称号及び氏名

博士（獣医学）

学位授与の日付

平成２４年３月３１日

論

イヌ卵子の発育・成熟技術の改良に関する研究

文

名

論文審査委員

大村 雅

主査

稲葉俊夫

副査

玉田 尋通

副査

中村 洋一

副査

杉浦喜久弥

論文要旨
緒言
前世紀には、遺伝子組換え技術、クローン技術、および胚性幹細胞（ES 細胞）の樹立技術等が開発され、現在も急速に発展しつつある生命科学の進展に大きく貢献した。
これらの技術の多くはマウスにおいて高い完成度を見ているが、その他の動物種、特に、大型・中型の実験動物では、上記の技術を実用的に利用することは依然として困難である。近年、イヌについてのゲノムの解析が完了し、イヌはマウスよりもヒトに近い遺伝子を持っていることが明らかにされた。また、イヌはヒトと類似した癌の自然発症がみられる唯一の動物種であることから、疾病研究、臨床応用、実験モデル等に多くの需要がある。しかしながら、発情休止期間が長く、年に 1〜2 回の繁殖期をもつイヌ特有の繁殖生理学的特徴から、イヌにおける細胞工学的技術の開発は遅れている。現在、イヌ受精卵を用いた ES 細胞の樹立，優秀な盲導犬の遺伝子保護、イヌ科希少動物保護等において、雄および雌イヌの優良遺伝子を有効に利用する体外受精が重要視されている。
体外受精の成功率を高めるには、多くの良質な成熟卵子が必要となる。
一般に、成熟卵子を得る方法として、発情誘起処置により体内で成熟させた卵子を回収する方法（体内成熟法）と、卵巣から未成熟な卵子を採取し、体外成熟（IVM）によって成熟卵子を得る方法があるが、いずれの方法でも、イヌの成熟卵子を得ることは極めて困難であり、他の動物種で確立されている技術をそのままイヌに応用することはできない。
そこで本研究では、イヌ卵子の体内成熟促進技術および体外成熟技術の改良を目的として、性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体（GnRH-A）の徐放剤（GnRH 徐放剤）を用いた発情誘起による体内卵子の発育促進、性腺刺激ホルモンの体外成熟卵への影響、およびコラーゲン・ゲルによる三次元培養卵子の体外成熟への影響について検討した。
第1章発情誘起によるイヌ体内卵子の発育促進

非発情期のイヌにおける卵巣内卵子の発育・成熟促進には、発情を誘起する方法が用いられる。この方法として、従来、黄体形成ホルモン（LH）とほとんど同様の生物学的作用を持つヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）、および強い卵胞刺激ホルモン（FSH）作用と弱い LH 作用を持つ妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）等を用いて試みられてきたが、正常な妊娠・出産を伴う発情誘起の成功率は非常に低い。この理由として
PMSG の長期投与により、エストラジオール（E2）が大量に分泌される結果、卵子の卵管通過を早め、卵管内での卵子の発育・成熟が阻害されることが想定されている。本章では下垂体ホルモン系とは異なる GnRH 徐放剤を用いてイヌ卵子の体内成熟促進を試みた。
第 1 節 GnRH 徐放剤による雌イヌの性成熟促進
雌イヌは通常 7～12 カ月で初回発情を迎えるが、これを過ぎても発情のみられない個体に GnRH 徐放剤を用いて性成熟の促進を試みた。
生後 1 年を過ぎても発情のみられない未成熟イヌに、体重 1 kg 当たり 100 μg のGnRH 徐放剤を 1 回投与し、その後、発情が誘起された日に排卵を促進するために体重 1 kg 当たり 3 μg の GnRH-A を投与して雄イヌと交配した。分娩に至るまでの観察期間中、継時的に血中 E2 および progesterone（P）濃度を測定した。その結果、GnRH
徐放剤投与後約 10 日に、ほとんどのイヌが発情を開始し、そのうちの 83%が正常な妊娠および分娩に至った。妊娠した個体の血中ホルモン動態は、自然発情のものと同様であった。一方、妊娠しなかった個体では血中 P 濃度の上昇期間が短いことがわかった。
以上の結果より、GnRH 徐放剤は性成熟の開始が遅延している雌イヌに発情を誘起させ、卵子の体内発育・成熟を促進させるのに有用であることが示唆された。
第 2 節 GnRH 徐放剤と Prostaglandin F2α の併用による雌イヌの次回発情回帰の短縮
成熟したイヌにおける卵子の体内成熟促進法としては、雌イヌの発情が年に 1～2 回のために、発情を人為的に誘起することが試みられてきた。本節では，発情休止期の雌イヌに prostaglandin F2α （PGF2α）を投与して黄体期間を短縮させ、その後に GnRH徐放剤を用いて、発情回帰の短縮を試みた。
発情休止期の雌イヌに、排卵後 15 日または 30 日より、体重 1 kg 当たり 250 μg のPGF2α を 1 日 2 回、4 日間連日投与した。
PGF2α 投与開始後 50 日に前節と同量の GnRH徐放剤を 1 回投与し、その後、発情が誘起された日に GnRH-A を投与して雄イヌと交配した。分娩に至るまでの観察期間中、継時的に血中 P 濃度を測定した。その結果、PGF2α 投与開始後血中 P 濃度は急激に減少し、処置終了時には基底値まで減少した。
PGF2α 処置開始後 50 日に GnRH 徐放剤を投与すると、発情の回帰が観察され、発情間隔は有意に短縮された。発情誘起時に雄イヌとの交配により、排卵後 15 日または 30日に PGF2α を処置開始した群では、それぞれ 71%および 83%のイヌが妊娠し、正常子イヌを分娩した。
以上の結果より、発情休止期の雌イヌに PGF2α を投与することにより、黄体の早期退行を引き起こすことが可能であり、その後、GnRH 徐放剤を併用することにより、次回発情開始を早めてイヌ卵子の体内発育・成熟を促進できることが明らかとなった。
第2章

イヌ卵子の体外成熟に及ぼす性腺刺激ホルモンの影響

哺乳類の卵子は、その周囲の卵丘細胞と複合体（COCs）を形成し、卵丘細胞からエネルギーの供給や、代謝産物の交換を受け、その発育は FSH や LH などの性腺刺激ホルモンによって促進されると考えられている。しかし、イヌ COCs における FSH 受容体（FSHR）および LH 受容体（LHR）の発現動態や、IVM における FSH および LHの効果の有無については未だよく分かっていない。
本章では IVM の改善を目的として、イヌ卵丘細胞の FSHR および LHR の発現を調べた。また、FSH および hCG を IVM 培地に添加し、卵子の IVM の効率について検討した。
第1節

卵丘細胞における性腺刺激ホルモンレセプターの発現

イヌ卵丘細胞における FSHR と LHR の発現について調べた。
非発情期のイヌ卵巣から COCs を回収した。本 COCs を FSH 含有 M199 培地で 12～48 時間培養した後、卵丘細胞を回収した。本卵丘細胞から total RNA を抽出し、リアルタイム PCR 法により、FSHR および LHR の mRNA 発現量を調べた。その結果、イヌ卵丘細胞において、FSHR および LHR の発現が認められた。FSHR の発現量は培養 12 時間後と比較し、培養 36 時間後で有意に増加した。また、LHR の発現量は培養12 および 24 時間後と比較し、培養 48 時間後で増加する傾向がみられた。
以上の結果より、イヌ卵丘細胞において、FSH を含む培地で培養することで、FSHRの増加とそれに続く LHR の増加が確認できた。
第2節

卵子の体外成熟に及ぼす性腺刺激ホルモンの影響

本節では、第 1 節の知見を応用し、FSH および LH が卵子の核成熟に及ぼす影響について検討した。

非発情期のイヌ卵巣から COCs を回収し、10%FBS 含有 M199 培地に FSH を添加して培養した。24 時間後、培地交換の際に FSH を添加(FSH 群)、あるいは FSH に加えて hCG を添加(FSH+ hCG 群)し、さらに培養した。合計 48 あるいは 72 時間培養後、COCs の直径を計測し、オルセイン染色により卵子の核成熟を比較した。その結果、COCs の直径は、48 時間培養した群と比較し、72 時間培養した群で有意に増加した。
また、成熟(MII)卵子の割合は、FSH 群と比較し、FSH+hCG 群で増加する傾向にあった。
以上の結果より、FSH、LH などの 2 ステップの培養方法だけでは、卵子の核成熟率の大きな改善に繋がらないために、更なる培養方法の検討が必要であると考えられた。
第3章

イヌ卵子の体外発育・体外成熟に及ぼす三次元培養の影響

現在、多くの哺乳動物において IVM 後に核成熟しているにも関わらず、受精やその後の発生能力が体内で成熟した卵母細胞よりも劣る原因として、細胞質の発育不十分が挙げられている。本章では、前章の知見を応用し、IVM の前に卵巣から回収した卵母細胞を FSH および核成熟抑制因子の hypoxanthine（HX）を用いて体外発育（IVG）させることを試みた。
第1節

卵子の体外発育に及ぼす三次元培養および Hypoxanthine の影響

イヌ COCs の立体構造を長期間保ち、卵母細胞を大きく発育させるために、コラーゲン・ゲルによる三次元培養を行い、HX 添加が卵母細胞の IVG に及ぼす影響について検討した。
非発情期のイヌ卵巣から未成熟卵母細胞を回収し、コラーゲン・ゲルに包埋した。
10 %FBS 含有 M199 培地に 0～4 mM の HX を添加した培養液を重層し、7 日間培養した。培養後、卵母細胞の直径、生存率、卵丘細胞付着卵子率、卵母細胞の核成熟を比較した。その結果、三次元培養により COCs の形態は培養期間中保持され、卵母細胞の直径は培養後で有意に増加した。卵丘細胞付着卵子および卵核胞（GV）期の割合はHX 4 mM 添加群で有意に高値を示した。
以上の結果より、HX 存在下のコラーゲン・ゲルによる三次元培養では、COCs の立体構造を長期間維持し、卵母細胞の発育に有効であることが示唆された。
第2節

三次元培養卵子の体外発育に及ぼす卵胞刺激ホルモンの影響

HX を添加した状態で FSH が IVG に及ぼす影響について検討した。
前節と同様に、卵母細胞をコラーゲン・ゲルに包埋し、4 mM の HX と 0～5 μg/ml のFSH を添加した培養液で、7 日間培養した。培養後、生存率、卵丘細胞付着卵子率、核成熟を比較した。その結果、FSH 添加により、卵丘細胞付着卵子の割合は有意に高値を示し、卵胞様の構造（疑似卵胞）が観察された。また生存率および GV 期の割合には、FSH 添加による影響は認められなかった。
以上の結果より、培養液に HX を添加することで、卵母細胞の核の成熟を GV 期の状態に保ちながら、その細胞質の発育を促進させ、さらに、FSH を添加することで疑似卵胞を作製できることが分かり、HX と FSH はより効果的に卵母細胞の発育を促進することが示唆された。
第3節

三次元培養した体外発育卵子の体外成熟

第 1 および 2 節で得られた知見をもとにして、三次元体外発育培養が体外成熟の改善につながるかを検討した。
非発情期のイヌ卵巣から回収した卵母細胞を、FSH および hCG 含有培地で 48 時間
IVM した群（IVM 群）と、HX 4 mM および FSH 0.5 μg/ml 添加培養液で 7 日間コラーゲン・ゲル前培養後に IVM した群（IVG＋IVM 群）の核成熟を比較した。その結果、MII 卵子の割合は IVG＋IVM 群で有意に高値を示した。
以上の結果より、三次元培養による卵母細胞の発育は、その後の核成熟に効果的であることが示唆された。
総括
イヌ卵子の体内および体外における発育・成熟技術の改良を目的として、GnRH 徐放剤を用いた発情誘起による体内卵子の発育促進、性腺刺激ホルモンによる卵子の体外成熟への影響、および FSH を用いたコラーゲン・ゲルによる三次元培養卵子の体外発育・成熟法を検討し、以下のことを明らかにした。
1． GnRH 徐放剤は性成熟の開始が遅延している雌イヌに発情を誘起させ、卵子の体内発育・成熟を促進させるのに有用であることが示唆された。
2.

発情休止期の雌イヌに PGF2α を投与することにより、黄体の早期退行を引き起こすことが可能であり、その後、GnRH 徐放剤を併用することにより、次回発情開始を早めて卵子の体内発育・成熟を促進できることが明らかとなった。
3.

イヌ卵丘細胞において、FSH を含む培地で培養することで、FSHR の増加とそれに続く LHR の増加が確認でき、また体外成熟卵子を得る上で、FSH とそれに続く hCGの添加が有用と思われた。
4.

三次元培養は、HX と FSH の添加により、イヌ卵母細胞の発育を促進し、その後の核成熟率を増加することで、イヌ卵子の体外成熟に効果的であることが示唆された。
以上、本研究により、GnRH 徐放剤の投与および三次元培養法と組み合わせた FSH処置により、イヌ卵子の体内発育・成熟の促進および体外成熟率の改善が期待できることが示唆された。今後、これらの基盤技術により、雌イヌの繁殖機能の人為的調節法の確立や体外受精技術の開発に新たな可能性が開けると考えられる。

審査結果の要旨
近年、イヌについてのゲノムの解析が完了し、イヌはマウスよりもヒトに近い遺伝子を持っていることが明らかにされた。また、イヌはヒトと類似した癌の自然発症がみられる唯一の動物種であることから、疾病研究、臨床応用、実験モデル等に多くの需要がある。しかしながら、発情休止期間が長く、年に 1〜2 回の繁殖期をもつイヌ特有の繁殖生理学的特徴から、イヌにおける細胞工学的技術の開発は遅れている。現在、イヌ受精卵を用いた胚性幹細胞（ES 細胞）の樹立、優秀な盲導犬の遺伝子保護、イヌ科希少動物保護等において、雄および雌イヌの優良遺伝子を有効に利用する体外受精が重要視されている。体外受精あるいはその研究を推進するには、多くの良質な成熟卵子（卵細胞）が必要となる。
一般に、成熟卵子を得る方法として、発情誘起処置により体内で成熟させた卵子を回収する方法（体内成熟法）と、卵巣から未成熟な卵子（卵母細胞）を採取し、体外で発育・成熟させる方法（体外成熟法）があるが、いずれの方法でも、イヌの成熟卵子を得ることは極めて困難であり、他の動物種で確立されている技術をそのままイヌに応用することはできない。
そこで本研究では、性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体の徐放剤（GnRH 徐放剤）を用いた発情誘起による体内卵子の発育促進、卵子の体外成熟に及ぼす性腺刺激ホルモンの影響、および卵胞刺激ホルモン（FSH）を用いたコラーゲン・ゲルによる三次元培養卵子の体外発育・成熟法を検討し、以下の成果を得た。
1． GnRH 徐放剤は性成熟の開始が遅延している雌イヌに発情を誘起させ、卵子の体内発育・成熟を促進させるのに有用であることが示唆された。
2.

発情休止期の雌イヌに prostaglandin F2α を投与することにより、黄体の早期退行を誘起することが可能であり、その後、GnRH 徐放剤を併用することにより、次回発情開始を早めて卵子の体内発育・成熟を促進できることが明らかとなった。

3.

培養イヌ卵丘細胞において、培地への FSH の添加は、FSH 受容体とそれに続く黄体形成ホルモン（LH）受容体の遺伝子発現を増加したことから、FSH に続く LHの培地への添加が体外成熟卵子を得る上で有用と思われた。

4.

核成熟抑制因子の hypoxanthine と FSH を添加する三次元培養は、イヌ卵子の成熟発育を促進し、その後の核成熟率を増加することで、イヌ卵子の体外成熟に効果的であることが示唆された。
以上のように本研究では、GnRH 徐放剤の投与および三次元培養法と組み合わせたFSH 処置により、イヌ卵子の体内発育・成熟の促進および体外成熟率の改善が期待できることを実証した。本研究の成果に基づく雌イヌの繁殖機能の人為的調節法や体外受精技術の開発は、獣医学の発展のみならずヒト再生医学の発展にもつながるものであり、本論文の審査ならびに最終試験の結果と併せて、博士（獣医学）の学位を授与することを適当と認める。