原始クラミジアから紐解く
病原体の細胞内生存戦略と制御
Primitive chlamydiae: a hint to uncover the intracellular survival strategy of human pathogens
北海道大学大学院保健科学研究院病態解析学分野

感染制御検査学研究室

山口 博之

Hiroyuki Yamaguchi
Departoment of Medical Laboratry Sciences, Faculty of Health Sciences,
Hokkaido University Graduate School of Health Sciences

入らない。一方、2004 年、Science に一本の興味深い

1. はじめに論文が掲載された。驚いたことに自然環境に広く生息性感染症や呼吸器疾患を起こすクラミジアは、長いする原生動物アカントアメーバ（以下アメーバ）に、クラミ年月をかけ感染する細胞に認識されないようにさまざまジアが進化の過程で捨ててしまった分子をいまだ温存な分子を捨てヒトを含む哺乳細胞に適応進化してきた。

する原始的なクラミジアが現存しているというものであっ失った分 子の中には、感 染 細 胞にいち早く認 知され、た［ヒトに起病性のあるクラミジアの平均ゲノムサイズが病原体の排除機構を効率良く活性化する分子が含ま1.0-1.2Mbp 程度と比較的小さいのに比べ、この原始れているはずであり、その分子の機能解析は、細胞内クラミジア（Protochlamydia UWE25）のゲノムサイズはに持 続 的に寄 生するさまざまな病 原 体を制 御する上

約 2.4Mbpと2 倍近く大きい］。そこで私達は、クラミジで、新たな戦略を生み出す可能性がある。だが残念な

アが 哺 乳 細 胞に適 応 進 化する過 程で捨てた分 子をことに、クラミジアが一度失った分子は、そう容易く手に求め、土 壌や水 系 環 境から原 始クラミジアが共 生す

図 1 16S rRNAを指標にしたクラミジアの系統分類

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参考文献 1、Figure 1 より引用

原始クラミジアから紐解く病原体の細胞内生存戦略と制御るアメーバを株化し、共生する原始クラミジアのユニーへと変換して行くが、封入体膜上には食胞が成熟する

クな特 性について細 胞 分 子レベルでの 検 討を始めために必要なマーカーが見られず、リソソームとの融合た。本 稿では、まずクラミジアの概 要を説 明した上でが起こらない 8, 9）。更に、感染した宿主細胞がアポトーシ

原 始クラミジアのユニークな特 徴について私 達 の 実スに陥らない様な細胞修飾機構を保有している 10）。そ験データをもとに紹介したい。の機構も良く調べられていて、菌体から分泌され細胞質に放出されるCPAF（chlamydial protease/proteosome-

2. 病原性クラミジアと原始クラミジア

like activity factor）が、アポトーシス刺激の主要なセンサーであるBH3-only proteinを分解することで、感染クラミジアの分類上の広がりは極めて広くクラミジアスー細胞がミトコンドリアの機能不全を介してアポトーシスにパーファミリーとも称されている（図 1）1）。現在クラミジア目陥ることを防いでいる 11）。その一方、強力な殺菌機構は、Chlamydiaceae、Parachlamydiaceae、Waddliaceae、を備えたアメーバへの感染様式やアメーバ内での原始Simkaniaceae の 4 科に分類されている。ヒトに感染し、クラミジアの宿 主 細 胞 への修 飾 機 構は全く明らかに肺炎や性感染症の原因となるChlamydia pneumoniaeなっていない。

や C. trachomatis などを 含 む 病 原 性クラミジアはChlamydiaceae の 1 科に属し、後者 3 科が原始クラミジAアである。原始クラミジアと病原性クラミジアの分岐は今から7 億年以上前に遡るが、分岐後の進化の過程で適応した宿主域は大きく異なり、病原性クラミジアが哺乳動物から魚類に至るまで、脊椎動物に幅広く生息する一方、原始クラミジアの生息環境は主にアメーバなど原生動物に限られている 1, 2）。一方、どちらのクラミジアも他の細 菌 種には見られないユニークな増 殖 環を持ち、宿主細胞への感染能力はあるが分裂増殖能を欠いた基本小体（elementary body：EB）と感染能力はない細胞内にて分裂する網様体（reticulate body：RB）
より構成されている（図 2）1）。原始クラミジアには更にユニークな形 態 学 的な特 徴があり、環 境の劣 悪 化に伴い、EB から三日月体（crescent body：CB）という特異なB形態が観察される場合がある（図 2B、c）。病原性クラミジアの細 胞 への付 着ならびに細 胞 内での生 存・増 殖様式は大変良く調べられている。まず病原性クラミジアの宿主細胞への付着には、菌体表層に発現している外膜蛋白 OmcB やストレス蛋白質 HSP70 が宿主細胞上の細胞外マトリックスプロテオグリカンの側鎖ヘパリンや繊維芽細胞増殖因子 2 に結合することが重要である 3-5）。その後、細胞に付着した EB の III 型分泌装置
にて細胞質に打ち込まれるTARP（translocated actinrecruiting phosphoprotein）
によりアクチンの再重合が誘導され、それに伴い形成される細胞表層の台座を介して宿主細胞内へと取り込まれて行く6, 7）。宿主細胞内に移行したEB は食胞に類似した封入体膜に包まれ RB

図 2 原始クラミジアの増殖環と形態学的な特徴
A. 原始クラミジアの増殖環。最終分化や死滅する過程ではないので生活環とは呼ばない。aからg：増殖環の進行方向。EB：基本小体、RB：網様体、CB：三日月体。参考文献 1、Figure 3より引用
B. 原始クラミジアの形態学的な特徴を示す透過型電子顕微鏡像。左（a）：
ヒト上皮細胞 HEp-2 細胞に感染した病原性クラミジア（Chlamydia
pneumoniae TW183 株）とその封入体。感染後 72 時間。右（b, c）
：ア（c）
はP.
メーバに感染したParachlamydia acanthameobae 。三日月体
acanthaomebae の特徴と考えられているが、電顕固定時のアーチファクトの可能性も否定できない。一部の電顕写真は、私達の発表論文（Microbiology and Immunology, 54：63-73, 2010）より転用。

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図 3 FISHによる株化アメーバ内共生細菌の可視化
アメーバを固定後、アメーバ18SrRNA（緑）とクラミジアあるいはクラミジアを除く細菌 16SrRNA（赤）に特異的なプローブを用いてFISHを行い、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。参考文献 12, Figure 2 より引用、一部改変

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3. 原始クラミジアが共生するアメーバの株化と共生細菌の可視化や栄養分枯渇など生育環境の悪化に伴い耐久型シストに移行する。シストに移行した休眠状態のアメーバは分裂・増殖せず、代謝活性が極めて低い状態に維持さ既に述べたように原始クラミジアは、病原性クラミジアれているので、シストは偏性細胞内寄生性の環境クラミの適応進化を紐解く鍵になる有用なモデルにもかかわジアにとっても極めて過酷な環境であると考えられる。そらず、その宿主細胞への修飾機構は明らかになっていこで私達は、アメーバシスト内でもProtochlamydia R18ない。そこで私達は、土壌や河川水から41 株のアメーの生 存 性や感 染 性が維 持されているかどうか 検 討しバを株化し、共生細菌の有無を調査することから始めた。シスト移行後 1ヶ月間 4℃に放置したアメーバを復帰た。その結果、偏性細胞内寄生性の細菌が共生する5 株のアメーバ
株の樹 立に成 功し系 統 解 析の結果、そのうち 3 株に原 始クラミジア（NeochlamydiaとProtochlamydia）が共生していることをつきとめた 12）。
FISH による可視化からは、いずれの共生細菌もアメーバ細胞質に広く分 布していることが判 明した（図3）12）。樹 立したアメーバ内でのこれら原 始クラミジアの共 生 様 式は極 めて 興 味 深く、以 下 に 紹 介 する。原 始クラミジア Neochlamydia

図 4 原始クラミジアProtochlamydia R18はアメーバに再感染できるがNeochlamydia S13はできない。
（TEM）
上段：アメーバより取り出したNeochlamydia S13 のアメーバへの再感染後の透過型電子顕微鏡像。アメーバに侵入するが、その後の分裂増殖は認められない。
下段：アメーバより取り出したProtochlamydia R18 のアメーバへの再感染後の TEM 像。
参考文献 12, Figure 4 より引用、一部改変

S13とProtochlamydia R18 が共生するアメーバ株は土 壌ならびに河川水よりそれぞれ分離株化された。これらアメーバに共生するどちらの原始クラミジアも、アメーバから取り出すと24 時 間 以 内に死 滅した。興味深いことにアメーバより取り出された Protochlamydia R18 は容 易にアメーバへ 再 感 染したが、Neochlamydia S13 はアメーバに侵 入できるが 消 化されてしまい再感 染 の 成 立 は 確 認 できなかった（図 4）12）。このように他の原始クラミジア Protochlamydia R18に比べNeochlamydia S13 は進化の過程で、アメーバへの依存度が増したものと考えられる。
一 方、アメーバは、栄 養 分が豊富にある環境では活発に分裂増殖する栄養型として存在するが、乾燥

図 5 TEM 解析で観察されたアメーバシスト内の原始クラミジアProtochlamydia R18 の局在と栄養型に復帰したアメーバ細胞質での分裂増殖。
A. アメーバシスト内のProtochlamydia R18。E：基本小体 □は拡大（B）
B. シスト内共生細菌の微細構造。mt：ミトコンドリア（D）
C. 栄養型に復帰したアメーバ内のProtochlamydia R18。E：基本小体 R：網様体 □は拡大
D. 栄養型に復帰したアメーバ内共生細菌の微細構造。mt：ミトコンドリア

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させ菌数算定や FISH にてアメーバ 内 の Protochlamydia R18 の動態についてモニタリングした。その 結 果、シストから復 帰 後 のアメーバで菌 数の増 加 が 確 認されたことより、Protochlamydia R18がアメーバシスト内においても感染性を維 持しながら生 存できることが明らかになった（図 5）13）。このように Protochlamydia R18 にとってアメーバシストは土壌や河川水など自然環境中で普遍的に起こりうる激しい温度や栄養分の変化から身を守るためのシェルターとして機能し
図 6 Protochlamydia 除菌アメーバで観察された糸状仮足の異常発現。
Neochlamydia S13 除菌アメーバではこのような現象は観察されなかった。
参考文献 14、Figure 5より引用ている可能性がある。
4. 原始クラミジアProtochlamydia R18による宿主アメーバの運動能と発育スピードの制御
何故、アメーバは原始クラミジアの共生を許容したのだろうか。その理由を探るためにアメーバに共生する原始クラミジアを抗菌剤で除菌し無菌アメーバを樹立し、除菌前の親アメーバの発育スピードや運動能などの表現 型について比 較した。その 結 果、原 始クラミジア

無添加

スタウロスポリン添加

Protochlamydia R18 添加
図 7 Protochlamydia R18 刺激ヒト上皮細胞株 HEp-2 細胞はアポトーシスを誘導する。
Protochlamydia R18をMOI 90でHEp-2 細胞に添加し、24 時間後に、TUNEL 染色にて核酸の断片化を可視化した。緑はTUNEL 染色陽性のアポトーシス細胞。倍率：100 倍
参考文献 16、Figure 2 より引用、改変

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図 8 低温30℃培養条件下ヒト細胞株HEp-2細胞内で増殖するParachlamydiaBn9。
（30℃）
下で3日間培養し、HEp-2細胞にParachlamydia Bn9を添加し低温固定後、抗Parachlamydia ポリクローナル抗体で染色した. 標本は共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。緑：菌体 青：DAPI

原始クラミジアから紐解く病原体の細胞内生存戦略と制御

Protochlamydia R18を除菌したアメーバでは、アメー活性を阻害することで、アポトーシスからの回避を妨げバの増殖と運動能が顕著に低下し、再感染アメーバでるコンパウンドとして知られているが 17）、この薬剤添加は回復することを見つけた 14）。一方、除菌はアメーバのは Protochlamydia R18 によるアポトーシス誘導も顕著飲作用や貪食には影響を与えなかった。興味深いこに抑制した 18）。この結果は、病原性クラミジアと原始クとに Protochlamydia 除菌アメーバではアクチン再重合ラミジアがそれぞれ保有するCPAF の基質特異性が、の鈍化と異常な糸状仮足が観察され、共生細菌による進化の過程で大きく変化した可能性を示唆するものでアメーバの制御は、アメーバアクチン重合系の修飾を要あり極めて興味深い。

14）

求する可能性が示唆された（図 6） 。これらの現象は
14）

Neochlamydia S13共生アメーバでは見いだすことができなかった。このように、アメーバと共生する原始クラミジ

6. 原始クラミジア（Parachlamydia Bn9）の低温下でのヒト株化細胞 HEp-2 内不完全増殖

アとの間には極めて安定したしかも特異な共生様式が存在する可能性が示唆された。Protochlamydia R18

既に述べたように原始クラミジアは、37°C ではヒト株の共生は、アメーバが効率良く周囲の細菌を補食する化上皮細胞へ侵入できるが増殖できない。その一方、ことを可能とし、アメーバの生存性に大きな優位性を賦

低温下（30°C）で Parachlamydia Bn 9 は細胞に侵入し与している可能性が高い。一方、Neochlamydia S13

核周囲にて活発に分裂増殖できることを見つけた（図8）の除菌は、アメーバの増殖スピードを向上させた。予（未発表データ）。しかしながら原始クラミジアの成熟は想に反したこの結果はどのように解釈したら良いのだろ

不 完 全であり、周 辺 細 胞 への二 次 感 染は起こらないうか。私達はその理由を探るべく検討を進めている。

（未発表データ）。何故、低温下で原始クラミジアはヒト

14）細胞に侵入し不完全ながらも増殖できるようになるのだ
5. 原始クラミジアProtochlamydia R18によるヒト上皮系細胞株 HEp-2 細胞へのアポトーシス誘導

ろうか。クラミジアの細胞への侵入には III 型分泌装置を介して細胞質に打ち込まれるエフェクターTARP へのグアニンヌクレオチド交換因子（VAV）の結合を介した

私達は、通常の培養条件下において一部の原始クRho GTPase の活性化に伴うアクチン重合が必要であラミジア（Parachlamydia Bn 9 ）が株化ヒト細胞内で増る 19）。しかしながらいずれの原 始クラミジアゲノムにも殖できないことを見つけた 15）。何故、増殖できないのだ

TARP ホモログは存 在せず、未 知エフェクターとVAVろうか。その理由を明らかにすべく、Protochlamydiaの結合を介してアクチン重合が促進されている可能性

R18をヒト上皮細胞株 HEp-2 細胞に添加し細胞の修がある。また感染細胞の脂質を利用し成熟するクラミジ

飾 変 化について詳 細に解 析 することにした。その結アは、その菌体周囲に形成した“封入体膜”へ宿主細果、驚いたことに Protochlamydia R18 生 菌 刺 激は胞の CERT（脂質輸送蛋白）とSMS（スフィンゴ脂質合

HEp-2 細胞にアポトーシスを誘導した（図 7）16）。このア成酵素）を、エフェクターIncを巧みに利用し動員していポトーシス誘導は、アクチン重合阻害剤サイトカラシンDることが明らかにされた 20）。競合するエフェクターの存やカスパーゼ 3 阻害剤の添加で顕著に抑制された 16）。

在は脂 質の獲 得に障 害を与えている可 能 性がある。

その一方、細胞内での Protochlamydia R18 の増殖

現在 VAV、CERT、SMSと会合する菌体エフェクターは確認できなかった 16）。これらの結果は、このアポトー分子を原始クラミジアのゲノム情報を基に見つけだす

シス誘導には、Protochlamydia R18 の細胞内への侵作業を現在進めている。

入が不可欠であるが、菌体増殖に伴う代謝活性は要求しないことを示唆している。このアポトーシスを誘導するProtochlamydia R18 エフェクターとはどのような分

7. 今後の展望子なのだろうか。私達はそのヒントを既に見つけている。

病原性クラミジアは長い年月をかけ、感染細胞の監プロテオソーム阻害剤ラクタシスチンは病原性クラミジア

視ネットワークに捉えられ易い分子を捨てることで哺乳から分泌されるCPAF に結合し、CPAF のプロテアーゼ細胞への適応進化に成功したと考えられる。失った分THE CHEMICAL TIMES

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子を見つけその機能を紐解く作業は細胞寄生性病原

8）Scidmore-Carlson, M.A.; Shaw, E.I.; Dooley, C.A.; Fischer,体の細胞内生存戦略を理解する上で極めて興味深い

E.R.; Hackstadt, T. Molecular Microbiology. 1999, 33, 753-

研究の方向性であるが、失った分子を病原性クラミジ
ア自身から求めことはできない。そこで私達は独自に株化した原始クラミジアのエフェクター分子の機能解析からその手掛かりを探っている。幾つかの原始クラミジアのゲノム解読も並列して進めているが、ユニークなゲノム構造やその配列から蛋白・蛋白相互作用に関わるロイシンリッチリピートやアンキリンモチーフを含む機能未知の分子が多数同定されている。これら分子中にはクラミジアの進化を説明するものや、細胞内に侵入する病原体の制御に極めてクリティカルな機能を保有するものが含まれているものと期 待している。まだ研 究は始まったばかりである。
本研究プロジェクトは松尾淳司先生（北海道大学保健科学研究院）、中村眞二先生（順天堂大学医学研究科）、林田京子先生（北海道大学人獣共通感染症リサーチセンター）、杉 本 千 尋 先 生（北 海 道 大 学 人 獣共 通 感 染 症リサーチセンター）、黒田誠 先 生（国 立 感染症研究所）、関塚剛史先生（国立感染症研究所）、竹内史比古先生（国立感染症研究所）、永井宏樹先生（大阪大学微生物病研究所）との共同研究として進められています。また研究に関わってくれた多くの大学院生に深謝します。

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