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五十嵐

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Trial of rapid diagnosis of ifection and individual confirmation
厚生連医誌
against 第tissue
２５巻contamination
１号 １２７〜
by１３
real
０ ２time
０１６
PCR（polymerase chain reaction）of SYBR Green method to paraffin-embedding specimens

ReportTrial of rapid diagnosis of ifection and individual
confirmation against tissue contamination by real time
PCR（polymerase chain reaction）of SYBR Green methodto paraffin-embedding specimens
Nagaoka Central General Hospital, Department of pathology ; Pathologist

Toshihiko Ikarashi
Objective : We have provided a pathological diagnosis on
the basis of genetic PCR analysis using paraffineembedded materials for １０ years. For labor saving
and more precision of results, we tried to use thereal time PCR.
Materials : ① paraffin-embedded block（＃１
５-１２５２２）,EBV（Ebstein-Barr virus）infection, ② mixed-up
cases
（＃１
５-１２
１２３and ＃１
５-１２
１２４）, multiple sampling from breasts, examined three kinds of STR（short tandem repeat）regions of D３S１３５８ on
chromosome ３, D５S８１８ on chromosome ５, andvWA on chromosome１２（２）（Tab.１）.
Method : The nucleic acid extraction process was reported in previous papers（１, ２）; the real-time
PCR was done using Mx３０００P Real-time QPCR
System（Agilent Technologies）and SYBR! Pre.
mix Ex Taq TM（Tli RNaseH Plus）（Takara）
Results : ① In real time PCR of EBV infection, the positivity required ２９-３０ cycles of PCR, and over ３３cycles led to false-positive result. In dissociation
curve, the peak of positive case was８５℃（Fig.１）.
② About the correspondence at the mix-up ofspecimens, we were able to identify its confusionby the STR mutation of vWA on an electrophoretic gel, which was also confirmed as a peak temperature difference of the dissociation curve in realtime PCR（Fig.２,３）.
Discussion : We were able to shorten the time required of
１-２ days for amplification / electrophoresis / confirmation of band in the PCR process to only twohours by automation process with the real-time
PCR. The identification methods became the digital confirmation from visual confirmation, and theprecision of judgment was able to improve, too.
There were several false-positive cases in the realtime PCR diagnosis in lymphoma, tuberculosis,
and tsutsugamushi disease diagnosed by the conventional nested PCR, which prevented from practical use at present.
Key words : genetic analysis for pathological diagnosis,

real time PCR（polymerase chain reaction）, efficiency, accuracy, paraffine-embedded pathological
specimen, EBV infection（Epstein-Barr virus）, contamination of other person s tissue, short base tandem repeat sequence（Short tandem repeat : STR）
,internal variability of STR, D３S１３５８ on chromosome３, D５S８１８on chromosome５, vWA on chromosome１２, genetic individual identification

Reference
１．Hidehiro Hasegawa, Takemitsu Katagiri, ToshihikoIkarashi. Detection of Epstein-Barr virus（EBV）DNA
and RNA from gastric carcinoma with lymphoid stroma
by genetic analysis. Niigata-Ken Koseiren Med J２００６;
１５:６５-９.
２．Hidehiro Hasegawa, Toshihiko Ikarashi. Genetic individual identification of paraffin-embedded pathologicalpreparations to rule out the sporadic contamination ofother patient s tissue during preparation of paraffin sections of pathological examination . Niigata - Ken
Koseiren Med J２０１１;２０:４６-９.

和 文 抄

録

報告
SYBR Green 法リアルタイム PCR 導入によるパラフィン包埋材料を使った PCR 遺伝子診断の効率化の試み―感染症診断、検体取り違い診断の実用化―
長岡中央病院、病理部：病理医
いか らしとしひこ

五十嵐俊彦
目的：従来我々はパラフ ァ イ ン 包 埋 材 料 を 使 っ て
PCR 診断を実施してきたが、リアルタイム PCRによる省力化とその精度を確認し実用化したので報告する。

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厚生連医誌

第２５巻

五十嵐

１２７‐１３０2016.02.10 1１号 １２７〜１３０ ２０１６

材料：① ＃１５-１２５２２EBV 感染症、② ＃１５-１２
１２３，＃１５−１２１２４ 二症例間の検体取り違え事例に関して検討した。②に関しては、１２番染色体上に存在する vWA、５番染色体上の D５S８１８と３番染色体上の D３S１３５８の３種類の STR 領域を検討した。
方法：核酸抽出工程は従来方式とし、リアルタイム
PCR は Mx３０００P Real-time QPCR System（Agilent Technologies）、SYBR! Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（タカラ）を使用した。
結果：① EBV 感染症に関しては、増幅において、PCR２９−３０サイクルで陽性となり３３サイクル以上で偽陽性となる。解離曲線において、陽性例ピークは８５℃であった。② 検体混入時の対応に関しては、STR 検索において従来式電気泳動上確認できた vWA の変異をリアルタイム
PCR においては解離温度のピーク差として同定できた。
考察：従来 PCR 工程の増幅・電気泳動・バンド確認に要する１〜２日間の所要時間を、リアルタイム PCR による自動化により２時間に短縮できた。結果の判定も目視確認からデジタル確認となり精度を向上できた。従来の nested PCR による遺伝子診断を実施していたリンパ腫、結核、ツツガムシに関しては、リアルタイム PCR
診断においては偽陽性症例があり現時点では実用化に至らなかった。
キーワード：病理診断精度を担保する遺伝子診断、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、有効性、正確性、パラフィン包埋検体、EBV 感染症、検体混入・取り違え、遺伝学的個人識別、短鎖直列型反復配列（STR）変異、染色体３番
D３S１３５８、染色体５番 D５S８１８、染色体１２番 vWA

Fig１. Real time PCR of EBV.
Upper : Amplification plots showed positive PCR. Bottom :Dissociation curve was positive to EBV with the same peakas positive control.
Circle : sample, square : positive control, triangle : negativecontrol, PCR : polymerase chain reaction, EBV : EpsteinBarr virus.

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五十嵐

１２７‐１３０2016.02.10 1

Trial of rapid diagnosis of ifection and individual confirmation against tissue contamination by real time
PCR（polymerase chain reaction）of SYBR Green method to paraffin-embedding specimens

Table １. Clinical, pathological, and genetic list of two cases with mutualintermixed specimens

Fig２. Dissociation curve of real time PCR of vWA and D５S８１８.
Upper : vWA showed two groups of different peak, samples of ＃１５-１２１２３-１, ２ at ７８．
５℃, and samples of ＃１５-１
２１２
３-３ and ＃１５-１２
１２
４-１ at ７
７．
５℃, respectively. Middle : enlarged view of upper figure. Bottom : D５S
８１８showed same peak of７６℃.
Circle : sample ＃１５-１
２１２３-１, square : sample ＃１５-１２１２
３-２, diamond : sample ＃１５-１２１２
３-３, triangle : sample ＃１５-１
２１
２４-２, PCR : polymerase chain reaction, EBV : Epstein-Barr virus.

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厚生連医誌

第２５巻

五十嵐１２７‐１３０2016.02.10 1１号 １
２７〜１３０ ２０１６Fig３. Electrophoresis of PCR of vWA.
Lane２-５：benign lesions showed２bands,１３８-１６２base-pairs. Lane６-８: malignant lesions showed close
bands looked alike a single upper broad band.
Lane １:１００-base-pair marker, lane ２-４: ＃１
５-１２１２４-１, ２, ４, ５ of benign lesions, lane ６-８：＃１５-１２１２４-１,２, and＃１５-１２
１２
３-３ of malignant lesions. PCR : polymerase chain reaction.

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６／０１／１０受付）― 130 ―