研究フロンティア

ハムスターの GnIH の同定および発現制御と生理機能の解析
産賀 崇由，井上 和彦，筒井 和義
早稲田大学教育・総合科学学術院/先端生命医科学センター

つの LPXRFamide ペプチド（RFRP―１，RFRP―３）をコー

はじめに．GnIH 受容体は G タンパク共役型受容ドする［１６―１８］
１９７０年代初めに，ゴナドトロピン（黄体形成ホルモン：体の．GnIH やつ で あ る GPR１４７で あ る［１１，１５―２１］

LH，ろ胞刺激ホルモン：FSH）の分泌を促進する神経

哺 乳 類 の GnIH（RFRP―３）は シ リ ア ン ハ ム ス タ ーペプチドである生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（Mesocricetus auratus）［２２］やラット（Rattus norvegicus）―［２３，２４］において LH の分泌を抑制する．また，哺乳（GnRH）が発見された［］．一方，生殖腺から分泌される性ステロイド，フォリスタチン，インヒビンに類の GnIH （RFRP―３） はヒツジ （Ovis aries）［２５，２６］

よるゴナドトロピン分泌の抑制作用が知られていたが，やウシ（Bos

ゴナドトロピン分泌を抑制する神経ペプチドの存在は永状分泌を抑制する．

primigenius）［２７］において LH のパルス

く不明であった．筒井らは日本ウズラ（Coturnix japon-

季節繁殖を行う多くの鳥類や哺乳類では，松果体からica）の脳から単離した SIKPSAYLPLRF―NH２という構造

夜間に分泌されるメラトニンの分泌パターンに依存してを有する新規の神経ペプチドが下垂体からのゴナドトロ，われわ
生殖が制御されると考えられているが［２８―３２］ピンの放出を抑制することを見い出し，これを生殖腺刺れは季節繁殖を行うウズラにおいて，メラトニンがメラ

激ホルモン放出抑制ホルモン（GnIH）と名付けた［

トニン受容体の］．

つ（Mel１c）を介して直接 GnIH ニュー

鳥類において GnIH を産生する神経細胞体は視床下部のロンに作用して GnIH の発現［３３］と放出［３４］を制御室傍核に存在し，その神経線維は正中隆起に投射する［することを以前に見い出した．また，最近になり，ハム―１０］．GnIH 受容体はウズラの下垂体に発現しており

スター［３５，３６］やヒツジ［３７］においても GnIH の発，GnIH は下垂体に作用してゴナドトロピンの合成［１１］

現は光周期により制御されることが報告された．哺乳類と放出を抑制する［６，１２，１３］．また，GnIH 免疫陽性において GnIH ニューロンが存在する脳領域である視床の神経線維は GnRH 免疫陽性の神経細胞体に投射して下部背内側部（DMH）はメラトニンが生殖周期を制御，GnRH 免疫陽性神経細胞体には GnIH
おり［１４，１５］

するために必須の脳領域であることが知られており［３８，受容体 mRNA が発現している［１５］．したがって，GnIH

３９］，メラトニンは哺乳類においても GnIH ニューロン

は下垂体に直接作用するだけでなく，GnRH ニューロンを介してゴナドトロピンの放出を制御する可能性が考えにも作用してゴナドトロピン分泌を抑制すると考えられられる．

．
る［１６―１８］

シベリアンハムスター（Phodopus sungorus）は，光GnIH は魚類，両生類，アカゲザル（Macaca mulatta）

周期による視床下部―下垂体―性腺軸を介した生殖制御［２０］を含む哺乳類の脳［１９］やヒト（Homo sapiens）

を研究する良いモデル動物として広く用いられている．

．GnIH は RFamide ペプチドファミに存在する［１６―１８］

したがって，本研究において，われわれはまず，シベリリーに属し，C 末端側には LPXRFamide（X＝L or Q）

アンハムスターの GnIH 前駆体 cDNA の配列を PCR ク．鳥類の GnIH 前駆体 mRNA は構造を有する［１６―１８］

ローニングにより決定し，成熟 GnIH ペプチドを HPLC

つの LPXRFamide ペプチド（GnIH，GnIH―RP―１，GnIHと質量分析により単離・同定した．次に，光周期の違い―RP―２）をコードし，哺乳類の GnIH 前駆体 mRNA はや松果体除去とメラトニン投与が GnIH 前駆体 mRNAや 成 熟 GnIH ペ プ チ ド（RFRP―１と RFRP―３）の 発 現 に

連絡先：産賀崇由，早稲田大学教育・総合科学学術院生物学教室統合脳科学研究室 早稲田大学先端生命医科学センター（TWIns）〒１６２―８４８０ 東京都新宿区若松町 番
TEL ：０３―５３６９―７３６９ 内線（３２０１）
FAX：０３―３３５５―０３１６
E-mail：t.ubuka@aoni.waseda.jp

どのような影響を及ぼすのかを調べた．また，光周期による GnRH 免疫陽性神経細胞体に投射する GnIH 免疫
陽性神経線維の変化，GnRH 免疫陽性神経細胞体における GnIH 受容体の発現を調べた．最後に，GnIH の生理作用を明らかにするため，異なる光周期にあるハムス

日本生殖内分泌学会雑誌（2013）18 : 27-33

27

産賀

崇由

他

図

シベリアンハムスター GnIH 前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列
ハムスター GnIH ペプチド（RFRP―１と RFRP―３）として切り出されると推定されるアミノ酸配列を囲んだ（RFRP―１：７６-９６，RFRP―３：１１４-１２７．GnIH ペプチド に 特 徴 的 な LPXRF（X＝L or Q）
配列を太字で示した．

図

内因性および合成ハムスター GnIH（RFRFP―１と RFRP―３）の HPLC における挙動および質量分析
による質量数タ ー に 成 熟 GnIH ペ プ チ ド（RFRP―１と RFRP―３）を 脳室投与して血中ゴナドトロピン濃度がどのように変化す
るのかを調べた．

シベリアンハムスターの GnIH 前駆体 cDNA の配列
５/３ RACE 法によりシベリアンハムスターの GnIH
前 駆 体 cDNA の 全 長 配 列 を 決 定 し た（GenBank JF
７２７８３７）．GnIH 前駆体 cDNA は全長８１１塩基からなり，
５５６７塩基の翻訳領域，
１９３末端側から５１塩基の非翻訳領域，
塩基の非翻訳領域よりなる．翻訳領域は１８９アミノ酸からなるポリペプチドをコードし，そのポリペプチドは，グリシン（G）とアルギニン（R）からなる C 末端のアミド化シグナルを持つ

つの LPXRF （X は L または Q）

配列を含んでいた（図）．

図光周期，松果体除去，メラトニン投与による GnIH
前駆体 mRNA 発現の変化
LD：長日条件， SD：短日条件， Px：松果体除去．
n＝ ．カラム上の異なる文字は統計的有意差を示
０５）．
す（ P ＜０．

成熟 GnIH ペプチドの同定
次にわれわれは，シベリアンハムスターの脳の抽出液

合成物と天然物を用い，HPLC における挙動と質量分析

を GnIH 抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグ

における質量値を比較したところ，両者の数値は一致しラフィーにより精製し，HPLC 溶出液中の GnIH 免疫陽

た（図

）
．

性 分 画 に 存 在 し た 成 熟 GnIH ペ プ チ ド を 質 量 分 析（MALDI―TOF―MS）により同 定 し た．成 熟 GnIH ペ プ

光周期，松果体除去，メラトニン投与による GnIH

チドの質量は GnIH 前駆体 cDNA の配列から推定され前駆体 mRNA 発現の変化

るアミノ酸配列（図）から予想した．HPLC において

２８〜３０分および３０〜３２分に溶出した物質の質量はそれぞ
＋

３９９．
８と１，
９８６．
３m/z（
［M＋H］）であったが（図れ１，

GnIH 前駆体 mRNA の発現量は，ハムスターを１３週間），

短日条件下（時間明：１６時間暗）に置くと長日条件下

こ れ ら の 数 値 は GnIH 前 駆 体 cDNA の 配 列 か ら 推 定（１６時間明：

時間暗）のハムスターに比較して著しくさ れ た TLSRVPSLPQRF―NH２（RFRP―３）お よ び SPA-

低下することが定量的 RT―PCR 法により明らかになっ

PANKVPHSAANLPLRF―NH２（RFRP―１）の 理 論 値 と 同た（図じであった（図てハムスターを１３週間短日条件下に置いた場合は GnIH

28）
．次に，これらのペプチドを合成し，日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013）
．メラトニン合成器官である松果体を除去しハムスターの GnIH

図

光周期，メラトニン投与，松果体除去による
GnIH 免疫陽性神経細胞体の免疫反応性の変化
A GnIH 抗体によるハムスター視床下部背内側領域の免疫染色．スケールバーの長さはすべて１００μm を示す．B GnIH 免疫陽性神経細胞
体の免疫反応性．
LD：長日条件，SD：短日条件，MEL：メラト
ニン投与，Px：松果体除去．n＝ ．カラム上の 異 な る 文 字 は 統 計 的 有 意 差 を 示 す（ P ＜
０．
０５）
．

前駆体 mRNA 発現の発現量は低下しなかったが，松果体を除去したハムスターにメラトニンをサイラスティッ
クプレートにより皮下投与すると GnIH 前駆体 mRNAの発現量が著しく低下した（図）．

GnIH 免疫陽性神経細胞体の分布と光周期，メラトニン投与，松果体除去による免疫反応性の変化
シベリアンハムスターの脳における GnIH 免疫陽性神
経細胞体の分布を免疫染色法により調べた．GnIH 免疫
陽性神経細胞体は前視床下部，視床下部背内側核，乳頭体前核にわたる視床下部内側部に分布していた（図A）．GnIH 免疫陽性神経細胞体の免疫反応性はハムス
ターを１３週間短日条件下に置くと長日条件下のハムス
ターに比較して低下した（図Aa，c，B）．短日条件下では夜間に松果体から分泌されるメラトニンの分泌時間が長くなる．そこで長日条件下のハムスターにメラトニ

図光周期，メラトニン投与，松果体除去による GnIH 免疫陽性神経線維の免疫反応性の変化
A，B 中隔核（SEP）．C，D 視索前核（POA）．E，F
扁桃体（Amg）．G，H 視床下部背内側領域（DMH）．G，
I 視床下部内側基底部（MBH）および弓状核（Arc）．G，
J 正中隆起（ME）．スケールバーの長さは全て１００μm を示す．K GnIH 免疫陽性神経線維の免疫反応性．LD：長日
条件，MEL：メラトニン投与，SD：短日条件，Px：松果体除去．n＝ ．＊は LD 群に比較して統計的有意差がある
ことを示す（ P ＜０．
０５）．

研究フロンティア

29

崇由

他

ンをサイラスティックプレートにより１３週間皮下投与したところ，GnIH 免疫陽性神経細胞体の免疫反応性が短日条件下のハムスター同様に低下した（図A

B 30
Percentage of GnRH-ir cellswith GnIH-ir fiber terminals

産賀

20

Ab，B）
．

一方，ハムスターを短日条件下に置く前に松果体を除去しなかった（図Ad，B）．

GnIH 免疫陽性神経線維の分布と光周期，メラトニ

***

10

すると，GnIH 免疫陽性神経細胞体の免疫反応性は低下

C

0

LD

SD

D

ン投与，松果体除去による免疫反応性の変化
GnIH 免疫陽性神経線維は，外側中隔核（図内側視索前核（図核（図C，D），扁桃体（図

A，B）
，

E，F）
，弓状

I）に最も密に分布していた．GnIH 免疫陽性神経線維は，視床室傍核，視床下部室傍核，中心灰白質に

E

F

G

も分布していた．一方，正中隆起にも僅かであるが GnIH
免疫陽性神経線維が分布していた（図J）．次に，GnIH

免疫陽性神経線維の免疫反応性の光周期，メラトニン投与，松果体除去による影響を調べた．GnIH 免疫陽性神
経線維の免疫反応性は GnIH 免疫陽性神経細胞体の免疫
反応性と同様に，長日条件下におけるメラトニン投与（図K）または短日条件下（図K）により低下した．しかし，短日条件下でも松果体を除去するとほとんどの脳領域で GnIH 免疫陽性神経線維の免疫反応性は低下しな
かった（図

K）
．

GnIH 免疫陽性神経線維の GnRH 免疫陽性神経細胞体への投射と光周期の影響
GnIH 抗体と GnRH 抗体を用いた

重免疫染色により，GnIH 免疫陽性神経線維は GnRH 免疫陽性神経細胞体へ投射していることが観察された（図図A GnIH 免疫陽性神経線維の GnRH 免疫陽性神経細胞体への投射．
白矢頭：GnIH 免疫陽性神経線維，黒矢頭：GnRH 免疫陽性神経細胞体．スケールバーの長さは１０μm を示す．B 光周期による
GnIH 免疫陽性神経線維が投射する GnRH 免疫陽性神経細胞体の００１．
割合の変化．LD：長日条件，SD：短日条件．＊＊＊， P ＜０．
C GnRH 免疫陽性神経細胞体．D GnIH 受容体の発現．E GnRH
抗体を用いずに免疫染色を行った場合．F GnIH 受容体に対する抗体を用いずに免疫染色を行った場合．G C と D を重ねることにより GnRH 免疫陽性神経細胞体に GnIH 受容体が発現していることが示された． スケールバーの長さはすべて１０μm を示す．

GnIH（RFRP―１と RFRP―３）の脳室投与による血中ゴナドトロピン濃度の変化

A）
．また，

GnIH 免疫陽性神経線維が投射する GnRH 免疫陽性神経

ハムスターの GnIH （ハムスター RFRP―１と RFRP―３）

細胞体の割合はハムスターを１３週間短日条件下に置くとがゴナドトロピン放出にどのような影響を及ぼすかを調

長日条件下のハムスターに比較して低下した（図べるために，ハムスター RFRP―１と RFRP―３を長日条件

B）．

下および短日条件下のハムスターの脳室に投与し，血中GnRH 免疫陽性神経細胞体における GnIH 受容体のゴナドトロピン（LH と FSH）濃度を EIA 法により定量発現した．５００ pmol のハムスター RFRP―１または RFRP―３を
長日条件下のハムスターの脳室に投与すると，

GnRH 抗体と GnIH 受容体に対する抗体を用いた

重

血中 LH 濃度が著しく低下した（図分後にA）．１００ pmol の免疫染色により，GnRH 免疫陽性神経細胞体には GnIH

ハムスター RFRP―３を長日条件下のハムスターの脳室に受容体が発現していることが明らかになった（図投与した場合にはC―

分 後 に 血 中 LH 濃 度 が 低 下 し たが，１００ pmol のハムスター RFRP―１の投与ではG）．

に血中 LH 濃度は低下しなかった（図分後A）．ハムスター

RFRP―１または RFRP―３（５００ pmol および１００ pmol）の長日条件下のハムスターへの脳室投与３０分後には血中30

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

ハムスターの GnIH

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

*
***
VehicleLH (ng/ml)C**

RFRP-1 RFRP-1 RFRP-3 RFRP-3
500
100
500
100
pmol
pmol
pmol
pmol

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

*

SD 5 min
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
VehicleD

LD 30 min

Vehicle図B††

LH (ng/ml)

LD 5 min***

RFRP-1 RFRP-1 RFRP-3 RFRP-3
500
100
500
100
pmol
pmol
pmol
pmol

LH (ng/ml)

LH (ng/ml)

A

RFRP-1 RFRP-1 RFRP-3 RFRP-3
500
100
500
100
pmol
pmol
pmol
pmol

SD 30 min
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

††

*
*
Vehicle

RFRP-1500pmol

RFRP-3500pmol

ハムスター GnIH（RFRP―１と RFRP―３）の脳室投与による血中ゴナドトロピン濃度の変化
A 長日条件下（LD）のハムスターの脳室にハムスター RFRP―１または RFRP―３を投与した 分後の血中 LH
濃度．B 短日条件下（SD）のハムスターの脳室にハムスター RFRP―１または RFRP―３を投与した 分後の血中 LH 濃度．CLD のハムスターの脳室にハムスター RFRP―１または RFRP―３を投与した３０分後の血中 LH 濃
度．DSD のハムスターの脳室にハムスター RFRP―１または RFRP―３を投与した３０分後の血中 LH 濃度．n＝＊．
， P ＜０．
０５；＊＊， P ＜０．
０１；＊＊＊， P ＜０．
００１ vs vehicle 投与群．††， P ＜０．
０１．

LH 濃度が有意に低下した（図C）．一方，ハムスター

免疫陽性神経繊維は GnRH 神経細胞体に投射し，GnRH

RFRP―１または RFRP―３（５００ pmol および１００ pmol）は神経細胞体には GnIH 受容体が発現していることが明ら

血中 FSH 濃度を低下させなかった．

かになった．GnIH 前駆体 mRNA や GnIH ペプチドの発

一方，短日条件下のハムスターの脳室にハムスター

現は長日条件下で高く，短日条件下で低かった．夜間に

RFRP―１またはハムスター RFRP―３を投与しても，投与

松果体から分泌されるホルモンであるメラトニンを長日分後に血中 LH 濃度に変化はなかった（図B）．し条件下のハムスターに投与すると GnIH の発現が低下しかし，ハムスター RFRP―１または RFRP―３（５００ pmol）

たが，松果体を除去した短日条件下のハムスターではを短日条件下のハムスターの脳室に投与すると，３０分後

GnIH の発現が低下しなかった．同定したに血中 LH 濃度が上昇した（図を長日条件下のハムスターに脳室投与すると投与D）．ハムスター RFRP

種の GnIH
分お―１または RFRP―３（５００ pmol）は血中 FSH 濃度を上昇

よび３０分後に LH の放出が抑制されたが，短日条件下のさせなかった．

ハムスターへの脳室投与では３０分後に LH の放出が促進された．以上の結果より，ハムスターの GnIH は LH 放

おわりに出を制御していることが分かった．さらに，ハムスターの GnIH の発現はメラトニンにより制御されており，季本研究では，季節繁殖動物であるハムスターの視床下部からを同種の GnIH（ハムスター RFRP―１と RFRP―３）

節によって GnIH は異なる生理作用を有することが分．
かった［４０，４１］

定した．
成熟ペプチドの構造は，
SPAPANKVPHSAANLPLRF―NH２（ハ ム ス タ ー RFRP―１）と TLSRVPSLPQRF―NH２（ハムスター RFRP―３）であった．また，ハムスター GnIH

研究フロンティア

31

産賀

崇由

謝

辞

他

本研究発表の機会を与えていただきました日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔先生，第１７回学術集会会長 吉村𣳾典先生，また本誌編集委員の先生方に感謝申し上げます．

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