研究フロンティア（平成２１年度学術奨励賞受賞論文）

卵巣顆粒膜細胞における転写共役因子 PGC―１α の役割

矢澤 隆志１），梅澤 明弘２），宮本薫１）

１）福井大学医学部分子生体情報学
２）国立成育医療センター研究所・生殖医療部門

はじめに幹細胞をステロイドホルモン産生細胞へと分化させる能力があることを証明している［４］．

哺乳類の主要なステロイドホルモン産生器官は，副腎

私たちは，この間葉系幹細胞の分化系を用いて，ステと生殖腺である．両者は，中間中胚葉由来の生殖腺・副ロイドホルモン産生酵素遺伝子群の発現における DNA腎原基と呼ばれる共通の発生学的な起源をもつが，発生メチル化の役割，卵巣におけるアンドロゲン代謝経路やが進行するにつれて分岐し，それぞれのステロイドホル電子伝達体・P４５０ oxidoreductase（POR）の下垂体ホモン産生細胞へと分化する［１］．発生の起源と同じく，ルモンによる発現制御機構などについて，新たな知見を副腎と生殖腺のステロイドホルモン合成経路は，コレス．本研究では，間葉系幹細胞の研究に端得ている［４―６］

テロールが P４５０scc によりプレグネノロンに変換されるを発して，転写共役因子の PGC―１α が，卵巣顆粒膜細過程で始まり，途中までは共通であるが，それぞれに発胞におけるプロジェステロン産生に重要な役割を果たす

現する P４５０水酸化酵素や脱水素酵素により特有のステことを証明したので，以下に報告する［７］．

ロイドホルモンが産生される．これらの現象に深く関（SFわっているのが，転写因子の Steroidogenic factor―１

ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の黄体化顆粒膜細胞へ―１）／adrenal ４ binding protein（Ad４BP）／NR５A１での分化ある．SF―１／Ad４BP は，核内受容体スーパーファミリーに属し，ステロイドホルモン合成系遺伝子全般のプロまずはじめに，上記の骨髄由来の間葉系幹細胞をステモーター領域に結合して転写を制御している．そのノッロイドホルモン産生細胞へと分化させる方法を，ヒト臍

クアウトマウスでは，副腎と生殖腺が形成されないこと

３に帯血由来の間葉系幹細胞株である UCB４０８E６E７T―３から，ステロイドホルモン産生器官のマスターレギュ適用した．臍帯血に含まれる間葉系幹細胞は，骨髄の間レーターであることが証明されている［２］．

葉系幹細胞に比べると非常に希少であり，４検体から１

私たちは，このステロイドホルモン産生器官の発生・コロニー程度しか得られない［８］．しかしながら，骨分化の複雑な分子メカニズムを調べる系を作るべく，幹髄の細胞に比べて，増殖活性が著しく高いなどの理由に細胞から生殖腺や副腎の細胞を作製することを試みてきより，幹細胞の供給源として注目されている．

た．そして，in vivo と in vitro の実験を通じて，ステこの細胞は，骨髄の細胞と同様，SF―１の導入と cAMPロイドホルモン産生器官と同じ中胚葉起源である骨髄由の添加により，多くのステロイドホルモン産生に関わる来の間葉系幹細胞が，SF―１／Ad４BP の安定導入と培地遺伝子を発現した．しかしながら，その発現パターンは，への cAMP の添加により，生殖腺や副腎のステロイド骨髄の細胞とは異なり，黄体化顆粒膜細胞に近い性質をホルモン産生細胞に分化することを証明した［３］．さ示した（図１A）．この遺伝子発現パターンを支持するらに，SF―１と同じ核内レセプターの５A ファミリーに属ように，細胞は，大量のプロジェステロンを産生した（図する Liver receptor homolog―１（LRH―１）にも，間葉系１B）．

連絡先：矢澤隆志，福井大学医学部分子生体情報学〒９１０―１
１９３ 福井県吉田郡永平寺町松岡下合月２
３―３
TEL：０
７７６―６１―８３１６FAX：０
７７６―６
１―８１０２E-mail : yazawa@u-fukui.ac.jp

転写共役因子・PGC―１α は，顆粒膜細胞におけるプロジェステロン産生に関わる
私たちは，以前，ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞株 hMSC

日本生殖内分泌学会雑誌（2010）15 : 29-3429矢澤隆志他

図１

ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞の黄体化顆粒膜細胞への分化（A）ステロイドホルモン合成系遺伝子 mRNA の RT―PCR による発現解析（B）ステロイドホルモン産生量

図２ （A）PGC―１α は，臍帯血由来の間葉系幹細胞に発現し，分化に伴い発現が上昇する．
（B）マウス卵巣と肝臓における NR５A ファミリーと PGC―１α mRNA の発現（C-F）マウス卵巣における NR５A ファミリーと PGC―１α タンパク質の免疫組織化学法による解析

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卵巣顆粒膜細胞における転写共役因子 PGC―１α の役割―１α は卵巣で比較的高いレベルで発現しており，間葉系幹細胞における発現と一致して，顆粒膜細胞に局在していた．PGC―１α は，顆粒膜細胞において，私たちが間葉系幹細胞を分化させるために用いた SF―１（顆粒膜細胞と莢膜細胞）や LRH―１（顆粒膜細胞）と共局在していた．よって PGC―１α は，これらの転写因子の共役因子として機能する可能性が強く示唆される．そこで，mammalian one hybrid を使ったレポーターアッセイ行った
ところ，PGC―１α は，導入するプラスミド量に依存して，SF―１と LRH―１の転写活性を上げることがわかった（図３A）．PGC―１α のコアクチベーターとしての能力は，００）
既知の SF―１や LRH―１のコアクチベーター（SRC―１，p３に比べて，著しく強いものであった（図３B）．この活１A１，HSD性は，SF―１や LRH―１の標的である StAR,CYP１３B２や Inhibin―α 遺伝子のプロモーター領域を用いたレポーターアッセイにおいても観察された（図４）．よって，PGC―１α は NR５A フ ァ ミ リ ー（SF―１と LRH―１）の強力なコアクチベーターとして働くことがわかった．
次に，レポーターアッセイの結果が，細胞内の遺伝子
図３

PGC―１α は，SF―１や LRH―１の強力なコアクチベーターとして働く上で実際に起こるかどうかを調べるために，ヒト顆粒膜細胞腫由来の KGN 細胞に，アデノウイルスを用いてPGC―１α を過剰発現させた．すると，レポーターアッセ―TERT―E６／E７ が，同じ分化誘導法で，副腎束状層様イの結果を支持するように，PGC―１α により，StAR,CYPの細胞に分化することを報告している［３］．よって，

１
１A１，HSD３B２mRNA の発現が誘導され，細胞はプロ間葉系幹細胞は，由来に関わらずステロイドホルモン産ジェステロンを産生するようになった（図５）．また，生細胞へと分化するが，その形質は，細胞間で異なるこ驚いたことに，PGC―１α の導入は，SF―１と LRH―１の発とがわかる．一方で，分化形質は細胞株内ではほぼ不変現も誘導した．よって，PGC―１α は，単に SF―１や LRH―であったことから，間葉系幹細胞のステロイドホルモン１のコアクチベーターとして働くだけではなく，これら産生細胞への分化運命は，株化の時点で，あらかじめ決の転写因子そのものを誘導することにより，プロジェスまっているものと考えられる．私たちは，この間葉系幹テロン産生を誘導するものと考えられる．PGC―１α の効

細胞間の性質の違いを調べることにより，各ステロイド果は，LRH―１の発現上昇において顕著であり，その発現ホルモン産生細胞への分化機構を調べられると考えた．

は SF―１よりも，はるかに高くなった．この結果は，黄そこで，骨髄ならびに臍帯血由来の間葉系幹細胞で DNA

体顆粒膜細胞において LRH―１の発現が非常に高くなるマイクロアレイを行い，両細胞で発現する遺伝子の違いという事実と一致する［１３］．よって，PGC―１α は，顆を調べた．すると，転写共役因子の PGC―１α は，臍帯粒膜細胞における NR５A ファミリーの発現に関しても，血由来の間葉系幹細胞に発現しており，その発現量は黄黄体化のパターンを誘導する因子であると考えられる．

体化顆粒膜細胞への分化と共に上昇することがわかった

私たちは，この KGN 細胞における結果が生理的である（図２Α）．PGC―１α は，PPARγ を含む核内レセプターのことを，未成熟ラット由来の初代培養・顆粒膜細胞にお転写共役因子であり，肝臓における糖新生やインスリンいて PGC―１α をノックダウンすることにより証明して感受性など代謝機能に深く関与していることが，よく知いる［７］．

２］．私たちは，PGC―１α が顆粒膜細胞られている［９―１の黄体化（プロジェステロン産生）において重要な機能

DAX―１は，PGC―１α に よ る SF―１や LRH―１のをするものと考えて，以下の実験を行った．

活性化を阻害する

まずは PGC―１α の卵巣における発現を，RT―PCR と免疫組織化学法により調べた（図２B,C）．すると，PGC

初代培養の顆粒膜細胞は，FSH の刺激により大量の研究フロンティア

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矢澤隆志

他

図４

図５

PGC―１α は，ステロイドホルモン合成系遺伝子を含む SF―１や LRH―１の標的遺伝子のプロモーター活性を強く上昇させる

ヒト顆粒膜細胞腫由来の KGN 細胞におけるアデノウイルスによる GFP と PGC―１α による過剰発現
各遺伝子の mRNA の発現（A―E）とプロジェステロン産生（F）プロジェステロンが産生する細胞に分化することがよくされているものと考えられる．その最たる候補は，核内知られている．このとき，StAR（１３１倍）や p４５０scc（１０４

レセプターのリプレッサーである DAX―１である．初代倍）といったステロイドホルモン産生に関わる遺伝子が培養の顆粒膜細胞において，DAX―１は FSH 刺激により大きく誘導されるのに比べて，PGC―１α（５倍）は FSH急激に発現が低下しステロイドホルモン産生酵素を含む刺激前から比較的高いレベルで存在しており，刺激後もSF―１や LRH―１の標的遺伝子の転写が誘導されることが，あまり発現が変化しない（図６A）．よって FSH 刺激前

私たちの過去の研究でわかっている［１４］．DAX―１と PGCの PGC―１α は，何らかの因子により，その活性が抑制―１α の関係を調べるためにレポーターアッセイを行った

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卵巣顆粒膜細胞における転写共役因子 PGC―１α の役割

図６ （A）ラット初代培養顆粒膜細胞における FSH による各遺伝子の mRNA 発現の経時的変化（B）DAX―１は，PGC―１α のコアクチベーターとしての能力を著しく阻害する

ところ，DAX―１は，PGC―１α の SF―１や LRH―１対するコたホルモンの産生が異常となる［１８，１９］．PGC―１α は In-アクチベーターとしての能力をほぼ完全に抑制した（図hibin―α や AMH の遺伝子発現に関わっていたことから６B）．よって DAX―１は，ゴナドトロピン非存在下では［７］，今後の研究により，PGC―１α が生殖機能と代謝機PGC―１α の活性を抑制することにより，プロジェステロ能の異常を関連づける新たな因子となる可能性があるとン産生を抑制するものと考えられる．

考えられる．

おわりに引用文献

本研究では，間葉系幹細胞に端を発した研究から転写共役因子の PGC―１α が，卵巣顆粒膜細胞のプロジェステロン産生に重要な役割を果たすことが明らかとなった．PGC―１α は，肝臓においてインスリン抵抗性を引き起こすことがよく知られている．多くの周産期女性の月経不順や不妊の原因となっている多嚢性卵巣症候群（PCOS）の患者は，しばしばインスリン抵抗性を併発している［１５，１６］．PCOS では，元々，莢膜細胞におけるアンドロジェン産生が過剰になることがよく知られていた．近年は顆粒膜細胞にも異常があることがしばしば報告されており［１７，１８］，インヒビンや AMH といっ

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