博士（医学）安原満夫
学位論文題名
ラット小腸温阻血再灌流障害に対するL‑Glutamine誘導性Heme oxygenase‑lの効果
学位論文内容の要旨
I目的
移植 医療にお いて小腸 は他の固 形臓器と 異なる特 徴を有して いる。それは、小腸が常に外界 と接して おり、腸 内細菌に より移植 片自体が 複雑な免疫 反応に修飾され、かつ単層円柱上 皮による管腔構造が阻血再灌流障害に対して高い感受性を示すことによる。そのため、
臨 床 の安 全 な 小腸 冷 却保 存 時 間は 12時間以内 であり、小 動物実験 でも24時間 の保存が ぃ
ま だ 確立 し て いな い 。従 来 よ り、 照射後腸 炎、薬剤誘 発性腸炎 や腸内細 菌叢の菌 交代現象などに対して、L―Glutamine(L−Gln）の保護効果が報告され、またラット小腸から分離した細 胞培養系 において 、酸化ス トレスや 熱処理後 に弓fき起こ された組織障害がL‑Gln投与によって抑制されたが、そのメカニズムのーっとしてストレス蛋白質（heatshockprotein：HSP）の発現による細胞保護効果が指摘されている。
本研 究 で は、 種 々の HSPsの 中 でもとく に抗酸化 作用を有す るheme oxgenase‑l／HSP32（ HO‑1）に 着目し、 L‑Glnを前投与 したラッ ト小腸内 組織におけ るHO‑1の発現 性ならび に
小腸 温阻血再 灌流傷害 に対する 耐性の獲 得のメカ ニズムにつ いて、生体内の主要な抗酸化物質 であるreducedglutathione( GSH)量 との相互 関係の面 から検討した。さらに、小腸陰窩の enterochromaffin細胞に存 在し再灌流障害時に小腸内腔に放出されるserotininや、組織中マクロファージから放出されるtumor necrosis factor‑a（TNFーQ）などの放出能からみた細胞傷害度および移植後生存率など多面的な解析を行った。
II方法
実 験 動 物 に は 6〜 8週 齢 の Lewis系 雄性 ラ ッ トを 用 い た。 L− Gln液5mmol/kgを 尾 静脈よ り20分 間の持続 静脈内投 与した群 をL‑Gln群とし た。同様に lactated Ringer（LR)液を投 与 し た 群 を LR群 と し 、 無 処 置 の ラ ッ ト を 用 い た 群 を 新 鮮 対 照 群 と し た 。
1．L‑
Gln投与後の小腸組織内抗酸化物質の発現
被 験 薬投 与 後 2、4、6、24時 間に 開 腹し 、 摘 出し た 小 腸片 を免疫組 織染色で HO‑1の発現 を 検 討し た 。

さ らに 、 小 腸組 織 内HO‑1量 を ELISAお よぴWestern blot法 にて、また組織内GSH量をcalorimetric法にて測定した。
2．小腸温阻血モデルにおけるL―Glnの効果Megisonら の方法 に準 じて 、上 腸間 膜動 脈（ SMA)を遮断した小腸温阻血モデルを作成し た 。 被 験 薬 投 与 後 24時間 に温 阻血 負荷 し、 小腸 組織 内serotoninを 免疫 組織 染色 にて検 討し た。 さら に小 腸腔 内に 放出 され たserotonin量も測定した。また、温阻血再灌流後の門脈血中のTNF‑a値を測定した。
3．同所性小腸移植モデルにおけるL‑Glnの効果
被 験薬 投与 後24時間 に全 小腸 を摘 出し て、60分の 温阻 血負 荷後 に小 腸移 植を行い、一週 間生 存率 を検 討した。さらに、小腸摘出時、温阻血終了直後および移植再灌流後60分における移植片内GSH量の推移を検討した。
III結果
1．小腸組織内抗酸化物質の発現
免 疫 組 織 染 色 に お い て 、 HO‑1は 新 鮮 対 照 群 お よびLR群に 比ベ 、L‑Gln群で は6時 間をピ ーク に24時間 まで 小腸 全体 特に 絨毛 、陰窩 およ び筋 層に 強く 発現 が認 められた。
また、L‑Gln群で組織内GSH値の増加も確認された。
2．小腸温阻血モデル
免 疫組 織染 色に おい て、 L‑Gln群は 阻血 後小 腸陰 窩の serotoninはLR群に 比較して多数残 存し 、小 腸内 腔へ の放 出量 もLR群に 比ベ低 値な 傾向 にあ った 。温 阻血 再灌流後の門 脈 血 内 TNF‑a値 は 、 L‑Gln群 に て 測 定 可 能 値 以 下 に 著 明 に 抑 制 さ れ た 。
3．同所性小腸移植モデル
移 植 後 生 存 率 で L‑Gln群 は 6/6と LR群 の 1/6に 比 ベ 有 意 に 延 長 が 認 め ら れ た 。
ま た 、 移 植 片 内 GSH値 は各 ポイ ント にお いて LR群 と比較 して 有意 に高 値を 維持 した 。
IV考察
従来より、¨con
diti
onallyessentialaminoacid¨であるL‑Glnの小腸組織に対する細胞保護効 果 が 報 告 さ れ 、 そ の メカニ ズム のー っと して HSPの発現 によ る細 胞保 護効 果が 指摘 されている。
本 研 究 で は HSPの 中 で も と く に 抗 酸 化 作 用 を 有 す る HO‑1に 着 目 し た 。 HOはprooxidantであるへムを分解し、同時に産生されるbiliverdinやbiliver
dinreductaseによって変換されたbilirubinはその強カな抗酸化作用によルストレス刺激からの細胞障害を抑制
す る。 また 、同 様に 産生されるCOはnitric oxideと同様なガス状メディエ一夕―であり、血 管 ト ― ヌ ス を 減 少 さ せ る こ と が 知 ら れ て い る 。 HOのう ち、 誘導 型の HO‑1はあ らゆ る
種 類の スト レス 、と くに酸化ストレスを受けた場合に強く誘導されるので酸化ストレスに対するsensitive markerとして考えられている。今回免疫組織染色やWestern blot法、ELISAなどの解析により、L―GlnがHO−1を誘導することが示された。
本 研 究 で は さ ら に 生 体内の 主要 な抗 酸化 物質 であ るGSHや小 腸の 細胞 障害 のマ ーカ ー
で あ る serotoninお よ びTNF‑aと の 関 連 性 や 移 植 後 生存率 など 多面 的な 解析 を試 みた 。
GSHの 前 駆 物 質 で あ る L‑Gln投 与 に よ り 小 腸 組 織 GSH量 は 増 加 し 、 再 灌 流 後 も LR群と比 較し てそ の相 対的 低下 が阻 止さ れた 。さ らに、 温阻血モデルにおいてL‑Glnの前投与によ り温 阻血 後の 小腸 内腔 に放 出さ れる serotonin量は抑制される傾向にあり、再灌流後LR

群では経時的に門脈血中TNF‑a活性が増加したが、L‑Gln群では測定限界値以下に著明に
抑 制 さ れた 。 さ ら に、 移 植 後 生存 率 の 著 明な 改 善 も 認めら れた。
以上より、本研究における温阻血障害を受けた小腸組織に対するL‑Glnの効果は、serotoninや TNF‑aの放 出 抑 制 なら びに 生存 率の改 善と して 認めら れた が、 donorpreconditioningとして積極的にHO‑1やGSHなどの細胞保護物質を誘導することと関連することが示唆された。
V結語
L‑Glnの経静脈的前投与により、HO‑1は小腸全体に強く発現され、GSH値も増加した。
温阻血再灌流後のserotoninおよびTNF‑aの放出が抑制され、小腸移植における生存率の改善も認められたことから、L‑Glnの前投与は安全な細胞保護物質の誘導法として今後小腸移植への応用が期待される。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査

教授
教授
教授

省
藤堂
浅香 正博
石橋 輝雄

学 位 論 文 題 名

ラット小腸温阻血再灌流障害に対する
Lー Glutamine誘導 性 Heme oxygenase‑lの効果
移 植医療に おいて小 腸は他 の固形臓 器と異 なり、外 来抗原 ・細菌により特有な免疫反応に 修飾され、構造上阻血再灌流障害に感受性が高い。腸粘膜に保護効果を示すアミノ酸とし て L‑
Glutamine(L‑Gln)
が 知ら れてお り、その 作用機 序のーっ として ストレス 蛋白質(HSP)の誘導 が考え られてい る。申請 者は種 々のHS
Pの中で もとくに抗酸化作用を有する
heme oxgenase‑l／HSP32 (HO‑1)に着目し 、L‑Glnを前投与 したラット小腸内組織におけるHO‑1の発現性 ならび に小腸温 阻血再 灌流傷害 に対する 耐性の獲得のメカニズムについて、主要な抗酸化物質であるreducedglutathione(GSH)
量との相互関係の面から検討した。
さ らに、小腸陰窩のenterochromaffin
細胞に存在し再灌流障害時に小腸内腔に放出される
serotininや、組織中マクロフアージから放出されるtumornecrosisfactor‑a(TNF‑a)などの 放出量からみた細胞傷害度および移植後生存率など多面的な解析を行った。実験動物には 6〜 8週齢のLewis
系 雄 性 ラッ ト を 用い て 、 L‑Gln液5mmo:Ukg
を 尾 静 脈よ り 投 与し た
群 を L‑Gln群と し 、 同様 に lactated Ringer液を投 与した 群をLR群、 無処置 のラット を用 いた群を 新鮮対照 群とし た。まず 、L‑Gln
投与後のHO‑1の発現の局在を免疫組織染色で検 討 し 、そ の 発 現量 を ELISA
お よびWestern blot
法 にて測 定した。 また組 織内GS
H量をcalorimetric法にて測定した。次に上腸間膜動脈(SMA)を遮断した小腸温阻血モデルにおけるL‑Glnの効 果を、 小腸腔内 に放出さ れたserotonin量および再灌流後の門脈血中のTN
F‑a値 にて検討した。さらに同所性小腸移植モデルにおいて60分温阻血負荷後の一週間生存率
お よび移 植片内GS
H量の 推移につ いて検 討した。 L・Gln投与 後の小腸 組織に おけるHO‑1の 発現量は 6時間 をピ― クに24時間 まで小腸全体特に絨毛、陰窩および筋層に強く発現が認 め ら れた 。 ま た、 組 織 内GS
Hは、L‑Glnの投 与後HO‑1と 共誘導性 に増加 し、再灌 流後もLR群と比較 して高 値を維持 した。小 腸組織 傷害度の 指標と なるserotoninはL‑Gln
投与に より抑制 される傾 向にあ り、また 温阻血再灌流後の門脈血内TNF‑a値は、測定可能値以下に著明に抑制された。温阻血後移植されたラットは、L‑Gln群では、全例一週間以上生存ー 114 ‑し 、LR群と 比較 して 著明 な改 善が認められた。L‑GlnによりHO‑1が誘導され、また生体内 の主 要な 抗酸 化物 質で ある GSHも増加し、 再灌流後もLR群と比較してその相対的低下が阻止された。 さらに、温阻血モデルにおいてL‑Glnの前投与により温阻血後の小腸内腔に放出されるserotonin
量は抑制される傾向 にあり、再灌流後LR群では経時的に門脈血中TNF‑a活性が増加 したが、L‑Gln群では測定限 界値以下に著明に抑制された。さらに、移植後生存率の著 明な改善も認められた。以上のことから、細胞毒性のないアミノ酸である
L‑Glnの経静脈的前投与は安全な細胞保護因子の誘導物質として、また移植後の粘膜再生促進物質として今後小腸移植への応用が期待された。
審査にあって、石橋教授から実験モデルの臨床的意義について、freeradicalとの関係や、HO‑1の活性・発 現部位についての質問があった。申請者は抗酸化作用についての文献、申請者自身のデ一 夕―を用いて、臨床上生体小腸移植におけるdonorpreconditioningを想定していること、今回の実験系ではradicalscavengerとしての活性は測定してはいないが、
L‑Gln投 与に より G
SHやHO‑1が 増 加し 、文 献的 には radical scavengerとし て働 くとの報 告があること、またHO‑1は小腸において強 く誘導されるが、心臓や肝臓など他の臓器に も誘 導さ れる こと など を回 答した。次いで浅香教授からL‑GlnによるHO‑1発現の機序
お よび確認方法、TNF‑aとの関係、GSHの関与 の程度にっき質問があった。申請者はHO‑1や セロ トニ ンに 関す る文 献、 申請者自身のデ一夕一を用いてL‑GlnがH
O‑1を誘導するシグ ナル 伝達 の経 路の 仮説 、今 後 の課 題と して H
O‑1発現 の検 証に はHO．1の mRNAの測定や HO‑1のノ ヅク アウ トマ ウス で の検 討が 必要 なこ と、 L‑GlnがTN
F‑aを抑制する機序につ いて 、L‑Glnの 細胞 保護 効果 には GSH、 H
O‑1やHSPな どが 相 乗的 に働 いて いる と考えられることなど回答した。最後に、藤堂からL‑Gln
投与よる保護効果の組織学的評価、L‑Glnの臨床応用につ いての質問があった。申請者はL‑Glnに関する文献、自身のデ一夕―を用いて、組織学的 にL‑Glnの前投与により小腸 の絨毛上皮の再生が促進されること、臨床上
L‑Glnは水に溶解されにくく分解が速いという問題があるが、それにはダイ・ペプタイドという方法が考えられることなどを回答した。
この 論文 は独 創的 で、 小腸 阻血再灌流障害に対するL‑Glnの保護効果とHO‑1の面から検討したことで 高く評価され、今後安全な細胞保護物質の誘導法として今後小腸移植への応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。

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