免疫工学による免疫システム分子機構の解析
Analysis of molecular mechanisms in the immune system by immunoengineering

Ⅰ. T細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウスを用いたアレルギー発症機構の解析
─ Mechanism of allergy induction analyzed by using T cell antigen receptor gene transgenic mice ─
日本医科大学

医学部

医学科

微生物学・免疫学

熊谷准教授

善博

Yoshihiro Kumagai (Associate Professor)

Department of Microbiology and Immunology, Nippon Medical School and Graduate School of Medicine

免疫のパラダイムを図 1 に示したが、異物に対する反1. はじめに応の強弱、反応対象の異物の属性によって免疫応答

免疫工学とは、免疫系の機能分子、担当細胞、個体の内容が大きく異なっている。免疫は、スーパーシステムに対し、遺伝子工学、細胞工学、タンパク質工学、発生ともいえる精緻な細胞相互作用と介在分子によるネット工学などの、いわゆる生命に手を加える手法により、免ワークを形成しているが、システム自体のパラダイム（こ疫機構の解析や解明を試みたり、疾病の治療アイデアこでは「大きな枠組み」という意味で用いる）は、動的なを提供する学問である。

バランスによって維持されている。

ここでは、4 回のシリーズに分けて、筆者らが過去 20

免疫のパラダイム
Paradigm of Immune System

年程継続してきた研究の中から、免疫工学を有効に免疫機構の解明や調節に利用した、以下の 4トピックスについて紹介する。

抗自己抗非自己自己免疫病

アレルギー

Ⅰ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマ
Ⅱ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマ

高ウスを用いたアレルギー発症機構の解析
ウスを用いた免疫調節機構の解析
Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗移植片拒否反応

体の作製―タンパク質工学によるワクチンの創製―

低Ⅳ. エピトープ移植抗体

ガン感染症

2. 免疫のパラダイム
免疫系は、自然免疫系（innate immunity）と獲得免8

図 1 免疫のパラダイムと疾病疫系（acquired immunity）により構成されるが、免疫記

本 来、免 疫 応 答は、個 体に侵 入するあらゆる異 物

憶や異物排除におけるエフェクター機構においては、T（非自己）に対して反応し、その際異物を、自分の体内細胞が中枢的な役割を担っている。T 細胞は、抗体のの成分（自己）との対比により識別し見分けるように仕組

産 生の調 節（増 幅と抑 制）、炎 症 細 胞の局 所 への動まれている（組織適合性抗原複合体拘束）。免疫細胞員、効果細胞としての機能等、獲得免疫の大局的な反を過度に活性化し続けると、アレルギー反応や自己成分応のほとんどに関わっている。

を標的とした自己免疫病による過度な炎症が惹起され、THE CHEMICAL TIMES

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Ⅰ. Ｔ細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウスを用いたアレルギー発症機構の解析対照的に、免疫応答が不十分だと、様々な感染症やガれば、免疫系はそれをヒトの成分ではあるが、同種の異ンが高頻度に発生することになる。免疫系細胞が必要として識別する。その結果、物（同種抗原、alloantigen）な時に必要な程度反応するという状態、つまり適度な免ヒトはヒトでも、他人はもちろん、親や兄弟の違いも同様疫応答が異物に対して適度に反応するバランスを保っに厳密に見分けることができる。これが免疫システムのていることが生体の免疫学的恒常性の維持には必要不可思議ながら、最も重要な機能である。生体にとっなのである。て、自己の物質と非自己の物質（異物）を区別する「免ヒトをはじめとする動物は従属栄養生物で、動植物疫系」は、神経系や内分泌系とは役割は異なるが生存の成分（肉や野菜）を食物として摂取して、消化器系おに必須な仕組みなのである。その重要性は、エイズといよび消化酵素の働きをかりて吸収されやすい形に分解う免疫系の働きの破綻を原因とする後天性免疫不全にする。そして、生命維持のために必要な栄養源やビタミ罹ると生存できないことからも分かる。非自己物質を自ンを体内に吸収し、代謝系を駆動することによって生命己物質と区別し、これを異物と認識して排除するための活動を営んでいる。一方では、なんらかの理由でもともと反応が免疫反応なのである 1）。

体の中に存在しなかった物質が侵入したり、もともとのアレルギーを、免 疫 反 応が「過 度に」、あるいは「不体の構成成分と似ていてもその構造の違いが明確な適切に」進行した反応と表現したが、さらに、標的を明場合には、その排除のためのシステムが作動する。

らかにして表現すると、「自己あるいは非自己に対するこの生体異物に対する防御反応を総称して免疫反過度で不適切な反応」ということになる。標的抗原が自応と呼ばれているが、アレルギーという反応はもともと免己抗原である場合、自己への反応それ自体が不適切疫反応そのものであるが、アレルギーは「過度に」、あるであるのは自明であるため、自己免疫病の病態の多くがいは「不適切に」進行した免疫反応と理解できる。

アレルギー反応として位置づけられている。よって反応の内容を知ることが、アレルギーの制御や治療に重要

3. 免疫反応の本質＝自己と非自己の識別
そもそも免疫反応は他の生体反応と異なった特徴を有している。感染性微生物が体に侵入した場合を考えであることは言うまでもない。
4. アレルギー反応の特徴＝自己あるいは非自己に対する過度で不適切な免疫反応てみると、外敵である感染性微生物も当然生物である
ため、これらが生体物質でできているのは、私たちヒト科

自己・非自己を厳密に識別する免疫反応は、大別しの生物と共通である。したがって、微生物が体内に侵て体液性免疫や細胞性免疫といわれる2 種類の反応入するということを具体的な言葉で表現すると、「彼らに分類できる。体液性免疫は、抗体がその抗体のでき微生物の体を作っている生体物質と微生物の生命シスる原因を作った抗原と結合することにより異物排除に導テムが体 内に入ってくる」ということになるわけである。

く反応であり、異物を処理する反応に細胞が直接関与

免 疫 反 応とは「微 生 物を構 成する生 体 物 質のように、するのが細胞性免疫である。例えば、ウイルスに感染し本来人間（個体）がもっていない物質が体に入ってきたた細胞を排除する場合には、感染細胞の表面にあるウとき、これを排除しようとする反応」である。アレルギー反イルス蛋白質を感染細胞の組織適合性抗原とともに認応の相手も外来の生体物質や環境物質である。我々識することができるT 細胞が、感染細胞に直接反応しの体も生体物質でできているが、自分自身の生体物質て標的細胞を傷害する。この体液性免疫や細胞性免を排除してしまうと不都合なため、自己の生体物質に対疫が自己あるいは非自己物質に対して過度あるいは不しては、免疫反応は起こらないように仕組まれている。こ適切に進行した反応がアレルギーである。のことはヒトと微生物の関係にとどまらない。ヒトの個体

体液性免疫や細胞性免疫は、厳密にいえば多様な同士にもあてはまる。ヒト個体の中に存在しない非自己反応様式から成り立っている。したがって、「自己あるいの物質を異物と呼ぶが、全く構造の異なる成分も、構造は非自己に対する、過度で不適切な免疫反応」であるは異なっているが明確な構造の違いが 1 つでも存在すアレルギー反応も必然的に多様な様式を呈することにな

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るが、アレルギー反応の結果起こる炎症や組織障害のとT 細胞抗原レセプターα鎖遺伝子（TCR-α）の cDNA様式に着目して分類すると4 つのタイプに分類できる。

クローンを単離した。それぞれの配列を決定し、V 領域

それは、クームスとゲル（Coombs ＆ Gell）の分類と呼ばの発現遺伝子、Vβ5.5-Dβ1-Jβ2.2、VαJα遺伝子、Jβれるものである（図 2）

2 ゲノム遺伝子をプローブとして、発現型に遺伝子再構。

2）, 3）

成した TCR ゲノム遺伝子を単離した。T 細胞抗原レセ
5. 先天的に遅延型（IV）アレルギー反応を有する
トランスジェニックマウスの創製 4）

プター遺伝子の再構成パターンは、図 3 に示した。
発現型ゲノム遺伝子 DNAを3-7-3T 細胞ゲノムDNAライブラリーから単離し、図 4に示した発現型 TCRβゲノム

我々は、卵 白アルブミンのアミノ酸 配 列（OVA323-遺伝子と発現型 TCRαゲノム遺伝子の 33.8kbと22.1kb

339=ISQAVHAAHAEINEAGR）
をマウスクラスII 組のCosmidコンストラクトを作製し、（BALB/cXDBA）F1 受織適合性抗原複合体をI-A とともに認識するIL-2 依

精卵にマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウス

存性 T 細胞クローン7-3-7 からpoly（ A） mRNAを抽出を作製した。
トランスジェニックマウスは、BALB/c マウスと精製し、λg t10cDNAライブラリーを作製した。そのライ退交配（バッククロス）を繰り返し、BALB/cをバックグラウン

ブラリーからT細胞抗原レセプターβ鎖遺伝子（TCR-β）

ドとするトランスジェニックマウスラインを確立した。

d＋

図 2 Coombs ＆ Gell の古典的アレルギーの分類

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Ⅰ. Ｔ細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウスを用いたアレルギー発症機構の解析

図 3 T 細胞クローン3-7-3 の T 細胞抗原レセプター遺伝子再構成パターン
β鎖遺伝子は、対立遺伝子座両方が遺伝子再構成していたが、Vβ15-Dβ1-Jβ2.2 の再構成をしている対立遺伝子座が発現型で、他方の Vβ5.2-Dβ2-Jβ2.4は非発現型の遺伝子再構成をしていた。Vα遺伝子に関しては、遺伝子再構成ゲノム遺伝子フラグメントをそれぞれクローニングし、発現遺伝子再構成地図を作製した。

図 4 トランスジーンの構築
発現型ゲノム遺伝子 DNAを3-7-3T 細胞ゲノムDNAライブラリーから単離し、図 4に示した発現型 TCRβゲノム遺伝子と発現型 TCRαゲノム遺伝子の 33.8kbと22.1kb の Cosmidコンストラクトを作製した。

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トランスジェニックマウスDNA の挿入スクリーニングと強い遅延型アレルギー反応を示した。このことは、未感フローサイトメトリーによるT 細胞表面マーカースクリーニ

作の CD4 陽性 T 細胞、つまり、ナイーブヘルパーT 細胞

ングにより、TCRトランスジーンを発現するCD4 陽性 Tが 1 次細胞免疫応答の過程で遅延型アレルギー反応細胞だけが胸腺内選択分化成熟した TCR 遺伝子トラ（DTH：Delayed Type Hypersensitivity）を惹起できるンスジェニックマウスを確立できた。図 5 に代表的な系ことが明らかとなった（図 7）。特殊なサイトカインを産生統のリンパ節 CD3 陽性 T 細胞のフローサイトメトリーパする特殊な T 細胞が DTH の惹起効果細胞であるといターンを示した。ほとんどの成熟 T 細胞がトランスジーンう推定は誤りであることが判明した。

を発現しており、遺伝子再構成装置を欠くRAG2ノックTHの過程で産生される炎症性サイトカインをRT-PCR

アウトマウスをバックグラウンド遺伝子とした交配ラインでとウェスターンブロットにより解 析 すると、IL-2、IL-3、も同様の結果が得られた。

Interferon-γ（IFNγ）、GMCSF、MIP-1α、MIP-1βなど

この TCRトランスジェニックマウスの下肢フットパッドでの産生は検出されたが、IL-4、IL-5 の産生は誘導され遅延型アレルギー反応試験（図 6 参照）を行うと、驚いなかった。ナイーブ T 細胞は、炎症性サイトカインやケモたことに、TCRトランスジェニックマウス自身は、一度も卵カインを産生し、DTHを直接誘導できることが初めて証

白アルブミンに暴露されたことはないのにもかかわらず、明された。

図 5 腸間リンパ節 CD3 陽性 Tリンパ球の TCRトランスジェニックマウスにおけるフローサイトメトリーパターン
成熟 T 細胞ほとんどが TCRトランスジーンを発現し、CD4 陽性細胞として成熟しており、遺伝子再構成装置を欠くRAG2ノックアウトマウスをバックグラウンド遺伝子とした交配ラインでも同様であった。

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6. TCRトランスジェニックマウスを用いた即時型アレルギーの解析 5）−9）

Ⅰ. Ｔ細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウスを用いたアレルギー発症機構の解析特異性を有するTCR のトランスジェニックマウスの CD4
陽性 T 細胞は、Ⅰ型のアレルギー反応の惹起にどのような関係性を持つのだろうか。

図 2 に示した 4 つの型の非自己に対するアレルギー

Ⅰ型アレルギーを起こす卵白アルブミン特異的 IgE 抗の中で最も症例が多く重要なのはⅠ型アレルギー（気管体の産 生を、卵白アルブミンの経口投 与で試みると、支喘息、花粉症、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アナフィ

我々の TCRトランスジェニックマウスでは、図 8 に示したラキシーショック、蕁麻疹など）である。卵白アルブミンに抗体産生パターンを示した。

図 6 遅延型アレルギー反応試験
マウス下肢フットパッドに一定量の抗原を注入し、48 時間後にノギスで注入部フットパッドの腫脹をノギスで測定する。

図 7 ナイーブT 細胞によって惹起される遅延型アレルギー反応（DTH）
正常マウスは、フットパッドに卵白アルブミンを注入しても、DTH 反応は強く惹起されない（左）が、TCRトランスジェニックマウスでは、ばらつきこそあれ、強いDTHが誘導される。

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ヒトⅠ型アレルギーでは、気管支喘息、花粉症、枯草熱、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、蕁麻疹

7. おわりになどが誘導されるが、このトランスジェニックマウスを用い我々の TCRトランスジェニックを用いた研究により、Ⅰて全身性のアナフィラキシーショックが誘導されるか否か

型アレルギー（即時型アレルギー）とⅣ型アレルギー（遅を検討した。図 9 に示されるように、経口抗原投与による延型アレルギー）は、アレルギー反応として複合的に惹

卵白アルブミン特異的IgE抗体産生量とアナフィラキシー起されることが推定された。最近、アレルギーの反応連ショックの重篤度は正の相関を持つことが判明した。

鎖が、アレルギー症例の多くで報告されているようになってきた 10）が、我々の TCRトランスジェニックマウスを用いた研究が先駆けになっていたら幸いである。
次回は、抗原の侵入量と免疫応答の関係、ワクチンの投与量は何によって規定されるのかといった、免疫学の基本的な問題をTCRトランスジェニックマウスで解析した結果を紹介したい。

参考文献
1）熊谷善博 . 蛋白質核酸酵素 . 1986. 31. 813-830.
2）Abbas, A.K.; Lichtman, A.H.; Pober, J.S. Cellular andMolecular Immunology. 2nd ed., W.B. Saunders , 1994, 457p.
3）富岡玖雄 , 羅智晴 編著 . マスト細胞とアレルギー. 医科学出版社 , 1993, 224p.
図 8 卵白アルブミン（OVA）
特異的 IgE 抗体の経口投与による誘導
OVAを20％含む固形飼料を餌に与え、2 週おきに血中 IgE 抗体価を酵素抗体法で測定した。アラムとともに腹腔過免疫したマウス血清を1000unitとした相対 unitで抗体価は示したトランスジェニックマウスで有意にOVA 特異抗体の産生が誘導された。

4）Sato, T.; Sasahara, T.; Nakamura, Y.; Osaki, T.; Hasegawa, T.;
Tadakuma, T.; Arata, Y.; Kumagai, Y.; Katsuki, H.; Habu, S.
Eur. J. Immunol. 24, 1994, 1512-1516.
5）Shida, K.; Makino, K.; Morishita, A.; Takamizawa, K.;
Hachimura, S.; Ametani, A.; Sato, T.; Kumagai, Y.; Habu, S.;
Kaminogawa, S. Int. Archive. Allergy and Immunol. 1998,115, 278-287.
6）Ise, W.; Totsuka, M.; Takato, R.; Hachimura, S.; Sato, T.;
Ametani, A.; Kumagai, Y.; Habu,S.; Kaminogawa, S. FEBS
Letters. 2000, 465, 28-33.
7）Shida, K.; Hachimura, S.; Ametani, A.; Ishimori, M.; Ling, M.;
Hashiguchi, M.; Ueda, Y.; Sato, T.; Kumagai, Y.; Takamizawa,K.; Habu, S.; Kaminogawa, S. J Allergy Clin.Immunol. 2000,105, 788-795.
8）Ise, W.; Totsuka, M.; Sogawa,Y.; Ametani, A.; Hachimura, S.;
Sato, T.; Kumagai, Y.; Habu, S.; Kaminogawa, S. J. Immunol.
2002, 168, 3242-3250.
9）Goto, M.; Hachimura, S.; Ametani, A.; Sato,T.; Kumagai, Y.;
Habu, S.; Ishikawa, H.; Kaminogawa, S. Biosci Biotechnol
Biochem. 2003, 67, 1223-1229.

図 9 血中卵白アルブミン特異的 IgE 抗体の産生量とアナフィラキシースコアの相関
1mg/0.1ml の卵白アルブミンを尾静脈から注入後、30 分間観察した。
−: 無反応、＋：動けるが動作が緩慢、＋＋：動けず、うずくまる、＋＋＋：昏倒
し痙攣する。

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（通巻 232 号）

10）Murphy,K. “IgE-mediated allergic reaction have a rapid onset
and can lead tochronic responses.” Janeway's Immunobiolgy.
8th ed., Garland Science Press, 2011, 587-589.
11）熊谷善博 . Dear Pharmasist. 2013, 16, p3.