学術奨励賞受賞論文

オレキシンの生殖機能抑制作用に関する作用機序についての検討
尾形 理江１），松崎 利也１），清川麻知子２），岩佐武１），清水 扶美１），田中 尚子１），苛原稔１）

１）徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部発生発達医学講座女性医学分野
２）徳島市民病院

背景

ダイエットによる体重減少で無月経が起きるように，摂食行動と生殖機構は密接に関連しているが，両者を結びつける機構は明らかではなかった．近年，分子生物学，らかにするために卵巣摘出ラットを用いて検討した．

方法

１）実験動物

分子遺伝学的手法を用いた研究により摂食行動を調節す

実験動物は，ウイスター系成熟雌ラットを用いた．8

る物質が発見され，それらが性機能に影響を及ぼすこと

週齢時に，ペントバルビタール（40mg/kg）の腹腔内が報告されるようになってきた．

投与による麻酔下に，両側卵巣を摘出した．10週齢時，1998年に未知のＧ蛋白質共役受容体に対するリガンド

ペントバルビタール（50mg/kg）腹腔内投与による麻として同定されたオレキシンは摂食促進作用をもってお酔下に，定位固定装置を用いて第３脳室内への投与針をり［１］，絶食により摂食中枢として知られる視床下部留置した．11週齢時，ケタミンおよびキシラジン（20:外側野（LHA）とその周辺に発現する．強力な摂食促５mg/kg）の腹腔内投与による麻酔下に，外頸静脈よ進物質であるNeuropeptide Y（NPY）が存在する視床り右心房内へシリコンチューブを留置し，翌日下記の実下部の弓状核（ARC）や室傍核（PVN）周辺へオレキ験を行った．

シンの神経投射がみられ［２］，NPYのY1受容体拮抗薬によってオレキシンの摂食促進作用が低下することか

２）NPYの関与の有無に関する実験

ら，オレキシンの摂食促進作用の一部はNPYを介すこ①摂食実験：暗期にオレキシンA3nmolまたは生理食塩とが明らかになっている［３］．オレキシンの生殖機能

水５μlを第３脳室内へ投与し，投与後２時間の摂食量への影響に関して，われわれは卵巣摘出後ラットを用いを測定した．てオレキシンが視床下部レベルでGnRHのパルス状分泌② 生 殖 実 験： 明 期 に， オ レ キ シ ン Ａ 投 与 の10分 前 にを抑制することを報告した［４］．オレキシンのGnRH

NPY抗体５μlまたは生理食塩水５μlを前処置として脳分泌抑制作用に関しては，オレキシンが齧歯類では室内投与した後，オレキシンA3nmolまたは生理食塩水

GnRH産生細胞が存在する視索前野（POA），中隔核群５μlの脳室内投与を行った．2時間にわたり，6分毎に（septal nuclei）に神経投射していることから，GnRHニ

右心房内カテーテルより採血を行い，採血と同時に生理ューロンへの直接作用が考えられ，また，ARCやPVN食塩水を静脈内投与した．にも神経投射し，GnRH分泌を抑制する作用をもつNPY検討群は，Group C（n＝9）：生理食塩水脳室内投与

ニューロンやβエンドルフィンの前駆体である前処置および生理食塩水脳室内投与，Group O（n＝8）：proopiomelanocortin（POMC）を神経支配している［５生理食塩水脳室内投与前処置およびオレキシンＡ脳室内-７］ことから，これらの神経ペプチドを介して間接的投与，Group ON（n＝8）：NPY抗体脳室内投与前処置に作用している可能性も考えられる．

およびオレキシンＡ脳室内投与の３群とした．

今回われわれは，NPYおよびβエンドルフィンが，オレキシンのGnRH分泌抑制作用に関与しているかを明連絡先：尾形理江，徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス
研究部発生発達医学講座女性医学分野，〒770-8503 徳島市蔵本町2-3-5
TEL: 088-633-7177
FAX: 088-631-2630
E-mail: oga@clin.med.tokushima-u.ac.jp

３）βエンドルフィンの関与の有無に関する実験
オレキシンA3nmol，オレキシンB3nmolまたは生理食塩水５μlを第３脳室内へ投与し，投与後２時間にわたり，6分毎に右心房内カテーテルより採血を行った．採血と同時に，ナロキソン（0.5mg/kg/h）または生理食塩水を静脈内投与した．

日本生殖内分泌学会雑誌（2004）9：45-48

45尾形 理江他

検討群は，Group 1（n＝7）：生理食塩水脳室内投与0.01），NPY抗体を前投与した後にオレキシンＡを投与および生理食塩水静脈内投与，Group 2（n＝8）：生理したGroup ONでは，Group Oと比べてパルス状分泌の食塩水脳室内投与およびナロキソン静脈内投与，Group頻度が有意に（p＜0.05）多かった（図２）．しかし，3（n＝7）：オレキシンＡ脳室内投与および生理食塩水Group ONのLHパルス状分泌の頻度は，Group Cと比べ静脈内投与，Group 4（n＝7）：オレキシンＡ脳室内投ると有意に（p＜0.05）少なく，オレキシンＡのLHパル

与およびナロキソン静脈内投与，Group 5（n＝8）：オス状分泌抑制効果はNPY抗体により解除されるが，完レキシンＢ脳室内投与および生理食塩水静脈内投与，全ではないと考えられた．パルス状分泌の振幅は各群でGroup 6（n＝8）：オレキシンＡ脳室内投与およびナロ有意差を認めなかった．脳室内投与後の血中LH濃度のキソン静脈内投与の６群とした．

推移を脳室内投与前のLHの値を100%として解析した

４）血中LH濃度の測定と統計処理（図３）．オレキシンＡを投与したGroup Oでは，30分後検体は，ただちに血清を分離し−40℃で冷凍保存した．
後日，血清LH値をRIAにて測定し，LHパルス状分泌の平均値，頻度，振幅につき検討した．LHパルスの判定**（pulses/2hrs）***

5

Pulse frequency

基準は，平均LH値付近での測定内変動係数の２倍以上の上昇とした．血清LH濃度は，ラジオイムノアッセイキット（Amersham Bioscience社製）を用いて測定した．
統計解析は，ANOVAを用いて行い，p＜0.05を有意差43210ありと判定した．

Group C(n=9)

Group O(n=8)

Group ON(n=8)

Group C(n=9)

Group O(n=8)

Group ON(n=8)(ng /ml)績8

Pulse amplitude

成１）NPYの関与の有無
暗期における脳室内投与後２時間の摂食量は，コントロールであるGroup Cの0.81±1.01g（mean±SD）に比べ，6420オレキシンＡを投与したGroup Oでは有意に（p＜0.05）
多かった（図１）．NPY抗体を前処置した後，オレキシ*:p<0.01, **:p<0.05(mean±S.E.)

ンＡを投与したGroup ONの摂食量はGroup Oよりも有図２

脳室内投与後のLHのパルス状分泌の頻度と振幅意に少なく（p＜0.05），オレキシンＡによる摂食促進効(%)
120

果が完全に解除されていた．に 比 べ て パ ル ス 状 分 泌 の 頻 度 が 有 意 に 少 な く（p＜＊＊60分後180400Group C(n=9)

図１4640012020**

80

120分後

Food intake＊＊*

400120(g/2hrs)
3**

80

30分後

LHパルス状分泌の頻度と振幅を解析結果したところ，オレキシンＡを脳質内投与したGroup Oでは，Group C*Group O
Group ON(n=8)(n=8)(mean±S.E.) ＊＊ p<0.05

脳室内投与後２時間の摂食量

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 92004

Group C(n=9)

図３Group O(n=8)

Group ON(mean±S.E.)(n=8)*:p<0.01, **:p<0.05

脳室内投与後の血中LH濃度の推移（投与前の値を100%とした）

オレキシンの生殖機能抑制作用に関する作用機序についての検討および60分後の血中LH濃度はGroup Cに比べて有意にNPYを介して摂食促進作用を発揮する［１］．その他，（p＜0.01）低かった．NPY抗体を前投与したGroup ON

自発運動量の亢進や覚醒レベルの増加など，オレキシン

では，30分後および60分後で，血中LH濃度がＯ群に比は多彩な生理作用を有するが，本研究では性機能抑制作べて有意に（p＜0.05）高かった．120分後のLH濃度は用とその経路について検討を行った．

各群に有意差を認めず，今回の単回投与量では，効果の持続が一時間程度と考えられた．

本研究で卵巣摘出後ラットの脳室内にオレキシンを投与したところ，摂食量を増加させる作用が確認され，同時にLHのパルス状分泌は強く抑制された．オレキシン２）βエンドルフィンの関与の有無のLH分泌に対する抑制作用は，脳室内投与後ただちにLHパルス状分泌の解析結果を図４および図５に示し現れ，約１時間にわたって持続していた．パルス状分泌た．間欠的にナロキソンを静脈内投与したGroup 2は，の頻度が低下していることから，オレキシンは視床下部

平均LH値，LHのパルス頻度にコントロール（Group １）のGnRH分泌を抑制していると考えられた．NPY抗体のと差異はなかった．オレキシンＡを投与したGroup 3で前処置により，オレキシンＡの摂食促進作用は完全に解は，コントロールに比べて平均LH値が有意（p＜0.01）

除され，一方，LHのパルス状分泌抑制作用は部分的にに低く，LHのパルス状分泌の頻度も有意（p＜0.01）に解除された．このことから，オレキシンＡの摂食促進作少なかった．オレキシンＡとナロキソンを同時に投与し用はほぼ完全にNPYを介し，GnRHパルス状分泌抑制作

たGroup 4では，オレキシンＡのみを投与したGroup 3

用は，部分的にNPYを介することが示唆された．に比べて平均LH値が有意（p＜0.01）に高く，LHのパル摂食およびエネルギー調節に重要な役割を果たしていス状分泌の頻度も有意（p＜0.01）に多かった．しかし，るARCのNPYニューロンは，GnRHニューロンの存在す

LHのパルス状分泌の頻度はコントロールに比べると有るPOAへ神経投射していることが形態学的に証明され意（p＜0.01）に少ない頻度であった．オレキシンＢのており，medial basal hypothalamus（MBH）にも直接みを投与したgroup 5でも，平均LH値が有意（p＜0.05）

的に神経投射し，GnRHの産生および放出を調節していに低く，LHのパルス状分泌の頻度も有意（p＜0.05）にることが推察されている［９］．一方，GnRHの株細胞少なかった．オレキシンＢとナロキソンを同時に投与しで あ るGT-1細 胞 に はNPY Y1受 容 体 が 存 在 し［10］，たgroup 6は，group 5と差異を認めなかった．LHパル

NPY受容体のサブタイプのうち，Y1とY4がLHの放出

ス状分泌の振幅には差異を認めなかった．

を促進することが報告されている［11］．In vivoにおいては，NPYを卵巣摘出ラットへ脳室内投与するとLHの考察パ ル ス 状 分 泌 を 抑 制 す る が，E2を 前 処 置 し た 場 合，
NPYはLH分泌を促進することも報告されている［７］．

オレキシンの前駆体であるprepro-orexin mRNAの発このように，NPYのゴナドトロピン分泌系に対する作現は，48時間絶食後のラットで絶食前に比べ約2.5倍に用はエストロゲンの有無で異なると考えられる．オレキ

上昇し，産生されたオレキシンは視床下部弓状核のシンのゴナドトロピン分泌に対する作用も同様であり，卵巣摘出ラットに脳室内投与するとLH値［12］および

mean LH

Pulse frequency

LHパルス状分泌が抑制され［４］，卵巣摘出後にE2をPulse amplitude

補充したラットに脳室内投与するとLH値が上昇し［12］，*(ng/ml)10***(pulses/2hrs)
6**(ng/ml)88
46

発情前期のラットから摘出した脳にオレキシンを投与す

6る とGnRH分 泌 が 促 進 さ れ る［13］． 以 上 の よ う に，442220group1group2group 3group 40group1group2group 3group 40group1(mean±S.E.)

group2group 3group 4*:p<0.01, **:p<0.05

図４ 脳室内投与後の平均LH，LHのパルス状分泌の頻度と振幅（オレキシンＡ）
mean LH

Pulse frequency**(ng/ml)10(pulses/2hrs)
6**にもレプチンや，迷走神経由来の延髄からの神経投射な

6464420group1group2group 5group 60

どの多様な情報を統合することで体内のエネルギー状態

22group1group2group 5group 60のGnRHへの作用がNPYを介していることを支持していNPYは強力な摂食促進物質であり，オレキシン以外(ng/ml)
88系への影響が変化する点でも共通性があり，オレキシン
る．

Pulse amplitude****

NPYとORXはともにエストロゲンの存在によって性腺group1(mean±S.E.)

group2group 5group 6**:p<0.05

図５ 脳室内投与後の平均LH，LHのパルス状分泌の頻度と振幅（オレキシンＢ）を認識し，食欲を調節する重要な役割を担っている．個体生命の維持と種の保存にとって，生殖機能は，エネル

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尾形 理江他

ギー状態が良好な時に活性化され，不良の場合には抑制されることが好ましく，事実，絶食状態の雌動物では，性周期が抑制され［14］，性行動も抑制される［15］．したがって，NPYのように栄養状態の情報を統合するニ
ューロンからの情報は性機能の調節に重要な意味をもつと考えられ，今回のわれわれのデータもそのことを支持している．
一方，内因性オピオイドのβエンドルフィンはGnRHの抑制系として働いている．βエンドルフィンの拮抗薬であるナロキソン（NAL）は，βエンドルフィンが活性化されている状況下でGnRHの抑制を解除する効果をもつが，本研究でオレキシンＡとNALの同時投与で平均LH濃度はほぼコントロールと同等にまで回復し，パルス状分泌の頻度も若干は回復した．この結果より，オレキシンＡのLHパルス状分泌抑制作用は一部βエンドルフィンを介していることが示唆された．一方，オレキシンＢのLHパルス状分泌抑制作用はNALの同時投与により解除できず，オレキシンＢによるGnRH分泌抑制作用には，βエンドルフィンは関与していないと考えられる．GnRH分泌を調整する重要な因子としては，βエンドルフィン，NPYの他，CRHがあり，オレキシンにはCRHを介した作用経路が存在する可能性や，直接的にGnRH分泌を抑制する可能性も考えられ，今後さらなる検討が必要と考えられる．

結論

摂食調節物質オレキシンは，体内のエネルギー状態の欠乏をNPYに伝える因子のひとつであり，オレキシンの摂食促進作用とGnRH抑制作用はともにNPYを介していることが明らかになった．また，GnRH抑制作用にはβエンドルフィンを介する経路も存在していた．オレキシンを含めた摂食調節系から性機能調節系へのクロストークシグナルは，生体の生殖機能が適した時期に行われるために重要であると考えられる．

文

献

１．Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, Matsuzaki I, Chemelli RM,Tanaka H, Williams SC, Richarson JA, Kozlowski GP, Wilson
S, Arch JR, Buckingham RE, Haynes AC, Carr SA, Annan
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２．Date Y, Ueta Y, Yamashita H, Yamaguchi H, Matsukura S,48

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 92004

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３．Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, Matsuzaki I, Chemelli RM,Tanaka H, Williams SC, Richarson JA, Kozlowski GP, WilsonS, Arch JR, Buckingham RE, Haynes AC, Carr SA, Annan
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