称号及び氏名

博士（理学）

学位授与の日付

平成 23 年 3 月 31 日

論文

名

論文審査委員磯貝純美「Study on the reassembly mechanism of fluorescent protein(蛍光タンパク質の再構成機構に関する研究)」
主査
副査
副査

多田徳富藤井俊治
哲郁雄

論文要旨
【序論】
多くのタンパク質は単独で機能するのではなく、他のタンパク質と相互作用することで転写やシグナル伝達経路の調節のような重要な役割を担っている。タンパク質は独特の構造をもち、相手分子と互いに認識し合うことで厳密な制御機構を遂行し、細胞の恒常性を保っている。したがって、タンパク質間の相互作用解析はさまざまな生命現象の解明につながる。
近年、蛍光タンパク質を用いた細胞の動態解析が実用化され、細胞内の構造体の細かな動きや、形態変化の時期や順序を知ることができるようになった。蛍光タンパク質を用いた
細 胞 内 で の タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 を 解 析 す る 方 法 の 一 つ に Bimolecular fluorescencecomplementation (BiFC) 解析がある。それは、N 末端側と C 末端側に分割され蛍光を失った状態の蛍光タンパク質各断片が、互いに相補的に結合して蛍光を回復する現象を利用するものである。観察したいタンパク質を蛍光タンパク質断片に融合させて細胞内で共発現させ、目的タンパク質間の相互作用を通して蛍光タンパク質の再構成により回復した蛍光を観察する (Fig. 1)。このような BiFC 解析にも問題点がある。それは、使用する蛍光タンパク質や融合タンパク質の組み合わせによって結果が著しく左右されることである。特に、融合タンパク質に非依存的な蛍光タンパク質断片同士の相互作用は、正確な蛍光回復の検出を妨げる最大の問題である。
本研究課題は、有用な BiFC 解析系構築のための手がかりを得ることを目的としたものであり、蛍光タンパク質である Venus について、その再構成体の構造および形成機構の解明を、各種クロマトグラフィー、タンパク質結晶構造解析、質量分析、動的光散乱、円二色性測定などにより試みた。さらに、再構成体形成の鍵と考えられた部位に変異を導入し、再構成体形成能を示差走査熱量測定により評価を行った。

Fig. 1 BiFC の原理-1-

Absorbance at 280 nm【第一章 Venus 再構成体の発現および精製】
peak 3
蛍 光 タ ン パ ク 質 Venus の Ｎ 末 端 側 (VN155:1-154 残基) とＣ末端側 (VC155: 155-238 残基)を
peak 1
大腸菌で共発現させ、Ni アフィニティー、陰イオン交換カラムにより精製した。陰イオン交換クロマト
peak 2
グラフィーで Venus 再構成体が 3 本の成分に分離するという現象を示した (Fig. 2)。各成分と whole
Venus の蛍光スペクトル特性に違いは見られなかったことから、これらの成分は Venus 再構成体に相当するものと考えられる。各成分をそれぞれゲルろ過
12.0
15.0
18.0
21.024.0
クロマトグラフィーにより精製すると、peak 1 およElution volume (ml)び peak 2 は単量体、peak 3 は多量体であることが示唆された。さらに、peak 3 のゲルろ過クロマトグ
Fig. 2 陰イオン交換クロマトグラム
ラフィーでは多量体以外に単量体のピークが検出された。peak 3 を 37ºC で 3 日間インキュベートしたところ、多量体が減少し、単量体が増加した。このことから、再構成 Venus は多量体から単量体へ転移することが示唆された。同様に発現し、精製した whole Venus ではこのような現象は見出されなかったことから、この成分分離は再構成 Venus 固有の問題である。
【第二章 Venus 再構成体の物理学的特性】
質量分析：peak 1 および peak 3 は VN155/VC155 再構成体を基本とした分子であることが明らかとなった。一方、peak 2 では、VN155 の分子量が peak 1 や 3 で得られた実測値や計算値に比べて約 180 程度大きいという結果になった。これは、アミノ酸残基の修飾によるものではないかと考えている。
動的光散乱：peak 3 は 8 量体であることが明らかとなった。対照として測定した peak 1および whole Venus はそれぞれ単量体であることが確認された。これはゲルろ過カラムクロマトグラムの結果と一致する。
円二色性(CD)測定：peak 1 および peak 3 の CD スペクトルに有意な差は見られなかったことから、これら成分は類似のβバレル構造を持つものと推定した。また、多量体から経時あるいは加熱により産生した単量体においても同一のスペクトルを示したことから、多量体から得られた単量体も同様のβバレル構造を持つと結論した。一方、whole Venus と比較した結果、再構成体のαヘリックス含量は僅かに減少していることが示唆された。
Ｘ線結晶構造解析：単量体と推定された精製成分についてシッティングドロップ蒸気拡散法により 20ºC 下で結晶化を行った。その結果、25%(w/v) PEG3350、0.1 M HEPES buffer pH
7.5、0.2 M Li2SO4 を含む沈殿剤を用いた条件下で、黄色の蛍光を発する結晶が得られた。
大型放射光施設 KEK・Photon Factory において回折Ｘ線測定を行い、2.1 Å 分解能の良質なデータを得た (空間群 P212121、a = 59.05、b = 116.05、c = 156.85 Å、Z = 4、completeness
99.9%、Rmerge = 10.2%、I/σ = 23.9)。分子置換法により位相を決定し、Venus 再構成体の構造を明らかにした(PDB: 3AKO)。Venus 再構成体は非対称単位中に 4 分子存在しており、それぞれの構造は、11 本のスβ4β9β8トランドから成る β バレル構造を形成していた(Fig. 3)。再構成体は、
β7β10N
既出の whole Venus の構造と極めて良く似ており、主鎖間の r.m.s.d
β11C値は 0.54 Å であった。一方、両構造にわずかではあるが興味深い差がC存在する。すなわち、再構成体の VN155 側の 7 番目のストランド(β7)
Nが whole Venus と比較して短くなっていた。さらに、β7 は VC155 側の 8 番目と 10 番目のストランドに挟まれており、主鎖間の水素結合のFig. 3 Venusの数の減少や構造のゆらぎが観察された。
再構成体の構造-2--1-1

ExcessHeat
Capacity
ExcessHeat
CapacityEndo.

【第三章 Venus 再構成体の変異体と熱安定性の比較】(a)(b)
構造解析の結果より、β7 付近のアミノ酸残基にTyr143
変異を入れることで VN155 と VC155 の相互作用をTyr145弱めることができると仮定した。その相互作用に関Ser208与していると考えられるアミノ酸を見出し、変異体
His169(c)を作製した (Y143F、Y145F、H148G) (Fig. 4)。
His148whole Venus、Venus 再構成体およびその変異体について、示差走査熱量 (DSC) 測定を行った結chromophore
果を Fig. 5 に示す。whole Venus の Tm 値は 89.0ºC
Arg168と、耐熱性に富んだタンパク質であることが明らかとなった。一方、Venus 再構成体 peak 1 の Tm 値
Fig. 4 β7 近傍のアミノ酸は 77.5ºC と低下していた。変異体 Y143F、Y145F、(a) Tyr143 (b) Tyr145) (c) His148
H148G は、それぞれ 77.1ºC、83.8ºC、72.1ºC でピー
whole Venus
クを示した。Tyr143 と Ser208 間の水素結合を切断
peak
1 -1mol-1
20kJmol
20K kJKしたのにも関わらず (Fig. 4a)、Y143F は Venus 再peak 3
H148G
構成体 peak1 とほぼ同じ Tm 値を示した。Y145F でY143F
Y145F
は、Venus 再構成体 peak1 と比較して、Tm 値が大きく上昇した。これは、水分子を介した水素結合ネットワークの一部を切断したために (Fig. 4b)、周辺の疎水性残基によって疎水性コアが高まった、あるいはアミノ酸残基の再配列が生じ、構造全体のパッ
20304050607080901002030405060708090100
キングがより密になったため、耐熱性が増加したと
Temperature / C
Temperature /ºC考えられる。一方、H148G では、側鎖の占める割合が大幅に減少したこと、クロモフォアとの水素結合
Fig. 5DSC 曲線(Fig. 4c) が切断されたことからβストランド間に新たに空間が生じ、構造が不安定化したものと考えられる。
また、peak3 の DSC カーブは 2 つのピークを示した。1 つは 40ºC から 65ºC にかけての緩やかなピーク、もう 1 つは Venus 再構成体 peak 1 と同じ 77.6ºC であった。低温側の緩やかなピークは、8 量体から単量体への転移に、また、77.6 ºC の Tm 値を示すピークは、転移によって形成された単量体に由来するものと考えられる。しかし、高温側のピークの ΔH は期待されるものより小さく、このことから、多量体が解ける際、正確なフォールディングを持つ単量体を形成するのみならず、一部ミスフォールドしてしまう経路も存在するものと考えられる。この８量体は経時的に減少し単量体が同時に増加する。したがって、大腸菌で共発現した VenusＮ末断片とＣ末断片の再構成は、熱力学的に準安定な多量体の形成を経て安定な単量体へと転移して行く機構によっているものと推定した。
Ｎ末断片とＣ末断片の再構成における多量体の形成が他の蛍光タンパク質においても見出されるのか、Venus との一次構造の相同性が低いサンゴ由来の赤色蛍光タンパク質である
mCherry について検証した。その結果、極めて興味深いことに、mCherry 再構成体においても単量体と同時に８量体と推定される多量体の形成が見出された。このことは、BiFC を目的として断片化された蛍光タンパク質は、再構成において多量体を経て単量体を形成する機構が一般的に存在する可能性を示唆するものと考えられる。βストランドが豊富なタンパク質では、しばしばβストランドの乗り換え（スワップ）が起こる。ヒンジ領域にあるプロリンのシス－トランス異性化がβストランドのスワップに大きく関わるという報告も近年された。Venus では短いＣ末断片側の 2 種のストランド間 (β9-β10) のループ上にプロリン残基が 3 個、mCherry でも同様の部位に 2 個のプロリン残基が存在しており、これらの異性化によりβストランドのスワップが容易に可能であると思われる。これらのことより、蛍光タo-3-ンパク質のＮ末断片とＣ末断片の再構成においては、βストランドのスワップを伴う多量体が容易に形成されるものと結論した。
【総括】
本研究により、Venus のＮ末断片とＣ末断片は、再構成する過程でβストランドのスワップを伴う多量体を形成し、その後、より構造安定性の高い単量体へ移行する機構が存在することを明らかにした。さらに、N 末断片および C 末断片の接触部位への変異の導入は、蛍光タンパク質再構成体の熱安定性に変化をもたらし、より有用な BiFC 解析の構築の可能性を示すことができた。

審査結果の要旨
タンパク質は互いに認識し合うことで厳密な制御機構を遂行し、細胞の恒常性を保っている。近年、蛍光タンパク質を用いた細胞の動態解析が実用化され、細胞内の構造体の形態変化や時期などを知ることができるようになった。その方法の一つに BiFC 解析と呼ばれるものがある。それは、Ｎ末端側とＣ末端側に分割され蛍光を失った状態の蛍光タンパク質各断片が、互いに相補的に結合して蛍光を回復する現象を利用するものである。しかし、本解析法には、融合タンパク質に非依存的な蛍光タンパク質断片同士の相互作用が生じ、正確な蛍光回復の検出を妨げる大きな問題が存在する。本学位論文は、その問題を解決し BiFC の有効利用を図ることを目的とし、未解明であった蛍光タンパク質再構成機構についてさまざまな物理化学的手法を用いて基礎的な検討を行った結果を取り纏めたものである。
第１章では、蛍光タンパク質 Venus のＮ末端側とＣ末端側の大腸菌を用いた共発現を行い、Venus の再構成体には単量体以外に多量体が存在すること、多量体は単量体へ転移するという新たな知見を見出した。
第２章では、Venus 再構成体の構造や物理学的特性につき検討している。単量体のＸ線結晶構造解析からは、再構成体も・バレル構造を形成していることを明らかにした。また、whole
Venus の構造に比べて、繋ぎ目のストランドの構造にゆらぎが生じていることを見出し、部位特異的変異により再構成体の安定性が変わり得ると論じている。また、さまざまな物理化学的手法により、多量体は、単量体と同様にＮ末端側とＣ末端側の再構成体を基本とし、それが８個集まった分子であることを明らかにした。
第３章では、Venus 再構成体の変異体を含め示差走査熱量測定を行い、部位特異的変異により再構成体の安定性が変わることを明らかにし、このことから構成成分間の親和性を制御できる可能性を示した。さらに、同測定により昇温過程で 8 量体から単量体に転移することを明らかにした。また、同様の多量体が、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質である mCherryにおいても形成されることを見出し、断片化された蛍光タンパク質は、再構成において多量体を経て単量体を形成する機構、それも Pro 残基のシス・トランス異性化に伴う機構が一般的に存在する可能性を示唆した。
以上のように、本論文は、有用な BiFC 解析法構築の基盤研究として優れた成果を上げており、構造生物学および分子生物学の研究に大きく貢献している。したがって、本学位論文審査委員会は、当該論文が博士（理学）の学位を授与するに相当すると結論した。

-4-