博 士 （ 医 学 ） 張福 先

学位論文題名Effec
tof
Ci
10stazolonEn
dothelialC
e11Denudation
andPr01iferationinCanineVeinGraftS（イヌ静脈グラフトにおける内皮細胞剥離及び増殖に対するシロスタゾールの効果）
学位論文内容の要旨【背景］下肢閉塞性動脈硬化症において静脈グラフトによる再建はいまだ第一選択と され てい る。ま た、 虚血 性心 疾患 にお いて は動脈グラフトの優位性は確立
され てい るが 、その 本数 や口 径、 長さ など に限 界があり静脈グラフトの重要性が再 認識 され ている 。し かし 、静 脈を 動脈 系に 使用することにより比較的早期に狭 窄性 病変 を生じ 、病 理学 的に は線 維組 織の 増生や血管平滑筋細胞の増殖などに よる 内膜 肥厚が みら れる 。動 脈グ ラフ トは 移植後から内皮細胞の剥離はほとんどみられず、nitricoxideやprostacyclin産生など内皮細胞機能が維持されている 。一 方、 静脈グ ラフ トは 血管 内皮 細胞 の多 くがいったん脱落して、再生内皮 細 胞 で覆 わ れ る ま で 3〜 4週 を 要 する ため、 それ らの 機能 が低 下し 内膜 肥厚を促 進す るこ とが示 唆さ れて いる 。従 って 、静 脈グラフトにおいては、移植後の 血 管 内皮 細 胞 脱 落 を 阻 止 す る こ とに より、 内膜 肥厚 の抑 制が 期待 でき る。
cilostazolは近年増加しつっある脳梗塞や心筋梗塞、慢性動脈閉塞症のような動 脈血 栓症 におけ る血 栓形 成阻 止を 目的 とし て開発され、慢性動脈閉塞症の虚血症状の改善薬として臨床応用されている。cilostazolの作用機序は細胞内のcyclicadenosinemonophosphate(cWP） の 分 解 酵 素 で あ る cAMPphosphodiesterase（PDE）を 阻害 する こと によ りcAMP濃度を上昇させることであり 、そ れに より抗 血小 板作 用や 抗血 栓作 用、 血管拡張作用のような薬理作用を発揮する。さらに、cilostazolは内皮細胞の増殖や高血糖で惹起される内皮細胞 の ア ポト ー シ ス を 抑 制 す る こ と が invitroの 実 験 で 示 さ れ て いる 。ま た、cilostazolはラット頚動脈のバルーン障害モデルやイヌ腸骨動脈のステント移植モデルで内膜肥厚を抑制することが報告されている。今回、われわれはcilos
tazolが 有 す るこ れ ら の 内 皮 細 胞 の 増 殖 作用 やアポ 卜ー シス 抑制 作用 に注 目し て、cilostazolの内皮 細胞の剥 脱や増殖に対する作用をイヌ頚静脈移植モデルを使用して検 討した。
【 材料 と 方法 ］ 体 重10〜 15kgの 雑 種 成犬 20頭を 使 用し て 、 自家 静 脈移 植を 行っ た。 動 物の 取り扱 いは北京 鉄道病院 のガイド ラインに従 って行わ れた。実 験
動 物の 10頭 は 移 植10日 前よ り cilostazolの 経 口投 与 (50mg/日 ） を摘 出 時まで続けた (cilostazol群）。一方、対照としてcilostazolを与えない群10頭を作成した（対 照群）。 自家静脈移 植は以下のように行った。イソゾール静注し、挿管、調 節呼 吸 とし た。頚 部正中切 開にて一 側頚静脈 を剥離し、 できるだ け損傷を 与
え ない よ うに 約 4cmの自 家 静脈 グ ラ フ卜 を 採取し た。腹部正 中切開に て腹部大動脈と 右側腸骨 動脈を剥離 して、ヘバリン静注後それらの動脈をクランプした。
自 家静 脈 グラ フトの 中枢側を 腹部大動 脈に6ー0プ 口ーリン連 続縫合で 端々吻合を 行っ た 。自 家静脈 グラフト の末梢側 を右側腸 骨動脈に同 様に吻合 した。中 枢側 と末 梢 側の 間の自 家動脈は 競合しな いように 結紮した。 術中、ペ ニシリン 系抗生剤 を点滴静 注した。
そ れぞ れ の群 に お いて 移 植静 脈 グ ラフ 卜 の摘 出 を 5頭 ずっ 移 植1日目 と移植 50日 目に 行 っ た。 摘 出 は全 身 麻酔 下 で へバ リ ン化 し て 行い 、 取り 出 した移植静脈 グラフトはへパリン生理食塩水で洗い、縦方向に切開した。内表面を0.3％硝 酸銀 で 染色 して、 実体顕微 鏡で観察 した。多 辺形の細胞 を内皮細 胞として 同定 して 、 全面 積に対 する内皮 細胞で被 覆された 面積の割合 を内皮細 胞被覆率 として算 出した。 また、標本 の一部を 10u/o緩衝ホル マリン液 で、固定しバラフイン で包 埋 した 。Symの厚 さに切り 出しHematoxylin‑Eosin(H‑E)染色 を行い、 光学顕微 鏡で内膜 の変化を観 察した。統計はMann‑WhitneyU‑testで行い、pく0.05を有 意 差あ りと し た。 また 、 数値 は平 均 土標準偏 差で示した。
【結果 ］術中術 後に両群と もに出血による合併症はなかった。両群ともに摘出時に移植 静脈グラ フトは全例 開存して いた。
肉 眼的 観 察で は 、 cilostazol群 では 移 植1日目と 移植50日目 ともに内面 は内 皮細 胞 に広 く被覆 されてい たが、対 照群では 内面の内皮 細胞は大 きく剥脱 されてい た。内皮 細胞被覆率 は、cilostazol群では移植1日目80.2土7.9％、移植50日 目81.8土 813％で あ り 、対 照 群は 移 植 1日目 15.9士2.3％、移 植50日目40.7土1411％ であ っ た。 内 皮 細胞 被 覆率 は 移 植1日目と移 植50日目とも にcilostazol
群 が対 照 群に 比 較 して 有 意に 高 値 であ っ た。 また、対照 群では移 植1日目と 比較 して 移 植50日目で有 意に増加 したが、 cilostazol群では有 意な増加は なかった。
光 顕的 観 察で は 、 移植 1日 目 では 両 群 で正常静 脈に比較し て内膜肥 厚していた が 、cilostazol群 で対照群 より薄か った。移植 50日目では 両群で内 膜肥厚が 続 い て い た が 、 や は り cilostazol群 で 対 照 群 よ り 薄 か っ た 。
［考察］ 自家静脈グ ラフト採 取の際の 低酸素や加圧、操作などのストレスは内膜障害 を 引き 起 こ し、 採 取後 48時間 以 内 に 60〜 70％の内 皮細胞が 脱落する 。その修 復 治癒 は グ ラフ ト内面に 残存した内 皮細胞や 吻合部の 宿主動脈 の内皮細 胞の増 殖 によ っ て 行わ れ 、移 植 条 件に 左 右 され る が再被覆 の完成ま で通常1週 から数 カ 月か か る 。こ の内皮細 胞の脱落や 増殖とと もに、グ ラフト壁 では細胞 増殖、 細 胞死 、 細 胞遊 走、およ び細胞外マ トリック スの産生 ・分解を きたすよ う
な血 管 構築 の 変 化が 起きてい る。内皮細 胞の剥脱 により血 小板の付 着や壁透 過性の 亢 進な ど が 起こ り、血液 よりしみ込 むあるい は局所的 に産生さ れる増殖 因子や 血 管作 動 性 物質 などによ り血管平滑 筋細胞の 増殖や線 維性成分 の産生を きたし内膜肥厚を生ずることが示唆されている。
今 回 使 用 し た cilostazolは PDE阻 害 薬で あ り、 c揃 Pの 分 解 を阻 害 して 増加させる 。それによ りphospholipaseやcyc100xygenaseが抑 制され血 小板の凝集が阻害さ れたり、Ca2゛ の放出が 抑制され 血管収縮 が阻止さ れたり、 血管平滑筋細胞 の 増殖 が 抑 制さ れたりす ることによ って、パ ルーン拡 張やステ ント留置 後の閉塞に有効であることが報告されている。また、hepatocyteび0wthfa
ctor（HGF）
産生 を 活性 化 す るこ とにより 、内皮細胞 増殖の促 進や高血 糖による 内皮細胞 障害を予防 することが 示されて いる。今 回の実験ではcilostazolによる内皮細胞増殖の 促 進作 用 は みら れなかっ たが、静脈 グラフト 採取とい った物理 的な刺激 に
対し て 内皮 細 胞 障害 の予防効 果があるこ とを示唆 された。 また、今 回の実験 ではcilostazol投与 によ る静脈グ ラフトの 内膜肥厚の 抑制も観 察された 。これはcilostazolによる血小板凝集の阻止や血管平滑筋細胞増殖の抑制によるとともに、内 皮 細 胞 層 が よ く 保 持 さ れ た こ と が 関 与 し て い るこ と が推 測 され た 。
【結語］ イヌ頚静脈 移植モデ ルにおい てcilostazol
は内皮細胞の剥脱を抑制し、内膜 肥 厚を 抑 制 した 。内皮細 胞障害は血 管リモデ リングの 初期変化 にあたり 、その 予 防は も っ とも 効果的な 内膜肥厚の 抑制法の ひとつと 考えられ 、今後の 発展が期待される。

学位 論文審査の要旨
主 査 教 授 加 藤 紘 之
副 査 教 授 北 畠顕副 査 教 、 安 田 慶 秀授

学位論文題名Effe
ct ofCilostazolonEndothelialCellDenudationand Proliferation in Canine Vein Grafts（ イ ヌ 静 脈 グ ラ フ ト に お け る 内 皮 細 胞 剥離 及び増殖に対するシロスタゾールの効果）
下肢閉 塞性動脈 硬化症にお いて静脈 グラフト による再 建はいま だ第一選 択とされてい る。しか し、静脈を 動脈系に 使用する ことによ り比較的 早期に狭 窄性病変を生 じ、病理 学的には線 維組織の 増生や血 管平滑筋 細胞の増 殖などに よる内膜肥厚 がみられ る。静脈グ ラフトは 血管内皮 細胞の多 くがいっ たん脱落 して、再生 内 皮細 胞 で 覆わ れ る まで 3〜 4週 を 要す る ため 、 そ れら の機 能が低下 し内膜肥厚が 促進され ることが示唆されている。従って、静脈グラフトにおいては、移植後 の血管内 皮細胞脱落 を阻止す ることに より、内 膜肥厚の 抑制が期 待できる 。 cilostazolの 作 用 機 序 は 細 胞 内 の cAMPの 分 解 酵 素 で あ る cAMP
phosphodiesterase (PDE)を 阻 害す る こと に よ りcWP濃 度を 上昇 させるこ とであり、 それによ り抗血小板 作用や抗 血栓作用 、血管拡 張作用の ような薬 理作用を発揮す る。また 、cilos
tazolは内皮細胞の増殖や高血糖で惹起される内皮細胞のアポトーシスを抑制することがinvi
tToの実験で示されている。今回、cilostazolが有 す るこ れ ら の内 皮 細 胞の 増 殖作 用 や アポ ト ーシ ス 抑 制作 用に注目 して、cilostazolの内皮細 胞の剥脱や増殖に対する作用をイヌ頚静脈移植モデルを使用して 検 討し た 。 雑種 成 犬 を使 用 して 、 自 家静 脈 移植 を 行 った 。移植10日 前よりcilostazolの経口投与（50m〆日）を摘出時まで続けた群（cilostazol群）と、対照とし てcilostazolを与えない群を作成した（対照群）。それぞれの群において 移 植 静 脈 グ ラ フ 卜 の 摘 出 を 5頭 ず つ 移 植 1日 目 と移 植 50日 目 に行 っ た 。内表面 を 013％ 硝 酸 銀で 染 色 して 、実体 顕微鏡で 観察した 。多辺形 の細胞を 内皮細胞と して同定し て、全面 積に対す る内皮細 胞で被覆 された面 積の割合を 内皮細胞被 覆率として 算出した 。また、 標本の一 部を100/0緩衝ホルマリン液で、固定しバ ラフィンで 包埋した 。Symの厚さ に切り出 しHematoxylin‑Eosin(H‑E)染色を行 い、光学顕 微鏡で内 膜の変化 を観察し た。両群 ともに摘 出時に移植 静脈
グラフ トは全例開 存してい た。肉眼 的観察で は、ci
lostazol
群では移植1日目と移 植50日目 と も に内 面 は内 皮 細 胞に 広 く 被覆 さ れて い たが 、対照群 では内面の内皮 細胞は大き く剥脱されていた。内皮細胞被覆率は、cilostazol
群では移植
1日目80． 2土7．9％、移 植50日目81.8土 8.3％であり 、対照群 は移植1日 目15.
9
土 2.3％ 、 移植 50日目 40.7土14． 1％であっ た。内皮 細胞被覆 率は移植 1日目と移植50日 目ともにcilostazol群が対照群に比較して有意に高値であった。また、
対 照群 で は移 植 1日 目 と比 較し て移植50日 目で有意 に増加し たが、cilostazol群 では 有 意な 増 加 はな か った 。光顕的 観察では 、移植1日 目では両 群で正常静脈に比 較して内膜 肥厚していたが、cilostazol群で対照群より薄かった。移植50日目で は両群で内 膜肥厚が続いていたが、やはりcilostazol群で対照群より薄かった。 従って、cilostazolによる内皮細胞増殖の促進作用はみられなかったが、静脈グ ラフト採取 といった 物理的な 刺激に対 して内皮 細胞障害 の予防効果 があること を示唆され た。また、今回の実験ではcilostazol投与による静脈グラフトの内膜 肥厚の抑制 も観察された。これはcilostazolによる血小板凝集の阻止や血管平滑 筋細胞増殖 の抑制に よるとと もに、内 皮細胞層 がよく保 持されたこ とが関与し ていること が推測さ れた。口 頭発表に 際して、 北畠教授 からシ口ス タゾールの 血小板抑制 作用の機 序、初期 の内皮細 胞脱落の 機序、投 与期間など について質 問がなされ た。次に 加藤教授 からシ口 スタゾー ルの前投 与と後投与 の意
義、検 索部位の妥 当性につ いて質問 がなされ た。安田 教授から は実験の進 め方につい てコヌント があり、 関連実験 の現況に ついて質 問がなさ れた。いず れの質問に 対しても、 申請者は 過去のデ ータや関 連論文を 引用し、 概ね妥当な 回答を行っ た。
今後こ の論文で得 られた結 果は薬剤 による移 植血管内 膜肥厚の 予防法の開発に貢献 することが 期待され る。
審査員 一同は、こ れらの研 究成果を 高く評価 し、申請 者が博士 （医学）の学位を受 けるのに十 分な資格 を有する ものと判 定した。