上原記念生命科学財団研究報告集, 34 (2020)

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

62. 造血器腫瘍におけるゲノム異常と微小環境との相互作用
千葉 滋
筑波大学 医学医療系 血液内科
Key words：クローン性造血，TET2，血管免疫芽球性 T 細胞リンパ腫，微小環境

緒 言
形態的に正常な末梢血白血球、様々な系統の骨髄細胞、あるいはコロニー形成能をもつ前駆細胞などに、造血器腫瘍で同定される遺伝子変異と同様の体細胞性遺伝子変異が同定されることが明らかになり、クローン性造血（clonal hematopoiesis、CH）と呼ばれている［1，2］。CH 細胞は加齢に伴い健常者でも高頻度に検出されるようになる。一方、CH 細胞は一部の造血器腫瘍をもつ患者でも検出され、これらの患者における CH 細胞は通常、同一患者の腫瘍組織・細胞で同定される遺伝子異常と同一の異常をもつ。すなわち、こうした患者の造血器腫瘍は、CH 細胞を供給する造血幹細胞（hematopoietic stem cell、HSC）に由来する。
CH 細胞で変異が同定される遺伝子としては DNMT3A がもっとも高頻度であり、次いで TET2 の頻度が高い［1，2］。DNMT3A および TET2 はいずれも DNA メチル化を修飾する酵素をコードし、これらの遺伝子には骨髄系腫瘍でもリンパ系腫瘍でも高頻度に変異が同定される。CH 細胞や造血器腫瘍で同定される TET2 変異はいずれも機能喪失型変異である。
リンパ系造血器腫瘍である血管免疫芽球性 T 細胞リンパ腫（AITL）は、TET2 変異が約 80％の患者で同定される［3］。さらに AITL の大多数は、TET2 変異をもつクローン性 HSC に由来することが示唆されている。AITL は腫瘍組織中の腫瘍細胞割合が低く、様々なリンパ球など炎症細胞が腫瘍組織を構成する特徴を有し、こうした微小環境細胞も CH 細胞の一部であると考えられる。一方、TET2 変異をもつ AITL 組織の 60～90％で、RHOA 遺伝子の特定の変異（G17V）が同定される［3，4］が、この変異は T 細胞特異的に検出される［5］。
本研究では、造血幹細胞における TET2 変異と、T 細胞における RHOAG17V 変異を模倣するマウスを作製することで、AITL モデルを構築した［6］。このモデルマウスに生じている病態を解析することで、AITL における微小環境変化と、AITL 発症メカニズムとの関連を考察する。

方 法
Tet2flox/flox・Mx-Cre・CD2-RHOAG17V マウスに 3〜4 週齢で pIpC を投与し、Tet2null/null・Mx-Cre・CD2-RHOAG17Vマウス（Tet2RHOA マウス）を作製した。本マウスは、HCS で Tet2 がノックアウトされ、T 細胞で RHOAG17V を発現するように設計された。Tet2RHOA マウスの腫大リンパ節由来の細胞について、フローサイトメトリー、免疫染色、トランスクリプトーム解析を行った。またこの細胞を放射線照射したヌードマウスの腹腔内に移植して腫瘍形成を観察し、その腫瘍由来細胞についてフローサイトメトリー、免疫染色で解析した。

1

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

結 果
1．Tet2RHOA マウスにおける腫瘍発症とその解析

Tet2null/null・Mx-Cre マウスは、既報通り慢性骨髄単球性白血病に類似した病態を呈し、18 ヶ月後までに約 20％のマウスが死亡した。CD2-RHOAG17V マウスは明らかな異状を示さず、観察期間中 100％生存していた。一方、Tet2RHOAマウスは中央値 48 週齢で死亡した（図 1a）。死亡したマウスはいずれも脾腫とリンパ節腫大を呈していた（図 1b）。
肺や肝臓にも腫瘍浸潤が認められた。組織学的には、脾臓、リンパ節とも濾胞構造が消失し、中型のリンパ球とともに、多彩な細胞浸潤が観察された（図 1c）。また血管の増生を認めていた。フローサイトメトリー解析では、濾胞性ヘルパーT（Tfh）細胞が増加しており、典型的には Tfh 細胞が全細胞の 10％以上（5～80％）を占めていた（図 2）。
Tet2RHOA マウスおよび野生型マウスの脾臓由来 CD4 陽性細胞の transcriptome 解析では、Tet2RHOA マウスにおいて T 細胞受容体（TCR）経路遺伝子および Tfh 細胞関連遺伝子の発現が有意に増加していた。
abc

Lymph nodes
WT

Tet2-/G17VRHOA

SpleenLymph nodes

図 1．Tet2RHOA マウスは AITL 様リンパ腫を発症して死亡する
a） 生存曲線。Tet2－/－G17GRHOA（A）、Tet2－/－G17GRHOA（B）は、独立したラインの Tet2RHOA マウスを示す。
b） 腫大した脾臓およびリンパ節。Tet2RHOA マウスの腫大したリンパ節の組織像。
c） リンパ節組織像（上：×4；下：×100）。Tet2RHOA マウスの腫大したリンパ節では濾胞構造が消失しておりびまん性に種々の細胞が浸潤している。Arrow（黄色）：好酸球、Arrowhead（水色）：免疫芽球。Scale bar（水色）：50μm。
［6］より再掲。

図 2．野生型および Tet2RHOA マウス脾臓細胞
Tet2RHOA マウス脾臓では、CD4 陽性 T 細胞の割合が約 35％と多く、そのうち約 35％をPD1 陽性 ICOS 陽性の Tfh 様細胞が占めている。一方多数の B 細胞（CD19 陽性 B220 陽性）も含まれている。
［6］より再掲。

2

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

2．腫瘍移植マウスにおける腫瘍発症とその解析
Tet2RHOA マウスの腫大したリンパ節細胞浮遊液を、放射線照射したヌードマウスに腹腔内投与すると、末梢血中のドナー由来細胞が徐々に増加し、脾腫とリンパ節腫大を呈して多くのレシピエントマウスは死亡した（図 3）。
腫大 した脾臓やリンパ節ではドナー由来の Tfh 様細胞がもっとも大きな割合を占めていたが、その他の T 細胞、あるいは骨髄系細胞、B 細胞も種々の割合で混在していた。

abc

図 3．Tet2RHOA マウス腫瘍移植ヌードマウスにおける腫瘍a） 移植 7 日および 14 日目の末梢血におけるドナー細胞の割合。
b） ドナー細胞生着後のレシピエントマウスにおける脾臓腫大。
c） ドナー細胞生着後のレシピエントマウス脾臓細胞の解析。CD4 陽性の割合が高く、その半数程度を ICOS 陽性 PD1 陽性の Tfh 様細胞が占める。
［6］より再掲。

3．個別微小環境細胞の AITL 発症への関与
我々は過去に、AITL 患者検体からマイクロダイセクション法を用いて、免疫染色した PD1 陽性細胞（PD1 は Tfh細胞マーカーで、腫瘍細胞が濃縮される）および CD19 陽性細胞（CD19 は B 細胞に特異的なマーカーで、非腫瘍細胞である B 細胞が濃縮される）分画を個別に収集し、当該患者の腫瘍組織由来 DNA で同定された遺伝子変異の解析を行なった。その結果、TET2 変異はいずれの分画でも同定され、RHOAG17V 変異は PD1 陽性分画でのみ同定。こうした発見から、微小環境に存在するされた。一方、CD19 分画のみで NOTCH1 変異が繰り返し同定された［5］B 細胞は TET2 変異やその他の遺伝子変異（たとえば NOTCH1 変異）を有しており、これらにより機能的にも異常をきたしていると推察される。
現在、個々の微小環境細胞の AITL 発症への関与について、シングルセル・シークエンスや個別細胞の移植実験等を通じて研究を進めている。こうした研究については論文化に至っていないため、論文発表後いずれかの機会に報告したい。
4．腫瘍移植マウスを用いた、チロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブの有効性の検討
AITL に特徴的な RHOAG17V 変異による AITL 発症メカニズムの研究において、報告者らは以前に、野生型 RHOAタンパク質が本来もつ small GTPase としての機能を、RHOAG17V 変異タンパク質は失っている［3］一方、特異的にVAV1 と結合して VAV1 のチロシンリン酸化を促進し、TCR シグナルを亢進することを見出した［7］。さらに培養細胞を用いた研究で、チロシンキナーゼ阻害剤であるダサチニブが VAV1 のチロシンリン酸化を抑制し、TCRシグナルを強力に阻止することも見出している。
こうした知見に基づいて、Tet2RHOA マウス由来腫瘍を移植したヌードマウスへのダサチニブ投与実験を行なった。
その結果、ダサチニブがマウス腫瘍内の VAV1 リン酸化を抑制し、マウスの生存を延長することを見出した（図 4）。

3上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

図 4．チロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブによる AITL モデルマウスの生存延長コントロール（vehicle）群では 78％のマウスが死亡したが、ダサチニブ治療群での死亡率は33％であり、有意にダサチニブ群で生存が延長した。
（Kaplan-Meier 法；p 値は log-rank
検定による）。

考 察
T 細胞リンパ腫の 1 病型である AITL は、TET2 遺伝子の機能喪失型変異および RHOA 遺伝子の G17V 変異によって特徴づけられる。AITL のモデル動物樹立をめざし、T 細胞で Tet2 が不活化され、かつ RhoaG17V を発現するマウス（T-Tet2Rhoa マウス）が樹立された［8］。しかし、患者 AITL では TET2 変異は HSC で生じ、RHOA 変異はT 細胞で生じると考えられている。このため、T-Tet2Rhoa マウスは AITL のゲノム異常を不完全にしかモデル化できていない。実際、T-Tet2Rhoa マウスそのものは T 細胞リンパ腫を発症していない。AITL 発症のためには、T-Tet2Rhoaマウスの骨髄細胞を同系マウスに経静脈的に移植し、かつレシピエントマウスに大量の羊赤血球を投与して免疫刺激を行う必要があった。これに対し、我々のマウスでは造血幹細胞で Tet2 を不活化させており、より AITL 患者のゲノムに近い［6］。AITL 様リンパ腫が発症したのは、多系統の造血細胞で Tet2 が不活化されることによって、腫瘍細胞以外の微小環境を構成するリンパ球や骨髄系炎症細胞に変化が生じることが重要であったと推察される。

ダサチニブによる治療効果は、腫瘍細胞内で生じている RHOAG17V – VAV1 リン酸化による TCR シグナル亢進を阻害することが重要であったと考えられる。なお本知見の結果を受けて、我々は単施設で小規模の第 I 相臨床試験を行い、有望な結果が得られたため多施設臨床試験を医師主導治験として開始している。
AITL は高齢者に多発する予後不良の疾患で、新規治療法の開発が待たれる。ダサチニブ治療などのように腫瘍細胞を標的にした治療の他、微小環境細胞を標的にした治療法開発も進められる必要がある。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、筑波大学医学医療系血液内科学研究室の坂田（柳元）麻実子博士である。本研究にご協力いただいた久留米大学病理学講座の大島孝一博士および三好寛明博士、Tet2flox マウスを提供いただいた
Olivier A. Bernard 博士に深甚の謝意を表する。また、本研究を進めるにあたり協力いただいた筑波大学血液内科大学院生諸氏に心からの謝意を表する。

4

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

文 献1） Jaiswal S、Fontanillas P、Flannick J、et al.、Ebert BL. Age-related clonal hematopoiesis associated withadverse outcomes. N Engl J Med. 2014 Dec 25;371(26):2488-98. doi: 10.1056/NEJMoa1408617.
PMID: 25426837
2） Genovese G、Kähler AK、Handsaker RE、et al.、McCarroll SA. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk
inferred from blood DNA sequence. N Engl J Med. 2014 Dec 25;371(26):2477-87. doi: 10.1056/NEJMoa1409405.
PMID: 25426838
3） Sakata-Yanagimoto M、Enami T、Yoshida K、et al.、Chiba S. Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic
T cell lymphoma. Nat Genet. 2014 Feb;46(2):171-5. doi: 10.1038/ng.2872. PMID: 24413737
4） Palomero T、Couronné L、Khiabanian H、et al.、Ferrando AA. Recurrent mutations in epigenetic regulators、RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas. Nat Genet. 2014 Feb;46(2):166-70. doi:
10.1038/ng.2873. PMID: 24413734
5） Nguyen TB、Sakata-Yanagimoto M、Asabe Y、et al.、Chiba S. Identification of cell-type-specific mutations in
nodal T-cell lymphomas. Blood Cancer J. 2017 Jan 6;7(1):e516. doi: 10.1038/bcj.2016.122. PMID: 281571896） Nguyen TB、Sakata-Yanagimoto M、Fujisawa M、et al.、Chiba S. Dasatinib is an effective treatment forangioimmunoblastic T-cell lymphoma. Cancer Res. 2020 May 1;80(9):1875-1884. doi: 10.1158/0008-5472.
CAN-19-2787 PMID: 32107212
7） Fujisawa M、Sakata-Yanagimoto M、Nishizawa S、et al.、Chiba S. Activation of RHOA-VAV1 signaling inangioimmunoblastic T-cell lymphoma. Leukemia. 2018 Mar;32(3):694-702. doi: 10.1038/leu.2017.273. PMID:28832024
8） Cortes JR、Ambesi-Impiombato A、Couronné L、et al.、Palomero T. RHOA G17V Induces T Follicular Helper
Cell Specification and Promotes Lymphomagenesis. Cancer Cell. 2018 Feb 12;33(2):259-273.e7. doi:
10.1016/j.ccell.2018.01.001. PMID: 29398449

5