研究フロンティア（平成年度学術奨励賞論文）

子宮内膜間質細胞の脱落膜化におけるEpidermal Growth Factor Receptor を介した細胞機能調節後藤 香里 ，），河野 康志 ），甲斐 由布子 ），宇津宮 隆史 ），楢原 久司 ）大分大学医学部産科婦人科 ），セント・ルカ産婦人科 ）はじめに脱落膜化に伴う EGFR の mRNA 発現とタンパク発現

着床期には，子宮内膜間質細胞はホルモンの影響を受けて脱落膜細胞へと分化する．この子宮内膜の脱落膜化）

は，胚着床のために必要な分化であり ，妊娠成立には）子宮筋腫等手術時にインフォームドコンセントを得て採取した子宮内膜は間質細胞を分離し，回継代した細）胞を実験へ用いた ．子宮内膜間質細胞の脱落膜化にお子宮内膜の受容能に加えて，成熟した胚盤胞の存在 ，ける機能を検討するため，分離された子宮内膜間質細胞

ホルモンや成長因子などの分泌 ），母体免疫寛容 ）などがは ． mM の dibutyryl（db）-cAMP（cAMP）と必須である．脱落膜化の分子機序については，分泌期中の 酢 酸 メ ド ロ キ シ プ ロ ゲ ス テ ロ ン ア セ テ ー ト（me-期において，子宮内膜間質細胞は卵巣の黄体から産生さdroxyprogesterone acetate；MPA）を用い 日間刺激しれる黄体ホルモン（progesterone；P ）や着床した場合て脱落膜化を誘導した ）．子宮内膜間質細胞の脱落膜化には胚の絨毛から産生されるヒト絨毛性ゴナドトロピンの確認は形態変化，および培養上清中の prolactin の産（human chorionic gonadotropin；HCG）が細胞内の環状生を確認した．

nM

アデノシン一リン酸（cyclic adenosine monophosphate；

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化に伴う経時的なcAMP）濃度を上昇させ，脱落膜細胞へと分化する．脱EGFR の mRNA 発現とタンパク発現について検討した．

落膜へ分化した細胞の機能についてはさまざまな局所因EGFR mRNA の 発 現 は cAMP と MPA の 添 加 後子が関与する．多くの組織で発現が報告されている上皮から増加した（図成 長 因 子 受 容 体（epidermal growth factor receptor：と MPA の添加前であるコントロールと比較して増加をEGFR）も子宮内膜での発現が認められており，増殖期認めなかった．タンパクでは刺激）日目

A）．一方，非脱落膜化細胞では cAMP
日目で脱落膜化細胞で増加し，分泌期で低下がみられるという報告 や分泌の EGFR 発現が増加し，コントロールでは増加を認め期に増加するという報告がある ）．また，黄体ホルモンなかった（図作用薬（progestin）により発現が増加するという報告の発現は増加した．

）

もある ．EGF ファミリーのB）．この結果より，脱落膜化に伴い EGFRつであり EGFR のリガンドとなる epiregulin に関しては，分泌期後期に子宮内膜脱落膜化細胞における EGFR を介した間質細胞での発現を認め ），主に末梢血マクロファージ

IL― ，MCP― ，MMP― ，VEGF の mRNA 発現）や 正 常 胎 盤 組 織 に も 認 め ら れ る が EGFR を 介 しepiregulin がリガンドとして，脱落膜細胞がどのような脱落膜化細胞におけるEGFRを介したinterleukin（IL）― ，機能変化をするか，着床や妊娠維持にどのような影響を― ，matrix metallomonocyte chemotactic protein（MCP）

与えるかについては知られていない．

― ，vascular endothelial growth factor
proteinase（MMP）

本研究では，ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化におけ（VEGF）の mRNA 産生を検討するため， 日間脱落膜る EGFR の発現変化ならびに EGFR を介した細胞の機化 を 誘 導 し た 細 胞 に EGFR の リ ガ ン ド の能変化について検討した．

epiregulin を添加し検討した． nM の epiregulin 添加し，つである時間後の細胞を実験に用いた．IL― および MMP― はepiregulin の添加によりコントロールと比較して発現が連絡先：後藤香里，大分大学医学部産科婦人科〒 ―大分県由布市挾間町医大ヶ丘 丁目 番地
TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：k-goto@oita-u.ac.jp12

日本生殖内分泌学会雑誌（2019）24 : 12-17増加する結果を示した．細胞内伝達経路を検討するため，
MEK 阻害剤である Uた．Uを用い mRNA の産生を検討し添加により産生は抑制され，EGFR を介した反応は ERK/ を介することが示唆された（図）
．

(A)

(B)
(day)

0controldb-cAMP (0.5 mM)+ MPA (100 nM)

8 12 12 16 16

175 kDa →EGFR

37 kDa →

GAPDH

33*

*
21**

Relative intensity(EGFR/GAPDH)*(fold of control)(EGFR/GAPDH)

82*

10004

8120

168(day)

図**

8 12 12 16 16(day)

脱落膜化に伴う EGFR の発現
子 宮 内 膜 間 質 細 胞 は 日 間 ． mM の dibutyryl（db）-cAMP（cAMP）との MPA を用い脱落膜化を誘導した．

nM（A）子宮内膜間質細胞の脱落膜化に伴う経時的な EGFR の mRNA 発現．
（B）子宮内膜間質細胞の脱落膜化に伴う経時的な EGFR のタンパク発現．
＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ． , vs. day

(B)
**

2.5
2.0
1.5

##

1.00.5*0**

MCP-1 mRNA (fold of control)

IL-8 mRNA (fold of control)

(A)

2.5
2.01.5

**

1.0

**

0.5

**

0epiregulin-++

epiregulin

-++

U0126

--+

U0126

--+

(D)
**

2.5
2.0
1.5
1.00.5**0VEGF mRNA (fold of control)

MMP-1 mRNA (fold of control)

(C)

2.5
2.0
1.5
1.0

**

0.5
0epiregulin-++

epiregulin

-++

U0126

--+

U0126

--+

図

脱落膜化細胞における EGFR を介した IL― ，MCP― ，MMP― ，VEGF の mRNA発現
日間脱落膜化を誘導した細胞に nM の epiregulin を添加し産生された mRNAを検討した．また MEK 阻害剤である Uを添加し情報伝達経路についても検討した．
（A）IL― ，（B）MCP― ，（C）MMP― ，（D）VEGF＊＊：p＜ ． , vs. コントロール

wound repair assay を行った．方法は以前の検討方法に

EGFR を介した細胞の走化性

従 っ た ， ）．serum free DMEM，も し く は serum free
DMEM に epiregulin を加え， mm の cell scraper を用

EGFR を介した細胞の走化性を検討するため，in-vitro

い細胞を剥離した．剥離後直ちに観察する箇所を決定し，研究フロンティア

13

後藤香里

他

(B)
Relative wound repair (%)

80***a, c

*

60
**
40

b24᫬㛫ᚋ48᫬㛫ᚋc20a, b0
db-cAMP+MPA--++epiregulin (1 nM)-+-+(a)

(b)

(c)

(d)

図

EGFR を介した細胞の走化性を検討するため，行した．

wound repair assay を施（A）培養 時間における非脱落膜化細胞，脱落膜化細胞の走化性．
（a）非脱落膜化細胞コントロール，（b）非脱落膜化細胞 epiregulin 添加，（c）脱落膜化細胞コントロール，（d）脱落膜化細胞 epiregulin 添加．
（B）培養 時間における非脱落膜化細胞，脱落膜化細胞の細胞修復率．
＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ．

時間培養を行った．epiregulin 刺激前，刺激後 時間，時間の細胞は Diff-Quic solution（Sysmex）を用いて脱落膜化に伴う homeobox AmRNA の発現染色し，剥離後の細胞修復率は ImageJ，ver. k ．（National Institutesof Health）を用い算出した．ス ク ラ ッ
チされた細胞の走化性について示す（図A）． 時間

脱落膜化に伴う homeobox A （HOXA ）mRNA 発
現について示す．cAMP と MPA の刺激後

日目から非後の細胞において，脱落膜化細胞の修復率は促進し，脱落膜化細胞において発現は増加し， 日目で最も増加

epiregulin 添加によりさらに促進する結果を示した（図する結果を示した．一方脱落膜化細胞では 日目で最も発現が増加し， 日目で減少する傾向を示した（図B）．

14日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.24 2019）．

子宮内膜間質細胞の脱落膜化における Epidermal Growth Factor Receptor を介した細胞機能調節

5**control(fold of control)(HOXA10/GAPDH)

4

db-cAMP (0.5 mM)+ MPA (100 nM)

3****

*

*

*

2100481216(day)図

脱落膜化に伴う HOXA mRNA の発現
子宮内膜間質細胞は 日間 cAMP と MPA を用い脱落膜化を誘導した，子宮内膜間質細胞の脱落膜化に伴う経時的な HOXA の mRNA 発現について検討した．
＊：p＜ ． ，＊＊：p＜ ． , vs. day

加するが，脱落膜化後は発現が減少することでLIFやIL―

おわりにを産生し，STATを活性化させて MMPs を産生し絨毛の浸潤を促す ）ということが報告されている．今回の今回，子宮内膜間質細胞の脱落膜化における EGFR

結果より，HOXA も脱落膜化ならびに MMPs 産生に）脱落膜化細影響を与え，栄養膜細胞の浸潤に関与することが示唆さ

胞において，EGFR の mRNA およびタンパク発現は非れた．VEGF は epiregulin の添加により増加が確認され脱落膜化細胞と比較して増加した．

）脱落膜化細胞になかったが，脱落膜化に伴い発現は増加し血管新生に寄EGFR のリガンドである epiregulinnM を添加したと与すると考える ）.

を介した細胞機能調節について検討し，ころ，IL― および MMP― は発現が増加し，MEK 阻害剤である U

脱落膜の機能変化に関する以前の検討では，protease）activated receptor（PAR）― も cAMP と MPA の刺 激 に細胞走化性は，刺激 時間後の脱落膜化細胞において促より発現が増加し，着床や栄養膜細胞浸潤により起こる進し，epiregulin 添加群でさらに促進した．

）HOXA

微量な出血より誘導されると推測される thrombin がリmRNA 発現は，非脱落膜化細胞において増加した一ガンドとなり PAR― を活性化し，IL― ，MMP― ，MCP―方，脱落膜化細胞は刺激 日目で最も発現が増加したが，を産生すること，細胞走化性が促進されることを報告しを用いた場合，産生は阻害された．

日目で減少する傾向を示した．今回の結果から，分化た ）．EGF フ ァ ミ リ ー のつ で あ る heparin-binding

した脱落膜化細胞では EGFR の発現が増加し，着床期

EGF-like growth factor（HB―EGF）は脱落膜 細 胞 に おの子宮内膜間質細胞や栄養膜細胞で発現する epiregulin

いて発現し，栄養膜細胞の浸潤に関与することが報告さがリガンドとなり，EGFR を活性化し，その下流の ERKれている ）．着床前の増殖期にも PAR― や EGFR の存在/ を活性化した結果，IL― や MMP― の産生を増加は確認されているが ，， ），今回の結果より，脱落膜へと）．着床部位には IL― の分化することで EGFR や PAR― などの受容体発現は増増加により白血球が遊走され，免疫細胞の分布の変化が加し，その増加した受容体は着床時期に発現が増加するおこり，MMP― が増加することで細胞外マトリックスリガンドにより刺激され，妊娠に必要な環境へ推移するを分解，改変し，栄養膜細胞の浸潤に貢献すると考えらと考えられる．

させることが示唆された（図れる．また，脱落膜化細胞において epiregulin 添加後に以上のことより，EGFR はその活性化を介して絨毛細細胞の走化性が促進したことより，栄養膜細胞浸潤によ胞浸潤の受容や組織修復，免疫細胞分布の変化など，妊る脱落膜組織の再構築や修復に関与することも推測され娠成立と維持に向けての機能調節の一旦を担っている可る．HOXA は脱落膜化刺激中，一旦は産生が増加する能性が示唆された．

もののその後低下する傾向を示した．HOXA に関しては子宮内膜間質細胞において，脱落膜化に伴い発現が増研究フロンティア

15

後藤香里他

EmbryoBlood vessel
Epithelial cells
Stromal cellsIL-1βepiregulin

Decidual cells

HCG

EGFR
Ovary
P4↑

HCG

EGFR

ERK1/2cAMP↑

Cytokeleton

PGE2
MMP3↑
COX2↑
IL-1β図pIL-8പ݄‫ࡋځ‬๖༣ૺʀ໖Ӻࡋ๖෾ා͹รԿ

MMP-1

ECM෾մʀրร
ࡋ๖ૺԿ੓

VEGF

݄؇৿ਫ਼

HOXA10 ↓Disruption

ECM
Degradation

脱落膜化細胞における EGFR の役割分化した脱落膜化細胞は EGFR の発現が増加し，着床時期に子宮内膜間質細胞に発現する epiregulin や栄養膜細胞からの epiregulin がリガンドとなり，EGFR が活性化する．EGFR が活性化することで ERK / を活性化し，IL― や MMP― が産生される．HOXA も脱落膜化ならびに MMPs 産生に影響を与えると考えられる．
VEGF もまた，血管新生に寄与すると考えられる．

謝辞

本稿は，平成 年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．本稿を執筆す
る機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事
長 緒方勤教授，第 回学術集会会長 楢原久司教授，ならびに本誌編集委員の先生方に心から感謝申し上げます．

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