博 士 （ 水 産 学 ）藤 田敏 明
学位論 文題名
Immunochemicalandbiochemicalstudies
on precursors of vitelline envelope proteinsof masu salmon(O,zcor乃 ッ 髭 Cカ 勿 S絖 ￠ S〇 勿 ）（サク ラマスの 卵膜蛋白 前駆物質 に関する免 疫生化学的研究）

学位論文内容の要旨
サ ク ラ マス （ 〇 ncorhynchusmasou)は北 部 日 本に 広 く分 布 す る重 要 な増養殖 対象魚で あり、北 海道の河 川では稚魚 の放流事 業また沿 岸では海 中養殖なども 推進され ている。 増養殖を 行う上で健 全な卵を 得ること は重要で あるが、それ には親魚 の卵形成 過程を詳 細に理解す る必要が ある。卵 重量の殆 どを占める卵 黄蛋白は 発生中の 胚の栄養 として必要 不可欠で ある。一 方、卵膜 は受精時の多 精拒否お よび浸透 圧保持の 機能を持っ ばかりで なく、外 部環境か らの胚体の保 護など多 くの役割 を果たし ている。
硬 骨 魚類 の 卵膜 は 一 般に 、 ほ乳 類 の 卵透 明 帯 と相 同 な器官と され、卵 母細胞 由来のい わゆる一 次卵膜と 考えられて きた。し かし、近 年多くの 魚類におい て 、卵 膜 蛋白 は エ スト ラ ジ オー ル ー17p(E2)の 刺 激に より 肝臓で合 成された後 、血流を 介して卵 巣に運ば れることが 明らかと なり、メ ダカにお いては、
こ の 卵 膜 蛋 白 前 駆物 質 をコ リ オ ジェ ニ ン (Chg)と呼 ぶ こ とが 初 めて 提 唱 された (Yamagami， 1996)。 従っ て 卵 膜蛋 白 前駆 物 質 は、 卵 黄蛋 白前駆物 質（ピテロ ジ ェニ ン ；Vg)と 同 様に 、 卵母細 胞の成長に 関わる外 因性の卵 形成因子 に加えら れる。し かし、魚 類の卵膜 蛋白前駆物 質に関す る知見、 ホルモン による合成の 制御およ び卵膜の 構築過程 には未解明 な点が多 く残され ており、 統一した見解 は得られ ていない。本研究では卵膜形成過程を明らかにすることを目的に、

サク ラマス 卵膜 蛋白前駆物質の検出、精製を行い、さらにE2処理による血中への誘 導およ び成 熟に伴う血中量の変化、並びに卵巣における卵膜蛋白前駆物質と卵膜蛋白の動態を調べた。
供試魚 には 北大 水産 学部 附属 七飯 養魚 実習 施設 で飼 育中 のサク ラマ スを用い た。非 イオ ン性界面活性剤を用いて可溶化した孵化後の卵膜を抗原として抗卵 膜血清 （a‑VE)を作 製し た。 a‑VEを 用い た二重免疫拡散法により雌雄成熟魚の 血清と 肝臓 抽出液および卵膜抽出液を解析した結果、成熟雌の血清および肝臓抽出液中には卵膜関連蛋白(viteLlineenvelope‑relatedprotein;VERP)が存在する ことが 明ら かになったことから、サクラマスの卵膜もまた卵巣外由来であると 考えら れた 。さらに、非還元下でのa‑VEを用いたウェスタンブ口ッティン
グ に お い て 雌 血 清 中 に 126、 48お よ び 43kDaの バ ン ド が 観 察 さ れ 、 3種 類 のVERPが存在することが示唆された。
ウ ェ ス タ ン ブ □ ッ テ ィ ン グ で の 分 子 量 の 違 い か ら 血 清 中 の 3つ の VERPをそれぞれvery high、highおよびlow molecular weight VE
RP（vh VERP、1NERP
お よび NERP)と 名 付 け 、 各 種 ク口 マトグ ラフ イー を用 いて 精製 を行 った 。精製 vlNERPは ゲ ル 濾 過 で は 分 子 量 520kDaで あ り 、 SDS ‑PAGEで は 175お よ び126kDaのバ ンド が還 元処 理に 関わ らず 観察 された。精製hVERPはゲル濾過で分子量 88kDa、SDS ‑PAGEで は、 非還 元下 で48kDa、 還元 下で は53kDaで あっ た。
さら に精製 NERPの分 子量 はゲ ル濾 過で 55kDaと推 定さ れ、 SDS ‑PAGEにお いて非還 元下で 43 kDa、還元下で47 kDaのバンドが観察された。これらの結果から
hVERPは 2量 体 、 NERPは 単 量 体 と し て 血 中 に 存 在 す る こ と が示 唆さ れた 。さら に、 hVERPお よ び NERPの ア ミノ 酸組成 はそ れぞ れメ ダカ とイ 卜ウ のコ リオ
ジ工 二ンHおよ びコ リオ ジ工 二ン Lに極 めて 類似していた。一方、vh VERPは、コリ オジェ ニン Hも しく は本 種の hVERPとの 類似 性を 示し た。 続いて 、そ れぞれの精製品に対する特異抗体（a―VH、a‑H、a−L）を作製した。ウェスタンブ□
ッテ ィング にお いて 、a‑Lは NERPのみを 特異 的に 染色 した 。一 方、 a‑VHとa‑H
GSIな ら び に E2の 増 加 に 伴 っ て 上昇 し 、 8月 に 最 大 値 (Vg 10.93mg/ml、 ChgH

618.47yg/ml、ChgL977.05yg/ml)を示した後、排卵月の9月には急激に減少した。 血中Vg濃度はChgと比較して著しく高い値を示したが、E2濃度が低い個体（く Ing/ml)ではVgより高濃度のChgが検出された。以上の結果からChgの合成分泌 がE2によって直接的に制御されることおよびChgとVgの合成量の割合はE2の濃度によって調整されることが示唆された。
Chgか ら卵 膜が 形成 され る過 程を 明ら かに する ため に、 a‑Hおよびa‑Lを用いて卵母細胞質を解析した。抽出した卵母細胞質はa‑HとLの両者に対して、沈降 線を 形成 した 。こ れら の沈 降線はそれぞれ血清中のChgHおよびChgLの沈降線 と融合したことから、卵母細胞質中にはChgHおよびLとそれぞれ共通する抗原 性を持つ成分が存在することが示された。従って、Chgは卵母細胞質中に取り込まれた後、卵膜を構築することが示唆された。さらに、成熟に伴う卵膜蛋白 の変化をSDS ‑PAGE並びにウエスタンブ口ッテイングで観察した。その結果、卵母細胞の成長に伴い、比較的高分子量のバンドの割合が増加することが明ら かに なっ た。 これ らの パン ドはa‑HとLの両者に反応したことから、ChgH
およ びL由来の成分から構成されると考えられた。排卵卵の卵膜においては血中の Chgと同じ分子量をもっバンドは殆ど消失し、それらより分子量の大きいノヾンドのみが観察された。以上の様なバンドバターンの変化は他の魚種で報告されている受精時における卵膜の不溶化の際に観察される変化と類似していた。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

原 彰彦
山内晧平
麦谷泰雄
足立伸次

学 位論文題 名
Immunochemical and biochemical studies
on precursors of vitelline envelope proteinsof masu salmon(OTzcorみ ッ 刀 Cカ 勿 S0兜 CZS〇 勿 ）（ サ ク ラ マ ス の 卵 膜 蛋 白 前 駆 物 質 に 関 す る 免 疫 生 化 学 的研 究 ）硬 骨 魚 類 の 卵膜 は 、 受精 か ら孵 化 に 至る 間 多く の 重 要な 役 割を 果 た して お り、 種 の 繁殖 に 深く 関 わ っている 。近年数種 の魚類に おいて、 卵膜蛋白が ェ ス ト ラ ジ オ ー ル ー 17t3 (E2)に よ り 肝 臓 で 合 成 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ て おり 、 ヌ ダ カ に お い て は 2種 類 の 卵 膜 蛋 白 前 駆 物 質 が 同 定 、 精 製 さ れ 、 コ リ オジ ェ ニ ン （ Chg)と 呼 ぶ こ と が 提 唱 さ れ た 。 (Yamagami， 1996)。 し か し 、 魚 類の 卵 膜蛋 白 前 駆物 質 に関 す る 知見は非 常に限られ ており、 特に卵形 成過程に
お け る血 中 量の 変 化は 、 ほと ん ど明 ら かに さ れて い な い。 サ クラ マス（ Oncorhynchus masou)は 北 部 日 本 に 分 布 す る 重 要 な 増 養 殖 対 象 魚 で あ り 、 健
全 な 卵を 得 る ため に 親魚 の 卵 形成過程 を詳細に理 解する必 要がある 。本研究は サクラマ ス雌の卵膜 形成過程を 解明するこ とを目的と して行われ た。
最 初 に 、 孵 化 後 の 卵 膜 を 抗 原 と し て 抗 卵 膜 血 清 （ a― VE)を 作 製 し 、 卵膜 関 連 成 分 の 検 索 を 行 っ た 。 a‑VEを 用 い た 二 重 免 疫 拡 散 法 に よ り 成 熟 雌 の 血
清 お よ び 肝 臓 抽 出 液 中 には 卵 膜 関連 蛋 白 (vitellineenve
lope‑relatedproteln；VERP)が 存 在 す る こ と が 明 ら か に な り 、 サ ク ラ マ ス の 卵 膜 蛋 白 質 は 肝 臓 由 来で あ るこ と が 示唆 さ れた 。 さ らに、ウ エスタンブ 口ッティ ングにお いて、雌‑ 1197ー

血清中には126、48および43kDaのバンドが観察され、3種類のVERPが存在することが示された。
次に、 3つのVERPを それ ぞれ very hig
h、highおよびlow‑molecularweig
ht VERP（vh VERP、 hVERP
お よび NERP)と 名付 け、 各種ク 口マ トグ
ラ フイ ー を 用 い て 精 製 を 行 っ た 。精 製 し た伽VE
RP、hVE
RP、お よびN
ERPの分子 量は ゲル濾過法においてそれぞれ520、88および55kDaと推定された。さらに、hVERPおよびNER
Pのアミノ酸組成はそれぞれメダカおよびイトウのCh
gHおよびLに極めて類似しており、これらに対して作製した特異抗体(a‑H、a‑L)は卵膜を特異的に免疫染色した。一方、vhVERPのアミノ 酸組成 はhVE
RPと類似し、hVERPと抗原性を一部共有することが示された。従って、vh VERPはhVE
RPを構成成分のーっとする蛋白質であると考えられた。以上の結果より、精製したhVERPとNERPは本種の卵膜蛋自前駆物 質で あ る こ とが 免疫化 学的 に明 らと なり、 hVERPを ChgH、NERPを Chg
Lと同定した。
続いて、血清中のChgの測定法をaーHおよびa‑Lを用いて一元放射免疫拡 散法 (SRID)およ び酵素 免疫 測定 法に より確 立し た。 E
2投与 の結 果、Chg
HとLは少なくとも投与8時間後には血中に誘導されたが、10yg/kg
魚体重以下のE2投与ではChgの増加は認められなかった。また、血中量の最大値はE2投与量依存的に増加した。成熟に伴う血清Chg、VgおよびE2量を測定した結果、雌魚の成熟に伴ってChg
およびVg量は増加した。卵黄形成期に血中VgはChgに比較して非常に高い値を示したが、それ以前にはChg量の方が高濃度であった。E2の投与量または血清中の濃度が低い個体（くIng/ml)
では
Vgよ りもChg量が高 く、E2投与量または血清濃度が高い個体ではChgよりVgが高濃度に検出された。以上の結果からChgの合成分泌がE2によって直接的に制御されることおよびC
hgとVgの合成量の割合はE2の濃度によって調整されることが示された。
最後に 、Chg
か ら卵膜が形成される過程を明らかにするために、a‑Hおよびa‑Lを用いて卵母細胞質中のChg関連蛋白質を解析した。卵母細胞質中にはChgHおよびLとそれぞれ共通する抗原性を持つ2種類の成分が存在することが明らかになり、Chgは卵母細胞質中に取り込まれた後、卵膜を構築することが示唆された。さらに、成熟に伴う卵膜蛋白の変化をSDS‑PAGE並びにウエスタンブ□ッティングで観察した結果、卵母細胞の成長に伴いa−HとLの両者に反応する比較的高分子量のパンドの割合が増加した。還元処理後もこれらのパンドが低分子化しないことから卵膜蛋白はS一S結合ではない結合様 式 に よ り 架 橋 さ れ 、 卵 成 長 に 伴 っ て 強 固 に な るこ と が 示 さ れ た 。
以上のように、本研究では、サクラマスの卵膜蛋白が卵巣外由来であることを明らかにし、血清中に存在する卵膜蛋白質の前駆物質2種類を免疫化学的に同定した。また、それらの合成がE2濃度によって調節されていることを示した。さらに、卵膜蛋白前駆物質が卵母細胞に取り込まれた後卵膜を構築する可能性を示し、卵膜蛋白質は卵成長に伴って架橋され高分子化することを明らかにした。これらの結果は、健全な卵を得る上で重要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博士（水産学）の学位請求論文に値する業績であると認定した。