原著論文
81（短報）

藻類 Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 81-84, July 10, 2020

Spirogyra fluviatilis（ホシミドロ科）の膨圧調節岩田和佳 1*・岡崎芳次 ・田沢仁 3・新免輝男
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兵庫県立大学大学院生命理学研究科（〒 678-1297 兵庫県赤穂郡上郡町光都 3 丁目 2 番 1 号）
大阪医科大学生物学教室（〒 569-8686 大阪府高槻市大学町 2 番 7 号）
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福井工業大学応用理化学科（〒 910-8505 福井県福井市学園町 3 丁目 6 番 1 号）
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Kazuyoshi Iwata1*, Yoshiji Okazaki2, Masashi Tazawa3 and Teruo Shimmen1: Characterization of turgor regulation of Spirogyra fluviatilis(Zygnemataceae). Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 81-84 July 10, 2020
Turgor regulation of Spirogyra fluviatilis was investigated. Turgor regulation was completely inhibited by Gd 3+ (stretch-activated(SA) channel blocker), which suggests that sensor of turgor might be SA channel. Turgor was also inhibited by dark condition,
tetraethylammonium (K+ channel inhibitor), NPPB (Cl- channel inhibitor), amiprophos-methyl (anti-microtubule reagent). It was shownthat malate and NO3- increased significantly accompanying turgor regulation when solutes of Spirogyra cell were analyzed with ionchromatography. Detection of malate was characteristic of this phenomenon because malate was not detected in control cell. These results
showed similarity between turgor regulation of S. fluviatilis and osmoregulation of guard cell of land plants. In addition, character ofconjugation of Spirogyra was discussed from these results.
Key Index Words: Gd3+, malate, Spirogyra, turgor regulation
Graduate School of Life Science, University of Hyogo, Harima Science Park City, Hyogo 678-1297, Japan
Department of Biology, Osaka Medical College, Takatsuki, Osaka 569-8686, Japan3
Department of Applied Physics and Chemistry, Fukui University of Technology, Fukui, Fukui 910-8505, Japan
12*Author for correspondence: k-iwata@arion.ocn.ne.jp

植物は，浸透ストレスに対し，膨圧を元に戻そうとする反用い各種阻害剤を用いたり光条件を変えたりした生理学的解応（膨圧調節）や浸透圧を元に戻そうとする反応（浸透圧調節）を行う。藻類では，膨圧調節は海藻（緑藻 Valonia，析と，イオンクロマトグラフィーによる浸透調節物質の分析形成誘導において，前処理として膨圧調節を行わせると細胞になるように溶解して保存液とした），アクチンフィラメンを行い，膨圧調節の現象解析を行った。

Chaetomorpha など）（Zimmermann 1978，Kirst 1990）や
S. fluviatilis は， 京 都 府 城 陽 市 の 池 で 採 取 し，C 培 地
汽水域の藻類（シャジクモ植物 Lamprothamnium，黄緑藻（Closterium 用培地，Ichimura 1971）で，23 ℃で継代培養
Vaucheria な ど ）（Okazaki 1996，Muralidhar et al. 2015） したもので，以前の研究（Iwata 1995，Iwata & Itoh 1998，など，浸透圧調節は淡水産シャジクモ植物 Chara（Kamiya
Iwata et al. 2001）で用いたものと同じ株である。明暗条件は 16 h light（蛍光灯）-8 h dark，光強度は 90 µmol m-2 s-1& Kuroda 1956，Bisson & Bartholomew 1984）で報告がある。とした。新しい培地に植継いでから 2~7 日経過した細胞（増アオミドロの一種である Spirogyra fluviatilis Hilse（Fig.
殖期）を実験に用いた。
膨圧調節の誘導には，人工池水（0.1 mM each of KCl,1a）は，膨圧調節を行う淡水藻として最初に報告された（Iwataet al. 2001）。また，アオミドロは，系統的に最も陸上植物
NaCl, CaCl2, and 5 mM HEPES-Tris [pH7.5]）を用いた。に近い藻類とされるホシミドロ目に含まれる（Delaux et al.
培地中の細胞を人工池水で軽くすすぎ，マンニトールを人工池水に溶解した溶液中に移して膨圧調節を誘導した（Iwata2015）。したがって，アオミドロの膨圧調節が，膨圧調節をet al. 2001）。マンニトール濃度は，人工池水中での細胞の行うことが知られている陸上植物（Shabara & Lew 2002）浸透圧（限界原形質分離法で求める）の約 3/4 にあたる 0.40や，汽水域産を含む海藻（Zimmermann 1978，Kirst 1990，
Okazaki 1996，Muralidhar et al. 2015）のいずれに近い性M を採用した。
質を持つか，系統進化的視点から興味が持たれる。
阻害剤は，SA-channel blocker として Gd3+，微小管破壊Spirogyra castanacea G.C. Couch は，溶液中での接合子剤として amiprophos-methyl（APM，DMSO に 5 mg mL–1のダメージが少なく，接合子形成が効率よく誘導されること

ト破壊剤としてサイトカラシン D（CD，DMSO に 10 mM形成誘導の理解にはアオミドロ属藻類の膨圧調節の更なる理解が必要と考えられる。そこで本研究では，S. fluviatilis をと し て テ ト ラ エ チ ル ア ン モ ニ ウ ム（TEA），Cl-channel
blocker として 5-Nitro-2-(3ʼ -phenylpropyl-amino)benzoicが明らかになっている（岩田ら 2020）。したがって，接合子になるように溶解して保存液とした），K-channel blocker

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岩田らCell osmotic pressure (M)bc0.550.50.450.40.35

controlGd0 261224
Incubation time (h)Cell osmotic pressure (M)

a0.55
0.5

0.45
0.4
0.35

controldark0 261224
Incubation time (h)Fig. 1. Turgor regulation of Spirogyra fluviatilis. a. Spirogyra fluviatilis cells, bar=100 µm. b. Time course of effect of Gd3+ on turgor regulation. Turgorpressure value was shown as concentration of mannitol equal to limit plasmolysis concentration (cell osmotic pressure (M)). n=5. c. Time course of light effecton turgor regulation. Turgor pressure value was shown as concentration of mannitol equal to limit plasmolysis concentration (cell osmotic pressure (M)). n=5acid（NPPB，DMSO に 50 mM になるように溶解して保の後，阻害が見られた（24 h 処理後 1% 水準で有意差あり）
3+存液とした）を用いた。Gd は 20 µM（対照は蒸留水）， （Figs 1c, 2）。他の阻害剤では，K channel 阻害剤 TEA，ClAPM は 3 µg mL-1（対照は 0.06% DMSO），CD は 10 µM
channel 阻害剤 NPPB，微小管破壊剤 APM に阻害作用が（対照は 0.1% DMSO），TEA は 10 mM（対照は蒸留水），見られたが（いずれも 24 h 処理後 5% 水準で有意差あり），NPPB は 10 µM（対照は 0.02% DMSO）の濃度で，マンactin 破壊剤 CD は阻害作用が見られなかった（Fig. 2）。まニトール溶液に加えた。阻害剤などの処理を含む膨圧調節は，た，膨圧調節と並行して，硝酸イオンとリンゴ酸が対照に比プレートをアルミホイルで包むことにより行った。細胞は，検出されず，この現象を特徴付けるものであった。

6 穴プレート（AGC テクノグラス）中で行った。光の遮断は，ピンセットでひとつまみ，各プレートに入れた。
細胞の浸透圧は限界原形質分離法で求めた。限界原形質分離法で求めた値と，オスモメーターで測定した値は，前者の値が約 50 mM 高いが，外液の浸透圧と膨圧調節の増減との関係は同様（即ち，外液の浸透圧が上昇すると膨圧が上昇してある値で安定する）であったため（Iwata et al. 2001），今回は前者の手法を用いた。細胞は，様々な濃度のマンニトール溶液中で 15 min 静置した。そして，半分以上の細胞が原形質分離した最低の濃度を細胞の浸透圧とした。

浸透調節物質の分析はイオンクロマトグラフィーにより行った。マンニトール溶液中で 24 h 静置した細胞（対照は24 h 人工池水処理）の周囲の水を濾紙（Whatman）で 3 回拭った。次に細胞を約 20 mg エッペンドルフチューブに移し，-20 ℃で 1 h 静置した。室温で融解後，細胞の重量の 9倍の蒸留水を加え，限外濾過器 minicent-10（東ソー株式会社）で，1000 x g で 10 min 遠心した。得られた濾液を蒸留水で 4 倍希釈し，イオンクロマトグラフ HIC-6A（島津製作所）を用いてイオン種の分析を行った。

SA channel 阻害剤 Gd は，膨圧調節を阻害した（Figs1b, 2）。阻害は処理後 2 h 以内に見られ，細胞の浸透圧上昇を完全に阻害した（24 h 処理後 1% 水準で有意差あり）。暗黒下では，処理後 2 h までは対照と変わらなかったが，そ3+べ有意に増加した（Fig. 3）。特に，リンゴ酸は対照では全く阻害剤実験の結果から，膨圧センサーとして SA channelが機能し，浸透調節物質として，K+，Cl- が利用されている可能性が考えられた。また，細胞骨格としては微小管が関与していると考えられた。

膨圧調節が Gd3+ で阻害される現象は，Vaucheria の場合と同様である（Muralidhar et al. 2015）。しかし，浸透調節物質の測定結果では，膨圧調節による K+ と Cl- の有意な増加は見られず，阻害剤実験の結果と一見矛盾するように見える。ただ，例えば K+ と Cl- の一時的な流入がトリガーになり，硝酸イオン，リンゴ酸が増加すると考えると矛盾はなく，今後の課題となろう。
細胞の浸透圧の測定値は，限界原形質分離法とイオン分析で大きく異なっていた。すでに述べたように，オスモメー

ターの測定値は限界原形質分離法より 50 mM 低く，今回の結果から，イオン分析は 200 mM 低い。オスモメーターとイオン分析における試料調製は，凍結した試料を融解するところまで共通であることから，試料成分そのものはほぼ同じであると考えられる。したがって，この差は測定されていな
い浸透調節物質によるものである可能性がある。例えば有機物として，藻類ではグリセロール（Ben-Amotz & Avron1973），ベタイン（Blunden et al. 1992），トレハロース，ショ糖（Bremauntz et al. 2011）が使われている。アオミドロも

830.7

mannitol

0.60.50.4**0.3

成する（Ikegaya et al. 2012），膨圧調節能がある（岩田らtreatment*****2020），乾燥ストレスで接合子形成誘導できる（Ikegaya etal. 2012）という点で類似した性質を持っている。したがって，溶液系の S. fluviatilis と，溶液系や乾燥系の S. castanaceaが現象的に類似している可能性がある。溶液系と乾燥系のS. castanacea においても，阻害剤の影響やリンゴ酸の形成などを検討する必要があるかもしれない。今回明らかになっ

0.2

た，SA channel による乾燥ストレスの受容の可能性，光要0.1

求性の現象である点，浸透制御にリンゴ酸を利用する点など
が，溶液系と乾燥系の S. castanacea でも共通であれば，S.

kdar

BPPNEA
T10µM

10µM

10mM3µMAPMCGDd020µM

Cell osmotic pressure (M)アオミドロの膨圧調節

castanacea の接合子形成誘導過程の理解が深まることが期待される。

また，溶液系と乾燥系の浸透ストレスが対応しているとす
ると，本来，乾燥系，野外では例えば水を抜いた後の水田での乾燥ストレスへの適応が，実験室レベルの溶液系では膨圧

Fig. 2. Effect of inhibitors and light condition on turgor regulation ofSpirogyra fluviatilis, after 24 h. Gd3+ (SA-channel blocker), amiprophos-methyl (APM, anti-microtubule reagent), cytochalasin D (CD, anti-actinreagent), Tetraethylammonium (TEA, K-channel blocker) and NPPB (Clchannel blocker) were used as inhibitors. Turgor pressure value was shownas concentration of mannitol equal to limit plasmolysis concentration (cellosmotic pressure (M)).*p<0.05, **p<0.01 (t-test), n=5.

調節という形で現れていた可能性がある。一般的な膨圧調節は，膨圧を一定に保つ現象であり，外液の浸透圧上昇分と同じだけ細胞内浸透圧の上昇が見られる（Zimmermann 1978，Kirst 1990，Okazaki 1996，Muralidhar et al. 2015）。しかし，S. fluviatilis の膨圧調節は外液の浸透圧上昇分の一部しか細胞内浸透圧の上昇が見られない（Iwata et al. 2001）。その生理的意味は不明であったが，本来，水中で行われる膨圧調節とは別の現象，即ち乾燥ストレスに対応する反応を，膨圧調こうした物質を利用しているのかもしれない。

節と捉えていたのかもしれない。その場合，今回の知見は，リンゴ酸を浸透調節物質として利用していることは陸上植

乾燥ストレスへの反応の解析につながる可能性があり，今後物との関係が推測される。光要求性の現象であることを含めの進展が期待される。
本研究では，S. fluviatilis の膨圧調節の解析を行った。今

ると，いわゆる膨圧調節ではないが，気孔の開閉現象に類似する（Dittrich & Raschke 1977，Scheibe et al. 1990）。汽水域の藻類や海藻からは，浸透調節物質としてのリンゴ酸は，回の結果が，単にアオミドロの研究に終わるのでなく，進化的視点を持った研究につながれば幸いである。

我々の知る限り見出されていないため，進化的に興味が持たれる。
気孔の開閉現象には，細胞骨格系として微小管とアクチンの両者が関与していることが報告されているが（Fukuda etしている可能性を指摘した。類似点の一つとして浸透ストレス（乾燥系における乾燥と溶液系におけるマンニトール処理）がある。また，S. fluviatilis と S. castanacea とは，仮根を形

*

50

*
34totalSONO0Cm lalate

系の S. castanacea の接合子形成誘導過程が，現象的に類似

100Pに思われる。
岩田ら（2020）は，乾燥系（Ikegaya et al. 2012）と溶液150a

トリガーになる可能性との比較は，検討する価値があるよう200Cることが知られている（Raschke & Schnabl 1978）。前述の，S. fluviatilis の K+，Cl- の一時的な流入がリンゴ酸の増加の250Mg

バランスを取るために，Cl- の流入やリンゴ酸の合成が起こ

300

K性があり，興味深い。更に，気孔開口時には，K+ と電荷の*controlmannitola

構造変化と気孔開閉との関係と，何らかの共通点がある可能

350

N応関係があることを報告している。孔辺細胞における微小管Concentration (mM)

al. 1998，Higaki et al. 2010），今回の現象については微小管のみが関与する可能性が示された。Iwata et al（. 2001）は，
S. fluviatilis において表層微小管の配向変化と膨圧変化に対400Fig. 3. Change of ionic concentration of Spirogyra fluviatilis cells
accompanying turgor regulation. Cells were incubated in 0.40 M mannitol
solution or artificial pond water (control) for 24 h. *p<0.05 (t-test), n=4.

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引用文献

岩田ら

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(Received Mar. 23, 2020; Accepted Apr. 28, 2020)