研究フロンティア（平成 年度学術奨励賞受賞論文）

尿道形成過程におけるアンドロゲンによる遺伝子発現制御機構の解明
松下 祥子，鈴木堅太郎，山田源

和歌山県立医科大学先端医学研究所遺伝子制御学研究部

間葉細胞におけるアンドロゲン受容体（AR）シグナル

はじめにが雄型の尿道形成に必須であることが明らかになってい多くの生物種において，雄と雌を作り出す仕組み（性る［］．さらに，尿道両側間葉細胞において Wnt シグ差構築）は生殖に不可欠であり，その確立は種の存続をナルの細胞内伝達因子であるβ-catenin が雄型の尿道形かけた重要課題である．ヒトを含む哺乳類の性差構築は，成に関与していることが示唆されている［

遺伝的支配による性差構築と分化後の生殖腺より分泌さうに雄型の尿道形成は，AR シグナルに加えて増殖因子れるホルモンによる支配をうけるもの（ホルモンによるによる制御の重要性が示唆されているが，その詳細は明性差構築）に大別される．外生殖器は，ホルモンによるらかではなかった．これまでホルモンによる外生殖器形性差構築を示す代表的な器官である．また，さまざまな成における性差構築の理解が大きく遅れていた一因は，］．このよ種において子孫を残すため必要不可欠な生殖器官であAR シグナルの標的遺伝子が同定されていなかったことり，雌雄においてその形態は大きく異なる．マウスの場にある．以前我々は，尿道の雄性化因子，特にアンドロ合，外生殖器の原基である生殖結節（genital tubercle；ゲン標的遺伝子の探索を目的として，AR シグナルが機GT）は，胎生 ．日目（E ．）以降に体幹末端の総排能する尿道両側間葉細胞を用いてマイクロアレイ解析を泄腔領域から隆起する．E ．〜 ．の間，GT は著し行った［く伸長し，その後 E ．以降になると精巣から分泌され発現する Mafb 遺伝子を同定した（図るアンドロゲンの作用によって，形態学的な性差が認めベーシックジッパープロテイン型転写因子であり，血球られるようになる．雄では将来尿道が形成される周辺の分化などに重要な機能をもつことが報告されているが，間葉細胞（尿道両側間葉細胞）と包皮が正中線に沿ってホルモン応答性や性差構築に関与するといった報告はな］．その結果，雄の尿道両側間葉細胞に強く．MAFB はB）

A）．まかった．我々は，この MAFB が AR シグナルの下流でた雄の GT は，雌に比べてサイズが増大し，陰茎および尿道の雄性化に重要な因子であることを Mafb 遺伝子改亀頭を形成する．一方，雌の GT は，尿道の取り込みが変マウスの解析などによって明らかにした［起こらず，GT は陰核を形成する［ ， ］．尿道形成過しながら，尿道形成過程における Mafb 遺伝子の発現制程は，特に顕著に性差がみられるプロセスであり，性ホ御機構は，依然として不明であった．

癒合し，尿道が GT 内部に取り込まれる（図］．しかルモンによる性差構築の分子基盤を理解するうえで有用

本研究では，Mafb 遺伝子の発現制御機構を理解し，なモデルである．また尿道下裂は，外生殖器に高頻度にその発現制御エレメントを同定するために，マウス GTみられる先天異常である［］．よって，尿道形成過程を用いた詳細な発現解析，in silico 解析，in vitro レポーの分子機構を解明することは，性差構築の理解に加えてターアッセイ，そして AR に対する抗体を用いたクロマ

その病態発症機構の理解にも寄与することが期待されチン免疫沈降解析（ChIP assay）を行った．また Mafb のる．

上流因子の候補として，外生殖器雄性化因子の外生殖器形成過程の分子機構は，遺伝子改変マウスを駆使した遺伝学的解析により明らかになりつつある．外つであるβ-catenin が Mafb の発現を制御する可能性についても検討を行った．

生殖器は，間葉細胞，外胚葉性上皮細胞，総排泄腔由来の内胚葉性上皮細胞から構成されている．特に尿道両側連絡先：松下祥子，和歌山県立医科大学先端医学研究所遺伝子制御学研究部〒 ―和歌山市紀三井寺 ―TEL/FAX： ― ―内線：
E-mail：smatsu@wakayama-med.ac.jp

mRNA の発現は，アンドロゲン投与によって亢進する
遺伝子発現制御機構を理解するために，まず MafbmRNA の 発 現 を in situ hybridization 法 に よ り 解 析 を日本生殖内分泌学会雑誌（2016）21 : 23-26

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松下祥子

他

AMAFB
E16.5

E16.5
CB図

マウス生殖結節（GT）における MAFB の発現パターン（A）E ．雄マウスの GT の冠状断面図．尿道周辺には尿道形成に重要な尿道両側間葉細胞が存在する．
（B）E ．マウス GT における MAFB の発現．雄マウスでは，尿道両側間葉細胞に MAFB の発現が認められる（矢頭）．

行った．E ．までは Mafb mRNA の発現に雌雄差が認ローニングし，ルシフェラーゼレポーターアッセイをめられなかったが，E ．から尿道両側間葉細胞におい行った．アンドロゲン応答性を有するヒト肝がん細胞株て雄特異的な発現が認められた．次に in vitro 器官培養である HepG 細胞を用いたレポーターアッセイにおい系を用いて，アンドロゲン投与によって Mafb mRNAて，アンドロゲン投与群が非投与群に比べ約 倍の活性の発現が亢進するかどうか定量的 PCR 法により解析をを示した．以上の結果より，Mafb 遺伝子近傍の多くの行った．その結果，アンドロゲン投与 時間後，雌雄ど生物種に保存されている領域は，アンドロゲン応答性のちらにおいても非投与群に比べてアンドロゲン投与群で領域であることが示唆された．

Mafb mRNA の発現が亢進した．

次に，この多くの生物種に保存されている領域の中で，アンドロゲンによる制御における重要な制御領域の同定

非翻訳領域（UTR）は，AR シグナルを行った．まず，同領域の中で特に高い保存性を示したによって制御されるエンハンサー活性をもつUTR に注目した．その結果，〜＋）・後半部（＋〜＋UTR 前半部（＋）は，AR 受容体シMafb mRNA の発現が尿道形成過程においてアンドログナルによって制御されるエンハンサー活性をもつこと

ゲン投与によって顕著に亢進したことから，我々は Mafbが明らかになった．さらに，クロマチン免疫沈降実験，が AR シグナルの直接的なターゲットである可能性につ変異を導入したレポーターベクターを用いた解析によいて検証した．Mafb 遺伝子近傍のアンドロゲン応答性

り，雄の GT において AR が Mafbの領域を明らかにするために，Mafb 遺伝子の配列を生る物種間で比較した．その結果，に結合することが示唆された．

領 域（上流領域，UTR）を 含 む 約 ．kb（−〜＋非翻訳

UTR 上に存在す

つの機能的なアンドロゲン応答エレメント（ARE），＋UTR もアンドロゲン応答性を示す＝転写開始点）は，多くの生物種で保存されていることが明らかになった．実際にこの領域がアンドロゲン応答性を有しているのかを検証するために，この領域をク

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.21 2016

次にUTR 以外の領域のプロモーターを含む

上尿道形成過程におけるアンドロゲンによる Mafb 遺伝子発現制御機構の解明-catenin-cateninMafb
Mafb
MAFB

図

流 領 域（−〜−した．その結果，マウス胎仔期尿道形成過程における MAFB の発現制御機構

UTR（＋），MAFB）に 注 目部分的に重複した．さらにβ-catenin が Mafb の発現を誘UTR はアンドロゲン応答性を示し，導する可能性をレポーターアッセイにより検証したとこ

一方でプロモーターを含む

上流領域はアンドロゲンろ，恒常的活性化型β-catenin を発現させた実験群ではUTR に関して詳細に非発現群に比べ 倍以上の活性を示した．以上の結果よ応答性を示さなかった．さらに解析を行ったところ，〜

UTR の後半部（＋〜＋）り，外生殖器雄性化因子の一種であるβ-catenin は，Mafbがアンドロゲン応答性の領域であることが示唆された．の上流候補因子である可能性が示唆された．

外 生 殖 器 雄 性 化 因 子 の つ で あ るβ-catenin は，

おわりにの上流候補因子である
本研究により Mafb 遺伝子
UTR だけでなく，非翻訳領域（UTR）がUTRアンドロゲン受容体（AR）シグナルによって制御されもアンドロゲン応答性の領域であることが示唆された．

るエンハンサー様の領域であること，そして同領域に含本研究により，Mafb の
しかしながら，UTR にはUTR と違ってアンドロゲン応答エレメント（ARE）は存在しなかった．そこで，UTR を介したアンドロゲンによる発現制御には ARまれる個のアンドロゲン応答エレメント（ARE）が明UTR に加えて，らかになった．またUTR もアンドロゲン応答領域を含んでいた．さらに，外生殖器雄性に加え，他の因子を介した制御の可能性が想起された．

化因子のそこで我々は，Mafb の上流候補因子としてβ-catenin に可能性が初めて示唆された（図注目した．β-catenin は Wnt シグナルの構成因子として，従来から解析が進んでいる翻訳制御のみならず，転写制転写制御因子としての機能を有している．Wnt シグナ

御にも重要であることが報告され，近年注目されている．

ルは，胚発生やがんに関連する多くのタンパク質のシグ

実際に外生殖器先天異常である尿道下裂の患者の中にナルネットワークである［は，Bmp 遺伝子や Mafb 遺伝子と同じ bZip ファミリー］．当研究室の解析により，β-catenin が外生殖器雄性化因子のつであることが明つであるβ-catenin が Mafb の発現を制御するの Atf 遺 伝 子 の）［］．

UTR は，UTR 上 の 変 異 が 報 告 さ れ て い る］
．間葉細胞特異的β-catenin knock-［ ， ］．このように UTR を介した転写制御メカニズ

out マウスの雄では，正常な雄型の尿道形成が認められムをさらに詳細に解析することは，尿道下裂をはじめとなかった．またβ-catenin は AR と直接結合して，下流遺した病態解明に役立つと考えられる．さらにアンドロゲ伝子の転写を協調的に活性化することも報告されている

ン応答性の遺伝子発現制御機構のモデルとしても今後注らかになっている［［］．そこでβ-catenin が Mafb の発現をマウス GT において制御するか検討を行った．まず外生殖器における目される．
Wnt シグナルの重要な制御因子であるβ-catenin は，MAFB とβ-catenin の発現の比較を行ったところ，MAFB

外生殖器雄性化因子のとβ-catenin の発現は E ．の雄の尿道周辺間葉細胞でいるが，尿道両側間葉細胞における下流因子は不明でつであることが明らかになって研究フロンティア

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松下祥子

他あった．今回の解析によってβ-catenin が Mafb の発現を制御する可能性が示唆された．今後は遺伝子改変マウスを用いた解析に加え，タンパク質相互作用解析等を行い，外生殖器における AR とβ-catenin の直接的な相互作用の可能性も含めて，詳細に分子メカニズムを調べる予定である．さらに，次世代シークエンサーを用いたゲノムワイドな解析を行い，Mafb を軸とした性差発現制御機構を理解することで，これまで未解明であった外生殖器形成過程におけるホルモン依存的性差構築機構の全容が解明されることが期待される．
謝辞

本稿は年度に日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．執筆する機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔教授，第回学術集会会長 藤澤正人教授，ならびに筒井和義教授，井上 聡教授に心から感謝申し上げます．

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