土壌環境をモデルとした培養基による難培養放線菌のP-3分離法の開発と微生物資源の獲得
松本厚子（北里大学北里生命科学研究所）[要旨] 環境微生物にとって個々に取り出された実験室環境と土壌環境では生育条件が劇的に変化する。そこで、自然環境に近づけた培養条件すなわち土壌中で共存する細菌叢に注目した優占種菌との共培養による難培養土壌放線菌の分離法を開発し、未利用な放線菌資源の取得を試みた。
2種の土壌（A, B）から、22株および18株の放線菌を分離後、土壌ごとに各々菌体混合液を加えた寒天培地の上にメンブレンフィルターを置くことで仕切り、その上で再度分離を行なった (Methods)。土壌A からは51株の放線菌を分離し、25 種（Streptomyces 属20種、希少放線菌3属5種）に分類された。同時に菌体混合液無添加から分離した30株は、21種（Streptomyces 属19種、希少放線菌1属2種）に分類された。そのうち重複しているのはStreptomyces 属7種のみであった。土壌B からは添加群から100株、24種（Streptomyces 属22種、希少放線菌1属2種）、無添加群からは62株、20種（Streptomyces 属20種）が分離され、重複種はStreptomyces 属15種であった (Results 2)。いずれの土壌においても共培養により異なる菌株が分離され、KV-967 株は近縁種との相同性が低く、新規放線菌と考えられる (Results 3)。
一方、 細菌叢解析から土壌中のActinobacteria に占めるStreptomyces 属の割合はわずかで、分離できていない放線菌が多数存在することが検証された (Results 1)。

Soil sample

Methods

Culture-independent analysis

Soil samples
Sampling point
Ishigaki, Okinawa Pref.
MinamiDaitojima, Okinawa Pref.

AB

Culture-dependent analysis

Isolation of actinomycetes

Microbiome analysis

Medium 1
ProlineAgarNalidixic acidBenlate
Tap water

Medium 1
100%27ºC, 1 w
Soil

16S rDNA sequencing

Medium 1Isolate mixture*

Membrane (Ø 0.45µm)
0%Microbiome

Medium 2

分離に使用する土壌中の細菌叢を 16S rDNA部分塩基配列に基づき推定した。

Results 1 (Microbiome)
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%

Ac#nobacteria

30%
20%
10%
0%

Classification of phylum level in Bacteria
Soil A

100%

90%

80%

70%

Nonomuraea(0.2%)

Streptomyces(2.0%)

60%

50%

Jiangella(0.4%)

40%

Oder Actinomycetales
30%
Catellatospora
20%(0.2%)

10%

0%Solirubrobacter
Fam. Patulibacteraceae
Fam. Conexibacteraceae
Ord. Solirubrobacterales
Fam. Gaiellaceae
Rubrobacter
Phy. Actinobacteria
Actinomadura
Fam. Thermomonosporaceae
Streptosporangium
Nonomuraea
Fam. Streptosporangiaceae
Streptacidiphilus
Fam. Streptomycetaceae
Saccharomonospora
Jiangella
Fam. Pseudonocardiaceae
Microlunatus
Promicromonospora
Propionicimonas
KribbellaActinopolymorpha
Fam. Nocardioidaceae
Nocardia
Mycobacterium
Pilimelia
Catellatospora
Fam. Micromonosporaceae
Microbacterium
Fam. Microbacteriaceae
Phycicoccus
Gordonia
Geodermatophilus
Fam. Frankiaceae
Saccharothrix
Fam. Actinosynnemataceae
Ord. ActinomycetalesCl. Actinobacteria
Fam. Microthrixaceae
Fam. Iamiaceae
Ord. Acidimicrobiales
Ord. Acidimicrobiales

Fam. Solirubrobacteraceae
Conexibacter
Fam. Conexibacteraceae
Ord. Solirubrobacterales
Ord. Gaiellales
Fam. Rubrobacteraceae
Ord. Micrococcales
ActinoallomurusFam. Thermomonosporaceae
Sphaerisporangium
Fam. Streptosporangiaceae
Streptomyces
Fam. Streptomycetaceae
Sporichthya
Pseudonocardia
Amycolatopsis
Fam. Pseudonocardiaceae
Xylanimicrobium
Cellulosimicrobium
Nocardioides
Aeromicrobium
Fam. Nocardioidaceae
Rhodococcus
Fam. Nakamurellaceae
Virgisporangium
Dactylosporangium
ActinoplanesFam. Micromonosporaceae
Agromyces
Terracoccus
Intrasporangium
GlycomycesFrankia
Fam. Cryptosporangiaceae
Fam. Actinosynnemataceae
Ord. Actinomycetales
Cl. Actinobacteria
Ord. Acidimicrobiales
Iamia
Ord. Acidimicrobiales
Ord. Acidimicrobiales
Ord. Acidimicrobiales( ): the ratio in Bacteria

Soil B
100%

90%

80%

70%

60%

Streptomyces(0.3%)

50%

Amycolatopsis(0.02%)

40%

Order Actinomycetales
30%

20%

10%0%

Solirubrobacter
Fam. Patulibacteraceae
Fam. Conexibacteraceae
Ord. Solirubrobacterales
Ord. Gaiellales
Rubrobacter
Phy. Actinobacteria
Phy. ActinobacteriaActinomadura
Streptosporangium
Fam. Streptosporangiaceae
Streptacidiphilus
Fam. Streptomycetaceae
Pseudonocardia
Actinomycetospora
Fam. Pseudonocardiaceae
Fam. Propionibacteriaceae
Promicromonospora
Nocardioides
Aeromicrobium
Fam. Nocardioidaceae
Nocardia
Mycobacterium
Pilimelia
Catellatospora
Fam. Micromonosporaceae
Microbacterium
Fam. Microbacteriaceae
Terracoccus
Intrasporangium
Gordonia
Fam. Frankiaceae
Fam. Cryptosporangiaceae
Cellulomonas
Fam. Actinosynnemataceae
Ord. Actinomycetales
Ord. Acidimicrobiales
Iamia
Ord. Acidimicrobiales
Ord. Acidimicrobiales*Isolates were cultured in yeast
extract- dextrose broth and thenwashed and suspended with PBS(-).

New isolates

土壌希釈液を Medium 1 に混釈し、27ºC 、1週間培養後、出現するコロニーを釣菌した。分離株は YD培地 (1.0% 酵母エキス、1.0% デキストロース) にて各々培養後、集菌、洗浄し、PBS(-)に懸濁し、各菌株を混合した菌体混合液を作製した。この混合液を加えた Medium 2 を大型シャーレの中で固化した。その上にメンブレンフィルター (Ø 0.45µm) を置き、底面に穴を開けたガラスシャーレ (Co-cultured plate) を重ね、同一土壌希釈液をMedium 1 にて、27℃で１- 2週間培養し放線菌を分離した。

Results 2 (Isolation)

Acidobacteria
Actinobacteria
Armatimonadetes
BRC1Bacteroidetes
ChlorobiChloroflexi
Elusimicrobia
Fibrobacteres
Firmicutes
Gemmatimonadetes
Nitrospirae
OD1
Planctomycetes
Proteobacteria
SBR1093
TM6
TM7
Verrucomicrobia
WS3WS4
Other(Bacteria)
Other(Unclassified)

Soil B

Soil A

Co-cultured plate

Medium 2
Isolate mixture 1 mL each*
Agar
15 g
Nalidixic acid 25 mg
Benlate25 mg
Tap water
1L

Co-cultured plate

Isolates

Approx. 300 bp

Soil

10 g
15 g
25 mg
25 mg
1L

Fam. Solirubrobacteraceae
Fam. Conexibacteraceae
Ord. Solirubrobacterales
Fam. Gaiellaceae
Ord. Gaiellales
Fam. Rubrobacteraceae
EuzebyaOrd. Micrococcales
Fam. Thermomonosporaceae
Nonomuraea
Streptomyces
Fam. Streptomycetaceae
Sporichthya
Amycolatopsis
Fam. Pseudonocardiaceae
Microlunatus
Xylanimicrobium
Propionicimonas
Kribbella
Fam. Nocardioidaceae
Rhodococcus
Fam. Nakamurellaceae
Virgisporangium
Dactylosporangium
Actinoplanes
Fam. Micromonosporaceae
Agromyces
Fam. Kineosporiaceae
Phycicoccus
Fam. Intrasporangiaceae
Frankia
Fam. Frankiaceae
Demequina
Saccharothrix
Ord. Actinomycetales
Cl. Actinobacteria
Fam. Microthrixaceae
Ord. Acidimicrobiales
Ord. Acidimicrobiales
Ord. Acidimicrobiales( ): the ratio in BacteriaClassification of phylum Actinobacteria

Actinomycete strains isolated
from two soil samples
SoilA

Culture with isolate
mixture (Co-culture)

Co-culture
1280
77Control
126574

BCulture without isolate
mixture (Control)

Isolate

2727

1618

Colony

66

66

3660

Isolate

4753

31

31

Soil A: Different colonies of actinomycetes were picked up.
Soil B: Almost all colonies of actinomycetes were picked up.

Isolating plates (Soil A)
Classification of isolates (Soil A)
Taxonomy
Co-culture
Catellatospora chokoriensis
1
Jiangella alkaliphila
1Nonomuraea candida
1
Nonomuraea kuesteri
1
Nonomuraea stahlianthi
1
Streptomyces coeruleofuscus
4Streptomyces lannensis
4
Streptomyces aculeolatus
3
Streptomyces echinatus
3
Streptomyces graminilatus
2
Streptomyces caeruleatus
1
Streptomyces cinnabarinus
1
Streptomyces krungchingensis
1
Streptomyces platensis
1
Streptomyces pseudogriseolus
1Streptomyces roseolus
1Streptomyces sasae
1
Streptomyces virginiae
1
Pseudonocardia hierapolitana
0
Pseudonocardia adelaidensis
0
Streptomyces neopeptinius
0
Streptomyces arenae0
Streptomyces albiflavescens
0
Streptomyces albogriseolus
0
Streptomyces cellostaticus
0Streptomyces chartreusis
0
Streptomyces lateritius
0
Streptomyces malachitofuscus
0Streptomyces naganishii
0
Streptomyces palmae
0
Streptomyces xanthophaeus
0
Streptomyces atratus
0
Streptomyces alboniger
5
Streptomyces formicae
4
Streptomyces glauciniger
4
Streptomyces wuyuanensis
4
Streptomyces nogalater2
Streptomyces phaeoluteigriseus
2
Streptomyces lilacinus
1
Total
51

Classification of isolates (Soil B)

Control0

KV-9670000000000000000011322111111111211322130

Strains in isolate mixture
Soil AS. albiflavescens
S. alboniger
S. glauciniger
S. hawaiiensis
S. lannensis
S. viridochromogenes
S. wuyuanensis
Total

1
171
22
622

Soil BS. alboniger
1
S. avidinii
1
S. curacoi
1
S.exfoliatus
4
S. flavovirens
1
S. griserolus
1
S. krungchingensi
1
S. lavendulcolor
1S. phaeoluteigriseus
1
S. pluricolorescens
1
S. puniceus
1
S. roseoviridis
1
Isoptericola nanjingensis 1N.D.
2
Total
18

Taxonomy
Amycolatopsis regifaucium
Amycolatopsis speibonae
Streptomyces angustmyceticus
Streptomyces arenae
Streptomyces capoamus
Streptomyces chartreusis
Streptomyces fulvissimus
Streptomyces lannensis
Streptomyces tanashiensis
Streptomyces humidus
Streptomyces pulveraceus
Streptomyces rhizosphaerihabitans
Streptomyces flavotricini
Streptomyces koyangensis
Streptomyces graminilatus
Streptomyces griseolus
Streptomyces zaomyceticus
Streptomyces globisporus
Streptomyces neopeptinius
Streptomyces badius
Streptomyces violarus
Streptomyces scabiei
Streptomyces puniceus
Streptomyces roseolus
Streptomyces curacoi
Streptomyces pratensis
Streptomyces phaeoluteigriseus
Streptomyces exfoliatus
Streptomyces flavovirens
NDTotalCo-culture
211112113000001111222335581114199100Control0000000001112211231221224211105662

１．共培養の有無に関わらず２土壌からの主な分離株はStreptomyces 属であったが、異なった菌株が多数分離された。
２．共培養により希少放線菌の分離率がわずかに上昇した。

Results 3 (Taxonomy of isolate, KV-967)
The closely related strains basedon blast search
12345678910Name
Jiangella alkaliphila
Jiangella muralis
Jiangella mangrovi
Jiangella alba
Jiangella endophytica
Phytoactinopolyspora alkaliphila
Haloactinopolyspora alkaliphila
Haloactinopolyspora alba
Jiangella gansuensis
Phytoactinopolyspora halotolerans

Cultivation for 2 weeks on water-proline agar

StrainDSM 45079
DSM 45357
3SM4-07
DSM 45237
KE2-3
EGI 80629
EGI 80088
YIM 93246
DSM 44835
YIM 96448

0.01
Micromonospora chalcea DSM 43026T (X92594)

Isolate KV-967

Similarity(%)
97.1
96.7
96.7
96.6
96.6
96.5
96.4
96.2
96.1
96.0100

Haloactinopolyspora alba FJ969846T (FJ96984)
Haloactinopolyspora alkaliphila EGI 80088T (KF040422)

87 62

Jiangella alkaliphila JBRI 2008T (AM422451)
Jiangella mangrove 3SM4-07T (AB976540)

96 96
95

Jiangella muralis 15-Je-017T (FN645214)
Jiangella alba YIM 61503T (FJ157186)

58

Jiangella gansuensis YIM 002T (AY631071)
Phytoactinopolyspora alkaliphila EGI 80629T (KU042078)

Cultivation for 8 weeks on water-proline agar
99

１．２種類の土壌は Actinobacteria 門菌株を約60％および45％含むことを示した。
２．分離株の多数を占める Streptomyces 属およびその他の分離希少放線菌はActinobacteria 門の中での存在率はわずかであった。

Phytoactinopolyspora endophytica EGI 60009T (KP271925)

Phylogenetic tree with KV-967 and related strains[結論]
１．共培養により非共培養（通常法）とは異なる菌株が分離された。
２．細菌叢解析から分離株は土壌中のマイナーな菌群で、大多数の放線菌が分離できていないことが確認された。

Plate No.
Colony

1 µm

SEM of KV-967

1 µm

１．共培養により分離した KV-967 株は Jiangella alkaliphila DSM
45079T と最も高い相同性を示したがその値は低かった (97.1%)。
２．Jiangella 属を含む Jiangellaceae 科の各種との系統解析結果もまた、いずれともクラスターを形成しないことを示した。