Istruzioni per l'uso

LymphoTrack Dx Software – S5/PGM™ Versione 2.4.8®

Il presente pacchetto software viene fornito con ogni LymphoTrack® Dx Assay per l'analisi di file FASTQ grezzi con gli strumenti
Thermo Fisher Scientific Ion S5™ e Ion PGM™. Il software si compone di tre parti distinte: l'applicazione LymphoTrack Dx Data
Analysis, un plugin LymphoTrack Reporter che viene eseguito automaticamente dopo l'analisi e un metodo opzionale divisualizzazione LymphoTrack costituito da tre fogli di calcolo Microsoft Excel® XLSM. Il software viene eseguito su piattaforme
Microsoft Windows® supportate.
Il pacchetto software permette di eseguire analisi di clonalità di dati di target singoli (IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, o TRG) oltre
che per l'analisi simultanea di dati IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK e TRG.
Per uso diagnostico in vitro.

Compatibilità del prodotto
Il LymphoTrack Dx Software – S5/PGM (stato specificamente sviluppato:
N. di catalogo

95000007) è compatibile esclusivamente con i seguenti saggi Invivoscribe, per i quali èDescrizione

91210007

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay – S5/PGM

00850052003777

91210037

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay – S5/PGM

00850052003784

91210047

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay – S5/PGM

00850052003791

91210057

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay – S5/PGM

00850052003807

91220007

LymphoTrack Dx IGK Assay – S5/PGM

00850052003890

92270007

LymphoTrack Dx TRG Assay – S5/PGM

00850052003951

Uso previsto
Il pacchetto LymphoTrack Dx Software – S5/PGM è progettato per essere utilizzato per l'analisi di dati bioinformatici e la visualizzazione difile FASTQ grezzi generati dallo strumento Thermo Fisher Scientific Ion S5 o Ion PGM quando impiegato con saggi LymphoTrack Dx.

95000007

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Requisiti minimi di sistema
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Processore: consigliato CPU Intel Core 2 Duo o più recente.
Disco rigido: sono richiesti almeno 80 GB di spazio libero su disco; consigliati 250 GB.
RAM: sono richiesti 4 GB; consigliati 8 GB o più.
Sistema operativo: è richiesto Windows 7 (64 bit).
Java 8 per sistemi operativi a 64 bit o versione successiva (Java configurato per sistemi operativi a 32 bit non è compatibile con il
LymphoTrack Dx Software – S5/PGM). La versione più recente di Java può essere scaricata direttamente da Oracle al sito
http://www.java.com/.
Un lettore PDF, quale Adobe Acrobat Reader, per visualizzare i report dei dati generati da LymphoTrack Reporter.
Per la visualizzazione di dati obsoleti è richiesto Microsoft Office Excel 2007, 2010, 2013 o 2016 con supporto macro abilitato.
Un'unità CD-ROM.
Il LymphoTrack Dx Software – S5/PGM v2.4.8 è stato validato per l'uso con Windows 7 o Windows 10 configurato per la lingua
inglese (Stati Uniti) e con le impostazioni predefinite delle dimensioni di visualizzazione, e con Microsoft Excel
2007/2010/2013/2016 per la visualizzazione alternativa dei dati. L'uso di altre versioni di Windows/Excel e/o impostazioni dilingua/dimensioni di visualizzazione diverse potrebbero non essere compatibili.

Avvertenze e precauzioni
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Versione software: verificare la versione più recente per il LymphoTrack Dx Software - S5/PGM è installato e utilizzato per l'analisi
dei dati.
Dimensioni dello schermo predefinite. La risoluzione ottimale dello schermo per il LymphoTrack Dx Software – S5/PGM è 100%.
L'aumento delle dimensioni dello schermo predefinite del proprio monitor oltre il 100% può influire sulla visualizzazione dei campidi testo nell'interfaccia utente.
Tipo di carattere del sistema. L'interfaccia utente è progettata per utilizzare le impostazioni predefinite del tipo di carattere delsistema su un computer Windows configurato per la lingua inglese (Stati Uniti). Modifiche alle impostazioni del tipo di caratteredel sistema o l'utilizzo di una lingua diversa dall'inglese (Stati Uniti) possono influire sulla visualizzazione dei campi di testo
nell'interfaccia utente.
Decompressione dei dati. I dati di esecuzione Ion S5 o Ion PGM potrebbero trovarsi all'interno di una cartella (*.zip) compressa.
In tal caso, i dati devono essere estratti in una cartella facendo clic con il tasto destro sul file e selezionando “Extract All” (Estrai
tutto) dal menu contestuale.
Non rinominare i file S5 o PGM prima di analizzarli con questo software. La modifica dei nomi predefiniti potrebbe comportare
messaggi di errore e la mancata elaborazione dei file di dati a causa di un potenziale guasto dell'applicazione che non consente diriconoscere i file di input corretti.
File compatibili. Il LymphoTrack Dx Software – S5/PGM è compatibile con i file fastq.gz generati dal software Ion S5 o Ion PGM
Reporter.
Impostazioni di sospensione o ibernazione. Considerare la disabilitazione delle modalità di sospensione o ibernazione prima dieseguire l'applicazione LymphoTrack Dx Data Analysis. Se il computer passa alla modalità sospensione o ibernazione, il softwaresi potrebbe arrestare.
Caratteri in nomi di percorsi e di file. 1) Evitare spazi nei percorsi di file di dati o del software (i percorsi includono cartelle di filee nomi di file) e non è consentito più di uno spazio consecutivo. 2) È importante che i nomi dei file contengano solo i seguenti
caratteri (A-Z, a-z, 0-9, ., _ (trattino basso), - (trattino)). Se il software trova un carattere diverso da quelli indicati, potrebbe
verificarsi un errore. Accertarsi che venga seguita questa nomenclatura per la denominazione dei campioni quando si imposta il
foglio campioni per Ion S5 o Ion PGM. 3) I nomi di percorsi non devono superare i 255 caratteri. Nomi di campioni che determinanola creazione di nomi di file prossimi a questo limite sono difficili da copiare in altre posizioni.
I campioni duplicati devono avere un nome di campione univoco. Quando si denominano i campioni, assegnare a ogni campione
un nome o identificatore univoco. Se si analizzano campioni duplicati, è possibile utilizzare un nome simile (ovvero Campione1a eCampione1b). La mancata assegnazione di nomi univoci a campioni che saranno analizzati contemporaneamente sulla stessa
cartuccia farà sì che durante il processo di analisi venga analizzato dal software solo un campione.
Sicurezza. Informatica dei dati Invivoscribe consiglia vivamente l'installazione di software antivirus fornito dall'utente perproteggere il computer dai virus Invivoscribe consiglia vivamente di installare il software su un solo utente e di garantire che ireport di output siano conservati in una posizione protetta con protezione della password di rete.
Permessi. Nei casi in cui un utente diverso ha trasferito i dati rispetto all'utente corrente, entrambi gli utenti devono disporredelle autorizzazioni di accesso e scrittura per la cartella di input. Nei casi in cui ciò non è vero, L'utente corrente dovrà spostare i
dati o acquisire le autorizzazioni per la cartella di input affinché l'analisi proceda.

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1. Installazione del software
1.1.

Copiare l'archivio LymphoTrackDxS5-PGM_2.4.6.zip dal CD del software su un'unità locale sul proprio computer. Installare il
software esclusivamente su un'unità locale e non su un'unità di rete. Se eseguito attraverso una connessione di rete, il
software potrebbe non funzionare correttamente.

1.2.

Estrarre il file di archivio che era stato copiato sul computer locale nel passaggio precedente. Questa operazione in generepuò essere eseguita facendo clic sul file con il pulsante destro del mouse e selezionando Extract all (Estrai tutto) nel menu
contestuale.

 Dopo l'estrazione dell'archivio viene creata una cartella denominata LymphoTrackDxS5-PGM_2.4.6.

2. Esecuzione dell'applicazione Data Analysis
2.1.

Identificare i file FASTQ.GZ da analizzare.

 I file nomatch*.fastq non sono necessari per l'analisi.
2.2.

Scaricare questi file dal server Torrent Ion in una cartella sull'unità locale: saranno utilizzati come input per l'applicazione
LymphoTrack Dx S5/PGM Data Analysis.

 Scaricare questi file sullo stesso computer su cui è stato installato il software.
 L'unità contenente la cartella con i file da analizzare richiede almeno 80 GB di spazio disponibile.
 Lo spazio disponibile è sufficiente per un'analisi completa Se l'unità non ha spazio sufficiente, se l'unità non dispone
di spazio sufficiente.

 Questa cartella sarà la <cartella_input> per il software menzionata di seguito.
IMPORTANTESalvare tutti i file sul computer locale che l'utente ha il permesso di utilizzare per prevenire ilrischio di integrità dei dati del paziente. Quando si trasferisce la cartella di input, assicurarsi che
Ion S5 o Ion PGM abbia completato la sua analisi. Tenere tutti i file di dati nella stessa cartella ;non dividere i dati in più cartelle.

2.3.

Fare doppio clic sul file startLymphoTrackDxS5-PGM che si trova nella cartella LymphoTrackDxPGM_2.4.6 copiata sul
computer durante l'installazione.

2.4.

Leggere il contratto di licenza. Se si accettano i termini, fare clic sul pulsante Accept (Accetta) per continuare.

2.5.

Contrassegnare la modalità di analisi desiderata dalle opzioni della casella di spunta Choose analysis mode(s) (Scegli modalitàanalisi). La modalità di analisi deve corrispondere al saggio utilizzato per generare i dati della corsa (IGH FR1, IGH FR2, IGH
FR3, IGK e/o TRG).

2.6.

Selezionare la notazione del separatore decimale desiderata nelle opzioni Choose decimal mark (Scegli separatore decimale).
Questa opzione influisce sull'uso successivo della macro di visualizzazione dei dati di Microsoft Excel ed è un parametrorichiesto. Le opzioni possibili per il separatore decimale sono il punto decimale (“.”) o la virgola decimale (“,”).
IMPORTANTE!

Separatore decimale. Per determinare quale opzione scegliere, aprire un nuovo foglio di lavoro
Excel e digitare “=10000” nella cella A1. Fare clic su questa cella con il pulsante destro del mousee selezionare Format Cells (Formato celle).
 Nella scheda Number (Numero), osservare l'elenco Category (Categoria) e selezionare Number(Numero). A destra, il valore Decimal places (Cifre decimali) è impostato su 2.
 Sotto questo valore è presente la casella di spunta Use 1000 Separator (Usa separatore delle
migliaia). Spuntare questa casella e il numero di campione sopra riportato conterrà ilnumero originale immesso, formattato in base alle impostazioni predefinite di Excel per unnumero con separatore decimale.
 Se questo numero appare come “10,000.00”, selezionare l'opzione decimal point (punto
decimale). Se questo numero appare come “10.000,00”, selezionare l'opzione decimalcomma (virgola decimale).

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2.7.

Fare clic sul pulsante Browse (Sfoglia) per scegliere una cartella di input. Questa cartella è la <cartella_input> menzionata sopra
e contiene i file che si desidera analizzare. Quando viene selezionata, la cartella di input apparirà vuota.
IMPORTANTE!

La <cartella_input> selezionata non deve contenere file che presentino con lo stesso nome dellacartella di input. Se il programma viene eseguito con un campione che condivide lo stesso nome
file della cartella indicata come input per le analisi, il programma si bloccherà e il tempo diesecuzione dell'analisi aumenterà in modo significativo (ovvero, saranno necessari 30 minuti per
elaborare un piccolo campione che impiega secondi per elaborare normalmente).

Dopo aver selezionato la <cartella_input> e la modalità di analisi desiderata, fare clic sul pulsante Launch Program (Avvia
programma).

2.8.

IMPORTANTE!

2.9.

La <cartella_input> selezionata deve contenere soltanto file *.fastq o *.fastq.gz. Se non è presentenessuno di questi tipi di file né una combinazione di questi tipi di file, il programma visualizzerà unmessaggio di errore e chiederà all'utente di scegliere un'altra cartella.

Stato dell'analisi. Dopo aver fatto clic sul pulsante Launch Program (Avvia programma), verrà visualizzata la finestra
principale del programma con lo stato del programma. Quando il programma conclude l'analisi dei file di dati di input, lafinestra principale del programma visualizza il messaggio Analysis is complete… (Analisi completata...) mostrando la posizionedella cartella di output e chiede all'utente di aprire il foglio di calcolo Excel appropriato per la visualizzazione dei dati. Dallafinestra principale del programma può essere avviata una nuova analisi non appena quella precedente è stata completata.
IMPORTANTE!

Durata dell'analisi. Il tempo richiesto dal programma per elaborare i dati dipende dalle
dimensioni e dal numero di campioni da analizzare, nonché dalla modalità di analisi e dalla
configurazione hardware del computer. Le dimensioni tipiche del campione per una corsa di 12
campioni sono comprese tra 500.000 e 3 milioni di read. Tali numeri dipendono dal chip e dallachimica utilizzati sulle piattaforme Ion S5 o Ion PGM.
Il completamento dell'analisi di un singolo campione IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK o TRG tipico
richiede circa 1-2 minuti. Il completamento di una tipica corsa di 12 campioni solo IGH FR1, solo
IGH FR2, solo IGH FR3, solo IGK o solo TRG richiede circa 8-20 minuti. Nel caso di una tipica corsa
di 12 campioni combinati IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK e/o TRG, la durata dell'analisi va
moltiplicata per il numero di target da analizzare.

2.10.

Cartella/e di output. In base alla modalità di analisi prescelta, verranno create una o più cartelle di output nella <cartella_input>
contenente i file di origine .fastq o fastq.gz. La Tabella 1 indica il rapporto tra la modalità di analisi e il nome della/e cartella/e
di output.
Tabella 1. Nome della cartella di output in base alla modalità di analisi

2.11.

Modalità di analisi

Nome della/e cartella/e di output

IGH FR1

IGH_FR1_output

IGH FR2

IGH_FR2_output

IGH FR3

IGH_FR3_output

IGK

IGK_output

TRG

TRG_output

Qualsiasi combinazione di:
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK e TRG

Da due a cinque cartelle di output tra quelle
indicate sopra

Al termine di un'analisi eseguita correttamente da parte del programma, la cartella di output conterrà diversi file TSV e unfile PDF per ciascun campione elaborato. Si noti che l'asterisco “*” nelle tabelle di seguito rappresenta il nome del campionecosì come immesso nel foglio campioni, seguito da informazioni specifiche sulla piattaforma (ad es.
“nomecampione_S1_L001_001_combinato”).
 Per le analisi IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 e IGK, consultare la Tabella 2 per le descrizioni dei nove file forniti perciascun campione.

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Tabella 2. Descrizione dei file di output IGH e IGK.
Analisi di IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 e IGK
Contiene un elenco delle 200 sequenze uniche più abbondanti, ordinate per conta (numero di read), conindicazione di:
A quale evento di ricombinazione V-J si adatta meglioLunghezza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totaliIn che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%)
Sequenza CDR3 putativa*.fastq_read_summary.tsv

IGH FR1 indica anche:
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a) (Sì/No/n/a). Se, a causa della qualitàdell'allineamento, non può essere previsto l'uso del segmento genico V o J, il software non sarà in gradodi prevedere se il gene è in frame e il risultato sarà n/a.

Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N) (Sì/No). Quando nonpuò essere fatta una previsione in frame, non è possibile prevedere con precisione se è presente
un codone di stop.

*.fastq_read_summary_merged_top
10_searchtop500.tsv*.fastq_unique_reads.tsv*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv*.fastq_VJ_sequence_frequency _family.tsv*.fastq_read_summary_family.tsv

Stesso formato del file read_summary, ma contiene solo le 10 read più abbondanti dell'elenco
read_summary, sottoposte a merging con le read incluse nell'elenco delle 500 più abbondanti. Viene
eseguita un'operazione di merging tra due read se la differenza tra di esse è di sole 1 o 2 coppie di basi (bp);in tal caso, la read che presenta la conta maggiore mantiene la sua identità di sequenza, mentre la read conla conta minore viene aggiunta alla maggiore.
File FASTA di sequenze uniche, ordinate per conta.
File FASTA di sequenze CDR3 putative trovate nel file *.fastq_unique_reads.
Ogni famiglia è un raggruppamento di tutte le possibili ricombinazioni trovate in una determinata regione V oJ, come una famiglia V1 o una famiglia J4. Nell'ambito della famiglia V1 è possibile trovare qualsiasi numero diricombinazioni, come ad esempio V1-69 e V1-8. Questo file contiene un elenco di tutte le possibili
ricombinazioni famiglia V – famiglia J, per ognuna delle quali è indicato un elenco ordinato di read (dalla % piùalta a quella più bassa). Questo file viene utilizzato al meglio in un grafico di tipo “impilato” in Excel.
Contiene un elenco di sequenze uniche ordinate per conta, con indicazione di:
A quale evento di ricombinazione delle famiglie V-J si adatta meglio ogni sequenza
Lunghezza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totaliIn che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%)
Sequenza CDR3 putativa
IGH FR1 indica anche:
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a) (Sì/No/n/a).

Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N) (Sì/No).

*.fastq_VJ_usage.tsv*.fastq_VJ_usage_family.tsv*<timestamp>.pdf

Matrice delle conte e delle % dei diversi eventi di ricombinazione V-J.
Matrice delle conte e delle % dei diversi eventi di ricombinazione famiglia V – famiglia J.
Il report PDF generato da LymphoTrack Reporter contiene informazioni simili al file Merged Read Summary(Riepilogo delle read sottoposte a merging), al file Read Summary (Riepilogo delle read), un grafico V – J Usage(Uso di V-J) e un grafico V – J Sequence Frequency (Frequenza delle sequenze V-J). Per maggiori informazioni
consultare
la sezione 3:
Visualizzazione
dei
dati
mediante LymphoTrack Reporter(automatizzata, raccomandata)

Nota: L'analisi di IGK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).

 Per l'analisi di TRG, consultare la Tabella 3 per le descrizioni dei sette file forniti per ciascun campione.

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Tabella 3. Descrizione dei file di output TRG.

Analisi di TRG*.fastq_read_summary.tsv*.fastq_read_summary_merged_
top10_searchtop500.tsv*.fastq_unique_reads.tsv*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv*.fastq_VJ_sequence_frequency.tsv*.fastq_VJ_usage.tsv*<timestamp>.pdf

Elenco di sequenze uniche ordinate per conta, con indicazione di:
A quale evento di ricombinazione V-J si adatta meglio ogni sequenza
Lunghezza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totaliSequenza CDR3 putativa
Stesso formato del file read_summary, ma contiene solo le 10 read più abbondanti dell'elenco
read_summary, sottoposte a merging con le read incluse nell'elenco delle 500 più abbondanti. Viene
eseguita un'operazione di merging tra due read se la differenza tra di esse è di sole 1 o 2 bp; in tal
caso, la read che presenta la conta maggiore mantiene la sua identità di sequenza, mentre la readcon la conta minore viene aggiunta alla maggiore.
File FASTA di sequenze uniche, ordinate per conta.
File FASTA di sequenze CDR3 putative trovate nel file *.fastq_unique_reads.
Elenco di tutte le possibili ricombinazioni V-J, per ognuna delle quali è indicato un elenco ordinato diread (dalla % più alta a quella più bassa). Il primo numero indica che % di read totali rappresenta la
prima read unica rispetto a tutte le read sequenziate. Questo file viene utilizzato al meglio in un
grafico di tipo “impilato” in Excel.
Matrice delle conte e delle % dei diversi eventi di ricombinazione V-J.
Il report PDF generato da LymphoTrack Reporter contiene informazioni simili al file Merged Read
Summary (Riepilogo delle read sottoposte a merging), al file Read Summary (Riepilogo delle read), un
grafico V – J Usage (Uso di V-J) e un grafico V – J Sequence Frequency (Frequenza delle sequenze V-J).
Per maggiori informazioni consultare la sezione 3: Visualizzazione dei dati mediante LymphoTrack
Reporter (automatizzata, raccomandata)

Nota: La “sequenza putativa CDR3” viene determinata mediante il confronto con un'esatta definizione di una sequenza CDR3. Qualsiasi mutazione di punti
di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).
Nota: L'analisi di GK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).

2.12.

La cartella o le cartelle di output contengono report in formato PDF e file di dati di output TSV. I file TSV possono essere
utilizzati come input per il foglio o i fogli di calcolo per la visualizzazione dei dati.

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3.

Visualizzazione dei dati mediante LymphoTrack Reporter (automatizzata, raccomandata)
3.1.

Al completamento dell'analisi viene automaticamente generato un report PDF per ogni campione. Il report prende il nomedal campione presente nel foglio campioni, seguito da informazioni specifiche della piattaforma e termina con l'indicazione
di data e ora (GGMMAAhhmmss).
IMPORTANTE!

3.2.

Fare attenzione quando si salva il report PDF: in base al programma utilizzato per aprire il PDF,
una o più colonne possono essere modificate. NON eseguire alcuna modica in nessuna parte del
PDF. Qualora si sospetti che sia stata apportata una modifica, NON salvare il PDF. Qualora si
sospetti che sia stata salvata una modifica, eseguire nuovamente l'analisi per generare un nuovo
report PDF.

La prima pagina del report PDF contiene una tabella dei risultati del Merged Read Summary (Riepilogo delle read sottopostea merging), seguita dai grafici V – J Sequence Frequency (Frequenza delle sequenze V – J) e V – J Usage (Uso di V – J), mentre
le restanti pagine contengono una tabella dei risultati del Read Summary (Riepilogo delle read) relativi alle read nonsottoposte a merging. Il contenuto di questi elementi è descritto in dettaglio nella Tabella 4.

Tabella 4. Pagine incluse nel file pdf di output.

PDF generato da LymphoTrack Reporter
Merged Read Summary (Riepilogo delle
read sottoposte a merging)

Stesso formato del foglio di lavoro Read Summary (Riepilogo delle read), ma relativo alle sole 10 readpiù abbondanti dopo merging con le 500 read più abbondanti, se la differenza tra le read è di sole 1
o 2 bp.

V – J Sequence Frequency Graph (Grafico difrequenza delle sequenze V – J)

Istogramma che mostra le frequenze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione
famiglia V – famiglia J (per IGH e IGK) o gene V – gene J (per TRG).

V – J Usage Graph(Grafico dell'uso di V – J)

Grafico a barre 3D che mostra l'uso della famiglia V – famiglia J nelle 200 sequenze più abbondanti(per IGH e IGK) o gene V – gene J in tutte le sequenze (per TRG).

Read Summary (Riepilogo delle read)Contiene un elenco delle 200 sequenze uniche più abbondanti, ordinate per conta, con indicazionedi:
A quale evento di ricombinazione V – J si adatta meglio ogni sequenzaSequenzaLunghezza della sequenza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totali indicata per le 200 read più abbondanti - In che misura la readcopre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%). (IGH/IGK)
Sequenza CDR3 putativa
Per Leader e IGH FR1 indica anche:

Tasso di mutazione a gene V parziale (%)

Per Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a) (Sì/No/n/a). Se, a causa della qualitàdell'allineamento, non può essere previsto l'uso del segmento genico V o J, il software non saràin grado di prevedere se il gene è in frame e il risultato sarà n/a.
Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N) (Sì/No). Quando
non può essere fatta una previsione in frame, non è possibile prevedere con precisione seè presente un codone di stop.

Nota: La “sequenza putativa CDR3” viene determinata mediante il confronto con un'esatta definizione di una sequenza CDR3. Qualsiasi mutazione di punti
di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).
Nota: L'analisi di IGK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).

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4.

Visualizzazione dei dati: uso dei fogli di calcolo Excel per la visualizzazione dei dati
(manuale, sconsigliato)
4.1.

Verificare le impostazioni di sicurezza di Microsoft Excel per accertarsi che il supporto per le macro sia correttamente abilitato: Excel 2007: fare clic sul pulsante Office e selezionare Excel Options (Opzioni di Excel).
 Excel 2010/2013: fare clic sul menu File e selezionare Options (Opzioni).
 Nella finestra Opzioni, fare clic su Trust Center (Centro protezione) e poi sul pulsante Trust Center settings...
(Impostazioni Centro protezione...).
 Fare clic su Macro Settings (Impostazioni delle macro) e impostare il livello di sicurezza delle macro appropriato.
L'opzione raccomandata è Disable all Macros with notifications (Disabilita tutte le macro con notifica).
 Fare clic su Ok e poi nuovamente su Ok.
 Chiudere Excel.

4.2.

Aprire il file del foglio di calcolo appropriato per la visualizzazione dei dati facendo doppio clic su di esso. I file di visualizzazione
si trovano nella cartella LymphoTrackDxS5-PGM_2.4.6 precedentemente copiata dal CD del software sul proprio computer: LymphoTrackDxIGHVisualization.xlsm per IGH FR1, IGH FR2 e IGH FR3
 LymphoTrackDxIGKVisualization.xlsm per IGK LymphoTrackDxTRGVisualization.xlsm per TRG

4.3.

All'apertura del file potrebbe comparire il messaggio: Security Warning – Macros have been disabled (Avviso di sicurezza - Lemacro sono state disattivate).
 Excel 2007: fare clic sul pulsante Options (Opzioni...) situato a destra dell'avviso, selezionare Enable this content(Abilita questo contenuto) e fare clic su Ok.
 Excel 2010/2013: fare clic sul pulsante Enable Content (Abilita contenuto).
 La macro di visualizzazione dati si avvia automaticamente.

4.4.

Viene mostrato il contratto di licenza. Per utilizzare il software è necessario accettare il contratto di licenza.

4.5.

Dopo che il contratto di licenza è stato accettato, si apre una finestra di dialogo con il messaggio: Please select the Read
Summary file for the sample you want (Selezionare il file Riepilogo delle read per il campione desiderato).

Nota:

La macro può eseguire la visualizzazione dei dati su un solo campione per volta, pertanto questa procedura deveessere ripetuta per ogni campione che si desidera visualizzare.

4.6.

Selezionare la cartella di output creata dall'applicazione di analisi dei dati che contiene i dati che si desidera visualizzare eselezionare il file *.fastq_read_summary per il campione che si desidera esaminare.

4.7.

Fare clic sul pulsante Open (Apri).

4.8.

La macro carica i file di dati relativi al campione prescelto e crea diversi fogli di lavoro, ognuno dei quali presenta diverse
visualizzazioni leggibili dei dati. Questa operazione può richiedere alcuni secondi, a seconda delle dimensioni del campione e
dell'hardware del computer.
IMPORTANTE!

A causa di una limitazione di Microsoft Excel, il software di visualizzazione non è in grado divisualizzare più di 1.048.576 righe di dati per foglio. Se un file di output dell'analisi dei dati per ilcampione corrente contiene un numero di righe di dati superiore a tale limite, saranno mostratesoltanto le prime 1.048.576 righe.
Se viene raggiunto questo limite, il programma visualizzerà un messaggio in cui viene specificato quale
foglio o quali fogli sono interessati da tale limitazione. Fare clic su OK per continuare.
Sebbene potrebbero non essere visualizzati tutti i dati, ciò non influirà sui grafici, che saranno
comunque accurati.

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IMPORTANTE!

I grafici vengono generati presupponendo una direzione di visualizzazione “da sinistra a destra”. Nei
Paesi in cui la normale direzione di lettura è “da destra a sinistra”, le impostazioni predefinite di Excel
potrebbero non essere compatibili, con la conseguente generazione di grafici non corretti. Per risolvere
questo problema, l'opzione di visualizzazione di Excel deve essere modificata a “da sinistra a destra”.
Tale opzione può essere impostata da Office > Excel Options (Opzioni di Excel) in Excel 2007, oppure
File > Options (Opzioni) in Excel 2010/2013. Selezionare Advanced (Impostazioni avanzate), quindi
scorrere verso il basso fino alle impostazioni di Display Settings (Visualizzazione). Modificare l'opzione
Default dirrection (Direzione predefinita) impostandola su left-to-right (Da sinistra a destra), quindi fareclic su OK. Alla successiva apertura di Excel, i fogli di lavoro verranno letti da sinistra a destra e il
software di visualizzazione genererà i grafici correttamente.
Qualora si verifichi un caso simile e per ulteriore assistenza, contattare l'Assistenza tecnica
Invivoscribe al numero +1 (858) 224-6600, dal lunedì al venerdì, dalle 7:00 alle 17:00 (fuso orariodel Pacifico), oppure inviare un'e-mail all'indirizzo support@invivoscribe.com.

4.9.

Se viene visualizzato il messaggio Complex Formatting (Formattazione complessa), fare clic su Yes (Sì).

4.10.

Salvataggio del file di visualizzazione. Al termine dell'elaborazione, viene visualizzato un messaggio che comunica che il
programma ha completato l'operazione. A questo punto, si raccomanda vivamente di salvare il file.

IMPORTANTE!

Quando si salva il file, occorre ricordarsi di selezionare Save As (Salva con nome) e scegliere una
cartella di lavoro Excel (XLSX o XLS), dal momento che se si seleziona Save (Salva) o si fa clic sul
pulsante con l'icona del dischetto il programma sostituirà la macro XLSM con la cartella di lavoro
corrente. Ciò richiederà la reinstallazione della macro con una nuova copia dal CD del software
per le analisi successive.

4.11.

Se viene visualizzato un messaggio di avviso relativo al salvataggio come cartella di lavoro priva di macro, fare clic sul pulsanteYes (Sì).

4.12.

La cartella di lavoro completata per IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK e TRG includerà gli 8 fogli di lavoro descritti nella Tabella
5.

Tabella 5. Fogli di lavoro inclusi nel file di output Excel.

Cartella di lavoro completata per IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK e TRG

Read Summary (Riepilogo delle read)Contiene un elenco delle 200 sequenze uniche più abbondanti, ordinate per conta, con indicazionedi:
A quale evento di ricombinazione V-J si adatta meglio ogni sequenzaSequenzaLunghezza della sequenza% effettiva delle read totali% cumulativa delle read totali indicata per tutte le read (solo TRG)% cumulativa delle read totali indicata per le 200 read più abbondanti (IGH/IGK)
In che misura la read copre il gene V bersaglio dei primer che è stato identificato (%)(IGH/IGK)
Sequenza CDR3 putativa
IGH FR1 indica anche:
Tasso di mutazione a gene V parziale (%)
IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 indica anche:Se si prevede che il riarrangiamento sia in frame (Y/N/n/a) (Sì/No/n/a). Se, a causa dellaqualità dell'allineamento, non può essere previsto l'uso del segmento genico V o J, il
software non sarà in grado di prevedere se il gene è in frame e il risultato sarà n/a.

Se si prevede che il riarrangiamento non contenga un codone di stop (Y/N) (Sì/No).
Quando non può essere fatta una previsione in frame, non è possibile prevedere conprecisione se è presente un codone di stop.

Sequenza CDR3 putativa

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Tabella 5. Fogli di lavoro inclusi nel file di output Excel.

Cartella di lavoro completata per IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK e TRG
Merged Read Summary(Riepilogo delle read sottoposte a merging)

Stesso formato del foglio di lavoro Read Summary (Riepilogo delle read), ma relativo alle sole 10
read più abbondanti dopo merging con le 500 read più abbondanti, se la differenza tra le read è disole 1 o 2 bp.

VJ Sequence Frequency Graph(Grafico di frequenza delle sequenze VJ)

Istogramma che mostra le frequenze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione
famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Usage(Uso di VJ)

Frequenze e conte grezze delle 200 ricombinazioni più abbondanti famiglia V – famiglia J (perIGH/IGK) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Usage Percent Graph(Grafico percentuale dell'uso di VJ)

Grafico 3D che mostra le frequenze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione
famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Usage Raw Graph(Grafico grezzo dell'uso di VJ)

Grafico 3D che mostra le conte grezze delle 200 sequenze più abbondanti di ogni ricombinazione
famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK) o gene V – gene J (per TRG).

VJ Sequence Frequency(Frequenza delle sequenze VJ)

Elenco “impilato” di tutte le possibili ricombinazioni famiglia V – famiglia J (per IGH/IGK) o gene V –gene J (per TRG), per ognuna delle quali è riportato un elenco ordinato delle 200 read più
abbondanti (dalla % più alta a quella più bassa).

Unique Reads(Read uniche)
Nota:
Nota:
Nota:
Nota:

File FASTA di sequenze uniche, ordinate per conta.

Nella tabella sopra, IGH si riferisce all'analisi di IGH FR1, IGH FR2 e IGH FR3. Nei grafici di frequenza relativi a questi geni bersaglio viene specificato
IGH soltanto nel titolo. Nella cartella di output dei dati è specificato quale delle regioni framework (FR) è stata analizzata dal software e questa
informazione è compresa nel campo della posizione del file di dati nella parte superiore del foglio di lavoro Read Summary (Riepilogo delle read).
L’analisi di IGK include inoltre informazioni relative ad altri elementi nel locus IGK coinvolti in ricombinazioni (IGKINTR e IGKDEL).
200 sequenze più abbondanti - Quando specificato sopra, i fogli di lavoro mostreranno le sequenze più abbondanti (fino a 200) per IGH FR1, IGH
FR2, IGH FR3 e IGK. Nel Read Summary (Riepilogo delle read) per TRG sono mostrate tutte le sequenze.
La “sequenza putativa CDR3” viene determinata mediante il confronto con un'esatta definizione di una sequenza CDR3. Qualsiasi mutazione dipunti di ancoraggio o interruzione dello schema di lettura determina un valore “not found” (non trovato).

IMPORTANTE!

Per le assegnazioni ai geni V/J riportate nel Read Summary (Riepilogo delle read) può talvolta essere
visualizzato il valore “none” (nessuna). Tali assegnazioni si basano sulla qualità del migliore
allineamento tra la read e i geni di riferimento. Se il valore del migliore allineamento è inferiore a
una determinata soglia di qualità, l'assegnazione al gene non può essere eseguita con un livello diaffidabilità sufficiente e verrà visualizzato come “none” (nessuna).

IMPORTANTE!

Il tasso di mutazione a gene V parziale (%) verrà visualizzato come “n/a” per IGH FR2 e IGH FR3.
La copertura del gene V è limitata a causa delle dimensioni ridotte degli ampliconi, che determina
calcoli imprecisi del tasso di mutazione.

 La colonna V-coverage (Copertura V) è un indicatore importante del livello di affidabilità con cui la read è stata assegnata
a un gene V. Se tale valore è inferiore al 90% (ovvero, la read sequenziata si sovrappone per meno del 90% al gene diriferimento), è altamente improbabile che questa read sia stata generata da un evento di ricombinazione V-J reale e può
essere considerata come un potenziale artefatto.
 Quando si analizza lo stato delle ipermutazioni somatiche dei campioni, concentrarsi sulle 4 read più abbondanti (per i
campioni monoclonali o biclonali limitarsi, rispettivamente, alle 2 o 4 read più abbondanti), poiché il tasso di
ipermutazione somatica (SHM) e le analisi in frame/dei codoni di stop sono i parametri più informativi per queste read.
A causa della natura priva di bias delle piattaforme NGS, vengono sequenziate e analizzate molte più read che non lesole 4 più abbondanti e la maggior parte di queste corrispondono a riarrangiamenti di ridotta abbondanza o possono
essere attribuite ad artefatti di amplificazione o sequenziamento. In questi casi, le analisi di SHM e in frame/dei codoni
di stop non sono utili nelle read non clonali.
 Si noti che Invivoscribe utilizza GRCh37 per le sequenze di riferimento e i risultati possono essere leggermente differentida altri database. Inoltre, molti pseudogeni e geni non funzionali non sono inclusi nell'analisi. Interpretare iriarrangiamenti con stati di ipermutazione somatica prossimi o corrispondenti al valore soglia del 2% con cautela, inparticolare quando si esegue il saggio IGH FR1, che riguarda solo una porzione della regione IGHV dal momento che lasequenza a monte del sito di legame del primer non verrà esaminata.

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5. Assistenza tecnica e Assistenza clienti
I nostri clienti sono molto importanti per noi. Saremo lieti di assistervi nella comprensione del presente software e offriamo
assistenza tecnica continua dal lunedì al venerdì per garantire che i saggi vengano eseguiti sempre con la massima efficienza
nel vostro laboratorio.
Contatti
Invivoscribe, Inc
10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | Stati Uniti d'America
Tel.: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Orario d’ufficio: 7:00 – 17:00 (fuso orario del Pacifico)Assistenza tecnica: support@invivoscribe.com | Servizio cliente: sales@invivoscribe.com | Sito web: www.invivoscribe.com

6. Simboli
Sulle etichette dei prodotti basati su NGS Invivoscribe sono utilizzati i seguenti simboli.
Numero di catalogo

Data di scadenza

Volume del reagente

Rappresentante autorizzato nella
Comunità europea

Numero di lotto

Consultare le istruzioni per l'uso

Condizioni di conservazione

Per uso diagnostico in vitro

Identificatore Dispositivo Univoco

Produttore

Conformità Britannica Valutata

Persona responsabile nel Regno Unito

Rappresentante Autorizzato per laSvizzera

Conformità Europea

7. Domande frequenti sul software
D1:

Quando viene selezionato Launch Program (Lancia programma), comprare il seguente errore (o uno simile):
Application terminated with error: Cannot run program “.\resources\Parse_TRG_PGM.exe”: CreateProcess error=2, the system cannot find thefile specified. (Applicazione terminata con errore: impossibile eseguire il programma “.\resources\Parse_TRG_PGM.exe”: CreateProcess error=2,
errore CreateProcess=2, il sistema non riesce a trovare il file specificato.)
For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support. (Per indicazioni su questo errore, rivolgersi all'Assistenza tecnica
Invivoscribe.)

R1:

Il file compresso del programma è stato decompresso (vedere la sezione 1: Installazione del software)? Questo errore si
verifica in genere quando si cerca di eseguire il programma prima della decompressione del relativo file. Windows permettedi visualizzare il contenuto di un file zip facendo semplicemente doppio clic sul file; il contenuto appare completo e
funzionante, ma il programma non può essere eseguito correttamente da questo stato.

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D2:

Perché il Read Summary (Riepilogo delle read) dell'analisi di IGH e/o IGK contiene meno di 200 read?

R2:

Il programma LymphoTrack Dx – S5/PGM esegue l'allineamento delle 200 read più abbondanti durante l'analisi, tuttavia nel
Read Summary (Riepilogo delle read) sono riportate soltanto le read che sono state allineate a un gene
V o J presente nel riferimento. Se una read non può essere allineata al riferimento, non viene inclusa nel Read Summary(Riepilogo delle read).
I possibili motivi del mancato allineamento al riferimento sono numerosi, ma in genere dipendono da un problema con il
campione che determina una grande quantità di amplificazioni aspecifiche. Questo evento può essere causato da un basso
numero di cellule target nel campione, condizioni di PCR inadeguate o tipi di campioni di bassa qualità, come materiale
fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) frammentato. Per ridurre la probabilità che tali eventi si verifichino, si
raccomanda di seguire esattamente le istruzioni per l'uso.

D3:

Perché nella tabella del Read Summary (Riepilogo delle read) è riportato “none” (nessuna) per l'assegnazione a V o J?

R3:

Per l'assegnazione di una read a un gene V e/o J specifico, è necessario che durante l'allineamento venga raggiunta una
soglia minima di qualità. Se l'allineamento è scadente, l'assegnazione non può essere eseguita con un livello di affidabilitàsufficiente e quindi viene etichettata come “none” (nessuna). Si noti che a una read non può essere assegnato il valore“none” (nessuno) per entrambi i geni V e J, dal momento che in una situazione del genere non sarebbe inclusa nel report,
in base alla condizione illustrata nella domanda 2.

D4:

Nel mio “VJ Sequence Frequency Graph” (Grafico di frequenza delle sequenze VJ) sono riportati valori strani sull'assedelle ordinate (y). Il valore “% total reads” (% read totali) è nell'ordine dei milioni, come è possibile?

R4:

Verosimilmente ciò è dovuto all'esecuzione del programma LymphoTrack Dx utilizzando il separatore decimale errato perla propria area geografica. Vedere la sezione 2: Esecuzione dell'applicazione Data Analysis, in particolare riguardo alla
selezione de separatore decimale.

D5:

Tutti i fogli di lavoro con grafici sono vuoti, ma i fogli di lavoro senza grafici contengono dati. Cosa è successo ai grafici?

R5:

Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che la direzione predefinita del programma Excel che si sta usando va “da destra asinistra” invece che “da sinistra a destra”. Se le etichette delle colonne su un foglio di lavoro vuoto iniziano con la “A” adestra del foglio, cambiare direzione impostandola su “da sinistra a destra” prima di utilizzare la macro di visualizzazione
dei dati. Per modificare questa impostazione, andare alle Excel Options (Opzioni di Excel) tramite il pulsante Office situato
nell'angolo in alto a sinistra, fare clic su Impostazioni avanzate e scorrere verso il basso fino alla sezione Display Options(Visualizzazione). Qui è presente un'opzione chiamata Default direction (Direzione predefinita) e la selezione di left-to-right(Da sinistra a destra) farà sì che le successive visualizzazioni dei dati avvengano correttamente. Nota: questa operazione
modifica permanentemente la direzione fino a che l'impostazione non viene nuovamente modificata. La chiusura di Excel
non annulla questa modifica.

D6:

Perché i risultati dell'analisi sembrano contenere meno read di quanto atteso?

R6:Se, in base al Read Summary (Riepilogo delle read), le read totali analizzate sono molto poche o pari a zero, assicurarsi diaver selezionato il tipo di analisi corretto (IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK o TRG) al momento dell'esecuzione delLymphoTrack Dx Software – S5/PGM. Se il numero di read totali sembra molto ridotto, confrontare le dimensioni dei file
FASTQ che si stanno analizzando con le dimensioni dei file FASTQ presenti sullo strumento Ion S5 o Ion PGM. Se lo strumento
Ion S5 or Ion PGM contiene file di dimensioni maggiori, sarà necessario trasferire nuovamente i dati di sequenza per
garantire l'analisi del set di dati completo.
Il sequenziatore Ion S5 o Ion PGM visualizza diversi messaggi durante l'elaborazione dei dati di sequenziamento. Un
messaggio potrebbe indicare “Sequencing Complete” (Sequenziamento completato) e un altro, in seguito, potrebbe
indicare “Analysis Complete” (Analisi completata). Il trasferimento dei dati FASTQ nel periodo che intercorre tra questi due
messaggi potrebbe determinare un'analisi incompleta con LymphoTrack Dx.

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D7:

Perché tra le dieci read più abbondanti del Read Summary (Riepilogo delle read) compare una read che non è presente
nel Merged Read Summary (Riepilogo delle read sottoposte a merging)?

R7:

La read “scomparsa” potrebbe essere stata combinata con una read di frequenza superiore, oppure è possibile chel'allineamento di questa read fosse di qualità eccezionalmente scadente. Durante il processo di merging, le read incluse nel
Read Summary (Riepilogo delle read) vengono allineate con quelle presenti nel file delle read uniche; tuttavia, le readincluse nel Read Summary (Riepilogo delle read) sono state orientate in modo da coincidere con l'allineamento delriferimento e potrebbero trovarsi nell'orientamento antisenso rispetto al gene di riferimento. Ciò si verifica soltanto quando
l'allineamento è di qualità molto scadente e quando l'allineamento nell'orientamento senso o antisenso è pressoché
equivalente, con l'allineamento nell'orientamento antisenso che si è rivelato leggermente migliore. In tali casi, è meglio
ignorare completamente la read.
IMPORTANTE:

Per stabilire se vi è evidenza di clonalità, possono essere utilizzate solo le read del Merged Read
Summary (Riepilogo delle read sottoposte a merging).

D8:

Perché l'analisi richiede molto tempo (oltre un'ora per campione)?

R8:

Nel file di registro è possibile vedere in dettaglio quando tempo sta richiedendo ogni passaggio. Dopo la linea “INFO:
Decompressing files” (INFORMAZIONE: decompressione file in corso) è presente un'altra linea che indica quanti file sono
stati decompressi e quanto tempo ha richiesto la decompressione. Questo numero è espresso in millisecondi. Se ladecompressione sta richiedendo diverse ore, verificare se i file di interesse sono su un file server. Tipicamente, l'esecuzione
di processi intensivi di I/O come la decompressione è molto più lenta su rete. Se possibile, copiare i file sul computer locale
o decomprimere direttamente i file prima di eseguire questo software. Assicurarsi che i file compressi e decompressi non
siano entrambi presenti nella stessa cartella. Il software non procede se nella cartella di destinazione si trovano sia i file
FASTQ che i file FASTQ.GZ.
Se le successive fasi di parsing e di analisi richiedono molto tempo, è possibile che i file FASTQ siano molto grandi. Ad
esempio, si ottengono file FASTQ di grandi dimensioni quando in una singola corsa Ion S5 o Ion PGM sono inclusi meno di
12 indici e quindi i campioni sequenziati presentano una maggiore profondità di copertura, oppure nel caso in cui la libreria
non sia bilanciata e contenga una percentuale maggiore di un campione con un indice rispetto alla percentuale di campioni
con altri indici. Il tempo di esecuzione previsto indicato nelle presenti Istruzioni per l'uso presuppone una corsa con 12
indici con librerie bilanciate.

D9:

Perché nella cartella di output dell'analisi mancano i report PDF?

R9:

Il computer potrebbe aver esaurito lo spazio disponibile sul disco rigido. Assicurarsi che ci sia spazio sufficiente sul disco
rigido (almeno 80 GB) prima di iniziare l'analisi. Se questo errore si ripresenta, contattare l'assistenza tecnica.

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D10:

Qual è la risoluzione per un errore quando si avvia il software LymphoTrack Dx – S5/PGM facendo doppio clic sul filestartLymphoTrackDxS5-PGM.jar?

R10:

Clicca sul menu di Windows e digita Settings (Impostazioni) nella barra di ricerca, quindi seleziona la prima icona
visualizzata.

2.

3.

1.2.

Nella barra di ricerca della nuova finestra, digita Add or remove programs (Aggiungi o rimuovi programmi) e
seleziona la prima opzione che appare.

1.3.

Scorri l'elenco dei programmi installati.
•

Se nell'elenco è presente un programma con un nome che inizia con le lettere Java 8 e termina con i caratteri
64 bit, è installata la versione corretta di Java.

•In caso contrario, è necessario installare Java 8 a 64 bit; passare alla sezione 3.

Disinstallare le vecchie versioni di Java:
2.1.

Segui i passaggi 1.1 e 1.2.

2.2.

Scorri l'elenco dei programmi installati. Identifica qualsiasi programma che inizia con le lettere Java e contiene
anche le lettere Java 8 e 64-bit, fai clic sulla voce nell'elenco, quindi fai clic su Uninstall (Disinstalla).

Disinstalla Java e reinstalla Java:Se è installata la versione corretta di Java e il software non si apre ancora, disinstallare e reinstallare Java.

4.

3.1.

Segui i passaggi 1.1 e 1.2.

3.2.

Scorri l'elenco dei programmi installati e clicca sulla voce con il nome Java 8 che termina con i caratteri 64-bit,
quindi clicca su Uninstall (Disinstalla).

3.3.

Passare al sito Web Java per scaricare il software Java 8 a 64 bit direttamente da Oracle all'indirizzo
http://www.java.com/.

3.4.

Segui le istruzioni per installare il software.

Puntare il file JAR sull'eseguibile Java corretto:
4.1.

Fare clic con il tasto destro sul file startLymphoTrackDxS5-PGM.jar, quindi selezionare Properties (Proprietà).

4.2.

Nella finestra di dialogo che appare, seleziona il pulsante Change (Modifica) accanto opens with (all'aperturacon) testo.

4.3.

Nella finestra di dialogo successiva che appare, seleziona Choose another app (Scegli un'altra app).

4.4.

Nella nuova finestra che si apre, fai clic su More apps (Altre app), quindi seleziona Look for another app on thisPC (Cerca un'altra app su questo PC).

4.5.

Nella finestra di navigazione che appare, vai alla posizione della cartella dell'installazione di Java 8 a 64 bit.
•

Probabilmente sarà: Local Disk (C:) > Program Files > Java > jre1.8.0_(version number) > bin (Disco
locale (C:) > Programmi > Java > jre1.8.0_(numero di versione) > bin).

4.6.

Seleziona javaw.exe e fai clic su Open (Apri).

4.7.

Una volta confermata l'installazione, ripetere la sezione da 4.1 a 4.3 e selezionare la casella di controllo che
indica Always open .jar files with this app (Apri sempre i file .jar con questa app), quindi accedere allo stesso filejavaw.exe dal passaggio 4.6. Ciò consentirà al software LymphoTrack Dx di aprirsi correttamente.

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Contratto di licenza con l'utente finale
IL PRESENTE CONTRATTO DI LICENZA CON L'UTENTE FINALE DEVE ESSERE ACCETTATO DA UN RAPPRESENTANTE AUTORIZZATO DELL'UTENTE FINALE DI QUESTO PRODOTTO
PRIMA DELL'USO DEL SOFTWARE LYMPHOTRACK® DX (il “Software”). UTILIZZANDO IL SOFTWARE LYMPHOTRACK® DX, L'UTENTE DICHIARA DI ESSERE UN RAPPRESENTANTEAUTORIZZATO DELL'UTENTE FINALE CON L'AUTORITÀ DI SOTTOSCRIVERE IL PRESENTE CONTRATTO. LEGGERE ATTENTAMENTE IL PRESENTE CONTRATTO. UTILIZZANDO IL
SOFTWARE, L'UTENTE ACCETTA DI ESSERE VINCOLATO AI TERMINI DEL PRESENTE CONTRATTO. SE L'UTENTE NON ACCETTA I TERMINI DEL PRESENTE CONTRATTO, È PREGATODI INTERROMPERE L'UTILIZZO DEL SOFTWARE. SE L'UTENTE ACCETTA LE CONDIZIONI DEL PRESENTE CONTRATTO PER CONTO DI SE STESSO E/O DELL'ENTITÀ CHE
RAPPRESENTA PUÒ CONTINUARE A UTILIZZARE IL SOFTWARE.
Il presente Contratto di licenza con l'utente finale (End User License Agreement, “EULA”) è stato redatto e sottoscritto da INVIVOSCRIBE, INC, una società con sede in California,(“Licenziante”) e l'utente del Software (una persona fisica o giuridica), il “Licenziatario” per la licenza e l'uso del Software del Licenziante. Il Licenziatario riconosce e accetta che
il diritto del Licenziatario di utilizzare il Software in qualsiasi modo sarà regolamentato dal presente EULA e che tale uso dovrà essere rigorosamente in conformità con i termini
e le condizioni del presente EULA.
1.

CONCESSIONE DI LICENZA. Il Licenziante concede al Licenziatario una licenza non esclusiva, non trasferibile e limitata, senza diritto di cessione in sublicenza, di utilizzare il Software,qualsiasi documentazione scritta ad esso allegata e qualsiasi documento o altro contenuto che includa informazioni contenute nel Software (collettivamente, il “Prodotto”)
esclusivamente per uso interno del Licenziatario. Fatto salvo quanto concordato in un documento firmato dal Licenziante, la licenza del Software concessa nella frase precedente èlimitata all'uso con i saggi LymphoTrack® Dx del Licenziante acquistati presso il Licenziante o un distributore autorizzato del Licenziante. Il Licenziante si riserva tutti i diritti nonespressamente concessi al Licenziatario. La licenza limitata concessa dal presente EULA e il pagamento da parte del Licenziatario degli oneri di licenza conferiscono al Licenziatario il
diritto di utilizzare il Prodotto solo in conformità ai termini del presente EULA. Questa licenza non è una vendita del software originale o di una sua copia.
2. RISERVATEZZA. Il Licenziatario accetta che il Prodotto è di proprietà del Licenziante e si basa su e include la proprietà intellettuale del Licenziante, inclusi, a titolo esemplificativo, ma
non limitativo, uno o più segreti commerciali, copyright, domande di brevetto e/o brevetti concessi (“Proprietà intellettuale”) del Licenziante. Il possesso e l'uso del Prodotto da partedel Licenziatario devono essere strettamente conformi al presente EULA e il ricevimento o il possesso non conferiscono alcun diritto a divulgare, riprodurre o consentire ad altri diutilizzare il Prodotto al di fuori dei termini del presente EULA senza la specifica autorizzazione scritta del Licenziante. Il Licenziatario si impegna a non divulgare, pubblicare, tradurre,rilasciare o distribuire copie del Prodotto o parte di esso ad altri al di fuori dei termini del presente EULA. Il licenziatario non può modificare, adattare, tradurre, decodificare,decompilare, disassemblare o creare opere derivate basate sul Prodotto o parte di esso, compresi eventuali documenti o altri contenuti prodotti utilizzando il software.
3. PROPRIETÀ DEL PRODOTTO. La titolarità, la proprietà e tutti i diritti e gli interessi nel Prodotto, qualsiasi sua copia e la “Proprietà intellettuale” a esso relativa, rimangono
permanentemente attribuiti al Licenziante, e il presente EULA non concede alcun diritto di proprietà al Licenziatario.
4. RESTRIZIONI DI COPIA. Il Prodotto è protetto da copyright. La copia o la modifica non autorizzata del Prodotto, compresi - a titolo esemplificativo e non esaustivo - i casi in cui il
software sia stato modificato, unito o incluso con altro software, sono espressamente vietate. Il Licenziatario può essere ritenuto legalmente responsabile per qualsiasi violazionedel copyright causata da o riconducibile al mancato rispetto da parte del Licenziatario dei termini del presente EULA.
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nessun caso il Licenziatario può trasferire, assegnare, noleggiare, cedere in leasing, vendere o altrimenti disporre del Prodotto, o di una qualsiasi sua parte, in via temporanea,
salvo nei casi espressamente previsti nel presente documento.
6. RISOLUZIONE. Questo EULA verrà risolto automaticamente senza preavviso se il Licenziatario non si attiene a una qualsiasi delle sue disposizioni.
7. GARANZIA LIMITATA. IL PRODOTTO, INCLUSO IL SOFTWARE E LA DOCUMENTAZIONE SCRITTA AD ESSO ALLEGATA, COMPRESE LE ISTRUZIONI PER L'USO, VENGONO FORNITI“COSÌ COME SONO”, SENZA GARANZIE DI ALCUN TIPO E IL LICENZIATARIO NON RICONOSCE NESSUN'ALTRA GARANZIA, SIA ESSA ESPRESSA, IMPLICITA O DI LEGGE, INCLUSE
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8. RESPONSABILITÀ LIMITATA. NELLA MISURA MASSIMA CONSENTITA DALLA LEGGE, IN NESSUN CASO IL LICENZIANTE SARÀ RESPONSABILE PER EVENTUALI PERDITE DI PROFITTIO OPPORTUNITÀ COMMERCIALI, PERDITA DI UTILIZZO, PERDITA DI RICAVI, PERDITA DI AVVIAMENTO, INTERRUZIONE DELL'ATTIVITÀ, PERDITA DI DATI O QUALSIASI ALTRODANNO INDIRETTO, SPECIALE, INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE IN BASE A QUALSIASI TEORIA DI RESPONSABILITÀ, SIA ESSA BASATA SU RESPONSABILITÀ CONTRATTUALE,RESPONSABILITÀ EXTRACONTRATTUALE, NEGLIGENZA, RESPONSABILITÀ DA PRODOTTO O ALTRO. POICHÉ ALCUNE GIURISDIZIONI NON CONSENTONO L'ESCLUSIONE O LA
LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ PER DANNI CONSEQUENZIALI O INCIDENTALI, LA LIMITAZIONE PRECEDENTE POTREBBE NON ESSERE APPLICABILE AL LICENZIATARIO. LA
RESPONSABILITÀ DEL LICENZIANTE AI SENSI DEL PRESENTE EULA NON SARÀ, IN NESSUN CASO, INDIPENDENTEMENTE DAL FATTO CHE IL RECLAMO SIA BASATO SURESPONSABILITÀ CONTRATTUALE, RESPONSABILITÀ EXTRACONTRATTUALE, RESPONSABILITÀ OGGETTIVA O ALTRO, SUPERIORE AGLI EVENTUALI ONERI DI LICENZA PAGATI DALLICENZIATARIO PER IL SOFTWARE. LE LIMITAZIONI DI CUI SOPRA SI APPLICANO INDIPENDENTEMENTE DAL FATTO CHE IL LICENZIANTE SIA STATO AVVISATO DELLA POSSIBILITÀ
DI TALI DANNI E INDIPENDENTEMENTE DAL FATTO CHE EVENTUALI RIMEDI NON RAGGIUNGANO IL LORO SCOPO ESSENZIALE.
9. RIMEDIO ESCLUSIVO. Il rimedio esclusivo del Licenziatario e l'intera responsabilità del Licenziante per la violazione da parte del Licenziante del presente EULA saranno limitati, aunica ed esclusiva discrezione del Licenziante, a: (i) la sostituzione di qualsiasi Software difettoso o documentazione correlata; o (ii) il rimborso del corrispettivo pagato al
Licenziante per il Software.
10. LEGISLAZIONE APPLICABILE. Il presente EULA è regolato dalle leggi dello Stato della California, indipendentemente dai suoi conflitti con principi di legge, e il Licenziatario
acconsente alla giurisdizione da parte di tribunali statali e federali situati nello Stato della California.
11. ACCORDO COMPLETO. Il presente EULA costituisce l'intero accordo tra il Licenziante e il Licenziatario in relazione ai termini specifici qui enunciati relativi alla licenza e allegaranzie del Prodotto e qualsiasi altro termine o obbligo inclusi. Il presente EULA sostituisce tutte le precedenti intese e accordi, sia scritti che orali. Il presente EULA non può
essere modificato a meno che il Licenziante e il Licenziatario non acconsentano a tale modifica per iscritto.
12. DIVISIBILITÀ. Se per qualsiasi motivo un tribunale di giurisdizione competente dovesse ritenere che una disposizione o parte di una disposizione del presente EULA sia
inapplicabile, tale parte o disposizione deve essere applicata nella misura massima consentita dalla legge in modo da influire sull'intento delle parti, e la restante parte dell'EULA
continuerà ad avere piena validità ed efficacia.
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280465 Rev. F | Marzo 2023