MINI REVIEW （平成16年度学術奨励賞受賞論文）

マウス造精機能障害モデルにおけるTRAIL発現抑制の効果
合田土橋上政１），後藤正樹１），岡田章暢２），白川弘３），守殿利朗２），寺尾貞夫１），藤澤秀治１），正人１）

１）神戸大学大学院医学系研究科器官治療医学講座腎泌尿器科学２）神戸大学医学研究国際交流センター
３）帝京大学泌尿器科学

はじめに

cellsに広く分布していることが知られており，アポトーシスを介した精子形成の調節に関与していることが示唆

不妊症の約半数は男性要因であり，原因として造精機されている（図１）［９，10，11］．本研究ではマウス精能障害の占める割合は大きい［１，２］．精子形成は細胞巣におけるTRAIL，TRAIL receptorsの発現を調べる

増殖，減数分裂，機能分化の過程からなり，精巣内にはとともに，マウス停留精巣作成による造精機能障害モデ複雑な細胞間調節機構が存在する．精巣機能を調べるた

ルでTRAIL発現抑制の効果について検討した．

めにもっともよく用いられる動物実験モデルの１つに停留精巣モデルがある［３］．マウス停留精巣モデルにおいて停留精巣作成後に精巣重量は減じ，病理組織学的には精細管径の減少と精子形成の障害，アポトーシス細胞研究の方法
１）実験動物の増加を認め，造精機能障害は長期間の停留精巣化の後本研究では８週齢C57BL/6Jマウスを用いた．すべてには精巣固定術を施行しても不可逆となることが知られの動物実験はNational Institute of Health Guide for theている．これまでにp53，bcl-2，Fas/Fas ligandなど多Care and Use of Laboratory Animalsの指針に沿って行くのsystemsが精巣内のアポトーシスに関与しているこった．とが知られており，またp53［４］やFas［５］のノックアウトマウスにおいて停留精巣作成による造精機能障害過程の遅延が報告されている．

２）プラスミドべクター作製
pEGFP-N1 vector に MoLV-LTR promoter，Tumor necrosis factor-α-related apoptosis-inducing

hygromycin cassetteを組み込んだpMoHygroを作製，ligand（TRAIL）はFas ligandと同じくTumor necrosis

さ ら に マ ウ ス TRAIL を antisense 方 向 に 組 み 込 みfactor（TNF）ファミリーに属し1995年にWiley［６］ら，

pMoHygro-TRAILasを， ま たLacZ遺 伝 子 を 組 み 込 み

1996年 に Pitti［７］ ら に よ り そ れ ぞ れ ヒ ト TRAIL

pMoHygro-LacZをそれぞれ作製した（図２）［12］．

cDNAが同定された．またヒトでは281アミノ酸，マウスでは291アミノ酸からなり，ヒトとマウスで65%のア３）造精機能障害モデル

ミノ酸相同性があることが明らかとなった．TRAILはマウス片側停留精巣作成時に各プラスミドベクターをdeath domainを細胞内領域に含む受容体であるDR4/30μg精細管注入し，８ square electric pulses，voltage

TRAIL-R1，DR5/TRAIL-R2を介してアポトーシスを50V，pulse length 50msecの条件のin vivo electroporation

誘導し，機能的death domainをもたない受容体DcR1/法で遺伝子導入した［13，14］．造精機能障害過程の７

TRAIL-R3，DcR2/TRAIL-R4は TRAIL の decoy

日と14日目にPAS染色による精子形成，精巣重量を評価receptorsとして働くことが知られている［８］．これました．

で に ヒ ト， ラ ッ ト 精 巣 に お け る TRAIL，TRAIL
receptorsの発現が報告されておりgerm cells，Leydig
連絡先：合田上政，神戸大学大学院医学系研究科器官治療医学講座腎泌尿器科学，〒650-0017 神戸市中央区楠町7-5-1TEL: 078-382-6155
FAX: 078-382-6169
E-mail: godagoda@med.kobe-u.ac.jp

４）X-gal染色，免疫組織染色
プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー 注 入 ４ 日 目 に X-gal 染 色（pMoHygro群，pMoHygro-LacZ群 ）， 免 疫 組 織 染 色（pMoHygro群，pMoHygro-TRAILas群）で遺伝子導入を確認した．

日本生殖内分泌学会雑誌（2005）10：37-4237

合田 上政他

図１

ヒト，ラット精巣におけるTRAIL，TRAIL receptorsの発現

図２

pMoHygro-TRAILasプラスミドの構造

マウス精巣におけるTRAILと受容体の発現

５）PCR，Western blot
プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー 注 入 ４ 日， ７ 日，14日 目 にマ ウ ス 精 巣 に お い て TRAIL は spermatogonia，

TRAILas specific primersを 用 い たPCRで 導 入 を 確 認

spermatocytes，round spermatids，elongated［12］，Western blotでTRAIL発 現 の 抑 制 を 確 認 し た．

spermatids，Leydig cells に 広 く 発 現 を 認 め た．

さらにcaspase-8，caspase-3 cleavageの抑制を確認し

pMoHygro-LacZ精 細 管 注 入 ４ 日 目 のX-gal染 色 で，た．

germ cells と somatic cells に 遺 伝 子 導 入 を 確 認 し，
MoLV-LTR promoter下 のin vivo electroporation法 に６）TUNELよる精巣への効果的な遺伝子導入が確認された．同様に

プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー 注 入 ４ 日， ７ 日，14日 目 に

pMoHygro-TRAILas精細管注入によってgerm cellsとTUNEL法により一精細管あたりのアポトーシス細胞数

somatic cellsにTRAIL発現の抑制を免疫組織染色で認めを評価した．

た（ 図 ３）．TRAIL 受 容 体 の DR4/TRAIL-R1，DR5/
TRAIL-R2，DcR1/TRAIL-R3，DcR2/TRAIL-R4に つ

７）統計解析

いてもspermatocytes，round spermatids，elongated

統計学的処理はStudent's t testを用い，p＜0.05を以って有意と判定した．

38

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.102005

spermatids，Leydig cellsに広く発現を認めた（図４）．

マウス造精機能障害モデルにおけるTRAIL発現抑制の効果

図５

図３

X-gal染色，免疫組織染色による遺伝子導入の確認

図４

マウス精巣におけるTRAIL，TRAIL receptorsの発現

マウス造精機能障害モデルにおけるTRAILas遺伝子導入とTRAIL抑制MINI REVIEW

39

合田 上政他

図６

マウス造精機能障害モデルにおけるPAS染色による精子形成の確認

側精巣へのpMoHygro-TRAILasのelectroporationによる遺伝子導入は対側精巣へのTRAIL発現に影響せず，electroporationによる遺伝子導入は精巣局所でTRAIL発現を抑制した．停留精巣作成後，造精機能障害過程７日，14日 目 の 精 子 形 成 に つ い て は 各 seminiferous
tubules内のgerm cells数においてpMoHygro control群に 比 べ てpMoHygro-TRAILas群 で 増 加 を 認 め た（ 図６）．同様に精巣重量についてもpMoHygro control群（術後 ７ 日 目；0.056±0.005g， 術 後14日 目；0.042±0.004g）と 比 較 し て，pMoHygro-TRAILas群（ 術 後 ７ 日 目；
図７

マウス造精機能障害モデルにおける精巣重量の経時変化

0.070±0.007g，術後14日目；0.050±0.006g）で増加を認めた（p＜0.01 and p＜0.05，respectively）（図７）．また 精 子 形 成 と 精 巣 重 量 は pMoHygro-LacZ 群 とpMoHygro control群で差を認めなかった．このように

マウス停留精巣モデルにおける
TRAIL発現抑制の影響

マウス造精機能障害モデルにおいてTRAIL発現の抑制により，精子形成の障害と精巣重量の減少が抑制されることが確認された．

マ ウ ス 造 精 機 能 障 害 モ デ ル 精 巣DNA extractのTRAILas specific primersを 用 い たPCRに よ る 解 析 でTRAIL発現抑制による抗アポトーシス効果

TRAILas（1385bp）は，pMoHygro-TRAILas注入後４日目に最も強く発現し，14日目にかけて徐々に減じた．

精巣におけるTRAIL/TRAIL Receptorsシグナルを調

pMoHygro control群 で はTRAILasを 認 め な か っ た．

べるためcaspase-8，caspase-3についてwestern blotにTRAIL蛋白（35kD）についても同様にwestern blotに

よ り 確 認 し た． 遺 伝 子 導 入 後 ４ 日 目 のpMoHygro-

よりpMoHygro-TRAILas群で抑制されていることを確

TRAILas群ではpMoHygro control群に比べてcaspase-8，認した（図５）．またTRAIL発現はpMoHygro-LacZ群

caspase-3 cleavageの抑制を認め，14日目にかけて徐々とpMoHygro control群で差を認めなかった．さらに片に そ の 差 を 減 じ た（ 図 ８）． 結 果 TRAIL/TRAIL

40

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.102005

マウス造精機能障害モデルにおけるTRAIL発現抑制の効果

図８

マウス造精機能障害モデルにおけるcaspase-8，caspase-3 cleavageの抑制

図９

マウス造精機能障害モデルにおけるアポトーシスの経時変化

Receptorsのinteractionsは造精機能障害モデル精巣の精により精子形成の障害が抑制されたと考えられた．

子形成に重要な役割を果たしたと考えられた．最後にTRAIL抑制による抗アポトーシス効果をTUNEL法により検討した．一般に停留精巣作成によりアポトーシス細おわりに胞は増加することが知られており，遺伝子導入後４日，７日目ともにpMoHygro control群に比べ，pMoHygro-

マウス精巣においてもTRAILおよびTRAIL受容体でTRAILas群でアポトーシス細胞の減少を認めた（図９）．

ある DR4/TRAIL-R1，DR5/TRAIL-R2，DcR1/

このことから停留精巣による胚細胞数の減少にアポトーTRAIL-R3，DcR2/TRAIL-R4の発現を認めた．マウス

シスが関与し，TRAIL抑制による抗アポトーシス効果

造精機能障害モデルにおいてTRAIL antisense遺伝子導MINI REVIEW

41

合田 上政他入による抗アポトーシス効果を認め，停留精巣による造精機能障害にTRAIL-induced apoptosisの関与することが示唆された．また，マウス造精機能障害モデルにおいてTRAIL antisense遺伝子導入による精子形成および精巣重量の増加を認め，精巣におけるTRAIL/TRAIL-Rssystemの重要性が示唆された．

謝辞
第９回日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞し，またこのような執筆の機会をいただきましたことを大変光栄に存じます．本研究の遂行にあたり多大なご指導をいただきました藤澤正人先生，後藤章暢先生にこの場をお借りして深く感謝の意を表します．

文

献１．Comhaire FH (1996) In : Comhaire FH (ed) Male Infertility.
Chapman & Hall Medical, London, pp.123-131.
２．Mosher WD, Pratt WF (1991) Fecundity and infertility in
the United States: Incidence and trends. Fertil Steril 56,192-193.
３．Nishimune Y, Maekawa M, Sakamaki K, Haneji T (1986) Effect of duration of cryptorchidism on ability of mouse germ
cells to regenerate and differentiate. Arch Androl 16, 89-96.
４．Yin Y, DeWolf WC, Morgentaler A (1998) Experimental
cryptorchidism induces testicular germ cell apoptosis by
p53-dependent and -independent pathways in mice. Biol Reprod 58, 492-496.
５．Ogi S, Tanji N, Yokoyama M, Takeuchi M, Terada N (1998)
Involvement of Fas in the apoptosis of mouse germ cells induced by experimental cryptorchidism. Urol Res 26, 17-21.

42日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.102005

６．Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA (1995)
Identification and characterization of a new member of theTNF family that induces apoptosis. Immunity 3, 673-682.
７．Pitti RM, Marsters SA, Ruppert S, Donahue CJ, Moore A,Ashkenazi A (1996) Induction of apoptosis by Apo-2 ligand,a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.
J Biol Chem 31, 12687-12690.
８．Younes A, Kadin ME (2003) Emerging applications of thetumor necrosis factor family of ligands and receptors in cancer therapy. J Clin Oncol 15, 3526-3534.
９．Grataroli R, Vindrieux D, Selva J, Felsenheld C, Ruffion A,
Decaussin M, Benahmed M (2004) Characterization of tumour necrosis factor-alpha-related apoptosis-inducing ligand
and its receptors in the adult human testis. Mol Hum Reprod 10, 123-128.
10．Grataroli R, Vindrieux D, Gougeon A, Benahmed M (2002)
Expression of tumor necrosis factor-alpha-related apoptosisinducing ligand and its receptors in rat testis during development. Biol Reprod 66, 1707-1715.
11．Spierings DC, de Vries EG, Vellenga E, van den Heuvel FA,Koornstra JJ, Wesseling J, Hollema H, de Jong S (2004) Tissue distribution of the death ligand TRAIL and its receptors.
J Histochem Cytochem 52, 821-831.
12．Strebel A, Bachmann F, Wernli M, Erb P (2002) Tumor necrosis factor-related, apoptosis-inducing ligand supports
growth of mouse mastocytoma tumors by killing tumor-infiltrating macrophages. Int J Cancer 20, 627-634.
13．Yamazaki Y, Fujimoto H, Ando H, Ohyama T, Hirota Y,Noce T (1998) In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous
tubules and subsequent electroporation. Biol Reprod 59,1439-1444.
14．Muramatsu T, Shibata O, Ryoki S, Ohmori Y, Okumura J(1997) Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem Biophys Res Commun 7,45-49.