博 士 （水 産学 ） 北村 真紀子
学 位論文題名
Immunochemical and biochemical studies on egg yolk
protein， vitellin， in Ezo abalone (llaliotisdiscusカ口 刀 刀ロ ぎ ）（ エ ゾ ア ワ ビ に お け る 卵 黄 蛋 白 ビ テ リ ン に 関 す る 免 疫 生 化 学 的 研究 ）

学位論文内容の要旨
ア ワ ビ 類は 軟体動物 の原始腹 足類に属 する草食 性の大型 巻き貝であ り、古く から食 用に 供 され てきた が、その 漁獲量は 年々滅少 している 。近年、資 源を回復 するため に増 養 殖が 行われ 、特に人 工種苗生 産技術の 開発が進 められてき た。エゾ ァワビは 国内 の アワ ビ類漁 獲高の40％ 以上を占 めており 、水産上 重要種であ る。しか しなが ら、 成 熟生 理機構 、特に卵 黄形成に 関する生 化学的研 究はほとん どなく、 基礎的な知見 を得るこ とは重要 であると考 えられる 。
無 脊 椎 動物 である昆 虫におい て、卵黄 蛋白前駆 物質（ビ テロジェニ ン）は脂 肪体
で 合成 さ れへ モリン フを介し て卵黄蛋 白の主成 分である ビテリンと して卵内 に貯蔵される 。また、 海産無脊 椎動物であ るエビ・カニ類では、卵巣内で合成される種と、卵 巣外 器 官（ 肝膵臓 、脂肪組 織）で合 成される 種が存在 することが これまで 報告され てい る 。― 方、貝 類におけ るビテリ ンの合成 部位に関 する研究は 、陸上巻 き貝のカ タツ ム リ、 二枚貝 のムラサ キイガイ およびマ ガキに限 られ、海産 巻き貝に おける
この分 野の研究 はない。
卵 内 に 蓄積 された卵 黄蛋白は 、摂餌を するまで 初期発生 時の栄養源 並びにエ ネルギ ―源 と して 消費さ れる。最 近、マガ キにおい て胚発生 並びに幼生 発生に伴 うビテリ ンの 低 分子 化が観 察されて いるが、 他の軟体 動物にお ける卵黄蛋 白の低分 子化に関 する 研 究は ほとん どない。 そこで、 本研究で は腹足類 のエゾアワ ビを対象 種として 、そ の 卵黄 形成機 構を解明 すること を目的と して、卵 黄蛋白の主 成分であ るビテリ ンを 精 製し 、その 諸性質を 解析した 。次に精 製蛋白に 対する抗血 清を作製 し、卵黄 形 成に 伴 うビ テリンの 動態並び に免疫組 織学的観察 によルビ テリンの 合成部位 を検 討 した 。 また 、貝類間 のビテリ ンを比較 するために ホタテガ イのビテ リンを精 製し た 。さ ら に、 エゾアワ ビにおい て胚発生 並びに幼生 発生に伴 う卵黄蛋 白の低分 子化 を観察し 、その低分 子化に関 わる酵素 を解析し た。
実 験に 用 いたア ワビは、 北海道南 西部大成 町種苗育成 センター で飼育中 のエゾアワ ビ を用 い た 。卵 抽 出 液を ハ イド ロ キ シル アパタイ 卜および ゲル濾過 カラムの 2つの ク ロマ ト グ ラフ ィ ー に供 し てビ テ リ ンを 精 製し た 。 精製 ビ テリ ン は ゲル瀘過 で500kDaであ り 、 糖、 脂 質 およ び カロ テ ノ イド を 含む 複 合 蛋白 で あっ た 。また 、精製 蛋 白 を SDS− PAGEに よ り 泳 動 し た 結 果 、 150kDaと 95kDaのボ リ ベ プチ ド から 成る へ テロ ダ イマ ーであっ た。アミ ノ酸組成 を解析した 結果、ア スパラギ ン酸、グ ル
タ ミ ン酸 、 ア ラニ ン お よび ロ イシ ン を 各々 9％以上含 んでいた 。これら の分子量 およ び サブ ユ ニッ ト構造、 並びにア ミノ酸組 成は、カイ コ、ウシ エビ等の 無脊椎動 物の ビテリン と類似して いた。作 製したエ ゾアワビ のビテリ ンに対す る抗血清(a‑Vn)を 用 いて 、 免疫 交叉反応 性を有す るへモリ ンフ蛋白を 検索した 結果、ビ テリン関 連
雌 特 異蛋 白 、即 ちビテロ ジェニン 様蛋白は エゾアワビ には存在 しないこ とが示さ れた。
二 枚貝 の ホタテ ガイのビ テリンを 精製し、 腹足類のエ ゾアワビ と性状比 較を行った 。 ホタ テ ガ イの ビ テ リン は ゲル 濾 過 で500kDaの糖 、 脂 質お よ びカ ロ テノイ ドを
含 む 複合 蛋 白で あり、エ ゾアワビ のビテリ ンの結果と よく一致 した。ま た、アミ ノ酸 組成もエ ゾアワビの ビテリン とほぼ同様であった。一方、、ホタテガイのビテリンは 210kDaの ボ リ ペプ チ ド から 成 るホ モ ダ イマ ー であ り 、 エゾ ア ワビ や マガキ のサブ ユニツ卜 構造と異な っていた 。
エ ゾアワビ の卵成長に 伴うビテ リンの動 態を観察 するため に、a−Vnを用いたマン
シ ー ニ法 に より 卵巣内の ビテリン 量を測定 した。ビテ リン量は 卵成熟に 伴って増 加し 、産卵期 の9月（1997年） または10月 （1998年）に 最大値（ 100，350mg/govaツ）を 示 した 。 この 傾向はマガ キやホタテガ イの結果とよ く一致していた 。
各 月に お ける卵 母細胞の ステージ を組織学 的に解析し た結果、 卵原細胞 、染色仁期 、 無卵 黄 期お よび油球 期の卵母 細胞は一 年を通して 観察され た。ー方 、卵黄顆 粒‑1050−

期および 成熟期の 卵母細胞 は各々5月 、7月から 出現した。免疫組織学的観察により、卵母細胞 内の卵黄 穎粒がa‐ Vnで染色さ れ、この 卵母細胞は5月の卵巣で観察された。
これ よ り 、5月に は 既に 卵 巣 内で ビ テリ ン の 蓄積 が 開 始され ており、 生殖周期 に伴って発達 した卵母 細胞内に 蓄積され ると考え られた。
ビテリン の合成部 位を検討 するため に、a−Vnを 用いた免疫 組織学的 観察を行 った
結果、卵 黄穎粒は 染色され たカゞ、 肝膵臓に おいては検出されなかった。また、鰓、筋肉 、 肝 膵臓 お よび 生 殖 巣の 抽 出 液を a‐ Vnを 用 い たWesternblottingに供した 結果、 卵 巣 以外 で は免 疫 染 色され る蛋白は 観察され なかった。 これらの 結果およ びへ
モリ ン フ 中に ビ テリ ン 関 連蛋白 が存在し ないこと から、エゾ アワビの ビテリン は卵巣内で合 成される 可能性が 強く示唆 された。
エゾアワ ピにおけ る胚発生 並びに幼 生発生に 伴うビテリ ンの低分 子化をa− Vnを用い た Westernb｜ ottingに よ り 観 察 し た 。 150kDaと 95kDaの 2つ の ビ テ リ ン の サブ ユ ニ ッ ト の う ち 、 150kDaが 受 精 後 48hrに 消 失 し 、 135kDa、 133kDaお よ び
50kDaの バ ン ド が 新 た に 出 現 し た 。 ― 方 、 95kDaの サ プ ユ ニ ッ ト バ ン ドは 受 精後48hrに お い ても 検 出さ れ た 。最 終 的に 、 受 精後 120hrで は 2つ のサ ブ ユ ニッ ト はほぼ消 失 し た。 異 なる ス テ ージ の 胚 体抽 出 液は ゲ ル 濾過 カラ ムで2つの メインピ ーク(500kDaの ビ テ リン ピ ーク と 6.5kDa以 下 の低 分 子 ピー ク ）を示 した。メイ ンピ―クの位 置 は 胚発 生 に伴 っ て 変化し なかった が、ステ ージが進む に従いビ テリン量 は減少 し た 。受 精 後48hrで 150kDaのサ ブ ユニ ッ ト が消 失 し たに も かか わ ら ず、 ゲ ル濾
過 で は 500kDaの ビテ リ ン ピー ク が 観察 さ れた 。 こ れら の 結果 か ら 、胚 体 また は 幼生の 抽 出 液中 の ビテ リ ン は分解 されたの ではなく 、分子内に ニックが 入ったと 推察された。 各ステ― ジの胚体中のビテリン相対量は受精後12hrまで変化しなかったが、受 精 後 18hrか ら 滅 少 し 始 め 、 120hrで は42％ まで 滅 少 した こ とか ら 、 ビテ リ ンが胚発生に 伴って消 費された と考えら れた。
ビ テ リン の 低 分子 化 に関 わる酵 素を検討 するため に、DigoxlgenIn標識ビ テリン（ DIG‐ ビテ リ ン） を 、 受精 後 48hrの抽 出 液 の水 可 溶 性分 画 （WSF） と 共に 37℃ 、DH5． 6― 5． 8、 16hrの 条件 下 で 反応 さ せた 後 、 SDSー PAGEで解析し た。その結 果、DIG− ビ テリ ン のmレftr0で の 蛋 白分 解 の泳 動 パ ター ン は受 精 後 48hrと同 様 なパ タ―l051―

一 ン を 示し た。ビテ リンの低 分子化を 様々なイ ンヒビタ ―を用い て阻害した 結果、
キ モ ス タチ ンで阻害 されたこ とから、 この低分 子化には セリンプ ロテア―ゼ が関与し ている可 能性が考 えられた 。
以 上、 エ ゾアワビの ビテリン は他の無 脊椎動物 と同様に 糖、脂質 およびカロ テノ
イ ド を 含む 高分子複 合蛋白で あり、卵 母細胞内 の卵黄顆 粒中に蓄 積されるこ とが示
さ れ た 。ま た免疫生 化学的解 析の結果 、ビテリ ンは卵巣 内で合成 されると考 えられた 。 一 方、 エゾアワ ビのビテ リンは胚 発生並び に幼生発 生に伴っ て低分子化 し、その 低分子化 にはセリ ンプ口テ アーゼが関与している可能性が示唆された。本研究は、今 後 貝類 の 再生産 を検討する上 で有効な知見を 提供すると考 えられる。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

原 彰彦
山 内 晧平麦 谷 泰雄足 立 伸次学位論文題名Immunochemical and biochemical studies on egg yolk
protein， vitellin， in Ezo abalone (llaliotis discus ha7zTzai)（エゾアワビにおける卵黄蛋白ビテリンに関する免疫生化学的研究）

エゾァワビは国内のアワビ類漁獲高の40％以上を占め、商業的価値が高く、水産上の重要種であり、これまで増養殖が盛んに行われてきた。しかしながら、成熟生理機構、特に卵黄形成並びに胚発生に関する生化学的研究はほとんどなく、基礎的な知見を得ることは重要であると考えられる。
無脊椎動物の昆虫においては、卵黄蛋白前駆物質（ビテロジェニン）は脂肪体で合成されへモリンフを介して卵黄蛋白の主成分であるビテリンとして卵内に貯蔵される。また、エビ・カニ類では、ビテロジェニンが卵巣内で合成される種と、卵巣外器官（肝膵臓、脂肪組織）で合成される種が存在することがこれまで報告されている。―方、貝類におけるビテリンの合成部位に関する研究は少なく、海産巻き貝におけるこの分野の研究はない。
卵内に蓄積された卵黄蛋白は、摂餌をするまでの初期発生時のエネルギ一源並びに器官形成に関わっていると考えられている。最近、マガキにおいて胚発生に伴うビテリンの低分子化が観察されているが、分解過程に関する研究はほとんどない。
そこで、本研究では海産巻き貝のエゾアワビを対象種として、その卵黄形成機構並びに胚発生機構を解明することを目的として、卵黄蛋白の主成分であるビテリンを精製し、その藷性質を解析した。次にビテリンに対する抗血清を作製し、卵黄形成に伴うビテリンの変動を観察するとともに免疫組織学的手法によルビテリンの合成部位を特定した。さらに、胚発生に伴うビテリンの低分子化を観察し、その低分子化に関わる酵素を解析した。
実験に用いたアワビは、北海道南西部大成町種苗育成センターで飼育中のエゾアワビを用いた。卵抽出液をハイドロキシル・アパタイトおよびゲル瀘過カラムに供してビテリンを精製した。精製ビテリンは分子量500kDaの糖および脂質を含む複合蛋白であり、150kDaと95kDaの2つのサブュニットから構成されると推察された。
エゾアワビのビテリンの分子量、サブユニット構造、並びにアミノ酸組成は、カイコ、ウシエビ等の他の無脊椎動物のビテリンと類似していた。ビテリンに対する抗血清（a―Vn)を作製し、免疫交叉反応性を有するビテロジェニン様蛋白を検索した結果、ヘモリンフ中には検出されなかった。
エゾアワビの卵成長に伴うビテリンの動態をa− Vnを用いたマンシーニ法により測定 し た結 果 、卵巣 内ビ テリ ン量 は卵黄 形成 に伴 って増 加し 、産 卵期 に最大 値（350mg/govary)を示した。
卵母細胞のステージを組織学的に解析した結果、卵黄球期および成熟期の卵母細胞は各々5月、7月から出現した。これより、5月には既に卵巣内でビテリンの蓄積が開始されており、7月以降卵母細胞内の卵黄の蓄積が活発であることが示された。
ビテリンの合成部位を検討するために、a−Vnを用いて免疫染色した結果、卵黄球期以降の卵母細胞は染色されたが、肝膵臓では免疫反応が認められなかった。また、各体組織の抽出液をWesternblottingに供した結果、卵巣以外では免疫染色される蛋白は観察されなかった。これらの結果およびへモリンフ中にビテロジェニン様蛋白が検出されないことから、ビテリンは卵母細胞内で合成される可能性が強く示唆された。
胚発生に伴うビテリンの低分子化をa‑Vnを用いたWesternblottingにより観察した。受精後48hrに2つのピテリンのサブユニットのうち、150kDaのバンドが完全に消失し、135kDaおよび50kDa前後のバンドが新たに出現した。さらに、受精後120hrで95kDaのバンドの染色性が減少した。異なるステ―ジの胚体抽出液はゲ

ル濾過カラムで2つのメインピーク（ビテリンのピークと6.5kDa以下の低分子ピーク）を示した。ビテリンのピークの位置は胚発生に伴って変化しなかったが、発生が進むに従いビテリン量は滅少した。これらの結果から、胚体または幼生中のビテリンは低分子化されると考えられたが、Intactの分子量には変化が見られないことから、一部は分子構造が保持されていると推察された。
ビテリンの低分子化に関わる酵素を解析するために、Digoxigeninを標識したビテリンを受精後48hrの抽出液の水溶性画分と共に至適条件下で反応させた後、SDS−PAGEで解析した。その結果、分解産物の泳動パタ―ンは受精後48hrと同様なパ夕一ンを示した。｀ビテリンの低分子化を様々なインヒビターを用いて阻害した
結果、キモスタチンで比較的阻害されたことから、この低分子化にはセリンプロテア―ゼが関与している可能性が考えられた。
以上のように、本研究では海産巻き貝で初めてビテリンを精製し、その合成部位が卵母細胞である可能性を強く示唆レた。さらに、ビテリンは胚発生に伴って低分子化し、その低分子化には酵素が関与している可能性を示唆した。これらの結果は、今後貝類の再生産を検討する上で有効な知見を提供するものとして高く評価され、
本 論 文 が 博 士（ 水 産 学 ） の 学 位 請 求 論 文 に値 す る 業 績 で あ る と 認 定し た。

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