５．細胞死の誘導機構!

f58B34785!F4<9B64,BGGE!,781;7G6!gT^NG48=53!,5GG!35B19!!
48!G52=5:4B!g2;=B1!'!,5GG6!
Xiuyang Ma et al. Antioxid. Redox Signal. 4:371 (2002)!
メナディオンは白血病g2;=B1!'細胞におけるgT^に連結した細胞死を!
二相性に制御する!
メナディオン（ビタミンＫ３、MD、強い活性酸素種の産生剤）、ネクローシス（カスパーゼの活性化を伴わない細胞死）、アポトーシス、細胞死誘導の二相性
コントロール、JNKのリン酸化と活性化の二相性コントロール

メナディオンLf)Oと_"h"によるg2;=B1細胞の)TIフラグメンターションと!
細胞死の誘導
+/
++

,,

1

LIOメナディオンはネクローシスを、LHO!_"h"はアポトーシスを誘導した。!
L(O!メナディオンによる細胞死（ネクローシス）の誘導は二相性にコントロール!
され、L)O!_"h"によるアポトーシスの誘導は一相性にコントロールされた。

メナディオンと_"h"によるgT^のリン酸化と活性化
+

,

/

1

LIO Y#!µfのf)はgT^のリン酸化を0#〜Z#!分間誘導したが0##!µfのf)は誘!
導しなかった。LHO_"h"は濃度依存性にgT^をリン酸化し、0#〜0"#分間持続させた。!
LIK!HO!gT^のリン酸化とL(K!)O基質,Ng28のリン酸化能は相関した。

ドミナントネガティブgT^遺伝子導入g2;=B1細胞における!
低濃度のメナディオンによる細胞死の誘導の抑制

f)はgT^の活性化を介して細胞死を誘導する。

高濃度の_"h"による細胞死の誘導およびgT^のリン酸化と活性化の!
高濃度のメナディオンによる抑制
,
+

/

5

1

LIO!高濃度の_"h"が誘導する膜の破壊を*##!µfのf)は抑制した。 _"h"が誘導するgT^のLHK!(Oリン酸化とL)O基質,Ng28のリン酸化をf)は阻止した。!
L>O!48!A4A7で_"h"で活性化されたgT^による無細胞系L48!A41;7Oでの基質,Ng28のリン酸化をf)はgT^に直接作用して阻止した。!
メナディオンによるネクローシスの誘導はgT^によって二相性にコントロールされる。

５．細胞死の誘導機構!

R97;F7G!0"N:E;461B15!0*NB,51B15!<;715,16!g2;=B1!,5GG6!
@;7:!:519EGJGE7]BGN4832,53!B<7<17646!FE!<;5A58D8J!,N
g28!TN15;:48BG!=48B65N:534B153!G5B=BJ5!7@!,E17,9;7:5!,!
48!B8!5]1;B,5GG2GB;!64J8BGN;5J2GB153!=48B65N35<583581!
:B885;!
Yoshikazu Takagi et al. Mol. Pharmacol. 65:778 (2004)!
ホルボル0"Nミリステート0*Nアセテート（RfIOは,Ng28!T‐ターミナルキナーゼ（gT^Oに媒介されたチトクローム,の漏れを細胞外シグナル制御キナーゼ（>-^O依存性に防ぐことでg2;=B1細胞をメチルグリオキ
サルLfMOが誘導するアポトーシスから防御する!
メチルグリオキサル、アポトーシス、ＰＭＡ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、カスパーゼ９/３、ミトコンドリアの膜電位の低下、チトクロームｃの放出!

RfIはg2;=B1細胞においてメチルグリオキサルLfMOが誘導する!
アポトーシスを阻止する

LIO!fMは)TIフラグメンテーションを誘導したが、RfIはそれを抑制した。!
LHO!その時間経過67+の抗アポトーシス効果は75)859)経路に依存する

fMによるLIO!)TIフラグメンテーションの誘導と>-^によるその抑制はf>^のインヒビターR)$b#Y$で解除された。LHO!RfIによるf>^と>-^のリン酸化はfMの影響を受けないがf>^のインヒビターで阻止された。!

f>^W>-^経路はfMで処理されたg2=B1細胞におけるカスパーゼの活性化を抑制する

LIO fMが誘導する)TIフラグメンテーションを汎カスパーゼインヒビターのCNiI)は!
抑制した。LHO!fMが誘導するカスパーゼ$W*の活性化はRfIで阻止されたが、それ!
はf>^のインヒビターで解除された。

f>^W>-^経路はfMが誘導するアポトーシスにおいてチトクローム,の!
放出を阻止するが、ミトコンドリアの膜電位を制御しない

LIO!fMが誘導するミトコンドリアからのチトクロームｃの放出をRfIは阻止し!
たが、f>^のインヒビターはその阻止を解除した。LHO!fMが誘導するミトコン!
リアの膜電位の低下はRfIで阻止されたが、f>^のインヒビターはそれを解!
除しなかった。

RfIはfMが誘導するgT^の活性化を抑制しない
,

+

/

LＡOfMの誘導するgT^のリン酸化を抗酸化剤のTI(は抑制したが、!RfIは抑制し!
なかった。LHO!fMが誘導する)TIフラグメンテーションをRfIもTI(も抑制した。!
L(O!fMが誘導するミトコンドリアでのgT^のリン酸化をRfIは抑制しなかった。

活性化>-^はgT^が誘導するチトクローム,の放出を阻止する,+

LIO!RfIはミトコンドリアでの>-^のリン酸化を誘導した。LHO!分離し!
たミトコンドリアに活性化>-^を0時間作用させた後、活性化gT^を"!
時間作用させた。活性化gT^はミトコンドリアからのチトクロームｃ!の放出を誘導し、活性化>-^はそれを阻止したが、不活性な>-^は!
阻止しなかった。!
fMとRfIはそれぞれミトコンドリアにおけるgT^と>-^の活性化を誘導し、活性化>-^は活性化gT^によるチトクローム,の放出を阻止することによりアポトーシスの誘導を抑制する。

６．トリプトファン代謝による免疫の調節!
・ 4837G5B:485!"K*N347]EJ58B65!L/)hO\!トリプトファン代謝のキ !
ヌレニン経路の律速酵素。この経路の最終産物はTI)であ !
る。!
・ 異系マウス間の妊娠の/)hインヒビターによる流産!L0$$bO!
・ /)hは肝臓以外の組織に存在し、炎症において樹状細胞や !
マクロファージに発現が誘導される。発現誘導物質：/+TN!、 !
/+TN"W#、QR.、ＣｐＧ、()b#W()bZ!のリガンドL('QINVO、M/'-!!
!!!!!等!
・ ＩＤＯを発現した形質細胞様L<GB6:B,E1743O樹状細胞L)(Oや!
!!!!!リンパ系)(は免疫抑制活性を示し、制御性（サプレッサー） !
'細胞と常に協力関係にある。 !
・ /)hによる'細胞免疫抑制機構：L0O局所的なトリプトファンの!
枯渇による増殖の阻止LM(T"が関与）L"Oキヌレニン経路の !
代謝産物によるアポトーシスの誘導!
^`T\!=E82;58485!
*N_^\!*N9E;37]E=E82;58485!
・ /)hの利点：移植の拒絶、自己免疫疾患、アレルギーなど !
*N_II\!*N9E3;7]EB819;B84G4,!B,43!の免疫抑制、一部の感染抵抗性!
jk/T\!l2487G484,!B,43・ /)hの悪い点：腫瘍免疫や感染免疫の抑制、脳神経疾患 !
キヌレニン経路
（エ イズ、アルツハイマー病など）の促進等!

６．トリプトファン代謝による免疫の調節!

(488BFB;484,!B,43!J585;B153!@;7:!*N9E3;7]EB819;B84G4,!!
B,43!61;78JGE!4832,56!B<7<17646!48!19E:7,E156!19;72J9!!
195!J585;BD78!7@!;5B,DA5!7]EJ58!6<5,456!B83!!
195!4832,D78!7@!,B6<B65!!
Rie Hiramatsu et al. J. Cell. Biochem. 103:42 (2008)!
*Nハイドロオキシアントラニル酸L*_IIOから生成されるシナバリン酸
L(IOは活性酸素種L-h.Oの産生とカスパーゼの誘導を介して胸腺細胞にアポトーシスを強力に誘導する!
3HAA（キヌレニン経路のトリプトファン代謝産物）、トリプトファン代謝、キヌレニン経路、トリプトファンの代謝産物によるT細胞抑制、アポトーシス、シナバリン酸(CA)、SOD、カタラーゼ、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、ミトコンドリアの膜電位の低下、カスパーゼ３*‐ハイドロオキシアントラニル酸L*_IIOの酸化によるシナバリン酸の生成

CAはアクチノマイシンDと基本構造が同じである。CAがアポトーシスを誘導する論文はない。

*_IIによって刺激された胸腺におけるアポトーシスの誘導と!
TI(やmNiI)による防御

*_IIによって誘導される)TIフラグメンテーションのLIOフローサイトメトリー!と、LHO電気泳動（ラダーの形成Oによる解析、!LIOK!LHOともに*##〜Y##!µf $*_IIで強くフラグメンテーションが誘導され、0!:fの*_IIではネクローシ!
スが誘導された。L(O抗酸化剤のTI(と汎カスパーゼインヒビターのmNiI)は!
*_IIの誘導する)TIフラグメンテーションを抑制した。!

*_IIが胸腺細胞に誘導するアポトーシスの.h)やf8(G"による増強!

単独で)TIフラグメンテーションを誘導できないY#〜0##!µfの*_IIに!
LIO "##!kW:G!の.h)、LHO!"Y!µfのf8(G"を加えると、)TIフラグメンテションが!
誘導され、それは"##kW:Gのカタラーゼの添加によってさらに促進された。

.h)やf8(G"による*_IIの酸化を介した(I生成の増強とカタラーゼによる促進!

*_IIからシナバリン酸L(IOの生成のLIK!HK!(O吸収スペクトルL吸収のピーク：VY#!8:O!
による検出、!L)O!_RQ(による検出。*_IIから(Iの生成のLIO!TI(による阻止、!
LHK)O!.h)とカタラーゼによる増強、 L(K)O!f8(G"とカタラーゼによる増強

/+は2:++よりも!"倍強いアポトーシス誘導活性を示す

LIO!合成した(Iのスペクトル、LHO!*#〜Y#!µfの(Iが最も強くＤＮＡフラグメンテションを誘導した。 L(O!*#!µfの(Iは*##!µfの*_IIより強く)TIフラグメンテーションを誘導した。

(Iによって刺激された胸腺細胞に誘導される急速で一時的な活性酸素種の産生*_IIは活性酸素種L-h.Oの産生をV!時間まで徐々に増加させたが、(Iは0Y分以内に高い-h.の産生を誘導し、V!時間までにコントロール近くまで減少させた。!

(Iで刺激された胸腺細胞における急速なミトコンドリアの膜電位の低下と!
カスパーゼ*の活性化

LIO*_IIと(Iによるミトコンドリアの膜電位の低下の誘導、LHO!(Iによる)TI!
フラグメンテーションの誘導と汎カスパーゼインヒビターによるその抑制、!
L(O!(Iによるカスパーゼ*のタンパク発現と活性の誘導!
(Iは活性酸素種の産生、ミトコンドリアの膜電位の低下、カスパーゼ*の!
活性化を介して胸腺細胞に強力にアポトーシスを誘導する。

６．トリプトファン代謝による免疫の調節!

)4BC7DCBD78!7@!=E82;58485!FE!B,434U53!841;415!65,;5153!!
@;7:!4837G5B:485!"K*N347]EJ58B65N5]<;56648J!:E5G743!
3583;4D,!,5GG6!
Toshiaki Hara et al. J. Immunol. Methods 332:162 (2008)!

インドールアミン"K*Nジオキシゲナーゼを発現する骨髄系樹状細胞から分泌されるナイトライトと酸性で反応することによるキヌレニンのジアゾ化!
骨髄由来骨髄系樹状細胞（BMDC)、CpG(CpGオリゴヌクレオチド、バクテリアのDNA)、IDO、トリプトファン代謝、キヌレニン、NO産生、ナイトライト(-.'&)、酸による除タンパク、キヌレニンのジアゾ化

ＣｐＧオリゴヌクレオチドで刺激された骨髄由来骨髄系樹状細胞LfH)(Oの性状!

LIO!骨髄細胞をMfN(.+でZ日間培養し分化させた骨髄由来骨髄系樹状細胞LHf)(Oにおける()00,と()00Fの発現、!LHO!!(<Mによる/)hと4Th.のタンパク発現の誘導、L(O!(<MによるTh産生とTh.インヒビターTfIによるその抑制

ＣｐＧで刺激された7,1/はキヌレニン;)<=>をトリクロロ酢酸;?/+>存在下で崩壊する因子を@A産生と連結した状態で放出する#,+,

Hf)(を(<Mまたは(<MにTh.のインヒビターを加えて"V時間刺激した培養上清にY#!µfのキヌレニンを添加し、'(Iとメタノールでそれぞれ除タンパクして_RQ(でキヌレニンを測定した。LIO!(<M刺激した培養上清のキヌレニン濃度は低下したが(<MにTh.インヒビターを添加することにより回復した。メタノールで除タンパクすれば(<M刺激によるキヌレニンの低下は防げた。LHO同様な実験による_RQ(での溶出プロファイルＨＰＬＣで検出される酸性でのキヌレニンとナイトライトの反応

LIO!キヌレニンとTBナイトライトをYd!'(I存在下で反応させて_RQ(で!
キヌレニン量を測定するとキヌレニンは消失していた。LHO!_RQ(での!
溶出プロファイル酸性でナイトライトと反応して生成するキヌレニン化合物の!
マススペクトロメトリーによる解析

キヌレニンとTBナイトリライトを'(Iあるいは_(Gによる酸性溶液中で反応させると、キ!
ヌレニンの質量は"#b!:WCから""#!:WC!へ0"!:WC増加した。芳香族アミンが酸性でTB!
ナイトライトと反応してジアゾ化されることからキヌレニンのジアジ化が予測された。!
Thが産生される条件でキヌレニン測定のために酸で除タンパクをするとキヌレ!
ニンのジアゾ化が生じるので、メタノールで除タンパクをすべきである。

６．トリプトファン代謝による免疫の調節!

_4J9NBn841E!2<1B=5!7@!=E82;58485!B83!841;4,!7]435N:534B153!4894F4D78!7@!4837GB:485 "K*N347]EJ58B65!
48!F785!:B;;7[N35;4A53!:E5G743!3583;4D,!,5GG6!
Toshiaki Hara et al. Immunol. Lett. 116:95 (2008)

骨髄由来骨髄系樹状細胞（ＢＭＤＣ）における高親和性のキヌレ
ニンの取り込みと酸化窒素によって媒介されるインドールアミン"K*Nジオキシゲナーゼの抑制!
BMDC、NO産生によるIDO活性の抑制、キヌレニンの取り込み、トランスポートシステムＬ

(<Mで刺激されたHf)(におけるTh産生によるＩＤＯ活性の抑制!

LIO (<Mで刺激されたHf)(による/)hと4Th.タンパクの発現誘導、LHO!(<Mに!
よるTh産生とTh.インヒビターによるその抑制、L(O!(<Mによる/)hの酵素活!の誘導のTh.インヒビターによる増強!!
(<MによってHf)(に誘導される/)hの活性はTh産生によって抑制される。#

(<Mで刺激されたHf)(は/)hタンパクを発現していてもキヌレニンを分泌しない+,LIO コントロールあるいは0##!µfのトリプトファンを添加し、(<Mあるいは(<Mと!
Th.のインヒビターを加えて"V!時間培養した培養上清中のLIO!キヌレニン濃度と!
LHO!トリプトファン濃度はほとんど変化しなかった。

,71/はキヌレニンを/BC刺激に非依存性にトランスポートシステム&によって取り込む
+

/

,

1

(A)24時間の培養に加えたキヌレニンのBMDCによるCpG刺激非依存性取り込み、（Ｂ）
Ｎａ非依存性のキヌレニンの15分間の取り込み、(C) キヌレニンの取り込みの経時変化、(D) キヌレニンの15分間の取り込みのトランスポートシステムLのインヒビターによる阻止。BMDCはトランスポートシステムLでキヌレニンを取り込む。
形質細胞様・リンパ系樹状細胞による免疫抑制と骨髄系樹状細胞による免疫誘導

６．トリプトファン代謝による免疫の調節!

_5:7JG7F48!4832,56!195!5]<;566478!7@ 4837G5B:485!"K*N
347]EJ58B65!48!3583;4D,!,5GG6!19;72J9!195!B,DABD78!7@!!
R^(K!R/*^K!T+NoH!B83!195!J585;BD78!7@!;5B,DA5!7]EJ58!
6<5,456!
Nanako Ogasawara et al. (in submission)
ヘモグロビンはR^(、R/*^、T+N!o!Hの活性化と活性酸素種の産生を介して樹状細胞にインドールアミン"K*Nジオキシゲナーゼの発現を誘導する!
IDO、ヘモグロビン(Hb)、ヘム（ヘミン）、Hb-ハプトグロビン-CD163、ヘム-ヘモペ
キシン-ＣＤ９１、ヘムオキシゲナーゼー１(HO-１）、溶血性貧血患者血清中のキヌレニン/トリプトファン比の上昇、ＰＫＣ、PI3K、NF-!B、NF-kBの古典経路(RelA-p50、自然免疫)、NF-!Bの別経路(RelB-p52、獲得免疫)、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生

ヘモグロビン!"#$による%&'(と)"*+,細胞での-'.発現の誘導!"#$
酵素活性%&'()

培養上清 

!/$0"#で刺激された%&'(における-'.と12.3タンパクの発現、!%$000"#で刺激された%&'(の細胞抽出液を用いた-'.の酵素活性の測定、!($0"#で刺激されたヒト単球様)"*+,細胞における-'.タンパクの発現、!'$0"#で刺激された)"*+,細胞の培養上清中のキヌレニン濃度0%&'(においてヘモグロビンが-'.発現を誘導するには0
アポヘモグロビンとヘムの両方が必要である

!/40%$0"#は-'.と12.3のタンパク発現を誘導したが、!/40%$0ヘミンと!%$0ヘムフリー0のアポ"#は-'.と12.3のタンパク発現を誘導しなかった。!/$0".+,は"#でもヘミン0でも発現が誘導された。0%&'(においてヘモグロビンが-'.発現を誘導するには0*5(と*-65の活性化が必要である

"#による-'.発現の誘導は*5(のインヒビターである786,+9::;と0*-65のインヒビターである<=:>?;;:によって抑制された。

!"#$においてヘモグロビンが*#+発現を誘導するには,-.(!!の活性化が必要である),/

0,/!/$! "#による-'.発現の誘導を古典経路の2@+A%阻害剤は抑制した。0!%$"#は別経路の2@+!%!BC:$の産生を誘導した。!(40'$0"#は古経0路の2@+A%（7DE/$と別経路の2@+!%0!BC:$の両方を核に移行させる0ことを!($ウエスタンブロティングと!'$免疫染色で示した。

%&'(においてヘモグロビンが-'.発現を誘導するには0活性酸素種の産生が必要である !/$! 活性酸素種!7.3$の産生、!%$ 2/(による-'.発現の抑制、!($03.'とタ0ラーゼによる-'.発現の抑制、!'$0カタラーゼのインヒビターによる-'.発現0誘導の増強0
ヘモグロビンは*-65と*5(の活性化、7.3の産生、2@+!%の活性化を介して-'.発現を誘導する。

&%!長寿遺伝子./-'0と免疫!
・ 哺乳類の./-'は長寿遺伝子と言われるイーストの.4;"に相同な分子ファミリー!
であり、./-'0〜./-'&が存在する。./-'はキヌレニン経路の最終代謝産物で!
あるTI)を基質として脱アセチル化する酵素である。./-'0は+hXh、<Y*、!
T+N%H、RM(N0"などを脱アセチル化し転写活性を調節する因子である。!
・ .4;"がカロリー制限による延命に関与することがイースト、線虫、ハエなどで!
報告されているがヒトにおいて./-'0が寿命に関係しているか明らかでない。!
・ カロリー制限や適度の運動がメタボリックシンドロームを防ぐことは認められて !
いる。この調節に./-'0が関与しているようである。カロリー制限はミトコンドリ!
アの数と機能の増加を介して、活性酸素種の産生を抑制し効率的なエネギー !
LI'RO産生を誘導することにより効果を示すと報告されている。ブドウに多く含!
まれるポリフェノールのレスベラトロールは./-'0を最も強く活性化する物質で!
あるが、マウスモデルで過食による肝臓障害を防ぐことが報告されている。!
・ ./-'0欠損マウスは自己免疫疾患症状を示し、./-'0は免疫応答に重要な!
T+N%Hを抑制する。./-'0は不要物の除去、栄養補給、感染防御、胸腺での!
'細胞のネガティブセレクションなどに重要なオートファジー（細胞が生きる!
ために自分の一部を食べること）に必要である。しかし、./-'0と免疫の関係!
は論文が少なくほとんど明らかにされていない。!
・ f0の大学院生の小黒君と坂部君は免疫細胞をマイトジェンで刺激すると免 !
疫応答と共に./-'0タンパクの発現が誘導されることを発見し研究中である。!

御静聴ありがとうございました