放射光第 11 巻第 5 号

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く::JXAFS シリーズ(2)じ>

生体試料の XAFS足立伸一，谷田肇，城生体内には多くの種類の金属原子が存在し，蛋白資@核宜嗣(理化学研究所生体物理化学研究室*)

XAFS ラインについても簡単に触れる。

駿@糖など生体物繋の構造維持，酸化還元反応，酸塩基触媒，配位子結合などの活性中心として働き，これらを通し2. 一酸化窒素還元酵素て多くの重要な生理作用に関わっている。例えば，金属原

一酸化窒素還元欝素 (NOR) は，脱窒過程で生じる一子を活性中心とする酸化還元酵素では，その触媒反応サイ酸化窒素 (NO) を，細胞にとって無毒な亜酸化窒素 (N2クルにおいて，金属原子の酸化数の変化，配位構造の変化0) に変換する酵素である。この酵素は活性中心に鉄と平を伴う。また，金属原子と配位原子との結合距離や角度の面配位子であるポルフィリンとの錯体(ヘム)を含んでお微妙な相違が，金属原子の生理活性の相違を決定しているり，その鉄原子上で一酸化窒素還元反応が行われる。我々例もある。そこで，これら金属原子の働きを分子レベルでは，脱窒カビの NOR の結晶構造を解く事に成功したが，明らかにする為には，金属の配位環境あるいは電子状態を驚くべき事にその基本的な構造は(分子全体の構造も鉄周詳細に明らかにする必要がある。 XAFS 法はこの目的に辺の構造も) ，同じヘム酵素である一原子酸素添加酵素

最も適する物理化学的手法として注目されている。

(MO)

1. 生体試料の XAFS 測定構造を比較した。その結果，三価の鉄に NO が結合したと非常に似ていた。そこで，これら反応性の異なる 2 つのヘム酵素について， XAFS 法を用いて鉄の配位XAFS 法は，金属涼子による X 線の吸収過程，および状態 (Fe 3 十一NO 型酵素)において， Fe-NO の結合距離がそれに伴う光電子の放出と金属周辺の配位原子による散乱

NOR では1. 67 A, MO では1. 77 A である事が明らかとな過程を観測する分光法であり，生物科学のみならず，酸化った。すなわち， Fe-NO 結合は NOR の方が MO よりも物超伝導物質や化学触媒などの材料科学の分野にも広く応強くなっていた。一方，振動スペクトル解析の結果， Nｭ

用されている手法である。しかし， XAFS 測定において，O 結合は NOR の方が MO よりも強い事が分かっている。

生体試料が材料試料と比べて決定的に異なる点は，試料濃以上の結果は， NOR の方が MO よりも， NO から Fe へ度が非常に希薄な点である。一般に，生体試料はその溶液篭子供与が多い為に NO 分子上の電子密度が下がっていをどんなに濃縮することができても，その濃震はせいぜいる事を示している。 Fe 3 十 -NO 型酵素は NO 還元反応の最数ミリモル (mil1imole) 程度である。これは，生化学者初の状態であり，この状態が電子供与体 NADH からの電XAFSを受け取る事から触媒反応は始まる。 XAFS 解析の結測定の観点からは極めて希薄である。このために，生体試果は，この NOR の性質 (NO が NADH から電子を受け料の XAFS 測定には，吸収法を用いる事ができず，より取り易くなっている)と矛盾なく，その反応機構を確立す感度の高い測定が可能な蛍光法を用いる事が一般的である上で，大きな手助けとなった。

@生物学者が開けばび、っくりする高濃度であるが，る。蛍光法は，金属原子が X 線のエネルギーを吸収後に，二次的な過程として放出する蛍光 X 線の強度を検出する

3. 酸素センサー蛋自質方法であり，試料が希薄かっ厚みを持っている場合には，豆科の植物の根に共生する根粒菌は，空気中の窒素の詔吸収法と近似的に同じ結果が得られる。それでも， 2mM定をすることで有名である。窒素閤定に係わる酵素ニトロの濃度の試料で，良好な SjN 比のデータを得る為には，ゲナーゼは，空気中の酸素に対して不安定であり，その発半日の積算が必要である。

現は酸素濃度に依存して調節されている。酸素センサー蛋

我々はここ数年来，高エネルギー加速器研究機構物質構FixL は，根粒菌中の酸素濃度を感知する蛋白質であ造科学研究所放射光研究施設において，いくつかの金属蛋る。 FixL も上記 NOR 同様に 9 鉄ーポルフィリン錯体を白質の XAFS を蛍光法で測定し，活性中心の微細構造解活性中心に含むが，この鉄は触媒部位ではなく，酸素の結析を行ってきた。その成果の中から 2 つをここで紹介し，合部位となっている。すなわち，酸素濃度が高い環境でさらに今春より稼動を開始した理研の SPring-8 生体用は，酸素分子は鉄に結合し，低くなると鉄から解離する。

*理化学研究所生体物理化学研究室

千 679-5143

兵庫県佐用郡三日月町三原 323-3

TEL 07915‑
8‑2817 FAX 07915‑
8‑2818e-mail足立伸一

sadachi@spring8.or.jp

谷田肇tanida@spring8.or.jp

域宜鯛yshiro@postman.riken.go.jp‑38‑(C) 1998 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

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この酸素の結合解離の情報が， FixL の他の部位にある触Si(111) 反射を使用している。ミラー調整装置はベント機媒部位(キナーゼ部位)に伝達され，他の蛋白質のリン酸構をもっ 1m 長ミラーシステムである。ミラ一本体の材化をとおしてニトロゲナーゼ、遺伝子の発現調節を行っていは Si であり，1000x90x50mm t の母材を用いてサジタル方向に曲率半径 6 1. 13 mm のシリンダー形状に加工さる。

酸素の結合解離によって鉄罵辺にどんな構造変化がおこるのか?

それがどのようにキナーゼ部位に伝わるのか?

れている。ミラー表面は Pt コートであり，本体の側面を間接水冷している。 XAFS 実験時には高調波除去のため

それを知れば酸素センサー蛋白質としての，分子内情報伝に 0'"'-'5.5 mrad の間に設寵され，試料への入射は，はね達の機構を分子レベルで理解できる。そこで， XAFS 法

上げ方向の斜入射となる。第一スリットの関口が 10mmを用いて FixL の酸素結合型と非結合型の鉄の配位構造を(H)x1m m(V) (角度発散 0.38 mrad(H)x0.
038mrad

解析した。

(V)) でミラーをベントさせた時の，実験ハッチ内のミラ

酸素結合型では，鉄はポルフィリン部内に位置し，その商に対して酸素分子と反対の位置に結合している内部配位ー集光位置での集光サイズは，

0.
25mm(耳) xO.18mm(V) (FW日M) であった。

(ヒスチジン残基のイミダゾ…ル窒素原子)との結合距

XA.FS 実験ハッチ内には，上下の移動と傾斜機構を持離は 2.07 Á であった。鉄より堅実素分子が解離すると(酸つ定盤(シグマ光機製)が設置され，その上に光学レール素非結合型) ，鉄はヒスチジンの方向にヲ l っ張られ，ポルを国定して， 4 象限スリット，イオンチャンバー，フィリン商内から約 0.56Á 飛び出し，鉄ーイミダゾール検出器，クライオスタット等が設寵される。測定は吸収法

窒素原子の距離も 2.12Á に伸びた。すなわち，酸素分子・蛍光法の両方法が可能である。蛍光法用の検出器は EGSSDの鉄からの解離により，内部配位子であるイミダゾール基&G Ortec 社製の 19素子型 SSD 検出器を用い，検出田路はポルフィリン萌に対して約 0.6Á 移動する事が明かとな

系として XIA 社の DXP (4ch) ボードを採用している。

った。このイミダゾール基の動きが， FixL のキナーゼ部

クライオスタットは， 10K から室温までの温度コント口位活性化と直接関係あるかどうか，現在検討中であるが，-}レが可能である。測定系の制御はすべて， PC ベースのヘモグ口ピンの R-T 転位における Trigger 機構を思わせ

LabVIEW (Ver・4.0) で開発したソフトウエアを使用してる構造変化である事は事実である。

いる。

我々は，これ以外にも一酸化窒素センサー蛋白質

以上のように設置した装置を用いて，吸収法によるテス(sGC) や一酸化炭素センサー蛋自費 (CooA) の XAFS

ト測定を行った結果，我々が主な測定対象としている 6'"'-'測定も完了しており，現在解析中である。ちなみに，我々

25keV に K 吸収端を持つ試料 (Mn'"'-'Pd) について良好S.S.Hasnain 教授のなスベクトルが得られる事を確認している。ただし，測定好意により Daresbury 研究所(英)より供与された EX­

エネルギー領域によっては，エネルギースキャン中の入射CURV92 を用いている。

ビーム強度の安定性に若干の問題があり，スキャン中にロ4. SPring幽8 の生体試料用 XAFS ライン対処している。

は EXAFS 解析プログラムとして，ッキングカーブのチューニングを断続的に行うことにより理化学研究所では， SPring-8 に生体試料を対象としたXAFS 測定用のビームライン BL44B2 を建設した。この5. 最後にラインは単色 X 線および白色 X 線回折測定と併用される

生体 XAFS は試料条件(濃度，容量，金属原子の種類予定である。平成 10 年 7 月現在，イオンチャンバーを検と数)さえ適合すれば，金属を含む生体分子の金属周辺の出器として使った，吸収 XAFS 測定のテストは終了して構造を精密に簡便に解析できる手法であり，世界の多くのおり，夏休み明けの 9 月末には蛍光測定用の SSD 検出器研究グループがこの手法を用いて生体高分子の構造生物学が設寵されテスト測定が開始される予定である。

研究を行っている。しかし，我が圏にはこの分野に未だ数

BL44B2 の光学系は，第 1 スリットの下流に二結品分えるほどのグループしかおらず， SPring-8 の稼動を契機

光器があり，その下流にベントシリンダー型ミラーを置くに，今後さらに多くの研究グループの参画を期待してい配置になっている。二結晶分光器の第一結晶は直接水冷式る。のフインクーリング結晶，第二結晶は間接水冷式であり，‑39‑