特集

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ゲノム編集の歴史と基礎
History and Basics of Genome Editing Technology

広島大学大学院理学研究科 教授

山本 卓

Takashi Yamamoto, PhD (Professor)
Graduate School of Science, Hiroshima University

キ ーワード01

CRISPR-Cas9、TALEN、Gene knockout、ゲノム編集治療

はじめにある細菌のもつ制限酵素に着目した。制限酵素は、侵入してきた外来DNA(ファージなど)を切断・不活性化するために細菌がもつ防御システムに利用されるタンパク質である。多く

ゲノム編集は、人工のDNA切断システムを利用して正確にの制限酵素は4塩基あるいは6塩基の特定の配列（認識配列）遺伝子を改変するバイオテクノロジーである。これまで狙ってを認識して、2量体となってDNAを切断する。例えば、制限酵改変ができなかった培養細胞株や生物種において、遺伝子ノックアウトや遺伝子ノックインが可能であることから、基礎から応用の幅広い分野での利用が期待されている。本稿では、
ゲノム

素のBam HIを哺乳類の細胞や植物の細胞内で働かせると、Bam HIの認識配列は染色体DNAはバラバラになってしまう。

GGATCCであり、4,000〜5,000塩基対に1箇所の頻度で現編集の開発の歴史とその基本原理を紹介すると共に、ゲノム編れるため、30億塩基対を持つヒトのゲノムはバラバラになって集の応用分野で可能性について紹介する。

しまう。そこで、より長い塩基配列に特異的に結合して切断できる酵素が人工で作れるようになれば、ヒトで2万以上ある遺02伝子の中から選んで特定の遺伝子を改変できると考えられた。

ゲノム編集技術の開発の歴史

この目的で開発されたのが、人工の制限酵素である。1996年

ゲノム編集の開発の歴史は、基盤となる人工DNA切断酵素ンからなるキメラタンパク質である(図1)4)。ジンクフィンガーはに開発された第一世代のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)
は、DNAの認識・結合を行うドメインとDNAを切断するドメイ（ゲノム編集ツールとも呼ばれる）の開発の歴史と言える。古
くから、細胞内のDNAが切断を受けると、これが原因となって突然変異が誘導されることが知られていた。放射線による変異導入は1950年以降に農作物で開始され、「ゴールド二十世紀」など多くの品種が作られてきた。目的の遺伝子に変異（点変異や欠失挿入変異）が導入された個体を、PCRを利用して効率的しかしながら、に選別する方法(Tilling法)も確立されている1)。
これらの方法では、基本的にDNAへランダムに切断や修飾が起こり、その結果、変異が導入される。また、複数の遺伝子へ同時に変異が導入されることもしばしばである。そのため、標的遺伝子の塩基配列(A, G, C, Tの４つの塩基の並び順)に応じて、特異的に切断を導入する方法の開発が重要であると考えられてきた。一方、DNAの切断を介さない改変法として遺伝子ターゲティングが開発されてきた2)。遺伝子ターゲティングは、相同組換え(HR)修復を利用したDNAの切断を介さない方法であり、大腸菌や酵母、ニワトリのDT40細胞、マウスES細胞、ヒメツ
リガネゴケなどに限られた生物種で可能な技術である。この方法は正確な改変が可能な一方、HR修復活性の低い生物種では利用できないという問題があった。
そこで研究者は、特定の塩基配列を認識・切断する酵素で

図1 様々な人工DNA切断システム
FokIはフラボバクテリウム属細菌の制限酵素であり、そのDNA切断ドメインがZFNやTALENのDNA切断ドメインとして利用される。

3

THE CHEMICAL TIMES

特集

多くの生物で転写因子のDNA結合ドメインに利用されるドメ断する（図1）。Cas9の切断には、sgRNAの結合に加えて、PAMインである。1フィンガーが3塩基を認識・結合し、複数のフィン配列と呼ばれるCas9切断のために認識する配列が必要とさ

遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

ガーを連結することによって長い配列に特異的に結合させるこれる。化膿レンサ球菌のSpCasのPAM配列は5’-NGG-3’であとができる。例えば、4フィンガーのZFNは12塩基を認識してり、黄色ブドウ球菌のSaCas9のPAM配列は5’-NNGRRT-3’で結合する。制限酵素は1組で働くので、ZFNペアで24塩基の特ある。CRISPR-Cas9を用いたゲノム編集は、2013年初頭から異性で働かせることができる。24塩基の連続する配列は哺乳次々と報告され、2014年以降は毎週のようにCRISPR-Cas9を類ゲノムであれば理論的には一箇所しか現れないため、標的遺使った論文が発表されている。

伝子のみに切断を導入することが可能になる。ZFNは分子サイズが小さいというメリットある一方で、特異性の高いZFNの作製が難しく、一部の企業に作製を頼らざるを得なかった。私の研究室では、2008年以降にZFNの作製システムを導入し、ウニ胚でのゲノム編集に取り組んできた。ZFNによる標的遺伝子の切断によって蛍光遺伝子を挿入し、初期胚で骨を作る遺伝子の発現をモニターすることに成功している5)。

03

ゲノム編集による遺伝子改変

細胞内のDNAは、自然放射線や化学物質などによって切断を受けるだけでなく、DNAの複製においても切断されることが2010年には、米国のグループから第二世代のゲノム編集知られている。切断されたDNAは、そのままにしておくと遺伝ツールとしてターレン（TALEN）が発表された6)。ZFNに比べ子が分断された状態となり致命的である。そのため、細胞内でると格段に作製が簡便であり、切断特異性が高いことも特徴

は、切断されたDNAは速やかに修復される。高い確率でよってである。TALENは植物病原細菌キサントモナスが作る転写因正確に元通りにつなぎ合わされる一方で、修復のエラーが起こ

子様エフェクター（TALEタンパク質）を利用した人工制限酵素

る場合がある。この修復エラーは、疾患の原因になる可能性がである。TALEタンパク質には、34アミノ酸残基を単位とするあるが、品種改良や生物の進化の原動力となっている。

DNA結合リピート(TALEリピート)が存在し、この部分で標的ゲノム編集は、TALENやCRISPR-Cas9などのゲノム編集遺伝子の塩基配列と結合する（図１）。TALEリピートの繰返し

ツールによる標的遺伝子の切断とその修復エラーを利用した数は、TALENでは15〜20と長いので、一組で作用させる場合技術である（図2）。細胞内でツールを導入することによって、目30〜40塩基の標的配列を認識して切断させることが可能で的の遺伝子の切断を繰返し、修復エラーを誘導し遺伝子を破ある。私の研究室では、アミノ酸配列の改変によって、高活性型壊する（遺伝子ノックアウト）。また、切断箇所に挿入する外来TALEN(Platinum TALEN)を開発し、様々な生物種での高効DNAを入れておくと切断箇所に高い確率で外来DNAを挿入率での改変を報告した 。現在では、モジュールライブラリーをすることが可能である（遺伝子ノックイン）。これらゲノム編集使って3日間でPlatinum TALEN構築することが可能である。

ツールを利用した遺伝子改変は、ゲノム編集とよばれる。後者

7)

しかし、作製する数にはよるが、一からTALENを作製するとなの遺伝子ノックインは、外来DNAを挿入するので、遺伝子ノッると、かなりの労力を必要とする。そのため、TALENを使った研クイン個体は遺伝子組換え体となる（培養細胞は組換え体から究を考える場合は、作製に慣れている研究グループと共同研究除外される）。

で進めることを推奨している。
TALENの開発によってゲノム編集は使いやすくなってきた
ものの、依然として作製には煩雑な作業が必要とされた。このような状況は、2012年のCRSIPR-Cas9の開発によって大きく変わった。CRISPR-Cas9は、簡便かつ高効率なことに加えて、基礎研究であれば自由に使うことができた。そのため、2013年からはZFNやTALENに変わってCRISPR-Cas9が急速に広がった。CRISPR-Cas9は、細菌の獲得免疫機構を利用したシステムである。米カリフォルニア大学バークレー校のジェニファー・ダ
ウドナ博士と独マックスプランク研究所のエマニュエル・シャル
パンティエ博士のグループが共同開発し、2012年にScience誌に発表した8)。同年リトアニアのヴィリュニュス大学のヴィル
ギニユス・シクスニス博士もCRISPRシステムでのDNA切断をウイルス（バクテリオファージとよば発表している9)。細菌には、れる）が感染するが、このウイルスを不活性化するのが獲得免疫機構として働くCRISPR-Cas9システムである。細菌は、感染したウイルスのDNAをCRISPR遺伝子座へ取り込み、再び感染

図2 ゲノム編集による遺伝子改変した場合にCRISPR遺伝子座から転写される短鎖RNA（シングルガイドRNA：sgRNA）
を利用してウイルスDNAを切断する。

4

上述のゲノム編集には、複数のDNA修復経路が関与する。

ダウドナとシャルパンティエは、sgRNAとCas9ヌクレアーゼ

遺伝子ノックアウトでは、DNAの修復経路には切断末端を保護を利用して試験管内において標的遺伝子を切断できることをし、末端を連結する非相同末端結合(NHEJ)修復のエラーが利示したのである。sgRNAは標的遺伝子と20塩基長で結合し、用される。NHEJ修復エラーでは多くの場合、数塩基から数十sgRNAと複合体を作るCas9ヌクレアーゼがDNA二本鎖を切塩基の欠失が誘導され、遺伝子の読み枠にずれが生じ、正常なTHE CHEMICAL TIMESな開発につながることは言うまでもない。国内外において、組換えによって修復される。これにより、正確な改変や外来遺伝様々な農水畜産物でのゲノム編集が競って進められている。

子のノックイン（蛍光遺伝子の挿入など）が可能となる。

国内では穂の多いイネや毒のないジャガイモ10)など農作物で04（SIP）で進められている。水畜産物では、筋肉細胞の増殖を抑遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―

農作物でのゲノム編集は、食料問題などの解決のため重要端の削り込みが起こる一方で、鋳型となるDNAを介した相同特集タンパク質が合成できなくなる。遺伝子ノックインでは、切断末のゲノム編集が内閣府の戦略的イノベーション創造プログラム

培養細胞や生物個体でのゲノム編集

えるミオスタチン遺伝子を破壊した肉付きのよいタイ（マッスルマダイ）が京都大学の木下らによって作出され、広島大学の堀内らは、アレルゲン物質の原因遺伝子をノックアウトしたニワゲノム編集技術（特にCRISPR-Cas9）の開発によって、これまトリを作出している。

で遺伝子改変ができなかった培養細胞、動物や植物での遺伝子ノックアウトや遺伝子ノックインが可能となった。培養細胞の遺伝子改変は簡単に思われがちだか、ゲノム編集以前の技術を使った場合、効率的な改変ができる細胞種は限られていた。
マウスES細胞やニワトリDT40細胞は、相同組換えによって目06

ゲノム編集の医学分野での利用的の遺伝子を薬剤耐性遺伝子に置き換え、遺伝子を破壊する

ゲノム編集は、医学研究および創薬において大きく期待され遺伝子ターゲティングが可能な数少ない細胞であった。原理的ている。医学研究では、培養細胞や動物を用いた疾患モデルのにはこの方法によって、薬剤耐性を指標としてノックイン細胞を作製にゲノム編集技術は重要である。単に原因遺伝子を遺伝子得ることが可能であるが、HR修復活性が低い細胞種での遺伝ノックアウトするだけでなく、疾患の原因変異を正確に再現する子ノックイン細胞の取得はこれまで困難であった。この問題をことも最近では可能となってきた。特に人工多能性幹細胞(iPS)解決したのがゲノム編集である。ゲノム編集ツールによるDNA細胞での疾患モデル細胞の作製や、疾患患者から樹立したiPS切断は、相同組換え活性を上昇させ、現在多くの細胞種での遺細胞での変異の修復において、ゲノム編集の利用価値は高い。

伝子ノックインを実現している。さらに、ゲノム編集ツールの発iPS細胞で疾患変異を再現することによって、疾患の発症メカニ現ベクターあるいはタンパク質の導入によって多くの細胞種にズムを解明することも可能となる。これらの細胞を利用した低おいてNHEJを介した遺伝子ノックアウトが報告されている2)。

分子化合物スクリーニングを行うことによって、今後薬の候補最近では単なる遺伝子破壊と挿入に加えて、同じ染色体を2箇となる物質を見つけ出すことが効率的に進められると期待され所切断することによって大きな欠失変異を導入できることが確る。

認されている。また、異なる染色体を同時に切断することによって、がん細胞株で転座が誘導されることも報告されている。
動物個体でのゲノム編集は、基本的には受精卵へゲノム編集ツールを導入することによって可能である。例えば、マウス
であれば、ゲノム編集ツールの形状は、DNA、mRNAあるいはゲノム編集を利用した遺伝子治療は、既に米国や中国で進められている。ゲノム編集治療は、生体内(in vivo )ゲノム編

11)（図3）。
集と生体外(ex vivo )ゲノム編集の２つに分けられる

in vivo ゲノム編集は、ゲノム編集ツールをウイルスベクターやナノ粒子などを利用して体内に直接導入する方法である。米国

タンパク質のどれを使っても一定の効率で改変が可能である。

では、血友病やムコ多糖症に関して、ウイルスベクターを介し特に、遺伝子ノックアウトは簡便かつ高効率であり、CRISPR-て対象タンパク質をコードする遺伝子を肝臓でノックインするCas9を使ったノックアウトマウス作製がES細胞を利用したマウことによって、不足したタンパク質を血中へ分泌させる方法をス作製に置き換わっている。これまで1年近くかかっていたES細胞を使った遺伝子ターゲティングが、今ではCRISPR-Cas9を使って数ヶ月から半年で可能である。

05

ゲノム編集の産業利用

ゲノム編集の利用が期待される産業分野は、生物工学、農水畜産学や医学など幅広い。微生物は、様々な機能性物質を産生するが、産業利用においてはその生産量や性質をコントロールすることが必要になる。この目的では産業微生物において自在に遺伝子改変を加えることが重要である。
しかしながら、大腸菌や酵母などのモデル微生物では、遺伝子改変は自在であるものの、産業微生物については必ずしも自在な改変法は確立していない。そのため、ゲノム編集ツールの導入やゲノム編集効率化などの技術開発が今後必要と考えられる。

図3 ゲノム編集を利用した遺伝子治療の戦略
文献2)から引用5

THE CHEMICAL TIMES

特集行っている。一方、
ex vivo ゲノム編集は、取り出した細胞をゲノム編集によって改変し、体内へ移植する方法である。HIVの共受容体であるCCR5遺伝子を遺伝子ノックアウトすることによっ遺伝子工学 ―ゲノム編集と最新技術―て作製したT細胞を移植することで、HIVウイルス量が低下する効果が得られている。この方法のメリットは、正確にゲノム編集ができた細胞を選別することが可能な点にある。最近ゲノム編集では予期せぬ変異導入（オフターゲット作用）や大きな欠失が起きる可能性について指摘されている。これらの問題を解決するため、オフターゲット作用を低減させた様々なCas9ヌクレ
オフターゲット変アーゼの変異体が開発されている12)。さらに、異導入の有無をゲノムワイドに評価する方法（GUIDE-seq法13）やDigenome-seq法14)など）も確立されている。

072） 山本卓, ゲノム編集の基本原理と応用 (裳華房, 東京, 2018).
3） Y. G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
93(3), 1156-1160 (1996).
4） M. Christian, T. Cermak, E. L. Doyle, C. Schmidt, F. Zhang, A. Hummel,
A. J. Bogdanove, D. F. Voytas, Genetics 186(2), 757-761 (2010).
5) H. Ochiai, N. Sakamoto, K. Fujita, M. Nishikawa, K. Suzuki, S. Matsuura,
T. Miyamoto, T. Sakuma, T. Shibata, T. Yamamoto, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 109(27), 10915-10920 (2012).
6） T. Sakuma, H. Ochiai, T. Kaneko, T. Mashimo, D. Tokumasu, Y. Sakane,
K. Suzuki, T. Miyamoto, N. Sakamoto, S. Matsuura, T. Yamamoto, Sci
Rep 3, 3379 (2013).
8） M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E.
Charpentier, Science , 337(6096), 816-821(2012).
9） G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys, Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 109(39), E2579-E2586 (2012).

おわりに

ゲノム編集は、開発から数年でライフサイエンス分野では必要不可欠な技術となってきた。基礎研究目的であれば世界中に配付される仕組み（オープンイノベーション）が整っており、基礎研究では誰もが自由に使える。国内のゲノム編集技術開発は遅れ気味ではあるが、新しいゲノム編集ツールも開発されつつあり、日本の巻き返しには多くの研究者の参入が不可欠である。筆者らは、国内のゲノム編集の研究推進および情報共有を図る目的で、平成26年に日本ゲノム編集学会を設立した。1人でも多くの若い研究者がこの技術に興味を持って導入してくれることを願っている。

6参考文献
1） C. M. McCallum, L. Comai, E. A. Greene, S. Henikoff, Nat. Biotechnol .
18(4), 455-457 (2000).

10）S. Sawai, K. Ohyama, S. Yasumoto, H. Seki, T. Sakuma, T. Yamamoto, Y.
Takebayashi, M. Kojima, H. Sakakibara, T. Aoki, T. Muranaka, K. Saito,
N. Umemoto, Plant Cell 26(9), 3763-3774 (2014).
11) D. B. T. Cox, R. J. Platt, F. Zhang, Nat. Med. 21(2), 121-131 (2015).
12) H. Mitsunobu, J. Teramoto, K. Nishida, A. Kondo, Trends Biotechnol .
35(10), 983-996 (2017).
13) S. Q. Tsai, Z. Zheng, N. T. Nguyen, M. Liebers, V. V. Topkar, V. Thapar,
N. Wyvekens, C. Khayter, A. J. Iafrate, L. P. Le, M. J. Aryee, J. K. Joung,  
Nat. Biotechnol. 33(2), 187-197 (2015).
14) D. Kim, S. Bae, J. Park, E. Kim, S. Kim, H. R. Yu, J. Hwang, J. I. Kim, J. S.
Kim. Nat. Methods 12(3), 237-243 (2015).