平成13年度〔2001〕№46
宮崎県工業技術センター・宮崎県食品開発センター研究報告

Aspergillus kawachii の脂質代謝関連酵素に関する検討＊
工藤哲三＊１・水谷政美＊１・本部恭平＊２・太田一良＊３

Lipase Production by Aspergillus kawachii
Tetsuzo KUDO, Masami MIZUTANI, Kyouhei HONBU and Kazuyoshi OHTA
焼酎製造における脂肪酸エチル生成には、こうじ菌の生産する酵素リパーゼが関与し、グリセライドからの遊離脂肪酸の生成と、その脂肪酸とエタノールから逆合成反応により脂肪酸エチルが生成されると推定された。そこで、焼酎製造用こうじ菌Aspergillus kawachiiの生産するリパーゼについて、２, ３検討した。こうじ菌リパーゼの抽出には、40％エタノールを含むpH5.0のM 10酢酸緩衝液（含0.5％NaCl）が有効であった。リパーゼの至適pHは、pH4.15と6.32に二つ存在し、少なくとも2種類のリパーゼが存在すると考えられた。米と大麦を使ったこうじ製造工程における酵素活性を比較したところ、麦こうじの方が、酸性領域でのリパーゼ活性が高かった。
キーワード：焼酎、こうじ、リパーゼ、Aspergillus kawachii
１ はじめにそこで、焼酎用麹菌として使用されているAsper-

蒸留酒である焼酎の製造においては、原料に由来する脂肪酸が、もろみ中でエタノールと結合しgillus kawachiiのリパーゼ生産について２、３の検討をおこなった。てエチルエステルとなり、エチルアルコールとともに留出してくる。この脂肪酸エチルのうち、不飽

２

実験方法

和脂肪酸であるリノール酸エチルは、原酒貯蔵中

２−１

モデル発酵系での脂肪酸エチル生成に酸化分解を受け、油臭の原因物質であるアゼラ

発酵過程における脂肪酸エチル生成の主な要因

イン酸セミアルデヒド（OHC（CH２）７ COOC２ H５ ）を確認するため、以下の２つのモデル発酵系を設やヘキサナール（CH３（CH２）４ CHO）が生成して、定して脂肪酸エチル生成量を比較した。

１,２）

製品劣化を引き起こす要因となる。そのため

２−１−１

こうじ抽出液無添加試験器

脂肪酸エチルの大部分は、貯蔵前に冷却ろ過等にYPD培地100ml（グルコース15％，酵母エキスよる除去工程が必要となる。この脂肪酸エチルの１％， ペプトン２％）に焼酎酵母１mlと５mM生成においては、まずこうじ菌のリパーゼ等によのパルミチン酸を加えて28℃，3日間培養後、脂り原料由来のトリグリセライドから遊離の脂肪酸肪酸エチル生成量を調べた。培養液にはあらかじが生成され、もろみ中のエタノールが遊離脂肪酸め加圧滅菌したセルロースパウダー（100〜200メッに結合してエステルが生成していくと推察されシュ）を分散剤として１％加えた。パルミチン酸13）

る 。このこうじ菌の生成するリパーゼについてのかわりにトリパルミチンを加えた系についてもは、脂肪酸エチルの生成のみならず、発酵過程に同様に脂肪酸エチル生成量を調べた。

おいて重要な役割をはたしていると考えられる。

２−１−２＊ 食品微生物の遺伝子解析とその研究＊１ 応用微生物部＊２ 霧島酒造㈱＊３ 宮崎大学

こうじ抽出液添加試験区

pH5.0の0.1M酢酸バッファー20mlに、 麹抽出液７ml（0.4 フィルターろ過）、エタノール10ｍl及びセルロースパウダー1gを加え、これにパルミチン酸もしくはトリパルミチンを添加して脂肪159

Aspergillus kawachiiの脂質代謝関連酵素に関する検討

酸エチル生成量を調べた。試験においては、対照量を求めた。対照区は酵素液を加えないで同様にとして加熱処理したこうじ抽出液についても生成処理後、アセトン・エタノール混液を添加後に酵量を調べた。

素液を加えた。活性は１分間あたりに遊離する脂２−２肪酸量

発酵過程における脂肪酸エチルの測定

発酵過程における脂肪酸エチル生成量を調べるため、以下の原料配合で発酵試験を行った。一次（U＝ mol min）で表示した。
２−４

パルミトイルセルロースの調製

もろみは、米こうじ300g （原料米250g相当）にHoriutiら10） の方法に従い、３gの脱脂綿ある水309g、焼酎酵母５mlを加えて、28℃、5日間発

いはガーゼを40mlの脱水ピ リジン中で10mlの酵さ せ 、 ２次 も ろみ は 一次 発 酵終 了 もろ み にpalmitoyl chlorideと30℃、10時間反応させた。

1,257gの甘藷（澱粉価30.4）と水608gを加えて28℃

反応液を200mlのクロロホルム:エタノール＝１:で発酵させ、炭酸ガス減量値による発酵経過と、１で洗浄し、さらに２回100mlのエタノールで洗脂肪酸エチル、遊離脂肪酸及びグリセライドの経浄後ろ過して、50℃で乾燥させ、粗酵素液からの時変化を調べた。

リパーゼの濃縮試験に用いた。

トリ、ジ、モノグリセライド，遊離脂肪酸，脂２−５

こうじ製造工程における諸酵素の測定

肪酸エチルの分離定量には、薄層クロマトグラフィ−

こうじ製造過程における酵素生産とその活性ので分離したスポットを、水素炎イオン化検出装置

経時変化を調べるために、精白米10kg及び大麦で 検 出 定 量 し て い く イ ア ト ロ ス キ ャ ン MK- ５10kgを用いて常法により、米、麦こうじを調製（TLC FID）（ヤトロン㈱）を用いた。脂質は10〜した。種菌は白麹菌（河内源一郎商店㈱）を用い、20gの試料を凍結乾燥後、クロロホルム：メタノー

経時的にサンプリングを行い、水分、酸度、グルル＝２：１（v v））で抽出した。展開溶媒はヘキ

コアミラーゼ、耐酸性 -アミラーゼ、酸性プロ

サン：エーテル：酢酸＝90：10：１（v v v）を用

テーアゼ、カルボキシペプチダーゼ及びリパーゼ

い、この溶媒組成では分離できないトリグリセラ活性を測定した。測定方法は、おおむね国税庁所

イドとモノグリセライドの分離にはヘキサン：エー

定分析法３） にしたがったが、リパーゼについてテル：酢酸＝70：30：１（v v v）を用いた。

は、以下に述べる方法によりpH3.8、pH7.0にお２−３ける同活性を測定した。

こうじにおけるリパーゼの抽出および活性測定法の検討

こうじの諸酵素を調べるときに用いる抽出用pH5.0のM 10酢酸緩衝液（含0.5％NaCl）を用いた３結果及び考察３−１

モデル発酵系におけるエステル生成

ところ、リパーゼ活性は検出されなかったので、酵母培養用培地に遊離脂肪酸、トリグリセライホモジナイザー（ポリトロン、モデルPT10 35 :ドを加えたモデル系での脂肪酸エチル生成量はセントラル科学貿易㈱）により、こうじを微粉砕

１mg l以下と微量であった。一方、0.4 mのフィ後、エタノールを0〜50％含む同酢酸緩衝液で抽ルターろ過したこうじ抽出液６mlに、トリパル出した。

ミチン500ppmとエタノールを10％加え30℃，72

リパーゼ活性の測定には滴定法を用い、中性域時間の反応で、 32ppmのパルミチン酸エチルがと酸性域における活性を調べた。PVAを乳化剤生成した（図１）。この結果から、焼酎もろみ中として調製したオリーブ油乳液5mlとリン酸緩衝

では、トリグリセライド→遊離脂肪酸→脂肪酸エ液（pH3.8及びpH7.0）４ml、酵素液１mlを50ml

チルという、グリセライドからの脂肪酸生成と同容共栓付三角フラスコ中でよく混合し、30℃で50時に、リパーゼによるエタノールと脂肪酸からの分間反応させた。アセトン・エタノール混液20m

エステル合成が、同時進行していると考えられlを加えて反応を停止させ、フェノールフタレイ

た４、12）。

ンを加え、N 20 NaOH溶液を一定量添加後、窒素気流下でN 20 HClを用いて滴定し遊離脂肪酸160

Aspergillus kawachiiの脂質代謝関連酵素に関する検討

二次もろみ においては、図３に示すようにパルミチン酸エチルなどは減少傾向にあった。
このことは、リパーゼの油脂に対する分解反応は絶えず逆反応を伴い、遊離脂肪酸と脂肪酸のエステル化反応が可逆的な反応であることから、もろみ中においてエチルエステルの分解、合成が常におこり、エタノール濃度や、温度等の諸条件により生成量に変化が生じると考えられた。図４には、イアトロスキャンで測定した一次もろみの発酵過程におけるトリグリセライド、脂肪酸エチル等の変化を示した。一次もろみ発酵開始時には
脂肪 酸エチルはほとんど検出できないが、24時
間後 には脂肪酸エチル生成が確認でき、発酵終実験条件
１ 遊離脂肪酸添加、こうじ抽出液無添加
２ 遊離脂肪酸、こうじ抽出液添加
３ トリグリセライド、こうじ抽出液添加
図１

こうじ抽出液が脂肪酸エチル生成に与える影響

３−２

もろみ製造工程における脂肪酸エチル生成了時まで増加傾向にあった。一方、遊離脂肪酸は減少傾向にあり、ジグリセライドはほとんど検出されず、モノグリセライドも発酵期間を通じてわずかな検出量であった。

米麹に水と酵母を加えて一次もろみをつくり、これに甘藷を加えて二次もろみを調製し、脂肪酸エチルの生成状況を調べた。一次もろみでは、オレイン酸、リノール酸及びパルミチン酸の 各エチル エステルは発酵の進行とともに増加していった（図２）。

図３

二次もろみにおける脂肪酸エチルの変化

３−３

こうじ菌の生産するリパーゼ活性の測定法に関する検討

こうじ菌の生産する酵素群は、一般にpH5.0のM 10酢酸緩衝液（含0.5％NaCl）により，容易に抽出できるが、リパーゼ活性は同抽出液では見出せなかった。そこで、ホモジナイザーによる微粉砕後、エタノールを０〜50％含む同酢酸緩衝液で３℃、14時間抽出し、リパーゼ活性を調べた。
図２

一次もろみにおける脂肪酸エチルの変化
161

Aspergillus kawachiiの脂質代謝関連酵素に関する検討

図５

酵素抽出液のエタノール濃度がリパーゼ活性に与える影響

その結果を図５に示す。活性測定は30℃，140
分反応後、反応を停止し、 10mlのN 20 NaOHを加え、窒素気流下でN 20 HClによる逆滴定法で行った。その結果、ホモジナイズした試料を用いた場合、抽出液中のエタノール濃度が高くなるにつれリパーゼ活性が上昇し、40％の時に最大となり、50％では低下してきた。ホモジナイズ処理をしない試料でも、抽出液のエタノール濃度が高まる程活性はあがっていくがホモジナイズ処理をした試料より活性は低かった。以後、エタノール濃度40％の抽出液を用いることにした。また、リパーゼ活性に与えるpHの影響を調べたところ、pH4.15付近の酸性域とpH6.32の中性域に高い活性が見られ、少なくとも２種類のリパーゼの存在が考えられた。
３−４

こうじ製造工程における酵素活性の変化

大麦及び米による総原料重量10kgでこうじを製造し、諸酵素の生成状況を調べた。図７に大麦
こうじにおける水分含量の変化と酸の生成状況を、
図８に大麦こうじの糖化酵素、 図９には蛋白分解関連酵素を、そして図10には、米こうじと麦こ
a：トリグリセライド b：シグリセライド
c：モノグリセライド d：遊離脂肪酸
e：脂肪酸エチルエステル
図４

一次もろみにおける脂質の変化

うじの酸性域と中性域のリパーゼ活性を示した。
Aspergillus kawachiiのグルコアミラーゼや アミラーゼについては、 Aspergillus oryzeに比較して耐酸性が高いことが報告されている14） が、リパーゼについても、pH3.8で活性が高いことな

162

Aspergillus kawachiiの脂質代謝関連酵素に関する検討

どから、耐酸性を有しているものと考えられる。
大麦こうじの方が、酸性域のリパーゼ活性がかなり高かった。中性域では米こうじのリパーゼ活性の方が高くなった。また、パルミトイルセルロー
スのリパーゼへの親和性を利用して吸着させ、トリトンX-100等に溶出することにより、こうじ菌リパーゼは容易に 濃縮できた。
すでにAspergillus oryzeについては２種類のリパーゼが単離、精製及びクローニングされており５,６,12）、 Aspergillus kawachiiの近縁種である
Aspergillus nigerでは、膜結合性のリパーゼ６）や耐酸性リパーゼ７，８）あるいは耐熱性のリパーゼ９）の存在が指摘されている。クエン酸酸性下で発酵が進行する焼酎もろみにおいては、耐酸性を有す

図８

こうじ製造工程における糖化酵素の生成

リパーゼ活性のpHによる変化

図９

こうじ製造工程における蛋白分解酵素の生成

麦こうじ製造工程における酸の生成及び水分含量の変化

図10

こうじ製造工程におけるリパーゼの生成

るリパーゼが活性を保持して機能しているのではないかと考えられる。今後、こうじ菌リパーゼの酵素化学的諸性質の解析や、リパーゼ遺伝子のこうじ製造工程における発現等について解明したい。

図６

図７163

Aspergillus kawachiiの脂質代謝関連酵素に関する検討

Nakazawa ： FEMS

要約
脂肪酸エチル生成に関与するこうじ菌のリパーゼについて 検討し以下のような結果を得た。
甘藷製もろみにおける脂肪酸エチル生成は、Microbiology

Letters,126, 145〜150（1995）
７）Akio Sugihara, Yuji Shimada, Yoshio
Tominaga：J. Agri. Biol. Chem, 1591〜1592

一次もろみでは増大し、二次もろみでは幾分減（1988）

少傾向にあった。

８）K. Torossian，A．W．Bell：Biotechnology

リパーゼの抽出にはエタノール40％を含む緩Applied Biochemistry, 13, 205〜211（1991）

衝液の使用とホモジナイズ処理が有効であった。

９）Variketta ， M. Haridasan Namboodiri ，

リパーゼ活性はpH4.15とpH6.32での活性がRajagopal Chattopadhyaya：Lipids，35,（5）（2000）高かった。

10）Yosifumi

Horiuti，Sigeyuki Imamura：J.

Biochem，81，1639〜1649（1977）

文献
１）西谷尚道，菅間誠之助：醸協, 73, 844〜849

11）Mahmoud K.Tahoun，M.F.Ei-Kady A. A.
Wahba：Microbios, 47, 45〜51,（1986）（1978）
他：醗工,56, 182 〜187（1978）12）Atsushi Tsuchiya, Hidekazu Nakazawa,３）第４回改正国税庁所定分析法注解：注解編集

Jinichi Toida ， Kunio Ohnishi ， Junichi

２）西谷尚道Sekiguchi ： FEMS委員会（1993）
４）岩井美恵子：リパーゼその基礎と応用, p256
（1991）幸書房
５）Kunio

Yohko

Yoshida,andJunichi Sekiguchi ： J. Fermentation and77（5）490〜495（1994）

６）Kunio Ohnishi，Jinichi Toida，Hidekazu

164

Letters,143, 63〜67（1996）
13）石川雄章, 吉沢淑：農化，50，13（3）１〜136

Ohnishi,Bioengineering

Microbiology（1976）
14）岩野君夫，三上重明，福田清治，椎木島田豊明：醸協，81，490〜494（1986）

敏，