（15）

第 37 回若手研究者のための健康科学研究助成成果報告書
2020 年度 pp.15〜21（2023.7）

脳−筋連関の観点からとらえた運動による認知症発症予防効果にかかわる分子メカニズムの同定
伊藤祐規＊，＊＊ 武田朱公＊，＊＊ 樂 木 宏 実＊＊＊森 下 竜 一＊

IDENTIFICATION OF MOLECULAR MECHANISMS INVOLVED IN
THE PREVENTIVE EFFECT OF EXERCISE ON THE ONSET OFDEMENTIA IN TERMS OF BRAIN-MUSCLE INTERACTIONS
Yuki Ito, Shuko Takeda, Hiromi Rakugi, and Ryuichi Morishita
Key words: dementia, brain-muscle interactions, microﬂuidic device, Alzheimer’s disease, tau.

緒

言が認知機能に及ぼす影響を司る主要な因子は現時点で不明なままである。近年、各組織由来の液性超高齢社会である本邦においては、高齢者人口因子を介して離れた臓器が相互調節を行う現象の増加に伴う認知症患者の増加が生じており、（臓器連関）が明らかとなり 5）、この観点からみ2040年には認知症患者数が800万人を超えると推ると運動により生じた筋組織の変化が液性因子を定されている。Livingston ら の報告では、認知介して、認知機能（神経機能）の調節を行う可能

症発症のリスク因子の約35〜40％は糖尿病などの性が考えられる。ヒトにおいても運動により神経生活習慣病を始めとする回避可能な要因であるこ保護因子である BDNF（brain-derived neurotrophicと、運動が認知症発症の抑制に効果的な介入手法

1）
factor）の血中濃度が増加することが報告されての 1 つであることが示されている。これは、運動おり、全身に存在する筋由来の液性因子が神経細や糖尿病など全身のエネルギー代謝に関与する因胞へ直接影響を及ぼす可能性が考えられる。

6）子が認知症発症に強く関与することを示唆してお認知症の約60％はアルツハイマー病（Alzheim-り、動物モデルでは運動によるエネルギー代謝のer’s disease; AD）が原因疾患であるが、AD の根変化が認知機能の低下を抑制することも報告され本的治療法は確立されていない 2）。AD 患者の脳ている7）。

内では過剰なリン酸化修飾を受けた病的なタウタ

一方で、運動はエネルギー代謝以外の因子（筋ンパクが蓄積した神経原線維変化という脳内病理活動や神経活動，血液循環，等）にも影響を及ぼ像がみられ、その蓄積量は神経変性や認知機能障すため、多面的な構成因子を含む運動という行為害の程度と相関する3）。以上から、運動のもつ認******

大阪大学大学院医学系研究科臨床遺伝子治療学

Department of Clinical Gene Therapy, Graduate School of Medicine, Osaka University, Osaka,
Japan.
大阪精神医療センターこころの科学リサーチセンター Osaka Psychiatric Research Center, Osaka Psychiatric Medical Center, Osaka, Japan.
大阪大学大学院医学系研究科老年・総合内科学
Department of Geriatric and General Medicine, Graduate School of Medicine, Osaka University,Osaka, Japan.

（16）知症発症予防効果の分子メカニズムとして、筋組PMT）によりフォトレジストに反映させた後、現織由来の液性因子が神経細胞および AD などの認像液を用いて余分なフォトレジストを取り除いた知症疾患の脳内病理の形成に影響を与える可能性（フォトマスクの作成）。
原液、およびシクロロペンタンで 2 倍希釈したが考えられる。
しかしながら、筋細胞由来の液性因子が神経細SU-8（SU-8 50, Kayaku Advanced Materials） を ガ胞および認知症疾患の脳内病理へ与える影響の分ラスウエハに塗布し、スピンコーター上で回転さ子メカニズムは未知である。その理由の 1 つとしせることで、SU-8を 2 種類の均一な厚さをもつて、互いに離れた位置にある神経細胞と筋細胞間層に成形した（厚い層：原液の SU-8を500 rpm でで生じる液性因子を介した相互調節を評価可能な3 秒間回転した後，1200 rpm で30秒間回転；薄系が存在しないことが挙げられる。培養細胞を用

い層： 2 倍希釈した SU-8を500 rpm で 3 秒間回転

いた既存の神経−筋共培養モデルは、神経細胞とした後，3500 rpm で30秒間回転）。その後、ホッ筋細胞が同一空間内に混在しているため各細胞由トプレート上で10分間加熱（65℃で 5 分間加熱し来の液性因子を独立して評価することが困難であた後に95℃で 5 分間加熱）し、硬化させた。
フォトマスクを薄い SU-8層の表面に重ねた状る。
そこで本研究では、マイクロ流路チップを用い態で、350〜400 nm の波長をもつ UV ランプを用た神経−筋共培養モデルを樹立することで、神経いて一定時間感光させた。ホットプレート上で 8細胞と筋細胞を互いに独立した区画で共培養する

分間加熱（65℃で 2 分間加熱した後に95℃で 6 分ことを可能とし、筋組織由来の液性因子が神経細間加熱）した後、現像液（SU-8 Developer, Y020100,胞へ与える影響を担う主要な液性因子を同定する

Kayaku Advanced Materials）を用いて余分な SU-8ことを目指した。また、神経細胞、特に AD 発症を 取 り 除 い た。 そ の 後、 フ ォ ト マ ス ク を 厚 いに関与するタウタンパクに着目し、同定した筋細SU-8層に重ねた状態で、薄い SU-8層の適切な位胞由来の液性因子が認知機能へ及ぼす影響を AD置に重ね合わせ、再度、感光・加熱・洗浄を実施

マウスモデルおよびヒト検体を用いた解析によっした。ガラスウエハ上に残った SU-8製のマイクて明らかにすることを試みた。

ロ流路の鋳型はホットプレート上で150℃、30分

方法

Ａ．マイクロ流路チップの作成

間加熱し、硬化させた（図 1 A）。
2 ．PDMS 製のマイクロ流路チップの作成
マイクロ流路チップは SU-8により作成した流微細かつ任意の形状に加工可能な polydimethyl-路の鋳型に対して、PDMS 液を流し込み固化するsiloxane（PDMS）製のマイクロ流路チップを用ことで作成した。SYLGARD 184 Silicone Elastomer

いて、神経細胞と筋細胞を別区画かつ培養液の連Kit（3097358-1004，ダウコーニング）の主剤の続性を保った状態で共培養することができる特殊A 液と、架橋剤である B 液を10： 1 で混合した後、培養チャンバーを作製する。

30 分 間 脱 気 を し た も の を PDMS 原 液 と し た。

1 ．SU-8製のマイクロ流路の鋳型作成

PDMS 原液は用時調整し、75℃で30分間加熱してSU-8は光照射により硬化するエポキシ樹脂で硬化させた（図 1 B）。

あり、照射部をマスクにより制限することで目的とする形状の鋳型を作成することが可能である。

3 ．スライドガラスへのマイクロ流路チップの貼り付け

鋳型の作成は SU-8が感光しない（500 nm 以下のPDMS 製マイクロ流路チップは、PDL コート波長をカットした）長波長の蛍光灯が設置された後のスライドガラスへ貼り付けて使用した。培養暗室にて実施した。エタノール洗浄後のガラス基

チャンバーの inlet および outlet 部分に穴を空け板に対してフォトレジスト（AZ 5206-E Photore-

た後、プラズマ照射処理したマイクロ流路チップ

sist, Hoechst Celanese）を塗布し、作図した任意のの流路側の面をスライドガラスの PDL コート処流 路 パ タ ー ン を LED 描 画 シ ス テ ム（PLS-1010,

理側の面と密着させ、ホットプレート上で105℃、

（17）

A

B

Glass
wafer

SU-8

SU-8(2-fold dilution)

PDMS

C

Inlet
Inlet

OutletOutletSlide glass

図 1 ．神経細胞­筋細胞共培養系に用いる特殊培養チャンバー作成の模式図
Fig.1．Schematics diagram of the procedure for the creation of microfluidic
device for culturing neuron and myoblast.
（A）The procedure for the creation of SU-8 mold for PDMS microﬂuidic chip.
SU-8 of diﬀerent concentrations（light yellow and dark yellow）
is placed on
the glass wafer（gray）to the desired shape.
（B）The procedure for the creation of PDMS microﬂuidic chip. PDMS（green）ispoured onto SU-8 to make microﬂuidic channels in the mold.
（C）Schematic of the microfluidic device for culturing neuron and myoblast.
The PDMS with microﬂuidic channels was mounted on slide glass（blue）
and punctured at the inlet and outlet.
PDMS; polydimethylsiloxane.

6 分間加熱することで特殊培養チャンバーを作成

GlutaMAX（35050061, Thermo Fisher Scientific）した（図 1 C）。チャンバー間の連結（マイクロを含む DMEM 培地（043-30085，富士フイルム和流路内の液体の移動）は、緑色および赤色の蛍光光純薬）を加え、濃度を1.2×106 cells/ml に調製色素を一方のチャンバーにアプライすることで生した。調整後の細胞懸濁液はマイクロ流路チップじる蛍光の変化を観察することで確認した。の inlet を介して培養チャンバー部分にピペットＢ．各チャンバーでの細胞培養方法の確立

マンを用いてアプライした。培地はピペットマン

マイクロ流路チップを用いた特殊培養チャンを用いてマイクロ流路チップの outlet から古い

バー内で細胞培養を行う際には、乾燥を防ぐ目的

DMEM 培地を回収し、その後、新たな DMEM 培

でマイクロ流路チップを10 cm dish 内に設置した。

地を inlet からアプライすることで交換（ 1 回／日）

また、マイクロ流路チップはセーフティーキャビした。培養細胞の増殖および形態学的変化はスラ

ネット内で紫外線を 1 時間照射することで滅菌しイドガラス側からの観察が可能な倒立型蛍光位相た後、各細胞の培養に用いた。

差顕微鏡（BZ-900, KEYENCE）を用いて評価した。

1 ．Tau-biosensor 細胞の培養

2 ．マウス初代運動神経細胞の培養

Tau-biosensor 細胞は HEK293細胞を基に作成さ市 販 の マ ウ ス 初 代 運 動 神 経 細 胞（Primary

れた病的タウの凝集体形成が評価可能な細胞であ

Mouse Cortical Neurons, A15585, Gibco） を、B-27

る 。Tau-biosensor 細胞は CFP および YFP がタ

Supplement（50X）、serum free（17504044, Gibco）

グ付けされたヒトタウタンパクを過剰発現しておと GlutaMAX を含む Neurobasa Medium（21103049,

り、蛍光顕微鏡下において細胞の形態および細胞Gibco）を用いて特殊培養チャンバー内に、1.0×内タウ凝集が観察可能である。10 cm dish で継代

106 cells/ml の濃度でアプライした。その後、37℃培養を行った Tau-biosensor 細胞を80％コンフルの CO2インキュベーター内で培養を行い、細胞のエントの時点でトリプシン処理により dish から形 態 学 的 変 化 は 倒 立 顕 微 鏡（Primovert photo,剥離・回収した後、10％ FBS（26140079, Gibco）+ZEISS）を用いて観察した。

1 ％ PC/SM（26253-84，ナカライテスク）+ 2 mM

3 ．マウス筋芽細胞の培養4）

（18）市販のマウス筋芽細胞（C2C12, CRL-1772, Gibco）能評価（open-ﬁeld test，概日リズム測定）と脳内を、10％ FBS を 含 む DMEM 培 地（30-2002,

タウ量の解析（WB, ELISA）を行う。これにより、

ATCC）を用いて特殊培養チャンバー内に、1.0×同定した液性因子が生体内でタウタンパクや認知10 cells/ml の濃度でアプライした。その後、37℃機能へ及ぼす影響を明らかにする。

6の CO2インキュベーター内で培養を行い、細胞の形態学的変化は倒立顕微鏡を用いて観察した。
Ｃ．神経細胞へ影響を与える筋細胞由来の液性因子の同定

Ｅ．同定した液性因子の血中・髄液中濃度と高齢者の認知機能との相関関係の解析研究への同意が得られた大阪大学医学部附属病院老年・総合内科に入院、およびもの忘れ外来に特殊培養チャンバーを用いた神経細胞と筋細胞

通 院 し て い る 高 齢 者 に 対 し て、 認 知 機 能 検 査の共培養系を用いて筋細胞側に電気刺激を加える（Mini-Mental State Examination; MMSE）と血液・ことで筋収縮を筋細胞に促し、培養液中に筋細胞脳脊髄液検体採取を実施した。同定した筋細胞由由来の液性因子を放出させる。静水圧を利用して来の液性因子の血中および脳脊髄液中濃度と、認一定期間、筋細胞由来の液性因子が神経細胞に一知機能検査結果や血中・脳脊髄液中の AD バイオ方向性に作用可能な状態とした後、細胞や細胞培マーカー濃度との相関関係を解析することで、同養液をチャンバーごとに独立して回収し、刺激に定した筋細胞由来の液性因子がヒトの認知機能やより変動した液性因子をプロテオーム解析またはAD の脳内病理へ与える影響の検証を行う。

抗体アレイを用いて網羅的に解析する。各細胞のＦ．倫理的配慮

形態学的変化は各細胞マーカーを用いた免疫染色

ヒトを対象とした研究は、大阪大学医学部附属により評価する。以上により、神経細胞に対して病院（承認番号：807-3）および大阪大学大学院

生化学的・形態学的な変化を引き起こす筋細胞由医学系研究科（承認番号：16478）の倫理審査委

来の液性因子群およびその主要な因子の同定を試

員会の承認のもと、全対象者に対して研究の内容みる。これらの実験の実施条件は現在検討中であと目的を十分に説明し、書面によるインフォームる。

ドコンセントを得たうえで実施した。また、すべＤ．同定した液性因子が細胞内タウタンパクやマウス脳へ与える影響の解析
同定した筋細胞由来の液性因子を病的タウの凝ての処置・測定はヘルシンキ宣言、および人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針を遵守して実施した。

集体形成が評価可能な Tau-biosensor 細胞に添加し、Ｇ．統計解析

病的タウの凝集体形成に与える影響を解析する。

ヒトを対象とした研究に関しては、被験者の年病的タウの凝集体数はハイコンテントイメージン

齢、および MMSE スコア、脳脊髄液中の AD バ

グ装置による画像処理を用いて実施する。また、イオマーカー値の群間差は Kruskal-Wallis test の病的なタウは過剰なリン酸化修飾を受けているこ

後に Steel-Dwass multiple comparison tests を用いてとが報告されているため、同定した筋細胞由来の検討した。各群における男女比は両側カイ二乗検

液性因子が細胞内のリン酸化タウ量へ及ぼす影響定を用いて比較した。統計解析には、Statcel 4 ソについては各リン酸化タウ抗体を用いた western

フトウェア（OMS 出版）を使用した。結果は平blotting により評価する。また、脳内にタウ病理均値±標準偏差（standard deviation; SD）で表し、を呈する AD マウスモデル（タウ Tg, PS19マウス）

P < 0.05を有意とした。

に対して同定した液性因子を投与することで、その薬効評価を行う。脳内のタウ病理が少ない若齢結果（ 3〜4 か月齢）時点で投与を開始し、 3 か月間程Ａ．マイクロ流路チップの作成

度の反復投与を行うことで習慣的な運動を模したマイクロ流路チップとして、外径は縦1.5 cm ×投与モデルを樹立する。脳内に病的なタウタンパ横1.0 cm の長方形、各細胞を培養するチャンバー

クが蓄積し始める月齢（ 6 〜 7 か月齢）で認知機部分は高さ94 µm、各チャンバー間をつなぐマイ（19）A
Inlet
OutletSlide glass

50 µm

50 µm

30 µm v

30 µm v

BGreenRed

Injection of redfluorescent dye

Length
600µm
Length
600µm

Width
7 µm

MergedThe flow of solvent

Inlet
OutletMicrofluidic
channel

Width
3 µm

図 2 ．神経細胞と筋芽細胞の培養用のマイクロ流路デバイスのイメージ図
Fig.2．Images of a microﬂuidic device for culturing neuron and myoblast.
（A）The images show the outside of a home-made microﬂuidic device（left）and
the pattern of microﬂuidic channels（right）.
（B）Fluorescent images of microﬂuidic channel show the distribution of red-ﬂuorescent dye in the upper compartment after green ﬂuorescent dye was applied
to both compartments.

クロ流路は、高さ2.4 µm、長さ600 µm、流路幅がなかった（データ非表示）。以上から、自作した

3 µm もしくは 7 µm、流路間隔が30 µm もしく

マイクロ流路チップのチャンバー内でマウス初代は50 µm の形状のチップを作製した（図 2 A）。ま運動神経細胞を培養する場合は、細胞濃度およびた、蛍光色素を用いた肉眼的な観察の結果、各チャ培地交換の条件を更に高濃度・高頻度へと変更すンバー間および各マイクロ流路間が互いに独立しる必要があることが示唆された。また、マウス筋ていること、色素をアプライしたチャンバーから芽細胞の細胞培養に関しては、96 well plate 内で反対側のチャンバー方向へ一方向的な水流が生じの培養条件の検討を現在実施中である。

ることが確認できた（図 2 B）。
Ｂ．各チャンバーでの細胞培養方法の確立

Ｃ．神経細胞へ影響を与える筋細胞由来の液性因子の同定

Tau-biosensor 細胞を用いたマイクロ流路チップ

前述の結果から、特殊培養チャンバーを用いたのチャンバー内での細胞培養に関しては、アプラ

マウス初代運動神経細胞とマウス筋芽細胞の共培

イ後の Tau-biosensor 細胞がスライドガラス上に養系を樹立するための細胞濃度、および培地交換接着し、その後チャンバー内で増殖する様子が観頻度の必要条件を確認することができた。今後こ察された。一方で同じ細胞濃度かつ同量の細胞懸れをマウス初代運動神経細胞とマウス筋芽細胞そ濁液をアプライした場合であっても、培地交換のれぞれにおいて最適化し、神経細胞へ影響を与え頻度を 2 日ごとに減少させた場合では、培養開始

る筋細胞由来の液性因子の同定を実施する予定でから 3 日目の時点で細胞の増殖が認められなかっある。

た（データ非表示）。以上から、マイクロ流路チップのチャンバー内という微小空間においても Tau-Ｄ．同定した液性因子が細胞内タウタンパクやマウス脳へ与える影響の解析

biosensor 細胞は生着・増殖が可能であること、おTau-biosensor 細胞を用いた病的タウの凝集体形

よびマイクロ流路チップのチャンバー内での細胞成評価のプロトコールは既に確立しており、解析培養においては培地交換の頻度が細胞の生存率へに必要な AD マウスモデルは既に必要数確保でき影響を及ぼすことが示唆された。ている。そのため今後は、神経細胞へ影響を与えマウス初代運動神経細胞の培養に関しては、る筋細胞由来の因子の絞り込みを上記の神経−筋0.25×10 cells/ml 以上の濃度において96 well plate

細胞共培養系を用いて実施した後に、同定した筋への細胞の接着、および軸索の伸長がみられた。

細胞由来の因子が細胞内タウタンパクや AD マウ

一方で、マイクロ流路チップのチャンバー内でのス脳へ及ぼす影響を検討予定である。

6細胞培養に関しては、1.0×10 cells/ml の濃度で6チャンバー内へアプライしたマウス初代運動神経Ｅ．同定した液性因子の血中・髄液中濃度と高齢者の認知機能との相関関係の解析細胞であっても、培養開始から 2 日目の時点にお2021年 4 月から2022年12月の間で、同意が得らいてスライドガラス上への細胞の接着が確認できれた高齢者118名の血液・脳脊髄液検体の採取と（20）表 1 ．参加者の特徴
Table 1．Participant characteristics.
Clinical diagnosis

P valueHCMCIDementia

776

35

74.1（8.5）

76.4（7.0）

79.6（7.6）

6（85.7）35（46.1）

8（22.2）< 0.0001

28.9（1.1）

23.7（4.4）a17.8（5.9）a,b< 0.0001

1212.9（370.9）

a717.1（301.5）

582.0（208.7）a< 0.0001

Phosphorylated tau, pg/ml, mean（SD）

49.3（23.7）

74.7（36.2）

76.2（41.4）

0.21

p-tau/Aβ42, mean（SD）

0.043（0.020）

0.125（0.090）

0.144（0.087）< 0.05No.
Age, years, mean（SD）
Sex, male, n（%）
MMSE

0.05

CSF biomarkers for AD diagnosis
Aβ42, pg/ml, mean（SD）

aa

Age was compared by the Tukey-Kramer test followed by ANOVA. MMSE and, CSF biomarkers for AD diagnosis were compared bythe Kruskal-Wallis test followed by Steel-Dwass multiple comparison tests. The sex ratio was analyzed using the Chi-square independence test. a P < 0.01 compared to control, b P < 0.01 compared to MCI. ANOVA; analysis of variance, CSF; cerebrospinal ﬂuid, AD; Alzheimer’s disease, HC; healthy controls, MCI; mild cognitive impairment, MMSE; Mini-Mental State Examination, SD; standard deviation.

認知機能検査を実施した。また、専門医による認や水分が確保できていないことを示唆していると知症の臨床診断、および脳脊髄液中の AD バイオ考えられる。そのため今後は、最適な培地の交換マーカー（Aβ42，リン酸化タウ）量の測定も全頻度の検討を中心としたマウス初代運動神経細胞被験者を対象に実施した（表 1 ）。その結果、軽の培養条件の検討を実施し、神経−筋細胞の共培度認知機能低下（mild cognitive impairment; MCI）

養系の樹立、および各培養チャンバー内の液性因の方、および認知症患者が全被験者の90％以上を子の解析を行う予定である。現時点で既に十分量占め、そのなかには、AD バイオマーカーが陽性のマウスおよびヒト検体が確保できているため、となる（AD の脳内病理の存在が強く疑われる）

上記の細胞系を樹立し、標的となる筋細胞由来の患者が含まれていることが確認できた。この結果液性因子を絞り込むことができれば、本研究課題から、各臨床診断区分間の筋由来の液性因子量のは飛躍的に進展すると考えられる。

比較や、認知機能や AD バイオマーカーと筋由来の液性因子量の関係の検討に必要な検体は既に十分量確保できていると考えられる。

考察

総括

特殊培養チャンバーを用いたマウス初代運動神経細胞とマウス筋芽細胞の共培養系を樹立するための細胞濃度、および培地の交換頻度の必要条件

本研究により、特殊培養チャンバーを用いたマが確認できた。今後は、最適な培地の交換頻度のウス初代運動神経細胞とマウス筋芽細胞の共培養検討を中心としたマウス初代運動神経細胞の培養系を樹立するための細胞濃度、および培地の交換条件の検討を実施し、マイクロ流路チップを用い頻度の必要条件を確認することができた。今後、た神経−筋共培養系の樹立、および各培養チャン微小空間におけるマウス初代運動神経細胞、およバー内の液性因子の解析を行う。

びマウス筋芽細胞における培養方法の最適化を行運動による認知症発症予防効果の分子生物学的うために、細胞濃度や培地交換頻度の追加検討がな根拠を得ることができれば、運動習慣や生活内必要であると考える。特にマウス初代運動神経細容の改善による健康寿命延伸を目指すための重要胞においては、同じ細胞濃度であっても96 wellな科学的裏付けとなる。

plate を用いた場合では細胞培養が可能であるが、マイクロ流路チップを用いた場合では細胞の生着謝辞本研究は、公益財団法人明治安田厚生事業団による第がみられなかった。この結果は、マイクロ流路チッ

37 回若手研究者のための健康科学研究助成のご支援によプを用いた培養では細胞の生存に十分な量の栄養り実施いたしました。本研究課題をご採択・ご支援いた（21）
だいた関係者の皆様に厚く御礼申し上げます。

参 考 文 献1）Erickson KI, et al.（2011）: Exercise training increases sizeof hippocampus and improves memory. Proc Natl Acad Sci
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