タンパク質を並べ、貼り付ける 古野泰二（医学部）物理学の出発点：

質量、力、ニュートン方程式

F=ma

分子生物学の出発点： そこにその分子が存在するのか
分子Aと分子Bは結合するのか
水中では、１分子レベルでの評価は難しい
研究背景
フェリチン
Ferr 1IER

非特異吸着
配向しない、変性が起こる

二層膜モデル

カタラーゼ
CAT 4BLC

アフィニティ結合
His-tag - Ni-NTA... His×6 tagged protein

480 kDa 12 nm
pI ~5
牛血清アルブミン共有結合による固定
aldehyde (substrate)-amine (lys)amine (substrate)-carboxy (asp, glu)... random orientation

アフィニティ結合
ビオチン－ストレプトアビジン結合を利用して、ストレプトアビジンの配向配列を作り、ビオチン化したタンパク質を結合させる

BSA 3V03

アルコールデヒドロゲ
ナーゼ
AD 4W6Z

250 kDa 10 nm
pI 5.4ストレプトアビジン

SAv 1SWE

60 kDa 6 nm
pI 6.466 kDa 8 nm
pI 5.3トリプシンインヒビター TrpI 1AVU

20 kDa 4 nm
pI 4.5150 kDa 9 nm
pI ~5.8
カーボニックアンヒド
ラーゼ CA 1V9E

リゾチーム

Lyz 2LYZ
29 kDa 5 nm
pI 6.414 kDa 4 nm
pI 11.4

分子量14,000の小さなリゾチーム～
分子量480,000の大きなフェリチン

膜転写
ラングミュア-・シェーファー法

水面に展開したタンパク質の単分子膜と変性モザイクモデル

本研究で主に用いたタンパク質

タンパク質の各種固定法

生命現象の担い手であるタンパク質分子は小さく、たとえばそれがひとつの細胞内に「存在するのか」、あるいは、「たんぱく分子Aと分子Bが結合するのか」など、低次元の問題でもそれを短時間で分析し評価するのは難しい。時間とともに変化する生命現象の理解において、これらの短時間判定は重要なテクニックである。対象となる分子がガラスなどの基板表面に固定されていれば、それらに結合する抗体などの分子と蛍光法などとを組み合わせ「あるなし」の判断が可能になる。現在発展中のプロテインチップの出発点であり、成功の如何は機能する状態の分子を「活かしたまま高密度に」基板に固定できるかどうかにかかっている。タンパク質の多くは、基板表面にくっついただけで変性してしまう。
分子の固定法について多くの研究がなされてきたが、ここでは古くから知られている気/液界面を利用したタンパク質の単分子膜作成法と、ビオチン－アビジン結合と呼ばれる低分子とタンパク質の強い結合を利用した固定法を紹介する。基板の表面に固定する（くっつける）というのはもっとも基本的な技術であるが、プロテインチップだけでなく広い意味での分子デバイスや分析技術などにおいて重要であり、また基礎的の側面からも興味深い課題である。

（１） 直接展開のタンパク膜の転写固定
ビオチン化タンパク単分子膜
膜へのSAvの高密度結合

未変性タンパクと変性タンパクの膜が混在

未変性タンパクが変性タンパクの膜に吸着

UnfoldedSpread protein

疎水化したシリコンやガラスの基板を水平に水面に接触させることで水面のタンパク膜を表面に転写固定できる

Fully unfolded

未変性・変性の多相混合膜（２） ビオチン－ストレプトアビジン
反応を使ったタンパク分子固定
ビオチン化
タンパク膜

タンパク質単分子膜の面積－圧力曲線
Partly unfolded

Almost intact

A

4.5 mg/m2

40 minSurface pressure (mN/m)

100.8
Area (m2/mg)

207)
1)
6)

15リジン複合体2)ビオチン化タンパク質膜

ビオチン化4)

50.2

0.3

20.4

Area (m /mg)

0.50.6

00.5

Area (m2/mg)(d) AD

2015105000.2

0.40.6

20.8

Area (m /mg)

111.2

1.5(e) BSA

2530 s10 minSurface pressure (mN/m)

100.102510 min
10 min30 s0ビオチン－

101.5(a) CAT

1505 min5)

アビジン

10 min20 min10 min20 min5 min

1.5 mg/m2

HMDS-Si wafer
Si wafer

30 s
30 s
10 min201510SAv

50Teflon-coatedadhesive tape

Liquiddrop

ビオチン（ビタミンＨ）はストレプトアビジンに極めて強く結合する。
タンパク質のリシン残基をビオチン化することは容易である。
変性タンパク質膜を転写後ビオチン化し、これにストレプトアビジンを結合した後に、さらに、ビオチン化した目的タンパクを結合させることができる。
ストレプトアビジンは4個のビオチン結合部位をもっている。
Sulfo-NHS-Biotin

00.250.50.75

21Area (m /mg)

1.251.5Biotinylated
proteins

1.75

PBLH単分子膜への吸着と結晶化
3.0 mg/m2

Denaturedcarbonicanhydrase (CA)9)

2040 min1) Cat2) Ferr3) ApoF
4) TrpI
5) AD
6) CA
7) BSA
8) CA (denatured)
9) CytC

8)5

Surface pressure (mN/m)

カーボニックアンヒドラーゼの界面変性

200

Surface pressure (mN/m)

静かにタンパク質水溶液を水面に展開すると、多くのタンパクが変性を起こすことが古くから知られているが、その構造については未だにはっきりしない。タンパクにより極めて速く変性するものもあれ
ば、ほとんど変性せずそのまま水中に分散するものもある。
変性した膜と未変性の粒状のタンパクとの混合膜の構造は原子間力顕微鏡を用いても明瞭な粒子像を得るのが難しい。

Surface pressure (mN/m)タンパク質の界面変性

3)

2530

ストレプトB30Biotin-lysineconjugate

ビオチン化CA膜に高密度に結合したSAv
SAv layer

5 min

100nm

時間が経つと粒子の密度は減少するが、逆に、表面の圧力は増大する。分子がほどけて水面に一様な膜が生成した状態になると解釈できる。

高密度SAv配列に結合したビオチン化タンパク質

カタラーゼ、フェリチンの変性混合膜A

CAT

C3T10B

CAT

C9T5C

CAT

C21T1

水面に展開した合成ポリぺプチドの単分子膜にタンパク質を吸着させることにより、高密度の2次元配列や2次元結晶が生成した。

100nm

DFerr

C3T80

E

Ferr

C6T60

F

Ferr

Furuno, T. et al. 1989. Thin Solid Films. 180:23-30.
Furuno, T., Sasabe. H. 1993. Biophys. J. 65:1714-1717.

C12T5

100nm

水面への
直接展開

ペプチド単分子膜への吸着ビオチン化タンパク質をストレプトアビジン
配列に結合

界面変性で生成したタンパク質の膜は明瞭な粒子像を与えず、AFMのチップの汚れが頻繁に発生し、像質低下が起こる。

biotinylated AD

急速に界面変性する牛血清アルブミン、カーボニッ
クアンヒドラーゼ: BSA, CA (85 °C-treated )Spread high conc. solutions & short incubation time ∼ 5 s

空気と水の界面に展開したタンパク質の膜への吸biotinylated CA

着を利用し、異なる方法でタンパク質の2次元配列を作ることができた
多くのタンパク質は界面変性は急速である。転写した膜内の粒子の密度を上げるには、高濃度のタンパク溶液を水面に展開後、短時間の内に基板表面に転写する必要がある。
Furuno, T. 2014. Thin Solid Films. 552:170-179.

ビオチン化した変性タンパク質の膜にストレプトオアビジンを結合させて2次元の高密度配列を作り、これにビオチン化した任意のタンパク質を結合させて高密度な2次元配列を作成することができた。

ビオチン化した変性タンパク質の膜にストレプトオアビジンを結合させて2次元の高密度配列を作り、これにビオチン化した任意のタンパク質を結合させて高密度な2次元配列を作成することができた。
Furuno, T. 2016. Thin Solid Films. 604:40-47.