平成13年度〔2001〕№46
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発＊
岡崎 益己＊１・柏田雅徳＊１・日高照利＊２・水谷政美＊１ ・工藤哲三＊１

Development of wines and liqueurs made from subtropical fruits and kumquats
Masumi OKAZAKI, Masanori KASHIWADA, Terutoshi HIDAKA,
Masami MIZUTANI and Tetsuzo KUDO
本県ではフルーツランド構想のもとで県産リゾート果実及びきんかんの生産が拡大してきている。
本研究では、これらの果実を利用してリキュールの試験醸造を行い、各製成酒のアンギオテンシン変換酵素阻害活性を比較したところ、きんかんリキュールが25.9％で最も高い阻害率を示した。また、きんかん果実中からACE阻害物質を見いだし、FAB-MS測定によりその分子量を決定した。
さらに、浸漬時間等の異なる各きんかんリキュールのACE阻害率と阻害活性画分（E5-①）のHPLCクロマトグラム上の各ピーク面積との関係について調べたところ、E5-①の各ピーク面積と各きんかんリキュールのACE阻害率に高い相関（R２＝0.93）が認められた。
キーワード：亜熱帯果実、きんかん、リキュール、ACE阻害活性
１ はじめに害物質は、血圧上昇抑制作用が期待できる。

県産リゾート果実のうち生産拡大が図られてい今回は亜熱帯果実及びきんかんを利用した各リるマンゴー、スターフルーツ果実や全国一の栽培キュールの機能性を明らかにするために、ACE実績があるきんかんの高付加価値化、原料特性を阻害活性を調べ阻害率の比較を行った。

活かした製品化を目的に11年度より県産リゾート

２−１−１

供試試料（製成酒）

果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュー

供試試料は、平成11年度及び12年度試験醸造でルの試験醸造を行ってきた１）,２）。今年度は、これ製造したマンゴー、スターフルーツ及びきんかんらの果実を利用した製成酒のACE阻害活性を比リキュールを用いた。

較した。また、きんかん果実からACE阻害物質

２−１−２試料調整及び測定を見いだした。さらに、浸漬期間等の異なるきん各製成酒は果汁割合がそれぞれ異なるため、果かんリキュールのACE阻害率と阻害活性画分の汁割合の最も少なかったきんかんリキュールにあHPLCクロマトグラム上の各ピーク面積との関係わせるため、他のリキュールを適宜水で希釈、調等について調べたので報告する。

整後、さらに水で20倍希釈し、0.45 フィルターろ過したろ液を試料溶液とした。アンギオテンシ

２ 実験方法ン変換酵素阻害活性の測定は、堀江ら３） の方法

２−１に準じ以下の方法で行った。

各製成酒のACE阻害活性

アンギオテンシンⅠ変換酵素（以下ACEと略す）は高血圧の引き金となる酵素であり、その阻＊＊１＊２

亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発（第３報）
応用微生物部
食品開発部

酵素基質：Hippryl-His-Leu （２mgに対しリン酸緩衝液1mlの割合で溶解した溶液-4.7mM）
酵 素 ：（和光ウシ肺製）0.2Uに蒸留水８ml加えて溶解した溶液（0.025U ml）
上記の酵素基質を0.1ml、 酵素溶液を0.1ml及び試料溶液0.05mlを混合し、 37℃で30分間反応143亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発を行った。反応は0.3M−NaOH1.5mlを用いて終脂（XAD-２ オルガノ㈱製）カラムクロマトグ了させた。反応終了液に２％オルトフタルアルデラフィー（層高150mm）を行うことで表１のとヒド（メタノールに溶解）を0.1ml入れVortexでおり分画した。溶出は水（E１）、30％メタノー

10秒撹拌し、正確に10分後3M-HCL0.2mlを加えル（E２）、50％メタノール（E３）、80％メタノー

反応を停止した。この液を水で250倍に希釈し、

ル（E４）、メタノール（E５）、エタノール（E６）

60分後の蛍光強度（励起波長360nm及び酢酸エチル（E７）の順序で行った（溶出量は蛍光波長480nm）（b） を測定した。 阻害率は阻害剤なし何れも120ml）。また、溶出速度はSV３とし、得で反応したときの酵素基質、酵素溶液、水の組みられた各画分（E１〜E７）を70℃減圧乾固後、合わせ蛍光強度（a）及び酵素基質、水、試料溶水及び80％エタノール水溶液で各画分を7mlに定液の組み合わせ蛍光強度（c）とし、次のように容し試験液とした。

求めた。

２−２−３×100
ACE阻害率（％）＝（１−（b−c）a）
２−２

きんかん果実中の機能性成分（アンギオ各画分（E１〜E７）の抗酸化活性、ACE阻害率及び -グルコシダーゼ阻害活性

テンシン変換酵素阻害物質、 -グルコ

２−２−２で得られた試験液を次のとおり調整

シダーゼ阻害物質及び抗酸化物質）の探した。抗酸化活性測定は80％エタノール水溶液で索について３倍希釈、ACE阻害活性測定はHEPES緩衝液で果実の消費拡大には、果実の健康増進効果を明２）らかにする必要がある。今回は、前報２倍希釈し試料溶液とした。また、 -グルコシで最もダーゼ阻害活性は50％ジメチルスルホキシド水溶ACE阻害率（相対値）が高い値を示したきんか液で20倍希釈し定容することで試料溶液とした。

ん果実についてACE阻害物質の検索を行った。

各画分（E１〜E７）の抗酸化活性測定は前報２）に併せて各画分の -グルコシダーゼ阻害活性及び準じ、ACE阻害活性測定は堀江ら３） の方法に準抗酸化活性を調べた。

じて行った。 -グルコシダーゼ阻害活性の測定

２−２−１

原料きんかん及び租サンプルの調整は川端ら５） の方法に準じて以下のとおり行った。

原材料きんかんは、経済連宮崎の完熟きんかん

基質としてはシュクロースを用い、標準反応液組を使用した。活性試験に供する試料は、きんかん

成は、60mM基質溶液（シュクロースを0.1Mリン

果実を乳鉢で磨砕し、うち果汁７gを採取し試料酸カリウム緩衝液pH6.3に溶解したもの）0.7ml、とした。

（各画分E５〜E７分画成分を濃縮乾固してから50

２−２−２ きんかん果汁の多孔質合成吸着樹脂カ％ジメチルスルホキシド水溶液で20倍に希釈定容）

ラムクロマトグラフィーによる分画試料（きんかん果汁）７gを多孔質合成吸着樹表１0.2ml、 -グルコシダーゼ酵素液（TOYOBO製0.02U）0.1mlとした。これを37℃、15分間反応

きんかん果汁の多孔質合成吸着樹脂カラムクロマトグラフィー等による分画（きんかん破砕果汁）＜合成吸着樹脂（XAD-2）カラムクロマトグラフィー：溶出速度SV３＞
水（E１）
30％メタノール（E２）
50％メタノール（E３）

ピーク①
E５-①

80％メタノール（E４）E５-②

メタノール（E５）エタノール（E６）
酢酸エチル（E７）144

逆相HPLCカラムクロマトグラフィー

E５-③

ピーク②
FAB-MS測定

亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発

させ、２Mトリス塩酸緩衝液（pH7.0）1.5mlを用

２−３−２

基本仕込配合及び原料処理いて反応を停止させ試験液とした。次に発色試薬

各きんかんリキュールの基本仕込配合を表２に〔グルコースＢテストワコー（和光純薬製）〕2.0mlまとめた。また、原料処理及び浸漬期間は表３のに試験液0.5mlを加え37℃で30分間インキュベー

とおりとした。

トした後、490nmの吸光度を測定した。基質溶液の代りに0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.3）を表２加えた時の吸光度をブランク値とし、この値を差項

基本仕込配合目配合量し引いた値をA490sとした。試験液の代りに50％

果ジメチルスルホキシド水溶液を加えた時の吸光度

麦焼酎（AL44％）

0.5L

糖類

0.2kg

表３

原料処理及び浸漬期間をコントロール値（A490c）とし、下式により −実0.5kg

グルコシダーゼ阻害活性を求めた。
-グルコシダーゼ阻害活性（％）＝［（A490c−A490s）A490c］×100
２−２−４逆相HPLCによるACE阻害活性画

NO

原料果実処理方法

浸漬期間

１

果実原形のまま20日で分画した各画分のうち、ACE阻害活性の最も２果実原形のまま30日高かった画分（E５）について逆相HPLCを十数

３

果実原形のまま40日回繰り返して、活性画分を更にE５-①〜E５-③

４

二つ切り30日分の精製及び各画分のACE阻害率
多孔質イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーの３画分に分画し、各画分のACE阻害活性を測定した。
逆相HPLC：SHIMADZU SPD10Aシステム
カラム：NaviC30（φ4.6mm×150mm）
移動相：MeOH H２O＝70 30.

２−３−３

各きんかんリキュールのACE阻害
活性２−３−２の製造方法により得られた各製成酒

流速：0.5ml min.、検出：340nm.の試料調整及びACE阻害活性測定は２−１の方

注入量：20 l法に 準 じて 測 定し 、 各 きん か んリ キ ュー ル のE５-①画分については更に逆相HPLCを十数ACE阻害活性を比較した。

回繰り返して、主要ピークを単離回収した。
２−２−５

２−３−４ 逆相HPLCによる各きんかんリキュー

FAB-MS測定によるACE阻害物質

ルのACE阻害活性画分（E５-①）及の分子量の決定

び阻害物質（ピーク①）のピーク面

質量分析はJEOL製質量分析計JMS-AX505W

積とACE阻害率との関係

を用い、単離・回収した主要ピークについてグリ

各きんかんリキュール（NO1〜4）を水で20倍セロールをマトリックスとして、 FAB-MS法に希釈調整後、0.45 フィルターろ過したろ液を試より分子量を測定した。

料溶液とした。これらを２−２−４と同様のカラ２−３

逆相HPLCによる各きんかんリキュー

ム条件により分析し、 各きんかんリキュールのルのACE阻害活性画分の各ピーク面積

E５-①画分のピーク面積和及びピーク①の面積とACE阻害率との相関についてを求め、ACE阻害活性との相関について調べた。

２−３−１

きんかんリキュールの試験醸造原料
果実

供試果実は宮崎県高千穂産の完熟きんかんを用いた。

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亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発

３ 結果及び考察
３−１ 各製成酒（リキュール類）のACE阻害活性測定結果
結果を表４に示す。今回の各製成酒のなかでは、きんかんリキュールが25.9％で最も高い阻害率を示した。前報２）において示した原料果実のACE阻害率を反映する結果となった。
表４
試

各製成酒のACE阻害率（％）
料名

ACE阻害率（％）

マンゴーリキュール

18.4

スターフルーツリキュール

22.8

きんかんリキュール

25.9

図１

各溶出画分の抗酸化活性及びACE阻害率

図２

各溶出画分の -グルコシダーゼ阻害活性※添加量は1.5mgの各試料に相当
この数値が高いほど血圧上昇抑制作用の可能性が高いことを示す。

３−２

きんかん果汁の機能性成分の特定・単離

３−２−１

きんかん果汁の各画分における抗酸化活性、ACE阻害活性及び -グルコシダーゼ阻害活性結果を図１及び図２に示す。ACE阻害活性及び抗酸化活性のいずれも図１のとおりE５画分（メタノール溶出画分）が最も高い活性を示した。
-グルコシダーゼ阻害活性については、E１〜E４画分はHPLCによる糖分析によりシュクロース及びグルコースを含んでいることが判明したため測定から除き、E５〜E７について -グルコシダーゼ阻害活性を測定した。図２のとおりE６画分（エタノール溶出画分）が最も高い活性を示した。
３−２−２

逆相HPLCによるACE阻害活性画分（E５-①）の精製及び各画分のACE阻害率測定結果

結果を図３に示す。多孔質合成吸着樹脂による分画において最も阻害率の高かったE５画分のうち逆相HPLCによる分画ではE５-①画分（Rt4.0〜12.0）のACE阻害率が22.3％と最も高い値を示した。

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図３

E５画分の逆相HPLCクロマトグラム

亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発

図４
表５FAB-MS法によるピーク①の正イオンFABスペクトル

各きんかんリキュールのACE阻害率（％）

m z245（M＋H）＋ に特徴的な分子イオンピークを検出したため、ACE阻害物質の分子量を244とNO

ACE阻害率（％）

１8.0推定した。

２14.6

３−３ リキュールのACE阻害率と阻害活性画分

３29.2

３−３−１４37.6

各きんかんリキュールのACE阻害率測定結果結果を表５に示した。基本配合は同一でも浸漬※添加量は1.5mgの各試料に相当期間や原料処理条件等の違いがきんかんリキュー
ルのACE阻害率に影響を与えることが示唆された。
３−３−２ 逆相HPLCによる各きんかんリキュー
ルのACE阻害活性画分のピーク面積とACE阻害率との相関
図５にきんかんリキュールについてのACE阻害率とACE阻害活性を有する画分（E５-①：Rt4.0〜12.0） の各ピーク面積の相関関係を示す。
相関係数は0.9以上と高い相関が認められた。また、E５-①画分の主要ピークであるピーク①の面積との相関も0.81であり高かった。
４
図５

ACE阻害活性とE５-①画分のピーク面積

まとめ
亜熱帯果実及びきんかんを利用したリキュー
ルのACE阻害率を相対比較したところ、きん３−２−３

FAB-MSによるACE阻害物質の分

かんリキュールが25.9％で最も高い阻害率を示子量の測定した。

E５画分のうちACE阻害率が最も高かったE５-

きんかん果実から、多孔質合成吸着樹脂カラ①画分の主要ピークについてFAB-MS及びFrit-ムクロマトグラフィー、 逆相HPLCを行ってFAB LC MS で 分 子量 を 調 べ た。 ピー ク ① のACE阻害物質を単離し、 FAB-MSにより阻害FAB-MSスペクトルについては、 図４に示す。

物質の分子量を推定した。 分子量は244 （Rt147

亜熱帯果実及びきんかんを利用したワイン及びリキュールの開発

５8.7）であった。

参考文献

浸漬期間や原料処理条件がきんかんリキュー

１）岡崎益己・柏田雅徳・日高照利・松田儀四郎・ルのACE阻害率に影響を与えることが示唆さ

二見久雄；宮崎県工技センター・食品開発センれた。また、きんかん果実のACE阻害物質のター研究報告 第44号 p119〜p124（1999）

単離精製過程で明らかになったACE阻害活性画

２）岡崎益己・柏田雅徳・日高照利・松田儀四郎・分（E５-①）の各ピーク面積ときんかんリキュー

二見久雄；宮崎県工技センター・食品開発セン

２ルのACE阻害率に高い相関（R ＝0.93） が認められた。
単離した阻害物質（ピーク①）のピーク面積

ター研究報告 第45号 p145〜p152（2000）
３）食品の機能性評価マニュアル集（農林水産省
農林水産技術会議事務局 1999）p117〜p121と各きんかんリキュールのACE阻害率との相

４）田口ら：特開2001-240539

関も0.81であり高かった。

５）川端ら：特開2000-229875（P2000-229875A）

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