博士（医学）七戸秀夫
学位論文題名FK506 Reduces Infarct Volume Due to Permanent
Focal Cerebral Ischemia by MaintainlngBAぽ t
TurnOVerandInhibitingCytOChromeCReleaSe（FK506はBADturnov
er、ミトコンドリア機能を維持して脳梗塞の進展を抑制する。）
学位 論文内容の要旨【目的 】―過性 前脳虚血 モデル、 あるいは 一過性局所 脳虚血モ デルでは 、免疫抑 制剤FK506が虚血 性神経細胞障害を抑制することが報告されている。しかし、．日常診療で多く経験する
永 久 局 所 脳 虚 血 モ デ ル に お け る FK506の 効 果 に つ い て は 明 確 で は な い 。
FK506(tacrolimus:Prograf)は、calcineurinの もつ様々 な器質に対する脱リン酸化酵素活性を 阻害する 作用を有 する免疫 抑制剤で ある。同様 に脳保護効果を報告されている免疫抑制 剤 cyclosporinAで は 、 cyclophilinDに選 択 的に 結 合 する こ とに よ る MPT抑 制 効 果が 要因とさ れる―方 、FK506ではそ の機序が 何に由来 するかが研 究の焦点 となって いる。近 年、低 酸 素 負 荷 を 加 え ら れ た 神 経 細 胞 や 、 脊 髄 損 傷 モ デ ル 等 で calcineurinに よ る BAD(apoptosis関連タ ンパク質 であるBcl‑2familyに 属するタ ンノヾク質。BH3‑onlys
ubfa
milyに属し 、apop
tosis促進に働くとされている。）の脱リン酸化を阻害することによりapoptosisを抑制 し、脳保 護作用を 得ている という説 が報告され ているが、異論もあり評価は定まってい な い 。 我 々 は マ ウ ス MCA永 久 閉 塞 モ デ ル に お い て 、 FK506が 脳 梗塞 を 縮 小さ せ る効 果を 有す る か 、ま た 有効 で あ る場 合 にFK506が、 ど の よう な 機序を介 して脳虚 血におけ る脳保護作 用を発揮 している のかを検 討した。
【 方 法 】マ ウ ス(Balb／ c、24−28g、雄 ）をFK506投与 群（1.00r3.0mg/kg、虚血 30分前i． p．）とVehicle群 に分け、 それぞれ吸 入麻酔下 で右MCAを凝固閉塞した。脳梗塞体積の測
定 は 、 各群 と も虚 血 24時 間 後に TTC染 色を 行 い (n=25）、 脳 梗 塞体 積 の評 価 は 、対側 の大脳 半 球 に対 す る比 で 表 した 。 また 虚 血 1、 3、 6時間 後、お よび偽手 術後に大 脳皮質よ り得ら れた細胞 質分画サ ンプルを用 いて、ウ ェスタン ブロッティングを行いミトコンドリアから細 胞 質 分画 へ のcytochromec漏 出を 検 討 した （ n＝ 24） 。 さら に 虚 血1、3時 間 後に 永久標
本 を 作 成 し 、 cytochromec、 total BAD、 リ ン 酸 化 BAD (p‑BAD)の 免 疫 染 色 を 実 施 し た（n＝16)。以上すべての動物実験は、当学の動物実験に関する指針に則リ行われた。

【結果】

脳梗塞体積のTTC染色による測定結果

今 回使 用し たマ ウス MCA永 久閉 塞モ デル では 、脳 梗塞 巣は 大脳 皮質 に局 在して いた 。FK506
投与群では、虚血辺縁部の梗塞巣が抑制される傾向がみられた。Vehicle群では22.
9土4.1％、FK506投 与 群 で は 、 1.Omg投 与 群 で 21.5土 5.7％ 、 3.Omg投 与 群 で 17.3士 5.1％ で あ った （ 平 均 値 土 標 準 偏 差 ） 。 FK506は 3.Omg/kg投 与 群 で 、 梗 塞 体 積 を 75.5％ に 有 意に 縮 小した(p=0.0146）。
細 胞 質 分 画 中 の cytochromecに 関 す る ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ の 結 果
ミ ト コ ン ド リ ア か ら の cytochromecの 漏 出 は 、 Vehicle群 と FK506投 与 群 と も に 、 虚 血開 始 時 か ら 経 時 的 に 増 加 す る 傾 向 がみ られ た。 Vehicle群 とFK506投与 群で比 較す ると 、Vehicle群 は虚 血 開 始 後 6時 間 の 時 点 で 、cytochromecの 細 胞 質 へ の漏 出が有 意に 増加 して い た が 、 FK506投 与 群 で は こ の 漏 出 が 抑 制 さ れ て い た (p=0.0453） 。
cytochromeC、 total BAD、p‑BADに おけ る免 疫染 色の 結果
虚 血 中 心 部 で は 、 cytochromeC、 total BAD、 p‐ BADの い ず れ も 、 Vehicle群 と FK506投
与 群の 間で 免疫反応に差がみとめられなかった。―方、梗塞辺縁部では、神経細胞の胞体での cytochromecの 免 疫 反 応 が、 vehicle群で 虚血1、3時 間後 とも に増 加が 認め られ たが 、FK506投 与 群 で は 増 加 が 抑 制 さ れ て い た 。 こ れ ら の 所 見 か ら 、 FK506投 与 に よ り
cytochromecの ミ卜 コン ドリア から 細胞 質へ の漏 出が 抑制 され てい ると考えられた。total
BADに 関し ては 、梗 塞辺 縁部に おい て神 経細 胞の 胞体 での 免疫 反応 が、vehicle群で虚血開始 1、 3時 間 後 と も に 増加 し て い た が 、 FK506投 与 によ っ て 、 虚 血 開 始 後 の total BADの免 疫 反 応 の 増 加 が 抑 制 さ れ た 。 し か し p−BADは、 梗塞 辺縁 部に てvehicle群、 FK506投 与群 とも に、 虚血 開始 後に 明ら かな 変化 が認 めら れな かった 。
【考 察】 FK506はマ ウス MCA永久閉 塞モ デル にお いて も、 有意 な脳 梗塞縮小効果を示した。
ま た 免 疫 染 色 にて 示 さ れ た 、 FK506投 与に よる 神経 細胞 での BAD発 現の 変化 は、 脳保 護作
用 の 機 序 を考 察す る上で 重要 な所 見と 考え られ た。 すな わち BADは turnoverが非 常に 短い蛋白 質と して知られており、定常時には細胞内で量的制御をうけているが、これらの所見か
ら脳 虚血 急性 期に はこ れら のメカ ニズ ムが破綻し、total BADが神経細胞内で増加を示すこと が 示 唆 さ れ た。 ま た 詳 細 な 機 序 は 不 明 であ るが、 FK506は BADの turnoverを維 持す ることで 、虚 血辺 縁部 にお ける total BADの増 加を 抑制 し、 p←BAD、非 リン酸化BADのバランスを維 持す るこ とで 、mitochondrial permeability transition、お よびcytochromecの細胞質 へ の 漏出 か ら 開 始 す る 細 胞 死 の プロ セ ス を 抑 制 し て いる 可能 性が示 唆さ れた 。

学位論文審査の要旨
主 査
副 査
副 査

教 授 長 嶋教 授 岩 崎教 授 吉 岡．

和 郎
喜 信充 弘

学位論文題名FK506Red
ucesI
nf
arc
tVolu
meDu
etoPerm
anent
Focal Cerebral Ischemia by M
aintainingBATTur
nover andInhibit
ing CytochromeCRelease(FK506はBADtu
rnover、ミトコンドリア機能を維持して脳梗塞の進展を抑制する。）

一過性前脳虚血モデ ル、あるいは一過性局所脳 虚血モデルでは、免疫抑制剤 FK506が虚血性神経細胞 障害を抑制することが報告さ れている。しかし、日常診 療で多く経験する永久局所脳虚血
モ デル に おけ るFK506の効 果については明確では ない。またFK506のもつ神経 細胞障害を抑制する機序 が何に由来するかが研究の焦点となっている。近年、低酸素負荷を加えられた神経細胞や、脊 髄損 傷 モデ ル等 でcalcineurinに よ るBAD (apoptosis関 連タ ンパ ク質 であ るBc｜ー2familyに属す るタンパク質。BH3−only subfamilyに属し、apoptosis促進に働くとされている。）の脱リ ン酸化を阻害するこ とによりapoptosisを抑制し 、脳保護作用を得ていると いう説が報告されている が、異論もあり評価は定まっ ていない。我々はマウスMCA永久閉塞モデルにおいて、FK506が脳梗 塞を縮小させる効果を有する か、またどのような機序を 介して脳虚血における脳保護作用を発揮しているのかを検討した。
方法 としてマウスをFK506投与群（1.00r 3.0 mg/kg、虚血30分前i．p．）とvehic
le群に分け、そ れぞれ吸入麻酔下で 右MCAを凝固閉塞した。゛脳 梗塞体積の測定は、各群と も虚血24時間後にTTC染色 を行った（n 25）。また虚血後、大脳皮質より得られた細胞質分画サンプルを用いて、ウエ スタ ン ブロ ッテ ィン グを 行 いミ トコ ンド リア か ら細胞質分画へのcytochromec漏出を検討した（n 24）。さらにcytochromec、totalB
AD、リン酸化BAD（p―BAD)の免疫染色を実施した（n=16）。
脳梗 塞 体積 のTTC染 色に よる測定では、FK506投 与群では、虚血辺縁部の梗 塞巣が抑制される傾向が みられた。Vehicle群では22.9土4.1%、FK506投与群では 、1．Omg投与群で21.5土5．7％、3． Omg投与群で17.3士5．1％であった（平均値士標準偏差）。FK506は3．Omg/kg投与群で、梗塞体積を75.5Xに有意に縮小した(p=0. 0146)。
Cytochromecに 関 す る ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ の 結 果で は、 ミ卜 コン ド リア から のcytochromecの漏出が、両群ともに 、虚血開始時から経時的に増 加する傾向がみられた。Vehicle−63一群 は 虚血開 始後6時 間の時 点でcytochromecの細胞 質への 漏出が 有意に 増加し ていた が、FK506投与 群では この漏 出が抑制 されて いた(p=0.0453)。
Cytochromec、 totalBAD、p―BADにお ける免 疫染色 の結果は 、梗塞 辺縁部では、神経細胞の胞 体 でのcytochromecの免 疫反応が 、vehicle群 で虚血 後に増 加が認 められ たが、 FK506投与群
で は 増加 が 抑 制 され て い た 。こ れらの 所見か ら、FK506投 与によ りcytochromecの ミトコ ンド
リア から細 胞質へ の漏出が 抑制さ れてい ると考 えられた。To
ta｜BADに関しては、梗塞辺縁部におい て神経 細胞の 胞体での 免疫反 応が、 vehicle群で 虚血開 始後に 増加し ていたが、FK506投与によ って、 免疫反 応の増加 が抑制された。しかしp一BADは、梗塞辺縁部にて両群ともに、虚血開始後 に明ら かな変 化が認め られな かった 。
結語 として 、FK506はマ ウスMCA永久閉塞モデルにおいても、有意な脳梗塞縮小効果を示した。
また 免疫染 色にて 示された 、FK506投与による神経細胞でのBAD発現の変化は、脳保護作用の機序を考 察する 上で重 要な所見 と考え られた 。すな わちBADはturnoverが非常に短い蛋白質として知られ ており 、定常 時には細 胞内で量的制御をうけているが、これらの所見から脳虚血急性期にはこれ らのメ カニズ ムが破綻 し、totalBADが神経 細胞内で増加を示すことが示唆された。また詳細な 機序は 不明で あるが、 FK506はBADのturnoverを維持することで、虚血辺縁部におけるtota｜BADの増 加を抑 制し、 p−BAD、非 リン酸 化BADのバ ランスを維持することで、cytochromecの細胞質 へ の 漏 出 か ら 開 始 す る 細 胞 死 の ブ ロ セス を 抑 制レ て い る可 能 性 が示 唆 さ れ た。

口 頭発 表 に 当 たり 、 副 査の 吉岡教 授から FK506のBBB通過 、投与 量につ いて、 aIpoptosisの関与 、虚血 急性期 のBADリン 酸化に 関して 質問が あった。同じく副査の岩崎教授から、脳虚血辺縁部 におけ る効果 、cyclosporinAとの比較 、穿通 枝梗塞 での効 果、他 の脳保護薬との併用に関する 質問が あった 。また 主査の 長嶋教 授より calcineurinの誘 導、TUNELの検討、虚血再濯流モ
デル との違 い、KOマ ウスを 用いた 検討等 に関す る質問 があっ た。最 後にフロアから、将来的に虚血 中心部 を救う 手段、 また研究の背景について質問があった。これらの質問に対して申請者はおお むね適 切な回 答を行 った。
こ の論文 はFK506の脳 保護作 用の機 序を明 らかにした点で優れていると判断され、今後の脳虚血 の治療 に貴重 な示唆 を与え たもの と考え られた 。
審 査員一 同は、こ れらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格 を有す るもの と判定 した。

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