研究フロンティア （平成18年度学術奨励賞受賞論文）

出生直後のDiethylstilbestrol 投与による多卵性卵胞誘導とエストロジェンレセプターβ佐藤友美１），２），金翰那１），桐ヶ谷明子２），井口泰泉３），林しん治１），２）

１）横浜市立大学大学院・国際総合科学研究科
２）横浜市立大学大学院・総合理学研究科
３）自然科学研究機構・岡崎統合バイオサイエンスセンター

はじめにの卵胞内に複数の卵細胞をもつ多卵性卵胞の多発，卵巣間質の肥大，hemorrhagic cystの形成，子宮の萎縮や筋

エストロジェンは，エストロジェンレセプター(ER)層の乱れ，卵巣に依存しない腟上皮の恒常的な増殖などを介してその作用を示す．マウスのERにはαタイプとの組織学的な異常が引き起こされる［５-９］．多卵性卵βタイプの２種類が存在しており，子宮，腟などでは胞は，女性ホルモンが卵巣に直接作用することにより形ERαが，卵巣や前立腺ではERβが多く発現している．

成され，さらに，多卵性卵胞由来の卵細胞の受精率は低ERαとERβのノックアウトマウスを用いた研究結果か

い こ と が 知 ら れ て い る［10-12］． ま た， 胎 仔 期 のら，生体内でエストロジェン作用を主に仲介しているのethinylestradiol投与や［13］，内分泌かく乱化学物質のはERαであることが分かっている．しかし，ERβの生１つと疑われているbisphenol-A投与によっても誘導さ理的機能については未だに不明な点が多い．

れる［14］．DESはエストロジェンと同様に，ERに結合

1996年，KuiperらによってERβ cDNAがラット前立することによってエストロジェン様作用を示す．DESに腺から同定された［１］．単離されたラットERβは485よる腟上皮の増殖には，ERαが関与していることが分個のアミノ酸を含み，分子量54,200と推定された．それかっているが［15］，多卵性卵胞の誘導にERαとERβまでに単離されていたER（ERα）とは，cDNAレベルどちらが関与しているかは不明であった．

で65%の相同性があり，タンパクレベルでの相同性はドメインごとに16.5（ABドメイン），95.5（Cドメイン），ERβとERαとの比較，ノックアウトマウスの特徴

28.9（Dドメイン），53.5%（EFドメイン）となっている．
また，エストロジェン，合成エストロジェン，その他のERα mRNAは子宮，精巣，脳下垂体，卵巣，腎臓，ステロイドホルモンとの親和性は，Kd値の高い順に副精巣，副腎に，ERβ mRNAは前立腺，卵巣，肺，膀

17β-estradiol > diethylstilbestrol (DES) > estriol >胱，脳，子宮，精巣に発現している［16］．125I-17β-estradiol

estrone > 5α-androstane-3β，17β-diol >> testosterone

を用いて解離定数を調べると，ERαはKd = 0.1 nM，= progesterone = corticosterone = 5αandrostane-3α，ERβはKd = 0.4 nMを示した．生理的作用をもつエス

17β-diolとなっている．CHO細胞を用いたレポーター

トロジェンとの結合親和性は，ERαとERβとでは似通ジーンアッセイでは，10 nM 17β-estradiolにより約３っていたが，植物性エストロジェンはERβと強く結合倍の転写活性が認められた．その後ERβは，ヒト［２］，することが明らかとなった．たとえば，17β-estradiol

マウス［３］と次々と単離され，現在ではほ乳類に限らとの結合親和性をそれぞれ100とすると，coumestrolはず鳥類，は虫類，両生類，魚類，軟骨魚類まで数十種類

ERαが94に対してERβは185，genisteinはERαが５にの動物種で単離，同定されている［４］（図）．

対 し てERβ が36で あ っ た． さ ら に，bisphenol-Aも一方，出生直後のマウスに合成エストロジェンである

ERαが0.05に対してERβが0.33となっていた．このよ

diethylstilbestrol (DES)を投与すると，視床下部─下垂うに，ERαとERβとは構造，局在，リガンドとの結合体系の恒久的な変化により無排卵になるとともに，１つ連絡先：佐藤友美，横浜市立大学大学院国際総合科学研究科
理学専攻〒236-0027 横浜市金沢区瀬戸22-2
TEL: 045-787-2394
FAX: 045-787-2413
E-mail: tomomi@yokohama-cu.ac.jp

親和性において共通点が多くみられる一方で，ERβ独特の特徴もあり，何かしらの特異的な生理的機能を担っていることが予想されている．
ERαとERβの生体内での役割を調べるために，それぞれのノックアウトマウス，およびERαとERβのダブルノックアウトマウスが作製され，さまざまな結果が報

日本生殖内分泌学会雑誌（2007）12：９-13

9佐藤 友美他

図が 少 な く， 生 ま れ た 仔 は 野 生 型 よ り も 小 さ か っ た．

告されている［17］．
ERαノックアウトマウスは1993年に作製され［18］，PMSGに続いてhCGを投与して排卵を誘発させたとこ

大きな特徴として，成獣になるまで普通に成長すること，ろ，排卵数が野生型よりも有意に少なかったことから，雌雄ともに不妊であることが挙げられる．メスの子宮は排卵機能にERβが関与していることが示された．のち重度の形成不全を示し，卵巣には嚢胞があり黄体は認めに，ERβノックアウトマウス卵巣ではPMSGの投与にられない．エストロジェンを３日間投与しても子宮，腟よる顆粒膜細胞の分化が起こらず，エストロジェン合成に変化はなく，したがって，生体内の生殖器官および生も抑制されており，続くhCGの刺激に反応できないため殖に対するエストロジェン作用はERαを介しているこであることが示されている［23］．また，器官培養したとが明らかとなった．その後，ERαノックアウトマウ

ERβノックアウトマウスの卵巣では，初期の胞状卵胞

ス 卵 巣 で はFSHレ セ プ タ ー お よ びLHレ セ プ タ ー のから成熟卵胞への発達が抑制されており，エストロジェmRNA量が野生型に比べて増加していること［19］，視ンの産生も低下していたことからも［24］，ERβが卵胞床下部─下垂体─生殖腺系のネガティブフィードバックの成熟に必要であることが示されている．

機構が働かないことから，脳下垂体でのLH発現およびERαとERβのダブルノックアウトマウスは1999年，血中LH量が増加し，その結果，卵巣において嚢胞の発生，2000年に独立に作製された［25，26］．ダブルノックアウ

ステロイド合成酵素の高発現が引き起こされていること

トマウスは，ERαノックアウトマウスの特徴に加え，が明らかとなった［20］．実際，抗GnRH剤の長期投与

卵巣の卵胞顆粒膜細胞が精巣でみられるセルトリ細胞ににより，高LH状態が抑制されて嚢胞が消失する．さらに，転分化することが報告されている．

生殖腺刺激ホルモンの投与により排卵が誘発されるという報告もある［21］．

これら３種類のノックアウトマウスの特徴から，子宮や腟といったエストロジェン標的器官でのエストロジェ

一方，ERβノックアウトマウスは1998年に作製されン作用はERαを介していること，一方，ERβは卵巣機た［22］．ERβノックアウトマウスは，ERαノックア能に関わっていることが徐々に明らかとなってきた．

ウトマウスの場合と同様，成獣になるまで普通に成長し，さらに雌雄ともに繁殖能力をもっている．しかし産仔数10日本生殖内分泌学会雑誌

Vol．122007

出生直後のDiethylstilbestrol投与による多卵性卵胞誘導とエストロジェンレセプターβ

卵巣におけるERβの局在と役割対照群に比べて卵巣の発達が遅れていた．卵巣の組織切片を詳細に観察したところ，卵胞の発達の遅れのみならERβ mRNAの卵巣内での局在をみてみると，一次卵ず，卵細胞を取り囲む顆粒膜細胞の配列や卵巣内での卵胞から成熟卵胞にいたるまでのすべての顆粒膜細胞で強胞の配列が乱れていた．一方，卵巣内における間質部分く発現しており，間質細胞および卵細胞ではほとんどシの占める割合が増加し，間質内の間隙も多く存在した．

グナルが認められない［１］．経時的な発現を調べると，

すなわち，出生直後のDES投与は，卵巣全体に対する形卵巣では胎齢14．5日からERα mRNAが，胎齢16.5日か態的な異常を引き起こした．10日齢を除くすべての日齢らERβ mRNAが発現している［27］．また，ERβタンで，出生直後にDESを投与すると多卵性卵胞の発生頻度

パクの発現は，一次，二次および成熟卵胞の顆粒膜細胞が対照群に比べて有意に増加した（表１）．また多卵性で認められ，間質細胞，莢膜細胞，黄体細胞，卵細胞で卵胞の数を経時的に見ると，20日齢でピークを示し，そは認められない［28，29］．免疫組織化学的手法を用いるの後，加齢に伴い徐々に減少した．このとき総卵胞数は，と，出生直後の新生仔マウスの卵巣ではERβ免疫陽性30，50日齢のDES群において有意に増加していた．この細胞は認められず，５日齢，10日齢の一次，二次卵胞のことからDESは，０〜20日齢までの卵胞形成時に大きな顆粒膜細胞のみで弱く発現している［29］．一方，生殖影響を与えていることが明らかになった．さらに，５，腺刺激ホルモンのPMSGとhCG投与により強制排卵させ10日齢のマウスの卵巣では，ERβとmullerian inhibiting

た卵では，RT-PCRを用いた解析によりERβのmRNAsubstance(MIS)のタンパクは共に顆粒膜細胞に発現しが検出されている［30］．ており，DESを投与しても局在，発現量に変化はみられ前述したように，ERβは卵巣での卵胞の成熟に必要であることがいくつかの報告から示されている．さらに，なかった．また多卵性卵胞においても，ERβタンパクは対照群と同様に顆粒膜細胞に発現していた．

成熟したERβノックアウトマウスにおける卵巣内の卵

次に，卵巣の形態的な異常や多卵性卵胞形成に関与す胞の発達段階ごとの解析では，原始卵胞の数が増加してるERを同定するために，ERαノックアウトマウスおよいることが報告されている［24］．また，成熟したアロびERβノックアウトマウスを用いて組織学的解析を行マターゼノックアウトマウスでは，原始卵胞および一次った．DESを投与されたERαノックアウトマウスでは，卵胞の数が減少しており，成熟後にエストロジェンを補野生型と同様に高頻度で多卵性卵胞がみられたが，っ ても改善されないこと［31］，20日齢のマウスに抗ERβノックアウトマウスでは，野生型と比べて多卵性GnRH 剤 と ER β 特 異 的 ア ゴ ニ ス ト で あ る

卵 胞 の 出 現 が 有 意 に 減 少 し た． し た が っ て，DESは8-vinylestra-1,3,5 (10)-triene-3,17β-diolを同時に投与

ERαではなく，ERβを介して多卵性卵胞を誘導していすると，3a/bタイプの卵胞（一次卵胞），初期胞状卵胞，ることが明らかとなった．この結果は，植物性エストロ成熟卵胞の数が増加するという報告から［32］，初期のジェンの１つであるgenisteinを新生仔マウスに投与す

卵胞形成に対するエストロジェンの効果にもERβが関ると誘導される多卵性卵胞も，ERβを介しているとい与していると考えられている［33］．

う報告とも一致する［34］．
DESによる多卵性卵胞誘導のメカニズムを解析する

出生直後の合成エストロジェン処理による多卵性卵胞誘導とERβ
われわれは，新生仔期のマウスにDESを投与し，卵巣への影響と多卵性卵胞の誘導メカニズムを解明することを目的としていくつかの実験を行った．まずDESの卵胞形成への影響を調べるため，組織学的な解析と，卵胞形ために，卵胞形成に関するいくつかの因子のmRNA量

表１

Incidence of PFs in an ovary of C57BL/6J mice treated with oil
or 3μg DES neonatally.

Treatments

Age (day)

Incidence of PF (%)

Oil

10

1.70 ± 1.043

200.94 ± 0.187

300.28 ± 0.171

成に関わるタンパクの発現変化を調べた．
出生日を０日齢とし，０〜４日齢までの５日間，１日１回ゴマ油，もしくは３μg DESをC57BL/6Jマウスの新生仔に投与した．DESを投与されたマウス卵巣の形態的変化と多卵性卵胞の発生頻度を調べた結果，出生直後にDESを投与されたC57BL/6Jマウスでは，同じ日齢のDES

103.30 ± 0.745

2015.66 ± 2.017*

30

9.62 ± 1.234*

Data were expressed as the mean ± standard error.
*: p < 0.05 compared with age-matched oil control mice.

研究フロンティア

11佐藤 友美他

をリアルタイムPCR法により経時的に定量したところ，おわりにbone morphogenetic protein-15 (BMP-15)の発現量が，対照群に比べてDES投与群において増加する傾向にあ

ノックアウトマウスの解析や，ERβ特異的アゴニスった（表２）．BMP-15のノックアウトマウスでは，女トの投与により，卵巣機能にERβが重要な役割を果た性ホルモンを投与していないにも関わらず多卵性卵胞がしていることが徐々に明らかにされつつある．一方，わ観察されていることから［35］，BMP-15の増加と多卵れわれの結果から，出生直後の女性ホルモン処理によっ性卵胞の発生に何らかの関連が考えられる．そこで，て引き起こされる多卵性卵胞の誘導は，ERβを介してDESがERβを介してBMP-15のmRNA量を変化させていることが明らかとなった．今後は，ERβ以降のシグいるかどうかERβノックアウトマウスを用いて調べた

ナル伝達経路の解析や，出生後の卵細胞のアポトーシス

ところ，BMP-15の発現量は野生型，ERβノックアウの解析などを通して，多卵性卵胞の発生メカニズムの解トマウスともにDES投与により有意に増加していた（表明を進めていきたい．

３）．このことから，DES投与によるBMP-15の発現量の 増 加 にERβ が 関 与 し て い な い 可 能 性 が 示 さ れ た．
BMP-15は卵細胞が産生する成長因子であり，DES投与による総卵胞数の増加とBMP-15の発現量の増加には関連があるのかもしれない．しかし他の遺伝子群の中には，DESを投与していないにもかかわらず，野生型と比較してERβノックアウトマウスで発現量が変化していたものもあり，ERβアゴニストなどを用いたさらなる解析が必要であると考えている．

表２

Relative expression of BMP-15 mRNA in oil- or DES- treated
C57BL/6J mice neonatally by real-time quantitative PCR.

Treatments

Age (day)

Oil

20

Relative mRNA expression (fold)
1.00 ± 0.832

DES20

1.65 ± 0.692

Data were expressed as the mean ± standard error.
Measurements are normalized to the cyclophilin mRNA and shown
relative to the mRNA expression levels of 20-day-old oil control mice.

表３

Relative expression of BMP-15 mRNA in oil- or DES- treatedwild-type (WT) or ER β knockout (KO) mice neonatally by
real-time quantitative PCR.

Genotypes
WT
KO

Treatments

Age(day)

Relative mRNA expression(fold)

Oil

20

1.00 ± 0.124

DES

20

1.73 ± 0.190*

Oil

20

1.00 ± 0.068

DES

201.78 ± 0.199*

Data were expressed as the mean ± standard error.
Measurements are normalized to the cyclophilin mRNA and shown
relative to the mRNA expression levels of 20-day-old oil control mice.
*: p < 0.05 compared with age-matched oil control mice.

12

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol．122007

文

献

１．Kuiper GGJM, Enmark E, Pelto-Huikko M, Nilsson S, Gustafsson J-A (1996) Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc Natl Acad Sci USA,93, 5925-5930.
２．Mosselman S, Polman J, Dijkema R (1996) ER beta: identification and characterization of a novel human estrogen receptor. FEBS Lett 392, 49-53.
３．Tremblay GB, Tremblay A, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Labrie F, Giguere V (1997) Cloning, chromosomal
localization, and functional analysis of the murine estrogen
receptor β. Mol Endocrinol 11, 353-365.
４．Katsu Y, Myburgh J, Kohno S, Swan GE, Guillette LJ, Iguchi
T (2006) Molecular cloning of estrogen receptor α of theNile crocodile. Comp Biochem Physiol 143, 340-346.
５．Iguchi T (1992) Cellular effects of early exposure to sex
hormones and antihormones. Int Rev Cytol 139, 1-57.
６．Iguchi T, Sato T (2000) Endocrine disruption and developmental abnormalities of female reproduction. Am Zool 40,402-411.
７．Iguchi T (1985) Occurrence of polyovular follicles in ovariesof mice treated neonatally with diethylstilbestrol. Proc Japan
Acad Series B 61, 288-291.
８．Iguchi T, Takasugi N, Bern HA, Mills KT (1986) Frequent
occurrence of polyovular follicles in ovaries of mice exposedneonatally to diethylstilbestrol. Teratology 34, 29-35.
９．Iguchi T, Ohta Y, Fukazawa Y, Takasugi N (1987) Strain
differences in the induction of polyovular follicles by neonatal treatment with diethylstilbestrol in mice. Med Sci Res 15,1407-1407.
10．Iguchi T, Todoroki R, Takasugi N, Petrow V (1988) The effects of an aromatase inhibitor and a 5 alpha-reductase inhibitor upon the occurrence of polyovular follicles, persistentanovulation, and permanent vaginal stratification in micetreated neonatally with testosterone. Biol Reprod 39, 689-697.
11．Iguchi T, Fukazawa Y, Uesugi Y, Takasugi N (1990) Polyovular follicles in mouse ovaries exposed neonatally to diethylstilbestrol in vivo and in vitro. Biol Reprod, 43, 478-484.
12．Iguchi T, Kamiya K, Uesugi Y, Sayama K, Takasugi N(1991) In vitro fertilization of oocytes from polyovular follicles in mouse ovaries exposed neonatally to diethylstilbestrol. In Vivo 5, 359-363.

出生直後のDiethylstilbestrol投与による多卵性卵胞誘導とエストロジェンレセプターβ

13．Kirigaya A, Hayashi S, Iguchi T, Sato T (2006) Developmental effects of ethinylestradiol on reproductive organs of female mice. In Vivo 20, 867-874.
14．Suzuki A, Sugihara A, Uchida K, Sato T, Ohta Y, Katsu Y,Watanabe H, Iguchi T (2002) Developmental effects of perinatal exposure to bisphenol-A and diethylstilbestrol on reproductive organs in female mice. Reprod Toxicol 16,107-116.
15．Couse JF, Dixon D, Yates M, Moore AB, Ma L, Maas R, Korach KS (2001) Estrogen receptor-alpha knockout mice exhibit resistance to the developmental effects of neonatal diethylstilbestrol exposure on the female reproductive tract.
Dev Biol 238, 224-238.
16．Kuiper GGJM, Carlsson B, Grandien K, Enmark E, HäggbladJ, Nilsson S, Gustafsson J-Å (1997) Comparison of the ligand
binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors α and β. Endocrinology 138, 863-870.
17．Couse JF, Korach KS (1999) Estrogen receptor null mice:
What have we learned and where will they lead us? Endocrine Rev 20, 358-417.
18．Lubahn DB, Moyer JS, Golding TS, Couse JF, Korach KS,Smithies O (1993) Alteration of reproductive function but
not prenatal sexual development after insertional disruptionof the mouse estrogen receptor gene. Proc Natl Acad Sci
USA 90, 11162-11166.
19．Schomberg DW, Couse JF, Mukherjee A, Lubahn DB, Sar
M, Mayo KE, Korach KS (1999) Targeted distribution ofthe estrogen receptor-α gene in female mice: Characterization of ovarian responses and phenotype in the adult. Endocrinology 140, 2733-2744.
20．Couse JF, Yates MM, Walker VR, Korach KS (2003) Characterization of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in estrogen receptor (ER) null mice reveals hypergonadism andendocrine sex reversal in females lacking ERα but not ERβ.
Mol Endocrinol 17, 1039-1053.
21．Couse JF, Bunch DO, Lindzey J, Schomberg DW, Korach KS(1999) Prevention of the polycystic ovarian phenotype andcharacterization of ovulatory capacity in the estrogen receptor-αknockout mouse. Endocrinology 140, 5855-5865.
22．Krege JH, Hodgin JB, Couse JF, Enmark E, Warner M,
Mahler JF, Sar M, Korach KS, Gustafsson J-Å, Smithies O(1998) Generation and reproductive phenotypes of micelacking estrogen receptor β. Proc Natl Acad Sci USA 95,
15677-15682.
23．Couse JF, Yates MM, Deroo BJ, Korach KS (2005) Estrogen
receptor-β is critical to granulosa cell differentiation and theovulatory response to gonadotropins. Endocrinology 146,3247-3262.
24．Emmen JMA, Couse JF, Elmore SA, Yates MM, Kissling GE,Korach KS (2005)
growth and ovulation of follicles
from ovaries of estrogen receptor (ER)α and ERβ null miceindicate a role for ERβ in follicular maturation. Endocrinology 146, 2817-2826.
25．Couse JF, Hewitt SC, Bunch DO, Sar M, Walker VR, Davis
BJ, Korach KS (1999) Postnatal sex reversal of the ovaries
in mice lacking estrogen receptors α and β. Science 286,2328-2331.
26．Dupont S, Krust A, Gransmuller A, Dierich A, Chambon P,
Mark M (2000) Effects of single and compound knockoutsof estrogen receptors α(ERα) and β(ERβ) on mouse reproductive phenotypes. Development 127, 4277-4291.
27．Lemmen JG, Broekhof JLM, Kuiper GGJM, Gustafsson J-Å,van der Saag PT, van der Burg B (1999) Expression of estrogen receptor alpha and beta during mouse embryogenesis. Mech Dev 81, 163-167.
28．Fitzpatrick SL, Funkhouser JM, Sindoni DM, Stevis PE,Deecher DC, Bapat AR, Merchenthaler I, Frail DE (1999)
Expression of estrogen receptor-beta protein in rodent ovary. Endocrinology 140, 2581-2591.
29．Sar M, Welsch F (1999) Differential expression of estrogen
receptor-beta and estrogen receptor-alpha in the rat ovary.
Endocrinology 140, 963-971.
30．Hiroi H Momoeda M, Inoue S, Tsuchiya F, Matsumi H, Tsutsumi O, Muramatsu M Taketani Y (1999) Stage-specific expression of estrogen receptor subtypes and estrogen responsive finger protein in preimplantational mouse embryos.
Endocrine J. 46, 153-158.
31．Britt KL, Saunders PK, McPherson SJ, Misso ML, Simpson
ER, Findlay JK (2004) Estrogen actions on follicle formationand early follicle development. Biol Reprod, 71, 1712-1723.
32．Hegele-Hartung C, Siebel P, Peters O, Kosemund D, Muller
G, Hillisch A, Walter A, Kraetzschmar J, Fritzemeier KH(2004) Impact of isotype-selective estrogen receptor agonists on ovarian function. Proc Natl Acad Sci USA 101,5129-5134.
33．Woodruff TK, Mayo KE (2005) To beta or not to beta: estrogen receptors and ovarian function. Endocrinology 146,3244-3246.
34．Jefferson WN, Couse JF, Padilla-Banks E, Korach KS, Newbold RR (2002) Neonatal exposure to genistein induces estrogen receptor (ER)α expression and multioocyte follicles
in the maturing mouse ovary: Evidence for ERβ-mediatedand nonestrogenic actions. Biol Reprod 67, 1285-1296.
35．Yan C, Wang P, DeMayo J, DeMayo FJ, Elvin JA, Carino C,Prasad SV, Skinner SS, Dunber BS, Dube JL, Celete AJ,
Matzuk MM (2001) Synergistic roles of bone morphogenetic
protein 15 and growth differentiation factor 9 in ovarianfunction. Mol Endocrinol 15, 854-866.

研究フロンティア13