Instruções de Utilização

LymphoTrack® Dx TRG Assay – MiSeqTM
Para identificar e localizar rearranjos génicos do recetor gama de células T (TRG) utilizando Sequenciação de Nova Geração(NGS) com o sistema Illumina® MiSeq.

Este ensaio destina-se a diagnóstico in vitro.

Representação esquemática do locus do gene TRG:

Condições de armazenamento: -85ºC a -65ºC(Os controlos de ADN podem ser separados dos kits de ensaio e armazenados a uma
temperatura entre 2C e 8C)

Ref. Catálogo
92270019
92270009

Produtos
LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq
LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

Quantidade
8 índices – 5 reações cada24 índices – 5 reações cada

Página 2 de 28Índice1.

UTILIZAÇÃO PRETENDIDA ............................................................................................................................................................................ 3

2.

RESUMO E EXPLICAÇÃO DO ENSAIO................................................................................................................................................................ 3
2.1.
2.2.

3.

PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO .................................................................................................................................................................... 4
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.

4.

Termociclador................................................................................................................................................................................ 8
Suporte Magnético ........................................................................................................................................................................ 8
Instrumento de PCR em Tempo Real ............................................................................................................................................. 8
Equipamento Illumina MiSeq* ...................................................................................................................................................... 8

RECOLHA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS ......................................................................................................................................................... 9
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.

7.

Componentes dos Reagentes ........................................................................................................................................................ 6
Advertências e Precauções ............................................................................................................................................................ 7
Armazenamento e Manuseamento ............................................................................................................................................... 7

EQUIPAMENTOS........................................................................................................................................................................................ 8
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.

6.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ........................................................................................................................................ 4
Purificação de Amplicons .............................................................................................................................................................. 4
Quantificação de Amplicons .......................................................................................................................................................... 4
Sequenciação de Nova Geração (NGS) .......................................................................................................................................... 4
Multiplexação de Amplicons ......................................................................................................................................................... 5

REAGENTES ............................................................................................................................................................................................. 6
4.1.
4.2.
4.3.

5.

Contextualização ........................................................................................................................................................................... 3
Resumo .......................................................................................................................................................................................... 3

Precauções .................................................................................................................................................................................... 9
Substâncias Interferentes .............................................................................................................................................................. 9
Requisitos e Manuseamento de Amostras .................................................................................................................................... 9
Armazenamento de Amostras ....................................................................................................................................................... 9

PROCEDIMENTO DE ENSAIO ....................................................................................................................................................................... 10
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
7.11.
7.13.

Materiais Fornecidos ................................................................................................................................................................... 10
Materiais Necessários (não fornecidos) ...................................................................................................................................... 10
Preparação de Reagentes ............................................................................................................................................................ 11
Amplificação ................................................................................................................................................................................ 11
Purificação com AMPure XP ........................................................................................................................................................ 12
Quantificação de Amplicons ........................................................................................................................................................ 13
Agrupamento e Quantificação da Biblioteca ............................................................................................................................... 14
Diluição da Biblioteca Agrupada .................................................................................................................................................. 14
Preparar qPCR para Library Quantification (Quantificação de Biblioteca) .................................................................................. 14
Preparação da Biblioteca para a Análise de Sequenciação MiSeq .............................................................................................. 15
Carregamento da MiSeq Flow Cell (Lâmina de fluxo MiSeq) ....................................................................................................... 16
Configuração da MiSeq Sample Sheet (Folha de amostras MiSeq) ............................................................................................. 16
Início da Análise MiSeq................................................................................................................................................................ 178.

ANÁLISE DE DADOS ................................................................................................................................................................................. 17

9.

VALORES ESPERADOS ............................................................................................................................................................................... 18

10.

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO ................................................................................................................................................................. 18

11.

INTERPRETAÇÃO E RELATÓRIO .................................................................................................................................................................... 19

12.

DADOS DE AMOSTRAS .............................................................................................................................................................................. 21

13.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ............................................................................................................................................................. 21

14.

GUIA DE RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS ........................................................................................................................................................... 2215.

SERVIÇOS TÉCNICOS E APOIO AO CLIENTE ...................................................................................................................................................... 23

16.

BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................................................................................ 2317.

SÍMBOLOS ............................................................................................................................................................................................. 23

18.

AVISO LEGAL ......................................................................................................................................................................................... 24

19.

LYMPHOTRACK DX TRG ASSAY - MISEQ: GUIA DE PÁGINA ÚNICA ...................................................................................................................... 25

20.

ANEXO A: CRIAR UMA BIBLIOTECA DE SEQUENCIAÇÃO COM MÚLTIPLOS ALVOS NGS .................................................................................................. 26

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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1. Utilização Pretendida
O Ensaio LymphoTrack Dx TRG para o sistema Illumina MiSeq é um produto de diagnóstico in vitro para a determinação dafrequência de distribuição, baseada em sequenciação de nova geração (NGS), dos rearranjos génicos de TRG em doentes
com suspeita de doença linfoproliferativa. Este ensaio é um auxiliar na identificação de doenças linfoproliferativas.

2. Resumo e Explicação do Ensaio
2.1.

Contextualização
O locus do gene do recetor gama de células T humanas (TRG, anteriormente conhecido como TCRG) no cromossoma
7 (7q14) inclui 14 genes Vγ (região variável) (Grupos I, II, III e IV), 5 segmentos génicos Jy (região de junção) e 2 genes
Cy (região constante) distribuídos por mais de 200 quilobases.
As células linfoides são diferentes das outras células somáticas no corpo. Durante o desenvolvimento, os genes derecetores antigénicos nas células linfoides sofrem rearranjos génicos somáticos. 1 Por exemplo, durante odesenvolvimento da célula T, os genes que codificam as moléculas do TRG são constituídos a partir de múltiplos
segmentos de genes polimórficos que sofrem rearranjos e seleção, gerando combinações Vγ–Jγ que são únicas, em
termos de comprimento e sequência. Uma vez que as leucemias e os linfomas têm origem em transformações
malignas de células linfoides individuais, as células leucémicas ou de linfoma de um indivíduo partilham geralmente
um ou mais rearranjos génicos de recetores antigénicos específicos de células ou “clonais”. Por conseguinte, os testes
que detetam rearranjos clonais de TRG podem ser úteis no estudo das neoplasias de células B e T.
Inicialmente, os rearranjos clonais eram identificados através da utilização das técnicas de Fragmentos de Restrição e
Hibridação de Southern Blot (RF-SBH). No entanto, estes testes mostraram ser complexos e morosos, requeriam
grandes quantidades de ADN e não eram adequados para analisar muitos dos loci de recetores antigénicos menos
diversos.
Durante as últimas décadas, a utilização de ensaios de RF-SBH tem sido substituída por testes de clonalidadebaseados em PCR, desenvolvidos por Alexander Morley2 que são atualmente considerados o método padrão por
excelência. Estes ensaios identificam a clonalidade com base na sobrerrepresentação de produtos V-D-J amplificados(ou produtos D-J incompletos) após a sua separação através de eletroforese em gel ou capilar. Embora sensíveis eadequados para testar pequenas quantidades de ADN, estes ensaios não conseguem distinguir facilmente populações
clonais e rearranjos múltiplos que poderão estar ocultos por um pico de tamanho único, e também não sãoconcebidos para identificar a sequência específica de ADN V-J que é necessária para localizar populações clonais emanálises subsequentes. Esta segunda limitação pode ter uma importância particular, visto que uma vez identificada asequência única de ADN específica para o clone, esta pode ser utilizada em análises subsequentes para localizar emonitorizar as populações clonais de células.

2.2.

ResumoEste LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq representa uma melhoria significativa em relação aos ensaios declonalidade existentes que utilizam a análise de fragmentos, uma vez que deteta de forma eficiente a maioria dos
rearranjos génicos de TRG utilizando uma multiplex master mix individual e, ao mesmo tempo, identifica a sequência
de ADN específica para cada rearranjo génico clonal. Este ensaio tem assim duas aplicações importantes ecomplementares, é um auxiliar na deteção de populações clonais iniciais e identifica informações de sequências
necessárias para localizar esses clones em amostras subsequentes.
Cada multiplex master mix individual para TRG visa as regiões conservadas nos segmentos Vγ e Jγ descritas nas
neoplasias linfoides. Os primers incluídos nas master mixes são concebidos com os adaptadores da Illumina e até 24índices diferentes. Este método permite uma reação de PCR em uma etapa e o agrupamento de amplicons de várias
amostras e alvos diferentes (gerados com outros Ensaios LymphoTrack Dx para o equipamento Illumina MiSeq,
vendidos separadamente) numa MiSeq flow cell (lâmina de fluxo MiSeq), permitindo a análise de até 24 amostras por
alvo em paralelo, numa única análise.
O LymphoTrack Dx Software – MiSeq associado disponibiliza um método de análise e visualização de dados simples edinâmico. Seguindo as orientações apresentadas na secção 11: Interpretação e Relatório, os resultados da amostra
resumidos no software podem ser facilmente interpretados quanto à presença ou ausência de clonalidade.

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Os resultados dos testes de clonalidade molecular devem ser sempre interpretados no contexto de dados clínicos,
histológicos e imunofenotípicos.
Os controlos positivos e negativos para a clonalidade estão incluídos no kit.
Nota: Para uma explicação mais completa sobre o locus e a estratégia de sequenciação direcionada, consulte Miller J.E., 2013. 3

3. Princípios do Procedimento
3.1.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Os ensaios de PCR são habitualmente utilizados para a identificação de populações clonais de células B e T. Estes
ensaios amplificam o ADN entre primers direcionados para as regiões conservadas V e J dos genes de recetores
antigénicos. Estes primers são direcionados para as regiões conservadas e encontram-se em ambos os lados de umaárea onde ocorrem rearranjos genéticos programados durante a maturação de todos os linfócitos B e T. É a partir
destes rearranjos genéticos que são originadas diferentes populações de linfócitos B e T.
Os genes de recetores antigénicos que sofrem rearranjos constituem os loci das cadeias pesadas (IGH) e das cadeias
leves (IGK e IGL) das imunoglobulinas nas células B, e os loci do gene do recetor das células T (TRA, TRB, TRG e TRD)
nas células T. Cada célula B e T contém um ou dois rearranjos V-J produtivos com um comprimento e sequência
únicos. Portanto, quando o ADN de uma população normal ou policlonal é amplificado utilizando primers de ADN que
flanqueiam a região V-J, são gerados amplicons com uma sequência e comprimentos únicos, refletindo a população
heterogénea. Em alguns casos, nos quais não está presente ADN linfocitário, não serão gerados amplicons. As
amostras que contêm populações clonais de TRG originam um ou dois produtos principais amplificados com o mesmo
comprimento e sequência, que são detetados com uma frequência significativa num contexto policlonal diminuído.

3.2.

Purificação de Amplicons
Os amplicons de PCR são purificados para remover primers em excesso, nucleótidos, sais e enzimas utilizando
tecnologia de esferas paramagnéticas para a imobilização reversível em fase sólida (SPRI) para purificação de alto
rendimento de amplicons de PCR. Utilizando um tampão otimizado, os produtos de PCR com um comprimento de
100 pares de bases ou superior ligam-se seletivamente às esferas paramagnéticas, enquanto que contaminantes
como primers em excesso, dímeros de primers, sais e dNTPs não incorporados são removidos. Os amplicons podementão ser eluídos e separados das esferas paramagnéticas, resultando num produto de PCR mais purificado parasubsequente análise e quantificação de amplicons.

3.3.

Quantificação de Amplicons
Os amplicons purificados são quantificados utilizando os Kits KAPA™ Library Quantification (Quantificação debiblioteca KAPA™) para plataformas Illumina. Amplicons de PCR purificados e diluídos e um conjunto de seis padrões
de ADN pré-diluídos são amplificados através de métodos quantitativos (qPCR), utilizando master mix e primers KAPASYBR® FAST qPCR. Os primers no kit KAPA têm como alvo as sequências de oligonucleotídeos do adaptador de lâmina defluxo Illumina P5 e P7.
A pontuação Ct média para os padrões de ADN pré-diluídos é representada em gráfico contra o log10 para gerar uma
curva padrão, que pode ser utilizada para calcular a concentração (pM) dos amplicons de PCR derivados do ADN da
amostra. Calcular a concentração de amplicons de PCR permite uma igual representação de amplicons na biblioteca
final agrupada que é carregada no MiSeq para sequenciação.

3.4.

Sequenciação de Nova Geração (NGS)Os métodos de sequenciação de Sanger são os mais populares entre uma variedade de tecnologias de sequenciação
de ácidos nucleicos de “primeira geração”. Métodos mais recentes, que utilizam abordagens de sequenciação
massiva paralela, são muitas vezes referidos como Sequenciação de Nova Geração (NGS). Estas tecnologias podem
utilizar várias estratégias de combinação para a preparação do molde, sequenciação, imagiologia e bioinformática
para o alinhamento e montagem de genomas.
As tecnologias NGS utilizadas neste ensaio recorrem à amplificação de sequências genéticas, através de uma série deprimers de consenso forward e reverse que inclui adaptadores e marcadores de índice. Os amplicons gerados com as
LymphoTrack Dx Master Mixes são quantificados, agrupados e carregados numa lâmina de fluxo para sequenciação
numa plataforma de sequenciação Illumina MiSeq. Especificamente, os produtos amplificados na biblioteca são

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hibridados para oligonucleotídeos numa lâmina de fluxo e amplificados para formar colónias clonais locais(amplificação em ponte). São adicionados quatro tipos de bases de terminador reversível (bases RT) e o vetor desequenciação do ADN é alargado um nucleótido de cada vez. Para registar a incorporação de nucleótidos, a câmara
CCD capta uma imagem da luz emitida à medida que cada base RT é adicionada e, em seguida, clivada para permitir aincorporação da base seguinte.
3.5.

Multiplexação de Amplicons
Este ensaio foi concebido para permitir dois níveis diferentes de multiplexação a fim de reduzir os custos e o tempo
necessários para os laboratórios. O primeiro nível de multiplexação tem origem nos vários índices que são fornecidos
com os ensaios. Cada um destes 24 índices atua como um código de barras único que permite que os amplicons deamostras individuais sejam agrupados após a amplificação por PCR para gerar a biblioteca de sequenciação; assequências resultantes são ordenadas pelo software de bioinformática que identifica as sequências que originaram
de uma amostra individual.
O segundo nível de multiplexação tem origem na capacidade do software incluído ordenar dados de sequenciação
por índice e alvo. Isto permite que os amplicons gerados com primers direcionados (mesmo os marcados com o
mesmo índice) sejam agrupados para gerar a biblioteca e sequenciados numa lâmina de fluxo único. Um exemplo
seria sequenciar uma combinação de produtos de vários Kits de Ensaio Invivoscribe LymphoTrack Dx para o MiSeq,
tais como Líder IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG. Na multiplexação de amplicons de diferentes alvos
génicos, é importante utilizar a química de sequenciação adequada. O número de ciclos de sequenciação deve sersuficiente para sequenciar o maior amplicon no multiplex. Por exemplo, na multiplexação de uma combinação deamplicons IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG, utilize o kit de sequenciação MiSeq v2 (500 ciclos) para, nomáximo, 4 alvos ou o kit de sequenciação v3 (600 ciclos) para, no máximo, 7 alvos. Na multiplexação conjunta dequalquer um destes amplicons com o Líder IGHV, utilize o kit de sequenciação MiSeq v3 (600 ciclos). No caso de uma
multiplexação apenas com os amplicons IGH FR3 e TRG, uma vez que ambos têm tamanhos de amplicons mais
reduzidos, utilize os kits de sequenciação MiSeq v2 (300 ou 500 ciclos) e ajuste as definições do ciclo na folha deamostras. Para instruções adicionais, consulte o Anexo A (secção 20).
O número de amostras que podem ser utilizadas na multiplexação numa lâmina de fluxo único depende também dalâmina de fluxo utilizada. As lâminas de fluxo padrão da Illumina (MiSeq v3) são capazes de gerar entre 22 - 25milhões de leituras. Para determinar o número de leituras por amostra, divida o número total de leituras para alâmina de fluxo pelo número de amostras que serão utilizadas na multiplexação e o número de leituras por amostra
será suficiente para uma interpretação válida. Para obter mais informações, consulte a secção 11 Interpretação e
Relatório. A Illumina também fabrica outras lâminas de fluxo que utilizam a mesma química de sequenciação, masgeram menos leituras. Ao utilizar estas lâminas de fluxo alternativas, deve ter-se em consideração que um número
total de leituras mais reduzido significa uma menor extensão (depth) por amostra ou que serão analisadas menos
amostras na lâmina de fluxo para alcançar a mesma extensão (depth) por amostra.

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4. Reagentes
4.1.

Componentes dos Reagentes

Tabela 1. Kits Disponíveis

Ref. Catálogo

Descrição

Número de Master Mixes Indexadas

Total de Reações

92270019

LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq

8 índices – 5 análises de sequenciação cada

4092270009

LymphoTrack Dx TRG Assay Panel – MiSeq

24 índices – 5 análises de sequenciação cada120

Tabela 2. Componentes dos Kits

92270009
Número de
UnidadesTRG MiSeq 01

1

1

TRG MiSeq 02

1

1

TRG MiSeq 03

1

1

TRG MiSeq 04

1

1

TRG MiSeq 05

1

1

TRG MiSeq 06

1

1

TRG MiSeq 07

1

1

TRG MiSeq 08

1

1

TRG MiSeq 09

01

TRG MiSeq 1001

TRG MiSeq 11

0

1

0

1

TRG MiSeq 12

Master Mixesǂ

ADN de Controlo
Positivo

92270019
Número de
UnidadesComponentes dos
Reagentes

Reagente

TRG MiSeq 13(

Quantidade
Unitária

225 µL

0

1

TRG MiSeq 14

01

TRG MiSeq 15

01

TRG MiSeq 1601

TRG MiSeq 18

01

TRG MiSeq 19

01

TRG MiSeq 20

01

TRG MiSeq 21

01

TRG MiSeq 22

01

TRG MiSeq 23

01

TRG MiSeq 25

01

TRG MiSeq 27

0

1

1

3

TRG POS (+)
42270019)

45 µL

Temperatura deArmazenamento

Notas
N/A

V11/ J1/2 ADN diluído em ADN
de amígdala faríngeaou

ADN de Controlo
Negativo

NGS NEG (-)(
40920018)

45 µL

1

3

ADN de amígdala faríngea,
a frequência de sequência maiselevada pode variar entre lotes

Nota: Não são utilizados conservantes no fabrico destes kits.
ǂNota: Os índices 17, 24 e 26 não são utilizados nestes kits

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4.2.

Advertências e Precauções
Leia atentamente as Instruções de Utilização antes de iniciar o procedimento de ensaio e siga rigorosamente cadapasso.
▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪

▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪
4.3.

Este produto destina-se a diagnóstico in vitro.
O kit de ensaio deve ser utilizado como um sistema. Não substitua os reagentes com os de outros fabricantes.
A diluição, redução das reações de amplificação ou outros desvios deste protocolo podem afetar o desempenho
desta análise e/ou anular qualquer sublicença limitada que acompanha a compra destes kits.
Os materiais são estáveis até à data de validade indicada no rótulo, quando armazenados e manuseados comoindicado. Não utilize os kits após a sua data de validade.
O cumprimento do protocolo na íntegra irá garantir um desempenho e reprodutibilidade ótimos. Certifique-sede que são usados os programas corretos do termociclador, uma vez que outros programas poderão fornecer
dados imprecisos/erróneos, tais como resultados falsos positivos e falsos negativos.
Não misture nem combine reagentes de kits com diferentes números de lote.
Elimine os reagentes não usados e os resíduos de acordo com os regulamentos nacionais, federais, estaduais elocais.
Todos os procedimentos laboratoriais devem ser realizados com equipamento de proteção individual padrão
(luvas, batas de laboratório e proteção ocular). Siga as boas práticas laboratoriais e precauções universais
ao trabalhar com amostras. Não pipete com a boca. Não coma, beba ou fume nas áreas de trabalho dolaboratório. Lave bem as mãos após manusear as amostras e os reagentes dos ensaios. As amostras devem ser
manuseadas em instalações de contenção de segurança biológica aprovadas e só devem ser abertas em câmarasde segurança biológica certificadas.
É recomendada a utilização de água para biologia molecular para a preparação do ADN de amostra.
Devido à elevada sensibilidade analítica desta análise, deve ser tomado extremo cuidado para evitar qualquer
contaminação dos reagentes ou misturas de amplificação com amostras, controlos ou materiais amplificados.
Use pontas de pipeta novas e resistentes a aerossóis para cada amostra e cada reagente. Todos os reagentes
devem ser cuidadosamente controlados quanto a sinais de contaminação (p. ex., controlos negativos que
originam sinais positivos). Elimine quaisquer reagentes suspeitos de contaminação.
Para minimizar a contaminação, utilize luvas limpas ao manusear amostras e reagentes e limpe regularmenteas áreas de trabalho e as pipetas antes de preparar a PCR.
O fluxo de trabalho no laboratório de PCR deve ser unidirecional entre as áreas de trabalho separadas:
começando pela preparação da master mix, passando para a preparação das amostras e, em seguida, para aamplificação e, finalmente, para a deteção. A autoclavagem não elimina a contaminação de ADN. Não leve ADN
amplificado para áreas designadas para master mixes ou para a preparação das amostras.
Todas as pipetas, pontas de pipeta e equipamentos utilizados numa determinada área devem ser exclusivos
dessa área do laboratório.
Os artigos não descartáveis devem ser descontaminados com lixívia a 10% e enxaguados com água destilada
duas vezes antes de os devolver às áreas iniciais.
Sempre que possível, deve ser utilizado material plástico estéril e descartável, para evitar a contaminação.

Armazenamento e Manuseamento▪
▪
▪
▪

Se o ensaio não for utilizado de imediato, armazene a uma temperatura entre -85ºC e -65ºC.
A temperatura de armazenamento ótima para os controlos de ADN é entre 2°C a 8°C, mas o ADN também podeser armazenado entre -85°C e -65°C.
Todos os reagentes e controlos devem ser descongelados e misturados em vórtex, ou completamente
misturados, antes da utilização de forma a assegurar que estão completamente ressuspensos.
Devido a elevadas concentrações de sal, as master mixes de PCR são sensíveis aos ciclos
de congelamento/descongelamento. O número de ciclos deve ser limitado a um máximo de quatro.

Em caso de dúvidas, entre em contacto com a equipa técnica da Invivoscribe. Teremos todo o gosto em ajudá-lo adeterminar as suas necessidades de armazenamento ótimo.

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5. Equipamentos
Os equipamentos específicos abaixo indicados são recomendados com base nos métodos utilizados para validar este ensaio.
5.1.

Termociclador▪
▪
▪

Utilização ou função: Amplificação de amostras de ADN
Equipamento sugerido: Thermal Cycler Veriti ™ Dx (Termociclador Veriti™ Dx) ou equivalente
Características de desempenho e especificações:
o
o

▪
▪
5.2.

Siga os procedimentos de instalação, funcionamento, calibração e manutenção do fabricante.
Consulte a secção 7.4 Amplificação para informações sobre o programa do termociclador.

Suporte Magnético
▪
▪

Utilização ou função: Purificação de produtos de PCR
Equipamento sugerido:
o
o
o

▪

▪

Esferas paramagnéticas de precipitado

Consulte a secção 7.5 Purificação AMPure XP para informações sobre métodos de purificação de produtos de PCR.

Instrumento de PCR em Tempo Real▪
▪
▪

Utilização ou função: Quantificação de produtos de PCR purificados
Equipamento sugerido: Real-Time PCR Instrument Fast Dx (Instrumento de PCR em tempo real Fast Dx) da Applied
Biosystems® 7500 ou equivalente
Características de desempenho e especificações:
o

▪
▪
5.4.

Magnetic Stand 96* (Suporte magnético 96*) da Ambion ® (AM10027)
96 Ring Super Magnet Plate* (Placa magnética 96 Ring Super*) da Agencourt SPRIPlate® (A32782)
DynaMag™-96 Side Skirted Magnet* (Magneto com rebordo 96 DynaMag™*) da Thermo Fisher Scientific(12027)

Características de desempenho e especificações:o5.3.

Gama térmica mínima: 15 ºC a 96 ºC
Velocidade de rampa mínima: 0,8 ºC/seg

Capaz de detetar o comprimento de onda do SYBR Green

Siga os procedimentos de instalação, funcionamento, calibração e manutenção do fabricante.
Consulte a secção 7.6 Quantificação de Amplicons para informações sobre o programa de PCR em tempo real.

Equipamento Illumina MiSeq*▪
▪

Utilização ou função: Sequenciação da biblioteca de ADN normalizado
Características de desempenho e especificações:
o
o

▪
▪

Compatível com o MiSeq Reagent Kit v2 (kit de reagente MiSeq v2)*
Compatível com o MiSeq Reagent Kit v3 (kit de reagente MiSeq v3)* para multiplexação

Siga os procedimentos de instalação, funcionamento, calibração e manutenção do fabricanteConsulte as secções 7.11 Carregamento da MiSeq Flow Cell (Lâmina de fluxo MiSeq), 7.12 Configuração da MiSeq
Sample Sheet (Folha de amostras MiSeq) e 7.13 Início da Análise MiSeq para informações sobre os parâmetros
MiSeq.
*Aviso: Estes produtos não possuem a marcação CE

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6. Recolha e Preparação de Amostras
6.1.

Precauções
As amostras biológicas de seres humanos podem conter materiais potencialmente infeciosos. Todas as amostras
devem ser manuseadas de acordo com o programa de Agentes Patogénicos Transmitidos pelo Sangue do seu
instituto e/ou de acordo com o Nível 2 de Biossegurança.

6.2.

Substâncias Interferentes
As seguintes substâncias são conhecidas por interferir com a PCR:
▪
▪
▪
▪

6.3.

Requisitos e Manuseamento de Amostras
▪
▪
▪

6.4.

Quelantes de catiões divalentes
Pontas de pipeta de baixa retençãoEDTA (não significativo em baixas concentrações)Heparina
A quantidade de análise mínima é de 50 ng de ADN de alta qualidade (5 L de ADN de amostra numa concentração
mínima de 10 ng/µL).
Este ensaio testa ADN genómico extraído e purificado. O ADN deve ser quantificado com um método específico
para ADN de cadeia dupla (dsDNA) e livre de inibidores de PCR.
Deve ressuspender o ADN numa solução apropriada, tal como tampão TE 0,1X (Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, pH
8.0, preparado com água para biologia molecular), ou apenas água para biologia molecular.

Armazenamento de Amostras
As amostras devem ser armazenadas utilizando um método que previna a degradação de ADN.

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7. Procedimento de Ensaio
7.1.

Materiais Fornecidos
Consulte a Tabela 2 para informações sobre os materiais fornecidos.

7.2.

Materiais Necessários (não fornecidos)

Tabela 3. Materiais Necessários (não fornecidos)

Reagentes Necessários ou
Recomendados/Fornecedores

Reagente/Material

ADN polimerase

Roche:• EagleTaq™ DNA Polymerase (ADN
EagleTaq™ polimerase)ou
Invivoscribe:• FalconTaq DNA Polymerase
ou equivalente

Ref. Catálogo

05206944190
ou

Notas

5 U/μL60970130Água para biologia molecular

N/A

N/A

Pipetas calibradas

N/A

N/A

Devem ser capazes de medir com precisão
volumes entre 0,2 μL e 1000 μL

Placas ou tubos de PCR

N/A

N/A

Sem ADNase/ARNase/Inibidores de PCR

Pontas de pipeta com filtro

N/A

N/A

Tubos de microcentrifugadora

N/A

N/A

Esterilizados

Beckman Coulter, Inc:
• Agencourt AMPure XP

A63880

N/A

Purificação de PCR

Thermo Fisher Scientific:• Magnetic Stand 96(Suporte magnético 96) da Ambion• DynaMag-96 Side Skirted Magnet(Magneto com rebordo 96 DynaMag)ouBeckman Coulter:• 96 Ring Super Magnet Plate(Placa magnética 96 Ring Super)da Agencourt SPRIPlateou equivalente

AM10027
12027
ou
A32782

N/A

Quantificação de amplicons
e biblioteca

KAPA Biosystems:• Kit KAPA Library Quantification(Quantificação de biblioteca KAPA) –Illumina

KK4824

N/A

Análise MiSeq

Illumina:• MiSeq Reagent v2 kit (Kit de reagente
MiSeq v2) (300 ciclos) ou• v2 kit (Kit v2) (500 ciclos)ou• v3 kit (Kit v3) (600 ciclos)para multiplexação

Kit de Purificação de PCR•
Software MiSeq•
Tampão de diluição A

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

MS-102-2002
ou
MS-102-2003
ou
MS-102-3003

Sem ADNase/ARNase

Esterilizadas, sem
ARNase/ADNase/pirogénios

Lâmina de fluxo padrão

MiSeq Software Control (Software decontrolo MiSeq) v2.6 ou versão mais
recenteLocal Run Manager v2.0 ou versão mais
recente

N/A

N/A

N/A

N/A

Preparar uma solução de 10 mM Tris-HCl, pH
8.0 + 0,05% solução Tween 20

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7.3.

Preparação de Reagentes
Para garantir que as amostras de ADN não contêm inibidores de PCR e têm uma qualidade e quantidade suficientes
para gerar um resultado válido, podem ser analisadas com a Specimen Control Size Ladder Master Mix (Master Mix
da Escala de Tamanhos de Controlo de Amostras) da Invivoscribe (20960021 para deteção ABI ou
20960020
para deteção em gel). A Specimen Control Size Ladder (Escala de Tamanhos de Controlo de Amostras) visa vários
genes e gera uma série de amplicons com 100, 200, 300, 400 e 600 pb; o tamanho pode variar +/- 5 pb devido aopadrão de tamanho e/ou diferenças de instrumentos. A verificação da integridade do DNA é especialmente
importante para amostras desafiadoras, p.ex., tecidos fixados em formalina e incorporados em parafina (FFPE).
Utilize sempre controlos positivos e negativos para garantir que o ensaio foi realizado corretamente.
Configure sempre um controlo sem molde (NTC) para verificar a contaminação durante o processo de preparação da
PCR.
7.3.1.
7.3.2.

Com as mãos protegidas com luvas, retire as Master Mixes do congelador. Deixe os tubos descongelar e,em seguida, misture-os cuidadosamente em vórtex e centrifugue-os brevemente.
Numa câmara de fluxo laminar ou câmara isolada, pipete 45 L de cada tubo de Master Mix para uma placa
de PCR limpa (um poço para cada Master Mix e uma Master Mix por amostra).
▪
▪

7.3.3.
7.3.4.

Cada análise deve incluir dois controlos (um positivo e um negativo) e um NTC.
Para o NTC, utilize água para biologia molecular como molde, em vez de ADN.

Adicione 0,2 L de ADN Taq polimerase (a 5 U/L) a cada poço contendo Master Mixes aliquotadas.
Adicione 5 L de ADN de amostra (numa concentração mínima de 10 ng/L), ADN de controlo ou água para
biologia molecular (NTC) aos poços individuais contendo as reações de Master Mix respetivas.
▪
▪

Pipete para cima e para baixo 5 a 10 vezes para misturar.
Sele a placa e coloque-a no termociclador de PCR.
Tabela 4. Preparação da Reação

7.4.

Reagente

VolumeMaster Mix

45,0 μL

ADN Taq polimerase

0,2 μLADN de Amostra ou Controlo

5,0 μL

Volume Total

50,2 μL

Amplificação
7.4.1.

Amplifique as amostras utilizando o programa de PCR da Tabela 5.

No caso de multiplexação de vários alvos, consulte o Anexo A (secção 20) para outras condições do termociclador com o LymphoTrack Dx
Assay - MiSeq.
Tabela 5. Programa de PCR

Etapa

Temperatura

Duração

Ciclo

1

95 °C

7 minutos

1

2

95 °C

45 segundos

3

60 °C

45 segundos

4

72 °C

90 segundos

5

72 °C

10 minutos

1

6

15 C

∞

1

29x

Nota: Defina a tampa aquecida para 105 °C e o volume de reação para 50 μL

7.4.2.

Retire a placa de PCR do termociclador uma vez concluído o programa de amplificação. Se não prosseguir
imediatamente para as próximas etapas, guarde os produtos de PCR a 4 °C durante 1 dia.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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7.5.

Purificação com AMPure XP
A purificação de produtos de PCR das amostras, controlos positivos e negativos e controlos sem molde, foi feita
utilizando o sistema PCR Purification (Purificação de PCR) Agencourt AMPure XP.

Preparação:7.5.1.

Retire o reagente AMPure XP do local de armazenamento e deixe-o equilibrar à temperatura ambiente antes
de ser utilizado. Agite suavemente o frasco de Agencourt AMPure XP para ressuspender quaisquer partículasmagnéticas que possam ter assentado.

Consulte o Anexo A (secção 20) para obter informações sobre os volumes de reagente AMPure XP utilizados noutros produtos de PCR do
LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.

7.5.2.

Transfira o volume apropriado de reagente Agencourt AMPure XP necessário para a placa para um novo tubo
de 2 mL, de forma a minimizar o risco de contaminação por pontas de pipeta.
▪

7.5.3.

O volume necessário de reagente Agencourt AMPure XP = n × 50 µL (n é o número de amostras a purificar).

Prepare um novo lote (0,5 mL para cada amostra a ser purificada) de etanol a 80%, utilizando água estéril.

Ligação de Amplicons a Partículas Magnéticas:
7.5.4.

Adicione 50 μL de reagente Agencourt AMPure XP aliquotado, à temperatura ambiente a cada amostra
a ser purificada.
▪
▪
▪

7.5.5.

Coloque as amostras misturadas num DynaMag-96 Side Skirted (Magneto com rebordo 96 DynaMag) ou num
Magnetic Stand-96 (Suporte magnético 96) da Ambion e incube-as à temperatura ambiente durante 5 minutos
para permitir que as partículas magnéticas se separem da solução.
▪

7.5.6.

Misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
A cor da mistura deve aparecer homogénea após a mistura.
Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Mantenha sempre a placa no suporte magnético durante este procedimento, até à etapa 7.5.10 a seguir.

Utilizando uma pipeta P200 (ou pipeta multicanal equivalente) calibrada para 95 μL, aspire o sobrenadante
limpo e elimine-o.
▪
▪

Utilize uma pipeta P10 (ou pipeta multicanal equivalente) calibrada para 10 μL para remover qualquer
sobrenadante em excesso.
Evite remover quaisquer partículas magnéticas.

Lavagem:
7.5.7.

Mantendo a placa no suporte magnético, adicione 200 µL de etanol a 80% a cada amostra. Incube durante
30 segundos à temperatura ambiente.
▪
▪
▪

7.5.8.
7.5.9.

Utilizando uma pipeta P200 (ou pipeta multicanal equivalente) calibrada para 195 μL, aspire o etanole elimine-o.
Utilize uma pipeta P10 (ou pipeta multicanal equivalente) calibrada para 10 μL para remover o excesso
de etanol.
Evite remover quaisquer partículas magnéticas.

Repita a etapa 7.5.7 para um total de duas lavagens.
Com a placa ainda no suporte magnético, deixe as partículas magnéticas secar ao ar durante 5 minutos.

Eluição:7.5.10.

Retire a placa do suporte magnético. Adicione 25 μL de 10 mM Tris-HCl, tampão pH 8.0.
▪
▪

7.5.11.
7.5.12.

Misture pipetando até ficar homogéneo.
Certifique-se de que todas as partículas magnéticas estão em solução.

Incube à temperatura ambiente durante 2 minutos.
Coloque a placa no suporte magnético durante 5 minutos ou até o sobrenadante estar límpido.

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7.5.13.

Transfira 22 μL do eluato para uma nova placa. Sele com tiras de tampas. Rotule a placa e centrifugue
brevemente para garantir que o sobrenadante assenta completamente no fundo do poço. Armazene a -20 oC
ou prossiga para a próxima etapa.
A imagem do gel na Figura 1 ilustra a eficácia de uma purificação típica (mostrando os amplicons antes e após
a purificação).

Figura 1: Exemplo deum resultado dapurificação de amplicons
a partir da TRG MiSeq
Master Mix. A imagem
foi gerada pela análise
de produtos não
purificados e purificados
no LabChip GX.

7.6.

Quantificação de Amplicons
As etapas que se seguem foram realizadas durante a validação do ensaio para quantificar amplicons de PCR
purificados gerados a partir de amostras, bem como controlos positivos, negativos e sem molde utilizando o kit KAPA
library quantification (Quantificação de biblioteca KAPA) (KAPA Biosystems).
7.6.1.

Diluição de amplicons
O tampão de diluição A abaixo refere-se a: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0,05% Tween 20

1: 4000 Final:
Etapa A:
2 μL de eluato de amplicon purificado + 198 µL de Tampão de diluição A.
Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
Etapa B:
5 μL da Etapa A + 195 μL de Tampão de diluição A.
Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
7.6.2.

Prepare uma análise qPCR para quantificação de amplicons seguindo a Tabela 6 para cada reação (consulte as
instruções do kit KAPA library quantification (Quantificação de biblioteca KAPA) para obter mais detalhes):
Tabela 6. Preparação da qPCR

Reagente

7.6.3.

VolumeÁgua de grau PCR

3,6 μL

Master Mix KAPA SYBR FAST qPCR contendo Primer Premix

12,0 μL

ROX

0,4 μL

Amplicons diluídos ou Padrão (1-6)

4,0 μL

Volume Total

20,0 μL

Siga a Tabela 7 para o programa do termociclador para qPCR.
Tabela 7. Programa qPCR

Etapa

Temperatura

Duração

Ciclo

1

95 °C

5 minutos

1

95 °C

30 segundos

60 °C

45 segundos (leitura da placa)

2

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7.6.4.

Utilize os dados da análise qPCR para verificar a contaminação, calculando os valores ΔCt entre os controlos(positivo e negativo) e o NTC, utilizando a seguinte equação:ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Controlo)
Se ΔCt ≥4,0 para ambos os controlos, avance para a etapa seguinte. Se ΔCt <4,0 para um dos controlos, consultea secção 14 Guia de Resolução de Problemas para instruções adicionais.

No caso de multiplexação de vários alvos, consulte o Anexo A (secção 20) para a qualificação do valor ΔCt para outros produtos de PCR do
LymphoTrack Dx Assay - MiSeq.

7.6.5.

Utilize os dados da análise qPCR para determinar a concentração de amplicons para cada amostra utilizando
a seguinte equação:𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛𝑠 𝑛ã𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢í𝑑𝑜𝑠 (𝑛𝑀) =452 × 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑚é𝑑𝑖𝑎(𝑝𝑀)𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑞𝑃𝐶𝑅
×4
A

452 representa o comprimento médio do fragmento (bp) do DNA Standard (Padrão de ADN) KAPA Illumina.
A = O comprimento médio do fragmento de amplicons gerados utilizando o ensaio TRG = 300 bp. (A = 300).
O comprimento das sequências inclui nucleótidos adicionais necessários para a sequenciação.
Nota:

7.7.

No caso de multiplexação de vários alvos, consulte o Anexo A (secção 20) para o comprimento médio do fragmento de amplicons
gerados para outro LymphoTrack Dx Assay - MiSeq

Agrupamento e Quantificação da Biblioteca
A quantidade de ADN da biblioteca carregado para a MiSeq flow cell (lâmina de fluxo MiSeq) é crítica para gerar uma
densidade ideal do conjunto e obter dados de elevada qualidade numa análise de sequenciação. Recomenda-sevivamente a quantificação da biblioteca por qPCR.
7.7.1.

Com base na concentração de amplicons calculada a partir dos resultados de qPCR, adicione uma quantidade
igual de amplicons (à exceção do NTC, que pode ser excluído).
▪
▪

7.7.2.
7.8.

Por ex., dilua cada amplicon para 4 nM num volume total de 10 μL utilizando o Tampão de diluição A como
diluente. Combine 10 μL de cada amplicon de 4 nM.
Para amostras com uma concentração <4 nM, adicione a quantidade máxima de amostra possível (10 μL) e
não adicione Tampão de diluição A a essa amostra.

Misture suavemente em vórtex, seguido por uma breve centrifugação.

Diluição da Biblioteca Agrupada
1:1000 Final:
Etapa A:
2 μL de biblioteca agrupada + 198 μL de Tampão de diluição A.
Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
Etapa B:
20 μL da Etapa A + 180 μL de Tampão de diluição A.
Misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes.

7.9.

Preparar qPCR para Library Quantification (Quantificação de Biblioteca)
Consulte a Tabela 6 para a preparação de qPCR e a Tabela 7 para o programa do termociclador.
7.9.1.

Determine a concentração da biblioteca agrupada a partir dos resultados de qPCR.
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑝𝑙𝑖𝑐𝑜𝑛𝑠 𝑛ã𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢í𝑑𝑜𝑠 (𝑛𝑀) =452 × 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑚é𝑑𝑖𝑎(𝑝𝑀)𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑞𝑃𝐶𝑅
A

452 representa o comprimento médio do fragmento (bp) do DNA Standard (Padrão de ADN) KAPA Illumina.
A = O comprimento médio do fragmento de amplicons gerados utilizando o ensaio TRG = 300 bp. (A = 300).
O comprimento das sequências inclui nucleótidos adicionais necessários para a sequenciação.
Nota:

No caso de multiplexação de vários alvos, consulte o Anexo A (secção 20) para o comprimento médio do fragmento de amplicons
gerados para outro LymphoTrack Dx Assay - MiSeq

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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7.10.

Preparação da Biblioteca para a Análise de Sequenciação MiSeq
No fim desta secção, a concentração do ADN da biblioteca será de 12 pM para o MiSeq reagent kit v2 (kit de reagente
MiSeq v2) e de 20 pM para o MiSeq reagent kit v3 (kit de reagente MiSeq v3) aquando da multiplexação. Para amultiplexação de amplicons de diferentes ensaios LymphoTrack Dx para o MiSeq numa única biblioteca, consulte asecção 20: Anexo A: Criar uma Biblioteca de Sequenciação com Múltiplos Alvos NGS.

7.10.1.

Determine a quantidade de biblioteca a preparar com base na concentração da biblioteca agrupada a partir
dos resultados de qPCR e dilua, se necessário:▪
▪

7.10.2.

Se a biblioteca for superior a 4 nM, dilua a biblioteca para 4 nM num volume final de 10 μL utilizandoo Tampão de diluição A.
Se a biblioteca for inferior a 4 nM, utilize 10 μL da biblioteca diretamente para a etapa seguinte.

Siga as instruções que se seguem para desnaturar o ADN da biblioteca.
▪
▪

Prepare uma nova solução de 0,2 N de NaOH. Preparar uma nova solução é essencial para desnaturar
completamente o ADN de amostra e para gerar o conjunto ideal no MiSeq.
Adicione 10 μL de 0,2 N de NaOH à biblioteca diluída (10 μL) preparada na etapa anterior.
Tabela 8. Desnaturação da Biblioteca

7.10.3.

7.10.4.

Reagente

VolumeBiblioteca diluída

10 μL

0,2 N de NaOH

10 μL

Volume Total

20 μL

Misture brevemente a solução em vórtex e, em seguida, centrifugue para garantir que toda a solução assentou
no fundo do tubo. Incube durante 5 minutos à temperatura ambiente para desnaturar a biblioteca de dsDNA
num ADN de cadeia simples (ssDNA).
Adicione 980 μL de tampão HT1 pré-refrigerado (fornecido nos kits de reagente MiSeq) ao tubo que contém
o ADN da biblioteca desnaturada:
Tabela 9. Adição de Tampão HT1

7.10.5.
7.10.6.
7.10.7.

Reagente

VolumeBiblioteca desnaturada

20 μLTampão HT1

980 μL

Volume Total

1000 μL

Misture brevemente em vórtex e, em seguida, centrifugue a solução de ADN da biblioteca diluída edesnaturada.
Coloque a biblioteca diluída e desnaturada em gelo até à próxima etapa.
Retire a biblioteca ssDNA diluída do gelo e utilize as instruções que se seguem para diluir a biblioteca ainda
mais, em preparação para o carregamento no MiSeq.

No caso de multiplexação de vários alvos, consulte o Anexo A (secção 20) para a concentração de carregamento e o MiSeq reagent kit (kitde reagente MiSeq).
No MiSeq Software Control (Software de controlo MiSeq) (v2.6 ou versão mais recente):
A concentração do ADN da biblioteca é de 12 pM para o MiSeq reagent kit v2 (kit de reagente MiSeq v2).
A concentração do ADN da biblioteca é de 12 a 20 pM para o MiSeq reagent kit v3 (kit de reagente MiSeq v3) no casode multiplexação.

▪

Se a concentração da biblioteca de ssDNA for 40 pM (isto é, a concentração inicial era 4 nM),dilua a biblioteca para a concentração de carregamento pretendida no MiSeq utilizando os seguintes
exemplos:LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Tabela 10. Preparação da Biblioteca para Carregamento no MiSeq▪

▪
7.10.8.
7.10.9.
7.11.

Concentrações Finais

12 pM

Biblioteca desnaturada

300 μLTampão HT1

700 μL

Concentração final de NaOH (mM)

0,60 mM

Se a concentração da biblioteca de ssDNA for inferior a 40 pM (a concentração inicial era inferior a 4 nM),dilua adequadamente o ADN desnaturado para a concentração de carregamento pretendida no MiSeq(por ex., 12 pM).
Certifique-se de que a concentração final de NaOH não é superior a 1,0 mM.

Inverta a biblioteca final 5 vezes para misturar e centrifugue por impulsos.
Coloque a biblioteca final preparada em gelo até ser carregada no MiSeq Reagent Cartridge (Cartucho dereagente MiSeq).

Carregamento da MiSeq Flow Cell (Lâmina de fluxo MiSeq)
Carregue 600 μL da biblioteca final preparada num MiSeq Reagent Cartridge (Cartucho de reagente MiSeq).
Configuração da MiSeq Sample Sheet (Folha de amostras MiSeq)
Consulte a documentação mais recente da Illumina para a criação da planilha de amostras. Carregue a planilha deamostras no instrumento MiSeq. Se estiver a usar software associado à Illumina (como o Local Run Manager (LRM)),
selecione TruSeq Nano DNA (TruSeq Nano ADN) para o Library Prep Kit (Kit de preparação de bibliotecas) e TruSeq
DNA Single Indexes Set A B (TruSeq Conjunto A B de indexadores únicos de ADN) para o Index Kit (Kit de indexadores).

Caracteres no nome da amostra:•
Crie um nome e identificador únicos a cada amostra ao designar as amostras. Se estiver a analisar amostras em duplicado, podeusar um nome semelhante (i.e., Amostra1a e Amostra1b).
•
Se não atribuir nomes únicos às amostras sequenciadas em conjunto na mesma lâmina de fluxo, apenas uma amostra seráanalisada pelo LymphoTrack Dx Software – MiSeq durante o processo de análise.
•
Utilize apenas alfanuméricos e hífens (A-Z, a-z, 0-9, ., -,) ao preparar a Sample Sheet (Folha de amostras).
Nome da amostra na multiplexação:Cada índice só pode ser incluído na Sample Sheet (Folha de amostras) uma vez. Assim sendo, qualquer informação de localização
necessária para amostras sequenciadas com múltiplos alvos utilizando o mesmo índice deve ser incluída num único campo Sample
ID (ID de amostra) (que é incorporado no nome do ficheiro FASTQ).
Acompanhe todas as amostras e alvos numa análise MiSeq que são sequenciados utilizando o mesmo índice. Deve dar-se a este
conjunto de amostras/alvos um identificador único, a incluir no campo Sample ID (ID de amostra) na Sample Sheet (Folha deamostras). Lembre-se de que o campo Sample ID (ID de amostra) tem um limite rigoroso de 40 caracteres na seleção da convenção
de denominação.

O campo Sample Name (Nome de amostra) na Sample Sheet (Folha de amostras) é incorporado por predefinição
no nome do ficheiro FASTQ em vez da Sample ID (ID de amostra) quando a informação é introduzida neste campo.
Deixe este campo em branco ou copie a informação que foi introduzida no campo Sample ID (ID de amostra). Se forem
introduzidas informações alternativas no campo Sample Name (Nome de amostra), certifique-se de que inclui um
identificador único e segue as recomendações acima para a localização de amostras.

Importante!

As sequências de adaptadores não são reconhecidas pelo LymphoTrack Dx Software – MiSeq.


Se estiver usando software associado à Illumina (como Local Run Manager (LRM)), tem de selecionar aopção Adapter trimming (Corte de adaptador) ao criar a folha de amostras.

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Tabela 11. Índices usados com amostras dos LymphoTrack Dx Assays

7.13.

LymphoTrack Dx Assay – MiSeq PCR
Master Mix IndexadaSequência do Índice

TruSeq DNA Single Indexes Set A B(TruSeq Conjunto A B de indexadoresúnicos de ADN)[LRM “Index Kit” (Kit de indexadores)]

id01

ATCACG

AR001

id02

CGATGT

AR002

id03

TTAGGC

AR003

id04

TGACCA

AR004

id05

ACAGTG

AR005

id06

GCCAAT

AR006

id07

CAGATC

AR007

id08

ACTTGA

AR008

id09

GATCAG

AR009

id10

TAGCTT

AR010

id11

GGCTAC

AR011

id12

CTTGTA

AR012

id13

AGTCAA

AR013

id14

AGTTCC

AR014

id15

ATGTCA

AR015

id16

CCGTCC

AR016

id18

GTCCGC

AR018

id19

GTGAAA

AR019

id20

GTGGCC

AR020

id21

GTTTCG

AR021

id22

CGTACG

AR022

id23

GAGTGG

AR023

id25

ACTGAT

AR025

id27

ATTCCT

AR027

Início da Análise MiSeq
Inicie a análise MiSeq seguindo as instruções do MiSeq Control Software (Software de controlo MiSeq). Os tempos deanálise MiSeq aproximados são indicados na Tabela 13.

Tabela 12. Tempos de Análise MiSeq

MiSeq Reagent Kit (Kit deReagente MiSeq)

Duração da LeituraVersão MCS

Tempo de Análise MiSeq Total

2x151 bpv2.6 ou versão mais recente~ 24 horas

2x251 bpv2.6 ou versão mais recente~ 39 horas

2x301 bpv2.6 ou versão mais recente~ 56 horasv2
v3

Nota: A utilização de um kit com menos ciclos não será suficiente para gerar leituras com a duração exigida para este ensaio.

8. Análise de Dados
O LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq foi concebido para produzir dados de sequenciação que podem ser analisados
utilizando o pacote LymphoTrack Dx Software – MiSeq fornecido no CD associado (95000009), que está incluído na
compra do ensaio. Este CD inclui instruções detalhadas para a instalação e utilização do pacote do software.

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9. Valores Esperados
Os cálculos gerados pelo software são arredondados até à décima mais próxima para determinação do resultado do ensaio.

▪
▪
▪

% de primeiras leituras do controlo positivo do TRG ≥2,5%% de primeiras leituras do controlo negativo NGS <1,0%
Validade da análise MiSeqooo*Nota:%Q30 >80% para v2 (2x151)%Q30 >75% para v2 (2x251)%Q30 >70% para v3 (2x301)
O Q30 de todas as validações analíticas cumpriu os critérios acima da especificação Q30 do sistema Illumina MiSeq. Contudo, o score
Q30 pode variar dependendo da qualidade da amostra. Se o Q30 apresentar um valor inferior à especificação Q30 do sistema
Illumina, verifique o valor Q30 do índice do relatório do LymphoTrack Dx após a análise de dados pelo LymphoTrack Dx
Software - MiSeq. Se um score Q30 do índice no relatório do LymphoTrack Dx não cumprir a especificação do sistema Illumina,
considere esse índice inválido.
A química do MiSeq v2 foi validada para este ensaio de alvo único. A química do MiSeq v3 foi validada para multiplexação doensaio.

10. Limitações do Procedimento▪
▪
▪
▪

Este ensaio não identifica 100% das populações de células clonais.
Um nível de variância superior, ao nível ou próximo do limite de deteção (LoD) analítico, é inerente à maior parte das
tecnologias, incluindo, entre outras, a sequenciação de nova geração. Recomendam-se análises de seguimento quando
um resultado se apresenta próximo do LoD analítico do ensaio.
Os ensaios baseados em PCR estão sujeitos a interferências por degradação do ADN ou inibição da amplificação por PCR
devido a heparina ou outros agentes que possam estar presentes na amostra analisada.
Os resultados dos testes de clonalidade molecular devem ser sempre interpretados no contexto de dados clínicos,
histológicos e imunofenotípicos.

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11. Interpretação e Relatório
O relatório de Merged Read Summary (Resumo das leituras fundidas) deve ser utilizado para identificar as principais
sequências de leitura fundidas e as suas frequências antes da determinação da clonalidade, utilizando os critérios
apresentados abaixo. Consulte a secção 8: Análise de Dados para obter mais informações sobre o relatório Merged Read
Summary (Resumo das leituras fundidas). Existem alguns processos clonais que podem resultar na deteção de dois ou maisclones. Exemplos de tal incluem uma população dominante com uma pequena população subclonal ou quando estão
presentes várias doenças linfoproliferativas. É especialmente importante que estes casos sejam interpretados no seu
contexto clínico.
*Tenha cuidado ao interpretar a presença de “none” (“nenhum”) para o gene V, D e/ou J em leituras clonais suspeitas. “None” (“Nenhum”)
é atribuído quando o alinhamento não cumpre o limiar mínimo de qualidade devido a um alinhamento de qualidade inferior.
Tabela 13. Critérios de Interpretação

Critério 1

O número total de leituras poramostra é ≥20 000.

O número total de leituras poramostra é ≥10 000 e <20 000.

Critério 2

A primeira sequência fundidatem ≥2,5% do total deleituras.

Critério 3

Resultado

A % de leituras para uma sequência fundidaclonal suspeita é >2X a % de leituras para a 3ªsequência fundida mais frequente.1

EVIDÊNCIA DE
CLONALIDADE DETETADA

A % de leituras para uma sequência fundidaclonal suspeita é ≤2X a % de leituras para a 3ªsequência fundida mais frequente.1

Sem evidência declonalidade detetada

A % de leituras para uma sequência fundidaclonal suspeita é >2X a % de leituras para a 3ªsequência fundida mais frequente.1

EVIDÊNCIA DE
CLONALIDADE DETETADA

A % de leituras para uma sequência fundidaclonal suspeita é ≤2X a % de leituras para a 3ªsequência fundida mais frequente.1

Sem evidência declonalidade detetada

N/ANão avaliável

A primeira sequência fundidatem ≥5,0% das leituras totais.

O número total de leituras poramostra é <10 000.

N/A

1Os cálculos gerados pelo software são arredondados até à décima mais próxima para comparação.

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Figura 2: Interpretação de dados com base em critérios da Tabela 13.

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12. Dados de Amostras

Figura 3:

Esta tabela, gerada com o LymphoTrack Dx Software - MiSeq, mostra as 10 primeiras leituras do resumo fundidas com as primeiras 500
leituras. Uma leitura é fundida com outra se apresentarem apenas uma diferença de 1 ou 2 pares de bases. As sequências foram geradas
utilizando o LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq e analisadas com o LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009).

13. Características de Desempenho
Os resultados do LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq foram comparados com o relatório de diagnóstico de laboratório e aconcordância (ou concordância percentual global), a concordância percentual positiva (PPA) e a concordância percentual
negativa (NPA) foram: 89% (51/57 casos), 81% e 97%, respetivamente.
Tabela 14. Comparação entre o LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq e o Relatório de Diagnóstico do Laboratório

Relatório de Diagnóstico do Laboratório
ClonalNão Clonal

Clonal22

1

Não Clonal

529

LymphoTrack Dx TRG
Assay - MiSeq

O desempenho analítico do LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq foi avaliado através da análise de ADN de uma linha celularclonal introduzida no ADN de amígdala faríngea a diferentes diluições. O limite de deteção (LoD) foi observado em ADN
diluído a 5%. A % mais alta de leituras de ADN da amígdala faríngea foi <1%. A regressão linear R2 foi >0,98 para um
intervalo de 0 a 10% da diluição do ADN. O coeficiente de variação (CV%) em 8 análises por 2 operadores, com 2 lotes dereagentes e 2 equipamentos, foi inferior a 15% ao testar diluições do ADN a 5% e 10%.

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14. Guia de Resolução de ProblemasTabela 15. Guia de Resolução de ProblemasOcorre Durante

Erro

Ação

Preparação de amostras e reagentes

A quantidade de ADN da amostra
é inferior a 50 ng
por um método baseado em dsDNA

Não analise a amostra

Preparação de amostras e reagentes

A integridade do ADN de amostra é baixa

Analise a amostra utilizando a Specimen Control
Size Ladder (Escala de Tamanhos de Controlo de
Amostras) fornecida pela Invivoscribe(

20960021 para deteção ABI ou
20960020 para deteção em gel)

Quantificação de amplicons utilizando o
kit KAPA library quantification(Quantificação de biblioteca KAPA)

ΔCt <4,0
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Controlo)

Verifique a curva padrão na qPCR.
Verifique a existência de contaminação e repita aqPCR KAPA para todas as amostras e controlos.
Se ΔCt <4,0 novamente, repita a PCR e a qPCR para
todas as amostras e controlos.

Criação da biblioteca por quantificação
e agrupamento de amplicons

A concentração de amplicons
é inferior a 1 nM

Verifique a curva padrão na qPCR e repita a PCR seinferior a 1 nM

Folha de amostras não encontrada
Folha de amostras incorretamente formatada
Falha na verificação dos fluidos
Preparação da análise MiSeq

Espaço em disco reduzido
Frasco de resíduos vazio

Consulte a resolução de problemasdo sistema Illumina
ou contacte o Apoio Técnico da Illumina+1-800-809-4566

Rede desligada
Falha RFID
Análise MiSeq%Q30 <80% para v2 (2x151)*%Q30 <75% para v2 (2x251)*%Q30 <70% para v3 (2x301)*

Contacte o Apoio Técnico da Invivoscribe+1-858-224-6600

Instalação com CD

O Software LymphoTrack Dx não se instalacorretamente

Contacte o Apoio Técnico da Invivoscribe+1-858-224-6600

Análise de Dados

O Software LymphoTrack Dx deixa de funcionar

Contacte o Apoio Técnico da Invivoscribe+1-858-224-6600

Análise de DadosNão é detetada nenhuma sequência clonal parao Controlo Positivo

Contacte o Apoio Técnico da Invivoscribe+1-858-224-6600

Controlo Sem Molde (NTC)

O NTC apresenta amplificação após a PCR

Repita o ensaio* O Q30 de todas as validações analíticas cumpriu os critérios acima da especificação Q30 do sistema Illumina MiSeq. Contudo, o score Q30 pode variar dependendoda qualidade da amostra. Se o Q30 apresentar um valor inferior à especificação Q30 do sistema Illumina, verifique o valor Q30 do índice do relatório do
LymphoTrack Dx após a análise de dados pelo LymphoTrack Dx Software - MiSeq. Se um score Q30 do índice no relatório do LymphoTrack Dx não cumprira especificação do sistema Illumina, considere esse índice inválido.

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15. Serviços Técnicos e Apoio ao Cliente
Obrigado por adquirir o nosso LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq. Damos valor ao seu negócio. Temos todo o gosto em
auxiliá-lo/a na compreensão deste ensaio e em fornecer-lhe assistência técnica contínua, de segunda a sexta-feira, paramanter o desempenho eficiente dos ensaios no seu laboratório.
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Serviços Técnicos: support@invivoscribe.com | Apoio ao Cliente: sales@invivoscribe.com | Website: www.invivoscribe.com

16. Bibliografia
1.
2.
3.

4.

▪
▪
▪
▪
▪
▪

Tonegawa, S. (1983). Somatic Generation of Antibody Diversity. Nature 302, 575-581
Trainor KJ. et al., (1990). Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood 75, 2220-2222
Miller, JE. (2013). Principle of Immunoglobulin and T Cell Receptor Gene Rearrangement. Em Cheng, L., Zhang,D., Eble, JN. (Eds), Molecular Genetic Pathology (2nd Ed., sections 30.2.7.13 and 30.2.7.18). New York,EUA: Springer Science & Business Media.
JJM van Dongen et al., (2003). Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the
BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17, 2257–2317.
Instruções de utilização do pacote LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009)
https://www.beckmancoulter.com
http://www.illumina.com
http://www.invitrogen.com
http://www.kapabiosystems.com
http://www.thermofisher.com

17. Símbolos
Os seguintes símbolos são utilizados na rotulagem dos produtos de NGS de diagnóstico da Invivoscribe.
Referência do catálogo

Data de validade

Volume de reagente

Representante autorizado
na União Europeia

Número de lote

Consulte as instruções de utilização

Condições de armazenamento

Para utilização em diagnóstico in vitro

Identificador de Dispositivo Exclusivo

FabricanteConformidade do Reino Unido Avaliada

Pessoa responsável no Reino Unido

Representante Autorizado Suíço

Conformidade Europeia

Aplicação de software

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18. Aviso Legal
Este produto está protegido por uma ou mais das seguintes patentes e pedidos de patente detidas por ou licenciadas
exclusivamente à Invivoscribe, Inc. (IVS). Patente dos EUA número 7785783, Patente dos EUA número 8859748 (juntamente
com as reivindicações do pedido divisionário relativas ao registo original), Patente europeia número EP 1549764B1 (válida
em 16 países e reforçada por Patentes europeias relacionadas com os números EP 2418287A3 e EP 2460889A3), Patentejaponesa número JP04708029B2, Pedido de patente japonesa número 2006-529437, Pedido de patente brasileira número
PI0410283.5, Patente canadiana número CA2525122, Patente indiana número IN243620, Patente mexicana número
MX286493, Patente chinesa número CN1806051 e Patente coreana número 101215194.
A utilização deste produto pode exigir métodos de amplificação de ácidos nucleicos, tais como a reação em cadeia da polimerase(PCR). Qualquer licença necessária para executar métodos de amplificação ou para utilizar reagentes, enzimas deamplificação ou equipamentos protegidos por patentes de terceiros é da responsabilidade do utilizador e não seráconcedida pela Invivoscribe, Inc., expressamente ou de forma implícita.
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19. LymphoTrack Dx TRG Assay - MiSeq: Guia de Página Única
19.1.

Com as mãos protegidas com luvas, retire as Master Mixes do congelador. Deixe os tubos descongelar. Em seguida,agite suavemente no vórtex para misturar.

19.2.

Numa câmara de fluxo laminar ou câmara isolada, pipete 45 L de Master Mix para poços individuais de uma placa
de PCR. Um poço para cada Master Mix e uma Master Mix por amostra, controlo positivo, negativo e sem molde.

19.3.

Adicione 0,2 L de ADN Taq polimerase (a 5 U/µL) a cada uma das Master Mixes.

19.4.

Adicione 5 L de ADN de amostra (numa concentração mínima de 10 ng/µL) e 5 L de amostras de controlo aos
poços contendo as respetivas reações de Master Mix e pipete para cima e para baixo 5 a 10 vezes para misturar.

19.5.

Adicione 5 L de água para biologia molecular ao poço contendo a respetiva Master Mix para o controlo sem molde,e pipete para cima e para baixo 5 a 10 vezes para misturar.

19.6.

Amplifique o ADN alvo utilizando o seguinte programa do termociclador:
Etapa

Temperatura

Duração

Ciclo

1

95 °C

7 minutos

1

2

95 °C

45 segundos

3

60 °C

45 segundos

4

72 °C

90 segundos

5

72 °C

10 minutos

1

6

15 C

∞

1

29x

19.7.

Retire a placa de amplificação do termociclador.

19.8.

Purifique os produtos de PCR utilizando o sistema PCR Purification (Purificação de PCR) Agencourt AMPure XP.
Adicione 50 μL de partículas a cada 50 µL de reação; efetue a eluição do ADN em 25 µL de eluato.

19.9.

Quantifique os amplicons utilizando o kit KAPA library quantification (Quantificação de biblioteca KAPA)
seguindo as instruções do kit. Dilua os amplicons a 1:4000 antes de avançar para a qPCR.

19.10.

Agrupe quantidades iguais de amplicons das amostras (não inclua o controlo sem molde), dilua 1:1000 e quantifiquea biblioteca utilizando o kit KAPA library quantification (Quantificação de biblioteca KAPA).

19.11.

Desnature e dilua a biblioteca a 12 pM para o MiSeq reagent kit v2 (kit de reagente MiSeq v2) e 12 a 20 pM parao MiSeq reagent kit v3 (kit de reagente MiSeq v3) aquando da multiplexação (MCS v2.6 ou versão mais recente).

19.12.

Carregue 600 μL da biblioteca desnaturada e diluída para o MiSeq Reagent Cartridge (Cartucho de reagente MiSeq).

19.13.

Prepare uma MiSeq Sample Sheet (Folha de amostras MiSeq) e carregue a planilha de amostras no instrumento (senecessário ).

19.14.

Inicie a análise MiSeq.

19.15.

Analise e visualize os dados adquiridos utilizando o pacote LymphoTrack Dx Software – MiSeq associado.

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20. Anexo A: Criar uma Biblioteca de Sequenciação com Múltiplos Alvos NGS
Ao analisar múltiplos alvos utilizando diferentes LymphoTrack Dx Assay - MiSeq em paralelo, é importante registar asdiferenças de procedimento entre cada ensaio. Por exemplo, o ensaio Líder IGHV utiliza 32 ciclos de PCR e deve ser
colocado numa análise de ciclagem térmica separada de outros Ensaios LymphoTrack Dx que utilizam apenas 29 ciclos de
PCR. A Tabela 16, abaixo, resume as diferenças de procedimento. Para instruções completas, consulte as instruções deutilização do respetivo LymphoTrack Dx Assay – MiSeq.
Tabela 16. Diferenças de procedimento do Ensaio LymphoTrack Dx

LymphoTrack Dx Assay - MiSeq

Procedimento
Etapa

Descrição
Líder IGHV

IGH FR1

IGH FR2

IGH FR3

IGK

TRG

TRB

7.4.1

Número de ciclos de PCR

32

29

29

29

29

29

29

7.5.1

Volume de reagente
AMPure XP (Rácio)50 µL(Rácio 1:1)

50 µL
(Rácio 1:1)

50 µL
(Rácio 1:1)

50 µL
(Rácio 1:1)

50 µL
(Rácio 1:1)

50 µL
(Rácio 1:1)

35 µL
(Rácio 0,7:1)

7.6.4

Verificação de contaminação
Valor ΔCt =Ct (NTC) – Ct (Controlo)

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥4,0

ΔCt ≥3,0

7.6.5
e
7.9.1

A
(Comprimento médio
do fragmento)

660 bp450 bp390 bp260 bp410 bp300 bp400 bpConcentração de carregamento

12 - 20 pM

12 pM

12 pM

12 pM

8 pM

12 pM

12 pM

MiSeq Reagent Kit(Kit de reagente MiSeq) parasequenciação de alvo único*v3 (600)

v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)

Definições da folha deamostras para:
Cycles Read 1*(Leitura do ciclo 1*)
Cycles Read 2*(Leitura do ciclo 2*)

301

251

251

151

251

151

251

7.10.7

7.12*Nota:A química do MiSeq v2 foi validada para estes ensaios de alvo únicos. A química do MiSeq v3 foi validada para o Líder IGHV e para multiplexação doensaio.

Duas ou mais bibliotecas de sequenciação geradas a partir das mesmas master mixes de genes alvo LymphoTrack (p. ex.,duas bibliotecas de sequenciação do TRG, do mesmo lote de kits ou de lotes diferentes) podem também ser multiplexadas
em conjunto numa única biblioteca de sequenciação, desde que cada índice para essa master mix seja apenas incluído uma
vez por análise de sequenciação. Consulte a tabela que se segue para determinar as definições dos ciclos e os kits dereagente Illumina MiSeq a utilizar com diferentes combinações de alvos. Recomenda-se a utilização do MiSeq reagent kit v3(kit de reagente MiSeq v3) aquando da sequenciação dos sete alvos em conjunto, a fim de se obterem leituras suficientes
por amostra.
Tabela 17. Definições dos Ciclos e Kits de Reagente para uma Análise MiSeq com Múltiplos Alvos

Alvos de Multiplexação

Definições da Folha de
Amostras

MiSeq Reagent Kit

Concentração deCarregamento

Ref. Catálogo

Apenas IGH FR3 e TRG
em conjunto

151 cycles Read 1
151 cycles Read 2

v2 kit (300 ciclos)ou
v2 kit (500 ciclos)

12 pM (v2)ou
20 pM (v3)MS-102-2002
ou
MS-102-2003

Qualquer combinação destes alvos
em conjunto:
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3,
IGK, TRB e TRG

251 cycles Read 1
251 cycles Read 2

v2 kit (500 ciclos)até 4 alvos ou
v3 kit (600 ciclos)

12 pM (v2)ou
20 pM (v3)MS-102-2003
ou
MS-102-3003

Ao combinar qualquer um dos
ensaios com o Líder IGHV

301 cycles Read 1
301 cycles Read 2

v3 kit (600 ciclos)

20 pM (v3)MS-102-3003

20.1.

Determine a concentração de cada biblioteca individual, (por ex., Líder IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e
TRG).

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20.2.

Determine a quantidade de cada biblioteca a desnaturar.
Na tabela abaixo, os Casos A, B, C, D, E e F são exemplos diferentes de multiplexação do ensaio (por ex., o Caso A é uma
multiplexação de Líder IGHV, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG). T, U, V, W, X, Y e Z são volumes em µL.
n=número de alvos a carregar num cartucho MiSeq

T=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca de Líder IGHV (nM)]U=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca IGH FR1 (nM)]V=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca IGH FR2 (nM)]W=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca IGH FR3 (nM)]X=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca IGK (nM)]Y=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca TRG (nM)]Z=

40 fmole/[n x concentração da biblioteca TRB (nM)]

Nota: O valor 40 fmole corresponde aos 20 µL de 2 nM no fim da etapa 20.3.
Tabela 18. Cálculo de Dados de Bibliotecas Individuais para gerar uma Biblioteca de Sequenciação de Múltiplos Alvos para a Análise MiSeq

Biblioteca

Volume da Biblioteca Individual (µL)

Nome doEnsaioConcentração

Caso A

Caso B

Caso C

Caso D

Caso E

Caso F

Líder IGHV

2,3

T

n=7

n=6

n=5

n=4

n=3

n=2

2,5

2,9

3,5

4,3

IGH FR1

1,5

U

3,8

4,4

5,3

6,7

8,9

(nM)

IGH FR2

4

V

1,4

1,7

2

2,5

3,3

IGH FR3

2,1

W

2,7

3,2

3,8

4,8

6,4

IGK

3,5

X

1,6

1,9

2,3

TRG

2,6

Y

2,2

2,6

TRB

2

Z

2,9

T+U+V+W+X+Y+Z

17,1

20.3.

16,7

5,7
7,7

16,9

18,3

18,6

13,4

Desnature as bibliotecas combinadas para 2 nM.
▪

Adicione reagentes de acordo com a Tabela 19 com base na quantidade determinada na etapa anterior.

Se T+U+V+W+X+Y+Z >18, como nos casos D e E na Tabela18, misture as bibliotecas aplicáveis primeiro e, em seguida,
adicione 18 µL à reação desnaturada, conforme apresentado na tabela que se segue.
Tabela 19. Desnaturação da Biblioteca

Reagente

Volume (µL)

Biblioteca de Líder IGHVT

Biblioteca de IGH FR1

U

Biblioteca de IGH FR2

V

Biblioteca de IGH FR3W

Biblioteca de IGK

X

Biblioteca de TRG

Y

Biblioteca de TRBZ

1N NaOH

2

10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,05% Tween 20
Total

18 – (T+U+V+W+X+Y+Z)
20

Misture brevemente a solução em vórtex e, em seguida, centrifugue para garantir que toda a solução assentou no
fundo do tubo. Incube durante 5 minutos à temperatura ambiente para desnaturar o ADN da biblioteca combinado
em cadeias simples.
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20.4.

Dilua a biblioteca desnaturada para 40 pM.
Adicione 980 μL de tampão HT1 pré-refrigerado (fornecido no MiSeq Reagent kit (kit de reagente MiSeq)) ao tubo quecontém 20 μL de ADN da biblioteca desnaturada. Misture brevemente em vórtex e centrifugue a amostra por impulsos.

20.5.

Prepare a biblioteca desnaturada para carregamento no MiSeq.
Dilua a biblioteca para 12 pM para o MiSeq reagent kit v2 (kit de reagente MiSeq v2) e 20 pM para o MiSeq reagent kit v3(kit de reagente MiSeq v3) aquando da multiplexação (MCS v2.6 ou versão mais recente) seguindo a Tabela 20. Misture
brevemente em vórtex e centrifugue a amostra por impulsos.
Tabela 20. Preparação da Biblioteca Combinada para Carregamento no MiSeq

VolumeReagente
12 pM

20 pM

Biblioteca de 40 pM

300 µL500 µLTampão HT1 refrigerado

700 µL500 µL

Total

1000 µL

1000 µL

20.6.

Carregue 600 µL da biblioteca desnaturada combinada da etapa anterior para um MiSeq Reagent Cartridge(Cartucho de reagente MiSeq).

20.7.

Prepare uma MiSeq Sample Sheet (Folha de amostras MiSeq) e carregue a planilha de amostras no instrumento (senecessário ).

20.8.

Inicie a análise MiSeq.

20.9.

Analise e visualize os dados adquiridos utilizando o pacote LymphoTrack Dx Software – MiSeq associado.

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