Next-generation reaction flask having a 3dimensional air-water interface
Teruhiko Matsubara*
Department of Biosciences and Informatics, Faculty of Science and Technology, Keio University
3-14-1 Hiyoshi, Kohoku-ku, Yokohama 223-8522, JAPANmatsubara@bio.keio.ac.jp
Water droplets in air have a non-contact and three-dimensional air-water interface because theinterface is maintained owing to its surface tension. In the present study, we investigated chemicaland biochemical reactions in water droplets floated using an acoustic levitation device withultrasonic waves in air. In particular, the click reaction in the levitated droplet proceeded
approximately four times faster than that in a test tube, whereas most reactions proceed without
a decrease in conventional flasks. Furthermore, the target proteins were highly expressed in thecollected cells after the culture cell suspension was levitated for 4 h for transfection. The
treatment with endocytosis inhibitor indicated that expression was improved by the enhancementof macropinocytosis. Our results suggest that the levitated droplet is available as a chemical andbiological flask with advanced functions.
Keyword: levitation, containerless reactor, air-water interface, plastic free, sustainable

Teruhiko Matsubara received a PhD in Engineering at the Tokyo Institute ofTechnology in 2000. He worked in the Department of Chemical Science andTechnology at The University of Tokushima from 2000–2002. In 2003, he moved toKeio University as an assistant professor. Since 2019, he has been an associate
professor in the Department of Biosciences and Informatics, Keio University. His
research interests include application of levitation technology in chemical biology anddesign of peptide-based biofunctional molecules.

Acc. Mater. Surf. Res. 2024, Vol.9 No.1, 18-24.

18三次元の気水界面を有する次世代の反応容器の開発
松原 輝彦

慶應義塾大学理工学部
１．はじめに：気水界面化学および生物学研究では多くの場合、対象を 1 秒以上維持するのが困難である。

物を容器にいれて液相反応を行う。しかし対象磁気、低温超伝導、光、電気、空気力学などが物が反応容器の材料表面と接触して変質する提案されている[1]。もっとも手軽なものは磁性をほか、物理吸着して溶液中の濃度が減少するこ利用するものであるが、対象物が磁性体であるとがあり、実験の再現性を下げる要因の 1 つとな必要がある。超伝導は低温にする必要があり、り得る。例えば、溶液を異なる反応容器に移動水溶液は凍ってしまうために利用できない。光するだけで、タンパク質濃度が半分程度に減少

ピンセットは微粒子や細胞をトラッピングできるすることは少なくない。この影響を少なくするた技術であるが、その保持力は数ピコニュートン

め、各研究グループで独自のプロトコールが整（pN）であり、溶液自体を捕捉するには力が足り備されるほか、市販の研究用キット類では、誰でない。空気力学は高熱の金属やガラスを成形すも再現性良く結果が得られる詳細な使用マニュる場合に有用であるが、水溶液など溶媒を用いアルが添付されている。また近年では材料表面る条件には適用が困難である。

を加工し、タンパク質や核酸が吸着しないことを化学反応および生物を取り扱う場合には、ま売りとする商品が売り出されている（低吸着チュず常温・常圧が好ましく、さらに出来得るならばーブやチップなど）。

浮揚させる物質の制限が少ないほうが望ましい。

反応溶液は容器材料表面と接触するだけでな

そ こ で 本 研 究 で は 音 響 浮 揚 現 象 （ acoustic

く、空気（気相）とも接する（二次元の気-液界面、levitation）に着目した [2] 。この現象は、音響波

Figure 1A 左）。もし空気中の酸素と反応する対（音波もしくは超音波）の発生源となる振動子と象物であった場合に、これも期待しない副反応反射板の間に定在波音場を形成させると、そのの原因となり得る。これらは言い換えれば、固-音圧により定在波の節（node）の位置に物体液界面と気-液界面のヘテロな界面を有すると（数 mm 程度）を捕捉（浮揚）させることができるいうことである。仮に接する界面を単一にするこ（Figure 1B）。

物質を浮かせる技術は、1980 年代にすでにとができれば、これらの諸問題を解決することができるかもしれない。固-液界面をなくし、気-液界面のみにするということは、具体的には溶液を空気中に浮かせることでその実装が可能になる。
２．気相中での溶液の浮揚（音響浮揚）
溶液が接する界面が気相（空気）のみという状
態は、身近にある例では、雨つぶや飛散した水滴が考えられる（三次元の気-液界面、Figure1A 右）。しかし重力のため地球上ではこの状態
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19（合成）を行った。この高分子は分子ふるい能があるため、電気泳動によってタンパク質や核酸などの生体高分子を分離・精製する用途で用いられている（ポリアクリルアミドゲル電気泳動,PAGE）。
モノマーとしてアクリルアミドと N,N'-メチレンビ
スアクリルアミドを入れた溶液をマイクロピペッタ
ーを用いて節の位置付近で吐出し、液滴として浮揚させた。ここに重合開始剤として過硫酸アンモニウム（APS）および N,N,N',N'-テトラメチレンジアミン（TEMED）を加えて重合反応を開始した（Figure 2A）。電気泳動で用いる場合、この反応は２枚のガラス板を挟んだ間隙で行わ
Figure 1. Three-dimensional (3D) air–water

れるが、浮揚液内でも重合が進行し、ゲル化すinterface. (A) Schematic representation of 2Dることが確認できた。また重合後の液滴に綿棒(water in trough, left) and 3D (droplet, right)を近づけ、ゲル（数 mm の大きさ）を回収するこinterface. (B) Single-axis ultrasonic levitator usedとが可能であった。

in this study. Three (two 5 µL and one 10 µL)（b）クリック反応

levitated droplets are shown.

試験管内や培養細胞内の水溶液中において多くの化合物が共存する場合に、部位特異的ランジュバン型の超音波振動子（周波数 60にマーカーとなる官能基（蛍光性物質など）kHz）に凹型ホーンを装着し、反射板をホーンかを修飾することができれば、標的分子の細胞ら 15 mm 程度の距離に設置した（Figure 1B）。

内および体内動態を調べることができ、大変ここで波長 λ（m）、空気中の音速 c（340 m）、周有用である。この修飾は標的とする分子のみ波数を f（Hz）とすると、この周波数での音波は λに特異的に反応（生体直交型の反応）できる= c / f = 5.67 mm となる[3]。この時の音圧は数ことが望ましい。
「クリック反応」と呼ばれる2Pa (=N/m )であることから、数 mm 程度の小さくアジドとアルキン残基の間の Huisgen 1,3-双て軽い物質であれば捕捉させることができる。実極子付加環化反応はこの目的に適しており、装した装置では、1〜20 µL の範囲の水滴を定水溶液中での修飾反応に頻用されている[5]。

在波の節に安定に固定することができ、また複リシン側鎖の ε-アミノ基がアジドに置換さ数の節で 2 つ以上の水滴が同時に浮揚可能でれた Fmoc-アジドリジン（Fmoc-Lys(N3)）とあった[4]。この装置は原理的に指向性スピーカ

アルキン修飾されたビオチンとクリック反ーでも構築可能であるが、水溶液を使用する場応で連結させる反応を行なった。これらの化合は、防水が必要と考え、本研究では金属製の合物を含む溶液 を浮揚させた後、 最後に振動子を用いた。

CuSO4 水溶液を添加して反応を開始した。試験管内では 20 分程度かかる反応が、浮揚液３．有機合成反応

滴内では 5 分以内で進行し、数倍促進される（a）高分子重合ことが明らかになった（Figure 2B）[4]。合成し音響浮揚させた液滴内部で、有機合成反応を行った研究例は見当たらないようであった。そこでまず最初に、ポリアクリルアミドの高分子重合た化合物の分解も観察されず、試験管内よりAcc. Mater. Surf. Res. 2024, Vol.9 No.1, 18-24.

も反応が早く進行した。これらの結果は、浮20揚液滴が合成反応の無容器フラスコとして液滴を撮影してモニタリングすると、浮揚液滴利用できる可能性を示す。

は時間とともに色が変化した（Figure 3A） [4] 。
ELISA などで発色するための反応時間は 20 分以内であることが多い。試験管内と同条件で、浮揚液滴内での酵素反応が進行することが示された。

Figure 2. Organic synthesis reactions in theFigure 3. Enzymatic reaction in a levitatedlevitated

droplet.

droplet.

(A)

Polyacrylamide(A)

Chromogenic

reaction

ofo-polymerization. The polyacrylamide gel obtained

phenylenediamine

was collected with a cotton swab. (B) Cu(I)-horseradish

catalyzed click reaction. The reaction waselectrophoresis of plasmid DNA after digestion bycompleted within 5 min.

restriction enzyme.[4](OPD)

peroxidase.

catalyzed(B)byAgarose４．酵素反応（a）発色反応
浮揚液滴を生命科学研究で用いるには、酵素反応は必須である。酵素は反応容器に吸着して濃度が減少するだけでなく、失活することも多い。
まず、発色反応を検討した。例えば酵素結合免 疫 吸 着 測 定 法 （ enzyme-linked
immunosorbent assay, ELISA）、ウエスタンブ
ロッティング、免疫組織化学染色などでは、基質を酵素反応で着色分子や蛍光性の分子に転換する方法が頻用される。浮揚液滴内において酵素反応の進行を可視化するため、酵素は西洋
ワサビペルオキシダーゼ、比色基質として o-フェニレンジアミン（OPD）を用いた。酵素と OPDを浮揚させ、そこに過酸化水素（H2O2）を加えることで反応を開始した。
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（b）制限酵素による切断
遺伝子操作を行う際には、酵素による反応が必要である。遺伝子を切断する場合は制限酵素、連結ではリガーゼ、伸長（増幅）する場合はポリメラーゼを用いる。浮揚液滴内でこれらの酵素反応が進行するか検証するため、二本鎖DNA（dsDNA）の切断反応（消化）を行った。
3.4 キロベース（kb）の dsDNA および制限酵素（HindIII）を浮揚液滴内で 15 分間反応させた。
アガロースゲル電気泳動で解析したところ、切断された 2.6 kb と 0.8 kb のフラグメントが確認できた（Figure 3B）[4]。またこれらのフラグメント以外のバンドが観察されないことから、浮揚させることで DNA が損傷（切断）されないことが確認された。最近、浮揚液滴内でウイルス RNA 遺伝子を酵素で増幅する研究が報告され[6]、浮揚液21

滴内での様々な遺伝子操作への応用が期待でゼ発現活性が増加し、4 時間で有意に高い活きる。

性を示した（Figure 5B）。
エンドサイトーシス阻害剤による処理を行った

５．細胞への遺伝子導入

ところ、pDNA 複合体はカベオラ/ラフト介在性エ（a）培養細胞の浮揚ンドサイトーシスを抑制し、マクロピノサートーシ

生命科学研究において培養細胞への遺伝子スを亢進していることが示された。つまりルシフ導入（トランスフェクション）は、タンパク質や遺伝ェラーゼなどの遺伝子発現の向上は、浮揚させ子の役割を評価する極めて重要な操作の１つたことによる取り込み効率の増加に起因することである。遺伝子導入に先立ち、細胞を 4 時間空が示された。

気中で浮揚させ、その生存率を評価した。細胞懸濁液を浮揚（levitated）させるほか、対照実験と し て 試 験 管 を 静 置 （ static ） お よ び 振 盪（shaken）させ、トリパンブルー色素排除試験法を行った。静置条件などと比較してやや生存率は低かったものの、遺伝子導入操作に影響ないことが示された（Figure 4）。

Figure 5. Plasmid DNA (pDNA) transfection bylevitation. (A) The cell suspension was mixed
with the pDNA complex and the mixture was
Figure 4. Influence of levitation on the cell

levitated for 4 h. (B) Luciferase activity of the cells

viability. Huh-7 cells were levitated for 4 h andlevitated for 4h was greater than that of the staticthen subjected to trypan blue exclusion assay.[7]and shaken cells.

（b）遺伝子導入（トランスフェクション）

６．超音波の生体試料への影響について

浮揚液滴を用いてプラスミドの細胞ヘの遺伝

上述したクリック反応や遺伝子導入は、試子導入を試みた研究はすでに報告がある。しか験管の中と比較して数倍の反応速度や導入し、浮揚させたのは数分間の混合操作だけであ効率の向上があった。しかしながら、このようなり、数時間のトランスフェクションは培養皿で行っ影響は予想外であり、直接的な因子は明らかに[8][9]ていた。

なっていない。生命科学研究での超音波は、器そこで我々は、プラスミド DNA（pDNA、ルシフ

具洗浄はもちろん、細胞破砕を破壊するほか、ェラーゼ遺伝子を含む）と遺伝子導入試薬（リポリポソームを作製する際にも用いられる。これら

フェクトアミン）の複合体を浮揚させた Huh-7 細の操作で有効な因子はキャビテーションであり、胞懸濁液に投与し、4 時間遺伝子導入を行った

ソノケミストリー（sonochemistry）分野の研究対（Figure 5A）。継時変化を追跡したところ、トラ照である。キャビテーションは物理的な負荷にンスフェクション時間の増加とともにルシフェラー

加 え 、 活 性 酸 素 （ reactive oxygen species,Acc. Mater. Surf. Res. 2024, Vol.9 No.1, 18-24.

22ROS）が発生する。例えばホモジナイザー（細いた[15]。Wood らは浮揚させた赤血球をラマン胞破砕機）は、100 W 以上の強力な出力で超スペクトル測定し、Raman acoustic levitation

音波（周波数：20 kHz〜100 kHz）を発生させる

spectroscopy（RALS）と命名している[16]。2010

装置である。本研究で用いる超音波の出力は、年代になり、少しずつケミカルバイオロジーに適最大で超音波強度 1.6 W/cm2 であり、見かけ上用できる研究が報告され始めた。Cheng らは、の DNA への損傷も観察されず、Miller らによる溶媒が蒸発することを利用し、浮揚させた状態[10]の結果と一致する。ここで超音波強で DNA を含むナノアセンブリを作製している[17]。

度（W/cm2）は、単位面積に垂直に照射された

また、上述したが、変調超音波アレイによって浮場合の単位時間あたりのエネルギーであり、空揚させた液滴内で酵素を用い、ウイルス遺伝子間ピーク時間平均強度（spatial peak temporalを増幅する研究も報告された [6] 。今後、化学おaverage intensity, SPTA）という指標で評価さよび生命科学研究への音響浮揚技術の適用が先行研究2れる。ただし超音波強度を 8 W/cm まで増加さ期待される。

せて 10 分間連続的照射すると、細胞内の一本鎖 DNA が損傷すると報告している（周波数 1.6MHz） [10] 。本装置でキャビテーション気泡やそれに起因するソノルミネッセンス[11]などは観察できていないが、微弱なキャビテーションがクリック反応や遺伝子導入への影響があったと考えられる[12,13]。さらに、浮揚液滴の内外で特異な流動[14] があるとの報告もあり、今後の研究が必要である。
非侵襲の診断装置として、超音波はすでに医療現場で実用化されている。超音波診断装置
は、熱的作用を評価するサーマルインデックス（thermal index, TI）や非熱的作用を評価するメカニカルインデックス（mechanical index, MI）が生体への影響を調べる指標とされ、厳格な基準が設けられている[3]。ここで MI は音圧（MPa）と周波数（MHz）で定義され、キャビテーションは非熱的作用に分類される。超音波は、周波数と出力の組み合わせで音響エネルギーを選択し、生体に与える影響がない条件を設定することが可能である。
７．研究動向浮揚現象を利用した学術研究は、物理現象と

８．最後に
本稿では、水溶液中における有機合成および酵素反応、液滴内での培養細胞が関わる成果について紹介した。従来の試験管内と比較し、いくつかその利点は見出されてきている。ただし３次元界面を活用した効果や因子はまだ見出されておらず、今後の研究が期待される。
また、バイオ系実験で用いる消耗品の多くは使い捨てプラスチックであり、実験従事者が年間で数十 kg の廃棄物を出しているとの報告がある[18]。ゼロにすることは難しいかもしれないが、無容器にすることで、その廃棄量を大きく削減することが期待できる。バイオ系実験室のゴミは焼却処分されることが多いが、持続可能な開発目標（SDGs）への取り組みの一環として、利用制限されることも想定すべきである。無容器のフラスコとしての普及により、次世代の研究環境が変わることを期待したい。
９．謝辞
本研究の一部は JSPS 科研費 20K21113 および学内研究費補助金による支援を受けた。本
研究を遂行するにあたり、協力を得た本多電子
株式会社、株式会社アイカムス・ラボ、共同研究者および学生諸氏に心より謝意を表する。

しての理論研究が多く、生命科学に適用した例はあまり多くない。2000 年代では 5〜10 mm 程度の昆虫などの生物（蟻、てんとう虫、クモなど）を浮かせるなどのユニークな研究も報告されてAcc. Mater. Surf. Res. 2024, Vol.9 No.1, 18-24.

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