CKANTO CHEMICAL CO., INC.

2015 No.3（通巻237号）

ISSN  0285-2446

感染症四方山話（10）：感染症研究との出会い（2）流体物理洗浄（2）超音波洗浄

真田

免疫工学による免疫システム分子機構の解析
Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体の作製
最近のトピックス



俊之

菊池

賢

2

渡部

正夫

8

熊谷

善博

14
20

感染症四方山話（10）：
感染症研究との出会い（2）
Various topics concerning infectious diseases (10) an encounter with infectious diseases research (2)東京女子医科大学

感染症科

教授

菊池

賢

Ken Kikuchi, MD, PhD.(Professor)
Department of Infectious Diseases, Tokyo Women’s Medical University

1. はじめにして、研究会を主催させて頂く栄誉ある機会も得た。私2011 年の感染症四方山話（3）で感染症研究との出合った仲間と行ったものである。様々な成果を上げること

会い、特に viridans group streptococci（VGS）との長い付ができたが、私の役割は臨床と基礎のパイプ役を果たし

き合いの始まりの話を書いた 。
「おわりに」にあるように、たに過ぎない。今回、ここで取り上げる内容は、こうしたこれは編集部と続きを書く約束になっていたのだが、ずっ数多くの共同研究者との共同作業で生み出されたことと先延ばしにしていた。自慢出来るような研究成果を上を、改めてご認識の上で、本稿を読んで頂きたいと思う。

のレンサ球 菌の仕 事はほとんどがこの会を通じて知り

1）

げている訳でもなく、この内容を臆面もなく誌面に登場させるには、抵抗感があったのだ。しかし、感染症四方山
話（9）が出てから休筆が続いていて、断れなくなった。

2. Streptococcus anginosus groupとStreptococcus intermedius について

私とレンサ 球 菌との 歩 みで避けて通れないのが、

2

Lancefieldレンサ球菌研究会である。この会は日本医科

VGS は口腔 内 常 在 菌の最 優 位 菌で、歯 面に多い

大学の大國教授、大阪大学歯学部の浜田教授、山梨Streptococcus sanguinis, S. gordoniiなどの属するS. mitis

医科大学の山田教授が世話人となり、特に若手研究group, 舌表面に多く見られるS. salivarius の属するS.

者の育成を目的に「レンサ球菌談話会」として 1992 年

salivarius group, 齲歯の原因として知られるS. mutansのに発足した。昨年からは歴史の長いレンサ球菌感染症

属するS. mutans group, 嫌気環境を好み、歯周ポケット研究会と一緒になり、「レンサ球菌研究会」
として発展や扁桃腺窩などに見られるS. anginosus group（SAG）のを遂げている。この会は、当初、旅館などに泊まり込み、

4 クレードから構 成される 1）。SAG は S. anginosus, S.

昼間は缶詰になって研究発表・激しいディスカッションを

constellatus, S. intermediusの 3 菌種 5 亜種から成り、以行う一方、夜はかなり羽目を外した宴会が延々と続き、前、“Streptococcus milleri”, “Streptococcus MG”, “minute

繰り広げられた様々なエピソードは「この誌面ではとてもcolony streptococci”などと呼ばれていたグループに相当す

書けない伝 説」として語り継がれる、実に楽しい会でる 1）。SAGはいずれもCO2 指向性（capnophilic）があり、あった。読者の方で、このあたりのエピソードを知りたい

嫌気要求性、栄養要求性も比較的高く、血液寒天培地

方は、レンサ球菌を研究テーマにしている50 歳以上の上で観 察されるコロニーが他の VGS に比 べて小さい研究者であれば、誰でもご存知だと思うので、お尋ねさ（minute colonyの由来）。このため、口腔−気道領域のれたい。当時、滅茶苦茶をやっていた若手の研究仲間検体だと、他の発育の良い菌のコロニーに隠れ、特に好達は、ほとんどが教室を運営する責任者になっている。

気培養では検出するのが難しい。レンサ球菌の重要な

今、思い返してみても濃厚な凄いメンバーであったと思

鑑 別 点 の 溶 血 性もα, β, γのいずれのタイプ があり、う。私は 1998 年から参加しており、2013 年には世話人とLancefield 血清型もA, C, F か non-typeを示すため、S.

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

感染症四方山話（10）：感染症研究との出会い（2）pyogenes, S. dysgalactiaeと間違えられることもある。普段、外膜炎など、やはり化膿性病変を作る傾向が強い。一部

溶血性レンサ球菌以外のレンサ球菌同定に慣れていなの膿瘍から分離された SAG は図 1 に示すようにムコイド

いと、SAGを臨床検体から適切に分離・同定するのはか

型を示す場合があり、膿瘍形成の際の白血球の貪食かなり経験を要する。私も最初は無菌部位以外からSAGをら免れる一因になっているのであろう。これは多発性肝集めようとして、その難しさに辟易した。菌の分離は平板膿瘍の患者から分離された株で、あらゆる抗菌薬に感でのコロニーの顔 つきを覚える事から始めるのだが、受性を示していた。しかし、ムコイド基質が抗菌薬の透SAGの場合、兎に角、目がいく溶血性、コロニー性状が過性に影響したかどうかは定かではないが、行った全てバラバラであり、他の VGSや溶血性レンサ球菌との区別の抗菌化学療法が無効だった。この症例では肝臓内にも難しい。γレンサ球菌であれば S. mutansと、βレンサ球

無数の蜂の巣状の膿瘍を形成していたため、ドレナージ菌であればS. agalactiae, S. pyogenesなどと区別しにくい。

も出来ず、抗菌薬治療の限界を痛感させられた。

αレンサ球菌の SAG は、はっきり言ってお手上げである。

SAG は口 腔 が 起 源 のことが 多 いため、膿 瘍 では

昔、VGSの同定方法の論文を投稿したとき、reviewerかPrevotella 属 , Fusobacterium 属 , Peptostreptococcus 属ならのコメントで一番答えに窮したのが「SAGを検討しない

どの口 腔 領 域の嫌 気 性 菌などとの混 合 感 染 が 多いのは何故か」であった 2）。何のことはない、当時、検討にが、S. intermediusは SAGの中では、深部膿瘍などから十分な数の分離株を集められなかったからである。唯単独で分離される頻度が高く、病原性が最も高いと考一、役に立つのは平板を開けた時の臭いである。SAGはえられている 4）。その理由として挙げられるのが本菌をピルビン酸からジアセチルを産生し、特有のカラメル臭を特 徴 づける毒 素、intermedilysin（ILY）である。ILY は示すため、純培養のように菌量が多いと気がつくが、口Clostridium perfringensの perfringosin O, S. pneumoniae

腔領域の検体だと他の菌が多数生えているので臭いでの pneumolysin, S. pyogenesの streptolysin O, Listeria

気がつくのは難しいだろう。また、SAGではマクロライド、

monocytogenesの listeriolysin O, S. suisの suilysinなどにテトラサイクリン、クリンダマイシン耐性を持つ菌株が存在類似した膜孔形成性細胞溶解毒素であり、S. anginosus

することが知られているが、まだペニシリン耐性の報告はgroupの残り2 菌種を含む他の菌種からの検出は知られない。このような非常に多様な性質を示す一方、他のレンていない 4）。ILYのターゲットはヒト型 CD59（huCD59）
で、サ球菌と鑑別する適当な抗菌薬耐性も持たないので、霊長類以外の動物細胞にはほとんど毒性を発揮しない

選択培地の開発が極めて難しく、実際の SAG の分布、ため、S. intermediusのほとんどは通常検査室で使用さ

特に、健常部位での分布はまだよくわかっていないことがれるヒツジやウマ血液寒天培地上では溶血を示さない

多く、検査室・研究者泣かせの菌である。しかし、これま（γ溶血性）5）。CD59は活性化補体から自己細胞を守る

での我々の検討では、口腔領域だとS. anginosusは比較タンパクで、CD59 への自己免疫により、活性化補体で的 口 腔 全 域に広く分 布し、S. constellatus は扁 桃、S.

容易に溶血するCD59 欠損赤血球ができると発作性夜intermediusは歯周ポケットのような嫌気度の高い環境に間血尿症（PNH）が起こる 6）。全身性ループスエリテマ

限定されることがわかってきた（投稿中）。我々は SAG3

トーデス
（SLE）やシェーグレン症候群（SS）では CD8＋T

菌種の標準株の全ゲノム解析を行い、いくつか、他のレ細 胞で CD59 発 現 が 減 少し、これらの細 胞は通 常のンサ球菌とは異なる代謝経路を見いだしたので、今後はCD59 発現細胞に比してアポトーシスを起こし易く、病態

これを応用した選択培地の開発を考えている。

と関与することが報告されている 7）。

一方、SAG が引き起こす感染症としては化膿性病変を形成するのが特徴であり、脳膿瘍、肝膿瘍、膿胸などの深部膿瘍の原因となる 1）。VGSは感染性心内膜炎の3. 原発性胆汁性肝硬変（PBC）との出会い起因菌としてポピュラーであるが、SAG の頻度はそれほ前述した Lancefieldレンサ球菌研究会で徳島大学

ど高くない。しかし、SAGによる感染性心内膜炎は通常

歯 学 部の弘田先 生とSAG の雑 談をしていたとき、「S.

の S. mitis group 菌種によるものとは臨床像が際立って異intermedius でマウスに歯周病を起こさせると、何故かなっている 3）。弁上の疣贅形成よりは、弁輪部膿瘍、心肝臓の胆管周囲に炎症が起きるんですよ」という一言

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

3

が、引っかかった。研究会から戻って、「動物実験してが発症している 8）。無症候性 PBCは登録患者の 4 〜 5

みたら面白いのだろうか。胆管周囲の炎症というと、原倍はいるものと想定されている。全くの偶然だったが、発性胆汁性肝硬変（primary biliary cirrhosis: PBC）
だ

彼女は PBC の研究をしていて、PBCの肝組織を抗リポ

なあ。誰か消化器内科で興味を持っている人はいない

タイコ酸（LTA）抗体で染めると、胆管周囲の炎症部位かな？」と思い、研修の同期だった消化器内科の春田が染色されることに気がついて、「LTAの起源を調べる

先生に電話してみた。PBCとは閉経後の中年女性に好方法はないか？」と私に連絡しようとしていたところだった

発する肝内小胆管周囲の非化膿性炎症（慢性非化膿のだ。図 2 に PBC 患 者と対 照 の 慢 性 C 型 肝 炎 の 抗性破壊性胆管炎：chronic nonsuppurative destructive

LTA 抗体による免疫染色像を示す 9）。PBCでは小葉間

cholangitis CNSDC）
を主病態とする原因不明の進行性

胆管周囲に浸潤している細胞とその周囲の間質にLTA疾患である 8）。進行すると肝硬変から肝不全となり、肝が染め出されているのがわかる。そこで「こういう話があ移植しか治療の手だてのない難病だが、ほとんど進行

るんだけど」と話すと、トントン拍子に事は進んだ。PBCのみられない患者（無症候性 PBC）も存在する。1990 年

患者の血清中の IgG, IgM, IgA classの抗 LTA 抗体の値に特定疾患に指定され、医療費公費負担患者は 15,000を慢性 C 型肝炎（Chronic hepatitis C: CHC）、健常者血人程登録されており、毎年 500 〜 1,000 名程の新規患者

清と比較してみたところ、PBC 患者では IgM, IgA class

コロニー外観莢膜染色（Hiss 染色）像

図 1 ムコイド型S. anginosus 株

PBC
図 2 PBC 患者と慢性 C 型肝炎（CH-C）
患者肝臓組織の抗 LTA 抗体による免疫染色所見

4

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

慢性 C 型肝炎（CH-C）

感染症四方山話（10）：感染症研究との出会い（2）の抗LTA抗体が有意に高値を示すことが確認できた9）。

（PDC）のE2, E3 binding protein, E1α, E1β, 2-oxoglutarate

次にこの LTA 酸が何のグラム陽性菌由来なのか調べ

dehydrogenase complex（OGDC）E2, branched chain

るため、PBC 患者血清の様々なグラム陽性菌に対する2-oxo acid dehydrogenase complex（BCOADC）E2などで、抗体価を測定することになった。図 3 に結果の一部を示

PBCでは PDC-E2 抗体が最も高率に陽性となる。PBC 患す。様々なグラム陽性菌の中では、レンサ球菌との反者ではこの他にも、抗 gp210 抗体 , 抗 p62 抗体 , 抗 lamin

応性が高く、特に S. intermediusの抗体価が他のレンサ

B receptor 抗体 , 抗 sp100 抗体、抗セントロメア抗体など、球菌に対する抗体価よりも高いことが明らかとなった。

多種類の自己抗体が陽性になる 4,8）。これらのエピトープ

10）は PDC E2, gp210などで明らかになっているが、その分
4. PBC の自己抗体の起源

子相同性（molecular mimic）の対象となる微生物については今なお、特定に至っていない。これまでに、大腸菌、

PBC 検査所見では肝胆道系酵素の上昇、IgM 高値

Novosphingobium aromaticivorans, Propionibacteriumに加え、抗ミトコンドリア抗体が高率に（>90%）陽性にな

acnes, レトロウイルスなどの様々な微生物が候補にあげることから、自己免疫疾患と考えられている。抗ミトコンドられたが、PBC の動物実験モデルなどによる直接的な

リア抗体のエピトープは pyruvate dehydrogenase complex

証明はされていなかった 4）。

図 3 PBC 患者、慢性 C 型肝炎（CH-C）
患者、健常者血清の各種レンサ球菌全菌体に対する抗体価

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

5

今回、PBC患者血清のレンサ球菌、特にS. intermedius

反応することが明らかになった 12）。ヒトgp210のエプトーの抗体価が高いことを見いだしたが、更に PBC 患者血プとS. intermedius-Hlpの配列を比較すると、エピトープ

清では S. intermedius histone-like protein（Hlp）
に対するの共有が確認できたのである（図 4）。しかし、何故、核抗体が高いこと、患者肝組織の免疫染色で PBC 病変

膜孔を構成するタンパク核膜孔を構成するタンパクで部位に Hlp が検出されることから、S. intermdiusの菌体ある gp210 に対 する抗 体 が PBC で認められるのか。

成分、とりわけ、LTA, Hlp が molecular mimicとして

Susilowatiらは S. intermediusの産生するILY が胆管上PBC の発症に関与していることが示唆された 9）。

皮細胞に作用すると、核内にカルシウム流入が起こり、Hlp は菌種毎の保存性が極めて高い（種特異性がnuclear factor of activated T cells 1（ NFAT1）
を活性化す高い）RNA, 1 本鎖、2 本鎖 DNA 結合性タンパクであり、ることで、細胞傷害をきたすことを報告した 13）。胆管上菌の生育には必須である。レンサ球菌では 91アミノ酸

皮細胞は CD59を高発現していることが知られており、から構成され、2 量体を形成している。細胞内でDNAILYは細胞膜傷害のみならず、核膜傷害により核内タンの複製、転写調整、翻訳調整、ストレス応答などにかかパクの漏出を引き起こしたことにより、自己抗体獲得につわる一 方、Hlp は細 胞 外にも放 出され、細 胞 外 放 出

ながると想定された。また、この PBC モデルマウスの脾DNAと共にバイオフィルム形成に寄与し、免疫細胞から臓細胞をT 細胞の欠如した RAG2-/-マウスに移植するの炎症性サイトカイン（IL-8, IL-1β, TNF-α）の分泌を引きと、同じPBC様病変が移植マウスに再現された 14）。これ

起こし、糸球体腎炎、リウマチ熱の病原因子としても知らの結果から、本モデルは優れた PBC 動物実験モデルられている。ところが、Hlpには抗ミトコンドリア抗体のとして用いられるのではないかと考えている。おそらく、

抗原エピトープであるPDC-E2の EIETDK 配列は含まれPBC 発症に当たっては、閉経等で引き起こされるエストない。それでは Hlpは何と反応しているのであろうか。

ロゲン低下による免疫変化が前段階として存在し、発

11）

11）

症の引き金となるイベントと炎症を継続させ、進行させる
5. PBC 動物実験モデルの確立
先に S. intermdiusは SAGの中でもかなり嫌気度の高いニッチな環境からしか分離されないことを説明した。

6. おわりにその部位として、最も疑われるのが歯周病ポケットであPBCの molecular mimicに関して、候補になった微生る。そこで、マウス歯肉に S. intermdiusを週 2 回、8 週

物はレトロウイルスから、マイコプラスマ、グラム陰性菌、間投与して歯周病モデルを作成し、肝臓にどのようなグラム陽性菌など、非常に多岐に渡る。PBC 患者側の変 化が生じるのか 調 べてみた

。驚くべきことに、S.

因子として、HLA-DQB1などの HLA 領域、IL12/IL12R

intermedius は生菌でも加熱死菌でも典型的な肝臓小シグナル伝達、TLR/TNAα−NHκBシグナル伝達、B 細

胆 管 周 囲の非 化 膿 性 炎 症 像が観 察され、投 与 終了

胞成熟分化、上皮細胞分化、アポトーシス、小胞体スト

20ヶ月後でもPBC 様の病変は安定して検出された。肝レス応答などの種々の遺伝子多型の影響が明らかに組織では小胆管周囲の非化膿性炎症部位に一致しされている 11）。これらの点から考えても、PBCの発症要て、免疫染色でHlpが検出された（図 5）。まさにヒトPBC

因は非常に複雑であり、疾患としての多様性を感じさとそっくりの病態が再現された訳である。ここで更に大せる。現 在、我々は PBC 患 者、PBC 以 外の自己免 疫

変興味深い事実が明らかになった。PBC患者にみられ疾患患者、コントロールで歯周病部位から検出される

る抗 gp210 抗 体は近 年、PBC の予 後 予 測 因 子として

SAGの比較解析を行っている。仮に、PBCの一部が S.

注目されている 。PBC 患者全体での陽性率は抗ミトintermediusの歯周の慢性炎症が原因で起きているとすコンドリア抗体に比べて低いが、抗 gp210 抗体陽性患

れば、歯周病治療が PBC の予防・治療に直結する可者では陰性患者に比べ、肝硬変へ進展する症例の割能性が出てくる。今後はマイクロバイオーム解析を加え合が高い 。このマウスモデルで抗 gp210 抗体値の上て、本研究を更に進めれば、新しい風景が見えてくるの昇がみられ、かつ、抗 Hlp 抗体はマウスの gp210と交差ではないかと期待している。

12）

4）

4）

6

別々の複雑な経路が必要と推察される。

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

感染症四方山話（10）：感染症研究との出会い（2）図 4 マウスPBCモデルの非化膿性破壊性胆管炎病変の抗 Hlp 抗体による免疫染色所見

図 5 S. intermedius -Hlpとヒトgp210エピトープの比較

参考文献
1）菊池賢 . THE CHEMICAL TIMES. 2012, 224, 8-14.
2）Kikuchi, K.; Enari, T.; Totsuka, K.; Shimizu, K. J. Clin.
Microbiol. 1995, 33（5）, 1215-1222.
3）Ko, T.; Mahara, K.; Ota, M.; Kato, Y.; Tobaru, T.; Takanashi, S.;
Kikuchi, K.; Umemura, J.; Sumiyoshi, T.; Tomoike, H. Heart
Lung. 2013, 42（5）, 379-381.
4）菊池賢 . 化学療法の領域 . 2011, 27（1）, 71-78.
5）長宗秀明 . 日本細菌学雑誌 . 2008, 63（3）, 425-435.
6）Kim, D.D.; Song, W-C. Clin. Immunol. 2006, 118（2-3）, 127136.
7） Song, W-C. Autoimmunity. 2006, 39（5）, 403-410.
8）中村稔 , 相葉佳洋 , 小森敦正 , 石橋大海 . 医療 . 2009, 63（6）,357-362.
9）Haruta, I, Hashimoto E, Kato Y, Kikuchi K, Kato H, Yagi J,
Uchiyama T, Kobayashi M, Shiratori K. Autoimmunity. 2006,
39（2）, 129-135.

10）Haruta, I.; Kikuchi, K.; Hashimoto, E.; Kato, H.; Hirota, K.;
Kobayashi, M.; Miyake, Y.; Uchiyama, T.; Yagi, J.; Shiratori, K.
Clin. Immunol. 2008, 127（2）, 245-251.
11）菊池賢 . Bio Industry, 2015, 32（4）, 20-24.
12）Haruta, I.; Kikuchi, K.; Hashimoto, E.; Nakamura, M.;
Miyakawa, H.; Hirota, K.; Shibata, N.; Kato, H.; Arimura,Y.; Kato, Y.; Uchiyama, T.; Nagamune, H.; Kobayashi, M.;
Miyake, Y.; Shiratori, K.; Yagi, J. Lab. Invest. 2010, 90, 577588.
13）Susilowati, H.; Okamura, H.; Hirota, K.; Shono, M.; Yoshida,K.; Murakami, K.; Tabata, A.; Nagamune, H.; Haneji, T.;
Miyake, Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011, 404（1）,57-61.
14）Haruta, I.; Kikuchi, K.; Nakamura, M.; Hirota, K.; Kato,
H.; Miyakawa, H.; Shibata, N.; Miyake, Y.; Hashimoto, E.;
Shiratori, K.; Yagi, J. J. Clin. Immunol. 2012, 32（5）, 10261037.

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

7

流体物理洗浄（2）超音波洗浄
Physical Fluid Cleaning (2) Ultrasonic cleaning
静岡大学

学術院

工学領域

准教授

真田 俊之

Sanada Toshiyuki (Associate Professor)
College of Engineering, Academic Institute, Shizuoka University
北海道大学

大学院工学研究院

機械宇宙工学専攻

教授

渡部

正夫

Watanabe Masao (Professor)
Division of Mechanical and Space Engineering, Faculty of Engineering, Hokkaido University

1. はじめに

2. 流体の基礎とキャビテーション

前回は流体物理洗浄の基本的概念について述べ

まずは、超音波の定義について述べる。音波は流体た。洗浄原理を理解することは機器を正しく扱うことにつや固体中を伝わる波であり、圧力の疎密波、すなわちながり非常に重要である。また様々な技術は、新たなメ

局所的に圧力が高くなったり、低くなったりする現象であ

カニズムの解明によって進歩してきた 1）。今回と次回でる。人間の耳に感じない振動数の大きな波のことを超は個別の手法について、それぞれの原理に着目し紹介

音 波と呼ぶ。そのため、振 動 数（周 波 数）が 20kHzとすることとし、まずは超音波洗浄について述べる。異ないった値を境に、それ以上の振動数の音波を超音波とる専門の方に、違った視点から超音波洗浄を眺めて頂呼ぶことが多い。

けると幸いである。問 題 解 決のプロセスとしてのアプ
ローチ手法を増やすことができるためである。

液体は不思議な物質で、固体のように密度は高いが、超音波洗浄は幅広く利用されており、大学等の研究

分子は自由に動きまわることができる。一方で気体ほど室等、小さなものを洗浄する際には欠かすことのできな

バラバラではなく、ある程度分子間に引力が働いていい装置であるにも関わらず、その原理は良く知られている。また、温度を上げると蒸発する。液体が蒸発する温ない。最も身近な例として眼鏡の洗浄が挙げられるの度すなわち沸点は、飽和蒸気圧曲線を見れば良い。水で、経験したことのある方も多いと思う。しかしこの超音の場合は大気圧（1013hPa）下で 100℃で沸騰する。こ波洗浄、実際に何が起こっているのかはそれほど知らの沸騰現象と超音波照射が関係しているである。

れていない。例えば、超音波なのに何故「キーン」とい

飽和蒸気圧曲線（図 1）を見ると、圧力が低い場合にう高い音がするのであろうか？その鍵をにぎるのは気泡

は沸点は下がる。これは良く知られた話であり、気圧のである。

低い高い山の頂上ではカップラーメンが良くできなかっ

音波が洗浄していると思われがちな超音波洗浄について、その原理を流体工学の視点から解説する。もちろ

8超 音 波を液 体に照 射すると何が起こるのだろうか？

たり、ご飯が半生状態になるのもこのためである。すな
わち、より低い温度で沸騰してしまう。

んその全ては解明されておらず、現在も様々な研究がそれでは、常温で液体の圧力が低くなるとどうなるの進められている。また後に詳細を述べるが、この泡が関であろうか？ やはり液体が気体になる。このように液体の与する現象についても、化学的視点、物理的視点から

圧力が、その温度によって決まる蒸気圧より低くなり、蒸様々な論争が行われた。そのようなことが洗浄において発する現象をキャビテーション（Cavitation）と呼ぶ（ここも繰り返されないよう、超音波による物理的作用と洗浄では文献 2 2）の定義で説明する。なお液体中の微小気液による化学的作用がうまく利用され、適切な洗浄が行

泡との関連は後述する。）。キャビテーションは沸騰と同われることを期待する。

様に液相が気相へと相変化する現象である。定義はTHE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

流体物理洗浄（2） 超音波洗浄研究者によって異なるが、沸騰を液体を加熱して液体

キャビテーションが発生すると何が問題なのであろうの温度がその圧力の蒸発温度より高くなった際に起こか。それは、気泡の崩壊と関係している。気泡崩壊時る現象と定義すれば（図 1 ①）、キャビテーションは、系には様々な複雑な現象が発生し、結果として表面を壊の温度は一定で、圧力が下がったために起こる蒸発現

食（エロージョン）
してしまう恐れがある。この壊食を起こ

象と言える（図 1 ②）。

すような強力な物理的作用を洗浄に利用する、というのが超音波洗浄である。そのため、キャビテーションの発
生 箇 所では無く、崩 壊する場 所が重 要となる。次に、超音波によって発生するキャビテーションについて紹介する。
3. 音響キャビテーション
前述したように、超音波は周波数の高い圧力の疎密波（縦波）である。そのため、液体中に照射すると、液体の圧力がその超音波の周期で変動する。その圧力変動に応じて気泡が生成され振動するのである。すなわ
ち、圧力が下がり、例えば飽和蒸気圧を下回ると気泡が生成され膨張し、圧力が高くなると気泡は収縮する（図 2）。一般的に超音波洗浄で使用されている周波数

図 1 飽和蒸気圧曲線、蒸発に至るプロセス

は数十から数百 kHz のものが多い。そのため、周期は0.1msecから0.01msecと非常に短い時間であるが、その次に、流体中の圧力と流れについて簡単に紹介す短い時間で気泡が膨張収縮を繰り返している。ただし、る。キャビテーションは、船舶など高速な流体機械ではこの気泡の生成には様々な要因がある。まずはこの点様々な問題を引き起こすが、なぜ常温で圧力が下がるに着目しよう。

のであろうか？流体力学の有名なベルヌーイの定理がその訳を教えてくれる。この定理は様々な導出方法があり、状況により運動量保存則になったり、エネルギー保存則になったりする複雑な式であるが、簡単に言えば、
圧力と速度の関係を示している。

ここで、p は圧力、V は速度、ρは密度である。すなわ
ち、速度が大きければその地点での圧力は下がるのである。例えば、前回の記事で紹介した粒子除去モデルの Lifting が良い例で、粒子の上を通過する流れが速い場合、その部分の圧力が下がり粒子が浮き上がるのである。飛行機に揚力が働くのも翼の上面の流れが下

図 2 超音波（音響）
キャビテーション

面より速いためであるし、変化球が曲がる仕組みも同様

液体中に気泡が存在する状況を考える。気泡の中身である。そのため、流れが局所的に速くなる回転機械のである気体は何であろうか？ 前述したキャビテーション

先端などでは圧力が下がりキャビテーションが発生してや沸騰の場合、液体が蒸発しているため、その液体のしまう。

蒸気が主成分である。例えば液体が水の場合、水蒸

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

9

気である。それでは、キャビテーションと同様に減圧して定し表面張力を無視した Minnaert Frequencyと呼ばれ気泡を生成する炭酸飲料はどうであろうか（研究者にる気泡の固有振動数 f 0 は次式で表される 4）

よってはこの現象もキャビテーションと呼ぶ）。液体にはその圧 力に応じて気 体を溶 存させることができ（ヘンリーの法則）、減圧するとその気泡が生成される。そのため、二酸化炭素を溶けこませた炭酸飲料は、大気圧へと減圧することによって、その溶存気体が析出するのである。一方超音波によって生成される音響キャビテー
ションの場合、その両方の要素を検討する必要があり、現象を複雑にしている。すなわち、飽和蒸気圧を下回る

ここで、R 0 は気泡の平均径、p ∞は周囲液体の平均圧力、γは比熱比、
ρは液体密度である。
空気の場合（γ=1.4）で、液体を水、圧力を大気圧と仮定すれば、おおよそこの周波数と半径の積はことによる蒸発と、液体中に溶存している気体の析出の双方が発生することが一般的であり、気泡の中身は不凝縮気体と蒸気になる。ここで不凝縮気体とは、この条となる 4）。すなわち超音波の周波数を50kHz, 100kHz,

件下では凝縮しない空気などの気体のことを示す。

1MHzとすれば、対応する気泡半径はそれぞれ 60μm,

また気泡の生成についても注意が必要である。気泡の30μm, 3μmとなり、液体中に存在する気泡核程度の大成長には核と呼ばれる微小気泡等が関連しており、そのきさとなる。すなわち、この気泡振動の固有振動数が超核生成には大きく2 種類がある。固体表面などが核となる

音 波の周 波 数と近いため振 動を起こしやすいのであ

不均質核生成（heterogeneous nucleation）と、明確な核る。なお、実際の気泡振動は、気泡の膨張や収縮の際生成部位のない均質核生成（homogeneous nucleation）に、気泡と液体の気液界面を通して熱や物質移動、相である。シャンパングラスを想像していただきたい。気泡

変化があり、さらに気泡内のミストの生成など、非常には、グラスを拭く際に残されたわずかな繊維やグラスの複雑な現象となる。このような振動を詳細に調査した研傷部分からのみ発生する 3）。すなわち限られた箇所か究も数多く行われている。この気泡力学の詳細は文献

らの気泡生成である、不均質核生成である。これは、中を参照されたい 5）。

学校などの沸騰の実験で利用した沸騰石と同じ原理であり、過飽和の状態も非平衡ながら存在するためである。一方均質核生成は起こりにくい。例えば長時間保管し、気泡核が無くなったシャンパンの瓶の中では発泡は次にキャビテーションによる気泡によって、なぜ船舶や起こりにくい 。そのため、脱気したような超純水では、

流 体 機 械など損 傷を生じるのか、また音 響キャビテー

同じエネルギーの超音波を照射しても水道水等と比較ションによって、なぜ洗浄が可能なのか、その物理的作してキャビテーションは発生しにくい。

用について述べる。また超音波洗浄独特の高い「キー3）

それでは、超音波のような高周波数でなぜ気泡は振10

4. エロージョン・コロージョン

ン」という音の発生理由も検討したい。

動できるのだろうか？それには共振と呼ばれる振動現象

壊食（エロージョン、erosion）とは、古くは河川の流れが関係している。共振とは、振動体にその固有振動数

によって川岸等が侵食を受けることなどを意味し、電気と等しい振動を外部から加えたとき，非常に大きい振幅

化学的腐食（コロージョン、corrosion）は金属表面がイオで振動する現象である。固有振動数は、ブランコで考えンになって溶出することや酸素と反応し酸化物へと変ると分かりやすい。自分で漕ぐことのできない子供のブラ化することである。しかし、船舶のプロペラや水車羽根

ンコの振幅を大きくしようとすれば、その動きのタイミング

による侵食が、壊食なのか腐食なのかは長い間論争がに合わせて外 力を加える必 要がある。日本の洗 濯 機あった。長い時間によって発生し、さらに海中での侵食が、停止する前に大きく振動するのもこの共振現象であには、純粋に 2 つの作用を分けることが困難だからである。一方で空気バネが存在するように、気泡内の空気もる。アメリカ材料試験協会（ASTM）のコロージョン委員

圧縮すると高圧になり反発し、振動する。断熱変化を仮会とエロージョン委員会では、規格用語としても統一が

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

流体物理洗浄（2） 超音波洗浄

なされておらず、双方の委員会にて意見の違いが見らするのは困難だが、逆に大きな密度を持つ液体が一旦れるそうである 6）。洗浄液を使用し、超音波を照射する

加速を始めると収縮は容易なものとなる。図 2 の気泡径

超音波洗浄でも同様のことが予測される。

変化を注意深く観察すれば、気泡径が収縮する過程

様々な研究者がキャビテーションの物理的作用のみの最後は非常に速いことが分かる。もちろん、蒸発・凝でも壊食が発生することを実験や理論解析より明らか

縮、熱・物質移動等も発生するためそれほど容易な話にしている。そこで、まず純 粋な物 理 的作用を紹 介し

ではない。いずれにせよ、気泡が収縮する際には周囲たい。これは簡易的な超音波洗浄機とアルミホイルのの液体が気泡中心へと高速で集まる。

みで簡単に実験できるため、ぜひ読者の皆様にも体験

なお、この非線形振動によって、気泡から照射するしていただきたい。図 3 にその結果を示している。アル超 音 波とは異なる周 波 数の音が発 生するために、超ミホイルを数秒、超音波洗浄機に入れると非常に細か音波洗浄では高い音が聴こえるのである。すなわち、なピット（穴）が 多 数 生 成する。これが 音 響キャビテー

サブハーモニクスと呼ばれる超音波の周波数の半分なションの物理的作用である。超音波洗浄機では、針のどの周波数の音がする。なお雨の日や台所などで、液ように細かな液 体ジェットが 表 面を叩いて洗 浄してい膜に液滴が衝突するときに発生する音も、この気泡振る。アルミホイルのように柔らかい物 質の場 合には変動に由来している 7）。液滴が液面に衝突する音は非常形、もしくは穴が開いてしまうのである。アルミホイルをに小さい。いずれにせよ、人間が超音波洗浄機で音を数秒水に浸したのみで酸化や電気化学的反応が起こ聴くことができるときには、音響キャビテーションが発生るとは考えにくい。そのためこれこそ純粋な物理的作用している。

と言えよう。

次に、非球形崩壊について述べる。先ほど気泡が振動するということは、周囲から高速で液体が集まること、
また気泡は大きくなりにくく、小さくなり易いと述べた。この現象が壁面近傍で発生すると、非球形崩壊が発生する。気泡の周囲液体は気泡中心へ向けて集まろうとするが、壁面側からは液体が供給できないためである。その結果、壁面と反対側からのみ液体が気泡に向けて集
まり、最終的に壁面に向けた高速な流れとなってしまう（図 4）。これが図 3 で紹介した穴の生成メカニズムと考えられている。このように、高速な液体のジェットが衝突

図 3 超音波洗浄機とアルミホイル

それでは、なぜ液体中で気泡が振動するとこのような穴がたくさん形成されるのであろうか？ 理由は大きく2 つすることによって局所的に高い物理的作用を表面へと及ぼす。このような視点に立てば、二流体ジェット洗浄な
どの液滴衝突エロージョンとキャビテーションエロージョ
ンは同じ現象であるとも言える 8）。

あり、そのキーワードは非 線 形 振 動と非 球 形 崩 壊という、2 つの「非」が挙げられる。
まず非線形振動とは、気泡の振動（半径変化）が超音波の圧力の変化と完全に一致しないことである。図 2の気泡径変化に着目すると、確かに圧力が増加すると気泡径は減少し、圧力が減少すると気泡径は増加する。しかし変化は圧力変化とは一致しない。これは、液体中で気泡が大きくなりにくく、一方で小さくなり易いため

図 4 気泡の非球形崩壊である。これは、様々な理由が挙げられるが、例えば密音響キャビテーションの物理作用としては、その他の度が 1000 倍もある液体を押しのけながら成長（膨張）現象も知られている。前述したように、気泡は高速に崩THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

11

壊する。高速に気泡が崩壊することによって気泡内がのように対策すれば良いのであろうか。

高圧になり、周囲への衝撃波の発生も報告されている。

まず、洗浄のムラについて述べる。まず、音響キャビ

衝 撃 波とは、爆 発などによってできた大きな圧 力変 動

テーションが洗浄の主たる原因の場合には、洗浄槽内で、不連続的な波面を有し、音よりも高速で伝わる波のの音圧分布が重要となる。すなわち音響キャビテーショことである。その衝撃波による物理的作用も考えられる。

ンが存在しないと、その物理的作用が発生しないため

また衝撃波によって、気泡が崩壊すれば、さらに高速なである。超音波は可聴域の音波に比べてその指向性ジェットが生成されることも知られており、これらの要因

は良い（すなわち真っ直ぐ進む）
ものの、洗浄槽の形状が複合的に働き洗浄されていると考えることができる 。

や挿入された被洗物の影響を大きく受ける 16）。そのた

本当にそのような現象が発生しているのであろうか？

め、洗浄対象物上で、できるだけ同程度の音圧が作用

このような気泡振動や崩壊は、様々な分野で応用されするようにする必要がある。その対策として、複数の周ており、現象は幅広い分野で確認されている。例えば、

波数を組み合わせたり、振動子や被洗浄物の位置を

医療の現場で行われている結石破壊だが、結石の破移動させながら洗浄することが挙げられる。実際に図 3

壊には衝撃波と気泡の相互作用が重要な役割を果たで示したように、アルミホイル等を洗 浄 槽に入れれば、している9）。また気泡が高速で収縮する際には、気泡内

キャビテーションエロージョンの分布を見ることができ、こが高温・高圧となり、プラズマ化して発光するソノルミネッの分布を参考にすれば良い。なお、これは物理的作用

センスも幅広く研究されておりを利用した洗浄の良い点で、弱い材料を使用すれば、

5）、その高音・高圧場を10）利用して新たな化学反応場を作るソノケミストリー

、さ

11）

らに、気泡内高温高圧場で核融合を試みる研究者も存

その物理的作用を可視化することができき、その作用を定量化できる。

。ソノケミストリーと洗浄との融合は著者らの知次にダメージの対策、すなわち物理的作用の制御にる限り報告されて無いが、化学作用と物理作用を併用

ついて検討する。この点は非常に困難を伴うが、音響することができ、興味深い。

キャビテーションが実に様々な因 子の影 響を受けて発

在する

12）

またメガソニックと呼ばれる、メガヘルツ帯の周波数の生するため、逆にその様々な因子を利用すれば良い。

超音波を使用して洗浄する技術は、当初メガヘルツ帯

文献 5）によれば、キャビテーションエロージョンに及ぼすなので音響キャビテーションは発生しないと言われてい因子は多岐にわたり、液体因子のみを挙げても、温度、たが、様々な研究者によって、メガソニックであっても洗蒸 気 圧、音 響インピーダンス、表 面 張 力、粘 度、圧 縮

浄には気泡が関係していることが報告されている 13）。ま性、腐食性（pH）が紹介されており、さらに、その際の流た、医療用の超音波診断で使用される周波数帯がメガ

動因子（圧力など）や材料因子（弾性係数、硬さ、組織

ヘルツ帯であるため、医療用の血管造影（血管に気泡など）なども加わり、その組み合わせ全てを一般化するこのようなマイクロカプセルを注射しその非線形振動を可とは困難である。そこでその一例を紹介しよう。

視化する）に使用される超音波もメガヘルツ帯である。

例えば、温度を変更すると何が起こるだろうか。温度

このように気泡振動には様々な現象が隠されており、が低い場合には、液体への気体の溶解度が大きい。一

物理的に非常に興味深い。このような様々な気泡の面

方温度が上昇すると蒸気圧が増す。このため気泡振動

白い現象に関して書かれた文献という観点から見れば、温度が低い場合には気体が、を紹介しておく。

14）

温度が高い場合には蒸気がクッションとなり気泡振動に

12

5. 超音波洗浄・洗浄のヒント

よる衝撃力が弱まると予想されている。そのため、気体

次に、このような音響キャビテーションと洗浄の関連にい程度の温度でエロージョンが最大となる 17）。このようついて述べたい。洗浄で良く問題となるのは、洗浄のムに、気泡の振動を増長もしくは阻害させるような因子をラやダメージが挙げられる。例えば、Chemical Timesで用いて制御すれば良い。

の溶解度が比較的小さく、蒸気圧がそれほど増加しな紹介されている最先端半導体洗浄においても、キャビ

また、機能水と呼ばれる、液体に様々な気体を制御しテーション崩壊と思われるピットが紹介されている 15）。どて溶けこませる手法も有効であろう。凹凸を持つ洗浄対

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

流体物理洗浄（2） 超音波洗浄

象物そのものが、不均質核生成の原因となり表面での激しい気泡振動が被洗浄物へのダメージとなる場合、
予め気泡を溶かしこむことにより、均質核生成を促進して一 定の音 響キャビテーションによる物 理 的 作用が期待できる。メガソニックと併用することで、様々な洗浄効
果が報告されている 18）。
一方、表面への物理的作用は、気泡崩壊時のジェットにも依存する。例えば、速度 V のジェットが弾性体に衝突する際に発生する圧力 pは、以下の式で表される。

参考文献
1）山 口 栄 一 . “イノベーション 破 壊と共 鳴”. NTT 出 版 . 2006,
312p.
2）Brennen, C.E. “Cavitation and Bubble Dynamics”. Oxford
University Press. 1995.
3）ジェラール・リジェ・ベレール. “シャンパン 泡の科学”. 立花峰夫
訳 . 白水社 . 2007, 149p.
4）Leighton, T.G. “The Acoustic Bubble”. Academic Press. 1994,
640p.
5）加藤洋治 . “新版 キャビテーション 基礎と最近の進歩”. 槇書店 . 1999, 430p.

ここで、ρC は音響インピーダンスと呼ばれ、添字の L、

6）松村昌信，礒本良則，矢吹彰広 . “エロージョン・コロージョン入門”. 日本工業出版 . 2005, 221p.

S はそれぞれ液体、気体を意味する。液体のこの値が7）Prosperetti, A.; Oguz, H.N. Annual Review of Fluid Mechanics.
1993, 25, 577-602.

大きいほど衝撃圧力が増し、衝突する弾性体の値が小8）Field, J.E. Phys. Med. Biol. 1991, 36（11）, 1475-1484.

さいほど圧力は減少する。水銀のように音響インピーダンスが高い液体では、キャビテーション崩壊は深刻な問題となる 19）。一方で、発生圧力を減らすために、あえて9）Johnsen, E.; Colonius, T. J. Acoust. Soc. Am. 2008, 124（4）,2011-2020.

柔らかい（音響インピーダンスが小さな）材料を使用する

10）Brenner, M.P.; Hilgenfeldt, S.; Lohse, D. Rev. Mod. Phys.
2002, 74, 425-484.

という手も考えられる。

11）Suslick, K.S. Science. 1990, 247（4949）, 1439-1445.

なお、近 年では「ソフトなキャビテーション」と呼ばれる、音響キャビテーションを利用、もしくは簡易的に利用して、表面へのダメージを減らす試みも報告されている。

12）Taleyarkhan, R.P.; West, C.D.; Cho, J.S.; Lahey Jr, R.T.;
Nigmatulin, R.I.; Block, R.C. Science. 2002, 295（ 5561）,
1868-1873.

動させ、気泡の気液界面の移動を利用するもの 20,21）

13）Holsteyns, F.; Lee, K.T.; Graf, S.; Palmans, R.; Vereecke, G.;
Mertens, P.W. Solid State Phenomena. 2005, 103-104, 159162.

や、ある程度遠方で気泡を崩壊させその際の崩壊に14）Lohse, D. Physics Today. 2003, 56, 36-42.

例えば、予め気泡を存在させておいて、その気泡を振よって形成された流体の渦を用いた洗浄などが挙げられる。このように、気泡の崩壊は工夫次第で、強力な物
理的作用から弱い物理的作用まで広い領域で利用できることが、今日、幅広い分野で超音波洗浄が利用されている原因だと思われる。
6. まとめ今回、超音波洗浄の洗浄メカニズムについて紹介した。超音波によって生成された気泡振動が様々な現象を引き起こしていること、またどこから発生するか分からないこの気泡は、その制御が困難であることを述べた。
一方で様々な因子の影響を受けるこの音響キャビテー
ションを制御できれば、洗浄の制御も可能になると予測

15）冨田寛 . The Chemical Times. 2009, 213, 2-7.
16）安藤英一 , 加川幸雄 . 電子情報通信学会論文誌 A. 1988,
J71-A
（5）
, 1079-1090.
17）服部修次，
田中雄. 日本機械学会論文集 B編. 2002, 68（675）,
130-136.
18）角田光雄 . “洗浄技術の展開，
CMCテクニカルライブラリ−269”.
シーエムシー出版 . 2007.
19）Takahira, H.; Kobayashi, K.; Matsuno, T. International Journalof Emerging Multidisciplinary Fluid Sciences. 2009, 1（2）, 8599.
20）Kim, W.; Kim, T-H.; Choi, J.; Kim, H-Y. Appl. Phys, Lett.
2009, 94（8）
, 081908.
21）Mettin, R.; Frommhold, P.E.; Xi, X.; Cegla, F.; Okorn-Schmidt,
H.; Lippert, A.; Holsteyns, F. Solid State Phenomena. 2013,
195, 161-164.

する。読者に少しでも気づきがあれば幸いである。

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

13

免疫工学による免疫システム分子機構の解析
Analysis of molecular mechanisms in the immune system by immunoengineering

Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体の作製

─ Production of antibodies by efficient utilization of protein and cell engineering ─
日本医科大学

医学部

医学科

微生物学・免疫学

熊谷善博

Yoshihiro Kumagai
Department of Microbiology and Immunology, Nippon Medical School and Graduate School of Medicine, Tokyo, Japan

作製されている。このシリーズⅢでは、バイオテクノロジー

1. はじめにを有効に利用して、単なるモノクローナル抗体の作製を

このシリーズで紹介する免疫工学とは、免疫系の機能分子、担当細胞、個体を遺伝子工学、細胞工学、タンパ

超えた次世代技術ともいえる研究手法や作製手法を、筆者の研究例を中心に紹介する。

ク質工学、発生工学などの、いわゆる、生命に手を加える手法で免疫機構の解明を試みたり、疾病の治療アイデ
アを提供する学問を指しているが、下記の 4 回のシリーズのうち、第 3 回目として、Ⅲ．
タンパク質工学と細胞工学

2. 遺伝子クローニングや遺伝子デザインによるモノクローナル抗体の作製：抗体の遺伝子配列情報を用いたモノクローナル抗体の作製を有効に利用した抗体の作製について紹介する。
細胞融合により作り出されたハイブリドーマ（Hybridoma）
Ⅰ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウ
スを用いたアレルギー発症機構の解析

1）

Ⅱ. T 細胞抗原レセプター遺伝子トランスジェニックマウ
スを用いた免疫調節機構の解析
Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体全てが、安定に大量のモノクロナール抗体を分泌してくれるわけではない。特定のハイブリドーマを選択株化した後も、ハイブリドーマは必ずしも安定ではない。筆者らは、マウス/ マウスの同種間ハイブリドーマの一部、マウス/ラットのハイブリドーマ、マウス/アルメニアンハムスターのハイブリドーマ，
ヒト/ マウスのハイブリドーマ等のようなの作製
Ⅳ. エピトープ移植抗体

─タンパク質工学によるワク

異種間ハイブリドーマにおいて、脱分化や染色体消失等を主因とした、高頻度の低産生株化や無産生株化

チンの創製─

を経 験している。このようなハイブリドーマによるモノク
KolerとMilstein によって、初めて単一の形質細胞ク
1）ローンに由来するヒツジ赤血球に対するモノクローナル

14

ローナル抗体産生の欠点を克服する方法の 1 つがトラ
ンスフェクトーマによる抗体産生法である。

抗体が細胞融合法で作製されて以来、40年近くの歳月

トランスフェクトーマの作製方法のついてはさまざまなが流れた。現在、様々なモノクローナル抗体が医学生方法が報告されてきた。細胞融合で作り出したハイブリ

物学の研究のみならず、治療用生物製剤としても多用

ドーマ、低抗体産生株化したハイブリドーマ、あるいは、され始めた。モノクローナル抗体の作製技術は、ほぼ確

Epstein-Varr virusで株化した抗体産生ヒト形質細胞株

立されており、細胞融合と融合細胞の選択を基幹的ななどから抽出した DNA から、ゲノム遺伝子ライブラリー

技術とするが、遺伝子工学、細胞工学、ならびに発生をファージやコスミドベクターで作製し、発現型の抗体ゲ工学の技術を組み合わせて有機的に利用することによノム遺伝子を取得したのち、遺伝子導入に用いる古典

り、多様なモノクローナル抗体や関連融合タンパク質が的な方法は、煩雑で時間や高度な技術を要するため最THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

免疫工学による免疫システム分子機構の解析

近では用いられなくなった。現在は、簡便な方法として遺伝子増幅法（Polymerase Chain Reaction:PCR）を用い

Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体の作製

3. 作製方法の流れる方法が主流となっている。ただし、抗体遺伝子は複数

図 1 に、筆 者が遂 行してきた作 製 法のプロトコール

かつ多様な遺伝子断片が遺伝子再構成のプロセスをを、図 2、3 に筆者の抗体遺伝子発現コンストラクトの一経て発現されるため、PCRに利用するプライマーのデザ例 2）,3）を示した。表 1，2，3 には、抗体遺伝子増幅に利インが肝要となる。

用する5ʼプライマーと3ʼプライマーについての、膨大な情報の中から、様々な抗体可変部遺伝子や定常部遺伝子に共用でき、なおかつ、抗体の遺伝子発現の転写翻訳の条件を満たし、試験管内抗体タンパク質産生に汎用性の高いものを、例示した。実際に作製を試みる場合に参考にしてもらいたい。ハイブリ
ドーマの樹立成功した後、抗体の特性に手を加えたり、抗体骨格を含むキメラタンパク質の創製には有用な方法である。図 4 に、筆者が作製した抗 DNP（ 2,4-dinitrophenyl）基に対するIgE 抗体遺伝子を、抗体 H 鎖とL 鎖の産生を欠落した SP2 形質細胞腫に導入することにより樹立したしたトランスフェ
クトーマの産生タンパク質の還元条件下二次元電気泳動パターンを示した。効率よく
抗 IgE 抗 体 H 鎖（図 4 右 写 真の楕円で囲んだ上 部）とL 鎖（楕 円で囲んだ下 部）が

図 1 遺伝子クローニングとトランスフェクトーマを用いたモノクローナル抗体の作製

産生されていることがわかる。

図 2 ヒト抗体 H 鎖発現コンストラクトの例と制限酵素地図

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

15

図 3 マウスL 鎖発現コンストラクトの例と制限酵素地図
表 1 マウス抗体遺伝子の cDNA 合成に利用する3’プライマーの DNA 塩基配列 2）

表 2 遺伝子増幅用マウスH 鎖可変部リーダー領域 5’センスプライマー2）

表 3 遺伝子増幅用マウスL 鎖可変部センスプライマー2）

16

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

免疫工学による免疫システム分子機構の解析

Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体の作製

図 4 IgE 産生トランスフェクトーマの作製
抗 DNP（2,4-dinitrophenyl）基に対するIgE 抗体遺伝子を遺伝子増幅法を組み合わせて作製し、抗体 H 鎖とL 鎖の産生を欠落したSP2 形質細胞腫に導入することにより樹立したしたトランスフェクトーマの産生タンパク質の還元条件下 2 次元電気泳動パターンを示した。効率よく抗 IgE 抗体 H 鎖（図 4 右写真の楕円で囲んだ
上部）とL 鎖（楕円で囲んだ下部）が産生されていることがわかる。左の写真は、抗体 H 鎖とL 鎖の産生を欠落したSP2 形質細胞腫のタンパク質合成パターン。検出には、高感度銀染色を用いた。

4. 二重特異性抗体産生融合細胞（クアドリオーマ）の作製

抗原に対応した抗体を作製することができる。異なった
抗体可変部を単分子抗体に発現させたのが、クアドリ
オーマ（Quadrioma）である。

IgMは成熟分子として5 量体を形成し10 価のエピトー

目的は多種多様にあるが、ニーズに応じて、がん細胞

プ結合価を有する。2 量体 IgAは 4 価、IgG に代表されと毒 素 の 両 方をリンクできる抗 体 や 抗 原と ELISA

る単 量 体 抗 体では 2 価のエピトープ結 合 価を有する。

（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）用酵素の両方

抗体の多価性を利用すると、抗体の特異性が複数のに反応する抗体などの報告がある 4）。
クアドリオーマの選 択 方 法には、図 5 に示した細 胞
再融合と薬剤選択を組み合わせた方法や、図 6 に示したフローサイトメトリー（Flowcytometry）
を用いた、2 種の蛍光標識後、細胞を再融合して選択する方法がある。作製された抗体の分子種によって、イオン交換クロマ

図 5 2 種のハイブリドーマの再融合と薬剤選択を利用したクワドリオーマの作製

図 6 フローサイトメトリーを用いたクワドリオーマの選択

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

17

トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、あるいは、親和性ク

伝子改変抗体で、現在、20 種類近くの分子標的抗体

ロマトグラフィーを組み合わせた高 速 液 体クロマトグラ

ががん治療や抗炎症治療薬として使われている。ただフィーにより、二重特異性抗体を精製できる。

し、患者と社会への経済的負担が多大で、製薬会社の経済的な成功と医療上の社会的成功は全く別の問

5. モノクローナル抗体の利用：抗体分子の遺伝子改変とモノクローナル抗体を用いた分子標的治療題である。それに加え、モノクローナル抗体による標的治療は、元々、このシリーズのⅠで紹介した免疫のパラ
ダイム 6）のバランスを大きく崩す本質を抱えており、副作用については長い時間軸を設定すればするほど未知

近年、抗体や抗体のキメラ分子を用いた分子標的

数で、モノクローナル抗体による標的治療が、未来永治療が臨床治療の現場で多用され始めている。分子劫に定着するかどうかについては懐疑を抱かざるを得

標的治療（targeted therapy）とは、特定の分子を標的とない。

して、その分 子の機 能や動態を制 御する治 療 法である。抗体やキメラ抗体を用いる場合は、標的分子への高い特異性を利用し、リガンドとその受容体の反応を阻止する活性を、主に利用している。

モノクローナル抗体作製技術の確立にノーベル賞が目的は、ガン治療や炎症反応の治療などであるが、ガ授与され 1）、臨床検査、研究、治療等さまざまな目的にン細胞排除や炎症に関わる分子を特異的に抑えること汎用されている。免疫グロブリンは血中で安定性の高いを主目的とする。従来の多くの薬剤もその作用機序を探タンパク質であり、標的特異性にのみならず、標的に対ると何らかの標的分子を持つが、分子標的治療は創薬する持続的効果を発動することができる。これと対照的や治療方法の設計段階から、分子標的を定めているに、時を同じくした頃、試験管内実験では効果が確認で点で大きく異なる。

きるアンチセンスDNA やアンチセンスRNAを用いた製

20 世紀初頭に抗破傷風毒素に代表される血清療法が開始されたが、破傷風毒素を標的とした抗体の毒素剤は、標的細胞核への到達が不充分で、実用化への道のりは遠いと思われる。

中和活性を利用していることから、現在の抗体活性を

一方、抗体関連製剤の開発は活況で、次世代モノク

利用した分子標的療法の起源は、血清療法にあるとい

ローナル抗体と呼ばれる、放射性同位体結合抗体や、える。血清から免疫グロブリンのみを精製して用いたも標的特異性だけを重視し、抗体低上部が副次的に発のを免疫グロブリン製剤（第 1 世代抗体医薬品）と呼ん

動する補体結合反応や抗体依存性細胞障害活性等

でいるが、標的抗原特異性を有する抗体製剤が第 2の生物活性をキャンセルした、抗体可変部位のみの単世代抗体医薬品として登場した。開発初期は、マウス

鎖抗体なども開発されつつある。

モノクローナル抗体を利用していたが、マウスモノクロー

筆者も、可変部だけを持ち、標的に対し結合特異性

ナル抗体はヒトに対して異物であるため、大量にヒトにのみを有する単鎖抗体（sinngle chain antibody; scAb）

投与すれば、HAMA（human anti-mouse antibody）が誘や可溶性単鎖 T 細胞レセプター（sinngle chain T Cell

導され、血清病による強いアナフィラキシーを誘導する

Receptor; scTCR）の作 製に成 功している（図 7 参 照、ため、ヒト型モノクローナル抗体へ改変が遂行されてき未発表データ）。また、このシリーズの 4 回目として次回た。製剤名の末尾に−omabと付くものはマウスモノク

紹介するが、抗体の超可変部に様々なアミノ酸配列をローナル抗体を意味し、−ximabと付くものは、抗体可

導入し、モノクローナル抗体を抗原として作製し、ワク

変部はマウス抗体であるが、定常部はヒト抗体に改変

チンに利用するという次世代抗体（図 8）
も注目を集めしてあるキメラ抗体である。可変部も定常部もヒト型であている。

る抗体は、末尾が−zmabと命名されている。
昨 今、分 子 標 的 治 療を目的とした生 物 製 剤 の 約
30％はモノクローナル抗体を骨格としたキメラ抗体や遺18

6. おわりに

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

免疫工学による免疫システム分子機構の解析

Ⅲ. タンパク質工学と細胞工学を有効に利用した抗体の作製

図 7 可変部のみを有する単鎖抗体（sinngle chain antibody; scAb）や可溶性単鎖 T 細胞レセプター（sinngle chain T Cell Receptor; scTCR）
抗体可変部や、T 細胞レセプターα鎖、β鎖可変部を遺伝子増幅法により作製し、トランスフェクトーマを作製する技術を組み合わせ、中央に自由度の高いリンカー（Linker）
を人為的に組み込んだ単鎖分子を作製した。左図は、精製分子の電気泳動図（クーマジーブリリアントブルー染色）、右図は、scAbとscTCRの構造模式図。

図 8 エピトープ分子移植によるエイズワクチンの創製模式図 8）

参考文献
1）Köhler, G.; Milstein, C. Nature, 1975, 256, 495-497.
2）熊谷善博 . 臨床消化器内科 . 2001, 16（7）, 815-823.
3）Kumagai, Y. Vaccines 94: Modern Approaches to New Vaccines
Including Prevention of AIDS. Norrby, E., ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1994, 9-14.
4）Kumagai, Y. Vaccines 96: Molecular Approaches to the Control
of Infectious Diseases. Brown, F.; Norrby, E.; Burton, D.;
Mekalanos, J. eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996,
283-288.

5）Fanger, M.W. Bispecif ic Antibodies（Molecular Biology
Intelligence Unit）. R.G. Landes, Austin, Tex, 1995, 110p.
6）Shin, D.S.; Ribas, A. Curr. Opin. Immunol., 2015, 33, 23-35.
7）Callahan, M.K.; Wolchok, J.D. J. Leukoc. Biol., 2013, 94, 4153.
8）Kumagai, Y. J. Nippon Med. Sch., 2011, 78（2）, 66-67.

THE CHEMICAL TIMES

2015  No.3
（通巻 237 号）

19

最 近 の ト ピ ッ ク ス
多様化するβ-ラクタマーゼと検査試薬に関する一考（２）
ペニシリン系、セフェム系、カルバペネム系抗菌薬などのβ-ラクタム系抗菌薬は様々な病原微生物に対する抗菌活性の強さと、ヒトに対する安全性の高さからもっとも汎用されている抗菌薬です。
しかしながら、カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌（Carbapenemase-producing Enterobacteriaceae; CPE）
はほぼ全てのβラクタム系抗菌薬に高度耐性化を示し、近年、本邦でもその主な耐性菌であるMBL（Metallo-β-lactamase）産生菌の増加傾向が危惧されています。CPEはヒト腸内でも定着しやすい微生物であることからも注意が必要とされます。MBL以外にも、KPC型β-lactamase、OXA型β-lactamaseなどの様々な耐性酵素を産生するCPEが世界を覆いつくそうとしています。
これら武装化した微生物の侵入を早期にキャッチし、感染対策をとるシステムの必要性はますます高まるものと考えられます。
の検査
（検出）
CRE
（Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae ）CPEとしては、肺炎桿菌が主な菌種で、大腸菌がそれに続きます。国内で検出されているCPEのほとんどはClassB型のMBLです
が、米国ではClassA型（KPC型）
による流行が認められています。
KPC型β-lactamaseはわが国においても症例報告があり、2010年にはインド渡航歴のある患者からNDM-1型MBL産生腸内細菌も分離されており、その後、渡航歴のない患者からも同β-lactamase
産生株が分離されているため、今後の流行についても注意が必要と考えられます。そのような中、やや意味合いが異なりますが、平成26年9月19日の感染症法施行規則改正によって、CPEのうち、カルバペネム系抗菌薬に耐性を示すカルバペネム耐性腸内細菌科
細菌（CRE）感染症が5類全数把握疾患に追加されました。
これらCREを検出するためには、まずは専用の選択分離培地によりCREをスクリーニングすることが必須です。近年、カルバペネム
系抗菌薬を選択剤として用いた選択分離培地が利用できるようになり、さらに特殊酵素基質を利用することにより主要なCREを分離培地上で簡易鑑別できるようになりました。本手法を利用したクロモアガー KPC／ESBL分画培地（図1）
は、CREとESBL産生菌の検出を目的として開発され、優れた検出感度を有しています1）。
また、CRE疑いとして分離される菌株のなかには、AmpC産生と外膜透過性変異を伴うことによりカルバペネマーゼ産生を伴わなくとも（CPEでない）、in vitroの薬剤感受性試験にてCREと判定される菌株も含まれます。本来であれば、その耐性化がCPEによるものか判断する必要があります。メロペネムを基剤とし、MBL阻害剤、KPC阻害剤、AmpC阻害剤を含有した4ディスク法によるカルバペ
ネマーゼ鑑別ディスク（図2）は、これらCREを簡易鑑別する鑑別
2, 3）
ディスクです 。本カルバペネマーゼ鑑別ディスクは、このような菌株も判別可能であり、クロモアガー KPC／ESBL分画培地とカルバペネマーゼ鑑別ディスクを組み合わせることにより、煩雑な検査の簡略化が期待されます（図3）。このような手法を用いることにより、様々な腸内細菌が存在するような検体（特に便検体）から、積極的に耐性菌を検出できるようになり、アクティブサーベイランス等にも有用と考えられます（なお、OXA型やESBL産生と外膜透過性
変異を伴う株については判定できないため、遺伝子検査に頼らざるを得ません）。

C K
表紙写真：ミズバショウとリュウキンカ
（撮影／北原音作）

図1 クロモアガー KPC／ESBL分画培地上の各種耐性菌の発育所見

図2 カルバペネマーゼ鑑別ディスク における鑑別基準

図3 ＣＲＥの簡易鑑別スキーム

参考文献1）吉川 耕平, 長川 隼也, 園田 美代子, 嶋谷 泰明, 竹田 真未, 木下 幸保. 日
本臨床微生物学雑誌. 2014, 24（1）, 9-16.
2）Doyle, D.; Peirano, G.; Lascols, C.; Lloyd, T.; Church, D.L.; Pitout, J.D.D. J.
Clin. Microbiol. 2012, 50（12）, 3877-3800.
3）Saito, R.; Koyano, S.; Dorin, M.; Higurashi, Y.; Misawa, Y.; Nagano, N.;
Kaneko, T.; Moriya, K. J. Microbiol. Methods. 2015, 108, 45-48.

〒103-0022 東京都中央区日本橋室町2丁目2番1号
室町東三井ビルディング
電話（03）
6214−1056 FAX（03）3241−1029
インターネットホームページ http://www.kanto.co.jp
編集責任者 金田 尚
平成27年7月1日 発行「無断転載および複製を禁じます。」