脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析
Structural analyses of glycosphingolipids in lipid rafts
東海大学

糖鎖科学研究所准教授

樺山 一哉

Kazuya Kabayama (Associate Professor)
Institute of Glycoscience, Tokai University
立命館大学

生命科学部助教

小島寿夫

Hisao Kojima (Assistant Professor)
College of Life Sciences, Ritsumeikan University
日本大学

理工学部

助教

鈴木佑典

Yusuke Suzuki (Assistant Professor)
College of Science and Technology, Nihon University

1. はじめに響を及ぼすメカニズムの解明研究において、蛍光顕微

シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシド

れてきた生化学的手法により得られた脂質ラフトに存在は、疎水性の脂質部分であるセラミドと親水性の糖鎖かするガングリオシドの構造解析を行い、多角的に得られら構成され、さらに、セラミド部分はスフィンゴイド塩基と脂たデータをすり合わせた考察を展開していくことを目標と肪酸から構成されている。この細胞膜に埋め込まれていしている。

鏡を用いた分子動態解析と並行して、従来から用いらるセラミド部分は、スフィンゴミエリン、コレステロール等と脂 質ラフトの分 離 精 製の生 化 学 的 解 析 手 段として疎水性相互作用に基づいて互いに会合し、様々な情報は、Triton X-100, Lubrol 98, Brij 58/97, NP-40 等の非伝達分子が集積している微小領域（脂質ラフト）の形成イオン性界面活性剤を用いて、低温下でショ糖密度勾に重要な役割を果たしていると考えられている。そして、配超遠心により界面活性剤不溶性画分（DRM）としてセラミド部分の構造変化、特に脂肪酸組成変化は、膜の分画する方法が一般的に用いられている（図 1）。しか流動性や膜マイクロドメインへの細胞内情報伝達因子し、得られた DRM 中のガングリオシドの構造解析においの集積を変化させることにより、脂質ラフトを介した情報て、界面活性剤の除去は必須であり、各種カラムクロマ

伝達や特異的部位への膜輸送を調節し、細胞の内外をトグラフィーによる精製法等が報告されているものの、簡繋ぐ様々な生命現象を制御していると考えられている。

便な操作で完全にガングリオシドから界面活性剤を分現在我々が進めているガングリオシドが形成する生体離・除去できる方法は未だ報告されていない。この問題

膜の微小領域が膜受容体の局在及びシグナリングに影を解決するために以下の実験を行った。

図 1 ショ糖密度勾配超遠心による界面活性剤不溶性画分（DRM）の分画法

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2. 各種カラムクロマトグラフィーによる界面活性剤除去 1）を確認した結果、1ng 以下まで除去する必要があること

ショ糖密度勾配超遠心による脂質ラフト分画システム

次に、Triton X-100（ 4µg）- GM3（ 4µg）混合物を作製の確認、及び分画後に残存する界面活性剤の MSスペ

し、従 来 から界 面 活 性 剤 の 除 去 に用 いられている

クトル測 定 への影 響を確 認するため、脂 肪 前 駆 細 胞

SepPak C18、DEAE-sephadex A-25、Iatrobeads、及び（3T3-L1）を材料とし、ショ糖密度勾配超遠心分離及びFlorisilカラム（オープン）
によるTriton X-100 の除去率をSepPak C18カートリッジによる脱塩後、薄層クロマトグラ

TLC 及び MALDI-QIT-TOF MSスペクトル測定によってフィー（TLC）解析及びマトリックス支援レーザー脱離イオ確認した。その結果、TLC 展開後のプリムリン発色結果

ン化 四 重 極イオントラップ 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 法

では、それぞれ 90％以上の Triton X-100 の除去は可能（MALDI-QIT-TOF MS）
によるMSスペクトル測定を行っであったものの、MALDI-QIT-TOF MSスペクトルでは残た。TLC 解析の結果、DRM はコレステロール及びガング

存するTriton X-100 のためにGM3 由来ピークを検出すが判った（Data not shown）。

リオシド GM3 が集積しているフラクションNo.4 及び 5 であり、Triton X-100 濃度はショ糖濃度勾配に伴って分配されていることが明らかになった（図 1）。また、MALDI-QIT-TOF MSスペクトル測
定 結 果では、すべてのフラクションでTriton X-100に起因する44 Da 間隔のピークのみが検出され、GM3 由来ピークを検出することはできなかった（図 2）。
そこで、Triton X-100 の希釈倍列を作製し、MSスペクトル測定時にGM3 のイオン化を阻害しない Triton X-100 濃度

表 1 本研究に使用した有機溶媒の諸性質

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図 2 超遠心画分（脱塩後）の MALDI-QIT-TOF-MS 解析（No.4 andポジティブイオンモード測定。▶がガングリオシドGM3に起因するフラグメント。DRM 画分5）にGM3 由来ピークが検出されない。

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析ることはできなかった。またカラムへのガングリオシドの吸の GM3 の損失が確認された（図 3）。
しかしTLCによる解着が生じるため、完全に回収できていないことが判った

析において、DCEによる洗浄ではGM3 の損失なくTriton（Data not shown）。それ故、新たな界面活性剤除去法

X-100のみを完全に除去できることが確認された。
さらに、を確立するために以下の実験を行った。

MALDI-QIT-TOF MSスペクトル測定を行った結果では、
DCE 洗浄によりTriton X-100 は 1ng の検出限界以下ま3. 各種有機溶媒洗浄による界面活性剤の除去 1）

で完全に除去され、GM3 由来ピークが検出されることが確認された（図 4）。

GM3-Triton X-100 混合物をTLC により展開すると、GM3 の R f 値は約 0.5 であるが、Triton X-100 は溶媒先端部まで移動し、GM3とTriton X-100はTLC 上で完全4. DCEによる各種界面活性剤の除去 1）に分 離することから、TLC 上のシリカゲルの水 酸 基と上述のように、D C E 洗浄により、ガラス試験管内でTriton X-100 は相 互 相 関しないと考えられた（図 1）。

乾 固し た GM3-Triton X-100 混 合 物 か ら 完 全 に

TLC 上のシリカゲルと同様に、ガラス表面には水酸基がTr i t o n X -100 のみを除去することが可能であったこと露出していることから、GM3-Triton X-100 混合物をガラから、次に、脂質ラフト分画に用いられる他の非イオンス製試験管内に乾固し、各種有機溶媒による洗浄を検討

性界面活性剤であるBrij 58、Brij 97、及び NP-40や、し、水酸基と相互相関しないTriton X-100 のみを除去で糖 脂 質の糖 転 移 酵 素・糖 加 水 分 解 酵 素 反 応に用いきるか確認を行った。検討はアセトニトリル、メタノール、アられる3-［（3-Cholamidopropyl）-dimethylammonio］

セトン、1-ブタノール、ピリジン、テトラヒド
ロフラン、酢酸メチル、ジエチルエーテ
ル、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、トルエン、ベンゼン、キシレン、ジイソプロ
ピルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタ
ン、1,2-ジクロロエタン（DCE）の性質の異なる有機溶媒、計 18 種類で行った（表 1）。
その結果、極性の高い有機溶媒で洗浄した場合、Triton X-100と同時にGM3もガラス試験管表面（Residue, R）から除去され、洗浄画分（Wash fraction, W）に

図 3 各種有機溶媒で洗浄後の界面活性剤 TritonX-100とGM3 複合体の TLC 解析移行してしまう傾向が観察された（図 3）。
逆に非極性の有機溶媒による洗浄ではGM3は試験管表面に保持され、TritonX-100 のみが除去される傾向が観察された。一方で、検討した非極性有機溶媒の中で、誘電率の低いヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタンによる洗浄では、Triton X-100 が試験管表面に残存することが確認された。
その他の非極性有機溶媒による洗浄 や Svennerholm 分 配 法 で、TritonX-100 の除去が可能であったが、多少

図 4 各種有機溶媒で洗浄後の界面活性剤 TritonX-100とGM3 複合体の MS 解析▶がガングリオシドGM3に起因するフラグメント。

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表 2 本研究に使用した界面活性剤の諸性質- 1 - p r o p a n e s u l f o n a t e（ C H A P S ）,Taurocholic acid, Deoxycholic acidに関して、DCE 洗浄によってこれらの界面 活 性 剤 が 除 去 可 能 で あるか をMALDI-QIT-TOF MS により確認した（表 2）。
その結果、Brij 58 及び CHAPS は界 面 活 性 剤 由来ピークが検出されたが、大部分が除去可能であり、すべての界面活性剤を含むサンプルで、GM3由来ピークが検出されることを確認した（図 5）。

図 5 各種界面活性剤とGM3 複合体におけるDCE 洗浄後の MS 解析

5. 脂肪前駆細胞の脂質ラフト画分からの Triton X-100 の除去 1）
次に当初の目的であった脂質ラフト画分の糖脂質の構造解析を行うために、
3T3-L1 脂肪前駆細胞を材料とし、ショ糖密度勾配超遠心による脂質ラフト分画及び脱塩後、さらにSvennerholm 分配及び DCE 洗浄後、MALDI-QIT-TOFMSを行った。その結果、界面活性剤由来ピークは 検 出され ず、フラクション
No.4-5 及び No.6-9 でGM3の分子種に由来するピークを検出した（図 6）。

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図 6 超遠心画分（DCE 洗浄後）の MALDI-QIT-TOF-MS 解析（DRM 画ポジティブイオンモード測定。▶がガングリオシドGM3に起因するフラグメント。No.4および 5分）とNo.6-9にGM3 由来ピークが検出された。

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析

そして、MALDIイオン化質量分析法よりも界面活性剤によるサンプルのイオン化が抑制されやす
い液 体イオン化 質 量 分 析 法においても、これらGM3分子種由来イオンが検出されることを確認した（Data not shown）。
さらに、上記サンプルのネガティ
ブイオンモードによるMALDI-QIT-TOF MSスペクト
ル解析結果から、脂肪前駆細胞の脂質ラフト上に存在するGM3 の分子種は d18:1（スフィンゴイド塩基）-C16:0（脂 肪 酸）、-C18:0、-C20:0、-C22:0、-C22:1、-C23:0、-C24:0、及び -C24:1 であることを確認した（図 7）。

図 7 3T3-L1 脂肪前駆細胞の DRM 画分に存在するGM3 のセラミド構造（MS2 から推定）

6. 脂肪組織 / 細胞におけるトリグリセリドの簡便な除去法の検討

処理によりインスリン抵抗性に惹起した 3T3-L1 脂肪細胞のインスリン感受性を高めることが報告された 5）ことから、脂肪細胞の糖脂質全般の重要性が認識されつつあ2）

1993 年に Spiegelmanら により肥満マウス脂肪組織る。そこで、TNFα処理によりインスリン抵抗性に惹起しでの TNFα産生の亢進が報告されて以降、脂肪細胞のた 3T3-L1 脂肪細胞において簡便にトリグリセリドを除去

分子細胞生物学的な研究が進展したことにより、脂肪する方法を検討することで、脂肪細胞の糖脂質全般の細胞は多彩な生理活性物質（アディポサイトカイン）を産分析を行った。

生・分泌し、糖・脂質代謝および動脈壁の恒常性維持に重要な役割を果たす器官であることが分かってきた。
肥満による脂肪の蓄積でアディポサイトカインの産生が異常になることで、糖尿病を始めとする種々の生活習慣病を発症することが明らかとなっている。

7. 脂肪組織での DCE 洗浄によるトリグリセリドの除去
上述したように、ショ糖密度勾配遠心法で調製した界面活性剤不溶性画分（DRM）からの界面活性剤の効我々の研究室では、2 型糖尿病における糖脂質の役率的かつ簡便な除去法が開発された 1）。この方法では割の解明を上述したような様々なアプローチで進めておTriton X-100を始めとして生化学的な研究に一般的にり、現在までに、3T3-L1 脂肪細胞をTNFα処理した 2 型

多用される数種の界面活性剤についても有用であり、固糖尿病の病態において、発現が亢進するガングリオシド相抽出の前処理カラムおよび各種のカラムワークでは除GM3 が細胞膜上の負電荷のクラスターを形成し、イン去しきれず質量分析でイオン化妨害を引き起こす界面活スリン受容体の細胞膜直上のリジン残基と相互作用す性剤をほぼ完全に除去できることが明らかとなった。これることでインスリン受容体をカベオラ構造から引き剥がすらの 界 面 活 性 剤 は 順 相 系 の 薄 層クロマトグラフィー

ためにインスリンシグナルが伝達されなくなることを示して（TLC）では溶媒先端付近まで展開される物質であるこいる 。一方、肥満モデル動物の脂肪組織においてもとから、同様に溶媒先端付近まで展開されるトリグリセリド

GM3の発現亢進が報告されているが、脂肪組織はエネへの応用の可能性が考えられた。

3）

4）

ルギー貯蔵臓器として大量のトリグリセリドを蓄積していそこで、マウス（C57BL/6J）の副睾丸脂肪組織より総ることから、同じように極性の低い脂質である糖脂質全脂質を抽出し、これをトリグリセリドとみなしてDCE 洗浄に般の分析がトリグリセリドの妨害を受けるために困難であよる除去を試みた。総脂質と中性糖脂質の標準品を混り、そのために特に中性糖脂質については明確にその合したもので試した結果、脂肪量に関わらずトリグリセリド構造やプロファイルを明らかにした報告はない。しかしなは洗浄画分（Wash fraction, W）に移行し、ガラス表面がら、近年、グルコシルセラミド（GlcCer）の合成阻害剤（Residue, R）には残らないことが分かった（図 8A）。まであるAMP-Deoxynojirimycin（ AMP-DNM）が TNFα

た、副睾丸脂肪を大量に用いて DCE 洗浄を行ったとこ

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ろ、副睾丸脂肪由来の脂質がバンドとして可視化できた（図 8B）。

その結果、CMH（セラミドモノヘキソシド）と考えられるR f値のバンドを確認した（図 10 左）ものの、CDH（セラミドジヘキソシド）の移動度からGM3の移動度までの間にリン脂質と考えられる複数のバンドを認めたため（図 10 右）、最終目標である糖脂質の一斉質量分析のためにはリン脂質の分解除去が必要と考えられた。そこで、アルカリメタノリシスお図 8 マウス副睾丸脂肪の DCE 洗浄（A）トリグリセリドは完全にW 画分に移行し、中性糖脂質は大半が R 画分に残留する。
（B）大量の副睾丸脂肪をDCE 洗浄するとR 画分に副睾丸脂肪由来の脂質が見えてくる。

8. 脂肪細胞での DCE 洗浄によるトリグリセリドの除去

図 9 TNFα処理した3T3-L1 脂肪細胞での DCE 洗浄によるTG の除去（0.1mgprotein 相当）

DCE 洗浄によりトリグリセリドの効果的な除去が可能であることが示されたので、次に、TNFα処理によりインスリン抵抗性を惹起した3T3-L1 脂肪細胞を用いて総脂質を抽出し、一部（0.1mg protein 相当）を用いてDCE 洗浄によるトリグリセリドの除去効果を検証した（図 9）。その結果、副睾丸脂肪での場合と同様に、トリグリセリドはW 画分に完全に移行し、糖脂質はR画分に残留したことから同洗浄により効果的に分画が行えた。

図 10 TNFα処理した3T3-L1 脂肪細胞での DCE 洗浄によるTG の除去（1mg protein 相当）

しかしながら、0.1mg protein 相当分では、糖脂質としてはGM3とGD1aのバンドしかオルシノール試薬で呈色が見られなかった。これら2 種類のガングリオシドに関しては、トリグリセリドが大量に存在する条件下でもシアル酸残基の負電荷を利用した陰イオン交換（DEAE）
カラムクロマトグラ
フィーを行ってトリグリセリドから分離が可能であることから、既に報告がなされている。よって、より大量（1mg protein 相当）に処理することで未報告の中性糖脂質のバンドが検出できるかを試みた（図 10）。

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図 11 TNFα処理した3T3-L1 脂肪細胞での DCE 洗浄によるTG の除去（1mg protein 相当）とリン脂質の分解除去

脂質ラフトに存在する糖脂質の詳細な構造解析

よび Sep-pak C18による脱塩を行ってTLC 分析に処した。

ることで分子種の同定を行った（表 3）。これまでは、脂肪その結果、溶媒先端付近にやや夾雑物が見られるものの組織の糖脂質については、ブタの後背部脂肪（ロインバッ

上述のリン脂質を除去することが出来、質量分析に供しうク）を用いて大量のトリグリセリドをアセトン脱脂して古典的ると考えられる試料を調製することが出来た。
（図 11）

な糖脂質構造解析した報告 6）、ブタ腹膜（大網）の内臓脂肪の糖脂質をTLC 解析した報告 7）、マウス副睾丸脂肪の9. 脂肪細胞における中性糖脂質の検出と構造解析

GlcCer 量をLC-MS 解析した報告 8）、マウスの卵巣周囲脂肪および副睾丸脂肪のガングリオシド量をLC-MS 解析

上述の1,2-ジクロロエタン（DCE）洗浄法により脂肪細胞した報告 9）などがあるが、糖脂質のセラミド組成を詳細にのトリグリセリドを効果的に除去しえたことから、さらにリン脂調べた報告は見られない。よって、本報告は脂肪細胞の質を弱アルカリ処理して分解除去し、Sep-pak C18による脱糖脂質、特に中性糖脂質の詳細な構造解析を行った初塩の後、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS）でネガの報告である。脂肪細胞では主要な糖脂質はGM3 であティブイオンモードにて糖脂質の分子種の解析を試みた。

り、次いでGD1a、CMH、CDH が検出されたが、いずれも

本 実 験では MS による構 造 解 析が可 能な装 置（島 津

長鎖塩基はd18:1を成分とした分子種が豊富で、脂肪酸LCMS-IT-TOF）を用い、MS3 でセラミドの分子量を設定し、はC16からC24の飽和脂肪酸が優勢であった。

n脂肪酸および長鎖塩基由来のフラグメントの出現を確認す
表 3 3T3-L1 脂肪細胞における主な糖脂質とその分子種

10. 脂肪細胞におけるDRMに集積する糖脂質の分子種解析
ショ糖密度勾配遠心法で用いたTriton X-100（1%）
は質量分析に影響を及ぼすため、脂質ラフト分画後に氷冷DCE 洗浄を行い、Triton X-100を除去した（図 12）。DRM画分をそのままLC-MS 解析したところ、糖脂質以外の成分が多いためにMS の検出器が飽和し、回避するために希釈するとベースラインノイズの影響が見られた。そこで、

図 12 TNFα処理前後での 3T3-L1 脂肪細胞をショ糖密度勾配遠心法による分画の後 DCE 洗浄・脱塩したTLC（サンプル量は1mg protein 相当量）
呈色試薬はオルシノール硫酸（A）およびプリムリン（B）を用いた。糖脂質はNo.5 画分を中心にNo.4-6（DRM 画分）に分画され、TNFα処理によってGM3 の量が増加した。

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Svennerholm 分配によって極性の低い物質を除去したの型解析やリスクファクターとしての定量解析が報告されるばち、LC-MS 解析を行った（図 13）。以前に100pM 96 時間

かりであり、上記分子を構成成分とする細胞膜表面上でどのTNFα処理により脂肪細胞のGM3 が約 2 倍に増加するのような変化が起こっているのか（細胞膜上のシグナル伝ことを報告しているが、増加する際にセラミド鎖長の選択性達分子にどのような影響を及ぼすのか）に関しては、依然とは見られずほぼ一様に増加することが分かった。

して明確な説明は成されていない。

今回解析した3T3-L1 脂肪細胞では TNFα処理によっ

我々の研究において細胞膜脂質の体系的な解析法がてGM3 は分子種に関わらず 2 倍に増加する結果を得た確立しつつある。細胞膜の流動性および細胞膜受容体のが、高脂肪食を与えた高齢肥満マウス（C57BL/6J）副睾

側方拡散についての情報を数値化するためには、ライブセ

丸脂肪や高齢の糖尿病モデルマウス（KKおよび KKAy）ルイメージング技術が非常に適しており、細胞膜構成脂質の卵巣周囲脂肪において詳細な分子種は報告されていなの構造解析にはLC-MSを主力とする各種質量分析技術いながら短鎖脂肪酸（C16 や C18）の割合が増加することが不可欠であると考えている。これらの技術を併用してが報告されている 。また、高齢 ob/ob マウスの脂肪組織様々な病態モデルを解析することが、細胞膜脂質の矯正において短鎖脂肪酸（C16）を含むスフィンゴミエリン（SM）療法が未来の治療戦略になっていくことを願い、より一層が増加し、長鎖脂肪酸（C24）のSM が減少することが示さ研究に邁進していきたい。

9）れている。このように肥満状態でスフィンゴ脂質のセラミ10）

ド鎖長変化が報告されていることから、今後、若齢の肥満モデルマウスを用いて GM3 をはじめとする糖 脂 質のLC-MS 解析を行うことで、肥満を引き金とする2 型糖尿病の病態のさらなる解明を行う予定である。

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図 13 脂肪細胞の DRM 画分の GM3 分子種DRM 画分をSvennerholm 分配で粗精製し、LC-MSで解析した。TNF
α処理でGM3が約 2 倍に増加するが、セラミド分子種の選択的な増加は見られなかった。

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