平成18年度〔2006〕No.51
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

PCR反応によるLactobacillus paracaseiの識別
高山 清子＊1・水谷 政美＊1・工藤 哲三＊1
Identification of Lactobacillus paracasei by Polymerase Chain Reaction
Kiyoko TAKAYAMA, Masami MIZUTANI and Tetsuzo KUDO
これまで宮崎県内の焼酎製造場の焼酎もろみについて生酸菌の分布を調査した。そして63株の乳酸菌を分離，分類し，その性質を調べてきた1−3）。ユニバーサルプライマー（5Ｆ，531Ｒ）を用いた16S rDNA解析で分類した結果，分離株の約半数がLactobacillus pacasei（以下L. paracaseiと表記）と分類された。今回，16S rRNA遺伝子のV1領域においてL. paracaseiに特異的なプライマーを用いたPCR反応をおこない同定結果の再確認をおこなった。
キーワード：Lactobacillus paracasei，PCR，焼酎もろみ
１

はじめに後，ヒートブロックにて100℃で8分間加熱した。

これまで宮崎県内13社の焼酎製造上より24点10秒間かくはんし，遠心（13000rpm, 3min）後の焼酎もろみを採取し，生酸菌の分布を調査したの上清をDNA抽出液とした。

結果，焼酎もろみ中には腐造に至らないまでも乳２−２ L. paracaseiに特異的なプライマーを用酸菌が存在していた 。分離した乳酸菌はグラム
1）

いたPCR反応

反応試験，カタラーゼ試験，ユニバーサルプライ

焼酎もろみから最も多く分離された乳酸菌がL.

マーを用いた16S rDNA遺伝子解析およびApiキparacasei であることを再確認するため，16Sットによる糖類資化性試験で分類した 。そして

rRNA遺伝子のV1領域においてL. paracaseiに特異焼酎もろみから分離した乳酸菌の多くがL. para-的なプライマーを用いたPCR反応をおこなった。

caseiであることを確認した。

PCR反応には焼酎もろみから分離し，ユニバーサ

2）

今回，焼酎もろみから最も多く分離された乳酸

ルプライマーを用いた16S rDNA遺伝子解析およ菌が L. paracasei であることを再確認するため，

びApiキットによる糖類資化性試験でL. paracasei

16S rRNA遺伝子のV1領域においてL. paracaseiにと分類された３株，およびその標準株L. paraca-

特異的なプライマーを用いたPCR反応をおこなっ

sei subsp. paracasei（JCM 8130），L. paracasei

たので報告する。

subsp. tolerans（JCM 1171），その他焼酎もろみから検出された乳酸菌のそれぞれの標準株L.

２plantarum（JCM 1149），L. pentosus（JCM 1558），

実験方法

２−１

L. fermentum（JCM 1173），L. buchneri（JCMDNAの抽出Matrix1115），L. parabuchneri（JCM 1162），L. hilgar-（BIO-RAD製）を用いた。菌体をMilli-Q水1mlにdii（JCM 1155），L. brevis（JCM 1059），P. pen-懸濁させ，遠心（13000rpm, 1min）後上清を除tosaceus（JCM 5890），P. acidilactici（JCM 8797）

乳 酸 菌 の DNA抽 出 は ， InstaGeneいた。InstaGene

TMTMMatrixを200ml加え，湯浴中で15分から30分間56℃に保った。10秒間かくはんを用いた。
PCR反応はWardらの方法を参考に4,5），L. para-casei に特異的なプライマー（Y2:5 -CCCACT＊１

応用微生物部

GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3 , para:5 -CACC115

PCR反応によるLactobacillus paracaseiの識別

GAGATTCAACATGG-3 ）を用いた。PCR反応のサンプルは，TaKaRa Ex TaqTM（タカラバイオ製）を用いて調製した。すなわち，100倍希釈したDNA抽出液15μl，Ex Taq 0.1μl，10×PCR
Buffer 2μl，dNTP mix 1.6μl，プライマーY2（5pmol/μl）2μl，プライマーpara（5pmol/μl）
2μl，Milli-Q水 7.3μl（Total 30μl）をPCRチューブに調製した。反応条件は，1cycle 94℃ 3min, 55℃ 45s, 70℃ 1 min; 30 cycles 94℃ 45 s,55℃ 45 s, 70℃ 1 min; 1 cycle 94℃ 45 s, 55℃ 45

図１ L. paracasei に特異的なプライマーを用いたPCR反応後の電気泳動写真s, 70℃ 5 min とし，GeneAmp PCR System 9700
（Applied Biosystems, U.S.製）にてPCR反応をおLactic acid bacteria isolated from Shochu mash

こなった。

（lanes 1〜3）L.paracasei subsp. paracasei JCM２−３8130（lane4）L.paracasei subsp. tolerans JCM

PCR反応の確認

PCR反応後，2%アガロースゲルにて電気泳動

1171（lane5）L.plantarum JCM 1149（lane6）をおこない増幅を確認した。すなわち，アガロー

L.pentosus JCM 1558（lane7）L.fermentum JCM

スLO3（タカラバイオ製）２gを1×TAE buffer1173（lane8） L.buchneri JCM 1115（lane9）

100mlに加熱溶解させた。その後0.2%エチジウム

L.parabuchneri JCM 1162（lane10）L.hilgardii

ブロマイドを5μl加え，アガロースゲルを作成しJCM 1155（lane11）L.brevis JCM 1059（lane12）た。

P. pentosaceus JCM 5890（lane13）P.acidilactici

電気泳動におけるDNAサイズマーカーには，JCM 8797（lane14）

λ-Hin d III digest（タカラバイオ製）を使用した。
DNAサイズマーカーのフラグメントとそのサイズ （ bp） は ， A:23,130, B:9,416, C:6,557,

L. pentosus JCM 1558（lane7），L. fermentum

D:4,361, E:2,322, F:2,027, G:564, H:125であっ

JCM 1173（lane8）， L. buchneri JCM 1115

た。電気泳動はλ-Hin d III digestのプロトコール（lane9），L. parabuchneri JCM 1162（lane10），に従いサンプルを調製し，100Vで15分間マイナ

L. hilgardii JCM 1155 （lane11），L. brevis JCM

スからプラス方向に泳動した。そして，電気泳動

1059（ lane12）， P. pentosaceus JCM 5890

後 の ア ガ ロ ー ス ゲ ル は Image Master VDS（lane13），P. acidilactici JCM 8797（lane14）に（Pharmacia Biotech製）にて紫外線を照射し，バおいて，特異的なバンドは確認されなかった。しンドを確認した。

たがって，焼酎もろみから最も多く分離された菌株はL. paracasei と相同性が高いことを再確認し

３

結果および考察た。

16S rRNA遺伝子のV1領域においてL. paracaseiに特異的なプライマーを用いたPCR反応後の電気泳動写真を図１に示す。

４

まとめ
これまで焼酎もろみから分離した乳酸菌はグラ

焼酎もろみから分離した菌株（lanes 1, 2, 3），ム反応試験，カタラーゼ試験，ユニバーサルプラおよび標準株L. paracasei subsp. paracasei（JCM

イマーを用いた16S rDNA遺伝子解析及びApiキ8130, lane4），L. paracasei subsp. tolerans（JCMットによる糖類資化性試験で分類した結果，その1171, lane5）では特異的なバンドが確認された。

約半数がL. paracaseiであった。

しかしながら，その他焼酎もろみから検出された

今回，16S rRNA遺伝子のV1領域において L.

乳酸菌の標準株L. plantarum JCM 1149（lane6），paracaseiに特異的なプライマーを用いたPCR反応

116

PCR反応によるLactobacillus paracaseiの識別の結果，焼酎もろみから分離した菌株および L.

paracaseiの標準株において特異的なバンドが確認され，同定結果を再確認した。
５

参考文献

１）竹下淳子，工藤哲三，山本英樹，水谷政美，
柏田雅徳：宮崎県工業技術センター・食品開発センター研究報告，49， p.127-131 （2004）
２）竹下淳子，工藤哲三，山本英樹，水谷政美，柏田雅徳:宮崎県工業技術センター・食品開発センター研究報告，49，p.119-125 （2004）
３）高山清子，工藤哲三，水谷政美，山本英樹，柏田雅徳:宮崎県工業技術センター・食品開発センター研究報告，50， p.117-119 （2005）
４）L.J.H.Ward，M.J.Timmins:Letters in Applied

Microbiology，29， p.90-92 （1999）
５ ） L.J.H.Ward， J.C.S. Brown and G.P.
Davey:Letters in Applied Microbiology，20，p.204-208（1995）

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