評価報告書

エ ス ト ロ ゲ ン 受 容 体 （ ER））結合親和性化学物質の検出のための、
ヒト組み換えエストロゲン受容体（hrER））in vitro 試験法に関する性能準拠試験法ガイドライン（TG493））

受容体結合試験資料編纂委員会

令和 2 年（2020 年）2 月 18 日

17

受容体結合試験資料編纂委員会
小野敦 （委員長：岡山大学）

井 口 泰 泉 （横浜市立大学）
青 柳 智 子 （独立行政法人 製品評価技術基盤機構）

8北嶋聡 （国立医薬品食品衛生研究所）

児玉進 （岡山大学）

2

略語
CAB:

Chemical Advisory Board

CERI:

Chemicals Evaluation and Research InstituteCV:

Coefficient of Variation

DBP:

Di-n-Butyl Phthalate

E2:17β-estradiol

EPA:

Environmental Protection Agency

ER:

Estrogen Receptor

ERα:

Estrogen Receptor AlphaERβ:

Estrogen Receptor BetaFW:

Freyberger-Wilson

GLP:

Good Laboratory PracticehERα:

Human Estrogen Receptor Alpha

hrER:

Human Recombinant Estrogen Receptor

hrERα:

Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha

IC50:

The half maximal effective concentration of an inhibitory test chemical

ICCVAM:

Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

LBD:

Ligand Binding Domain

MMTV:

Mouse Mammary Tumor Virus

NICEATM:NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological
Methods

OECD:

Organisation for Economic Co-operation and Development

OECD CF:

Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters

OECD EDTA TF: Endocrine Disruptor Testing and Assessment Task ForceOTES:

Octyltriethoxysilane

PBTG:

Performance Based Test Guideline

PS:

Performance Standard

RLU:

Relative Light Units

SD:

Standard Deviation

STTA:

Stably Transfected Transactivation Assay

TA:

Transactivation

TG:

Test Guideline

VMG-NA:

Validation Management Group for Non-Animal testing

3

9

要旨
性能標準（PS）に基づく性能準拠試験法ガイドライン（PBTG）として経済協力開発機構（OECD）で承認された ER 結合親和性化学物質の検出のための、ヒト組み換えエストロゲ
ン受容体 （hrER） in vitro 試験法1, 2) は、in vitro で化学物質のエストロゲン受容体（ER）に対する結合活性を生体内リガンドであるエストラジオールとの競合結合活性を指標として検出するスクリーニング試験法であり、化学物質の ER への作用による生体反応の起点である ER 結合活性を評価することが出来る。本 PBTG には、国際的な多施設バリデー
ション研究により、試験法の妥当性と信頼性が証明された 2 種の試験法 （FWアッセイおよび化学物質評価研究機構 （CERI）アッセイ） が参照試験法として収載されている。また、
本 PBTG には、試験の目的である化学物質の hrER 結合親和性を検出する類似試験法の開発とバリデーション研究のための PS が設定されており、PS を満たすことが示された新規の類似試験法を追加することが可能である。本試験法に収載されている 2 つの試験法についての再現性や信頼性および試験法としての科学的妥当性と規制試験法としての妥当性については、米国環境保護庁 （米国EPA） の主導により日米欧 6 施設の参加 （CERIアッセイについてはうち 5 施設が参加）による国際バリデーション研究の結果をもとに、OECD 第三者評価により評価され、OECD 内分泌かく乱物質の試験と評価に関するタス
クフォース（OECD EDTA TF）で提案された OECD 内分泌かく乱物質の試験法と評価に関する概念枠組み（OECD CF）のレベル 2 に該当する内分泌かく乱物質のスクリーニング評
価に有用な in vitro 試験法として OECD TG493 が成立した。本試験法の課題として、本試
験法は化学物質の ER への結合活性を評価できるのみであり化学物質のアゴニスト・ア
ンタゴニスト活性を区別することは出来ず、本試験法で陽性と判定される化学物質が生体内でどのような影響を示すかについては評価できないという点があげられる。本試験
法はあくまでもスクリーニング法であり、ER を介して惹起されると想定される有害影響を確定評価する試験法と組み合わせて評価を行うことで今後の化学物質管理に大きく貢献すると考えられる。

104

1. 本試験法の科学的妥当性と規制試験法としての妥当性
ER 結合親和性化学物質の検出のための、hrER in vitro 試験法 1, 2) に関する PBTGは、invitro で化学物質の ER に対する結合親和性を検出するスクリーニング試験法である。本
試験法ガイドライン（TG）は、OECD のガイダンス文書 「Guidance Document on the Validation
and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment」3) に規定されるバリデーション研究の原則に従った新たな類似試験または改良試験の開発を促進する PBTG であり、参照試験法として国際的な多施設バリデーション研究により1) 試験法の妥当性と信頼性が証明された下記の 2 つの機序および機能的に同等の試験法が示されている。
・完全長ヒト組み換え ERα を用いた Freyberger-Wilson（FW）の in vitro hrERα 結合試験（以下、FWアッセイ）1)・ヒト組み換えリガンド結合ドメイン（LBD）タンパク質を用いた化学物質評価研究機構（CERI）の in vitro hrERα-LBD 結合試験（以下、CERIアッセイ）1)
本 PBTG には、試験の目的である化学物質のヒト組み換えヒトエストロゲンアルファ受容体（hrERα）結合親和性を検出する類似試験法の開発とバリデーション研究のためのPS 2) が設定されており、現行の PBTG を適時修正して新規類似試験法を追加することが可能である。ただし、類似試験法の追加は PS に示された参照物質 23 物質（表1-1）を用いたバリデーション研究により再現性や信頼性の基準を満たすことを示して合意された後にのみ可能である。
環境中や市場に流通する多くの化学物質が内分泌系に影響する生物活性を有することが示されており、そうした化学物質による内分泌系のかく乱による潜在的なヒト健康や環境に対する影響が指摘されている。OECD では、1998年に重点活動項目の 1 つとして、内分泌かく乱作用を有する可能性のある化学物質のスクリーニングおよび試験のためのTG の整備のため、OECD EDTA TF を設置し、化学物質の内分泌かく乱作用評価のための試験法を OECD CF として整理し、既存 TG の改訂と、新規 TG の整備を進めている。
OECD CF は、それぞれ生物学的複雑性の異なる 5 つのレベルから構成されており、本 TG
は、レベル 2 の 「機構に関する情報をもたらす in vitro 試験」 に示されている該当するホルモン受容体結合試験法である。化学物質の内分泌かく乱作用のスクリーニングに有用な指標として、OECD CF では化学物質のホルモン受容体との結合性または受容体を介した内分泌機能の活性化および阻害を測定する方法が示されている。エストロゲン活性*に関する試験法としては†、これまでに in vitro エストロゲン受容体転写活性化試験法（OECDTG455）や in vivo 試験法として子宮肥大試験（OECD TG440）が確立されているが、ER を介した生体反応の起点となる化学物質と受容体リガンド結合部位への特異的相互作用の簡便で迅速なスクリーニング法として組み換えタンパク質を用いた in vitro 結合試験法の開発が進められてきた。
*エストロゲン活性：化学物質がエストロゲン受容体結合において 17β-エストラジオールを模す能力。

hERα への結合は本 PBTG で検出することができる。

511

表 1-1hrERα結合試験(TG 493)の性能標準の参照物質 23 物質

No.

Chemical Name

CAS RN

Expected
Response #Concentration Range
Tested(M)117β‐Estradiol

50‐28‐2

Strong Binder

1x10‐11 – 1x10‐6

BinderBinderSteroid217α‐ethynyl estradiol

57‐63‐6

Strong Binder

1x10‐11 – 1x10‐6

BinderBinderSteroid3

Diethylstilbestrol (DES)

56‐53‐1

Strong Binder

1x10‐11 – 1x10‐6

BinderBinder4

Meso‐Hexestrol

84‐16‐2

Strong Binder

1x10‐11 – 1x10‐6

BinderBinder5

Zearalenone

17924‐92‐4

Strong Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder6

Tamoxifen

10540‐29‐1

Strong Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder7

Norethynodrel orModerate Binder

3x10‐9 – 30x10‐4

BinderBinder8(Norethindrone)
Genistein

68‐23‐5(68‐22‐4)aHydrocarbon,(Cyclic), Phenol
Hydrocarbon(cyclic), Phenol
Hydrocarbon(heterocyclic),
LactoneHydrocarbon,(Cyclic)
Steroid

446‐72‐0Moderate Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder9Equol

531‐95‐3Moderate Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder10Butyl paraben (n‐butyl‐4‐ 94‐26‐8hydroxybenzoate)
Nonylphenol (mixture)
84852‐15‐3

Weak Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder

11
12

a

d

FW AssayClassification

CERI Assay
Classification

Weak Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinderAlkylphenol,

Weak Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinderOrganochlorine
Steroid,
Nonphenolic
Phenolo,p’‐DDT
5α‐ dihydrotestosterone

521‐18‐6

Weak Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder14

Bisphenol A (BPA)

80‐05‐7

Weak Binder

1x10‐10 – 1x10‐3

BinderBinder15
16

4‐n‐heptylphenol
Kepone (Chlordecone)

1987‐50‐4
143‐50‐0

Weak Binder
Weak Binder

1x10‐10 – 1x10‐3
1x10‐10 – 1x10‐3

Equivocal
BinderBinderBinder17
18

Enterolactone* Di‐n‐butyl phthalate(DBP)
Octyltriethoxysilane

78473‐71‐9
84‐74‐2

Weak Binder
Non‐binder

1x10‐10 – 1x10‐3
1x10‐10 – 1x10‐4

BinderNon‐Binder*

BinderNon‐Binder*

20

Corticosterone

21

Benz(a)anthracene

22

Progesterone

23

AtrazineC

C

C

Hydrocarbon(heterocyclic),
Flavonoid
Phytoestrogen
Metabolite
Paraben789‐02‐6

13

19

MESH Chemical Class

2943‐75‐1

Non‐binder

1x10‐10 – 1x10‐3

Non‐Binder

Non‐Binder

Alkylphenol
Hydrocarbon,(Halogenated)
Phytoestrogen
Hydrocarbon(cyclic), Ester
Silane50‐22‐6

Non‐binder

1x10‐10 – 1x10‐3

Non‐binder

Non‐Binder

Steroid

1x10‐10 – 1x10‐3

Non‐Binder

Non‐Binder

Aromatic
Hydrocarbon
Steroid

56‐55‐3

Non‐Binder

57‐83‐0Non‐binder

1x10‐10 – 1x10‐4

Non‐Binder

Non‐Binder

1912‐24‐9

Non‐binder

1x10‐10 – 1x10‐4

Non‐Binder

Non‐Binderb

Heterocyclic
compound

Product Class
Pharmaceutical,
Veterinary Agent
Pharmaceutical,
Veterinary Agent
Pharmaceutical,
Veterinary Agent
Pharmaceutical,
Veterinary AgentNatural Product

Pharmaceutical,
Veterinary Agent
Pharmaceutical,
Veterinary AgentNatural Product

Natural ProductPreservative
Intermediate
CompoundInsecticide
Natural ProductChemicalIntermediate
Intermediate
Pesticide
Natural Product
Plasticizer,
Chemical
Surfacemodifier
Natural ProductIntermediate
Natural Product
Herbicide

Abbreviations: DES, diethylstilbestrol; HPTE, 2,2‐bis(p‐hydroxyphenyl)‐1,1,1‐trichloroethane, an intermediate by‐product of methoychlor; o,p’‐DDT, 1,1,1‐
trichloro‐2‐2‐[o‐ chlorophpenyl]‐2‐[p‐chlorophenyl]ethane#: The expected response for each chemical was based upon published data from in vitro studies and were reviewed by a Chemical Advisory Board whose
members were not directly associated with the validation study for the FW and CERI hrER Binding Assays. Chemicals were selected to represent multiple
chemical classes and cover a range of binding affinity potencies commonly associated with ER agonist activity. When tested in the FW or CERI hrER Assays, theLogIC50 for strong binders typically ranged from ‐ 9 to ‐7 (M), moderate ‐7.1 to ‐6.0 (M) and weak < ‐5.9 (M).
*: The use and classification of Di‐n‐butyl phthalate (DBP) as a non‐binder was based on testing up to 10‐4 M because the chemical was observed to be insolubleat 10‐3M (e.g. turbidity) in some laboratories during the pre‐validation studies. When DBP was tested up to 10‐3M as a coded chemical, it was classified as‘equivocal’ due to displacement of (3H)17b‐estradiol at highest in 3/5 laboratories using the CERI assay and 5/6 laboratories using the FW assay.
a: Norethindrone is provided as an alternate for the control weak binder for cases when norethynodrel is unavailable.
b: During the validation study, benz(a)anthracene was reclassified as a non‐binder (i.e., negative) based on published literature demonstrating that the in vitro
estrogenic activity reported for this chemical is primarily dependent upon its metabolic activation. Enzymatic metabolic activation of the chemical would not be
anticipated in the cell free hrER assays as used in this inter‐validation study. Thus, the correct classification for this chemical is a ‘non‐binder’ when used underthe experimental conditions for the FW and CERI assays.
c: Chemicals were observed to be insoluble at 10‐3M (e.g.,turbidity) in some laboratories during the validation study.
d: Optional where o,p’‐DDT is prohibited by regulatory authorities when replaced by chemical with comparable binding affinity.

参考文献(2) Table 1 を一部改変

12

6

本 PBTG は、ER のリガンド結合部位と被験物質との特異的結合を検出するため、被験物質（競合物質）存在下での放射標識リガンド（[3H]-17β-エストラジオール : [3H]-E2）のER への結合能を被験物質の濃度を上昇させながら測定する競合結合試験としてデザインされている。ER に対して高い親和性を有する被験物質は、受容体親和性の低い化学物
質と比べて、より低濃度で放射標識リガンドと競合する。ただし本試験法で評価できるのはあくまでも化学物質の ER への結合活性であり化学物質のアゴニスト・アンタゴニ
スト活性を区別することはできない。
参照試験法として示されている試験法のうち FW アッセイは完全長 hrERα への結合における被験物質の E2 に対する競合結合能を測定する手法であり、試験にはバキュロウイ
ルスに感染させた昆虫細胞で作製、単離した完全長 hrERα を用いる。FW アッセイに用いる hrERα は、市販（Thermo Fisher Scientific, USA, A15674）で入手可能である。一方、CERI
アッセイは hrERα の LBD を用いた in vitro hrERα-LBD 競合結合試験法であり、グルタチ
オン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質として E. coli で発現させた hrERα-LBD を用いる。CERI アッセイで用いる hrERα-LBD タンパク質は CERI によって作製されたものであり、入手可能である。CERI アッセイは FW アッセイと同様、hrERα へ結合する物質をスクリーニングする手法であり、hrERα-LBD への結合における被験物質の E2 に対する競合結合能を測定する。それぞれの試験プロトコルは 2 つの要素から構成されており、一つは試験に用いる組み換え受容体タンパク質と生理的リガンドである E2 との相互作用活性を明らかにする飽和結合試験であり、他の一つは、被験物質の ER への特異的結合性を評価するため放射標識リガンド（[3H]-E2）と被験物質との ER 結合への競合作用を確認する競合結合試験である。いずれのアッセイ法とも、定量的評価結果として、IC50（50%の [3H]-E2 を hrERα から解離させるのに必要な被験物質の濃度）、hrERα に関する被験物
質の E2 に対する相対結合親和性などを求めることが可能である。化学物質のスクリーニ
ングのための定性的評価結果として、結合曲線に関して設定された基準に従い被験物質を hrERα 結合物質、非結合物質、または判定不能に分類することが可能である。
これらの参照試験法として、FW アッセイについては、Freyberger と Wilson により作成されたプロトコルに基づいて、CERI アッセイについては CERI により作成されたプロト
コルに基づいて、米国 EPA の主導により日米欧 6 施設の参加 （CERI アッセイについては
うち 5 施設が参加） による国際バリデーション研究 1）が実施され、試験法の使用目的に対する妥当性と信頼性が証明されている。バリデーション研究では、サブタスク 0 から
サブタスク 4 まで、段階的に実施された。サブタスク 0 においては、飽和結合試験によりアッセイに用いるヒトエストロゲンアルファ受容体（hERα）タンパク質のリガンド結合能が試験実施性能の許容範囲を満たすことを全ての参加施設で確認した後、サブタス
ク 1 では、陽性・陰性対照の 3 物質（陽性 2、陰性 1 ）の測定、サブタスク 2 では陽性・陰性対照の 3 物質と非コード化 9 物質（陽性 8、陰性 1 ）、サブタスク 3 では陽性・陰性対照を含むコード化 14 物質（陽性 9、陰性 5 ）を被験物質として施設内および施設間再現性の評価が行われた。1 試験施設では、誤判定および不定判定、承認基準を満たせないケースが多く認められたが、施設特有の問題であると判断され、他の参加施設の測定結果の再現性は良好であった。ラット子宮のサイトゾルを使用した ER 結合試験（TG OPPTS 890.1250：
ER-RUC）結果が入手可能かつ ER 反応性が明確な 22 物質（陽性17、陰性 5 ）を用いた解析
713

の結果、CERI および FW アッセイの「判定不能」を除く分類結果は100%一致しており、各試験法での陽性物質（ER に対して結合性をもつことが予測される物質）の一致率は、CERI および FW アッセイは共に100%（16/16）、ER-RUC アッセイは94.1%（16/17）であった。一方、陰性物質（ER に対して結合性を示さないと予測される物質）については、CERIおよび FW アッセイは共に 5 物質全てを陰性と判定した。一方、ER-RUC アッセイの判定
結果の内訳は陰性 1、偽陽性 1、評価不能 3 であった。最終的に、「判定不能」を除く各々の試験法の正確度は、CERI および FW アッセイは共に100%（21/21）、一方、ER-RUC ア
ッセイは94.4%（17/18）であった。なお、比較に用いた物質の予想される結果の妥当性は、OECD VMG-NA のメンバーのうち本バリデーション研究に直接関わっていない 3 名から構成された CAB により確認された。
また、バリデーション研究開始時点のプロトコルで指定されていた弱結合陽性対照のノルエチノドレルおよび陰性対照（非結合性）のフタル酸ジ-n-ブチル（DBP）は、溶解性に問題があったため、追加のサブタスク 4 として 2 施設の参加によりコード化 7 物質を被験物質とした測定が実施され、弱結合性を示す陽性対照としてノルエチンドロンが、陰性対照としてオクチルトリエトキシシラン（OTES）が適切であることが示され、最終的なプロトコルでは、対照物質（基準エストロゲン E2、CAS 50-28-2）、弱結合物質（ノルエチ
ノドレルやノルエチンドロンなど）、非結合物質（OTES）を用いて競合結合試験を実施することとされている。
なお、いずれの試験法とも放射性リガンドを用いるため、試験施設は放射性物質取扱に関する国の認可が必要であり、放射性同位元素および有害化学物質を扱う工程についてはすべて、国の法令で定められた規則および手順に従う必要がある。
2. 試験法の妥当性
2-1. 試験法の概略
2-1-1. 目的と原理
本試験法は内分泌かく乱物質のうち hrERα に作用（結合）する化学物質を検索し、その人体および自然界に対する有害影響を避けることを目的として開発された。本法は、
hrERα に結合し、アゴニスト作用あるいはアンタゴニスト作用を示す化学物質のスクリーニング試験法であり、濃度を変えた試験物質（競合物質）の存在下において放射性同位元素［3H］で標識した内因性のリガンド（E2）と hrERα との結合能を測定し、被験物質のhrERα に対する結合親和性を推測するものである。
2-1-2. 標準測定条件
結合試験は受容体-リガンド相互作用パラメーターを特徴付ける飽和結合試験および被験物質と標識リガンドとの間の競合によって結合親和性を推定する競合結合試験の 2
つの主な要素からなる。
飽和結合試験は、競合結合試験に用いる hrERα の結合親和性（Kd）および活性受容体部
位数（Bmax）を特徴付ける目的で実施される。CERI および FW アッセイプロトコルに記載されている飽和結合実験では、それぞれ規定の過剰濃度の非標識リガンド（E2）の存在
下および非存在下で、8 濃度の標識リガンドの結合量を評価する。活性結合部位を高濃度148の標識リガンドで飽和させた全結合および非特異的結合の両方を測定し、全結合から非特異的結合を差し引くことによって特異的結合量を計算する。Kd および Bmax は、非線形回帰分析とこれに続く Scatchard プロットにより求められる。
競合結合実験では、FW アッセイでは 1 nM の標識リガンドが20±5%、CERI アッセイでは 0.5 nM の標識リガンドが40±10%の特異的結合を示す量の hrERα を用いて異なる濃度の被験物質の存在下で標識リガンドの結合量を測定する。親和性は平衡状態で標識リガ
ンドの特異的結合を50%阻害する化学物質の濃度（IC50）によって定量評価される。したがって、被験物質の結合曲線の特性が十分に示されるよう、Logistic 式における「頂点（TOP）」と「底値（BOTTOM）」を含まれるよう最終的な結果は LogIC50 の両側に十分な濃度範囲を確保する必要がある。
また、対照物質（基準エストロゲン E2）、弱結合物質（ノルエチノドレルまたはノルエ
チンドロン）、非結合物質（原則 OTES であるが、DBP を用いることもできる）の結合親和性を測定し、試験法の当該条件下での有効性および実験間での比較の指標とする。

図2-1 競合結合試験における評価例

2-2. 生物学的妥当性
ER の内因性のリガンドである E2 の ER との結合は標的遺伝子の転写を活性化し、最終的には生理学的作用をもたらす。したがって、ER とリガンドの結合は一連の生物応答の起点であり、この試験法は生体系におけるエストロゲンシグナル伝達に必要な最初の分子的現象を反映している。また、不適切な ER シグナル伝達は、ホルモン依存性がん発症リスクの増加、生殖能力の低下および胎児の成長および発達の変化などの影響をもた
らすことも報告されている4)。
検証試験の競合結合試験から得られた結果は、既存の論文、ER 結合および試験方法に関する総説等 5-10）を基にまとめられた予想される結果と比較され、その妥当性が確認された。
ER 結合試験は、内因性エストロゲンと競合して ER に競合する可能性のある化学物質
915

を迅速に同定するための、有用かつ単純なツールであることが歴史的に証明されており、その実用性および in vivo の反応と密接に関連することが科学的資料に記載されている11, 12)。
2-3. ER 結合試験法の注意点
結合試験に共通の注意点として、以下が挙げられる。
放射標識リガンドを使用することから、放射性同位体の取り扱いに十分な知識を有した熟練した作業者によって実施される必要がある。
結合試験の結果は被験物質の in vitro 系における受容体への結合に関するものであり、invivo での内分泌システムへの影響に直接外挿することはできず、アゴニストとアンタゴ
ニストの区別もできない。また、界面活性剤やアッセイ緩衝液の pH を変化させる物質では正しい結果を得ることができない可能性がある。
3. バリデーション研究に用いた物質の分類と結果の妥当性
両アッセイともに、飽和結合試験（サブタスク 0 ）では [3H]-E2 について、競合結合試
験（サブタスク 1 ～ 3 ）では陽性対照 （ER 結合高親和性化学物質：E2、弱結合：ノルエチ
ノドレル）および陰性対照（非結合：DBP）を含むのべ 29 物質（表 3-1 および表 3-2 参照）について試験が実施された。また、適切な弱結合および非結合対照物質の探索のため、オプションとして 7 物質（表 3-1 および表 3-2 参照）が追加され競合試験（サブタスク 4 ）が実施された。
表3-1バリデーション研究に用いた物質数
競合結合試験
サブタスク1
物質数
コード化 1/非コード化2の区別対照物質 3 物質

サブタスク2

サブタスク3

サブタスク4（オプション）

対照物質 3 物質 14 物質（対照物＋ 9 物質質 3 物質含む）

7 物質

非コード化

非コード化

コード化

コード化

陽性物質3数

2 物質

10 物質

9 物質

4 物質

陰性物質4数

1 物質

2 物質

5 物質

3 物質

1

試験に際し物質の本体が何であるかわからないように、また結果を予測できないようにするためにコードを付して試験施設に配付される被験物質。コード化には、試験を実施するに当たり、意図的、非意図的に結果を偏らせることを防ぐ役割がある。

162

試験に際し物質名が明記された状態で試験施設に配付される被験物質。

3

ERに対して強い又は弱い結合性をもつことが予測される物質。

4

ERに対して結合性を示さないと予測される物質。

10

表 3-2

バリデーション研究に用いた物質名
Subtask 1(controls, uncoded)

Test chemical

CAS #dExpected binding

Expected Classification FW

aﬃnity†and CERI assays

17β-Estradiol

50-28-2

StrongBinderNorethynodrel

68-23-5Moderate

BinderDi-n-butyl phthalate (DBP)

84-74-2

Negative
Subtask 2*17β-Estradiol

50-28-2*Norethynodrel

68-23-5Moderate

Binder* Di-n-butyl phthalate (DBP) 84-74-2

Negative

Non-binder(uncoded chemicals)
Strong

Non-binder

BinderDiethylstilbestrol (DES)

56-53-1

Very strong

Binder17α-ethynyl estradiol

57-63-6

Very strong

Binder

Meso-Hexestrol

84-16-2

StrongBinder

Genistein446-72-0

Moderate

BinderEquol

531-95-3

Moderate

Binder

94-26-8

Weak

Binder84852-15-3

WeakBindero,pʼ-DDT

789-02-6

Weak

BinderCorticosterone

50-22-6

Negative

Non-binder

Butyl paraben (n-butyl-4hydroxybenzoate)
Nonylphenol (mixture)a

Subtask 3(coded chemicals)*17β-Estradiol

50-28-2*Norethynodrel

StrongBinder68-23-5Moderate

Binder* Di-n-butyl phthalate (DBP) 84-74-2

Negative

Non-binder

Zearalenone

17924-92-4

StrongBinderTamoxifen

10540-29-1

StrongBinder5α-dihydrotestosteroneb

521-18-6

Weak

BinderBisphenol A

80-05-7

Weak

Binder4-n-heptylphenol

1987-50-4

Weak

Binder

Kepone (Chlordecone)

143-50-0

Weak

BinderBenz(a)anthracene

56-55-3

Weak

Non-binder1

Enterolactone

78473-71-9

WeakBinderProgesterone

57-83-0

Negative

Non-binder

Octyltriethoxysilane

2943-75-1

Negative

Non-binder

Atrazine

1912-24-9

Negative
Subtask 4*,‡

Non-binder

Bisphenol A

80-05-7

Weak

Binder

Genistein446-72-0

Weak

BinderHPTEc2971-36-0

Weak

BinderNorethindrone

68-22-4

Weak

BinderCorticosterone

50-22-6

Negative

Non-binder(optional, coded chemicals)

Dexamethasone

50-02-2

Negative

Non-binder

Octyltriethoxysilane

2943-75-1

Negative

Non-binder

1117競合試験（サブタスク 1 ～ 3 ）で用いられた 29 物質のうち、21 物質が陽性、8 物質が陰性物質であり、オプションの競合試験（サブタスク 4 ）では、4 物質が陽性、3 物質が陰性物質である。陽性物質には強結合性を有する物質とともに弱結合物質も含まれている。
これらバリデーション研究に用いられた物質には、多様な用途の化学物質から代表的な ER 強結合性、弱結合および非結合物質が含まれていることから選択は妥当と判断される。
なお、競合試験（サブタスク 1 ～ 3 ）に用いた物質の妥当性は、OECD VMG-NA のメン
バーのうち本バリデーション研究に直接関わっていない 3 名から構成された CAB により確認された（Appendix 1 参照）。JaCVAM 受容体結合試験資料編纂委員会は、CAB の判
断はいずれも妥当であり、バリデーションに用いられた化合物セットは ER 結合アッセ
イの評価に十分なケミカルスペースを確保出来ており、バリデーションは適切に実施されたと評価した。
4. 試験法のデータと結果の有用性
バリデーションでは競合試験 （サブタスク 1 ～ 3 ）において 29 物質（陽性 21 物質、陰性 8物質）の測定が実施され、さらに、オプションとして実施されたサブタスク 4 において、陽性 4 物質、陰性 3 物質の測定が実施された。
両アッセイのバリデーション研究に用いられた化学物質は、既知見情報や入手の容易さ等をもとに可能な限り広範な用途・構造の物質が選択されており、それら陽性物質には強結合性を有する物質とともに弱結合物質も含まれており、本バリデーション研究で得られた評価結果は各アッセイ系の特性を示す有用な情報である。
また、両アッセイのバリデーション試験で評価が行われた化学物質の既知見情報から想定される結合活性および構造による分類（ステロイド類、ベンゼン環を一つ有する化合物類等）については、TG493 の習熟度確認物質リスト（表 1-1）として試験濃度域および各
アッセイでの評価結果とともに示されており、これらの情報は新たな関連試験系開発の参照物質として有用である。

1812

5. 試験方法の再現性
CERI アッセイには 5 施設（A－E）が、FW アッセイには CERI アッセイに参加した 5 施設と施設 F を含めた 6 施設が、バリデーション研究に参加した。
（A：University of Missouri-Columbia、B : Lovelace Respiratory Research Institute、C： CERI、
D：Bayer HealthCare, Bayer Pharma AG、E：CeeTox、F：University of Konstanz）
5-1. 飽和結合試験（サブタスク 0）
8 濃度段階の [3H]-E2 の hrERα に対する全結合量、非特異的結合量および特異的結合量を測定し、測定結果をもとに再現性が評価された。両アッセイの全ての測定（CERI アッ
セイ：17、FW アッセイ：20）で、ER の標識リガンドによる飽和と強い結合性を有する単一のリガンド結合部位を有することが確認された。両アッセイ共に、全施設にて妥当な
Kd 値が報告された（CERI アッセイ：各施設平均=0.244～0.758 nM、全体平均±SD=0.451±0.16
nM；FWアッセイ：各施設平均=0.230～0.707 nM、全体平均=0.423±0.20 nM）。特定の施設（FWアッセイ：施設 F）への輸送過程における受容体サンプルの分解が原因とされる場合を除き、殆どの施設が競合結合試験に必要なアッセイ条件を担保する活性受容体濃度を得た。CERI アッセイの場合、推奨される承認基準は （1） 標識リガンド0.5 nM 存在下の全特異的結合量は40±10%、（2） 標識リガンド 4.0 nM 使用時の非特異的結合量は全結合の35%未満であるのに対して、参加 5 施設の平均値±SDはそれぞれ33±5.4%、46±7.6%であった。FWアッセイの場合、推奨される承認基準は （1） 標識リガンド1.0 nM 存在下の全特異的結合量は20±10%、（2） 標識リガンド3.0 nM 使用時の非特異的結合量は全結合の35%未満であるのに対して、参加 6 施設の平均値±SDはそれぞれ20±7.7%、21±10.2%であった。
従って、両アッセイで、共に参加施設の実施性能は概ね許容範囲内であった（表 5-1､ 5-2､
5-3､ 5-4 参照）。
表 5-1

CERI アッセイ、hrERαへの標識リガンド(0.5 nM)の特異的結合の割合

Run 1
Run 2
Run 3
Run 4
Mean ± SD (n)CeeTox (%)

Lovelace (%)

Missouri (%)

Bayer (%)

CERI (%)

21
15
21
49
27 ± 15.3 (4)

27
33
27

23
43
33
50
38 ± 12.2 (4)

40
19
34

45
39
43

31 ± 10.8 (3)42 ± 3.1 (3)29 ± 3.5 (3)参考文献(1) Table 14 を引用。

表 5-2

CERI アッセイ、hrERαへの標識リガンド(4 nM)の非特異的結合の割合
CeeTox (%)

Lovelace (%)

Missouri (%)

Bayer (%)

CERI (%)

Run 1
Run 2
Run 3
Run 4

60
50
60
22

64
53
51

65
25
34
37

35
42
35

50
48
47

Mean ± SD (n)48 ± 18.0 (4)56 ± 7.6 (3)40 ± 17.3 (4)37 ± 4.0 (3)48 ±1.5 (3)参考文献(1) Table 15 を引用。

1319

表 5-3

FW アッセイ、hrERαへの標識リガンド(1.0 nM)の特異的結合の割合
CeeTox (%) Lovelace (%) Missouri (%)

Bayer (%)

CERI (%)

Konstanz (%)

Run 1
Run 2
Run 3
Run 4

27
21
23

33
30
23

22
17
16
15

23
20
24

22
21
16

6a
5a
5a
8b

Mean ±SD

24 ± 3.1

29 ± 5.1

18 ± 3.1

22 ± 2.1

20 ± 3.2

6 ±1.4a

実施施設から受容体分解の可能性が報告された（U. Konstanz）。
新しいバッチの受容体を使用して測定を実施した（U. Konstanz）。
参考文献(1) Table 18 を引用。
b

表 5-4

FW アッセイ、hrERαへの標識リガンド(3 nM)の非特異的結合の割合
CeeTox (%) Lovelace (%) Missouri (%)

Run 1
Run 2
Run 3
Run 4

12
12
14

Mean ±SD (n) 13 ± 1.2 (3)Bayer (%)

CERI (%)

Konstanz (%)

8
9
11

7
9
21
17

31
32
26

21
24
28

35a
45a
41a
16b

9 ± 1.5 (3)14 ± 6.6 (4)30 ± 3.2 (3)24 ± 3.5 (3)34 ± 12.8 (3)a

実施施設から受容体分解の可能性が報告された（U. Konstanz）。
新しいバッチの受容体を使用して測定を実施した（U. Konstanz）。
参考文献(1) Table 19 を引用。
b5-2. 競合結合試験（サブタスク 1 ～ 3 ）段階的に技術的難易度が高まる一連のサブタスクでは、8 濃度段階の被験物質の存在下、単一濃度の [3H]-E2 の hrERα に対する結合量を測定する競合アッセイの測定結果をもとに施設内および施設間での再現性の評価が行われた。
5-2-1. サブタスク 1
3 つの非コード化被験物質陽性対照（強結合性：E2、弱結合性：ノルエチノドレル）および陰性対照（非結合性：DBP）の測定結果をもとに再現性が評価された。結合競合曲線の「頂点」、「底値」および「傾き」を注視するとの助言以外のデータ分析に関する定量的な承認基準の指示は無く、各施設は、アッセイパフォーマンスの評価尺度（表 5-5 参照）に基づき「承認」し得ると判断した 3 回の測定データと共に、全測定データの提出を求められた。両アッセイ共に、承認基準を満たした場合はいずれの被験物質も正しく判定し、アッセイ間で各々の陽性対照の LogIC50 が良く一致していた。CERI アッセイについて、
E2 とノルエチノドレルおよび DBP の許容測定数の割合（許容測定数／全測定数）は、それぞれ27/28、27/28および25/28であった。一方、FW アッセイについて、E2 は20/23、ノルエチノドレルは21/22、DBP は24/24であった。全施設の全体平均値 LogIC50 （平均値±SD）と R2 値（平均値±SD）は、CERI アッセイについて、E2 は-9.03±0.20、0.97±0.06（許容測定数：27）、ノルエチノドレルは -6.14±0.28、0.98±0.02（許容測定数：27）であった（表 5-6 参照）。また、施設毎の LogIC50 の SD 値は E2 とノルエチノドレルそれぞれ、最大で0.442

20

14

と0.259であった。一方、FW アッセイについて、E2 は -8.89±0.18、0.97±0.03（許容測定数：20）、ノルエチノドレルについては -6.25±0.34、0.98±0.02（許容測定数：21）であった（表 56 参照）。さらに、施設毎の LogIC50 の SD 値は E2 とノルエチノドレルそれぞれ、最大で0.255と0.401であった。なお、両アッセイの承認基準を満たさない測定結果の多くの場合においても、競合結合曲線の「頂点」が100%予測値と著しく乖離していたが、それらは明確な標識リガンドの ER 結合に対する濃度依存的な阻害を示し、適切な LogIC50 を得ていた。従って、両アッセイで、共に施設内と施設間それぞれにおける定性的および定量的な再現性が示された。
表 5-5飽和結合試験および競合結合試験のアッセイパフォーマンスの評価尺度
Saturation Binding

1. Did the specific binding curve reach a plateau with increasing concentrations of [3H]17β-estradiol)?
2.

Was the ratio of specific binding to total radioligand used in the assay within the limits
recommended for the assay?

3. Was non-specific binding within the limits as recommended for the assay?
4.

When data were analyzed using the recommended non-linear regression model with a correction
for ligand depletion, was fit for the data linear when displayed using a Scatchard (Rosenthal) plot?
Competitive Binding

1.

Did increasing concentrations of the reference estrogen (17β-estradiol) displace [3H]17β-estradiol
from the hrERα in a manner consistent with a one-site competitive binding model?

2. Was the IC50 for the reference estrogen consistent across multiple runs?
3.

Was the ratio of specific binding to total radioligand used in the assay within the recommended
range for the assay?

4. Did the negative control (Di-n-butyl phthalate) displace less than 25% of the [3H]17β- estradiol?
5.

Did comparison of solvent and buffer controls confirm that the solvent does nothave any effect on ER binding?

参考文献(1) Table 9 を引用。

表 5-6

CERI アッセイと FW アッセイの比較、サブタスク 1（対照物質）

Reference estrogen(17-estradiol)
LogIC50
R2
Weak Binder(Norethynodrel)
Log IC50
R2
Non-binder
Di-n-butyl phthalatea
Non-binder

CERI Assay
Mean ± SD (n)FW Assay
Mean ± SD (n)-9.03 ± 0.20 (27)0.97 ± 0.06 (27)-8.88 ±0.18 (23)0.97 ± 0.03 (23)

-6.14 ± 0.28 (27)0.98 ± 0.02 (27)

-6.22 ± 0.34 (24)0.98 ± 0.02 (24)

27/29 total runsb

24/24 total runsba

対照非結合物質として、最大 10-4M まで試験した。
全測定回数に対する DBP を非結合物質と判定した測定回数を記す。
参考文献(1) Table 31 を引用。
b

15

21

5-2-2. サブタスク 2
ER 結合性が明確な 9 つの非コード化被験物質の測定結果をもとに再現性が評価された。測定データの分析は、（1） 陽性対照の曲線フィットパラメータに基づく許容判別と（2） 各試験施設の許容判定を共に満たす測定結果に限定され、測定毎に被験物質を分類判定した。なお、技術的検討を受け、「判定不能」に分類された被験物質に対して10%ルー
ル‡を適用させた後§、再分析された測定結果を含む。両アッセイにおいて、共に 9 物質の各施設における分類結果を総合すると、結合物質と非結合物質を問わず予想結果と一致しており、両アッセイで、共に施設間における非コード化被験物質の定性的な再現性が示された（表 5-7、5-8 参照）。施設 B では、両アッセイ共に分類判定に不正確な点があったが、施設特有の問題と判断された。詳細な技術的検討の結果、分類判定の不正確さの要因として、（1） 10%ルールの不適切な適用、（2） 4 パラメータロジスティック回帰分析
へのデータの不適合性、③最適数に満たない許容可能な測定結果を基にした分類の限界、などが挙げられ、これらの理由から、最終的な分類前に段階的な分析アプローチの導入が推奨された。

表 5-7

CERI アッセイ、サブタスク 2（非コード化被験物質の分類判定）

Chemical

Expected
ResultCeeTox

Lovelace

Missouri

Bayer

CERI

SimpleAverage

Butyl paraben

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderCorticosterone

Non-Binder

Non-Binder

Equivocal

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Bindero, p’-DDT

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderDiethylstilbestrol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderEthynyl estradiol

BinderBinderEquivocal

BinderBinderBinderBinderEquol

BinderBinderEquivocal

BinderBinderBinderBinder

Genistein

BinderBinderEquivocal

BinderBinderBinderBinder

Meso-Hexestrol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderNonylphenol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder

緑色背景は、予想される結果との不一致を示す。
参考文献(1) Table 32 を引用。

‡

10%ルール：[3H]-17β-エストラジオールの特異的結合の割合について、反復試験の平均値が低濃度で認められた平均値よりも 10%以上大きい場合、解析のデータポイントから除外する選択肢。

22

16

表 5-8FW アッセイ、サブタスク 2（非コード化被験物質の分類判定）

Chemical
Butyl paraben
Corticosterone

Expected
ResultBinder

CeeTox

Lovelace

Missouri

Bayer

CERI

Konstanz

BinderBinderBinderBinderBinderBinder

Non-Binder Non-Binder

Binder

SimpleAverage
Binder

Non-Binder Non-Binder Non- Binder Non-binder Non-Bindero, p’-DDTb

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderDiethylstibesterol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderEthynyl estradiol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderEquol

BinderBinder§BinderBinderBinderBinderBinder

Genistein

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder

Meso-Hexestrol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderNonylphenol

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder

緑色背景は、予想される結果との不一致を示す。
§
許容基準を満たす測定結果の提出なし。
bo,p’-DDT: 1,1,1,-trichloro-2-[o-chlorophenyl]-2-[p-chlorophenyl]ethan
参考文献(1) Table 33 を引用。

5-2-3. サブタスク3
ER 結合性が明確な14のコード化被験物質の測定結果をもとに施設内および施設間再現性の評価が行われた。データ分析と分類判定はサブタスク 2 と同様に実施した。全体
として、両アッセイにおいて、共に14 物質の各施設における分類結果の単純平均は、結合物質と非結合物質を問わず予想結果と良く一致しており（CERI アッセイ：12 物質で一致、FW アッセイ：12 物質で一致）、両アッセイで、共に施設間におけるコード化被験物質の良好な定性的な再現性が示された（表 5-9、5-10 参照）。なお、これらの単純平均は、測定回数を考慮した加重平均と一致していた。特記すべき点として、両アッセイにおいてコー
ド化被験物質として評価した場合、DBP（陰性）は 「判定不能 : equivocal」 と分類され、各施設で出された分類判定の総合結果は予測結果と一致しなかった。この要因として、（1） 反
応液中の溶解度限界と （2） 最大溶解濃度での ER に対する結合性が、依然として不確定であることが挙げられた。ヘプチルフェノール（弱結合性）は CERI アッセイにおいて分類判定の総合結果は 「判定不能」 と分類されたが、非常に弱い陽性物質では、十分な高濃度域で評価ができず、完全な競合結合曲線が得られないため正しく分類できない場合が指摘された。なお、本物質は FW アッセイでは当初､各施設における分類結果の単純平均に基づいて 「結合物質 : Binder」 と判定されていたが､ CERI アッセイと同様に十分な高濃度域で評価ができず、完全な競合結合曲線が得られないため､ 「判定不能 : equivocal」 に変更された。また、E2 の様に非常に強い陽性物質では、完全な結合曲線を得るためにより低濃度の結果が含まれるべきであると指摘された。これらの結果を受けて、分類判定の不正確さについてサブタスク 2 と同様の要因が挙げられた他、最終的な分類前に段階的な分析アプローチの導入が強く推奨された。また、施設 B では誤判定および不定判定、承認基準を満たせないケースが多く認められたが、施設特有の問題であると判断された。

1723

表 5-9

CERI アッセイ、サブタスク 3（コード化被験物質の分類判定）
ChemicalAtrazine

Expected
ResultNon-Binder

Bisphenol A

CeeTox

Lovelace

Missouri

Bayer

CERI

Non-Binder

Equivocal

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

SimpleAverage
Non-Binder

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBenz(a)anthracene

Non-Binder

Non-Binder

Non-binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Dibutyl phthalate-TC

Non-Binder

BinderEquivocal

Non-Binder

Binder

Non-Binder

Equivocal

Dihydrotestosterone

BinderBinderBinderEquivocal

BinderBinderBinder17B-estradiol-TC

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderEnterolactone

BinderBinderBinderEquivocal

BinderEquivocal

BinderHeptylphenol

BinderBinderEquivocal

Equivocal

BinderEquivocal

Equivocal

KeponeBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderNorethynodrel-TC

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder

Octyltriethoxysilane

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Progesterone

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Non-Binder

Tamoxifen

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderZearalenone

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderaa

緑色背景は、予想される結果と不一致を示す。
a
対照物質をコード化被験物質として試験した。
参考文献(1) Table 34 を引用。

表 5-10FW アッセイ、サブタスク 3（コード化被験物質の分類判定）

Chemical

Expected
ResultAtrazine

Non-Binder Non-Binder

Bisphenol A
Benz(a)anthracene_DMSO
Benz(a)anthracene_EtOH
Di-n-butylphthalate†Binder
Non-Binderb

CeeTox

Lovelace§

Missouri

Bayer

CERI

Non-Binder Non-Binder Non-Binder

BinderBinderBinderEquivocal§

Non-Binder

BinderBinder

SimpleAverage

Equivocal

Non-Binder

BinderBinder

Non-Binder

Non- Binder Non- Binder

Non-Binderb

Konstanz

Non-Binder
Non- Binder Non- Binder

Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder

Di-n-butyl phthalate Non-Binder
TCa

Equivocal§

Equivocal

Equivocal

Equivocal

Equivocal

Equivocal

Dihydrotestosterone

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder17-β-estradiol-TCa

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderEnterolactone

BinderBinder§BinderBinderBinderBinderBinderHeptylphenol

BinderEquivocal

Binder

Non-Binder

BinderBinderBinderEquivocal

KeponeBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderNorethynodrel-TCa

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder

Octyltriethoxysilane

Non-Binder

Equivocal

Progesterone

Non-Binder Non-Binder§

Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder

Binder

Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder Non-Binder

Tamoxifen

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderZearalenone

BinderBinderBinderBinderBinderBinderBinderBinder

緑色背景は、予想される結果と不一致を示す。
a
対照物質をコード化被験物質として、通常、溶解限界濃度または最大 10-3M まで試験した。
§
許容基準を満たす測定結果の提出なし。
†
DBP は陰性対照（非結合物質）として、最大 10-4M まで試験した。
参考文献(1) Table 35 を引用。

24

18

5-2-4. R2値に基づいた評価
より包括的な施設内および施設間における再現性の評価を目的として、陽性対照のデー
タ許容の有無を問わず、実施施設が各プロトコルの承認基準に基づき除外したものを除く全ての測定データを適用させて、測定データのモデルへの適合の指標となる R2 値を用いた評価が行われた。データ分析において、各測定の R2 値が0.9（または90%）以上の場合を「良好」と判定した。
CERI アッセイについて、施設毎の全測定結果の R2 値の分布を比較すると、施設 B を除く 4 施設では、8 割超が「良好」と判定され、平均値が各々95%以上、変動係数（CV）値
は6.5%以下であった（図 5-1 参照）。施設 B では、「良好」は 6 割弱にとどまり、平均値とCV 値はそれぞれ91.8%と11.9%であった。施設毎の予測陽性物質の正判定率（R2>0.9以上）の比較では、施設 A では80%以上、施設 C－E では90%超であったが、施設 B では～70%と他 4 施設と比べて偽陰性率が有意に高かった。また、施設 A および C では偽陽性判定は無く、他 3 施設の偽陽性率は約5－12%の範囲であった。特筆すべき点として、DBP を被験物質とした場合（10-3 Mまで試験）が 「偽陽性」 の約半分を占めた。FW アッセイでは、4 施設において 「良好」 判定が高い割合を占めたが、施設 B と F では 7 割程度にとどまった（A：96.6%、B：70.3%、C：94.8%、D：88.6%、E：92.8%、F：71.0%）（図 5-2 参照）。
施設毎の平均 R2 値は、施設 B を除く 4 施設で95%以上、施設 B は93%であった。また、それらの施設毎の CV 値は、最低値0.8%（施設 A）、最大値9.4%（施設 B）、残り 4 施設では
5.5～8.4%の範囲に収まった。施設毎の予測陽性物質の正判定率（R2>0.9以上）を比較すると、4 施設では90%を超えた（偽陰性率、2－7%）一方、施設 B と施設 F では、それぞれ85%（偽陰性率、15%）、75%（偽陰性率、25%）と有意に低かった。また、施設 A および F では
偽陽性判定は無く、他 4 施設の偽陽性も2.3－7.6%の範囲に収まった。従って、R2 値に基づく分析の結果、一部の施設で技術的問題が見受けられたが、全体として、両アッセイ
では、共にコード化を問わず、良好な定性的な再現性が示された。

参考文献(1) Figure 14(A)を抜粋引用。

図 5-1

CERI アッセイ、施設毎における全測定結果の R2 値分布比較
1925

参考文献(1) Figure 16(A)を抜粋引用。

図 5-2

FW アッセイ、施設毎における全測定結果の R2 値分布比較

5-2-5. サブタスク4
両アッセイの実施に適用可能な弱結合性および非結合性対照物質の探索を目的として、
2 施設（施設 A および E）において 7 物質（ 6 物質に各々 2 つのコード、および 1 物質に 4つのコードを付した）が合計 16 の独立したコード化被験物質として提供され、それらの競合結合試験が実施された。両施設は共に、どちらのアッセイを使用した場合においても、各々コード化被験物質を正しく分類判定した。なお、幾つかの被験物質で溶解度の問題が認められたものの、弱結合性物質の分類判定には影響が無かった。サブタスク 4の結果から、アッセイに最適な弱結合性物質としてノルエチンドロンが選択され、DBPの代替えとなる最も有望な陰性対照として OTES が同定された。これらの結果を受けて、両アッセイを使用する場合のより適切なデータの分析と解釈には、（1）被験物質の溶解限界の決定とその分類判定への影響の確認と（2）10%ルールが適用されるケースの適切な判別が重要であることが示された。

26

20

6.試験方法の正確性・信頼性
CERI および FW アッセイによる評価結果の信頼性の検証のため、各々の施設で実施された全被験物質の hrERα への結合能の評価を基にした最終分類結果を用いて、米国 EPAの現行 Tier I スクリーニング試験群に含まれるラット子宮のサイトゾルを使用した ER
結合試験（TG OPPTS 890.1250：ER-RUC）の結果が比較された（表 6-1 参照）。なお、比較には、3 種の試験法全てにおいて結合試験データが入手可能であった ER 結合性が明確な22 物質（予測陽性：17、予測陰性：5）を用いた。「判定不能」を除き、3 アッセイの分類判
定結果を比較したところ、それぞれ CERI および FW アッセイの結果は、予想された ERに対する結合親和性の強弱を問わず、全ての被験物質の分類において100%一致していた。
各々の試験法の陽性物質の一致率は、CERI および FW アッセイは共に100%（16/16）、ERRUC アッセイは94.1%（16/17）であった。陰性物質については、CERI および FW アッセイ
は共に 5 物質全てを陰性と判定した一方、ER-RUCアッセイの判定結果の内訳は陰性 1、
偽陽性 1、評価不能 3 であった。また、「判定不能」を除く各々の試験法の正確度は、CERIおよび FW アッセイは共に100%（21/21）、ER-RUC アッセイは94.4%（17/18）であった。従って、CERI および FW アッセイ共に、米国 EPA の現行の TG OPPTS 890.1250と同等以上の性能標準を満たすことが示された。

2127

表 6-1FW アッセイ、CERI アッセイおよびテストガイドライン OPPTS 890. 1250 を用いた
化学物質分類判定の性能比較

Chemical Name

CAS RN

Expected
FW Assay
Response

CERI
Assay

TG
OPPTS
890.125
0

MESH
ChemicalClass

17β-Estradiol

50-28-2

BinderBinderBinderBinderSteroid

Norethynodrel

68-23-5

BinderBinderBinderBinderSteroid*Di-n-butyl phthalate

84-74-2

Non-binder

Binder*†Binder*†Not Tested

Ester,
Phthalic Acid

DES

56-53-1

BinderBinderBinderBinderHydrocarbon,(Cyclic)

17α-ethynylestradiol

57-63-6

BinderBinderBinderBinderSteroidMeso-Hexestrol

84-16-2

BinderBinderBinderBinderHydrocarbon,(Cyclic)

Genistein446-72-0

BinderBinderBinderBinderEquol

531-95-3

BinderBinderBinderBinderButyl paraben(n butyl-4hydroxybenzoate)

94-26-8

BinderBinderBinderBinderParabenBinderBinderBinderBinderAlkylphenol,
Intermediate
Compund

BinderBinderNonylphenol (mixture) 84852-15-3o,p’-DDT

789-02-6

Corticosterone

50-22-6

Zearalenone

17924-92-4

BinderTamoxifen

10540-29-1

5a-dihydrotestosterone

Non-

Non-

Flavonoid,
Heterocyclic
CompoundPhytoestrogen
Metabolite

BinderBinderOrganochlorine

Non-Binder

BinderBinderBinderBinderSteroid
Resorcyclic
Acid
Lactone,Mycotoxin

BinderBinderBinderBinderAntiestrogen521-18-6

BinderBinderBinderEquivocal

Steroid,
Nonphenolic

Bisphenol A

80-05-7

BinderBinderBinderBinderPhenol4-n-heptylphenol
Kepone(Chlordecone)

1987-50-4

BinderEquivocal

Equivocal

BinderBenz(a)anthracene

56-55-3

143-50-0

Non-binder* Non-binder

BinderBinderBinderBinderEquivocal

BinderBinderBinderPhytoestrogen

Non-binder* Non-Binder

Non-Binder

Equivocal

SteroidEnterolactone

78473-71-9

Progesterone

57-83-0Octyltriethoxysilane

2943-75-1

Non-binder Non-Binder

Non-Binder Non-Binder

SilaneAtrazine

1912-24-9

Non-binder* Non-Binder

Non-Binder

Triazine

Equivocal

Pharmaceutical,
Veterinary
Agent
Pharmaceutical,
Veterinary
Agent
Plasticizer,
ChemicalIntermediate
Pharmaceutical,
Veterinary
Agent
Pharmaceutical,
Veterinary
Agent
Pharmaceutical,
Veterinary
Agent
NaturalProduct

Natural Product

Pharmaceutical,
Veterinary
Agent

ChemicalIntermediate

Alkylphenol
Hydrocarbon,(Halogenated)
Aromatic
Hydrocarbon

Non-Binder* Non-Binder Non-Binder
BinderProduct Class

Pesticide

Natural Product
Herbicide

濃いグレーの背景は、予想される結果と不一致を示す。
*†
10-4M まで試験した場合、非結合物質に分類された。10-3M まで試験した場合、最大濃度で標識
リガンドとの競合が検出されたことから「判定不能」に分類された（CERI アッセイ—5 施設中 3 施設、FW アッセイ—6 施設中 5 施設、表 5-8 および 5-9 参照）。
参考文献(1) Table 40 を改編引用。

28

22

7.データの質
本 試 験 法 の バ リ デ ー シ ョ ン 研 究 に お け る 多 施 設 間 試 験 は 、 GLP（ Good Laboratory
Practice）に準拠した精神で試験責任者による科学的指導および管理下で実施されたものである。また、すべてのデータは取り纏めを行った米国 EPA に提出される前に、それぞれの試験施設において独立した品質保証担当者による査察が実施されており、データの質および信頼性は確保されていると考えられる。
8. 試験法の有用性、限界および提言
1) CERI および FW アッセイは原理の項でも述べた様に、放射性標識リガンド（[3H]-E2）と被験物質との hrERα 結合への競合作用を確認することにより、化学物質と hrERα との直接的な結合を検出できる。しかし、被験物質がアゴニスト作用を及ぼすかアンタ
ゴニスト作用を及ぼすかの判定はできない。特異性は極めて良好である。混合物への応用については検討されていない。
2) 本試験法では放射性リガンドを用いるため、試験施設は放射性物質取り扱いに関する認可を要する。放射性同位元素および有害化学物質を扱う工程についてはすべて、国の法令で定められた規則および手順に従う必要がある。
3) 標準的な品質管理を実施し、受容体の活性、化学物質濃度の正しさ、信頼限界が複数の反復試験を通じて安定な状態に保たれ、かつ試験期間中、期待される hrERα 結合反応を示す性能が保持されていることを確認することが必要である。
4) 新たに試験を実施する試験施設は、予め hrERα 標品の特異性と活性を確認する飽和試
験および E2 と TG に示された習熟度確認物質（弱結合物質および非結合物質）を用いた競合結合試験を実施し、当該試験法を使用する習熟度のあることを証明する必要がある。さらに、異なる日に実施した 3 ～ 5 試験より得られた基準エストロゲン（E2）および対照物質の結果を含む履歴データベースを作成する必要がある。
5) 未知の化学物質を試験するには、予備試験を実施し、各被験物質の溶解限界を確認するとともに、試験実施に用いる適切な濃度範囲を特定する必要がある。各被験物質の溶解度はまず溶媒で決定し、さらに試験条件下で混濁や沈殿の有無を確認する。試験で用いる最高濃度は 1 mM を超えてはならない。
6) 望ましい溶媒として FW アッセイではエタノールが、CERI アッセイでは DMSO がそれぞれ示されているが、両アッセイともエタノール及び DMSO が使用可能である。各
溶媒の試験ウエル内の最終濃度は、FW アッセイでは1.5%（最大 2 %を超えてはならない）、CERI アッセイでは、2.05%（最大2.5%を超えてはならない）とされている。
7) hrERα 結合試験（CERI および FW アッセイ）は、スクリーニングのための試験法であり、化学物質の安全性評価に用いる際には、他の in vitro および in vivo 評価系等との結果と併せて実際の生体影響について総合的に判断を行うべきである。
9.その他の試験方法の科学的な報告
内分泌かく乱に係ると考えられる ER に関わる試験法としては、被験物質の受容体への結合実験がまず考えられる。実際、本 PBTG（OECD TG493）で取り上げられている、
hrER 結合親和性化学物質の検出のための、hrER in vitro 試験法は、二つの機序および機23

29

能的に同等と評価された hrERα 結合物質確認試験法から成るが、いずれも非細胞系(cellfree)において、RI 標識リガンドに対する被験物質の競合的な結合阻害により、hrERα との結合能を調べる、というものである。結合実験では、化学物質との相互作用が容易となるように、受容体が水相に露出していることが望ましいが、この目的には細胞を破壊した cell-free が有利であり、実際、この系を用いた結合実験が本 TG にて提案されている。
一方、受容体と相互作用を示す化学物質には、受容体に結合して本来結合すべき生体内物質と同様の細胞内情報伝達系を作動する（活性化する）「アゴニスト」と、受容体に結合はするが本来結合すべき生体物質と異なり生体反応を起こさず、その結合によって本来結合すべき生体内物質と受容体の結合を阻害することで生体応答反応を起こさない「アンタゴニスト」があり、上述した結合実験のみでは、アゴニスト・アンタゴニスト両者の区別が困難である。さらに、非細胞系における結果は、細胞系の場合と一致しないという報告も多く、この理由として、細胞内への移行性による差異や細胞内に特有の結合を制御する因子の存在が示唆され、したがって、受容体との相互作用の検討には、細胞系を利用して調べることが望ましい。
この点、hERα の転写活性を指標とするレポーターアッセイでは、アゴニスト・アンタ
ゴニスト作用の有無を判定できる。現時点で hERα のレポーターアッセイに関する OECD
TG として OECD TG455 が成立している。OECD TG455 もまた PBTG であり、参照試験法
として ER STTA 法（hERα-HeLa-9903 細胞を用いた ER 恒常発現系転写活性化試験法）とVM7LucER TA 法（VM7Luc4E2 細胞を用いる ER 転写活性化（TA）試験）の 2 種の方法が示されている。
両方法の相違は、（1）ER STTA 法が hERα を HeLa 細胞に組み込んだものであるのに対し、VM7LucER TA 法では VM7 細胞に内在する hER を利用する、（2）ER STTA 法では、組み込まれた受容体は hERα のみであるが、VM7 細胞では ERα と ERβ の双方を発現している。ただし、2 種の ER アイソフォーム（hERα、hERβ）に対して完全な選択性を示す化
学物質は、知られておらず、定性的評価において両測定系の結果は、同等と考えられる。
（3）VM7LucER TA 法のアンタゴニスト試験では、バリデーション研究において高濃度領域でのルシフェラーゼ活性の非特異的阻害が認められたことから、評価可能な被験物質の最大濃度は、20μg/mL（約10μM）に制限されているのに対して、ER STTA 法では、媒体への溶解性が良好かつ細胞毒性が認められない場合、アゴニスト・アンタゴニスト試験
とも最大 1 mM まで評価可能である。
ER STTA 法については、CERI が、安定的形質移入による転写活性化試験の妥当性確認
研究を、ヒトの子宮頚癌に由来する hERα-HeLa-9903 細胞株を用いて実施し、hERα を介してエストロゲンアゴニスト活性を検出する試みを行い、実施目的に関する試験の適合性および信頼性を証明している。この細胞株には、次の 2 種類を安定的に挿入されている : （i）hERα 発現ベクターおよび （ii） マウスのメタロチオネイン（MT）遺伝子 のプロモーター部位である TATA エレメントによって駆動される、アフリカツメガエルのビテロ
ゲニン由来のエストロゲン応答エレメント（ERE）のタンデムリピートを 5 個含むホタ
ル・ルシフェラーゼのレポーター遺伝子。
もう一方の VM7LucER TA 法は、NICEATM および ICCVAM によって妥当性の確認がなされてきた。ヒト卵巣腺癌細胞株 VM7 において安定的に形質移入した hER 応答ルシ
30

24

フェラーゼ・レポーター遺伝子を用いて in vitro hER アゴニスト活性またはアンタゴニス
ト活性を有する物質に関する濃度反応データを提供する。具体的には、マウス乳癌ウイ
ルス（MMTV）プロモーターの上流に位置する 4 つの ERE の制御の下でルシフェラーゼ・
レポーター遺伝子を安定的に形質移入した ER 応答ヒト卵巣腺癌細胞株 VM7 を利用して、in vitro の ER アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質を検出する。アッセイには安定的に形質移入した VM7 細胞株を使用する。さらに PS を満たす類似（me too）
試 験 法 と し て 、 ERα CALUX ア ッ セ イ （ Stably Transfected Human Estrogen Receptor-αTransactivation Assay for Detection of Estrogenic Agonist and Antagonist Activity of Chemicals
using the ERα CALUX cell line）が収載されている。このアッセイは、BioDetection Systems
BV（オランダ）によって妥当性の確認がなされてきた。CALUX とは、Chemical-Activated
Luciferase Expression の略であり、ヒト骨肉腫細胞株 U-2 OS において安定的に形質移入した ERα CALUX 細胞株を使用し、3 つの ERE 制御による、hER 応答ルシフェラーゼ・
レポーター遺伝子を用いて、in vitro hER アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を、
ルシフェラーゼの活性（発光量）を測定することにより検出する。内因性のレポーター活
性はほとんど検出されないと報告されている。
内分泌かく乱作用としては他にも、リガンド結合ポケット以外の部位での ERαとの相互作用や、エストロゲンシグナル伝達に関連する他の受容体である ERβ、Gタンパク質
共役エストロゲン受容体およびその他の受容体あるいは、内分泌系内の酵素系との相互作用なども考慮する必要があるが、現時点でこうした点を考慮したバリデーション研究が終了している試験系はない。
なお、2012年に改訂された OECD CF は 5 つのレベル（level 1 〜 5 ）から構成され、それぞれの異なったレベルの生物学的複雑性に対応している。上記のレポーターアッセイは、
レベル 2 の「選択された内分泌機構/経路に関する情報をもたらす in vitro アッセイ（非哺乳類の方法）」に相当する。
10. 結論ER 結合親和性化学物質の検出のための、hrER in vitro 試験法に関する PBTG は、in vitro
で化学物質の ER に対する結合親和性を生体内リガンドであるエストラジオールとの競合結合により検出するスクリーニング試験法である。現在、本 PBTG には、2 種の試験法（CERI および FW アッセイ）が参照試験法として掲載されている。また、本 PBTG には、類似試験法の開発とバリデーション研究のための PS が設定されており、PS を満たすことが示された新規の試験法を追加することが可能である。
現在、本 PBTG に参照試験法として掲載されている 2 種の試験法についての科学的妥
当性と規制試験法としての妥当性については、日米欧 6 施設の参加によるバリデーショ
ン研究において陽性 21 物質、陰性 8 物質を用いた評価が行われ、施設内・施設間再現性とも良好な結果が示されており、OECD の第三者評価では、それらバリデーション研究の結果をもとに本試験法の正確性・信頼性が評価され、OECD EDTA TF で提案されたOECD CF のレベル 2 に該当する内分泌かく乱物質のスクリーニング評価に有用な試験法として OECD TG493 が成立した。
本試験法による評価の課題として、本試験法で評価できるのはあくまでも化学物質の25

31

ER への結合活性であり化学物質のアゴニスト・アンタゴニスト活性を区別することは出来ず、本試験法で陽性と判定される化学物質が生体内でどのような影響を示すかについては評価出来ないというという点があげられる。本試験法はあくまでもスクリーニング法であり、ER を介して惹起されると想定される有害影響を確定評価する試験法と組み合わせて評価を行うことで今後の化学物質管理に大きく貢献すると考えられる。
11. 利益相反（COI）について利益相反の観点から、CERI アッセイが適切に評価されたことを受容体結合資料編纂委
員会は確認した。
謝辞
本評価報告書を編纂するに当たり、武吉正博博士（一般財団法人

化学物質評価研究機構）より CERI アッセイに関する具体的な方法などを詳細に解説いただきました｡ ここに深く感謝申し上げます。
1) OECD (2015), Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human
Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on
Testing and Assessment (No. 226), Organisation for Economic Cooperation and Development,
Paris.
2) OECD (2015), Performance Standards for Binding Assays Using Human RecombinantEstrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing andAssessment (No. 222), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
3) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or
Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications,
Series on Testing and Assessment (No. 34), Organisation for Economic Cooperation andDevelopment, Paris.
4) Diamanti-Kandarakis, E., Bourguignon, J-P., Giudice, LC., Hauser, R., Prins, GS., Soto，AM.,
Zoeller, RT., Gore, AC. (2009). Endocrine-disrupting chemicals: An Endocrine Society ent.
Endocr. Rev., 30: 293–342.
5) ICCVAM (2003), ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential
Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional
Activation Assays.
6) ICCVAM (2006), ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential
Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional
Activation Assays.
7) Akahori, Y., Nakai, M., Yamasaki, K., Takatsuki, M., Shimohigashi, Y., Ohtaki, M. (2008),
Relationship between the results of in vitro receptor binding assay to human estrogen receptoralpha and in vivo uterotrophic assay: Comparative study with 65 selected chemicals, Toxicol.
In Vitro, 22(1): 225-231.
8) OECD (2007). Additional Data Supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay inRodents, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.
67.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
9) Takeyoshi, M. (2006), Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For

32

26

Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity - The
Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell
Line, Chemicals Evaluation and Research Institute (CERI): Japan. p. 1-188.
10) USEPA (2009). Endocrine Disruptor Screening Program Test Guidelines. OPPTS
11) 890.1250: Estrogen receptor binding assay using rat uterine cytosol (ER-RUC). Available at:
http://www.regulations.gov/#!documentDetail;D=EPA-HQ-OPPT-2009-0576-0005.
12) Yamasaki, K., Noda, S., Imatanaka, N., Yakabe, Y. (2004), Comparative study of theuterotrophic potency of 14 chemicals in a uterotrophic assay and their receptor-binding affinity,
Toxicol. Lett., 146: 111-120.

27

33