博 士（ 水 産 科学 ） 植 木知 佳
学 位 論 文題 名
紅藻スサビノリ(Porphyra yezoeTzsisUeda)の生活環を通した細胞微細構造比較、および生殖細胞形成と発生に関する研究
学位論文内容の要旨
紅色 植 物 門、 原 始紅 藻 亜 網ウ シ ケ ノリ 目 に属 す る スサ ビ ノリ (PorphyrayezoensisUeda)は 海苔養 殖現場に おいて代 表的な種 であり、育 種を目的 とした研 究が古く からなされてきた 。現在で も栄養実 験などの 生理学的 な研究や 分子生物学 的な研究が盛んに行われている。 一方、本 種の細胞 生物学的 な分野に おける研 究例は他の 紅藻に比べて報告が少なく、核分 裂などの 基本的な 現象も報 告されて いないの が現状であ る。本種の基礎生物学的な知見が 欠如して いる状況 は、応用 研究を進 める上で いくっかの 具体的な生物学的知見に基づぃた 研究戦略 の立案を 困難にし ている。 したがっ て、本研究 はスサビノりの生活環を通して起 こる諸現 象を細胞 微細構造 レベルで 観察する ことを目的 とし、得られた結果は本種に関わ る基礎生 物学の分 野の充実 だけでを く、海藻 を用いた応 用研究の礎とすることを目標 と し た。以下 では本研 究におい て行った研 究結果（ 第2章殻胞 子嚢形成 に関する 培養実験 お よ び色落ち の形態学 的観察、 第3章配偶体 の栄養細 胞と有性 生殖細胞 における 微細構造 観 察 、第4章胞 子体の栄 養細胞に 韜ける基本 構造およ ぴ殻胞子 嚢におけ る細胞質 分裂過程、第 5章細胞壁 に関する 組織化学 ）にっい てまとめ た。
第2章では 殻胞子嚢 の形成条 件につい て温度条 件（5〜25℃ ）、栄養塩濃度条件（標準栄 養 強 化 培 地 と し て PES培 地 を 使 用 、 通 常 海 水 100 mlに っ き2mlの PES原液 を 添加 ） に関する培 養実験を 行った。 その結果 、実験開 始25日目頃 から殻胞子 嚢形成が観察され、50日目には 15℃、1/4PE
S (0.5ml/100ml)で最も高密度で殻胞子嚢が形成されたことから、本条 件 を 最適とし た。培地 交換する ことで1週間 後に殻胞 子の放出 が観察で きた。以 上より、アマ ノリ属植 物の胞子 形成にお いて重要 な要因と 報告されて いる水温、光周期に加えて、 培地中の栄 養塩濃度 も重要で あること が明らか となった 。また、配 偶体ならぴに胞子体を 貧栄養条件 下で培養 すること により藻 体の色落 ちを誘導 し、細胞微 細構造を調べた。
その 結果、どち らにおい ても葉緑 体で最も 大きな変 化が観察 され、ピレ ノイドは縮小し、チラ コイド膜の 不規則な 融合、圧 着が随所 で起こっ た。この ような構造 の変化はクリプト藻や 単細胞性紅 藻で観察 されてい ることか ら、貧栄 養状態に おいて細胞 が受けたダメージのーっであると考えられた。
第 3、 4章 では 配 偶 体な ら びに 胞 子 体の 細胞微 細構造の 特徴を記 載した後 に、配偶 体では 核分裂、胞 子体では 細胞質分 裂、ピッ トプラグ 形成、そ して減数分 裂について観察を行っ た。生活環 を通した 単胞子、 果胞子、 殻胞子の 形成過程 は、液胞の 縮小やデンプン粒の増 加などで共 通した現 象であっ た。配偶 体の造精 器細胞で は形成初期 から繊維物質が充満し た小胞が分 裂極付近 に形成さ れ徐々に 大型化し ていった 。また、葉 緑体が縮小し、デンプ ン粒が消失 した。さ らに、そ れに伴う 核分裂で は紅藻の 分裂極に存 在する特徴的な構造、NAO (nuclearassociatedorganelle)を構成するりングが終期に複製する様子が観察された こと か ら 、NAOが細胞周 期を通し て半保存的 な構造で あること が示唆さ れた。さ らに、
スサ ビノリ配偶 体におけ る核分裂 は前中期 から中期 にかけて 紡錘体極で 観察される微細構
造に よって分類 されているPG (polar gap)、PF (polarfenestration)タイプの両方の特徴を有し ていること が明らか となった 。以上の 結果は、 原始紅藻 亜網と真正 紅藻亜網の中間とい うウ シ ケ ノリ 目 の 系統 的 な位 置 を 示唆 す る分子系 統学的な 報告を支 持するも のであった。 本研究では 配偶体の 核分裂期 の微細構 造につい て考察を 行ったが、 今後は胞子体において も核分裂期 の微細構 造を確認 すること で生活環 を通した 特徴付けが 可能になると考えている。
胞 子体 で は 栄養 細 胞な ら び に殻 胞 子 嚢の微 細構造を 詳細に記 載した他 に、細胞 質分裂と ピットプラ グ形成の 過程を観 察した。 細胞質分 裂は細胞 膜が細胞の 内側に向かって陥入す ることで進 行した。 その後、 細胞質分 裂の途中 にできた 開口部にピ ットプラグが形成され た。ピッ卜 プラグの縁まで及んでいた細胞膜はキャップ層に沿ってループ状に伸長し、最終 的にチュー ブ状の膜 とともに ほぼ全体 を覆った 。ウシケ ノりにおい ても同様の構造が観察 されたこと から、ス サビノり で示唆さ れた細胞 膜の伸長 様式はウシ ケノリ目に共通した構 造であると 考えられ た。ダル スならび にマキイ トグサで は細胞膜か らニ又分岐したキヤ ップ 膜 の 存在 が急速 凍結置換 法を用いて 明らかと なった。 また、胞 子体の細 胞では2種

類の特徴 的な膜構 造である数 珠状小胞 とロマソ ームが観 察された 。数珠状 小胞は細胞膜が細胞壁側 に突出す ることで形 成され、 細胞質分 裂時に頻 繁に観察 された。 また、それらが隔壁に蓄 積したこ とから、細 胞壁形成 への関与 が示唆さ れた。一 方、ロマ ソームは隔壁形成箇所で はほとん ど観察され なかった が、成熟 した殻胞 子嚢、貧 栄養処理 した胞子体において発達 していた ことから、 細胞の生 存、維持 に関わる 機能を有 している と考えられた。
次に ス サビ ノ リ 生活 環を 通して染色 体数の計 測を行い 、配偶体 では3本、 果胞子嚢 、胞子 体 栄養 細 胞 、殻 胞 子 嚢では6本の 染色体が 観察され た。殻胞 子嚢の成 熟過程で 染色体数が 6本 か ら3本に 半 減 し、 殻 胞子 発 芽 体で は 染色 体 数 が3本で あ った こ と 、そ し て 成熟した殻胞 子嚢にお いて第一減 数分裂前 期に特徴 的な構造 が観察さ れたこと から、スサビノリ生活環 における 減数分裂は 殻胞子嚢 の成熟過 程におい て起こる ことが示 唆された。しかし、殻胞 子の大き さが均一で なかった ことなど から、殻 胞子の発 芽時にお ける減数分裂を否定 す るこ と は でき ず 、 今後 は シナ プ ト ネマ 構 造の 出 現時期の 特定をす る必要が ある。
第5章で は 配偶 体 、 胞子 体 にお い て 細胞 壁 の成 分 と 微細 構 造 が大 き く異 な る こと を踏まえて 、8種の多 糖染色剤、 レクチン 7種を用い た組織化 学的実験 を行った 。その結果、配偶体で は内部細 胞壁に中性 多糖なら びに硫酸 多糖が他 の多糖に 比べて多 く含まれていることが明 らかとな った。レク チン標識 ならびに 多糖染色 剤による 結果から 、胞子体は配偶体よりも 硫酸多糖 を多く含む ことが示 唆された 。また、 単胞子、 果胞子発 芽体においてカルコフロールホワイ卜、コンゴーレッドによる染色濃度検定を行った結果、（1→4）‐p‐グルカンなど のセルロ ース性の細 胞壁成分 に量的な 差がある ことが示 唆された 。さらに、レクチンの標 識パター ンおよび透 過型電子 顕微鏡に よる観察 結果から は、単胞 子ならびに果胞子が着生 直後に形 成する細胞 壁は組織学的、微細構造学的にも同質であることが示された。
しかし、 果胞子の 発芽管に形 成される 細胞壁は 胞子部分 とは大き く異なっ ており、果胞子発芽 体 は2種の 全 く 異な る 細胞壁をひ とつの細 胞内で分 泌すると いう特徴 的な発生 過程を経ることが明らかになった。
以 上 の よ う に 、 本 研 究 で は 生活 環 を 通し て 観察 さ れ る諸 現 象 につ い て形 態 学 的な種々の手 法を用い て観察を行 い、新し い結果を 明確に示 した。今 後は本研 究で得られた基礎的なデ ータをも とに、細胞 壁や葉緑 体に関す る生理学 的な研究 を進め、 細胞形態学、生理学、そ して分子 生物学的結 果を統合 した新た な展開を 試みたい 。また、 世代間における細胞壁の 組成の違 いについて 行った組 織化学的 な実験手 法、また 海苔藻体 の色落ち状態に

おける細胞微細構造の変化にっいては水産科学ならびに育種の現場において応用できるような研究を進めていきたぃ。

学 位 論 文 審 査 の要 旨
主査 教授 嵯峨 直恆
副査 教授 本村 泰三
副査 教授 都木 靖彰
副査 准教授 長里千香子
副査 准 教授 三上 浩司

学位論文 題名紅 藻 ス サ ビ ノ リ (Porphyra yezoensis Ueda)の生活環を通した細胞微細構造比較、
お よび 生 殖 細 胞形 成 と発生 に関す る研究

海産 紅 藻 スサ ビ ノ リ（ Porp轟 卿 閂z舶 ぬ 嫡Ueda）は 海 苔 養殖 現 場 にお い て 代表 的 な 種であり 、育種を目的とした研究だけでなく、生理学、分子生物学的な観点から広く研究が行われている。
一 方、細 胞生物学 の分野 では核分 裂など の基本的 な現象も報告されていないのが現状である。本研
究 は ス サビノ りの生活 環を通 して起こ る諸現 象を主に 電子顕微 鏡を用 いた細胞 微細構 造レベル で観 察する ことを目 的とし て研究を 進めて いる。
本論 文 は 6
つ の 章 より 構 成 され 、 第 1章 で は 全体 に お け る緒 言 を 示し 、 第 2章 に お いて 殻胞
子 嚢の形 成条件に 関する 培養実験 、なら びに貧栄 養処理することで色落ちさせた配偶体、胞子体の微 細構造 の変化に ついて 調べた。 第3章 では配 偶体の基 本的な 微細構造 の他に 、造精器形成に伴う核 分裂に ついて詳 細に観 察した。 第4章 では胞 子体の微 細構造 を記載し 、殻胞 子嚢形成における細胞 質分裂 の過程を 詳細に 観察した 。また 、染色体 の計測、核分裂像を観察して減数分裂の生活環にお け る 位 置に つ い て考 察 し た。 第 5章 では第 3、4章の結 果を踏 まえて、 多糖染色 剤、レ クチンを用 いて細 胞壁の組 織化学 的実験を 行った 。第6章では本 研究の 総括を行 い、ス サビノりを用いた将来 の細胞 学と水産 科学ー の応用に 向けた 課題と展 望について述べた。以下では第2〜5章の詳細につい て記す 。
第2章 で は殻 胞 子 の形 成 条 件に つ い て温 度 条 件（ 5〜 25℃ ）、栄 養塩濃度 条件に 関する培 養実 験 を 行 った 。 そ の結 果 、 実験 開 始から 50日目に は15℃、1／4PES
培 地で最も 高密度 で殻胞子 嚢が 形成さ れた。培 地交換 すること で1週 間後に 殻胞子の 放出が 見られた 。また 、貧栄養処理を施した 配偶体 ならびに 胞子体 では葉緑 体の構 造が最も 大きく変化していた。ピレノイドは縮小し、チラ―12n―コイド膜の不規則な融合、圧着が随所で観察され、細胞質中のデンプン粒は増加していた。
第3章において観察した配偶体の造精器細胞では形成初期から繊維物質が充満した小胞が分裂極付近に形成され、葉緑体の縮小、デンプン粒の消失が観察された。核分裂では紅藻の分裂極に特徴的な構造であるNAO (nuclear associatedorganelle)を構成するりングが終期に複製する様子が観察されたことから、NAOが細胞周期を通して半保存的な構造であることが示唆された。
第4章では細胞質分裂ならびにピットプラグの形成過程を観察した。細胞質分裂は細胞膜が内側に向かって陥入することで進行し、その過程においてピットプラグが形成された。その後、ピットプラグはループ状に伸長した細胞膜とチューブ状の膜によってほば全体が覆われた。ウシケノりにおいても同様の構造が観察され、スサビノりで示唆された細胞膜の伸長様式はウシケノリ目に共通した構造であると考えられた。ダルスとマキイトグサでは細胞膜からニ叉分岐したキャップ膜の存在が急速凍結置換法を用いて明らかとなった。次にスサビノリ生活環を通して染色体数の計測を行い、配偶体では3本、果胞子嚢、胞子体栄養細胞、殻胞子嚢では6本の染色体が観察された。
殻胞子嚢の成熟過程で染色体数が6本から3本に半減し、殻胞子発芽体では染色体数が3本であったこと、成熟した殻胞子嚢において第一減数分裂前期に特徴的な構造が観察されたことから、スサ
ビ ノリ 生 活 環 に お け る減 数分裂 は殻 胞子 嚢の成 熟過 程で ある ことが 示唆 され た。
第5章では8種の多糖染色剤ならびに7種のレクチンを用いて配偶体、胞子体の細胞壁の違いを組織化学的に捉えた。配偶体の内部細胞壁には他の多糖よりも中性多糖ならびに硫酸多糖が多く、外部細胞壁には種々の多糖が含まれていた。一方、胞子体では硫酸多糖が豊富で、セルロース性の細胞壁成分が配偶体よりも多く含まれていることが明らかにされた。本研究で行った網羅的かつ詳細な形態学的観察の報告は、水産科学の分野では非常に少なく、今後の応用研究の基礎的な知見となりうる。また、細胞壁の組織化学的な実験手法の確立により育種の現場への応用が期待される。
主論 文 は 平 成 20年 1月 21日 13時から 14時 まで 第二 研究 棟特 別講 義室 にお いて 、審 査員および関連教員16名および一般聴講22名出席のもと発表された。一般聴講においては、造精器細胞に形成される繊維物質を含んだ小胞の内容物が精子外被の粘質多糖の成分になる経緯について、造果器細胞に見られる受精突起の位置、そして殻胞子嚢から殻胞子が放出される時にはどのようにしてピットプラグから離れるのかについて質疑・応答がなされた。また、審査員および関連教員においては、受精突起に付着した精子が核分裂が完了した際にいくつの精子核が造果器細胞内に進入するのか、細胞質分裂の特徴は他の紅藻と比べて系統的に関連性があるのか等について質疑・応答がなされた。また、本研究は今後進められる様々な研究の基礎的な知見として十分な価値があり、そして造精器細胞の内部細胞壁で見られた変化について組織化学的な研究を進めることで水産科学に応用できるなどのコメントがなされた。これらの研究で得られた結果は本種の基礎生物学の分野の充実だけでなく、今後の海藻を用いた応用研究の発展に資するところ大と判断し、博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した。