研究報告 2019(KISTEC Annual Research Report,2019)【研究開発部】
実用化実証事業「食品機能性評価」グループ◆総括･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 175
グループリーダー 阿部啓子◆食品素材を対象とした脳機能評価系の導入･･･････････････････････････････････････････････ 178
嶋田

耕育◆腸における自然薯ムカゴ投与の影響･････････････････････････････････････････････････････ 182
篠﨑

文夏◆食品機能性評価研究－脳機能評価･･･････････････････････････････････････････････････････ 185
亀井飛鳥◆食品機能性評価のための新規マーカー検出手法の開発と検討･･･････････････････････････････ 188
野原

正勝、嶋田

耕育、亀井 飛鳥、篠崎 文夏◆機器共用化･･･････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 191
飯尾

将太、亀井 飛鳥◆業績･････････････････････････････････････････････････････････････････････････････････ 193

【研究開発部】食品機能性評価

食品機能性評価グループ
グループリーダー

阿部啓子【基本構想】
食は健康な生体を築き上げ、それを維持する上で限りなく重要であり、適正な食生活は “quality oflife”(QOL)の向上に寄与し、生活習慣病を防ぎ、健康寿命を延ばす手段としても高い関心が寄せられている。わが国ではまもなく 65 歳以上の高齢者が人口の 30％に達すると予想されており、健康を保ち、エイジング（加齢）に伴う生活習慣病の発症や認知機能・運動機能の低下を遅らせる機能性食品の開発は国際的にも注目されている。本テーマの出口としては、科学的エビデンスに基づく商品を開発するための公的機能性評価システム機関を世界に先駆けて構築し、この日本発の領域を、学術的・産業的・社会的に発展させ世界に発信していくことにある。

１．平成 30 年度の研究目的＜実施項目＞

グループ 2 年目となる平成 30 年度は、以下の各項目を重(1)-1

自然薯ムカゴの機能性解析：動物実験

点項目として実施した。

(1)-2 メタボリックシンドロームへの作用から脳機能への作用まで(1) 食品機能性評価技術センター(1)-1 動物とヒトのシームレス研究

食品の機能性評価研究は、特定保健用食品（トクホ）に食品は私たちが日常的に摂取するものである。複数の成おいてはメタボリックシンドロームに対する作用が中心分から成り、それらが相加・相乗・拮抗作用するために機であったが、機能性表示制度の対象が脳機能、運動機能（ロ

能性は多岐に亘るという特徴を持つ。食品に期待される機

コモティブシンドローム）等多岐に亘るようになったこと

能性は、未病の維持・改善に働く効果であるため、本グルを受け、脳機能評価にも重点を置いて進めており、その成ープでは、未病評価という観点から食品機能性の評価技術

果についても紹介する。

センター構想を描き、実現に向けて取り組んでいる。

＜実施項目＞

食品には、長い食経験という歴史を持つものが多いが、昨今の研究開発により、特定の成分の高含有作物や、特定(1)-2-1(1)-2-2

脳機能評価方法の導入：動物実験
脳機能評価方法の導入：ヒト実験の成分を抽出したサプリメント食品等が普及し始めてい(1)-3 未病改善食品の評価技術の開発（未病マーカー）る。そのため、現在の食品の機能性評価においては安全性の確認が必須条件であり、さらにその理解のためには作用

われわれは動物実験やヒト試験を行い、トランスクリプ

メカニズムを明らかにすることが不可欠であることから、

トーム解析等により食品の有効性や機能性についての評
価を行っているが、評価技術センターとして、新しい評価

動物を対象とする実験を中心に進めてきた。一方で、2015
年に始まった食品の機能性表示制度においては、ヒトにお系で新しいマーカーを探索することは、受託研究を進める
うえで非常に重要である。そこで新たなマーカー候補探索

ける評価研究が求められることから、ヒトにおける食品機を目的とし、単一細胞のトランスクリプトーム解析技術の導入を試みた。また、生体ガス（呼気ガス）も動物とヒト

能性評価の需要も高まってきた。現状では、ヒトにおいては血液の生化学データ等、健康診断に用いられる手法で判ものであり、病気の治癒を目的としない食品の機能性評価との双方で測定可能な指標のひとつであることからマーカー候補とし、微細な変化を検出するための精度化を常時においては、指標としての有効性が低い。食品機能性評価

検討している。これらの研究成果について紹介する。

のためには、より感度が高く応答がはやく、ヒトにも応用＜実施項目＞

断せざるを得ないが、これら指標は病気を検出するための(1)-3-1 単一細胞トランスクリプトーム解析技術の検討(1)-3-2 生体ガス分析を利用した食品機能性の機能性評価系の高精度化

可能な評価試験手法や指標が必要である。現在、動物からヒトへ、研究展開を図るための取り組みを進めているが（図 1）、その一方で、ヒトで得られた結果について、動物でメカニズム解明をする研究にも着手しており、その成果について紹介する。

175

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

現を変動させた。このことから、自然薯ムカゴ摂取が高脂肪による腸管免疫の低下を抑制すると示唆された。また、
自然薯ムカゴ摂取が動物の腸内細菌にも影響していたことから、摂取されたムカゴ成分がある種の細菌の生育を促
進、あるいは、抑制することによって高脂肪の影響を解消する方向に作用すると考えられた。
小腸は栄養吸収の主要部位であり、遺伝子発現では栄養成分に対する応答に関与する遺伝子も改善方向に変動していたことから、吸収の段階でムカゴ摂取の効果は現れていると推察された。これまでの肝臓に対する効果と今回の結果を考慮すると、自然薯ムカゴの摂取は代謝のみならず免疫を含む生体機能を調節する可能性が示唆された。

(1)-2 メタボリックシンドロームへの作用から脳機能への作用まで(1)-2-1 脳機能評価方法の導入：動物実験

図 1 機能性食品の評価技術センター構想(2) 地域イノベーション戦略支援プログラム事業－機器の共用化

食品の機能性成分が脳機能に与える影響を評価する為、実験動物を用いた行動試験を導入した。実験動物を用いた2017 年度にて終了予定であった地域イノベーション戦

行動試験では認知、不安様行動をはじめとした様々な項目の脳機能評価が可能である。食品の機能性成分摂取が脳機

略支援プログラム事業について、業績が認められ、1 年間の期間延長となった。この期間を活かし、機器共用化の推能に及ぼす影響を評価するために、動物へのストレス負荷が低いと考えられる測定手法を取り入れ、検討、精査を重進に力を入れ、前年度（2,328 時間）に比べて著しい延伸（3,400 時間）を達成した。6 年間の活動を通じ、食品のねた。その結果、不安様行動、短期記憶や好奇心などの評価系が確立された。

機能性評価研究に関連する様々な装置の周知を図り、徐々に利用拡大に至った。今後も活動に力を入れ、評価センタ
ーの利用拡大に努める。

また、これらの方法については、より微細な変化を検出するために、高精度化の検討も重ねている。現在、認知、(3) 受託・共同研究

不安様行動測定について手法の改良を行い、これまでの手法よりもさらに詳細な解析とかつ顕著な差異の検出に成企業との共同研究に加え、文部科学省「地域イノベーシ

功しており、今後も他の行動測定方法についても高精度化を図る。

ョン戦略支援プログラム事業」、内閣府 戦略的イノベーシ
ョン創造プログラム（ＳＩＰ）「次世代農林水産業創造技術」（管理法人：生研支援センター）等の国家プロジェク(1)-2-2

トにて研究コンソーシアムを形成し、産学官連携の共同研

脳機能評価方法の導入：ヒト実験

ヒトを対象とした試験において、食品の単回摂取で脳機究の推進も目指した。

能（テスト成績や疲労度）の差異を検出可能であることを示し、脳機能に対する作用を明らかにするためのヒト試験

２．平成 30 年度の研究成果(1)
食品機能性評価技術センター(1)-1 動物とヒトのシームレス研究(1)-1 自然薯ムカゴの機能性解析：動物実験の基盤を構築した。当グループでは、動物を対象とする脳機能測定のための手法の高精度化を検討しており、食品摂
取によるわずかな差の検出を試みている。これまでは主にメタボリックシンドロームへの作用についての研究を積

本研究はヒト試験で得られた結果を基に、動物でその作み重ねてきた実績があるが、脳機能に関しても同様に動物を対象とする試験（主にメカニズム解明）とヒト試験（現用メカニズムを明らかにする取り組みの例である。
これまでの基礎研究では代謝の要である肝臓に対する影響を明らかにし、ヒト試験においても同様の作用を見出象）とを組み合わせ、両者を行き来しながら評価を進めていくことで、より効率的に、かつより詳細に食品の機能性している。一方、ヒト試験において、腸内細菌叢の変化のを明らかにすることができると確信している。

兆しを見出したことから、腸管に着目した作用とそのメカ(1)-3 未病改善食品の評価技術の開発（未病マーカー）(1)-3-1 単一細胞トランスクリプトーム解析技術の開発と導入

ニズム解明のための研究に着手した。
本研究から、脂肪負荷時の自然薯ムカゴ摂取が小腸の遺伝子発現および腸内細菌に影響することが明らかとなった。小腸の遺伝子発現では免疫関係の遺伝子発現の変動が血液を用いてトランスクリプトーム解析を行い、全体を見た変化から食品の機能性を評価することも大切であり、検出され、高脂肪と自然薯ムカゴの同時摂取は高脂肪による免疫関連遺伝子発現の低下を解消するように遺伝子発KISTEC研究報告2019（2019.7）

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【研究開発部】食品機能性評価

これまでに動物、ヒト試験でその有効性を評価してきた。
一方で、血液は液体成分である血漿、固形成分である赤血球、白血球、血小板で構成されており、生体防御にかかわる免疫担当細胞である白血球は、細胞のなかに顆粒を有す
る好中球、好酸球、好塩基球、顆粒を持たないリンパ球、
単球とさらに細かく分類される。血液細胞全体から見えてきた食品の機能性が免疫系に影響した結果であれば、血液細胞とりわけ白血球の 1 つ 1 つの変化も重要な情報となる。
また、食品に対する個々人の応答のブレを解消し、個々の細胞について食品への応答の小さな変化を捉えるためには、細胞の単一細胞分離（シングルセル化）がトランスク(2) 地域イノベーション戦略支援プログラム事業－機器の共用化
実験室、動物室、機器・インフラ等の整備を行い、徐々に共用化への展開を図った。5 年間の活動を通し、食品機能性評価における動物試験から作用メカニズム解明までの一連の研究システムについて共用化体制を整えるに至った。また、企業ニーズについてヒアリングを行い、機能性表示やトクホ等の認定を目指すまでの専門人材や資金のない中小企業等の利用を促進することを目標とした他、大企業からのエビデンス検証のニーズも強いことから、それらへの協力も併せて実績を作りつつある。なお、一連の食の評価には、ノウハウ・経験を要するため、利用する企

リプトーム解析の高精度化に向けて必要となる。未病におけるヒト血液トランスクリプトームの高精度な評価系を業や公設試担当者への指導も随時行っている。

確立するために、われわれはまずマウスの血液から白血球を分離するための条件検討を行い、さらに、得られた白血(3) 受託・共同研究

球サンプルからシングルセルの分離を試みた。複数の手法による検討を重ねた結果、単一細胞のトランスクリプトー

企業との共同研究に加え、文部科学省「地域イノベーシ
ョン戦略支援プログラム事業」、内閣府 戦略的イノベーシ
ョン創造プログラム（ＳＩＰ）「次世代農林水産業創造技

ム解析に適した条件を見出し、予備的な結果を得た。さらにその解析について検討を行い、細胞種毎のクラスター形術」（管理法人：生研支援センター）等の国家プロジェク
トにて研究コンソーシアムを形成し、産学官連携の共同研

成と飼育条件の差異の検出に至った。

究も推進した。

(1)-3-2 生体ガス分析を利用した食品機能性の評価系
の高精度化

(4)

その他

食品の機能性の一般的な評価系として、食品を実験動物

平成 28 年 10 月 1 日から JSPS 先導的研究開発委員会「食に長期間継続摂取させ、身体的変化を検出する方法がある。
この身体的変化は、摂取した食品に起因する僅かな代謝変による生体恒常性維持の指標となる未病マーカーの探索戦略」（委員長：阿部啓子）が発足した。未病マーカーの化の積み重ねによって引き起こされるが、既存の手法では僅かな変化の初期段階を捉えることが困難であった。本研

開発研究には、本グループの研究員も従事し、全国の大学、企業との連携により、最新のマーカー探索に向けての情報

究では、より初期に引き起こされる僅かな代謝変化を生体ガス分析により検出することで、食品機能性評価マーカー

共有、情報収集、開発研究を進めている。
また、平成 30 年 3 月に、本グループの研究手法を基盤として利用することを目指した。現時点で、食餌のわずかな組成変化に応答する変化を検出するに至っており、今後、とする「ワンストップ型食品機能性評価サービス」が神奈
川県 ME-BYO BRAND に認定された。今後、周知を図り、さらなる精度化に努める。

評価センターでの食品機能性評価の受託あるいは共同研
究拡大を目指す。

177

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

食品素材を対象とした脳機能評価系の導入
嶋田

１．

耕育

はじめに

近年、食品及び食品素材が持つ機能性に注目が集まっている。食品には主に３つの機能性があるがとりわけ栄
養機能、感覚機能以外の三次機能(生体調節機能)としての食品非栄養成分の持つ新たな機能性の探索、及びその効
果検証が鋭意進められている。現在、食品非栄養成分の多岐に亘る効果が知られている。例として、食品に含まれる食品ポリフェノールであるカテキンは、脂肪吸収の阻害作用や抗酸化作用などを有することが報告されている 1。食品の機能性成分の作用の特徴は、薬物(特に人工的な化合物)のように少数の作用点に強く働きかけるのではなく、複数の作用点に対して穏やかに働きかけることである。食品ポリフェノールの多くが有する抗酸化作用

図 2：ストレス関連性神経症性障害(躁鬱含む)の年次患者推移

は多面的な作用の一例である。
このように多様な効果を有し、穏やかな効果が見込まなどの複雑な機構に対する機能性効果を検証することがれる食品の機能性成分は、今後社会問題として憂慮されている超高齢化や深刻なストレス社会の分野においても、その効果を期待されている。未曾有の高齢化社会の到来に伴い、アルツハイマー病などに代表される認知症疾患

可能な重要なツールである。現在、薬物(医薬品など)の効果を対象とした動物実験系がいくつか存在し、脳機能、
身体ロコモーション機能、ストレス抑制効果の検出のための検討が進められている。上記のような動物を対象とした実験系の多くは実験動物に対して一定のストレス源を負荷することによってなんらかのストレス起因性疾患の推定有病率の増加が危惧されている(図 1)。一方高齢化因子以外において、全年代を通してストレス起因性の疾を誘起するモデルが多い。しかしながら作用点の明確な医薬品や化合物などの効果を推定する場合、これらモデ患も近年増加傾向にある(図 2)。益々進む高齢化社会において認知機能低下を予防する効果、また深刻なストレス

ル動物による評価は有用であるが、作用点が複数存在し、また全体として緩やかな効果を期待する食品機能性成分

社会においてストレス軽減・予防効果、身体ロコモーシ
ョン向上機能を有する食品機能性素材の探索は、生活のの評価においては必ずしも有用とは限らない。その理由として、モデル動物作出時に使用されるストレス負荷が質(QOL)の向上を目指す上でも重要な課題である。食品によるこのような機能の多くは、食品ポリフェノールに代過大である場合、食品機能性成分による効果がマスクされてしまうことが懸念される。一般的にモデル動物作出

表される多面的作用によってその効果を発揮すると考えられている。しかしこれらの効果を検討する為には培養細胞を対象とする実験のみで評価することは困難である。
一方で、マウスやラットなどの実験動物を用いた評価系
は全身に張り巡らされた神経系や内分泌系、腸内細菌叢
による代謝物等を介した脳機能への作用やストレス応答に用いられるストレス源はトラウマティックな侵襲度の高い(高侵襲ストレス)ものが多く使用されている(図３)。
また高侵襲ストレス負荷を長期間や複数回もしくは複数の組み合わせで動物に対して実施する場合、従事する実図１：超高齢化社会の到来とそれに伴う認知症有病率の推移

KISTEC研究報告2019（2019.7）

178

【研究開発部】食品機能性評価

験者への負担も大きく、操作が煩雑となることからのばることから精神的・肉体的への負荷は低く、かつ、多く

らつきなども危惧される。従って、食品機能性成分を用いた評価においては、操作によるばらつきを低減するたの情報を得ることができる試験である。現在、行動試験の導入は完了し、予備検討を重ねた結果、運用に使用でめに、比較的短期間かつ簡便に実施可能で、トラウマテ
ィックな侵襲度の低い(低侵襲ストレス)負荷源を用いたきる水準に達している。したがって、同一個体に対して複数組み合わせて実施することが可能であり、同一個体

モデル動物実験系を用意することが望ましいと考えられる。

から多くの行動指標を得ることができる環境が整った。

図 3：モデル動物作出に用いられる一般的なストレス源

以上のことから脳機能、身体ロコモーション機能、ス
トレス抑制効果を期待する食品や食品素材の探索を実現するためには、『食品の機能性評価に適した抗ストレス効
果、もしくは脳機能に対する効果を検証する動物実験系の構築』が求められる。そこで、本グループでは脳機能解析の一端として、一つにはその表現型の解析を目的として、新たに行動試験の導入や飼育環境の整備を行ってきた。また、食品の機能性評価に適したモデル動物の構築についても現在検討を開始している。今後、我々がこれまで蓄積してきた従来の遺伝子発現解析技術の手法と行動学的解析を合わせた総合的な食品機能性解析を用いて、食品または機能性成分の脳機能を含めた網羅的・多角的な評価を遂行することを目指している。

２．
２．１

実験と結果

図 4：行動試験の導入

行動試験の導入（脳機能）２．２

脳機能の表現型の解析方法として、マウスを用いた行行動試験の導入（身体ロコモーション）

身体ロコモーションの評価として運動機能を測定する
以下の２つの装置の導入を進めた。①マウス四肢筋力測動学的解析を挙げることができる。本グループにおいては、食品の機能性成分が脳機能に与える影響を評価する

定装置、②行動量測定装置(図５)。これらの装置を用いた測定はマウスに別段負荷をかけることなく連続的もしく目的として数種類の行動解析技術を導入している。我々
は複数の行動試験を実施し、総合的な行動指標の評価をは経時的な測定が可能である。これらの機器を用いて食品機能性成分による運動・身体機能への影響を評価をす

目指している。複数の行動試験を実施するにあたり、既存の様々な行動試験項目から精神的・肉体的に負荷の少ない試験を選択する必要がある。このような試験は別の行動試験に及ぼす影響も低いと考えられる。これまで本グループで導入した主な行動試験は①マウスの情動行動
や不安様行動の観察に用いられているオープンフィール
ドテスト及び高架式十字迷路試験、②マウスの自発的な行動量と空間作業記憶(自発的交替行動)の評価に用いられる Y 迷路試験、③新規物質への好奇心を評価する新規
物体認識試験、④マウスの社会性行動の評価に用いられる社会的相互作用テストなどを導入している(図 4)。これ
らの行動試験は、マウスによる一般的な認知・記憶試験の機能評価に使用される場所課題試験、モーリス水迷路、
受動回避試験のようにある種の報酬系、罰刺激を加える
ことなく、マウス自身の自発行動の測定を行うものであ

図 5：運動・身体機能測定装置の導入

179

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

べく現在、稼働に向け予備検討を鋭意重ねている。

２．３に適した負荷源及び条件の検討を実施している。

試験環境の整備行動試験を実施するにあたりマウスの飼育環境(温度・湿度条件、照度、室内騒音度など)が大きく試験結果に影響を及ぼすことが報告されている 2,3。食品の機能性成分
による行動様式へのわずかな影響をも精査する必要があるため、安定した飼育環境の維持は非常に重要であると考えられる。飼育環境がどのように行動試験に影響するのかを検討するため、異なる照度下で飼育したマウスを用い、オープンフィールドテストを実施した結果、飼育環境の違いが行動様式に対して影響を及ぼすことを確認した(図 6)。現在、マウスの飼育環境について、全ての飼育ケージ内の照度を一定に保つために適宜照度を確認し飼育環境の整備を進めている。その他、マウス飼育施設の環境(温度、湿度、室内騒音度など)についても全ての飼育マウスにおいて一定となるように適宜飼育室内の環境測定を実施し、環境整備を務めている。
図７：負荷の異なるモデルマウスによる行動様式(Y 路迷路)の変化

３．

考察及び今後の展望

食品機能性成分は、医薬品や化合物のように治療効果を期待し服用するものではなく、食品または食材として日々の食生活に取り入れることで結果的に代謝ストレス、
精神的ストレス抑制効果や緩和作用を期待するものである。このような効果を評価するためにはモデル動物を用

図 6：飼育環境の違いによる行動様式(オープンフィールドテスト)の変化

２．３

いた評価系の樹立が必要である。我々はまず行動試験法
自体において精神的・肉体的に負荷の少ない行動試験の低侵襲ストレス負荷動物モデルの構築

食品による脳機能、身体ロコモーションへの影響やス
トレス抑制効果といった機能性評価を実施するにあたり、動物実験を用いた評価系は重要なツールである。一般的にマウスを用いて脳機能を評価する方法として、一定の効果についても検証する必要があることから行動試験に影響を与える飼育条件及び飼育環境の整備に尽力した。
安定した行動試験データを得るための環境整備は概ね整いつつあり、現在は『食品による脳機能性評価に適した

ストレス負荷を与えたモデル動物を用いた方法が挙げられる。モデル動物に与える様々なストレス負荷によってモデル動物』の作成に取り組んでいる。
“医薬”とは異なる“食品の機能性成分”の脳機能効果を評価するためにマウスなどの実験動物の行動様式が変化することが知られている 4。本グループでは『食品による脳機能性評価には、いわゆる“ストレス未病モデル”のような動物モデ
ルが評価に向け有用ではないかと想定される。
“ストレ

適したモデル動物』の作出を目指しており、いくつかの負荷源を用いてマウスの行動解析を実施して最適な方法

ス未病モデル”とは、ストレス起因性疾患と健常の間のグレーゾーンに位置し、一見正常かのように見られるモの検討を開始している。求められるモデル動物は、低侵襲ストレスではあるが、短期間の負荷によって行動様式デルである。このようなモデル動物を用いて食品の機能性成分によるストレス抑制・緩和効果を検討することはの表現型が認められるモデル動物である。我々はまず、
低侵襲ストレスを短期間マウスに負荷し、行動様式がどのように変化するかを検討するために行動解析を実施した。負荷強度の異なる２つの負荷源を用い、負荷した群(強、弱)と負荷しない群について行動学的試験の一つである Y
字迷路試験を実施した。結果、負荷の程度に従って Y 字

脳機能に対して効果が期待される素材のスクリーニング
だけでなく、その機能メカニズムの解明にもつながることが期待される。我々は比較的低い精神ストレス源を短期間マウスに負荷することで負荷の有無やその程度の違いによってマウスの行動様式が変化することを見出しており、このモデル動物が食品の脳機能性評価に応用でき

迷路内での行動回数に各群間で有意な差が認められた（図 7）。現在、行動試験による評価をいくつかの侵襲性るのではないかと期待し、鋭意研究を進めている。今後
はモデル動物を用いて、脳機能への効果が期待される食の低い負荷源を用いて実施しており、食品の脳機能評価

KISTEC研究報告2019（2019.7）

導入を試み、同一個体での複数の行動試験による脳機能評価系を確立した。また、食品による脳機能への僅かな180

【研究開発部】食品機能性評価

品機能性素材を投与することでストレス負荷に起因する
行動フェノタイプもしくは遺伝子発現の変化を緩和、改善し得るかなどの機能メカニズムについても順次検討を開始する予定である。

謝辞
本研究（の一部）は，総合科学技術・イノベーション会
議のＳＩＰ（戦略的イノベーション創造プログラム）「次世代農林水産業創造技術」及び、科学研究費助成事業・
挑戦萌芽「孤独ストレスによる脳トランスクリプトーム
失調とその食品三次機能成分による予防」によって実施されました。

【参考文献】
1. Bose M, Lambert JD, Ju J, Reuhl KR, Shapses SA, Yang
CS., The Journal of Nutrition., 133, 9 (2008).
2. ED. Kemble and MJ. Goblirsch, The Psychological Record.,
47, 167-174 (1997)
3. F.J Martin-Arenas and C.O.Pintado, Proceedings of
Measuring Behavior., August 27-29, (2014)
4. Jessica L. Ihne, Paul J. Fitzgerald, Kathryn R. Hefner1, andAndrew Holmes, Neuropharmacology., 62, 464-473 (2012)

181

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

腸における自然薯ムカゴ投与の影響
食品機能性評価グループ
篠﨑はじめに自然薯 Dioscorea japonica は日本に現存するヤマノイ

文夏

１．

ムカゴの方が茹でムカゴよりも活性酸素除去能が高いが、モ類の中で唯一の日本原産種で、8 世紀に編纂された出雲

茹でたムカゴでもキャベツくらいの活性酸素除去能があった。

国風土記に登場するくらい古くから食べられている食物である。神奈川県では伊勢原市を中心とした地域で栽培さ

以上、in vitro の結果から自然薯ムカゴは機能性食材の候補であることが推測された。次に、in vivo での機能れている。
通常は根の部分をイモとして食べる。粘りが強いことや、性を検討した。

皮が非常にうすく皮ごと食べられるという特徴がある。食品としての自然薯は滋養強壮・血糖安定などに効果がある

１．１．２ 肝臓のトランスクリプトーム解析とされるが、その機能性については伝承によるものが多く、科学的エビデンスは乏しい。また、自然薯は通常食べる根の遺伝子発現変動を調べた。階層的クラスター解析では、
おおまかにそれぞれの餌ごとに集団を形成していたことの部分の他に葉の根元にできる零余子（ムカゴ）(図 1)も食用である。ムカゴも古くから親しまれている食材である。

から、摂取する餌の違いが肝臓の遺伝子発現に影響していることが明らかとなった。

生産者の方からムカゴを摂取した翌日の体調が良いとの声を聞き、また、ムカゴの機能性に関してはほぼ事例がな

高脂肪負荷によって発現変動した遺伝子を通常の状態に近づける方向に変動した遺伝子を改善変動遺伝子としかったことから、当グループではムカゴに注目して研究してきた。

て抽出した。それらの遺伝子を Gene Ontology に基づく生物学的機能性で分類したところ、脂質代謝に関わる遺伝子

マウスに高脂肪餌を与え、代謝負荷を与えた場合の肝臓が多く、中でもステロイド生合成に関連するものが改善していることがわかった。ステロイド生合成経路の遺伝子は高脂肪負荷によって発現が上昇するが、自然薯ムカゴを同時に摂取すると高脂肪群よりもそれらの遺伝子発現が低かった。以上の結果から、自然薯ムカゴの摂取は肝臓における高脂肪負荷によるステロイド生合成の亢進を抑制する可能性が示唆された 1,2）。
これまでの基礎研究では代謝の要である肝臓に対する影響を明らかにしてきたが、本研究では摂取し消化された

２．

成分を体内に取り込むための主な器官である小腸をターゲットとした。

２．１. 材料と方法

１．１

２．１. １

これまでの研究

実験と結果

試料作製

ムカゴの機能性を探索するにあたり、in vitro の系で機能性を有する可能性を調べた上で、in vivo の系で摂取

本実験では神奈川県伊勢原市産の自然薯ムカゴを使用した。自然薯ムカゴの粉化は神奈川県農業技術センターで後、消化され体内に吸収された際の影響を調べた。

以下の手順で行われた。洗浄したムカゴはコンビオーブン（フジマック FCE-C）にて 100℃で 10 分間スチーム処理し１．１．１ 栄養成分および抗酸化能

た後、圧縮粉砕した。その後、凍結乾燥し、石臼型粉砕器
で冷却しながら粉末化した。

自然薯ムカゴは皮ごと加熱して食べることが多いため、まず自然薯ムカゴを皮ごと加熱後凍結乾燥し粉末化したものについて栄養成分を測定した。その結果、カロテンや２．１. ２

ミネラルが多いことがわかった。また、ポリフェノールが比較的多く含まれ、粉 100 グラムあたり 680ｍｇであった。

動物は C57BL6J 雄性マウスとした。マウスは 1 週間通
常脂肪餌（LFD：脂質エネルギー比 10％）で環境馴化し、

ポリフェノール含量が多い場合には抗酸化活性が高いと言われていることから、生ムカゴと茹でたムカゴを用い3 群に分けた。試験餌は LFD、高脂肪餌（HFD：脂質エネ
ル ギ ー 比 45 ％ ）、 高 脂 肪 餌 に ム カ ゴ 粉 を 添 加 し た 餌て、抗酸化能として活性酸素除去能を測定したところ、生（HFD+P）の 3 種類用意し、4 週間または 8 週間飼育した。

KISTEC研究報告2019（2019.7）

182

動物実験

【研究開発部】食品機能性評価

ムカゴ粉はαコーンスターチと置き換えて５％となるよれた（図 2）。改善変動遺伝子を GO TERM 分類後、FDR 補正

うに添加した。解剖前日は一晩絶食し、麻酔後採血および採材を行った。採材したサンプルは使用時まで－80℃で保p-value<1x10-5 で階層図を作成し、最下層の GO Term を抽出したところ、代謝（脂肪酸代謝プロセス、小分子生合成

存した。飼育期間中の餌と水は自由摂取とし、毎日体重測
定と摂食量を測定した。動物実験は実験動物中央研究所のプロセス）、制御（細胞内シグナルトランスダクション制
御、細胞接着制御、獲得免疫応答制御など）、また、応答承認を得て実施した。

（バクテリアに対する応答、内因性刺激に対する応答、サイトカイン刺激に対する細胞応答、栄養レベルに対する応２．１. ３答など）が多いことがわかった(表１)。また、遺伝子発現

遺伝子発現解析採材した小腸からトータル RNA を抽出し、Affymetrix

表1 改善遺伝子のGO Term分類

社の GeneChip™ Mouse Genome 430 2.0 Array を用いて遺伝子発現解析を行った。
得られた CEL データは正規化し、Term

階層的クラスター解析を行った。また、LFD 群と HFD 群、
HFD 群と HFD+P 群で二群間比較を行い、それぞれ変動遺fatty acid metabolic process

48

small molecule biosynthetic process

53

伝子を得た。LFD 群と HFD 群の比較で発現が変動した遺伝子で、HFD 群と HFD+P 群の比較で HFD+P 群の方が LFD

negative regulation of intracellular signal transduction

59

regulation of cell adhesion70

群に近くなるように変動した遺伝子（LFD＜ HFD かつ
HFD＞HFD+P、LFD＞ HFD かつ HFD＜ HFD+P）を“改regulation of adaptive immune response28

regulation of B cell activation25

善変動遺伝子”として抽出した。また、それらの変動遺伝
子がどのような機能を有しているかを Gene Ontology にpositive regulation of apoptotic process

63

positive regulation of lymphocyte activation

35

基づく生物学的機能で分類によって調べた。

regulation of inflammatory response38

regulation of lymphocyte proliferation

32

negative regulation of apoptotic process

83

positive regulation of cell proliferation

84

響を与えると推測されたため、試験餌を 8 週間与えたマウスから大腸内糞を回収し、次世代シーケンス解析による腸homeostatic process136

response to bacterium

62

内菌叢解析を行った。取得したデータは、菌属レベルの占有率を算出し、三群間で比較した。

response to endogenous stimulus

132

cellular response to cytokine stimulus

59

cellular response to oxygen-containing compound89

response to nutrient levels

51

response to decreased oxygen levels

41

２．１. ４

腸内菌叢解析

自然薯ムカゴにはオリゴ糖が多く含まれ腸内環境に影

２．２．実験結果
２．２. １

小腸の遺伝子発現Count

immunoglobulin mediated immune response

22

ムカゴ摂取は飼育期間中の体重増加や総摂取エネルギ
ー量に影響しなかった。

cell-cell adhesion

113

cell migration109

階層的クラスター解析の結果、各群でクラスターを形成しており、群によって遺伝子発現に特徴があると考えら

FDR補正p-value<1x10 -5 で階層図を作成した際の最下層を抽出

変動の方向性を調べると、高脂肪負荷によって低下した免
疫関連遺伝子がムカゴ摂取群では逆に変動していた。
以上の結果から、高脂肪負荷時のムカゴ同時摂取は小腸遺伝子発現に影響することが明らかとなった。また、ムカゴ摂取によって高脂肪負荷による影響が改善された遺伝子は脂質代謝や免疫に関与するものが多く、ムカゴ摂取は小腸では代謝のみならず免疫にも大きな影響を与えると示唆された。

２．２. ２

腸内菌叢解析

大腸内糞の菌叢解析を実施した結果、顕著ではないが菌の多様性や均一性がムカゴを摂取した群で高い傾向にあった。また、主成分分析を行ったところ、高脂肪ムカゴ摂取群が通常脂肪および高脂肪群とは異なる分布をし、それぞれの群の摂取物が腸内細菌に影響していると考えられた（図３）。また、属レベルでの菌の占有率を比較すると
図４に示すように、各群で腸内細菌の占有率が異なってお183

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

り、ムカゴ摂取群で占有率が有意に高くなる、または、低されたムカゴ成分がある種の細菌の生育を促進、あるいは、くなる菌があった。変化した中には有用であると推定される細菌の仲間も含まれていたことから、生体の健常性に貢抑制することによって高脂肪の影響を解消する方向に作用すると考えられた。

献すると示唆された。

小腸は栄養吸収の主要部位であり、遺伝子発現では栄養成分に対する応答に関与する遺伝子も改善方向に変動し３．

以上、高脂肪負荷時の自然薯ムカゴ摂取が小腸の遺伝子ていたことから、吸収の段階でムカゴ摂取の効果は現れていると推察された。これまでの肝臓に対する効果と今回の発現および腸内細菌に影響することが明らかとなった。小腸の遺伝子発現では免疫関係の遺伝子発現の変動が検出

結果を考慮すると、自然薯ムカゴの摂取は代謝のみならず免疫を含む生体機能を調節する可能性が示唆された。

され、高脂肪と自然薯ムカゴの同時摂取は高脂肪による免疫関連遺伝子発現の低下を解消するように遺伝子発現を【参考文献】

変動させた。このことから、自然薯ムカゴ摂取が高脂肪による腸管免疫の低下を抑制すると示唆された。また、自然

1. 日本農芸化学会 2014 年度大会
2. 日本農芸化学会 2015 年度大会

考察

薯ムカゴ摂取が腸内細菌にも影響していたことから、摂取

KISTEC研究報告2019（2019.7）

184

【研究開発部】食品機能性評価

食品機能性評価研究－脳機能評価亀井

飛鳥

１．はじめにトランスクリプトーム解析（網羅的な遺伝子発現解析）に

神奈川県立産業技術総合研究所では、これまでに食品機能性研究として、主に動物を対象とする評価を実施してきより実施してきた。例えば、桑の葉の脂質代謝に及ぼす作
用 (1, 2)、サラシア属植物の免疫に及ぼす作用 (3, 4)、ビ

た。これらの研究成果や評価技術を応用し、現在はヒト試
験、特に未病という観点から評価する研究へと展開しつつフィズス菌の脂質代謝に及ぼす作用(5, 6)、短鎖フルクト
オリゴ糖の脂質代謝に及ぼす作用 (7)、アミノ酸混合液のある。これまでの研究対象の多くは、メタボリックシンド
ロームの緩和・改善作用を期待し、その作用メカニズム等作用 (8)、栄養素の一つである鉄の摂取量の違いが身体に及ぼす作用 (9, 10)などである。さらに、食品の機能性成を明らかにすることを目指すものであった。一方、昨今ではメタボリックシンドロームに加えて、脳や運動機能に対分について、その効果を発揮する至適な量があることも明らかにした。これはメープルシロップの機能性評価研究にする作用への期待も高まっている。例えば、機能性表示食品には、体脂肪等に加えて記憶、ストレス、疲労、関節とおいて見出された（11, 12, 13）。

いったキーワードが並ぶ。食品の多岐に亘る機能性について少しずつ解明し、その情報を活用して生活に取り入れる

１．３

ことで、健康寿命の延伸や生活の質（QOL）の向上に繋がると期待される。本稿では、食品の機能性評価研究の一環

例えば厚生労働省の平成 28 年国民生活基礎調査の概況によると、世代に関わらず日本人の約半数がストレスを抱えとして、脳機能、なかでもストレスや疲労に対する作用を評価する実験系の確立に向けての取り組みを紹介する。

ながら生活をしているとあることからも、ストレスは非常に身近にあり、認識されていることがわかる。ストレスは

１．１

必ずしも身体にとって負の影響を及ぼすものではなく、うまく活用することで健康維持に貢献するものでもあるが、脳機能と食品

私たちは日常生活の中で様々なストレスを受けている。

未病とその評価

未病は、病気ではないが、健康でもない状態であり、日本未病システム学会では「自覚症状はないが検査では異常

それを逸脱するような過度のストレスや継続的なストレ
ス負荷によって健康を損なうものでもある。また、ストレがある状態」と「自覚症状はあるが検査では異常がない状態」とを合わせたものと定義している。健康状態から病気スと密接な関係にある疲労についても 2004 年の文部科学省の大阪地区を対象にした調査によれば、半数以上が疲労に至るまで、身体の中は徐々に変化するが、このわずかな変化、すなわち病気に至る兆しを捉え、対策を講じることを感じているという結果であった。疲労は作業効率の低下
やひいては病気の原因にもなり得る。すなわち、ストレスが病気の予防の一つであると考えられる。このわずかな変化は、既存の手法では検出が難しいため、未病を評価する

や疲労は脳の未病状態であり、その軽減は現代社会において急務である。そのためには生活習慣の改善が不可避であにあたり新たなマーカー分子の探索が必須である。

り、そこには食事が大いに貢献すると期待される。
本稿では、ヒトを対象とした食品の疲労・ストレス軽減

１．２作用の検出を試みた研究成果について報告する。

未病と食品

１．１にて述べたように、未病は病気に至る前の状態で２．方法と結果
２．１ 方法
２．１．１ 試験食の選定ある。そのため、医薬に頼る段階ではないが、未病から病気に至ることのないように講じるべき対策として、食品の機能性への期待が高い。食品にはそれぞれに様々な機能があるが、そのほとんどにおいて、摂取することによる身体試験食として、複数の素材候補について調査を行い、主の中の変化はわずかである。しかし食品は日常的に摂取するものであるため、そのわずかな変化が重要な意味を持つに海外にて動物およびヒトを対象とする脳機能評価研究が進んでいる食品を 1 つ、脳機能評価の研究の基礎的デーと考えられる。例えばわずかな変化の積み重ねにより大きな変化となる、あるいはわずかな変化を繰り返すことによタが報告されている和食素材の食品を 1 つ選抜した。それ
ぞれの食材に対してプラセボ食を設定し、プラセボ食と試り、病気への進行を遅らせるといったことなどが期待される。

験食との比較にて機能性を評価した。

KISTEC ではこれまで、主にメタボリックシンドローム
やその予備軍を想定した条件下において、食品による改善

２．１．２ 脳機能テストの作成

作用とその作用メカニズムを明らかにしてきた。いずれも応）を反復実施し、それに伴う疲労度の変化と成績を測定

今回の試験では、脳機能テスト（計算や提示条件への反185

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価することにした（図 1）。脳機能テストは、各小課題 3 つ

表 1 脳機能テスト結果から構成される大課題 3 つとし、大課題ごとに独立した試
験対象者を募集して実施した。脳機能の適切な評価をする

TEST

項目
項目A
項目B
項目C
項目D
項目E
項目F
項目G
項目H
項目I
項目J
TEST_A 項目K
項目L
項目M
項目N
項目O
項目P
項目Q
項目R
項目S
項目T
項目U
項目V
項目W
項目X
項目Y
項目Z
項目AA
項目AB
項目AC
項目AD
TEST_B 項目AE
項目AF
項目AG
項目AH
項目AI
項目AJ
項目AK
項目AL
項目AM
項目AN
項目AO
項目AP
項目AQ
項目AR
項目AS
項目AT
項目AU
項目AV
項目AW
TEST_C 項目AX
項目AY
項目AZ
項目BA
項目BB
項目BC
項目BD
項目BE
項目BF
項目BG

ためには、試験問題や内容を試験対象者の母国言語に最適化して設定する必要があるため、いずれも日本人を対象に実施した実績のある脳機能テストであることを条件に選抜し、本試験に合わせて編成した。

図 1 脳機能評価試験の流れ

２．１．３ 試験実施
試験方法については KISTEC 立案とし、実施機関は東海大学とする共同研究にて実施した。本試験は、単回摂取の効果を測定すること、そのため効果を長期にわたって持ち越すことがないと想定されること、試験成績には個人差が大きいことが予備テストにより示されていたことから、単回摂取の二期クロスオーバー比較試験として実施した。長期的な持越しは想定されないものの、ウォッシュアウト期間として、2 回の試験の間を 3 日以上と設定した。
1 つの大課題に対し、20 名を集め、3 つの独立した大課
題を設定、食品素材を 2 つ設定したために、20（名）×3（課題）×食材（2 つ）の合計 120 名を対象とする試験と
した。

食品B

評価マーカーの探索を試みる。

介入試験実施機関である東海大学では、伊勢原キャンパ
スおよび湘南キャンパスにて学生を対象に募集を行い、試験説明に同意を得た方に参加いただいた。
本試験を通して得られたデータを KISTEC にて集計し、東海大学の統計解析責任者を中心とする担当チームにて結論の確認を行った。

３. 考察と今後の展望
ヒトを対象とした試験において、食品の単回摂取で脳機能（テスト成績や疲労度）の差異を検出可能であることを示し、脳機能に対する作用を明らかにするためのヒト試験の基盤を構築した。
当グループでは、動物を対象とする脳機能測定のための手法の高精度化を検討しており、食品摂取によるわずかな２．２ 結果両食材について、それぞれプラセボに対して有意に変動する評価項目が見出された。プラセボに対して優位に変動差の検出を試みている。これまでは主にメタボリックシン
ドロームへの作用についての研究を積み重ねてきた実績

した項目について黄色でハイライトする（表 1）。すなわ
ち、複数の項目において、試験食摂取によりプラセボ食摂があるが、脳機能に関しても同様に動物を対象とする試験（主にメカニズム解明）とヒト試験（現象）とを組み合わ取時とは異なる成績であることが示された。なお、食品 Aと食品 B を比較した場合、プラセボ食摂取時と試験食摂せ、両者を行き来しながら評価を進めていくことで、より効率的に、かつより詳細に食品の機能性を明らかにするこ取時とで有意な差を招じる試験項目が異なることも示された。ここから、食品によって、その機能を評価するのにとを目指す。
このプロジェクトの一部は、JSPS 科研費 15H05346、

適した脳機能テストがあることが示唆された。今後は、脳機能への作用を評価する場合に、どのような種類の食品に

18K05514 の助成を受けて実施されました。

どの試験方法が適しているかを明らかにするとともに、血液トランスクリプトーム解析との組み合わせから脳機能

KISTEC研究報告2019（2019.7）

食品A【参考文献】
1.

186

Kobayashi Y, Miyazawa M, Araki M et al. (2015)

【研究開発部】食品機能性評価

Effects of Morus alba L. (Mulberry) Leaf Extract in2.

79:1893-1897.

Hypercholesterolemic Mice on Suppression ofCholesterol Synthesis. J Pharmacogn Nat Prod 1:113.

13. Kamei A, Watanabe Y, Shinozaki F et al. (2017)
Quantitative deviating effects of maple syrup extract

Kobayashi Y, Miyazawa M, Kamei A et al. (2010)
Ameliorative effects of mulberry (Morus alba L.) leaves

supplementation on the hepatic gene expression of mice
fed a high-fat diet. Mol Nutr Food Res 61.

on hyperlipidemia in rats fed a high-fat diet: inductionof fatty acid oxidation, inhibition of lipogenesis andsuppression of oxidative stress. Biosci Biotechnol
Biochem 74:2385-2395
3.

Oda Y, Ueda F, Utsuyama M et al. (2015) Improvementin Human Immune Function with Changes in Intestinal
Microbiota by Salacia reticulata Extract Ingestion: A
Randomized Placebo-Controlled Trial. PLoS One

4.

10:e0142909.
Oda Y, Ueda F, Kamei A et al. (2011) Biochemical
investigation and gene expression analysis of theimmunostimulatory functions of an edible Salacia

5.

extract in rat small intestine. BioFactors 37:31-39
Kondo S, Kamei A, Xiao JX et al. (2013)
Bifidobacterium breve B-3 exerts
syndrome-sippressing effects in themetabolicliver ofdiet-induced obese mice: a DNA microarray analysis.
Beneficial Microbes 4:247-251
6.

Kondo S, Xiao JZ, Satoh T et al. (2010) Antiobesity
effects of bifidobacterium breve strain B-3
supplementation in a mouse model with high-fat
diet-induced obesity. Biosci Biotechnol Biochem

7.

74:1656-1661
Fukasawa T, Kamei A, Watanabe Y et al. (2010)
Short-chain fructooligosaccharide regulates hepatic
PPARa and FXR target gene expression in rats. J Agric8.

Food Chem 58:7007-7012
Shinozaki F, Abe T, Kamei A et al. (2016) Coordinatedregulation of hepatic and adipose tissue transcriptomes
by the oral administration of an amino acid mixture
simulating the larval saliva of Vespa species. Genes
Nutrition 11:21.

9.

Kamei A, Watanabe Y, Kondo K et al. (2013) Influenceof a short-term iron-deficient diet on hepatic gene

expression profiles in rats. PLoS One 8:e65732
10. Kamei A, Watanabe Y, Ishijima T et al. (2010) Dietaryiron deficient anemia induces a variety of metabolicchanges and even apoptosis in rat liver: a DNA
microarray study. Physiol Genomics 42:149-156.
11. Watanabe Y, Kamei A, Shinozaki F et al. (2011)
Ingested Maple syrup evokes a possible liver-protecting
effort －physiologic and genomic investigations with
rats. Biosci Biotechnol Biochem 75:2408-2410
12. Kamei A, Watanabe Y, Shinozaki F et al. (2015)
Administration of a maple syrup extract to mitigate
their hepatic inflammation induced by a high-fat diet: atranscriptome analysis. Biosci Biotechnol Biochem

187

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

食品機能性評価のための新規マーカー検出手法の開発と検討
野原

１．

正勝、嶋田

耕育、亀井 飛鳥、篠﨑

文夏

はじめに

われわれは動物実験やヒト試験を行い、トランスクリプ
トーム解析等により食品の有効性や機能性についての評
価を行っているが、評価センターとして、新しい評価系で新しいマーカーを探索することは、受託研究を進めるうえで非常に重要である。

１．１

トランスクリプトーム解析の現状

マウスやラットを用いた研究では、脳や肝臓といった組織や臓器単位で材料採取を行い、これらの組織や臓器をサンプルにしてデータを得ることが一般的である。そして，脳や肝臓といった組織や臓器は 1 種類の細胞のみで構成
されているのではなく、役割の異なる複数の種類の細胞が
図 1 臓器・組織を構成する細胞の種類

集まってできている（図 1）。したがって、これらの組織や臓器をサンプルとして行われるトランスクリプトーム
解析は、平均化されたデータを抽出して全体の変化を評価していることになる。一方ヒト試験の場合、ヒトから組織や臓器を採取することは非常に困難であるが、血液を採取することは比較的容易であり（図 2）、ヒト試験を行う際には、血液をサンプルとしてトランスクリプトーム解析を行い評価する。

１．２

血液の組成について

血液は液体成分である血漿、固形成分である赤血球、白血球、血小板で構成されており、生体防御にかかわる免疫担当細胞である白血球は、細胞のなかに顆粒を有する好中球、好酸球、好塩基球、顆粒を持たないリンパ球、単球とさらに細かく分類される（表 1）。ヒトにおいて好中球は白血球のうち最も多く存在し、体内に侵入した細菌を攻撃

図 2 ヒトにおいて用いることが容易なサンプル

して貪食する機能を有している。また、好酸球と好塩基球
はアレルギー反応に関与しており、好中球に次いで多く存

表 1 血球の分類とヒトにおける正常値 [看護 roo!，血液の仕組みとはたらき— 血液の流れから理解する（5）「血球の種類」（https://www.kango-roo.com/sn/k/view/1845）を基に作成]在するリンパ球は免疫反応の中心的な役割を担っている。
さらに、好中球に次ぐ活発な貪食作用を有する単球は、体内に侵入してきた細菌や不用な細胞を貪食する。このように、他の組織や臓器と同様に、血液はそれぞれが別々の役割を担っている複数の種類の細胞で構成されており、複数種類の細胞の集合である血液を用いてトランスクリプトーム解析を行うと、組織・臓器で行う際と同様に、血液においても平均化されたデータを抽出して全体の変化を評価することになる。

KISTEC研究報告2019（2019.7）

188

【研究開発部】食品機能性評価

表 2 白血球の単一細胞補足率

単一細胞

１．３

死細胞

≧ 2細胞

細胞なし

生細胞の割合 (%)

1回目 (条件B)

66

1

23

7

67.7

2回目 (条件A)

75

8

10

11

69.8

平均値

70.5

4.5

16.5

9.0

68.8

トランスクリプトーム解析の高精度化

血液を用いてトランスクリプトーム解析を行い、全体を

い、血液からの白血球分離を試みた。赤血球凝集試薬で得られた細胞懸濁液には白血球のほかに多くの赤血球や血見た変化から食品の機能性を評価することも大切である。
一方で、血液細胞全体から見えてきた食品の機能性が免疫小板が認められ、白血球のみを分離することができなかった。また密度勾配分離試薬では赤血球の層と白血球の層が系に影響した結果であれば、血液細胞とりわけ白血球の 1
つ 1 つの変化も重要な情報となる。また、食品に対する分離せず、白血球のみを分離することができなかった。この 2 系統の試薬では白血球を分離することができなかっ個々人の応答のブレを解消し、個々の細胞について食品への応答の小さな変化を捉えるためには、細胞の単一細胞分たため、次いで、細胞表面の構造の違いを利用して赤血球を破裂させる溶血試薬を用いて白血球分離を検討した。当離（シングルセル化）がトランスクリプトーム解析の高精度化に向けて必要となる。

初は白血球のほかに血小板も多く含むサンプルであったが、遠心分離の条件を検討し、細胞懸濁液の洗浄工程を経本研究では、生体防御にかかわる免疫担当細胞である白ることにより、細胞保存試薬と混和した血液から血小板をほとんど含まない白血球を分離することができた（図 4）。

血球に着目し、未病におけるヒト血液トランスクリプトー
ムの高精度な評価系を確立するために、われわれはマウスの血液から白血球を分離するための条件検討を行った。ついで、得られた白血球サンプルから単一細胞への分離を行い、そこで得られたシングルセルについて大規模塩基配列解析を行った。

２．

実験と結果

本研究の一番の特徴は、ヒト試験を想定し、採取した血液をRNA、タンパク質や細胞を安定的に保存することができる細胞

図 4 溶血試薬を用いた血液からの白血球分離の結果。採血した血液では多くの赤血球に囲まれた中にわずかな白血球が認められるが、溶血試薬を加えることで赤血球はなくなり、白血球のみとなった。

保存試薬と混和してサンプル処理を行っていることである。
採血から塩基配列解析までの流れは次に示すとおりである。
① 採血し、血液を細胞保存液と混和② 血液からの白血球分離③ 単一細胞分離装置による単一白血球の分離

２．２

白血球の単一細胞分離④ 顕微鏡観察による細胞分離の確認⑤ 塩基配列解析用サンプルの調製材料として、流路分離型の単一細胞分離装置による白血球のシングルセル化を行った。この実験では異なる飼育条件⑦ 大規模塩基配列解析によるデータの取得（条件 A、条件 B）で飼育をしたマウスの血液を用いて、単一細胞の分離と塩基破裂解析を行った。

２．１

次いで、確立した白血球分離法で得られた細胞懸濁液をまず、本研究の特徴である細胞保存試薬と混和した血液

単一細胞分離装置はシングルセル遺伝子解析のための自動化システムであり、細胞のシングルセル化から塩基配から白血球を分離するための条件検討を行った。
表 1 に示したように、白血球数は血液 1 mm3 あたり 5 千

列解析用サンプルの調製を行うことができる。この装置はシングルセル研究には欠かせない重要なアイテムとなっから 1 万個であるのに対して、その数の 400 倍から 1000
倍近くの赤血球が血液中には存在している。白血球をターている。単一細胞分離装置を用いた研究は、腫瘍学、神経学、免疫学、遺伝性疾患などのとりわけヒトの疾病にかかゲットにしてシングルセル化を行う場合、この赤血球の多さが問題となるため、血液から赤血球を取り除き白血球をわる分野において多く報告されている。しかしながら、食品の機能性について、単一細胞解析を用いた研究は現在報分離する必要がある。
マウスから採取した血液を RNA、タンパク質や細胞を安告されていない。
今回使用した単一細胞分離装置では、細胞サンプルを流定的に保存可能な細胞保存試薬と混和した。この血液を材料として赤血球を凝集させて白血球と分離する試薬（赤血

すと個々の細胞が 96 個の小さなチャンバーを通り、それぞれのチャンバーに 1 個 1 個の細胞が留まる仕組みとなっ球凝集試薬）と混和、または細胞の密度の違いによって分離する試薬（密度勾配分離試薬）に重層して遠心分離を行ている。細胞分離後の顕微鏡観察によって捕捉率を算出した結果、およそ 70％の単一細胞捕捉率であった（表 2）。

血液からの白血球分離

189

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

次に塩基配列解析用のサンプルを調製すると，細胞のあるチャンバーからは細胞由来の DNA のピークが認められたのに対して、細胞のないチャンバーからは、DNA のピー
クは認められなかった（図 5）。
この塩基配列解析用のサンプルについて大規模塩基配列解析を行い、t 分布型確率的近傍埋め込み法により、個々の細胞をクラスターに分類した。分類の結果、細胞は 3 つのクラスターに分けられ、クラスター1 およびクラスター
2 は、飼育条件 A および飼育条件 B 由来の細胞がほぼ均一に分散する集団であることが明らかとなった（図 6）。一方クラスター3 に分類される細胞は、飼育条件 A の方が飼育条件 B よりも多く（図 7）、この特徴のあるクラスター3について、現在解析を行っている。

図 5 細胞由来 DNA の確認

３. 考察及び今後の展望
本研究の特徴である細胞保存試薬と混和した血液から白血球を分離する方法を確立し、この細胞懸濁液を用いて高い捕捉率での単一細胞分離を実現した。そして、ここで得られた塩基配列用のサンプルについて解析を行ったと
ころ、特徴のあるクラスターを得ることができた。
今後はヒト試験への実用化に向けて、飼育条件の違いや食品成分の効果などを示す普遍的なマーカーの選定を行うとともに、さらなる解析を進め、新たなマーカーとしての可能性を探る。

４.

謝辞

図 6 得られたーデータからクラスターに分類した結果

本研究の一部は、文部科学省「地域イノベーション戦
略支援プログラム事業」により実施されました。

図 7 得られたーデータからクラスターに分類した結果

KISTEC研究報告2019（2019.7）

190

【研究開発部】食品機能性評価

機器共用化
飯尾

１．

はじめに

将太、亀井

飛鳥

めの計算環境についても更なる展開を図り、共用機器の利

本稿では、地域イノベーション戦略支援プログラム・神奈川国際ライフサイエンス実用化開発拠点におけるニュ

用拡大へと繋げた（図 2）。なお、一連の食の評価には、
ノウハウ・経験を要するため、利用する企業や公設試担当

ートリゲノミクス研究関連事業の機器共用化への取り組
みについて紹介する。

者への指導も随時行っている。

地域イノベーション戦略支援プログラムにおけるニュートリゲノミクス研究は、神奈川科学技術アカデミー 健
康・アンチエイジングプロジェクト（2013〜2014 年度）、
未病改善食品評価法開発プロジェクト（2015〜2016 年度）、
神奈川県立産業技術総合研究所 食品機能性評価グルー
プ（2017 年度）の 3 プロジェクトに亘って継続実施された。特任研究員を採用し、実験室、動物室、機器・インフラ等の整備を行い、徐々に共用化への展開を図った。5 年間の活動を通し、食品機能性評価における動物試験から作用メカニズム解明までの一連の研究システムについて共用化体制を整えるに至った。また、企業ニーズについてヒ
アリングを行い、機能性表示やトクホ等の認定を目指すま

図 2 DNA マイクロアレイ実験の流れと代表的な使用機器

での専門人材や資金のない中小企業等の利用を促進することを目標とした他、大企業からのエビデンス検証のニーズも強いことから、それらへの協力も併せて実績を作りつつある。

なお、共用化時間の実績は下記の通りである。
・平成 25 年度共用時間実績：29 時間２．

・平成 26 年度共用時間実績：44 時間
・平成 27 年度共用時間実績：281 時間

具体的な取り組みと実績

DNA マイクロアレイ装置は、当初より県内の企業による共同研究あるいは受託研究による利用が進んでいる。ま・平成 28 年度共用時間実績：1,042 時間
・平成 29 年度共用時間実績：2,328 時間

た、DNA マイクロアレイ装置による食の評価にあたり、必
要な前処理や、解析の検証で必要となる装置類の他、組織・平成 30 年度共用時間実績：3,400 時間

学的解析の受託等を可能にするための装置を徐々に共用化へと展開したことで、共用化機器の利用実績が増加した（図 1）。さらに、平成 28 年度には、DNA マイクロアレイ
装置にかけるサンプルを得るための動物飼育を行う環境を整備し、また、DNA マイクロアレイデータ等の解析のた

図 3 共用化実績

３．

今後の展望

共同および受託研究契約の範囲で、評価法を指導し、装置の利用方法を覚えていただいた上で、使用していただく
事を希望しており、今後もこれまで同様、その活動は継続

図 1 共用化機器リスト

191

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価して行く。なお、この 5 年間の活動を通し、共用時間実績

手法を用いた研究の相談や共同研究による取り組みを目

は経年増加しており（図 3）、食品機能性評価研究への関心の高さがうかがえる。また、RNA 抽出装置、マイクロチ

指す。機器共用化のさらなる拡大を目指し、食品機能性評
価のための一連の研究システムを広く紹介する活動も進ップ型電気泳動装置の活用による安定的な DNA マイクロアレイのデータ取得や、リアルタイム PCR 装置等を用いためていく。
本取り組みは、文部科学省「地域イノベーション戦略支援プ

解析を行う補助を継続して行う他、要望に応じて新規解析

ログラム事業」により実施されました。

KISTEC研究報告2019（2019.7）

192

【研究開発部】食品機能性評価

業 績【原著論文】

【総説】

1.

1.

Ogawa, M., Nagai, T., Saito, Y., Miyaguchi, H.,
Kumakura, K., Abe, K., and Asakura, T. Short-term
mastication after weaning upregulates GABAergic
signalling and reduces dendritic spine in thalamus.

Abe, K., Misaka, T. Food functionality research as a newnational project in special reference to improvement ofcognitive and locomotive abilities. Biosci Biotechnol
Biochem. 82(4):573-583 (2018)

Biochem Biophys Res Commun. 498(3):621-626 (2018)
2.
2.

Tanaka, M., Yasuoka, A., Yoshinuma, H., Saito, Y.,
Asakura, T., and Tanabe, S. Seasoning ingredients in aの成果と今後の展望、BioJapan2018 SIP 主催セミナー（2018.10.11）JBA 機関紙「B&I」(2018)

medium-fat diet regulate lipid metabolism in peripheral
tissues via the hypothalamic-pituitary axis in growing rats.

3.

Biosci Biotechnol Biochem. 82(3):497-506. (2018)3.

Yoshinaga, K., Nakai, Y., Izumi, H., Nagaosa, K.,
Ishijima, T., Nakano, T., and Abe, K. Oral Administration【口頭発表】
1.

Rats: A DNA Microarray Analysis. Mol Nutr Food Res.
62(12) e1700828 (2018)5.

篠﨑文夏、廣川隆彦、神奈川県発フードイノベーショ
ン 食品の機能性評価と機能性食品の開発、月刊誌
FOOD STYLE 21 (2018)of Edible Wakame Seaweed Undaria pinnatifida(Wakame) Modifies Glucose and Lipid Metabolism in4.

亀井飛鳥、「次世代機能性農林水産物・食品の開発」

豊田集、石島智子、亀井飛鳥、阿部啓子、岡田晋治、
2 型糖尿病モデルマウスにおけるメープルシロップ抽出物の抗炎症作用、第 72 回日本栄養・食糧学会大会（2018 年 5 月 12 日、岡山）

Hori, T., Ouchi, M., Otani, N., Nohara, M., Morita, A.,2.

Hazuki Maehata, Yodai Kobayashi, Kousuke Shimada, Eri

Otsuka, Y., Jutabha, P., Shibasaki, I., Matsushita, Y.,
Fujita, T., Fukuda, H., and Anzai, N. The uricosuric

Mitsuyama, Tetsuya Kuhara1, Akihito, Akihito Yasuoka,
Takashi Kondo, Keiko Abe and Jin-zhong Xiao

effects of dihydropyridine calcium channel blockers invivo using urate under-excretion animal models. J

Bifidobacterium breve strain A1 has potential to improve
cognitive dysfunction in the Alzheimer’s disease model

Pharmacol Sci. 136(4):196-202 (2018)

mice. IPC (international probiotics conference) 2018（2018 年 6 月 18-21 日、Hungary Budapest）

Izuchi, R., Ishijima, T., Okada, S., Abe, K., and Nakai, Y.
Hepatic fatty acid biosynthesis in KK-Ay mice is3.

modulated by administration of persimmon peel extract:
A DNA microarray study Food Sci Nutr 6(6):1657-1663

亀井飛鳥、未病と食品 －食品の機能性評価研究－ 、鹿児島県工業技術センター
年 7 月 19 日、鹿児島）

研究成果発表会（2018(2018)
4.
6.

先導的研究開発委員会「食による生体恒常性維持の指標となる未病マーカーの探索戦略」公開シンポジウム

H., Abe, K., Misaka, T., and Asakura, T. Novel indoleand benzothiophene ring derivatives showing differential（2018 年 7 月 20 日、東京）

modulatory activity against human epithelial sodium
channel subunits, ENaC β and γ. Biosci Biotechnol

5.

Biochem. 83(2):243-250 (2018)7.

阿部啓子、未病マーカーによる食のイノベーション、

Kasahara, Y., Sakurai, T., Matsuda, R., Narukawa, M.,
Yasuoka, A., Mori, N., Watanabe, H., Okabe, T., Kojima,

阿部啓子、ILSI 寄付講座の成果、ILSI Japan 寄付講座
「機能性食品ゲノミクス」主催シンポジウム 機能性
食品科学の基盤から実用化に至る統合的成果と新たな息吹き（2018 年 9 月 18 日、東京）

Shimazu, K., Fukumitsu, S., Ishijima, T., Toyoda, T.,
Nakai, Y., Abe, K., Aida, K., Okada, S., and Hino, A. The

6.

阿部啓子、パネルディスカッション“ 食品科学の産業

Anti-Arthritis Effect of Olive-Derived Maslinic Acid inmice is Due to its Promotion of Tissue Formation and its

的新展開 ”、ILSI Japan 寄付講座「機能性食品ゲノミクス」主催シンポジウム 機能性食品科学の基盤から

Anti-Inflammatory Effects.
63(3):e1800543 (2018)

実用化に至る統合的成果と新たな息吹き（2018 年 9月 18 日、東京）

Mol

Nutr

Food

Res.

193

KISTEC研究報告2019（2019.7）

【研究開発部】食品機能性評価

7.

8.

亀井飛鳥、ヒトを対象とする食品機能性評価への取り与する血漿マイクロ RNA の探索とその機能の解析、組み、ILSI Japan 寄付講座「機能性食品ゲノミクス」
主催シンポジウム 機能性食品科学の基盤から実用

日本農芸化学会 2019 年度大会（2019 年 3 月 26 日、
東京）

化に至る統合的成果と新たな息吹き（2018 年 9 月 18
日、東京）

19. 篠﨑文夏、山下治之、亀井飛鳥、嶋田耕育、野原正勝、

嶋田耕育、食品の機能性評価

荒井綜一、阿部啓子、肝臓遺伝子発現による自然薯ム
カゴ粉末および抽出物摂取効果の検証、日本農芸化学

抗メタボリックシンド

ロームから脳機能活性化へ 基盤研究を中心にして、
食品開発展 2018（2018 年 10 月 5 日、東京）
9.

会 2019 年度大会（2019 年 3 月 27 日、東京）

抗メタボリックシンド

20. Keiko Abe, Asuka Kamei, Tsudoi Toyoda, Humanintervention trial on maple syrup to evaluate its preclinical

ロームから脳機能活性化へ 基盤研究を中心にして、
食品開発展 2018 ポスターセッション（2018 年 10 月

effects、 the 257th ACS (American Chemical Society)
National Meeting（2019 年 3 月 29 日、アメリカ、オー

3-5 日、東京）ランド）

嶋田耕育、食品の機能性評価

10. 亀井飛鳥、科学的エビデンスに基づいた次世代農林水
産物・食品の開発と社会実装事例、BioJapan2018 セ
ミナー（2018 年 10 月 11 日、神奈川）
11. 亀井飛鳥、桑葉の機能性評価、BioJapan2018 ポスターセッション（2018 年 10 月 10-12 日、神奈川）
12. 篠﨑文夏、自然薯ムカゴの生理的機性、BioJapan2018
ポスターセッション（2018 年 10 月 10-12 日、神奈川）
13. Mizuki Honda, Mio Aida, Asuka Kamei, and Hideo Satsu
Establishment of a stable NFB-responsive cell line andanalysis of anti-inflammatory food substances 日本動物細胞工学会国際会議（JAACT2018）（2018 年 11 月 8 日、つくば市）
14. 亀井飛鳥、食品の機能性を明らかにするために－研究
事例と受託研究のご案内、アグリビジネス創出フェア（展示会）（2018 年 11 月 22 日、東京）
15. 亀井飛鳥、桑葉の機能性評価研究におけるマーカーとしてのトランスクリプトーム解析、JBA 平成 30 年度
機能性食品研究会講演会・第 3 回研究会「miRNA とmRNA」（2018 年 12 月 10 日、東京）
16. 亀井飛鳥、食品の機能性評価事例、戦略的イノベーシ
ョン創造プログラム（SIP）自然免疫制御技術研究組
合第 8 回シンポジウム『未来志向の次世代食品機能性と自然免疫』（2019 年 3 月 15 日、東京）
17. 本 田 瑞 希 、 亀 井 飛 鳥 、 相 田 美 緒 、 薩 秀 夫 、
1-Deoxynojirimycin による抗炎症作用の解析、日本農芸化学会 2019 年度大会（2019 年 3 月 24 日、東京）
18. 家山智子、長谷知輝 、山下玲 、嶋田耕育、濱口毅 、
篠原もえ子 、山田 正仁、阿部啓子、小林彰子、ロスマリン酸摂食によるアルツハイマー病発症遅延に関KISTEC研究報告2019（2019.7）

194