研究フロンティア（令和年度学術奨励賞受賞論文）

mTOR 阻害剤による卵巣予備能温存法の開発
佐藤 可野，河村 和弘
国際医療福祉大学医学部産婦人科高度生殖医療リサーチセンター

おらず，ヒト卵胞発育に対するラパマイシンの作用の報はじめに告はない．そこで，本研究ではラパマイシンの休眠原始先進国では近年初産年齢が高くなっている．しかし年卵胞維持能についてさらなる調査を行った．

齢とともに卵胞数と卵子の質の両方が低下し，不妊症の割合が高くなる．高齢女性における卵子の質の低下の主実験概要な原因は，減数分裂中の異常な染色体分離が原因であると考えられており，初期胚の異数性の増加につながって本研究における実験概要を図に示した．まずは，ラいる ）．さらに，ゴナドトロピン治療に対する卵巣の反応

パマイシンをも卵巣予備能の低下により年齢とともに低下する ）．した評価を行った．そして次にラパマイシンを投与した後，がって，将来の妊娠を希望する女性にとって加齢に伴う卵マウスの卵胞発育期間である巣予備能の低下を遅らせることにより，卵巣の残存卵胞巣機能について評価を行った．さらに，ラパマイシンのを維持する方法を確立することが重要だと考えられる．

卵子の質への影響を調べた．最後にヒト卵巣を断片化しわれわれは以前，PI K/Akt 経路の刺激が原始卵胞活たものを SCID マウスの腎被膜下に移植し，移植後のマ）週間投与したマウスの卵巣機能について週間休薬したマウスの卵性化を誘導することを報告し ，卵巣断片を Akt 製剤でウスにラパマイシンを投与することでヒト卵巣に対する処理し卵胞発育を誘導することを示した．この方法を用ラパマイシンの卵胞数温存効果について検証を行った．

いて早発卵巣不全（POI）の不妊患者に「in vitro activation（IVA）法」として臨床応用している ）．しかし，こラパマイシン投与マウスの卵巣機能評価

れらの治療法は残存卵胞の活性化による卵胞発育を誘導するため，残存卵胞が存在しない場合，有用ではない．

まず，ラパマイシ ン（mg/kg body weight）を 卵そこで本研究では，残存卵胞の維持を目的とした卵巣予胞発育期間である備能の維持に関する治療法の開発を行った．

機能の評価を行った．まず，ラパマイシンによる mTOR近年になり，PI K の下流でもある mTOR が原始卵胞）週間マウスに投与し，その後の卵巣シグナルが阻害できていることを確認した後，ラパマイの活性化に関与していることが報告された ．そこで，シン投与で休眠原始卵胞が維持されているかを組織学的

われわれは mTOR 阻害剤としてよく知られ，既に臨床に解析し，投与後に得られた卵子の体外授精・胚移植を応用されているラパマイシンに着目した．ラパマイシン

行い，投与マウスから得られた卵子の質について検証をはマウスの寿命延長を促進することが知られている行った．

）

mTOR 阻害剤であり ，卵胞予備能を維持し早期の卵巣）

ラパマイシン投与により，マウス卵巣において mTOR機能不全を予防することが報告されている ．また，ラの下流であるリン酸化 S K の発現が減少したことが示

パマイシンは化学療法による卵巣損傷を予防することもされ（図）A），ラパマイシンによる mTOR 抑制がおき報告され ，さらに化学療法と組み合わせて mTOR 阻害ていることを確認した．そこでラパマイシン投与後の卵剤を投与された動物の産仔数は，化学療法のみを投与さ巣を HE 染色した後，各発育段階の卵胞数を計測したと）れたマウスよりも多かった ことも示されている．しかころ，コントロールと比較するとラパマイシン投与によしながら，ラパマイシン投与後の卵子の質は解析されてり原始卵胞数が有意に高値を示し，後期発育卵胞が減少
し て い る こ と が 明 ら か に な っ た（図連絡先：佐藤可野 国際医療福祉大学医学部産婦人科
高度生殖医療リサーチセンター〒 ―千葉県成田市公津の杜 ―TEL ：― ―FAX：― ―E-mail：yorinos@yahoo.co.jp30

日本生殖内分泌学会雑誌（2021）26 : 30-35

B,D）．ま たFOXO は核内で転写因子として細胞周期を停止させ，原始卵胞を休眠状態に維持しているが，核外に移行すると原始卵胞が活性化される．ラパマイシン投与群のマウス卵巣で FOXO の免疫染色を行うと，ラパマイシン投mTOR 阻害剤による卵巣予備能温存法の開発

図与群では FOXO が核内に認められ，原始卵胞が休眠状態であることが示された（図本研究の概要

ラパマイシン投与後に週間休薬したマウスでは，ラC）．さらに過排卵処理

パマイシン投与で低下した排卵数が正常に戻ることが明

後に排卵数を計測したところ，投与群において排卵卵子らかになった．また得られた卵子の受精率，胚盤胞到達が有意に減少することが示された（図E）．このこと率は正常であった．この結果は休薬により mTOR の抑からラパマイシンにより休眠原始卵胞が温存されている制が解除され，卵胞発育が再開したことで排卵数が正常ことが示された．に回復し，ラパマイシン自体は卵子の質に影響を与えな

次に，ラパマイシン投与マウスから得られた卵子の質いことが明らかとなった（図）．

について検証するため，体外授精と胚移植を行った．投与後に得られた卵子の体外授精率および胚盤胞到達率はヒト移植卵巣片の卵巣機能評価有意さが認められなかった．これらを胚移植して得られた産仔について，体重と胎盤重量は正常性であり，これヒト卵巣に対するラパマイシンの卵胞発育抑制効果をまで形態学的異常や生殖能力は正常であることを確認し調べるため，ヒト移植卵巣断片の卵巣機能について評価ている．これらのことからラパマイシンを投与したマウを行った（図A）．患者の同意が得られた凍結卵巣組mm 角に細切したものを SCID マスから得られた卵子の質は正常であること考えられる織片を融解した後，（図ウスの腎被膜下に移植した．このヒト卵巣断片を移植し）．

た SCID マウスにラパマイシンを投与し，その後の卵巣ラパマイシン投与後に休薬したマウスの卵巣機能評価片について評価を行った．

，週間後に移植した卵巣断片を回収した後，HE 染色の組織標本を作製して卵巣次にラパマイシンにより活性化が抑制されていた休眠断片中の全卵胞数を計測し，発育ステージを調べた．コ

原始卵胞は，休薬することで正常に卵胞発育を再開する

ントロール群では時間毎に発育卵胞が増加し原始卵胞数かを調べた．ラパマイシンを投与した後，休眠原始卵胞が減少していたが，ラパマイシン投与群では卵胞発育がから排卵前卵胞までの期間である抑制され，原始卵胞数が維持されることが明らかになっ週間，ラパマイシン投与を休止したマウスの卵巣機能について，このマウスた（図の排卵数の減少が回復するかを調べた．

して形態学的に異常は認められない（図B）．またこれらの卵胞はコントロールと比較C）．

研究フロンティア

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mTOR 阻害剤による卵巣予備能温存法の開発

図ラパマイシン投与における原始卵胞活性化の抑制
Ａ：MTOR 経路の下流タンパク質である S K のリン酸化
ラパマイシンおよび対照群を 日齢雌マウスに 週間腹腔内投与した後に卵巣を摘出し，ウエスタンブロッティング解析を行った．
Ｂ：ラパマイシン投与後の卵巣組織像 Bar：m
Ｃ：ラパマイシン投与後の卵巣 Foxo 免疫染色像
左：対照群，中央： 日齢マウス卵巣，右：ラパマイシン投与マウス卵巣，Bar：m.
Ｄ：ラパマイシン投与マウスの各発育卵胞数の変移 ＊P＜ ． vs. control
Ｅ：ラパマイシン投与マウスの過排卵処理による排卵卵子数の変化 ＊P＜ ． vs. control32

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.26 2021

mTOR 阻害剤による卵巣予備能温存法の開発

図

ラパマイシン投与マウスから得られた卵子の質
ラパマイシン投与マウスから得られた卵子は体外授精後に正常な胚発育を示し，胚移植後に得られた産仔の正常性が確認できた．受精卵を KSOM 中で培養し胚盤胞期胚まで培養し，受精率，胚盤胞到達率を算出した．
さらに胚移植後に得られた産仔の体重および胎盤重量を計測した． ＊P＜ ． vs. control

図

ラパマイシン投与により減少した排卵数のラパマイシン投与休止による変化
ラパマイシン投与後に卵胞発育期間である 週間ラパマイシンを休薬した後，過排卵処理を施し排卵数を計測した． ＊P＜ ． vs. control

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mTOR 阻害剤による卵巣予備能温存法の開発

図

ヒト移植卵巣片における原始卵胞数の維持
Ａ：ラパマイシン投与によるヒト残存原始卵胞の休眠状態の維持を評価するための実験概要
卵巣機能不全の患者から卵胞活性療法の際に得られたヒト卵巣皮質のシート（ × ×mm）をmm 角に細切した後，SCID マウスの腎臓被膜下に移植した．その後ラパマイシンを投与し，週間後に卵巣片を摘出し HE 染色後に全卵巣片中の卵胞数を計測した．
Ｂ：ラパマイシン投与後のヒト卵巣片における原始卵胞数の変移．
Ｃ：ラパマイシン投与における原始卵胞の形態． Bar：34

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.26 2021m.

，

mTOR 阻害剤による卵巣予備能温存法の開発

引用文献
終わりに
今回，mTOR 阻害剤であるラパマイシンを用いてマウス卵巣内の原始卵胞の活性化が抑制されるかを検討した．ラパマイシン投与群ではコントロールと比較して原始卵胞数が有意に高値となり，排卵数が減少した．また，受精率，胚盤胞到達率は影響がなく，胚移植により正常な産仔を得ることができた．ラパマイシンを休薬すると抑制されていた原始卵胞の卵胞発育が再開し，排卵数が回復した．そして，SCID マウスにヒト卵巣断片を腎被膜下移植した実験により，ラパマイシン投与はヒト休眠原始卵胞も温存することが明らかになった．以上から，ラパマイシンは卵子の質に影響を及ぼすことなく，原始卵胞の活性化を抑制することが示された．さらに休薬す
れば原始卵胞の活性化が再開し，排卵数も回復することが明らかになった．
先述したように，卵巣内の卵子は加齢や病的原因により減少する．その結果，排卵障害による不妊を引き起こす．本研究の成果から，将来的には高齢不妊や早発卵巣不全に対して mTOR 阻害剤を用いて原始卵胞の活性化を抑制し，卵巣内の卵胞数を温存する治療が可能になると考えられる．今後はより安全な mTOR 阻害剤の探索を行い，卵胞温存療法のさらなる改善を試みる．
謝辞

本稿は，令和 年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞
した研究内容をまとめたものであり，本稿を執筆する機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事 杉野法広教授，第 回学術集会会長 伊藤潔教授ならびに本誌編集委員の先生方に心から感謝申し上げます．

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