学術奨励賞受賞論文

20α-水酸化ステロイド脱水素酵素ノックアウトマウスの生殖機能
石田真帆１），平林啓司２），鈴木正寿２），山内啓太郎２），西原真杉２）

１）山梨大学大学院医学工学総合研究部第一生理学教室
２）東京大学大学院農学生命科学研究科獣医生理学教室

要

約

娩にはその濃度低下が必須である［１］．齧歯類においては，妊娠末期，黄体でプロジェステロンの不活化酵素

20α-水酸化ステロイド脱水素酵素(20α-HSD）は，20α-hydroxysteroid dehydrogenase (20α-HSD）の活

プロジェステロンを不活性な20α-ジヒドロプロジェス性が著しく上昇し，プロジェステロン濃度が低下する．

テロン(20α-OHP）に代謝する酵素である．齧歯類で20α-HSD は NADP(H）を補酵素とし，プロジェステは主として黄体で発現し，プロジェステロン分泌を低下

ロンを生物活性のない20α-OHPに代謝する酵素である

させることにより妊娠・偽妊娠の終了，あるいは不完全［２］．20α-HSDの発現は黄体退行因子で分娩誘発剤と性周期（黄体相を欠く短い性周期）の成立に関与していして知られるプロスタグランジン(PG)F2αにより促進さると考えられている．また妊娠中・後期の子宮内でも発れるが，PGF2αレセプターノックアウト(KO）マウスに現が認められるが，その意義は不明である．本研究では，おいては妊娠末期，20α-HSDの発現上昇が見られず，20α-HSDの活性発現に必須なエクソン領域を欠失した

プロジェステロン濃度も低下しない［３］．したがって，ノックアウト(KO）マウスを作成してその表現型を解析

20α-HSD発現こそが分娩に必須であると推測できるし，20α-HSDの生物学的意義について検討した．性周が，PGF2α による黄体退行作用には20α-HSDを介さな期の回帰において，KOでは野生型(WT）よりも発情休いものも知られているため，分娩の発来に20α-HSDが止期が有意に延長していた．偽妊娠末期，血中プロジェどれほど貢献しているかは明らかではない．一方，ラッステロン濃度はWTとほぼ同時期に低下したが，偽妊娠

トでは性周期中には機能的に退行した黄体由来の血中期間は有意に延長した．妊娠末期の血中プロジェステロ

20α-OHP濃度が高いことから［４］，20α-HSDが性周ン濃度の低下や妊娠期間にはKOとWTで差は認められ期黄体の機能的退行因子であり，齧歯類に特徴的な不完なかった．しかし，KOでは生存産子数がWTに比べて全性周期の成立に関わると考えられている．さらに偽妊有 意 に 減 少 し て い た． 以 上 よ り， マ ウ ス に お い て娠末期にもプロジェステロン濃度の低下に伴い発現が上20α-HSDは性周期や偽妊娠の回帰に重要な役割を果た

昇することから［５］，20α-HSDは齧歯類におけるプしていることが確認されたが，プロジェステロン濃度のロジェステロンの不活化に大きく貢献すると考えられ低下には20α-HSD以外の因子も関与していることが示る．また，黄体以外にも，筆者らは妊娠中・後期の子宮唆 さ れ た． さ ら に， 妊 娠 後 期 に 子 宮 内 で 発 現 す る

内膜上皮細胞において20α-HSD mRNAの発現を20α-HSDが胎子の生存に関与していることが示され，hybridization法により検出した［６］．妊娠期子宮には20α-HSDの生殖機能制御における新たな意義が見い出妊娠維持に必須の作用を有する高濃度のプロジェステロされた．

ンが作用しており，20α-HSDのプロジェステロン不活化作用がどのような意義をもつのか興味深い．
本研究は，はじめに齧歯類の生殖周期における黄体の機能的退行因子としての20α-HSDの重要性，および高濃度のプロジェステロ

プロジェステロンは妊娠の成立・維持に必須のステロンの影響下にある妊娠子宮におけるプロジェステロン代イドホルモンであり，妊娠中高濃度に維持されるが，分謝因子としての20α-HSDの役割を調べることを目的に，20α-HSD KOマウスを作成し，その表現型の解析

連絡先：石田真帆，山梨大学大学院医学工学総合研究部第一生理学教室，〒409-3898 山梨県中巨摩郡玉穂町下河東1110
TEL & FAX: 055-273-6730
E-mail: mahoi@yamanashi.ac.jpを行ったものである．

日本生殖内分泌学会雑誌（2004）9：35-3835

石田 真帆他

図１20α-HSD KOマウスの作出
Ａ．ターゲティングストラテジー
Ｂ．Southem blottingによる相同組換え体の解析

20α-HSD KOマウスの作成てはまったく活性が認められなかったことから，KOにおいて20α-HSDの触媒活性が欠失していることを確認

全長約18kbのマウス20α-HSD genomic DNAを129/した．20α-HSD cDNAの全長をプローブとして用いた

SvJ mouse genomic libraryからクローニングし［７］，Northern hybridizationにより，KOにおいてはWTよりターゲティングベクターの作成に用いた．20α-HSDがも短い転写産物が検出されたが，シークエンシングによ属するaldo-keto reductase superfamilyでは，触媒活性り配列を調べた結果，エクソン２-４をスキップした転に 必 須 の ア ミ ノ 酸，Asp50，Tyr55，Lys88，His117が写産物であった．また冷却CCDカメラを用いた卵巣の保存されていることから，20α-HSDにおいてこれらア凍結切片の観察により，黄体においてEGFPの蛍光を検

ミノ酸をコードするエクソン２-４を欠失させるように，出したことから，ターゲティングベクターが20α-HSD相同組換え用のターゲティングベクターを構築した（図の遺伝子座で機能していることを確認した．

１Ａ）．ターゲティングベクターにはネオマイシン耐性
遺 伝 子 の 他，EGFP 遺 伝 子 を 組 み 込 み，20α-HSD

20α-HSD KOマウスにおける生殖機能の解析

promoterの活性化がEGFPの蛍光により確認できるようにした．Southern blottingにより相同組換え体を選出し性周期の回帰を，腟スメア法により14日間解析した．

（図１Ｂ），C57BL/６Jと戻し交配した．ターゲティング

WTにおいても，規則的な４日周期を示す個体は多くはの可否は，20α-HSDの発現が高まる分娩確認日の卵巣なかったが，KOではWTに比べて発情休止期の連続日を用いて確認した．卵巣サイトゾル中の20α-HSD活性数が約1.5日間有意に延長した（表１）．齧歯類では黄体を，NADPHの産生を指標に測定した結果，KOにおいは形成後まもなく機能的に退行し，引き続いて形態的に36

日本生殖内分泌学会雑誌

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20α-水酸化ステロイド脱水素酵素ノックアウトマウスの生殖機能

表１20α-HSD KOマウスにおける，性周期中連続した発情休止期の日数，偽妊娠期間，妊娠期間の変化

表２20α-HSD KOマウスにおける産子数の変化

PGF2αの黄体退行作用も重要であることが明らかになった．PGF2α の黄体退行作用には，20α-HSDの発現誘導
以 外 に も，steroidogenic acute regulatory proteinも退行するため，実質的な黄体相を欠く．偽妊娠や妊娠（StAR）の抑制［９］，アポトーシス誘導［10］，LH作

期にみられる黄体相は，子宮頸部刺激により誘起される用の抑制［11］，endothelin-1の発現による血管収縮［12］プロラクチンサージにより新生黄体における20α-HSDなどがあり，これらの作用が分娩時のプロジェステロンの発現が抑制されることにより導入されると考えられて濃度低下に寄与しているものと推測される．

いるが［８］，KOにおいて発情休止期の延長が1.5日間

分娩後，KOにおいては死亡している産子がしばしばに止まったことから，マウス性周期黄体の退行および偽みられた．死亡していたものも合わせた全産子数には妊娠・妊娠期の導入がどのように制御されているのかはKOとWTで有意な差は認められなかったが，死亡産子今後の興味ある課題である．

を除いた生存産子数を比較すると，KOの産子数はWT

精管結紮した雄と交配し，腟栓を確認した日を０日目

よりも有意に減少していた（表２）．妊娠10日目頃の胎として，偽妊娠を誘起した．RIA法により血中ステロイ

盤 内 や 妊 娠 中・ 後 期 の 子 宮 内 膜 上 皮 細 胞 に お い て

ド濃度を測定した結果，KOでは偽妊娠末期に特徴的な20α-HSD mRNAの発現が検出されることから［６］，20α-OHP濃度の上昇が認められず，常に低値を維持し今回の結果はマウスの妊娠子宮内において発現するた．しかしKOにおいてもプロジェステロン濃度は着実20α-HSDが胎子の発育・生存に重要な役割を果たしてに減少し，次回の腟栓形成も確認した．雄を常時同居さいることを示唆している．とくに子宮内膜上皮細胞におせた場合の腟栓形成間隔は，KOではWTに比べて約2.5いて，エストロジェンによる細胞増殖促進作用をプロジ日間，有意に延長した（表１）．ただし延長は認められェステロンが抑制することが知られている［13］ことかたものの，KOにおいてプロジェステロン濃度はWTとら，妊娠後半期での子宮内膜上皮細胞の増殖，あるいは同様10日目頃には基底レベルまで低下しており，また胎盤機能に20α-HSDが関わる可能性が考えられる．

WTにおいても20α-OHP濃度が上昇し始めるのはプロジェステロン濃度が基底レベルにまで低下した後であっおわりにた．20α-HSD活性が欠失しているKOでも10日目以降プロジェステロン濃度は低値を維持しているため，KOで本研究の結果からは，黄体で発現する20α-HSDは黄腟栓形成が遅延した理由については今後さらに検討が必

体の機能的退行において，とくに偽妊娠末期と妊娠末期要である．

では必須の因子ではなかった．これは同じ齧歯類である妊娠末期においても，KOではWTにみられるようなラットでの20α-HSD研究に基づいた，20α-HSDが黄20α-OHP濃度の上昇はなく，低値を推移したが，偽妊体の機能的退行における重要因子であるというこれまで

娠同様，KOにおいてもプロジェステロン濃度は低下し，の見解からすると，意外な結果であった．しかし，KO分娩可能であった．妊娠期間にも，KOとWTに差はみ

では性周期および偽妊娠期における発情休止期が有意にられなかった（表１）．20α-HSD発現は，PGF2αにより延長するという結果を得た．齧歯類における不完全性周転写因子Nur77を介して促進される［３］．プロジェス

期は，多産動物として進化的に獲得した繁殖戦略と考えテロン濃度が低下せず分娩に至らなかったPGF2αレセプ

られている．その意味で，本研究における20α-HSD

ターKOマウスの結果と本研究の結果より，分娩時プロKOマウスにみられた性周期中発情休止期の期間およびジェステロン濃度の低下には，20α-HSDを介さない偽妊娠中次回交尾までの期間が延長したことは，交尾の学術奨励賞受賞論文37

石田 真帆他

機 会 を 多 く 獲 得 す る と い う 繁 殖 戦 略 に お い て，20α-HSDが貢献していることを示すものとなった．さらに，KOにおいて産子の数が減少していたことから，胎子の発育と生存における20α-HSDの新たな役割を見い出すことができた．これらの現象のさらに詳細なメカニズムの解明が，今後の課題である．
謝辞
第８回日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞し，またこのような執筆の機会をいただきましたことを大変光栄に存じます．学会理事長 青野敏博先生，広報担当理事 峯岸 敬先生
はじめ学会役員の諸先生に感謝いたします．本研究の遂行にあたり，多大なご指導をいただきました西原真杉先生，高橋迪雄先生，山内啓太郎先生，岩倉洋一郎先生をはじめ，教室員のみなさまにこの場をお借りして心よりお礼を申し上げます．

文献

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