Instrucciones de uso

LymphoTrack® Dx TRG Assay – MiSeqTM
Para identificar y hacer un seguimiento de los reordenamientos del gen receptor gamma de linfocitos T (TRG) clonales
usando la secuenciación masiva (SNG) con Illumina® MiSeq.

Este ensayo se utiliza para diagnóstico in vitro.

Representación esquemática del locus del gen del TRG:

Condiciones de conservación: -85 °C a -65 °C(Los controles de ADN pueden separarse de los kits de ensayo y conservarse entre 2 C y 8 C)

N.º de catálogo
92270019
92270009

Productos
LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq
LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

Cantidad
8 índices, 5 reacciones cada uno
24 índices, 5 reacciones cada uno

Página 2 de 28Índice1.
2.

USO PREVISTO ............................................................................................................................................................................... 3
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA ............................................................................................................................................... 3
2.1.
2.2.

3.

PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO ........................................................................................................................................................ 4
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.

4.

Precauciones ................................................................................................................................................................................. 9
Sustancias que pueden interferir .................................................................................................................................................. 9
Requisitos y manipulación de las muestras ................................................................................................................................... 9
Almacenamiento de la muestra .................................................................................................................................................... 9

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO ............................................................................................................................................................10
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
7.11.
7.12.
7.13.

8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.

Termociclador................................................................................................................................................................................ 8
Soporte magnético ........................................................................................................................................................................ 8
Instrumento de PCR en tiempo real .............................................................................................................................................. 8
Instrumento Illumina MiSeq* ........................................................................................................................................................ 8

RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS........................................................................................................................................ 9
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.

7.

Componentes de los reactivos ...................................................................................................................................................... 6
Advertencias y precauciones ......................................................................................................................................................... 7
Almacenamiento y manipulación .................................................................................................................................................. 7

INSTRUMENTAL.............................................................................................................................................................................. 8
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.

6.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .................................................................................................................................. 4
Purificación de amplicones ............................................................................................................................................................ 4
Cuantificación de amplicones ........................................................................................................................................................ 4
Secuenciación masiva (SNG) .......................................................................................................................................................... 4
Multiplicación de amplicones ........................................................................................................................................................ 5

REACTIVOS ................................................................................................................................................................................... 6
4.1.
4.2.
4.3.

5.

Antecedentes ................................................................................................................................................................................ 3
Descripción general ....................................................................................................................................................................... 3

Materiales suministrados ............................................................................................................................................................ 10
Materiales necesarios (no suministrados) ................................................................................................................................... 10
Preparación de los reactivos ....................................................................................................................................................... 10
Amplificación ............................................................................................................................................................................... 11
Purificación con AMPure XP ........................................................................................................................................................ 11
Cuantificación de amplicones ...................................................................................................................................................... 13
Combinación y cuantificación de la genoteca ............................................................................................................................. 14
Dilución de la genoteca combinada............................................................................................................................................. 14
Configuración de qPCR para la cuantificación de genotecas ....................................................................................................... 14
Preparación de la genoteca para la carrera de secuenciación de MiSeq .................................................................................... 14
Carga de la Flow Cell (Celda de flujo) de MiSeq .......................................................................................................................... 16
Configuración de la Sample Sheet (Hoja de muestras) de MiSeq ................................................................................................ 16
Inicio de la serie de MiSeq ........................................................................................................................................................... 17ANÁLISIS DE DATOS........................................................................................................................................................................17
VALORES PREVISTOS ......................................................................................................................................................................17
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO ...................................................................................................................................................18
INTERPRETACIÓN Y ELABORACIÓN DE INFORMES ....................................................................................................................................18
DATOS DE MUESTRA ......................................................................................................................................................................21
CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO ...................................................................................................................................................21GUÍA DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS .................................................................................................................................................22
SERVICIO TÉCNICO Y ATENCIÓN AL CLIENTE ...........................................................................................................................................23
REFERENCIAS ...............................................................................................................................................................................23SÍMBOLOS ...................................................................................................................................................................................23
AVISO LEGAL ................................................................................................................................................................................24
LYMPHOTRACK DX TRG ASSAY – MISEQ: GUÍA SINTÉTICA ......................................................................................................................25
ANEXO A: CREACIÓN DE UNA GENOTECA DE SECUENCIACIÓN CON VARIAS DIANAS SNG..................................................................................26

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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1. Uso previsto
El ensayo LymphoTrack Dx TRG para Illumina MiSeq es un producto de diagnóstico in vitro diseñado para la determinación
por secuenciación masiva (SNG) de la distribución de frecuencia de reordenamientos del gen TRG en pacientes con posible
neoplasia linfoproliferativa. Este ensayo ayuda a identificar neoplasias linfoproliferativas.

2. Resumen y explicación de la prueba
2.1.

Antecedentes
El receptor gamma de linfocitos T humanos (TRG, antes conocido como locus del gen TCRG) del cromosoma 7 (7q14),
está compuesto por 14 genes Vy (región variable) (grupos I, II, III y IV), 5 segmentos genéticos Jy (región de unión) y 2
genes Cy (región constante) repartidos entre 200 kilobases.
Las células linfoides son distintas del resto de células somáticas del organismo. Durante el desarrollo, los genes delreceptor de antígenos de las células linfoides se someten a un reordenamiento somático.1 Durante el desarrollo de
los linfocitos T, por ejemplo, los genes que codifican las moléculas de TRG se ensamblan a partir de múltiples
segmentos de genes polimórficos que se someten a reordenamiento y selección, lo que da lugar a combinaciones VγJγ únicas tanto en longitud como en secuencia. Dado que las leucemias y los linfomas se originan a partir de latransformación maligna de células linfoides individuales, las células leucémicas o linfómicas de una persona por lo
general comparten uno o más reordenamientos del gen del receptor de antígenos específicos de la célula o "clonal".
Por lo tanto, las pruebas de detección de reordenamientos clonales de TRG resultan útiles para estudiar neoplasias
de los linfocitos B y T.
Al principio, los reordenamientos clonales se identificaban mediante la técnica de restricción de fragmentos ehibridación por Southern blot (RF-SBH). Sin embargo, estas pruebas resultaban engorrosas y laboriosas, necesitaban
grandes cantidades de ADN y no eran adecuadas para el análisis de muchos de los locus de receptores de antígeno
menos diversos.
A lo largo de las últimas décadas, la técnica de RF-SBH se ha visto reemplazada por la prueba de clonalidad mediante
PCR, que desarrolló Alexander Morley2 y que se considera el método de referencia en la actualidad. Estos ensayos
identifican la clonalidad mediante la sobrerrepresentación de productos V-D-J amplificados (o D-J incompletos)
después de su separación y a través de electroforesis capilar o en gel. A pesar de su sensibilidad e idoneidad para
probar pequeñas cantidades de ADN, estos ensayos no distinguen con facilidad entre poblaciones clonales yreordenamientos múltiples bajo un pico único, ni se han diseñado para identificar la secuencia de ADN V-J específica,
necesaria para hacer un seguimiento de poblaciones clonales en análisis posteriores. Esta segunda limitación puede
revestir cierta importancia, pues una vez identificada la secuencia de ADN clonal específica, esta puede usarse en
pruebas posteriores para hacer un seguimiento de dichas poblaciones celulares clonales.

2.2.

Descripción general
LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq representa una mejora significativa con respecto a los ensayos de clonalidad
existentes que usan análisis de fragmentos, ya que detecta los reordenamientos del gen TRG a través de una única
mezcla maestra múltiple e identifica la secuencia de ADN específica para cada reordenamiento del gen clonal. Este
ensayo ofrece, de este modo, dos usos importantes y complementarios: ayuda a detectar poblaciones clonales
iniciales e identifica la información secuencial necesaria para hacer un seguimiento de dichos clones en muestras
posteriores.
Las mezclas maestras multiplicadas para TRG se dirigen a las zonas de preservación de las regiones Vγ y Jγ descritas
en las neoplasias linfoides. Los cebadores incluidos en las mezclas maestras se han diseñado con adaptadores deIllumina y hasta 24 índices distintos. Este método posibilita la ejecución de la PCR de un solo paso y el agrupamientode amplicones de distintas muestras y dianas (generados a partir de otros ensayos LymphoTrack Dx para elinstrumento Illumina MiSeq que se venden por separado) en una única celda de flujo de MiSeq, lo que permite
analizar en paralelo hasta 24 muestras por diana en una sola serie.
El LymphoTrack Dx Software – MiSeq asociado ofrece un método simple y optimizado para el análisis y visualizaciónde datos. Si se siguen las pautas que figuran en el apartado 11: Interpretación y elaboración de informes, los resultados
de la muestra resumidos en el software pueden interpretarse fácilmente en cuanto a la presencia o ausencia declonalidad.

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Los resultados de las pruebas de clonalidad molecular siempre deben interpretarse en el contexto de los datos
clínicos, histológicos e inmunofenotípicos disponibles.
El kit incluye controles positivo y negativo de clonalidad.
Nota: Para obtener una explicación más detallada del locus y la estrategia de secuenciación dirigida, consulte Miller, J. E., 2013.3

3. Principios del procedimiento
3.1.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las pruebas basadas en la PCR se usan de forma habitual para identificar poblaciones clonales de linfocitos B y T.
Estos ensayos amplifican el ADN entre cebadores dirigidos a las regiones conservadas V y J de los genes del receptor
de antígenos. Los cebadores se dirigen a regiones conservadas que se encuentran a ambos lados de la zona en la quese producen los reordenamientos genéticos programados durante la maduración de los linfocitos B y T. Comoconsecuencia de estos reordenamientos genéticos, se producen diferentes poblaciones de linfocitos B y T.
Los genes del receptor de antígenos que se someten a reordenamiento son cadenas pesadas de la inmunoglobulina(IGH), locus de cadenas ligeras (IGK e IGL) en linfocitos B y locus de los genes del receptor de linfocitos T (TRA, TRB,TRG y TRD) en linfocitos T. Cada linfocito B y T presenta uno o dos reordenamientos V-J productivos, que son únicos
en longitud y secuencia. Por lo tanto, cuando se amplifica el ADN de una población normal o policlonal con cebadoresde ADN que flanquean la región V-J, se generan amplicones únicos tanto en secuencia como en longitud, lo que
refleja una población heterogénea. En caso de ausencia de ADN de los linfocitos, no se generan amplicones. Las
muestras que contienen poblaciones clonales de TRG generan uno o dos productos amplificados prominentes de lamisma longitud y secuencia que los que se detectan con una frecuencia significativa en un fondo policlonaldisminuido.

3.2.

Purificación de amplicones
Los amplicones derivados de la PCR se purifican por purificación de alto rendimiento mediante microesferas
paramagnéticas de inmovilización reversible de la fase sólida (SPRI), que eliminan el exceso de cebadores,
nucleótidos, sales y enzimas. Los productos derivados de la PCR con un mínimo de 100 pb se fijan selectivamente alas microesferas paramagnéticas mediante una solución tampón optimizada, mientras que los contaminantes —exceso de cebadores, dímeros de primers, sales y dNTP no incorporados— se eliminan por lavado. A continuación, losamplicones se eluyen y separan de las microesferas paramagnéticas, lo que da lugar a un producto de la PCR más
purificado para el análisis posterior y la cuantificación de amplicones.

3.3.

Cuantificación de amplicones
Los amplicones purificados se cuantifican utilizando los kits Library Quantification (Cuantificación de genotecas)
KAPA™ para plataformas Illumina. Los amplicones de la PCR purificados y diluidos, y un conjunto de seis patrones de
ADN previamente diluidos, se amplifican mediante métodos cuantitativos (qPCR), utilizando la mezcla maestra y loscebadores de qPCR SYBR® FAST de KAPA. Los cebadores del kit KAPA se dirigen a las secuencias de oligonucleótidos
de los adaptadores de las celdas de flujo P5 y P7 de Illumina.
La puntuación Ct promedio para los patrones de ADN previamente diluidos se traza frente a log10 para generar una
curva estándar, que luego se puede usar para calcular la concentración (pM) de amplicones de PCR obtenidos del
ADN de la muestra. El cálculo de la concentración de amplicones de PCR posibilita una representación igual de losamplicones en la genoteca combinada final que se carga en MiSeq para la secuenciación.

3.4.

Secuenciación masiva (SNG)
Los métodos de secuenciación de Sanger son los más habituales en las tecnologías de secuenciación de ácido nucleicode "primera generación". Los métodos más novedosos, que se valen de enfoques de secuenciación masiva en
paralelo, se conocen como SNG. Estas tecnologías usan distintas estrategias de preparación, secuenciación,
obtención de imágenes y bioinformática para la alineación y el ensamblaje del genoma.
Las tecnologías de SNG empleadas en este ensayo se basan en la amplificación de secuencias genéticas que utilizan
una serie de cebadores directos e inversos con etiquetas de índice y de adaptador. Los amplicones generados con las
mezclas maestras de LymphoTrack Dx se cuantifican, agrupan y cargan en una celda de flujo para secuenciarlos con
una plataforma de secuenciación Illumina MiSeq. En concreto, los productos amplificados de la genoteca se hibridan
con oligonucleótidos en una celda de flujo y se amplifican para formar colonias clonales locales (amplificación

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puente). Se añaden cuatro tipos de bases de terminador reversible (bases TR) y la cadena de ADN de la secuenciación
se amplía un nucleótido cada vez. Para registrar la incorporación de nucleótidos, una cámara CCD toma una imagen
de la luz emitida al agregar cada base TR y, a continuación, se escinde para poder incorporar la base siguiente.

3.5.

Multiplicación de amplicones
Este ensayo se diseñó para permitir dos niveles de multiplicación distintos, con el fin de reducir costes y ahorrar
tiempo a los laboratorios. El primer nivel de multiplicación proviene de los diversos índices que se suministran con losensayos. Cada uno de estos 24 índices actúa como un código de barras exclusivo que permite agrupar los ampliconesde muestras individuales después de la amplificación mediante PCR para generar la genoteca de secuenciación; lassecuencias resultantes se clasifican mediante un software de bioinformática que identifica las que se han originado apartir de una muestra individual.
El segundo nivel de multiplicación proviene de la capacidad del software para ordenar los datos de secuenciación poríndice y diana. Esto permite que los amplicones generados con cebadores específicos (incluso aquellos marcados con
el mismo índice) se agrupen para generar la genoteca que se secuenciará en una celda de flujo individual. Un ejemplo
sería secuenciar conjuntamente una combinación de productos de varios kits de ensayo Invivoscribe LymphoTrack Dxpara MiSeq, como IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB y TRG. Es importante usar la bioquímica desecuenciación adecuada cuando se multiplican amplicones de diferentes dianas génicas. El número de ciclos desecuenciación debe ser suficiente como para secuenciar el amplicón de mayor tamaño de la multiplicación. Porejemplo, al multiplicar conjuntamente una combinación de amplicones de IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB y TRG,
utilice el kit de secuenciación MiSeq v2 (500 ciclos) para un máximo de 4 dianas o MiSeq v3 (600 ciclos) para un
máximo de 7 dianas. Al multiplicar cualquiera de estos amplicones juntos con IGHV Leader, utilice el kit desecuenciación MiSeq v3 (600 ciclos). Si multiplica conjuntamente solo amplicones IGH FR3 y TRG, ambos con un
tamaño de amplicón más corto, utilice el kit de secuenciación MiSeq v2 (300 o 500 ciclos) y ajuste la configuración delciclo en la hoja de muestras. Para obtener más instrucciones, consulte el Anexo A (apartado 20).
El número de muestras que se pueden multiplicar en una celda de flujo individual también depende de la celda deflujo utilizada. Las celdas de flujo estándar de Illumina (MiSeq v3) pueden generar 22-25 millones de lecturas. Para
determinar el número de lecturas por muestra, divida el número total de lecturas de la celda de flujo entre el número
de muestras que se van a multiplicar; el número de lecturas por cada muestra será suficiente para una interpretación
válida. Para obtener más información, consulte el apartado 11 Interpretación y elaboración de informes. Illumina
también fabrica otras celdas de flujo que utilizan la misma bioquímica de secuenciación, pero que generan menos
lecturas. Si se usan estas celdas de flujo alternativas, hay que tener en cuenta que un número menor de lecturas
totales significa menos profundidad por muestra, o que se pueden procesar menos muestras en la celda de flujo
para obtener la misma profundidad por muestra.

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4. Reactivos
4.1.

Componentes de los reactivos

Tabla 1. Kits disponibles

N.º de catálogo

Descripción

N.º de mezclas maestras indexadas

Reacciones totales

92270019

LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq

8 índices, 5 carreras de secuenciación cada uno

4092270009

LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

24 índices, 5 carreras de secuenciación cada uno

120

Tabla 2. Componentes del kit

Reactivo

Mezclas maestrasǂ

ADN de control
positivo

N.º deunidades de92270019

N.º deunidades de92270009

TRG MiSeq 01

1

1

TRG MiSeq 02

1

1

TRG MiSeq 03

1

1

TRG MiSeq 04

1

1

TRG MiSeq 05

1

1

TRG MiSeq 06

1

1

TRG MiSeq 07

1

1

TRG MiSeq 08

1

1

TRG MiSeq 09

01

TRG MiSeq 1001

TRG MiSeq 1101

TRG MiSeq 12

0

1

0

1

TRG MiSeq 14

01

TRG MiSeq 15

01

TRG MiSeq 1601

TRG MiSeq 18

01

TRG MiSeq 19

01

TRG MiSeq 20

01

TRG MiSeq 21

01

TRG MiSeq 22

01

TRG MiSeq 23

01

TRG MiSeq 25

01

TRG MiSeq 27

0

1

1

3

Componentes delreactivo

TRG MiSeq 13(

TRG POS (+)
42270019)

Cantidadpor unidad

225 µL

45 µL

Temperatura dealmacenamiento

Notas

N. P.

ADN de V11/J1/2 diluido
en ADN de amígdalao

ADN de control
negativo

SNG NEG (-)(
40920018)

45 µL

1

3

ADN de amígdala;la frecuencia secuencial más
alta puede variar entre lotes

Nota: En la fabricación de estos kits no se usan conservantes.
ǂNota: En estos kits no se usan los índices 17, 24 y 26.

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4.2.

Advertencias y precauciones
Lea atentamente las instrucciones de uso antes de comenzar el procedimiento de ensayo y siga cada paso
atentamente.
▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪

▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪
4.3.

Producto para uso diagnóstico in vitro.
Utilice este kit de ensayo como un conjunto. No utilice los reactivos de otros fabricantes. La dilución, la
reducción de las reacciones de amplificación o cualquier otra alteración del protocolo puede afectar al
rendimiento de la prueba y anular cualquier sublicencia limitada derivada de la adquisición de estos kits.
Los materiales son estables hasta la fecha de caducidad indicada si se almacenan y manipulan según las
instrucciones. No utilice los kits después de su fecha de caducidad.
El estricto cumplimiento del protocolo garantiza un rendimiento y una reproducibilidad óptimos. Asegúrese deusar los programas de termociclador correctos, ya que otros programas pueden generar datos imprecisos oerróneos, como falsos positivos y falsos negativos.
No mezcle ni combine reactivos de kits con diferentes números de lote.
Elimine los reactivos no utilizados y los residuos de acuerdo con las regulaciones nacionales, federales, estatales
y locales.
Utilice equipos de protección personal estándar (guantes, batas de laboratorio y gafas protectoras) para realizar
las tareas de laboratorio. Siga las prácticas óptimas de laboratorio y tome las precauciones necesarias cuando
trabaje con muestras. No pipetee con la boca. No coma, beba ni fume en las zonas de trabajo del laboratorio.
Lávese bien las manos después de manipular las muestras y los reactivos del kit de ensayo. Manipule lasmuestras en instalaciones aprobadas de contención de seguridad biológica y ábralas solo en campanas deseguridad biológica certificadas.
Utilice agua para uso en biología molecular al preparar el ADN de la muestra.
Dado que se trata de una prueba de gran sensibilidad analítica, debe ser extremadamente cauteloso para evitar
la contaminación de los reactivos o mezclas de amplificación con muestras, material de referencia o material
amplificado. Use puntas de pipeta nuevas y resistentes a aerosoles entre muestras y entre reactivos dedispensación. Todos los reactivos deben controlarse atentamente para detectar signos de contaminación (p. ej.,controles negativos que den señales positivas). Elimine cualquier reactivo que pueda haberse contaminado.
Para reducir al mínimo la posibilidad de contaminación, use guantes para manipular las muestras y los reactivos
y limpie las zonas de trabajo y las pipetas antes de configurar la PCR.
En el laboratorio de PCR, siga una secuencia de trabajo unidireccional entre las distintas zonas de trabajo:
comience con la preparación de mezclas maestras, continúe con la preparación de las muestras, luego con la
amplificación y finalmente con la detección. El autoclave no elimina la contaminación del ADN. No lleve ADN
amplificado a las zonas designadas para mezclas maestras o preparación de las muestras.
Las pipetas, puntas de pipetas y cualquier otro instrumento utilizado en una zona específica deben ser de uso
exclusivo de dicha zona.
Descontamine los elementos no desechables con lejía al 10 % y aclárelos con agua destilada dos veces por
separado antes de devolverlos a las zonas de inicio.
Siempre que sea posible, utilice material plástico estéril desechable para evitar la contaminación.

Almacenamiento y manipulación▪
▪
▪
▪

Si el ensayo no se va a utilizar de inmediato, almacénelo entre -85 °C y -65 °C.
La temperatura óptima de almacenamiento de los controles de ADN es entre 2 °C y 8 °C, pero el ADN también sepuede almacenar entre -85 °C y -65 °C.
Los reactivos y controles deben descongelarse y mezclarse en un agitador vortex antes de su uso para garantizar
una resuspensión completa.
Debido a las altas concentraciones de sal, las mezclas maestras de PCR son sensibles a los ciclos de congelación/
descongelación. Limite el número de ciclos a un máximo de cuatro.

Si tiene alguna duda, póngase en contacto con el personal técnico de Invivoscribe. Estaremos encantados de ayudarlea determinar sus necesidades óptimas de almacenamiento.

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5. Instrumental
Se recomiendan los instrumentos específicos indicados a continuación de acuerdo con los métodos utilizados para validar
este ensayo.
5.1.

Termociclador▪
▪
▪

Uso o función: amplificación de muestras de ADN
Instrumento recomendado: Thermal Cycler (Termociclador) Veriti™ Dx o equivalente
Características de rendimiento y especificaciones:
o
o

▪
▪
5.2.

Siga los procedimientos de instalación, uso, calibración y mantenimiento del fabricante.
Consulte el apartado 7.4. Amplificación para obtener información sobre el programa del termociclador.

Soporte magnético
▪
▪

Uso o función: purificación de productos para PCR
Instrumento recomendado:
o
o
o

▪

▪

A32782)12027)

Microesferas paramagnéticas de precipitado

Consulte el apartado 7.5 Purificación con AMPure XP para conocer los métodos de purificación de los productospara PCR.

Instrumento de PCR en tiempo real▪
▪
▪

Uso o función: cuantificación de productos para PCR purificados
Instrumento recomendado: Fast Dx Real-Time PCR (PCR en tiempo real Fast Dx) Applied Biosystems® 7500
o equivalente
Características de rendimiento y especificaciones:
o

▪
▪
5.4.

Magnetic Stand 96* (Soporte magnético 96) Ambion ® (AM10027)
96 Ring Super Magnet Plate* (Superplaca magnética con anillo 96) Agencourt SPRIPlate® (96 Side Skirted Magnet* (Imán con faldón lateral 96) Thermo Fisher Scientific DynaMag™ (Características de rendimiento y especificaciones:o

5.3.

Intervalo térmico mínimo: entre 15 °C y 96 °C
Velocidad mínima de rampa: 0,8 °C/s

Puede detectar la longitud de onda de SYBR Green

Siga los procedimientos de instalación, uso, calibración y mantenimiento del fabricante.
Consulte el apartado 7.6 Cuantificación de amplicones para obtener información sobre el programa de PCR entiempo real.

Instrumento Illumina MiSeq*▪
▪

Uso o función: genoteca de ADN normalizada por secuencia
Características de rendimiento y especificaciones:
o
o

▪
▪

Compatible con Reagent Kit v2* de MiSeq
Compatible con Reagent Kit v3* de MiSeq para la multiplicación

Siga los procedimientos de instalación, uso, calibración y mantenimiento del fabricante.
Consulte los apartados 7.11 Carga de la Flow Cell (Celda de flujo) de MiSeq, 7.12 Configuración de la Sample
Sheet (Hoja de muestras) de MiSeq y 7.13 Inicio de la serie de MiSeq para conocer los parámetros aplicables
a MiSeq.
*Advertencia: Estos productos no poseen el marcado CE.

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6. Recogida y preparación de las muestras
6.1.

Precauciones
Las muestras biológicas procedentes de seres humanos pueden contener materiales potencialmente infecciosos.
Manipule las muestras de acuerdo con el programa sobre patógenos de transmisión hemática de su centro y deacuerdo con un nivel de bioseguridad 2.

6.2.

Sustancias que pueden interferir
Se sabe que las siguientes sustancias interfieren con la PCR:
▪
▪
▪
▪

6.3.

Requisitos y manipulación de las muestras
▪
▪
▪

6.4.

Quelantes de cationes divalentes
Puntas de pipeta de baja retención
EDTA (no significativo en concentraciones bajas)
Heparina

La cantidad mínima empleada es de 50 ng de ADN de alta calidad (5 L de ADN de la muestra a una
concentración mínima de 10 ng/µL).
Este ensayo permite probar ADN genómico extraído y purificado. El ADN debe cuantificarse de acuerdo con unmétodo específico para ADN bicatenario (ADNbc) y debe estar exento de inhibidores de la PCR.
Resuspenda el ADN en una solución tampón como 0,1X TE (Tris-HCl 1 mm, EDTA 0,1 mm, pH 8,0, preparada con
agua para uso en biología molecular) o en agua para uso en biología molecular.

Almacenamiento de la muestra
El método de conservación de las muestras debe garantizar la ausencia de degradación del ADN.

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7. Procedimiento de ensayo
7.1.

Materiales suministrados
Consulte la Tabla 2 para saber qué materiales se suministran.

7.2.

Materiales necesarios (no suministrados)

Tabla 3. Materiales necesarios (no suministrados)

Reactivos/proveedores obligatorioso recomendables

Reactivo/material

ADN polimerasa

Roche:• DNA Polymerase EagleTaq™
oInvivoscribe:• DNA Polymerase FalconTaq
o equivalente

N.º de catálogo
05206944190
o

Notas

5 U/μL60970130

Agua para uso en biología
molecular

N. P.

N. P.

Exenta de DNasa y RNasa

Pipetas calibradas

N. P.

N. P.

Deben ser capaces de medir con
precisión volúmenes entre 0,2 μL y1000 μL

Placas o tubos para PCR

N. P.

N. P.

Exentas de inhibidores de DNasa, RNasa
y PCR

Puntas de pipeta con barrera
de filtro

N. P.

N. P.

Estériles y exentas de RNasa, DNasa
y pirógenos

Tubos de microcentrífuga

N. P.

N. P.

Estériles

Kit de purificación de PCR

Beckman Coulter, Inc:
• Agencourt AMPure XP

A63880N. P.

Purificación de PCR

Cuantificación de amplicones
y genotecas

Serie de MiSeq

Thermo Fisher Scientific:• Magnetic Stand 96 Ambiono• 96 Side Skirted Magnet DynaMagoBeckman Coulter:• 96 Ring Super Magnet Plate (Superplaca
magnética con anillo 96) Agencourt
SPRIPlateo equivalente
KAPA Biosystems:• Library Quantification Kit (Kit decuantificación de genotecas) KAPA – Illumina
Illumina:• Reagent v2 kit de MiSeq (300 ciclos)o• v2 kit (500 ciclos)o• v3 kit (600 ciclos) para la multiplicación•

Software de MiSeq
•

N. P.

A32782

KK4824MS-102-2002
oMS-102-2003
oMS-102-3003

N. P.

Celda de flujo estándar

Control Software (Software de control)de MiSeq v2.6 o posterior
Local Run Manager v2.0

N. P.

N. P.

N. P.

N. P.

Prepare una solución de Tris-HCl de
10 mM, pH 8,0 + Tween 20 al 0,05 %Solución tampón dedilución A

7.3.

AM10027o
12027
oPreparación de los reactivos
A fin de asegurarse de que las muestras de ADN no contengan inhibidores de la PCR y sean suficientes, tanto en
calidad como en cantidad, para generar un resultado válido, analícelas con Specimen Control Size Ladder Master Mix
de Invivoscribe (20960021 para detección por ABI o
20960020 para detección por gel). Specimen Control
Size Ladder tiene como diana numerosos genes y genera una serie de amplicones de 100, 200, 300, 400 y 600 ; eltamaño puede variar +/- 5 pb debido al estándar de tamaño y/o a las diferencias entre instrumentos. La verificaciónde la integridad del ADN es especialmente importante para muestras difíciles, p.ej., como los tejidos FFPE.

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Utilice siempre los controles positivo y negativo para garantizar que el análisis se realiza correctamente.
Configure siempre un control blanco (CB) para asegurarse de que no haya contaminación durante el proceso deconfiguración de la PCR.
7.3.1.
7.3.2.

Use guantes para sacar las mezclas maestras del congelador. Deje que los tubos se descongelen. A continuación,
mézclelos suavemente en el agitador vortex y centrifugue brevemente.
Encienda la campana de contención o cabina sin circulación de aire y pipetee 45 L de cada tubo de mezcla dereacción en una placa para PCR limpia (un pocillo por mezcla maestra y una mezcla maestra por muestra).
▪
▪

7.3.3.
7.3.4.

Incorpore dos controles a cada serie (uno positivo y uno negativo) y un CB.
Por lo que respecta al CB, utilice agua para uso en biología molecular en lugar de ADN.

Añada 0,2 L de ADN Taq polimerasa (5 U/L) a los pocillos con las alícuotas de las mezclas maestras.
Añada 5 L de ADN de la muestra (con una concentración mínima de 10 ng/L), ADN de control o agua para uso
en biología molecular (CB) a los pocillos individuales con las reacciones de mezcla maestra respectiva.
▪
▪

Pipetee arriba y abajo de 5 a 10 veces para mezclar.
Cierre la placa e introdúzcala en el termociclador de PCR.
Tabla 4. Configuración de la reacción

7.4.

Reactivo

VolumenMezcla maestra

45,0 μL

ADN Taq polimerasa

0,2 μLADN de muestra o control

5,0 μL

Volumen total

50,2 μL

Amplificación
7.4.1.

Amplifique las muestras mediante el programa de PCR de la Tabla 5.

Si está multiplicando varias dianas, consulte el Anexo A (apartado 20) para obtener más información sobre otras condiciones determociclado de LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.
Tabla 5. Programa de PCR

Paso

Temperatura

Tiempo

Ciclo

1

95 °C

7 minutos

1

2

95 °C

45 segundos

3

60 °C

45 segundos

4

72 °C

90 segundos

5

72 °C

10 minutos

1

6

15 C

∞

1

29x

Nota: Caliente la tapa a 105 °C y ajuste el volumen de reacción a 50 μL.

7.4.2.
7.5.

Cuando el programa de amplificación termine, extraiga la placa para PCR del termociclador. Si no va a continuar
con el proceso de inmediato, conserve los productos de la PCR a 4 °C durante 1 día.

Purificación con AMPure XP
La purificación de los productos de la PCR —derivados de las muestras y los controles positivos, negativos o en
blanco— se realizó durante la validación del ensayo mediante el sistema PCR Purification (Purificación por PCR)
Agencourt AMPure XP.

Preparación:
7.5.1.

Extraiga el reactivo AMPure XP del espacio de conservación y deje que se ajuste a la temperatura ambiente antes
de usarlo. Agite suavemente el frasco de Agencourt AMPure XP para resuspender las partículas magnéticas que
puedan haberse asentado.

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Consulte el Anexo A (apartado 20) para obtener más información sobre los volúmenes del reactivo AMPure XP usados en otros productos
de LymphoTrack Dx Assay – MiSeq PCR.

7.5.2.

Transfiera el volumen necesario del reactivo Agencourt AMPure XP para la placa a un tubo de 2 mL nuevo a finde reducir al mínimo el riesgo de contaminación por las puntas de pipeta.
▪

7.5.3.

Volumen necesario del reactivo Agencourt AMPure XP = n x 50 µL (siendo n el número de muestras que sedesean purificar).

Prepare una solución matriz (0,5 mL por cada muestra que se desee purificar) de etanol al 80 % y agua estéril.

Fijación de amplicones a partículas magnéticas:
7.5.4.

Añada 50 µL de alícuota del reactivo Agencourt AMPure XP a temperatura ambiente a cada muestra que desee
purificar.
▪
▪
▪

7.5.5.

Coloque las muestras mezcladas en el 96 Side Skirted Magnet (Imán con faldón lateral 96) DynaMag o el
Magnetic Stand-96 (Soporte magnético 96) Ambion e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos paraque las partículas magnéticas se separen de la solución.
▪

7.5.6.

Pipetee arriba y abajo 10 veces para mezclar.
El color debe ser homogéneo tras la mezcla.
Incube 10 minutos a temperatura ambiente.

Mantenga la placa en el soporte magnético en todo momento a lo largo del procedimiento hasta llegar al
paso 7.5.10.

Utilice una pipeta P200 (o una pipeta multicanal similar) ajustada en 95 μL para aspirar el sobrenadante aclarado
y deséchelo.
▪
▪

Utilice una pipeta P10 (o una pipeta multicanal similar) ajustada en 10 μL para eliminar el exceso desobrenadante.
No elimine las partículas magnéticas.

Lavado:7.5.7.

Sin retirar la placa del soporte magnético, añada 200 μL de etanol al 80 % a cada muestra. Incube durante
30 segundos a temperatura ambiente.
▪
▪
▪

7.5.8.
7.5.9.

Utilice una pipeta P200 (o una pipeta multicanal similar) ajustada en 195 μL para aspirar el etanol ydeséchelo.
Utilice una pipeta P10 (o una pipeta multicanal similar) ajustada en 10 μL para eliminar el exceso de etanol.
No elimine las partículas magnéticas.

Repita las instrucciones que figuran en el apartado 7.5.7 hasta completar dos lavados.
Asegúrese de no retirar la placa del soporte magnético y deje que las partículas magnéticas se sequen al airedurante 5 minutos.

Elución:7.5.10.

Retire la placa del soporte magnético. Añada 25 μL de la solución tampón de Tris-HCl, 10 mm, pH 8,0.
▪
▪

7.5.11.
7.5.12.
7.5.13.

Mezcle con la pipeta hasta obtener una mezcla homogénea.
Asegúrese de que todas las partículas magnéticas se encuentren en la solución.

Incube a temperatura ambiente durante 2 minutos.
Coloque la placa en el soporte magnético durante 5 minutos o hasta que el sobrenadante se haya aclarado.
Transfiera 22 μL del eluido a una placa nueva. Selle con cintas de tapa. Etiquete la placa y centrifugue
brevemente para asegurarse de que el sobrenadante se asiente completamente en el fondo del pocillo.
Conserve a -20 °C o proceda con el paso siguiente.
La imagen de gel de la Figura 1 ilustra la eficacia de una purificación normal (se muestran los amplicones antes
y después de la purificación).

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Figura 1: Ejemplo del resultado
de purificación de ampliconesde la mezcla maestra de TRG de
MiSeq. La imagen se generó tras
el procesamiento de productos
no purificados y purificados en
LabChip GX.

7.6.

Cuantificación de amplicones
Los siguientes pasos se realizaron durante la validación del ensayo para cuantificar los amplicones de PCR purificados
generados a partir de muestras, así como de controles positivos, negativos y blancos, con el Library Quantification Kit(Kit de cuantificación de genotecas) KAPA (KAPA Biosystems).
7.6.1.

Dilución de amplicones
La solución tampón A a la que se hace referencia a continuación es: Tris-HCl, 10 mM, pH 8,0 + Tween 20 al 0,05 %1:4000 Final:
Paso A:
2 μL de eluido de amplicón purificado + 198 μL de solución tampón A.
Pipetee arriba y abajo 10 veces para mezclar bien.
Paso B:
5 μL del paso A + 195 μL de solución tampón A.
Pipetee arriba y abajo 10 veces para mezclar bien.
7.6.2.

Prepare un análisis qPCR para la cuantificación de los amplicones siguiendo la Tabla 6 en cada reacción(consulte las instrucciones del kit de cuantificación de genotecas KAPA para obtener más detalles):Tabla 6. Preparación de qPCR

Reactivo

7.6.3.

VolumenAgua de calidad PCR

3,6 μL

Mezcla maestra SYBR FAST qPCR (qPCR rápida) KAPA con cebador Premix

12,0 μL

ROX

0,4 μL

Amplicones diluidos o patrón (1-6)

4,0 μL

Volumen total

20,0 μL

Siga la Tabla 7 para determinar el programa térmico de qPCR.
Tabla 7. Programa de qPCR

Paso

Temperatura

Tiempo

Ciclo

1

95 °C

5 minutos

1

2

7.6.4.

95 °C

30 segundos

60 °C

45 segundos (lectura de placa)

35x

Utilice los datos del análisis qPCR para comprobar la contaminación; para ello, calcule los valores de ΔCt entre
los controles (positivo y negativo) y el CB mediante la ecuación siguiente:
ΔCt = Ct (CB) – Ct (control)
Si ΔCt es ≥ 4,0 para ambos controles, continúe con el paso siguiente. Si ΔCt es < 4,0 para cualquiera de loscontroles, consulte el apartado 14 Guía de resolución de problemas para obtener más instrucciones.

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Si está multiplicando varias dianas, consulte el Anexo A (apartado 20) para obtener más información sobre el valor de ΔCt cualificado para
otros productos de PCR en LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.

7.6.5.

Utilice los datos del análisis qPCR para determinar la concentración de amplicones de cada muestra mediante laecuación siguiente:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐ó𝑛 (𝑛𝑀) =452 × 𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑝𝑟𝑜𝑚. (𝑝𝑀) 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑞𝑃𝐶𝑅
×4
A

452 representa la longitud media de fragmento (pb) del DNA Standard (Patrón de ADN) de KAPA Illumina.
A = longitud media de fragmento de los amplicones generados con el ensayo TRG = 300 pb (A = 300).
La longitud de la secuencia incluye nucleótidos adicionales necesarios para la secuenciación.
Nota:

7.7.

Si está multiplicando varias dianas, consulte el Anexo A (apartado 20) para conocer la longitud media de fragmento de los amplicones
generados en otro LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.

Combinación y cuantificación de la genoteca
La cantidad de ADN de la genoteca cargada en la celda de flujo de MiSeq es esencial para generar una densidad deconglomerados óptima y obtener datos de alta calidad en una carrera de secuenciación. Se recomienda
encarecidamente la cuantificación de la genoteca por qPCR.
7.7.1.

De acuerdo con la concentración de amplicones calculada a partir de los resultados de qPCR, añada la misma
cantidad de amplicones (a excepción del CB, que se puede excluir).
▪
▪

7.7.2.
7.8.

P.ej., diluya cada amplicón a 4 nM en un volumen total de 10 μL usando solución tampón A como
diluyente. Combine 10 μL de cada amplicón a 4 nM.
Para las muestras con una concentración < 4 nM, añada la cantidad máxima posible de muestra (10 μL) y
no añada solución tampón A a esa muestra.

Mezcle suavemente en el agitador vortex y centrifugue brevemente.

Dilución de la genoteca combinada
1:1000 Final:
Paso A:
2 μL de genoteca combinada + 198 μL de solución tampón A.
Pipetee arriba y abajo 10 veces para mezclar bien.
Paso B:
20 μL del paso A + 180 μL de solución tampón A.
Pipetee arriba y abajo 10 veces para mezclar bien.

7.9.

Configuración de qPCR para la cuantificación de genotecas
Consulte la configuración de qPCR en la Tabla 6 y el programa del termociclador en la Tabla 7.
7.9.1.

Determine la concentración de la genoteca combinada a partir de los resultados de qPCR.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐ó𝑛 𝑠𝑖𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑟 (𝑛𝑀) =452 × 𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑝𝑟𝑜𝑚. (𝑝𝑀) 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑞𝑃𝐶𝑅
A

452 representa la longitud media de fragmento (pb) del DNA Standard (Patrón de ADN) de KAPA Illumina.
A = longitud media de fragmento de los amplicones generados con el ensayo TRG = 300 pb (A = 300).
La longitud de la secuencia incluye nucleótidos adicionales necesarios para la secuenciación.
Nota:

7.10.

Si está multiplicando varias dianas, consulte el Anexo A (apartado 20) para conocer la longitud media de fragmento de los amplicones
generados en otro LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.

Preparación de la genoteca para la carrera de secuenciación de MiSeq
Al final de este apartado, la concentración de ADN de la genoteca será de 12 pM para el kit de reactivos MiSeq v2 yde 20 pM para el kit de reactivos MiSeq v3 al multiplicar. Para multiplicar amplicones de diferentes ensayos
LymphoTrack Dx para MiSeq en una sola genoteca, consulte el apartado 20, Anexo A: Creación de una genoteca desecuenciación con varias dianas SNG.

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7.10.1.

Determine la cantidad de genoteca que va a preparar en función de la concentración de la genoteca combinada
obtenida a partir de los resultados de qPCR y diluya si es necesario:▪
▪

7.10.2.

Si la genoteca es de más de 4 nM, diluya la genoteca a 4 nM en un volumen final de 10 μL usando lasolución tampón A.
Si la genoteca es de menos de 4 nM, use 10 μL de la genoteca directamente para el paso siguiente.

Siga estas instrucciones para desnaturalizar el ADN de la genoteca.
▪

▪

Prepare una solución de NaOH, 0,2 N. Para posibilitar la desnaturalización total del ADN de la muestra y
generar una densidad de conglomerados óptima en MiSeq, es fundamental usar una solución recién
preparada.
Agregue 10 μL de NaOH, 0,2 N a la genoteca diluida (10 μL) preparada en el paso anterior.
Tabla 8. Desnaturalización de la genoteca

Reactivo

7.10.3.

7.10.4.

VolumenGenoteca diluida

10 μL

NaOH, 0,2 N

10 μL

Volumen total

20 μL

Agite brevemente con el agitador vortex para mezclar la solución y, a continuación, centrifugue brevementepara asegurarse de que toda la solución se haya asentado en el fondo del tubo. Incube durante 5 minutos atemperatura ambiente para desnaturalizar la genoteca de ADNbc en ADN monocatenario (ADNmc).
Agregue 980 μL de buffer HT1 previamente enfriado (se incluye en los kits de reactivos de MiSeq) al tubo que
contiene el ADN de la genoteca desnaturalizada:
Tabla 9. Adición de buffer HT1

Reactivo

7.10.5.
7.10.6.
7.10.7.

VolumenGenoteca desnaturalizada

20 μL

Buffer HT1

980 μL

Volumen total

1000 μL

Agite con el agitador vortex brevemente para mezclar y, a continuación, centrifugue por pulsos la solución de
ADN de la genoteca diluida y desnaturalizada.
Coloque la genoteca diluida y desnaturalizada en hielo hasta el paso siguiente.
Saque la genoteca de ADNmc diluida del hielo y siga estas instrucciones para diluirla aún más como preparaciónpara su carga en MiSeq.

Si está multiplicando varias dianas, consulte el Anexo A (apartado 20) para conocer la concentración de carga y el kit de reactivos de MiSeq.
Para el Control Software (Software de control) de MiSeq (v2.6 o posterior):
La concentración de ADN de la genoteca debe ser de 12 pM para el kit de reactivos MiSeq v2.
La concentración de ADN de la genoteca debe ser de 12 pM a 20 pM para el kit de reactivos MiSeq v3 para la multiplicación.

▪

Si la concentración de la genoteca de ADNmc es de 40 pM (es decir, la concentración inicial era de 4 nM),
diluya hasta la concentración de carga en MiSeq deseada de acuerdo con los ejemplos siguientes:
Tabla 10. Preparación de la genoteca para la carga en MiSeq▪

▪

Concentraciones finales

12 pM

Genoteca desnaturalizada

300 μL

Buffer HT1

700 μL

Concentración final de NaOH (mM)

0,60 mM

Si la concentración de la genoteca de ADNmc diluida es inferior a 40 pM (la concentración inicial era
inferior a 4 nM), diluya el ADN desnaturalizado adecuadamente hasta la concentración de carga en MiSeq
deseada (p.ej., 12 pM).
Asegúrese de que la concentración final de NaOH no sea superior a 1,0 mM.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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7.10.8.
7.10.9.
7.11.

Invierta la genoteca final 5 veces para mezclarla y centrifugue por pulsos.
Coloque la genoteca final en hielo hasta el momento de cargarla en el Reagent Cartridge (Cartucho de reactivos)
de MiSeq.

Carga de la Flow Cell (Celda de flujo) de MiSeq
Cargue 600 µL de la genoteca final en un Reagent Cartridge (Cartucho de reactivos) de MiSeq.

7.12.

Configuración de la Sample Sheet (Hoja de muestras) de MiSeq
Consulte la documentación más reciente de Illumina para la creación de hojas de muestras. Cargue la hoja demuestras en el instrumento MiSeq. Si utiliza un software asociado a Illumina (por ejemplo, Local Run Manager (LRM)),
seleccione TruSeq Nano DNA (TruSeq ADN Nano) para el Library Prep Kit (kit de preparación de genotecas) y TruSeq DNA
Single Indexes Set A B (TruSeq ADN Conjunto de índices individuales A B) para el Index Kit (kit de índices).

Caracteres en el nombre de la muestra:•
Cree un nombre e identificador únicos al nombrar cada muestra . Si analiza muestras duplicadas, use nombres similares(p. ej., Muestra1a y Muestra1b).
•
Si no utiliza nombres exclusivos para las muestras secuenciadas en una misma celda de flujo, LymphoTrack Dx Software –MiSeq solo analizará una de las muestras en el proceso de análisis.
•
Utilice únicamente caracteres alfanuméricos y guiones (A-Z, a-z, 0-9, ., -,) al configurar la Sample Sheet (Hoja de muestras).
Nombre de la muestra al multiplicar:
Los índices solo pueden aparecer una vez en la Sample Sheet (Hoja de muestras). Por lo tanto, el campo Sample ID(ID de la muestra) —que figurará en el nombre de archivo FASTQ— debe abarcar todos aquellos datos necesarios para hacer unseguimiento de las muestras secuenciadas con dianas múltiples y un mismo índice.
Haga un seguimiento de todas las muestras y dianas de la misma serie de MiSeq que se hayan secuenciado utilizando el mismoíndice. A este conjunto de muestras/dianas se le debe asignar un identificador único en el campo Sample ID (ID de la muestra) de laSample Sheet (Hoja de muestras). Al elegir el nombre, tenga en cuenta que el Sample ID (ID de la muestra) tiene un límite estricto
de 40 caracteres.

Cuando se introduce información en el campo Sample Name (Nombre de la muestra) de la Sample Sheet (Hoja demuestras), la información se incorpora de manera predeterminada al nombre del archivo FASTQ en lugar del Sample
ID (ID de la muestra). Deje este campo en blanco o copie los datos que introdujo en el campo Sample ID (ID de la muestra).
Si introduce otra información en el campo Sample Name (Nombre de la muestra), asegúrese de incluir un identificador único
y cumplir las recomendaciones anteriores para poder hacer un seguimiento de las muestras.
¡Importante!

LymphoTrack Dx Software – MiSeq no reconoce las secuencias del adaptador.


Si utiliza un software asociado a Illumina, como Local Run Manager (LRM), debe seleccionar el ajuste deladaptador al crear la hoja de muestras.

)
Tabla 11. Índices de las mezclas maestras de LymphoTrack Dx AssaysÍndice de mezcla maestra de PCR de
LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Secuencia de índice

id01
id02
id03
id04
id05
id06
id07
id08
id09
id10
id11

ATCACGCGATGT
TTAGGCTGACCAACAGTGGCCAATCAGATC
ACTTGAGATCAGTAGCTT
GGCTAC

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

TruSeq DNA Single Indexes Set A B(TruSeq ADN Conjunto de índicesindividuales A B)
(LRM “Index Kit” [kit de índices])
AR001
AR002
AR003
AR004
AR005
AR006
AR007
AR008
AR009
AR010
AR011
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Tabla 11. Índices de las mezclas maestras de LymphoTrack Dx Assays

7.13.

Índice de mezcla maestra de PCR de
LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Secuencia de índice

id12
id13
id14
id15
id16
id18
id19
id20
id21
id22
id23
id25
id27

CTTGTAAGTCAAAGTTCCATGTCA
CCGTCCGTCCGCGTGAAAGTGGCCGTTTCGCGTACGGAGTGGACTGAT
ATTCCT

TruSeq DNA Single Indexes Set A B(TruSeq ADN Conjunto de índicesindividuales A B)
(LRM “Index Kit” [kit de índices])
AR012
AR013
AR014
AR015
AR016
AR018
AR019
AR020
AR021
AR022
AR023
AR025
AR027

Inicio de la serie de MiSeq
Inicie la serie de MiSeq siguiendo las instrucciones del Control Software (Software de control) de MiSeq. La Tabla 12
recoge los tiempos aproximados de las series de MiSeq.

Tabla 12. Tiempos de las series de MiSeq

Kit de reactivos de MiSeq

Longitud de lectura

Versión de MCS

Tiempo total de la serie de
MiSeq

2x151 pb

v2.6 o posterior~ 24 horas

2x251 pb

v2.6 o posterior~ 39 horas

2x301 pb

v2.6 o posterior~ 56 horasv2
v3

Nota: Si se usa un kit con menos ciclos, no será suficiente para generar las longitudes de lectura necesarias para este ensayo.

8. Análisis de datos
LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq se diseñó para producir datos de secuenciación que pudieran analizarse con el paquete
LymphoTrack Dx Software – MiSeq, el cual se proporciona en el CD (95000009) incluido con el ensayo. Dicho CD
incluye instrucciones detalladas de instalación y uso del software.

9. Valores previstos
Los valores que genera el software se redondean a la cifra decimal más cercana para determinar el resultado del ensayo.

▪
▪
▪

% de lecturas más comunes con control positivo en TRG ≥ 2,5 %% de lecturas más comunes con control negativo en SNG < 1,0 %Validez de la serie de MiSeqooo% Q30 > 80 % para v2 (2x151)% Q30 > 75 % para v2 (2x251)% Q30 > 70 % para v3 (2x301)

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Página 18 de 28*Nota:El Q30 de todas las validaciones analíticas cumple los criterios de la especificación Q30 de Illumina MiSeq indicados arriba.
No obstante, la puntuación Q30 puede variar en función de la calidad de la muestra. Si el Q30 está por debajo de laespecificación Q30 de Illumina, compruebe el valor Q30 del índice en el informe de LymphoTrack Dx después de analizar losdatos con LymphoTrack Dx Software – MiSeq. Si la puntuación Q30 de un índice en el informe de LymphoTrack Dx no satisface
la especificación de Illumina, considere el índice como no válido.
Los productos químicos de MiSeq v2 se han validado para este ensayo de una sola diana. Los productos químicos de MiSeq v3
se han validado para la multiplicación de ensayos.

10. Limitaciones del procedimiento▪
▪
▪
▪

Este ensayo no identifica el 100 % de las poblaciones de células clonales.
La mayor parte de las tecnologías, incluso la de secuenciación masiva, presentan un mayor nivel de varianza cuando sealcanza el límite de detección (LD) del propio método. Se sugiere realizar pruebas de seguimiento si un resultado se acerca
al LD analítico del ensayo.
Los ensayos basados en la PCR están sujetos a interferencia por degradación del ADN o inhibición de la amplificación de
PCR en caso de presencia de heparina u otros fármacos en la muestra analizada.
Los resultados de las pruebas de clonalidad molecular siempre deben interpretarse en el contexto de los datos clínicos,
histológicos e inmunofenotípicos disponibles.

11. Interpretación y elaboración de informes
El informe Merged Read Summary (Resumen de lecturas combinadas) permite identificar las secuencias de lecturas
combinadas más comunes y su frecuencia antes de determinar la clonalidad mediante los criterios que se recogen acontinuación. Consulte el apartado 8 Análisis de datos para saber más sobre el informe Merged Raed Summary (Resumen delecturas combinadas). Ciertos procesos clonales pueden dar lugar a la detección de dos o más clones. Ejemplos de esto
serían una población dominante con una pequeña población subclonal o si hay presentes varias neoplasias
linfoproliferativas. Es fundamental que estos casos se interpreten en un contexto clínico.
* Tenga cuidado al interpretar resultados "none" (ninguno) para el gen V, D o J en lecturas con posible clonalidad. Se asigna "none" (ninguno)si la alineación no satisface el umbral de calidad mínimo debido a una alineación deficiente.

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Página 19 de 28
Tabla 13. Criterios de interpretación

Criterio 1

El número total de lecturas decada muestra es ≥ 20 000.

El número total de lecturas decada muestra es ≥ 10 000 y< 20 000.

El número total de lecturas decada muestra es < 10 000.

Criterio 2

La secuencia combinada más
común abarca ≥ 2,5 % deltotal de lecturas.

La secuencia combinada más
común abarca ≥ 5,0 % deltotal de lecturas.

Criterio 3

Resultado

El % de lecturas de una posible secuencia
clonal combinada es > 2 veces el % de lecturasde la 3.ª secuencia combinada más
frecuente.1

DETECCIÓN DE SIGNOSDE CLONALIDAD

El % de lecturas de una posible secuencia
clonal combinada es ≤ 2 veces el % de lecturasde la 3.ª secuencia combinada más
frecuente.1

Sin detección de signos
de clonalidad

El % de lecturas de una posible secuencia
clonal combinada es > 2 veces el % de lecturasde la 3.ª secuencia combinada más
frecuente.1

DETECCIÓN DE SIGNOSDE CLONALIDAD

El % de lecturas de una posible secuencia
clonal combinada es ≤ 2 veces el % de lecturasde la 3.ª secuencia combinada más
frecuente.1

Sin detección de signos
de clonalidad

N. P.

No evaluable

N. P.

1

Los cálculos del software se redondean a la cifra decimal más cercana para su comparación.

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Figura 2: Interpretación de los datos según los criterios de la Tabla 14.

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12. Datos de muestra

Figura 3:

Esta tabla, generada por medio de LymphoTrack Dx Software – MiSeq, presenta las 10 lecturas más comunes del resumen de lecturas
combinadas con las 500 lecturas más comunes. Las lecturas se combinan entre sí cuando se diferencian en 1 o 2 pares de bases (pb). Lassecuencias se generaron con LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq y se analizaron con LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009).

13. Características de rendimiento
Se compararon los resultados de LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq con el informe de diagnóstico del laboratorio y lacoincidencia (o porcentaje total de coincidencia), el porcentaje de coincidencias positivas (PPA) y el porcentaje decoincidencias negativas (NPA) fueron del 89 % (51/57 casos), el 81 % y el 97 % respectivamente.
Tabla 14. Comparación entre LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq y el informe de diagnóstico del laboratorio

Informe de diagnóstico del laboratorio
ClonalNo clonal

Clonal22

1

No clonal

529

LymphoTrack Dx TRG
Assay – MiSeq

El rendimiento analítico de LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq se evaluó mediante el análisis de ADN de una línea celularclonal y ADN de amígdala en distintas diluciones. El límite de detección (LD) se observó en una dilución de ADN al 5 %. El
mayor porcentaje de lecturas de ADN de amígdala fue < 1 %. La regresión lineal R2 fue > 0,98 para un intervalo entre el 0 % y
el 10 % de dilución de ADN. El coeficiente de variación (CV%) en 8 series de 2 operadores, 2 lotes de reactivos y 2
instrumentos fue inferior al 15 % cuando se analizaron diluciones del 5 % y el 10 % de ADN.

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14. Guía de resolución de problemas
Tabla 15. Guía de resolución de problemas

Se produce durante

Error

AcciónPreparación de muestras y reactivos

La cantidad de ADN de la muestra
es inferior a 50 ng
en un método con ADNbc

No analice la muestra

Preparación de muestras y reactivos

La integridad del ADN de la muestra es baja

Analice la muestra con la Specimen Control Size
Ladder (Escalera de tamaño de control demuestras) de Invivoscribe(

20960021 para la detección por ABI o
20960020 para la detección por gel)

Cuantificación de amplicones mediante
el kit de cuantificación de genotecas
KAPA

ΔCt < 4,0
ΔCt = Ct (CB) – Ct (control)

Compruebe la curva estándar en qPCR.
Compruebe si existe contaminación y repita
la qPCR KAPA para todas las muestras y controles.
Si ΔCt vuelve a ser < 4,0, vuelva a realizar la PCR yla qPCR de todas las muestras y controles

Creación de la genoteca mediante
cuantificación y agrupamiento de
amplicones

La concentración de amplicones
es menor que 1 nM

Compruebe la curva estándar en la qPCR y repita la
PCR si es inferior a 1 nM

No se encuentra la hoja de muestras
Hoja de muestras con formato incorrecto
Error de comprobación de fluidos
Configuración de la serie de MiSeq

Poco espacio en el disco

Consulte la resolución de problemas de Illumina
o llame al soporte técnico de Illumina al+1-800-809-4566

Frasco de residuos vacío
Red desconectada
Fallo de RFID
Serie de MiSeq% Q30 < 80 % para v2 (2x151)*% Q30 < 75 % para v2 (2x251)*% Q30 < 70 % para v3 (2x301)*

Llame al soporte técnico de Invivoscribe al+1-858-224-6600

Instalación del CD

El software LymphoTrack Dx no se instalacorrectamente

Llame al soporte técnico de Invivoscribe al+1-858-224-6600

Análisis de datos

El software LymphoTrack Dx deja de funcionar

Llame al soporte técnico de Invivoscribe al+1-858-224-6600

Análisis de datos

No se detecta ninguna secuencia clonal para elcontrol positivo

Llame al soporte técnico de Invivoscribe al+1-858-224-6600

Control blanco (CB)El CB muestra amplificación tras la PCR

Repita el ensayo* El Q30 de todas las validaciones analíticas cumple los criterios de la especificación Q30 de Illumina MiSeq indicados previamente. No obstante,la puntuación Q30 puede variar en función de la calidad de la muestra. Si el Q30 está por debajo de la especificación Q30 de Illumina, compruebe el valor
Q30 del índice en el informe de LymphoTrack Dx después de analizar los datos con LymphoTrack Dx Software – MiSeq. Si la puntuación Q30 de un índiceen el informe de LymphoTrack Dx no satisface la especificación de Illumina, considere el índice como no válido.

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15. Servicio técnico y atención al cliente
Gracias por adquirir LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq. Damos a su negocio el valor que realmente tiene. Será un placer
ayudarle a comprender cómo funciona el kit de ensayo. Proporcionamos asistencia técnica continuada de lunes a viernes,
de modo que pueda seguir usando eficazmente los kits de ensayo en su laboratorio.
Datos de Contacto
Invivoscribe, Inc
10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | Estados Unidos
Téléfono: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Horario comercial: De 07:00 a 17:00 PST/PDT
Servicio técnico: support@invivoscribe.com | Atención al cliente: sales@invivoscribe.com | Sitio web: www.invivoscribe.com

16. Referencias
1.
2.
3.

4.

▪
▪
▪
▪
▪
▪

Tonegawa, S. (1983). Somatic Generation of Antibody Diversity. Nature 302, 575-581
Trainor KJ. et al., (1990). Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood 75, 22202222
Miller, JE. (2013). Principle of Immunoglobulin and T Cell Receptor Gene Rearrangement. En: Cheng, L.; Zhang, D.; Eble,
J. N. (Eds), Molecular Genetic Pathology (2nd Ed., sections 30.2.7.13 and 30.2.7.18). New York, USA: Springer
Science & Business Media.
JJM van Dongen et al., (2003). Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the
BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17, 2257–2317.
Instrucciones de uso del paquete LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009)
https://www.beckmancoulter.com
http://www.illumina.com
http://www.invitrogen.com
http://www.kapabiosystems.com
http://www.thermofisher.com

17. Símbolos
Los siguientes símbolos se usan en el etiquetado de los productos de diagnósticos por SNG de Invivoscribe.
Número de Catálogo

Fecha de Caducidad

Volumen de Reactivo

Representante Autorizado en la
Comunidad Europea

Número de Lote

Consulte las instrucciones de uso

Condiciones de Conservación

Para uso diagnóstico in vitro

Identificador Único de Dispositivo

FabricanteConformidad del Reino Unido Evaluada

Persona Responsable del Reino Unido

Representante Autorizado en Suiza

Conformidad Europea

Aplicación de software

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18. Aviso legal
Este producto está cubierto por una o más de las siguientes patentes o solicitudes de patente, que son propiedad o cuentan
con licencia exclusiva de Invivoscribe, Inc. (IVS): patente estadounidense n.º 7,785,783; patente estadounidense n.º8,859,748 (junto con las solicitudes de división relacionadas con la solicitud original); patente europea n.º EP1549764B1(validada en 16 países y ampliada por las patentes europeas relacionadas n.º EP2418287A3 y EP2460889A3); patentejaponesa n.º JP04708029B2; solicitud de patente japonesa n.º 2006-529437; solicitud de patente brasileña n.º PI0410283.5;
patente canadiense n.º CA2525122; patente india n.º IN243620; patente mexicana n.º MX286493; patente china n.º
CN1806051; y patente coreana n.º 101215194.
El uso de este producto puede requerir métodos de amplificación de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR). La adquisición de las licencias necesarias para llevar a cabo métodos de amplificación o para usar
reactivos, enzimas de amplificación o equipos cubiertos por patentes de terceros es responsabilidad del usuario.
Invivoscribe, Inc. no otorga dicha licencia de forma explícita ni implícita.
©2024 Invivoscribe, Inc. Todos los derechos reservados. Las marcas comerciales que figuran en este documento son
propiedad de Invivoscribe, Inc. o de sus filiales y, en el caso de marcas comerciales de terceros, de sus respectivos
propietarios.

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19. LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq: guía sintética
19.1.

Use guantes para sacar las mezclas maestras del congelador. Deje que los tubos se descongelen y, a continuación,
mezcle suavemente con el agitador vortex.

19.2.

En una campana de contención o cabina sin circulación de aire, pipetee 45 L de la mezcla maestra en pocillos
individuales de una placa para PCR. Un pocillo para cada mezcla maestra y una mezcla maestra por muestra y controles
positivo, negativo o blanco.

19.3.

Añada 0,2 L de ADN Taq polimerasa (5 U/µL) a cada mezcla maestra.

19.4.

Añada 5 L de ADN de la muestra (con una concentración mínima de 10 ng/µL) y 5 L de las muestras de control a lospocillos con las reacciones de mezcla maestra respectiva y pipetee arriba y abajo 5-10 veces para mezclar.

19.5.

Añada 5 L de agua para uso en biología molecular al pocillo con la mezcla maestra para el control blanco y pipetee
arriba y abajo 5-10 veces para mezclar.

19.6.

Amplifique el ADN diana mediante el siguiente programa del termociclador:
Paso

Temperatura

Tiempo

Ciclo

1

95 °C

7 minutos

1

2

95 °C

45 segundos

3

60 °C

45 segundos

4

72 °C

90 segundos

5

72 °C

10 minutos

1

6

15 C

∞

1

29x

19.7.

Extraiga la placa de amplificación del termociclador.

19.8.

Purifique los productos derivados de la PCR por medio del sistema PCR Purification (Purificación por PCR) Agencourt
AMPure XP. Añada 50 µL de partículas a cada reacción de 50 µL; eluya el ADN en 25 µL de eluido.

19.9.

Cuantifique los amplicones con el kit de cuantificación de genotecas KAPA de acuerdo con las instrucciones del kit.
Diluya los amplicones a 1:4000 antes de continuar con la qPCR.

19.10.

Agrupe cantidades iguales de amplicones de muestras (sin incluir el control blanco), diluya a 1:1000 y cuantifique lagenoteca con el kit de cuantificación de genotecas KAPA.

19.11.

Desnaturalice y diluya la genoteca a 12 pM para el kit de reactivos MiSeq v2 y a 12-20 pM para el kit de reactivos MiSeq
v3 al multiplicar (MCS v2.6 o posterior).

19.12.

Cargue 600 μL de la genoteca desnaturalizada y diluida en el Reagent Cartridge (Cartucho de reactivos) de MiSeq.

19.13.

Configure una hoja de muestras de MiSeq y cargue la hoja de muestras en el instrumento (si es necesario).

19.14.

Inicie la serie de MiSeq.

19.15.

Analice y visualice los datos adquiridos por medio del paquete LymphoTrack Dx Software – MiSeq.

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20. Anexo A: Creación de una genoteca de secuenciación con varias dianas SNG
Si se analizan en paralelo varias dianas con un LymphoTrack Dx Assay – MiSeq diferente, es importante tener en cuenta lasdiferencias de procedimiento entre cada ensayo. Por ejemplo, el ensayo IGHV Leader utiliza 32 ciclos de PCR y debe
colocarse en un ciclo térmico separado de otros ensayos LymphoTrack Dx que utilizan solo 29 ciclos de PCR. La Tabla 16
siguiente resume estas diferencias de procedimiento. Para obtener instrucciones completas, consulte las Instrucciones de
uso del LymphoTrack Dx Assay – MiSeq correspondiente.
Tabla 16. Diferencias de procedimiento de los ensayos LymphoTrack Dx

LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Paso delprocedimiento

Descripción

7.4.1

IGHV
Leader

IGH FR1

IGH FR2

IGH FR3

IGK

TRG

TRB

Número de ciclos de PCR

32

29

29

29

29

29

29

7.5.1

Volumen del reactivo
AMPure XP (proporción)

50 µL
(1:1)

50 µL
(1:1)

50 µL
(1:1)

50 µL
(1:1)

50 µL
(1:1)

50 µL
(1:1)

35 µL
(0,7:1)0Comprobación decontaminación
Valor de ΔCt =Ct (CB) – Ct (control)

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 3,0

7.6.5
y
7.9.1

A
(longitud media defragmento)

660 pb450 pb390 pb260 pb410 pb300 pb400 pbConcentración de carga

12 - 20 pM

12 pM

12 pM

12 pM

8 pM

12 pM

12 pM

Kit de reactivos de MiSeq
para la secuenciación deuna sola diana*

v3 (600)

v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)

Configuración de la hoja demuestras para:
Cycles Read 1*
Cycles Read 2*

301

251

251

151

251

151

251

7.10.7

7.12*Nota:

Los productos químicos de MiSeq v2 se han validado para estos ensayos de una sola diana. Los productos químicos de MiSeq v3 se han validado para
IGHV Leader y para la multiplicación de ensayos.

También pueden multiplicarse en una misma genoteca individual dos o más genotecas de secuenciación generadas a partirde ciertas mezclas maestras diana de genes de LymphoTrack (p. ej., dos genotecas de secuenciación de TRG del mismo o dediferentes lotes), siempre que los índices de dicha mezcla maestra solo se incluyan una vez por carrera de secuenciación.
Consulte la tabla siguiente para determinar la configuración de ciclos y kits de reactivos de Illumina MiSeq que se emplean
con las diferentes combinaciones de dianas. Para lograr suficientes lecturas por muestra, se recomienda utilizar el kit dereactivos MiSeq v3 para secuenciar las siete dianas juntas.
Tabla 17. Configuración de ciclos y kits de reactivos para una serie de MiSeq de varias dianas

Multiplicación de dianas

Configuración de la hoja
de muestras

Solo IGH FR3 y TRG juntas

Lectura 1 de 151 ciclos
Lectura 2 de 151 ciclos

Cualquier combinación deestas dianas:

Lectura 1 de 251 ciclos
Lectura 2 de 251 ciclos

Al combinar cualquiera delos ensayos con IGHV
LeaderLectura 1 de 301 ciclos
Lectura 2 de 301 ciclos

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

Kit de reactivos de MiSeq

Concentración de carga

N.º de catálogo

Kit v2 (300 ciclos)o
Kit v2 (500 ciclos)Kit v2 (500 ciclos)hasta 4 dianaso
Kit v3 (600 ciclos)

12 pM (v2)o
20 pM (v3)MS-102-2002
oMS-102-2003

12 pM (v2)o
20 pM (v3)MS-102-2003
oMS-102-3003

Kit v3 (600 ciclos)

20 pM (v3)MS-102-3003

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20.1.

Determine la concentración de cada genoteca individual (p. ej., IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB y
TRG).

20.2.

Determine la cantidad de cada genoteca que se debe desnaturalizar.
En la tabla siguiente, los casos A, B, C, D, E y F son diferentes ejemplos de multiplicación de ensayos (p. ej., el caso A
es una multiplicación de IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB y TRG). T, U, V, W, X, Y y Z son volúmenes
en µL.
n=T=

número de dianas que se cargan en un cartucho de MiSeq
40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de IGHV Leader (nM)]U=

40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de IGH FR1 (nM)]V=

40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de IGH FR2 (nM)]W=

40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de IGH FR3 (nM)]X=

40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de IGK (nM)]Y=

40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de TRG (nM)]Z=

40 fentomoles/[n x concentración de la genoteca de TRB (nM)]

Nota: El valor de 40 fentomoles se corresponde con los 20 µL de 2 nM al final del paso 20.3.

Tabla 18. Cálculo de entradas de la genoteca individual para generar una genoteca de secuenciación de varias dianas para la serie de MiSeq

Genoteca

Volumen de la genoteca individual (µL)

Nombre delensayoConcentración

Caso A

Caso B

Caso C

Caso D

Caso E

Caso F

(nM)

n=7

n=6

n=5

n=4

n=3

n=2

IGHV Leader

2,3

T

2,5

2,9

3,5

4,3

IGH FR1

1,5

U

3,8

4,4

5,3

6,7

8,9

IGH FR2

4

V

1,4

1,7

2

2,5

3,3

IGH FR3

2,1

W

2,7

3,2

3,8

4,8

6,4

2,3

20.3.

IGK

3,5

X

1,6

1,9

TRG

2,6

Y

2,2

2,6

TRB

2

Z

2,9

T+U+V+W+X+Y+Z

17,1

16,7

5,7
7,7

16,9

18,3

18,6

13,4

Desnaturalice las genotecas combinadas a 2 nM.
▪

Añada los reactivos de acuerdo con la Tabla 19, en función de la cantidad determinada en el paso anterior.

Si T+U+V+W+X+Y+Z > 18, como en los casos D y E de la Tabla 18, mezcle primero las genotecas aplicables y,a continuación, añada 18 µL a la reacción desnaturalizante como se muestra en la tabla siguiente.
Tabla 19. Desnaturalización de la genoteca

Reactivo

Volumen (µL)

Genoteca IGHV Leader

T

Genoteca IGH FR1UGenoteca IGH FR2V

Genoteca IGH FR3W

Genoteca IGK

X

Genoteca TRG

Y

Genoteca TRBZ

NaOH, 1 N

2

10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, Tween 20 al 0,05 %Total

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

18 – (T+U+V+W+X+Y+Z)
20

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Agite brevemente con el agitador vortex para mezclar la solución y, a continuación, centrifugue brevemente para
asegurarse de que toda la solución se haya asentado en el fondo del tubo. Incube durante 5 minutos a temperatura
ambiente para desnaturalizar el ADN de la genoteca combinada en ADN monocatenario (ADNmc).
20.4.

Diluya la genoteca desnaturalizada a 40 pM.
Agregue 980 μL de buffer HT1 previamente enfriado (se incluye en el kit de reactivos de MiSeq) al tubo que contienelos 20 μL de ADN de la genoteca desnaturalizada. Mezcle brevemente con el agitador vortex y centrifugue la muestra
por pulsos.

20.5.

Prepare la genoteca desnaturalizada para cargarla en MiSeq.
Diluya la genoteca a 12 pM para el kit de reactivos MiSeq v2 y a 20 pM para el kit de reactivos MiSeq v3 al multiplicar(MCS v2.6 o posterior) según la Tabla 20. Mezcle brevemente con el agitador vortex y centrifugue la muestra por
pulsos.
Tabla 20. Preparación de la genoteca combinada para la carga en MiSeq

Volumen
Reactivo
12 pM

20 pM

Genoteca a 40 pM

300 µL500 µL

Buffer HT1 enfriado

700 µL500 µL

Total

1000 µL

1000 µL

20.6.

Cargue 600 µL de la genoteca desnaturalizada combinada del paso anterior en un Reagent Cartridge (Cartucho dereactivos) de MiSeq.

20.7.

Configure una hoja de muestras de MiSeq y cargue la hoja de muestras en el instrumento (si es necesario).

20.8.

Inicie la serie de MiSeq.

20.9.

Analice y visualice los datos adquiridos por medio del paquete LymphoTrack Dx Software – MiSeq.

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