研究フロンティア

妊娠における補体 iC b の新たな胎仔免疫寛容への効果中村 圭吾 ），草間 和哉 ），白汝嵐 ），須田 義人 ），今川 和彦 ））東京大学大学院農学生命科学研究科実験資源動物科学教室）宮城大学食産業学部動物遺伝育種学教室

因子 I（CFI）とその補酵素である補体受容体様タンパ

はじめにク質（CRRY）の存在下で，iC b に転換される［ ］．
胎児や胎盤は父方由来の遺伝子をもつため，本来ならさらに，前眼房において生成・分泌された iC b が細胞ば母体にとって異物として認識され，母体免疫系によっ表面上の補体受容体て排除される．そのため，胎盤形成やその後の妊娠維持作用を抑制する抗炎症性サイトカインの産生につながには，母体の胎児に対する免疫寛容システムが必要となり，免疫寛容を起こすことが報告されている［ ］．こる［（CR ）と結合することで，炎症］．この半同種異である胎児や胎盤を保護する母れらの知見は，補体系はさまざまな免疫機能を有してお体免疫系の詳細を明らかにするため，多くの研究が行わり，そのなかには異物排除だけではなく寛容機能もあるれてきた．その結果，さまざまな免疫細胞の存在や遺伝ことを示している．

子発現が明らかにされてきたが，依然として不明な点が補体成分は主に肝臓で産生されるが，肝臓以外にも胎．また，免疫系には自然免疫と獲得免疫が存多い［ ― ］

盤を含むさまざまな組織で産生されることが知られてい在するが，これまでの母体免疫系に関連する研究は，抗る［ ］．また，マウスの着床期において，C が栄養膜原が体内に侵入してから特異的な免疫細胞を産生する時細胞の脱落膜への浸潤を促進しているとの報告がある

間，いわゆる学習時間を必要とする獲得免疫に注目した［ ］．一方，C や C q のノックアウトマウスでは，胎ものが多い．一方，自然免疫は，獲得免疫の起動に必須盤のラビリンス層が発達不全となる［ ， ］．さらに，であるにもかかわらず，妊娠の免疫では，獲得免疫ほど正常な胎盤と比べ，子癇前症の患者では C q と C が発重要視されてこなかった．したがって，胎盤形成期にお現していないことが報告されている［ ］．これらは，ける自然免疫の存在や機能を明らかにすることは，複雑補体系が生体防御だけでなく，胚着床や胎盤形成にも関な母体免疫系の理解につながる．

与していることを示唆している．これまでさまざまな補補体系とは自然免疫を担う主要な免疫系であり， 種体系に関する研究が行われてきた一方で，補体系の母体類以上の主要なタンパク質分子から構成される．この補―胎児間における役割，とりわけ胎盤形成期からその後体系を活性化するには，古典経路，副経路，レクチン経の分娩に至る時期までの役割は，依然として不明な点が路と呼ばれる多い．

つの生化学的プロセスがある［］．

つの経路の活性方法はそれぞれ異なるが，すべての経路

したがって本研究では，はじめに二次元電気泳動法お成分（C ）の分解につながよび MALDI―TOF/MS 法を用いて，妊娠中期から後期る［ ］．C とは補体系のなかで最も重要な因子としてに発現が変化する獲得免疫以外の免疫関連因子とくに自知られており，補体経路が活性化されると，C は補体然免疫に関わる因子を探索し，さらにそれら因子の胎盤因子 B（CFB）と補体因子 D（CFD）と複合体を形成す形成期から分娩前における役割について検証した．

は活性化されると補体第ることで新たに C b の生成を促進する［ ， ］．その後，生成された C b は再度 CFB，CFD と複合体を形成胎盤形成初期のマウス脱落膜における特異的タンパし，さらに多くの C b を生成する．これら C b が細胞ク質の発現表面上で蓄積されることで，白血球の貪食作用や細胞融解が促進されることが知られている．一方，C b は補体マウスでは，交配後，腟栓が確認された日を妊娠とすると，妊娠連絡先：中村 圭吾，東京大学大学院農学生命科学研究科実験資源動物科学教室〒 ―茨城県笠間市安居
TEL： ――
FAX： ――
E-mail：knakam00@yahoo.co.jp

日

日の着床を経て，その後，胚・栄養膜細胞との相互作用で子宮内膜細胞は脱落膜化する．さらに，妊娠日から 日には栄養膜細胞と脱落膜細胞との間で胎盤形成が始まる．本研究では，二次元電気泳動法を用いて，胎盤形成初期である妊娠 日のマウス脱落膜

日本生殖内分泌学会雑誌（2017）22 : 39-47

39

中村圭吾

他

図

胎盤形成初期のマウス脱落膜における特異的タンパク質の発現
偽妊娠 日の子宮内膜（左）と妊娠 日の脱落膜（右）からそれぞれ抽出したタンパク質を二次元電気泳動法により分離し，Ruby 染色を行った．妊娠 日の脱落膜において，偽妊娠 日の子宮内膜に対して，とくに発現変化が大きくみられた丸で囲ったスポットを取り出し，MALDI―TOF/MS 解析に供した．

組織のタンパク質を，精管結紮したオスと交配させた偽期 ， 日から妊娠後期 日までの脱落膜および胎盤に妊娠 日のマウス子宮内膜組織のタンパク質と比較するおける C 遺伝子発現と C ，C b および iC b タンパク

ことで，母体―胎児間での自然免疫に関わる因子を探索質発現をそれぞれ検討した（図した（図て，妊娠 日 と 比 べ て， ， 日 の C3 mRNA 発 現 は）．偽妊娠に比べて妊娠マウスの脱落膜では，）．脱落膜組織におい特異的なスポット（タンパク質）が検出された．とくにそれぞれ約発現変化が大きくみられた赤丸で囲んだスポットを切りける C3 mRNA 発現は，各妊娠ステージで変化がみら取り，MALDI―TOF/MS 解析に供した結果，スポットれなかった（図から 個のペプチドが同定された．さらに，これらペプ質は，妊娠 日と比べて，妊娠 ， 日の脱落膜および倍と約倍高かった．一方，胎盤組織におA）．また，C ，C b，iC b タンパクチドから自然免疫に関わる因子を探索した結果，C ，C

妊娠 日の胎盤でそれぞれ発現量が上昇した（図b，iC b タンパク質が同定された．

C）．このことから，補体タンパク質 C ，C b，iC b は，B，胎盤形成から分娩に向かい，その発現が増加することがマウス妊娠中期から後期の脱落膜および胎盤組織に判明した．

おける C 遺伝子発現と C ，C b，iC b タンパク質
妊娠後期の脱落膜と胎 盤 に お け る iC b 転 換 酵 素

発現とその補酵素の発現

マウス胎盤形成期の脱落膜で，自然免疫に関わる因子を探索した結果， 妊娠 日の脱落膜から補体 C ， C b，

C b タンパク質は，iC b 転換酵素 CFI とその補酵素iC b のペプチドが検出された．この結果から，リアルである CRRY の存在下で，iC b へと変換される［ ］．

タイム PCR とウエスタンブロット法を用いて，妊娠中そこで，妊娠後期の母体―胎児境界面において iC b が生40

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妊娠における補体 iC b の新たな胎仔免疫寛容への効果

C3

⬺ⴠ⭷⫾┙
C3
C3biC3b

ACTB

D11 D15 D19

図D11 D15 D19

マウス妊娠中期から後期の脱落膜および胎盤組織における C 遺伝子発現と C ，C b，iC b タンパク質発現（A）妊娠 ， ， 日の脱落膜（黒グラフ）と妊娠 ， ， 日の胎盤における C の遺伝子発現（リアルタイム PCR）
．小文字アルファベットの違いは，脱落膜における発現量の差を示す．p＜ ．
（B）妊娠 ， ， 日の脱落膜（左）と妊娠 ， ， 日の胎盤（右）における C ，C b，iC b タンパク質発現（ウエスタンブロット）．
（C）C ，C b，iC b タンパク質発現のデンシトメトリー解析．小文字アルファベットの違いは，脱落膜における発現量の差を示す．大文字アルファベットの違いは，胎盤における発現量の差を示す．p＜ ．

研究フロンティア

41

中村圭吾

他

Cfi

図Crry

妊娠後期の脱落膜と胎盤における iC b 転換酵素とその補酵素の発現
妊娠 ， ， 日の脱落膜組織（黒グラフ）と妊娠 ， ， 日の胎盤組織（白グラフ）におけるとの遺伝子発現（リアルタイム PCR）
．小文字アルファベットの違いは，脱落膜における発現量の差を示す．大文字アルファベットの違いは，胎盤における発現量の差を示す．p＜ ．

成されているのかを確認するために，リアルタイム PCR

ウス胎盤スポンジオ層の特異的マーカーである TPBPA法により，妊娠 ， ， 日の脱落膜および胎盤におけ［ ， ］の染色箇所が一致したことから，iC b 受容体

る Cfi と Crry の遺伝子発現を調べた（図CR は，妊娠 日の胎盤において，スポンジオ層に局在）．Cfi は，妊娠 日の脱落膜と胎盤で妊娠 ， 日と比べて，それしていることが明らかとなった（図ぞれ約 倍と約 倍高く発現していた（図．このことかB）

）
．一方で，

ら，妊娠後期の脱落膜および胎盤において生成された iC

Crry の発現量は，妊娠 日の脱落膜組織および胎盤組b は，母体―胎児の境界面に作用していることが示され織で，上昇する傾向がみられた（図た．と iC b タンパク質発現（図）．これらの結果B，C）から，妊娠 日の脱落膜と胎盤で，C b から iC b への転換が促進される妊娠中期から後期にかけての抗炎症性サイトカインことが示された．の発現

脱落膜および胎盤における iC b 受容体 CR の発現と局在

ここまでの結果から，補体 C から生成された iC b 発現が，脱落膜および胎盤において，妊娠中期から後期に向かい上昇していることが明らかとなった．さらに，こ次に，母体―胎児の境界面における iC b の作用部位をの iC b の受容体 CR が妊娠 日の脱落膜および胎盤の明らかにするために，妊娠 ， ， 日の脱落膜およびスポンジオ層に局在していることが判明した．次に，iC胎盤における iC b 受容体 CR を構成する CD b と CDb が免疫寛容に関与しているか検証するために，妊娠の mRNA 発現を検証した（図A）．胎盤では，Cd11b， ， 日の脱落膜および胎盤における炎症性サイトおよび Cd18の発現量は，妊娠 日では最小であったが，カイン Il12と抗炎症性サイトカイン Il10と Tgfb1の遺伝

妊娠 日には約 倍と約子発現を調べた（図倍の上昇がみられた（図A）．一 方，脱 落 膜 で は，Cd11b と Cd18の mRNA 発 現は，各妊娠ステージで一定の発現量を維持していた（図）．炎症性サイトカイン Il12を構成するサブユニット Il12a と Il12b の発現は，妊娠 日目に比べて，妊娠 ， 日の脱落膜および胎盤で少なかっA）．

た（図マウス胎盤は，母体側と胎児側の組織が混在するスポiC b の発現と同様に妊娠 日の脱落膜および胎盤で上ンジオ層と，胎児組織から構成されるラビリンス層に分昇し，Tgfb1の発現は，妊娠 日の胎盤で上昇が確認さ）． 一方， 抗炎症性サイトカイン Il10の発現は，けられる．そこで，免疫組織染色法により，妊娠 日のれた（図胎盤組織における CD b タンパク質の局在を検証した

後期において iC b が脱落膜や胎盤に局在する CR に作（図42B）．胎盤組織における CD b の染色箇所と，マ

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.22 2017）．これらサイトカインの発現変化は，妊娠用した結果，生じたものと考えられる．

妊娠における補体 iC b の新たな胎仔免疫寛容への効果

Cd11b䝷䝡䝸䞁䝇ᒙ䝷䝡䝸䞁䝇ᒙ䝷䝡䝸䞁䝇ᒙ

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図Cd18䝇䝫䞁䝆䜸ᒙ䝷䝡䝸䞁䝇ᒙ

脱落膜および胎盤における iC b 受容体 CR の発現と局在（A）マウス妊娠 ， ， 日の脱落膜（黒グラフ）および胎盤（白グラフ）における iC b 受容体 CR を構成するとの遺伝子発現（リアルタイム PCR）
．大文字アルファベットの違いは，胎盤における発現量の差を示す．p＜ ．
（B）マウス妊娠 日の胎盤組織におけるマウス胎盤のスポンジオ層を特異的に染色する TPBPA（a，c，e）と CD b（b，d，f）の免疫組織染色像．
（a）および（c）の組織切片は，抗 TPBPA 抗体，（b）および（c）の組織切片は，抗 CD b 抗体でそれぞれ染色された．
（c）は（a）そして（d）は（b）の黒枠で囲われた箇所をそれぞれ拡大した．また，ネガティブコントロールとして，（e）と（f）の組織切片は，それぞれ抗 IgG 抗体で染色された．スケールバー＝ µm（a，b，c，d）， µm（e，f）

研究フロンティア

43

中村圭吾

他

図

Il12a

Il12b

Il10

Tgfb1

妊娠中期から後期にかけての抗炎症性サイトカインの発現
マウス妊娠 ， ， 日の脱落膜（黒グラフ）および胎盤（白グラフ）における炎症性サイトカインを構成するサブユニット，と抗炎症性サイトカインとの遺伝子発現（リアルタイム PCR）
．小文字アルファベットの違いは，脱落膜における発現量の差を示す．大文字アルファベットの違いは，胎盤における発現量の差を示す．p＜ ．

妊娠後期の子宮における抗炎症性サイトカイン発現

おわりにに対する iC b の効果
本研究では，妊娠中期から後期に特徴的な自然免疫に
次に，われわれは妊娠後期の子宮における抗炎症性サ関わる因子を探索し，さらにそれら因子の胎盤形成からイトカインの発現に対する iC b の効果を検証するため分娩期における役割について検証し，補体因子 iC b のに，妊娠マウスへの iC b 中和抗体の投与実験を行った．

妊娠中期から後期における新たな胎児免疫寛容への役割

妊娠 日に iC b 中和抗体を尾静脈より投与し，妊娠について明らかにした．iC b は，自然免疫系のオプソ

日に脱落膜/胎盤の形態変化と抗炎症性サイトカインのニン作用に関わり，マクロファージなどの白血球の細胞遺伝子発現を調べた（図表面に存在する CD b と CD から構成される補体受）．脱落膜／胎盤の形態は，PBS 投与群に対して，iC b 中和抗体投与群で出血，炎容体 CR に結合し，食作用を促進する因子として知ら症反応がみられた（図A）．また，PBS 投与群と比べれている［ ］．本研究で，脱落膜および胎盤において，て，抗炎症性サイトカイン Il10と Tgfb1の遺伝子発現は，Cd11b と Cd18が高発現しており，CD b が妊娠 日のiC b 中和抗体投与群で減少していた．これらの結果か胎盤のスポンジオ層に局在していることを明らかにしら，iC b が，脱落膜および胎盤で抗炎症性サイトカイた．さらに，抗炎症性サイトカイン Il10と Tgfb1の発現ンの発現を制御していることが示唆された．

が，妊娠 日の脱落膜組織と胎盤組織で高い一方で，炎症性サイトカイン Il12発現が，妊娠 ， 日の脱落膜44

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妊娠における補体 iC b の新たな胎仔免疫寛容への効果PBSᢞ୚⩌Il10

図iC3bᢠయᢞ୚⩌Tgfb1

妊娠後期の子宮における抗炎症性サイトカイン発現に対する iC b の効果
妊娠 日のマウスに iC b 中和抗体と尾静脈より投与し，妊娠 日に胎盤の形態変化と脱落膜および胎盤の抗炎症性サイトカインとの遺伝子発現を調べた．また，コントロールとして PBS投与群も設けた．
（A）妊娠 日のマウス胎盤の形態変化．
（左）PBS 投与群（右）iC b 中和抗体投与群（B）妊娠 日マウスの脱落膜および胎盤における PBS 投与群（白グラフ）と iC b 中和抗体投与群（黒グラフ）のとの遺伝子発現（リアルタイム PCR）
．p＜ ．

および胎盤において減少していた．加えて，iC b 中和

ン IL の発現が減少することが報告されており［ ］，抗体の投与は，抗炎症性サイトカインの遺伝子発現を減今回の報告とも一致している．

少させた．これらの知見から，母体―胎児境界面である

今回の実験で，妊娠 ， ， 日の脱落膜および胎盤脱落膜や胎盤のスポンジオ層に存在する iC b が，白血で，iC b の発現に加えて C b から iC b への転換に必要球表面に存在する CR に結合することで，抗炎症性サな Cfi と Crry の高発現が明らかになった． その一方で，イトカイン産生の促進につながり，その結果として免疫妊娠 ， ， 日の脱落膜と胎盤で，C b の発現を促進寛容が起こることが示唆された．さらに，免疫寛容が起する Cfb と Cfd の発現は，確認されなかった（結果は省こっていると考えられている前眼房においても，iC b略）．Crry 欠損マウスでの胚の生存率は，補体系の破綻と CR が結合することで，抗炎症性サイトカイン ILや胎盤の炎症とともに，妊娠 ．日目以降に急激に減少と TGFB の発現が上昇し，一方で，炎症性サイトカイする［ ］．CRRY は，CFI とともに C b から iC b への研究フロンティア

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中村圭吾

他

転換を制御しており［ ］，さらに，今回の実験で，妊娠中期から後期にかけて iC b の発現が上昇したことから，妊娠中期から分娩に至るには，C b から iC b への転換促進が必要であることが示唆された．
これまでの報告から，補体系の破綻が，胎盤形成不全を原因とする妊娠合併症に関与していることが明らかとなっている．実際，早期胎盤剥離の患者では，補体系 Cを中心とした機能障害がみつかっている［ ］．さらに今回の実験で，iC b 中和抗体投与群マウスの胎盤形態が，早期胎盤剥離を発症した患者の胎盤と類似していた点から，iC b が妊娠中期から後期における胎盤維持に関与していることが考えられた．また，自己免疫疾患の一種である抗リン脂質抗体症候群の患者では，胎盤損傷とともに C b の高発現が確認されている［ ］．これらの知見は，活性型の C b から抑制型の iC b への転換制御が，胎盤形成および機能不全に関わる疾患に対する新たな治療法につながることを示唆している．
以上，本研究で得られた知見から，マウスは獲得免疫だけではなく補体系などの自然免疫も駆使することで，妊娠中期から分娩期までの免疫系を維持していることが明らかとなった．さらに，これまでの臨床報告や今回の結果から，補体 iC b は胎盤機能不全を原因とする流産や早産に対する新たな治療薬になることが示唆された．

謝辞

本稿を執筆する機会を与えてくださった日本生殖内分泌学会理事長 緒方 勤先生，第 回学術集会会長 杉野法広先生，ならびに本誌編集委員の先生方に心から感謝申し上げます．

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