博 士 （ 理 学 ） 横 山 隆 亮
学位論文題名The study of the transcriptional regulation of theERECTA gene in Arabidopsis thaliaTza（アラビドプシスにおけるERECTA遺伝子の発現調節機構の研究）

学位論文内容の要旨
植物は発芽後、栄養成長を経て生殖成長に入る。この生殖成長への移行に伴い植物は劇的な形態変化を引き起こし、その結果複雑な花序形態が生み出される。このような花成に伴う形態の変化、即ち花序形態形成の機構の解明は近年、植物分子遺伝学において注目されてお り、本研究はこのような形態形成に関与する遺伝子の解析を目標としている。
モデル実験植物シロイヌナズナにおいてerectaと呼ばれる突然変異体が知られている。
この変異体は本来総状花序とぃう形態をとるシロイヌナズナが散房花序に変わってしまったもので、花序形態を決定する機構を解明するための重要な材料と考えられていた。この突然変異体解析の第一歩として、その原因遺伝子であるERECTA遺伝子の発現様式をノーザン・ハイブリダイゼイション法と而釘ぬハイブリダイゼイション法を用いて明らかにした。その結果、本遺伝子の発現と植物の形態変化との密接な関わり合いが示された。
即ち本遺伝子の発現は植物体の茎頂部に限られており、頂端分裂組織が栄養生長から生殖生長ヘ移行するのに伴いその発現量が著しく増加していたのである。特にその発現は花が分化していく組織において強いことが示された。こうして総状花序形態の形成には、あらかじめ茎頂部でのERECTA遺伝子の発現増加調節必要であると考えられた。erecta突然変異体が花序形態形成に関与する突然変異体のーつであることからも、ERECTA遺伝子の発現変化を引き起こす機構を明らかにすることは、このような形態変化に必要な遺伝子群の発現調節機構を明らかにする糸口になることと期待された。そこで次にERECTA遺伝子の発現調節機構の解明を試みた。
ERECTA遺伝子発現調節機構の研究の第一歩として、発現に必要なプロモーター上のシス領域を欠失ERECTAプロモーターとレポーター遺伝子とのキメラ遺伝子を導入した形質転換植物体の解析より同定した。この結果、ERECTAプロモーター上の少なくてもニケ所の領域がERECTA遺伝子の発現に必要であることを明らかにした。これらの領域には現在植物で単離されている転写因子が結合する認識配列と相同な配列は存在しなく、既知の転写因子やそのフんミリーに属する転写因子が関与している可能性は低く、新たにこれら領域と相互作用するような転写因子の単離、同定が必要とされた。そこで本研究においては、細胞内とぃう状態で相互作用するとぃうことを重視した酵母を利用した生物学的手法を用いてERECTAプロモーターのシス領域に相互作用するような転写因子の単離を試みた。具体的な方法は以下の通りである。同定したERECTAプロモーターのシス領

域を ミニマル・ プロモー ターの上 流に複数 連結し、 その下流 にレポーター遺伝子を連結し酵母 に導入する。この酵母に植物由来の蛋白質が発現するようなライブラリーを導入する。
植物 由来の蛋白 質がシス 領域と相 互作用し た場合、 その蛋白 質が植物の転写因子であることが 期待され、 その転写 因子がも つ活性ド メインが 働いて下 流にあるレポーター遺伝子の転写 翻訳が起こ ることが 期待され た。レポ ーター遺 伝子とし てべー夕・グルコシダーゼ遺伝子 を利用する ことによ り発色の 有無でシ ス領域と 相互作用 している蛋白質が発現している株 を選択する ことが可 能であっ た。さら に発現ベ クターと してガラクトースで発現が誘導 でき るGALプ ロモータ ーを用い ることで 、偽陽性 を示す株と 植物由来 の蛋白質 に依存して 発色 を示 す株を選 別を可能 にした。 約百万ク ローンをこ のように スクリー ニングし 、7個の 陽性クロー ンを単離 した。こ れらのク ローンよ り目的の 遺伝子を単離し、全長あるいは部 分的な塩基 配列を決 定した。 ホモロジ ー検索に よる塩基 配列の比較ではこれら遺伝子と相 同性の高い既知の転写因子は見っからず、新たな転写因子である可能性が期待された。
さら にこれらの遺伝子産物を大腸菌を用いて大量に精製し、それら遺伝子産物がむvitiー〇で ERECTAプ ロ モ ー タ ー の シ ス 領 域 と 結 合す る か を確 認 した 。 こ の結 果 、 少な く とも 1
遺伝 子について は而vitr〇に おけるシ ス領域と の結合活 性が確認 された。この遺伝子の発現様 式を調べた ところ、 植物体の 茎頂部で 強い発現 が見られ 、またその発現量は頂端分裂組 織 の 栄 養生 長 から 生 殖 生長 ヘ 移 行に 伴 い著 し く 増加 し てい た 。 この よ うに ERECTA遺伝 子 と 酷 似し て いる 発 現 様式 は 、 本遺 伝 子が ERECTA遺伝 子 の転 写 因 子で あ るこ と を さら に支 持 す る結 果 と なっ た 。ま た こ の遺 伝 子の ア ン チセ ン スRNAが転 写される 形質転換植 物を 作 成 した と こ ろ、 形 質転 換 植物 体におけ るERECTA遺伝子の 発現の減 少がみら れ、而 Vlvoに おい て も この 遺 伝子 の 産 物が ERECTA遺 伝 子 の転 写 因 子であ ることを 示した。
この 遺伝子の塩 基配列よ り推定さ れるアミ ノ酸配列 を調べた ところ、動物で報告されている 癌遺 伝 子 のー つ で ある SKIと部 分 的に非 常に高い 相同性を示 した。SKI遺 伝子は細 胞増
殖や 分化に関わ る転写調 節因子と 推測され ているこ とから、 この転写因子も花序形態形成に 関 わ る 細胞 増 殖と 分 化 に関 与 す るも の と期 待 さ れ、 ERECTA遺 伝 子 はそ の よう な 転 写因子 の調節下に あるもの と推測さ れた。
以 上 の よ う に ERECTA遺 伝子 の 発 現と 花 序形 態 形 成と の 関係 を 示 すと と も に、 そ の発
現制 御に必要な プロモー ター上の シス配列 、および シス配列 に相互作用する転写因子の同定を 行った。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

米田好文
落合 廣
福永典之
加藤敦之

学位論文題名The study of the transcriptional regulation of theERECTA genem4撒 ろ Zdゆ sお 競 ロ Zを 刀 口 ・（ ア ラ ビ ド プ シ ス に お け る E． 兄 ECヱ M遺 伝 子 の 発 現 調節 機構 の 研究 ）植 物は発芽後、栄養成長を経て生殖成長への移行に伴い劇的な形態変化を引き起こし、その 結果複雑な花序形態が生み出される。このような花成に伴う形態の変化、即ち花序形態形 成の機構の解明は近年、植物分子遺伝学において注目されており、本研究はこのような形 態形 成に 関与 する 遺伝 子の解 析を 目標 とし た。
モ デ ル 実 験 植 物 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て erectaと 呼 ば れ る 突 然 変 異 体 は 本 来 総 状 花 序とぃ う形態をとるシロイヌナズナが散房花序に変わってしまったもので、花序形態を決定する 機構を解明するための重要な材料と考えられていた。この突然変異体解析の第一歩とし て 、 そ の 原 因 遺 伝 子 で あ る ERECTA遺 伝 子 の 発 現 様 式 を ノ ー ザ ン ・ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ イシ ョ ン 法 と む situハ イ ブ リ ダ イ ゼ イ シ ョ ン 法 を 用 い て 明 ら か に し た 。 そ の 結 果 、 本 遺 伝子の 発現は植物体の茎頂部に限られており、頂端分裂組織が栄養生長から生殖生長ヘ移行する のに伴いその発現量が著しく増加していたのである。特にその発現は花が分化していく組 織に おい て強 いこ とを 発見し た。
erecta突 然 変 異 体 が 花 序 形 態 形 成 に 関 与 す る 突 然 変 異 体 の ー つ で あ る こ と か ら も 、ERECTA遺 伝 子 の 発 現 変 化 を 引 き 起 こ す 機 構 を 明 ら か に す る こ と は 、 こ の よ う な 形 態 変化に 必要な遺伝子群の発現調節機構発見の糸口になることと期待され、同遺伝子の発現調節機 構の 解明 を試 みた 。
ERECTA遺 伝 子 発 現 調 節 機 構 の 研 究 の 第 一 歩 と し て 、 発 現 に 必 要 な プ ロ モ ー タ ー 上 のシ ス 領 域 を 欠 失 ERECTAプ ロ モ ー タ ー と レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 と の キ メ ラ 遺 伝 子 を 導 入 し た
形 質 転 換 植 物 体 の 解 析 よ り 同 定 し た 。 こ の 結 果 、 ERECTAプ ロ モ ー タ ー 上 の 少 な く て も
ニ ケ 所 の 領 域 が ERECTA遺 伝 子 の 発 現 に 必 要 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。 こ れ ら の 領 域には 現在植物で単離されている転写因子が結合する認識配列と相同な配列は存在せず、新規な 配列を発見した。新たにこれら領域と相互作用するような転写因子の発見が必要とされた 。

本研究 において は、細胞内 とぃう状 態で相互作用するとぃうことを重視した酵母を利用し た生 物 学的 手 法 を用 い てERECTAプ ロモ ー タ ーの シ ス領 域 に 相互 作 用す るような 転写因 子の 単 離を 少 な くと も 1遺 伝子 に つ いて は試 みた。植物 由来の蛋 白質がシ ス領域と 相互作用 した場合 、その蛋白 質が植物 の転写因子であることが期待され、その転写因子がもつ活性 ドメイン が働いて下 流にある レポーター遺伝子の転写翻訳が起こることが期待された。約 百万クロ ーンをこの ようにス クリーニ ングし、 7個の陽性 クローンを単離した。これらの クローン より目的の 遺伝子を 単離し、全長あるいは部分的な塩基配列を決定した。
ホモロ ジー検索 による塩基 配列の比 較ではこれら遺伝子と相同性の高い既知の転写因子は見っか らず、新 規な転写因 子である 可能性が期待された。さらにこれらの遺伝子産物を大腸 菌を 用 いて 大 量 に精 製 し、 そ れ ら遺 伝 子産 物が而vitroでERECTAプ ロモータ ーのシス領域と 結合する かを確認し た。この 結果、而 vitroにおける シス領域 との結合活性が確認される 1つの遺伝 子を発見し た。この 遺伝子の 発現様式 を調べた ところ、植物体の茎頂部で強い 発現が見 られ、また その発現 量は頂端分裂組織の栄養生長から生殖生長ヘ移行に伴い 著 し く 増 加 し て い た 。 こ の ERECTA遺 伝 子 と 酷 似 して い る発 現 様 式は 、 本遺 伝 子 がERECTA遺 伝 子の 転 写 因子 で ある こ と をさ ら に 支持 す る結 果 で ある 。 また この遺伝 子のア ンチ セ ンス RNAが 転写 さ れる 形 質 転換 植 物を作 成したとこ ろ、形質 転換植物 体における ERECTA遺 伝 子 の 発 現 の 減 少 が み ら れ 、 而 VI VOに お い て も こ の 遺 伝 子 の 産 物 がERECTA遺 伝 子の 転 写 因子 で ある こ と を示 し た 。こ の 遺伝 子 は 、植 物 で新 発見の遺 伝子であり 、その塩 基配列より 推定され るアミノ酸配列を調べたところ、動物で報告されている 癌遺 伝 子の ーつで あるSKIと部 分的に非 常に高い 相同性を示 した。SKI遺 伝子は細 胞増殖や分 化に関わ る転写調節 因子と推 測されていることから、この転写因子も花序形態形成に 関わ る 細胞 増 殖 と分 化 に関 与 す るも の と 期待 さ れた 。 し たが っ てERECTA遺伝子 はそのよう な転写因 子の調節下 にあるも のと推測 された。
以 上 のよ う に 独自 の 手 法を 用 いて 、 新 たな ERECTA遺 伝 子 の発 現 と花 序形 態形成と の関係を 示すとと もに、その 発現制御 に必要なプロモーター上のシス配列、およぴシス配列に相互 作用する 転写因子の 新発見を 行った。
よ って 著 者は 、北海 道大学博 士（理学 ）の学位 を授与され る資格が あるもの と認める 。