REVIEW

卵巣の機能調節における低酸素環境の生理的意義亮 ，），奥田西村潔））岡山大学大学院環境生命科学研究科生殖生理学教室）現所属：鳥取大学農学部共同獣医学科獣医繁殖学教室（oxygen-dependent degradation domain :はじめにしており［年に Wang と Semenza により低酸素誘導性転写因子（hypoxia-inducible factor :以来［HIF）が見い出されて］，低酸素環境（hypoxia）における細胞の応答ODD）を有］，これが normoxia ではユビキチン―タンパクリガーゼ複合体（von Hippel-Lindau : pVHL）により認識されることで［― ］，α subunit が proteosome

系において分解される［ ， ， ］．一方，hypoxia でに注目が集まり，これに関する研究報告が年を追うごと

は pVHL が HIF αの ODD を 認 識 で き ず，結 果 と し てに増加している．しかし，生殖科学の分野において，黄HIF αタンパクが蓄積し，HIF βとの結合が可能となる体内の低酸素環境に関する研究を進めている研究グルー［ ， ］．当初，HIF は赤血球増殖因子（erythropoietin :プは世界においても数えるほどしかない．われわれは，EPO）の発現を増加させる因子として Wang と Semenza

低酸素環境と黄体機能の関係について，培養系を用いてにより見い出された［検討を重ねてきた．その結果，低酸素環境は黄体の形成誘導されることの分かっていた血管内皮細胞増殖因子

時においては血管新生を促進し，黄体の退行時において（vascular endothelial growth factor : VEGF）の転写をはプロジェステロン（P ）分泌を衰退させ，アポトーHIF が強く刺激することが報告され［ ］，「hypoxia―HIF］．その後，既に低酸素環境でシスを誘導するという新しい知見を得た．本稿では，こ―VEGF―血管新生」というシステムの存在が明らかとれらの知見を見い出すに至った一連の研究，および卵巣なった．VEGF の他にも，糖輸送（GLUT ）や細胞増機能と低酸素環境の関係に関する近年の報告について紹殖（insulin-like growth factor［IGF］

介する．

proteins，and，IGF-binding）など，HIF により転写制御される遺伝子が数多く見い出されている［］．また，アポ低酸素誘導性転写因子（hypoxia-inducible factor :トーシスに関する因子としては BCLHIF）

E B-nineteen kilodalton interacting protein― （BNIP ）andadenovirusが HIF による制御を受ける可能性が示されている［ ］．
HIF はα subunit とβ subunit（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator : ARNT）からなる

アポトーシスは黄体生理のなかでも，特に黄体退行にお量体のいて黄体組織の構造的消失に必須の現象であり，われわ転写因子であり，α subunit には HIF α， αおよび αがれは先の報告のなかでウシ黄体細胞においても hypoxia存在し，それぞれがβ subunit（ARNT: HIF β）と結合において HIF αタンパクが増加し［ ］，さらに BNIPして HIF ，HIF および HIF として 機 能 す る．HIF が発現の増加することを示している［ ］．

低酸素環境において活性を高めるシステムはα subunitのタンパク質代謝機構によっている［ ， ］．HIF の場

卵胞発育・排卵と低酸素環境

合，HIF αタンパクは通常の酸素環境（normoxia）においては分解されるが，hypoxia においては分解されずに卵胞液中の酸素濃度はウシ［ ］，ブタ［ ］およびHIF βと結合し， 転写因子 HIF として機能する［ ， ］．

ヒト［ ］において示されており，卵胞の直径が大きい

HIF αを含むα subunit は，酸素依存性分解ドメイン

ほど酸素濃度が低くなる点は種を超えて共通し，ヒトでは卵胞の成熟に伴い卵胞液中酸素濃度が低下するという連絡先：奥田 潔，岡山大学大学院環境生命科学研究科生殖生理学教室〒 ―岡山市北区津島中 ― ―TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：kokuda@cc.okayama-u.ac.jp

報告もある［ ］．これら卵胞液中酸素濃度に関しては年代から報告されているが，卵胞発育に VEGF の関与することは年 Ravindranath らによって初めて明らかにされた［ ］．さらに，卵胞発育における HIF

日本生殖内分泌学会雑誌（2014）19 : 31-36

31

西村亮

他の関与が示されたのは最近のことであり，ブタ［ ， ］するかについてはタンパクレベルでの解析が必須と考えおよび霊長類［ ］において示されている．Basini らがられた．最近，Duncan らは霊長類の黄体において HIFブタにおいて示したのが世界で最も早く，以下のようなαタンパク発現が初期に高いことを免疫組織学的に示仮説を示唆している［ ］．卵胞が発育しその大きさをした［ ］．われわれの報告でも同様にウシの黄体組織増すにつれ，卵胞液中の酸素濃度が減少し，これによりにおいて初期および形成期に HIF αタンパク発現の高HIF αが蓄積する．この HIF αが ARNT（HIF β）と結いことが Western blot により証明された［ ］．同報告

合して転写因子 HIF として機能し，VEGF の転写を促ではさらに形成期の黄体細胞を低酸素環境において培養進することにより卵胞周囲の血管新生が促されるというすることにより HIF αタンパク，VEGF仮説である．また，卵胞は排卵後直ちに黄体へと機能とに VEGF タンパクの増加することが示され，ウシの黄構造を変化させていく．この変化は血管新生を伴うこと

体形成に低酸素環境およびそれによって誘導される血管，黄 体 の 形 成 に お い て も 同 様 の HIF とか ら［ ― ］新生の関与することを示唆した．

mRNA，さらVEGF を介したシステムが機能している可能性が高い．
これについては次項において，われわれの成果を交えな黄体退行と低酸素環境がら解説する．
卵巣動脈における血流量の周期的な変化に関する知見

黄体形成と低酸素環境は年代から存在し，ウシおよびヒツジにおいては，電磁的血流計のプローブを卵巣動脈に装着する手法で調黄体の形成において，血管新生の起こることは年．これらの報告では，一様に，卵べられてきた［ ― ］

年までに総説として巣動脈の血流量が黄体退行期において血中 P 濃度の減．一方，今日では強力な血管も報告されている［ ― ］

少と同調して減少することが示されている．黄体より分

新 生 因 子 と し て 知 ら れ る VEGF は年，Ferrara と泌される P の血中濃度における減少は，黄体の機能的Henzel により見い出され［ ］，その後，黄体形成時のな退行を意味しており，血流量の減少と黄体退行に何ら血管新生に VEGF の関与することがウシ［ ］およびかの関係があることが示唆されてきた．この関係を裏付

年の HIF

けるものとして，Sawyer ら［ ］は黄体退行を誘導す］に続いて，HIF が VEGF の強力な転写促るために PGF αを投与したヒツジにおいて，黄体内の進因子であることが示された［ ］．以上の報告に加え，小型血管の血管内皮細胞が血管腔内に脱落することを示

排卵直後の黄体組織が低酸素環境であることは，その血している．そして，この現象が卵巣動脈血流の減少と関管系が未熟であることから容易に想像できた．そこでわ係し，さらに黄体内の低酸素環境を導くことを示唆してれわれは黄体の形成において，低酸素環境に起因するいる［ ］．しかし，この報告を踏まえても，血流量のHIF ，VEGF を介した血管新生の機能することを推察

減少からどういった機構を介して黄体退行が誘導される

し，これを証明すべく研究計画を立案，実施した．黄体かについては，不明な点が多く残されていた．そこでわ形成における低酸素環境の役割に関する報告としてれわれは，卵巣動脈における血流量の減少は黄体へ供給

は，年に培養ウシ黄体由来血管内皮細胞においてされる酸素量の減少につながると考え，酸素濃度の減少

mRNA レベルにおける HIF α発現が VEGF 発現とともが黄体退行に関与するという仮説の下，黄体細胞の培養に示されている［ ］．しかしこの報告では，血管内皮系を用いて解明を試みた．ウシの中期黄体細胞を低酸素細胞を低酸素環境において培養しても HIF α mRNA，環境において培養すると，通常の培養環境（ ％O ）とVEGF

mRNA ともに通常の培養気相における発現との比較して P 産生が著しく低下した［ ］．さらに，この違いが認められていない．一方，ブタにおいては黄体組P 産生の低下は，コレステロールの側鎖を開裂し P の代前半に示されており［ ］，

ヒト［ ］において示されてきた．さらに，の発見［織中の HIF α mRNA 発現が黄体初期において高いこと前駆体であるプレグネノロンへと転換する酵素 Pが示され，初めて HIF が黄体形成に関与することが示（cytochrome P．しかし，以上の報告は HIF 発現の mRNA
唆された［ ］A ）の発現および酵素活性が低酸素環境において低下レベルにおける報告であった．HIF αはタンパクに翻訳したためであることが明らかとなった［ ］．また，低された後，酸素濃度に依存したタンパク質分解によって酸素環境において培養したウシ黄体細胞では，アポトー蓄積量が調節され，組織中の酸素濃度が高い場合に急速シスの誘導される割合も増加することが見い出されたに分解される［［ ］．アポトーシスは黄体の構造的退行における主徴で32］．そのため，HIF が黄体形成に関与

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.19 2014scc

side-chain cleavage enzyme : CYP

卵巣機能と低酸素環境あり［ ］，低酸素環境が黄体の機能的退行のみならず構造的退行にも関与することがこの報告により示された．同報告では，アポトーシス誘導機構において機能するシステインプロテアーゼ caspase― の発現および活性が低酸素環境において増加すること，また，アポトーシス調節因子 Bcl―

family のアポトーシス促進タンパク

BNIP の発現も低酸素環境において増加することを見い出し，これらが低酸素環境において誘導される黄体細胞のアポトーシスに関与することも示した［ ］．これら
近年の成果からわれわれは，黄体退行機構において，血流の減少に起因する黄体内の低酸素環境が，他の黄体退行誘導機構とともに，黄体の機能的な退行および構造的図

通常の培養気相（ ％O ）および低酸素環境（ ％O ）において培養したウシ中期黄体細胞における GAPDH mRNA 発現．ウシ
中期黄体細胞を ％O もしくは ％O において 〜 時間培養しな退行に関与すると考えている．

た後，定量的 RT―PCR により GAPDH mRNA 発現を調べた．
時間以上の培養において，低酸素環境において培養した細胞では通常の培養気相の細胞と比較して GAPDH mRNA 発現が有意にHypoxia 研究における注意点高い（＊各培養時間において通常の培養気相と比較して有意に発現が高い［P＜ ． ；Student’s t ―test］）．

われわれは，本総説のテーマを研究し始める際に，研究室に初めて低酸素環境に関する実験系を導入した．そある HIF αが低酸素環境においてタンパクレベルで蓄して，研究を進めるなかで hypoxia 研究独特の問題に遭積するからである．このように hypoxia 研究においては遇し，それらを解決したうえで上述のような成果を得る

特有の注意点が挙げられ，新しい研究分野であるだけにことができた．問題点のなかで最も印象的なものは，今後も新たな注意点が出現しうる．低酸素シグナルは既mRNA やタンパク発現に用いられる内部標準に関する知の赤血球増産，血管新生やアポトーシスに限らず多岐問題である．一般的な内部標準としては，アクチン，に広がり，これまでの基本を覆す要素を多く含んでいる．

GAPDH， S rRNA などかよく知られており［ ］，わ

今後も hypoxia 研究を進める際にはより綿密な最新情報

れわれも hypoxia 研究を始めるまでは GAPDH を内部標の調査が必要である．

準として頻繁に用いていた．しかし，GAPDH は hypoxia
研究においては内部標準として活用できない．すでに総説においても示されている通り［おわりに］，GAPDH は HIFつであり，低酸素環境においてそHIF の発見により，生体の低酸素応答に関する研究はの発現が増加する．われわれの用いたウシ黄体細胞にお癌の形成機構や生殖生理をはじめ，多岐にわたる分野でいても認められている（図の制御する遺伝子の）．内部標準がその実験系進められている．HIF の発現はさまざまな組織，細胞ににおいて適切かどうかを調べることは実験系確立の基本おいて認めらており，多くの組織において細胞が低酸素であるが，hypoxia 研究が現在もまだ新しい段階にある環境に対する応答機能を備えていると考えられる．低酸

ことから，内部標準を定める際には最新の文献を調べ，素応答はあるときは組織障害における組織の再構築に寄

内部標準として選択した遺伝子またはタンパクが HIF与し，あるときは生理的な組織変化において機能する．などの制御因子に含まれないかどうか必ず確認すべきで近年のわれわれの研究では，卵巣の特に黄体における生ある．内部標準の選択の他にも，hypoxia 研究において理的な低酸素応答がどのように機能するかについて追求は低酸素環境を証明する必要性がある．培養系においてしてきた．興味深いことに，黄体において，低酸素環境細胞が本当に低酸素環境にさらされていたかを何らかのは黄体の形成と退行，言いかえれば組織の生と死の両方形で示さなければならない．これには低酸素環境で増加に関与することが明らかとなった．黄体の形成においてする遺伝子やタンパクが用いられるが，最も確実な方法

は，黄体を構築する血管新生を促し［ ］，退行においつは HIF αの発現増加を mRNA ではなくタンパクては P 分泌の低下およびアポトーシスの誘導に低酸素の質レベルで示すことである．これは，現在進められてい環境が関与していた［ ， ］（図る多くの hypoxia 研究が Wang と Semenza による HIF

素環境の関係図）．組織，細胞において低酸素応答がスの発見［

タートした後，生と死の分かれ目がどのようにして決定］に基づいており，HIF のサブユニットで：卵巣機能と低酸REVIEW

33

西村亮

他

図

卵巣機能と低酸素環境の関係図
卵巣内において組織構造や血流の変化に伴って形成される低酸素環境はさまざまなシグナルを介して黄体形成，黄体退行，卵胞発育などの現象に関与する．

されるのかは完全には明らかにされていない．一説には，酸素濃度が素環境であれば血管新生などの「生」の応答がなされ，anoxia（無酸素環境）に近づくにつれてアポトーシスなどの「死」の応答が増強されると考えられている［ ］．
また最近では，通常の酸素濃度においても HIF αの発現調節機構の存在が示されており，ヒトの顆粒層細胞ではヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）が通常酸素濃度下において HIF α発現を増加させることが明らかにされている［ ］．このような卵巣機能を調節するホルモンによる HIF 発現調節機構と既知の低酸素環境によるシグナルの関係，さらにこれらに加えてホルモンの周期性を合わせて解析することにより，卵巣機能における低酸素シグナルの役割がより明確にできると考えられる．
謝辞

本研究は，日本学術振興会（科学研究費補助金基盤研究 B；）および農林水産省（委託プロジェクト研究「ゲノム情報を活用した家畜の革新的な育種・繁殖・疾病予防技術の開発」；REP）の援助を受けました．

34

引用文献

つの分かれ目とされており，基本的に低酸

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.19 2014

．Wang GL, Semenza GL（）Purification and characterization of hypoxia-inducible factor . J Biol Chem,.
．Wenger RH（）Cellular adaptation to hypoxia : O -sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription
factors, and O -regulated gene expression. FASEB J,.
．Bruick RK（）Oxygen sensing in the hypoxic response
pathway : regulation of the hypoxia-inducible transcription
factor. Genes Dev ,.
．Jiang BH, Semenza GL, Bauer C, Marti HH（）Hypoxia-inducible factor
levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O tension. Am J Physiol,C.
．Salceda S, Caro J（）Hypoxia-inducible factor alpha（HIF- alpha）protein is rapidly degraded by the ubiquitinproteasome system under normoxic conditions. Its stabilization by hypoxia depends on redox-induced changes. JBiol Chem,.
．Huang LE, Gu J, Schau M, Bunn HF（）Regulation of
hypoxia-inducible factor
alpha is mediated by an O -dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome
pathway. Proc Natl Acad Sci USA ,.
．Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, Clifford SC, Vaux
EC, Cockman ME, Wykoff CC, Pugh CW, Maher ER, Ratcliffe PJ（）The tumour suppressor protein VHL targets
hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis.

卵巣機能と低酸素環境

Nature,- .
．Ohh M, Park CW, Ivan M, Hoffman MA, Kim TY, Huang
LE, Pavletich N, Chau V, Kaelin WG（）Ubiquitinationof hypoxia-inducible factor requires direct binding to thebeta-domain of the von Hippel-Lindau protein. Nat CellBiol ,- .
．Tanimoto K, Makino Y, Pereira T, Poellinger L（）
Mechanism of regulation of the hypoxia-inducible factoralpha by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein.
EMBO J,.
．Cockman ME, Masson N, Mole DR, Jaakkola P, Chang
GW, Clifford SC, Maher ER, Pugh CW, Ratcliffe PJ, Maxwell PH（）Hypoxia inducible factor-alpha binding andubiquitylation by the von Hippel-Lindau tumor suppressorprotein. J Biol Chem,.
．Kamura T, Sato S, Iwai K, Czyzyk-Krzeska M, Conaway
RC, Conaway JW（）Activation of HIF alpha ubiquitination by a reconstituted von Hippel-Lindau（VHL）tumor suppressor complex. Proc Natl Acad Sci USA,.
．Kallio PJ, Wilson WJ, O’Brien S, Makino Y, Poellinger L（）Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J BiolChem,.
．Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M,Salic A, Asara JM, Lane WS, Kaelin WG Jr（）HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation : implications for O sensing. Science,- .
．Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, Wilson MI, Gielbert J,Gaskell SJ, Kriegsheim Av, Hebestreit HF, Mukherji M,Schofield CJ, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ（）
Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O -regulated prolyl hydroxylation.
Science,- .
．Forsythe JA, Jiang BH, Iyer NV, Agani F, Leung SW,Koos RD, Semenza GL（）Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-induc.
ible factor . Mol Cell Biol ,．Bruick RK（）Expression of the gene encoding theproapoptotic Nip protein is induced by hypoxia. Proc
Natl Acad Sci USA ,.
．Nishimura R, Sakumoto R, Tatsukawa Y, Acosta TJ, Okuda
K（）Oxygen concentration is an important factor formodulating progesterone synthesis in bovine corpus luteum. Endocrinology,.
．Nishimura R, Komiyama J, Tasaki Y, Acosta TJ, Okuda K（）Hypoxia promotes luteal cell death in bovine corpus
luteum. Biol Reprod ,- .
．de Castro E Paula LA, Andrzejewski J, Julian D, Spicer LJ,Hansen PJ（）
Oxygen and steroid concentrations in preovulatory follicles of lactating dairy cows exposed to acuteheat stress. Theriogenology,- .
．Basini G, Bianco F, Grasselli F, Tirelli M, Bussolati S,
Tamanini C（）The effects of reduced oxygen tension
on swine granulosa cell. Regul Pept,- .
．Redding GP, Bronlund JE, Hart AL（）
Theoretical investigation into the dissolved oxygen levels in follicular fluidof the developing human follicle using mathematical mod-elling. Reprod Fertil Dev ,- .
．Fischer B, Künzel W, Kleinstein J, Gips H（）Oxygentension in follicular fluid falls with follicle maturation. EurJ Obstet Gynecol Reprod Biol , - .
．Ravindranath N, Little-Ihrig L, Phillips HS, Ferrara N,Zeleznik AJ（）Vascular endothelial growth factor messenger ribonucleic acid expression in the primate ovary.
Endocrinology,- .
．Boonyaprakob U, Gadsby JE, Hedgpeth V, Routh PA, Almond GW（）Expression and localization of hypoxia inducible factor- alpha mRNA in the porcine ovary. Can J
Vet Res ,- .
）Inhibi．Duncan WC, van den Driesche S, Fraser HM（tion of vascular endothelial growth factor in the primate
ovary up-regulates hypoxia-inducible factor- alpha in thefollicle and corpus luteum. Endocrinology,.
．Reynolds LP, Killilea SD, Redmer DA（）Angiogenesis
in the female reproductive system. FASEB J ,- .
．Reynolds LP, Grazul-Bilska AT, Killilea SD, Redmer DA（）Mitogenic factors of corpora lutea. Prog GrowthFactor Res ,- .
．Redmer DA, Reynolds LP（）Angiogenesis in the ovary.
Rev Reprod ,- .
．Reynolds LP, Grazul-Bilska AT, Redmer DA（）Angiogenesis in the corpus luteum. Endocrine, - .
．Ferrara N, Henzel WJ（）
Pituitary follicular cells secretea novel heparin-binding growth factor specific for vascularendothelial cells. Biochem Biophys Res Commun,.
．Grazul-Bilska AT, Redmer DA, Killilea SD, Zheng J, Reynolds LP（）Initial characterization of endothelial mitogens produced by bovine corpora lutea from the estrouscycle. Biochem Cell Biol ,- .
．Kamat BR, Brown LF, Manseau EJ, Senger DR, Dvorak
HF（）Expression of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor by human granulosa andtheca lutein cells. Role in corpus luteum development. AmJ Pathol,- .
．Tscheudschilsuren G, Aust G, Nieber K, Schilling N,
Spanel-Borowski K（）Microvascular endothelial cells
differ in basal and hypoxia-regulated expression of angiogenic factors and their receptors. Microvasc Res,.
．Nishimura R, Okuda K（）Hypoxia is important for establishing vascularization during corpus luteum formationin cattle. J Reprod Dev ,- .
．Niswender GD, Reimers TJ, Diekman MA, Nett TM（）
Blood flow : a mediator of ovarian function. Biol Reprod,- .
．Nett TM, McClellan MC, Niswender GD（）Effects ofprostaglandins on the ovine corpus luteum : blood flow,
secretion of progesterone and morphology. Biol Reprod,- .
．Wise TH, Caton D, Thatcher WW, Barron DH, Fields MJ（）Ovarian function during the estrous cycle of thecow : ovarian blood flow and progesterone release rate. JAnim Sci ,- .
．Sawyer HR, Niswender KD, Braden TD, Niswender GD（）Nuclear changes in ovine luteal cells in response toREVIEW35

西村亮

他

PGF α. Domest Anim Endocrinol ,- .
．Juengel JL, Garverick HA, Johnson AL, Youngquist RS,
Smith MF（）Apoptosis during luteal regression in cattle. Endocrinology,- .
．de Leeuw WJ, Slagboom PE, Vijg （J）
Quantitative comparison of mRNA levels in mammalian tissues :S ribosomal RNA level as an accurate internal control. NucleicAcids Res ,.
．Piret JP, Mottet D, Raes M, Michiels C（）Is HIF- al-36

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.19 2014pha a pro- or an anti-apoptotic protein? Biochem Pharmacol ,- .
．van den Driesche S, Myers M, Gay E, Thong KJ, Duncan
WC（）HCG up-regulates hypoxia inducible factor- alpha in luteinized granulosa cells : implications for the hormonal regulation of vascular endothelial growth factor A
in the human corpus luteum. Mol Hum Reprod,.