研究フロンティア

生殖腺におけるIGF低親和性結合蛋白質 IGF-Binding Protein-RelatedProtein （1 IGFBP-７/mac25）の発現とその生理的意義について
田村和広，沓掛

真彦，遠藤愛樹，向後博司

東京薬科大学薬学部内分泌分子薬理学教室

はじめに
Insulin-like growth factor-I（IGF-I） 結 合 蛋 白 質（IGFBP）は，体液中のIGFが高分子複合体として存在することからIGFに結合する蛋白質として同定された分子であり，IGFBP-1からIGFBP-6まで６種類のアイソフォームが存在する．IGFBPはIGFに結合することにより，IGFの代謝，分布，IGF受容体への結合性を修飾する．
IGFBP間にはお互いに18個の相同なシステイン残基が存在し，このうち12個はＮ末端に偏在しており，IGFへ

図１

IGF結合蛋白質関連蛋白質（IGFBP）スーパーファミリーとIGFシステムの結合に関与する．IGFBPはIGFと同様に胞胚と子宮内膜において発現し（マウスではIGFBP-2〜6，ラットはた［４］．

IGFBP-1，3，4，5が発現），オートクライン/パラクラ

IGFBP-rP1の特徴は，IGFに対する親和性がIGFBP1イン様式で作用することが示唆されている［１，２］．卵〜6の約１/100であるが，インスリンに対する親和性に巣においても，主席卵胞の選択にIGFBP-4，5が関与しついては他のIGFBPと比べて数百倍高い点があげられているという知見が報告されている［２，３］．

る．また，インスリン受容体に対するインスリン結合に近年，Ｎ末端領域におけるIGFBPに対するホモロジも干渉する．

ーは高いにもかかわらず，IGFBP-1〜6のＣ末端領域とIGFBP-rP1はIGFやインスリンに対する結合性を有すは 相 同 性 の 低 いIGF結 合 蛋 白 質 関 連 蛋 白 質（IGFBPる点を含めて多様な作用が報告されているが，正常生理

related protein：IGFBP-rP） と し てIGFBP-rP1〜10が機能における役割はほとんど知られていない．筆者ら同定された（図１参照）．このIGFBP-rPファミリーは，は，IGFBP-rP1が，子宮内膜組織や卵巣顆粒膜細胞で概してIGFBPに比べて，IGF，インスリンに対する親和細胞・時期特異的に発現し，その機能と密接に関連して性が低いことが特徴で，IGF作用の調節以外の独自かついる結果を得ているので，本稿ではその概要を紹介する．

多彩な生理活性があることが注目されている［４，５］．
このなかで，ヒト染色体の4q12-13に存在し，マウスと着床関連因子としてのIGFBP-rP1の同定高いホモロジーを示すIGFBP-rP1は，髄膜腫と比べて正常髄膜細胞で高発現している遺伝子（mac25）としてげっ歯類（ラット）において，受精成立後，卵管内で見出されたIGF結合蛋白質である［６］が，ほぼ同年代桑実胚となった卵は，妊娠５日目までに胞胚を形成し，に 複 数 の 研 究 者 が 独 立 し て 分 離 し，TAF（tumor

子宮は胞胚の受容と侵入を可能にする準備を整える．胚adhesion factor），PSF（prostacyclin-stimulatingと子宮内膜は，増殖分化して着床の準備を整える．このfactor）などと記述されていた．しかし，IGFBP-7と呼ような胞胚の受容能獲得と着床誘起に役割をもつ分子とばれるようになり，最近ではIGFBP-rP1と再分類されして卵巣ステロイドにより制御される母体（子宮）側の連絡先：田村和広，東京薬科大学薬学部内分泌分子薬理学教室〒192-0392 東京都八王子市堀之内1432-1
TEL: 0426-76-4536
FAX: 0426-76-4536
E-mail: hiro@ps.toyaku.ac.jp

leukemia inhibitory factor（LIF），cyclooxygenase-2（COX-2） 代 謝 産 物 な ど が 同 定 さ れ て い る［７］．
IGFBP-rP1は，筆者らが着床機構の研究においてラットの着床成立時に特異的に発現が上昇する子宮因子としてサブトラクション法により単離した遺伝子の１つであ

日本生殖内分泌学会雑誌（2006）11：21-25

21田村 和広他ている．
ラット着床前日の子宮から調製した全子宮細胞の増殖におけるIGF-IとIGFBP-rP1の作用について検討を行うと，IGFBP-rP1はIGF-Iによる細胞増殖を抑制した．その際，細胞周期G２/Ｍ期の細胞が減り，G１期に停滞が
図２

妊娠初期の子宮内IGFBP-rP1発現（Northern blot）
腟内の精子の確認日を妊娠１日目とした。6 IS；妊娠６日目の着床部位．6；全子宮．6 Inter；着床部位間の子宮組織（文献９より一部改変）みられた［９］．IGFBP-rP1は子宮細胞の増殖においてIGF-I作用を抑制することにより妊娠初期の子宮機能の調節に関与している可能性が考えられる．IGFBP-rP1発現は正常なヒト子宮筋層に比べ，子宮筋腫において減少しているとの報告［10］もあるので，ヒトでも子宮構る［８］．すなわち，ラット妊娠初期の６日目の着床が成細胞の増殖制御に関与していると考えられる．

開始された子宮内膜で本遺伝子発現レベルは急増する．

さらに，線維芽細胞で報告されているように，培養ラ

ノーザンブロットで解析すると，妊娠５，６日目で明瞭

ット子宮筋細胞においてもIGFBP-rP1はプロスタサイな1.1kbの単一バンドが認められる（図２）．非妊娠動物クリン（PGI2）産生を促進した［９］．なお，子宮筋細においてはそのレベルは低い．下垂体摘出により着床遅胞 は，PGI2の 主 要 な 子 宮 内 産 生 部 位 で あ る．IGFBP-延を誘起した着床遅延ラットでも，エストロゲン投与にrP1蛋白質を発現することが可能なIGFBP-rP1発現アデより着床を誘起すると増加する［９］．しかし，興味深

ノウイルスベクター（Ad-mac）を構築して子宮内膜間いことに，その発現レベルは着床部位ではなく非着床部質細胞にAd-mac処置を行うと，COX-2とmicrosomal位で高い．この局在性は着床部位において着床時に同様

prostaglandin E synthase（mPGES）の発現は上昇した．に発現が高進し，脱落膜化組織に発現がみられる微小管

また，リコンビナントIGFBP-rP1を処置すると，COX-2不安定化因子であるスタスミンとは対照的である［８］．

発現の上昇とその代謝産物であるPGI2産生は上昇した

IGFBP-rP1は子宮筋層および腺上皮細胞ではなく，非（投稿中）．種を越えて着床に必須と考えられているLIF

着床部位の子宮筋層に近い内膜間質細胞で強く発現しての 下 流 に あ る 着 床 シ グ ナ ル と し てheparin binding-いる．

epidermal growth factor-like growth factor（HB-EGF），Hoxa-10やCOX-2の重要性が示唆されている．COX-2

子宮におけるIGFBP-rP1の生理活性と意義発現は，着床を開始した胞胚周囲の子宮内膜でみられ，LIF遺伝子欠損マウスが不妊であるのと同様にCOX-2遺IGFとインスリンは構造的に関連のあるペプチドで栄伝子欠損マウスも不妊である．LIFは着床における管腔養輸送，代謝酵素の調節，細胞増殖刺激を調節している．

上皮の変化の誘導に役割をもち，COX-2とHoxa-10は間IGF-Iは，骨由来細胞をはじめとする種々の細胞におい質の変化に役割をもつと報告されている．このCOX-2て増殖や分化を促進し，ヒトでは多量投与により血糖降代謝産物であるPGI2は核内レセプターのPPARδを介し下作用を示すが，妊娠初期の子宮内で発現する主要なマて着床に必須な遺伝子発現を起こすと考えられているイトゲンでもある．IGF-Ｉ遺伝子欠損マウスでは，子［７］．PGI2合成酵素の発現部位は，着床日においては着宮内での胎児の発育遅延がみられ，出生時体重が正常の床部位周辺の間質細胞と筋層であることから，IGFBP-60%に抑制され，生後も抑制され続け，８週後の体重はrP1はオートクライン，パラクライン様に作用し，着床正常の30%となる．子宮を含めた生殖臓器は小さいうえ誘起に必要なPGI2の産生を上昇させて，より着床しやすに不妊であり，IGF-Iが子宮の発育と機能維持に不可欠い環境をつくることが推察される．なお，本研究過程で，であることは明らかである．IGF-IIの生理的意義は未だIGFBP-rP1がヒトの着床の受容能獲得に関与する可能に不明な点が多いが，遺伝子欠損マウスでは，IGF-Iの性を示唆する論文が発表されている［11］．この報告では，遺伝子欠損マウスと同程度の子宮内発育遅延がみられマイクロアレイ解析により受容期の内膜組織と非受容期る．ラット子宮ではIGFが内膜をはじめ筋層，胞胚で発間，ならびに，接着能が高い内膜細胞株（RL95-２）と現が確認されており，IGF-I受容体は子宮内膜に存在し，接着能が低いHEC-1A株間で，発現量が，それぞれ前者筋層または胞胚には検出されない．子宮でのIGF-I発現において著しく上昇している遺伝子として，いずれの場は着床周辺期で約50倍に増加することがブタで確認され合もIGFBP-rP1（各比較において同定された因子で第ており，ブタでは胞胚の形態変化に関与すると考えられ２番目に差があり）を検出している．

22

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.112006

生殖腺におけるIGF低親和性結合蛋白質（IGFBP-rP1）の発現とその生理的意義について

さらに，ヒト培養子宮内膜間質細胞もIGFBP-rP1をョン，アロマターゼ活性の高進，卵成熟の刺激作用をも生成していることを確認しているが，最近，筆者らは，つ．したがって，FSHと協調的に働き，卵胞発育を促進

この内因性IGFBP-rP1産生をIGFBP-rP1のsiRNA処置している．アクチビン，GDF，BMPを含めたTGFβスによりノックダウンすると，脱落膜化が進行しないこと

ーパーファミリーは，原始卵胞から卵胞形成を制御するを見い出している［12］．このように，IGFBP-rP1は受［14］．そこで，FSHとアクチビンの併用処置を行い，そ容能ばかりでなく脱落膜化を含めた妊娠初期の子宮機能のステロイド分泌に対するIGFBP-rP1の作用をみた．の維持に関与している可能性が示唆される．

培養メディウム中のエストラジオール濃度はFSH単独処置と比べてアクチビン存在下では顕著に増加し，アロ

卵巣におけるIGFBP-rP1の発現と卵巣機能との関わりマターゼ遺伝子（CYP19）mRNA発現も上昇したが，これらの上昇はIGFBP-rP1処置で阻害された（図３）．
図には示していないが，培養メディウム中のプロゲステ

IGFBP-rP1の発現は，ブタ卵巣の洞卵胞の莢膜に隣ロン濃度はFSH単独とアクチビンとの併用処置群で差接する顆粒膜細胞にみられる［13］．成熟分化した顆粒がみられなかった．IGFBP-rP1処置は，増加したプロ膜細胞で高度に合成・分泌されているエストラジオール

ゲステロン分泌およびコレステロールからステロイド前は，LH作用により莢膜細胞内でコレステロールから産駆体であるプレグネノロンを生成するコレステロール側生されるアンドロゲンが顆粒膜細胞に供給され，FSH作用を受けた顆粒膜細胞で活性化したアロマターゼ（CYP19；p450arom）により生成される．筆者らは，ブタで報告がある顆粒膜細胞で発現するIGFBP-rP1について，その卵巣での生理的意義を探るため，ラット顆粒
膜細胞における産生の有無とリコンビナントIGFBPrP1のステロイド産生に対する生理活性を検討した．24
日齢のWistar-今道系ラットに妊馬血清性ゴナドトロピン（eCG）を皮下投与し，48時間後に卵巣組織を摘出し，注射針で卵胞を穿刺して細胞を溢出させる方法で回収した顆粒膜細胞を用いて検討を行った．まず，培養顆粒膜細胞のライセートと培養上清中のIGFBP-rP1の検出を抗IGFBP-rP1抗体を用いた免疫沈降を行った後にウエスタンブロッティングを行い確認したところ，31kDaに単一のバンドを得た．また，卵胞液中の存在の有無についても顆粒膜細胞の回収過程で遊離する卵胞液を回収し，セントリコンで濃縮し，ウエスタンブロッティングで確認したところ，同様なバンドが得られた．このように，ラット顆粒膜細胞は，IGFBP-rP1を分泌し，卵胞液中にも本蛋白質が存在していることを確認した．
次に，ステロイド産生に対するIGFBP-rP1の影響を調べるた
め，FSH存在下で刺激されるエストラジオール（17βエストラジオール）とプロゲステロン産生に対するリコンビナントIGFBP-rP1の作用を検討したところ，FSHに よ る 両 ホ ル モ ン の 産 生 増 加 は，30ng/mL以 上 のIGFBP-rP1処置で有意に抑制された．
循環血中のアクチビンは，下垂体FSH分泌に対して促進的に，逆にインヒビンは抑制的に作用するが，卵巣レベルにおいては，顆粒膜細胞由来のアクチビンは，顆粒膜細胞の増殖，FSHとLH受容体のアップレギュレーシ

図３

FSHとアクチビン刺激下でのエストロゲン産生とアロマターゼ（CYP19）発現に対するIGFBP-rP1の影響
FSH（25ng/mL）とアクチビン（Activin A: 25ng/mL）存在下で各濃度のIGFBP-rP1（ng/mL）を処置し，24時間インキュベートした．培養顆粒膜細胞の培養上清中17β-エストラジオールを測定し（上段），細胞はpoly（A）＋RNAを抽出し，CYP19のRT-PCR解析を行った（中段：代表的な１例．下段：デンシトメトリー解析
結果をG3PDHに対する割合として無処置群を１として算出）．

研究フロンティア

23

田村 和広他

鎖切断酵素（p450scc：CYP11A1）発現を抑制したが，胞ステロイド産生を調節しているものと推察できる．

その影響はエストラジオールレベルとCYP19発現の変

IGFBP-rP1はウシの黄体組織に高度に発現している遺化と比べると少なかった．このように，IGFBP-rP1は，伝子の１つであり，かつ退行期に増加することも発表さ

FSH刺激下の性ステロイド産生，とくにエストラジオーれており［17］，黄体細胞の直接的な増殖抑制とIGF-Ｉ

ル産生に対して抑制作用を有することが確認された．

作 用に 対 す る抑 制 効 果が 推 察さ れ て い る．よ って，

興味深いことに，IGFBP-rP1は，アクチビンに結合するフォリスタチンと類似の構造を有しており，アクチ

IGFBP-rP1は顆粒膜細胞の増殖，分化にも直接影響しているかもしれない．

ビンと結合することが示唆されている［15］．
したがって，もしこの作用が発揮され，アクチビン受容体との結合が阻害されるのであれば，図４に示すようにFSHとアクチヒトの生殖機能とIGFBP-rP1，他のIGFBP-rP1の生理活性ビンの共存下でのエストラジオール抑制作用は，アクチビンとIGFBP-rP1の結合によるアクチビン作用の減弱

IGFBP-rP1は，ヒトでも黄体化した顆粒膜細胞で発効果によるものと考えられる．また，顆粒膜細胞は，ヘ現している［18］．子宮では，腺上皮細胞に発現が高い．

パラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を高度に産生し免疫組織化学的な検討においては，生殖器以外では，とていることが知られているが，IGFBP-rP1はHSPGと結くに，癌組織の血管内皮細胞に強い染色がみられ，正常合することも報告されているので［16］，産生・分泌さな血管内皮細胞でも染色される［19］．正常な肺小葉のれたIGFBP-rP1のほとんどはHSPGと結合して貯蔵され上皮細胞，乳腺，神経支持細胞や多くの間質組織にも局た状態と考えられる．

在が観察されている．よって，IGFBP-rP1が腫瘍形成

次に，顆粒膜細胞での内因性IGFBP-rP1発現の役割時の血管新生に何らかの関与があることが疑われていを検討する目的で，siRNA処置により抑制した際のステる．侵襲性の高い乳癌において，IGFBP-rP1の発現がロイド産生とステロイド代謝酵素のmRNA発現を解析低いことを示した報告では，乳癌での腫瘍抑制活性を支した．なお，siRNA実験では約50％の単層培養顆粒膜細持するデータを与えている［５］．IGFBP-rP1は多くの胞の培養系で，無血清Ｄ-MEMでIGFBP-rP1 siRNAを腫瘍で増殖抑制作用を示すが，細胞老化の誘導と関連し24時間処置し，その後に，FSHを処置して24時間後にメたメカニズムで作用が発揮されているように思われる．

ディウムと細胞を回収した．その結果，IGFBP-rP1のさらに，IGFBP-rP1は，リンパ組織の血管にも存在発現抑制は，FSH誘導性CYP19発現レベルを上昇させしていて，なかでも絶えずリンパ球の血管外遊出が起きることが分かった（投稿中）．以上の結果とIGFBP-rP1ている高内皮静脈（HEV）に発現していること，さらがブタ卵巣の排卵前成熟卵胞の顆粒膜細胞に高発現してにSLC，IP-10，RANTESのような特異的ケモカインといることを合わせて考えると，IGFBP-rP1は卵胞のス結合することが示され，リンパ球のトラッキングの調節テロイド産生を抑制的に調節することにより排卵前の卵に関与している証拠が得られている［20］．HEVの基底膜に結合しているIGFBP-rP1は，これらケモカインの足場蛋白質として機能すると考えられる．

おわりに上述したように，IGFBP-rP1は生殖臓器のみならず，多くの生理機能の調節分子として機能している．ごく最近，IGFBP-rP1欠損マウスが作成され，その動物では，卵巣（とくに黄体），筋肉組織，肝臓に異常を来たすことが，発表された［21］．これらの結果は，IGFBP-rP1が，顆粒膜細胞の分化，成熟，そして黄体機能に深く関係していることを示唆している．今後，このマウスの解析により，これらの臓器における生理的役割が明らかにされていくであろう．
図４24

顆粒膜細胞におけるIGFBP-rP1発現と他分子との相互作用

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.112006

生殖腺におけるIGF低親和性結合蛋白質（IGFBP-rP1）の発現とその生理的意義について

文

献１．Nayak NR, Giudice LC（2003）Comparative biology of theIGF system in endometrium, decidua, and placenta, and clinical implications for foetal growth and implantation disorders.
Placenta 24, 281-296．
２．Wang H-S, Chard T（1999）IGFs and IGF-binding proteinsin the regulation of human ovarian and endometrial function.
J Endocrinol 161, 1-13．
３．Fortune JE, Rivera GM, Yang MY（2004）Follicular development：the role of the follicular microenvironment in selection of the dominant follicle. Anim Reprod Sci 82-83, 109-126．
４．Hwa V, Oh Y, Rosenfeld RG（1999）The insulin-like growth
factor ?binding protein（IGFBP）superfamily. Endocrine
Rev 20, 761-787．
５．Burger AM, Leyland-Jones B, Banerjee K, Spyropoulos DD,Seth AK（2005）Essential roles of IGFBP-3 and IGFBP-rP1
in breast cancer. Eur J Cancer 41, 1515-1527．
６．Swisshelm K, Ryan K, Tsuchiya K, Sager R（1995）Enhanced expression of an insulin growth factor-like bindingprotein（mac25）in senescent human mammary epithelialcells and induced expression with retinoic acid. Proc Natl
Acad Sci USA 92, 4472-4476．
７．Paria BC, Reese J, Das SK, Dey SK（2002）Deciphering thecross-talk of implantation : advances and challenges. Science296, 2185-2188．
８．Tamura K, Hara T, Yoshie M, Irie S, Sobel A, Kogo H（2003）
Enhanced expression of uterine stathmin during the processof implantation and decidualization in rats. Endocrinology
144, 1464-1473．
９．Tamura K, Hara T, Kutsukake M, Iwatsuki K, Yoshie M,Kogo H（2004）Expression and the biological activities ofinsulin-like growth factor-binding protein related protein 1 inrat uterus during the periimplantation period. Endocrinology
145, 5243-5251．
10．Kim JG, Kim MH, Kim IS, Moon SY, Kang SB, Lee HP, Lee
JY（2000）Decreased expression of mac25 mRNA in uterine
leiomyomata compared with adjacent myometrium. Am J
Reprod Immunol 43, 53 - 57．
11．Dominguez F, Avila S, Cervero A, Martin J, Pellicer A, Castrillo JL, Simon C（2003）A combined approach for genediscovery identifies insulin-like growth factor-binding protein-related protein １ as a new gene implicated in humanendometrial receptivity. J Clin Endocrinol Metab 88,1849-1857．
12．Tamura K, Kutsukake M, Yoshie M, Hara T, Nishi H, IsakaK, Kogo H（2006）Expression of human uterus and endometrial stromal cell. 39th Annual Meeting Society of the Studyof Reproduction［Abstract # 414］
13．Wandji S-A, Gadsby JE, Barber JA, Hammond JM（2000）
Messeger ribonucleic acids for MAC25 and connective tissue
growth factor（CTGF）are inversely regulated during folliculogenesis and early luteogenesis. Endocrinology 141,2648-2657．
14．Pangas SA, Matzuk MM（2004）Genetic models for transforming growth factor beta superfamily signaling in ovarianfollicle development. Mol Cell Endocrinol 225, 83 - 91．
15．Kato MV（2000）A secreted tumor-suppressor, mac25, withactivin-binding activity. Mol Med 6, 126 -135．
16．Sato J, Hasegawa S, Akaogi K, Yasumitsu H, Yamada S,Sugahara K, Miyazaki K（1999）Identification of cell-bindingsite of angiomodulin（AGM/TAF/Mac25）that interacts
with heparan sulfates on cell surface. J Cell Biochem 75,
187-195．
17．Casey OM, Fitzpatrick R, McInerney JO, Morris DG, PowellR, Sreenan JM（2004）Analysis of gene expression in thebovine corpus luteum through generation and characterisation of 960 ESTs. Biochim Biophys Acta 1679, 10-17．
18．Phan B, Rakenius A, Pietrowski D, Bettendorf H, Keck C,Herr D（2006）hCG-dependent regulation of angiogenic factors in human granulose lutein cells. Mol Reprod Dev 73,878-884．
19．Lopez-Bermejo A, Khosravi J, Corless CL, Krishna RG, Diamandi A, Bodani U, Kofoed EM, Graham DL, Hwa V, Rosenfeld RG（2003）Generation of anti-insulin-like growth factorbinding protein-related protein 1（IGFBP-rP1/MAC25）
monoclonal antibodies and immunoassay : quantification ofIGFBP-rP1 in human serum and distribution in human fluids
and tissues. J Clin Endocrinol Metab 88, 3401-3408．
20．Nagakubo D, Murai T, Tanaka T, Usui T, Matsumoto M,
Sekiguchi K, Miyasaka M（2003）A high endothelial venule
secretory protein, mac25/angiomodulin, interacts with multiple high endothelial venule-associated molecules including
chemokines. J Immunol 171, 553-561．
21．Burger AM, Spyropoulos DD, Kahn HJ et al.（2005）Development of an insulin-like growth factor binding protein-related protein 1 knockout mouse. Proc Amer Assoc Cancer Res
46, 1080．

研究フロンティア

25