研究フロンティア （平成17年度学術奨励賞受賞論文）

成体脳の神経新生に対するエストロジェン作用
─グラニュリンの関与と加齢に伴う変化─
千葉秀一，鈴木正寿，山内啓太郎，西原真杉

東京大学大学院農学生命科学研究科獣医生理学教室

はじめに

このうちエストロジェンについては，海馬歯状回SGZの神経前駆細胞の増殖を促進し，幼若な神経細胞の数を近年，ヒトを含む多くの哺乳類の成体においても神経増加させることが示唆されたことから，近年注目を集め細胞の新生が生じていることが明らかになってきたている［７］．エストロジェン受容体βのノックアウト［１］．哺乳類の成体脳における神経新生はごく限られたマウスの研究などから，エストロジェンは学習や記憶と領域で生じており［２］，１つは側脳室上皮細胞下に存いった脳機能を促進することが明らかになっている

在する脳室下領域（subventricular zone；SVZ）で増殖［８］．また閉経後の女性におけるエストロジェン補充療した神経前駆細胞がrostral migratory streamと呼ばれ法が認知機能を向上させるとの報告もある［９］．さらに，る構造を経て嗅球へと移動し，顆粒細胞や傍糸球体細胞

エストロジェンは脳虚血などによって生じる脳障害を軽といった介在神経細胞へと最終分化することが知られて減させることも報告されている［10］．このようなエスいる（図１Ａ）．また，神経新生は海馬歯状回においてトロジェンの神経保護作用において，神経新生の促進がも生じており，顆粒細胞層と歯状回門の境界領域である何らかの貢献をしている可能性がある．

subgranular zone（SGZ）で増殖した神経前駆細胞は顆粒細胞へと分化する（図１Ｂ）．新生した神経細胞は電SVZやSGZで増殖する神経前駆細胞にはエストロジェ

気生理学的な実験などから機能的な成熟神経細胞へ分化

ン受容体の発現が報告されているが［11］，in vitroの神することが示唆されており［３］，細胞分裂阻害薬を用経前駆細胞に対するエストロジェンの直接作用による影いることによってこれらの領域における神経新生を阻害

響が in vivo の報告と一致しなかったことなどから，エすると，記憶形成［４］や抗うつ薬の作用［５］が障害ストロジェンの神経前駆細胞の増殖促進メカニズムにつされることなどが明らかになっている．成体脳におけるいてはいまだ検討の余地が大きい．神経前駆細胞の増殖神経新生の制御メカニズムの解明は現在精力的に行われはいわゆるnicheにおける細胞外因子より制御されていており，アルツハイマー病やパーキンソン病といった神ると考えられ，エストロジェン受容体を発現する細胞は経変性疾患や脳虚血等によって生じた脳の障害に対する再生療法の開発に大きな貢献がなされるものと期待されている．現在のところ，線維芽細胞成長因子（FGF）や大脳新皮質インスリン様成長因子-Ｉ（IGF-Ｉ）といった成長因子や脳由来神経栄養因子（BDNF）といったニューロトロ

側脳室

海馬歯状回

フィン，セロトニンやグルタミン酸などの神経伝達物質，エストロジェンやアンドロジェンなどのホルモンが神経新生の制御因子として知られている［２］．さらに，神経新生は加齢に伴って減少することが明らかになっていAる［６］
．

側脳室

BSVZ

連絡先：千葉秀一，東京大学大学院農学生命科学研究科獣医生理学教室〒113-8657 東京都文京区弥生1-1-1
TEL: 03-5841-5386
FAX: 03-5841-8017
E-mail: aa47162@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

顆粒細胞層SGZ
歯状回門

図１

Subventricular zone（SVZ；Ａ）およびsubgranular zone（SGZ；Ｂ）
におけるBrdU標識された増殖細胞（矢頭）．脳断面図はPaxinosand Watson（1996）より改変．Scale bar：200 μm．

日本生殖内分泌学会雑誌（2006）11：17-20

図１. 千葉ら17千葉 秀一他

増殖中の細胞自身のみならず，その近傍の細胞にも発現がみられるようである［12］．そこで，われわれは海馬神経前駆細胞の増殖と成長因子遺伝子発現に対するエストロジェンの作用においてエストロジェンにより誘導され，なおかつ神経新生に関与すると考えられる成長因子がエストロジェン10週齢と50週齢のWistar-Imamichi系雌ラットの卵巣の神経前駆細胞の増殖促進作用に関与しているとの仮説を摘出（OVX）し，その２週間後に芳香化エストラジを 立 て た． そ し て， そ の 候 補 と し て グ ラ ニ ュ リ ン，オール（EB）を投与した．EB投与２時間後にブロモデ

IGF-ＩそしてBDNFの３種の成長因子を候補にあげた．

オキシウリジン（BrdU）を投与し，さらにEB投与４時間後に４%パラホルムアルデヒドによって灌流固定した

グラニュリン

脳をサンプリングした．サンプリングした脳から30μm厚の切片を作成し，BrdUに対する免疫染色を行った．

ここで，まずグラニュリンについての説明をしたい．

BrdUはチミジン類似化合物で，細胞周期のＳ期にDNA

グラニュリンは別名をエピセリンとも呼ばれ，分子量６に取り込まれ，増殖中の細胞を標識することができる（図ｋのシステインリッチなポリペプチドの性状をとる成長１の写真参照）．このことを利用し，海馬歯状回におけ因子である［13］．グラニュリンの発現は肺や脾臓，腎臓，るBrdU標識された増殖細胞数を計測した結果（表１），精巣上体といったさまざまな臓器で見られる［14］．マ

12週齢のOVXラットではEB処置によって増殖細胞数がウスにおけるin situ hybridizationによるグラニュリン増加していることを確認した．52週齢のOVXラットでmRNAの発現解析では，脳においては海馬の錐体細胞は，12週齢と比較して増殖細胞数の大きな減少が溶媒投や顆粒細胞，小脳のプルキンエ細胞などに発現している与群とEB投与群の双方で観察された．また，52週齢のことが明らかになっている［15］．われわれは，出生後OVXラットではEB処置による増殖細胞数の変化は観察まもないラットの視床下部におけるmRNA量をcDNAされなかった．

subtraction法を用いて雌雄で比較し，その結果雄にお次に，12および52週齢のOVXラットにEBを投与し，いてグラニュリン前駆体のmRNA発現量が増加していその４時間後に海馬をサンプリングして，total RNAをることを発見した［16］．この時期の雄のラット視床下

抽 出 し た． 逆 転 写 反 応（RT） に よ りtotal RNAか ら部では，精巣由来のテストステロンから代謝されたエスcDNAを得た後に，リアルタイムPCRを行い，グラニュトロジェンが作用して雄特有の神経回路を形成すること

リン，IGF-I，BDNFのそれぞれの前駆体mRNA量を測で，成熟後に見られる視床下部の解剖学的な性差や雄型定した（表２）．その結果，12週齢のOVXラットでは，性行動の発現，神経内分泌学な性差が生み出されている

グラニュリン前駆体のmRNA量がEB処置によって約４と考えられている［17］．グラニュリン前駆体mRNAに倍に増加していることが明らかになったが，IGF-I，対するアンチセンスオリゴDNAを雄ラット新生子の視床下部に投与したところ雄型性行動の発現に影響が見られたことから，グラニュリンは雄型神経回路の形成に関

表１

海馬歯状回SGZにおける細胞増殖に対するエストロジェンの影響与していることが示唆されている［18］．また，グラニ週齢処置

BrdU陽性細胞数ュリン前駆体mRNAの発現はエストロジェンにより誘

12125252

対照
EB対照
EB

10.3±0.7
13.3±1.1*
1.2±0.3†
0.9±0.1†

導され，乳腺がん細胞であるMCF７においてエストロジェン依存性の増殖に関与していることが示唆されている［19］．以上の報告から本研究においてグラニュリンに着目することにし，上記の仮説を検討するために12週

EB：芳香化エストラジオール．値は１切片あたりの細胞数の平均±標準誤差．＊は対照に対して，†は12週齢の同処置群に対してP＜0.05で有意差があることを表す．

齢のラットと，middle-ageのモデルとして52週齢のラットを用いて，海馬歯状回における細胞増殖を検討するとともにグラニュリンを含む３種の成長因子mRNA量を解析した．

表２

海馬の成長因子mRNAレベルに対するエストロジェンおよび加齢の影響

週齢12125252

処置対照
EB対照
EB

グラニュリン
0.69±0.31
2.60±0.72*
0.61±0.190.56±0.15

IGF-I
0.33±0.042
0.29±0.036
0.23±0.023
0.24±0.033

BDNF
1.08±0.09
1.01±0.04
0.97±0.16
0.76±0.12

IGF-I：insulin-like growth factor-I, BDNF：brain-derived neurotrophicfactor．値は各mRNA量をribosomal protein S29で標準化したものの平均±標準誤差．＊は対照に対してP＜0.05で有意差があることを表す．

18

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.112006

成体脳の神経新生に対するエストロジェン作用の加齢に伴う変化

BDNF前駆体のmRNA量には変化が見られなかった．一

示している可能性もあり，今後さらなる解明を進めたい．

方，52週 齢 のOVXラ ッ ト で は， ３ 種 の 成 長 因 子 のmRNA量はいずれもEB処置によって変化しなかった．

おわりに以上の実験の結果から，エストロジェンの歯状回の細胞増殖および海馬グラニュリン発現に対する促進作用は

本研究によりエストロジェンの神経新生に対する作用加齢に伴って消失してしまうものの，12週齢のOVXラにグラニュリンが関与していることが示唆された．グラットにおいて，エストロジェンによって発現誘導されたニュリンの神経新生に対する作用については今後もさらグラニュリンが，エストロジェンの歯状回の細胞増殖になる検討が必要だと考えている．われわれはグラニュリ対する促進作用を仲介している可能性が示された．

ンノックアウトマウスを作出して，解剖学的・行動学的な解析を進めており，そこから新たな知見が得られるも培養神経前駆細胞に対するエストロジェン作用のと期待している．
また，本研究では加齢に伴って神経前駆細胞増殖に対上記の可能性を検討するために，10週齢の雌ラット由するエストロジェン作用が消失していたことが見い出さ来の海馬をトリプシン処理し，回収・播種した神経前駆れた．本研究のようにエストロジェン作用が加齢に伴っ細胞をbFGF，上皮成長因子（EGF），ヘパリンを加えて変化することを報告した例はあまり見られないが，嗅たDMEM/F12で培養した．培養神経前駆細胞にβエス球や視床下部ではエストロジェン受容体が加齢に伴ってトラジオール処置し，24時間後の細胞数をテトラゾリウ変化しているとの報告もある［20，21］．海馬歯状回にム塩（WST-1）の還元によって生じたホルマザンの濃おけるエストロジェン受容体発現の加齢に伴う変化にも度を測定した．神経前駆細胞はβエストラジオールの濃興味がもたれるところであるが，そのためにも神経前駆度依存的に増殖し，もっとも顕著な反応がみられた10-5細胞増殖に対するエストロジェンの作用期序について，Ｍβエストラジオール存在下では対照の約1.5倍に増加

さらなる解明が必要であろう．近年のWomen's Healthしていた．さらに，10 Ｍβエストラジオール存在下で，Initiativeの報告［22］等により，認知機能に対するエスグラニュリン前駆体に対する抗体を10ｍｇ加えたとこ

トロジェン補充療法の効果については懐疑的な見方も多ろ，βエストラジオールの細胞増殖促進作用は消失した

くなってきているが，この効果について，加齢などの条（表３）．培養神経前駆細胞からtotal RNAを抽出し，件がエストロジェン作用を修飾している可能性があるこ

RT-PCRによってエストロジェン受容体（ER）およびとを提唱したい．

-5

グラニュリン前駆体のmRNA発現を調べたところ，ERaおよびERbのmRNA発現は今回の実験では確認することができなかったが，グラニュリン前駆体mRNAが発現していることが確認できた．以上の結果から，エストロジェンは神経前駆細胞に直接作用して細胞増殖を促進することが示唆され，この作用にはグラニュリンの自己分泌作用によって仲介されている可能性がある．なお，今回の実験では神経前駆細胞にエストロジェン受容体の発現が確認できなかったが，エストロジェンの作用が比較的急性であることなどを考えると，エストロジェンが細胞膜受容体を介して，遺伝子の転写を伴わない作用を

表３ 培養神経前駆細胞の増殖に対するエストロジェンおよび抗グラニュリン抗体（Anti-Grn）の影響
抗体
IgG
IgG
Anti-Grn
Anti-Grn

処置対照
E2
対照E2相対細胞数（％）
100±14147±12＊100±13115±10値は対照を100%とした時の相対細胞数±標準誤差．＊は対照に対してP＜0.05で有意差があることを表す．

文

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19千葉 秀一

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