博 士 （ 医 学 ） 品 田 恵佐
学 位 論 文 題 名

大腸癌特異的ユビキチンリガーゼRNF43の機能解析
学位論文内容の要旨【背景と目的】欧米における悪性新生物の部位別死亡数の統計によると，大腸癌は最も多い死因のひとっである．遠隔転移があった場合，切除および化学療法等の治療法が適用される．近年，大腸癌における化学療法は著しい進歩を遂げている．しかしながら，転移性大腸癌は，いまだに根治が困難な疾患に位置している．これまでに，アポトーシスに影響を及ばすp53，NF‑KB，Bcl‑2，
APc/p ‑
カテニン及ぴCOX‑2などが，発癌に関与していることが報告されている．p53遺伝子は，ヒトの 癌で最も多くの変異が検出される癌抑制遺伝子のひとっである．p53は細胞周期の停止およびア ポトー シスを引 き起こし ，DN
A損傷応答 の中心 的役割を 果たし ている． DNA損傷が起こった際 には，p53
はりン酸化やアセチル化およびユビキチン化等の翻訳語修飾を受けることで，その安定性が変化する．ユビキチン化修飾は，細胞制御・シグナル伝達・ DNA
修復等の細胞機能の制御系として機能するタンパク質の翻訳後修飾系である，遺伝子発現に関する網羅的な解析において，Rin
gfingerprotein43(RNF43)
は大腸癌に高頻度に発現する遺伝子として同定された．
これま でに， R
NF
43の過 剰発現 により細 胞増殖が 促進さ れ，siRN
Aによる ノックダ ウンでは細胞の増 殖が抑 制される ことが報 告され ている． また， 免疫療法 におい てR
NF
43は 細胞障害性Tリンパ球を誘導するエピトープペプチドを含む腫瘍抗原となる可能性があり，癌ワクチンとして臨床試 験が行 われてい る．以上 のこと より，大 腸癌に おいてR
NF43は癌遺伝子の特徴を有すると考え られるが，癌化に及ばす機能は未だ解明されていない． NED
D4‑likeubiquitinproteinligase‑l(NEDLl)は ， 神 経 組 織 に 高 発 現 し ， 変 異 型 superoxide dismutase‑l(SODl)とdis
hevelled‑l(Dvll)に結合 すること が報告 されてい る．また，NED
L1はp53と結合することでp53の 転写活 性を制御 し，アポ トーシ スを誘導 するこ とが知られている，これらの結果より，
NEDL1は 細 胞 増 殖 お よ び ア ポ ト ー シ ス な ど の 制 御 に 関 与 し て い る こ と が 推 測 さ れ た ．
今回， RNF
43の 結合タン パク質 を網羅的 に同定 し，RNF43分子の 機能を解 析するこ とを試みた．ま ず酵母 ツーハイ ブリット 法によ り、RN
F43結合タ ンパク質 として NEDL1を同 定した．この結果 を踏まえ，RN
F43が大腸癌の癌化制御にどのような影響を与えているかを生化学的及び細胞生物学的手法により解析した．
【材料 と方法 】酵母ツ ーハイブ リット 法を用い てRN
F43と結合するタンパク質を網羅的に検索し た， 同 定 され た タ ンパ ク 質 であ る NED
L1と RNF
43との 哺乳類 細胞内で の結合 および安 定性にっい て検討 した．さ らに、RNF
43とp53との結 合につ いて検討 した． ルシフェ ラーゼレポー
ターア ッセイ を用いて ，RNF
43によるp53の転写 活性へ の影響を 検討し た．アポ トーシスヘの影 響 を 調 べ る ため に ， R
NF43‑FLAG恒 常 発現 HCT1
16細 胞を 作 製 し， FAC
Sを 使 用し た 細 胞周―321―

期 解析 によ って sub‑
G1分画の測定， 及ぴカスパーゼ・3の切断を 免疫ブロット法で解析した．
【 結果 】酵 母ツ ーハイブリット法に てHeLa cD
NAライブラリーの スクリーニングを行った，陽性 ク ロ ー ン の う ち の ー っ が ， ヒ ト NED
L1と同 一の 塩基 配列 で あっ た． R
NF43と NE
DL1の結 合は 酵母 細胞 内で のD．ガラクトシダーゼアッセイにて確認した． 哺乳類細胞内でRNF43がNEDL1と物理的に相互作用するかどうかを確かめるためにinvivo結合実験を行った．その結果，哺乳類細 胞 内 に お い て も ， RNF43は NEDL1と 結合 する こと が判 明し た． NE
DL1はp53と 結合 し， p53に よる アポ トー シス を増 強 する と報 告さ れており，RN
F43もまたp53と結合しうるかを検討した ． そ の 結 果 ， RNF43は NEDL1と 同 様 にp53と も結 合す るこ と が判 明し た． H1299
細 胞に p53のレスポンス エレメントを持っルシフェラーゼレポーター，p53の発現プラスミド，及ぴ異なる量 のRNF43を 同時 に発 現さ せ， ルシ フェ ラー ゼ活性を測定した．その結果，RN
F43は容量依存性 に p53の 転 写 活 性 を 抑 制 し た ． RNF43過 剰 発 現 HCT116細 胞 に シ スプ ラチ ンを 添加 し14時
間 培養 した 後， 免疫 プロ ッ ト法 で解 析し た， その 結果 ，RNF43過 剰発 現H
CT
116細胞においてカ スパ ーゼ ‐3の 切断 が抑 制さ れて いた ，さ らに，RNF
43過剰発 現H
CT
116細胞にUVを照射し，FACSに て sub‑Gl分 画を 解析 した とこ ろ， 陰性 対象 との 比較 に おい て， UV照 射12時間 後及 び
18時間 後の sub‑Gl分 画が 減 少し てい るこ とが 判明 した ．こ れら の結 果より，RNF43はアポトーシスを抑制 することが判明した．
【 考察 】NEDL1が p53の転 写 活性 を増 強し ，p53に よる ア ポト ーシ スを 増強させることが報告
さ れ て い る ， 本 研 究 に よ り ， RNF43がNEDL1と 結合 しp53の 転 写活 性を 抑制 する こと を示 した ． し た が っ て ， RNF43は NEDL1を 負 に制 御す るこ とが 示唆 され る． また ，RNF43は ，直 接もしくは間接 的に野生型p53によるアポト ーシスを制御する役割を果たす可能性も考えられる．
しかしながら ，この点に関しての分子生物学的機序は不明であり，今後の検討が必要と考えられる．
【 結 論 】 RNF43の 結 合 タ ン パ ク 質 と し て NEDL1を 同 定 し た ． RNF43
は p53と の結 合す るこ とで ，p53の転 写活 性を 抑制 して ，UVおよ びcDDPに よる ア ポト ーシ スを 抑制することを証明した ，大 腸癌 で高 発現 する RNF43は， NE
DL1と協 調す るこ とで ，p53によ るアポトーシスを制御し，大腸上皮 細胞の癌化に関与することが示唆された．

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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 浅 香 正 博
出 利
副 査 教 授 上光永 敏
副 査 教 授 岩 内 哲 彦
副 査 教 授 守也

学 位 論 文 題 名

大腸癌特異的ユビキチンリガーゼRNF43の機能解析
欧米における悪性新生物の部位別死亡数の統計によると、大腸癌は最も多い死因のひとっである。近年、大腸癌に韜ける化学療法は著しい進歩を遂げているが、転移性大腸癌はいまだに根治が困難な疾患として位置している。p53は細胞周期の停止およぴアポトーシスを引き起こし、DNA損傷応答の中心的役割を果たしている。DNA損傷が起こった際には、p53はりン酸化やアセチル化およぴユビキチン化等の翻訳語修飾を受けることで制御され、その安定性が変化する。ユビキチン化修飾は，細胞制御・シグナル伝達・ DN
A修復等の細胞機能の制御系として機能するタンパク質の翻訳後修飾系である。ユビキチン関連酵素Ring finger protein 43 (RNF43)
は、遺伝子発現量に関する網羅的な解析において、大腸癌に高頻度に発現しているタンパク質として同定された 。RNF43の過 剰発 現 によ り、 細胞 増殖 が促進され、siRN
Aによるノックダウンでは細胞の増殖 が抑 制さ れる こと が報 告さ れて いる 。また 、RNF43
は免疫療法において 細胞障害性Tリンパ球を誘導するエピトープペプチドを含む腫瘍抗原となる可能性があり、癌ワクチンとして臨床試験 が行 われ ている 。以上のことより、大腸癌においてRNF43は癌遺伝子的特徴を有すると考え ら れ る が 、 生 化 学 的 機 序 は ま だ 解 明 さ れ て い な い 。 NEDD4‑like ubiquitin proteinligase‑l(NEDLl)は 、 神 経 組 織 に 高 発 現 し 、 変 異 型 superoxide dismutase‑l(SODl)とDishevelled‑l(Dvll)に結合することが報告され ている。また、NED
L1はp53と結合することでp53の転 写活 性を 制御し、アポトーシスを誘導す ることが知られている。これらの結果より、
NEDL1は 細 胞 増 殖 お よ び ア ポ ト ー シ ス な ど の 制 御 に 関 与 し て い る こ と が 推 測 さ れ る 。
今 回、 酵母 ツー ハイ ブリ ッ ト法 によ りRNF43の結 合タ ン パク 質を 網羅 的に 解析 し、 NE
DL1が 同 定さ れた 。哺 乳類 細胞 内 でRNF43がNEDL1と 物理 的に 相互 作用 する かど うか を確 か める
た め に in vivo結 合 実 験 を 行 っ た 結 果 、 RNF43と NEDL1が 結 合 する こと が判 明し た。 NEDL1
は p53と結 合し 、p53に よる ア ポト ーシ スを 増強 する と報 告さ れて いた ため 、RNF4
3も p53と結 合 し う る か を 調 べ た と こ ろ 、 RN
F43はNED
L1と同 様に p53に も結 合す るこ とが 判明 し た。

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また ルシフェ ラーゼ レポータ ーアッセ イによ り、RN
F43は用量 依存性に p53の 転写活性 を抑制した 。シスプ ラチン を添加し てもRNF43恒常発 現H
CT116細胞 において 、カス パーゼ． 3の切断が 抑 制 さ れ て い た 。 さ ら に 、 RNF43恒 常 発 現 HCT116細 胞 に UV照 射 し 、 FACSに て sub‑Gl分 画 を 解 析 し た と こ ろ 、 RNF43は ア ポ ト ー シ ス 抑 制 活 性 を 有 す る こ と が 判 明 し た 。
審査会において、副査の守内教授より論文内に使用されている科学用語に関する適切な指導を受け 、最終提出論文においては訂正を加えると説明した。また、酵母ツーハイブリッド法でp53が同 定されな かった 理由に関 して質問 を受け、使用したライブラリーにおけるp53c
DNAのクローン 数もしく はHeLa
細胞 内のp53 mRNAの 発現量が その原 因の可能 性とし て言及し た。副査の岩永教授より、消化器組織を含め組織学的な発現に関しての質問を受け、現在利用できるデータベー スや論文 等を引 用しRN
F43の発現 する組織 の情報を 述べた 。副査の上出教授より、転写や細胞 死に関す るデー タがNE
DL1を介し ているこ とを証明 するた めの実験に関する質問を受け、NEDL
1ノックダ ウン細 胞を使う 必要性 を述べた 。また、 ヒト大 腸癌組織を使った生化学的実験及び抗癌剤耐性細胞を使用した実験の可能性を指摘されたが、今後の研究遂行において重要であると 言及した。副査の浅香教授より、今回解析した3っのタンパク質問の作用に関する分子メカニズムに関する質問を受け、研究結果等から予想されるモデルを言及した。主査の畠山教授より、RN
F43遺伝子の発現調節、膜タンパク質としての動態に関しての質問を受け、これまでの知見を踏まえ、各種転写因子による制御の可能性について説明した。
この 論 文 は、 大 腸 癌に 特 異 的に 発 現 する RNF43が N
EDL1やp53と相 互作用す ることで 、p53依存性転写制御や細胞死に対する感受性を制御することを示しており、今後はこの研究をもとに臨床的な応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院過程における研鑽や取得単位なども併せ申請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学位 を 取 得す る の に十 分 な資 格 を 有す る もの と 判 定し た 。

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