博士 （生 命科学 ）櫻庭康 仁
学 位 論 文 題 名高 等 植 物 に お け る ク ロ ロ フ イ ル ろ 蓄 積調 節 の役割 と分子 機構
学 位 論 文 内 容 の要 旨
クロロフイル餅よ全ての高等植物が保持している、主要な光合成色素の1っです。クロロフイル6は光集光機能の他に、光合成の光集光アンテナのサイズの調節と密接に関わっている事が分かっています。そのため、クロロフイル6の蓄積量の調節は高等植物が様カな光環境に適応する のに重要 です。 葉緑体に おいて、 クロロフイル6はクロロフィリドaオキシゲナーゼ(CAO)に よってク ロロフ イルaから合成 されま す。CA
Oの蓄積量は主に、クロロフイル6の量に依存したタンパク質レベルでの制御によって決定されています。そのためCAOタンパク質の蓄積制御機構を解明する事は、高等植物の光環境適応を考える上で重要です。高等植物のCA
Oのアミノ酸配列をアライメントした研究によって、CAOは3っのドメインからなることが明らかになっています（N末端からそれぞれA，B，Cドメインと呼ぶ）。そのうちCドメインは触媒活性をもち、AドメインはCAOの蓄積制御機構に関わっていることが明らかにされています。
さらに 、このCA
Oの蓄 積制御機構には、葉緑体プロテアーゼの1っであるClpプロテアーゼが関わっている事が、遺伝学的研究から示されました。
この学 位論文に おいて私は、CAO
タンパク質の蓄積制御機構の全容を解明するために、まず形質転換体の解析によってBドメインの機能を明らかにする事を試みました。その結果、B
ドメイ ンはCAOタンパ ク質を安 定化する 機能を もってお り、Aドメイ ンとCドメインが独立して構造を保っためのりンカーの役割を担っている事が予想されました。またこの結果により、CAOの3つのドメ インの うち、CAOの蓄 積制御機構に関わっているのはAドメインだけである事 がわかり 、A
ド メイン内にCAOの蓄積制御に関わる、っまりClpプロテアーゼのdegron配列が ある事が 示唆されました(Sakurabaeta
l.2007)。そこで次にAドメイン内のdegron配列を 形質転換 体を用 いた解析 により同 定しました。私はまず、AドメインのN末端から10‑1341ーアミノ 酸残基ず つ削っ ていった CAO
遺 伝子のC末端に GFPを 融合し、 それらをシロイナズナに導入しました。完成した形質転換体について、共焦点顕微鏡やウエスタンブロットによるGF
P融合タン パク質 の蓄積を 解析し たところ 、Aド メイン のN末 端から50アミノ酸残基削った形質転換体から、融合タンパク質の過剰な蓄積が見られ、さらにその過剰な蓄積によってク ロロフィ ル6の 合成量 も劇的に 増加し ていました。これらの結果から、Aドメインの40〜50残基目の配列がシグナル配列である可能性が高いことが明らかになりました。このことを検証 するため に、次 に、この 40〜 50残基目の配列をAドメインを除去したC
AO
遺伝子に融合したところ、過剰に蓄積するはずのタンパク質の蓄積が抑制されていることが明らかになりました。これらのことからこの10アミノ酸残基の配列が単独でC
AOの蓄積制御に関わり、Clp
プロテ アーゼ認 識配列 である可 能性が 高いこと がわかりました。さらにこの10アミノ酸をGFPに 融合したところ、GFPタンパク質の蓄積も抑制されていることが明らかになり、葉緑体内で一般的にタンパク質を制御する配列として働くことが明らかになりました。このようなタンパク質蓄積制御に関わる配列は葉緑体では見っかっておらず、本研究が初めての報告となります）。
さら に私は、 C
AOの 蓄積制御 機構に異 常をき たしたEM
S
変異体を66株単離し、それらの変異体の表現形解析を行い，7つのグループに分類しました。それらの変異体の表現形が多岐にわたることから、CAOの蓄積制御機構には、さらに複数の因子が関わっている事が示唆されました。
私はまた、高等植物の成長過程におけるクロロフイル6の蓄積の影響を、シロイヌナズナのクロロフィル6過剰蓄積株(BC株）を用いて解析しました。私はこのB
C株を様カな条件で生育した結 果、2つの興 味深い 表現形を 発見しました。まず1つ目は、BC株は強光条件下で深刻な 光障害 を起こす 事を発見しました。スベクトル解析の結果、光化学系2のエネルギー移動効率が野生株に比べ著しく低下している事がわかり、これによってB
C株では強光条件下において大量の活性酸素が発生している事がわかりました。またマイクロアレイによる遺伝子発現解析の結果、BC株の強光条件下に韜いて、核の遺伝子発現に大きな変化が観察されました。
活性酸素のーっである過酸化水素で誘導される遺伝子が、BC株においても誘導されている事が分か りました 。2つ 目として、BC株は老化過程において顕著な老化遅延を起こす事を発見― 1342―

し ました。この老化遅延は、老化過程における核での遺伝子発現の変化によって引き起こされ ると考えられ、クロロフイルbの量の変化が老化過程における葉緑体と核の間のレトログレー ドシグナルに関係している事が示唆されました。このBC株における2つの現象は自然界で植 物が繁栄して行くためには都合の悪い現象です。
以 上 の 研 究 か ら 、 ク ロ ロ フ イ ル 6の 蓄 積 制 御 機 構 と そ の生 理的 役割 を明 らか にし た 。

― 1343―

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 田 中
歩
副 査 教 授 山 本朗
副 査 教 授 内 藤 興 太 哲

学 位 論 文 題 名

高等植物におけるクロロフイルろ蓄積調節の役割と分子機構
クロロフイル6は全ての高等植物が保持している主要な光合成色素の1っです。クロロフイル6は集光機能の他に、光合成の集光アンテナのサイズの調節と密接に関わっており、クロロフイル6の蓄積量の調節は高等植物が様々な光環境に適応するのに重要です。葉緑体において、
クロ ロフイル 6はク ロロフ ィリドaオキシ ゲナー ゼ(CAO)によってクロロフイルaから合成されます。CAOの蓄積量は主に、クロロフイル6の量に依存したタンパク質レベルでの制御によって決定されています。そのためC
AOタンパク質の蓄積制御機構を解明する事は、高等植物の光環境適応を考える上で重要です。高等植物のCA
Oのアミノ酸配列をアライメントした研究によって、CAOは3つのドメインからなることが明らかになっています（N末端からそれぞれA，B，Cドメインと呼ぶ）。そのうちCドメインは触媒活性をもち、AドメインはCA
Oの蓄積制御機構に関わっていることが明らかにされています。さらに、このC
A
Oの蓄積制御機構には、葉緑体プロテアーゼの1っであるClpプロテアーゼが関わっている事が、遺伝学的研究から示されました。
この学位論文において著者は、CA
Oタンパク質の蓄積制御機構の全容を解明するために、まず形質転換体の解析によってBドメインの機能を明らかにする事を試みました。その結果、B
ドメ インはCAOタンパ ク質を 安定化する機能をもっており、AドメインとCドメインが独立して構造を保っためのりンカーの役割を担っている事が予想されました。またこの結果により、CAOの3
つ のドメイ ンのう ち、CA
Oの蓄積 制御機構 に関わっているのはAドメインだけである
事が わかり、 A
ドメ イン内 にC
AOの 蓄積制 御に関わ る、っま りCl
pプロテア ーゼのdegron
配ー1344一列 があ る事 が示 唆さ れま した(Sakuraba et al. 2007)。そこ で次にAドメイン内のdegron
配列を次のような形 質転換体を用いた解析により同定しました。著者はまず、AドメインのN末 端か ら10アミ ノ酸 残基 ずつ削っていったCA
O遺伝子のC末端 にGFPを融合し、それらをシロイナズナに導入し ました。完成した形質転換体について、共焦点顕微鏡やウエスタンブロッ トに よる GF
P融 合タ ンパク質の 蓄積を解析したところ、Aド メインのN末端から50アミノ酸残基削った形質転 換体で、融合タンパク質の過剰な蓄積が見られ、さらにその過剰な蓄積によってクロロフイ ル6の合成量も劇的に増加していました。これらの結果から、Aドメインの40 ‑‑50残基目の配列がシグナル配列である可能性が高いことが明らかになりました。このことを検証するため に、この40 ¥‑50残基目の配 列をAドメインを除去したC
AO遺伝子に融合したところ、過剰に 蓄積するはずのタンパク質の蓄積が抑制されていることが明らかになりました。これらのこ とからこの10アミノ酸残基の配列が単独でCAOの蓄積制御に関わり、Clpプロテアーゼ認識配列である可能性が高いことがわかりました。さらにこの10アミノ酸をGFPに融合したところ、GFPタンパク質の蓄積も抑制されていることが明らかになり、葉緑体内で一般的にタンパク質 を制御する配列として働くことが明らかになりました。このようなタンパク質蓄積制御に関 わる配列は葉緑体では見っかっておらず、本研究が初めての報告となります。
著者はまた、高等植物の成長過程におけるクロロフイル6の蓄積の影響を、シロイヌナズナのクロロフィル6過剰蓄積株(BC株）を用いて解析しました。私はこのB
C株を様々な条件で生育した結果、2つの興味深い表現形を発見しまし た。まず1つ目は、BC株は強 光条件下で深刻な光障害を起こす 事を発見しました。スペクトル解析の結果、BC株では光化学系2のエネルギー移動効率が野 生株に比べ著しく低下していおり、これによって強光条件下において大量の活性酸素が発生 している事がわかりました。2つ目として、BC株は老化過程において顕著な老化遅延を起こ す事を発見しました。このBC株における2つの現象は自然界で植物が繁栄して行くためには 都合の悪い現象です。
以上の研究から、 クロロフィル6の蓄積制御機 構とその生理的役割を明らかにしました。
よって著者は，北海 道大学博士（生命科学）の学位を授与される資格がある ものと認めます。

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