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霧するスプレー法を実習した。用いた培地は，気生藻のほとただいた高知大学教育研究部の峯一朗准教授，並びに協力しんどに適合する BBM 培地（Bischoff & Bold 1963）である。ていただいたスタッフ一同に感謝申し上げる。

また，野生状態と培養状態で形態が大きく異なる種もあり（図1-F），単離作業においては，培養プレートを途中段階で観察しつつ，コロニーが目的の藻類から生じたことを確認する重要性についても説明した。参加者それぞれが興味ある内容に取り組むということで，雑然とした中で作業は進んだが，何とか各自培養プレートを作ることができた様子であった。初めての試みではカビだらけになったり，藻類が繁茂しすぎて単離が難しくなったり，藻類のコロニーがほとんど出ない失引用文献
Bischoff, H. W. & Bold, H. C. 1963. Some soil algae from Enchanted Rockand related algal species. Phycoloigical studies IV. Univ. Texas Public.
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Ohmura, Y., Mizobuchi, A., Handa, S. & Lücking, R. 2016. Coenogonium
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with taxonomic notes of the photobiont in culture. J. Jpn. Bot. 91:
74–78.

敗もあるかもしれない。参加者それぞれの培養プレートの，その後の様子が楽しみである。

（広島県環境保健協会）

本実習に当たり実験室の準備や大学バスの調達など尽力い

クロレラ分類の現在
保科 亮
球状緑色藻「クロレラ」は，健康食品として長年愛されるもっ

このピレノイドはデンプンで囲まれ，二重のチラコイドメンブレとも知られた藻類のひとつである。しかし，分類学的にみると，ンが貫入する。現在では，このような形態種を，クロレラ型，あChlorella 属はきわめて複雑な経緯をへて現在に至っている。本稿ではクロレラ類の分類の変遷と問題点について触れていきたるいは Chlorella-like と称す。
クロレラは，様々な研究や産業上の重要種であったことから，い。なお，本稿では広義のクロレラ = 球状緑色藻 ( 近似系統群

生理特性や成分分析等によりその多様性が示され，100 種以上を含む ) と，分類学的意味としての Chlorella を区別して記述する。

が記載された。しかし，形態的差異はほとんどなく，また有性生クロレラが記載されたのは Chlorella としてではなく，動物内にいる緑の藻 類，すなわち，共生藻として記 載された形質の一部として採用されてきた量的差異は，わずかな培養条Zoochlorella (Brandt 1881) が 始まりである。Brandt は同論文で同様に共生する黄色の藻 類，Zooxanthella も記載している。Chlorella が 記 載されるのは 9 年 後の 1890 年となる。
Beijerinck (1890) は，Zoochlorella と同様の藻類が，ふつうに淡水中に存在することが分かったため，新属 Chlorella ( タイプ種 : Ch. vulgaris) を 立 ち上 げ，Zoochlorella は Chlorella の一部である，とした。当時，学名の Priority がどうなっていたのか不明だが，学名としての Zoochlorella は徐々に使用されなくなっていった。現代的な分類学的処置としては，Silva (1990)
が Chlorella と Zoochlorella はシノニムとみなすことができ，また Zoochlorella に Priority が あるが，Chlorella 属 が あまりに有名なため Chlorella を保存名とし，Zoochlorella を廃棄している (ICBN 2000, Appendix IIIA)。なお，現在でも生態学的な意味においては，原生動物等の内部にいる球状緑色藻をZoochlorella ( 属名扱いとは異なる ) と称す。
クロレラの典型的な特徴は，直径 5 µm 前後の球状緑色藻で自生胞子による無性生殖。鞭毛や刺，ゼリーなどの装飾が一切殖しないため，その分類や同定は困難をきわめた。特に，分類件の差，培養者や施設による影響によることも多く，また，長期培養で性状が変化する種もいる (e.g., Shihira & Krauss 1965)。
こうしたクロレラ類を整理・統合してきたのがドイツ人研究者らで，特に Kessler 氏や Huss 氏らの功績は大きい。その彼らが分子系統解析に着手して以降，クロレラの分類観は大きく変貌していく。Huss, Kessler et al. (1999) は SSU rDNA で系統樹を構築し，クロレラがトレボウクシア藻綱と緑藻綱の両綱に散在することを示した。すなわち，クロレラと呼ばれる球状緑色藻は他人の空似であり，タイプ種とクラスターを形成する 4 種 (Ch.

vulgaris，Ch. lobophora，Ch. sorokiniana，Ch. kessleri) のみを「真のクロレラ」とした。ところが，シークエンスデータが増えるに従い，真のクロレラ系統群の中に様々な形態種が入り混じることが分かってきた。Krienitz, Huss et al. (2004) は SSUrDNA に ITS2: Internal transcribed spacer 2 を加えて系統解析をおこない，これらが明瞭に 2 系統に分かれ，タイプ種 Ch.

vulgaris を含む方を Chlorella-clade，もう一方のクレードに入る Ch. kessleri の属名を変えて Parachlorella-clade とし，双方併せてクロレラ科と定義している。これ以降，クロレラの分類ない，スムースな細胞壁をもち，群生せず単細胞状態を保つ。

は Krienitz 氏を中心としたグループによって進められていくこと

葉緑体はペリフェラルな一枚で，多くはカップ状。光学顕微鏡でになる。

は目立たない場合もあるが，葉緑体の内部にピレノイドを有す。

Chlorella-clade 内には刺を持つ藻類 Mircactinium pussilum

116

CBC，C が U に置換するなど，ゆらぎ塩基対を形成 ( 逆パターンも ) する現象を hemi-CBC と呼ぶ ( 図 2b)。比較する 2 者間の ITS2 で，CBC がみつかれば別種とみなすことができる。これは陸上植物からクラミドモナスまで，様々な生物群で統計的データが示されている (e.g., Müller et al. 2007)。CBC による
種コンセプトは，より保存性の高い Helix II と III の CBC に限られていたが，Krienitz 氏らの解析では Helix I と IV も同様に扱うようになった。私見ではあるが，Helix I と IV は，時に激しい Length polymorphism がみられ，どの塩基対同士を比較して CBC の有無を探るのか，バイアスを払拭することができない。
図 1. SSU-ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 系統解析によるクレード形成と，クレード固有の共有派生的塩基置換 / インデル ( 白抜き文字 ) (Luoet al. 2010 より一部を抜粋して改編 )。なお，Chlorella 属には共有派生的変異はみられない。

一方，同じ ITS2 を使いながら一次配列比較による種分類も模索されている。比較したい 2 者の ITS2 を Clustal X などを用いてアライメント ( セッティングはデフォルトでよい ) する。このさいGap も 1 塩基として数えると，ほぼすべてのケースで，その差異が 2％以内か 10％以上となるため，ここに種の境界がみえてくる(Hoshina & Fujiwara 2013, Hoshina 2014)。この比較手法を用いると，ITS2 を BLASTN にかけることで，同種の ITS2 が登録されているかどうかも，すぐに判明する。
さて，クロレラ科のその後である。科内にはさらに様々な種が流入し，種分類も進められた。Chlorella 属だけでも約 15 種，Chlorella 属といえど，形態形質はクロレラ型だけではなくなっ

図 2. ITS2 と CBC。2a. ITS2 の 二 次 構 造。 各 Helix に は 5' よ り，I–IV の名前がつく。4-helix 構造は多くの真核生物で共有されるが，Helix が付加されていたり，欠如する分類群も散見される。例えば，繊毛虫の多くは Helix I および IV を欠く。2b. CBC および hemiCBC の具体例。

がいる。 Luo, Krienitz et al. (2006) は M. pussilum の系統によっては，培養下でクロレラ様の形態をなし，また，培養液に捕食者を入れることで，再度刺の形成が惹起されることを示した。

た (Bock, Krienitz et al. 2013)。遺伝子比較のみで分類を行っているため，それ自体に問題はない。しかし，Krienitz 氏らの系統解析手法には疑念を禁じ得ない。彼らは系統解析に SSU-ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 全域を用いている。ITS2 の差異は種間だと 10％以上と上述したが，ITS1 の差異はそうしたレベルをはるかに超える。例えば，伝統的な Chlorella 2 種，Ch. vulgarisと Ch. sorokiniana の ITS1 の相違は 44％に達する。もちろん，激しい Length polymorphism が随所にみられる。公開されている彼らのアライメント (Bock, Krienitz et al. 2010) は，大きなギャップが入り混じるもので，この種のこの塩基が，別の種のこ微細藻の分類では，形態，生理，系統や生殖的隔離など，多面の塩基に相当する根拠は往々にして不明である。ITS1 を用いず，的なアプローチが理想とされるが，クロレラ関連群においては，比較的安定的なアライメントが得られる SSU + ITS2 のみで系生理的特徴に加えて今度は，形態的特徴も危うさを含むことが統樹を構築すると，いくつか属の単系統性が担保されないこと判明したわけである。さらに，有性生殖もしないので，多面的アが，最近になって指摘されている (Heeg & Wolf 2015)。とりわ

プローチに頼らない，遺伝子の差異のみで分類しようという下地が出来上がった。このような背景があり，クロレラ科では SSU-け Chlorella 属は，Chlorella-clade において 5 つの小クレードに分散する多系統群であることが示された。

ITS1-5.8S-ITS2 rDNA を用いた分子系統，および，各クレー生理特性や形態形質に疑問符が付き，かつ有性生殖をおこなドにみられる共有派生的な塩基置換やインデルをもって属を定わないクロレラ類を，遺伝子比較のみで分類していこうという義づけする ( 図 1) という提案がなされた (Luo, Krienitz et al.
2010)。

Krienitz 氏らの目指した新しい方向性は評価されるべきである。
しかし，比較領域をわずかに変えるだけでトポロジーが大きく変ところで種はどう定義するのか。種の境界はクロレラに限らず，化する現在の解析，すなわち，rDNA 領域を主体とした系統解最近は ITS2 という領域の比較が重要視されてきている。スペー

析では，クロレラ科内における系統関係の確定には至っていない。

サーと銘打っているが，RNA として機能する遺伝因子で，「4 本現在，rDNA 以外のデータは，それ自体がほとんどなく，今後，指の手」と呼ばれる特定の構造をとる ( 図 2a)。ITS2 に限らず，新たな分子種を加えた解析による，属の再編が待たれる。

高次構造をとる RNA には CBC: Compensatory base changeという，特徴的な塩基置換がよくみられる。例えば，C-G ペアの C が A に置換するとペアを形成できない。偶然か必然かはさておき，C-G が両塩基とも置換し A-U ペアに置き換わる現象を

引用文献
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（長浜バイオ大学バイオサイエンス学部）

文献データベースから見た微細藻類バイオマス研究の動向
大田修平
2017 年 3 月 25 日午後，日本藻類学会高知大会の一般講に，Web of Science のリソースを利用し，検索クエリを組み演が無事に終了し，引き続きワークショップⅡが開催された。

合わせて動向分析した。Web of Science を使ったクエリ検索

このワークショップは 1 日目の講義編と 2 日目の実習編から

では Web of ScienceTM Core Collection より，例えば，「algae成る。講義編では，トレボウクシア藻類を研究材料とした生態，fuel」等のトピック検索を行った。クエリワードが複数ある場

分類，カルチャーコレクション，バイオマス利用に関する研合は OR 検索を行った。以降の本文中で「・」は OR を示す。

究動向が紹介された。講義編で解説した藻類バイオマス研究

今回の分析では最小レコード件数（しきい値）は２報／年とに関する内容は既に和文としてまとめているので，ご興味あしてカウントした。国・地域別の分析では，上位 10 レコードる方は参照されたい（大田・河野 2015，大田・河野 2017）。

を抽出した。分析結果はテキストデータに保存して，エクセ今回の講義の導入部では，藻類バイオマスの国内外の研究動ルに再度読み込み，データの編集を行いグラフ化した。本稿

向について紹介した。の図 1A と図 2 は 2017 年 3 月，それ以外は 2017 年 5 月に調ト ム ソ ン・ ロ イ タ ー 社 に よ り 提 供 さ れ て い る Web of
Science は，オンラインの学術データベースの総合プラット フ ォ ー ム で あ る。PubMed，ScienceDirect や Google
Scholar などと併用して論文検索に使用されている方も多いかもしれない。Web of Science は自然科学，社会科学，人文査したものを示している。
ワードとして真っ先に思い浮かぶ。そこでこれらについての科学の全分野における主要論文誌の情報がカバーされており，く，ある年を境にして，急に論文が増えていた。特に藻類原文献調査に関する分析ツールが充実している。また，Web料・食料は出版数の増加傾向が顕著であり，1990 年で 41 報

of Science のデータベースのひとつである InCites Journal
Citation Reports は，インパクトファクターの計算に使われてくまで跳ね上がっている。藻類原料・食料に関しては 1985 年いるおなじみのリソースである。

〜 1989 年，藻類燃料に関しては 1985 年〜 2006 年以前に出藻類バイオマスの研究では「燃料」，「原料」，「食料」がキー
論文出版動向を年代別に調べたのが図１A である。藻類燃料，藻類原料・食料ともに徐々に論文が増えているのではな

であったものが，翌年には 198 報まで増加し，一気に 5 倍近国内外の学術の動向を知りたい場合，当該分野の出版論文版された論文についてさらに詳しく調査した結果，当該期間数がひとつの指標となる。特許案件の研究では論文公表が控の論文は 38 報あり，被引用数の 2017 年までの合計は 1050えられるが，特許申請と論文執筆は並行的に進められている件，平均被引用件数は 27.63 件 / 報であった。一方，藻類燃ことも多い。特許案件の研究でも公知後，論文は出版される料に関しては 1985 年〜 2006 年以前を調査したところ，当該ことが多く，当該分野の論文の報告数は研究動向の重要な指期間の論文は 15 報あり，被引用数の合計は 2017 年までの合標である。今回，藻類バイオマスの研究動向を分析するため

計は 117 件，平均被引用件数は 7.8 件 / 報であった。