■第11回日本放射光学会奨励賞受賞報告
時分割 X 線回折法による紫膜の光反応過程の研究
岡俊彦(慶應義塾大学理工学部）

第 3 世代の放射光の登場により X 線強度が増加し，さらに CCD に代表される検出器などの測定装置の進歩もあり，時分割 X 線回折散乱測定を行いやすい環境が整ってきている。この手法では試料に大量の X 線を照射することになるため X 線によるダメージを十分注意する必要があるが，さまざまな試料の反応機構の解明において有効な手法となっている。
生体試料を対象にした時分割 X 線回折散乱測定において代表的な手法は次の 3 つがある。
◯

試料に連続的に X 線を照射し，反応中の回折散乱の変化を検出器で連続的に取り込む。

◯

反応開始後，遅延をおいて試料に X 線パルスを照射し回折散乱を測定する。

◯Fig. 1(a) Photocycle of bacteriorhodopsin. M intermediate isrevealed to have two structurally diŠerent states, M1 andM2. (b) Structure of bacteriorhodopsin from cytoplasmicside of membrane. A retinal is connected to Lys216 locatedin G helix.

X 線照射位置で試料の反応を（見かけ上）とめてしかしレチナールから 20 Å 程度離れた細胞膜表面への水回折散乱を測定する。
 は最も標準的な手法であるが，時間分解能は検出器の◯素イオン輸送を可能とするためには，7 本の a ヘリックス

データ取り込み時間に依存する。とくに 2 次元の CCD 検と呼ばれる棒状の構造単位からなる BR 自身が大きく構造出器を使用した場合，時間分解能はミリ秒から秒程度とな変化することが要求される（ Fig. 1b ）。この吸光度変化と の方法は時間分解能が反応開始トリガとってしまう。◯

構造変化とのかかわりを調べることが本研究の目的であX 線パルスの時間幅に依存する。このためトリガの時間る。試料は紫膜を高分子などの膜上に多数配向させたもの

幅が十分狭ければ，原理的には蓄積リングのシングルバンを用いた。これに X 線を照射することにより～ 7 Å 分解

チからの X 線での測定も可能である。しかし一回の反応能の粉末様回折が得られる。この分解能では蛋白質に含まで 1 イメージの回折散乱しか測定できないため，遅延をれる個々のアミノ酸の変化を識別することは難しいが，a変えながら測定を繰り返す必要がある。このため試料は繰

ヘリックスなど 2 次構造の変化を調べることができる。

り返し反応するものか，交換が容易で大量に準備できるも
 と◯ について（特に◯ に関して）八のになってしまう。◯
 は反応中の試料を移動させなが木による総説がある1)。◯

M 中間体から N 中間体での構造変化～ミリ秒分解能測定

ら測定する手法である。たとえばフローセルを用いた X

BR の光反応過程では M 中間体と N 中間体で始状態に線溶液散乱などがこれにあてはまるが2)，この場合時間分比べて大きな構造変化がおきることが分かっていた。しか解能は溶液の混合時間に依存する。

し光反応を止めた測定からは， M 中間体と N 中間体の間 と◯ の手法を用いて行った紫膜の時
本研究では上記の◯での大きな構造変化の有無について相反する実験結果が報

分割 X 線回折測定を行った。紫膜は高度好塩菌の細胞膜告されていた3,4) 。このため，我々はこの遷移過程での構上に存在し，バクテリオロドプシン（BR ）と呼ばれる膜造変化を調べるために，SPring-8 の BL45XU 小角散乱ス蛋白質の 2 次元結晶で構成されている。この BR は光を吸テーションにおいて紫膜のミリ秒分解能 X 線回折実験を収して水素イオンを細胞内から細胞外へ輸送し，高度好塩行った5)。試料条件を M 中間体から N 中間体への遷移が菌の細胞の内外に水素イオン勾配を作り出す。このため観測しやすい pH 9 ， 10 °C とした。波長 1.000 Å の X 線を

BR は一分子からなる最も単純な光エネルギー変換シス連続的に照射し，浜松ホトニクス製 6 インチ X 線イメーテムといえる。光を吸収して水素イオンを輸送する過程で，ジインテンシファイア付 CCD カメラ（ C4880 82 ）によBR は主に吸光度変化で識別される反応中間体，K, L, M,り時間分解能244ミリ秒で回折像を記録しながら，フラッN などを経て反応前の状態に戻る（ Fig. 1a ）。これらの中シュランプ照射し光反応を開始させ，反応過程での構造変間体は BR 内に存在するレチナールと呼ばれる光を吸収す化を測定した。

る色素の状態とその近傍の蛋白質の状態を反映している。

この結果，始状態の構造とともに， M 中間体， N 中間

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(C) 2007 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research放射光ニュース ■ 第11回日本放射光学会奨励賞受賞報告

体がヘリックスレベルで区別可能な構造を持つことが分か化を直接示す実験は行われていなかった。この遷移過程のった。また 2 次元投影差電子密度図より， M 中間体が主直接測定を，マイクロ秒時分割 X 線回折測定システムを要な速い成分のものは始状態に比べ G ヘリックスのみが用いて行った9)。紫膜試料は野生型 BR の紫膜（pH 7）で，大きく変化していたのに対し， N 中間体が主要と考えら

温度は 25 °C で測定した。この試料に対し YAG レーザーれる遅い成分のものは F，G ヘリックス近傍が大きく変化（532 nm）で反応を開始させ，遅延をおき幅 6 マイクロ秒していた。これは MN 遷移で F ヘリックスが大きく変化の X 線を照射した（ Fig. 2 ）。レーザー照射から X 線照射することによる。

までの遅延を 5 マイクロ秒から500 ミリ秒まで変えること

また変異型 BR の D96N では M 中間体に続いて，レチにより一連のデータとした。

ナールの状態が M 中間体で蛋白質全体の構造としては N

その結果 BR の光反応過程で X 線回折強度の変化が観中間体に近い MN 中間体を経る。この変異型を用いて，測された。特異値分解による解析から， X 線で観測されM 中間体から MN 中間体への遷移を 36 ミリ秒分解能で測た光反応過程には一つの中間体構造が存在することが分か定したところ，野生型 BR の M → N 遷移で観測された変った。この中間体構造は反応開始後 5 ミリ秒で蓄積比率化と同様の構造変化を観測した6)。これは N 中間体の生成が最大となった（ Fig. 3a ）。一方吸光度測定から求まる M過程で， N 中間体様の構造が先に生成した後，レチナー中間体の蓄積では，400 マイクロ秒に最大を持ち，5 ミリルが再び水素イオンを結合することを示唆している。

秒付近に肩を持つ（ Fig. 3b ）。この不一致は BR が M 中間

マイクロ秒分解能 X 線回折測定システム
検出器の分解能に依存しない時間領域での測定を行うた
めに，SPring-8 の BL40XU にマイクロ秒時分割 X 線回折測定システムを構築した7,8) 。回転式シャッタを用いて 6マイクロ秒の幅を持つ X 線パルスを作成し，開閉式シャッタで 1 パルスのみ取り出せるようにした。さらにレーザーと同期を取り，検出器に X 線イメージインテンシフ
ァイア付 CCD カメラを用いて光反応過程での X 線回折の変化を測定できるようにした。この結果，最高 6 マイク
ロ秒の時間分解能を持つシステムを構築できた。

M1 中間体から M2 中間体での構造変化～マイクロ秒分解能測定
M 中間体は，その生成過程ではレチナールの水素イオンを細胞外側に受け渡し，また崩壊過程では細胞質側から水素イオンを受け取るため，光反応の鍵となる中間体だと考えられている。先述した M 中間体で観測される構造変化は，分光測定との比較をもとに，M1 中間体から M2 中間体への過程で起こると一部で考えられていた。しかしM1 から M2 への遷移過程を観測した実験で大きな構造変Fig. 2Fig. 3(a) Time-course of intensity changes in X-ray diŠraction.
The time-course corresponds to amount of intermediate statethat has diŠerent structure from original state. (b) Timecourse of absorbance at 410 nm, which corresponds toamount of M intermediate.

(a) A photograph of experiment system. (b) A sequence of laser and X-ray. Delay is changed to record timedependent diŠraction change in photocycle.

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体で均一な構造を持っているのではなく，構造変化の量が少ない M と構造変化量が多い M が存在することを示して4)いる。つまり M 中間体の中で構造変化が起こっていることを示すものであり，M1 から M2 への遷移過程で大きな

5)構造変化が起こることを示唆する（ Fig. 1a ）。この実験により M1 M2 での構造転移をはじめて直接的に示すもの

6)となった。
7)

謝辞

8)

本研究は多くの方々との共同研究によるものです。心より感謝いたします。八木直人博士，井上勝晶博士（高輝度光科学研究センター）には，研究全般に渡って多大なご支

9)and M. Kataoka: Biochemistry 36, 12282
12287 (1997).
S. Subramaniam, M. Lindahl, P. Bullough, A. R. Faruqi, J.
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T. Oka, N. Yagi, F. Tokunaga and M. Kataoka: Biophys. J. 82,2616 (2002).
2610
岡 俊 彦 ， 井 上 勝 晶 ， 八 木 直 人  放 射 光 14, 384 388
(2001).
T. Oka, K. Inoue and N. Yagi: AIP Conf. Proc. 705, 1197
1200 (2004).
T. Oka, K. Inoue, M. Kataoka and N. Yagi: Biophys. J. 88, 436
442 (2005).

援を頂きました。片岡幹雄教授（奈良先端科学技術大学院大学）には紫膜の研究についてご指導いただきました。また野生型 BR を用いたミリ秒時分割実験については，藤澤哲郎博士（理化学研究所），徳永史生教授（大阪大学），上久保裕生博士（奈良先端科学技術大学院大学）と共同で行いました。また SPring-8 の方々の有形無形のご支援に深く感謝します。

参考文献
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3) H. Kamikubo, T. Oka, Y. Imamoto, F. Tokunaga, J. K. Lanyi1)
2)

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● 著者紹介 ●岡俊彦
慶應義塾大学理工学部物理学科助手
E-mail: oka＠phys.keio.ac.jp専門生物物理学， X 線小角回折散乱，蛋白質結晶構造解析［略歴］
2000 年大阪大学大学院理学研究科博士課程修了（博士（理学））， 1997 年日本学術振興会特別研究員（ DC1 ）， 2000 年
理化学研究所基礎科学特別研究員，
財 高輝度光科学研究所研究員を2001 年経て2003年より現職。