研究フロンティア（平成２０年度学術奨励賞受賞論文）

着床期子宮局所における STAT―３活性の役割

中村 仁美１），香山 晋輔１），谷口
武２），荻田 和秀１），熊澤 恵一１），張３）
４）
古山 将康 ，杉野 法広 ，田村 博史４），金田 安史５），木村
正１）慶１），筒井 建紀１），

１）大阪大学大学院医学系研究科産婦人科
２）医療法人定正会谷口病院
３）田附興風会医学研究所北野病院産婦人科
４）山口大学大学院医学系研究科産婦人科
５）大阪大学大学院医学系研究科遺伝子治療学

はじめに

マウス着床期子宮における STAT３の機能

現在の不妊治療において，着床不全にたいする診断方

遺伝子欠損マウスによる検討では，時にその遺伝子の法および治療方法を確立することが求められているが，欠損が致死的であったり，他の遺伝子によって代償され着床不全の病態だけでなく，生理的な着床現象の物質的るため，結局その遺伝子自身の機能がわからないことがな基盤も解明されていないのが現実である．

ある．われわれは，着床現象を検討するためには着床期

着床期は短い期間であるにもかかわらず経時的に多数の子宮局所で一過性に遺伝子導入できるシステムが必要の物質が関与する多段階反応であり，この間子宮内膜はと考え，その開発を行った．過去にリポフェクションに構造的にも機能的にもダイナミックに変化をすることがよるマウス子宮に対する遺伝子導入の報告があるが知られている．この経時的な多段階性を保つためにいく［８］，遺伝子導入効率の検討はされておらず，われわれ

つかの多機能転写因子がこれらを制御しているのと考の行ったところでは，有効な遺伝子導入効率を得ること

え，多機能転写因子の１つである signal transducer andができなかった．Naked DNA を子宮腔内に入れる方法

activator of transcription―３（STAT―３）に着目した．

も，同様に有効な導入効率を得ることはできなかった．

STAT３は IL―６，leukemia inhibitory factor（LIF）

Gene gun を用いた方法では，組織への侵襲があまりに１などの IL―６ファミリーサイトカインによってや IL―１

強く，子宮内膜で有効な導入効率を得ることが困難であ活性化されることが知られている［１］．このうち，LIFると考えた．そこで，haemagglutinating virus of Japan

１レセプターα［３―４］の欠損マウス［２］および IL―１

（別名：センダイウイルス） envelope（HVJ―E） vec-

が着床不全を起こしたことから，これらが着床現象におtor を用いたシステムの開発を行った．

いて重要な役割を果たしていると考えられてきた．STAT
３はマウスおよびラットの着床期子宮内膜においてその

１．HVJ―E vector system，STAT３の欠損マウスが活性が報告されたが［５―６］

HVJ は別名，センダイウイルスともいわれ，マウス

胎生致死を示したために［７］，STAT３の着床期子宮内パラインフルエンザウイルスであり，RNA ウイルスで膜における機能は不明であった．本稿では，着床期子宮ある．その膜に存在する HN および F 蛋白により強い内膜における STAT３の機能を検討するためにマウス一細胞融合能をもっている．HVJ―E

過性子宮局所における遺伝子導入方法を用いた検討を中は，ウイルス自身の genomic RNA を不活化し除去，精心に着床期子宮内膜における STAT３活性の役割とその製してそこへプラスミド DNA だけでなく短い２本鎖オ意義についての知見を概説したい．

リゴヌクレオチド，siRNA，蛋白，低分子の薬剤などを

vector の概念として

外殻内に封入し遺伝子導入ベクターとして用いることが連絡先：中村仁美，大阪大学大学院医学系研究科産婦人科
〒５
６
５―０
８
７
１大阪府吹田市山田丘２―２
Tel：０
６―６
８
７
９―３
３
５
６
Fax：０
６―６
８
７
９―３
３
５
９
E-mail : hitomi@gyne.med.osaka-u.ac.jp

できる［９］．生体内子宮に対する遺伝子導入においては，リ ポ フ ェ ク シ ョ ン に 比 べ，１２０倍 以 上 の，HVJ―
liposome 法に比べ，７倍以上の高い遺伝子導入効率が得られ［９］，また子宮に対してこの導入遺伝子の発現

日本生殖内分泌学会雑誌（2009）14 : 35-40

35

中村仁美

他

*

a

b

14

No. of implantation sites

12
10
8
6
4

c

d

Primitive somite
Mouse developmental
stage XII

Fetus (-)
Decidualization (-)

20

Scrambledecoy/ HVJ-E

STAT-3decoy/ HVJ-E

Scramble decoy/ HVJ-E

Stat-3 decoy/ HVJ-E（文献１
３より引用改変）

図２

STAT３ decoy 導入による影響（着床期終了後―交配後８．
０日目）
Hematoxylin and eosin 染色を行った，交配後８．
０日目の子宮．
Scale bars : a：１mm, b：５００μm, c：２５０μm and d：１００μm（文献１３より引用改変）
図１

STAT３ decoy 導入による着床の阻害
STAT３ decoy またはコントロールとして scramble decoy を交
配後１．
５日目に導入し，交配後５．
０日目に尾静脈より Evans blue
を静注し，implantation site を観察した．Scramble decoy 導入群
では卵巣を除去しているが，STAT３ decoy 群ではすべての子宮の両端に青色に染まった卵巣が観察できる．
＊P＜０．
０
１ by Mann-Whitney's U-test.
STAT３ decoy 導入群では子宮において着床部位が認められなかったものの，子宮内腔からは正常に発育する胚が確認された．

配後５．
０日目）の子宮において有意に着床が阻害されていることが確認された（図１）．遺伝子導入により，胚の発育が阻害されることによって着床が阻害されたのであろうか？

しかしながら，交配後４．
０日目の STAT３

decoy 導入群子宮腔内より正常に発育した胚が確認された（図１）．また通常，着床が既に終了した交配後８．
０日目において，コントロールとして scramble

decoy を導入した群においては正常な胎仔発育が確認された一方が一過性であることを確認した［１０］．導入遺伝子は胎で，STAT３

児に移行せず，この遺伝子導入が妊娠に影響を与えないた着床現象において子宮側に不可欠な過程である脱落膜［１０］．さらにこのシステムは着床期だけでなく，妊娠中化も認められなかった（図２）．STAT３欠損マウスは胎期から後期マウス子宮にも妊娠を阻害することなく，遺生致死を示した［７］ために，今回の実験系において胚２］．
伝子導入を行うこともできることも確認した［１１―１の STAT３活性を抑制したわけではないことを証明する

この方法を用いて，着床期子宮局所における STAT―３

ために，STAT３の dominant negative である mSTAT３の機能を検討するために，生体内でその活性を抑制でき

Y７
０
５F の強制発現 plasmid DNA を HVJ―E vector を用

decoy 導入群では胎仔成分を認めず，まdecoy を設計［１３］，いて同様に遺伝子導入を行い，decoy と同様に着床不全導入し，マウス着床期子宮における STAT―３活性を抑が認められること，交配後４．
０日目に子宮腔内から採取

制した．

した胚に導入遺伝子が移行していないことを確認した

る２本鎖 DNA からなる STAT―３

２．STAT３ decoy の導入［１
３］．
STAT３活性の抑制により，脱落膜化が抑制され，そSTAT３ decoy の導入により，着床期子宮において約れにより着床不全が起こったのではないかと仮定し，実５０％の STAT３活性が抑制され，これにより，着床期（交験的な脱落膜化を誘導し，STAT３ decoy 導入による影

36

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

着床期子宮局所における STAT―３活性の役割

a

b

c

d

A

b

Scramble decoy/ HVJ-E

B

e

a

f

Progesterone concentration ( ng / ml )A

STAT-3 decoy/ HVJ-E

16
14
12
10
8
6
4
2
0
Scramble decoy/ HVJ-E

B

Fold increases in uterine weight (%)

Scramble decoy/ HVJ-E

STAT-3 decoy/ HVJ-E*

900

Vehicle(HTF)

Scrambledecoy/ HVJ-E

STAT-3decoy/ HVJ-E

PR-A
G3PDH

800

（文献１
３より引用改変）

700
図４

600
500
400
300
200
100
0
Scramble decoy/ HVJ-E

STAT-3 decoy/ HVJ-E（文献１
３より引用改変）

図３

C

STAT-3 decoy/ HVJ-E

Experimentally induced decidualization.
A：脱落膜化を誘導して７２時間後の組織学的検討を行った．Scramble decoy の導入を行った（a，c，e）では特徴的な脱落膜化が観察されるのに対して，STAT３decoy の導入を行った（b，d，f）では脱落膜化現象の組織学的特徴が明らかに抑制されている．Scale bars : a, b：５００μm, c, d：１００μm and e, f：
５０μm.
B：脱落膜化の誘導による子宮重量の変化を検討した．All bars
represent the mean ＋ S.E.M. from at least ５ animals.
＊ : p＝０．
００２．

卵巣機能の検討
A：交配後５．
０日目の卵巣組織に関して，組織学的に検討を行ったが，STAT３ decoy 導入群と scramble decoy 導入群で，差が認められなかった．
B：交配後５．
０日目の血中プロゲステロンレベルを測定したが，両群間で差を認めなかった．Bars represent the mean ＋ S.E.
M. from at least ５ animals.
C：交配後５．
０日目子宮における progesterone receptor（PR）−
A mRNA の発現について semi-quantitative RT―PCR にて検討を行った．
導入時の溶媒として用いた Human Tubal Fluid（HTF）medium のみ導入した群，HVJ―E vector にて scramble
decoy 導入群，
STAT３ decoy導入群において差を認めなかった．

とが知られているが，脱落膜化が抑制された STAT３ decoy 導入群において血中プロゲステロンレベルは正常であり，また卵巣の組織学的検討および子宮局所における
プロゲステロンレセプター A の mRNA 発現もコントロール群と差が認められなかった（図４）．したがって，響を検討した．Rider らの方法により［１
４］
，精管結紮

STAT―３ decoy の導入により STAT―３活性が約５０％抑雄マウスと交配後３．
５日目の偽妊娠マウス子宮腔内に制され，プロゲステロン非依存的に脱落膜化の抑制によsesame oil を投与し物理的な脱落膜化を誘導した．STAT

る着床不全を認めたと考えられる［１３］．これが着床不３ decoy 導入群では明らかに脱落膜化の誘導が抑制さ全を疑う原因不明のヒト不妊症の状態を再現しているかれた（図３）．

否かを検討する目的で，ヒト不妊症例において以下の検脱落膜化にはプロゲステロンの作用が不可欠であるこ討を行った．

研究フロンティア

37

中村仁美

他

表１

Serum P level (ng/ml)

40
30
20

0

endometrial thickness (mm)

-4

-3

-2
day of gap

-1

0

16

12

３
７
３
９
２
９
３
３
４
１
４
３
２
３
４
４

POD＋５
POD＋５
POD＋６
POD＋４
POD＋４
POD＋６
POD＋６
OPU＋４

＋４−５
＋３−４
＋３−４
＋２−３
＋２−３
＋２−３
＋３−４
＋３−４

P

EM

６．
２
１
０
７．
２ ９．
８
１
５．
０
１
０
１
２．
３ １
２．
５
９．
８
７
６．
７
７
１．
０
１
０
１
６
０．
０

ST３ YP―ST３
＋
＋
＋
＋
−
−
−
−

＋
＋
＋
＋
−
−
−
−

History
AIHx２
IVFx１
hMG−hCG
IVFx１
IVFx４
AIHx７, IVFx２
AIHx２
ICSIx８8ない症例があまりに多い．実際に内膜の厚さによってグ-5

endometrial thickness (mm)En- dometri
al dating（POD）

POD : post ovulation day, OPU : the day of oocyte pick up, P : serum progesterone levels（ng/ml）on the day of biopsy, EM : Measurement of endometrial thickness（mm）just before endometrial biopsy, ST３：immunohistochemistry for STAT３, YS-ST３：immunohistochemistry for phosphorylated Tyr
７０
５ STAT３，IVF : In vitro Fertilization, AIH : Artificial insemination-husband,
ICSI : intra-cytoplasmic sperm injection, hMG : human menopausal gonadotropin, hCG : human chorionic gonadotropin.

20

4
-4

-3
-2
days of gap-1

ループに分けて，それぞれのグループにおける妊娠率を0比較したときに，子宮内膜の厚さが６mm 未満では８20mm 以上のときと比べて妊娠率が有意に低いという報告がある［１６］．しかし一方で，妊娠した群と妊娠に至ら16なかった群との比較では内膜の厚さに有意差がないとい
８］．IVF 周期において採卵日から＋う報告もある［１７―１

12１
２日目（胚移植から１０日目）におけるプロゲステロンレ
8

ベルは妊娠した群では有意に高値を示したが，それ以前
では両群間に差がないという報告がある［１
６，１
８］
．内

4
0

図５

Biopsy

１
２
３
４
５
６
７
８

10

-5

No. Age10
20
Serum P level (ng/ml)

3040

ヒトにおける血中プロゲステロンレベル，超音波下における内膜の厚さ，日付内膜診の検討
黄体期中期にインフォームドコンセントを得たうえで，日付内膜診を行った．子宮内膜の採取の直前に採血と超音波下における子宮内膜の厚さを測定した．３つのパラメーター間に相関を認めなかった．

膜日付診検体の採取は子宮内膜を鋭利な器具で擦過するため，侵襲が大きくルーチンで行うことが困難であるのに加え，実際にはその意義と臨床における効果について
未だ結論が出ていない．われわれは，これら３つのパラメーターについて，改めて検討を行った．インフォーム
ドコンセントを得たうえで内膜日付診検体は黄体期中期に採取し，採取する直前に超音波下に内膜の厚さを測定，採取日に血中プロゲステロン値を測定した．内膜日付診による組織学的な検討による日数と実際の日数のギャッ

ヒト着床不全プ，血中プロゲステロン値，子宮内膜の厚さの３つのパラメーターと妊娠の帰結について検討を行った（図５）．

ヒトの着床不全はホルモン環境と子宮内膜の形態およ

この３つのパラメーター間に相関性を認めず，それぞれ

び機能の不一致により引き起こされると考えられていると妊娠の帰結とも相関を認めなかった．われわれの予備［１５］．そして，子宮内膜の着床能を評価するために，（１）

実験として，妊娠に至った４症例と至らなかった４症例

血中プロゲステロンレベル，（２）超音波下における子について，前述の３つのパラメーターに加え，STAT３

宮内膜の厚さ，（３）子宮内膜を採取して組織学的に検活性を検討するために，STAT３およびリン酸化 STAT

討した内膜日付診により検討されてきた経緯がある．し

３の免疫染色を行った（表１）．内膜日付診，血中プロかしながら，（１）血中プロゲステロンレベル，（２）超ゲステロン値および超音波下における内膜の厚さについ

音波下における子宮内膜の厚さ，のこの２つのパラメーて，両群間に差を認めなかった．しかしながら，妊娠にターにおいて問題がないのにもかかわらず，妊娠に至ら至った症例では，子宮内膜において STAT３およびリン38

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

着床期子宮局所における STAT―３活性の役割

酸化 STAT３の染色性を認めたが，着床不全によって妊依存的に着床不全を再現することができた．その点にお娠に至らなかったと考えられた症例においては STAT３

いて，このマウスモデルは遺伝子欠損マウスなどのようおよびリン酸化 STAT３の染色性が認められなかった．

に完全にその標的遺伝子の発現を抑制しているモデルに

内膜日付診，プロゲステロンレベルおよび超音波下にお比べて，より臨床の状態を反映しているのではないかとける内膜の厚さ，これら３つのパラメーターにおいて，
１考えられる．今回の検討において，交配後４．
０日目のつでも問題がある（内膜日付診で２日以上の差がある，

STAT３ decoy 導入群で子宮腔内をフラッシュアウトすプロゲステロンレベルが８ng/ml 以下，超音波下におけることにより，正常に発育した胚を観察することができる内膜の厚さが６mm 以下）症例では STAT―３および

たが，一方で，コントロールとして scramble

リン酸化 STAT３の染色性が認められず，妊娠に至らな導入した群では胚を回収することがほとんどできなかっdecoy をかった．これら結果より STAT―３が着床不全の診断おた．このことから，STAT３活性は着床現象において脱よび治療の分子標的と成り得ることが示唆された．

落膜化だけではなく，胚の接着にも関与しているかもしれない．今後，プロゲステロンと STAT３の関係性をさおわりにらに検討していくことで着床不全の病態の解明に繋がればと期待する．

遺伝子欠損マウスの検討から LIF［２］および IL―１
１
［３―４］が着床現象に重要な役割を果たしていると考え謝辞られてきた．ヒトにおける検討で，黄体期中期から後期

本稿は２
０
０
８年度第１
３回日本生殖内分泌学会学術講演会で学術奨励賞を受賞した発表についてまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えてくださった日本生殖内分泌学会理事長
峯岸 敬教授，第１３回大会長の寺川直樹名誉教授および広報担当理事の筒井和義教授に御礼申し上げます．本研究を遂行するにあたり，ご指導，ご協力いただいたすべての皆様に感謝いたします．
HVJ―E vector については大阪大学遺伝子治療学金田安史

におけるヒト子宮腔内の flusing 液中の LIF 発現が不妊
７］．しか症で減少していることが報告されている［１６―１
しながら，ヒト着床期子宮における LIF 発現の免疫染色法による検討，および mRNA の発現について，着床不全を疑う不妊症と妊孕性の確認されている女性では差
０］
．IL―１
１について
がなかったという報告もある［１８―２は，免疫染色方法による検討において，不妊症で黄体期１発現が減少してい
中期の子宮内膜腺上皮における IL―１
ることが報告されている［２１］．しかしながら，マウス
子宮における LIF の発現ピークがちょうど着床期の直１発現のピークは交配後５．
５日前にあるのに対して，IL―１目から７．
５日目である［４］．これら IL―６サイトカイン
ファミリーは，gp１
３０を介しており，不妊症患者の黄体期中期の子宮内膜では免疫組織染色の検討において，
３０発現が減
LIF および IL―６発現に差はないものの gp１
少しているという報告もある［１８］．今後，着床不全の教授のご指導，および遺伝子治療学教室の多くの先生方にご助力いただきました．マウス脱落膜化の誘導には Virginia
Rider 教授（Pittsburg Uni）
，マウス子宮の組織学的な検討には木曾康郎教授（山口大学農学部獣医学科），今川和彦准教授（東京大学農学部）にご指導いただきました．mouse STAT
３の dominant negative である mSTATY７
０
５F の強制発現プ
ラスミド DNA は独立行政法人 理化学研究所バイオリソー
スセンターを通して，審良静男教授（大阪大学微生物病研究所）が御樹立されたものを使用させていただきました．HVJ―E vecor は現在 GenomONE―NEOÑとして石原産業より商品化されており，本研究においては石原産業のご好意によりご提供いただいたものを使用させていただきました．

病態の解明には，さらなる，これら物質の基盤とホルモン環境の関係の解明が求められている．

引用文献

不妊症の患者が治療の休止期に自然に妊娠されることは少なくない．このことから，着床不全を疑う多くの不妊症患者では，結果的に妊娠に至らず，不妊の状態ではあるが，これが遺伝子欠損マウスのような不可逆的な状
況というよりも，
多くの場合は，
たとえばその周期において一時的になんらかの発現低下もしくは発現が過剰というような，何らかの理由で一時的にそのバランスが適当ではない，
一過性の可逆的な状況ではないかと思われる．
今回のマウスモデルでは，子宮局所で着床期一過性に５０％の STAT３活性を抑制するだけでプロゲステロン非

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