEQ/mL nonane)14) 保管用標準液(2-1) PCDDs/PCDFs 混合溶液(180ng-TEQ/mL DMSO) 13)の標準液を DMSO に転溶し、DMSO で 22.8 倍する
15) Quality Control PCDDs 及び PCDFs 混合溶液(QC 溶液)(0.250ng-TEQ/mL DMSO)

14)の保管用標準液(2-1)を DMSO で 720 倍希釈する(表 3-1-2)16) ルシフェラーゼ定量キット
17) 細胞溶解液(Cell culture lysis reagent(×5 solution))

Cell culture lysis reagent(×5solution)2mL に、水 8mL を加え調製する
18) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

19) ヘキサン

JIS K8825 に規定するもの又は同等の品質のもの

20) 炭酸ガス

CO2 99.99%

21) 液体窒素(注 7) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

表 3-1-1 検量線作成用標準液の調製例
濃度(ng/mL) (有効数字 3 桁表記)

標準物質(1)

2,3,7,8-TeCDD

STD0

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

25.0

12.5

6.25

3.13

1.56

0.781 0.391 0.195 0.997 0.488

36

STD6

STD7

STD8

STD9

表 3-1-2

QC 溶液の調製例
濃度(ng/mL)

標準物質

標準物質(2)

2,3,7,8-TeCDD

保管用標準液
(2-1)

QC 溶液

1000

44

0.061

2000

88

0.12

5000

219

0.30

1000

44

0.061

2000

88

0.12

OCDF

5000

219

0.30

Total PCDD/Fs(ng-TEQ/mL)

4111

180

0.250

1,2,3,7,8-PeCDD
1,2,3,4,7,8-HxCDD
1,2,3,6,7,8-HxCDD
1,2,3,7,8,9-HxCDD
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD
OCDD
2,3,7,8-TeCDF
1,2,3,7,8-PeCDF
2,3,4,7,8-PeCDF
1,2,3,4,7,8-HxCDF
1,2,3,6,7,8-HxCDF
1,2,3,7,8,9-HxCDF
2,3,4,6,7,8-HxCDF
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF

2.3

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、以下による。
1) ルミノメーター
2) インキュベーター 室温＋5℃〜50℃、飽和湿度、5% CO2 濃度
回転数 3000〜4000 min-1 が得られるもの

3) 遠心分離機

4) 安全キャビネット クラスⅡタイプ A
5) 液体窒素容器
6) システム顕微鏡
7) 培養顕微鏡8) 恒温槽9) 高圧蒸気滅菌器

JIS T7322 又は JIS T7324 に規定するもので 121℃以上に加熱でき、196kPa の器内圧力で使用できるもの
10) 乾熱滅菌器

160〜200℃に調節できるもの

11) バキュームポンプ
12) ミキサー3713) 遠心エバポレータ
14) パスツールピペット

ガラス製、ピペット滅菌箱に入れ、乾熱滅菌をしておく

15) 10mL プラスチックピペット
16) プラスチックチューブ
17) 培養フラスコ18) チップ

ポリスチレン製、使い捨てできるもの

10mL、50mL、ポリプロピレン製、使い捨てできるもの

2

25cm 、75cm2、150cm2、ポリプロピレン製

20μL 用、200μL 用、1000μL 用、オートクレーブ可能なもの、ポリプロピレン製、高圧蒸

気滅菌を行う19) 連続分注ピペットチップ

10mL20) 96 ウェルクリアボトムプレート(マイクロプレート) 96well Flat Bottom、ポリスチレン製、白色プレート、細胞培養表面処理、滅菌済み
21) バッキングテープ
22) 凍結保存用バイアル23) 25mm シリンジフィルタ24) 13mm ガラス試験管

孔径 0.2μm、滅菌済み

13×100mm 直口フリントガラスチューブ

25) マイクロピペット 20μL、200μL、1000μL
26) 8 連ピペット27) 連続分注ピペット28) 血球計算盤(改良型ノイバウエル血球計算盤、ブライトライン)
29) プレートシェーカー
2.4

器具等の滅菌操作

器具等の滅菌操作は、次の通り行う。
1) 乾熱滅菌 ガラス製及び金属製器具類の滅菌に用いる。約 170℃で約 1 時間滅菌する。
2) 高圧蒸気滅菌 使用済み培地等の滅菌に用いる。121℃で約 30 分間滅菌する。
2.5

消毒操作

消毒操作は、次の通り行う。
1) 試験操作の前後には、手指及び実験台、キャビネットを消毒する。消毒用エタノール(エタノール(70%体積分率))を用いる。
2) 使用済みのパスツール、吸引瓶、培地は、次亜塩素酸(10%)で消毒する。
2.6

吸引操作

吸引操作は、次の通り行う。
1) 安全キャビネット内で、バキュームポンプに接続しているチューブに滅菌済のパスツールピペッ
トをつなぎ、バキュームポンプのスイッチを入れる。
2) 作業終了後は、2.5 の 2)の消毒操作を行う。
３．細胞の取り扱い
3.1

培養細胞の起眠1) 液体窒素保存容器(凍結保存用バイアル)から取り出し融解後、培養フラスコ(25cm2)にて培養(1) 液体窒素保存容器から凍結保存用バイアルを取り出す。
(2) 培地 1mL をマイクロピペットで凍結保存用バイアルに移し、ピペッティングにより凍結保存用

38

バイアル内の氷を溶かす。溶けたものはプラスチックチューブ(15mL)に移す。これらの動作を数回繰り返す(注 8)。
(3) 凍結保存用バイアル内の培地を全部移したプラスチックチューブ(15mL)を 500rpm、10min 遠心
分離する。
(4) パスツールピペットを使用し、プラスチックチューブより培地を吸引除去する(注 8)。
(5) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブに 10mL プラスチックチューブを用いて培地 5mLを加え、ピペッティングにより細胞のペレットを懸濁する(注 8)。
(6) 培養フラスコ(25cm2)に細胞懸濁液を全量移し、培養フラスコを数回傾けてなじませる(注 8)。
(7) インキュベーターにフラスコを入れ、CO2 5%、37℃の環境下で培養する。
2) 培養フラスコ(25cm2)から播種し、培養フラスコ(75cm2 又は 150cm2)へ継代培養を行う。
(1) 翌日より毎日細胞の増殖状況を観察し、コンフルエントになったのが確認できたら、培養フラスコ(25cm2)をインキュベーターから取り出し、中の培地が濁っていないか目視で確認し、培養顕微鏡で細胞状態を確認する。
(2) 空の培養フラスコ(75cm2 又は 150cm2)を用意し、3.2 及び 3.3 の操作を行う(注 8)(注 9)。

(注 8) 安全キャビネット内で無菌操作を行う。
(注 9) 中の培地が濁っていたり、細胞が接着面より剥がれている場合、雑菌汚染を起こしているため、同じ培養系列の細胞を破棄して新しく冷凍細胞を起こして培養したものを使用する。

3) 特記事項(1) 液体窒素保存容器(凍結保存用バイアル)から立ち上げて、150cm2 でコンフルエントになった状態（約 1 週間）から試験に使用可能な細胞とする。
(2) 試験に使用できる期限としては、40〜50 代までを目安とし、期限前であっても、測定をする際に問題があった場合は、原因を追及し、細胞の使用期限であると考えられた場合は、直ちに破棄する。
(3) 停電時には、細胞をインキュベーター内で保管し、温度及び CO2 の低下を極力抑えるため、解放しない。使用する際には、細胞の状況を確認し、問題なければ、測定し、問題があれば、直ちに破棄する。
3.2

試験使用細胞の回収

1) 培養フラスコ(150cm2)(注 10)をインキュベーターから取り出し、中の培地が濁っていないか目視で確認し、培養顕微鏡で細胞状態を確認する。
2) パスツールピペットで培養フラスコから培地を完全に吸引除去する(注 8)。
3) プラスチックピペット(10mL)で PBS a)を 5mL 加え、培養フラスコ壁面の洗浄を行い、パスツールピ
ペットで PBS を吸引除去する(注 8)。
4) プラスチックピペットで、トリプシン溶液 b)を 2mL 加え、細胞接着面になじませる(注 8)。
5) 1 分程度培養フラスコを寝かせて静置し、細胞が浮き上がってきたら、手のひらの付け根で培養フ
ラスコの側面をたたいて細胞を剥がす(注 8)。
6) プラスチックピペットで培地 c)を 10mL 加え、フラスコの壁面を洗いながら注ぎ込む(注 8)。
7) プラスチックピペットで、培養フラスコ中の培地を吸い取り、プラスチックチューブに移し、

39

500rpm、10 分間遠心分離する。
8) 細胞を吸い取った培養フラスコは、プラスチックピペットで PBS d)を 10mL 加え、壁面の洗浄を行い、パスツールピペットで PBS d)を吸引除去する(注 8)。
9) 培養フラスコをすぐに使用しない場合は、冷蔵庫で保管する。

(注 10) 培養フラスコの種類は、この限りではない。面積により試薬の注入量を変更すればよい。

表 3-1-3 培養フラスコの容量と試薬の分注量の一覧(回収時)
培養フラスコ(cm2)

3.3

a)

PBS (mL)b)

トリプシン溶液 (mL)c)

培地(mL)d)PBS (mL)

150

5

2

10

10

75

2

1

5

5

25

1

0.5

2

2

試験使用細胞の継代

1) インキュベーターから培養フラスコ(150cm2)(注 11)を取り出し、3.2 の回収操作を行う(注 8)。
2) 空の培養フラスコ(150cm2)にあらかじめ培地 e)を 19mL 入れておく(注 8)。
3) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブ(50mL)に細胞懸濁液 f)を加える。加える培地の量は、希釈倍率に応じて変わるため、回収した培養フラスコ 1 枚分の細胞につき表 3-1-3 のようになる(注 8)(注 12)。
4) プラスチックピペットで 10 回程度ピペッティングし再懸濁し、細胞懸濁液 1mL を接種用に用意した培養フラスコに接種する(注 8)。
5) 培養フラスコを穏やかに数回傾け、培地中の細胞が均一になるようになじませる(注 8)。
6) インキュベーターにフラスコを入れ、CO25%、37℃の環境下で培養する。
(注 11) 培養フラスコの面積は、この限りではない。面積により試薬の注入量を変更すればよい(表 3-1-4 参照)。
(注 12) 細胞の希釈率の決定：試験使用細胞株は、24 時間でほぼ 2 倍に増殖する。したがって、細胞を回収、使用したい日にコンフル
エントなフラスコ(フラスコ底面を細胞が 80%以上覆っている状態のもの)を手に入れるためには、以下の希釈倍率を用いればよい。コンフルエントなフラスコ 1 個から細胞を回収し、n 日後にコンフルエントな同等のフラスコ１個が欲しいとき、希釈率は、1:2n(n=1〜3)で表すことができる。また、コンフルエントなフラスコ A 個から接種用のフラスコに 1：B の希釈率で接種するとき、回収した細胞を新しい培地(A×B)mL で再懸濁し播種用のフラスコに 1mL 播種する。

40

表 3-1-4 フラスコ容量と試薬の分注量の一覧(継代時)
培養フラスコe)

培地 (mL)

希釈倍率

(cm2)

150

75

f)

細胞懸濁液
(mL)

19

9

1:2

2

1:4

4

1:8

8

1:2

2

1:4

4

1:8

8

f)の細胞懸濁液は、細胞のペレットを再懸濁させる時に使用する培地の液量(mL)のことで、所定の培地で懸濁後、細胞懸濁液
1mL を接種し、培養フラスコ播種する場合を想定した分注量となる。

3.4

試験使用細胞の保存

1) インキュベーターから培養フラスコ(150cm2)を取り出し、3.2 の回収操作を行なう(注 8)。
2) パスツールピペットを使用し、プラスチックチューブ(50mL)より培地を吸引除去する(注 8)。
3) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブにプラスチックピペット(10mL)を用いて、(20mL×播種したフラスコ数)の培地を加え、ピペッティングにより細胞のペレットで懸濁液を作成する(注 8)。
4) 4.1 の細胞数の計測に従い、細胞濃度を 0.4×106cells/mL〜1.2×106cells/mL となるように、培地を加え、プラスチックチューブを上下にしてよく混合する(注 8)。
5) 細胞懸濁液と細胞凍結用保存液を 1：1 の割合で混合する(注 8)。
6) マイクロピペット(1000μL)を用いて、1.5mL ずつ凍結保存用バイアルに分注する(注 8)。
7) 発泡スチロールの容器に入れ、−20℃で 4 時間保存する。
8) −80℃で一晩保存する。
9) 液体窒素保存容器へ移し保管する。
４．測定操作4.1

細胞のマイクロプレートへの播種

1) インキュベーターから培養フラスコ(150cm2)を取り出し、3.2 の操作を行なう(注 8）。目安として、およそ培養フラスコ 1 枚からプレート 1 枚作成が可能である。
2) パスツールピペットを使用し、プラスチックチューブ(50mL)より培地を吸引除去する(注 8）。
3) 細胞のペレットが入ったプラスチックチューブにプラスチックピペット(10mL)を用いて培地 20mLを加え、ピペッティングにより細胞のペレットを懸濁液を作成する(注 8）。
4) マイクロピペット(20μL)を用いて細胞懸濁液 15μL を血球計算盤に乗せ、システム顕微鏡(×100)
で細胞数(1mL 当りの細胞数)を求める。
5) 下記の計算を行い(注 13）、最終濃度 7.5×105 cells/mL となるよう最終容量を求め、最終容量になるように培地で適宜、希釈調製を行う(注 8）。
6) 8 連ピペットを用いてマイクロプレートの各ウェルに細胞懸濁液を 200μL ずつ加えていく(注 8）。

417) インキュベーターにマイクロプレートを入れ CO2 5%、37℃の環境下で 14〜24 時間培養する。
(注 13）細胞数の計測の仕方：計算時の細胞濃度(cells/mL)＝血球計算盤の 4×4 グリッドの細胞数の平均×104

最終容量(ml )＝現在の容量(ml )計算時の細胞濃度(cells/ml )×

7.5×105(cells/ml )4.2 曝露4.2.1

希釈率決定曝露操作

1) 溶液の適量配分(1) 測定用試料の分取a) 13mm ガラス試験管に DMSO を 2μL 分注する。
b) 測定用試料を 4mL バイアルより一部適量を分取する(注 14)。

(注 14) 希釈率決定曝露操作で適量とは、表 3-1-5 に示す分注量を指す。
希釈率は、4mL 精製液に対して、2 ウェルに必要な試料割合のことで、1:40 であれば、4mL の 1/40 量(100μL)が測定用試料の分注量である。今回、希釈倍率決定の際には、3 段階の希釈倍率を各 1 ウェルを用いて測定を行うため、希釈倍率 1:40 では、その半分(50μL)が適量となる。

表 3-1-5 希釈率と測定用試料の分注量の一覧
希釈率

測定用試料の分注量(1 ウェル当たり)

1:40

50μL

1:400

5μL

1:40000.5μL(2) 検量線作成用標準液及び QC 溶液の分取a) 13mm ガラス試験管に DMSO を 4μL 分注する。
b) 9 段階に希釈された検量線作成用標準液及び QC 溶液を適所に 4μL ずつ加える。
(3) ネガティブコントロール(NC)の分取
a) 13mm ガラス試験管に DMSO を 4μL 分注する。
2) DMSO 置換及び培地混合操作(1) ヘキサンを加え、測定用試料の試験管内液量を 0.5mL、検量線作成用標準液、QC 溶液及び NC の試験管内液量を 1mL になるようメスアップする。
(2) 遠心エバポレータに試験管を入れ 12 分間濃縮する。
(3) その後、2 分ごとに、ガラス試験管内のヘキサンの残量確認を行う。
(4) 濃縮が確認されれば、最後に 2 分間濃縮を行い、完全に揮発させる。
(5) 連続分注ピペットを使用し、測定用試料の 13mm ガラス試験管に培地を 200μL、検量線作成用標
準液、QC 溶液及び NC の試験管に培地を 400μL 加え、10 秒程ミキサーにかけ攪拌する。

423) 細胞への曝露(1) 14〜24 時間培養したマイクロプレートをインキュベーターから取り出す。
(2) マイクロプレートのデカンテーションを行い、培地を完全に取り除く。
(3) 培養顕微鏡で全てのウェルの細胞の状態を確認する。少しでも異常が見られたらプレートシー
トにチェックをしておく。
(4) 2)で得られた DMSO 置換溶液(測定用試料＋検量線作成用標準液及び QC 溶液＋NC をマイクロピペ
ットで、測定用試料 190μL を 1 ウェル、検量線作成用標準液及び QC 溶液＋NC を 190μL ずつ 2
つのウェルに分注する。
(5) 37℃、CO2 5%の環境下で、20〜24 時間培養する。
1

2

A

3

5

6

NC

1.2

1.3

2.1

NC

STD9

10

11

12

STD8

2.2

2.3

3.1

3.2

3.3

4.2

4.3

5.1

5.2

5.3

6.2

6.3

7.1

7.2

7.3

→〃 STD3 →〃 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
8.1

E

9

→〃 STD4 →〃 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
6.1

D

8

→〃 STD5 →〃 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
4.1

C

7

希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
1.1

B

4

8.2

8.3

9.1

9.2

9.3

→〃 STD2 →〃 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
10.1 10.2 10.3 11.1 11.2 11.3

F

STD7

→〃 STD1 →〃 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
12.1 12.2 12.3 13.1 13.2 13.3

G

H

STD6

→〃

QC

→〃 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈溶液

14.1 14.2 14.3 15.1 15.2 15.3

希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈 希釈
16.1 16.2 16.3 17.1 17.2 17.3 18.1 18.2 18.3
図 3-1-8 レイアウト例(希釈率決定)(注 15)① 太枠：B2〜G2、B3〜G3、B4〜G4 及び B5〜G5 は、検量線作成用標準液、QC 溶液並びに NCに 2 ウェルごとに使用する②

それ以外のウェル：1 試料当り希釈率 3 段階の調製液を 1 ウェルずつ曝露する。

(注 15) 定量操作における希釈率の決定：定量範囲として、STD8：0.977〜STD：31.2 pg/mL を設定する(詳細は 6.1 を参照)。定量範囲に入る希釈倍率を希釈倍率決定用の曝露試験にて、試料ごとに決定する。定量範囲より低い RLU を示した場合、希釈倍率を下げる。定量範囲より高い RLU を示した場合、希釈倍率を上げる。希釈倍率としては、1：4 が最高濃度となることに注意する。

43

4.2.2

定量曝露操作1) 溶液の適量配分(1) 測定用試料の分取a) 13mm ガラス試験管に DMSO を 4μL 分注する。
b) 測定用試料を 4mL バイアルより一部適量を分取する(注 16)。

(注 16) 適量とは、希釈率決定曝露操作で得た情報を元に分取率を決定する。

(2) 検量線作成用標準液及び QC 溶液の分取a) 9 段階に希釈された検量線作成用標準液及び QC 溶液を適所に 4μL ずつ加える。
(3) NC の分取
a) 13mm ガラス試験管に DMSO を 4μL 分注する。
2) DMSO 置換及び培地混合操作(1) ヘキサンを加え、全ての 13mm ガラス試験管中の液量を 1mL とする。
(2) 遠心エバポレータに 13mm ガラス試験管を入れ 12 分間濃縮する。
(3) その後、2 分ごとに、ガラス試験管内のヘキサンの残量確認を行う。
(4) 濃縮が確認されれば、最後に 2 分濃縮を行い、完全に揮発させる。
(5) 連続分注ピペットを使用し、各試験管に培地を 400μL 加え、10 秒程ミキサーにかけ攪拌する。
3) 細胞への曝露(1) 14〜24 時間培養したマイクロプレートをインキュベーターから取り出す。
(2) マイクロプレートのデカンテーションを行い、培地を完全に取り除く(注 8)。
(3) 培養顕微鏡で全ウェルの細胞の状態を確認する。少しでも異常が見られたら記録用紙にチェッ
クをしておく。
(4) 2)で得られた DMSO 置換溶液(測定用試料＋検量線作成用標準液及び QC 溶液＋NC をマイクロピペ
ットで、190μL ずつ 2 つのウェルに分注する(注 8)。
(5) CO2 5%、37℃の環境下で、20〜24 時間培養する。

44

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A
B

NC

→〃 STD5 →〃 試料 →〃 試料 →〃 試料 →〃
1.1

C

NC
STD9
STD8
STD7
STD6

5.1

8.1

5.2

8.2

→〃 STD1 →〃 試料 →〃 試料 →〃 試料 →〃
3.1

G

7.2

→〃 STD2 →〃 試料 →〃 試料 →〃 試料 →〃
2.2

F

4.2

→〃 STD3 →〃 試料 →〃 試料 →〃 試料 →〃
2.1

E

7.1

→〃 STD4 →〃 試料 →〃 試料 →〃 試料 →〃
1.2

D

4.1

→〃

QC

6.1

9.1

→〃 試料 →〃 試料 →〃 試料 →〃

溶液

3.2

6.2

9.2

H
図 3-1-9 レイアウト例(定量)① 中太枠：B2〜G2、B3〜G3、B4〜G4、B5〜G5 は、検量線作成用標準液、QC 溶液、NC に 2 ウ
ェルごとに使用する。
②
4.3

太枠：1 試料当り 2 つの同じ希釈調製液をそれぞれ横方向の 2 ウェルごとに曝露する。

ルシフェラーゼ活性の測定

1) 細胞の溶解(1) 20〜24 時間培養したマイクロプレートをインキュベーターより取り出す。
(2) マイクロプレート内の培地をデカンテーションにより完全に取り除く。
(3) 8 連ピペットを用いて PBS を各ウェルに 50μL ずつ加え、洗浄する。
(4) マイクロプレート内の PBS をデカンテーションにより完全に取り除く。
(5) 顕微鏡で全てのウェルの細胞の状態を確認する。少しでも異常がみられたら、プレートシートにチェックをしておく。
(6) マイクロプレートの底にバッキングテープを貼る。
(7) 連続分注ピペットを用いて細胞溶解液を各ウェルに 30μL ずつ加える。
(8) プレートシェーカーにてマイクロプレートを 2 分間穏やかに振動させ混合する。
(9) 10 分間静置する。
2) ルシフェラーゼ活性の測定(注 17)(1) インジェクターに発光基質溶液を充填する。
(2) フタをはずした 96 穴プレートをセットし、ルシフェラーゼ活性を測定する。

(注 17) ルミノメーターの機器管理の一環として、毎日のセットアップ時にテストプレートを用いて、機器の発光の精度を確認することを薦める。

45

５．定量
5.1

検量線の作成1) 本法のダイオキシン類の検出原理を記述する最も単純化した反応式は酵素反応式と同様の反応と考えて、下の通りに記述できる。

k1

k2

E + S ⇔ C → E + P
k-1
ここに、E

: 酵素反応式における酵素(本法では Ah 受容体に該当)S: 酵素反応式における基質(本法ではダイオキシン類に該当)C: 酵素反応式における酵素−基質複合体(本法では Ah 受容体-ダイオキシン類結合体に該当)

P: 酵素反応式における反応生成物(本法ではルシフェラーゼに該当)k: 反応速度定数

本生物検定法ではダイオキシン類(S)と Ah 受容体(E)との結合、そしてその結果、活性化される
ルシフェラーゼ遺伝子により生成するルシフェラーゼ(P)を、上記の酵素反応式に適用している。
2) 酵素反応のモデル式には Hill の式を用いている。
Hill の式は最も単純な式である Michaelis-Menten の式

V =Vmax・[S ]+b
K m + [S ]ここに、 V： 反応速度Vmax ： 最大反応速度［S］ ： 基質濃度Km

： V=1/2Vmax の時の基質濃度b： Intercept parameter（切片変数）の[S]の代わりに[S]n を適用したもので、薬理学で薬物濃度とそれによる臓器や組織の反応を表現
するのによく使われている式である。
3) 検量線のモデル式には Hill の式を用いる。

Vmax・[S ]nV =[K m ]n + [S ]n

ここに、 V+b： 薬理反応(ルシフェラーゼの生成濃度＝RLU)

Vmax ： 最大薬理反応(ルシフェラーゼ最大生成量)［S］ ： 基質濃度(ダイオキシン類濃度)の自然対数値

Km： V=1/2Vmax の時の基質濃度の自然対数値

n： Hillʼs coefficient（Hill の係数）、Slope parameter（勾配変数）b： Intercept parameter（切片変数）

4) 検量線の係数を求める
2,3,7,8‐TeCDD 標準物質の添加により生じる細胞の RLU を測定し、モデル式でカーブフィットさせ、パラメーターを決定する。

46

10 段階のダイオキシン類濃度希釈列に対する RLU を測定し、理論式に代入し、表計算ソフト等を用いて、4 つのパラメーター、Vmax、Km、n、b の最適化(測定した RLU と理論式における RLU との偏差の 2 乗が最小になるようにする)を行う。

A
23.75
11.9
5.94
2.97
1.48
0.742
0.371
0.186
0.0928Vmax =
Km =

標準物質
濃度
(pg/ml )B=
A/190*1000
125
62.5
31.3
15.6
7.81
3.91
1.95
0.977
0.488

標準物質
対数
変換値
C=
LN(B*100)
9.43
8.74
8.05
7.35
6.66
5.97
5.27
4.58
3.89

パラメーター
28631
7.75

CALUX TeCDD 濃度-応答曲線

標準物質
計測値
RLU
22880
19448
16471
12357
7517
4754
2114
1233
434

25000

Rusiferase Light Unit

標準
物質量(pg/well)

20000
15000
10000
5000
0
3.0

5.0

7.0

9.0

11.0

[TeCDD]C=LN(B*100)
n =
b =

6.59
192

図 3-1-10 検量線作成及びパラメーターの例
5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、検量線の確認及び感度変動の確認について、
管理限界（μ±2σ）を用いて行う（μ:工程平均、σ:測定量（毒性等量）の標準偏差）。
STD5(TeCDD：0.78ppt)及び QC 溶液の測定値から、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準は、管理限界（μ±2σ）からの逸脱状況に応じて下記の通りとする。
1点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
感度変動の管理図作成の例を次に説明する。
1) ４．測定操作に従って、定量を行う。
2) STD5(TeCDD：0.78ppt)については、5.3 測定試料の定量に従って毒性等量を算出する。
3) QC 溶液については、5.3 測定試料の定量に従って実測濃度を算出する。
4) QC 溶液の実測濃度に対して、PCDDs/PCDFs 混合標準液の換算係数(0.642)を乗じて、毒性等量を算出する。
測定値(毒性等量)（ng-TEQ/mL）＝実測濃度(ng/mL)×換算係数
QC 溶液(ng-TEQ/mL)＝0.53(pg/μL)×0.642＝0.35

47

表 3-1-6

STD5(TeCDD：0.78ppt)及び QC 溶液の算出例

QC 溶液 (ng-TEQ/mL)＝0.53(pg/μL)×0.642＝0.35
STD5

発光量

対数

TeCDD

(RLU)

換算値

7815

6.64

発光量

対数

(RLU)

換算値

5923

6.28

0.78ppt

QC 溶液

標準物質

標準物質

希釈

相当量

相当量

倍率

(pg/mL)(pg/400μL)

7.68

3.07

1

標準物質

標準物質

希釈

相当量

相当量

倍率

(pg/mL)(pg/400μL)

5.34

2.14

1

(%)

(μL)

100

4

分取率

供試量

(%)

(μL)

100

4

測定量
（毒性等量）(pg-TEQ/μL)
0.77
測定量（毒性等量）(pg-TEQ/μL)
0.53

1.00

測定値(ngTEQ/ml )0.50

測定値 (ngTEQ/ml ）供試量

TeCDD(0.78ppt)

QC溶液;PCDDs/PCDFs混合溶液

0.30
測定値
μ；工程平均±2σ；管理限界0.75
測定値μ；工程平均±2σ；管理限界

0.10

0

10

20

30

40

0.50

50

0

10

プレート（#)

20

30

40

50

プレート（#)

図 3-1-11 管理図例（QC 溶液）
5.3

分取率

図 3-1-12 管理図例(TeCDD:0.78ppt)

測定試料の定量

実測濃度の算出方法の手順を以下に示す(注 18)。
1) 定量範囲にある RLU から対数換算値の算出−Hill の式に検量線から求めた係数を当てはめる。なお、定量範囲については 6.1 の 2)で定義する。

k =((RLU−b )× Km n ) 1

V max −RLU＋b

ここに、k

n

：対数換算値

2) 実測濃度(pg/mL)の算出−対数換算値を乗数に換算する。

X =

ek
100

ここに、X

：測定試料中の実測濃度(pg/mL)3) 試験管あたりの実測濃度(pg：試験管あたり 400μL 培地)

C T = X × 0 .4
ここに、CTX：試験管あたりの実測濃度(pg：400μL 培地)：測定試料中の実測濃度(pg/mL)484) 精製液中の実測濃度(pg：4mL 精製液)

CC = CT × n
ここに、CCn：精製液中の実測濃度(pg：4mL 精製液)
：希釈倍率5) 抽出液中の実測濃度(pg：抽出液)

CE = CC ×
ここに、CE

VE
V’ E：抽出液中の実測濃度(pg：抽出液)

CC ：精製液中の実測濃度(pg：4mL 精製液)
VE ：抽出液量(mL)VʼE : 抽出液分取量(mL)6) 試料中の実測濃度(ng/m3N 又は ng/g)

CS =ここに、CS

CE
1
×
V
1000

：実測濃度(ng/m3N 又は ng/g)：試料採取量(m3N 又は g)V(注 18) 解析例：1 試料につき、n=2 の試験管を用いて、DMSO 転溶し、培地に溶解後、1 試験管当たり 2 ウェルに分注する。1 試料当たり、2 ウェルの RLU の平均を n=2 で算出する。
(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正が必要な場合には、次式によって所定の酸素濃度に換算する。

C=

21 − On
21 − Os× Cs： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)

ここに、C

On

： 換算する酸素の濃度(%)

O： 排出ガス中の酸素の濃度(注 19)(%)

Cs： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 19) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

表 3-1-7 実測濃度の算出例
標準物
発光量

対数

質相当

(RLU)

換算値

量
(pg/mL)

標準物質

希釈

相当量

倍率

(pg/400μL)

分取率
(%)

試料
採取量
(m3N, g)

実測濃度(ng/m3N,ng/g)

6570

6.41

6.08

2.43

100

20

6

0.405

5890

6.27

5.30

2.12

100

20

6

0.353

49

６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認

検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量（毒性等量）の定量値の変動係数(CV%)が30%以下となる点を検出下限、20%以下となる上下2点間を定量範囲として算出し、結果を記録しておく。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
表 3-1-8 に示す濃度の検出下限等算出用標準溶液を調製する。
表 3-1-8 検出下限等算出用標準溶液の調製例
濃度(ng/mL)

標準物質(1)
2,3,7,8-TeCDD

STD0

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

STD6

STD7

STD8

STD9

STD10

25.0

12.5

6.25

3.13

1.56

0.781 0.391 0.195 0.0997 0.0488 0.0244

2) 検出下限及び定量範囲の算出例
調製した検出下限等算出用標準溶液を n=5 で測定した検量線より定量し、測定量（毒性等量）の平
均、標準偏差及び変動係数(CV%)を算出し、精度プロファイルを作図し、検出下限及び定量範囲を図より読み取る。
1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

A
B

NC

→〃 →〃 →〃 →〃 STD5 →〃 →〃 →〃 →〃C

STD10 →〃 →〃 →〃 →〃 STD4 →〃 →〃 →〃 →〃

D

STD9

→〃 →〃 →〃 →〃 STD3 →〃 →〃 →〃 →〃

E

STD8

→〃 →〃 →〃 →〃 STD2 →〃 →〃 →〃 →〃

F

STD7

→〃 →〃 →〃 →〃 STD1 →〃 →〃 →〃 →〃

G

STD6

→〃 →〃 →〃 →〃 STD0 →〃 →〃 →〃 →〃H
図 3-1-13 レイアウト例(検出下限及び定量範囲の確認)
検出下限及び定量範囲の算出例を表 3-1-9、図 3-1-14 に示す。
表 3-1-9 測定結果例(n=5 測定)
検出下限：0.977(pg/mL) 定量範囲：1.95〜62.5(pg/mL)
標準
物質量(pg/well)
A
47.5
23.8
11.9
5.94
2.97
1.48
0.742
0.371
0.186
0.09280.0464

標準物質
標準物質
濃度
対数
変換値
(pg/ml )B=
C=
A/190*1000 LN(B*100)
250
10.13
125
9.43
62.5
8.74
31.3
8.05
15.6
7.35
7.81
6.66
3.91
5.97
1.95
5.27
0.977
4.58
0.488
3.89
0.244
3.20

標準物質濃度 (n=5)(pgTEQ/ml )

標準物質
計測値
(RLU)

平均

標準偏差(σ）

24560
23926
19727
15002
9696
5195
2597
1328
637
364
271

257
189
62.2
31.0
15.5
7.82
4.17
2.30
0.97
ND
ND

173
106
11.6
5.54
1.00
0.338
0.267
0.303
0.260
−
−

50

変動係数
（C.V.(%)）

67.5
56.0
18.6
17.9
6.43
4.33
6.39
13.1
26.8
−
−

乖離度
1.03
1.51
1.00
0.99
0.99
1.00
1.07
1.18
0.99
−
−

定
量
範
囲
定量下限
検出下限

12

TeCDD標準液の変動係数(n=5)
7060

C.V.(%)

50
40
30
20
10
0
4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0 10.0 11.0

[TeCDD]C=LN(B*100)

図 3-1-14 精度プロファイルの例
標準物質における検出下限及び定量範囲は、少なくとも 6 ヶ月に 1 回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担
当者の変更等）にも、確認する。
6.2

試料における検出下限及び定量下限
試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、反応液中の標

準物質における検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。
1) 試料ガス
試料ガスにおける検出下限及び定量下限は、下記の式により算出する。

C DL =Q DL × 0.4 × k × v VE 1
×
×
1000
VE′ V

C QL =Q QL × 0.4 × k × v
1000

×

VE 1
×
VE′ V

ここに、CDL： 試料ガスにおける検出下限(0℃、101.32kPa)(ng/m3)

CQL： 試料ガスにおける定量下限(0℃、101.32kPa)(ng/m3)

QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 0.977pg/mL)

QQL： 標準物質における定量下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 0.195pg/mL)v： 測定用試料の液量(mL)
希釈倍率(測定用試料中からの分注量)(例 4、d=1mL)
4mL 容測定用試料の一部を分注する率＝4/d(d：測定用試料の液量(mL))

VE： 抽出液量(mL)(例 50mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)(例 10mL)V： 試料ガスの採取量(0℃、101.32 kPa)(例 4m3)k

： 補正係数＝0.253(排出ガス)

512) ばいじん及び燃え殻
ばいじん及び燃え殻試料における検出下限及び定量下限は、下記の式により算出する。

C DL =Q DL × 0.4 × k × v VE 1
×
×
1000
VE′ W

C QL =Q QL × 0.4 × k × v
1000

×

VE 1
×
VE′ W

ここに、CDL： ばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng/g)

CQL： ばいじん及び燃え殻試料における定量下限(ng/g)

QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 0.977pg/mL)

QQL： 標準物質における定量下限(pg/mL, 反応溶液中)(例 1.95pg/mL)v： 測定用試料の液量(mL)
希釈倍率(測定用試料中からの分注量)(例 4、d=1mL)
4mL 容測定用試料の一部を分注する率＝4/d(d：測定用試料の液量(mL))

VE： 抽出液量(mL)(例 50mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)(例 25mL)W： ばいじん及び燃え殻試料の採取量(g)(例 7g)k： 補正係数＝0.345(ばいじん及び燃え殻)(平成 18 年 3 月改訂)

７．測定量(毒性等量)への換算
測定量(毒性等量)の算出方法を以下に示す。
本生物検定法における実測濃度は、2,3,7,8-TeCDD 検量線より求めた生物検定法独自の毒性評価値となる。従って HRGC/HRMS 法にて測定した毒性等量と比較するためには、換算が必要となる。
あらかじめ、
多検体の HRGC/HRMS 法によって測定された試料について本生物検定法による測定を行い、両法における相関関係を求め、その回帰式の傾きを換算係数として、実測濃度から測定量(毒性等量)を算出する。
測定量(毒性等量)(ng-TEQ/g、ng-TEQ/m3N)＝実測濃度(ng/g、ng/m3N)×換算係数
なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。
８．換算係数の確認
少なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若し
くは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1〜4.3 及び 5.3

52

に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、厚生省平成4年告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法4.1〜4.3及び5.3に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を
算出する。

53

第６節

参考資料

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=46、n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求め、HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-1-15 では Y/X の平均値である 0.253 を換算係数とした)。
「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
多数のばいじん及び燃え殻試料(この例では n=93、n=20 以上が望ましい)について本測定方法とHRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-1-16 では Y/X の平均値である 0.318 を換算係数とした)。
80
排出ガス
y = 0.221x
R 2 = 0.993(n=46)

15

毒性等量(ng-TEQ/g)

毒性等量(ng-TEQ/m 3N)

20

10
5

ばいじん及び燃え殻
y = 0.318x
R2 = 0.899(n=94)

60
40
20
0

0
0

20
40
60
実測濃度(ng/m 3N)

0

80

50
100
実測濃度(ng/g)

図 3-1-15 換算係数算出(例)

図 3-1-16 換算係数算出(例)（排出ガス）（ばいじん及び燃え殻）

54

150

その２

前処理に、硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムを使用し、測定に、ダイオキシン類応答性

組換え細胞 101L を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 2)
第1節

測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応
答性組換え細胞 101L を用いた測定により定量する。測定方法のフローを図 3-2-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 101L を用いた測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-2-1 測定方法のフロー
第2節

用語の定義

1) 遺伝子組換え細胞 組換え DNA 技術を用いて作製された細胞2) 組換え DNA 技術
3) Ah 受容体

組換え DNA を作製し、それを生細胞(宿主)に移入し、増殖させる技術

Ah Receptor、Arylhydrocarbon Receptor、アリール炭化水素受容体、特異的な細胞外シグナル伝達分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる
4) リガンド

Ligand、タンパク質又は他の分子の特異的部位に結合する分子の総称。受容体が鍵穴

でリガンドが鍵の関係。両者が結合すると、両者の関係に特異的な信号が発生し生理反応が引き起こされる
5) ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene、生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子
6) CYP1A1

Cytochrome P450、薬物代謝酵素シトクロム P450 類に属する薬物代謝酵素。CYP1A1 は、

ダイオキシン類により誘導されることが知られている
7) DRE

Dioxin Responsive Element、ダイオキシン応答配列、ダイオキシン類が特異的に結合する

遺伝子の塩基配列部分

55

8) プラスミド
9) 継代培養

Plasmid、小型の環状 DNA 分子のこと
Subculture、保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え継ぎ、再び培養したもの
10) 発光基質
第３節

生物発光反応の基質

試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量
試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

V =QDL × k × v VE
1
××
VE′ C DL
1000

ここに、V

： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

VʼE： 抽出液分取量(mL)

CDL： 必要となる試料ガスにおける検出下限 (ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出
下限は 0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に0.08mL の測定用試料溶液に調製する場合の試料ガス採取量を下記に示す。

V =300 × 0.217 × 0.08 20
1
× ×＝0.0611000
10 0.17

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量
ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

W =

QDL × k × v VE
1
××
VE′ C DL
1000

56

ここに、W： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

VʼE： 抽出液分取量(mL)

CDL： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料における検出下限は0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 10mL に定容し、その抽出液全量を用いてクリーンアップを行い、最終的に 0.2mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を下記に示す。

W =

第４節

300 × 0.217 × 0.2 10 1
× × ＝0.13
1000
10 0.1

試料の前処理１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-2-2に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-2-2 試料の前処理から測定までのフローの例

２．試薬
試料の前処理に用いる試薬は、JIS K0311 又は厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に記載の試薬(ただし、内標準物質は使用しない) 又は同等の品質のもの、及び次による。これらの試

57

薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) ジメチルスルホキシド(DMSO)JIS K9702 に規定するもの又は同等の品質のもの(注 1)

2) ケイソウ土(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

３．器具及び装置
試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2.1

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.2.2

高速溶媒抽出装置(ASE 抽出装置)

ダイオネクス製 ASE-300 又は同等品。ASE 用の器具一式(セルボディー、セルエンドキャップアセンブ
リ、溶媒ボトル、捕集ボトルアセンブリー、コンプレッサー等)
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはなら
ない
3.4

その他

JIS K0311 又は厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(1)に記載のもの及び下記の器具、又は同等品
1) pH 試験紙 ばいじん等の pH 測定に使用
2) アルミロート

ハイドロマトリックスの充填に使用

3) セルロースフィルター

φ33mm、ASE 抽出に使用

4) 固相抽出用チューブ 60mL 用、フリット付、クリーンアップに使用
5) 固相抽出用チューブ 10mL 用、クリーンアップに使用
6) フリット φ9mm、クリーンアップに使用
7) ユニストッパー

4)と 5)の連結に使用、中央にφ4mm 程度の穴を開けたもの

8) カラムアタッチメント

50mL プラスチックボトルのフタ中央にφ4mm 穴を開けたもの

9) KD 管４．前処理操作
4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-2-3 に排出ガス

58

試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理ろ液

ダスト 1g に対して 20mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液−液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-2-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例
2) ばいじん及び燃え殻
厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)又は下記の方法により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。適量の試料を用いてダイオキシン類の測定及び含水率の測定を行う。
図 3-2-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

59

試料

含水率測定

HCl 処理試料の pH が 7 を超える場合

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ASE 抽出(ｱｾﾄﾝ、ﾄﾙｴﾝ)
脱水
濃縮：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 3-2-4 ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例
以下に、ASE 抽出装置を用いた方法を示す。
(1) 試料を適量の精製水中に入れて混和し、pH 試験紙で水層の pH を測定する。pH が 7 を超える場
合は、塩酸処理を行う。pH が 7 以下の場合には塩酸処理を省略し、抽出操作に進む。
(2) 抽出操作を行う場合には損失のないように注意し、容器に残った試料を完全に拭き取りセル中に合わせる。
(3) ASE の抽出は下記の条件で行う。
サイクル数 ： 2(1 サイクル目：アセトン、2 サイクル目：トルエン)
HEATING： 9分

STATIC： 10 分

FLUSHING： 50%

PURGING： 300 秒温度

： 200℃

圧力： 1500psi

60

(4) アセトン抽出液を濃縮し、トルエン抽出液と合わせた後無水硫酸ナトリウムで脱水する。
(5) ナスフラスコをエバポレータ等の濃縮器にセットし抽出液を濃縮する。
(6) 濃縮液をヘキサンで 10mL にメスアップする。
4.3

クリーンアップ

厚生省平成 4 年告示第 192 号に記載の方法、又は下記の方法によりクリーンアップを行う。図 3-2-5にクリーンアップのフローの例を示す。

抽出液：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業：物又は試料

濃縮

硫酸シリカゲル／活性炭
カラムクロマトグラフ操作
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ：ﾍｷｻﾝ (1：3)
第 1 画分

ﾄﾙｴﾝ
第 2 画分夾雑物の多い場合

硫酸シリカゲルカラム
クロマトグラフ操作
夾雑物の多い場合

濃縮

測定用試料

図 3-2-5 クリーンアップのフローの例
1) 抽出液の分取
抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。（通常、抽出液の 1/1〜1/10 程度を用いる。高濃度であることが予想される場合には、より少61

量を分取してもよい。）
2) 精製カラムの作成(図 3-2-6)(1) 硫酸シリカゲルカラム
60mL 用固相抽出用チューブに下から乾式充填法で、脱脂綿適量、44%硫酸シリカゲル 10±0.1g、シリカゲル 1.8±0.1g、無水硫酸ナトリウム 5〜5.5g、フリットの順に積層する。
(2) 活性炭カラム
12mL 用固相抽出用チューブに下から乾式充填法で、フリット、活性炭埋蔵シリカゲル 0.5±0.02g、無水硫酸ナトリウム 0.3±0.02g、フリットの順に積層する。

60μL 固相抽出チューブ

フリット
無水硫酸ﾅﾄﾘｳﾑ：5〜5.5g
シリカゲル：1.8±0.1g
44%硫酸シリカゲル：10±0.1g
脱脂綿：適量ユニストッパー
12μL 固相抽出チューブ
フリット
無水硫酸ナトリウム：0.3±0.02g
活性炭埋蔵ｼﾘｶｹﾞﾙ：0.5±0.02g
フリット
図 3-2-6 精製カラムの例
3) クリーンアップ(1) 硫酸シリカゲルカラム及び活性炭カラムにヘキサンを 20mL 流す。
(2) 活性炭カラムの上に硫酸カラムをセットし、ヘキサンを 10mL 流す。
(3) ヘキサンが流れ終わってから、試料をカラムに添加する。ヘキサンで抽出液の入っていた容器を洗浄し、洗液をカラムに注入する。
(4) カラムにヘキサン 70mL を流す。
(5) 硫酸シリカゲルカラムの層を観察し、破過した場合には(8)まで操作を行った後(10)へ。
(6) 硫酸シリカゲルカラムを外し、活性炭カラムの上に空の 60mL 用固相抽出用チューブを接続し、ジクロロメタン：ヘキサン＝1：3 を 50mL 流す。
(7) 活性炭カラムの下にナスフラスコをセットし、トルエン 70mL で溶出する。
(8) ナスフラスコをロータリーエバポレータ等の濃縮器にセットし、トルエン層を 0.5mL 程度まで濃縮する。
(9) 濃縮液を KD 管に移す。ナスフラスコをヘキサンで洗い込みながら KD 管に移し約 3mL にし 4)の62

溶媒置換の工程へ。
(10) 新しい硫酸シリカゲルを用意し、ヘキサン 30mL を流す。
(11) 硫酸シリカゲルカラムの下に空のナスフラスコをセットする。
(12) 濃縮液をカラムに注入する。濃縮液の入っていたナスフラスコをヘキサンで洗い洗液をカラムに注入する。
(13) カラムにヘキサン 70mL を流す。
(14) ナスフラスコをロータリーエバポレータ等の濃縮器にセットし、ヘキサン層を 0.5mL 程度まで濃縮する。
(15) 硫酸シリカゲルカラムが破過していない場合は(9)、破過している場合は(10)の工程へ。
4) 溶媒置換及び測定用試料の保存(1) 3)で得られた試料(ヘキサン層)の入った KD 管を吹き付け装置にセットして 20μL まで濃縮し、着色や沈殿等の異常がないことを確認する。次に DMSO 20μL を添加し、20 μL まで濃縮すること
により DMSO に溶媒置換する。
(2) KD 管に DMSO を適量加え(排出ガス試料の場合 60 μL、ばいじん等試料の場合 180 μL。試料の濃度等により増減する場合もあり)、試験管ミキサー等でよく撹拌する。
(3) 試料をバイアルに移し、試料識別用のラベルを貼り、最終検液として室温で暗所に保存する。
第５節

測定

１．測定の概要
ヒト遺伝子組み換え細胞である 101L 細胞が用いられる。試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光を発光光度計(ルミノメーター)で測定することによりダイオキシン類の定量を行う。
2,3,7,8-TeCDD により検量線を作成し、試料の発光量(RLU)から実測濃度を算出する。排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数を実測濃度に乗じることにより、測定量(毒性等量)を算出する。
２．試薬、器具及び装置
2.1

使用細胞

ダイオキシン類応答性組換え細胞 101L：3 個の生体異物応答配列 XRE を含むヒトのシトクロム P450
（CYP1A1）プロモーターにホタルのルシフェラーゼ遺伝子と融合した 5ʼ隣接配列が安定的に統合されたプラスミド pL1A1N を、人肝細胞由来 HepG2 に導入したもの
2.2

試薬

測定に用いる試薬は、次による。
1) 培地

イーグル MEM 炭酸水素ナトリウム含有、L-グルタミン不含、ろ過滅菌及びエンドトキシン

テスト済、冷蔵保存
2) FETAL BOVINE SERUM(FBS)
3) L-グルタミン

56℃、30 分間非働化処理済、-20℃凍結保存

200 mM、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、0℃以下凍結保存

4) ピルビン酸ナトリウム

100mM、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済、冷蔵保存

5) 培養液 1)の 500mL、2)の 25mL、3)の 10mL、4)の 5mL を混合したもの、冷蔵保存

636）滅菌水7) G418

滅菌済みの JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

GENETICIN(G418)(γ線滅菌済)

1g に 25mL の滅菌水を加えて 40mg/mL に調製し、0℃以下で凍結保存したもの
8) ペニシリン・ストレプトマイシン

10000units ペニシリン・10mg/mL ストレプトマイシン、ろ過

滅菌及びエンドトキシンテスト済、0℃以下凍結保存
9) トリプシン溶液

1×solution、0℃以下凍結保存

10) ハンクス緩衝液 炭酸水素ナトリウム含有、ろ過滅菌及びエンドトキシンテスト済
11) リン酸緩衝生理食塩液(PBS)

マグネシウム及びカルシウム不含12) ルシフェラーゼアッセイキット

BD PharMingen 製 556866(発光基質、緩衝液、細胞溶解液同梱)

又はこれと同等の性能を有するもの
13) 標準物質

2,3,7,8-TeCDD (50μg/mL DMSO)

14) 炭酸ガス

CO2 99.5%15) 液体窒素16）細胞凍結用保存液 1)、2)、DMSO 及び 7)を 40：50：9：1 の割合で混合したもの、使用時に毎回
調製する
2.3

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、以下による。
1) 培養シャーレ(ペトリ皿)
2) 培養マイクロプレート
3) メスピペット

φ100 mm、滅菌済のもの

96 ウェル、滅菌済のもの

50mL 及び 10mL、滅菌済のもの

4) 遠心管 50mL 及び 10mL、滅菌済のもの
5) 三角フラスコ

滅菌済のもの

6) ビーカー 滅菌済のもの
7) マイクロピペット用滅菌チップ 200 μL、1000 μL 、滅菌済のもの
8) マイクロピペット用チップ

200 μL、1000 μL

9) マイクロピペット
10) 12 チャンネルマイクロピペット
11) ピペットエイド
12) 安全キャビネット
13) インキュベーター 37℃恒温、飽和湿度、5% CO2 濃度
14) ウォーターバス
15) 遠心分離機

1000rpm で遠心分離できるもの

16) 試験管ミキサー17) 血球計算盤
18) 光学顕微鏡
19) カウンター
20) 微量遠心管
21) 試験管

φ12×75mm22) マイクロプレートミキサー

6423) ルミノメーター
24) オートクレーブ
25）凍結保存用バイアル26）凍結処理容器

2mL、滅菌済のもの

BICELL 又はそれと同等の性能を有するもの又はプログラムフリーザー

27）ドライアイス又はディープフリーザー−80℃28）液体窒素保管容器
29) 吸引装置(アスピレーター)
30）リザーバー
３．細胞の取り扱い
3.1

培養細胞の起眠1) 液体窒素保管容器から 101L 細胞の入った凍結保存用バイアルを取り出し、37℃のウォーターバス
中で解凍する。
2) バイアルの内容物を培養シャーレに移した後、培養液 12mL を加えて混和する(注 2)。
3) 培養シャーレをインキュベーターに入れ、5 時間程度培養する。
4) 培養シャーレをインキュベーターから取り出し、培養液を取除き、新しい培養液を 12 mL 加えた
後、G418 及びペニシリン・ストレプトマイシンを 120 μL ずつ加えて混和する（終濃度で G418：
0.4mg/mL、ペニシリン 100units、ストレプトマイシン 0.1mg/mL になるように調製する）(注 2)。
5) 培養シャーレをインキュベーターに入れ、3〜4 日間培養する。
6）継代操作を繰り返し、細胞が安定して増殖するようになったことにより、細胞に異常がないことを確認し測定に使用する。
3.2

細胞の継代

1) 培養シャーレをインキュベーターから取り出し培養液を取り除く。トリプシン溶液を 2mL 分注し混和する（細胞の成育状況に応じてトリプシンの分注量を増減してもよい。）(注 2)。
2) 培養シャーレをインキュベーターに 8 分間入れる。
3) 培養シャーレをインキュベーターから取り出し、1)で使用したトリプシン溶液と等量の培養液を分注し混和する。
シャーレの底面に張り付いている細胞をメスピペットを用いてピペッティングで剥がして遠心管に移す(注 2)。
4) 遠心管を遠心分離機に入れ、1000rpm で 5 分間遠心分離操作を行う。
5) 上澄み液を廃棄し、残ったペレット状の細胞に培養液を適量加えてメスピペットを用いてピペッ
ティングし、懸濁液を作製する(注 2)。
6) 懸濁液の一部を微量遠心管に移し、ハンクス緩衝液等の緩衝液又は培養液をマイクロピペットで適量加えて希釈する(注 2)。
7) よく混和した懸濁液を血球計算盤に適量分注し、顕微鏡で細胞数をカウントする。カウントをもとに懸濁液の濃度(cells/mL)を計算する。
8）作製する培養シャーレ 1 枚当り 12mL、培養マイクロプレート 1 枚当り 24mL を目安として、調製に必要な液量を計算する。
9) 125,000cells/mL の濃度調製に必要な懸濁液量と培養液量を計算し、両者の合計量の 1/100 量に相65当する G418 及びペニシリン・ストレプトマイシン量を計算する（終濃度で G418：0.4mg/mL、ペニシリン 100units、ストレプトマイシン 0.1mg/mL になるように調製する）(注 2)。
10) G418 及びペニシリン・ストレプトマイシンと培養液を混合した後、懸濁液を加えて混和し、培養
シャーレ 1 枚当たり 12mL ずつ、培養マイクロプレートの 1 ウェル当たり 200μL ずつ分注する。培養マイクロプレートに分注する際は、懸濁液をリザーバーに移し、12 チャンネルマイクロピペッ
ト等で分注する(注 2)。
11) インキュベーターに入れ、3〜4 日間培養する。
12）試験に使用する細胞株は 3〜4 日間で 3〜5 倍程度に増殖するのでそれを目安として作製する培養
シャーレの枚数を決定する。
13）細胞の継代操作は起眠後 25 回までを目安とし、期限前であっても測定に支障が生じる等細胞に問題があると考えられる場合にはそれ以後の継代には使用せず廃棄する。
14）インキュベーター内で細胞を培養中に停電した際には、温度及び CO2 濃度の低下を極力抑えるため、扉の開閉を控える。復旧後細胞の状況を確認し、問題があると考えられた場合には使用せず廃棄
する。
3.3

細胞の保存

下記に細胞保存の例を記載する。
1）3.2 の 1)〜7）の方法で細胞懸濁液を調製する。
2）細胞懸濁液を遠心管に移し(注 2)、遠心分離機に入れ、1000rpm で 5 分間遠心分離操作を行う。
3）上澄み液を廃棄し、残ったペレット状の細胞に細胞凍結用保存液を加えてピペッティングし、細胞懸濁液の濃度が 2.0×106〜4.0×106cells/mL 程度になるよう調製する(注 2)。
4）凍結保存用バイアルに 1mL ずつ分注(注 2)して凍結処理容器の中に入れ、ドライアイス入りの箱又はディープフリーザー（−80℃）に 3 時間程度入れる。
5）凍結保存用バイアルを取り出し、液体窒素保管容器の中に入れて保存する。

(注 2) 安全キャビネット内で無菌操作を行う。

４．測定操作4.1

細胞の培養マイクロプレートへの播種

1) 3.2 の 9)で調製した懸濁液を培養マイクロプレートの各ウェルに 200 μL ずつ分注する(注 2)。
2) 培養マイクロプレートをインキュベーターに入れ、3〜4 日間培養する。
4.2

曝露1) 測定値が定量範囲内に入るよう必要に応じて、第 4 節 4.3 の 4)で調製した測定用試料に DMSO を加えて希釈系列試料を作製する。
2) ブランク溶媒、検量線作成用標準液(STD：濃度調製例 0.5、1、2、5、10ng/mL))、及び 1)で作製した希釈系列試料を試験管内で培養液で 100 倍希釈し、測定用試料液を調製する(注 2)。
3) 3〜4 日間培養した培養マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、ウェル中の培養液をアスピレーター等で吸引除去する(注 2)。
4) 2）で調製したブランク溶媒、STD、希釈系列試料の測定用試料液を培養マイクロプレートの各ウ66

ェルに 50μL ずつ、2 つ以上のウェルに分注する。同一操作で扱う培養マイクロプレートが複数枚ある場合には、それらを 1 つのバッチとして扱い、バッチごとに STD を入れる(注 2)。
5) 培養マイクロプレートをインキュベーターに入れ、16±0.5 時間曝露する。
表 3-2-1 試料希釈の例
1 倍試料、5 倍希釈試料、25 倍希釈試料、125 倍希釈試料、625 倍希釈試料を作製する際の調製例
試料

希釈元

分取量（μL）

DMSO 分注量（μL）

1 倍試料

1 倍試料

--

0

5 倍希釈試料

1 倍試料

20

80

25 倍希釈試料

5 倍希釈試料2080

125 倍希釈試料

25 倍希釈試料

2080625 倍希釈試料

125 倍希釈試料

20

80

DMSO

DMSO

STD1

STD1

STD2

STD2

STD5

STD5

QC

QC

試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料

試料

試料

1-1

1-1

STD3
1-2

STD3
1-2

STD4
1-3

STD4
1-3

試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料
1-4

1-4

1-5

1-5

2-1

2-1

2-2

2-2

2-3

2-3

試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料
2-4

2-4

2-5

2-5

3-1

3-1

3-2

3-2

3-3

3-3

試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料
3-4

3-4

4-3

4-3

試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 試 料 QC

QC

4-4

試料

4-4

3-5
4-5

図 3-2-7

3-5
4-5

4-1

4-1

5-1

5-1

4-2
5-2

4-2
5-2

試料

96 ウェルプレート上での試料の配置例(注 3)(注 3）プレートの外周部分のウェルは、培養中に培養液の蒸発等の影響を受けやすいため、原則として定量には使用しない。

4.3

ルシフェラーゼ活性の測定

1) 曝露が終わった培養マイクロプレートをインキュベーターから取り出し、ウェル中の測定用試料液をアスピレーター等で吸引除去する。
2) 培養マイクロプレートの各ウェルに PBS を 100 μL 加え、アスピレーター等で吸引除去する。
3) 各ウェルに細胞溶解液を 50 μL 加え、室温で 10 分間放置する。
4) 培養マイクロプレートをマイクロプレートミキサーにセットし、5 分間撹拌する。
5) ルミノメーターに発光基質及び緩衝液をセットし、ルミノメーターに接続されたコンピュータ等に設定条件を入力する。

67

6) 培養マイクロプレートをルミノメーターにセットし、緩衝液及び発光基質を適量自動分注させ、発光基質分注 1 秒後から 2 秒後までの 1 秒間の RLU を測定する。
５．定量
5.1

検量線の作成1) ルミノメーターで測定した STD の発光量（RLU)をブランク溶媒の発光量（RLU)で除し、foldinduction(発光量比)を求める。
2) STD の濃度(X)及び fold induction (Y)について、一次回帰式による検量線を作成する。一例を図3-2-8 に示す。
140
120

Fold Induction

100
80
60
40
20
0

0

2

4
6
TeCDD(ng/ml)

810

図 3-2-8 検量線例
5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。管理図による処置基準は、管理限界（μ±２σ）からの逸脱状況及び図の傾向等に応じて下記の通りとする（μ：工程平均、σ：測定量（毒性等量）の標準偏差）。
データが 1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
5.1 により作成した検量線の 10ng /mL の点の検量線による換算値（ng-TEQ/mL）を算出し、管理図にプロットする。一例を図 3-2-9 に示す。

68

12

TeCDD(ng-TEQ/ml)

11
10

μ+2σ

9

μ-2σ

μ

8

7
6
0

5

10

15

20

25

30

測定回数(回)

図 3-2-9 管理図例
5.3

測定試料の定量

1) ルミノメーターで測定した試料の発光量をブランク溶媒の発光量で除し、fold induction を求める。
2) 測定試料の fold induction を検量線の回帰式に代入し、測定試料の定量を行う。
3) 検量線の定量範囲内にある発光量(fold induction）のうち、試料の希釈倍率と定量データの間に良好な直線関係(希釈直線性)が得られる希釈段階について、定量データに希釈倍率を乗じて実測濃度(測定用試料当たり）を求める。
4) 3)で求めた実測濃度(測定用試料当たり）について、抽出に供した実試料及びクリーンアップ、測定に供した試料の分取割合等から単位測定試料量当たりの実測濃度を算出する。
5) 試料希釈列の全ての発光量(fold induction）が検量線の定量範囲から外れた場合、試料の希釈倍率を再度調製した上で測定を行う。

(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正が必要な場合には、次式によって所定の酸素濃度に換算する。

C=

21 − On
21 − Os

ここに、C

× Cs

： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)

On： 換算する酸素の濃度(%)

Os： 排出ガス中の酸素の濃度(注 4)(%)

Cs： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 4) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲

第２章各論（生物検定法に共通する事項）第３節では、非線形検量線を対象とした「原則として、検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定量（毒性等量）の定量値の変動係数(CV%)が30%以69下となる点を検出下限、20%以下となる点を定量下限とする」としているが、本方法では、線形検量線を使用するため、本マニュアル第２章第３節に記載の通り、上記算出方法を誘導する際の元となった方法「測定値の標準偏差を検量線の傾きで割った数値を求め、その3.3倍に相当する標準物質濃度を検出
下限、10倍に相当する標準物質濃度を定量下限とする」により検出下限及び定量下限を求め、検量線が直線となる最大濃度（通常10ng/mL）迄を定量範囲とする。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、少なくとも6ヶ月に1回十分な性能が得られていることを確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
2,3,7,8-TeCDD 標準溶液を DMSO で希釈し、検出下限等算出用標準溶液を調製する。
調製濃度の例：ブランク（DMSO）、0.1、0.3、0.5 ng/mL2) 検出下限及び定量範囲の算出例(1) 1)で調製した検出下限等算出用標準溶液を n=5 以上で測定し、ブランク RLU を差し引いた RLU
から、直線回帰検量線を作成する。検出下限等算出用検量線の例を、図 3-2-10 に示す。
(2) ブランクの各測定値（RLU）の平均値と標準偏差を算出する。
(3) (2)で求めた標準偏差を、(1)で求めた検量線の傾きで割る。
(4) (3)で得られた数値の 3.3 倍に相当する標準物質濃度を検出下限、10 倍に相当する標準物質濃度を定量下限とし、検量線に直線性の認められる範囲(通常約 10ng/mL)迄を定量範囲とする。
算出例を表 3-2-2 に示す。
表 3-2-2 検出下限及び定量下限の算出例
ブランク（DMSO）の RLU
244

202

224

傾き

21.3

932

196

検量線回帰式：RLU=932×TeCDD

2(R =0.990)

検出下限＝21.3÷932×3.3＝0.075 ng/mL
定量下限＝21.3÷932×10 ＝0.23 ng/mL
500

400

300
RLU

195

標準偏差

200

100

0

0

0.1

0.2
0.3
0.4
TeCDD(ng-TEQ/ml)

0.5

図 3-2-10 検出下限等算出用検量線例703) 実運用上における検出下限及び定量下限
上記の計算を用いた検出下限及び定量下限の値は測定機器の安定性が高い場合にはかなり低い数
値として計算される場合がある。しかし現実の運用上は測定機器の分解能等から考え、標準物質の測定値がブランクの測定値に対し 1.5 倍〜2 倍以上の RLU（Fold Induction として 1.5〜2.0 以上）を与える濃度以上で定量することが望ましい。現状の測定系で実際に使用している検出下限及び定量下限を表 3-2-3 に示す。
表 3-2-3 標準物質における検出下限及び定量下限の実運用例
検出下限
0.15 pg/well
6.2

定量下限
0.3 ng/mL

0.25 pg/well

0.5 ng/mL

試料における検出下限及び定量下限

試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限及び定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。
表 3-2-4 試料における検出下限算出例（排出ガス）
バイオアッセイ
測定媒体

検出下限
pg/well

排出ガス

0.15

1well 中試料量μL /well
0.5

試料調製
採取量

酸素濃度

m3N

%

4

12

媒体中濃度

分取液量/

最終

抽出液量

定容量

mL/mL

mL

10/20

0.08

希釈

実測濃度

倍率

ng/m3N１

0.01

表 3-2-5 試料における検出下限算出例（ばいじん及び燃え殻）
バイオアッセイ
測定媒体

検出下限
pg/well

1well 中試料量μL /well

試料調製
採取量

固形分

ｇ

%

5

100

媒体中濃度

分取液量/

最終

抽出液量

定容量

mL/mL

mL

10/10

0.2

希釈

実測濃度

倍率

ng/g

1

0.01

ばいじん
及び

0.15

0.5

燃え殻
表 3-2-6 試料における定量下限算出例（排出ガス）
バイオアッセイ
測定媒体

定量下限
pg/well

排出ガス

0.25

1well 中試料量μL/well
0.5

試料調製
採取量

酸素濃度

m3N

%

4

12

71

媒体中濃度

分取液量/

最終

抽出液量

定容量

mL/mL

mL

10/20

0.08

希釈

実測濃度

倍率

ng/m3N1

0.02

表 3-2-7 試料における定量下限算出例（ばいじん及び燃え殻）
バイオアッセイ
測定媒体

定量下限
pg/well

1well 中試料量μL/well

試料調製
採取量

固形分

ｇ

%

5

100

媒体中濃度

分取液量/

最終

抽出液量

定容量

mL/mL

mL

10/10

0.2

希釈

実測濃度

倍率

ng/g

1

0.02

ばいじん
及び

0.25

0.5

燃え殻
７．測定量(毒性等量)への換算5.3 で求めた実測濃度に排出ガス、ばいじん及び燃え殻ともに換算係数を乗じることで測定量(毒性等量)に換算する。なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照する
こと。
８．換算係数の確認
少なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若し
くは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1〜4.3 及び 5.3
に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、厚生省平成4年告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法4.1〜4.3及び5.3に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を
算出する。

72

第６節

参考資料

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=32、n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-2-11 では Y/X の平均値である 1/4.6 を換算係数とした)。
「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
多数のばいじん及び燃え殻試料(この例では n=39、n=20 以上が望ましい)について本測定方法とHRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-2-12 では Y/X の平均値である 1/5.5 を換算係数とした)。

排ガス試料(n=32)

ばいじん及び燃え殻試料(n=41)
10000

y = 5.3797x
R2 = 0.9766

100

y = 5.4738x
R2 = 0.97431000
毒性等量(ng-TEQ/g)

毒性等量(ng-TEQ/m3N)

1000

10

1

100
10
1
0.1

0.1
0.01

0.1

1

10

0.01
0.001

100

3

実測濃度(ng/m N)

0.1

10
実測濃度(ng/g)

図 3-2-11 換算係数算出(例)

図 3-2-12 換算係数算出(例)(排出ガス)(ばいじん及び燃え殻)

73

1000

その３

前処理に、多層カラムを使用し、測定にダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いたレポータージーンアッセイを利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 1 の 3)
第１節

測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、ダイオキシン類応
答性組換え細胞 HeB5 を用いた測定により定量する。測定方法のフローを図 3-3-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5 を用いた測定
ダイオキシン類(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 3-3-1 測定方法のフロー
第２節

用語の定義

1) 遺伝子組換え細胞 組換え DNA 技術を用いて作製された細胞2) 組換え DNA 技術
3) Ah 受容体

組換え DNA を作製し、それを生細胞(宿主)に移入し、増殖させる技術

Arylhydrocarbon Receptor、アリール炭化水素受容体、特異的な細胞外シグナル伝達

分子(リガンド)に結合し、細胞の応答するきっかけとなるタンパク質。ダイオキシン類の生体影
響の多くは、この受容体と結合することにより引き起こされる
4) ルシフェラーゼ遺伝子

Luciferase Gene、生物発光反応を触媒する酵素を発現するホタル由来の遺伝子5) 転写調節領域
6) XREある遺伝子の転写調節に関わる遺伝子上の領域

Xenobiotics Responsive Element、生体異物応答配列

7) 継代培養

Subculture、保存培養から微生物あるいは培養細胞の一部を分けて別の新鮮な培地に植え継ぎ、再び培養したもの
8) 発光基質 生物発光反応の基質
9) 精度プロファイル 精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図

74

第３節

試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量
試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

V =QDL × k × v VE
1
××
VE′ C DL
1000

ここに、V

： 測定に必要な最小の試料ガスの量(m3N)

QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となる試料ガスにおける検出下限(ng-TEQ/m3N)4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出
下限は 0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液から 25mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 0.07mLの測定用試料溶液に調製する場合の試料ガス採取量を下記に示す。

V =100 × 0.375 × 0.07 50
1× ×＝0.0311000
25 0.17

２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量
ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

W =

QDL × k × v VE
1
××
VE′ C DL
1000

ここに、W

： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(pg/mL, DMSO 溶液中)k

： 測定量(毒性等量)への換算係数v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

75

VʼE ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限は 0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 50mL に定容し、その抽出液全量を用いてクリーンアップを行い、最終的に 0.07mL の測定用試料溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を下記に示す。

W =

第４節

100 × 0.872 × 0.07 50 1
× × ＝0.061
1000
50 0.1

試料の前処理１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 3-3-2に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

多層シリカゲルカラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 3-3-2 試料の前処理から測定までのフローの例
２．試薬
試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

2) メタノール

JIS K8891 に規定するもの又は同等な品質のもの

3) アセトン JIS K8040 に規定するもの又は同等の品質のもの
4) トルエン JIS K8680 に規定するもの又は同等の品質のもの
5) ジクロロメタン

JIS K8117 に規定するもの又は同等の品質のもの

6) ヘキサン JIS K8825 に規定するもの又は同等の品質のもの

76

7) ジメチルスルホキシド(DMSO)
8) 硫酸ナトリウム

JIS K9702 に規定するもの又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K8987 に規定するもの又は同等の品質のもの

9) 塩酸

JIS K8180 に規定するもの又は同等の品質のもの

10) 硫酸JIS K8951 に規定するもの又は同等な品質のもの

11) ヘキサン洗浄水
12) シリカゲル

1)の水を 6)のヘキサンで十分洗浄したもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの又は同等な品質のもの

13) 水酸化カリウム(2%質量分率)シリカゲル
14) 硫酸(44%質量分率)シリカゲル

JIS K0311 6.2 に規定するもの又は同等な品質のもの

JIS K0311 6.2 に規定するもの又は同等な品質のもの

15) 硝酸銀(10%質量分率)シリカゲル JIS K0311 6.2 に規定するもの又は同等な品質のもの
16) アルミナ

JIS K0311 6.2 に規定するもの又は同等な品質のもの

17) ガラス繊維ろ紙

JIS K0311 6.2 に規定するもの又は同等な品質のもの

18) 窒素JIS K01107 に規定するもの又は同等な品質のもの

19) 酢酸JIS K8355 に規定する特級又は同等の品質のもの

20）無水酢酸

JIS K8886 に規定する特級又は同等の品質のもの

21) テフロンフィルタ 孔径 0.5μm 以下のもので、ダイオキシン類の吸着や妨害成分の溶出がないもの(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

３．器具及び装置
試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはなら
ない
3.4

還流抽出器

3.2 のソックスレー抽出器(JIS R3503 付図 71)の抽出塔を外して、代わりに共通すり合わせ直管形連結管(JIS R3503 付図 76)により、共通すり合わせ球管冷却器と共通すり合わせ短首平底フラスコを連結したもの、又は同等のもの
3.5

超音波洗浄器水槽を約 50℃に加温でき、38kHz 前後の超音波を発振できるもの
3.6

マントルヒーター

3.2 のソックスレー抽出器及び 3.4 の還流抽出器を加熱し、還流させることが出来るもの

77

４．前処理操作
4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出

4.2.1 排出ガス
JIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 3-3-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理ろ液

ダスト 1g に対して 20mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液−液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液
図 3-3-3 排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例

78：物又は試料

4.2.2 ばいじん及び燃え殻
試料を酢酸に浸して酸処理を行った後、還流抽出器にかけて抽出を行い、硫酸ナトリウムによる脱水
後に、濃縮器等で濃縮する。分取して用いる場合はこれを一定量とする。
図 3-3-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

試料

含水率測定

酢酸処理

還流抽出

超音波抽出
脱水
濃縮
：検体又は試料：作業

抽出液

図 3-3-4 ばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例
1) 分析試料採取
試料約 2g を共通すり合わせ短首平底フラスコ等に採取する。水分の多い試料の場合は風乾を行った後に採取することが望ましい。
2) 酢酸処理酢酸を 10mL 加える。湿りのある、発泡や発熱が著しいサンプルについては、さらに無水酢酸を 10mL添加する。その後、超音波洗浄器に 10 分以上かける。
3) 還流抽出
酢酸処理を行った平底フラスコにトルエン 50mL を加え、直管形連結管により、球管冷却器と平底フラスコを連結し、2 時間以上還流抽出を行う。(酢酸処理の酢酸は、還流抽出前に取り出す必要は無
く、トルエンを追加してそのまま還流を行うことができる。酢酸又は無水酢酸を追加している場合には還流抽出前に酢酸を取り出し、抽出後のトルエンと合わせる方が良い。)
4) 超音波抽出
還流抽出後、超音波洗浄器に約 20 分かける。

795) 脱水ろ過
ガラスロートに石英ウールをいれ、その上に無水硫酸ナトリウムを約 50g 敷き詰め、あらかじめヘ
キサン 100mL で洗浄した脱水用ロートをセットした 300mL ナスフラスコに試料液を移して脱水ろ過する。トルエンで 3 回、ヘキサンで 3 回洗浄する。1 回では脱水が不充分な場合は、濃縮後に再度、無水硫酸ナトリウムによる脱水操作を繰り返す。
4.3

クリーンアップ

図 3-3-5 にクリーンアップのフローを示す。

抽出液：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業

濃縮

多層シリカゲルカラム
クロマトグラフ操作
白濁の少ない場合白濁の多い場合
白濁の無い場合

アルミナカラム
クロマトグラフ操作
白濁の少ない場合白濁の多い場合

ろ過

ﾃﾌﾛﾝﾌｨﾙﾀｰ

ろ過

ﾃﾌﾛﾝﾌｨﾙﾀｰ
白濁の無い場合

濃縮

測定用試料
図 3-3-5 クリーンアップのフローの例

801) 抽出液の分取
抽出液を分取して一部を測定に使用する場合には、定容した抽出液から目的に合わせて一部を分取する。(通常、抽出液の 1/1〜1/10 程度を用いる。高濃度であることが予想される場合には、より少量を分取してもよい。)
2) 精製カラムの作製(1) 多層シリカゲルカラムa) 石英ウールを詰めたガラスクロマト管(内径 15mm)に、図 3-3-6 に示すように、下から、シリカ
ゲル、硝酸銀シリカゲル、シリカゲル、水酸化ナトリウムシリカゲル、シリカゲルをトルエン
でクロマト管に湿式充填により積層する。
b) ヘキサン 30mL を通液し、カラム内の溶媒をヘキサンに置換する。
c) 硫酸(44%質量分率)シリカゲル、シリカゲル、硫酸ナトリウムをヘキサンで湿式充填により積層する。
d) ヘキサン 100mL を通液し、充填カラム全体の洗浄を行う。ヘキサンの液面が無水硫酸ナトリウ
ムの上面まで下がったところで通液を止める。

硫酸ナトリウム：2g程度
シリカゲル：2g程度
硫酸(44%質量分率)シリカゲル：8〜10g程度

シリカゲル：1g程度
水酸化カリウム(2%質量分率)シリカゲル：3g程度
シリカゲル：1g程度
硝酸銀(10%質量分率)シリカゲル：7〜5g程度
シリカゲル：1g程度
石英ウール：適量
化学修飾シリカゲル等の充填量・充填割合は、試料性状に応じて、適宜変更してもかまわない。
ただし、ダイオキシン類の回収が得られることを確認しておくこと。

図 3-3-6 多層シリカゲルカラムの例(2) アルミナカラム
石英ウールを詰めたガラスクロマト管(内径 10mm)に、アルミナ 10g を湿式充填により充填する。
ただし、アルミナカラムは試料の性状によって必要な場合のみ使用するため、必要の都度、作製する。
3) クリーンアップ操作
クリーンアップは、2)の(1)多層シリカゲルカラム、(2)アルミナカラム、及び孔径 0.5μm 以下のテ

81

フロンフィルタ等を用いて、図 3-3-5 のフローに従って行う。
4) 溶媒置換及び測定用試料の保存
溶媒置換は、トルエン、ヘキサン等の極性の低い溶媒から、DMSO への転溶を行う。溶媒置換はロー
タリーエバポレータ等の濃縮器を用いて、可能な限り無極性溶媒の量を減じる。
約 50mL のアセトンを加えて再度、濃縮器で濃縮を行う。この操作を 3 回繰り返す。その後、アセトンに、測定用試料として必要な量の DMSO を添加して濃縮する。
濃縮液は、測定用試料の保存容器にアセトンを用いて洗い込む。アセトンによる洗い込み及び、窒
素吹付け等による濃縮を繰り返し、最終的に DMSO のみの溶液に調製する。
測定用試料は、測定するまでの間、室温で暗所に保存する。
第５節

測定

１．測定の概要
マウス肝由来の遺伝子組み換え細胞である HeB5 細胞を用いて、試料中に含まれるダイオキシン類が細胞内の Ah 受容体と結合することに由来して発現するルシフェラーゼの活性に基づく発光を発光光度計(ルミノメーター)で測定することにより、ダイオキシン類の定量を行う。
2,3,7,8-TeCDD により検量線を作成し、試料の発光量(RLU)から実測濃度を算出する。排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数を実測濃度に乗じることにより、測定量(毒性等量)を算出する。
２．試薬、器具及び装置
2.1

使用細胞

ダイオキシン類応答性組換え細胞 HeB5：ラットグルタチオン S-トランスフェラーゼ Ya サブユニット
遺伝子の転写調節領域にあるダイオキシン応答配列をプラスミド pGL3 のホタルのルシフェラーゼ遺伝
子上流域に含むプラスミド pGL3-chTATA-YaXRE×5-bsd を、マウス肝由来 Hepa-1 細胞に導入したもの
2.2

試薬

測定に用いる試薬は、次による。
1) 培地

αMEM、NaHCO3(特級)2) Fetal Bovine Serum(FBS)

56℃、30 分間非働化処理済、-20℃凍結保存

3) リン酸緩衝生理食塩液(PBS(-))

マグネシウム及びカルシウム不含4) トリプシン溶液

0.25%、0℃以下凍結保存5) 細胞分散用試薬

0.25%トリプシン溶液／1mM EDTA 溶液

6) ブラストサイジン S(Bsd)

塩酸塩 1%含有

7) 細胞凍結用保存液
8) 発光基質 ルシフェリン及び組成物
9) 細胞溶解液10) 標準溶液

ホタルルシフェラーゼによる発光が測定可能なもの
2,3,7,8-TeCDD (50μg/mL DMSO)

11) ジメチルスルホキシド(DMSO)
12) 水JIS K9702 に規定するもの又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等な品質のもの

13) 炭酸ガス

CO2 99.99%

8214) 液体窒素
2.3

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、以下による。
1) 細胞培養用プレート φ100mm 培養シャーレ(ペトリ皿)
2) 培養／アッセイ用プレート

96 ウェルプレート

3) ピペット 滅菌ピペット 10mL、25mL 等
4) 滅菌用フィルター

0.22μm5) マイクロピペット及びマルチチャンネルピペット用チップ類

200μL、1000μL、1200μL 等6) 細胞凍結保存用チューブ
7) 血球計算盤
8) 96 ウェルディープウェルプレート
9) リザーバー

ポリプロピレン製、試料を培地に添加・混合するのに用いる細胞懸濁液の調製、分注に用いる

10) マルチチャンネル(8ch 又は 12ch)ピペッター

電動又はマニュアル

11) マイクロピペット
12) インキュベーター 37℃恒温、飽和湿度、5% CO2 濃度
13) 安全キャビネット クラスⅡB
14) オートクレーブ
15) 培養用倒立位相差顕微鏡
16) ルミノメーター マルチウェル発光プレートリーダー
17) ディープフリーザー−80℃18) 液体窒素保存容器(細胞保存用)
19) 培地吸引装置(吸引ポンプ、トラップ及びチューブ等一式)
20) 吸引装置(アスピレーター)
３．細胞の取り扱い
3.1

培養細胞の起眠1) 培地の調製
粉末αＭＥＭ培地(1L 分)を超純水に溶解した後、NaHCO3 を 2.2g 添加・溶解し(黄色透明→赤色透明)、
超純水で 1L 容とする。これを滅菌用フィルターで減圧濾過し、この無血清培地 500mL に対し、50mLの FBS を混合し、10%血清入り培地とする。培地の容器を開放する(フィルターを取り外す、又は蓋を開ける)等の無菌操作が必要な場合は安全キャビネット内で行う。安全キャビネット内に物品及び手を入れる際、約 80%エタノールのスプレーでそれらを消毒する。
ブラストサイジン S(Bsd)含有培地は以下のように調製する。Bsd が粉末の場合はまず PBS(-)に溶解
し、 0.22μm のフィルターでろ過滅菌する。滅菌済み Bsd 溶液は適当量(目安として 2mg/mL の濃度で4mL ずつ)小分けし凍結保存しておくと良い。この Bsd 溶液を上記 10%血清入り培地の Bsd の終濃度が16μg/mL となるように添加・混合する。
2) 細胞の立ち上げ
冷蔵庫に保管している Bsd 含有/10%血清入り培地を、37℃恒温水槽であらかじめ温めておく。前記
培地を φ100mm の培養シャーレに 10mL 注ぐ。液体窒素又はディープフリーザーで保存した細胞入り83

細胞凍結保存用チューブを取り出し、直ちに 37℃恒温水槽で細胞凍結保存用チューブを振りながら融解する(1〜2 分程度)。細胞凍結保存用チューブの外側を 80%エタノール噴霧により消毒し、融解した細胞懸濁液を培地入り φ100mm 培養シャーレに注ぐ。凍結塊が残っている状態で培地を少量添加し、融解・懸濁させて培養シャーレに注いでも良い。培養シャーレを縦及び横方向に数回ゆすって細胞を拡散させた後、この培養シャーレをインキュベーターに入れて培養する。培養条件は、CO2 5%、37℃、飽和湿度に設定する。起眠後、継代 3 回目から試験に用いる。
3.2

細胞の継代

通常、細胞が培養シャーレの底面一杯を覆うまで増殖する前に細胞を継代する。使用する培地及び
PBS(-)をあらかじめ 37℃恒温槽で温めておく。培養シャーレをインキュベーターから取り出し、80%エ
タノールを噴霧して消毒後、安全キャビネット内に入れる。培養シャーレに付着しているエタノール液をふき取っておく。片手で培養シャーレを持ち、蓋を開け(全開にはしない)、先にチップ(200μL)を装着したアスピレーター等で培地を吸引除去する。次に PBS(-)をピペットで 5mL 程度、培養シャーレの側面に液を当てながら注入する。培養シャーレを傾ける等により PBS(-)が培養シャーレの底面全体に行き渡るようにする。洗浄済みの PBS(-)を吸引除去する。細胞分散用試薬(トリプシン/EDTA 溶液)を培養シ
ャーレの側面から 1〜2mL 程度注ぎ、培養シャーレを傾けて底面全体に液が行き渡るようにする。細胞分散用試薬(トリプシン/EDTA 溶液)を吸引除去し、培養シャーレを室温で 5〜10 分程度静置する。培養
用倒立位相差顕微鏡で細胞が底面から剥がれそうになっていること、及び細胞が互いに分離していることを確認したら、培養シャーレの底を手で軽く叩き(タッピング)、細胞を底面から剥離させる。安全キャビネット内で、剥がれた細胞に培地(通常 Bsd 不含/10%血清培地)を 10mL 程度加え、ピペットによる吸引・吐出を繰り返し細胞を分離させる。あらかじめ 10mL の Bsd 含有／10%血清培地を注いだ培養シャーレに、細胞懸濁液の一部(通常 0.3〜0.5mL 程度、目的に応じて増減させる)を注ぎ、培養シャーレを
縦及び横方向に数回ゆすって細胞を拡散させる。培養シャーレをインキュベーターに入れて培養する。
通常、細胞懸濁液の 1/20 を継代培養に用い、2〜3 日間培養後、同様に継代を行う。顕微鏡観察で、2日間の培養で培養シャーレ底面の 70%以上に細胞が安定して増殖するようになったことにより細胞に異常がないことを確認する。継代は 20 代程度までを使用の目安とする。継代中の細胞がある場合、工事停電等によりインキュベーターの運転が止まってしまう恐れがある際は、予備電源等を用意して、可能な限り培養環境を一定に保つように留意する。
3.3

試験使用細胞の保存3.2 の記載方法に従って細胞懸濁液を調製後、細胞懸濁液を遠心チューブに移して低速(〜1000rpm)
で 2〜5 分間遠心する。培地を除去した後、細胞ペレットに細胞凍結用保存液を加え、ピペッティング
によって穏やかに懸濁させる。懸濁液の濃度は目安として 2×106〜1×107 cells/mL とする。細胞凍結保存用チューブに 0.5〜1mL/細胞凍結保存用チューブの割合で細胞保存懸濁液を分注し、-80℃のディー
プフリーザーにて凍結させる(-20〜-30℃のフリーザーで凍結後、ディープフリーザーに移しても良い)。
ディープフリーザーにて凍結後、適宜、細胞凍結保存用チューブを液体窒素保存容器に移して保管する。
４．測定操作4.1

細胞の 96 ウェルプレートへの播種

3.2 の記載方法に従って細胞を剥離し、10%血清培地(Bsd 不含)により細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液の一部を血球計算盤に採取し、位相差顕微鏡で細胞数を計測する。細胞の数え方は血球計算盤の使84

用方法に従う。
細胞懸濁液を 10%血清培地(Bsd 不含)で適宜希釈し、10,000〜20,000(通常 15,000)cells/100μL 濃度に調製する。希釈細胞懸濁液をリザーバーに注ぎ、マルチチャンネルピペッター(8ch 電動)等で 96 ウェルプレートに 100μL/well の割合で分注する。この間、細胞懸濁液がなるべく均一になるよう、混合・攪拌に努める。細胞を播種した 96 ウェルプレートをインキュベーターに入れ、培養する。
4.2

曝露

前処理の後、DMSO 溶液とした試料は、適宜、DMSO により希釈する。TEQ 濃度が全く未知の試料の場合、1 例として、
原液、10 倍希釈液、100 倍希釈液、及び 1000 倍希釈液の 4 水準濃度の測定を行う(表 3-3-1)。
必要に応じて更に希釈を行う。希釈にはガラス容器(ガラスバイアル)を用いる。
表 3-3-1 試料の希釈例

1倍
10 倍

希釈元(μL)DMSO(μL)

原液

0

原液

10

90

100 倍

10 倍希釈液 10

901000 倍

100 倍希釈液 1090試料のほかに、必ず検量線作成のための標準溶液を用意する。1 例として、0(DMSO)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、50 及び 100pg/μL 濃度の 2,3,7,8-TeCDD の DMSO 溶液を調製する。希釈元には市販の 2,3,7,8-TeCDD の DMSO 溶液が利用できる。
上述各調製 DMSO 溶液を 10%血清培地(Bsd 不含)に添加する。例として、あらかじめ 37℃の恒温槽で温めた 10%血清培地(Bsd 不含)をリザーバーに注ぎ、96 ウェルディープウェルプレートにマルチチャンネ
ルピペッター(8ch 電動)を用いて 990μL/well 分注する。これに上で調製した試料の DMSO 溶液を10μL/well 添加する。一連(例えば、96 ウェルプレートの 1 枚分)の試料添加が終了したら、マルチチャ
ンネルピペッター(8ch 電動)で試料添加済み培地を、吸引、吐出の繰り返しにより混合した後、4.1 で播種し 1 日(約 24 時間)培養した 96 ウェルプレートに 100μL/well の割合で添加する(DMSO 溶液ベースでは 1μL/well：DMSO の終濃度は 0.5%体積分率)。96 ウェルプレート上での試料の配置例を図 3-3-7 示す。
通常 4 ウェルの平均値をとることとし、4 ウェルずつに試料を添加する。試料の添加後、96 ウェルプレ
ートをインキュベーターに戻し、培養を続ける。
4.3

ルシフェラーゼ活性の測定

以下に、培地を除去後、細胞を溶解してから発光基質を添加する方法(ノン・ホモジニアスアッセイ)
について記す。試料添加の 20〜24 時間後に、96 ウェルプレートから培地を吸引除去する。続いて、PBS(-)(非滅菌)をマルチチャンネルピペッター(8ch 電動)で 80〜100μL/well 添加し、96 ウェルプレー
トを緩やかに傾け(回して)ウェル内を洗浄する(細胞が剥がれないように注意)。PBS(-)を吸引除去し、再び PBS(-)を 80〜100μL/well の割合で添加する。同様にウェル内を洗浄後、PBS(-)を吸引除去する。
別途作製した細胞溶解液(通常 5 倍濃度のものを超純水で 5 倍希釈する)を 15μL/well 添加する。96 ウェ
ルプレートを傾けてウェル底面全体に溶解剤が行き渡るようにする。時々、96 ウェルプレートを傾けながら、室温で 30 分間細胞を溶解する。
細胞が溶解していることを確認後(細胞の溶解後の組織片の目視、

85

あるいは顕微鏡観察)、96 ウェルプレートをラップで包み、冷凍庫に保管する。96 ウェルプレートが複数の場合は前の 96 ウェルプレートの細胞溶解中に培地の除去・洗浄等の作業を行ってよい。
凍結保存した 96 ウェルプレートを取り出し、室温で融解する。融解後は 96 ウェルプレートを傾けて底面全体に液を行き渡らせ、また、ミキサーで攪拌する。室温においてから約 15 分後に 96 ウェルフォ
ーマットのルミノメーターに 96 ウェルプレートをセットする。ルミノメーターのパラメーターは機器
付属マニュアルを参照して設定する。表計算ソフト等により、測定結果のデータ処理を行う。
1

2

A

DMSO

B

DMSO

C

DMSO

D

DMSO

E
F
G
H
1

A

DMSO

B

DMSO

C

DMSO

D

DMSO

E
F
G
H

3

4

5

6

7

8

9

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

0.1

0.2

0.4

0.6

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

0.1

0.2

0.4

0.5

0.8

1

2

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

3

4

5

10

20

50

100

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

pg/μl

2
操作BL
（n1）
x1000
操作BL
（n2）
x1000
操作BL
（n3）
x1000
操作BL
（n4）
x1000
操作BL
（n1）
x10
操作BL
（n2）
x10
操作BL
（n3）
x10
操作BL
（n4）
x10

3
試料a
（n1）
x1000
試料a
（n2）
x1000
試料a
（n3）
x1000
試料a
（n4）
x1000
試料a
（n1）
x10
試料a
（n2）
x10
試料a
（n3）
x10
試料a
（n4）
x10

4
試料b
（n1）
x1000
試料b
（n2）
x1000
試料b
（n3）
x1000
試料b
（n4）
x1000
試料b
（n1）
x10
試料b
（n2）
x10
試料b
（n3）
x10
試料b
（n4）
x10

5
試料c
（n1）
x1000
試料c
（n2）
x1000
試料c
（n3）
x1000
試料c
（n4）
x1000
試料c
（n1）
x10
試料c
（n2）
x10
試料c
（n3）
x10
試料c
（n4）
x10

6
試料d
（n1）
x1000
試料d
（n2）
x1000
試料d
（n3）
x1000
試料d
（n4）
x1000
試料d
（n1）
x10
試料d
（n2）
x10
試料d
（n3）
x10
試料d
（n4）
x10

7
操作BL
（n1）
x100
操作BL
（n2）
x100
操作BL
（n3）
x100
操作BL
（n4）
x100
操作BL
（n1）
x1
操作BL
（n2）
x1
操作BL
（n3）
x1
操作BL
（n4）
x1

8
試料a
（n1）
x100
試料a
（n2）
x100
試料a
（n3）
x100
試料a
（n4）
x100
試料a
（n1）
x1
試料a
（n2）
x1
試料a
（n3）
x1
試料a
（n4）
x1

図 3-3-7

9
試料b
（n1）
x100
試料b
（n2）
x100
試料b
（n3）
x100
試料b
（n4）
x100
試料b
（n1）
x1
試料b
（n2）
x1
試料b
（n3）
x1
試料b
（n4）
x1

10

11

12

10
試料c
（n1）
x100
試料c
（n2）
x100
試料c
（n3）
x100
試料c
（n4）
x100
試料c
（n1）
x1
試料c
（n2）
x1
試料c
（n3）
x1
試料c
（n4）
x1

11
試料d
（n1）
x100
試料d
（n2）
x100
試料d
（n3）
x100
試料d
（n4）
x100
試料d
（n1）
x1
試料d
（n2）
x1
試料d
（n3）
x1
試料d
（n4）
x1

12

96 ウェルプレート上での試料の配置例(上段：検量線プレートの例、下段：試料測定プレートの例)

86

100
pg/μl
100
pg/μl
100
pg/μl
100
pg/μl

５．定量
5.1

検量線の作成濃度既知の標準溶液を 5 濃度水準以上測定し、最小二乗法により回帰させた式を使用する。以下に
2,3,7,8-TeCDD 標準溶液を用い 14 濃度水準で測定して検量線を求める例を記載する。
測定した RLU に関し、4 ウェルの平均値及び標準偏差(si)を求める。
2,3,7,8-TeCDD の各濃度に対応する平均 RLU から、DMSO コントロール(0)の平均 RLU を差し引いて、
総 RLU を求める。0 濃度を除き、各 s i−2を求め、その総和∑s−2iを算出する。

i

次に各 RLU の重み wi = s i

−2

∑ (s

−2
i

n)

を求める。

i

ロジスティック曲線の一般式

y=α+δ ・・・(式Ⅰ) を基にし、
1 +β* e -γx

表計算ソフトで変数α、β、γ及びδパラメーターのセルを設定する(図 3-3-8)。
図 3-3-7 の y の予測値の欄に式Ⅰを入力する。ただし、濃度 X は常用対数 log(x)を用いる。次に試料の RLU y と y の予測値の差の平方(残差平方)を求める(式を入力)。次いで、各残差平方に対応する重み
wi を乗じた重み付き残差平方を求める(式を入力)。この重み付き残差平方和が最小となるように変数 α、β、γ 及び δ を算出する。

ｙ = α/(1+β*EXP（-γ*LOG(x)))+δ
α
β
γ
δ
ｘ
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
2
3
4
5
10
20
50
100

946789.21
15.662918
3.1685912-801.9887

重み付きxのｙの予測値 残差平方 残差平方*重み 予測値
18531733.8
1.43E+04
1.43E+05
0.10
7848
5752.1
4.39E+06
1.88E+05
0.25
14501
16024.3
2.32E+06
6.40E+06
0.37
31478
28210.0
1.07E+07
9.39E+06
0.65
42904
41668.8
1.53E+06
1.99E+05
0.82
61160
56018.1
2.64E+07
3.85E+05
1.1134792 133794.7
9.95E+05
1.39E+04
2.0
201875 211775.0
9.80E+07
2.73E+06
2.9257310 283967.8
7.11E+08
3.22E+06
3.6350956 348555.2
5.76E+06
4.27E+05
5.0579009 569956.5
8.19E+07
1.92E+05
10724430 754322.7
8.94E+08
3.59E+05
17889940 882453.6
5.60E+07
3.49E+04
55
918315 920457.2
4.59E+06
1.31E+04
94
ｙ

残差平方和

1.89E+09

2.37E+07 ←最小二乗法計算ｾﾙ

図 3-3-8 表計算ソフトを用いたロジスティック曲線近似式による予測の例
5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

検量線の作成例を図 3-3-9 に示す。

87

定量操作が適切に行われているかどうかを確認するため、測定担当者は、検量線作成用標準液の測定操作により得られたデータから、測定量（毒性等量）を求め、管理図に記録し保存する。作成した検量線の 50%RLU を求め、検量線からその強度における EC50 値（pg-TEQ/μL）を読み取り管理図にプロットする。一例を図 3-3-10 に示す。管理図による処置基準は、管理限界（μ±2σ）からの逸脱状況に応じて下記の通りとする。
1.2 106

1 106

RLU

8 105

6 105

4 105

2 105

0

0.1

1
10
2,3,7,8-TeCDD(pg/μl)100

図 3-3-9 検量線の例
1 点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うとともに、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。また、管理限界内であっても基準値に対して、一定の傾向で外れていくような状態又は偏った測定量が続くような状態においては、原因の究明を行い、必要に応じ、改善を行うとともに、再測定する。
15

μ+2σ

10
EC50

μ

μ-2σ

5

0
0

5

10

15

20

25

測定回数(回)図 3-3-10 管理図例

88

30

35

40

5.3

測定試料の定量

通常、試料の RLU から、並行処理している操作ブランクの RLU を差し引いた総 RLU を求める。この総RLU を 5.1 で求めた近似式に代入し、実測濃度を算出する。また、希釈試料の複数の水準が定量範囲に収まった場合、それぞれの希釈水準から求められた濃度を平均して実測濃度とする。
求めた濃度 X（ng/mL）から以下の式によって試料量あたりの実測濃度を求める。

X = 10濃度 X の求め方：

1 ⎛⎛ α ⎞ ⎞− ln ⎜⎜ ⎜⎜-1 ⎟ β⎟γ ⎝ ⎝ y -δ ⎟⎠ ⎟⎠1) 排出ガス

Cs = X × n × v ×
ここに、Cs

VE 1
×
VE′ V

： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N)

X： 希釈試料中実測濃度(ng/mL）n： 希釈倍率v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)V： 試料ガスの採取量(m3N)(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正が必要な場合には、次式によって所定の酸素濃度に換算する。

C=

21 − On
21 − Os

× Cs

ここに、C ： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)

On ： 換算する酸素の濃度(%)
Os ： 排出ガス中の酸素の濃度(注 2)(%)
Cs ： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 2) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

2) ばいじん及び燃え殻

Cw = X × n × v ×
ここに、Cw

VE 1
×
VE′ W

： ばいじん及び燃え殻中の実測濃度(ng/g)

X： 希釈試料中実測濃度(ng/mL)n： 希釈倍率v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)89

W： ばいじん及び燃え殻試料の採取量(g)６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認

検出下限等算出用検量線の測定操作により得られた測定値の定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限、20%以下となる上下 2 点間を定量範囲とする。
この標準物質における検出下限及び定量範囲は、少なくとも 6 ヶ月に 1 回確認する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若しくは測定担当者の変更等）にも、確認する。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例
2,3,7,8-TeCDD の DMSO 標準溶液を用い、0(DMSO)、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10、20、30、50 及び 100pg/μL の DMSO 溶液を調製する。
2) 検出下限及び定量範囲の算出例
4.1〜5.1 に準じて測定を行い、17 濃度水準の検量線を作成する。ただし、各濃度水準におけるウェル数は 5 以上とする。個々の RLU について、検量線から毒性等量（pg-TEQ/μL）を求め、濃度水準ごとに測定量の変動係数を算出し、精度プロファイルを作成する。
変動係数(CV%)が 30%となる点を検出下限、20%となる上下 2 点間を定量範囲とする。濃度水準ごとに 6 ウェルで測定した例を図 3-3-11 に示す。
40

CV=30%

CV(%)

30

CV=20%

20

10

0
0.01

0.1

1
10
毒性等量(pg/μl)100

図 3-3-11 精度プロファイルの例
6.2

試料における検出下限及び定量下限

試料における検出下限及び定量下限は、試料量と前処理を経た最終検液量の数値と、標準物質における検出下限並びに定量下限から理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量
や最終検液量等により異なってくるため、試料ごとに求める。
７．測定量(毒性等量)への換算
図 3-3-12 に、生物検定法によって測定された濃度の HRGC/HRMS 法によって求めた濃度に対する相関図を示す。現時点で相関図より近似式を求めた結果、排出ガスの場合 y=0.375x、ばいじん及び燃え殻の場合 y=0.411x となっている。従って、生物検定法で求めた実測濃度(ng/m3N あるいは ng/g)を、排出ガ

90

スの場合、換算係数 0.375、ばいじん及び燃え殻の場合、換算係数 0.411 を乗じて測定量(毒性等量)を求める。なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。
８．換算係数の確認
少なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若し
くは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
得られた換算係数が、第６節の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求める。残りは、本法 4.1〜4.3 及び5.3 に従って操作し、生物検定法における測定量（毒性等量）を求める。
ばいじん及び燃え殻試料については、厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）ならびに本法 4.1〜4.3 及び 5.3
に従って操作し、それぞれの方法について測定量（毒性等量）を求める。
HRGC/HRMS 法により求めた毒性等量と生物検定法により求めた実測濃度の相関図を作成し、回帰直線の係数を換算係数とする。相関図の例を次節に示す。

91

第６節

参考資料

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
多数の排出ガス試料(この例では n=20、n=20 以上が望ましい)について本測定方法と HRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求め、HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)排出ガス試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-3-12 では Y/X の平均値である 0.375 を換算係数とした)。
「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
複数のばいじん及び燃え殻試料(この例では n=34、n=20 以上が望ましい)について本測定方法とHRGC/HRMS 法でそれぞれ実測濃度、毒性等量を求める。HRGC/HRMS 法による毒性等量を本測定方法による実測濃度で除したものの平均値を換算係数とする。
(例)ばいじん及び燃え殻試料の換算係数導出の方法
1) 本測定方法による実測濃度を X、HRGC/HRMS 法による毒性等量を Y とし、Y/X を求める。
2) 全試料について Y/X の値を求め、全試料の平均値を計算し、これを換算係数とする(図 3-3-12 では Y/X の平均値である 0.390 を換算係数とした)。

図 3-3-12 換算係数算出(例)(排出ガス、ばいじん及び燃え殻)

92

第４章

各論(ダイオキシン類を抗原とする抗原抗体反応を利用した方法)

前処理に、多層シリカゲルカラム及びカーボンカラムを使用し、測定に、抗ダイオキシン類モノクローナル抗体と、検量線作成用標準品及びプレート固相抗原を用いた抗原固相化-酵素免疫反応を利用してダイオキシン類の毒性等量を測定する方法(環境省平成 17 年告示第 92 号第 2)第1節

測定方法の概要

対象媒体ごとに試料を採取し、ダイオキシン類を抽出後、クリーンアップを行い、抗原固相化-酵素
免疫反応を用いた測定により定量する。測定方法のフローを図 4-1-1 に示す。

試料採取
抽出
クリーンアップ
抗原固相化-酵素免疫反応を用いた測定
標準物質(実測濃度)の定量
換算係数による測定量(毒性等量)への換算
測定値確定
図 4-1-1 測定方法のフロー
第2節

用語の定義

1) 抗ダイオキシン類抗体

免疫反応によって脊椎動物に産生される抗体(タンパク質)を、マウス由来の融合細胞(ハイブリドーマ)を用いて収得したもので、ダイオキシン類と特異的に反応する性質を有する。
2) 一次抗体溶液

抗ダイオキシン類抗体を緩衝液中に溶解させたもの

3) 二次抗体溶液

マウス由来の抗ダイオキシン類抗体と特異的に反応するヤギ由来の酵素標識されたポリクローナル抗体を緩衝液に溶解したもの
4) 一次免疫反応

抗ダイオキシン類抗体と抗原(ダイオキシン類)との反応

5) 二次免疫反応

固相プレート上の擬似抗原に結合した抗ダイオキシン類抗体と二次抗体との反応

6) B/B0%

測定対象の吸光度をブランク(濃度 0)の吸光度で除し 100 倍した数値

7) IC5050%の阻害がかかる濃度(50% Inhibition Concentration)8) 精度プロファイル 精度確認用の標準溶液濃度と変動係数(CV%)との関連図

93

第3節

試料採取方法に関する特記事項

１．試料ガスの採取量
試料ガスの採取量は、次のような手順によって決定する。採取時間については、その目的に応じて試料ガスの発生状況等を十分考慮して代表試料が採取できるようにしなければならない。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小の試料ガスの量を算出する。

⎛Q ⎞V = 0.0744 × ⎜ DL ⎟⎝ 1000 ⎠0.8351

×ν ×

VE
1
×
VE′ C DL

ここに、V ：測定に必要な最小の試料ガスの量(0℃、101.32kPa)(m3N)

QDL ：標準物質における検出下限(ng/mL, DMSO 溶液中)
（他の方法と単位が異なることに注意）

v ：測定用試料の液量(mL)
VE ：抽出液量(mL)VʼE ：抽出液分取量(mL)
CDL ：必要となる試料ガスにおける検出下限(0℃、101.32kPa)(ng-TEQ/m3N)
なお、QDL には、第 5 節「6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲の確認」に従い算出した検出下限(DMSO 溶液 1mL 相当量)を用いる。
「6.1 の 2) 検出下限及び定量範囲の算出例」における
表 4-1-7 に示した例では、排出ガス測定用キットの標準物質における検出下限は 0.01ng-TEQ/mLである。
4) 算出された最小の試料ガスの量以上を試料ガスの採取量とする。ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)5ng-TEQ/m3N レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料ガスにおける検出
下限は 0.17ng-TEQ/m3N)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合の試料ガス採取量を下記に示す。

⎛ 120 ⎞
V = 0.0744 × ⎜⎟⎝ 1000 ⎠0.8351

× 1×

20
1
×
＝0.15
10 0.17(原則として、4 時間 3m3N の試料ガス採取を標準とする。)
２．ばいじん及び燃え殻試料の採取量
ばいじん及び燃え殻試料の採取量は、次のような手順によって決定する。
1) 評価しなければならない最小の濃度を決定する。
2) 特に指定がない限り、1)で決定した濃度の 1/30 以下に試料ガスにおける検出下限を設定する。
3) 以下の式によって測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量を算出する。

94

⎛Q ⎞
W = 0.0038 × ⎜ DL ⎟⎝ 1000 ⎠ここに、W

0.9779

×ν ×

VE
1
×
VE′ C DL： 測定に必要な最小のばいじん及び燃え殻試料の量(g)QDL ： 標準物質における検出下限(ng/mL, DMSO 溶液中)
(他の方法と単位が異なることに注意)v： 測定用試料の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)
CDL ： 必要となるばいじん及び燃え殻試料における検出下限(ng-TEQ/g)
なお、QDL には、第 5 節「6.1 標準物質における検出下限及び定量範囲の確認」に従い算出した検出下限(DMSO 溶液 1mL 相当量)を用いる。
「6.1 の 2) 検出下限及び定量範囲の算出例」における
表 4-1-7 に示した例では、ばいじん及び燃え殻測定用キットの標準物質における検出下限は0.006ng-TEQ/mL である。
4) 算出された最小のばいじん及び燃え殻試料の量以上をばいじん及び燃え殻試料の採取量とする。
ただし、試料の代表性及び均一性を確保するように配慮しなければならない。
(例)3ng-TEQ/g レベルのダイオキシン類濃度を測定する場合(必要となる試料における検出下限は0.1ng-TEQ/g)
抽出液を 20mL に定容し、その抽出液から 10mL を分取してクリーンアップを行い、最終的に 1mLの DMSO 溶液に調製する場合のばいじん及び燃え殻試料の採取量を下記に示す。

⎛ 1500 ⎞W = 0.0038 × ⎜⎟⎝ 1000 ⎠0.9779× 1×20 1
× ＝0.12
10 0.195

第４節

試料の前処理１．試料の前処理の概要
採取した試料は、抽出を行う。抽出液は必要に応じて分取を行い、クリーンアップに移る。図 4-1-2に試料の前処理から測定までのフローの例を示す。

試料
抽出
抽出液
一部分取

（省略可能）

硫酸処理
多層シリカゲル／活性炭カラムクロマトグラフ操作
測定用試料
図 4-1-2 試料の前処理から測定までのフローの例
２．試薬
試料の前処理に用いる試薬は、次による。これらの試薬は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
1) 水

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等の品質のもの

2) アセトン JIS K8040 に規定するもの又は同等の品質のもの
3) トルエン JIS K8680 に規定するもの又は同等の品質のもの
4) ジクロロメタン

JIS K8117 に規定するもの又は同等の品質のもの

5) ヘキサン JIS K8825 に規定するもの又は同等の品質のもの
6) ジメチルスルホキシド(DMSO)
7) 硫酸ナトリウム
8) 硫酸

JIS K9702 に規定するもの又は同等の品質のもの(注 1)

JIS K8987 に規定するもの又は同等の品質のもの

JIS K8951 に規定するもの又は同等の品質のもの

9) 多層シリカゲルカラム
10) 活性炭カラム

JIS K0311 に規定されたシリカゲル類と同等の分離性能を有するもの

ダイオキシン類のクリーンアップ用として市販されているものの中で、本法に適用して良好な結果が得られることが確認されているもの(リバーシブルカーボンカラム又はそれと同等以上の性能を有するもの)
11) 円筒ろ紙

ソックスレー抽出に用いる。ガラス製又は石英製で、必要量の風乾した試料が入るサ

イズのもの。使用に先立ってアセトン洗浄し、さらにトルエン等でソックスレー抽出を行うか、又は 450℃以上で 4 時間以上加熱処理して用いるとよい
12) 窒素JIS K1107 に規定する高純度窒素 2 級(注 1) ジメチルスルホキシド(DMSO)の品質変動は、測定結果に影響を及ぼすことがあるためロットの変更時等には十分注意する。

96

３．器具及び装置
試料の前処理に用いる器具及び装置は、次による。これらの器具及び装置は、ブランク試験等によって測定に支障がないことを確認する。
3.1

ガラス器具

JIS R3503 及び JIS R3505 に規定するもの。コックの部分がふっ素樹脂製のものを用いてもよい
3.2

ソックスレー抽出器

JIS R3503 に規定するもの又はこれと同等の品質のもの。接続部にグリースを使用してはならない
3.3

濃縮器

クデルナ-ダニッシュ(KD)濃縮器又はロータリーエバポレータ。接続部にグリースを使用してはなら
ない
3.4

その他

吸引ポンプ、最高使用圧力が 0.25MPa の真空ポンプ、又は同等の性能を有するもの
４．前処理操作
4.1

試料量の記録

採取した試料は、試料量を記録する。
4.2

抽出1) 排出ガスJIS K0311 6.4 により、抽出を行う。ただし、内標準物質の添加は行わない。図 4-1-3 に排出ガス試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

97

樹脂

円筒ろ紙

吸収プローブ洗液

吸収液、洗液ろ過

残さ
HCl(2mol/l)処理

ろ液

試料 1g に対して 20mmol
以上の塩酸

ろ過

残さ

ろ液

風乾

ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液−液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水

濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液
図 4-1-3 排出ガス試料の抽出液調製フローの例

98：物又は試料2) ばいじん及び燃え殻
厚生省平成 4 年告示第 192 号別表第一(第一号関係)(2)により抽出を行う。ただし、内標準物質の添加の操作は行わない。図 4-1-4 にばいじん及び燃え殻試料の抽出液調製までのフローの例を示す。

試料

含水率測定

試料 1g に対して 20mmol
以上の塩酸

HCl(2mol/l)処理

ろ過

残さ

ろ液

風乾
ソックスレー抽出(ﾄﾙｴﾝ、16 時間以上)

液−液振とう抽出
ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ(3 回)

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ層

水層

脱水
濃縮

：検体又は試料：作業

抽出液：物又は試料

図 4-1-4 燃え殻・ばいじん試料の抽出液調製フローの例
4.3

クリーンアップ

1) 抽出液の分取
抽出液を濃縮し、溶媒を加えて通常 20mL に定容する。採取した試料の量及び試料中の予想されるダイオキシン類濃度から下式を用いて分取量を算出する。最終的に DMSO 溶液中のダイオキシン類濃度が 20〜1000pg-TEQ/mL の範囲内となるように分取量を決定する。

99

V ' E =C 1 ×v ×V E×

1
C 2 × x × 1000

ここに、VʼE ： 抽出液分取量(mL)
C1： キット測定用試料(DMSO 溶液)中のダイオキシン類濃度(20〜1000pg-TEQ/mL の範囲内が望ましい)v： キット測定用試料(DMSO 溶液)の液量(mL)

VE： 抽出液量(mL)

C2： 試料中の予想ダイオキシン類濃度(ng-TEQ/g 又は ng-TEQ/m3N)

X： 試料採取量(g 又は m3N)

(例)ダイオキシン類濃度が 1ng-TEQ/g と予想されるばいじん試料 5g を抽出し、20mL の抽出液を得て、約 250pg-TEQ/mL のキット測定用試料を 1mL 調製する場合の抽出液分取量は、以下の通りとなる。

V ' E = 250 × 1 × 20 ×1
=1
1 × 5 × 1000

2) 精製カラムの作成
JIS K0311 に規定された方法に準拠して、多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムを作成する。
3) クリーンアップ
図 4-1-5 にクリーンアップのフローの例を示す。

抽出液：検体又は試料：作業

一部分取：省略できる作業

濃縮

硫酸処理
夾雑物の多い場合

多層シリカゲル／活性炭カラム
クロマトグラフ操作

濃縮

測定用試料
図 4-1-5 クリーンアップのフローの例

100(1) 硫酸処理
JIS K0311「6.4.4 硫酸処理/−シリカゲルカラムクロマトグラフ操作又は多層シリカゲルカラムク
ロマトグラフ操作」に準拠した方法。
(2) 多層シリカゲルカラムクロマトグラフ／活性炭カラムクロマトグラフ操作(注 2)a) 多層シリカゲルカラムと活性炭カラムを図 4-1-6 に示す通りに連結し、最初にトルエン 100mLで洗浄する。続いてヘキサン 100mL で洗浄する。なお、カラムの空気抜きには吸引ポンプを使用すること。
b) 溶媒リザーバーをはずし、コックを閉じてヘキサンを多層シリカゲルカラムの上面まで充填する。
c) 多層シリカゲルカラムの上面に試料を充填し、溶媒リザーバーにヘキサン 60mL を入れ、多層シリカゲルに再度セットする。
d) ヘキサンを滴下(2mL/min)する。
e) 多層シリカゲルカラムを取り外し、活性炭カラムを逆向きにして上端に溶媒リザーバーをセットする。
f) 溶媒リザーバーにトルエン 60mL を入れ、コックを開いてトルエンを自然滴下させ、得られた溶出液を 2mL 程度まで濃縮する。

(注 2) 多層シリカゲルカラム及び活性炭カラムのプレ洗浄の際に、トルエンがカラム内に残存していると試料中のダイオキシン類が流出し、回収率が著しく低下するため、ヘキサンで十分置換すること。

溶媒リザーバー
コネクター
多層シリカゲルカラム
コネクター
活性炭カラムコック
吸引ポンプへ錘

フラスコ

図 4-1-6 多層シリカゲルカラムと活性炭カラムの組み立て例

1014) DMSO への置換操作及び測定用試料の保存(1) 3)の操作により得られた濃縮液を窒素気流下で試験管壁をヘキサンで洗い込みながら乾固寸前まで濃縮する。ヘキサン等の疎水性有機溶媒が残っていると、測定操作の段階で検体溶液が白濁することがあるので注意すること。
(2) 濃縮後、試験管にすばやく DMSO 溶液 0.5mL を加え、攪拌する。
(3) (2)の DMSO 溶液をパスツールピペットでメスフラスコに移す。
(4) 少量の DMSO 溶液で試験管内を洗浄し、その洗液も先のメスフラスコに移す。最終的に DMSO 溶
液で一定量に定容する。(通常 1mL に定容する。試料中の予想ダイオキシン類濃度により定容量を変更しても良い。)(5) 定容した DMSO 溶液を所定の褐色バイアル瓶に移し、密栓後、室温で暗所に保存する。
第５節

測定

１．測定の概要
本方法は、ダイオキシン類の毒性等量(TEQ)と相関性が高い、五塩化及び六塩化ジベンゾフラン類と特異的に反応する抗ダイオキシン類抗体を用いた酵素免疫測定法を利用するものである。
2,4,5-トリクロロフェノールグリシルグリシン(TCP)により検量線を作成し、試料の吸光度から実測濃度を算出する。排出ガス、ばいじん及び燃え殻について定められた換算係数を実測濃度に乗じることにより測定量(毒性等量)を算出する。
２．使用キット、試薬、器具及び装置
2.1

使用キット

酵素免疫測定法キット(抗ダイオキシン類モノクローナル抗体には、マウス由来の融合細胞（ハイブ
リドーマ）から収得した五塩化ジベンゾフラン類を特異的に認識する抗体を、検量線作成用標準品及びプレート固相抗原には、2,4,5-トリクロロフェノール及びグリシルグリシン又は牛血清アルブミン（BSA）から合成した化合物を使用する)(注 3)(注 3) 排出ガス測定用キットとばいじん及び燃え殻測定用キットがあり、用途に応じて使い分けること。キットの内容物の例を以下に示す。なお、1)〜4)までの試薬は発送時に室温保存用箱に収納されており、5)〜12)までの試薬及びパーツは冷蔵保存用箱に収納されている。

1) 2,4,5 トリクロロフェノール-グリシルグリシン(TCP)濃縮標準溶液 1mL2) 試料希釈用 DMSO
3) 反応停止液

10mL

15mL

4) 10 倍濃縮洗浄液

50mL5) 抗原固相マイクロプレート
6) 一次免疫反応用緩衝液
7) 一次抗体溶液

1枚

10mL

15mL

8) 二次抗体濃縮溶液

0.15mL

9) 二次抗体希釈用緩衝液

15mL

102

10) 発色基質液

15mL11) プレート密閉用シール

1枚12）取り扱い説明書
2.2

試薬

測定に用いる試薬は、次による。
1) 水
2.3

JIS K0557 に規定する A4(又は A3)の水又は同等の品質のもの

器具及び装置測定に用いる器具及び装置は、次による。
1) 吸光マイクロプレートリーダー 分光光度計、測定波長 450 nm、温度制御機能は不要
2) プレートウォッシャー
3) 試験管ミキサー
4) 冷蔵庫5) マイクロピペット 10〜100μL
6) マイクロピペット

100〜1000μL

7) マイクロピペット

1〜10mL8) マルチチャンネルピペット

8 チャンネル 30〜300μL

9) マルチチャンネルピペット

12 チャンネル 30〜300μL (8 チャンネルで代用可)

10) 分注用電子ピペット

マイクロピペットで代用可

11) ピペットチップ
12) ピペッティングリザーバー
13) マイクロチューブ

1.5mL14) マイクロチューブ用ラック
15) キャップ付マイクロチューブ
16) 遠沈管

マルチチャンネルピペットに対応したもの
1.5mL 程度の容量

15mL 容量より大きいもの

17) ストップウォッチ
18) 金属トレー

氷でも代用可、一次免疫反応時のプレート分注操作で使用

19) ペーパータオル
３．キットの取り扱い
以下の取り扱い上の注意点を遵守すること。
1) 冷蔵保存用箱に収納されている試薬及びパーツは、冷蔵庫(2〜8℃)にて保管すること。ただし、プレート密閉用シール及び取り扱い説明書は室温にて保管しても差し支えない。
2) 室温保存用箱(別便にて提供)にて送付する TCP 濃縮標準溶液は必ず常温(15〜25℃)で保管すること。
3) キットの有効期間は、未開封の状態で製造より 1 年間。キットを分割使用する場合は、未使用の試薬類及びプレートを適切な保存条件で保管し、開封後 1 ヶ月以内に使い切ること。なお、プレートの残りは専用の収納袋に戻し、袋内の空気を極力抜いた状態でしっかりとチャックを閉じておくこと。
4) キットの内容物である「試料希釈用 DMSO」が凍っている場合があるが、品質に影響しない。ただ

103

し、使用前に常温で解凍すること。
5) キットを保管する場合は、保存場所、保存方法、汚染の配慮、温度及び湿度の情報を記録し、保存すること。
４．測定操作4.1

抗体溶液の調製

1) 一次抗体溶液の調製調製不要。
2) 二次抗体溶液の調製
二次抗体濃縮液を二次抗体希釈用緩衝液で 150 倍に希釈して使用する。二次抗体溶液は、二次抗体の安定性確保の観点から、二次免疫反応を行うまでの 2 時間以内に調製することが望ましい。
分割使用の場合は、二次抗体濃縮液を必要に応じて量り取り調製すること（開封後 1 ヶ月以内に使い切ること）。また、希釈調製した二次抗体溶液は使用するまで冷蔵保管すること。
4.2

標準溶液の調製

以下の操作はキャップ付マイクロチューブを用いて行う。
試料希釈用 DMSO を用いて「TCP 標準溶液(1mg/mL)」を 5 倍に希釈し、200μg/mL 標準溶液を調製する(例：
TCP 標準液 0.2mL に希釈用 DMSO を 0.8mL 加え混和する)。その後、希釈調製した TCP 溶液(200μg/mL)を試料希釈用 DMSO で 4 倍ずつ希釈し、50、12.5、3.13、0.78、0.20、0.05μg/mL 濃度になるようにそれぞれ調製する(例：TCP 標準溶液 0.2mL に希釈用 DMSO 0.6mL を加え混和する)。最終的に、200μg/mL から 7段の希釈系列を調製する。
マイクロチューブを 8 本用意し、希釈調製した各 TCP 標準溶液を、濃度系列に従って 80μL ずつマイ
クロチューブに移す。TCP 濃度が 0.05μg/mL の次のマイクロチューブには試料希釈用 DMSO 80μL を入れる。
4.3

試料希釈系列の調製

DMSO に転溶した試料から、希釈用 DMSO を用いて 4〜8 水準の 2 倍希釈系列を調製する。
(例：8 水準の希釈系列で n=2 で測定する場合)
1) マイクロチューブ 8 本を用意し、1 本目のチューブに原液 80μL を加え、残り 7 本の各チューブに希釈用 DMSO 80μL を加える。
2) 更に 2 本目のチューブに原液 80μL を加え、攪拌後にその混合液 80μL を分取して 3 本目のチュー
ブに加えて攪拌する。同様の操作を 8 本目のチューブまで行う。
3) 8 本目のチューブ(残量 160μL)から 80μL を抜き取り、廃棄する。
4.4

混合溶液の調製

マイクロチューブに調製した(a)TCP 標準溶液及び試料に、(b)一次免疫反応用緩衝液及び(c)一次抗体
溶液を 1：1：2 の割合で添加する(表 4-1-1)。試薬を添加する順番は(a)→(b)→(c)とする。試薬を添加後、すばやくマイクロチューブを試験管ミキサー等で攪拌混合する。混合後、4℃で 10 分間静置する。

104

表 4-1-1 混合溶液の調製
試薬

4.5

添加量

添加順

(a) 標準溶液及び試料

80μL(b) 一次免疫反応用緩衝液

80μL(c) 一次抗体溶液

160μL

↓

一次免疫反応4℃で 10 分間静置後、抗原固相マイクロプレートに混合溶液を 100μL/well ずつ分注する。分注操作は冷却した金属プレート上(又は氷上)で行うこと。分注後、軽く抗原固相マイクロプレートを振とうし、
密閉シールで抗原固相マイクロプレートを密閉して 4℃(注 4)で 60 分間静置する。
n＝2 で測定する場合の、各混合溶液のマイクロプレートへの分注(配置)例を図 4-1-7 に示す。
標準物質

試料１

試料２

試料３

試料４

試料５

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

DMSO

DMSO

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-1

1-1

2-1

2-1

3-1

3-1

4-1

4-1

5-1

5-1

B

STD7

STD7

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-2

1-2

2-2

2-2

3-2

3-2

4-2

4-2

5-2

5-2

C

STD6

STD6

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-3

1-3

2-3

2-3

3-3

3-3

4-3

4-3

5-3

5-3

D

STD5

STD5

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-4

1-4

2-4

2-4

3-4

3-4

4-4

4-4

5-4

5-4

E

STD4

STD4

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-5

1-5

2-5

2-5

3-5

3-5

4-5

4-5

5-5

5-5

F

STD3

STD3

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-6

1-6

2-6

2-6

3-6

3-6

4-6

4-6

5-6

5-6

G

STD2

STD2

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-7

1-7

2-7

2-7

3-7

3-7

4-7

4-7

5-7

5-7

H

STD1

STD1

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

試料

1-8

1-8

2-8

2-8

3-8

3-8

4-8

4-8

5-8

5-8

図 4-1-7

96 ウェルマイクロプレート上での試料の配置例

一次反応終了後、プレートウォッシャーで反応液を除去し、各ウェルを洗浄液 300μL で 4 回洗浄する。
洗浄後、ペーパータオル上で抗原固相マイクロプレートをタッピング(軽く叩く)し、洗浄液を完全に除去する。

(注 4) 反応温度が高くなる(8℃以上)と感度が低下する場合がある。

105

4.6

二次免疫反応

洗浄した抗原固相マイクロプレートに希釈調製した二次抗体溶液を 100μL/well ずつ分注する。分注
後、プレート密閉シールで抗原固相マイクロプレートを密閉し、室温(25℃前後)で 60 分間反応させる。
二次免疫反応終了後、各ウェルを洗浄液 300μL で 6 回洗浄する。洗浄後、タッピング(軽く叩く)で洗浄液を完全に除去する。なお、マイクロプレートの洗浄には、プレートウォッシャーを使用すること。
4.7

発色反応

洗浄した抗原固相マイクロプレートに発色基質液を 100μL 添加し、室温(25℃前後)で 30 分間反応させる(要遮光)。試料数が多いときは、各試料の発色反応時間が一定になるようにすばやく分注操作を行うことが望ましい。発色反応後、反応停止液を各ウェルに 100μL 添加し、反応を停止させる。
4.8

吸光度測定

抗原固相マイクロプレート外側の底面に付着した汚れや水分を、柔らかなペーパータオル等できれいに拭き取った後、波長 450nm における吸光度を吸光マイクロプレートリーダーで測定する(注 5)。

(注 5) 吸光度測定は反応停止後、速やかに行うこと(5 分以内が望ましい)。

4.9

測定操作時の留意事項

1) 一次免疫反応、二次免疫反応、発色反応の反応時間及び反応温度は所定の条件で必ず行うこと。
2) 一次抗体溶液をマイクロチューブに分注した後は、速やかに混合攪拌すること。
3) マイクロチューブから抗原固相マイクロプレートへの分注操作は素早く行い、室温で長時間(5 分以上)放置することがないように注意すること。
4) 抗原固相マイクロプレートの洗浄後は、次の試薬を分注する前に、残液が極力少なくなるように
タッピング(軽く叩く)を行い、残液を除去すること。
5) 発色反応の際に異常発色が認められる場合は、二次抗体による非特異反応が考えられる。抗原固相マイクロプレートの洗浄条件を再検討し、ウェル内の二次抗体が十分除去できる洗浄条件に設定すること。
6) 反応停止液を分注した後は、5 分以内に吸光度を測定することが望ましい。
５．定量
5.1

検量線の作成標準物質(TCP)の濃度に対して吸光度をプロットし、検量線を作成する。
1) 標準物質
2,4,5 トリクロロフェノール-グリシルグリシン (略称 TCP 標準物質)2) 標準溶液の調製
表 4-1-2 に検量線作成用標準液の調製例を示す。まず、TCP 濃縮標準溶液を試料希釈用 DMSO で 5 倍に希釈して STD1 を調製する。次に、STD1 から一定量を分取して試料希釈用 DMSO で 4 倍に希釈してSTD2 を調製する。同様の操作で順次 4 倍希釈操作を行えば、表 4-1-2 に示す濃度の STD1〜STD7 を調製することができる。なお、TCP 標準物質を含まない試料希釈用 DMSO のみをブランクとする。

106

表 4-1-2 検量線作成用標準溶液の調製例
単位

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

STD6

STD7

ブランク

ng/well

5000

1250

313

78.1

19.5

4.88

1.22

0

ng/mL

200000

50000

12500

3125

781

195

48.8

0

3) 検量線の作成
各濃度に調製した TCP 標準溶液のキット測定を行い、吸光マイクロプレートリーダーにより波長450nm における吸光度を測定する。TCP 標準溶液の吸光度測定は、必ず試料測定と同一の抗原固相マ
イクロプレートで同時に行うこと。TCP 標準物質設定濃度及び吸光度から、下記に示す 4-パラメータ
ーの式の各係数(A〜D)を算出(吸光マイクロプレートリーダーコントロールソフトを用いても良い)する。

y=( A−D ) ＋D

⎛x⎞1＋⎜ ⎟ B⎝C ⎠ここに、x ： 実測濃度(ng/mL)

y ： 吸光度A ： 0 濃度の吸光度
B ： 曲線部分の傾き
C ： IC50 (50%阻害濃度)(ng/mL)
D ： 最小吸光度各係数

ng/mL

B/B0

吸光度

%

ブランク

0

2.405

100

STD7

48.8

2.279

94.7

STD6

195

2.043

84.9

STD5

781

1.597

66.4

STD4

3125

0.913

38.0

STD3

12500

0.358

14.9

STD2

50000

0.126

5.2

STD1

200000

0.096

4.0

100

80

B/B０（％）

TCP 標準物質濃度

4-パラメーター式の各係数A

0 濃度の吸光度2.389B

曲線部分の傾き0.8643C

50%阻害濃度

1669

D

最小吸光度

0.02887

60

40

20

0
10

100

1000

10000

100000 1000000

ＴＣＰ標準品濃度（ng/ml ）図 4-1-8 検量線作成及びパラメーターの例

107

5.2

検量線の確認及び感度変動の管理図による確認

検量線作成用標準溶液の測定操作により得られたデータから測定量(毒性等量)を求め、管理図に記録し保存する。以下に、ばいじん及び燃え殻の例を示す。
1) 検量線における IC50(B/B0 で 50%)付近の吸光度から、4-パラメーターの式を用いて標準物質濃度を算出する。表 4-1-3 の例では、STD3 における測定値の B/B0 がおよそ 50%(47〜48%)に相当する。
2) 標 準 物 質 濃 度 に 希 釈 倍 率 ( 例 で は 16) を 乗 じ た 数 値 を 換 算 式 に 代 入 し 、 測 定 量 ( 毒 性 等量)(ng-TEQ/mL)を算出する。（表 4-1-3 参照）
3) 得られた測定量(毒性等量)(ng-TEQ/mL)を平均(例：(0.58+0.64)/2=0.61)し、管理図に記録し保存する。
4) IC50 付近における測定量(毒性等量)の工程平均(μ)と標準偏差(σ)を算出し、μ±2σ を管理限界とする。変動係数(CV%)は 20%以内に収まることが望ましい。使用キットごとの管理限界等の数値
例を表 4-1-4 に示す。
5) １点でも管理限界を超えた場合は、原因の究明と改善を行うと共に、再測定する。改善のために講じた措置及び再測定の結果について、記録をする。
表 4-1-3 管理図用データ導出例(ばいじん及び燃え殻)
n=1

TCP 標準物

n＝2

質濃度

測定値

B/B0

標準物質濃

TEQ

測定値

B/B0

標準物質濃

TEQ

ng/mL

(吸光度)

%

度

ng-TEQ/mL

(吸光度)

%

度

ng-TEQ/mL

ng/mL

ng/mL

ブランク

2.177

100

2.134

100

STD7

2.106

96.7

2.034

95.3

STD6

2.057

94.5

1.995

93.5

STD5

1.972

90.6

1.893

88.7

STD4

1.631

74.9

1.567

73.4

STD3

1.055

48.5

1.006

47.1

STD2

0.376

17.3

0.334

15.7

STD1

0.135

6.2

0.148

6.9

→

10758

→ 0.58→11895→ 0.64

表 4-1-4 管理図用データ算出例
使用キット

排出ガス用

ばいじん及び燃え殻用

工程平均

μ

6.16

0.639

測定値の標準偏差

σ0.67730.0530測定値の変動係数

C.V.

11.0%

8.29%

管理限界

μ±２σ

4.81〜7.51

0.533〜0.745

作成した管理図の例を、図 4-1-9 に示す。

108

IC50近傍毒性等量（ng-TEQ/ml）

0.80
0.75

μ+2σ

0.70
0.65

μ

0.60
0.55

μ-2σ
0.50
0.45
0

5

10

15
20
測定回数（回）

25

30

35

図 4-1-9 管理図の例(ばいじん及び燃え殻)
5.3

測定試料の定量

各試料の吸光度を検量線に内挿し、阻害率(B/B0) 20〜80%の範囲でかつ希釈直線性が認められる範囲の濃度に各希釈倍率を掛けた値の平均値（濃度の平均値）を用いて、次式により実測濃度(排出ガスにおいては ng/m3N、ばいじん及び燃え殻においては ng/g)を算出する。

CS = X ×

VE v
×
V E′ V

ここに、CS ： 実測濃度（ng/m3N 又は ng/g）

X： 濃度の平均値(ng/mL)

VE ： 抽出液量 (mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量（m3N 又は g)(備考) 排出ガスの酸素濃度による補正が必要な場合には、次式によって所定の酸素濃度に換算する。

C=

21 − On
21 − Os

ここに、C

× Cs

： 酸素の濃度 On における実測濃度(ng/m3N)

On： 換算する酸素の濃度(%)

Os： 排出ガス中の酸素の濃度(注 6)(%)

Cs： 排出ガス中の実測濃度(ng/m3N）(注 6) 排出ガス中の酸素の濃度が 20%を超える場合は、Os=20 とする。

109

６．検出下限及び定量範囲6.1

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認

標準物質における検出下限及び定量範囲の確認は、定量値の変動係数(CV%)が 30%以下となる点を検出下限とし、20%以下となる上下 2 点間を定量範囲とする方法で行う。下記に、排出ガス測定用キットを用いて n=5 で測定した例を示す。
1) 検出下限等算出用標準溶液の調製例(1) TCP 濃縮標準溶液を試料希釈用 DMSO で 8 倍に希釈し、STD1 を調製する。
(2) STD1 から一定量を分取し、試料希釈用 DMSO で 4 倍に希釈して STD2 を調製する。
(3) 以下、同様の手順で順次 4 倍希釈液(STD3〜STD6)を調製し、検出下限等算出用標準溶液としてTCP 標準物質の 6 段希釈系列を調製する(表 4-1-5 参照)。
表 4-1-5 検出下限等算出用標準溶液
単位

STD1

STD2

STD3

STD4

STD5

STD6

ng/mL

125000

31250

7813

1953

488

122

2) 検出下限及び定量範囲の算出例(1) 調製した検出下限等算出用標準溶液を４．測定操作に従って測定する。n=5 の 6 段希釈系列で測定する場合のマイクロプレートへの分注操作の一例を図 4-1-10 に示す。
(2) 吸光度（測定値）を測定して、4-パラメーターの式の各係数(A〜D)を算出(吸光マイクロプレー
トリーダーコントロールソフトを用いても良い)し、吸光度から検出下限等算出用標準溶液相当
量(定量値)を算出する。
(3) 検出下限等算出用標準溶液相当量(定量値：ng/mL)を下式に代入し、測定値(毒性等量)に変換する。

⎛ 定量値 ⎞
測定値(毒性等量 )(ng - TEQ/mL ) = 0.0744 × ⎜⎟⎝ 1000 ⎠0.8351(4) 各希釈濃度域における測定値(毒性等量)の平均値、標準偏差(σ)及び変動係数(CV%)を算出する。
(表 4-1-6 参照)。
(5) 横軸に検出下限等算出用標準液濃度、縦軸に変動係数をプロットした精度プロファイルを作成する(図 4-1-12 参照)。
(6) 精度プロファイルより、変動係数 30%の点を検出下限、20%となる上下 2 点間を定量範囲とする。

110

1

2

3

4

5

6

A

STD6.1

STD6.2

STD6.3

STD6.4

STD6.5B

STD5.1

STD5.2

STD5.3

STD5.4

STD5.5C

STD4.1

STD4.2

STD4.3

STD4.4STD4.5

D

STD3.1

STD3.2

STD3.3STD3.4

STD3.5E

STD2.1

STD2.2STD2.3

STD2.4

STD2.5F

STD1.1

STD1.2

STD1.3

STD1.4

STD1.5

7

8

9

10

11

12

G
H
図 4-1-10 96 ウェルマイクロプレート上での検出下限等算出用標準溶液の配置例
表 4-1-6 変動係数の算出例（排出ガス）
Std

測定結果（ng-TEQ/mL）

標準液濃度

σ

ＣＶ

ng-TEQ/mL

1

2

3

4

5

平均

（％）

Std.6

0.013

0.013

0.012

0.014

0.022

0.019

0.016

0.0042

26.1

Std.5

0.041

0.046

0.044

0.045

0.041

0.042

0.044

0.0020

4.5

Std.4

0.13

0.13

0.13

0.14

0.14

0.13

0.13

0.0051

3.9

Std.3

0.41

0.43

0.43

0.44

0.43

0.41

0.43

0.010

2.4

Std.2

1.3

1.3

1.2

1.5

1.4

1.3

1.3

0.11

7.9

Std.1

4.2

4.3

4.3

5.4

7.5

6.8

5.7

1.4

25.4

50
45
40

CV（％）

35

CV=30%

30
25

CV=20%

20
15
10
5
0
0.01

0.1
1
毒性等量（ng-TEQ/ml）

10

図 4-1-11 精度プロファイルの例(排出ガス)
上記方法により算出した排出ガス及びばいじん並びに燃え殻測定用キットにおける検出下限及び定量範囲を表 4-1-7 及び表 4-1-8 に示す。なお、本法により算出した検出下限及び定量範囲は、イムノア

111

ッセイに供する DMSO 溶液 1mL 中の毒性等量(ng-TEQ/mL)である。
最終的に 1mL に定容した試料(DMSO 溶液)から 80 μL を分取し、これに一次免疫反応用緩衝液 80μL 及び一次抗体溶液 160μL を加えて攪拌混合した溶液 100μL をウェルに分注するため、１ウェル当たりの試料分注量は 25μL となる。本操作は測定媒体に関わらず同じである。
表 4-1-7 標準物質における検出下限
検出下限
ng-TEQ/wellng-TEQ/mL

排出ガス測定用キット

0.000250.01

ばいじん及び燃え殻測定用キット

0.000150.006

表 4-1-8 標準物質における定量範囲
定量範囲

6.2

ng-TEQ/wellng-TEQ/mL

排出ガス測定用キット

0.00038〜0.075

0.015〜3.0

ばいじん及び燃え殻測定用キット

0.0002〜0.025

0.008〜1.0

試料における検出下限及び定量下限の確認

前処理に供した試料量と前処理を経た最終検液量等から、毒性等量における検出下限及び定量下限を用いて理論的に算出する。試料における検出下限及び定量下限は、試料採取量や最終検液量等により異なるため、表 4-1-9 及び表 4-1-10 に例を示す。
表 4-1-9 試料における検出下限
キット
測定媒体

検出下限

サンプル調製
分注量

ng-TEQ/well μL/well
排出ガス0.0002525

ガス量 酸素濃度 分取量/総抽出液量

検出下限0.00015

検出下限

分注量

25

分注量

0.00015

25

実測濃度

mL/mL

mL

−

ng-TEQ/m3N

4.0

12.0

10/20

1.0

1.0

0.005

試料量 分取量/総抽出液量

媒体中濃度

最終検液量 希釈倍数 実測濃度

ｇ

mL/mL

mL

−

ng-TEQ/g

10.0

10/20

1.0

1.0

0.0012

サンプル調製

ng-TEQ/well μL/well
燃え殻

検液量 倍数

％

キット
測定媒体

希釈

サンプル調製

ng-TEQ/well μL/well
ばいじん

最終

m 3N

キット
測定媒体

媒体中濃度

試料量 分取量/総抽出液量

媒体中濃度
最終検液量 希釈倍数 実測濃度

ｇ

mL/mL

mL

−

ng-TEQ/g

50.0

10/20

1.0

1.0

0.00024112

表 4-1-10 試料における定量範囲（注 7）
キット
測定媒体

サンプル調製

定量範囲値

分注量

ガス量 酸素濃度 分取量/総抽出液量

ng-TEQ/well μL/well
排出ガス0.00038〜

25

0.075

定量範囲値

分注量

0.0002〜

25

0.025

定量範囲値

mL/mL

mL

−

4.0

12.0

10/20

1.0

1.0

分注量

0.0002〜
0.025

25

実測濃度
ng-TEQ/m3N
0.0075〜
1.5
媒体中濃度

試料量

分取量/総抽出液量

最終検液量 希釈倍数 実測濃度

ｇ

mL/mL

mL

−

10.0

10/20

1.0

1.0

サンプル調製

ng-TEQ/well μL/well
燃え殻

検液量 倍数

％

キット
測定媒体

希釈

サンプル調製

ng-TEQ/well μL/well
ばいじん

最終

m3N

キット
測定媒体

媒体中濃度

ng-TEQ/g
0.0016〜
0.2
媒体中濃度

試料量

分取量/総抽出液量

最終検液量 希釈倍数 実測濃度

ｇ

mL/mL

mL

−

50.0

10/20

1.0

1.0

ng-TEQ/g
0.00032〜
0.04(注 7) 本例では、定量下限及び定量上限の両方を求めた。

７．測定量(毒性等量)への換算
測定量(毒性等量)は下記の換算式を用いて実測濃度から算出し、結果を記録する。また、使用した換算式も含め、測定量の算出に至った計算過程を説明できる資料を作成する。
1) 排出ガス
希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈系列希釈倍数(以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、排出ガス総抽出液当たり)への換算を行う。

⎛ Q ⎞測定量(毒性等量 )(ng - TEQ/m N ) = 0.0744 × ⎜⎟⎝ 1000 ⎠30.8351
×

v VE
×
VE′ V

ここに、Q ： 希釈系列希釈倍数に実測濃度を乗じたもの (ng/mL)

VE ： 抽出液量 (mL)VʼE ： 抽出液分取量(mL)v： 測定用試料の液量(mL)V： 試料採取量（m3N 又は g)2) ばいじん及び燃え殻

希釈系列 1mL 当たりの実測濃度(ng/mL)×希釈系列希釈倍数(以下「Q」と表記)から換算式を用いて測定量(毒性等量、ばいじん総抽出液当たり)への換算を行う。

113

⎛ Q ⎞⎟⎝ 1000 ⎠測定量(毒性等量 )(ng - TEQ/g ) = 0.0038 × ⎜0.9779
×

v VE
×
VE′ V

ここに、Q ：希釈系列希釈倍数に実測濃度を乗じたもの (ng/mL)

VE ：抽出液量 (mL)VʼE ：抽出液分取量(mL)v：測定用試料の液量(mL)

V：試料採取量（g)なお、測定結果の報告様式については、第２章第２節「測定結果の報告」を参照すること。
８．換算係数の確認

少なくとも 6 ヶ月に 1 回、HRGC/HRMS 法によって測定された試料について、本測定法による測定を行い、HRGC/HRMS 法により得られた測定量（毒性等量）と本測定法で得られた実測濃度より換算係数を算出し、換算係数と比較する。また、測定条件が大幅に変わった場合（機器、試薬又は施設等の変更若し
くは測定担当者の変更等）にも、確認を行う。得られた換算係数が、第６節記載の換算係数と大きく換算係数が乖離する場合又は相関が悪い場合には、原因の究明を行い、その結果及び講じた措置を記録する。
試料は、片方について HRGC/HRMS 法に定められた方法により前処理を行い、残りについては生物検定法に定められた方法により前処理を行って試料を調製する。
排出ガス試料については、JIS K0311 に従い抽出までを行った抽出試料（ただし、アッセイに影響を及ぼすサンプリングスパイク及び抽出工程でのクリーンアップスパイクの添加は行わない）を分割し、片方は JIS K0311 に定められた方法により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法 4.1〜4.3 及び 5.3
に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を算出する。
ばいじん及び燃え殻試料については、厚生省平成4年告示第192号別表第一(第一号関係)(2)に準拠した方法（ただし、同表ウ(イ)の内標準物質の添加の操作は行わない）により測定量（毒性等量）を求め、残りは、本法4.1〜4.3及び5.3に従って操作した生物検定法における実測濃度と比較して、換算係数を
算出する。

114

第６節

参考資料

「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(排出ガス試料)」
濃度既知の試料を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS 法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した。

排出ガス n=44
1000
y=0.0699(x/1000)0.8301
R2 = 0.9941

毒性等量 (ng-TEQ/m3N)

100
10
1
0.1
0.01
0.001
0.001

0.01
0.1
1
10
100
1000
HRGC/HRMS 実測濃度 (ng-TEQ/m3N)

図 4-1-12 換算係数算出(例)(排出ガス)「実測濃度から測定量(毒性等量)を求める際の換算係数の導出について(ばいじん及び燃え殻試料)」
濃度既知の試料を本測定方法により測定し得られた実測濃度(ng/mL)と、HRGC/HRMS 法により測定し得られた試料中の毒性等量(ng-TEQ/mL)の関係から測定量(毒性等量)への換算式を算出した。

ばいじん及び燃え殻 n=24100

毒性等量 (ng-TEQ/g)

y=0.0035(x/1000)0.974
R2 = 0.973
10

1

0.1

0.01
0.01

0.1
1
10
HRGC/HRMS 実測濃度 (ng-TEQ/g)100

図 4-1-13 換算係数算出(例)(ばいじん及び燃え殻)

115