生命科学におけるデザイナブル溶媒「双性イオン液体」
Designable solvents “Zwitterionic liquids” in life sciences

黒 田 浩介
Kosuke Kuroda

金沢大学理工研究域生命理工学系（准教授）

Faculty of Biological Science and Technology, Institute of Science and Engineering, Kanazawa University (Associate professor)

双性イオン液体

凍結保存薬剤溶解01

構造は図2）”
を開発し、セルロース系バイオン液体（OE2imC3C，生命科学において、最も高頻度で使用される非水溶媒は、ジメ明らかにした。この双性イオン液体は、DMSOに代わる生命科学チルスルホキシド（DMSO）である（図1）。DMSOは毒性が比較用の非水溶媒、すなわち「難溶性薬剤の添加溶媒」
および「細胞的低く、「難溶性薬剤の溶媒」「細胞の凍結保存剤」として長らく使の凍結保存剤」として使用できることが分かった。本稿はこの生われている。
しかし、DMSOは“有機溶媒の中では低毒性”にすぎ命科学的応用について紹介する。

はじめにこの双性イオン液
エタノールの高効率生産を達成した4)。さらに、体が大腸菌だけでなく、動物細胞に対しても低毒性であることをず、例えば1〜2%の添加でも細胞へダメージを与える。さらに、0.1%のような低濃度の添加でも細胞の機能に悪影響を及ぼす。
しかし、現在に至るまでDMSOの代替品は探索されていない。
その理由として、“有機溶媒は既に研究し尽くされており、DMSO

OE2imC3Cの毒性より低毒性な溶媒が存在する”という発想が欠けていたことが挙022-1. 細胞毒性

げられる。
しかし、イオン液体は基
ここで我々はイオン液体1)に注目した。

ヒト線維芽細胞(hNF-1)をOE2imC3Cを含む培地で24時間、。

培養した結果、毒性が低いことが分かった。その毒性は、DMSO

本的に毒性が高く、細胞に対しては使用できないものが多い

2, 3)

その一方で2017年に我々は、大腸菌への毒性が低い“双性イオ5)。例えば、10% (w/v) OE2imC3C水溶液よりも低かった（図3）

中で培養した場合、細胞の生存率は約80%だったが、10% (v/v)
DMSO水溶液中では生存率が35%だった。同様の傾向は、他種のヒト線維芽細胞やマウス線維芽細胞でも観察された。

図1 生命科学の非水溶媒

図2 低毒性な双性イオン液体OE2imC3Cの構造

図3 2% DMSO
（左）もしくは OEE2imC3C（右）中で24時間培養した後のヒト線維芽細胞の生存率。
*DMSOは% (v/v), OEE2imC3Cは% (w/v)。以下同様。

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特集

イオン液体

細胞の機能に対する影響も検討した。DMSOは細胞周期を報告も多数出版されている8-10)。

停止させるが、OE2imC3Cは細胞周期に影響を与えなかった 。

「カチオンアルイオン液体の毒性メカニズム11)のひとつとして、また、DMSOはiPS細胞などの幹細胞の分化を誤誘導する6)。

キル鎖が細胞膜に挿入され、細胞膜が破壊される」ことが知られDMSOを2% (v/v)添加すると、未分化マーカーNanog の発現る
（図5右）。カチオンアルキル鎖の挿入は、次に示す2段階のス

5)量の減少が確認された（図4）。一方、OE2imC3Cを2% (w/v)添テップで起こる。①イオン相互作用により、カチオンが細胞膜ヘッ加した場合、未分化マーカーの発現量が維持され、iPS細胞が未ドグループのリン酸基へ接近する。②疎水性相互作用により、
カ分化状態を維持できていることが示唆された5)。

チオンアルキル基が細胞膜アシル基（長鎖アルキル基）と強く相互作用し、細胞膜へ挿入される。そのため、以上のメカニズム①もしくは②のいずれかを抑制することで低毒性化できると考えられる。我々は、極性の高い官能基であるアニオン部位をカチオンアルキル鎖の末端に導入し、上記②の疎水性相互作用を抑制した。これが、現時点で判明している「双性イオン液体が低毒性な理由」
である。DMSOとは異なり、OE2imC3Cは細胞内部へ浸透しないことも示されており、これが細胞の機能を阻害しない理由であると考えられる。
2-3. ゼブラフィッシュへの毒性
ゼブラフィッシュ胚への毒性評価を行った（図6）。ゼブラフィッ
シュ胚に5% (v/v)のDMSOを添加した場合、27匹中23匹が死亡し、残る4匹も奇形を示した。それとは対照的に、5% (w/v)

図4 2% DMSOもしくは OE2imC3C 中で培養したiPS細胞における未分化マーカー（Oct 3/4, 左；Nanog, 右）発現量。のOE 2imC 3Cを添加した場合、総て生存し、奇形を示さなかった。このことから、生体においてもOE 2imC 3Cの安全性が確認された5)。

2-2. イオン液体の毒性メカニズムと、双性イオン液体が低毒性な理由
典型的なイオン液体は毒性が高い。毒性の指標のひとつとし（イオン液体）を添加しない場てEC50がある。EC50とは、被験物質合と比べ、細胞の増殖が半分になるときのイオン液体濃度であ。たとえばIPC-81細胞を用る（= EC 50が高いほど毒性が低い）（図5左）のEC50は、わずか0.002 wt%でいたときの[C8mim]Cl

図6 5% DMSOもしくは OE2imC3C 中で発生したゼブラフィッシュ
胚の様子と生存率。

ある7)。このことは、1Lのペットボトル中に耳かきわずか1、2杯の[C8mim]Clを添加すると、IPC-81細胞の増殖を阻害することを意味する。
メタノールのEC50がおよそ5 wt%7)であることと比較しても[C8mim]Clの毒性が高いことは明らかである。これを利用して逆に、イオン液体を抗がん剤や殺菌剤として利用するという難溶性薬剤の添加溶媒としてのOE2imC3C

03

3-1. OE2imC3Cへの薬剤の溶解17種類の薬剤について、OE2imC3CまたはOE2imC3C水溶液への溶解性を調査した。1 wt%の薬剤を溶液に添加し、常温および80℃で撹拌し、薬剤が溶解するかを確認した。その結果、図7に示されているように、一部の薬剤が溶解したことが確認され（アデノシン3’-リン酸など）
や、た5)。DMSOには溶解しない薬剤
DMSOと水の両方に溶解しない薬剤（ゾレドロン酸一水和物、インスリン）
がOE2imC3Cに溶解した。これにより、双性イオン液体が難溶性薬剤の添加溶媒として有用であることが示された。
次に、非水溶性の抗がん剤であるシスプラチンに焦点を当てた。シスプラチンは、DMSOに溶解した場合にその抗がん作用（右）細胞膜と、挿入された[C8mim]+カチオン。
図5（左）[C8mim]Clの構造、
Adapted with permission from the literature (J. Phys. Chem. B,
2014, 118, 10444-10459). Copyright 2014 American ChemicalSociety.

16が失われることが知られている。
しかし、OE2imC3Cに溶解した場
合、シスプラチンの抗がん作用が維持された（図8）。これらの結果から、シスプラチンの抗がん効果を維持できる低毒性溶媒を開発できた5)。

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3-2. 天然の双性イオンへの薬剤の溶解
OE2imC3Cは低毒性だが新規化合物であり、人体への安全性

凍結保存剤としてのOE2imC3Cについての証拠は未だない。そのため、既に食品添加物などとして使用されている天然の双性イオンに焦点を当て、トリメチルグ04

4-1. OE2imC3Cによる細胞の凍結保存

リシンとL-カルニチンを調査した。これら2つの双性イオンは固Cで凍結5% (w/v)のOE2imC3C水溶液を使用し、細胞を-85°体だが、高濃度の水溶液として使用することで、いくつかの疎水保存した。9種の細胞のうち、5種は効果的に凍結保存できた5)。

シスプラチン性薬剤を溶解できた。さらに、OE2imC3Cと同じく、このときの凍結保存効率は、市販の凍結保存剤（Culture Sure、の抗がん作用を維持したまま溶解できることも明らかにした 。

富士フイルム和光純薬株式会社）を使用した場合と遜色なかっ12)た（図9）。市販の凍結保存剤は、数十年にわたり最適化された複雑な混合物（DMSO、アルブミンタンパクなどで構成）である。そのため、OE 2imC 3Cを超純水に溶かすだけで同等の性能を示したことは驚嘆に値する。一方、残りの4種の細胞について（図10、は、OE2imC3C 水溶液ではうまく凍結保存できなかった
DMSO非添加のサンプルを参照）。そのため、OE2imC3C以外の双性イオンを17種類合成し、最適な双性イオンを探索した。
しかし、上記4種の細胞を効果的に凍結保存できる双性イオンは見つからなかった13)。

図7 溶解を検討した薬剤分子の例。OE2imC3Cへ溶解した薬剤は赤で名称を表記してある。

図9 各溶液を利用して凍結保存した後のマウスアストロサイト細胞の生存率。
(Commercialは市販の凍結保存剤) **: p<0.01

図8 OE2imC3C水溶液、DMSO水溶液中へ溶解したシスプラチンを投与した後のヒト乳がん細胞 (MDA-MB-231)の生存率。
aq.: 水溶液

図10 OE2imC3C溶液、OE2imC3C/DMSO混合溶液を用いて凍結保存した後のBOSC細胞、K562細胞の細胞生存率。**: p<0.01（Commercialは市販の凍結保存剤）

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イオン液体

原因を分析するため、OE 2imC 3Cによる凍結保護メカニズム剤よりも、OE2imC3C + DMSO混合溶液は効率良くスフェロイを分析した。細胞が凍結時に傷害を受ける理由は、細胞の「外」ドを凍結保存できた。さらに、マウス・ヒト腫瘍組織の凍結保存にと「内」で氷晶が形成され、物理的にダメージを受けるためであ対してもOE2imC3C + DMSO混合溶液は有効であった14)。

る。OE2imC3Cは水との相互作用が強く、細胞の外側の氷晶形成を抑制していることが分かった。
しかし、OE2imC3Cは細胞内に浸透しないため、細胞の内部に関しては直接的に氷晶形成を抑制できない。詳細な調査の結果、OE 2imC 3Cの添加による浸透圧

おわりに上昇によって、細胞内が脱水され、間接的に細胞内での氷晶形成

05

したがって、OE2imC3Cでうまく凍結保存が抑制されていた13)。

我々は、低毒性溶媒OE 2imC 3Cを「細胞の凍結保存剤」
およできない細胞は、細胞内での脱水が不足していることが示唆さび「非水溶性薬剤の溶媒」として提案した。双性イオン液体はれた。

DMSOの代替溶媒としても使用できるが、DMSOが使用できない（またはDMSOでは不十分な）場合に特に有用であると考えら

4-2. OE2imC3C + DMSO混合溶液による細胞の凍結保存れる。たとえば、以下のような場合に有効であると想定される。

前述の通り、OE 2imC 3Cは細胞内に直接浸透せず、細胞内の氷晶を直接的に抑制することはできない。このため、従来の研究① 細胞が未分化である場合。

方針からは外れるものの、細胞内に浸透する凍結保存剤、すなわ② 薬剤がDMSOに溶解しない（溶解度が低い）場合。

ちDMSOをOE2imC3C水溶液に添加した。その結果、上記4種の③ DMSOでは細胞の凍結保存効率が十分ではない場合。

細胞についてもうまく凍結保存できた（図10）。さらに、凍結に対して弱い細胞（K562、OVMANA）も効果的に凍結保存できた。

これらを含め、多彩な問題を解決することにより、双性イオン

この結果について、分子動力学シミュレーションを用いて詳細に液体が生命科学界の基礎を広く押し上げていくことを期待して検討したところ、OE2imC3CがDMSOの毒性を軽減している可いる。

能性も示唆された13)。
また、
この研究は学際的な挑戦でもある。双性イオン液体には4-3. OE2imC3C + DMSO混合溶液による細胞塊（スフェロイド）・組織の凍結保存
スフェロイドは生体定着性が高いなどの特長をもつため、再生多くの応用可能性がある一方で、我々の発想力には限界がある。
本稿を読んで、「双性イオン液体を使用するとこんなことができる！」と考える方がいらっしゃれば、ぜひご連絡いただきたい。

医療の生体材料として重要である。
しかしその一方で、スフェロイ

最後に、「 双性イオン液体」という単語についても注記してドの凍結保存は難しいことが知られ、適した凍結保存剤が求めらおく。液体の双性イオンは種類が少なく、まだあまり研究が進れている。

んでいない。そのため、その単語自体が正式に確立されていスフェロイ
4-2.で開発したOE2imC3C + DMSO混合溶液は、ない。英語でも同様であり、zwitterionic liquidなのかliquid

ドの凍結保存に対しても有効であった（図11）。スフェロイド専用

zwitterionなのか定まっていない。日本で同様の研究を行っての凍結保存剤は市販されていないため、市販の凍結保存剤とのいるのはおそらく、藤田先生（上智大学）のグループ 15)と我々の比較は難しい。
しかし少なくとも、分散細胞用の市販の凍結保存グループだけであり、さらに藤田先生の科研費の報告書（2015年）
にて「双性イオン液体」という単語が見つかったため、この表現を使用させていただいた。
謝辞
本研究は、ACT-X「生命と化学」（JST）、A-STEPトライアウトタ
イプ（JST）、スーパーハイウェイ事業（JST）、科研費学術変革領域研究（B）、基礎生物学研究所 共同利用研究、金沢大学 先魁プロジェクト2020, 2022によって支援されたものです。ゼブラ
フィッシュ毒性は小林功准教授（金沢大）に、浸透圧測定は田中大介 資源保存ユニット長（農研機構）に、分子動力学シミュレーションは宇都卓也准教授（宮崎大）にご協力いただきました。この場をお借りして厚く御礼申し上げます。また、図表の一部は生化学

図11 OE 2 imC 3 C/DMSO混合溶液を用いて凍結保存した 後 の 5 5 5 5 細 胞 スフェロイドの 細 胞 生 存 率 。O D - 5 / 5はOE 2imC 3C/DMSO/水 = 5/5/90 (w/w/w)を示す。
（Commercialは市販の分散細胞用の凍結保存剤）

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第94巻 pp298-301（2022）
より転載しております。

THE CHEMICAL TIMES
参考文献
1.

T. Welton. Room-temperature ionic liquids. Solvents forsynthesis and catalysis. Chem Rev 1999, 99, 2071-2083

2.

D. Zhao, Y. Liao, and Z. Zhang. Toxicity of ionic liquids.
CLEAN – Soil, Air, Water 2007, 35, 42-48

3.

S.M. Lee, W.J. Chang, A.R. Choi, and Y.M. Koo. Influence ofionic liquids on the growth of esherichia coli. Korean J ChemEng 2005, 22, 687-690

4.

K. Kuroda, H. Satria, K. Miyamura, Y. Tsuge, K. Ninomiya,and K. Takahashi. Design of wall-destructive but membranecompatible solvents. J Am Chem Soc 2017, 139, 16052-16055

5.

K. Kuroda, T. Komori, K. Ishibashi, T. Uto, I. Kobayashi,
R. Kadokawa, Y. Kato, K. Ninomiya, K. Takahashi, and E.
Hirata. Non-aqueous, zwitterionic solvent as an alternative fordimethyl sulfoxide in the life sciences. Commun Chem 2020, 3,
163

6.

S. Chetty, F.W. Pagliuca, C. Honore, A. Kweudjeu, A. Rezania,and D.A. Melton. A simple tool to improve pluripotent stem celldifferentiation. Nat Methods 2013, 10, 553-556

7.

J. Ranke, K. Mölter, F. Stock, U. Bottin-Weber, J. Poczobutt, J.
Hoffmann, B. Ondruschka, J. Filser, and B. Jastorff. Biologicaleffects of imidazolium ionic liquids with varying chain
lengths in acute vibrio fischeri and wst-1 cell viability assays.
Ecotoxicol Environ Saf 2004, 58, 396-404

8.

J. Gravel, and A.R. Schmitzer. Imidazolium andbenzimidazolium-containing compounds: From simple toxicsalts to highly bioactive drugs. Org Biomol Chem 2017, 15,1051-1071

9.

A.R. Dias, J. Costa-Rodrigues, M.H. Fernandes, R. Ferraz,and C. Prudencio. The anticancer potential of ionic liquids.
ChemMedChem 2017, 12, 11-18

10. J. Pernak, K. Sobaszkiewicz, and I. Mirska. Anti-microbialactivities of ionic liquids. Green Chem 2003, 5, 52-56
11. G.S. Lim, J. Zidar, D.W. Cheong, S. Jaenicke, and M. Klähn.
Impact of ionic liquids in aqueous solution on bacterial plasma
membranes studied with molecular dynamics simulations. JPhys Chem B 2014, 118, 10444-10459
12. R. Kadokawa, T. Fujie, G. Sharma, K. Ishibashi, K. Ninomiya,K. Takahashi, E. Hirata, and K. Kuroda. High loading oftrimethylglycine promotes aqueous solubility of poorly watersoluble cisplatin. Sci Rep 2021, 11, 9770
13. Y. Kato, T. Uto, D. Tanaka, K. Ishibashi, A. Kobayashi, M.
Hazawa, R.W. Wong, K. Ninomiya, K. Takahashi, E. Hirata,and K. Kuroda. Synthetic zwitterions as efficient non-permeablecryoprotectants. Commun Chem 2021, 4, 151
14. T. Ishizaki, Y. Takeuchi, K. Ishibashi, N. Gotoh, E. Hirata, and K.
Kuroda. Cryopreservation of tissues by slow-freezing using anemerging zwitterionic cryoprotectant. Sci Rep 2023, 13, 37
15. M. Yoshizawa-Fujita, T. Tamura, Y. Takeoka, and M. Rikukawa.
Low-melting zwitterion: Effect of oxyethylene units on thermal
properties and conductivity. Chem Commun 2011, 47, 23452347

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