研究フロンティア

OocyteとBone Morphogenetic Proteinによる卵胞顆粒膜細胞でのステロイド産生調節メカニズム大塚文男

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科腎・免疫・内分泌代謝内科学

はじめにてautocrine-paracrine作用により卵胞を構成する細胞間での機能的連携を形成していると考えられる．

卵胞におけるステロイド合成は，FSH(follicle-stimulatinghormone)および卵巣局所のさまざまな因子により調節されている．卵胞に発現するBMP(bone morphogenetic

BMP-6とBMP-7による卵胞ステロイド合成調節に対する作用の相違protein)分 子 は 共 通 し て 顆 粒 膜 細 胞 で のFSHに よ るprogesterone: P4産生を抑制するが，estradiol: E2産生

Diethylstilbestrol(DES)-implanted 雌 Spragueに対する作用はリガンドにより異なっている．われわれ

Dawley(SD)ラットから単離したpreantral follicle由来

は，BMP-6とBMP-7の卵胞ステロイド産生への作用のの顆粒膜細胞・oocyteの共培養系を用いた検討において違いに着目し，ラット顆粒膜初代培養細胞を用いてE２,［９］，BMP-6, BMP-7は Luteinizing InhibitorとしP４産生に対するBMPの作用機序とoocyteの役割についての作用を発揮し，FSHによるP４産生を共通して抑制て検討した．今回の検討では，BMP分子による顆粒膜す る（ 図 １A）．StARの 発 現 もP４ 産 生 調 節と 同 様 に

細 胞 で のE２ 産 生 調 節 に 重 要 な 細 胞 内 シ グ ナ ル とFSHに よ り 増 強 さ れ，BMP-6, BMP-7はFSHに よ る

oocyte-granulosa cell communicationによる新たな機能StAR発現の誘導を抑制する．興味深いことにBMP-6,連携の存在が明らかになった［１］．

BMP-7ともに，FSHのみならずforskolinによるP４合成に対しても抑制するが，BtcAMPにより直接的にPKA卵胞におけるBMPシステムを刺激した場合にはP４合成を抑制しない（図１B）．これらのP４産生刺激に対するBMP作用の相違に基づく発育卵胞におけるBMPはリガンド間で異なる分布をと，BMP-6, BMP-7は顆粒膜細胞におけるcAMP産生を呈し，BMP-2, -6は顆粒膜細胞に，BMP-4, -7は莢膜・抑制することによりP４を抑制することが示唆される．

間質細胞に，BMP-6, -15, GDF-9は卵母細胞oocyteに特確かに顆粒膜細胞でのcAMP産生レベルを測定すると，徴的に発現が認められる［2-4］．一方，BMP受容体でFSH お よ び forskolin に よ り 上 昇 し た cAMP 産 生 がは BMP の I 型 受 容 体 (ALK-2, -3, -6) と II 型 受 容 体BMP-6, BMP-7によって共通して抑制されること，また(BMPRII, ActRII)の発現が卵巣において証明されていこの作用はoocyteにより影響されないことが明らかとなる［2, 5-7］．ラット卵巣ではI型受容体のうちALK-3がった（図２）．

oocyteと顆粒膜細胞に分布し，とくにoocyteに強く発現

BMP-6, BMP-7に共通するP４に対する作用とは異なする．ALK-6もoocyteとともに一次卵胞以降の顆粒膜り，BMP-6, BMP-7はFSHによるE２合成に対しては明細胞に分布を認める．II型受容体では，BMPRIIが顆粒らかな作用の相違を呈する．つまりBMP-6はFSHによ膜細胞を主体に発現し，ActRIIはoocyteを主体に発現するE２産生には影響しないが，BMP-7はFSHによるE２る［７］．これらの卵巣に存在するBMPリガンドと受容産生を増加し，この作用はoocyteの存在下でさらに促進体に加えて，顆粒膜細胞に発現するfollistatinをはじめされる（図３A）．ところがこれらのBMP-7の作用は，とするBMP結合蛋白［８］を含め，BMPシステムとしforskolinやBtcAMPを用いてFSH受容体作用をbypassし連絡先：大塚文男，岡山大学大学院医歯薬学総合研究科
腎・免疫・内分泌代謝内科学〒700-8558 岡山市鹿田町2-5-1
TEL: 086-235-7235
FAX: 086-222-5214
E-mail: fumiotsu@md.okayama-u.ac.jp

た場合には，E２産生に影響を与えない（図３Ｂ）．すなわち，BMP-7はFSH-cAMP系以外のFSH受容体特異的なシグナルを調節してE２産生の促進をもたらす可能性，さらにそのBMP-7作用はoocyteの存在によって増強されることが示唆された．BMP-7はFSHにより誘導

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図１

Effects of oocytes and BMPs on FSH-induced progesterone production
Rat granulosa cells (1 × 105 viable cells in /200μl) were cultured with or without oocytes (100oocytes/ml). The cells were treated with (A) FSH (30 ng/ml), (B) forskolin (FSK; 10 μM) or
BtcAMP (1 mM) in the culture medium with either alone or combination of BMP-6 and BMP-7(10 to 100 ng/ml). After 48-h culture the culture media was collected and progesterone levels
were determined by radioimmunoassay. Results show the mean ± SEM of data performed withtriplicate treatments; **, < 0 01 and *, < 0.05 vs. basal levels treated with FSH or FSK.

図２

Effects of oocytes and BMPs on FSH-induced cAMP production
Rat granulosa cells were cultured with or without oocytes in serum-free medium containing 0.1
mM of IBMX. Cells were treated with (A) FSH (30 ng/ml) or (B) FSK (10μ M) with either
alone or combination of BMP-6 and BMP-7 (100 ng/ml). After 48-h culture the conditioned
medium was collected and the extracellular contents of cAMP was determined by EIA. Results
show the mean ± SEM of data performed with triplicate treatments; **, < 0.01 and *, < 0.05vs. control or between the indicated groups.

図３Effects of oocytes and BMPs on FSH-induced estradiol production
Rat granulosa cells were cultured with or without oocytes. The cells were treated with (A) FSH(30 ng/ml), (B) FSK (10 μM) or (FSK; 10μM) or BtcAMP (1 mM) in serum-free medium
containing 100 nM of androstenedione with either alone or combination of BMP-6 and BMP-7 (10to 100 ng/ml). After 48-h culture the culture media was collected and estradiol levels weredetermined by radioimmunoassay. Results show the mean ± SEM of data performed withtriplicate treatments; **, < 0.01 and *, < 0.05 vs. basal levels treated with FSH or between theindicated groups.

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OocyteとBone Morphogenetic Proteinによる卵胞顆粒膜細胞でのステロイド産生調節メカニズム

図４

Effects of ERK1/ERK2 inhibition on steroidogenesis
Rat granulosa cells cultured with or without oocytes in serum-free medium containing 100 nMof androstenedione. Cells were treated with FSH (30 ng/ml), FSK (10 μM) or BtcAMP (1mM) in the presence or absence of U0126 (1 and 3μM) for 48 h. The levels of (A) estradioland (B) progesterone in the media were determined by radioimmunoassay. Results show themean ± SEM of data performed with triplicate treatments; **, < 0.01 and *, < 0.05 vs. basal
levels treated with FSH or FSK.

される顆粒膜細胞でのP450arom(aromatase)発現レベイド合成への影響は，前述したBMP-7の作用と近似しルを増加するが，これはoocyteの共存によりさらに増強ている．そこでERK1/ERK2シグナルに対するBMPの影されることも示された．

響について検討したところ，FSHによるERK1/ERK2の卵巣ステロイド合成系におけるMAPKシグナルの関与より強く抑制されることが明らかとなった（図５A）．

リン酸化は，BMP-6では影響をうけないが，BMP-7につまり，顆粒膜細胞でのFSH依存性のERKカスケードの活性化はE２抑制的かつcAMP・P４には促進的に作
以上のように，BMP-6, BMP-7による卵巣顆粒膜細胞でのE２とP４の調節作用には明らかな違いが認められ用しているが，BMP-7はその作用を抑制することによりE２, P４の異相性の調節をなすと考えられる．

る．この相違を生じるメカニズムとして，FSH受容体シグナルの１つである顆粒膜細胞のMAPKシグナル活性化に着目した［10-12］．われわれも以前に報告したが，OocyteのBMPシグナルおよびFSH作用に対する影響

ラ ッ ト 顆 粒 膜 細 胞 で はFSH刺 激 に よ りMAPKの １ つ
ERK1/ERK2蛋白のリン酸化が速やかに促される［10］．

これまで述べたように，BMP-6, BMP-7が顆粒膜細胞

この反応はcAMP刺激ではほとんどみられないことよで のFSH受 容 体 以 下 のcAMP-PKAあ る い はERK1/

り，FSH受容体を介したcAMP-PKA cascadeとは異な

ERK2 pathwayを制御してE２とP４の産生を異相性にる系によると考えられる．ERK1/ERK2シグナルの活性変化することが示された．この顆粒膜細胞でのBMP作化を選択的に阻害するU0126を用いて検討すると，ERK用は，oocyteの存在によりさらに効率よく発揮されるこの阻害によりFSHによるE２合成が著明に増強されるとになる．つまり，BMP-7はFSHによるE２合成を促進（図４A）一方で，FSHによるP４合成に対しては抑制効するが，これはoocyteの存在によりさらに増強する（図果を発揮する（図４B）．ERK阻害によるP４の抑制は３A）．またFSHによる顆粒膜細胞でのERKのリン酸化

forskolinで の 刺 激 下 に お い て も 生 じ る が， こ れ はも，oocyteの存在により強力なものとなる（図５A）．

BtcAMP刺激下では再現されないことから，ERKの抑興味深いことに，BMP-6, BMP-7によるSmad1,5,8のリ制によるcAMP産生の減弱を介する機序と考えられた．

ン酸化はFSHにより増強され，さらにoocyteの存在によ

事実，FSHおよびforskolinにより上昇する顆粒膜細胞のりFSHと相加的にBMPシグナル伝達が促進される（図cAMPレベルはU0126処理により減少した．しかしERK５Ｂ）．BMPの標的遺伝子であるId-1 promoter assayにの 抑 制 に よ る E ２ 合 成 の 促 進 作 用 は，forskolin やよる検討でも，FSH＋oocyteはBMP転写活性を増強すBtcAMPでは再現されないことから（図４A），cAMPる．FSHによる顆粒膜細胞でのBMPシグナルの増幅効系とは独立したFSH受容体特異的な作用と考えられる．

果は，ラット顆粒膜細胞のみならずヒト顆粒膜細胞株

これらERKシグナルの阻害によって生じる卵胞ステロ

KGNを用いた検討においても認められる［13］．この研究フロンティア

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図６図５Mutual effects of BMPs, FSH and oocytes on FSH-induced
ERK activation and BMP-Smad signaling by granulosa cells.
Rat primary granulosa cells cultured with or without oocytes
were treated with FSH (30 ng/ml) in combination withBMP-6 or BMP-7 (100 ng/ml) for 1 h. The cell lysates werethen subjected to SDS-PAGE immunoblotting analysis using(A) anti-phospho ERK1/2, anti-total ERK1/2 antibodies and(B) anti-phospho Smad1, 5, 8 antibody. Results show themean ± SEM of data performed with triplicate treatments; **,< 0.01 and *, < 0.05 vs. control or between the indicatedgroups.

A possible mechanism by which BMPs differentially regulate
steroidogenesis in granulosa cells and functional roles of oocytes
ERK1/2 activation induced by FSH receptor (FSH-R) signaling
is directly linked to inhibition of estradiol synthesis andamplification of cAMP. BMP-7 inhibits FSH-induced ERK1/2
phosphorylation, leading to upregulation of estradiol production[1]. A common signaling between BMP-6 and BMP-7 is theinhibition of cAMP synthesis linked to progesterone production.
The presence of oocytes facilitates i) BMP-Smad signaling andii) FSH induction of ERK signaling pathway in granulosa cells.
In addition, iii) oocytes enhance FSH-induced estradiol
production via upregulating FSH-R signaling in the presence ofestrogen [16].の検討では，これらのBMPシグナルとFSH作用の増幅に直接関わるoocyte factorについてはまだ解決していな
い．同じ培養系におけるFSH依存的なE２合成において，BMP-15やBMP-6は影響を与えず［3, 17, 18］，GDF-9はむしろ抑制的に作用することから［19］，これらのoocyte-derived BMP分子の直接的な寄与は少ないと考

FSHおよびoocyteによるBMPシグナルのupregulationにえられる．しかしGDF-9はcumulus顆粒膜細胞におけるは，抑制性Smad (Smad6,7)の発現抑制や受容体SmadMAPKの活性化を促す作用をもつことから［20］，FSH(Smad1,5,8)の発現増加などが寄与すると考えられる．

によるMAPKの活性化にはGDF-9による影響も少なかOocyteによる卵胞ステロイド合成への影響に関して，らず関与していると 推測される． 今後，BMPおよびVanderhydenらはoocyteがFSHによるE２産生を増加さFSHシグナルを統御するoocyte-derived factorについてせる一方でFSHによるP４産生を抑制することをマウスさらなる検討が必要である．

顆粒膜細胞において明らかにした［14］．またAdashiら
はestrogenの存在がFSHによる顆粒膜細胞の分化を促進まとめすることを示した［15］．われわれはFSHによる顆粒膜
細 胞 で のE２ 産 生 お よ びP450aromの 発 現 レ ベ ル が，このように，卵胞に発現するBMP-6とBMP-7は共通oocyte作用に外因性estrogenが加わることよってさらにしてFSHによるcAMPシグナルを制御するが，BMP-7増加することを報告した［16］．このestrogenとoocyteはBMP-6と異なりFSHによるERK1/ERK2の活性化をの協調作用（図６）はforskolinや8-BrcAMPによるE２抑制してE２産生の増加とP４の減少を促す（図６）．さ産生においては認められないことから，estrogenが何ららにFSHおよびoocyteが，顆粒膜細胞のBMP-Smadシ

か のFSH受 容 体 シ グ ナ ル の 増 強 に 寄 与 す るoocyte-グナルを増強してBMP作用を支持するという新たな相derived factorの分泌を促すことによりFSH依存性のE互作用の存在も示された．Oocyteと顆粒膜細胞の細胞２合成を促進している可能性が示唆された［16］．今回間communicationとして，FSHとoocyteによるBMPシグ

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ナルの増強，estrogenとoocyteによるFSH受容体シグナルの促進などが，細胞間の機能的ネットワーク（図６）として効率のよい顆粒膜細胞からのE２産生を促していると言えよう．

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研究フロンティア

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