レアミューテーション検出
ベストプラクティスガイドライン目次
１

はじめに ........................................................................................................................................... 1

PrimePCR™ ddPCR™遺伝子変異検出アッセイ ..................................................................... 1
ミューテーション検出アッセイの検出限界 ............................................................................. 2
検出限界と３の法則（Rule of Three） .................................................................................... 5２

実験のセットアップ......................................................................................................................... 6

変異検出反応のセットアップ ................................................................................................... 6
変異検出のための適切な実験の実施 ........................................................................................ 6
実験環境の確認 ......................................................................................................................... 7
野生型（変異陰性）ウェル ....................................................................................................... 7
変異陽性コントロールウェル ................................................................................................... 7
測定（サンプル）ウェル .......................................................................................................... 8
制限酵素による消化 .................................................................................................................. 9
FFPE 臨床サンプルの UDG 処理............................................................................................ 10３

予備実験 ..........................................................................................................................................11

ノンテンプレートコントロール（NTC）を用いた適切な実験の評価 ....................................11
偽陽性率（FPR）の推定 .........................................................................................................11
実験に基づく検出限界の決定 ................................................................................................. 12
未知のサンプルのテスト ........................................................................................................ 14４

データ解析 ..................................................................................................................................... 15

データの質の評価 ................................................................................................................... 15
陽性サンプルの確実なコール ................................................................................................. 19
定性的陽性サンプルのコール ................................................................................................. 20
５

トラブルシューティングとよくある質問（FAQ）........................................................................ 21
附属書 A：PrimePCR™ ddPCR™変異検出アッセイを使用する反応のセットアップ................. 24
附属書 B：ヒト DNA の場合の質量（ナノグラム）からコピー数への変換 ................................. 26
附属書 C：モル濃度からコピー数への変換 .................................................................................. 27
附属書 D：感度の高い検出限界のためのサンプルプレートのレイアウト ................................... 28
附属書 E：DNA 量に伴う偽陽性率の変化 ..................................................................................... 29

１ はじめにPrimePCR™ ddPCR™ 遺伝子変異検出アッセイ
レアミューテーション検出（Rare Mutation Detection; RMD）とは、野生型（WT）バックグラウンドプールに非常に低い頻度で存在するバリアント配列を検出することです。RMD を行う場合、高い類似性を示す２つの配列があり、そのうちの１つが他方に比べて著しく豊富に存在する場合に、この２つを識別することはかなり困難です。
RMD アッセイの一例として癌生検サンプル中の低頻度一塩基変異の検出などが挙げられます。
バイオ・ラッドでは癌変異に関してその有効性が確認されている RMD アッセイキッ
トとして PrimePCRTM ddPCRTM 遺伝子変異検出用キットを提供しています。このキットにはプライマー１セットと対立遺伝子に対する 2 種類のプローブが含まれており、１つは野生型（HEX）を検出し、１つは変異型（FAM）を検出します（図 1A）。
このアッセイキットで混合サンプルの試験を行う場合、典型的な２D プロット
（図 1B）
は次のような４つのドロップレットのクラスターを含みます：（１）ターゲット DNA
テンプレートを含まないダブルネガティブのドロップレット（灰色の丸）；（２）WT
のみのドロップレット（緑色の丸）；（３）ミュータント（MT）のみのドロップレット（青色の丸）；（４）WT および MT DNA テンプレート両方を含むダブルポジティブのドロップレット（オレンジ色の丸）。WT および MT テンプレートの濃度は、各クラスター中のドロップレットの数に基づいて計算されます。
ドロップレットは両方のテンプレートを含む

変異＼FAM の蛍光強度

ドロップレットは変異型
テンプレートのみを含む

標的 DNA
野生型/HEX の蛍光強度
ドロップレットはテンプ
ドロップレットは野生型
レートを含まない
テンプレートのみを含む

図１. 変異アッセイの特徴。Ａ. FAM と HEX による対立遺伝子のミューテーションアッセイの概略図
Ｂ. ２D 散布図内の様々なテンプレートのドロップレットの場所の例

1

PrimePCRTM ddPCRTM 遺伝子変異検出用キットは実験室レベルの研究において、1 ウ
ェル内の WT DNA に対し、変異型 DNA 0.1%の存在比を検出できることが確認されています。一般的に、複数のウェルを測定することによってさらに優れた 0.005～0.1%の感度を得ることができます。この有効性が確認された PrimePCRTM ddPCRTM 遺伝
子変異検出用キットに加え、弊社では発生頻度の低い COSMIC（Catalogue of Somatic
Mutations in Cancer）変異のための、in silico 上で有効性が確認された変異検出アッ
セイキットも提供しています。
このガイドではバイオラッドの PrimePCRTM ddPCRTM
遺伝子変異検出用キットを元に解説を行いますが、ユーザーが作成したミューテーシ
ョン検出アッセイにも同じ原理が当てはまります。

ミューテーション検出アッセイの検出限界
RMD 実験では、検出限界（Limit of Detection; LOD）がどの程度なのかという疑問がよく議題となります。LOD は WT（変異陰性）コントロールから確実に識別される最も低い変異型濃度と定義されます。LOD はアッセイデザインだけの問題ではなく、多くの実験要因によって変わってきます。
１. アッセイの特異性 — WT 配列から変異型（MT）を識別する試験性能は非常に重要です。もし MT プローブが WT ターゲットと交差反応する場合は、WT のみのクラスターとダブルポジティブのクラスターの分離が低下します。この結果として
図 1B にある４つのエリアにドロップレットを明確に割り当てる事が困難になります（図 2）。また WT 濃度が上昇しても分離に悪影響がでます。
適切にデザインされたアッセイは高い WT 濃度に耐えることができ、一定の反応液量で優れた感度を実現するためにより多くのコピーをスクリーニングすることができます。全ての検証済み PrimePCRTM ddPCRTM 遺伝子変異検出用キットは、
20 μl の反応において 130 ng までのヒトゲノム DNA（gDNA）（40,000 コピー）測定において最良のパフォーマンスを発揮します。
Ｂ. 良好なアッセイデザイン

野生型/HEX

野生型/HEX

野生型/HEX

野生型/HEX

変異/FAM

変異/ FAM野生型 gDNA
インプット量変異/ FAM

Ａ. 不良なアッセイデザイン

野生型/HEX

野生型/HEX

図２. アッセイデザインおよび DNA 量に応じたクラスター分離。 DNA 添加量に応じたクラスターの分離例（赤色の矢印）：A. デザイン不良のアッセイを使用した場合と、B. 良好にデザインされたアッセイを使用した場合の比較。DNA 添加量が増えるに従い、ダブルポジティブクラスターと野生型クラスターの分離は低下する。

2

２. サンプルの品質 — 大部分のケースでは、サンプルの量と品質が LOD の決定要因となります。例えば、1 ml の血液から増幅可能な 3,000 ゲノム等量が抽出された
場合、このサンプルでは 1/3,000 より優れた LOD を達成することは不可能です｛附属書 B：ヒト DNA の場合の質量（ナノグラム）からコピー数への変換｝。加えてサンプルの種類および調製方法は利用できる増幅可能なコピー数に影響をあたえる場合があります。細胞株 DNA は比較的損傷が少なく、分離、効率、クラスター
分布に関して最適な結果をもたらします。
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、バイサルファイト処理された gDNA
（BSC）
、セルフリーDNA（cfDNA）のようなサンプルでは DNA が複数箇所の損傷を受けている場合が多く、これはクラスターの振れ幅や見た目を変化させ、また分離に影響を与え、その結果 LOD に多大なる影響を与える可能性があります（図３）。さらにホルマリン固定は C>T 変換アーチファクトを引き起こし、これは LODに悪影響を及ぼします。

変異/FAM

細胞株

野生型/HEX

野生型/HEX

野生型/HEX図３. DNA サンプルの種類と品質に起因するクラスター分離の変化。同じ変異検出アッセイでも細胞株
DNA（Ａ）、FFPE サンプル（Ｂ）、またはセルフリーDNA（Ｃ）を使用した場合でクラスター分離は大きく異なる。

変異/FAM 蛍光強度

１. 阻害物質 — lysis buffer に使用される界面活性剤などの強力な PCR 阻害因子はドロップレットクラスターの場所を変化させうるものであり、感度が失われる原因となります。劣化した DNA が過剰に存在すると PCR 反応を阻害し、感度を低下させます。例えば FFPE サンプルは PCR 阻害物質を含む可能性があるだけでなく、多くの場合で増幅可能なサンプルは 10%未満に劣化しています（UV 吸収または DNA 色素結合法によって測定した場合）。
図 4 に示すように、通常は希釈またはサンプルの添加量を少なくすることにより、この問題は解決できます。

野生型/HEX 蛍光強度

野生型/HEX 蛍光強度

図４. 阻害物質によって変化するクラスター分離。このサンプルは蛍光強度を減少させうる阻害物質を含み、これによりクラスター分離および定量に影響が出ている。クラスター分離はサンプルを希釈することにより改善されるケースが多い（5 μl と 2 μl の比較）。

3

2. 偽陽性ドロップレット — 偽陽性ドロップレットには２つの種類があります：1
つはノンテンプレートコントロール（テンプレート非含有コントロール：NTC）に見られるもので、コンタミネーションを示唆します。もう一つは WT（変異陰性）コントロールのみに見られるものです（図 5）。偽陽性ドロップレットはLOD に悪影響を及ぼし、MT 濃度が低い場合、偽陽性率は非常に低い LOD と正確な定量性を得るための最重要ファクターとなります。偽陽性ドロップレットの原因については下記に詳細を示しますが、これには実験室内の汚染または試薬の汚染、ドロップレット取り扱い方法の問題、サンプル品質の問題、ポリメ
ラーゼによって誘発されるエラー、テンプレートの配列、そして装置に起因するものなど複数の要因が挙げられます。
Ａ. サンプルの取扱い：偽陽性の主な発生理由の一つに試薬および作業スペースの汚染があります。こうした偽陽性は NTC で最も顕著に現れますが、サンプルウェルにも存在します（図 5A）。NTC で認められる偽陽性シグナルのもう一つの発生理由は、ドロップレットの取扱いに問題があって生じた不均
一なドロップレットです（図 5B）。
Ｂ. サンプルの種類と品質：特殊な DNA 配列や DNA 損傷は、ポリメラーゼによって誘発されるエラーにつながるため、野生型（変異陰性）コントロールでの偽陽性ドロップレット増加の原因となる可能性があります（図 5C）。例
えば、ホルマリン固定はシトシンの脱アミノ化によって C>T 移行を引き起こします。FFPE サンプルのウラシル DNA グリコシラーゼ（UDG またはUNG）処理は、ホルマリン固定によって誘発される偽陽性シグナルを防ぐことができます。このため、当社は RMD に関して分析される FFPE サンプ
ルには UDG 添加を推奨しています。
偽陽性率を推定するためには、WT DNA のみを含む最低３種類の陰性コント
ロールを測定することが推奨されます。この時の WT コントロールの濃度は、テストサンプルと同等の濃度、または複数の濃度とします。例えば 1 ウェル
あたり約 130 ng のサンプルをアプライする場合、その濃度に対し 130 ngの WT DNA を用いる３種類の陰性コントロールウェルを設定する必要があります。WT DNA コントロールは、テストされるサンプルと類似のソースから入手し、同じサンプル調製法によって抽出されたものであることが理想です。例えば FFPE サンプルをテストするのであれば、理想的には WT コント
ロールも FFPE サンプルであるべきです。詳細は附属書 E：DNA 量に伴う偽陽性率の変化を参照下さい。

Ｂ. ノンテンプレートコントロール

野生型/HEX

野生型/HEXＣ. 野生型（WT）のみ

変異/FAM

Ａ. ノンテンプレートコントロール

野生型/HEX

図５. ノンテンプレートコントロール（NTC）と WT（変異陰性）コントロールに認められる偽陽性。A. NTC
における汚染の兆候；B. 正しいハンドリングが行われなかったドロップレットの兆候、分裂（下側の枠内）と融合（上側の枠内）ともに 45°の軸上に存在する；C. WT（変異陰性）コントロールにおける偽陽性ドロップレット。

4

3. エラー — LOD はアッセイデザインが適切でない場合の内因性エラー、サンプルの取扱いに起因する外因性エラー、そして確率論的なエラーなどによる影響を受けます。変異検出実験におけるエラーは、さらにサブサンプリングエラー
およびポアソンエラーのような追加の発生源による影響も複合的に受けます。
ポアソンエラーはテクニカルリプリケートにより改善され、一方でトータルエ
ラーは人的エラーおよびバイオロジカルエラーを検討する必要があります。エラー関する更に詳細な考察については、Droplet Digital™ PCR Application
Guide、bulletin 6407 附属書 B をご参照ください。

検出限界と３の法則（Rule of Three）
ddPCR において LOD を決める重要な要因はスクリーニングされるサンプルの量であり、使用された任意の量のサンプルに関して理論上の LOD を推定する有用な手法の一つが３の法則（Rule of Three：下記枠内参照）です。例えば 10 ng の増幅可能なヒト gDNA（～3,000 コピー）を 1 ウェル内にてアッセイさせた場合、スクリーニング
される 3,000 コピーのうち 3 つの陽性事象（感度 0.1%）がこの反応の理論上の LODとして必要となります。表１は３の法則（Rule of Three）に基づいて特定の LOD を達成するために必要な開始材料の量を示します。
サンプル添加量に基づく反応の LODの理論上の推定値については Appendix B をご参照ください。ただし、上述の実際のアッセイや実験に関する因子が理論上の LOD の達成を妨げることになることにも留意してください。
LOD と３の法則（Rule of Three）
離散的な事象を検証できるポアソンの法則によると、定量可能な独立した事象がランダムに分布している場合、それらの事象が起こる可能性を確率論的に予測することが可能です。この時ポアソンの法則では、分子の数と分割に基づいて既知の平均発生率における分散の程度を予測します（95%信頼区間）。サンプルの発生頻度が1/1,000 である場合、信頼水準 95%を得るためには 3,000 の事象のうち３事象を同定する必要があり、従って３の法則（Rule of Three）となります。
表１. 検出限界を決定するために必要とされる最低初期サンプル必要量*
必要な開始材料（ヒト）
ドロップレ
ウェルの数
ットの数
LOD
合計コピー数２倍体細胞数DNA の量
1,000 に１つ
3,000
1,500
1,500
1
0.010 g
10,000 に１つ
30,00015,00015,0001
0.10 g
100,000 に１つ
300,000
150,000
150,0008
1.0 g* この値はアプライするコピー数を１ウェルにつき 2,000 コピー/μl（cpm）、１ウェルにつき
15,000 個のドロップレットと仮定している。

5

２ 実験のセットアップ

変異検出反応のセットアップ
最適な変異検出実験を行うためには次のような戦略が必要になります（表２）。これらの詳細は後ほど詳しく考察します。
表２： 最適な実験デザイン戦略
構成要素
ノンテンプレートコントロール(NTC）ウェル
野生型（変異陰性）のみのコントロールウェル
変異陽性コントロールウェル
実験（サンプル）ウェル目的
環境の汚染を同定する
アッセイ/サンプルの偽陽性率を推定する
アッセイ性能を検証し、閾値設定の情報を提供するために予想されるクラスター位置を同定する
未知サンプルの測定

重要なポイント：ノンテンプレートコントロールにより実験の適切性を必ずモニタリ
ングしてください。

変異検出のための適切な実験の実施
変異検出実験を実施する場合、クリーンな作業環境を確保することが不可欠です。作業を行う場所（実験台、椅子、チップ、ピペット、他）のふき取りを、ブリーチを用いて毎回行ってください。試薬調製用（クリーンルームまたはアンプリコンフリーエリア）およびテンプレート添加用（PCR フード）の隔離された作業領域が推奨されます。ドロップレットリーダーはサンプル調製エリアから隔離された室内に設置するのが理想的です。手袋を頻繁に交換し、カートリッジ、ガスケット、ピペット、またはトレイを再利用しないことで汚染を抑えることができます。
重要なポイント：高コピー（合成テンプレート）陽性コントロールの希釈または保管を試薬調製エリア内で行わないでください。

6

実験環境の確認
Droplet Digital™ PCR（ddPCR™）の実験を行う環境を整えたら、実験環境がクリーンであることの検証を行うために複数のノンテンプレートコントロール（NTC）ウェ
ルのランを推奨します。デジタル PCR は極めて感度が高いため、以前は“クリーン”
であった環境でも NTC で陽性検出につながることは珍しくありません。NTC の偽陽性を排除するために、実験スペースと機器のクリーニングを複数回実施する必要があ
る場合があります。初回のテストランを行った後でも、毎回のランプレートにて数ウ
ェルの NTC を設定する事が必須となります。

野生型（変異陰性）ウェル
野生型（WT：変異陰性）のみを入れたウェルは、サンプルの種類またはアッセイの性能に起因する偽陽性率を推定するのに不可欠なものです。複数の WT ウェルのランを行うことで偽陽性の推定率が向上します（下記参照）。偽陽性率は部分的には添加されるサンプルの量に応じて変化するため、WT ウェルはそのサンプルで予想されるものと同程度の濃度でランを行うのが理想的です。例えば 100 ng のサンプルアッセ
イを行うのであれば、100 ng の WT サンプルのランをコントロールウェル内で行います。この WT のテンプレートはテストするサンプルと類似のサンプル調製方法によって入手されたものが理想的です。例えばホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）
サンプルを調べるのであれば WT も同じ処理をします。
重要なポイント： ddPCR の前にウラシル DNA グリコシラーゼ（UDG）で FFPE サ
ンプルを処理する場合（下記および附属書Ａ参照）、必ず FFPE WT コントロールも同様の方法で処理してください。

変異陽性コントロールウェル
陽性コントロールはアッセイの性能確認に不可欠なものであり、陽性クラスターの位
置予測に有用です。可能であれば、陽性コントロールは測定サンプルと同種類のサン
プル由来のものを用意するのが理想的です。優れた陽性コントロールの選択肢には次のようなものがあります:
1. 細胞株 DNA（供給元の例：ATCC など）
2. プラスミドコントロール — これらは完全に線状化されたものである必要があります。中央に目的とする変異部分を含む 500 bp 前後のゲノム DNA 断片を調整して下さい。完全な消化が得られるよう、変異検出部位を切断しない制限酵
素サイトを数コピー、インサートの両側に設定してください。未消化のプラス
ミドは ddPCR のテンプレートとして適切ではなく、極端な rain の原因となります。
（図 6）。
消化済

野生型/HEX 蛍光強度

未消化

事象数
図６. 未消化のプラスミドサンプルによって生じた中間部ドロップレット（rain）。制限酵素による消化はテンプレートへの完全なアクセスを可能にし、定量性を著しく向上させる。

7

3. 遺伝子断片（供給元の例：IDT またはオペロンなど）— 二本鎖の配列検証されている DNA 断片。
HPLC で精製された長鎖合成オリゴ（例えば ultramer）は ddPCR の陽性コントロー
ルとして適切ではないことに注意してください。一般的な合成オリゴは様々な長さのDNA 断片を混合物として含んでいます。完全長ではない断片は ddPCR データ中で、陽性クラスターと陰性クラスターの中間に位置する Rain ドロップレットとして現れます。
プラスミドまたは遺伝子断片のような増幅された陽性コントロールテンプレートは高い濃度で扱われるため、適切に作業を行わないと反応エリアまたは作業エリアを容易に汚染します。測定可能なダイナミックレンジ内に収めるためこれらのテンプレー
トを希釈する場合は、PCR 反応後専用の実験エリアで作業を行い、PCR 反応前の実験エリアには高濃度のストックを持ち込まないよう注意してください。手袋を頻繁に交換し、ブリーチを使用して全ての面のふき取りを行うことも不可欠です。高濃度のストックからの汚染は非常に容易に起こります。
販売業者により提供される合成テンプレートの定量が正確でない場合があることに注意してください。附属書Ｃに予想されるモル濃度からコピー数への変換表の記載がございます。
低濃度で保管された DNA はプラスチックチューブに付着し、そのため濃度が時間と共に変化する可能性があります。合成テンプレートは目的領域の断片しか含んでいな
いため、20,000 コピー/μl のストックでも全 DNA 濃度は非常に低濃度となります。低濃度でテンプレートを長期保存する場合は、polyA DNA のようなキャリアを含むバッ
ファーでこれらを希釈してください。当社では 100 ng/μl polyA 含有 TElo バッファーを推奨しています。

測定（サンプル）ウェル
各 ddPCR 反応は次の構成要素を含みます。
（反応液調製の詳細については附属書Ａをご参照ください）■ マスターミックス：2 x ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）■ 野生型アッセイセット■ 変異型アッセイセット■ 制限酵素（推奨）最適な結果を得るため、次のような理由から加える DNA テンプレート量を調節する
必要があります。
1. 装置のダイナミックレンジ — QX100™および QX200™ Droplet Digital PCR シ
ステムでは 1μl 当たり 0.5～5,000 コピーのターゲットの正確な定量が可能です（１反応あたり 100,000 ヒトゲノム等量、または 330 ng のインタクトなヒトゲノム
DNA）。合成テンプレートの場合、濃度がシステムのダイナミックレンジの範囲内にくるよう注意してください。臨床サンプルを用いた場合、サンプル濃度は多くのケースにおいてダイナミックレンジ範囲内であり、1～100,000 コピー/ウェル内で検出されます。使用するサンプルの濃度が低い場合、レアミューテーションの正確な定量を確実に行うために複数のウェルデータを統合することができます。

8

2. アッセイの性能 — クラスター分離の難易度によっては、最大添加量（5,000 コピー/μl）で良好なパフォーマンスを発揮できないアッセイもあります。PrimePCR™
ddPCR™遺伝子変異検出用キットは約 2,000 コピー/ μl（130 ng のゲノム DNA）の添加量を使用して有効性が確認されており、その多くは最高 5,000 コピー/μl（330 ng のゲノム DNA）の濃度で良好なパフォーマンスを発揮します。研究者がデザインしたアッセイ系を使用する場合は、アッセイの適切なダイナミックレンジを推定するために DNA テンプレートの希釈系列を用いてアッセイ系の検証を行うことが推奨されます（図２）。

制限酵素による消化制限酵素処理による DNA の断片化はタンデムコピー遺伝子を分離し、サンプルの粘性を低下させ、テンプレートへのアクセス性が向上し、結果として正確性を向上させます。全ての Bio-Rad PrimePCR アッセイは制限酵素による消化を用いて有効性が確認されており、最適なパフォーマンスを得るために制限酵素処理を行うことが推奨されています。
推奨される制限酵素については PrimePCR ウェブサイト（注意：米国用 HP のみのサービス）をご確認ください。PrimePCR アッセイと一緒に使用することが推奨される全ての制限酵素は ddPCR Supermix との適合性があり、追加のインキュベー
ション時間を必要とせずに直接反応に添加することができます（附属書Ａ参照）。
断片化された DNA または低濃度 DNA の場合は、制限酵素処理をしなくてもアッセイできる可能性があります。しかし、制限酵素処理することで ddPCR の精度、再現性、および正確性が向上する可能性もあります。
いくつかのターゲット（例えば HRAS G12V）は、制限酵素処理しない場合にはアッセイのパフォーマンスに悪影響を及ぼす阻害性の立体構造を有しています。更に
測定サンプルの濃度範囲が幅広い場合は、制限酵素処理が結果の標準化に役立つ場
合があります。例えば、血漿から精製されたセルフリーDNA は長さと量に大きなばらつきを持つ可能性があります。大部分のサンプルでは制限酵素処理は必須ではありませんが、一部のサンプルは大きすぎる DNA 断片を含む場合があり、このよ
うなサンプルでは時系列変化での変異検出率の測定に悪影響がでる場合があります。DNA のランダムな寸断は大部分のケースで役に立ちますが、変異を持つテン
プレートを破壊し、アッセイ内に発生する rain を増加させ、感度が低下する可能性があることも注意して下さい。

9

FFPE 臨床サンプルの UDG 処理

処理なし

変異/FAM 蛍光強度

変異/FAM 蛍光強度

ホルマリン固定（例えば FFPE サンプル）によって生じる損傷の種類の一つとして Cから U への脱アミノ化があります（Do および Dobrovic 2012 年）。この損傷は、PCR
増幅時に C>T 変異につながる可能性があり、偽陽性率を直接上昇させます。この現象による C>T 変異を減らすための効果的な戦略として、ウラシル DNA グリコシラー
ゼ（UDG）を用いて FFPE サンプルの前処理を行うことが推奨されます（図７）。この処理は ddPCR 反応セットアップ中に、 または ddPCR の前に直接行うことができます（詳細については附属書Ａを参照）。FFPE サンプルを WT コントロールとして使用する場合は、これらのサンプルを実験サンプルと同様の方法で処理してください。

UDG 処理あり

濃度（コピー/μl）

変異の存在比 （%）

野生型/HEX 振幅

コントロール

UDG 処理あり

図 7. ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルのウラシル DNA グリコシラーゼ（UDG）による前処理は偽陽性シグナルを防ぐ。ホルマリン処理により DNA は複合的なダメージを受けます。UDG 処理は脱アミノ化シトシンを消化し、シトシン>チミン（C>T）偽陽性を排除します。UDG で処理した場合、FFPE サンプル（M2W、肉眼的に正常）の G13D 変異陽性ドロップレット（ＡおよびＢ、それぞれ事象数 12 vs.2）は著しく減少し、サンプルのコールを変異（MT）から野生型（WT）に変化させています。NTC 内の G13D 変異の存在比は UDG 処理を行ったサンプルとは有意に異なり、UDG 処理が異なるコールをもたらす可能性を示唆しています（Ｃ）。
WT テンプレート濃度（）；変異テンプレート濃度（）；MT fractional abundance（）。

参考資料
Do H and Dobrovic A (2012). Dramatic reduction of sequence artefacts from DNA
isolated from formalin-fixed cancer biopsies by treatment with uracil-DNA glycosylase.
Oncotarget 3, 546–558.

10

３ 予備実験

PrimePCR™ ddPCR™遺伝子変異検出用キットは、野生型（WT）ゲノム DNA のバ
ックグラウンドにスパイクした陽性コントロールを用いてその有効性が完全に確認されています。それでも、やはり新規ユーザーの方には、ワークフロー、環境、およびサンプルに慣れて頂くためにも、新しいアッセイのそれぞれについて本書で説明す
る予備実験を行って頂くことをお勧めします。実サンプルの試験を行う前に、お客様がお使いのシステムの偽陽性率（FPR）および検出限界（LOD）をテストするための推奨フォーマットを以下に記載します。

ノンテンプレートコントロール（NTC）を用いた適切な実験の評価
Droplet Digital™ PCR（ddPCR）は試薬およびドロップレットを慎重に取り扱う必要があります。ddPCR プラットフォームは感度が高いため、極めて低いレベルのコン
タミネーションでも検出されてしまいます。レアミューテーションの検出を行う場合、
コンタミネーションの監視が不可欠になります。新規ユーザーの方に確認頂きたい予
備実験の１つとして、使用するアッセイ系で NTC を数列プレートに置くことが推奨されます。これにより実験室内のコンタミネーションの存在をテストできるだけでな
く、今後の実験のための閾値設定も行うことができます。

偽陽性率（FPR）の推定
非常にレアな事象の測定を考える場合、たとえば変異検出実験中の偽陽性ドロップレ
ットのような低頻度の事象は、より多くの数の測定を行うことで正確な推定が可能となります。以下に述べる実験では（図 8A）、同じ WT DNA サンプルを使用して８つの独立したウェル内で偽陽性が検出されています（図 8A、 2～9 列目）。これらの独立したウェルにおいて観察された変異陽性ドロップレット数は 0、0、1、2、3、3、3、および 0 でした。8 つを統合したメタウェル（図 8A、１列目）は合計 12 の陽性を示しますが、平均としては 1.5 ドロップレット/ウェルであることを示しており、他のウ
ェルを個別に見たときに比べてエラーバーは狭くなります（図 8B）。測定ウェルが１
ウェルのみの場合には、ばらつきにより FPR の過大評価または過小評価が起こる可能性が低くありません。

11野生型濃度（コピー/μl）

変異陽性事象の数
変異濃度（コピー/μl）

図８. 偽陽性率（FPR ）の推定と統合ウェルの有益性。Ａ. 野生型（WT）ウェルにおいて認められる変異
陽性事象の数。統合ウェル（１列目）と個別ウェル（2～9 列目）；Ｂ. 統合ウェルと個別ウェルに関連する濃度とエラーバー。統合された事象のエラーバーは個別ウェルのものより小さい。WT テンプレート濃度（）；変異テンプレート濃度（）。

実験に基づく検出限界の決定
検出限界（LOD）を実験的に決めるための確認項目を表３に示します。NTC ウェル、WT（変異陰性）コントロールウェル、および一定の WT DNA バックグラウンドに変
異陽性コントロール（MT）テンプレートの希釈系列を入れたサンプルをプレートにセットしランを行います。図９は、サンプル１つにつき１つのウェルで、１つのウェ
ルあたり 130 ng のインプットサンプル DNA を使用する例のデータを示しています。
感度を高めるために、インプットサンプル DNA の量や望ましい感度に応じて、１つの希釈につき多数のウェルを使用するようこの設計を変更することができます。望ましい感度を達成するために必要なサンプル必要量については附属書Ｂを、サンプルプ
レートのレイアウトについては附属書Ｄをご参照ください。
表３. 単一ウェル内の LOD の実験に基づく決定戦略
ウェルの数/サンプル
目的
1： NTC
汚染の確認
2～3：野生型（変異陰性） 偽陽性の確認
コントロール
4～5：変異陽性コントロール LOD の 閾 値 設 定 との希釈系列
コールの作成12

DNA テンプレートの内容
DNA テンプレートなし
１回の反応あたり 130 ng の野生型のみ
ゲノム DNA
130 ng/反応の野生型ゲノム DNA にスパ
イクした変異陽性の連続希釈。期待される LOD を含むよう希釈濃度を検討する。

濃度（コピー/μl）

Fractional abundance（%）

検出限界は、陰性コントロールと希釈系列の統計的有意差より論理的に推定されます。これはテンプレート混合サンプルにおいて検出される最も低い MT 濃度ですが、さらに測定された MT 濃度のエラーバー下端が、WT（変異陰性）コントロールにおいて測定された MT（偽陽性）濃度のエラーバー上端と重ならないことが条件です（図９、赤色の点線）
。

WT のみ

WT バックグラウンドが一定の MT 連続希釈

図９. レアミューテーション検出の LOD の妥当性確認。単位コピー/μl（cpm）の野生型（WT）テンプレー
ト濃度（）、変異テンプレート（cpm） （）、および WT テンプレートに対する Fractional abundance（変異の存在比）（）。WT（変異陰性）コントロールにおける変異濃度のエラーバーの上端は、希釈系列内の変異濃度のエラーバーの下端と交差しないことが条件（赤色の点線）。これが満たされることで陰性コントロー
ルと変異希釈系列の間に統計的有意差があることを示す。

13

未知のサンプルのテスト
未知サンプルのテストを行う場合は、NTC、WT（変異陰性）コントロール、および
MT 陽性コントロールも測定することが不可欠です（表４）。未知のサンプルの全 DNA
量が著しく変動する場合は、様々な添加量における FPR を適切に推定するために、各種の DNA 濃度で多数の WT コントロールを測定することが推奨されます。DNA 濃
度に応じて FPR がどのように変化するかを示す例については附属書 E をご参照ください。
表４. 推奨される最小限の実験設計。リプリケートは考慮しないと仮定する。
ウェルの数
目的
DNA テンプレートの内容
1：NTC
汚染の確認
DNA なし1 つ以上：野生型（変異陰性） 偽陽性の確認
１回の反応あたり 130 ng の野生型ゲコントロールノム DNA
1：変異陽性コントロール
閾値設定のための陽性 1 つの反応あたり 130 ng の野生型ゲコントロールノム DNA と 2.6 ng（>2%）を上回る
変異ゲノム DNA を用いた混合テンプ
レート
サンプルあたり１つ
濃度の測定
未知のサンプル DNA* 例えばホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）またはセルフリーDNA（cfDNA）臨床サンプルなどの低濃度の部分的に劣化したサンプルを使用する場合は、陰性コントロールウェル１つにつき増幅可能な 130 ng のテンプ
レートを添加することは不可能です。これらのケースでは、未知のサンプル内に予想される増幅可能なテンプレ
ートの最大量を陰性コントロールウェルにも適用することが推奨されます。

最大感度の検出を行うために、１つのサンプルにつき２つ以上のウェルを測定することが必要になる場合があります。1/10,000 の検出感度を達成するためには、利用可能なサンプルの量に応じて複数のウェルを統合しなくてはいけない場合があります。5
章のトラブルシューティングの項にこういった例の記載があります。

14 | レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン

４ データ解析

データの質の評価
ドロップレットデータの体系的な評価を実施することを推奨します。QuantaSoft™ソ
フトウェアはデータの自動的な閾値設定を試行しますが、レアミューテーション検出については、多くの場合で実験者が手動で閾値設定を行うことで最適な結果が得られます。
１. ドロップレット測定後のデータを検討し、データの質を記録する。
ａ.得られた全事象についてウェルごとに評価します（事象の数が 10,000 に満たない場合は、下記に記載するような問題に関して慎重にデータを評価する必要があります）。

チャンネル１の蛍光強度

ｂ. 異常な蛍光強度の有無についてウェルをチェックします。リプリケートサンプル間の著しい強度の差および濃度の差（図 10）は、サンプルのハンドリングまたは混和に問題があったことを示唆しています。

事象の数
図 10. 蛍光強度の差はデータの質の問題を示唆する可能性がある。上記のウェルはテンプレート陽性ドロップレット（）およびテンプレート陰性ドロップレット（）を含むリプリケートウェル実験の結果である。混和不良、ハンドリング、またはサンプル中の沈殿物によりドロップレット生成不良が起こり、蛍光強度およびドロップレットの大きさの差が生じる可能性がある。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 15

ｃ. ドロップレットの品質不良またはサンプルに問題があることを示唆する 45°の対角線上に分布するデータがないか確認して下さい。データが 45°の対角線上に現れており、ドロップレットが数個しかない場合は（図 11A）、閾値ツールを使用してそれらのドロップレットを陰性とします。分布数が過剰に多い場合は（図 11B）、そのウェルを解析対象外とします。

変異/FAM 蛍光強度

変異/FAM 蛍光強度

これらのドロップレット
を陰性とする

野生型/HEX 蛍光強度

このウェルは使用
しないこと

野生型/HEX 蛍光強度

図 11. ドロップレットの品質問題の同定。Ａ. 分裂または融合したドロップレット（点線で丸く囲んだ部
分）が 45°の対角線上に低いレベルで存在する場合は QuantaSoft ソフトウェアツールを使用して閾値設定か
ら除外することができます；Ｂ． 時に過剰な分裂が生じた場合はウェルを解析対象外とします。

２D および１D-両プロットを用いてコントロールウェルを検討し、閾値設定を実行する。
ａ. 最初の手順として、３種類のコントロールウェル（ノンテンプレートコントロ
ール、WT（変異陰性）、および MT（変異陽性））を検討する必要があります。
その後必要に応じて閾値の設定をさらに調節します。
（下記 b～g）。全てのコン
トロールウェルを選択し、2D-プロットによってクラスターの質を精査します。
適切な閾値設定のためには、クラスター間が明確に分離されていなければいけません。MT 陽性コントロールウェル内の MT DNA 濃度は、単一陽性（WT）ク
ラスターとダブルポジティブクラスター（WT および MT）の端部位置を正確に特定できる十分に高い濃度でなければいけません。全てのコントロールおよび
サンプルについて同じ閾値を使用することにより、同じ偽陽性率を全ての反応に適用する事ができます。QuantaSoft ソフトウェア内の閾値設定ツールのいず
れかを使用してこれを行うことができます（図 12）。
Ａ. ノンテンプレートコントロール

Ｂ. 野生型

Ｃ. 野生型 + 1%変異

変異/FAM 蛍光強度2.

野生型/HEX 蛍光強度

野生型/HEX 蛍光強度

野生型/HEX 蛍光強度

図 12. コントロールウェルの２D 表示. Ａ. ノンテンプレートコントロールウェル；Ｂ. 一つの二重陽性偽陽性ドロップレット（丸で囲んだ部分）を含む、WT（変異陰性）コントロールウェル；Ｃ. 1%変異陽性コン
トロールウェル。クラスターの場所と分離、および強度の小さい蛍光ドロップレットを考慮して同一の閾値
設定を全てのウェルに適用した。

16

ｂ. NTC ウェル：必要に応じて閾値を調節して、全ての NTC ウェルを検査します。
WT および MT コントロールからカットオフする真の陽性が多すぎない限り（通
常は 1～5 個のドロップレット）、蛍光強度の小さいランダムなドロップレット
より上側で閾値ラインを引くことは許容されます（図 12A）
。もし WT またはMT 検出時のいずれかに大きな蛍光強度を示す陽性がある場合は汚染が考えられます。３つ以上の NTC ウェルの陽性ドロップレット合計数が 5～10 を上回る場合は、このプレートを使用して収集されたデータは疑わしいものになります。手順をさかのぼり、実験台とピペットの汚染を除去し、新しい水、マスターミックス、アッセイ、サンプルを用意して実験を再度開始してください。NTC
ウェル内の二重陽性ドロップレット（図 5B）は、キャリーオーバーまたは異常なドロップレットである可能性が高くなります（２つの大きな単一陽性集団を伴わない二重陽性が起こる可能性は極めて低いです）。
ｃ. WT ウェル：WT ウェルは偽陽性率を決定するために試験します（図 12B）
。偽陽性率を正しく推定するためには、WT DNA 量が未知のサンプルの DNA 添加
量以上でなければいけません。テンプレート量が幅広く分布する未知サンプルを測定する場合は、各サンプルごとにサンプル量以上の WT コントロール量を使用して適切に閾値を設定してください。
ｄ. MT ウェル： 真の MT（変異陽性）ドロップレットの出現位置は MT コントロールウェルを使用して推定することができます。MT ウェル内の４つのクラス
ター間の閾値を設定し、WT ウェルを検査することによって、WT ウェル内のどのドロップレットが偽陽性であるかが明らかになります。
（図 12B の赤丸と12C）
。この閾値設定手順後、測定された変異の存在比が予想される値（例えば1%）にある状態を確保するために Ratio タブを使用する必要があります。
ｅ. 全てのサンプルとコントロールを選択し、コントロールの閾値設定に基づいて
閾値ラインを再度引きます。

A

野生型/HEX 蛍光強度

ｆ. 蛍光強度と濃度の両方のコールの再現性に関して各リプリケートウェルセット
をチェックします。非常に低い濃度では、このばらつきは通常のエラーに従って増加します（図 13）。

B

濃度（コピー/μl）

イベント数

図 13. １D プロットでのリプリケートウェル内の蛍光強度。Ａ. 同一の蛍光強度を示す４つの複製ウェル（黄色の点線で示される）；Ｂ. 同一の濃度コールを示す４つの複製ウェル。これらはマージが可能である。

17

Fractional abundance（%）

濃度（コピー/μl）

ｇ. ウェルをマージし、濃度および fractional abundance（変異の存在比）グラフを使用してデータを精査します（図 14）。

図 14. 統合ウェルの濃度と変異の存在比. Ａ. 野生型（WT. ）と変異（MT. ）の濃度コール。95%信頼区
間エラーバーを含む；Ｂ. ３倍希釈系列における[WT+MT]バックグラウンド（）内の[MT]の変異の存在比。
WT-hi および WT-lo はテストされたサンプル内の WT テンプレートの予想濃度の上限と下限のテンプレート
濃度である。

QuantaSoft ソフトウェアは、データ閾値設定のためのフレキシブルな視覚化および解析ツールを備えています。下記にシンプルかつ効率的な閾値設定戦略を説明します（図 15）：■ 実施したアッセイの全てのウェルを選択します。２D プロット（図 15A）はク
ラスターの場所に関する情報を提供し、後で行う１D 閾値設定のための各クラスターの境界の同定に役立ちます。左側のパネルにあるツールを使用して大まかな閾値を選択します。
■ １D プロットに切り替えて（図 15B）
、マルチウェル閾値ツールを使用して MT
陽性コントロールウェル内の陽性クラスターのすぐ下側に位置するようにチャンネル１の閾値を調節します。二重陽性クラスターの境界は１D プロットを用いて推定する方が簡単な場合もあり、それによって偽陽性が多くなることが回避されます。その後２D プロットに戻って、正しい閾値設定が行われていることを確認します。

18

変異/FAM 蛍光強度
変異/FAM 蛍光強度

野生型/HEX 蛍光強度

WT のみ

図 15. ２D および１D プロット内の閾値ツール. Ａ. ２D プロット内のクラスターにドロップレットを割り当てるために使用される閾値設定ツール;Ｂ. １D プロット内のマルチウェル閾値設定のための閾値設定ツー
ル. A03～B03, NTC；A04～B05, 野生型コントロールウェル；A06～B10,変異陽性コントロールウェル。

陽性サンプルの確実なコール
サンプルを陽性としてコールする迅速かつ簡潔な方法は、WT（変異陰性）コント
ロールとテストサンプルの間のエラーバー（95% CI）が重なっていないことを確認することによって可能です（図 16）。陰性と陽性に有意差があることを判定するためにｔ検定は大変有用です。もしも 95% CI エラーバーが重なっていなければ、ｔ検定は常に有意性を示します。もしもエラーバーが重なっていた場合ｔ検定は状況に応じ有意性を示します。

サンプルＤ

サンプルＣ

サンプルＢ

サンプルＡ

濃度（コピー/μl）

コール

図 16. 陽性サンプルのコール。QuantaSoft ソフトウェア濃度タブは、変異対立遺伝子の濃度と 95%信頼区間（エラーバー）を表示する。１つのウェルにつきサンプルと同等の量の DNA がロードされた野生型（WT）
コントロール（WT-lo および WT-hi）のエラーバー上端がサンプルのエラーバー下端と重なっていなければ（赤の線）、サンプルは変異陽性である。WT-hi および WT-lo はテストされたサンプル内の WT テンプレート
濃度の予想範囲の両端に隣接するコントロールテンプレート濃度である。WT テンプレート濃度（）；変異
テンプレート濃度（）。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 19

定性的陽性サンプルのコール
場合によっては確実なコールの境界線上にサンプルが存在する事があります。可能であれば、より多くのコピースクリーニングを行うために、サンプルの追加測定を試してください。
追加測定が行えない場合は、境界線上のデータについては DNA 量が少ない（<20ng/ウェル）ときと同じ挙動を示すと仮定して（図 17、A vs. B）処理を行います。
この仮定は、DNA 量が少ない場合、大部分の二重陽性ドロップレットはポリメラーゼによって誘発されるエラーである可能性が高いということを意味します。
そのため、１つのウェルあたり 20 ng 未満のサンプルしか入っていないウェルについては、二重陽性ドロップレットを、二重陽性と扱わずに HEX（WT）単一陽性ド
ロップレットとみなして QuantaSoft ソフトウェア内で再割り当てを行うことができます。これはつまり、サンプルウェル内の FAM 単一陽性ドロップレットの数を、WT（変異陰性）コントロールウェル内の FAM 単一陽性ドロップレットの数と比較評価することになります。
単一陽性の統計的な増加により、一般的には実際の変異の存在を反映しているということができます。

Ａ. WT サンプルのみ
濃度（コピー/μl）

Ｃ. 正常

Ｂ. MT サンプル

コール:

濃度（コピー/μl）

Ｄ. 二重陽性なし

図 17. 低 DNA 濃度ウェル内の境界線上サンプルのコール。野生型（変異陰性）コントロールは 変異単一陽性ドロップレットをごくわずか有しているか、または全く有していない（Ａ）。これに対し、変異含有サンプル（Ｂ）は多くの単一陽性ドロップレットを有している。閾値を再度設定して、二重陽性ドロップレット（オレンジ）を野生型単一陽性ドロップレット（緑）とすることにより、定性的な変異陽性（青）コールを行うことが可能となる（C vs. D、赤色の線）。WT-hi 濃度は、テストされるべきサンプル内の最も高い予想 WT
テンプレート濃度が反映される。

20

５ トラブルシューティングとよくある質問（FAQ）

１. どんな場合に複数ウェルのマージを使用するべきですか?
サンプル量が比較的多いものの、関心を持たれている遺伝子の存在比が少ない
場合に複数ウェルによるマージが必要になります。例えば、サンプルには数コ
ピーの変異 HRAS G12V が存在している可能性があるが、サンプル量が 50 μlで抽出されている場合などです。できるだけ多くの変異コピーを維持するために、これ以上の濃縮作業は回避する必要があります。20 μl Droplet Digital™ PCR（ddPCR™）反応内の最大サンプル添加量は 8 μl なので、50 μl のサンプル全量のスクリーニングを行うためには少なくとも７つの反応ウェルが必要です。
データ解析については、QuantaSoft™ソフトウェアの統合機能を用いて、一回の測定で 140 μl の反応ウェルを使用し測定した結果として、全ての反応を統合することができます。
よくある質問の一つとして、サンプル 8 μl を用いた１ウェルの反応結果のみで、サンプルのスクリーニングを行うことが可能かというものがあります。サンプルの一部分のみをスクリーニングすると、ターゲットが極めてレアなものであった場合、サンプルのサブサンプリングエラーに悩まされる可能性が高くなります。ターゲットが 1～100 コピーの範囲である場合、使用するサンプルにターゲットの遺伝子が数コピーしか存在していないため、分注された少量サンプ
ルは真のコピーの割合を表すものでない可能性があります。従って、サンプルのサブサンプリングエラーが実験の正確さに著しい影響を及ぼす可能性がある濃度である場合は、サンプル全体のスクリーニングを行うことが常に推奨されます。
QuantaSoft ソフトウェアのウェルマージ機能は、 多くの点でレアな事象の検出に有用です。これは、異なるサンプル量の反応を解析するために大変有用で
フレキシブルな方法です。エンドポイント PCR の特性は増幅効率の低いアッセ
イでも検出できることです。そのためリアルタイムプラットフォームでは不可能なシングルコピーの検出も ddPCR プラットフォームにおいては可能となります。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 21

２. 事前に有効性が確認されている定量的 PCR（qPCR）TaqMan アッセイを
ddPCR に使用することはできますか?
qPCR 用にデザインされている多くの TaqMan アッセイは、直接 ddPCR プラ
ットフォームに移行させることができます。ddPCR スーパーミックス内での最適なアニーリング温度を決定するために、温度グラジェントを用いた予備実験を行うことが推奨されます。しかし、一部のアッセイでは予想通りのパフォー
マンスを示さない場合があり、最適化が必要となる可能性があります。
３. rainy な表現型が起こる原因は何ですか?
Rain の原因となりうる因子は次の通りです:
サンプルの品質 — 断片化または、その他の損傷が生じた DNA の存在、PCR
阻害物質の存在
サンプルの種類 — DNA 修飾や一塩基多型が存在する不均質なサンプル
テンプレートのアクセス性 — テンプレートの局所的構造または、その他の結合要素がプライマー/プローブ結合を阻害
アッセイデザインの最適性 — オリゴヌクレオチド間（プライマーおよびプローブ）の Tm の非共通性。 非特異的なプライマーによるターゲットではないア
ンプリコンの増幅
温度条件の最適性— 最適化されていないアニーリング温度、アニーリング時間、
および/またはサイクル数
操作とシステム — 不適切な操作、ハンドリング、またはシステムエラーが原因で生じる不均一なドロップレットサイズや壊れたドロップレットの存在
４. デュプレックス変異検出アッセイを行っており、陰性クラスターに近い場所に、WT または MT の場所以外に存在するクラスターが出現します。このクラスタ
ーは何ですか?
スクリーニング対象となっているサンプル内に、その変異の多型が多数存在する可能性がある場合、１つの変異に特異的なデュプレックス変異検出アッセイを行うと交差反応するクラスターが出現する場合があります。下記の例では、サンプルのスクリーニングに KRAS G12A アッセイ が使用されました。サンプ
ルは KRAS G12A に関しては陰性になりましたが、別のクラスター（赤の丸）は、このサンプルがもう一つの、恐らくは１塩基の不一致を示す関連 KRAS 変異を含んでいることを示唆しています。研究者がターゲットとしている変異に関して、これらのクラスターを陰性として閾値設定することが可能です。

変異/FAM 蛍光強度

サンプル

野生型/HEX 蛍光強度

野生型/HEX 蛍光強度

図 18. 交差反応集団は関連変異の存在を示唆する

22

５. 任意の遺伝子座における複数の変異スクリーニング（例えば、KRAS G12D、
KRAS G12、KRAS G12A）に同じ WT コントロールを使用できますか?
各アッセイはそれぞれ独自の WT（変異陰性）コントロールを必要とします。
WT コントロールはそれぞれの特異的なアッセイ（プライマーおよびプローブ）の偽陽性率（FPR）測定を目的としており、異なるプライマー・プローブは異なる FPR となる可能性があります。つまりプライマーが共通であってもプロー
ブが異なる場合は FPR も異なるので、プローブごとに WT コントロールを測定する必要があります。例えば、KRAS G12D、G13D、および G12S 変異内のC>T 移行では KRAS G12A 変異に比べて FPR が高くなります。
６. 私のアッセイは ddPCR の推奨条件とは異なる温度とサイクリングでランを行っています。ddPCR 以外のプラットフォーム（手法）で行っている内容をそのまま ddPCR に適用する場合、同様のアッセイをランすることはできますか?
ddPCR は独自の反応性と特殊な技術のために特定のパラメータは変更することになります。一般的に弊社 では ddPCR Supermix を用いたアッセイに最適なアニーリング温度を決定するために、温度グラジェントでの検証を推奨しています。ddPCR にとってプライマー濃度は非常に重要であり、当社が推奨するものより著しく低いプライマー濃度でランを実行すると陽性ドロップレットの消失（ドロップアウト）、蛍光強度の低下、および不正確なターゲットの定量を引き起こします。弊社のサイクリングパラメーターは、最も正確な定量を実現するため、弊社アッセイの全てと適合性を持つようデザインされています。
ddPCR アッセイ以外のアッセイ用のサイクリングパラメーターを転用することは、特定の限界値の範囲内であれば可能です。プレートのドロップレット中の環境は標準的な qPCR 反応の環境とは大きく異なります。指定した温度に達するには qPCR よりも長い時間が必要です。このため、ddPCR では温度上昇速
度の調整（～2°C/秒）と長いアニーリング/エクステンション時間（最低１分）を必要としています。

23

附属書 A：PrimePCR™ ddPCR™変異検出
アッセイを使用する反応のセットアップ

試薬の内容 — PrimePCR ddPCR 変異検出アッセイは 20x 濃縮の ready-to-use プ
ライマー＆プローブミックスであり、ddPCR Supermix For Probes（No dUTP）と一緒に使用するために最適化されています。各キットには 200 μl、1,000 μl,または
2,500 μl の 20x アッセイミックス（最終濃度は各プライマー900 nM、各プローブ
250 nM）が同梱されており、それぞれ 200、1,000、または 2,500 x 20 μl の反応に十分に使用できる仕様となっております。
制限酵素による消化 — ドロップレット作成前に制限酵素による消化により DNAを断片化することで、タンデム遺伝子コピーを分離し、サンプルの粘度を低下させ、テンプレートへのアクセス性を改善し、正確な測定を可能にします。各アッセイと一緒に使用するのに最適な制限酵素については PrimePCR ウェブサイト（現在米国サイトのみのサービスとなっています）をご確認ください。DNA サンプルの制限酵素による消化は、セットアップ時に ddPCR 反応に酵素を直接スパイクすることによって（表５）、または製造業者の取扱い説明に従い ddPCR の前に消化手順を行うことによって実施することができます。
ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルのウラシル DNA グリコシラー
ゼ（UDG）処理 — サンプルのホルマリン固定は異常な C>T 移行につながるため、UDG によるサンプル処理が推奨されます。UDG は、シスチンの脱アミノ化の副産物として産生されたウラシルを含有するテンプレートを除去します。UDG 処理は
迅速かつ安価であり、前処理としてまたはマスターミックス内で直接実施することができます。
前処理：10 μl FFPE サンプルに 2 μl 10x UDG 反応バッファーと 2Unit の UDGを添加し 37°C で 20 分間インキュベートします。マスターミックス内に添加する場合は１Unit UDG を 20 μl 反応セットアップに添加します。PCR 反応の前に37°C で 20 分間インキュベートします。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 24

表５. ddPCR 反応セットアップ
コンポーネント1 反 応 当 た り 最終濃度の試薬量（μl）
2x ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）
101x
450 nM プライマー
20x 変異ターゲットプライマー/プローブ（FAM） 1
250 nM プローブ
450 nM プライマー
20x 野生型プライマー/プローブ（HEX）
1
250 nM プローブ
制限酵素（希釈済み）*
適当な制限酵素による DNA サンプルの消化が実験により異なる
1
事前に行われていない場合は、反応系に加える必要があります。
DNA サンプル/水 **,***
実験による50 fg-132 ng
20
最終液量
20 μl の ddPCR 反応につき約 2～5 Unit の制限酵素が推奨されます。
ddPCR 反応のセットアップの前に制限酵素による消化を実施済みの場合、DNA 精製を行う必要はありま
せんが、ddPCR を阻害する可能性がある塩濃度の高い制限酵素バッファーの添加は避ける必要があります。サンプルの塩含有量を少なくするために、消化産物を最低 10 倍希釈してください。
*** DNA １マイクログラムあたり 5～10 ユニットの酵素を使用し、タンデム反復配列を分離する場合はゲノム DNA １マイクログラムあたり 10～20 ユニットの酵素を使用します。
***

ddPCR 反応のセットアップ
１. 使用する全ての反応試薬を溶解して室温に戻します。よく混和し、卓上遠心分離等でチューブ上部に付いている溶液を底に集めてから遮光した状態で氷上に置いておきます。
２. サンプルを室温で調製します。同じターゲットおよび野生型アッセイを使用して多数のサンプルのアッセイを行う場合は、サンプルテンプレートを含まない
マスター反応ミックスを調製し、反応チューブに等量を分注し、最後のステップで各反応チューブにサンプルテンプレートを添加します。サンプル DNA が均一に分散するように 5 回から 10 回ピペッティングを行って混和します。大部分のルーチンの変異検出実験の場合は、最終濃度が 2,000 コピー/μl となるように、
ddPCR ウェル１つにつき最大 130 ng のヒトゲノム DNA を添加します。
３. 反応溶液をボルテックスでよく混和し、スピンダウンした後に QX100™または
QX200™ Droplet Generator カートリッジのサンプルウェル内に反応溶液 20 μlを分注します。Droplet Generator の一般的なガイドラインに従って実験を行います。
４.ドロップレット作成後、反応溶液を推奨されるエッペンドルフ 96 ウェル PCR
プレートに移します。
表 6 に従い 96-Deep Well 反応モジュールを用いて、C1000
Touch™サーマルサイクラー上のサーマルサイクリングプロトコールをプログラムします。
５. PCR プレートをサーマルサイクラーにセットし PCR を開始します。PCR 反応の後、PCR 反応プレートを QX100 または QX200 ドロップレットリーダーに移し、Droplet Reader のガイドラインに従って測定を行います。
表６. サーマルサイクリングのプロトコール*
サイクリング手順
温度（°C） 時間
酵素活性化
10 分
95
DNA 変性30 秒
94
アニーリング/伸長反応55
１分
酵素の不活化10 分
98
ホールド（オプション）ホールド
4*リッド温度は 105°C に設定

25

ランプ速度
-

サイクル数
1

～2°C/秒40～1°C /秒

11

附属書 B：ヒト DNA 量(ナノグラム）からコピー数への変換
表７. ナノグラムからコピー数への変換
アッセイあたり解析される増幅可能な
DNA の量（ng）
400
ウェル１つにつき許350
容される DNA 最大量
300
250
200
150
100
75
50
40
33
25
20
15
10
5
DNA 添加量が非常に少量の場合最小コピー数

QuantaSoft ソフト
ウェア算出値（コピー/μl）
6,060.6

1
0.5
0.1
0.01

半数体ゲノム等量*

最大感度**

121,212.1

0.002%

5,303.0

106,060.6

0.003%

4,545.5
3,787.9
3,030.3
2,272.7
1,515.2
1,136.4
757.6
606.1
500.0
378.8
303.0
227.3
151.5
75.8

90,909.1
75,757.6
60,606.1
45,454.5
30,303.0
22,727.3
15,151.5
12,121.2
10,000.0
7,575.8
6,060.6
4,545.5
3,030.3
1,515.2

0.003%
0.004%
0.005%
0.007%
0.010%
0.013%
0.020%
0.025%
0.030%
0.040%
0.050%
0.066%
0.099%
0.198%

15.2
7.6
1.5
0.2

303.0
151.5
30.3
3.0

0.99%
1.98%
9.90%
99.00%* 3.3 pg DNA/半数体ゲノム量と仮定** 偽陽性がなく、完全なコントロールであると仮定

任意のアッセイによって得ることができる最大感度はスクリーニングされるゲノムのコピー数によって制限されます。この表は解析される DNA 量（ナノグラム）から想定される解析ターゲットのコピー数を変換しています。前提として半数体ヒトゲノムは DNA 量 3.3 pg（C 値）であるとしています。また QuantaSoft ソフトウ
ェアの読出し値の単位はコピー/μl（cpm）であり、その濃度に 20 μl/反応を掛けたものがスクリーニングされる半数体ゲノムの数（３つめの列）に反映されます。さらに３つの陽性テンプレートがスクリーニングされた半数体コピーの合計数で割ることにより得られる可能性がある最大感度（４つめの列）が算出されています。
これには実際のエラー発生源は含まれておらず、指針としての役割を果たすためのものです。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 26

附属書 C：モル濃度からコピー数への変換

表８. モル濃度からコピー数への変換
モル濃度からコピー/μl
モル数からコピー数へ
QuantaSoft™ソフト
ウェア算出値（cpm） モル
モル濃度コピー/μl
コピー
–6
17
16
1M
1 マイクロモル（10 モル） 6.02  1017
6.02  10
3.01  1016
15
16
100 ナノモル
100 mM
6.02  10
3.01  10
6.02  10
15
14
15
10 mM
10 nmol
6.02  10
3.01  10
6.02  10
–9
14
13
14
1 mM
1 nmol（10 モル）
6.02  10
3.01  10
6.02  1013
12
13
100 ピコモル
100 M
6.02  10
3.01  10
6.02  101211
12
10 pmol
10 M
6.02  10
3.01  10
6.02  10
–12
11
10
11
1 pmol（10モル）
1 M
6.02  10
3.01  10
6.02  1010910100 フェムトモル
100 nM
6.02  10
3.01  10
6.02  10
9
8
9
10 nM
10 fmol
6.02  10
3.01  10
6.02  10
–15
8
7
8
1 nM
1 fmol（10モル）
6.02  10
3.01  10
6.02  1076
7100 アトモル
100 pM
6.02  10
3.01  10
6.02  10
6
5
6
10 pM
10 amol
6.02  10
3.01  10
6.02  10
–18
5
5
1 pM
30,110.71
1 amol（10モル）
6.02  10
6.02  104
4100 fM
3,011.07
100 ゼプトモル
6.02  10
6.02  103
3
10 fM
301.1110 zmol
6.02  10
6.02  10–21
1 zmol（10 モル）
1 fM
602
30.10
602
100 aM
60.2
3.01
100 ヨクトモル
60.2
10 aM
6.02
0.30
10 ymol
6.02
cpm =コピー/μl、20 μl の反応に 1 μl が含まれていると仮定
１つのウェル内の ddPCR の一般的な作動範囲：0.24～5,000 cpm
23
17
1 M = 6.02 x 10 コピー/L = 6.02 x 10 コピー/μl23
１モル = 6.02 x 10 コピー
23
アボガドロ定数：6.02 x 10

この表は、ストック溶液のモル数またはモル濃度を QuantaSoft ソフトウェアによって示される合計コピー数およびコピー/ μl（cpm）に変換するための参考表です。
中央の QuantaSoft の列については、
1 μl のストック溶液が 20 μl の Droplet Digital™
PCR（ddPCR™）反応に含まれると仮定されています。最初の 2 つの列はモル濃度であり、これらは３つめの列においてコピー/ストック溶液 μl の単位で合計コピー数に変換されています。右側はモル数から合計コピー数への変換です。オレンジ色に強調されている部分は、１つのウェル内のシステムの一般的なダイナミックレ
ンジを示します。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 27

附属書 D：高感度の検出限界を得るためのサンプルプレートのレイアウト

表９. 高感度 LOD のためのプレートのレイアウト

マスターミックス

開始

最終

水
2x ddPCR Supermix
Probes（No dUTP）

for

反応数 7

WT-hi +
0.01–0.1%
MT
反応数 5

反応数 2.5

45 l

35 l

25 l

12.5 l

NTC

WT-lo +
0.004% MT

反応数１

反応数 9

5 l

0.33～1%
MT

2

1

10 l

90 l

70 l

50 l

25 l

20x 変異ターゲットプライ
マー/プローブ（FAM ）

20

1

1 l

9 l

7 l

5 l

2.5 l20x 野生型プライマー/プローブ（HEX ）

20

1

1 l

9 l

7 l

5 l

2.5 l

1 l

9 l

7 l

5 l

2.5 l18 l162 l126 l

90 l

45 l

2,000cpm,
200cpm1.00 l

-

7 l

5 l

2.5 l

変異テンプレート

1-0.004%

1.00 l

-

7 l

5 l

2.5 l

水

実験による

-

9 l

-

-

-

20 l

171 l140 l100 l

50 l

制限酵素

2-5 U

小計
野生型テンプレート

最終液量

プレートのセットアップ
１
２

３

４

５

WT-lo

0.01%

0.11%

WT-hi

WT-lo

0.01%

0.11%

WT-hi

0.004%

0.01%

0.11%

NTC

WT-hi

0.004%

0.01%

0.11%

NTC

WT-lo

0.004%

0.04%

0.33%

Ｆ

NTC

WT-lo

0.004%

0.04%

0.33%

Ｇ

NTC

WT-lo

0.004%

0.04%

1%

Ｈ

NTC

WT-lo

0.004%

0.04%

1%

Ａ

NTC

WT-hi

Ｂ

NTC

Ｃ

NTC

Ｄ
Ｅ

６

７

８

９

10

11

12

サイクリングパラメーター
温度（°C）

時間

サイクル数

95

10 分

1

94

30 秒

55

１分

98

10 分

4

ホールド

20x プライマー＆プローブミックス：18 μM PCR プライマー（それぞれ）
、5 μM
プローブ
最終濃度：900 nM PCR プライマー（それぞれ）、250 nM プローブ

40
1

1 つの PCR 反応につき 20 μl が推奨されます。20 μl のドロップレットをドロッ
プレットジェネレータカートリッジ内で使用できるように、0.5～1 ウェル分ほ
ど余分にマスターミックスを調製してください。

レアミューテーションの検出 最良の実施ガイドライン | 28

濃度（コピー/μl）

附属書 E：DNA 量に伴う偽陽性率の変化

Fractional abundance %野生型 DNA 添加量（ng）

野生型 DNA 添加量（ng）

図 19. DNA 量に伴う偽陽性率（FPR）の変化。野生型（WT）DNA の２倍希釈系列のアッセイを行い検出される MT 変異陽性率（FPR）を算出した。野生型 DNA 内の MT コピーの濃度は添加する WT DNA の量に伴って変化する。これは単純な線形関係ではなく、統計的誤差が重要な役割を果たしうる。このため、テストされるサンプルと類似の量の WT コントロールを加えることが推奨される。WT テンプレート濃度（）；MT テンプレート
濃度（）；MT fractional abundance（）。

29Eppendorf is a trademark of Eppendorf AG. FAM and HEX are trademarks of Life Technologies Corporation. TaqMan is a trademarkof Roche Molecular Systems, Inc.
Bio-Rad’s thermal cyclers and real-time thermal cyclers are covered by one or more of the following U.S. patents or their foreigncounterparts owned by Eppendorf AG: U.S. Patent Numbers 6,767,512 and 7,074,367.
The QX100 or QX200 Droplet Digital PCR System and/or its use is covered by claims of U.S. patents, and/or pending U.S.
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