Istruzioni per l’uso

LymphoTrack® Dx TRG Assay – MiSeqTM
Per l’identificazione e la tracciatura dei riarrangiamenti clonali dei geni codificanti per la catena gamma del recettore dellecellule T (TRG) utilizzando il sequenziamento di nuova generazione (NGS) con il sistema Illumina® MiSeq.
Questo saggio è per uso diagnostico in vitro.

Rappresentazione schematica del locus genico TRG:

Condizioni di conservazione: da -85 °C a -65 °C(I controlli di DNA possono essere separati dai kit del saggio e conservati a una temperatura compresa
tra 2 C e 8 C)

N. di catalogo
92270019
92270009

Prodotti
LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq
LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

Quantità
8 indici – 5 reazioni ciascuno
24 indici – 5 reazioni ciascuno

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Indice1.

DESTINAZIONE D’USO....................................................................................................................................................................................................... 3

2.

SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL TEST .................................................................................................................................................................................... 3

2.1.
2.2.
3.

PRINCIPI DELLA PROCEDURA .............................................................................................................................................................................................. 4

3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
4.

Termociclatore .............................................................................................................................................................................. 8
Supporto magnetico ...................................................................................................................................................................... 8
Strumento PCR real-time ............................................................................................................................................................... 8
Strumento Illumina MiSeq* ........................................................................................................................................................... 8

RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI ............................................................................................................................................................................ 9

6.1.
6.2.
6.3.
6.4.
7.

Componenti del reagente .............................................................................................................................................................. 6
Avvertenze e precauzioni .............................................................................................................................................................. 7
Conservazione e manipolazione .................................................................................................................................................... 7

STRUMENTI ................................................................................................................................................................................................................... 8

5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
6.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)...................................................................................................................................... 4
Purificazione degli ampliconi ......................................................................................................................................................... 4
Quantificazione degli ampliconi .................................................................................................................................................... 4
Sequenziamento di nuova generazione (NGS) .............................................................................................................................. 4
Multiplexing degli ampliconi ......................................................................................................................................................... 5

REAGENTI ..................................................................................................................................................................................................................... 6

4.1.
4.2.
4.3.
5.

Contesto ........................................................................................................................................................................................ 3
Sommario ...................................................................................................................................................................................... 3

Precauzioni .................................................................................................................................................................................... 9
Sostanze interferenti ..................................................................................................................................................................... 9
Requisiti e manipolazione dei campioni ........................................................................................................................................ 9Conservazione dei campioni .......................................................................................................................................................... 9

PROCEDURA DEL SAGGIO ................................................................................................................................................................................................ 10

7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
7.11.
7.12.
7.13.

Materiali forniti ........................................................................................................................................................................... 10
Materiali necessari (non forniti) .................................................................................................................................................. 10
Preparazione dei reagenti ........................................................................................................................................................... 10
Amplificazione ............................................................................................................................................................................. 11
Purificazione con AMPure XP ...................................................................................................................................................... 11
Quantificazione degli ampliconi .................................................................................................................................................. 13
Pooling e quantificazione della libreria ....................................................................................................................................... 14
Diluizione della libreria sottoposta a pooling .............................................................................................................................. 14
Preparazione della qPCR per la quantificazione della libreria ..................................................................................................... 14
Preparazione della libreria per la corsa di sequenziamento MiSeq ............................................................................................. 15
Caricamento della Cella a flusso MiSeq ....................................................................................................................................... 16
Impostazione del Foglio campioni MiSeq .................................................................................................................................... 16
Avvio della corsa MiSeq ............................................................................................................................................................... 17

8.

ANALISI DEI DATI ........................................................................................................................................................................................................... 17

9.

VALORI PREVISTI ........................................................................................................................................................................................................... 18

10.

LIMITI DELLA PROCEDURA ................................................................................................................................................................................................ 18

11.

INTERPRETAZIONE E REFERTAZIONE.................................................................................................................................................................................... 19

12.

DATI DEL CAMPIONE ...................................................................................................................................................................................................... 21

13.

CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI ..................................................................................................................................................................................... 21

14.

GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI ............................................................................................................................................................................ 22

15.

ASSISTENZA TECNICA E SERVIZIO CLIENTI ............................................................................................................................................................................. 23

16.

BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................................................................................................................. 23

17.

SIMBOLI...................................................................................................................................................................................................................... 23

18.

AVVISO LEGALE............................................................................................................................................................................................................. 24

19.

LYMPHOTRACK DX TRG ASSAY - MISEQ: GUIDA DI UNA SOLA PAGINA ...................................................................................................................................... 25

20.

APPENDICE A: CREARE UNA LIBRERIA DI SEQUENZIAMENTO CON PIÙ TARGET NGS........................................................................................................................ 26

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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1. Destinazione d’uso
Il LymphoTrack Dx TRG Assay per Illumina MiSeq è un prodotto diagnostico in vitro destinato al sequenziamento di nuova
generazione (NGS) per la determinazione della frequenza di distribuzione dei riarrangiamenti dei geni TRG in pazienti con
sospetta patologia linfoproliferativa. Questo saggio contribuisce all’identificazione dei disturbi linfoproliferativi.

2. Sommario e spiegazione del test
2.1.

Contesto
Il locus dei geni che codificano per la catena gamma del recettore delle cellule T umane (TRG, noto precedentemente
come TCRG), situato sul cromosoma 7 (7q14), include 14 geni Vγ (regione variabile) (Gruppo I, II, III e IV), 5 segmenti
genici Jγ (regione di giunzione) e 2 geni Cγ (regione costante) distribuiti su 200 kilobasi.
Le cellule linfoidi sono diverse dalle altre cellule somatiche dell’organismo; durante lo sviluppo, i geni dei recettori
antigenici delle cellule linfoidi vanno incontro a riarrangiamento genico somatico.1 Per esempio, durante lo sviluppo
dei linfociti T i geni che codificano per le molecole TRG vengono assemblati a partire da molteplici segmenti genici
polimorfici che vanno incontro a riarrangiamenti e selezione, generando combinazioni Vγ–Jγ che sono uniche sia in
termini di lunghezza che di sequenza. Poiché le leucemie e i linfomi hanno origine dalla trasformazione maligna di
singole cellule linfoidi, generalmente le cellule leucemiche e linfomiche di un soggetto condividono uno o più
riarrangiamenti cellula-specifici o “clonali” dei geni dei recettori antigenici. Pertanto, i test che permettono di rilevare
i riarrangiamenti clonali di TRG possono essere utili nello studio delle neoplasie maligne che coinvolgono i linfociti B e
T.
Inizialmente i riarrangiamenti clonali venivano identificati utilizzando tecniche basate su frammenti di restrizione e
ibridazione mediante Southern blot (RF-SBH). Tuttavia, questi test si sono rivelati complicati e impegnativi,
richiedevano grandi quantità di DNA e non erano adatti all’analisi di molti dei loci dei recettori antigenici meno
eterogenei.
Negli ultimi decenni, l’uso dei test RF-SBH è stato soppiantato dai test di clonalità basati su PCR sviluppati daAlexander Morley2 che attualmente sono considerati il metodo di riferimento. Questi test permettono di determinare
la clonalità sulla base della sovrarappresentazione di prodotti V–D–J (o prodotti D–J incompleti) amplificati, a seguitodella loro separazione mediante elettroforesi su gel o capillare. Benché siano sensibili e adatti all’analisi di piccole
quantità di DNA, questi saggi non permettono di differenziare rapidamente popolazioni clonali e riarrangiamenti
multipli che potrebbero nascondersi sotto un picco monodimensionale, né sono progettati per identificare lasequenza specifica di DNA V–J che è necessaria per la tracciatura delle popolazioni clonali nelle analisi successive.
Questa seconda limitazione può essere particolarmente importante dal momento che, una volta che la sequenza DNA
unica specifica per il clone è stata identificata, può essere utilizzata per test successivi per tracciare e seguire lepopolazioni di cellule clonali.

2.2.

Sommario
Questo LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq rappresenta un significativo miglioramento rispetto ai saggi di clonalitàesistenti che impiegano l’analisi dei frammenti, dal momento che permette di rilevare efficacemente la maggior partedei riarrangiamenti genici di TRG utilizzando una singola master mix multiplex e, contemporaneamente, diidentificare la sequenza di DNA specifica per ogni riarrangiamento genico clonale. Pertanto, questo saggio ha due usi
importanti e complementari: contribuisce al rilevamento delle popolazioni clonali iniziali e identifica informazioni disequenza necessarie per la tracciatura di tali cloni nei campioni successivi.
Ogni singola master mix multiplex per TRG ha come bersaglio le regioni conservate nelle regioni Vγ e Jγ descritte nei
tumori maligni linfoidi. I primer inclusi nelle master mix sono progettati con adattatori Illumina e fino a 24 indici
diversi. Questo metodo permette di eseguire una PCR one-step e di raggruppare in pool gli ampliconi derivanti dasvariati campioni e target diversi (generati con altri LymphoTrack Dx Assay per lo strumento Illumina MiSeq, venduti
separatamente) su una singola cella a flusso MiSeq, offrendo la possibilità di analizzare in parallelo fino a 24 campioni
per target in un’unica corsa.
Il LymphoTrack Dx Software – MiSeq associato offre un metodo di analisi e visualizzazione dei dati semplice ed
efficace. Seguendo le indicazioni fornite nella sezione 11: Interpretazione e refertazione, i risultati dei campioni
riepilogati nel software possono essere facilmente interpretati per determinare la presenza o assenza di clonalità.

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I risultati dei test molecolari di clonalità devono sempre essere interpretati nel contesto di dati clinici, istologici
e immunofenotipici.
Nel kit sono inclusi controlli positivi e negativi per la clonalità.
Nota: per spiegazioni più dettagliate riguardo al locus e alla strategia di sequenziamento mirata, consultare Miller J.E., 2013.3

3. Principi della procedura
3.1.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)
I saggi PCR vengono utilizzati solitamente per l’identificazione delle popolazioni di linfociti B e T clonali. Questi saggi
permettono di amplificare il tratto di DNA compreso tra primer che hanno come bersaglio le regioni V e J conservate
dei geni dei recettori antigenici. Questi primer hanno come bersaglio le regioni conservate e si trovano su entrambi i
lati di un’area in cui si verificano riarrangiamenti genetici programmati durante la maturazione di tutti i linfociti B e T.
Tali riarrangiamenti genetici sono all’origine della generazione di popolazioni diverse di linfociti B e T.
I geni dei recettori antigenici che vengono sottoposti a riarrangiamenti sono i loci della catena pesante (IGH) e dellacatena leggera (IGK e IGL) delle immunoglobuline nei linfociti B e i loci genici del recettore dei linfociti T (TRA, TRB,TRG e TRD) nei linfociti T. Ogni linfocito B e T presenta uno o due riarrangiamenti produttivi V–J che sono unici sia in
termini di lunghezza che di sequenza. Pertanto, quando il DNA di una popolazione normale o policlonale viene
amplificato utilizzando primer di DNA che affiancano la regione V–J, vengono generati ampliconi unici per quantoriguarda la lunghezza e la sequenza, che riflettono l’eterogeneità della popolazione. In alcuni casi, quando il DNA
linfocitario è assente, non viene generato alcun amplicone. In caso di campioni contenenti popolazioni clonali per
TRG, il risultato è costituito da uno o due prodotti preminenti amplificati aventi la stessa sequenza e lunghezza, che
vengono rilevati con una frequenza significativa, in un background policlonale ridotto.

3.2.

Purificazione degli ampliconi
Gli ampliconi PCR vengono purificati per rimuovere primer, nucleotidi, sali ed enzimi in eccesso impiegando latecnologia di immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) con biglie paramagnetiche per la purificazione ad alto
rendimento di ampliconi PCR. Utilizzando un tampone ottimizzato, i prodotti PCR con dimensioni di 100 bp o maggiori
si legano selettivamente alle biglie paramagnetiche mentre i contaminanti, quali dNTP non incorporati e primer,
dimeri di primer e sali in eccesso vengono lavati via. Gli ampliconi possono quindi essere eluiti e separati dalle biglie
paramagnetiche in modo da ottenere un prodotto PCR più purificato per l’analisi a valle e la quantificazione degli
ampliconi.

3.3.

Quantificazione degli ampliconi
Gli ampliconi purificati vengono quantificati utilizzando i KAPA™ Library Quantification Kit per le piattaforme Illumina.
Gli ampliconi PCR purificati e diluiti e un set di sei standard di DNA prediluito vengono amplificati con metodi
quantitativi (qPCR) utilizzando primer e master mix qPCR KAPA SYBR® FAST. I primer del kit KAPA hanno comebersaglio gli oligonucleotidi dell’adattatore della cella a flusso P5 e P7 di Illumina.
Il punteggio medio per gli standard di DNA prediluito viene tracciato nella tipologia di grafico log10 per generare una
curva standard che può quindi essere utilizzata per calcolare la concentrazione (pM) degli ampliconi PCR derivati dal
DNA campione. Il calcolo della concentrazione degli ampliconi di PCR permette di fare in modo che gli ampliconi
risultino ugualmente rappresentati nella libreria finale sottoposta a pooling che viene caricata sullo strumento MiSeq
per il sequenziamento.

3.4.

Sequenziamento di nuova generazione (NGS)
I metodi di sequenziamento di Sanger sono quelli più diffusi nella gamma di tecnologie di sequenziamento degli acidi
nucleici di “prima generazione”. Metodi più recenti, che sfruttano approcci di sequenziamento massivo in parallelo,sono spesso definiti come NGS. Queste tecnologie possono utilizzare varie strategie combinate di preparazione deltemplato, sequenziamento, imaging e bioinformatica per l’allineamento e l’assemblaggio del genoma.
Le tecnologie NGS utilizzate in questo saggio si basano sull’amplificazione di sequenze genetiche mediante una serie
di primer consenso diretti e inversi che includono tag costituiti da adattatori e indici. Gli ampliconi generati con lemaster mix LymphoTrack Dx vengono quantificati, raggruppati in pool e caricati su una cella a flusso per il

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sequenziamento con la piattaforma Illumina MiSeq. In particolare, i prodotti amplificati nella libreria sono ibridati aoligonucleotidi su una cella a flusso e sono amplificati per formare colonie clonali locali (amplificazione
collegamento). Vengono aggiunti quattro tipi di basi terminatori reversibili (basi RT) e il filamento di sequenziamentodel DNA viene esteso di un nucleotide alla volta. Per registrare l’incorporazione di nucleotidi, una telecamera CCD
scatta un’immagine della luce emessa quando viene aggiunta una base RT e quindi scissa per consentirel’incorporazione della base successiva.
3.5.

Multiplexing degli ampliconi
Questo saggio è stato progettato per consentire due diversi livelli di multiplexing, al fine di ridurre i costi e i tempi dilaboratorio. Il primo livello di multiplexing deriva dagli indici multipli che vengono forniti con i saggi. Ognuno di questi
24 indici agisce come un codice a barre univoco che consente di raggruppare in pool gli ampliconi di singoli campioni
dopo l’amplificazione PCR per generare la libreria di sequenziamento. Le sequenze ottenute sono ordinate dalsoftware bioinformatico per identificare quelle originate da un singolo campione.
Il secondo livello di multiplexing deriva dalla capacità del software associato di ordinare i dati di sequenziamento sia
per indice sia per target. Ciò consente di raggruppare in pool gli ampliconi ottenuti con primer mirati (anche quelli
contrassegnati con lo stesso indice) per generare la libreria che deve essere sequenziata su una singola cella di flusso.
Un esempio potrebbe essere il sequenziamento contemporaneo di prodotti di diversi kit di Invivoscribe LymphoTrack
Dx Assay per lo strumento MiSeq quali Leader IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG. Quando si esegue ilmultiplexing di ampliconi di geni bersaglio diversi, è importante utilizzare una chimica di sequenziamento
adeguata. Il numero di cicli di sequenziamento deve essere sufficiente a sequenziare l’amplicone maggiore
presente nella multiplex. Per esempio, quando si esegue il multiplexing contemporaneo di una combinazione diampliconi IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG, utilizzare il kit di sequenziamento MiSeq v2 (500 cicli) per unmassimo di 4 geni target o il kit di sequenziamento v3 (600 cicli) per un massimo di 7 geni target. Quando si esegue ilmultiplexing di uno di questi ampliconi insieme a IGHV Leader, utilizzare il kit di sequenziamento MiSeq v3 (600 cicli).
Se si esegue il multiplexing contemporaneo solo di ampliconi IGH FR3 e TRG, entrambi con dimensoni ridotte degli
ampliconi, utilizzare il kit di sequenziamento MiSeq v2 (300 o 500 cicli) e regolare le impostazioni del ciclo sul foglio
campioni. Per ulteriori istruzioni, consultare l’Appendice A (sezione 20).
Il numero di campioni che può essere sottoposto a multiplexing su una singola cella a flusso dipende anche dalla cellaa flusso utilizzata. Le celle a flusso standard di Illumina (MiSeq v3) possono generare tra i 22 e i 25 milioni di read. Per
determinare il numero di read per campione, dividere il numero totale di read per la cella di flusso per il numero dicampioni che saranno sottoposti a multiplexing e il numero di read per ciascun campione sarà sufficiente per
un’interpretazione valida. Per maggiori informazioni, consultare la sezione 11: Interpretazione e refertazione. Illumina
produce anche altre celle a flusso che utilizzano la stessa chimica di sequenziamento, ma generano un numero
inferiore di read. Quando si utilizzano queste celle a flusso alternative, si deve considerare che un numero inferiore
di read totali equivale a una minore profondità per campione o a un minor numero di campioni che possono essere
analizzati sulla cella a flusso per ottenere la stessa profondità per campione.

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4. Reagenti
4.1.

Componenti del reagente

Tabella 1. Kit disponibili

N. di catalogo

Descrizione

N. di master mix indicizzate

Reazioni totali

92270019

LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq

8 indici – 5 corse di sequenziamento ciascuno

40

92270009

LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

24 indici – 5 corse
di sequenziamento ciascuno

120

Tabella 2. Componenti del kit

Reagente

Componenti delreagente

DNA di controllo
positivo

92270019
N. di unità

92270009
N. di unità

TRG MiSeq 01

1

1

TRG MiSeq 02

1

1

TRG MiSeq 03

1

1

TRG MiSeq 04

1

1

TRG MiSeq 05

1

1

TRG MiSeq 06

1

1

TRG MiSeq 07

1

1

TRG MiSeq 08

1

1

TRG MiSeq 09

01

TRG MiSeq 1001

TRG MiSeq 11

0

1

0

1

0

1

TRG MiSeq 14

01

TRG MiSeq 15

01

TRG MiSeq 1601

TRG MiSeq 18

01

TRG MiSeq 19

01

TRG MiSeq 20

01

TRG MiSeq 21

01

TRG MiSeq 22

01

TRG MiSeq 23

01

TRG MiSeq 25

01

TRG MiSeq 27

0

1

1

3

TRG MiSeq 12

Master mixǂTRG MiSeq 13(

TRG POS (+)
42270019)

Quantitàunitaria

225 µL

45 µL

Temperatura diconservazione

Note

N/D

DNA di V11/ J1/2 diluito in
DNA della tonsilla
oppureDNA di controllo
negativo

NGS NEG (-)(
40920018)

45 µL

1

3

DNA della tonsilla, la frequenza
massima delle sequenze puòvariare da lotto a lotto

Nota: per la produzione di questi kit non sono stati utilizzati conservanti.
ǂNota: in questi kit non sono utilizzati gli indici 17, 24 e 26.

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4.2.

Avvertenze e precauzioni
Leggere attentamente le Istruzioni per l’uso prima di iniziare la procedura del saggio e seguire attentamente ogni
passaggio.
▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪

▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪
4.3.

Questo prodotto è per uso diagnostico in vitro.
Utilizzare il kit del saggio come un unico sistema. Non utilizzare reagenti di altri produttori. La diluizione,
la riduzione delle reazioni di amplificazione o altre deviazioni da questo protocollo possono influire sulleprestazioni di questo test e/o invalidare eventuali sublicenze limitate concesse con l’acquisto di questi kit.
I materiali sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta quando conservati e maneggiati comeindicato. Non utilizzare i kit oltre la data di scadenza.
Il rigoroso rispetto del protocollo garantisce prestazioni e riproducibilità ottimali. Utilizzare i programmi deltermociclatore corretti, poiché altri programmi potrebbero fornire dati imprecisi/errati, come risultati falsi
positivi e falsi negativi.
Non mescolare o combinare reagenti provenienti da kit con numeri di lotto diversi.
Smaltire i reagenti inutilizzati e i rifiuti in conformità alle normative nazionali, federali, statali e locali.
Tutte le procedure di laboratorio devono essere eseguite con dispositivi di protezione individuale standard(guanti, camici da laboratorio e occhiali protettivi). Seguire le buone pratiche di laboratorio e le precauzioni
universali quando si lavora con i campioni. Non pipettare con la bocca. Non mangiare, bere o fumare nelle aree
di lavoro del laboratorio. Lavarsi accuratamente le mani dopo aver maneggiato i campioni e i reagenti del saggio.
I campioni devono essere maneggiati in strutture di contenimento per la sicurezza biologica approvate e aperti
solo in cappe di biosicurezza certificate.
Per la preparazione del DNA del campione utilizzare solamente acqua per biologia molecolare.
A causa dell’elevata sensibilità analitica di questo test, è necessario prestare estrema attenzione per evitarequalsiasi contaminazione dei reagenti o delle miscele di amplificazione con campioni, controlli o materiali
amplificati. Utilizzare puntali per pipette resistenti agli aerosol e cambiare il puntale tra un campione e l’altro e
tra una dispensazione di reagenti e l’altra. Tutti i reagenti devono essere attentamente monitorati per lapresenza di segni di contaminazione (ad es. controlli negativi che danno segnali positivi). Smaltire tutti i reagenti
di cui si sospetta la contaminazione.
Per ridurre al minimo la contaminazione, indossare guanti puliti quando si maneggiano campioni e reagenti epulire regolarmente le aree di lavoro e le pipette prima di preparare la PCR.
Il flusso di lavoro nel laboratorio di PCR deve essere unidirezionale tra le distinte aree di lavoro: iniziare conla preparazione della master mix, passare alla preparazione del campione, quindi all’amplificazione e infine
al rilevamento. La sterilizzazione in autoclave non elimina la contaminazione del DNA. Evitare di portare DNA
amplificato nelle aree destinate alla preparazione dei campioni o delle master mix.
Tutte le pipette, i puntali delle pipette e qualsiasi apparecchiatura utilizzata in una determinata area devono
essere dedicati a quella zona del laboratorio.
Gli articoli che non sono monouso devono essere decontaminati in candeggina al 10% e risciacquati con acqua
distillata due volte in due momenti diversi prima di riportarli nelle aree di partenza.
Quando possibile, utilizzare materiale da laboratorio in plastica sterile usa e getta per evitare la contaminazione.

Conservazione e manipolazione▪
▪
▪
▪

Se il saggio non viene utilizzato immediatamente, conservarlo a una temperatura compresa fra -85 °C e -65 °C.
La temperatura di conservazione ottimale per i controlli di DNA è compresa fra 2 °C e 8 °C, ma il DNA può anche
essere conservato a una temperatura compresa fra -85 °C e -65 °C.
Tutti i reagenti e i controlli devono essere scongelati e passati al vortex o mescolati accuratamente primadell’uso per garantire che siano completamente risospesi.
A causa delle elevate concentrazioni di sali, le master mix per PCR sono sensibili ai cicli dicongelamento/scongelamento. Il numero di cicli deve essere limitato a un massimo di quattro.

Per eventuali domande, rivolgersi al personale tecnico Invivoscribe. Saremo lieti di aiutare ciascun utente a
determinare le proprie esigenze di conservazione ottimali.

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5. Strumenti
Gli strumenti specifici elencati di seguito sono raccomandati sulla base dei metodi utilizzati per la validazione di questo
saggio.
5.1.

Termociclatore▪
▪
▪

Uso o funzione: amplificazione dei campioni di DNA
Strumento raccomandato: Veriti™ Dx Thermal Cycler o equivalente
Caratteristiche prestazionali e specifiche:
o
o

▪
▪
5.2.

Seguire le procedure di installazione, utilizzo, calibrazione e manutenzione del produttore.
Consultare la sezione 7.4 Amplificazione per il programma del termociclatore.

Supporto magnetico▪
▪

Uso o funzione: purificazione dei prodotti PCR
Strumento raccomandato:
o
o
o

▪

▪

Biglie paramagnetiche di precipitato

Consultare la sezione 7.5 Purificazione con AMPure XP per i metodi di purificazione dei prodotti PCR.

Strumento PCR real-time▪
▪
▪

Uso o funzione: quantificazione dei prodotti PCR purificati
Strumento raccomandato: Applied Biosystems® 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument o equivalente
Caratteristiche prestazionali e specifiche:
o

▪
▪
5.4.

Ambion® Magnetic Stand 96* (AM10027)
Agencourt SPRIPlate® 96 Ring Super Magnet Plate* (A32782)
Thermo Fisher Scientific DynaMag™-96 Side Skirted Magnet* (12027)

Caratteristiche prestazionali e specifiche:o5.3.

Intervallo termico minimo: da 15 °C a 96 °C
Velocità di rampa minima: 0,8 °C/sec

In grado di rilevare la lunghezza d’onda del SYBR Green

Seguire le procedure di installazione, utilizzo, calibrazione e manutenzione del produttore.
Consultare la sezione 7.6 Quantificazione degli ampliconi per il programma PCR real-time.

Strumento Illumina MiSeq*▪
▪

Uso o funzione: libreria di DNA normalizzata in sequenza
Caratteristiche prestazionali e specifiche:
o
o

▪
▪

Compatibile con MiSeq Reagent Kit v2*
Compatibile con MiSeq Reagent Kit v3* quando si esegue il multiplexing

Seguire le procedure di installazione, utilizzo, calibrazione e manutenzione del produttore.
Per i parametri dello strumento MiSeq, consultare la sezione 7.11 Caricamento della Cella a flusso MiSeq,
7.12 Impostazione del Foglio campioni MiSeq e 7.13 Avvio della corsa MiSeq.
*Avvertenza: questi prodotti non sono provvisti di marchio CE.

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6. Raccolta e preparazione dei campioni
6.1.

Precauzioni
I campioni biologici umani possono contenere materiali potenzialmente infettivi. Tutti i campioni devono essere
maneggiati conformemente agli standard riferibili ai patogeni a trasmissione ematica e/o al livello di biosicurezza 2del proprio istituto.

6.2.

Sostanze interferenti
È noto che le seguenti sostanze interferiscono con la PCR:
▪
▪
▪
▪

6.3.

Requisiti e manipolazione dei campioni
▪
▪
▪

6.4.

Chelanti cationi divalenti
Puntali per pipetta a bassa ritenzione
EDTA (non significativo a basse concentrazioni)
Eparina

La quantità minima da caricare è di 50 ng di DNA di alta qualità (5 L di DNA del campione alla concentrazione
minima di 10 ng/µL).
Questo saggio permette di analizzare DNA genomico estratto e purificato. Il DNA deve essere quantificato con
un metodo specifico per DNA a doppio filamento (dsDNA) ed essere privo di inibitori di PCR.
Risospendere il DNA in una soluzione appropriata come TE 0,1X (Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0, preparata
con acqua per biologia molecolare) o sola acqua per biologia molecolare.

Conservazione dei campioni
I campioni devono essere conservati utilizzando un metodo che eviti la degradazione del DNA.

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7. Procedura del saggio
7.1.

Materiali forniti
Consultare la Tabella 2 per l’elenco dei materiali forniti.

7.2.

Materiali necessari (non forniti)

Tabella 3. Materiali necessari (non forniti)

Reagente/Materiale

DNA polimerasi

Reagenti necessari o consigliati/Produttori
Roche:• EagleTaq™ DNA Polymerase
oppureInvivoscribe:• FalconTaq DNA Polymerase o equivalente

N. di catalogo

Note05206944190
oppure5 U/μL60970130

Acqua per biologia molecolare

N/D

N/D

Senza DNasi / RNasi

Pipette calibrate

N/D

N/D

Devono essere in grado di misurare conprecisione volumi compresi tra
0,2 μL e 1000 μL

Piastre o provette per PCR

N/D

N/D

Senza inibitori della PCR / DNasi / RNasi

Puntali per pipette con filtro

N/D

N/D

Privi di pirogeni/RNasi/DNasi, sterili

Provette per microcentrifuga

N/D

N/D

Sterili

Kit di purificazione per PCR

Beckman Coulter, Inc:
• Agencourt AMPure XP

A63880N/D

Purificazione per PCR

Thermo Fisher Scientific:• Ambion Magnetic Stand 96• DynaMag-96 Side Skirted Magnet
oppureBeckman Coulter:• Agencourt SPRIPlate 96 Ring Super Magnet
Plate o equivalente

AM10027
12027
oppureA32782

N/D

Quantificazione di ampliconi elibreria

KAPA Biosystems:• KAPA Library Quantification Kit – Illumina

KK4824

N/D

Corsa MiSeq

Illumina:• MiSeq Reagent v2 kit (300 cicli) o v2 kit (500cicli)
oppure• v3 kit (600 cicli) quando si esegue ilmultiplexing•

Software MiSeq•

Cella a flusso standard

MiSeq Control Software v2.6 o versione più
recenteLocal Run Manager v2.0 o versione più
recente

N/D

N/D

N/D

N/D

Preparare una soluzione di Tris-HCl
10 mM, pH 8,0+0,05% Tween 20

Tampone A di diluizione

7.3.

MS-102-2002
oppureMS-102-2003
oppureMS-102-3003

Preparazione dei reagenti
Per garantire che i campioni di DNA non contengano inibitori della PCR e siano di qualità e quantità sufficienti a dar
luogo a un risultato valido, i campioni possono essere testati con Specimen Control Size Ladder Master Mix di
Invivoscribe (20960021 per la rilevazione ABI o
20960020 per la rilevazione su gel). Lo Specimen Control Size
Ladder ha come bersaglio vari geni e genera una serie di ampliconi di 100, 200, 300, 400 e 600 bp; ildimensionamento può variare di +/- 5 bp a causa delle dimensioni standard e/o delle differenze dello strumento. La
verifica dell'integrità del DNA è particolarmente importante per campioni difficoltosi, ad es. tessuto fissato informalina e incluso in paraffina (FFPE).

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Devono sempre essere utilizzati i controlli positivi e negativi per assicurarsi che il saggio sia stato eseguito
correttamente.
Predisporre sempre un controllo senza templato (NTC) per verificare l’eventuale presenza di contaminazione
durante il processo di preparazione della PCR.
7.3.1.
7.3.2.

Indossare dei guanti e rimuovere le master mix dal congelatore. Lasciare scongelare le provette; quindi
passarle delicatamente al vortex per mescolarle e poi centrifugarle molto brevemente.
In una cappa di contenimento o in una cappa per PCR pipettare 45 L da ogni provetta di master mix in una
piastra per PCR pulita (un pozzetto per ciascuna master mix e una master mix per campione).
▪
▪

7.3.3.
7.3.4.

Includere due controlli per ogni corsa (uno positivo e uno negativo) e un NTC.
Per l’NTC, utilizzare acqua per biologia molecolare come templato anziché DNA.

Aggiungere 0,2 L di DNA polimerasi Taq (a 5 U/L) in ogni pozzetto contenente le master mix aliquotate.
Aggiungere 5 L di DNA del campione (alla concentrazione minima di 10 ng/L), DNA di controllo o acqua per
biologia molecolare (NTC) ai singoli pozzetti contenenti le rispettive reazioni di master mix.
▪
▪

Pipettare 5-10 volte su e giù per mescolare.
Sigillare la piastra e porre nel termociclatore per PCR.
Tabella 4. Preparazione della reazione

7.4.

Reagente

VolumeMaster mix

45,0 μL

DNA polimerasi Taq

0,2 μLDNA del campione o di controllo

5,0 μL

Volume totale

50,2 μL

Amplificazione
7.4.1.

Amplificare i campioni con il programma PCR indicato nella Tabella 5.

Se viene eseguito il multiplexing di più target, fare riferimento all’Appendice A (sezione 20) per altri requisiti relativi al termociclatore peril LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.
Tabella 5. Programma PCR

Fase

Temperatura

Tempo

Ciclo

1

95 °C

7 minuti

1

2

95 °C

45 secondi

3

60 °C

45 secondi

4

72 °C

90 secondi

5

72 °C

10 minuti

1

6

15 C

∞

1

29x

Nota: impostare il coperchio riscaldato su 105 °C e il volume di reazione su 50 μL.

7.4.2.

7.5.

Una volta completato il programma di amplificazione, rimuovere la piastra PCR amplificata dal termociclatore.
Se non si procede immediatamente con i passaggi successivi, i prodotti di PCR possono essere conservati
a 4 °C per 1 giorno.

Purificazione con AMPure XP
La purificazione dei prodotti PCR dai campioni, i controlli positivi e negativi e i controlli senza templato è stata
eseguita durante la validazione del saggio utilizzando il sistema di purificazione per PCR Agencourt AMPure XP.

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Preparazione:
7.5.1.

Rimuovere il reagente AMPure XP dal frigorifero e lasciare che raggiunga la temperatura ambiente prima
di usarlo. Agitare delicatamente il flacone di Agencourt AMPure XP per risospendere eventuali particellemagnetiche che potrebbero essersi depositate sul fondo.

Consultare l’Appendice A (sezione 20) per i volumi dei reagenti AMPure XP utilizzati in altri prodotti PCR per il LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.

7.5.2.

Trasferire il volume appropriato di reagente Agencourt AMPure XP necessario per la piastra in una nuova
provetta da 2 mL per ridurre al minimo il rischio di contaminazione da parte dei puntali delle pipette.
▪

7.5.3.

Il volume del reagente Agencourt AMPure XP necessario è uguale a n × 50 µL (n corrisponde al numero
di campioni da purificare).

Preparare una soluzione madre fresca (0,5 mL per ogni campione da purificare) di etanolo all’80% utilizzando
acqua sterile.

Legame degli ampliconi alle particelle magnetiche:
7.5.4.

Aggiungere 50 μL del reagente Agencourt AMPure XP aliquotato, a temperatura ambiente, a ogni campione
da purificare.
▪
▪
▪

7.5.5.

Collocare i campioni mescolati su un DynaMag-96 Side Skirted o su un Ambion Magnetic Stand 96 e incubare
a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire alle particelle magnetiche di separarsi dalla soluzione.
▪

7.5.6.

Mescolare pipettando su e giù 10 volte.
Dopo aver mescolato, il colore della miscela deve apparire omogeneo.
Incubare 10 minuti a temperatura ambiente.

Durante questa procedura, mantenere la piastra sul supporto magnetico per tutto il tempo, fino alpassaggio 7.5.10 descritto di seguito.

Utilizzando una pipetta P200 (o una pipetta multicanale equivalente) impostata su 95 μL, aspirare il surnatantelibero dalle particelle ed eliminarlo.
▪
▪

Utilizzare una pipetta P10 (o una pipetta multicanale equivalente) impostata su 10 μL per rimuovere
eventuale surnatante in eccesso.
Evitare di rimuovere particelle magnetiche.

Lavaggio:
7.5.7.

Con la piastra su un supporto magnetico, aggiungere 200 μL di etanolo all’80% a ciascun campione. Incubare
per 30 secondi a temperatura ambiente.
▪
▪
▪

7.5.8.
7.5.9.

Utilizzando una pipetta P200 (o una pipetta multicanale equivalente) impostata su 195 μL, aspirarel’etanolo ed eliminarlo.
Utilizzare una pipetta P10 (o una pipetta multicanale) impostata su 10 μL per rimuovere eventuale
etanolo in eccesso.
Evitare di rimuovere particelle magnetiche.

Ripetere il passaggio 7.5.7 per un totale di due lavaggi.
Con la piastra ancora sul supporto magnetico, lasciare asciugare all’aria le particelle magnetiche per 5 minuti.

Eluizione:
7.5.10.

Rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Aggiungere 25 μL di tampone Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.
▪
▪

7.5.11.
7.5.12.

Mescolare pipettando fino a ottenere una soluzione omogenea.
Accertarsi che tutte le particelle magnetiche siano in soluzione.

Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
Posizionare la piastra sul supporto magnetico per 5 minuti o fino a quando il surnatante non è libero dalle
particelle.

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7.5.13.

Trasferire 22 μL di eluato su una nuova piastra. Sigillare con strip di tappi. Etichettare la piastra e centrifugare
brevemente per accertarsi che il surnatante si trovi sul fondo del pozzetto. Conservare a -20 °C o procedere alpassaggio successivo.
L’immagine del gel nella Figura 1 illustra l’efficacia di una tipica purificazione (mostrando gli ampliconi prima
e dopo la purificazione).

Figura 1: Esempio del risultato della purificazione di ampliconi ottenuti con le master mix MiSeq TRG.
L’immagine è stata generata analizzando prodotti non purificati e purificati sul sistema
LabChip GX.

7.6.

Quantificazione degli ampliconi
I seguenti passaggi sono stati eseguiti durante la validazione del saggio per quantificare gli ampliconi PCR generati dai
campioni, e i controlli positivo, negativo e senza templato, utilizzando il KAPA Library Quantification Kit (KAPA
Biosystems).
7.6.1.

Diluizione degli ampliconi
Il tampone A di diluizione indicato di seguito fa riferimento a: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 +0,05% Tween 20.

1:4.000 finale:
Fase A:
2 μL di eluato di amplicone purificato +198 µL di tampone A di diluizione.
Mescolare bene pipettando su e giù 10 volte.
Fase B:
5 μL ottenuti dalla fase A +195 μL di tampone A di diluizione.
Mescolare bene pipettando su e giù 10 volte.
7.6.2.

Impostare una corsa qPCR per la quantificazione degli ampliconi seguendo la Tabella 6 per ciascuna reazione(per maggiori dettagli, consultare le istruzioni relative al KAPA Library Quantification Kit):
Tabella 6. Preparazione della qPCR

Reagente

7.6.3.

VolumeAcqua per PCR

3,6 μL

Master mix per qPCR KAPA SYBR FAST contenente primer Premix

12,0 μL

ROX

0,4 μL

Ampliconi diluiti o standard (1-6)

4,0 μL

Volume totale

20,0 μL

Seguire la Tabella 7 per il programma del termociclatore per qPCR.
Tabella 7. Programma per qPCR

Fase

Temperatura

Tempo

Ciclo

1

95 °C

5 minuti

1

95 °C

30 secondi

60 °C

45 secondi (read piastra)

2

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7.6.4.

Utilizzare i dati ottenuti dalla corsa qPCR per verificare l’eventuale presenza di contaminazione calcolando
i valori ΔCt tra i controlli (positivo e negativo) e l’NTC, utilizzando la seguente equazione:
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Controllo)
Se ΔCt ≥4,0 per entrambi i controlli, procedere alla fase successiva. In caso di ΔCt <4,0 per uno dei due controlli,
consultare la sezione 14 Guida alla risoluzione dei problemi per ulteriori istruzioni.

Se viene eseguito il multiplexing di più target, fare riferimento all’Appendice A (sezione 20) per il valore ΔCt qualificante per altri prodotti
PCR per il LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.

7.6.5.

Utilizzare i dati ottenuti dalla corsa qPCR per determinare la concentrazione di ampliconi per ciascun campioneutilizzando la seguente equazione:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑧𝑖𝑜𝑛𝑒 𝑑𝑖 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛𝑖 𝑛𝑜𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑡𝑖 (𝑛𝑀) =452 × 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 (𝑝𝑀) 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑜𝑙𝑎𝑡𝑎 𝑡𝑟𝑎𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑞𝑃𝐶𝑅
×4
A

452 indica la lunghezza media dei frammenti (bp) dello standard DNA KAPA Illumina.
A = lunghezza media dei frammenti degli ampliconi generati utilizzando il saggio TRG = 300 bp (A = 300).
La lunghezza della sequenza include nucleotidi aggiuntivi necessari per il sequenziamento.
Nota:

7.7.

se viene eseguito il multiplexing di più target, consultare l’Appendice A (sezione 20) per la lunghezza media dei frammenti degli
ampliconi generati per altri LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.

Pooling e quantificazione della libreria
La quantità di DNA della libreria caricata nella cella a flusso MiSeq è critica per generare una densità ottimale delcluster e ottenere dati di alta qualità in una corsa di sequenziamento. È fortemente consigliata la quantificazionedella libreria tramite qPCR.
7.7.1.

In base alla concentrazione degli ampliconi calcolata a partire dai risultati qPCR, aggiungere una quantità
uguale di ampliconi (con l’eccezione di NTC che può essere escluso).
▪
▪

7.7.2.
7.8.

Ad es. diluire ciascun amplicone a 4 nM in un volume totale di 10 μL utilizzando come diluente il tampone
A di diluizione. Combinare 10 μL di ciascuno degli ampliconi a 4 nM.
Per i campioni che presentano una concentrazione <4 nM, aggiungere la quantità massima possibile
di campione (10 μL) e non aggiungere alcun tampone A di diluizione per quel campione.

Passare delicatamente al vortex per mescolare e poi centrifugare brevemente.

Diluizione della libreria sottoposta a pooling
1:1.000 finale:
Fase A:
2 μL della libreria sottoposta a pooling +198 μL di tampone A di diluizione.
Mescolare bene pipettando su e giù 10 volte.
Fase B:
20 μL ottenuti dalla fase A +180 μL di tampone A di diluizione.
Mescolare bene pipettando su e giù 10 volte.

7.9.

Preparazione della qPCR per la quantificazione della libreria
Consultare la Tabella 6 per la preparazione della qPCR e la Tabella 7 per il programma del termociclatore.
7.9.1.

Determinare la concentrazione della libreria sottoposta a pooling a partire dai risultati della qPCR.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑧𝑖𝑜𝑛𝑒 𝑑𝑖 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛𝑖 𝑛𝑜𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖𝑡𝑖 (𝑛𝑀) =452 × 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 (𝑝𝑀) 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑜𝑙𝑎𝑡𝑎 𝑡𝑟𝑎𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑞𝑃𝐶𝑅
A

452 indica la lunghezza media dei frammenti (bp) dello standard DNA KAPA Illumina.
A = lunghezza media dei frammenti degli ampliconi generati utilizzando il saggio TRG = 300 bp (A = 300).
La lunghezza della sequenza include nucleotidi aggiuntivi necessari per il sequenziamento.
Nota:

se viene eseguito il multiplexing di più target, consultare l’Appendice A (sezione 20) per la lunghezza media dei frammenti degli
ampliconi generati per altri LymphoTrack Dx Assay - MiSeq

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7.10.

Preparazione della libreria per la corsa di sequenziamento MiSeq
Alla fine di questa sezione, la concentrazione del DNA della libreria sarà 12 pM per il kit del reagente MiSeq v2 e
20 pM per il kit del reagente MiSeq v3 quando si esegue il multiplexing. Per il multiplexing degli ampliconi derivantida diversi LymphoTrack Dx Assay per MiSeq in una singola libreria, consultare la sezione 20: Appendice A: Creare una
libreria di sequenziamento con più target NGS.

7.10.1.

Determinare la quantità di libreria da preparare in base alla concentrazione della libreria sottoposta a poolinga partire dai risultati qPCR e diluire se necessario:▪
▪

7.10.2.

Se la libreria è superiore a 4 nM, diluire la libreria a 4 nM in un volume finale di 10 μL utilizzando iltampone A di diluizione.
Se la libreria è inferiore a 4 nM, utilizzare 10 μL della libreria direttamente per il passaggio successivo.

Utilizzare le seguenti istruzioni per denaturare il DNA della libreria.
▪
▪

Preparare una nuova soluzione di 0,2 N di NaOH. Una nuova soluzione è fondamentale per denaturare
completamente il DNA campione e per la generazione ottimale dei cluster sul MiSeq.
Aggiungere 10 μL di 0,2 N di NaOH alla libreria diluita (10 μL) preparata nel passaggio precedente.
Tabella 8. Denaturazione della libreria

Reagente

7.10.3.

7.10.4.

VolumeLibreria diluita

10 μL

0,2 N di NaOH

10 μL

Volume totale

20 μL

Passare brevemente la soluzione al vortex per mescolarla, quindi centrifugarla brevemente per assicurarsi chetutta la soluzione si sia depositata sul fondo della provetta. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per
denaturare la libreria dsDNA in DNA a filamento singolo (ssDNA).
Aggiungere 980 μL di tampone HT1 precedentemente raffreddato (fornito con i kit del reagente MiSeq)
alla provetta contenente il DNA della libreria denaturata.
Tabella 9. Aggiunta del tampone HT1

7.10.5.
7.10.6.
7.10.7.

Reagente

VolumeLibreria denaturata

20 μL

Tampone HT1

980 μL

Volume totale

1000 μL

Passare brevemente al vortex per mescolare, quindi centrifugare ad impulsi la soluzione del DNA della libreria
denaturata e diluita.
Mettere nel ghiaccio la libreria diluita e denaturata fino al passaggio successivo.
Rimuovere la libreria ssDNA diluita dal ghiaccio e utilizzare le seguenti istruzioni per diluire ulteriormente
la libreria in preparazione per il caricamento sul MiSeq.

Se si esegue il multiplexing di più target, consultare l’Appendice A (sezione 20) per la concentrazione di caricamento e il kit del reagente
MiSeq.
Per il MiSeq Control Software (v2.6 o versione più recente):
La concentrazione del DNA della libreria è di 12 pM per il kit del reagente MiSeq v2.
La concentrazione del DNA della libreria è compresa tra 12 e 20 pM per il kit dei reagenti v3 MiSeq se si esegue il multiplexing.

▪

Se la concentrazione della libreria di ssDNA diluita è di 40 pM (per esempio, con una concentrazione
iniziale di 4 nM), diluire alla concentrazione desiderata per il caricamento sul sistema MiSeq utilizzando gli
esempi seguenti:

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Tabella 10. Preparazione della libreria per il caricamento su MiSeq▪

▪
7.10.8.
7.10.9.
7.11.

Concentrazioni finali

12 pM

Libreria denaturata

300 μL

Tampone HT1

700 μL

Concentrazione NaOH finale (mM)

0,60 mM

Se la concentrazione della libreria di ssDNA diluita è inferiore a 40 pM (con una concentrazione
iniziale inferiore a 4 nM), diluire opportunamente il DNA denaturato alla concentrazione desiderata peril caricamento sul sistema MiSeq (ad es. 12 pM).
Assicurarsi che la concentrazione finale di NaOH non sia superiore a 1,0 mM.

Capovolgere la libreria finale 5 volte per mescolare e centrifugare ad impulsi.
Mettere nel ghiaccio la libreria finale preparata finché non viene caricata sulla Cartuccia di reagente MiSeq.

Caricamento della Cella a flusso MiSeq
Caricare 600 μL della libreria finale preparata sulla Cartuccia di reagente MiSeq.

7.12.

Impostazione del Foglio campioni MiSeq
Fare riferimento alla documentazione Illumina più recente per la creazione del foglio campioni. Caricare il foglio
campioni sullo strumento MiSeq. Se si utilizza il software associato a Illumina (ad esempio Local Run Manager (LRM)),
selezionare TruSeq Nano DNA (TruSeq DNA Nano) per il Library Prep Kit (Kit di preparazione delle librerie) e TruSeq
DNA Single Indexes Set A B (Serie A B dei singoli indici TruSeq DNA) per l'Index Kit (Kit degli indici).

Caratteri nel nome del campione:•
Creare un nome e un identificatore univoco quando si denomina ciascun campione. Se si analizzano campioni duplicati, è possibile
utilizzare un nome simile (ovvero Campione1a e Campione1b).
•
La mancata assegnazione di nomi univoci a campioni sequenziati sulla stessa cella a flusso farà sì che, durante il processo di analisi,
venga analizzato solo un campione dal LymphoTrack Dx Software – MiSeq.
•
Utilizzare solo questi caratteri caratteri alfanumerici e trattini (A-Z, a-z, 0-9, ., -,) durante la preparazione del foglio campioni.
Nome del campione per il multiplexing:
Ogni indice può essere riportato solo una volta nel foglio campioni; pertanto qualsiasi informazione di tracciatura necessaria per i
campioni sequenziati con più target che utilizzano lo stesso indice deve essere inclusa in un campo Sample ID (ID campione) (che è
incorporato nel nome del file FASTQ).
Si raccomanda di tenere traccia di tutti i campioni e target che vengono sequenziati utilizzando lo stesso indice in una corsa MiSeq. A
questo set di campioni/target deve essere assegnato un identificatore univoco da includere nel campo Sample ID (ID campione) nel
foglio campioni. Quando si sceglie una convenzione di denominazione, tenere presente che l’ID campione presenta un rigoroso limite
di 40 caratteri.

Il campo Sample Name (Nome campione) nel Sample sheet (Foglio campioni) viene incorporato per impostazione
predefinita nel nome del file FASTQ e non l’ID campione quando vengono immesse informazioni in questo campo.
Lasciare vuoto questo campo o copiare le informazioni inserite per l’ID campione. Se vengono immesse informazioni
alternative nel campo Sample Name (Nome campione), assicurarsi che includano un identificatore univoco e siano conformi
alle raccomandazioni sopra riportate per il monitoraggio dei campioni.
Importante!

Le sequenze dell'adattatore non vengono riconosciute dal LymphoTrack Dx Software – MiSeq.


Se si utilizza un software associato a Illumina (come Local Run Manager (LRM)), è necessario selezionare
l'opzione di trimming adattatore quando si crea il foglio campioni.

Tabella 11. Indici utilizzati con le master mix del LymphoTrack Dx Assays

Indice master mix per PCR per
LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Sequenza
indice

TruSeq DNA Single Indexes Set A
B dei singoli indici TruSeq DNA)(LRM “Index Kit” [Kit degli indici])

id01

ATCACG

AR001

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Tabella 11. Indici utilizzati con le master mix del LymphoTrack Dx Assays

7.12.1.

Sequenza
indice

TruSeq DNA Single Indexes Set A
B dei singoli indici TruSeq DNA)(LRM “Index Kit” [Kit degli indici])

id02

CGATGT

AR002

id03

TTAGGC

AR003

id04

TGACCA

AR004

id05

ACAGTG

AR005

id06

GCCAAT

AR006

id07

CAGATC

AR007

id08

ACTTGA

AR008

id09

GATCAG

AR009

id10

TAGCTT

AR010

id11

GGCTAC

AR011

id12

CTTGTA

AR012

id13

AGTCAA

AR013

id14

AGTTCC

AR014

id15

ATGTCA

AR015

id16

CCGTCC

AR016

id18

GTCCGC

AR018

id19

GTGAAA

AR019

id20

GTGGCC

AR020

id21

GTTTCG

AR021

id22

CGTACG

AR022

id23

GAGTGG

AR023

id25

ACTGAT

AR025

id27

ATTCCT

AR027

Selezionare Finish (Fine) e salvare il file. Assicurarsi che il nome del file corrisponda al codice a barre della
Cartuccia di reagente MiSeq che si trova sulla Cartuccia di reagente per la corsa MiSeq corrente, per es.
MS200xxxx-500v2. (Questo file CSV verrà utilizzato per la corsa MiSeq.)
▪

7.13.

Indice master mix per PCR per
LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Copiare questo file nella cartella del foglio campioni del MiSeq Control Software.

Avvio della corsa MiSeq
Avviare la corsa MiSeq seguendo le istruzioni del MiSeq Control Software. I tempi approssimativi di una corsa MiSeq
sono indicati nella Tabella 12.

Tabella 12. Tempi della corsa MiSeq

Kit del reagente MiSeq

Lunghezza read

Versione MCS

Tempo totale della corsa MiSeq

2x151 bpv2.6 o versione più recente~24 ore2x251 bpv2.6 o versione più recente~39 ore2x301 bpv2.6 o versione più recente~56 orev2
v3

Nota: l’utilizzo di un kit con un numero inferiore di cicli non sarà sufficiente per generare le lunghezze delle read richieste per questo saggio.

8. Analisi dei dati
Il LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq è stato progettato per produrre dati di sequenziamento che possano essere analizzati
utilizzando il pacchetto LymphoTrack Dx Software – MiSeq fornito nel CD associato (95000009), incluso nel prezzo conl’acquisto del saggio. Questo CD include istruzioni dettagliate per l’installazione e l’uso del pacchetto software.

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9. Valori previsti
I valori calcolati generati dal software sono arrotondati al decimo più prossimo per determinare il risultato del saggio.

▪
▪
▪

% più elevata di read per il controllo positivo del TGR ≥2,5%% più elevata di read per il controllo negativo dell’NGS <1,0%
Validità corsa MiSeqooo*Nota:%Q30 >80% per v2 (2x151)%Q30 >75% per v2 (2x251)%Q30 >70% per v3 (2x301)
il punteggio Q30 di tutte le validazioni analitiche ha soddisfatto i criteri sopra indicati contenuti nelle specifiche relative al
punteggio Q30 dello strumento Illumina MiSeq. Tuttavia, il punteggio Q30 può variare a seconda della qualità del campione.
Se il punteggio Q30 dovesse risultare inferiore rispetto alle specifiche relative al Q30 di Illumina, controllare il valore Q30
dell’indice risultante dal report LymphoTrack Dx dopo l’analisi dei dati eseguita con il LymphoTrack Dx Software - MiSeq. Se ilpunteggio Q30 dell’indice sul report LymphoTrack Dx non soddisfa i criteri stabiliti nelle specifiche di Illumina, considerare
l’indice non valido.
La chimica MiSeq v2 è stata validata per questo saggio con target singolo. La chimica MiSeq v3 è stata validata per ilmultiplexing del saggio.

10. Limiti della procedura▪
▪
▪
▪

Questo saggio non permette di identificare il 100% delle popolazioni cellulari clonali.
Un livello di varianza più elevato in corrispondenza o prossimo al limite di rilevazione (LOD) analitico è tipico in tutte
le tecnologie, compreso il sequenziamento di nuova generazione. Si consigliano analisi di follow-up quando un risultato
è prossimo al limite di rilevazione analitico del saggio.
I saggi basati su PCR sono soggetti a interferenze dovute a degradazione del DNA o inibizione dell’amplificazione della
PCR a causa della possibile presenza di eparina o altri agenti nel campione analizzato.
I risultati dei test molecolari di clonalità devono sempre essere interpretati nel contesto di dati clinici, istologici
e immunofenotipici.

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11. Interpretazione e refertazione
Usare il report Merged Read Summary (Riepilogo delle read sottoposte a merging) per identificare le sequenze delle readsottoposte a merging più abbondanti e le relative frequenze prima di procedere alla determinazione della clonalitàutilizzando i criteri elencati di seguito. Fare riferimento alla sezione 8 Analisi dei dati per maggiori informazioni sul report delMerged Read Summary (Riepilogo delle read sottoposte a merging). Esistono alcuni processi clonali che potrebbero
determinare il rilevamento di due o più cloni. Ciò si può verificare ad esempio nel caso di una popolazione dominante con
una piccola popolazione sub-clonale o quando sono presenti più disturbi linfoproliferativi. È particolarmente importante chequesti casi siano interpretati nell’ambito del relativo contesto clinico.
* È necessario essere cauti nel formulare interpretazioni quando è presente il valore “None” (“nessuno”) per i geni V, D e/o J in read clonali
sospette. Il valore “None” (“nessuno”) viene assegnato quando l’allineamento non soddisfa la soglia minima di qualità a causa di uno scarso
allineamento.
Tabella 13. Criteri di interpretazione

Criterio 1

Il numero totale di read per
ciascun campione è ≥20.000.

Il numero totale di read per
ciascun campione è ≥10.000 e<20.000.

Il numero totale di read per
ciascun campione è <10.000.

Criterio 2

La sequenza sottoposta
a merging risultata più
abbondante corrispondea ≥2,5% delle read totali.

La sequenza sottoposta
a merging risultata più
abbondante corrispondea ≥5,0% delle read totali.

Criterio 3

Risultato

La % di read per una sospetta sequenza
clonale sottoposta a merging è >2 volte la % diread per la 3a sequenza più frequente
sottoposta a merging.1

EVIDENZA DI CLONALITÀ
RILEVATA

La % di read per una sospetta sequenza
clonale sottoposta a merging è ≤2 volte la % diread per la 3a sequenza più frequente
sottoposta a merging.1

Nessuna evidenza
di clonalità rilevata

La % di read per una sospetta sequenza
clonale sottoposta a merging è >2 volte la % diread per la 3a sequenza più frequente
sottoposta a merging.1

EVIDENZA DI CLONALITÀ
RILEVATA

La % di read per una sospetta sequenza
clonale sottoposta a merging è ≤2 volte la % diread per la 3a sequenza più frequente
sottoposta a merging.1

Nessuna evidenza
di clonalità rilevata

N/D

Non valutabile

N/D

1I calcoli del software sono arrotondati al decimo più prossimo a scopo comparativo.

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Figura 2: Interpretazione dei dati in base ai criteri della Tabella 13.

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12. Dati del campione

Figura3:

Questa tabella, generata con il LymphoTrack Dx Software - MiSeq, mostra le 10 read più abbondanti del riepilogo delle read che sonostate sottoposte a merging con le 500 read più abbondanti; viene eseguita un’operazione di merging tra due read se la differenza tra diesse è di solo 1 o 2 coppie di basi (bp). Le sequenze sono state generate con LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq e analizzate con il
LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009).

13. Caratteristiche prestazionali
I risultati di LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq sono stati messi a confronto con il report diagnostico di laboratorio e laconcordanza (o accordo percentuale globale), l’accordo percentuale positivo (PPA) e l’accordo percentuale negativo (NPA)sono stati rispettivamente: 89% (51/57 casi), 81% e 97%.
Tabella 14. Confronto tra LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq e il report diagnostico di laboratorio

Report diagnostico di laboratorio
ClonaleNon clonale

Clonale221

Non clonale

529

LymphoTrack Dx TRG
Assay - MiSeq

Le prestazioni analitiche di LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq sono state valutate analizzando il DNA di una linea cellulare
clonale addizionato a DNA della tonsilla a diverse diluizioni. Il limite di rilevazione (LOD) è stato osservato alla diluizione al
5% del DNA. La % più elevata di read relative al DNA della tonsilla è stata <1%. La regressione lineare R2 è risultata >0,98 perl’intervallo di diluizione del DNA dallo 0 al 10%. Il coefficiente di variazione (CV%) su 8 corse eseguite da 2 operatori, con 2
lotti di reagenti e 2 strumenti è stato inferiore al 15% per l’analisi delle diluizioni del DNA al 5% e al 10%.

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14. Guida alla risoluzione dei problemi
Tabella 15. Guida alla risoluzione dei problemi

Fase in cui si verifica il problema

ErroreAzionePreparazione del campionee dei reagenti

La quantità del DNA del campioneè inferiore a 50 ng
con un metodo basato su dsDNA

Non analizzare il campione

Preparazione del campionee dei reagenti

Analizzare il campione utilizzando lo Specimen
Control Size Ladder disponibile presso Invivoscribe
L’integrità del DNA del campione è bassa(

20960021 per la rilevazione ABI o
20960020 per la rilevazione su gel)

Quantificazione degli ampliconi
utilizzando il KAPA Library
Quantification Kit

ΔCt <4,0
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Controllo)

Verificare la curva standard nella qPCR.
Verificare l’eventuale presenza di contaminazione
e ripetere la qPCR KAPA per tutti i campioni e tutti
i controlli.
Se il risultato è nuovamente ΔCt <4,0, rifare PCR
e qPCR per tutti i campioni e tutti i controlli.

Creazione della libreria tramite
quantificazione e poolingdegli ampliconi

La concentrazione degli ampliconi
è inferiore a 1 nM

Verificare la curva standard nella
qPCR e ripetere la PCR se inferiore a 1 nM

Foglio campioni non trovato
Foglio campioni non formattato correttamente
Controllo della fluidica non riuscito
Impostazione della corsa MiSeq

Spazio su disco insufficiente
Flacone rifiuti vuoto

Consultare la guida alla risoluzione dei problemi di
Illumina
oppure contattare l’Assistenza tecnica di Illumina+1-800-809-4566

Rete disconnessa
Errore RFID
Corsa MiSeq%Q30 <80% per v2 (2x151)*%Q30 <75% per v2 (2x251)*%Q30 <70% per v3 (2x301)*

Contattare l’Assistenza tecnica Invivoscribe+1-858-224-6600

Installazione del CD

Il LymphoTrack Dx Software non si installa
correttamente

Contattare l’Assistenza tecnica Invivoscribe+1-858-224-6600

Analisi dei dati

L’esecuzione del LymphoTrack Dx Software
viene interrotta

Contattare l’Assistenza tecnica Invivoscribe+1-858-224-6600

Analisi dei dati

Nessuna sequenza clonale rilevata peril controllo positivo

Contattare l’Assistenza tecnica Invivoscribe+1-858-224-6600

Controllo senza templato (NTC)

Rilevamento di amplificazione NTC dopo la PCR

Ripetere il saggio*Il punteggio Q30 di tutte le validazioni analitiche ha soddisfatto i criteri sopra indicati contenuti nelle specifiche relative al punteggio Q30 dello strumento
Illumina MiSeq. Tuttavia, il punteggio Q30 può variare a seconda della qualità del campione. Se il punteggio Q30 dovesse risultare inferiore rispetto alle
specifiche relative al Q30 di Illumina, controllare il valore Q30 dell’indice risultante dal report LymphoTrack Dx dopo l’analisi dei dati eseguita con il
LymphoTrack Dx Software - MiSeq. Se il punteggio Q30 dell’indice risultante dal report LymphoTrack Dx non soddisfa i criteri stabiliti nelle specifiche diIllumina, considerare l’indice non valido.

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15. Assistenza tecnica e Servizio clienti
Grazie per aver acquistato il LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq. I nostri clienti sono molto importanti per noi. Saremo lieti
di assistervi nella comprensione del presente saggio. Invivoscribe vi offre assistenza tecnica continua dal lunedì al venerdì
per garantire che i saggi vengano eseguiti sempre con la massima efficienza nel vostro laboratorio.
Contatti
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10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | Stati Uniti d'America
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16. Bibliografia
1. Tonegawa, S. (1983). Somatic Generation of Antibody Diversity. Nature 302, 575-581.
2. Trainor KJ. et al., (1990). Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood 75, 22202222.

3. Miller, JE. (2013). Principle of Immunoglobulin and T Cell Receptor Gene Rearrangement. In Cheng, L., Zhang, D., Eble,
▪
▪
▪
▪
▪
▪

JN. (Eds), Molecular Genetic Pathology (2nd Ed., sections 30.2.7.13 and 30.2.7.18). New York, USA:
Springer Science & Business Media.
Istruzioni per l’uso del pacchetto LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009).
https://www.beckmancoulter.com
http://www.illumina.com
http://www.invitrogen.com
http://www.kapabiosystems.com
http://www.thermofisher.com

17. Simboli
Sulle etichette dei prodotti diagnostici basati su NGS Invivoscribe sono utilizzati i seguenti simboli:
Numero di catalogo

Data di scadenza

Volume del reagente

Rappresentante autorizzato nella
Comunità europea

Numero di lotto

Consultare le istruzioni per l'uso

Condizioni di conservazione

Per uso diagnostico in vitro

Identificatore Dispositivo Univoco

Produttore

Conformità Britannica Valutata

Persona responsabile nel Regno Unito

Rappresentante Autorizzato per laSvizzera

Conformità Europea

Applicazione software

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18. Avviso legale
Questo prodotto è coperto da uno o più dei seguenti brevetti e domande di brevetto di proprietà o concessi in licenza
esclusiva a Invivoscribe, Inc. (IVS). Numero di brevetto statunitense 7,785,783, numero di brevetto statunitense 8,859,748(unitamente alle rivendicazioni di domande divisionali relative alla stessa domanda originale), numero di brevetto europeo
EP 1549764B1 (validato in 16 paesi e ampliato dai brevetti europei correlati con numero EP 2418287A3 ed EP 2460889A3),
numero di brevetto giapponese JP04708029B2, numero di domanda di brevetto giapponese 2006-529437, numero di
domanda di brevetto brasiliano PI0410283.5, numero di brevetto canadese CA2525122, numero di brevetto indiano
IN243620, numero di brevetto messicano MX286493, numero di brevetto cinese CN1806051 e numero di brevetto coreano
101215194.
L’uso di questo prodotto può richiedere metodi di amplificazione degli acidi nucleici come la reazione a catena dellapolimerasi (PCR). Qualsiasi licenza necessaria per l’esecuzione di metodi di amplificazione o per l’uso di reagenti, enzimi diamplificazione o apparecchiature coperte da brevetti di terze parti è di responsabilità dell’utente e nessuna di tali licenze èconcessa da Invivoscribe, Inc., espressamente o per implicazione.
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di Invivoscribe, Inc. e/o delle sue affiliate, o (per quanto riguarda i marchi commerciali di terzi utilizzati nel presente
documento) dei rispettivi titolari.

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19. LymphoTrack Dx TRG Assay - MiSeq: guida di una sola pagina
19.1.

Indossare dei guanti e rimuovere le master mix dal congelatore. Lasciare scongelare le provette, quindi passarledelicatamente al vortex per mescolarle.

19.2.

In una cappa di contenimento o una cappa per PCR, pipettare 45 L di master mix nei singoli pozzetti di una piastra
PCR. Un pozzetto per ciascuna master mix e una master mix per campione, positivo, negativo o controlli senza templato.

19.3.

Aggiungere 0,2 L di DNA polimerasi Taq (a 5 U/µL) a ciascuna master mix.

19.4.

Aggiungere 5 L di DNA del campione (alla concentrazione minima di 10 ng/µL) e 5 L dei campioni di controllo nei
pozzetti contenenti le reazioni con le rispettive master mix e pipettare su e giù 5-10 volte per mescolare.

19.5.

Aggiungere 5 L di acqua per biologia molecolare nel pozzetto contenente la rispettiva master mix per il controllo senza
templato e pipettare su e giù 5-10 volte per mescolare.

19.6.

Amplificare il DNA bersaglio utilizzando il seguente programma del termociclatore:
Fase

Temperatura

Tempo

Ciclo

1

95 °C

7 minuti

1

2

95 °C

45 secondi

3

60 °C

45 secondi

4

72 °C

90 secondi

5

72 °C

10 minuti

1

6

15 C

∞

1

29x

19.7.

Rimuovere la piastra di amplificazione dal termociclatore.

19.8.

Purificare i prodotti di PCR utilizzando il sistema di purificazione per PCR Agencourt AMPure XP. Aggiungere 50 μL diparticelle per ogni 50 µL di reazione; eluire il DNA in 25 µL di eluato.

19.9.

Quantificare gli ampliconi con il KAPA Library Quantification Kit secondo le istruzioni del kit. Diluire gli ampliconi 1:4.000
prima di procedere alla qPCR.

19.10.

Raggruppare in pool quantità uguali di ampliconi ottenuti dai campioni (non includere il controllo senza templato),
diluire 1:1.000 e quantificare la libreria utilizzando il KAPA Library Quantification Kit.

19.11.

Denaturare e diluire la libreria a 12 pM per il kit v2 del reagente MiSeq e a 12-20 pM per il kit v3 del reagente MiSeq
se viene eseguito il multiplexing (MCS v2.6 o versione più recente).

19.12.

Caricare 600 μL di libreria denaturata e diluita sulla Cartuccia di reagente MiSeq.

19.13.

Impostare un foglio campioni MiSeq e caricare la scheda campione sullo strumento (se necessario).

19.14.

Avviare la corsa MiSeq.

19.15.

Analizzare e visualizzare i dati acquisiti utilizzando il pacchetto LymphoTrack Dx Software – MiSeq associato.

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20. Appendice A: Creare una libreria di sequenziamento con più target NGS
Quando si analizzano più target utilizzando diversi LymphoTrack Dx Assay - MiSeq in parallelo, è importante notare ledifferenze procedurali tra i vari saggi. Per esempio, il saggio Leader IGHV utilizza 32 cicli PCR e deve essere posizionato su
una corsa PCR separata rispetto ad altri LymphoTrack Dx Assay che utilizzano solo 29 cicli PCR. La Tabella 16, riportata diseguito, riassume tali differenze procedurali. Per le istruzioni complete, consultare le Istruzioni per l’uso del rispettivo
LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.
Tabella 16 Differenze procedurali nei LymphoTrack Dx Assay

Fase dellaprocedura

Descrizione

7.4.1

LymphoTrack Dx Assay - MiSeq
Leader IGHV

IGH FR1

IGH FR2

IGH FR3

IGK

TRG

TRB

Numero di cicli PCR

32

29

29

29

29

29

29

7.5.1

Volume di reagente AMPure XP(rapporto)

50 µL(rapporto
1:1)

50 µL
(rapporto
1:1)

50 µL
(rapporto
1:1)

50 µL
(rapporto
1:1)

50 µL
(rapporto
1:1)

50 µL
(rapporto
1:1)

35 µL
(rapporto
0,7:1)

7.6.4

Verifica contaminazione
Valore ΔCt =Ct (NTC) – Ct (Controllo)

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥3,0

7.6.5
e
7.9.1

A
(lunghezza media dei
frammenti)

660 bp450 bp390 bp260 bp410 bp300 bp400 bpConcentrazione di caricamento

12- -20 pM

12 pM

12 pM

12 pM

8 pM

12 pM

12 pM

Kit del reagente MiSeq per
sequenziamento target singolo*v3 (600)

v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)

Impostazioni foglio
campioni per:Cicli read 1*
Cicli read 2*

301

251

251

151

251

151

251

7.10.7

7.12*Nota:

la chimica MiSeq v2 è stata validata per questi saggi con target singolo. La chimica MiSeq v3 è stata validata per il multiplexing del saggio e di Leader
IGHV.

Anche due o più librerie di sequenziamento generate a partire da master mix LymphoTrack per gli stessi geni target (ad es.
due librerie di sequenziamento di TRG, ottenute sia con kit dello stesso lotto che di lotti diversi) possono essere sottoposte a
multiplexing in una singola libreria di sequenziamento, purché ogni indice per quelle master mix sia incluso solo una volta
per ogni corsa di sequenziamento. Consultare la tabella qui di seguito per determinare le impostazioni dei cicli e i kit delreagente Illumina MiSeq da utilizzare con diverse combinazioni di target. Si consiglia di utilizzare il kit del reagente MiSeq v3
quando si esegue il sequenziamento contemporaneo dei sette target per ottenere read sufficienti per campione.
Tabella 17 Impostazioni cicli e kit del reagente per una corsa MiSeq di target multipli

Target sottoposti a multiplexing

Impostazioni foglio
campioni

Kit del reagente
MiSeq

Concentrazione
di caricamento

N. di catalogo

Solo IGH FR3 e TRG insieme

151 cicli read 1
151 cicli read 2

kit v2 (300 cicli)
oppurekit v2 (500 cicli)

12 pM (v2)
oppure20 pM (v3)MS-102-2002
oppureMS-102-2003

Qualsiasi combinazione di questi
target insieme:
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3,
IGK, TRB e TRG

251 cicli read 1
251 cicli read 2

kit v2 (500 cicli)
fino a 4 target
oppurekit v3 (600 cicli)

12 pM (v2)
oppure20 pM (v3)MS-102-2003
oppureMS-102-3003

Se si combina uno di questi saggi
con Leader IGHV

301 cicli read 1
301 cicli read 2

kit v3 (600 cicli)

20 pM (v3)MS-102-3003

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20.1.

Determinare la concentrazione di ciascuna libreria individuale (ad es. Leader IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB
e TRG).

20.2.

Determinare la quantità di tutte le librerie che devono essere denaturate.
Nella tabella sottostante, i casi A, B, C, D, E e F rappresentano esempi diversi di multiplexing del saggio (ad es. il caso A
rappresenta un multiplexing di Leader IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG). T, U, V, W, X, Y e Z indicano ivolumi in µL.
n=numero di target caricati su una cartuccia MiSeq

T=

40 fmole/[n x concentrazione libreria Leader IGHV (nM)]U=

40 fmole/[n x concentrazione libreria IGH FR1 (nM)]V=

40 fmole/[n x concentrazione libreria IGH FR2 (nM)]W=

40 fmole/[n x concentrazione libreria IGH FR3 (nM)]X=

40 fmole/[n x concentrazione libreria IGK (nM)]Y=

40 fmole/[n x concentrazione libreria TRG (nM)]Z=

40 fmole/[n x concentrazione libreria TRB (nM)]

Nota: il valore 40 fmole corrisponde ai 20 µL di 2 nM al termine della fase 20.3.

Tabella 18. Calcolo degli input della libreria individuale per generare una libreria di sequenziamento di target multipli per la corsa MiSeq

Libreria

Volume libreria individuale (µL)
Caso A

Caso B

Caso C

Caso D

Caso E

Caso F

n=7

n=6

n=5

n=4

n=3

n=2

T

2,5

2,9

3,5

4,3

1,5

U

3,8

4,4

5,3

6,7

8,9

IGH FR2

4

V

1,4

1,7

2

2,5

3,3

IGH FR3

2,1

W

2,7

3,2

3,8

4,8

6,4

IGK

3,5

X

1,6

1,9

2,3

TRG

2,6

Y

2,2

2,6

TRB

2

Z

2,9

T+U+V+W+X+Y+Z

17,1

Nome saggio

Concentrazione(nM)

Leader IGHV

2,3

IGH FR1

20.3.

16,7

5,7
7,7

16,9

18,3

18,6

13,4

Denaturare le librerie combinate a 2 nM.
▪

Aggiungere i reagenti secondo la Tabella 19 in base alla quantità determinata nel passaggio precedente.

Se T+U+V+W+X+Y+Z >18, come nei casi D ed E indicati nella Tabella 18, mescolare prima le librerie applicabili,
quindi aggiungere 18 µL alla reazione di denaturazione come mostrato nella tabella seguente.

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Tabella 19. Denaturazione della libreria

Reagente

Volume (µL)

Libreria Leader IGHVT

Libreria IGH FR1

U

Libreria IGH FR2

V

Libreria IGH FR3

W

Libreria IGK

X

Libreria TRG

Y

Libreria TRBZ

1N NaOH

2

Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, 0,05% Tween 20

18 – (T+U+V+W+X+Y+Z)

Totale20

Passare brevemente la soluzione al vortex per mescolarla, quindi centrifugarla brevemente per assicurarsi che tutta
la soluzione si sia depositata sul fondo della provetta. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per denaturare
il DNA della libreria combinata in filamenti singoli.
20.4.

Diluire la libreria denaturata a 40 pM.
Aggiungere 980 μL di tampone HT1 precedentemente raffreddato (fornito con il kit del reagente MiSeq) alla provetta
contenente i 20 μL di DNA della libreria denaturata. Passare brevemente al vortex per mescolare, quindi centrifugare
il campione ad impulsi.

20.5.

Preparare la libreria denaturata per il caricamento sul MiSeq.
Diluire la libreria a 12 pM per il kit del reagente MiSeq v2 e a 20 pM per il kit del reagente MiSeq v3 se viene eseguito
il multiplexing (MCS v2.6 o versione più recente) seguendo la Tabella 20. Passare brevemente al vortex per mescolare,quindi centrifugare il campione ad impulsi.
Tabella 20. Preparazione della libreria combinata per il caricamento su MiSeq

VolumeReagente
12 pM

20 pM

Libreria 40 pM

300 µL500 µL

Tampone HT1 raffreddato

700 µL500 µL

Totale1000 µL

1000 µL

20.6.

Caricare 600 µL della libreria combinata denaturata ottenuta nel passaggio precedente su una cartuccia di reagente
MiSeq.

20.7.

Impostare un foglio campioni MiSeq e caricare la scheda campione sullo strumento (se necessario).

20.8.

Avviare la corsa MiSeq.

20.9.

Analizzare e visualizzare i dati acquisiti utilizzando il pacchetto LymphoTrack Dx Software – MiSeq associato.

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