研究フロンティア

LH Receptorからのチロシンリン酸化シグナル伝達経路の解明
水谷哲也１），Mario Ascoli２），宮本薫１）

１）福井大学医学部医学科生命情報医科学講座分子生体情報学領域
２）Department of Pharmacology, Carver College of Medicine, The University of Iowa

はじめにィッヒ細胞腫由来のCell Lineである［４］．この細胞の特徴は，内在的にLHRが発現していることと，ステロ黄体形成ホルモン受容体（LHR）は，精巣および卵イドホルモン産生能をもつことである．しかしながら近巣で発現するGタンパク質共役型受容体の１つで，下垂年，理由は不明だがMA-10細胞における内在的なLHR体から分泌される黄体形成ホルモン（LH）と特異的にの 発 現 が 著 し く 低 下 し て い る． そ こ で 最 近 で は，結合し，細胞内にシグナルを伝達し，性腺機能を調節しMA-10細胞にLHRの発現ベクターをトランスフェクトている．

して，過剰発現させることによりLHRの機能やシグナ

LHRの遺伝子異常によって引き起こされる思春期早リングについて検討することが多い［５］．

発症は男性のみ発症し，２歳前後より急激な性早熟が発現する．これはLHR遺伝子の変異により，リガンド非依存的にレセプターが恒常的に活性化されるために引きMA-10細胞で，hCGによってチロシンリン酸化が誘導されるタンパク質の同定起こされ，アンドロゲン産生の亢進とともに，精巣ライ
ディッヒ細胞の腺腫や過形成を伴うケースが多い［１,２］．このことは，恒常的なLHRの活性化が，ライMA-10細胞で，hCGによって早期にチロシンリン酸化が誘導されるタンパク質の同定を試みた．

ディッヒ細胞の増殖異常と密接に関係している可能性をヒトLHR（hLHR）を過剰発現させたMA-10細胞に示唆している．ライディッヒ細胞におけるLHからのシhCGを添加後，経時的に細胞を回収し細胞抽出液を作成

グナリングのうち，ステロイドホルモン産生メカニズムした．これらのサンプルをSDS-PAGEで分離後，抗チに関しては多くの研究報告がある．しかし，細胞増殖・ロシンリン酸化抗体（４G10）を用いて，ウェスタンブ分化に対するLHの役割に関しては，Erkの活性化メカロッティングを行った（図１）．その結果，約120 kDa

ニズムに関する報告［３］はあるものの非常に限られてのタンパク質がhCGによって早期にチロシンリン酸化さいるのが現状である．
一方，タンパク質のチロシンリン酸化は，さまざまな

Myc-hLHR

Transfection

細胞機能に関与し，とくに細胞増殖と密接に関係するシグナル伝達の１つである．われわれは，マウスライディ

Addition

ッヒ細胞由来MA-10細胞で，LHによって，早期にチロhCG (1 µg/ml)
00.5

15 30

EGF

01 (min)

シンリン酸化が促進されるタンパク質を同定し，それがどのようなシグナル伝達経路を経てリン酸化されるのか����明らかにした．

117k

95k

MA-10細胞MA-10細胞は，約25年前に樹立されたマウスライデ
連絡先：水谷哲也，福井大学医学部医学科生命情報医科学講座分子生体情報学領域〒910-1193 福井県吉田郡永平寺町松岡下合月23-3
TEL: 0776-61-8316
FAX: 0776-61-8102
E-mail: mizutani@fmsrsa.fukui-med.ac.jp

図１MA-10細胞でのhCGによる約120kDaのタンパク質のチロシンリン酸化
hLHR発現ベクターをトランスフェクトしたMA-10細胞にhCGまたはEGFを添加し，一定時間後に細胞を回収して，細胞溶解物を作
成 し た． こ の細 胞 溶 解 物 を 抗 チ ロ シ ン リ ン 酸 化 抗 体を 用 い てWestern blotを行った．hCGによって約120kDaのタンパク質がチロシンリン酸化を受けた．

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水谷 哲也他

れ る こ と が 明 ら か と な っ た． し か し な が ら，EGF

Transfection

receptorと考えられる約180 kDaのタンパク質や他のタ��������ンパク質では，hCGによるチロシンリン酸化はみられなかった．
れ る， 約120kDa の タ ン パ ク 質 を 同 定 す る た め に細胞，約１×107個より，細胞抽出物を作成し，先ほど�����の抗チロシンリン酸化抗体によって，免疫沈降を行った．

�����

そして，そのサンプルをSDS-PAGEで分離後，silverstainingで可視化し，約120 kDaのタンパク質を回収しAdhesion Kinase（FAK）であることが示された．

Focal Adhesion Kinase（FAK）

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MALDI-TOF MS解析を行った．hCG刺激後のMA-10

MSに よ り 解 析 し た 結 果， こ の タ ン パ ク 質 はFocal������

そこでまず，hCGによってチロシンリン酸化が誘導さた．そのサンプルをトリプシン消化後，MALDI-TOF

Myc-hLHR���������
図２

MA-10細胞でhCGによって誘導されるFAKのリン酸化は，576番目のチロシン残基（FAKpY576）特異的である
hLHR発現ベクターをトランスフェクトしたMA-10細胞にhCG添加し，15分後に細胞を回収して，細胞溶解物を作成した．この細胞溶解物を，FAKリン酸化特異的抗体を用いてWestern blotを行った．FAKpY576のみに，hCGによるリン酸化の誘導が見られた．

FAKはviral Srcの基質として同定された，非レセプリン酸化されることが明らかとなった（図２）．また577

ター型チロシンキナーゼである［６］．発現はユビキタ番目のチロシン残基でもリン酸化が促進される傾向がみ

ス で あ り， 細 胞 内 で は 細 胞 接 着 斑 に 多 く 局 在 す る．

られた．しかしながら，397番目，407番目および861番

FAKの活性化により接着点複合体自身を含む多数の標目のチロシン残基ではhCGによるリン酸化の促進はみら的をリン酸化し，細胞の形態変化や移動に関与している．

れなかった．FAKpY576（およびFAKpY577）のリンがん細胞の多くはFAKの量が多く，これががん細胞の酸化は，FAKのキナーゼ活性に重要なことが明らかにより高い運動性に関わっているかもしれない．またなっているので，LHによってFAKのキナーゼ活性が促

FAKは，インテグリンのみならずシグナル伝達受容体進されるものと推察された．とも結合し，チロシンリン酸化シグナルを含む，さまざまなシグナル伝達にも関与している．

Src Family Kinases（SFK）の関与の検討

またFAKには，少なくとも６ヵ所のチロシンリン酸化部位が明らかにされている．その中で，397番目のチMA-10細胞でhCGによるFAKpY576のリン酸化を，ロシン（FAKpY397）は，インテグリンの活性化に伴い，SFKが仲介しているか検討した．SFK特異的インヒビタ

FAK 自 身 に よ り 自 己 リ ン 酸 化 さ れ る． さ ら に，ーであるPP２でMA-10細胞を前処理した後hCGを添加

FAKpY397のリン酸化によって，その領域（SH２ドメし，15分後に細胞抽出液を作成し，ウェスタンブロット

イン）にSrc Family Kinases（SFK）が結合し，SFKに解析によりFAKpY576のリン酸化を検討した．その結よってFAKの397番目以外のチロシン残基がリン酸化さ

果，hCGによって誘導されたFAKpY576のリン酸化が，れる．また576番目（FAKpY576）と577番目（FAKpY577）PP2の前処理により消失した．またMA-10細胞へ酵素活のチロシン残基は，FAKキナーゼドメイン中に含まれ性を消失したDominant Negative SFKを過剰発現させるチロシン残基で，このリン酸化がFAKの酵素活性にることによっても，hCGによるFAKpY576のリン酸化の重要であることが明らかになっている［７,８］．

誘導が消失した（図３）．
次に，MA-10細胞におけるSFKの発現をウェスタン

FAKチロシンリン酸化部位の同定ブロットにより解析した．SFKの中で，ユビキタスに発現していると考えられているSrc，FynおよびYesについMA-10細胞ではhCGによってFAKのどのチロシン残て検討した結果，MA-10細胞ではFynとYesの発現は認基がリン酸化されるかを，部位特異的リン酸化抗体を用められたが，Srcの発現は認められなかった（図４）．こいてウェスタンブロット解析した．その結果，FAKののことから，MA-10細胞におけるSFKは，FynとYesが576番目のチロシン残基（FAKpY576）が，hCGにより，中心的な役割を担っていると考えられた．またSrc，

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図３������������������� ����� ����� ����� ��� ����� ����� ���������� ����� ���������� ����� ����������
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MA-10細胞でhCGによるFAKpY576のリン酸化は，Src Family kinasesによって仲介される（A）hLHR発 現 ベ ク タ ー を ト ラ ン ス フ ェ ク ト し たMA-10細 胞 を，Src FamilyKinases特異的抑制剤であるPP２で前処理した後hCGを添加し，15分後に細胞を回収して，細胞溶解物を作成した．この細胞溶解物を，抗FAKpY576抗体を用いてWestern blotを行った．PP２によってhCGによるリン酸化の誘導は消失した．
（B）hLHR発現ベクターと共に酵素活性を消失させたDominant negative SrcおよびFynをトランスフェクトしたMA-10細胞にhCGを添加し，15分後に細胞を回収して，細胞溶解物を作成した．この細胞溶解物を，抗FAKpY576抗体を用いてWestern blotを行った．Dominant negative SrcおよびFynによってhCGによるリン酸化の誘導は消失した．

 ��� ���

表１

hCGはFynおよびYes活性を促進する

Kinase Assayed�������������

図４�������������

�������������

MA-10細胞におけるSrc Family Kinasesの発現
MA-10細胞におけるSrc Family Kinasesの発現をそれぞれ特異的な抗体を用いてWestern blotにより検討したところ，FynとYesの発現は認められたがSrcの発現は認められなかった．
（文献10より一部改変）

Cell Stimulated withhCG（fold-over-basal）

Fyn

1.54±0.12a（n=7）

Yes1.26±0.05a（n=6）

MA-10細胞にhLHR発現ベクターをトランスフェクトし，無処理またはhCG添加後10分で細胞を回収し，細胞溶解物を作成した．この細胞溶解物を抗Fyn抗体または抗Yes抗体を用いて免疫沈降を行った後，免疫沈降されたサンプル中のホスホトランスフェラーゼ活性を測定し，その活性を無処理のサンプルに対する倍率で表した．a（P＜0.05，paired test）（文献10より一部改変）

Fyn，Yesは構造的に類似しているため，その機能の多よびGαi/oを活性化する．そこで，まずMA-10細胞で恒く も 重 複 す る［９］． そ の た め そ れ ぞ れ のDominant

常的活性型Gタンパク質（Gαs, Gαq, Gα11, Gαi, Gαo）を

Negative SFKを用いても，これらの活性が影響を受け過剰発現させ，これらGタンパク質のFAKpY576リン酸るため，Srcの発現していないMA-10細胞でもDominant化に対する影響を検討した．その結果，恒常的活性型

Negative Srcの過剰発現の影響がみられたものと考えら

Gαs，GαqおよびGα11の過剰発現によってFAKpY576のれる．さらにMA-10細胞でのFynおよびYesの活性を，リン酸化が誘導された（図５）．このことから，hCGにホスホトランスフェラーゼ活性測定により検討したとこよるFAKpY576リン酸化の誘導に，Gαs pathwayおよろ，hCGによって，FynおよびYesの酵素活性が増大す

びGαq/11 pathwayが関与していることが示唆された．

ることが明らかとなった（表１）．

Gαs pathway

以上の結果から，SFKを介してhCGによりFAKpY576のリン酸化が誘導されることが示唆された．

GαsのセカンドメッセンジャーであるcAMPアナログの添加により，MA-10細胞でFAKpY576のリン酸化が誘導された（図２）．

Gタンパク質の関与の検討

Gαq/11 pathway
MA-10細胞にGαq/11のみを活性化することが知られ

LHRはリガンドであるLHと結合し，Gαs，Gαq/11おているGタンパク質共役型受容体（エンドセリンA受容研究フロンティア

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水谷 哲也他� ������������������������������������������������������������������������ ��� ���� ��� �������������������� ���������� ������������������������ ������������������������������

図５

MA-10細胞でGαs，GαqおよびGα11の恒常的活性型変異体の過剰発現によりFAKpY576のリン酸化が誘導される
Emptyベクターまたは様々なGαサブユニットの恒常的活性型変異体をトランスフェクトしたMA-10細胞より，細胞溶解物を作成した．この細胞溶解物を，抗FAKpY576抗体を用いてWestern blotを行った．FAKpY576のリン酸化はGαs，GαqおよびGα11の恒常的活性型変異体の過剰発現によって誘導された．
（文献10より一部改変）

表２

LHRまたはETAをトランスフェクトしたMA-10細胞でのcAMPおよびイノシトールフォスフェイト産生の効果

AdditionTransfection

cAMP
Inositol Phosphates（pmol/106 cells） （cpm/106cells）

Buffer

hLHR

52±13

1861±242

hCG

hLHR

2,021±50a

13,399±1,861a

BufferETA

36±13

1732±283

ET１ETA70±2223,263±2,233ahLHRまたはエンドセリンETAレセプターの発現ベクターをトランスフェクトしたMA-10細胞にhCGまたはET１を添加し、30分後（cAMP産生測定用）または60分後（イノシトールフォスフェイト産生測定用）にサンプルを回収し、それぞれの産生量を測定した。
a（P＜0.05, paired test）（文献10より一部改変）

図６MA-10細胞でGαq/11の活性化によってFAKpY576のリン酸化が誘導される
hLHRまたはエンドセリンETAレセプターの発現ベクターをトランスフェクトしたMA-10細胞にhCGまたはET１を添加し，15分後に細胞を回収して，細胞溶解物を作成した．この細胞溶解物を，抗FAKpY576抗体を用いてWestern blotを行った．FAKpY576のリン酸化はGαq/11のみを活性化するエンドセリンETAレセプターによっても誘導された．（文献10より一部改変）として知られているパキシリンのチロシン残基のリン酸化が促進されることから，hCGによりFAKの酵素活性が増強され，その結果パキシリンのリン酸化が促進されたものと推察される．
またhCGによるFAKのリン酸化を，SFKが仲介することが示された．SFKはさまざまなシグナル系，すなわ
ち，さまざまな機能に関与することが知られているチロシンキナーゼである．本研究により，hCGによってSFKの活性化が促進されることが明らかになったことから，
MA-10細胞ではFAKのみならずSFKを介して，さまざまなチロシンリン酸化シグナル系がhCGにより活性化さ体）を過剰発現させて，そのリガンド（エンドセリン−れると推察された．

１）を添加したところ，FAKpY576のリン酸化が誘導

これらの結果は，LHRを介してチロシンリン酸化シされた（図６，表２）．このことから，MA-10細胞では，グナルが活性化されることを初めて示したものである．

Gαq/11の活性化によっても，FAKpY576のリン酸化が今後さらにLHによって活性化されたSFKやFAKがどの誘導されることが示された．おそらくLHRのhCGによるような役割を担っているか，検討していきたいと考えて活性化の際にも，GαsのみならずGαq/11の双方を介しいる．てFAKpY576のリン酸化が誘導されると考えられる．
以上の結果から，hCGの刺激によりLHRからGαsおよびGαq/11両方のpathwayが活性化され，続いてSFKの活性化を介して，FAKのリン酸化が促進されるものと推察された．

おわりに
本研究により，マウスライディッヒ細胞由来MA-10細胞でhCGによってFAKのチロシンリン酸化が誘導されることが明らかとなった．さらに，このリン酸化の誘導はFAKのキナーゼドメイン中のチロシン残基で惹き起こされ，このリン酸化によりFAKの酵素活性が増強されると考えられる．実際，hCGによってFAKの基質

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文

献

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