博 士 （ 水 産 学 ） 風藤 行 紀
学位論文題名rvIolecular biological studies on ovarian steroid hormone
biosynthesis in Japanese eel， Anguilla japonica（ニホンウナギ卵巣のステロイドホルモン生合成に関する分子生物学的研究）

学位論文内容の要旨
二ホンウナギ（Anguilla japonica）は水産養殖上重要な魚種である。しかし、本 種は 飼育 環境 下で は成熟しない。また、降海時の下リウナギの卵巣卵の多く は、 卵黄 形成 初期 まで発達しているが、それ以上に成熟段階が進んだ卵巣を 持つ 個体 は捕 獲さ れていない。そのため、これまでサケ脳下垂体懸濁物（SPH） 等の ホル モン 投与 による 人為 催熟 が試 みら れており、成熟卵および孵化 稚魚 を得 るこ とに 成功している。しかし、その結果は必ずしも安定しておら ず、 催熟 技術 の改 善が望まれている。これらの問題点を解決し、最適な催熟 技法 を確 立す るた めには、生殖腺の発達を制御する内分泌因子に関する詳細な知見が不可欠である。
魚類 の卵 母細 胞の 成長 および最終成熟は卵濾胞組織で合成されるステロイドホル モン に制 御さ れて いる。一般に、卵黄形成にはエストラジオ―ル−17p（邑）が、最終成熟には17a, 20p‐ジヒドロキシ―4‐プレグネン‑3‑オン（DHP） が、 重要 な役 割を 果た してい ると 考え られ てい る。そのため、多くの魚種 の 卵 濾 胞 に お い て 邑 お よ び DHPの 合 成 に関 する 研究 がな され おり 、ウナギで も、 卵巣 の発 達に 伴うこれらステロイドホルモンの合成能の変化等が調べら れて いる 。し かし 、これらステ口イドの合成経路に関しては、未だ不明な点 が多 い。 また 、ス テロイドホルモンの産生量の変化は様々なステロイド合成 酵素 の活 性変 化に 依存している。ステロイド合成酵素の活性変化はその遺伝 子の 発現 によ って 調節されると考えられている。そのため、卵巣でのステロイドホルモンの合成機構を理解するためには、それぞれのステロイド合成酵素遺伝子の発現変化を明らかにする必要がある。しかし、ニホンウナ
ギの卵巣においてその発現変化が調べられているのはアロマ夕一ゼ（P450arom）のみである。本研究は、卵巣の発達に伴うステロイド合成経路の変化を明らかにするとともに、幾つかのステ口イド合成酵素に関して遺伝子レベルでの知見を得ることにより、ニホンウナギ雌のステ口イドホルモン合成をより詳細に理解することを目的に行われた。
先ず、卵黄形成初期（SPH投与前）、卵黄形成中期および核移動期の卵濾胞をプレグネノロン（Preg）とともに培養し、培養後のステロイド代謝物を解析した。卵黄形成初期の卵濾胞はPregを他のステロイドに殆ど転換しなかった。卵黄形成中期では、Pregは、幾っかのステロイド代謝物に転換され、中でもアンドロゲンであるアンド口ステンジオン（A）およびデヒドロエピアンド口ステロン（DHA）が、どの個体においても主要な代謝物として検出 された 。― 方、 核移 動期で は、 Aお よび DHAにか わっ て17a‑ヒドロキシプロゲステロン（1 7a‑OHP）およびDHPが多量に合成された。以上の結果、本種の卵濾胞ではSPH投与により各種ステロイド合成酵素が活性化され、卵黄形成中期には主にアンドロゲンが、核移動期には170r‑OHPおよびDHPが合成されるステロイド合成経路が誘導されることが明らかとなった。
また、このステ口イド合成経路の変換は、主にC17‑20側鎖切断酵素活性の低下および20p−水酸基脱水素酵素（20[3‑HSD）活性の上昇に起因していると考え られた 。P450c17は 、哺 乳類 におい て17a水酸化 酵素 およびG17‑20側鎖切断酵素のニつの酵素活性有することが知られており、ウナギの卵巣におい てはア ンド ロゲ ンお よびDHP双方の合成に関与していると考えられる。 そこで 、ウ ナギ P450c17 cDNAの構造解析を行った。ウナギP450c17cDNAから推定されるアミノ酸配列は他の動物種のものと高い相同性を示した。 遺伝子 導入 によ ルウ ナギP450c17を COS‑7細胞中 で発 現させ、その酵素活性を調べたところ、17a水酸化酵素およびC17‑20側鎖切断酵素の両酵素活性を示した。次に、成熟に伴うP450c17 mRNA量の変化を調ぺた。
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SPH投与前 の卵 巣で はP450c17 mRNAは検出されなかった。催熟により卵黄 形成が姶まると、P450c17 mRNAが検出されはじめ卵黄形成中期までその量は増加し、その後大きな変化を示さなかった。以上の結果、SPH投与によ りP450c17 mRNAの転 写が 誘導 される こと が示 された 。ま た、 ウナギ
P450c17は17a水酸化酵素およびC17‑20側鎖切断酵素のニつの酵素活性を有しており、卵黄形成中期ではアンドロゲンの、核移動期では17a‑〇HPやDHPの 合 成 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る と 考 え ら れ た 。
20 [3‑HSDは 、17a‑OHPを DHPに直 接転換する酵素である。近年ブ夕精巣の20{3‑HSDの―次構造が決定され、可溶性タンパクのーつであるカルボニルリダク夕―ゼ（CR）であることが明らかにされた。そのため、魚類の20 [3‑HSDもCR様夕ンパクであると考えられている。そこで次に、ウナギ卵巣 の20 [3‑HSDのタンバクレベルでの性状解析およびCR cDNAの構造解析を 行い、20 t3‑HSDがCRであるか否かを検討した。203‑HSD活性は、ウナ
ギ卵巣において主にミトコンドリアおよびミク口ソ―ム画分に分布しており、本酵素は細胞膜結合型タンパクであった。20[3‑HSD活性はSPH投与前の卵巣で検出され、その後卵巣の発達に伴ない上昇した。ウナギCRcDNAから推定されるアミノ酸配列は、他の動物種のものと高い相同性を示した。
また、その立体構造も高度に保存されていると推測され、ウナギCRは哺乳類のCRと同様に可溶性夕ンパクであると考えられた。卵巣の発達に伴うCRmRNA量の変化を調べたところ、卵黄形成中期で若干高まったが、その後大きな変化を示さなかった。更に、CR遺伝子を導入したCOS‑7細胞は、20p．
HSD活性を示さなかった。以上の結果、ウナギの卵巣では、SPH投与により20 [3‑HSD活性が高まることが示された。また、本種の20DーHSDはCR様タンパクではないことが示唆され、CRと異なる203‑HSD遺伝子の単離および構造解析が今後の課題として残された。
最後に、P450aromとともにエストロゲン合成の最終段階を触媒する酵素である17p‐水酸基脱水素酵素タイブ‐｜（173‑HSDl）のcDNAを単離した。
単 離し たウ ナギ17 t3‑HSD lcDNAを ヒト腎臓由来293細胞（HK293）に導―1152−

入した。遺伝子を導入したHK293をA、テストステロン、工ストロン（E1）および邑と培養した。培養後、ステロイド代謝物を解析したところ、本酵
素は 日 か ら 邑 を 合成 する 還元 反応の みを 触媒 した 。また 、17(3‑HSDlmRNAは SPH投与 前の 個体 の卵 巣では 検出 され なかっ たものの、SPH投与後は全個体において検出され成熟に伴って大きな変化を示さなかった。以上の結果、173‑HSDIの基質特異性よルウナギ卵巣においては、巳は主にEiの前駆体であるAからE1を経て合成されることが示された。また、178・
HSDlmRNAの 転写 活性は SPH投与により誘導されるものの、成熟に伴い大きな変化を示さないことが明らかとなった。これまに知られている卵巣の発達 に 伴 う 邑 合 成 能 お よ び P450arom mRNA量 の 変 化 と 17 {3‑HSDImRNA
量の変化を考え合わせると本種の卵巣における邑産生の制限要因はP450aromであると考えられた。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査副査

教授
教授
教授
助教授
助教授

山内晧平
山崎文雄
原 彰彦
上田 宏
足立伸次

学 位 論 文題 名
:N/Iolecular biological studies on ovarlanSteroidhormone
biOSyntheSiSinJapaneSeeel， 4鏐 ぎ 勿 ff励 ッ 砂 〇 刀 ； Cロ
（ ニ ホ ンウ ナ ギ 卵巣 の ス テロ イ ド ホル モ ン 生 合成に関 する分子 生物学 的研究）

二 ホ ン ウ ナ ギ （ Anguilla japonfca） は 水 産 養 殖 上 重 要 な 魚 種 で あ る 。 し か し 、 本種 は飼育 環 境 下で は 成 熟しない 。また、 降海時の 下ルウナ ギの卵巣 卵の多く は、卵黄形 成初期ま で 発 達し て い るが、そ れ以上に 成熟段階 が進んだ 卵巣を持 つ個体は 捕獲されて いない 。 そ の た め 、 こ れ ま で サ ケ 脳 下 垂 体 懸 濁 物 （ SPH） 等 の ホ ル モ ン 投 与 に よ る 人 為 催 熟が試 み ら れて き た が、その 結果は必 ずしも安 定してお らず、催 熟技術の 改善が望ま れている 。 最 適な 催 熟 技法を確 立するた めには、 生殖腺の 発達を制 御する内 分泌因子に 関す
る詳 細 な 知見 が 不 可欠であ る。ー般 に、卵母 細胞の成 長および 最終成熟 は卵濾胞組 織で合 成 さ れ る ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン に 制 御 さ れ て い る が 、 ウ ナ ギ で も 、 E2が 卵 黄 形 成 に 、17Q， 20pー ジ ヒ ド ロ キ シ − 4− プレ グ ネ ン −3ー オ ン（ DHP） が 卵 母細 胞 の 最終 成 熟 に関 与 してい る と 考え ら れ ている。 本研究は 、二ホン ウナギ雌 の成熟過 程におけ るステロイ ドホル モ ン の 生 合 成 に 関 し て 遺 伝 子 レ ベ ル で 詳 細 に 調 べ る こ と を目 的 とし て 行 われ た 。
先 ず 、 卵 黄 形 成 初 期 （ SPH投 与 前 ） 、 卵 黄 形 成 中 期 お よ び 核 移 動 期 の 卵 濾 胞 を プ レ グ
ネ ノ ロ ン （ Preg） と と も に 培 養 し 、 培 養 後 の ス テ ロ イ ド 代 謝 物 を 解 析 し た 。 そ の 結 果 、SPH投 与 前 の 卵 黄 形 成 初 期 の 卵 濾 胞 は Pregを 他 の ス テ ロ イ ド に 殆 ど 転 換 し な い の に 対し 、 SPH投 与 後 は 各 種 ス テ ロ イ ド 合 成 酵 素 が 活 性 化 さ れ 、 卵 黄 形 成 中 期 に は 主 に ア ン ドロ ゲ ン が 、 核 移 動 期 に は 17aー ヒ ド ロ キ シ プ ロ ゲ ス テ ロ ン （ 17Qー OHP） お よ び DHPが 合成さ れ る ステ 口 イ ド合成経 路が誘導 されるこ とが明ら かとなっ た。また 、このステ ロイド 合 成 経 路 の 変 換 は 、 主 に C17・ 20側 鎖 切 断 酵 素 活 性 の 低 下 お よ び 20pー 水 酸 基 脱 水 素 酵素 （ 206ー HSD） 活 性 の 上 昇 に 起 因 し て い る と 考 え ら れ た 。
P450c17は 、 哺 乳 類 に お い て 17Q水 酸 化 酵 素 お よ び C17・ 20側 鎖 切 断 酵 素 の ニ つ の酵素 活性有 する こと が知 られて いる 。そ こで 、ウナ ギP450c17 cDNAを単 離し た。単離し たP450c17 cDNAを用いてタンノヾクを発現させ、その酵素活性を調ぺたところ、17a水 酸 化 酵 素 お よ び C17‑20側 鎖切 断 酵 素 の 両 酵 素 活 性 を 示し た 。 ま た 、 本 酵 素mRNAは、SPH投与 前の卵 巣で は検 出され なか った ものの、催熟により卵黄形成が始まると、検出されはじめ卵黄形成中期までその量は増加し、その後大きな変化を示さなかっ た 。以 上 の 結 果 、 SPH投 与 によ りP450c17 mRNAの転 写が 誘導 される こと が示 された 。 また 、 ウ ナ ギ P450c17は 17a水 酸化 酵 素 お よ び C17‑20側 鎖 切断酵 素活 性を 有しており、卵黄形成中期ではアンドロゲンの、核移動期では17a―OHPやDHPの合成に重要な役割を果たしていると考えられた。
20[3−HSDは、17a−OHPをDHPに直接転換する酵素である。近年ブ夕精巣の20(3−HSDの一次構造が決定され、可溶性夕ンパクのーつであるカルボニルリダク夕―ゼ（CR）であることが明らかにされた。そのため、魚類の20(3−HSDもCR様夕ンパクであると考えられている。そこで次に、ウナギ卵巣の20t3―HSDのタンパクレベルでの性状解析およびCRcDNAの構造 解析 を行い、20[3−HSDがCRであるか否かを検討した。20(3−HSD活性は、ウナギ卵巣において主にミトコンドリアおよびミクロソ―ム画分に分布しており、本酵素は細胞膜結合型夕ンパクであった。20(3ーHSD活性はSPH投与前の卵巣で検出され、その後卵巣の発達に伴ない上昇した。ウナギCR cDNAから推定されるアミノ酸配列は、他の動物種のものと高い相同性を示し、哺乳類のものと同様に可溶性夕ンノヾクであると考えられた 。卵巣 の発 達に伴うCRmRNA量の変化を調べたところ、卵黄形成中期で若干高まったが 、その 後大 きな変化を示さなかった。更に、CR遺伝子を導入したCOSー7細胞は、20(3−HSD 活性 を示さなかった。以上の結果、ウナギの卵巣では、SPH 投与により20(3―HSD活性が高まることが示された。また、本種の20(3−HSDはCRではないことが魚類で初めて示された。
最後に、P450aromとともにェス卜ロゲン合成の最終段階を触媒する17(3一水酸基脱水
素酵 素夕イ プ− ｜（17[3−HSD−I）のcDNAを魚類で初めて単離した。単離したウナギ
17[3‑HSD−lcDNAを用いてタンパクを発現させ、その酵素活性を調べたところ、本酵素はエス トロン （Ei）か らE2を合成 する 反応 のみ を触媒した。また、17pーHSD−lmRNAは
SPH投与前の個体の卵巣では検出されなかったものの、SPH投与後は全個体において検出され成熟に伴って大きな変化を示さなかった。以上の結果、17[3‑HSD−Iの基質特異性よル
ウナ ギ卵巣 にお いては、E2は主にEiの前駆体であるアンド口ステンジオンからEiを経て合成されることが示された。また、17(3−HSD―｜mRNAの転写活性はSPH投与により誘導されるものの、成熟に伴い大きな変化を示さないことが明らかとなった。これまでに知られ ている 卵巣 の発 達に 伴うE2合成 能お よび P450arom mRNA量の変化と17[3−HSD−lmRNA量の変 化を 考え 合わ せると 本種 の卵 巣に おける E2産 生の 制限要 因は P450aromであると考えられた。
上述のように、本研究では、人為催熟されたウナギ雌を用い、卵黄形成および卵母細胞の最終成熟を制御するE2およびDHPの合成に関与するステロイド合成酵素に関する詳細な知見が数多く得られた。これらの結果は、人為催熟により誘導される卵黄形成および最終成熟の問題点をステロイドホルモン合成の観点から考察する足がかりとなり、今後、催熟法を改良するうえで極めて重要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博士 （ 水 産 学 ） の 学 位 請 求 論 文 と し て 相 当 の 業 績 で あ る と 認 定 した 。