CellKey™システムを用いた
新しい GPCR の活性評価系
Novel Functional Assay System of GPCRs by CellKey™ System
北里大学

薬学部

生命薬化学教室教授

藤井秀明

Hideaki Fujii, Ph.D. (Professor)
Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Kitasato University
国立がん研究センター研究所がん患者病態生理研究分野

研究員

宮野加奈子、 分野長 上園保仁

Kanako Miyano, Ph.D. (Researcher), Yasuhito Uezono, MD, Ph.D. (Chief)
Division of Cancer Pathophysiology, National Cancer Center Research Institute

はじめに

CellKey ™ システムの測定原理

近年、医薬開発は化学合成により得られたいわゆる

CellKey ™ システムは MDS Sciex 社により開発され、低分子医薬から、抗体医薬などのバイオ医薬にシフトし2005 年より欧米で発売、2007 年に国内導入された新しいていると言われている。実際、欧米の製薬企業では以技術で、本邦においては日本モレキュラーデバイス株式前より、日本の製薬企業においても数年前から、バイオ会社において取り扱われている。国立がん研究センター

医薬研究の割合が増加している。現在臨床的に使用

研究所がん患者病態生理研究分野では、2010 年 8月にされている医薬の約 30% は、Gタンパク質共役受容体

アカデミアにおいては国立がん循環器病研究センターに（以下、GPCR）を標的分子としており次いで2 番目にCellKey ™ システムを導入した（図 1）。

、その大部分1,2）は低分子医薬が占める。今後その割合は低下するかもしれないが、低分子医薬の開発の必要性が無くなったというわけではなく、医薬開発における重要な一分野であることに変わりはない。
受 容 体には、GPCR、イオンチャネル型 受 容 体、キナーゼ結合型受容体等の種類があり、GPCRは重要な医薬標的分子の一つである。GPCRを標的とした化合物のスクリーニング法としては、主に受容体結合実験、［ 35 S］GTPγS結合実験、cAMP評価系、レポーター−ジー
ンアッセイを利用した細胞内 Ca2+ イメージング法などが用いられてきた。これらの評価法に共通する点は、ラジオアイソトープや蛍光色素等により標識する必要があること、または遺伝子操作等の人為的な操作を加える必要があることである。これに対して、CellKey

図 1 国立がん研究センター研究所がん患者病態生理研究分野に導入された
CellKey ™ システム

CellKey ™ システムの測定原理の概要は、以下の通システムりである。CellKey ™ システムで用いられる専用プレートは標識や人為的操作を加える必要のないラベルフリーのウェル底部には 2 本の電極が取り付けられており、そセルベースアッセイ系であり、CellKey

システムを用いのプレート上に細胞を培養し、高周波電流を流す。電て評価することで種々の応用が期待できる。本稿では、流は細胞間および細胞内を通り、結果として電極間にCellKey ™ システムを用いた新しい活性評価法につい電気抵抗（インピーダンス）が生じる。このインピーダンスて紹介したい。

変 化をシグナルとしてとらえるのが 細 胞 誘 電 分 光 法

TMTM（Cellular Dielectric Spectroscopy）である（図2）。インピー

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ダンスは、細胞接着性、細胞形態・体積、細胞間相互引き起こす（図 3）。従って、評価化合物を添加すること作用により変化する。細胞に発現した GPCRに作動薬で生じるインピーダンス変化を観測することにより、評価が結合するとGタンパクがαサブユニットとβγサブユニッ化合物の活性評価が可能となる。更には、インピーダン

ト複合体に分解する。
αサブユニットには G s、G i、G q など

ス変化のパターンを解析することにより、結合しているGのタイプが存在し、各タイプに対応したシグナル伝達がタンパクのタイプを知ることも可能である（図 4）。

起こり、そのいずれもが、細胞接着性、細胞形態・体積、CellKey ™ システムは 96 穴および 384 穴プレートに対細胞間相互作用に影響を及ぼしインピーダンス変化を応しており、迅速な化合物スクリーニングも可能である。

図 2 ウェル底部の電極と、細胞間および細胞内を通過した電流（extracellular current（iec）および transcellular current（itc））のイメージ図 3）

図 3 GPCR 下流のシグナルとインピーダンス変化の概念図 3）
GDP: guanosine diphosphate, GTP: guanosine triphosphate, cAMP: cyclic adenosine monophosphate

図 4 Gタンパクのタイプとインピーダンス変化パターンの違い 3）
dZiec: the changes in impedance related to extracellular current, dZitc: the changes in impedance for transcellular current

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GPCRを標的とした化合物評価の例

よって拮抗された（図 6B）。
したがって、α2-AR受容体活

本項において、G s、G i、および G qタンパクに結合した作用であることが示唆された。

性化によるインピーダンスの上昇は Giタンパクを介したGPCRとして各々プロスタグランジンEP4 受容体（EP4 受H 1 受容体は G qタンパクに結合しており、H 1 受容体を容体）、α2 アドレナリン受容体（α2 -AR 受容体）、およびヒ発現させた HeLa 細胞を用いて検討した。その結果、スタミンH 1 受容体（H 1 受容体）を取り上げ、化合物評価

H 1 受容体作動薬であるヒスタミン（Histamine, 10µM）はの実例を示す。

一過的なインピーダンスの低下とそれに続くインピーダン

EP4 受容体は G sタンパクに結合しており、EP4 受容体スの上昇を示した（図 7A）。ヒスタミンによる一過的なイを発現させた HeLa 細胞を用いて検討した。その結果、

ンピーダンス 低 下 は、細 胞 内 カルシウムキレーター

EP4 受 容 体 作 動 薬 で あるプ ロスタグランジン E2BAPTA-AM（10µM）により抑制された（図 7B）。一方、（Prostaglandin E2（ PGE2）, 10µM）はインピーダンスの低持続的なインピーダンスの上昇はプロテインキナーゼ C下を引き起こし（図 5A）、PGE2 による作動活性は G s タ（Protein kinase C, PKC）阻害剤 Phorbol 12-myristate

ンパクに特 異 的な阻 害 薬 であるコレラ毒 素（Cholera13-acetate（ PMA, 100nM）により抑制された（図 7C）。しtoxin（CTX）, 100nM）
によって拮抗された（図 5B）。したたがって、ヒスタミンによるH 1 受容体活性化による一過がって、EP4 受容体活性化によるインピーダンスの低下的なインピーダンスの低下は細胞内カルシウム濃度の上は Gsタンパクを介した作用であることが示唆された。

昇が関与しており、それに続くインピーダンスの上昇は

α2-AR 受容体は Giタンパクに結合しており、α2 受容PKCを介した作用であることが示唆された。

体を発現させた HeLa 細胞を用いて検討した。その結このように、G s、G i、および G q いずれの Gタンパクに果、α2 受 容 体 作 動 薬である UK14,304（100nM）はイン結合した GPCRにおいても、CellKey ™ システムを用いピーダンスの上昇を示し（図 6A）、α2 受容体活性化によた化 合 物 評 価 は 可 能 である。ここで気になるのが、るインピーダンスの上昇は G iタンパクに特異的な阻害薬

CellKey ™ システムを用いた評価結果と従来の方法にである百日咳毒素（Pertussis toxin（PTX）, 100ng/mL）により評価された活性評価結果との相関性である。これに

図 5 EP4 受容体における化合物評価 3）
EP4 受容体発現 HeLa 細胞をProstaglandin E2（PGE2, 10µM）
で刺激
しCellKey TM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した
（A）
。
（B）
Cholera toxin（CTX, 100nM）
は18 時間前処置した。

図 6 α2- 受容体における化合物評価 3）
α2- 受容体発現 HeLa 細胞をUK14,304（100nM）で刺激しCellKey TM シ
ステムを用いてインピーダンスの変化を測定した
（A）
。
（B）
Pertussis toxin（PTX, 100ng/mL）
は18 時間前処置した。

図 7 H1 受容体における化合物評価 3）
H1 受容体発現 HeLa 細胞をHistamine（10µM）
で刺激しCellKey TM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した（A）。BAPTA-AM（B）
は30 分間、phorbol
12-myristate 13-acetate（PMA, C）
は18 時間前処置した。

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ついては、PetersらがドパミンD 2 受容体において検討している 4）。また、我々もオピオイド受容体において検討しその他の化合物評価の例発表している 5）。それらによると、評価系により得られる

CellKey ™ システムは GPCRを標的とした化合物評

結果の絶対値は異なり、異なる評価系から得られる結価だけではなく、キナーゼに結 合した受 容 体やイオン果を直接比較することはできないが、各々の評価系からチャネルを標的とした化合物の評価に用いることも可能

得られる化合物の活性プロファイルの傾向はほぼ一致である。

しており、化合物の構造活性相関研究においては有用であると考えられる。

上皮成長因子（epidermal growth factor（EGF））受容体はチロシンキナーゼに結合した受容体である。EGF は

ここではどのタイプの Gタンパクと結合しているかがインピーダンスの上昇を示し（図 8A）、EGF（ 1pg/mL）によ既知である受容体を用いた評価例を示したが、図 4 にるインピーダンスの上昇は EGF 受容体チロシンキナーゼ

示した電気抵抗変化のパターンおよび本項で示した実阻害薬であるAG1478（ 1µM）、ならびにphosphoinositide

例から、結合しているGタンパクのタイプが未知である

3-kinase（ PI3K）阻害薬 wortmannin（ 25µM）
により抑制

GPCRに対しても活性評価が可能であり、かつ結合してされた（図 8B, C）。したがって、EGFによるEGF 受容体いるGタンパクのタイプを推定できることがご理解いただ

活性化によるインピーダンス変化には EGF 受容体のリンけると思う。

酸化とPI3K が関与することが示唆された。

図 8 EGF 受容体における化合物評価 3）
EGF 受容体発現 HeLa 細胞をEGF（1pg/mL）
で刺激しCellKeyTM システムを用いてインピーダンスの変化を測定した（A）。AG1478（B）とWortmannin（C）はそれぞれ30 分間前処置し、EGFにて刺激した。

表 1 CellKeyTM システムにて測定可能な受容体・イオンチャネル 3）

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おわりにた（表 2）6）。本稿において紹介した化合物評価は比較

CellKey ™ システムは、GPCRだけではなくGPCR 以のいずれでもラベルフリーで評価が可能、人為的な操外の受容体やイオンチャネルを標的とした化合物評価作を加える必 要 がないといった特 徴を利 用 すれば、にも利用可能である（表 1）。また、具体例は示さなかっ

CellKey ™ システムにより評価できる範囲はさらに拡大たが、迅速評価が可能であるため、受容体の安定発現するものと期待できる。例えば、受容体の二量体（ダイ細胞を作製する際の細胞株選定も効率的に行うことがマー）または／および多量体（オリゴマー）に関する評価可能である。に利用できるのではないかと考え、現在検討を進めてい的簡単な例であったが、生体由来の細胞でも発現細胞ラベルフリーアッセイシステムというCellKey ™ システる。以前は、受容体は単体（モノマー）として発現し機能ムの特徴は、単純に操作の簡便化を意味するだけではしていると考えられてきたが、約 10 数年の間に、受容体なく、標識化合物による影響などを考慮する必要がないはダイマーまたはオリゴマーとしても存在し、かつ生体内ことと考えられる。化合物の受容体結合実験の結果とで機能していることを示す報告が相次いでいる 7-9）。し

活性評価の結果を同等に扱うことはできないが、［ 3 H］

かし、受容体ダイマーおよびオリゴマーに対する評価系

標識化合物を用いる受容体結合実験は、評価に用いるが確立されていないのが現状である。更には、漢方薬［ H］標識化合物により得られる結果が大きく影響されるによる薬理作用の作用機序解明にも利用可能と考えてようである。実際、TRK-820とU69,593はいずれもκオピいる。

3オイド受容体（KOR）作動薬であるが、［ H］TRK-820 おCellKey ™ システムは開発されて 10 年程度の新しいよび［ 3 H］U69,593を用いた実験において、［ 3 H］TRK-評価システムである。評価者の工夫により、まだまだ可820および［ H］U69,593のK d 値やB max 値は大きく異なっ能性が広がるシステムであると期待している。

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表 2 モルモット小脳における［3H］
TRK-820および［3H］
U69,593を用いた受容体結合実験

ab[3H]TRK-820a[3H]U69,593

Kd

0.46 nMb

1.17 nM

Bmax

284 fmol/mg proteinb

83.7 fmol/mg protein

TRK-820は［3H］
TRK-820の結合を完全に置換したが、U69,593は約 80%しか置換しなかった。
DAMGO（µ 作動薬、100nM）
およびDPDPE（δ作動薬、200 nM）
存在下における［3H］TRK-820のK d 値およびBmax 値は、非存在下の値と同等であった（K d=0.51nM,Bmax=265fmol/mg protein）。

参考文献
1）Overington, J. P.; Al-Lazikani, B.; Hopkins, A. L. Nat. Rev.
Drug Discov. 2006, 5（12）, 993-996.
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ChemMedChem 2006, 1（8）, 761-782.
3）Molecular Devices 社 CellKeyTM システム紹介資料 .
4）Peters, M. F.; Knappenberger, K. S.; Wilkins, D.; Sygowski, L.
A.; Lazor, L. A.; Liu, J.; Scott, C. W. J. Biomol. Screen. 2007,12（3）, 312-319.
5）Fujii, H.; Hayashida, K.; Saito, A.; Yokoyama, A.; Hirayama, S.;
Iwai, T.; Nakata, E.; Nemoto, T.; Sudo, Y.; Uezono, Y.; Yamada,M.; Nagase, H. ACS Med. Chem. Lett. 2014, （5 4）368-372.

6）Fujii, H.; Hirayama, S.; Nagase, H. “Opioid Kappa Receptor
Selective Agonist TRK-820（ Nalfurafine Hydrochloride）”.
Pharmacology. Ed. by Gallelli, L. InTech, 2012, 81-98.
7）Milligan, G. Mol. Pharmacol. 2004, 66（1）, 1-7.
8）Prinster, S. C.; Hague, C.; Hall, R. A. Pharmacol. Rev. 2005, 57（3）, 289-298.
9）Rozenfeld, R.; Gomes, I.; Devi, L. A. “Opioid ReceptorDimerization”. The Opiate Receptors. 2nd ed., Ed. by Pasternak,
G. W. Humana Press, 2010, 407-437.

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