研究フロンティア（平成29年度学術奨励賞受賞論文）

多囊胞性卵巣症候群の卵巣線維化における小胞体ストレスの役割
髙橋望，原田 美由紀，廣田泰，小池泉 玄太郎，平田 哲也，甲賀 かをり，平池洋，國冨 千智，吉野修
修，大須賀 穣，藤井 知行

東京大学産婦人科学教室

で，卵巣における小胞体ストレスの役割はほとんど示さ

はじめにれていない．われわれの研究室ではマウスの卵巣におい多囊胞性卵巣症候群（polycysticovarysyndrome ;PCOS）は排卵障害，高アンドロゲン血症，多囊胞性卵巣を認める症候群である．生殖可能年齢の〜 ％に認て，次卵胞以降の顆粒膜細胞に活性化された小胞体ス

トレスセンサータンパク質（inositol requiring enzyme（IRE ），double-stranded RNA-activated protein kinase］．

-like ER kinase（PERK）），小胞体ストレス応答因子でPCOS は複合的な病態を示し，ゴナドトロピン分泌異常，あるspliced-form of X-box-binding protein （XBP（S）），

高アンドロゲン，インスリン抵抗性，卵巣機能障害，卵Heat shock protein

胞発育停止などのさまざまな因子の相互作用によって起ことを明らかにした［きている［

える影響は不明である．近年，小胞体ストレスが組織のめ，排卵障害をきたす不妊の主な原因となっている［］．PCOS の卵巣では，コラーゲンと線維（HSPA ）mRNA の発現を認める］．しかし，その細胞機能に与］．

線維化を誘導することが示されてきた［ ，］．本研究でしかし，PCOS における線維化の機序は明らかとなっては，卵巣の線維化に着目し，小胞体ストレスが PCOSいない．近年の研究で，顆粒膜細胞における Transform-の卵巣で活性化し，TGF-β を介して卵巣線維化を誘導

ing growth factor（TGF）-β とその下流で作用する con-しているかどうかを検討した．さらにヒトで安全性が確

nective tissue growth factor（CTGF）が卵巣におけるかめられている小胞体ストレス阻害剤の PCOS 卵巣に細胞外マトリックスのリモデリングに関与し，また，おける卵巣線維化改善効果を検討した．

組織の沈着により，卵巣皮膜の肥厚化を認める［PCOS 患者の血清中ならびに卵巣における TGF-β の発現が増加している［ ，］ことから，TGF-β が PCOS のPCOS 患者の顆粒膜細胞で小胞体ストレスは活性化病態に関与している可能性が示唆されている．

し，TGF-β の発現が増加している

炎症や酸化ストレスなどの卵巣内の局所因子の PCOS
つとPCOS の卵巣で小胞体ストレスの活性化および線維化して小胞体ストレス応答が種々の臓器における細胞の恒を認めているかを調べた．小胞体ストレスが活性化する常性維持ならびに病態に深くかかわることが知られていと小胞体ストレスセンサータンパク質である IRE とる．小胞体はタンパク質合成・成熟を行う細胞内器官でPERK はリン酸化を認め，小胞体ストレス応答因子を誘あるが，さまざまな因子や環境要因などのストレス負荷導する．図により，折りたたみ不全なタンパク質が蓄積される．小において，phospho-IRE ，phospho-PERK の発現は有意胞体の処理能力を超えて異常タンパク質が蓄積した状態に増加し，TGF-β の発現も増加を認めた．また，Masson’sを小胞体ストレス，それに対する細胞の適応反応を小胞trichrome 染色において，PCOS 患者では卵巣間質にお体ストレス応答と呼ぶ．糖尿病において小胞体ストレスける線維組織の増生を認めた（図の病態への関与が報告されているが，局所因子のA に示すように，PCOS 卵巣の顆粒膜細胞A）．

が活性化し，耐糖能障害の原因となっていることが示さ

次に，体外受精を施行した PCOS 患者（n＝ ）と Con-れ，以降，神経変性疾患，癌，胎盤機能などさまざまなtrol 患者（n＝ ）のヒト黄体化顆粒膜細胞（GLCs）に病態に関与していることが明らかとなった［おける小胞体ストレス応答因子および線維化誘導因子の連絡先：髙橋 望，東京大学産婦人科学教室
東京都文京区本郷 ― ―〒 ――
TEL ：0 ――FAX：0 ―
E-mail：nozotakahashi@hotmail.co.jp

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日本生殖内分泌学会雑誌（2018）23 : 14-19］．一方mRNA 発現を調べた．小胞体ストレス応答因子であるXBP（S），HSPA ，activating transcription factor （ATF），ATF ，C/EBP homologous protein（CHOP）の mRNA
発現は，Control 患者に比べて PCOS 患者の GLCs で有多嚢胞性卵巣症候群の卵巣線維化における小胞体ストレスの役割

図

Control 患者と PCOS 患者における小胞体ストレスの活性化と卵巣線維化および線維化誘導因子の発現
Ａ．Control 患者（n＝ ）と PCOS 患者（n＝ ）の卵巣における phospho-IRE1，phospho-PERK，TGF-β のタンパク発現を免疫染色で，卵巣の線維化を Massonʼs trichrome 染色で評価した．グラフは定量的評価を示す．＊P＜ ． GC，顆粒膜細胞層．
Ｂ．Control 患者（n＝ ）と PCOS 患者（n＝ ）のヒト黄体化顆粒膜細胞（GLCs）における小胞体ストレス応答因子と線維化誘導因子の mRNA発現を定量的 PCR を用いて評価した．Internal control として GAPDH を用いた．＊P＜ ．

意に発現が上昇していた．また，線維化誘導因子である

おける TGF-β の分泌が亢進し，XBP （S）の経路が発TGF-β ，CTGF の mRNA 発 現 も，PCOS 患 者 の GLCs現調節に関与していることが示された．

で有意に増加していた（図B）．PCOS 患者の顆粒膜細胞において小胞体ストレスが活性化し，線維化誘導因小胞体ストレス阻害剤は，PCOS モデルマウスの卵子の発現が増加していることが示された．

巣における線維化誘導因子の発現を低下し，卵巣線維化を改善する

ヒト顆粒膜培養細胞において小胞体ストレスは
TGF-β と CTGF の発現を誘導する小胞体ストレス阻害剤の生体内における卵巣線維化への効果を調べるため，PCOS モデルマウスに種類の小顆粒膜細胞における小胞体ストレスの TGF-β 発現へ胞体ストレス阻害剤を投与した．PCOS モデルマウスはの影響を調べるため，ヒト GLCs に小胞体ストレス刺激

先 行 研 究 で 確 立 さ れ て い る dehydroepiandorosterone剤である tunicamycin を投与した．tunicamycin 投与に．
（DHEA）投与モデルを用いた［ ― ］

より TGF-β と CTGF の mRNA 発 現 の 増 加 を 認 め，小/C 雌マウスを使用し，DHEA（胞体ストレス応答因子である XBP （S）も同様に増加/day）を 日間皮下投与した．小胞体ストレス抑制剤を認めた（図A）．小胞体ストレス阻害剤の TUDCAとして，TUDCA（ mg/投与により，tunicamycin によって誘導される TGF-βは BGP- （と CTGF の発現の抑制を認めた．ELISA の結果より，tu-口投与した．

nicamycin で活性型 TGF-β タンパクの分泌が上昇し，TUDCA によって抑制されることが示された（図図mg/mg/

週齢の Balbg body weightg body weight/day）また

g body weight/day）を 日間経

A に 示 す と お り，Masson’s

trichrome 染 色 でB）．

PCOS モデルマウスの卵巣間質では線維組織の増加を認

小胞体ストレスによる TGF-β の発現上昇の分子学的機めた．また，PCOS マウスの卵巣では間質部分における序を調べるため，XBP （S）を siRNA でノックダウン

collagen type I，基底膜における collagen type IV の発した．XBP （S）の mRNA 発現は siRNA により ％の現増加を認めた．TUDCA または BGP- の経口投与に減少を認め，TGF-β mRNA の発現は ％の減少を認め

より，線維組織・collagen type I と type IV 発現の低下た（図を認めた．さらに，TGF-β 発現は，PCOS マウスの顆

C）．小胞体ストレス刺激により顆粒膜細胞に研究フロンティア

15髙橋

図望他

小胞体ストレスはヒト GLCs における線維化誘導因子の発現を促進する
Ａ．ヒト GLCs に ． g/ml tunicamycin を 〜 時間投与した．
Ｂ．ヒト GLCs に TUDCA mg/ml を 時間投与後， ． g/ml tunicamycin を 時間投与した．
Ｃ．ヒト GLCs に XBP siRNA nM を 時間投与後， ． g/ml tunicamycin を 時間投与した．線維化誘導因子（TGF-β ，CTGF）と XBP（S）の mRNA 発現を定量的 PCR で評価した．Internal control として GAPDH を用いた．活性化 TGF-β のタンパク分泌を ELISA で評価した．
＊
異符号間で，P＜ ． を示す．Tm, tunicamycin ; TUDCA, tauroursodeoxycholic acid.

粒膜細胞で発現上昇を認め，TUDCA または BGP- 投炎症は互いに密接に影響していると考えられる．近年の与により，減少を認めた．また，PCOS の顆粒膜細胞で研究で，全身の軽度炎症状態および顆粒膜細胞における増加していた phospho-IRE のタンパク発現，XBP （S）

局所の炎症状態が，PCOS の病態に関与していることがの mRNA 発現は，TUDCA・BGP- 投与により抑 制 を示されてきた［ ， ， ］．さらに，PCOS で認める過剰認めた．定量的 PCR の結果により，XBP （S）
・TGF-βアンドロゲン状態も局所炎症との関連を認め，炎症刺激・CTGF の卵巣全体における mRNA 発現は，PCOS マは莢膜細胞からのアンドロゲン産生を刺激し，また高アウスで上昇し，TUDCA・BGP- 投与によって減少を認

ンドロゲン状態は顆粒膜細胞で炎症性サイトカインの産めた（図生を誘導する［ ， ］．PCOS の卵胞液中において酸化B）．

ストレスマーカーの上昇を認め［ ］，酸化ストレスがおわりにPCOS の病態に関与していることが示唆される．これらの知見より，小胞体ストレス・酸化ストレス・炎症が，小胞体ストレスは，さまざまな生理的因子や酸化スト

PCOS の卵巣における卵胞内の微小環境に悪影響を与えレスおよび炎症などの病的因子により惹起され，変性タていると考えられる．また，PCOS の特徴であるインス

ンパク質の蓄積または小胞体処理能力の低下をきたすリン抵抗性が，直接的または間接的に小胞体ストレスの［ ， ］．一方で小胞体ストレスは酸化ストレス・炎症活性化に寄与する可能性が考えられる．脂肪細胞においを誘導する因子でもあり，酸化ストレスもまた炎症を誘て，糖毒性は小胞体ストレスを活性化していることから，導する．したがって，小胞体ストレス・酸化ストレス・インスリン抵抗性が顆粒膜細胞における小胞体ストレス

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.23 2018

多嚢胞性卵巣症候群の卵巣線維化における小胞体ストレスの役割

図

小胞体ストレス阻害剤の PCOS マウスにおける卵巣線維化への影響
Control 群（n＝ ）は sesami oil を皮下投与し，生理食塩水を 日間経口投与した．PCOS 群（n＝）では，DHEA（mg/g body weight/day）を皮下投与し，生理食塩水を 日間経口投与した．PCOS＋TUDCA 群（n＝ ）では，DHEA を皮下投与し，TUDCA（ mg/ g bodyweight/day）を 日間経口投与した．PCOS＋BGP- 群（n＝ ）では，DHEA を皮下投与し，BGP- （ mg/ g body weight/day）を 日間経口投与した．
Ａ．卵巣線維化を Massonʼs trichrome 染色で，collagen type I,collagen type IV,phospho-IRE ，TGF-β のタンパク発現を免疫染色で，XBP（S）mRNA 発現を in situ hybridization で評価した．グラフは定量的評価を示す．
Ｂ．卵巣における XBP （S），TGF-β ，CTGF の mRNA 発現を定量的 PCR で評価した．Internal control として GAPDH を用いた．
異符号間で，P＜ ． を示す．TUDCA, tauroursodeoxycholic acid.

研究フロンティア

17髙橋

望他

を直接惹起している可能性，また，インスリン抵抗性がムと考えられる［ ］．小胞体ストレスが卵巣線維化を脂肪細胞を介して全身の炎症状態を引き起こす，あるい誘導する詳細なメカニズムの解明にはさらなる研究が必

は局所のアンドロゲン産生を亢進することにより小胞体要と考えられる．

ストレスが間接的に惹起される可能性などが考えられ

本研究の結果より，小胞体ストレスは PCOS の病態

る．以上のように，PCOS の病態でみられる酸化ストレに関与し，小胞体ストレス阻害剤は卵巣線維化を改善し，ス・炎症・高アンドロゲン状態・インスリン抵抗性など

PCOS の治療薬になりうる可能性が示唆された．のさまざまな卵胞局所環境異常によって，卵巣で小胞体ストレスが惹起されているものと考えられる．
PCOS 患者の顆粒膜細胞において，線維化誘導因子である TGF-β と CTGF の発現が増加していた．しかし，
PCOS 患者の卵巣における TGF-β 発現の調節メカニズ
ムは明らかとされていない．本研究結果では，小胞体ス
ト レ ス 刺 激 剤 に よ り 顆 粒 膜 細 胞 に お け る TGF-β とCTGF の発現増加を認め，小胞体ストレス阻害剤によっ謝辞本稿は，平成 年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．なお本研究内容は Scientific Reports 誌［ ］に掲載されているため，詳細についてはそちらを参照されたい．本稿を執筆する機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長緒方 勤教授，第回学術集会会長前多敬一郎教授，ならびに本誌編集委員の方々に心から感謝申し上げます．て抑制を認めた．また，siRNA の実験結果により，小胞つである XBP （S）が小胞体体ストレス応答因子の引用文献

ストレス誘導下の TGF-β の発現調節に関与していることが示唆された．近年，肝細胞や線維芽細胞において，小胞体ストレスで TGF-β の発現を誘導することが報告されている［ ， ］．PCOS の卵胞局所環境異常によって顆粒膜細胞で活性化した小胞体ストレスが，TGF-βの発現を増加している可能性が示唆された．
本研究においてヒトへの臨床応用を想定し，PCOS モ
デルマウスに小胞体ストレス抑制剤（TUDCA，BGP- ）を経口投与し，卵巣線維化の抑 制 効 果 を 評 価 し た．
TUDCA は熊の胆汁酸として漢方治療として何千年も使用されている薬剤であり，またイタリアでは Tauroliteとして肝障害，胆石症の治療に用いられている．近年，TUDCA はケミカルシャペロンとして，変性タンパク質の蓄積を是正し，小胞体ストレスを抑制する作用が明らかとなり，型糖尿病などの小胞体ストレス関連疾患の治療薬として注目されている［ ］．また，BGP- は，糖尿病の治療薬として第相臨床試験が済んでおり，HSP の発現を誘導し，近年小胞体ストレス阻害剤として注目されている［ ］．本研究においてはヒトへの臨床応用を想定し，TUDCA と BGP- を経口投与し，卵巣線維化の抑制効果を評価した．小胞体ストレス阻害剤である TUDCA と BGP- の投与によって，線維組織・コラーゲン沈着の抑制を認め，顆粒膜細胞における TGF-β の発現低下を認めた．In vitro の結果と合わせると，小胞体ストレスにより，顆粒膜細胞における TGF-β の発現が誘導され，卵巣の線維化を引き起こしている可能性が示唆された．C 型肝炎や遺伝性肝疾患においては，小胞体ストレスにより肝細胞からの TGF-β が誘導され，肝線維化をきたしており，本研究と同様のメカニズ

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