称号及び氏名

博士（獣医学）

学位授与の日付

２０２３年９月２３日

論Development of an Escherichia albertii selective enrichment broth文

名XU BINGTING

and bacteriological characterization of E. albertii isolated fromwild raccoons (Procyon lotor) in Osaka, Japan（Escherichia albertii の選択増菌培地の開発とそれを用いたアライグマからの E. albertii の分離及び分離菌の性状解析）
論文審査委員

主査
副査
副査
副査

山﨑 伸二
向本 雅郁
堀江 真行
日根野谷 淳論文要旨
緒言 Escherichia albertii は 2003 年に Escherichia 属の新たな菌種として同定されたヒトに下痢等の消化器症状を引き起こす新興人獣共通感染症菌である。近年日本では、患者数が 100 人を超える E. albertii による集団食中毒事例が相次いで報告され注目を集めている。しかしながら、原因食品として特定の食材が同定されておらず、それらの感染源および感染経路は不明である。そのため本菌食中毒を制御していくためには、環境中での本菌の分布を明らかにすることが重要である。所属研究グループでは、E.
albertii に特異的な Eacdt-PCR により野生動物のアライグマが E. albertii を高率(57.7％) に保菌していることを示した。しかしながら、E. albertii の鑑別分離培地である XRM-MacConkey を用いても、アライグマから本菌の分離率は 25%と低かった。アライグマにおける本菌の疫学的特徴をより詳細に解析するには、本菌の分離率の向上が必須であり、このためには選択増菌培地の開発が必要である。
本研究では、第一章で、アライグマでの E. albertii の詳細な保菌調査として、季節性、地域性、年齢・性別等と本菌の保菌率との関係について 2017 年～2020 年の 3 年間にわたり調査を行った。また、その過程でアライグマ検体からの本菌の分離率は、検体中の E. albertii の菌数と正の相関性があることを明らかとした。第二章ではアライグマ検体からの E. albertii 分離率の向上を目的に、選択増菌培地を構築した。第三章では、従来法および本研究開発した選択増菌培地を用いて分離した E. albertii の細菌学的性状について詳細に解析した。
第一章 大阪府下の野生アライグマにおける E. albertii の保有状況と分離
大阪府下(北摂、北・中河内、南河内、泉州地域)に生息するアライグマにおける E.
albertii の保菌率とその季節性、地域性、年齢・性別等との関係を明らかにすることを目的に、E. albertii に特異的な Eacdt-PCR を用いて E. albertii を検出した。2017 年 10月~ 2020 年 12 月に捕獲されたアライグマの直腸スワブを TSB で増菌培養し、1,606検体中 993 検体 (62%) から Eacdt 遺伝子を検出した。地域別、年齢別、性別におけるEacdt 遺伝子の陽性率(E. albertii の保菌率)に差は認められなかった。一方、月別保菌率では 1 月から徐々に減少し 4 月を境に上昇に転じ、その後、12 月まで増加傾向にあった。本傾向は調査を行った 3 年間いずれの年においても確認され、アライグマにおける E. albertii の保菌率には季節性があることを明らかとした。
さらに、E. albertii の月別の保菌率と分離率の関係性を検証するために、Eacdt-PCRが陽性となったアライグマ 664 検体の直腸スワブの PBS 懸濁液（PBS 懸濁液）からXRM-MacConkey 培地を用いて、196 検体 (30%) から E. albertii を分離することができた。E. albertii の総分離率は以前の報告同様に低率であったが、月によって 6～69%と大きく異なっていた。保菌率が低い月は分離率も低い傾向が見られた。そこで、分離率には検体中の E. albertii の菌数が影響している可能性を考え、Eacdt-PCR 陽性アライグマ PBS 懸濁液 412 検体中の E. albertii の菌数を E. albertii 特異的 real-time PCRにて定量した。E. albertii の菌数が 4 log CFU/ml 未満の検体では分離率は 14%であったが、4 log CFU/ml 以上の検体では 66%であり、有意な差が認められた。すなわち、
XRM-MacConkey 培地を用いた方法による分離率は検体中の初期菌数に大きく依存することが明らかとなった。本菌を効率的に分離するためには本菌を選択的に増菌できる選択増菌培地の構築が必要であると考えられた。
第二章 E. albertii 選択増菌培地の構築
本章では、アライグマ糞便からの本菌の分離率を向上させることを目的に、E.
albertii の選択増菌培地の構築を試みた。まず増菌培地に加える選択剤を選定するために、アライグマ糞便から非選択的に分離した E. albertii 以外の 85 株の菌種を生化学性状試験および 16S rRNA / rpoB 遺伝子の塩基配列解析より同定した。その結果、11 株がグラム陽性菌、74 株が Proteus 属を含む 10 種の腸内細菌目細菌であった。本結果
より、グラム陽性菌および Proteus 属を含む多くの腸内細菌目細菌の発育を阻止する
Deoxycholate (D, 1.04 g/l), Tellurite (T, 2.5 mg/l), Cefixime (C, 0.05 mg/l) の 3 種の薬剤を用い、D-TSB、TD-TSB、CTD-TSB の 3 種類の選択増菌培地を作製した。基礎培地のTSB を含む計 4 種類の増菌培地を用いて、E. albertii 50 株および non-E. albertii 85 株の発育を調べた。その結果、全ての E. albertii は全ての培地で増殖したが、他菌種 85菌株のうち 11 株は D-TSB で、57 株は TD-TSB、61 株は CTD-TSB で増殖が抑制された。以上の結果より、選択剤 TD と CTD が E. albertii 以外の菌種の発育を有意に抑制し、CTD が分離率の向上に寄与する可能性が示唆された。

次に、アライグマ検体を用いて TD と CTD の有効性を検証するため、PBS 懸濁液中の E. albertii の菌数が 4 log CFU/ml 未満と 4 log CFU/ml 以上の 23 および 11 検体を用い、TSB、TD-TSB、CTD-TSB と以前に E. albertii の分離に用いられていた EE Brothで培養し E. albertii の菌数を定量した。同時に、各増菌液と PBS 懸濁液から XRMMacConkey 培地を用いて E. albertii の分離を行った。E. albertii の菌数が 4 log CFU/ml以上の 11 検体では E. albertii の分離率、平均菌数ともいずれの選択増菌培地においても有意差は認められなかった。一方、E. albertii の菌数が 4 log CFU/ml 未満の 23 検体
においては、増菌後の平均菌数は TSB、TD-TSB、CTD-TSB、EE Broth でそれぞれ6.17±1.31、7.33±1.62、7.76±1.74、6.28±1.12 log CFU/ml となり、TD-TSB および CTDTSB での菌数は TSB と比較し有意に高かった。さらに PBS 懸濁液、TSB 増菌液および EE Broth からの分離率はそれぞれ 22、13、4.0%であったが、増菌後の菌数が多かった TD-TSB および CTD-TSB 増菌液からの分離率はそれぞれ 65、87%であった。以上の結果より、3 種類の抗菌物質 C、T、D を加えることで、アライグマ検体からの E.
albertii の分離率を大きく向上させることができた。
さらに構築した CTD-TSB の有用性を検証するため、CTD-TSB、TSB および従来のPBS 懸濁液を用いた場合のアライグマ検体からの E. albertii の検出・分離率の比較を行った。アライグマ糞便 412 検体を TSB で増菌した時の Eacdt-PCR による検出率は65%、CTD-TSB 増菌では 64%であり、有意な差が認められなかった。しかしながら、PBS 懸濁液と TSB 培地からの分離率はそれぞれ 19%と 13%であったが、CTD-TSB培地からの分離率は 48%と大幅に向上した。以上の結果より、E. albertii の選択増菌培地である CTD-TSB はアライグマ検体からの E. albertii の分離率を大きく向上させ、アライグマを始めとする野生動物からの XRM-MacConkey 培地を用いた E. albertii の分離に有用であり、E. albertii の疫学調査に役立つと考えられた。
第三章 アライグマから分離した E. albertii の細菌学的性状の解析
本章では、従来の分離方法および CTD-TSB 培地から分離された E. albertii の細菌学的性状を解析することを目的とした。同一検体由来の分離株の重複を避けるため、286 検体から分離した E. albertii 1,362 株に対して ERIC-PCR を行った。その結果、243検体からは 1 種類、33 検体からは 2 種類、9 検体からは 3 種類、1 検体からは 4 種類の遺伝子型を示す E. albertii が同定された。次に、それぞれの検体から異なる遺伝子型として同定された 340 株の E. albertii のクローナリティーをより詳細に解析するた
めに、XbaI 消化による PFGE 解析を行った。340 株は 119 種類の PFGE パターンに分類され、アライグマ由来の E. albertii には多様性があることが明らかになった。また、
340 株のうち 39%に相当する E. albertii 133 株は 9 種類の PFGE クラスターに型別され、これらの E. albertii が少なくとも大阪府下でドミナントな株であると考えられた。
かつ、これらの 9 種類の PFGE クラスターに型別された E. albertii は、アライグマより少なくとも 2 年間継続的に分離されており、今回の調査地域において適応性の高い遺伝子型であると考えられた。さらに、アライグマなどの動物および臨床由来の E.
albertii 株との関連性を検証するため、当研究室で保有する豚由来 1 株、臨床由来 50株を含め再度 PFGE で比較解析した。その結果、PFGE パターンの類似度が 85%以上となる異なる由来の菌株を含むクラスターは 6 つ確認された。そのうち 2 つのクラス
ターはそれぞれアライグマ由来 2 株と臨床由来１株または豚由来１株で構成され、残り 4 クラスターはそれぞれアライグマ由来１株と臨床由来１株で構成されていた。
アライグマ由来の E. albertii 340 株の病原性を評価するために、腸管粘膜への接着に関与する eae, paa, bfpA 遺伝子、細胞膨化致死毒素（EccdtI）遺伝子、志賀毒素（stx1,stx2[a-e, g], stx2f）遺伝子をそれぞれに特異的な遺伝子プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法により検出した。340 株全てから eae, paa、7 株から bfpA、23株から EccdtI、3 株から stx2f 遺伝子のみをそれぞれ検出した。stx2f 陽性 E. albertii 3株の培養上清を Vero 細胞に添加したところ致死活性が認められ、これら 3 株は活性のある Stx2f を産生していることがわかった。以上より、アライグマはヒトに下痢症のみならず溶血性尿毒症症候群も引き起こす可能性がある E. albertii を保菌していることが明らかとなった。
総括
1. アライグマの E. albertii の保菌率には季節性があり、1 月から 4 月にかけて減少後、5 月から 12 月にかけて保菌率が高くなる傾向があった。
2. 従来の分離法における E. albertii の分離率は検体中の E. albertii の菌数と正の相関性があった。
3. E. albertii の選択増菌培地として CTD-TSB を新たに構築し、本培地を用いることでアライグマ検体からの E. albertii の分離率を大幅に向上することできた。
4. 大阪府下のアライグマが保菌する E. albertii には多様性があること、stx2f 保有株など高病原性の可能性がある株も存在することを明らかとした。

審査結果の要旨
Escherichia albertii は 2003 年に Escherichia 属の新たな菌種として同定されたヒトに下痢等の消化器症状を引き起こす新興人獣共通感染症菌である。近年我が国では、患者数が 100 人を超える E. albertii による集団食中毒事例が相次いで報告され問題となっている。しかしながら、原因食品として特定の食材が同定されておらず、それらの感染源および感染経路は不明である。そのため本菌食中毒を制御していくためには環境中での本菌の分布を明らかにすることが重要である。野生動物のアライグマが E.
albertii を高率 (57.7％) に保菌していることが明らかとされているが、季節性、年齢、性別との関係は明らかとなっていない。また、アライグマからの本菌の分離率は 25%と低い。それゆえ、アライグマにおける本菌の疫学的特徴をより詳細に解析するには本菌の分離率の向上が必須であり、その改善策の１つとして E. albertii の選択増菌培地の構築が挙げられる。そこで本研究では、１）アライグマの E. albertii の保菌率に関して、季節性、地域性、年齢・性別等との関連性を調べ、２）アライグマ検体から

E. albertii の分離率を向上させるための選択増菌培地を構築し、３）分離した E. albertiiの細菌学的性状について詳細に解析した。
第 1 章では大阪府下の様々な地域に生息するアライグマの E. albertii の保菌率とその季節性、地域性、年齢・性別等との関係を明らかにすることを目的に、E. albertii に特異的な Eacdt-PCR を用いて E. albertii を検出した。その結果、2017 年 10 月~ 2020
年 12 月に捕獲されたアライグマ 1,606 検体中 993 検体 (62%) から Eacdt 遺伝子を検出した。地域別、年齢別、性別における Eacdt 遺伝子の陽性率に差は認められなかった。Eacdt-PCR 陽性アライグマの PBS 懸濁液 412 検体中の E. albertii の菌数を realtime PCR で定量した結果、E. albertii の菌数が 4 log CFU/ml 未満の検体では分離率は14%であったが、4 log CFU/ml 以上の検体では 66%と有意な差が認められた。E. albertiiの分離率は検体中の初期菌数に大きく依存することが明らかとなった。
第 2 章ではアライグマ糞便からの本菌の分離率を向上させることを目的に、E.
albertii の選択増菌培地の構築を試みた。アライグマ糞便から分離した E. albertii 以外のグラム陽性菌 11 株と腸内細菌目細菌 74 株の増殖を抑制できると考えられる
Deoxycholate (D), Tellurite (T), Cefixime (C) の 3 種の薬剤を含む、D-TSB、TD-TSB、CTD-TSB の 3 種類の選択増菌培地を作製した。E. albertii 50 株は全ての培地で増殖したが、他菌種 85 菌株のうち 11 株は D-TSB で、57 株は TD-TSB で、61 株は CTD-TSBで増殖が抑制された。PBS 懸濁液中の E. albertii の菌数が 4 log CFU/ml 未満と 4 logCFU/ml 以上の 23 および 11 検体を用いて選択増菌培地の評価を行った。4 log CFU/ml以上の 11 検体は、いずれの選択増菌培地においても有意差は認められなかった。一方、4 log CFU/ml 未満の 23 検体においては、増菌後の平均菌数は CTD-TSB で TSB の6.17±1.31 log CFU/ml と比較し 10 倍以上上昇した。CTD-TSB 増菌液からの分離率は87%と TSB の 13%と比べて大幅に上昇した。さらにアライグマ糞便 412 検体を TSBで増菌した時の Eacdt-PCR による検出率は 65%、CTD-TSB 増菌では 64%であり、有意な差が認められなかった。しかしながら、CTD-TSB 培地からの分離率は 48%と TSBの 13%と比べて大幅に上昇した。
第 3 章では E. albertii の細菌学的性状を解析することを目的に、アライグマ 286 検体から分離した E. albertii 1,362 株を ERIC-PCR で 340 株に絞り込み、PFGE 解析、病原遺伝子プロファイル解析を行った。その結果、大阪府下で分離された E. albertii は、地域や分離年を越えて類似のパターンを示す株、さらには患者由来株と類似のパターンを示す株も存在した。さらに、全ての株が E. albertii に特徴的な eae や cdt 遺伝子を保持するのみならず重症化に関わると言われている stx2f 遺伝子を保有する株も存在し、患者由来株と同等あるいはそれ以上の Stx2f を産生していた。
以上の結果は、E. albertii の新規選択増菌培地の開発に成功し、特に E. albertii の初期菌数が少ない検体の本菌の分離を大きく改善させた。さらに、アライグマの E.
albertii 保菌率には季節性があること、分離株には患者分離株と類似の遺伝子型を持つ株が存在することを明らかとした。本研究成果は獣医学の分野のみならず、公衆衛生学の分野において多大な貢献をすると考えられる。従って、本論文の審査ならびに最終試験の結果と併せて博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。