研究フロンティア

排卵に関する新知見，遺伝子発現を介す/介さない
EGF-like factor の機能
奥田 哲司，梅原崇，島田 昌之

広島大学大学院生物圏科学研究科

element（CRE）と GC-box（SP ）があり，Ereg 遺伝子はじめにのそれには複数の GC-box（SP ）サイトが存在する．CRE
排卵は，脳下垂体から分泌された LH が十分発達したに結合する転写因子 CRE binding protein（CREB）と胞状卵胞（排卵直前卵胞）に作用することで，卵胞破裂，GC-box に結合する SP は，cAMP-PKA 系によりリン酸

顆粒膜細胞の黄体化，卵丘細胞層の膨化と卵の成熟が誘化され，核内移行し，標的遺伝子の発現を誘起する［ ］．

起され，受精可能な第減数分裂中期に進行した卵が，顆粒膜細胞の培養系において，cAMP を人為的に合成さ卵丘細胞層とともに卵管へと排出される現象である．こせる薬剤である forskolin 処理が，Areg と Ereg それぞの排卵を誘起する LH に対する受容体（LHR/LHCGR）

れのプロモーター活性を上昇させ，それらは PKA 抑制は，卵には全く発現せず，卵丘細胞にもほとんどなく，剤により有意に抑制される［］．排卵過程では，LH顆粒膜細胞に高発現していることから，LH の作用を顆の分泌は一過的であること，その強い刺激が 受 容 体

粒膜細胞から卵や卵丘細胞に伝達する（LHCGR）を分解することから，LH による cAMP 合成ある［次因子が必要でも一過的である．しかし，Areg や Ereg の発現は，排卵］．

Conti M 博士のグループは，排卵刺激前後の顆粒膜刺激後の一定期間持続している．この仕組みとして，細胞で発現する遺伝子の網羅的比較解析を行い，EGF-AREG や EREG により発現誘導される Ptgs2が PGE 合like factor である Amphiregulin（AREG）や Epiregulin

成を促進し，それが EP 受容体を介して cAMP を合成（EREG）を LH の］．われさせることで Areg と Ereg の発現を担保する「ポジティ

われは，これら EGF-like factor の発現は，プロスタグブフィードバックループ」が，Ptgs2欠損マウスの解析

ランジン E （PGE ）によるポジティブフィードバックから明らかとなった［次因子として同定した［］（図）．

機構により担保されること，EGF-like factor は EGF 受

EGF-like factor は，細胞膜貫通部位を有し，細胞質側容体（EGFR）を介して MAPK / （ERK / ）を活性化にはシグナル配列，細胞膜外にはプロテアーゼ応答配列し，それが排卵に必須であることなどを明らかとしてきや EGF 部位をもち，特定のプロテアーゼの作用によりた［ ，］．しかし，卵・卵丘細胞複合体の培養系においEGF 部位が放出され，近傍の細胞を刺激する．AREGて，AREG や EREG を添加したとき，体内の排卵過程や EREG の EGF 部位を放出させる酵素として，TACE/における卵の減数分裂進行時間と比較して早期に減数分ADAM が知られており，これらは顆粒膜細胞にも排卵裂が再開し，第期に発現し，PKC や c-Src により活性化され，EGF 部減数分裂中期へと移行したことから，］．この AREG や EREG のEGF-like factor の調節因子の存在が示唆された．本稿で位の放出に関与している［は，EGF-like factor の発現と機能に加えて，ネガティブEGF 部位は，EGF 受容体（EGFR）に作用し，下流 シ制御因子の同定とその作用機構，ならびに生理学的意義グナル伝達系を活性化させる．EGF 受容体の機能低下について紹介する．

型 mutant マウス（Egfr wa2 ; waved- ）は，排卵刺激後においても顆粒膜細胞の ERK / のリン酸化は低値を示す

EGF-like factor の発現と作用機構ことが報告されている［］．また，顆粒膜細胞特異的

Egfr 欠損マウスは，排卵数の低下と卵成熟不全によるAreg遺伝子のプロモーター領域にはcAMP responsible
連絡先：島田昌之，広島大学大学院生物圏科学研究科〒 ―東広島市鏡山 ― ―TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：mashimad@hiroshima-u.ac.jp

低妊孕性であり，体外培養においては，LH による ERK/ のリン酸化は，EGF 受容体の Tyr kinase 抑制剤である AGによって，ERK / のリン酸化レベルは低下する［ ， ］．
われわれの研究グループは，顆粒膜細胞特異的に ERK

日本生殖内分泌学会雑誌（2018）23 : 9-13

9

奥田哲司

他

（A）
EREG

AREG

Heparin⤖ྜ㒊఩EGF㒊఩䝥䝻䝔䜰䞊䝊ᛂ⟅㓄ิ⣽⬊⭷㈏㏻㒊఩䝅䜾䝘䝹㓄ิTACE/ADAM17
PKC

c-Src（B）

LH
EP2ཷᐜయ

LHR
EP2ཷᐜయ

cAMPPGE2

EGF-like factor Ptgs2

PKA
SP1

CREB

GC-boxCRE

AregEreg㢛⢏⭷⣽⬊cAMP
PKA

ERK1/2

SP1CREBAP-1᤼༸ᮇ䛾㑇ఏᏊⓎ⌧

C/EPB
EGFR

図

排卵期に発現する EGF-like factor の構造と作用機構（A）AREG と EREG の構造とその分泌機構．
（B）EGF-like factor-ERK / 系を中心とした排卵制御機構．

/ を欠損した Mapk3 -/- ; Mapk1 flox/flox ; Cyp19a1 Cre マウスを作出し，排卵過程で EGF-like factor-EGFR 依存

Neuregulin （NRG ）の発現と作用的に活性化される ERK / の生理的役割を解析した．交配試験や過剰排卵刺激処理の結果，排卵不全による完全

上述のように EGF-like factor が，EGFR を介して ERK不妊を呈することが明らかとなったことから，標的遺伝/ を活性化し，顆粒膜細胞や卵丘細胞の遺伝子発現を子の探索を行い，排卵期に有意に発現上昇する遺伝子変化させることで，排卵が誘導されることが明らかと）が ERK / 依存的であることを示なった．しかし，AREG や EREG を添加した培養系にした．さらに，これらの遺伝子発現機構の解析から，ERKおいて，顆粒膜細胞の遺伝子発現は誘起されるが，その/ が C/EBP と AP- family を 介 し て cAMP-PKA 系 で持続時間は体内における排卵過程のそれに比較して著し活性化された CREB や SP と協調的に遺伝子発現を制く短い．さらに，卵・卵丘細胞複合体の体外成熟培養系御していることが明らかとなった［

では，AREG や EREG の添加により，卵は第％以上（/］．

減数分裂中期に到達するが，その卵の受精後の発生能は低い．

10日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.23 2018

排卵に関する新知見，遺伝子発現を介す/介さない EGF-like factor の機能（A）（B）
b45000c4000030000

6a25000
20000
15000
10000

5c432a1500000C

図b7ng/ng protein

Fluorescence signal(334nm/365nm)

35000

8AANCAAN

排卵期に発現する Neuregulin の構造とその役割（C : Control a，b，c 異符号間に有意差有り）（A）マウス顆粒膜細胞を AREG 単独（A）あるいは AREG＋NRG （AN）を添加した培地で 分間培養した時の細胞内 Calcium 濃度．
（B）マウス顆粒膜細胞を AREG 単独（A）あるいは AREG＋NRG （AN）を添加した培地で時の PKC 活性．

特に，卵の減数分裂再開と第時間培養した減数分裂中期への進行速度が体内の排卵過程のそれと比較して，著しく早い［ ］．

顆粒膜細胞特異的欠損マウスの解析これらの報告は，AREG や EREG などの既知の EGF-likefactor は排卵の開始シグナルとなるが，それを持続的に顆粒膜細胞特異的に Nrg1の機能部位を欠損する Nrg誘導する因子ではなく，補完および制御する他の因子の1 flox/flox ; Cyp19Cre マウスは，排卵数は正常であるが， 腹重要性が推察された．

産子数が有意に少なく，分娩間隔が有意にばらつく低妊

EGF-like factor の作用は，上述したとおり ERK / の孕性を示した．この産子数の低下は，排卵後の時間経過活性化であるが，それだけでなく EGFR の下流シグナにより Nrg1欠損マウス卵の受精能が著しく低下するこルとして PI- kinase-PKB 系や PLC-PKC 系なども排卵過とで，精子侵入タイミングが遅い卵が異常受精を呈する程の顆粒膜細胞で活性化すると推察できる．そこで，こことに起因していた．また，交尾のタイミングが遅い場

れらの因子の活性変化を検討した結果，EGF-like factor

合，すべての排卵された卵が受精能を消失するため，妊の添加は PKB をリン酸化するだけでなく，PKC 活性も娠が成立しにくいことから，分娩間隔の延長も生じてい著しく上昇させた．しかし，排卵過程の顆粒膜細胞ではた．卵には NRG の受容体である ErbB は発現していな

PKC の活性上昇は限定的であったことから，EGF-like

いことから，この卵の異常は卵丘細胞と顆粒膜細胞に起factor-EGFR による PKC 活性化を抑制する因子がある因していると考えられた．そこで，両細胞における NRGと仮説立て，その探索を以下のように行った．まず，遺による Ca ＋流入抑制の意義の解明を試みた．

伝子発現データベースを用いて顆粒膜細胞で発現し，卵Ca ＋の標的のつに PKC があり，野生型マウスと比丘細胞に作用する因子の組み合わせを候補化し，それが較して Nrg1欠損マウスでは排卵刺激後の卵丘細胞と顆AREG により誘導される Ca ＋流入を抑制するか否かを粒膜細胞で PKC 活性が有意に高い値を示した．その高スクリーニングした．その結果，Neuregulin

い PKC 活性が CREB と SP をリン酸化することで，CRE（NRG ）が選択され，その詳細な解析から排卵過程で EGF-like

サイトあるいは GC-box をプロモーター領域に有する遺factor-EGFR-ERK / 依存的に発現し，ERK / リン酸化伝子の発現が非生理的水準に一過的に高められていた．

を増強する作用と，Ca ＋流入を抑制する作用をもつこと

さらに，この異常な Ca ＋-PKC 系の活性化により，ギャッ）．つまり，NRG が EGF-like fac-プジャンクション構成因子である connexin- （Cx ）が明らかとなった（図tor のバランサーであることが明らかとなった［ ］．のリン酸化が亢進され，ギャップジャンクションの閉鎖が早期化していた．この結果，減数分裂再開と第減数分裂中期へ到達する時間が野生型マウスのそれに比較し研究フロンティア

11奥田哲司

他

1009080706050403020100（B）
ba%%（A）

cWT

KO

1009080706050403020100bac

WT

KO+BIM

KO

KO+CI3（C）
EGF-like factor

LH

AREG
EREG
NRG1

EGFR

ErbB2/ErbB3

ERK1/2

༸ୣ⣽⬊

Ca2+
PKC

CalpainCx-43

㻼 㻼䝁䝛䜻䝅䞁43䛾䝸䞁㓟໬

༸ୣ⣽⬊䛾
⬺᥋╔

༸

図

マウス（KO）を用いた減数分裂再開メカニズムの解析（a，b，c 異符号間に有意差有り）（A）時に投与したマウスに PKC 抑制剤である Bisindolylmaleimide（BIM）を LH 刺激と同時間後における核膜崩壊した卵の割合．

（B）
マウスに Calpain 抑制剤である Calpain inhibitor
同時に投与した 時間後における核膜崩壊した卵の割合．
（C）NRG が制御する卵の減数分裂再開メカニズム．て（CI ）を LH 刺激と時間程度早まっていた．また，予想しなかったこと

calpain family により引き起こされ，それが細胞間へのにギャップジャンクションの閉鎖は Cx- のリン酸化にヒアルロン酸を主成分とする細胞外マトリクスの蓄積による立体構造変化に起因する一過的なものだけでなく，必須であることを報告している［ ］．そこで，Nrg1欠Cx- の分解による不可逆的変化であった．このことは，損マウスの calpain 酵素活性を測定した結果，野生型マギャップジャンクションによる物質輸送が遮断されただ

ウスの卵丘細胞における活性に比較して有意に高い値をけでなく，卵丘細胞間の細胞間接着の剥離も早期に誘導示した．そして，Nrg1欠損マウスに calpain 抑制剤あるされていることを意味している［ ］．

いは PKC 抑制剤を投与することで，卵の減数分裂再開

われわれは，卵丘細胞間の細胞接着は，Ca ＋依存的な12

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.23 2018時間が正常化した（図）．したがって，NRG は，EGF

排卵に関する新知見，遺伝子発現を介す/介さない EGF-like factor の機能-like factor による遺伝子発現誘導だけでなく，遺伝子発現を伴わない機能変化である細胞の脱接着をも調節する因子であることが明らかとなった．

おわりにNrg1欠損マウスの解析結 果 か ら，NRG は EGF-likefactor-EGFR-ERK / 依存的に発現し，Ca ＋-PKC 系を抑制し，ERK / 系を活性化することで排卵過程の時期特異的な卵丘細胞と顆粒膜細胞の機能変化を遺伝子発現依存的および非依存的に制御することが明らかとなった（図）．さらに，NRG が EGF-like factor の機能を選択的に発揮させる仕組みが，卵の減数分裂進行速度を調節し，それが卵の受精能保持時間を決定するという雌の妊孕性を司る重要な役割も示された Nrg1欠損マウスは，妊娠が成立しにくいために同一月齢でも野生型マウスに比較して発情周期の回転サイクルが早く，そのことが加齢による卵巣機能低下が若年期から認められる．今後は，マウスをモデルとした Nrg1の研究成果を高齢女性の妊孕性低下などの不妊症，ならびに家畜の繁殖障害の研究に展開していきたいと考えている．
謝辞

本稿は年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究の一部を含めて，これまでの研究室での研究成果をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えてくださいました
日本生殖内分泌学会理事長 緒方 勤先生，第 回同学会大会長 前多敬一郎先生に感謝いたします．また，本研究は，
アメリカ合衆国 Baylor College of Medicine の JoAnne S.
Richards 博士との共同研究であり，Richards 博士と Richards研究室のメンバーに感謝の意を表します．

引用文献．Peng XR, Hsueh JW, Lapolt PS, Bjersing L, Ny T （）Localization of luteinizing hormone receptor messenger ribonucleic acid expression in ovarian cell types during follicle development and ovulation. endocrinology.
,.
．Park JY, Su YQ, Ariga M, Law E, Jin SL, Conti M（）
EGF-like growth factors as mediators of LH action in theovulatory follicle. Science,- .
．Shimada M, Hernandez-Gonzalez I, Gonzalez-Robayna I, Richards
JS（）Paracrine and autocrine regulation of epidermal

growth factor-like factors in cumulus oocyte complexes andgranulosa cells: key roles for prostaglandin synthaseandprogesterone receptor. Mol. Endocrinol ,.
．Fan HY, Liu Z, Shimada M, Sterneck E, Johnson PF,Hedrick SM, Richards JS（）MAPK / （ERK / ）in
ovarian granulosa cells are essential for female fertility.
Science,- .
．Richards JS, Liu Z, Kawai T, Tabata K, Watanabe H,Suresh D, Margareta F, Pisarska D, Shimada M（）Adiponectin and its receptors modulate granulosa cell and cumulus cell functions, fertility, and early embryo development in the mouse and human. Fertility and Sterility,- .
．Fan HY, O’Connor A, Shitanaka M, Shimada M, Liu Z,Richards JS.（）β-Catenin（CTNNB ）Promotes Preovulatory Follicular Development but Represses LH-MediatedOvulation and Luteinization. Molecular Endocrinology,.
．Yamashita Y, Okamoto M, Ikeda M, Okamoto A, Sakai M,Gunji Y, Nishimura R, Hishinuma M, Shimada M（）
Protein kinase C（PKC）increases TACE/ADAM enzyme
activity in porcine ovarian somatic cells, which is essential
for granulosa cell luteinization and Oocyte maturation. Endocrinology,.
．Hsieh M, Lee D, Panigone S, Horner K, Chen R, Theologis A, Lee DC, Threadgill DW, Conti M（）LuteinizingHormone-Dependent Activation of the Epidermal GrowthFactor Network Is Essential for Ovulation. Mol. Cell Biol,.
．Hsieh M, Thao K, Conti M（）Genetic dissection ofepidermal growth factor receptor signaling during luteinizing hormone-induced oocyte maturation. PLoS One , e.
．Panigone S, Hsieh M, Fu M, Persani L, Conti M（）
Luteinizing Hormone Signaling in Preovulatory Follicles Involves Early Activation of the Epidermal Growth Factor
Receptor Pathway. Mol Endocrinol ,- .
．Downs SM, Chen J（）EGF-like peptides mediate FSHinduced maturation of cumulus cell-enclosed mouse oocytes. Molecular Reproduction and Development,.
．Noma N, Kawashima I, Fan HY, Fujita Y, Kawai T, Tomoda Y, Mihara T, Richards JS, and Shimada M（）
LH-Induced Neuregulin （NRG ）Type III Transcripts Control Granulosa Cell Differentiation and Oocyte Maturation.
Mol. Endocrinol ,- .
．Kawashima I, Umehara T, Noma N, Kawai T, Shitanaka
M, Richards JS, Shimada M（）Targeted Disruption ofNrg1 in Granulosa Cells Alters the Temporal Progressionof Oocyte Maturation. Mol. Endocrinol ,- .
．Kawashima I, Liu Z, Mullany LK, Mihara T, Richards JS,Shimada M（）EGF-like factors induce expansion of thecumulus cell-oocyte complexes by activating calpain- mediated cell movement. Endocrinology,- .

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