博士（地球環境科学）土居信英
学位論文題名
Selection of New Proteins from RandomLibraryD
isplayedon aProteinScaffold、（酵素夕ンパク質表面に提示したランダムライブラリーからの新規夕ン パク質のス クリ，ーニ ングに関す る基礎的研 究）
学位論文内 容の要旨

人類の活動が、これまで人類が生存してきた環境を乱してしまう原因のーっは、その活動系すなわち生産一消費の連鎖の系が、生態系の中で物質的に閉じた循環系を成していないことにある。すなわち、活動の過程で生じた人工物が分解されず、ときに環境汚染物質として蓄積することにーつの問題がある。夕ンバク質工学により、そのような人工物を分解する酵素を創ることは可能だろうか？従来の方法では、既存のタンパク質の部分的改変が主に試みられてきたが、自然界にこれまで存在しなかった基質を認識するためには、おそらく、全く新しい立体構造の「枠組み」もつタンパク質を創り出す必要がある。現在、遺伝子工学により特定のアミノ酸配列をもつ人工夕ンバク質を創ることは可能である。しかし、タンパク質のアミノ酸配列と立体構造との対応関係が明らかになっていないために、望む機能をもつ酵素を自由にデザインすることは、現在のところ困難である。
一方、生命は、意図的なデザインの方向性をもたずに、環境に対応したランダムな変異と選択の繰り返しにより、数多くの精巧な酵素を生み出してきた。進化分子工学は、この進化の仕組みを模倣して、非常に大きな遺伝子型のプールから望む表現型をもつ分子を選び 出す手法である。しかし、現在、進化分子工学の成功例はRN
Aとぺプチドに限られており、100残基以上のタンパク質については、全くランダムなライブラリーから構造や機能をもつ新規夕ンパク質のスク1Jーニングに成功した例はない。その主な理由は、探索すべきアミノ酸配列空間の膨大さに比べて、現在の選択系の効率が低いことにある。しかし、実際のタンパク質進化の過程においても、全ての配列空間を調べる時間はなかったはずなので、選択効率を上げる工夫がタンパク質進化の仕組みの中に隠されている可能性は高い。したがって、タンパク質の進化分子工学を実現するためには、タンパク質の構造・機能単位であるドメインが、分子進化の過程でどのようにして創られたのかを知ることが重要と考えられる。
本論文では、まず、全く新しいドメイン進化の仮説を提案し、次に、本仮説を実験的に証 明 し、 そ れ を進 化分子工 学に応用す るために必 要となる基 礎的条件を 検討する。
イントロンの発見以来、ドメインはより小さな構造単位の組み合わせで創られたとぃう
エキソン混成仮説が提唱されてきたが、最近、この仮説は疑問視されている。それに対して、本論文で提案する仮説では、ランダムで柔軟な構造をもっポリペプチドが、それを支える「土台」の上で折れ畳み、機能を獲得して、現在の精巧でコンパクトな構造をもつ球状夕ンパク質に進化したと仮定する。ポリペプチド鎖の両末端が土台に固定されると、ランダム鎖の取り得るコンフォメーションの数は大幅に制限される。そのことがドメイン構
築の効率を上げることに寄与すると考えられる。現存するタンパク質ドメインのN末端とC末 端 が 近 接 す る 傾 向 に あ る と い う 事 実 も 、 本 仮 説 を 支 持 し て い る 。
以下の実験では、ランダムな「タンパク質」のライブラリーを「土台」の上に提示することが可能かどうかについて検討した。提唱した仮説においては「土台」として膜夕ンパク質を考えたが、実験ではモデルタンパク質として水溶性の酵素夕ンパク質を用いた。その実験上の利点は、提示されたタンパク質の発現を「土台」の酵素活性でモニターできること、および、精製・特徴付けの際の水溶性夕ンパク質の取り扱い易さにある。これまで、ある酵素夕ンパク質に外来性のアミノ酸配列を挿入して、その構造・機能に与える影響を調べた例は少ない。特に、挿入する配列の長さに関しては、10数残基鎖長までしか調べられていない。そこで、本研究では初めて、100残基以上のランダムなアミノ酸配列を酵素タンパク質に挿入し、どの程度の割合の変異体が酵素活性を維持できるかを調べた。
具体的には、土台とする酵素夕ンパク質として大腸菌RNaseHIを選んだ。R
NaseH
IはDNA/RNAハ イブリッド のRNA
鎖の みを特異的 に分解する 酵素であり、その詳細な立体構造が既知で、活性部位や基質結合部位などの情報も豊富にあり、また、面VIVOおよび面vitroのRN
aseH
活性測定法が確立していることなどから、本実験に適している。また、挿入するランダム配列としては、20
種類のアミノ酸をすべてコードし、停止コドンを全く含
ま な い よ う に デ ザ イ ン さ れ た セ ミ ・ ラ ン ダ ム な 合 成 DNAを 用 い た 。
まず、ランダム配列を挿入する部位を決定するために、2〜5残基の特定のアミノ酸配列をRN
ase HIの7つの部 位に挿入して、RNaseH
活性が維持され得る部位を検索した。その結果、活性部位に近い3つの部位への挿入では活性は失われたが、夕ンパク質表面に近い4つの部位への挿入では活性は維持された。
次に、その4つの部位のうち1次配列上の中央に位置するHis62部位を選び、120〜130
アミノ酸残基のランダム配列を挿入した変異体ライブラリーを作製した。大腸菌RNaseH欠損株を用いたスクリーニングの結果、約10％のクローンが生育可能なレベルのR
Nase
H活性を維持していた。挿入変異体を含むクローンの変性・再生ゲルアッセイにより、野生型 （18kDa)より 大 きい 、 予想 さ れる 分 子 量(32kDa)の 位 置に RN
aseH
活 性 を示すバンドが確認された。塩基配列を決定した10個の挿入変異体タンパク質は、大腸菌内で大量発現すると主に不溶性画分に蓄積した。このうち、よく発現した5個の変異体タンパク質を精製した。精製した変異体夕ンバク質は野生型の0.
2〜1％の比活性を示した。さらに挿入領域にランダム変異を導入することにより、活性が3％まで回復し、同時に溶解度の増大した変異体が得られた。変異体夕ンパク質のCD
スペクトルの解析から、挿入されたランダム領域は、特定の二次構造をもたないことが示唆された。また、RNase
H活性の強さと挿入したランダム領域のアミノ酸組成との間には相関があり、ランダム領域のアミノ酸組成 が 天 然 球 状 夕 ン パ ク 質 の 組成 に 近い 変 異体 ほ ど 、活 性 が高 い 傾向 が みら れ た。
以上の結果から、二次構造を含まない可塑的な構造をもつランダムなタンパク質のライブラリーを、大腸菌R
N
aseHIの表面に提示できることがわかった。また、それに引き続いてのランダム変異による機能の上昇は、可塑的な構造からアミノ酸置換にともなって構造形成していくドメイン進化の過程をシミュレートできる可能性を示している。今後、この「土台」上に提示したタンパク質のランダム配列ライブラリーを利用することにより、新しい構造や機能をもつ新規夕ンパク質の創出に道を開くことができると期待される。

学位論文審査の要旨
主査

教授、戸倉清一

副査

教授

副査

柳川弘志

西則雄

（三菱化学生命科学研究所グループリーダー主任研究員）

学 位 論 文 題 名Se
lection of New Protei
ns from RandomLi
braryD
isplayedon aProteinS
caffold（酵 素夕 ンパ ク質 表面 に提 示し たラ ンダ ムラ イブ ラリ ーから の新規 夕ン パク 質のス クリ ーニ ング に関す る基 礎的 研究）

申 請者 は、 人類 の活動がこれまで人類が生存してきた環境を乱してしまう原因のーつは、 その 活動 系す なわち生産一消費の連鎖の系が、生態系の中で物質的に閉じた循環系を成 して いな いこ とにある、すなわち、活動の過程で生じた人工物が分解されず、ときに環 境汚 染物 質と して蓄積することにーつの問題がある、と考えた。そこでタンパク質工学 によ り、 その ような人工物を分解する酵素を創ることを思いついた。自然界にこれまで 存在 しな かっ た基質を認識するためには、全く新しい立体構造の「枠組み」をもつタンバク質を創り出す必要がある。
進化 分子 工学 は、 生命 の進 化の 仕組 みを 模倣 して、 進化 を伴 う非 常に 大き な遺伝子型のプ ール から 望む 表現型をもつ分子を選び出す手法である。しかし、現在、進化分子工学 の 成 功 例 は RNAと 低 分 子 量 ベ プ チ ド に 限 ら れ て お り 、 100残 基 以 上 の 高 分 子 量 夕 ン
バク 質に つい ては 、全くランダムなライブラリーから構造や機能をもつ新規夕ンバク質のス クリ ーニ ング に成功した例はない。その主な理由は、探索すべきァミノ酸配列空間の膨 大さ に比 べて 、現在の選択系の効率が低いことにある。しかし、実際のタンバク質進化 の過 程に おい ても、全ての配列空間を調べる時間はなかったはずなので、選択効率を 上 げ る 工 夫 が タ ン バ ク 質 進 化 の 仕 組 み の 中 に 隠 さ れて いる 可 能性 は高 い。 した がっ て、夕ン パク 質の 進化 分子工学を実現するためには、夕ンパク質の構造・機能単位であるドメイ ンが 、分 子進 化の過程でどのようにして創られたのかを知ることが重要と考えられている。
本論 文で は、 まず 、全 く新 しい ドメ イン 進化 の仮説 を提 案し 、次 に、 本仮 説を実験的に 証 明 し 、 そ れ を 進 化 分 子 工 学 に 応 用 す る た め に 必 要と なる 基 礎的 条件 を検 討し てい る。
ド メイ ンは より 小さな構造単位の組み合わせで創られたとぃうエキソン混成仮説が、最近疑 問視され ている。 それに対 して、本 論文で提 案する仮説 では、ランダムで柔軟な構造を もつポリ ベプチド が、それ を支える 「土台」 の上で折れ 畳み、機能を獲得して、現在の 精巧でコ ンバクト な構造を もつ球状 夕ンパク 質に進化し たと仮定し、ポリベプチド鎖の 両末端が 「土台」 に固定さ れると、 ランダム 鎖の取り得 るコンフエメーションの数は限 られたも のになる ことに注 目し、そ のことが ドメイン構 築の効率を上げることに寄与す ると考え た。
まず、 ゛ランダムな「夕ンパク質」のライブラリーを「土台」の上に提示することが可能かど うかにつ いて検討 している 。モデル タンバク 質として水 溶性の酵素夕ンバク質を用いて いるが、この利点は、提示されたタンノペク質の発現を「土台」の酵素活性でモニターで きること 、および 、精製・ 特徴付け の際の水 溶性夕ンパ ク質の取り扱い易さにある 。こ れ ま で、 挿 入す る 配 列の 長 さ では 、10数残基 鎖長まで が限界で あった。 本研究で は初 め て 、100残基以 上のラン ダムなアミ ノ酸配列 を酵素夕 ンパク質 に挿入し 、どの程度の 割合の変 異体が酵 素活性を 維持でき るかを調 べた。
ま ず 、 ラン ダ ム 配列 を 挿入 す る 部位 を決 定するた めに、2〜 5残基の特 定のアミ ノ酸配 列 を RNaseHIの 7つ の 部 位 に 挿 入 し て 、 RNaseH活 性 が維 持 さ れ得 る 部位 を 検 索した。そ の結果、 活性部位 に近い3つ の部位への挿入では活性は失われたが、夕ンノヾク質
表 面 に 近 い 4つ の 部 位 へ の 挿 入 で は 活 性 は 維 持 さ れ る こ と を 確 認 し た 。
次 に 、 その 4つの部位 のうち1次 配列上の中 央に位置 するHis62．部 位を選び 、120〜130アミ ノ 酸 残基 の ラン ダ ム 配列 を 挿 入し た 変異 体 ラ イブ ラ ルー を 作 製した。 大腸菌
RNaseH欠 損 株 を 用 い た スク リ ーニ ン グ の結 果 、 約10％の ク ロ ーン が 生育 可 能 なレ ベル のRNaseH活 性を 維 持し て い た。 挿 入 変異体を 含むクロ ーンの変 性・再生 ゲルアッ セ
イ に よ り 、 野 生 型 （ 18kDa)よ り 大 き い 、 予 想 さ れ る分 子 量 (32kDa)の 位 置に RNaseH活性を 示すバン ドが確認 された。 塩基配列 を決定し た10個の挿入 変異体夕ンバク質は、大 腸菌 内 で 大量発現 すると主 に不溶性画 分に蓄積 した。こ のうち、 よく発現 した5個の変異体 夕ンパク 質を精製 した。精 製した変 異体夕ン パク質は、 野生型の0.
2〜1％の比活性 を示 し た 。さらに 挿入領域 にランダム 変異を導 入するこ とにより 、活性が 3％まで回復 し、 同 時 に溶 解 度の 増 大 した 変 異 体が 得られた 。変異体 夕ンバク 質のCDスベ クトルの 解 析 か ら 、 挿 入 さ れた ラ ンダ ム 領 域は 、 特 定の 二 次構 造 を もた な いこ と 、 また 、RNaseH活 性 の 強さ と 挿入 し た ラン ダ ム 領域のア ミノ酸組 成との間 には相関 があり、 ランダム 領域のア ミノ酸組 成が天然 球状夕ン パク質の 組成に近い 変異体ほど、活性が高い傾向の あること を見出し ている。
以上の 結果から 、二次構 造を含ま ない可塑 的な構造 をもつラン ダムなタンパク質のライブラ リーを、 大腸菌RNaseHIの 表面に提 示できる ことを示 した。今後、この「土台」
上に提 示したタ ンバク質 のランダ ム配列ラ イブラリ ーを利用す ることにより、新しい構造 や機 能 をも つ 新規 夕 ンバ ク 質 の創 出 に道 を 開く こ とが できる と期待され る。
審査員 一同は、 これらの 成果を高 く評価し 、申請者 が博士（地 球環境科学）の学位を受ける のに充分 な資格を 有するも のと判定 した。