平成18年度〔2006〕No.51
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

生分解性資材投入における土壌微生物への影響評価
地頭所 眞美子＊2，溝添 暁子＊1，里岡 嘉宏＊1，中田 一則＊1
The Reseach of Effect of Biodegradable Material Injection to Soil Microbe
Mamiko JITOUSYO, Akiko MIZOZOE , Yoshihiro SATOOKA and Kazunori NAKATA
農業用畑地に生分解性マルチフィルムを鋤き込み，経時的にサンプリングを行った土壌についてPCRDGGE法を用い菌叢変化の観察を行った。また，ハロー試験において分解能を示した微生物に関して16SrDNA塩基配列解析を行い菌種の特定を行った。特定された菌種の中で植物病原性を持つ分解菌

Verticillium属を特異的に検出できるプローブを設計し，土壌中からの検出を試みた。
キーワード：生分解性マルチフィルム，土壌，PCR-DGGE法，FISH法
１

はじめに化石燃料を原料として化学合成したプラスチッ

２

実験方法

２−１

栽培試験クは目的に応じて加工でき，安価で安定な材料で宮崎県総合農業試験場内畑地にて，３種類の生あることから数多くの製品に使用されている。し分解性マルチ（キエ丸（PBSA系），耕楽（PCL系），かし，その一方で種類によっては焼却により有害エコグリーンマルチⅡ（スターチ系）），対照としガスが発生し，また，埋め立てにおいても分解して生分解性のない農業用ポリマルチ（ポリエチレにくいといった問題が指摘されている。その解決ン）を使用して大根の試験栽培を実施した。栽培策の一つとして，地中や水中で微生物により分解後はそれぞれのマルチを畑地に鋤き込み，定期的される生分解性プラスチックの利用があり，農業に土壌をサンプリングした。採取した土壌は，小用資材，コンポスト用生ゴミ袋，包装用資材等に石などを取り除くため２mmのふるいにかけ試験も使用されている。

土壌とした。

そうした中，生分解性資材を実環境中で使用した際，特に農地においては同一箇所で繰り返し使用した時の土壌微生物への影響が懸念されている。本研究では，土の乾燥防止や雑草抑制などの目的で用いられている生分解性マルチフィルム（以下生分解性マルチ）を使用した農地での微生物群集健全性の評価を行い，生分解性マルチの安全性，適正使用に寄与することを目的としている。

図１
＊１

資源環境部

＊２

資源環境部（現 産業技術総合研究所関西センター）

２−２

マルチを使用した栽培風景

生菌数測定

試験土壌10gを滅菌した生理食塩水90mlに加え，超音波３分，静置１分の工程を３回繰り返し
9生分解性資材投入における土壌微生物への影響評価

た後，懸濁液上清を土壌抽出液とした。一般生菌

DNA Extraction Kitを用いてDNA抽出を行い，数の測定は標準寒天培地（酵母エキス2.5g，ペプ

GC-Clamp付きPrimer GM5Fと531Rを用いてホットン5.0g，ブドウ糖1.0g，寒天15.0g/L）を用いたトスタートタッチダウン法でPCRを行った。

塗抹平板法により30℃，48時間培養で行った。
２−３

プラスチック分解試験

２−３−１

乳化培地の作製アクリルアミド濃度は８％，変性剤濃度40〜70％（変性剤100％は７M尿素，40％ホルムアミドに相当）に調製した。PCR-DGGEには，D

生分解性試験の方法は各種生分解性マルチを乳

code system（Bio Rad社）を用い，泳動条件は，化させた培地に植菌を行い，分解により生じるコ

電圧120V，泳動槽温度60℃，泳動用緩衝液1×

ロニーの周りの透明部分（ハロー）の有無を調べTAEで７時間で行い，菌叢の経時的変化を調査しることでその微生物の分解能の評価を行う。このた。

ハロー試験においてハローを形成したものをマルチ分解菌と判断し，分離を行うことにした。
まずはじめに，各種生分解性マルチをそれぞれ表１

本研究で用いたPrimer sequence

Primer nameNucleotide Sequence（5 −3 ）5F

TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG

塩化メチレンに溶解させた後，無機塩組成の培地

GM5F（GC-clamp） CCTACGGGAGGCAGCAG（KH 2PO 4 1.0g， K2PO 4 1.0g，（NH 4）2SO 4 1.0g，

531R

NaCl 0.1g， MgSO4・7H2O 0.2g， FeSO4・7H2O

GC-clamp

0.01g， CaCl2・2H2O 0.02g，Yeast extract 0.1g
Plysurf

TACCGCGGCTGCTGGCACCGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG

0.1g/L）に加えて乳化させ，溶媒を蒸散
FISH法を用いた植物病原性分解菌の検出させて乳化培地を作製した。この乳化培地に土壌２−６抽出液を塗抹し，ハローを形成したものを分解菌

２−６−１ プローブの設計
ARBのProbe Designを用いて植物病原性分解菌と判断し分離培養を行った。
２−４

分解菌の同定２−４−１

DNAの抽出単離出来た分解菌についてタカラバイオ社製として検出されたVerticillium dahliaeを特異的に検出するプローブの設計を行った。（５（Cy-3）AAGAAGTCAGTACTACCCG-3 ）プローブにはDNA抽出キットに供しDNAの抽出を行った。抽Cy-3を蛍光標識として付加した。

出したDNAをテンプレートとし，Primer 5F，２−６−２

FISH法による検出

531Rを用いてPCRでDNA断片の増幅を行い，エFISH法はAmannの方法に準拠して行った。ハチジウムブロマイド染色による1.5％アガロース

イブリダイゼーションは，ハイブリダイゼーショゲル電気泳動（100V，15分間）で確認を行った。

ンバッファー（0.9M NaCl，20mM Tris-HCl

２−４−２（pH7.2），ホルムアミド５％，0.01％ SDS）を試

分解菌の同定アガロースゲル電気泳動で確認できたPCR産物料に滴下し，プローブ溶液を加えて46℃で２時間に つ い て ， Applied Biosystems社 の Cycleハイブリダイズした。プローブの洗浄は，プロー

sequence Kit を用いてサイクルシーケンスを行

ブを含まないハイブリダイゼーションバッファー

い，ABI PRISM 310 Genetic Analyzerで塩基配列を用い，48℃で20分間行った後，存在する全ての解析を行った。同様に真菌についても，の菌を検出するためDAPIを用いて全菌染色し，Applied Biosystems社のMicroSeq D2 rDNA

蛍光顕微鏡下で観察を行った。

Fungalキットを用いて塩基配列解析を行った。得られたデータはNCBI BLASTデータベースを用い３て分解菌の同定を行った。

３−１

２−５

PCR-DGGE法による菌叢解析結果および考察各マルチ土壌中における生菌数の経時変化

生菌数の測定結果を表２に示す。

定期的にサンプリングした試験土壌について季節の変動による菌数の変化は見られたもののEPICENTRE Biotechnologies社製Soil Master

生分解性マルチの鋤き込み前後での顕著な菌数増

10生分解性資材投入における土壌微生物への影響評価

表２一般生菌数測定

キエ丸

耕楽

エコグリーン農ポリ

４月

4.70E＋07

1.10E＋08

1.10E＋08

6.00E＋07

６月

4.90E＋06

4.50E＋06

5.20E＋06

4.30E＋06

８月

4.50E＋06

9.60E＋06

4.30E＋06

5.90E＋06

10月

2.80E＋06

1.10E＋07

1.30E＋07

2.20E＋07

図２

ハロー試験

加は見られなかった。６月から９月にかけて菌数

エ丸M分解菌としてBacillus sp.，Bacterium sp.，が減少しているのは，雨により微生物が流出した

Acremonium sp.，Verticillium sp.など，エコグリためではないかと考えられた。

ーンマルチⅡ分解菌としては Burkholderia sp.，

３−２Enterobacter sp.など，および耕楽分解菌としてハロー試験結果

３種類の生分解性マルチを乳化させたプラスチ

はRoseateles sp.やAspergillus sp.などが検出されック培地についてハロー試験を行った結果，全てた。の培地よりマルチ分解菌が検出された。このこと

３−４より各種マルチ分解菌が土壌に存在することが確

PCR-DGGE法による菌叢解析

図３に生分解性マルチを鋤き込んだ土壌のPCR-DGGE結果を示す。

認された。
また，キエ丸Ｍや耕楽に比べ，エコグリーンマそれぞれ３種類のマルチ鋤き込み前後におい

ルチⅡはハローが薄い分解菌が多い傾向が見られて，（微生物群のバンドに大きな変化は見られなた。このことから，エコグリーンマルチⅡはキエかった）特定のバンドの蛍光が強くなっていくパ

丸や耕楽に比べ分解しにくい可能性が示唆されターンは見られなかった。このことより，マルチた。

鋤き込みによって特定の分解菌が優先種となり増３−３加していく可能性が低いことが推察され，マルチマルチ分解菌の同定

図２のようにハローを形成した菌について純粋分離し，16S-rDNA遺伝子解析を行った結果，キ図３添加による既存の微生物群集への影響は低いと考えられた。

PCR-DGGE法による解析結果
11生分解性資材投入における土壌微生物への影響評価

図４３−５

FISH法によるVerticillium dahliaeの検出条件検討

FISH法を用いた植物病原性分解菌の検出向は低いことが示唆された。

今回設計したプローブを用いて Verticillium5）FISH法での条件検討の結果， Verticillium

dahliae の検出を試みた。まず，プローブの選択dahliae のみに結合するプローブの選択性の確性を確認するため，単菌のE. coli（ネガティブコ認ができた。

ントロール）とVerticillium dahliae（ポジティブコントロール）を混合したものをサンプルとし観５

参考文献

察を行った。その結果，図４のＢのように全菌染１）Muyzer G, de WaalEC,. Profiling of complex

色のDAPI視野ではVerticillium dahliaeとE. coliど

microbial populations by denaturing gradient gel

ちらの菌も観察されているのに対し，プローブのelectrophoresis analysis of polymerase chain

蛍光色素Cｙ-３視野では，Verticillium dahliaeのreaction-amplified genes coding for 16Sみが光っていることが確認された。このことより，

rRNA.Appl Environ Microbiol. 1993 Mar;59

今回，設計を行ったプローブの選択性が確認され（3）:695-700.

た。

２）Amann,R.I, Identification of individual
prokaryotic cells by using enzyme-labeled,

４まとめ1）生菌数測定の結果，生分解性マルチ鋤き込み前後での菌数の増加は見られなかった。

rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl
Environ Microbiol. 1992 Sep;58（9）:30073011.

2）ハロー試験の結果より，各種マルチにおいて

３）藤田芳和,鮫島暁子,山内博利,宮崎県工業技術

分解菌を確認することができた。キエ丸Ｍや耕センター・食品開発センター研究報告，48，9

楽に比べ，エコグリーンマルチⅡはハローが薄（2003）

いものが多く，キエ丸や耕楽に比べエコグリー

４）鮫島暁子,藤田芳和,友行眞美子,山内博利,宮崎

ンマルチⅡは分解しにくいことが推察された。

県工業技術センター・食品開発センター研究報

3）分解菌の同定結果より，数種類の生分解性マルチ分解菌が明らかになり，以前実施していた生分解性プラスチック分解菌と同一のものも検出された。
4）PCR-DGGE法による解析の結果，鋤き込み前後において微生物のバンドに大きな変化はみられないことから特定の菌のみが増加していく傾
12告，49，9（2004）