研究フロンティア（平成１９年度学術奨励賞受賞論文）

排卵過程の顆粒層細胞における SNAP２５により制御されるホルモン分泌機構
島田 昌之１），西松 恵子１），JoAnne S. Richards２）
１）広島大学大学院生物圏科学研究科
２）Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine［６］．この Amphoregulin や Epiregulin は，Conti M 等

はじめにのグループにより２００４年に排卵過程の顆粒層細胞に発現哺乳動物卵子の排卵は，下垂体からの LH サージの作することが明らかとされた因子である［７］．その後の用により，引き起こされる．この LH に対する受容体は，彼らの研究により，それらの遺伝子欠損マウスでは排卵卵子には全く発現せず，卵子を直接取り囲み，排卵時に数の低下が認められることが示され，顆粒層細胞が合共に卵管へと排出される卵丘細胞にもほとんど存在しな成・分泌し，卵丘細胞を刺激する重要な因子であると考い．これは，卵子が分泌する GDF９がその発現を抑制す

えられている［８］．これら EGF like factor は，細胞膜るためであり，LH 受容体は，排卵直前卵胞の顆粒層細貫通部位をもち，細胞外部位に EGF胞に発現する．したがって，排卵刺激は顆粒層細胞を介ことから，切断酵素による修飾を経て，初めて活性型へして，卵子および卵丘細胞に伝達されると考えられる．と変化する．Shain らは，a disinteglin and metallopro-

これまでの多くの研究により，LH 刺激を受けた顆粒

tease

domain を有する

family に 属 す る ADAM１７が amphiegulin と層細胞は，プロスタグランジン E２（PGE２）とプロジェ

epiregulin を切断することを明らかとした［９］．著者

ステロンを合成することが知られている［１］．PGE２合らは，この ADAM１７がブタ顆粒層細胞と卵丘細胞で FSH成酵素である COX―２（Ptgs2）の遺伝子欠損マウスは，/LH 刺激により発現し，酵素活性も上昇すること，こ卵丘細胞の膨潤が不十分であり，排卵数が低下し，受精の ADAM１７の抑制剤が卵丘細胞と顆粒層細胞におけるが完全に認められず，不妊を呈する［２］．PGE２の受容ERK１/２のリン酸化を阻害し，その結果卵丘細胞の膨潤体である EP２（Pger2）の遺伝子欠損マウスも同様の表が認められないことを示した［１０］．さらに，ラットの現系を示すことから［３］，排卵および卵子成熟への PGE

顆粒層細胞において Adam17を siRNA によりノックダ２の役割が明らかとなっている．一方，プロジェステロ

ウンすると ERK１/２のリン酸化が抑制されることも示しンは，プロジェステロン合成に関わる P４５０scc の抑制剤た．これらの結果から，LH 刺激を受けた顆粒層細胞にで あ る aminoglutethimide や３βHSD の 抑 制 剤 で あ る

おいて PGE２やプロジェステロン系を介して EGF

likeepostatin の投与が，ラットの排卵数を低下させることfactor が発現され，それが ADAM１７により修飾されるこが報告されている［４］．さらに，プロジェステロンにとで，EGF domain が卵丘細胞を刺激する結果，卵丘細対する受容体である Pgr 遺伝子の欠損マウスは，排卵直胞の膨潤と卵子の成熟が誘起されることが明らかとなっ前卵胞が形成されるが卵子の排卵が完全に抑制され，黄た．

体内部に卵子がトラップされた状態を示す［５］．

Kawamura らは，マウス卵巣をサンプルとしたマイク

われわれは，この Ptgs 2 遺伝子欠損マウスと Pgr 遺ロアレイ解析により，顆粒層細胞と卵丘細胞が brain―de-伝子欠損マウスのマイクロアレイ解析から，排卵過程

rived neurotrophic factor（BDNF）を発現すること，そに お い て EGF

factor に 属 す る Amphiregulin やの受容体である TrkB receptor は卵子に発現することをEpiregulin の発現量が野生型マウスの顆粒層細胞におけ認めた［１１］．この BDNF あるいは TrkB receptor の抑るそれらに比較して有意に低いことを明らかとした制剤をマウスの卵胞培養系に添加する実験により，likeBDNF が卵子の第一極体放出を促進することが明らか
連絡先：島田昌之，広島大学大学院生物圏科学研究科〒７３９―８５２８ 広島県東広島市鏡山１―４―４TEL :０８２―４２４―７８９９FAL :０８２―４２４―７８９９E―mail : mashimad@hirosima-u.ac.jpとされている．さらに，排卵過程において顆粒層細胞がInterleukin（IL）類とその受容体を発現すること，卵巣の組織培養系において IL―１が排卵を促進し，IL―６はプロジェステロン合成を制御することなどが報告されてい日本生殖内分泌学会雑誌（2008）13 : 17-23

17

島田昌之

他

た．その結果，Ca２＋結合部位を有する Syt1，2，6とそれらと結合する Snap25は，hCG 刺激により発現が有意に増加したが，Syt3，4，7および Snap23に有意な変化は認められなかった（図２）．
Western blotting の結果，SYT１と SNAP２５のタンパク質レベルでの発現上昇も確認されたことから，免疫沈降法により両者の結合状態について検出した．その結果，
hCG 投与８時間および１６時間において，SYT１と結合した SNAP２５のバンドが認められた．これらの結果から，排卵過程において Ca２＋依存的な制御系エキソサイトー
図１

神経細胞におけるエキソサイトーシス機構のモデル
Ａ：Ca２＋依存的エキソサイトーシス，Ca２＋との結合依存的に分泌顆粒に存在する SYT１が，細胞膜状の SNAP２５と結合し，膜融合により分泌顆粒内部のホルモンが細胞外へと放出される．
３と結Ｂ：Ca２＋結合部位をもたない SYT３あるいは SYT７が SNAP２合し，分泌顆粒内部から放出されるシスが機能していることが初めて明らかとなった（図３）．

Snap25 の発現制御機構
制御系エキソサイトーシスに関わる因子についてマイる［１２―１４］．IL 類や BDNF は，細胞膜貫通部位をもた

クロアレイ解析のデータベースを検索した結果，Snap25ないため，分泌顆粒から放出されると考えられることかの発現が Pgr 遺伝子欠損マウス（PRKO）において有意ら，エキソサイトーシスによるホルモン分泌機構も排卵に抑制されていた．RT―PCR や western blotting によるに重要な役割を果たしていると推察される．しかし，こ結 果 に お い て も，PRKO マ ウ ス で は 排 卵 刺 激 に よ る

れまで，排卵過程におけるエキソサイトーシス機構は，SNAP25の発現上昇が認められなかった（図４Ａ，Ｂ）．

ほとんど解明されていないのが現状であり，いつ，どの体外培養系においても，PGR の拮抗的阻害剤である RU

ような制御機構により生理活性因子が分泌されるかは，４８６の添加は，LH により誘導される顆粒層細胞の Snap

全く明らかとされていない．

25発現を低下させ，一方で PGR の過剰発現は Snap25の発現を促進させたことから，PGR による直接的 な排卵過程におけるエキソサイトーシス関連因子の発現

Snap25発現制御機構の存在が示唆された（図４C，D）．
そこで，この PGR による Snap25 の発現制御機構を解

エキソサイトーシスは，Ca２＋上昇により誘起される制２＋御系エキソサイトーシスと Ca 非依存的な構造系エキソサイトーシスに区分される（図１）．これは，分泌顆析する目的で，Snap25 の promoter construction を作成し，プロモーター活性測定を行った．
Snap25 のプロモーター領域には，AP１ site，SP１/SP粒膜に存在する Synaptotagmin（Syt）family の構造の違

３site，TATA

いによるものである．すなわち，SYT１，２，４―６は C 末を欠損させた construction も作成し，その活性を測定し端付近に Ca２＋結合部位をもち，この Ca２＋結合部位を有た結果，−４１bp から−１０２bp に存在する３つの SP１/SP２＋box と CRE が存在することから，これらする Syt は Ca 存在下で細胞膜に局在する Synaptoso-３site の欠失によりプロモーター活性が低下した（図５）．

―２５と結合することによmal associated protein（SNAP）

この結果は，同様のプロモーター活性測定を神経細胞系り，分泌顆粒と細胞膜の融合が生じ，分泌顆粒の内容物において行った Wilson らの結果と同様であったことか２＋が放出される［１５］．一方，SYT３や SYT７は Ca 結合部
２＋ら［１７］，細胞種を問わず SP１/SP３が Snap25の発現に

位 を も た な い が，Ca 非 存 在 下 に お い て も 細 胞 膜 の重要な役割を果たしていると考えられた．この promoter３と結合し， 分泌顆粒の開裂が誘起される［１６］．
SNAP―２construction と PGR の 発 現 ベ ク タ ー を co―transfection

そこで，排卵過程の顆粒層細胞における Syt family とした結果，顆粒層細胞においてはプロモーター活性が強Snap23や Snap25の発現変化の解析を行った．

発現した PGR と SP１/SP３サイトの相互作用により上昇

３週齢の C５７BL６雌マウスに４IU の eCG を投与して，したが，神経細胞のモデルである PC１２細胞においては，卵胞を発達させ，４８時間後に hCG を投与して排卵を誘

その PGR によるポジティブな影響は検出されなかった．

起した．hCG 投与後，経時的に顆粒層細胞を回収し，これらの結果から，卵巣特異的な PGR に依存した Snap

抽出した RNA を逆転写後，real―time18

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.13 2008

PCR 解析を行っ25の発現機構が初めて明らかとなった．

排卵過程の顆粒層細胞における SNAP２５により制御されるホルモン分泌機構

図２

排卵過程の顆粒層細胞におけるエキソサイトーシス関連因子の発現変化
Ａ：脳および顆粒層細胞における Syt１〜７ mRNA の RT―PCR による検出
８時間後に hCG を投与したマウスから回収した顆粒層細胞におけるＢ―Ｅ：eCG 投与４
Syt１（Ｂ），Syt２（Ｃ），Syt６（Ｄ），Snap２５（Ｅ）mRNA の発現変化
Fold induction : hCG 投与前（０hr）を１とした相対比＊：hCG 投与前（０hr）に比較して有意差あり（P＜０．
０５）

SNAP２５の機能解析
排卵過程において，卵巣特異的な PGR 依存的な機構により発現し，かつ Ca２＋結合部位を有する SYTfamilyと結合する SNAP２５の機能を明らかとすることを目的として，以下の実験を行った．顆粒層細胞を LH 様の作用を有する forskolin＋PMA 添加培地で培養し，培養後の培地を抗体アレイによるサイトカイン類の網羅的解析に，顆粒層細胞は分泌因子の遺伝子発現解析に供試した．
その結果，forskolin＋PMA 処理により，１１種類のサイ
図３

排卵過程の顆粒層細胞における SYT１および SNAP２５のタンパク質量とその相互作用トカイン類の分泌が検出された．RU４８６の添加により，Snap25の発現は抑制されたが，Syt1や Snap23などの分泌機構に関わる因子および Il６などの分泌因子の発現に研究フロンティア

19

島田昌之

他

図４

顆粒層細胞の SNAP２５の発現に及ぼす PGR の役割
Ａ，Ｂ：hCG 注入８時間後の Pgr knockout mice から回収した顆粒層細胞における SNAP２５のタンパク質量（Ａ）と mRNA 発現量（Ｂ）
Ｃ，Ｄ：顆粒層細胞を forskolin（For）＋PMA あるいは LH 添加培地で培養した時の SNAP２５のタンパク質量（Ｃ）および mRNA 発現（Ｄ）に及ぼす RU４８６の影響影響はなかった．しかし，サイトカイン類の培地中へのス［１９］は，胚発生期に致死となることから，その体内分泌は，RU４８６により有意に抑制されたことから，RUにおける生殖機構に関わる役割はまだ充分には解明でき

４８６による Snap25の発現抑制により，エキソサイトーていない．しかし，排卵不全を呈する PRKO マウスにシスが機能を低下したと考えられた．

おいてその発現上昇が認められないこと，PRKO マウス

そこで，Snap25 siRNA により SNAP２５の発現量を特とは異なったメカニズムにより排卵不全となる phos-異的に低下させ，サイトカイン類の発現と分泌量に及ぼphodiesterase type４D（PDE４B）遺伝子欠損マウスにおす影響を検出した．Snap25 siRNA は，forskolin＋PMA

いても，LH 刺激による Snap25の発現は認められない処理による SNAP２５の発現を著しく低下させたが，Il6こと（Conti M., personal communication）から，重要mRNA の発現に影響はなかった（図６）．このときの培な役割を担っていると考えている．今後，Cre―LoxP を地中に分泌されたサイトカイン量は，IL―６のみでなく，用いた卵巣特異的欠損個体の作出により，その機能の詳

他の forskolin＋PMA 処理により分泌が上昇する因子す細を検討していく計画である．

べてにおいて低下したことから（表１），顆粒層細胞の排卵に関わる研究は，マイクロアレイ解析により新規

細胞膜貫通部位をもたない親水性ホルモンの分泌は，の生理活性因子が同定され，近年急速に発展している．

SNAP２５と SYT family による制御系エキソサイトーシス

この分泌因子を卵子の体外培養系の改善に応用するためが担っていることが初めて明らかとなった．には，その作用する時期の同定が重要になるが，エキソサイトーシスの制御機構に関する研究が大きく貢献すると考えている．つまり，発現した因子がいつ，どれぐらおわりにい分泌されるかを解明し，それらを制御することで，培著者等の研究により，排卵過程におけるエキソサイトーシス機構とその役割が明らかとなってきた．しかし，Snap25遺伝子欠損マウス［１８］や Syt1遺伝子欠損マウ

20

日本生殖内分泌学会雑誌

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養系は大きく発展することが期待される．

排卵過程の顆粒層細胞における SNAP２５により制御されるホルモン分泌機構

図５

顆粒層細胞の Snap２５のプロモーター活性化機構における PGR の役割
Ａ：Snap２５プロモーター活性のレポーターアッセイ
Ｂ，Ｃ：顆粒層細胞の Snap２５プロモーター活性に及ぼす PGR の役割

図６

顆粒層細胞の SNAP２５の mRNA（Ａ）およびタンパク質量（Ｂ）に及ぼす Snap２５ siRNA の影響

研究フロンティア

21

島田昌之

他

表１

顆粒層細胞に Snap２５ siRNA を導入したときのサイトカイン，ケモカイン分泌量
Forskolin/PMAfree

NCsiRNA

IL―１b５７１．
２６＋／−０．

３８２．
４８＋／−０．

３
３＃
１．
９
６＋／−０．

IL―６

４．
６
９３
５．
３
５＋／−１

７
６．
６
７＊
８８
１．
３
８＋／−１５９２．
７２＋／−８１．
４
５＃＊

IL―９０９３．
４
８＋／−０．

１
１．
１２＋／−０．
６
６

７．
０
５＋／−０．
８
２＃

GM―CSF０８
０．
３
１＋／−０．

２．
６
８＋／−０．
８
１＊

２．
２
９＋／−０．
２
６KC

３．
５
０５
１．
１２＋／−１

１
７
３．
４
１＋／−１
６．
１
９＊

１．
５
１＃
１２
５．
４
３＋／−１

７８
６．
２
３＋／−３．

＊

２
７．
００＋／−４．
１
３

１
７．
５２＋／−３．
５３＃

MIP―１b４９２．
４３＋／−０．

＊８．
１３＋／−１．
３０４．
０７＋／−０．
４
８＃

RANTES

９８２
２．
２２＋／−７．

２
４．
８２＋／−１．
５０２
０．
０６＋／−１．
５１＃

MCP―１（pg/ml）

謝辞

本稿は２００
７年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えて下さいました日本生殖内分泌学会理事長 武谷雄二先生，第１２回同学会大会長 田谷一善先生，ならびに広報理事 峰岸 敬先生に感謝いたします．本研究は，文部科学省海外先進教育研究推進プログラムにより，著者がアメリカ合衆国 Baylor College of Medicine の JoAnne S. Richards 博士とともに開始したものである．また，本研究の一部は文部科学省科学研究費補助金（若手研究（A））１８６８８０１６により実施した．研究を遂行するに当たり，多く の 補 助 を い た だ い た，JoAnne S.
Richards ラボのメンバーおよび広島大学の著者の研究室のメンバーに感謝の意を表します．

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