Analyses on biocompatible polymer poly(2methoxyethyl acrylate) (PMEA)/water interface.
Daiki Murakami1, Masaru Tanaka2,*
1: Department of Biological and Environmental Chemistry, Faculty of Humanity-Oriented Science andEngineering, Kindai University, 11-6 Kayanomori, Iizuka, Fukuoka, 820-8555, Japan
2: Institute for Material Chemistry and Engineering and Graduate School of Engineering, Kyushu
University, Fukuoka 819-0395, Japanmasaru_tanaka@ms.ifoc.kyushu-u.ac.jp
Poly(2-methoxyethyl acrylate) (PMEA) is a well-known biocompatible polymer. We performed thedetailed analyses of the interfacial structure and property on PMEA/water interface. Atomic force
microscopy (AFM) revealed the presence of fine structures on PMEA/water interface. Thesestructures are generated by the phaseseparation of polymer and water at theinterfacial region. The polymer-poor (water-rich)regions contribute to the biocompatibility ofPMEA. Our research revealed that the polymer
density on the interface is an important factor.
Frequency modulation AFM demonstrated thatthe hydrated polymer layer causes the repulsion
force in the polymer-poor region on thePMEA/water interface. Thus the hydration ofwater molecules (called Intermediate water) on
PMEA interface is a key of the biocompatibility.

Keyword: PMEA, biocompatibility, interface, hydration, AFM
Daiki Murakami has been a lecturer at Kindai University since 2022.He received aPh.D from Kyushu University in 2009. He worked as a researcher in Kyushu
University and visited University of Bayreuth (Germany) in 2009. In 2010~2015, heworked for the research of polymer surface in JST ERATO project and moved toSAGA Light Source. He started the research of biomaterials as an assistantprofessor in Kyushu University in 2015~2022. His main research field is interfacial
analysis on polymer materials, and he published over 50 papers in peer reviewed
journals.
Masaru Tanaka worked for TERUMO Co. and commercialized medical devices
such as artificial lung (Approved by FDA and Global market’s No.1 share). In 2000
he moved to Hokkaido University and in 2007 he moved to Tohoku University. He
was a Visiting Scientist, at Max-Planck-Institute (2008-2009). In 2009 he wasawarded a full professorship at Yamagata University. Since 2015, he has been atKyushu University as a full Professor. Thus far, he has published over 200 papers inpeer reviewed journals (H-index 56), 50 book chapter, 125 others, more than 250patents. He received the Japanese Society for Biomaterials Award, the SPSJ Asahi
Kasei Award, and the British Council PMI2 Connect-Research Co-operation (UK) Award.

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生体親和性高分子 Poly(2-methoxyethl acrylate) (PMEA)／水界面の構造解析
村上大樹 1、田中 賢 2

1: 近畿大学産業理工学部、2: 九州大学先導物質化学研究所
１．背景
少子高齢化社会を迎えている現代、高い生制しながら、他の接着性細胞は接着する細胞選活水準を維持するために医療機器の発展は必

がん細胞の分離・診断技術への応用などが期要不可欠なものとなっている。医療機器には待されている。PMEA のこのような性質には、生様々な金属材料や高分子材料が用いられるが、体の主成分である水との特異な相互作用が深く血液や生体組織と接触して使用される材料の関わっていると考えられている。通常、含水状態

場合、時間経過とともに血液の凝固や生体成分の高分子材料中では高分子鎖と弱く相互作用の付着などにより十分な機能を発揮することがした自由水と、強く相互作用した不凍水の 2 種できなくなってしまう。例えば人工血管や透析膜類の水が観測される。PMEA の場合には自由水、のように血液と接する材料では、血液との接触不凍水に加えて、それらの中間的な性質を有す後すぐに血液凝固や血栓形成が生じ、生命にる「中間水」が存在することが、熱測定や赤外分関わる重大な事故に繋がってしまう可能性があ

光測定、NMR 測定から解明されている。5-7 このる。そのため、生体と接触して使用される材料、中間水の存在が PMEA の特異な性質の根幹をすなわちバイオマテリアルには、高い生体親和担っていることが、これまで種々の研究から報告性が求められる。

されている。

択的な特徴を有しており、例えば血液中からの特に血栓形成反応を抑制する性質である「抗しかし、なぜ PMEA は含水することで中間水血栓性」を有する材料は、血栓形成反応の初期を生じるのか、中間水が具体的にどのように抗過程である材料表面へのタンパク質の吸着・構血栓性に寄与しているのかについては不明な造変化や血小板の粘着・活性化を抑制すること点も多い。本稿では PMEA／水界面の構造・物が重要となる。抗血栓性材料の研究は数多く為性解析を通して、そのメカニズムの解明に向けされ、高機能な材料も開発されているが、具体た一連の研究成果を紹介する。

的に材料表面のどのような性質が機能発現に本質的に寄与しているのか、いまだに明確な答えは得られていない。

２．PMEA／水界面の AFM 観察 8PMEA およびその類似化合物である poly(3-Poly(2-methoxyethyl acrylate) （PMEA；Fig.1methoxypropyl acrylate) (PMC3A), poly(n-butyl

中の化学構造参照）は近年高い注目を集めてacrylate) (PBA), poly(2-methoxyethyl metha-

い る 抗 血 栓 性 高 分 子 材 料 で あ る 。 poly(2-crylate) (PMEMA)を polyethylene terephthalate

methacryloyloxyethyl(PET)基板上にスピンコートし、原子間力顕微鏡phosphorylcholine)など(AFM)による観察を行った。Fig. 1 には PBS 中のよく知られた抗血栓性高分子が水溶性を示での観察結果を示している。（図中では x, y 軸すのに対し、PMEA は非水溶性であるためコーは 2 µm のスケールで示し、z 軸はより拡大してティングが容易であることに加え、優れた抗血栓示している。）PMEA は乾燥時（空気／PMEA 表性を有している。また、PMEA は血栓形成を抑面）ではほぼ完全に平滑な界面であったのに対(PMPC)

1,2や poly(ethylene glycol) (PEG)

3,4

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し、PMEA／リン酸緩衝生理食塩水（PBS）界や PMC3A と同様に、生体温度である 37 ℃で面では数十～百ナノメートル程度の微細な凹凸は界面にナノメートルスケールの微細構造が一構造が界面一様に観察された。この構造は純様に形成していた。しかし、この界面構造は温水との界面でも同様に観察されており、PMEA と度低下と共に減少し、22 ℃ではほぼ平滑な界水の相互作用に起因した構造であると考えられ面が観察されたが、温度を 37 ℃に戻すことで再た。PMEA と同様に中間水を有し優れた抗血栓び発現した。類似の界面構造の変化が以前に性を示す PMC3A についても同様の現象が観察

高分子ブラシ／溶媒系で観察されており、界面さ れ た 。 一 方 、 中 間 水 を 有 さ な い PBA やにおける高分子と溶媒の面内ミクロ相分離に起PMEMA では水中、PBS 中において界面形状の因するものと推察されている。 10 今回我々が観変化は観察されたものの、その構造は前述高分察した、下部臨界溶解温度よりもわずかに高い子のように均一ではなく、大きな凝集体や不規温度で構造変化が起こる挙動は、この高分子ブ則な界面構造が形成されていた。これらの結果

ラシ系での報告と類似している。このことから界から、界面構造と中間水の存在には相関関係

面構造の形成駆動力は、高分子/水界面領域があることが予想される。そのため、この界面構における高分子密部、高分子疎部への面内相造についてより詳細な検討を行った。

分離現象によるものと結論付けた。この相分離現象は膨潤し、高分子と水が高い割合で混ざり合った界面領域で発現する。またバルク中での高分子の絡み合いのためにナノメートルスケールの相分離構造が生じ、さらに高分子疎部における少量の高分子鎖の存在は AFM では感知できないため、Figs. 1, 2 に示したような凹凸構造が観察されたと予想している。

Fig. 2 Temperature dependence of interfacial
structures of PMe2MA/PBS interface.
Fig. 1 Interfacial structures of polymer/PBS

さらに、面内相分離構造と生体親和性との相interfaces observed by AFM.

関を検証するために、PMe2MA を用い、抗血栓9３．界面構造の形成駆動力の解明
ここでは上述の界面構造の形成駆動力を明性を示す重要な生体現象である血小板粘着のらかにすることを目的に研究を行った。PMEA とた。ヒト全血から採取した血漿成分を高分子膜と同様に中間水を有して抗血栓性に優れ、PBS接触させ、その後血小板の粘着数を走査型電中で約 19 ℃に下限臨界溶解温度を有する高子顕微鏡により観察した。Fig. 3 には PET,分 子 で あ る poly[2-(2-methoxyethoxy)ethylPMEA, PMe2MA 上における血小板粘着数を示

methacrylate] (PMe2MA) を 合 成 し 、 PMe2MAしている。高分子未コートの PET 基板上では温/PBS 界面の AFM 観察を行った (Fig.2)。PMEA

度によらずほぼ一定の、高い粘着数を示していAcc. Mater. Surf. Res. 2023, Vol.8 No.3, 159-165.

度合いを 37℃および 22℃のそれぞれで測定し161た。それに対し、PMEA 上では 37℃、22℃のどた。PBA の方が強い引力が働いているのは、疎ちらにおいても血小板粘着数は極めて低く、高水性相互作用がより強く働いているためと考えい抗血栓性が確認された。一方、PMe2MA の場られる。この引力は PBA 疎部においてはかなり合には 37℃では PET の半数ほどであった血小弱まっていた。これは高分子疎部では密部に比板の粘着数が、22℃では顕著に減少していた。

べて多量の水を含んでおり、そのため疎水性相

Fig. 2 の AFM 観察の結果から、22℃では高分互作用が弱まっていることによる。一方、興味深

子密部がほぼ消失し、一面が高分子疎部で被いことに、中間水を有する PMEA では疎部にお覆されたような状態と考えられる。このことから、

いて引力は観測されず、緩やかな斥力のみが高分子疎部が血小板粘着の抑制に寄与してい観測され た。こ のことは、フ ィブリノ ーゲン がることが予想された。

PMEA 疎部には吸着せず、密部に優先的に吸着するということを意味している。Fig. 4 には代表的な相互作用カーブのみを載せているが、各点で測定した吸着力をヒストグラム化した結果をFig. 5 に示す。明らかに、PMEA の疎部ではフィブリノーゲンの吸着が起きていないことが確認でき、PMEA の優れた抗血栓性には、界面相分離構造の高分子疎部におけるフィブリノーゲンの吸着抑制が大きく寄与していることが明らかとなった。

Fig. 3 Temperature dependence of platelet
adhesion on PET, PMEA and PMe2MA.

さらに最近の研究では、タンパク質の種類によって、高分子密部・疎部への吸着挙動が大きく異なることも分かってきている。 12 血球細胞は４．PMEA 表面-フィブリノーゲン間相互作用の評価 11
ここでは上述したような高分子疎部が血小粘接着しないが、その他の多くの細胞は接着する
PMEA の選択的な細胞接着性にもこの界面構造が関連していると予想できる。

着を抑制するという考えをより定量的に評価することを目的とした。材料表面への血小板粘着や細胞接着は、初めに生体中のタンパク質が材料表面に吸着し、構造変化を起こして細胞接着部位を露出することで引き起こされる。ここでは血小板粘着・血栓形成の重要な足場タンパク質であるフィブリノーゲンを AFM 用カンチレバーの探針に修飾し、界面の相分離構造の各部との相互作用を測定した。高分子には PMEA と、含水時に中間水をほとんど形成しない PBA（Fig.
1 参照）を使用した。各高分子の高分子密部・疎部それぞれにおける相互作用測定の結果を Fig.
4 に示している。高分子密部では PMEA, PBA ど

Fig. 4 Interaction-distance curves on PMEA/PBS

ちらにおいても、ある距離において探針が界面and PBA/PBS interfaces.に引き寄せられる、引力的相互作用が観測されAcc. Mater. Surf. Res. 2023, Vol.8 No.3, 159-165.

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Fig. 5 Histograms of interaction on (A)PMEA and(B)PBA. (red)polymer-rich, (blue)polymer-poor.
(inlet) detailed histograms in narrow range.
Fig. 6 PMEA density dependence of fibrinogen５．高分子ブラシを用いた PMEA 密度と抗血栓性の関係の評価 13
高分子密部、疎部でタンパク質の吸着挙動が異なることを示したこれまでの結果から、界面における PMEA の密度がタンパク質吸抑制や抗血栓性に大きく関わることが予想できる。そこで
PMEA の界面密度を制御して抗血栓性との関係を評価するために、高分子鎖の片末端を基板に化学的に固定した高分子ブラシを合成して研究を行った。はじめに末端にチオール基を有する PMEA を合成し、金表面に graft-to 法により修飾した。修飾する際の溶液濃度や反応時間を変えることにより、様々な界面密度の PMEA ブラシを作製した。PMEA ブラシの密度は水晶振動子マイクロバランス（QCM）法により決定した。
QCM 法により測定した PMEA ブラシ上でのフィブリノーゲン吸着量と PMEA 密度 (σ)との関係を Fig. 6 に示している。また PMEA のキャスト膜で得られたフィブリノーゲンの吸着量（PMEAfreecast）も 同時に示し てい る。 σ = 00.042 chains/nm2 の低密度領域では、グラフト密度の増加に伴い、フィブリノーゲン吸着量は減少 す る 傾 向 が 観 察 さ れ た 。 σ = 0.09-0.12chains/nm2 の範囲では PMEAfreecast よりも吸着量が少なく、σ= 0.12 chains/nm2 付近で最小値となった。一方、σ= 0.12-0.13 chains/nm2 の範囲では密度の増加に伴って、吸着量は増加する傾向を示し、σ= 0.13 chains/nm2 での吸着量は 0.70 µg/cm2 と最小値とは明らかに有意な差を示していた。
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adsorption on PMEA brushes.

さらに、ヒト全血を用いて、密度制御したPMEA ブラシ上での血小板粘着数の評価を行った (Fig. 7)。血小板の活性化度は I 型から III型に向かうほど血栓形成を誘起する。したがって、血小板が粘着していても III 型が多い高分子
より I 型が多い高分子では、血栓形成を惹起しにくいとされている。ネガティブコントロールである金薄膜上には、血小板は多く粘着しており活性化もしていた。対してポジティブコントロール
である PMEA スピンコート膜（PMEAS）は、血小板の粘着を良く抑制しており、粘着した血小板の活性化度も I 型が多く、活性化も抑制していた。PMEA ブラシに着目すると、すべてのグラフト密度において Au 薄膜よりも血小板の粘着を抑制していた。σ= 0.020-0.113 chains/nm2 の範囲ではグラフト密度の増加に伴い、血小板の粘着数は減少する傾向を示した。またσ = 0.1130.124 chains/nm2 の範囲では、PMEAS と同等の血小板粘着数であり、血小板の粘着を良く抑制していた。一方で、σ = 0.131 chains/nm2 にグラフト密度が増加すると、血小板粘着数は増加していた。この高密度領域で抗血栓性が低下する傾向は上述したフィブリノーゲン吸着実験で得られた結果と同様である。
これらの結果から、予想したように PMEA の抗血栓性には PMEA の界面密度が大きく関与していることが分かった。PMEA 密度が高すぎると抗血栓性が低下するという結果は、高密度ではPMEA と相互作用した水分子が排斥されることが原因であると予想される。
163

Fig. 7 PMEA density dependence of platelet
adhesion on PMEA brushes.

6．周波数変調型 AFM を用いた、PMEA の水和膨潤層の観察 14
PMEA の界面密度と抗血栓性を評価した上記の研究から、PMEA は 0.1 chains/nm2 付近で最も抗血栓性が高くなることが明らかとなった。
水和して膨潤した高分子による斥力が抗血栓性発現の理由であると予想したが、そのような極めて弱い相互作用の存在を実証することは容易ではない。そこで周波数変調型 AFM (FM-AFM)を用いた評価を実施した。FM-AFM はカンチレバーの振動周波数をフィードバックに利用することで、従来の AFM に比べて高い分解能での測定が可能である 15, 16。
試料には前項で最も抗血栓性が高かったσ=0.1 chains/nm2 の PMEA ブラシを使用した。また比較のため、Fig.1 に示した PMC3A、PBA,PMEMA についても同様にσ=0.1 chains/nm2 の高分子ブラシを作製し、評価を行った。 FMAFM 測定は島津製作所の SPM8100 を用いて、PBS 中、23℃の条件で行った。
Fig. 7 は FM-AFM 測定による高分子ブラシ／PBS 界面の z-x 平面スキャンの結果を示しており、青白く示された領域が斥力が観測された領域を示している。PMEMA の場合には界面において短距離の斥力が観察された以外には顕著な斥力は観察されず、未修飾金基板とほぼ同様であった。PMEA, PMPA, PBA のグラフト高分子／PBS 界面では高分子密部および高分子疎部ドメインへのミクロ相分離が生じることが従来の AFM 観察により確認されており、ぞれぞれの界面に観測されるドーム状の構造は高分子密部ドメインに対応している。中間水をほとんど
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形成しない PBA の場合には高分子密部ドメインの他には明確な斥力層は確認されず、これは高分子疎部中では高分子鎖と水がほとんど相互作用せず、バルク水に近い水が存在していることを意味している。一方、PMEA や PMPA の場
合には高分子疎部と考えられる領域でも明確な斥力層が観測されており、高分子鎖と水が混和した水和高分子層を形成することで斥力が生じていると予想される。これまでの実験結果から高分子疎部ドメインがタンパク質の吸着および構造変化を抑制することで抗血栓性発現に寄与していることも分かっており、本研究でその起源となる水和高分子層の存在を実証することに成功したといえる。

Fig.7 FM-AFM images of polymer brush/PBSinterfaces.

７．結語
本稿では生体親和性高分子 PMEA の界面構造解析に基づく一連の研究を紹介した。AFMにより発見された PMEA/PBS 界面における微細構造は界面における高分子と水の相分離に起因するものであり、その存在が PMEA の優れた抗血栓性に寄与していることがタンパク質吸着や血小板粘着挙動の詳細な解析により明らかとなった。高分子ブラシを用いた検討では、
PMEA の界面密度が 0.1 chains/nm2 付近で最も抗血栓性が高くなることが明らかとなった。周波数変調型 AFM による観察では、この密度では164

PMEA 界面がほぼ高分子疎部で覆われた状態になっており、高分子の水和膨潤層による明確な斥力が存在する様子も観察された。
これら一連の研究により、PMEA の優れた抗血栓性には界面における高分子の水和状態が大きく寄与していることが明らかとなった。高分子
疎部中で PMEA 鎖と相互作用する水が、PMEAが有する中間水と強く関連していると予想できる。
この関連については X 線や中性子などを用いた解析も行っており、また別の機会で報告したい。最後に、本稿を通して得られた高分子と水の界面における解析結果が、さらなる高機能なPMEA より優れた抗血栓性を有する合成高分子の創製と予防・診断・治療用の医療機器の表面処理技術の発展に繋がることを期待したい。
６．謝辞
本稿で紹介した一連の研究成果は日本学術
振 興 会 科 研 費 (18K12080, 19H05720,22H00591)、「人・環境と物質をつなぐイノベーシ
ョン創出ダイナミック・アライアンス」の助成を受けて実施されました。

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