Gebrauchsanweisung

LymphoTrack® Dx TRG Assay – MiSeqTM
Identifikation und Nachverfolgung klonaler Genumlagerungen von T-Zell-Rezeptor-Gamma (TRG) mittels NextGeneration Sequencing (NGS) mit dem Illumina® MiSeq System.
Dieser Assay ist zur Verwendung als In-vitro-Diagnostikum vorgesehen.

Schematische Darstellung des TRG-Genlocus:

Lagerbedingungen: -85ºC bis -65ºC(DNA-Kontrollen können aus dem Assay-Kit genommen und bei 2 ºC bis 8 ºC gelagert werden)

Katalognummer
92270019
92270009

Produkte
LymphoTrack Dx TRG-Assay-Kit A – MiSeq
LymphoTrack Dx TRG-Assay-Panel – MiSeq

Menge
8 Indizes – jeweils 5 Reaktionen
24 Indizes – jeweils 5 Reaktionen

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Inhaltsverzeichnis
1.

VERWENDUNGSZWECK ............................................................................................................................................................................... 3

2.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES ASSAYS ........................................................................................................................................ 3
2.1.
2.2.

3.

VERFAHRENSGRUNDLAGEN .......................................................................................................................................................................... 4
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.

4.

Thermocycler................................................................................................................................................................................. 8
Magnetstand ................................................................................................................................................................................. 8
Real-Time PCR-Instrument ............................................................................................................................................................ 8
Illumina MiSeq Instrument* .......................................................................................................................................................... 8

GEWINNUNG UND AUFBEREITUNG VON PROBEN ............................................................................................................................................... 9
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.

7.

Reagenzienbestandteile ................................................................................................................................................................ 6
Warn- und Vorsichtshinweise ....................................................................................................................................................... 7
Lagerung und Handhabung ........................................................................................................................................................... 7

INSTRUMENTE .......................................................................................................................................................................................... 8
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.

6.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................................................................................. 4
Amplikonaufreinigung ................................................................................................................................................................... 4
Amplikonquantifizierung ............................................................................................................................................................... 4
Next-Generation Sequencing (NGS) .............................................................................................................................................. 4
Multiplexing von Amplikons .......................................................................................................................................................... 5

REAGENZIEN ............................................................................................................................................................................................ 6
4.1.
4.2.
4.3.

5.

Hintergrund ................................................................................................................................................................................... 3
Zusammenfassung ......................................................................................................................................................................... 3

Vorsichtsmaßnahmen ................................................................................................................................................................... 9
Störsubstanzen .............................................................................................................................................................................. 9
Probenanforderung und -handhabung.......................................................................................................................................... 9
Probenlagerung ............................................................................................................................................................................. 9

ASSAY-VERFAHREN ................................................................................................................................................................................. 10
7.1.
7.2.
7.3.
7.4.
7.5.
7.6.
7.7.
7.8.
7.9.
7.10.
7.11.
7.12.
7.13.

Im Lieferumfang enthaltene Materialien .................................................................................................................................... 10
Erforderliche Materialien (nicht im Lieferumfang enthalten) ..................................................................................................... 10
Vorbereitung der Reagenzien ...................................................................................................................................................... 11
Amplifikation ............................................................................................................................................................................... 11
AMPure XP-Aufreinigung ............................................................................................................................................................. 12
Quantifizierung von Amplikons ................................................................................................................................................... 13
Pooling und Quantifizierung der Bibliothek ................................................................................................................................ 14
Verdünnung der gepoolten Bibliothek ........................................................................................................................................ 14
qPCR-Setup für die Bibliotheksquantifizierung............................................................................................................................ 15
Vorbereitung der Bibliothek auf den MiSeq-Sequenzierungslauf ............................................................................................... 15
Laden der MiSeq Flow Cell (Flusszelle) ........................................................................................................................................ 16
Setup für MiSeq Sample Sheet (Probenblatt) ............................................................................................................................. 16
MiSeq-Lauf starten ...................................................................................................................................................................... 17

8.

DATENANALYSE ...................................................................................................................................................................................... 17

9.

ERWARTETE WERTE ................................................................................................................................................................................. 18

10.

VERFAHRENSEINSCHRÄNKUNGEN ................................................................................................................................................................. 18

11.

INTERPRETATION UND BERICHTERSTELLUNG ................................................................................................................................................... 18

12.

BEISPIELDATEN ....................................................................................................................................................................................... 21

13.

LEISTUNGSEIGENSCHAFTEN ........................................................................................................................................................................ 21

14.

FEHLERSUCHE UND -BEHEBUNG ................................................................................................................................................................... 22

15.

TECHNISCHER SUPPORT UND KUNDENDIENST.................................................................................................................................................. 23

16.

REFERENZEN .......................................................................................................................................................................................... 23

17.

SYMBOLE .............................................................................................................................................................................................. 2318.

HAFTUNGSHINWEIS ................................................................................................................................................................................. 24

19.

LYMPHOTRACK DX TRG-ASSAY - MISEQ: KURZANLEITUNG ............................................................................................................................... 25

20.

ANHANG A: ERSTELLUNG EINER SEQUENZIERUNGSBIBLIOTHEK MIT MEHREREN NGS-ZIELEN ....................................................................................... 26

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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1. Verwendungszweck
Der LymphoTrack Dx TRG Assay für das Illumina MiSeq System ist ein In-vitro-Diagnostikum für das Next-Generation
Sequencing (NGS) zur Bestimmung der Häufigkeitsverteilung von TRG-Genumlagerungen bei Patienten, bei denen der
Verdacht auf eine lymphoproliferative Erkrankung besteht. Dieser Assay unterstützt die Identifizierung lymphoproliferativer
Erkrankungen.

2. Zusammenfassung und Erläuterung des Assays
2.1.

Hintergrund
Der humane Genlocus T-Zellrezeptor-Gamma (TRG, früher bezeichnet als TCRG) auf Chromosom 7 (7q14) umfasst
14 Vy-Gene (variable Region) (Gruppe I, II, III und IV), 5 Jy-Gensegmente (Verbindungsregion) und 2 Cy-Gene(konstante Region), die über 200 Kilobasen verteilt sind.
Lymphatische Zellen unterscheiden sich von anderen somatischen Zellen des Körpers; während der Entwicklung
durchlaufen die Antigen-Rezeptor-Gene von lymphatischen Zellen eine somatische Genumlagerung. 1 Zum Beispiel
werden während der T-Zellentwicklung Gene, die TRG-Moleküle codieren, aus mehreren polymorphen
Gensegmenten zusammengesetzt, die eine Umlagerung und Selektion durchlaufen, wodurch Vγ-Jγ-Kombinationen
entstehen, die sowohl hinsichtlich Länge als auch Sequenz einmalig sind. Da Erkrankungen wie Leukämien und
Lymphome aus der malignen Transformation einzelner lymphatischer Zellen entstehen, teilen sich alle Leukämie- und
Lymphomzellen in der Regel ein oder mehrere zellspezifische oder „klonale“ Antigen-Rezeptor-Gen-Umlagerungen.
Somit können Tests, die klonale TRG-Umlagerungen nachweisen können, für die Untersuchung bösartiger B- und TZell-Erkrankungen herangezogen werden.
Ursprünglich wurden klonale Umlagerungen mittels Restriktionsfragment/Southern-Blot-Hybridisierung (RF-SBH)
identifiziert. Diese Untersuchungen erwiesen sich jedoch als langwierig, arbeitsintensiv, erforderten große Mengen
an DNA und eigneten sich nicht für die Analyse vieler der weniger diversen Antigen-Rezeptor-Loci.
Im Laufe der vergangenen Jahrzehnte wurden RF-SBH-Assays von PCR-basierten Klonalitätsuntersuchungen abgelöst,
die von Alexander Morley2 entwickelt wurden und derzeit die Goldstandardmethode sind. Diese Assays stellen eine
Klonalität dadurch fest, dass amplifizierte V-D-J- (oder unvollständige D-J-)Produkte nach ihrer Auftrennung mittels
Gel- oder Kapillarelektrophorese überrepräsentiert sind. Diese Assays sind empfindlich und eignen sich für das Testen
geringer DNA-Mengen, sie können jedoch nicht ohne Weiteres zwischen klonalen Populationen und multiplen
Umlagerungen unterscheiden, die möglicherweise an der gleichen Position ein Signal zeigen. Des Weiteren wurden
die Assays nicht für die Identifizierung der spezifischen
V-J-DNA-Sequenz entwickelt, die für die Nachverfolgung klonaler Populationen während nachfolgender Analysen
erforderlich ist. Diese zweite Einschränkung kann von besonderer Bedeutung sein, da die einzigartige klonspezifische
DNA-Sequenz nach ihrer Identifizierung für die Nachverfolgung dieser klonalen Zellpopulationen während nachfolgender
Tests verwendet werden kann.

2.2.

Zusammenfassung
Dieser LymphoTrack Dx TRG-Assay – MiSeq ist eine wesentliche Verbesserung im Vergleich zu bestehenden
Klonalitäts-Assays, die die Fragmentanalyse anwenden, da er den Großteil aller TRG-Genumlagerungen mit einem
einzigen Multiplex-Master-Mix effizient nachweist und gleichzeitig die für jede klonale Genumlagerung spezifische
DNA-Sequenz identifiziert. Somit erfüllt dieser Assay zwei wichtige, einander ergänzende Funktionen: Er trägt zum
Nachweis der ursprünglichen klonalen Populationen bei und identifiziert Sequenzdaten, die für die Nachverfolgung
der Klone in nachfolgenden Proben erforderlich sind.
Jeder einzelne Multiplex-Master-Mix für TRG zielt auf die konservierten Regionen in den Vγ- und Jγ-Regionen ab, die
mit bösartigen lamphatischen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. In den Master-Mixen enthaltene Primer
verfügen über Illumina-Adapter und bis zu 24 unterschiedliche Indizes. Diese Methode ermöglicht eine One-Step-PCR
und es können Amplikons mehrerer verschiedener Proben und Genziele (erzeugt mit anderen LymphoTrack Dx
Assays für das Illumina MiSeq System, separat erhältlich) in einer MiSeq Flow Cell (Flusszelle) gepoolt werden, sodass
bis zu 24 Proben pro Genziel parallel während eines einzigen Laufs analysiert werden können.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Die zugehörige LymphoTrack Dx Software – MiSeq ermöglicht die einfache und optimierte Analyse und Visualisierung
der Daten. Anhand der Informationen in Abschnitt 11, Interpretation und Berichterstellung, lassen sich die in derSoftware zusammengefassten Probenergebnisse einfach auf das Vorhandensein oder Fehlen von Klonalität
interpretieren.
Die Ergebnisse molekularer Klonalitätstests müssen immer unter Berücksichtigung klinischer, histologischer und
immunphänotypischer Daten interpretiert werden.
Positivkontrollen und Negativkontrollen für Klonalität sind im Kit enthalten.
Hinweis: Eine detailliertere Erläuterung des Locus und der zielgerichteten Sequenzierung finden Sie in Miller, J.E., 2013. 3

3. Verfahrensgrundlagen
3.1.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
PCR-Assays werden routinemäßig für die Identifizierung klonaler B- und T-Zellpopulationen eingesetzt. Diese Assays
amplifizieren die DNA zwischen Primern, die auf die konservierten V- und J-Regionen von Antigen-Rezeptor-Genenabzielen. Diese Primer binden an die konservierten Regionen und liegen auf beiden Seiten eines Bereichs, in dem
während der Reifung aller B- und T-Lymphozyten programmierte Genumlagerungen stattfinden. Infolge dieser
Genumlagerungen entstehen unterschiedliche B- und T-Lymphozytenpopulationen.
Bei den Antigen-Rezeptor-Genen, die umgelagert werden, handelt es sich um Loci schwerer Immunglobulinketten(IGH) und leichter Immunglobulinketten (IGK und IGL) in B-Zellen sowie die T-Zell-Rezeptor-Gen-Loci (TRA, TRB, TRG
und TRD) in T-Zellen. Jede B- und T-Zelle hat eine oder zwei produktive V-J-Umlagerungen, die hinsichtlich Länge und
Sequenz einmalig sind. Wenn somit DNA einer normalen oder polyklonalen Population mit DNA-Primern amplifiziert
wird, die an die V-J-Region angrenzen, werden Amplikons generiert, die hinsichtlich Sequenz und Länge einmalig sindund damit die heterogene Population widerspiegeln. In einigen Fällen, in denen keine Lymphozyten-DNA vorliegt,
werden keine Amplikons generiert. Proben, die klonale TRG-Populationen enthalten, verfügen über ein oder zwei
markante amplifizierte Produkte der gleichen Länge und Sequenz, die mit signifikanter Häufigkeit innerhalb eines
verminderten polyklonalen Hintergrunds nachgewiesen werden.

3.2.

Amplikonaufreinigung
PCR-Amplikons werden aufgereinigt, um überschüssige Primer, Nukleotide, Salze und Enzyme zu entfernen. Bei
diesem Verfahren kommt die Methode „Solid-Phase Reversible Immobilization“ (SPRI; festphasengebundene reversible
Immobilisierung) mittels paramagnetischer Partikel zur Hochdurchsatz-Aufreinigung von PCR-Amplikons zum Einsatz.
Durch Verwendung eines optimierten Puffers werden PCR-Produkte mit 100 bp oder mehr selektiv anparamagnetische Partikel gebunden, während Verunreinigungen wie überschüssige Primer, Primer-Dimere, Salze undnicht eingebaute dNTP entfernt werden. Die Amplikons lassen sich anschließend eluieren und von den
paramagnetischen Partikeln trennen. Nun liegt ein aufgereinigtes PCR-Produkt für die weitere Analyse und
Amplikonquantifizierung vor.

3.3.

Amplikonquantifizierung
Aufgereinigte Amplikons werden mithilfe des KAPA™ Library Quantification Kits (Bibliotheksquantifizierungskits) fürIllumina-Plattformen quantifiziert. Aufgereingte und verdünnte PCR-Amplikons sowie ein Set aus sechs vorab
verdünnten DNA-Standards werden durch quantitative Verfahren (qPCR) amplifiziert, wobei der KAPA SYBR® FASTqPCR Master-Mix und entsprechende Primer verwendet werden. Die Primer im KAPA-Kit binden an die Illumina P5
und P7 Flusszellen-Adapter-Oligosequenzen.
Der durchschnittliche Ct-Wert für die vorab verdünnten DNA-Standards wird zur Erstellung einer Standardkurve
gegen log10 (Konzentration in pM) aufgetragen. Diese Standardkurve dient dann zur Berechnung der Konzentration(pM) der PCR-Amplikons. Die Berechnung der Konzentration der PCR-Amplikons ermöglicht eine ausgewogene
Amplikonrepräsentation in der endgültig gepoolten Bibliothek, die zur Sequenzierung in das MiSeq geladen wird.

3.4.

Next-Generation Sequencing (NGS)
Sanger-Sequenzierungen sind die beliebtesten Sequenzierungsverfahren der NukleinsäureSequenzierungstechnologien der „ersten Generation“. Neuere Verfahren, die erstaunliche parallele Sequenzierungen

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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ermöglichen, werden häufig als „NGS“ bezeichnet. Diese Technologien können verschiedene Strategien für die
Template-Vorbereitung, Sequenzierung, Bildgebung und Bioinformatik für Genom-Alignments und -Assemblierung
kombinieren.
Die in diesem Assay verwendeten NGS-Technologien basieren auf der Amplifizierung von Gensequenzen unter
Verwendung einer Reihe von Consensus-Vorwärts- und -Rückwärtsprimern, die Adapter- und Indexmarkierungenumfassen. Mit den LymphoTrack Dx Master-Mixen generierte Amplikons werden quantifiziert, gepoolt und zur
Sequenzierung mit einer Illumina MiSeq Sequenzierungsplattform in eine Flusszelle geladen. Hierzu werden die
amplifizierten Produkte in der Bibliothek in einer Flusszelle mit Oligonukleotiden hybridisiert und amplifiziert, um
lokale klonale Kolonien auszubilden („Bridge Amplification“). Es werden vier Typen reversibler Terminator-Basen (RTBasen) hinzugegeben und der DNA-Sequenzierungsstrang wird um ein Nukleotid nach dem anderen verlängert. Um
den Einbau von Nukleotiden aufzuzeichnen, nimmt eine CCD-Kamera ein Bild des Lichts auf, das emittiert wird, wenn
die einzelnen RT-Basen hinzugefügt und dann gespalten werden, um den Einbau der nächsten Base zu ermöglichen.
3.5.

Multiplexing von Amplikons
Dieser Assay wurde so konzipiert, dass zwei verschiedene Multiplexing-Levels möglich sind, um den Labors Zeit undKosten zu ersparen. Das erste Multiplexing-Level wird durch die multiplen Indizes ermöglicht, die mit den Assays
bereitgestellt werden. Jeder dieser 24 Indizes agiert wie ein eindeutiger Barcode, der es ermöglicht, Amplikons
mehrerer verschiedener Proben nach der PCR-Amplifizierung zu poolen, um die Sequenzierungsbibliothek zu
erstellen. Die so entstandenen Sequenzen werden von der Bioinformatik-Software sortiert, um diejenigen zu
identifizieren, die aus einer bestimmten Probe stammen.
Das zweite Multiplexing-Level entsteht durch die Fähigkeit der zugehörigen Software, Sequenzierungsdaten sowohl
nach Index als auch nach Gen zu sortieren. Somit können Amplikons, die mit zielgerichteten Primern erzeugt wurden(selbst solche mit dem gleichen Index), vereinigt werden, um eine Bibliothek zu erstellen, die dann mit einer einzigen
Flusszelle sequenziert wird. Ein Beispiel hierfür wäre die gemeinsame Sequenzierung einer Kombination aus
Produkten aus verschiedenen Invivoscribe LymphoTrack Dx Assay Kits für den MiSeq, beispielsweise IGHV Leader, IGH
FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB und TRG. Wird ein Multiplexing von Amplikons verschiedener Genziele durchgeführt,muss auf die passende Sequenzierungschemie geachtet werden. Die Anzahl der Sequenzierungszyklen mussausreichend groß sein, sodass auch das längste Amplikon des Multiplex sequenziert werden kann. Sollbeispielsweise ein Multiplexing von Amplikons aus einer Kombination von IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB und
TRG vorgenommen werden, sollte das Sequenzierungs-Kit MiSeq v2 (500 Zyklen) für bis zu 4 Ziele oder das
Sequenzierungs-Kit v3 (600 Zyklen) für bis zu 7 Ziele verwendet werden. Für ein Multiplexing eines dieser Amplikons
mit IGHV Leader sollte das Sequenzierungs-Kit MiSeq v3 (600 Zyklen) verwendet werden. Für ein Multiplexing vonausschließlich IGH FR3 und TRG Amplikons, die beide eine kürzere Amplikongröße aufweisen, sollten die
Sequenzierungs-Kits MiSeq v2 (300 oder 500 Zyklen) verwendet und die Zykluseinstellungen im Probenblatt angepasst
werden. Weitere Anweisungen sind Anhang A (Abschnitt 20) zu entnehmen.
Die Anzahl der Proben, für die ein Multiplexing in einer einzigen Flusszelle durchgeführt werden kann, hängt auch vonder verwendeten Flusszelle ab. Die Standardflusszellen von Illumina (MiSeq v3) können 22−25 Millionen
Lesevorgänge generieren. Zur Bestimmung der Anzahl der Lesevorgänge pro Probe teilen Sie die Gesamtzahl derLesevorgänge für die Flusszelle durch die Anzahl der Proben, für die das Multiplexing vorgenommen werden soll. Die
Anzahl der Lesevorgänge pro Probe sollte für eine Interpretation ausreichen. Für weitere Informationen siehe
Abschnitt 11: Interpretation und Berichterstellung. Illumina stellt auch andere Flusszellen her, bei denen dieselbe
Sequenzierungschemie verwendet wird, aber weniger Lesevorgänge generiert werden. Bei Verwendung dieser
alternativen Flusszellen ist zu berücksichtigen, dass bei weniger Gesamtlesevorgängen entweder die Tiefe je Probe
reduziert wird oder dass der Lauf auf der Flusszelle weniger Proben enthalten muss, um dieselbe Tiefe je Probe zu
erzielen.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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4. Reagenzien
4.1.

Reagenzienbestandteile

Tabelle 1. Verfügbare Kits

Katalognummer

Beschreibung

Anzahl der Index-Master-Mixe

Reaktionen insgesamt

92270019

LymphoTrack Dx TRG Assay Kit A – MiSeq

8 Indizes – jeweils 5 Sequenzierungsläufe

4092270009

LymphoTrack Dx TRG-Assay-Panel – MiSeq

24 Indizes – jeweils 5 Sequenzierungsläufe

120

Tabelle 2. Kit-Bestandteile

Reagenz

92270009
Anzahl derEinheiten

TRG MiSeq 01
TRG MiSeq 02

1
1

1
1

TRG MiSeq 03
TRG MiSeq 04

1
1

1
1

TRG MiSeq 05
TRG MiSeq 06

1
1

1
1

TRG MiSeq 07
TRG MiSeq 08

1
1

1
1

TRG MiSeq 09
TRG MiSeq 10
TRG MiSeq 11

0
0
0

1
1
1

0
0

1
1

TRG MiSeq 14
TRG MiSeq 15

0
0

1
1

TRG MiSeq 16
TRG MiSeq 18

0
0

1
1

TRG MiSeq 19
TRG MiSeq 20

0
0

1
1

TRG MiSeq 21
TRG MiSeq 22

0
0

1
1

TRG MiSeq 23
TRG MiSeq 25

0
0

1
1

TRG MiSeq 27

0

1

1

3

TRG MiSeq 12
TRG MiSeq 13

Master-Mixeǂ

DNA für die
Positivkontrolle

92270019
Anzahl derEinheiten

Reagenzienbestandteile(

TRG POS (+)
42270019)

Verpackungseinheit

225 µL45 µL

Lagertemperatur

Anmerkungenkeine Angabe

V11/ J1/2 DNA verdünnt in
Tonsillen-DNA
oder

DNA für die
Negativkontrolle

NGS NEG (-)(
40920018)

45 µL

1

3

Tonsillen-DNA, maximale
Sequenzhäufig-keit kann je
nach Charge schwanken

Hinweis: Für die Herstellung dieser Kits werden keine Konservierungsstoffe verwendet.
ǂHinweis: Indizes 17, 24 und 26 werden für diese Kits nicht verwendet

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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4.2.

Warn- und Vorsichtshinweise
Lesen Sie die Gebrauchsanweisung aufmerksam durch, bevor Sie mit dem Assay-Verfahren beginnen, und halten
Sie sich strikt an die Anweisungen.
▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪

▪
▪

▪
▪

▪
▪
▪

4.3.

Dieses Produkt ist zur Verwendung als In-vitro-Diagnostikum vorgesehen.
Verwenden Sie das Assay-Kit als System; verwenden Sie keine Reagenzien anderer Hersteller. Verdünnung,
Reduzierung der Amplifikationsreaktionen und andere Abweichungen vom vorliegenden Protokoll können sich auf die
Testergebnisse auswirken und/oder zur Ungültigkeit beschränkter Unterlizenzen führen, die mit dem Erwerb der Kits
bereitgestellt werden.
Die Materialien sind bis Ablauf des aufgedruckten Verfallsdatums stabil, wenn Handhabung und Lagerung wie hierbeschrieben erfolgen. Kits nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden.
Optimale Leistung und Reproduzierbarkeit können nur bei genauer Einhaltung des Protokolls gewährleistet werden.
Stellen Sie sicher, dass die richtigen Programme für den Thermocycler ausgewählt werden, da ungeeignete
Programme zu ungenauen/falschen Ergebnissen, wie z. B. falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse,führen können.
Mischen und kombinieren Sie Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen Chargennummern nicht.
Entsorgen Sie nicht verwendete Reagenzien und Abfälle gemäß national, bundesstaatlich, staatlich und lokal gültigen
Bestimmungen.
Sämtliche Laborverfahren sind mit Standardschutzkleidung (Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz)
durchzuführen. Bei der Handhabung von Proben ist gemäß guter Laborpraxis zu arbeiten und es sind universelle
Schutzmaßnahmen zu ergreifen. Nicht mit dem Mund pipettieren. In Arbeitsbereichen des Labors nicht essen, trinken
oder rauchen. Hände nach dem Umgang mit Proben und Assay-Reagenzien gründlich waschen. Proben sollten inzugelassenen biologischen Sicherheitsbereichen gehandhabt und nur in zugelassenen Sicherheitswerkbänken geöffnet
werden.
Für die Vorbereitung von DNA-Proben ist Wasser in Molekularbiologie-Qualität zu verwenden.
Aufgrund der hohen analytischen Sensitivität dieses Tests sind Kontaminationen der Reagenzien oder
Amplifikationsprodukte durch Proben, Kontrollen oder Amplikons unbedingt zu vermeiden. Zwischen Proben und
zwischen dem Dispensieren von Reagenzien jeweils eine neue, aerosol-beständige Pipettenspitze verwenden.
Sämtliche Reagenzien sind auf Anzeichen einer Kontamination hin zu überwachen (z. B. Negativkontrollen, die positive
Signale geben). Reagenzien, bei denen der Verdacht einer Kontamination besteht, sind zu entsorgen.
Zur Minimierung des Kontaminationsrisikos sind beim Umgang mit Proben und Reagenzien Handschuhe zu tragensowie Arbeitsbereiche und Pipetten regelmäßig und vor dem PCR-Setup zu reinigen.
Der Arbeitsablauf im PCR-Labor sollte unidirektional zwischen den verschiedenen Arbeitsbereichen ablaufen: zunächst
Vorbereitung des Master-Mix, anschließend Probenaufbereitung, dann Amplifikation und abschließend Nachweis.
Autoklavieren beseitigt keine DNA-Kontamination. Amplifizierte DNA sollte nicht in den Bereich gebracht werden,
der für die Zubereitung der Master-Mixe oder Proben vorgesehen ist.
Alle in einem bestimmten Laborbereich verwendeten Pipetten, Pipettenspitzen und anderen Geräte müssen
in diesem Laborbereich verbleiben.
Gegenstände, die nicht entsorgt werden können, müssen zweimal je in 10-prozentiger Bleichelösung dekontaminiert
und mit destilliertem Wasser gespült werden, bevor sie in den Ausgangsbereich zurückgebracht werden können.
Wann immer möglich sollten sterile Kunststoffartikel für den Einmalgebrauch verwendet werden, um einer
Kontamination vorzubeugen.

Lagerung und Handhabung▪
▪
▪
▪

Wird der Assay nicht sofort verwendet, ist er bei Temperaturen zwischen -85 ºC und -65 ºC zu lagern.
Die optimale Lagertemperatur für DNA-Kontrollen beträgt 2 ºC bis 8 ºC, DNA kann jedoch auch bei Temperaturen von-85 ºC bis -65 ºC gelagert werden.
Alle Reagenzien und Kontrollen müssen vor der Verwendung aufgetaut und vortexiert oder gründlich gemischt
werden, um sicherzustellen, dass sie vollständig resuspendiert wurden.
Aufgrund ihrer hohen Salzkonzentrationen sind PCR-Master-Mixe empfindlich gegenüber Einfrier- und Auftauzyklen.
Sie dürfen höchstens viermal eingefroren und wieder aufgetaut werden.

Sollten Sie Fragen haben, wenden Sie sich an die technischen Mitarbeiter von Invivoscribe. Wir unterstützen Sie
gerne dabei, die optimalen Lagerbedingungen zu bestimmen.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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5. Instrumente
Die nachfolgend aufgelisteten spezifischen Instrumente werden basierend auf den Methoden empfohlen, die zur
Validierung dieses Assays verwendet werden.
5.1.

Thermocycler▪
▪
▪

Zweck oder Funktion: Amplifikation von DNA-Proben
Empfohlenes Instrument: Veriti™ Dx Thermal Cycler (Thermocycler) oder ein vergleichbares Gerät
Leistungseigenschaften und Spezifikationen:
o
o

▪
▪
5.2.

Befolgen Sie die Installations-, Betriebs-, Kalibrierungs- und Wartungsanweisungen des Herstellers.
Angaben zum Thermocyclerprogramm finden Sie in Abschnitt 7.4 Amplifikation.

Magnetstand▪
▪

Zweck oder Funktion: Aufreinigung von PCR-Produkten
Empfohlenes Instrument:
o
o
o

▪

▪

12027)

Fällung paramagnetischer Partikel

Angaben zu den Verfahren zur Aufreinigung von PCR-Produkten finden Sie in Abschnitt 7.5 AMPure XP-Aufreinigung.

Real-Time PCR-Instrument▪
▪
▪

Zweck oder Funktion: Quantifizieren aufgereinigter PCR-Produkte
Empfohlenes Instrument: Applied Biosystems® 7500 Fast Dx Real-Time PCR- (schnelles Dx Echtzeit) Instrument oderein vergleichbares Gerät
Leistungseigenschaften und Spezifikationen:
o

▪
▪
5.4.

Ambion® Magnetic Stand (Magnetstand) 96* (AM10027)
Agencourt SPRIPlate® 96 Ring Super Magnet Plate (Ring-Super-Magnetplatte)* ( A 32782)
Thermo Fisher Scientific DynaMag™-96 Side Skirted Magnet (Magnet mit Seitenumrandung)* (Leistungseigenschaften und Spezifikationen:o

5.3.

Temperierbereich: 15 ºC bis 96 ºC
Mindestheizrate: 0,8 ºC/s

Detektion SYBR Green Wellenlänge

Befolgen Sie die Installations-, Betriebs-, Kalibrierungs- und Wartungsanweisungen des Herstellers.
Angaben zum Real-Time PCR-Programm finden Sie in Abschnitt 7.6 Quantifizierung von Amplikons.

Illumina MiSeq Instrument*▪
▪

Zweck oder Funktion: Sequenzierung der normalisierten DNA-Bibliothek
Leistungseigenschaften und Spezifikationen:
o
o

▪
▪

Kompatibel mit MiSeq Reagenzkit v2*
Kompatibel mit MiSeq Reagenzkit v3* beim Multiplexing

Befolgen Sie die Installations-, Betriebs-, Kalibrierungs- und Wartungsanweisungen des Herstellers.
Siehe Abschnitt 7.11 Laden der MiSeq Flow Cell (Flusszelle), 7.12 Setup für MiSeq Sample Sheet (Probenblatt) und
7.13 MiSeq-Lauf starten, für MiSeq-Parameter.
* Warnung: Diese Produkte tragen keine CE-Kennzeichnung.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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6. Gewinnung und Aufbereitung von Proben
6.1.

Vorsichtsmaßnahmen
Biologische Proben von Menschen können potenziell infektiöse Stoffe enthalten. Sämtliche Proben sind in Einklang
mit Ihren institutsinternen Vorschriften für blutübertragbare Krankheitserreger bzw. gemäß biologischer Schutzstufe
2 zu handhaben.

6.2.

Störsubstanzen
Folgende Substanzen stören bekanntermaßen die PCR:
▪
▪
▪
▪

6.3.

Probenanforderung und -handhabung
▪
▪
▪

6.4.

Zweiwertige Kationenchelatoren
Low-Retention-Pipettenspitzen
EDTA (in geringen Konzentrationen zu vernachlässigen)Heparin

Die Mindestmenge beträgt 50 ng hochwertige DNA (5 L DNA-Probe bei einer Mindestkonzentration von 10 ng/µL).
Dieser Assay untersucht extrahierte und aufgereinigte genomische DNA. Die DNA muss mit einem für DoppelstrangDNA (dsDNA) geeigneten Verfahren quantifiziert werden und darf keine PCR-Inhibitoren enthalten.
DNA in einer geeigneten Lösung wie 0,1X TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH-Wert 8,0, hergestellt mit Wasser
in Molekularbiologie-Qualität), oder nur in Wasser in Molekularbiologie-Qualität resuspendieren.

Probenlagerung
Proben sind auf eine Weise zu lagern, die einen Abbau der DNA verhindert.

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7. Assay-Verfahren
7.1.

Im Lieferumfang enthaltene Materialien
Angaben zu den im Lieferumfang enthaltenen Materialien finden Sie in Tabelle 2.

7.2.

Erforderliche Materialien (nicht im Lieferumfang enthalten)

Tabelle 3. Erforderliche Materialien (nicht im Lieferumfang enthalten)

Reagenz/Material

Erforderliche oder empfohlene
Reagenzien/Hersteller

DNA-Polymerase

Roche:• EagleTaq™ DNA Polymerase
oder
Invivoscribe:• FalconTaq DNA Polymerase
oder ein vergleichbares Gerät

Katalognummer
05206944190
oderAnmerkungen

5 U/μL60970130

Wasser in MolekularbiologieQualität

Keine Angabe

Keine Angabe

Ohne DNase/RNase

Kalibrierte Pipetten

Keine Angabe

Keine AngabeMuss für die genaue Messung vonVolumina zwischen 0,2 μL und 1000 μL
geeignet sein.

PCR-Platten oder -Röhrchen

Keine Angabe

Keine Angabe

Ohne DNase/RNase/PCR-Hemmer

Pipettenspitzen mit Filter

Keine Angabe

Keine Angabe

Steril, ohne RNase/DNase/Pyrogene

Mikrozentrifugengefäße

Keine Angabe

Keine Angabe

Steril

A63880Keine Angabe

PCR-Aufreinigungskit

PCR-Aufreinigung

Beckman Coulter, Inc:
• Agencourt AMPure XP
Thermo Fisher Scientific:• Ambion Magnetic Stand (Magnetstand) 96• DynaMag-96 Side Skirted Magnet (Magnet
mit Seitenumrandung)oder
Beckman Coulter:• Agencourt SPRIPlate 96 Ring Super Magnet
Plate (Ring-Super-Magnetplatte)oder ein vergleichbares Gerät

Amplikon- und
Bibliotheksquantifizierung

KAPA Biosystems:• KAPA Library Quantification Kit(Bibliotheksquantifizierungskit) – Illumina

MiSeq-Lauf

Illumina:• MiSeq Reagent v2 kit (Reagenzkit v2)(300 Zyklen) oder
• v2 kit (v2-Kit) (500 Zkylen)oder• v3 kit (v3-Kit) (600 Zyklen) bei Multiplexing•

MiSeq-Software•
Verdünnungspuffer A

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AM1002712027
oderKeine Angabe

A32782

KK4824MS-102-2002
oder
MS-102-2003
oder

Keine Angabe

Standard-Flow-Cell

MS-102-3003

MiSeq Control Software (Kontrollsoftware)v2.6 oder neuer
Local Run Manager v2.0 oder neuer

Keine Angabe

Keine Angabe

Keine Angabe

Keine Angabe

10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0,vorbereiten + 0,05 % Tween-20-Lösung

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7.3.

Vorbereitung der Reagenzien
Damit gewährleistet ist, dass die DNA-Proben keine PCR-Inhibitoren enthalten und in ausreichend hoher Qualität undMenge vorliegen, um gültige Testergebnisse erzeugen zu können, können diese mit dem Specimen Control Size
Ladder Master Mix (Master Mix Probengröße-Kontrollskala) von Invivoscribe überprüft werden (20960021 für
ABI-Nachweis oder20960020 für Gel-Nachweis). Der Specimen Control Size Ladder (Probengröße-Kontrollskala)Mix zielt auf mehrere Gene ab und erzeugt eine Reihe von Amplikons mit einer Länge von ca. 100, 200, 300, 400 und
600 bp; Die Größe kann aufgrund von Größenstandards und/oder Instrumentenunterschieden um +/- 5 bp variieren.
Die Überprüfung der DNA-Integrität ist besonders wichtig für anspruchsvolle Proben, z.B. FFPE-Gewebe zählt.
Immer die Positiv- und Negativkontrollen verwenden, um zu gewährleisten, dass der Assay sachgemäß durchgeführt
wurde.
Um Kontaminationen während der PCR-Vorbereitung auszuschließen, stets eine Nicht-Template-Kontrolle (NTC)
einsetzen.
7.3.1.
7.3.2.

Mit behandschuhten Händen Master-Mixe aus dem Gefrierschrank nehmen. Röhrcheninhalte langsam
auftauen lassen, anschließend vorsichtig vortexen und nur kurz zentrifugieren.
Unter einer Sicherheitshaube oder in einer „Dead-Air-Box“ 45 L aus jedem Master-Mix-Röhrchen in einesaubere PCR-Platte pipettieren (ein Well für jeden Master-Mix und ein Master-Mix pro Probe).
▪
▪

7.3.3.
7.3.4.

In jedem Lauf müssen zwei Kontrollen (eine positive und eine negative) sowie ein NTC enthalten sein.
Für die NTC statt DNA Wasser in Molekularbiologie-Qualität als Matrize verwenden.

Geben Sie 0,2 L Taq-DNA-Polymerase (bei 5 U/L) in jedes Well, das aliquotierte Master-Mixe enthält.
Geben Sie 5 L Proben-DNA (mit einer Mindestkonzentration von 10 ng/L), Kontroll-DNA oder Wasser
in Molekularbiologie-Qualität (NTC) in die einzelnen Wells, die die entsprechenden Master-Mixe enthalten.
▪
▪

Zum Mischen 5- bis 10-mal auf und abpipettieren.
Platte verschließen und zum PCR-Thermocycler bringen.
Tabelle 4. Reaktions-Setup

7.4.

Reagenz

Volumen

Master-Mix

45,0 μL

Taq-DNA-Polymerase

0,2 μL

Proben- oder Kontroll-DNA

5,0 μL

Gesamtvolumen

50,2 μL

Amplifikation
7.4.1.

Proben mit dem PCR-Programm aus Tabelle 5 amplifizieren.

Beim Multiplexing mehrerer Ziele ist für andere Bedingungen im Zusammenhang mit dem LymphoTrack Dx Assay – MiSeq Thermocycler
auf Anhang A (Abschnitt 20) Bezug zu nehmen.
Tabelle 5. PCR-Programm

Schritt

Temperatur

Dauer

Zyklus1

95 °C

7 Minuten

1

2

95 °C

45 Sekunden

3

60 °C

45 Sekunden

4

72 °C

90 Sekunden

5

72 °C

10 Minuten

1

6

15 C

∞

1

29x

Hinweis: Den erwärmten Deckel auf 105 °C und das Reaktionsvolumen auf 50 μL einstellen

7.4.2.

Sobald das Amplifikationsprogramm abgeschlossen ist, die amplifizierte PCR-Platte aus dem Thermocyclernehmen. Werden die folgenden Schritte nicht unmittelbar im Anschluss ausgeführt, lagern Sie die PCRProdukte 1 Tag bei 4 °C.

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7.5.

AMPure XP-Aufreinigung
Die Aufreinigung der PCR-Produkte aus den Proben, positiven, negativen und Nicht-Template-Kontrollen wurde
während der Validierung des Assays mit dem Agencourt AMPure XP PCR Purification System durchgeführt.

Vorbereitung:7.5.1.

Nehmen Sie das AMPure XP-Reagenz aus der Lagerung und warten Sie vor dem Gebrauch, bis es sich an die
Raumtemperatur angepasst hat. Die Agencourt AMPure XP-Flasche leicht schütteln, um etwaige abgesetzte
Magnetpartikel zu resuspendieren.

Informationen zu AMPure XP-Reagenzvolumina, die in anderen LymphoTrack Dx Assay MiSeq PCR-Produkten verwendet werden, sindAnhang A (Abschnitt 20) zu entnehmen.

7.5.2.

Geben Sie die für die Platte erforderliche Menge Agencourt AMPure XP-Reagenz in ein neues 2-mL-Röhrchen,um eine Kontamination durch Pipettenspitzen zu vermeiden.
▪

7.5.3.

Das erforderliche Volumen des Agencourt AMPure XP-Reagenz = n × 50 µL (wobei n der Anzahl deraufzureinigenden Proben entspricht).

Bereiten Sie eine frische Stammlösung (0,5 mL für jede Probe, die aufgereinigt werden soll) aus 80 % Ethanol
mit sterilem Wasser zu.

Bindung der Amplikons an die Magnetpartikel:
7.5.4.

50 μL des aliquotierten und auf Raumtemperatur gebrachten Agencourt AMPure XP-Reagenz zu jeder Probegeben, die aufgereinigt werden soll.
▪
▪
▪

7.5.5.

Die gemischten Proben auf einem DynaMag-96 Side Skirted (Magnet mit Seitenumrandung) oder Ambion
Magnetic Stand (Magnetstand) 96 platzieren und 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren, damit sich die
Magnetpartikel aus der Lösung ausfällen können.
▪

7.5.6.

Proben und Reagenz durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren mischen.
Die Farbe der Mischung sollte nach diesem Vorgang gleichmäßig sein.
Zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Die Platte während dieses Vorgangs auf dem Magnetstand belassen, bis Sie mit Schritt 7.5.10 unten fortfahren.

Mit einer auf 95 µL eingestellten P200-Pipette (oder einer vergleichbaren Mehrkanalpipette) den klarenÜberstand absaugen und entsorgen.
▪
▪

Mit einer P10-Pipette (oder einer ähnlichen Mehrkanalpipette) mit der Einstellung 10 μL etwaigen übrigenÜberstand absaugen.
Vermeiden Sie, Magnetpartikel zu entfernen.

Waschen:
7.5.7.

Während die Platte auf dem Magnetstand belassen wird, 200 μL einer 80-prozentigen Ethanollösung auf jede
Probe geben. Dreißig Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren.
▪
▪
▪

7.5.8.
7.5.9.

Mit einer auf 195 µl eingestellten P200-Pipette (oder einer gleichwertigen Mehrkanalpipette) das Ethanol
absaugen und entsorgen.
Mit einer auf 10 µL eingestellten P10-Pipette (oder einer Mehrkanalpipette) überschüssiges Ethanol absaugen.
Vermeiden Sie, Magnetpartikel zu entfernen.

Für insgesamt zwei Waschgänge den Schritt 7.5.7 wiederholen.
Die Magnetpartikel 5 Minuten an der Luft trocknen lassen, die Platte verbleibt dabei auf dem Magnetstand.

Elution:
7.5.10.

Nehmen Sie die Platte vom Magnetstand. Geben Sie 25 μL Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0) hinzu.
▪
▪

Pipettieren Sie die Mischung auf und ab, bis sie homogen ist.
Stellen Sie sicher, dass sich alle Magnetpartikel in Lösung befinden.

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7.5.11.
7.5.12.
7.5.13.

Zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Stellen Sie die Platte 5 Minuten (oder so lange, bis der Überstand klar ist) auf den Magnetstand.
Überführen Sie 22 μL des Eluats auf eine frische Platte. Diese mit Cap Strips verschließen. Beschriften Sie die
Platte und zentrifugieren Sie sie kurz, um sicherzustellen, dass sich der Überstand vollständig am Boden desWells absetzt. Bei -20 oC lagern oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Das Gelbild in Abbildung 1 zeigt die Effizienz einer typischen Aufreinigung (Amplikons vor und nach der
Aufreinigung).
Abbildung 1:
Beispiel eines
Aufreinigungsergebnisses
für Amplikons, erzeugt
mit dem TRG-MiSeqMaster-Mix. Die
Aufnahme entstanddurch die Analyse vonnicht aufgereinigten undaufgereinigten
Produkten mit dem
LabChip GX.

7.6.

Quantifizierung von Amplikons
Die folgenden Schritte wurden während der Assay-Validierung durchgeführt, um aufgereinigte PCR-Amplikons vonProben sowie von Positiv-, Negativ- und Nicht-Template-Kontrollen mit dem KAPA Library Quantification Kit(Bibliotheksquantifizierungskit) (KAPA Biosystems) zu quantifizieren.
7.6.1.

Verdünnung der Amplikons
Der Verdünnungspuffer A unten entspricht 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0 + 0,05 % Tween-20

Ziel 1:4.000:
Schritt A:

2 μL aufgereinigtes Amplikon-Eluat + 198 µL Verdünnungspuffer A.
Zehnmal auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.
5 μL aus Schritt A + 195 μL Verdünnungspuffer A.
Zehnmal auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.

Schritt B:
7.6.2.

Führen Sie gemäß Tabelle 6 einen qPCR-Lauf für die Amplikon-Quantifizierung jeder Reaktion durch (weitereAnweisungen finden Sie im Handbuch für das KAPA Library Quantification Kit (Bibliotheksquantifizierungskit)):Tabelle 6. qPCR-Setup

Reagenz
Wasser (PCR-grade)

7.6.3.

Volumen
3,6 μL

KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix mit Primer-Premix
ROX

12,0 μL
0,4 μL

Verdünnte Amplikons oder Standard (1−6)
Gesamtvolumen

4,0 μL20,0 μL

Angaben zum Thermocyclerprogramm für die qPCR finden Sie in Tabelle 7.
Tabelle 7. qPCR-Programm

Schritt

Temperatur

Dauer

Zyklus1

95 °C

5 Minuten

1

95 °C

30 Sekunden

60 °C

45 Sekunden (Plattenanalyse)

2

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7.6.4.

Nutzen Sie die Daten des qPCR-Laufs, um auf Kontaminationen zu prüfen. Berechnen Sie dazu mittels derfolgenden Gleichung die ΔCt-Werte aus Kontrollen (positiv und negativ) und der NTC:
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Kontrolle)
Beträgt der ΔCt-Wert für beide Kontrollen ≥ 4,0, können Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Beträgt der
ΔCt Wert für eine der Kontrollen < 4,0, siehe Abschnitt 14 Fehlersuche und -behebung, für weitereAnweisungen.

Beim Multiplexing mehrerer Ziele ist bezüglich des qualifizierenden 20Ct-Wertes für andere LymphoTrack Dx Assay – MiSeq PCR-Produkteauf Anhang A (Abschnitt 20) Bezug zu nehmen.

7.6.5.

Nutzen Sie die Daten des qPCR-Laufs, um auf Kontaminationen zu prüfen. Berechnen Sie dazu mittels derfolgenden Gleichung die ΔCt-Werte aus Kontrollen (positiv und negativ) und der NTC:
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Kontrolle)
Beträgt der ΔCt-Wert für beide Kontrollen ≥ 4,0, können Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Beträgt der
ΔCt Wert für eine der Kontrollen < 4,0, siehe Abschnitt 14 Fehlersuche und -behebung, für weitereAnweisungen.

Beim Multiplexing mehrerer Ziele ist bezüglich des qualifizierenden 20Ct-Wertes für andere LymphoTrack Dx Assay – MiSeq PCR-Produkteauf Anhang A (Abschnitt 20) Bezug zu nehmen.

7.6.6.

Verwenden Sie die Daten des qPCR-Laufs, um mittels folgender Gleichung die Amplikonkonzentrationen fürjede Probe zu bestimmen.
𝐾𝑜𝑛𝑧𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑣𝑜𝑛 𝑢𝑛𝑣𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑡𝑒𝑚 𝐴𝑚𝑝𝑙𝑖𝑘𝑜𝑛 (𝑛𝑀) =452 × 𝐷𝑢𝑟𝑐ℎ𝑠𝑐ℎ𝑛. 𝐾𝑜𝑛𝑧. (𝑝𝑀)𝐵𝑒𝑟𝑒𝑐ℎ𝑛𝑒𝑡 𝑑𝑢𝑟𝑐ℎ 𝑞𝑃𝐶𝑅
×4
A

Die durchschnittliche Fragmentlänge (bp) für den KAPA Illumina DNA Standard (DNA-Standard) beträgt 452.
A = Die durchschnittliche Fragmentlänge der mit dem TRG-Assay generierten Amplikons = 300 bp. (A = 300).
Die Sequenzlänge umfasst weitere Nukleotide, die für die Sequenzierung erforderlich sind.
Hinweis:7.7.

Beim Multiplexing mehrerer Ziele ist bezüglich der durchschnittlichen Fragmentlänge der für andere für LymphoTrack Dx Assays –MiSeq generierte Amplikons auf Anhang A (Abschnitt 20) Bezug zu nehmen.

Pooling und Quantifizierung der Bibliothek
Die Menge der in die MiSeq Flusszelle geladenen Bibliotheks-DNA ist entscheidend für eine optimale Cluster-Dichte in
der Flusszelle und somit für die Erzeugung qualitativ hochwertiger Daten in einem Sequenzierungslauf. Die
Quantifizierung der Bibliothek durch qPCR wird dringend empfohlen.
7.7.1.

Geben Sie ausgehend von der von den qPCR-Ergebnissen berechneten Amplikonkonzentration eine
gleichgroße Menge Amplikons (mit Ausnahme der NTC, die vernachlässigt werden kann) hinzu.
▪
▪

7.7.2.
7.8.

z. B. jedes Amplikon auf 4 nM in einem Gesamtvolumen von 10 μL verdünnen und Verdünnungspuffer A als
Verdünnungsmittel verwenden. 10 μL von jedem 4-nM-Amplikon kombinieren.
Bei Proben mit einer Konzentration von < 4 nM wird die höchstmögliche Menge Probe hinzugefügt (10 μL).
Geben Sie zu diesen Proben keinen Verdünnungspuffer A.

Röhrcheninhalte vorsichtig vortexen und anschließend kurz zentrifugieren.

Verdünnung der gepoolten Bibliothek
Ziel 1:1.000:
Schritt A:
Schritt B:

2 μL der gepoolten Bibliothek + 198 μL Verdünnungspuffer A.
Zehnmal auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.
20 μL aus Schritt A + 180 μL Verdünnungspuffer A.
Zehnmal auf- und abpipettieren, um gründlich zu mischen.

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7.9.

qPCR-Setup für die Bibliotheksquantifizierung
Angaben zum qPCR-Setup finden Sie in Tabelle 9, Angaben zum Thermoprogramm in Tabelle 10.
7.9.1.

Bestimmen Sie die Konzentration der gepoolten Bibliothek anhand der qPCR-Ergebnisse.
𝐾𝑜𝑛𝑧𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑣𝑜𝑛 𝑢𝑛𝑣𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑡𝑒𝑚 𝐴𝑚𝑝𝑙𝑖𝑘𝑜𝑛 (𝑛𝑀) =452 × 𝐷𝑢𝑟𝑐ℎ𝑠𝑐ℎ𝑛. 𝐾𝑜𝑛𝑧. (𝑝𝑀)𝐵𝑒𝑟𝑒𝑐ℎ𝑛𝑒𝑡 𝑑𝑢𝑟𝑐ℎ 𝑞𝑃𝐶𝑅A

Die durchschnittliche Fragmentlänge (bp) für den KAPA Illumina DNA Standard (DNA-Standard) beträgt 452.
A = Die durchschnittliche Fragmentlänge der mit dem TRG-Assay generierten Amplikons = 300 bp. (A = 300).
Die Sequenzlänge umfasst weitere Nukleotide, die für die Sequenzierung erforderlich sind.
Hinweis:7.10.

Beim Multiplexing mehrerer Ziele ist bezüglich der durchschnittlichen Fragmentlänge der für andere für LymphoTrack Dx Assays –MiSeq generierte Amplikons auf Anhang A (Abschnitt 20) Bezug zu nehmen.

Vorbereitung der Bibliothek auf den MiSeq-Sequenzierungslauf
Am Ende diese Abschnitts beträgt die Kozentration der Bibliothek-DNA 12 pM für das MiSeq-Reagenzkit v2 und
20 pM für das MiSeq Reagenzkit v3 beim Multiplexing. Angaben zum Multiplexing von Amplikons aus verschiedenen
LymphoTrack Dx Assays für MiSeq in einer einzigen Bibliothek finden Sie in Abschnitt 20: Anhang A: Erstellung einer
Sequenzierungsbibliothek mit mehreren NGS-Zielen.

7.10.1.

Bestimmen Sie die Menge der zu bearbeitenden Bibliothek ausgehend von der Konzentration der gepoolten
Bibliothek der qPCR-Ergebnisse und verdünnen Sie sie, falls erforderlich:▪
▪

7.10.2.

Sollte die Bibliothek eine Konzentration von mehr als 4 nM aufweisen, muss sie mit Verdünnungspuffer A auf
4 nM in einem Zielvolumen von 10 μL verdünnt werden.
Wenn die Konzentration der Bibliothek weniger als 4 nM beträgt, verwenden Sie für den nächsten Schritt 10 μL
direkt aus der Bibliothek.

Gehen Sie zur Denaturierung der DNA-Bibliothek wie folgt vor.
▪
▪

Bereiten Sie eine frische 0,2 N NaOH Lösung zu. Für die vollständige Denaturierung der DNA und eine optimale
Cluster-Erzeugung auf dem MiSeq ist eine frische Lösung unerlässlich.
Geben Sie 10 μL der 0,2 N NaOH Lösung zur verdünnten Bibliothek (10 μL), die im vorherigen Schritt hergestellt
wurde.
Tabelle 8. Denaturierung der Bibliothek

Reagenz

7.10.3.

7.10.4.

VolumenVerdünnte Bibliothek

10 μL

0,2 N NaOH

10 μL

Gesamtvolumen

20 μL

Zur Mischung der Lösung kurz vortexen und anschließend kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich die
Lösung am Boden des Röhrchens absetzt. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die dsDNABibliothek in einzelsträngige DNA (ssDNA) zu denaturieren.
Geben Sie 980 μL vorgekühlten HT1-Puffer (in MiSeq-Reagenzkits enthalten) in das Röhrchen, das die
denaturierte DNA-Bibliothek enthält.
Tabelle 9. Hinzugabe des HT1-Puffers

Reagenz

7.10.5.
7.10.6.

Volumen

Denaturierte Bibliothek

20 μL

HT1-Puffer

980 μL

Gesamtvolumen

1000 μL

Zum Mischen kurz vortexen, dann verdünnte und denaturierte DNA-Bibliothekslösung pulszentrifugieren.
Verdünnte und denaturierte DNA-Bibliothekslösung bis zum nächsten Schritt auf Eis legen.

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7.10.7.

Die verdünnte ssDNA-Bibliothek vom Eis nehmen und die nächsten Schritte befolgen, um die Bibliothek für die
Beladung des MiSeq-Geräts weiter zu verdünnen.

Beim Multiplexing mehrerer Ziele ist bezüglich Beladungskonzentration und MiSeq-Reagenzkit auf Anhang A (Abschnitt 20) Bezug zu
nehmen.
Für die MiSeq Control Software (Kontrollsoftware) (v2.6 oder neuer):•
Die Konzentration der DNA-Bibliothek für das MiSeq-Reagenzkit v2 beträgt 12 pM.
•
Beim Multiplexing beträgt die Konzentration der DNA-Bibliothek 12 bis 20 pM für das MiSeq-Reagenzkit v3.

▪

Sollte die Konzentration der verdünnten ssDNA-Bibliothek 40 pM betragen (d. h. die ursprüngliche
Konzentration betrug 4 nM), verdünnen Sie sie wie folgt, bis die erforderliche Konzentration für die Beladungdes MiSeq erreicht ist:
Tabelle 10. Vorbereitung der Bibliothek für die Beladung des MiSeq-Geräts▪

▪
7.10.8.
7.10.9.
7.11.

Zielkonzentrationen

12 pM

Denaturierte Bibliothek

300 μL

HT1-Puffer

700 μL

NaOH-Zielkonzentration (mM)

0,60 mM

Sollte die Konzentration der verdünnten ssDNA-Bibliothek weniger als 40 pM betragen (die ursprüngliche
Konzentration betrug weniger als 4 nM), verdünnen Sie die denaturierte DNA, bis die erforderliche
Konzentration für den MiSeq (z. B. 12 pM) erreicht ist.
Stellen Sie sicher, dass die endgültige NaOH-Konzentration nicht mehr als 1,0 mM beträgt.

Die fertige Bibliothek 5-mal zum Mischen umkehren und dann pulszentrifugieren.
Legen Sie die fertig aufbereitete Bibliothek auf Eis, bis sie in die MiSeq Reagent Cartridge (Reagenzkartusche)eingelegt wird.

Laden der MiSeq Flow Cell (Flusszelle)
Geben Sie 600 μL der fertig aufbereiteten Bibliothek in eine MiSeq Reagent Cartridge (Reagenzkartusche).

7.12.

Setup für MiSeq Sample Sheet (Probenblatt)Informationen zur Erstellung von Musterblättern finden Sie in der neuesten Illumina-Dokumentation. Laden Sie das
Probenblatt auf das MiSeq-Gerät hoch. Wenn Sie Software verwenden, die mit Illumina assoziiert ist (z. B. Local Run
Manager [LRM]), wählen Sie TruSeq Nano DNA (Nano-DNA) für das Library Prep Kit (Kit für die
Bibliotheksvorbereitung) und TruSeq DNA Single Indexes Set A B (DNA-Einzelindizes Satz A B) für das Index Kit (IndexKit) aus.

Zeichen im Probennamen:•
Erstellen Sie bei der Benennung jeder Probe einen eindeutigen Namen und eine eindeutige Kennung. Wenn Sie
Probenduplikate analysieren, kann ein ähnlicher Name verwendet werden (z. B. Probe1a und Probe1b).
•
Wenn mehrere Proben, die gemeinsam in der gleichen Flusszelle verarbeitet werden, nicht über eindeutige Namen verfügen,wird nur eine Probe während des Analyseverfahrens von der LymphoTrack Dx Software − MiSeq analysiert.
•
Verwenden Sie bei der Vorbereitung des Probenblatts nur alphanumerische Zeichen und Bindestriche (A-Z, a-z, 0-9, ., -,) dass Sie
bei Erstellung des Sample-Sheets.
Probenbenennung beim Multiplexing:
Jeder Index kann im Sample Sheet (Probenblatt) nur einmal genannt werden. Somit müssen alle Nachverfolgungsdaten von Proben,
die mit mehreren Zielen und unter dem gleichen Index sequenziert werden, im gleichen Feld „Sample-ID“ (Proben-ID) genannt
werden (was in den FASTQ-Dateinamen übernommen wird).
Verfolgen Sie alle Proben und Ziele, die während eines MiSeq-Laufs unter dem gleichen Index sequenziert werden. Dieser Satz
Proben/Ziele sollte eine eindeutige Kennzeichnung erhalten, die im Feld „Sample ID“ (Proben-ID) im Probenblatt zu verzeichnen ist.
Beachten Sie bei der Festlegung einer Namenskonvention, dass die Sample-ID (Proben-ID) auf 40 Zeichen beschränkt ist.

Das Feld Sample Name (Probenname) im Sample Sheet (Probenblatt) wird standardmäßig anstelle der Sample ID(Proben-ID) in den FASTQ-Dateinamen aufgenommen, wenn das Feld ausgefüllt wird. Lassen Sie das Feld leer oder
LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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kopieren Sie die für die Sample ID (Proben-ID) eingegebenen Daten in dieses Feld. Werden Alternativdaten in das Feld fürSample Name (Probenname) eingegeben, stellen Sie sicher, dass eine eindeutige Kennzeichnung vorhanden ist und derName den oben aufgeführten Empfehlungen für die Nachverfolgung von Proben entspricht.

Achtung!

Adaptersequenzen werden von der LymphoTrack Dx Software – MiSeq nicht erkannt.
Wenn Sie mit Illumina verbundene Software verwenden (z. B. Local Run Manager (LRM)), bei der Erstellung desSample Sheet (Probenblatt) muss Adapter trimming (Adapter-Trimming) aktiviert sein.

Tabelle 11. Indizes, die mit LymphoTrack Dx Assay-Mastermischungen verwendet werden

7.13.

LymphoTrack Dx Assay – MiSeq
PCR Master Mix Index

Indexsequenz

id01
id02
id03
id04
id05
id06
id07
id08
id09
id10
id11
id12
id13
id14
id15
id16
id18
id19
id20
id21
id22
id23
id25
id27

ATCACGCGATGT
TTAGGCTGACCAACAGTGGCCAATCAGATC
ACTTGAGATCAGTAGCTT
GGCTACCTTGTAAGTCAAAGTTCCATGTCA
CCGTCCGTCCGCGTGAAAGTGGCCGTTTCGCGTACGGAGTGGACTGAT
ATTCCT

TruSeq DNA Single Indexes Set A B (DNAEinzelindizes Satz A B) (LRM „Index Kit“
[Index-Kit]
AR001-B
AR002-A
AR003-B
AR004-A
AR005-A
AR006A
AR007
AR008
AR009
AR010
AR011
AR012
AR013
AR014
AR015
AR016
AR018
AR019-A
AR020
AR021
AR022
AR023
AR025
AR027

MiSeq-Lauf starten
Starten Sie den MiSeq-Lauf, indem Sie den Anweisungen der MiSeq Control Software (Kontrollsoftware) folgen. Die
ungefähren MiSeq-Laufzeiten sind in Tabelle 12 angegeben.

Tabelle 12. MiSeq-Laufzeiten

MiSeq-Reagenz-Kit
v2
v3

Lese-Länge

MCS-Version

MiSeq-Gesamtlaufzeit

2x151 bpv2.6 oder neuerca. 24 Stunden

2 x 251 bp

v2.6 oder neuerca. 39 Stunden

2 x 301 bp

v2.6 oder neuerca. 56 Stunden

Hinweis: Wenn ein Kit mit weniger Zyklen verwendet wird, reicht das nicht aus, um die für diesen Assay erforderlichen Lese-Längen zu generieren.

8. Datenanalyse
Der LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq wurde für die Erstellung von Sequenzierungsdaten entwickelt, die mit der
LymphoTrack Dx Software – MiSeq analysiert werden können. Die LymphoTrack Dx Software – MiSeq ist auf der zugehörigen CD (LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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95000009) im Assay-Lieferumfang enthalten. Diese CD enthält detaillierte Anweisungen zur Installation und
Verwendung der Software.

9. Erwartete Werte
Die von der Software generierten Berechnungswerte werden für die Ermittlung des Assay-Ergebnisses auf das nächste
Zehntel gerundet.

▪
▪
▪

TRB Positivkontrolle, häufigste Lesevorgänge in % ≥ 2,5 %NGS Negativkontrolle, häufigste Lesevorgänge in % < 1,0 %Validität des MiSeq-Laufsooo% Q30 > 80 % für v2 (2x151)% Q30 > 75 % für v2 (2x251)% Q30 > 70 % für v3 (2x301)*Hinweis:

Q30 aller analytischen Validierungen erfüllt die oben genannten Kriterien der Spezifikation für Illumina MiSeq Q30. Der
Q30-Wert kann jedoch abhängig von der Probenqualität variieren. Sollte der Q30-Wert unter dem Spezifikationswert fürIllumina Q30 liegen, prüfen Sie den Index-Q30-Wert des LymphoTrack Dx Berichts nach der Datenanalyse mit der
LymphoTrack Dx Software – MiSeq. Sollte ein Index-Q30-Wert des LymphoTrack Dx Berichts die Illumina-Spezifikation
ebenfalls nicht erfüllen, ist anzunehmen, dass der Index ungültig ist.
MiSeq v2 Chemie wurde für diesen Einzelziel-Assay validiert. MiSeq v3 Chemie wurde für das Multiplexing von Assays
validiert.

10. Verfahrenseinschränkungen▪
▪
▪
▪

Dieser Assay identifiziert nicht 100 % der klonalen Zellpopulationen.
Die meisten Technologien weisen an oder in der Nähe der analytischen Nachweisgrenze (LOD) ein höheres Varianzlevelauf. Dies gilt auch für das Next-Generation Sequencing. Liegt ein Ergebnis in der Nähe der analytischen Nachweisgrenze(LOD) eines Assays, werden Folgetests empfohlen.
PCR-basierte Assays werden vom Abbau der DNA oder der Hemmung der PCR-Amplifikation durch Heparin oder andereWirkstoffe beeinflusst, die sich in der analysierten Probe befinden könnten.
Die Ergebnisse molekularer Klonalitätstests müssen immer unter Berücksichtigung klinischer, histologischer und
immunphänotypischer Daten interpretiert werden.

11. Interpretation und Berichterstellung
Verwenden Sie den Bericht Merged Read Summary (zusammengelegte Lesevorgangszusammenfassung), um die häufigsten
zusammengelegten Lesevorgangssequenzen und deren Häufigkeit zu bestimmen, bevor anhand der unten stehenden
Kriterien die Klonalität analysiert wird. Weitere Informationen zum Bericht „Merged Read Summary“ (Zusammengelegte
Lesevorgangszusammenfassung) finden Sie in Abschnitt 8: „Datenanalyse“. Bei einigen klonalen Prozessen kann es dazu
kommen, dass zwei oder mehr Klone nachgewiesen werden. Beispiele hierfür sind dominante Populationen mit einer kleinen,
subklonalen Population oder das Vorhandensein mehrerer lymphoproliferativer Erkrankungen. Somit ist es besonders
wichtig, dass solche Ergebnisse im klinischen Kontext interpretiert werden.
* Gehen Sie bei der Interpretation einer vermutlich klonalen Sequenz mit Vorsicht vor, wenn der Wert für ein V-, D- und/oder J-Gen „none“(keine) lautet. Der Wert „none“ wird dann zugewiesen, wenn ein Alignment den Qualitäts-Mindestwert aufgrund eines dürftigen
Alignments nicht erfüllt.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Tabelle 13. Interpretationskriterien

Kriterium 1

Die Gesamtzahl derLesevorgänge pro Probebeträgt ≥ 20.000.

Die Gesamtzahl derLesevorgänge pro Probebeträgt ≥ 10.000 und < 20.000.

Die Gesamtzahl derLesevorgänge pro Probebeträgt < 10.000.

Kriterium 2

Die am häufigsten
zusammengelegte Sequenz
hat einen Anteil von ≥ 2,5 %an den Gesamtlesevorgängen.

Die häufigste
zusammengelegte Sequenz
hat einen Anteil von ≥ 5,0 %an den Gesamtlesevorgängen.

Keine Angabe

Kriterium 3

Ergebnis

Die Lesevorgänge in % für die vermutete
klonale zusammengelege Sequenz betragen> 2X der Lesevorgänge in % der am
dritthäufigsten zusammengelegten
Sequenz.1

KLONALITÄTSNACHWEISERBRACHTDie Lesevorgänge in % für die vermutete
klonale zusammengelegte Sequenz betragen≤ 2X der Lesevorgänge in % der am
dritthäufigsten zusammengelegten
Sequenz.1

Kein Klonalitätsnachweis
erbracht

Die Lesevorgänge in % für die vermutete
klonale zusammengelegte Sequenz betragen> 2X der Lesevorgänge in % der am
dritthäufigsten zusammengelegten
Sequenz.1

KLONALITÄTSNACHWEISERBRACHTDie Lesevorgänge in % für die vermutete
klonale zusammengelegte Sequenz betragen≤ 2X der Lesevorgänge in % der am
dritthäufigsten zusammengelegten
Sequenz.1

Kein Klonalitätsnachweis
erbracht

Keine Angabe

Keine Beurteilung möglich

1Die von der Software generierten Berechnungswerte werden für den Vergleich auf das nächste Zehntel eines Prozents gerundet.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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Abbildung 2: Interpretation von Daten ausgehend von den Kriterien in Tabelle 13.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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12. Beispieldaten

Abbildung 3:

Diese Tabelle wurde mit der LymphoTrack Dx Software – MiSeq erstellt und zeigt die 10 häufigsten Lesevorgänge der
Lesevorgangszusammenfassung, zusammengelegt mit den 500 häufigsten Lesevorgängen. Lesevorgänge werden dannzusammengelegt, wenn sich lediglich 1 oder 2 Basenpaare (bp) voneinander unterscheiden. Sequenzen wurden mit dem
LymphoTrack Dx TRG-Assay – MiSeq generiert und mit der LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009) analysiert.

13. Leistungseigenschaften
Die Ergebnisse des LymphoTrack Dx TRG-Assays – MiSeq wurden mit dem Labordiagnosebericht verglichen; dieÜbereinstimmung (prozentuale Gesamtübereinstimmung), die positive prozentuale Übereinstimmung (PPA) und die
negative prozentuale Übereinstimmung (NPA) lagen bei 89 % (51/57 Fälle), 81 % bzw. 97 %.
Tabelle 14. Vergleich zwischen dem LymphoTrack Dx TRG-Assay – MiSeq und dem Labordiagnosebericht

Labordiagnosebericht
KlonalNicht klonal

Klonal22

1

Nicht klonal

529

LymphoTrack Dx
TRG-Assay – MiSeq

Die analytische Performance des LymphoTrack Dx TRG-Assays – MiSeq wurde geprüft, indem Tonsillen-DNA mit klonaler
Zelllinien-DNA gespikt und in verschiedenen Verdünnungsgraden untersucht wurde. Die Nachweisgrenze (LOD) lag bei einer
DNA-Verdünnung von 5 %. Die höchsten prozentualen Lesevorgänge der Tonsillen-DNA betrugen < 1 %. Das
Bestimmtheitsmaß R2 der linearen Regression lag bei einer DNA-Verdünnung zwischen 0 und 10 % bei > 0,98. Der
Variationskoeffizient von 8 Läufen mit zwei Bedienern, 2 Reagenzienchargen und 2 Instrumenten betrug bei der
Untersuchung einer DNA-Verdünnung von 5 % und 10 % weniger als 15 %.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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14. Fehlersuche und -behebung
Tabelle 15. Fehlersuche und -behebung

Tritt auf während

FehlerMaßnahme

Vorbereitung der Proben
und Reagenzien

Proben-DNA-Menge
beträgt weniger als 50 ng
mit einer Methode auf dsDNA-Basis

Probe nicht untersuchen

Präparation der Proben undVorbereitung der Reagenzien

Die Integrität der DNA-Probe ist gering

Probe mit der Specimen Control Size Ladder(Probengröße-Kontrollskala) von Invivoscribe
untersuchen(

20960021 für ABI-Detektion oder20960020 für Gel-Nachweis)

Quantifizierung der Amplikons mit dem
KAPA Library Quantification Kit(Bibliotheksquantifizierungskit)

ΔCt < 4,0
ΔCt = Ct (NTC) – Ct (Kontrolle)Standardkurve in qPCR prüfen.
Auf Kontamination prüfen und KAPA-qPCR für alle
Proben und Kontrollen wiederholen.
Sollte erneut der Wert ΔCt < 4,0 festgestellt
werden, wiederholen Sie PCR und qPCR für alle
Proben und Kontrollen.

Bibliothekserstellung
durch Amplikonquantifizierungund -pooling

Amplikonkonzentration
beträgt weniger als 1 nM

Prüfen Sie die Standardkurve in qPCR
und wiederholen Sie das PCR-Verfahren, wenn der
Wert weniger als 1 nM beträgt

Probenblatt nicht gefunden
Falsch formatiertes Probenblatt
Strömungsprüfung fehlgeschlagen
MiSeq-LaufvorbereitungZu wenig Speicherplatz
Abfallbehälter leeren

Siehe Fehlerbehebungsleitfaden von Illumina
Oder rufen Sie den technischen Kundendienst vonIllumina an+1-800-809-4566

Netzwerkverbindung abgerissen
RFID-Fehler
MiSeq-Lauf%Q30 < 80 % für v2 (2x151)*%Q30 < 75 % für v2 (2x251)*%Q30 < 70 % für v3 (2x301)*

Rufen Sie den technischen Kundendienst
von Invivoscribe an+1-858-224-6600

CD-Installation

LymphoTrack Dx Software lässt sich nicht
ordnungsgemäß installieren

Rufen Sie den technischen Kundendienst
von Invivoscribe an+1-858-224-6600

Datenanalyse

LymphoTrack Dx Software wird
plötzlich angehalten

Rufen Sie den technischen Kundendienst
von Invivoscribe an+1-858-224-6600

Datenanalyse

Die positive Kontrolle erkennt keine
klonale Sequenz

Rufen Sie den technischen Kundendienst
von Invivoscribe an+1-858-224-6600

Nicht-Template-Kontrolle (NTC)

NTC zeigt nach PCR eine Amplifikation

Assay wiederholen* Q30-Wert aller analytischen Validierungen erfüllte die oben genannten Kriterien der Illumina MiSeq-Spezifikation für den Q30-Wert. Der Q30-Wert kann jedoch
abhängig von der Probenqualität variieren. Sollte der Q30-Wert unter dem Spezifikationswert für Illumina Q30 liegen, prüfen Sie den Index-Q30-Wert desLymphoTrack Dx Berichts nach der Datenanalyse mit der LymphoTrack Dx Software − MiSeq. Sollte ein Index-Q30-Wert des LymphoTrack Dx Berichts die
Illumina-Spezifikation ebenfalls nicht erfüllen, ist anzunehmen, dass der Index ungültig ist.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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15. Technischer Support und Kundendienst
Vielen Dank, dass Sie sich für unseren LymphoTrack Dx TRG-Assay – MiSeq entschieden haben. Wir schätzen Ihre Treue. Wir
helfen Ihnen gerne, diesen Assay zu verstehen, und bieten Ihnen durchgehend von montags bis freitags technischen Support
an, damit Sie die Assays effizient in Ihrem Labor durchführen können.
Kontaktdaten
Invivoscribe, Inc
10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | USA
Telefon: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Geschäftszeiten: 7:00 Uhr bis 17:00 Uhr PST/PDT
Technischer Kundendienst: support@invivoscribe.com | Kundenbetreuung: sales@invivoscribe.com | Webseite: www.invivoscribe.com

16. Referenzen
1. Tonegawa, S. (1983). Somatic Generation of Antibody Diversity. Nature 302, 575-581
2. Trainor KJ. et al., (1990). Monoclonality in B-lymphoproliferative disorders detected at the DNA level. Blood 75,
2220-2222

3. Miller, JE. (2013). Principle of Immunoglobulin and T Cell Receptor Gene Rearrangement. In Cheng, L., Zhang, D., Eble,
JN. (Eds), Molecular Genetic Pathology (2nd Ed., sections 30.2.7.13 and 30.2.7.18). New York, USA: Springer
Science & Business Media.
4. JJM van Dongen et al., (2003). Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal
immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the
BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17, 2257–2317.
▪ Gebrauchsanweisung für die LymphoTrack Dx Software – MiSeq (95000009)▪ https://www.beckmancoulter.com▪ http://www.illumina.com▪ http://www.invitrogen.com▪ http://www.kapabiosystems.com▪ http://www.thermofisher.com

17. Symbole
Die folgenden Symbole werden auf den Etiketten der Invivoscribe NGS-Diagnostikprodukte verwendet.
Katalognummer

Verfallsdatum

Reagenzvolumen

Autorisierter Vertreter in der Europäischen
Gemeinschaft

Chargennummer

Gebrauchsanweisung Beachten

LagerbedingungenIn-vitro-Diagnostikum

Eindeutige Gerätekennung

Hersteller

UK-Konformität Geprüft

Verantwortliche Person im Vereinigten Königreich

Bevollmächtigter Schweizer Vertreter

Europäische Konformität

Computerprogramm

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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18. Haftungshinweis
Dieses Produkt ist durch eines oder mehrere der folgenden Patente und angemeldeten Patente geschützt, die Eigentum vonInvivoscribe, Inc. (IVS) sind oder für die das Unternehmen über eine exklusive Lizenz verfügt. Patent Nummer 7,785,783 inden Vereinigten Staaten von Amerika, Patent Nummer 8,859,748 in den Vereinigten Staaten von Amerika (gemeinsam mit
Teilanträgen, die sich auf den gleichen Originalantrag beziehen), Europäisches Patent der Nummer EP 1549764B1 (validiertin 16 Ländern und gestützt durch die verwandten Europäischen Patente der Nummern 2418287A3 und EP 2460889A3),
Patent Nummer JP04708029B2 in Japan, Patentanmeldung Nummer 2006-529437 in Japan, Patentanmeldung Nummer
PI0410283.5 in Brasilien, Patent Nummer CA2525122 in Kanada, Patent Nummer IN243620 in Indien, Patent Nummer
MX286493 in Mexiko, Patent Nummer CN1806051 in China und Patent Nummer 101215194 in Korea.
Die Verwendung dieses Produkts erfordert unter Umständen Methoden zur Nukleinsäureamplifikation wie eine
Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Der Nutzer ist für jegliche notwendige Lizenzierung zur Durchführung von
Amplifikationsmethoden oder zum Nutzen von Amplifikationsenzymen oder Geräten, welche durch von Drittparteien
gehaltenen Patente geschützt sind, verantwortlich, und Invivoscribe Technologies, Inc. erteilt weder ausdrücklich nochstillschweigend eine derartige Lizenz.
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LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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19. LymphoTrack Dx TRG-Assay - MiSeq: Kurzanleitung
19.1.

Mit behandschuhten Händen Master-Mixe aus dem Gefrierschrank nehmen. Röhrcheninhalte auftauen lassen; zum
Mischen leicht vortexen.

19.2.

Unter einer Sicherheitshaube oder in einer „Dead-Air-Box“ 45 L Master-Mix in die einzelnen Wells einer PCR-Platte
pipettieren. Ein Well für jeden Master-Mix und ein Master-Mix pro Probe, Positiv-, Negativ- oder Nicht-TemplateKontrolle.

19.3.

Geben Sie 0,2 L Taq-DNA-Polymerase (bei 5 U/µL) zu jedem Master-Mix hinzu.

19.4.

Geben Sie 5 L DNA-Probe (mit einer Mindestkonzentration von 10 ng/µl) und 5 L je Kontrollprobe in Wells,
die die entsprechenden Master-Mixe enthalten, und mischen Sie, indem Sie 5- bis 10-mal auf- und abpipettieren.

19.5.

Geben Sie 5 L Wasser in Molekularbiologie-Qualität in das Well mit dem entsprechenden Master-Mix für die NichtTemplate-Kontrolle und mischen Sie, indem Sie 5- bis 10-mal auf- und abpipettieren.

19.6.

Amplifizieren Sie die Ziel-DNA mit dem folgenden Thermocycler-Programm:
Schritt

Temperatur

Dauer

Zyklus1

95 °C

7 Minuten

1

2

95 °C

45 Sekunden

3

60 °C

45 Sekunden

4

72 °C

90 Sekunden

5

72 °C

10 Minuten

1

6

15 C

∞

1

29x

19.7.

PCR-Platte aus dem Thermocycler nehmen.

19.8.

Die PCR-Produkte mit dem Agencourt AMPure XP PCR Purification System (PCR-Aufreinigungssystem) aufreinigen.
Geben Sie 50 μL Magnetpartikel zu jeder 50-µL-Reaktion, eluieren Sie die DNA in 25 µL Eluat.

19.9.

Quantifizieren Sie die Amplikons mit dem KAPA Library Quantification Kit (Bibliotheksquantifizierungskit) gemäß KitAnweisungen. Verdünnen Sie die Amplikons im Verhältnis 1:4.000, bevor Sie mit dem qPCR-Verfahren fortfahren.

19.10.

Gleiche Amplikonmengen von Proben (nicht jedoch die Nicht-Template-Kontrolle) poolen, im Verhältnis 1:1.000
verdünnen und die Bibliothek mit dem KAPA Library Quantification Kit (Bibliotheksquantifizierungskit) quantifizieren.

19.11.

Die Bibliothek auf eine Konzentration von 12 pM für das MiSeq-Reagenzkit v2 und 12 bis 20 pM für das MiSeqReagenzkit v3 bei Multiplexing (MCS v2.6 oder neuer) denaturieren und verdünnen.

19.12.

Geben Sie 600 μL der denaturierten und verdünnten Bibliothek in die MiSeq Reagent Cartridge (Reagenzkartusche).

19.13.

Richten Sie ein MiSeq-Probenblatt ein und laden Sie das Probenblatt auf das Gerät hoch (falls erforderlich).

19.14.

Starten Sie den MiSeq-Lauf.

19.15.

Analysieren und visualisieren Sie die generierten Daten mit der LymphoTrack Dx Software – MiSeq.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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20. Anhang A: Erstellung einer Sequenzierungsbibliothek mit mehreren NGSZielen
Wenn mehrere Ziele parallel mit einem unterschiedlichen LymphoTrack Dx Assay – MiSeq ausgeführt werden, ist es wichtig,
auf die unterschiedlichen Verfahren bei jedem Assay zu achten. Beispielsweise verwendet der IGHV Leader Assay 32 PCRZyklen und sollte auf einen separaten Thermocycler-Lauf gesetzt werden als andere LymphoTrack Dx Assays, die nur 29 PCRZyklen verwenden. Tabelle 16 unten zeigt diese Verfahrensunterschiede im Überblick. Vollständige Anleitungen sind derGebrauchsanweisung zum betreffenden LymphoTrack Dx Assay – MiSeq zu entnehmen.
Tabelle 16 LymphoTrack Dx Assay – Verfahrensunterschiede

LymphoTrack Dx Assay – MiSeq

Verfahren
Schritt

Beschreibung

IGHV
Leader

IGH FR1

IGH FR2

IGH FR3

IGK

TRG

TRB

7.4.1

Anzahl PCR-Zyklen

32

29

29

29

29

29

29

7.5.1

Volumen AMPure XP Reagenz(Verhältnis)

50 µL
(1:1
Verhältnis)

50 µL
(1:1
Verhältnis)

50 µL
(1:1
Verhältnis)

50 µL
(1:1
Verhältnis)

50 µL
(1:1
Verhältnis)

50 µL
(1:1
Verhältnis)

35 µL(0,7:1
Verhältnis)

7.6.5

Kontaminationsprüfung
ΔCt-Wert =Ct (NTC) – Ct (Kontrolle)

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 4,0

ΔCt ≥ 3,0

7.6.5
und
7.9.1

A
(durchschnittliche
Fragmentlänge)660 bp450 bp390 bp260 bp410 bp300 bp400 bp

Ladekonzentration

12 – 20 pM

12 pM

12 pM

12 pM

8 pM

12 pM

12 pM

MiSeq-Reagenzkit fürEinzelzielsequenzierung*v3 (600)

v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)v2 (300)
v2 (500)

v2 (500)

Probenblatt-Einstellungen für:Zyklen Lesevorgang 1*
Zyklen Lesevorgang 2*

301

251

251

151

251

151

251

7.10.7

7.12*Hinweis: MiSeq v2 Chemie wurde für diese Einzelziel-Assays validiert. MiSeq v3 Chemie wurde für IGHV Leader und das Multiplexing von Assays validiert.

Zwei oder mehr Sequenzierungsbibliotheken, die mit den gleichen LymphoTrack Genziel-Master-Mixen hergestellt wurden(z. B. zwei TRG-Sequenzierungsbibliotheken aus der gleichen oder aus verschiedenen Kit-Chargen), können ebenfalls
gemeinsam in einer einzigen Sequenzierungsbibliothek kombiniert werden, solange jeder Index für den Master-Mix nur
einmal pro Sequenzierungslauf enthalten ist. Angaben zu den Zykluseinstellungen und dazu, welche Illumina MiSeqReagenzkits für die Kombination verschiedener Genziele verwendet werden können, finden Sie in der folgenden Tabelle. Es
wird empfohlen, das MiSeq Reagenzkit v3 zu verwenden, wenn alle 7 Ziele gemeinsam sequenziert werden, um ausreichend
Lesevorgänge pro Probe zu erhalten.
Tabelle 17 Zykluseinstellungen und Reagenzkits für einen MiSeq-Lauf mit mehreren Zielen

Multiplexing von Genzielen

Sample-SheetEinstellungen

MiSeq-Reagenzkit

Ladekonzentration

Katalognummer

Nur IGH FR3 und TRG
gemeinsam

151 Zyklen Lesevorgang 1
151 Zyklen Lesevorgang 2

v2-Kit (300 Zyklen)oder
v2-Kit (500 Zyklen)

12 pM (v2)oder
20 pM (v3)MS-102-2002
oder
MS-102-2003

Beliebige Kombination derfolgenden Ziele:
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3,
IGK, TRB und TRG

251 Zyklen Lesevorgang 1
251 Zyklen Lesevorgang 2

v2-Kit (500 Zyklen)
bis zu 4 Ziele
oderv3-Kit (600 Zyklen)

12 pM (v2)oder
20 pM (v3)MS-102-2003
oder
MS-102-3003

Bei Kombination des Assays mit
IGHV Leader

301 Zyklen Lesevorgang 1
301 Zyklen Lesevorgang 2

v3-Kit (600 Zyklen)

20 pM (v3)MS-102-3003

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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20.1.

Bestimmen Sie die Konzentration der einzelnen Bibliotheken (z. B., IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB
und TRG).

20.2.

Bestimmen Sie, welche Menge jeder Bibliothek denaturiert werden soll.
Die Tabelle unten enthält die Fälle A, B, C, D, E und F als verschiedene Beispiele für das Multiplexing von Assays(z. B. ist Fall A ein Multiplex aus IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB und TRG). T, U, V, W, X, Y und Z
entsprechen dem Volumen µL.
n=Anzahl der Ziele, die in eine MiSeq-Kartusche geladen werdenT=

40 fmol/[n x IGHV Leader Bibliothekskonzentration (nM)]U=

40 fmol/[n x IGH FR1 Bibliothekskonzentration (nM)]V=

40 fmol/[n x IGH FR2 Bibliothekskonzentration (nM)]W=

40 fmol/[n x IGH FR3 Bibliothekskonzentration (nM)]X=

40 fmol/[n x IGKBibliothekskonzentration (nM)]Y=

40 fmol/[n x TRG Bibliothekskonzentration (nM)]Z=

40 fmol/[n x TRB Bibliothekskonzentration (nM)]

Hinweis: Der Wert 40 fmol entspricht den 20 µL 2 nM am Ende von Schritt 20.3.
Tabelle 19. Berechnung der einzelnen Bibliothekseinsätze zur Erzeugung einer Sequenzierungsbibliothek mit mehreren Genzielen für den MiSeq-Lauf

Bibliothek
Konzentration
Assay-Name(nM)

Volumen der einzelnen Bibliothek (µL)
Fall A
Fall B
Fall C
Fall D
n=7
n=6
n=5
n=4

Fall En=3

IGHV Leader

2,3

T

2,5

2,9

3,5

4,3

IGH FR1

1,5

U

3,8

4,4

5,3

6,7

8,9

IGH FR2

4

V

1,4

1,7

2

2,5

3,3

IGH FR3

2,1

W

2,7

3,2

3,8

4,8

6,4

IGK

3,5

X

1,6

1,9

2,3

TRG

2,6

Y

2,2

2,6

TRB

2

Z

2,9

T+U+V+W+X+Y+Z

17,1

20.3.

16,7

Fall F
n=2

5,7
7,7

16,9

18,3

18,6

13,4

Die kombinierten Bibliotheken auf 2 nM denaturieren.
▪

Fügen Sie Reagenzien gemäß Tabelle 20 basierend auf der im vorigen Schritt festegelegten Menge hinzu.

Wenn T+U+V+W+X+Y+Z > 18, wie beispielsweise in den Fällen D und E in Tabelle 19, mischen Sie zunächst die
entsprechenden Bibliotheken und fügen Sie 18 µL zur denaturierenden Lösung hinzu, wie in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 20. Denaturierung der Bibliothek

Reagenz

Volumen (µl)

IGHV Leader-Bibliothek

T

IGH FR1-Bibliothek

U

IGH FR2-Bibliothek

V

IGH FR3-Bibliothek

W

IGK-Bibliothek

X

TRG-Bibliothek

Y

TRB-Bibliothek

Z

1 N NaOH

2

10 mMl Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,05 % Tween-20
GesamtLymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

18 – (T+U+V+W+X+Y+Z)
20
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Zum Mischen der Lösung kurz vortexen und anschließend kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich die
Lösung am Boden des Röhrchens absetzt. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die kombinierte DNABibliothek in einzelsträngige DNA zu denaturieren.
20.4.

Die denaturierte Bibliothek auf eine Konzentration von 40 pM verdünnen.
Geben Sie 980 μL vorgekühlten HT1-Puffer (im MiSeq-Reagenz-Kit enthalten) in das Röhrchen, das die 20 µL derdenaturierten DNA-Bibliothek enthält. Kurz vortexen, um die Bestandteile zu mischen, und die Probe dannpulszentrifugieren.

20.5.

Bereiten Sie die denaturierte Probe für die Übertragung in das MiSeq-Gerät vor.
Verdünnen Sie die Bibliothek auf eine Konzentration von 12 pM für das MiSeq-Reagenzkit v2 und 20 pM für das
MiSeq-Reagenzkit v3 (MCS v2.6 oder neuer), siehe Tabelle 21. Zum Mischen kurz vortexen, und die Probe dannpulszentrifugieren.
Tabelle 21. Vorbereitung der kombinierten Bibliothek für die Beladung des MiSeq-Geräts

VolumenReagenz
12 pM

20 pM

40-pM-Bibliothek

300 µL500 µL

Gekühlter HT1-Puffer

700 µL500 µL

Gesamt1000 µL

1000 µL

20.6.

Geben Sie 600 µL der kombinierten denaturierten Bibliothek aus dem vorangegangenen Schritt in eine MiSeq
Reagent Cartridge (Reagenzkartusche).

20.7.

Richten Sie ein MiSeq-Probenblatt ein und laden Sie das Probenblatt auf das Gerät hoch (falls erforderlich).

20.8.

Starten Sie den MiSeq-Lauf.

20.9.

Analysieren und visualisieren Sie die generierten Daten mit der LymphoTrack Dx Software – MiSeq.

LymphoTrack Dx TRG Assay – MiSeq

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