厚生連医誌

原第１３巻

１号 ２
５〜２
９ ２００４著

Polymerase chain reaction―restriction fragment length
polymorphism（PCR―RFLP）法による子宮頚癌関連
Human papillomavirus（HPV）の同定
病理センター、遺伝子診断室（中越遺伝子診断研究会）；臨床検査技師 １）、病理医 ２）
がわひで

ひろらしとしひこ

長谷川はせ秀浩 １）、五十嵐い俊彦 ２）

子宮頚癌関連 HPV の分子生物学的解析法として、ホルマリン固定パラフィン包埋された子宮頚部病変２４症例を対象に、Polymerase chain reaction（PCR）法による HPV―DNA の検出を可能とし、Double catalyzed
signal amplification―in situ hybridyzation（DCSA―ISH）
法との検出結果について比較検討した。さらに増幅された HPV―DNA を各種制限酵素により処理する Restriction fragment length polymorphism（RFLP）法により、HPV の型同定を行なった。その結果、HPV type１６の検出率が DCSA―ISH 法では１６．
６％であったのに対し、PCR 法では２９％と検出感度については PCR 法の方が高いと判断された。また、RFLP 法での型同定
では HPV type １６が７例、type ５８が５例、type ５２b が１例認められ、DCSA―ISH 法で検出不可能な HPVtype も高率に確認された。従って、これら検出不可能であった HPV 検出の重要性からも、本法による HPV―DNA の検出と型同定は、より詳細な HPV type の解析が可能であり、婦人科病変の予後や進展を推測するうえでも極めて有用な情報を提供してくれるものと判断された。
キーワード：PCR―RFLP，ヒトパピローマウイルス（HPV），子宮頚癌，ホルマリン固定パラフィン包埋組織緒言

Human papillomavirus（HPV）は、約８０００bp の環状二本鎖 DNA をゲノムとして持つ DNA 腫瘍ウイルス
で、子宮頸癌組織から分離されて以来、遺伝子型を異にする約１００種類の亜型が確認されている。その感染は皮膚や粘膜上皮に生じる良性腫瘍の病因ウイルスであるほか、婦人科領域においては子宮頚部前癌病変とされる子宮頸部上皮内腫瘍（CIN）および子宮頚癌の発生に関与していることが知られている。中でも HPV
type１６，１８，３１，３３，３５，５２，５８は high risk group および intermediate risk group に分類されていることから、感染による病変の進行について注意を払わなければならない!。これら癌関連ウイルスとされる HPV の各タイ
プは感染後、増殖細胞である基底細胞ないし傍基底細胞の核内に取り込まれ、ウイルス粒子を作らないことから、ウイルスカプシド抗原に対する抗体を用いた免疫染色では、その存在を確認することが不可能であかる。また、in situ hybridyzation（ISH）法では HPV の検出感度は６００コピー以上とされることから、増殖細胞の核内にエピゾームとして取り込まれている HPV―DNA の検出は不可能である。検出感度から考えるな
らば PCR 法を用いることが望ましいものの、通常の病理組織標本から抽出された DNA を検出材料とした場合、標本製作過程における固定液や有機溶媒、熱等の影響により DNA が断片化されていることから、新鮮な組織材料に比べ分子生物学的技法を用いた遺伝子解析には不向きである"#。しかし、病理組織像から考えられる感染症について、証明可能な病理組織標本からの遺伝子解析法の確立が望まれる。我々は HPV感染について PCR 法と同程度の検出感度を持つとされる Catalyzed Signal Amplification in situ hybridyzation（CSA―ISH）法$%に改良を加え、さらに高感度にした Duble Catalyzed Signal Amplification in situ hybridyzation（DCSA―ISH）法&'を考案し、HPV highrisk group DNA の検出を実施してきた。本法は通常の染色と同様にパラフィン切片をスライドガラスに貼り付けた状態で試行できることから、顕微鏡下で組織所見と対比しながら、組織や細胞レベルにおける局在を検索できるという利点がある優れた分子病理学的解析法の一つである。しかし、市販されている HPV highrisk group 検出用プローブは Type１６，１８，３１，３３のみであり、その他のタイプについて検索できないことから子宮頚癌関連 HPV の検出にも限界がある。
今回、我々は子宮頚部病変が認められた病理組織材料から子宮頚癌関連 HPV の分子生物学的検出法の確立を目的に検討をおこなった。すなわち、発癌に最も関係が深いとされる HPV E６およ び E７遺 伝 子 をコードする consensus primer により、PCR 法での HPVhigh risk group および intermediate risk type の HPV
DNA の検出を行ない、DCSA―ISH 法との検出結果について比較し、有用性について検討した。さらに増幅された PCR 反応産物を RFLP 法により型同定を行った。

症例および方法
１：症例
検討材料は２００２年に当施設における細胞診検査の結果、要精査を指摘され、その後おこなわれた組織検査の結果、軽度異型成から上皮内癌と診断された１７才か― 25 ―

Polymerase chain reaction―restriction fragment length polymorphism（PCR―RFLP）法による子宮頚癌関連 Human papillomavirus（HPV）の同定

ら８１才までの２４例のホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いた。細胞診検査結果および組織診検査結果については Fig．
１に示す。
Sample
A
B
CDEF
GHIJK
LM
NO
P
QRS
TUVW
X

Age２９７３３４３５１７２２４２３８２９４４３７３９４７３２３１３５６２
５０３０２９４７４９５２８
１

Cytological diag. Histological diag. Fixed days
Class Ⅲ asever dysplasis
１moderate dysplasis
１Class Ⅳ
moderate dysplasis
２
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
koilocytosis
１
Class Ⅲ akoilocytosis
１
Class Ⅲ akoilocytosis
２moderate dysplasis
２
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
koilocytosis
２
Class Ⅲ a
CIS
２Class Ⅲ acervicitis
１Class Ⅲ asever dysplasis
２
moderate dysplasis
２
Class Ⅲ b
Class Ⅲ acervicitis
２Class Ⅲ akoilocytosis
２Class Ⅲ asever dysplasis
４
Class Ⅲ b
mild dysplasis
３Class Ⅲ bCIS
２moderate dysplasis
１Class Ⅲ aClass Ⅲ asever dysplasis
２moderate dysplasis
２Class Ⅲ aClass Ⅲ amild dysplasis
２Class Ⅲ acervicitis
２Class Ⅲ amild dysplasis
２Class ⅣCIS
１Fig．
１ Detection sample of HPV DNA by DCSA―ISH and PCR―RFLP methods.

４：PCR 法DNA サンプル１ml で、全量２０ml 反応液（d―DW：１４ml、１０×PCR buffer with １５mM MgCl２：２ml、２mM dNTP：２ml、２５pM F primer：０．
５ml、２５pM Rprimer：０．
５ml、１U Ampli Taq Gold）を調整し、DNA増幅にはプログラムテンプコントロールシステム PC７０７（Astec Japan）を使用した。サーマルプログラム
は９５℃１０分の Hot start を行った後、① denature ９４℃１分、② annealing ５５℃２分、③ extension ７２℃２分を４０サイクル行った後 Last extension として７２℃１０分間伸張させた。
５：増幅 DNA の検出
PCR 反応液３ml を１２．
５％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動後、エチジュウムブロマイド（EtBr）染色を行い紫外線（UV）イルミネーターにより増幅産物の確認を行った。
６：制限酵素断片長多型（Polymerase chain reaction― restriction fragment length polymorphism : PCR―RFLP）法による解析
PCR 法での結果、子宮頚癌関連 HPV DNA の存在が確認された症例について、HPV 各タイプの DNA 配列から、それぞれのタイプについて特徴的であると判断される配列を制限酵素により切断し、その電気泳動パターンよりタイピングを行なった。使用した制限酵素と切断された結果、確認されるフラグメントの長さについては Fig．
２に示すとおりである。また、制限酵素処理の反応液の組成は増幅 HPV―DNA６ml について
１０×M Universal buffer ２ml , Enzyme １ml , d―H２O
１１ml を加え、３７℃２時間の反応を行なった。
HPV type HPV１６ HPV１８ HPV３１ HPV３３ HPV３５ HPV５２b HPV５８Total length（bp） ２
３８ ２
６８ ２３３ ２４４ ２
３２ ２３１ ２４４Enzyme Ava Ⅱ １５７／８１１７２／９６ NC １３６／１０８ NC
NC
NCNC
NC
NC
Afa Ⅰ
NC
NC １１７／１１５ NC
Bgl ⅡNC
NC
NC
NC
NC １７６／５５ NC
Acc ⅠNC
NC
NC
NC
NC
NC １２６／１１８Ava ⅠNC
NC
NC
NC １８６／４６ NC
NC

２：DNA 抽出
ホルマリン固定パラフィン包埋された子宮頚部組織を１０mm の厚さに薄切し、その組織片２枚をマイクロチューブにとり、TaKaRa DXPAT を約０．
５ml 添加し、能書に従い得られた抽出液に対し、PCR 阻害物質を除 去 す る 目 的 で DNA 抽 出 液１００ml に 対 し 冷 プ ロ パ
ノール２５０ml、３M 酢酸ナトリウム液１０ml を加え DNAを再度、析出沈降させた後、冷７０％エタノールにより２回の洗浄をおこない、ヒートブロックにより乾燥した後、５０ml の TE 液に溶解した。
３：プライマー６の塩基Seedorf, K 等!により解析された HPV type１配列の中で、Fujinaga 等"により設定された子宮頚癌関連 HPV の各タイプを増幅可能な E６と E７遺伝子の一部をコードする consensus primer でシーケンスの４１９―６５６に該当する遺伝子増幅が行なわれる。プライマーの塩基配列は Fowerd：５ ―tgg caa aaa ccg ttg tgt
cc―３ と Reverse：５ ―gag ctg tcg ctt aat tgc tc―３であり、この組み合わせにより増幅される２３１bp―２
６８bp を標的領域とした。尚、本プライマーにより増幅される
HPV は type１６，１８，３１，３３，３５，５２b，５８であり、尖圭コンジローマーの原因ウイルスされている type６，１１などを含み、現状において DNA シーケンスが確認されている他の HPV とのホモロジーについては否定されている。

*NC : not confirmedFig．
２ Restriction fragment size of consensus PCR products.

結果

PCR 反応液を１２．
５％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動した結果を Fig．
３に、その結果、子宮頚癌関連 HPV の存在が確認された PCR 反応産物を RFLP法により解析した泳動パターンを Fig．
４に示す。PCR法および DCSA―ISH 法による子宮頚癌関連 HPV の検出結果を Fig．
５に示す。PCR―RFLP 法により解析された HPV type についてみてみると type１６が７例、type５８が５例、type５２b が１例であり、その中 で type１６と５８の複合感染例も１例認められた。DCSA―ISH 法で陽性と判断されたものが、検討した症例数の１６．
６％にあたる４例のみであったのに対し、PCR 法での検出結果は検討した症例の５０％にあたる１２例から検出された。なお、DCSA―ISH 法により陽性とされた４例のうち３例は PCR―RFLP 法により HPV type１６と判断され― 26 ―

厚生連医誌

第１３巻

１号 ２５〜２９ ２００４

たが、Sample V において DCSA―ISH 法で陽性と判断されたものの PCR 法では HPV DNA の増幅が認められなかった。DCSA―ISH 法により検出できないタイプを除外し、検出率を比較した場合、PCR 法で検出された type１６の検出率を１００％とすると DCSA―ISH 法でFig．
３ Amplification of the malignant HPV DNA genes
cording for the E６ and E７ genes.のそれは４３％となる。また、子宮頚癌関連 HPV の感染が認められた症例について、年代別にみると２０才代
以下で８０％、３０才代で４４％、４０才代で５０％の感染がみられた。

Fig．
４ Restriction fragment patterns of consensus PCR products byPCR-RFLP.

SampleAge

Cytological diag.

Histological diag.

DCSA―ISH

PCR

A
B
C
DE
FGH
IJKLM
NO
P
Q
R
S
T
U
V
W
X

２９７３３４３５１７２２４２３８２９４４３７３９４７３２３
１３
５６２
５０
３０２
９４
７４９５２８１

Class Ⅲ a
Class ⅣClass Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ b
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ b
Class Ⅲ b
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅲ a
Class Ⅳ

severe dysplasia
moderate dysplasia
moderate dysplasia
koilocytosis
koilocytosis
koilocytosis
moderate dysplasia
koilocytosis
CIS
cervicitis
severe dysplasia
moderate dysplasia
cervicitis
koilocytosis
sever dysplasia
mild dysplasia
CIS
moderate dysplasia
severe dysplasia
moderate dysplasia
mild dysplasia
cervicitis
mild dysplasia
CIS

−＋−
−
−
−＋−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
＋
−
−＋−
−＋＋＋−
＋＋＋−＋＋＋−−＋−−−−＋−−−−＋

Fainally confirmed
HPV subtype
５８１６５８５８１６１６５８５２b１６１６１６１６＋５８Fig．
５ Analysis results of HPV DNA by DCSA―ISH and PCR―RFLP methods.

考察

過去にさかのぼり情報収集を行う事ができるレトロス
ペックな検索が可能であるという大きな利点がある。
しかし、病理組織材料を用いた病原遺伝子の検出についてはホルムアルデヒドの影響により、抽出されるDNA が断裂されている事や PCR 阻害物質の混入から、比較的長い領域を増幅するようなプライマーの設定では検出感度および再現性の面において極めて不安定であるとされている。従って、本解析法を用いた場合、増幅領域の短いプライマーを設定するとともにホ近年の分子生物学的技術の発展により、病理組織診断の補助的手段として、迅速かつ高感度である PCR法により、細菌やウイルスゲノムが検出され確定診断の一助とされている。!"#病理組織標本からの遺伝子検索については生標本と異なり、バイオハザードについて特別な装置は必要とされない事から、通常の検査室で一般の検体と同様に扱える事ができると共に、― 27 ―

Polymerase chain reaction―restriction fragment length polymorphism（PCR―RFLP）法による子宮頚癌関連 Human papillomavirus（HPV）の同定

ルムアルデヒドによる影響を最小限に抑える必要があ０る。中島（１３）は PCR 法による HPV―DNA 増幅には２０bp 程度を増幅するプライマーの設定が望ましいとしているが、我々は固定液を中性ホルマリン（pH６．
０）を使用し、固定時間を短期間にすることにより DNAに与えるダメージを最小限に抑え、同時に組織内に存在するさまざまな PCR 疎外物質や狭雑物を除去する
目 的 か ら 市 販 の DNA 抽 出 キ ッ ト よ り 回 収 さ れ た
DNA テンプテートを再沈降させ、DNA ペレットをバッファーで洗浄することにより、２３１bp―２６８bp と通常の病理組織標本からは難しいと考えられる増幅領域について安定した DNA 増幅を可能とした。DCSA―ISH法はシングルコピーの HPV―DNA の検出も可能なことから PCR 法に匹敵するとされるものの、今回の比較検討した結果において、検出用プローブが HPV type１６，１８，３１，３３だけであり、検出できる HPV type の数が異なることを考慮しても PCR 法の検出感度に及ぶものではなかった。本法は、組織所見が観察できるという特性ゆえに薄切されるパラフィン切片の厚さは３mm から４mm と通 常 の 染 色 標 本 と 同 様 の 厚 さ と なる。従って、その厚さの中に必ずしも HPV―DNA が含まれているとは限らないことからも偽陰性と判断される可能性も否定できない。今回検出された HPV typeは DCSA―ISH 法で検出不可能な type５８が５例、type５２b が１例含まれていることから、仮に DCSA―ISH 法の検出感度が PCR 法と同様であると仮定しても、子宮頚癌発生に関連する HPV の５０％は検出できないことになる。したがって、これらの type も含め検出が可能な方法の導入が望まれる。また、DCSA―ISH 法で陽性と判断されながら PCR 法で HPV―DNA が増幅してこなかった症例についてはホルムアルデヒドによるDNA の断片化や PCR 阻害物質の混入の結果、生じる偽陰性反応であることも否定できないが、DCSA―ISH法の陽性基準は比較的、相対的な部分もあり、厳密には鏡検する人により、多少のバラツキがあることも事実である。また、タイラマイドによる増幅反応を繰り返すことにより生じる非特異的なドットを陽性と判断してしまう可能性も否定できない。したがって、陽性基準が DCSA―ISH 法に比べ客観的な PCR 法では担当者による判断の違いは生じにくく、再現性についても安定しているものと考えられる。一方、HPV 感染は性行為感染症として、特に若年層に急速に広まっていることが報告されているが、今回検討した結果においても２０才代以下の平均感染率が８０％と高率であり、同様の傾向があるものと判断された。HPV 感染のスクリーニング検査として有効と考えられる細胞診検査では、その感染が示唆される parakeratosis , koilocytosis ,smudged 核など特徴的な所見が認められるものの、厳密にはそれらの所見のみにおいて、HPV 感染と断定することはできない。同様にそれらの所見と型別との関連については確立されていない事から所見だけでのTyping についても不可能である。しかし、CIN から子宮頚癌に進展するリスクが感染している HPV typeによって異なることからも、その type を同定することは、病変の進展予測が可能となり、有用性の高い情報であると考えられる。しかし、その型判定については免疫染色等では解析できない事から PCR 法などの分子生物学的手法が不可欠となる。本法は DCSA―ISH法と比較しても、その検出感度は高く、増幅されるHPV は一度に多くの HPV―DNA を増幅できる consen-sus primer を用いていることから、発癌に関与するといわれている high risk type および intermediate risk typeのほとんどの HPV が増幅でき、同時に制限酵素による切断パターンから重複感染も含み、その型判定が可能であった。また、これらのバンドの位置は DNA シーケンスから理論的に予想される制限酵素処理におけるバンドの位置と一致するものであり、現状において最も高感度で特異性の優れた方法であると判断される。
したがって、本法による HPV 感染と感染タイプの固定の結果は個々の症例に対し、適切な対応が可能となることからも、その利用価値は極めて有用であると考えられる。
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― 28 ―厚生連医誌

第１３巻

１号 ２５〜２９ ２００４

英 文 抄録Hidehiro Hasegawa１），Toshihiko Ikarashi２）

amplified malignant HPV DNA. The examined tissues
were collected from ２４ cases of the routinely―processedparaffin―embedded sections that were fixed by neutral formalin. Those tissue samples were histopathologically diagnosed as having HPV in ２
００３ in our center. The amplification PCR products were digested with restriction enzymes and HPV subtype diagnosed from digested patterns. Results and Conclusion : The malignant HPV DNA
were confirmed in １
２ cervical tissues as follow．（HPVtype１６was detected in ７ cases, HPV type５
８ in ５ cases,and HPV type５２b in one case）．This method is very useful for a detection and typing of malignant HPV DNA.

Objective and study design : This study was conducted
to establish for an identification and typing of the malignant subtypes HPV DNA（types１６，１８，３１，３３，３５，５２b and５８）by PCR―RFLP. We used consensus primer pairs andKey word : Polymerase chain reaction―restriction length
polymorphism（PCR ― RFLP ）， Human papillomavirus（HPV），Cervical cancer, Formalin―fixed paraffin―embedded tissue

Original article
Detection and typing of the malignant subtype of Human
papillomavirus（HPV）by polymerase chain reaction―restriction length polymorphism（PCR―RFLP）．
Department of Genetic diagnosis（Chu―etsu genetic diagnosis study group），Pathology Center ; Clinical technologist１），Pathologist２）― 29 ―