Illumina

アンプリコンシーケンス解析■ 解析概要
Illumina シーケンサーを使用してPCR産物のディープシーケンスを行い、配列の種類と割合を集計します。

■ 解析プランシーケンサー

NovaSeq

MiSeq

ご用意いただくサンプル

リンカー配列付き・精製済み PCR産物

リンカー配列付き・精製済み PCR産物

読み取り方法Paired-End 150 bp x 2

Paired-End 300 bp x 2

データ取得量の単位

330万リードペア(1 Gb)/検体～10万リードペア(60 Mb)/検体～

標準解析仕様〇 ライブラリ調製〇 ライブラリ調製〇 150 PE 330万リードペア/検体〇 300 PE 10万リードペア/検体〇 リードカウント解析〇 リードカウント解析〇 検体間比較テーブル作成〇 検体間比較テーブル作成

追加データ取得

330万リードペア/検体単位で可能

10万リードペア/検体単位で可能

推奨インサートサイズ

200 bp～250 bp

250 bp～450 bp(対応可能インサートサイズ)（ 約 20 bp ～ 約 800 bp ）（ 約 20 bp ～ 約 800 bp ）PCR産物(インサート)
サイズについてPCR産物サイズが推奨インサートサイズの範囲外であってもシーケンスは可能です。
ただし、データ量保証の対象外とさせていただく場合がございますので、推奨範囲から大きく異なる場合は事前にご相談ください。
推奨インサートサイズよりも大きいPCR産物の場合、リード後半部のQV低下により Read1/Read2 の※ インサートサイズ：

1st PCR産物のサイズからリンカー配列の67 bpを除いたサイズオーバーラップが取り難くなります。Amplicon-Seqでは Read1/Read2 のオーバーラップを取ることでアンプリコン全長の配列を決定するため、解析上の有効リード数が減少しますのでご注意ください。

■ ご提供いただくサンプル
以下の条件をご確認の上、サンプルをご用意ください。

アンプリコンの配列構造

 精製済みPCR産物の必要量：5 ng ( 0.2 ng/µl ) 以上

 指定リンカー配列 (右図参照) が付加されていること
 プライマーや非特異的産物の除去が行われていること※ リンカー配列・プロトコル詳細はお問い合わせください。

■ 標準解析内容
【 ① ライブラリ調製 】【 ③ リードカウント解析 】【 ④ 検体間比較テーブル作成 】

2nd PCRによりアダプターを付加し、ライブラリを作製します。

各検体で Read1-Read2 を連結し、アンプリコン全長で同一配列を集計します。

各検体のリードカウント結果を統合し、検体間でカウント数を比較可能なテーブルを作成します。

データ例）リードカウントデータ例）比較テーブル

アダプター

2nd PCR

アダプター

ライブラリ

【② シーケンスデータ取得 】
Illuminaシーケンサーを使用して、シーケンスデータを取得します。

AGCTTTTCATTCTGACTGCAACGG...

26,552

AGCTTTTCATTCTGACTGCAACGG...

SampleA
Count
26552

SampleB
Count
18742

AGCTTTTCATTCTGACTCCAACGG...

21,408

AGCTTTTCATTCTGACTCCAACGG...

21408

37819

534AGCTTTTCATTCTGCCGG...

6,585

AGCTTTTCATTCTGCCGG...

6585

4325643

AGCTTTTCATTCTGACTGCACCGG...

5,033

AGCTTTTCATTCTGACTGCACCGG...

5033

12013

7431

Sequence

CountSequence

SampleC
Count
32088

Read1
Read2

※ オプションデータ解析もございます。詳細は裏面をご覧ください。

北海道システム・サイエンス株式会社

■ オプションデータ解析
表面のリードカウント解析を実施した後、下記のオプションデータ解析も承ります。

ターゲット解析
アンプリコン全長①解析対象領域の切り出し

保存配列

アンプリコン全長の中から、解析対象領域の塩基配列を切り出し、配列を再集計します。
保存配列を除去することで、多型配列の集計結果が見やすくなります。

多型配列

保存配列

解析対象領域を切り出して集計
Sequence②アミノ酸配列への翻訳・集計Count

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

33,256ATGGTCAGCAAGGGCGAGGAG

22,305

Sequence
ATGGTGAGCAAGGAGGAGGAG
9,182
MVSKGEELFTGVVPILVELDG
ATGGTGCGCAAGGGCGAGGAG
1,824

塩基配列をアミノ酸に翻訳し、アミノ酸配列のリードカウントを行います。

③アライメント作成

Ref

リードカウント後の塩基配列やアミノ酸配列について、カウント数上位の配列を対象としてアライメントを作成します。
リファレンスの配列を含めてアライメントを作成することもできます。

Count
55,687

MVSKEELFTGVVPILVELDG

5,267

MVRKEELFTGVVPILVELDG

2,715

MVRKGEELFTGVVPILELDG

972

A T GG T G AG C A AGGG C G AGG AG

seq1 A T GG T G AG C A AGGG C G AGG AG
seq2 A T GG T C AG C A AGGG C G AGG AGRef MV S KG E E L F T G V V P I L V E L DG
seq3 A T GG T G AG C A AGG - GG AGG AG
seq1 MV S KG E E L F T G V V P I L V E L DG
seq4 A T GG T G C G C A AGGG C G AGG AG
seq2 MV S K - E E L F T G V V P I L V E L DG***** *************
seq3 MV R K - - E L F T G V V P I L V E L DG
seq4 MV R KG E E L F T G V V P I L - E L DG*****************塩基頻度集計
リードデータをリファレンス配列にマッピングし、リファレンス配列上の1塩基ごとに、塩基 (A・T・G・C) の出現頻度を算出します。
※ 変異間のフェージング情報は失われます。

ReferenceATposseq

1T

110% 106,791

2C

20%

3T

3,104

4

G

50%

5T

496G

270%

Count％CountG％CountC％Count％

100%

40%

460%

160%

20% 100,108

100%

3% 102,802

97%

220%

34

200%

98,997

100%420% 105,100

100%

410%

410%

0%

56,69632%

52,10548%

90%0%■ こんな使い方も可能です【内部バーコードを利用した多サンプル解析】【ライゲーション法によるアダプター付加】

リンカー配列とPCR用プライマー配列の間に、サンプル識別用の任意配列を組み込むことで、1口分のご依頼で多サンプルのシーケンスも可能です。
低コストに多くのサンプルのタイピングを行う際に有効です。

1st PCRの際に、PCR用プライマーへのリンカー配列の追加が難しい場合、ライゲーション法によるアダプター付加も可能です。プライマーの変更が難しい場合、再PCRが難しい場合に有効です。
アダプター

鋳型DNA
：識別用配列①：遺伝子増幅用配列：識別用配列②：リンカー配列

PCR産物

アダプター

ライゲーションによるアダプター付加

ライブラリ化

：識別用配列③

上記以外のカスタム解析につきましても、ご要望に合わせて対応いたしますのでお気軽にご相談ください。

代理店
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