博 士 （水 産 学 ） 呂寅圭

学位 論文題名PharmacoloヰC甜StumeSOntheRoleofC甜CiumandcANIPinViteuogeninInducdonbyEstradiol‐170
inthePnmaryHepatOCyteCultureinthe
闘 nboWTrout伽 C〇 蜘 Cカ 鰡 絖 始 沁（ニジマスの初代培養肝細胞におけるビテロゲニンの合成に及ぼす， カ ル シ ウ ム お よ び cAMPの 影 響 に 関 す る 薬 理 学 的 研 究 ）学位論文内容の要旨
硬骨魚類は卵生動物であり、卵黄成分は胚発生時および仔魚期の栄養源として利用されている。この卵黄は、エストラジオール‑17ロ(Ez)の刺激により肝臓でピテ口ゲニン(VTG)として合成され、血液を経てりポピテリン、ホスピチン、およびロ‑componentに分離された後、卵に蓄積されたものである。したがっ て VTGの 合 成 機 構 を 明 らか に するこ とは 水産 学上 重要な 課題 であ る。
VTGはカルシウム、リン酸、糖及び脂質などを含む複合蛋白質であり、二ジマスにおいては、0.7％のカルシウムを含有することが報告されている。VTG結合カルシウムは、そのほとんどがホスピチンに結合されており、胚胎のカルシウ ム供給 源と して機 能して いるも ので あると 考えら れてい る。
一般にカルシウムは蛋白質の合成、分泌に関与していることが知られている。例えば、ラットの培養肝細胞において、細胞外カルシウムを減少させることにより蛋白質の合成が抑制されることが報告されている。このような蛋白質合成の抑制は、細胞内カルシウムの欠乏によルポリベプチド開始因子のーつであるeIF‑2のa‑サブュニットのりン酸化によるものであると推察されている。
一方、カルシウムアゴニストA23187による細胞内貯蔵カルシウムの枯渇によっても、カルシウム依存性翻訳開始が抑制されることが知られている。このような抑制作用はA23187による脱リン酸化によるものであると考えられている。

蛋白質のりン酸化および脱リン酸化はプ口テインキナーゼCを含む種々のカルシウム依存性プ口テインキナーゼにより調節されることが知られている。これ
らのカルシウム依存性プロテインキナーゼは細胞外および細胞内貯蔵カルシウ
ムの動員による細胞内カルシウムの上昇により活性化される。VTGはりンおよびカルシウムを多量に含んでいるため、VTGの合成および分泌過程にはカルシウムが特異的に働く可能性が高い。しかし、このようなVTGの合成および分子統合にカルシウムがどのように関わっているのかに関する研究は未だない。
一方、、近年、ラットにおけるEzによるサイクリックAMP(cAMP)およびアデニルシクラーゼの活性が蛋白質合成の転写因子の調節に関わることが報告されている。同様に、EzによるcAMPの活性化により核結合蛋白質がりン酸化されることが報告されている。さらに、ウナギにおいてVTG合成の促進作用を持つことが知られている成長ホルモン(G珂の投与においても細胞内cWPを介した蛋白質合成の調節が報告されている。このことはE2の刺激により合成されるVTGにおいてcAMPによる二次的効果が予想されるが、VTG合成におけるc問ゾ田の役割は不明である。
そこで本研究では、二ジマス培養肝細胞を用い、VTG合成に対するカルシウムアンタゴニスト、アゴニストおよびcAMP関連試薬などの影響を電気泳動的手法により調ベ、VTG合成におけるカルシウムおよびcAMPの影響について調べた。さらに、面W閉におけるVTGへのカルシウム結合能についても調べた。
二ジマスにおける肝細胞培養はその改善法が検討されており、本研究においても、ポジティブチャージを施したプラスチックデッシュを用いることにより培養肝細胞は7日間の培養において単層に伸展し、約80％の高い生存率と共にDNA量 の維 持が確認された。しかし、培地カルシウム濃度0mMでの肝細胞はその伸展が見られなかった。E2投与によるVTGの合成は3日目に検出され、11日目まで徐々に増加した。本研究におけるVTG合成はE2投与後7日目の培地を回収し、5〜20％のSDS‐濃度勾配電気泳動により分離し、各パンドの吸光度を測定し、全蛋白質に対するVTGの割合を算出することにより分析を行った。
VrG結合カルシウムは血ガmおよびルW舳条件下でそれぞれ限外濾過法により 算出し た。その結果、VTGにおけるカルシウム結合能は血W的に比ベ、面VIVOにおいて約3倍の高い値を示した。また、VTGの合成割合もin v
itroに比ベ、約2.5倍の 値を 示し、有意に高かった。このことから、in vivoにおけるVTG合成に お い て 、 E2以 外 の 因 子 に よ り 促 進 さ れ る こ と が 考 え ら れ る 。
さ らに 、Ezの投 与に よる カル シウム の取 り込みは90分後有意に高い値を示した。 また 、VTG合成 誘導 時の 細胞 内カ ルシ ウム 濃度 にお いて もE2の 添加 により約 12％ 高 い 値 を 示し た 。 この こと から 細胞 内へ の細 胞外 カル シウ ムの流 入がVT
G合成に重要な役割を果たしていると考えられる。
培 養肝 細胞 にお ける VTG合 成は 培地 のカ ルシ ウム 濃度 依存 的に増 加し 、カル
シ ウ ム 2.5mMで 最 も 高 い 値 を 示 し た 。 培 地 の カ ル シ ウ ム0.25mM以 下 で は 、VTG合 成 は 有 意 に 減 少 し 、 OmMで は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た 。
7日 間 の Ezに よ る VTG合 成 の 誘 導 後 、 培 地 カ ル シ ウ ムOmMの 条件 で培養 を行うこ とに より 、そ の合 成は 3日後 約30％減 少し 、E2を取 り除 いた群 より 急激な減少 傾向 を示 した 。こ のこ とか ら、細 胞外 カル シウ ムは VTG合成に おい て重要であ り、 また VTG合 成の 最終 段階 であ る翻 訳お よび 翻訳 後調 節の段 階に 関わる可能性が示唆された。
カ ルシ ウム アン タゴ ニス トの 投与に よる VTG合成 はラ ンタ ン（全 カル シウムチャネルの阻害剤）、ベラバミル（電位依存性カルシウムチャネル阻害剤）およびりアクテイブブルー（レセプター依存性カルシウムチャネル阻害剤）の添加において 有為 に減 少し た。 この こと から、 肝臓 におけるカルシウム輸送機構はべラ
バミ ルお よび レセ プタ ー依 存性 カルシ ウム チャ ネル であ り、 VTG合 成に おいて機能していると考えられる。
細 胞内 貯蔵 カル シウ ムを 枯渇 させる こと が知られているカルシウムアゴニス
トであるA23187(10‑7ー丶´10‑5M)およびカフェイン(10→〜10'zM）の投与によってもVTG合成は濃度依存的に減少した。また、リアノヂン（10→M）においてもその合成は有意に抑制された。小胞体くER）のカルシウムを特異的に枯渇させるタプシガル ギン (10‥ 〜1016M）では濃度依存的にVTG合成は減少したが、ミトコンドリ
ア内のカルシウムを特異的に枯渇させるオリゴマイシン(1〜10ロg／ml）では変化が 見 ら れ な か っ た。 さ ら に、 5日 間の E2によ るVTG合 成の 誘導 後、 A23187の投与 に よ り VrG合 成 は 培 地 カル シウ ム0mMに比 ベ、 急激 な減 少傾 向が 見られ た。

こ の こ と か ら 、VTG合 成 に は 細 胞 内 貯 蔵 カ ルシ ウ ム 、 特 に、 ER内 の貯 蔵カ ル
シウ ムが 重要 な役 割を 果た してお り、 その 役割 の過 程は VTG合 成の 最終 段階である翻訳または翻訳後調節の段階であると考えられる。
脳 下垂 体お よび 甲状 腺ホ ルモン (T3)によ るVTG合 成へ の影響 はGHの100ng/mlの 高 濃 度 に お いて 約 21％ の 増加 が認め られ た。 しか し、 プ口 ラク チン (100〜500ng/ml)およびT3 (10°〜10 M）においては、いずれの濃度においてもVTG合成に 対 す る 影 響 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 、 二 ジ マ ス の 下 垂 体 抽 出 液 (0.75pituitary7dish)の投与においてもその影響は認められなかった。このことから、VTG合 成 に 及 ぼ す ホ ル モ ン 作 用 は 種 に よ っ て異 な る も の であ ると 思わ れる 。
近 年 、 GHに よる 細 胞 内 cAMPの 上昇は 蛋白 質合 成を 調節 して いる と報 告さ れて い る 。 本 研 究で は cAMPお よ び G蛋 白 質 関 連試 薬 を 用 い 、細 胞内 cAMP濃度 を上 昇 さ せ るこ と に よ り VTG合 成 が 促 進 され た 。 cAMPは プ 口 テ イ ン キ ナ ー ゼ Aの活 性を 促進 させ るこ とに より、 蛋白 質の りン酸化または脱リン酸化を調節する 。 こ の こ と から 、 リ ン 蛋 白 で あ る VTGの 合成 は 細 胞 内 cAMPに依 存し てい るものであると考えられる。
以 上 の よ う に、 二 ジ マ ス に お け る VTG合 成に は 肝 細 胞 のER内の 貯蔵 カル シ
ウ ム の 調 節 が 重要 な 役 割 を 果た してお り、 さら に、 卵黄 形成 期に おい てGHの刺 激 に よ り 肝 細胞 内 の c触佃 が上 昇し 、そ の結 果VTGの合 成が 促進 され るも ので あ る と 推 察 され る 。 し か し 、 カ ル シ ウ ム お よ び cAMPの効 果はVTGの りン 酸化の 促進 によ るも ので ある と考え られ るが 、本研究ではりン酸化および脱リン酸化 にど の程 度関 わっ てい るのか につ いて は不明であり、今後検討すべき課題である。

学 位 論 文 審 査 の 要旨
主 査 教 授 麦 谷 泰 雄
副 査 教 授 山 崎 文 雄
副 査 教 授 原彰 彦

Pharmacolog:
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udies onthe Role of Calcium andcAINtIPinVitellogeninInductionbyEstradiol‑17B
in the Primary Hepa
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heRainbow Trout Oncorhy7zchtts Tnykiss（ ニ ジマ ス の 初代 培 養肝 細 胞 にお けるビ テロゲニ ンの合成に 及ぼす
カ ル シ ウ ム お よ び cAMPの 影 響 に 関 す る 薬 理 学 的 研 究 ）

魚類 の 卵 黄成 分 の前 駆 体 であ る ビテロ ゲニン(VTG)は エストロ ゲンの刺 激により 肝 臓で 合 成さ れ 、 血液 を 介 して 卵に 蓄積する 。したが ってVTGの合 成機構を 明ら か にする ことは、 健全な魚類 の再生産 機構の維 持に極め て重要で あるが、 このこと を肝細胞 培養系を 用いて直 接調べた研 究は少な い。
申請 者 は VTGが Ca結 合 タ ンパ ク 質で あ る こと に 着 目し 、 VTG合 成に おけるCaの役割 を種々の Ca関連試薬 を用いてinvit
roで薬理学的に調べ、また合わせて成長ホル モ ン、 cAMPな どが VTG合 成に 及 ぼす 影響を電 気泳動に より調ぺ た。得ら れた結果の 概要は次 の通りで ある。
1． 肝細 胞 培地 に エ スト ロ ゲ ンを 添 加す る こ とに よ り活 発 な VTGの合成 が誘導さ れ たが 、 合成 に 先 立ち 細 胞 内へ の Ca流 入 が増 加 する こ と を示 し、 このこと がVTG合成 誘導の発 端のーっ になって いることを 示唆した 。
2． VTGの合成は 培地の[Ca]に 依存してお り、[Ca]2.5mMで最 高を示し 、0．25mM以下 ではVTGはほ とんど合 成されな かった。
3． 種々 の Caア ン タゴ ニ ス トに よ りCaチ ヤン ネ ル を阻 害 する と 、VTGの合成 は
顕 著 に抑制 され、受 容体依存性 およびべ ラパミル 感受性Caチ ヤンネル を介して のCa流入 がVTG合成に 関与して いた。
4． 細胞 内 貯蔵 Caを枯 渇 さ せる 作 用の あ る 種々 の Caア ゴ ニス ト により、 VTGの合成は抑制された。特に小胞体のCa枯渇に特異作用のあるタプシガルギンにより、VTGの合成は濃度依存的に抑制されたが、ミトコンドリアに特異的なオリゴマイシンは抑制効果がなかった。
5．これらの作用はVTGに特異的であり、肝細胞由来の他のタンパク質の合成は用いたCa関連試薬によりほとんど影響されなかった。
6．高濃度の成長ホルモン（100ng/ml)によりVTGの合成は促進されたが、プロラ ク チ ン お よ び 甲 状 腺 ホ ル モ ン (T3） に よ る 影 響 は な か っ た 。
7．Gタンパク質の機能促進試薬（コレラ毒素）などにより細胞内cAMP濃度を上昇させると、VTGの合成は増加した。
以上の研究成果はVTGの合成にCaが特異的に必要なことを示し、特に細胞内（小胞体）の貯蔵CaがVTGの合成に重要な機能を果たしている事を明らかにしたものである。また成長ホルモンが細胞内cAMP濃度を上昇させることにより、VTGの合成に関与していることを示唆したものであり、魚卵の成熟機構の解明に貢献するものである。よって審査員一同は本論文が博士（水産学）の学位論文として相当の業績であると認定した。