230622 Literature Seminar Q&A (Takamaru)
Q. タンパク質以外の液中のカルボン酸との反応は進⾏するのか？（以下の質問の中で答えています。
）
Q. tetrazole 構造を⾊々な分⼦に組み込んでいると思うのですが、その際の構造(例えば、カルボン酸との初期検討では芳⾹環に挟まれた構造でしたが、他の分⼦では異なっているようです)はどのように設計されているのでしょうか？合成のしやすさなどでしょうか？
A. 反応性を⽐較した実験はありますが、設計上の理由についての⾔及はなかったです。
液中の他のカルボン酸との反応は低そうだと考えられます（本⽂記載はなし）

詳しくは説明していなかったのですが、構造は後半の検討では異なっています。研究者の異なる論⽂で、同時期に発表されたということもあり、本⽂中での⾔及はほとんどなかったです。”ほとんど”と⾔ったのは、diaryltetrazole と、2-aryl-5-carboxytetrazole で反応性を⽐較した実験はありました1。
下図の c)が diaryltetrazole（S12）で、b)が 2-aryl-5-carboxytetrazole （S4）の化合物です。
図から分かるように、S12 では、Glu によって架橋された⽣成物が得られる⼀⽅で、S4 の化合物では同条件で架橋⽣成物はほとんど⾒られず、塩化物で quench された化合物が得られました。筆者たちは、S4 で Glu 架橋が⾒られなかったことについて、反応性の⾼いカルボキシニトリルイミンが早く quench されるということなので、⽬的としない架橋反応を、diaryl-tetrazole を⽤いた化合物よりも抑えられる点で有利だとしています。ただ、個⼈的には、10mM の Glu を⽤いて架橋がほとんど進⾏しないのは反応性が低すぎるような気もしています。⼀⽅で、BTK と化合物 1a（2-aryl-5-carboxytetrazole 系）の反応では、in vitro で 25µM ながらも〜60%収率で架橋が進⾏しています。
（資料 p.26, 反応条件: BTK / 1a = 2.5 µM /25 µM）そのため、液中のフラフラしているカルボン酸とは反応性が低く、ligand 付近にあるカルボン酸（Glu）とは反応性が⾼いのではないかと考えています。
設計上の理由については、仮説になってはしまうのですが、おっしゃる通り合成上の都合だ
ろうと考えています。⽚⽅をカルボニル基にすることでアミド結合を介して ligand と繋げやすくしていると考えています。また、芳⾹族部位を減らすことで平⾯性を下げ、⾮特異的な相互作⽤を防ぐ役割もあるかもしれないと推測しています。

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Herner, A., et al. Journal of the American Chemical Society 2016, 138(44), 14609-14615.

c) Diaryltetrazole S12 (100 μM)+10 mM glutamic acid in PBS/ACN (1:1), irradiated at 302 nm for 5 min

Nitrile imine

S19
Gluquenching
Waterproductquenchingproduct

Herner, A., et al. Journal of the American Chemical Society 2016, 138(44), 14609–14615.

Figure S10. Model studies of the quenching reaction of S12 by glutamic acid in PBS/acetonitrile(1:1).

Q. p.13 で Additive を⼊れた時の副⽣成物は⾒ていますか？
A. 今回紹介した論⽂2の中には、反応時の HPLC の結果が SI に載っていましたが、副⽣成物に関する記述は全くなかったです。

しかしながら、他の論⽂3上で、化合物 1e（⽚⽅のベンゼン環パラ位にメチルエステルが置換した化合物）とメルカプトエタノールを反応させた例はあり、反応条件は違いますが Cysがニトリルイミンと共有結合を形成することは⽰されていました。そのため、Cys での副⽣成物としては Cys がニトリルイミンに求核付加した化合物が含まれると推測されます。また、今回中盤にお話しした ACT を⽤いた論⽂4においても、ACT とメルカプトエタノールの反応でメルカプトエタノール付加体が得られることが確認されています。
Q. p.39 について、架橋剤を⽤いた今回の系での Western blot の結果から⼀過性の結合だと判断していましたが、EGFR と Grb2 の結合が⼀過性だという過去の知⾒はあるのでしょうか？
A. EGFR-Grb2 の結合に関して、調べた限りでは⼀過性だという過去の知⾒はなかったです。
質疑応答の際に⾔及のあった論⽂5内に、EGFR-Grb2 の結合が⼀過性だという実験結果はなかったです。ただ、EGF 刺激応答のシグナル伝達経路で Grb2 と Shc1、EGFR と Shc1 の相互作⽤が⼀過性であるという論⽂6はありました。ここで、Shc1 タンパク質は、EGF 刺激のシグナル伝達経路に関わるタンパク質で EGFR とも Grb2 とも相互作⽤するタンパク質として知られています。今回紹介した論⽂7では、Westen blot の結果と、Grb2、EGFR に関する結合の知⾒ 6 から、EGFR-Grb2 の結合も⼀過性だろうと結論づけていました。
Q. （p.17）グルタミン酸の修飾はどの段階で⾒えるのでしょうか？MSMS はどこで切れるのでしょうか？
A. タイムコースを取ってはいないですが、今回は UV 照射 10 分の段階で、LC-MS/MS で修飾を⾒ています。MSMS の切れ⽅については、SI にも載っていなかったです。

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Zhao, S., et al. Chem. Commun. 2016, 52, 4702-4705.
Feng, W., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 8732-8735.
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Herner, A., et al. Journal of the American Chemical Society 2016, 138(44), 14609-14615.
5Sorkin, A., et al. Current Biology 2000, 10, 1395-1398.
6Zheng, Y., et al. Nature 2013, 499, 166–171.
7Tian, Y., et al. Journal of the American Chemical Society 2017, 139(17), 6078–6081.
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Q. 紫外線による細胞毒性はありますか？
A. 紹介した三報 2, 4, 7 の本⽂中に細胞毒性によって細胞が死んでしまったという記述はなかったです。

今回⽤いられている 302nm の紫外線ではないですが、紫外線照射時の細胞⽣存率を調べた
実験8（下図）はありました。UVA（320 nm〜400 nm）、UVB（280 nm〜320 nm）であり、照射は UVA が 10 [J/cm2]、UVB が 0.5 [J/cm2]で、照射して 24h 後の⽣存率を調べています。
今回の実験結果と照射時の単位が違うこと、今回の実験では紫外線照射の詳細が書かれておらず単位を揃えられないこと、そもそも細胞種が違うことから、単純な⽐較はできないですが、今回の系 2, 4, 7 に近い UVB 照射では半分ほどの細胞が死んでいることがわかります。そのため、302 nm の強さの紫外線を当てた際に細胞毒性が出ている可能性はありそうだと推察しました。また、今回⽤いている HepG2 細胞について、UV-B（280-320 nm）よりもエネルギーの⾼い UV-C （200-280 nm）については細胞毒性が⽰されていました9。結果としては、20 J/m2 の弱い照射でも毒性が出ていることがわかります。また、今回使⽤した他の細胞種である K562 細胞についても、UVC 照射で細胞毒性が出ることがわかっています10。
この結果からも 302 nm の紫外線照射によって細胞毒性が出ている可能性が⽰唆されます。

Gag, O., Life 2023, 13(5), 1144.

Pujari, I., et al. 3 Biotech 2021, 11, 281.
8Gag, O., Life 2023, 13(5), 1144.
Pujari, I., et al. 3 Biotech 2021, 11, 281.
10Foresti, M., & Avallone, B. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 2008, 90, 816.
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Q. Western blot の際、SDS による変性に耐えると⾔っていたが、SDS によって予期せぬクロスリンクが発⽣するなど悪影響は考えられるのでしょうか？
A. 可能性は低いと考えられます。
詳しく説明しませんでしたが、⼤まかな実験⼿順としては、PBS に溶かした細胞溶解液（cell lysate）に対して UV を 10 分間照射した後、30 分間インキュベートして、⽬的のタンパク質を抽出。1.2% SDS/PBS に溶解させたのちに、click 反応でビオチンを繋いで、avidinで濃縮し、Western blot を⾏っています。click 反応の前の段階で 1.2%の SDS 溶液に溶解させています。⼀般に SDS-PAGE の際の sample buffer は 2% SDS でタンパク質を変性させているので、1.2% SDS の条件は反応前の段階としては⽐較的 harsh であるといえます。発表時に触れたところは、このような厳しい条件を経ても HDAC が click 反応を経て取れてきているという点です。もしクロスリンクされていない化合物ならば、この変性の段階で相互作⽤が弱くなってしまい、アルキンタグがついた SAHA と HDAC が離れてしまい、click 反応
後に biotin-avidin で濃縮してきても HDAC は釣れてこないはずです。しかしながら、今回の実験結果では HDAC が検出できているので、SAHA と HDAC はクロスリンクしているだろうと結論づけています。SDS による予期せぬクロスリンクについてですが、まず UV 照射で反応活性種が⽣じた後 30 分間 incubation しているので、この間に活性種は H2O などでquench されていると考えられます。また、抽出の操作の際にも⽔を⽤いていることからSDS で処理する段階では反応活性種は系中にほとんど存在しないと推測されます。そのため、SDS による予期せぬクロスリンクは⽣じないだろうと考えています。
Q. p.16 で、12 の親和性はほとんど無いと考えてもいいですか？それともより弱い親和性のものは拾ってこれないということですか？
A. ヒドロキサム酸を持つ化合物 11 よりも親和性は低いと考えていいと思います。
12 は Zn2+でのキレートが弱いので HDAC との親和性はほとんどないと考えても問題ないと思います。11 と 12 の親和性の違いについて定量的なデータは論⽂内にはありませんでした。
Q. p.24 の親和性のアッセイをしたところで、タンパク質の選び⽅がよくわかりませんでした。
A. タンパク質の選び⽅については、論⽂中に記述はなかったです。
親和性を⼤幅に損なわないような化合物を選んできていると考えられます。BTK, BRD4 を選んだ詳細な理由は不明です。
Q. p.25 の JQ-1 の競合のところで、JQ-1 は⼗分量⼊っているということでいいですか？4, 5,6 は元の JQ-1 より親和性が⾼いという話でしたが、競合のところで JQ-1 に勝ってしまっているということはないですか？
A. JQ-1 は probe の 50 倍の濃度⼊れているという記載があるので、⼗分量⼊っていると考えて良いと思います。競合のところで probe が JQ-1 に勝ってしまっている可能性はあると考えられます。