［加藤：クロマトグラフィーによる医薬品分析の国際調和］［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS, 54（2），185〜191（2023）］▲

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報告書

令和 3 年度「日本薬局方の試験法等に関する研究」研究報告

クロマトグラフィーによる医薬品分析の国際調和＊2
加藤 くみ子＊1

International Harmonization of Drug Analysis Using Chromatography ＊2
Kumiko SAKAI-KATO ＊1

Summary
The harmonised general chapter Chromatography was signed-off by the Pharmacopoeial Discussion Group (PDG) in
September 2021. One of the main topics is the harmonization of terminology, definitions and interpretation ofchromatograms. In this study, some terms which had not been included in the version <2.01> were examined.
Key words
Chromatography, Harmonization, Terminology

1

れている．第十五改正（厚生労働省告示第 285 号平緒言

成 18 年 3 月 31 日）で現在の試験法番号に整備され，クロマトグラフィーは，固定相と移動相からな

試験法の名称も「○○クロマトグラフ法」から「○り，試料中の各成分を固定相や移動相への親和性の○クロマトグラフィー」に改められている．現第違いにより分離する方法である．日本薬局方へのク

十八改正日本薬局方では，クロマトグラフィー関連ロマトグラフィーの収載の変遷を Table 1 に示し試験法は，〈2.01〉液体クロマトグラフィー，〈2.02〉た．第七改正（厚生省告示第 76 号

昭和 36 年 4 月 1

ガスクロマトグラフィー，〈2.03〉薄層クロマトグラ日）で「33．ろ紙クロマトグラフ法」が新規収載さフ ィ ー，〈2.04〉 タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 分 析 法，れた．第八改正（厚生省告示第 73 号

〈2.05〉サイズ排除クロマトグラフィーと整理されて1 日）で

昭和 46 年 4 月「4．ガスクロマトグラフ法」及び「24．

薄層クロマトグラフ法」が新規収載された．第十改いる．
クロマトグラフィーの国際調和は 2009 年より日昭和 56 年 4 月 1 日）で 「3．

米欧三薬局方検討会議（PDG）において議論が進め液体クロマトグラフ法」が新規収載され，装置，操られ，2021 年 9 月に調和合意された．調和試験法

作法，内部標準法，絶対検量線法に関する内容が記は，〈2.00〉クロマトグラフィー総論として第十八改述された．液体クロマトグラフ法には，第十一改正

正日本薬局方第一追補（JP18‑1）に収載される予定（厚生省告示 58 号

昭和 61 年 3 月 28 日）で条件調整である．〈2.00〉には，現行の一般試験法〈2.01〉液に関しての文言が追加され，第十三改正（厚生省告体クロマトグラフィーには記載のない，新しい用語示 73 号が定義されている．また，現行の〈2.01〉に記載さ正（厚生省告示第 49 号

＊1
＊2

平成 8 年 3 月 13 日）で用語の解説が追記さ

北里大学薬学部 東京都港区白金 5‑9‑1（〒 108‑8641）
School of Pharmacy, Kitasato Universtiy, 5‑9‑1 Shirokane, Minato‑ku, Tokyo 108‑8641, Japan
本研究は一般財団法人医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団の令和 3 年度「日本薬局方の試験法等に関する研究」事業により行ったものである．

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185［加藤：クロマトグラフィーによる医薬品分析の国際調和］

Table 1
改正7日本薬局方へのクロマトグラフィーの収載

89101112131415

ろ紙クロマトグラフ
ガスクロマトグラフ

ガスクロマトグラフィー

薄層クロマトグラフ

薄層クロマトグラフィー

液体クロマトグラフ

液体クロマトグラフィー

れている用語と内容が一部異なる用語もある．本研①

グラジエント遅延容量（dwell volume）（ ）究では，これらの用語やその定義を調査・整理し，移動相の混合箇所からカラムの入り口までの容量国際調和試験法の理解に活かすことを目的とする．

で，〈2.00〉には，グラジエント遅延容量の測定方法が記載されている．現時点で日本薬局方の医薬品各〈2.00〉におけるクロマトグラフィー
2
関連用語の定義条にはグラジエント遅延容量の記載はないが，USPでは，例えば Entecavir の定量の移動相条件に記載がある注．

〈2.00〉では，JP18 の〈2.01〉に記載されている用装置によりグラジエント遅延容量が異なること

語を含む約 25 の用語が定義されることになる．各で，規定した分離能，保持時間及び保持比に影響す種クロマトグラフィーに共通の用語のほかに，サイる可能性がある．〈2.00〉「4．クロマトグラフィー条

ズ排除クロマトグラフィーや薄層クロマトグラ

件の調整」では，グラジエント条件でグラジエントフィーに特有の用語も定義されている．サイズ排除

遅延容量の違いに応じ，グラジエント勾配表に記載

クロマトグラフィーは欧州医薬品庁で既収載である

された時間の調整法が記載されている．

が，日本薬局方では未収載であった．そのため，②

ホールドアップタイム（ M）及びホールドアッ〈2.00〉に記載の用語を取り入れる形で，〈2.05〉サイプボリューム（ズ排除クロマトグラフィーが JP18 に新規収載されカラムに保持されない成分の溶出に必要な時間をた．また，〈2.03〉薄層クロマトグラフィーも〈2.00〉

ホールドアップタイム（ M）という．また，カラムに記載の用語を取り入れるとともに，試験内容もよに保持されない成分の溶出に必要な移動相の液量を1）り詳細に記載されて改正される予定である ．

），Mホールドアップボリューム（M）という．〈2.01〉では，移動相のカラム通過時間 0（ ＝ 0 の物質の注入

2.1 新たな用語

時からピーク頂点までの時間）と表記されていたパ〈2.00〉で新たに定義された主な用語は，グラジエラメーターになる．

ント遅延容量（ ），ホールドアップタイム（ M），③

ホールドアップボリューム（保持比（ ）），保持比（ ），ホー

ホールドアップタイムで補正した被検成分ピーク

ルドアップタイムでの補正なしの保持比（ G），相対と標準成分ピークの保持時間の比を保持比という．

M

保持時間（RRT），保持係数（ ，〈2.01〉では質量分布比），保持容量（），理論段高さ（ ），換算理論R段高さ（ ）である（Table 2）．
これらの概要を記す．
注

186

＝
Ri

−M−M

Ri

Rst

＝ 被検成分のピークの保持時間

Rst＝ 標準成分のピークの保持時間（通常試験されグラジエント溶離時間についてグラジエント遅延容量をおよそ 1.0mL として，HPLC システムが設定されている2）．

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Table ２2.00

クロマトグラフィー関連用語の比較

クロマトグラフィー総論

改正前の2.01 液体クロマトグラフィー

クロマトグラム
グラジエント遅延容量（ ）（Dとも呼ばれる）ホールドアップタイム（ M）
ホールドアップボリューム（）M

ピーク
ピークバレー比（ / ）理論段高さ（ ）ピークバレー比（ / ）（同義語 : 理論段相当高さ（HETP））

理論段数（ ）

理論段数（ ）

換算理論段高さ（ ）保持比（ ）
ホールドアップタイムでの補正なしの保持比（ G）又は相対保持時間（RRT）
分離度（S）

分離度（保持係数（ ））S

質量分布比（ ）保持時間（ R）保持容量（）

R分離係数（α）

分離係数（α）

SN 比（ / ）SN 比（ / ）シンメトリー係数（Sシステムの再現性）

シンメトリー係数（ ）（相対標準偏差（%RSD）で表される）

相対標準偏差 RSD（％）

る成分に対応するピーク）

distribution coefficient としても知られる）＝ ホールドアップタイム

M④

ホールドアップタイムでの補正なしの保持比

S（ G）

Ri

＝−M

R

M

Ri
Rst

R

＝ 保持時間＝ 被検成分のピークの保持時間

M＝ 標準成分のピークの保持時間（通常試験されから算出できる．

Rst＝ ホールドアップタイム

なおこの式は， Ｒ ＝（1 ＋ ） M と変形でき，同様る成分に対応するピーク）⑤＝ 移動相の容量

具体的には， はクロマトグラムを用いて保持時間（RRT）」に相当する．次の式で表される．
＝＝ 固定相の容量M

日本薬局方の医薬品各条で用いられている「相対G＝分配係数（又は平衡分配係数 equilibrium

Cの式は〈2.01〉に記載されていた．

保持係数（ ）
保持係数は以下の式で与えられ，質量分布比は，移動相に存在する溶質量に対する固定相に）又は，キャパシティファクター（ ʼ）とも呼ば存在する溶質量の比であり，各成分に固有の値で，れる．
〈2.01〉では，「質量分布比」と記載されていこの値が小さい化合物ほど，固定相に保持されにくた．

く，速やかにカラムから溶出する 3）．

（m＝

固定相に存在する成分量＝
異動相に存在する成分量SCM⑥

保持容量（）

R

ある成分が，溶出するために必要な移動相の容量

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試料：10μg/mL

で，保持時間と流量を用いて次の式より計算できる．
RR⑦‑acetyl‑ L ‑cysteine（富士フィルム和光純薬株式会社・特級）＝ R×

HPLC システム：Shimadzu LC‑2060C（㈱島津製＝ 保持時間作所）＝ 流量（mL/ 分）

検出器：紫外吸光光度計（測定波長：220nm）

理論段高さ（ ）カラム：

理論段高さ（ ）は , 理論段相当高さ（HETP）と①

サイエンス㈱）も呼ばれ，カラムの長さ（ ）（μm）と理論段数（ ）②の比である．

InertSustain C18 5μm 4.6 × 250mm（ジーエル
Inertsil ODS‑3 5μm 4.6 × 100mm（ジーエルサ
イエンス㈱）＝

カラム温度：40℃

理論段高さは，1 理論段当たりに必要なカラム長を表している．通例，単位はμm で表す． の値が移動相：薄めたリン酸（1 → 2500）/ アセトニトリ
ル混液（19：1）

小さいことは，カラム効率のよいカラムであり，理流量 0.9 mL/min

論段数

注入量：10μLの大きなカラムを意味する．したがって，分析法を開発する際に，試料の分離には，小さい
3）

代表的なクロマトグラムを Fig. 1 に示す．粒子径値が得られる条件を設定する ．ま

5μm，内径 4.6 cm､ カラム長 25 cm の ODS カラムをた，カラムの長さが長いほど理論段数も大きくなる

使用し，アセチルシステインのピーク理論段数及びため，理論段高さを用いて長さの異なるカラムの効

シンメトリー係数は，Table 3 に示す通りであった．

率を比較する際に有用である．

医薬品各条に記載のシステム性能の要件は，それぞ値と大きい

具 体 的 に ア セ チ ル シ ス テ イ ン（ ‑acetyl‑ L ‑れ 15000 段以上，1.5 以下となっており，この値を参cysteine）の分析事例で示す．日本薬局方医薬品各考にすると適切なカラム効率を有していると考えら条に収載されている「アセチルシステイン」の類縁れる．同様の試験を粒子径 5μm，内径 4.6 cm､ カラ物質の試験法条件を参考にした 4）．

ム長さ 10 cm の ODS カラムで分析すると，Table 3

試験条件に示す通り，理論段数は 25 cm と比較して半分以下

HPLCড়݇
᳨ฟჾ㸸⣸እ྾ගගᗘィ( ᐃἼ㛗㸸220nm)
࣒࢝ࣛ㸸 InertSustain C18 5μm 4.6250mm࣒࢝ࣛ ᗘ㸸40Υ⛣ື┦㸸ⷧࡵࡓࣜࣥ㓟(1ń2500)/࢔ࢭࢺࢽࢺࣜࣝΰᾮ(19㸸1)

Fig.１188

アセチルシステインの代表的なクロマトグラム

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Table ３る6）．したがって，グラジエント法では理論段数のカラムのピーク性能

カラム長 シンメトリー係数（ S）

理論段数（ ）

理論段数高さ（ ）規定はできない．
③

感度係数は，〈2.01〉の「8．用語」に記載は25 cm

1.1217931

13.9

なかったが，原案作成要領には，「感度係数が 0.7

10 cm

1.087956

12.6〜 1.3 の範囲を超える場合には補正する．」とある．
＝6〈2.00〉では，「6．その他の留意事項

6.1．検出器の応答」に「応答係数」つまり検出器からのレスポンに低下し 15000 段以上ではない．医薬品各条に記載

スの比が記載され，「感度係数は，応答係数の逆数の試験条件であるカラム長さ 25 cm を，システム適である．」と定義されている．〈2.00〉には，応答係合性試験で規定されている理論段数 15000 段で割っ数が 0.8〜1.2 の範囲外の場合に適用されるとあるた値は 16.6μm であるので，理論段高さは 16.6μmが，感度係数に変換すると，これまでの感度係数以下に相当する．本研究で得られた結果は，Table0.7 〜 1.3 の範囲とは異なるので注意が必要である．

3 に示す通り，25 cm カラムで 13.9μm，10 cm カラ

なお，定義や算出法は変わっていないが，〈2.01〉

ムで 12.6μm と同様の値でいずれも 16.6μm 以内ででは，シンメトリー係数は で示されていたが，あった．このように，理論段高さでカラム効率を表〈2.00〉ではsと表記する．

すことにより，カラム長の影響を排除できる．
換算理論段高さ（ ）5）⑧

2.3 サイズ排除クロマトグラフィー及び薄層ク理論段高さ（ ）（μm）と粒子径（ p）の比（μm ）で，次の式で表される．

ロマトグラフィーに特異的な用語〈2.00〉には，サイズ排除クロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィーに特異的な用語も収載され＝ている（Table 4，5）．

p

換算理論段数は，カラムの長さや粒子径に関係なくカラム効率を比較するのに役立つ，無次元パラTable 4メーターである．

2.00

2.2 調和試験法の収載により〈2.01〉から内容が一部変更となった用語

クロマトグラフィー総論

分配係数（0）

カラムに保持されない物質の保持時間（ 0）〈2.01〉の「8．用語」に記載されていた用語の中で，定義が一部変わるのが，① / の算出に用いるブランクの取り方，及び②理論段数の適用範囲である．また，〈2.00〉の「2．定義」に記載はないが，③感度係数の設定範囲も変わることになる．
①

サイズ排除クロマトグラフィーに特異的な用語

SN 比（ / ＝ 2 / ）： ,カラムに保持されない成分の保持容量（ 0）
完全浸透する物質の保持時間（ t））（Total mobile phase time（ t）
完全浸透する物質の保持容量（ t））（Total mobile phase volume（ t）

標準溶液から得られたクロマトグラム中の被験成分のピーク高さ：，ブランクを注入後に得られたノイズ幅
計算法は〈2.01〉から変更はないが，分母の は，「対象物質のピークの前後〈2.01〉「8．用語」では，における試料溶液又は溶媒ブランク」となっていたが，今後は の取得は「ブランク」つまり「溶媒ブTable 52.00

薄層クロマトグラフィーに特異的な用語

クロマトグラフィー総論

相対保持比（Rf 値（rel））

Fランク」の使用のみとなる．
②

理論段数自身の計算方法は〈2.01〉から変わらないが，理論段数は，恒温，アイソクラティック条件下で得られたデータによって求めることができ

2.3.1 サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィーは固定相として用Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 2（2023）

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189［加藤：クロマトグラフィーによる医薬品分析の国際調和］

Fig.２

サイズ排除クロマトグラフィーの概略

いる充塡剤の細孔を利用して，サイズの大きいもの

大孔より分子サイズが大きな成分の保持時間をカラムから試料を順次分離する分析手法である（Fig. 2）．に保持されない成分の保持時間（ 0）という（Fig. 2）．

固定相と試料分子との相互作用がないことを原則と③カラムに保持されない成分の保持容量（0）する．カラムにサイズの異なる混合試料を流した

最大ゲル孔より分子サイズが大きな成分の保持容

時，ゲルの細孔より大きいサイズの成分は細孔に入量をカラムに保持されない成分の保持容量というることができないため，ゲルの外側を通ってカラム（Fig. 2）．カラムに保持されない成分の保持時間とから溶出し， 0（ 0）の位置にピークとして現れる．

流量（ ：mL/ 分）を用いて以下の式により計算する．

細孔に入ることができる成分はその大きさに応じて（ 0）と0（ t）の間に現れる．そして，あるサイtズより小さい成分（一般的にはゲルの最小孔径よりも分子サイズが小さな成分）は一様にt（ t）の位置に溶出する．
①分配係数（0④＝ 0×

完全浸透する成分の保持時間（ t）

ゲルの最小孔径よりも分子サイズが小さな成分の保持時間を完全浸透する成分の保持時間という（Fig. 2）．

0⑤）

完全浸透する成分の保持容量（ t）

サイズ排除クロマトグラフィーでは，特定のカラゲルの最小孔径よりも分子サイズが小さな成分のムにおけるある成分の溶出特性は，次式で求められ保持容量を完全浸透する成分の保持容量というる分配係数によって与えられる．

（Fig. 2）
．完全浸透する成分の保持時間と流量（ ）0＝（mL/ 分）を用いて次式により計算する．

−0t− 0Rt＝ t×R＝ 保持時間

2.3.2 薄層クロマトグラフィー0＝ カラムに保持されない成分の保持時間①t＝ 完全浸透する成分の保持時間②

カラムに保持されない成分の保持時間（ 0）

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンスrel）

相対保持比は，標準成分の移動距離に対する被検サイズ排除クロマトグラフィーにおいて，ゲルの最190

相対保持比（成分の移動距離の比として求められる（Fig. 3）．
rel＝ ／Vol. 54 No. 2（2023）

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［加藤：クロマトグラフィーによる医薬品分析の国際調和］＝ 被検成分の移動距離3＝ 標準成分の移動距離
②f

値（ f）

まとめ
本研究では，調和試験法〈2.00〉に定義されたク

値は，試料を載せた点からスポットの中心まロ マ ト グ ラ フ ィ ー 関 連 用 語 に つ い て 調 査 し た．

での距離と，同じプレート上で試料を載せた点から〈2.01〉や〈2.02〉も用語については〈2.00〉に従う

溶媒先端までの移動距離の比である（Fig. 3）．

こととなったため，新たに定義された用語や，内容ffが一部変わった用語が速やかに浸透することを望＝む．

＝ 被検成分の移動距離
文＝ 溶媒先端の移動距離

献1）〈2.03〉薄層クロマトグラフィー．日本薬局方フォーラ
ム，2022, 31（3），p. 505‑506.
2）Entecavir. USP‒NF 2022. Issue 1, 2022, May 1.

༻ഖ઎୼3）吉田秀幸，巴山忠．パートナー分析化学 II 改定第 4 版，第 3 章分離分析 , 2. 液体クロマトグラフィー D 定性・定අ‫ݗ‬੔෾ηϛρφa͍

量分析．萩中淳，加藤くみ子編集．東京，南江堂．2021年．
4）アセチルシステイン．第十八改正日本薬局方，令和 3 年ඬ६੔෾ηϛρφb6 月 7 日．厚生労働省告示第 220 号 .
5）Giddings, J.C. Reduced plate height equation: Ac

common link between chromatographic methods.

‫఼ݬ‬ʤતʥ, 1964, 13, p.301‑304.
6）Meyer, R. Veronika. Practical High‑Performance Liquid
Chromatography. Fourth edition, John Wiley & Sons,

Fig.３

薄層クロマトグラフィーの概略

Ltd., 2004.

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 54 No. 2（2023）

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