研究フロンティア（平成２２年度学術奨励賞受賞論文）

卵巣機能低下および多胎発生における５/GDF―９変異の関与
ヒト BMP―１稲垣 兼一１），大塚 文男２），Shunichi Shimasaki３）
１）岡山大学病院腎臓・糖尿病・内分泌内科
２）岡山大学病院内分泌センター３）University of California, San Diego, U.S.A.

はじめにがヘテロ体で多胎・多産，ホモ体で不妊というユニークな表現型を示すことが相次いで報告され，この分野の研Premature ovarian failure（POF）/primary ovarian in-ENREF １．また BMP
究のブレイクスルーとなった［１―３］sufficiency（POI）は年齢４０歳未満での４〜６ヵ月間の―１５および GDF―９に対して能動・受動免疫された野生型

無月経期間（続発性・第２度無月経で第２次性徴があヒツジにおいても遺伝子変異ヒツジと同様に不妊と多産る），高ゴナドトロピン値・低エストロゲン値を満たす５と GDFの表現型が再現される［４，５］ことから，BMP―１症候群であり，早期卵胞枯渇あるいは卵胞減少が病態と―９の少数排卵動物の生殖における重要性が裏づけられして存在する一方，加齢による閉経とは異なり卵巣機能５/GDF―９の生殖表現型にた．一方でこのような BMP―１が復活するケースもみられるなど幅広いスペクトラムを対する作用はマウスやラットなどの多数排卵動物におい包含する．POF/POI は不妊を来たす疾患として重要でて認められないことから，BMP―１
５/GDF―９は少数排卵あるが，その病因について未だ十分に明らかにされてい動物と多排卵動物との排卵数の違いを調節する，すなわない．そのようななか，これまでに遺伝的要因を示唆す

ち生殖形質発現の種差を決定する因子とも考えられる．

るいくつかの報告があり，
近年 bone morphogenetic pro５（BMP―１５）と growthtein―１

differentiation

factor―９ヒトにおける BMP―１５/GDF―９遺伝子変異（GDF―９）がその候補として注目されている．BMP―１５と GDF―９はともに TGF―βスーパーファミリーの BMP

ヒトの生殖における BMP―１５/GDF―９の重要性を示すサブファミリーに属し，そのなかでも相同性が非常に高初めての知見として，Di Pasquale らが２００４年にイタリい分子である．卵巣においては卵母細胞に特異的に存在ア人姉妹の原発性無月経症例に BMP―１５遺伝子変異（Yすることが知られ，卵胞発育に重要な役割を果たしてい２３５C）を発見し報告した［６］．姉妹はともに卵巣低形ると考えられている．今回われわれは POF/POI 患者と成で父親と姉妹はヘテロ変異を認めた．そして同グルー５/GDF
二卵性双生児の母親に発見・報告された BMP―１５遺伝子変プが非家族性 POF/POI 患者における BMP―１―９遺伝子の変異が生理活性に及ぼす影響について検討

異スクリーニングにより数多くの遺伝子異常が POF/し，特徴的な生殖表現型を示すメカニズムについて考察

POI 患者に高頻度に存在することが明ら か に な っ た

した．

０］，GDF―９遺伝［７］．その後同様の報告が相次ぎ［８―１
子異常についても POF/POI 患者に高頻度に出現するこ

ヒツジにおける BMP―１５/GDF―９遺伝子変異

３］．興味深いことに，BMP―とが報告された［９，１１―１１５/GDF―９遺伝子のこれらの変異のほとんどがプロ領域

２０００年以降，ヒトと同じく少数排卵動物であるヒツジに集中していることも明らかとなった．また，ヒツジの５および GDF―９遺伝子変異において自然発症の BMP―１多産に相当すると考えられる二卵性双生児の誕生について，以前より一卵性双生児に比べ高頻度の家族内発生が連絡先：稲垣兼一，岡山大学病院腎臓・糖尿病・内分泌内科〒７００―８５５８ 岡山県岡山市北区鹿田町２―５―１TEL：０８６―２３５―７２３５
FAX：０８６―２２２―５２１４
E-mail : kenina@md.okayama-u.ac.jp

指摘されてきたが，二卵性双生児の母親に関するスク
５/GDF―９の変異が高頻リーニングにて，やはり BMP―１度に認められることが報告された［１４，１５］．特に GDF―９の P１０３S 変異は POF/POI と二卵性双生児の母親の両

日本生殖内分泌学会雑誌（2011）16 : 21-25

21

稲垣兼一

他

図１

BMP―１５/GDF―９変異によるラット顆粒膜細胞増殖作用への影響方に発見されている．

図２

BMP―１５/GDF―９変異による Smad リン酸化への影響

以上のように，POF/POI 患者や二卵性双生児の母親
５/GDF―９遺伝子の変異がに卵母細胞因子である BMP―１頻発することから，BMP―１５/GDF―９がヒトの生殖表現低下し，変異型 GDF―９についても同様に Smad２/３のリ型に大きく関与していることが示唆されるが，遺伝子変ン酸化の減弱を認めた．

異が生物的活性にどのように影響するかの in vitro によBMP―１
５/GDF―９遺伝子変異のタンパク産生・分泌る解析はこれまでほとんどされていない．

への影響
POF/POI と二卵性双生児の母親 に 認 め た 変 異 型
BMP―１５/GDF―９の生物学的活性の検討

BMP―１
５/GDF―９遺伝子変異を導 入 し た HEK２
９３F 細胞の培養上清による細胞増殖作用が野生型に比較して減そこでわれわれは POF/POI と二卵性双生児の母親に弱しており，それが受容体 Smad のリン酸化減弱による５と GDF―９の遺伝子変異のなかから発見された BMP―１

ことが示唆されるため，培養上清中に分泌される BMP―高頻度に認められ，かつ対照群に全く認められない変異

１５/GDF―９タンパクを Flag 抗体によるイムノブロットに（BMP―１５ ，BMP―１５）をより検討した（図３）．BMP サブファミリーは共通して

R７６C

R２０６H，GDF―９ ，GDF―９K６７E

P１０３S抽出し，その生理学的活性を評価した［８，１２，１３］．まシグナルペプチド，プロ領域，成熟タンパクの結合した

５/GDF―９発
ず Flag tag を C 末端に付加したヒト BMP―１

プロタンパクとして産生され，シグナルペプチド離脱後現プラスミドに site-directed mutagenesis により遺伝子にダイマーを形成しプロ領域と成熟タンパクが切断され変異を導入し，変異遺伝子発現プラスミドを作成した．

るプロセシングが起こり，成熟タンパクが生理活性を発次いで HEK２
９３F 細胞に上記の変異遺伝子を導入した

５の成熟タンパクは経時的に培養揮する．野生型 BMP―１

後，変異がプロ領域に存在し成熟タンパクは野生型と同５では４８h―液中への分泌が増加するが，変異型 BMP―１一であることが予想されるため，培養上清を用いてラッ９
６h 培養条件のいずれにおいても野生型より成熟タンパ

ト卵巣顆粒膜初代培養（GC）細胞の細胞増殖作用をクの分泌低下を認めた．また GDF―９においても変異型

BrdU 取り込みアッセイにて検討した（図１）．ヒト BMPでは野生型より成熟タンパクの分泌低下を認めた．次い―１５はラット顆粒膜細胞を増殖させることが知られていで，細胞溶解液における成熟タンパクとプロタンパクの５ではともにその増殖作用の低るが，２種の変異 BMP―１発現をイムノブロットにて検討し，翻訳および翻訳後プ下を認めた．変異ヒト GDF―９の検討についても野生型ロセシングへの遺伝子変異の影響を評価した（図４）．に比較し細胞増殖作用の減弱を認めた．POF/POI また

５および変異 GDF―９導入細胞中
その結果，変異 BMP―１は二卵性双生児の母親に発見された遺伝子変異により，の成熟タンパクが野生型に比べ減少しており，これは細５/GDF―９の本来有する顆粒膜細胞増殖作用が低BMP―１

胞培養液中の分泌タンパクと一致した結果であったが，５/GDF―９の下するメカニズムを探るため，次に BMP―１

それに加えてプロタンパクが変異型では野生型より有意

細胞内シグナル伝達分子である受容体 Smad のリン酸化に多く存在し，さらに成熟タンパク/プロタンパク比は５をイムノブロットで検討した（図２）．変異型 BMP―１

変異型において顕著に低下していることが明らかとなっ５に比較し Smad１/５/８のリン酸化がでは野生型 BMP―１

た．変異型導入細胞においても野生型と同等の導入効率

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.16 2011

卵巣機能低下および多胎発生におけるヒト BMP―１
５/GDF―９変異の関与

図３

遺伝子変異が BMP―１
５/GDF―９タンパク産生・分泌に与える影響

図４

遺伝子変異が BMP―１
５/GDF―９タンパク産生・分泌に与える影響が得られたことが PCR でも確認されており，以上の結たな S―S 結合の追加などが生じ，正常なダイマー形成

５および GDF―９における成熟タンパ
果より変異 BMP―１が損なわれた可能性があると考えられた．

ク分泌低下はプロタンパクのプロセシング障害によるこ以上のように，POF/POI 患者と二卵性双生児の母親とが示唆された．BMP ファミリーではプロタンパクの５/GDF―９遺伝子変異はプロタンパに発見された BMP―１ダイマー形成に続きプロセシングが起こり，このダイクのダイマー形成・プロセシングのステップを障害するマー形成にはプロ領域が不可欠であることが以前から知ことにより成熟タンパクの産生・分泌を低下させることられている．今回の４種の変異では極性の異なるアミノが明らかとなった（図５）．

酸への変換によるプロタンパク上の３次元構造変化や新５/GDF―９の卵巣顆粒膜細胞に対卵母細胞因子 BMP―１

研究フロンティア23稲垣兼一他

図５Propeptide の変異が mature protein 分泌に与える影響に顆粒膜細胞の細胞増殖を刺激し，FSH 受容体発現抑制により顆粒膜細胞でのプロゲステロン産生を抑制する．
５/GDF―９の生理活
これらの知見を踏まえて，BMP―１性低下と生殖表現型の関連についての仮 説 を 図６に示す．
５/GDF―９は FSH 感受性を有さない卵胞形成（A）BMP―１
初期段階から細胞増殖作用により卵胞成長（recruitment）に寄与し，FSH 受容体の発現する FSH 依存期において FSH 感受性を負に制御することで主席
図６

５/GDF―９活性低下と生殖表現型の関連
BMP―１

卵胞の選別（selection）と卵胞成熟（maturation）の過程を調節していると考えられる．
５/GDF―９活性が高度に障害されると初期か（B）BMP―１する作用についてのこれまでの in vitro 研究における知ら卵巣発育が得られず，表現型として原発性無月見は，以下のようにまとめられる［１６―１８］．

経のイタリア人姉妹例やヒツジの遺伝子変異ホモ

５は FSH 非依存的に顆粒膜細胞の細胞増殖をABMP―１接合体にみられる不妊の病態を呈する．
５/GDF―９活性の障害が軽度の場合，細胞増（C）BMP―１刺激する，
BFSH 受容体発現を減少させることなどにより顆粒膜細胞でのプロゲステロン産生を抑制する，殖作用の低下により卵胞発育が抑制されるが，いった ん FSH 感 受 性 を 有 す る 段 階 ま で 成 長 す る と

CFSH によって誘導される顆粒膜細胞でのステロイド

５/GDF―９による FSH 感受性の負の制御が減BMP―１合成酵素系（StAR，P４５０scc，３βHSD など），LH 受容弱するため，主席卵胞の選別や卵胞成熟が十分に体，インヒビン・アクチビンサブユニット（α，βA，βB）得られぬままに複数の未成熟排卵を生じると考えの発現を抑制する，られる．そして複数の排卵は二卵性双生児の誕生

DGDF―９は FSH 非依存的にプロスタグランジン E２/やヒツジのヘテロ変異にみられる多産を，また卵24EP２受容体系を介してマウス顆粒膜細胞のプロゲステ

胞発育不全と過剰排卵は早期の卵プールの枯渇，５に認められない生ロン分泌を調節するなどの BMP―１

すなわち POF/POI の病態形成に寄与しているのか

５と同様に FSH 非依存性
理活性も有するが，BMP―１もしれない．

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.16 2011

卵巣機能低下および多胎発生におけるヒト BMP―１
５/GDF―９変異の関与

おわりにわれわれは POF/POI と二卵性双生児の母親に発見さ５/GDF―９遺 伝 子 変 異（BMP―１
５R７６C，BMP―
れ た BMP―１
１５R２０６H，GDF―９K６７E，GDF―９P１０３S）に 着 目 し，そ の 生 理 活性に与える影響について明らかにした．４種の変異はすべてプロ領域に存在し，プロタンパク翻訳後のプロセシングのステップを障害し，生理活性を有する成熟タンパ５/GDF―９の成熟タンパクの分泌を減少させた．BMP―１クの減少がヒツジにおける排卵数増加や多産と関連することから，ヒトにおいて今回の遺伝子変異が排卵数増加に伴う二卵性双生児の誕生や，過排卵の結果としての卵プール枯渇による不妊（POF/POI）を引き起こす可能性が示唆された［１９］
．
謝辞

本稿は２０
１０年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 峯岸 敬先生，第１５回同学会大会長 並木幹夫先生，ならびに広報理事 筒井和義先生に感謝いたします．

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