SPring-8 理化学研究所播磨研究所ハイスループッ
トファクトリーにおける蛋白質大規模 X 線結晶構造解析にむけた取り組み
国島直樹
菅原光明

理化学研究所播磨研究所ハイスループットファクトリー

〒6795148 兵庫県佐用郡三日月町光都 1
1
1

理化学研究所播磨研究所ハイスループットファクトリー

〒6795148 兵庫県佐用郡三日月町光都 1
1
1

要旨
ヒトをはじめとする150以上の生物の遺伝子配列が解読されたが，それらの遺伝子機能の多くは未知である。構造ゲノ
ム科学の目的はタンパク質の基本構造を網羅的かつ系統的に解析することによりそのゲノム機能を明らかにすることである。近年，遺伝子産物であるタンパク質の構造と機能を網羅的に解き明かそうとする大規模プロジェクトが日米欧を中心とした世界各国で始まった。本稿では，SPring-8 キャンパスにある理化学研究所播磨研究所のハイスループットファク
トリーにおける高効率タンパク質 X 線結晶構造解析に向けた試みについて紹介する。

.

はじめに

.

蛋白質 X 線結晶構造解析は，高輝度で波長可変の放射構造ゲノム科学
近年150 を超える生物のゲノム情報が次々と解明される

光の利用と，検出器や計算機，解析ソフトなどの周辺技術中で， 2003 年 4 月およそ 30 億塩基対からなるヒトの全ゲの進歩により，回折能の高い良質な結晶が一つあれば，1ノム配列の完全解読が報告され遺伝子の数は32000前後で週間程度で構造決定ができるまでになった。しかし，ヒトあると推定された。しかし，ゲノム機能の大部分は依然とゲノムの配列完読の発表をうけて，約 1 万種類といわれして未知である。ポストゲノム研究の大きなテーマの一つ

る蛋白質の基本構造の解明を数年で達成しようとする構造

として遺伝子機能の発現主体であるタンパク質の全基本構

ゲノム科学プロジェクトが始まり，そのための作業の効率造を網羅的かつ体系的に解析し，ゲノム機能を解き明かそ

化，自動化を含めた新たな技術開発が世界各所の放射光施うと する構造 ゲノム科学 プロジェクト が提唱され た。

設や大学，研究機関，企業が参入して国際的な競争と協調

2000 年 6 月のヒトゲノムの概要配列の発表以来，推定さの下に進められている1)。世界最大規模の第 3 世代大型放れた 1 万種類の全基本構造の解明を目標に掲げて，世界射光施設 SPring-8 では， 1 日に多数の結晶の回折チェッ

各国で大規模プロジェクトが発足した。 2001 年 4 月に開クからデータ測定までを連続して自動で行うために理研構かれた第 2 回国際構造ゲノム会議において，構造ゲノム

造ゲノムビームライン（ BL26B1 /B2 ）が建設され，運用科学を国際的に協調して進める上で必要な合意がなされ，に向けた準備が進められているところである2)。理研播磨

ISGO （国際構造ゲノム科学機構）がスタートした（http:研究所ハイスループットファクトリーは，ビームラインを//www.isgo.org/）。

有効に活用するために，これまで手間と時間のかかってい理化学研究所においては，世界に先駆けて 1995 年に理た蛋白質試料の調製から結晶化および構造決定のプロセス

化学研究所が構造ゲノム/プロテオミクス研究としてをハイスループット（高効率）に行うための施設であり，NMR 及び X 線結晶解析によるタンパク質の立体構造とこれまでおもに耐熱性の細菌由来の安定な蛋白質をパイロ

機 能 を 解 析 す る プ ロ ジ ェ ク ト を 提 案 し ， 1997 年 か らットとして，多数の試料の処理を可能とする蛋白質の生産「タンパク質基本構造解明プロジェクト」（現横浜 GSCから結晶化および構造解析計算の効率のよいシステムの構

蛋白質構造機能研究グループ横山プロジェクトディ

築および各工程からの膨大な実験データの統合，整理を行

レ ク タ ー ， http: / / www.gsc.riken.go.jp / j / group /うハイスループットファクトリーデータベース（ HTPF 

themeproteinJ.html）が発足した。1999年には高度好熱菌

DB ）などのハードウェアおよびソフトウェアの自動化にをターゲットとしたストラクチュローム連携研究グループ

向けた開発を内外の研究機関および日本の企業数社と共同（倉光グループリーダー， http: //www.thermus.org ）がスでおこなってきた。 SPring-8 /理研構造ゲノムビームライ

タートした。2001年にこれらを融合する形で RSGI（理研ンと連動した一通りの流れができ，順調に稼働していると

構 造 ゲ ノ ム / プ ロ テ オ ミ ク ス 推 進 本 部  http: // www.

ころである3)。本稿では，理研ハイスループットファクト

rsgi.riken.go.jp /）が発足し，横浜研究所ゲノムサイエン

リーの大規模蛋白質結晶構造解析に向けた取り組みについスセンター（横浜 GSC ）と播磨研究所が協力してプロジて紹介したい。

ェクトを推進する体制となった4)。2002年に国の委託事業

May 2004 Vol.17 No.3 ● 135(C) 2004 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

である新世紀重点研究創生プラン（RR2002）の重要テー（ http: // www.htpf.harima.riken.jp, Table 1 ）。 今 後 は ，マとして，「我が国初のゲノム創薬の実現等を目指し，我ISGO （国際構造ゲノム科学機構）の基準に準拠した形でが国の研究機関の能力を結集して，平成 14 年度から 5 年

RSGI 全体のデータベースの中で進捗報告が行われる予定

間でタンパク質の全基本構造の1/3（約3000種）以上のタである。

ンパク質の構造およびその機能を解析し，特許化まで視野

蛋白 3000 プロジェクトが開始してから 2 年が経過し，に入れた研究開発を推進することを目的とする。」タンパ

設備や装置，データベースなどインフラの整備がほぼ整い

ク 3000 プロジェクトが理化学研究所と 7 大学研究機関につつあり，簡単なターゲットについては構造解析が容易によ っ て 開 始 さ れ た （ http: // www.mext.go.jp / b _ menu /なってきた。現在までの成果を維持する一方で，これまで

houdou/14/02/020213ha.htm）。

の体制を見直し，より解析困難なターゲットに挑戦してゆく技術開発も必要となる。内部の連携はもちろん，大学，.

ハイスループットファクトリー（HTPF）

ハイスループットファクトリー（ HTPF ）は 2001 年 4

研究機関，企業などとのよりいっそうの連携が重要である。

月に大型放射光施設 SPring-8 のキャンパス内にある播磨研究所にタンパク質の大量高速構造解析を目的として発足した（Fig. 1）。2002年からは RSGI（理研構造ゲノム/プ
ロテオミクス推進本部）の枠組みの中でタンパク 3000 プ
ロジェクト「タンパク質基本構造の網羅的解析プログラム」
を受託し， SPring-8 の強力な放射光を利用して X 線結晶解析によるタンパク質の立体構造決定をそのハイスループット化に必要な技術開発とあわせて進めている。これまでに，おもに高度好熱菌 Thermus thermophilus HB8 や超好熱古細菌 Pyrococcus Horikosii OT3 由来の蛋白質をターゲットとして，多数の蛋白質試料に対応した効率のよい遺伝
子発現から蛋白質精製までのプロセスの確立，全自動結晶化観察ロボットシステム「 TERA 」（ Fig. 2 ），迅速 X 線
蛋白質結晶評価装置（Fig. 3）の開発を行い，さらにそれらの過程で生じる大量のデータを整理するハイスループッ
トファクトリーデータベース「HTPFDB」などを構造ゲ
ノムビームラインと連携する形で開発整備し，運用を始めている。これらのシステム開発は，理研のノウハウと優れた技術をもつ日本の複数の企業の協力，共同研究開発によって進めている。各ターゲットについての発現ベクターのFigure 2. Full Automatic Protein Crystallization and Observation
Robot System ``TERA''.
There are three components; (1) liquid-handling robot for dispensing crystallization setup robot in the right of front, (2) microscopic
photo system with CCD camera and XY plate loader at the center offront, and (3) storage for 2,500 crystallization micro plates and 125
crystallization reagent plates in the back. Close-up views: parts ofthe microscopic photo system (bottom-center panel) and the crystallization robot (bottom-right panel). Upper right shows various protein crystals.

構築，タンパク質の発現，精製，結晶化， X 線回折，立体構造のモデリング，解析結果を PDB に登録といった進捗状況は月一回， HTPF DB の各データをもとに自動で更新 され ， HTPF の 公 式ホ ーム ペー ジ で公 開し て いる

Figure 1. RIKEN Highthroughput Factory at SPring-8.
At SPring-8 campus, we have been established an integrated highthroughput synchrotron radiation protein crystallographic facility as
RIKEN Highthroughput Factory including new development ofmany elements for the purpose in the early phase.

136 ● May 2004 Vol.17 No.3

Figure 3. in situ X-ray diŠractometer for protein crystal.
The system accepts the microbatch crystallization plate and canmeasure X-ray diŠraction of protein crystals without mounting. The
system consists of two major parts: optical microscope and X-ray
diŠraction parts.

生命科学特集 ■ ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄﾌｧｸﾄﾘｰにおける蛋白質大規模 X 線結晶構造解析にむけた取り組み

Table 1. The over-all tracking statistics of structural determination of the proteins from the thermophile bacteria, Thermus thermophilus HB8 and Pyrococcus horikoshii OT3 by January, 2004
T. thermophilus(HB8)

P. horikoshii(OT3)

Expressed

215

855

Soluble188

465

Puriˆed
Crystallized

170
90

214
64

DiŠraction quality Crystals
Native diŠraction data

79
58

51
24

Phasing51

19

Crystal structure
In PDB39
38

8
8Figure 4.

The crystallization protocol in HTPF.

モザイク度など結晶の結晶学的な質のチェックをおこな.

蛋白質の生産

X 線結晶構造解析の成否は生産されたタンパク質の性う。これらをすべてパスした結晶のみが結晶構造解析計算に使うための回折データセット収集の対象となる。また，

質に帰着されることもしばしばであるが，蛋白質の性質はこうした結晶評価の結果， X 線結晶構造解析に適さない

多種多様であり精製手順も様々である。多数の試料についと判定された時は，結晶化の再検討，時にはもう一度サンて特に X 線結晶構造解析で要求されるグレードの高純度

プルの発現精製段階にまでさかのぼって検討し直すこと

で大量のサンプルの自動調製は実質大変困難であり，もっになる。従来，これらの作業を 1 人の研究者が 1 つ 1 つとも人手と時間がかかる行程である。大規模かつ迅速にサのサンプルについて手作業で行なってきた。構造ゲノム科

ンプルを調製する様々な努力は，大腸菌高密度培養5)や無学では多数のサンプルに対応した標準的な結晶化プロトコ

細胞発現6) ，タグ付きタンパク質試料のワンステップ精ル，結晶化ドロップ，生成した結晶の質の評価基準を確立

製7)など各方面でなされているところである。HTPF におし，必要に応じて再検討することが重要である。

いては，おもに高度好熱菌と超高熱古細菌由来の安定な蛋

理化学研究所では HTPF で設定した標準的なプロトコ

白質試料を用いて，供与された大量発現ベクターのスモール（Fig. 4）に基づき結晶化分注および観察などの結晶化

ルスケールでの発現チェックから，大腸菌の発現系を用いスクリーニング作業を行なう全自動蛋白質結晶化観察ロボて培養から精製調製，結晶化に適した試料の分析までの，ットシステム「 TERA （テラ）」（ Fig. 2 ）を設計開発し効率のよいシステム構築を行ってきた。大腸菌の培養は発た8)。TERA はオイルマイクロバッチ法を採用した結晶化

現チェックの結果に応じて 2 L ～ 9 L の培地を用い，収量

分注ロボット，結晶化ウェル自動観察装置， 2,500 枚の結がほぼ一定になるようにしている。またいくつかの検討を晶化用プレートと125枚の試薬プレートの保管棚，各々の経て，収量の実績の高い精製プロトコルを標準化し，作業装置間を連携するロボットハンドをもつプレート搬送系ロの単純化をはかった。結晶化に用いる精製タンパク質試料

ボットからなるシステムである（Fig. 4）。

について，ネイティブ電気泳動や動的溶液光散乱測定，N

結晶化分注装置については，いくつかの既存の結晶化ロ

末単アミノ酸分析などにより，溶液中での蛋白質分子の物

ボットで実際に結晶化を行い検討した結果，動作が単純で理化学的均一性を確認して，結晶化の適否を判断しながら自動化に適している点，もっとも広く行われている蒸気平行っている（Fig. 4）。

衡法との比較対照実験より結果が良かったオイルマイクロ
バッチ法で結晶化を行う英国ダグラス社製の IMPAX1 5.

全自動結晶化観察ロボット「TERA」

蛋白質結晶化のプロセス（Fig. 4）は，X 線結晶構造解の機構9)を同社の了承を得て採用し，さらに分注精度と分注速度を向上させた（Fig. 2）。

析のプロセスの中でもっとも手間のかかる作業である。構結晶化スクリーニングは米国 Hampton Research 社10)

造解析に適した分解能の高い良質な結晶を得るためには，などの複数の市販されているスクリーニングキットから，数百から数千条件にも及ぶ結晶化条件をスクリーニングす

使用頻度の高い沈殿剤，緩衝剤，添加剤の条件を整理し，るため結晶化セットアップを行い，この結晶化ドロップの独自の初期スクリーニング条件を設定し効果のある条件を観察をする必要がある。回折測定が可能となる約 0.1 mm

取り入れて評価，見直しが行えるようにデザインしてい以上の単結晶が得られれば，この結晶を顕微鏡下で操作しる。代表的な沈殿剤および沈殿剤と添加剤の組み合わせて，グリセロールやオイルなどを含んだ抗凍結剤に浸した24 種類と pH 4.5～9.5までの 6 種類の緩衝剤を組み合わせ

のち，強力な放射光 X 線による損傷を低減するため，液た独自の144条件の 1 次スクリーニング，この初期結晶化

体窒素温度の気流中で瞬間凍結して X 線による回折能，スクリーニング条件のそれぞれに対応して各初期条件のMay 2004 Vol.17 No.3 ● 137

pH と沈殿剤濃度をわずかに変化させた近傍の24条件を第結晶化の観察は，数百から数千条件にもおよぶ結晶化セ

2 ステップスクリーニングの展開用結晶化条件セットとしットアップの定期的な観察および評価を行う結晶化実験のて 3456 条件，結晶の質の改善に効果のあるとされる添加なかで最も人手がかかる作業である。結晶化ドロップの顕剤スクリーニングを 48 条件とした。これらの試薬は全部微鏡からの像は観察者が判定を行なえる鮮明な画像イメー

で約 3,500 種類にも及び，人手による試薬作業では時間とジとして自動撮影する倒立型顕微鏡に XYZ ステージと労力を要するばかりでなくミスや誤差の恐れも大きいの

CCD カメラを搭載した結晶化ドロップ観察装置を開発導で，市販の試薬分注ロボットを利用した試薬調製法を確立入した（Fig. 2 ）。この装置による結晶化用プレートの結し，ひとりのスッタフがすべての溶液を 2～3 日で調製可晶化ドロップ写真は複数の画像を自動再構成し，結晶がド能である。全結晶化試薬は 1 ヶ月ですべて交換する。

ロップのどの位置に成長しても鮮明となる。蛋白質の結晶

Figure 5.

Figure 6.

138 ● May 2004 Vol.17 No.3

The score for the evaluation of crystallization setting.

Observation of crystallization setting on the web browser of HTPFDB.

生命科学特集 ■ ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄﾌｧｸﾄﾘｰにおける蛋白質大規模 X 線結晶構造解析にむけた取り組み

化ドロップはさまざまな色形をした沈殿，非晶質の凝集

大なデータが自動的に電子記録されるので，必要なデータ

物および結晶性の沈殿物やそれらの組み合わさった複雑なをすぐにアクセスして利用できるように整備を進めてい様相を呈するので，実験記録は煩雑で，統一をしておかな

る。今後，蓄積した結晶化ウェルの写真を使って画像処理

いと実験記録の間で比較不能となり，データの整理さえ困による特徴量抽出などの手法を使って自動判定ソフトウェ難になる。そこで，評価観察者の判別のしやすさに留意しアの開発や蓄積される実験データをもとに蛋白質結晶化率

た上で，結晶化ドロップ中に典型的に現われる様相を 0

の向上を目指したい。

透明，1～3沈殿（茶色，白色，透明），4非晶質の粒，5大きさ50 mm 以下の微結晶，6 針状，板状結晶，7.

迅速 X 線結晶評価装置

結晶のクラスター，8, 950 mm 以上の 3 次元単結晶の10

結晶の評価は実際に X 線を照射し，回折能により判断段階とした独自の判定基準を設定した（ Fig. 5 ）。現在，

しなければならない。放射光での測定には凍結した結晶をTERA はパソコンのコンソールから各構成ユニットを一用いるが，このためには結晶化プレートのウェルから顕微括管理し，初期から 3 次スクリーニングまでの結晶化作

鏡下で一つ一つ結晶を取り出さなければならない。このた業，結晶化ドロップの状態の経時変化を自動的に画像イ

めの抗凍結剤の種類や濃度などの条件により，結晶が損傷メージとして定期的に撮影保存できる結晶観察作業をスケすることもしばしばであり，結晶化プレートに生成した状

ジュール化して実行できる。全自動結晶化システムからの態で の結晶の 評価は作業 の効率化に大 変重要であ る。

あらゆる情報はハイスループットファクトリー全体の実験

HTPF では迅速 X 線結晶評価装置を理学電気と共同で開データベースに自動的に保存され，観察者はインターネッ

発した（Fig. 7 ）。このシステムによりマイクロバッチ用

トを通じて web ブラウザーから結晶化作業の要求や結晶の結晶化プレート中の結晶を取り出さずに X 線回折チェ

化ドロップの観察画像の判定を随時行なうことができるックを行うことが出来る。迅速 X 線結晶評価装置は紫外（Fig. 6）。

線光学顕微鏡と X 線回折装置の 2 つの部分で構成されて

全自動蛋白質結晶化観察ロボットの導入によって，いおり，蛋白質の結晶は紫外線照射により蛍光を発するのままで手作業で行なっていた結晶化作業，結晶観察作業がで，顕微鏡の画像により蛋白質の結晶かどうかの確認とそ

24 時間自動で行なえるようになり，大幅に作業の効率との位置を CCD カメラからの画像を解析することにより決結晶化の再現性が上がった。現在の TERA の作業速度か定 す る 。 X 線 発 生 源 と し て CuKa 線 よ り 波 長 の 短 いら，僅か数人で年間千以上の試料の結晶化作業が可能とな

MoKa 線を用いプラスチックのプレートと結晶化母液にった。さらに，結晶化作業の履歴，結晶化ドロップの観察

よる X 線の吸収を抑えている。 X 線回折装置の X 線源と画像など結晶化作業をするうえで扱わなければならない膨CCD 検出器は垂直方向に配置され，結晶は XYZ ステー

Figure 7.

The view showing a frame format of work ‰ow in HTPF.

May 2004 Vol.17 No.3 ● 139

ジ上で自動的に X 線に当たるように配置され，静止あるる程度尊重しなくてはならない。ハイスループットファク

いは振動写真の撮影が可能である。この装置により迅速にトリーでは，これらの要求を満たすための実験フォーマッ

分解能などの評価を行い，質のよい結晶を選別して凍結トの確立を行った。実験フォーマットは，回折予備実験

し，ビームラインでの測定に用いている。現在はまだテス（Preliminary experiment）回折データ（Data set）位相

ト段階であり，一月に迅速結晶評価装置により約250個の付け（Phasing）モデル構築および精密化（Model build-

結晶をチェックし，ビームラインで約120 個の結晶のチェ

ing and reˆnement）モデル確認（Model check）最終

ックおよびデータ測定を行い検討している。

報告（ Final report ）の 6 種類から構成され，各研究者に実験法の画一化を強いることなく解析情報の標準化ができ

.

X 線結晶構造解析

るよう工夫されている。さらに，解析進捗の把握を正確に高分解能の非常によいデータがあれば Tom Terwilliger

行うための進捗報告フォーマットも用意されており，各解が開発した SOLVE / RESOLVE11) などのソフトウェアに析担当者から毎月提出されファイルされている。これらのよって構造構築まではほぼ自動的に行えるようになった。

フォーマットは実験データベースに組み込まれた形で構造

しかし多くの場合，電子密度図に立ち返った全域にわたる

解析のインフラとして利用されており，解析担当者にとっタンパク質構造の精密化と決定された構造の評価はまだまて欠くべからざるものになっている（ Fig. 8 ）。これまでだ時間のかかる段階であり，経験が必要なところである。

の技術開発により，蛋白質結晶の回折チェックから PDB精密化したタンパク質の立体構造の評価は複数の構造正当登録までの解析情報の規格化がほぼ実現したといえる。こ性のチェックをするソフトウェアを使って総合的に行うべ

れからは蓄積されたデータをいかに効率化に結びつけるかきである。結晶化から回折データの再収集など実験の継を考える必要があるが，一つには，標準化された解析手順

続，部分構造モデル構築，イメージ処理や位相改良などのをスクリプトにより自動化することが挙げられる。この解多くの結晶解析ソフトウェアをうまく組み合わせた具体的析標準スクリプトの開発により，経験の浅い担当者でも正実験経験と結晶構造解析的センスが構造解析の成功には必しい手順で解析ができるようになることに加え，手順が標須である。蓄積したノウハウをアルゴリズム化することで準化されていることから指導者による助言が容易になると自動化が可能となる。

期待される。もう一つには，解析プロトコルを改善するた

大規模な構造解析を効率良く行うためには，解析結果かめのデータマイニングツールの開発が挙げられる。現在，ら有用な統計的情報が容易に抽出できることや，解析担当

蛋白質のアミノ酸配列を入力すると試すべき重原子化法が者が変わった時の実験データ引継ぎが容易なこと等が要求

優先順位付きで出力されるシステムの開発を進めている。

される。そのためには，各研究者の実験情報を一定の客観解析された結晶構造を学術論文特許創薬などに結び的なフォーマットで常時管理することが必要である。一つけるための基盤整備もまた，タンパク 3000 プロジェク

方，研究の活性化のためには，各研究者の個別の手法をあトの重要な目的である。構造と機能の関係を明らかにする

Figure 8.

140 ● May 2004 Vol.17 No.3

Experimental database for structural analysis in HTPFDB.

生命科学特集 ■ ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄﾌｧｸﾄﾘｰにおける蛋白質大規模 X 線結晶構造解析にむけた取り組み

ボット TERA8)を用いて試みたところ，リガンドなしのもの と は全 く 異な る 条件 で 2 種 類 の複 合 体結 晶 が 得ら れた。また， TERA を用いて得られた 3 つの異なる結晶型の結晶構造比較から，本酵素がリガンドなしの状態では様々な形を取り得ることが示された。このようなリガンド添加を含む膨大な結晶化条件の検討は， TERA を用いれば比較的手軽に行うことができる。これらの情報に基づき，反応機構を含む本酵素の詳細な構造機能相関について考察することができた。また，本蛋白質が塩素イオンを結合していることを利用し，新しいタイプの塩素イオンキレート剤の開発法に関する特許を出願した（特願2003
050153）。

Figure 9. Ribbon diagram of the crystal structure of PaaI
homotetramer from Thermus thermophilus HB8 (TT0310/
HTPF00044) in hexanoyl-CoA liganded form.

.

ハイスループットファクトリーデータベース（HTPF
DB）

複数の研究グループが共同で網羅的研究を推し進めるには，進行状況などの情報を正確にかつリアルタイムに共有してゆく必要がある。また，研究過程で生産される膨大なための機能研究の取り組みの例として，以下に Thermus

実験データの蓄積はこれまでに得られなかった多面的な情

thermophilus HB8 由来プロジェクトコード310番蛋白質の報を含んでおり，それ自体として価値がある。複数のデー構造解析について紹介する。本蛋白質の構造解析はいろい

タベースを統合した研究情報管理利用システムとしてろな意味でハイスループットファクトリーにおけるモデル

HTPF DB の設計開発を日立ソフトウェアエンジニアリ

ケースとなっており，これまで述べた効率化の試みの多く

株 との共同研究により行ってきた。 HTPF では，各
ングはこの解析例に基づいて行われている。また，我々はこれグループ間でデータ共有，交換や情報の一元管理のため

ら機能解析の作業も標準化効率化する必要があると考えに，そのレポートのフォーマットを統一化している。タンている。具体的には，論文作成や特許出願の際に必要な構パク質は各々に性質が大きく異なり，個別に最適な実験方

造評価基礎データの標準化を現在進めており，近い将来自法や条件を選択する必要があるため，画一的なデータベー動化を行う予定である。

ス化が非常に困難であるので，データベースには変更拡張

310 番蛋白質は， paa 遺伝子群によってコードされる一に柔軟に対応できる画面インターフェースの自動生成と木連のフェニル酢酸分解関連蛋白質のうちの機能未知蛋白質

構造による動的モデルとモデルからのユーザインタフェー

PaaI である12)。本蛋白質の結晶構造は，セレノメチオニ

スの自動構築を採用した。HTPFDB は，基礎 DB，プラン 化 蛋 白 質 結 晶 を 利 用 し た MAD 法 に よ り 決 定 さ れ た

スミド DB，培養 DB，精製 DB，サンプル DB ，自動結晶（ Fig. 9 ）。分子モデルは 2.3 Å 分解能の初期電子密度図を化観察ロボットシステムと連携した結晶 DB ，構造ゲノム

もとにプログラム ARP /wARP13)を用いて自動構築され，ビームラインからの回折 DB ，解析 DB の 8 つから成り立

最終的に1.7 Å 分解能で精密化された。構造解析自体にかっており，DB 利用ツールとして mmCIF 登録ツールがあかった時間は 1 週間以内であり，それ以後のほぼ 1 年間る。

は機能解析に費やされた。まず，プログラム MATRAS14)を用いて構造既知蛋白質との構造比較を行ったところ，

.

おわりに

hotdog fold 蛋白質と呼ばれるコエンザイム A 関連酵素群

これまで述べたように，蛋白質結晶構造解析の高速化のとの構造類似性が見出された。このプログラムはハイス

ためには，構造解析のそのものの効率化に加え，得られたループットファクトリー内のデータベースを利用してお立体構造を評価するための機能解析環境も効率化する必要

り，外部へのデータ漏洩の心配なく構造検索ができる。次がある。今後，横浜研究所や内外の研究機関，企業と協力に，この結果に基づき，各種アシルコエンザイム A を用して，応用上重要なヒト，マウスなどの高等生物由来のタ

いた酵素学的解析を行った。その結果，本蛋白質はフェニ

ンパク質の 3 次元構造解析によって生命現象を理解する

ルアセチル CoA に特異的な加水分解酵素であることが示

基礎的情報を得て，創薬など応用分野への貢献を視野に入唆された。さらに，活性部位周辺のアミノ酸残基の部位特れて研究を進めていく方向である。そのために必要な装置

異的変異体 8 種類をハイスループットファクトリー内でや技術の開発や理研のもつ情報を企業が利用できるために作成し，それらの酵素学的解析を行った結果，本酵素の活必要な制度として，理化学研究所では融合的産業界連携制

性残基 Asp48 が同定された。次に，リガンドであるコエ度（ http: // www.riken.go.jp / r-world / info / release / press /ンザイム A 誘導体との複合体の結晶化を，自動結晶化ロ2004 / 040216 / index.html ）や理研パートナー制度（ http:May 2004 Vol.17 No.3 ● 141

// www.rsgi.riken.go.jp / partner / index.html ）等の法整備も進められているところである。現在ハイスループットフ

7)ァクトリーでは年間 50 構造を解析できるが，これら効率化のための技術開発を通じて，より経験の浅い人員でより多くの構造解析ができるようにしていきたい。 2007 年に

8)タンパク 3000 プロジェクトが終了した時には構造解析の9)

専門家でない研究者が手軽に蛋白質結晶構造解析を行えるようになっているよう願いつつ我々は作業を進めている。
10)

謝辞
本稿に記述した高度好熱菌由来サンプルの発現ベクターは倉光成紀，横山茂之両プロジェクトディレクターをはじ11)めとするストラクチュローム研究グループから供与され，超好熱古細菌由来サンプルの発現ベクターは林崎良英グ

12)

ループディレクターの横浜 GSC 遺伝子構造機能研究グ
ループにより作成された。理研構造ゲノムビームラインの建設および運用は X 線干渉光学研究室の山本雅貴副主任

13)

研究員，石川哲也主任研究員によってなされたものである。試料の調製および分析，構造解析は，飯塚哲太郎播磨研所長，宮野雅司ファクトリー長のもとでハイスループッ
トファクトリーのタヒールタヒロフ，湯谷克英の各チーム
リーダー，瀧尾擴士上級研究員をはじめとするメンバーに

14)

Biochem (Tokyo) 110, 166 (1991).
J. A. Sigrell, P. Eklund, M. Galin, I. Hedkvist, P. Liljedahl,
C. M. Johansson, T. Pless and K. Torstenson: Automatedmulti-dimensional puriˆcation of tagged proteins. J Struct
Funct Genomics 4, 109 (2003).
菅原光明，宮野雅司ハイスループット自動結晶化観察システムの開発，蛋白質核酸酵素 47, 1026 (2002).
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著者紹介

よってなされたものである。また，装置の開発と実際の運国島直樹

用は HTPF ，理研播磨研究所，大型放射光施設 SPring-8

理化学研究所播磨研究所ハイスループの研究，支援スタッフにより行なわれた。 TERA の開発

ットファクトリー構造解析第一チームには竹田理化工業，エステック，アドバンソフト，迅速E-mail: kunisima＠spring8.or.jp

X 線蛋白質結晶評価装置の開発および構造ゲノムビーム

専門X 線結晶構造解析

ラインの運転にはリガク， HTPF DB の開発には日立ソフトウェアエンジニアリングの企業各社との共同研究により進めてきた。ここに述べた多くの方々をはじめ SPring-

略歴

8 および理研の関係者の方々に深く感謝の意を表したい。

1994年

大阪大学大学院博士課程修了

2001年まで

株 生物分子工学研究所


参考文献

現在まで

1)

チームリーダー

2)

3)

4)

5)

6)

R. F. Service: Structural genomics. Tapping DNA for structures produces a trickle, Science 298, 948 (2002).
山本雅貴，後藤俊治，竹下邦和，石川哲也構造ゲノム
ビームライン（BL26B1/B2 ）の計画，SPring-8 利用者情報
6, 202 (2001).
宮野雅司，菅原光明，山本雅貴タンパク質の大規模結晶
構造解析または，ハイスループットということ，日本結晶学会誌 45, 267 (2003).
S. Yokoyama, H. Hirota, T. Kigawa, T. Yabuki, M.
Shirouzu, T. Terada, Y. Ito, Y. Matsuo, Y. Kuroda, Y.
Nishimura, Y. Kyogoku, K. Miki, R. Masui and S.
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T. Kigawa and S. Yokoyama: A continuous cell-free protein
synthesis system for coupled transcription-translation. J

142 ● May 2004 Vol.17 No.3

博士（理学）
研究員

理化学研究所ハイスループットファクトリー

菅原光明
理化学研究所播磨研究所

構造生物物

理研究室ハイスループットファクト
リー結晶化チーム
E-mail: sugah＠spring8.or.jp
専門構造生物学 X 線結晶構造解
析
略歴

2000年

大阪大学大学院博士課程修了

2000年

理化学研究所播磨研究所

基礎科学特別研究員

2002年

理化学研究所播磨研究所

研究員

2003 年

理 化学 研 究所 ハイ ス ルー プッ ト ファ ク トリ ー

博士（理学）

チームリーダー（兼任）現在に至る

生命科学特集 ■ ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄﾌｧｸﾄﾘｰにおける蛋白質大規模 X 線結晶構造解析にむけた取り組み

The EŠorts toward High-throughput Protein X-ray Crystallography inHighthroughput Factory, SPring-8/RIKEN Harima instituteNaoki KUNISHIMA
Mitsuaki SUGAHARA

Highthroughput Factory, RIKEN/SPring-8,111 Koto, Mikazuki-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, JAPANHighthroughput Factory, RIKEN/SPring-8,111 Koto, Mikazuki-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, JAPAN

Abstract
Although genome sequences of over 150 bio-organisms including human-being are being rapidly determined,
most of their genome functions are unknown. The goal of structural genomics is to bring out the genome functions
by analyzing cyclopedically and systematically all of the protein basic structures. Now a lot of people are making
every eŠort to solve all structures and functions of the existing proteins as gene product by every means imaginable. Here we introduce some trials including technological development toward the high-throughput protein X-ray
crystallography in our Highthroughput Factory, Spring-8/RIKEN Harima institute.

May 2004 Vol.17 No.3 ● 143