研究フロンティア（令和年度学術奨励賞受賞論文）

マウスを用いた経時的エンハンサー RNA 解析による卵巣体細胞特異的エンハンサー候補領域および疾患感受性領域の同定
中川 竜一，鹿島田健一
東京医科歯科大学発生発達病態学

緒

サーも同定可能であると考えたためである．

言eRNA を解析するにあたり，本研究では cap analysis
卵巣の遺伝学的分化制御メカニズムは，精巣と比較しof gene expression（以 下 CAGE）法 を 用 い た．CAGEて未知な部分が多く， ，XY 性分化疾患（differences法は理化学研究所が開発したトランスクリプトーム解析

of sex development ; DSD）と比較し， ，XX DSD で手法で，メッセンジャー RNA（以下 mRNA）と同様に）は遺伝学的原因が不明なものが多い ．また早発卵巣機

eRNA にも存在する能不全（以下 POI）の疾患に関わる多型の多くはエンハンスを行う手法である．このような原理から正確な転写

cap をキャプチャーしてシークエンサーなどの非翻訳領域に存在するとされる ）．卵巣特開始点を決定でき，ひいては双方向に転写される eRNA

異的遺伝子のエンハンサー同定は卵巣分化に関わる疾患を効率的に同定でき ），eRNA の定量的・経時的な解析の病態解明に有用と考えられる．一方，エンハンサーはに有用と考えた．

標的遺伝子から遠く離れた位置にあることが多く ），その同定は容易ではない．

目

的以前よりエンハンサーの位置を推定する方法として
DNase I hyper sensitivity 領 域 に 注 目 す る DNase-seq

胎生期の卵巣分化に重要な既知の遺伝子（Wnt ，法 ）や，遺伝子とエンハンサーの空間的近接性に注目す

Rspo ，Foxl ，Bmp ，Fst）の mRNA およ び 周 辺 領 域

る chromosome conformation capture 法 ，）等 が 用 い らの eRNA 発現プロファイルを，経時的，網羅的に比較れ，多くの成果を挙げてきた．一方，同定した領域とそし，新規エンハンサー候補領域を同定する．のエンハンサー活性が必ずしも一致しない，解析に多量のサンプル（細胞数）を必要とする，などの制約がある．

方法

そのため既存の手法では，胎生期の臓器発生に関わるエンハンサーなど，解析のために採取できる細胞数が限られている場合，特に標的遺伝子から離れた場所に位置す

性腺支持細胞の回収には，Wt の周辺領域

kb，および Wt コード領域を mCherry― A―EGFP に置き換えるエンハンサーを効率的に同定することは困難であった 配 列 を も つ Wt ―mCherry― A―EGFP（以 下 PBWt ―た．

RG））を用いた．このマウスでは Wt を発現する性腺支

近年，活性化したエンハンサーから双方向に転写され持細胞特異的に EGFP，mCherry を発現する．卵巣分化る enhancer RNA（以下 eRNA）が注目されるようになっに関わる遺伝子の発現変化を捉えるために E ．，E― ）た ．この双方向に転写される eRNA の転写量は，エ．，P のステージを選択し，各ステージにおいてンハンサーの活性と相関する可能性が示唆されてい

PBWt ―RG マウスから性腺を摘出し，fluorescence-acti-る ）．われわれは，この eRNA と標的遺伝子の発現量をvated cell sorting を用いて EGFP/mCherry 陽性細胞を定量的・経時的に比較し，エンハンサーを同定すること分取した．分取した細胞から total RNA を抽出し，を試みた．この手法であれば，標的遺伝子から離れた位イブラリあたり置に存在し，胎生期卵巣発生など，採取細胞数が限られライブラリを作成した．従来の CAGE 法では，た臓器において重要な役割を果たす遺伝子のエンハンの RNA を必要とし，胎生期性腺支持細胞から得られる連絡先：鹿島田健一 東京医科歯科大学発生発達病態学〒 ―東京都文京区湯島 丁目 ―TEL ： ――
FAX： ――
E-mail：kkashimada.ped@tmd.ac.jp18

日本生殖内分泌学会雑誌（2022）27 : 18-23

ラng の RNA サンプルを用いて cDNA― ug

RNA サンプルで解析可能な量を直接回収することは困難であるため，PCR によって cDNA を増幅し，ステージ毎に，n＝でライブラリを作成した．またコントロー

ルとして，E ．の精巣からも同様に支持細胞を回収し，マウスを用いた経時的エンハンサー RNA 解析による卵巣体細胞特異的エンハンサー候補領域および疾患感受性領域の同定

図

エンハンサー候補領域の抽出（Nakagawa et al HMG, Figure を一部改変）（A）経時的・定量的にエンハンサー候補領域を抽出するためのフローチャート．
（B）Two-way ANOVA による検定の概要．eRNA の発現量/標的遺伝子の発現量を従属変数，各ステージを独立変数として設定した．eRNAの発現量/標的遺伝子の発現量は，それぞれの全ステージにおける発現量の平均で標準化した．CPM : count per million.

CAGE 法による解析を行った．

A）．Two-way ANOVA では，帰無仮説を「エンハンサー次に卵巣の分化に重要な遺伝子（Wnt ，Rspo ，Foxlの経時的発現変化が標的遺伝子と相似する」とし，従属，Bmp ，Fst）のエンハンサーを同定するため，CAGE変数を eRNA/標的遺伝子の発現量，独立変数を各ステー法でプロファイルした eRNA と該当遺伝子 mRNA の経ジとして設定した．Two-way ANOVA で p＜ ． となる時的発現量変化を解析した．エンハンサーから標的遺伝

tag は，標的遺伝子との発現量の比がステージ毎に変化）子までの距離は Mb 程度以内が多く ，余裕をもって，する，すなわち eRNA の発現が標的遺伝子とは相似し遺伝子の上下流 Mb に存在する CAGE tag に注目しないと判断されるため除外した．一方，p＞＝ ． の tag

た．続いて，転写開始点の特徴であるクラスターを形成

は標的遺伝子との発現量の比がステージ間で変化しなし，かつ卵巣特異的に発現をしている（＝E ．の精巣い，すなわち eRNA の発現が標的遺伝子と相似する可では発現を認めない）ものを選択した．このうち，経時能性があると判断し，エンハンサー候補として選択した的発現量変化が標的遺伝子 mRNA と相似する tag の領（図B）．

域を，Two-way ANOVA を用いて検定，抽出した（図研究フロンティア

19

中川竜一

他

―E /Wn ―E の標的となっている可能性を除外するため，Rs ―E /Wn ―E の 周 辺 Mb に 存 在 す る 遺 伝 子 のmRNA 発現量が，Rs ―E /Wn ―E の発現量と相似する可能性の有無を検討した．結果，Rs ―E /Wn ―E 周辺
Mb には Rspo や Wnt 以外に該当領域と発現量変化が相似する遺伝子は存在しなかった．このことは，Rspo/Wnt が Rs ―E /Wn ―E による調節を受けている可能性が高いことを示唆した．

Rs ―E ，Wn ―E は In vitro で活性を示した
Rs ―E ，Wn ―E を luciferase vector にクローニング細胞（マウス顆粒膜細胞由来）に Lipofection

し，KK―
図

PCR を併用した CAGE ライブラリの定量性（Nakagawa et al HMG, Figure を一部改変）
RNA input＝ ng， ng， ng で cDNA ライブラリ法を用いて導入し転写活性を評価した．結果，いずれもに対しそれぞれ異なるサイクルの PCR による増幅を行い，得られたライブラリ間の発現プロファイルを比較した．上段は各ライブラリ間の相関係数を表で表している．下段は，各サンプル間の発現プロファイルのハンサー活性を in vitro で証明した．

エンハンサー候補領域周辺にヒト POI 患者で有意一部を拡大したもの．

なバリアントを同定した

有意な転写活性を示し（図），つの候補領域のエン同定されたエンハンサー候補領域はヒトとマウス間で結果比較的高い保存性を認めた（図PCR を併用した CAGE では定量性が担保されていた）．そこで，同定したエンハンサー候補領域が臨床的にもつ意義を検討した．
卵巣分化が障害されていると考えられる日本人女性の患

CAGE 法のライブラリ作成において，PCR による増幅の有用性を確認するため， ng/ ng/ng の RNA者（ ，XX DSD例，性腺異形成例，POI例，計 例）について，血液から抽出された genomic DNAから cDNA を作成し，それぞれ / / サイクル数でを用い，ヒトにおけるエンハンサー候補領域（以下 RS

PCR による増幅を行い，得られたライブラリ間の発現―E ，WN ―E ）周 辺 の copy number variation（以 下プロファイルの相関を検証した．結果，ライブラリ間でCNV）および single nucleotide variant（以下 SNV）を高い相関（r＝ ． 〜 ． ）を示し，PCR で増幅した CA-検証した．結果，CNV は認められなかったが，POI 患

GE 法でも発現プロフィルが変化しないことを確認した者において稀な SNV を RS ―E 内（NC_（図C＞G（rs）．
．

Rspo と Wnt のエンハンサー候補領域を同定したにeRNA/標的遺伝子 mRNA の発現量変化を経時的に解析し，最終的に Rspo の上流

Mb（mm chr :，以下 Rs ―E ）および Wnt 上流―
chr :―kb（mm），Minor Allele Frequency ．

）つずつ同定した．日本人健常人のバリアントデータベースである ToMMo（Tohoku Medical Megabank Orた Odds Ratio はそれぞれ ． （ ． ―（ ． ―． ），．

）と有意であった．

）．これらの領域は assay for transposase-accessible chromatin withhigh-throughput． ：g．

ganization database）を参照して関連解析を行い算出し，以下 Wn ―E ）にそれぞれエンハンサー候補領域を同定した（図）と WN ―E 周 辺（NC_G＞A（rs． ：g．

），Minor Allele Frequency

考察sequencing （ATAC-seq）でいずれもopen chromatin 構造をもつことを確認し，エンハンサー

本研究の特筆すべき点は主に以下の領域として矛盾しない結果であった．一方，Rs ―E /Wn

第一に，PCR を併用することで，少量の RNA を用い―E の周辺に存在する Rspo /Wnt 以外の遺伝子が Rs

た CAGE 法の開発に成功したこと，第二に，eRNA を20

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.27 2022

つである．

マウスを用いた経時的エンハンサー RNA 解析による卵巣体細胞特異的エンハンサー候補領域および疾患感受性領域の同定

図

同定されたエンハンサー候補領域の特徴（Nakagawa et al HMG, Figure を一部改変）
E ， /E ．/P 卵巣支持細胞の CAGE データ，E ．精巣支持細胞の CAGE データおよび CAGE と同様の方法で分取した性腺支持細胞を使った ATAC-seq のデータ（E ．精巣支持細胞，E ．卵巣支持細胞）をゲノムブラウザ上に表示している．縦軸は CPM（countper million）を示し，CAGE では eRNA が転写される方向が→の場合に＋（正），→の場合に−（負）とした．Rs ―E とWn ―E の in vitro における転写活性の評価は Renilla を内因性コントロールとし，dual luciferase assay system で解析した．CTRL
は Firefly luciferase ベクター単体．Mean±SEM，n＝ ，＊：p＜ ． ．

図

エンハンサー候補領域のマウス/ヒト間における保存性（Nakagawa et al HMG, Figure を一部改変）
マウスとヒトにおけるエンハンサー候補領域の配列の保存性を VISTA（visualization tool for alignments）を用いて表示した．赤で示された部分は，保存性が ％を超える領域を示している．青矢印は患者で同定されたバリアントを示しており，このうち濃い青の矢印は関連解析でOdds ratio が有意に高かったバリアントを意味する．

定量することで，エンハンサー活性をもつエンハンサーブラリ作成前に PCR により増幅するという比較的簡便候補領域を同定することができる新たな手法を見出したな方法を試みたが，この方法でも，特に遺伝子プロファこと，第三に，ヒトにおける本法で同定された候補領域イルに大きな変化を与えることなく増幅できることが明から，ヒトにおける卵巣発生障害をもつ患者からまれならかとなった．これにより，少ない RNA を試料とする多型を同定したことである．

解析，とくに胎仔マウスの臓器や特定の細胞など広く in

CAGE の原法は解析に必要な RNA 量が多く大量の細胞を必要とする技術的な限界があるため ），過去にもいくつかの方法が試みられてきた， ）．本研究では，ライvivo における希少な細胞の解析実験への応用可能と考えられる．
また，本研究で最も大きな問題となったのは，同定し研究フロンティア

21

中川竜一

他たエンハンサー候補領域と候補となる対象遺伝子との関連づけである．エンハンサーは標的遺伝子から遠く離れた位置に存在することが多く，実際に候補となるエンハンサーが対象遺伝子の制御に関わることを証明することは 容 易 で は な い．本 研 究 で は eRNA の 定 量 性 に 着 目し ，），絞り込んだ卵巣特異的なエンハンサー候補領域に対して，さらにエンハンサー候補領域周辺の別の遺伝子が逆にエンハンサー候補領域のターゲットとなる可能性を除外することで，同定したエンハンサー候補領域と候補となる対象遺伝子との関連づけを行った．今後はより直接的な手法を用いた解析法の開発，例えば少量の試料で可能な HiC 法などが望まれる．
最後に，本来 genome wide association study（以下GWAS）のような統計的手法で疾患と関連しうるバリアントを同定する場合，多くの患者数を含むコホートが必要となる．その点，POI に対して GWAS で解析を行った既報 ― ）と比較すると，本研究はより少ない症例数から有意なバリアントを同定できた．マウスを用いた機能解析結果をもとにヒトのエンハンサーを同定する手法
は，以前より用いられているが，そうした手法ではより簡便にかつ網羅的にマウスのサンプルを用いる技術が望まれる．本研究により開発した手法はそうした点を満たすと考えられ，今後さらなる疾患に関連するバリアントの探索に有用であると考えられた．
今後，本研究で示したアプローチを発展させることで，卵巣以外の組織/臓器においてもエンハンサーを効率的にとらえられるようになる可能性がある．これにより将来的には，様々な組織/臓器の発生分化のメカニズムが解明され，ひいては多くの疾患の病態解明につながることが期待される．
（なお本研究は，Human Molecular Genetics（）に掲載された．
）

引用文献．Knarston I, Ayers K, Sinclair A（）Molecular mechanisms associated with, XX disorders of sex development. Clin Sci（Lond）,,― .
．Rossetti R, Ferrari I, Bonomi M, Persani L（）Geneticsof primary ovarian insufficiency. Clin Genet ,― .
．Chandra V, Bhattacharyya S, Schmiedel BJ, Madrigal A,
Gonzalez-Colin C, Fotsing S, Crinklaw A, Seumois G, Mohammadi P, Kronenberg M, Peters B, Ay F, Vijayanand P（）Promoter-interacting expression quantitative trait lociare enriched for functional genetic variants. Nat. Genet,―.
．Thurman RE, Rynes E, Humbert R, Vierstra J, Maurano
MT, Haugen E, Sheffield NC, Stergachis AB, Wang H,Vernot B, Garg K, John S, Sandstrom R, Bates D, Boat-22

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.27 2022

man L, Canfield TK, Diegel M, Dunn D, Ebersol AK,Frum T, Giste E, Johnson AK, Johnson EM, Kutyavin T,
Lajoie B, Lee BK, Lee K, London D, Lotakis D, Neph S,
Neri F, Nguyen ED, Qu H, Reynolds AP, Roach V, Safi
A, Sanchez ME, Sanyal A, Shafer A, Simon JM, Song L,Vong S, Weaver M, Yan Y, Zhang Z, Zhang Z, Lenhard
B, Tewari M, Dorschner MO, Hansen RS, Navas PA, Stamatoyannopoulos G, Iyer VR, Lieb JD, Sunyaev SR, Akey
JM, Sabo PJ, Kaul R, Furey TS, Dekker J, Crawford GE,
Stamatoyannopoulos JA（） The accessible chromatin
landscape of the human genome. Nature,― .
．Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N（）Capturing chromosome conformation. Science,―.
．Sanyal A, Lajoie BR, Jain G, Dekker J（） The longrange interaction landscape of gene promoters, Nature,― .
．Melgar MF, Collins FS, Sethupathy P（）Discovery ofactive enhancers through bidirectional expression of shorttranscripts. Genome Biol , R .
．Andersson R, Gebhard C, Miguel-Escalada I, Hoof I, Bornholdt J, Boyd M, Chen Y, Zhao X, Schmidl C, Suzuki T,Ntini E, Arner E, Valen E, Li K, Schwarzfischer L, Glatz
D, Raithel J, Lilje B, Rapin N, Bagger FO, Jørgensen M,Andersen PR, Bertin N, Rackham O, Burroughs AM, Baillie JK, Ishizu Y, Shimizu Y, Furuhata E, Maeda S, Negishi Y, Mungall CJ, Meehan TF, Lassmann T, Itoh M,Kawaji H, Kondo N, Kawai J, Lennartsson A, Daub CO,Heutink P, Hume DA, Jensen TH, Suzuki H, Hayashizaki
Y, Müller F, Forrest ARR, Carninci P, Rehli M, Sandelin
A（）An atlas of active enhancers across human celltypes and tissues. Nature,―.
．Arnold PR, Wells AD, Li XC（）Diversity and Emerging
Roles of Enhancer RNA in Regulation of Gene Expression
and Cell Fate. Front Cell Dev Biol ,.
．Kim TK, Hemberg M, Gray JM, Costa AM, Bear DM,Wu J, Harmin DA, Laptewicz M, Barbara-Haley K, Kuersten S, Markenscoff-Papadimitriou E, Kuhl D, Bito H,Worley PF, Kreiman G, Greenberg ME（）Widespreadtranscription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature,― .
．Zhao L, Ng ET, Koopman P（）A piggyBac transposon- and gateway-enhanced system for efficient BAC transgenesis. Dev Dyn,―.
．Lettice LA, Heaney SJH, Purdie LA, Li L, de Beer P,
Oostra BA, Goode D, Elgar G, Hill RE, de Graaff E（）A long-range Shh enhancer regulates expression inthe developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Hum Mol Genet ,―.
．Cvetesic N, Leitch HG, Borkowska M, Müller F, Carninci
P, Hajkova P, Lenhard B（）SLIC-CAGE : high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levelsof total RNA. Genome Res ,―.
．Plessy C, Bertin N, Takahashi H, Simone R, SalimullahM, Lassmann T, Vitezic M, Severin J, Olivarius S, Lazarevic D, Hornig N, Orlando V, Bell I, Gao H, Dumais J,Kapranov P, Wang H, Davis CA, Gingeras TR, Kawai J,Daub CO, Hayashizaki Y, Gustincich S, Carninci P （）Linking promoters to functional transcripts in small samples with nanoCAGE and CAGEscan. Nat. Methods,

マウスを用いた経時的エンハンサー RNA 解析による卵巣体細胞特異的エンハンサー候補領域および疾患感受性領域の同定―.
．Kang H, Lee SK, Kim MH, Song J, Bae SJ, Kim NK, Lee
SH, Kwack K（）Parathyroid hormone-responsive B
gene is associated with premature ovarian failure. Hum
Reprod ,―.
．Knauff EAH, Franke L, van Es MA, van den Berg LH,
van der Schouw YT, Laven JSE, Lambalk CB, Hoek A,Goverde AJ, Christin-Maitre S, Hsueh AJ, Wijmenga C,Fauser BCJM, Consortium DPOF（）Genome-wide association study in premature ovarian failure patients suggests

ADAMTS
as a possible candidate gene. Hum. Reprod,―.
．Pyun JA, Cha DH, Kwack K（）LAMC gene is associated with premature ovarian failure. Maturitas ,― .
．Qin Y, Zhao H, Xu J, Shi Y, Li Z, Qiao J, Liu J, Qin C,Ren C, Li J, Qin C, Ren C, Li J, Chen S, Cao Y, China
POF Study Group ; Joe Leigh Simpson, Chen ZJ（）
Association of q ． locus in Chinese Han with idiopathic premature ovarian failure（POF）. Hum Mol Genet,― .

研究フロンティア

23