平成 29 年度

佐賀県工業技術センター研究報告書

6 次産業化を志向した県産農林資源からの機能性素材探索に関する研究－コゴミ（Matteuccia struthiopteris）に含まれる機能性成分の探索－
食品工業部
鶴田裕美 岩元彬 柘植圭介
佐賀県が中山間地域で栽培普及を行っているコゴミ（クサソテツの若芽）の高付加価値化を目的として，コゴミに含まれるキサンチンオキシダーゼ（XOD）阻害成分および抗酸化成分の探索を行った．本報では，高速溶媒抽出装置を用い，ヘキサン，エタノール，75%エタノール，50%エタノール，25%エタノール，水による連続抽出を行い，各抽出物の XOD 阻害活性および抗酸化活性を測定した．その結果，50%エタノール抽出物で最も高い XOD 阻害活性および抗酸化活性が認められ，コゴミが痛風や高尿酸血症の予防効果を有する機能性食品素材として有効利用できる可能性を見出した．また，機器分析の結果，これらの活性成分は，コゴミの既知成分であるクロロゲン酸と L-O-カフェオイルホモセリン以外の成分であることが認められた．

有効成分の有無について検討したので報告する。

１．はじめに近年、農林水産従事者の収入増加，生産物や加工品の高付加価値化を目的として，農林水産物の 6 次産業化が盛んに行われている．6 次産業化とは，農林漁業者（1 次産業）が，食品加工（2 次産業）と流通・販売（3次産業）にも取り組み，多角的な経営を行う状態を意

２．実験方法2.1 試薬類実験に使用する試薬類について，海砂（40～80 mesh）
はナカライテクス社（京都）製，Trolox は BIOMOL

味する 1）．6 次産業化の推進には、地域の特色を活かした食品のブランド化や食品の機能性を明らかにして農産物の価値を高めることが販売促進の一助となる．
山菜の一種であるコゴミは，クサソテツ（Matteucciastruthiopteris）の若芽で日本各地に生息しており，佐賀県では，農業試験研究センター三瀬分場を中心に中山

Research Labs. Inc.（USA）製，Fluorescein, sodium salt はSigma-Aldrich Inc.（USA）製，2-Morpholinoethanesulfonicacid（MES）は株式会社同仁化学研究所（熊本）製，XODはオリエンタル酵母工業株式会社（東京）
製（EC 1.17.3.2，Butter milk 由来），クロロゲン酸（純度 99%）は Acros
Organics Inc.（USA）製を用いた．その他の試薬は，富間地域での栽培普及活動を行っている（図 1）．
我々は，以前の研究で，コゴミの含水エタノール抽出物（バッチ式抽出法）がキサンチンオキシダーゼ（XOD）阻害活性や高い抗酸化活性を有することを報告し，高尿酸血症や痛風の予防に有効である可能性を示した 2）．今後，コゴミの栽培や販売促進を行うために機能性評価士フィルム和光純薬株式会社（大阪）製を用いた．

や機能性成分の探索が求められている．
本研究では，コゴミに含まれる XOD 阻害活性や抗酸化活性の有効成分を探索することを目的とした．また，コゴミの抗酸化活性については，既にポリフェノールの一種であるクロロゲン酸や L-O-カフェオイルホモセリンが有効成分として報告されている（図 2）3, 4）．
しかし，コゴミに含まれる他の機能性成分についてはほとんど明らかにされていない．
そこで，今回は，高速溶媒抽出装置（図 3）を用いた連続抽出法にてコゴミから抽出物を調製し，各抽出物のクロロゲン酸や L-O-カフェオイルホモセリン以外の－ 27 －図 1 コゴミ（Matteuccia struthiopteris）

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96 穴マイクロプレートに 10 μL の試料溶液を加え，10倍希釈したフォーリン・チオカルト試薬 75 μL を加えて攪拌し，室温で 5 分間静置した．さらに，2％炭酸ナトリウム溶液 75 μL を加え，攪拌し，室温で 15 分間静置後，750 nm の吸光度をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices，Spectra Max M5）を用いて測定した．標準物質に没食子酸を用いて検量線を作成し，試料のポリフェノール量を没食子酸当量として換算した．
2.4 クロロゲン酸の定量
試料は，抽出溶媒で 5 mg/mL に溶解後，0.2 μm メンブレンフィルターでろ過した．クロロゲン酸の定量は，超高速液体クロマトグラフ（Waters，ACQUITY UPLCH-Class）を用いて測定した．分析条件は，表 2 のとおりである．クロロゲン酸標準品を用いて検量線を作成し，定量した．
2.5 キサンチンオキシダーゼ（XOD）阻害活性の測定
XOD 阻害活性の測定は，Nguyen ら 6)の方法を一部改

図 2 クロロゲン酸および L-O-カフェオイル
ホモセリンの構造式変して行った．すなわち，96 穴マイクロプレートに，コントロール（1%DMSO）または試料溶液 50 L，75mM リン酸緩衝液（pH 7.5）35 L および XOD （0.01units/mL リン酸緩衝液溶解）30 L を加え，37ºC で 15分間予備加温した．450 M キサンチン溶液（リン酸緩衝液溶解）60 L を加え，37ºC で 60 分間反応させた後，1 M 塩酸 25 L を加えて反応を停止した．生成した尿酸量は，市販の測定キット：尿酸 C－テストワコーを用い，常法に従って測定した．XOD 阻害率は以下の計算式より算出した．
XOD 阻害率（%）＝100－(A÷B)×100
A：試料溶液の尿酸産生量
図 3 高速溶媒抽出装置
2.2 試料調製および抽出操作
コゴミは，凍結乾燥後，ハンマークラッシャー（メッシュ孔径 2 mm）で粉砕し，試料とした．抽出は，高速溶媒抽出装置（Thermo Fisher Scientific，Dionex ASE-350）

B：コントロールの尿酸産生量
また，アロプリノール（市販の痛風治療薬：XOD 阻害剤）を陽性対照，クロロゲン酸（標準品）を比較対照とを用いた．具体的には，コゴミ凍結乾燥粉末 3 g を精秤し，洗浄した海砂 25 g と混合後，抽出セル（66 mL）に充填した．1 つの抽出セルに対し，ヘキサン，エタノー
ル，75%エタノール，50%エタノール，25%エタノール，水の順に連続的に抽出を行った．高速溶媒抽出装置の抽出条件は表 1 に示したとおりである．捕集瓶に回収された抽出液を減圧濃縮乾固し，1%DMSO に溶解した試料を各種分析に供した．
2.3 総ポリフェノール量の測定
総ポリフェノール（TP，以下 TP と略す）量の測定はFolin-Ciocalteu 法 5)を一部改良して行った．すなわち，－ 28 －表 1 高速溶媒抽出装置による抽出条件
項目

条件

抽出溶媒

ヘキサン→エタノール→75%エタ
ノール→50%エタノール→25%エタノール→水

加熱温度

40℃

加熱時間

5分

静置時間

5分

サイクル数

3回

リンス量

100%

窒素パージ

120 秒

圧力

1,500 psi

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表 2 UPLC によるクロロゲン酸分析条件
項目
移動相 A
移動相 B
グラジエント

佐賀県工業技術センター研究報告書として表した．蛍光マイクロプレートリーダーにおける測定条件は表 3 のとおりである．
2.8 高速液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）による定性分析
試料は，抽出溶媒で 2 mg/mL に溶解後，0.2 μm メン

条件
0.1%ギ酸水溶液
0.1%ギ酸アセトニトリル溶液
（時間）

(A)

(B)

0.0 分

95%

5%

0.5 分

95%

5%

8.0 分

70%

30%

9.0 分

10%

90%

10.0 分10%90%

10.1 分

95%

5%

項目

条件

12.0 分

95%

5%

励起波長

485 nmブレンフィルターでろ過した．LC/MS（LC：Agilent 製
1100 series，MS：Brucker Daltnics 製 HCT-ultra）による各抽出物の定性分析の条件は表 4 のとおりである．
表 3 ORAC 測定条件

流量0.4 mL / 分

蛍光波長535 nm

カラム

Waters ACQUITY UPLC BEH C18

測定間隔2分

2.1×100 mm，1.7 µm

測定時間

90 分

カラム温度40℃

測定回数

46 回

検出波長320 nm

恒温器

37℃

試料注入量2 µL

表 4 LC/MS による定性分析条件
して同様に測定した．
2.6 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）ラジカル消去活性の測定
DPPH ラジカル消去活性を須田らの方法 7)を用いて測定し，抗酸化能の評価を行った．すなわち，96 穴マ
イクロプレートに 200 mM MES 緩衝液（pH 6.0）50 μL，適宜希釈した試料溶液 50 μL を加え，攪拌した．エタ
ノールに溶解した 200 μM DPPH 溶液を加え，室温で 20分間反応後，520 nm の吸光度をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices，Spectra Max M5）を用いて測定した．標準物質には，Trolox を用いて検量線を作成
し，DPPH の退色率から試料の抗酸化能を Trolox 当量として換算した．
2.7 親水性活性酸素吸収能(H-ORAC)の測定
H-ORAC は，国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構食品総合研究所の H-ORAC 分析法標準作業手順書 8)に従い，蛍光マイクロプレートリーダー（TECAN，Infinite 200 PRO）を用いて測定した．試料
溶液および標準物質の Trolox は，リン酸緩衝液で適宜希釈した．96 穴マイクロプレートにブランク（リン酸緩衝液），試料溶液，標準物質 35 μL を分注し，各ウェ
ルに 100.7 nM Fluoresein sodium salt 溶液 115 μL を加えた．
10 分間のプレインキュベーション後，31.7 mM 2,2’-azobis (2-amidinopropane) hydrochloride 50 μL を加え，撹拌後，蛍光強度を測定した．H-ORAC 値は，蛍光強度の減衰曲線下面積を算出し，検量線から Trolox 相当量－ 29 －項目LC 条件
移動相 A移動相 B
グラジエント条件
0.1%酢酸水溶液
0.1%酢酸アセトニトリル溶液
（時間）

(A)

(B)

0分

95%

5%

5分

95%

5%

40 分

70%

30%

45 分

10%

90%

49 分

10%

90%

50 分

95%

5%

60 分

95%

5%

流量

0.2 mL / 分

カラム

YMC Meteoric Core C18
2.1×150 mm，2.7 µm, 8 nm

カラム温度

40℃

検出波長

DAD 190-400 nm (320 nm)

試料注入量

5 µL

MS 条件
イオン化

ESI Negative

乾燥ガス

N2 , 10 L/min

イオン源温度

350℃

ネブライザー45 psig

キャピラリー電圧

4,000 V

スキャン範囲100～1,000 m/z

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３．結果および考察
3.1 高速溶媒抽出法による抽出物の収量
高速溶媒抽出法は，高温・高圧条件下で固体試料から成分を短時間で効率的に抽出する方法である．バッ
チ式抽出法に比べて，異なる溶媒による連続抽出も容サン抽出物で少なく，50%エタノール抽出物で最も高い値を示し，次に 75%エタノール抽出物が高かった．
しかし，抽出物の収量は，75%エタノールが大半を占めているため，ポリフェノールの抽出量自体は 75%エタノールが最も多いことが認められた．

易に行うことができるのが特徴である．コゴミ乾燥粉
末 3g をヘキサン→エタノール→75%エタノール→50%エタノール→25%エタノール→水で順次抽出した（図4）．抽出液の量は，ヘキサンから 50%エタノールまでは同程度であったが，25%エタノールおよび水ではセル内に残存する液量が多く，回収した液量が若干少な

3.3 コゴミ抽出物のクロロゲン酸含量
表 6 にコゴミ抽出物のクロロゲン酸を定量した結果を示す．その結果，既報どおりコゴミにクロロゲン酸が存在することが確認された。全ての抽出物でクロロゲン酸が検出されたが，その含量は，75%エタノール抽出物で最も高く，次にエタール抽出物で多かった．まかった．また，クロロフィルのような緑の色素成分は，ほとんどがエタノールで抽出された．表 5 に乾固した抽出物の収量， 収量比および供試量に対する回収率を示す．その結果，抽出物は 75%エタノールが最も多く，次いでエタノール，50%エタノールの順で多かった．全体として，供試量の 42.9%が抽出された．

た，抽出されたクロロゲン酸の総量を比較したところ，コゴミに含まれるクロロゲン酸全量の約 86%が 75%エタノール抽出物に存在していることが示された．
3.4 コゴミ抽出物の XOD 阻害活性
表 7 にコゴミ抽出物の XOD 阻害活性を測定した結果を示す．XOD は，プリン体代謝経路の最終 2 段階を250
総ポリフェノール量 PJJ*$(

3.2 コゴミ抽出物の TP 量
コゴミは、クロロゲン酸等のポリフェノール類の含有量が高いと報告されている．図 5 に抽出物あたりのTP 量を測定した結果を示す．その結果，TP 量は，ヘキ200150100500

図 4 高速溶媒抽出法によるコゴミの抽出液①ヘキサン，②エタノール，③75%エタノール，④50%エタノール，⑤25%エタノール，⑥水

図 5 コゴミ抽出物の総ポリフェノール量（GAE：没食子酸当量，平均±標準偏差，n=4）

表 6 コゴミ抽出物のクロロゲン酸含量

表 5 高速溶媒抽出法によるコゴミ抽出物の収量
収量
（g）

収量比
（%）

回収率
（%）

クロロゲン酸含量（%）

クロロゲン酸総量（mg）①ヘキサン

0.0493

3.8

1.6

①ヘキサン

0.03

0.01

②エタノール

0.264520.6

8.8②エタノール

1.72

4.54③75%エタノール

0.695254.0

23.2③75%エタノール

5.22

36.31

④50%エタノール

0.217916.9

7.3④50%エタノール

0.56

1.22

⑤25%エタノール

0.03722.9

1.2⑤25%エタノール

0.07

0.03

⑥水0.0231

1.80.8⑥水0.050.01

合計

1.2872100.042.9

合計―42.12

抽出溶媒

抽出溶媒

クロロゲン酸総量＝クロロゲン酸含量×抽出物収量－ 30 －

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表 8 コゴミ抽出物の抗酸化活性

触媒する酵素であり，ヒポキサンチン，キサンチンから尿酸を生成する．血中の尿酸が過剰になると痛風や腎障害を発症すると言われており，現在，これらの治療薬として XOD 阻害剤が処方されている．
コゴミ抽出物の XOD 阻害活性は，100 µg/mL の添加

酵素反応時
添加濃度

阻害率
（%）

①ヘキサン

100 µg/mL-38.2±1.2②エタノール

100 µg/mL

12.6±1.0③75%エタノール

100 µg/mL

20.7±1.5④50%エタノール

100 µg/mL

29.3±1.7⑤25%エタノール

100 µg/mL

26.5±1.0⑥水

100 µg/mL

7.0±3.0

0.2 µg/mL

56.6±1.5

10 µg/mL-5.2±0.0

抽出溶媒

アロプリノール（陽性対照）
クロロゲン酸（標準品）（µmol /g TE）①ヘキサン

31±1.1138±2.9②エタノール

431±5.91385±44.7③75%エタノール

1723±40.64254±122.6④50%エタノール

2064±32.03945±144.0⑤25%エタノール

1302±9.32355±62.7⑥水748±17.31306±39.83363±86.8

14276±208.6（標準品）（TE：Trolox 当量，平均±標準偏差，n=4）

表 9 コゴミ抽出物の抗酸化活性に対するクロロゲン酸の寄与率
DPPH 消去活性H-ORAC 値

寄与率（%）

寄与率（%）①ヘキサン

2.92.8②エタノール

13.4

17.7③75%エタノール

10.217.5④50%エタノール

0.92.0⑤25%エタノール

0.20.5⑥水0.20.6

抽出溶媒分が関与していることが示唆された．
3.5 コゴミ抽出物の抗酸化活性
表 8 にコゴミの抗酸化活性を測定した結果を示す．
その結果，DPPH ラジカル消去活性は，50%エタノール抽出物で最も高い活性を示し，TP 量と高い正の相関（相関係数 r=0.996）が認められた．H-ORAC 値につい表 7 コゴミ抽出物の XOD 阻害活性

H-ORAC 値（µmol /g TE）

クロロゲン酸活性を示した．また，コゴミに比較的多く含有しているクロロゲン酸の阻害活性についても標準品を用いて測定したが，添加濃度 10 µg/mL で阻害活性は認められなかった．抽出物のクロロゲン酸含量と XOD 阻害活性に相関が認められないことから（相関係数 r=0.290），コゴミの XOD 阻害活性には，クロロゲン酸以外の成ノール抽出物で高かったが，その寄与率は 10%程度でDPPH 消去活性抽出溶媒濃度で比較した．その結果，ヘキサン以外の抽出物で阻害活性が認められ，50%エタノール抽出物で最も高い阻害活性を示した．次に 25%エタノール抽出物で高い値を示し，ヘキサン抽出物は，逆に XOD 活性を増加する傾向が認められた．市販の XOD 阻害薬アロプリノール（陽性対照）は，0.2 µg/mL の低濃度で強い阻害ては，75%エタノール抽出物で最も高い活性を示した．
また，クロロゲン酸標準品の抗酸化活性を同様に測定し，各抽出物の抗酸化活性に対するクロロゲン酸の寄与率を調べた（表 9）．その結果，DPPH ラジカル消去活性は，エタノール抽出物が最もクロロゲン酸の寄与度が高く，次にクロロゲン酸を最も多く含む 75%エタ

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寄与率＝クロロゲン酸の活性×クロロゲン酸含量÷抽出物の活性あった．最も DPPH ラジカル消去活性が高かった 50%
エタノール抽出物では，クロロゲン酸の寄与率は 1%未満であり，他の成分が関与していることが強く示唆された．H-ORAC 値についても DPPH ラジカル消去活性と同様の傾向を示し，エタノール抽出物と 75%エタノール抽出物で寄与率が高かった．
3.6 コゴミ抽出物の LC/MS による定性分析
コゴミに含まれる抗酸化物質としては，クロロゲン酸の他に新規物質である L-O-カフェオイルホモセリンの存在が知られている．しかし，L-O-カフェオイルホモセリンは，標準品が市販されていないため，コゴミ抽出物を LC/MS で分析し， L-O-カフェオイルホモセリンを含有するか否か調べた．図 6 にコゴミ抽出物のマスクロマトグラム，図 7 に UV クロマトグラムを示す．その結果，3.3 で前述したとおり，全ての抽出物でクロロゲン酸のピークが確認された．
また，L-O-カフェオイルホモセリンの分子量（[M-H]-（平均±標準偏差，n=3）= 280 m/z）の MS クロマトグラムを抽出し，MS/MS ス
ペククトルを確認したところ，溶出時間 7.3 分のフラ－ 31 －

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図 6 コゴミ抽出物の LC/MS クロマトグラム（Base Peak Chromatogram）－ 32 －

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図 7 コゴミ抽出物の HPLC クロマトグラム（UV 320 nm）－ 33 －

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グメントのピークが既報の文献値と一致したため 3, 4），L-O-カフェオイルホモセリンであると同定された（図8）．L-O-カフェオイルホモセリンは，エタノール，75%エタノールおよび 50%エタノール抽出物で検出されたが，その他の抽出物では検出されなかった．75%エタノ

された．その他の成分については、今後、詳細な分析を行い，明らかにする予定である．
これまで，コゴミの機能性成分については，クロロゲン酸と L-O-カフェオイルホモセリン以外，ほとんど報告がなされていなかったが，本研究によりコゴミは，ール抽出物では，比較的高い強度で L-O-カフェオイル
ホモセリンが検出されたが，最も強い XOD 阻害活性を示した 50%エタノール抽出物では，マスのイオン強度および UV の強度が低く，L-O-カフェオイルホモセリンの含有量は多くないことが推察された．したがって，コゴミの XOD 阻害活性には，クロロゲン酸と同様高い XOD 阻害活性や抗酸化活性を有し，その他の機能性成分を含むことを見出した．今後，未同定の機能性成分を明らかにし，痛風や高尿酸血症の予防効果を有する機能性食品素材として有効活用していきたい．
なお，本研究を実施するにあたって使用した真空凍結乾燥機，マイクロプレートリーダー，高速溶媒抽出に L-O-カフェオイルホモセリンもほとんど関与していない可能性が示された．その他の成分については，今後，LC/MS による分析や分取後に NMR 等による構造解析を行い，明らかにする予定である．

装置，超高速液体クロマトグラフおよび高速液体クロマトグラフ質量分析装置は，電源立地地域対策交付金で導入した．

４．おわりに

参考文献
１）農林水産省 HP：http://www.maff.go.jp/j/shokusan/

本研究では，コゴミの付加価値向上を目的とし，コゴミに含まれる XOD 阻害成分や抗酸化成分の探索を行った．先の研究では、含水アルコールによるバッチ式抽出法で試験を行ったが，バッチ式抽出では広範囲の極性を有する成分が一斉に抽出されるため，その後の分析前に液－液分配やリクロマト等による分画操作

sanki/6jika.html
２）吉村臣史，鶴田裕美，柘植圭介：6 次産業化を志向した県産農林資源からの機能性素材探索に関する研究－コゴミにおける機能性素材としての可能性評価－：佐賀県工業技術センター研究報告書，25, 19-26 (2016)を必要とする場合が多い．今回は，高速溶媒抽出装置を用いた連続抽出による分析を試み，既知成分を多く含む抽出物と少ない抽出物を初めから分けて抽出することができ，機能性の評価や LC/MS による成分分析を効率的に行うことができた．
各抽出物の XOD 阻害活性と抗酸化活性を比較した

３ ） Kimura T, Suzuki M, Takenaka M, Yamagishi K,
ShinmotoH.
:L-O-Caffeoylhomoserine
from
Matteuccia struthiopteris. Phytochemistry. 65 (4), 423426 (2004)
４）木村俊之，鈴木 雅博，山岸 賢治，新本 洋士：国内特許第 3706906 号：カフェオイルホモセリン及ところ，クロロゲン酸や L-O-カフェオイルホモセリンをほとんど含んでいない抽出物で高い活性が認められ，これらの活性には他の成分が関与していることが示唆

びラジカル消去剤（2005.8.12）
５）Sun T, Tang J, Powers J. R.: Effect of pectolytic enzyme
preparations on the phenolic composition andantioxidant activity of asparagus juice. J. Agric. FoodChem., 53 (1), 42-48 (2005).
６）M.T.T. Nguyen, S. Awale, Y. Tezuka, Q.L. Tran, H.
Watanabe, and S. Kadota; Xanthine oxidase inhibitory
activity of Vietnamese medical plants, Biol. Pharm.
Bull., 27(9), 1414-1421 (2004.)
７）須田郁夫，食品機能研究法，光琳，218-220 (2000).
８）渡辺純，沖智之，竹林純，H-ORAC 分析法標準作
業手順書，国立研究開発法人農業・食品産業技術

図 8 [M-H]- = 280 m/z（溶出時間 7.3 分）の MS/MS
スペクトル－ 34 －総合研究機構食品総合研究所(2013).