平成 26 年度研究報告書
研究代表者
所属

島根大学医学部内科学講座 内科学第一氏名

山内美香、杉本利嗣

1. 研究テーマ
新たな骨質評価マーカーの解明：骨細胞分泌因子の関与の検討
2. 研究者氏名
山内美香 1)、名和田清子 1) 2)、清原信昭 1) 、杉本利嗣 1)
島根大学医学部内科学講座内科学第一 1)、島根県立大学健康栄養学科 2)
3. 研究概要（目的）
超高齢社会突入後も高齢化が進み続けているわが国、わが県において、介護予防、健康寿命の延伸が急務である。その点で重要な疾患の一つに骨粗鬆症がある。より骨折しやすい人を早く見つけて、治療介入することが重要である。これまで、骨粗鬆症の診断は骨密度によって行われてきたが、骨密度で表される骨強度は 70％程度で、骨密度のみでは表されないとされる。骨密度以外の骨強度に関与する因子は骨質と表現され、骨質劣化型の骨粗鬆症が存在することが明らかとなってきた。そこで、新たな骨質評価マーカーを解明することを目的とする。Ca、P、ビタミン D 代謝の異常が、骨質劣化に関与する可能性があるため、生理的状況において、Ca、P、ビタミン D 代謝に関与する因子を明らかにする。
近年、骨細胞が分泌するスクレロスチンが骨形成に重要な Wntβカテニン系シグナルの抑制因子であることが明らかとなった。また、同様に骨細胞が分泌する FGF-23 はαKlotho とともにリンやビタミン D 代謝に関与する。そこで、スクレロスチンや FGF-23、αKlotho と Ca 代謝および骨代謝との関係を検討し、骨質評価マーカーとなりうるか否かを検討する。
（方法）
1) 対象

骨粗鬆症健診受診者のうち、本研究に対して同意の得られた健常閉経後女性 174 名を対象とした。骨代謝に影響を及ぼす疾患の合併や薬剤の服用歴を認めるものは除外した。
2) 検査項目骨粗鬆症健診を受けた健常閉経後女性 174 名を対象とした。血液検査において Ca (mg/dL)、P (mg/dL)、Cr (mg/dL)、intact PTH (pg/mL)、
25(OH)D (ng/mL)、骨形成マーカーである I 型プロコラーゲン N-プロペプチド(P1NP) (ng/mL)、オステオカルシン(OC) (ng/mL)、骨吸収マーカーである I 型コラーゲン架橋 C-テロペプチド(CTX) (ng/ml)を測定した。また、既報の ELIZA 法を用いた方法にて患者血清における可溶性αKlotho (pg/mL)濃度を測定した 1)。尿検査にて uCa (mg/dL)、uCr (mg/dL)、uP (mg/dL)を測定し、eGFR (estimated glomerular filtrationrate) (ml/min/1.73m2)、尿中 Ca/Cr 比、FECa (%)、リン再吸収率 (tubularreabsorption of phosphate: %TRP)を算出した。
また、DXA 法で腰椎、大腿骨頸部骨密度を測定し、椎体骨折の有無を判定した。非椎体骨折の有無は医師による聴取により確認した。
非外傷性の椎体骨折および非椎体骨折のいずれかを有する者を脆弱性骨折有りと判定した。
3) 統計学的解析
統計解析は SPSS-17.0 を用い、いずれの場合も危険率 5%未満をもって有意とした。
（結果）
1) 対象者の背景
対象群の平均年齢(mean±SD)は 63.2±7.4 歳であった。（表 1）。
2) 可溶性αKlotho と各因子における単回帰分析
可溶性αKlotho は年齢、BMI と相関を認めなかった（図 1）。
また、可溶性αKlotho は Cr、eGFR（図 2）、Ca（図 3）、intact PTH、25(OH)D（図 4）、P1NP、CTX、OC、uCa/uCr、FECa、および骨密度と相関を認めなかったが、P (r=-0.156, p=0.040) （図 3）、および%TRP (r=-0.178, p=0.019) と有意な負相関を認めた。（図 5）。
3) 可溶性αKlotho と P および%TRP における重回帰分析

可溶性α-Klotho と P は年齢を考慮すると相関を認めなかった。一方、可溶性αKlotho は年齢、BMI、Ca、intact PTH、25(OH)D、FGF23、HDL-C、カルシウム摂取量、リン摂取量、ビタミン K 摂取量で補正後も%TRP と有意な負相関を認めた(r=-0.172, p=0.038)（図 6）。
4) 脆弱性骨折の有無での FGF23 およびαKlotho の比較
FGF23 およびαKlotho は椎体骨折、非椎体骨折、および全脆弱性骨折の有無での検討において、いずれも骨折有り群と無し群で有意差を認めなかった。
（考察）
αKlotho は早期老化様症状を呈する突然変異マウスの原因遺伝子として同定された 2)。αKlotho は副甲状腺、腎臓尿細管、脳の脈絡膜で発現し て お り 、 α Klotho 遺 伝 子 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 血 中 Ca 、 P 、1,25(OH)D2D3 の著明な上昇を認め、その後の分子機能解析により、Ca-P代謝調節因子であることが明らかとなった 3)。αKlotho は細胞膜上に存在するタイプと、細胞膜貫通ドメインの直上で切断された分泌されるタイプが知られており、膜型αKlotho は FGF 受容体(FGFR1)、FGF23 と複合体を形成することで、ビタミン D の活性化や P 利尿に関与する。一方、細胞外ドメインで切断された可溶性αKlotho は血中、尿中、脳脊髄液中に存在するが 4)、その機能の詳細は明らかとなっていない。αKlotho はβ-glucronidase 活性を示し、この作用によりαKlotho が結合蛋白の特殊な糖鎖構造を認識することで、FGFR1 が FGF23 と選択的に結合することを可能にしていると考えられている。一方、可溶性αKlotho もβ-glucronidase 活性を保持していることから可溶性αKlotho が酵素、あるいはグルクロン酸結合蛋白としての機能を有する可能性が示唆されている。実際、可溶性αKlotho が NaPi-2a 蛋白の N 型糖鎖に作用し、NaPi-2a蛋白が分解されやすくしているとの報告がある 5)。本検討では生理的範囲において可溶性αKlotho が Ca、P、ビタミン D 代謝に関与するか、そして骨折の予測因子となるか、もしなるとすると FGF23 と独立したものかを、健常閉経後女性において検討した。今回の可溶性αKlotho が%TRPと負相関を示すとの結果を得た。可溶性αKlotho 自身がヒトにおける生理的状態においても、P 代謝に関与する可能性を初めて明らかにした。

一方、αKlotho、FGF23 はいずれの骨折の有無でも差を認めず、骨脆弱性の予測因子としては選択されなかった。FGF23、αKlotho は腎機能との関連を有するため、腎機能別に検討しこれらが骨折予測因子となりうるかを検討していく予定である。
（結語）
可溶性αKlotho 自身が P 代謝をはじめとするミネラル代謝異常症に関与する可能性がある。

文献
1) Yamazaki Y, et al: Establishment of sandwich ELISA for soluble alpha-Klotho measurement:Age-dependent change of soluble alpha-Klotho levels in healthy subjects. Biochemical andbiophysical research communications 398: 513-518, 2010.
2) Kuro-o M, et al: Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing.
Nature 390: 45-51, 1997.
3) Yoshida T, et al: Mediation of unusually high concentrations of 1,25-dihydroxyvitamin D inhomozygous klotho mutant mice by increased expression of renal 1alpha-hydroxylase gene.
Endocrinology 143: 683-689, 2002.
4) Imura A, et al: Secreted Klotho protein in sera and CSF: implication for post-translationalcleavage in release of Klotho protein from cell membrane. FEBS letters 565: 143-147, 2004.
5) John GB, et al: Role of Klotho in aging, phosphate metabolism, and CKD. Am J Kidney Dis
58: 127-134, 2011.

図表
表 1．対象群の背景

図 1．閉経後女性における可溶性αKlotho と年齢および BMI との単相関図 2．可溶性αKlotho と Cr および eGFR との単相関図 3．可溶性αKlotho と血中 Ca および P 濃度との単相関

図 4．可溶性αKlotho と血中 PTH および 25(OH)D 濃度との単相関図 5．可溶性αKlotho と%TRP との単相関図 6．可溶性αKlotho と%TRP における重回帰分析

4. 学会機関誌もしくは学会への関連論文（演題）発表状況
論文
1) Yamauchi M, Yamaguchi T, Nawata K, Tanaka K, Takaoka S, Sugimoto T:
Increased low-density lipoprotein cholesterol level is associated withnon-vertebral fractures in postmenopausal women. Endocrine. 48:279-86, 2015
2) Tanaka K, Kanazawa I, Yamaguchi T, Yano S, Kaji H, Sugimoto T: Activevitamin D possesses beneficial effects on the interaction between muscle andbone. Biochem Biophys Res Commun. 450: 482-487, 20143) 山内美香, 杉本利嗣: Ca 検査値異常のアプローチ, 日本内科学会雑誌,103: 870-877, 2014
学会発表
1) Nawata K, Yamauchi M, Yamamoto M, Tanaka K-I, Ogawa N and Sugimoto T:
Relationshipbetweensolubleα klothoandnutritional

intakeinpostmenopausal women, 24th annual scientific meeting of Australian and New
Zealand Bone and Mineral Society, Queenstown, 2014 in September
2) Yamaguchi T, Tada Y, Kanazawa I, Morita M, Furuya N, Yamamoto M,Yamauchi M and Sugimoto T: Intensive glycemic control improved theexcretion of urine mineral ions in type 2 diabetes mellitus, 24th annual
scientific meeting of Australian and New Zealand Bone and Mineral Society,Queenstown, 2014 in September3) 杉本利嗣: シンポジウム、骨粗鬆症治療における薬剤選択とその長期展
望、テリパラチドの適応症例、第 16 回日本骨粗鬆症学会、東京、2014.10.234) 田中賢一郎, 金沢一平, 山口徹, 梶博史, 杉本利嗣: AGE2、3 及び活性型
ビタミン D の筋芽細胞分化及び骨芽細胞分化促進因子 Osteoglycin 発現に及ぼす影響、第 32 回日本骨代謝学会学術集会、大阪、2014.7.24-265) 名和田清子, 山内美香, 田中賢一郎, 小川典子, 杉本利嗣: 閉経後女性における可溶性αklotho と栄養摂取量の関係についての検討、第 32 回日本
骨代謝学会学術集会、大阪、2014.7.24-266) 杉本利嗣:パネルディスカッション、骨粗鬆症治療の今後の展望, 骨形成促進剤:Daily と WeeklyPTH の相違点第 87 回日本整形外科学学会学術総会、神戸、2014.5.237) 田中賢一郎, 金沢一平, 山口徹, 梶博史, 杉本利嗣: 活性型ビタミン D はAGE2、3 による筋芽細胞分化抑制及び骨芽細胞分化促進因子 Osteoglycin
発 現 抑 制 を 回 復 さ せ る , 第 87 回 日 本 内 分 泌 学 会 学 術 総 会 , 福 岡 ,2014.4.24-268) 山内美香、杉本利嗣: クリニカルアワー; 骨・ミネラル代謝異常症診療の進歩、骨粗鬆症診療の state-of-the-art、第 87 回日本内分泌学会学術総会、福岡、2014.4.24-26