内分泌攪乱物質関連標準液（フェノール類）の開発
Development of Standard Solutions for Endocrine Disrupters (phenols)

財団法人 化学物質評価研究機構 東京事業所 化学標準部

宮田 由起子YUKIKO MIYATA

四角目 和広KAZUHIRO SHIKAKUME
Chemical Standards Department, Tokyo Laboratory,Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan (CERI)

1. はじめにがそのまま分析値の質に繋がっている。このような意味から標準物質の信頼性が、そのまま機器分析による測2

最近、さまざまな分野において認証、品質システム、定結果の信頼性を左右することとなる。標準物質の重トレーサビリティなどの用語が用いられるようになった。

要性はこの点にあるといえる。特にトレーサビリティを形

その背景には、社会や経済のグローバル化に伴い、地成する手順によってその特性値が決定された認証標準

球環境問題、製品の質や安全に関する問題などが、ひ物質は、国際社会の中でその重要性が一層増大してとつの国だけでは解決できないほど大きな問題として注いる。また、分析機器の高感度化、高精度化にはめざ目を集め、これらの問題を新しい枠組みで解決しようとましいものがあり、測定結果の信頼性という点では分する国際的な動きがある。このような状況のなか、化学析機器そのものの信頼性だけでなく、試験環境や分析的な分析は、これらの問題に対する現状把握や解決の方法と併せて、分析機器の校正に用いる標準物質のためには欠かせない重要な部分を占めている。これら

信頼性も重要な問題であると考えられているのが現状の化学的な分析においては、質量や体積の測定を基である。

本とした重量分析や容量分析から、高度な機器を用い一方、経済産業省（当時は、通商産業省）は、産業る機器分析の占める部分が大きくなり、最近の化学分技術審議会・日本工業標準調査会合同会議知的基盤

析とは、機器分析を指すと言っても過言ではないほど機整備特別委員会を設け、計量標準、標準物質、生物資器分析法が多く用いられるようになってきている。最近

源情報、化学物質安全、材料関連知的基盤及び生活・の化学的な分析結果の多くが様々な機器分析法によ福祉関連知的基盤の分野について、その推進方策をるものであり、内分泌攪乱物質（いわゆる環境ホルモン）検討し、平成10年6月に「我が国の知的基盤の充実にやダイオキシン類などは、機器分析計によらなければ測向けて」と題した報告書1）を取りまとめた。その中で標準定できない物質である。ところがこれらの機器分析の物質については、平成13年度末（2001年度末）までに結果として得られる値は電流値や電圧値であり、測定平成１０年度当時の42物質を120物質までに整備拡充す対象物の濃度として換算するためには、電流値や電圧るとし、これらの施策に加え、内分泌攪乱物質として疑値と測定対象物の濃度との関係が明らかとならなけれいのある物質の計測に必要な標準物質の開発も提案さばならない。このために必要となるのが標準物質といれた。

うことになる。従来行われてきた重量分析などの化学

このような背景のもと、当機構では環境ホルモン計測分析では、主に分析者の技能が分析結果の質を左右に必要とされる標準物質のうち、フタル酸エステル、フェしていたようであるが、一般的な機器分析では前処理ノール類等の標準物質の開発を行ってきた。このうち、操作等を除けば 、分析者の技能に左右される部分は本稿ではフェノール類の標準物質の開発の状況につい少なくなり、機器分析には必要不可欠な標準物質の質て紹介する。

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2.2.2 溶媒2. 開発の内容

溶媒のみを標準液の測定と同条件で測定した際に、2.1 概要

定量成分の面積値の算出に影響を与えるクロマトグラム

これまでも当機構では、計量法トレーサビリティ制度が得られる場合がある。これは主として溶媒中に元々含（Japan Calibration Service System：JCSS）におけるまれる夾雑成分の影響であるが、定量成分そのものでな標準物質供給体系に基づいて、標準物質を供給するこくとも妨害成分となりうるため、分析装置、分析条件等とを目的とした標準物質の開発を行っており、濃度値がに広く依存する。そのため妨害成分が全くないことを証精確で保存安定性に優れた標準液を供給するために明することは事実上不可能であり、よって検出限界付近・純度の決定された高純度基準物質の濃度の標準液のクロマトグラムと溶媒のみのクロマトグ

・高精度な調製技術

ラムを比較することで、溶媒ブランクとして求めることとし・再現性の良い測定方法た。産総研において以下のような検討が行われ、標準・標準液の保存安定性の評価等を検討項目としてあげ無機標準液、有機標準液について開発を進めてきた。

液の溶媒として用いたメタノール及びヘキサンについての溶媒ブランクの不確かさが算出された。
まず、検出限界付近の濃度の標準液として濃度100μg

本研究では、ビスフェノールA、4-n-ノニルフェノール及/Lのフェノール類混合標準液を調製した。希釈に用いた

び2,4-ジクロロフェノールについての基準物質の純度確

溶媒はメタノール（関東化学製水質試験用）及びヘキサン定、単成分標準液の調製方法の確立、濃度測定方法（関東化学製水質試験用）である。この標準液及び溶媒の確立、保存安定性の評価、さらに4-t-ブチルフェノール、を高速液体クロマトグラフにより同条件で分析してクロマ

4-n-ヘプチルフェノール、4-t-オクチルフェノール、ビスフェノトグラムを得た。標準液の分析で得られたクロマトグラムールA、4-n-ノニルフェノール及び2,4-ジクロロフェノールのから算出した定量成分のS/Nと、溶媒の分析で得られたフェノール類6種混合標準液について、標準液の調製方

クロマトグラムから算出した各定量成分の保持時間付近法の確立、濃度測定方法の確立、保存安定性の評価をのS/Nを比較し、溶媒の分析におけるS/Nが標準液の分行った。

析におけるS/N以上でないことを確認した。したがって、メタノール､ヘキサンとも定量成分であるビスフェノールＡ、2.2 標準液の原料4-n-ノニルフェノール、2,4-ジクロロフェノールに関して、溶2.2.1 基準物質媒に起因する妨害成分は100μg/L以下であることが保基準物質を原料とする特定標準液は国家標準となるも証された。そこで溶媒ブランクの不確かさとしては、妨のである。したがって基準物質は高純度であることに加害成分の濃度が標準液として調製した各定量成分の濃え、その純度値が国際単位（SI）にトレーサブルな方法で度100μg/Lと0μg/Lの間の一様分布であると仮定し、決定され、表示されていることが必要となる。基準物質

100/2√3≒30μg/Lとした2）。以上のことより、溶媒ブランの高純度化、純度の決定は独立行政法人 産業技術総クの不確かさとして、標準液の濃度が1000mg/Lの場合合研究所（以下、産総研という）が行った。基準物質のは0.003%、また100mg/Lの場合は0.03%と見積もった。

純度値が99.9％程度となることを目標として合成または精製方法を検討したが、最終的には市販試薬から純度の2.3 標準液の調製方法高い原料を選定し、これを再結晶または蒸留法にて精製標準液の調製は、操作のしやすさと気密性の高さから、することにより高純度化を図った。精製された基準物質

テフロン製ピストンシール型スクリューキャップ付密閉型ガ

は、一次標準測定法（SIにトレーサブルな測定法）であるラス容器を調製容器とし、質量比混合法で行う方法とし凝固点降下法により純度が測定された。純度値はビスフた3）｡まず、質量を測定した調製容器に原料を入れてひょェノールＡが99.93％、4-n-ノニルフェノールが99.86％、う量し、溶媒を加えて10000mg/Lの試料原液とした。こ

2,4-ジクロロフェノールが99.69％であった。なお、これらの試料原液を質量比法により順次希釈して単成分標準

純度値の標準不確かさは0.02％〜0.08％であった。

液（1000mg/L）
及び混合標準液（100mg/L）を調製した。

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調製した標準液の種類は、単成分標準液（1000 mg/L）

表1に示す。

としてビスフェノールＡ、4-n-ノニルフェノール及び2,4-ジク

表1 フェノール類標準液の測定条件

ロロフェノールのメタノール溶液及びヘキサン溶液（ビスフェノールAについてはメタノール溶液のみ）、また混合標
準液（100mg/L）
として4-t-ブチルフェノール、4-n-ヘプチルフェノール、4-t-オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、4-nノニルフェノール及び2,4-ジクロロフェノールを混合したメタノール溶液（6種）及びヘキサン（ビスフェノールA以外の5種）溶液である。
2.5 標準液の保存安定性
2.4 標準液の測定方法
ガスクロマトグラフ法または高速液体クロマトグラフ法あったとしてもその変化分を補正せずに初期に決めた値による測定方法の比較検討を行った。まず、フェノールを標準液の濃度として用いるため、標準液はその保存類混合標準液（メタノール溶液及びヘキサン溶液）をオ安定性が評価されていることが必要である。標準液の保ートインジェクタにて連続注入し、5回の繰返し測定にお存安定性試験として、上述の調製、測定方法を用いてけるピーク面積の変動係数（%）
を各条件について比較次のような試験を行った。

した。ガスクロマトグラフ法においては、パージパックド調製した標準液をほうけい酸ガラス製褐色アンプルにカラム注入よりも、クールオンカラム注入を行った条件が充てんしてバーナーで熔封したのち、5℃及び20℃で保変動係数が小さく、各物質について変動係数が0.08〜存した。濃度の測定は調製直後を0ヶ月目とし、保存後0.24%となり再現性は良好であった。高速液体クロマト

3ヶ月目、6ヶ月目の計3回、保存したアンプルを3本ずつグラフ法については、ステップワイズ溶離法に比べグラ取り出し、その都度新たに調製した検量線用標準液をジエント溶離法が変動係数が小さく、その変動係数は基準として行った。その結果、測定濃度の調製濃度か0.04〜0.09%であった。さらに、標準液の濃度付近でらの偏差は全ての条件において±0.5%以内となり、標ある80 〜120mg/Ｌの範囲で濃度を変えて調製した標準液の保存安定性が確認され、またアンプル間に差が準液をガスクロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフに無いことが確認された。フェノール類6種混合標準液（メて測定し、ピーク面積と調製濃度の関係から検量線のタノール溶液）を20℃保存した結果を図1に示す。また、直線性を確認した。信頼性のある標準液を供給するたアンプルに充てん後、5℃で保存した場合と20℃で保存めには、より再現性の良い測定方法での値付けが必要した場合の測定値からEn値4）を計算した結果、両者はであるので、フェノール類標準液の測定方法としては高不確かさの範囲で一致し（En<1）、保存温度による有意速液体クロマトグラフ法を用いることとした。測定条件をな差がないことが確認された。

図1 フェノール類標準液の保存安定性

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標準液の濃度は、長期の保存により仮に濃度変化がTHE CHEMICAL TIMES 2003 No.4（通巻190号）

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2.6 標準液の不確かさ

さらに、各要因の不確かさをもとに、不確かさの伝播計量法における標準物質供給体系において標準液を則に従って標準液の不確かさを計算した。その結果、供給する場合、特定標準液による特定二次標準液への特定標準液により値付けする場合の特定二次標準液の値付け（jcss校正）においては、その値付けされた濃度

拡張不確かさは、単成分標準液(1000mg/L)で0.3％〜値とともにその不確かさを明らかにする必要がある。そ

0.6％（k＝2）、混合標準液(100mg/L)で0.3％〜0.9％のため、標準物質の開発の一部として不確かさの算出（k＝2）と見積もられた。不確かさの一例を表2に示す。

を行った。
まず、標準液の不確かさを見積もるにあたり、要因とし2.7 混合標準液の測定における検量線用標準液の種類て基準物質純度の不確かさ、溶媒ブランクの不確かさ、混合標準液は、単成分標準液に比べ調製における操特定標準液（検量線用標準液）調製の不確かさ、値付作が繁雑になり、また測定条件も各成分の分離を充分にけ（濃度測定）の不確かさ、6ヶ月の安定性の不確かさ考慮しなければならない。したがって、調製方法及び測を取り上げ、それぞれの不確かさを算出した。調製の不定条件によっては、混合標準液の測定において混合標確かさ及び測定の不確かさを算出するために、独立し準液を検量線用標準液として用いた場合と、単成分標た4個の検量線用標準液を調製して、標準液の濃度を準液を検量線用標準液として用いた場合との間で、測繰返し測定する試験を行った。ここで得られた測定値の定濃度に差が生ずることも考えられる。そこで次のような解析では、jcss校正（特定標準液を1回調製して特定二試験を行い、検量線用標準液の種類による測定濃度間次標準液の濃度を測定し、測定濃度は3回測定の平均の差異について検討した。

値で表示する値付け法）を想定し、1回調製の不確かさ、まず、混合標準液と単成分標準液をそれぞれ4回ずつ3回測定の不確かさを算出した。開発された方法による調製し、これらを検量線用標準液として混合標準液の濃標準液の調製の標準不確かさは0.00%〜0.32%、また度を測定した。測定は一つの検量線用標準液につき3測定の標準不確かさは0.07%〜0.19%であった。さらに、回ずつ行い、得られた24個の測定値をJIS Q 0035 5）に保存安定性試験の結果を統計的に解析した結果、6ヶ基づいて解析した。解析の手順としては、まず一元配置

月間の保存安定性の標準不確かさは、各物質についての二段枝分かれを用いて有意差検定を行い、次に一元0.04%〜0.22%と見積もられた。

配置の分散分析を行い、jcss校正（調製1回、測定3回）

表2 標準液の不確かさの一例

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表3 検量線用標準液による測定濃度の比較

図2 検量線用標準液の種類による測定濃度の比較における不確かさの算出を行った。解析の結果、有意標準液を供給する準備が整った。今後、これら標準物差検定では検量線用標準液が混合標準液の場合と単質の供給に向けての取り組みが期待される。

成分標準液の場合で、有意な差（有意水準5％）があることが示唆された物質があったが、全ての物質においてなお、この開発は新エネルギー・産業技術総合開発機

測定値は不確かさの範囲内で一致した（En<1）。一例

構からの委託により実施したものであり、横浜国立大学としてヘキサン溶液の結果を表3及び図2に示す。このこ大学院工学研究院教授佐藤寿邦氏を委員長とする「内とから、当該試験法において混合標準液の調製及び測

分泌撹乱化学物質関連標準物質の研究開発委員会」を定は問題なく行われており、混合標準液の測定に用いる設置して進めた。さらに、基準物質の純度確定は共同検量線用標準液としては、混合標準液また単成分標準研究機関である独立行政法人産業技術総合研究所の液のいずれを用いても問題ないと判断された。

協力を得て実施した。委員会委員及び関係者の皆様方に謝意を表します。

3. まとめ参考文献
本研究を含め、当機構では平成11年度から13年度にかけて環境ホルモン計測に必要とされる標準物質のうちフタル酸エステル4物質の単成分標準液及び混合標準

1）産業技術審議会・日本工業標準調査会合同会議知的基盤整備特別委員会，報告書

我が国の知的基盤の充実に向けて(平成10年6月).

液、フェノール類6物質の単成分標準液及び混合標準液の開発を行った。標準液の調製に用いる基準物質の純度を国際単位（SI）にトレーサブルな方法で決定し、標準

3）上野博子，THE CHEMICAL TIMES，No.187,1(2003).

液の調製方法及び測定方法を検討して、保存安定性の4）JIS Q 0043-1, 試験所間比較による技能試験すぐれた精確な標準液を開発した。さらに標準液の不確かさを算出して、環境ホルモン計測に必要な計10物質の標準物質が、計量法トレーサビリティ制度において特定標準物質として指定され、精確で不確かさの明らかな

62）ISO 6143(2001).

THE CHEMICAL TIMES 2003 No.4（通巻190号）

第1部：技能試

験スキームの開発(1998).
5）JIS Q 0035, 標準物質の認証−一般的及び統計学的原則(1997).