Istruzioni per l'uso

LymphoTrack Dx Software – MiSeq Versione 2.4.3®

TM

Il presente pacchetto software viene fornito con ogni LymphoTrack Dx Assay per l’analisi di file FASTQ grezzi con lo strumento
Illumina MiSeq. Il software si compone di tre parti distinte: l’applicazione Data Analysis LymphoTrack, un plugin LymphoTrack
Reporter che viene eseguito automaticamente dopo l’analisi e un metodo opzionale di visualizzazione LymphoTrack costituito daquattro fogli di calcolo Microsoft Excel® .xlsm. Il software viene eseguito su piattaforme Microsoft Windows® supportate.
Il pacchetto software permette di eseguire analisi di clonalità di dati di target singoli o multipli (IGHV Leader (o “Leader”), IGH
FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB o TRG) e inoltre fornisce lo stato di ipermutazione somatica dei campioni analizzati con i saggi
Leader o IGH FR1.
Per uso diagnostico in vitro.

Compatibilità del prodotto
Il LymphoTrack Dx Software – MiSeq (è stato specificamente sviluppato:
N. di catalogo

95000009) è compatibile esclusivamente con i seguenti saggi Invivoscribe, per i quali

Descrizione

91210059

LymphoTrack Dx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Kit A - MiSeq

00850052003814

91210069

LymphoTrack Dx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Panel - MiSeq

00850052003821

91210009

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay Kit A – MiSeq

00850052003647

91210039

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay Panel – MiSeq

00850052003654

91210089

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay Kit A – MiSeq

00850052003838

91210099

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay Panel – MiSeq

00850052003845

91210109

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay Kit A – MiSeq

00850052003852

91210119

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay Panel – MiSeq

00850052003869

91210129

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay Kit A – MiSeq

00850052003876

91210139

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay Panel – MiSeq

00850052003883

91220009

LymphoTrack Dx IGK Assay Kit A – MiSeq

00850052003906

91220019

LymphoTrack Dx IGK Assay Panel – MiSeq

00850052003913

92270019

LymphoTrack Dx TRG Kit A – MiSeq

00850052003678

92270009

LymphoTrack Dx TRG Panel – MiSeq

00850052003661

92250009

LymphoTrack Dx TRB Kit A – MiSeq

00850052003937

92250019

LymphoTrack Dx TRB Panel – MiSeq

00850052003944

95000009

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Destinazione d’uso
Il pacchetto LymphoTrack Dx Software – MiSeq è progettato per essere utilizzato per l’analisi di dati bioinformatici
e la visualizzazione di file FASTQ grezzi generati dallo strumento Illumina MiSeq quando impiegato con LymphoTrack Dx Assay.

Requisiti minimi di sistemaProcessore: consigliato CPU Intel Core 2 Duo o più recente.

Disco rigido: sono richiesti almeno 80 GB di spazio rigido su disco; consigliati 250 GB.



RAM: sono richiesti 4 GB; consigliati 8 GB o più.



Sistema operativo: è richiesto Windows 10 (64 bit).

Java 8 per sistemi operativi a 64 bit (Java configurato per sistemi operativi a 32 bit non è compatibile con il LymphoTrack
Dx Software – MiSeq). La versione più recente di Java può essere scaricata direttamente da Oracle sul sito
http://www.java.com/.

Un lettore *.pdf, quale Adobe Acrobat Reader, per visualizzare i report dei dati generati da LymphoTrack Reporter.

Per la visualizzazione di dati è richiesto Microsoft Office Excel 2007, 2010 o 2013 con supporto macro abilitato.

Un’unità CD-ROM.



Il LymphoTrack Dx Software – MiSeq v2.4.3 è stato validato per l’uso con Windows 10 configurato per la lingua inglese(Stati Uniti) e con le impostazioni predefinite delle dimensioni di visualizzazione, e con Microsoft Excel 2007/2010/2013
per la visualizzazione alternativa dei dati. Altre versioni di Windows/Excel e/o impostazioni di lingua/dimensioni
di visualizzazione diverse potrebbero non essere compatibili.

Avvertenze e precauzioni












Dimensioni dello schermo predefinite. La risoluzione ottimale dello schermo per il LymphoTrack Dx Software – MiSeq
è 100%. L’aumento delle dimensioni predefinite dello schermo del proprio monitor oltre il 100% può influire sulla
visualizzazione dei campi di testo nell’interfaccia utente.
Tipo di carattere del sistema. L’interfaccia utente è progettata per utilizzare le impostazioni predefinite del tipo dicarattere del sistema su un computer Windows configurato per la lingua inglese (Stati Uniti). Eventuali modifiche alle
impostazioni del tipo di carattere del sistema o l’utilizzo di una lingua diversa dall’inglese (Stati Uniti) possono influire sulla
visualizzazione dei campi di testo nell’interfaccia utente.
File compatibili. Il LymphoTrack Dx Software – MiSeq è compatibile con i file fastq.gz generati dal software MiSeq
Reporter. Il LymphoTrack Dx Software – MiSeq non è compatibile con i file *.fastq.gz generati dal software Bcl2fastq.
Trimming dell’adattatore. È necessario selezionare l’opzione di trimming dell’adattatore  durante la creazione di fogli
campioni MiSeq, in questo modo per i file fastq.gz generati che ne derivano l’adattatore risulta sottoposto a trimming.
Impostazioni di sospensione o ibernazione. Considerare la disabilitazione delle funzionalità della modalità di sospensione
e/o sospensione o ibernazione prima di eseguire l’applicazione Data Analysis LymphoTrack Dx. Se il computer passa alla
modalità sospensione o ibernazione, il software si potrebbe arrestare.
Caratteri in nomi di percorsi e di file. 1) Evitare spazi nei percorsi di file di dati o del software (i percorsi includono cartelledi file e nomi di file) e non è consentito più di uno spazio consecutivo. 2) È importante che i nomi dei file contengano solo
i seguenti caratteri (A-Z, a-z, 0-9, ., - (trattino)). Se il software trova un carattere diverso da quelli indicati, potrebbe
verificarsi un errore. Accertarsi che venga seguita questa nomenclatura per la denominazione dei campioni quando si
imposta il foglio campioni per MiSeq. 3) Un nome di percorso non deve superare 255 caratteri. Nomi di campioni che
determinano la creazione di nomi di file prossimi a questo limite sono difficili da copiare in altre posizioni.
I campioni duplicati devono avere un nome del campione univoco. Quando si denominano i campioni, assegnare a ogni
campione un nome e un identificatore univoco. Se si analizzano campioni duplicati, è possibile utilizzare i seguenti nomi:“Campione1a” e “Campione1b”. La mancata assegnazione di nomi univoci a campioni che saranno analizzati
contemporaneamente sulla stessa cella a flusso farà sì che, durante il processo di analisi, venga analizzato solo un
campione dal software.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Installazione del software
1.1.
1.2.

Copiare l’archivio LymphoTrackDxMiSeq2.4.3.zip dal CD del software su un’unità locale sul proprio computer.
Installare il software esclusivamente su un’unità locale e non su un’unità di rete. Se eseguito attraverso una
connessione di rete, il software potrebbe non funzionare correttamente.
Estrarre il file di archivio che era stato copiato sul computer locale nel passaggio precedente. Questa operazione
in genere può essere eseguita facendo clic sul file con il pulsante destro del mouse e selezionando Extract All(Estrai tutto) nel menu contestuale.
Dopo l’estrazione dell’archivio viene creata una cartella denominata LymphoTrackDxMiSeq2.4.3.

Esecuzione dell’applicazione Data Analysis
2.1.
2.2.

2.3.
2.4.
2.5.
2.6.

Identificare i file *.fastq.gz da analizzare con estremità accoppiate e con trimming dell’adattatore. Questi file si
trovano all’interno della cartella di esecuzione MiSeq e si tratta dei file *.fastq.gz che verranno utilizzati come input
per l’applicazione Data Analysis LymphoTrackDxMiSeq. I file Undetermined_*.fastq.gz non sono necessari per l’analisi.
Copiare i file *.fastq.gz indicati in precedenza in una cartella vuota sul computer. Scaricare questi file sullo stesso
computer locale su cui è stato installato il LymphoTrack Dx Software. L’unità contenente questa cartella richiedealmeno 80 GB di spazio disponibile. Questa cartella sarà la <input_folder> (<cartella_input>) per il softwaremenzionata di seguito.
Fare doppio clic sul file startLymphoTrackDxMiSeq che si trova nella cartella LymphoTrackDxMiSeq2.4.3 copiata sul
computer durante l’installazione.
Leggere il contratto di licenza. Se si accettano i termini, fare clic sul pulsante Accept (Accetta) per continuare.
Contrassegnare la modalità di analisi desiderata dalle opzioni della casella di spunta Choose analysis mode(s)(Scegli modalità di analisi). La modalità di analisi deve corrispondere alla tipologia di dati utilizzati durantel’esecuzione (Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e/o TRG).
Selezionare la notazione del separatore decimale desiderata nelle opzioni Choose decimal mark (Scegli separatore
decimale). Questa opzione influisce sull’uso successivo della macro di visualizzazione dei dati di Microsoft Exceled è un parametro richiesto. Le opzioni possibili per il separatore decimale sono il punto decimale (“.”) o la virgoladecimale (“,”).
IMPORTANTE!

Separatore decimale. Per determinare quale opzione scegliere, aprire un nuovo foglio di lavoro
Excel e digitare =10000 nella cella A1. Fare clic su questa cella con il pulsante destro del mousee selezionare Format Cells (Formato celle).
 Nella scheda Number (Numero), cercare l’elenco Category (Categoria) e selezionare
Number (Numero). A destra, il valore Decimal places (Cifre decimali) è impostato su 2.
 Sotto questo valore è presente la casella di spunta Use 1000 Separator (Usa separatoredelle migliaia). Selezionare questa casella e cercare il numero del campione sopra riportatoche conterrà il numero originale immesso, formattato in base alle impostazioni predefinite
di Excel per un numero con separatore decimale.
 Se questo numero appare come “10,000.00”, selezionare l’opzione decimal point(punto decimale). Se questo numero appare come “10.000,00”, selezionare l’opzione
decimal comma (virgola decimale).

2.7.

Fare clic sul pulsante “Browse (Sfoglia) per scegliere una cartella di input. Questa cartella è la <input_folder>menzionata sopra e contiene i file che si desidera analizzare. Quando viene selezionata, la cartella di input apparirà
vuota.
IMPORTANTE!

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

La <input_folder> selezionata non deve contenere file che presentino lostesso nome dellacartella di input. Se il programma viene eseguito con un campione che condivide lo stesso
nome della cartella indicata come input per leanalisi, il programma si bloccherà e il tempo diesecuzione dell'analisi aumenterà in modo significativo (ovvero, saranno necessari 30 minuti
per elaborare un piccolo campione che impiega secondi per elaborare normalmente).

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Dopo aver selezionato <input_folder> e la modalità di analisi desiderata, fare clic sul pulsante Launch Program (Avvia
programma).

2.8.

IMPORTANTE!

2.9.

L’<input_folder> selezionata deve contenere soltanto file *.fastq o *.fastq.gz. Se non è
presente nessuno di questi tipi di file né una combinazione di questi tipi di file, il programma
visualizzerà un messaggio di errore e chiederà all’utente di scegliere un’altra cartella. Se i file*.fastq vengono generati da Bcl2fastq (i nomi dei file contengono la sequenza di codici a barre
anziché la nomenclatura “S1, S2, S3” ecc.), il programma visualizzerà un messaggio di errore echiederà all’utente di eseguire nuovamente l’analisi dei dati utilizzando il software MiSeq
Reporter.

Stato dell’analisi. Dopo aver fatto clic sul pulsante Launch Program (Avvia programma), verrà visualizzata la finestra
principale del programma con lo stato del programma. Quando il programma conclude l’analisi dei file di dati diinput, la finestra principale del programma visualizza il messaggio Analysis is complete… (Analisi completata...)mostrando la posizione della cartella di output e chiede all’utente di aprire il foglio di calcolo Data Visualization(Visualizzazione dati) di Excel appropriato. Dalla finestra principale del programma può essere avviata una nuova
analisi non appena quella precedente è stata completata.
IMPORTANTE!

Durata dell’analisi. Il tempo necessario per l’esecuzione del programma dipende dalle
dimensioni e dal numero di campioni da analizzare, nonché dalla modalità di analisi e dalla
configurazione hardware del computer. Una distribuzione tipica di read per una corsa di
24 campioni è compresa tra 200.000 e 1 milione di read per campione. Questi numeri
potrebbero cambiare con le versioni future della piattaforma MiSeq.
Il completamento dell’analisi di un singolo campione IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3,
IGK, TRB o TRG tipico richiede circa 1-2 minuti. Il completamento di una tipica corsa di 24
campioni solo Leader, solo IGH FR1, solo IGH FR2, solo IGH FR3, solo IGK, solo TRB o solo TRG
richiede circa 25-50 minuti. Nel caso di una tipica corsa di 24 campioni combinati Leader, IGH
FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e/o TRG la durata dell’analisi va moltiplicata per il numero ditarget da analizzare.

2.10.

Cartella/e di output. In base alla modalità di analisi prescelta, verranno create una o più cartelle di output
nell’<input_folder> (<cartella_input>) contenente i file di origine *.fastq o *.fastq.gz. La Tabella 1 indica
il rapporto tra la modalità di analisi e il nome delle cartelle di output.
Tabella 1. Nome della cartella di output in base alla modalità di analisi

2.11.

Modalità di analisi

Nome delle cartelle di output

LeaderLEADER_output (output_LEADER)

IGH FR1

IGH_FR1_output (output_IGH_FR1)

IGH FR2

IGH_FR2_output (output_IGH_FR2)

IGH FR3

IGH_FR3_output (output_IGH_FR3)

TRB

TRB_output (output_TRB)

TRG

TRG_output (output_TRG)

IGK

IGK_output (output_IGK)

Qualsiasi combinazione di:Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3,
IGK, TRB e TRG

Da due a sette cartelle di output indicate sopra

Al termine di un’analisi eseguita correttamente da parte del programma, la cartella di output conterrà diversi file*.tsv e un file *.pdf per ciascun campione elaborato. Si noti che l’asterisco “*” nelle tabelle di seguito rappresenta ilnome del campione così come immesso nel foglio campioni, seguito da informazioni specifiche sulla piattaforma(ad es. samplename_S1_L001_001_combined).

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2.12.

Per le analisi Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB e IGK consultare la Tabella 2 per le descrizioni dei nove file forniti
per ciascun campione.

Tabella 2. Descrizione dei file di output IGH, TRB e IGK

Analisi di Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB e IGK*.fastq_read_summary.tsv(*.fastq_riepilogo_read.tsv)

Contiene un elenco delle 200 sequenze uniche più abbondanti, ordinate per conta (numero di read),
con indicazione di:
A quale evento di ricombinazione V – J si adatta meglio ogni sequenza
Lunghezza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totaliIn che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%)(IGH/IGK e TRB)
Sequenza CDR3 putativa
Per Leader e IGH FR1 indica anche:
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)
Per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a (Sì/No/n/d)). Se, a causa dellaqualità dell’allineamento, non può essere previsto l’uso del segmento genico V o J, il
software non sarà in grado di prevedere se il gene è in frame e il risultato sarà n/a (n/d).
Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N (Sì/No)).
Quando non può essere fatta una previsione in frame, non è possibile prevedere conprecisione se è presente un codone di stop.

*.fastq_read_summary_merged_top10_
searchtop500.tsv(*.fastq_riepilogo_read_10piùabbondanti_sotto
posteamerging_ cerca500piùabbondanti.tsv)*.fastq_unique_reads.tsv(*.fastq_read_uniche.tsv)

Stesso formato del file read_summary (riepilogo_read), ma contiene solo le 10 read più abbondanti
dell’elenco read_summary (riepilogo_read) sottoposte a merging con le read incluse nell’elencodelle 500 più abbondanti. Viene eseguita un’operazione di merging tra due read se la differenza tradi esse è di soli 1 o 2 nucleotidi (nt); in tal caso, la read che presenta la conta maggiore mantiene lasua identità di sequenza, mentre la read con la conta minore viene aggiunta alla maggiore.
File *.fasta di sequenze uniche, ordinate per conta.

*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv(*.fastq_CDR3_read_uniche.tsv)

File *.fasta di sequenze CDR3 putative trovate nel file ‘*.fastq_unique_reads’ (‘*.fastq_read_uniche).

*.fastq_VJ_sequence_frequency_family. tsv(*.fastq_VJ_sequenza_frequenza_famiglia. tsv)

Ogni famiglia è un raggruppamento di tutte le possibili ricombinazioni trovate in una determinata
regione V o J, come una famiglia V1 o una famiglia J4. Nell’ambito della famiglia V1 è possibile trovare
qualsiasi numero di ricombinazioni, come ad esempio V1-69 e V1-8. Questo file contiene un elenco ditutte le possibili ricombinazioni famiglia V – famiglia J per ognuna delle quali è riportato un elenco
ordinato delle read (dalla % più alta a quella più bassa). Questo file viene utilizzato al meglio in un
grafico di tipo “impilato” in Excel.

*.fastq_read_summary_family.tsv(*.fastq_riepilogo_read_famiglia.tsv)

Contiene un elenco delle sequenze uniche, ordinate per conta, con indicazione di:
A quale evento di ricombinazione gruppo V – J si adatta meglio ogni sequenza
Lunghezza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totaliIn che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%)(IGH/IGK)
Sequenza CDR3 putativa
Per Leader e IGH FR1 indica anche:
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)
Per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a (Sì/No/n/d))Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N (Sì/No))*.fastq_VJ_usage.tsv (*.fastq_VJ_uso.tsv)*.fastq_VJ_usage_family.tsv(*.fastq_VJ_uso_famiglia.tsv)

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

Matrice delle conte e delle % dei diversi eventi di ricombinazione V-J.
Matrice delle conte e delle % dei diversi eventi di ricombinazione famiglia V – famiglia J.

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Tabella 2. Descrizione dei file di output IGH, TRB e IGK

Analisi di Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB e IGK*<timestamp>.pdf (*<timestamp>.pdf)

Nota:
Nota:
Nota:

Il report *.pdf generato da LymphoTrack Reporter contiene informazioni simili al file “Merged Read
Summary” (Riepilogo delle read sottoposte a merging), al file “Read Summary” (Riepilogo delle read),
un grafico “V – J’ usage” (Uso di V-J) e un grafico “V – J sequence frequency” (Frequenza delle
sequenze V-J). Per maggiori informazioni consultare la sezione 3 Visualizzazione dei dati mediante
LymphoTrack Reporter (automatizzata, raccomandata).

l’analisi di IGK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).
l’analisi di TRB include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus TRB coinvolti in ricombinazioni della regione D – J.
la "Putative CDR3 sequence" (sequenza CDR3 putativa) viene determinata mediante il confronto con un’esatta definizione di una sequenza CDR3.
Qualsiasi mutazione di punti di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).

 Per l’analisi di TRG, consultare la Tabella 3 per le descrizioni dei sette file forniti per ciascun campione.
Tabella 3. Descrizione dei file di output TRG.
Analisi di TRG*.fastq_read_summary.tsv(*.fastq_riepilogo_read.tsv)*.fastq_read_summary_merged_top10_s
earchtop500.tsv (*.fastq_riepilogo_read_10piùabbondanti_sottopostea merging_cerca500piùabbondanti.tsv)*.fastq_unique_reads.tsv(*.fastq_read_uniche.tsv)*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv(*.fastq_CDR3_read_uniche.tsv)

Un elenco delle sequenze uniche, ordinate per conta, con indicazione di:
A quale evento di ricombinazione V – J si adatta meglio ogni sequenza
Lunghezza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totaliSequenza CDR3 putativa
Stesso formato del file read_summary (riepilogo_read), ma contiene solo le 10 read più abbondanti
dell’elenco read_summary (riepilogo_read) sottoposte a merging con le read incluse nell’elenco delle 500
più abbondanti. Viene eseguita un’operazione di merging tra due read se la differenza tra di esse è di sole1 o 2 nt; in tal caso, la read che presenta la conta maggiore mantiene la sua identità di sequenza, mentre laread con la conta minore viene aggiunta alla maggiore.
File *.fasta di sequenze uniche, ordinate per conta.
Un file *.fasta di sequenze CDR3 putative trovato nel file *.fastq_unique_reads (*.fastq_read_uniche).

*.fastq_VJ_sequence_frequency.tsv(*.fastq_VJ_frequenza_sequenza.tsv)

Un elenco di tutte le possibili ricombinazioni V-J per ognuna delle quali è riportato un elenco ordinato delle
read (dalla % più alta a quella più bassa). Il primo numero indica quale % di read totali rappresenta la primaread unica rispetto a tutte le read sequenziate. Questo file viene utilizzato al meglio in un grafico di tipo
“impilato” in Excel.

*.fastq_VJ_usage.tsv (*.fastq_VJ_uso.tsv)

Matrice delle conte e delle % dei diversi eventi di ricombinazione V-J.

*<timestamp>.pdf (*<timestamp>.pdf)

Il report *.pdf generato da LymphoTrack Reporter contiene informazioni simili al file “Merged Read
Summary” (Riepilogo delle read sottoposte a merging), al file “Read Summary” (Riepilogo delle read), un
grafico “VJ Usage” (Uso di VJ) e un grafico “VJ Sequence Frequency” (Frequenza della sequenza VJ). Per
maggiori informazioni consultare la sezione 3 Visualizzazione dei dati mediante LymphoTrack Reporter(automatizzata, raccomandata).

Nota:

2.13.

la "Putative CDR3 sequence" (sequenza CDR3 putativa) viene determinata mediante il confronto con un’esatta definizione di una sequenza CDR3.
Qualsiasi mutazione di punti di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).

La cartella o le cartelle di output contengono report in formato *.pdf e file di dati di output in formato *.tsv. I file *.tsv
possono essere utilizzati come file sorgente per il foglio o i fogli di calcolo per la visualizzazione dei dati.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Visualizzazione dei dati mediante LymphoTrack Reporter (automatizzata,raccomandata)
3.1.

Al completamento dell’analisi viene automaticamente generato un report *.pdf per ogni campione. Il report prende
il nome del campione presente nel foglio campioni, seguito da informazioni specifiche della piattaforma e termina
con l’indicazione di data e ora (GGMMAAhhmmss).
IMPORTANTE!

3.2.

3.3.

Prestare attenzione durante il salvataggio del report *.pdf: in base al programma utilizzato peraprire il *.pdf, una o più colonne possono essere modificate. NON eseguire alcuna modifica innessuna parte del PDF. Qualora si sospetti che sia stata apportata una modifica, NON salvare il*.pdf. Qualora si sospetti che sia stata salvata una modifica, eseguire nuovamente l’analisi per
generare un nuovo report PDF.

La prima pagina del report PDF contiene un valore Index Q30 (Q30 dell’indice). Questo valore viene calcolato comepercentuale di basi con un punteggio qualitativo pari a 30 o maggiore, ma solo quelle derivanti dalle read assegnatea un’indice dopo l’operazione di trimming. Questo valore può essere utilizzato per verificare se l’indice ha superatole specifiche standard di Illumina. In alcuni casi, il punteggio Q30 della corsa fornito dal sistema di sequenziamento
sottovaluterà la qualità di una corsa a causa del conteggio di sequenze indeterminate e regioni non sottoposte atrimming con il punteggio Q30. Regioni indeterminate e non sottoposte a trimming sono solitamente di qualitàinferiore e non contribuiscono all’analisi a valle eseguita con LymphoTrack.
La prima pagina del report PDF contiene una tabella dei risultati del Merged read summary (Riepilogo delle readsottoposte a merging), seguita dai grafici dei risultati di V – J Sequence Frequency (Frequenza della sequenza V – J)e V – J Usage (Uso di V – J) mentre le restanti pagine contengono una tabella dei risultati del Read summary(Riepilogo delle read) relativi alle read non sottoposte a merging. Il contenuto di questi elementi è descritto
in dettaglio nella Tabella 4:

Tabella 4. Descrizione del contenuto del report in formato *.pdf.

*.pdf generato da LymphoTrack Reporter

Read Summary (Riepilogo delle read)Contiene un elenco delle 200 sequenze uniche più abbondanti, ordinate per conta, con indicazionedi:•A quale evento di ricombinazione V – J si adatta meglio ogni sequenzaoSequenzaoLunghezza della sequenzao% effettiva delle read totali•% cumulativa delle read totali indicata per le 200 read più abbondantioIn che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%)(IGH/IGK)o
Sequenza CDR3 putativa
Per Leader e IGH FR1 indica anche:•
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)

Per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:•
Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a (Sì/No/n/d)). Se, a causa dellaqualità dell’allineamento, non può essere previsto l’uso del segmento genico V o J,
il software non sarà in grado di prevedere se il gene è in frame e il risultato sarà n/a (n/d).
Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N (Sì/No)). Quando non può
essere fatta una previsione in frame, non è possibile prevedere con precisione se è presente uncodone di stop.
Merged Read Summary (Riepilogo delle readsottoposte a merging)

Stesso formato del foglio di lavoro Read Summary (Riepilogo delle read), ma relativo alle sole 10
read più abbondanti dopo merging con le 500 read più abbondanti, se la differenza tra le read è disoli 1 o 2 nt. Inoltre, il punteggio Q30 dell’indice viene visualizzato sotto Total Read Count (Conta
totale read).

V – J Sequence Frequency Graph (Grafico difrequenza delle sequenze V – J)

Istogramma che mostra le frequenze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione
famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK e TRB) o gene V – gene J (per TRG).

V – J Usage Graph (Grafico dell’uso di V – J)

Grafico a barre 3D che mostra l’uso della famiglia V – famiglia J nelle 200 sequenze più abbondanti(per IGH/IGK e TRB) o l’uso del gene V – gene J in tutte le sequenze (per TRG).

Nota:
Nota:
Nota:

la Putative CDR3 sequence (sequenza CDR3 putativa) viene determinata mediante il confronto con un’esatta definizione di una sequenza CDR3. Qualsiasi
mutazione di punti di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).
l’analisi di IGK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).
l’analisi di TRB include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus TRB coinvolti in ricombinazioni della regione D – J.

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Visualizzazione dei dati (manuale): uso dei fogli di calcolo Excel perla visualizzazione dei dati - Sconsigliato
4.1.

Verificare le impostazioni di sicurezza di Microsoft Excel per accertarsi che il supporto per le macro sia correttamente
abilitato: Excel 2007: fare clic sul pulsante Office e selezionare Excel Options (Opzioni di Excel).
 Excel 2010/2013: fare clic sul menu File (File) e selezionare Options (Opzioni).
 Nella finestra Options (Opzioni), fare clic su Trust Center (Centro protezione) e poi sul pulsante Trust Center
Settings... (Impostazioni Centro protezione...).
 Fare clic su Macro Settings (Impostazioni delle macro) e impostare il livello di sicurezza delle macro appropriato.
L’opzione raccomandata è Disable all macros with notification (Disabilita tutte le macro con notifica).
 Fare clic su Ok (OK) e poi nuovamente su Ok (OK).
 Chiudere Excel.

4.2.

Aprire il file del foglio di calcolo appropriato per la visualizzazione dei dati facendo doppio clic. I file di visualizzazione
si trovano nella cartella LymphoTrackDxMiSeq_2.4.3 precedentemente copiata dal CD del software sul
proprio computer:





4.3.

LymphoTrackDxIGHVisualization.xlsm per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3
LymphoTrackDxIGKVisualization.xlsm per IGK
LymphoTrackDxTRBVisualization.xlsm per TRB
LymphoTrackDxTRGVisualization.xlsm per TRG

All’apertura del file potrebbe comparire il messaggio: Security Warning -Macros have been disabled (Avviso di
sicurezza - Le macro sono state disattivate).
 Excel 2007: fare clic sul pulsante Options... (Opzioni...) situato a destra dell’avviso, selezionare Enable thiscontent (Abilita questo contenuto) e fare clic su Ok (OK).
 Excel 2010/2013: fare clic sul pulsante Enable Content (Abilita contenuto).
La macro di visualizzazione dati si avvia automaticamente.

4.4.
4.5.

4.6.
4.7.
4.8.

Viene mostrato il contratto di licenza. Per utilizzare il software è necessario accettare il contratto di licenza.
Dopo che il contratto di licenza è stato accettato, si apre una finestra di dialogo con il messaggio: Please select theRead Summary file for the sample you want (Selezionare il file Riepilogo delle read per il campione desiderato). La
macro può eseguire la visualizzazione dei dati su un solo campione per volta, pertanto questa procedura deve essere
ripetuta per ogni campione che si desidera visualizzare.
Selezionare la cartella di output creata dall’applicazione di analisi dei dati che contiene i dati che si desidera
visualizzare e selezionare il file *.fastq_read_summary (*.fastq_riepilogo_read) per il campione che si desidera
esaminare.
Fare clic sul pulsante Open (Apri).
La macro carica i file di dati relativi al campione prescelto e crea diversi fogli di lavoro, ognuno dei quali presenta
diverse visualizzazioni leggibili dei dati. Questa operazione può richiedere alcuni secondi, a seconda delle dimensionidel campione e dell’hardware del computer.
IMPORTANTE!

A causa di una limitazione di Microsoft Excel, il software di visualizzazione non è in gradodi visualizzare più di 1.048.576 righe di dati per foglio. Se un file di output dell’analisi dei dati per
il campione corrente contiene un numero di righe di dati superiore a tale limite,saranno mostrate soltanto le prime 1.048.576 righe.
Se viene raggiunto questo limite, il programma visualizzerà un messaggio in cui viene specificato
quale foglio o quali fogli sono interessati da tale limitazione. Fare clic su OK (OK) per continuare.
Sebbene potrebbero non essere visualizzati tutti i dati, ciò non influirà sui grafici, che saranno
comunque accurati.

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IMPORTANTE!

I grafici vengono generati presupponendo una direzione di visualizzazione Left-to-right(da sinistra a destra). Nei Paesi in cui la normale direzione di lettura è da destra a sinistra,le impostazioni predefinite di Excel potrebbero non essere compatibili, con la conseguente
generazione di grafici non corretti. Per risolvere questo problema, l’opzione di visualizzazione di
Excel deve essere modificata con Left-to-right (da sinistra a destra). Tale opzione può essere
impostata da Office > Excel Options (Office > Opzioni di Excel) in Excel 2007, oppure File >Options (File > Opzioni) in Excel 2010/2013. Selezionare Advanced (Impostazioni avanzate),quindi scorrere verso il basso fino alle impostazioni Display (Visualizzazione). Modificare
l’opzione Default direction (Direzione predefinita) impostandola su Left-to-right (da sinistra a
destra), quindi fare clic su OK (OK). Alla successiva apertura di Excel, i fogli di lavoro verranno
letti da sinistra a destra e il software di visualizzazione genererà i grafici correttamente.
Qualora si verifichi un caso simile e per ulteriore assistenza, contattare l’Assistenza tecnica
Invivoscribe al numero +1 (858) 224-6600, dal lunedì al venerdì, dalle 7:00 alle 17:00 (fuso orariodel Pacifico), oppure inviare un’e-mail all’indirizzo support@invivoscribe.com.

4.9.
4.10.

Se viene visualizzato il messaggio Complex Formatting (Formattazione complessa), fare clic su Yes (Sì).
Salvataggio del file di visualizzazione. Al termine dell’elaborazione, viene visualizzato un messaggio che comunica
che il programma ha completato l’operazione. A questo punto, si raccomanda vivamente di salvare il file.

IMPORTANTE!

4.11.
4.12.

Quando si salva il file, occorre ricordarsi di selezionare Save As (Salva con nome) e scegliere
una cartella di lavoro Excel (*.xlsx o *.xls), dal momento che, se si seleziona Save (Salva) o si fa
clic sul pulsante con l’icona del dischetto, il programma sostituirà la macro *.xlsm con lacartella di lavoro corrente. Ciò richiederà la reinstallazione della macro con una nuova copia dal
CD del software per le analisi successive.

Se viene visualizzato un messaggio di avviso relativo al salvataggio come cartella di lavoro priva di macro, fare clic sul
pulsante Yes (Sì).
La cartella di lavoro completata per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG includerà gli otto fogli dilavoro descritti nella Tabella 5.

Tabella 5. Fogli di lavoro inclusi nel file di output Excel.

Cartella di lavoro completata per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG
Contiene un elenco delle 200 sequenze uniche più abbondanti, ordinate per conta, con indicazione di:
A quale evento di ricombinazione V-J si adatta meglio ogni sequenzaSequenzaLunghezza della sequenza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totali indicata per tutte le read (solo TRG)% cumulativa delle read totali indicata per le 200 read più abbondanti (IGH/IGK e TRB)In che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%) (IGH/IGK)
Sequenza CDR3 putativa
Read Summary (Riepilogo delle read)

Per Leader e IGH FR1 indica anche:
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)
Per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a (Sì/No/n/d)). Se, a causa della qualitàdell’allineamento, non può essere previsto l’uso del segmento genico V o J, il software non saràin grado di prevedere se il gene è in frame e il risultato sarà n/a (n/d). Se si prevede che ilriarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N (Sì/No)). Quando non può essere fatta
una previsione in frame, non è possibile prevedere con precisione se è presente un codone distop.
Sequenza CDR3 putativa

Merged Read Summary (Riepilogo delle
read sottoposte a merging)

Stesso formato del foglio di lavoro Read Summary (Riepilogo delle read), ma relativo alle sole 10 read più
abbondanti dopo merging con le 500 read più abbondanti, se la differenza tra le read è di soli 1 o 2 nt.

VJ Sequence Frequency Graph (Grafico difrequenza della sequenza VJ)

Istogramma che mostra le frequenze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione famiglia V– famiglia J (per IGH/IGK e TRB) o gene V – gene J (per TRG).

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Tabella 5. Fogli di lavoro inclusi nel file di output Excel.

Cartella di lavoro completata per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB e TRG
VJ Usage (Uso di VJ)

Frequenze e conte grezze delle 200 ricombinazioni più abbondanti famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK e
TRB) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Usage Percent Graph(Grafico percentuale dell’uso di VJ)

Grafico 3D che mostra le frequenze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione famiglia V –famiglia J (per IGH/IGK e TRB) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Usage Raw Graph(Grafico grezzo dell’uso di VJ)

Grafico 3D che mostra le conte grezze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione famiglia
V – famiglia J (per IGH/IGK e TRB) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Sequence Frequency (Frequenza dellasequenza VJ)

Elenco “impilato” di tutte le possibili ricombinazioni famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK e TRB) o gene V –gene J (per TRG), per ognuna delle quali è riportato un elenco ordinato delle 200 read più abbondanti(dalla % più alta a quella più bassa).

Unique Reads (Read uniche)
Nota:

Nota:
Nota:
Nota:
Nota:

File *.fasta di sequenze uniche, ordinate per conta.

nella tabella sopra, IGH si riferisce all’analisi di Leader, IGH FR1, IGH FR2 e IGH FR3. Nei grafici di frequenza relativi a questi geni bersaglio viene
specificato IGH soltanto nel titolo. Nella cartella di output dei dati è specificato se Leader o una delle regioni framework (FR) sono state analizzate
dal software e questa informazione è compresa nel campo della posizione del file di dati nella parte superiore del foglio di lavoro Read Summary(Riepilogo delle read).
l’analisi di IGK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).
l’analisi di TRB include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus TRB coinvolti in ricombinazioni della regione D – J.
200 sequenze più abbondanti - Quando specificato, i fogli di lavoro mostreranno le sequenze più abbondanti (fino a 200) per Leader, IGH FR1, IGH
FR2, IGH FR3, TRB e IGK. Nel Read Summary (Riepilogo delle read) per TRG sono mostrate tutte le sequenze.
la "Putative CDR3 sequence" (sequenza CDR3 putativa) viene determinata mediante il confronto con un’esatta definizione di una sequenza CDR3.
Qualsiasi mutazione di punti di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).

IMPORTANTE!

Per le assegnazioni ai geni V/J riportate nel Read Summary (Riepilogo delle read) può talvolta
essere visualizzato il valore “none” (nessuno). Tali assegnazioni si basano sulla qualità delmigliore allineamento tra la read e i geni di riferimento. Se il valore del migliore allineamento èinferiore a una determinata soglia di qualità, l’assegnazione al gene non può essere eseguita
con un livello di affidabilità sufficiente e verrà visualizzato come “none” (nessuno).

IMPORTANTE!

Il tasso di mutazione a gene V parziale (%) verrà visualizzato come “n/a” (n/d) per IGH FR2 e
FR3. La copertura del gene V è limitata a causa delle dimensioni ridotte degli ampliconi,che determina calcoli imprecisi del tasso di mutazione.

 Quando si analizza lo stato di ipermutazione somatica dei campioni, concentrarsi sulle 4 read più abbondanti (peri campioni monoclonali o biclonali limitarsi, rispettivamente, alle 2 o 4 read più abbondanti), poiché il tasso
di ipermutazione somatica (SHM) e le analisi in frame/dei codoni di stop sono i parametri più informativi perqueste read. A causa della natura priva di bias delle piattaforme NGS, vengono sequenziate e analizzate moltepiù read che non le sole 4 più abbondanti e la maggior parte di queste corrispondono a riarrangiamenti di ridotta
abbondanza o possono essere attribuite ad artefatti di amplificazione o sequenziamento. In questi casi, le analisi
di SHM e in frame/dei codoni di stop non sono utili nelle read non clonali. Si noti che Invivoscribe utilizza GRCh37
per le sequenze di riferimento e i risultati possono essere leggermente differenti dal database IMGT. Inoltre,
molti pseudogeni e geni non funzionali non sono inclusi nell’analisi. Interpretare i riarrangiamenti con stati diipermutazione somatica prossimi o corrispondenti al valore soglia del 2,0% con cautela, in particolare quando si
esegue il saggio IGH FR1, che riguarda solo una porzione della regione IGHV dal momento che la sequenza amonte del sito di legame del primer non verrà esaminata.

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Assistenza tecnica e Servizio clienti
I nostri clienti sono molto importanti per noi. Saremo lieti di assistervi nella comprensione del presente software.
Invivoscribe vi offre assistenza tecnica continua dal lunedì al venerdì per garantire che i saggi vengano eseguiti sempre conla massima efficienza nel vostro laboratorio.
Contatti
Invivoscribe, Inc
10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | Stati Uniti d'America
Tel.: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Orario d’ufficio: 7:00 – 17:00 (fuso orario del Pacifico)Assistenza tecnica: support@invivoscribe.com | Servizio cliente: sales@invivoscribe.com | Sito web: www.invivoscribe.com

Simboli
Sulle etichette dei prodotti basati su NGS di Invivoscribe sono utilizzati i seguenti simboli.
Numero di catalogo

Data di scadenza

Volume del reagente

Rappresentante autorizzato nella
Comunità europea

Numero di lotto

Consultare le istruzioni per l'uso

Condizioni di conservazione

Per uso diagnostico in vitro

Identificatore Dispositivo Univoco

Produttore

Conformità Britannica Valutata

Persona responsabile nel Regno Unito

Rappresentante Autorizzato per laSvizzera

Conformità Europea

Applicazione software

Domande frequenti relative al software
D1:

Quando viene selezionata l’opzione Launch Program (Avvia programma), si verifica il seguente errore (o uno
simile):Application terminated with error: Cannot run program “.\resources\Parse_TRG_miseq.exe”: CreateProcess error=2,
the system cannot find the file specified.
For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support.
(Applicazione terminata con errore: impossibile eseguire il programma ”. \resources\Parse_TRG_miseq.exe”:
CreateProcess error=2, il sistema non riesce a trovare il file specificato.
Per indicazioni su questo errore, rivolgersi all’Assistenza tecnica Invivoscribe.)

R1:

Il file compresso del programma è stato decompresso? (Vedere la sezione 1 Installazione del software.) Questo
errore si verifica in genere quando si cerca di eseguire il programma prima della decompressione del relativo file.
Windows permette di visualizzare il contenuto di un file zip facendo semplicemente doppio clic sul file; il contenuto
appare completo e funzionante, ma il programma non può essere eseguito correttamente da questo stato.

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D2:

Perché il Read Summary (Riepilogo delle read) dell’analisi di IGH, IGK o TRB contiene meno di 200 read?

R2:

Il LymphoTrack Dx Software - MiSeq esegue l’allineamento delle 200 read più abbondanti durante l’analisi, tuttavia
nel Read Summary (Riepilogo delle read) sono riportate soltanto le read che sono state allineate a un gene V o J
presente nel riferimento. Se una read non può essere allineata al riferimento, non viene inclusa nel Read Summary(Riepilogo delle read).
I possibili motivi del mancato allineamento al riferimento sono numerosi, ma in genere dipendono da un problema
con il campione che determina una grande quantità di amplificazioni aspecifiche. Questo evento può esserecausato da un basso numero di cellule target nel campione, condizioni di PCR inadeguate o tipi di campioni di bassaqualità, come materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) frammentato. Per ridurre la probabilità chetali eventi si verifichino, si raccomanda di seguire esattamente le istruzioni per l’uso.

D3:

Perché nella tabella del Read Summary (Riepilogo delle read) è riportato “none” (nessuno) per l’assegnazione a V
o J?

R3:

Per l’assegnazione di una read a un gene V e/o J specifico, è necessario che durante l’allineamento venga raggiunta
una soglia minima di qualità. Se l’allineamento è scadente, l’assegnazione non può essere eseguita con un livello diaffidabilità sufficiente e quindi viene etichettata come “none” (nessuno). Si noti che a una read non può essere
assegnato il valore “none” (nessuno) per entrambi i geni V e J, dal momento che in una situazione del genere nonsarebbe inclusa nel report, in base alla condizione illustrata nella domanda 2.

D4:

Nel “V-J Sequence Frequency Graph” (Grafico di frequenza della sequenza V-J) sono riportati valori strani
sull’asse delle ordinate (y). Il valore “% total reads” (% read totali) è nell’ordine dei milioni, come è possibile?

R4:

Verosimilmente ciò è dovuto all’esecuzione del programma LymphoTrack Dx utilizzando il separatore decimale
errato per la propria area geografica. Vedere la sezione 2 Esecuzione dell’applicazione Data Analysis, in particolare
riguardo alla selezione del separatore decimale.

D5:

Tutti i fogli di lavoro con grafici sono vuoti, ma i fogli di lavoro senza grafici contengono dati. Cosa è successo
ai grafici?

R5:

Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che la direzione predefinita del programma Excel che si sta usando è right-toleft (da destra a sinistra) invece di left-to-right (da sinistra a destra). Se le etichette delle colonne su un foglio dilavoro vuoto iniziano con la A a destra del foglio, sarà necessario cambiare la direzione impostandola su left-toright (da sinistra a destra) prima di utilizzare la macro di visualizzazione dei dati. Per modificare questa
impostazione, andare su Excel options (Opzioni di Excel) tramite il pulsante Office situato nell’angolo in alto asinistra, fare clic su Advanced (Impostazioni avanzate) e scorrere verso il basso fino alla sezione Display(Visualizzazione). Qui è presente un’opzione chiamata Default direction (Direzione predefinita) e la selezione Leftto-right (da sinistra a destra) farà sì che le successive visualizzazioni dei dati avvengano correttamente. Nota:questa operazione modifica in modo permanente la direzione fino a che l’impostazione non viene nuovamente
alterata. La chiusura di Excel non annulla questa modifica.

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D6:

Il programma si è interrotto dopo aver fatto clic su “Launch Program” (Avvia programma) e ha generato
l’errore seguente:

Application terminated with error: Filename not compatible. Please use only MiSeq MSR software generated FASTQ
files.
For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support.
(Applicazione terminata con errore: nome file non compatibile. Utilizzare esclusivamente file FASTQ generati dal
software MiSeq MSR.
Per indicazioni su questo errore, rivolgersi all’Assistenza tecnica Invivoscribe.)

R6:

Il LymphoTrack Dx Software – MiSeq prevede file FASTQ con estremità accoppiata generati dal software MiSeq
Reporter (MSR) presente nel sistema MiSeq. Se non è stato utilizzato il software MSR per generare i file disequenza, il processo di identificazione delle basi deve essere eseguito utilizzando il software MSR. Per maggiori
informazioni, consultare la Guida per l’utente del software MiSeq.
L’esecuzione del processo di identificazione delle basi utilizzando il software MSR è di estrema importanza dal
momento che, a differenza degli altri programmi che sono in grado di generare risultati molto simili a quelli
prodotti dal software MSR (per esempio, Bcl2fastq), questi programmi possono generare anche risultati molto
diversi, a seconda dei parametri specifici. Il LymphoTrack Dx Assay è valido solo per l’analisi dei file FASTQ generati
dal software MSR.

D7:

Perché i risultati dell’analisi sembrano contenere meno read di quanto atteso?

R7:Se, in base al Read Summary (Riepilogo delle read), le read totali analizzate sono molto poche o pari a zero,assicurarsi di aver selezionato il tipo di analisi corretto (Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB o TRG) al
momento dell’esecuzione del LymphoTrack Dx Software – MiSeq. Se il numero di read totali sembra molto ridotto,
confrontare le dimensioni dei file FASTQ che si stanno analizzando con le dimensioni dei file FASTQ presenti sullo
strumento MiSeq. Se lo strumento MiSeq contiene file di dimensioni maggiori, trasferire nuovamente i dati disequenza per garantire l’analisi del set di dati completo.
Il sequenziatore MiSeq visualizza diversi messaggi durante l’elaborazione dei dati di sequenziamento. Un messaggio
potrebbe indicare “Sequencing Complete” (Sequenziamento completato) e un altro, in seguito, potrebbe indicare“Analysis Complete” (Analisi completata). Il trasferimento dei dati FASTQ nel periodo che intercorre tra questi due
messaggi potrebbe determinare un’analisi incompleta con LymphoTrack Dx.

D8:Perché tra le dieci read più abbondanti del Read Summary (Riepilogo delle read) compare una read che nonè presente nel Merged Read Summary (Riepilogo delle read sottoposte a merging)?

R8:

La read “scomparsa” potrebbe essere stata combinata con una read di frequenza superiore, oppure è possibile chel’allineamento di questa read fosse di qualità eccezionalmente scadente. Durante il processo di merging, le readincluse nel Read Summary (Riepilogo delle read) vengono allineate con quelle presenti nel file delle read uniche;tuttavia, le read incluse nel Read Summary (Riepilogo delle read) sono state orientate in modo da coincidere conl’allineamento del riferimento e potrebbero trovarsi nell’orientamento antisenso rispetto al gene di riferimento.
Ciò si verifica soltanto quando l’allineamento è di qualità molto scadente e quando l’allineamento
nell’orientamento senso o antisenso è pressoché equivalente, con l’allineamento nell’orientamento antisenso chesi è rivelato leggermente migliore. In tali casi, è meglio ignorare completamente la read.

IMPORTANTE:

per determinare se vi è evidenza di clonalità, utilizzare solo le read del Merged Read Summary(Riepilogo delle read sottoposte a merging).

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D9:Perché l’analisi richiede molto tempo (oltre un’ora per campione)?

R9:

Il file di registro fornisce i dettagli della durata di ciascun passaggio. Dopo la riga “INFO: Decompressing files”(INFORMAZIONE: decompressione file in corso) è presente un’altra riga che indica quanti file sono stati decompressi
e quanto tempo ha richiesto la decompressione. Questo numero verrà espresso in millisecondi. Se ladecompressione sta richiedendo diverse ore, verificare se i file di interesse sono su un file server. Di solito,
l’esecuzione di processi intensivi di I/O come la decompressione è molto più lenta su rete. Se possibile, copiare i filesul computer locale o decomprimere direttamente i file prima di eseguire questo software. Assicurarsi che i filecompressi e decompressi non siano entrambi presenti nella stessa cartella. Il software non procede se nella cartella
di destinazione si trovano sia i file .fastq che i file .fastq.gz.
Se le successive fasi di parsing e di analisi richiedono molto tempo, è possibile che i file FASTQ siano molto grandi.
Ad esempio, si ottengono file FASTQ di grandi dimensioni quando in una singola corsa MiSeq sono inclusi meno di
24 indici e quindi i campioni sequenziati presentano una maggiore profondità di copertura, oppure nel caso in cui lalibreria non sia bilanciata e contenga una percentuale maggiore di un campione con un indice rispetto alla
percentuale di campioni con altri indici. Il tempo di esecuzione previsto indicato nelle presenti Istruzioni per l’uso
presuppone una corsa con 24 indici con librerie bilanciate.

D10:

La corsa Q30 riportata dallo strumento MiSeq non rispetta le specifiche di Illumina. Se l’analisi LymphoTrack èstata eseguita e i controlli sembrano essere stati effettuati come previsto, la corsa ha effettivamente avuto
esito negativo?

R10:

La corsa Q30 viene calcolata in tempo reale durante il processo di identificazione delle basi. In questa fase non è
stata eseguita nessun’altra elaborazione di dati, come per esempio il demultiplexing e il trimming dell’adattatore.
Ciò significa che qualsiasi sequenza proveniente da un indice di bassa qualità o che si verifica al di fuori dellasequenza dell’adattatore contribuisce al punteggio Q30. La sequenza trovata al di fuori della sequenza
dell’adattatore è in genere di bassa qualità e tale situazione si verifica spesso con dimeri di primer. Se una libreria
ha un livello sufficiente di dimeri di primer, ciò può causare una diminuzione del punteggio della corsa Q30. Comecontrollo secondario, l’output di LymphoTrack Reporter mostra il punteggio Q30 dell’indice, calcolato a partire datutte le read sottoposte a trimming assegnate a quell’indice. Se anche il punteggio Q30 dell’indice non rispetta lespecifiche di Illumina, quell’indice presenta un errore.

D11:

Qual è la risoluzione per un errore quando si avvia il software LymphoTrack Dx – MiSeq facendo doppio clic sul
file startLymphoTrackDxMiSeq.jar?

R11:

Questo problema può verificarsi quando si verifica un problema con l'installazione corrente di Java. La versione
corretta di Java (Java 8 64-bit) deve essere installata sul sistema per poter eseguire LymphoTrack Software – MiSeq.
Inoltre, il file startLymphoTrackDxMiSeq.jar deve essere impostato per essere aperto con la versione corretta diJava.
È possibile eseguire i seguenti passaggi per la risoluzione dei problemi per garantire che sia installata la versione
corretta di Java e che il JAR sia aperto con la versione corretta di Java:
1. Verificare che il software Java sia installato:
1.1.
1.2.
1.3.

Apri il Windows Menu (menu di Windows) e digita Settings (Impostazioni) nella barra di ricerca,
quindi seleziona la prima icona visualizzata.
Nella barra di ricerca della nuova finestra, digita Add or remove programs (Aggiungi o rimuovi
programmi) e seleziona la prima opzione che appare.
Scorri l'elenco dei programmi installati.
••

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

Se nell'elenco è presente un programma con un nome che inizia con le lettere Java 8 e termina
con i caratteri 64 bit, è installata la versione corretta di Java.
In caso contrario, è necessario installare Java 8 a 64 bit; passare alla sezione 3.
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2.

Disinstallare le vecchie versioni di Java:
2.1.
2.2.

3.

Segui i passaggi 1.1 e 1.2.
Scorri l'elenco dei programmi installati. Identifica qualsiasi programma che inizia con le lettere Java econtiene anche le lettere Java 8 e 64-bit, fai clic sulla voce nell'elenco, quindi fai clic su Uninstall(Disinstalla).

Disinstalla Java e reinstalla Java:Se è installata la versione corretta di Java e il software non si apre ancora, disinstallare e reinstallare Java.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.

Segui i passaggi 1.1 e 1.2.
Scorri l'elenco dei programmi installati e clicca sulla voce con il nome Java 8 che termina con i
caratteri 64-bit, quindi clicca su Uninstall (Disinstalla).
Passare al sito Web Java per scaricare il software Java 8 a 64 bit direttamente da Oracle all'indirizzo
http://www.java.com/.
Segui le istruzioni per installare il software.

4. Puntare il file JAR sull'eseguibile Java corretto:
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.

Fare clic con il tasto destro sul file startLymphoTrackDxMiSeq.jar, quindi selezionare Properties(Proprietà).
Nella finestra di dialogo che appare, seleziona il pulsante Change (Modifica) accanto opens with(all'apertura con) testo.
Nella finestra di dialogo successiva che appare, seleziona Choose another app (Scegli un'altra app).
Nella nuova finestra che si apre, fai clic su More apps (Altre app), quindi seleziona Look for anotherapp on this PC (Cerca un'altra app su questo PC).
Nella finestra di navigazione che appare, vai alla posizione della cartella dell'installazione di Java 8 a
64 bit.
•

4.6.
4.7.

Probabilmente sarà: Local Disk (C:) > Program Files > Java > jre1.8.0_(version number) > bin(Disco locale (C:) > Programmi > Java > jre1.8.0_(numero di versione) > bin).

Seleziona javaw.exe e fai clic su Open (Apri).
Una volta confermata l'installazione, ripetere la sezione da 4.1 a 4.3 e selezionare la casella dicontrollo che indica Always open .jar files with this app (Apri sempre i file .jar con questa app), quindi
accedere allo stesso file javaw.exe dal passaggio 4.6. Ciò consentirà al software LymphoTrack Dx diaprirsi correttamente.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Contratto di licenza con l’utente finale
IL PRESENTE CONTRATTO DI LICENZA CON L’UTENTE FINALE DEVE ESSERE ACCETTATO DA UN RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO DELL’UTENTE FINALE DI QUESTO
PRODOTTO PRIMA DELL’UTILIZZO DEL SOFTWARE LYMPHOTRACK® MISEQ (il “Software”). UTILIZZANDO IL SOFTWARE LYMPHOTRACK® MISEQ, L’UTENTEDICHIARA DI ESSERE UN RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO DELL’UTENTE FINALE CON L’AUTORITÀ DI SOTTOSCRIVERE IL PRESENTE CONTRATTO. LEGGERE
ATTENTAMENTE IL PRESENTE CONTRATTO. UTILIZZANDO IL SOFTWARE, L’UTENTE ACCETTA DI ESSERE VINCOLATO DAI TERMINI DEL PRESENTE CONTRATTO.
SE L’UTENTE NON ACCETTA I TERMINI DEL PRESENTE CONTRATTO, DEVE SMETTERE DI UTILIZZARE IL SOFTWARE. SE L’UTENTE ACCETTA LE CONDIZIONI DELPRESENTE CONTRATTO PER CONTO DI SE STESSO E/O DELL’ENTITÀ CHE RAPPRESENTA PUÒ CONTINUARE A UTILIZZARE IL SOFTWARE.
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280435 Rev. E | febbraio 2024