研究フロンティア

卵母細胞因子 FGF―８と BMP による新たな卵胞ステロイド分泌調節の検討
三好 智子，大塚 文男
岡山大学大学院医歯薬学総合研究科腎・免疫・内分泌代謝内科学

はじめに異的に作用する因子の存在は不明であった．１９９
２年にアンドロゲン誘導因子としてクローニングされた線維芽細

近年，卵巣における卵胞発育は下垂体からのゴナドト［４］胞増殖因子 Fibroblast growth factor―８（FGF―８）

ロピンだけでなく，卵巣局所因子によっても制御されて５とともに卵丘細胞の解糖系を調節し，排卵は，BMP―１いることがわかってきた．これまでに，われわれは卵巣過程に関与していると報告され［５］，卵巣にも重要な顆粒膜細胞の増殖・分化・成長に重要な細胞増殖因子，役割を担っていることが明らかとなった．

骨形成蛋白 Bone morphogenetic protein（BMP）に着

FGF はヒトで２２種類の分子からなる FGF ファミリー目して研究を進めてきた．BMP は TGF-β スーパーファを形成しており，線維芽細胞の増殖因子としてだけではミリーメンバーに属する分子である．卵巣における BMPなく，さまざまな細胞に対する細胞増殖や分化活性能を，―６，―７，―１５とは，現在までに BMP―２，―４，―３b（―３）

有している．FGF はレセプター型チロシンキナーゼファ

GDF―９の発現が明らかになっている．卵母細胞に存在ミリーに属する細胞膜上の FGF 受容体（FGFR）と結する BMP―１５は顆粒膜細胞において FSH 受容体の発現合し，FGFR には FGFR１〜４が存在する．

を低下させることにより，FSH によるプロゲステロン

胎芽発育において FGF は細胞の分化増殖・遊走を調産生を抑制する［１］．卵巣顆粒膜細胞より分泌される節することにより，形態発生に重要な役割を担っており，BMP―２，―６および莢膜細胞より分泌される BMP―４は，FGF―８ノックアウトマウスは胎生致死となる．卵巣ではFSH による cAMP 産生を抑制することによりプロゲス，FGFR
FGF―８は FGFR―４および FGFR―３C と結合し［６］テロン産生を抑制する［２，３］．一方で，BMP はエスト―３あるいは FGFR―４のノックアウトマウスは妊孕能を有ロゲン産生においてはリガンドにより異なる作用を呈すするが，FGFR―３の変異（G３７４R）や FGFR―３/―４両者のることが知られている．さらに，顆粒膜細胞と卵母細胞ノックアウトマウスでは不妊となる［７，８］．成熟マウとを共培養することにより，BMP―Smad シグナルの増スでは卵巣と精巣のみに FGF―８ mRNA が発現してお強，FSH による MAPK の増強，エストロゲンと協調しり，特に卵巣では成熟マウスの antral follicle の卵母細FSH 受容体シグナルの活性化，といった卵母細胞の働．一方，FGFR はこれま
胞 FGF―８が発現している［９］きもわかってきた［２，３］．つまり，卵巣では卵母細胞での報告からラットを含む種々の哺乳類の卵巣顆粒膜細と顆粒膜細胞の細胞間コミュニケーションが存在すると胞に発現が認められている［１０］．

考えられる．

このように FGF―８は卵巣顆粒膜細胞において重要な役割を担っていると考えられるが，卵胞発育における卵巣と FGF ファミリー

FGF―８の役割については解明されていない．そこでわれ
われはラット初代顆粒膜細胞／卵母細胞培養系を使用

この卵母細胞と顆粒膜細胞の細胞間コミュニケーショ

し，FGF―８と BMP による卵胞ステロイド合成調節作用ンのなかで，BMP は一律にプロゲステロン産生を抑制とその機能的連関を明らかにすることを研究の目的としする黄体化抑制因子として作用するが，エストロゲン特た．

顆粒膜細胞における卵母細胞因子 FGF―８の作用
連絡先：三好智子，岡山大学大学院医歯薬学総合研究科
腎・免疫・内分泌代謝内科学〒７００―８５５８ 岡山市北区鹿田町２―５―１
TEL：０８６―２３５―７２３５FAX：０８６―２２２―５２１４E-mail : tmiyoshi@md.okayama-u.ac.jp

ラット顆粒膜細胞および卵母細胞の初代培養細胞を用いて検討した．はじめに，ラット卵巣における FGF―８と FGFR の発現を確認した．RT―PCR にて，卵母細胞に

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他

図１

卵母細胞および顆粒膜細胞における FGF―８と FGF 受容体の発現A）Isolated oocytes（２×１０３ viable cells）were cultured in serum-free McCoy s
５A medium with or without DES（５×１０―８ M）. After ４
８―h culture, oocyte RNA
was extracted and RT―PCR were performed for detecting the expression ofFGF―８ and RPL１
９.
―３ and ―４ was examined by SDSB）The expression of FGF receptor（FGFR）―PAGE/immunoblotting analysis using anti―FGF receptor and anti―actin antibody in cell lysates derived from rat granulosa cells（５×１０５ viable cells）
treated with BMP―６, ―７, FGF―８, and FSH for １ h. The results shown are representative of those obtained from three independent experiments.

図２

顆粒膜細胞におけるステロイド産生に対する FGF―８の影響A），B）Rat granulosa cells（１×１０５ viable cells in ２００ µl）were cultured in serum―free McCoy s５A medium containing １００ nM of androstenedione（a substrate for aromatase）. FSH（３０ ng/ml）was added to the culture medium with either alone or in combination with FGF―８（３ to １００ng/ml）. After ４
８―h culture, the levels of estradiol（A）and progesterone（B）in the medium weredetermined by CLIA.
０ µl）were cultured in serum―free McCoy s ５A meC）Granulosa cells（１×１０５ viable cells in ２０dium containing ０．
１ mM of IBMX. FSH（３０ ng/ml）was added to the culture medium with either
０ to１００ ng/ml）. After ４
８―h culture, the levels of cAMP inalone or in combination with FGF―８（１the medium were determined by EIA after the acetylation of each sample. Results are shownas mean ± SEM of data from at least three separate experiments, each performed with tripli０
１ and ＊, P＜０．
０５ vs. control or between the indicated groups.
cate samples ; ＊＊, P＜０．

はエストロゲンの有無にかかわらず，FGF―８の発現が検濃度反応性に特異的に抑制した（図２A）．一方で，FGF出された（図１A）．また，顆粒膜細胞には FGF―８の受―８はプロゲステロン産生および StAR の発現には影響を容体として報告されている FGFR―３，―４だけでなく，与えなかった（図２B）．そこで FSH 受容体のセカンドFGFR―１，―２も蛋白レベルで検出し，これらの FGF 受

メッセンジャー cAMP について検討したところ，FGF―容体の発現は FSH・FGF―８・BMP により影響を受けな

８は FSH による cAMP 産生に対して，直接的には影響かった（図１B）．次に FGF―８によるステロイド合成へしなかった（図２C）．つまり，FGF―８は FSH シグナルの影響を検討したところ，興味深いことに FGF―８は FSHの cAMP―PKA 経路以外の経路でエストラジオール産生によるエストラジオール合成および aromatase の発現をを抑制することが示唆された．

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図３

FGF―８の MAPK リン酸化に対する影響
０ oocytes/ml）were cultured in serum―free McCoy s ５AA）Rat granulosa cells（５×１０５ viable cells in １ ml） with or without oocytes（１００ to １００ ng/ml）and FSH（３０ ng/ml）were added to the cultured media for ６０ min. Cell lysates weremedium. After preculture, FGF―８（３subjected to SDS―PAGE/immunoblotting for ERK１/ERK２ and SAPK/JNK analysis. The results shown are representative of those obtained
from three independent experiments. The relative integrated density of each protein band was digitized. The results shown are representative of those obtained from three independent experiments. ＊＊, P＜０．
０１ and ＊, P＜０．
０５ vs. control or between the indicated groups.
００ ng/ml）and FSH（３０ to １００ ng/ml）in the presence or abB）Granulosa cells（５×１０５ viable cells in １ ml）were treated with FGF―８（１sence of various inhibitors including SU５４０２（Su；１ to １０ µM）and U０
１２６（U；３ to １０ µM）for ６０ min. Cell lysates were subjected to SDS―PAGE/immunoblotting analysis for ERK１/ERK２ analysis.

図４BMP シグナルに対する FGF―８の影響０ µl）were cultured in serum―free McCoy s ５A medium containing ０．
１ mM of IBMX. CellsA）Rat granulosa cells（１×１０５ viable cells in ２０were treated with FSH（３０ ng/ml）in combination with FGF―８（１０ ng/ml）and BMPs including BMP―２, ―４, ―６ and ―７（１００ ng/ml）. After ４
８―h culture, the levels of cAMP in the medium were determined by EIA after the acetylation of each sample.
B）Rat granulosa cells（５×１０５ viable cells in １ ml）were cultured in serum―free McCoy s ５A medium with FGF―８（１００ ng/ml）. After ４８―
h culture, total cellular RNA was extracted and Smad６ and Smad７ mRNA levels were determined by quantitative real―time RT―PCR. The
expression levels of Smad６ and Smad７ were standardized by RPL１９ level in each sample.
０ ng of ID―１―Luc reporter plasmid andC）After preculture, granulosa cells（５×１０５ viable cells in １ ml）were transiently transfected with ５０. After transfection, cells were treated with FGF―８（１００ ng/ml）in combination with BMP
５０ ng cytomegalovirus―βgal plasmid（pCMV―β―gal）―２, ―４, ―６ and ―７（１００ ng/ml）for ２４ h, and then luciferase activity and βgal activity of the cell lysate were measured. The data wereshown as the ratio of luciferase to βgal activity. Results are shown as mean ± SEM of data from at least three separate experiments,
０１ and ＊,P ＜０．
０５ vs. control or between the indicated groups.
each performed with triplicate samples ; ＊＊, P＜０．

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三好智子

他

近年，卵巣での FSH 受容体と MAPK 経路の関与が報告されており，ラット顆粒膜細胞において，FSH は FSH受容体を介し ERK を活性化することによりエストラジオール産生を抑制し，一方で FSH は p３８経路を活性化してエストラジオール産生の増加に寄与する［２，３］．
そこで FSH と FGF―８による MAPK 経路の活性化について検討したところ，FGF―８は顆粒膜細胞において ERKおよび SAPK/JNK を FSH の有無に関わらずリン酸化したが，p３８には影響を与えなかった（図３A）．また，FGFシグナル阻害剤である SU５４０２は FSH による ERK のリン酸化には影響を与えないことから（図３B），FGF はFSH シグナルと異なる経路で ERK を活性化すると考えられた．

BMP システムと FGF シグナルの相互作用
次に，FGF―８と BMP の相互作用について検討したところ，FGF―８は FSH による cAMP 産生には影響を与えなかった（図２）が，BMP による cAMP 抑制作用をさらに増強した（図４A）．そこで，BMP シグナルに対する FGF の影響を検討した．FGF―８は抑制型 Smad６/７の発現を減少することにより（図４B），BMP シグナルである ID―１転写の活性化を増強することが示唆された（図４C）．さらに，BMP シグナルを増 強 さ せ る FGF―８とMAPK の関与について検討するために，SP６００１２５を用いて SAPK/JNK を抑制すると FGF―８によって増強され．つまり，FGF―た ID―１転写の活性が低下した（図５A）
８は SAPK/JNK 活性化を介して BMP シグナルを増強することが示唆された．また，SAPK/JNK を抑制することにより，FSH 誘導性のエストラジオールおよびプロゲステロン産生の低下を認めることより，SAPK/JNK

図５

FGF―８影響下における MAPK と BMP シグナルの関与
A）Cells（５×１０５ viable cells in １ ml）were transiently transfected with ID―１―Luc reporter plasmid and pCMV―β―gal. Aftertransfection, cells were treated with FGF―８（１０ to １００ ng/ml）
００ ng/ml）in combination with U０１２６, SP６００１２５and BMP―６（１and SU５４０２（１ to １０ µM）for ２４ h, and then luciferase activity and βgal activity of the cell lysate were measured. Thedata were shown as the ratio of luciferase to βgal activity.
０ µl）wereB）Rat granulosa cells（１×１０５ viable cells in ２０００cultured in serum―free McCoy s ５A medium containing １nM of androstenedione. FSH（３０ ng/ml）was added to the culture medium with either alone or in combination with SP６００１２５（０．
３ to １０ µM）. After ４８―h culture, the levels of estradiol and progesterone in the medium were determined by
CLIA method. Results are shown as mean ± SEM of datafrom at least three separate experiments, each performed
０１ and ＊, P＜０．
０５ vs. conwith triplicate samples ; ＊＊, P＜０．
trol or between the indicated groups.

活性化は FSH によるエストラジオールおよびプロゲステロン産生の増加に関与することも示唆された（図５

おわりにB）．
このような BMP システムと FGF シグナルの連関は卵巣だけでなく，他の臓器においても証明されている．

今回の研究を通じて，)卵母細胞因子 FGF―８は ERK

骨組織では FGF―２が BMP 阻害因子である noggin の発を活性化することにより FSH によるエストラジオール

現を抑制することで，BMP―４の働きを 支 持 し て い る産生を抑制する，*FGF―８は SAPK/JNK を活性化する

８が noggin の［１１］．また，軟骨形成においては FGF―１

ことにより BMP―Smad シグナル作用を増強する，とい２］．
発現を抑制することで， BMP―２の働きが増強する［１う新たな“FGF―BMP 機能連関

同様の FGF と BMP シグナル相互作用は神経や異所性の卵母細胞―顆粒膜細胞間コミュニケーションとしての骨化でも認められており，BMP システムと FGF シグナ

BMP と FGF―８の協調作用は，顆粒膜細胞でのステロイ

ルは生体内で密接に関連していることが示唆された．

ド合成に重要であると考えられた．

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.15 2010が明らかとなった．こ卵母細胞因子 FGF―８と BMP による新たな卵胞ステロイド分泌調節の検討

謝辞

本稿は２００
９年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞候補演題に選出された研究をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 峰岸 敬先生，第１４回同学会大会長 倉智博久先生に御礼申し上げます．

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