REVIEW

ラットの精子形成を誘導する in vitro 精巣組織培養系の開発
松村 貴史，小川 毅彦
横浜市立大学大学院医学研究科臓器再生医学替物質（knockout serum replacement；KSR）のおかげはじめにである．
男性が生涯を通して精子を作り出すことができるの

その後，われわれは KSR の主成分であるウシアルブ

は，緻密に制御された精巣内環境と精細管内に存在するミン製剤（AlbuMAX）に，マウスの精子形成を体外で精子幹細胞の働きによる．精子幹細胞は自己複製を行い誘導するために必要な生理活性物質がすべて含まれていながら，減数分裂やダイナミックな構造変化を経て精子ることを見いだした．MEMαに ％（v/v）の KSR，もmg/ml の AlbuMAX を加えた培地を用いて，へと分化する．このような精子形成のメカニズムは，主

しくはに固定したサンプルとしての精巣の組織学的観察により未成熟なマウスの精巣をおよそ 日間培養することで円明らかにされてきた．近代では，CRISPR/Cas システ

形精子細胞や伸長精子細胞を誘導することができ，顕微ムなどのゲノム編集技術が発展し，さまざまな遺伝子改授精によって産仔を得ることに成功した ）．その後，酸変マウスを用いた実験から精子形成に重要な遺伝子の同素透過性の高いシリコーン樹脂（PDMS）製のマイクロ定も進められている．しかしながら，同様の手法でヒト流体デバイスや PDMS Ceiling（アガロースゲル上の組を含む非モデル動物の精子形成を調べることは難しい．

織にかぶせて平板的に培養することで，栄養と酸素をよまたヒトでは 日，マウスでは 日を超える生殖細胞分り一様に供給できる：PC）（図化の全過程を正確に理解するには，長時間にわたり特定可能期間の長期化や精子形成誘導効率の改善を行ってきの細胞の挙動を追える実験系が必要である．このようなた ，）．一方この培地・培養環境を基本として，複数の研観点に基づき，われわれは数週間，数カ月にわたって精究グループによる改良が続けられてはいるものの，マウ子形成を体外で観察することを目的とした精巣器官培養

ス以外の哺乳類の伸長精子までの精子形成や次世代作出法の開発に注力してきた．

は現在まで達成されていない．われわれは，さらなる培）の開発も行い，培養年ごろから始ま養環境の改良を目指すべく，AlbuMAX に含まれる精子

年代には液体培地に浸したアガロースゲル上で形成を誘導する物質の同定を進めてきた．本稿では，培の組織培養法が考案された．Steinberger 夫妻はビタミ

養液改良に関する試行錯誤，改良培養液とマイクロデバ

ン A/C/E，グルタミンを添加した培養液により精原細イスを用いた培養環境の改良，そして，それらによるラッ胞を減数分裂パキテン期の精母細胞まで分化させること

ト in vitro 精子形成の成果について概説する．

体外で精子形成を誘導する試みはり，に成功したが，精子形成は減数分裂を終えることはなく，精巣組織培養の限界だと考えられた ）．そのような状況

AlbuMAX の脂質解析を通した精子形成に重要な生で，理活性物質の同定

年にわれわれがマウスの未成熟精巣を培養し，未分化な精原細胞を伸長精子細胞まで分化させることに成功したのは，分化した生殖細胞が GFP 蛍光を発する

アルブミンは血漿タンパク質の中で最も量が多いタントランスジェニックマウス（Haspin-EGFP/Acr-EGFP マ

パク質であり，血液の浸透圧維持の他，脂肪酸やホルモウス）を用いた評価系と，最小必須培地（Minimum Es-ンといったさまざまな物質と結合して，体中へ運搬する

sential Medium α modified；MEMα）に加えた血清代等の機能がある．AlbuMAX は，その精製手法の詳細は公にはなっていないが，クロマトグラフィー法で精製さ連絡先：小川毅彦
横浜市立大学大学院医学研究科臓器再生医学〒 ―横浜市金沢区福浦 ―B （研究室）B （教授室）TEL ： ― ―（研究室）， ― ―（教授室）
FAX： ― ―E-mail：ogawa@yokohama-cu.ac.jp

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日本生殖内分泌学会雑誌（2021）26 : 4-8

れており，lipid-rich albumin とうたわれ多くの脂質を含んでいると想定される．血清からアルブミンを精製する手法としては，クロマトグラフィー精製法の他に，エタノール精製法，ヒートショック法がある．
ヒートショック法はエタノール精製に加熱処理を加えた簡便法であラットの精子形成を誘導する in vitro 精巣組織培養系の開発

ACB≈ 10 mm160 µm

図Ａ：PDMS 製のマイクロデバイス
Ｂ：Ａ内の点線囲み部分の拡大写真
Ｃ：組織は底面のアガロースゲルと天井の PDMS に挟まれたり，エタノールを用いる後者法が汎用されている．こm 高の空間で平板状に培養される．

未成熟ラット精巣の組織培養

れらのアルブミン製剤のなかで，未成熟なマウス精巣を培養して精子形成を誘導できるのはクロマトグラフィー

ラットはマウスと同様，生後すぐに未熟な前精原細胞精製アルブミンのみであり，なかでも AlbuMAX は優れが増殖を始め，精子幹細胞の出現や生殖細胞の分化を伴ていることが確認された．このことは，AlbuMAX にはい， ― 日で精子が出現する．ラットの精巣組織培養

精子形成誘導に重要なさまざまな因子が含まれているこの試みはと，そして，それらは主として脂溶性であることを示唆確立に成功した後，数報が発表されている．

年にわれわれがマウスの体外精子形成系のReda らは v/v％ KSR 添加 MEMαによりしているが，その実態は未解明であった．

年に

日齢のラッ

そこでわれわれは，基礎培地 MEMαにさまざまな候ト精巣を 日間培養し，わずかではあるが円形精子細胞補因子を添加した合成培地（化学組成が規定された培地）までの生殖細胞の分化を誘導したと報告した ）．しかしを作製し，精子形成誘導効果を培養実験で確認する作業

われわれを含めた，）グループによる研究では KSR 添加を繰り返した ．同時に AlbuMAX に含まれる物質を質培地によりパキテン期精母細胞の分化誘導に成功した報量分析によるオミックス解析手法で解析した．その結果，告はあるが，いずれのグループでも円形精子細胞の分化

AlbuMAX に含まれる主な脂質として，脂肪酸，リン脂は追試することができていない ― ）．KSR のロット差や質，スフィンゴミエリン，コレステロール，リゾフォス

培養液以外の微小環境の違いなど，精子形成に影響を及

ファチジルコリン（LPC）やリゾフォスファチジルセリ

ぼす因子はさまざま考えられるが，KSR 添加培地がラッン（LysoPS），リゾフォスファチジン酸（LPA）といっト精巣組織培養に最適ではないことは明白である．

たリゾリン脂質が同定され，これらが精子形成に重要なわれわれのグループでは，前項で同定した種類のホ脂質であることを見いだした．また，いくつかのホルモ

ルモン： Hs（テストステロン，T ，LH，FSH）とンやビタミンは精子形成に重要であることが，すでに知類の脂質抗酸化剤： As（ビタミン E，ビタミン C，グられている．テストステロン，LH，FSH に関しては，ルタチオン）を AlbuMAX と組み合わせ，ラット精子形

これまで多くの研究・報告がなされてきた．レチノイン成の誘導を試みている．この際，PDMS 製のマイクロ酸は，未分化な精原細胞が分化し減数分裂に入るためにデバイスの効果も検討した．減数分裂パキテン期以後の）種必要不可欠な因子であることが確立している ．またト生殖細胞で Venus 蛍光タンパク質を発現するトランスリヨードサイロニン（T ）はセルトリ細胞の成熟に必要ジェニックラット（Haspin-Venus ラット）を用いて，である ）．合成培地には，これらのホルモン・ビタミン生後を添加したが，なかでもレチノイン酸と T は必須であ―日の精巣組織を培養したところ，AlbuMAX につのホルモン類とつの脂質抗酸化剤を加えた培養液

り，T なしではセルトリ細胞はアンドロゲンレセプターと，PDMS 製のマイクロデバイスの使用を組み合わせ（AR）
タンパク質を発現せず，精子形成は誘導されなかったときにだけ Venus 陽性細胞が出現した．つまり，精た．培養液のメタボローム解析の結果から，脂質の抗酸子形成が減数分裂パキテン期以降にまで進んだことが明化剤であるビタミン E が FBS や他の精製アルブミンとらかとなった（図比べて AlbuMAX に多く含まれることが見いだされた．

全く誘導されず，一方 Hs のみの添加では Venus 陽性）． As のみの添加では精子形成はそこで前述の合成培地に，ビタミン E とその抗酸化作細胞は培養後用を助けるビタミン C やグルタチオンをともに添加しした．組織切片の観察では，培養たところ，精子形成は顕著に亢進することが確認された．

はパキテン期精母細胞が観察されるが，それ以前の分化〜週目まで増加するが，その後は減少
週後の Hs 添加群でREVIEW

5

松村貴史

他

20 mg/mL AlbuMAX
PC 160 µm

non-PCPC 160 µm

Venus

BF

non-PC

20 mg/mL AlbuMAX + 3As/4Hs

図

さまざまな培養条件で 週間培養した精巣組織中の Venus 発現，白矢頭は Venus 発現領域を示す．培地に Hs， As を添加しPDMS Ceiling（PC）を使用した群では Venus 発現領域が大きく増加した．スケールバー ． mm．

図

培養 週目の精巣組織の PAS 染色．左写真内の破線で囲まれた部分を右に拡大した．白矢頭は特徴的な三日月型の先体構造をもつ円形精子細胞．スケールバーm.
mg/mL AlbuMAX ＋ As/ Hs/LPC/LysoPS；PCm（ ―week）

段階にある生殖細胞はほとんど見られず，培養週後にるような生理活性物質が含まれている可能性がある．さは減数分裂期の生殖細胞はほぼ認められなかった． Hsらにリゾリン脂質の添加も Venus 細胞数を増加させた．と As の両方を添加した群では培養週後にもパキテン

とくに 週間前後の長期培養時には，LPC や LysoPS 添期精母細胞やそれ以前の分化段階にある生殖細胞が観察

加により Venus 陽性細胞は有意に増加した．このようされたことから， Hs には精子形成を進める働きがあるな培養環境の改善により，われわれはラットの円形精子のに対し， As には生殖細胞の生存を助ける働きがある細胞を安定的に分化誘導することに成功した ）（図）．ただし伸長精子細胞の誘導には至っておらず，顕と考えられる．
なお，培養液中の AlbuMAX 添加量がマウスで用いられる，微授精による産仔作出も今後の課題である．

mg/mL の条件下では Hs と As 添加による精子形成誘導効率の向上は認められず，それより少ない添加

他の哺乳類における精巣組織培養研究量の時にのみ観察された．この理由は定かではないが，培地中の脂質量が増えたことにより脂質抗酸化剤が不足

精巣組織培養法が完成すれば，ヒトにおける精子形成したか，AlbuMAX にラットの生殖細胞の分化を抑制すメカニズムの解明や不妊治療への応用などの有用な技術

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.26 2021

ラットの精子形成を誘導する in vitro 精巣組織培養系の開発‫ع‬ๅ͹๏๑••੠฾ࡋ๖

40 mg/mL AlbuMAX శՅകஏ10% KSRశՅകஏ

6ुؔക཈੠‫ࡋݬ‬๖ιϩφϨࡋ๖ԃ‫ܙ‬੠ࢢࡋ๖੠฾ࡋ๖
PDMS Ceiling (PC 160 µm)
րྒྷͪ͢๏๑ᶅ AlbuMAXశՅྖ͹௒੖ᶆ ϙϩϠϱྪʀࢹ࣯߇࢐Կࡐ͹శՅᶇ PDMS Ceiling (PC)͹࢘༽図

ラット精巣培養系の改良．培養液の改良と PC の使用により円形精子細胞までの分化を安定的に誘導可能になった．

基盤になることが期待されている．がん患者に対する抗なる培養液の最適化が必要である．詳細な分子メカニズ

がん剤や放射線による治療は精子形成を障害し，がん治

ムは未解明の部分もあるが，マウスの精子形成を体外で療から解放された後に不妊という問題が残る．日本では誘導する効果が見いだされてきたホルモン類，脂質抗酸

治療前の精子凍結が行われているが，精子形成が始まっ化剤やリゾリン脂質はラットの精巣培養系でも有効であていない思春期前の患者の妊孕性保存が問題となっていり，円形精子細胞までの分化を促進する効果を示した．

る．欧米では若年がん患者精巣組織の凍結保存が進んで年代に Steinburger 夫妻がラットの未分化な精原細おり，それらの一部を用いた研究も行われているが，胞からパキテン期までの減数分裂期生殖細胞を分化させDMEM や MEMαなどの基本培地に KSR や FBS を添加ることに成功してから，ようやくラット伸長精子細胞のした培地では，減数分裂期の精母細胞への分化誘導すら分化誘導まで後一歩のところに迫ってきた．今後もヒト困難な状況となっており，培養が進むにしたがった生殖を含めた広汎な哺乳動物の精巣培養系確立のための研究細胞数の減少が観察されている．LH や FSH を添加したが望まれる．

培養液も用いられているが，添加していない培養液と比べて大きな変化は見られていない ― ）．ヒト以外では，引用文献

ネコやマーモセットでも同様の結果が報告されており，
L―グルタミンやレチノイン酸，ビタミン A，ビタミン C,FSH，hCG，エストラジオールなどの添加も検討されているが，現状を打破するような違いを生み出す培養液の開発には至っていない ， ）．KSR の添加によりパキテン期までの生殖細胞の分化が誘導できる，げっ歯類とはまた違ったアプローチが必要であるように思われる．

終わりにマウスの精子形成は，AlbuMAX や KSR といった血清代替物を添加した培養液を用いると体外で誘導可能だ
が，他種の哺乳動物での体外精子形成系確立には，さら．Steinberger A（）Factors affecting spermatogenesis inorgan cultures of mammalian testes. J Reprod Fertil Supplement, ,- .
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松村

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