『愛媛大学社会共創学部紀要』第８巻第１号

論

2022年

p.35－39

説

流路を移動する植物プランクトンの深層学習による自動計数
小長谷
寺 田
白 石
中 山
高 橋
柴 田
清 水山 本圭 志（産業イノベーション学科）
淑 乃（農学研究科）・谷涼 太（理工学研究科）・
悠 介（理工学研究科・修了生）・未奈美（産業イノベーション学科・卒業生）・
学・八 木 秀 次（産業イノベーション学科）・論・穆盛林（理工学研究科）・園 子（南予水産研究センター）・
智 規（産業イノベーション学科）

An Automatic Counting of Moving Phytoplankton in Channel using Deep Learning
Keiji KONAGAYA（Department of Industrial Innovation）,
Yoshino TERADA（Graduate School of Agriculture）,
Ryota TANI（Graduate School of Science and Engineering）,
Yusuke SHIRAISHI（Former Student of Graduate School of Science and Engineering）,
Minami NAKAYAMA（Former Student of Department of Industrial Innovation）,
Manabu TAKAHASHI, Hidetsugu YAGI（Department of Industrial Innovation）,
Satoru SHIBATA, Shenglin MU（Graduate School of Science and Engineering）,
Sonoko SHIMIZU（South Ehime Fisheries Research Center）,
Tomonori YAMAMOTO（Department of Industrial Innovation）
キーワード：植物プランクトン、深層学習、移動物体検出、滞留プランクトン、微細流路
Keywords: phytoplankton, deep learning, moving object detection, retained plankton, micro channel【原稿受付︰2022 年 1 月 17 日

受理・採録決定︰2022 年 1 月 31 日】

要旨
われわれは、植物プランクトンのモデルであるミドリムシを自動計数する手法として、計数板準備を省略した流路方式を採用した。移動する植物プランクトンの顕微鏡データに深層学習を適用し、植物プランクトンの自動計数を行った。赤潮プランクトンの魚類に対する致死濃度レベル 103 細胞 /mL において、計数板を用いた目視計数との差は 16% 以下に収まった。
１．はじめに沿岸海域での赤潮発生とそれによる漁業被害の低減は世界的な課題であり、その対策業務の省力化が望まれている（石田、1997 ）。赤潮とは海水や湖沼の色が植物プランクトンの大量発生によって色付くことを指す（日色 , 1991 ）。この原因は富栄養化をはじめとした増殖因子の変動、生物環境の変動が考えられている（日色、1991 ）。赤潮による漁業被害を最小限に抑えるには、その発生を早期に予測することが求められる。従来からの赤潮の判断指標として、クロロフィル蛍光（和西、2007 ）、分光反射率（稲村ら、1985 ）の測定などが挙げられるが、これらの手法では大量発生しやすい種や有害な種を判別して計数することはできない。それに対して、画像処理技術に基づくヴィ
ジュアルプランクトンレコーダー（Visual PlanktonRecorder; VPR）
（市川ら、2014 ）や分子生物学手法の一つである環境 DNA 解析では、プランクトンの種類とその量を同時に知ることができるため、注目を集めている。オンサイト分析では、VPR などの簡易な光学顕微鏡と画像処理を組み合わせた方法が実用化に近い。
光学顕微鏡と画像処理を用いた方法では、検査が三－ 35 －

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つの段階に分けられる。すなわち、海水サンプリン
グ、計数板準備、計数の三つである。最初の段階である海水サンプリングにおいては、ドローンや ICT を活用して、多地点・複数回に及ぶ作業を省力化する研究が行われている（安藤ら、2016 ）。宇和海では、愛媛県と愛媛大学により赤潮発生情報のデータベース「You see U-Sea」が公開され、現在は漁協や地方自治体を含む「宇和海水温情報運営協議会」により運営されている。また、三つ目の段階である計数についても自動化の試みがなされている（寺田ら、2019 ）。ここで、細胞や浮遊物を計数するアルゴリズムを三つに大別すると、研究者が自ら特徴量とその変数の閾値を設計する方法、研究者が特徴量のみを指定し分類方法を学習する方法、特徴量すら設定しない方法がある（藤吉、2019 ）。こうした深層学習を赤潮プランクトンの自動計数に適用しようという試みは長崎大学を中心とするグループにおいて公開されているものの、仕様や計数精度の詳細な報告はなされていない（総務省、2019）。われわれが対象としている愛媛県宇和海では、プランクトン計数の自動化を 2018 年より検討してきた（寺田ら、2019 ）。先に述べた長崎大学らのグループとの違いは、プランクトンを含む計数板の準備作業を不要とする点である。本稿で示す方法は、顕微鏡対物レンズ下に流路を設けてそこに試料を流す方法で、計数板の準備作業を省略している。この方法では希釈から顕微鏡による計数までを連続して自動化できるという大きな利点がある。
このような流路を用いて画像処理により細胞を計測する方法では、FlowCAM® が同様の研究で用いられている（宮村ら、2014; 小池ら、2014 ）。しかし、
FlowCAM では細胞よりも遥かに小さいサブμ m の微粒子までも対象としているため、光学系がワイドレンジ設計であり、高濃度ではかえって定量性が低下するとの報告もある（宮村ら、2014 ）。そこでわれわれは、植物プランクトンに絞った計数システムとすることで、既存の市販品よりも低価格で計数を実現できるか検討した。具体的には、トリガーなどを用いずに植物プランクトンに合わせた流路、顕微鏡、画像処理系の３つにより構成されるシステムである。
本研究では、顕微鏡観察下の流路を移動する植物プランクトン（ミドリムシ）に対して深層学習を適用し自動計数を試みた。また、日本を含む北西太平洋海域に分布する有害赤潮プランクトン種のいくつかで魚類が斃死する危険濃度の一つ 103 細胞 /mL 程度（Imaiet al., 2006; NOWPAP CEARAC, 2007 ）における計数の可能性を調査した。

2021

２．実験方法
2.1. 試料
赤潮プランクトンのモデルとして、ユーグレナ門に属するミドリムシ（Euglena sp.）（藤めだか）を使用した。細胞濃度は日本を含む北西太平洋海域に生息するいくつかのプランクトン種で魚類が斃死する危険濃度である 103 細胞 /mL 程度における（Imai etal., 2006; NOWPAP CEARAC, 2007; 城、1985 ）の二つの値を設定した。水で希釈した後、最終濃度が 1.76× 103 お よ び 3.08 × 103 細 胞 /mL と な る よ う に 10mL ずつ調整し、１ mL ずつ流路に右から左へ連続的に流して計数結果を比較した。試料を交換する際には、水で流路を洗浄したのち、次の試料を注入した。従来法との比較のため、同じ未固定試料をプランクトン計数板 MPC-200（松浪硝子工業製）に注入して、光学顕微鏡で計数し、１ mL あたりに換算して示した。
2.2. 流路構造と計数方法
流路構造の決定においては、海水サンプルの浮遊物のサイズを考えることとした。本研究では赤潮対策省力化を目指しているため植物プランクトンが対象となり、特に大量発生や有害生産物の観点からモニタリングに重要なプランクトンを識別する必要がある。動物プランクトンの多くは 0.1 mm を上回る体サイズをもつが、植物プランクトンの多くはこれより小さい（千原ら , 1997 ）。このことに基づき、撮影および計数に用いる微細流路の断面厚を 0.1 mm に設定した。なお、環境省は動物プランクトンやそれ以外の浮遊物は 0.1mm メッシュを用いて事前に取り除く方法を示しており（環境省自然環境局生物多様性センター、2013 ）、これを想定した。顕微鏡の被写界深度が浅いと奥行き方向にプランクトンの見逃しが生じるため、顕微鏡のコンデンサにより調整した。
流路はスライドグラス（ 25 mm × 75 mm × １mm）# 7101（Shangdong Harmowell Trade 製）２枚を 0.1 mm 厚のフッ素樹脂テープ T6-5S-1P（トラスコ中山製）により離すことで作製した（Fig. 1a）。これらは UV レジン クラフトアレンジ（ケミテック製）（アクリレートプレポリマー）を用いて固定した。流路の幅と長さはスライドグラスの寸法から接着部分を除いた部分となり、それぞれ 17 mm、70 mm となった。導入部にはシリコンチューブ（内径 0.5 mm、外径 1.0 mm）を用いた。
顕微鏡 SD200DL（SWIFT 製）を使い透過明視野照明で撮影される計数可能領域を Fig. 1b に示した。
計数可能領域の寸法は幅 W 1.0 mm × 長さ L 1.5 mm
× 深さ d 0.1 mm であり、流路断面のうち計測した断面積は W × d = 1.0 mm × 0.1 mm = 0.1 mm2 であ－ 36 －

流路を移動する植物プランクトンの深層学習による自動計数

（a）

（b）

Fig. 1 Schematic diagram of the experimental set-up.（a）Schematic diagram of the flow channel.（b）Exemplar microscopic
image of the flowing phytoplankton.

る。顕微鏡の対物レンズは倍率 10 ×、NA 0.25 であった。デジタルカメラ SC633-R-FL（SWIFT 製）（ 630万画素）で撮影した。顕微鏡写真および視野寸法はこれよりも狭くした。流路中央の１視野について 5 分間撮影した。
2.3. 深層学習
フレームレート f を平均的移動速度 v （ 1.5 mm/s）と計数領域の流路長手寸法 L’< L = 1.5 mm の比率から求まる滞在時間 T = L’/v の逆数にすることで（f= 1/T = 3 fps）、フレーム間のプランクンの重複を実質的に無くすことができる。これにより、プランクトン数の計算は撮影動画フレームから切り出される静止画中の物体検出に帰着させることができる。画像処理には、Python を使用した。学習データと検証データの組み合わせはそれぞれ 800 枚とし、内訳は各濃度で400 枚とした。
検出枠であるバウンディングボックスの候補を計算する際に必要となるアンカーボックスの数は、学習データの平均 IoU（Intersection Over Union）に基づいて、平均 IoU が 0.5 より大きくかつ増加が漸近に達した９とした。アンカーボックスの形状やサイズは、予備検討より求めた。特徴量の抽出を効率化するため、ImageNet データベースから配布されている汎用の特徴抽出層 darknet-53 を使用した。検出層には YOLO（you only look once）v3 を使用した。YOLO は検出と分類を同時に行えるため、高速性を要求される場合に有効である（Redmon and Farhadi, 2018 ）。パラメーターとして、ミニバッチサイズは 32、初期学習率は 0.001、最大のエポック数は 50 とした。

３．結果
Fig. ２に本システムにおいて流路を移動するプランクトンを深層学習により検出しているようすを示す。一方で学習データのうち、15% のプランクトンは太枠で示したように滞留した。計数結果が実測値に対して著しく過剰に算出した（滞留プランクトン数×フレームレート×計測時間の積）。そこで、滞留するプランクトンを流れるプランクトンと区別する分類アルゴリズムを追加した。
つまり、各フレーム画像内の細胞にラベルを付け、次のフレーム画像のラベルとの距離が一番近いプランクトンを認識させ、その距離がアンカーボックスの一辺未満であれば前フレームと同じ個体ラベルを付けるようにした。そして、３フレーム連続して存在するプ
ランクトンは滞留プランクトンと判定し、累計数から差し引く処理を行った。すなわち、そのままのプランクトンの累計数 NRaw、滞留プランクトンの累計数
NRetention として、真のプランクトンの累計数 NTotal を以下の（ 1 ）式により計算した。
NTotal = NRaw – NRetention
式（ 1 ）
今回の場合、試料体積 V は 1 mL であるので、細胞密度は累積数と等しい。
その結果、Table １に示すように、計数板を用いた目視計数との差は 1.76 × 103 細胞 /mL で 0.9 ～ 6.3%、
3.08 × 103 細胞 /mL で 4.2 ～ 16% となり、目視計数との差は 16% 以下に収まった。目視計数の結果も一－ 37 －

『愛媛大学社会共創学部紀要』第６巻第１号

般的には１～２桁の有効桁数で表されることを踏まえると（東京都環境局、2020 ）、誤差 16% という今回の結果は有効桁数１桁の表示については実用に足ると判断できる。また、今回の濃度は先行研究（宮村ら、2014 ）において FlowCAM の定量性が悪いとされる濃度であった。サンプル自体が異なるため直接比較することはできないものの、今回の結果は流路の断面サイズの変更によりプランクトンの定量性が向上する可能性を示唆した。
今回、われわれは計数板準備を省略した流路を移動するプランクトンの計数において、深層学習と滞留プランクトン補正アルゴリズムの組み合わせが有効であることを示した。プランクトンが滞留する現象は海底におけるシスト形成などで報告されている（千原ら、1997 ）。流路を用いた計数においては、平均的移動速度を基準に撮影のフレームレートを決定したため、集団に従わない例外的な移動速度を持つプランクトンを個別に計数する必要があった。今後検討できる他の計数法としては、滞留プランクトンの密度やサイズに着目して分離する方法も考えられる。
深層学習についても今回は ImageNet データベー
ス か ら 取 得 し た darknet-53 を 特 徴 抽 出 に 用 い たが、深層学習の精度を比較した文献では単純な CNN（convolutional neural network）４層でも darknet-53と同じデータベースリソースによる ResNet-50 と同等 の 正 答 率 を 示 す と い う 報 告 も あ り（Itakura andHosoi、2020 ）、実行に必要なメモリのダウンスケー
ルのためには、より最適な層の選定が可能と思われる。

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デジタルカメラを用いて画像を取得し、深層学習を適用して自動計数を試みた。その結果、日本を含む北西太平洋海域に生息する赤潮プランクトン危険濃度範囲の 1.76 × 103 および 3.08 × 103 細胞 /mL の二つの条件において本手法が適用でき、計数板準備の作業から計数に至るまでを連続して省力化できる可能性が示された。今回は赤潮の指標となる植物プランクトンのモデルとしてミドリムシを選定したが、今後は赤潮の早期発見に重要なプランクトン（Karenia mikimotoi,Chattonella marina/antiqua 等）の分類と計数が必要であり、形状や動きといった特徴が活用できると考えられる。今後、実際の海水サンプルの前処理方法やそれに続く赤潮プランクトンの分類と計数などについて取り組んでいきたい。

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流路を移動する植物プランクトンの深層学習による自動計数
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『愛媛大学社会共創学部紀要』第６巻第１号－ 40 －

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