学術奨励賞受賞論文

生殖内分泌学への新たな重要因子：BMP-15
大塚文男

岡山大学大学院医歯学総合研究科腎・免疫・内分泌代謝内科学

はじめに近年，卵巣自体で産生される局所因子がゴナドトロピンを中心とする元来の内分泌調節系と協調的に卵胞成長・成熟を修飾していることが明らかとなり，卵巣における生殖内分泌の動態はいっそう複雑なものであることが分かってきた．卵巣の発育過程において，顆粒膜細胞の増殖・分化・成長のいずれもが重要な要素といえるが，われわれはこれらの機能を合わせもつ細胞増殖因子，骨形成蛋白Bone Morphogenetic Protein（BMP）に着目して研究を進めてきた．BMPは，TGF-β・インヒビン・アクチビン・Vg１・ミューラー管抑制物質（MIS/AMH）などを含むTGF-βスーパーファミリーメンバーに属する分子であり，初期胚の器官形成や中胚葉誘導にも重要な役割を果たしている．

図２

卵巣におけるBMP-15 mRNAおよび蛋白の発現パターン：ラッ
ト卵巣における組織学的検討から，BMP-15のmRNAおよび蛋白が卵母細胞特異的に発現しており，一次卵胞から排卵前の成熟卵胞まで発現が維持されている（→：卵母細胞）．

卵巣におけるBMPの発現パターン
BMPリガンドの卵巣での発現には種差がみられるが，現在までにBMP-2，-3，-3b，-4，-6，-7，-15とGDF-9の発現が明らかとなっている［１，２］．分布のパターン
はリガンド間で異なっており，BMP-2は顆粒膜細胞に，
BMP-4，-7は 莢 膜・ 間 質 細 胞 に，BMP-6，-15，GDF-9は卵母細胞に特徴的に発現している（図１）．このうちBMP-15の発現パターンは，より卵母細胞に特異的であり，マウス・ラット・ヒトの卵巣において卵母細胞にのみ強く発現している［３］．マウスの検討では，卵母細胞のBMP-15 mRNAは一次卵胞から出現し，その発現は卵胞成長に伴い増強する．
ラットでの検討では，
BMP-15のmRNAとともに蛋白も同時に卵母細胞に検出

図１

卵巣におけるBMPシステム：卵胞を構成する卵母細胞・顆粒膜細胞・莢膜細胞にはBMPリガンドとBMPのI型・II型受容体およびその結合蛋白フォリスタチンが存在し，オートクライン・パラクライン機序により卵胞成長を調節していると考えられる．

連絡先：大塚文男，岡山大学大学院医歯学総合研究科腎・免疫・内分泌代謝内科学，〒700-8558 岡山市鹿田町2-5-1
TEL: 086-235-7235
FAX: 086-222-5214
E-mail: fumiotsu@md.okayama-u.ac.jp

され，一次卵胞から排卵前の成熟卵胞まで発現が維持される（図２）．
またBMP受容体として，BMPのI型受容体（BMPRIAとBMPRIB）とII型受容体（BMPRII）の発現が卵巣において証明されている［４］．ラット卵巣ではI型受容体のうちBMPRIA（ALK-3）が卵母細胞と顆粒膜細胞に分 布 し， と く に 卵 母 細 胞 に 強 く 発 現 す る．BMPRIB（ALK-6）も卵母細胞とともに一次卵胞以降の顆粒膜細胞に分布を認める（図１）．一方，BMPRIIの発現パタ

日本生殖内分泌学会雑誌（2004）9：39-43

39大塚 文男

図３

BMP-15の顆粒膜細胞における作用：ラット顆粒膜初代培養細胞において，BMP-15はFSH非依存的にDNA合成（thymidine取り込み）と細胞増殖を促進する．顆粒膜細胞によるステロイド産生において，BMP-15はFSH刺激によるプロゲステロン合成を抑制するがエストラジオール合成には影響しない．またBMP-15は，forskolin（FSK）により誘導されるステロイド合成には影響しない．

図４

BMP-15によるステロイド合成酵素およびFSH受容体発現の調節：ラット顆粒膜初代培養細胞において，BMP-15はFSHによって増加したStAR・P450sccのmRNAレベルを抑制するがP450aromには影響しない．またforskolin（FSK）により誘導されるStAR・P450sccの発現はBMP-15によって抑制されない．BMP-15は顆粒膜細胞におけるFSH受容体（FSH-R）のmRNAレベルを直接抑制することにより，FSHの作用を広く抑制す
る．

ーンはほとんど顆粒膜細胞に限局しており，二次卵胞の

１）
［１，２］
．

最初の段階から強く発現する．またヒツジの卵巣でもBMPRIA（ALK-3），BMPRIB（ALK-6），BMPRII のすべてのBMPレセプターが一次卵胞から成熟卵胞に至顆粒膜細胞におけるBMP-15の作用と卵胞成長における役割るまでの顆粒膜細胞に発現しており，一部は卵母細胞・莢膜細胞および黄体にも発現する．これらの卵巣に存在卵母細胞に発現する新しいBMP分子，BMP-15についするBMPリガンドとレセプターが，オートクライン・ては1998年のクローニング以降その作用は卵巣のみならパラクライン機序によって卵胞を構成する細胞間でのコずまったく不明であった．われわれはHEK293細胞を用ミュニケーションを形成していると考えられる（図いてBMP-15のstable transformantを作成し，リコンビ

40

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 92004

生殖内分泌学への新たな重要因子：BMP-15

図５

BMP-15受容体とシグナル伝達機構：BMP-15は顆粒膜細胞においてBMPRIB（ALK-6）とBMPRIIに結合し，Smad１/５/８のリン酸化を介してsteroidogenesisとmitosisへの作用を発揮する．とくにBMP-15の細胞増殖作用にはMAPK（ERK）の活性化も寄与していると考えられる．

図６

BMP-15による顆粒膜細胞の増殖メカニズム：BMP-15は顆粒膜細胞からのkit ligand（KL）-1，2の発現を刺激する一方で，KLは卵母細胞からのBMP-15の発現レベルを減少させる．さらに卵母細胞のc-kit作用を中和抗体によって抑制するとBMP-15の細胞増殖作用が抑制されることから，卵母細胞と顆粒膜細胞間でのKL/c-kitシグナルの活性化が顆粒膜細胞増殖のキーファクターであると考えられる．しかしそれには卵母細胞から顆粒膜細胞へのなんらかのmitogen ？ の存在が必要である．

ナ ン トBMP-15蛋 白 を 精 製 し て そ の 機 能 解 析 を 行 った［ ３］．ラット顆粒膜細胞の初代培養系を用いた

steroidogeneisisとmitosisに お い て，BMP-15は 異 な るbioassayの結果（図３），①BMP-15はFSH非依存的にシグナル伝達系を活性化する可能性がある．

顆粒膜細胞のDNA合成・細胞増殖を刺激すること，まBMP-15の顆粒膜細胞におけるmitogenとしての作用

た②BMP-15はFSHによるプロゲステロン産生を抑制すには，卵母細胞と顆粒膜細胞間の細胞間シグナルが重要るがエストラジオール産生には影響しないこと，さらにと考えられる．Kit ligand（KL）は初期卵胞の卵母細胞③FSHによって誘導されるステロイド合成酵素，LH受発育に必須の因子であるが，BMP-15はこの顆粒膜細胞容体，インヒビン・アクチビンなどの発現もBMP-15でのKL発現を増強し一方でKLは卵母細胞由来のBMP-15強く抑制されることを明らかにした［３，５］．しかしの発現を抑制する（図６）．さらにKLの受容体である卵forskolinで誘導された因子についてはBMP-15により抑母細胞側のc-kitシグナルを阻害すると，BMP-15による制 さ れ な い 点 か ら（ 図 ４）
，BMP-15の 作 用 点 が顆粒膜細胞の増殖が抑制される．このようにBMP-15とadenylate cyclase（AC）よりも上流に位置しているこKL/c-kitには細胞間レベルで負のフィードバック機構とが示唆された．ついで行われたFSH受容体の発現・転が形成されており，この機能連携

写レベルの検討により，④BMP-15が直接的にFSH受容cell communication

体 の 発 現 を 抑 制 す る こ と が 判 明 し， こ れ に よ っ て調節されていることが示唆された［７］．

oocyte-granulosaによって顆粒膜細胞の増殖刺激がBMP-15がすべてのFSH作用を抑制することが示唆されこれらのBMP作用は，細胞外の結合蛋白によってもた（図４）［５］．BMP-15は顆粒膜細胞上のBMPR-IB間接的に制御されている（図１）．顆粒膜細胞で産生さ（ALK-6） と BMPR-II 受 容 体 に 結 合 す る こ と，れるフォリスタチンはアクチビンに強く結合してアクチSmad1/5/8のリン酸化シグナルが惹起されることも明

ビン作用を抑制する結合蛋白であるが，BMPについてらかとなった［６］．しかしBMP-15による顆粒膜細胞もBMP-2,-4,-7,-4/７に対する活性阻害作用が示されての増殖作用はMAPK（ERK）の阻害によって抑制されいる．BMP-15もフォリスタチンと比較的高い親和性でることから，BMP-15の顆粒膜細胞での生理活性には結合し，BMP-15の細胞増殖活性やステロイド合成調節

Smadに加えてMAPKの活性化も関与しており，新しい能が中和されることが明らかとなった［８］．今後，BMPシグナルのクロストークとして興味深いと考えら

Noggin・Chordinなど他のBMP結合蛋白の存在と作用れた（図５）．このERKの抑制はBMP-15によるFSH作についても検討を加える必要がある．さらにBMP-15は用の抑制には影響しないことから，顆粒膜細胞における卵母細胞のみならず下垂体前葉ゴナドトロープにおいて学術奨励賞受賞論文

41大塚 文男も発現しており，FSHのβ鎖の転写を増強してFSHの産増殖が停止する結果として不妊となるものと考えられ生を促進する［９］．この作用はFSHに特異的であり，る．一方ヘテロ体の表現型には，BMP-15のFSH受容体LH産生やGnRH受容体の発現には影響しない．卵巣でへの作用が寄与している可能性がある．ヘテロ体の卵巣のFSH受容体の発現調節に加えて，下垂体ゴナドトローには特徴的にエストロゲン産生性の小型卵胞が多く存在

プではFSH分泌を調節するBMP-15は，下垂体─卵巣内し，その顆粒膜細胞でのLH反応性が亢進していること，分泌系を全身的に制御する非常に興味深い分子であると形成された黄体も小型であることなどから，なんらかの考えられた．

異 常 に よ っ て 卵 胞 発 育 の 未 成 熟 排 卵（precociousovulation） が 生 じ て い る． お そ ら く ヘ テ ロ 体 で は卵母細胞由来BMP-6との相違点

BMP-15活性の低下によって顆粒膜細胞のFSH感受性の抑 制 が 不 完 全 と な り， 発 育 早 期 の 卵 胞 か ら 十 分 な

卵母細胞から分泌される他のBMP，BMP-6の作用にselectionやmaturationの過程を経ずに排卵が生じ，多産ついてBMP-15と比較検討した．ラット顆粒膜初代培養という表現型を引き起こすものと考えられる．また細胞において，BMP-6はFSHによるプロゲステロン産

Inverdale 変 異 を も つ BMP-15と 正 常 な GDF-9を生を抑制するがエストラジオール産生には影響しな

HEK293T細胞に共発現した場合に，GDF-9成熟蛋白のい［10］．顆粒膜細胞のStARやP450scc，インヒビン・正常なプロセッシングが障害されることも明らかとな

アクチビン，LH受容体などの種々のFSH依存因子の発り［13］，Inverdaleホモ体の不妊の原因として活性型

現 に つ い て もBMP-6は 抑 制 的 に 作 用 す る．BMP-6はGDF-9の分泌低下も寄与しているようである．最近みadenylate cyclase（AC）を直接活性化するforskolinにつかったよ っ て 誘 導 し た 因 子 に つ い て も 抑 制 す る が，8-Br-Belclare・Cambridge 種 の ヒ ツ ジ の 生 殖 形 質 もcAMPによってPKAを直接刺激した場合には作用しな

Inverdale・Hanna種 と 同 様 で あ る が， こ の 場 合 に もい こ と か ら， こ のBMP-6の 作 用 点 はAC活 性 化 か ら

BMP-15成熟蛋白のアミノ酸置換（S99I）の存在によりcAMP産生の段階であることが示唆された［10］．またBMP-15とGDF-9両方の成熟蛋白の分泌が抑制されるこBMP-6は，BMP-15や莢膜細胞由来のBMP-7［11］ととが示された［14］．さらに最近になり，高ゴナドトロは異なり，顆粒膜細胞の増殖には影響しないことも特徴

ピン性卵巣不全のイタリア人姉妹例において的 で あ る． こ の よ う に BMP-15は， 顆 粒 膜 細 胞 の伝子のヘテロ変異の存在が報告された［15］．この変異

steroidogenesisにおいてBMP-6と重複した役割をもつでは，BMP-15プロ蛋白部位のアミノ酸置換（Y235C）にもかかわらずその作用点が違うこと，また顆粒膜細胞が生じるためにBMP-15成熟蛋白のプロセッシングに異の増殖作用をもつ点においてBMP-6と異なっている．

常をきたし，正常なBMP-15による細胞増殖作用に干渉-15遺伝子の新しい変異（FecXB）をもつ-15遺する．この発見は，ヒトの原発性卵巣機能低下やゴナド

生殖内分泌におけるBMP-15の意義

トロピン分泌異常の原因にBMP-15の機能異常が関与する可能性を示唆する重要なものである．

自然発症的に不妊となるヒツジ（Inverdale・Hanna種）が存在するが，この原因遺伝子（FecXI・FecXH）

おわりにはＸ染色体にリンクしており，ホモ体では不妊をヘテロ体では多胎・多産という生殖表現型を呈する．この遺伝子の本体がこのように，哺乳類卵巣機能の調節に卵巣BMPシス-15遺伝子であるという発見は，生殖内テムが非常に重要な役割を担っていることが徐々に明ら

分 泌 に お け るBMP-15研 究 の ブ レ イ ク ス ル ー と な っかになりつつある．今後，BMPシステムがヒトの生殖た［12］．このInverdale種では成熟活性型BMP-15の31

生理や生殖病態にどのように関わるかを明らかにし，病番目のアミノ酸がバリンからアスパラギン酸（V31D）態診断のための検査やその治療への臨床応用を試みたに変異しており，Hanna種では成熟活性型BMP-15の23い．

番目のアミノ酸が停止コドンへと変異している．いずれの変異もBMP-15活性を損なう重要な変異と考えられる．これまでの検討結果から考察すると，InverdaleやHanna種のホモ体では，活性型BMP-15が完全欠損となるためにKL/c-kit系の活性化が中断され顆粒膜細胞の42

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 92004

謝辞
この度，本学会の学術奨励賞を受けるにあたり，本研究の総 指 揮・ 指 導 を し て い た だ い たShunichi Shimasaki教 授生殖内分泌学への新たな重要因子：BMP-15（University California，San Diego，USA）に深く感謝の意を表します．

文

献

１．Shimasaki S, Moore RK, Otsuka F, Erickson GF (2004) The
bone morphogenetic protein system in mammalian reproduction. Endocr Rev 25, 72-101.
２．Shimasaki S, Moore RK, Erickson GF, Otsuka F (2003) The
role of bone morphogenetic proteins in ovarian function. Reproduction (Suppl) 61, 323-327.
３．Otsuka F, Yao Z, Lee TH, Yamamoto S, Erickson GF, Shimasaki S (2000) Bone morphogenetic protein-15: Identificationof target cells and biological functions. J Biol Chem 275,39523-39528.
４．Shimasaki S, Zachow RJ, Li D, Kim H, Iemura S, Ueno N,Sampath K, Chang RJ, Erickson GF (1999) A functionalbone morphogenetic protein system in the ovary. Proc Natl
Acad Sci USA 96, 7282-7287.
５．Otsuka F, Yamamoto S, Erickson GF, Shimasaki S (2001)
Bone morphogenetic protein-15 inhibits follicle-stimulating
hormone (FSH) action by suppressing FSH receptor expression. J Biol Chem 276, 11387-11392.
６．Moore RK, Otsuka F, Shimasaki S (2003) Molecular basis ofbone morphogenetic protein-15 signaling in granulosa cells. J
Biol Chem 278, 304-310.
７．Otsuka F, Shimasaki S (2002) A negative feedback system
between oocyte bone morphogenetic protein 15 and granulosa cell kit ligand: its role in regulating granulosa cell mitosis.
Proc Natl Acad Sci USA 99, 8060-8065.
８．Otsuka F, Moore RK, Iemura S-I, Ueno N, Shimasaki S(2001) Follistatin inhibits the function of the oocyte-derived

factor BMP-15. Biochem Biophys Res Commun 289, 961-966.
９．Otsuka F, Shimasaki S (2002) A novel function of bone morphogenetic protein-15 in the pituitary: selective synthesis
and secretion of FSH by gonadotropes. Endocrinology 143,4938-4941.
10．Otsuka F, Moore RK, Shimasaki S (2001) Biological function
and cellular mechanism of bone morphogenetic protein-6 inthe ovary. J Biol Chem 276, 32889-32895.
11．Lee W, Otsuka F, Moore RK, Shimasaki S (2001) The effectof bone morphogenetic protein-7 on folliculogenesis and ovulation in the rat. Biol Reprod 65, 994-999.
12．Galloway SM, McNatty KP, Cambridge LM, Laitinen MPE,
Juengel J L, Jokiranta TS, McLaren RJ, Luiro K, Dodds KG,
Montgomery GW, Beattie AE, Davis GH, Ritvos O (2000)
Mutations in an oocyte-derived growth factor gene (BMP15)cause increased ovulation rate and infertility in a dosagesensitive manner. Nature Genet 25, 279-283.
13．Liao WX, Moore RK, Otsuka F, Shimasaki S (2003) Effect of
intracellular interactions on the processing and secretion ofbone morphogenetic protein-15 (BMP-15) and growth anddifferentiation factor-9. Implication of the aberrant ovarianphenotype of BMP-15 mutant sheep. J Biol Chem 278,3713-3719.
14．Liao WX, Moore RK, Shimasaki S (2004) Functional and molecular characterization of naturally occurring mutations inthe oocyte-secreted factors bone morphogenetic protein-15
and growth and differentiation factor-9. J Biol Chem 279,17391-17396.
15．Di Pasquale E, Beck-Peccoz P, Persani L (2004) Hypergonadotropic ovarian failure associated with an inherited mutation of human bone morphogenetic protein-15 (BMP15)
gene. Am J Hum Genet 75, 106-111.

学術奨励賞受賞論文

43