研究フロンティア（平成 年度学術奨励賞受賞論文）の組織特異的発現は DNA メチル化により制御される
前川亮，佐藤俊，城崎 幸介，田村功，白蓋雄一郎，三原由実子
品川 征大，岡田 真紀，浅田 裕美，竹谷 俊明，田村 博史，杉野 法広
山口大学大学院医学系研究科産科婦人科学講座

はじめにの mRNA の発現と DNA メチル化状態

エストロゲンレセプターαをコードする Estrogen re-ESR1の発現を子宮内膜，乳腺，胎盤，皮膚においてceptor （ESR1）はエストロゲンの作用を仲介する転RT―PCR 法で調べたところ，子宮内膜と乳腺では高発現，写因子である．ESR1の発現は子宮内膜や乳腺では高発現である一方，胎盤や皮膚では低発現であり，組織特異的であることが知られている（図）［ ， ］．しかし，この組織特異的発現がどのように制御されているかについては不明であった．
DNA メチル化はエピジェネティックな機構のつであり，CpG 配列の C（シトシン）に生じる．一般に CpGが密な領域は遺伝子の転写開始点近傍のプロモータ領域に位置し，多くの正常組織では低メチル化になっている．

ESR1
L19
図

各組織におけるの発現状態の発現状態を RT―PCR 法で検討した．
L ；internal control

遺伝子プロモータ領域に生じた DNA メチル化はメチル化 CpG 結合タンパクを誘導し，ヒストン脱アセチル化酵素を介してクロマチンの凝集を引き起こすなどして転．すなわち，遺伝子プロ写因子の結合を抑制する［ ― ］

Gene

モータ領域の DNA メチル化は遺伝子のサイレンシングにおいて中心的な役割を果たしている．

Ⓨ⌧↓

⤌⧊A

DNA メチル化プロファイルは細胞や組織によって異なることが知られ，遺伝子の細胞・組織特異的な発現制Ⓨ⌧．このよう御において重要な役割を有している［ ― ］
な組織特異的発現制御に関与する DNA メチル化領域⤌⧊Bは，組織特異的 DNA メチル化可変領域（T―DMR）と呼ばれる（図）．近年の網羅的遺伝子解析により T―

DMR は種々の遺伝子において数多く存在することがわⓎ⌧↓⤌⧊C

かってきている［ ， ， ］．われわれは，ESR1にもこの T―DMR が存在し，組織特異的発現に関与しているⓎ⌧↓

可能性があると考え，本研究を行った．

⤌⧊D

7'05
連絡先：前川 亮，山口大学大学院医学系研究科産科婦人科学講座〒 ―山口県宇部市南小串 ― ―
TEL：
― ―
FAX：
― ―
E-mail：rmaekawa@yamaguchi-u.ac.jp

図

㠀䝯䝏䝹໬

䝯䝏䝹໬

DNA メチル化と組織特異的メチル化可変領域（Tissuedependent and differentially methylated region；T―DMR）
組織特異的発現に関与する組織特異的メチル化可変領域（T―DMR）の模式図．いずれの組織も近位プロモー
タ領域は非メチル化であるが，T―DMR が非メチル化の組織 B のみが発現可能である．
矢印は転写開始点を示す．

日本生殖内分泌学会雑誌（2017）22 : 25-3225

2+1C-1188BᏊᐑෆ⭷2⓶⭵3⓶⭵2⓶⭵1⫾┙3-790Ꮚᐑෆ⭷3Distal region (T-DMR1)-1188

CpG sites⫾┙2⫾┙1ங⭢3ங⭢2

ங⭢10Ꮚᐑෆ⭷31Ꮚᐑෆ⭷2A他

Ꮚᐑෆ⭷1亮ESR1/GAPDH

前川

Promoter region+1-790ங⭢2+229-556

ங⭢3Ꮚᐑෆ⭷1
⫾┙2
ங⭢1
⫾┙3

⫾┙1

⓶⭵2⓶⭵3⓶⭵1㠀䝯䝏䝹໬CpG

図䝯䝏䝹໬CpGの発現状態と DNA メチル化状態（A）子宮内膜，乳腺，胎盤，皮膚におけるの発現状態を RT―PCR 法で検討した．GAPDH ; internal control（B）DNA メチル化状態を bisulfite sequencing 法により転写開始点上流領域（−から＋ bp）で検討した．Open circle は非メチル化を，closed circle はメチル化を示す．
（C）追加サンプルでの T―DMR の DNA メチル化状態．

胎盤と皮膚では低発現であった（図A）．次に，遺伝と，高メチル化のコンストラクト（pGL（pGL ―TDMR―U）

bp）と遠位領域（−―TDMR―M）を作成した．これらのコンストラクトをbp）の DNA メチル化状態を Bisulfite se-ESR1を高発現する細胞（子宮平滑筋細胞）に導入し，quence 法で調べた．その結果，すべての組織でプロモーレポーター活性を測定した．その結果，pGL ―TDMR―

タ領域は低メチル化であった一方で，遠位領域では高発U ではコントロールベクター（pGL b）と比較して活性現の子宮内膜と乳腺では低メチル化，低発現の胎盤と皮が約膚では高メチル化であった（図―U と比較して活性が有意に減少した（図子プロモータ領域（−から−から＋B）．追加サンプルで倍に上昇し，pGL ―TDMR―M では pGL ―TDMRB）． つまり，C）．遠位領域の DNA メチ

T―DMR に DNA メチル化が加わることで活性が低下す

ル化は発現状態と負の相関を認めており，ESR1の T―ることを意味しており，T―DMR のメチル化が実際に発DMR であると考えられた．われわれはこの領域を T―現制御に関与していることが明らかとなった．

も同様の結果であった（図DMR と定義した．

variants の転写開始点領域 の DNA メ チ ル
T―DMR メチル化レポーターアッセイ
T―DMR が実際に発現に抑制的に作用するかについて

化と mRNA 発現状態
ESR1はプロモータ上流領域に複数の転写開始点があ検討するため，T―DMR メチル化レポーターアッセイをることが知られており（図行った．まず，図点から各 variant が転写される（図A に示すようにプロモータ領域が低メチル化で T―DMR が低メチル化の コ ン ス ト ラ ク ト26

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.22 2017A），それぞれの転写開始B）．ESR1を高発現する組織では主として転写開始点 A，B，C から転写DNA メチル化による ESR1発現制御A㠀䝯䝏䝹໬CpG

䝯䝏䝹໬CpG

BLuc

pGL3b

Luc

TDMR-ULucTDMR-M**0246
Relative luciferase activity
図T―DMR メチル化レポーターアッセイ（A）プロモータ領域が低メチル化で T―DMR がメチル化（pGL ―TDMR―M），および非メチル化（pGL―TDMR―U）のコンストラクト．
（B）ルシフェラーゼ活性の比較．子宮平滑筋細胞にトランスフェクションして活性を測定した．pGLb は empty vector. ＊p＜ ． （）．

bp では子宮されることが知られている［ ］．しかし，各細胞・組低メチル化であったが，−織がどのように転写開始点を選択するかについてはこれ

内膜と乳腺では低メチル化，胎盤と皮膚では高メチル化

までにわかっていなかった．われわれはこれも T―DMRであった（図によって制御されている可能性があると考えた．

bp の領域にも T―DMR が存在していることが明らかとから−E）．この結果により，−から−子宮内膜，乳腺，胎盤，皮膚において転写開始点 A，なった．われわれはこの領域を T―DMR と定義した．

B，C からの variant の発現を RT―PCR 法で検討したとこれらの結果から，各転写開始点からの転写はそれぞれころ，子宮内膜と乳腺ではすべての variant が発現しての転写開始点が有する T―DMR によって制御されているいる一方，胎盤と皮膚ではいずれの variant も発現してと考えられた．

いなかった（図C，D）．次に，転写開始点 A，B，Cの上流の DNA メ チ ル 化 状 態 を bisulfite sequencing 法で検討した．その結果，図T―DMR およびへ結合する転写因子の検討と同様に，転写開始点 Abp のプロモータ領域（AB―DNA メチル化はメチル化された塩基配列への転写因promoter）ではすべての組織で低メチル化であり，T―子の結合を阻害することが知られている．そこで，T―DMR （−DMR の DNA メチル化が転写因子の結合を制御してと B 上流の−から＋から−bp）は子宮内膜と乳腺では低メチル化，胎盤と皮膚では高メチル化であった（図E）．

ESR1の発現制御に関与していると考え，T―DMR と転写開始点 C の上流においては，−bpの塩基配列に対して MEME を用いてモチーフ解析をから−のプロモータ領域（C―promoter）ではすべての組織で行った［ ］．その結果，T―DMR およびの両者にお研究フロンティア

27

前川亮

他

AB
mRNA structure of each variant and primer loci

Common acceptorsplice site㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼀㻿㻿㻌㼡㻱 㼤㼛㼚㻙㻭㻌㻱㼤㼛㼚㻝㻌variant1㻱㼤㼛㼚㻝㻌variant2㼀㻿㻿㻌+234

Exon 1+163+1A-170-321

B-1859-1977

C-3655

D-3750-16118

T2-15967-16307

T1-16220-105804-105674-117140

E2-117015

F-151007

E1-150916

ATG

㼡㻱㼤㼛㼚㻙㻮㻌

*㼀㻿㻿㻌* spliced region㼡㻱 㼤㼛㼚㻙㻯㻌variant3㻱㼤㼛㼚㻝㻌*㻲㼛㼞㼣㼍㼞㼐㻌㼜㼞㼕㼙 㼑㼞㻌㻾㼑㼢㼑㼞㼟㼑㻌㼜㼞㼕㼙㼑㼞㻌CᏊᐑෆ⭷㻱㼚㼐㼛㼙㼑㼠㼞㼕㼡㼙㻌
E4E5E6E7E8E9

㻹 㼍 㼙ங⭢㼙 㼍 㼞㼥 㼓 㼘㼍 㼚 㼐

E10 E11 E12 E13

M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13㻼 㼘㼍⫾┙
㼏㼑 㼚 㼠㼍
P4P5P6P7P8P9⓶⭵㻿 㼗 㼕㼚P10 P11 P12 P13S4S5S6S7S8S9S10 S11 S12 S13

variant1
variant2
variant3
GAPDH

EndometriumᏊᐑෆ⭷ Mammaryங⭢(n=10)
gland(n=10)

Placenta⫾┙(n=12)

Skin
⓶⭵

(n=3)

1.4
1.2
10.8
0.6
0.4
0.20

Variant3/GAPDH mRNA

14121086420

Variant2/GAPDH mRNA

Variant1/GAPDH mRNA

DEndometriumᏊᐑෆ⭷ Mammaryங⭢(n=10)gland(n=10)

Placenta⫾┙(n=12)

Skin
⓶⭵

(n=3)

1.2
10.8
0.6
0.40.20EndometriumᏊᐑෆ⭷ Mammaryங⭢(n=10)
gland(n=10)

Placenta⫾┙(n=12)

Skin
⓶⭵
(n=3)

Ꮚᐑෆ⭷4ங⭢4⫾┙4⓶⭵4㠀䝯䝏䝹໬CpG

図䝯䝏䝹໬CpGの各転写開始点からの発現と DNA メチル化状態（A）の複数の転写開始点（B）転写開始点 A，B，C からの転写と各 variant の構造．矢印は本研究で設計した RT―PCR のプライマーを示す．
（C および D）子宮内膜，乳腺，胎盤，皮膚からの各 variant の発現状態．各組織 サンプルで検討した．
（E）転写開始点 A，B，C の DNA メチル化状態．Bisulfite sequencing 法で検討した．上に転写開始点 A を基準とした各転写開始点の位置を示している．

28

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.22 2017

DNA メチル化による ESR1発現制御A㻯㼜㻳㻌㼟㼕㼠㼑㼟㻌㻙㻞㻥㻡㻟㻌㻙㻞㻢㻟㻠㻌

T-DMR1㻯㻙㻞㻟㻜㻞㻌㻙㻞㻟㻣㻟㻌㻙㻝 㻤 㻣 㻢㻙㻞 㻜 㻥 㻥㻙㻝㻣㻜㻌㻙㻟㻞㻝㻌㻙㻝㻥㻣㻣㻌 㻙㻝㻤㻡㻥㻌

T-DMR2㻙㻝㻝㻤㻤㻌㻮㻌㻙㻣 㻥 㻜㻗㻝㻌 㻗㻝㻢㻟㻌㻭㻌㻗㻝㻌㻙㻡㻢㻢㻌㻱 㼤㼛㼚㻝㻌㻗㻞㻞㻥㻌consensus sequence of EGR1B*Control siRNA

ESR1/GAPDH mRNA

1.4

EGR1 siRNA

EGR1ESR1β-tubulin

1.2
10.8
0.6
0.40.20Control siRNAC

*4
3.5
32.5
21.5
10.50

*0.2
0.15
0.1
0.05
0ESC

図T-DMR2EGR1 T-DMR2(% INPUT)

EGR1 T-DMR1(% INPUT)

T-DMR1

EGR1 siRNA

MDA-MB-231

ESC

MDA-MB-231

T―DMR に結合する転写因子（A）T―DMR と におけるモチーフ解析．のコンセンサス配列が両領域に共通して検出された．
（B）の siRNA によるノックダウン実験．ウエスタンブロット法（左）および RT―PCR 法（右）により EGR のノックダウンが現に与える影響を検討した．
（C）T―DMR および へのの結合の ChIP―qPCR による検討．ESC；子宮内膜平滑筋細胞．MDA―MB―

いて early growth response element （EGR1）が検出された（図A）．EGR1は EGR ファミリーに属し転写

MB―；乳癌細胞株．＊p＜ ．（と比較して EGR1の T―DMR およびが有意に高かった（図の発）．

への結合C）．この結果により，T―DMRの DNA メチル化は，EGR1の結合を抑制する因子として機能することが知られている［ ］．まず，およびEGR1が実際に ESR1発現に関与するかを検討するため，ことで ESR1の組織特異的な発現に関与していることがESR1を高発現する子宮内膜間質細胞において siRNA明らかになった．

（EGR，
ON―TARGET plus SMART pool, Dharmacon）

を用いて EGR1のノックダウンを行い，ESR1の発現が乳癌細胞における発現とDNAメチル化の検討

有意に 低 下 す る こ と を Western blotting 法 と RT―PCRB）．次に，EGR1の結合が DNA

乳癌症例において，ERα陰性，すなわち ESR1の低発メチル化により阻害されるかを検討するため，T―DMR

現は不良な予後と関連することが知られている［ ］．

が低メチル化で高発現の子宮内膜間質細胞と，T―DMR

また乳癌細胞においては，過去に ESR1の低発現は近位法にて確認した（図）プロモータ領域の異常高 DNA メチル化により引き起こにおいて，EGR1の T―DMR への 結 合 を ChIP―qPCR 法．一方で，こされていることが報告されている［ ― ］

で検討した．その結果，子宮内膜間質細胞では，MDA―の近位プロモータ領域が低メチル化にもかかわらずが高メチル化で低発現の乳癌細胞株（MDA―MB―研究フロンティア

29前川亮他AGroup YGroup Z

25
2015105Variant2/GAPDH mRNA

05

Variant3/GAPDH mRNA

Variant1/GAPDH mRNA

Group X

4

BK-1

BK-2

BK-3

BK-4

BK-5

BK-6

BK-7

BK-8

BK-9

BK-10

BK-11

BK-12

BK-13

BK-14

BK-15

BK-16

BK-17

BK-1

BK-2

BK-3

BK-4

BK-5

BK-6

BK-7

BK-8

BK-9

BK-10

BK-11

BK-12

BK-13

BK-14

BK-15

BK-16

BK-17

BK-1

BK-2

BK-3

BK-4

BK-5

BK-6

BK-7

BK-8

BK-9

BK-10

BK-11

BK-12

BK-13

BK-14BK-15

BK-16

BK-174321032106543210

Variant3/GAPDH mRNA

Variant2/GAPDH mRNA

Variant1/GAPDH mRNA

B
6543215432100
MCF76MCF7

MDA-MB-231

ESR1の発現を認めない場合も多く報告されている［ ，］．つまり，これまで乳癌細胞における ESR1低発現

MDA-MB-231

MCF7

MDA-MB-231

ル化であり，正常子宮内膜組織と乳腺組織で認めた結果と同様であった．Group Y と MDA―MB―

においては，を近位プロモータ領域の高メチル化のみでは説明するこ

T―DMR と T―DMR はいずれも高メチル化であり，正とはできなかった．この近位プロモータ領域は，われわ

常 胎 盤 組 織 と 皮 膚 組 織 と 同 様 で あ っ た．Group X とれの AB―promoter 領域に相当する．われわれは乳癌組Group Y の結果は，乳癌においても T―DMR の DNA メ

織の ESR1の発現制御においても T―DMR の DNA メチチル化が ESR1の発現制御に関与していることを示してル化が発現制御に関与している可能性があると考え，乳いる．また興味深いことに，Group Y においては，AB―癌組織と乳癌細胞株において各 variant の転写と各転写

promoter はいずれも低メチル化であったが，C―promoter開始点上流の DNA メチル化状態について検討を行った．

は低メチル化の組織もある一方，メチル化されている組

まず の乳癌組織で variant の転写状態を RT―PCR 法織も存在していた．さらに MDA―MB―

では，AB―pro-をすべて高発moter の上半領域と C―promoter に高度のメチル化を認現する Group X，いずれの variant も発現しない Groupめていた．このことは，癌での特徴として T―DMR が高Y，variant とメチル化の場合，プロモータ領域にもメチル化が及ぶもで検討した．その結果，variant ，れた（図，を高発現する Group Z の群に分類さA）．乳癌細胞株である MCF は variant ，のがあることを示している．一方で，プロモータ領域がはいずれの variant の発高メチル化で T―DMR が低メチル化の組織・細胞はなB）．次に AB―promoter，C―pro-かった．元来，乳腺組織ではプロモータ領域と T―DMR

moter，T―DMR および T―DMR の DNA のメチル化状のいずれも低メチル化状態であることを鑑みると，まず

態 の 検 討 を Bisulfite sequence 法 で 行 っ た（図を発現しており，MDA―MB―現も認めなかった（図C）．

癌化によって T―DMR にメチル化修飾が入って ESR1のGroup X では AB―promoter，C―promoter はいずれも低発現が抑制され，さらに一部ではプロモータ領域にまでメチル化，また T―DMR と T―DMR もいずれも低メチメチル化が及ぶことが推測される．これは，癌組織では

30

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.22 2017

DNA メチル化による ESR1発現制御㠀䝯䝏䝹໬CpG

図

乳癌組織におけるの発現と DNA メチル化（A）乳癌 組織においての variant ， ， の発現を qRT―PCR 法により検討した．発現プロファイルにより（B）乳癌細胞株（MCF および MDA―MB― ）において qRT―PCR 法により各 variant の発現を検討した．

䝯䝏䝹໬CpG群に分類した．

（C）乳癌組織・細胞株において DNA メチル化状態を bisulfite sequencing 法により検討した．

遺伝子近位プロモータに異常メチル化が生じることがあ

タ上流に存在する組織特異的メチル化可変領域（T―るという報告と一致する［ ， ］．過去の AB―promoter

DMR）の DNA メチル化によって制御されていることが領域の高メチル化が ESR1の低発現に関与するという乳明らかとなった．また，ESR1の転写開始点の選択の制癌での報告は，プロモータにメチル化が及んだ例のみを御においても T―DMR が重要な働きをしていることがわ検討した結果であったと推測される．

かった．さ ら に，T―DMR の DNA メ チ ル 化 が ESR1発Group Z で は，promoter，T―DMR と も に DNA メ チ

現に促進的に作用する EGR1の結合を制御することも明ル化状態は Group X と同様の結果であったにもかかわらかとなった．これまで，ESR1の発現制御における DNAらず，発現は variant とのみであった．また MCF でメチル化の役割は乳癌組織・細胞によってなされておは比較的高度の DNA メチル化を認めり，プロモータ領域の DNA メチル化が発現制御に重要は，T―DMR とるにもかかわらず，variant とを発現していた．Groupであると報告されてきた．しかし本研究により，正常組Z と MCF の結果は，乳癌においては T―DMR の DNA織および，一部乳癌組織においても近位プロモータ領域メチル化以外の制御機構も存在している可能性を示唆しは低メチル化に保たれていることが明らかとなり，T―ている．

DMR の DNA メチル化によって組織特異的発現が制御されていることが示された．

おわりに主要なホルモン受容体のつであるエストロゲン受容体がどのように生体内で発現調節されているかが明らか
本研究により ESR1の組織特異的な発現が，プロモーになったことは，子宮内膜症などのエストロゲン依存性研究フロンティア

31

前川亮

他

疾患や，エストロゲン受容体の発現により予後が大きく異なる乳癌において重要な意味をもつ．今後，本成果を踏まえて，臨床検体を用いた研究が加速する可能性がある．

謝辞

本稿は

年度に日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．執筆する機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長勤教授，第 回学術集会長

緒方杉野法広教授に心から感謝申し上げます．

引用文献．Ciocca DR, Roig LM（）Estrogen receptors in humannontarget tissues : biological and clinical implications. Endocr Rev , - .
．Grandien K, Berkenstam A, Gustafsson JA（）The estrogen receptor gene : promoter organization and expression. Int J Biochem Cell Biol ,.
．Bell AC, Felsenfeld G（）Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igfgene. Nature,- .
．Bird A（）DNA methylation patterns and epigeneticmemory. Genes Dev , - .
．Hark AT, Schoenherr CJ, Katz DJ, et al（）CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at theH /Igf locus. Nature,- .
．Maier H, Colbert J, Fitzsimmons D, et al（）Activationof the early B-cell-specific mb― （Ig-alpha）gene by Pax―
is dependent on an unmethylated Ets binding site. Mol
Cell Biol ,.
．Takizawa T, Nakashima K, Namihira M, et al（）DNAmethylation is a critical cell-intrinsic determinant of astrocyte differentiation in the fetal brain. Dev Cell ,- ．
．Wade PA（）Methyl CpG-binding proteins and transcriptional repression. Bioessays,．
．Lee L, Asada H, Kizuka F, et al（）Changes in histone
modification and DNA methylation of the StAR and Cypa promoter regions in granulosa cells undergoing luteinization during ovulation in rats. Endocrinology,.
．Lieb JD, Beck S, Bulyk ML, et al（）Applying wholegenome studies of epigenetic regulation to study humandisease. Cytogenet Genome Res, - .
．Maekawa R, Sato S, Yamagata Y, et al（）Genome-wide
DNA methylation analysis reveals a potential mechanism forthe pathogenesis and development of uterine leiomyomas.
PLoS One , e.
．Maekawa R, Yagi S, Ohgane J, et al（）Disease-dependent differently methylated regions（D―DMRs）of DNA areenriched on the X chromosome in uterine leiomyoma. JReprod Dev ,- ．

32

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.22 2017

．Sato S, Maekawa R, Yamagata Y, et al（）Potentialmechanisms of aberrant DNA hypomethylation on the x
chromosome in uterine leiomyomas. J Reprod Dev,.
．Shiota K, Kogo Y, Ohgane J, et al（）Epigenetic marks
by DNA methylation specific to stem, germ and somaticcells in mice. Genes Cells ,- .
．Shiota K, Yanagimachi R（）Epigenetics by DNA methylation for development of normal and cloned animals. Differentiation ,- .
．Sakamoto H, Suzuki M, Abe T, et al（）Cell type-specific methylation profiles occurring disproportionately in CpG-less regions that delineate developmental similarity. GenesCells ,.
．Yagi S, Hirabayashi K, Sato S, et al（）DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylatedregions（T―DMRs）in mouse promoter regions demonstrating tissue-specific gene expression. Genome Res,.
．Reid G, Denger S, Kos M, et al（）Human estrogen
receptor-alpha: regulation by synthesis, modification and degradation. Cell Mol Life Sci ,- ．
．Bailey TL, Boden M, Buske FA, et al（）
MEME SUITE :tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res, W - .
．Poirier R, Cheval H, Mailhes C, et al（）Distinct functions of egr gene family members in cognitive processes.
Front Neurosci , - .
．McGuire WL（）Hormone receptors : their role in predicting prognosis and response to endocrine therapy. SeminOncol ,- .
．Ferguson AT, Vertino PM, Spitzner JR, et al（）Roleof estrogen receptor gene demethylation and DNA methyltransferase. DNA adduct formation in -aza- ’deoxycytidineinduced cytotoxicity in human breast cancer cells. J Biol
Chem,.
．Giacinti L, Claudio PP, Lopez M, et al（）Epigenetic
information and estrogen receptor alpha expression in breastcancer. Oncologist , - .
．Lapidus RG, Ferguson AT, Ottaviano YL, et al（）Methylation of estrogen and progesterone receptor gene ’ CpG
islands correlates with lack of estrogen and progesteronereceptor gene expression in breast tumors. Clin Cancer
Res ,- .
．Yan L, Yang X, Davidson NE（）Role of DNA methylation and histone acetylation in steroid receptor expressionin breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia ,.
．Yoshida T, Eguchi H, Nakachi K, et al（）Distinct mechanisms of loss of estrogen receptor alpha gene expression
in human breast cancer : methylation of the gene and alteration of trans-acting factors. Carcinogenesis,.
．Barrow TM, Michels KB（）Epigenetic epidemiology ofcancer. Biochem Biophys Res Commun, - .
．Hattori N, Ushijima T（）Compendium of aberrant DNA
methylation and histone modifications in cancer. BiochemBiophys Res Commun, - .