土壌肥沃度診断（ SOFIX ）－総合的物質循環に基づく土壌診断－
 土壌中の総細菌数および物質循環活性に基づいた土壌肥沃度診断（SOFIX：Soil Fertile Index）を開発した。
 SOFIXを適応し土壌改善・改良を行うことで、化学肥料の低減や安定的な有機農業へ貢献できる。
SOFIX成分の実測例
測定項目(mg/kg)
硝酸態窒素

土壌A

土壌B

950

水溶性リン酸85

0

水溶性カリウム

60

0

全炭素

50,0005,000

全窒素

10,000
,600

全リン酸

3,000

700

全カリウム

3,000

900

50

2

平均45点

土壌B
20点

土壌B

50
250

亜硝酸酸化活性アンモニア酸化活性

図１．窒素循環活性のレーダーチャート

土壌A
壌
80点

1007550

土壌A

75

土壌A
壌80点

100251000
土壌試料No.

図２．窒素循環活性評価値の相対的位置

水溶性リンの評価値（点）水レーーダーチャートの評価値（点）総細菌数（億個/g）総細菌数755025

平均36点

土壌B
10点0
土壌試料No.

図３．リン循環活性評価値の相対的位置

立命館大学 総合理工学院 生命科学部・生物工学科 教授 久保 幹
連絡先 理工リサーチオフィス TEL:077-561-2802 E-mail:liaisonb@st.ritsumei.ac.jp

農地土壌診断－有機農法のための農地物質循環の評価－

松野敏英1)、津田治敏1)、久保田謙三1)、松宮芳樹1)、久保幹1)＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝Diagnosis of agricultural soil
– Assessment of Material Cycle for Organic agriculture –Toshihide Matsuno1), Harutoshi Tsuda1) Kenzo Kubota1), Yoshiki Matsumiya1) andMotoki Kubo1)

A simple and rapid method for extracting environmental DNA (eDNA) from soils was constructed byslow-stirring with chemical treatment.
of soil.

eDNA was efficiently extracted with minimal damage from various kinds

The amount of eDNA and soil bacterial biomass showed a linear proportional relation, indicating thatbacterial biomass could be evaluated by quantifying levels of eDNA. An average bacterial biomass of 220
agricultural soils was 3.0 × 109 cells/g-sample by the slow-stirring method.

For analysis of the circulation of

inorganic nitrogen in agricultural soils, ammonia nitrogen and/or nitrite nitrogen were added into the soils, andthen the reduction amounts of each nitrogen compound were measured after three days incubation.

A bacterial

biomass based on eDNA and the reduction ratio of both ammonia nitrogen and nitrite nitrogen were used forassessment of the agricultural soils.

Consequently, a novel quantification method based on nitrogen circulation

using the radar chart was constructed.

Key words; Environmental DNA, Nitrogen circulation, Organic agriculture, Material cycle, Soil assessment

E-mail: kubo@sk.ritsumei.ac.jp (M. Kubo)＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
1)

立命館大学生命科学部生物工学科
Department of Biotechnology, Faculty of Life Sciences, Ritsumeikan University,
1-1-1, Nojihigashi, Kusatsu, Shiga 525-8577, Japan1)

１．はじめにを考慮していないのが現状である。また、有機農法

日本や多くの先進国では、化学肥料の普及によっでは土壌中に未分解の有機物が蓄積する。このようて農作物の生育に必要な栄養分を容易に施用するこな有機物の一部は植物生長促進作用を有することがとが可能となり食料増産に成功した。世界の人口は近年知られつつある（4, 5）。しかし、土壌中の有機今後も増加することが予想されており、食料生産性物の大部分は植物によって直接的に利用されることを向上させるために化学肥料の適切な施用は今後もはなく、土壌生物や土壌細菌の働きによって分解（無重要であろう。

機化）されることで、やがて農作物に利用される。

一方、現在では化学肥料の連用や過剰使用に起因

このため、特に有機農法では施肥効果に影響を及ぼする様々な問題点が顕在化してきている。例えば、すことから、土壌生物や土壌細菌に基づく物質循環土壌生産力の低下（化学肥料の連用によって土壌団を考慮することが重要である。換言すれば、有機農

粒の減少、土壌の硬質化）、環境汚染（化学肥料の過法の安定的な施用には土壌環境および堆肥環境を正剰使用によって土壌や地下水の汚染）などが挙げら確に把握する必要がある。しかし、従来の診断技術

れる（1）。さらに、近年の世界的な化学肥料需要のでは化学分析による肥料成分の解析のみであった。

増大に伴って化学肥料価格も高騰しており、農業生このため、今後は土壌の物質循環に寄与する生物活産コストの大幅な上昇は農業への経済的負担を招い性に着目した生物的解析が重要である。本研究では、ている。

農地土壌診断の指標として土壌細菌（生物活性）に

農業における農作物の生育や収穫量は農地の土壌着目し、土壌中の総細菌数およびそれらの細菌に起環境に大きく依存している（2）。このため、農地の因する窒素循環活性に基づいた農地土壌診断を開発

土壌環境を農作物栽培に適した状態にコントロールした。

することが重要である。このような状況下で、農地の土壌環境を簡便かつ高精度に把握・評価する技術が求められている。農地土壌診断は、土壌の物理化

２．材料および方法学的性質やその土壌中の栄養分の質および量を科学的に解析する技術であり、農作物栽培に適した施肥

環境 DNA（environmental DNA、eDNA）解析設計のための情報を提供する技術として注目されて

自 然 環 境 中 の 細 菌 由 来 DNA （ environmentalいる。このような診断技術は、これまでの経験的なDNA、以下 eDNA）の抽出および解析を行った（6, 7）。

施肥を改め、診断に基づいた適正な施肥を可能にし滅菌したチューブに供試土壌 1.0 g、DNA抽出緩衝た。この結果、減肥による肥料コストの低減、適正液（100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM 2Na・施肥による環境汚染の防止が期待されている。

EDTA、100 mM NaH 2 PO 4 、1.5 M NaCl、1% (w/v)

また、近年の“食の安全・安心”に対する消費者

Hexadecyltrimethylammonium Bromide）を 8.0

意識の高まりに伴い、有機農法に対する関心が増大

ml、20 % (w/v)ドデシル硫酸ナトリウム溶液 1.0 ml

している。有機農法で施用する堆肥などの有機肥料を加え、攪拌機（簡易型微生物DNA抽出前処理装置は化学肥料と異なり肥料成分バランスの調整が不可

1004、井元製作所）で攪拌（1,500 rpm、室温、20能である。このため、有機農法では有機肥料中の肥分間）した。攪拌した溶液 1.5 mlを遠心分離（8,000料成分の過不足を見極めることが重要である（3）。

rpm、室温、10 分間）に供し、水層 700 µlを新たなしかし、堆肥などの有機肥料の作製は、多くの場合、チューブに分取し、クロロホルム・イソアミルアル経験的に行われており、その中に含まれる肥料成分

コール（24:1 (v/v)）700 µlを添加し、緩やかに転倒

混和後、遠心分離（14,000 rpm、室温、10 分間）

KCl 溶液 20 ml を混和（100 rpm、室温、60 分間）した。水層 500 µlを新たなチューブに分取し、2-プした後、遠心分離（10,000 rpm、室温、5 分間）しロパノール 300 µlを添加し、緩やかに転倒混和後、た。この上清に含まれるアンモニア態窒素、亜硝酸遠心分離（14,000 rpm、室温、20 分間）した。水態窒素および硝酸態窒素の定量はそれぞれインドフ層を除去後、70 %(v/v)エタノール 1.0 mlを添加し、ェノール青法、ナフチルエチレンジアミン法および遠心分離（14,000 rpm、室温、5 分間）した。水層

ブルシン・スルファニル酸法に従い行った（8, 9）。

を除去後、アスピレーターで減圧乾燥し、環境DNA（eDNA）を得た。このeDNAをTE 緩衝液に溶解し、アガロースゲル電気泳動に供した。マーカーとして
smart ladder（NIPPON

３．結果および考察

GENE、富山）を使用した 。 ア ガ ロ ー ス ゲ ル 上 の DNA 量 は KODAK 1D

eDNA と総細菌数の関係解析

Image Analysis software（KODAK、東京）を用い

これまで、eDNAの抽出には、コストパフォーマて解析した。eDNA量は以下の式（A）から算出しンスや処理時間、特殊な機器の必要性、物理的なた。

DNAのせん断、土壌中の腐食酸のような不純物の混eDNA 量 = ゲル中の DNA 量(ng) ×
全溶液量(µl)
分取した水層量(µl)× 10−3

TE 緩衝液量(µl)

eDNA 溶液量(µl)×…（A）

さらに、eDNA-総細菌数の検量線（R2 = 0.94）から算出した以下の式（B）に従って総細菌数を算出した。そこで、土壌中に存在する総細菌数を短時間で簡便かつ高精度に把握できるeDNA解析方法を構築した。さらに、本解析方法に基づくeDNA量と総細菌数の関係解析を行ったところ、抽出したeDNA量とDAPI染色によって求めた総細菌数は高い相関性を示した（eDNA量と総細菌数の検量線はY=(1.70た（図 1）。
総細菌数（cells/g-sample）＝eDNA量（µg/ g-sample）
×1.70×108

入による酵素反応阻害など改良すべき課題が存在し…（B）

×108)Xであり、相関係数R 2値は 0.96 を示した（図1 ））。 本 検 量 線 に お け る 検 出 限 界 は 7.8 × 106
cells/g-sampleであった。これらの結果から、本解析方法によって土壌中に含まれる総細菌数を短時間で簡便に解析することが可能になった（10）。

窒素循環活性測定法
1.0 × 1010

よび畑土壌はそれぞれ最大保水量の 100%および60%の含水率に調整した。これらの土壌にアンモニア態窒素として硫酸アンモニウム水溶液あるいは亜硝酸態窒素として亜硝酸カリウム水溶液を終濃度が60 µg-N/g-soil になるように添加し、25℃で 4 日間静置した。添加したアンモニア態窒素および亜硝酸態窒素の減少率からアンモニア酸化活性および亜硝酸酸化活性を見積もった。土壌中に含まれる無機態
窒素含有量を測定するために、土壌 2.0 g と 1.0 M

総細菌数（cells/g-sample）

供試土壌の含水量を調整するために、水田土壌お8.0 × 109
6.0 × 109
4.0 × 109
2.0 × 109
7.3 × 1060.042

204060eDNA 量（µg/g-sample）

図 1 土壌 57 サンプルの DAPI 染色による総細菌（△）農地数と eDNA の相関性.（■）農地土壌、以外の土壌、（◇）石油汚染土壌を示す.

eDNA 解析方法による土壌中の総細菌数
eDNA解析方法によって様々な土壌中における総80細菌数を解析するために、農地（86 サンプル）、農60

地以外の土壌（60 サンプル）、石油汚染土壌（63 サ40ンプル）の合計 209 サンプルを用いて解析を行った。

30

その結果、農地の総細菌数は 1.2 × 109 ～ 1.8 × 1010

10cells/g-sampleの範囲であり、その平均は 6.0 × 109

60

は 3.0 × 108 ～ 9.6 × 109 cells/g-sampleの範囲であ

5020

サンプル数

cells/g-sampleであった。農地以外の土壌の総細菌数70

A7.8 × 106

1.0 × 108

1.0 × 109

1.0 × 1010

7.8 × 106

1.0 × 108

1.0 × 109

1.0 × 1010

7.8 × 106

1.0 × 108

1.0 × 109

1.0 × 1010

50
403020り、その平均は 1.9 × 109 cells/g-sampleであった。

10さ ら に 、 石 油 汚 染 土 壌 の 総 細 菌 数 は 1.0 × 109

60cells/g-sample以下であり、検出限界以下の土壌が多50数存在した（図 2）。これらの結果から、土壌中の総30B4020

細菌数は土壌環境によって大きく異なることが明らC10かになった。このため、土壌中の総細菌数が農地や総細菌数（cells/g-sample）

その他の土壌環境を判断するための指標の 1 つとし

図 2 各種土壌での eDNA 量からの総細菌数の分布（合計 209 サンプル）.（A）農地土壌（86 サンプル）、（B）農地以外の土壌（60 サンプル）、（C）石油汚染土壌（63 サンプル）を示す.て使用可能であることが示唆された。

農地土壌の総細菌数の解析
農地土壌を評価・診断するための指標の 1 つとして農地土壌の総細菌数を使用するためには、先述した農地土壌（60 サンプル）よりも多数の土壌を解析し、総細菌数の閾値を把握することが重要であることが考えられた。このため、実際の農地土壌（220
結果、これらの農地土壌の総細菌数の平均は 3.0 ×
109 cells/g-sampleであった（図 3）。この値は先述の農地土壌（60 サンプル）よりも低い値を示した。
この理由として、栽培環境や肥培管理が幅広く異なった多数の農地土壌を供試土壌として使用したためであることが考えられる。結果的に、実際の農地土壌診断では農地土壌の現状を反映すべきであることから、農地土壌診断のための総細菌数の平均は 3.0 ×
109 cells/g-sampleを使用した。また、総細菌数が2.0 × 108 cells/g-sample以下の土壌では窒素循環活性の顕著な低下を示した。

10010
1.0×10
総細菌数（cells/g-sample）

サンプル）における総細菌数の解析を行った。その1091.0×10

1.0×1018

1.0×1007
1126505176100150 176 200101 126 151
201
サンプル数

図 3 農地土壌の総細菌数. 220 サンプルの農地土壌の総細菌数を解析した.

農地土壌の窒素循環大の面積を 100 点（評価値）とすることで、各供試

農地土壌の窒素循環過程では、アンモニア態窒素土壌の評価値（点）を算出した。一例として、本土が亜硝酸態窒素に変換され、さらに亜硝酸態窒素か壌診断によって有機栽培土壌と無機栽培土壌を比較ら硝酸態窒素に変換されている。そこで、農地土壌したところ、有機栽培土壌では無機栽培土壌よりもにおける無機態窒素の蓄積量を明らかにするために、多数の土壌細菌の生育が見られた。さらに、これら複数の土壌中のアンモニア態窒素、亜硝酸態窒素おの土壌細菌に起因した窒素循環活性も有機栽培土壌よび硝酸態窒素の含有量を測定した。その結果、使の方が高い値を示した。結果的に、本農地土壌診断用した大部分の試料土壌において他の窒素化合物とにおける有機栽培土壌の評価値は 62.7 点であり、無比較して硝酸態窒素含有量が最も高い値（7.0～46.0

機栽培土壌の評価値は 7.1 点であった（図 4）。これµg-N/g-sample）を示した。さらに、使用したすべらの結果から、本農地土壌診断の利用によって土壌ての土壌において亜硝酸態窒素含有量が最も低い値中の生物活性（物質循環）に基づいた土壌の定量的（0.03～0.41 µg-N/g-sample）を示した。さらに、な評価・診断が可能であることが示唆された。

これらの農地土壌における無機態窒素の変換活性を明らかにするために、供試土壌にアンモニア態窒素（硫酸アンモニウム）、亜硝酸態窒素（亜硝酸ナトリ

有機栽培土壌
土壌微生物数の相対値（%）

ウム）および硝酸態窒素（硝酸ナトリウム）をそれ100ぞれ添加し、4 日間静置した後の各無機態窒素の減75少率を測定した。その結果、アンモニア態窒素の減50少率は 13～96%の範囲であり、平均は 43%であった。

25

亜硝酸態窒素の減少率は 18～100%の範囲であり、0平均は 86%であった。また、硝酸態窒素含有量は変化しなかった。本結果から、農地土壌の窒素循環過程ではアンモニア態窒素から亜硝酸態窒素への変換

亜硝酸態窒素の減少率（%）

アンモニア態窒素の減少率（%）

評価値：62.7 点が律速段階であることが示唆された（11, 12）。本
結果は既知の報告と一致するものであった（13, 14）。

無機栽培土壌
土壌微生物数の相対値（%）

土壌中の総細菌数と窒素循環活性に基づく農地土

100

壌診断

75

農地土壌診断を行うためのパラメーターとして農50

地土壌中の総細菌数およびそれらの細菌に起因する25

窒素循環活性を使用することにした。具体的には「ア0ンモニア態窒素の減少率」、「亜硝酸態窒素の減少率」さらに「総細菌数の相対値」の 3 つのパラメーターである。
「総細菌数の相対値」は、先述した農地土壌

亜硝酸態窒素の減少率（%）

アンモニア態窒素の減少率（%）

評価値：7.1 点

中の総細菌数の平均値（3.0 × 109 cells/g-sample）を 100％として算出した。さらに、これらのパラメーターから成るレーダーチャートを作成し、この最図 4 窒素循環に基づく土壌評価. 有機栽培土壌の評価値は 62.7 点であり、無機栽培土壌の評価値は 7.1 点を示した.

このため、有機農法で施用するための肥料成分が整窒素循環に基づく農地の土壌評価
先述した農地土壌診断に基づいて滋賀県、京都府った理想的な堆肥の開発も重要である。土壌診断におよび宮城県の農地土壌（37 サンプル）を解析した。

基づいた適正施肥や土壌改良は、健全な農作物を育その結果、解析した農地土壌の評価値は 2.6 点～み、人の健康維持、環境汚染防止に繋がることが期37.1 点の範囲であり、その平均は 22.2 点であった待される。本稿で紹介した土壌細菌に基づいた農地（図 5）。これらの農地土壌の中には、類似した総細土壌診断が農地土壌の包括的評価の一助となること菌数（総細菌数の相対値）を示した土壌が複数確認を期待したい。

されたが、最終的な評価値は必ずしも類似していなかった。これは、「アンモニア態窒素の減少率」や「亜硝酸態窒素の減少率」が土壌毎に異なったためである。これらの結果は、農地土壌における窒素循環の文(1)

ような土壌の状態を評価するためには、総細菌数および窒素化合物の挙動（アンモニア態窒素および亜硝酸態窒素の挙動）の両方を解析することが重要で(2)(3)あることを示している。
(4)

土壌評価値（点）403020(5)100(6)

1102030

サンプル数

図 5 窒素循環に基づく農地の土壌評価. 37 サンプルの農地土壌を解析した. 土壌評価の平均は 22.2 点であった.

４．おわりに
今後は、農地土壌を評価する因子として、土壌の物理化学的性質や栄養分組成のみならず生物活性に基づいた物質循環が重要になることが予想される。
土壌中の有機物は土壌生物や土壌細菌の分解作用によって無機化されることで農作物に利用される。このため、特に、有機農法では農作物の生育にとって土壌中の物質循環が重要である。さらに、有機農法
では、堆肥の肥料成分が明確であると共に、容易に分解（無機化）される堆肥を施用するべきである。

(7)

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土壌機能モニタリング調査のための土壌、水質及び植物体分
析法、財団法人 日本土壌協会(9)

堆肥等有機物分析法、財団法人 日本土壌協会(10) 津田治敏、松野敏英、佐藤貴宣、諸江泰宏、久保田謙三、松宮芳樹、久保 幹、農地土壌のアンモニア酸化細菌と窒素循
環（1）－アンモニア酸化細菌数とアンモニア酸化活性との関係解析－、生物工学会誌、9 月、2009 年(11) 松野敏英、津田治敏、佐藤貴宣、諸江泰宏、久保田謙三、松宮芳樹、久保 幹、農地土壌のアンモニア酸化細菌と窒素循
環（2）－アンモニア酸化細菌の土壌投与による窒素循環活性の促進－、生物工学会誌、9 月、2009 年(12) 佐藤貴宣 (2009) 土壌における窒素循環に関する研究～アンモニア酸化細菌と硝化能の関係解析～、修士論文、立命館大学大学院 理工学研究科 創造理工学専攻(13) Adair K. L and Schwartz E (2008) Evidence thatammonia-oxidizing archaea are more abundant thanammonia-oxidizing bacteria in semiarid soils of northern
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Ammonia-oxidizing bacteria: A model for molecular
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有機・植物工場の開発－有機・植物工場でのイチゴ有機栽培－
有機・植物工場用の有機土壌開発
SOFIXを適応した有機土壌の開発を行い、有機・植物工場システムの構築に取り組んでいる。
有機土壌成分成分（mg/kg）
全炭素
全窒素
アンモニア態窒素
亜硝酸態窒素
硝酸態窒素

有機土壌60,0006,00010080

成分（mg/kg）
全リン酸
水溶性リン酸
全カリウム
水溶性カリウム

有機土壌
3,800
600
4,500
1,700

有機・植物工場でのイチゴ栽培過程

有機・植物工場における子株の有機育成

イチゴの有機栽培

夏期のイチゴ栽培は困難であるが、植物工場では年間を通じ収穫が可能を通じ収穫が可能。

有機・植物工場の特徴
多品種に対応： 葉菜類に限らず、果菜類および根菜類の栽培も可能。

周年栽培： 日長、温湿度管理により年間を通じた安定した収穫が可能。
長、温湿度管理 より年間を通じた安定した収穫 可能。

有機土壌： SOFIXに基づき製造するため、安定な品質を保証。

設置場所： 都市部の空き店舗等の利用が可能。輸送コストが低減。

立命館大学 総合理工学院 生命科学部・生物工学科 教授 久保 幹
連絡先 理工リサーチオフィス TEL:077-561-2802 E-mail:liaisonb@st.ritsumei.ac.jp