研究フロンティア（平成２０年度学術奨励賞受賞論文）

排卵期特異的な EGF like factor の発現機構とその作用

下中麻奈美１），山下 泰尚２），JoAnne S. Richards３），島田 昌之１）
１）広島大学大学院生物圏科学研究科
２）鳥取大学農学部獣医学科
３）Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

はじめにた［７］．さらに，マウス顆粒層細胞の体外培養系において，PGE２の添加や Nr3c3の過剰発現処理が，EGF like

脳下垂体から分泌された LH は，十分発達した胞状卵factor の発現を誘起させること，EGF like factor は，Ptgs胞（排卵直前卵胞）を刺激し，卵子成熟および排卵を誘2や Progesterone 合成に関わる Star，Cyp11a1の発現を起させる．この LH に対する受容体（LHR/LHCGR）は，上昇させることを示した［７］．この結果は，EGF like

卵子には全く発現せず，卵子とともに排卵される卵丘細factor と PGE２，Progesterone の 間 に は，ポ ジ テ ィ ブ

胞にもほとんどなく，顆粒層細胞に高発現している．しフィードバック機構が存在することを示している．

たがって，LH 刺激は顆粒層細胞にまず作用し，顆粒層これまで紹介したように，EGF like factor，PGE２お細胞の分泌因子を介して卵丘細胞や卵子が刺激すると考よび Progesterone は，それぞれ排卵に必須な因子であえられている．

り，かつ相互作用していると考えられる．したがって，米国の Conti M 博士のグループは，顆粒層細胞が発LH により誘起される排卵過程において，これらの因子現する生理活性因子をマイクロアレイ解析により網羅的が発現し，機能する仕組みを詳細に解明することが，排に検出した．その結果，EGF卵機構の解明，特にその誘起メカニズムの解明に必須でlikefactor である Am-phiregulin（AREG），β―cellulin（BTC），Epiregulin

あると考えられることから，排卵期におけるこれら因子（EREG）が， LH 刺激により顆粒層細胞で発現すること，の発現制御機構の解明を試みた．

これら EGF like factor の添加が，卵胞培養における卵子減数分裂再開と卵丘細胞の膨潤を誘起することを明らかとした［１］．さらに，EGF 受容体の機能低下型 mutant
マ ウ ス（Egfr wa2 ; waved―２）や EGF 受 容 体 Tyr

Areg ， Ptgs2 ， Cyp11a1 プ ロ モ ー タ ー 活 性)
cAMP―PKA―CREB 系による制御

kinase抑制剤が，排卵数の低下を生じさせることも示され，
EGF

Areg，Ptgs2および Cyp11a1遺伝子のプロモーター領

like factor が LH 刺激を伝達する因子と考えられるよう域を探索した結果，Areg 遺伝子においては，cAMP re-になってきた［２，３］．

sponsible element（CRE）と GC-box（SP１）が，Ptgs2

一方，排卵過程において，Prostaglandin E２ （PGE２）に は CRE と CCAAT 配 列，Cyp11a1に は CRE と AP１や Progesterone が合成されること，これらの合成抑制サイトと予想される配列が認められた（図１A）．した剤の投与．あるいは合成酵素，受容体の遺伝子欠損マウがって，細胞内の cAMP 量を増加させ，PKA を介して．わスが，排卵不全となることも知られている［４―６］CRE binding protein（CREB）を活性化させる forskolin

れわれは，PGE２合成酵素である COX―２をコードするがいずれのプロモーター活性も上昇させると推察され

Ptgs2遺伝子欠損マウスと Progesterone 受容体（PGR）た．そこで，これら遺伝子のプロモーター領域をクローをコードする Nr3c3遺伝子欠損マウスにおいて，EGFニングし，luciferase 遺伝子を用いたレポーターアッセ

like factor の遺伝子発現が有意に低下することを報告しイを行った．その結果，予想通り forskolin 刺激が，いずれのプロモーターの活性を上昇させたが，PKA 抑制

連絡先：島田昌之，広島大学大学院生物圏科学研究科〒７３９―８５２８ 東広島市鏡山１―４―４Tel/Fax：０８２―４２４―７８９９E-mail : mashimad@hiroshima-u.ac.jp

剤に対する反応が異なっていた（図１B）．すなわち，Areg
プロモーターの活性は，PKA 抑制剤である KT５７２０により有意に抑制されるが，Ptgs2や Cyp11a1では影響がな

日本生殖内分泌学会雑誌（2009）14 : 21-2721

下中麻奈美

他

BA

SP1

CRE
Ptgs2

Firefly/Renilla

P<0.01Areg

CRE CCAAT
Cyp11a1
CAP1For+KTC

AregDCREmutant

CRE probe

ForCyp11a1

Super shiftCRE
complex

WT

CRE
CRE
WTmut
mut
01

Areg

Ptgs2

22 .5 34

2hCG 2hr

hCG (hr)F

Firefly/Renilla

Firefly/RenillaE

PD CCAAT
mut
WT

図１+KT
C

Ptgs2

Firefly/Renilla

CFor

No
rm
An al Ig
IgG ti-p G-C
RE
B+KT
CRE

PD
WT

マウスの排卵過程における遺伝子発現解析（A）Areg，Ptgs２および Cyp１１a１遺伝子のプロモーター領域．
（B）
マウス顆粒層細胞を Forskolin（For）と PKA 抑制剤（KT５７２０，KT）で処理したときの Areg，Ptgs２，Cyp１
１a１プロモーター活性．
（C）Areg および Ptgs２プロモーターの CRE サイトの機能欠失（CRE mut）がその活性に及ぼす影響．
（D）Areg 遺伝子のプロモーター領域における CRE 配列と排卵過程の顆粒層細胞のリン酸化 CREB の結合．
８０５９，PD）と CCAAT 結合サイトの機能欠失（CCAAT mut）の影響．
（E）Ptgs２プロモーター活性に及ぼす ERK１／２系抑制剤（PD９８０５９，PD）の影響．
（F）Cyp１１a１プロモーター活性に及ぼす ERK１／２系抑制剤（PD９の CRE 配列とのゲルシフトアッセイを行った．hCG 刺かった．
この PKA 抑制剤に対する反応の違いをより詳細に解激により CRE 配列への結合が増加し，このバンドはネ明する目的で，Areg と Ptgs2プロモーターにおける CRE

ガティブコントロールに用いたウサギ IgG では影響はサイトを（GATGTCA）から（CACGTCA）へと変異さなかったが，抗リン酸化 CREB 抗体によりそのバンドせた機能欠失型プロモーターを作出し，これらを用いたがシフトした（図１D）．これらの結果から，排卵刺激レポーターアッセイを行った．その結果，Areg プロモーにより，顆粒層細胞の LH 受容体が活性化し，cAMP がターにおいては，その活性が有意に野生型に比較して低合成され， PKA を介して CREB がリン酸化されること，下したが，Ptgs2プロモーターでは，有意な影響が認めその結果 Areg プロモーターの CRE サイトに結合し，られなかった（図１C）．さらに，eCG 投与により卵胞Areg が発現することが明らかとなった．

発達を誘起し，hCG により排卵誘起を行ったマウスの卵巣を回収し，その溶解液を用いて Areg プロモーター

22

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

排卵期特異的な EGF like factor の発現機構とその作用

A

B
2080mRNA levelmRNA level

1006040

151052000024812 1602

hCG (hr)

4812 16hCG (hr)CD
Firefly/Renilla

2pEGFR

1.5
1pERK1/20.5ERK1/20C
図２+KTFor0min

CAG PD

AREG (5min)

マウスの排卵過程における EGF like factor の発現変化とその役割（A）顆粒層細胞における Areg 遺伝子発現変化．
（B）顆粒層細胞における Ereg 遺伝子発現変化．
（C）マウス顆粒層細胞を Forskolin （For）と PKA 抑制剤（KT５７２０，KT）で処理したときの Ereg プロモーター活性．
８０５９，PD）で（D）マウス顆粒層細胞を AREG，EGF 受容体 Tyr kinase 抑制剤（AG１４８７，AG），ERK１／２系抑制剤（PD９５分間処理したときの ERK１／２のリン酸化状態．

（図１E，F）．Cyp11a1プロモーター領域には，AP１サAreg , Ptgs2 ，Cyp11a1 プロモーター活性* ERKイトがあり，AP１領域に結合する転写因子として，排１／２による制御

卵期には Fura２と Jun-D が知られているが［１０］，これらは ERK１／２によりリン酸化されることから，Ptgs2

Ptgs2のプロモーター活性は，その領域に CRE サイトを有するにもかかわらず，CRE サイトの機能欠損や PKAと Cyp11a1の遺伝子発現は，ERK１／２により制御されていると考えられた．

抑制剤による影響を受けなかったことから，プロモーター領域における他の転写因子結合領域が重要な役割をEGF like factor が顆粒層細胞と卵丘細胞の ERK

果 た し て い る と 推 察 さ れ た．そ こ で，CCAAT 配 列１／２をリン酸化する（TTGCGCAA）に着目し，その機能欠失型（CCGCTCAA）を作製して，レポーターアッセイを行った結果，CCAAT

Areg の発現は，PKA に依存し，これは LH による直配列の変異により 活 性 が 有 意 に 低 下 し た（図１E）．

接的な制御であり，排卵刺激後，直ちに発現が上昇可能

CCAAT 配列には，CCAAT enhancing binding proteinとなると考えられる．実際に，顆粒層細胞の体外培養系（C/EBP）が結合し，それは ERK１／２によるリン酸化において，Areg mRNA を real-time PCR により定量しにより正に制御されることが知られている［８，９］．

た結果，１時間以内にその発現は有意に上昇していた

ERK１／２の活性は，MEK によるリン酸化により制御［７］．また，in vivo においても eCG 投与により卵胞発されることから，MEK 抑制剤（PD９８０５９）の Ptgs2プロ達を促したマウスに hCG を投与することにより，２時モーター活性に及ぼす影響を検討した．PD９８０５９は，野間後に Areg mRNA の発現は最大値を示した（図２A）．

生型 Ptgs2プロモーターの活性を有意に低下させ，またまた，Ereg mRNA も排卵刺激後２時間以内に最大値をCyp11a1プロモーターにおいてもその活性が低下した

示し，プロモーター活性測定においても PKA 抑制剤に研究フロンティア

23

下中麻奈美他

A
EGF domain
TACE/ADAM17P

ERK1/2

PHas2
Tnfaip6
Ptgs2

EREG
AREG
10B
mRNA level

CAreg
Adam178P-ERK6TotalERK4021204

LH01224

LH+TAPI-24hr

LH (hr)DE
ADAM17P-ERK

β-Actin

TotalERK110NC

図３11(nM)

1001240

NC

siRNA

124siRNAhr

EGF like factor を活性化させる ADAM１７（A）EGF like factor の構造と活性化機構．
（B）ラット顆粒層細胞の初代培養系における Areg と Adam１７の発現変化．
（C）ラット顆粒層細胞の ERK１／２に及ぼす ADAM１７抑制剤（TAPI―２）の影響．
（D）Adam１７ siRNA のタンパク質レベルに及ぼす影響．
（E）siRNA により Adam１７発現をノックダウンしたときの ERK１／２のリン酸化への影響．

より有意にその活性が低下した（図２B，C）．Ereg 遺１４８７により抑制されること［１２］，細胞外のプロテアー伝子のプロモーター領域は，Areg とは大きく異なり，SPゼ抑制剤である Galardin によっても ERK１／２のリン酸１／３結合領域が，その活性を制御していることが報告

化レベルは低下することから［１３］，排卵過程の顆粒層されている［１１］．この PKA を介した系が，排卵過程の細胞における ERK１／２のリン酸化は，EGF 受容体を刺顆粒層細胞において SP１を活性化するのかは不明であ激する AREG の新規合成に依存していることが明確化

るが，PKA が直接的リン酸化することや SP１が他の転された．

写因子と結合して，プロモーター活性を調節しているのかもしれない．この点については，今後の研究が必要でEGF like factor による ERK１／２のリン酸化は，ある．

排卵に必須である

Areg や Ereg の遺伝子欠損マウスを EGF 受容体の機能低下型 mutant マウス（Egfr wa2；waved―２）と交配してわれわれの研究グループでは，顆粒層細胞特異的に作出した雌マウスにおいて，排卵刺激後においても顆粒ERK１／２を欠損した ERK1 −/− ; ERK2 flox/flox ; Cyp19a1 Cre層細胞の ERK１／２のリン酸化は低値を示すことが報告

マウスを作出し，その解析を行った［１４］．このマウスされている［３］．また，体外培養においては，AREG

では，Cyp19a1が発現する胞状卵胞以降において ERKの添加が，ERK１／２のリン酸化を誘起することも明ら１／２が欠損しているが，卵胞発達に異常は認められなかとなった（図２D）．さらに，LH による ERK１／２のかった．しかし，排卵刺激を行ったときにおいても黄体リン酸化は，EGF 受容体の Tyr kinase 抑制剤である AGは形成されず，コンパクトな卵丘細胞層に覆われた第一24

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

排卵期特異的な EGF like factor の発現機構とその作用A

B
25

Fold increase

6Fold increase

2015104250005102030400510(hr)

C

30800

p<0.011008060**

4020600
400
200
00freeC0hr free

TAPI-2 GalC+EGF
TAPI-2

FSH40hF
6mRNA level

6ADAM17 Activity+EGFGalFSH

E

420420051020 30 FSH CalC(hr)

図４40D
Diameter of COCs (mm)Proportion of oocytes reachedat the MII stage (%)

20(hr)

40

CH89CalC

FSH

ブタ卵丘細胞卵子複合体の膨潤と卵子成熟に果たす ADAM１７の役割（A）成熟雌ブタの排卵過程における Areg mRNA の発現変化．
（B）成熟雌ブタの排卵過程における Ereg mRNA の発現変化．
，非特異的 metalloprotease 抑制剤（Galardin, Gal）がブタ卵子の第２減数分裂中期への進行に及ぼす影響．
（C）ADAM１７抑制剤（TAPI―２）（D）TAPI―２および Galardin（Gal）が卵丘細胞の膨潤に及ぼす影響．
（E）
ブタ卵丘細胞卵子複合体を FSH 添加培地で培養したときの ADAM１７活性の変化とそれに及ぼす PKC 抑制剤（Calphostin C, CalC）の影響．
（F）Adam17遺伝子発現に及ぼす PKA 抑制剤（H８９）と PKC 抑制剤（Calphostin C, CalC）の影響．

減数分裂前期の卵子を有する排卵直前卵胞が認められれたが，そのうち３７６遺伝子が ERK１／２依存的であっる，排卵不全による不妊マウスであった．おもしろいこた．そのなかには，Ptgs2や Cyp11a1，Star などの Pro-とに，発情周期が有意に長く，血中 Estrogen 濃度が有gesterone 合成に関わる遺伝子のみでなく，Estrogen の意に高く，Progesterone 濃度が有意に低いという表現

代謝に関わる Sult1e1， 細胞分裂を停止させる Cdkn1b，系を示し，排卵期への移行が完全に抑制されていること

制御系エキソサイトーシスにかかわる Snap25など，こが示唆された．そこで，この顆粒層細胞特異的に ERKれまで排卵に必須であると報告されている遺伝子が含ま１／２が欠損したマウスの排卵刺激後における顆粒層細れていた．つまり，排卵期に発現する EGF like factor

胞をサンプルとしたマイクロアレイ解析を行い，排卵刺によりリン酸化される ERK１／２は，その下流の転写因激による ERK１／２のリン酸化により発現する遺伝子を子を介して排卵に必須な多くの遺伝子発現を制御してい網羅的に検出した．

ることが示された．

排卵期に有意に発現が上昇する遺伝子は４６６個認めら研究フロンティア

25

下中麻奈美他

膨潤や卵子の減数分裂再開も促進する［１］．そこで，

LH

ブタ卵丘細胞卵子複合体の体外培養系を用いて，TAPI―２
ADAM17
Ca2+
ATP

PKCの影響を検討し，EGF like factor の修飾機構の意義をAREG検討した．ブタ体内においては，卵胞発達を促し，そこcAMPに hCG を投与することにより Adam17の遺伝子発現はPK

Adam17, Areg

卵丘細胞と顆粒層細胞でともに有意に上昇した ［１６］
．

CREB
CRE

体外培養系においても，高濃度の FSH 刺激により Areg

顆粒層細胞および Adam17 mRNA は有意に増加した（図４A，B）．
pRas

高濃度の FSH は，単独添加により卵丘細胞の膨潤や卵p子の成熟を誘起するが，これらは TAPI―２の添加によりERK1/2

AP1有意に抑制された（図４C，D）．この TAPI―２による抑制は，EGF の添加により克服されたことから，卵丘細胞CEBPの変化にも EGF like factor の修飾機構が重要な役割を果たすことが明確化された．

・Ptgs2 (Cox-2)
PGE2

この卵丘細胞における ADAM１７の酵素活性は，FSH・Has-2, TSG-6,(ヒアルロン酸合成，安定化)・progesterone

卵子成熟・排卵刺激により直ちに増加する（図４E）．この酵素活性は，PKC 抑制剤により有意に低下した（図４E）．しかし，PKC

黄体化

卵丘細胞膨潤抑制剤では Adam17mRNA レベルには影響を与えない

顆粒層細胞

卵丘細胞

こと，PKA 抑制剤が Adam17の発現を抑制することか
ら，PKA 系が Adma１７を直ちに発現させ，PKC がその図５

EGF like factor を中心とした排卵制御機構

酵素活性を上昇させることが示された（図４F）．

おわりにEGF like factor の修飾機構

著者等や Conti

M 博士らの研究により，排卵過程において，LH 刺激を卵丘細胞に伝達し，卵丘細胞を膨潤
これら AREG や EREG は，膜結合型タンパク質であさせ，卵子の成熟を誘起する EGF like factor 系の役割

り，ADAM１７により特異的に切断され，細胞膜表面からが明らかとなってきた（図５）．すなわち，LH 刺激は，遊離し，標的細胞に発現する EGF 受容体を刺激する［１５］cAMP―PKA―CREB 系を介して Areg や Adam17の発現を（図３A）．したがって，ADAM１７が AREG や EREG の機誘起する．LH は，PKC 系も活性化することが知られて能発現を調節していることとなることから，われわれは，いるが，この PKC が ADAM１７の酵素活性を上昇させ，ADAM１７に着目し，その発現と酵素活性，生理的意義にAREG を顆粒層細胞の細胞膜表面から遊離する．活性型

ついて検討を行った．

AREG は顆粒層細胞と卵丘細胞に作用し，EGF 受容体

ラット顆粒層細胞の体外培養において，LH 刺激はを介して ERK１／２をリン酸化し，それが AP１因子やmRNA を１時間以内に発現させ，Adam17mRNAC/EBP を活性化する結果，Ptgs2や Cyp11a1などを発現の発現も有意に上昇させた（図３B）．LH 刺激は，同時させ，顆粒層細胞の黄体化，卵丘細胞の膨潤，卵子の成．ADAM１７に ERK１／２のリン酸化も誘起した（図３C）

熟が誘起される．本稿で紹介した結果の多くは，レポーに対する抑制剤である TAPI―２の添加により，LH によタ−アッセイによるものであり，十分に排卵期の顆粒層Aregり引き起こされる ERK１／２のリン酸化は抑制され（図細胞で起こっている遺伝子発現変化を再現しているとは３C），Adam17の発現を siRNA によりノックダウンしいえない．したがって，今後，クロマチン免疫沈降法にた時も抑制されたことから（図３D，E），LH による一よる詳細な解明が必要である．しかし，申請者らのグルー連の機能変化は，ADAM１７により遊離された EGF

プでは，C/EBPαや C/EBPβの顆粒層細胞特異的遺伝likefactor が引き起こしていることが明確化された．
EGF like factor は，オートクライン的に顆粒層細胞に作用するだけでなく，卵丘細胞に作用し，卵丘細胞の26

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

子欠損マウスが，ERK１／２欠損マウスと同様に，排卵不全を呈し，かつ Ptgs2の遺伝子発現が低下することを認めている［１３］（Fan et al.,未発表データ）．この結排卵期特異的な EGF like factor の発現機構とその作用果は，上記の仮説モデルを補完するものである．しかし，卵丘細胞における直接的影響は明らかとされつつあるが，卵子成熟を誘起する仕組みは未だ不明である．卵丘細胞における EGF like factor の標的遺伝子をさらに詳細に解明することにより，卵丘細胞が発現する卵子成熟制御因子が同定されるものと考え，研究を進めているところである．
排卵に関わる研究は，マイクロアレイ解析により新規の生理活性因子が同定され，近年急速に発展している．
この因子を卵子の体外培養系の改善に応用するためには，本稿の後半で紹介した ADAM１７の作用といった修飾機構を解明し，作用時期を同定することが必要と考えている．つまり，どのような仕組みで発現し，それがいつ機能するかを解明し，それらを制御することで，培養系は大きく発展することが期待される．
謝辞
本稿は２００
８年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究と候補演題に選出された研究とをまとめたものである．
本稿の執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 峯岸 敬先生，第１３回同学会大会長 寺川直樹先生，ならびに広報担当理事 筒井和義先生に感謝いたします．
また，本研究は，アメリカ合衆国 Baylor College of Medicineの JoAnne S. Richards 博士との共同研究であり，研究の遂行に多くの補助をいただいた，JoAnne S. Richards ラボのHeng-Yu Fan 博士をはじめとするメンバーに感謝の意を表します．

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