厚生連医誌

第１５巻

１号 ６５〜６９ ２００６

症例報告

リンパ球浸潤性胃癌における Epstein-Barr virus（EBV）の分子生物学的検出
病理センター遺伝子診断室；臨床検査技師 １）、病理医 ２）長谷川秀浩 １）、片桐

丘充 １）、癌原性ウイルスとして複数の悪性腫瘍の発生に関与しているとされている Epstein-Barr virus（EBV）は発癌のプロセスが解明されつつあり、将来的に遺伝子治療法の開発が期待される。今回、EBV 再活性化により発生したと推測された胃癌組織より EBV を分子生物学的手法により検出したので報告する。

定条件などを厳密に管理した免疫組織染色による手法以外、病理検査室への検出技術の導入は一般化されていない。今回、我々は組織学的所見から EBV 感染が推測された胃癌摘出材料について分子生物学的解析を行なった結果、EBV 感染陽性と判断された症例を経験したので、再活性化された EBV の検出の意義とその解析方法の有用性について報告する。

キーワード：Polymerase chain reaction（PCR）、in situhybridization（ISH）、Epstein-Barr virus（EBV）、リンパ球浸潤性胃癌、ホルマリン固定パラフィ
ン包埋組織

緒

言

今日の著しい分子生物学的技術の発展に伴い、さまざまな疾患が分子レベルで解明されつつある。その中より、将来に悪性へと進展する可能性のあるものや、疾患の悪性度と相関するもの、抗癌剤の適応性を判断する指標になるものなど、多岐にわたる重要な情報を我々は得ることができる。病理検査の分野においても癌遺伝子産物や癌抑制遺伝子産物に対する抗体を用いた免疫組織化学的検索が広く行なわれており、病理診断のみならず臨床へフィードバックできる重要な情報の解析が可能となり、現在では病理検査室には欠かせない手技となっている。しかし、免疫学的検索にも限界があることから、疾患の基本的な原因遺伝子を組織、細胞レベルで検出しようとする試みも病理検査室に導入され、さまざまな検出技術が確立され始めている。１）−３）γ−ヘルペスウイルスに分類される EBVは、通常小児期に感染し感染 B リンパ球により全身に広がった後、感染症状を起こさない潜伏感染状態で体内に潜伏する普遍的なウイルスとして知られている。しかし、１９６４年に Burkitt リンパ腫から始めて分離同定されて以来、伝染性単核症をはじめ悪性リンパ腫、ホジキン病、鼻咽頭癌の発生に関連する事が明らかにされてきた。一方、さまざまな組織学的形態をとる胃癌の中で中分化管状〜低分化非スキルス癌の組織型を示し、著しいリンパ浸潤と lacy pattern を構築するタイプの胃癌はリンパ球浸潤性胃癌と呼ばれ、その特徴的な組織所見と共に良好な経過を示す事が知られてきた。近年、このリンパ球浸潤性胃癌は、EBV 感染に関連した胃癌であることが報告され、全体の約１０％ 程度を占める事が明らかにされた。４）５）これまで、病理組織学的に EBV 感染を証明するには固五十嵐俊彦 ２）症

例

７２才、男性。
現病歴：自覚症状はなかったが、胃集団検診にて異常を指摘され、同月、魚沼病院内科受診。胃内視鏡検査で下部後壁に隆起性病変を認めたため生検。当施設における病理検査の結果、!Group Ⅴ、低分化型腺癌と診断され、胃部分切除術が施行された。
病理検査所見
摘出された腫瘍は M, post, p０Ⅱ a＋０ Ⅱ c，
２．
５㎝
×２．
５㎝×１．
０㎝，T１（sm２），inf β, intermediate, ly０，v０と診 断 さ れ、そ の 組 織 所 見 は Adenocarcinoma,por２＞por１であり、著しいリンパ浸潤を伴う所見から EBV 感染の可能性が示唆された（図．
１，２）。

方法および結果
ウイルスゲノムの検出
in situ hybridization（ISH）法
パラフィン包埋された組織を ３ µm に薄切し、シランコーティングされたスライドガラスにとり乾燥させた。EBV 遺伝子の検出には EBV-m-RNA を標的とし、EBV encoded small RNAs（EBER）を特異的に認識する Peptide nucleic acid（PNA）プローブ（Dako cytomation）を用いた。薄切後、乾燥した標本は脱パラフィンを行い proteinase K によりタンパク分解処理を施し、m-RNA を露出させた。そこに PNA プローブを滴下し５６℃ にて一時間の hybridyzation を行なった。
その後、FITC 標識されたプローブをアルカリフォス
ファターゼ標識 FITC 抗体で検出し BCIP／NBT により発色を行なった。鏡検の結果、腫瘍細胞の核に EBV-m-RNA の存在を示す濃紺色の陽性所見が認められた
（図．
３）
。

― 65 ―

リンパ球浸潤性胃癌における Epstein-Barr virus（EBV）の分子生物学的検出

Polymerase chain reaction（PCR）法
パラフィン包埋された組織は１０µm の厚さに薄切しマイクロチューブに採取した。そこに TaKaRa DEXPAT を添加し、能書に従い DNA 抽出を行なった。さらに、その抽出液に冷プロパノールと酢酸ナトリウムを添加し DNA を再度、析出、沈降させ冷７０％ エタ
ノールにより洗浄をおこない PCR 阻害物質の除去を行なった後、TE 液に溶解させた。EBV DNA の検出には１７２Kbp の二本鎖 DNA の中で、その内側に位置し EBNA 遺 伝 子 の 転 写 プ ロ モ ー タ ー で あ る EBNA
leader protein をコードする領域である Internal repeat1：IR１（BamH１−W）の一部を特異的に増幅するように Tomita 等 ６）により設定されたプライマーの配列を合成し PCR 反応液を調整した。EBV DNA 増幅のため用いたプライマーの塩基配列は図．
４に、PCRの反応液の組成およびサイクルコンディションは図．
５に示す。PCR 増幅後、その反応液を１２．
５％ ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、EtBr 染色を施し UVイルミネーターにより観察を行なった結果、EBV のDNA シーケンスから予想された１２９bp の位置にバンドを認めた。
（図．
６）
したがって、本症例は ISH および PCR の解析結果より、EBV 陽性の胃癌であると判断された。

考証明について、現時点では臨床的意義は乏しいと言わざるをえない。しかし、EBV 感染が原因とされる Duncan 病の原因遺伝子が同定され１０）、さらに、Burkitt
リンパ腫では、すでに腫瘍原性と EBV により発現される Epstein-Barr virus-encoded nuclear antigen 1（EBNA１）との関係が明らかとなり、腫瘍化へのプロセスが徐々に解明されている。EBV 感染で発現される蛋白は EBV 関連胃癌と Burkitt リンパ腫は同様に EBNA１と EBER のみであることが知られており１１）、これらが仮に同様の癌化へのプロセスをたどるとするならば将来的に EBNA１を標的とした特異的遺伝子治療法の開発が期待される。
しかし、検出技術の面からではパラフィン包埋組織
か ら 免 疫 学 的 手 法 を 用 い て EBV 関 連 抗 原 で あ る
EBNA１や Latent membrane protein（LMP）等の検出は可能ではあるものの活用できる抗体が非常に限られており、EBV の潜伏状態や組織の固定状態によっては検出できない事も多い。また、リンパ球浸潤性胃癌での EBV の検索において早期癌の胃粘膜からは EBVによって産生される LMP 蛋白の過剰発現は見られな
いと報告１２）されていることから、その検索にあたっては EBER もしくは EBNA１を標的にすることが必須とされる。ウイルス感染と発癌の関係がクローズアップされ、これらの微生物を確実に、かつ迅速に同定する技術の確立が迫られている現状において、今回、我々が用いた PNA プローブはアミノ酸誘導体のN−グリシンをモノマーとしてペプチド結合によりオリゴマーを形成する人工産物であることから、生体内に存在しない非常に安定しているプローブであり、従来 ISH 法に使用されている DNA プローブ、RNA プローブおよびオリゴヌクレオチドプローブに比べ核酸と強い結合力を持ち、Tm 値が高い事から目的とする核酸以外との非特異的な結合の可能性は低いとともに極めて短時間で標的とする核酸との間にハイブリットを形成するという特徴がある。１３）また、病原遺伝子の核酸をポリメラーゼ反応により増幅させ検索する
PCR 法は、病理組織標本より抽出された DNA を検出材料とした場合には不向きとされていたが標本製作過程における固定液やプライマーの選定など各種条件に配慮しながら、その検出条件が確立されはじめており
１）−２）、今後の適応項目の拡大が望まれる。今回、我々が用いた解析法は病理組織からのウイルスの遺伝子レベルの検索方法として病理診断に有用な手技となることが期待される。

察

近年の分子生物学的手技を用いた癌の研究からさまざまな遺伝子の関連や異常が明らかとなっている。その中には、将来癌へと病変が進展する可能性のあるものや、悪性度と良く相関するもの抗癌剤の適応性を判断する情報を提供してくれるものなどさまざまである。中でも癌原性ウイルスとして知られるヒト乳頭腫ウイルス（HPV）や C 型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトT 細胞白血病ウイルス（HTLV）などの感染の有無を確認する事は病変の進展を予測するためには極めて重要な情報である。今回、検出された EBV は複数の発癌のプロセスに関与している事が知られており、胃癌患者においては１０％ に感染が認められると報告されており、本邦では年間約５０００例以上と推測される。
したがって、胃粘膜における EBV の再活性化は H.pylori 感染と並んで発癌の危険因子となる可能性がある。EBV 関連胃癌は臨床的には男性に多く、噴門部や胃体部に発生しやすく周囲浸潤傾向の乏しい隆起病変をつくり、他の低分化胃癌と比較すると予後が良好である事が報告されている。７）８）通常、EBV 抗原は細胞傷害性 T 細胞（CTL）の標的となるため EBV感染細胞は排除されるが、免疫寛容や不全がある場合には CTL の標的になりにくい事から増殖を続け、さらに癌遺伝子である c-myc の転座が加わり癌化にいたることが知られている。さらに、この EBV 再活性化による胃粘膜の癌化では、腫瘍細胞のほとんどに早期の段階から EBV の特異的核内抗原である EBER 陽性シグナルが確認されることが報告されている。９）しかし、EBV の腫瘍原性を考えるうえで、EBV の胃粘膜への感染状態、感染機構、さらに癌化に関与するEBV の遺伝子や、その遺伝子によって産生されたどの蛋白が癌化に重要な役割を担っているかという発癌のプロセスについては明確な解答が得られておらず今後の解明が待たれる。したがって、EBV 再活性化の文

献

１． 長谷川秀浩、五十嵐俊彦．Polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism（ PCR RFLP）法による子宮頚 癌 関 連 Human papillomvirus（HPV）の同定．新潟県厚生連医誌，
２００４；１３!：２５−２９．
２． 長谷川秀浩、片桐丘充、五十嵐俊彦．Polymerase
chain reaction（PCR）法による病理組織からの Cytomegalovirus（CMV）DNA の検出．新潟県厚生連
医誌 ２００３；１２!：６−８．
３． 長谷川秀浩、五十嵐俊彦．Fluorescence in situ hybridization（FISH）法による染色体異的シグナルの検出−ホルマリン固定パラフィン包埋組織への応用― 66 ―

厚生連医誌

第１５巻

１号 ６５〜６９ ２００６−．新潟県厚生連医誌 ２００４；１３#：３０−３
３．
４． Min K W, Holmquist S, Peiper S, O' Leavy T. Pooly
differentiated adenocarcinoma with lymphoid stroma（Lymphoepithelioma-like carcinoma）of stomach : Report of three cases with Epstain-Barr virus genome
demonstrated by the polymerase chain reaction. Am JClin pathol．
１９９１；９６：２１９−２２
７．
５． Pittaluga S, Loke S L, So K C et al. Clonal Epstain Barr virus in lympho- epithelioma - like carcinoma ofthe stomach : demonstration of viral genome by in situ
hybridization and southern blot analysis. Mod Pathol．
１９９２；５：６６
１−６６４．
６． Tomita Y, Ohsawa M, Mishiro Y, et al. The presenceand subtype of Epstein-Barr virus in B and T cell lymphomas of the sino-nasal region from the Osaka andOkinawa districts of Japan. Lab invest １９９５；７３：１９０−１９６．
７． Shibata D, Weiss L W. Epstein-Barr virus associatedgastric adenocarcinoma. Am J Pathol. １９９３；１４３：
１２５０−１２５４．
８． Watanabe H, Enjouji M et al. Gastric carcinoma withlymphoid stroma. Cancer１９７９；３
８：２３２−２４３．
９． 深山正久：Epstein-Barr ウイルス関連胃癌．病理と臨床１９９５；１３$：１１７５−１１８３．
１０． Sayos J, et al. The X-linked lymphoproliferative-desease gene product SAP regulates signals induced
through the co-receptor SLAM. Nature １９９８；３
９５：
４６２−４６９．
１１． Rowe M, et al. Three pathways of Epstein-Barr virus gene activation from EBNA１ positive latency in
B lymphocytes. J Virol.１
９９２；６６：１２２−１
３１．
１
２． Imai S, Koizumi S, Sugiura M et al. Gastric carcinoma : monoclonal epithelial malignant cells expressing Epstein-Barr virus latent infection protein. Proc
Natl Acard Sci USA.１
９９４；９
１：９１
３１−９１３５．
１
３． Demidov V, Yavnilovich M V, Beloserkovskii B P.
et al. Kinetics and mechanism of polyamide（!peptide"）
nucleic acid binding to duplex DNA, Proc. Natl Acard

図１Sci. USA １
９９５；９２：２
６３７−２６４１．

Case repot
Detection of Epstein-Barr virus（EBV）DNA and RNA
from gastric carcinoma with lymphoid stroma by geneticanalysis.
Department of genetic diagnosis room, Pathology center ;Medical technologist １），Pathologist ２）
Hidehiro Hasegawa １），Takemitsu Katagiri １），Toshihiko
Ikarashi ２）
Background and Case : Infection of Epstein-Barr virus（EBV）is the causes of many disease. EBV infection was suggested histologically from the evidence poorly differentiated adenocarcinoma withlymphoid stroma of gastric carcinoma. We detected EBV RNA and DNA in paraffin embedded
tissue by genetic analysis. The detection techniqueconsisted of in siute hybridization（ISH）and polymerase chain reaction（PCR）methods. We detected both EBV encoded small RNA（EBER）by
ISH method with peptide nucleic acid probe andEBV encoded nuclear antigen leader protein by
PCR method in this case. Our gastric carcinoma
was the infection of EBV.
Conclusion : These techniques appear to be useful in theindentification of EBV from routine pathologicaltissue in terms of both sensitivity and specificity.
Keyword : Epstein-Barr virus（EBV），Polymerase chainreaction（PCR），in situ hybridization（ISH），Gastric carcinoma with maked lymphoid infiltrate,
Formalin-fixed paraffin embedded tissue.

摘出された胃の肉眼所見― 67 ―

リンパ球浸潤性胃癌における Epstein-Barr virus（EBV）の分子生物学的検出

図 ２ 組織所見（HE 染色像）

図 3 In situ hybridization 法による EBV m-RNA の検出― 68 ―

厚生連医誌

第１５巻

１号 ６５〜６９ ２００６

図４EBV DNA 増幅に使用したプライマ−の塩基配列

図 ５ PCR 反応液の組成と PCR サイクルコンディション

図 ６ PCR 法による EBV DNA の検出結果― 69 ―