研究フロンティア（平成２１年度学術奨励賞受賞論文）

ラット卵巣 LH 受容体の発現調節における microRNA の意義北原 慈和
群馬大学大学院医学系研究科産科婦人科学教室

はじめに

このように，顆粒膜細胞における LH 受容体の発現調
節はさまざまな因子によって行われていることが知られ卵巣などの性腺の機能調節には，視床下部―下垂体―るようになってきたが，これらの発現調節機構の解明

性腺の相互作用が重要である．なかでも下垂体前葉からは，受容体遺伝子の転写や mRNA の安定性に着目して分泌されるゴナドトロピン（FSH, LH）は，卵巣におけ行われてきた．そこでわれわれは!post

る卵胞の発育を促し，LH サージにより成熟卵の排卵をregulation に着目し，新たなゴナドトロピン受容体発引き起こし，さらに排卵後の卵胞の黄体化を誘導するな現調節機構の解明を目指すこととした．そのため!post

ど，さまざまな役割を担っている．また，これらのゴナ

transcriptional

ドトロピンは，卵巣の顆粒膜細胞と莢膜細胞に発現して最近注目されている microRNA（miRNA）に着目し，研いるゴナドトロピン受容体（FSH 受容体や LH 受容体）究を進めることとした（図２）．

transcriptionalregulation において重要な因子としてに結合することにより，細胞内におけるステロイド産生の調節を行っている．さらに，卵巣より分泌されるステ

microRNA（miRNA）とはロイドホルモンやインヒビンが中枢にフィードバックをかけることにより，ゴナドトロピンの分泌の調節を行っ

microRNA（miRNA）は，１９〜２３塩基からなる小さな１本鎖 RNA である．幅広い生物種に存在しており，RNAている．
われわれの研究グループでは，ゴナドトロピン受容体ではあるがそれ自身はタンパク質をコードしていない．の機能や発現調節について，さまざまな角度から研究を

しかし，miRNA と相補性を示す mRNA（メッセンジャー行ってきた．例えば，卵胞発育の際には FSH 受容体のRNA）と結合することにより，mRNA の分解や翻訳の発現の増強がみられるが，その増強を誘導する因子とし制御を行っていると考えられている．このように，タンてアクチビンが作用していることなどを報告してきた

パク質をコードしていないが，何らかの機能を果たして［１，２］．また，卵巣の顆粒膜細胞における LH 受容体のいる RNA のことを，一般的にノンコーディング RNA発現調節においても，その発現を増強する因子として（non―coding RNA : ncRAN）と呼んでいる．よく知られFSH やアクチビン［１］，エストラジオール（E２）などている ncRNA には，トランスファー RNA（tRNA）やが関与していることを報告してきた．

リボゾーム RNA（rRNA）などがある．さらに，miRNA

さらに，顆粒膜細胞において FSH の刺激により発現が誘導された LH 受容体は，hCG や LH の刺激が加わるとその受容体の発現が低下する，いわゆる LH 受容体
mRNA の down regulation が起こることも知られている（図１）．これに関連するタンパク質の１つとして，メバロネート

カイネース（MvK）が発見された［３，４］．

この MvK はコレステロール合成に関与している酵素であり，LH 受容体 mRNA に結合することにより mRNAを不安定な状態にすると考えられている［５］．

連絡先：北原慈和，群馬大学医学系研究科産科婦人科学教室〒３７１―８５１１ 群馬県前橋市昭和町３―３９―１
５
TEL：０２７―２２０―８４２３
FAX：０２７―２２０―８４４３
E-mail : kitahara@med.gunma-u.ac.jp

図１

hCG 投与後に起こるラット卵巣 LH 受容体の mRNA レベルでのdown regulation（northern blotting）

日本生殖内分泌学会雑誌（2010）15 : 41-45

41

北原慈和

転写
５ CapmRNAの安定性

FSH

Activinなど
AAAAAA３Mvk、IGF-１
TGB-β、E2など

図３
図２

ラット卵巣における miRNA

マイクロアレイについて

ラット顆粒膜細胞における LH 受容体の発現調節の概略図てさらに切断されることにより，２２塩基程度の miRNA―のように短い塩基鎖からなる non―coding

RNA には，miRNA＊ duplex（２本 鎖）を 形 成 す る．そ の 後，一 般RNA 干渉を引き起こす small interfering RNA （siRNA）

的 に は pre―miRNA の５ 末 端 側 の miRNA が 成 熟 し たや，生殖幹細胞の分化に関与していると考えられている

miRNA として RNA―induced silencing complex （RISC）

piwi-associated RNA（piRNA）などがあげられる．に取り込まれることにより，miRNA としての働きをな

miRNA の最初の発見は，
１９９３年の Ambros らのグルーすと考えられている．

プが線虫の lin ― 4遺伝子を同定したことによるといわれている［６］．lin ― 4遺伝子は，２２塩基と６１塩 基 の２種

miRNA マイクロアレイを用いたラット卵巣に類の RNA をコードしており，このかなり短い塩基鎖かおける miRNA の変化

４タンパク質の発現レベルの一時らなる RNA が，LIN―１的な減少と関係があるということを見い出した．さらに，３週齢の雌のラットに妊馬血清性性腺刺激ホルモン

Ruvkin らのグループとともに，lin ― 4遺伝子より転写さ（pregnant mare serum gonadotropin ; PMSG）を投与れた短い方の２２塩基 の RNA と，lin ― 14mRNA の３し，卵胞を発育させる．その後，hCG を投与し排卵を非翻訳領域（UTR）の塩基配列と相補性をもっており，誘起させると，先に述べたように，PMSG の刺激によっlin ― 4は lin ― 14の翻訳に何らかの影響を及ぼしているこて発現していた顆粒膜細胞における LH 受容体の downとが示唆されると報告した［７］．その後，同じく線虫

regulation が 起 こ る（図１）．こ の LH 受 容 体 の downから発見された短い RNA である let ― 7などが，さまざregulation が起こっている時相に一致して，増加していまな種類の動物たちにおいても検出され，進化の過程にるタンパク質として MvK があり，この働きによって LH

おいて lin ― 4や let ― 7などは保存されていることがわ

受 容 体 の mRNA が 不 安 定 と な り，LH 受 容 体 の down

かった［８］．

regulation が起こっていることは先に述べたとおりであ

このような発見によって，進化の過程で保存されている．そこで，もしこの時相に増加している miRNA がある，タンパク質をコードしていない２０塩基程度の短い１

れば，それらの miRNA もまた，LH 受容体の down regu-

本鎖 RNA が，発生過程や細胞機能の制御などに重要なlation に関与している可能性があると考えた．つまり，役割を果たしている可能性が示され，これを microRNA

miRNA は遺伝子の翻訳の制御・抑制，もしくは，mRNA（miRNA）と呼ぶようになった．の分解を行っていると考えられているので，LH 受容体

miRNA の発現は，siRNA とは異なり，miRNA 遺伝子より転写されることにより 引 き 起 こ さ れ る．ま ず，の down

regulation が miRNA の働きによって引き起こされている可能性もあると考えた．

miRNA 遺伝子より数百から数千の塩基からな る pri―

そこで，われわれは，PMSG―hCG 刺激を行った３週

miRNA に核内で転写される．この pri―miRNA は Drosha

齢の雌ラットより経時的（PMSG ０h, hCG ０h（PMSGを含む MicroProcessor という複合体により切断され，４８h）， hCG ３h, hCG ８h, hCG ２４h）に卵巣を摘出し，

stem loop 構造をもつ約７０塩基程度の長さの pre―miRNAそれぞれの卵巣より RNA 抽出を行った．これらの RNAとなる．この pre―miRNA は輸送タンパクである Expotinを用いて，ラット卵巣に発現している miRNA を網羅的―５によって細胞質へと輸送される．そこで，Dicer によっに探索するために，miRNA マイクロアレイ を 行 い，

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ラット卵巣 LH 受容体の発現調節における microRNA の意義

図５
図４

ラット卵巣における miRNA と LH 受容体の発現量の経時的変化（in vivo）

顆粒膜細胞における miRNA と LH 受容体の発現量の経時的変化（in vitro）

る miRNA の デ ー タ ベ ー ス（miRBase ; http : //www.
miRNA の発現量の経時的な変化を調べることとした．

mirbase.org/）を用いて，LH 受容体と結合し得る配列

この miRNA マイクロアレイの結果において，PMSGをもつ miRNA を検索した．その結果，LH 受容体と結０h を除いた残りの４群（hCG ０h（PMSG ４８h）
，hCG合し得る配列をもった miRNA を１つに絞り込むことが３h，hCG ８h，hCG ２４h）を用いて，一元配置分散分できた．この miRNA をターゲットとして，以後の実験析を行った．その結果，統計学的に有意な差を認めたを行うこととした．

miRNA は４４個であった．これらの miRNA を用いて階層クラスタリング解析を行ったところ，３群にクラスラット卵巣における miRNA の発現量と LH 受容体ター分割することができた（図３）．それぞれのクラスの発現量の経時的変化（in vivo において）ターは，以下である．
第１クラスター；経時 的 に 発 現 の 変 動 が み ら れ な い

先ほどと同様の方法で，PMSG―hCG 刺激を行った３miRNA.

週齢のメスのラットより卵巣を摘出し，それぞれの卵巣第２クラスター；hCG ３h 時点で若干の発現の増加がより RNA を抽出し，real time RT―PCR を行い，miRNAみられ，その後，発現が減少している miRNA.と LH 受容体の経時的な発現量の変化を調べた（図４）．

第３クラスター；hCG ３h 時点で若干の発現の減少がこれらの結果は，先の miRNA マイクロアレイの結果とみられ，その後，発現が増加している miRNA同様に，LH 受容体 mRNA の down regulation が起こっと分割することができた．ている時相に一致して miRNA の発現量が増加し，さらこ れ ら の ク ラ ス タ ー の な か で，LH 受 容 体 の downに，LH 受容体の発現量が回復してくると，miRNA の発regulation に関連していると考えられるのは，第２クラ現量は減少傾向となっていた．これらの結果より，LHスターであろうと予想した．なぜならば，LH 受容体の受容体の down発現を抑制する方向に miRNA が作用しているのであれ及ぼしている可能性があることが，再度示唆された．

ば，LH 受 容 体 が downregulation に miRNA が何らかの影響をregulation さ れ て い る 時 相 でmiRNA の発現量は増加し，逆に，LH 受容体の発現が回未熟な顆粒膜細胞の初代培養における miRNA の発復してくる時相においては，miRNA の発現量は減少し現量の経時的変化について（in vitro において）てくると予想されるからであった．そこで，第２クラスターに分類さ れ た miRNA ２３個 を LH 受 容 体 の down
regulation を引き起こす miRNA の候補とし，実験を進めることとした．

次に，ラット卵巣より未熟な顆粒膜細胞を採取したのち初代培養を行い，実験を行うこととした．
３週齢のメスラットに DES を２mg/body/day ４日間投与し，その後卵巣を摘出し未熟な顆粒膜細胞を採取しmiRNA database を用いた miRNA の絞り込みた．血清無添加の培養液で培養しながら FSH 添加し，LH 受容体の発現を誘導して，さらに FSH を添加してかmiRNA マイクロアレイの結果により，候補に挙がっ

ら４８h 後に hCG を添加し，LH 受容体の down regulation

た２３個の miRNA について，web site 上に公開されていを惹起した．その際の miRNA の発現量の変化を，real

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図６

顆粒膜細胞における miRNA の機能解析
A）miRNA をトランスフェクトした場合の LH 受容体の発現量の変化
B）miRNA inhibitor をトランスフェクトした場合の LH 受容体の発現量の変化

time RT―PCR にて確認した（図５）．
すると，LH 受容体の downregulation が起こる時相に，miRNA の増加がみられ，in vivo の結果と同様，顆粒膜細胞の初代培養の系においても，LH 受容体の down

図７A） luciferase assay に用いたベクター
B） LH 受容体 mRNA における miRNA binding site の同定について（luciferase assay）

regulation に miRNA が何らかの関与をしていることを

LH 受容体 mRNA における miRNA の結合部位の示唆する結果であった．

同定について未熟な顆粒膜細胞の初代培養における miRNA の機能解析

miRNA は RISC に取り込まれたのち，ターゲットとしている mRNA の３ 末端非翻訳領域（３ UTR）に結合

先と同じ方法で DES

priming を行った３週齢のメスラットより，未熟な顆粒膜細胞を採取し，培養を行った．

することにより，翻訳の制御（抑制）や，場合によっては mRNA の分解を引き起こすと考えられている．

この未熟な顆粒膜細胞に miRNA をトランスフェクト

今回ターゲットにしている miRNA の結合部位は，し，miRNA を強発現させた後，FSH を添加し LH 受容ラット LH 受容体 mRNA の３ UTR 内の２８４８〜２８６６番目体の発現を誘導した．その際の，LH 受容体の発現量をにあると，先にあげた miRBase（miRNA のデータベー

real time RT―PCR にて調べると，コントロールに比べス）で予想されている．そこで，luciferase

miRNA をトランスフェクトした顆粒膜細胞では，LH 受いて，LH 受容体に対する miRNA の結合部位の同定を容体の mRNA レベルでの減 少 が み ら れ た．つ ま り，試みた．

miRNA をトランスフェクトすることにより，LH 受容体の発現の抑制が引き起こされたと考えられた（図６A）．
逆に，顆粒膜細胞に miRNA inhibitor をトランスフェassay を用

まず，ラット LH 受容体の cDNA を用いて，miRBaseに予想されている結合部位を含んだ luciferase（これを vectorvector１とする）と，結合部位を含まない lu-クトし， その後 FSH を添加し LH 受容体を発現させた．

ciferase vector（これを vector ２とする）を作製した（図その際の LH 受容体の発現量を real time RT―PCR にて７A）．これらのベクターを，未熟な顆粒膜細胞の初代調べたところ，コントロールに比べ LH 受容体の発現量培養にトランスフェクトしたのち，FSH を添加し LH 受は増加していた．これは miRNA inhibitor によって顆粒容体の発現を促した．その際に，細胞内で産生される膜細胞内の miRNA の働きが抑制されたため，LH 受容miRNA によって翻訳の抑制（もしくは，mRNA の分解）体の発現の抑制が起こらず，LH 受容体の発現量の増加が起こると，Vector １の luciferase タンパクの発現が抑につながったと考えられた（図６B）．

制されるため，luciferase 活性がコントロール（empty

これらの２つの実験より，LH 受容体の発現調節にはmiRNA が大きく関わっていることが示唆された．

vector の luciferase 活性）と比べて低下することとなる．
実際に今回の実験においても，lciferase 活性は約５０％低下していた．

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ラット卵巣 LH 受容体の発現調節における microRNA の意義

さらに，luciferase vector とともに，miRNA inhibitor

引用文献も同時にトランスフェクトすると，FSH の添加によって誘導された miRAN の働きを抑制するため，luciferaseタンパクの発現の抑制が起こりにくくなり，luciferase活性が回復することとなる．実験においても，その活性はコントロールに比べ約８０％の活性（２０％の活性の低下）を示し，inhibitor をトランスフェクトしなかったときに比べ，明らかにその活性は回復していることが示された（図７B）．
ちなみに，結合部位を含まない Vector ２は，いずれの条件においても，コントロール（empty vector）の luciferase 活性とほぼ同等の活性であった．つまり，miRNAの結合部位をもたない vector は，翻訳の制御などが起こらず，luciferase 活性の変化も起こらないことが示された．

おわりにわれわれのグループでは今までに，卵巣に発現しているゴナドトロピン受容体がどのように発現調節されているかを解明してきた．今回はその一環として，翻訳の制御や mRNA の分解など!post transcriptional regulationに関与している miRNA に着目し研究を行った．
タ ー ゲ ッ ト と し た miRNA は，LH 受 容 体 の down
regulation において，何らかの作用を及ぼしていることが今回の実験結果から示すことができたと思われる．しかし，そもそも miRNA がどのように誘導され，どのように翻訳の制御や mRNA の分解を行っているのかなど，まだまだ解明されていない点も多くあるのも事実である．今後，そのような点を解明していければと考えている．
謝

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辞

このような執筆の機会を与えてくださいました，日本生殖内分泌学会理事長 峯岸 敬教授，第１４回日本生殖内分泌学会
学術集会会長 倉智博久教授に感謝申し上げます．

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