ORIGINAL PAPER

ラットの黄体形成ホルモン（LH）の律動性分泌リズムと摂食パターン―摂食パターンを用いた非侵襲的性周期判定法―
治京 玉記１），内山 文昭１，２））中村学園大学薬膳科学研究所分子栄養学部門）中村学園大学大学院栄養科学研究科

キーワード：エストロゲン，サージ状黄体形成ホルモン

下垂体前葉―性腺軸のホルモン情報伝達系により調節さ（LH）
分泌，腟垢スメア検査法，性周期判定，摂食パター

れている．視床下部から分泌される性腺刺激ホルモン放ン

出ホルモン（gonadotropin-releasing hormone ; GnRH）
や下垂体前葉から放出されるゴナドトロピンである卵胞

要約

刺 激 ホ ル モ ン（follicle-stimulating hormone ; FSH）および黄体形成ホルモン（luteinizing hormone ; LH）が性周期を観察・分類する判定方法として，腟垢スメア性周期の発現に主要な役割を果たしている．また，下垂検査法が主に用いられている．しかし，腟垢スメア検査

体前葉における GnRH 受容体や卵巣における FSH およ法は，腟垢スメアの採取から乾燥，染色そして鏡検によび LH 受容体が量的に変動することも性周期発現の一因る判定から評価するため時間と手間がかかる．さらに，として注目されている．卵巣は女性生殖腺として，性周腟垢スメアを採取時にラットにストレス負荷をかけるた期に応じて，ステロイドホルモンであるエストロゲンおめ不規則な性周期を示しやすい．

よびプロゲステロンを産生する［］．脳下垂体から分

本研究では，エストロゲンの標的組織ギムザ染色法で泌される FSH は，卵胞の発達とエストロゲン産生を促ある腟垢スメア検査法と血清中黄体形成ホルモン （LH）し，その後の LH の律動性分泌（LH サージ）により排量から摂食パターンと性周期の関連性を明らかにし，非卵が起きる［侵襲的に性周期を判定する方法ついて検討を行った．

からは，プロゲステロンが産生される．

はじめに

性周期判定には，エストロゲンの標的組織ギムザ染色法］．排卵後に黄体が形成されると，卵巣現在，生殖内分泌系の研究で用いられているラットのである腟垢スメア検査法が汎用されている［―１０］．し近年，女性の社会進出がめざましくなり，それと同時かし，腟垢スメア検査法は，腟垢スメアの採取，乾燥，に若年性更年期障害，月経異常や不妊症等の患者数は染色そして鏡検により判定するため時間と手間がかか年々増加傾向にあり，薬の対症療法だけでは対処できなる．さらに，ラットにストレス負荷をかけず腟垢スメアい深刻な社会問題となっている．そこで，原因療法を目を採取するためには熟練度が必要とされている．また，的とした手法として，生殖生理機能を調節する漢方療法

腟粘膜上皮の角質層の形成に伴うインピーダンス（交流が欠かせない治療手法になっている．しかし，数ある漢電気抵抗）値を指標とする腟インピーダンス法［１１，１２］

方療法の効能・効果の研究では，in vitro レベルでの報も性周期判定に用いられているが，腟内にプローブを挿］，六君子湯［４，５］のように動入するため腟垢スメア検査法同様に挿入ストレスにより物実験を用いた in vivo レベルでの作用機序の解明が切不規則な性周期を示す．そこで，非侵襲的に性周期を判望されている．

定する方法が望まれている．

告が大半を占め［―生殖生理機能を調節する生殖内分泌系は，視床下部―

本研究では，週齢の Sprague―Dawley（SD）系雌性ラットに一般的に用いられている CE２食餌を自由摂食
連絡先：治京玉記，中村学園大学薬膳科学研究所分子栄養学部門〒８１４―０１９８ 福岡市城南区別府 丁目７―１
FAX：０９２―８５１―６７１２
FAX：０９２―８４１―７７６２
E-mail：tjikyo@nakamura-u.ac.jp

で与え，腟垢スメア検査法と血清中 LH 量から摂食パターンと性周期の関係ついて検討を行った．

日本生殖内分泌学会雑誌（2013）18 : 35-38

35

治京玉記

他

図

角化上皮細胞数と摂食量
A．性周期正常ラット，B．連続非発情ラット

実験方法

結果と考察

実験動物の管理は，中村学園大学アニマルセンター運営規定に基づき行った．

週齢雌ラット１０匹を用いて，連続１４日間における体重，摂食量および腟垢スメア検査法による角化上皮細胞１０匹の Sprague-Dawley（SD）系雌性ラット（９W，日数と有核上皮細胞の変動をモニタリングした．その結果，本チャールス・リバー社）を用いた．ラットは，個別の角化上皮細胞数の変動パターンから１０匹中１２時間明暗サイクル（ステンレスケージで，な性周期を回帰しており，残り：００点灯），匹が，正常匹においては発情が起室内一定（２２℃）下で管理した．水道水，粉末飼料（CEこらない連続非発情性の性周期が認められた．また，正２，日本クレア株式会社）は，自由摂食させた．体重，常性周期ラットでは，発情期において摂食量が減少し，：３０に重量を測定した．腟垢スメア検

一方，連続非発情ラットでは，摂食量の変化が認められ摂食量は，毎日査は，毎日：３０〜：００の間に腟垢スメアを採取し，なかった（図）．

ギムザ染色液（メルク社）にて染色を施し，血球計算盤

腟垢スメアは，エストロゲンとプロゲステロンの標的（Burker-Turk）を用いた検鏡による角化上皮細胞数と有組織である腟粘膜上皮の剥離細胞からなる．そのため，核上皮細胞数をカウントした．細胞の構成要素により性卵巣発育，排卵，黄体形成，黄体退行といった一連の卵周期を判定した．

巣の変化に伴うホルモン変動に対応して腟垢スメアも変連続非発情ラットは，実験開始１４日目の午後１６時に，化することから，腟垢スメアの角化上皮細胞を指標とし正常周期ラットは，１４日間モニタリング後，発情前期のた性周期の観察を行うことができる．エストロゲンは，午後１６時に断頭屠殺し，それぞれ採血をした．血液は，腟上皮を多層化し角化を促進させ，プロゲステロンは，血清分離した後−８０℃に保存し血中 LH の測定に供し腟上皮の角化を抑制し，粘液化させる．ラットの性周期た．血清中 LH ホルモンの測定は，三菱化学メディエン

はス株式会社動物検査センターに依頼し，シバヤギ社レビが順番に繰り返される．発情前期，発情後期では，角化

スⓇLH―ラット（S タイプ）キットにて測定した．本測上皮細胞と有核上皮細胞が観察され，発情期では，すべ３〜１０ ng/mL であり，定におけるアッセイ感度は，０．て角化上皮細胞で有核上皮細胞は観測されない．休止期

またアッセイ内変動係数（CV : Coefficient of variation）

では，粘液化が観測される．腟垢スメア検査法による角３〜２．
７％，平均値は１．
９（±０．
４９）％であった．
は，１．

化上皮細胞数の変動パターンから，正常性周期ラットで０５以下を有意差検定は，T 検定法により行い，P＜０．

は，エストロゲンが分泌されており，一方，連続非発情有意差ありと判定した．統計処理には，統計解析ソフト

ラットでは，エストロゲンが分泌されていないと考えら

IBM SPSS Statistics version １９（IBM 社）を使用した．

れる．

日間で発情前期，発情期，発情後期，休止期の期

排卵は，発情前期の１５時〜１８時の間にサージ状の LH分泌がなされ，原始卵胞の成熟分裂を再開させ，排卵・36

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

ラットの黄体形成ホルモン（LH）の律動性分泌リズムと摂食パターン―摂食パターンを用いた非侵襲的性周期判定法―発情を引き起こす．正常な性周期を回帰しているラットの LH サージ時での血清中 LH 量と連続非発情ラットの血清中 LH 量を図LH 量が，に示す．正常性周期ラットの血清中ng/mL であったのに対し，連続非発情ラットの血清中 LH 量は，ng/mL と差が認められた．LHの分泌パターンは，基礎分泌（パルス状分泌）と律動性分泌（サージ状分泌）のつのパターンに分けることができる．生殖生理機能を調節する性腺刺激ホルモン分泌を調整するのは，視床下部からの GnRH 分泌であり，そこで，パルス状 LH 分泌は，パルス状 GnRH 分泌に，サージ状 LH 分泌は，サージ状 GnRH 分泌にそれぞれ支配されている．エストロゲンのポジティブフィードバッ
ク作用は，サージ状 GnRH 分泌を促進し，ネガティブ図

フィードバック作用は，パルス状 GnRH 分泌を促進さ

発情ラットと非発情ラットの血清中LH 量．
（平均±標準誤差，＊＊P＜０．
０１）．角化上皮細胞の変動パターンと血清中 LHせる［１３］量の結果から，正常性周期ラットでは，日周期でエストロゲンの分泌とサージ状の LH が分泌されることによ分泌を促進され，次いで，サージ状 LH が分泌されるこり排卵・発情が引き起こされているが，一方，連続非発とにより発情が起こると同時に，エストロゲン分泌によ情ラットでは，エストロゲンが分泌されなかったためにり摂食量が抑制されたためと考えられ，性周期と摂食パ

サージ状の LH 分泌されず排卵・発情は引き起こされなターンには，一連の相関性があるといえる．この結果，かったものと考えられる．

摂食パターンを用いることでラットにストレス負荷をかところで，エストロゲンは性ホルモンであるが，摂食．
調整にも関わっていることが知られている［１４，１５］
卵巣除去したラットにエストロゲンを持続投与すると摂けず非侵襲的に性周期を判定することができた．
今後，この摂食パターンを用いた性周期判定が，生殖内分泌系の in vivo 研究に役立つことを期待したい．

食量が減少し，脂肪量減少を伴った体重減少が観測され．
たことから摂食抑制因子があると考えられている［１６］

引用文献

エストロゲンは，主に成熟卵胞から分泌され，その受容体は全身に分布しているが，脳内では摂食調節に重要な神経核である視床下部弓状核に多く発現している．エス
トロゲン受容体は核内受容体であり，リガンドであるエストロゲンと結合することで活性化し，ある特定の遺伝子発現を制御する転写因子となる．エストロゲン受容体は，視床下部弓状核に多く分布している．視床下部弓状核には，グレリン，ニューロペプチドおよびアグーチ関連ペプチドなど，摂食調節に係わる内分泌物質のニューロンが局在しており，エストロゲンがこれらニューロン．
を介して摂食調整に関与していると考えらている［１７］
このことは，正常性周期ラットでの発情期における摂食量減少と連続非発情ラットでの摂食量不変化の現象の要因であると考えられる．
本研究では，サージ状 LH が分泌される正常な性周期を回帰しているラットでは，発情期で摂食量が減少し，一方，連続非発情ラットでは，発情期がないため摂食量に変化が認められなかった．これは，エストロゲンのポジティブフィードバック作用により，サージ状 GnRH

．Usuki S, Tanaka J, Kawakura Y, Usuki Y（１９９２）A proposalof ovarian ERAANPS（endothelin-renin-angiotensin-atrial natriuretic peptide system）and effects of tokishakuyakusan,keishibukuryogan, shakuyakukanzoto and unkeito on theERAANPS. Am J Chin Med ２０, ６５-７４.
．Tasaka K, Miyake A, Ohtsuka S, Yoshimoto Y, Aono T,Tanizawa O（１９８５）Stimulatory effect of a traditional herbal
medicine, Unkeito on LH-RH release. Nihon Sanka Fujinka
Gakkai Zasshi ３７, ２８２１-２８２６.
．Usuki S（１９９２）Effects of tokishakuyakusan, keishibukuryogan and unkeito on DNA polymerase alpha activity inuteri of pregnant mare’s serum gonadotropin-treated immature rats. Am J Chin Med ２０, ７５-８２.
．Matsumura T, Arai M, Yonemitsu Y, Maruoka D, TanakaT, Suzuki T, Yoshikawa M, Imazeki F, Yokosuka O（２０１０）
The traditional Japanese medicine Rikkunshito increases
the plasma level of ghrelin in humans and mice. J Gastroenterol ４５, ３００-３０７.
．Kito Y, Suzuki H（２０１０）Properties of Rikkunshi-to（TJ-４３）-induced relaxation of rat gastric fundus smooth muscles.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol ２９８, ７５５-７６３.
．Brown-Grant K（１９７１）The role of steroid hormones in thecontrol of gonadotrophin secretion in adult female mam-ORIGINAL PAPER37

治京玉記他

mals. U.C.L.A. Forum Med Sci １５, ２６９-２８８.
．Yen SS, Tsai CC, Naftolin F, Vandenberg G, Ajabor L（１９７２）Pulsatile patterns of gonadotropin release in subjects with and without ovarian function. J Clin Endocrinol
Metab ３４, ６７１-６７５.
．Allen E（１９２２）The oestrous cycle in the mouse. Amer J
Anat ３０, ２９７-３７１.
．Long L A, Evans HM（１９２２）The oestrous cycIe in the ratand its associated phenomena. Memoirs of the Universityof Califomia ６, １-１４８.
１０．Clauberg C（１９３１）GenitalcycIus und Schwangerschaft bei
der weisen Maus. Dauer des GenitalcycIus. Archiv f Gynakologie １４７, ５４９-５９６.
１１．Bartos L（１９７５）Oestral cycle phase determination by meansof electrical impedance measurements of the vaginal mucous membrane in rats. Physiol Bohemoslov ２４, ４２７.
１２．増田善行，高倉賢二，廣瀬雅哉，中西桂子，後藤栄，竹林浩
一，野田洋一（１９９９）自然性周期におけるラット胚の回収と38

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

培養―腟インピーダンス法による交配時期に決定と胚培養に用いる培養液の検討―．産婦の進歩 ５１, １７９-１８５.
１３．舩橋利也，貴邑冨久子（２００４）ラット性腺刺激ホルモン分泌の中枢性調節機構．日本生殖内分泌学会雑誌 ９, １１-１４.
１４．Asarian L, Geary N（２００２）Cyclic estradiol treatment normalizes body weight and restores physiological patterns of
spontaneous feeding and sexual receptivity in ovariectomized rats. Horm Behav ４２, ４６１-４７１.
１５．Asarian L, Geary N（２００６）Modulation of appetite by gonadal steroid hormones. Philos Trans R Soc Lond B BiolSci ３６１, １２５１-１２６３.
１６．Shimizu H, Ohtani K, Kato Y, Tanaka Y, Mori M（１９９６）
Withdrawal of corrected estrogen increases hypothalamic
neuropeptide Y（NPY）mRNA expression in ovariectomized
obese rat. Neurosci Lett ２０４, ８１-８４.
１７．樋口宗史，山口 剛，仁木剛史（２００６）NPY-Y５受容体ノッ
クアウトマウスの摂食ペプチド発現の制御と摂食．日本薬理学雑誌 １２７, ９２-９６.