研究フロンティア（平成 年度学術奨励賞受賞論文）

精子形成を長期間維持できる
in vitro 精巣組織培養システムの開発
古目谷 暢 ），林功晃 ），山中 弘行 ），三條 博之 ），小島 一晃 ），片桐久美子 ），佐藤 卓也 ），）矢尾 正祐 ，木村 啓志 ），藤井 輝夫 ），小川 毅彦 ，））横浜市立大学大学院医学研究科泌尿器科学）横浜市立大学生命医科学研究科プロテオーム科学）東海大学工学部機械工学科）東京大学生産技術研究所統合バイオメディカルシステム国際研究センターの小組織片を培養液に半分浸したアガロースゲルに乗せはじめにて培養するシンプルな培養方法を開発した．試行錯誤のこれまで男性不妊の病態の解明を目指し多くの研究が後に到達した培養液（Minimal essential medium eagle行われてきたが，その主役は動物実験（in vivo）によalpha modification（αMEM）培地に血清代替物であるる精子形成研究であった．生体内現象を忠実に体現する

knockout serum replacement（KSR）を ％添加）を用

優れた研究手法で多くの成果を上げている．しかし，ヒいて ℃で器官培養すると，減数分裂像，円形精子細胞，トでの精子形成の研究をすすめる際には in vivo 実験は精子を認めた（図行えない．男性不妊の研究をすすめるためには，ヒト精したところ産仔が得られ，順調に発育し，兄妹交配によ巣組織やヒト由来の精巣構成細胞を用いた in vitro 実験

り孫世代も誕生した．顕微授精の成功率は in vivo に由の確立が求められる．また，in vivo 実験は，観察評価

来する精子細胞や精子を使った結果に劣らないもので）．得られた精子を用いて顕微授精のために精巣を摘出する必要があり同一サンプルで経時あった［ ， ］．これによってマウスでの in vitro 精子的な評価が行えない，視床下部・下垂体，副腎など精巣形成を実現することに成功した．しかし，生体内と比べ以外の臓器の相互作用の影響を受けるため結果の解釈がて精子形成の持続期間が最長でも複雑になる，といった特有のデメリットも存在する．し子形成効率も低く，真の意味で in vivo を再現できておかし，in vitro 研究はこれらのデメリットを補完しうるらず，その結果が必ずしも生体内現象を反映しているわというメリットもある．

けではないという欠点がある．われわれは，培養環境がこのような観点に基づき in vitro 精子形成研究は古くから行われている．

年にはマウス新生仔の精巣を凝血塊の上にのせて培養し，減数分裂パキテン期まで精子形成が進行した［養法［］．

ヵ月ほどと短く，精非生理的であることが一因と考え，マイクロ流体システムを用いて生体内微小循環系を再現することで生体内での精子形成を in vitro で再現することを目指した．

年代には気相液相境界部培］を用いて Steinberger 夫妻が精巣器官培養をマイクロ流体デバイスの作製行い，精子形成において重要な因子や条件をいくつも明らかにしたが，精子形成はパキテン期の精母細胞よりもマイクロ流体システムは半導体製造技術を応用し，μm］．その後も，器官培養のレベルの微細な回路状流路を作製することが可能で，そ他に細胞培養を含めた様々な手法が試みられたが in vi-の中に培養液を流すことによって生体内環境を再現する

tro 精子形成は減数分裂の壁を超えられなかった．その．今回われわれは毛細血管を模倣しことができる［ ― ］

ような状況でわれわれは精巣内環境をそのまま利用できた培養回路と精巣組織培養スペースを多孔膜で隔てる膜る器官培養法の有用性を重視し，型デザインを採用した（図進展することはなかった［年に器官培養法のスタンダードである気相液相境界面培養法に準じ，精巣A）．このデザインでは培養液の流れが組織培養スペースに入り込むことなく，拡，生理的な物質散による物質供給が可能であり［ ― ］

連絡先：古目谷 暢，横浜市立大学大学院医学研究科泌尿器
科学〒 ―横浜市金沢区福浦 ―TEL ： ― ―（内線）
FAX： ― ―E-mail：komeyam@yokohama-cu.ac.jp

供給を再現できる（図B）．

日本生殖内分泌学会雑誌（2016）21 : 27-31

27

古目谷

暢他

図

気相液相境界部培養法

図マイクロ流体デバイス

マイクロ流体デバイスによる精子形成効率の改善
新生仔マウス精巣の培養 日目の観察で精細管が本の厚さで培養スペースに配列していることが確認でき，組織中央部も含めて組織全体で GFP 発現を認めた（図A）．一方で AG 群では組織を本の厚みでアガロースゲルに載せても半円状に凝集してしまい，中央部の精細管の変性や壊死を認め，GFP 発現は認めなかった（図B）． マイクロ流体デバイスで培養した精巣をほぐし，精子細胞を確認した（図C）．マイクロ流体デバイス

は，従来法とは異なり培養精巣全体での精子形成を実現
図osin-トランスジェニックマウスの生殖細胞の GFP 発現することができた．

マイクロ流体デバイスによる精子形成の長期維持

マイクロ流体デバイスでの組織培養
新生仔 Acr-Gfp マウスの精巣をマイクロ流体デバイス

そこで長期培養下でも精子形成を維持できるのか確認

培養群（MF 群）と従来のアガロースゲルを用いた気相するため，MF 群と AG 群に分けて 週間培養し GFP液相境界部培養群（AG 群）に無作為に振り分けて培養

Grade を用いて精子形成効率を評価した．精巣全体に占した．このマウスは減数分裂を開始した生殖細胞で GFP

める GFP 発現部位の割合をを発現し，アクロソームが凝集するにつれて GFP 発現を認めないものを Grade

部位の形態が変化する特徴があるため，GFP の形態変以下を Grade化で精子形成の進展を評価することができる［ ， ］（図）．MF 群，AG 群 と も に 温 度 ℃，CO 濃 度％段階に分類し，GFP 陽性， ％以下を Grade， ％以下を Grade，それ以上を Gradeとした（図， ％， ％以下を Grade）．

培養 週間目に，MF 群で 組織中 組織，AG 群でに設定したインキュベータで培養した．培養液はα-Mini-は 組織中組織で GFP 発現を維持していた．しかし

mum essential medium に AlbuMAX を濃度 mg/mL でGFP Grade以上を維持した組織は MF 群で 組織中添加したものを用いた．

組織，AG 群では 組織中の平均値も MF 群では28

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.21 2016

組織であった．GFP Grade

ヵ月にわたり以上を推移し精子形成を長期間維持できる in vitro 精巣組織培養システムの開発

図MF 群と AG 群でのScale bars :図はほぼ行い培養であった（図長期培養下での精子形成の推移
Scale bars :m（B）.

以下に低下し， 週以降B）．

マイクロ流体デバイスによる生殖能の長期維持

A）．また，適宜高倍率観察を日目時点まで半数体細胞が存在することが確認できた（図m（C）.

GFP Grade Score による精子形成効率の評価

図

たが，AG 群では 週時点で週間培養後の精子形成の評価
m（A & B）
,ここまで形態学的手法により精子形成を評価していたが，長期培養後にも真に妊孕性という機能を維持できているか確認するため，培養した精巣由来の半数体細胞を研究フロンティア

29

古目谷

暢他用いて顕微授精を行った．培養

日目の組織に多数存するため，組織が周囲の壁や膜と接触しており白膜によ在した半数体細胞を用いて顕微授精を行ったところ，産り覆われた生体内環境を従来の培養法よりも忠実に再現仔が得られ（図できている．さらに，物質供給能が高まるため精巣局所C），正常に成熟し交配によって孫世D）．このことからマで産生される Paracrine，Autocrine 物質が増加し，間質イクロ流体デバイスは精巣の最重要機能である産仔獲得環境が改善すると考えられる．マイクロ流体デバイスで能をは物質供給能が改善しているため間質成分の漏出も従来代を得ることにも成功した（図ヵ月もの長期にわたって維持することができた．

法よりも早くなるが，直接流束の中で培養すると精子形おわりに成効率が減弱するが（unpublished data），多孔膜により流路と精巣を隔てて直接流束に晒さず拡散による物質

これまで多くの研究者が，組織の構造と機能を体外で供給を行う多孔膜型デバイスでは精子形成が維持され長期にわたって維持する試みを行ってきた．精巣に関しる．このことから，膜型デバイスは毛細血管と組織間質てはラット精巣組織片を週間培養し精巣の構造を維持の関係を再現することで，間質成分の急激な漏出を防いした報告があるが，精子形成を維持することはできなでいると考えられる．そして，間質成分の産生増大に対かった［］．このような状況でわれわれは気相液相境して，間質成分の漏出は相対的に低く抑え，生体内の間界部培養法を用いてマウスでの in vitro 精子形成を実現質環境を再現している．従来の培養法では物質供給の増した．これによって未熟な精巣を in vitro で成熟させ，大と間質成分の漏出を調整するのは困難だが，マイクロ主要な機能である忍容性を発現することに世界で初めて流体システムはこれらパラメーターの調整がしやすく，成功した．しかし，精子形成の維持は最長でも週最良のバランスで釣り合わせることが可能と考えられ週目をピークに急激に低下して最終的る．そして，われわれのマイクロ流体デバイスはこれらには消失し，精細管構造も変性してしまった．このことのバランスを従来法よりも最適化し生体内の間質環境をは組織培養のゴールデンスタンダードである気相液相境疑似的に再現したため，長期間にわたって in vivo 精子間であり，〜〜界部培養の限界を示唆するものであった．従来法は簡便形成を匹敵する in vitro 精子形成を維持できたと思われで信頼性の高い実験手法ではあるが，生体内での物質供る．

給を再現できていない．そこで，マイクロ流体システム

われわれの開発したマイクロ流体デバイスはマウス精を用いて生体内微小循環系を再現したところ，精巣全体巣での精子形成を長期間維持できたことから，精子形成での均一な精子形成が実現し，内部の変性・壊死を認め研究の進展に貢献でき，将来的にはヒトを含む他動物種ず，従来の気相液相境界部培養法よりも非常に効率的にの精子形成研究への応用が期待される．また，精巣以外精子形成を誘導することができた．さらに，の組織培養への応用が期待でき，再生医療や創薬分野へヵ月にもわたって継続して精子形成を維持することができた．の波及効果が期待される．さらなる改良によって，器官ヵ月培養した精巣から得られた精子から健康な産仔が得培養全般の性能向上，ひいてはられた．われわれの知る限り，組織の機能を体外でこれの発展へ貢献できると考えている［ ］．

organs-on-chips 技術

ほど長期間安定して維持した報告は今まで認めない．
当初，われわれはマイクロ流体デバイスによって組織に接する培養液の流れによって物質交換が改善すること．しかし，アガロースゲル上での培養を期待した［ ― ］
結果を改めて注意深く観察してみると，最外周の精巣組織ではなく外周部よりやや内側で精子形成が維持されて謝辞

本稿は平成 年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究をまとめたものである．本稿を執筆する機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔教授，第 回日本生殖内分泌学会学術集会会長 藤澤正人教授に感謝申し上げます．

いることに気付いた．物質交換に関しては最外周がもっとも有利なはずであり，予想に反していた．このことか引用文献

らマイクロ流体システムには精巣組織への物質供給を改善する以外にもメリットがあると考えた．マイクロ流体デバイスでの培養はアガロースゲルと異なり PDMS を介して酸素が供給される．このため直接酸素に暴露されるよりも酸素毒性が軽減され［ ］，組織が長期間維持できると考えた．また，密閉された培養スペースで培養

30

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.21 2016

．Martinovitch PN（）The Development in vitro of theMammalian Gonad. Ovary and Ovogenesis. Proc R Soc
Lond B Biol Sci,- .
．Trowell OA（）The culture of mature organs in a synthetic medium. Exp Cell Res ,- .
．Steinberger A, Steinberger E（）
The Testis. eds Johnson

精子形成を長期間維持できる in vitro 精巣組織培養システムの開発

AD, Gomes WR, Van Dermark NL, The Testis. AcademicPress, pp.
- .
．Sato T, et al（）In vitro production of functional sperm
in cultured neonatal mouse testes. Nature,- .
．Yokonishi T, Sato T, Katagiri K, Ogawa T（）In vitro
spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol Biol,- .
．Berthier E, Young EWK, Beebe D（）Engineers arefrom PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip,.
．Tehranirokh M, Kouzani AZ, Francis PS, Kanwar JR（）Microfluidic devices for cell cultivation and proliferation. Biomicrofluidics ,- .
．Mehling M, Tay S（）Microfluidic cell culture. CurrOpin Biotechnol ,- .
．Halldorsson S, Lucumi E, Gómez-Sjöberg R, Fleming RMT（）Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron,- .
．Kimura H, Yamamoto T, Sakai H, Sakai Y, Fujii T （）An integrated microfluidic system for long-term perfusion
culture and on-line monitoring of intestinal tissue models.

Lab Chip ,- .
．Kimura H, et al（）On-chip single embryo coculture
with microporous-membrane-supported endometrial cells. IEEETrans Nanobioscience ,- .
．Kawada J, Kimura H, Akutsu H, Sakai Y, Fujii T（）
Spatiotemporally controlled delivery of soluble factors forstem cell differentiation. Lab Chip ,.
．Kimura H, Ikeda T, Nakayama H, Sakai Y, Fujii T （）An On-Chip Small Intestine-Liver Model for Pharmacokinetic Studies. J Lab Autom ,- .
）Real-time observation of acroso．Nakanishi T, et al（mal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker
protein. FEBS Lett,- .
．Ventelä S, et al（）Regulation of acrosome formationin mice expressing green fluorescent protein as a marker.
Tissue Cell ,- .
．Charati SG, Stern SA（）Diffusion of Gases in Silicone
Polymers: Molecular Dynamics Simulations. Macromolecules,.
．Komeya M, et al（）Long-term ex vivo maintenance oftestis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Sci Rep,.

研究フロンティア31