博 士（水産 科学）小林秀誉
学位論 文題名水系における高度不飽和脂肪酸の酸化機構に関する研究
学位論文内容の要旨
高度 不飽 和脂 肪酸(PUFA)には n―3系 とn― 6系 が存 在し、 ドコサヘキ
サ エ ン 酸 (DHA)や イ コ サ ペ ンタ エ ン 酸 (EPA)等 の n― 3系は 抗ア レルギ−、血液凝固防止、記憶カや視カの増進機能を持ち、アラキドン酸(AA)、口 一リ ノレ ン酸 (LN)
、 リノ ール 酸(LA)など のn−6系 はエイ コサノイドに 代謝 され て免 疫反応 など に寄 与する 。い ずれ も生 体内で は生合成でき ず、 相互 変換 も出来 ない こと から、 両方 の脂 肪酸 を食品 から適度に摂 取す るこ とが 必要で ある 。そ の一方 、高 度不 飽和 脂肪酸 は容易に酸化 され る。 生成 した過 酸化 脂質 は食品 の品 質を 劣化 させ、 また生体内で は細 胞を 傷害 し、老 化や 疾病 の原因 とな る。 その ため、 脂質過酸化反 応の 機構 を研 究する こと は重 要であ る。 いく っか 知られ ている酸化機 構の うち 最も 重要な 自動 酸化 はラジ カル 反応 であ り、ビ スアリル位の 水素 がラ ジカ ル的に 引き 抜か れるこ とか ら始 まる 連鎖反 応である。
よって、分子内にピスアリル位を多く持つ化合物ほど酸化されやすい、
例 え ば DHAや EPAは LAよ り も酸 化 に 対 し 不 安 定 で あ る こと が予 想される 。こ の予 想は バルク 系及 び有 機溶媒 溶液 中に おい ては正 しい。しかし 、エ マル ジョ ンやミ セル 、ま たホス ファ チジ ルコ リン(PC)と結合して り ポ ソ ― ム を 形 成 し た 場合 に は DHAや EPAが LAよ り 安定 とな り、酸化 安 定 性 が バ ル ク 系 や 有 機溶 媒 溶 液 系 と 逆 転 す る こ とが 知ら れている 。っ まり 、周 囲の環 境に よっ て脂質 鎖の 物理 的な 状態が 変わると、そ の脂 質鎖 の酸 化に対 する 挙動 が変わ る。 しか しな がら、 その原因は分 かっ てい ない 。細胞 や食 品に おける 一般 的な 脂質 の存在 状態である
エ マル ジョ ンは 複雑な 系で ある ため、 本研 究で はま ず細胞 のモデルとし て り ポ ソ ー ム 、 エ マル ジョ ンの モデル とし てミ セル を用い 、DHAなど が酸 化に 対し て安定 化す る機 構につ いて 、そ の反 応生成 物や物理的な 状態 に着 目し て検討 した 。さ らに、 実際 の細 胞に ついて も酸化実験を行い、モデルであるりポソームと比較検討した。
PUFAの ラ ジ カ ル 酸 化 で は 、 LAで 2種 、 LNで 4種 、 AAで 6種 、 EPAで 8種 、 DHAで 10種 の モ ノ ヒ ドロ ペ ル オ キ シ ド (MHP)が 生 成す る こ とが 知ら れて いる が、そ の異 性体 比を定 量的 かつ 正確 に分析 する方法は

知 ら れ て い な い 。 本 研 究 で は 、 水 素 添 加、 エ ステ ル交 換 、ト リ
メチ ル シリ ル 化し て から ガ スク ロ マト グラ フイーマス スペクトロ メトリ−(GC−MS)を用い る異性体比 分析法をま ず確立した。ここで、リポソ― ムに お ける 酸 化現 象 を 知る た め、 グ リセ ロ ール の 1
位 に パル ミ チン酸、2位 にPUFA(LA，AA，DHA)、3位にホスフ ァチジルコリン(PC)を持つ物質(PC−PUFA)を2―メチルー2−プロパノール(tBuOH)溶液及び―枚膜リ
ポソ ー ムに 調 製、 そ れぞ れ を酸 化 させ 、上 記の方法に より分析し た。
LAで は 2種 の 異 性 体 が い ず れ の 条 件で も 等量 生 成 した 。 AA， D
HAで はtBuOH溶液 で は生 成 し得 る すべ て の異 性 体 がほ ぼ 等量 ず つ生 成 する のに 対し 、 リポ ソ ―ム で は 異性 体 組成 に 偏り が 見ら れ 、AAでは 11位、 8位 、 5位 に 、 DHAで は 20位 、 16位 、 10位 、 8位 、 4位 に ヒ ド ロ ペ ル オ
キシ ド 基が付加 した化合物 が多く生成 した。なお 、いずれの 場合もMHP
以外 の 酸化 物 は少 量 しか 生 成し な かっ た。 今までのり ポソームに 関す
る 研 究 結 果 に よ り 、 DHA鎖 や AA鎖 か ら な る PCに よ る り ポ ソ ― ム は フ
レキ シ ブル か つ透 水 性が 高 いこ と が知 られ ていること を考えあわ せ、
これ ら のり ポ ソー ム では 脂 質鎖 の 反応 部位 近傍に水分 子が多く存 在す
るこ と で反 応 部位 間 の距 離 が遠 く なり 、そ の結果とし て連鎖反応 の速度が 遅く な り、 ま た異 性 体組 成 が偏ると いうことが考 えられる。
次 に、 PUFAエ チル エ ステ ル をク 口 口ホ ルム中に溶 かし、また エマル
ジョ ン にし て それ ぞ れを ラ ジカ ル 酸化 させ 、先に確立 した方法を 用いてMHPの 異性 体 組成 を 分析 し た。 LA， LNでは ク 口口 ホ ルム 溶 液と エ マル ジ ョ ン と で 異 性 体 組 成 に 違 い は 見 られ な かっ た が、 AA、EPA、 DHAで は違 い があ っ た。 ク 口 口ホ ル ム溶 液 の場 合 、生 成 し得 る M
HPの うちヒド ロ ペル オ キシ ド 基が 最 もメ チ ル基 に近 い位置及び 最もカルボ キシル 基に 近 い位 置 に結 合 し た化 合 物が 多 く見 ら れた が 、そ れ はこ の 2者
以外 で は1，3―環 化反応が起 こることに よりMHPが 生成しにく いためと考え ら れる 。 エマ ル ジョ ン でも そ の傾 向は 見られたが 、A
Aでは11位、
EPAで は 14位 、 DHAで は 16位 と 10位 に ヒ ド ロ ペ ル オ キ シ ド 基 が 結 合した 酸 化物 も 多く 見 られ た 。酸 化 生成 物に 違いが生じ る原因を検 討す
るた め 、エ マ ルジ ョ ンの モ デル と して ミセ ルを調製し 、1H‑NMRの緩和
時 間 を 用 い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 DHAや AAの ミ セ ル は LAミ セ ル と比較 し 、メ チ ル基 近 傍が よ ルフ レ キシ ブル であること を示唆する 結果が 得ら れ た。 っ まり 、 ミ セル に おい て もDHAや AAでは ミ セル に おい 疎
水性 の 高い 部 位が よ ルル ― ズに 集 合し てい ると考えら れ、透水性 も高いこ と が予 想 され た 。以 上 のこ と より 、ミ セルにおい てもりポソ ―ムの場 合 と同 じ く、 脂 質鎖 の 反応 部 位近 傍に 水分子が多 く存在する ことで反 応 部位 問 の距 離 が遠 く なり 、 連鎖 反応 の速度が遅 くなると共 に酸化部位に選 択性が現れ ると考えら れた。

続いて、培養細胞とりポソ―ムにおける脂質酸化を比較した。まずPUFAを添加した培地で細胞を培養すると、細胞中の脂肪酸組成において添加 したPUFAが増加する ことが確認さ れた。LA，AA及びDHAを添加した培地で細胞を培養し、酸化ス卜レスをかけた後にMHP存在比を測定したところ、いずれでもLA由来のMHPが最も多く検出されたことから、 細胞において はLAがDHAやAAよりも酸化 されやすい可能性がある。 AA由来MHPはAA添加培地で 培養した細胞 から比較的多く見られ、DHA由来MHPはDHA添加培地で培養した細胞からしか検出されず、いずれもりポソームを酸化した場合とは異なる異性体組成を示した。
AA由来MH
Pについて、ぱ―トコフェロール添加リポソームでほとんど生成しない5−MHPが多く生成し、細胞に取り込まれたP
UFAの酸化がりポソームに抗酸化物質を添加したものとも異なることが明らかとなった。ただし、この結果は酸化生成物を測定しているため、酸化反応部位に偏りがあるのか、或いは一部のMHPが比較的早く分解、代謝されるのかについては今後の検討を要する。
以上より、GC―MSやNMRを用いた本研究の検討により、食品中や生体内といった複雑系におけるAAやDHAのような機能性脂肪酸の酸化挙動が始めて明らかにされた。こうした結果は今後のこの分野の研究に大きく寄与するものと考えられる。

学 位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教 授

宮下 和 夫教 授

板橋教 授

高橋 是太 郎助教授

細 川 雅 史豊

学 位 論 文 題 名

水 系に おけ る高 度不飽和脂肪酸の酸化機構に関 する研究
ドコサヘキサエン酸(DHA)、アラキドン酸(AA)、リノール酸(LA)などの高度不飽和脂肪酸(PUFA)は様々な生体機能を有する。しかし、一方でこれらのPUFAは分子内に多数の二重結合を有するために、非常に酸化されやすい。生成した過酸化脂質は食品の品質を劣化させ、また生体内では細胞に傷害を与え、老化や疾病の原因となる。そのため、これらのPUFAの過酸化反応の機構を研究することはその利用を図る上で重要である。一般に、各PUFAの酸化安定性は不飽和度の高いものほど低下するが、エマルジョン中、ミセル中、リポソーム中といった水系では上述とはまったく逆に、不飽和度の高いものほど安定となることが知られている。しかし、水系における酸化反応生成物の特徴や酸化機構の詳細にっいては不明を点が多い。水系での各PUFAの酸化反応を知ることは、食品や生体といった脂質が水と共存して複雑に存在している場合の脂質酸化を理解する上で有益な知見を与えるものである。そこで、本研究では水系での各PUFAの酸化生成物の構造、異性体粗組成の特徴や、酸化反応の特徴を明らかにすることを目的として検討を行った。
1．各PUFAの過酸化で生ずる初期酸化生成物としてのモノヒドロペルオキシド(MHP)の異性体組成比を、GC‑MSを用いて定量的かつ正確に分析する方法を開発した。
2.食 品に おける 一般 的な 脂質の 存在 状態 であ るエマ ルジ ョン中での各PUFAの酸化の特徴にっいて明らかにするため、ミセル（エマルジョンのモデル）中での各PUFAの反応生成物や物理的な状態にっいてクロロホルム中と比較した。その結果、LA、LNではクロロホルム中とミセル中とでMHPの異性体組成に違いは見られなかったが、AA、EPA、DHAでは顕著な相違が観察された。
3.ミセル中とクロロホルム中で酸化生成物に違いが生じる原因を検討する

ため、1H‑NMRの緩和時間を用いてミセル中での各PUFAの物理的状態について検討した。その結果、DHAやAAのミセルはLAミセルと比較し、メチル基近傍がよルフレキシブルであることを示唆する結果が得られた。っまり、AAやDHAからなるミセルにおいては、脂質鎖の反応部位近傍に水分子が多く存在することで反応部位間の距離が遠くなり、連鎖反応の速度が遅くなると共、に酸化部位に選択性が現れることが示された。
3．生体膜モデルであるりポソームにおける酸化の詳細を知るため、グリセ
ロールの1位にパルミチン酸、2位にPUFA(LA，AA,DHA)、3位にホスファチジルコリン(PC)を持つ物質(PC‑PUFA)を有機溶媒中及び一枚膜リポソーム中に分散させ酸化反応を行った。LAでは2種の異性体がいずれの条件（有機溶媒中とりポソーム中）でも等量生成した。AA、DHAではtBuOH溶液中では生成し得るすべての異性体がほぼ等量ずつ生成したのに対し、リポソーム中では異性体組成に偏りが見られ、AAでは11位、8位、5位に、DHAでは20位、16位、10位、8位、4位にヒドロベルオキシド基が付加した化合物が多く生成した。
4．培養細胞においてもLAがDHAやAAよりも酸化されやすい可能性が示唆された。また、培養細胞中では、AAとDHAの酸化で生成するMHP異性体に偏りが見られ、その傾向はりポソームの場合と一致した。ただし、その偏りはりポソームの場合よりも顕著であり、細胞中ではDHAやAAは非常に特徴的かつ特異的な酸化反応を受けること、そのため、その分子構造から予想されるよりも酸化安定性が高くなること、また、その原因はこれらPUFAの立体構造や物理的化学的な特徴に起因することなどが初めて明らかにされた。
以上より、GC‑MSやNNn<を用いた本研究の検討により、食品中や生体内といった複雑系におけるAAやDHAのような機能性脂肪酸の酸化挙動が始めて明らかにされた。DHAは水産物に特徴的に多く含まれるPUFAであり、その高い生理作用のゆえに、現在、機能性食品、薬品などの様々な分野にその応用が図られている。しかし、一方で、DHAはその酸化安定性が化学構造的に低いことが予想されるため、食品・薬品への利用についての問題点や、摂取後の生体内脂質過酸化の亢進などの問題が指摘されていた。本研究で得られた成果はこうした点にっいて明確な解答を与えるものであり、DHAなどの高度不飽和脂質を積極的に活用する上で有益詮知見を与えるものと高く評価される。よって審査員一同は本研究の申請者が博士（水産科学）の学位を授与される資格のあるものと判定した。