博 士 （ 水 産 科 学 ） 太 田 万 里

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Cellular Damage and Its Restoration
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in Eugle7za gracilis as h/Iodel Organism（ ユ ー グ レ ナ ・ グ ラ シリ ス をモ デル 生 物に 用 いた
トリ ブ チ ルス ズ 惹 起細 胞 障害 発 現 と生 理 的機 能 化 水溶 液 による機能 回 復 に関 す る細 胞 生 物学 的 研 究）

学位論文内容の要旨

地 球 環境 の 悪 化は 食 物連鎖 により広く 生物に被 害をもた らす．ま た，環境 汚染化
学 物質 艫 生体 の 恒 常性 や生 理機能に作 用し，健 康障害， 疾病を顕 在化させ る恐れがあ る． 環 境汚 染 問 題が 深刻 化するなか ，近年， 低濃度で も生体障 害を惹起 する化学物質，なかでも有機スズ化合物，tributyltinchloride(TBTCl)による影響が高濃度域のみ なら ず 極低 濃 度 域に おい ても指摘さ れ，その 実態解明 を合め早 急な対応 が望まれて いる ． TBTC1は かつ て 生 物付 着 防止 の 目 的で 船 底塗 料や漁 網に使用 され，現 在も内湾に 蓄積され た本化合物 による汚 染や水圏 生物に対 する被害 が指摘さ れ，ppbレベルの曝 露で巻貝 の生殖機能 障害が堀 ロら(1998)によって報告されている．比較的高、等 な生 物 への 影 響 につ いて 詳細な検討 が始めら れている 一方，水 圏の一次 生産者に対 する 細 胞機 能 障 害に 関す る研究は殆 ど行われ ていない ．高等動 物のみな らず，食物 連鎖 の 低位 に 位 置す る生 物に対して もその毒 性発現メ カニズム を明らか にし。双方 から 問 題の 解 決 に取 り紺 む事が有効 である． 環境汚染 物質によ る障害を 解析すると き， 高 等動 物 で は様 々な 過程を経る ため症状 が複雑化 し解析が 困難にな るため，
基 本的 に 類似 し た 細胞 機能 を持つ真核 単細胞生 物を用い る方がよ り単純か つ高感度81一

に評価できる．
本 研究 は， 水圏 環境 汚染 物質有 機ス ズ化 合物 の水 圏微 小生物に対する障害発現と生理 的機 能化 水溶 液に よる 機能回 復の 細胞 生物 学レ ベル での解明を目的とした．モデル 生物 とし てス トレ スに 対して 特徴 的な 細胞 応答 を示 すユーグレナ・グラシリス（Euglenagracilis)を選んだ．単細胞真核生物ユーグレナは生物の進化で系統樹の根幹に位 置し ，白 身が 藻類 と鞭 毛虫， 植物 と動 物の 双方 に分 類されている．ユーグレナ
は原 核生 物に 較ベ 代謝 や異 化作用 ，細 胞機 能に 高等 生物 との多くの共通項を有し，外部ストレスに対しても鋭敏に反応する．
先 ず ， 顕 微 鏡画 像 解 析 シ ス テ ム を 用 い て TBTCI曝 露 濃 度 ， 接 触 時間 と遊 泳能 ，細胞形態との関係を調べた，ユ゛ーグレナは通常の環境下では紡錘型をしており，細胞 を回 転さ せな がら 直進 ある いは 蛇行 ，後 退運 動を する． TBTC1曝 露ス トレ スに より瞬 時に 鞭毛 を切 離し ，涙 滴型を へて 球形 とな り運 動能 を喪失し休止状態へ移行する ．そ の形 態変 化は 一定 レベ ルま でTBTC1曝 露濃 度に 依存 して 惹起 し， ユー グレ ナの 細胞 障害 発現 評価 モデ ルと して の有 効性 が示 唆さ れた． 続い て， TBTC1ス トレ ス
負 荷 に よ る 細 胞内 カ ル シ ウ ム 濃 度 変化 につ いて Neomycin等シ グナ ル伝 達系 作用 物質を用いて比較検討し，TBT
C1曝露ユーグレナ細胞形態変化におけるinosit
ol一1，4，争msphosphateが 介在 する シグ ナル伝達系の関与，TBTCl曝露によるCa2十一ATPase活性阻害を明らかにした．
TBTClの ユー グレ ナ細 胞内へ の取 り込 みと 細胞 内小 器官 にお ける 分布 を調 べた 結果 ，TBTClはユ ーグ レナ 細胞に 対し pMレ ベル で障 害を 発現 し， その 発現 ヌカ ニズ ムが高 等動 物の それ と多 くの 共通点 を有 する こと を明 らか にし，単に水圏微小真核生物の みな らず 他の 水圏 生物 に対し ても 同様 の影 響を もた らす可能性が示唆された．
さらに，哺乳動物や植物においても何らかの機能障害が予想され，その障害の予防，治療対策が急がれる．
そ こで ，生 命機 能の 発現 ，維持 に重 要な 役割 を果 たす 水に種々のミネラル添加や

セラミック浸漬処理による解毒，疾病治癒効果など機能性が宣伝されている生理的機能化水溶液（機能水）に着目した．各種機能水とそれを調製する素材中でTBTC1を曝露することにより遊泳機能障害を発現したユーグレナに対する遊泳能回復効果の有無と効果発現ヌカニズムの細胞レベルでの解明を試みた．ユーグレナ細胞とTBTC1を用いて設定した評価系により，各種機能水のTBTC1障害惹起ユーグレナの遊泳能回復効果について比較評価し，脱塩深層海水とセラミック浸漬処理水に高い回復効果を認め，その効果はキレート剤処理により著しく低下することがわかった・
また，回復効果を示した機能水に含まれる元素成分のICP分析により，共通元素としてカルシウム，マグネシウム，ケイ素及び鉄を検出したが，各種ミネラルの添加による十分な回復効果は認められなかった．セラミック樹脂の組成についてX線回折法により結晶構造の解析を行った結果，主成分はSi02やAl203からなるアルミノケイ酸塩であった．
アルミノケイ酸塩の効果解明を目的に触媒能や吸着能，イオン交換能等の機能を持つ結晶性アルミノケイ酸塩であるゼオライトを用い，TBrI℃1細胞障害発現ユーグ
レナの遊泳能同復に対するゼオライ卜処理水の機能性評価とそのヌカこズムについて検討した．結晶格子中に鉄，マンガン，亜鉛を包含させたゼオライト処理水で高い回復効果を認め，微量の遷移金属の関与を見いだしたが，この効果はキレート剤処理により失われ，ゼオライト処理水を構成するミネラル組成に相当する再構成系においてもそれと同等の効果を認めなかったことからゼオライト処理水による細胞遊泳能回復には，単に微量元素のみならずゼオライトの立体構造が関与していることを推察した・
ユーグレナの異物代謝機能に対するゼオライト処理水の作用を明らかにするため，ゼオライト処理水中に保持した細胞内小器官におけ呑スズ量分布の経時的変化と TBT代謝 物につ いて 原子 吸光 ，GLC，GC―MS分析により検討し，さらに異物代謝酵素チトク口ムP―450 (P450)の′I'BTCl代謝への関与について調べた．取り込まれ た TBTC1は ゼ オ ラ イ ト 処 理 水 中 で の 培 養 に よ り 速 や か に 脱 プ チ ル 化 さ れ
dibutyltin (DB:L、）となり細胞外へ排出されることが判った．ユーグレナのミクロゾー ム 画 分 を 用 い た 加 vitroでの 異 物 代 謝酵 素反 応系 でも ゼオ ライ ト処 理水 はTBTC1の DBTへ の 変 換 を 促 進 さ せ てい る こ と が 明 ら か と な っ た が ， ゼ オ ライ ト自 体に は異 物 代 謝 機能 は認 められ なか った ．さ らに ，P450誘 導の 有無 をWestern一blotting
法 に よ り 分 析 し た 結 果 ， ゼ オ ラ イ ト 処理 水は P450が 関与 する 異物 代謝 酵素 活性 に
間 接的 に関 与し てい る可 能性 が示 唆さ れた ．微 量元 素は異 物代謝機能やシグナル伝
達 系 ， エ ネ ル ギ ー 代 謝 な ど の 生 理 的 機能 に不 可火な 元素 であ り， 鉄は P450が関 与
す る 生 体 内 変 換 (PhaseI反 応） の 触 媒 活 性 を 担 っ て い る 重 要 な 元 素で ある ．P450
酵 素類 似の 触媒 作用 をも つと 報告 され てい る鉄 包含 ゼオラ イトはユーグレナにおけるr113tI℃1の解毒機構に関与していると推察された．
本 研 究 を 通 じ て T13TClが 微 小 生 物 に対 して 機能障 害を 発現 する こと ，ま たそ の障 害が いく っか の機 能水 によ って 回復 可能 であ るこ とを細 胞生物学的手法により明ら かにした．その機能同復は細胞とCa，Mg，Fe，Siなどの元素と水分子の：．次元的配 向関 係に よる と考 えら れる ．本 研究 結果 から ，ユ ーグレ ナは細胞障害発現評価モデ ルと して 有用 な生 物で あり ，ま た化 学物 質に より 障害を 受けた生体に対し回復効果 を持 つ物 質の スク リー ニン グヘ の応 用が 可能 であ ること を示すものであり，今後より広範な利用が期待される．

学位論文審 査の要旨
主査
副査
副査
副査
副査
副査

教 授

鈴木 鐡 也教 授

麦谷 泰 雄

教 授

原彰彦

教 授

宮下 和 夫

教 授

久

万 健 志

助教授

工 藤

勲

学 'ftL論文題名
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Cellular Damage and Its Restoration
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nin Eugle7za gracilis as rvIodel Organism（ ユ ーグ レ ナ ・ グ ラ シ リス を モ デ ル 生 物 に用い たトリブチルスズ惹起細胞障害発現と生理的機能化水溶液による機能回復に関する細胞生物学的研究）

地球環境汚染は食物連鎖により生物の恒常性や生理機能を乱し，健康障害，疾病を顕在化させる．近年，低濃度でも障害を惹起する化学物質，有機スズ化合物，tributyltinchloride(TBTCI)の影響が高濃度域のみならず極低濃度域でも指摘され，その実態解明と早急な対応が望まれている．TBI℃1は生物付着防止を目的に船底塗料や漁網に使用され，現在も内湾に蓄積された本化合物による汚染や水圏生物に対する被害が，ppbレベルで巻貝で報告されている（堀口ら1998）．多細胞生物への影響の検討に対し，水圏の一次生産生物に対する研究は殆ど行われていな
い．高等動物のみならず，食物連鎖の低位に位置する生物に対しても毒性発現メカ
ニ ズ ム を 明 ら か に し ， 双 方 か ら の 問 題 解 決 へ の 取 り組 み が 必 要 で あ る ．
環境汚染物質の障害解析に高等動物をモデルとする場合、複雑な要因が関与し解析が困難だが，基本的に同一の細胞機能を有す真核単細胞生物を用いることによ‑ 85

り迅速・ 簡単に評 価できる．
本 研 究は ， 水圏 環 境 汚染 物 質、 有 機 スズ 化合物の 水圏微小生 物に対す る障害発現と生理 的機能化 水溶液によ る機能回 復の細胞 生物学レ ベルでの 解明とその解毒を目的 と して い る．モデ ル生物と してユー グレナ・ グラシリス (Euglenagrac伍めを選んだの は、本生 物のストレ スに対す る鋭敏な 形態変形 能にある ．単細胞真核生物
ユーグレ ナは牛物 の進化で系 統樹の根 幹に位置 し，分類 学上でも 藻類と鞭毛虫，つまり植物 と動物の 双方に属し ている． ユーグレ ナは、他 の原核生 物に較ベ代謝や異化作用， 細胞機能 に高等生物 との多く の共通性 を示す。 また，外 部ストレスに対しても鋭敏 に反応す る．
先 ず ，顕 微 鏡画 像 解 析シ ス テム に よ り1、BTC1曝 露 濃度 ， 接 触時 間 と遊泳 能，細胞形態 との関係 を調べてい る．通常 の環境下 では紡錘 型細胞を 回転させ直進、蛇行，後退 運動する 細胞が、曝 露により 数分以内 に鞭毛切 離，涙滴 型をへて運動能を喪失した 球形とな り休止状態 へ移行す る．形態 変化は一 定レベル まで曝露濃度に依存し，細 胞障害発 現評価指標 としての 有効性を 明らかに してい． 次ぎに細胞生物学的手 法 によ る ストレス 作用点の 解析を行 い，印31℃ 1ストレス負 荷による 細胞内カル シ ウ ム 濃 度 変 化 に つ い て Neomycin等 シ グ ナル 伝 達 系作 用 物質 を 用 いて 比 較検討し，曝 露ユーグ レナ細胞形 態変化に おけるinosito
l―1，4，5−tnsphosphateを媒体と す るシ グ ナル伝達 系の関与 、曝露に よるCa2十一 A冊ase活性阻害 を明らか にしている．
田 3TClの細 胞 内 への 取 り 込み と 細胞 内 小器官 における 分布を調ベ ，W3TC1カ沁Mレベルで 障害を発 現し，その メカニズ ムが高等 動物のそ れと多く の共通点を有することを明 らかにし ，水圏微小 真核生物 のみなら ず他の水 圏生物に 対しても同様の影響をもた らす可能 性を示唆し ている．
ユ ー グレ ナ細 胞への印 弧℃1障害 発現機構 を明らか にした太田 は、次ぎ に解毒方法に目を 向け、種 々のミネラ ル添加や セラミッ ク浸漬処 理による 解毒，疾病治癒効果など機 能性が宣 伝されてい る生理的 機能化水 溶液（機 能水）に 着目した．各種機
能水とそ れを調製 する素材中 でT】弧℃ 1を曝露す ることに より遊泳機能障害を発現した ユ ーグ レ ナ に対 す る 遊泳 能 回復 効 果 の有無を ユーグレナ 細胞とTぢ ℃1を用い86

て設定した評価系により，各種機能水の1、BTCl障害惹起ユーグレナの遊泳能回復効果について比較評価し，脱塩深層海水とセラミック浸漬処理水に高い回復効果を認めた。その効果はキレート剤処理により著しく低下すること，回復効果を示す機
能水に含まれる，共通元素としてカルシウム，マグネシウム，ケイ素及び鉄を検出レた．セラミックの結晶構造の解析から，キ．成分はSi02や魁203からなるアルミノケイ酸塩と同定した．
結晶性アルミノケイ酸塩であるゼオライトを用い、細胞障害発現ユーグレナの遊泳能回復へのゼオライト処理水の機能性評価とそのメカニズムについて検討し、結品格子中に鉄，マンガン，亜鉛を包含するゼオライト処理水に高い回復効果を認めている，ゼオライト処理水中で培養し罰ヨ1℃1曝露細胞のスズ量細胞内小器官分布の経時的変化と1丶BT代謝物め分析，異物代謝酵素P450のT13TCl代謝への関与について
調ぺ、細胞内TBTC1はゼオライト処理水中での培養により速やかに脱ブチル化されdibutyltin（DBT）となり細胞外へ排出されること、ミク口ゾーム両分を用いた
mW打．〇での異物代謝酵素反応系でもゼオライト処理水はT1弭℃1のDBTへの変換を促進させることを明らかにしたが，ゼオライト自体の異物代謝機能は認めなかった．P450誘導の有無をWestem−blotting法により検討し，ゼオライト処理水
は 、 異 物 代 謝 酵 素 活 性 に 間 接 的 に 関 与 し て い る可 能 性 を 示 唆 し た。
本研究を通じて1BTC1が微小生物に対して機能障害を発現すること，またその障害がいくっかの機能水によって回復可能であることを細胞生物学的于法により明らかにした．本研究結果から，ユーグレナは細胞障害発現評価モデルとして有用な生物であることを明らかにした．また、これまで十分な科学的検証が行われてこなかった機能化水溶液にも科学のヌスを入れたことは、大いに評価m来る学位論文である。

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