博 士 （ 医 学 ） 前 多 一 彦

学位論文題名
AlterdE
xpr
essionsofE
f〇Xg
enesinHumanCutaneousMa
lignantI
VIelanoma（ヒト皮膚悪性黒色腫におけるH〇X遺伝子発現の変化）

学位論文内容の要旨【緒言】癌 の浸潤・転移は、原発巣から癌細胞の遊離に始まり、最終的には標的臓器における増殖で完了する。すなわち癌細胞の発生母地からの空間的な位置移動と捉えることができる。形態形成のマスター調節遺伝子にホメオポックス遺伝子が知られている。ヒトのホメオボックス 遺伝子群のうち、クラスIに属するものは、H〇X
遺伝子と呼ばれている。H〇X
遺伝子群は A〜Dの4つのクラスターを形 成し、それぞれ別の染色体に位置し、現在39個の 遺伝 子が 知ら れて い る。 H〇 X遺伝 子は 胎生 期の 細胞 に空 間的 な位 置情 報を 与え、形態形成プログラムを実行に移す遺伝子と考えられてきた。
最近、H〇X
遺伝子の発現は、胚発生の過程だけでなく、成体においても組織・臓器に特徴的な発現 パターンを示すことが分かってきた。さらに癌組織ではH〇X遺伝子群の発現パターンが正 常組織のそれと異なることが報告され、H〇X遺伝子の発現パターンの変化と、発癌・浸潤・転移を結び付けて考えることが可能になってきた。
そこで我 々は、H〇X
遺伝子の発現変化が、悪性黒色腫の発生や転移に関与すると考え、悪性黒色腫 と色素性母斑において、HO
X39遺伝子の発現パターンについて解析を行った。
【材料と 方法】
1． 臨床 検体 ：同 意を 得た 、悪性黒色腫15例、色素性母斑7例について解析を行った。
2． RNA抽出 とcDNA化 ：ト ライゾールを使用して、臨床検体から 全RNAを抽出し、逆転写反応を 行いcDNAを合成した。
3．定量的リアルタイムRT‑PCR：HO
X39遺伝子、汐‑actin、それぞれのプライマー対を作 成。 サイ バー グ リー ン螢光色素と ABI PRISM 7900H
Tを使用して定量的RT‑PCRを行った。サン プルにおけるmRNAの較差を考慮し、内因性コントロール遺伝子（汐‑actin)の発現量で、 標的H〇X遺伝子の発現量を補正した相対比を用いた。
4．解析：統計学的解析には、マンホイットニーUテストを用いた。pく0.
01を統計学的な有 意差 とし た。 ク ラス ター 解析 には 、MAT
LAB6.
1に よるプログラムを使用し行った。
【結果】
1． 悪 性 黒 色 腫 と 色 素 性 母 斑 に お け る HOX遺 伝 子 の 発 現 ： 悪 性 黒 色 腫 に お い て 、H〇 M‖，AJ3，B9，D´2，DJ3の5遺伝子の発現が、色素性母斑よりも高く有意差を認めた。
さらに、悪性黒色腫15例に対しクラスター解析を行った。その結果、悪性黒色腫の採取部位による、H〇X
遺伝子の発現パターンの分類は不可能であった。
2．腫瘍 の厚さの違いによるH〇ズ遺 伝子の発現の違い：悪性黒色腫のpT
ステージの違いによる、H〔）メ遺伝子の発現の違いについて検証を行った。その結果、H〇X
Au，」陀遺伝子の発現は、pTl，pT2，pT3と比較してpT4において有意に高かった。一方、Hく垪C´3
遺伝‑ 544−

子の発 現はpT4に おいて 有意に 低かっ た。
3． 転 移 の 有 無 に よ る HOX遺 伝子 の 発 現 の違 い ： ま ず、 リ ン パ 節転 移 の 有 無に 関 し て は有意差を 認めな かった。しかし、術後の遠隔転移の有無に関して、H〇．XAJ，A2 ぢJヱC，4の4遺伝 子の 発 現 が 、術 後に 遠隔転 移を認め た症例 におい て高く 、明ら かな有 意差を 認めた 。さらに 、H〇ス ン 〆 ＿ acHnの 発現 比 に お いて 、 H〇 冫 ひ 2は 0． 00032l〜 O． 000364、H〇 ．XBJ3はO． 000273〜 O． 000399の 範 囲 で 、 術 後 の 遠 隔 転 移 の 有 無 を 識 別 可 能 で あ っ た 。
【 考 察】
本 研 究 に お い て 我 々 は 、 以 下 の 2つ の 仮 説 の 証 明 を 試 み た 。
1） HOX遺 伝 子 の 発 現 異 常 は 、 悪 性 黒 色 腫の 発 生 と 進行 （ 浸 潤 や転 移 ） に 関係 し て い る。
2） H〇 X遺 伝 子 の 発 現 パ タ ー ン は 、 悪 性 黒 色 腫 細 胞 の 位 置 を 決 定 し て い る 。
ま ず、 悪 性 黒 色腫 と 色 素 性母 斑 の 比 較に お いて、 H〇XA11， A13，B9 D12 D13の5遺 伝子に 有 意 差を 認 め た 。っ ま り 、 この 5遺 伝 子 の 発現異 常が、 悪性黒 色腫の 発生に関 係して いると 考 え られ る 。 ま た興 味 深 い こと に 、 こ の5遺伝 子 は す ぺて Abd‑Bファ ミリー （尾側 領域）に 属してい る。
次 に、 腫 瘍 の 厚さ に よ り 、H〇XAパ ， B2 C13の3遺 伝子に 有意差 を認め た。皮 膚悪性 黒色腫 における 腫瘍の 厚さ｜ ま、主 に垂直 方向へ の浸潤 の程度 を反映している。それゆえに、この3遺 伝 子 の 発 現 変 化 は 垂 直 方 向 へ の 浸 潤 能 に 関 係 し て い る の か も し れ な い 。
さ らに、術 後に遠隔 転移を 認めた群 では、 遠隔転移 を認め なかった 群と比較 して、
H〇 ．スひ J，A2 C4BJ3の 4遺伝子 に、明 らかな 有意差 を認め た。こ の4遺伝 子は、 悪性黒色腫と 色 素 性母 斑 に お いて 違 い を 認め た 5遺 伝 子 と、 腫 瘍 の 厚さ に よ り 違い を認め た3遺伝 子とは 異 な る遺 伝 子 で あっ た 。 っ まり 、 発 生 と浸 潤 に 関 係す る H〇 X遺 伝 子と 、転移 に関係 する
H〇 X遺伝子 は異な ると考え られる 。
し かし 、 な ぜ 遠隔 転 移 を 認め た 群 で 、こ の 4遺伝子 が増加 したか は不明 である 。そこ で、我 々 は 以下 の よ う に推 測 す る 。H〇MJ， A2の 発 現 は 、flbroblastgrowthfactor（ FGF）ファミ リ ー に属 す る 成 長ホル モンと 、成長 因子に よって 調節さ れてお り、悪 性黒色腫 も成長 ホル
モ ン レ セプ タ ー と FGFレ セ プ タ ーを 発 現 し てい る。そ れゆえ に、そ のよう なホル モンや 成長因 子 に より 、 特 定 のH〇 X遺伝子 の発現変 化を経 て、遠 隔転移 を引き 起こす のかも しれな い。
次 に 、 H〇 XC4は膀 胱 癌や前 立腺癌 のほと んどで 発現が確 認され ている 。悪性 黒色腫 を含め 、H〇 閲4の 過剰発 現は、悪 性度が 変化す る際の 一般的 な経路 のーっなのかもしれない。また、
遠 隔転移を 認めた 症例で 、H〇 XBJ3遺伝 子の発現 増加は 非常に 興味深 い。な ぜなら 、これによ ル パ ラロ グ 13に属 す る 4遺 伝 子（ H〇 縦 J3 BJ3JCJ3， DJ到 すぺ て に 有 意差 を 認 め たか らで あ る 。同 一 パ ラ ログの H〔）X遺伝子は 、互い に協カ し補う ことが 知られ ている 。っま り、
悪 性 黒 色腫 に お い ては 、 4つ の H〔 ） XJ3遺伝 子 を含むネ ットワ ークの 乱れが 、結果 的に悪 性度 を 増 強し て い る のか も し れ ない 。 今 後 、H〇X遺 伝子 間 の 発 現ネ ッ トワ ークの 解析や 、下流 の 標 的遺 伝 子 の 同定 が 、 転 移に お け る この 4遺伝 子の役 割を、 より詳 しく理解 するた めに必 要である 。
さ らに 本 研 究 では 、 悪 性 黒色 腫 の 検 体に お い て 、H〇 兄 42もし く はBJ3の 相対的発 現比（ H〇iシ〆 −ac灯功 が0．00035以 上で遠 隔転移 を発生 しやす いことを示している。悪性黒色腫
は 高 率 に転 移 を 引 き起こ す腫瘍 として 知られ ている 。それ ゆえに 、手術 検体から 将来的 な転移 の り ス ク を 予 測 す る 事が 出 来 れば 、 その 臨 床的 意 義は 非 常に 高 い。
最 近、 成 人 ヒ ト線 維 芽 細 胞に は 、 胎 生期 に 獲 得 した H〇 X遺伝 子 の 位置情 報が保 存され てい る と いう 報 告 が なされ た。し かし、 本研究 では悪 性黒色 腫にお いて部 位による 発現パ ターン の 違 いを 認 め な かっ た 。 っ まり 、 悪 性 黒色 腫 に お いて H〇 Xcodeが郵 便番号 として 機能する という仮 説は棄 却され る結果 となっ た。
ま とめと して、 H（）ズ 遺伝子の 発現異 常は、 ヒト悪 性黒色 腫の発 生や浸 潤、転 移に関係して い る とい う 仮 説 が証 明 さ れ た。 さ ら に 、あ る 特 定 のH〇X遺 伝子 は 、遠 隔転移 を予測 する
有 用なマー カーに なるか もしれ ない。

― 545 ‑

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 秋 田 弘 俊
副 査 教 授 守 内 哲 也
副 査 教 授 杉 原 平 樹

学位論文題名
AlterdExpressionsofH
OXgenesin
Human Cutaneous Malignant Melanoma（ヒト皮膚悪性黒色腫における̲I〇X
遺伝子発現の変化）

形 態形 成の マスター調節遺伝子であるH〇X遺伝子群はA〜Dの4つのク ラスターを形成し、 現在 39個 の遺伝子が知られている。最 近、HOX
遺伝子の発現は、胚 発生の過程だけでなく、成体においても組織・臓器に特徴的な発現パターンを示すことが分かってきた。本
研究は、H〇X遺伝子の発現変化が、悪性黒色腫の発生や転移に関与すると考え、同意を得た悪性黒色腫15例、色素性母斑7例について、HOX 39遺伝子の発現パターンを解析した。
その結果、悪性黒色腫においてH〇XAII，A13，B9，D12 D13の5遺伝子の発現が、色素性母斑よりも高く有意差を認めた。っまり、この5遺伝子の発現異常が、悪性黒色腫の発生に関与していると考えられる。また興味深いことに、この5遺伝子はすべてAbd‑Bフんミリー（尾側領域）に属している。次に、腫瘍の厚さの違いによる比較において、HOXA
II，B2 C13の3遺伝子の発現に有意 差を認めた。この3遺伝子の発現変化は垂直方向への浸潤能に関係していると考えられる。さらに、術後の遠隔転移の有無に関して、H〇．X
Aj，A2，C4B
J3の4遺伝子の発現に明らかな有意差を認めた。この4遺伝子は、色素性母斑との比較と、腫瘍の厚さによる比較で有意差を認めた遺伝子とは異なる。っまり、発生と浸潤に関係するH〇X
遺伝子と、転移に関係するH〇ズ遺伝子は異なると考えられる。しかし、なぜ遠隔転移を認めた群でこの4遺伝子が 増加したかは不明である。そこで、我々は以下のように推測する。
H〇X4J，A2の発現は、fibroblastgrowthfactor（FGF）ファミリーに属する成長ホルモン（GH）などによって調節され、悪性黒色腫もGHレ セプターやFGFレセプターを発現している。そのため、GHや成長因子の変化が遠隔転移に 関与しているのかもしれない。次に、
H〇M〔Xの過剰発現は、膀胱癌や前立腺癌などで広く確認されている。そのため、悪性黒色腫を含め悪性度が変化する際の一般的な経路のーっなのかもしれない。さらに、遠隔転移を認めた群におけるH〇 X
BJ3の発現増加は非常に興味深い。なぜなら、これによルパラログ13に属する4遺伝子す べてに有意差を認めたからである。同一パラログのH〇X遺伝子は、互いに協カし補うことが知られている。っまり、悪性黒色腫においては、パラログ13を含むネットワークの乱れが、結果的に悪性度を増強しているのかもしれない。今後、H〔冴遺伝子間の発現ネットワークの解析や、下流の標的遺伝子の同定が必要である。さらに本研究
では、H〇 X
A2 B
J3によって術後の遠隔転移の有無を識別可能であった。悪性黒色腫は高率に転移を引き起こす腫瘍として知られている。それゆえに、手術検体から将来的な転移のりスクを予測する事が出来れば、その臨床的意義は非常に高い。最近、成人ヒト線維芽細胞には、胎生期に獲得したH〇X
遺伝子の位置情報が保存されているという報告がなされた。しー 546 ‑かし、本研究では悪性黒色腫において部位による発現パターンに違いを認めなかった。っまり、悪性黒色腫においてHO
Xcodeは郵便番号として機能はしていないと考えられる。まとめとして、H〇X
遺伝子の発現異常は、ヒト悪性黒色腫の発生や浸潤、転移に関係していると考え られる。さらに、ある特定のHOX
遺伝子は、遠隔転移を予測する有用なマーカーになるかもしれない。
公開発 表において、副査杉原平樹教授より1）リンパ節転移の有無や原発巣と転移巣の比較の具体的な方法ついて、2）腫瘍の厚さによる発現の違いは原因と結果のどちらなのか質問が あった。次いで、副査守内哲也教授より1）症例を増やすために各大学からのサン
プル提 供の可能 性、2）悪性 黒色腫で はAbd‑Bファミリ ーに属 するH
OX
遺伝子の発現が高かった ことについて質問とコメントがあった。最後に、主査秋田弘俊教授より1）転移予測におけるprospectiv
estudyの可能性、2）各遺伝子について今後予定している分子細胞生物学的な検証について質問があった。いずれの質問に対しても、申請者は学位論文の背景および本研究の経過と結果について詳細な説明を交え、最新の知見を引用し、概ね適切に回答した。
この論文は、悪性黒色腫におけるH〇ズ39遺伝子の発現パターンを定量的に解析し、H〇X
遺伝子の発現異常が、悪性黒色腫の発生、浸潤、転移に関係していることを明らかにした点で高く評価され、今後、皮膚悪性黒色腫に対する診断、治療、予後予測への応用が期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併せ申 請 者 が博 士 （ 医 学） の 学 位を 受 け るの に 充 分な 資 格 を有 するも のと判定 した。

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