山形県衛生研究所報短No.56 2023/11

報
インフルエンザウイルスと SARS-CoV-2 のfast リアルタイム逆転写 PCR 検出系の妥当性評価
駒林賢一，佐々木美香，瀬戸順次，池田陽子，青木洋子，水田克巳

Validation of the fast real-time reverse transcription PCR detection
system for influenza virus and SARS-CoV-2
Kenichi KOMABAYASHI，Mika SASAKI，Junji SETO，Yoko IKEDA，Yoko AOKI，and
Katsumi MIZUTA
地方衛生研究所におけるウイルス感染症病原体の検出にはリアルタイム逆転写（ RT）PCR 法を用いることが多い．本研究ではインフルエンザウイルスおよび重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2（SARSCoV-2）それぞれの遺伝子検出系について，国立感染症研究所の病原体検出マニュアルに記載された標準法と，fast リアルタイム RT-PCR 法（改良法）の比較を行った．インフルエンザウイルスの 8 つおよび
SARS-CoV-2 の 2 つの検出系について，陽性コントロール希釈系列を標準法及び改良法で測定し，反応系の PCR 効率および検出感度を決定した．改良法では総反応時間 53 分の熱反応条件を両ウイルスともに用いた．改良法の検出感度は標準法に比べ概ね同等以上であった．改良法は定量を伴わない病原ウイルスのスクリーニング検査には有用であり，インフルエンザウイルスおよび SARS-CoV-2 の検査を短時間かつ同一プレート上で実施できるため，検査に要する時間とコストが低減できる可能性がある．

キーワード：fast リアルタイム RT-PCR 法，インフルエンザウイルス，新型コロナウイルス，コスト削減

Ⅰ

はじめに

くの物的，時間的，人的コストが必要となる．病原体

地方衛生研究所は感染症が発生した際に起因病原検出マニュアルに記載の方法とは異なる試薬・機器・体を同定する役割を担っており，正確な検査結果を迅

反応条件を用いる場合は，その使用の妥当性を確認す

速に提供することが求められる 1）．ウイルス感染症のることとなっており，検査方法を改良してコストを抑場合は遺伝子検査が一般的に用いられ，特に TaqMan

えることができれば，地方衛生研究所の健康危機管理

プローブを用いたリアルタイム逆転写（RT）PCR 法が体制の強化に資することができると考えられる．

主流となっている．現在国立感染症研究所によって示

本研究では，fast リアルタイム RT-PCR 法の熱反応されているウイルスの病原体検出マニュアルでは，ス

条件を統一した上で，インフルエンザウイルスと重症

タンダードモードでのリアルタイム RT-PCR 法が標準

急性呼吸器症候群コロナウイルス 2（SARS-CoV-2）検法として記載されている場合が多く，測定完了までに出系のそれぞれの妥当性を評価することで，迅速かつ

1.5～2.5 時間程度を要する．加えて，ウイルス毎に反効率的な遺伝子検出系を構築することを目的とした．

応液の総量や PCR の温度条件が異なることもあり，複数種のウイルスの検査を並行実施する場合には多1

山形県衛生研究所報表1No.56 2023/11

プライマー・プローブ一覧

ターゲット

検出系

オリゴ名

塩基配列

最終
濃度
(μM)

A 型共通 M 遺伝子 1）2）FluA

A 型 H1pdm09 亜型 HA 遺伝子

A 型 H3 亜型 HA 遺伝子

1）

H1

1）

H3

Ｂ型共通 NS 遺伝子 1）

FluB

Ｂ型ビクトリア系統 HA 遺伝子

Ｂ型山形系統 HA 遺伝子1）1）

A 型 H7 亜型 HA 遺伝子 2）

A 型 H5 亜型 HA 遺伝子

2）

N 遺伝子 3）

S 遺伝子

3）

BVi

BYa

H7

H5

N2

S2

MP-39-67For

5'-CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC

0.6

MP-183-153Rev

5'-TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA

0.6

MP-96-75ProbeAs

5'-(FAM)ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG(MGB)

0.1

NIID-swH1 TMPrimer-F15'-AGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGT

0.6

NIID-swH1 TMPrimer-R1

5'-TGTTTCCACAATGTARGACCAT

0.6

NIID-swH1 Probe25'-(FAM)CAGCCAGCAATRTTRCATTTACC(MGB)

0.1

NIID-H3 TMPrimer-F15'-CTATTGGACAATAGTAAAACCGGGRGA

0.6

NIID-H3 TMPrimer-R15'-GTCATTGGGRATGCTTCCATTTGG

0.6

NIID-H3 Probe15'-(FAM)AAGTAACCCCKAGGAGCAATTAG(MGB)

0.1

NIID-Type B TMPrimer-F15'-GGAGCAACCAATGCCAC

0.6

NIID-Type B TMPrimer-R15'-GTKTAGGCGGTCTTGACCAG

0.6

NIID-Type B Probe25'-(VIC)ATAAACTTYGAAGCAGGAAT(MGB)

0.1

Type B HA F3vic v25'-CCTGTTACATCTGGGTGCTTTCCTATAATG

0.6

Type B HA R3vic v25'-GTTGATARCCTGATATGTTCGTATCCTCKG

0.6

FAM-Type B HA Victoria

5'-(FAM)TTAGACAGCTGCCTAACC(MGB)

0.1

Type B HA F3yam v25'-CCTGTTACATCCGGGTGCTTYCCTATAATG

0.6

Type B HA R3yam v25'-GTTGATAACCTKATMTTTTCATATCCTCTG

0.6

FAM-Type B HA Yamagata25'-(FAM)TCAGRCAACTACCCAATC(MGB)

0.1

NIID-H7 TMPrimer-F15'-TGTGATGAYGAYTGYATGGCCAG

0.6

NIID-H7 TMPrimer-R15'-ACATGATGCCCCGAAGCTAAAC

0.6

NIID-H7 Probe15'-(FAM)ATCTGTATTCTATTTTGCATTGCYTC(MGB)

0.1

H5HA-205-227v2-For

5'-CGATCTAGAYGGGGTGAARCCTC

0.6

H5HA-326-302v2-Rev

5'-CCTTCTCCACTATGTANGACCATTC

0.6

H5HA-205-227-For(2010)

5'-CGATCTAAATGGAGTGAAGCCTC

0.15

H5HA-326-302-Rev(2010)

5'-CCTTCTCTACTATGTAAGACCATTC

0.15

H5-Probe-239-RVa

5'-(FAM)AGCCAYCCAGCTACRCTACA(MGB)

0.075

H5-Probe-239-RVb

5'-(FAM)AGCCATCCCGCAACACTACA(MGB)

0.025

NIID_2019-nCOV_N_F2

5'-AAATTTTGGGGACCAGGAAC

0.5

NIID_2019-nCOV_N_R2

5'-TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC

0.7

NIID_2019-nCOV_N_P2

5'-(FAM)-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-(TAMRA)

0.2

SARS-CoV-2_NIID_S_F1

5'-CAGTCAGCACCTCATGGTGTA

0.4

SARS-CoV-2_NIID_S_R3

5'-AACCAGTGTGTGCCATTTGA

0.7

SARS-CoV-2_NIID_S_P2

5'-(ABY)-TGCTCCTGCCATTTGTCATGATGG-(QSY)0.21）：季節性インフルエンザウイルス，2）：鳥インフルエンザウイルス，3）：SARS-CoV-2

Ⅱ
1

材料と方法

Scientific）を用いた fast リアルタイム RT-PCR 法（以リアルタイム RT-PCR 法

下，T 法）を用意した．Q 法は，国立感染症研究所がQuantitect probe RT-PCR kit（ QIAGEN）を用いたスタ示した病原体検出マニュアル（インフルエンザ診断マ

ンダートリアルタイム RT-PCR 法（以下，Q 法）と，

ニュアル第 4 版 2)，高病原性鳥インフルエンザ（H5N1）

TaqMan fast virus 1-step Master Mix （ Thermofisher

診断マニュアル第 3 版 3)，鳥インフルエンザ A(H7N9)2

山形県衛生研究所報No.56 2023/11

ウイルス検出マニュアル第 2 版 4)，病原体検出マニュ

陽性コントロール RNA は季節性インフルエンザウ

アル 2019-nCoV Ver.2.9.1 5) ，「感染研・地衛研専用」

イルス，鳥インフルエンザウイルス，SARS-CoV-2 のSARS-CoV-2 遺伝子検出・ウイルス分離マニュアル

各検出系においてそれぞれ 4，2，および 2 種類を用意

Ver.1.16)）に従い実施した．検出ターゲット毎のプライした（表 2）．

マー・プローブと最終濃度を表 1 に示す．T 法は富山

季節性インフルエンザウイルスは MDCK 細胞でウ

県衛生研究所による先行研究 7)を参考に反応液組成とイルスを培養し，培養上清から抽出した RNA を陽性

反応条件を設定した．T 法ではプライマーとプローブ

コントロール RNA とした．抽出した RNA の濃度は T

を Q 法と同じ最終濃度で用いた．Q 法と T 法の反応液法で Threshold が 0.1 における Cycle threshold（Ct）値

組成を図 1 に示す．Q 法の反応液の総量は，インフルを測定して調整した．A 型 2 種，B 型 2 種それぞれ，

エンザウイルスと SARS-CoV-2 でそれぞれ，25μL，FluA 検出系の Ct 値が 20 前後，FluB 検出系の Ct 値が20μL であるのに対し，T 法の反応液の総量は全て 20μL

23 前後となるように濃度を調整し，原液とした．

とした．全ての反応系において 5μL の陽性コントロー

鳥インフルエンザウイルスの陽性コントロール

ル RNA をテンプレートとして用い測定を行った．熱

RNA は，国立感染症研究所が配布した添書に従い溶解

反応条件は，Q 法は 50℃30 分；95℃15 分；95℃15 秒

し，原液とした．
SARS-CoV-2 の陽性コントロール RNA は，1×105 コと 56℃75 秒（SARS-CoV-2 は 60℃60 秒）を 45 サイクル（総反応時間 137–147 分 ），T 法は 50℃5 分；95℃20

ピー/μL を原液とした．

秒；95℃5 秒と 60℃35 秒を 45 サイクル（総反応時間353 分），とした．Q 法，T 法での測定はそれぞれ Quant

Q 法と T 法の性能を比較するため，同一の陽性コン

Studio 3 （ Thermofisher Scientific ）， Quant Studio 5

Fast リアルタイム RT-PCR 法の妥当性評価

トロール RNA を両法で測定した．

（Thermofisher Scientific）を使用した．

全 8 種の陽性コントロール RNA について，10 倍階段希釈により 8 段階（鳥インフルエンザウイルス A 型

表22

用いた陽性コントロール RNA
陽性コントロール RNA

ウイルスの種類RNA 由来AH1-RNA

A 型 H1pdm 亜型 1）

2019-2224

MDCK2 代目分離株抽出 RNA

AH3-RNA

A 型 H3 亜型 1）

2019-0170

MDCK2 代目分離株抽出 RNA

BYa-RNA

B 型山形系統 1）

2018-0110

MDCK2 代目分離株抽出 RNA

BVi-RNA

B 型ビクトリア系統 1）

2020-0098

MDCK2 代目分離株抽出 RNA

AH5-RNA

A 型 H5 亜型 2）

国立感染症研究所配布，合成 RNA（FluA と AH5 の配列を含む）

AH7-RNA

A 型 H7 亜型 2）

国立感染症研究所配布，合成 RNA（FluA と AH7 の配列を含む）

N2-RNA

SARS-CoV-2

国立感染症研究所配布，合成 RNA

S2-RNA

SARS-CoV-2

国立感染症研究所配布，合成 RNA

本稿での
略称

1）：季節性インフルエンザウイルス，2）：鳥インフルエンザウイルス3

山形県衛生研究所報No.56 2023/11

図 1 反応液 1 ウェルあたりの組成（μL）
1)：Quantitect probe RT-PCR kit を使用したスタンダードリアルタイム逆転写 PCR 法
2)：TaqMan fast virus 1-step Master Mix を使用した fast リアルタイム逆転写 PCR 法3)，4)，5)，6)：それぞれあらかじめ混合して，Primer Probe Mix として用意し，反応液の調製時に使用した．

H5 亜型および A 型 H7 亜型は 7 段階）の希釈を用意

11 個では検量線の傾きが理想的な範囲にあった（図し，1 濃度につき 3 ウェル（検出が確実な低希釈域の2A，B）．AH1-RNA を用いた T 法の FluA 検出系は検場合）または 6 ウェル（検出限界濃度付近の高希釈域

量線の傾きが理想的な範囲を逸脱した．H1 検出系おの場合）を測定した．測定結果は Q 法，T 法それぞれ

よび BVi 検出系の傾きも逸脱したが，Q 法より T 法のThreshold が 0.01，0.1 における Ct 値を取得した．測定方が理想値に近い値を示した．相関係数は全ての検出結果から検量線を作成して傾きを求め，反応効率の指系において 0.99 以上であった．検出限界は H3 検出系標とした．また，6 ウェル全てが検出できた陽性コン

および BVi 検出系において T 法の方が低濃度を示し，トロール RNA の希釈のうち最も低い濃度を求め，検他の検出系は同等であった．

出限界濃度とした．

2

Ⅲ

図 2C に鳥インフルエンザウイルスの検出系の測定

結果

1

鳥インフルエンザウイルスの検出系の比較

季節性インフルエンザウイルスの検出系の比較

結果を示す．8 個の検量線のうち，7 個では検量線の

図 2A および 2B に季節性インフルエンザウイルス

傾きが理想的な範囲にあった（図 2C）．AH7-RNA をの検出系の測定結果を示す．一般的に PCR 反応効率

用いた T 法の FluA 検出系は検量線の傾きが理想的なは 90～110%が理想的な範囲とされ，検量線の傾きで範囲を逸脱した．相関係数は全ての検出系においては-3.10～-3.58 に相当する 8)．16 個の検量線のうち，0.99 以上であった．検出限界は AH5-RNA を用いた

4

山形県衛生研究所報No.56 2023/11

図2A

5

山形県衛生研究所報No.56 2023/11

図2B

6

山形県衛生研究所報No.56 2023/11

図2C

7

山形県衛生研究所報No.56 2023/11

図2D

図２ ２つのリアルタイム RT-PCR 法による陽性コントロール RNA 希釈系列の測定結果
縦軸は Ct 値，横軸は RNA の量を表す．黒丸のプロットが検出結果，青の直線は検量線を表す．赤の縦線と赤文字の detection limit は検出限界の RNA 量を示す．いずれも検出限界以上の濃度かつバラつきが少ない範囲の結果を用いて検量線を作成した．A：季節性インフルエンザウイルス A 型のゲノム RNA
0
-7
0
-4
である AH1-RNA，AH3-RNA を用いて，10 ～10 倍の 8 段階の希釈系列を測定し，10 ～10 倍の希釈系列の測定結果を用いて検量線を作成した．B：季節性インフルエンザウイルス B 型のゲノム RNA であ
0
-7
0
-4
る BYa-RNA，BVi-RNA を用いて，10 ～10 倍の 8 段階の希釈系列を測定し，10 ～10 倍の希釈系列の測定結果を用いて検量線を作成した．C：鳥インフルエンザウイルス A 型の陽性コントロール RNA であ
0
-6
0
-3
る AH5-RNA，AH7-RNA を用いて 10 ～10 倍の 7 段階の希釈系列を測定し，10 ～10 倍の希釈系列の測定結果を用いて検量線を作成した．D：SARS-CoV-2 の陽性コントロール RNA である N2-RNA，S25-2
5
1
RNA を用いて 10 ～10 copy/μL の 8 段階の希釈系列を測定し，10 ～10 copy/μL の希釈系列の測定結2果を用いて検量線を作成した．slope：傾き，R ：相関係数，detection limit：検出限界．
FluA 検出系では Q 法の方が低濃度を示し，AH5-RNA

検出系において 0.99 以上であった．検出限界は N2 検を用いた H5 検出系，AH7-RNA を用いた FluA および出系において T 法の方が低濃度であり，S2 検出系は

H7 検出系では T 法の方が低濃度を示した．

同等であった．

3

SARS-CoV-2 の検出系の比較

Ⅳ考察

図 2D に SARS-CoV-2 の検出系の測定結果を示す．

本研究ではインフルエンザウイルスと SARS-CoV-2

4 個の検量線のうち，3 個 では検量線の傾きが理想的それぞれの遺伝子検査において，従来法である Q 法とな範囲にあった（図 2D）．T 法の N2 検出系は検量線

fast リアルタイム RT-PCR 法である T 法との比較を行の傾きが理想的な範囲を逸脱した．相関係数は全てのった．53 分で検査結果を得られる T 法において検量8山形県衛生研究所報No.56 2023/11

線の傾きが理想値を逸脱するものが Q 法よりも多かを行った．

ったが，T 法の検出感度の多くは Q 法と同等あるいは結論として，TaqMan Fast virus 1-step master mix を用いた fast リアルタイム RT-PCR 法によるインフルエン

それ以上であることが示された．
T 法のインフルエンザウイルスおよび SARS-CoV-2

ザウイルスおよび SARS-CoV-2 の遺伝子検出系は，定の検出感度は Q 法より優れている可能性がある．検出量を伴わない病原ウイルスのスクリーニング検査を感度が良い検査系の方がより少ない量の病原体を検実施する上では有用であり，両ウイルスの検査を 53 分出できるため，病原体のスクリーニング検査においてで，かつ同一プレート上で実施できるため，検査に要有用と考えられる．ただし，鳥インフルエンザ A 型 H5する時間とコストを低減できる可能性がある．

亜型でウイルス量が少ない検体の場合，FluA 検出感度Ⅴの低さから，H5 検出系だけが陽性となり，再検査とな謝辞
本研究を実施するにあたり，fast リアルタイム RT-

PCR 法について情報提供をしていただいた愛知県衛るケースが生じる可能性がある．
T 法を用いたインフルエンザウイルスおよび SARS-

生研究所の安達啓一先生，妥当性評価の方法について

CoV-2 検出系の一部は Q 法より定量性が劣っている可アドバイスをいただいた国立感染症研究所の竹前喜能性がある．季節性および鳥インフルエンザウイルス

洋先生に深く御礼を申し上げます．

検出系において，Q 法に比べて T 法では反応液量がⅥ

5μL 少ないこと，および PCR のアニーリング温度が1) 厚生労働省健康局長，「感染症の予防及び感染症の4℃高いこと，の 2 点が PCR の反応効率を下げ，検量患者に対する医療に関する法律等の一部を改正する

線の傾きが理想的範囲を逸脱した要因であった可能

法律」の一部の施行について（通知），健発 0327 第 11

性が考えられる．そのため T 法を用いた FluA，H1，

号 令和 5 年 3 月 27 日

BVi，N2 検出系についてはスクリーニング検査のため

2) 国立感染症研究所，インフルエンザ診断マニュアルに用いられるべきなのかもしれない．

第4版

本研究により，インフルエンザウイルスと SARS-

文献<http://www.niid.go.jp/niid/images/lab-

CoV-2 の遺伝子検出系を単一 PCR プレート上で検査

manual/influenza20190116.pdf>， 2023 年 7 月 14 日ア

できることが示された．2022/23 シーズンのようなイ

クセス

ンフルエンザと COVID-19 の同時流行時にＴ法は有用

3) 国 立 感 染 症 研 究 所 ， 高 病 原 性 鳥 イ ン フ ル エ ン ザと考えられる．また，国内で鳥インフルエンザ H5N1

（H5N1）診断マニュアル第 3 版が発生した際に，必要に応じて同一プレートに鳥イン<https://www.niid.go.jp/niid/images/lab-

フルエンザ用の反応液を追加可能な点においてもＴ

manual/avian_influenza_2003.pdf>，2023 年 7 月 14 日ア

法は有用性が高いと考えられる．

クセス

本研究では 2 つの限界がある．1 つは，インフルエ

4) 国立感染症研究所，鳥インフルエンザ A(H7N9)ウインザウイルスの陽性コントロール RNA はコピー数がルス検出マニュアル第 2 版

不明なことである．1 反応あたり数コピー程度の RNA<https://www.niid.go.jp/niid/images/flu/H7N9manual/h7nが検出限界であることが多いが，本研究における検出

9_manual_v2.pdf>，2023 年 7 月 14 日アクセス

限界のコピー数は不明である．2 つ目は，Q 法，T 法5) 国立感染症研究所，病原体検出マニュアル 2019-

それぞれ Quant Studio 3，Quant Studio 5 を使用したこ

nCoV Ver.2.9.1とである．陽性コントロール RNA の希釈後の時間経<https://www.niid.go.jp/niid/images/lab-manual/2019-

過による劣化を避ける目的で 2 台の機器を用いて測定

nCoV20200319.pdf>，2023 年 7 月 14 日アクセス

9山形県衛生研究所報No.56 2023/11

6) 国立感染症研究所，「感染研・地衛研専用」SARS-

風疹ウイルスを対象としたリアルタイム PCR の迅速

CoV-2 遺伝子検出・ウイルス分離マニュアル Ver.1.1

化，富山県衛生研究所年報（平成 29 年度）. 41:105-8.

<https://www.niid.go.jp/niid/images/lab-manual/SARS-

8) ThermoFisher scientific，リアルタイム PCR におけるCoV-2_gene_detect_and_isolation_manual_Ver1_1.pdf>，

検量線による効率，感度および再現性の評価，

2023 年 7 月 14 日アクセス<https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-7) 板持雅恵，米田哲也，成相絵里ら，麻疹ウイルスと

bench/qpcr-basic46/#PCR>， 2023 年 7 月 14 日アクセス10

山形県衛生研究所報11

短No.56 2023/11

報
DNA バーコーディング法による巻貝の鑑別およびテトラミンの定量分析
櫻井千優，真田拓生，和田章伸，長岡由香

Identification of snails by DNA barcoding methods and quantitative
analysis of tetramethylammonium ion
Chihiro SAKURAI,

Takuo SANADA,

Akinobu WADA andYuka NAGAOKA

令和 3 年 4 月, 購入した巻貝を喫食した 2 名が, めまいやしびれを訴える有症事例が山形県内で発生した.
提供された喫食残品について, DNA バーコーディング法による鑑別を試みた結果, エゾボラ属の種である可能性が示唆された. また, 毒性成分であるテトラミンを 180 µg/g±23 µg/g 含有しており, 喫食量からテトラミンの摂取量は 18 mg±2 mg, 29 mg±4 mg と推定した.

キーワード： DNA バーコーディング DNA barcoding, テトラミン Tetramethylammonium ion
液体クロマトグラフ–タンデム質量分析法 Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS)

Ⅰ性）は 8 個喫食しており, 喫食して約 1 時間半からはじめに
テトラミン（テトラメチルアンモニウムイオン）

2 時間後に症状を呈し, 救急外来を受診した. このはエゾバイ科エゾボラ属・エゾバイ属巻貝の多くの状況からテトラミン食中毒が疑われた. 山形県水産

種の唾液腺に含まれる食中毒の原因物質である. テ

研究所は残品の貝殻から形態学的鑑別を行ったが,トラミンによる食中毒の主な症状は , 激しい頭痛,

産地が不明であったため種の特定までは至らず, 原

めまい, 船酔い感, 酩酊感 , 足のふらつき, 眼底の因食品が不明となり有症事例扱いとなった.

痛み, 眼のちらつき, 嘔吐感であるが, 通常数時間

当所では, 調理済み残品の巻貝（以下, 有症事例

で回復し死亡することは無いとされている 1), 2). テ

検体）の提供を受け, DNA バーコーディング法 3)に

トラミンは, 唾液腺に局在しており, これを取り除

よる種の鑑別および LC-MS/MS を用いてテトラミン

くことで食中毒を予防できることが多いが, 唾液腺の定量分析を行った.

を取り除かずに中毒する例が全国的に散発している.
実際, テトラミン食中毒は平成 15 年から令和 4 年で

Ⅱ

実験方法

推定事例も含めて全国で 68 件発生している 2).

1

試料

山形県内では, 令和 3 年 4 月, 購入した巻貝を喫有症事例検体は, 管轄保健所より提供を受けたも食した 2 名がめまいやしびれを訴え, 医療機関を受のを使用した. 比較用としてホタテおよびクロバイ

診した事例が発生した. 患者らは, 他 2 名と夕食でを県内の小売店より購入した. 試料はいずれも冷凍購入した巻貝, ホタテを喫食したが, 巻貝の喫食は状態であったため, 4 ℃で解凍した後に使用した.

患者らだけであった. ゆでて内臓を外した剥き身の2巻貝を, 1 名（30 代女性）は 5 個, もう 1 名（30 代男

DNA バーコーディング法による種の鑑別
有症事例検体は n = 2, ホタテおよびクロバイは各11

山形県衛生研究所報12No.56 2023/11

n = 1 で筋肉部 25 mg を分取し, NucleoSpin® Tissue

検索を行った.

Kit（MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG 社製）の3

プロトコルに従い DNA 抽出を行った.

1) 試薬

テトラミンの定量分析

DNA 増幅では, GoTaq ® G2 Hot Start Green Master

テトラミン標 準品は 塩化 テ トラメチルア ンモニ

Mix（Promega 社製）を使用した. プライマーにはミウム（純度 98+%）（Acros Organics 社製）を用いた.

トコンドリア DNA にコードされるシトクロムオキ

ぎ酸アンモニウムは特級（富士フイルム和光純薬（株）

シターゼサブユニットⅠ（COⅠ）遺伝子の一部領域を製）, ぎ酸, メタノールおよびアセトニトリルは増幅する LCO1490 と HC021984) を使用し,全体量がLC/MS 用（富士フイルム和光純薬（株）製）を用い25.0 µL になるように反応液を調製した（表 1）. 調

た. メンブレンフィルターは DISMIC® 13HP045AN

製した反応液を適宜希釈した後, 表 2 の条件で増幅（孔径 0.45 µm, 親水性 PTFE 製）（東洋濾紙（株）

し, DNA 増幅産物の有無を, 2%アガロースゲルを用製）を用い, 遠心式限外ろ過フィルターは Amicon ®

いた電気泳動により確認した. 得られた増幅産物は,Ultra -10K（MERCK 社製）を用いた.

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up kit（タカラバイオ

2) 装置
LC-MS/MS は, LC 部に AB SCIEX 社製 Exion LCTM（株）製）にて精製し, ファスマック（株）の受託解
析サービスを使用してシーケンス解析を行った. 得AC, MS 部に同社製 QTRAP ®4500 を使用した.

ら れ た 配 列 を , National Center for Biotechnology

3) 分析条件
LC-MS/MS の分析条件は食品衛生検査指針 5)に従Information（NCBI）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, 令
和 5 年 7 月 12 日確認）のデータベース上で BLAST
表１

った（表 3）

DNA 増幅液調製

表2

表3LC-MS/MS 分析条件

12

DNA 増幅の反応条件

山形県衛生研究所報13

No.56 2023/11

4) 試験液の調製

これらの増幅産物についてシーケンス解析を行

有症事例検体には, 唾液腺 が存在していたため,

い, NCBI での BLAST 検索の結果, 有症事例検体は

試料は唾液腺も含めて細切均一化したものを用いた.

Neptunea subdilatata（ナデガタチョウセンボラ）, N.

試験液の調製は, 食品衛生検査指針 5) に従い, 試行

constricta（チヂミエゾボラ）といったエゾボラ属の

回数 n = 3 で行った. すなわち, 試料 2.0 g を, メタ

種と相同性が高かった（表 4）. しかし, 相同性がノール 25 mL 中でホモジナイズ後, 超音波抽出を 15

100%のものはなく, 種の特定には至らなかった. 比分, 2500 rpm で 10 分遠心分離し, 上澄み液を分取し較で使用したホタテはイタヤガイ属, クロバイはバた. 残留物にメタノール 20 mL を加え, 再度超音波

イ属などと相同性が高かった（表 5, 6）.

抽出, 遠心分離を行い, 得られた上澄み液を, 先に今回用いたプライマーが増幅する領域は, COⅠ遺分取した上澄み液と合わせてメタノールで 50 mL に伝子の一部領域で, 動物や真核生物の DNA バーコ

定容した. これを孔径 0.45 µm のメンブレンフィル

ーディング法において一般的に用いられる 領域でターでろ過し, 50%メタノールで 10 倍希釈した後,ある. 今回, 相同性が 100%のものがなかったこと

遠心式限外ろ過フィルターに通し, 4℃, 3500 rpm でから, 他の領域に関しても DNA バーコーディング

30 分限外ろ過を行った. 得られたろ液を 50%メタノ法により確認することで, 総合的に判断し, 種を同ールで 100 倍希釈し, 試験液とした.

定する必要があると考える.

5) ドリップ液の分析
冷凍保存していた検体を解凍する際に水分（ドリップ液）が出たため, ドリップ液の分析 も行った.
試験液の調製は, ドリップ液 2.0 mL を用い, 以降は4) 試験液の調製に従った.

Ⅲ

結果および考察1

DNA バーコーディング法による種の鑑別
増幅産物を電気泳動した結果, ホタテでは約 300

bp, クロバイでは約 700 bp にバンドを確認した. 有症事例検体もクロバイと同様に約 700 bp にバンド

図1を確認した（図 1）.

電気泳動の結果

Lane L: 100 bp DNA Ladder
Lane N: Negative Control

表4
学名
Neptunea subdilatata
N. constricta
N. constricta
N. constricta
N. constricta

NCBI での BLAST 検索結果（有症事例検体）

和名
ナデガタチョウセンボラ
チヂミエゾボラ
チヂミエゾボラ
チヂミエゾボラ
チヂミエゾボラ

科
エゾバイ
エゾバイ
エゾバイ
エゾバイ
エゾバイ

13

属
エゾボラ
エゾボラ
エゾボラ
エゾボラ
エゾボラ

相同性 (%)
95.69
94.12
93.92
93.92
93.92

識別番号
EU883630.1
AB185305.1
AB185310.1
AB185309.1
AB185299.1

山形県衛生研究所報14No.56 2023/11

表5
学名Chlamys islandica
Pecten maximus
P. maximus
P. maximus
P. maximus

和名
アイスランドホタテガイ
ヨーロッパホタテ
ヨーロッパホタテ
ヨーロッパホタテ
ヨーロッパホタテ

表6
学名Babylonia formosae habei
B. laniHemipolygona armata
Tudivasum armigerum
T. armigerum

2

NCBI での BLAST 検索結果（ホタテ）
科
イタヤガイ
イタヤガイ
イタヤガイ
イタヤガイ
イタヤガイ

属
イタヤガイ
イタヤガイ
イタヤガイ
イタヤガイ
イタヤガイ

相同性 (%)
96.77
83.04
81.87
81.42
80.97

識別番号
EU127910.1
LR736844.1
LR736852.1
LR736842.1
LR736846.1

相同性 (%)
96.90
88.77
83.79
83.59
83.59

識別番号
AY819773.1
HQ424448.1
KT753974.1
MF782559.1
MF782558.1

NCBI での BLAST 検索結果（クロバイ）

和名
タイワンバイランゾウゲバイ-科
バイバイイトマキボラオニコブシガイ
オニコブシガイ

テトラミンの定量分析の結果

属
バイバイ
ヘミポリゴナトゥディヴァスム
トゥディヴァスム

また, ドリップ液を分析した結果, 有症事例検体

有症事例検体を分析した結果, テトラミン標準品と同様にテトラミン標準品と同様の保持時間にピーと同様の保持時間にピークが見られ, 有症事例検体クが見られ, ドリップ液全量中にテトラミンが 445

はテトラミンを 180 µg/g±23 µg/g 含有していることµg 含まれていることが判明した（図 2（C））. テトが判明した（図 2（B））. 管轄保健所からの聞き取り

ラミンは, 水溶性の化合物であることから, 凍結おによると, 1 名（30 代女性）は 5 個, もう 1 名（30 代

よび融解により細胞が破壊され, 細胞中の水分とと男性）は 8 個巻貝を喫食しており, 喫食した巻貝 1もに出てくることでドリップ液中に存在したと推定

個当たりの重量を 20 g と仮定すると, テトラミンのした.

摂取量は 18 mg±2 mg（30 代女性）, 29 mg±4 mg（30今後摂取量の推定には喫食部位に加えて, ドリッ代男性）と推定した. テトラミンの中毒量は, 約 10

プ液も分析する必要がある.

mg6), 数十 mg7), 8), 50 mg 以上 9), 350 ~ 450 mg10)と様々な報告があり, 個人差が大きいと推察される.
(B)

(A)

図2

(C)

LC-MS/MS 分析結果（ m/z ;74.1 > 58.0 テトラミン）；(A)テトラミン標準液(5 ng/mL), (B) 有症事例検体, (C)ドリップ液

Ⅳ2) 厚生労働省 HP 食中毒統計資料, 自然毒のリスク

文献1) 小山完二, 急性中毒標準診療ガイド（日本中毒学

プロファイル（令和 5 年 6 月 14 日閲覧）会編）, じほう, 東京, 668-669 (2008).

3) 熊澤慶伯ら, 名古屋市産淡水貝類の DNA バーコ

14山形県衛生研究所報15

No.56 2023/11

ーディング, なごやの生物多様性, 6:1-14 (2019).

8) 成田弘子, 巻貝による食中毒 , 食品衛生学雑誌,

4) O. Folmer, et al., DNA primers for amplification of26, 549 (1985).

mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from9) 藤井令子ら, テトラブロモフェノールフタレイ

diverse metazoan invertebrates, Mol. Mar. Biol. andンエチルエステルを用いた巻貝中テトラミンの比色

Biotechnology, 3(5), 294-299 (1994).

定量法, 食品衛生学雑誌, 33, 237-240 (1992).

5) 食品衛生検査指針 理化学編 2015（公益社団法人）

10) 橋本芳郎, 魚貝類の毒, 学会出版センター , 東

日本食品衛生協会, 848-853 (2015).

京, 24-26 (1977)

6) 新藤哲也ら, イオンクロマトグラフィーによる巻貝（軟体動物）中テトラミンの分析及び調理によⅤる消長, 食品衛生学雑誌, 41, 11-16 (2000).

謝辞
有症事例検体をご提供いただいた村山保健所生活

7) 小林香夫, 巻貝によるテトラミン中毒, 食品衛生

衛生課の皆様に心から感謝申し上げます.

学雑誌, 31, 424-425 (1990).

15