REVIEW

卵巣内の「幹細胞」をめぐる現状
高井泰

埼玉医科大学総合医療センター産婦人科

helicase である DDX （DEAD box polypeptide

はじめに）の細胞外ドメインを認識する抗体を用いた FACS（蛍光活
卵巣組織中，あるいは胚性幹細胞（ES 細胞）・人工多性細胞分離法）によって，OSCs とみられる細胞を分離）． このヒト OSCs は直径m の細胞で，能性幹細胞（iPS 細胞）から卵子幹細胞と考えられる細した（図胞が分離，あるいは作成され，マウスでは産仔が得られ卵巣中にごくわずかに（懸濁生細胞中の約 ．％）存在たとの報告がなされた．ES 細胞や iPS 細胞からの配偶し，PRDM ，DPPA ，IFITM ，TERT などの初期生殖〜子形成に関する研究はその後めざましい成果を上げ，今細胞に特異的な mRNA を発現していた． ヒト OSCs を，日に至るまでその動向が高い関心を集めている．一方，

マウス胎仔線維芽細胞（MEF）を feeder として卵巣組織中から増殖可能な「幹細胞」が得られたことは，週間培養したところ，MEF 非存在下で安定的に増殖す

成体卵巣中の始原生殖細胞は補充・再生されないというる細胞が得られ，従来の学説の見直しを迫るものであるにも関わらず，今殖細胞特異的な mRNA および蛋白を発現していた．

〜カ月以上の培養後も前述した初期生日に至るまで懐疑的な評価が少なくない．卵巣内の「幹細胞」に関する研究の現状を概説し，今後の可能性を展卵子幹細胞からの卵子の産生望した．
培養ヒト OSCs では，継代の 時間後をピークとして卵巣組織からの卵子幹細胞の分離

直径 〜m の大きな細胞が産生された．この大細胞は DDX ，KIT,YBX ，LHX などの mRNA および蛋
卵巣中の始原生殖細胞は出生後減り続けるのみであ白を発現しており，卵母細胞と考えられた．さらに継代り，補充・再生されないというのは生殖医学における「セ時間後のヒト OSCs では減数分裂特異的な DMC おントラル・ドグマ」ともいうべき学説だった．これに対よび SYCP 蛋白の発現を核に認め，FACS を用いた核して年，マウス成体卵巣中での卵胞再生を示唆する

DNA 量分析では生殖細胞（卵子）と思われる n 細胞を知見［］が報告され，大論争を引き起こした．その後，認めた．

複数の施設から，ショウジョウバエやメダカ同様に，マウス成体卵巣中にも少数の増殖可能な生殖細胞が存在し，卵子さらには産仔を生成しうることが報告された［］．そして遂にまた，ヒト OSCs を GFP で標識してからヒト卵巣組織の細胞懸濁液と培養したところ， 時間後には直径m 超の大きな GFP 陽性細胞を小さな GFP 陰性細胞が年，ヒト成人の卵巣から増殖可能取り囲む卵胞に類似した構造を認めた．これは，ヒトな卵子幹細胞（oogonial stem cells ; OSCs）が分離さOSCs から卵母細胞が産生され，卵巣組織懸濁液中の顆れ［］，臨床応用の可能性が議論されることとなった．

粒膜細胞が周囲に結合したものと考えられた．さらに

本研究では，性同一性障害に対する性別適合手術を受GFP 標識ヒト OSCs をヒト卵巣組織片に注入し，このけた 代から 代前半までの人の卵巣を，Cryotissue法という卵巣組織に最適化されたガラス化凍結保存技術［］によって予め凍結保存したものを使用した．この組織片を免疫抑制マウスに異種移植すると，〜週間後に GFP 陽性細胞を扁平な細胞が取り囲んだ原始卵胞を認めた（図）．この GFP 陽性細胞は卵母細胞特異的凍結ヒト卵巣組織を融解した細胞懸濁液から，上述したな LHX および YBX 蛋白を発現しており，特に YBX］を改良した，生殖細胞特異的な RNA

は減数分裂の複糸期（相同染色体の対合・交差・相同組

従来の分離法［連絡先：高井 泰，埼玉医科大学総合医療センター産婦人科〒 ―川越市鴨田
TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：yastakai@saitama-med.ac.jp

4

日本生殖内分泌学会雑誌（2018）23 : 4-8

み替えが起こる）に特異的なマーカーである点が重要である．倫理的・法的理由からヒト OSCs から得られた卵子をヒト精子と受精させることはできなかったが，同様の方法でマウス卵巣から分離された細胞を GFP で標識卵巣内の「幹細胞」をめぐる現状

他の動物同様に，卵胞新生を支持する仕組みが存在する

༸Ꮚᖿ⣽⬊

ことが示唆された．

ཎጞ༸⬊「卵子幹細胞」に対する懐疑論䝠䝖༸ᕢ⓶㉁⣽⬊ᠱ⃮ᾮ
ᢠDDX4FACS䛻䜘䜛ศ㞳ᢠయ

この「卵子幹細胞」に関する Tilly らの報告［］に対しては，複数の懐疑的な論評や反証が呈示され，議論య⣽⬊は現在も続いている．まず，「卵子幹細胞」の分離の際に手懸かりとされた DDX （マウスでは Ddx ）は従来ቑṪάᛶ䜢ᣢ䛴༸Ꮚᖿ⣽⬊⥅௦ᇵ㣴GFP㑇ఏᏊ䜢ᑟධ

細胞質に局在すると考えられていたため，その細胞外ドメインを対象とした FACS を用いた方法論に対する疑義が示された．これに対して Tilly らは，初期生殖細胞特異的で細胞膜貫通型蛋白として知られる Ifitm （Fragilisとも呼ばれる）を用いても，同様の細胞がマウス成体卵巣から分離できることを報告した［ ，］．さらに，細胞䝠䝖༸ᕢ⓶㉁⤌⧊∦䛻ὀධ

GFPᶆ㆑༸Ꮚᖿ⣽GFP㝧ᛶ༸ẕ⣽⬊⬊䜢᭷䛩䜛ཎጞ༸⬊7-14᪥㛫

外に helicase ドメインが「隔離」されて機能を抑制された Ddx が， OSCs の継代培養の過程で細胞質に移動し，減数分裂開始に関わる Stra などの発現に関与する可能性を示唆した［］．また，マウス OSCs の遺伝子発現プロファイルを，マウス胚性幹細胞（ESCs）やマウス胎仔始原生殖細胞（PGCs）と比較したところ，分離直後の OSCs では ESCs や PGCs でみられる多能性遺伝子を認めず，数カ月間の継代培養後に多能性遺伝子を発現

1-3᪥㛫
ᇵ㣴
図ච␿୙඲䝬䜴䝇䛻␗✀⛣᳜

ヒト卵巣組織からの卵子幹細胞（OSCs）の分離と OSCs 由来卵胞の新生
文献［ ］より改変．

することが報告された［］．

一方，Liu らは Cre-loxP 部位特異的組換えシステムを応用して Ddx を発現する生殖系列細胞を蛍光により可視化した Ddx4-Cre ; Rosa26 rbw/+マウスを作成し，の同マウスの卵巣から直径日齢m 未満の細胞を分離し培養したところ，分割能をもった Ddx 発現細胞は認めなかったと報告した［］．これに対して Tilly らは，同様tdTm/+して成体マウスの卵巣に移植し，ゴナドトロピン製剤にの Ddx4-Cre ; Rosa26

よって排卵誘発したところ，GFP を発現した成熟卵子胞の大部分は生殖系列細胞ではなかったが，抗 Ddx 抗が得られ，マウス精子との体外受精で胚盤胞が得られた．

体を用いた FACS によって tdTm 陽性の OSCs が分離さ

なお，従来の分離法で得られた OSCs を GFP で標識しれたと報告した［ ］．て不妊マウスの卵巣に注入したところ，GFP を発現する産仔が得られている［］．

マウスを作成し，tdTm 陽性細さらに，Liu らは他の告［研究室と共同で Tilly らの報］の追試を行った［ ］．ヒト卵巣から抗 DDX

以上の知見は精子幹細胞研究で広く受け入れられた手抗体を用いた FACS によって細胞を分離したが，これら法を応用して得られたものだが，凍結保存したヒト卵巣の細胞に DDX は発現しておらず，非特異的な抗 DDX組織からヒト OSCs が分離・同定され，卵子が産生され抗体への結合が示唆された．また，分離した細胞を EGFPることを強く示唆している．また，ヒト OSCs は数カ月で標識してヒト卵巣組織片に注入し，この組織片を免疫以上にわたって分裂・増殖が可能であり，雌性生殖細胞抑制マウスに異種移植したが，EGFP 陽性の卵子は認めは出生後に増殖しないという従来の学説の変更を迫る画なかった．これに対して Tilly らは，Liu らの分離した期的な発見でもある．さらに，ヒト OSCs を注入したヒ細胞は純度が低く，解析法に改善の余地があることを指週間のうちに OSCs 由来の原始摘し，サルやヒヒでも OSCs が分離されたことを報告しト卵巣で，わずか〜卵胞が認められたことより，ヒト成人卵巣においても，た［ ， ］．

REVIEW5高井泰ዷᏎᛶ

Ꮡ⒪ἲ෾⤖ಖᏑ䝠䝖༸Ꮚᖿ⣽⬊⏤᮶䝭䝖䝁䞁䝗䝸䜰䛻䜘䜛༸Ꮚάᛶ໬䝠䝖iPS⣽⬊䝠䝖༸Ꮚᖿ⣽⬊䝠䝖༸Ꮚᖿ⣽⬊άᛶ໬ᅉᏊ䛾ྠᐃ䝠䝖༸Ꮚᖿ⣽⬊⏤᮶༸Ꮚ䛾in vitro maturaon䝠䝖༸Ꮚᖿ⣽⬊⏤᮶άᛶ໬ᅉᏊ䛻䜘䜛༸Ꮚάᛶ໬図෾⤖䝠䝖༸ᕢ⤌⧊ቑṪ䛥䛫䛯䝠䝖༸Ꮚᖿ⣽⬊䛾༸ᕢ䜈䛾ὀධ/⛣᳜༸ᕢணഛ⬟ᅇ᚟䛻䜘䜛ዷᏎ⬟䛾ᅇ᚟䞉㈿ά໬

⏕Ṫ⿵ຓ་⒪ヒト卵子幹細胞（OSCs）を用いた研究が生殖補助医療や妊孕性温存療法に及ぼす影響
文献［ ］より改変．

その後，Tilly らは，自殺遺伝子 HSVtk を Stra 発現細とに成功している［ ］．そこでヒト OSCs 由来の原始胞特異的に発現させたトランスジェニックマウスを作製

卵胞を本法によって培養・発育させ，得られた胞状卵胞週間の GCV 投与で HSVtk を作動させたから卵子を単離し，in vitro maturation（IVM）によっし，成体へのところ原始卵胞数が減少したが，GCV 中止後週間でてヒト MII 期成熟卵子を得ることが計画されている（図原始卵胞数が回復すること，この回復には減数分裂開始）．に関わる Stra 発現細胞が関わること，回復した新生卵

また，OSCs の in vitro 培養によって卵子が分化・産胞由来の卵子によって産仔が得られたことを報告した

生される分子メカニズムが解析され，卵巣組織内におけ［ ］．

る卵子生成メカニズムと比較検討することによって，卵また，Tilly らとは別個に Wu らは，生殖補助医療に子の産生や質に影響する因子を同定・評価することが期おける採卵時の卵巣穿刺液からヒト OSCs と思われる細待される．さらに，成人女性の卵巣中に存在する OSCs胞が分離抽出できたと報告した［ ］．さらに最近，Silves-に作用する因子の投与によって，卵巣予備能を維持・回

tris らもヒト卵巣皮質からヒト OSCs を分離し，ごく一復させる治療が可能となるかもしれない（図部が直径m までの大細胞に分化すること，これらの大細胞が GDF-9お よ び SYCP3 mRNA を 発 現 し た倍）．

さらに，OSCs は細胞エネルギー源としての有用性も期待されている．加齢に伴う卵子の質の低下の理由の体細胞であること，その他の小細胞が DPPA3 mRNA をつとして細胞内エネルギー産生能の低下が推定され，若発現した倍体細胞であることを報告するなど［ ］，

年ドナーの卵子から得られた少量の卵細胞質を反復 IVF

ヒト OSCs の存在を支持する知見も散見されるように不成功例の卵子に注入することにより，生殖補助医療なった．

（ART）の成功率が著しく改善したとの報告が年代になされた．しかしながら，他者からの卵細胞質移植は卵子幹細胞の臨床応用

他者のミトコンドリア DNA を子孫に伝えることに繋がるため，米国食品衛生局はこれを直ちに禁止した．

上述したように，OSCs から成熟 MII 期卵子を得るた

この他者の遺伝子の混入という問題点を克服するため

めには，これを卵巣組織中に注入して，卵巣組織中の顆に，患者自身から得られたヒト OSCs のミトコンドリア粒膜細胞に包囲させた原始卵胞を形成させることが必要

やその活性化因子を顕微授精（ICSI）時などに注入するである．一方，既に原始卵胞を含んだヒト卵巣組織を inことによって，卵子の質を改善し，ART 成功率を上昇

vitro で培養し，前胞状卵胞まで発育させた後に単離しさせる臨床研究が行われており，年末にわが国からて，アクチビンＡ存在下の卵胞培養によって胞状卵胞まもで発育させる，ステップ無血清卵胞培養法が報告されによると，海外では既に 名の ART 不成功歴をもつ不ており［ ］，最近世界で初めてヒト MII 卵子を得るこ

妊症患者からヒト OSCs が得られ，ミトコンドリアが抽6日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.23 2018

施設の参加が発表された（図）．現時点の報告［ ］

卵巣内の「幹細胞」をめぐる現状出された．電子顕微鏡による観察では，ヒト卵子とヒトOSCs のミトコンドリアは類似した形態を示していた．

文献

これらの患者から得られた卵子に，自身の OSCs 由来のミトコンドリアを注入したところ，採卵周期あたりの継続 妊 娠 率 が ．〜 ．％か ら 〜 ％に 著 明 に 改 善 した． 名の患者では，ICSI 時に卵子を群に分け，一方は ICSI のみ，一方は ICSI と同時に自身の OSCs 由来のミトコンドリアも注入したところ，ICSI 単独群に比べてミトコンドリア注入群で有意に妊娠率が改善した．
しかしながら，対象となった患者は必ずしも高齢では無く，多囊胞性卵巣症候群など卵巣予備能が不良とはいえない症例も含まれており，適応の妥当性，安全性の検証など検討すべき多くの問題が指摘され，有効性は確立されていない．
また，卵巣組織由来の OSCs は，不妊症患者に対する生殖補助医療のみならず，悪性腫瘍患者に対する妊孕性温存にとっても非常に有用な選択肢を提供できる可能性がある．現在，わが国でも妊孕性温存療法としての卵巣組織の凍結保存が始められているが［ ］，将来的には卵巣組織から OSCs を分離し，がん細胞を含まない体外培養系で増殖させ，そのまま体外で成熟させたり，残存性腺組織に再移植することなどによって，多くの成熟配偶子を安全に得ることが可能になるかもしれない．

卵子幹細胞研究の今後の課題
OSCs から得られた卵子そのものを用いた ART や妊孕性温存を施行するためには，なお一層の基礎的研究が必要である．例えば，成熟した卵子を得るためには，いったん卵巣組織中に注入することが必要だが，注入後に組織内で起こっている現象に関する知見は乏しい．また，幹細胞におけるヒストン修飾や DNA 修飾といったエピジェネティック制御に関する知見も重要であろう．既にマウスでは産仔が得られているが，ヒトへの応用には霊長類などの高等動物を用いた安全性の検証が必須と思われる．
今後，OSCs を用いた生殖医学の研究が一層発展することが期待されるが，技術の進歩に議論が追いついていないのが現状である．わが国は，ART の研究に限って生体から採取した卵子と精子を受精させることを認めているが，幹細胞の取り扱いを定めた国の指針では「できた卵子や精子を受精させない」としている．研究の進展による成果への期待が高まるなか，どの段階までの研究が認められるのか，具体的な幅広い議論が必要だろう．

．Johnson J, Canning J, Kaneko T, Pru JK, Tilly JL（）
Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal
mammalian ovary. Nature,- .
．Zou K, Yuan Z, Yang Z, Luo H, Sun K, Zhou L, Xiang J,Shi L, Yu Q, Zhang Y, Hou R, Wu J（）Production ofoffspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries. Nat Cell Biol ,- .
．White YA, Woods DC, Takai Y, Ishihara O, Seki H, Tilly
JL（）Oocyte formation by mitotically active germ cells
purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med,- .
．Kagawa N, Silber S, Kuwayama M（）Successful vitrification of bovine and human ovarian tissue. Reprod Biomed Online,- .
．Woods DC, White YA, Tilly JL（）Purification of oogonial stem cells from adult mouse and human ovaries : anassessment of the literature and a view toward the future.
Reprod Sci , - .
．Woods DC, Tilly JL（）Isolation, characterization andpropagation of mitotically active germ cells from adult- .
mouse and human ovaries. Nat Protoc ,．Imudia AN, Wang N, Tanaka Y, White YA, Woods DC,Tilly JL（）Comparative gene expression profiling ofadult mouse ovary-derived oogonial stem cells supports adistinct cellular identity. Fertil Steril in press.
．Imudia AN, Wang N, Tanaka Y, White YA, Woods DC,Tilly JL（）Comparative gene expression profiling ofadult mouse ovary-derived oogonial stem cells supports adistinct cellular identity. Fertil Steril,.
．Zhang H, Zheng W, Shen Y, Adhikari D, Ueno H, Liu K（）Experimental evidence showing that no mitotically
active female germline progenitors exist in postnatal mouseovaries. Proc Natl Acad Sci USA,.
．Park ES, Tilly JL（）Use of DEAD-box polypeptide（Ddx ）gene promoter-driven fluorescent reporter mice toidentify mitotically active germ cells in post-natal mouseovaries. Mol Hum Reprod , - .
．Zhang H, Panula S, Petropoulos S, Edsgard D, Busayavalasa
K, Liu L, Li X, Risal S, Shen Y, Shao J, Liu M, Li S,Zhang D, Zhang X, Gerner RR, Sheikhi M, Damdimopoulou P, Sandberg R, Douagi I, Gustafsson JA, Liu L, Lanner F, Hovatta O, Liu K（）Adult human and mouseovaries lack DDX -expressing functional oogonial stemcells. Nat Med ,.
．Woods DC, Tilly JL（）Reply to Adult human andmouse ovaries lack DDX -expressing functional oogonialstem cells. Nat Med ,.
．Wang N, Satirapod C, Ohguchi Y, Park ES, Woods DC,Tilly JL（）Genetic studies in mice directly link oocytes
produced during adulthood to ovarian function and naturalfertility. Sci Rep,.
．Ding X, Liu G, Xu B, Wu C, Hui N, Ni X, Wang J, Du
M, Teng X, Wu J（）Human GV oocytes generated bymitotically active germ cells obtained from follicular aspirates. Sci Rep ,.

REVIEW7

高井泰．Silvestris E, Cafforio P, D’Oronzo S, Felici C, Silvestris F,Loverro G（）In vitro differentiation of human oocytelike cells from oogonial stem cells : single-cell isolationand molecular characterization. Hum Reprod ,- ．
．Telfer EE, McLaughlin M（）In vitro development ofovarian follicles. Semin Reprod Med ,- .
．McLaughlin M, Albertini DF, Wallace WHB, Anderson RA,
Telfer EE（）
Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Mol
Hum Reprod ,- .
．Fakih MH, Shmoury MEl, Szeptycki J, dela Cruz DB, LuxC, Verjee S, Burgess CM, Cohn GM, Casper RF（）8日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.23 2018

The AUGMENTSM Treatment : Physician Reported Outcomes of the Initial Global Patient Experience. JFIV Reprod Med Genet ,.
．Takai Y（）Recent advances in oncofertility care worldwide and in Japan. Reprod Med Biol doi :.
/rmb .
.
．Telfer EE, Albertini DF（）The quest for human ovarian stem cells. Nat Med ,- .
．Woods DC, Tilly JL（）The next（re）generation of ovarian biology and fertility in women : is current science tomorrow’s practice? Fertil Steril , - .