様式第2号

公益財団法人 東京医科大学がん研究事業団 がん研究助成金研究報告書
令和

3年

6月28日

公益財団法人がん研究事業団理事長 殿氏

研究所

名者 淺岡 真理子 ㊞（職名）

研

究課

研

究

目

研

究

方研

究成（助教）

属

施

施
電所
東京医科大学病院
東京都新宿区西新設
在乳腺科学分野
宿６-７-１
名話
地設
03-3342-6111

題 乳癌における腫瘍免疫応答とAPOBEC3の関連性についての解析
アポリポ蛋白質BmRNA編集触媒ポリペプチド様3（APOBEC3）ファミリーは、一本鎖DNAまたはRNAを標的としたcytidine deaminase活性を持つ酵素群であり、ヒトでは7つのAPOBEC3群 (A3A, A3B, A3C, A3D, A3F, A3G, A3H) が確認されている。これらは、塩基の脱アミノ化により特有のゲノム編集により、突然変異を引き起こすことが知られている。網羅的ゲノムシークエンス解析により、特に乳癌を含む一部の癌のゲノム変異はC→T変異が圧倒的多数を占めており、その特徴的な遺伝子変異は主に的A3Bによって起因されることが明らかとなった。さらに、乳癌腫瘍内のA3B発現量とゲノム不安定性、核Gradeや乳癌サブタイプなどの悪性度や予後にも関連することが示された。このように、乳癌領域におけるA3Bの臨床学的意義について多くの報告があるが、A3B同様にゲノム編集能を持つ他のAPOBEC3群については不明である。
そこで、本研究ではAPOBEC3ファミリーの臨床学的意義について着目し、その遺伝子およびタンパク発現を確認する。
先行研究として、Bioinformatic解析を行った。公開データベース（The Cancer
Genome Atlas及びCancer Cell Line Encyclopedia)より乳癌細胞55株と治療介入前乳癌手術検体のRNA及びDNA Sequenceデータを引用した。各APOBEC3群発現と、mutationやintratumor heterogeneityなどのゲノム不安定性、および抗腫瘍免疫応答についての関連性を検討した。さらに、当院乳癌患者の未治療手術検体または生法
検FFPE検体を用いて、腫瘍浸潤リンパ球数とAPOBEC3発現量を比較し、腫瘍内でのAPOBEC3群の発現局在を同定した。通常の免疫染色(IHC)では個々のAPOBEC3の分子構造が似通っているため、それぞれを別々に認識することができない。そのため、RNAscope®を使用したRNA in situハイブリダイゼーションで蛍光多重染色(Multiplex Assay)を行い、より高精度のAPOBEC3 mRNAの局在解析を行った。
乳癌細胞55株の観察では、A3Bは約半数の細胞株、A3Cは約30％の細胞株で高発現を認めたが、A3D, A3F, A3G, およびA3Hは低～無発現だった。ヒト乳癌組織内において、A3A及びA3B高発現腫瘍では、mutationやintratumor heterogeneityが優位に増加した
一方で、 A3C, A3D, A3F, A3G, およびA3H発現とゲノム不安定性には有意差は認めなかった。Gene set enrichment analysisでは、A3C, A3D, A3F, A3G, およびA3H高発
果 現群は、低発現群に比較して癌免疫応答関連遺伝子群が優位に高発現した。

研

究

成

さらに、腫瘍内浸潤リンパ球（TILs）特にCD8陽性Tリンパ球の浸潤度、T細胞受容体の多様性（TCR diversity）、抗腫瘍免疫の活動性 (Cytolytic activity) の比較でも、A3Bよりも優位にA3C, A3D, A3F, A3G, およびA3Hとの強い関連性を見出だした。
これらよりA3A及びA3Bと、A3C, A3D, A3F, A3G, A3Hは同一の酵素活性を持つタンパク群でありながら乳癌腫瘍内において異なる生物学的意義を持つ事が示唆された。
次にtriple negative乳癌HE染色検体を用いて腫瘍浸潤リンパ球を評価し、腫瘍内リンパ球を十分に含む高浸潤部と腫瘍リンパ球がほとんど見られない低浸潤部を選別し、APOBEC3B及びAPOBEC3G抗体により免疫染色を行った。前研究の結果から、癌細胞内にはAPOBEC3Bが、腫瘍リンパ球にはAPOBEC3Gがそれぞれ高発現することを予想していたが、各タンパク分子の局在に有意差は見られなかった。これはAPOBEC3ファミリーはタンパク分子構造が類似しているため、免疫染色では別々に認識することは困難であるためと考えられ、既報通りの結果となった。そこで、RNAscope®を使用し高精度な局在解析を行った。腫瘍内のうちリンパ球が高浸潤を占めす部分では、低浸潤部に果比較しAPOBEC3GのｍRNAシグナルが増幅される傾向にあった。一方で、癌細胞内ではAPOBEC3BのｍRNAシグナルが確認でき、各ｍRNA発現の不均一性を証明することができた。しかし、腫瘍内APOBEC3B及びAPOBEC3Gの発現量はいずれも非常に低値であったため、視覚的に存在の有無を証明することはできたが、発現量を定量化し統計学的手法により検討するまでには至らなかった。

通常、triple-negative乳癌に対しては術前化学療法を行われる。本研究では、対象を治療介入前の検体に絞ったため、使用可能な検体が限定された。診断時（針生検）の検体では、腫瘍一部の観察となり、局在診断には有用ではない。一方で、手術時の検体では腫瘍全体の観察が可能だが、術前化学療法が施行されたものは除外となる。
また、個々の検体処理における相違からRNAの保存状態に影響があった可能性も否定
今 後 の 予 定 できない。今後、研究対象症例数をさらに増やし、triple-negative乳癌以外のサブタイプについても検討する。また、術前化学療法が導入されたものに関しては、薬物治療への反応性とAPOBEC3B及びAPOBEC3Gの発現量及び発現局在を比較検討する。

様式第3号

公益財団法人

東京医科大学がん研究事業団

がん研究助成金収支決算報告書
令和3年

6月

28日

公益財団法人

がん研究事業団理事長

殿
研究者所属施設名
氏

収支決

東京医科大学病院乳腺科学分野
淺岡名算真理子㊞書(単位 円)

交付を受けた助成金額
費

支

出

内

2,000,000

金目

明

細単 価 及 金 額

額

設備、備品費41,50341,50341,503

消 耗 品 費1,850,235

1,850,235

1,850,235

訳

1,891,738

計過 △ 不 足 額
消費税など
合計
備

計

考

￥108,262￥2,000,000（領収書及び納品書に詳細記載）

支区

分

金

出費

額

内

訳

根

拠

2,550

デジタル温度計

2,850

TPX染色バット

1,260

アイボーイ

フロロテクト

200

細口

１L

J洗浄瓶

250ml

675

アイボーイ

細口

500ｍｌ

432

アイボーイ

細口

250ｍｌ

設備、備品費477

ブラシ洗浄用2号

585

ブラシ洗浄用

5号

4,860

染色篭

4,050

TPX染色バット

3,564

スライドボックス

20,000

学位審査手数料

123,000 BASEscope® Target Probe BA-Hs-APOBEC3B-1z
266,500

BASEscope® Duplex Reagent Kit

18,860 BASEscope® Duplex Control Probe-BA-Hs-1zz
18,860BASEscope® Duplex Negative Control Probe

26,240 RNAscope® Control slides - Human Hela Cell
15,580

Vector Labs Vectamount 60ml

4,140

Pen Super liquid blocker

18,400 BASEscope® Duplex Control Probe-BA-Hs-1zz
18,400BASEscope® Duplex Negative Control Probe

25,600 RNAscope® Control slides - Human Hela Cell
15,200

RNAscope® Wash Buffer

15,200

RNAscope® Target Retreival Reagent

24,000

RNAscope® H2O2 and Proteasse Reagent kit

120,000

BASEscope® Target Probe BA-Hs-APOBEC3G

120,000 BASEscope® Target Probe BA-Hs-APOBEC3B-1z
260,000

BASEscope® Duplex Reagent Kit

123,000

BASEscope® Target Probe BA-Hs-APOBEC3G

78,000Set up for Base scope new target design

15,580

BASEscope® Prove Diluent

35,150Eaststart Essential DNA Green Mastermix

2,240

2-メルカプトエタノール

10,115

ART200 フィルターチップ

49,000

PD-L1 Rabbit mAb

17,100

RNAscope® Wash Buffer

1,770エタノール（特級）

消 耗 品 費11,400
6,650

0.2ml

8連ストリップチューブ

0.2ml

8連ドームキャップ

1,400

アジ化ナトリウム（特級）25G

12,800antibody-diluent with Background reducin

8,820リン酸緩衝生理食塩水

3,546

マイクロチューブ

T7100BK

432

キムワイプ

8,910

プラスチックピペット

9,010

ART200 フィルターチップ

160,000

Fetal Bovine Serum E.U Origin

6,720

Barrier Tip

108,000

ビオラモディスポピペット

5ml

5,760

ビオラモディスポピペット

10ml

7,920

Vディスポピペット

25ml

600

アズワン

ペーパータオル

8,000

TrueLine

遠心チューブ3,240

遮光プラスチック遠心管

49,000

PD-L1

XPRabbit mAb

3,192

カバーガラスNeo

11,400E＠syOligo Standard DNA

1,500※注意：旅費（出張費、宿泊費、交通費）は研究経費に入りません。

未染標本作成費