免疫工学による免疫システム分子機構の解析
Analysis of molecular mechanisms in the immune system by immunoengineering

Ⅱ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウスを用いた免疫調節機構の解析

─ Mechanisms of immunoregulation analyzed by using T cell antigen receptor gene transgenic mice ─
日本医科大学

医学部

医学科

微生物学・免疫学

熊谷善博

Yoshihiro Kumagai
Department of Microbiology and Immunology, Nippon Medical School and Graduate School of Medicine, Tokyo, Japanには、セントラルメモリー細胞とエフェクターメモリー細胞

1. はじめに機能の獲得）などが観察される（図 1）2）, 3）。

このシリーズで紹介する免疫工学とは、免疫系の機この T 細胞活性化と個々の T 細胞クローンの運命は、能分子、担当細胞、個体を遺伝子工学、細胞工学、タ暴露される抗原量によって大きく異なることが知られていンパク質工学、発生工学などの、いわゆる生命に手を加る 3）。

える手法で免疫機構の解明を試みたり、疾病の治療ア

我々は、シリーズⅠで紹介した、卵白アルブミンのアミイデアを提供する学問を指している。今回は下記の 4 回ノ酸配列（OVA323-339=ISQAVHAAHAEINEAGR）
を、のシリーズのうち、第 2 回目として、T 細胞抗原レセプター

マウスクラスⅡ組織適合性抗原複合体をI-A dとともに認遺伝子トランスジェニックマウスを用いた免疫調節機構

識する T 細 胞レセプターαβ鎖トランスジェニックマウスの解析について紹介する。

（OVA23-3 マウス）を用いて、ナイーブ CD4 陽性 T 細胞が抗原の暴露条件によって、活性化プロフィールの質〈免疫工学による免疫システム分子機構の解析シリーズ〉

的量的な違いについて精査した 4）−6）。解析内容は、活Ⅰ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウ性化に伴う、早期活性化細胞表面分子の動的変化、スを用いたアレルギー発症機構の解析 1）
Ⅱ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウ
スを用いた免疫調節機構の解析

サイトカイン産生、転写因子の発現や B 細胞応答への影響等について、抗原暴露条件による差異を定量的に検討したものである。

Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体の作製
Ⅳ. エピトープ移植抗体抗体

─タンパク質工学によ2. ナイーブCD4陽性T細胞の初期活性化マーカー
発現への暴露抗原濃度の影響

るワクチンの創製─
OVA23-3マウスのナイーブ CD4 陽性 T 細胞は、活性2T 細胞上の T 細胞レセプター（TCR）分子が、共刺激化前は、CD62L high CD4+ の表現型を示す。しかし、脾分子の共役下で、抗原提示細胞上の主要組織適合臓抗原提示細胞の存在下で、異なった抗原濃度で 12性抗原複合体クラスⅠあるいはクラスⅡ分子と共に提示

時 間 刺 激を与え、初 期 活 性 化マーカーである CD69、された抗原ペプチドと反応すると、多くの T 細胞は活性CD25 の発現量、ならびに TCR のダウンレギュレイション化される。活性化シグナルにより惹起される応答は単純を比較した結果、初期活性化マーカー発現は抗原投で はなく、活 性 化 条 件 により、クローン拡 大（clonal

与量とともに増大し 500nM でプラトーに達し、一方 TCRexpansion）、クローン欠 失（clonal deletion）、エフェク

発 現は 50nM 以 上で急 速に低 下することが判 明した

ター細胞機能の獲得、メモリー細胞機能の獲得（厳密（図 2）。

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3. 投与抗原量により、ナイーブ CD4 陽性 T 細胞の増殖とサイトカイン産生の抗原濃度の影響

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50nM が至適濃度で、高濃度及び低濃度では産生が誘導されないか、減少した。IFN-γは、50nM 以上の刺激でしか 産 生は誘 導されず、高 濃 度の抗 原ペプチド

脾臓抗原提示細胞の存在下で、異なった抗原濃度で産生が上昇した（図 3）。この結果は、細胞性免疫をで 12 時間刺激を与え、細胞増殖とIL-4 産生、ならび増強する傾向を持つTh1（ IFN-γ産生）と抗体産生やクに、IFN-γの産生量を比較した（図 3）。その結果、細ラススッチングを増 強する Th2（ IL-4 生 産）のバランス

胞増殖は抗原濃度依存的に上昇し、500nM 前後でプが、抗原暴露濃度に依存して形成されることを意味しラトーに達した。IL-4 産生は、抗原濃度依存性が高く、ている。

図 1 T 細胞と抗原提示細胞（Antigen Presenting cell）との相互作用によるT 細胞活性化とT 細胞クローンの運命
T細胞上のT細胞レセプター分子（TCR）が、共刺激分子の共役下で、抗原提示細胞上の主要組織適合性抗原複合体クラスⅠあるいはクラスⅡ分子と共に提示された抗原ペプチドと反応すると、T 細胞は活性化され、活性化条件により、クローン拡大（clonal expansion）、クローン欠失（clonal deletion=Death）、エフェクター細胞機能の獲得、メモリー細胞機能の獲得（厳密には、セントラルメモリー細胞とエフェクターメモリー細胞機能の獲得）に至る。

図 2 ナイーブCD4陽性T細胞の初期活性化マーカー発現への暴露抗原濃度の影響
ナイーブCD4陽性T細胞を様々な濃度のOVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）
ペプチドと脾臓抗原提示細胞の存在下で、12時間刺激を与えた。白丸（○）
はOVA23-3マウスで、黒丸（●）
はOVA23-3マウスとRAG2--/-マウスの交配マウスF1マウスのデータを示す。両マウスともに、初期活性化マーカー（CD69、CD25）
発現は抗原投与量とともに増大し500nMでプラトーに達することが判明し、一方TCR発現は50nM以上で急速に低下した。

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図 3 抗原濃度に依存したナイーブCD4 陽性 T 細胞の増殖とサイトカイン産生
ナイーブ CD4 陽性 T 細胞に、様々な濃度の OVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）
ペプチドと脾臓抗原提示細胞の存在下で刺激を与えた。白丸（○）
はOVA23-3マウスで黒丸（●）
はOVA23-3マウスとRAG2--/-マウスの交配マウスF1マウスのデータを示す。ナイーブCD4 陽性 T 細胞の増殖とサイトカインの産生は抗原濃度に依存する。
（A）
は刺激後 48－72 時間の 3H の取り込み、（B）
は72 時間後の IL-4 産生、ならびに、（C）は72 時間後の IFN-γの産生を示す。

図 4 抗原刺激後のサイトカインmRNAや転写因子 mRNA の誘導
ナイーブCD4 陽性 T 細胞を様々な濃度のOVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）
ペプチドと脾臓抗原提示細胞の存在下で、24 時間刺激を与えた。全 RNAを抽出後、それぞれのサイトカインあるいは逆転写酵素で作成した転写因子のcDNAを定量（A、B、E、F）
あるいは定量的リアルタイムPCR（C、D、G、H）
で解析した。E、F、G、Hは、それぞれの発現パターンへのIL-4とIL-12の影響を調べるため、抗IL-4（αIL-4）
あるは抗IL-12（αIL-12）
抗体存在下でのプロフィールを示している。

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図 5 ナイーブ CD4 陽性 T 細胞活性化に伴うB 細胞の IgM 産生形質細胞誘導への影響
ナイーブCD4陽性T細胞を様々な濃度のOVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）
ペプチドと脾臓抗原提示細胞の存在下で、刺激を与えた。白丸（○）
はOVA23-3マウスで黒丸（●）
はOVA23-3マウスとRAG2--/-マウスの交配マウスF1 マウスのデータを示す。培養上清を7日後に採取し、総IgM 産生量を酵素抗体法により測定した。四角（□）
はT 細胞非存在下のIgM 産生を示す。

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図 6 様々な抗原濃度で刺激をうけたナイーブ CD4 陽性 T 細胞が、B 細胞の細胞死に与える影響
白丸（○）
はOVA23-3マウスで黒丸（●）
はOVA23-3マウスとRAG2--/-マウスの交配マウスF1 マウスのデータを示す。96 時間後にB220 陽性 B 細胞を採取し、抗アネキシンV（annnexin V）
でアポトーシス誘導細胞の有無を測定した。四角（□）
はT 細胞非存下での生細胞率を示す。

図 7 様々な抗原濃度で刺激をうけたナイーブCD4 陽性 T 細胞のおける、FasL、CD40L、ならびに、OX40 の発現
ナイーブCD4 陽性 T 細胞に、様々な濃度の OVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）
ペプチドと脾臓抗原提示細胞の存在下で、刺激を与えた。CD40Lは24時間後、OX40は48 時間後にフローサイトメトリーで解析した（A）。また、細胞を12 時間後に回収してCD40LとOX40 の mRNA の測定、72 時間後にFasL のmRNAを定量的リアルタイムPCRで測定した（B）。

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5抗原刺激の初期過程での違いを解析するため、OVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）ペプチド刺激後INEAGR）ペプチド存在下では、アポトーシスが強く誘導され、生細胞が減少していることが分かる（図 6）。

24 時間でのサイトカインmRNAや転写因子 mRNAを定量した（図 4）。GATA-3や c-mafのようなTh2- 特異的転写因子は IL-4 産生に伴い転写誘導されることが判明し

5. アポトーシス誘導に伴うFasリガンド（FasL）の発現には、CD40LやOX409）,10）より高濃度の抗原ペプチドを要するた。IFN-γは濃度依存的に産生が誘導された。サイトカインあるいは転写因子の発現パターンへの IL-4とIL-12

アポトーシス誘導に伴うFasリガンド（FasL）の発現にの影響を調べるため、抗 IL-4（αIL-4）あるは抗 IL-12（αは、CD40L や OX40 9）,10）より高 濃 度の抗 原ペプチドをIL-12）抗体存在下でのプロフィールを調べた（図 4のE、要する（図 7）。また、抗 体による阻 害 実 験から、IL-4、F、G、H）。IFN-γの転写誘導は抗 IL-4 存在下で上昇

CD40L、ならびに、OX40を介したシグナルが、抗原刺激し、GATA-3の転写誘導は、抗 IL-4存在下で減少するこをうけたナイーブ CD4 陽性 T 細胞が抗体産生におけるとが判明した。それと対照的に、抗 IL-12 存在下では、ヘルパーT 細胞機能を発現するために必要であること

IFN-γの転写誘導は減少し、GATA-3 の転写誘導は、が推定された（図 8）。

抗 IL-4 存在下で上昇した。興味深いことに、c-mafは抗IL-4と抗 IL-12の大きな影響を受けなかった。

4. B 細胞の抗体産生形質細胞への分化誘導とアポトーシス（apoptosis）の誘導に抗原刺激を受けた
ナイーブCD4 陽性 T 細胞が与える影響

6. まとめT 細胞上の T 細胞レセプター分子が、共刺激分子の共役下で、抗原提示細胞上の主要組織適合性抗原複合体クラスⅠあるいはクラスⅡ分子と共に提示された抗原ペプチドと反応すると、T 細胞は活性化されるが、暴様々な抗原濃度で刺激をうけたナイーブ CD4 陽性 T

露される抗原濃度により、各 T 細胞クローンの活性化の細胞は、B 細胞活性化に影響を与える。抗体産生形質

内容に違いが生じることを証明できた。サイトカイン産生細胞誘導には、至適抗原濃度が存在し（図 5）、また、や B 細胞の抗体産生細胞への分化への影響の中身

50nM 以上の高濃度の OVA323-339（ =ISQAVHAAHAEが異なることが証明できた。図 9 にまとめたが、ナイーブ

図 8 抗 IL-4、抗 CD40L、ならびに、抗 OX40 のナイーブCD4 陽性 T 細胞によるB 細胞への IgM 産生形質細胞誘導への影響
ナイーブCD4 陽性 T 細胞に、様々な濃度の OVA323-339（=ISQAVHAAHAEINEAGR）
ペプチドと脾臓抗原提示細胞の存在下で、刺激を与えた。それぞれの単クローン抗体を5μg/ml の濃度で加え、IgM 産生濃度を7日後に測定した。

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CD4陽性 T 細胞初期活性化過程、サイトカイン産生、ヘ応答のバランスゲームも抗原濃度依存的に形成される

ルパー機能としての T 細胞─ B 細胞相互作用が、抗原ことも推定され、疾病の制御にも重要な情報を提供してへの暴露条件（濃度）により応答が大きく異なることがいると思われる。

判明した。様々な予防接種のワクチンの分子デザインと今回紹介した研究の生データは、大阪大学免疫学フ投与条件や方法を考案するための基礎情報の提供にロンティア研究センター 伊勢渉博士の貢献を主としたも貢献できるものと思われる。また、前回のシリーズⅠ1）でのであることを最後に付記する。

紹介した、免疫のパラダイム＝自己非自己に対する免疫

図 9 ナイーブCD4 陽性 T 細胞活性化の暴露抗原濃度依存性
初期活性化過程、サイトカイン産生、ヘルパー機能としての T 細胞ーB 細胞相互作用に強い抗原濃度依存性が確認される。

参考文献
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