■第23回日本放射光学会奨励賞受賞研究報告
高難度タンパク質微小結晶試料から迅速に構造決定を行うシステムの開発
山下恵太郎（東京大学大学院理学系研究科）

1. はじめに細胞膜上で機能し，細胞内外への物質の輸送や情報伝達なタンパク質は20種類の La アミノ酸がアミド結合によどを担う非常に重要なタンパク質である。中でも G タンって直鎖状につながった高分子である。 DNA にコードさパク質共役型受容体（GPCR）は細胞外からの物理的化れた遺伝情報に従って合成された後，自発的に折り畳まれ学的シグナルを細胞内へ伝達する膜タンパク質であり，市て固有の立体構造を形成することで機能を発揮する。その販薬の 40が GPCR を標的としているなど，応用面でも大きさは数アミノ酸から成る小型のペプチドから数千アミ重要度は高い。膜タンパク質の解析難度が高い理由は，試ノ酸から成る巨大なものまで幅広く，さらにはタンパク質料調製の難度が高いことはもとより，結晶化にも困難が大同士や核酸と複合体を形成して機能を持つなど多種多様できい。膜タンパク質の場合，疎水性の表面を界面活性剤である。細胞内の構造体として働くものや触媒（酵素)物覆うことで可溶化させ結晶化を行うが，この際に通常の可質輸送など，それぞれ固有の機能を持ち，生命活動を支え溶性タンパク質と同様に蒸気拡散法を適用すると，パッキている。構造生物学では，タンパク質の立体構造を詳細にングに寄与する部位が少ないことから強固な相互作用を形調べることによって，機能発現メカニズムの解明を行って成できず，良質な結晶が得られにくい。そこで，膜タンパいる。構造決定の手法は種々存在するが，なかでも X 線ク質に特化した結晶化方法として脂質キュービックフェー結晶学は最もよく利用され（Fig. 1），ペプチドから巨大複ズ（LCP）法が考案された2)。LCP 法では，脂質二重膜に合体まで幅広いサイズのタンパク質構造を高い分解能で決膜タンパク質を再構成してから結晶化を行うため，相互作定可能な強力な方法である。 X 線結晶学の利用がこれほ用面積が大きく，良質な結晶ができやすい。このため，こど広がった背景として放射光の発展は欠かせなかった。タの 10年ほどで LCP 法の膜タンパク質への適用は大きく拡

ンパク質結晶構造解析には 1995 年頃から放射光が利用さ大してきている。

れるようになったが，それ以降，放射光の普及に伴って決LCP 法の利用が拡大した背景として，放射光における定された構造の数は飛躍的に増大した1)。さらに近年ではマイクロビームの貢献は大きい。 LCP 法による結晶は，第三世代放射光施設による光源の高輝度化，検出器や試料良質ながらも数ミクロンから数十ミクロン程度の微小結晶調製技術の進歩により，これまで構造決定困難であったよに留まることが多いため，高品質な回折強度データを得るうな試料も含めより多くの構造がより迅速に決定可能になにはマイクロビームの利用が欠かせない。タンパク質結晶ってきている。

を用いたデータ収集を行う際は，クライオループを用いて今日でも高難度試料として挙げられるものの一つに膜タンパク質がある。膜タンパク質は脂質二重膜で構成された結晶をその周囲の溶媒ごと拾い上げて X 線を照射するため，結晶サイズとマッチした X 線ビームを用いることは，溶媒による散乱を抑え高 S /N 比の回折データを得る上で非常に重要だからである。 SPring-8 で 2010 年から運用されている BL32XU は真空封止ハイブリッドアンジュ
レータを光源とし， KB ミラーによって試料位置で最小1×1 mm2（半値全幅）のビームサイズに最大 2×1012光子/秒という高フラックス微小ビームが利用できるマイクロビームビームラインである。 BL32XU は初期の頃から膜タンパク質をはじめとした微小結晶を用いた構造決定に大きく貢献してきた。当初は横幅のある結晶を用い，ラインフォーカスビームによるヘリカルデータ収集によって 1個の結晶から解析に必要なデータ（ 180 360 °）を取り切る戦略が主流だった。ヘリカルデータ収集による放射線損
Fig. 1

The growth of the total number of PDB depositions for eachmajor structure determination method. Plotted using datafrom RCSB PDB Statistics (http://www.rcsb.org/stats/).

傷の程度を予測し，適切なビーム強度を提示する KUMA
(Kessho-wo Ugokashitari Mawashitari-suru Application）の開発によって，ユーザはデータ収集を簡便に行うことが108 ● 放射光 March 2019 Vol.32 No.2
(C) 2019 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research放射光ニュース ■ 第23回日本放射光学会奨励賞受賞研究報告

Fig. 2(Color online) Small-wedge data collection scheme from multiple microcrystals. Crystal localization by X-ray
diŠraction scan, followed by data collection and processing. Slightly modiˆed from the review5) under CC-BY 2.0(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0/).

できた3)。

ダの大きさに依存するが，多いときは 1 万箇所以上をスマイクロビームによるヘリカルデータ収集は強力な手法

キャンして結晶位置を探索する。BL32XU では EIGER X

だが，回折能が低く，さらに小さな各辺 5 10 mm 程度の9M ( DECTRIS Ltd. ）を導入して通常 50 Hz の連続的読結晶では十分なデータが取り切れない。結晶体積が小さい

み出しでスキャンを行っている。高速に生み出される大量ため，高分解能の回折強度を得ようと高強度（高光子密度）のイメージを即座に解析して結晶位置を提示するため，プの X 線を用いると簡単に吸収線量の限界（～10 MGy）をログラム SHIKA (Spot-wo Hirotte Ichiwo Kimeru Appli-

超えてしまうためである。

cation ） を 開 発 し た 。 EIGER の streaming interface は

こ の 場 合 ， 1 結 晶 あ た り 5 10 °程 度 の 狭 い 振 動 範 囲

ZeroMQ ( ØMQ ）ネットワークライブラリを利用してイ（ small-wedge ）だけ測定し，複数の結晶に由来するデーメージデータをネットワーク上に順次送信（PUSH sock-タをマージ（結合）する方法が有用であり，通常数十からet）しており， SHIKA はそれを複数プロセスから受け取数百個程度の結晶だけで十分なデータが得られる。クライる（ PULL socket ）ことによって並列処理を実現していオループ等の結晶ホルダに複数の結晶が収められている場

る 。 SHIKA の 仕 組 み を Fig. 3 に 示 し た 。 SHIKA は ，合，この程度の角度領域であれば正面から見た結晶の位置

SFX 実験のために開発されたプログラム Cheetah6)に含まを決めるだけで照射野から測定中大きくずれずにデータをれるピークサーチ関数を利用して，分解能 5 Å 以下の低収集できるので自動化においても有利である。本稿ではこ角領域に存在する回折斑点を数えてスコアとする。 SHI-の測定スキームについて述べる。

KA GUI は保存されたファイルを読むことで，結果を表

複数の微小結晶を用いたデータ収集において鍵となるの示する。レポート HTML ファイルも生成され，ユーザはが，結晶の位置探索，放射線損傷予測に基づいた最適な露持ち帰ったデータからも Web ブラウザを利用して結果を光条件の決定，得られたデータの処理である。 SPring-8

確認できる。 GUI から評価基準を選択し，しきい値最BL32XU で は ， こ れ ら は そ れ ぞ れ SHIKA, KUMA,小距離を入力することで自動的にスコアの高い座標を選択

KAMO としてプログラム化され，これによってルーチンでき，KUMA へのゴニオメータ座標情報転送機能によっ的にデータ収集処理が可能になった（Fig. 2）。加えて自て即座にデータ収集を構築できる。

動ループセンタリングプログラムとして INOCC が開発さ
れ ， サ ン プ ル 交 換 ロ ボ ッ ト SPACE の 制 御 を 含 む BSS

3. KAMO による自動データ処理( Beamline Scheduling Software ）も組み合わせて自動化

データ処理の自動化は非常に重要である。多数の結晶を（ZOO）が達成された4)。本稿では，筆者が開発した SHI-用いる場合，より多くの結晶を用いることによってより高KA および KAMO について詳細に記述し，いくつか実例分解能や多型の解析が可能になることが期待できる。デーを紹介する。

タ処理が自動化されていないと，多量のデータを収集することに対して心理的抵抗が大きい。あるいは実験中にこれ

2. SHIKA による迅速な微小結晶探索以上データを取る必要があるかどうかを判断する上でも自回折データを収集する際，ビームに対して結晶位置をあ動処理は重要である。そこでプログラム KAMO (Katap-わせるセンタリング作業が必要になる。微小結晶，特にpashikara Atsumeta data wo Manual yorimoiikanjide

LCP 法によって結晶化された試料は凍結後に顕微鏡下でOkaeshisuru ）を開発した7) 。 KAMO は， i ）個別 wedge

目視しづらいことが多く，高い位置精度も要求されるため，の適切な処理（指数付け積分），ii）空間群の決定，iii）

X 線を用いた結晶位置の決定が必須である。このとき極indexing ambiguity の解決（あれば）， iv ）同型性に基づ力損傷を起こさない程度の低線量（光子密度～ 2 × 107 /いたデータの分類，v）異常値の除去とスケールマージ，mm2/frame）でスキャンを行う。結晶位置の確認のためにvi ）結果の視覚的な出力の機能を持つ。 KAMO を用いたは強度の大きい低分解能の回折斑点が観測できれば十分な処理の流れを Fig. 4 に示した。個別データの処理とマージので，低線量でも問題ない。スキャン領域はサンプルホル

は XDS パッケージ8) を利用する。個別データの処理には

放射光 March 2019 Vol.32 No.2 ● 109Fig. 3Fig. 4(Color online) The mechanism of on-the-‰y hit-ˆnding using EIGER detector by SHIKA.

(Color online) The ‰ow of KAMO programs. Copied from the Yamashita et al. (2018)7) under CC-BY 2.0(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0/).

DIALS9)も利用できるが， small-wedge の処理には現時点方に幾何学的に等価な複数の可能性が生じる（ indexing

では XDS のほうが実績がある。 CCP4 パッケージ10) からambiguity）ため，実際に強度を比較して指数の付け方をは POINTLESS11), CTRUNCATE, BLEND12)を利用する。

合 わ せ る 作 業 が 必 要 に な る 。 KAMO で は ， selective

KAMO はもともと SPring-8 ビームライン，特に ZOO のbreeding アルゴリズム13) をデフォルトの解決方法として一部として利用するために開発したが，現在ではその他の採用している。

施設でも利用可能である。 SPring-8 ビームラインで利用

マージの準備が整ったら，クラスタリングとマージの作する場合は， BSS のログを監視することでデータ収集と業へ進む。階層的クラスタリングの基準として格子定数と並行した自動処理ができるようになっている。

相関係数の 2 種類を用意している。格子定数ベースには個別データセットの処理が完了したら，マージ処理に進BLEND12)のクラスタリング機能を用いる。相関係数ベーむ。各データセットについて，格子定数が類似しているもスの場合は，各データ間の共通反射から相関係数（corre-の同士をグループ化し，各グループに関して，可能な点群

lation coe‹cient: CC）を計算し，d(i, j)＝ 1－CC(i, j) を対称性がリストアップされ，この中からマージ時に仮定す

データセット i, j 間の距離として Ward 法で階層的クラスる対称性を選択する。ここで強度の対称性よりも格子の対タリングを実行する。またデータセット間で分解能に対す称性が高い場合（たとえば P4 など），反射の指数の付ける強度の落ち方が大きく異なる場合，そのまま CC を計算

110 ● 放射光 March 2019 Vol.32 No.2

放射光ニュース ■ 第23回日本放射光学会奨励賞受賞研究報告することは不適切なので，規格化構造因子の二乗 |E|2 をが，多数のデータをマージすることによってフレキシブル使うオプションも用意している。

な ドメ イン の電 子密 度が 改善 した 例も ある

クラスタリング計算を行ったら，各クラスタについて（ unpublished）。微小結晶はもちろんのこと，微小結晶にcompleteness と multiplicity を計算し，両者が高い（デフ限らなくても，上記のようなケースでお困りの方は，利用ォルトではそれぞれ90かつ2）クラスタのみ，マーを検討していただければ幸いである。

ジ処理を行う。スケーリングには XSCALE を用い，その出力に基いて異常値（outlier）を検出し，除外する。除く

5. おわりにべきものは，マージ後の結果を悪化させる悪いフレームあマイクロビーム技術の登場によって微小結晶を用いた構

るいは悪い結晶の 2 種類ある。これらを順次検出除外

造解析が技術的に可能になり，これまで大きく良質な結晶するため，スケールマージ計算のサイクルは最大 3 回が得られず構造解析できなかったような試料も解析対象に行われる。まず最初に全データセットをスケールマージなった。本稿で述べた small-wedge データ収集では，なし，各フレーム上の強度とマージ後の強度から相関係数をるべく多くのデータを集め，適切にマージを行うことで，計算し，その極端に低いものを Tukey の基準を用いてをより高分解能かつ高精度のデータが得られることが期待さ検出除外する14) 。悪いフレームを除いたデータセットれる。SHIKAKAMO を含む微小結晶のためのワークフをマージし，そのうち特に大きな系統誤差あるいは極端なローおよびソフトウェア環境整備と，その自動化システム

B 値を持つデータセットを Tukey の基準に照らして検出ZOO の開発によって，大量の微小結晶を用いた構造解析除外し，最終結果とする。結果のレポートは HTML フが 非 常 に 簡 易  高 速 に な っ た 。 KAMO は GitHub に てァイルで出力され，クラスタリング結果と統計値を視覚的オ ー プ ン ソ ー ス で 公 開 し て お り （ https: // github.com /に確認できるようになっている。

keitaroyam / yamtbx ）， SPring-8 のデータに限らず利用可能である。出版済みの構造解析に関して，生データへのリ

4. 利用成果
BL32XU において， SHIKA および KAMO は既にほとンクやデータ処理の方法等も同ドキュメントに掲載しているので，興味のある方はあわせて参照頂きたい。

んどの実験に利用されている。 BL32XU 以外からの利用も含め， KAMO を用いた構造解析成果として現在 27 報謝辞（2017年以降）の論文が出版されている。BL32XU におい

本研究は，日本医療研究開発機構（AMED）「創薬等支て本スキームを利用して最初に出版された，細胞内結晶化援技術基盤プラットフォーム事業」および日本学術振興会

によって得られた多角体タンパク質の微小結晶解析では（ JSPS）科学研究費補助金研究活動スタート支援「多数の100以上収集したうち40個程度の結晶をマージして分解能微小結晶を用いた結晶構造解析手法および自動化システム

1.55 Å で構造決定を行った15) 。 GPCR であるリゾホスフの開発」などの支援を受けて行われました。関係各所に深ァチジン酸受容体 LPA616) ，ヒト由来オレキシン 2 受容く感謝します。また本研究の遂行にあたり， SPring-8 構体17)，ロイコトリエン B4 受容体 BLT118)はいずれも数百造生物学ビームライン関係者の方々，特に理化学研究所放個の結晶をマージし，それぞれ分解能 3.2, 3.7, 1.96 Å で射光科学総合研究センターの山本雅貴部長平田邦生専任決定された。また同じく GPCR であるムスカリン M2 受

技 師 に は 大 変 お 世 話 に な り ま し た 。 さ ら に ， SPring-8

容体の解析19) では，水銀置換体の結晶から収集した 5 °×BL32XU のユーザの方々には実サンプルの提供やフィー459のデータセットを用い，2.5 Å 分解能において SAD 法ドバックを通じて多大なご協力を頂きました。この場を借による位相決定にも成功した。このとき 32 個のクライオりてお礼申し上げます。

ループを用い， ZOO による自動測定で 7 時間弱をかけて参考文献671 データセットを収集した。他にもトリオースリン酸/リン酸輸送体（ TPT )20) 真核生物由来 MATE トランスポーター21)などの輸送体や，鉄還元酵素 Dcytb22)の解析にも 成 功 し て い る 。 い ず れ も 1 結 晶 あ た り 5 10 °程 度 のデータを数十から数百個の結晶から収集し，構造解析に成功している。利用成果の多くは LCP 法によって結晶化された膜タンパク質だが，本稿で述べた手法の適用範囲は膜タンパク質に限らない。最初に挙げた多角体タンパク質は細胞内結晶化によって得られた可溶性タンパク質試料であるし，また，同じく可溶性タンパク質で，砕けた状態の針状結晶を含んだ 1 ループのみから構造決定に成功した例

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)

H. M. Berman: Protein Science 21, 1587 (2012).
M. CaŠrey: Acta Cryst. F 71, 3 (2015).
K. Hirata et al.: J. Physics: Conf. Series 425, 012002 (2013).
K. Hirata et al.: Acta Cryst. D 75, 138 (2019).
M. Yamamoto et al.: IUCrJ 4, 529 (2017).
A. Barty et al.: J. Appl. Cryst. 47, 1118 (2014).
K. Yamashita, K. Hirata and M. Yamamoto: Acta Cryst. D74, 441 (2018).
W. Kabsch: Acta Cryst. D 66, 125 (2010).
D. G. Waterman et al.: CCP4 Newsletter on Protein Crystallography 49, 13 (2013).
M. D. Winn et al.: Acta Cryst. D 67, 235 (2011).
P. R. Evans: Acta Cryst. D 67, 282 (2011).

もある（ unpublished ）。その他にも，微小結晶でもない

放射光 March 2019 Vol.32 No.2 ● 11112)
13)
14)
15)
16)
17)
18)
19)
20)
21)
22)

J. Foadi et al.: Acta Cryst. D 69, 1617 (2013).
W. Kabsch: Acta Cryst. D 70, 2204 (2014).
J. W. Tukey: Exploratory data analysis (Addison-Wesley,1977).
S. Abe et al.: ACS Nano 11, 2410 (2017).
R. Taniguchi et al.: Nature 548, 356 (2017).
R. Suno et al.: Structure 26, 7 (2017).
T. Hori et al.: Nature Chemical Biology 14, 262 (2018).
R. Suno et al.: Nature Chemical Biology 14, 1150 (2018).
Y. Lee et al.: Nature Plants 3, 825 (2017).
H. Miyauchi et al.: Nature Communications 8, 1633 (2017).
M. Ganasen et al.: Communications Biology 1, 120 (2018).

112 ● 放射光 March 2019 Vol.32 No.2

● 著者紹介 ●山下恵太郎
東京大学大学院理学系研究科 助教
E mail: keitaro.yamashita ＠ bs.s.u tokyo.ac.jp
専門X 線構造生物学［略歴］
2013 年北海道大学大学院生命科学院博士後期課程修了，博士（生命科学）取得。
同年より理化学研究所放射光科学研究センターにて勤務。 2018 年より同客員
東京大学大学院理学系研究科。