上原記念生命科学財団研究報告集, 30 (2016)

88. 細胞内小胞ホメオスタシスの動作原理
大場雄介

北海道大学 大学院医学研究科 細胞生理学分野
Key words：細胞内シグナル伝達，細胞内小器官，エンドサイトーシス，蛍光イメージング緒

言

細胞膜は単に細胞内外を隔てる脂質二重膜ではなく、外部環境や他の細胞とのコミュニケーションのインターフェースとして機能する。また、2 次元方向の流動性のみならず、エンドサイトーシスやエキソサイトーシスにより内膜成分と相互に交流があり、細胞内外の膜のホメオスタシスを維持している。内膜成分であるエンドソームやエキソソームも、シグナル伝達発信のプラットホームとして機能する。
アンジオテンシン II（angiotensin II, AII）は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、および心不全臓等の心血管疾患の発症において重要な役割を持つ多面的なペプチドホルモンである１,２）。AII 受容体の 4 つサブタイプのうち、1 型受容体（AT1R）は最も研究の機能解析の進んでいる受容体であり、AII 依存性血管収縮に関与する１,２）。Extracellularsiganl-regulated protein kinase（ERK）/mitogen-activated protein kinase（MAPK、以下 ERK）は AT1R シグナル伝達の重要な下流因子であり３）、 AT1R を介した病態発症の主要なエフェクター分子であると考えられる。AT1R 以外の受容体のシグナル伝達機構は不明な点が多いが、2 型受容体（AT2R）は ERK 活性化の阻害を介して AT1R の作用に拮抗することが報告されている１,２,４,５）。しかしながら、生理的条件下における AT2R による AT1R シグナルの調節機構は、未だ議論の余地がある。
本研究では、AT1R と AT2R の直接的な機能連関を明らかにするため、蛍光タンパク質タグ付き AT1R およびAT2R を用い、AT2R が AT1R と直接相互作用することを明らかにした。受容体複合体は AT1R、AT2R および PKCの活性に依存してエンドサイトーシスによって内在化され、この内在化に伴い両受容体の C 末端が近接するような構造を取ることを、フェルスター共鳴エネルギー移動（Förster resonance energy transfer, FRET）を用いて見出した。
これらの知見により、リガンド依存性の AT1R 活性化を AT2R が阻害する分子メカニズムの一端を解明したといえる。

方法

ヒト AT1R および AT2R の cDNA はヒト臍帯静脈内皮細胞の cDNA ライブラリーから、PCR 法によりサブクローニングした。なお、以前の報告６）に従い、開始コドンの直後に HA および FLAG タグが挿入されるようプライマーを設計した。得られた PCR 産物を pCR-BluntII-TOPO にクローニングし、pCXN2-YFPC と pCXN2-CFPC ベクターのEcoRI および NotI 部位にサブクローニングすることで、HA-AT1R-YFP と FLAG-AT2R-CFP を得た。352-354 番目のセリン残基をアラニンに置換したリン酸化欠損 AT2R 変異体は、2 ステップ PCR 法により作製した。 Entacmaeaquadricolor eqFP650（TurboFP650）の cDNA は、PCR で増幅後 pCMV 由来ベクターにクローニングし、pFX-eqFP650と命名した。また、ラット ERK2 cDNA を PCR で増幅し、pFX-eqFP650 の XhoI および NotI 部位にサブクローニングすることで、pFX-eqFP650-ERK2 を得た。
AII、LPA、および PD123319 は Sigma から入手した。 EGF およびロサルタンは PeproTech 社および LKT ラボラトリーズ社から購入した。Staurosporine および AG1478 とは Calbiochem 社から購入した。Höechst33342 およびGö6983 はそれぞれ、Invitrogen 社およびケイマン･ケミカルから入手した。 FLAG および HA に対する抗体はストラタジーンおよび Roche 社から、抗 ERK およびリン酸化 ERK2 は Cell Signaling Technology 社から購入した。リン酸化セリン／スレオニン抗体はエンゾライフサイエンスから入手した。

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HeLa 細胞は 10 ％ FBS 含有ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、Sigma）中で培養しました。発現プラスミドがFuGENE HD（Roche 社）を用いて導入した。
免疫沈降およびイムノブロットは常法に基づき実施した。なお、細胞可溶化液に SDS サンプルバッファーを添加した後は、AT1R と AT2R の凝集を防ぐため、ボイルせず 50 ℃でインキュベートした。蛍光顕微鏡観察および FRET
効率の算出は、以前の報告に従い行った７）。なお、補正 FRET 値（FRETc）は、以下の式を用いて画像中の各画素ごとに計算した：FRETc = FRET－（0.5×CFP）－（0.02×YFP）。0.5 および 0.02 は同条件で撮像した場合の CFP とYFP 蛍 光 の FRET チ ャ ネ ル へ の 漏 れ 込 み 比 で あ る 。 FRETc 画 像 は 最 終 的 に 擬 似 カ ラ ー モ ー ド で 表 示 し た 。
eqFP650-ERK の核移行を定量化するために核をヘキストで染色し、核領域と細胞領域に対して作成されたマスク画像を用いて、核と細胞全体における eqFP650-ERK の蛍光強度を定量し、その日を ERK の活性とした。

結果

１．AT2R は選択的に AT1R 依存性 ERK リン活性化を阻害する
AT2R シグナルは AT1R 依存性シグナルと拮抗することが報告されているため１,２,４,５）、まず AT1R または他の受容体により誘導される ERK 活性化に対する AT2R の効果を検討した。AII 処理は HeLa 細胞ではほとんど ERK を活性化しないが、AT1R の存在下では ERK リン酸化を誘導する（図 1a）。また、蛍光タンパク質タグした ERK2 の局在を定量化したところ、AT1R の発現依存的かつ AII 刺激依存的な ERK 核移行が観察された（図 1b）。これらの方法によって得られた ERK 活性化の時間経過は互いにと一致していたので（図 1c）、意図したタンパク質を発現する HeLa 細胞における ERK 活性をモニターするため、以下の実験では ERK の核移行でその活性化をモニターした。AT2R の発現は AII 依存性 ERK 活性化を誘導しないが、AII および AT1R 依存性の ERK 活性化を抑制した（図 1d）。 AT2R 阻害薬 PD123319 はこの AT2R による抑制効果をキャンセルした。
次に、AT2R による作用が AT1R に特異的か否かを検討した。EGFR 阻害薬 AG1478 処理は AII-AT1R 依存 ERK 活性化に対する阻害効果を有さないことから（図 1e）、HeLa 細胞においては EGFR のトランス活性化経路は存在しないことが解った。この条件下において、AT2R は EGF 依存的な ERK 活性化抑制しないことがわかった（図 1f）。また、
リゾホスファチジン酸（LPA）（図 1g）、ウシ胎児血清（FBS）（図 1h）による ERK 活性化に対しても、AII-AT2R は抑制効果を示さなかった。以上より、AT2R による ERK の抑制効果は AT1R シグナルに選択的であり、その作用点はERK/MAPK カスケードより上流であることが示唆された。

2図 1． AT2R は AT1R シグナル伝達を特異的に抑制する（a）HeLa 細胞に AT1R 発現ベクターまたはコントロールベクターを遺伝子導入した。 24 時間後に 4 時間の血清飢餓処理をした後、AII 刺激または未処理のままとした。図に示す時刻に細胞可溶化液を調製し、SDS-PAGEで可溶化タンパク質を展開した。ERK のリン酸化状態はリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロッティングにより決定した。 また、ERK および AT1R の発現は ERK および HA に対する抗体を用いて評価した。（b）
eqFP650-ERK 単独または AT1R と共発現した HeLa 細胞を Hoechst 33342 で染色し、落射蛍光タイムラプス顕微鏡で観察した。時刻 0 で AII 刺激を行った。スケールバー: 50μm。（c）a におけるバンドの強度と b における核 ERK /総 ERK の平均蛍光強度を定量し、それぞれ左右のグラフにプロットした。エラーバーは平均値の標準誤差（s.e.m）、タイムラプスイメージングのサンプルサイズは N = 8 である。（d）HeLa 細胞に AT1R 単独、AT2R 単独あるいは AT1R と AT2R を共発現させ、AT2R 特異的阻害薬 PD123319 の非存在下または存在下で4 時間インキュベートした。細胞をタイムラプス顕微鏡でモニターしながら、時刻 0 で AII 刺激を行った。平均核 ERK /総 ERK 比を経時的にプロットした。エラーバーは s.e.m.を示す（N = 5）。
（e）AT1R を発現する HeLa細胞を EGFR 阻害薬 AG1478 の非存在下または存在下で 4 時間インキュベートし、タイムラプス顕微鏡によって観察した。時刻 0 で AII 刺激を行った。平均核内 ERK 蛍光強度比を経時的にプロットした。エラーバーはs.e.m.を示す（N = 3）。
（f-h）AT2R 発現ベクターまたはコントロールベクターを導入した HeLa 細胞を、AII の存在下においてタイムラプス顕微鏡で観察した。時刻 0 において、EGF（f）、LPA（g）、および FBS（h）で刺激した。エラーバーは s.e.m.を示す [N = 6（f）、5（g）、5（h）]。
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２．AT2R は AT1R と相互作用する
図 1 の結果から、AT2R は複合体を形成することにより AT1R シグナル伝達を減弱すると推察した。実際、AT1Rと AT2R が直接結合することが、免疫沈降法で過去の報告において示されている８）。しかし、これらの報告では AII刺激によって相互作用が増強するかどうかは示されていない。そこで、HeLa 細胞株において AT1R と AT2R の直接的な相互作用か否かを免疫共沈法を用いて検討した。その結果、AT1R と AT2R は AII 非存在下においても結合すること、AII 処理によりその結合は僅かに増強するが、AT1R および AT2R の阻害薬処理は両者の結合に影響を及ぼさないことが明らかになった（図 2）。この結果は、図 1 に示した ERK 活性化のプロファイルとは一致しない。しかしながら、このことは必ずしも AT2R が受容体レベルで AT1R のシグナル伝達を抑制する可能性を否定するのではなく、むしろシグナルクロストークメカニズムのさらなる理解のためには、生化学的分析以外のアプローチが必要であることを示唆している。

図 2． AT2R は AT1R と相互作用する上部に示される発現ベクターを導入した HeLa 細胞を、血清飢餓処理し、AT1R 特異的阻害薬ロサルタンまたはAT2R 特異的阻害薬 PD123319 で前処理した後 AI で刺激した。可溶化バッファーで細胞を可溶化し、抗 FLAG抗体による免疫沈降産物を抗 HA または抗 FLAG 抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。タンパク質の発現は細胞可溶化液の一部を使用したイムノブロットで確認した。
３．AII 刺激は AT1R 依存的に AT2R の内在化を誘導する
AT1R は AII 刺激によりエンドサイトーシスにより内在化されることが報告されているため９）、AT2R は時空間的な制御を介して AT1R シグナル伝達の調節に関与する可能性があるという仮説を立てた。AT1R および AT2R の細胞内局在と輸送を可視化するために、CFP および YFP タグした受容体の発現ベクターを作製し、それらの局在を観察した。 AII の非存在下では、AT1R および AT2R ともに、主として細胞膜に局在した（図 3a）。 AII 刺激により AT1Rはすぐに内在化されたのに対し、AT2R 単独発現時は AII 刺激後も細胞膜にその局在が保持された。次に、共発現時の AT1R および AT2R での細胞内局在性とその変化を調べた。AII 刺激の非存在下でも AT1R および AT2R は細胞膜で共局在し（図 3b）、免疫共沈の結果（図 2）と一致した。しかし、AII 刺激により、AT2R は AT1R とともに内在化し、顆粒状構造で特に強く共局在していた（図 3b）。

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図 3． AT2R は AT1R とともに内在化される（a）AT1R-YFP または AT2R-CFP を導入した HeLa 細胞を蛍光顕微鏡で観察した。AII 刺激前と刺激後 30 分の画像を示す。
（b）AT1R-YFP および AT2R-CFP の両方を発現している HeLa 細胞を用いて多次元タイムラプ
ス蛍光顕微鏡観察を行った。撮像開始後 10 分で AII 刺激を行った。マージ画像を右に示す。
（c、d）b と同様に顕微鏡観察した画像を用いて、補正 FRET 画像（FRETc）を再構成して疑似カラーモードで表示した（c）。また、平均 FRETc の時間経過をプロットした（d）。エラーバーは s.e.m.を示す（N = 3）。スケールバー: 50μm（a-c）。
FRET は生きた細胞内の分子間相互作用を検出するための強力なツールであるので、AT2R-CFP と AT1R-YFP で生じる FRET を解析した （図 3c）。非刺激時には弱い FRET シグナルが検出されたのに対し、AII 刺激によって生じる顆粒状構造において強い FRET が観察された（図 3d）。以上の結果より、AII 非存在下でも AT2R と AT1R が結合しているが、AT1R と AT2R の分子配向は FRET シグナルを強く生じる位置関係にはないこと、AII 刺激により両者の複合体の構造変化が生じ、FRET が生じることが明らかになった。
４．AT1R-AT2R 複合体の構造変化には両受容体へのリガンド結合が必要である
さらに AT1R と AT2R 間の関係を明確にするために、AII 依存性受容体複合体構造変化に対する受容体拮抗薬の効果を調べた。AT1R 阻害薬であるロサルタンは、受容体間の FRET シグナルのみならず、両受容体の内在化を完全に抑制した（図 4a、b）。したがって、AII 依存性の受容体内在化および構造変化は AT1R シグナル伝達に完全に依存していたことが示された。一方、AT2R 拮抗薬 PD123319 処理は AT1R の内在化を抑制しないものの、AT2R 輸送および両受容体間の FRET を有意に抑制した（図 4a、b）。よって、AT2R シグナルは受容体ヘテロ二量体の構造変化に、少なくとも部分的に関与していることが示唆された。これらの結果から、両受容体からのシグナルが受容体ヘテロダイマーの構造変化のために不可欠であることを示している。
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図 4． 受容体への AII 結合は受容体複合体内在化に必要である（a）図 3c と同様に調製した細胞を、ロサルタンまたは PD123319 のいずれかで前処理した。蛍光顕微鏡による観察を開始した後、時刻 0 で AII 刺激を行った。スケールバー: 50μm。（b）a と同様に調製した細胞をタイムラプス顕微鏡で観察した。各細胞群の FRETc の時間経過をプロットした。エラーバーは s.e.m.を示し（N =3）。
５．PKC にる AT2R リン酸化が AT1R と AT2R の機能連関に重要である
PKC は AT1R の主たる下流のエフェクターの 1 つであるため、受容体の動態における PKC 阻害薬の効果を検討した。PKC 阻害薬処理は AT1R 内在化に影響を与えなかったのに対し、AT2R の内在化は抑制され、AT1R とは異なる局在を示した（図 5a）。 PKC 阻害薬は受容体間の FRET シグナルに対し、AII 刺激後 20 分までは影響を示さなかったのに対し、20 分以降は有意な抑制効果を示した（図 5b）。このデータは、PKC 活性化が AT1R と AT2R と二量体の内在化との機能的関連性（受容体二量体の構造変化）のために不可欠であることを示している。

6図 5． PKC 活性は受容体複合体内在化に必要である（a、b）HeLa 細胞に AT1R-YFP および AT2R-CFP の発現ベクターを導入した。24 時間後、細胞を PKC 阻害薬（スタウロスポリンまたは Gö6983 のいずれか）で前処理または未処理のまま 30 分間インキュベートした。
続いて細胞を蛍光顕微鏡で観察し、時刻で AII 刺激を行った。代表的な画像を示す。スケールバー: 50μm（a）。
スタウロスポリンと Gö6976 の存在下または非存在下での FRETc の時間経過のプロット（b）。エラーバーはs.e.m.を示す（N = 3）。
（c）HeLa 細胞に AT1R 発現ベクターまたはコントロールベクターを導入した。 24 時間
後、細胞をスタウロスポリンまたは Gö6976 のいずれかまたは未処理でインキュベートした後、AII で刺激した。
ERK のリン酸化状態をイムノブロッティングにより評価しました。（d）AT1R と eqFP650-ERK を発現するHeLa 細胞を、PKC 阻害薬の存在下または非存在下でインキュベートし、蛍光顕微鏡によりモニタリングした。
時刻 0 で AII 刺激を行った。核 ERK 蛍光強度比（FP）とイムノブロットの強度（IB）を経時的にプロットした。エラーバーは s.e.m.を示す（N = 4）。
最後に、AT1R シグナル伝達に対する AT2 の抑制効果に対する PKC の効果を評価した。 PKC は AT1R 依存 ERK活性化に関与することが報告されているため 10）、ERK 活性化をエンドポイントとする本実験系においては PKC 阻害薬の使用は適していない可能性がある。実際、スタウロスポリンまたは Gö6983 処理は、AT1R 依存性の ERK 核移行を阻害する（図 5c、d）。AT2R のアミノ酸配列を解析したところ、C 末端領域に PKC によりリン酸化可能な配列を同定した。抗リン酸化セリン/スレオニン抗体を用いた免疫沈降産物のイムノブロットにより、AII-AT1R シグナルによる AT2R のリン酸化が検出できた（図 6a）。このリン酸化は、AT2R の C 末に存在する３つのセリン残基をアラニン7に置換した変異体（AT2R-3A）では抑制された。また、AT2R-3A は野生型と比較して AT1R 依存的は ERK 活性化に対する抑制効果も小さかった（図 6b）。AT2R-3A 変異体は AT1R 存在下でも内在化や AT1R との共局在は示さず、細胞膜および核周辺領域に局在した（図 6c）。さらに、AT1R と AT2R 間の FRET も 3A 変異体では有意に減弱していた（図 6d）。以上より、AII 依存的かつ AT1R-PKC 依存的な AT2R リン酸化が、AT2R による AT1R シグナル伝達抑制に重要であることが示された。

図 6． PKC にる AT2R リン酸化は ERK 活性化の阻害に必要である（a）上に示すタンパク質の発現ベクターを導入した HeLa 細胞を、4 時間血清飢餓処理し、10 分間 AII によって刺激した。細胞を可溶化バッファーで溶解し、抗 FLAG 抗体で免疫沈降を行った後に抗リン酸化セリン/スレオニン抗体（pSer / Thr）または抗 FLAG 抗体を用いたイムノブロッティングで解析した。（b）HeLa 細胞に
eqFP650-ERK、AT1R-YFP および AT2R-CFP か AT2R-3A-CFP のいずれかを発現させ、24 時間後にタイムラプス顕微鏡観察を行った。時刻 0 で AII 刺激を行った。核 ERK 蛍光強度比を経時的にプロットしたエラーバーは s.e.m.を示す（N = 3）。
（c、d）HeLa 細胞を AT1R-YFP および AT2R-3A-CFP を発現ベクターでトランスフェクトした。 24 時間後、細胞を蛍光顕微鏡観察に付し、AII によって刺激した。代表的な画像を示す。スケールバー: 50μm（c）。 AT1R と AT2R または AT2R-3A 間 FRETc の経時変化を示す（d）。エラーバーは s.e.m.
を示す（N = 4）。

考察

本研究により、AT1R と AT2R の複合体形成およびその構造変化が、AT2R による AT1R シグナル伝達の阻害に重要であることが示された（図 7）。また、この減少には PKC による AT2R のリン酸化が重要である。特にこの一連の過程はエンドソームにおいて生じることがイメージングのデータが明らかになっており、シグナル伝達のプラットフォ8

ームとしてのエンドソームの重要性が明らかになってきた。今後はこれらのシグナル伝達の結果生じるエンドソームや細胞内小器官の動態変化やそのホメオスタシスについて、さらに研究を進めていきたい。
尚、本研究の成果については、既に論文発表済である 11）。

図 7． AT2R による AT1R シグナル抑制機序の模式図
AII による AT1R の刺激は、PKC を介した ERK リン酸化と AT1R 自身の内在化を引き起こします。一方
AT2R 単独では刺激後も細胞膜に留まる。両方の受容体が存在する場合は、AII 刺激は、PKC による AT2RC末端のリン酸化を引き起こし、受容体間ヘテロダイマーの構造変化と受容体複合体の内部移行を誘導する。このプロセスが AT2R による AT1R 依存性 ERK リン酸化の抑制に必要である。

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