技術資料

免疫干渉反応ブロッキング剤の使用方法
Januar y 2018

はじめに免疫干渉反応ブロッキング剤の役割とは？
免疫診断薬開発とキット製造において高い性能品質を確保する
ことは、キット製造者にとって市場での成功と高い評価を得るキーとなります。免疫干渉反応は検査の品質に大きな脅威となります。
そしてその影響は広範囲に及びます。干渉反応による誤った、信頼性を欠く検査結果は、患者に誤った診断を与え不適切な処置を施す恐れがあります。このような事例が報告されると同じブランドの全ての製品に対する不信感につながります。また、この問題の解決と是正措置のため多くの費用と時間を費やすことになります。最適なブロッキング技術は、可能性のある干渉反応による影響を抑え、検査キット競合における優位性を保つための重要な要素となります。
ロシュ・カスタムバイオテックでは、最もよく見られる免疫干渉反応のタイプに応じて高い抑制効果を発揮できる幅広いブロッキング剤を取りそろえています。これらの製品は、ロシュが 25 年以上に渡り培ってきた体外診断用免疫検査試薬に用いる原料についての専門技術をもとに開発されたもので、安定した基盤を持つ当社免疫製品群のなかのひとつです。ロシュ・カスタム
バイオテックは、診断薬業界からの要望を理解し、お客様への適切なブロッキング剤の提供のみならず、免疫測定検査における正確度、感度および精密度の向上のための最適な分析条件（濃度範囲、特異性等）についてもご相談に応じております。

Introduction

ロシュ製ブロッキング剤は、以下の３種類の主な干渉に対してその機能ごとに分類されています：

抗体における干渉検出系における干渉

固相表面における干渉

2 | Technical notePreface

ブロッキング剤の使用方法

抗体における干渉

A-1: はじめに
A-2: ブロッキング剤の概要
A-3: ブロッキング剤の選択法
A-4: ブロッキング効果の確認
A-4-1: ブロッキング剤を評価するための一般的な推奨法
A-4-2: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、
例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤をサンプル希釈液中に溶解
A-4-3: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、
例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤を抗体コンジュゲート／酵素標識抗体を含む反応緩衝液に溶解検出系における干渉

B-1: はじめに
B-2: ブロッキング剤の概要
B-3: ブロッキング効果の確認
B-3-1: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤をサンプル希釈液中に溶解
B-3-2: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤を抗体コンジュゲート／酵素標識抗体を含む反応緩衝液に溶解

固相表面における干渉

C-1: はじめに
C-2: ブロッキング剤の概要
C-3: 性能改善効果の確認
C-3-1: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤を抗体コンジュゲート／酵素標識抗体を含む反応緩衝液に溶解Technical note | 3

Antibody interferences
抗体における干渉

A-1: はじめに異好性抗体とリウマチ因子（RF）は免疫測定検査において大きな干渉の原因となります。血清／血漿サンプルに存在する異好性抗体
は他の動物由来の抗体に対して幅広い反応性を示す特性があります。このような抗体は、一般的に human-anti-animal-antibodies（HA A A）と呼ばれており、最も代表的なものとして、ヒト抗マウス抗体（human anti-mouse antibodies: HAMA）がこれに属します 。異好性抗体は、偽陽性または偽陰性両方の誤った測定結果を与えます。
この干渉に対しては、最適な抗体コンジュゲートと試薬組成のデザインとともに、動物種とサブクラスが同じブロッキング剤を使用することで最大のブロッキング効果が得られます。

A-2: ブロッキンング剤の概要
製品名剤型/包装
サイズ

溶解法/ 保存サンプルサイ
ズ/単位

調製液の濃度（低/中/高）Cat. No.

MAB33
IgG1

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

25 mg

50/500/5,000 µg/ml

11 200 941 103

Framework
IgG

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

25 mg

50/500/5,000 µg/ml

03 369 846 103

MAB33 IgG1/IgG1 Poly

Frozen liquid 0.005,0.05, 0.250, 1, 5n/a-60°to -90°C
for 24 months

0.005 GAI

0.50/50/500 µg/ml

11 939 661 103

MAB33 IgG1/
Fab1 Poly

Lyo, 0.005, 0.05,0.250

a,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

0.005 GAI

0.50/50/500 µg/ml

11 368 338 103

MAB IgG2b/
Fab2a Poly

Lyo, 5, 50, 250

a,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

5 mg

0.50/50/500 µg/ml

11 355 830 103

PAB H-IgG/
Fab Poly

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

0.01 GAI

0.50/50/500 µg/ml

11 668 544 103

PAB Sheep
IgG

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

0.5 g

0.5/1.5/2.5 mg/ml
PAB の 10 倍濃度
concentration

10 717 606 103

PAB Rabbit
IgG

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°C
for 36 months

0.5 g

0.5/1.5/2.5 mg/ml
PAB の 10 倍濃度

10 912 280 103

PAB Bovine
IgG

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°C
for 24 months

0.5 g

0.5/1.5/2.5 mg/ml
PAB の 10 倍濃度

11 108 751 103

HAMA Serum
Type I
positive control

Lyo-15 to -25°C
for 24 months

1 piece

1 ml の精製水に溶解後1:20 に希釈

11 767 275 103

HAMA Serum
Type II
positive control

Lyo-15 to -25°C
for 24 months

1 piece

1 ml の精製水に溶解後1:20 に希釈

05 167 060 103* ストック溶液（最終タンパク濃度 c=10 または 20 mg/ml）a) 1x PBS, 50 mM KPO4, 150 mM NaClb) 反応緩衝液c) 0.9% PBS （0.45 μm 無菌濾過、NaN3 添加、pH 6.9 以上）

4 | Technical noteAntibody interferences
抗体における干渉A-3: ブロッキング剤の選択法

製品名

コンジュゲート
抗体の種類

コンジュゲート抗体のサブクラス

コンジュゲート
抗体のデザイン

MAB33 IgG1#11200941103

Mouse IgG
(HAMAs)

IgG1

1 価*

MAB33 IgG1/IgG1 Poly
#11939661103

Mouse IgG
(HAMAs)IgG2

多価**
リウマチ因子MAB33 IgG1/Fab1 Poly
#11368338103

Mouse IgG
(HAMAs)

IgG1,
Fab fragment

多価**
リウマチ因子MAB IgG2b/Fab2a Poly
#11355830103

Mouse IgG
(HAMAs)IgG2

多価**
リウマチ因子Framework IgG#03369846103

Mouse IgG
(HAMAs)

IgG2

1 価*

PAB H-IgG/Fab Poly
#11668544103

Human IgG

IgG2

多価**
リウマチ因子PAB Sheep IgG#10717606103

Sheep IgGPAB Rabbit IgG#10912280103

Rabbit IgG

PAB Bovine IgG

Bovine IgG#11108751103* コンジュゲート抗体は多価抗体または固相表面に高濃度でコーティングされた抗体** コンジュゲート抗体は 1 価抗体または液 相 中 の 抗 体Technical note | 5

Antibody interferences
抗体における干渉

A-4: ブロッキング効果の確認
A-4-1: ブロッキング剤を評価するための一般的な推奨法
1. 2 種類のモノクローナル抗体を用いる競合法またはサンドイッチ法の測定試薬に適用

10. HAMA 陽性コントロール（HAMA serum Type I, II）は、偽陽性または偽陰性に対する感受性の評価のために用いること

2. ブロッキング剤はサンプル希釈液に直接添加するか、または、反応緩衝液、抗体コンジュゲートあるいはラテラルフロー（イムノクロマトグラフィー）測定試薬の固相に低濃度で添加します（A2 の表：”調製液の濃度”の欄を参照）。
3. 最大の効果を得るためには、ブロッキング剤をモノクローナル抗体より先にサンプルに接触させます。このためには、ブロッキング剤をサンプル希釈液に添加します。

ができます。これらは、干渉物質を含む正常ヒト血清ベースの凍結乾燥品で、保存剤は添加されていません。特性は以下のとおりです。
・保存温度：-15～-25°C（輸送時は室温）もし、お使いの試薬にサンプル希釈液が含まれていない場合
は、第 1 反応開始前（サンプルとコンジュゲート抗体のインキュベーション時）、または第 2 反応開始前（後続のサンプルとコンジュゲート抗体のインキュベーション時）にブロッキング剤を反応緩衝液（コンジュゲート抗体含有）に添加します。
ラテラルフロー（イムノクロマトグラフィー）測定試薬においては、ブロッキング剤はコンジュゲートパッド、サンプル希釈液または前処理緩衝液に添加するか、試験パッドの手前に置かれているブロッキング用のメンブランに添加します。

・溶解法：1 ml の精製水で溶解し、使用前に 1:20 に希釈・溶解後の安定性：
短時間の場合 +2～+8⁰C 保存で 1 週間
長時間の場合 -15～-25⁰C 保存で 24 か月
ただし、上記安定性は内容成分の安定性に依存。
また、繰り返しの凍結、融解を避ける。
11. ブ ロ ッ キ ン グ 剤 を A-2 の表に従って溶解、調製してください。溶解後は、+2～+8⁰C 保存で 1 週間間、-15～-25⁰C 保存で 24 か月安定です。
12. ネイティブの干渉サンプルの測定数を増やしてブロッキングの効果を検証してください。個別の患者血清サンプル（n=100以上）を測定し、実際の測定条件（サンプルの種類、測定範

4. ブロッキング剤の調製濃度は A-2 の表をご参照ください。
5. 現行お使いのブロッキング剤は試薬（希釈液や反応緩衝液）から取り除いてください。
6. 陽性コントロール（干渉サンプル：例えば ロシュ製 HAMA

13.

囲、測定装置、測定対象項目、測定濃度範囲）による参照法
で得られた測定値について個々の患者血清測定回収率を比較してください。
ブロッキング剤の組成その他詳細については各々の製品のserum Type I, II）および陰性コントロール（HAMA を含まない緩衝液等）を用意してください。

規格書をご参照ください。最適な反応条件はそれぞれの検査試薬の測定方法やブロッキング剤の種類によって異なります。

7. サ ン プ ル と し て は 、 H A M A 、 H A A A ま た は リ ウ マ チ 因 子

したがいまして、ここでの記載内容はあくまでも参考としてください。最適な調製液濃度の設定等、反応条件の最適化を行ってください。

（RF）を含むヒト血清または血漿を用いてください。 市販の サ ン プ ル を 用 い る 場 合 は 、 干 渉 が H A M A 、 H A AA また は リ ウ マ チ 因 子 （ R F ） に 起 因 し て い る こ と を 確 認 して ください。干渉は、非特異的な結合や検出系等の他の要因で発生する可能性があります。
8. ブロッキングの効果は、異なった濃度のブロッキング剤を用いて確認してください。
9. ブロッキング剤は 2～3 ロットを用いてロット間差を確認してください。

6 | Technical noteAntibody interferences
抗体における干渉

A-4-2: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤をサンプル希釈液中に溶解
1. A-3 の表（または別の選択ガイド）に従って最適なブロッキング剤を選択してください。
2. 抗体ブロッキング剤を A-2 の表に従って溶解してください。
3. ブロッキング剤を含まないサンプル希釈液を用意してください。
4. A-2 の表に従ってブロッキング剤をサンプル希釈液で溶解し、各種濃度の調製液を作製してください。
5. 干渉サンプルをブロッキング剤を含むサンプル希釈液で希釈してください。

10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.

測定法に従って インキュベーションしてください。
反応容器を洗浄してください。
基 質 を反 応容 器に入 れて く ださい。
測定法に従ってインキュベーションしてください。
反応停止液を添加してください。
OD 値を読み取ってください。
偽陽性の回避率（%）を計算してください。
干 渉 陽 性 サ ン プ ル と し て 、 ロ シ ュ 製 HAMA
serum Type I: Cat. No. 11767275103 および Type II:
Cat. No. 05167060103 をお使いいただくと便利です。

6. 希釈後の干渉サンプルを反応容器に分注してください。
7. 測定法に従ってインキュベーションしてください。
8. 反応容器を洗浄してください。
9. 抗体コンジュゲートを反応容器に入れてください。

A-4-3: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤を抗体コンジュゲート／酵素標識抗体を含む反応緩衝液に溶解
1. A-3 の表（または別の選択ガイド）に従って最適なブロッキング剤を選択してください。
2. 抗体ブロッキング剤を A-2 の表に従って溶解してください。
3. ブロッキング剤を含まない反応緩衝液を用意してください。
4. A-2 の表に従ってブロッキング剤を抗体コンジュゲートを含む反応緩衝液で溶解し、各種濃度の調製液を作製してください。
5. 干渉サンプルを反応容器に分注してください。調製した抗体コンジュゲートおよびブロッキング剤を含む反応緩衝液を添加し10. 反応停止液を添加してください。
11. OD 値を読み取り検量線から測定対象物の濃度を求めてください。
12. 偽陽性の回避率（%）を計算してください。
13. 干 渉 陽 性 サ ン プ ル と し て 、 ロ シ ュ 製 HAMA
serum Type I: Cat. No. 11767275103 および Type II:
Cat. No. 05167060103 をお使いいただくと便利です。てください。
6. 反応容器中の干渉サンプルおよび抗体コンジュゲートとブロッキング剤を含む反応緩衝液を測定法に従ってインキュベーションしてください。
7. 反応容器を洗浄してください。
8. 基 質 を 反 応容 器に 入れてく だ さ い。
9. 測定法に従って インキュベーションしてください。

Technical note | 7

Detection interferences
検出系における干渉

B-1: はじめに検出系における干渉は、ストレプトアビジンまたはアルカリフォスファターゼ（AP）標識酵素のような検査試薬中の構成成分と患者検体中の異好性抗体との交差反応により惹起されます。これらの反応は、被検物質が存在しない場合でもシグナルとして認識され偽陽性の原因となります。標識酵素や直接標識剤は抗体による干渉のターゲットとなります。

B-2: ブロッキング剤の概要

製品名剤型/包装
サイズ

溶解法/ 保存サンプルサイ
ズ/単位

調製液の濃度（低/中/高）Cat. No.

*Alkaline Phosphatase
Mutein rec.1

Lyo, custom fill+2 to +8°C
for 24 months0.5 g

0.3/30/300 µg/ml

04 781 007 103β-Galactosidase
Mutein rec. 2Lyo, custom fill

-15 to -25°C
for 24 months

0.1 MGI

ß-Galactosidase の濃度に依存

11 184 024 103

Streptavidin rec.
inactive, Poly

Frozen liquid, 0.01,0.4, 2 GAI-60 to -90°C
for 12 months

0.01 GAI

0.3/120/300 μg/ml

11 922 122 103* 凍結乾燥品で以下の成分を含む
NaCl, 0.2 mmol/l, ZnCl2 0.1 mmol/l, TE A 30 mmol/l, MgCl2 1 mmol/l, raffinose, 50% (w/v), pH 7.6
1AP rec. highly active Cat. No.03137031103 ま た は AP rec. highly active CR reduced Cat. No.0535452103 と組み合わせて使用

2

ß-Gal, rec. Cat. No.10570079103 と組み合わせて使用

B-3: ブロッキング効果の確認
B-3-1: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤をサンプル希釈液中に溶解抗体における干渉、A-4-2 の項を参照し同様な手順にて実施してください。
調製液の最適濃度は、B-2 の表に従って求めてください。

B-3-2: 酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤を抗体コンジュゲート ／酵素標識抗体を含む反応緩衝液に溶解抗体における干渉、A-4-3 の項を参照し同様な手順にて実施してください。
調製液の最適濃度は、B-2 の表に従って求めてください。

最大のブロッキング効果は、最初にサンプルをブロッキング剤とともにインキュベーションしたときに得られます。

8 | Technical note

Surface interferences
固相表面における干渉

C-1: はじめに固相表面における干渉は、試験サンプル中の血清・血漿タンパクや疎水性物質と保護されていない固相表面の間での非特異的な相互作用によって惹起されます。このような相互作用は、使用されている各種固相（例えばコーティング処理または未処理のマイクロタイタープレートや各種ディスポーザブル製品）の表面の状態に依存し、バックグラウンドを増加させます。
ロシュ・カスタムバイオテックのウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin: BSA）系ブロッキング剤は、免疫検査で使用されるあらゆるタイプの固相に対して有効です。これらのブロッキング剤は、反応表面、試薬成分および被検物質間の複雑なマトリックス中で発生する広範囲な干渉反応に対して効果があります。表面における干渉反応を効率的にブロッキングすることにより、バックグラウンドのシグナルを減少させ、感度を増加させることができます。また、試薬の安定性の向上にも寄与します。

Technical note | 9

Surface interferences
固相表面における干渉

C-2: ブロッキング剤の概要
製品名剤型/包装
サイズ

溶解法/ 保存サンプルサイズ/単位

調製液の濃度（低/中/高）Cat. No.

Bovine Serum
Albumin BSA),
Fraction V, fatty
acid freeLyo, custom filln/a+2 to +8°C
for 24 months

0.025 kg

0.5/2/5%

10 774 111 103

Bovine Serum
Albumin (BSA),
Fraction V

Lyo, custom filln/a+15 to +25°C
for 24 months

0.05 kg

0.5/2/5%

10 738 328 103

Bovine Serum
Albumin (BSA),
reduced sodium
and potassium

Lyo, custom filln/a+15 to +25°C
for 36 months

0.01 kg

0.5/2/5%

11 297 368 103

PAB BovineIgG

Lyo, custom filla,b,c*-15 to -25°Cfor 36 months

0.5 g

0.5/2/5%,
PAB の 10 倍濃度

11 108 751 103

Poly BSA I
acetylated

Frozen solution 1.5,10, 20 GAI

n/a-15 to - 25°C
for24 months

1g

0.5/2/5%

11 866 737 103

Poly BSA II
succinylated

frozen solution 1.5,
10, 20 GAI

n/a-15 to - 25°C
for 24 months

1g

0.5/2/5%

11 816 438 103

BPL A Type I

Lyo, custom filln/a+2 to +8°C
for 24 months

0.01 kg

0.5/2/5%

11 726 536 103

BPL A Type IV

Lyo, custom filln/a+2 to +8°C
for 24 months

0.01 kg0.5/2/5%

11 726 544 103* ストック溶液（最終タンパク濃度 c=10 または 20 mg/ml）a) 1x PBS, 50 mM KPO4, 150 mM NaClb) 反応緩衝液c) 0.9% PBS （0.45 μm 無菌濾過、NaN3 添加、pH 6.9 以上）

10 | Technical note

Surface interferences
固相表面における干渉

C-3: 性能改善効果の確認
C-3-1:酵素免疫測定法（1 ステップまたは 2 ステップ、例：アルカリフォスファターゼ）の場合の評価法

ブロッキング剤を抗体コンジュゲート ／酵素標識抗体を含む反応緩衝液に溶解
1. ブロッキング剤の選択ガイドに従って最適なブロッキング剤を選択してください。

10. OD 値を読み取り検量線から測定対象物の濃度を求めて

2. ブロッキング剤を C-2 の表に従って溶解してください。
3. ブロッキング剤を含まない反応緩衝液を用意してください。
4. C-2 の表に従ってブロッキング剤を抗体コンジュゲートを含む反応緩衝液で溶解し、各種濃度の調製液を作製してください。

11. シグナル、バックグラウンド、S/N（シグナル/ノイズ）比、感度、精密度および試薬の安定性等の性能因子を計算してください。

ください。

12. 異なった種類のサンプル について確認してください。
例：キットのキャリブレーター 、コントロール、ヒト検体

5. 異なった種類の干渉サンプル、抗体コンジュゲートおよびブロッキング剤を含む反応緩衝液を測定法に従い反応容器中でインキュベーションしてください。
6.
7.
8.
9.

反応容器を洗浄してください。
基 質 を 反 応容 器に 入れてく だ さ い。
測定法に従って インキュベーションしてください。
反応停止液を添加してください。

Technical note | 11

免責事項
製造用途に限定免責事項（Poly BSA Type I および Poly BSA Type II に関して）
体外診断用医薬品および医療機器製造用途に限定

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