ト ピ ック ス

クロマチン高次構造変換解析による転写調節領域の同定
福井大学医学部医学科生命情報医科学講座分子生体情報学領域

水谷 哲也，宮本薫!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

度を低くすることで，ランダムなライゲーションをはじめに抑える）

近年のクロマチン免疫沈降法の普及やゲノム解析技術

ライゲーション後，脱クロスリンク，DNA 精製を行の進歩（次世代高速シーケンサーや全ゲノムを網羅した

い，PCR を用いてライゲーション効率を確認する．タマイクロアレイの普及）によって，転写因子の結合領域ンパク質の相互作用がある領域同士の DNA は物理的にやクロマチン構造変換を司るヒストン修飾などをゲノム近接するため，ライゲーション効率が高くなり，PCRワイドに解析することが可能となった．目的の転写因子産物が検出される．

やヒストン修飾に対する良い抗体と均一な細胞さえあれば，ゲノム上における転写因子の結合領域やヒストン修飾を同定することが可能である．一方，実際にゲノムワ

３C アッセイによるヒト StAR 遺伝子の新たな転写活性化領域の同定

イドに転写因子の結合領域を同定してみると，転写因子筆者らは間葉系幹細胞に転写因子 SF―１を導入するこはきわめて多様な領域に結合しており，どの転写因子結とにより，効率よくステロイドホルモン産生細胞へ分化合部位が標的遺伝子の転写を制御しているのか見当がつ誘導させることに成功している［４］．そこで SF―１導入かない．実際，転写調節領域が標的遺伝子の近傍にある幹細胞における SF―１結合領域をゲノムワイドに明らかとは限らず，β-globin 遺伝子のように非常に離れた転写にするために，ChIP-on-Chip アッセイを行った．その活性化領域が存在する場合［１］や，極端な例では Wsb１

結果，StAR 遺伝子近傍では転写開始点のみならず上流/Nf１遺伝子のように異なる染色体上に転写活性化領域３kb，１５kb 付近において新たな SF―１結合領域が同定さが存在するケースも報告されている［２］．
こういった問題を解決できる方法の１つが Chromosome

Conformation Captureassay（３C アッセイ）である．３C アッセイは，核内で３次元的に近接する領域を検出できる［３］ため，標的遺伝子のプロモーター領域と核内で近接している領域を同定することができ，標的遺伝子と（一次元的に）離れた位置に存在する転写活性化領域を同定する有用なツールである．本稿では，
３
C アッセイやその応用例とともに筆者らが３C アッセイを用いて同定した StAR 遺伝子の新たな転写活性化領域について紹介する．

３C アッセイ
上述のように３C アッセイは核内で３次元的に近接する領域を検出する方法である．３C アッセイの概略を図１に示す．その実験の原理および手順は以下のとおりである．
¸

ホルムアルデヒドによる DNA―タンパク質およびタンパク質―タンパク質の固定¹

任意の制限酵素による消化º

低濃度 DNA 下におけるライゲーション（DNA 濃図１

３C アッセイの概略図

日本生殖内分泌学会雑誌（2011）16 : 27-29

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TOPICS

図２

ヒト StAR 遺伝子における SF―１依存的なクロマチン構造変換（A）ヒト StAR 遺伝子近傍の概略図（B）コントロールまたは SF―１導入幹細胞を用いた３C アッセイ
SF―１導入幹細胞で，転写開始点（Common Primer）と上流３kb（―３ k Primer）のプライマーを用いた場合のみ，PCR プロダクトが検出されたれた．そこでこれらの領域が StAR プロモーター領域とみ合わせることで転写因子やコファクター依存的な核内の間でループを形成しているか否か，３C アッセイを用

高次構造を検出する ChIP―３C や ChIA―PET 法も開発さいて検討した．その結果，SF―１導入幹細胞特異的にプれており，核内高次構造変換解析が今後さらに発展してロモーター領域と上流３kb の SF―１結合領域との間でいくものと考えられる［６］．

ループ形成が認められた．しかしプロモーター領域と上流１５kb の SF―１結合領域を含む他の領域とでは，ループおわりに形成は認められなかった（図２）．この結果から，SF―１

近年，プロモーター領域近傍以外の転写活性化領域に導入幹細胞ではプロモーターと上流３kb の SF―１結合領関する報告が相次いでいる．高等生物が状況に応じて精域との間で特異的にループが形成（３次元的に近接）さ巧な遺伝子発現調節を行うには，プロモーター領域以外れ，StAR の転写が活性化されると考えられた［５］．

が関与する発現調節が多くの遺伝子に存在すると考えら

３C アッセイを応用した解析法れる．今後３C アッセイをはじめとした方法により，さまざまな遺伝子の新たな転写活性化領域が同定されると

３C アッセイは核内で３次元的に近接する領域を検出考えられる．しかしながら３C アッセイは実験方法の性する有用な方法であるが，特定の領域同士のみしか検出格上，シグナルノイズ比が低く，非特異的なバンドが検できないため，複雑な核内高次構造を解析するには困難出されやすい傾向があり，アーティファクトによる結果なケースも考えられる．近年，３C アッセイを改良したを招きやすい要素を含んでいる．さまざまなアプローチ

４C，５C，６C アッセイが開発され，多領域間の高次と組み合わせることでそのリスクを軽減させ，可能であ構造を検出する方法や未知の近接領域を同定する方法がれば SF―１［７，８］や Sox９［９］の転写活性化領域の同報告されている［６］．またクロマチン免疫沈降法と組定のように最終的には in vivo でそれらを証明していく

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.16 2011

TOPICS

ことが大切と思われる．

引用文献
１．Tolhuis B, Palstra RJ, Splinter E, Grosveld F, de Laat W（２００２）Looping and interaction between hypersensitive sites
in the active beta-globin locus. Mol Cell １０, １４５３１-４６５.
２．Ling JQ, Li T, Hu JF, Vu TH, Chen HL, Qiu XW, CherryAM, Hoffman AR（２００６）CTCF mediates interchromosomal
colocalization between Igf２/H１９ and Wsb１/Nf１. Science３１２, ２６９２- ７２.
３．Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N（２００２）Capturing chromosome conformation. Science ２９５, １３０６１- ３１１.
４．Yazawa T, Mizutani T, Yamada K, Kawata H, Sekiguchi T,Yoshino M, Kajitani T, Shou Z, Umezawa A, Miyamoto K（２００６）Differentiation of adult stem cells derived frombone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells.
Endocrinology １４７, ４１０４４- １１１.
５．Mizutani T, Yazawa T, Ju Y, Imamichi Y, Uesaka M,Inaoka Y, Matsuura K, Kamiki Y, Oki M, Umezawa A,Miyamoto K（２０１０）Identification of a novel distal control

region upstream of the human steroidogenic acute regulatory protein（StAR）gene that participates in SF-１-dependent
chromatin architecture. J Biol Chem ２８５, ２８２４０２- ８２５１.
６．Fullwood MJ, Ruan Y（２００９）ChIP-based methods for theidentification of long-range chromatin interactions. J Cell
Biochem １０７, ３０３- ９.
７．Zubair M, Ishihara S, Oka S, Okumura K, Morohashi K（２００６）Two-step regulation of Ad４BP/SF-１ gene transcription during fetal adrenal development : initiation by a Hox-Pbx１-Prep１ complex and maintenance via autoregulation
by Ad４BP/SF-１. Mol Cell Biol ２６, ４１１１４-１２１.
８．Shima Y, Zubair M, Komatsu T, Oka S, Yokoyama C,
Tachibana T, Hjalt TA, Drouin J, Morohashi K（２００８）Pituitary homeobox ２ regulates adrenal４ binding protein/steroidogenic factor-１ gene transcription in the pituitary gonadotrope through interaction with the intronic enhancer.
Mol Endocrinol ２２, １６３３１-６
４６.
９．Sekido R, Lovell-Badge R（２００８）Sex determination involves
synergistic action of SRY and SF１ on a specific Sox９ enhancer. Nature ４５３, ９３０９-３４.

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