ナノアーキアの検出と培養株確立の試み

P-10

11,21
隆 ・小笠原綾香 ・加藤真悟 ・雪伊藤112
真弘 ・大熊盛也 ・高品知典

1理研バイオリソース研究センター・微生物材料開発室, 2東洋大学大学院生命科学研究科
INTRODUCTION

COUNCLUSIONS/ DISCUSSION

近年, 大きさが500 nm程度と微小で, 他のアーキアに外部共生（寄生）していると思われる多様なアーキア群（本研究ではナノアーキアと称する）が見つかってきている. このうちNanoarchaeota門アーキア
は, 海底熱水孔や陸上温泉から頻繁に検出されており, これらは超好熱性のCreanarchaeotaアーキアに共生/寄生していると考えられている. これまでに2002年に海底熱水地帯から’Nanoarchaeum equitans’
Kin4-M（宿主はIgnicoccus hospitalis）, 2016年にはイエローストーン国立公園の酸性温泉から’Nanopusillus acidilobi’ （宿主はAcidilobus sp. strain 7A）の培養系が報告されている (1, 2). さらにはSulfolobales目アーキアの一種に共生/寄生していると思われる’Nanobsidianus stetteri’（Nst1）が単一分離され, そのゲノム解析が行われている (3). またカムチャツカの温泉にもNanoarcahotaが検出されており, その宿主はVulcanisata属ではないかと推定されている (4).
この様にNanoarchaeotaはCrenarchaotaが生存する熱水環境には普通に存在しているものと思われるが, その生態学的実態や宿主範囲,共生（寄生）のメカニズムはよく分かっていない. 本研究ではNanoarchaeotaを中心にその分布パターンの解明と培養株の確立を目指すことを目的とした.

図1 培養化されたNanoarchaeota:‘Nanoarchaeum equitans’（左）と’Nanopusillusacidilobi’（右）それぞれ文献(1)・(2)より引用.

（1）Nanoarchaeotaは日本の火山性温泉にもある程度の存在量を持って存在していた. また, 系統学的にもいくつかのグループに分けることができ, これらは他国の火山性温泉のものとは区別することが可能であった. これらのNanoarchaotaは宿主の系統関係よりも地域性や生育環境に依存して多様化した可能性もあるものと思われた.
（2）これまで絶対嫌気性アーキアに共生・寄生しているものだけが知られていたが, 好気的な集積培養でもその存在が確認された. 特にGroup 6に属するNanoarchaeotaは系統枝も長く、その系統学的位置もユニークであった.
（3）MPN培養法では、検出できた一つのアーキア種から複数の異なるNanoarchaeotaクローンが検出された. これらアーキアが単一の細胞から生じたpure cultureである証拠はないが, 異なるNanoarchaeotaが同一のアーキアを宿主とする可能性も見いだされた. 今後はシングルセル・ゲノム解析法も用いてNanoarchaeotaの宿主特異性を検討してみたい.
（4）自然界のNanoarchaeotaの存在量に比べて, 今回培養化したNanoarchaeotaは宿主アーキアに比べて格段に少ないものであった. また継代培養によってもその存在比はさらに減少していくようであった. 今
後は, Nanoarchaeotaの減少を抑えるような培養法・保存法も検討する必要がある.

RESULTS表1

温泉試料 本研究では栃木県及び秋田県の温泉地から採取した温泉水試料を使用した（表1）. このうち, 2016年10月2日に採取した奥塩原温泉・むじなの湯の温泉試料においては非培養菌体からDNAの回収は行わず, 本試料は集積培養だけに用いた. また玉川温泉・噴湯（図2参照）の試料はDNA回収量が低く,菌叢解析には用いなかった.

表2

本研究で用いた温泉水試料

Date

Hot spring sample

2016/10/02

栃木県奥塩原温泉・むじなの湯-1

Temp.
(oC)
45？

pH2.1

DNA（mg/L）
ND

2016/11/06 秋田県玉川温泉・噴湯

85

2.40.49

2016/11/07 秋田県後生掛温泉・温泉細流

45

3.46.55

2016/11/07

50

3.3

6.04

45

2.512.19

秋田県蒸ノ湯温泉・温泉細流

2017/10/02 栃木県奥塩原温泉・むじなの湯-2培養菌体及び非培養菌体からPCR検出したNanoarchaeota

Hot sring sample
奥塩原温泉・むじなの湯-1

奥塩原温泉・むじなの湯-2
玉川温泉・噴湯菌叢解析 後生掛温泉, 蒸ノ湯温泉, 奥塩原温泉について次世代シークエンサーを用いたアーキア・バクテリアの菌叢解析を行った. 各試料の解析リード数はそれぞれ, 57,117, 57,772, 56,644である.

後生掛温泉・温泉細流

図2
湯.

温泉サンプリング地の様子. 左は玉川温泉, 右は奥塩原温泉・むじなの

蒸ノ湯温泉・温泉細流

表3
蒸ノ湯温泉・温泉細流
ArchaealSpecies
奥塩原温泉・むじなの湯

10CloneGroup
6

Air, pH2.5, 70oC, SPrimal

6

Not cultivatedPrimal

1, 3Air, pH2.5, 70oC, N

Primal1

Air, pH2.5, 70oC, S

Primal6

Air, pH5.0, 70oC, S

Nested1

Not cultivated

Nested1, 4Air, pH2.5, 70oC, N

Nested1

Air, pH5.0, 45oC, N

Nested4

Air, pH5.0, 70oC, N

Nested1

N2/CO2, pH5.0, 45oC, TS

Nested1

N2/CO2, pH5.0, 70oC, TS

Nested1

H2/CO2, pH5.0, 70oC, S

Nested5

Not cultivatedPrimal1

Air, pH5.0, 70oC, N

Nested1*S, with So; TS, thiosulfate; without S0 or thiosulfate.

後生掛温泉・温泉細流

0Air, pH2.5, 70oC, NPCR
Detection
PrimalGrowth condition*

Acidianus sp.

20

Nanoarchaeota
Other archaea
Burkhoderiales

304050Sulfolobales
Aquifecales
Acidithiobacteriales
図36070pUWA2 group
Nitrospirales
Thermotage V5 group

8090100

Thermoplasmatales
Rhodospirillales
Other bacteria

Acidianus
brierleyi

各温泉の菌叢（分類群組成：目レベル）

MPN-培養菌体からアーキアとNanoarchaeotaの検出 アーキアとNanoarchaeotaの共生・寄生関係をより具体的に調べるために, 凍結保存してあった温泉水を融解後, MPN分配-集積培養（Air・pH2.5・70oC・S）を行った. この結果, 1,200倍に希釈・分配した培養物は培養管50本中12本にて生育が認められ, これらついてアーキア及びNanoarchaeotaの検出を行った（表3）. その結果, アーキアはAcidianus brierleyi様アーキア（type strainと99.6%相同性）とAcidianus sp.（既知種ではAcidianusambivalensと96.1%の相同性）の2種に分かれた（図6及び表3）. 一方, 検出されたNanoarchaeotaク
ローンはひとつの培養物について複数の塩基配列が得られ, これらはいずれもクローングループ1, 2, 3,4のいずれかであった. 事前の集積培養で検出できたグループ6に属するものは検出できなかった. 尚,
Nanoarchaeotaの16S rRNA増幅物は増幅量が低く,DNA抽出後に時間をおくと, 一次PCRのみによるNanoarchaeotaの検出が不可能となることからNanoarchaeotaの存在比はアーキアに比べて極めて低いものと思われた（図5参照）.

MPN/培養*菌体からPCR検出したアーキアとNanoarchaeota
CultureClone Group (Number)§

No. 1032, 3（3）

No. 111

1, 2, 3 （6）No. 1121, 3, 4 （5）No. 107, 109

Not determined

No. 1011, 2（3）

No. 1021, 3（3）

No. 104

1, 2（3）

No. 1052, 4（2）

No. 106

1, 2, 4（3）No. 108, 110

Not determined

図4 MPN/培養した菌体からアーキア及びNanoarchaeotaのPCR検出のイメージ. 中央マーカ（λ/HindIII）左側はARCH21F/ARCH958Rで, 右側は7mcF/N961Rで一次PCRを行ったものの電気泳動写真. アーキア及びNanoarchaeota由来の16SrRNA遺伝子産物を矢印で示した. それぞれ左から同じ培養物由来DNAを鋳型としたPCR反応液を電気泳動した.

*Cultivated under air, at pH 2.5 and 70oC, with S0.
§Numbers in paretheses are of clones analized.

目レベルによる分類群の構成を図1に示す. 各温泉のアーキア（ナノアーキアを除く）, ナノアーキア,バクテリアの比率は後生掛温泉でそれぞれ33.1%-17.0%-49.1%であり, 同様に蒸ノ湯温泉では51.0%35.7%-12.6%, 奥塩原温泉では26.8%-1.5%-71.5%であった. すなわち, 野外の温泉細流から採集した試料にはアーキアが30%以上を占め, またアーキアの大半はCrenarchaeotaに属し. そのほとんどはSulfolobaceae科に属するものである. 一方, 温泉施設浴槽の菌叢はバクテリアが相対的に増加し, またアーキアにおいてもCreanarchaeotaよりもEuryarchaeotaの方が多く検出された. 本温泉水も火山性酸性温泉であることを考えると, 浴槽内でバクテリアやEuryarchaeotaが優勢に増殖したものと思われる.
NanoarchaeotaはCrenarchaeotaに共生（寄生）すると考えられており, これらの温泉におけるNanoarchaeotaの比率もCrenarchaeotaの存在比に依存しているように思われた. 一方, Nanoarchaeotaのホストアーキアとして知られているIgnicoccus属, Acidilobus属は検出されておらずこれらのNanoarcaheotaはSulfolobales目などのCrenarchaeaotaをホストとしている可能性が高いものと思われた.
また, Nanoarchaeota以外のナノアーキアとしてMicrarchaeotaに属するアーキアも各温泉で0.1〜0.2%とごく低い検出率ながら検出されている. これらはEuryarchaeotaであるThermoplasmatales目アーキアがホストとして有力視されているが, Thermoplasmatalesが比較的多い奥塩原温泉でMicrarchaeotaが特に多いという兆候は見られなかった.

FK-2CL01-102
TM-1GS-3FK-1
0.02
GS-4
MS-F01
CL05-106
CL07_112
CL02_112
CL04-104
TM-2
MJ-3946 MJ-F02
GS-9989
CL01-101
GS-6
CL07-111
GS-F01
CL03-101
CL03-104
978 CL01-104
CL06-111
999 CL01-103
CL03-106
CL02-101
CL03-105
CL03-111
CL02-111
CL04-111
CL02-102
CL03-103
CL03_112
MJ0F01
CL03-102
CL04-103
999 CL05-111
CL01_112
Nanoarchaeal clone
clone CU-1
from Russia
GS01
CL01-105
999
GS0F02923 CL01-106
CL04_112‘Nanopusillus acidilobi’
Ca. Nanobsidianus stetteri Nst1
clone YLNA039
Nanoarchaeal clones fromclone YLNA028
USA/New Zealand
1000
clone YLNA007clone YLNA004
1000
clone PKF15
clone OP-9GS08
1000
D8-1
1000 MJ02
MJ01
MJ04
1000
clone A39
Nanoarchaeal clones fromclone A2
clone NZ13
China/New ZealandNanoarchaeon from
‘Nanoarchaeum equitans’ Kin4-M
a hydrothemal area
Thermoplasma volcanium
Ca. ‘Nitrosocaldus yellowstonensis’
Sulfolobus solfataricus
Vulcanisaeta distributa

0.01

1000
979

951 Acidianus infernus
Possible host archaeon No. 112
1000

Possible host archaeon No. 101
Acidianus brierleyi
Metallosphaera tengchongensis

1000997

Metallosphaera cuprina
Metallosphara hakonensis
1000 Metallosphara prunaeMetallosphara sedulaGroup 3Group 5Group 6

Acidianus ambivalens

Acidianus sulfidivoransGroup 2Group 4‘Acidianus hosopitalis’

996Group 1

非培養菌体及び培養菌体からNanoarchaeotaの検出 メンブレンフィルターで回収した非培養菌体のうち, 玉川温泉試料は一次PCR（primal PCR）あるいはネステッドPCR（nested PCR）においてもNanoarchaeotaは検出できなかったが, それ以外の試料からはNanoarchaeotaが検出できた. 一方, 集積培養を実施したものはほぼ全てでアーキアまたはバクテリアの生育が確認されたが, 生育量が多かった12培養液の培養菌体を用いてNanoarchaeotaの検出を行った. これら非培養菌体及び培養菌体から検出できた
Nanoarchaeotaクローンは6つの小グループに分けることが可能であった（図5及び表2）. これらのうち,一次PCRで検出できたのは奥塩原温泉・むじなの湯と蒸ノ湯温泉・温泉細流由来の未培養菌体, あるいは奥塩原温泉・むじなの湯の培養菌体（好気, pH2.5, 70oC, 硫黄添加または無添加）のみであった. 一方, 集積培養物を継代培養すると一次PCRによる検出は次第に困難となる傾向が観察された.

Nanoarchaeota

アーキア

Sulfolobus acidocaldarius

図6（上） 検出されたアーキアの系統樹. 近隣結合法による系統樹. 比較塩基数は816, ノードの数値はbootstrap値（1,000回）, barは0.01置換/塩基をしめす. アウトグループはSulfolobus
acidocaldarius.

図5（左） Nanoarchaeotaの系統樹. 近隣結合法による系統樹. 比較塩基数は659, ノードの数値はbootstrap値（1,000回）,barは0.02置換/塩基をしめす. アウトグループは
Euryarchaeota・Thaumarchaeota・Crenarchaetota代表種.
Group 1〜6は本研究で見いだされたNanoarchaeotaの小グループ.

METHODS
表4集積培養温泉試料

メンブレンフィルターによる細胞捕集

DNA抽出

凍結→MPN培養

図7

PCR検出↓シークエン
ス解析
菌叢解析

実験の流れ

温泉試料 本研究では表1に示す栃木及び秋田県の温泉から温泉採取を行った. 温泉水は研究室に2日以内に持ち帰り, 直ちにメンブレンフィルターによる細胞捕集, 集積培養培地への接種, 5％DMSOを加えた凍結保存（-80℃）を行った.
集積培養 Nanoarchaeotaの培養性について確認するために, Sulfolobus改変培地を用いて生育温度（45・70・85 ℃）, 気相（好気・N2-CO2 (4:1,v/v)・H2-CO2 (4:1,v/v)）, pH (2.5・5.0), 添加物の有無（硫黄・チオ硫酸・無添加）を変えていくつかの培養条件を設定し, 培養を行った.
メンブレンフィルターへの細胞捕集 未培養菌体を得るため温泉水1リット
ルを一旦3.0 µm孔径メンブレンフィルターに通し, その濾液を0.2µm孔径メンブレンフィルターにて濾過し, メンブレン上に細胞を回収した. 本メンブレンは使用するまで-20℃にて保存した.
MPN培養 凍結保存してあった温泉水を融解後, 集積培地を用いて120倍,1,200倍, 12,000倍に希釈し, それぞれ各1mlを50本ずつの3mlバイアル瓶に分注した後, 好気・pH2.5・70℃・硫黄存在下（Air, pH2.5, 70C, S）の条件で集積培養を行った.

DNA抽出 培養菌体からDNA抽出は, 一旦培養液から遠心法により細胞を回収し, これよりnexttec DNA isolation system(Nexttec GmbH)を使用してDNAを抽出した. 未培養菌からのDNA抽出はメンブレン上に捕集した菌体をsalineEDTAに懸濁しマニュアル法によりDNAを抽出した.
PCR検出及びシークエンス解析 上記の抽出DNAを用いてNanoarchaeota特異的プライマーを用いたNanoarchaeotaの検出およびNanoarchaeotaを除くアーキア（Crenarchaeota及びEuryarchaeota）のPCR検出を行った.
Nanoarchaeotaの検出では一次PCR法（primal PCR）またはネステッドPCR法（nested PCR）を用いた. それぞれのPCRプログラムは図6に示した. 一次
PCR法におけるPCRプライマーは7mcF/1511mcR, 7mcF/NA-1080R, NANO571F/1511mcRを使用し, またネステッドPCR法では一次PCRは7mcF/1511mcR, 二次PCRは7mcF/NA-1080Rで行った. 一方, MPN-培養法におけるNanoarchaeotaの検出は7mcR/N961Rを用いた一次PCRを行い, さらにNA-40F/A-910Rで二次PCRした産物をシークエンス解析に用いた. アーキアの検出はARCH21F/ARCH958Rを用いた一次PCR法によった. Nanoarchaeota
及びアーキアのシークエンス解析はクローニングを行い, 代表クローンについてシークエンス解析を行った. またMPN-培養によって検出したアーキアはPCR産物を直接シークエンスした.
菌叢解析 菌叢解析は秋田の後生掛温泉及び蒸ノ湯温泉, また奥塩原むじなの湯温泉抽出したDNAからNanoarchaeotaを含むアーキアとバクテリアを検出するためにU790F及びU1110Rを設計し, その16S rRNA増幅産物ライブラ
リーについてMiSeqを用いたpaired end法によってシークエンス解析を行った. 解析データはリードトリミング, ペアリードの連結を行い, クラスタリングされたOTUsを16S rRNAデータベースと相同性検索を行い, 群集解析を実施した（北海道システム・サイエンス株式会社へ委託）.

本研究で使用したPCRプライマー

Name

5’-Sequence (E.coli number)

TargetReference

U790F
U1110R
7mcF
1511mcR
NANO571F
N961R
NA-1080R
NA-40F
ARCH21F
ARCH958R
A-910RAAMGGGATTAGAKACCC (781 > 797)
CGGGTCKYGCTCGTT (1101 <1115)
CTCCCGTTGATCCTGCG (7 > 23)
CGGCTACCTTGTGTCGACTTAG (1490< 1511)
GCYTAAAGSGBYCGTAGC (571> 588)
CMATTAAACCGCRCACCC (944 < 961)
CCTGTTAAGTCAGGAAAC (1086 <1103)
GGCCACCGCTATCTCC (27 > 42)
TTCCGGTTGATCCYGCCGGA (7 >26)
YCCGGCGTTGAMTCCAATT (958 < 976)
CCGCCAATTCCTTTAAG (910 < 927)

Universal
Universal
Nanoarchaeota
Nanoarchaeota
Nanoarchaeota
Nanoarchaeota
Archaea
Nanoarchaea
Archaea
Archaea
ArchaeaThis study
This study(a)(b)
This study(b)This study
This study(c)(c)
This study

For Primal or initial PCR amplification（2U/100 µl of ex-Taq DNApolymerase ）94oC(4min)-[94oC(1min)-65oC*(1min)-72oC(2min)/20 cycles (*decreasing
by 0.5oC step-1)]- [94oC(1min)-55oC(1min)-72oC(2min)/25 cycles]72oC(7min)-4oC
For second PCR amplification（1U/100 µl of ex-Taq DNA
polymerase ）95oC(5min)-[94oC(1min)-60oC**(1.5min)-72oC(2min)/5cycle(**decreasing
by 1.0oC step-1)]- [94oC(1min)-55oC(1.5min)-72oC(2min)/25cycle]72oC(10min)-4oC(a) Hohn et al., 2002; (b) Casanueva et al., 2008; (c) DeLong et al., 1992

図8

PCR検出で使用したプログラム

REFERENCES
1.
2.
3.
4.

Huber, H. et al. 2002. A new phylum of Archaea represented by a nanosized hyperthermophilic symbiont. Nature 417, 63-67.
Wurch, L. et al. 2016. Genomics-informed isolation and characterization of a symbiotic Nanoarchaeota system from a terrestrial geothermal environment. Nat.
commun. 7, 12115.
Podar, M. et al. 2013. Insights into archaeal evolution and symbiosis from the genomes of a nanoarchaeon and its inferred crenarchaeal host from Obsidian
Pool, Yellowstone National Park. Biol. Direct 8, 9.
Mardanov, A.V. et al. 2018. Microbial diversity in acidic thermal pools in the Uzon Caldera, Kamchatka. Antonie van Leeuwenhoek (2018) 111: 35-43.