焼酎もろみから分離した乳酸菌の特性
高山清子 ＊１・水谷政美 ＊１・山本英樹 ＊１・越智洋 ＊１・工藤哲三 ＊１

Characteristic of Lactic Acid Bacteria Isolated from Shochu MashKiyoko TAKAYAMA, Masami MIZUTANI, Hideki YAMAMOTO, Hiroshi OCHI and Tetsuzo KUDO
これまで宮崎県内の焼酎製造場の焼酎もろみについて生酸菌の分布を調査した。そして 63 株の乳酸菌を分離，分類した。その結果，約半数が Lactobacillus pacasei（以下 L. paracasei と表記）と分類された 1-3) 。
今回，焼酎もろみから分離した乳酸菌の特性を調べるためクエン酸資化性試験，ジアセチル生産性試
験をおこなった。また，平成 19 年宮崎県本格焼酎鑑評会の出品酒を分析した結果，芋焼酎中のジアセチルおよび酢酸濃度は，その他穀類焼酎に比べ高い傾向にあり，もろみ中の乳酸菌が関与していると推察された｡
キーワード：焼酎もろみ，乳酸菌，クエン酸，酢酸，ジアセチル
１はじめにもろみから分離した乳酸菌のジアセチル生産性お焼酎の一次もろみは白麹菌，黒麹菌が生産する

よびクエン酸資化性にについて検討した 。さらに ，クエン酸により pH が低く保たれているため，乳本格焼酎に含まれるジアセチルおよび酢酸の分析酸菌は生育し難い。しかしながら二次もろみにおをおこない，乳酸菌が焼酎の品質に及ぼす影響をいては，主原料と水の投入によりクエン酸の濃度調査したので報告する。

が低下するため，乳酸菌が比較的生育し易い環境になり，しばしば酸度が非常に高くなるような異２常発酵現象が見られる。この原因は乳酸菌の汚染

２－１

実験方法によるものと考えられ，これまで研究がなされてきた

4-9)。高宮は南九州の焼酎工場の生酸菌の分ジアセチル生産性試験およびクエン酸資化性に使用した培地

ジ ア セ チ ル 生 産性 試 験 及 びク エン 酸資 化性 に

布状況を調査し， 417 点の試料から高頻度で生酸は，以下に示す３種の培地を用いた｡

菌を検出したと報告している 8) 。

(1)GYP 培地 12)

ジアセチルはつわり香の原因物質であり，弁別
閾値は低く

10)

，沸点が 88 ℃であることから蒸留

グルコース１％，酵母エキス 0.5%，ペプトン 0.5%，酢酸ナトリウム 0.2 ％ ，salts solution 0.5 ％ ，Tween

過程で焼酎に移行し，焼酎の香りに影響を与えて80 solution １％いる。岩田らは鑑評会の出品酒および焼酎もろみ(2)CYP 培地(炭素源としてクエン酸を含む)中のジアセチル量から，焼酎中のジアセチルは生クエン酸 0.2%，クエン酸三ナトリウム 0.8 ％，酵酸菌等の汚染菌に起因すると推察しており

11)，田辺らも焼酎もろみから分離した乳酸菌によるジアセチル生成を確認している 4-6) 。そこで，焼酎もろみ中の乳酸菌の特性を明らかにするため，焼酎

母エキス以下 GYP 培地と同様(3)CGYP 培地(炭素源としてグルコースとクエン酸を含む)
グルコース 0.5 ％，クエン酸 0.1 ％，クエン酸三ナトリウム 0.4 ％，酵母エキス以下 GYP 培地と＊1

応用微生物部

同様

２－２

焼酎もろみから分離した乳酸菌のクエン酸資化性

クエン酸資化性試験は，焼酎もろみから分離した乳酸菌９株 L. paracasei，L. plantarum/pentosus，L.

これまでに乳酸菌が増殖したと考えられる異常

brevis，L. hilgardii ，L. buchineri，L. parabuchneri ，L.

発酵もろみの有機酸分析を数件おこなった。図１

fermentum， Pediococcus

acidilactici( 以 後に正常なもろみの有機酸クロマトグラム，図２にacidilactici と表記） ， P. pentosaceus および，２

異常発酵したもろみのクロマトグラムを示す。異－１に示す培地を使用した。滅菌した CYP 培地

常発酵したもろみのクエン酸の濃度は正常もろみに十分に生育した前培養液を接種後， 30 ℃で３の約 1/10 程低く（ 1700mg/l），乳酸及び酢酸の濃日間静置培養した。そして培養液の 660nm にお度は高い（乳酸 8200mg/l，酢酸 5000mg/l）というける吸光度を測定し ，各乳酸菌の増殖度を求めた 。

特徴を確認した。このようなもろみでは，製麹で次に， CYP 培 地で増殖が確認された菌株につのクエン酸生成が少なかったことやクエン酸代謝

いて GYP， CYP， CGYP 培地で 30 ℃，３日間培経路をもつ乳酸菌が増殖し，クエン酸が代謝され養後の有機酸を測定した 。すなわち ，培養液を 20酢酸が生成したことが考えられる。そこで，宮崎

倍希釈し 0.45μm のメンブランフィルターでろ過

県内の焼酎製造場から分離，同定した乳酸菌につ後，高速液体クロマトグラフ LC-10A（島津製作

いてクエン酸資化性試験をおこなった。

所製，有機酸分析システム）により測定した。

P.

最後に， CYP 培地で最も増殖した L. paracasei
について経時的に増殖度を測定し，増殖曲線を作成した。培養，測定条件は以下のとおりとした。
装 置 ： BIO-PHOTORECORDER

クエン酸TN-2612（ ADVANTEC 製）
培養条件： GYP および CYP 培地に，十分生育した前培養液を 10 倍希釈し，その１滴をＬ字型試験管の培養液に接種した。直ちにＬ字型試験管を乳酸

酢
酸装置に取り付け， 30 ℃で静置培養した。途中，２時間間隔で培養液の吸光度（ 660nm）を測定し増殖曲線を作成した。

R e te n tio n tim e ( m in )

図１

２－３

焼酎もろみから分離した乳酸菌のジアセチルおよび2, 3-ブタンジオール生産性

正常もろみの有機酸クロマトグラム

培養後のジアセチルおよび 2,3-ブタンジオールは，しょうゆ試験法 13) を参考にガスクロマトグラ
フにて測定した。すなわち滅菌した培地に十分に乳 酸生育した前培養液を接種後， 30 ℃で３日間静置培養した。培養液 6ml に酢酸メチル 3ml および塩クエン酸酢酸化ナトリウム 1g を加えて抽出し，遠心分離後の酢酸メチル相を試料とした。また，分析条件は以下のとおりとした。
装置： HEWLETT PACKARD 5890 SERIES II ガ ス
クロマトグラフ①分析カラム： DB-WAXント製)

R e te n tio n tim e ( m in )図２

異常発酵もろみの有機酸クロマトグラム②検出器： FID
③注入口温度： 150 ℃( 0.53mm × 60m,アジレ

④検出器温度 :250 ℃

クエン酸を唯一の炭素源とした CYP 培地にお⑤カラム温度 :Initial Temp45 ℃ , Initial time7.0min. 5

いて 30 ℃で３日間静置培養後の濁度を測定し，℃ /min 220 ℃ 5min.

乳酸菌の増殖を確認した(図 3)。その結果，焼酎

２－４

本格焼酎中のジアセチルおよび酢酸の分醪から最も多く分離された L. paracasei は CYP 培析

地 で よ く 増 殖 し た 。 そ の 他 L. brevis， L.

平成 19 年宮崎県本格焼酎鑑評会に出品された

plantarum/pentosus， P. acidilactici においても増殖

芋焼酎（ 19 点）および麦，米，蕎麦の穀類焼酎が確認されたが， L. buchneri， L. parabuchneri， L.

（ 21 点）について，ジアセチル及び酢酸の分析

fermentum， L. hilgardii， P. pentosaceus では確認さをおこなった。本格焼酎中のジアセチルはれなかった。

Hayasaka らの方法 15) ，Kobayashi らの方法 16) ，BCOJ1.6ビール分析法 17) を参考に，ヘッドスペース中の揮1.4
1.2法にて分析をおこなった。すなわち 4ml バイアル

10.60.4アルを浸した。 SPME ファーバーをヘッドスペー

0.2

ス中に３分間露出させて揮発性成分をファイバー

idilacti
cim/pe
nt
osus
L.
bu
chiner
P.
i
pe
nt
os
ac
eu
L.
spara
bu
chne
ri
L.
fer
men
tu
m
L.
hilg
ardiiis析条件は以下のとおりとした。
(1)SPME ファイバー

aru

ac

sei

L.
plant

GCMS-QP5050A（ 島津製作所製）に導入した。分L.
paracaに吸着させた後，ガスクロマトグラフ質量分析計

0P.

を入れかくはん後， 40 ℃の恒温槽に 40 分間バイ0.8L.
brev(SUPERUCO 製)に試料 500μl 塩化ナトリウム 0.3g

Growth(OD660 )発成分を SPME ファイバーに吸着させる固相抽出

図３

焼酎もろみから分離した乳酸菌の CYP 培

65 m Carbowax-divinylbenzene ( SUPERUCO 製)

地における増殖（ 30 ℃， 72 時間静置培養(2)GCMS

後の濁度）

装置： GCMS-QP5050A(島津製作所製)①分析カラム： ZB-WAX ( 0.25mm × 60m, 島津製次に CYP 培地で増殖が確認された菌株につい作所製)て GYP，CYP，CGYP 培地で培養前のグルコース ，②気化室温度： 200 ℃

クエン酸濃度および 30 ℃， 72 時間静置培養後の③インタフェース温度： 200 ℃

クエン酸，乳酸，酢酸濃度を表１～３に示す。

④ カ ラ ム 温 度 ： Initial Temp 40 ℃ Initial time
10.0min. 3 ℃ /min 200 ℃ 0min.

表１⑤キャリアガス：ヘリウム(90kPa)⑥イオン化電圧： 70eV
⑦測定モード： SIM( m/z = 86)

GlucoseCitric acid
Lactic acidAcetic acid

ジアセチル( Wako 製，純度 98.0%)は再留して標
酢酸は，高速液体クロマトグラフ LC-10A（島津製作所製，有機酸分析システム）により測定し1000

GlucoseCitric acid
Lactic acidAcetic acid

7600
1000

表３
結果および考察３－１

焼酎もろみから分離した乳酸菌のクエン酸資化性

GlucoseCitric acid
Lactic acidAcetic acid(mg/l)
After fermentation
L. paracasei L. plantarum/pentosus
L. brevis P. acidilactici
nd88001100

nd54001200

nd38001200

nd51001200

CYP 培地における有機酸濃度

Before fermentation
CYP medium

た。
３Before fermentation
GYP medium10000

表２

準液を調製し，検量線を作成した。

GYP 培地における有機酸濃度(mg/l)
After fermentation
L. paracasei L. plantarum/pentosus
L. brevis P. acidilactici
nd800
4400

5800
202300300
15004800

3013004600

CGYP 培地における有機酸濃度

Before fermentation
CGYP medium
5000
3800
1000(mg/l)
After fermentation
L. paracasei L. plantarum/pentosus
L. brevis P. acidilactici
35004300
1200

nd42002500

nd34003000

6039002400

グルコースを炭素源とした GYP 培地において定法にもなっており 17) 広く使われている 18) 。

は主に乳酸を生成した。一方，炭素源をクエン酸

本研究ではガスクロマトグラフを使用し，ジアに置き換えた CYP 培地の場合，生成した乳酸はセチル及びその後還元されて生成する 2, 3-ブタ

少なく ，クエン酸が資化され主に酢酸を生成した 。

ンジオールの分析をおこなった。ジアセチル生産

また，その他の菌株についても発酵前後の有機酸が最も多かった L. paracasei を CGYP 培地で培養を比較したところ，クエン酸資化性菌において同後分析したクロマトグラムを図５に，焼酎もろみ様の結果が得られた。

から分離した乳酸菌のジアセチルおよび 2,3-ブタ

最 後 に ， GYP お よ び CYP 培 地 に お け る L.

ンジオール生産量を表４～６に示す。

paracasei の増殖を濁度（ OD660 ）で求めた増殖曲線を図４に示す。 CYP 培地において高い増殖を示した L. paracasei は，約 40 時間後から徐々に菌の増殖が確認された。以上の結果より，これらの乳酸菌ではクエン酸を炭素源として増殖可能であることが確認された。

Diacetyl
2,3-butanediol

2.5

Growth (OD 660)

21.5

1Retention time (min)0.5

図５0010203040506070

ジアセチルおよび 2, 3-ブタンジオールのガスクロマトグラム(Cultivation by L.

80Time/hparacasei was carried out at 30 ℃ for 72hours.)

図４

GYP および CYP 培地における L. paracaseiの増殖曲線●； GYP medium，▲； CYP medium

表４GYP 培地におけるジアセチルおよび 2,3-ブタンジオール濃度

３－２

焼酎もろみから分離した乳酸菌のジアセチルおよび2,3-ブタンジオール生産性ジアセチル（ 2,3-butanedione）は沸点 88 ℃，バター様と表現される物質である。ジアセチル臭は(mg/l)
After fermentation
Before fermentationL.
paracaseiL.
plantarum/pentosusP.
pentosaceusP.
acidilactici
GYP medium
Diacerhyl
2,3-butandiol

表５－－244nd41nd52nd37

CYP 培地におけるジアセチルおよび 2,3-ブ乳酸菌が発酵に関与した際に発生する特徴的な香タンジオール濃度りであり，乳酸発酵を主体として製造される発酵(mg/l)
After fermentation
Before fermentation
CYP medium L. paracasei L. plantarum/pentosus P. pentosaceus P. acidilactici

乳製品などでは良い香りとされるが、酒類では悪い香りとされる場合が多く，様々な研究がなされている。酒類においては ，「つわり香 」，「ジアセDiacerhyl
2,3-butandiol

表６－－119nd47

nd38nd177

CGYP 培地におけるジアセチルおよび 2,3-チル臭」などと表現され弁別閾値が低いという特ブタンジオール濃度徴がある。ジアセチルの分析法としては，比色分(mg/l)
After fermentation
Before fermentation
CGYP medium L. paracasei L. plantarum/pentosus P. pentosaceus P. acidilactici

析法とガスクロマト法がよく使われているが、ガスクロマト法は感度が高いため，現在ビールの公Diacerhyl
2,3-butandiol－－

1041440

weak
345106ジアセチルの生成量は，菌株，培地の種類によ

図６に示す 。ジアセチルは 11.9 分に検出された 。って異なっていた。焼酎もろみから最も多く分離
その他 L. plantarum/pentosus, P. acidilactici, P.
pentosaceus においてもジアセチルの生成が確認さSignal intensity

された L. paracasei はジアセチル生産性が高く，Diacetyl

れた 。また ，グルコースのみを炭素源とした GYPRetention time (min)培 地 に 比 べ ， グ ルコ ース にク エ ン 酸 を 添 加し た
CGYP 培地においてより多くジアセチルが生成し

図６

本格焼酎のジアセチル分析

Selected ion monitoring spectra. ( m/z = 86)

た｡
今 回 焼 酎 も ろ み か ら 最 も 多 く 検 出 さ れ た L.

Vaporic compounds were analyzed by GC-MS with

は，クエン酸資化性，ジアセチル生産

headspace method. The SPME fiber coated with a 65

性ともに高かった。また，これらの乳酸菌ではグ

μ mCarbowax – divinylbenzene was exponed to the

ルコースのみを炭素源とした培地に比べ，クエン

headspace for 3min at 40 ℃ .

paracasei

酸を添加した培地においてジアセチルを多く生産した。これは，クエン酸を代謝する過程においてクエン酸がオキサロ酢酸，ピルビン酸，活性アル次に芋焼酎およびその他穀類焼酎中のジアセチルおよび酢酸濃度を図７に示す。

デヒドとなり，活性アルデヒドとピルビン酸が縮合して α -アセト乳酸が生成され，酸化，脱炭酸

1200を経てジアセチルが生成したと考えられる 14) 。更1000

した CYP 培地における発酵試験後，クエン酸濃度が低下し，酢酸濃度が上昇した。クエン酸代謝経路を有する乳酸菌ではクエン酸を資化し，その代謝過程で酢酸を生成する 14) 。実際に，グルコー

Diacetyl( μg/l)にこれらの乳酸菌では，クエン酸のみを炭素源と800
600400

スがほとんど無い蒸留前のもろみにおいても乳酸200菌が検出され ，その大部分がクエン酸を資化した 。

0

したがってこれらのクエン酸資化性乳酸菌が増殖

020

高アルコール濃度に保たれているため乳酸菌は生6080100120

Acetic acid (mg/l)

した場合，揮発性酸が上昇すると考えられる。
焼酎の一次もろみにおいてはもろみが高酸度，40

図７

本格焼酎中のジアセチルおよび酢酸○； Sweet potato×； Grain (barley, rice, buckweat)

育し難いが，二次もろみにおいてはもろみが希釈され酸度が低下するため，乳酸菌が比較的生育で

芋 焼 酎 の ジ ア セ チ ル 濃 度 は 85μg/l か らきると考えられる。糖がほとんど残っていない発1000μg/l，酢酸濃度は 40mg/l から 110mg/l とばら

酵後期においては主にクエン酸資化性乳酸菌が生つきがあった。一方，麦，米，蕎麦の穀類焼酎の育し，焼酎中のジアセチル，酢酸に影響を及ぼしジアセチル濃度は 25μg/l から 500μg/l，酢酸濃度ていると推察された。

は 40mg/l 以下であった。図７より芋焼酎中のジ３－３アセチルおよび酢酸濃度は，その他穀類焼酎に比本格焼酎中のジアセチルおよび酢酸

本格焼酎中のジアセチルをガスクロマトグラフ
質量分析計で分析し，得られたクロマトグラムをべ高い傾向にあった。
次に，岩田らの報告 11) にあるように，本格焼酎中のジアセチルが焼酎の品質に影響を及ぼしているのではないかと推察されたため，宮崎県本格焼酎鑑評会出品酒の原料別評点順位とジアセチル濃度の関係を調査した。芋，麦，米，蕎麦焼酎の評
200

点順位とジアセチル濃度との関係を図８～ 11 に
Diacetyl （μg/l ）示す。

1200

150
1001000
Diacetyl （μg/l ）y = 10.197x + 17.156
R2 = 0.9441

50080005600

101520順位

400200

図10

米焼酎評点順位とジアセチル濃度

0020406080

図８

Diacetyl （μg/l ）順位

芋焼酎評点順位とジアセチル濃度

700
Diacetyl （μg/l ）

600
500

450400350300250200150
10050004005101520順位

300200100

図110010203040順位

蕎麦焼酎評点順位とジアセチル濃度50

本格焼酎中のジアセチルについて岩田らは，熊本国税局における鑑評会の出品酒中のジアセチル

図９

麦焼酎評点順位とジアセチル濃度分析値と官能評点を比較し，米製においてはジアセチルが官能評点と強い相関があること，大麦製では逆に負の相関があること，甘藷製焼酎においては官能評点と相関があったが有意なほどではなかったことを報告している 11) 。本研究において，平成 19 年宮崎県本格焼酎鑑評会出品酒中のジアセチル分析値と官能評点を比較したところ，米製焼酎においては相関がみられたがその他の焼酎においては確認されなかった。 主に乳酸菌により生成すると考えられるジアセチルについては，今後その影響についてさらに検討する必要がある。
焼酎もろみ中の乳酸菌について遠藤らがPCR-DGGE 法 に より 焼 酎 も ろ み 中に 多様 な乳 酸菌叢があると報告しているように 19) ，腐造に至る
ような増殖は示していないが，焼酎もろみ中に 1～ 108

CFU/ml の乳酸菌が存在していることが明

らかになった 1, 2) 。一方，ウイスキーの製造にお柏田雅徳 :宮崎県工業技術センター・食品開

いては従来汚染菌とされていた乳酸菌が見直され発センター研究報告 , 49, p.127-131 (2004)ており20)，鰐川は他の微生物と協調して甘い微量

2)

竹下淳子 , 工藤哲三 , 山本英樹 , 水谷政美 ,香気成分を生成し酒質の個性を形成していると報

柏田雅徳 :宮崎県工業技術センター・食品開告している 21) 。焼酎製造においても乳酸菌の存在

発センター研究報告 , 49, p.119-125 (2004)

は酒質を左右する大きな要因になっていると考え

3)られるため，今後さらに研究を進めていきたい。

高山清子 , 工藤哲三 , 水谷雅美 , 山本英樹 , 柏田 雅 徳 :宮 崎県 工業 技術 セ ンタ ー・食 品開 発センター研究報告 , 50, p.117-119 (2005)
４

まとめ4)

焼酎醪中の乳酸菌の特性を明らかにするため，分離菌のジアセチル生産性およびクエン酸資化性

志々目義紀 :鹿大農学術報告 , 32, p.69-77 ( 1982)
5)について検討し，本格焼酎中のジアセチル及びクエン酸量の分析をおこなったところ，以下の知見
焼酎もろみから最も多く分離された L.

6)

いても資化性が確認された。乳酸発酵前後の有機酸濃度から，クエン酸が資化されると主に酢酸が生成した。
2)

焼酎もろみから最も多く分離された L.
paracasei はジアセチル生産性が高く ，その他 ，

田邊幾之助 , 二石大介 , 金丸芳 :鹿大農学術報
告 , 34, p.45-57 ( 1984)

7)

paracasei はクエン酸資化性が高く，その他 L.
brevis, L. plantarum/pentosus, P. acidilactici に お田邊幾之助 , 二石真智子 , 迫間敬子 , 有川順子 :鹿大農学術報告 , 33, p.47-52 ( 1983)が得られた。
1)

田邊幾之助 , 音地龍夫 , 二石真智子 , 迫間敬子 ,百瀬洋夫 , 内山奈々 , 藤倉寛子 :醸協 , 92,p.452-457( 1997)8)

高宮義治 :醸協 , 77, p.907-910( 1982)

9)

玉城武 , 高宮義治 , 高江州朝清 , 下地睦子 :醸
協 , 81, p.130-132( 1986)10)宇都宮仁 :醸協 , 101, p.730-739( 2006)11)

岩田博 , 中嶋則行 , 水野昭博 , 高原康生 , 黒須
猛行 , 里見弘司 , 石井徹 , 伊藤康 , 菅間誠之助 :L. plantarum/pentosus, P. acidilactici, P. pentosaceusにおいてジアセチルが確認された。ジアセチルの生成量は，グルコースのみを炭素源とした培地よりもクエン酸を添加した培地で多かった。
3)

芋焼酎中のジアセチルおよび酢酸濃度は，その他穀類焼酎に比べ高い傾向にあり，もろみ中の乳酸菌が関与していると推察された。

4)

クエン酸が豊富な焼酎もろみではジアセチル生産性，クエン酸資化性乳酸菌が多く存在しており，焼酎中のジアセチルおよび酢酸濃度に影響していることが示唆された｡

５

謝辞

本研究を行うにあたり，宮崎県本格焼酎鑑評会
出品酒の分析にご協力頂いた宮崎県酒造組合に深謝申し上げます｡
６

参考文献

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