研究フロンティア

内分泌攪乱物質AtrazineはSF-１依存性にアロマターゼ転写活性を誘導する
柳瀬敏彦１），范呉強１），小松朋子２），諸橋憲一郎２），高柳涼一１），名和田

新３）１）九州大学大学院医学研究院病態制御内科
２）自然科学研究機構基礎生物学研究所
３）九州大学大学院医学研究院

はじめに激下でのSF-1依存性ArPII転写活性をさらに増強することが判明した．さらのこの２化学物質は単独でSF-1依除草剤のatrazineは米国で最頻用の除草剤であり，お存性にArPII転写活性を濃度依存性に増強したが（図１

そらく世界中でも最頻用と考えられているが，その使用A），10-5Mにおけるその強度はfoskoliin単独の強度より，の是非をめぐり，論争の渦中にある．土壌や表面水のも若干弱めであった（図１B）．また，NIH３T３細胞にっともありふれた汚染化学物質として［１］，その広範SF-1を発現導入しなければ，atrazine/simazineによるな使用が野生ガエルの世界的な減少を含め，生態系へのこのような効果は認められなかった（図１C）．

さまざまな影響を及ぼす可能性が懸念されている［２］．

同様の検討をわれわれ自身が樹立したaromatase発現Atrazineがaromatase活性の上昇作用を介してオスガエ細胞であるヒト卵巣顆粒膜細胞株KGN［６］とヒト副ルのメス化，半陰陽や不妊を引き起こす可能性が指摘さ

腎皮質際細胞癌株H295R細胞を用いて検討した．その結れているが，aromatase活性の上昇に関しては異論もあ果，すでにわれわれ自身が報告しているように［７］，る．一方では，ヒトにおいても精子数の減少との関連を

KGN細胞ではatrazine/simazineによるArPII活性の増強示唆する報告やエストロゲン依存性癌との関連で，その効果が認められなかったが，H295R（副腎癌細胞）では井戸水汚染と乳癌との関係［３］やatrazine製造工場の既 報［８］ の と お り atrazine に よ る H295R 細 胞 の周辺における高率の前立腺癌の発生［４］等も指摘され，aromatase活性の上昇を確認した（図２A）．この違いが懸念されている．今回，われわれは，chloro-s-triazine

何に由来するかを検討するために内因性のSF-1発現量系の除草剤であるatrazine/shimazineは細胞環境によっをRT-PCRにて比較検討したところ，H295RではKGNてはaromataseの活性化を引き起こすこと，すなわち細胞に比べ，約60倍の内因性SF-1の高発現を認めた（図SF-1/Ad4BP（以下SF-1）の高発現がその活性化には２B）．またWestern blottingによる蛋白レベルにおける必須であることを見い出したので，その機序の解析とと検討でも同様であった．

もに報告する．

そこでアデノウイルスによる発現系を用いてKGN細胞にAdx-bSF-1［９］を感染導入させ SF-1 を過剰発

結果

現 さ せ た と こ ろ，atrazine/simazineに よ りP450arommRNAレベルも，アロマターゼ活性レベルも（図３A）

われわれは以前，NIH3T3細胞にSF-1を遺伝子導入し上昇を認めた．一方，コントロールのAdx-lacZの発現た 系 に お い て，forskolin は SF-1依 存 性 aromatase

導入では，以上の効果は認められなかった．すなわち，promoter II（ArPII）活性（ルシフェラーゼアッセイにSF-1の発現量の増加に伴いatrazine/simazineに対するよる）を増強することを見い出し報告した［５］．今回，aromatase遺伝子の反応性を回復させ得ることが判明し56種類の内分泌攪乱候補物質のうち，この系に干渉するた．

化 学 物 質が 存 在 するか否 かを検討した．その 結 果，

次にH295R細胞におけるArPIIプロモーターとSF-1のatrazine/simazineが，NIH3T3細 胞 に お け るfoskolin刺相 互 作 用 を 既 報［10］ の ご と く，SF-1抗 体 を 用 い たChromatin Immunoprecipitation assay（ChIP assay）

連絡先：柳瀬敏彦，九州大学大学院医学研究院病態制御内科〒812-8582 福岡市東区馬出3-1-1
TEL: 092-642-5276
FAX: 092-642-5297
E-mail: yanase@intmed3.med.kyushu-u.ac.jp

にて行った．10-5M atrazine/simazineは10-6M forskolinほど強力ではなかったものの，SF1-ArPIIの相互作用を増強することが判明した．またaromatase promoter II
4Kbの欠失変異を用いた検討から，ArPIIの-516bp断片

日本生殖内分泌学会雑誌（2006）11：49-5249

柳瀬 敏彦他(A)

Atrazine

15

12.5
9.4

107.3

5.56 5.55
5.56
5.55

12.5

6

9.4

7.1

2.50
2.50

522.58

内因性 SF1 mRNA
(Real Time PCR )60

2.312.5++20EtOH AtraSima

200.5

1000SimazineTokyo）による表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いて精 製 SF-1蛋 白 と 内 因 性 リ ガ ン ド16PC（１ , ２16PCとの結合を検討したところ，強度の結合を認めた

30

1.00

1.0biosensoring system（Biacore,びに化学物質との結合の有無を検討した．精製SF-1と40Atrazine+4-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine） な ら

53.83

50

2.0DMSO+SF1

固定後，Biacore T100(B)Atrazine/SimazineはH295RのArPII 活性を（SF1の外因性発現なし）上昇させる
Relative Luciferase Activity-DMSO
FK(10 -6- M） Sima(10 --5 M）
DMSO Atra（10 -5M)

pcDNA（pcDNA（ no SF-1)

6atrazine/simazineはNIH3T3細胞においてSF-1依存性にArPII転写活性を増強する．
NIH3T3細胞にArPII-Luc並びにpcDNA3.1（control）あるいはpcDNA3.1-hSF-1を遺伝子導入し，ルシフェラーゼアッセイを行なった．
（A）濃度依存性（B）Forskolinとの強度比較（C）SF-1発現導入の有無での比較（化学物質濃度は10-5M）(A)

1.50.60
0.60

0SF1DMSO 10-7M 10-6M 10-5M

ArPII -Luc-

6.98
6.98

80

3.0

Atrazine/SimazineはSF-1発現下においてのみAr活性PIIを増強

17.820

図１

Forskolinとの強度比較

1017.7

Simazine(C)

Relative Luciferase Activity

Relative Luciferase Activity

SF1-依存性ArPII活性の増強はAtrazine 濃度に依存(B)（ 図 ４A）． 一 方，atrazineもSPR値 は 低 い な が ら も，
H295R

1.00

SF-1との濃度依存性の結合を認め（図４B），SF-1の弱KGN

い外因性リガンドである可能性が示唆された．一方，

図２ （A）H295R細胞ではSF-1の外因性発現なしにArPII活性が上昇（濃度は10-５M）．
（B）H295R細胞とKGN細胞におけるreal-timePCRによる内因性SF-1mRNAの発現比較．

shimazine お よ び ネ ガ テ イ ブ コ ン ト ロ ー ル のp-nitrotolueneとSF-1の結合を認めなかった．

考察中のSF-1サイトはatrazineによるArPIIの活性化に必須

atrazine/shimazineがaromatase活性を上昇させるかであることが判明した（図３B）．atrazine/simazineが否かについては論争があり，細胞によっては上昇させ，SF-1依存性のArPII活性を増強する機序として，SF-1細胞によっては不変であるとの報告がなされていた発現量を変化させる可能性はWestern blottingにより否［７，８］．今回の研究において，SF-1発現量の低いKGN定された．

細胞では，atrazineの効果が認められないのに対し，われわれは，atrazine/shimazineがSF-1と結合しうる

KGN細胞の60倍以上のSF-1の高発現を認める副腎皮質か否かをBiacoreT100システムによる表面プラズモン共細胞癌H295R細胞では，atrazineによりaromatase活性鳴（surface plasmon resonance, SPR）法を用いて検討の上昇を認めること，その差異は，KGN細胞へのSF-1した．SF-1蛋白の産生と精製は，既報［11］のごとく，導入実験からSF-1の発現量の差異によって生じている

baculovirus の 系 を 用 い て 行 っ た． 精 製 SF-1はことを明らかにした．報告者によるaromatase活性の上amincoupling法 に よ りsensor chip（CM5, Biacore） に昇に関する結論の差異もこの点に起因する可能性があ50

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.112006

内分泌攪乱物質AtrazineはSF-１依存性にアロマターゼ転写活性を誘導する

(A)

(B)

Aromatase活性350

Adeno --LacZ

300

304.19Adeno -SF-1

2.5

LacZ

SF-1

1.90

1.92

307.39
2.0

250
200

Folds of induction

160.35
1.5

150
100
500

1.0
25.03

22.68

0.91

22.05

0.88

0.5

DMSO Atrazine Simazine

Atrazine Simazine

3.0

RLA Folds induced by Atrazine

Enzymatic activity

Atrazine 刺激下でのArPII プロモーター（4Kb））の欠失と転写活性（ H295R 細胞）

2.58

2.52.23
2.122.03

2.01.37

1.51.04k

3.1 k2kk

516 516 -SF1-M

図３ （A）Adx-SF1導入はKGN細胞のatrazine/simazineに対するaromatase活性の反応性を回復させる（濃度は10-5M）．
（B）ArPIIの-516 bp断片中のSF-1配列はatrazineによるArPIIの活性化に必須である．516SF-1-MはSF-1サイトへの変異導入コンストラクト．

(A)

Response (RU)

1200
1000
100uM

800
600
40050uM

200025uM
50-20080110140170

12.5uM
6.2uM
200 3.1uM

Time (sec.)(B)

Response (RU)

12825uM612.5uM

50uM

420-2-4

図４100uM

10050

1000uM

150200250

3.1 uMTime (sec.)

SPR法を用いた精製SF-1と16PC（内因性SF-1 リガンド）（A）あるいはatrazine（B）との濃度依存性の結合る．このことはきわめて重要で，ヒトにおいてSF-1高ン受容体として認識されてきた．ごく最近，その生理学発現という条件下では，aromataseの活性上昇により的意義はいまだ未解明であるが，リン脂質がSF-1の内atrazineが局所的な高エストロゲン環境を作り出す可能因性リガンドとして同定された［12, 13］．今回の研究で性 を 示 唆 し て い る． 臨 床 疫 学 的 に 懸 念 さ れ て い るは，その内因性リガンドの１つである16-PCがSF-1とatrazineとエストロゲン依存性癌の乳癌や前立腺癌との相互結合することを，in vitroにおける親和性研究によ関連が示唆される．って初めて示し得た．また，16PCに比べるときわめてSF-1は長い間，内因性リガンドが未同定のオーファ弱いが，atrazineはSF-1に結合することを示し，SF-1研究フロンティア

51

柳瀬 敏彦

他の外因性リガンドとして作用する可能生を提示した．
atrazine の aromatase 活 性 の 上 昇 機 序 と し て，phosphodiesterase活性の抑制を介したcAMPの上昇による機序が報告されているが［８］，それのみではなく，SF-1のリガンドとしてSF-1とaromatase promoter IIの相互作用を増強する機序も関与している可能性が示唆された．環境中には，このような未知のSF-1リガンドが存在し，生態系に少なからず影響を与えている可能性があり，今後の重要な検討課題と考えられる．

結語

atrazine/simazineによるヒトaromatase遺伝子の転写活性化は，aromatase promoter IIを介して転写レベルで起こり，その転写活性の刺激にはSF-1の高発現が，必須であった．atrazineとSF-1の直接的結合が認められたことから，atrazineは弱いながらもSF-1の外因性リガンドとして作用している可能性が示唆された．

文献

１．Kolpin D, Barbash J, Gilliom R（1998）Occurence of pesticides in shallow groundwater of the United States: Initial results from the National Water-Quality Assessment Program.
Environ. Sci Technol 32, 558-566．
２．Hayes T, Haston K, Tsui M, Hoang A, Haeffele C, Vonk A（2002）Herbicides: feminization of male frogs in the wild.
Nature 419, 895-896．
３．Kettles MA, Browning SR, Prince TS, Horstman SW（1997）
Triazine exposure and breast cancer incidence: An ecologic
study of Kentucky counties. Environ Health Perspect 105,1222-1227．
４．Maclennan P, Delzell E, Sathiakumar N, Myers SL, Cheng H,Grizzle W, Chen VW, Wu X（2002）Cancer incidence amongtriazine herbicide manufacturing workers. J Occup Environ
Med 44, 1048-1058．
５．Fan W, Yanase T, Wu Y, Kawate H, Saitoh M, Oba K, Nomura M, Okabe T, Goto K, Yanagisawa J, Kato S, Takayanagi R, Nawata H.（2004）Protein kinase A potentiates adrenal 4 binding protein/steroidogenic factor 1 transactivation
by reintegrating the subcellular dynamic interactions of thenuclear receptor with its cofactors, general control nonde-52

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.112006

repressed-5/transformation/transcription domain-associatedprotein, and suppressor, dosage-sensitive sex reversal-1 : alaser confocal imaging study in living KGN cells. Mol Endocrinol 18, 127-141.
６．Nishi Y, Yanase T, Mu Y, Oba K, Ichino I, Saito M, Nomura
M, Mukasa C, Okabe T, Goto K, Takayanagi R, Kashimura
Y, Haji M, Nawata H（2001）Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cellline, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology 142, 437-445.
７．Morinaga H, Yanase T, Nomura M, Okabe T, Goto K, Harada N, Nawata H（2004）A benzimidazole fungicide, benomyl, and its metabolite, carbendazim, induce aromataseactivity in a human ovarian granulose-like tumor cell line
（KGN）．Endocrinology 145, 1860-1869.
８．Heneweer M, van den Berg M, Sanderson J（2004）A comparison of Human H295R and rat R2C cell lines as in vitro
screening tools for effects on aromatase. Toxicol Letters 146,183-194.
９．Gondo S, Yanase T, Okabe T, Tanaka T, Morinaga H, Nomura M, Goto K, Nawata H（2004）SF-1/Ad4BP Transforms primary long-term cultured bone marrow cells into
ACTH-responsive steroidogenic cells. Genes to Cells 9,1239-1247.
10．Fan W, Yanase T, Morinaga H, Mu YM, Nomura M, Okabe
T, Goto K, HaradaN, Nawata H（2005）Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and retinoid X
receptor inhibits aromatase transcription via nuclear factorkappaB. Endocrinology 146, 85-92.
11．Komatsu T, Mizusaki H, Mukai T, Ogawa H, Baba D, Shirakawa M, Hatakeyama S, Nakayama KI, Yamamoto H, Kikuchi A, Morohashi K.（2004）Small ubiquitin-like modifier1（SUMO-1）modification of the synergy control motif of
Ad４4 binding protein/steroidogenic factor 1（Ad4BP/SF-1）
regulates synergistic transcription between Ad4BP/SF-1
and Sox9. Mol Endocrinol 18, 2451-2462．
12．Li Y, Choi M, Cavey G, Daugherty J, Suino K, Kovach A,
Bingham NC, Kliewer SA, Xu HE（2005）Crystallographic
identification and functional Characterization of phospholipids as ligands for the orphan nuclear receptor SteroidogenicFactor-1. Mol Cell 17, 491-502．
13．Krylova IN, Sablin EP, Moore J, Xu RX, Waitt GM, MacKayJA, Juzumiene D, Bynum JM, Madauss K, Montana V, Lebedeva L, Suzawa M, Williams JD, Williams SP, Guy RK,Thornton JW, Fletterick RJ, Wison TM, Ingraham HA（2005）
Structural analyses reveal phosphatidyl inositols as ligands
for the NR5 orphan receptors SF-1 and LRH-1. Cell 120,343-355．