研究フロンティア （平成17年度学術奨励賞受賞論文）

卵巣由来Brain-Derived Neurotrophic Factor（BDNF）
による卵成熟機構の解明
河村和弘１），河村

七美２），Aaron JW Hsueh３），田中俊誠１）１）秋田大学医学部生殖発達医学講座産婦人科分野
２）秋田大学医学部感覚器学講座皮膚・形成外科学分野
３）Division of Reproductive Biology，Department of Obstetrics and Gynecology，Satnford University School of Medicine

はじめに末梢組織においても重要な働きをもつことが明らかとなってきている［５］．卵巣においては，BDNFは初期卵哺乳動物では卵胞破裂と卵の最終的な成熟は，下垂体由来のluteinizing hormone（LH）刺激が卵をとりまく顆粒膜細胞および莢膜細胞に作用することによっておこる．LHサージ後すぐに，late prophaseで休止していた胞の発育に必須であることが示されてきたが［６，７］，卵成熟や排卵への役割については不明である．
本研究では，BDNFの卵成熟への役割についてマウスを用いて分子生物学的な検討を行った．

卵は減数分裂を再開し，卵核胞崩壊（germinal vesicle
breakdown；GVBD），chromosomeの 濃 縮， 第 一 極 体方法の放出がおこり，来るべき受精・胚発育に備える．卵はLH受容体を発現していないため，LHは卵巣体細胞に作実験動物としてB6D2F1マウスを用い，すべての動物用し，そこから産生される局所因子がパラクライン作用

実験はNational Institute of Healthの指針に沿って行っにより卵の機能を調節していると考えられる．近年，た． 本 研 究 で は，DNA microarray，real-time RT-LH刺激により顆粒膜細胞からepidermal growth factor

PCR，ELISA，免疫染色，glutathioneアッセイ，卵胞（EGF）-like factorsが，莢膜細胞からinsulin-like３が産培養，第一極体放出試験，in vitro maturation（IVM）

生 さ れ，GVBDを 促 進 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た-in vitro fertilization（IVF），in vivoアッセイ，胚盤胞［１，２］．第一減数分裂終了時までにGVBDおよび第一細胞数測定，統計解析を用いて一連の実験を行った．

極体の放出に代表される卵の核成熟に加え，受精および胚発育能に重要な細胞質成熟（oocyte conditioning）がGonadotropinによる卵巣BDNFの発現調節おこる．しかし，これまでoocyte conditioningに重要な働きをする卵巣由来因子に関する研究は非常に少ない．

21日 齢 マ ウ ス に Humegon を 投 与 し，48時 間 後 にわれわれは，oocyte conditioningに関与する卵巣由来Pregnylを 投 与 し て 卵 胞 成 熟 お よ び 排 卵 を 誘 発 し た．

パラクライン因子を見い出すため，DNA microarrayをRNA 抽 出 の た め Humegon 投 与 後 は ２ 時 間 毎 に，用いて排卵期に発現量が著明に増加する卵巣の遺伝子をPregnyl投 与 後 は １ 時 間 毎 に 卵 巣 を 採 取 し た．DNA網羅的に検討した．その結果，新規卵成熟因子の候補とmicroarray 解 析 は Affymetrix mouse MGU74v2 array

し てBrain-derived neurotrophic factor（BDNF） を 見A, B, and Cを用いた．

い 出 し た．BDNFはneurotrophinフ ァ ミ リ ー に 属 し，

図 １ A（ 折 れ 線 グ ラ フ ） に 示 す よ う に，BDNF

high-affinity tyrosine kinase B（TrkB）受容体とlow-mRNAの発現量はHumegon投与後に軽度増加し，すぐaffinity p75NTR 受 容 体 に 結 合 し 活 性 を 示 す［３］．に減少した後，Pregnyl投与後２時間で再度増加し，３neurotrophinファミリーは中枢神経系に広く発現し，神時 間 後 に ピ ー ク に 達 し た．TrkB mRNAの 発 現 量 は経のアポトーシスや分化に重要な役割を果たすが［４］，gonadotropin投与によって変化しなかった（図１B〔折連絡先：河村和弘，秋田大学医学部生殖発達医学講座産婦人科分野〒010-8543 秋田県秋田市本道1-1-1
TEL: 018-884-6163
FAX: 018-884-6447
E-mail: kawamura@yf7.so-net.ne.jp

れ線グラフ〕）．また，TrkBのもう１つのライガンドであるneurotrophin-4/5（NT-4/5）の基礎値はBDNFと同程度であったが，gonadotropin投与による発現量の変化は認められなかった（図１C〔折れ線グラフ〕）．
DNA microarrayの結果は定量的real-time RT-PCR

日本生殖内分泌学会雑誌（2006）11：39-42

39

河村 和弘

他

A 600

0.025

hCG/Pregnyl *BDNF

A0.0204000.015**200*��������� ��BDNF

BDNF/ß-actin mRNA

expression intensity

PMSG/Humegon

B

BDNF

TrkB

0.010

p75NTR

0.005

PMSG/Humegon

hCG/Pregnyl

TrkB

2000.0004

0.0002

10000
PMSG/Humegon

hCG/Pregnyl

NT-4/5

2000.010
0.005

1000Time (h) 012243648

357120NT-4/5/ß-actin mRNAC

TrkB/ß-actin mRNA00B

BDNF (µg/mg)

D20*

*

100

図１**

3 5 7 120 48
hCG (h)PMSG (h)Gonadotropinによる卵巣BDNF発現量の増加．
（A-C）マウス卵巣におけるgonadotropinによるBDNF（A）, TrkB（B）, NT-４/５（C）
mRNAの発現調節．折れ線グラフ：DNA microarray data，棒グラ
フ： 定 量 的real-time RT-PCR data（D） マ ウ ス 卵 巣 に お け る
gonadotropinによるBDNFタンパクの発現調節．卵巣内BDNF量（μg/mg ovarian wet weight）はELISAにて測定した．
（mean±SEM, n=３）*, P < 0.05 vs．０ h of PMSG treatment．
（文献８より一部改変）

ß-actinC

図２Anti-TrkB

Hoechst33342

��BDNF, TrkB, p75 NTRの卵巣内局在．（A）BDNF, TrkB, p75 NTRmRNAの発現．排卵前卵胞より卵，壁側顆粒膜細胞（顆粒膜），卵丘細胞（卵丘）を単離しnested RT-PCRを行った．陽性コントロール：卵巣，内因性コントロール：β-actin（B）BDNFタンパクの卵巣内局在．hCG投与後，７時間の卵巣を用いて免疫染色を行った．BDNFのシグナルは排卵前卵胞の壁側顆粒膜細胞および卵丘細胞に強く認められ（矢印），前胞状卵胞では壁側顆粒膜細胞が弱く染色される（矢頭）．上：BDNF染色，下：陰性コントロール（Scale bars, 40μm）（C）TrkBタンパクのMI期卵での発現．上段：
TrkB染色，下段：陰性コントロール（文献８より一部改変）

前 胞 状 卵 胞の 壁 側 顆 粒 膜 細 胞に 認 め ら れ た．また，TrkBはMI期の卵に発現が認められた（図２C）．

BDNFによる卵の核成熟誘導
BDNFは卵巣顆粒膜細胞においてhCG刺激により発現にて検証し，同様の変化が認められることを確認した（図が増加し，その受容体であるTrkBが卵に局在している

１A-C〔棒グラフ〕）．さらに，ELISA法を用いて，タことから，BDNFはパラクライン因子として卵の機能をンパクレベルでの卵巣BDNFの発現量変化を検討したと調節している可能性が示唆された．そこで，BDNFの卵ころ，human chorionic gonadotropin（hCG）投与にての核成熟への影響を調べるため，排卵前卵胞培養試験を発現量が増加し，７時間でピークに達した（図１D）．

行い，GVBDへの作用について検討した（図３A）．６
時間の培養にてLHはGVBDを誘導したが，BDNFは高BDNFおよびTrkB受容体の卵巣内局在濃度でも効果を示さなかった．
次に，BDNFの卵における第一極体放出への作用を排卵巣におけるBDNF, TrkB, p75 NTRの局在を調べる

卵前卵胞より取り出した卵-卵丘細胞複合体を培養するため，排卵前卵胞から単離した卵，壁側顆粒膜細胞，卵こ と で 検 討 し た（ 図 ３B, C）． 図 ３Bに 示 す よ う に，丘 細 胞 を 用 い てnested RT-PCRを 行 っ た（ 図 ２A）．

BDNFは濃度依存性に卵の第一極体放出を促進した．しBDNF mRNAは壁側顆粒膜細胞および卵丘細胞に発現

か し， 他 の neurotrophin フ ァ ミ リ ー で あ る，nerveしており，TrkB mRNAは卵のみに発現が認められた．

growth factor（NGF） お よ びneurotrophin-3（NT-3）

p75 NTR mRNAはすべての細胞に発現していた．さらによる第一極体放出は認められなかった．また，このに，免疫染色を用いてタンパクレベルでの発現を検討しBDNFによる作用は，TrkBの細胞外ドメインとの共培たところ，図２Bに示すように，hCG投与後７時間の卵養によって抑制された（図３C）．TrkBの細胞外ドメイ

巣において，BDNFのシグナルは排卵前卵胞の壁側顆粒

ン単独による培養は卵の第一極体放出に影響を及ぼさな膜細胞および卵丘細胞に強く認められ，弱いシグナルがかった（図３C）．さらに，TrKキナーゼの抑制剤であ40

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.112006

卵巣由来Brain-Derived Neurotrophic Factor（BDNF）
による卵成熟機構の解明

GVBD������60%

40200C**600C

3 10 30 NGF NT-3

*20

K252a (100 nM)
K252b (100 nM)

図３60C*60*400+ + +00.3

3-3+ +- -+++2*0EVehicle (n= 9)40K252a (n= 4)

D+BDNFによる卵の核成熟促進．
（A）BDNFのGVBD促進作用の欠如．
排卵前卵胞を培養液のみ（control, C），LH（５μg/ml），BDNF
で ６ 時 間 培 養 後， 卵 のGVBDを 判 定 し た．
（n=3, 39-68 oocytesper experiment）（B）in vitroにおけるBDNFの第一極体放出への作用．排卵前卵胞より採取した卵-卵丘細胞複合体を培養液のみ（control, C），BDNF，NGF（10 ng/ml），NT-3（10 ng/ml）で20
時 間 培 養 後， 卵 の 第 一 極 体 の 放 出 を 判 定 し た．
（n=3, 30-148
oocytes per experiment）（C）BDNFの第一極体放出促進作用の特異性．卵-卵丘細胞複合体をBDNFの存在，非存在下でTrkBの細胞外ドメイン（TrkB EC），Trkキナーゼ抑制剤（K252a），K252bと培養した．
（n=3, 11-82 oocytes per experiment）（D）in vivoにおけるTrkキナーゼ抑制剤の第一極体放出への作用．PMSG投与したマウスにhCGのみ，hCG+K252a，hCG+K252bを腹腔内投与し，12時間後に排卵された卵の第一極体の放出を判定した．（n=４）★,
P < 0.05 vs．control or vehicle group．
（文献８より一部改変）

604010*0Fertilized oocytes Blastocyst

図４Vehicle

80

K252b (n= 5)20vehicle 102020
K252b
K252a
(µg/animal) (µg/animal)

GVC BDNFoocyte MII oocyte

503020-04*MII oocyte/2 cell/ Blastocyst/
Total oocyte MII oocyte MII oocyte

80

*

60D%
������������

1BDNF (ng/ml)

40

BDNF (3 ng/ml)

Control
BDNF

2060

TrkB EC (µg/ml)

B*

40*0(%)

20

LH 100 1,000%*40

BDNF(ng/ml)

CA*

GSH �� (mM)

B

*

���%

Number of embryos/animalA

*

K252a

200K252b
Vehicle K252a K252b

BDNFによる卵の細胞質成熟促進。（A）in vitroにおけるBDNFのoocyte conditioningへの作用。排卵前卵胞より採取した卵-卵丘細Figure 4胞複合体を培養液のみ（control）、BDNF（３ng/ml）で16時間培
養後、卵の第一極体の放出を判定した。MII期卵のみを受精させ、５日間培養し、２細胞期胚および胚盤胞期胚への到達率を評価した。
（n=5, 34-95 oocytes per experiment）（B）BDNFの卵内glutathione（GSH）濃度への影響。卵-卵丘細胞複合体を培養液のみ（control）、
BDNFで16時間培養後、MII期卵内GSH濃度を測定した。
（mean±SEM, n=６）（C）in vivoに お け るTrkキ ナ ー ゼ 抑 制 剤 のoocyte
conditioningへ の 作 用。PMSG処 理 を お こ な っ た マ ウ ス にhCG,
hCG+K252a, hCG+K252b（10μ g, injections at 0, 4, and ８ hafter hCG）を投与し、交配させた。受精卵を卵管より採取し、５日間培養後、胚盤胞への到達を評価した。（D）in vivoにおけるTrkキナーゼ抑制剤の胚盤胞細胞数への影響。（E）Hoechst 33342
染 色 の 胚 盤 胞 像（Scale bars, 20μm）*, P<0.05 vs．control orvehicle group．（文献８より一部改変）

るK252aを用いて，BDNFの作用の特異性に関して検討したところ，K252aはBDNFによる卵の第一極体放出を受精能と胚発生能についてin vitroで検討した．PMSG抑制したが，K252aの細胞膜非透過型であるK252bでは48時間処理によって得られた排卵前卵胞から卵-卵丘細抑制効果は認められなかった（図３C）．

胞複合体を採取し，BDNFの存在・非存在下で16時間培

DNA microarray の 解 析 結 果 か ら，BDNF 以 外 の養した．その際，透明帯の硬化を防ぐため，５%のFBS

neurotrophins（NGF, NT-3, NT-4/5）は排卵前期に増を添加した．FBS（-）のとき（図３B）と同程度に，加しなかったため，Trkキナーゼ抑制剤のK252a投与にBDNFは 第 一 極 体 の 放 出 を 促 進 し た（ 図 ４A，MII-よりin vivoにおけるBDNFの卵機能への役割について検stage oocytes）．得られたMII期卵をin vitroで受精させ討した．K252aおよびK252b投与は排卵数には影響を及たところ，BDNF前処理群では２細胞期胚，胚盤胞期胚

ぼ さ な か っ た が（vehicle, 40.2±7.5；K252a-treated,への発生率が，それぞれ約２倍，５倍に増加した（図４37.8±5.3；K252b-treated, 38.4±8.7），K252a は 排 卵 さA）．

れた卵の第一極体の放出を有意に抑制した（図３D；P

卵内 glutathione（GSH）濃度は精子核のdecondensation< 0.05）．K252b投与は卵の第一極体の放出に影響を与えに重要であり，細胞質成熟の指標の１つとなる［９］．

なかった（図３D）．排卵された卵はほぼすべてGVBD

そ こ で， 卵 内GSH濃 度 を 測 定 し た と こ ろ，germinalをおこしており，卵は拡張した卵丘細胞に覆われていた

vesicle（GV）期卵では低く，BDNF非存在下で培養し（cumulus expansion）．

たMII期卵も低値を示した（図４B）．しかし，BDNF前処理を行ったMII期卵では卵内GSH濃度は有意に上昇しBDNFによる卵の細胞質成熟誘導

た（図４B；P < 0.05）．
Trkキナーゼ抑制剤を用いて，in vivoにおけるBDNF

BDNFのoocyte conditioningへの役割に関して，卵のの oocyte conditioning へ の 作 用 に つ い て 検 討 し た．

研究フロンティア

41

河村 和弘他

PMSG処理を行ったマウスに，hCGおよびhCG+K252a投与を行い，交配させた．hCG投与後22時間で，マウス卵管より受精卵を採取し，体外培養を行った．受精卵の胚盤胞への発生は，コントロール群（vehicle）およびK252b投与群に比較し，K252a投与群では有意に減少した（図４C；P < 0.05）．K252a投与群から得られた胚盤胞は他の群より小さいものが多く（図４E），その細胞数を比較したところ，K252a投与群の胚盤胞の細胞数は他の群の約1/2に減少していた（図４D）．
結論
本研究ではDNA microarrayを用いてLH/hCG刺激により卵巣における産生が急増する分子を手がかりに，卵巣由来の卵成熟因子を検索した．得られた候補のうち，BDNFがパラクライン因子として卵に作用し，核成熟のうちの第一極体の放出と最適な受精・胚発育に必要なoocyte conditioningを 誘 導 す る こ と を 明 ら か に し た［８］．
Neurotrophinファミリーは卵巣機能に深く関与していることが明らかにされつつある．既知のneurotrophin
フ ァ ミ リ ー の う ち，NGF，BDNF，NT-3，NT-4/5とその受容体（TrkA，TrkB，TrkC，p75 NTR）が卵胞に発現している［10］．TrkBまたはBDNFとNT-4/5のノックアウトマウスの卵胞は一次卵胞で発育が停止する［６，７］．さらに，Trkキナーゼ抑制剤のK252a，あるいはBDNFとNT-4/5の中和抗体の投与により，primordialfollicleの発育が阻害される［７］．しかし，BDNFおよびTrkBの排卵前卵胞における役割は不明であった．
こ れ ま で，BDNF の 他 に epidermal growth factor（EGF）が第一極体の放出の促進［11, 12］と胚盤胞の細胞数増加［13］に関与することが報告されてきた．われわれのDNA microarrayによる検索の結果，BDNF以外にも卵成熟因子の候補となる分子がいくつか見い出されており，これらの分子の卵成熟への役割を明らかにしていくことで，総合的な卵成熟機構が解明され，今後の臨床応用へつながっていくと期待している．

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