何 . 荒 木 猪)11.西沢:スサピノリの亜硝還元酵素

87

何智恵ヘ荒木繁料，猪川倫好料水，西沢一俊料件:スサピノ

リの E硝酸還元酵素活性におよ{ます 2，3の培養僚件の影響
Chi‑Huie Ho*，Shigeru ARAKl**，Tomoyo喧hiIKAWA*** and Kazutosi
NrsrZAWA****: Effectsof some cultural conditions upon the nitriteezoensisreductase activ
ityin Porphyray
亜硝酸還元酵素 (Nitritereductase，NiR) は一般緑色植物においては，窒素代謝，特に硝酸同化に関係した重要な酵素であり，次の反応を触媒することが知られている。
N 02‑+6e‑+8H+←
ー→NH.++2H20

何は，すでに従来全〈行なわれていなかった紅漢について， ス十ビノリを選んでその酵素を純化精製し，その酵素化学的性質を明らかにした。日それはホウレ γ ソウなどのNiR にもよく似た性質を示したがめ剖， 多くの点でクロレラ NiR とは酷似しておりへ

この結果により藻類 NiR に共通した特性も暗示された。
今回は，人工培養ス+ピノリにおいて，通常の NiR活性および CytochromeC 553(Cytc553) を主とする加熱後 NiR活性を示す物質の光や培養液組成による影響をみたので，その結果の一部を報告する。
材料および実験方法

Porphyrayezoensis
1.実験材料:山本海苔研究所において培養しているスサピノリ (UEDA)の株を酵素原料とした。
2. 培養条件:標準培養としては，須藤 ASP6 の改変培地5) を用い， 4.0001ux 光照射下(三菱デラックス白色蟹光灯 30W8本)明暗 12時間交代で培養した。強光を用いる時には，照度 40，0001ux(東芝メタルハヲイドラ γプ 350W1本)とした。標準培養
では， N・源は NaNO.0.
2g/l であるが，低濃度 N.源の場合にはその 1/10 濃度を用いた。培養液は L・ずれも 1週間毎に全量を交換した。水温は， 3週間までは 180C，
そ傘

東京教育大学理学部植物学教室(112東京都文京区大塚 3‑29‑1)

DepartmentofBotany，TokyoKyoikuUniversity，Otsuka，Tokyo，112]
apan.
H山本海持研究所(143東京都大田区大森東 5‑
2‑
12)

Y田 namotoNoriResearchLaboratory，Oomori.
higashi，Oota.
ku，Tokyo，143]apan.
柿 * 筑波大学生物科学系∞(3 ‑31茨城県新治郡桜村大字表木宇実久保)

InstituteofB
iologicalSciences，TheUniversityo
fT四 kuba，Sakura，Ibaraki，
300.
31]
apan.
帥 梓日本大学lIl!獣医学部水蹟学科(154東京都世田谷区下馬 3‑
34‑1)

Departmen
tofF
isher
ies，CollegeofA
gr
icu
ltur
eandVeter
inar
yMedi
cine，Ni
honU
niver
si
ty，Shimou
ma，Setagaya・
ku，Tokyo，154]
apan.
Bull.Jap.Soc.Phyco
，.
l2
3:87‑
92，Sept.1
975.
‑1‑

88

藻 類 第23巻 第 3考 昭 和 50年 9月の後は 130C であった。藻体は，糸状体から放出された殻胞子をクレモナの単糸に付着させ生育させた。
3. ~案体重量:藻体重量測定には，別に対照培養に相当する試料を作り， 水分をよく切った後の生重量を測定した。

4. 藻体乾量: 葉状体表面に付着している水を吸い取ってから，硫酸デシケーター中で室温で一定重量になるまで減圧乾燥し，それを乾量とした。
5. タシパク質含量:酵素抽出液中のタンパク質は LOWRY 法 6) により，牛血清アルブミ γ を基準液として定量した。
6. 酵素液の調製:培養藻体のそれぞれの生長段階の葉状体 (3~7g) を取り出し，表面に付‑着している水を吸い取ってから，液体窒素で速かに凍結し，これを乳鉢中で等量

ris・HCl緩衝液 (pH7.
5) と共によく磨潰し， 3~4 時間 4 0 C に静置した後の 0.5MT24，000xg20分間遠沈し，その上澄液を酵素液とした。
7. NiR活性の測定

RAMIREZ らわの方法を多少改良した。すなわち

75μmolesの T
ris‑HCl緩衝液， pH7
ム 2μmolesの亜硝酸ナトリウム (NaN02)，0.75μmoleの，7.5mg の亜二チオン酸ナトリウム (Na.S.O会)を 0.29M
メチルピオロゲン (MV)

NaHCOs0.
15mlに溶かしたもの，および酵素液とから成る全体で 1ml の酵素反応液
00C に 10分間保ってから，反応容器を取出し還元型 M V が完全に脱色するまでを 300倍稀釈液 2mlにジアゾ化試薬の各 1機械的に激しく娠還する。次にこの反応液の 1mlずつを加え，水で全体を 5mlとなし 10分間室温に放置後，目立分光光度計 139型
で 540nm における吸光度を測定し，基準曲線から亜硝酸量を求め，還元された亜硝酸量を算出した。

この条件下で 1分間に 1μmole の亜硝酸を還元する酵素量を 1単位(U) とし， U/分を比活性とした。また主として cytc553による加熱後の NiR活性も同様の定量法により測定した。
実験結果
1.標準培養液における強弱の光条件下の藻体の生長。
メタルハライドランプ 40，0001ux下と白色蛍光灯 4，0001ux下の培養における藻体の生長量を比較した。図 1に示すように，前者の方が約 30%生育がよかった。

2. 標準光条件下およひ。低窒素培養条件下における藻体の生長。
光照度その他は標準条件とし，窒素源のみを標準の 1/10濃度 (NaNOs0.
02g/l)として培養し，その生長量を標準条件下のものと比較した。図 2に示すように，両者は実際上はほとんど同じであったが， 1忌 N圃濃度の場合には細胞内容に乏しく，水膨れ状態を呈し，すでに培養 2週間目頃から葉状体は標準培養のものに比べて色調が薄くなり始めた。別の実験セットで行なった結果であるが，この時期の藻体では，標準条件下の葉状体の乾量/生重量比は 0.
146，全 KJELDAHLN は 7.
49% に比し，前者の値は 0.
136で
‑ 2ー

何.荒木.猪川.西沢:スサピノリの亜硝還元酵素
100ノシ急言き︒﹄由ZM

01c.
68Cultural 酔討。d(we曲}Fig.1. GrowthofthalIiofPOゅhyrayezoensis under40，0ωlux from a metalhalidelampand41αlOlux
from ftuorescent lamps intheot岨 dardcu
lturemedium. NaN03 0.
2g/l w田 usedasnitrogen
田町田 (standardN・concen
tration).
40，0ω
0 4，脚 lux(standar
dirradiation).
lux，0‑‑.
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ralp酎 剖 (we曲)Fig.2. Growtho
fthalliofPOゅ，hyraye:w
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也 e.
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阻 dar
dculturalconclition and t
heculturalconclitionofalower N園田町田・ 4，0ωluxwa9 ir.
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iated.
NaNOa0.
02g/l，0NaN03
0.
2g1(standardN・
concentration)・.
.
一一.

‑ 3ー一一o8990

藻 類 第 23巻 第 3号 昭 和 50年 9月
AB1.
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c.
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itiesbefore(A)anda
fter(B)heating.一一ー.
under4，000¥ux，
一一 under 40，0 lux.

∞o

後者は 2.18%に低下した。

3. 強光および弱光条件下標準培養における藻体抽出液の通常および加熱 NiR 活 性の比較。
スサピノリを 4，OOOluxおよび 40，000luxの光照射下で標準培養液で培養し， 7，8，9週後のそれぞれの試料から酵素を抽出して， NiR活性および加熱 (700C， 10分間)後のNiR活性(主として Cytochromec 553含量に当る)1>を測定した。結果を図3に示す。
4，000lux 照射下の NiR活性は 7，8週間培養は非常に高く， 9週培養になると著しく低下した。

40，0001ux 照射下でもやや同じような傾向を示した。

主として cyt c 553

日

且20.

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216

主1.8c>

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8Culluralperiod(week)

ctofN‑concentr
ation on PorphyraNiR
Fig.
4. E古eactiv
itiesbefore (A) and after(B)heating.
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ation，
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一 at1/
1 N‑
concentration.

ー‑.

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∞

何.荒木.猪川.西沢:スサピノリの亜硝還元酵素

91含量を示す加熱後の活性は， 4，0001ux 照射下では 7，8，9週培養の順に低下してしら。
40，OOOlux の場合にも 8，9 週培養の順に低下はしているが， 4，0001ux 照射下の活性に比べると 2倍以上の活性を示した。この結果から， NiR活性はここで使用した光の強さに関係なく9週培養ではかなり低下したが， cytc553含量は強光の方が遁に高くなっていることが分った。
4. 標準培養条件および低蜜索培養条件下における通常および加熱 NiR 活性の比較。
スサピノリを 4，0001ux光照射下において，標準 N‑濃度とその 1/10濃度下において培養し 7，8，9週にわたり試料を採取して，抽出酵素液の加熱前後の NiR活性を測定した。その結果を図 4 に示す。
NiR活性は標準窒素濃度では 7週， 8週と培養が進むにつれて，その強さを増したが 9週培養になると 7週よりも低くなった。一方 1/10N‑源濃度によると， 8遜の活性はほぼ普通の N・濃度の活性と同じであったが， 9週になると，著しく低下した。また，主として cytc553の含量もほぼ前記 NiR活性と同じ傾向を示し， 9週培養では著しく少なくなった。これらの結果は，活性 NiRおよび cytc553含量は，藻体が成熟しその生長が遅くなると低下し，特に低 N‑濃度の方がこの傾向が遥かに大きいことを暗示している。
考 察

スザビノリの人工培養には，少なくとも本実験に関する限り標準条件として用いた培養条件が最も適しているように思われた。 N‑ 源として標準条件すなわち NaN03(0.
2g/l) を用いた場合には， 4，0001ux でもその 10倍の4O，0001ux でも，藻体の生重量はあまり違わなかったが， 強光照射下の方が cytc553 を主とした cytochrome量はむしろ増えた。それにもかかわらず， NiR 活性は光強度に関係なく， 培養が進んで藻体生長が遅くなると低下した。このような結果は藻体の成熟と NiR活性低下が密接に関係していることを暗示するものである。 また主として cytc553 の含量は強光の方が高いけれども，成熟に伴って低下する傾向は NiRと同じであった。

0 に低下しても ，NiR 活性および一方， N・源 (NaN03) の濃度を標準培養の 1/1cytc553含量の培養期間に伴う変化パターンは，量的には多少異なるがほぼ同じ傾向を示した。すなわち，藻体の成熟に伴い両者は低下したが，その際 NiR活性低下の方が逢かに著しかった。
SummaryPorphyra yezoensis UEDA was culturedin an artificial medium through 9weeks. Thee
妊ectsoflightintensityand thecon
centrationo
fnitrogensource(sodiumnitrate) upont
hea
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92

藻 類 第 23巻 第 3号 昭 和 50年 9月

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igated. Growtho
fthealgawas
cytochromec5appar
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tofintensity，andd
cytochromec5
53showed alsoasimilartendency，excep
tfo
r ahi
g
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undermainlyt
hes
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nten
sity. The conten
tofmainly cytochromeswellasthenitritereductaseactivitywasa
lsochangeds
imilarlyinde‑c553aheydecreasedwiththealgalaging.
pendento
fthenitrogenconcentration，andt
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‑ 6ー