F u n da m e n t a l Le c t u r e

光学系構築（実践編）
全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）を作ってみよう

Construction of an optical system (Practical):Letʼs create a total internal reflection
fluorescence microscope (TIRFM)
飯野 亮太
Ryota IINO
大学共同利用機関法人自然科学研究機構 分子科学研究所
Institute for Molecular Science, National Institutes of Natural Sciences〒 444-8787 岡崎市明大寺町字東山 5-1
5-1 Higashiyama Myodaijicho, Okazaki 444-8787
e-mail: iino@ims.ac.jp
分類番号 : 9.4, 7.10

全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）は，ガラス基板近傍の試料のみに届くエバネッセント場を局所的な励起光として用いる光学顕微鏡です．エバネッセント場を利用して背景光を大幅に低減することで，水中，室温で蛍光色素 1 分子をリアルタイムイメージングすることができます．本稿では，TIRFM の基本原理と装置の構築法を解説します．

1. まえがき：界面における光の全反射とエバネッセント場の形成と呼びます2)．エバネッセント場は遠距離には伝播できず，その強度 I は界面から離れるに従い指数関数的に減衰します．

全 反 射 蛍 光 顕 微 鏡（Total Internal Reflection FluoresI =I exp(−z/d)(2)cence Microscope: TIRFM）は，光の全 反 射で生じるエバネッセント場で観察試料を励起します1)．まず，屈折率の高い式(2)の I0 は界面におけるエバネッセント場の強度，z は界媒質から低い媒質に向け光を入射するケースを考えてみましょ

面からの距離，d はエバネッセント場の「しみ出しの深さ（侵う（図 1）．このとき，入射角がある角度以上（臨界角）にな入長）」です．d は媒質の屈折率，光の波長 λ，および入射ると光は両媒質の界面で全反射します．両媒質の屈折率をn1，n2（n1>n2）とすると臨界角 θc は式(1)で表されます．
sin θ =n/n

界面からの距離(1)

これは，スネルの法則で低屈折媒質側の屈折角が 90° であるのに相当します．生体試料を観察対象とした全反射照明
蛍光顕微鏡では，屈折率の高い媒質にはホウケイ酸ガラス（BK7，n1 =1.52，ただし光の波長により若干変化します），低い媒質には水（n2=1.33）が用いられることがほとんどで，エバネッセント場（ 〜100 nm)

エバネッセント場の強度

試料（水）2=1.33ガラス
1=1.520/e0

入射光

反射光

入射角θ

ガラスと水の界面の臨界角は 61.0° となります．
高屈折率側から入射された光が界面で全反射する際，界面の低屈折率側の表面に「しみ出す」光をエバネッセント場

図 1 ガラス（屈折率 1.52）と水（屈折率 1.33）の界面にガラス側から入射した光の全反射によるエバネッセント場の形成．エバネッセント場の侵入長 dは 100 nm 程度である．

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Fund amental L ectur e(a)

プリズム

反射光

（ｂ）

入射光

スライドガラス
エバネッセント場

試料

エバネッセント場

試料

カバーガラス

カバーガラス

油浸オイル
θc

油浸対物レンズθ後焦点面対物レンズ

蛍光蛍光
入射光

c= ×1.33=×
図2TIRFM を構築する 2 つの方式．(a)プリズム型，(b)対物レンズ型．対物レンズ型では，高い開口数（NA=1.4 以上）をもつ対物レンズの辺縁部（>wc）からレーザー光を入射する．

角 θ（ただし θ>θc）によって決まります（式(3)）．

ム型では，入射光のビーム径を大きくすれば大きな面積のエバネッセント場を形成することができます．また，低い開口数

d=λ/4π (nsin θ) −n (3)（NA）の低倍率の対物レンズが利用できます．これらの理由

例えば入射光の波長を 532 nm（2 倍波 YAG レーザー），からプリズム型では，直径が数百 μm 以上の広い視野も観察

入射角を 66° とすると，ガラスと水の界面で発生するエバネッ可能という利点をもちます．一方，対物レンズが接するカバーセント場の水側への侵入長は d=106 nm となります．また，ガラスとは反対側のスライドガラス面上にエバネッセント場を形

入射角 θ の最大値は 90°（sin(90°)=1）なので，エバネッセ成するため，観察には試料の厚みを数十 μm 程度に非常にント場の侵入長の最小値 dmin は式(4)で表され，波長 532薄くするか，作動距離が長い対物レンズを使用する必要があ

nm，n1 =1.52（ガラス），n2 =1.33（水）では dmin =58 nm

ります．
プリズム型のこのような欠点を解決する方法として，最近はとなります．

対物レンズ型が頻繁に使用されています（図 2(b))3)．対物d  =λ/4π n −n (4)レンズ型では，高い NA をもつ油浸対物レンズ（NA=1.4 以上，最近は 1.49 のものが主流です）の辺縁部からレーザー

2.

エバネッセント場を形成させる方法：プリズム型と光を入射し，カバーガラスと試料の界面にエバネッセント場を対物レンズ型形成させます．高い NA の対物レンズは高倍率（60 倍以上）

光の全反射で形成されたエバネッセント場を用いると，ガラであり，さらに形成できるエバネッセント場の面積も限られるたス表面から 100 nm 程度の距離に存在する蛍光色素を選択的め（後述），一般的に観察できる視野は直径 100 μm 以下にに励起することができます．光学顕微鏡上でエバネッセント場限定されます．対物レンズ型では広い視野の観察は難しくなりを形成させ照明光に用いる方法には，プリズム型と対物レンズますが，光学顕微鏡（我々はオリンパス(株)社製の倒立型顕型の 2 種類があります（図 2）．プリズム型，対物レンズ型と微鏡を利用）の落射照明用ポートからレーザー光を導入するもに多くの場合，励起光には平行性の高いレーザー光が用いだけで構築が可能となります．また試料の上部があくので，られます．

試料への薬剤の添加や溶液交換などが容易になるという利点

プリズム型では，試料を観察するためのプレパラート（フもあります．

ローセル）のスライドガラス側に密着させたプリズムにレーザー光を入射し，スライドガラスと試料水溶液の界面で全反1)射させてエバネッセント場を形成します（図 2(a)) ．プリズ

3.

対物レンズ型 TIRFM の構築

対物レンズの NA は，焦点位置にある点光源から発せられ光学系構築（実践編） TIRFMを作ってみよう（飯野）／ 基礎講座
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F u n da m e n t a l Le c t u r e

(a)

（ｂ）

エバネッセント場

対物レンズ

対物レンズ

後焦点面
1=

エバネッセント場
後焦点面
1=+ =+ + +Δ
M1

DMDM

M1

Δ
L1

BF

FS
BE

L2

L1

BF

FS

L2ND

BEND

レーザー

EMCCD

EMCCD

レーザー

(c)
NDBEFSレーザー

倒立型顕微鏡

図3L1( 1=450 mm)

M1対物レンズ型 TIRFM の構築例．ND：減光フィルタ，BE：ビームエキスパンダ，FS：視野絞り，L1：レンズ，M1：ミラー，DM：ダイクロイックミラー，BF：バリアフィルタ，L2：顕微鏡の鏡筒レンズ（オリンパス社の顕微鏡では f2=180 mm）．(a)L1 の手前の試料面と共役な位置に M1 を置き角度をあおる方法．各光学部品
は，L1 の焦点距離 f1 との間で f1=a+b=c が成り立つように配置する（図中の a+b と c の縮尺は異なる点に注意されたい）．(b)L1 の後に M1 を置いて平行移動する方法．M1 の平行移動により光路長が変化する（Δx）
点に注意が必要．各光学部品は，L1 の焦点距離 f1 との間で f1 =a+b+c+Δx が成り立つように配置する．
(c)(a)の方式の構築例．L1 として焦点距離 450 mm のレンズを利用（f1=450 mm）．定盤のねじ穴の間隔は25 mm．

る光をどのくらい広い角度まで集められるかの尺度であり，式ます．この強度分布を緩和して均一に近づけるため，ビーム(5)で定義されます．

エキスパンダ（BE）でビーム径を広 げ て視 野 絞り（FieldStop: FS）で中心部のみを用います．また，対物レンズから

NA=nsin θ (5)出射されたレーザー光を平行光にしてガラスと試料界面へのここで θNA は対物レンズが光を集めうる最大の角度であり，入射角を一定にするため，レンズ（L1）を用いて対物レンズ

n1 はガラス（油浸オイル）の屈折率 1.52 となります（図 2の後焦点面にあらかじめ集光させます．レーザー光の入射角(b)）．よって例えば，NA=1.49 の対物レンズの θNA は 78.6°の調整は，L1 の手前の試料面と共役な位置にミラー（M1）となります．また，前述したガラスと水の界面の臨界角 61.0°を置きその角度をあおる方法（図 3(a)），または L1 の後には NA=1.33（1.52×sin(61.0°)）に相当します．対物レンズ

M1 を置き平行移動させる方法（図 3(b)）の 2 種類が一般型 TIRFM の構築には，この臨界角以上の領域に相当する対的です．図 3(c)は前者（図 3(a)）の方法の構築例となりま物レンズの辺縁部にレーザー光を入射する必要があります．

す．なお，後者（図 3(b)）の方法では，ミラーの平行移動対物レンズ型 TIRFM の光学系の模式図を図 3 に示しまによって光路長が変化するので注意が必要です（図 3(b)のす．励起光に用いるシングルモードレーザーの強度分布はガΔx）．また，構築に必要な光学部品や光学素子は，シグマ光ウス関数で近似され，中心部と辺縁部で強度が大きく異なり機(株)4)，ソーラボジャパン(株)5)，クロマテクノロジ ジャパン

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Fund amental L ectur e(a)エバネッセント場
s偏光
p偏光

s偏光

（ｂ）

12対物レンズ

回折光学素子
試料面

(c)

後焦点面

L2( 2=150 mm)

視野絞り

輪帯絞り

L1
( 1=100 mm)(d)

倒立型顕微鏡図4

輪帯照明 TIRFM の構築例．(a)エバネッセント場の偏光の模式図．一方向のみから入射した光で形成したエバネッセント場は大きく偏光している．(b)輪帯照明光学系の模式図．回折光学素子を用いて輪帯照明を形成し偏光を解消．輪帯絞りと後焦点面，試料面と視野絞りはそれぞれ共役な位置に配置する．(c)顕微鏡入射直前の輪帯照明の写真．(d)実際の構築例．
定盤のねじ穴の間隔は 25 mm．

合同会社6)，(株)オプトライン7)などから購入することができま

面積は，視野絞り後のビーム径，およびレンズ L1 と対物レンす．

ズの焦点距離の比で決まります．例えば，ビーム径が 5 mm，なお，実際のレーザー光のビーム径は無限小でなく有限な

L1 の焦点距離が f1=300 mm とすると，60 倍の対物レンズの大きさをもつため，対物レンズの NA が高いほど光学系の調焦点距離 f=3 mm より，試料面でのエバネッセント場の直径整は容易になります．具体的にいうと，エバネッセント場を形は 50 μm（5 mm×(3 mm/300 mm））となります．ビーム径が成するには，図 2(b)の対物レンズ下部に示した wc と wNA の大きすぎる（>10 mm）と対物レンズ辺縁部への入射が困難間にレーザー光を入射，集光させる必要があります．ここでになり，試料面での完全な全反射が達成できなくなります．こwc，wNA はそれぞれ，入射角 θc，θNA に対応する光軸からのため，対物レンズ型で形成できるエバネッセント場の大きさ対物レンズ辺縁部への距離です．対物レンズの焦点距離を fは一般的に直径 100 μm 以下に限定されます．とすると，正弦条件から wNA は式(6)で表されます．
w= f ×NA

(6)

4.

TIRFM を利用するうえでの注意点：エバネッセ
ント場の偏光特性

例 え ば，オリン パ ス 社 製 の 倍 率 60 倍 の 対 物 レンズ

対物レンズ型に限らず，TIRFM を構築，利用するうえで注（NA=1.49）を例にとると，焦点距離 f は 3 mm（オリンパス

意すべき点は，エバネッセント場の偏光特性です2)．全反射社製顕微鏡の鏡筒レンズ L2 の焦点距離 180 mm より 180により形成されるエバネッセント場は，入射面に垂直な p 偏光mm/60=3 mm と計算）なので，wNA=4.47 mm となります．

方向の成分はほとんど打ち消され，入射面に平行な s 偏光の同 様 に，wc =3 mm×1.33=3.99 mm となります．よって，成分のみをもちます（図 4(a)）．このため，1 方向のみから

wNA −wc =0.48 mm の幅にレーザー光を入射，集光させるこ

光を入射して形成させたエバネッセント場は，ガラス表面に平とになります．また，試料面で形成されるエバネッセント場の行な平面において大きく偏光しています．よって，ガラス表面光学系構築（実践編） TIRFMを作ってみよう（飯野）／ 基礎講座
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F u n da m e n t a l Le c t u r eに蛍光色素を強固に結合させた場合，エバネッセント場の偏ていただければと思います．
「習うより慣れろ」です．次回

光方向に対して蛍光色素の遷移モーメントがどちらを向いていは，TIRFM による 1 分子イメージングの実際例について解説

るかで励起効率が大きく異なり，蛍光強度に大きなばらつきがします．

生じます．この問題を解決するため，直交する 2 方向から光を入射してエバネッセント場を形成させる方法や8)，リング状

文の入射光（輪帯照明）を用いてエバネッセント場を形成させ

1）D. Axelrod: Methods in Cell Biol. 30, 245 (1989).
2）D. Axelrod, T.P. Burghardt, and N.L. Thompson: Ann. Rev. Biophys. 13,247 (1984).
3）M. Tokunaga, K. Kitamura, K. Saito, A.H. Iwane, and T. Yanagida:
Biochem. Bioph. Res. Co. 235, 47 (1997).
4）http://www.sigma-koki.com
5）http://www.thorlabs.jp
6）https://jp.chroma.com
7）http://www.opto-line.co.jp
8）M.G. Bell, R.E. Dale, U.A. van der Heide, and Y.E. Goldman: Biophys. J.

る方法が報告されています9,10)．これらの方法を用いると，ガラス表面に平行な方向での蛍光色素の向きによらず，一定の蛍光強度を得ることができます（ただし，ガラス表面に垂直な方向の向きの違いによる強度のばらつきは解消されません）．
図 4(b)〜(d)は，輪帯照明 TIRFM の光学系の例を示しています．この例では，回折光学素子（米国 MEMS Optical 社
製 Diffractive diffuser #075）を用いて輪帯照明を形成していますが，代わりにアキシコンレンズ（円錐レンズ，例えばソーラボジャパン社製 AX2510-A）を用いることも可能です．
なお，エバネッセント場の偏光特性を逆手に取ると，1 分子の蛍光色素の向きを検出することも可能になります．例えば，対物レンズ辺縁部に沿って入射位置を周期的に回転させることで偏光の向きを一定周期で回転させ，タンパク質に強固に結合させた蛍光色素の向きの変化からタンパク質 1 分子の構献

83, 1050 (2002).
9）H. Makyio, R. Iino, C. Ikeda, H. Imamura, M. Tamakoshi, M. Iwata, D.
Stock, R.A. Bernal, E.P. Carpenter, M. Yoshida, K. Yokoyama, and S.
Iwata: EMBO J. 24, 3974 (2005).
10）K. Adachi, K. Oiwa, T. Nishizaka, S. Furuike, H. Noji, H. Itoh, M.
Yoshida, and K. Kinosita, Jr.: Cell 130, 309 (2007).
11）T. Nishizaka, K. Oiwa, H. Noji, S. Kimura, E. Muneyuki, M. Yoshida, andK. Kinosita, Jr.: Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 142 (2004).
12）T. Masaike, F. Koyama-Horibe, K. Oiwa, M. Yoshida, and T. Nishizaka:Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 1326 (2008).
（2018 年 1 月 15 日 受理）

造変化を検出する方法が報告されています11,12)．

5. むすび飯野

筆者が研究用の光学顕微鏡を初めて触ったのは，研究分

亮 太（いいの りょうた）2000 年名古屋大学大学院理学研究科単位取得退学．03 年

野を大きく変えて 1 分子蛍光イメージングに取り組み始めた博博士（理学）．国立研究開発法人科学技術振興機構（JST）
ERATO 研究員，大阪大学産業科学研究所特任助手，助手，士後期課程からでした．当初は研究室に同じテーマに携わる助教，東京大学工学系研究科講師，准教授を経て，14 年 6

者はおらず，1 人で手探りの状態で TIRFM の構築を試みて月より大学共同利用機関法人自然科学研究機構分子科学研究所・岡崎統合バイオサイエンスセンター教授．総合研究大学院いました．そのときの経験は今，大きな財産となっています．

大学教授兼任．

若い読者の方々もぜひ，自らの手で積極的に顕微鏡をいじっ

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