新しい銀イオンクロマトグラフィー用HPLC
カラム Silver column KANTO の開発（1）Development of New HPLC Column for Silver ion chromatography (1)関東化学株式会社 草加工場 生産技術部 試薬生産技術課

大瀧伸之

NOBUYUKI OHTAKI

Production Technique Dept. Soka Factory, kanto Chemical Co., Inc.

られている。ベンゼンスルホン酸基が固定化されているカチ

1．はじめにオン交換カラムに硝酸銀溶液を通液し、Ag＋をベンゼンスル銀イオンクロマトグラフィー（Silver ion chromatography）

ホン酸基に固定化して調製する。比較的安定ではあるが、は、有機化合物の不飽和結合と銀イオンが錯体を形成する担体であるシリカゲル表面のシラノール基や、カチオン交換基性質を利用する液体クロマトグラフィーである。分離対象でであるベンゼンスルホン酸基のフェニル部のπ電子が試料ある有機化合物分子中の二重結合の数や位置、cis/transと相互作用して保持の強さに影響を及ぼすことがある。

異性などの違いに応じて分離が行われる。銀イオンクロマト
1）

グラフィーの歴 史は古く、約50 年前に、Dutton やB.de2）3）

筆者らは、従来の銀イオンクロマトグラフィー用分離剤・HPLCカラムの課題を克服する高い安定性と特徴的な分離

4）

Vries 、Barrett 、L.J.Morris らが不飽和脂肪酸エステルの能を兼備する分離剤とHPLCカラムの開発を目指して検討

cis/trans異性体や食用油脂中のグリセリド成分を銀イオンを重ね、新しい銀イオンクロマトグラフィー用HPLCカラム＋カラムクロマトグラフィー（Ag -カラムクロマト）や薄層クロマトグ＋

Silver column KANTO を開発した。本稿では、銀イオラフィー（Ag -TLC）によって分離している。銀イオンクロマトグ

ンクロマトグラフィーの概要と、HPLCカラム Silver column

ラフィーは、複雑な組成を持つ油脂類の分離分析・精製にKANTO の特徴とアプリケーションについて述べる。

有用な手法であり、脂質化学およびその関連分野で多くの応用例が報告されている5）。また、それ以外の分野でも種々

2． 銀イオンクロマトグラフィーの原理と実際の有機化合物の分離に用いられている6）。
Duttonらが用いた分離剤である硝酸銀含浸シリカゲル

Ag＋と不飽和有機化合物は弱い電荷移動型錯体を形は、現在でもAg＋-カラムクロマトやAg+-TLC用の分離剤とし成する8）。 銀イオンクロマトグラフィーにおいては、固定相上のて利用されている。硝酸銀含浸シリカゲルは、シリカゲルを硝Ag＋と試料である不飽和有機化合物が形成する電荷移動酸銀溶液に浸漬処理して調製する。簡便に作製できる反型錯体の安定性の差異に基づいてクロマト分離される。

面、シリカゲルに含浸された硝酸銀が移動相中に溶け出す

Ag＋とアルケンは、（1）σ結合型：二重結合上の占有された2pために繰り返して使用できないことや、溶け出したAg＋によっ結合軌道のπ電子がAg＋の空の5s軌道に供与されて形成てクロマトグラフの配管部や分画したフラクションが汚染されされるσ結合（図1-a）と、（2）π結合型：二重結合上の非占有るといった問題がある。このような理由から、繰り返して使用のπ*−2p反結合性軌道に、Ag＋の占有された4d軌道からdすることのないカラムクロマトグラフィーやTLCの分離剤に用電子が逆供与されて形成されるπ結合（図1-b）の二種類の途が限定され、高い繰り返し再現性が求められる高速液結合様式によって錯体を形成すると考えられている9,10,11）。

体クロマトグラフィー（HPLC）
用の分離剤としては用いることが銀イオンクロマトグラフィーにおいては、固定相のAg＋と試料でできなかった。Ag＋-HPLC用カラムとしては、Christie7）が開ある不飽和有機化合物が形成する錯体の安定性が高い発したカチオン交換カラムにAg＋を固定化したカラムが用いほど、試料は固定相に強く保持されるものと考えられる。

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Kanetiらの計算によれば、不飽和脂肪酸（エステル）の二重3． Silver column KANTO −分離剤−＋結合とカルボニル炭素が近いほどAg と形成する錯体の安定性は高く12）、銀イオンクロマトグラフィーにおいてモノエン脂

3.1 銀イオン‐高速液体クロマトグラフィー（Ag＋-HPLC）
用
カラム Silver column KANTO の特徴

肪酸エステル位置異性体の二重結合がカルボニル炭素と13）近いほど強く保持される結果 とよく一致している。

銀イオン‐高速液体クロマトグラフィー（Ag＋-HPLC）
用カラム Silver column KANTO の固定相として新たに開発した分離剤の主な仕様を表1に示した。 無機イオン交換体でもあるリン酸ジルコニウムを担体として用いている。 非シリカ系の担体を用いていることと、担体自体がイオン交換体であることが大きな特徴である。 担体の表面にシラノール基はなく、またイオン交換基などの導入もないので試料分子との副次的な相互作用は少ないと予想される。 担体であるリン酸ジルコニウムに導入されたAg＋はその結晶構造に取り込まれて安定に存在する。 硝酸銀含浸シリカゲルなどは光に敏感で黒化しやすいが、本分離剤は白色の粉体である（図2）。

図1 Ag＋とアルケンが形成する電荷移動型錯体の結合様式

表 1 分離剤の仕様

銀イオンクロマトグラフィーでは、順相クロマトグラフィーと同様に移動相の極性を増加することによって試料分子をカラムから溶出する。 移動相にはヘキサンなどの無極性溶媒に酢酸エチル（〜10%）やアセトニトリル（〜2%）を添加したものを用いている。 銀イオンクロマトグラフィーにおける不飽和有機化合物の保持の強さに関しては、以下のような傾向が知られている。
①試料分子の二重結合数が多いほど保持が強い。
②cis/trans異性体ではcis体（Z体）の方がtrans体（E体）よりも保持が強い。
③複数の二重結合をもつ有機化合物では、非共役二重結合の方が、共役二重結合よりも保持が強い。

図2

Silver column KANTO 用分離剤の外観とSEM写真（左：外観の写真、右：SEM写真）

また、二重結合と二重結合が離れている方が保持は強い。

担体は、独自の製法によってHPLCカラム用充填材とし④脂肪酸（およびそのエステル）
では、二重結合とカルボニル炭素が近い方が保持は強い。

は4.6φ-250mmL.であり、粒子径5μmの分離剤を充填して＋実際のクロマトグラフィーでは、Ag と不飽和有機化合いる。なお、分離剤のAg含有率を加減することによって物との錯体形成に加えて、固定相の担体と試料分子との副保持の強さを調整できる。また、粒子径3μmの分離剤次的な相互作用も保持挙動に影響する。 特に、シリカゲルも作製できるので、分離対象物質や迅速分析用など使を担体とする従来型の固定相ではシリカゲルの表面に用目的に応じたカラム設計が可能である。

存在するシラノール基の作用によって保持の強さが大きく影響される。

18て最適な多孔性球状粒子として作製した。カラムサイズ

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移動相としてヘキサンやヘプタンにアセトニトリル（ACN）を添加したものを用いると、よりよい分離が得られることが多い。

新しい銀イオンクロマトグラフィー用 HPLC カラム Silver column KANTO の開発（1）

図3は、多環式芳香族化合物の分離について、2種の移3.2 カラムの耐久性−繰り返し再現性と銀イオンの溶出動相、アセトニトリル/ヘプタンとイソプロピルアルコール

Silver column KANTO は繰り返し使用におけるクロ（IPA）/ヘプタンを用いて比較したクロマトグラムである。

マトグラムの再現性が高いことと、分離剤から移動相へアセトニトリル/ヘプタンを移動相に用いた方がピーク形状のAg＋の溶出が無いことが大きな特長である。アセトニトはシャープであり、アントラセンとフェナントレンがよく分離さリル/ヘキサンを移動相とするリニアグラジェント溶離においれている。 図4はトリアシルグリセロールの立体位置異性て、高度不飽和脂肪酸メチルエステルの混合物を試料と体の分離に対する移動相（アセトニトリル/ヘキサン）のアセして1,000回の連続繰り返し分析を行い、それらの保持時トニトリル濃度の影響を示すクロマトグラムである。アセト間の変動を調べた。

ニトリル濃度の減少にともなってトリアシルグリセロールの不飽和脂肪酸エステルは二重結合数の少ない順に、ま保持時間は長くなり、立体位置異性体である1,2-ジパルミ

た、二重結合数が同じであればtrans体がcis体よりも早く溶

チン-3-オレイン（1,2-Dipalmin-3-olein；PPO）と1,3-ジパルミ出される。 表2において、比較的保持の弱いモノエン脂肪チン-2-オレイン（1,3-Dipalmitin-2-olein；POP）の分離度も酸メチル（二重結合数1）のピークは、使用回数の増加にともな向上した。なお、
アセトニトリル/ヘキサンでは、溶出力がって1分から2分程度溶出が早くなる傾向が見られたことで強すぎると考えられるときには、アセトニトリルに代えて酢酸保持時間の変動係数（CV％）
は高めだが、比較的保持のエチル（AcOEt）をヘキサンやヘプタンに添加した溶液を移強い不飽和脂肪酸メチル（二重結合数2以上）のCV％はお動相に用いるのがよい。

おむね1から2％以内であり、非常に高い再現性を示した。
また、繰り返し使用1,000回目のクロマトグラムにおいてもピーク割れなどといったカラムの劣化を示唆するような変化は見られなかった（図5）。 約２ヶ月間の長期間にわたる評価実験であり、HPLC装置自体の再現性（ポンプの送液精度など）や移動相組成の再現性（自然蒸発による組成変化の可能性）などのカラムと関係のない変動要因の影響を考慮すれ
表 2 繰り返し使用における保持時間の再現性

図3

移動相組成がクロマト分離に及ぼす影響
カラム：Silver column KANTO（4.6φ-250mmL.)
流速：1.0mL/分，カラム温度：20℃

図4 トリアシルグリセロール立体位置異性体の分離に対する移動相中のアセトニトリル（ACN)濃度の影響
試料：PPO（1,2-ジパルミチン-3-オレイン）, POP（1,3-ジパルミチン-2-オレイン）, 他の条件は図3と同じ

図5使用回数1,000回の高度不飽和脂肪酸メチルのクロマトグラム
移動相：リニアグラジェント溶離，0.2-2％ ACN/ヘキサン（30分）
カラム温度：40℃，
他の条件は図3と同じ

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ば非常に高い再現性を示しているものと考えられる。と同様に、trans体がcis体よりも早く溶出される。1分子に3実試料（精製魚油、エチルエステル体）を試料とし、図5と同個の二重 結合を有する不飽 和脂肪 酸であるリノレン酸

じ条件で1,000回の繰り返し分析を行い、カラム溶出液中の｛linolenic（9,12,15-octadecatrienoic）
acid}にはcis型二重Ag量、すなわち Silver column KANTO からのAgのリーク結合とtrans型二重結合の数と位置の組み合わせにより8種量を調べた。カラム溶出液を濃縮し原子吸光分析に供しの異性体が存在する。図7は、Silver column KANTO にた結果、1,000回分の総溶出液60Lに対してAgのリーク量はより得られたリノレン酸メチル（Linolenic acid methyl ester）の最大で20ngと見積もられ、濃度に換算すると3pptに相当クロマトグラムである。 3個の二重結合について、cis型二重する。また、この評価実験においてはUV検出器（検出波結合の数が少ない分子種から順に溶出されている。

長UV206nm）と蒸発式光散乱検出器（ELSD）を用いたが、Agの溶出が原因と考えられるようなベースラインの乱れやノイズの増加などの現象は見られなかった。以上の結果から、 Silver column KANTO からのAgの溶出はほとんど無いと考えられ、クロマトグラムの繰り返し再現性が高いことが裏づけられる。
3.3 cis/trans異性体の分離
Silver column KANTO は不飽和化合物における二重結合の状態の違いを識別して試料分子を分離する。
cis/trans異性体では、一般にcis体の方が双極子モーメントは大きく、立体的にも不安定である反面、Ag＋と形成する錯体

図7 リノレン酸メチル − cis/trans異性体の分離
移動相：リニアグラジェント溶離, 0.5-3％ ACN/ 2％ AcOEt/ ヘキサン（20分）, 検出：蒸発式光散乱検出器（ELSD), カラム温度：40℃, 他の条件は
図3と同じの安定性は高い。一方で、相対的に双極子モーメントが小さく、安定なtrans体とAg＋が形成する錯体の安定性は低い。したがって、Silver column KANTO とより安定な錯体

3.4 不飽和脂肪酸の保持挙動に対する共役二重結合とを形成するcis体は強く保持され、相対的に安定性の低い非共役二重結合の影響錯体を形成するtrans体の保持は弱い。

1分子に2個の炭素–炭素二重結合をもつ炭素数18の不飽和脂肪酸（octadecadienoic acid）には、リノール酸｛linoleic（cis,cis-9,12-octadecadienoic）
acid｝のほかに、二つの二重結合が共役している共役リノール酸（CLA：ConjugatedLinoleic Acid）が知られている。共役リノール酸は、共役二重結合におけるπ電子の非局在化により、非共役のリノール酸よりも安定である。したがって分子の安定性とは反対に、それらとAg＋が形成する錯体の安定性は、Ag＋と非共役のリノール酸が形成する錯体よりも低いものと予想される。
図8は、酢酸エチル/ヘキサンを移動相とする Silver column

図6 スチルベン − cis/trans 異性体の分離
移動相：0.2％ ACN/ ヘキサン, 他の条件は図3と同じ

KANTO による共役リノール酸メチル異性体のクロマトグラムである。共役リノール酸メチルの溶出に必要な酢酸エチル

20Silver column KANTO におけるスチルベン（stilbene）の濃度はcis型二重結合を1個もつcis-モノエン酸メチルと同等

cis/trans異性体のクロマトグラムを図6に示した。カルボニルであった。なお、非共役型のリノール酸メチルは酢酸エチル/基などをもたない炭化水素の場合も、脂肪酸エステルであヘキサンでは溶出されず、移動相には溶出力の大きなアセトるエライジン酸メチル｛elaidic（trans-9-octadecenoic）
acid

ニトリル/ヘキサンを用いる必要がある。試料分子中のπ電

methyl ester；図5のピークNo.2}とオレイン酸メチル｛oleic（cis-子の非局在化が Silver column KANTO に対する保持に9-octadecenoic）
acid methyl ester；図5のピークNo.3｝の場合影響することを示唆している。

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新しい銀イオンクロマトグラフィー用 HPLC カラム Silver column KANTO の開発（1）methyl ester｝、ペトロセリン酸メチル｛petroselinic（cis-6octadecenoic）acid methyl ester｝の順に溶出され、Ag＋と不飽和脂肪酸（エステル）が形成する錯体の安定性と保持の強さにはよい相関が認められる。 図11は、炭素数（エステル部を除く）が14から24のモノエン酸メチルエス
テルについて二重結合の位置と保持時間の関係を示す図である。 炭素数には関わりなく二重結合がカルボニル炭素から遠ざかるほど早く溶出される傾向が明らかである。 trans体についてもcis体と同様の傾向が認められ
図8 共役リノール酸メチル − cis/trans異性体の分離
移動相：リニアグラジェント溶離, 2-10％ AcOEt（20分）/ヘキサン, 他の条
件は図3と同じ

る。なお、電子供与性の官能基（ナフタシル基など）とのエステルであれば錯体の安定性は増し、カラムに対する保持はさらに強くなることが報告されている12）。

3.5 位置異性体の分離
不飽和脂肪酸やそのエステルでは、Aｇ＋は炭素–炭素二重結合だけではなく、カルボニル基とも相互作用してよ14）
り安定な錯体を形成する（図9）。また、trans体よりも分子内歪みが大きなcis体ではAg＋を介して炭素–炭素二重結合とカルボニル基が環状構造をとる錯体を形成する。この場合、炭素–炭素二重結合とカルボニル基の位置が近いほど環が小さくなり、安定であるといわれている11）。

図11 モノエン酸メチルの二重結合の位置と保持時間
移動相：リニアグラジェント溶離, 2-10％ AcOEt（20分）/ヘキサン, 他の条
件は図3と同じ
図9 Ag+とモノエン酸エステルが形成する錯体の模式図

図12に、 Silver column KANTO によるテルフェニル
図10は、 Silver column KANTO によるcis-オクタデセ（terphenyl）の位置異性体（o -、m -、p -異性体）のクロマトン酸メチル位置異性体のクロマトグラムである。 炭素–炭グラムを示す。 芳香族化合物であるテルフェニルはビフェ素二重結合がカルボニル炭素から遠いcis-バクセン酸メニル（biphenyl）に続いてo -体、m -体、p -体の順に溶出さチル｛cis-vaccenic（cis-11-octadecenoic）acid methylれた。 Silver column KANTO が脂肪族化合物だけでester｝、オレイン酸メチル｛oleic（cis-9-octadecenoic）acidはなく、芳香族化合物の分離にも適用できることを示す結果である。

図10 cis-オクタデセン酸メチル − 位置異性体の分離
移動相： イソクラティック溶離，0.3％ ACN/ ヘキサン, 他の条件は図3と同じ

図12 テルフェニル − 位置異性体の分離
移動相： イソクラティック溶離, 0.2％ ACN/ヘキサン, 他の条件は図3と同じ＊以下、2009 No.4（214号）に続く。

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