博士（地球環境科学）来生貴也
学位論文題名
StudiesonProteaseInhibitorsofF
reshwaterCyanobacteria（淡水産シアノバクテリアのプロテアーゼ阻害物質に関する研究）

学位論文内容の要旨
淡水産シアノバクテリアは富栄養化した湖沼などで大発生するアオコなどの現象で問題となる。これらは多種多様な2次代謝産物を合成しており、特にプ口テアーゼ阻害物質が多数存在する。このような阻害物質の生態的意義はアオコの大量発生・消失の機構との関連で興味深いうえ、医薬品への応用も期待できる。本研究では、 プロテ アーゼ の一種 である アミノ ベプチダーゼN(APN)およびカテプシンB(CatB)を用い、水生生物を対象とした阻害物質のスクリーニングにおいて顕著な活性を示した2種の淡水産シアノパクテリア由来の濳陸化合物の単離および構造解析を目的とした。

APNは、人の 内皮細 胞や上 皮細胞 などに 広く存 在する 膜結合 メタロプ ロテア ーゼで あり、 神経ベプチドや血 管作動 陸ベプ チド、 化学走 l'ftベプチ ドの分 解に関 与して いる。 また、APNljとして の役割 以外にもレセプターやシグナル伝達分子としても機能していることが知られており、非常に興味深いタンパク質である。
こ のAPNは多 くの癌 細胞に おいて 異常発 現が報 告されており、転移や浸潤への関与が示唆されている。近年
で は血管 新生過 程にお けるAPNの 役割に 注目さ れ、癌細胞の転陟を抑制する目的からその阻害剤の開発が望まれている。
北海道産海藻・海産無脊椎動物および淡水産シアノバクテルアを対象としたスクリーニングにおいて、顕著なAPN阻害活性を示した淡水産シアノパクテリア′vIicr
ocyst
is aeruginosa(NIES‑100)を大量培養し、阻害活陸物質の単離を行った。
ま ず、M aerugzmosaの培養 藻体の メタノ ール抽 出物を ジエチ ルェー テルと水で液液抽出後、水層をさらにブ タ ノ ー ル(BuOH)で 抽出す ること により 脂溶陸 画分．BuOH可溶陸 画分・ 水溶陸 画分を得 た。阻 貧音陸 を手 旨標と して、 BuOH画分を ODSフラ ッシュカ ラムクロマトグラフイーにより分画し、さらに逆沐目HPLCによっ て精製することにより阻害活性物質を単離した。lD‑NrvRおよびマススベクトルの解析から、この化合物を既知の直鎖ペプチドnucroguunであると同定した。さらに、micr0幽1
血と共に新規の活幽′匕合物を単離した。
こ の新規 化合物 を各種 NMRおよびマススベクトルにより解析したところ、micr0西I血の末端p・アミノ酸（Ahda冫 に隣接 するア ミノ酸 残基が心aからSerに置換した類縁体であることがわかった。得らゎた2種のmぬgininの 觝，N阻 害活J陸 を評価したところ、両化合物ともに顕著な阻害活J陸qC500．02嵋/mL）を示した。これまで にAPNに構 造的に 類似し ている kぬcinearniロ 0peptidase（LAP）とmicrog
血血FR1の結晶構造解析春吉果が報告されており、Ah（laおよび隣接するアミノ酸カ乳APの活性部位に近しゝサブサイトに結合するとされている。APNにおい ても同様の結合様式が予想 され、nucroglrunと新規microgininの阻幇刮生における差違が期待されたが、明 瞭な差異は確認できなかった。このことから、nucrog
lrunのAla残基およてrr規microgi
ninのSer残基がAPNのS1 サブサイトに対して弱い結合カしかもたないことが示唆された。
次に 、APN阻 害活 性化 合物 の 精製 過程 でODSクロマトグラフ イーにより得たフラクショ ンをLC/MSにより分析したとこ ろ、複数の新規化合物の存在 が示唆されたため、それらの単離・構造解析を行った。得られた4種の化合物は 、各種NMRスベクトJレおよ乙 j,Msの角翠析から環状ベプチドであるmicrope
ptin類の新規化合物であった。これらはmicropep
tm類に特徴的な3．amin0・2．hydro】サ6．p
ipeddone（Ahp）残基をもち、それに隣接するアミノ酸および倶｜J鎖の脂肪酸の長さが互いに異なる類縁体であった。それらを加水分解後、キラルカ
ラムを用いた HPLC分析により各アミノ酸の 絶対立体配置を全てLと決定 した。また、各種プロテア ーゼ（キモトリプシン 、トリプシン、ト口ンピン）に対する阻害活性を評価した。その結果：トリプシンおよびト口ンピンに対する 阻害活性は示さなかったが、 キモトリプシンに対しては強い阻害活性（IC50ト2嶇・／mL）を示した。Micropep血1類はセリンプロテアー ゼに対して阻害冶陸を示すこ とが知られており、Ahp残基 のN末端側に隣接する アミノ酸により阻害活性を示す酵素が異なるとされている。本研究においても、これまでに知られている構造活出旧関に基づく阻害活性を示した。

また、micropept血類のほかにも、新規 の三環性ベプチドであるmicr0妬nd血類で、分子量1700を超えるべプチドを単離したが、構造決定には至っていない。
CatBはりソソ ーム中に存在するエンドベプ チダーゼおよびェキソベプ チダーゼの活性をもつ興嚥栗い酵素である。この酵素は、悪性黒色腫をはじめ、大腸癌i丶胃癌、前立腺癌、乳癌における過剰発現カ瀞められ、癌細胞の浸潤や転 侈に関与していると考えられ ている。このことから、CatBは癌治療において重要なターゲットとされている 。また、CatB選択的阻害剤が アルツハイマー病の原因とされるp・アミ口イドの生成を抑制するとしゝった報告もあり、癌治療以外においても阻害剤の開発が望まれている。
上記のスク リーニングにおいて、非常に 強い阻害活性を示した淡水 産シアノパクテルアA珊ぬ凹 a學m琉おsZ露泣面ぬ9Q江ES．263）より阻害物質の探索を行った。
まず、4．甲 齔

ぬsr叩庇鹹第の培養藻 体メタノール抽出物を酢酸エ チルと水で液液抽出後、水 層をさらにBuOHで抽出 することにより脂溶性画分． BuOH可溶性画分．．水溶性 画分を得た。また、培養上清を合成吸着 剤XAD14によ り処 理し、培養上 清抽出物を得た。藻体由来の 水溶陸画分および培養上清 抽出物7掩轍阻害活性を示した ため、それらをODSク口マト グラフイーにより分画後、各種カラムを用いたHPI￡で阻暫暑I生物質 を精 製し た。 藻 体および培養上 清より精製したCatB阻害活 性物質は、その1H．NRスベク トルより同一のものであるこ とが示唆されたが、微量であったため構造解析には至らなかった。これまでに阻害物質として海綿由来のべプ チド類などが報告されている艤本研究で得られた化合物はべプチドに特徴的なアミノ′酸の叫ヌチンプ口トン 由来のピークが確認できなか った。また、同様にCatB阻 害物質として報告のあるフラポノイドのようなべン ゼン環プロトン由来のピークも確認されていない。したがって、高活性かつ、これまでに報告のない構造をもつ化合物ではないかと期待される。現在、ラン藻を再度大量培養し活 陸イ．匕合物の単離を目指している。
これまでに シアノバクテリアから多くの生理活性ベプチドが報告されているが、本研究においても新規化合物5種を含むプ 口テアーゼ阻害ペプチドを 得た。また、それらの阻害様式は結晶構造解析を基に検討されたこれまでの報告 に矛盾しないことが示唆され た。一方、CatB阻害活性を 示した化合物は、新規構造かつ高活性が期待される。

学位論文審査の要旨
主 査 准 教 授 沖 野 龍 文
副 査 教
授 松 田 冬 彦
副 査 教
授 坂 入 信 夫
副 査 教
授 中 村 貴 義

学 位 論文 題 名Studies on Protease Inhibitors ofFreshv¥rater Cyanobacteria（ 淡 水 産 シ ア ノ バ ク テ 1Jア の プ ロ テ ア ー ゼ 阻 害 物 質 に 関 す る 研 究 ）淡水 産シア ノパクテ リアが 富栄養化 した湖沼 におけ る大発生は世界中で問題となっている。
特 に 、ミ ク 口 シスチ ンなど の有毒物 質によ る死亡事 故が発 生してい るほか、 このよ うな湖沼の水 を適切 に処理す ることな く飲料 水に利用 してし ゝる地域では発ガンの原因となっていること カ 織れ て し ゝる。 また、 有毒物質 に加え て、多数 のぺプ チド性プ 口テアー ゼ阻害 物質が報告 さ れて お り 、これ らの物 質がシア ノパク テリアを 分解す るバクテ リアに対 する防 御物質として 働くな どの生態 的意義も 注目さ れてしゝ る。
本論 文 で は、 淡水 産シアノ バクテリ アから プ口テア ーゼ阻 害物質を 探索す ることを 目的とし た 。こ れ ま で、非 常に多 くの化合 物カ潮 告されて いるセ リンプ口 テアーゼ ではな く、メタロ プ 口テ ア ー ゼで あ る アミ ノ ベ プ チダ ー ゼ Nと シ ス テイ ン プ 口テ ア ーゼ のカテ プシンBをス
ク リ ーニ ン グ 対象 と し た。 ア ミ ノ ベプ チ ダー ゼN
は 、ガン 細胞の転 侈におけ る血管 新生過程に 重 要な 役 割 を果た してい るので、 その阻 害剤は転 移抑制 剤の開発 にっなが る。ま た、カテプ シ ンBも ガ ン細 胞 の 浸潤 や 転 移 に関 与 す るとされ ており 、ガン治 療の重要 なター ゲットである 。
スク リ ー ニン グ の 結果 、 顕 著 なア ミ ノ ペプチ ダーゼN阻害 活性を示 した淡 水産シア ノパク
テリ アI
Vlicrocystisaeruginosa(NIES‑100)の培養藻体より、溶媒分画と各種ク口マトグラフ
イ ー を用 し ゝ て極め て強し ゝ2
種 の阻害 活性物質 を単離し た。NM
RとMSの解 析によ り、既知 のmcroguunと micro餌 n
泣の心aが Serに 置 換 され た 新 規類 縁 体 であ る こ とが判 明した。 新規化
合物 の立体化学につしゝては、酸加水分解物をキラルカラムにより分析して通常のアミッ′酸を決 定 し、 長 鎖 p
ア ミ ノ 酸に つ し ゝ ては NMRの 化 学 シフ ト と 多数 の 既 知物 を注意 深く比較 して決 定 した 。 両 者のア ミノベ プチダー ゼN阻害活性 はI
C50が20nガ11
亅と きわめ て強かっ た。この 活 性は よ く 知ら れ る アミ ノ ペ プ チダ ー ゼN阻害物 質のべ スタチン に比べて 約30倍強 しゝ値
で あ る。 ジ ベ プチド である ベスタチ ンと酵 素の結合 様式を 比較して 議論した 。長鎖 ロアミノ―l084一酸の重要性はべスタチン の構造活I
生相関研究でも示唆されていたとおりであり、他の部位については差が認められた 。
次に 、同 株の 抽出 物に つい て、 酵素 阻害 活性 を 指標 とするのではなく、LC/MSの結果を指標 にす るこ とで 迅速 にぺ プチ ド類を分析する方法を採用した。その 結果、多数の新規化合物の 存在 が示 唆さ れた 。そ のう ち4種 の化 合物 の単 離に 成功し、機器 分析を中心に構造決定した とこ ろ、 nucro
peptin類 の新 規化 合物 であ った 。さ らに、加水分 解後キラルカラムを用いて 通 常 の ア ミ ノ 酸 残 基 の 立 体 を 決 定 し た 。 ま た 、 micropeptin類 に 特 徴 的 な 3‑amino‑2‑hydroxy‑6‑piperidoneの 立体 化学は、還元後加水分解して得られる べンタホモセリンを、合成 して 得ら れた 標品 とキ ラル カラムにより比較して決定した。Micropeptins C‑Fと命名した
新 規化 合物 の各 種セ リン プ口 テアーゼ阻害活性を評価したところ、 予想通ルキモトリプシンに対して強い阻害活性を 示した。
そ の 他 、 分 子 量 1700を 越え る三 環J生 のべ プチ ドな ど複 数の 新規 化 合物 の単 離に 成功 した 。 さ ら に 、 淡 水 産 シア ノバ クテ リア Anabaena sp
ぬ 丘ね ■叩 ぬ織 Q江ES．263）の 堵養 藻体 および培養ろ液よりカテプシンB阻害活Jl生物質の単離に成功した 。その構造は、既知のカテ プシ ンB阻害 物質 に みら れる べプ チド やフ ラボ ノイ ドではなく、 高活性かつシアノバクテリアとしても類をみない 構造であることが示唆された。
以上 のよ うに 、本 論文 にお いて淡水産シアノバクテリアのプ口テ アーゼ阻害活性物質の多様亅陸を明らかとし、精 密な立体化学を含む構造決定を最新の手法と合成を組み合わせて達成
す るこ とが でき た。 一部 、構 造未解明の化合物もあるが、逆にシア ノバクテリアの天然物探索 源と して の期 待が 示さ れた といえる。得られた構造や活性の情報 を基に、プ口テアーゼ阻害活性の実用化に向けた 開発を進めることができると期待される。
審査 委員 一同 は， これ らの 成果を高く評価し，また研究者として 誠実かつ熱心であり，大学 院博 士課 程に おけ る研 鑽や 修得単位などもあわせ，申請者が博士 （地球環境科学）の学位を受けるのに充分な資格 を有するものと判定した。