研究フロンティア （平成18年度学術奨励賞受賞論文）

セルトリ細胞においてIL-1βはJNK経路を活性化し，一酸化窒素（NO）発現を亢進させる
石川智基１）２），Patricia L. Morris２），藤澤正人１）１）神戸大学大学院医学系研究科腎泌尿器科学分野
２）Center for Biomedical Research, The Population Council and The Rockefeller University

はじめに関わっていることは数多く報告されているが，精巣における具体的な機能については明らかでない部分が多い．

精子形成過程は，精原細胞が体細胞分裂ののち減数分NOは，血管拡張因子，神経伝達物質，殺菌あるいは殺裂を行い，第一精母細胞に分化し，さらに形態形成過程腫瘍因子などとして多彩な役割が注目されているフリーを経て精子に分化するという複雑な過程から成る．このラジカルであり，情報伝達物質である．そのNO合成酵過程のなかで，精巣内に存在する細胞間でさまざまな情素であるNitiric Oxide Synthase (NOS)には３つのアイ報伝達が行われ，造精機能を保っていると考えられる．

ソフォーム(iNOS, eNOS, nNOS)が存在し，それぞれ異精巣内細胞間の機能調節には，視床下部─下垂体─精巣なったシグナル伝達系を介してその発現が調整されてい軸 か ら の 調 節 と は 別 に， 精 巣 局 所 で の paracrine/る．ヒト精巣においてもiNOSおよびeNOSがライディッ

autocrine機構が存在すると考えられ，精子形成までのヒ細胞とセルトリ細胞において発現していることが認め分化機構は，支持細胞である体細胞のセルトリ細胞が非られている．われわれは男性不妊患者のセルトリ細胞に常に重要な役割を果たしている．この細胞からのエストおけるeNOSのpotential bioactivityについて組織免疫学

ラジオール，乳酸，トランスフェリンなどの分泌物は，的に示し，eNOSの発現が変性をきたした精細胞に強く精細胞の分化調節に影響を与える．それらの分泌物の産発現していることから，eNOSとアポト−シスの関連性生調節には，インターロイキン(IL)を含むサイトカインを報告している［４］．また，eNOS活性が精細胞のアや成長因子，バクテリアエンドトキシン（LPS）などがポトーシスに関与していることをeNOSトランスジェニ関与する．このうちIL-1βはセルトリ細胞自身からも分ックマウスを用いた停留精巣モデルにて明らかにした

泌されており，その分泌は，卵胞刺激ホルモン(FSH)に［５］．さらに，諸家によりiNOSと精細胞のアポト−シよる刺激，また精巣内の急性炎症が関与していることがスの関連性も報告されている．

分かっている．われわれはセルトリ細胞機能の調節には，神経細胞，軟骨細胞，マクロファージなど数多くの細このIL-1βを介したautocrine機構も関与している可能胞においてもNOとアポトーシスとの関連が報告されて性を報告した［1, 2］．さらにIL-1βはテストステロン産おり，精細胞においてもNOがアポトーシスに強く関与生に重要なライディッヒ細胞においても，一酸化窒素している可能性がある．このような結果は，NOならび(Nitiric Oxide: NO)の分泌に大きな影響を与えているこにNOSが精巣機能に重要な関わりがあることを示唆しとについてもすでに報告している［３］．IL-1βに関している．てはさまざまな細胞において分泌物とその経路が解明さ精細胞のアポトーシスに影響を与えると考えられるれているが，精巣内において経路とその役割は未知の部

NOについては，われわれはセルトリ細胞やライディヒ分が多く，解明が急がれている．特に精巣炎などの急性細胞におけるNO産生が円形精子細胞からの分泌因子に炎症後の精子形成障害にはさまざまな説があることがこより増加する細胞間情報伝達機構を解明している［６］．の理由として挙げられる．

さらに，NO自身の機能としてライディヒ細胞における近年，NOは勃起能をはじめ，生殖機能において深く連絡先：石川智基，神戸大学大学院医学系研究科腎泌尿器科学分野〒650-0017 兵庫県神戸市中央区楠町7−5−1
TEL: 078-382-6155
FAX: 078-382-6169
E-mail: iskwtmmt@med.kobe-u.ac.jp

テストステロン産生を抑制することも報告した．先に示したeNOSトランスジェニックマウスを用いた研究により，熱ストレスや酸化ストレスに関連する精子形成障害においてeNOSを制御することが有効な治療法になりうる可能性が示唆された［５］．
今回われわれは，精製分離したラットセルトリ細胞を日本生殖内分泌学会雑誌（2007）12：21-25

21石川 智基他

用い，NOならびにNOSの発現について解析し，シグナ

ルトリ細胞においてIL-1βは30分以内にリン酸化JNKをル伝達の経路について検討を加えた．免疫応答のバラン活性化したが，同じMAP kinaseグループであるリン酸スが崩れることによる精巣内の障害を，酸化ストレスと化p44/42-(ERK)，リン酸化p38MAPKを活性化させな活性酸素，活性窒素，フリーラジカルとの関与を通して，かった(図1A, B)．またリン酸化Akt，リン酸化JAK2な分子細胞，組織及び個体レベルで明らかにすることを主ども活性化を示さなかった．同様に抗COX-2抗体を用眼としている．本研究の最終的な目的は，精巣局所でのい，Western Blottingを行ったところ，COX-2蛋白量はparacrine/autocrine機構の制御因子の１つとしてNOにIL-1β刺激後1時間から有意な上昇を認め，6時間で50倍注目し，IL-1βによるセルトリ細胞の機能調節機構を解の増加を認めた(図1C, D)．しかしながらCOX-1は活性明することにより，造精機能障害に対する治療法確立を化を示さなかった．
JNKがCOX-2を誘導するか否かについて検討すべく，目指すことである．

IL-1β 刺 激 と 同 時 にJNK活 性 阻 害 剤 で あ るSP600125

リン酸化JNK，COX-2の活性化(10μM)を添加し，比較を行った．SP600125はIL-1β刺激により増加したリン酸化JNKとCOX-2蛋白レベル

The mitogen-activated protein kinases (MAPKs) グを有意に阻害した(図2A, B)．

ループは重要な細胞内伝達分子であり，extracellular

NO がprotectiveに働くか，それともdestructiveに働

signal-regulated kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal

くかはNOとROSのバランスによることがさまざまな細kinase (JNK), そしてp38 MAPKが含まれる．さまざま胞において示唆されている［12］．

な細胞においてNOのシグナリングにはこれらのキナー

IL-1β刺激が活性酸素を増やすかを検討する目的にゼが関与していることが知られている．近年Petersonらて，活性酸素のバランスをフローサイトメトリー法にて［７］は増殖期である８日齢のラットセルトリ細胞にお測定した．IL-1β刺激による活性酸素反応をIL-6刺激，いてIL-1βがp38 MAPKを活性化させることを示した．

そしてポジティブコントロールとしてH2O2刺激と比較

また膵頭細胞，心筋細胞，精子やグリア細胞においてした．さまざまな細胞においてIL-1βは活性酸素を増加

NO はCOX-2の活性化，アラキドン酸カスケードによさせることが報告されているが，セルトリ細胞においてるプロスタグランジンにより調節されることが示されては増加しなかった．それどころか，活性酸素量に関して，いる［8-11］．

逆に抗炎症の役割を示していることが示唆された．IL-6

われわれは18日齢SD雄ラットより精巣を摘出し，セ刺激にても活性酸素の量は増加しなかった(図2C)．

ルトリ細胞を精製分離，培養の後，３日目にIL-1β(10ng/ml)刺激を加えた．刺激されたセルトリ細胞より蛋白を抽出し，Western Blotting法を用いて分析した．セ

図１22

日本生殖内分泌学会雑誌(A)リン酸化JNK (phospho-JNK; 54- と46 kDa)の2つのバンドが30分以内に活性化している．
(B)IL-1b刺激によりJNK経路が30分でコントロール群に比し4.1倍と有意に活性化が起こった．
(C)COX-2蛋白量はIL-1β刺激後1時間から有意な上昇を認め，(D)6時間で50倍の増加を認めた．(* p<0.05)

Vol.122007

セルトリ細胞においてIL-1βはJNK経路を活性化し，一酸化窒素（NO）発現を亢進させる

セルトリ細胞におけるIL-1β刺激によるNO生成はJNK経路を介するた．NO生成と細胞外への分泌はCOX-2阻害剤であるNS-398(10μM)添加では阻害されなかったが，SP600125添加にて有意にNO濃度の上昇が阻害された．なおFSH,セルトリ細胞におけるIL-1β刺激によるNO生成を測

forskolinにてはNO生成の増加はみられなかった(図３)．

定するために，セルトリ細胞培養液をGriess法により評

セルトリ細胞は主に内分泌的にゴナドトロピンのFSH価した．リン酸化JNKの活性化はIL-1β刺激後30分以内による調節を受けているが，本実験系においてはFSHに起こり，この時間に一致して細胞内のNO濃度の有意あるいはforskolin刺激にてiNOS, NO 生成は増加しなかな上昇がみられた(data not shown)．IL-1β刺激により，った．

培養液内のNO濃度が24時間以内に８倍と増加を示し

JNKは細胞外からの刺激に対してc-Jun, AP-1, activating

図２

SP600125はIL-1β刺激により増加したリン酸化JNK(A)とCOX-2蛋白レベル(B)を有意に阻害した．フローサイトメトリーを用いてIL-1β刺激による活性酸素反応をIL-6刺激，そしてポジティブコントロールとしてH2O2刺激と比較した．

図３

セルトリ細胞におけるIL-1β刺激によるNO生成の評価．IL-1β刺激によりNO濃度が24時間以内に8倍と増加を示した．このNO濃度の上昇はNS-398添加では阻害されなかったが，SP600125添加にて阻害された．
なおFSH, ForskolinにてはNO生成の増加はみられなかった．
(* p<0.05, Ctに比し）（†p<0.05, IL-1β刺激に比し)研究フロンティア23石川 智基

他

図４IL-1β刺激によるiNOS mRNAレベルの変化をRT-PCR法にて定量した(A, B)．iNOS, eNOSの蛋
白量の変化をWestern blotting法にて定量した(C, D)．(* p<0.05)

transcription factor-2 (ATF-2), nuclear transcription
factor-κB (NF-κB)やhistone modificationsなど数多くのtranscription factorを活性化する［13-17］．IL-1β刺
激はNF-κBとDNA結合を調節することが分かっている． 最 近 のtransformed and transfected immortalized
cell linesにおいて，NF-κB p65サブユニットのチロシンニトロ化がactivityをおさえることが証明され［18］，肺上皮細胞やJurkat細胞において，サイトカインによるNFκBの調節はニトロ化を介して行われ，これによりNO濃度が調節されていることが報告されている［19］．
これらの調節機構は細胞特異的であると考えられ，セル＋トリ細胞においてはいまだにはっきりと解明されておらず，さらなる検討が必要であると考えられる．

セルトリ細胞においてIL-1β刺激によりiNOS発現が亢進する

図５

iNOS蛋白量の増加はNS-398添加では阻害されなかったが(A)，SP600125添加にて有意に上昇が阻害された(B)．(* p<0.05)

eNOSの蛋白量の変化をWestern blotting法にて定量した．IL-1β刺激によりiNOS蛋白，mRNA量は有意に増正常な状態において精巣内にiNOSは発現しており，加したが，eNOSに関して増加はみられなかった(図４)．

このことはNOが生理的に産生されていることを示してiNOS蛋白量の増加はNS-398添加では阻害されなかったいる．精子形成における複雑な過程において，iNOS活が，SP600125添加にて有意に上昇が阻害された(図５)．

性化によるNO産生はサイトカインやgrowth factorの生成，伝達に影響を及ぼしていることが示唆されているまとめ［20］．精細管内においてLPSによる精細胞の損傷，アポトーシスに伴いiNOSとNO発現レベルの上昇が認められている［12, 21］．

セルトリ細胞においてIL-1β刺激はJNK経路を介してiNOS発現を亢進させ，NOを生成する．これらの経路のわれわれの実験において，セルトリ細胞においてIL-概念は精巣内病態における新たな治療戦略上において重1β刺激によりNO濃度の増加がみられたが，IL-1β刺激

要な一部であり，セルトリ細胞におけるサイトカイン制によるiNOS mRNAレベルの変化をRT-PCR法，iNOS,御機構の解明は将来的に精子形成障害の治療に貴重な情24

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.122007

セルトリ細胞においてIL-1βはJNK経路を活性化し，一酸化窒素（NO）発現を亢進させる報を与えることが期待される．

文

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