Instruções de Utilização

LymphoTrack Dx Software – MiSeq Versão 2.4.3®

TM

Este pacote de software é fornecido com cada Ensaio LymphoTrack Dx para o equipamento Illumina MiSeq com o objetivo de analisar
os ficheiros FASTQ originais. O software é composto por três partes distintas: a Aplicação de Análise de Dados LymphoTrack, um
plugin Repórter LymphoTrack, que é executado automaticamente após a análise e um método de Visualização LymphoTrack
opcional, que consiste em quatro folhas de cálculo Microsoft Excel® .xlsm. O software pode ser executado em plataformas suportadas
pelo Microsoft Windows®.
Este pacote de software permite o teste de clonalidade de dados de um único alvo ou de múltiplos alvos do Líder (IGHV (ou “Líder”),
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB ou TRG) e, para além disso, apresenta o estado de hipermutação somática de amostras
analisadas com os ensaios Líder ou IGH FR1.
Para utilização em diagnóstico in vitro.

Compatibilidade do Produto
Este LymphoTrack Dx Software – MiSeq (com os seguintes ensaios da Invivoscribe:

95000009) foi desenvolvido especificamente para ser utilizado e é apenas compatível

Ref. Catálogo

Descrição

91210059

LymphoTrack Dx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Kit A - MiSeq

00850052003814

91210069

LymphoTrack Dx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Panel - MiSeq

00850052003821

91210009

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay Kit A – MiSeq

00850052003647

91210039

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay Panel – MiSeq

00850052003654

91210089

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay Kit A – MiSeq

00850052003838

91210099

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay Panel – MiSeq

00850052003845

91210109

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay Kit A – MiSeq

00850052003852

91210119

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay Panel – MiSeq

00850052003869

91210129

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay Kit A – MiSeq

00850052003876

91210139

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay Panel – MiSeq

00850052003883

91220009

LymphoTrack Dx IGK Assay Kit A – MiSeq

00850052003906

91220019

LymphoTrack Dx IGK Assay Panel – MiSeq

00850052003913

92270019

LymphoTrack Dx TRG Kit A – MiSeq

00850052003678

92270009

LymphoTrack Dx TRG Panel – MiSeq

00850052003661

92250009

LymphoTrack Dx TRB Kit A – MiSeq

00850052003937

92250019

LymphoTrack Dx TRB Panel – MiSeq

00850052003944

95000009

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Utilização Pretendida
O pacote LymphoTrack Dx Software – MiSeq destina-se a ser utilizado na análise de dados bioinformáticos e na visualização deficheiros FASTQ originais gerados com o equipamento Illumina MiSeq quando usados com os Ensaios LymphoTrack Dx.

Requisitos Mínimos do Sistema











Processador: Recomenda-se Intel Core 2 Duo ou CPU mais recente.
Disco rígido: São necessários pelo menos 80 GB de espaço livre no disco; recomendam-se 250 GB.
RAM: Necessários 4 GB; recomendam-se 8 GB ou mais.
Sistema operativo: É necessário o Windows 10 (64 bits).
Java 8 para sistemas operativos de 64 bits (o Java configurado para sistemas operativos de 32 bits não é compatível com o
LymphoTrack Dx Software – MiSeq). A versão mais recente do Java pode ser obtida diretamente da Oracle em
http://www.java.com/.
Um leitor de ficheiros *.pdf como o Adobe Acrobat Reader, para visualizar os relatórios de dados gerados pelo
Repórter LymphoTrack.
É necessário o Microsoft Office Excel 2007, 2010 ou 2013 com suporte Macro ativado para a visualização de dados.
Uma unidade de CD-ROM.
O LymphoTrack Dx Software – MiSeq v2.4.3 foi validado para ser utilizado com o Windows 10, configurado para a língua
inglesa (EUA), com predefinições de visualização, e o Microsoft Excel 2007/2010/2013 para a visualização de dados
alternativos. Outras versões do Windows/Excel e/ou definições de idioma/visualização podem não ser compatíveis.

Advertências e Precauções


Tamanho do ecrã predefinido. A resolução de ecrã ótima para o LymphoTrack Dx Software – MiSeq é 100%. Aumentar otamanho do ecrã predefinido para mais de 100% pode afetar a visualização de texto nos campos da interface do utilizador.



Tipo de letra do sistema. A interface do utilizador foi desenhada de forma a utilizar as predefinições de letra do sistema num
computador Windows que utilize a língua inglesa (EUA) local. Alterações nas definições de letra do sistema ou o uso de outro
idioma local que não a língua inglesa (EUA) podem afetar a visualização de texto nos campos da interface do utilizador.



Ficheiros compatíveis. O LymphoTrack Dx Software – MiSeq é compatível com ficheiros fastq.gz gerados pelo Software
Repórter MiSeq. O LymphoTrack Dx Software – MiSeq não é compatível com ficheiros fastq.gz gerados pelo software
Bcl2fastq.

Corte de adaptador. A opção de corte de adaptador tem de ser selecionada  ao criar folhas de amostras MiSeq,
para que os ficheiros fastq.gz gerados sejam cortados em função do adaptador.



Definições de modo suspenso ou em hibernação. Deverá considerar desativar os modos suspenso e/ou em hibernação
antes de executar a Aplicação de Análise de Dados LymphoTrack Dx. Se o computador entrar em modo suspenso ou emhibernação, o software pode deixar de funcionar.



Caracteres no nome do caminho e no nome do ficheiro. 1) Evite usar espaços no nome do caminho para os ficheiros dedados ou software (os nomes de caminho incluem os nomes das pastas com os ficheiros e os nomes dos ficheiros); não é
permitido mais do que um espaço consecutivo. 2) É importante que os nomes dos ficheiros contenham apenas os
seguintes caracteres (A-Z, a-z, 0-9, ., - (hífen)). Se o software encontrar um carácter que não faça parte deste conjunto,
pode falhar. Certifique-se de que segue esta nomenclatura para as amostras quando configurar a folha de amostras parao MiSeq. 3) Não exceda os 255 caracteres para o nome do caminho. Os nomes de amostras que fazem com que os nomes
dos ficheiros de saída se aproximem deste limite são difíceis de copiar para outras localizações.

As amostras em duplicado devem ter um único nome. Atribua um nome e identificador únicos a cada amostra ao
designar as amostras. Se as amostras forem analisadas em duplicado, podem ser designadas por “Amostra1a”
e “Amostra1b”. Se não atribuir nomes únicos às amostras a serem analisadas em conjunto na mesma lâmina de fluxo,
apenas uma amostra será analisada pelo software durante o processo de análise.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Instalar o Software
1.1.
1.2.

Copie o arquivo LymphoTrackDxMiSeq2.4.3.zip do CD do software para uma unidade local no computador. Instale osoftware apenas numa unidade local e não numa unidade da rede. O software pode não funcionar devidamente sefor executado numa ligação em rede.
Extraia o ficheiro de arquivo que foi copiado para o computador local no passo anterior. Isto pode normalmente ser
feito, clicando no ficheiro com o botão direito do rato e selecionando Extract All (Extrair Tudo) no menu de contexto.
É criada uma pasta com o nome LymphoTrackDxMiSeq2.4.3 assim que o arquivo for extraído.

Executar o Software de Análise de Dados
2.1.

2.2.

2.3.
2.4.
2.5.
2.6.

Identifique os ficheiros .fastq.gz cortados para adaptador e com as extremidades emparelhadas para análise.
Estes ficheiros estão localizados na pasta da análise MiSeq e são os ficheiros *.fastq.gz que serão utilizados como
dados de introdução na aplicação de análise de dados LymphoTrackDxMiSeq. Os ficheiros Undetermined_*.fastq.gz
não são necessários para análise.
Copie os ficheiros .fastq.gz identificados acima para uma pasta vazia no computador. Transfira estes ficheiros para omesmo computador local onde o Software LymphoTrack Dx está instalado. A unidade que contém esta pasta tem deter no mínimo 80 GB de espaço disponível. Esta pasta será a <input_folder> (<pasta_de_entrada>) conforme
indicado a seguir para o software.
Clique duas vezes no ficheiro startLymphoTrackDxMiSeq localizado na pasta LymphoTrackDxMiSeq2.4.3 que foi
copiada para o computador durante a instalação.
Leia o acordo de licença. Para aceitar os termos, clique no botão Accept (Aceitar) para prosseguir.
Assinale o modo de análise pretendido a partir das opções nas caixas de seleção Choose analysis mode(s) (Selecionarmodo[s] de análise). O modo de análise deve corresponder ao tipo de dados na análise (Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH
FR3, IGK, TRB e/ou TRG).
Selecione a notação pretendida para a marca decimal a partir das opções Choose decimal mark (Selecionar marca
decimal). Esta opção afeta posteriormente como a macro de visualização de dados do Microsoft Excel é usada econstitui uma entrada obrigatória. As opções são utilizar um ponto (“.”) ou uma vírgula (“,”) para a marca decimal.
IMPORTANTE!

Marca decimal. Para determinar que opção selecionar, abra uma nova folha de cálculo no Excele escreva =10000 na célula A1. Clique nesta célula com o botão direito do rato e selecione
Format Cells (Formatar células).
 No separador Number (Número), procure na lista Category (Categoria) e selecione Number(Número). À direita, o valor para Decimal places (Casas decimais) é definido como 2.
 Abaixo deste valor está uma caixa de seleção Use 1000 Separator (Usar separador 1000).
Assinale esta caixa e observe o número de amostras acima. Este irá conter o número
original inserido, formatado de acordo com as predefinições do Excel para um número com
uma marca decimal.
 Se este número aparece como ‘10,000.00’, selecione a opção decimal point(ponto decimal). Se este número aparece como ‘10.000,00’, selecione a opção decimalcomma (vírgula decimal).

2.7.

Clique no botão Browse (Navegar) para selecionar uma pasta de entrada. Esta pasta é a <input_folder> indicada
acima e contém os ficheiros a serem analisados. Quando a pasta de entrada é selecionada, a mesma aparece vazia.
IMPORTANTE!

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

A <input_folder> selecionada não deve conter nenhum arquivo de amostra com o mesmo
nome da pasta de entrada. Se o programa foi executado com uma amostra que possuio
mesmo nome de arquivo da pasta fornecida como entrada para a funcionalidade de análise, oprograma irá congelar e o tempo de execução da análise aumentará significativamente (ouseja, levará 30 minutos para processar uma pequena amostra que leva segundos para
processar normalmente).

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Uma vez selecionada a <input_folder> e o modo de análise, clique no botão Launch Program (Iniciar programa).

2.8.

A pasta <input_folder> selecionada deve conter apenas ficheiros *.fastq ou *.fastq.gz. Se
nenhum destes tipos de ficheiro nem uma mistura de tipos de ficheiros estiver presente, oprograma irá apresentar uma mensagem de erro e solicitar que selecione uma pasta diferente.
Se os ficheiros *.fastq forem gerados pelo Bcl2fastq (os nomes dos ficheiros contêm a sequência decódigo de barras em vez da nomenclatura “S1, S2, S3” etc.), o programa apresenta uma
mensagem de erro e solicita uma nova análise dos dados utilizando o Software do Repórter
MiSeq.

IMPORTANTE!

2.9.

Estado da análise. Após clicar no botão Launch Program (Iniciar programa), a janela principal do programa irá
mostrar o estado do programa. Quando o programa terminar de analisar os ficheiros de dados de entrada, a janela
principal do programa irá mostrar a mensagem Analysis complete... (Análise concluída...) e a localização da pasta desaída, além de solicitar que abra a folha Data Visualization (Visualização de dados) Excel apropriada. Uma nova
análise pode ser iniciada a partir da janela principal do programa assim que a análise anterior for concluída.
IMPORTANTE!

Duração da análise. O tamanho e o número de amostras a serem analisadas, assim comoo modo de análise e o hardware do computador, irão determinar o tempo que o programa
necessita para fazer a análise. Uma distribuição de leitura típica para a análise de 24 amostras éde 200 000 para um 1 milhão de leituras por amostra. Estes números podem alterar-se com as
futuras versões da plataforma MiSeq.
Uma análise típica de uma amostra única de Líder IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB,
ou TRG requer aproximadamente 1 a 2 minutos para ser concluída. Uma análise típica de 24
amostras apenas de Líder, IGH FR1 apenas, IGH FR2 apenas, IGH FR3 apenas, IGK apenas, TRB
apenas ou TRG apenas requer aproximadamente 25 a 50 minutos para ser concluída. Uma
análise típica de 24 amostras combinadas de Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e/ou TRG
multiplica o tempo de análise pelo número de alvos a serem analisados.

2.10.

Pasta(s) de saída. Dependendo do modo de análise selecionado, será criada uma ou mais pastas de saída em<input_folder> contendo os ficheiros *.fastq ou *.fastq.gz de origem. A Tabela 1 resume a relação entre o modo deanálise e o(s) nome(s) da(s) pasta(s) de saída.
Tabela 1. Nome da pasta de saída de acordo com o modo de análise

2.11.

2.12.

Modo de Análise

Nome(s) da(s) Pasta(s) de Saída

Líder

LEADER_output (LÍDER_saída)

IGH FR1

IGH_FR1_output (IGH_FR1_saída)

IGH FR2

IGH_FR2_output (IGH_FR2_saída)

IGH FR3

IGH_FR3_output (IGH_FR3_saída)

TRB

TRB_output (TRB_saída)

TRG

TRG_output (TRG_saída)

IGK

IGK_output (IGK_saída)

Qualquer combinação de:
Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK,TRB e TRG

Duas a sete das pastas de saída indicadas acima

Após o programa ter terminado a análise com sucesso, a pasta de saída irá conter vários ficheiros *.tsv e um ficheiro*.pdf para cada amostra processada. De notar que “*” nas tabelas a seguir representa o nome da amostra tal como
introduzido na folha de amostras, seguido de informações específicas sobre a plataforma (p. ex.
samplename_S1_L001_001_combined).
Para as análises de Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB e IGK; consulte a Tabela 2 para as descrições dos nove
ficheiros fornecidos para cada amostra.

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Tabela 2. Descrição dos ficheiros de saída para IGH, TRB e IGK.

Análise de Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB e IGK*.fastq_read_summary.tsv(*.resumo_leitura_fastq.tsv)

Contém uma lista das primeiras 200 sequências únicas, ordenadas por contagem (número deleituras), especificando:Que evento de recombinação V-J melhor se adequaComprimento% total de leituras efetivas% total de leituras cumulativasQuão bem a leitura abrange o gene-V identificado que é alvo dos primers (%) (IGH/IGK
e TRB)
Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa)
Líder e IGH FR1 contém também:
Taxa de mutação para gene-V parcial (%)
Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 contêm também:Se se prevê que o rearranjo está in-frame (Y/N/n/a (S/N/n/a)). Se não é possível prever o
uso de segmento do gene V ou J devido à qualidade do alinhamento, o software não serácapaz de indicar se o gene está in-frame e o resultado será n/a.

Se se prevê que o rearranjo não contém um codão stop (Y/N (S/N)). Quando não é
possível fazer uma previsão de in-frame, não é possível indicar com exatidão se estápresente ou não um codão stop.

*.fastq_read_summary_merged_top10_
searchtop500.tsv(*.resumo_leituras_fundidas_fastq_primeiras10_ procurar500primeiras.tsv)*.fastq_unique_reads.tsv(*.leituras_únicas_fastq.tsv)

Mesmo formato que o ficheiro read_summary (resumo_das_leituras), mas inclui apenas as 10
primeiras leituras de read_summary (resumo_das_leituras) fundidas com leituras da lista nas 500
primeiras sequências. Uma leitura irá fundir-se com outra se tiverem apenas 1 ou 2 nucleótidos(nts) diferentes entre si e a leitura com a contagem mais alta mantém a sua identidade desequência, enquanto a leitura com a contagem mais baixa é adicionada à mais alta.
Um ficheiro *.fasta de sequências únicas, ordenadas por contagem.

*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv(*.leituras_únicas_fastq_CDR3.tsv)

Um ficheiro *.fasta de putative CDR3 sequences (sequências CDR3 putativas) encontradas noficheiro *.fastq_unique_reads (*.leituras_únicas_fastq).

*.fastq_VJ_sequence_frequency_family. tsv(*.família_frequência_
sequência_fastq_VJ. tsv)

Cada família constitui um agrupamento de todas as recombinações possíveis encontradas numaregião V ou J particular, tais como a família V1 ou J4. Dentro da família V1, pode ser observado
qualquer número de recombinações, tais como V1-69 e V1-8. Este ficheiro contém uma lista detodas as recombinações da família V – família J possíveis, cada uma com uma lista ordenada deleituras (da maior à menor %). Este ficheiro é melhor utilizado num gráfico “de barras” no Excel.

*.fastq_read_summary_family.tsv(*.família_resumo_leituras_fastq.tsv)

Contém uma lista das sequências únicas, ordenadas por contagem, especificando:Que evento de recombinação da família V-J melhor se adequaComprimento% total de leituras efetivas% total de leituras cumulativasQuão bem a leitura abrange o gene-V identificado que é alvo dos primers (%) (IGH/IGK)
Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa)
Líder e IGH FR1 contém também:
Taxa de mutação para gene-V parcial (%)
Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 contêm também:Se se prevê que o rearranjo está in-frame (Y/N/n/a (S/N/n/a))
Se se prevê que o rearranjo não contém um codão stop (Y/N (S/N))*.fastq_VJ_usage.tsv(*.utilização_fastq_VJ.tsv)*.fastq_VJ_usage_family.tsv(*.família_utilização_fastq_VJ.tsv)*<timestamp>.pdf(*<carimbohora>.pdf)
Nota:
Nota:
Nota:

Uma matriz de contagens e uma matriz de % dos diferentes eventos de recombinação V-J.
Uma matriz de contagens e uma matriz de % dos diferentes eventos de recombinação da família
V – família J.
O relatório *.pdf gerado pelo Repórter LymphoTrack irá incluir informações semelhantes às doficheiro merged read summary (resumo das leituras fundidas), o ficheiro read summary (resumo
das leituras), um gráfico V – J usage (uso de V – J) e um gráfico de V – J sequence frequency(frequência de sequências V – J). Consulte a secção 3 Visualização de Dados Utilizando o Repórter
LymphoTrack (Automatizado, Recomendado), para obter mais informações.

A análise de IGK inclui ainda informações para outros elementos no locus IGK envolvidos em recombinações (IGKINTR e IGKDEL).
A análise de TRB inclui ainda informações para outros elementos no locus TRB envolvidos em recombinações da região D – J.
A Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa) é determinada fazendo a correspondência de uma definição exata de uma sequência
CDR3. Qualquer mutação em pontos de ancoragem ou falha no quadro de leitura irá resultar num valor “not found” (“não observado”).

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 Para a análise de TRG, consulte a Tabela 3 para descrições dos sete ficheiros fornecidos para cada amostra.
Tabela 3. Descrição dos ficheiros de saída para TRG.
Análise de TRG*.fastq_read_summary.tsv(*.resumo_leitura_fastq.tsv)*.fastq_read_summary_merged_
top10_ searchtop500.tsv(*.resumo_leituras_fundidas_fastq_
primeiras10_ procurar500primeiras.tsv)*.fastq_unique_reads.tsv(*.leituras_únicas_fastq.tsv)

Uma lista das sequências únicas, ordenadas por contagem, especificando:Que evento de recombinação V-J melhor se adequaComprimento% total de leituras efetivas% total de leituras cumulativas
Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa)
Mesmo formato que o ficheiro read_summary (resumo_das_leituras), mas inclui apenas as
10 primeiras leituras de read_summary (resumo_das_leituras) fundidas com leituras da lista nas 500
primeiras sequências. Uma leitura irá fundir-se com outra se tiverem apenas 1 ou 2 nts diferentes
entre si e a leitura com a contagem mais alta mantém a sua identidade de sequência, enquanto que aleitura com a contagem mais baixa é adicionada à mais alta.
Um ficheiro *.fasta de sequências únicas, ordenadas por contagem.

*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv(*.leituras_únicas_fastq_CDR3.tsv)

Um ficheiro *.fasta de putative CDR3 sequences (sequências CDR3 putativas) encontradas no ficheiro*.fastq_unique_reads (*.leituras_únicas_fastq).

*.fastq_VJ_sequence_frequency.tsv

Uma lista de todas as recombinações da V-J possíveis, cada uma com uma lista ordenada de leituras(da maior à menor %). O primeiro número representa a % total de leituras que a primeira leituraúnica contabilizou em todas as leituras sequenciadas. Este ficheiro é melhor utilizado num gráfico “debarras” no Excel.

*.fastq_VJ_usage.tsv

Uma matriz de contagens e uma matriz de % dos diferentes eventos de recombinação V-J.

*<timestamp>.pdf

O relatório *.pdf gerado pelo Repórter LymphoTrack irá incluir informações semelhantes às doficheiro merged read summary (resumo das leituras fundidas), o ficheiro read summary (resumo dasleituras), um gráfico VJ usage (uso de VJ) e um gráfico de VJ sequence frequency (frequência desequências VJ). Consulte a secção 3 Visualização de Dados Utilizando o Repórter LymphoTrack(Automatizado, Recomendado).

Nota:

A Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa) é determinada fazendo a correspondência de uma definição exata de uma sequência
CDR3. Qualquer mutação em pontos de ancoragem ou falha no quadro leitura irá resultar num valor “not found” (“não observado”).

2.13.

A(s) pasta(s) de saída contêm relatórios *.pdf e ficheiros de dados de saída *.tsv. Os ficheiros *.tsv podem
ser utilizados como entradas na(s) folha(s) de cálculo de visualização de dados.

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Visualização de Dados Utilizando o Repórter LymphoTrack (Automatizado,
Recomendado)
3.1.

É criado automaticamente um relatório *.pdf para cada amostra após a análise ser concluída. Este relatório terá umnome derivado do nome da amostra presente na folha de amostras, seguido de informações específicas sobre aplataforma, e terminando com o registo da data e hora (DDMMAAhhmmss).
IMPORTANTE!

3.2.

3.3.

Atenção ao gravar o relatório *.pdf: Pode ser alterada uma ou mais colunas dependendo do
programa utilizado para abrir o ficheiro *.pdf. NÃO altere nenhuma secção do ficheiro *.pdf. Se
o utilizador suspeitar que foram feitas alterações, NÃO grave o ficheiro *.pdf. Se o utilizador
suspeitar que foram gravadas alterações, repita a análise a fim de criar um novo relatório *.pdf.

A primeira página do relatório *.pdf irá conter um valor de Index Q30 (Q30 do índice). Este valor é calculado como apercentagem de bases com um score de qualidade igual ou superior a 30, mas apenas de leituras atribuídas a umíndice após o corte. Este valor pode ser utilizado para determinar se o índice foi aprovado na especificação padrão dosistema Illumina. Em alguns casos, o score Q30 da análise fornecido pelo sequenciador irá subestimar a qualidade deuma análise devido à contagem indeterminada de sequências e regiões não cortadas na direção do Q30. As regiões
indeterminadas e não cortadas são normalmente de qualidade inferior e não contribuem para a subsequente análise
pelo LymphoTrack.
A primeira página do relatório *.pdf irá incluir uma tabela com os resultados do merged read summary (resumo dasleituras fundidas), seguida dos gráficos com os resultados da V – J Sequence Frequency (Frequência de sequências V –J) e V – J Usage (Uso de V – J). As páginas remanescentes contêm uma tabela com os resultados do read summary(resumo das leituras) não fundidas. O conteúdo destas será detalhado na Tabela 4:

Tabela 4. Descrição do conteúdo do relatório *.pdf.

Ficheiro *.pdf de Saída para o Repórter LymphoTrack
Contém uma lista das primeiras 200 sequências únicas, ordenadas por contagem, especificando:
Que evento de recombinação V – J melhor se adequa a cada sequência
•Sequência•
Comprimento das sequências•% total de leituras efetivas

Read Summary (Resumo das leituras)% total de leituras cumulativas listadas para as 200 primeiras leituras•Quão bem a leitura abrange o gene-V identificado que é alvo dos primers (%) (IGH/IGK)•
Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa)
Líder e IGH FR1 contém também:
Taxa de mutação para gene-V parcial (%)
Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 contêm também:•
Se se prevê que o rearranjo está in-frame (Y/N/n/a (S/N/n/a)). Se não é possível prever o uso desegmento do gene V ou J devido à qualidade do alinhamento, o software não será capaz de indicar
se o gene está in-frame e o resultado será n/a.
Se se prevê que o rearranjo não contém um codão stop (Y/N (S/N)). Quando não é possível fazer uma
previsão de in-frame, não é possível indicar com exatidão se está presente ou não um codão stop.

Merged Read Summary(Resumo das leituras fundidas)
V – J Sequence Frequency Graph (Gráfico
de frequência de sequências V – J)
V – J Usage Graph(Gráfico de uso V – J)
Nota:
Nota:
Nota:

Mesmo formato que a folha de cálculo Read Summary (Resumo das leituras), mas apenas para as
primeiras 10 leituras após a fusão com as 500 primeiras leituras se as leituras tiverem apenas 1 ou 2 nts
diferentes entre si. Adicionalmente, o score Q30 do índice é apresentado na Total Read Count (Contagem
total de leituras).
Um histograma que mostra as 200 primeiras frequências das sequências para cada recombinação de
família V – família J (para IGH/IGK e TRB) ou gene V – gene J (para TRG).
Um gráfico de barras 3D que mostra o uso da família V – família J para as 200 primeiras sequências (para
IGH/IGK e TRB) ou o uso do gene V – gene J para todas as sequências (para TRG).

A Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa) é determinada fazendo a correspondência de uma definição exata de uma sequência CDR3.
Qualquer mutação em pontos de ancoragem ou falha no quadro leitura irá resultar num valor “not found” (“não observado”).
A análise de IGK inclui ainda informações para outros elementos no locus IGK envolvidos em recombinações (IGKINTR e IGKDEL).
A análise de TRB inclui ainda informações para outros elementos no locus TRB envolvidos em recombinações da região D – J.

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Visualização de dados (manual): Executar as Folhas de Cálculo
de Visualização de dados de Excel (não recomendado)
4.1.

Verifique as definições de Segurança no Microsoft Excel a fim de verificar se o suporte Macro está devidamente
ativado: Excel 2007: Clique no botão Office e selecione Excel Options (Opções do Excel).
 Excel 2010/2013: Clique no menu File (Ficheiro) e selecione Options (Opções).
 Na janela Options (Opções), clique em Trust Center (Centro de Confiança) e, em seguida, no botão Trust Center
Settings... (Definições do Centro de Confiança...).
 Clique em Macro Settings (Definições Macros) e defina o nível apropriado de segurança para a Macro. A opçãoDisable all macros with notification (Desativar todas as macros com notificação) é a definição recomendada.
 Clique em OK e novamente em OK.
 Feche o Excel.

4.2.

Abra o ficheiro da folha de cálculo de visualização de dados adequado, clicando duas vezes sobre o mesmo. Os
ficheiros de visualização estão localizados na pasta LymphoTrackDxMiSeq_2.4.3 anteriormente copiada do CD do
software para o computador:





4.3.

LymphoTrackDxIGHVisualization.xlsm para Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3
LymphoTrackDxIGKVisualization.xlsm para IGK
LymphoTrackDxTRBVisualization.xlsm para TRB
LymphoTrackDxTRGVisualization.xlsm para TRG

Ao abrir o ficheiro, pode aparecer a mensagem: Security Warning - Macros have been disabled (Alerta de Segurança- As macros foram desativadas).
 Excel 2007: Clique no botão Options... (Opções...) à direita do alerta e selecione Enable this content (Ativar esteconteúdo) e clique em OK.
 Excel 2010/2013: Clique no botão Enable Content (Ativar Conteúdo).
A macro de visualização de dados irá iniciar automaticamente.

4.4.
4.5.

4.6.
4.7.
4.8.

Será mostrado o acordo de licença. Terá de aceitar o acordo de licença para utilizar o software.
Depois de aceitar o acordo de licença, abre-se uma caixa de diálogo com uma mensagem: Please select the Read
Summary file for the sample you want. (Selecione o ficheiro do resumo das leituras para a amostra que pretende.) A
macro só permite a visualização de dados de uma amostra de cada vez, pelo que terá de repetir este procedimentopara cada amostra que pretende visualizar.
Navegue até à pasta de saída criada pela aplicação de análise de dados que contém os dados a serem visualizados e
selecione o ficheiro *.fastq_unique_reads (*.leituras_únicas_fastq) para a amostra a analisar.
Clique no botão Open (Abrir).
A macro irá transferir os ficheiros de dados para a amostra selecionada e criar várias folhas de cálculo, cada uma com
diferentes visualizações legíveis dos dados. Isto pode demorar algum tempo, dependendo do tamanho da amostra e
do hardware do computador.
IMPORTANTE!

Devido a uma limitação do Microsoft Excel, o software de visualização não é capaz de mostrar
mais do que 1 048 576 linhas de dados por folha. Serão mostradas apenas as primeiras
1 048 576 linhas de dados se qualquer um dos ficheiros de saída da análise de dados paraa amostra atual exceder este limite de linhas.
Uma vez atingido este limite, o programa irá mostrar uma mensagem que indica a(s) folha(s)afetada(s) por esta limitação. Clique em OK para prosseguir.
Embora nem todos os dados possam ser mostrados, os gráficos não são afetados e estarão corretos.

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IMPORTANTE!

Os gráficos são gerados assumindo um sentido de visualização Left-to-right (Da esquerda para a
direita). Em países onde o sentido de leitura normal é “da direita para a esquerda”,
as predefinições do Excel podem ser incompatíveis e os gráficos não estarão corretos.
Para resolver este problema, a opção de visualização do Excel deve ser alterada para Left-toright (Da esquerda para a direita). Esta opção pode ser definida em Office > Excel Options(Office > Opções do Excel) no Excel 2007 ou em File > Options (Ficheiro > Opções) no Excel
2010/2013. Selecione Advanced (Avançadas) e percorra para baixo até às definições de Display(Visualização). Mude a opção Default direction (Direção predefinida) para Left-to-right (Daesquerda para a direita) e, em seguida, clique em OK. Da próxima vez que o Excel for iniciado,
as folhas de cálculo serão lidas da esquerda para a direita e o software de visualização irá gerar
gráficos corretamente.
Caso tal suceda e se for necessária assistência adicional, contacte o departamento de Assistência
Técnica da Invivoscribe através do número +1 (858) 224-6600, de segunda a sexta, 7:00 – 17:00(Verão: GMT - 9 horas/Inverno: GMT - 8 horas), ou por e-mail para support@invivoscribe.com.

4.9.
4.10.

Se aparecer uma mensagem relativa à Complex Formatting (Formatação complexa), clique em Yes (Sim).
A gravar o ficheiro de visualização. Quando o processamento for concluído, irá aparecer uma mensagem a informar
que o programa foi concluído. Recomenda-se vivamente que grave o ficheiro neste momento.

IMPORTANTE!

4.11.
4.12.

Ao gravar o ficheiro, certifique-se de que seleciona Save As (Guardar como) e selecioneum Livro do Excel (*.xlsx ou *.xls), porque o procedimento por defeito ao selecionar
Save (Guardar) ou clicar no botão de disco será substituir a Macro *.xlsm pelo livro atual. Isto irá
requerer que a macro seja reinstalada com uma nova cópia do CD do software para análises
subsequentes.

Se aparecer uma mensagem de aviso sobre gravar o ficheiro como um livro sem macros, clique no botão Yes (Sim).
O livro completo para Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG incluirá as seguintes oito folhas de cálculo
descritas na Tabela 5.

Tabela 5. Folhas de cálculo incluídas no ficheiro Excel de saída.

Livro Completo para Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG
Contém uma lista das primeiras 200 sequências únicas, ordenadas por contagem, especificando:Que evento de recombinação V-J melhor se adequa a cada sequência
Sequência
Comprimento das sequências
% total de leituras efetivas% total de leituras cumulativas para todas as leituras (TRG apenas)% total de leituras cumulativas listadas para as 200 primeiras leituras (IGH/IGK e TRB)Quão bem a leitura abrange o gene-V identificado que é alvo dos primers (%) (IGH/IGK)
Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa)
Read Summary (Resumo das leituras)

Líder e IGH FR1 contém também:
Taxa de mutação para gene-V parcial (%)
Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 contêm também:Se se prevê que o rearranjo está in-frame (Y/N/n/a (S/N/n/a)). Se não é possível prever o
uso de segmento do gene V ou J devido à qualidade do alinhamento, o software não serácapaz de indicar se o gene está in-frame e o resultado será n/a. Se se prevê que orearranjo não contém um codão stop (Y/N (S/N)). Quando não é possível fazer uma
previsão de in-frame, não é possível indicar com exatidão se está presente ou não umcodão stop.

Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa).

Merged Read Summary(Resumo das leituras fundidas)

Mesmo formato que a folha de cálculo Read Summary (Resumo das leituras), mas apenas para as
primeiras 10 leituras após a fusão com as 500 primeiras leituras se as leituras tiverem apenas 1 ou 2
nts diferentes entre si.

VJ Sequence Frequency Graph (Gráfico
de frequência de sequências VJ)

Um histograma que mostra as 200 primeiras frequências das sequências para cada recombinação de
família V – família J (para IGH/IGK e TRB) ou gene V – gene J (para TRG).

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Tabela 5. Folhas de cálculo incluídas no ficheiro Excel de saída.

Livro Completo para Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG
Contagens originais e frequências das 200 primeiras recombinações de família V - família J (para
IGH/IGK e TRB) ou gene V – gene J (para TRG).

VJ Usage (Uso de VJ)
VJ Usage Percent Graph (Gráfico depercentagem de uso de VJ)

Um gráfico a 3D que mostra as 200 primeiras frequências das sequências para cada recombinação de
família V – família J (para IGH/IGK e TRB) ou gene V – gene J (para TRG).

VJ Usage Raw Graph (Gráfico original deuso de VJ)

Um gráfico a 3D que mostra as 200 primeiras contagens originais para cada recombinação de família
V – família J (para IGH/IGK e TRB) ou gene V – gene J (para TRG).

VJ Sequence Frequency(Frequência de sequências VJ)

Uma lista “em pilha” de todas as possíveis recombinações da família V – família J (para IGH/IGK e
TRB) ou gene V – gene J (para TRG), cada uma com uma lista ordenada das primeiras 200 leituras (damaior à menor %).

Unique Reads (Leituras únicas)

Um ficheiro .FASTA de sequências únicas, ordenadas por contagem.

Nota:

Nota:
Nota:
Nota:
Nota:

IGH listado na tabela abaixo refere-se à análise de Líder, IGH FR1, IGH FR2 e IGH FR3. Os gráficos de frequências para estes alvos génicos
apenas especificam IGH no título. A pasta de dados de saída especifica se o Líder ou uma das regiões da framework (FR) foi analisada pelo
software e esta informação é incluída no campo de localização do ficheiro de dados no topo da folha de cálculo Read Summary (Resumo dasleituras).
A análise de IGK inclui ainda informações para outros elementos no locus IGK envolvidos em recombinações (IGKINTR e IGKDEL).
A análise de TRB inclui ainda informações para outros elementos no locus TRB envolvidos em recombinações da região D – J
Primeiras 200: Quando especificado acima, as folhas de cálculo irão mostrar as primeiras sequências (até 200) para Líder, IGH FR1, IGH FR2,
IGH FR3, TRB e IGK. Todas as sequências são mostradas para TRG em Read Summary (Resumo das leituras).
A Putative CDR3 sequence (Sequência CDR3 putativa) é determinada fazendo a correspondência de uma definição exata de uma sequência
CDR3. Qualquer mutação em pontos de ancoragem ou falha no quadro de leitura irá resultar num valor “not found” (“não observado”).

IMPORTANTE!

As atribuições de genes V/J encontradas no Read Summary (Resumo das leituras) são,por vezes, marcadas como “none” (“nenhum”). Estas atribuições baseiam-se na qualidade domelhor alinhamento entre a leitura e os genes de referência. Se o melhor alinhamento estáabaixo de um limite mínimo de qualidade, a atribuição do gene não pode ser feita com
confiança e é marcada como “none” (“nenhum”).

IMPORTANTE!

A taxa de mutação para o gene-V parcial (%) irá mostrar ‘n/a’ para IGH FR2 e FR3. O alcance dogene-V é limitado devido aos tamanhos de amplicons mais reduzidos para estes alvos, o que
resulta em cálculos inexatos da taxa de mutação.
 Ao analisar o estado de hipermutação somática das amostras, deverá focar-se nas 4 primeirasleituras (limite as amostras monoclonais ou biclonais às primeiras 2 ou 4 leituras, respetivamente),
visto que as análises de taxa de hipermutação somática (SHM) e de in-frame/codão stop são asmais informativas para estas leituras. Devido à natureza imparcial das plataformas de NGS, sãosequenciadas e analisadas muitas mais leituras do que as 4 primeiras, a maioria das quais são
rearranjos pouco abundantes, ou podem ser atribuídas a artefactos da amplificação esequenciação. As análises de SHM e in-frame/codão stop não são úteis em leituras não clonais
nestes casos. De notar que a Invivoscribe utiliza o GRCh37 para sequências de referência e os
resultados podem diferir ligeiramente comparado com a base de dados IMGT. Além disso, muitos
pseudogenes e genes não funcionais não são incluídos na análise. Deve interpretar com cuidado
rearranjos com um estado de hipermutação somática igual ou próximo do limite de 2%, em
particular quando realizar o ensaio de IGH FR1, que é apenas direcionado para uma porção daregião IGHV, visto que a sequência a montante do local de ligação do primer não será avaliada.

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Serviços Técnicos e Apoio ao Cliente
Damos valor ao seu negócio. Temos todo o gosto em auxiliá-lo/a na compreensão deste software e em fornecer-lhe
assistência técnica contínua, de segunda a sexta-feira, para manter o desempenho eficiente dos ensaios no seu laboratório.
Informações para Contacto
Invivoscribe, Inc
10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | EUA
Telefone: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Horário de funcionamento: 9:00 – 17:00 GMT - 8/GMT - 7
Serviços Técnicos: support@invivoscribe.com | Apoio ao Cliente: sales@invivoscribe.com | Website: www.invivoscribe.com

SímbolosOs seguintes símbolos são utilizados na rotulagem dos produtos de NGS da Invivoscribe.
Referência do catálogo

Data de validade

Volume de reagente

Representante autorizado
na União Europeia

Número de lote

Consulte as instruções de utilização

Condições de armazenamento

Para utilização em diagnóstico in vitro

Identificador de Dispositivo Exclusivo

FabricanteConformidade do Reino Unido Avaliada

Pessoa responsável no Reino Unido

Representante Autorizado Suíço

Conformidade Europeia

Aplicação de software

Perguntas Frequentes Sobre o Software
P1:

Quando seleciono ‘Launch Program’ (‘Iniciar programa’), aparece a seguinte mensagem de erro (ou semelhante):
Application terminated with error: Cannot run program “.\resources\Parse_TRG_miseq.exe”:
CreateProcess error=2, the system cannot find the file specified. (Aplicação fechou com um erro: não foi
possível executar o programa “.\resources\Parse_TRG_miseq.exe”: erro CriarProcesso=2, o sistema nãoconsegue localizar o ficheiro especificado.)

R1:

For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support. (Para assistência com este erro,contacte a Assistência Técnica da Invivoscribe.)
O arquivo do programa compactado (zip) foi descompactado (consulte a secção 1 Instalar o Software)? Este erro
normalmente ocorre quando se tenta executar o programa antes de descompactar o arquivo do programa. O
Windows permite visualizar o conteúdo de um arquivo zip, simplesmente clicando duas vezes no arquivo, e oconteúdo parece estar completo e funcional, mas não irá executar o programa devidamente a partir deste estado.

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P2:

Por que motivo o Read Summary (Resumo das leituras) da análise de IGH, IGK ou TRB tem menos de 200 leituras?

R2:

O LymphoTrack Dx Software - MiSeq alinha as 200 primeiras leituras durante a análise, mas o Read Summary(Resumo das leituras) apenas inclui as leituras que foram alinhadas com um gene V ou um gene J encontrado na referência.
Se uma leitura não puder ser alinhada com a referência, esta é excluída de Read Summary (Resumo das leituras).
Os motivos por trás de um não alinhamento com a referência são vários, mas normalmente concentram-se num
problema com a amostra, resultando na ocorrência de uma grande quantidade de amplificação não específica.
Este evento pode derivar de números reduzidos de células-alvo na amostra, condições de PCR inadequadas ou
tipos de amostras de baixa qualidade tais como tecidos fixados em formalina e impregnados em parafina
fragmentados. A fim de reduzir a probabilidade de ocorrência destes eventos, siga precisamente as Instruções deUtilização.

P3:

Por que motivo a atribuição-V ou a atribuição-J indica ‘none’ (‘nenhum’) na tabela com o Read Summary (Resumo
das leituras)?

R3:

A fim de se poder atribuir uma leitura a um gene V e/ou gene J específico, deve atingir-se um limite de qualidade
mínimo durante o alinhamento. Se o alinhamento é fraco, não pode ser feita uma atribuição com confiança e tal
é marcado ‘none’ (‘nenhum’). De notar que uma leitura não pode ser marcada ‘none’ (‘nenhum’) para ambos os
genes V e J, visto que estes não seriam comunicados, de acordo com a condição discutida na pergunta 2.

P4:

O ‘V–J Sequence Frequency Graph’ (‘Gráfico de frequência de sequências V–J’) tem valores insólitos para o eixo y. A ‘%
total reads’ (‘% total de leituras’) é da ordem dos milhões. Como é que isto é possível?

R4:

Tal deve-se provavelmente ao facto de executar o programa LymphoTrack Dx utilizando o tipo de marca decimal
errada para a sua região. Consulte a secção 2 Executar o Software de Análise de Dados, especificamente para aseleção da marca decimal.

P5:

Todas as folhas de cálculo dos gráficos estão vazias, mas as folhas de cálculo sem gráficos têm dados. Para onde
foram os gráficos?

R5:

Isto pode dever-se ao facto de a direção predefinida do programa Excel ser right-to-left (da direita para a esquerda)
em vez de left-to-right (da esquerda para a direita). Se os títulos das colunas numa folha de cálculo vazia começamem A no lado direito da folha, terá de mudar a direção para left-to-right (da esquerda para a direita) antes de usara macro de visualização de dados. Para alterar esta definição, escolha Excel options (Opções do Excel) no botão
Office no canto superior esquerdo, clique em Advanced (Avançadas) e desça até à secção Display (Visualização).
Aqui irá encontrar uma opção denominada Default direction (Direção predefinida) e ao selecionar Left-to-right(Da esquerda para a direita) poderá visualizar os dados das análises corretamente. Nota: Isto altera de forma
permanente a direção até que seja novamente alterada. Encerrar o Excel não reverte esta alteração.

P6:

O programa bloqueou depois de clicar em ‘Launch Program’ (‘Iniciar programa’) e apresentou este erro:

R6:

Application terminated with error: Filename not compatible. Please use only MiSeq MSR software
generated FASTQ files. (Aplicação terminou com erro: o nome do ficheiro não é compatível. Utilize apenas
os ficheiros FASTQ gerados pelo software MiSeq MSR.)
For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support. (Para assistência com este erro,contacte a Assistência Técnica da Invivoscribe.)

O LymphoTrack Dx software – MiSeq prevê ficheiros FASTQ com extremidades emparelhadas gerados pelo software
Repórter MiSeq (MSR) incluído na máquina MiSeq. Se o software MSR não tiver sido utilizado para gerar ficheiros desequências, a chamada de base tem de ser realizada utilizando o software MSR. Consulte o Guia do Utilizador do
MiSeq para obter mais informações.

Realizar a chamada de base utilizando o software MSR é importante porque, embora outros programas possam
gerar resultados muito semelhantes aos do software MSR (por exemplo, Bcl2fastq), estes programas também
podem gerar resultados muito diferentes, dependendo dos parâmetros específicos. O Ensaio LymphoTrack Dx só é
válido aquando da análise de ficheiros FASTQ gerados a partir do software MSR.

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P7:

Por que motivo os resultados da análise parecem incluir menos leituras do que o esperado?

R7:

Se existem poucas ou nenhumas leituras totais analisadas de acordo com o Read Summary (Resumo das leituras),verifique se foi selecionado o tipo de análise correto (Líder, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB ou TRG) quando
executar o LymphoTrack Dx software – MiSeq. Se parece haver um número reduzido de leituras totais,
compare o tamanho dos ficheiros FASTQ a serem analisados com o tamanho dos ficheiros FASTQ presentes
no equipamento MiSeq. Se o equipamento MiSeq tiver ficheiros maiores, então os dados de sequenciação devem
ser transferidos novamente a fim de garantir a análise de todos os conjuntos de dados.
O sequenciador MiSeq mostra mensagens diferentes quando processa os dados de sequenciação. Uma mensagem
pode indicar ‘Sequencing Complete’ (Sequenciação concluída) e a outra depois indicar ‘Analysis Complete’(Análise concluída). A transferência de dados FASTQ entre estas duas mensagens pode resultar numa análise
LymphoTrack Dx incompleta.

P8:

Por que motivo o Read Summary (Resumo das leituras) contém uma leitura na lista das dez primeiras que não
está no Merged Read Summary (Resumo das leituras fundidas)?

R8:

A leitura “desaparecida” pode ter sido fundida com uma leitura classificada acima da mesma, ou é possível queo alinhamento desta leitura tenha sido excecionalmente fraco. Durante o processo de fusão, as leituras no resumo
das leituras são alinhadas com as do ficheiro de leituras únicas. No entanto, as leituras no resumo das leituras
foram orientadas para cumprirem o alinhamento com a referência e, possivelmente, têm a orientação anti-sentido
comparativamente ao gene de referência. Isto acontece apenas quando o alinhamento é muito fraco e quando um
alinhamento do mesmo sentido ou anti-sentido é quase equivalente, sendo o alinhamento anti-sentido ligeiramente
melhor. Em casos como estes, é melhor ignorar completamente a leitura.

IMPORTANTE:

Utilize apenas leituras do Merged Read Summary (Resumo das leituras fundidas) para
determinar evidência de clonalidade.

P9:

Por que motivo a análise demora tanto tempo (mais do que uma hora por amostra)?

R9:

O ficheiro de registos apresenta o tempo que está a demorar cada passo. Após a linha ‘INFO: Decompressing files’(‘INFO: Descompactar ficheiros’), existe uma outra linha que indica quantos ficheiros e quanto tempo demorou
a descompactação. Este número está em milissegundos. Se a descompactação está a demorar várias horas,
verifique se os ficheiros de destino estão num servidor de ficheiros. Tipicamente, qualquer processo I/O intensivo,
como a descompactação, será mais lento numa rede. Se possível, copie os ficheiros para o computador local, ou
faça a descompactação dos ficheiros diretamente antes de executar o software. Certifique-se de que os ficheiros
compactados e descompactados não estão na mesma pasta. O software não irá prosseguir se ambos os ficheiros.fastq e .fastq.gz estiverem na pasta de destino.
Se os passos subsequentes de parsing e análise estiverem a demorar muito tempo, os ficheiros FASTQ poderão
ser muito grandes. Exemplos de ficheiros FASTQ grandes incluem ficheiros obtidos quando se incluem menos de 24índices numa única análise com o MiSeq e, como resultado, as amostras sequenciadas têm um maior alcance. Um
segundo exemplo seria se a biblioteca estiver desequilibrada e incluir uma maior proporção de uma amostra com
um índice versus a proporção de amostras com outros índices. O tempo de análise previsto nestas Instruções deUtilização assumem uma análise de 24 índices com bibliotecas equilibradas.

P10:

O Q30 da análise reportado pelo equipamento MiSeq não cumpre a especificação do sistema Illumina.
Se a análise LymphoTrack for executada e os controlos aparentarem ter tido o desempenho previsto, será quea análise falhou?

R10:

O Q30 da análise é calculado em tempo real durante o processo de chamada de base. Neste momento, não foi
executado qualquer outro processamento de dados, como demultiplexação e corte de adaptador. Isto significa que
qualquer sequência de um índice de qualidade fraco ou que ocorra fora da sequência de adaptadores está acontribuir para o score Q30. A sequência detetada fora da sequência de adaptadores é normalmente de baixa
qualidade e este cenário ocorre frequentemente com dímeros de primers. Se uma biblioteca tiver um nível
suficiente de dímeros de primers, tal pode provocar uma redução no Q30 da análise. Como verificação secundária,os resultados do Repórter LymphoTrack apresentam o score Q30 do índice conforme calculado a partir de todas as

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leituras cortadas nesse índice. Se um score Q30 do índice também não cumprir a especificação do sistema Illumina,
considere que esse índice falhou.
Q11:

Qual é a resolução para uma falha ao iniciar o software LymphoTrack Dx - MiSeq clicando duas vezes no arquivo
startLymphoTrackDx MiSeq.jar?

R11:

Esse problema pode ocorrer quando há um problema com a instalação atual do Java. A versão correta do Java
(Java 8 64 bits) deve ser instalada no sistema para que o software LymphoTrack Dx - MiSeq seja executado. Alémdisso, o arquivo startLymphoTrackDx MiSeq.jar deve ser definido para ser aberto com a versão correta do Java.
As seguintes etapas de resolução de problemas podem ser executadas para garantir que a versão correta do Javaesteja instalada e que o JAR seja aberto com a versão correta do Java:
1.

Verifique se o software Java está instalado:
1.1.
1.2.
1.3.

Abra o Windows Menu (Menu do Windows) e digite Settings (Configurações) na barra de pesquisa eselecione o primeiro ícone que é exibido.
Na barra de pesquisa da nova janela, digite Add or remove programs (Adicionar ou remover programas)
e selecione a primeira opção que aparece.
Percorra a lista de programas instalados.
••

2.

Desinstale as versões antigas do Java:
2.1.
2.2.

3.

Se um programa com um nome começando com as letras Java 8 e terminando com os caracteres de64 bits estiver na lista, a versão correta do Java está instalada.
Caso contrário, o Java 8 de 64 bits precisa ser instalado; vá para a secção 3.

Siga as etapas 1.1 e 1.2.
Percorra a lista de programas instalados. Identifique qualquer programa que comece com as letras Javae também contenha as letras Java 8 e 64 bits, clique na entrada na lista e em Uninstall (Desinstalar).

Desinstale o Java e reinstale o Java:Se a versão correta do Java estiver instalada e o software ainda não abrir, desinstale e reinstale o Java.
3.1.
3.2.
3,3.
3.4.

4.

Siga as etapas 1.1 e 1.2.
Percorra a lista de programas instalados e clique na entrada com o nome Java 8 e terminando com os
caracteres de 64 bits, a seguir clique em Uninstall (Desinstalar).
Navegue até o site do Java para baixar o software Java 8 de 64 bits diretamente da Oracle em
http://www.java.com/.
Siga as instruções para instalar o software.

Aponte o arquivo JAR para o executável Java correto:
4.1.
4.2.
4.3.
4,4.
4.5.

Clique com o botão direito do rato no arquivo startLymphoTrackDxMiSeq.jar e selecione Properties(Propriedades).
Na caixa de diálogo que aparece, selecione o botão Change (Alterar) ao lado de opens with (abre com)texto.
Na próxima caixa de diálogo que aparece, selecione Choose another app (Escolher outro aplicativo).
Na nova janela que é aberta, clique em More apps (Mais aplicativos) e selecione Look for another app
on this PC (Procurar outro aplicativo neste PC).
Na janela de navegação que aparece, navegue até o local da pasta de instalação do Java 8 de 64 bits.
•

4,6.
4.7.

Provavelmente será: Local Disk (C:) > Program Files > Java > jre1.8.0_(version number) > bin(Disco local (C :)> Arquivos de programas> Java> jre1.8.0_ (número da versão)> bin).

Selecione o javaw.exe e clique em Open (Abrir).
Assim que a instalação for confirmada, repita as secções 4.1 a 4.3 e marque a caixa de seleção que
indica Always open .jar files with this app (Sempre abrir arquivos .jar com este aplicativo) e, em seguida,
navegue até o mesmo arquivo javaw.exe da etapa 4.6. Isso permitirá que o LymphoTrack Dx Software
seja aberto corretamente.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Acordo de Licença do Utilizador Final
ESTE ACORDO DE LICENÇA DO UTILIZADOR FINAL DEVE SER ACEITE POR UM REPRESENTANTE AUTORIZADO DO UTILIZADOR FINAL DESTE PRODUTO ANTES DE SE
UTILIZAR O LYMPHOTRACK® MISEQ SOFTWARE (o “Software”). AO UTILIZAR O LYMPHOTRACK® MISEQ SOFTWARE, ESTARÁ A AFIRMAR QUE É UM
REPRESENTANTE AUTORIZADO DO UTILIZADOR FINAL COM AUTORIDADE PARA CELEBRAR ESTE ACORDO. LEIA ESTE ACORDO CUIDADOSAMENTE. AO UTILIZARESTE SOFTWARE, ESTARÁ A CONCORDAR EM SER REGIDO PELOS TERMOS DESTE ACORDO. SE NÃO CONCORDAR COM OS TERMOS DESTE ACORDO, DEIXE DEUTILIZAR O PRODUTO. SE EFETIVAMENTE CONCORDAR COM OS TERMOS DESTE ACORDO, EM SEU NOME E/OU EM NOME DA ENTIDADE QUE REPRESENTA,
PODERÁ CONTINUAR A UTILIZAR O PRODUTO.
Este Acordo de licença do utilizador final (“EULA”) é celebrado por e entre a INVIVOSCRIBE, INC., uma empresa da Califórnia (“Licenciante”) e você enquanto utilizador
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afirmação anterior está limitada à utilização com os Ensaios LymphoTrack® do licenciante, adquiridos ao Licenciante ou a um distribuidor autorizado pelo Licenciante.
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uma venda do software original ou de uma sua cópia.
2. CONFIDENCIALIDADE. O Licenciado concorda que o Produto é propriedade do Licenciante e que este se baseia e inclui propriedade intelectual do Licenciante,
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3. PROPRIEDADE DO PRODUTO. O título, a propriedade e todos os direitos e interesses inerentes ao Produto, incluindo, sem limitação, o Software, todas as suas cópias
e “Propriedade Intelectual” relacionada com o mesmo, continuam na posse do Licenciante, e este EULA não concede quaisquer direitos de propriedade ao Licenciado.
4. RESTRIÇÕES DE CÓPIA. Este Produto está protegido por direitos de autor. A cópia ou modificação não autorizada do Produto, incluindo o Software que foi modificado,
combinado ou integrado com outro software, é expressamente proibida. O Licenciado pode ser considerado legalmente responsável por quaisquer violações dedireitos de autor causadas por, ou resultantes da incapacidade de o Licenciado cumprir os termos deste EULA.
5. RESTRIÇÕES DE TRANSFERÊNCIA. Este Produto é licenciado ao Licenciado e não pode ser transferido para terceiros sem autorização por escrito por parte
do Licenciante. Em caso algum poderá o Licenciado transferir, atribuir, alugar, proceder a leasing, vender, ou de outra forma dispor do Produto, ou qualquer sua parte,a título temporário, exceto como aqui expressamente estabelecido.
6. RESCISÃO. Este EULA será rescindido automaticamente, sem aviso prévio, se o Licenciado não cumprir qualquer um dos seus termos.
7. GARANTIA LIMITADA. O PRODUTO, O SOFTWARE E OS MATERIAIS ESCRITOS QUE O ACOMPANHAM, INCLUINDO AS INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO, SÃO FORNECIDOS“TAL QUAL”, SEM GARANTIA DE QUALQUER TIPO, SENDO QUE O LICENCIANTE NEGA QUAISQUER OUTRAS GARANTIAS, EXPRESSAS, IMPLÍCITAS OU ESTATUTÁRIAS,INCLUINDO QUAISQUER GARANTIAS IMPLÍCITAS DE COMERCIALIZAÇÃO E ADEQUAÇÃO A UM PROPÓSITO EM PARTICULAR, TÍTULO, NÃO VIOLAÇÃO E QUAISQUERGARANTIAS RESULTANTES DO CURSO DE NEGOCIAÇÃO OU CURSO DE DESEMPENHO RELATIVO OU RELACIONADO COM O SOFTWARE, A DOCUMENTAÇÃO OU
QUAISQUER MATERIAIS FORNECIDOS OU FACULTADOS A SI NO ÂMBITO DESTE EULA. O LICENCIANTE NÃO GARANTE QUE O SOFTWARE IRÁ FUNCIONARININTERRUPTAMENTE OU QUE ESTARÁ ISENTO DE DEFEITOS, OU QUE O MESMO IRÁ CUMPRIR (OU SE DESTINE A CUMPRIR) OS SEUS REQUISITOS COMERCIAIS.
8. RESPONSABILIDADE LIMITADA. NO LIMITE MÁXIMO PERMITIDO POR LEI, O LICENCIANTE NÃO SERÁ RESPONSÁVEL POR QUALQUER PERDA DE LUCROS OU DEOPORTUNIDADES DE NEGÓCIO, PERDA DE UTILIZAÇÃO, PERDA DE DIVIDENDOS, PERDA DE CREDIBILIDADE, INTERRUPÇÕES DE ATIVIDADES COMERCIAIS, PERDA DEDADOS, OU QUAISQUER OUTROS DANOS INDIRETOS, ESPECIAIS, INCIDENTAIS OU CONSEQUENTES, NO ÂMBITO DE QUALQUER TEORIA DE RESPONSABILIDADE, QUERSE BASEIE EM CONTRATO, DELITO, NEGLIGÊNCIA, RESPONSABILIDADE PELO PRODUTO OU DE QUALQUER OUTRA FORMA. TENDO EM CONTA QUE ALGUMASJURISDIÇÕES NÃO PERMITEM A EXCLUSÃO OU LIMITAÇÃO DA RESPONSABILIDADE POR DANOS CONSEQUENTES OU INCIDENTAIS, A LIMITAÇÃO PRECEDENTE PODENÃO SE APLICAR AO LICENCIADO. A RESPONSABILIDADE DO LICENCIANTE NO ÂMBITO DESTE EULA NÃO DEVERÁ, EM CASO ALGUM, E INDEPENDENTEMENTE DE A
INDEMNIZAÇÃO SE BASEAR EM CONTRATO, DELITO, RESPONSABILIDADE ESTRITA OU DE QUALQUER OUTRA FORMA, EXCEDER AS TAXAS DE LICENÇA QUE O
LICENCIADO PAGOU PELO SOFTWARE, SE APLICÁVEL. AS LIMITAÇÕES PRECEDENTES SERÃO APLICÁVEIS INDEPENDENTEMENTE DE O LICENCIANTE TER SIDOACONSELHADO ACERCA DA POSSIBILIDADE DE TAIS DANOS, E INDEPENDENTEMENTE DE QUALQUER REMEDIAÇÃO FALHAR NO SEU PROPÓSITO ESSENCIAL.
9. RECURSO EXCLUSIVO. O recurso exclusivo do Licenciado e a total responsabilidade do Licenciante por violações do Licenciante deste EULA deverão ser limitados, acritério único e exclusivo do Licenciante, a: (i) substituição de qualquer Software defeituoso ou de Documentação relacionada; ou (ii) reembolso das retribuições
pagas ao Licenciante pelo Software.
10. LEGISLAÇÃO APLICÁVEL. Este EULA será regido pelas leis do Estado da Califórnia, independentemente dos seus conflitos de princípios da lei, e o Licenciado consenteà jurisdição dos tribunais estaduais e federais do Estado da Califórnia.
11. ACORDO COMPLETO. Este EULA constitui o acordo completo celebrado entre o Licenciante e o Licenciado no que respeita aos termos específicos aqui estabelecidos
relativos à licença e garantias do Produto e qualquer outro termo ou obrigação. Este EULA substitui todos os entendimentos e acordos anteriores, sejam escritos ou
orais. Este EULA não pode ser modificado, exceto se ambos o Licenciante e o Licenciado concordarem com tal modificação por escrito.
12. SEPARABILIDADE. Se, por qualquer motivo, um tribunal da jurisdição competente considerar inexequível qualquer disposição ou porção de qualquer disposição deste
EULA, essa porção ou disposição deverá ser cumprida na máxima extensão permitida pela lei, de forma a afetar a intenção das partes, sendo que as disposições
remanescentes do EULA permanecerão em vigor com toda a sua força e efeito legal.
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