REVIEW

ゲノム編集技術と生殖医学研究への応用大浦 聖矢 ，），伊川 正人 ，））大阪大学薬学研究科創成薬学専攻遺伝子機能解析学分野）大阪大学微生物研究所遺伝子機能解析分野

研究において果たす役割を，私たちの研究成果と今後のはじめに展望を交えて紹介したい．
マウスは生活環が比較的短く（妊娠期間は約 日間，性成熟は雄では約週間，雌では約週間），古くから体外受精や胚操作などの生殖工学技術も確立されるな

単純遺伝子破壊による精巣特異的発現遺伝子の網羅的機能解析

ど，生殖医療研究に適した実験動物である．
ゲノムの ％がヒトでも保存されていることや，遺伝子改変のノウハ

CRISPR/Cas システムを使用することで，容易に遺ウが蓄積されていることもあり，マウスは現在最も有用伝子を破壊できる現在，ノックアウトマウスを用いた必なモデル動物の須遺伝子の網羅的機能解析が現実のものとなりつつあつとなっている．

生命現象の解明において，遺伝子ノックアウト（KO）る．われわれは精巣特異的な発現がみられる遺伝子をマウスが果たしてきた役割は計り知れない．生殖研究に次々に欠損させることで，妊孕性に関わる遺伝子の同定限っても，数百の遺伝子が生殖能力に関わることが示さを試み，不妊の表現型を示す遺伝子を同定してきた．これてきた［れらについて詳細な表現型解析を行うことで，精子形成］．また，KO マウス実験は生殖巣特異的）生殖器はや受精の機構を明らかにし，避妊や不妊治療への橋渡し個体の生存に必須ではないため，条件付き KO にする必研究を進めることができる［ ， ］．一方で，精巣特異要がない．加えて，（的に発現しているにもかかわらず，KO しても正常に次遺伝子の機能解析と相性が良い．まず，（）交配試験で生殖に必須か否かを簡便に調べることができ，（）不妊であることが判世代が得られる遺伝子が，約割（ 遺伝子中 遺伝子）明すれば，生殖工学技術を用いて詳細な表現型解析を行もあった［

える．しかし，KO マウスの作製は年単位の時間と労力式のみから，その遺伝子機能の重要性を推測することはを要するもので，敷居の高い実験であった．さらに，コ

難しく，必須遺伝子の網羅的解析には，KO マウスを用スト，技術・設備などの問題で，KO マウス実験の恩恵いた個体レベルでのスクリーニングが有効であることをを受けられるのは一部の研究者に限られていた［示している．

］．

］．この結果は臓器特異的な遺伝子発現様

この状況を一変させたのが，遺伝子改変技術の革命と

ただし，この解析手法では，機能補完する遺伝子が存呼ぶべきゲノム編集ツール，とくに，CRISPR/Cas の在する場合には解析が難しい．例えば，同時期に骨格筋到来である（図）．CRISPR/Cas を用いた受精卵ゲノ前駆細胞で発現する転写因子の MyoD と Myf は，それカ月で KOぞれの単一 KO マウスでは骨格筋の異常は観察されない］．さらに，その［ ， ］が，両者を同時に欠失したダブル KO マウスはム編集により，標的遺伝子の選定から最短マウスを作製できるようになった［システムの簡明さ（標的配列を認識するガイド RNA と骨格筋形成異常を示すことがわかっている［切断する CAS タンパク質を導入するだけでよい．両者

ように，同時期に発現し機能が重複する場合や，相同遺は市販されているし，プラスミドから発現させることも伝子が存在する場合には，機能補完を避けるために複数できる）も相まって，KO マウス実験は多くの研究者にの遺伝子をまとめて欠損させる必要がある．従来の遺伝とって身近なものになった．本稿ではゲノム編集が生殖子ターゲティング法では，同時に複数の遺伝子を欠損さ］．このせるのは困難であり，それぞれの KO マウスを作製して連絡先：伊川正人，大阪大学微生物研究所遺伝子機能解析分野〒 ―大阪府吹田市山田丘 ―TEL ： ――
FAX： ――
E-mail：ikawa@biken.osaka-u.ac.jp

交配を重ねる必要があるため，膨大な時間とコストを要した．一方，CRISPR/Cas システムでは複数個所に一度で変異を導入できる［］ため，機能が他と重複する遺伝子をまとめて簡単に解析できる．

日本生殖内分泌学会雑誌（2017）22 : 5-85大浦聖矢

他

a.

PAM㓄ิ5’

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

NGG

3’5’3’gRNA
Cas9b.

6HU &\V /HX ,OH3UR c. 6HU &\V /HX ,OH3UR d.
$*7 7*7 &7$ $77 &&7$*7 7*7 &7$ $77 &&71 . D SB

図㑇ఏᏊX

2 . D SB + s s D N A$*7 7*7 7$$ 77& &7$$*7 7*7 *7$ $77 &&76HU &\V VWRS

6HU &\V 9DO ,OH3UR

㑇ఏᏊᶵ⬟ゎᯒ䝰䝕䝹ື≀సᡂ㑇ఏᏊ἞⒪3.DSB + dsDNA㑇ఏᏊX GFP䛺䛹ᒁᅾゎᯒ/┦஫స⏝ゎᯒ䝍䞁䝟䜽㉁⢭〇（་⸆ရ 䛺䛹）

CRISPR/Cas システムの原理とその使用例
Ａ．gRNA が標的配列の元へ Cas ヌクレアーゼを誘導する．ゲノム編集でよく使用される spCas の場合，gRNA の認識配列は NGG の直前 塩基でなければならない．ヒトやマウスゲノム上において 塩基が一致する配列は，理論的に ヵ所しか存在しないため，特異的な切断が期待できる．
Ｂ．Cas による標的配列切断後，細胞は DNA 修復を試みるが，数塩基の欠損や挿入が生じてしまう．このエラーにより読み枠がずれると正しいタンパク質が作られなくなる．
Ｃ．標的配列付近と相同性の高い DNA が存在すると，細胞はその DNA を参照して切断部位の修復を試みる．したがって，相同 DNA 内の一部を置換しておくと，その置換がゲノムに組みこまれる．
Ｄ．C と同一の原理により，GFP や GST といったタグを遺伝子近傍（内部）に挿入することで，細胞に融合タンパク質を作らせることもできる．この場合，挿入したい DNA 断片の上流・下流に相同領域をもたせる必要がある．

マウスにおいては， ， 以上の遺伝子が精巣特異的融合に必須な因子として同定されたが，IZUMO 内のそに発現することが知られており［ ］，精子形成や受精れぞれのドメインの詳細な機能は不明な点も多かった．に何らかの役割を果たしていると予測されるが，実際になかでも，細胞質側ドメインは精子成熟の過程でリン酸妊孕性に関わるか否か明確になっているものは少ない．

基修飾を受けることが示唆されている［ ］．前述のとCRISPR/Cas システムを用いた個体レベルでの遺伝子

おり ssODN を利用し，チミン（T）一塩基を Izumo1遺機能の網羅的解析により，この判然としない状況が打破伝子座内に挿入した．これにより，タンパク質コード領されると期待している．

域内に終始コドンが導入され，細胞質ドメインのみを欠損させることができた．このような緻密な遺伝子改変が緻密な遺伝子改変効率よく行える（得られた匹の産仔中匹が目的の変異を有していた）のは，CRISPR/Cas システムならでCRISPR/Cas システムの適用は単純な遺伝破壊にとはである．得られた IZUMO 細胞質ドメイン欠失マウ

どまらない．相同配列を有する DNA 断片（点変異や短スの生殖能力を調べるべく，自然交配での産仔数と IVF

断片挿入には ssODN，長断片挿入には dsDNA）を同時での融合率を解析したところ，両者とも野生型と同程度に導入することで，相同配列依存性修復，外来 DNA をであった．このことから，IZUMO の細胞質ドメインは狙った場所に挿入する（KI）ことができる．われわれマウスの生殖能力に必須ではないことが示唆された．

は標的 DNA 切断と ssODN を利用して，Izumo1遺伝子

ここに紹介したように CRISPR/Cas システムは，ま座内に点変異を導入することに成功した［ ］．IZUMO

さしく文章を編集するかのごとくゲノム遺伝子配列を書は精子頭部に局在する I 型の膜タンパク質で，卵子とのき換えることを可能にした．この緻密な遺伝子改変は，

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日本生殖内分泌学会雑誌 Vol.22 2017

ゲノム編集技術と生殖医学研究への応用

PITChἲ

HITIἲ
gRNA1

3H2OPἲ
gRNA1

gRNA2

gRNA1

Mouse gene XgRNA3

gRNA3

gRNA2

GFP

Human gene X

GFP䝥䝷䝇䝭䝗gRNA1

䝥䝷䝇䝭䝗MMEJ

ேᕤᰁⰍయ

NHEJ
ssODN1

図ssODN2KI 効率向上のさまざまな試み
PITCh 法： 〜 塩基程度の相同領域を利用して，外来 DNA をゲノムに挿入する．ゲノム内の標的配列，挿入配列の上流・下流のヵ所に gRNA を設計する必要がある．
HITI 法：ゲノムとプラスミドを切断し，非相同末端連結を介してそれぞれを結合する．gRNA は一種類のみを準備する．正向きに断片が挿入されると gRNA に再び認識され切断されるが，逆向きに挿入されるとそれ以上切断されない．
H OP 法：プラスミドに搭載できないサイズの DNA でもゲノムに組み込むことができる．例えば，マウスの遺伝子の上流・下流，ヒト遺伝子を搭載した人工染色体の ヵ所に gRNA を設計する．ゲノムと人工染色体の連結部分を橋渡しする ssODN が つ必要である．

部位を跨いで相同性を有する ssODNA を同時に受精卵

生命科学の加速器になると確信している．

へ導入することで，数外来遺伝子導入効率向上の試み

kbp の KI を可能にする H OP法を開発した［ ］．同法により，ヒト遺伝子座を搭載した人工染色体を対応するマウスの遺伝子座と置換し，前述のとおり，相同組み換えを利用したゲノムへの外来 DNA 導入手法は KI 動物作製に効果的である．しかコードされるタンパク質だけでなく遺伝子発現調節を含めたヒト化モデルマウスが現実のものとなった．

し，目的とする遺伝子改変，対象とする細胞・動物種によっては，改善の余地があり，さまざまなグループから効率向上の術が報告されている（図その他の活用法）．
end

ゲノム編集は，単純な遺伝子破壊に加え，点変異や数joining（MMEJ； ― bp の相同領域に依存した DNA 修

例 え ば，Nakade ら は microhomology-mediatedkbp に及ぶ外来遺伝子の導入，また染色体転座［ ，復機構）を利用することで，外来 DNA をゲノムに挿入］など，一塩基レベルから染色体レベルまで任意の遺する PITCh 法を開発した［ ］．また，Suzuki らは，non伝子改変が可能である．さらに，本稿では詳細に紹介し-homologous end joining（NHEJ）を利用した HITI 法をなかったが，DNA 切断活性を失った dCas を用いて，報告した［ ］． MMEJ は相同組み換え効率の低い細胞，ゲノムではなくエピゲノムを編集する［ ， ］ことや，HITI 法は生体内の非分裂細胞においても KI 可能なこと切断を伴わずにゲノムを書き換える［ ］ことが可能とが示されている．Suzuki らは，HITI 法により非増殖性なりつつある．また，CRISPR/Cas システムと光工学の網膜細胞に応用していたが，成人では分裂しないセル［ ］や植物のホルモン［ ］といったゲノム工学を超トリ細胞などの生殖研究への応用も，今後期待される．

えた異分野との融合も活発に進められるなど，その勢いこれまでに紹介した相同組み換え法（前章）や PITCh法，HITI 法は化学合成可能なはとどまるところを知らない．

塩基以下の ssODN やプラスミドを利用した手法であるため，非翻訳領域を含おわりにめた遺伝子全体といった数 kbp を超える外来 DNA をゲノムに挿入することはできない．Yoshimi らは，連結近年，ゲノムワイド関連（Genome Wide Association

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大浦聖矢他

Study ; GWAS）
解析により，ヒトの疾患に関連する SNPが次々と同定されつつある［ ， ］．患者で見つかった変異をモデル動物に導入して，その因果関係を明らかにするようなアプローチが，生殖を含めた医学・生命科学研究において定法となるであろう．基礎研究にとどまらず，臨床研究・創薬への橋渡しが期待されており，倫理的・法的懸念に対応したゲノム医療への展開が期待される．

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