博 士（ 理 学） 川 村

猛

学位論文題名セ1
Jン／スレオニン残基特異的プロテインホスファターゼ
PP2Bの 生理的 意義の 解析ならびにホスファターゼ阻害剤
ト ウ トマ イ シ ン の溝造／ 機能相関 に関す る研究
学 位 論 文 内容 の 要 旨

夕ンバク質のりン酸化／脱リン酸化は、そのタンバク分子の重要な機能調節機構であり、これにより生体機能は可逆的に調節され る。夕ンバク質のりン酸化と脱リン酸化は、それぞれブ口テインキナーゼとプ口テインホ スファターゼにより触媒される。プ口テインホス
ファターゼはその基質特異性によルセリ ン／スレオニン残基特異的ホスファターゼ、チ口シン残基特異的ホスファターゼ、スレオ ニン／チ口シン残基特異的ホスファターゼに分類される。このうちセリン／スレオニン残 基特異的プロテインホスファターゼ（以下セリン／ス レオ ニン ホス ファ タ ーゼ PPと する ）は 、内 在性 のインヒピターI‑lおよびI‑2により阻 害 さ れ る PP1と 阻 害 さ れ な い PP2に 分 け ら れ 、 PP2は さ ら に ポ リ カ チ オ ン 要 求 性 のPP2A、 カ ル シ ウ ム ／カ ルモ ジュ リン 要求 性 のPP2
Bお よび マグ ネシ ウム 要求 性の PP
2Cに分類される。
本 論文 にお いて 、1章 では 生体 内で のPP2Bの 役割 を 明ら かに する 目的 で、 脳および免疫担 当臓 器に おけ るPP2B活性 、免 疫担 当細 胞の 活性 化における本酵素活性の動態、肝癌細胞 にお ける PP
2Bの癌 性 変異 を解 析し た。 2
章 では 、 セリ ン／ スレ オニ ンホ スファター
ゼ阻害剤トウトマイシンの最小機能単位 を明らかにする目的で、トウトマイシンの構造／機能相関を調ぺた。本論文の要点は以下 にまとめられる。
1章 ： PP2Bは 、 脳 で の 発 現 が 高 く 、 ま た 免 疫 系 に お い て は T細 胞 の 活 性 化 や 細胞 死に関与するこ とが知られている。しかし、細胞の応答や病態における 本酵素の解析は、ほとん どな され てい ない 。 本章 では 、生 体内 での P
P2Bの意義を解析するため、正常および自己 免 疫 疾 患 モ デ ル マ ウス lprマウ スに お ける P
P2Bの挙 動、 T
細 胞の 細 胞内 情報 伝達 系での PP
2Bの動 き、 老化 促 進マ ウス にお ける P
P1，PP2A，PP2
B活 性、 およ び移 植性腹水肝癌細胞株と正 常肝細胞におけるPP2B活性を解析した。
1).マ ウ ス PP2Bで は 、 脳 の mRNA． 夕 ン バ ク 発 現 量が 脾臓 のそ れに 比 して 著し く高 いにもかかオ） らず、活性は逆に脾臓より低かった。またlprマウスにおいて正常マウスに比ぺ脾臓での活 性が2倍程度上昇していた。
2).T細 胞の 活性 化過 程 では 、PP2
B総 活性 に変 化は 見ら れな かっ た。 した がっ て、T細胞
活 性 化 に お け る PP2Bの活 性化 は、 P
P2Bの量 的変 化に よる もの では な く、 カル シウ ムによるPP
2Bの 活性化などの質的上昇によるものと考えられる。
3).老化 促進 マウ スで 脳の ホス ファ ター ゼ活 性を 測定した。PP
1，PP2A
は小脳・前脳で同程度の活性 が認められ、加齢による活性変化は見られなかった。し かしPP2
Bは、前脳で、小 脳の 約2倍 の活 性を 示し 、さ らに 老化 促進 P‑
10系 マウ スの 前脳 で、 加齢 に伴うPP2B活性の減少傾 向が観察された。
―192―

4).
移 槽陸 腹水 肝癌 細胞 で PP1の転 写が 亢進 する とき PP2
B活 性は 逆に 減少 してい るものが 多か った 。
以上 の実 験結 果に より 、PP2
Bが種々の病態や生理的条件下に、各々異なった分 子機構に より 、量 的・ 質的 に調 節さ れて いる こと がわ かっ た 。
2章 ： セ リ ン ／ スレ オニ ン残 基特 異的 プ口 テイ ンホ スフ ァ ター ゼ阻 害剤 オカ ダ酸 は、 T細胞にアポトーシスを 誘導する。本章ではまず、オカダ酸と類似した構造と分 子量をもつ
ト ウト マイ シン を用 いてT細胞へ与える影響を 調べた。その結果、トウトマイシンもまた
白 血 病 T細 胞 株 に 対 し ア ポ 卜 ー シ ス を 誘 導 す る こ と が 明 ら か に さ れ た 。
トウ トマ イシ ンは PP
1と P
P2Aを同 程度 の濃 度で 阻害 する が、 オカ ダ酸 はトウトマイシ
ン と類 似し た構 造と 分子 量を もち なが らPP2AをPP1に 比し てよ り強 く阻 害する。このことは部分構造の差異が 活性阻害の特異性を決定していることを強く示唆する。したがって、
ト ウト マイ シン の部 分構 造を 用い るこ とに よ りPP1， PP
2A活性 阻害 をも たらす最小機能
単 位の 決定 、さ らに P
P1，PP2A
それぞれの特異 的阻害構造を用いることによルアポトーシス誘導との関係を解析 することができる。そこでトウトマイシンおよびその部 分合成物や誘導体を用いて、ホス ファターゼ活性阻害とアポトーシス誘導につしゝて構造／機能相関を調ぺた。トウトマイシ ンは無水マレイン酸部分をもつ左セグヌン卜と、スピ口 ケタール構
造 を含 む炭 素数 26の 右セ グヌ ント から なる が 、ホスファターゼ活性阻害には既に報告がある無水マレイン酸部 分やC22の水酸基の重要性の 他に、C22‑C96炭素骨格が必 要であると結諭された。また活性 阻害を示す化合物は、左セグヌントを含む活性阻害を示 した最小構
造 の化 合物 以外 は、 PP2Aより PP1を 強く 阻害 した こと から 右セ グヌ ント が阻害の特異性を決定していると考え られる。一方、アポトーシス誘導にはトウトマイシンの 右セグメン
トのスビ口ケタール構 造を含むCi‑C18の骨格が最小単位と考えられ、ホスファ ターゼ阻害に 重要 な部 分で ある 無水 マレ イン 酸部 分を 改 変した化合物や左セグメントをもたない化合物でもアポトーシス 誘導能を示した。さらにアポトーシス誘導の最小骨格と 考えられるC1‑C18部分の化合物は 、ホスファターゼ活性を阻害しなかった。これらのこと より、ホスフ ァタ ーゼ 阻害 作用 を示 す構 造と アポ トー シ ス誘導を引き起こす構造には平行関係は見られず、トウトマイシ ンによるアポトーシス誘導とホスファターゼ阻害は異な る機序によるものと結論された。 また、アポトーシス誘導能を示す最小骨格のCi‑C18にあ るスピ口ケタール構造は、他のア ポトーシス誘導能を示すホスファターゼ阻害剤であるオ カダ酸やチルシフェリル‑23‑
アセ テートにも共有されており、これらの化合物においても アポトーシ
ス 誘 導と ホ ス フ ァ タ ー ゼ 阻 害 は 異 な る 機 序 に よ る も の で あ る と考 え ら れ る 。
本論 文で は、 セリ ン／ スレ オニ ン残 基特 異的 プ口テインホスファターゼPP2Bの生理機能 の解 析な らび にPP1，PP2A阻害剤トウトマイシンの構造／機能相関の解析を 行った。今後 、さ らに 脳と 免疫 系の PP2Bの差 異を 解析 する ためPP
2Bの精製などを行う必 要がある。
また、トウトマイシンに おいては、トウトマイシンのスピ口ケタール構造をもつ 部位を用いたアポトーシスのシグ ナル伝達分子の探索、他のスピ口ケタール構造をもっホ スファターゼ阻害剤でのアポトー シス誘導とホスファターゼ阻害の関係を解析することに より、その作用機構がさらに解明 されることが期待される。

ー 193 ‑−

学 位 論 文 審 査 の要 旨
主査
副査
副査

教 授 菊 池九二 三教 授 谷口和彌教 授 矢澤道生

学位論文題名セリン／スレオニン残基特異的プロテインホスファターゼPP2Bの 生理的 意義の 解析ならびにホスファターゼ阻害剤
ト ウ ト マイ シ ン の構造／ 機能相 関に関す る研究
夕ンバク 質のりン酸化／脱リン酸化ば、生体における重要な機能調節機構である。夕ンハク質 の脱リン酸化は、ブ口テインホスファターゼにより触媒される。本論文において、 1章で は生体 内でのホ スファ夕 一ゼPP
2Bの 役割を 明らかに する目的 で、脳 および免疫担当 臓器に おけるPP
2B
活 性、免 疫担当細 胞の活 性化にお ける本酵素活性の動態、肝癌 細 胞にお けるPP
2Bの 癌性変異 を解析 した。2章で は、ホス ファター ゼ阻害 剤トウ
トマイシ ンの最小機能単位を明らかにする目的で、トウトマイシンの構造／機能相関を調べた。 本論文 の要旨は 以下に まとめら れる‥
1章 ： 生 体内 に お ける PP2Bの 意 義 を明 ら か にす る た め、 正 常お よび自 己免疫疾 患
モ デ ルマ ウ ス ll)rマウ ス に お ける PP2
Bの 挙 動、 T細 胞の 細 胞 内情報 伝達系 でのPP
2Bの 動 き、 老化促 進マウ スにおけ るPP
1，PP2
A，PP
2B
活 性、およ び移植 性腹水肝 癌細胞
林と 正常肝 細胞にお けるPP
2B
活 性を解析 した。
1).
マ ウ ス脳で はPP
2BのmRNA． 夕ンバ ク発現量 が脾臓 のそれに 比して 著しく高 しゝにもか かオjらず、活性は逆に脾臓より低い値を示した。またlpr
マウスにおいて正常マウスに 比ぺ脾 臓での活 性が2倍程度 上昇して いた。
2）．T細胞の 活性化過 程で、 PP2B総活性に変化は見られなかった。したがって、T細胞
活 性 化に お け るPP2Bの 活 性 化 は、 PP
2Bの量 的変化 によるも のではな く、カ ルシウムに よ る PP2Bの 活 性 化 な ど の 質 的 上 昇 に よ る も の と 考 え ら れ る 。
3).老化促 進マウス で脳のホ スファ ターゼ活 性を測 定した。 PP1，PP
2
Aは小脳・前脳で同 程 度の 活性が 認めら れ、PP2A
は 加齢によ る活性変 化は見 られなか ったが 、PP1の前脳で 加齢に ともない 約30％の 活性上昇 が認めら れた。 またPP
2B
は 、前脳で、小脳の約2倍 の活 性を 示し、 老化促進 マウス 、コント 口ールマ ウスと もに、加 齢によ り前脳のPP
2B
活性 が減少 する個体 が多く 見られた ‥4).
移 植 性 腹水 肝 癌 細胞 で PP1の 転 写が亢 進すると き、PP2B
活 性は逆 に減少し ている
もの が多か ったー
2章 ：本 章 で はま ず 、 トウ ト マ イ シンが 白血病T細胞 株に対し アポトー シスを 誘導するこ とを明 らかにした。次いで、トウトマイシンおよびその部分合成物や誘導体を用いて、 ホスフ ァターゼ活性阻害とアポトーシス誘導について構造／機能相関を調ぺた。ト― 194 ‑ウトマイシンは無水マレイ ン酸部分をもつ炭素数7の左 セグヌントと、スピ口ケタール構 造を 合む 炭素 数26の右 セグヌン卜からなる。ホスファターゼ活性 阻害には無水マレイン酸部分やC,22の水酸基 の重要性が既に報告されているが、阻害活性を示さない左セグヌントにC22‑C2r）部分を合む骨格を付加した化合物が阻害活性を示すこと、Ci‑C26
フラグヌントが阻害活性をも つことから、活性阻害にはC22‑C26の炭素骨格が重要であると結論された‥また左セグ ヌントとC,22‑C26の炭素骨格を含む活性阻害を示した最小構
造 の 化 合 物 は PP1と PP2Aを同 じ濃 度で 阻害 した が、 他の 活性 阻害 を示 す化 合 物は す
べ て PP1を PP2Aよ り わ ず かで ある が低 濃度 で阻 害し た。 この こと から 右セ グ メン トが阻害の特異性に影響を与 えていると考えられる。一方、アポトーシス誘導には卜ウト
マ イシ ンの 右セ グヌ ント のスビ口ケタール構造を含むCi‑C18の骨格 が最小単位と考えられ、ホスファターゼ阻害 に重要な部分である無水マレイン酸部分を改変した化合物や左セグヌントをもたない化 合物でもアポトーシス誘導能を示した。さらにアポトーシス誘 導の 最小 骨格 と考 えら れるCl‑C18部分の化合物は、ホスファター ゼ活性を阻害しなかった‥これらのことより 、ホスファターゼ阻害作用を示す構造とアポトーシス誘導を引き起こす構造には平行関 係は見られず、トウトマイシンによるアポトーシス誘導とホスファターゼ阻害は異なる 機序によるものと結論された。また、アポトーシス誘導能を示 す最 小骨 格の Ci‑Ci
8に あるスビ口ケタール構造は、他のアポトー シス誘導能を示す
ホ スフ ァタ ーゼ 阻害 剤で あるオカダ酸やチルシフウリル‑23‑アセテ ートにも共有されており、これらの化合物に おいてもアポ卜ーシス誘導とホスファターゼ阻害は異なる機序によるものであると考え られるー
これ を要 する に、 著者はセリン／スレオニンブ口テインホスフ ァターゼP
P2Bの調節機 構な らび にホ スフ ァターゼ阻害剤卜ウトマイシンの構造／機能 相関について新知見を得たもので、ブ口テイン ホスファターゼ研究に貢献するところ大なるものがある。よっ て、 著者 は、 北海 道人学博士（理学）の学位を授与される資格 あるものと認める。

― 195−