Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

MAPSS-LS-202312-13
1Cytobank 簡易マニュアル

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202312

内容
１ クラウド型サイトメトリー解析ソフトウエア Cytobank について ......................................... 7
１-１ Cytobank とは ................................................................................... 8
１-２ 必要要件 ......................................................................................... 8
１-３ データセキュリティ .................................................................................. 8
１-４ クリニカルデータの保存についての注意点 ........................................................ 8
１-５ アカウント・ライセンス .............................................................................. 9
１-５-１ 購入ライセンスの種類 ..................................................................... 9
１-５-２ ライセンス終了後........................................................................... 9
１-５-３ アカウントアクセスレベル（ライセンスなし）でできること ................................... 9
１-５-４ アカウントのデータ容量 ................................................................... 10
１-６ 利用規約とプライバシーポリシー ................................................................ 10
１-７ お問い合わせ先 ................................................................................. 10
１-８ Cytobank 日本語関連資料・ガイドビデオ ................................................... 10
１-９ Cytobank 英語資料 .......................................................................... 12
２ 基本機能 .............................................................................................. 13
２-１ アカウント作成（Premium cytobank） ................................................... 14
２-２ ログイン画面（Experiment Manager） .................................................. 15
２-２-１ ログイン方法 .............................................................................. 15
２-２-２ Experiment Manager ............................................................... 15
２-２-３ Experiment を開く ..................................................................... 17
２-２-４ Label を付与・解除する ................................................................ 17
２-２-５ Experiment のアーカイブ化 ........................................................... 18
２-２-６ Project の作成とその管理.............................................................. 19
２-３ Experiment の新規作成・データアップロード ................................................ 22
２-３-１ Experiment 画面...................................................................... 25
２-３-２ 機能ツール一覧 .......................................................................... 25
２-４ Actions: ....................................................................................... 26
２-４-１ View Summary ....................................................................... 26
２-４-２ Clone .................................................................................... 28
２-４-３ upload .................................................................................. 31
２-４-４ Export ................................................................................... 32
２-４-５ Link to parent：Experiment のリンク付けと解除 ................................. 36
２-４-６ Reset：Experiment を初期化 ...................................................... 37
２-４-７ Delete：Experiment を削除 ........................................................ 37
２-５ スケール調整 .................................................................................... 382

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202312２-５-１ スケールの種類 ........................................................................... 38
２-５-２ スケール調整画面：Scale Editor .................................................... 39
２-６ コンペンセーション（蛍光補正） ............................................................... 40
２-６-１ Compensation Editor .............................................................. 40
２-６-２ 新規にマトリックスを作成する ............................................................ 40
２-６-３ マトリックスをインポートする ............................................................... 41
２-６-４ 自動コンペンセーション ................................................................... 42
２-７ データ QC：PeacoQC ........................................................................ 43
２-７-１ 自動データ QC ツール：PeacoQC とは................................................ 43
２-７-２ PeacoQC 設定・実行 .................................................................. 43
２-７-３ PeacoQC 結果の評価 ................................................................. 46
２-７-４ 実行上限の目安 ........................................................................ 49
２-８ ゲーティング ...................................................................................... 51
２-８-１ Cytobank でのゲーティングとポピュレーションの定義................................... 51
２-８-２ サーバー保存のタイミングと Experiment gate 情報としての保存 ................... 51
２-８-３ Gating Editor:ゲーティング画面の各機能 ........................................... 51
２-８-４ プロットに表示されるイベント数が多すぎる場合：Time Slice........................ 53
２-８-５ 測定中の異常イベントのクリーンアップ................................................... 54
２-８-６ ゲーティング後のコンペンセーション/チャネル変更：Hidden gate .................... 54
２-８-７ Boolean expression：ポピュレーションの定義と編集 .............................. 56
２-８-８ Check gates:ゲート位置の一括確認 ................................................ 60
２-８-９ Gate tailoring：ファイルや親集団でのゲート位置調整 ............................. 60
２-８-１０ ポピュレーションの階層構造の確認と編集 ........................................... 66
２-８-１１ ゲーティングストラテジーの自動表示：Gating hierarchy ........................ 69
２-８-１２ ゲート情報のインポート................................................................ 69
２-９ Sample tags:サンプルタグ ................................................................... 72
２-９-１ サンプルタグとは .......................................................................... 72
２-９-２ サンプルタグのつけ方 ..................................................................... 72
２-９-３ 他の Experiment からのサンプルタグのインポート ..................................... 73
２-９-４ サンプルタグの一括編集・追加 .......................................................... 74
２-９-５ チャネルとパネル設定：Assign panels ............................................... 75
２-９-６ ファイル属性の管理 ...................................................................... 77
２-１０ Figure 作成（Illustrations; Event level plot） .................................... 79
２-１０-１ 新規 illustrator の作成 ............................................................. 79
２-１０-２ Plots 設定 ............................................................................ 79
２-１０-３ Layout 設定 ......................................................................... 85
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202312２-１０-４ ファイル統合プロットの表示：Virtual concatenation............................ 86
２-１０-５ Save 設定 ............................................................................ 91
２-１０-６ Export 設定 ......................................................................... 92
２-１０-７ Templates ボタン .................................................................... 93
２-１０-８ 印刷ボタン ............................................................................. 93
２-１０-９ ロックボタン ............................................................................. 93
２-１０-１０ プロット上でのレイアウト変更操作 ................................................. 94
２-１０-１１ Statistic table：プロット下の統計表 ........................................... 94
２-１１ 統計グラフと統計的有意差検定（Illustrations; summary plot）................. 96
２-１１-１ 統計グラフ設定の基本................................................................ 96
２-１１-２ Heatmap：ヒートマップ ............................................................. 98
２-１１-３ Box Plot：箱ひげ図............................................................... 102
２-１１-４ Violin plot:バイオリンプロット ...................................................... 103
２-１１-５ Bar chart：棒グラフ .............................................................. 105
２-１１-６ Line chart & Stain index：線グラフとステインインデックス .................... 107
２-１１-７ Summary dots：サマリードット .................................................. 111
２-１１-８ 統計的有意差検定機能（共通） ............................................... 113
２-１１-９ 統計グラフのエクスポート ............................................................ 121
２-１２ 共有・プロジェクト・権限 ................................................................... 121
２-１２-１ ユーザーコネクション（Premium cytobank のみ）............................. 121
２-１２-２ データセキュリティ・デフォルトのアクセス権限について ............................... 122
２-１２-３ Experiment の共有 .............................................................. 122
２-１２-４ アクセス権限を付加した共有ができるプロジェクトの作成と管理................... 123
３ Advanced analyses（機械学習解析） ....................................................... 126
３-１ 機械学習による解析 ......................................................................... 127
３-２ 自動ゲーティング .............................................................................. 128
３-２-１ 自動ゲーティングとは ................................................................... 128
３-２-２ トレーニングデータの準備 .............................................................. 128
３-２-３ モデルトレーニングの設定・実行 ....................................................... 129
３-２-４ 新規データへのモデルの適用方法..................................................... 132
３-２-５ 自動ゲーティング（モデル作成/適用）の結果の評価............................... 133
３-２-６ 自動ゲーティング後の解析例 .......................................................... 139
３-２-７ トレーニング上限と計算時間の目安、トラブルシューティング ......................... 141
３-３ 次元削減アルゴリズム（tSNE-CUDA、UMAP、opt-SNE、viSNE） .................. 145
３-３-１ 軸スケールの調整（前処理） ........................................................ 145
３-３-２ ゲーティングによる解析対象の絞り込み（前処理） ................................. 146
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202312３-３-３ 設定と実行............................................................................. 146
３-３-４ 複数のアルゴリズム結果の比較表示.................................................. 158
３-３-５ 結果のマップ上でのゲーティング ........................................................ 159
３-３-６ 結果の良い/悪いの見方 .............................................................. 161
３-３-７ 結果の illustrations での表示と比較 ............................................... 162
３-４ FlowSOM .................................................................................... 167
３-４-１ FlowSOM とは ........................................................................ 167
３-４-２ tSNE/UMAP マップ上に FlowSOM メタクラスターを表示する場合 ................ 167
３-４-３ FlowSOM 設定・実行................................................................ 167
３-４-４ FlowSOM 結果の出力ファイル ....................................................... 170
３-４-５ FlowSOM 結果の Cytobank への出力 ............................................ 172
３-５ SPADE ....................................................................................... 179
３-５-１ SPADE とは............................................................................ 179
３-５-２ SPADE 設定・実行 ................................................................... 179
３-５-３ SPADE 結果の表示と解析 ........................................................... 180
３-５-４ バブルの作成 ........................................................................... 182
３-５-５ 選択したノードのプロット表示 .......................................................... 182
３-５-６ バブル内の細胞（イベント）の出力 .................................................. 182
３-６ CITRUS ...................................................................................... 184
３-６-１ CITRUS とは .......................................................................... 184
３-６-２ CITRUS 設定・実行.................................................................. 184
３-６-３ CITRUS 結果の確認 ................................................................. 186
３-６-４ CITRUS 結果ファイル ................................................................. 187
３-６-５ CITRUS 結果ファイルの見方 ......................................................... 190
３-６-６ CITRUS 結果から見出した候補クラスターの詳細解析・グラフ化 ................... 190
４ 各種機能 ............................................................................................ 192
４-１ ダウンロード・エクスポート ...................................................................... 193
４-１-１ Experiment アーカイブ（acs）のダウンロード...................................... 193
４-１-２ 統計計算結果・サンプルタブ・ゲート情報・Experiment 内 FCS ファイル＆添付ファイ
ル・Illustrations で表示している統計表・Illustrations で表示している細胞情報の FCS/text
ファイルのエクスポート ............................................................................... 193
４-２ Experiment の複製 ........................................................................ 194
４-２-１ Experiment の削除 ................................................................. 194
４-２-２ ゴミ箱に入れた Experiment を戻す・完全消去する................................ 194
４-３ FCS ファイル詳細情報 ....................................................................... 195
４-４ FCS ファイル以外のデータを Cytobank へインポート（DROP 機能） ................... 195
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４-５ アカウントの確認・設定変更 ................................................................. 196
４-５-１ パスワードの変更 ....................................................................... 196
４-５-２ 使用データ容量と内訳の確認 ........................................................ 197
４-５-３ ユーザーコネクションのリクエストとリストの確認......................................... 197
４-５-４ 登録 E-mail アドレスの変更 ......................................................... 198
４-５-５ その他細かいアカウント設定の変更 ................................................... 198
４-６ ログアウト ...................................................................................... 199
５ バージョン対応表 .................................................................................... 200

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１クラウド型サイトメトリー解析ソフトウエア
Cytobank について

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１-１Cytobank とは
シングルセルデータ解析のためのクラウドプラットフォームのソフトウエアです。
非常に高いセキュリティのクラウド上に、データや解析結果、関連ファイルを保存および一元管理することができます。
フローサイトメトリーのハイパラメータデータやその他シングルセルデータを、機械学習アルゴリズムをベースにした高次元解析ツールで簡単に解析することができます。
データや解析を世界中の共同研究者と、ハイセキュリティなクラウド上で安全にシェアすることができます。

１-２必要要件・ウェブブラウザ（Chrome, Firefox, Safari 最新バージョン推奨）・E-mail アドレス
・インターネット（通信速度 50 MBPS download/ 10 Mbps upload 以上推奨）
Speedtest.net にて速度環境を調べることができます。
※Microsoft Edge には対応しておりません。
※ブラウザの動作するデバイスであれば端末のスペックは要求しませんが、操作性からパソコンでの使用をおすすめします。
※複数のブラウザやデバイスから重複してログインするとサーバーセキュリティが不審者からのアクセスと判断し、アカウントを一時停止することがあります。

１-３データセキュリティ
Cytobank 上のデータは完全に安全な状態で保存されています。データと解析は暗号化され、定期的にバックアップされています。
セキュリティの詳細について記載された文書が必要な方はお気軽にお問合せください。

１-４クリニカルデータの保存についての注意点
Cytobank は研究用途のみにお使いいただけ、診断にはご使用になれません。
クリニカルデータをアップロードする際には、匿名化する必要があります。
21 CFR Part 11 には対応しておりません。

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１-５アカウント・ライセンス
Cytobank へのアクセスレベルは２つのレベルになっており、レベル１はアカウントアクセス、レベル２はサブスクリプションアクセスです。アカウントアクセスレベルでは閲覧とエクスポートのみが可能、サブスクリプション
アクセスではデータのアップロードや解析等すべての機能が可能です。アクセスレベルを上げるためには、トラ
イアル/Enterprise/Premium のいずれかのライセンスが必要となります。
１-５-１購入ライセンスの種類
Enterprise と Premium の２種類のライセンスがあります。
■Enterprise-

独立した専用サーバー+ライセンス（10 ライセンス以上）-

サーバー内アカウント数は制限なしで、管理者権限によるライセンス管理（ライセンスの移動）が可
能-

デフォルトデータ容量は 5 TB/サーバー-

データ共有は同一サーバー内のみで、他のサーバー（Premium Cytobank 含む）とは共有・ア
クセスできません。

-

ラボ / 企業単位向け■Premium-

Premium Cytobank サーバー内のアカウント単位ライセンス-

最小単位：１ライセンス-

デフォルトデータ容量は 500 GB/アカウント-

Premium Cytobank 内アカウントでのデータ共有が可能（Enterprise アカウントとは不可）

１-５-２ライセンス終了後Enterprise ではサーバー内でライセンスが移動しただけですので、アカウントアクセスはデータ・解析結果
とともにサーバー内に維持されます。
Premium ではライセンス終了後 90 日間はアカウントとデータ・解析結果は維持されますが、複数回のメール通知の後、データは完全削除されます。
データが削除される前にデータやアーカイブファイル（.acs）などをエクスポート・ダウンロードください。
１-５-３アカウントアクセスレベル（ライセンスなし）でできること
サブスクリプションアクセスレベルの時に作成した Illustrations や figure を表示したり、生データやアーカ
イブファイル（.acs）をダウンロードしたりすることができます。データを追加したり、解析したりすることはで
きません。

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１-５-４アカウントのデータ容量
Enterprise では契約時に購入したサーバーの容量（デフォルト 5 TB）を全アカウントで共有します。
Premium では 500 GB/アカウントです。
容量が不足しそうな場合、容量のみの追加購入も可能ですのでお気軽にお問合せください。

１-６利用規約とプライバシーポリシー
Cytobank の利用規約（Terms of Use）とプライバシーポリシー（Privacy Policy）はお使いの
Cytobank ページ下部からいつでもご確認いただけます。

１-７お問い合わせ先
ベックマン・コールター株式会社■Cytobank 専用サポートメール
cytobank_support@beckman.com■電話（お客様サポートセンター）
0120-566-730 または 03-6745-4704
9:00～17:30 （土・日・祝日・その他休業日を除く）

１-８Cytobank 日本語関連資料・ガイドビデオ■Cytobank サーバーの日本語サポート Experiment10

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Cytobank サーバーの日本語サポート Experiment にアクセスすると最新の日本語マニュアルなどの情報を取得いただけます。公開 Experiment なのでどなたでもアクセスできます。
Cytobank ログイン＞Experiment manager の検索ボックスに“日本語”と入力＞日本語サポート
Experiment にアクセス

最新版マニュアルは Experiment summary の Attachments セクションからダウンロードいただけます。

■Cytobank 最初のガイドビデオ
Cytobank お使い始めのための４つのガイドビデオ
https://www.beckman.jp/flow-cytometry/software/cytobank-premium/learningcenter/basics■Cytobank ラーニングセンター
機能ごとの案内ページで、特徴の説明やガイド動画も豊富に用意されています。
https://www.beckman.jp/flow-cytometry/software/cytobank-premium/learningcenter

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202312■Cytobank 資料まとめページ
日本語ガイド動画やアプリケーションノート、テクニカルノートなど Cytobank の情報をまとめてご提供しております。
https://www.beckman.jp/flow-cytometry/software/cytobank-premium/jp-helpfullinks?web=1&wdLOR=cA8BE831A-4B24-41F4-9BB9-C1B18BB56EBC

１-９Cytobank 英語資料
■Cytobank support portal
https://support.cytobank.org/hc/en-us＊本簡易マニュアルと製品マニュアル（英語版）の間に矛盾もしくは 不一致が生じた場合は英語版が優先するものとします。

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202312２基本機能

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202312２-１アカウント作成（Premium cytobank）
ベックマン・コールターウェブサイトの申し込みフォーム（https://www.beckman.jp/flowcytometry/software/cytobank-premium/free-trial）に登録をした後、Premium
Cytobank サーバー（https://premium.cytobank.org/cytobank/signup）にてアカウントを作成します。

セキュリティのため、アカウントと申し込みフォームの情報が照合がされ、米国オペレーションチームによって認証されるとアカウントが登録され、認証メール（英文）が登録メールアドレスに届きます。認証メールのリン
クをクリックすると、自動的に 30 日間の Cytobank premium トライアル（すべての機能を使用可能）が開始されます。
※認証作業は米国時間で行われるため、時差や祝日によって遅れる場合があります。３営業日を経過しても認証メールが届かない場合は、メールソフトのゴミ箱や迷惑メールに入っていないかをご確認の上、cytobank_support@beckman.com までご連絡ください。
※Enterprise ではご所属のサーバーでのアカウント作成が必要となりますので、ご施設の管理者にお問合せください。

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202312２-２ログイン画面（Experiment Manager）
２-２-１ログイン方法
アカウント作成後は、下記 URL または Google で Cytobank と検索し、Cytobank ウェブサイトの左上 Login＞Premium からログインページに入ることができます。
Premium Cytobank：https://premium.cytobank.org/

アカウント登録した User name または Email と、Password を入力し Login ボタンを押します。
パスワードを忘れた場合は Login ボタン下の Forget password をクリックしてガイドに従います。
２-２-２Experiment Manager
Cytobank では解析の単位（データセット）を Experiment として管理します。
ログインすると Experiment Manager 画面が表示されます。Experiment Manager はメール管理
ソフトのような構成で、アクセスできる Experiment の管理をすることができます。
アクセス可能な Experiment は、作成したものの他に共有しているものや公開されているものも含まれます。

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202312① Cytobank ロゴマーク：どの操作画面からでも Experiment Manager へ行くことができます。Ctrl
キー（Windows）や Cmd（Mac）キーを押しながらクリックすると、ブラウザの機能により別タブで開くことができます。
② New Experiment ボタン：新規 Experiment 作成を開始します。
③ カテゴリーセクション：Experiment を所有者ごとや Project ごと、Project Reader ごと、解析種
類ごと、Label ごとに自動的または任意に分類して呼び出すことができます。
各カテゴリー名の右の数字はそのカテゴリーに含まれる Experiment 数を示しています。数字部分をクリックすると Star this filter と hide this filter が表れます。
Star this filter：選択するとそのカテゴリーをリストの上部 All の下に移動します。
Hide this filter：選択するとリストの一番下に作成される Hidden filters へ格納します。
・

All：アクセスできるすべての Experiment を中央のリストに表示します。

・

Mine：ご自身が作成した（Clone を含む）Experiment のみを表示します。

・Shared with me：他のアカウントの Experiment で、アクセス許可をしてもらった共有
Experiment のみを表示します。

・

Cytobank curated：Cytobank が提供するデモデータ Experiment のみを表示します。

・

Public：公開されている Experiment のみを表示します。

・

Trash：ゴミ箱に入れた Experiment のみを表示します。

・

Project：クリックすると作成・共有している Project が表示され各々の Experiment のみを表示することができます。

・PRs：クリックするとアクセスできる Experiment の Project Reader リストが表示され各々の Experiment のみを表示することができます。

・Advanced analyses:クリックすると各種の解析が表示され、各々の解析結果
Experiment のみを表示することができます。

・Labels：クリックすると Label のリストが表示され、各ラベルを付与された Experiment だけを表示することができます。

④ Experiments ボタン：新規作成や最近開いた Experiment へのリンクが開きます。
⑤ Project ボタン：Project の新規作成や全 Project の表示、最近使用した Project のリンクが開きます。
⑥ フィルターボックス：入力した文字でフィルターをかけ、目的の Experiment を見つけやすくします。
⑦ Group linked ボタン：チェックを入れると、解析結果の Experiment やクローンなどの関連
Experiment をまとめて表示します。Linked Experiment も一覧に表示したい場合はチェックを外します。
⑧ 選択チェックボックス：Experiment を選択すると画面上部にアクションボタンが表示されます。
Apply label ボタンでラベル付与、Archive ボタンでアーカイブ化、Delete ボタンで削除をまとめてすることができます。Unselect ボタンでは選択を解除することができます。

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202312⑨ 水色丸：Linked clone experiment（関連するクローンや Link to parent で紐づけられたExperiment）がある場合、その数が表示されています。
⑩ 紫色丸：Advanced analyses 解析結果の Experiment がある場合、その数が表示されています。
⑪ Settings ボタン：中央の Experiment リストに表示する項目を設定することができます。
⑫ Help ボタン：サポートサイト（英語）のリンクなどが表示されます。
⑬ My profile ボタン：アカウント設定やログアウトができます。
２-２-３Experiment を開く① 開きたい Experiment 名の部分をクリックします。
② 右側にウィンドウが表れ、その Experiment の概要を確認することができます。
③ 上部水色の帯部分のメニューバーから使用したい機能を選択します（特にない場合はExperiment summary を開きます）。または、概要部分を下にスクロールして、Linked
experiments や各 Advanced analyses の解析結果をクリックし、それらを直接開くこともできます。

２-２-４Label を付与・解除する
Experiment に任意のラベルをいくつでも付けることができ、様々な分類をすることができます。
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202312① 対象の Experiment のチェックボックスにチェックを入れます。
② 上部にアクションボタンが表れますので、Apply label をクリックします。

③ 新規の Label を付与する場合は、Label name ボックスに名前を入力し、Create label andapply ボタンを押します。

④ Label が作成され付与されます。
⑤ Label の名前部分をクリックまたはカテゴリーセクションの Label をクリックすると、その Label が付与された Experiment のみが表示されます。
⑥ 上部の Rename label ボタンで、Label の名前を変更することができます。
⑦ Edit color ボタンで、色を変更できます。
⑧ Delete ボタンで、その Label 自体を削除することができます。
⑨ Label の名前の右に X マークをクリックすると、その Experiment の Label を解除することができます。

２-２-５Experiment のアーカイブ化
しばらく使用しない Experiment をアーカイブフォルダに格納することができます。
① 対象の Experiment のチェックボックスにチェックを入れます。
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202312② 上部にアクションボタンが表れますので、Archive をクリックします。
③ カテゴリーセクションの Public の下に Archived が作成され、これに格納されます。
２-２-６Project の作成とその管理
複数の Experiment を Project としてまとめて管理することができます。プロジェクトチームでの共同作
業にとても有用です。
Project は単に Experiment をまとめるだけでなく、ユーザーのアクセス権限も管理することができます。
２-２-６-１Project の新規作成① Experiment manager 画面上部の Projects ボタンをクリックし、New を選択します。

② 名前 Name（と必要であれば説明 Description）を入力します。
③ Project のアクセス権限を設定します。
・

Sharing level：illustrations 機能への権限を View Only（閲覧のみ）か
illustrations（ユーザーが各々illustrations を作成できる）から選択します。

・Cloning level：Clone（Experiment の複製）機能への権限を、Disabled（不可）、Clone Files Only（生データのみダウンロードや複製可能）、Full Clone（フルクローンが可能）から選択します。

④ Create project をクリックします。

⑤ Edit project ‘名前’の画面が表示されます。
⑥ Edit Details 欄は前画面の設定が表示されます。Manager はいつでも編集可能です。
⑦ Edit Project Members 欄で Project メンバーを追加します。メンバーの役割は Managers,
Leaders と Members の３種類があります。Managers は、メンバーや Experiment の追加、Project のアクセス権限の設定変更などすべてのことができます。Leaders と Members は名称は異なりますが権限は同じで、Project の設定（アクセス権限やメンバー）や Project 内の19

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Experiment（のゲートやスケール、コンペンセーションなどの設定を含む）を変更することはできません。また、Leaders と Members は③で設定されたアクセス権限（Sharing level と Cloning
level）の制限を受けます。
⑧ Add 役割名ボックスに Username またはアカウント登録されている E-mail アドレスを入力すると候補ユーザーが表示されるので、選択して追加します。
※候補ユーザーは user connections リストが対象となります。User connections に登録されていないユーザーを追加したい場合は、ボックスに表示される Connect with a user をクリックし、
ユーザーコネクションリクエストを行ってください。

⑨ メンバーを削除する場合は名前の右側に表示される X マークをクリックします。

⑩ Edit Experiments 欄で Project に含める Experiments を設定します。右のボックスでExperiments を選択し、ボックス下の Add Experiment(s)ボタンを押し、左のボックスに移動します。
⑪ Project から Experiment を削除する場合は、左のボックスで Experiment を選択し、ボックス下の Remove Experiment(S)ボタンを押します。※Project から削除されるだけで、この操作でExperiment 自体は削除されません。

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202312２-２-６-２Project の編集・削除① Experiment manager 画面上部の Projects ボタンをクリックし、View all projects を選択します。
② 編集したい Project の Actions 欄の︙ボタンをクリックし、閲覧したい場合は view を、編集したい
場合は Edit を、削除したい場合は Delete を選択します。
③ 編集する場合、設定については上述の Project の作成を参照ください。

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202312

２-３Experiment の新規作成・データアップロード
新規の解析を行う場合は Experiment を作成しデータをアップロードします。
①

Experiment Manager 左上のをクリックします。

②

Experiment Name、Purpose を入力して（その他は任意）、Create Experiment ボタン（２項目入力するとアクティブになる）を押します。

※ACS ファイル経由で Experiment をアップロードをしたい場合は、Create New Experiment 画面の Create via ACS File ボタンから行うことができます。
③

Add Files ボタンをクリックしてアップロードファイルを選択するか、アップロードしたいファイルを直接枠の中へドラッグ&ドロップします。
※データセットのサイズが大きい場合は Zip 圧縮し、枠上部の Upload File Using a Zip
file ボタンからもアップロードでき、時間を短縮することができます。

④

ファイルを選択後、Upload files をクリックするとアップロードが開始します。
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202312※インターネット通信速度が不安定な環境の場合、速度が低下した時にアップロードが停止してエラーが表示されたり、アップロードをやり直して重複してしまうことがあります。これを回避したい場合は多数のデー
タファイルを一度にアップロードせず、数から十数ファイルずつアップロードすると良いです。
※ファイルアップロードのやり直し等が発生し、Experiment 内にファイルが重複してしまった場合は、Clone Experiment で、重複したファイルのサイズの小さい方（または不要なファイル）を FCS files
to clone の選択から外して Clone を作成します。
⑤

アップロードが完了すると Set up new experiment ページが表示されます。

⑥

Set up new experiment では、データの QC・前処理の４つのステップ（１．スケール調
整、２．コンペンセーション、３．サンプルタグ、４．パネル・チャネル名）が表示されており、各ステップをクリックすると、機能ボタンにポップアップが現れてガイドします。

⑦

ガイドされた機能で調整が完了したら、機能ウィンドウを Close するかメニューバーに表示される
Set up experiment ボタンで戻ります。

⑧

ステップが完了すると緑色のチェックマークが付きます。

⑨

４ステップが完了したら、５．Done with setup and ready to start exploring yourexperiment data?をクリックします。

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202312

解析とレポートのボックスが表示されますので、次に行いたい作業をクリックします。

※各ステップは任意にスキップすることもできます。調整済みのファイル等で不要な場合、５．Donewith setup and ready to start exploring your experiment data?をクリックし、すぐに先の作業へ進むこともできます。

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202312２-３-１Experiment 画面
Experiment 画面では、上部に Experiment 名と機能ツールが用意されています。

２-３-２機能ツール一覧-

Actions：Experiment サマリーへのアクセスや複製、各種 Upport/Export 機能-

Sample Tags：サンプルタグ機能-

Data QC:測定時の異常イベントを自動検出・除去-

Gates ：ゲート作成・確認・編集機能-

Advanced Analysis：高度な解析ツール（クリックすると以下が選択できます）


Dimensionality Reduction：次元削減アルゴリズム（tSNE-CUDA, UMAP, optSNE, viSNE）



Clustering：クラスタリングアルゴリズム（FlowSOM, SPADE）



CITRUS

Automatic gating-

Illustrations：Figure の作成や統計グラフ、統計的有意差検定機能-

Scales：スケール設定-

Compensation：コンペンセーション設定-

Sharing Private：Experiment の共有機能

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202312

２-４Actions:
Experiment サマリーの表示や、複製、データの Export/Import などを行うことができます。

２-４-１View Summary
Experiment の詳細情報、関連する Experiment との相関、各種解析結果、fcs ファイル以外のファイル、fcs ファイル情報などすべての情報がまとめられています。
・Notes: Experiment の目的やコメントを記載できます（クリックで編集可）。

・

Linked experiments：関連する Experiment との相関図が表示されます。クリックするとそのExperiment へ移動できます。下図 Linked experiments 例は Demo test というExperiment のデータセットで FlowSOM、SPADE、viSNE の解析を行い、viSNE 解析結果を複製（クローン）したときのものです。

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・

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202312Illustrations：作成中と保存された illustration のリストが表示されています。名前をクリックするとその illustration に移動します。Experiment を共有していて、他のユーザーが illustration を作成している場合は Author のユーザー名で判断できます。自分が作成した illustration については、右端のゴミ箱アイコンをクリックすると削除でき、Delete all your illustrations ボタンで全て削除もできます。

・Clones：その Experiment の複製が作成された場合、リストで表示されます。

・

各種 Analyses：解析の結果や実行ステータスがリストとして表示されます。実施したものだけが表示されます。不要な結果は右端のゴミ箱アイコンをクリックすると削除できます。

・Attachments：Attach a File ボタンで fcs 以外のファイルを添付できます。fcs ファイルも添付ファイルとしたい場合は、Zip フォルダに格納することで添付できます。Word、Excel、PowerPoint
はもちろん、顕微鏡の画像ファイルなど関連するファイルを添付し、Experiment 内にまとめて管理できます。PNG、JPEG、TIFF ファイルの場合は位置情報（EXIF データ）はファイルのメタデータから削除されます。FCS と PDF ファイルのメタデータは削除されません。

・Protocols：実験や測定のプロトコルファイルをファイルアップロード、URL、手入力から選択して添付できます。

・FCS Files：Experiment に含まれている fcs ファイル数とその名前、細胞数（Events）、ファイ
ルサイズや Sample tags のリストを確認することができます。また、Panel は各 FCS ファイルのチャ
ネルパラメータパネルを表示しており、同一のファイルには同一の番号のパネルが割り当てられています。Panel 部分をクリックすると、パネルの内容（チャネル数、名前、ファイル名）を確認・編集できる Assign panels 機能へ移動します。

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202312※fcs ファイルの詳細について-

各ファイル名の右にあるをクリックすると、その fcs ファイルに記載されている詳細情報（Keyword、Laser Information, Channel Information 等）を確認することが出来ます。

-

アップロードした fcs ファイルはデータ取り扱いの信頼性の観点から、削除できない仕様になっています。特定のファイルを除いた Experiment にしたい場合は、Clone 機能の FCS files to clone
で除きたいファイル以外のファイルのみを含む Experiment を複製することが可能です。

２-４-２Clone
Experiment を複製することが出来ます。
Experiment を共有した後に複製することで元の Experiment を上書きすることなく、共有者も再解析することができるようになります。
また、option 設定によって、元 Experiment の一部の情報を反映したものとしてや、特定のゲートポピ
ュレーションのみでの複製を作成することもできます。
① Clone ボタンをクリックします。Create Clone of Experiment ウィンドウが表示されます。

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202312② Experiment name：に複製した Experiment 名を入力します。デフォルトでは元の名前＋（Clone）となります。
③ Sharing：で共有アクセスを選択できます。


Clone individual user access：元の Experiment を共有した共有者に、Clone した
Experiment へのフルアクセスも可とします。



Clone project membership：Project 内のメンバーのアクセス権限が Clone にも反映される設定です。デフォルトではチェックが入っています。

Link to originating experiment：チェックを入れると作成した Clone は元のExperiment に紐づけられます。デフォルトでチェックが入っています。

④ Clone options：で Clone に含める（反映する）内容をすべてまたは個別に選択できます。


Select all：すべて



Clone gates：ゲート

Clone compensation：コンペンセーション

Clone sample tag：サンプルタグ

Clone file panels：マーカーパネルファイルClone illustrations:保存した illustrations



Clone attachments and protocols：添付ファイルとプロトコルClone reagents：蛍光色素情報※gate と compensation など、一緒である必要がある項目は、Cytobank が自動で組み合わせます。

⑤ FCS files to clone：Clone に含めるファイルを選択することができます。Select files…ボタンで選択するか、下のリストで Clone に含めるファイルのみを選択します。

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202312⑥ Split Files by population：元 Experiment 内の特定のゲートポピュレーション（populations）を各 FCS ファイルに分割して Clone を作成することができます。Selectpopulation ボタンをクリックするとゲートリストがポップアップしますので、チェックを入れて選択することができます。

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202312２-４-２-１不要な FCS ファイルの Experiment からの削除
アップロードした fcs ファイルはデータ取り扱いの信頼性の観点から、削除はできない仕様になっています。
上述の手順⑤で不要なファイルを対象から外した Clone を作成することで、必要なファイルのみのExperiment とすることができます。
２-４-２-２特定のポピュレーションをファイルに分けて Clone Experiment を作成
上述の手順⑥で FCS ファイルとして分けたいポピュレーションを選択します。例えば、元 Experiment に
３ファイルがあり、Split files by populations で popA と popB の２つのポピュレーションを選択すると、popA の細胞のファイル３つと popB の３つを含む Clone Experiment が作成されます。
２-４-３ upload
Experiment に下記 3 種類のファイルをローカルからアップロードができます。

２-４-３-１Upload Sample Tags：サンプルタグファイルのアップロード
エクスポート後編集したサンプルタグファイルをアップロードして Sample tags に適用します。
２-４-３-２Upload Gates from Gating-ML：Gating-ML ファイルのアップロード※Cytobank が使用している Gating-ML のフォーマットは the International Society for
Advancement of Cytometry (ISAC)によって規格された Gating-ML 2.0 であり、その他の規格
ファイルはエラーとなります。
Spidlen, Josef et al. “ISAC's Gating-ML 2.0 data exchange standard for gating
description.” Cytometry. Part A : the journal of the International Society for
Analytical Cytology vol. 87,7 (2015): 683-7. doi:10.1002/cyto.a.22690

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202312２-４-３-３Upload More Files：FCS ファイルの追加アップロード
２-４-４ Export
Experiment の様々な情報を Export できます。

２-４-４-１Export Statistics：統計計算結果の出力
様々な統計値やサンプルタグ、ファイルキーワード情報を任意に選択し、全ファイルの一覧表を csv ファイ
ルとしてエクスポートします。
① Actions＞Export＞Export Statistics をクリックします。
② 新規に作成する場合は Define or new を選択します。テンプレートがあり、呼び出す場合はLoad a saved template リストから選択します。

③ （必要な場合）Export Options を開きファイルの設定をします。
-

Filename：ファイル名-

Orientation one FCS file per: FCS ファイルを項目として行（Column）と列（Row）のどちらに配置するかを選択します。

-

Compensation：どのコンペンセーションを適用するかを選択します。

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202312FCS Files to include：出力対象のファイルを選択します。Experiment にインポートさ-れている File type が設定されているファイルから、出力するファイルの種類を以下のパター
ンで選択できます。


サンプルファイルのみ（Only experimental files）



サンプルとコントロールファイル（Experimental and other control files）



サンプルとコンペンセーション単染色ファイル（Experimental and compensation
files）



サンプルとコントロールとコンペンセーションファイル-

Delimiter type：出力ファイル形式の選択-

Append time stamp to filename：ファイル名にタイムスタンプを入れます。

-

Include descriptive file header：ファイルのヘッダーを含めます。

-

Include Gating ML file with archive：アーカイブと Gating ML ファイルを含めます。

④ Define what to export で、統計計算、サンプルタグ、ファイルキーワードから選択します。
⑤ 統計計算を選択するとメニューが現れ、以下の順番に対象を指定していきます。
-

Pick a statistic type：使用する統計・Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Coefficient of variation:変動係数

・Percent of population：population A /population B ※B は A の上流ポピュ
レーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算出される。

・Standard deviation：標準偏差・

Variance：分散・Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Event count：細胞数・Event count ratio： Population A 細胞数 /population B 細胞数※ポピュレー
ション階層考慮なし。

・

Channel range：チャネルの範囲

・Geometric mean：幾何平均

・Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％含まれるか-Pick a population：対象の細胞集団-

Pick a channel：使用するチャネル(複数選択可)※使用する統計によっては非表示-

Enter column header name, separated by comma:指定された対象がコンマ区切
りで表示されます。

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202312⑥ Add column ボタンを押すと Column defined の表に追加できます。表では、Column
name をクリックすると名前を変更できます。また、左の×ボタンで表から削除できます。

⑦ Export statistics file ボタンでエクスポートを開始します。
⑧ エクスポートが完了すると、Experiment Summary の Exported Files セクションに zip として保存されるのでダウンロードしてエクセル等で開きます。
２-４-４-２Export events：細胞情報を FCS または Text ファイルでエクスポート① Actions＞Export＞Export events をクリックします。
② Export events ウィンドウの Settings で以下について設定します。
-

Filename：エクスポートするファイルの名前を入力します。

-

Compensation：適用するコンペンセーションを選択します。

-

Transformation：スケール設定の情報を反映するかを選択します。

-

File format：ファイル形式を FCS か Text か選択します。

③ エクスポートの対象とする Populations と FCS Files、（Text 形式で出力する場合はChannels）を Choose ボタンを押して、選択します。
④ Submit export ボタンを押します。

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202312⑤ ステータスバーが表示されます。完了するとメール通知がくるので、Cytobank から離れても大丈夫です。
⑥ 一度エクスポートしたファイルは Experiment summary ページの Exported files セクショ
ンに表示され、いつでもダウンロードできます。
２-４-４-３Export Experiment to ACS：ACS 形式ファイルのエクスポート
Experiment に含まれるデータや illustrations、Attachment ファイルなどすべてをまとめてアーカイブ
化し、ACS ファイルとしてエクスポートします。エクスポートした ACS ファイルはダウンロードすることで、ローカルへ保存することができます。ファイルは Cytobank 独自フォーマットのため、他のソフトウエアでは機能しませんが、サーバーの異なる Cytobank へはアップロードすることで移行できます。また、90 日以上
Cytobank のライセンスを停止しサーバーから Experiment が削除された後に、ローカルに保存しておいた ACS ファイルをアップロードすることで復元することも可能です。
① Actions＞Export＞Export ACS をクリックします。
② その Experiment に紐づいている Experiment によっては下記の３つから対象を選択します。
-

Express export:その Experiment だけを ACS としてエクスポートします。

-

Export with advanced analysis：その Experiment＋Linked Experiment で紐づいている Advanced analysis をまとめて ACS としてエクスポートします。

-

Export with linked descendants: その Experiment＋Linked Experiment で紐づ
いているすべての下流 Experiment をまとめて ACS としてエクスポートします。

※情報量が多く出力に時間がかかるため、ファイル出力終了後にメールにて連絡が入ります。
２-４-４-４Export Sample Tags：サンプルタグ情報をファイルとしてエクスポート
Experiment の各 FCS ファイルにアノテーションした Sample tags の情報を csv ファイルとしてエクスポートして、Excel で一覧表表示し、編集や tags を追加することができます。編集後は表を.txt、.csv または.tsv で保存し、Upload sample tags でアップロードして Experiment に適用することができます。

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202312２-４-４-５Export Gating-ML：ゲート情報を Gating-ML ファイルとしてエクスポート
Cytobank では、International Society for Advancement of Cytometry（ISAC）によって開発された Gating-ML 2.0 の規格を採用しています。Gating Editor で作成したゲート情報（最後に Apply gates ボタンを押して保存した Experiment gate のバージョン）をファイルとしてエクスポート
し、ダウンロードして他の Experiment にインポートしたり、ローカルで保存や編集したりもできます。
２-４-４-６Download Files：fcs ファイルや Attachment ファイルをダウンロード
Experiment の FCS ファイルや Attachment ファイルを一括ダウンロードします。

① ダウンロードしたいファイルにチェックボックスを入れます。一番上のボックスですべてのファイルを一括オン/オフできます。
② Filename 隣のダウンロードアイコンをクリックすると、直接ダウンロードが始まります（ブラウザ経由で
OS の設定するフォルダへ保存）。
③ Zip&Download Files ボタンをクリックするとチェックボックスオンのファイルが一括ダウンロードの処理に入ります。ダウンロードリンクの記載されたメールが登録メールアドレスに届きます。
※合計サイズが大きすぎる場合、エラーとなりメールも届きません。１日経過してもメールが届かない場合
はファイル数を減らすか、Export events にて FCS フォーマットでのエクスポートをご検討ください。
※メールのリンクには有効期間（半日程度）があり、期限を過ぎるとエラー画面が表示されます。
２-４-５ Link to parent：Experiment のリンク付けと解除
任意の Experiment を関連する Experiment（親）として紐づけ（リンク）したり、解除したりすることができます。リンクされると Experiment Summary 画面の Linked experiments の相関図に親Experiment として表示されます。
※下流の Experiment を残し、親または上流の Experiment を削除したい場合は、この機能で先にリンクを解除してから、削除を実行してください。
２-４-５-１任意の Experiment を親としてリンク付けする① リンクを解除したい Experiment の子（下流側）Experiment を開きます。
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202312② Actions > Link to parent をクリックします。
③ Select an experiment to link as parent で親 Experiment を指定します。
※フィルターボックスに名前や Experiment ID 入力すると便利です。

④ Apply changes を押します。
２-４-５-２親 Experiment からリンクを解除① リンクを解除したい Experiment の子（下流側）Experiment を開きます。
② Actions > Link to parent をクリックします。

③ OK を押します。

２-４-６Reset：Experiment を初期化
２-４-７Delete：Experiment を削除
Experiment は Trash（ゴミ箱）へ移動します。

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202312

２-５スケール調整
メニューバーの Scales で、スケール調整を行うことができます。

※Advanced analysis では、スケール調整が大きな影響を及ぼしますので、実行前に確認し、必要な場合調整を行ってください。
２-５-１スケールの種類
以下の３種類が選択できます。
-

Linear-Log-

Arcsinh：Biexponential, logicle, hyperlog 等と同じく 0 近傍がリニア、それ以降がLog のハイブリッドなスケールの表示形式で、パラメータ Argument は０近傍のリニア幅を調整するパラメータです。

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202312２-５-２スケール調整画面：Scale Editor① 入力する文字列でリストをフィルター表示することができます。
② Type、Arg.、Minimum、Maximum の各項目をクリックすると、選択または数値入力で変更することができます。
③ まとめて変更したい場合は、表左の□にチェックを入れ、Bulk edit scales for all selected andunfiltered channels で変更したい項目を変更し、Apply ボタンを押して適用します。
④ Channel 名にオーバーカーソルで表示される目玉マークをクリックすると、右側にそのチャネルのプロットが表示されます。
⑤ 他の Experiment のスケール設定を適用したい場合に、元となる Experiment を選択します。
⑥ Reset All Scales ボタンを押すとリセットできます。

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202312

２-６コンペンセーション（蛍光補正）
コンペンセーションはメニューバーの Compensation ボタンで設定ができます。

※Cytobank ではコンペンセーションは機器ソフトウエアや Kaluza などで補正を済ませた FCS ファイルをインポートし、File-internal compensation でお使いになることを基本的には強くお奨めいたします。
※コンペンセーションの再調整が必要なデータセットの場合は、解析を始める前にコンペンセーションを実施ください。Advanced analysis では用いるコンペンセーションを変更できなくなっております。
２-６-１Compensation Editor
Experiment で使用するコンペンセーションマトリックスを Experiment compensation:のプルダウンメ
ニューで選択できます。FCS ファイルに記載されているコンペンセーションマトリックスを用いる場合は Fileinternal compensation を選択します。

２-６-２新規にマトリックスを作成する① New matrix ボタンをクリックします。

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202312② コンペンセーションに用いるパラメータをすべて選択し、Create Compensation ボタンをクリックします。
③ Name 部分にマトリックス名を入力し、ボックス右の Rename ボタンを押します。
④ マトリックスに値を入力します。
⑤ 作成したマトリックスを Experiment に適用するには、Experiment compensation:のプルダウンメニューで選択します。
２-６-３マトリックスをインポートする
Experiment 内のある FCS ファイルに記載されているマトリックスや他の Experiment で使用されているマトリックス、他のソフトウエアで作成した CSV 形式のマトリックスファイルをインポートすることができます。
同一のマトリックスが全ファイルに適用されます。
① import ボタンをクリックします。
② Import new compensation(s)ウィンドウが表示されます。
③ インポート元を選択します。
-

File-internal compensation：どのファイルに記載されているマトリックスをインポートするかを選択します。

-

Experiment：アクセス可能な Experiment がリスト表示されるので、Experiment 名や ID から選択します。

-

CSV File：Choose file for upload ボタンから CSV ファイルを選択します。

④ Import compensation ボタンを押してインポートします。

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202312

２-６-４自動コンペンセーション① Automatic ボタンをクリックします。

② Automatic compensation ウィンドウが表示されますので、コンペンセーションに用いるパラメータを選択します。
③ 各パラメータチャネルのポジティブとネガティブコントロールのファイルを与えます。Cytobank で自動振り分けをしますが、正しく割り当てられているかご確認ください。
④ Calculate Compensation ボタンを押します。
⑤ 算出された値の入ったマトリックスとその下に各コントロールファイルのポジティブゲートとネガティブゲー
トが表示されます。

⑥ マトリックスの値は、セルをクリックして値を入力し、微調整することができます。その下の各コントロール
ファイルのゲートは変更できません。

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202312

２-７データ QC：PeacoQC
２-７-１自動データ QC ツール：PeacoQC とは
Peak Extraction And Cleaning Oriented Quality Control (PeacoQC) アルゴリズムはフロー、マス、スペクトルデータ（スケール調整、コンペンセーション/アンミキシング済）でワークし、測定時のク
ロッグ、一時的なインテンシティや流速の変化といった望ましくない状態のときのシグナルの変化をデータから除外することができます (Emmaneel et al., 2022)。このアルゴリズムでは、isolation tree（IT）と mean absolute deviation distance(MAD)よって除くべき異常値のイベント検出し、除去します。
シグナル強度の変化は誤って新規のポピュレーションに見えてしまうなど、データ解析者をしばしば翻弄する原因となってしまっています。そのような異常なイベントを除いてから解析を始めることは、結果の質と信頼性を高めます。Cytobank の PeacoQC：QC プロセスなら、自動的に異常イベントを除去した“Clean”ポピュレーションを作成してくれます。

Emmaneel A, Quintelier K, Sichien D, Rybakowska P, Marañón C, Alarcón-Riquelme
ME, Van Isterdael G, Van Gassen S, Saeys Y. PeacoQC: Peak-based selection ofhigh quality cytometry data. Cytometry A. 2022 Apr;101(4):325-338. doi:
10.1002/cyto.a.24501. Epub 2021 Oct 3. PMID: 34549881; PMCID: PMC9293479.
こちらのガイドビデオもご参照ください。
２-７-２PeacoQC 設定・実行① メニューバー＞Data QC をクリックし、PeacoQC 名を入力します。
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202312② FCS files ボックスの Choose ボタンをクリックし、ファイルを選択します。選択できるファイルは Time
パラメータを有していて、かつ 500 MB 未満です。500MB 以上のファイルは Time スライス（横軸Time でゲートを作成し、Clone 機能の Split files by populations で分割）が必要となります。800 万細胞以上 1500 細胞未満の細胞イベントのファイルは実行できません。

③ Channels ボックスの Choose ボタンをクリックします。Time チャネルは自動的に選択されています。少なくとも２チャネルを実行対象に選択します。

④ 必要な場合 Advanced settings を設定します。

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202312

Remove margins：ON にするとダイナミックレンジ外のすべてのイベントを除去します。サイト
メトリーデータでは自動で ON に設定されます。スペクトルサイトメトリーデータではデフォルトではOFF になっていて、必要な場合 ON に変更することもできます。マスサイトメトリーデータの場合は自動的に OFF で、ON は選択できないようになっています。

-

Anomaly detection method：異常イベントの検出と除去に用いる方法の選択を行います。デフォルトでは２つの方法の両方（Both）に設定されています。
１つ目の方法である IT（isolation tree）は Time パラメータ上の各ビンについてイベント
が、密度ピーク内にあるか外れているかで判断します。この方法は微妙な変化を検出できない
ことがあります。
２つ目の方法である MAD（mean absolute deviation）は、密度ピーク範囲内イベントの中央値を用いて算出された平均絶対偏差に対して設定値の倍数より大きいイベントをすべて除去します。

-

MAD parameter：デフォルトの設定値は６です。下げると基準を厳しくすることができ、上げると緩めて除去されるイベント数を減らすことができます。

-

IT Limit parameter：isolation forest tree の構築時に、標準偏差についてどの程度を外れ値とするかに影響します。デフォルトは 0.6 で値を下げるとより厳密になります。

-

MAX bins：PeacoQC プロセスでは Time パラメータについて bins を作成します。各 binについて評価をして、上記の検出方法で異常があるとされた bin を丸ごと除去します。範囲は40 から 1,000,000 で、デフォルトは 500 です。ほとんどのケースではデフォルト設定で良好であるため変更することはおすすめしません。

-

Consecutive bins：異常 bin と異常 bin の間の bin が設定値以下だった場合、間のbin も削除します。これはノイズ領域の bin が他の安定領域の bin と類似する場合にアルゴリ
ズム厳密性が不十分になるためで、値を上げるとより多くのビンを除去します。デフォルトは５です。

⑤ Transformations でスケールとコンペンセーションが適切に適用されているかを確認します。Data
scaling で File internal が設定されている場合は、各ファイルの＄PnR を読み込んで最大値と最小値を使用します。Compensation では Experiment compensation に設定されているコ
ンペンセーションが使用されます。

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202312

２-７-３PeacoQC 結果の評価
２-７-３-１PeacoQC 結果画面ページでの評価① PeacoQC が完了すると自動的に結果画面が表示されます。通知メールのリンクボタン、またはActions>View summary の Data QC セクションから、PeacoQC 結果をクリックします。

② PeacoQC 結果画面には、PeacoQC report と Download run info and plots ボタンがあります。

③ PeacoQC report には各 FCS ファイルについて、以下の情報が数値で表示されているとともに、結果を把握しやすいようにカラーヒートマップになっています。表示される項目は Advanced settings
で選択した方法や値によります。
-％ Remove margins：margins によって除去された細胞イベントの％46

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202312% Full analysis：すべての方法（IT・MAD の合計＋consecutive cells）によって除去された細胞イベントの％-% IT analysis：IT によって除去された細胞イベントの％-% MAD analysis：MAD によって除去された細胞イベントの％-% Consecutive cells：Consecutive cells によって除去された細胞イベントの％-Incre/Decre：シグナル強度の上昇/下降傾向の有無※Time に対するシグナルの単調な上昇/下降傾向を PeacoQC は検出し表示しますが、異常値としては扱いません。ファイルに含まれる細胞数が少ない場合、この機能が過度に働く場合がありますのでご注意ください。
④ より詳細な情報を確認したい場合は、Download run info and plots ボタンをクリックして、Zip
フォルダをダウンロードします。
⑤ フォルダを開くと以下のようなファイル類が保存されています。

⑥ このフォルダには上述の PeacoQC report の PDF ファイルとその数値情報の tsv ファイル、run
information と Log のファイルと plots フォルダが保存されています。Plots フォルダには
PeacoQC にかけた FCS ファイルごとの png ファイルが保存されており、設定で選択したすべてのチ
ャネルについて X 軸 Time の密度ピークが含まれています。
密度ピークの背景が白の領域は異常なしで、ピンク色の領域は IT、紫色は MAD、薄ピンク色はconsecutive cells によって異常が検出され、除去された領域となります。

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202312

２-７-３-２PeacoQC 結果が作成した FCS ファイルを用いた Cytobank での評価
① PeacoQC が完了すると、「オリジナルの FCS ファイル名_QC.fcs」という名前のファイルが自動的に作成されます。このファイルには anomaly という名前のパラメータが追加されており、オリジナルのFCS ファイルとは異なるパネルに割り当てられています。メニューバーの Sample tags＞Assign
panels で確認することができます。オリジナルの FCS ファイルは Original pre-QC files Panelに、作成された FCS ファイルは Cleaned files panel に割り当てられています。Visible にチェックを入れると Experiment で扱うことができるようになります。デフォルトでは Cleaned files panel
だけが Visible に設定されています。
② Gating Editor を開くと Gates に Anomaly と Clean のゲートとポピュレーションが自動作成されているのを確認できます。Clean ゲートをクリックすると、PeacoQC が自動作成した Anomaly パラ
メータが X 軸のプロットが表示され、％を確認することができます。異常イベントが除去された Clean
ポピュレーションから、マニュアルゲーティングや機械学習解析を開始すると良いです。

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202312③ メニューバー＞illustrations＞all saved を開くと、２つの illustration が自動作成されているのを確認できます。
-

PeacoQC Quality Check – Event count ration heatmap を開くと、Clean 前（Ungated）に対して後（Clean）の細胞数比（Fold of event count）がヒートマップ
で表示されます。PeacoQC によって細胞数がどのくらい減ったかを把握できます。

-

PeacoQC Quality Check-Cleaned and Anomaly events comparison は、Time
パラメータが X 軸、最初のチャネルパラメータが Y 軸のドットプロットが表示されます。列に FCS
ファイルが、行に Ungated、Anomaly、Clean ポピュレーションが並び、異常イベントがどのく
らい、どのように発生しているかを把握できます。

２-７-４実行上限の目安
他の解析アルゴリズムと同様、サーバーの計算処理リソースを超えるデータセットの場合、PeacoQC が完了せず Failed となります。
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202312

データセットの合計のサイズ上限は明らかとなっていませんが、以下のようなファイルが１つでも含まれる場合は実行できないようになっています。
-

500 MB 以上 /ファイル-

500 チャネル以上 /ファイル-

800 万細胞以上 /ファイル-

1500 細胞未満 /ファイル-

細胞イベント数とチャネル数の組み合わせが下表を超えている場合

PeacoQC が Failed になるのには、チャネル数とイベント数（１ファイルあたりの）が大きく影響します。
細胞数とチャネル数の下図に示すとおり、緑色は緑色が問題なく完了できる範囲、黄色が Failed となる可能性のある範囲、赤色がメモリオーバーで Failed になる範囲です。

黄色の領域の設定がされている場合は、メモリ上限のため Failed になる可能性があるという Warning
メッセージが表示されます。この時点でイベント数や対象ポピュレーションを削減することも可能です。
赤色の領域の設定がされている場合、設定したチャネル数での上限細胞イベント数を伝えるメッセージが表示されます。このアドバイスに従って選択対象を減らすことで、実行可能となります。

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２-８ゲーティング
２-８-１Cytobank でのゲーティングとポピュレーションの定義
Cytobank ではゲートを作成すると同時に同名のポピュレーションを自動作成し、作成されたポピュレーシ
ョンはポピュレーションとして扱います。
ゲート内容（位置やサイズの変更など）とポピュレーションは連動しますが、ゲート自体を削除してもポピュレーションは削除されなかったり、ゲート名を変更してもポピュレーション名はそのままだったりします。
ゲートとポピュレーションを分けて扱えるようにすることで、あるゲーティングを後から上流に挿入したり、ある
ゲートの NOT や OR を各々別名のポピュレーションとして設定したりすることができます。
メニューバーの Gating ボタンをクリックすると、Gating Editor と Gating hierarchy が選択できます。

２-８-２サーバー保存のタイミングと Experiment gate 情報としての保存
Cytobank では Gating Editor の変更を常にサーバーで保存しています。これに加えて Apply gates
ボタンを押した時の情報を Experiment gate 情報としてバージョン保存も行います。Gating Editor
以外の機能では、保存された最新の Experiment gate 情報のみを使用します。過去のバージョンのExperiment gate 情報は Cytobank からはアクセスできません。
Apply gates で Experiment gate 情報を保存しない状態で他の機能へ移動しようとするとメッセー
ジが表示されます。
２-８-３Gating Editor:ゲーティング画面の各機能

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202312① Apply gates ボタン
Gating Editor の状態を Experiment 全体に適用（Apply）するボタンです。
Cytobank では Gating Editor の変更を都度サーバーで保存しています。これに加えて Apply
gates ボタンを押した時の情報を Experiment gate 情報としてバージョン保存も行います。
Gating Editor 以外の機能では、保存された最新の Experiment gate 情報のみを使用します。過去のバージョンの Experiment gate 情報は Cytobank からはアクセスできません。
② ゲーティングツール
プロットにゲートをかけるためのツールです。左から四角形・円形・ポリゴン・クアドラント（四分割）・
スプリッド（二分割）・レンジゲートです。
③ Import gates ボタン
他の Experiment のゲート情報や Gating-ML をインポートします。
④ Cluster gates ボタン
クラスターチャネルを用いてクラスターゲートを自動作成します。
⑤ Reset all ボタン
ゲートやポピュレーションのすべての情報をリセットします。Undo はできません。
⑥ Compensation
適用されているコンペンセーションマトリックス名が表示されています。鉛筆アイコンをクリックするとCompensation Editor に移動し、Experiment compensation を変更することができます。
⑦ Gates リスト
作成されたゲートのリストが表示されます。Cytobank ではゲートは囲いの XY 座標情報であるだけ
で、階層構造の情報はここには反映されません。ゲートを組み合わせて使用して定義した階層構造
はポピュレーションとして扱います。
Gates 名部分にオーバーカーソルするとメニューが表示され、左から、ゲート名の変更（鉛筆マーク）、Gate tailoring（T マーク）、Check gates（五角形と四角アイコン）、ロック（錠前マーク）、削除（ゴミ箱アイコン）ができるようになっています。
Filter displayed ボックスで文字列の一致する Gates だけを表示することもできます。

⑧ Population
プロットに表示する対象のポピュレーションを示しています。クリックすると作成されたポピュレーションのリストが表示され、選択して変更することができます。
⑨ File52

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202312

プロット表示しているファイルを示しています。左右の矢印をクリックして表示ファイルを変更することができます。
⑩ Plot settings
クリックするとプロット設定を変更できます。

Plot type：プロット種類
Gate label：ゲートとともに表示する情報
Plot colors：カラー表示のパレット
Kernel smoothing：スムージングの強度
Percent per contour：等高線幅の％Outliers start at：何％以下の密度をドット表示とするか⑪ Population tree
ポピュレーションの階層構造⑫ Boolean expressions (旧 Population manager 機能を含む)作成されたポピュレーションの一覧と編集・新規作成ができます。
⑬ Sunburst view
ポピュレーションの階層構造と％分布を Sunburst プロットで表示します。
２-８-４プロットに表示されるイベント数が多すぎる場合：Time SliceFCS ファイルに含まれる細胞イベント数が多すぎてそのままではゲーティングが困難な場合、Time sliceをして表示イベント数を減らして下流のゲーティングを行い、作成したゲートを Time slice なしの元ポピュ
レーションに適用することができます。
① X 軸を Time にしたプロットを表示します。
② 適当なイベント数になるように Time slice ゲートをかけます。
③ プロットの上にある Population メニューで Time slice を選択し、X・Y 軸をゲーティングしたい設定に変更します。

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202312④ 少なくなったイベント数のプロットでゲーティングを行います。

⑤ Time slice の下に作成されたポピュレーションについて Boolean expression の expression
で、設定されている population を Time slice から元ポピュレーションに変更することで、元ポピュ
レーションでの展開とすることができます。
２-８-５測定中の異常イベントのクリーンアップ
測定時のクロッグ発生や、機器トラブルで途中のデータが正常でないようなデータの場合、安定して測定できている領域にだけ Time slice をかけることで、解析の信頼性を向上させます。

自動検出・除去をしてくれるデータ QC：PeacoQC もおすすめです。
２-８-６ゲーティング後のコンペンセーション/チャネル変更：Hidden gate
Cytobank ではゲーティング後にコンペンセーションの変更や修正、チャネルの変更を行うとそのゲートは隠れゲート(Hidden gate)となり、ゲートが表示されなくなります。

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202312

隠れゲートとなったものはゲーティング画面のゲートリストのゲート名に斜線の目玉マークが付きます。コンペ
ンセーションやチャネルをオリジナル（ゲートを作成した時の設定）に戻すと解除されます。

Hidden gate をクリックすると、理由がコンペンセーションの場合は赤い Warning メッセージが表示されますので、右上の compensation から、適用する Experiment compensation をオリジナルに戻してください。
理由がチャネルの場合は、X または Y 軸パラメータが Undefined for current panel と表示されます。

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202312２-８-７Boolean expression：ポピュレーションの定義と編集
Cytobank ではポピュレーションを（複数の）ゲートやポピュレーションの Boolean 式で定義するものとしています。例えばゲート A の集団（ポピュレーション a）の内のゲート B をポピュレーション b とする場合
は、ポピュレーションｂ＝ポピュレーション a AND ゲート B となります。

使用できる演算子は AND 、NOT、OR で、カッコを用いた式を作成し複雑なポピュレーションを定義することもできます。
２-８-７-１設定方法① Gating Editor 画面の右側 Population tree タブと Sunburst view タブの近くにある
Boolean expression タブを開きます。
② 作成されたポピュレーションとそのポピュレーションを定義する式（Expression）のリストが表示されます。デフォルトではゲート名と同名のポピュレーションが作成されています。Population 欄のポピュ
レーション名で鉛筆マークをクリックすると名前を変更することができます。
③ 各ポピュレーションは通常、ポピュレーション・Boolean 演算子・ゲートの組み合わせの式で定義されています。Expression 欄では、ポピュレーションは水色、ゲートは灰色のボックスで表示されています。Expression 欄のポピュレーションをマウスオーバーすると、そのポピュレーションを定義している式が吹き出し表示されます。式に入れられる要素は最大 50 です。

④ ポピュレーションの定義を編集するには、Expression 欄の各要素をクリックするか右端の＋マークをクリックして Expression builder を表示させ、変更または追加したい項目（カッコ、演算子、ポピュレーション、ゲート）を選択して式を編集します。
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202312⑤ リスト上にある New population ボタンをクリックすると新規ポピュレーションを作成して、式を作ることもできます。

⑥ ポピュレーションがたくさんある場合は New population ボタン左の Filter displayed ボックスで、文字列の一致するものだけを表示することもできます。
⑦ Population 欄のポピュレーション名の鉛筆アイコンをクリックすると名前を変更できます。

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202312⑧ リストの左端にあるボックスにチェックを入れると、複数のポピュレーションにまとめて Prefix：接頭に追加、Suffix：末尾に追加、Copy：コピー、Delete：削除をすることができます。

２-８-７-２AND 演算子
階層的なゲーティングストラテジーを作成するには、AND 演算子を用いて親ポピュレーションと新規ゲートを組み合わせます。典型的な例としては、CD3+ゲートを作成した後にその下に CD4+ゲートを作成した
場合は、CD3+ポピュレーション AND CD4+ゲートの新規のポピュレーション（CD3+CD4+）が作成されることになります。

また、AND 演算子を用いて複数のゲートの重複する領域に位置する細胞イベントを同定することもできます。例えば CD33+ポピュレーションについて、pSTAT3+と pp38+の２つをゲーティングして、
CD33+pSTAT3+と CD33+pp38+の２つのポピュレーションが作成された後に、CD33+pSTAT3+
ポピュレーションに AND 演算子で pp38+ゲートを追加すると、トリプルポジティブのポピュレーションを作成することができます。

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202312２-８-７-３NOT 演算子
NOT 演算子はその後ろのポピュレーションに含まれる細胞イベントを除外します。例えば
CD33+pSTAT3+と CD33+pp38+の２つのポピュレーションを作成し、その後、ポピュレーション pSTAT3+ NOT pp38+を作成すると、pSTAT3 だけが陽性の集団とすることができます。

２-８-７-４OR 演算子
OR 演算子はすべてのポピュレーションの細胞イベントを含みます。例えば CD33+pSTAT3+とCD33+pp38+の２つのポピュレーションを作成し、59

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202312

その後、ポピュレーションｐSTAT3+ OR pp38+を作成すると、どちらかまたは両方に属する細胞イベン
トすべてを含みます。

２-８-７-５カッコ（）を用いた組み合わせ
カッコを用いることで、ひとつの演算子を用いた式だけでなく複雑な式を作成することできます。式に使用できる要素は 50 個以下です。
２-８-８Check gates:ゲート位置の一括確認
Gate tailoring で Per File（TPF）をしている時など、設定したゲートがすべてのファイルに適切にかかっているかを一括で確認する方法です。
① Gates リストでチェックしたいゲートをオーバーカーソルすると、ゲートメニューが表示されます。
② メニューの左から３つめの Check gates ボタンをクリックします。

③ 別タブでウィンドウが開きすべてのファイルに適切にゲートがかかっているかを確認することができます。
※最後に Apply gates ボタンを押して保存した Experiment gate 情報が読み込まれますので、表示がおかしい場合は Apply gates ボタンを押してから再度確認ください。
２-８-９Gate tailoring：ファイルや親集団でのゲート位置調整
ゲートを作成すると、デフォルトでは自動でそのゲートをすべてのファイルに適用します（Globalmode）。特定のファイルや親ポピュレーションでのゲート位置だけを変更したい場合は Gate tailoringを使用します。
ファイルによってゲート位置を調整したい場合は Per File を、親ポピュレーションによってゲート位置を調整したい場合は Per Population を使用することでゲート位置を調整することができます。
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２-８-９-１ファイルによってゲート位置を調整したい場合：Per File（TPF）① 表示するファイルを調整したいファイルに変更します。
② Gates リストでゲートをオーバーカーソルし、表示されるメニューの左から２つめ T のボタンをクリック
し、Per File を Global から Tailored にします。

③ プロット上でゲート位置を変更します。
④ 変更後のゲート位置を複数のファイルに適用したい時は Apply tailored gate ボタンを押して、適用したいファイルを選択し、Apply ボタンを押します。
⑤ Tailored を解除したい場合は、戻したいゲートのファイルを表示した後、Per File を Global に戻します。
２-８-９-２親ポピュレーションによってゲートの位置を調整したい場合：Per Population（TPP）
例えば IL10 刺激前後で pSTAT3 反応する細胞％を CD33+monocytes と CD4+T cells について解析したい場合、Global mode では片方に合わせるともう片方が合わなくなってしまいます。

これを解決するため、pSTAT3+ゲートを親ポピュレーションである CD33+monocytes と CD4+T
cells とで異なるゲート位置に調整する必要があります。
このような場合に Gate tailoring の Per Population が有用です。
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202312① ゲートを作成します。
② Gates リストでゲートをオーバーカーソルし、表示されるメニューの左から２つめ T のボタンをクリック
し、Per Population を Global から Tailored にします。

③ Population を調整したい親ポピュレーションに変更します。
④ プロット上でゲート位置を変更します（変更しないと正常に機能しません）。
⑤ 変更後のゲート位置を他の親ポピュレーションに適用したい時は Apply tailored gate ボタンを押して、適用したい親集団を選択し、Apply ボタンを押します。

⑥ 各親ポピュレーションの下に TPP ポピュレーションが作成されます。Population tree や Boolean
expression タブで確認することができます。
※TPP は Boolean expression で編集することはできません。編集が必要な場合は一度
Global に戻す必要があります。

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202312⑦ Illustrations 機能で並べて表示することもできます。

２-８-９-３ファイルと親ポピュレーションの両方によってゲート位置を調整する：TPF&TPP
厳密なゲーティングが必要な場合は、ファイルと親ポピュレーションの両方によって異なるゲート位置が必要になります。そのような場合は、TPF と TPP を組み合わせで使用すると良いです。
① Gates リストでゲートをオーバーカーソル＞Gate tailoring ボタンを選択＞Per File と Per
Population の両方を Tailored にします。

② この後変更したすべてのゲートは、そのファイル・親ポピュレーションの場合での位置となります。設定
原理は TPF、TPP と同じです。
③ 位置を調整したゲートを複数のファイル・親ポピュレーションの場合に使用したい時は、Applytailored gate ボタンを押します。

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202312④ ファイルと親ポピュレーションのリストからゲートを適用したいものを選択して Apply ボタンをクリックします。

２-８-９-４複数の子ポピュレーションをまとめて他の親ポピュレーションの下にも展開する
定量的な比較を行う場合、ある親ポピュレーションで展開した子ポピュレーション解析を他の親ポピュレー
ションでも展開したいことがよくあります。
例えば、CD19+B cells 下の 3 つの機能性マーカーの展開を、CD4+T、CD8T、CD33+Mono でも展開し、％ポピュレーションを調べたい場合などです。

Boolean expression で、３つの子ポピュレーションをコピーして編集する方法もありますが、TPP とApply tailored gate 機能での以下の方法もあります。
① 子ポピュレーション（例えば pSTAT5+）のゲートを Gates リストで選択し、Gate tailoring の
Per Population を Tailored にします。
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202312② Apply tailored gate 機能で CD4+T、CD8+T、CD33+Mono を TPP の対象親ポピュレー
ションにして Apply ボタンを押します。
③ すべての親ポピュレーションの下に pSTAT5+が作成されたことを確認します。

④ 残りの２つの子ポピュレーションについても同様にして作成します。

⑤ Cytobank のゲートとポピュレーションの定義のとおり、TPP で自動作成されたポピュレーションはその後独立するため、もし子ポピュレーションの位置を親ポピュレーションによって微調整せず同じにしたい
場合は、適用したいゲート位置のものをプロットに表示した後に、Per Population の Tailored を
Global に戻すことですべての親ポピュレーションで同じゲート位置になります。
※TPP が適用されているポピュレーションはその下流も含めて Boolean expression で編集ができなくなる仕様です。

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202312２-８-１０ポピュレーションの階層構造の確認と編集
Cytobank ではゲートを作成すると同時に同名のポピュレーションを作成し、作成されたポピュレーションはポピュレーションとして扱います。ゲート内容（位置やサイズの変更など）とポピュレーションは連動します
が、ゲート自体を削除してもポピュレーションは削除されなかったり、ゲート名を変更してもポピュレーション
名はそのままだったりします。
この場合は、Population tree タブや Boolean expression タブでポピュレーションを選択し、Delete
ボタンでポピュレーションを削除したり、ポピュレーション名の部分の鉛筆マークをクリックして名前を変更した
りします。
２-８-１０-１Boolean expression: ポピュレーション一覧とその編集
Gating Editor 右の Boolean expression タブを開くと Population と Expression の表が表示されます。ここでは各ポピュレーションの削除・コピー・新規作成や名前の変更、ポピュレーションの定義（他のポピュレーション、ゲート、Boolean 演算子で構成される式）を編集することができます。
ポピュレーションがたくさんある場合は New population ボタン左の Filter displayed ボックスで、文字列の一致するものだけを表示することもできます。
詳細は Boolean expression を参照ください。

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202312２-８-１０-２Population tree: ポピュレーション階層構造表示
Gating Editor でゲートを作成すると、同名のポピュレーションも自動的に作成され、その後独立に扱うことができます。中央のプロットを挟んで左側がゲーティング、右側がポピュレーションとなっています。

ポピュレーション側はデフォルトでは Population tree タブが表示されており、ポピュレーションの階層構造が表示されています。階層レベルに沿って名前、％ of parent、細胞数が表示されています。
オーバーカーソルすると編集メニューが表示され、名前の変更やコピー、削除をすることもできます。
クリックで複数選択もでき、上部に表示されるメニュー（Prefix：接頭に追加、Suffix：末尾に追加、Copy：コピー、Delete：削除）で一括編集もできます。

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ここで表示されるポピュレーション名、％ of parent、細胞数の一覧の数値情報が必要な場合はExport statistics で csv ファイル出力できます。
２-８-１０-３Sunburst 表示
Population Sunburst タブを開くとポピュレーション階層と統計情報を多重円グラフで表示します。
① オーバーカーソルでそのポピュレーションの数値情報を表示することができます。
② ポピュレーションをクリックすると、そのポピュレーションを 360°で表し、下層の構成比率を感覚的に把握しやすくします。
③ 上位層を 360°にしたい場合は左上のバーをクリックします。

④ 左にある Palette：で表示するカラーパレットを変更できます。デフォルトは blue になっています。

⑤ Print view ボタンでは別タブで Sunburst だけを表示します。
⑥ Export to PDF ボタンでは、PDF ファイルとしてダウンロードできます。

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202312２-８-１１ゲーティングストラテジーの自動表示：Gating hierarchy
表示したいファイルとポピュレーションを指定すると、そのポピュレーションがどのようなゲーティングストラテジー
で作成されたのか、上流のゲーティングを自動的に一括表示することができます。
展開図を作成する手間を省くことができるだけでなく、途中のゲーティングを取り違えることがないため、確認だけでなく、レビュアーによる評価にも便利です。
① メニューバー＞Gates＞Gating hierarchy を選択します。
② FCS Files ボックスの Choose をクリックし、表示したいファイルを選択します。
③ Populations ボックスの Choose をクリックし、確認したいポピュレーションを選択します。
④ 選択したポピュレーションに至るゲーティングストラテジーがファイルごと、ポピュレーションごとにすべて表示されます。
⑤ 出力が必要な場合は Print view ボタンで別タブ表示後、ブラウザの印刷機能で PDF 出力もできます。

２-８-１２ゲート情報のインポート
インポートできるゲート情報は Experiment gate 情報です。
インポート元とコンペンセーションとチャネルの設定が異なる場合は Hidden gate となります。

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202312２-８-１２-１他の Experiment のゲート情報をインポート① Gating Editor メニュー＞Import Gates＞Import from another experiment をクリックします。

② インポート元となる Experiment の名前か Experiment ID で検索し、選択して Import
Gates ボタンを押します。

③ インポート結果が表示されます。
④ Gating Editor に移動するとインポートされたゲートが確認できます。
⑤ 問題なければ Apply gates ボタンを押して Experiment gate 情報として保存します。
※現時点では、ゲート情報はすべて Global としてインポートされ、Tailored gates は解除されます。
Gates リストの T マークも表示されなくなります。テンプレートとして使用して、Gate tailoring での微調
整や、Boolean expression での編集が必要な場合もあります。
Tailored gates もインポートで反映したい場合は、Gating-ML でインポートしてください。
２-８-１２-２Gating-ML のゲート情報をインポート
Cytobank では、International Society for Advancement of Cytometry（ISAC）による
Gating-ML 2.0 の規格を採用しています。
① Gating Editor メニュー＞Import Gates＞Upload gating-ML または、Actions＞
Upload> Upload gating-ML をクリックします。

② Gating-ML ファイルを指定してアップロードします。
③ インポート結果が表示されます。
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202312④ Gating Editor に移動するとインポートされたゲートが確認できます。
⑤ 問題なければ Apply gates ボタンを押して Experiment gate 情報として保存します。
Gating-ML ファイルのエクスポート方法もご参照ください。その際、Experiment gate の情報がGating-ML としてバージョン保存されることにご留意ください。
※Gating-ML ファイルは text editor で開いて編集が可能です。編集が必要な場合はサポートまでご相談ください。

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２-９Sample tags:サンプルタグ
２-９-１サンプルタグとはサンプルファイルの背景（疾患状態や投与化合物、タイムポイントなどの実験変数）の情報をサンプルタ
グとして付加することができます。FCS ファイルにサンプルタグを付加することで、illustrations のレイアウト
項目として使用することができるので、統計比較をより簡単に迅速に行うことができます。

Experiment 内のサンプルタグは、Advanced analysis の結果 Experiment や、クローンにも引き継がれるのでデータをアップロードした段階でサンプルタグをつけておくことをお勧めします。
２-９-２サンプルタグのつけ方※事前にファイルの情報にどのようなサンプルタグを付加するかを決定しておくことをおすすめします。
① メニューバーの Sample Tags を開き、Add experiment dimensions をクリックします。
② Add experiment dimensions ウィンドウには Doses、Individuals、Timepoints などがデフ
ォルトとして用意されています。その他任意のサンプルタグを Define a custom dimension で設定することができます。左でアイコンを、中央にカテゴリー名を入力し、Submit ボタンを押します。

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202312③ Add カテゴリー名欄に設定したい条件（例タイムポイントの場合、経過時間など）をサンプルタグとしてコンマ区切りで入力します。
④ 各サンプルタグが作成されますので、該当するファイルをドラッグ＆ドロップまたは Move file to で移動して分類します。※入力した条件名とファイル名が部分一致すると自動で振り分けられます。
⑤ ②－④を繰り返して複数のサンプルタグをファイルに付加し、Illustrations のレイアウトに用いることができます。

２-９-３他の Experiment からのサンプルタグのインポート① 元 Experiment での dimension と同一名の dimension を Sample tags＞Add
experiment dimensions で作成します。
② Import from another experiment をクリックし、元 Experiment を指定して適用します。

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２-９-４サンプルタグの一括編集・追加
ファイル数や追加するサンプルタグが多い場合、下記の手順でサンプルタブを一括編集・追加をすることができます。
① Actions＞Export＞Export sample tags でファイルとデフォルトサンプルタグのスプレッドシートを
エクスポート、ダウンロードします。

② ダウンロードしたファイルをエクセル等で開き、追加したい dimension や tags を表に追加、編集
し、.txt か.csv、.tsv 形式で保存します。

③ Cytobank に戻り、②で dimension を追加した場合は、同名の dimension を Sample tags
＞Add experiment dimensions で作成しておきます。
④ Actions＞Upload＞Upload sample tags で②で保存したファイルをアップロードして読み込みます。

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２-９-５チャネルとパネル設定：Assign panels
２-９-５-１チャネルとパネルとはチャネルとはデータ取得時の機器チャネルです。機器の種類やメーカーによって定義は異なりますが、FCS
ファイルには２つの情報が記載されています。１つは detector name で Channel Name またはshort channel name と呼ばれます。もう１つは marker/reagent name で Long channelname とも呼ばれます。

Detector name/Channel Name/Short channel name は機器が自動的につけるもので、通常は変更できません。Marker/Reagent name/Long channel name は通常測定時に任意に設定できるもので、オペレーターが実験や研究対象によって自由に設定しています。
この Channel Name と Marker/Reagent のセットをパネルとしています。Cytobank では上図のようにセットの表で示し、FCS ファイルをアップロードした時、そのファイルに記載されている２つのチャネル情報を読み取り、同一のパネルを持つファイルをパネルごとにまとめます。FCS ファイルに記載されているチャネ
ルの数や２つの名前が同一でない場合、パネル/チャネルの不一致となります。
２-９-５-２パネル/チャネルの確認と編集① メニューバー＞Sample tags＞Assign panels を選択します。

② Experiment 内のパネルが表示されます。Experiment 内のパネルが自動作成されており、チャネ
ル数と Name（＝Detector name/Channel Name/Short channel name）、Reagent（＝Marker/Reagent name/Long channel name）が表として表示されます。また、同一のパネルを持つファイルは各パネルボックス下部にまとめられています。
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202312③ ファイル名左のボックスにチェックを入れて選択し、Move ボタンをクリックすると New panel（新規のパネルを作成し移動）や既存の別のパネルに移動を選択することができます。既存の別のパネルに移動したい場合は、移動先のパネルに表示される Move to…ボタンでも可能です。

④ デフォルトでは含まれる全てのパネルが visible となっており、解析に使用できるようになっています。
特定のパネルの visible のチェックを外すとそのパネルに属するファイルは解析に使用できなくなります。

⑤ パネルの Reagent 欄は Marker/Reagent name/Long channel name を読み取った情報が表示されているため、オーバーカーソルで表示される鉛筆マークをクリックすることで名前を任意に変更することができます。
⑥ パネルの削除はできません（属する FCS ファイルがなくなった場合自動でパネルもなくなります）。

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202312

２-９-５-３パネル/チャネルの不一致の解消方法
Cytobank の解析では基本的に同一のパネルであることを前提としています（Advanced Analysis では設定で使用するチャネルが同一であれば実行できるものも例外としてあります。）。下図のようなメッセージが表示されたら、パネル/チャネルの不一致があります。

不一致のケースとその解消は以下の４つとなります。Assign panels 機能で行います。
-

測定時に設定した Reagent 名の入力ミスや大文字小文字、スペースの有無、半角全角の違い
による不一致の場合（例”CD38” vs “cd38”）
・ メッセージをクリックすると Assign panels に移動し、解消提案が表示されますので、参考にしてパネルを同一にします。

-

ある Channel name について異なるマーカーを使用したファイルが含まれているため Reagent が不一致の場合（例”pSTAT3”と”pp38”）
・ パネルを分けます（または別のパネルを新規作成してそこへ片方を移動）。
・ 両方を含む Regent 名（例” pSTAT3＆pp38”）のパネルを作成してまとめます。どちらのReagent かはファイル名や下流の解析で判断します。

-

チャネル数がファイルによって不一致の場合
・ パネルを分ける（または別のパネルを新規作成してそこへ片方を移動）。
・ 機器から FCS ファイルを出力し直します。
・ サポートまでお問い合わせください。

-

Reagent は同一だが、Channel name が不一致の場合（例”FL1” vs “FL-1”）
機器ソフトウエアのバージョンアップ等によって出力される Channel name 名（Detector
name/Channel Name/Short channel name）が変わってしまった場合など
・ パネルを分ける（または別のパネルを新規作成してそこへ片方を移動）。
・ 機器から FCS ファイルを出力し直します。
・ サポートまでお問い合わせください。

２-９-６ファイル属性の管理
２-９-６-１ファイル属性とはCytobank では FCS ファイルを下記の３つの属性に分類します。
１．

Experiment Files：Experiment のすべての機能で表示され、使用することができます。

２．

Compensation Controls：Compensation 画面以外では表示されず、解析画面でも選択対象になりません。また、Assign panels 画面にも表示されません。
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３．

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202312Other Controls：FMO や isotype control、その他コントロールファイルのための分類です。
Gating Editor、illustration Editor、Sample tags では表示され、使用できます。一方、Advanced Analysis や Export statistics では表示されず使用もできません。

FCS ファイルをアップロードする時、ファイル名に beads や comp、FMO などが含まれていると自動的に分類されます。その他のファイルは Experiment Files に分類されます。
２-９-６-２Experiment にある FCS ファイルが解析画面で表示されない
コントロールファイルとご認識してしまうような文字列がファイル名にある場合や、機器から出力された FCS
ファイルでないファイルをアップロードした時、または、コンペンセーションコントロールファイルだがファイル名にcom を含まずコントロールファイルとして認識されない時には、手動で属性を変更することができます。
① メニューバー＞Sample tags＞Assign panels を開きます。

② Assign panels 画面上部の Configure control files をクリックします。
③ Configure control files ウィンドウで、各ファイルがどの属性かをラジオボタンで設定します。属性
名のボタンを押すと全てのファイルをその属性にすることができます。
④ Apply changes ボタンを押します。

※コンペンセーションコントロールファイルを含むデータ QC：PeacoQC の実行後は、オリジナルのコンペン
セーションコントロールファイルは Other Control になり、QC 後のファイルのみが Compensation
Control になります。これはこの後自動コンペンセーションを行う場合に混乱を避けるためです。
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２-１０Figure 作成（Illustrations; Event level plot）

Cytobank ではひとつのデータからのグラフを作成して並べるのではなく、Experiment 内のデータセットを
サンプルタグを含む項目（dimension）でレイアウト表示する仕様になっています。
Illustration Editor では図や統計表を作成することができます。操作による変更は、デフォルトではすべて自動保存されるようになっています。illustration を別名で保存することで Experiment 内に複数のillustration を作成し保存することができます。
メニューバーの Illustrations で画面を表示します。

２-１０-１ 新規 illustrator の作成① メニューバー＞Illustrations＞New illustration をクリックします。
② Illustration の名前を入力します。
③ Illustration Editor 画面に切り替わります。
④ Plots、Layout で illustration を作成し、Save や Export で保存設定や出力します。

２-１０-２ Plots 設定① Illustration Editor で Plots をクリックします。
② Plot type でプロットの種類を選択します。ここでは Event level plot について説明します。

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202312２-１０-２-１Dot Plot：ドットプロット

以下の項目を設定できます。
-

Overlaid：オーバーレイ表示のオン/オフします。

-

Concatenate：ファイル統合プロットの有無/設定をします。

-

Color by：プロットのカラー表示を以下から選択して設定します。
・Black＝黒色単色・Density＝細胞密度でカラー表示

・

Z-axis channel=Z-axis に設定したチャネル強度のカラー表示

・Overlaid dimension＝オーバーレイカラー表示（自動的にオーバーレイもオンになります）-

Palette：カラー表示のパターンを設定します。

-

Show gates：Gates ツールでのゲーティング表示をオン/オフします。Overlaid やConcatenate で Tailored par file ゲーティングをしている場合は、最初のファイルのゲート位置が表示されます（統計値等は Tailored の位置で計算されます）。

-

Size：プロットサイズを選択します。

-

More plot settings：プロットの詳細設定ができます。

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202312２-１０-２-２Histogram：ヒストグラム

以下の項目を設定できます。
-

Overlaid：オーバーレイ表示のオン/オフします。

-

Concatenate：ファイル統合プロットの有無/設定をします。

-

Fill color：プロットのカラー表示を以下から選択して設定します。
・

None：塗りつぶしなし

・Fixed：左のカラーウィンドウで塗りつぶし色を指定します。

※線の色を指定したい場合は More plot settings の Outline color で可能です。

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・

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202312（Overlaid 使用時のみ）Statistics：各ヒストグラムの統計値で色付けします。Fill
opacity%：透明度、Statistic：色付けに使用する統計（統計によってその下の項目が変わります）、Scale range：最大値・最小値の範囲（global=全体、Local＝Table ごと、Custom＝最小値・最大値を任意に設定）を設定できます。

・(Overlaid 使用時のみ) Overlaid dimension：凡例ごとに色を変えます。Fill
opacity%：透明度を設定できます。プロットの凡例カラーボックスをクリックして好きな色に変更することもできます。

・（Overlaid 不使用時のみ）Show gates：ゲートを表示します。Concatenate でTailored par file ゲーティングをしている場合は、最初のファイルのゲート位置が表示されます（統計値等は Tailored の位置で計算されます）。

-

Size：プロットサイズを選択します。

-

More plot settings：プロットの詳細設定ができます。

82Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312２-１０-２-３Contour：等高線

以下の項目を設定できます。
-

Concatenate：ファイル統合プロットの有無/設定をします。

-

Color by：プロットのカラー表示を以下から選択して設定します。
・

None：黒色の等高線

・Density：細胞密度についてカラー等高線で表示します。Palette でカラーパターン
を選択できます。

・-

Z-axis channel：Z-axis に設定したチャネル強度のカラー表示

Show gates：Gates ツールでのゲーティング表示をオン/オフします。 Overlaid やConcatenate で Tailored par file ゲーティングをしている場合は、最初のファイルのゲート位置が表示されます（統計値等は Tailored の位置で計算されます）。

-

Size：プロットサイズを選択します。

-

More plot settings：プロットの詳細設定ができます。等高線のスムージングや％、低密度ドット表示の設定もできます。

83Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312２-１０-２-４More plot settings
左側でプロットの詳細な設定ができます。上部は選択した設定で細かく異なりますため、お気軽にサポー
トまでお問い合わせください。共通する General セクションより下の項目について説明します。

変更は Apply changes ボタンで反映されます。
---

General：以下の設定をすることができます。
・Plot size：プロットのサイズ

・Show gates：ゲート表示

・Black background：プロットの背景を黒色表示

Axis markings：以下の表示非表示を選択できます。
・

Axis tick marks：軸目盛り

・Scale numbers：軸の数値

・Show axis labels：軸ラベル（X/Y）

・Axis labels：開くと Row/Column 毎に軸ラベルを表示するかを設定できます。

Statistics：以下を設定できます。
・

Statistic：使用する統計値を選択できます。
Event count：細胞数
Percentile: パーセンタイル値
Percent of population：％ポピュレーション
Median：中央値
Mean: 平均値
Geometric mean：幾何平均Standard deviation：標準偏差Variance：分散
Coefficient of variation: 変動係数84

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v.4.100

202312

Minimum：最小値
Maximum：最大値
Pearson correlation (X vs Y) ：相関係数
Percent in gate：ゲート内％（Gate を選択します）
Percentile distance(5to95) ：パーセンタイル５と 95 の間の値
Channel range：チャネル範囲
・Show tables of statistics：画面下部の統計表の表示非表示

・Highlight control cells：統計表のコントロールセルの色の有無

２-１０-３ Layout 設定① Illustration Editor の Layout をクリックします。
② Rows と Columns に割り当てるカテゴリー（例：FCS ファイル、populations など）をクリッ
クして選択します。サンプルタグの dimension も割り当てることができます。
③ カテゴリーの右の数字 of 数字をクリックし、レイアウト表示する項目を選択します。

②

③

⑥
⑤

④

⑦

⑧

④ ③の右にオーバーカーソルで現れる網掛けをドラッグ＆ドロップすると割り当てを上下に移動することができます。
⑤ （必要な場合）作成した Rows, Columns をカテゴリーでさらに縦または横に並べたい場合
は、Add dimension をクリックして Table を作成します。
⑥ Table の右の両矢印をクリックして並べ方を縦・横と変更できます。Concatenate を設定している場合は、矢印マークを統合マークに変更することでファイル統合プロット表示にすることができます。
⑦ Table も Rows, Columns と同様の変更を行うことができます。また、網掛けの右の☓ボタンで、削除することもできます。
⑧ Layout Preview ボタンを押すと並び方のレイアウトが表示されます。

85

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312※Columns, Rows, Tables のいずれかに Channels を設定した場合、X,Y,Z と選択できるメニューが表示され、各チャネルを X 軸、Y 軸、Z 軸（色強度）に設定できます。

２-１０-４ ファイル統合プロットの表示：Virtual concatenation
視覚的に理解しやすい figure を示すために、いくつかの FCS ファイルを統合したプロットを表示する必要があることがあります。例えば健常者と疾患者、治療前と後、寛解者と応答なし者、などのグループ間のポピュレーション分布の違いを強調したい場合などです。
２-１０-４-１バーチャルファイル統合（Virtual concatenation）とは複数の FCS ファイルを１つの FCS ファイルに統合する方法は R や Kaluza など他の解析ソフトで提供されていますが、Cytobank ではファイル自体を統合することなくソフトウエア上でバーチャルに統合しプロット表示をすることができます。実際に統合ファイルを作成するのでないため、色々な観点のグループ間比較をするための統合プロットを簡易に作成することができます。
２-１０-４-２統合するためのグループの設定
Sample tags 機能で FCS ファイルにグループを割り当てます。グループの分類（dimension）はいく
つも作成できるので、治療前後、治療種類、治療後のタイムポイント、検体背景（性別や年代、リスク
スコア等）など様々な観点でのグループ分けができます。

86Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312２-１０-４-３基本操作のガイドビデオについて
Cytobank サーバーの日本語サポート Experiment の子 Experiment：v10.3 日本語ガイドビデオを開き、Experiment summary ページの Attachments セクションからダウンロードできます。

２-１０-４-４基本的な操作方法
バーチャルファイル統合（VC）は illustration 機能内にあります。Dot plot、histogram、contour
で使用することができます。
① Illustration Editor を開きます。
② Plots 設定を開きます。
③ Dot plot、histogram、contour のいずれかを選択します。
④ Overlaid がオフになっていることを確認します。Concatenate と Overlaid は併用できません。
⑤ Concatenate で以下を選択します。
-

All multi-file positions：Layout に割り当てられた dimension や sample tags で複数ファイルがあるものをすべて統合します。

-

Rows または Columns：Layout の Rows または Columns に割り当てられているものだけを統合します。

87Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312⑥ Layout 設定を開きます。
⑦ Rows, Columns, Tables に各々dimension や sample tags を割り当てます。
⑧ 統合または表示対象とするか対象外とするかをｘof y をクリックで選択することができます。

⑨ どのファイルが統合されたプロットかを確認するにはプロットオーバーカーソルで表示されるウィンドウ上部に示されます。

88Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312⑩ VC を解除/設定したい場合は、レイアウトの統合（Concatenated）マークを縦矢印または横矢印にします。

⑪ (Plots 設定の Concatenate が All multi-file positions の場合) プロットのオーバーカーソルで表示されるウィンドウの Concatenate を設定することでも統合プロットにすることができます。

※ヒストグラムや等高線プロットでも同様に設定できます。
※マニュアルゲーティング解析だけでなく、次元削減マップでも同様に設定できます。

89Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312２-１０-４-５簡単なチェック方法
表示されているプロットの統合を確認するには、プロット下の Statistics で Displaying を Raw、
event count に設定すると細胞数が表示されるので簡単に確認できます。

２-１０-４-６次元削減マップのファイル統合プロット表示
不均一性の高いデータセットの場合、次元削減マップの分布がファイルで偏りデータセット全体を把握し難いことがままあります。そのような時にファイル統合プロット（VC）にすると、全体と各ファイルや各グループの分布を確認することができます。
※VC の他に、R を使用して FCS ファイルを１つにまとめた統合ファイルを作成し、それを Cytobank へ
再アップロードする方法のご案内が必要な場合はサポートまでお気軽にお問い合わせください。
① 次元削減（tSNE または UMAP）解析結果 Experiment を開きます。
② グループごとに統合したい場合は Sample tags でグループの tags を作成しておきます。
③ メニューバーillustrations > New illustration をクリックし、新規 illustration を作成します。
④ DR マップを表示します。
⑤ Plots 設定で Concatenate を統合したいレイアウト（Rows または Columns）に設定する
か、Layout 設定で統合した項目の矢印マークを統合マーク（Concatenated）に設定します。

⑥ または、Plots 設定で Concatenate を All multi-file positions に設定すると、レイアウトで割り当てた dimension や sample tags で複数ファイルのものを統合して表示してくれます。

90Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312⑦ 統合プロット上にマウスオーバーするとウィンドウが現れ、どのファイルの細胞が統合されたプロットかを確認することができます。

２-１０-５ Save 設定
Illustration Editor の Save 設定では、以下を設定できます。

91Cytobank 簡易マニュアル

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202312① Auto-save enabled：illustration の自動上書き保存のオン/オフ。オフにすると Save ボ
タンが表示され、押した時にだけ上書き保存されるようになります。
② Clone new copy: 現在の illustration の複製を作成します。
③ Save settings template：Plots 設定をテンプレートとして名前をつけて保存します。保存
したテンプレートは右側の Templates ボタンから呼び出すことができます。
④ Reset：illustration を初期状態に戻します。
⑤ Delete：illustration を削除します。
２-１０-６ Export 設定
Illustration Editor の Export 設定では以下を設定し、Export ボタンを押すことで Figure としてエクスポートできます。

① Illustration の名前部分をクリックしてエクスポートファイル名の変更、右のプルダウンメニューでファイル形式を SVG、PDF、PNG から選べます。
② Export options を開くと以下の項目をエクスポートファイルに含めるかを設定できます。


Save a copy as experiment attachment: エクスポートファイルを experimentの attachment セクションに自動添付保存します（デフォルトオン）。

Include illustration name header：illustration 名をヘッダーにします（デフォル
トオン）。

92

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202312

Include experiment details：experiment の details 欄に記載した内容を含めます（デフォルトオン）。

Include tables of statistics：illustrations 画面下部の統計表を一緒にエクスポートします（デフォルトオフ）。

Include QR code link：URL の QR コードを含めます（デフォルトオフ）。

２-１０-７ Templates ボタン
Illustrations のテンプレートを呼び出して適用することができます。

Personal：ご自身で保存したテンプレートやアクセス共有されたテンプレートがリスト表示されます。削除したい場合は右のゴミ箱ボタンを押します。また、他のユーザーと共有したい
場合は、その隣にある共有ボタンを押し、ユーザーネームを入力、選択します。

Public：公開されている experiment のテンプレートを使用することができます。

２-１０-８ 印刷ボタン
印刷ビューをブラウザの別タブで開くことができます。

２-１０-９ ロックボタン
デフォルトではロックがかかっており、Experiment を他のユーザーとフルアクセス共有している場合、他のユーザーが illustration を編集できないようになっています。

93Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

他のユーザーと編集を共有したい場合は、ロックボタンをクリックして解錠します。各ユーザーからの変更は上書きになります。

ロック（デフォルト）アンロック

２-１０-１０ プロット上でのレイアウト変更操作
illustrations 上のプロットやその周辺（軸ラベルや Columns, Rows, Tables の項目名）をクリック
やドラッグ＆ドロップすることで、使用する項目を変更したり、順番を変更したりすることができます。
２-１０-１１Statistic table：プロット下の統計表
プロット下部にプロットと同じレイアウトの統計表が表示され、定量的な検討をすることができます。表の表
示/非表示は Plots 設定の more plot settings で設定できます。
表上部の Displaying セクションでは統計表と上部プロットで扱う統計値を以下から選んだり、統計対
象を変更したりすることができます。
-

Raw:生の値-

Log10 ratio：Log10 比-

Fold：フォールド-

Log2 ratio：Log2 比-

Arcsinh ratio：Arcsinh 変換後の比-Transformed ratio：スケール設定で設定されている変換（リニア/Log/Arcsinh）後の比-Difference：差分※統計グラフで複数のファイルの統計値を一つのセルの値で表示する場合は、Raw 以外は選択できな
くなります。

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Cytobank 簡易マニュアル

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202312

CSV ボタンを押すと、CSV ファイルとしてダウンロードし、エクセル等で数値を扱うことができます。

95Cytobank 簡易マニュアル

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202312２-１１統計グラフと統計的有意差検定（Illustrations; summary plot）
統計グラフとしては、Heatmap、Box plot、Violin plot、Bar chart、Line chart と Summary
dot があります。

Sample tags 機能と組み合わせることで多様な作図ができます。Sample tags 機能では実験上の個体番号や条件、サンプルの種類などの変数を“dimension”として扱い、各 FCS ファイルにアノテーショ
ンとして割り当てることができます。統計プロットや検定をする場合はこの Sample tags との組み合わせが特に重要で、例えばサンプルグループの dimension を作成し、健常者と疾患患者や治療前と後、治療効果のありとなし、など各グループの tags を FCS ファイルにアノテーションすれば、グループ間の違いを示すためのボックスプロットやバイオリンプロットを表示したり、有意差検定の結果を p 値やシンボル（＊）
でプロット内に表示したりすることもできます。
２-１１-１統計グラフ設定の基本
統計チャートは、イベントレベルプロットとは対照的に、ひとつのボックスやバイオリン、バー等にサンプルグル
ープの情報をまとめて表示するようデザインされています。多くの場合、ボックスやバイオリン、バーごとにある実験変数を反映する表示を目指すことでしょう。したがって、有意義な統計チャートを作成するには、
Sample tags でファイルに実験変数やそのカテゴリーをアノテーションしておくことが必須です。
サンプルグループでまとめた表示をしたくない場合は、FCS ファイルを Layout 設定で選択し、Sample
tags で作成したものは選択から除外します。
例として下図に、サンプルファイルごとの統計チャート（上）と Conditions でまとめられたグループでの統計チャート（下）を示します。

96Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312Plot 設定の Plot type でボックスプロット、バイオリンプロット、ラインチャートまたはサマリードットを選択す
ると、Layout 設定の Rows と Columns は、各々x-axis groups と Subgroups に表示が変わります。Subgroups では、ボックスやバー、バイオリンにサンプルをどうまとめるか（グループ間比較のグループ分け）を設定し、x-axis groups ではその比較を何を対象に X 軸に並べるかを設定します。
subgroups に Conditions を設定し、その Sample tags である unstimulated と stimulated についてボックスプロットを表示する設定になっています。X-axis groups には Channels を設定し検討したいチャネルであるＩＦＮｇとＴＮＦa を選択して表示しています。（Conditions, Channels の順
序は変更可能）。

97

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

最大 50 個の統計チャートを Table として並べて表示することができます。50 以上のチャートを使用してレイアウトを構成しようとすると、「The maximum number of summary charts supported is
50. Please adjust your layout. サポートされているサマリーチャートは最大 50 です。レイアウトを変更してください」というエラーメッセージが出ます。
２-１１-２Heatmap：ヒートマップ

２-１１-２-１基本のヒートマップ
Plots ＞Plot type を Heatmap にします。
以下の項目を設定できます。
-

Statistic：使用する統計値を選択できます。
・

Event count：細胞数

・

Percentile:パーセンタイル値

・Percent of population：population A /population B ※B は A の上流ポ
ピュレーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算出される。

・Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Geometric mean：幾何平均・Standard deviation：標準偏差・

Variance：分散・Coefficient of variation:変動係数

・

Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Pearson correlation (X vs Y)：相関係数

・

Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％か

・

Percentile distance (5to95)：パーセンタイル５と 95 の間の値
98

Cytobank 簡易マニュアル

・-

v.4.100

202312Channel range：チャネル範囲

Scale range:ヒートマップカラー範囲の設定を選択できます。
・Global：すべてのヒートマップ表での最小値と最大値で表示

・

Local：各ヒートマップ表ごとの最小値・最大値で表示

・

Custom：最小値・最大値を任意に指定して表示-

Palette：ヒートマップカラーを選択できます。

-

Viewthrough plot：ヒートマップをオーバーカーソルしたときにポップアップするプロットの設定-

More plot settings：詳細設定
99

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

ヒートマップのカラー表示に使用する値は、生値の他にプロット下部の Statistic table の Displaying
セクションでも変更できます。使用する統計値等を変更することで色強度表示の範囲も大きく影響を受けるため、より適切な設定をお使いください。

２-１１-２-２統計値ヒートマップ
Plots 設定で Collapse tables をオンにするか Layout 設定の Table で Collapsed を選択すると、Layout で Collapsed に割り当てた dimension の sample tags に従ってサンプルをまとめ、
median か mean の統計値ヒートマップ表示することができます。

-

Median か mean かは Plots 設定の More plot settings の Aggregate で選択できます。

100

Cytobank 簡易マニュアル-

v.4.100

202312

プロット上で Collapsed 項目をクリックし、ポップアップメニューの Header settings の Color で背景色を変更できます。

-

Table1、Table2…と複数を Collapsed にすると複数層の統計値ヒートマップ表示もできます。

101Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312２-１１-３Box Plot：箱ひげ図

Plots ＞Plot type を Box にします。
以下の項目を設定できます。
-

Show dots: オンにするとグループ内の各サンプルファイルの値をドットで表示します。

-

Dot size: ドットのサイズを大きくまたは小さくします。

-

Show lines: 対応ありデータの場合、同一サンプルをドットで結びます。プロットの下に、サンプルがどう対応しているかに関する説明が表示されます。

-

Gray shading: ドットはカラー表示のまま、ボックスをグレーで表示します。

-

Jitter: ドットの並び方を変更します。0 は全てのドットを垂直方向に、1 はドットを最大限離して表示します。

-

Y axis scales: Ｙ軸の最小・最大スケールを選択します。Local＝Table ごと、Global=表示データセット全体、または Custom（ユーザーが値を入力）が選択可能です。

-

Width: ボックスの幅を設定します。幅は、固定、自動拡大、カスタムの 3 つから選べます。

-

Statistic: Ｙ軸に使用する統計値を選択します。
・Event count：細胞数

・

Percentile:パーセンタイル値

・Percent of population：population A /population B ※B は A の上流ポピュレーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算出される。

・Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Geometric mean：幾何平均・Standard deviation：標準偏差102

Cytobank 簡易マニュアル-

v.4.100

・

Variance：分散・Coefficient of variation:変動係数

・

Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Pearson correlation (X vs Y)：相関係数

・

Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％か

・

Percentile distance (5to95)：パーセンタイル５と 95 の間の値

202312Significance test：有意差検定の方法を選択します。

CD4+T 細胞に対する刺激の効果を IFNg 及び TNFa の median 値で示すボックスプロッ
ト例。ドットは各サンプルファイルの値を示す（青は未刺激、オレンジは刺激）。

２-１１-４Violin plot:バイオリンプロット

Plots ＞Plot type を Violin にします。
103

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

以下の項目を設定できます。
-

Show dots: オンにすると各サンプルファイルの値ドットで示します。

-

Dot size: ドットのサイズを大きくまたは小さくします。

-

Show lines:

対応ありデータの場合、同一サンプルをドットで結びます。プロットの下に、サンプルがどう対応しているかに関する説明が表示されます。
-

Gray shading: ドットはカラー表示のまま、バイオリンをグレーで表示します。

-

Jitter:ドットの並び方を変更します。0 は全てのドットを垂直方向に、1 はドットを最大限離して表示します。
-

Show boxes：ボックスを表示します。

-

Y axis scales:

Ｙ軸の最小・最大スケールを選択します。Local＝Table ごと、Global=表示データセット全体、または Custom（ユーザーが値を入力）が選択可能です。
-

Width: ボックスの幅を設定します。幅は、固定、自動拡大、カスタムの 3 つから選べます。

-

Statistic: Ｙ軸に使用する統計値を選択します。
・Event count：細胞数

・

Percentile:パーセンタイル値

・Percent of population：population A /population B ※B は A の上流ポピュレーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算出される。

・Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Geometric mean：幾何平均・Standard deviation：標準偏差・

Variance：分散・Coefficient of variation:変動係数

・

Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Pearson correlation (X vs Y)：相関係数

・

Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％か

・

Percentile distance (5to95)：パーセンタイル５と 95 の間の値

104

Cytobank 簡易マニュアル-

v.4.100

202312Significance test：有意差検定の方法を選択します。

CD4+T 細胞が刺激後に IFNg 及び TNFs の増加を示すバイオリンプロット例。ドットは各サンプルファイ
ルの値を示す（青は未刺激、オレンジは刺激）。
２-１１-５Bar chart：棒グラフ

Plots ＞Plot type を Bar にします。
以下の項目を設定できます。
-

Stacked bar: このオプションをオンにするとスタックバー（積み上げ）表示になります。

-

Stacked method: absolute=積み上げ、relative=100％積み上げを選択できます。

-

Cut off: 入力した値に点線を表示します。

105Cytobank 簡易マニュアル-

Y axis scales:

v.4.100

202312

Ｙ軸の最小・最大スケールを選択します。Local＝Table ごと、Global=表示データセット全体、または Custom（ユーザーが値を入力）が選択可能です。
-

Width: ボックスの幅を設定します。幅は、固定、自動拡大、カスタムの 3 つから選べます。

-

Error bars：エラーバーを、None＝表示しない、Standard deviation=標準偏差、Standard error=標準誤差、95th confidence interval=９５％信頼区間から
選べます。

-

Summary method：Statistic で選択したパラメータについて、バーの表示を複数ファ
イルの平均値にするか中央値にするかを選べます。

-

Statistic: Ｙ軸に使用する統計値を選択します。
・Event count：細胞数

・

Percentile:パーセンタイル値

・Percent of population：population A /population B ※B は A の上流ポピュレーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算出される。

-

・Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Geometric mean：幾何平均・Standard deviation：標準偏差・

Variance：分散・Coefficient of variation:変動係数

・

Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Pearson correlation (X vs Y)：相関係数

・

Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％か

・

Percentile distance (5to95)：パーセンタイル５と 95 の間の値

Significance test：有意差検定の方法を選択します。

106

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

CD4+T 細胞に対する刺激の効果を、IFNg と TNFa の値で示す棒グラフ例。オレンジは刺激、青は未刺激コントロール。
２-１１-６Line chart & Stain index：線グラフとステインインデックス

Plots ＞Plot type を Line にします。
以下の項目を設定できます。
-

Stain index：ステインインデックスのオン/オフ。ステインインデックスの作成方法は、後述のステインインデックスの項をご覧ください。

-

Show dots: オフにするとドットが消え線のみの表示になります。

-

Dot size: ドットのサイズを大きくまたは小さくします。

-

Y axis scales:

Ｙ軸の最小・最大スケールを選択します。Local＝Table ごと、Global=表示データセット全体、または Custom（ユーザーが値を入力）が選択可能です。
-

Width: ボックスの幅を設定します。幅は、固定、自動拡大、カスタムの 3 つから選べ
ます。

107

Cytobank 簡易マニュアル-

v.4.100

202312

Summary method：Statistic で選択したパラメータについて、ライン表示を複数フ
ァイルの平均値にするか中央値にするかを選べます。

-

Statistic: Ｙ軸に使用する統計値を選択します。
・Event count：細胞数

・

Percentile:パーセンタイル値

・Percent of population：population A /population B ※B はA の上流ポピュレーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算
出される。

-

・

Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Geometric mean：幾何平均・Standard deviation：標準偏差・

Variance：分散・Coefficient of variation:変動係数

・

Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Pearson correlation (X vs Y)：相関係数

・

Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％か

・

Percentile distance (5to95)：パーセンタイル５と 95 の間の値

Significance test：有意差検定の方法を選択します。

刺激の有無による CD4＋T 細胞での IFNg (オレンジ) と TNFa (緑)の 発現強度中央値のグループ
内複数ファイル中央値の違いを示すラインチャート例（左：エラーバーは標準偏差で表示）。レイアウト
設定は右に示すとおり。

-

ステインインデックス

ステインインデックスは使用している機器において様々な蛍光色素の相対輝度を測定します。この値は蛍光色素の輝度の比較や順位付けに使用でき、質の高いサイトメトリーデータの取得には欠くことのできな
い、抗体タイトレーションによって最適濃度を決定するのに役立ちます。抗体の使用量が少なすぎると標108

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

識が不完全になってしまいますが、使用量が多すぎると蛍光バックグラウンドの増加や、親和性の低いサイトへの抗体の結合（擬陽性）の原因となってしまう上に実験コストが高くなります。
ステインインデックスは、ポジティブポピュレーションとネガティブポピュレーションとの分離を、ネガティブポピュレーションの標準偏差の 2 倍で割った値と定義されます。

図：ステインインデックス：ポジティブポピュレーション（緑）とネガティブポピュレーション（黒）との分離をネガティブポピュレーションの標準偏差の 2 倍で割った値と定義されます。
Cytobank ではステインインデックスチャートを使用して、タイトレーションから最適な抗体濃度を決定することができます。バックグラウンドノイズを最小限に抑えつつ、明るいシグナルを得るための最適な濃度や希釈率はステインインデックスチャートを基に決定されます。ステインインデックスチャートを作成する手順は下記の通りです。
① タイトレーションのサンプルデータを new experiment にアップロードし、Gating Editor で対象の抗体のチャネルでポジティブとネガティブのゲートをかけます。マーカー発現は抗体濃度によって異なることがあるため、必ず全てのファイルを確認してゲートを調整します。プロット左上の Apply gates ボ
タンをクリックしてゲートを illustrations に適用します。
② サンプルファイルに Doses と Reagents の dimension での sample tag を付けます。Sample
tags>Add experiment dimensions をクリックし、次のウィンドウで Tag files with Dosesと Tag files with Reagents をクリックして各々設定します。現在サポートされているのはひとつの109

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312

illustration につき１試薬です。同一の Experiment で複数の試薬を検討する場合は、試薬ごとに新規の illustration を作成し、ステインインデックスチャートを作成ください。

Tag files with Doses の画面（上）と Tag files with Reagents の画面（下）③ Sample tags 機能で、希釈情報 Doses をファイルにタグ付けします。抗体を 2X（推奨の抗体濃度の 2 倍）から 1:32 に希釈した例を下に示します。
④ ファイルをタグ付けしたら画面上部の水色のナビゲーションバーから Illustrations をクリックし、新規
illustration を作成します。Illustration Editor で以下のように Plots と Layout を設定します。Plot type として Line チャートを選択し、Stain index をオンにします。X-axis group に
Doses、 Table 1 に Reagents を設定します。希釈順序（並び順）は Doses の右側（x ofy (x と y は数字)）をクリックして変更できます。

ステインインデックスチャートの Plots 設定（左）と Layout 設定（右）110Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312⑤ ステインインデックスチャートは、Illustration Editor で直接保存やコピーができます。Reagent で指定した試薬の各 Dose のステインインデックス値は、チャートグラフ下の Stain Index Statisticsに表示されます。

２-１１-７Summary dots：サマリードット

Plots ＞Plot type を Summary dot にします。
以下の項目を設定できます。
-

Dot size: ドットのサイズを大きくまたは小さくします。

-

Swarm:オンでなるべく一列に並べます。

-

Jitter:ドットの並び方を変更します。0 は全てのドットを垂直方向に、1 はドットを最大限離して表示します。
-

Mean/median line：平均または中央値を示すラインを表示します。

111

Cytobank 簡易マニュアル-

Y axis scales:

v.4.100

202312

Ｙ軸の最小・最大スケールを選択します。Local＝Table ごと、Global=表示データセット全体、または Custom（ユーザーが値を入力）が選択可能です。
-

Width: ボックスの幅を設定します。幅は、固定、自動拡大、カスタムの 3 つから選べます。

-

Summary method：Statistic で選択したパラメータについて、ライン表示を複数ファ
イルの平均値にするか中央値にするかを選べます。

-

Statistic: Ｙ軸に使用する統計値を選択します。
・Event count：細胞数

・

Percentile:パーセンタイル値

・Percent of population：population A /population B ※B は A の上流ポピュレーションという前提。計算は厳密には（A⊆B)/B で算出される。

-

・Median：中央値

・

Mean:平均値

・

Geometric mean：幾何平均・Standard deviation：標準偏差・

Variance：分散・Coefficient of variation:変動係数

・

Minimum：最小値

・Maximum：最大値

・

Pearson correlation (X vs Y)：相関係数

・

Percent in gate：指定したゲート内イベントが何％か

・

Percentile distance (5to95)：パーセンタイル５と 95 の間の値

Significance test：有意差検定の方法を選択します。

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202312

CD4+T 細胞に対する刺激の効果を、IFNg と TNFa の値で示すサマリードット例。緑は刺激、オレンジ
は未刺激コントロール。
２-１１-８統計的有意差検定機能（共通）
統計チャートで統計検定を実施するには、 Plots 設定＞Significance test で使用しているデータセッ
トに適した検定方法を選択します。

Cytobank の推定的統計ツールでは、生物学のデータ解析で広く使われているいくつかの統計検定が実装されています。マニュアルゲートの結果についてでも、FlowSOM などの結果についてでも、Cytobank
上でそのまま有意差検定ができます。
下がそのリストです。

２-１１-８-１
２-１１-８-２有意差検定
Cytobank に実装されている有意差検定方法-

Student’s t-test ：Student’s t-test はひとつの独立変数の２つのグループの平均において違いがあるかを判定するのに用いられるパラメトリック検定です。データは正規分布に従うと仮定されています。
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202312Mann-Whitney U test ：Mann-Whitney U test はひとつの独立変数の２つのグループの分
布が等いかそうでないかを判定するのに用いられるノンパラメトリック検定です。データが正規分布に従っているなどの分布の仮定や制限はありません。

-

Paired student’s t-test ：Paired student’s t-test は、同一個体での治療前と後など対応ありデータでの２グループ間に有意差があるかを判定するのに用いられるパラメトリック検定です。
student’s t-test と同様 paired student’s t-test もデータは正規分布に従うという仮定のもと、２つのグループの平均が等いかそうでないかを判定します。

-

Wilcoxon signed-rank test ：Wilcoxon signed-ranks test は、ひとつの独立変数の対応ありの２グループについて、その分布が等いかそうでないかを判定するのに用いられるノンパラメトリック検定です。Mann-Whitney U test と同様 Wilcoxon signed-rank test も２つのグループが同じ分布を持つかどうかを判定します。

-

Kruskal-Wallis H test ：Kruskal-Wallis test は正規分布でないと仮定されるデータでのノンパラメトリック検定です。ひとつの独立変数について２以上のグループを比較し、すべてのグループの分
布が同じかそうでないかを判定するのに用いられます。

-

One-way analysis of variance (One-way ANOVA) ：One-way ANOVA はひとつの独立変数の２以上のグループについてのパラメトリック検定で、サンプルグループ間の平均に違いがあるかを判定するのに用いられます。

-

Two-way analysis of variance (Two-way ANOVA) ：The two-way analysis ofvariance analysis はパラメトリック検定で、２以上のグループでの２つの独立変数について同時に分析することができます。 Cytobank では２つの独立変数の交互作用は考慮しません。

２-１１-８-３多重検定と補正
同時に複数の統計検定を行う際には p 値を補正または調整することをおすすめします。この補正は多重検定問題として知られている、検定を繰り返すことによって偽陽率が増える問題を回避することに役立ちます。サイトメトリーデータの場合、複数の細胞集団からなるサンプルの免疫システムについて考えます。サンプルを比較する際には、各細胞集団について繰り返し統計検定される多重検定が通例ですので、そのような時に有用です。Cytobank では Layout settings で設定される dimension は Table ごとに処理されます。多重検定補正も各 Table 内で dimension に対して施されます。P-値補正は Table
間では実施されませんのでお気をつけください。
-

２グループ検定法の場合(Student’s t test, Mann-Whitney U test, Paired student’s ttest, and Wilcoxon signed-rank test)は、Bonferroni と FDR 補正法が Multiple test
methods メニューで選択できます。 Benjamini & Hochberg procedure は偽検出率（False discovery rate）を調整できるよう設計された多重検定補正法です。Bonferroni
method と比較すると FDR-controlling method は Type1 エラーに対しての厳しさが緩くなっ
ています。
114

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・

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Bonferroni correction：Bonferroni correction は多重検定問題への対処として一般
的な調整方法です。一緒に実行された検定数に基づいて補正を適用します。

・FDR correction - Benjamini & Hochberg procedure, a false discovery rate(FDR) correction method-

Kruskal-Wallis H test または Two-way ANOVA test の場合、p-値の調整と同じくすべてのグループのペアワイズ比較を実施するための２グループ検定法と補正法の組み合わせが選択できます。２グループ以上の時には、他のグループに対して有意に異なる特定のグループを特定します。
None を設定した場合には、結果は独立変数間の有意性を示す全体的な p-値のみになります。

-

Kruskal-Wallis H test の場合:
・

Mann-Whitney U test + Bonferroni：Mann-Whitney U test によるすべてのペアワ
イズ比較と Bonferroni correction による補正が実施されます。

・

Mann-Whitney U test + FDR：Mann-Whitney U test によるすべてのペアワイズ比較と FDR correction による補正が実施されます。

-

Two-way ANOVA test の場合:
・Student’s t test + Bonferroni ：Student’s t test によるすべてのペアワイズ比較とBonferroni correction による補正が実施されます。

・Student’s t test + FDR ：Student’s t test によるすべてのペアワイズ比較と FDR による補正が実施されます。

-

one-way ANOVA が用いられる時は、Tukey’s HSD test では各グループの独立変数についてのペアワイズ比較が可能です。
・

Tukey’s HSD (honestly significant difference) test ：Tukey’s HSD test はTukey’s range test や Tukey’s test という名称でも知られており、ワンステップで多重検定問題を補正しペアワイズ比較を実行します。どのグループの独立変数が他と有意にことなるかを特定するためにすべてのペアのグループ平均を比較します。

２-１１-８-４有意差検定の実行方法
推定的統計ツールは illustration Editor に実装されています。

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メニューバーの Illustrations＞New illustrations で新規の illustration を作成し、Plots にて Plottype を Box か Violin, Bar, Line, Summary dot に設定します。Significance test のドロップダ
ウンリストを開くと各検定法についての独立変数数（#IV）、グループ数（#Groups）、パラメトリック
かノンパラメトリックか（parametric）、対応ありかなしか（Paired）が一覧で表示されます（下図）。ここからデータセットに適した検定法を選択します。

２-１１-８-５有意差検定を含む統計ツールの設定手順① Illustration Editor の Plots でどの統計値と検定を用いるかを選択します。
i.

Plot type のプルダウンメニューで Summary plot に属するプロットを選択します。選択したプ
ロットに関連した設定項目に表示が変わります。

ii.

Statistic ドロップダウンメニューで用いたい統計値を選択します。各サンプルのプロットにはこの統計値が用いられます。また有意差検定にも使用します。

iii.

仮定に基づいて Significance test ドロップダウンメニューから用いる検定を選択します。対応
ありの検定(Paired Student’s t test または Wilcoxon signed-rank test)を選択した
場合、Cytobank は sample tags の情報をもとに自動的に対応の情報を抽出して使用し
ます。

iv.

各プロット内で複数の 2 グループ検定を実行するか、Kruskal-Wallis H、ANOVA (Oneway または Two-way) を選択した場合には、適切な多重検定法を選択します。

② Layout 設定でプロットのレイアウトを設定します。
i.

比較のために Sample tags でグループ分けを定義した dimension を独立変数(I.V.)として割り当てます。デフォルトでは Layout の上から２つ目 Subgroups に設定することで適用
116

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v.4.100

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されます。※独立変数(I.V.)が Layout の１つ目に設定される場合もありますため、確認ください。
ii.

２つ以上の Sample tags を表示対象に選択し、I.V.の比較グループに設定します。
・

Layout で２グループ検定法を選択した場合 (Student’s t-test, Mann-Whitney
U test, Paired student’s t-test, または Wilcoxon signed-rank test)、
Layout で I.V.に設定した dimension が２つのグループ（Tags）が選択されていることをご確認ください。グループ数が２以外の場合、Layout 内にエラーメッセージが表示
されます。

・

two-way ANOVA を選択した場合は２つの独立変数（I.V. #1 と I.V. #2：
Layout の一番上と２番目の項目）に各々dimension を割り当てます。

２-１１-８-６結果の表示方法
有意差検定の結果は２つの表示形式があります。

① プロット上に P 値かアスタリスクシンボルで表示
プロット内または横に P 値かアスタリスクシンボルで表示します。表示される値またはアスタリスクは選択された検定方法に依存します。P 値の範囲とシンボル（アスタリスクの数）の関係は以下の
通りです。

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２グループ検定（Student’s t test、Mann-Whitney U test、Paired student’s ttest、Wilcoxon signed-rank test）：
・

Show p-values で表示の項目を選択した場合、比較グループに跨るラインとその上中央に数値またはシンボルが表示されます。すべての比較を表示するか、有意差のあるものだけとして p <0.05 だけ表示するかを選択できます。

・Multiple testing で補正方法を選択した場合は、補正後の P 値またはシンボルが表示されます。

図：Student‘s t-test 検定結果を箱ひげ図上に表示．
補正なし（左）と Bonferroni 補正（右）-One-way ANOVA、kruskal-Wallis H test:・Show p-values で表示の項目を選択し、比較したいグループを X-axis group に設定した場合、グループ間に有意差のあるものの上部に、グループを跨る線と P 値またはシンボルが表示されます。X-axis group 以外に設定した場合、すべてのグループ間に有意差があるものの上部に線とＰ値またはシンボルが表示されます。

・Multiple testing を選択した場合は、プロット横に表が表示されます。この表は有意差（p<0.05）のあったペアワイズとその検定結果をシンボルで表示します。

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図：棒グラフ上に表示された one-way ANOVA 結果．
Tukey HSD なし（左）と Tukey HSD 適用後（右）-Two-way ANOVA：
・

有意差のある独立変数名がその検定結果のシンボルとともにプロット横の表に表示されます。

・Multiple testing の設定はプロット表示には反映されず、その下の Statistic
Inference table にのみ反映されます。

※データが欠損していたり、変化がない場合、Show p-values 設定が P values(all)またはSymbols（all）となっている場合は NaN が表示されます。
② Statistical inference 表での検定結果の表示

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有意差検定を行った場合に illustration のプロットの下に表示される Statistical Inferenceというセクションで表になっています。
-

２グループ検定：Student’s t-test, Mann-Whitney U test, Paired student’s ttest, Wilcoxon-signed rank test では、表の各行がひとつの比較にまとめられています。
・Mean A と Mean B：A と B に割り振られている独立変数グループについて算出された平均値（Plots 設定集計方法で Mean が選択されている場合）

・Median A と Median B：A と B に割り振られている独立変数グループについて算出された中央値（Plots 設定集計方法で Median が選択されている場合）

・SD A と SD B：独立変数グループ A と B の各々の標準偏差・

n A とｎB（ｎは数値）：独立変数グループＡとＢの各々のデータポイント数

・

p-value：補正なしのＰ値

・

Adjusted p-value：多重検定や補正後の p 値. Kruskal-Wallis H, Oneway or Two-way ANOVA test で multiple testing を実行した場合は補正後の P 値だけが表示されます。

-

・Significance p-value：補正なしＰ値に対応したシンボル

・Adjusted significance p-value：補正後のＰ値に対応したシンボル

Kruskal-Wallis H, One-way ANOVA, Two-way ANOVA：これらの検定方法を選択し、multiple testing を使用した場合は２つの結果の表が表示されます。プロット下に表示される Statistical inference の表は上述の２グループ検定と同様です。上部（プロットの横）の表では、検定方法名が記され、有意差のあった独立変数グループのすべての組が表示されます。
・Table 名：Layout 設定の Table を使用している場合、その名前が表示されます。

・X-axis 名：Layout 設定で x-axis を１I.V.に割り当てている場合、その名前が表示されます。Two-way ANOVA では x-axis が I.V.に割り当てられます。

・

独立変数名：グループ比較の独立変数名

・P-value：各組み合わせ、行の P 値

・Significance p-value：P 値に対応したシンボル

例えば検定方法を One-way ANOVA で、multiple testing を Tukey HSD にすると、上（プロット横）の結果表は one-way ANOVA での結果、下の statisticalinference 表は Tukey HSD の結果が表示されます。

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202312２-１１-９統計グラフのエクスポート
統計チャートの作成が完了したら、Cytobank experiment 内に illustration として保存（デフォルト
では自動保存になっています）するだけでなく、illustration editor の図として PDF、PNG、SVG 形式
でエクスポートできます。プロット下部にある統計検定の表と統計表は各々csv ボタンにて csv 形式でエクスポートすることも可能です。

２-１２共有・プロジェクト・権限
Cytobank のデータや Experiment は他のユーザーと安全に共有することができます。Experiment をまとめたプロジェクトには、共有メンバーに権限付けもできます。
※共有できるユーザーは同一サーバーのユーザーに限ります。Premium Cytobank ユーザー同士共有できます。Enterprise Cytobank ユーザーは同じ Enterprise サーバー内のみの共有となります。異なる Cytobank サーバーへデータ移行されたい場合はご相談ください。
２-１２-１ユーザーコネクション（Premium cytobank のみ）
アカウント間のアクセス許可を双方で確認し、user personal identification information (PII)
privacy に準拠するため、Experiment や Project の共有をする前にユーザーコネクションを確立します。
２-１２-１-１ユーザーコネクションにユーザーを追加① My profile ボタンをクリック＞account setting をクリックし、My account ページを開きます。
② スクロース下の User connections セクションの Request new user connection のボックスにコネクションに入れたいユーザーの Cytobank 登録 E-mail を入力します。

③ リクエストを受けたユーザーはメール通知を受け取るとともに Experiment manager に Userconnection requests が表示され、Accept か Decline かを選択できます。

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202312④ Accept されると Existing connections リストに追加され、Experiment や Project の共有が可能となります。
※ユーザーコネクションが確立された時点では共有が可能となっただけで、アカウント内の Experimentはこの時点では共有されていません。
２-１２-１-２ユーザーコネクションからのユーザーの削除① そのユーザーと共有しているすべての Experiment で共有を解除します。
② My account＞Existing connections でそのユーザーとの＃shared experiments と#shared projects が０となっているのを確認します。
③ その右の×マークをクリックします。
２-１２-２データセキュリティ・デフォルトのアクセス権限について
Cytobank へアップロードされたデータは基本的にはアップロードしたアカウントでのみ閲覧・操作可能です。他のアカウントとの共有には以下の操作によるいずれかの許可が必要となります。
２-１２-３Experiment の共有① 共有したい Experiment を開きメニューバー右の Sharing Private をクリックします。

② Experiment Sharing の Share with a User ボックスに共有者の Cytobank ユーザー名または登録 Email アドレスを入力します。
③ すでに共有したことのあるユーザーやユーザーコネクションに含まれているユーザーの場合、候補者リストが表示されるので、選択します。

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ユーザーコネクションのないユーザーの場合は、No users found の下に表示される Connect
with a user ボタンをクリックし、ユーザーコネクションに追加します。

④ 共有者はフルアクセスとなります。アカウント容量は所有者に帰属し、共有者の容量は消費しません。
※共有者が再解析する場合は、illustrations や Advanced analysis はアカウントごとに分かれて作成されますが、gating や Scale 等は上書きになってしまうため、Clone を作成して別にすることもおすすめします。
２-１２-４アクセス権限を付加した共有ができるプロジェクトの作成と管理① 画面上部の Projects から New を選択します。

② Name にプロジェクト名を入力します。
③ 必要であれば Description を記入します。
④ Sharing level でフルアクセス以外のプロジェクトの共有者（メンバー）の illustrations への制限を選択します。
-

View Only：保存された illustrations の閲覧のみ-

Illustrations：フルアクセス以外のユーザーも illustrations を作成可能⑤ Cloning level で他のユーザーが Clone を作成するときの制限を選択します。
-

Disable：メンバーの Clone の作成と生データのダウンロードを許可しません。

-

Clone Files Only：生データ以外（解析結果など）のダウンロードや Clone 作成は許可しません。生データのみの Clone とダウンロードは可。

-

Full Clone：生データ以外も含めた Clone の作成を許可します。

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202312⑥ Create Project ボタンを押します。

⑦ 詳細設定が表示されます。
-

Edit Project Members で付与する権限別にユーザーを追加し、プロジェクトのメンバーにすることができます。各々のボックスに Cytobank 登録 Email アドレスを入力し、候補リストから選択することで追加できます。各メンバーの右の×マークをクリックするとメンバーから外すこともできます。候補が表示されない場合、ユーザーコネクションにユーザーを追加ください。

-

Manager：プロジェクトメンバーやプロジェクト Experiment の追加や削除を管理できます。また、共有や Clone 権限の変更もできます。

-

Leaders：Manager によって設定された共有・Clone 制限下でプロジェクトのExperiment にアクセスできます。アクセス権限は Members と同じです（組織体制に対応するために名称を分けた）。

-

Members：Manager によって設定された共有・Clone 制限下でプロジェクトのExperiment にアクセスできます。アクセス権限は Leaders と同じです（組織体制に対応するために名称が分けられている）。

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202312⑧ Edit Experiments でプロジェクトに含める Experiment を選択することができます。リスト上部のボックスでリストにフィルターをかけることができます。左のリストがアクセス可能な Experiment、
右のリストがプロジェクトに含まれている Experiment になります。リスト下の AddExperiment(s)/Remove Experiment(s)ボタンで出し入れができます。

※例）プロジェクト A は５つの Experiment からなっており、各 Experiment に解析担当がいる（解析担当者５名＋PI）。各解析担当者は、担当する Experiment にはフルアクセスできるが、担当以外の Experiment については生データのみの Clone 作成かダウンロードしかできな
いようにしたい。この場合は、2－10－3 でプロジェクト A を作成し、以下の設定にします。
-Cloning level を Clone Files Only に設定-Edit Project Members で、各解析担当者を Leaders（または Members）に割り当て-Edit Experiments で５つの Experiment を選択
その後、2－10－2 の方法で各 Experiment を各々の解析担当者とだけフルアクセス共有します。

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202312３Advanced analyses（機械学習解析）

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202312３-１機械学習による解析
サイトメトリー技術の発達により測定から得られるデータの複雑性と規模が拡大する中で、バイアスを減らしマニュアルゲーティングでは気づけなかったサブセットへの気づきを得ることができる手法として、機械学習による解析が用いられています（Keyes, T.J et. al. “A Cancer Biologist's Primer on Machine
Learning Applications in High-Dimensional Cytometry”. Cytometry, 97;782-799）。
Cytobank では教師なし学習である次元削減アルゴリズムを４種類（tSNE-CUDA、UMAP、optSNE、viSNE）とクラスタリングアルゴリズム２種類（FlowSOM、SPADE）、教師あり学習 CITRUSを実装しています。
また、従来の手法であるマニュアルゲーティングは結果のばらつきの主な要因のひとつであるとされてきました（Maecker et al. 2005）。解析の信頼性と再現性を高めるために、データ解析の集中化やゲーティングストラテジーの標準化、オペレーション手順の標準化などが提案されていますが、時間のかかるものとなってしまっています（Macchia et al. 2020）。サイトメトリーデータの機械学習による解析は非常に有用ですが、仮説や知見に基づく独自のゲーティングストラテジー解析を機械学習で自動化する方法は欠けている現状があります（Hu et al. 2021）。Cytobank では、少数のサンプルでの独自のゲーティ
ングストラテジーから教師あり機械学習によってモデルを構築し、プログラミングなしで、機械学習による自動ゲーティングも実装しています。自動ゲーティングによって、解析者間のポピュレーション結果のばらつきを軽減するとともに、解析ワークフローを合理化することができます
これら機械学習解析はメニューバーの Advanced analyses から実行することができます。

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202312３-２自動ゲーティング
３-２-１自動ゲーティングとはCytobank の自動ゲーティング機能は、ユーザー独自の細胞集団の同定やゲーティング時の境界線を用いることを可能にします。この機能は２つのステップから構成されています。ひとつめのステップは、マニュアル
ゲートされたデータを用いてモデルをトレーニングします。モデルはユーザーの与えたゲート情報から細胞をどのように細胞集団に割り当てるかを学習します。ふたつめは inference（推論）ステップと呼ばれ、モデ
ルを新規データに適用して、マニュアルゲートの調整作業なしに各細胞イベントを細胞集団に分類（割り当て）します。

最低 10 ファイルのマニュアルゲーティングされたデータがモデルのトレーニングには必要です。必要な場合、ファイルや親ポピュレーションによって微調整した tailored gate 機能も使用してください。適切なゲーティ
ングストラテジーが確立したら、Gating Editor の Apply gates ボタンを押します。
作成されたモデルは、他の Experiment に適用することが可能なだけでなく、そのモデルを含む
Experiment を共有することで他のユーザーとも共有することができます。
良好に動作するモデルをトレーニングするには、解析データに含まれているばらつきがトレーニングデータにも含まれていることが重要です。ばらつきとは、試薬のロットや機器の設定などのテクニカルなものとサンプル毎のマーカー発現レベルの違いなどの生物学的なものとを含みます。また、このばらつきがモデルトレーニングの各段階であるトレーニング、バリデーション、テストの全てのセットに反映されるトレーニングデータセットでモデルの学習が行われる必要があります。
３-２-２トレーニングデータの準備• 実行可能な範囲でなるべく多くのサンプルをトレーニングデータに使用します（最低 10 ファイル）。
• トレーニングデータにはできる限り適切なゲーティングをします。
• トレーニングデータには予想されるばらつき、つまり試薬や機器設定、サンプルの生物学的要因などが可能な限り反映されるようにします。

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202312３-２-３モデルトレーニングの設定・実行① メニューバー＞Advanced Analysis > Automatic gating > Train new model を選択> Create をクリックします。
② Analysis name に名前を入力します。Create ボタンで設定画面に移動します。

③ Population でモデル構築の対象とするポピュレーションを選択します。選択されたポピュレーションの上流のポピュレーションは、そのポピュレーションを分類するのに必要な段階として自動的に対象となります。選択されたポピュレーションを同定するのに使用した全ての階層のチャネルがモデルのト
レーニング時に考慮されます。デフォルトでは、各ポピュレーションの重要度は全て同じとされています。モデルトレーニングの設定では、ポピュレーションの重み（KPI weighting）の値を増加させることもできます。weight 値を増加させた特定のポピュレーションは、全体の KPI を算出する際にそのポピュレーションの結果への影響を大きくすることとなります。Magnification を増加させて複数のモデルをトレーニングして比較する時に、最も重要なポピュレーションの weight を増加させると、どのモデルが最も求めるパフォーマンスかを知るのに役に立ちます。

④ FCS Files で、トレーニングに使用するファイルを選択します。
必要なファイル数は最低 10 ファイルですが、実行可能な範囲でなるべく多くのサンプルをトレーニ
ングデータに使用することをおすすめします。
ファイルには予想されるばらつき、試薬や機器設定、サンプルの生物学的要因などが可能な限り反映されるようにします。

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202312⑤ Event Sampling で、データのサンプリング方法を選択します。
Equal: 各ファイルの細胞数の違いは無視して同数の細胞をサンプリングします。
Proportional: 各ファイルの細胞数の違いの比を反映してサンプリングする細胞数を決めます。
Use all events:すべての細胞を用いる。

自動ゲーティングモデルのトレーニングで使用するダウンサンプリングは、Smart downsamplingという手法で、ランダムピックアップと異なり、トレーニングセットサンプル全ての中のポピュレーションの多様性に最大限最適化されています。マニュアルゲーティングで同定された各ポピュレーションが全て漏れなく確実にトレーニングにサンプリングされるようになっています。これにより希少な細胞のポピュレーションを見逃すリスクを回避できます。

Optional settings:⑥ Random Seed
機械学習モデルのトレーニングには乱数が多く組み込まれており、トレーニングデータのサンプリン
グやモデルトレーニングのパラメータなどが含まれます。トレーニング結果の再現性を確認したい
場合は、乱数シードの設定をランダムの変わりに任意のシードにすることで、複数のトレーニング
でも同一のサンプルとパラメータ選定で実行することができます。しかし、一般的にはランダムで実行することを推奨します。
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202312⑦ Optimal clusters
トレーニングデータセットがいくつのグループになる背景を持っているかの見積もりを設定します。
（例：４機器からのファイルの場合４グループ）⑧ Training magnifications
magnification を増加させると、異なるパラメータを持つ複数のモデルを同一のトレーニングデ
ータで実行することができ、最も KPI の高かったモデルが結果として返されます。
Magnification を１より大きい値にして特定のポピュレーションの重み（weight）を増加させると、そのポピュレーションにとってより適したパフォーマンスをするモデルが選択されるようにする
ことができます。注意点としては、magnification は計算時間がその値に比例して長くなることです。

⑨ Compensation と Data scaling
自動ゲーティングモデルはコンペンセーション済、スケール調整済のデータのパターンを学習します。
他のフローサイトメトリー解析と同じく、適切なコンペンセーションとスケール調整は重要です。コンペ
ンセーションおよびスケール調整のクオリティは、モデルのトレーニングに使用するデータセットとモデルを適用して自動ゲーティングする新規データセットとで同等に処理されている必要があります。自動ゲーティングを行う前には必ずコンペンセーションとスケール調整が適切に処理されているかをご確認ください。
Test view⑩ Create an experiment with blind test files and their inferred populations のボックスにチェックを入れると、モデルトレーニングのブラインドテストで用いたファイルとマニュアルゲーティン
グ、自動ゲーティング結果を含めた新規 Experiment として作成します。モデルトレーニングのテ
スト結果の評価・確認をすることができます。

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202312３-２-４新規データへのモデルの適用方法
トレーニングしたモデルを用いて新規の FCS ファイルを自動ゲーティングするには、新規 FCS ファイルのある Experiment を開きます。モデルトレーニングを行った Experiment と同じでも別でもどちらでも問題ありません。必ず、スケールやコンペンセーション、パネルとチャネル名設定が適切に前処理されているかを確認してください。
① メニューバーの Advanced Analysis > Automatic gating: Select Run inference
using model > Create をクリックします。
② Analysis name に名前を入力します。Create ボタンを押すと、設定画面に移動します。

③ FCS Files ボックスで対象の FCS ファイルを選択します。この後選択するモデルを適用して自動
ゲーティングしたいファイルを全て選択します。

④ FCS ファイルを選択すると、Trained Autogating Model セクションで自動ゲーティングモデルを選択することが可能になるのでモデルを選択します。

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202312⑤ Clone the gates from the current experiment にチェックを入れると Experiment 内のマニュアルゲーティングを自動ゲーティング適用後の結果 Experiment に引き継ぐことができます。
実行後の自動ゲーティング解析の結果をマニュアルゲーティングと比較して評価するのに便利です。
⑥ 画面上部緑色の Run Autogate inference analysis をクリックして実行を開始します。実
行が完了し結果の Experiment が作成されると登録 E-mail に通知が来ます。

⑦ 通知メールのリンクをクリックするか、親 Experiment の Experiment summary ベージの
Linked Experiment などから結果 Experiment にアクセスできます。
３-２-５自動ゲーティング（モデル作成/適用）の結果の評価
トレーニングモデルが作成されると Analysis run info が表示され、作成されたモデルで行ったブラインド
テストの結果が表示されます。また、Create an experiment with blind test files and theirinferred populations にチェックを入れるとブラインドテストで用いたデータファイルとトレーニングの正解であるマニュアルゲーティング、自動ゲーティング結果を含んだ Experiment が作成されるので、illustrations でグラフ化して評価することができます。
作成したモデルを使用して新規ファイルに自動ゲーティングを適用した場合、Clone the gates fromthe current experiment にチェックを入れると結果 Experiment にマニュアルゲーティングの情報も引き継ぐことができます。
３-２-５-１作成した自動ゲーティングモデルのパフォーマンスの評価-

Analysis run info での評価
モデルのトレーニングが完了すると、トレーニング設定ページに Analysis run info が表示され、実行時間やモデルの KPI を確認することができます。

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自動ゲーティングモデルの KPI は全てのポピュレーションの加重平均 F1 スコアです。F1 スコアはPrecision：適合率と Recall：再現率の調和平均で計算されます。適合率はモデルが陽性と予測したイベントが実際に陽性だったものの割合（％）、再現率は全ての陽性イベントのうちモデルが陽性と推測できたイベントの割合（％）で算出され、偽陰性のイベントについても考慮されます。
モデルの KPI の決定には、テストセットの全てのイベントとモデルトレーニングでの全てのポピュレーション
において、各イベントが有しているユーザーのマニュアルゲートによるポピュレーション属性と、そのイベントについて自動ゲーティングが予測したポピュレーション属性が一致するかどうかを Cytobank が採点します。
テストデータセットでのポピュレーションごとの情報は、以下の項目について一覧で表示されます。

Actual: マニュアルゲーティングでのイベント数
Predicted: 自動ゲーティングでのイベント数
True positives: マニュアルゲーティングと自動ゲーティングと両方ともがこのポピュレーションであるとしたイベント数。真陽性。
Precision: 自動ゲーティングがこのポピュレーションと予測した全イベントのうち真陽性だったものの割合（％）。値が大きいほど偽陽性または第一種過誤が少ないことを示します。
Recall: マニュアルゲーティングでこのポピュレーションとされたイベントのうち真陽性だったものの割合（％）。値が大きいほど偽陰性または第二種過誤が少ないことを示します。
F1 score: Precision（適合率）と Recall（再現率）の調和平均で、次の式で計算されます。

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202312

経験的に、F1 スコアが 90％以上の場合は very good、80 から 90％は good、50 から 80％はOK、50%以下は not good を示すとされています。
一覧表の他に、ポピュレーション毎の予測スコアについてテストセットファイルの分布をボックスプロットで確認することも可能です。

-

Create experiment with blind test files and their inferred populations チェックボック
スにチェックをいれて実行していた場合での作成された Experiment での評価

① 作成された Experiment へは、自動ゲーティングの setup ページの View createdexperiment からアクセスすることができます。
② 自動作成された Experiment には、ブラインドテストセットに割り当てられた FCS ファイルと自動ゲーティングポピュレーションごとにそのポピュレーションのためのチャネルパラメータが「auto_gate_ポピュ
レーション名」で追加されています。Gating Editor の軸パラメータを開くと確認することができます。

③ この追加チャネルでクラスターゲートとして同定され、「ポピュレーション名_auto_cluster_ gate」という名前のゲートが自動的に作成されています。
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202312④ Population manager では自動ゲーティングで作成されたポピュレーションには「ポピュレーション名[auto]」と名前がつけられています。

⑤ illustrations 機能の統計グラフを用いて自動ゲーティングモデルのパフォーマンスを検証するには、マニュアルゲーティングのポピュレーションと自動ゲーティングのポピュレーションを event count で比較します。
⑥ Illustrations メニューを開いて自動作成された Autogating boxplot…という名前のillustration を開きます。

⑦ 特定のポピュレーションについてのブラインドテストのパフォーマンスを検証するには、Autogating
boxplot の illustration editor メニューの Save >Clone new copy でコピーを作成した後その他のポピュレーションの表示選択を解除するか、新規 illustration を作成します。
⑧ 特定のひとつのポピュレーションについてマニュアルゲーティングと自動ゲーティングの結果をボックスプロ
ットで比較するには、Plots 設定画面の Show dots と Show lines をオンにします。プロットの統計値は csv ファイルとしてエクスポートすることができ、マニュアルゲーティングと自動ゲーティング結果の相関性を他の専用ソフトウエアで詳しく検討することもできます。

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202312⑨ イベント（細胞）レベルで結果を図示するにはオーバーレイドットプロットを使用します。
⑩ Plots 設定で Plot type を Dot に、Overlaid をオンにして、Layout 設定の Overlaid にPopulations が割り当てられるようにします。Populations では表示したい自動ゲーティングポピュ
レーションのみにチェックを入れて選択します。
⑪ マニュアルゲーティングで使用した X、Y 軸を設定して Show gates をオンにすると、自動ゲーティン
グで作成した各ポピュレーションのオーバーレイプロットと、マニュアルゲーティングでどの位置に境界線を引いたかを同時に確認することができます。Tailored par file ゲーティングをしている場合は、最初のファイルのゲート位置が表示されます（統計値等は Tailored の位置で計算されます）。
⑫ プロットの解像度を変更したい場合は Plots 設定の Size や Dot size で調整できます。

３-２-５-２モデルを適用した自動ゲーティング結果の評価① トレーニングモデルを適用した自動ゲーティングの結果 Experiment には、Set up 画面の View
created experiment をクリックしてアクセスします。

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202312② 結果 Experiment の FCS ファイルには、自動ゲーティングパラメータがチャネルに追加されており、その名前は auto_gate_ポピュレーション名（トレーニング時にマニュアルゲートで与えられたポピュレー
ション名）となっています。Gating Editor ではこのチャネルによる自動ゲートが作成されており、そのゲート名はポピュレーション名_auto_cluster_gate となっています。

③ この自動ゲートと一緒にポピュレーションも作成され、ポピュレーション名[auto]と名前がつけられます。Population manager や Illustration editor、Population tree でこれまでのポピュレー
ションと同様に扱うことができます。
④ マニュアルゲーティングと比較したい場合は、Population tree と Sunburst を用いると便利です。

⑤ また illustration Editor では統計比較も可能です。自動作成されている Autogating box
plot of event counts という名前の illustration を開きます。
⑥ Layouts 設定の subgroup に populations を割り当て、１つの自動ゲーティングポピュレーショ
ンと対応するマニュアルゲーティングポピュレーションの計２つを選択します。
⑦ Plots 設定で、Show dots と Show lines をオンにします。

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202312⑧ 統計的有意差検定機能で自動ゲーティングとマニュアルゲーティングの相違を確認します。
⑨ イベント（細胞）レベルで結果を図示するにはオーバーレイドットプロットを使用します。
⑩ Plots 設定で Plot type を Dot に、Overlaid をオンにして、Layout 設定の Overlaid にPopulations が割り当てられるようにします。Populations では表示したい自動ゲーティングポピュ
レーションのみにチェックを入れて選択し、マニュアルゲーティングで使用した X、Y 軸を設定します。

⑪ Show gates をオンにすると、自動ゲーティングで作成した各ポピュレーションのオーバーレイプロットと、マニュアルゲーティングでどの位置に境界線を引いたかを同時に確認することができます。
Tailored par file ゲーティングをしていた場合は、最初のファイルのゲート位置が表示されます（統計値等は Tailored の位置で計算されます）。
⑫ プロットの解像度を変更したい場合は Plots 設定の Size や Dot size で調整できます。
３-２-６自動ゲーティング後の解析例
３-２-６-１統計グラフを用いたグループ間比較① Sample tags 機能で、各 FCS ファイルに比較したいグループ（群）の情報（例えば、タイムポイ
ントや刺激や治療の有無や前後、疾患や変異の有無、洗浄の有無など）をアノテーションします。

139

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202312② Illustration Editor で新規の illustration を作成し、Plots 設定で Box plot などの統計プロッ
トを選択後、Layout 設定の Subgroups に比較したい sample tags の dimension を設定します。

③ Plots 設定の Significance test で使用したい統計検定方法を選択し、グループ間の有意差を検討します。
３-２-６-２次元削減マップでのバックゲーティング
自動ゲーティングで作成されたポピュレーションを次元削減マップ上にオーバーレイ表示することで、デー
タセットの全容をクリアに包括的に確認・把握することができます。また、使用したモデルが適用した新規データでも問題なくワークしているかを確認するのにも役立ちます。
① 自動ゲーティングの結果 Experiment で、メニューバー＞Advanced Analyses > New
dimensionality reduction を選択します。どの次元削減アルゴリズムを選択するかは、ガイドビデ
オやアプリケーションノートを参照ください。
② 次元削減アルゴリズムが完了したら、結果 Experiment が自動作成されます。
③ 次元削減アルゴリズム結果 Experiment で、メニューバー＞illustrations > new illustration
を選択します。
④ Illustration Editor では、Plots 設定で Plot type: Dot plot、Overlaid をオンにします。
⑤ Layout 設定で Overlaid に Populations を割り当て、自動ゲーティングで作成されたポピュレー
ションをすべて表示対象とします。

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202312３-２-７トレーニング上限と計算時間の目安、トラブルシューティング
３-２-７-１トレーニング上限と計算時間の目安
他の機械学習アルゴリズム同様、サイズの大きすぎるデータをインプットするとサーバーでの計算処理がFailed となります。モデルトレーニングでは、自動ゲーティングに使用するチャネルパラメータ数、細胞イベン
ト数、対象ポピュレーション数が大きく影響します。これらを少なくすると、Failed になる頻度を効果的に減少させることができます。
モデルのトレーニング時の目安として、249 ファイル、計 3700 万細胞のデータセットを用いた検証結果を下図に示します。縦軸がモデルトレーニングに使用するチャネル数、横軸がインプットする細胞イベント数
で、緑色が問題なく完了できる範囲、黄色が Failed となる可能性のある範囲、赤色がメモリオーバーで
Failed になる範囲です。

黄色の領域の設定がされている場合は、設定画面の Event sampling セクションに Warning メッセージが表示されます。この時点でイベント数や対象ポピュレーションを削減することも可能です。

赤色の領域の設定がされている場合、設定画面の Event sampling セクションに、メッセージが表示されます。設定したポピュレーション数での上限細胞イベント数と使用するチャネルパラメータ数が表示されま141

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202312

す。メッセージに従い、上限細胞イベント数以下になるように変更するか、細胞イベント数を優先したい場
合は使用するチャネルパラメータ数がメッセージに記されている数以下になるように対象ポピュレーションを変更することをおすすめします。

モデルのトレーニングに必要とする時間は対象ポピュレーションの数と細胞イベント数に依存します。一般
的なサイズのデータセットであれば、高速で計算処理されます。各細胞イベント数の時のポピュレーション数に応じた目安時間を下図に示します。

この他に Advanced options の Training magnification を１以上に設定すると、その数値の倍数分の計算時間が必要となります。

トレーニングしたモデルを適用するステップ（Autogating inference run）では、データサイズの上限はありません。
３-２-７-２トラブルシューティング-

モデルトレーニングの設定画面でマニュアルゲートしたポピュレーションが表示されない場合
142

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202312

Cytobank のゲーティング機能（Gating Editor）では、Apply gates ボタンを押すことでそれまでの操作でされたゲートとポピュレーションの情報を Experiment 全体つまり Gating Editor 以外の機能にも適用し、Experiment gate としてバージョン保存します。自動ゲーティング機能は Gating
Editor 外の機能のため、Apply gates ボタンを押した Experiment gate のバージョンが反映されます。
自動ゲーティングのモデルトレーニングの設定画面でポピュレーションが表示されない場合、Experiment gate が更新されていない可能性が高いため、Gating Editor に移動して Apply
gates ボタンを押してください。
-

モデルのトレーニングで、あるひとつのポピュレーションの F1 スコアが０の場合自動ゲーティングアルゴリズムではモデルトレーニング時いくつかの工程でランダム性を用います。その際たまにモデルが、あるポピュレーションを認識できないことがあります。このような場合は Copy settings をクリックし Random seed がランダムになっているのを確認して、トレーニングを再実行してください。

-

モデルトレーニング結果のプロットを見ると、各ポピュレーションのスコアがばらばらの場合
マニュアルゲーティングでも難しいようなポピュレーションはどうしてもばらつきが大きくなってしまいます。このような場合はトレーニングデータの一貫性を向上させるため、与えているマニュアルゲート位置を確認して修正をご検討ください。

-

モデルのトレーニングでひとつまたはいくつかのポピュレーションだけが F1 スコアが悪かった場合
発現パターンが変調するポピュレーションはマニュアルゲーティングが難しく、これが F1 スコアの低成績をしばしば招きます。トレーニングデータに与えたマニュアルゲート位置の確認と修正をご検討ください。
また、前述のように自動ゲーティングアルゴリズムではモデルトレーニング複数の工程でランダム性を使用するため、使用した乱数の組み合わせによってモデルのパフォーマンスが低い結果となることが稀にあります。この場合には Copy settings で、使用する seed をランダムにしてトレーニングを再実行してください。あるいは影響を受けるポピュレーションの重みを増やして、それらに寄ったモデルトレーニングを実行させることもできます。

-

トレーニングモデルの適用を実行した時にいくつかのポピュレーションについての自動ゲーティングが失敗する場合
トレーニングによってモデルはデータの情報と構造を学習します。この構造とは、チャネルパラメータのスケール設定やコンペンセーション設定によって大きく影響されます。コンペンセーションマトリックスとスケール
設定は完全に同一のものを使用する必要はありません。むしろトレーニングに使用するデータとモデルを適用するデータのスケールとコンペンセーションは処理後の見え方（データ構造）が整合するように前処理してください。同一のパネルが使われ、一貫性のある機器設定で測定されたデータの場合、既存の Experiment のスケール設定をインポートすれば適切です。

-

スケールとコンペンセーションの設定が適切であることを確認したのに、モデルでの自動ゲーティングが完璧でない場合
クアドラント（四分割）ゲートでトレーニングされたモデルを使用する際、細胞イベントが複数のクアドラ
ントに割り当てられることがあります。これは Cytobank がクアドラントゲートの４つを独立した四角形ゲ
143

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202312ートとして扱うからです。このため自動ゲーティングでは、境界線上のイベントなどは複数のゲートポピュレーションに割り当てることが予想されます。

144

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202312３-３次元削減アルゴリズム（tSNE-CUDA、UMAP、opt-SNE、viSNE）
機械学習の教師なし学習に属するアルゴリズムで、多次元情報が有するデータの背景にあるパターンや分布を低次元（２次元）上に反映して可視化する手法です。マーカー発現パターンにおいて類似性の高い細胞イベントが２次元プロット上で近い位置に配置されるように可視化されるため、これまでのマニュアルゲーティングとは異なるアプローチでのサブポピュレーション解析や比較が可能となります。
Cytobank では tSNE-CUDA、UMAP、opt-SNE、viSNE の４種類が実装されています。
３-３-１軸スケールの調整（前処理）次元削減アルゴリズムでは演算中にゼロ（０）やマイナス値が発生した場合にエラーとなるため、Log ス
ケールでのインプットができない仕様となっています。ほとんどの FCM 機器からの fcs ファイルでは、
Cytobank アップロード時に自動でスケールを Arcsinh に変換するようになっていますが、解析前にご確認ください。
一般的にマニュアルゲーティングなどの解析をするのに適したスケールに設定することで、良好に実行できます。または、以下の方法でスケールを調整します。
① メニューバー右の Scales をクリックします。
② Experiment Scales 画面で蛍光チャネルのパラメータの Scale が Arcsinh になっているかをご確認ください。

GOOD

NOT GOOD
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202312③ チャネル名の目玉マークをクリックして左にヒストグラム表示します。
④ 必要な場合、Arg.（＝０近傍のリニア表示幅のパラメータ）や min. 、max.の数値を変更し、ネガティブの集団がシングルのピークとなり 10^0 付近にくるようにします。
目安値：フローサイトメトリーArg.150 以上、CytoFLEX Arg.3000、マスサイトメトリーArg.5⑤ すべての蛍光チャネル（解析に使用する）について調整をします。
３-３-２ゲーティングによる解析対象の絞り込み（前処理）
死細胞やダブレットが含まれていると解析に影響するため、解析を始める前にゲーティングで除いておきます。ヒトでは見分けにくい機器測定時の異常イベントをデータ QC で自動検出・除去しておくと更に良いです。また、特定の細胞集団内を解析対象としたい場合は、ゲーティングしてポピュレーションを作成しておきます。Gating Editor でゲーティング完了後、Apply gates ボタンを押してゲートポピュレーションの情報
を Experiment 全体に反映するのを忘れずに行ってください。
３-３-３設定と実行① メニューバー ＞Advanced analyses >Dimensionality Reduction＞New analysis を選択します。
② 実行したい次元削減アルゴリズムを選択し名前を入力します。
３-３-３-１Basic settings（共通基本設定）① Population でインプットする対象の細胞集団を指定し、FCS Files でファイルを選択します。
（viSNE は population を複数選択することができ、選択した各 population についてファイルを選択します。）② Event sampling でサンプリング方法を選択します。Desired total events はインプットする細胞数を表示します。各アルゴリズムでの上限イベント数を下に示します。

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Cytobank 簡易マニュアル-

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202312

Proportional:各ファイルの細胞数/全ファイルの総細胞数を反映してサンプリングする細胞数を決めます。各ファイルの割合を Desired total Events に反映して各ファイルからのサンプリ
ング数を定めます。

-

Equal：各ファイルから同数の細胞をサンプリングします。Desired per file Events （ｔSNE-DUDA, UMAP, opt-SNE）または Desired total Events（viSNE）を元に各ファイルから同数をサンプリングします。細胞数の少ないファイルがある場合はその数に合わせて同数を他のファイルからサンプリングします。

-

All events：すべての細胞を用います。

③ Channels でサンプルの細胞集団サブセットやグループ分けに用いるパラメータを選択します。
-

一般的に除外すべきパラメータ：
・FSC, SSC

・核（DNA）染色

・

生死判定
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Cytobank 簡易マニュアル-

v.4.100

・

ビーズ

・

Time

・

ハウスキーピング遺伝子

・外因性制御遺伝子・（プレゲートをしている場合）プレゲートとその上流のパラメータ・（他のアルゴリズムと組み合わせている場合）結果として付与されたパラメータ

202312

すべてのファイルに共通する Channel のみ選択できます。ファイルのパネルが１種類でない場
合、パネル内で解析に用いるすべてのファイルで共通している Channel のみ選択できます。

④ 必要な場合、Advanced settings を変更します。Advanced settings については次のセクションに記載します。
⑤ （viSNE 以外で Advanced settings の下）Normalizing scales が必要な場合はチェックを入れます。ここでのノーマライズは各チャネルの平均を０、標準偏差１で規格化したものとなります。
フローサイトメトリーデータでチャネル間のダイナミックレンジが異なる場合に有効なことがあります。
⑥ Data scaling と compensation は事前に確認・調整してあることをお薦めします。
⑦ Run Analysis ボタンを押して実行します。
⑧ 画面上部にステータスバーが表示されたらサーバーでの計算が始まっています。端末ではCytobank を終了しても大丈夫です。
⑨ 完了すると通知のメールが登録のメールアドレスに届きますので結果の URL をクリックします。

３-３-３-２Advanced settings（アルゴリズム別）-

tSNE-CUDAtSNE を GPU で高速処理するため、最も高速に次元削減することができます。Cytobank では以下の各種パラメータ設定（Advanced settings）を自身で調整することも、自動的に調整させることもできます。

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Cytobank 簡易マニュアル

・

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202312Iterations は tSNE アルゴリズムのグラジエント演算の繰り返し計算数です。収束すると計算を終了する opt-SNE などとは異なり、設定した iteration だけ計算を実行します。
Automatic ボックスのチェックを入れると、対象イベント数を 1500 で除算した数（最小750）に自動調整されます。iteration 数が小さすぎると細胞集団やサブポピュレーショ
ンが tSNE-CUDA マップ上に十分反映されません。収束していない tSNE-CUDA マップの特徴は下図のようなフィラメント状や引き伸ばしたような状態で見られることがあります。
このような場合は、Automatic ボックスのチェックを外し、iteration 数に任意の数を入力して、iteration 数を増加します。

・Perplexity は、高次元での各イベントの近接点との類似性の計算の際に、近接する何点について考慮するかを設定します。デフォルトは 30 で、ほとんどのシングルセルデータセッ

149

Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312トに適していますが、大規模なデータセットの場合は検討する必要がある場合があります。
概ね５～50 での検討をお薦めします。

150

Cytobank 簡易マニュアル

・

v.4.100

202312

Learning rate は、機械学習の最適化においてどのくらい値を動かすかの設定をします。Automatic ボックスにチェックを入れると、対象イベント数を early exaggeration（後述）で除算した数（最小 200）に自動調整します。基本的にはデフォルトの自動調整をお使いいただくのをお薦めしますが、手動調整も可能です。Learning rate は小さすぎても大きすぎても細胞集団が適切に分離したマップになりません。また、iteration
とも密接に関係しているため、learning rate を下げる時は iterations を増やして検討することをお薦めします。

・

Early exaggeration は、グラジエント演算の初期段階において、類似性の計算に系数を乗算することで、イベントの動きを増加させ、グローバル構造的な主要な分布パターン
を先に反映させるとともにクラスター（ランド）の分離を向上させるために設定します。
Early exaggeration のフェーズの後は、局所構造の反映のみを実行するようになります。初期段階の計算において、ギャップが増加傾向を示す場合は earlyexaggeration か learning rate が大き過ぎる可能性があります。

-

UMAP
tSNE と同様に、高次元情報の各イベントの類似性（サイトメトリーデータの場合はマーカー発現パターン）の分布構造を、低次元（２次元）上に反映して表示（可視化）することができます。経験的に、UMAP の方が tSNE よりもグローバル構造が反映されたマッピングが可能です。３つのパラメータを設定することができます。
・Num neighbors は最も重要なパラメータで、初期の高次元グラフを構築する時に用いる最近傍のイベントの数を設定します。UMAP の局所構造とグローバル構造のバランスに寄与します。値が小さいと局所構造をより維持したマップを作成します。値が大きいとグローバル構造をより維持するマップを作成しますが、詳細構造が失われる可能性もあります。デフォルトは 15 で、範囲は２～100 です。

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・

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202312

Minimum distance は、UMAP マップに表示するイベント間の距離を設定できます。
値が小さいと密度が高いように表示し、値が大きいとイベント間距離を緩めて表示できます。デフォルトは 0.01 で、範囲は０～0.99 です。

・Collapse outliers は、外れ値のイベントをまとめることができます。Z スコアが３より大きい場合は外れ値と見なされ、チェックが入っている場合には自動的に最大値または最小値にまとめられます。ほとんどのデータが狭い範囲に絞られているような時には、チェックを外して検討すると良い場合があります。

152

Cytobank 簡易マニュアル-

v.4.100

202312

opt-SNEtSNE アルゴリズムのグラジエント演算時、計算の収束を自動的に判断して終了します。大規
模データセットでの解析の際に、結果の品質は維持しながらパラメータの最適化をするための試
行錯誤にかかる時間を節約することができる可能性があります。

・

Perplexity は、高次元での各イベントの近接点との類似性の計算の際に、近接する何点について考慮するかを設定します。デフォルトは 30 で、ほとんどのシングルセルデータセッ

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Cytobank 簡易マニュアル

v.4.100

202312トに適していますが、大規模なデータセットの場合は検討する必要がある場合があります。
概ね５～50 での検討をお薦めします。
・

Learning rate は、機械学習の最適化においてどのくらい値を動かすかの設定をします。Automatic ボックスにチェックを入れると、対象イベント数を early exaggeration（後述）で除算した数（最小 200）に自動調整します。基本的にはデフォルトの自動調整をお使いいただくのをお薦めしますが、手動調整も可能です。Learning rate は小さすぎても大きすぎても細胞集団が適切に分離したマップになりません。また、iteration
とも密接に関係しているため、learning rate を下げる時は iterations を増やして検討することをお薦めします。

・

Early exaggeration は、グラジエント演算の初期段階において、類似性の計算に系数を乗算することで、イベントの動きを増加させ、グローバル構造的な主要な分布パターン
を先に反映させるとともにクラスター（ランド）の分離を向上させるために設定します。
Early exaggeration のフェーズの後は、局所構造の反映のみを実行するようになります。初期段階の計算において、ギャップが増加傾向を示す場合は earlyexaggeration か learning rate が大き過ぎる可能性があります。

・Seed は tSNE アルゴリズムの２次元乱数マップを作成する際に用いる乱数シードを設定することができます。つまり、同一データ・同一設定・同一 seed で複数回アルゴリズムを実行すると、まったく同一の結果のマップを得ることができるので、ワークフローの検証やアルゴリズムの再現性の確認に用いることが可能です。実行前に指定しない場合は、
Cytobank がランダムに seed を設定して実行します。計算が完了して結果が表示されると、どの seed が使用されたのかを結果 Experiment の setting 画面で確認することができます。Seed は tSNE アルゴリズムの客観性の基盤となるパラメータのため、以下２点にご注意ください。

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Cytobank 簡易マニュアル

１．

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特定の seed をいつも（または複数の Experiment にまたがって）使用すること。tSNE アルゴリズムのランダム性に人為的に制限をかけることになります。

２．

Seed を入力して実行する場合は、無作為の数値を設定するようにします。
その時のお財布の中の金額やレシートの数値などが時々使われます。

・Max iterations は、tSNE アルゴリズムのグラジエント演算が収束しなかった場合に終了させる繰り返し計算回数を設定します。opt-SNE では、Max iterations よりも少ない計算回数でも、収束に至ると最適化されたと判断して自動的に計算を終了します。

-

viSNE
tSNE に Barnes-Hut を実装しており、Cytobank の次元削減アルゴリズムではもっとも早くに搭載されています。Premium Cytobank のトライアルユーザーでは、Advanced
settings はデフォルトで変更ができない仕様となっています。

・Seed は tSNE アルゴリズムの２次元乱数マップを作成する際に用いる乱数シードを設定することができます。つまり、同一データ・同一設定・同一 seed で複数回アルゴリズムを実行すると、まったく同一の結果のマップを得ることができるので、ワークフローの検証やアルゴリズムの再現性の確認に用いることが可能です。実行前に指定しない場合は、
Cytobank がランダムに seed を設定して実行します。計算が完了して結果が表示されると、どの seed が使用されたのかを結果 Experiment の setting 画面で確認することができます。Seed は tSNE アルゴリズムの客観性の基盤となるパラメータのため、以下２点にご注意ください。
1.

特定の seed をいつも（または複数の Experiment にまたがって）使用すること。tSNE アルゴリズムのランダム性に人為的に制限をかけることになります。

2.

Seed を入力して実行する場合は、無作為の数値を設定するようにします。その時のお財布の中の金額やレシートの数値などが時々使われます。

・# iterations (number of iterations)は、tSNE アルゴリズムのグラジエント演算の繰り返し計算回数で、デフォルトでは 1000 に設定されています。 データの種類、サンプ
155Cytobank 簡易マニュアル

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202312

ル種類、パネルや細胞数によってはデフォルトでは計算が十分でない場合があります。フローサイトメトリーデータでは細胞数が 10 万細胞あたり#iterations1000 を検討の目安となります。マスサイトメトリーの場合はもう少し少ない回数が目安となりますが、パネル（チャネル数）も影響することにご留意ください。Iterations が小さ過ぎると、下図のようにボール状やフィラメント状、引き伸ばされたようなマップが作成されます。また、tSNE１，
tSNE2 の各軸の範囲が 30 以下の場合も iteration 不足の目安となります。計算の収束は tSNE アルゴリズムの乱数マップの初期値にも依存するため、十分な iterations
も同様であることにご留意ください。

・

Perplexity は、高次元での各イベントの近接点との類似性の計算の際に、近接する何点について考慮するかを設定します。デフォルトは 30 で、イベント数 100 以上であればほとんどのデータセットで良好な結果となります。設定できる値の上限はイベント数に依存し、（解析対象イベント数-１）/３よりも大きい値は入力できません。一般的にPerplexity を大きくすると viSNE マップの空間的な分離が向上することが期待されますが、データセット内に分離できる細胞集団が十分ない場合は、perplexity を大きくしてもランドが形成されることはありません。

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・

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Theta は、Barnes-Hut の影響度の大きさを設定し、基本的にはデフォルトで変更しな
いことをお薦めします。値が小さいほど tSNE オリジナルに近く計算に時間がかかり、値が大きいほど Barnes-Hut の影響が強くなり計算は早く終了します。

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202312３-３-４複数のアルゴリズム結果の比較表示
次元削減アルゴリズムが完了すると、その結果は元の Experiment に紐づいた result Experimentとして Cytobank に存在します。解析前の Experiment（親 Experiment）はメニューバーの帯が水色ですが、 結果の Experiment は紫色です。
同一の親から複数のアルゴリズムを実行し、結果 Experiment が並列に子となっている場合、どの結果が最も良さそうかを並べて比較することができます。
① 結果 Experiment の Settings ボタンを押します。

② Analysis run info が開きます。
③ プロット上部の Compare results with other analysis をクリックします。または、右上
黄緑色の View results＞Compare with other analyses をクリックします。

④ Compare dimensionality reduction analysis results ウィンドウが開きます。
⑤ Select analysis to compare セクションで表示したい結果 Experiment にチェックを入れます。
⑥ 左側メニューで、比較表示するファイルやマーカー、More settings を開くと Zoom やカラー
パレット、表示ドットの設定変更や背景色を変更できます。

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202312⑦ （必要な場合）Analysis run info の下部は実行した設定を確認することができます。

３-３-５結果のマップ上でのゲーティング
結果の Experiment では、解析に用いたイベントについて元の Experiment の情報をすべて有したま
ま、チャネルパラメータに次元削減パラメータ（tSNE1 と tSNE2/UMAP1 と UMAP2）が追加されています。
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202312Gating Editor の X・Y 軸パラメータを tSNE1・2/UMAP1・2 にすることで、tSNE・UMAP マップとして表示し、ゲーティングすることが可能です。
結果 Experiment は帯紫色

ポピュレーションを選択

ゲートリストDot-Color By Channel
を選択

X 軸：tSNE1
Y 軸：tSNE2
Coloring Channel:色表示したいパラメータを選択① メニューバーの Gating をクリックします。
② Active Population でプロットに表示したい集団を選択します。
③ Plot type を Dot-Color by channel にします。
④ X 軸を tSNE1/UMAP1 に設定します。
⑤ Y 軸を tSNE2/UMAP2 に設定します。
⑥ Coloring Channel をカラースケールの色で表示したいパラメータに切り替えます。
⑦ パラメータを細胞集団を同定するマーカーに切り替えると、プロット上のどの細胞がそのマーカーを強く発現しているかを色で確認することができます。
⑧ どのランド（プロット上の島）がどの細胞集団であるかが判断できたら、ゲーティングツールで細胞集団を囲い、名前を付けます。
⑨ マップ上でゲーティングした集団も、マニュアルゲーティングの集団と同様ゲートリストに追加されます。
⑩ Apply gates ボタンを押します。
⑪ Illustration に移動しますので、マップ上でゲーティングしたポピュレーションを用いて、サンプル間比較やヒートマップ表示などを行うことができます。
160

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202312

ゲーティングツールtSNE 上で作成したゲートもリス
トに表示される。

Coloring Channel にポピュレーションを規定するパラメータを選択
ゲーティングしたら必ず Apply
gates して反映

３-３-６結果の良い/悪いの見方
機械学習処理である次元削減アルゴリズムでは、インプットするデータが適切な前処理をされていなかったり、設定が適切でなかったりすると良くない結果となります。
良くない例としては、たとえば viSNE では下図左のように奥行がありランドに分かれていないプロットが出力されます。
Poor
奥行きがあり分かれていない

Good
平面でランドに分かれている

このような結果が得られた場合は以下をご確認ください。
-

設定した細胞集団は適切か（デブリやダブレットを含んでいないか）。

-

使用したパラメータのスケール設定は適切か。

-

コンペンセーションは適切か。

上記に問題ない場合は、演算不足の可能性が考えられますため、viSNE 設定の Advanced setting
を開いて、Iterations をデフォルトの 1000 から 3000 または 5000 に増やしてお試しください。

161

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202312２次元ランダムマップを作成するときの乱数ジェネレーターのシード
数値にするとシードを指定でき、再現性を確認することが可能※シードを指定してしまうとランダムに制限が入るので解析には不適当
グラジエント演算の回数
ポイントペアワイズを測定する数

処理スピードと正確性のバランス

他のアルゴリズムについては、デフォルト設定でほとんどの典型的なデータセットに良好なようになっています
が、Advanced settings もご参照ください。
３-３-７結果の illustrations での表示と比較
特定のマーカーの発現強度のサンプル間での違いを、次元削減アルゴリズムのマップで比較したい場合、
illustrations でプロットを並べることで分かりやすい Figure にすることができます。
ここでは例として、viSNE 結果の刺激なしと LPS 刺激後のサンプルとの間で、CD33＋の細胞集団において pp38 リン酸化強度が異なっている figure の illustrations 設定を展開します。
背景：刺激なしサンプルと LPS 刺激ありサンプルについて、細胞集団を同定するマーカー
CD3,4,8,20,33 を Channels に設定し、viSNE を実行しました。viSNE 完了のメールを受け取り、
そのリンクを開きました。
３-３-７-１Channel colored map でサンプル間の発現変動を比較① Gating を開きます。

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202312② Coloring Channel を切り替えて各マーカーの色強度から、どのランドがどの細胞集団かを判断し（または対象の集団のみを）ゲーティングします。
③ Apply gates を押します。
④ メニューバー＞illustration > New illustration で illustration Editor に移動します。
⑤ Plots と Layout を開き、下図のように設定します。
⑥ Layout の各項目は数字 of 数字部分（上図赤枠）をクリックして以下に設定します。
⑦ FCS files では、刺激なし（Unstim1）と LPS 刺激あり（LPS）のサンプルファイルを選択します。
⑧ Channels では、CD33 と pp38 のみを選択します。
⑨ Populations では、singlets（プロットに表示したい細胞集団）を選択します。
⑩ プロットが自動で変更されます。
⑪ CD33+のランド（②のゲーティングでは viSNE CD33++）において、刺激なしのサンプルでは
pp38 は上がっていないが、LPS 刺激ありのサンプルでは pp38 が上がっていることが示されています（赤矢印）。

⑫ Plots 上で Show gates を ON にするとプロットに②のゲートを表示することもできます。

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202312

表示するラベルは More plot settings をクリックして Gate label 設定で、表示なし（None）、イベ
ント数（Event count）、ゲート名（Gate Name）、パーセント（Percentages）を選択することができます。

Overlaid や Concatenate で Tailored par file ゲーティングをしている場合は、最初のファイルのゲー
ト位置が表示されます（統計値等は Tailored の位置で計算されます）。
３-３-７-２各細胞集団のヒートマップ表示で比較① illustrations > New illustration で illustration Editor へ移動します。
② Plots と Layout を下図のように設定します。

③ Layout の各項目は数字 of 数字部分（上図赤枠）をクリックして以下に設定します。
④ Populations では作成したゲートからヒートマップに使用したいポピュレーションを選択します。ここでは viSNE マップ上で作成したゲートとします。
⑤ Channels では細胞表面マーカーと機能性マーカーをすべて選択します。

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202312⑥ FCS files では刺激なしサンプル（Unstim1）と LPS 刺激ありサンプル（LPS）のファイルを選択します。

⑦ ヒートマップが自動変更され、表示されます。
⑧ LPS 刺激サンプルで、viSNE マップ上で作成した CD33+のポピュレーションでのリン酸化機能性
マーカーpp38 の発現が増加していることが示されています。
⑨ ヒートマップ上にオーバーカーソルをするとポップアップが表れ、セル内イベントのプロットが表示されます。Viewthrough plot 部分でポップアッププロットの設定を変更することもできます。
⑩ ヒートマップに用いる統計値は Plots の Statistics で変更するか、ヒートマップ下部のStatistics 欄 Displaying 部分で変更可能です。
３-３-７-３マニュアルゲーティングを結果のマップ上に表示① Gating Editor でマニュアルゲートをしておきます。
② illustrations > New illustration で illustration Editor へ移動します。
③ Plots と Layout を下図のように設定します。

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202312④ Layout 設定の Populations で①のマニュアルゲートポピュレーションを選択します。

⑤ プロットの X 軸 Y 軸が tSNE1＆tSNE2 でない場合はプロットをクリックし、ポップアップのSetting で X axis と Y axis を変更します。
⑥ 凡例の名前をドラッグ＆ドロップで上下を変更することができます。凡例の一番上にある項目がオーバーレイの最下層に配置され、並び順に配されています。
３-３-７-４ファイル統合プロットでマップの全体像を表示する
次元削減マップのファイル統合プロット表示をご参考ください。

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202312３-４FlowSOM

３-４-１FlowSOM とは処理が速く質の高いクラスタリングができる Self-Organizing Maps (SOMｓ)アルゴリズムを用いて各マーカーが全細胞でどのように振舞っているかを可視化する手法です。設定されたパラメータをもとに細胞をクラスター化した後、クラスターの SOM を作成し、これを Minimum Spanning Tree(MST)にします。MST 上のクラスターには設定された数のグループに自動的に分けられメタクラスターとして割り当てられます。Cytobank では、FlowSOM 結果として、ポピュレーション細胞数とマーカー強度についてをパイチャ
ート、スターチャートやチャネルカラープロットなどの形式の SOMs と MTSs で出力するほか、新規
Experiment として作成し、元のチャネルにクラスターとメタクラスターの ID を付加します。
３-４-２tSNE/UMAP マップ上に FlowSOM メタクラスターを表示する場合
FlowSOM で作成されたメタクラスターを tSNE/UMAP マップ上に表示したい場合は、先に
tSNE/UMAP を施しておきます。流れとしては、データのインポート＞コンペンセーション、スケール調整、
データ QC、クリーンアップ＞（プレゲート）＞tSNE/UMAP>FlowSOM となります。この時、FlowSOM は tSNE/UMAP の結果 Experiment（帯が紫色）から始めてください。
３-４-３FlowSOM 設定・実行① メニューバー＞Advanced Analyses＞Clustering >FlowSOM >New Analysis を選択します。
② New FlowSOM analysis name;に解析名を入力します。
③ Population で、対象の細胞集団（ゲートポピュレーション）を選択します。
④ FCS Files で、ファイルを選択します。
⑤ Clustering channels でクラスタリングに用いるチャネルを選択します。

ViSNE 解析名の編集

解析対象集
団（ゲート
名）を選択

ファイルを選択

クラスタリング
チャネルを選択

データのサンプリング方法の選択

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202312⑥ Event Sampling で、データのサンプリング方法を選択します。
-

Equal: 各ファイルの細胞数の違いは無視して同数の細胞をサンプリングします。

-

Proportional: 各ファイルの細胞数の違いの比を反映してサンプリングする細胞数を決めます。
Use all events:すべての細胞を用いる（上限 400 万細胞）。

-

Algorithm settings⑦ SOM creation で、用いる SOM を選択します。
-

Create a new SOM:新規に SOM を作成します。

-

Use an existing SOM from another run:既存の SOM を用います。選択すると使用する SOM の Experiment の FlowSOM を指定できるウィンドウが表示されます。

⑧ Clustering method で、クラスタリング方法を選択します。Hierarchical Consensus を推奨します。
⑨ Number metaclusters で、メタクラスターの数を設定します。
⑩ Number clusters で、クラスターの数を設定します。
⑪ Iterations で、機械学習の繰り返し数を設定します。10 を推奨します。
⑫ Seed で、乱数シードの設定をします。Random を推奨します。
Transformations⑬ Data scaling で、スケールノーマライズの有無を設定します。
⑭ Compensation で、適用されているコンペンセーションを確認できます。

用いる SOM の選択（新規/既存）
クラスタリング方法:Hierarchical Consensus 推奨
メタクラスター数
クラスター数機械学習の繰り返し数：10 推奨
乱数シードの設定：Random 推奨

スケール設定コンペンセーション設定（表示のみ）

PDF output settings⑮ Populations for pie charts で、PDF 出力するパイチャートに表示する細胞集団を選択します。
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202312⑯ Channels to plot で、PDF 出力する MST で色強度表示するチャネルを選択します。
⑰ Clustering sizing で、クラスターの表示サイズを選択します。
-

Relative：クラスターの細胞数に応じて相対的に変化させます。

-

Fixed:固定-

Relative and Fixed:両方⑱ Output file type で、出力するファイル形式を選択します。PNG の方が解像度は高いです。
⑲ Toggle metacluster background in plots で、メタクラスター表示するプロットを選択します。

パイチャート表示する集団設定

MTS で表示するチャネル設定

クラスターの表示サイズ
出力ファイル形式

メタクラスタリングするプロットの選択

実行ボタン⑳ 画面上部緑色の Run FlowSOM Analysis ボタンを押して実行します。
㉑ 画面上部にステータスバーが表示されたら Cytobank を終了しても大丈夫です。
㉒ 計算が完了すると通知のメールが登録のメールアドレスに届きますので URL をクリックします。

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202312３-４-４FlowSOM 結果の出力ファイル① 通知メールの URL を開くと FlowSOM 結果画面が開きます。
② 画面上部の Download the run info and plots をクリックし、FlowSOM 結果フォルダをダ
ウンロードします。

③ ダウンロードしたフォルダの中には、FlowSOM 設定にもよりますが、以下のファイルが入っています。
-

FlowSOM run info file：設定や解析の情報が入っています。

-

Supporting_files：結果の解析には用いません。FlowSOM クラスターをもとに新規 FCS ファ
イルを作成したり、解析プロセス時間の記録が含まれています。

-

Results フォルダ：PDF や PNG 形式の結果ファイルが入っています（詳細は次のセクション）。
ファイル形式は FlowSOM 設定 Output file format によって異なります。

３-４-４-１Result フォルダ内結果ファイルの見方
FlowSOM 設定にもよりますが、典型的な results フォルダは以下のファイルを含みます。設定でOutput format を PNG にした場合は、PDF でなく同じ名前ルールで PNG ファイルとなります。

-

Legend.pdf：クラスターとメタクラスターの MST と SOM フォーマットでの ID を見ることができます。

-

Channel_colored _MSTs フォルダ：FlowSOM 設定の PDF output settings で選択したチャネルについてすべてのサンプルを統合した MST を表示する
aggregated_channel_coloerd_MSTs.pdf を含みます。メタクラスターの表示の有無は設定の toggle the meta-cluster background で変更可能です。

-

Metaclustering_comparisons.pdf：hierarchical consensus clustering・hierarchical clustering・k-Means の３つのクラスタリング方法によるメタクラスターMST が入っており、最適化のための比較ができます。設定で指定したものについてはラベルに記載があります。
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202312

Star_plots.pdf：スタープロットでの MST と SOM フォーマットによる結果です。スタープロットでは、クラスター内のすべての細胞についての、（FlowSOM 設定で指定した）clustering
marker の平均強度が示されています。扇形になっている各マーカーの高さが強度を示しており、扇が大きいものほど発現強度が高いということになります。クラスタリングチャネルとスタープロットで表示しるチャネルは別々に設定できるため、Seed を同一にして再実行することで、見せたいチャネルを強調することができます。

-

Population_pie_charts.pdf：マニュアルゲーティングとの比較ができます。パイチャートでは、
FlowSOM が自動的に作成したクラスター内に、マニュアルゲーティングでの各ポピュレーションが何％含まれているかを示します。MST と SOM フォーマットの両方が出力されます。クラスターの周りを囲む色で示されているメタクラスター表示の有無は設定の toggle the meta-cluster
background で変更可能です。

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202312

mst_definition フォルダ：MST の構築に関連する情報が入っています。

※csv ファイルの出力はなくなりました。FlowSOM 結果 Experiment から Export statistics にて出力ください（テンプレートを使用すると便利です）。
３-４-５FlowSOM 結果の Cytobank への出力
FlowSOM が完了すると、元の Experiment の情報に FlowSOM cluster ID と metacluster ID（下図）が追加された FlowSOM 結果 experiment が作成され元 Experiment の子
Experiment としてリンクされます。

FlowSOM 結果 Experiment では、metacluster_id を番号ごとに自動ゲーティングし（上図右）、
ポピュレーションとします。また、tSNE などの次元削減アルゴリズムの結果 Experiment から FlowSOMを実行すると、illustrations に Metacluster Box plot、Metacluster Dot overlays、Metacluster Heatmap の３つの illustration が自動的に作成されます。
３-４-５-１クラスターの自動ゲーティング：Cluster gates
FlowSOM メタクラスターは自動でポピュレーションとして作成されますが、FlowSOM クラスターや他のアルゴリズムのクラスターパラメータや、または任意の複数のクラスターを ID 番号で自動的にポピュレーション
化することができます。その他 file number などのナンバリングパラメータでも実行可能です（一度に作成できる数は 200 までなので、それ以上の場合は複数回に分けて実行します）。
① メニューバー＞Gates >Gating Editor をクリックします。
② Gating 画面上部の Cluster gates をクリックします。

③ Add Cluster Gates ウィンドウが表示されます。
④ Select a channel でクラスターチャネル（例 FlowSOM_cluster_id）を選択します。
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202312⑤ Gate name prefix: に名前を入力します。
⑥ Define specific gates: では必要であれば以下のような設定ができます。
特定の ID のクラスターだけゲートポピュレーションにしたい場合は、ID 番号をコンマ区切りで-入力します(例クラスターID１と２と３を各々ゲートポピュレーションにしたい→1,2,3)。
連続した番号を指定する場合は最初の番号と最後の番号をコロンで繋ぎます（例：クラス-

ターID５から 10 までを各々ゲートポピュレーションにしたい→5:10
クラスターを統合してゲートポピュレーションにしたい場合は()でくくります（例：クラスターID-

６と８と 10 を統合したい→(6,8,10)、20 から 40 までをすべて統合したい→（20:40）、クラスターID1 から３までと 10 から 12 までを１つに統合したい→(1:3,10:12)）。
⑦ Apply Change ボタンを一回だけ押します。ここでは画面は変わりません。

⑧ ブラウザの再読み込みボタンを押します。Gates リストに作成されたクラスターゲートが表示されます。
⑨ Gating 画面の Apply gates ボタンを押します。
３-４-５-２FlowSOM 結果の評価
FlowSOM 結果の評価方法としては、以下の３つが便利です。

-

FlowSOM メタクラスターを tSNE マップ上にオーバーレイ表示① FlowSOM を実行する前に tSNE 等の次元削減アルゴリズムを実施し、その結果
Experiment（紫色帯）の Advanced analysis から FlowSOM を実行します。
FlowSOM 結果 Experiment を開きます。
② メニューバー＞Illustrations >View all saved をクリックし Metacluster Dot Overlaysを開きます。

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202312③ Plots と Layout を下図のように設定します。

-

Plot type：Dot-

Overlaid：On-

Color by：Overlaid dimension-

Layout 設定の Overlaid：Populations-

Columns：FCS files④ Layout の Populations で FlowSOM メタクラスターのポピュレーションを設定します。
⑤ プロットの X 軸 Y 軸が tSNE1＆tSNE2 でない場合はプロットをクリックし、ポップアップのSetting で X axis と Y axis を変更します。

⑥ Save＞Clone new copy で複製を別名作成し、Layout の Populations でマニュアルポ
ピュレーションのみを選択すると、viSNE マップ上でのマニュアルゲーティングの分布とFlowSOM メタクラスターを比較することができます（下図左：マニュアルゲーティングのポピュレーションを viSNE マップ上に表示、右：FlowSOM によるメタクラスター）。この時、ブラウザのタブを分けることでモニターに並べて表示することもできます。

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クラスタリングチャネルでのメタクラスターのヒートマップ表示① メニューバー＞Illustrations > Metacluster Heatmap を開くか、ない場合は New を選択し、名前をつけます（例 FlowSOM Heatmap）。
② Plots と Layout を下図のように設定をします。Populations では FlowSOM で作成された
メタクラスターのポピュレーションを、Channels では各メタクラスターのフェノタイプを同定するため
Clustering channel を設定します。

-

Plot type：Heatmap-

Statistic：Median-Layout の Rows：Populations-

Columns：Channels-

Table 1：FCS Files③ 細胞表面マーカーの強度の情報から、各メタクラスターがどの細胞集団であるかや、どのような特性を有する集団であるかを確認し、同定することができます（下図の例ではFlowSOM_metacluster1 は CD3+CD4+、FlowSOME_metacluster2 は
CD3+CD4-など）。メタクラスターを統合したい場合は、Automatic cluster gate 機能で統合したゲートポピュレーションを作成し、そちらを illustration で使用します。

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202312■クラスタリングチャネルでのメタクラスターのヒストグラムやドットプロット表示
Illustrations で、下図のようにヒストグラムやドットプロットで比較や同定も可能です。
Populations では FlowSOM で作成されたメタクラスターのポピュレーションを、Channels では各
メタクラスターのフェノタイプを同定するため Clustering channel を設定します。
ヒストグラム例

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ドットプロット例

３-４-５-３グループ間で有意差のある FlowSOM メタクラスターを検討-

箱ひげ図でグループ間に有意差のあるメタクラスターがあるかを検討する
FlowSOM 結果 Experiment に自動作成された Metacluster Box plot という名前のillustrations を開き、Plots 設定と Layout 設定を sample tags を用いて調整して、各メタクラ
スターについて群間比較と有意差検定し、グループ間で有意差のあるメタクラスターを同定することが
できます。

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３-４-５-４ヒートマップでマーカーの変動を可視化する
FlowSOM 結果 Experiment に自動作成された Metacluster Heatmap という名前のillustrations を開き、Clustering channel に設定しなかった機能性マーカー（サイトカインやリン酸化、遺伝子など）を表示する Channel に設定することで、サンプル間の変動を可視化することができます。

３-４-５-５複数のファイルをグループにまとめて FlowSOM メタクラスターを次元削減マップ上にオーバーレイ表示する
FlowSOM メタクラスターを次元削減マップ上にオーバーレイで統合表示する機能は virtual
concatenate に搭載されていないため、R を使用して FCS ファイルを１つにまとめた統合ファイルを作成し、それを Cytobank へ再アップロードする必要があります。サポートまでお気軽にお問い合わせください。

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３-５SPADE
３-５-１SPADE とは
SPADE (Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events) とは、表現形の類似した細胞をクラスタリングし、階層的なツリー構造で表現する可視化手法です。
【参考文献】
Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.
Qiu P, et al. Nat Biotechnol (2011) 29(10):886-91
３-５-２SPADE 設定・実行① Experiment メニューバー＞Advanced analyses>SPADE > New analysis を選択します。
② New SPADE analysis name: に名前を入力します。
③ 画面が切り替わります。

Target Number of Nodes：
ノード数の指定目安）9～15 チャネルの解析で200 ノード
Down sampled Events
Target：ダウンサンプルの設定
Percent：各ファイルで総イベント
数あたり何％をインプットするか。
Absolute Number:インプット細胞数（各ファイル）
デフォルト 10％（推奨）実行ボタン

Population：
解析対象のゲートポ
ピュレーションの指定

Clustering
Channels：
クラスタリングに使用するチャネルの指定Fold-ChangeGroups：
フォールドチェンジのコントロールとなるファイルの指定④ Target Number of Nodes：クラスタリングによって形成されるノードの数を指定します。目安としては 9～15 パラメータのデータセットの場合 200 ノードを設定します。
⑤ Downsampled Events Target：ダウンサンプル強度を指定します。ダウンサンプルではヒスト
グラムで著しく高いピークの上部を切るような方法で SPADE へのインプット細胞数を減らすとともに、低いピークを持つ細胞集団を同定しやすくします。Percent または Absolute number のど
ちらかに値を入力します。Percent は、各ファイルの全細胞数を 100％としたとき、何％の細胞
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数にダウンサンプルして SPADE へインプットするかを設定します。Absolute number は、各ファ
イルから何細胞にダウンサンプルしてインプットに用いるかを設定します。10％をデフォルトとして推奨しています。
⑥ Population：解析に使用するゲートポピュレーションを指定します。通常は死細胞・ダブレット・
デブリ除去後のゲートポピュレーションを指定します。
⑦ Clustering Channels：クラスタリングに使用するチャネルを指定します。細胞集団を規定する
チャネル（細胞表面マーカーなど）をパラメータとして選択します。
⑧ Fold-Change Groups：コントロールとなるファイルを指定します。
⑨ Compensation: コンペンセーションの調整が可能ですが、先にコンペンセーション調整は済ませておいて File internal を使用することを推奨します。
⑩ 画面下部の緑色部分をクリックして実行します。
⑪ 画面上部に進捗バーが表示されたらサーバーでの計算処理が始まっていますので、Cytobank
を終了しても大丈夫です。計算が完了すると登録メールアドレスに通知とリンク URL が届きます。
３-５-３SPADE 結果の表示と解析① 通知メールの URL を開くと SPADE ツリーのある結果画面が開きます。

機能ツールボックス
SPADE 解析時の設定（表示のみ）
ノードサイズの細胞数とチャネル強度のカラーバー

選択したノードの情報表示② 画面左の機能ツールボックス SPADE Tree Rending を開き、ツリー表示するファイルやパラメー
タを切り替えてどのノードがどの細胞集団であるかを解析します。
-

Sample/File Name: 表示するサンプルファイルの選択
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プロット表示するファイルを選択表示するパラメータ（チャネル）やス
ケール、色、ノードサイズ等の設定

バブルの作成SPADE ツリー表示の変更
保存とリセット-

Parameter: ノードの色強度として表示するパラメータ-

Metric: ノードの色強度に用いる統計値-

Scale Range: ノードの色強度の最大/最小値の決定方法-



Local→現在表示されているファイルのみでの最大/最小値



Global→全てのファイルの最大/最小値

Scale Symmetry: 色強度を基準値から上下に対称とするか（Symmetry）しないか（Asymmetry）-

Color Scheme: 使用するカラースケールの選択-

Background Color: 背景色の選択-

Node Size: ノードの直径の最大/最小値の設定-

Scale Range: ノードの直径の最大/最小値の決定方法


Local→現在表示されているファイルのみでの最大/最小値



Global→全てのファイルの最大/最小値-

Add Bubble：選択したノードをまとめてバブルを作成します。

-

Remove Selected Bubble(s)：選択したバブルの解除-

Select All nodes：すべてのノードを一括選択します。

-

Rotate Selected Nodes：ノードやバブルを選択しボタンを押して回すと任意の角度に回転します。

-

Save Tree：結果から追加したバブルやツリーの修正を保存します。

-

Reset visualization：メール通知されたときの初期の SPADE ツリーに戻します。

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３-５-４バブルの作成① 表現形の似たノード同士を囲って細胞集団などの名前をつけることができます。
② バブルとして囲いたいノードを複数選択します。選択すると、ノードの縁が太くなります。Shift ボタ
ン＋クリックでノードごとに選択解除できます。
③ Add Bubble ボタンをクリックします。
④ バブルの名前（細胞集団名など）を入力し OK を押します。
バブルを選択して Remove selected bubble ボタンをクリックするとバブルを解除することができます。
３-５-５選択したノードのプロット表示
選択したノードまたはバブル内の細胞についてプロットで表示して確認することができます。
① ノードもしくはバブルを選択します② 画面左の機能ツール Events Plot を開きます。
③ Plot type：プロットの種類を選択します。
④ Y-Channel：Y 軸のパラメータを選択します。
⑤ X-Channel：X 軸のパラメータを選択します。
Pop-Out New Plot をクリックすると、プロット図を新しいウィンドウで表示できます。

選択しているノード（複数可）内のイベント（細胞）のプロットを表示

３-５-６バブル内の細胞（イベント）の出力
バブル内のイベントデータを出力し、新たな Experiment を作成することができます。SPADE 解析による細胞集団をバブルとして出力し、ドットプロットやヒートマップなどで再解析することができます。
① 画面左機能ツールの Actions を開きます。
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202312② Export の Select Bubbles To Export より、出力したいバブルを選択します。
③ Export to New Experiment をクリックします。
④ バブル内のイベントを新規の Experiment へ出力します。

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３-６CITRUS
３-６-１CITRUS とは
CITRUS (cluster identification, characterization, and regression)とは、相関または予測のアルゴリズムを用い、統計的な群間比較です。群（グループ）間の有意差やバイオマーカー探索を抽出するのに役立ちます。
CITRUS は２つの工程で構成されています。最初に群の識別なしにすべてのサンプルで SPADE に似た
クラスタリングを行います。次に各クラスタリングについて、群間で有意差があるものを相関または予測として抽出します。抽出に用いるアルゴリズムは SAM、PAMR、LASSO です。
各群３サンプル（n=3）以上で CITRUS 自体の実行は可能ですが、解析結果として用いるには
n=8 以上を強く推奨します。
３-６-２CITRUS 設定・実行① デブリ・ダブレット・死細胞除去や対象の細胞集団を絞るゲーティングを前処理として済ませておきます。
② Experiment メニューバー＞Advanced analyses>CITRUS > New analysis を選択します。
③ New SPADE analysis name:に名前を入力します。
④ 画面が切り替わります。
⑤ Population ボックスの Choose を押し、対象の細胞集団を選択します。

解析名を変更Population：解析対象となる細胞集団（ゲート名）を選択
File Grouping：サンプルファイルをグ
ループ分け
Clustering Chennels：サブポピュ
レーションを規定するパラメーターを選
択適用コンペンセーションの選択
使用するモデルを選択※判断つかない場合は全部選択し結果から検討
・SAMー相関・PAMRー予測
・LASSO via GLMNETー予測（２
群のみ）

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202312⑥ File Grouping ボックスの Choose を押します。
⑦ Add file group(s)ボタンを押し、グループ名をカンマ区切りで入力します。
⑧ グループ名が表に追加されるので、属するファイルのラジオボタンを ON にします。グループ名とファイル名が部分一致すると自動で割当てられます。間違いがないかも確認します。
⑨ Clustering channels ボックスの Choose を押し、クラスタリングに使用するパラメータを選択します。
⑩ Association Models を選択します。
-

SAMー相関

-PAMRー予測-LASSO via GLMNETー予測（２群のみ）⑪ Cluster Characterization で、各クラスターの何をもとに差異を検討するかを選択します。
-

Abundance：存在比率-

Medians：パラメータ強度（選択するとリストが表示されるので、そこから選択）⑫ Event Sampling で、CITRUS にインプットする細胞のサンプリング方法を選択します。
⑬ Equal：各ファイルから同数（最少のファイルに揃えます）⑭ Max per file：ファイルからの数を揃えない⑮ Event sampled per file で各ファイルから用いる細胞数を入力します。Est. total events
to be clustered に総細胞数が表示されます。

各クラスターのどちらをもとにして差異を検討するかを選択
・Abundance:存在比率
・Medians:パラメータ強度（パラメータを選択）解析に寄与するイベントのサンプリング方法
・Equal:各ファイルから同数（最少ファイルのイベ
ント数に揃える）
・Max per file:各ファイルの最大数（数を揃えない）

各ファイルから用いるイベント数を入力
統計モデルに使用するクラスターの最小イベント％（イベント数）
交差検証の標本データ分割数を設定（予測モデ
ルのみ使用）※解析時間に影響するので、トライ解析は１、論偽陽性が生じる確率の期待値を設定低くするとモデルに用いられるパラメータ数が制限
チェックすると、各パラメータ全イベントでの平均をゼ
ロ、標準偏差が１になるようノーマライズ
実行ボタン

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202312⑯ Minimum cluster size (%)で、CITRUS の最初のステップのクラスタリングでのクラスターの最小数（％を変えると下の Ext. minimum cluster size に下図が表示）を設定します。
⑰ Cross Validation Folds で、交差検証の標本データ分割数を設定します（予測モデルでのみ使用）。解析時間に大きく影響するので、検討では１を、論文使用では 10 を推奨します。
⑱ False Discovery Rate(％)で、FDR 閾値を設定します（PAMR でのみ使用）。
⑲ Normalize Scales では、チェックを入れると各パラメータの全イベントでの平均をゼロ、標準偏差が１になるようにノーマライズします。
⑳ Plot Theme で、結果グラフの背景を白か黒にできます。
㉑ 上部の Run CITRUS Analysis ボタンを押します。
㉒ 画面上部にステータスバーが表示されたら、Cytobank を終了しても大丈夫です。
㉓ 完了すると結果のリンクが登録のメールアドレスに送られてきます。
３-６-３CITRUS 結果の確認① CITRUS 完了通知メールのリンクをクリックすると CITRUS 画面が開きます。
② Download results をクリックして、結果をダウンロードします。
③ Zip フォルダがダウンロードされるので、解凍します。
④ フォルダの中には以下の３つが入っています。

CITRUS 結果をダウンロード-

Results フォルダ：結果-

Supporting_files：R やアルゴリズム関連-

Citrus_run_xxx_info.txt：CITRUS 設定情報

⑤ Results フォルダを開くと以下の２つのファイルと各モデルの結果フォルダが入っています。モデルフォ
ルダは、設定での選択によって作成されます。また、群間に有意差のない場合はフォルダ自体が作成されません。
-

markerPlotsAll.pdf：CITRUS 最初の工程のクラスタリングマップ（１ページにまとめてある）-

markerPlots.pdf：CITRUS 最初の工程のクラスタリングマップ（パラメータごとにページ分かれている）-

sam_results：SAM の結果-

pamr_results：PAMR の結果

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202312glmnet_results：LASSO via GLMNET の結果

CITRUS 解析設定等の情報
アルゴリズムや R の関連ファイル
結果

クラスタリングマップ（まとクラスタリングマップ（別フSAM の結果
PAMR の結果
LASSO via GLMNETの結果

３-６-４CITRUS 結果ファイル① markerPlots.pdf または markerPlotsAll.pdf を開きます。クラスターツリーの上のパラメータについて、各クラスターの強度が色で示されています。各クラスターがどのような細胞集団であるかを確認することが出来ます。
※CIRUS のクラスターツリーには矢印があり、親→子クラスターとなっています。親クラスターは子ク
ラスターを含んでいます。

サブポピュレーションを規定するパラメータで作成したクラスタ
ーを各パラメータの強度カラーで表示
markerPlotsall：1 枚の PDF にまとめたもの
markerPlot：パラメータ毎に一枚の PDF としたもの
親→子クラスター
親クラスターは子クラスターを含んでいる。

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202312② 各モデルの result ファイルを開きます。以下の５種類のファイルが入っています。
-

clusters….pdf-各クラスター内の細胞の表現型を確認するために使用します。各クラスターの表現型はバックグラウンドの表現型とオーバーレイされたヒストグラムで表示されています。クラスターが赤色、全細胞が青色で示されており、ピークでノーマライズされています。

-

featurePlots….pdf-グループ間で有意差のあるクラスターのツリー上の位置を確認するために使用します。抽出されたクラスターは赤色で示され、親子クラスターの場合は囲われています。

-

features….pdf-グループ間で有意差のあるものについて、その違いをボックスプロットで表示しています。
CITRUS 設定で cluster characterization を「Medians」にしていた場合：プロット
上部のクラスター番号の記載パラメータにおける違いを図示しています。グラフのスケール
は、データスケーリング（変換値）に一致します。



CITRUS 設定で cluster characterization を「abundance」にしていた場合：プロット上部のクラスターにおける細胞数の違いを示します。値は、CITRUS インプット細胞の総数に対するクラスター内細胞数の割合（０から１の間）で表示されます（例えば、あるサンプルの総細胞数が 1,000 で、クラスター内の細胞数が 100 である場合、値は0.1 となります）。

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注意：abundance の場合のスケールが Log10 と表示されている場合、不具合ですので無視してください。

-

features….csv- features….pdf の数値情報のスプレッドシートです。
注意：Medians 結果の値は CITRUS 解析を開始した時点でのスケール設定で変換されています。

-

ModelErrorRate.pdf-予測モデル（PAM, LASSO）の結果のクオリティ調査に使用します。
SAM は相関法であり、予測モデルではないため、このファイルは作成されません。

③ また、これら５種類のファイルについて、モデルによって３種類の結果が出力されています。
--

相関モデル（SAM）
…fdr_0_01…：FDR を１％としたときの結果

…fdr_0_05…：FDR を 5％としたときの結果

…fdr_0_10…：FDR を１0％としたときの結果予測モデル（PAMR、LASSO）
…cv_min…：交差検証で最もエラー率の低くなる候補数の時の結果

…cv_1se…：交差検証で最も低いエラー率よりも標準偏差が１高い時の結果で、一般的に新規のデータで予測検討する際に採用されます。

…cv_fdr_constrained…：(PAMR のみ)設定した FDR 以下のすべての候補

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３-６-５CITRUS 結果ファイルの見方① （予測モデル PAMR、LASSO の場合）ModelErrorRAte.pdf を開き、cv.1se または
cv.min の Model Cross Validation Error Rate(Y 値)を確認します。２群間の場合、この値が約 50％だと完全ランダム、３群の場合は約 66％です。
② Features….pdf を開き、違いのあるクラスターの数やその度合いを把握します。
③ featurePlots….pdf を開き、違いのあるクラスターがクラスタリングマップのどの位置にあるかを把握します。
④ markersPlots.pdf を開き、違いのあるクラスターが、どのような細胞集団であるかを把握します。Clusters….pdf も参照します。
例）刺激なしと LPS 刺激ありの２群で、median & SAM モデルを用いた FDR0.01 の CITRUS 結
果：６候補が抽出され、その features….pdf を見ると大きく異なる候補が１つ、cluster29993 における pp38 パラメータに着目した。クラスター番号と FeaturePlot….pdf から、着目クラスターのクラスタ
リングマップ上の位置を把握し、これを markerPlots.pdf と照合すると CD33+の集団であることが分かった。

FeaturePlots_fdr_0.01.pdf

markerPlots.pdf

クラスター29993 の pp38 で大きな違い
Features_fdr_0.01.pdf

クラスター29993 は CD33＋の集団

３-６-６CITRUS 結果から見出した候補クラスターの詳細解析・グラフ化抽出された候補クラスターを、各ファイル各クラスターとして fcs ファイルにし Cytobank の新規
Experiment に出力することで、詳細解析やグラフ化することができます。
作成された新規 Experiment で、Cytobank の他の機能と組み合わせて様々な作図や検討ができる
他、csv ファイルでエクスポートすると他のソフトウエアでも扱うことができます。
① CITRUS 結果から、候補クラスターを抽出しクラスター番号をメモします。
② CITRUS 結果画面を表示します。
③ Export clusters to new experiment ボタンを押します。
④ IDs of clusters to export で、メモした候補クラスター番号にチェックを入れます。

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202312⑤ 全細胞の情報も一緒に出力したい場合は、Original files to included でファイルを選択します。
⑥ 実行ボタンを押します。

クラスター内の細胞情報を新規エク
スペリメントに出力必要なクラスターを選択

全細胞の情報も一緒に出力したい
場合はファイルを選択

実行

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４各種機能

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202312４-１ダウンロード・エクスポート４-１-１Experiment アーカイブ（acs）のダウンロード
Experiment 丸ごとをファイル化してダウンロードします。
サーバーの異なる Cytobank で Experiment を移動させる場合や、Cytobank のライセンス契約を一定期間（90 日間）以上停止する場合、不要な Experiment を端末ローカルで保管する場合に使用します。
Export Experiment to ACS もご覧ください。
４-１-２統計計算結果・サンプルタブ・ゲート情報・Experiment 内 FCS ファイル＆添付ファイル・
Illustrations で表示している統計表・Illustrations で表示している細胞情報の FCS/text ファイルのエクスポート
Export をご覧ください。

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４-２Experiment の複製
Clone 機能にて Experiment を複製できます。
４-２-１Experiment の削除
Experiment の削除は２段階になっており、ゴミ箱にいれる段階と完全消去となっています。
ゴミ箱内の Experiment は 30 日後に自動的に完全消去されます。
４-２-１-１ゴミ箱に入れる削除
Experiment manager で削除する Experiment を選択し、Delete ボタンを押します。

または、対象の Experiment で Actions>Delete を選択します。

４-２-２ゴミ箱に入れた Experiment を戻す・完全消去する
Experiment Manager の Trash を開き、Experiment を選択して Remove from trash（ゴミ箱から戻す）または Permanently delete（完全消去）をクリックします。

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202312※アカウントのデータ空き容量は Permanently delete 実行後に増加します（処理にしばらく時間がかかります）。ゴミ箱に入れた状態では空き容量は増えません。
※完全消去（Permanently delete）したデータは復活しませんので十分ご注意ください。

４-３FCS ファイル詳細情報
メニューバーActions>View summary の一番下 FCS Files に表示されている各ファイルの details
をクリックすると、FCS ファイルのメタデータキーワードなど詳細を確認することができます。

４-４FCS ファイル以外のデータを Cytobank へインポート（DROP 機能）
DROP 機能では、フローサイトメーターが出力する FCS ファイルのデータ部分と同様、列に対象（シングルセル）・行に測定数値（発現タンパク質）の形式となっているスプレッドシート(.csv または.tsv)ファイ
ルのデータを Cytobank へインポートし解析を可能とします。
データ例

種類

Cytometry, RNA-Seq, segmented

シングルセル

image features

連続変数

RNA-Seq, Protein expression, clinicalfeatures, cell population features
Bulk DNA, clinical features

バルク
連続変数
バルク
順序変数

プロット/統計

viSNE

SPADE

CITRUS

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Yes

Premium Cytobank ではインポートできる行数は 100、Enterprise Cytobank では 818 です。
① 以下を確認し、.csv または.tsv ファイルを用意します。
-

列がイベント情報（１細胞の情報/１サンプルの情報）・行が測定数値（蛍光強度/発現遺伝子）-

行名（パラメータ名）に重複がない-

非数字情報は削除するか数字情報へ変換します（例：性別は１,2,3 とスコア化）。

-

行が 100 以上あるデータの場合、ソートや PCA で行数を減らしてください。

② New experiment をクリックします。
③ ファイルアップロード画面で、CSV または TSV ファイルをドラッグ＆ドロップします。

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202312④ Upload File ボタンをクリックします。
⑤ インポートする範囲を選択します。一般的にはパラメータ部分がグレーになるように指定します。除きたい行は行番号を Indices of columns to skip に入力します。

⑥ コンバートしたファイルの概要を確認し、Open experiment ボタンを押します。

４-５アカウントの確認・設定変更
画面右上の My profile ボタン（Username）をクリックすると、設定画面（account settings）ボ
タンと現在のデータ使用状況（Experiments の数と使用データ容量）、ログアウトボタンが表示されます。

４-５-１パスワードの変更① My profile＞Account settings（設定画面ボタン）をクリックします。
② My account 画面が開きます。

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202312③ Authentication 欄の Update password 部分で New password 等を入力し、Update
Password ボタンを押します。

４-５-２使用データ容量と内訳の確認
My account 画面の Experiment statistics セクションで使用中のデータ容量（使用率）、Experiment 数、共有している Experiment 数などが確認できます。

４-５-３ユーザーコネクションのリクエストとリストの確認
My account 画面のスクロール下、User connections セクションで、ユーザーコネクションを確立したい
ユーザーへのリクエストとコネクションのあるユーザーリストが確認できます。

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202312４-５-４登録 E-mail アドレスの変更① My account 画面上部の Edit ボタンを押します。
② Edit my account details 画面が開きます。
③ Contact email ボックスに変更する E メールアドレスを入力します。※間違えないようにお気をつけください。
④ 必要であれば First name と Last name を変更することもできます。
※ Username は変更できない仕様になっています。

⑤ Update user settings ボタンを押します。
４-５-５その他細かいアカウント設定の変更
Edit my account settings 画面では以下の設定変更も可能です。
-

Default new experiment landing page：新規 Experiment を作成した時にデフォルト表
示されるページを変更できます。

-

Default project：ログインした時にデフォルトで表示される Project を設定できます。

-

Email notification：チェックを外すと Cytobank からの通知メール（解析完了など）を解除することができます。

-

Receive news and updates from Cytobank：チェックを外すとアップデートなどのお知らせを送らないようにできます。

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４-６ログアウト
画面右上の My profile ボタンをクリックし、Logout ボタンを押すとログアウトできます。
パスワード機密保持のため、共通のパソコンでお使いの場合は忘れずにログアウトしてください。また、他の人も使用する可能性がある端末ではブラウザにパスワードを記憶させないようにご注意ください。

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５バージョン対応表
Cytobank version

簡易マニュアル版

7.2

1.000

8.1

2.000

9.3

3.000

10.2

4.000

10.3

4.100

200