称号及び氏名

博士（理学）

学位授与の日付

2022 年 3 月 31 日

論

プロテインキナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤とした選択的阻害剤

文

名

入江の創出

論文審査委員

主査
副査
副査

藤井 郁雄
円谷 健
木下 誉富隆行

プロテインキナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤とした選択的阻害剤の創出

⼊江隆⾏

プロテインキナーゼ（以下、キナーゼと略す）は有望な創薬ターゲットである。数多くのキナーゼ阻害薬が各国で医薬品として認可を受け使⽤されており、さらに千以上の臨床試験が進⾏中である。当初は、分⼦標的薬として、がん疾患の原因となる特定のキナーゼをターゲットとしていたが、キナーゼが様々な疾患との関連が明らかになるにつれ、⾃⼰免疫疾患や中枢神経系疾患など対象疾患も増え、キナーゼ阻害剤開発競争は益々激しくなっている。
キナーゼは、ATP のリン酸基を基質となるタンパク質に転移する酵素である。触媒活性をもつキナーゼドメインには、ATP 結合領域が存在し、キナーゼ間の相同性が⾼い。そのため、その領域に結合するキナーゼ阻害剤（Type I）は、特定の相互作⽤を狙えば活性を確保しやすい反⾯、意図に反して他のキナーゼをも阻害する傾向がある。キナーゼ選択性を確保するために、ATP 結合部位以外の隣接部位（Type II / III 阻害剤）や全く離れた部位（Type IV、アロステリック阻害剤）のそのキナーゼに特徴的な相互作⽤を利⽤した成功例がある。また、最近では、詳細な構造⽐較や構造活性相関等の知⾒の蓄積により、ATP 結合部位をターゲットとした Type I阻害剤でも精密なデザインで選択性を獲得した報告もあるが、どちらの場合も全てのキナーゼに対して同様にアプローチするのは難しい。
そこで、本研究では、キナーゼ⼀般に適⽤可能な、キナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤とした選択的阻害剤探索法を構築し、ヒットやリード化合物を簡便かつ迅速に⾒出した。
第１章では、基盤となるキナーゼ指向性化合物ライブラリの開発について述べる。キナーゼ
結合性フラグメントと多様性フラグメントをクリックケミストリーで簡便に連結させ、キナーゼ阻害剤開発の出発点となるヒット化合物を⽣み出す Kinase Focused Evolved Fragment（KFEF）ライブラリを作成した。第２章では、⾼効率なキナーゼ結合性フラグメントである 7-アザインドールを基にしたリード探索法について述べる。KFEF ライブラリから⾒出した HGK キナーゼのヒット化合物（7-アザインドール誘導体）から、7-アザインドールを⾜がかりにクリック合成法で簡便に構造展開し、100 倍以上の活性増強や、異なる選択性プロファイルを有する誘導体を迅速に⾒出した。第３章では、上述の KFEF ライブラリやリード探索法を活⽤して得た CDC7キナーゼのリード化合物（7-アザインドール誘導体）の最適化研究について述べる。ADME の課題を克服して経⼝投与可能な CDC7 選択的阻害薬 AS-0141 を創製した。
第１章

キナーゼ結合性フラグメントを⽤いた Kinase Focused Evolved Fragment（KFEF）ライブラリの開発

近年、フラグメントリード探索という、⼩さなフラグメントヒットからリードへ導く探索法が着⽬されている。B-RAF キナーゼ阻害薬 Vemurafenib など、この⼿法を元に開発された医薬品も出てきている。キナーゼは ATP 結合部位の相同性が⾼く、キナーゼ阻害剤（Type I）はヒンジと呼ばれる配列との⽔素結合を結合の基盤としている。そこで、蓄積されているキナーゼ阻害剤の結合構造情報からヒンジと相互作⽤している部分構造をキナーゼ結合性フラグメントとして抽出した（Figure 1）。フラグメント単体では結合活性が⾮常に弱いため、クリックケミストリーを利⽤して別の多様性フラグメントと簡便に連結させた。この Kinase FocusedEvolved Fragment（KFEF）は、相互作⽤の増加による結合活性の増強に加え、多様性フラグメントの選択

Figure 1. KFEF ライブラリデザインのコンセプト次第で物性や選択性を調整することも可能である。
本コンセプトの有⽤性を検証するため、キナーゼ結合性フラグメントのアルキン化合物５つと多様性フラグメントのアジド化合物８つを組み合わせてクリックライブラリを作成した。その際、クリック反応で構築されるトリアゾール環は、触媒の選択により容易に 1,4 置換体 (Cu)と 1,5 置換体 (Ru)を作り分けることができる。80 (5×8×2) の組み合わせのうち、合成に成功した 76 個のトリアゾール誘導体に対しキナーゼ阻害活性を測定した。チロシンキナーゼ（TK）とセリンスレオニンキナーゼ（STK）からそれぞれ FLT3 と GSK3を評価キナーゼとして選抜したが、両者でヒットするリガンド種に⼤きな違いがあった。最も阻害活性が強い誘導体は、
FLT3 で 4C4（IC50 = 1.1 M）、GSK3で 4C5（IC50 = 0.49 M）であり、ヒットとして⼗分な活性を有していた。興味深いことに、２つのヒットは⼀⽅のキナーゼに対しては活性が弱く 10倍以上の選択性を確認できた。
以上より、KFEF ライブラリは、選択的キナーゼ阻害剤のヒット化合物取得に有⽤であることが⽰された。
第２章 7-アザインドール：⾼効率なキナーゼ結合性フラグメントを活⽤したリード探索
前章で述べた KFEF ライブラリを拡充し、HPK/GCK like kinase (HGK)に対しスクリーニングを実施した。HGK は細胞の浸潤、吸着、移⾏などに関与する STK で、HGK の過剰発現ががんの転移リスクと相関があることが⽰されている。

得られたヒット 1 （HGK IC50 = 0.92 M）に含まれる

Replacing

7-アザインドール構造は、様々なキナーゼ阻害剤に存在す

3る kinase privileged fragment として知られている。
HGK との in silico 結合実験では、ヒット 1 の 7-アザインドールの２ つ の 窒 素 原 ⼦ と キ ナ ー ゼ の ヒ ン ジ 配 列 と の 間 で bidentate な⽔素結合が⽰唆された。得られた結合様式を基5Growing
Figure 2. ヒット 1 の構造展開に、リード創出への構造展開⽅針を決定した（Figure 2）。
クリック反応で構築可能な 3-トリアゾロ-7-アザインドールを基本⾻格とし、新たな相互作⽤を期待して 7-アザインドールフラグメントの５位に置換基を導⼊することとした。また、今回も1,4 と 1,5 置換の２種のトリアゾールを合成した。合成した 24 化合物のうち、最も阻害活性が強い誘導体は IC50 が 2.4 nM であり、ヒット化合物から 2 桁も活性が向上した。また、活性は少し低め（23 nM）だがキナーゼ選択性が改善した誘導体も取得できた。
以上より、7-アザインドールフラグメントとクリックケミストリーの活⽤により、簡便かつ迅速に特徴のあるリード化合物を取得できることが⽰された。
第３章 選択的 CDC7 阻害薬 AS-0141 の創出
CDC7 は、DNA 複製に関与する STK である。細胞周期の S 期において活性化され、基質のMCM タンパク質をリン酸化することで⼀連の DNA 複製プロセスが開始される。様々ながん種において⾼発現し、その発現度ががん患者の予後の悪さと相関していることから、CDC7 阻害薬
は新規メカニズムの抗がん剤として開発されている。
しかしながら、CDC7 は ATP の親和性が⾮常に⾼く（Km = 2.8 M）、ATP と拮抗するタイプの阻害剤は⽣理条件の⾼濃度 ATP では⼤幅に活性が減弱するため、細胞活性を⽰す CDC7 阻害剤を⾒出すのは困難であった。そこで、⾼濃度 ATP 条件下で CDC7 阻害スクリーニングを実施し、同条件でも活性を⽰す 7-azaindole 誘導体のヒット化合物を⾒出した。この⾼効率キナー
ゼ結合性フラグメントを固定し、様々な⺟核を探索することで、新規フラノン誘導体リードへ導いた（Figure 3）。
本誘導体は、ヒンジ配列結合性の 7-アザインドールを含むことから想定されるどおり、ATP濃度依存型の阻害を⽰したが、興味深いことに CDC7 とプレイ

Figure 3. リードから AS-0141 への最適化

ンキュベーションすると ATP依存性を失うというユニークな特徴を⽰した。また、Rapid dilution 法で酵素活性の再⽣（リガンド結合可逆性）を調べたころ、化合物は緩やかに酵素から乖離することがわかった。その時間依存的な阻害様式は、細胞内においても確認された。基質の MCM2 のリン酸化阻害効果は、化合物を除去してから 24 時間続いていた。構造最適化研究では、各パーツの構造活性相関を取得した。7-アザインドールからフラノンに⾄る⾻格は CDC7 阻害活性発現に重要であったが、アニリン部分の変換については許容性が認められたため、様々なタイプのアミンに置換し、活性だけでなく ADME/PK も良好な化合物を探索した。最終的に選抜した AS-0141 は、⾼いキナーゼ選択性に加え、各種試験動物で良好な PK プロファイルを⽰し、マウスの抗腫瘍モデル（SW-620xenograft）で⾼い抗腫瘍活性を⽰した。本剤は、前臨床試験を完了し、現在、臨床第１相試験を実施中である。
以上述べてきたように、キナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤としたキナーゼ阻害剤探索法は、迅速なヒット・リード開発を可能とし、得られたリード化合物で臨床開発化合物を創製できることを実証した。また、キナーゼ阻害剤に特有の難題である選択性についても、Kinase
Focused Evolved Fragment（KFEF）ライブラリから選択的なヒットを取得可能で、キナーゼ結合性フラグメントを基にした誘導体合成で更なる選択性向上が可能であることが⽰された。様々なキナーゼターゲットに対し本法を活⽤できると期待している。

原著論⽂
1. Irie, T.; Fujii, I.; Sawa, M. Design and combinatorial synthesis of a novel kinase-focusedlibrary using click chemistry-based fragment assembly. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012,22 (1), 591-596.
2. Irie, T.; Asami, T.; Sawa, A.; Uno, Y.; Hanada, M.; Taniyama, C.; Funakoshi, Y.; Masai,H.; Sawa, M. Discovery of Novel Furanone Derivatives as Potent Cdc7 Kinase Inhibitors.

Eur. J. Med. Chem. 2017, 130, 406−418.
3. Irie, T.; Sawa, M. 7-Azaindole: A Versatile Scaffold for Developing Kinase Inhibitors.

Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 2018, 66(1), 29-36.
4. Irie, T.; Asami, T.; Sawa, A.; Uno, Y.; Taniyama, C.; Funakoshi, Y.; Masai, H.; Sawa, M.
Discovery of AS-0141, a Potent and Selective Inhibitor of CDC7 Kinase for the Treatmentof Solid Cancers. J. Med. Chem. 2021, 64 (19), 14153−14164.

学位論文審査結果要旨
令和 4 年 3 月 1 日

学位論文草稿提出者氏名：入江 隆行
学位論文草稿題目：プロテインキナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤とした選択的阻害剤の創出
ヒトには 500 種類以上のプロテインキナーゼ（以下、キナーゼと略す）が存在することがゲノム情報から判っており，有望な創薬ターゲットになっている。触媒活性をもつキナーゼドメインには、ATP 結合領域が存在し、キナーゼ間の相同性が高い。そのため、その領域に結合する化合部物（Type I）は、阻害活性を確保しやすい反面、意図に反して他のキナーゼをも阻害する傾向がある。キナーゼ選択性を確保するために、ATP 結合部位以外の隣接部位（Type II / III 阻害剤）や全く離れた部位（Type V、アロステリック阻害剤）などの個々のキナーゼに特徴的な領域に作用する阻害剤の研究が行われているが，選択的キナーゼ阻害剤の開発は，未だ難易度の高い研究課題である。そこで、本研究では、キナーゼ一般に適用可能な手法として，キナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤とした選択的阻害剤探索法を構築した。
第１章では、基盤となるキナーゼ指向性化合物ライブラリの開発を検討した。キナーゼ結合性フラグメントと多様性フラグメントをクリックケミストリーで簡便に連結させ、キナーゼ阻害剤開発の出発点となるヒット化合物を生み出す Kinase Focused Evolved Fragment（KFEF）ライブラリを構築した。第２章では、高効率なキナーゼ結合性フラグメントである 7-azaindole を基にしたリード探索法について検討した。KFEF ライブラリから見出した HGK キナーゼのヒット化合物（7-azandole 誘導体）を足がかりにクリック合成法で簡便に構造展開し、100 倍以上の活性増強や、異なる選択性プロファイルを有する誘導体を迅速に見出した。第３章では、上述の KFEF ライブラリやリード探索法を活用して得た CDC7 キナーゼに対するリード化合物（7-azaindole 誘導体）の最適化を行った。その結果，ADME の課題を克服し，経口投与可能な CDC7 選択的阻害薬
AS-0141 の創出に成功した。
以上のように，申請者は，キナーゼ指向性化合物ライブラリを基盤としたキナーゼ阻害剤探索法を開発し，この手法が迅速なヒット・リード化合物の開発を可能とし、臨床開発化合物を創製できることを実証した。また、キナーゼ選択性についても、Kinase Focused Evolved Fragment（KFEF）ライブラリから選択的なヒット化合物を取得可能で、キナーゼ結合性フラグメントを基にした誘導体合成で更なる選択性向上が可能であることが示された。CDC7 キナーゼに対する阻害剤 AS-0141 は，マウスの抗腫瘍モデル（SW-620 xenograft）で高い抗腫瘍活性を示し，前臨床試験を完了し、現在、臨床第１相試験を実施中である。本手法が，様々なキナーゼターゲットに対し活用可能になり，今後の医薬品の研究開発に大きく貢献することが期待する。本学位論文には，顕著な新規性と独創性があり，申請者を博士（理学）の学位に値する能力を持つものと判断する。