MINI REVIEW

骨髄由来間葉系幹細胞からステロイドホルモン産生細胞の作製
矢澤隆志１，２），梅澤明弘３），宮本薫１，２）

１）福井大学医学部生命情報医学講座
２）CREST・JST
３）国立成育医療センター研究所・生殖医療研究部

はじめに増えにくいといった欠点がある．また，幹細胞研究の究極的な目的が再生医療であると考えるならば，胎児を殺ヒトを含む哺乳動物の主要なステロイドホルモン産生すことによって採取するES細胞は目的に全く合致する組織は，生殖腺と副腎である．両組織は，中間中胚葉由ものではない．そこで近年，注目を集めているのが成体来の生殖腺・副腎原基と呼ばれる共通の発生起源を有す幹細胞である［４］．元来，成体幹細胞は，ES細胞などる［１，２］．発生が進み原基が分かれて，生殖腺と副腎とは異なり，存在する組織の細胞にのみ分化すると考えとなるときに，胎児型のステロイドホルモン産生細胞がられてきた．しかしながら，近年の研究で成体幹細胞は，出現して，ステロイドホルモンの合成が始まる．出生後，由来組織以外の細胞にも分化しうること，さらには発生

この胎児型のステロイドホルモン産生細胞は死滅し，思学的な起源である胚葉を越えた分化能力をもつ例すら報春期になると出現する成体型のステロイドホルモン産生告されている．
このような成体幹細胞は，臍帯血・神経・細胞に置き換わっていく（メスの生殖腺では，ステロイ

心臓・脂肪など多くの組織から単離されている［４-６］ドホルモン産生細胞は出生後に出現する）．このようなが，中でも特に注目されているのは骨髄由来の間葉系幹複雑な変遷を辿るステロイドホルモン産生細胞の詳しい細胞である．この細胞は，骨髄の間質部に存在し，造血形成機構は，形態学的にも分子生物学的にも多くの謎が支持細胞，骨芽細胞，脂肪細胞といった細胞に分化する存在する．ステロイドホルモン産生細胞の発生学的な起多能性幹細胞である［４，７］．この細胞を骨髄から取り源には，さまざまな説が提唱されているがはっきりとし出して，さまざまな処理を行った場合，他の中胚葉系のた結論は出ていない．さらに，ノックアウトマウスの解細胞はもちろんのこと，内胚葉由来の肺や外胚葉由来の析により，これまでに多数の遺伝子がステロイドホルモ脳の細胞といった，非常に幅広い分化能力を発揮する．

ン産生細胞の形成に関わることが示唆されているもの

遺伝子操作も比較的容易であり，ジーンターゲティングの，その詳しい作用機構には不明な点が多く残されていを行うことに成功した初めての成体幹細胞でもある

る［２］．これは，生殖腺や副腎がステロイドホルモン［８，９］．また，成体の骨髄から容易に採取が可能であ産生細胞以外の複数の細胞系列からも形成されるため，ることから，再生医療も含めた幹細胞研究においてESその前駆細胞を単離することが事実上不可能であること細胞にとって代わる存在となりつつある．今回，私たちや，これらの細胞に分化誘導できる細胞株が存在しないは，この幹細胞からステロイドホルモンを産生する細胞ということによると考えられる．

を作ることに成功した．

このような複雑な組織の細胞分化機構を分子生物学的に調べる有効な手段となるのが幹細胞である．種々ある

間葉系幹細胞のin vivoにおける分化幹細胞のなかで，胚性幹細胞（ES細胞）は，その万能の分化能力から細胞分化のメカニズム解明に大きな役割

まず，初めに間葉系幹細胞がin vivoの環境によりスを果たしてきた［３］．しかしながら，ES細胞は発生後テロイドホルモン産生細胞に分化する能力を有している期の細胞には分化しにくいうえに，分化した後の細胞はか否かを確かめるために，移植実験を行った．全身性に緑色蛍光タンパク質GFPを発現するgreenラットの骨髄連絡先：宮本 薫，福井大学医学部生命情報医学講座，〒910-1104 福井県吉田郡松岡町下合月23-3
TEL: 0776-61-8316
FAX: 0776-61-8102
E-mail: kmiyamot@fmsrsa.fukui-med.ac.jp

から間葉系幹細胞を取り出し（図１Ａ），これを同系の３週齢・幼若ラット精巣に移植して，数週間経過させた．
この時期のラットの精巣は成体型のライディッヒ細胞が出現する時期であることから，移植した幹細胞は，その日本生殖内分泌学会雑誌（2005）10：21-2421他

間葉系幹細胞のin vivoにおける分化（Ａ）greenラット由来の間葉系幹細胞．（Ｂ）細胞移植前の幼若ラット精巣．
（Ｃ）細胞移植後，３週間経過したラット精巣．矢印は，生着したGFP陽性のgreenラット由来の細胞群を示す．
（Ｄ）（Ｃ）で示した精巣の切片の蛍光顕微鏡写真．GFP陽性細胞を示す．（Ｅ）（Ｄ）で示した切片を抗P450scc抗体で免疫組織化学を行った像．（Ｆ）（Ｄ）と（Ｅ）の像の重ね合わせた像．ST：精細管

AhumanCYP11A1 promoter

B

C1000

F1000

D

500

0%0%0SF-1500

3.7%

SCC37

SV40 e.p.

GH

E0Control

22

PURO-pA+55-2300

図２

EGFP-pA

P450scc-SCC+SCC

図１-SCC+SCC

矢澤 隆志

P450 11b1
P450 11b2

HSD3b1

LHR

HSD3b6ACTHRP450c17

GAPDH

P450c21

GFP

間葉系幹細胞のin vitroにおける分化（Ａ）プロモーターソーティングに用いた，ヒトCYP11A1遺伝子５'上流域によって，ステロイドホルモン産生細胞特異的にGFPを発現するベクターの模式図．ベクター導入後，クローン選抜の過程で出現したGFP陽性の間葉系幹細胞細胞（Ｂ，Ｃ）．コントロールベクター（Ｄ）並びにSCC-GFPベクター（Ｅ）導入クローンにおけるGFP陽性細胞の割合をFACSによる解析した．（Ｆ）セルソーターにより分離したGFP陽性細胞と（Ｇ）その抗P450scc抗体による免疫染色の像．（Ｈ）分離したGFP陰性（SCC-）並びに陽性（SCC+）細胞における各マーカー遺伝子の発現のRT-PCRによる解析．

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.102005

KUM9pIRES

C

CA

A C

SF7

SF9A

CA

(-)

testisDA

adrenal

骨髄由来間葉系幹細胞からステロイドホルモン産生細胞の作製

SF-1

StAR
P450scc
HSD3b1HSD3b6

BP450c17
HSD17b3
P450aro
P450c21
P450 11b1
P450 11b2
GAPDHCE

図３FGH

間葉系幹細胞へのSF-1の安定導入による分化（Ａ）ベクター未導入並びに，（Ｂ）コントロールベクターある
いは（Ｃ）SF-1発現ベクターを導入した間葉系幹細胞の顕微鏡写真．切り込みは，SF-1のウエスタンブロテ
ィングの像．
（Ｄ）間葉系幹細胞由来の各細胞株並びに精巣・副腎におけるステロイドホルモン産生酵素遺伝
子群のRT-PCRによる発現解析．cAMP未処理群（Ｃ）と処理した（Ａ）細胞群．SF-1導入後，cAMP未処理（Ｅ，Ｆ）並びに処理後７日（Ｇ，Ｈ）の間葉系幹細胞のDAPI（Ｅ，Ｇ）と抗P450scc抗体による免疫染色（Ｆ，Ｈ）の像

分化環境の下に置くことができるものと考えられる．移み 込 ん だ レ ポ ー タ ー ベ ク タ ー を 作 製 し（ 図 ２ Ａ ），植後，３週間が経過すると，GFP陽性細胞がrecipientのKUM9にトランスフェクションを行った．すると，クロ精巣内で生着し，間質にのみ存在した（図１Ｃ，Ｄ）．

ーン選抜の過程でKUM９中には，GFP陽性の細胞がわ

この細胞は，ステロイドホルモン合成の律速酵素であるずかながら現れた（図２Ｂ-Ｅ）．これらの細胞をソーテP450sccを発現していた（図１Ｆ）ことから，移植した

ィングにより分離し，P450sccの抗体染色を行ったとこ

細胞はライディッヒ細胞に分化していると考えられる．

ろ，陽性のシグナルが検出された（図２Ｆ，Ｇ）．さらに，

しかしながら，この方法では，プラスチックシャーレにさまざまなステロイドホルモン産生細胞のマーカー遺伝付着するという基準で間葉系幹細胞を濃縮していること

子の発現をRT-PCRで調べたところ，HSD3b6やLHRとから，ライディッヒ細胞に分化したと考えられる細胞がいったライディッヒ細胞のマーカーが検出された（図２

血球由来である可能性，ならびにcell fusionが起きていＨ）．よって，in vivoと同様に間葉系幹細胞はステロイる可能性が否定できない．

ドホルモン産生細胞（ライディッヒ細胞）に分化する能力を有することが分かった．

間葉系幹細胞のin vitroにおける分化

注 目 し た い 点 は， こ の 細 胞 が 核 内 レ セ プ タ ー のAd4BP/SF-1を発現している点である．この分子は，ス

そこで次に，マウスの骨髄から単離・株化した間葉系テロイドホルモン合成酵素群の発現を調節する転写因子幹細胞であるKUM９［10］が，in vitroでステロイドホであり，ステロイドホルモン合成細胞のマスタージーンルモン産生細胞に分化するか否かをプロモーターソーテではないかと考えられている［２］．そこでKUM９に，ィング法により調べた（図２）．生殖腺と副腎のステロAd4BP/SF-1の安定導入を行った（図３）．すると，ス

イドホルモン産生細胞特異的な遺伝子発現を司るヒトテロイドホルモン産生細胞の形態的指標である脂肪滴をCYP11A1プロモーター［10］をGFP遺伝子の上流に組細胞内に蓄積するようになった（図３Ｃ）．
しかしながら，MINI REVIEW

23

矢澤 隆志表他

８br-cAMP添加（+）または非添加（-）で培養したコントロール
ベクター（p IRES）ならびに、SF-1発現ベクター（SF9）導入間葉系幹細胞が培養液中に産生するステロイドホルモン濃度（ng/ml）
Cell(cAMP)progesterone

teststerone

estradiol

glucocorticoid

Aldosterone

pIRES-KUM9(-)

N.D

N.D

N.D

N.D

N.D

pIRES-KUM9(+)

N.D

N.D

N.D

N.D

N.D

SF9-KUM9(-)

N.D

N.D

N.D

N.D

N.D

SF9-KUM9(+)

24.3±4.25

1.6±0.29

N.D

N.D

N.D

1, N.D means for no detactable
2, Data are means and SEM values of at least duplicate assays.

これらの細胞はP450scc陰性であったことから，ゴナドトロピンのセカンドメッセンジャーであるcAMPを培養液に添加したところ，SF-1を導入した間葉系幹細胞はすべてがP450scc陽性となった（図３Ｅ-Ｈ）．RT-PCRによりP450scc遺伝子の発現をみたところ，やはりSF-1を導入し，cAMPを培養液に添加したときのみシグナルが検出できた（図３Ｄ）．さらに，その他のステロイドホルモン合成酵素の発現は，大方，精巣タイプ，つまりライディッヒ細胞に近かった．これらの結果から，間葉系幹細胞は，Ad4BP/SF-1の導入とcAMPの添加によってもライディッヒ細胞様の細胞に分化することが分かった．これは，これらの細胞が産生するステロイドホルモンが，プロジェステロンならびにテストステロンであったことからも支持されると考えられる（表）．
同様の実験をマウスのES細胞［11］を含む他の細胞群で行ったところ，StARやSR-BIといったコレステロールの輸送系を発現せずステロイドホルモンを作る細胞に分化しなかったが，ヒトの間葉系幹細胞［12］のみがステロイドホルモン産生細胞に分化した．ただし，これはラットやマウスの場合と異なり，コーチゾールを作る副腎皮質の細胞になった．

おわりにこのように，骨髄由来の間葉系幹細胞は，in vivoならびにin vitroでステロイドホルモン産生細胞に分化する能力を有することが分かった．ES細胞を初めとする他の細胞では，この能力がなかったことから間葉系幹細胞はステロイドホルモン産生細胞の研究のよいモデルであり，将来的にはステロイドホルモン産生組織の疾患に24

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.102005

おける再生医療への応用が期待される．
謝辞
ヒト間葉系幹細胞を提供していただいた京都大学医学部の戸口田淳也先生に厚く御礼を申し上げます．

文

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