博 士 （ 医学 ） 菊地 弘展

学位論文題名NF‑KB regulatesthestabilityandactivi
tyofp73by
inducing its proteolytic degradation througha ubiquitin― dependent proteasome pathway(NF‑ぼBによるユビキチン化を介したp73蛋白の分解と活性の調節機構の解析）

学 位論文内容の要旨

く背景及び目的＞
p73はアポトーシス誘導活性を持つp53ファミリーに属する核内転写因子である。一方、N
FーKB
は抗癌剤刺激あるしゝは放射線照射に起因するDN
A損傷に応答して、極めて早期に活性化される細胞生存因子であるが、細胞の生 と死の制御機構における両者の機能的相互作用の有無については不明である。今回、
我々はNF―KBがp73のユピキチン化を亢進させ、プロテアソーム依存性の分解を促進することによって、そのアポ卜ーシス誘導能を制御する機能を持つことを明らかにした。
く材料、方法＞
実 験 に は MEF、 COS7お よ び H1299の 3種 類 の 細 胞 株 を 用 い た 。 培 養 細 胞 へ の 遺 伝 子 導 入 はL
ipofectoA
MINE
2000およびFuG
ENE6を用いた。内在性のNF―1
くニBを活性化させる目的で、細胞をTN
F‑ocで処理した。p65△Cdeletionmutantの作成にっいては、

forwardprimer

5 ―TAGAAIICGGGACGATCTGTTTCCCCTCATC‑3'とreverseprimer
5 一T
T皿AGTTA
A
AGGA
CTG
GGGC
AGAGGA
CGG―3を 用い てPCRによ り増 幅した。プライマー配列の下線部分 にはE
coRIおよびXholの制限 酵素部位を導入し、PCR産物を両制限酵素によって消化し、pC
MV−HA
発現プラスミドの当該領域へ導入した。TNFー彊で処理した細胞および各種発現プラスミドを遺伝子導入した細胞を用いて、immuno
blott
ing法、免疫沈降実験、RT―PCR法、免役染色法、ルシフェラー ゼレポーター解析、FA
C
S解析、コロニーフオーヌーショ
ン ア ッ セ イ を 駆 使 す る こ と に よ っ て NF‑KBと p73の 機 能 的 相 互 作 用 の 解 析 を 行 っ た 。
く結果＞
NF―KB複合体を過剰発現させた細胞では、p73aの蛋白質レベルでの発現減少が容量依存的に検出された。
ー方で、p73aの転 写レベルでの変化は認められなかった。この現象はp73aに特異的であり、p53
ファミリーに属するp53、p63aおよびp73ロでは観察されなかった。TN
Fーa
処理により内在性のNFーKBを活性化させることで も同様に内在性のp73aの蛋白質レベルでの減少が認められたが、転写レベルでの発現量の変化は検出 されなかった。さらに、TNF‑a,処理によって内在性のNF―KBを活性化させた条件下では、野生型のME
F細胞においてはp73aの蛋白質 レベルでの発現低下が認められたが、NF−KB複合体のサ ブュ ニッ トで ある p65をノックアウトしたME
F細胞ではp73aのタンパク質の発現量の 変化は観察さー426―れなかった。過剰発現系を用いた実験から、NF‑KB複合体の共発現により、ユピキチン化の亢進を伴うp73の半 減期の 大幅な短 縮が認められた。またN
F‑KB複合体によるp73の転写活性能ならびにアポトーシス誘導能の顕著な阻害が検出された。以上の実験結果から、NFー佃の活性化に伴うp73の抑制作用は、転写レベルでの発現調節によるものではなく、ユニキチン／プ口テアソーム系を介した分解システムによる可能性が示唆された。一方、免疫沈降実験の結果からはN
F−KB複合体とp73aとの複合体形成は認められず、NF−KB複合体との結合によりp73aの分解が誘導されている可能性は低いと考えられた。そこで我々はp65の転写活性化能に着目し、p65のCOOH一末端に存在するTAD（転写活性化ドメイン）を削除し、転 写活性 化能を消 失させたp65△Cを作製した。興味深いことに、野生型のp65を過剰発現させた細胞で はp73aの分 解が検出 された が、p65△Cはp73aを分解する機能を失っていた。これらの実験
結果はN
F−KB複合体によって引き起こされるp73dの分解は、その転写因子としての活性に依存することが判明した。従って、NFーKB複合体はその標的遺伝子群の活性化を介してp73の分解を促進することによって、細胞の生と死を制御する可能性が示唆された
く考察＞
今回、我々は世界に先駆けてN
F―KBがその転写活性化能を介してユピキチン／プ口テアソーム依存性のp73の分解を促進することを明らかにした。従って、DN
A損傷に応答したN
F−KBによる抗アポトーシ
ス活性は、p73の選択的分解消化に起因することが示唆された。
DN
A損傷に応答して、非受容体型チ口シンキナーゼであるc一Ablによるp73のりン酸化を介したその安定化は 、p73の活性化 の仕組みのーつである。一方で、cーAblはIKBaのりン酸化を介してその安定性を増加させることによって、NF−KBの核内への移行および活性化を抑制することが示されている。また、シスプラチンによるアポ卜ーシス誘導過程において、NF―KBの転写活性化能の抑制とp73の安定性が相関していることを示唆する報告も存在する。さらに、DNA
傷害に応答してc―Ablが活性化されるのと対照的に、TNF‑aはc一Ablに影響を与えない。従って、NF−KBによるp73の制御機構にcーAblが重要な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性が あ り、 今 後の 研 究課 題と な ると 思 われ る 。
今回、我々は免疫沈降法によってNF―KB複合体とp73との共沈を検出することができなかったことから、NF−KBは間接的なメカニズムによりp73を制御している可能性が示唆された。転写活性化能を欠いたp65△Cを用いた実験から、NFーKBの転写活性化能がp73の分解に必要であることが示唆された。NFーKB
によるp73の分解誘導がユビキチン化を介することから、NF−KBの直接の標的遺伝子群の中にp73に対するE3ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子が存在する可能性が示唆された。最近、HECTーtypeのE3ユビキチンリガーゼのーつであるItchがp73と結合し、その分解を促進することが報告された。我々の実験結 果と同 様にItchはp53に対しては影響を及ぼさないことも報告された。Itchのプ口モーター領域に、予測されるNF‑KBの結合サイトがいくつか存在するが、我々の予備実験によればN
F―KBの過剰発現あるいはTNF‑a処理によるNF―KBの活性化は、Itchの発現昂進には結び付かなかった。NF―KBの直接の標的 遺伝子 群の網羅 的解析を用いた新たなp73のE3ユピキチンリガーゼの同定が今後の重要な研究課題のーつであると考えられる。

‑ 427

学位論文審査の要旨

主 査 教 授 浅 香 正 博
副 査 教 授 畠 山 鎮 次
副 査 教 授 藤 堂
省

学位論文題名N
F‑KB regulat
esthestabilityandac
tiv
ityofp73byinducing its proteolytic degradation througha ubiquitin― dependent proteasome pathway(NF‑MBによるユビキチン化を介したp73
蛋白の分解と活性の調節機構の解析）

p73はアポトーシス誘導活性を持つp53ファミリーに属する転写因子である。一方、NF―KB
は抗癌 剤刺激 および放 射線照射に起因するDNA損傷に応答して、極めて早期に活性化される細胞生存因子であるが、細胞の生と死の制御機構における両者の機能的相互作用の有無につい ては不 明である 。本研究ではNF−KBとp73との問の相互作用の解明を目的とした。
NF−KB複合体を遺伝子導入することによりp73aの蛋白質レベルでの減少を認めたが、転写レベル での変 化は認め なかった。この現象はp53ファミリーの中でもp73aに特異的であった。TNF‑aによ り内在性 のN
F−KBを活性化させることでも内在性のp73aの蛋白質レベルでの漸減 を認め 、転写レ ベルで は変化が なかっ た。この現象はp65をノックアウトしたM
EF細胞では認めなかったことから、NF−KB依存性に起こっていることが確認された。過剰発現系の実験から、N
F―KB複合体により、ユピキチン化の亢進を伴うp73の半減期の短縮が認められた 。また NF―KB複合 体によりp73の転写活性能ならびにアポトーシス誘導能の阻害が検出された。免疫沈降実験の結果からはNF−KB複合体とp73aとの間に複合体形成は認められなか った。 興味深い ことに p65のC末端に 存在す る転写活性化ドメインを削除し、転写活性化 能を消 失させた p65△Cを強 制発現さ せた場 合にはp73aの発現低下は起こらなかった。従って、NF−KB複合体はその標的遺伝子群の活性化を介してp73の分解を促進することによって、細胞の生と死を制御する可能性が示唆された。
公開発表にあたり副査の畠山教授より1） NF‑KBにより誘導され、p73をユピキチン化する
ものの候補の有無について、2） itchのプロモーター領域におけるコンセンサス配列の有無について、3） p73と結合する蛋白でp73の分解に関係するものについて、の質問があった。
これらの質問に対し1）

Itchがp73のE3ligaseであるという報告を最近認めたので、Itchのプラ イマー を作製し N
F−KBを強 制発現し た場合 とTNFaで活性化させた場合でR
T‑PCRを―428―施行したが、残念ながらItchのmRNAには変化を認めなかっだ2冫Itchのプ口モーター領域には、予想されるNF‑KBのコンセンサス配列がいくっか存在する3） RanB
PMがp73のCOOH

末 端と結 合し、p73のユ ピキチン 化を阻 害し分解を抑制する。p53のE3ligaseであるM
DM2はp73のN
H2
末端 に結合 し転写活 性を抑 制するこ とはでき るが、 ユピキチ ン化は起こさないことが過去の論文から知られているとの回答があった。

主査の浅香教授より1） NF−KBのノックアウトマウスの有無、2） TNFaの細胞に与える影響に ついて 、3)p73が 抑制さ れること により 腫瘍の増生にっながるか、4）NF−KBとp53との関係について、の質問があった。これらの質問に対し、1）

p65のノックアウトマウスは肝細胞のアポトージスにより胎生期に死亡してしまう。p50のノックアウトマウスは外見は正常 で、少 なくとも 1年 は生存可 能だが、 ある種 の細菌やウィルスに対する免疫系の異常が存在する

2）

だ

p73が分解されることによりそのアポトーシス誘導能が阻害され、結果的に腫瘍細胞

3）

TN
Faを処理したことによる細胞死は存在しないことを予備実験として確認しが生存し、腫瘍増生にっながると考えられる4冫

今回の我々の実験からはN
F―KBはp53の安定性にも機能にも影響を及ぼさないという結果を得た。しかし、過去の文献からは、N
F―KBがp53を 抑制する 、影響 を及ばさ ない、 共にアポトーシスに働くとの様々な報告があり、詳細は不明であるとの回答があった。

最後に副査の藤堂教授から、1）他のN
F−KB
ファミリーとp73との関係について、2）p73の今までの知見、今後の展望について、の質問があった。これらの質問に対し、1）

NFーKBとp73の相互作用については現在までほとんど報告が無く、文献的にも考察は難しい。また、
今 回の実 験を行う に当た ってまず 代表的 なNF‑
佃 のへテロ 二量体 であるp65/p50をもちいて 実験を 行ったの で、他 のN
F−KB
ファ ミリー とp73との関係については今回は検討できなかっだ2）

p73はp53と同様に細胞増殖抑制能やアポトーシス誘導能を有している。p73はp53と異なりほとんど変異を認めることはなく、細胞内では普段はきわめて発現量が低いが、DNA damageが細胞 に加わるとその発現量が増加しそのアポトーシス誘導活性が増加する。
p73はp53と共同 して、もしくは単独でアポトーシスを誘導することができる。また変異型の p53はp73と結合 しその機 能を抑 制するた め、特 にp53の 欠失、 変異した 腫瘍細胞 ではp53の代 わりとし て機能している可能性がある。またp73が抗ガン剤の耐性に関与していると の 報 告 も あ り 、 今 後 の さ ら な る研 究 に期 待 し たし ゞとの 回 答が あ っ た。

本論文は 、NF−KB複合体がその標的遺伝子群の活性化を介してプ口テアソーム依存性のp73の分解を促進することによって、細胞の生と死を制御する可能性を示した興味深い報告であり、臨床医学への今後の展開が期待される。
審査員一 同は、こ れらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併 せ 申 請 者が 博 士 （医 学 ） の学 位 を 受け るのに 充分な資 格を有す るもの と判定し た。

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