Instructions d’utilisation

LymphoTrack® Dx TRG Assay – MiSeqTM
Destiné à l’identification et au suivi des réarrangements clonaux du gène des récepteurs des lymphocytes T gamma (TRG)à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS) et du dispositif Illumina® MiSeq.

Ce test est destiné au diagnostic in vitro.

Représentation schématique du locus du gène TRG :Conditions de conservation : -85ºC à -65ºC(Les ADN contrôles peuvent être séparés des kits de test et conservés entre 2 C et 8 C.)

N° de référence
92270019
92270009

Produits
LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq
LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

Quantité
8 index – 5 réactions chacun
24 index – 5 réactions chacun

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Table des matières
1.
2.

UTILISATION PREVUE .................................................................................................................................................................................. 3
RESUME ET EXPLICATION DU TEST .................................................................................................................................................................. 3
2.1.
2.2.

3.

PRINCIPES DE LA PROCEDURE ........................................................................................................................................................................ 4
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.

4.

Précautions ............................................................................................................................................................................................... 9
Substances interférentes .......................................................................................................................................................................... 9
Conditions de prélèvement et manipulation ............................................................................................................................................ 9Conservation des échantillons .................................................................................................................................................................. 9

PROCEDURE DE TEST ................................................................................................................................................................................ 10
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
7.11.
7.12.
7.13.

8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.

Thermocycleur .......................................................................................................................................................................................... 8
Support magnétique ................................................................................................................................................................................. 8
Instrument de PCR en temps réel ............................................................................................................................................................. 8
Instrument* Illumina MiSeq ..................................................................................................................................................................... 8

PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS ............................................................................................................................................ 9
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.

7.

Composants .............................................................................................................................................................................................. 6
Mises en garde et précautions .................................................................................................................................................................. 7
Conservation et manipulation .................................................................................................................................................................. 7

INSTRUMENTS .......................................................................................................................................................................................... 8
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.

6.

Amplification en chaîne par polymérase (PCR) ......................................................................................................................................... 4
Purification des amplicons ........................................................................................................................................................................ 4
Quantification des amplicons ................................................................................................................................................................... 4
Séquençage de nouvelle génération (NGS)............................................................................................................................................... 4
Multiplexage des amplicons ..................................................................................................................................................................... 5

REACTIFS ................................................................................................................................................................................................ 6
4.1.
4.2.
4.3.

5.

Contexte ................................................................................................................................................................................................... 3
Résumé ..................................................................................................................................................................................................... 3

Matériel fourni........................................................................................................................................................................................ 10
Matériel nécessaire (mais non fourni) .................................................................................................................................................... 10
Préparation des réactifs .......................................................................................................................................................................... 11
Amplification........................................................................................................................................................................................... 11
Purification avec AMPure XP .................................................................................................................................................................. 12
Quantification des amplicons ................................................................................................................................................................. 13Groupement et quantification de la bibliothèque .................................................................................................................................. 14
Dilution de la bibliothèque poolée ......................................................................................................................................................... 14
Configuration de la qPCR pour la quantification de la bibliothèque ....................................................................................................... 15
Préparation de la bibliothèque pour le séquençage MiSeq .................................................................................................................... 15
Chargement de la Flow Cell MiSeq ......................................................................................................................................................... 16
Configuration de la feuille d’échantillons MiSeq .................................................................................................................................... 16
Démarrage de la réaction MiSeq ............................................................................................................................................................ 17

ANALYSE DES DONNEES ............................................................................................................................................................................. 17
VALEURS ATTENDUES ............................................................................................................................................................................... 18
LIMITES DE LA PROCEDURE ......................................................................................................................................................................... 18
INTERPRETATION ET RAPPORTS.................................................................................................................................................................... 18
DONNEES DE L’ECHANTILLON ...................................................................................................................................................................... 21
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE .......................................................................................................................................................... 21
GUIDE DE DEPANNAGE .............................................................................................................................................................................. 22
SUPPORT TECHNIQUE ET SERVICE CLIENT ........................................................................................................................................................ 23
BIBLIOGRAPHIE ....................................................................................................................................................................................... 23
SYMBOLES............................................................................................................................................................................................. 23
INFORMATIONS LEGALES ........................................................................................................................................................................... 24
LYMPHOTRACK DX TRG ASSAY – MISEQ : GUIDE ABRÉGÉ ................................................................................................................................. 25
ANNEXE A : CREATION D’UNE BIBLIOTHEQUE DE SEQUENÇAGE AVEC DES CIBLES NGS MULTIPLES .................................................................................. 26

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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1. Utilisation prévue
Le test LymphoTrack Dx TRG Assay pour le dispositif Illumina MiSeq est un produit de diagnostic in vitro destiné à ladétermination de la distribution des fréquences des réarrangements du gène TRG reposant sur le séquençage de nouvelle
génération (NGS) chez les patients suspectés d’être atteints d’une pathologie lymphoproliférative. Ce test facilite
l’identification de syndromes lymphoprolifératifs.

2. Résumé et explication du test
2.1.

Contexte
Le locus du gène des récepteurs des lymphocytes T gamma humains (TRG, auparavant appelé TCRG) sur lechromosome 7 (7q14) comporte 14 gènes Vγ (région variable) (groupe I, II, III et IV), 5 segments de gène Jγ (région dejonction) et 2 gènes Cγ (région constante) répartis sur 200 kilobases.
Les cellules lymphoïdes diffèrent des autres cellules somatiques de l’organisme ; au cours du développement, lesgènes du récepteur antigénique des cellules lymphoïdes subissent des réarrangements somatiques. 1 Ainsi, au coursdu développement des lymphocytes T, les gènes codant pour les molécules TRG sont assemblés à partir de plusieurs
segments de gènes polymorphiques subissant des réarrangements et une sélection, entraînant la formation decombinaisons Vγ–Jγ de longueur et de séquence uniques. Dans la mesure où les leucémies et les lymphomes sont dus
à la transformation maligne de cellules lymphoïdes individuelles, les cellules leucémiques ou lymphomateuses d’unindividu partagent généralement un ou plusieurs réarrangements spécifiques des cellules, ou « clonaux », de gène durécepteur antigénique. Par conséquent, les tests détectant les réarrangements clonaux du gène TRG peuvent êtreutiles à l’étude des affections malignes impliquant les lymphocytes B et T.
À l’origine, les réarrangements clonaux ont été identifiés à l’aide des techniques de fragment de restriction etd’hybridation en Southern Blot (RF-SBH). Toutefois, ces tests se sont avérés fastidieux et laborieux, nécessitaient degrandes quantités d’ADN et n’étaient pas appropriés pour l’analyse de la plupart des locus moins diversifiés durécepteur antigénique.
Au cours des dernières décennies, l’utilisation des tests RF-SBH a été remplacée par les tests de clonalité par
amplification en chaîne par polymérase (PCR) développés par Alexander Morley 2 qui sont considérés comme laméthode de référence à l’heure actuelle. Ces tests identifient la clonalité sur la base de la surreprésentation desproduits V–D–J amplifiés (ou D–J incomplets) suite à leur séparation par électrophorèse sur gel ou capillaire. Bien
qu’ils soient sensibles et adaptés à l’analyse de petites quantités d’ADN, ces tests ne permettent pas de différencier
aisément les populations clonales et les réarrangements multiples qui pourraient être à l’origine d’un pic unique, et
ils ne sont pas conçus pour identifier la séquence d’ADN V–J spécifique, nécessaire au suivi des populations clonales
dans les analyses ultérieures. Cette deuxième limitation peut être particulièrement importante, car une fois laséquence d’ADN unique spécifique du clone identifiée, la séquence peut être utilisée dans des tests ultérieurs poursuivre les populations clonales.

2.2.

Résumé
Le test LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq représente une avancée considérable par rapport aux tests de clonalité
existants ayant recours à l’analyse de fragment, dans la mesure où il détecte efficacement la majorité desréarrangements du gène TRG à l’aide d’un unique mélange mère (master mix) de multiplexes et identifie,
simultanément, la séquence d’ADN spécifique à chaque réarrangement de gène clonal. Par conséquent, ce test
comporte deux utilisations importantes et complémentaires : il permet la détection des populations clonales initiales
et identifie les informations de séquence requises pour suivre ces clones dans les échantillons ultérieurs.
Chaque mélange mère (master mix) unique de multiplexes pour TRG cible les régions conservées au sein des régions
Vγ et Jγ décrites dans les affections lymphoïdes malignes. Les amorces incluses dans les mélanges mères (mastermixes) sont conçues avec des adaptateurs Illumina comportant jusqu’à 24 index différents. Cette méthode permetd’effectuer une PCR à étape unique et le groupement d’amplicons de plusieurs échantillons et cibles différents(générés par d’autres tests LymphoTrack Dx pour l’instrument Illumina MiSeq, vendus séparément) sur une seule
Flow Cell MiSeq, ce qui permet d’analyser jusqu’à 24 échantillons par cible en parallèle et en une seule série.

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Le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq associé fournit une méthode d’analyse et une visualisation des données
simples et rationnelles. En suivant les recommandations fournies à la section 11 Interprétation et rapports, il est
possible d’interpréter facilement les résultats de l’échantillon résumés par le logiciel et de déterminer la présence oul’absence de clonalité.
Toujours interpréter les résultats des tests de clonalité moléculaire dans le contexte de données cliniques,
histologiques et immunophénotypiques.
Les contrôles positifs et négatifs pour la clonalité sont inclus dans le kit.
Remarque :pour obtenir une explication plus détaillée du locus et de la stratégie de séquençage ciblé, veuillez vous reporter à(Miller J.E., 2013).3

3. Principes de la procédure
3.1.

Amplification en chaîne par polymérase (PCR)
Les analyses par PCR sont utilisées en routine pour l’identification de populations clonales de lymphocytes B et T. Ces
tests amplifient l’ADN entre les amorces qui ciblent les régions conservées V et J des gènes du récepteur antigénique.
Ces amorces ciblent les régions conservées et s’étendent de part et d’autre d’une zone marquée par desréarrangements génétiques programmés se produisant au cours de la maturation de tous les lymphocytes B et T.
Différentes populations de lymphocytes B et T naissent de ces réarrangements génétiques.
Les gènes du récepteur antigénique qui subissent un réarrangement sont ceux des chaînes lourdes del’immunoglobuline (IGH), des locus de chaînes légères (IGK et IGL) des lymphocytes B, ainsi que les locus des gènesdes récepteurs des lymphocytes T (TRA, TRB, TRG et TRD). Chaque lymphocyte B et T possède un ou deux
réarrangements V–J fonctionnels dont la longueur et la séquence sont uniques. Ainsi, quand l’ADN d’une population
normale ou polyclonale est amplifié avec des amorces ADN qui flanquent la région V–J, des amplicons de séquence etde longueur uniques sont générés, lesquels reflètent la population hétérogène. Dans certains cas, en l’absence d’ADN
de lymphocyte, aucun amplicon n’est généré. Pour les échantillons contenant des populations clonales de TRG, un ou
deux produits amplifiés (amplicons) majeurs, d’une longueur et d’une séquence identiques, sont détectés avec une
fréquence significative, sur un fond polyclonal réduit.

3.2.

Purification des amplicons
Les amplicons de PCR sont purifiés afin de retirer les amorces en excès, les nucléotides, les sels et les enzymes à l’aide
de la technologie d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI) au moyen de billes paramagnétiques pour lapurification à haut débit d’amplicons de PCR. Grâce à un tampon optimisé, les produits de PCR supérieurs ou égaux à
100 paires de bases (pb) sont liés de manière sélective aux billes paramagnétiques, tandis que les contaminants tels
que les amorces en excès, les dimères d’amorces, les sels et les dNTP non incorporés sont éliminés. Les amplicons
peuvent alors être élués et séparés des billes paramagnétiques, ce qui permet d’obtenir un produit de PCR d’une
pureté supérieure pour l’analyse et la quantification d’amplicons en aval.

3.3.

Quantification des amplicons
Les amplicons purifiés sont quantifiés à l’aide des kits de quantification de bibliothèque KAPA™ pour les systèmes
Illumina. Les amplicons de PCR purifiés et dilués, ainsi qu’un ensemble de six étalons d’ADN prédilués sont amplifiés àl’aide de méthodes quantitatives (qPCR) qui utilisent le mélange mère (master mix) et les amorces KAPA SYBR ® FAST
qPCR. Les amorces du kit KAPA ciblent les oligoséquences des adaptateurs de la Flow Cell Illumina P5 et P7.
Le score Ct moyen des étalons d’ADN prédilués est transcrit en log10 afin de générer une courbe de référence qui
peut être utilisée pour calculer la concentration (pM) des amplicons de PCR dérivés de l’échantillon d’ADN. Le calcul
de la concentration d’amplicons de PCR permet une représentation égale des amplicons dans la bibliothèquecommune finale qui est chargée dans le MiSeq pour le séquençage.

3.4.

Séquençage de nouvelle génération (NGS)Les méthodes de séquençage de Sanger sont les plus populaires parmi les technologies de séquençage des acides
nucléiques de « première génération ». Les méthodes plus récentes, qui tirent grandement parti des approches deséquençage en parallèle, sont souvent appelées « NGS ». Ces technologies peuvent utiliser diverses stratégies

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combinées de préparation de la séquence modèle (template), de séquençage, d’imagerie et de bio-informatique pourl’alignement et l’assemblage du génome.
Les technologies NGS utilisées dans ce test reposent sur l’amplification de séquences génétiques utilisant une séried’amorces consensus, sens et antisens comprenant des adaptateurs et des marqueurs d’index. Les amplicons générés
avec les mélanges mères (master mixes) LymphoTrack Dx sont quantifiés, groupés et chargés dans une Flow Cell pourle séquençage avec la plateforme de séquençage Illumina MiSeq. Plus précisément, les produits amplifiés de la
bibliothèque sont hybridés à des oligonucléotides sur une Flow Cell, puis amplifiés pour former des colonies clonales
locales (amplification en pont ou bridge amplification). Quatre types de bases de terminateurs réversibles (bases RT)
sont ajoutés et le brin d’ADN séquencé est étendu, nucléotide par nucléotide. Pour enregistrer l’incorporation denucléotides, une caméra CCD réalise un cliché de la lumière émise lorsque chaque base RT est ajoutée, puis clivée
pour permettre l’incorporation de la base suivante.
3.5.

Multiplexage des amplicons
Ce test est conçu pour effectuer deux niveaux différents de multiplexage afin de permettre aux laboratoires deréduire les coûts et de gagner du temps. Le premier niveau de multiplexage provient des index multiples fournis avec
les tests. Chacun de ces 24 index agit comme un code-barre unique qui permet aux amplicons d’échantillons
individuels d’être regroupés après l’amplification par PCR afin de générer une bibliothèque de séquençage. Lesséquences obtenues sont triées par un logiciel de bio-informatique qui identifie celles qui proviennent d’unéchantillon en particulier.
Le second niveau de multiplexage provient de la capacité du logiciel fourni à trier les données de séquençage parindex et par cible. Cela permet aux amplicons générés avec les amorces cibles (y compris ceux comportant le mêmeindex) d’être regroupés pour générer la bibliothèque, puis d’être séquencés sur une seule Flow Cell. Il est notamment
possible de séquencer conjointement les produits de différents kits Invivoscribe LymphoTrack Dx Assay pour ledispositif MiSeq, tels que IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG. Lors du multiplexage desamplicons de différents gènes cibles, il est important d’utiliser la chimie de séquençage appropriée. Le nombre decycles de séquençage doit être suffisant pour séquencer le plus grand amplicon au cours de l’analyse multiplexe.
Ainsi, lors du multiplexage d’une combinaison d’amplicons des régions IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG,
utilisez le kit de séquençage MiSeq v2 (500 cycles) jusqu’à 4 cibles ou v3 (600 cycles) jusqu’à 7 cibles. Lors dumultiplexage conjoint de l’un ou l’autre de ces amplicons avec IGHV Leader, utilisez le kit de séquençage MiSeq v3(600 cycles). Lors du multiplexage conjoint des amplicons des régions IGH FR3 et TRG uniquement, qui ont des tailles
d’amplicon plus courtes, utilisez les kits de séquençage MiSeq v2 (300 ou 500 cycles) et réglez les paramètres de cycle
dans la feuille d’échantillons. Pour plus d’instructions, veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20).
Le nombre d’échantillons pouvant être multiplexés sur une seule Flow Cell dépend également de la Flow Cell utilisée.
Les Flow Cells standard d’Illumina (MiSeq v3) peuvent générer 22 à 25 millions de lectures. Afin de déterminer lenombre de lectures par échantillon, divisez le nombre total de lectures de la Flow Cell par le nombre d’échantillons à
multiplexer et le nombre de lectures par échantillon sera suffisant pour une interprétation valide. Pour plusd’informations, veuillez vous reporter à la section 11 Interprétation et rapports. Illumina fabrique également d’autres
Flow Cells qui utilisent une chimie de séquençage identique, mais génèrent des lectures moins nombreuses. En cas
d’utilisation d’autres Flow Cells, il est nécessaire de prendre en compte le fait qu’un nombre de lectures total
inférieur correspond à une profondeur inférieure par échantillon ou un nombre d’échantillons inférieur pouvantêtre analysés sur la Flow Cell afin d’atteindre la même profondeur par échantillon.

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4. Réactifs
4.1.

ComposantsTableau 1. Kits disponibles

N° de référence

Description

Nb de mélanges mères indexésNombre total de réactions

92270019

LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq

8 index – 5 séquençages chacun

4092270009

LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

24 index – 5 séquençages chacun

120

Tableau 2. Composition du kit

Réactif

Mélanges mèresǂ

ADN contrôle positif

92270019 Nb
d’unités92270009
Nb d’unités

TRG MiSeq 01

1

1

TRG MiSeq 02
TRG MiSeq 03

1
1

1
1

TRG MiSeq 04
TRG MiSeq 05

1
1

1
1

TRG MiSeq 06
TRG MiSeq 07

1
1

1
1

TRG MiSeq 08
TRG MiSeq 09

1
0

1
1

TRG MiSeq 10
TRG MiSeq 11
TRG MiSeq 12

0
0
0

1
1
1

0
0

1
1

TRG MiSeq 15
TRG MiSeq 16

0
0

1
1

TRG MiSeq 18
TRG MiSeq 19

0
0

1
1

TRG MiSeq 20
TRG MiSeq 21

0
0

1
1

TRG MiSeq 22
TRG MiSeq 23

0
0

1
1

TRG MiSeq 25
TRG MiSeq 27

0
0

1
1

1

3

Composants

TRG MiSeq 13
TRG MiSeq 14(

TRG POS (+)
42270019)

Quantité
unitaire

225 µl45 µlTempératuredeconservation

Remarques

S.O. (sans objet)

ADN V11/ J1/2 dilué dansl’ADN d’amygdaleou

ADN contrôle négatif

NGS NÉG (-)(
40920018)

45 µl

1

3

ADN d’amygdale, lafréquence de séquence laplus élevée peut varier d’unlot à l’autre

Remarque : aucun conservateur n’est utilisé dans la fabrication de ces kits.
ǂRemarque: les index 17, 24 et 26 ne sont pas utilisés dans ces kits.

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4.2.

Mises en garde et précautions
Veuillez lire attentivement les instructions d’utilisation avant de débuter la procédure de test et suivre attentivementchaque étape.
▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪

▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪
4.3.

Ce produit est destiné au diagnostic in vitro.
Le kit d’analyse forme un système qui doit être utilisé tel quel. Ne pas remplacer les réactifs par ceux d’un autre
fabricant. Une dilution, une réduction des réactions d’amplification ou tout autre écart par rapport à ce
protocole peut affecter la performance de ce test et/ou annuler toute sous-licence limitée accordée avec l’achat
de ce kit.
Les matériels sont stables jusqu’à la date de péremption figurant sur l’étiquette lorsqu’ils sont conservés etmanipulés conformément aux instructions. Ne pas utiliser les kits au-delà de leur date de péremption.
Le strict respect du protocole garantit une performance ainsi qu’une reproductibilité optimales. Veiller à utiliser
les programmes de thermocycleur adéquats, les autres programmes pouvant donner des résultats
imprécis/faussés, comme des faux positifs et des faux négatifs.
Ne pas mélanger ou combiner les réactifs de kits comportant des numéros de lots différents.
Éliminer les réactifs non utilisés et les déchets conformément à la réglementation en vigueur dans votre pays.
Réaliser toutes les procédures de laboratoire avec un équipement de protection individuelle standard (gants,
blouse et lunettes de protection). Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les précautions universelles lorsde la manipulation des échantillons. Ne pas pipeter à la bouche. Ne pas manger, boire ou fumer dans lelaboratoire. Se laver soigneusement les mains après manipulations des échantillons et des réactifs de test.
Manipuler les échantillons dans des installations de confinement de sécurité biologique approuvées et ouvrir lesrécipients uniquement dans une enceinte de sécurité biologique certifiée.
Utiliser de l’eau de qualité « biologie moléculaire » pour la préparation de l’échantillon d’ADN.
En raison de la sensibilité analytique de ce test, prendre de très grandes précautions pour éviter la contamination
des réactifs ou des mélanges d’amplification avec des échantillons, des contrôles ou des matériels amplifiés.
Utiliser de nouvelles pointes de pipette à filtre entre les échantillons et entre chaque transfert de réactifs.
Contrôler attentivement tous les réactifs pour détecter tout signe de contamination (p. ex., contrôles négatifs
donnant des signaux positifs). Jeter les réactifs suspectés d’être contaminés.
Afin de minimiser la contamination, porter des gants propres lors de la manipulation des échantillons et desréactifs et nettoyer fréquemment les plans de travail et les pipettes avant de réaliser la PCR.
La progression du travail doit toujours se faire en sens unique entre des zones de travail séparées dans lelaboratoire réalisant la PCR : commencer par la préparation des mélanges mères (master mixes), suivie de la
préparation des échantillons, puis de l’amplification et terminer par la détection. L’autoclavage n’élimine pas
l’ADN issu d’une contamination. N’introduire aucun ADN amplifié dans les zones réservées à la préparation desmélanges mères (master mixes) ou des échantillons.
Réserver toutes les pipettes et les pointes de pipette, ainsi que tout le matériel utilisé dans une zone particulièreà cette zone du laboratoire.
Décontaminer les articles non jetables avec une solution contenant de l’eau de Javel à 10 % et les rincer à l’eau
distillée à deux reprises avant de les replacer dans les zones où ils sont initialement utilisés.
Utiliser du matériel plastique jetable et stérile dans la mesure du possible pour éviter une contamination.

Conservation et manipulation▪
▪
▪
▪

Si le kit de test n’est pas utilisé immédiatement, il doit être conservé entre -85°C et -65°C.
La température de conservation optimale des ADN contrôles est de 2°C à 8°C, mais l’ADN peut également êtreconservé entre -85°C et -65°C.
Tous les réactifs et les contrôles doivent être décongelés et agités ou mélangés soigneusement avant utilisation
pour une remise en suspension complète.
En raison de la concentration élevée en sel, les mélanges mères (master mixes) de PCR sont sensibles aux cycles
de congélation/décongélation. Le nombre de cycles doit être limité à quatre maximum.

Pour toute question, veuillez contacter le personnel technique d’Invivoscribe. Nous vous aiderons volontiers àdéterminer vos conditions de conservation optimales.

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5. Instruments
Les instruments énumérés ci-après sont recommandés sur la base de méthodes utilisées pour valider le test.
5.1.

Thermocycleur▪
▪
▪

Utilisation ou fonction : amplification d’échantillons d’ADN
Instrument suggéré : thermocycleur Veriti™ Dx ou équivalent
Caractéristiques de performance et spécifications :
o
o

▪
▪
5.2.

Suivre les procédures d’installation, d’utilisation, d’étalonnage et de maintenance du fabricant.
Voir la section 7.4 Amplification pour le programme du thermocycleur.

Support magnétique▪
▪

Utilisation ou fonction : purification des produits PCR
Instrument suggéré :
o
o
o

▪

▪

Précipité de billes paramagnétiques

Voir la section 7.5 Purification AMPure XP pour les méthodes de purification des produits PCR.

Instrument de PCR en temps réel▪
▪
▪

Utilisation ou fonction : quantification des produits PCR
Instrument suggéré : instrument de PCR en temps réel Applied Biosystems ® 7500 Fast Dx ou équivalent
Caractéristiques de performance et spécifications :
o

▪
▪
5.4.

Ambion® Magnetic Stand 96* (AM10027)
Agencourt SPRIPlate® 96 Ring Super Magnet Plate* (A32782)
Thermo Fisher Scientific DynaMag™-96 Side Skirted Magnet* (12027)

Caractéristiques de performance et spécifications :o

5.3.

Plage de température minimale : 15 à 96°C
Vitesse minimale de montée de la température : 0,8°C/s

Détection des longueurs d’ondes vertes SYBR

Suivre les procédures d’installation, d’utilisation, d’étalonnage et de maintenance du fabricant.
Voir la section 7.6 Quantification des amplicons pour le programme de PCR en temps réel.

Instrument* Illumina MiSeq▪
▪

Utilisation ou fonction : séquençage de bibliothèque d’ADN normalisée
Caractéristiques de performance et spécifications :
o
o

▪
▪

Compatible avec le kit de réactifs MiSeq v2*
Compatible avec le kit de réactifs MiSeq v3* en cas de multiplexage

Suivre les procédures d’installation, d’utilisation, d’étalonnage et de maintenance du fabricant.
Voir les sections 7.11 Chargement de la Flow Cell MiSeq, 7.12 Configuration de la feuille d’échantillons MiSeq, et7.13 Démarrage de la réaction MiSeq pour les paramètres MiSeq.
*Mise en garde : ces produits ne comportent pas le marquage CE.

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6. Prélèvement et préparation des échantillons
6.1.

Précautions
Les échantillons biologiques humains peuvent contenir des matériels potentiellement infectieux. Manipuler tous leséchantillons conformément au programme de contrôle des pathogènes transmissibles par le sang de votreétablissement et/ou au Niveau 2 de sécurité biologique.

6.2.

Substances interférentes
Les substances suivantes peuvent interférer avec la PCR :
▪
▪
▪
▪

6.3.

Conditions de prélèvement et manipulation
▪
▪
▪

6.4.

Chélateurs de cations divalents
Pointes de pipette à faible rétention
EDTA (non significatif à faible concentration)
Héparine

La quantité ajoutée minimale est de 50 ng d’ADN de haute qualité (5 l d’échantillon d’ADN à la concentration
minimale de 10 ng/µl).
Ce test analyse l’ADN génomique extrait et purifié. L’ADN doit être quantifié au moyen d’une méthode spécifiqueà l’ADN double brin (ADNdb) et être dépourvu d’inhibiteurs de PCR.
Remettre en suspension l’ADN dans une solution appropriée telle qu’un tampon TE dilué au 1/10 (1 mM Tris-HCl,
0,1 mM EDTA, pH 8,0, préparée dans de l’eau de qualité biologie moléculaire) ou dans de l’eau de qualité
biologie moléculaire seule.

Conservation des échantillons
Conserver les échantillons à l’aide d’une méthode prévenant la dégradation de l’ADN.

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7. Procédure de test
7.1.

Matériel fourni
Voir le Tableau 2 pour le matériel fourni.

7.2.

Matériel nécessaire (mais non fourni)

Tableau 3. Matériel nécessaire (mais non fourni)

Réactifs nécessaires ou
recommandés/fournisseurs

Réactif/Matériel

ADN polymérase

Roche :• ADN polymérase EagleTaq™
ou
Invivoscribe :• ADN Polymérase FalconTaq
ou équivalent

N° de référence

Remarques

05206944190
ou

5 U/μl60970130

Eau de qualité biologie
moléculaire

S.O. (sans objet)

S.O.

Exempte de toute DNase/RNase

Pipettes étalonnées

S.O.

S.O.

Précision requise pour mesurer desvolumes allant de 0,2 à 1 000 μl.

Plaques ou tubes PCR

S.O.

S.O.

Exempts de DNase/RNase/inhibiteur de
PCR

Pointes de pipette à filtre

S.O.

S.O.

Stériles, exemptes de
RNase/DNase/pyrogène

Tubes microcentrifuges

S.O.

S.O.

StérilesA63880S.O.

Kit de purification de produits de
PCR

Purification de produits PCR

Quantification des amplicons etde la bibliothèqueAnalyse MiSeq

Beckman Coulter, Inc :•Agencourt AMPure XP
Thermo Fisher Scientific :• Ambion Magnetic Stand 96• DynaMag-96 Side Skirted Magnet
ouBeckman Coulter :•Agencourt SPRI Plate 96, Ring Super
Magnet Plateou équivalent
KAPA Biosystems :• Kit de quantification de la bibliothèque
KAPA – Illumina
Illumina :•kit de réactifs MiSeq v2 (300 cycles)ou•
v2 (500 cycles)ou•v3 (600 cycles) lors du multiplexage•

Logiciel MiSeq•
Tampon de dilution A

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

AM10027
12027
ou

S.O.

A32782

KK4824MS-102-2002
ou
MS-102-2003
ou
MS-102-3003

S.O.

Flow Cell standard

Logiciel de commande MiSeq v2.6 ou
logiciel plus récent v2.6 ou logiciel plus
récentLocal Run Manager v2.0 ou logiciel plus
récent

S.O.

S.O.

S.O.

S.O.

Préparer une solution de 10 mM de TrisHCl, pH 8,0 + Tween 20 à 0,05 %280385 Rév. J | février 2024

Page 11 sur 28

7.3.

Préparation des réactifs
Afin de garantir que les échantillons d’ADN ne contiennent pas d’inhibiteur de la PCR et qu’ils sont de qualité
adéquate et en quantité suffisante pour générer des résultats fiables, les échantillons peuvent être analysés avec lemélange mère (master mix) Specimen Control Size Ladder d’Invivoscribe (20960021 pour la détection par ABI ou
20960020 pour la détection sur gel). Le Specimen Control Size Ladder cible différents gènes et génère une séried’amplicons 100, 200, 300, 400 et 600 pb ; la taille peut varier de +/- 5 points de base en raison des différences denorme de taille et/ou d'instrument. La vérification de l'intégrité de l'ADN est particulièrement importante pour leséchantillons difficiles, p.ex. le tissu fixé au formol et inclus dans la paraffine (FFIP).
Toujours utiliser les contrôles positifs et négatifs pour vérifier que l’analyse a été réalisée correctement.
Toujours utiliser un contrôle négatif sans ADN (no template control, NTC) pour rechercher une éventuellecontamination au cours du processus de préparation de la PCR.
7.3.1.
7.3.2.

Enfiler des gants et retirer les mélanges mères (master mixes) du congélateur. Laisser les tubes décongeler
complètement, puis vortexer doucement pour mélanger et terminer par une centrifugation très brève.
Sous une hotte de confinement, pipeter 45 l de chaque mélange mère (master mix) dans une plaque PCR
propre (un puits pour chaque mélange mère (master mix) et un mélange mère (master mix) par échantillon).
▪
▪

7.3.3.
7.3.4.

Inclure deux contrôles dans chaque analyse (un positif et un négatif) ainsi qu’un NTC.
Pour le NTC, utiliser de l’eau de qualité biologie moléculaire comme modèle à la place de l’ADN.

Ajouter 0,2 l d’ADN polymérase Taq (à 5 U/l) dans chaque puits contenant les mélanges mères (mastermixes) aliquotés.
Ajouter 5 l d’échantillon d’ADN (à la concentration minimale de 10 ng/l), d’ADN contrôle ou d’eau de qualité
biologie moléculaire (NTC) respectivement dans chacun des puits individuels contenant les réactions demélange mère (master mix).
▪
▪

Aspirer et expulser 5 à 10 fois avec la pipette pour mélanger.
Sceller la plaque et la placer dans le thermocycleur pour PCR.
Tableau 4. Mise au point de la réaction

Réactif

7.4.

VolumeMélange mère

45,0 μl

ADN polymérase Taq

0,2 μlÉchantillon ou ADN contrôle

5,0 μlVolume total

50,2 μl

Amplification
7.4.1.

Amplifier les échantillons en utilisant le programme PCR du Tableau 5.

Lors du multiplexage de plusieurs cibles, veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20) pour d’autres conditions de thermocyclage deLymphoTrack Dx Assay – MiSeq.
Tableau 5. Programme PCR

Étape

Température

Durée

Cycle

1

95°C

7 minutes

1

2

95°C

45 secondes

3

60°C

45 secondes

4

72°C

90 secondes

5

72°C

10 minutes

1

6

15°C

∞

1

29 x

Remarque : définissez la température du couvercle sur 105°C et le volume de réaction sur 50 μl.

7.4.2.

Une fois le programme d’amplification terminé, retirer la plaque PCR amplifiée du thermocycleur. Si les étapes
suivantes ne sont pas immédiatement effectuées, conserver les produits de PCR à 4°C pendant 1 jour.

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7.5.

Purification avec AMPure XP
La purification des produits de PCR à partir des échantillons, des contrôles positifs et négatifs et des contrôles sans
ADN a été réalisée au cours de la validation du test à l’aide du système de purification de produits de PCR Agencourt
AMPure XP.

Préparation :7.5.1.

Retirer le réactif AMPure XP de son lieu de conservation et le laisser atteindre la température ambiante avant
utilisation. Agiter doucement le flacon Agencourt AMPure XP pour remettre en suspension toutes lesparticules magnétiques ayant pu se déposer.

Veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20) pour les volumes de réactif AMPure XP utilisés dans d’autres produits de PCR LymphoTrack
Dx Assay – MiSeq.

7.5.2.

Transférer le volume approprié de réactif Agencourt AMPure XP nécessaire à la plaque dans un nouveau tube
de 2 ml afin de minimiser le risque de contamination par les pointes de pipette.
▪

7.5.3.

Le volume de réactif Agencourt AMPure XP est égal à n × 50 µl (n représente le nombre d’échantillons à
purifier).

Préparer une solution extemporanée (0,5 ml pour chaque échantillon à purifier) d’éthanol à 80 % en utilisantde l’eau stérile.

Liaison des amplicons aux particules magnétiques :7.5.4.

Ajouter 50 μl de réactif Agencourt AMPure XP, aliquoté et à température ambiante, à chaque échantillon àpurifier.
▪
▪
▪

7.5.5.

▪
7.5.6.

Mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois avec la pipette.
La couleur doit être homogène après le mélange.
Incuber 10 minutes à température ambiante.

Placer les échantillons mélangés sur un support magnétique DynaMag-96 Side Skirted ou Ambion Magnetic
Stand-96 et incuber à température ambiante pendant 5 minutes afin de séparer les particules magnétiques dela solution.
Conserver la plaque sur le support magnétique en permanence au cours de cette procédure, jusqu’àl’étape 7.5.10 ci-dessous.
À l’aide d’une pipette P200 (ou d’une pipette multicanaux équivalente) réglée sur 95 μl, aspirer le surnageantclarifié et le jeter.
▪
▪

Utiliser une pipette P10 (ou une pipette multicanaux équivalente) réglée sur 10 μl afin de retirer l’éventuelexcès de surnageant.
Éviter de retirer les particules magnétiques.

Lavage :7.5.7.

Tout en conservant la plaque sur le support magnétique, ajouter 200 μl d’éthanol à 80 % à chaque échantillon.
Incuber pendant 30 secondes à température ambiante.
▪
▪
▪

7.5.8.
7.5.9.

À l’aide d’une pipette P200 (ou d’une pipette multicanaux équivalente) réglée sur 195 μl, aspirer l’éthanol
et le jeter.
Utiliser une pipette P10 (ou une pipette multicanaux) réglée sur 10 μl afin de retirer l’éventuel excèsd’éthanol.
Éviter de retirer les particules magnétiques.

Répéter l’étape 7.5.7 pour obtenir deux lavages au total.
Avec la plaque toujours sur le support magnétique, laisser les particules magnétiques sécher à l’air libre
pendant 5 minutes.

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Élution :7.5.10.

Retirer la plaque du support magnétique. Ajouter 25 μl d’un tampon contenant 10 mM Tris-HCl, pH 8,0.
▪
▪

7.5.11.
7.5.12.
7.5.13.

Mélanger en pipettant jusqu’à ce que la solution soit homogène.
Vérifier que toutes les particules magnétiques sont présentes dans la solution.

Incuber 2 minutes à température ambiante.
Placer la plaque sur le support magnétique pendant 5 minutes ou jusqu’à la clarification du surnageant.
Transférer 22 μl d’éluat dans une nouvelle plaque. Sceller avec des bouchons en bande. Étiqueter la plaque etcentrifuger brièvement afin de garantir que le surnageant soit bien déposé au fond du puits. Conserver à -20°C
ou passer à l’étape suivante.
L’image du gel de la Figure 1 illustre l’efficacité d’une purification type (en montrant les amplicons avant etaprès purification).
Amplicons non purifiés

Figure 1 :Exemple derésultat d’une
purification desamplicons desmélanges mères(master mixes)
TRG MiSeq.
L’image a été
générée enanalysant les
produits non
purifiés etpurifiés avec le
LabChip GX.

7.6.

Contrôle Pos

Contrôle Nég

Amplicons purifiés
Contrôle Pos

Contrôle Nég

Quantification des amplicons
Les étapes suivantes ont été effectuées lors de la validation du test pour quantifier les amplicons de PCR purifiés
générés à partir des échantillons, des contrôles positifs et négatifs, ainsi que des contrôles sans ADN, à l’aide du kit dequantification de la bibliothèque KAPA (KAPA Biosystems).
7.6.1.

Dilution des amplicons
Le tampon de dilution A ci-dessous fait référence à : 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 + Tween 20 à 0,05 %(finale : 1/4 000) :Étape A :2 μl d’éluat d’amplicon purifié + 198 µl de tampon de dilution A.
Bien mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois avec la pipette.
Étape B :5 μl provenant de l’étape A + 195 μl de tampon de dilution A.
Bien mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois avec la pipette.
7.6.2.

Préparer une réaction qPCR pour la quantification des amplicons d’après le Tableau 6 pour chaque réaction (sereporter aux instructions du kit de quantification de la bibliothèque KAPA pour plus d’informations) :Tableau 6. Configuration de la qPCR

Réactif

VolumeEau de qualité PCR

3,6 μlMélange mère (master mix) KAPA SYBR FAST qPCR avec prémélange d’amorce

12,0 μl

ROX

0,4 μlAmplicons dilués ou étalon (1-6)

4,0 μlVolume total

20,0 μl

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7.6.3.

Se reporter au Tableau 7 pour le programme du thermocycleur pour la qPCR.
Tableau 7. Programme qPCR

Étape

Température

Durée

Cycle

1

95°C

5 minutes

1

95°C

30 secondes

60°C

45 secondes (lecture de la plaque)2

7.6.4.

35 x

Utiliser les données du test qPCR pour vérifier la contamination en calculant les valeurs ΔCt entre les contrôles(positifs et négatifs) et le NTC, en utilisant l’équation suivante :ΔCt = Ct (NTC) – Ct (contrôle)
Si ΔCt ≥ 4,0 pour les deux contrôles, passer à l’étape suivante. Si ΔCt < 4,0 pour chaque contrôle, voir lasection 14 Guide de dépannage pour plus d’instructions.

Lors du multiplexage de plusieurs cibles, veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20) pour la valeur ΔCt admissible pour d’autres produitsde PCR LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.

7.6.5.

Utiliser les données d’exécution de la qPCR pour déterminer la concentration d’amplicon de chaqueéchantillon en utilisant l’équation suivante :𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑’𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛 𝑛𝑜𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢é (𝑛𝑀) =452 × 𝑐𝑜𝑛𝑐. 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛𝑛𝑒 (𝑝𝑀) 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙é 𝑝𝑎𝑟 𝑞𝑃𝐶𝑅× 4
A

La valeur 452 représente la longueur moyenne du fragment (pb) de l’étalon d’ADN KAPA Illumina.
A = longueur moyenne du fragment des amplicons générés à l’aide du test TRG Assay = 300 pb (A = 300).
La longueur de la séquence inclut des nucléotides supplémentaires nécessaires au séquençage.
Remarque :7.7.

lors du multiplexage de plusieurs cibles, veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20) pour la longueur moyenne du fragment desamplicons générés pour d’autres produits LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.

Groupement et quantification de la bibliothèque
La quantité d’ADN de la bibliothèque chargée dans la Flow Cell MiSeq est essentielle pour générer des clusters d’une
densité optimale et obtenir des données de haute qualité lors du séquençage. La quantification de la bibliothèquepar qPCR est vivement recommandée.
7.7.1.

Sur la base de la concentration d’amplicon calculée à partir des résultats de qPCR, ajouter une quantité égale
d’amplicons (à l’exception de NTC, qui peut être exclu),▪
▪

7.7.2.
7.8.

p. ex., ajouter 4 nM de chaque amplicon dans un volume total de 10 μl en utilisant le tampon de dilution A
comme diluant. Mélanger 10 μl de chaque amplicon à 4 nM.
Pour les échantillons dont la concentration est < 4 nM, ajouter la quantité maximale d’échantillon possible(10 μl) et ne pas ajouter de tampon de dilution A à cet échantillon.

Vortexer doucement pour mélanger, puis centrifuger brièvement.

Dilution de la bibliothèque poolée(finale : 1/1 000) :Étape A :2 μl de la bibliothèque poolée + 198 µl de tampon de dilution A.
Bien mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois avec la pipette.
Étape B :20 μl provenant de l’étape A + 180 μl de tampon de dilution A.
Bien mélanger en aspirant et en expulsant 10 fois avec la pipette.

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7.9.

Configuration de la qPCR pour la quantification de la bibliothèque
Se reporter au Tableau 6 pour la configuration de la qPCR et au Tableau 7 pour le programme du thermocycleur.
7.9.1.

Déterminer la concentration de la bibliothèque poolée d’après les résultats de qPCR.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑’𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛 𝑛𝑜𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢é (𝑛𝑀) =452 × 𝑐𝑜𝑛𝑐 . 𝑚𝑜𝑦𝑒𝑛𝑛𝑒 (𝑝𝑀) 𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙é 𝑝𝑎𝑟 𝑞𝑃𝐶𝑅A

La valeur 452 représente la longueur moyenne du fragment (pb) de l’étalon d’ADN KAPA Illumina.
A = longueur moyenne du fragment des amplicons générés à l’aide du test TRG Assay = 300 pb (A = 300).
La longueur de la séquence inclut des nucléotides supplémentaires nécessaires au séquençage.
Remarque :7.10.

lors du multiplexage de plusieurs cibles, veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20) pour la longueur moyenne du fragment
des amplicons générés pour d’autres produits LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.

Préparation de la bibliothèque pour le séquençage MiSeq
À la fin de cette section, la concentration de la bibliothèque d’ADN doit être de 12 pM pour le kit de réactifs MiSeq
v2 et de 20 pM pour le kit de réactifs MiSeq v3 lors du multiplexage. Pour multiplexer les amplicons provenant dedifférents tests LymphoTrack Dx pour le dispositif MiSeq dans une seule bibliothèque, reportez-vous à la section 20,
Annexe A : Création d’une bibliothèque de séquençage avec des cibles NGS multiples.

7.10.1.

Déterminer la quantité de la bibliothèque à préparer d’après la concentration de la bibliothèque poolée àpartir des résultats de qPCR et diluer si nécessaire :▪
▪

7.10.2.

Si la concentration de la bibliothèque est supérieure à 4 nM, diluer la bibliothèque à 4 nM dans un volume
final de 10 μl à l’aide du tampon de dilution A.
Si la concentration de la bibliothèque est inférieure à 4 nM, utiliser 10 μl de la bibliothèque directement
pour l’étape suivante.

Suivre les instructions suivantes pour dénaturer la bibliothèque d’ADN.
▪
▪

Préparer une solution extemporanée de NaOH 0,2 N. Une solution extemporanée est essentielle pourdénaturer totalement l’échantillon d’ADN et pour la génération de clusters optimaux avec MiSeq.
Ajouter 10 μl de NaOH 0,2 N à la bibliothèque diluée (10 μl) préparée à l’étape précédente.
Tableau 8. Dénaturation des bibliothèques

Réactif7.10.3.

7.10.4.

VolumeBibliothèque diluée

10 μl

NaOH 0,2 N

10 μl

Volume total

20 μl

Vortexer brièvement pour mélanger la solution, puis centrifuger brièvement pour garantir que toute lasolution s’est déposée au fond du tube. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour dénaturer labibliothèque d’ADNdb en ADN simple brin (ADNsb).
Ajouter 980 μl de tampon HT1 préalablement refroidi (fourni dans les kits de réactif MiSeq) au tube contenantla bibliothèque d’ADN dénaturée :Tableau 9. Ajout du tampon HT1

Réactif7.10.5.
7.10.6.
7.10.7.

VolumeBibliothèque dénaturée

20 μlTampon HT1

980 μlVolume total

1 000 μl

Vortexer brièvement pour mélanger, puis centrifuger brièvement la solution d’ADN de la bibliothèque diluée
et dénaturée.
Placer la bibliothèque diluée et dénaturée dans de la glace jusqu’à la prochaine étape.
Retirer la banque d’ADNsb diluée de la glace et utiliser les instructions suivantes pour diluer davantage labibliothèque en préparation pour le chargement sur le MiSeq.

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Lors du multiplexage de plusieurs cibles, veuillez vous reporter à l’Annexe A (section 20) pour la concentration du chargement et le kit deréactifs MiSeq.
Pour le logiciel de commande MiSeq (v2.6 ou logiciel plus récent) :La concentration de la bibliothèque d’ADN est égale à 12 pM pour le kit de réactifs MiSeq v2.
La concentration de la bibliothèque d’ADN est comprise entre 12 pM et 20 pM pour le kit de réactifs MiSeq v3 lors du multiplexage.

▪

Si la concentration de la banque d’ADNsb diluée est de 40 pM (la concentration initiale était de 4 nM),
diluer jusqu’à la concentration du chargement de MiSeq désirée en utilisant les exemples suivants :Tableau 10. Préparation de la bibliothèque pour le chargement dans MiSeq▪

▪
7.10.8.
7.10.9.
7.11.

Concentrations finales

12 pM

Bibliothèque dénaturée

300 μlTampon HT1

700 μlConcentration finale en NaOH (mM)

0,60 mM

Si la concentration de la banque d’ADNsb diluée est inférieure à 40 pM (la concentration initiale était
inférieure à 4 nM), diluer l’ADN dénaturé de manière appropriée à la concentration de chargement de
MiSeq désirée (p. ex. 12 pM).
Veillez à ce que la concentration finale en NaOH ne dépasse pas 1,0 mM.

Mélanger par inversion 5 fois les tubes contenant les solutions finales de bibliothèques, puis centrifuger
brièvement.
Placer les préparations finales de bibliothèques dans de la glace jusqu’au moment de leur chargement dans la
cartouche de réactifs MiSeq.

Chargement de la Flow Cell MiSeq
Charger 600 μl de la préparation finale de bibliothèque dans la cartouche de réactifs MiSeq.

7.12.

Configuration de la feuille d’échantillons MiSeq
Veuillez-vous référer à la dernière documentation Illumina pour la création d'une feuille d'échantillons. Téléchargez lafeuille d’échantillon sur l’instrument MiSeq. Si vous utilisez un logiciel associé à Illumina (par exemple Local Run Manager[LRM]), sélectionnez TruSeq Nano DNA (ADN TruSeq Nano) pour le Library Prep Kit (kit de préparation de la banque)et TruSeq DNA Single Indexes Set A B (Index uniques d’ADN TruSeq [A,B]) pour l’Index Kit (kit d'index).

Caractères dans le nom de l’échantillon :•Créez un nom et un identifiant uniques à chaque échantillon lorsque vous les nommez. En cas d’analyse d’échantillons en double, il est
possible d’utiliser un nom similaire (c.-à-d., Échantillon1a et Échantillon1b).
•
Si des noms uniques ne sont pas attribués aux échantillons analysés ensemble dans la même Flow Cell, un seul échantillon est analysé parle logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq au cours du processus.
•
Utilisez uniquement des caractères alphanumériques et des traits d'union (A-Z, a-z, 0-9, ., -,) lors de la configuration de la feuilled’échantillons.
Nom de l’échantillon lors du multiplexage :Chaque index ne peut être répertorié qu’une seule fois dans la feuille d’échantillons. Par conséquent, toute information de suivi nécessairepour les échantillons séquencés avec de multiples cibles en utilisant le même index doit figurer dans un seul champ Sample ID (ID del’échantillon) (qui est intégré dans le nom du fichier FASTQ).
Gardez une trace de tous les échantillons et de toutes les cibles d’une analyse MiSeq qui sont séquencés à l’aide du même index. Attribuer unidentifiant unique à ce lot d’échantillons/de cibles à faire figurer dans le champ Sample ID (ID de l’échantillon) de la feuille d’échantillons. Lors
de l’attribution du nom, garder à l’esprit que ce champ ne peut pas contenir plus de 40 caractères.

Le champ Sample Name (Nom de l’échantillon) de la feuille d’échantillons est incorporé par défaut dans le nom dufichier FASTQ au lieu de Sample ID (ID d’échantillon) lorsque des informations sont entrées dans ce champ. Veuillez
laisser ce champ vide ou copier les informations qui ont été entrées pour Sample ID (ID d’échantillon). Si d’autres informations
sont entrées dans le champ Sample Name (Nom de l’échantillon), assurez-vous qu’il contient un identifiant unique et qu’il est
conforme aux recommandations ci-dessus pour le suivi des échantillons.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Important !

Les séquences des adaptateurs ne sont pas reconnues par le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq.


Si vous utilisez un logiciel associé à Illumina (tel que Local Run Manager [LRM]), adapter trimming(élimination des adaptateurs) doit être sélectionné lors de la création de la feuille d’échantillons.

Tableau 11. Indices utilisés avec les mélanges méres des LymphoTrack Dx Assays

7.13.

TruSeq DNA Single Indexes Set A B(Index uniques d’ADN TruSeq [A,B])(LRM « Index Kit » [kit d'index])

Index du mélange mère de PCR
LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Séquence
d’index

id01

ATCACG

AR001

id02

CGATGT

AR002

id03

TTAGGC

AR003

id04

TGACCA

AR004

id05

ACAGTG

AR005

id06

GCCAAT

AR006

id07

CAGATC

AR007

id08

ACTTGA

AR008

id09

GATCAG

AR009

id10

TAGCTT

AR010

id11

GGCTAC

AR011

id12

CTTGTA

AR012

id13

AGTCAA

AR013

id14

AGTTCC

AR014

id15

ATGTCA

AR015

id16

CCGTCC

AR016

id18

GTCCGC

AR018

id19

GTGAAA

AR019

id20

GTGGCC

AR020

id21

GTTTCG

AR021

id22

CGTACG

AR022

id23

GAGTGG

AR023

id25

ACTGAT

AR025

id27

ATTCCT

AR027

Démarrage de la réaction MiSeq
Démarrer l’analyse MiSeq en suivant les instructions du logiciel de commande MiSeq. Les durées d’analyse
approximatives du MiSeq sont indiquées dans Tableau 12.

Tableau 12. Durées de réaction MiSeq

Kit de réactifs MiSeq

Longueur de lecture

Version MCS

Durée de réaction MiSeq totale2 x 151 pb

v2.6 ou logiciel plus récent

~ 24 heures

2 x 251 pb

v2.6 ou logiciel plus récent

~ 39 heures

2 x 301 pb

v2.6 ou logiciel plus récent

~ 56 heuresv2
v3
Remarque :l’utilisation d’un kit avec un nombre de cycles inférieur ne permettra pas de générer les longueurs de lecture requises pour ce test.

8. Analyse des données
Le test LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq est destiné à produire des données de séquençage qui peuvent être analysées à
l’aide de la suite logicielle LymphoTrack Dx Software – MiSeq fournie sur le CD (95000009) inclus lors de l’achat du test.
Ce CD comprend les instructions détaillées pour l’installation et l’utilisation de la suite logicielle.

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9. Valeurs attendues
Les calculs effectués par le logiciel sont arrondis au dixième le plus proche afin de déterminer le résultat du test.

▪
▪
▪

% de lectures le plus important du contrôle positif TRG ≥ 2,5 %% de lectures le plus important du contrôle négatif NGS < 1,0 %Validité de l’analyse MiSeqooo% Q30 > 80 % pour v2 (2 x 151)
% Q30 > 75 % pour v2 (2 x 251)
% Q30 > 70 % pour v3 (2 x 301)

*Remarque :le Q30 de toutes les validations analytiques remplit les critères ci-dessus de la spécification Q30 Illumina MiSeq. Cependant,le score Q30 peut varier en fonction de la qualité de l’échantillon. Si le Q30 est inférieur à la spécification Q30 Illumina,
vérifier la valeur Q30 de l’index dans le rapport LymphoTrack Dx après l’analyse des données par le logiciel LymphoTrack Dx
Software – MiSeq. Si le score Q30 d’un index dans le rapport LymphoTrack Dx ne correspond pas à la spécification Illumina,
considérer cet index comme non valide.
La chimie MiSeq v2 a été validée pour ce test à cible unique. La chimie MiSeq v3 a été validée pour l’analyse multiplexe.

10. Limites de la procédure
▪
▪
▪
▪

Ce test n’identifie pas 100 % des populations cellulaires clonales.
Une variance plus élevée à la limite de détection (LD) analytique ou à proximité est intrinsèque à la plupart destechnologies, notamment au séquençage de nouvelle génération. Des tests de suivi sont suggérés lorsqu’un résultat est
proche de la LD analytique du test.
Les analyses PCR sont sujettes à des interférences dues à la dégradation de l’ADN ou à l’inhibition de l’amplification par
PCR par l’héparine ou d’autres agents qui peuvent être présents dans l’échantillon analysé.
Toujours interpréter les résultats des tests de clonalité moléculaire dans le contexte de données cliniques, histologiques
et immunophénotypiques.

11. Interprétation et rapports
Utiliser le rapport Merged Read Summary (Résumé de lecture fusionné) pour identifier les séquences de lecture fusionnées
les plus importantes et leurs fréquences avant la détermination de la clonalité à l’aide des critères figurant ci-dessous.
Consulter la section 8: Analyse des données pour plus d’informations sur le rapport Merged Read Summary (Résumé delecture fusionné). Certains processus clonaux peuvent entraîner la détection de deux clones ou plus. Ceci peut inclure une
population dominante avec une population sous-clonale réduite ou la présence de syndromes lymphoprolifératifs multiples.
Il est particulièrement important d’interpréter ces causes dans leur contexte clinique.
* Soyez prudent dans l’interprétation si « none » (aucune) est présent pour le gène V, D et/ou J dans les lectures clonales suspectées. La
valeur « none » (aucune) est attribuée lorsque l’alignement est mauvais et n’atteint pas le seuil de qualité minimum.

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Tableau 13. Critères d’interprétation

Critère 1

Le nombre total de lecturespour chaque échantillon est≥ 20 000.

Le nombre total de lecturespour chaque échantillon est≥ 10 000 et < 20 000.

Le nombre total de lecturespour chaque échantillon est< 10 000.

Critère 2

La séquence fusionnée la plus
importante est ≥ 2,5 % dunombre de lectures total.

La séquence fusionnée la plus
importante est ≥ 5,0 % dunombre de lectures total.

S.O. (sans objet)

Critère 3

Résultat

Le pourcentage (%) de lectures pour uneséquence fusionnée clonale suspectée est > 2 x
le % de lectures pour la 3e séquence fusionnéela plus fréquente.1

PREUVE DE CLONALITÉDÉTECTÉE

Le pourcentage (%) de lectures pour uneséquence fusionnée clonale suspectée est ≤ 2 x
le % de lectures pour la 3e séquence fusionnéela plus fréquente.1

Aucune preuve declonalité détectée

Le pourcentage (%) de lectures pour uneséquence fusionnée clonale suspectée est > 2 x
le % de lectures pour la 3e séquence fusionnéela plus fréquente.1

PREUVE DE CLONALITÉDÉTECTÉE

Le pourcentage (%) de lectures pour uneséquence fusionnée clonale suspectée est ≤ 2 x
le % de lectures pour la 3e séquence fusionnéela plus fréquente.1

Aucune preuve declonalité détectée

S.O. (sans objet)

Non évaluable1

Les calculs effectués par le logiciel sont arrondis au dixième le plus proche à des fins de comparaison.

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Figure 2 : Interprétation des données d’après les critères du Tableau 13.

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12. Données de l’échantillon

Figure 3 :Ce tableau, généré via le LymphoTrack Dx Software – MiSeq, montre les 10 premières lectures du résumé de lecture fusionnées avec les
500 premières lectures ; une lecture est fusionnée avec une autre si seulement 1 ou 2 pb les différencient l’une de l’autre. Les séquencesont été générées avec le test LymphoTrack DxTRG Assay – MiSeq et analysées avec la suite logicielle LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009).

13. Caractéristiques de performance
Les résultats du test LymphoTrack Dx TRG – MiSeq ont été comparés au rapport de diagnostic biologique en termes deconcordance (ou pourcentage de concordance globale), pourcentage de concordance positive (PPA) et pourcentage deconcordance négative (NPA) ; les résultats ont été respectivement de 89 % (51/57 cas), 81 % et 97 %.
Tableau 14. Comparaison entre le test LymphoTrack Dx TRG – MiSeq et le rapport de diagnostic biologique

Rapport de diagnostic biologique

LymphoTrack Dx TRG Assay- MiSeq

ClonalNon clonal

Clonal221

Non clonal

529

La performance analytique du test LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq a été évaluée en analysant l’ajout d’ADN de lignée
de cellules clonales à différentes dilutions dans l’ADN d’amygdale. La limite de détection (LD) était observée avec la dilution
de l’ADN à 5 %. Les % de lecture les plus élevés dans l’ADN d’amygdale étaient < 1 %. La régression linéaire R2 était > 0,98
pour une plage de dilution de l’ADN comprise entre 0 et 10 %. Le coefficient de variation (CV en %) pour 8 analyses
effectuées par 2 opérateurs, avec 2 lots de réactif et 2 instruments était inférieur à 15 % lors de l’analyse des dilutions del’ADN à 5 % et 10 %.

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14. Guide de dépannage
Tableau 15. Guide de dépannage

Survenue pendant

ErreurActionPréparation de l’échantillon et duréactif

La quantité d’ADN est inférieure à 50 ng parune méthode basée sur l’ADNdb

Ne pas analyser l’échantillon

Préparation de l’échantillon etdu réactif

L’intégrité de l’ADN de l’échantillon
est faible

Analyser l’échantillon à l’aide du Specimen
Control Size Ladder d’Invivoscribe(

20960021 pour la détection par ABI ou
20960020 pour la détection sur gel)

Quantification des amplicons à l’aide
du kit de quantification de la
bibliothèque KAPA

ΔCt < 4,0
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (contrôle)

Vérifier la courbe de référence en qPCR.
Rechercher une éventuelle contamination etrépéter la qPCR KAPA pour tous les échantillons
et les contrôles.
Si ΔCt < 4,0 de nouveau, recommencer la PCR et
la qPCR pour tous les échantillons et lescontrôles.

Création de la bibliothèque parquantification des amplicons etgroupement

La concentration des amplicons est inférieure à
1 nM

Vérifier la courbe de référence en qPCR etrépéter la PCR si inférieure à 1 nM

Feuille d’échantillons non trouvée
Format de la feuille d’échantillons incorrect
Échec lors de la vérification du système
fluidique
Configuration de l’analyse du MiSeq

Espace disque faible

Se reporter au dépannage Illumina ou appeler lesupport technique Illumina au+1-800-809-4566

Flacon à déchets vide
Réseau déconnecté
Échec RFID
Analyse MiSeq% Q30 < 80 % pour v2 (2 x 151)*% Q30 < 75 % pour v2 (2 x 251)*% Q30 < 70 % pour v3 (2 x 301)*

Appeler le support technique Invivoscribe au+1-858-224-6600

Installation du CD

Le logiciel LymphoTrack Dx n’est pas installécorrectement

Appeler le support technique Invivoscribe au+1-858-224-6600

Analyse des données

L’exécution du logiciel LymphoTrack Dx est
interrompue

Appeler le support technique Invivoscribe au+1-858-224-6600

Analyse des données

Aucune séquence clonale n’est détectée pourle contrôle positif

Appeler le support technique Invivoscribe au+1-858-224-6600

Contrôle négatif sans ADN (NTC)

Le NTC montre l’amplificationaprès la PCR

Répéter le test

* Le Q30 de toutes les validations analytiques remplit les critères ci-dessus de la spécification Q30 Illumina MiSeq. Cependant, le score Q30 peut varieren fonction de la qualité de l’échantillon. Si le Q30 est inférieur à la spécification Q30 Illumina, vérifier la valeur Q30 de l’index dans le rapport
LymphoTrack Dx après l’analyse des données par le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq. Si le score Q30 d’un index dans le rapport LymphoTrack
Dx ne correspond pas à la spécification Illumina, considérer cet index comme non valide.

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15. Support technique et service client
Nous vous remercions d’avoir acheté le test LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq. Nous vous sommes reconnaissants devotre fidélité. Nous sommes à votre disposition pour vous aider à comprendre ce test, et notre support technique est
disponible du lundi au vendredi pour vous permettre de réaliser les tests efficacement dans votre laboratoire.
Coordonnées
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10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | États-Unis
Téléphone: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Heures d’ouverture: 7 h – 17 h heure du PacifiqueService technique: support@invivoscribe.com | Service client: sales@invivoscribe.com | Site internet: www.invivoscribe.com

16. Bibliographie
1.

2.

3.
4.

▪
▪
▪
▪
▪
▪

JJM van Dongen et al., (2003). Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the
BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17, 2257–2317.
Miller, JE. (2013). Principle of Immunoglobulin and T Cell Receptor Gene Rearrangement. In Cheng, L., Zhang, D., Eble,
JN. (Eds), Molecular Genetic Pathology (2nd Ed., sections 30.2.7.13 and 30.2.7.18). New York, USA: Springer
Science & Business Media.
Tonegawa, S. (1983). Somatic Generation of Antibody Diversity. Nature 302, 575-581
Trainor KJ. et al., (1990). Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood 75, 22202222
LymphoTrack Dx Software – MiSeq Package Instructions for Use (95000009)
https://www.beckmancoulter.com
http://www.illumina.com
http://www.invitrogen.com
http://www.kapabiosystems.com
http://www.thermofisher.com

17. Symboles
Les symboles suivants sont utilisés pour l’étiquetage des produits de diagnostic NGS d’Invivoscribe.
Numéro de référence

Date de péremption

Volume du réactif

Représentant agréé dans la
Communauté européenne

Numéro de lot

Consulter les instructions d’utilisation

Conditions de conservation

Destiné au diagnostic in vitro

Identifiant Unique de L'Appareil

FabricanteConformité Britannique Évaluée

Personne responsable au Royaume-Uni

Mandataire Suisse

Conformité Européenne

Application logicielle

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18. Informations légales
Ce produit est couvert par un ou plusieurs des brevets et demandes de brevets suivants détenus par ou sous licenceexclusive d’Invivoscribe, Inc. (IVS). Brevet américain n° 7,785,783, brevet américain n° 8,859,748 (ainsi que les demandes
divisionnaires liées à la même demande d’origine), brevet européen n° EP 1549764B1 (validé dans 16 pays et complété parles brevets européens liés n° EP 2418287A3 et EP 2460889A3), brevet japonais n° JP04708029B2, demande de brevet
japonais n° 2006-529437, demande de brevet brésilien n° PI0410283.5, brevet canadien n° CA2525122, brevet indien
n° IN243620, brevet mexicain n° MX286493, brevet chinois n° CN1806051 et brevet coréen n° 101215194.
L’utilisation de ce produit peut nécessiter des méthodes d’amplification des acides nucléiques telles que l’amplification enchaîne par polymérase (PCR). Les licences nécessaires à la pratique des méthodes d’amplification ou à l’utilisation desréactifs, des enzymes d’amplification ou d’équipements couverts par les brevets de tiers relèvent de la responsabilité del’utilisateur, et aucune de ces licences n’est accordée par Invivoscribe, Inc., expressément ou implicitement.
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Microsoft®, Windows® et Excel® sont des marques déposées de Microsoft Corporation.

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19. LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq : guide abrégé
19.1.

Enfiler des gants et retirer les mélanges mères (master mixes) du congélateur. Laisser les tubes décongeler ; puis
vortexer doucement pour mélanger.

19.2.

Sous la hotte de préparation des réactifs, pipeter 45 l de mélange mère (master mix) dans les puits individuels d’une
plaque de PCR. Un puits pour chaque mélange mère (master mix) et un mélange mère (master mix) par échantillon,
contrôle positif, contrôle négatif et contrôle sans ADN.

19.3.

Ajouter 0,2 l d’ADN polymérase Taq (à 5 U/µl) à chaque mélange mère (master mix).

19.4.

Ajouter 5 l d’ADN des échantillons (à une concentration minimale de 10 ng/µl) et 5 l des échantillons de contrôledans les puits contenant les réactions de mélanges mères (master mixes) respectives, aspirer et expulser 5 à 10 fois
avec la pipette pour mélanger.

19.5.

Ajouter 5 l d’eau de qualité biologie moléculaire au puits contenant le mélange mère (master mix) respectif pour lecontrôle négatif sans ADN, puis aspirer et expulser 5 à 10 fois avec la pipette pour mélanger.

19.6.

Amplifier l’ADN cible à l’aide du programme de thermocycleur suivant :Étape

Température

Durée

Cycle

1
2

95°C

7 minutes

1

95°C

45 secondes

3

60°C

45 secondes

4

72°C

90 secondes

5

72°C

10 minutes

1

6

15°C

∞

1

29 x

19.7.

Retirer la plaque d’amplification du thermocycleur.

19.8.

Purifier les produits de PCR à l’aide du système de purification Agencourt AMPure XP. Ajouter 50 μl de particules àchaque réaction de 50 µl ; éluer l’ADN dans une élution de 25 µl.

19.9.

Quantifier les amplicons à l’aide du kit de quantification de la bibliothèque KAPA conformément aux instructions dukit. Diluer les amplicons à 1/4 000 avant de procéder à la qPCR.

19.10.

Grouper des quantités égales d’amplicons provenant des échantillons (ne pas inclure le contrôle sans ADN), diluer à
1/1 000 et quantifier la bibliothèque à l’aide du kit de quantification de la bibliothèque KAPA.

19.11.

Dénaturer et diluer la bibliothèque à 12 pM pour le kit de réactifs MiSeq v2 et entre 12 et 20 pM pour le kit de réactifs
MiSeq v3 lors du multiplexage (MCS v2.6 ou logiciel plus récent).

19.12.

Charger 600 μl de bibliothèque dénaturée et diluée dans la cartouche de réactifs MiSeq.

19.13.

Configurer une feuille d’échantillons MiSeq et téléchargez-la sur l’instrument (si nécessaire).

19.14.

Démarrer la réaction MiSeq.

19.15.

Analyser et visualiser les données acquises avec la suite logicielle LymphoTrack Dx Software – MiSeq incluse.

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20. Annexe A : Création d’une bibliothèque de séquençage avec des cibles NGS
multiples
Lors de l’analyse de plusieurs cibles avec différents tests LymphoTrack Dx Assay – MiSeq en parallèle, il est important denoter les différences de procédure entre les tests. Ainsi, le test IGHV Leader utilise 32 cycles de PCR et doit être placé sur unprogramme de thermocyclage distinct de celui des autres tests LymphoTrack Dx qui utilisent uniquement 29 cycles de PCR.
Le Tableau 16 ci-dessous résume ces différences de procédure. Pour obtenir des instructions complètes, consultez les
instructions d’utilisation du test LymphoTrack Dx Assay – MiSeq correspondant.
Tableau 16 Différences de procédure entre les tests LymphoTrack Dx

LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Procédure
Étape

Description

7.4.1

IGHV
Leader

IGH FR1

IGH FR2

IGH FR3

IGK

TRG

TRB

Nombre de cycles de PCR

32

29

29

29

29

29

29

7.5.1

Volume de réactif AMPure XP(rapport)

50 µl(rapport de
1:1)

50 µl
(rapport de
1:1)

50 µl
(rapport de
1:1)

50 µl
(rapport de
1:1)

50 µl
(rapport de
1:1)

50 µl
(rapport de
1:1)

35 µl
(rapport de0,7:1)

7.6.4

Recherche de contamination
Valeur ΔCt =Ct (NTC) – Ct (contrôle)

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 3,0660 pb450 pb390 pb260 pb410 pb300 pb400 pbConcentration du chargement

12 – 20 pM

12 pM

12 pM

12 pM

8 pM

12 pM

12 pM

Kit de réactifs MiSeq pour leséquençage à cible unique*v3 (600)

v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)

301

251

251

151

251

151

251

7.6.5 et7.9.1
7.10.7

7.12

A(longueur moyenne du fragment)

Paramètres de la feuilled’échantillons pour :Cycles Read 1*(Cycles lecture 1)

Cycles Read 2*(Cycles lecture 2)*Remarque : la chimie MiSeq v2 a été validée pour ces tests à cible unique. La chimie MiSeq v3 a été validée pour IGHV Leader et l’analyse multiplexe.

Deux ou plusieurs bibliothèques de séquençage générées à partir des mêmes mélanges cibles de gènes LymphoTrack (parexemple, deux bibliothèques de séquençage TRG, provenant de lots identiques ou différents) peuvent également êtremultiplexées ensemble dans une bibliothèque de séquençage unique à condition que chaque index pour ce mélange mère
ne soit inclus qu’une fois par cycle de séquençage. Se reporter au tableau suivant pour déterminer les paramètres de cycle
et les kits de réactif Illumina MiSeq à utiliser avec les différentes combinaisons de cibles. Il est recommandé d’utiliser le kit
de réactifs MiSeq v3 lors du séquençage des sept cibles afin d’obtenir suffisamment de lectures par échantillon.
Tableau 17 Paramètres de cycle et kits de réactifs pour une analyse MiSeq à cibles multiples

Cibles de multiplexage

Paramètres de la feuilled’échantillons

Kit de réactifs MiSeq

Concentration
du chargement

N° de référence

Uniquement IGH FR3 et TRG
conjointement

151 cycles Lecture 1
151 cycles Lecture 2

Kit v2 (300 cycles)ou
Kit v2 (500 cycles)

12 pM (v2)ou
20 pM (v3)MS-102-2002
ou
MS-102-2003

251 cycles Lecture 1
251 cycles Lecture 2

Kit v2 (500 cycles)
jusqu’à 4 ciblesou
Kit v3 (600 cycles)

12 pM (v2)ou
20 pM (v3)MS-102-2003
ou
MS-102-3003

301 cycles Lecture 1
301 cycles Lecture 2

Kit v3 (600 cycles)

20 pM (v3)MS-102-3003

Toute combinaison de ces cibles
conjointement :IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3,
IGK, TRB et TRG
Lors de la combinaison de l’un ou
l’autre des tests avec :IGHV Leader

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20.1.

Déterminer la concentration de chaque bibliothèque individuelle (p. ex., IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2,
IGH FR3, IGK, TRB et TRG).

20.2.

Déterminer la quantité de chaque bibliothèque à dénaturer.
Dans le tableau ci-dessous, les cas A, B, C, D, E et F sont différents exemples d’analyses multiplexes (p. ex., le cas A est
une analyse multiplexe d’IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG). T, U, V, W, X, Y et Z sont lesvolumes en µl.
n=nombre de cibles chargées dans une cartouche MiSeq

T=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque IGHV Leader (nM)]U=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque IGH FR1 (nM)]V=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque IGH FR2 (nM)]W=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque IGH FR3 (nM)]X=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque IGK (nM)]Y=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque TRG (nM)]Z=

40 fmole/[n x concentration de la bibliothèque TRB (nM)]Remarque : la valeur 40 fmole correspond aux 20 µl de 2 nM obtenus à la fin de l’étape 20.3.

Tableau 18. Calcul des entrées d’une bibliothèque individuelle afin de générer une bibliothèque de séquençage à cibles multiples pour l’analyse MiSeq

Bibliothèque

Volume de la bibliothèque individuelle (µl)

Concentration

Cas A

Cas B

Cas C

Cas D

Cas E

Cas F

(nM)

n=7

n=6

n=5

n=4

n=3

n=2

Nom du test
IGHV Leader

2,3

T

2,5

2,9

3,5

4,3

IGH FR1

1,5

U

3,8

4,4

5,3

6,7

8,9

IGH FR2

4

V

1,4

1,7

2

2,5

3,3

IGH FR3

2,1

W

2,7

3,2

3,8

4,8

6,4

IGK

3,5

X

1,6

1,9

2,3

TRG

2,6

Y

2,2

2,6

TRB

2

Z

2,9

T+U+V+W+X+Y+Z

17,1

20.3.

16,7

5,7
7,7

16,9

18,3

18,6

13,4

Dénaturer les bibliothèques combinées à 2 nM.
▪

Ajouter les réactifs conformément au Tableau 19 d’après la quantité déterminée lors de l’étape précédente.

Si T+U+V+W+X+Y+Z > 18, comme dans les cas D et E du Tableau 18, mélanger d’abord les bibliothèques applicables,
puis ajouter 18 µl à la réaction de dénaturation comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

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Tableau 19. Dénaturation des bibliothèques

Réactif

Volume (µl)

Bibliothèque IGHV Leader

T

Bibliothèque IGH FR1

U

Bibliothèque IGH FR2

V

Bibliothèque IGH FR3W

Bibliothèque IGK

X

Bibliothèque TRG

Y

Bibliothèque TRBZ

NaOH 1N

2

10 mM Tris-HCl pH 8,0 + Tween 20 à 0,05 %18 – (T+U+V+W+X+Y+Z)

Total

20

Vortexer brièvement pour mélanger la solution, puis centrifuger brièvement pour garantir que toute la solution s’estdéposée au fond du tube. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour dénaturer la bibliothèque d’ADN
combinée en ADN simples brins.
20.4.

Diluer la bibliothèque dénaturée à 40 pM.
Ajouter 980 μl de tampon HT1 préalablement refroidi (fourni dans le kit de réactifs MiSeq) au tube contenant 20 µlde bibliothèque d’ADN dénaturée. Vortexer brièvement pour mélanger et centrifuger brièvement l’échantillon.

20.5.

Préparer la bibliothèque dénaturée pour la charger dans le MiSeq.
Diluer la bibliothèque à 12 pM pour le kit de réactifs MiSeq v2 et à 20 pM pour le kit de réactifs MiSeq v3 (MCS v2.6
ou logiciel plus récent) lors du multiplexage en suivant le Tableau 20 ci-dessous. Vortexer brièvement pour mélanger
et centrifuger brièvement l’échantillon.
Tableau 20. Préparation de la bibliothèque combinée pour le chargement dans le MiSeq

Réactif

Volume
12 pM

20 pM

Bibliothèque 40 pM

300 µl500 µlTampon HT1 refroidi

700 µl500 µlTotal

1 000 µl

1 000 µl

20.6.

Charger 600 µl de bibliothèque dénaturée combinée obtenue à l’étape précédente dans une cartouche de réactifs
MiSeq.

20.7.

Configurer une feuille d’échantillons MiSeq et téléchargez-la sur l’instrument (si nécessaire).

20.8.

Démarrer la réaction MiSeq.

20.9.

Analyser et visualiser les données acquises avec la suite logicielle LymphoTrack Dx Software – MiSeq incluse.

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