コラーゲンビトリゲル を用いた
新規肝細胞培養系における薬物動態研究®

Drug metabolism and pharmacokinetics researchin novel hepatocyte culture system using collagen vitrigel® membrane

渡 隆爾
Ryuji WATARI

エーザイ株式会社 ＤＨＢＬ メディスン開発バイオファーマシューティカル・アセスメント機能ユニット グローバル薬物動態研究部 マネージャー

Global Drug Metabolism and Pharmacokinetics Biopharmaceutical Assessments (BA) Core Function Unit (CFU),
Medicine Development, DHBL, Eisai Co., Ltd. (Manager)

コラーゲンビトリゲル®

細胞培養法

薬物動態01

ヒトにおける薬理効果や毒性発現に対する予測精度は低い。従っ

本稿では、創薬研究における薬物動態の役割を示し、動態研究正確に予測できる新たな評価法を構築し、可能な限りリスクの少における肝細胞培養技術と評価法の変遷を辿る。これらを踏まない開発候補品を選出できれば、成功確率の向上とともに、臨床

えて、関東化学株式会社より販売されているad-MED ビトリゲ研究の効率的な進行に貢献できる。

ル ®を用いた新規肝細胞培養法の構築、及び肝代謝に関わる代

医薬品開発において、薬物動態研究は、探索研究から、臨床研謝酵素であるシトクロムP450（CYP）の活性評価について述べ究、承認申請まで幅広いステージに関わっている。同時に、薬理る。さらに、CYPの典型基質を用いたヒト肝クリアランス(CL)のや安全性研究をサポートする大切な役割も担っている。薬理効予測を実施し、実際のヒト臨床値との比較にも言及する。

果や毒性の発現は、投与された薬物の全身暴露や薬効・毒性発はじめにの不足や予期せぬ毒性発現である。
しかし、従来の評価方法ではて、非臨床段階（探索研究）でヒトにおける薬理効果や安全性を現組織への移行が大きく関わっている。そのため、薬物動態研究

02

医薬品開発における薬物動態の役割において重要なことは、探索研究の段階において、最終候補医薬品のヒトでの安全性領域を保ち、かつ、有効薬効用量を正確に予測・提案することにある。さらに、最終開発候補品を決定する段階では、ヒトPK予測に加え、薬理効果や安全性を予測する

医薬品開発は、低分子化合物の場合、成功確率が約4%であり、PK/PD（Pharmacokinetics/Pharmacodynamics）
及びTK/

一つの医薬品を開発する期間として約13年、研究開発費用としTD（Toxicokinetics/Toxicodynamics）の実施が重要である。て約2,000億円がかかるといわれている 。従って、医薬品開発

PK/PD及びTK/TDは、ヒト投与量を基に規定される。ゆえに、薬の成功確率を向上させ、開発期間の短縮並びに開発費を低減す

理効果や毒性の発現の予測には、ヒトPK予測の精度が肝となる。

ることは、製薬企業として極めて重要な課題である。また、医薬品

このヒトPK予測の精度を向上させるための取り組みの一つが、の開発中止や市場撤退も、製薬会社として回避すべき事象であ

薬物代謝の中心臓器である肝臓を扱う肝代謝研究である。

1)

り、薬を望む患者様の期待に応えるためにもできる限りの対策を

筆者らは、肝代謝研究に必要な肝細胞培養法の検討を行い、薬講じることが必要である。

物動態評価に適した培養法の研究を推進した。

過去の医薬品開発の歴史を振り返ると、1990年代は薬物動態（DMPK：Drug Metabolism and Pharmacokinetics）が原因で開発中止となる医薬品候補化合物が、全体の約40%を占めていた2)が、2000年代以降は約10％以下に減少した3)。これは、肝細胞や肝ミクロソームなどのヒト生体試料が使用できるように肝細胞培養技術の変遷

03

なり、薬物動態研究の進展とともにヒトにおける動態予測を主と薬物動態研究では、医薬品候補化合物の生体内における肝CLしたトランスレーショナル/リバーストランスレーショナル研究のの予測や、代謝酵素誘導性及び細胞毒性を評価するin vitro評推進が寄与したと考えられる。一方で、安全性および薬理効果に価モデルとして肝細胞が利用されている。
しかしながら、従来のついては依然として開発中止の原因として多くを占めており、そ単純なin vitro評価法においては、薬物代謝酵素として最も重要。つまり、現なCYP活性が培養中に低下してしまう上、細胞は播種後数日しか在の医薬品開発で特に大きな障害となっているのは、薬理活性培養できない。そのため単純な培養法では、生体における肝臓のの比率は過去と比較しても大きく変動していない

2, 3)

9

特集

細胞アッセイ

生理学的機能を再現することは困難であった。医薬品候補化合雑であることから、Relay法と同様に探索研究段階で多くの医薬物のヒト肝CLや肝毒性をより正確に予測するには、生体内の肝品候補化合物を評価するスクリーニング手法としては不向きで臓に匹敵する肝機能を維持した新しい肝細胞培養法を構築するあるといえる。使用場面としては、数種類の医薬品候補化合物の必要がある。そこで筆者らは、従来法よりも優れた培養法の開発中から1品に絞る後期の段階において、活用することが想定されを目指した。

る。

細胞培養法の開発を考える上で重要な項目は3つある。それは、①培養基材（培養システム）、②細胞、そして③培地である。本

3.4 スフェロイド培養

項においては、特に、培養基材に焦点を当て、肝細胞培養法の変コラーゲンコーティングしたプレートに単純に細胞を播種する2遷を辿る。

次元平面培養では、複雑な立体構造を有する生体組織を模倣することはできない。そのため、細胞同士を集合させることによっ

3.1 従来の培養基材(システム)て、3次元細胞塊を形成するスフェロイド培養が提案された9)。ス

従来の培養法では、市販のコラーゲンコーティング済みプレート

フェロイド培養では、細胞同士が自発的に凝集することで、細胞（培養基材）を用いるのが一般的であるが、そうした簡便な方法

間相互作用が高まり、細胞機能の向上が期待されるとともに、立では代謝活性が数日間までしか維持ができない4)。そのため、代体的な組織を構築することで生体環境に近づけることができる謝活性を長期に渡り維持する培養基材(システム)の開発が進めと考えられた。ただし、細胞凝集塊は自律的なものではなく、単純られている。以下に、肝代謝評価で開発されてきた手法に関してな集合体であるため、細胞塊の大きさが一定以上を超えると、細簡単に述べる。

胞塊内部の細胞まで、酸素や栄養素の供給ができず、壊死してしまうという問題がある。こうした課題を解決するため、Cell-able®

3.2 Relay法(東洋合成工業株式会社)のような、細胞塊の大きさを一定以内

肝細胞を用いた代謝活性評価法では、凍結肝細胞を使用するに制御するプレートを開発して、細胞塊の品質を安定させることのが一般的であり、凍結融解直後の浮遊細胞(Suspension)をで代謝活性を維持する手法もある10)。また、代謝活性評価に限ら用いて、各化合物のCLを算出する。
しかし、足場のない、細胞間ず、スフェロイド培養を毒性評価に適用した事例も報告されてい接着の少ない浮遊状態では、4時間程度しか代謝活性が維持さスフェロイド培養には、線維芽細胞のような足場を作る11)。なお、れないことが知られている4)。そのため、肝細胞を4時間毎に交換るフィーダー細胞の存在を必要とする。フィーダー細胞は、細胞して化合物のCLを算出するRelay法がPfizer社により開発されの接着に必要な、細胞外マトリックスの供給など、細胞機能に必た5)。本手法により、代謝活性を長時間維持しないと評価できな要な足場を提供する。一方で、フィーダー細胞による代謝活性やい代謝安定性の高い低CL型化合物の評価が可能となった。一方

毒性評価への影響を考慮する必要があり、フィーダー細胞を必で、高価な凍結肝細胞あるいは新鮮肝細胞を大量に投入し、4時要としないスフェロイド培養法も提案されてきた12)。

間毎に細胞を交換しなければならないため、人的及び物的コスト

このように、2次元培養法や3次元培養法の取り組みも活発化しが大きいという欠点がある。ているが、薬物動態研究の観点として、3次元培養法の代謝活性のレベルはsuspensionを使った従来法と比べて低く、ヒト肝CL3.3共培養システム予測評価モデルとしては課題も多い。

3.1から3.2項で見てきた培養法は、肝臓組織における実質細胞としての肝細胞に焦点を当てている。本来、肝臓組織は、実質細3.4 オルガノイド胞である肝細胞と非実質細胞である星細胞・クッパー細胞・血管スフェロイドのような、自発的な細胞凝集を用いた3次元培養内皮系細胞によって構成された臓器である。生体肝臓組織を模法をさらに発展させた形として、より自律的に、複数の細胞種を倣するには、実質細胞だけではなく、非実質細胞の存在も忘れて伴って小器官(ミニ臓器)を形成する手法をとっているのが、オルはならない要素である。近年、実質細胞以外の細胞とともに培養ガノイドである。オルガノイド形成の際に使用する細胞種に関しを行う共培養法が多く研究されており、線維芽細胞との共培養ては、Embryonic Stem cell (ES細胞：胚性幹細胞)、inducedやHμREL法 が開発され、長期培養

Pluripotent Stem cell (iPS細胞：人工多能性幹細胞)のよう法として、Hepato-pac法

6,7)8)及び肝機能向上が認められるとともに、肝CL評価法として注目に幹細胞を主な細胞源としているものが多い。肝臓に関してされている。Hepato-pac法に関しては、培養プレートにマイク

は、iPS細胞から分化させた肝細胞と、endothelial cell（内皮ロパターニング手法を施すことで、細胞接着の場を制御するとい細胞）としてヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein

う培養基材側の工夫もなされている 。

Endothelial Cells：HUVEC）、mesenchymal cells（間葉系幹ただし、これら共培養法は肝細胞以外の細胞による影響を加味細胞）の3種類を組み合わせた肝オルガノイドが報告されている

6)。幹細胞による自律的な組織構築が可能となり、創薬利用にもする必要があり、得られた結果に対する非実質細胞や線維芽細13)胞の寄与に注意を要する。また、Hepato-pac法のようなマイク

期待されている14)。一方で、肝オルガノイドは薬理評価や毒性評

ロパターニング手法を取り入れた培養基材は、現在日本での入価に利用することが多く、薬物動態評価に適応している例は少な手が困難である。更に、共培養法は評価コストが高く、操作が複いのが現状である。

10

THE CHEMICAL TIMES
3.5 Microphysiological system（MPS）

な2次元培養で肝機能の向上及び長期培養を実現することが、従来のin vitroモデルは単一細胞かつ静置培養を基本とする閉創薬研究の観点から活用しやすいと判断した。本素材は、関東鎖系であり、生体における血流要素や多種多様な細胞・組織・臓として、Transwell ®
化学株式会社より「ad-MED ビトリゲル ®」器が存在する生体の複雑な環境を模倣していない。生体の模倣(Corning社)のような細胞培養用インサートとして販売されていを狙う上では、各臓器を個別に考えるだけでは不十分であり、臓る（図1）。本研究では、12ウェルプレート用のビトリゲル®を使用器同士の連結による応答、さらには全身への連関を考慮する必して評価を実施した。

要がある。そうした中で、Microphysiological system（MPS：生体模倣システム）と呼ばれる新しい培養システムが考案され、生4.2 細胞：PXB-cells®

体に近い環境を再現しようとする試みがなされている。中でも肝コラーゲンビトリゲル ® の先行研究として、株化細胞である

MPSに関しては、肝機能の再現を目指すおおよその指標も提示

HepG2細胞を用いて、代謝活性や肝機能の指標であるアルブ

しかし、MPSは主に安全性・薬理効果での研究がされている 。

しかし初代肝細ミン分泌及び尿素合成能が向上した例がある18)。

主流であり、オルガノイド研究と同様に薬物動態評価としての研胞を用いた実績はなかったため、本研究ではヒト初代肝細胞を用究報告は少ない。

いて検討することにした。肝細胞は、凍結ヒト肝細胞が一般的にこのように、様々な培養システム（培養基材）が提案、研究されて利用されているが、高コスト、ロット間差の大きさ、使用個数・期きているが、薬物動態評価での活用には多くの課題が存在し、探間の制限といった障壁がある。評価系構築の際には、再現性の観索研究において真に創薬活用できる簡便な培養システム（培養点から、ロット間差の大きい細胞源を扱うことはデータ解釈の上基材）の開発が必要である。

で問題となる可能性が高い。そこで我々は、ヒト肝細胞を移植し15)より単離した新鮮ヒト
たヒト肝置換キメラマウス（PXB-mouse®）

コラーゲンビトリゲル®による新規培養法の開発

04

ヒトの薬肝細胞であるPXB-cells®に注目した。PXB-mouse®は、物動態の予測において高い予測性を示す有望なモデル動物19,20)として近年認知度が上がっている。キメラマウスより単離した肝細胞は、一つのロットを安定的に数年に渡って使用することがで

前項では主に、培養基材に焦点を当てて、培養法の変遷を辿っき、低コストかつ、新鮮肝細胞の持つ良好な接着性・再現性・代謝たが、培養基材以外の細胞・培地も重要な要素である。これら3能を実現したヒト肝細胞の代替品として使用が期待される。

つの要素を適切に選択し、条件を設定していくことがより良い培養法構築の要である。我々は、培養基材：コラーゲンビトリゲル®、

4.3 培地：dHCGM

細胞：PXB-cells 、培地：dHCGMを基礎とする新規肝細胞培

本来培地は、購入する細胞ごとに最適化された推奨培地が存在

養法の開発を行った。以下に、決定した3つの要素に関して、紹介し、各メーカーにより多種の製品が販売されている。ところが、各を行う。

メーカー独自に開発された培地は、培地組成が開示されていな®

16)

いため、培地成分の何が良いのか、改善する部分はどこにあるの
4.1 培養基材：コラーゲンビトリゲル

かを把握しにくい点が、ユーザー側として悩ましい部分である。

コラーゲンビトリゲル は、竹澤俊明グループ長（国立研究開新たな培養法の開発を行う際には、培地組成が明らかなものを発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 生物機能利用研究部

使用したいという意図があったため、培地の検討を行う上では、門）が開発された新規培養基材である17)。コラーゲンビトリゲル

培地組成の開示にこだわり、研究を進めた。その結果、最終的に、®

を選んだ理由として、本培養基材は、生体内の結合組織に匹敵PXB-cells®を販売している株式会社フェニックスバイオから入手する高密度コラーゲン線維網で構成されており、生体内を擬似できるdHCGM培地に決定した。本培地は、DMEMを基本培地的に模倣した環境を提供できると期待したからである。また、共として組成成分が公開されており16, 21)、PXB-cells®の培養に用い培養法や3次元培養も捨てがたい方法であったが、まずは簡便る標準的な培地として販売されている。

®

®

A

B

4.4 ビトリゲル®培養法による肝機能評価
上記の細胞培養法構築のための3要素を基に、コラーゲンビト
リゲル®膜、並びにコラーゲンを塗布した従来のプレートにPXBcells®を播種し、3週間の長期培養を行い、CYP代謝活性及び肝特異的機能を比較した。その結果、肝臓で主要な5つのCYP分子種（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6及びCYP3A）の代謝活性が、従来法では培養開始後10日以降に減少するのに対し、ビトリゲル®培養法では、培養14日～17日目で代謝活性の向図1 A環状ナイロン膜の支持体付きコラーゲンビトリゲル®薄膜（提供：関東化学株式会社）、B ad-MED ビトリゲル®膜チャンバーの製品22)。
上が認められ、高い活性を維持することを見出した（図2）

また、ビトリゲル®培養法では培養14日目において、肝機能の11

特集細胞アッセイ

図2 ビトリゲル®培養法及び従来法におけるCYP典型基質化合物での代謝活性評価22)

指標であるアルブミン分泌能や尿素合成能が従来法と比較して23)。さらに、ビトリゲル®培養法によりCYP代謝活性の向上と維持増加することが確認された。

を実現したことから、従来法ではCLを求めることが困難であった

上 記 の 結 果 から、コラー ゲンビトリゲ ル ®とP X B - c e l l s ® 、warfarinやtolbutamideといった低CL化合物のCL値の予測もdHCGMを組み合わせたビトリゲル 培養法を構築し、従来法と可能であった。

比べてCYP代謝能を含む肝機能を長期に賦活化することが可能

一方、5倍以上の過大評価又は過小評価となった化合物は、となった。

alprazolam、diclofenac及びglimepirideの3化合物であった®

(表1)。DiclofenacとglimepirideはPXB-cells®への結合やコビトリゲル®培養法におけるヒト肝クリアランス予測への応用

05

かつ両化合
ラーゲンビトリゲル®膜への非特異的吸着も疑われ、物ともに血漿タンパク結合率が非常に高く（fu,p=0.005以下）、非結合型化合物濃度が低くなるため、ビトリゲル®培養法では過小評価になったと推察される。なお、本研究ではコラーゲンビト

PXB-cells を使用したビトリゲル 培養法では、播種後2週間付

リゲル®膜への非特異的吸着やPXB-cells®への結合は評価して近で代謝活性のピークがあることがわかったため、播種後2週いないが、Hepato-pac法でも同様の現象が確認されている7)。

®

®

間目にCYP典型基質22化合物の代謝評価を実施した。さらに、こうしたタンパク結合率が高い化合物は、過小評価となる危惧がヒト臨床で得られたCL値
ビトリゲル®培養法で算出したCL値と、ある。そのため、代謝評価を実施する際に、アッセイ培地中に分を比較し、本培養法の予測精度を検証した。その結果、評価化合泌されるアルブミンを考慮して、アルブミンへの結合率を補正す物の約80%が3倍以内の予測精度と高い予測性を示した（図3）

ることにより予測精度が向上した例も報告されている24)。ビトリ

12

THE CHEMICAL TIMES

図3 ビトリゲル®培養法によるCYP典型基質化合物の肝CL予測23)

表1 ビトリゲル®培養法による各CYP典型基質化合物の肝CL及びヒト臨床値23)ゲル®培養法では、培養後2週間でアルブミン分泌量も増加しているため、アルブミンへの結合率の補正処理を行う必要性が高おわりにいと考える。

06

以上、コラーゲンビトリゲル ®膜チャンバーとPXB-cells ®を用

本稿では、薬物動態におけるヒト予測の意義を説明し、薬物動態

いたビトリゲル 培養法は、CYP基質、特に低CL型化合物のヒト評価のための肝細胞培養法に関する変遷を、培養基材(培養シス肝CLを精度良く予測できる培養システムであることが明らかにテム)を中心に辿った。そして、培養基材としてコラーゲンビトリなった。ただし、タンパク結合率が高い化合物への適応には課題

ゲル®、細胞としてPXB-cells®、培地としてdHCGMを組み合わせがあり、そうした課題を踏まえた上で評価系を活用することが重た新規肝細胞培養法を提案し、ヒト肝CL予測精度の高い評価モ要である。今回、新たに構築したビトリゲル 培養法は、探索研究デルを構築した（図4）。

段階の創薬活動において精力的に活用していく。

今後は、培養基材の改良として、MPSとの組み合わせや、長期間®

®に渡って高い代謝活性能の維持ができる利点を活かし、安全性

13

特集細胞アッセイ

図4 ヒト肝CL予測精度の高いビトリゲル®評価モデル23)

評価への応用も検討している。
以上、探索研究から臨床へと繋ぐ創薬研究を支援する評価系の一つとして、今後もビトリゲル®を用いた薬物動態研究を進めていきたい。
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