博士（医学）寺崎康展
学 位 論 文 題名
An HLA― A3― binding prostate acidphosphatase− derived peptide can induce CTLs
restricted to HLA― A2 and− A24 alleles(HLA
一A3結合PAP
由来ベプチドのHLA一A
2および― A24拘 束 性 CTLsへ の 誘 導 能 の 研 究 ）学 位 論 文 内 容 の 要旨

【背景と目的】
癌患者に対するべプチドワクチンの臨床研究は近年盛んに行われている。しかし、免疫療法に 用いる べプチドはHLA拘束性をもっているので、現在行われている多くの臨床試験も頻 度 の高 い HL
Aで あ る H
LA‑A
2も し くは ‑A24陽性 の患者に 限られて いる。 従ってそ れら
以外の癌患者はべプチドを用いた免疫療法を受ける事が出来ず、そのような患者にも広く使用できるべプチドの同定が必要と考えられた。
我々 はHLA‑A
24結 合ベ プ チ ド で、 異 な るHLAに対 し CT
L誘 導 能を 持 つ ぺプ チ ド を 報告し た。そ こで今回 我々は 、いまま でに我々が同定した14種のHL
A‑A3スーバータイプ拘束性C
TL誘 導能 を 持 つ べプ チ ド の中 で HL
A‑A2も し く は‑A24
拘 束 性CT
Lに対し 同様に 誘導能を持つべプチドが無いか検討した。
【材料と方法】
材料：
PBMCは HLA‑A2及 び ‑A24の 前 立 腺 癌 患 者 の 血 液 か ら 分 離 し た も の を 用 い た 。
使用 した細 胞株は、 PAPの 発現を確 認した前 立腺や 大腸の癌 細胞株 や、RMA‑SというHLAをトランスフェストしたマウスの細胞株を用いた。
ベ プ チド は 、こ れまでに 我々が同 定して きたHLA‑
A3ス ーバータ イプ結 合能を有 する14種 類 と 、 HLA‑A2及 びHLA‑
A24に 結合 能 を 有す る EB
V由 来 ベプ チ ド 、HIV由来 ベ プ チ ド
を そ れぞ れ ポジ テ イブ タ ーゲ ッ ト、 ネ ガテ イ プターゲ トとして用 いた。
方法：
HLA
安 定 化 試験 では、HL
A‑
A0201、‑0206、‑0207、‑2402、‑2601をそれぞ れトラ ンスフ
ェク トさせ たR
MA‑S
細 胞株を 用いて、 H
LA‑A3スーバ ータイプ に結合 能をもつべプチドがそ れ ら の HLAに 対 し て も 交 差 結 合 能 を 持 っ か を 実 際 に 結 合 さ せ 検 討 し た 。
ベ プ チ ド 特 異 的 CTL誘 導 試 験 で は 、 実 際 に HLA‑A2及 び ‑A24の PBMCに HLA‑A3ス ーパータイプ結合ペプチドで刺激し、HLA拘束性〔）′r
L誘導能を持つかを、産生されたI
FN‑アをEL
ISAで測定することにより検討した。
細 胞 傷害 活 性試 験では、 ベプチド の刺激 によりIFN‑アを産生 したPB
MCを 用い、実 際に癌細胞に対し細胞傷害活性があるかを、51
Crを取り込ませた癌細胞株を用いて、癌細胞が障害されて放出された51Crを測定する事により検討した。またその細胞障害活性がHLA‑classI
特異的なものをそれぞれの抗体を入れることにより、さらにべプチド特異的なものかを、ベプチドでパルスし51Crを取り込ませていないコールドターゲットを混ぜて測定することによりそれぞれを検討した。
―23−

【結果】
HLA
安定化試験
14種類のHLA‑A3
スーバータイプ結合ベプチドのうち、PAP
155̲
163だけがm´A‑
A0201、ーA0206、‑A2402に対し濃度依存性を持って結合能を認めた。またH
LA‑
A0207、‑
A
2601に対しては結合能を 持 た なか った 。さ らに p‑ttibulir
i5 309‑318は H
LA‑A2402に のみ 結合 能 を認 めた 。
ベプチド特異的C
TL
誘導試験
PAP155̲
163で刺 激し たHLA‑
A020
1、 ‑A020
6、 ‑A2402の PB
MCは、 ネガ テイ プ コン 卜口 ールのべプチドで刺激したPBMCと比較し有意にIFNアを産生した。
細胞傷害活性試験
PAP155̲163で 刺 激 し 誘 導 さ れ た HLA‑A0201、 ‑A0206及 び ‑A2402の CT
Lは 、同 じHLAの癌細胞株に対して、 異なるH
LAの細胞株と比較し 有意に細胞傷害活性を持っていた。また
そ れぞ れの 抗体を加える事により、その細胞傷害活性はHLA‑
classI特異的であることが判った。さらにPA
P155̲
163またはHIV由来ベプチドでパルスしたコールドターゲットを加えることにより、その活性はべプチド特異的である事も判った。
【考察】
ベプ チド を用 いた 癌ワ クチ ン療 法と は、 ペ プチドが特定のMHCに結合し、その特定のMHCを もつ 癌細 胞 やウ ィル ス感 染に 反応 する CT
Lを 活性 化さ せる もの であ る。ベプチドとMHCの結合は非常に特異的なものだと考えられてきた。
近年の研究では、ベ プチドが異なるHLAに結合できる可能性がある事が示唆されている。
この研究でも、HL
A‑
A3スーバータイプ拘束性CLT
誘 導能を持つべプチドであるPA
P155
̲
163が 、 異 な る HLAで あ る ‑A0201、 ‑A0206、 ‑A2402に 結合 能を も ち、 C
TL誘導 能を 持つ こと が示 され た。 PAP155
̲163の 配列 はYLPF
RNCRP
で あり 、BioI
nfor
mati
c and Molec
ular
Analysis Section上で のHLA‑A020
1や ‑A24に対 する 結合 スコ アは 、HLA‑
A3スー バー タイ プに 対す るも のと 比ペ、非常に低い。しかし 実際はHLA‑A0201、，A0206、‑A2402のト
ランスフェクタント細胞と結合能を有した。その矛盾がなぜかははっきりとは解っていない。
HLA‑A2結 合 ベ プ チ ド の 特 徴 は 、 ア ミ ノ 酸 配 列 の 2番 目 が Iも し く は L、 C末端 がVもし くは F、 Mであ る。 しか しま れに HL
A‑A0207のよ うに 確実 にHI」A． A
2ス ーバータイプだと言しゝ切れないも のもあり、HLAーA2結合ペプ チドでもHLA．A0207に結合しないべプチドの報告もある。
一 方 、 HLA‐ A2402結 合 ベ プ チ ド は ア ミ ノ 酸 配 列 の 2番 目 が Fも し く は YでC末 端が Fも しく はL、I、 Wであ るが、HLA．A2301、・A3001とも交差結合性を有している。したがって、それらを含むHLA・A24スーパータイプの結合モチーフは2番目が（FWYI；YIMT）、C末端が（FrYWIM）と言える。
これらの事から、PAP
155一163aLPFRNCRP）はH
LA・A0201、．A0206、・A
2402と結合し、かつ．A0207と結合しない事の推測とできる。
また、PAPは前立腺関連抗体あり前立腺癌患者で の癌ワクチンとして使用されている。
しかしPA
Pは前立腺だけでなく、膵臓の神経内分泌 腫瘍や膵島細胞腫瘍、小腸腫瘍、膀胱腺癌などでも免疫組織 学的に陽性であり、また血管内大細胞型B細胞リンパ腫の腫瘍マーカ ーと して も検 討さ れている。また食道や肺小 細胞癌でも発現しており、PAP特異的C
TL
はそれらの細胞傷害活性を示している。その上、正常組織や正常の肛門や尿道の腺組織、胃幽門の粘膜組織でも発現が確認されている。
前立 腺癌 患者 に対 する PAP関 連蛋 白を 含む 樹状 細胞を用いた第1相臨床試 験では、PAPを標的とした免疫療法 は安全で；病気の進行とPAPに対する免疫反応とが関連していることが明らかになっている。また我々はかつて前立腺癌に対するテーラーメイド型癌ワクチンにおしゝてPA
P2は221がHLA‐A24
拘束性CTLを誘導し、臨床的反応を誘導するべ プチドの1つであることを報告し ている。また、その免疫反応がPAP特異的なものであることも報告している。
【結諭】
HIA・A2、・A
24、． A
3スーパータイプを合わせるとアジア人では98％、割合の少ない黒‑ 24 ‑

人でも59％ をカバーしている。このべプチドは多くの前立腺癌だけでなく大腸癌や胃癌患者にとって の癌ワクチンになる可能性があると考える。

ー 25―学 位論文審査の要旨
主 査 教 授 西 村 孝 司
副 査 教 授 秋 田 弘 俊
省
副 査 教 授 藤 堂

学位論文題名An HLA― A3― binding prostate acidphosphatase一derivedpeptidecaninduceC
TLsrestr
ict
ed to HL
A―A2 and−A24 alleles(HLA− A3結 合 PAP由 来 ベ プ チ ド の HLA− A2お よ び‑A24拘 束 性 CTLs
へ の 誘 導能 の 研究 ）現在、世界的にペプチドワクチンを用いた癌免疫療法の臨床試験が行われている。しかし、治療に用いられているベプチドはHLA
拘束性を持って韜り、同じHLA
タイ プによる患 者の制限が ある。しか し我々は以前にHLA‑A24結合ペプチドで、異なるHLAへの交差結合能を有するぺプチドを同定した。そこで今
回我々は、現在までに我々が同定してきたH
LA‑
A
3スーパータイプ結合ペプチドの中から、異なるHLAに対し交差結合能を有するペプチドを同定する事を目的 と し た。 まず H
LA結合試 験でH
LA
‑A3スーパー タイプ14種類 のペプチド を
HL
A‑A0201、‑A0206、‑A0207、‑A2402、‑A2601への結合能を検討した。結果、14種 類の う ちPAP
155ベプ チ ドだ け がHLA‑A0201、‑0206、‑A2402に濃度依存性を持って結合能を有し、かつHL
A‑
A0207、‑2601に結合能を持たなかった。
次 に こ の PAP155ペ プ チ ド に 対 し HLA‑A0201、 ‑A0206
及 ぴ HL
A‑A2402の癌
患 者末梢血へ のペプチド 刺激によるCTL誘導試験をinVIVOで行った。結果、
ど ち ら のHLAに 対してもペ プチド特異 的CTLを誘 導した。こ のPAP
ペプ チド特異的C
TL
は、クロム遊離試験においても、HLA‑
A0201、‑A0206、及び‑A2402の CTL
は 同 じHLAタ イ プ の癌 細 胞を 強 く障 害 する 一 方、 異 なる HLA
タイプの癌細胞に対しては細胞傷害性を示さなかった。さらにHLA
拘束´陸、CD8
依存 性 及 ぴペ プ チド 特 異性 を 検討 す るた め 、CTLからCD8を抽出した 後、抗HL
A‑classI分子 抗体による 抑制試験及 びcoldt
argetによる競合抑制試験を施 行した。誘 導されたCTLの細胞傷害活性は抗HLA‑class
I分子抗体添加により抑制された事、さらにPA｀ペプチドをパルスしたcoldtargetにより抑制された事から、HLA‑classI
拘束性、かっペプチド特異性である事が証明された。
こ れらの結果 より、HL
A‑A3
スー パータイプ 結合ペプチ ドであるPA
P
155
ペプチドはH
LA‑A0201、‑0206、及ぴHL
A‑
A2402に対し交差 結合能を有 し、かつCTL誘導能を持っことが示された。
‑26ー公開発表後、まず副査の秋田教授から、＠PA
P155ペプチドがHLA‑A2と‑A
24に結 合 す る機 序 、◎ PA
P155
ベ プ チド の 、HLA
‑A3スーパー タイプPB
MCに対する 反 応 と、 HL
A‑A2や ‑A24のPBMCに 対 する反応の 違いについ て、◎ペプチド療法の展望についての質問があった。それらに対し、＠結合を規定するアミノ酸以外の立体的な配列が、H
L
A‑
A2や‑
A24に結合するのに適合している可能性 が ある。 ◎IFNッ の産生能は H
LA‑
A3ス ーパータイ プのPBM
Cに対す るものよりも低いが、細胞傷害活性に明らかな違いは認めなかった。◎現在臨床試
験により安全性が確認され、かつ臨床効果も認められてきている。今後も同様なペプチドを同定し、より多くの患者へのペプチドワクチンの使用が可能になる、等の回答があった。
藤堂教授からは、＠ペプチド特異的Ig
G抗体を誘導する機序およぴevidence、◎ペプチド療法の未来についての質問があった。それらに対し、◎投与されたペプ チ ドワク チンがCD4のエピト ープにもな りC
D4陽性 T細胞を 誘導する。
臨床的にIgG抗体が上昇した症例のほうが有意差を持って予後が良い。◎腫瘍のH
LA発現低下の有無や、腫瘍による免疫抑制などの課題を克服しつつ、術後補助療法やあるいは術前の治療法としても確立することを期待する、等の回答がなされた。
また主査 の西村教授 より、(DPA
P155
ペプチ ドのHL
A‑
A2や‑
A
24の患者に対する臨床試験について、◎HL
A‑
A2、‑
A
24の患者に対する反応、◎stabilisaationassayの際 のH
LA‑A3スーパータイプとの違いについての質問があった。これらに対し、＠実際にそれらを対照とする臨床試験はまだ行われていないが、H
LA‑A2、‑A24も併せ持 つH
LA‑A3スーパータ イプ患者に対しては使用されており、◎ペプチド特異的I
gGの上昇を認めている。◎stabilizationassayに関しては、 HLA‑A0201、‑A0206と‑A2402への結合能は低くはない。等の回答がなされた。
本論文は 本来HLA
拘 束性をもっ ぺプチドが 、異なるHLAへの結合することを報告した論文であり、ペプチドワクチン療法の可能性を広げるものである。
今後の臨床応用が期待される。審査員一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。