Instructions d’utilisation

LymphoTrack Dx Software – MiSeq Version 2.4.3®

TM

Cette suite logicielle est fournie avec chaque test LymphoTrack Dx Assay pour l’instrument Illumina MiSeq afin d’analyser desfichiers *.fastq bruts. Le logiciel se compose de trois parties distinctes : l’application d’analyse de données LymphoTrack, unplugin LymphoTrack Reporter qui est exécuté automatiquement au terme de l’analyse, ainsi qu’une méthode de visualisation
LymphoTrack facultative qui consiste en quatre feuilles de calcul Microsoft Excel® .xlsm. Le logiciel fonctionne sur les systèmesMicrosoft Windows® pris en charge.
Cette suite logicielle est conçue pour l’analyse de la clonalité d’un ou de plusieurs gènes cibles (IGHV Leader (ou « Leader »),IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB ou TRG) et indique également le statut d’hypermutation somatique des échantillons
analysés avec les tests Leader ou IGH FR1.
Destiné au diagnostic in vitro.

Compatibilité du produit
Le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq (d’Invivoscribe suivants :95000009) a été développé spécifiquement et uniquement pour les tests

N° de référence

Description

91210059

LymphoTrack Dx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Kit A – MiSeq

00850052003814

91210069

LymphoTrack Dx IGHV Leader Somatic Hypermutation Assay Panel – MiSeq

00850052003821

91210009

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay Kit A – MiSeq

00850052003647

91210039

LymphoTrack Dx IGH FR1 Assay Panel – MiSeq

00850052003654

91210089

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay Kit A – MiSeq

00850052003838

91210099

LymphoTrack Dx IGH FR2 Assay Panel – MiSeq

00850052003845

91210109

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay Kit A – MiSeq

00850052003852

91210119

LymphoTrack Dx IGH FR3 Assay Panel – MiSeq

00850052003869

91210129

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay Kit A – MiSeq

00850052003876

91210139

LymphoTrack Dx IGH FR1/2/3 Assay Panel – MiSeq

00850052003883

91220009

LymphoTrack Dx IGK Assay Kit A – MiSeq

00850052003906

91220019

LymphoTrack Dx IGK Assay Panel – MiSeq

00850052003913

92270019

LymphoTrack Dx TRG Kit A – MiSeq

00850052003678

92270009

LymphoTrack Dx TRG Panel – MiSeq

00850052003661

92250009

LymphoTrack Dx TRB Kit A – MiSeq

00850052003937

92250019

LymphoTrack Dx TRB Panel – MiSeq

00850052003944

95000009

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Utilisation prévue
La suite logicielle LymphoTrack Dx Software – MiSeq est prévue pour être utilisée à des fins d’analyse des données bioinformatiques et de visualisation des fichiers *.fastq bruts de l’instrument Illumina MiSeq lors de l’analyse conjointe de tests
LymphoTrack Dx Assays.

Configuration minimale requise











Processeur : Intel Core 2 Duo ou processeur plus récent recommandé.
Disque dur : au moins 80 Go d’espace disque disponible sont nécessaires ; 250 Go sont recommandés.
Mémoire RAM : 4 Go nécessaires ; 8 Go ou plus sont recommandés.
Système d’exploitation : Windows 10 (64 bits) est nécessaire.
Java 8 pour les systèmes d’exploitation 64 bits (Java configuré pour les systèmes d’exploitation 32 bits n’est pas
compatible avec le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq). La version la plus récente de Java peut être téléchargée
directement du site d’Oracle à l’adresse suivante : http://www.java.com/.
Un lecteur de fichiers *.pdf, tels qu’Adobe Acrobat Reader, pour visualiser les rapports de données générés par
LymphoTrack Reporter.
Microsoft Office Excel 2007, 2010 ou 2013 avec exécution de macros autorisée est nécessaire pour la visualisation desdonnées.
Un lecteur de CD-ROM.
Le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq v2.4.3 a été validé pour une utilisation avec Windows 10 configuré avec lesparamètres de langue Anglais (États-Unis) et de taille d’affichage par défaut, ainsi que Microsoft Excel 2007/2010/2013
pour obtenir une visualisation différente des données. L’utilisation d’autres versions de Microsoft Excel/Windows et/ou
paramètres de langue/taille peut ne pas être compatible.

Mises en garde et précautions


Taille d’écran par défaut. La résolution d’écran optimale pour LymphoTrack Dx Software – MiSeq est 100 %.
L’augmentation de la taille d’écran par défaut du moniteur à plus de 100 % peut affecter l’affichage du texte des champs
dans l’interface utilisateur.



Police système. L’interface utilisateur est conçue pour utiliser les paramètres de police par défaut du système sur un
ordinateur Windows utilisant les paramètres régionaux Anglais (É.-U.). Les changements apportés aux paramètres depolice du système ou l’utilisation de paramètres régionaux de langue autres que l’anglais (É.-U.) peuvent avoir une
incidence sur l’affichage du texte des champs dans l’interface utilisateur.

Fichiers compatibles. LymphoTrack Dx Software – MiSeq est compatible avec les fichiers *.fastq.gz générés par le logiciel
MiSeq Reporter. Le logiciel LymphoTrack Dx Software – MiSeq n’est pas compatible avec les fichiers *.fastq.gz générés
par le logiciel *.Bcl2fastq.

Élimination des adaptateurs. L’option Adapter trimming (Élimination des adaptateurs) doit être sélectionnée  lors de lacréation des feuilles d’échantillons MiSeq afin que les fichiers *.fastq.gz générés ne contiennent pas d’adaptateurs.



Paramètres de veille ou de veille prolongée. Penser à désactiver le mode veille et/ou veille ou veille prolongée avantd’exécuter le logiciel d’analyse de données LymphoTrack Dx Data Analysis Application. Si l’ordinateur entre en mode veilleou veille prolongée, l’exécution du logiciel risque d’être interrompue.



Caractères utilisés pour les noms de chemin et de fichier. 1) Éviter d’inclure des espaces dans le nom du chemin desfichiers à analyser (les noms de chemin comprennent les noms de dossier et les noms de fichier) et ne pas utiliser plusd’un espace consécutif. 2) Il est important que les noms de fichier contiennent uniquement les caractères suivants (A-Z, az, 0-9, ., - (tiret)). Si le logiciel rencontre un caractère non compris dans cet ensemble, son exécution peut échouer. Veillezà suivre cette nomenclature d’affectation de nom pour les échantillons lors de la configuration de la feuille d’échantillons
pour le MiSeq. 3) Le nom du chemin ne doit pas dépasser 255 caractères. Si, en raison des noms des échantillons, lesnoms de fichiers générés avoisinent cette limite, ces derniers seront difficiles à copier vers d’autres emplacements.

Les échantillons en double doivent comporter un nom d’échantillon unique. Attribuer un nom et un identifiant uniques
à chaque échantillon lorsque vous les nommez. Si les échantillons sont analysés en double, ils peuvent être nommés« échantillon1a » et « échantillon1b ». Si des noms uniques ne sont pas attribués aux échantillons analysés ensemble dansla même Flow Cell, un seul échantillon est analysé par le logiciel au cours du processus.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Installation du logiciel
1.1.
1.2.

Copiez l’archive LymphoTrackDxMiSeq2.4.3.zip du CD du logiciel sur un disque local de l’ordinateur. Installez
uniquement le logiciel sur un disque local et non sur un lecteur réseau. L’exécution du logiciel au moyen d’uneconnexion réseau peut ne pas fonctionner correctement.
Extrayez le fichier d’archive copié sur l’ordinateur à l’étape précédente. Cette étape est normalement réalisée eneffectuant un clic droit sur le fichier et en choisissant Extract All (Extraire tout) dans le menu contextuel.
Un fichier nommé LymphoTrackDxMiSeq 2.4.3 est créé une fois l’archive extraite.

Exécution du logiciel d’analyse de données
2.1.

2.2.

2.3.
2.4.
2.5.
2.6.

Identifiez les fichiers *.fastq.gz à lecture appariée, avec adaptateurs éliminés, à analyser. Ces derniers se trouvent
dans le dossier d’analyse MiSeq et sont des fichiers *.fastq.gz qui seront utilisés comme source pour l’applicationd’analyse de données LymphoTrackDxMiSeq. Les fichiers Undetermined_*.fastq.gz ne sont pas nécessaires pourl’analyse.
Copiez les fichiers *.fastq.gz identifiés ci-dessus dans un dossier vide de l’ordinateur. Téléchargez ces fichiers sur lemême ordinateur local que celui sur lequel le logiciel LymphoTrack Dx Software est installé. Le disque contenant ce
dossier doit comporter au moins 80 Go d’espace libre. Ce dossier sera nommé <input_folder> (<dossier_source>)
comme expliqué ci-dessous pour le logiciel.
Double-cliquez sur le fichier startLymphoTrackDxMiSeq situé dans le dossier LymphoTrackDxMiSeq 2.4.3 qui a été
copié sur l’ordinateur lors de l’installation.
Veuillez lire le contrat de licence. Pour accepter les conditions du contrat, cliquez sur le bouton Accept (Accepter)pour continuer.
Cochez le mode d’analyse souhaité dans les options de la case à cocher Choose analysis mode(s) (Choisir le(s)mode(s) d’analyse). Le mode d’analyse doit correspondre au type de données dans l’analyse (Leader, IGH FR1, IGH
FR2, IGH FR3, IGK, TRB et/ou TRG).
Sélectionnez le séparateur décimal souhaité parmi les options Choose decimal mark (Choisir un séparateur décimal).
Cette option a des conséquences sur l’utilisation de la macro de visualisation des données dans Microsoft Excel par lasuite et nécessite d’être renseignée. Les choix possibles sont un séparateur décimal sous forme de point (.) ou devirgule (,).
IMPORTANT !

Séparateur décimal. Pour déterminer quelle option choisir, ouvrez une nouvelle feuille decalcul Excel et saisissez « =10000 » dans la cellule A1. Effectuez un clic droit sur cette cellule etsélectionnez Format Cells (Format de cellule).
 Dans l’onglet Number (Nombre), passez en revue la liste Category: (Catégorie :) etsélectionnez Number (Nombre). Sur la droite, la valeur Decimal places (Nombre dedécimales) doit être définie sur « 2 ».
 En dessous se trouve la case à cocher Use 1000 Separator (Utiliser le séparateur demilliers). Cochez cette case et observez l’exemple de nombre au-dessus. Le nombre
original que vous avez saisi doit avoir le format correspondant aux paramètres d’Excel pardéfaut pour un nombre comprenant un séparateur décimal.
 Si ce nombre apparaît sous la forme « 10,000.00 », sélectionnez l’option decimal point(point comme séparateur décimal). Si ce nombre apparaît sous la forme « 10.000,00 »,sélectionnez l’option decimal comma (virgule comme séparateur décimal).

2.7.

Cliquez sur le bouton Browse (Parcourir) pour choisir un dossier source. Ce dossier est le dossier <input_folder>(<dossier_source>) mentionné ci-dessus et contient les fichiers à analyser. Lorsque le dossier source est
sélectionné, il semblera vide.
IMPORTANT !

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

Le <input_folder> sélectionné ne doit pas contenir de fichiers échantillon portant le mêmenom que le dossier source. Si le programme a été exécuté avec un échantillon partageant lemême nom de fichier que le dossier fourni en entrée de la fonctionnalité d'analyse, leprogramme se bloquera et le temps d'exécution de l'analyse augmentera considérablement(c'est-à-dire qu'il faudra 30 minutes pour traiter un petit échantillon qui prend quelques
secondes à traiter normalement).
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Une fois le <input_folder> et le mode d’analyse sélectionnés, cliquez sur le bouton Launch Program (Démarrer leprogramme).

2.8.

IMPORTANT !

2.9.

Le <input_folder> sélectionné doit contenir uniquement des fichiers *.fastq ou *.fastq.gz.
En l’absence de ces types de fichier (seuls ou combinés), le programme affiche un message
d’erreur et demande de sélectionner un autre dossier. Si les fichiers *.fastq ont été générés
avec *.Bcl2fastq (les noms de fichier comportent la séquence du code-barre à la place de lanomenclature « S1, S2, S3 » etc.), le programme affiche un message d’erreur et demanded’analyser de nouveau les données à l’aide du logiciel MiSeq Reporter.

État de l’analyse. Après avoir cliqué sur le bouton Launch Program (Démarrer le programme), la fenêtre principale
du programme affiche l’état du programme. Lorsque le programme a fini d’analyser les fichiers de données source, lafenêtre principale du programme affiche le message Analysis is complete… (L’analyse est terminée...) et indiquel’emplacement du ou des dossiers de sortie en invitant à ouvrir la feuille de calcul Excel de visualisation des donnéescorrespondante. Une nouvelle analyse peut être effectuée à partir de la fenêtre principale du programme dès que laprécédente est terminée.
IMPORTANT !

Durée de l’analyse. La taille et le nombre d’échantillons à analyser, ainsi que le mode d’analyse
et le matériel informatique déterminent la durée d’exécution du programme. Une distribution
type pour une analyse de 24 échantillons est de 200 000 à 1 million de lectures par échantillon.
Ces chiffres peuvent varier avec les versions ultérieures de la plate-forme MiSeq.
L’analyse d’un échantillon type unique des gènes IGHV Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK,TRB ou TRG nécessite environ 1 à 2 minutes. L’analyse de 24 échantillons types des gènes
Leader seul, IGH FR1 seul, IGH FR2 seul, IGH FR3 seul, IGK seul, TRB seul ou TRG seul nécessite
environ 25 à 50 minutes. La durée d’analyse de 24 échantillons types combinés des gènes
Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et/ou TRG est fonction du nombre de cibles à
analyser.

2.10.

Dossier(s) de sortie. En fonction du mode d’analyse choisi, un ou plusieurs dossiers de sortie seront créés dans le<input_folder> contenant les fichiers sources *.fastq ou *.fastq.gz. Le Tableau 1 ci-dessous présente la relation
entre le mode d’analyse et le nom du ou des dossiers de sortie.
Tableau 1. Noms du dossier de sortie en fonction du mode d’analyse

2.11.

2.12.

Mode d’analyse

Noms du ou des dossiers de sortie

LeaderLEADER_output

IGH FR1

IGH_FR1_output

IGH FR2

IGH_FR2_output

IGH FR3

IGH_FR3_output

TRB

TRB_output

TRG

TRG_output

IGK

IGK_output

Toute analyse combinée de :Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG

Deux à sept dossiersde sortie énumérés ci-dessus

Lorsque le programme a terminé l’analyse avec succès, le dossier de sortie contient plusieurs fichiers *.tsv et unfichier *.pdf pour chaque échantillon traité. Remarque : dans les tableaux ci-dessous, « * » représente le nom del’échantillon tel qu’il est saisi dans la feuille d’échantillons, suivi des informations spécifiques de la plateforme(p. ex, nom d’échantillon_S1_L001_001_combiné).
Pour l’analyse des gènes IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB et IGK, veuillez consulter le Tableau 2 présentant les
descriptions des neuf fichiers fournis pour chaque échantillon.

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Tableau 2. Description des fichiers de sortie IGH, TRB et IGK.

Analyse des gènes Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB et IGK
Contient une liste des 200 séquences uniques les plus importantes, triées par nombre (nombre delectures) et précisant : À quel événement de recombinaison V-J elle correspond le mieux La longueur Le % de lectures totales réel
 Le % de lectures totales cumulé
 Dans quelle mesure la lecture couvre le gène V identifié ciblé par les amorces (%) (IGH/IGK et TRB)
 La séquence putative CDR3*.fastq_read_summary.tsv

Leader et IGH FR1 précisent également : Le taux de mutations du gène V partiel (%)
Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 précisent également : Si le réarrangement doit se situer à l’intérieur du cadre (Y/N/n/a [O/N/s.o.]). Si l’utilisation dusegment de gène V ou J ne peut pas être prédite en raison de la qualité de l’alignement, le logiciel
ne sera pas en mesure de prédire si le gène se situe à l’intérieur du cadre et le résultat sera n/a.
 Si le réarrangement ne devrait pas contenir un codon stop (Y/N [O/N]).
Si la position à l’intérieur du cadre ne peut pas être prédite, il n’est pas possible de prédire avec
exactitude si un codon stop sera présent.

*.fastq_read_summary_merged_top10_ searchtop500.tsv*.fastq_unique_reads.tsv*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv*.fastq_VJ_sequence_frequency_family.tsv*.fastq_read_summary_family.tsv

Même format que le fichier read_summary, mais il contient uniquement les 10 premières lectures dufichier read_summary fusionnées avec les 500 premières lectures. Une lecture est fusionnée avec une
autre si seulement 1 ou 2 nucléotides (nts) les différencient l’une de l’autre ; la lecture comportant lenombre le plus élevé conserve l’identité de sa séquence et la lecture comportant le nombre le moinsélevé est ajoutée à la plus importante.
Fichier *.fasta comportant des séquences uniques, triées en fonction de leur nombre.
Fichier *.fasta de séquences putatives CDR3 figurant dans le fichier *.fastq_unique_reads.
Chaque famille regroupe toutes les recombinaisons possibles que l’on trouve dans une région V ou J
particulière, comme la famille V1 ou la famille J4. On peut trouver n’importe quel nombre derecombinaisons au sein de la famille V1, tels que V1-69 et V1-8. Ce fichier contient une liste de toutes lesrecombinaisons possibles de la famille V – famille J, chacune comportant une liste de lectures triées (du %le plus élevé au plus faible). Ce fichier est parfaitement adapté aux graphiques « empilés » dans Excel.
Contient une liste triée de séquences uniques, par nombre et précisant : À quel événement de recombinaison de la famille V-J elle correspond le mieux La longueur Le % de lectures totales réel
 Le % de lectures totales cumulé
 Dans quelle mesure la lecture couvre le gène V identifié ciblé par les amorces (%) (IGH/IGK) La séquence putative CDR3
Leader et IGH FR1 précisent également : Le taux de mutations du gène V partiel (%)
Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 précisent également : Si le réarrangement doit se situer à l’intérieur du cadre (Y/N/n/a [O/N/s.o.]) Si le réarrangement ne devrait pas contenir un codon stop (Y/N [O/N])*.fastq_VJ_usage.tsv

Matrice de numération et matrice de % des différents événements de recombinaison V-J.

*.fastq_VJ_usage_family.tsv

Matrice de numération et matrice de % des différents événements de recombinaison famille V – famille J.

*<horodatage>.pdf

Le rapport *.pdf généré par LymphoTrack Reporter comporte des informations semblables à celles desfichiers « merged read summary » (Résumé de lecture fusionné) et « read summary » (Résumé de lecture)ainsi que des graphiques « V – J usage » (Utilisation de VJ) et « V – J sequence frequency » (Fréquence dela séquence VJ). Voir la rubrique 2.13 Visualisation des données à l’aide de LymphoTrack Reporter(Automatisée, Recommandée) pour plus d’informations.

Remarque :Remarque :Remarque :l’analyse d’IGK inclut également des informations sur d’autres éléments du locus IGK impliqués dans les recombinaisons (IGKINTR et IGKDEL).
l’analyse de TRB inclut également des informations sur d’autres éléments du locus TRB impliqués dans les recombinaisons de la région D – J.
la « séquence putative CDR3 » est déterminée par la correspondance d’une définition exacte d’une séquence CDR3. Toute mutation despoints d’ancrage ou perturbation du cadre de lecture entraînera une valeur « not found » (non trouvé).

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 Pour l’analyse de TRG, veuillez consulter le Tableau 3 présentant les descriptions des sept fichiers fournis pourchaque échantillon.
Tableau 3. Description des fichiers de sortie TRG.
Analyse de TRG*.fastq_read_summary.tsv*.fastq_read_summary_merged_top10_
searchtop500.tsv*.fastq_unique_reads.tsv*.fastq_CDR3_unique_reads.tsv*.fastq_VJ_sequence_frequency.tsv

Même format que le fichier read_summary, mais il contient uniquement les 10 premières lectures dufichier read_summary fusionnées avec les 500 premières lectures. Une lecture est fusionnée avec une
autre si seulement 1 ou 2 nts les différencient l’une de l’autre ; la lecture comportant le nombre le plusélevé conserve l’identité de sa séquence et la lecture comportant le nombre le moins élevé est ajoutéeà la plus importante.
Fichier *.fasta comportant des séquences uniques, triées en fonction de leur nombre.
Fichier *.fasta de séquences putatives CDR3 figurant dans le fichier *.fastq_unique_reads.
Liste de toutes les recombinaisons V-J possibles, chacune comportant une liste de lectures triées (du %le plus élevé au plus faible). Le premier nombre représente le % de lectures totales que la première
lecture unique a comptabilisé sur toutes les lectures de séquences. Ce fichier est parfaitement adapté
aux graphiques « empilés » dans Excel.

*.fastq_VJ_usage.tsv

Matrice de numération et matrice de % des différents événements de recombinaison V-J.

*<horodatage>.pdf

Le rapport *.pdf généré par LymphoTrack Reporter comporte des informations semblables à celles desfichiers « merged read summary » (Résumé de lecture fusionné) et « read summary » (Résumé delecture) ainsi que des graphiques « VJ usage » (Utilisation de V–J) et « VJ sequence frequency »(Fréquence de la séquence V–J). Voir la rubrique 2.13 Visualisation des données à l’aide de
LymphoTrack Reporter (Automatisée, Recommandée) pour plus d’informations.

Remarque :2.13.

Une liste des séquences uniques triées par nombre et précisant :À quel événement de recombinaison V-J elle correspond le mieux
La longueurLe % de lectures totales réel
Le % de lectures totales cumuléLa séquence putative CDR3la « séquence putative CDR3 » est déterminée par la correspondance d’une définition exacte d’une séquence CDR3. Toute mutation despoints d’ancrage ou perturbation du cadre de lecture entraînera une valeur « not found » (non trouvé).

Le(s) dossier(s) de sortie contiennent des rapports *.pdf et des fichiers de données de sortie *.tsv. Les fichiers *.tsv
peuvent être utilisés comme source de données pour la ou les feuilles de calcul de visualisation des données.

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Visualisation des données à l’aide de LymphoTrack Reporter (Automatisée,Recommandée)
3.1.

Un rapport *.pdf est automatiquement généré pour chaque échantillon à l’issue de l’analyse. Le rapport est nommé
en fonction du nom de l’échantillon présent dans la feuille d’échantillons, suivi des informations spécifiques de laplateforme, et se termine par des informations d’horodatage (JJMMAAhhmmss).

IMPORTANT !

3.2.

Lors de l’enregistrement du rapport *.pdf: en fonction du programme utilisé pour ouvrir le *.pdf, il est
possible de modifier une ou plusieurs colonnes. Ne PAS modifier une quelconque partie du PDF. Si
l’utilisateur suspecte qu’une modification a été effectuée, ne PAS enregistrer le *.pdf. Si l’utilisateur
suspecte qu’une modification a été enregistrée, relancer l’analyse afin de générer un nouveau rapport *.pdf.

La première page du rapport *.pdf comprend une valeur Index Q30. Cette valeur correspond au pourcentage desbases ayant un score de qualité de 30 ou plus, mais provenant uniquement de lectures affectées à un index aprèsélimination. Cette valeur peut être utilisée pour déterminer si l’index répond à la spécification standard Illumina.
Dans certains cas, le score de l’analyse Q30 fourni par l’outil de séquençage peut sous-estimer la qualité d’une
analyse du fait de la prise en compte de séquences non déterminées et de régions non éliminées en vue de l’analyse
Q30. Les régions non déterminées et non éliminées sont généralement de moins bonne qualité et ne sont pas
pertinentes pour l’analyse en aval par LymphoTrack.
La première page du rapport *.pdf comprend un tableau des résultats du merged read summary (Résumé de lecture
fusionné), suivi de graphiques représentant les résultats de V – J Sequence Frequency et de V – J Usage. Les pages
restantes contiennent un tableau des résultats du read summary (Résumé de lecture) non fusionnés. Ces résultats
sont détaillés dans le Tableau 4 :3.3.

Tableau 4. Description du contenu du rapport *.pdf.

Rapport *.pdf de LymphoTrack Reporter

Read Summary(Résumé de lecture)Contient une liste des 200 séquences uniques les plus importantes, triées par nombre et précisant :• À quel événement de recombinaison V – J chaque séquence correspond le mieuxo La séquenceo La longueur de la séquenceo Le % de lectures totales réel
• Le % de lectures totales cumulé sous forme de liste pour les 200 lectures les plus importantes
o Dans quelle mesure la lecture couvre le gène V identifié ciblé par les amorces (%) (IGH/IGK)o La séquence putative CDR3
Leader et IGH FR1 précisent également :• Le taux de mutations du gène V partiel (%)
Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 précisent également :•Si le réarrangement doit se situer à l’intérieur du cadre (Y/N/n/a [O/N/s.o.]). Si l’utilisation du segment degène V ou J ne peut pas être prédite en raison de la qualité de l’alignement, le logiciel ne sera pas en
mesure de prédire si le gène se situe à l’intérieur du cadre et le résultat sera n/a.
•
Si le réarrangement ne devrait pas contenir un codon stop (Y/N [O/N]). Si la position à l’intérieur du cadre
ne peut pas être prédite, il n’est pas possible de prédire avec exactitude si un codon stop sera présent.

Merged Read Summary(Résumé de lecture fusionné)Même format que la feuille de travail Read Summary (Résumé de lecture), mais uniquement pour les 10 premières
lectures après fusion avec les 500 premières si les lectures ne se différencient l’une de l’autre que par 1 ou 2 nts. En
outre, le score Q30 d’index est affiché sous Total Read Count (Nombre total de lectures).

V – J Sequence Frequency Graph(Graphique de la fréquence de laséquence V – J)

Histogramme représentant les 200 fréquences de séquence les plus importantes pour chaque famille V – famille J(pour IGH/IGK et TRB) ou recombinaison de gène V – gène J (pour TRG).

V – J Usage Raw Graph(Graphique brut d’utilisation de V – J)

Graphique en barres 3D illustrant l’utilisation de la famille V – famille J des 200 séquences les plus importantes(pour IGH/IGK et TRB) ou l’utilisation du gène V – gène J pour toutes les séquences (pour TRG).

Remarque :Remarque :Remarque :la séquence putative CDR3 est déterminée par la correspondance d’une définition exacte d’une séquence CDR3. Toute mutation des points
d’ancrage ou perturbation du cadre de lecture entraînera une valeur « not found » (non trouvé).
l’analyse d’IGK inclut également des informations sur d’autres éléments du locus IGK impliqués dans les recombinaisons (IGKINTR et IGKDEL).
l’analyse de TRB inclut également des informations sur d’autres éléments du locus TRB impliqués dans les recombinaisons de la région D – J.

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Visualisation des données (manuelle) : exécution des feuilles de calcul devisualisation des données - déconseillée
4.1.

Vérifiez les paramètres de sécurité dans Microsoft Excel afin de vous assurer que l’exécution des macros est bien
activée : Excel 2007 : cliquez sur le bouton Office et sélectionnez Excel Options (Options Excel).
 Excel 2010/2013 : cliquez sur le menu File (Fichier) et sélectionnez Options.
 Dans la fenêtre Options, cliquez sur Trust Center (Centre de gestion de la confidentialité), puis sur le bouton
Trust Center Settings... (Paramètres du Centre de gestion de la confidentialité).
 Cliquez sur Macro Settings (Paramètres des macros) et définissez le niveau de sécurité des macros approprié.
L’option Disable all macros with notification (Désactiver toutes les macros avec notification) est le paramètre
recommandé.
 Cliquez sur OK, puis de nouveau sur OK.
 Fermez Excel.

4.2.

Ouvrez la feuille de calcul de visualisation des données appropriée en double-cliquant dessus. Les fichiers devisualisation sont situés dans le dossier LymphoTrackDxMiSeq_2.4.3 copié précédemment depuis le CD du logiciel sur
l’ordinateur :





4.3.

LymphoTrackDxIGHVisualization.xlsm pour Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3
LymphoTrackDxIGKVisualization.xlsm pour IGK
LymphoTrackDxTRBVisualization.xlsm pour TRB
LymphoTrackDxTRGVisualization.xlsm pour TRG

À l’ouverture du fichier, le message suivant peut s’afficher : Security Warning - Macros have been disabled(Avertissement de sécurité - Les macros ont été désactivées).
 Excel 2007 : cliquez sur le bouton Options... à droite de l’avertissement et sélectionnez Enable this content(Activer le contenu), puis cliquez sur OK.
 Excel 2010/2013 : cliquez sur le bouton Enable Content (Activer le contenu).
La macro de visualisation des données démarre automatiquement.

4.4.
4.5.

4.6.
4.7.
4.8.

Le contrat de licence s’affiche. Il est nécessaire d’accepter le contrat de licence afin d’utiliser le logiciel.
Après avoir accepté le contrat de licence, une boîte de dialogue s’ouvre avec le message suivant : Please select theRead Summary file for the sample you want. (Veuillez sélectionner le fichier de résumé de lecture pour l’échantillon
souhaité.). La macro peut uniquement effectuer une visualisation des données sur un seul échantillon à la fois. Par
conséquent, cette procédure devra être répétée pour chaque échantillon à visualiser.
Parcourez le fichier de sortie créé par l’application d’analyse des données contenant les données à visualiser etsélectionnez le fichier *.fastq_read_summary pour l’échantillon à étudier.
Cliquez sur le bouton Open (Ouvrir).
La macro charge les fichiers de données pour l’échantillon choisi et crée différentes feuilles de calcul ; chaque feuillede calcul présente différentes vues des données en lecture. Cette opération peut prendre quelques instants, enfonction de la taille de l’échantillon et du matériel informatique.
IMPORTANT !

En raison des limites de Microsoft Excel, le logiciel de visualisation ne peut pas afficher plus de
1 048 576 lignes par feuille. Seules les 1 048 576 premières lignes de données seront affichées sil’un des fichiers de sortie d’analyse de données pour l’échantillon en cours contient un nombre
de lignes supérieur à cette limite.
Si cette limite est atteinte, le programme affiche un message indiquant la ou les feuilles
concernées par cette limite. Cliquez sur OK pour continuer.
Même si les données ne sont pas toutes affichées, cela n’a pas de conséquences pour les
graphiques et ceux-ci seront tout de même corrects.

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IMPORTANT !

Les graphiques sont générés en supposant une orientation d’affichage de gauche à droite. Dansles pays pour lesquels le sens de lecture habituel est de droite à gauche, les paramètres d’Excel
par défaut peuvent être incompatibles, et les graphiques ne sont pas générés correctement.
Pour y remédier, l’option d’affichage dans Excel doit être changée en De gauche à droite. Cette
option peut être configurée en sélectionnant Office > Excel Options (Options Excel) dansExcel 2007 ou File (Fichier) > Options dans Excel 2010/2013. Sélectionnez Advanced (Options
avancées), puis faites défiler vers le bas jusqu’aux paramètres Display (Afficher). Changez
l’option Default direction (Orientation par défaut) en Left-to-right (De gauche à droite), puis
cliquez sur OK. La prochaine fois qu’Excel sera ouvert, les feuilles de calcul liront de gauche à
droite et le logiciel de visualisation générera les graphiques correctement.
En cas de problème ou pour toute assistance supplémentaire, veuillez contacter le support
technique Invivoscribe au +1 (858) 224 6600, du lundi au vendredi, de 7 h à 17 h heure duPacifique, ou à l’adresse e-mail support@invivoscribe.com.

4.9.
4.10.

Si un message s’affiche concernant l’option Complex Formatting (Mise en forme complexe), cliquez sur Yes (Oui).
Enregistrement du fichier de visualisation. Lorsque le traitement est terminé, un message apparaît indiquant que leprogramme a terminé. Il est vivement recommandé d’enregistrer le fichier à ce stade.

IMPORTANT !

4.11.
4.12.

Lors de l’enregistrement du fichier, veillez à sélectionner Save as (Enregistrer sous) et à choisir
un classeur Excel (*.xlsx ou *.xls), car l’action par défaut Save (Enregistrer) ou le fait de cliquer
sur l’icône de disquette remplace la macro *.xlsm par le classeur actuel. Cela nécessitera deréinstaller la macro avec une nouvelle copie provenant du CD du logiciel en vue des analyses
ultérieures.

Si un message d’avertissement s’affiche à propos de l’enregistrement d’un classeur sans macro, cliquez sur le bouton
Yes (Oui).
Le classeur terminé pour Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG comprend les huit feuilles de calcul
suivantes décrites dans le Tableau 5.

Tableau 5. Feuilles de calcul incluses dans le fichier de sortie Excel.

Classeur terminé pour Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG

Read Summary(Résumé de lecture)Contient une liste des 200 séquences uniques les plus importantes, triées par nombre et précisant : À quel événement de recombinaison V-J chaque séquence correspond le mieux La séquence La longueur de la séquence Le % de lectures totales réel
 Le % de lectures totales cumulé sous forme de liste pour toutes les lectures (TRG
uniquement) Le % de lectures totales cumulé sous forme de liste pour les 200 premières lectures (IGH/IGK
et TRB) Dans quelle mesure la lecture couvre le gène V identifié ciblé par les amorces (%) (IGH/IGK) La séquence putative CDR3
Leader et IGH FR1 précisent également : Le taux de mutations du gène V partiel (%)
Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3 précisent également : Si le réarrangement doit se situer à l’intérieur du cadre (Y/N/n/a [O/N/s.o.]). Si l’utilisation dusegment de gène V ou J ne peut pas être prédite en raison de la qualité de l’alignement, lelogiciel ne sera pas en mesure de prédire si le gène se situe à l’intérieur du cadre et le résultat
sera n/a. Si le réarrangement ne devrait pas contenir un codon stop (Y/N [O/N]). Si la position
à l’intérieur du cadre ne peut pas être prédite, il n’est pas possible de prédire avec exactitude
si un codon stop sera présent.
 La séquence putative CDR3

Merged Read Summary(Résumé de lecture fusionné)

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Même format que la feuille de travail Read Summary (Résumé de lecture), mais uniquement pourles 10 premières lectures après fusion avec les 500 premières si les lectures ne se différencient l’unede l’autre que par 1 ou 2 nts.

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Tableau 5. Feuilles de calcul incluses dans le fichier de sortie Excel.

Classeur terminé pour Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB et TRG
VJ Sequence Frequency Graph(Graphique de la fréquence de la séquence VJ)

Histogramme représentant les 200 fréquences de séquence les plus importantes pour chaquefamille V – famille J (pour IGH/IGK et TRB) ou recombinaison de gène V – gène J (pour TRG).

VJ Usage(Utilisation de VJ)

Comptage brut et fréquences des 200 recombinaison famille V – Famille J (pour IGH/IGK et TRB) ou
gene V – Gene J (pour TRG) les plus représentés

VJ Usage Percent Graph(Graphique de pourcentage d’utilisation de VJ)

Un graphique 3D représentant les 200 fréquences de séquence les plus importantes pour chaquefamille V – famille J (pour IGH/IGK et TRB) ou recombinaison de gène V – gène J (pour TRG).

VJ Usage Raw Graph(Graphique brut d’utilisation de VJ)

Un graphique 3D représentant les 200 numérations brutes les plus importantes pour chaque famille
V – famille J (pour IGH/IGK et TRB) ou recombinaison de gène V – gène J (pour TRG).

VJ Sequence Frequency(Fréquence de la séquence VJ)
Unique Reads(Lectures uniques)
Remarque :Remarque :Remarque :Remarque :Remarque :Une liste « empilée » de toutes les recombinaisons possibles de la famille V – famille J (pourIGH/IGK et TRB) ou du gène V – gène J (pour TRG), chacune comportant une liste triée des200 premières lectures (du % le plus élevé au plus faible).
Fichier *.fasta comportant des séquences uniques, triées en fonction de leur nombre.

IGH figurant dans le tableau ci-dessus fait référence à l’analyse des gènes Leader, IGH FR1, IGH FR2 et IGH FR3. Les graphiques de la fréquence deces gènes cibles précisent uniquement IGH dans le titre. Le dossier de sortie des données indique si la région Leader ou l’une des régions
charpentes (FR) a été analysée par le logiciel, et cette information est incluse dans le champ d’emplacement du fichier de données, en haut de lafeuille de calcul Read Summary (Résumé de lecture).
l’analyse d’IGK inclut également des informations sur d’autres éléments du locus IGK impliqués dans les recombinaisons (IGKINTR et IGKDEL).
l’analyse de TRB inclut également des informations sur d’autres éléments du locus TRB impliqués dans les recombinaisons de la région D – J.
les 200 séquences les plus importantes : lorsque spécifié ci-dessus, les feuilles de calcul affichent les séquences les plus importantes (jusqu’à 200)
pour Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, TRB et IGK. Toutes les séquences sont affichées pour TRG dans le Read Summary (Résumé de lecture).
la séquence putative CDR3 est déterminée par la correspondance d’une définition exacte d’une séquence CDR3. Toute mutation des points
d’ancrage ou perturbation du cadre de lecture entraînera une valeur « not found » (non trouvé).

IMPORTANT !

Les assignations des gènes V/J présentées dans le Read Summary (Résumé de lecture) peuvent
parfois correspondre à « none » (aucune). Ces assignations sont basées sur la qualité du meilleuralignement entre la lecture et les gènes de référence. Si le meilleur alignement a un résultat
inférieur à un seuil de qualité, l’assignation du gène ne peut pas être déterminée avec certitude
et est classée « none » (aucune).

IMPORTANT !

Le taux de mutation en gène V partiel (%) indiquera « n/a » (s.o.) pour IGH FR2 et FR3. La
couverture du gène V est limitée en raison des tailles d’amplicon plus courtes de ces cibles, ce
qui entraîne des erreurs de calcul du taux de mutation.

 Lors de l’analyse du statut d’hypermutation somatique d’échantillons, concentrer l’analyse des données sur les
4 premières lectures (limiter les échantillons monoclonaux et biclonaux aux 2 ou 4 premières lectures,
respectivement), car le taux d’hypermutation somatique (HMS) et les analyses du cadre interne/du codon stop
fournissent davantage d’informations pour ces lectures. En raison de la nature non biaisée des plateformes NGS,de nombreuses lectures au-delà des 4 premières sont séquencées et analysées ; la plupart sont desréarrangements de faible abondance ou peuvent être imputées à des artefacts d’amplification ou deséquençage. Dans ce cas, le taux d’HMS et les analyses du cadre interne/codon stop ne sont pas utiles dans leslectures non clonales. Veuillez noter qu’Invivoscribe utilise GRCh37 pour les séquences de référence, ainsi lesrésultats peuvent différer légèrement de la base de données IMGT. En outre, un grand nombre de pseudogènes
et de gènes non fonctionnels ne sont pas inclus dans l’analyse. Il convient d’interpréter avec prudence lesréarrangements dont l’état d’hypermutation somatique est égal à ou proche du seuil de 2 %, en particulier lors
de l’exécution du test IGH FR1, qui cible uniquement une portion de la région IGHV, car la séquence en amont dusite de liaison des amorces ne sera pas évaluée.

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Support technique et service client
Nous vous sommes reconnaissants de votre fidélité. Nous sommes à votre disposition pour vous aider à comprendre ce
logiciel, et notre support technique est disponible du lundi au vendredi pour vous permettre de réaliser les tests
efficacement dans votre laboratoire.
Coordonnées
Invivoscribe, Inc
10222 Barnes Canyon Road | Building 1 | San Diego | California 92121-2711 | États-Unis
Téléphone: +1 858 224-6600 | Fax: +1 858 224-6601 | Heures d’ouverture: 7 h – 17 h heure du PacifiqueService technique: support@invivoscribe.com | Service client: sales@invivoscribe.com | Site internet: www.invivoscribe.com

SymbolesLes symboles suivants sont utilisés pour l’étiquetage des produits NGS d’Invivoscribe.
Numéro de référence

Date de péremption

Volume du réactif

Représentant agréé dans la
Communauté européenne

Numéro de lot

Consulter les instructions d’utilisation

Conditions de conservation

Destiné au diagnostic in vitro

Identifiant Unique de L'Appareil

FabricanteConformité Britannique Évaluée

Personne responsable au Royaume-Uni

Mandataire Suisse

Conformité Européenne

Application logicielle

Foire aux questions concernant le logiciel
Q1 :Après avoir cliqué sur Launch Program (Démarrer le programme), l’erreur suivante (ou une erreur similaire) se
produit :Application terminated with error: Cannot run program ".\resources\Parse_TRG_miseq.exe": CreateProcess error=2, the systemcannot find the file specified.

R1 :For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support. (L’application s’est terminée avec une erreur : Impossibled’exécuter le programme .\resources\Parse_TRG_PGM.exe": CreateProcess error=2, le système ne peut trouver le fichier spécifié.
Pour obtenir de l’aide concernant cette erreur, veuillez contacter le support technique Invivoscribe.)

Le fichier du programme compressé a-t-il été décompressé (voir la section 1 Installation du logiciel) ? Cette erreur
survient fréquemment lors d’une tentative d’exécution du programme sans que le fichier ait été préalablement
décompressé. Windows permet de visualiser le contenu d’un fichier compressé (.zip) en effectuant un simple
double-clic sur ce fichier ; son contenu semble alors complet et fonctionnel, mais il ne peut être exécuté tel quel.

Q2 :Pourquoi le Read Summary (Résumé de lecture) de l’analyse IGH, IGK ou TRB comporte-t-il moins de
200 lectures ?

R2 :Le logiciel LymphoTrack Dx – MiSeq aligne les 200 lectures les plus importantes pendant l’analyse, mais le Read
Summary (Résumé de lecture) contient uniquement les lectures ayant été alignées sur un gène V ou J qui se trouve
dans la référence. Si une lecture ne parvient pas à s’aligner sur la référence, elle n’est pas comptabilisée dans lerésumé de lecture.
Diverses raisons peuvent expliquer une absence d’alignement sur la référence. Toutefois, le problème se situe
généralement au niveau de l’échantillon, conduisant à une grande quantité d’amplification non spécifique. Cetévénement peut être dû à une faible numération de cellules cibles dans l’échantillon, à des conditions de PCR
incorrectes ou à des types d’échantillons de faible qualité, tels qu’un FFIP fragmenté. Afin de réduire la probabilitéde survenue de ces événements, veuillez suivre scrupuleusement les instructions d’utilisation.

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Q3 :Pourquoi l’assignation du gène V ou l’assignation du gène J indique-t-elle « none » (aucune) dans le tableau Read
Summary (Résumé de lecture) ?

R3 :Afin d’assigner une lecture à un gène V et/ou J spécifique, un seuil de qualité minimal doit être atteint pendantl’alignement. Si l’alignement est de mauvaise qualité, une assignation ne peut être effectuée avec certitude etcelle-ci comporte la mention « none » (aucune). Veuillez noter qu’une lecture ne peut être assignée à « none » à lafois pour les gènes V et J, car elle n’apparaîtrait pas dans le rapport, conformément à la condition exposée à laquestion 2.

Q4 :Le « VJ Sequence Frequency Graph » (Graphique de la fréquence de la séquence VJ) comporte des valeursétranges sur l’ordonnée. Le « % total reads » (% de lectures totales) est en millions, comment est-ce possible ?

R4 :Cela est certainement dû à une exécution du programme LymphoTrack Dx avec un type de séparateur décimal
incorrect pour votre région. Consultez la section 2 Exécution du logiciel d’analyse de données, en particulier en cequi concerne le choix du séparateur décimal.

Q5 :Toutes les feuilles de calcul des graphiques sont vides, mais les feuilles de calcul sans graphique comportent desdonnées. Où les graphiques sont-ils passés ?

R5 :Cela peut être dû à une mauvaise orientation par défaut du programme Excel, à savoir de droite à gauche et non degauche à droite. Si les en-têtes des colonnes d’une feuille de calcul vide commencent par la lettre A sur la droite dela feuille de calcul, vous devez modifier l’orientation en De gauche à droite avant d’utiliser la macro de visualisation
des données. Pour modifier ce paramètre, cliquez sur le bouton Office dans le coin supérieur gauche, puis sur Excel
Options (Options Excel), cliquez sur Advanced (Options avancées), puis faites défiler vers le bas jusqu’à la section
Display (Afficher). Une option intitulée Default direction (Orientation par défaut) apparaît ici et le fait desélectionner Left-to-right (De gauche à droite) permettra par la suite aux analyses de visualisation de données defonctionner correctement. Remarque : l’orientation est alors modifiée de façon permanente jusqu’à ce qu’elle soit
rétablie. La fermeture d’Excel n’inverse pas cette modification.

Q6 :Le programme est interrompu après avoir cliqué sur Launch Program (Démarrer le programme) et le message
d’erreur suivant s’affiche :Application terminated with error: Filename not compatible. Please use only MiSeq MSR software generated FASTQ files.

R6 :For help with this error, please contact Invivoscribe Technical Support. (L’application s’est terminée avec une erreur :Nom de fichier non compatible. Veuillez utiliser uniquement des fichiers FASTQ générés avec MiSeq MSR. Pour obtenir del’aide concernant cette erreur, veuillez contacter le support technique Invivoscribe.

Le logiciel LymphoTrack Dx – MiSeq utilise des fichiers *.fastq à lecture appariée générés par le logiciel MiSeq
Reporter (MSR) intégré à l’instrument MiSeq. Si le logiciel MSR n’a pas été utilisé pour générer des fichiers deséquence, la définition des bases doit être effectuée à l’aide du logiciel MSR. Veuillez vous reporter au Guide del’utilisateur MiSeq pour plus d’informations.

Il est important de définir les bases en utilisant le logiciel MSR car, même si d’autres programmes peuvent générer
des résultats très similaires à ceux de MSR (par exemple Bcl2fastq), ces programmes peuvent également générer desrésultats très différents selon les paramètres spécifiques utilisés. Le test LymphoTrack Dx Assay est valable
uniquement pour l’analyse de fichiers *.fastq générés avec le logiciel MSR.
Q7 :Pourquoi les résultats de l’analyse semblent-ils inclure un moins grand nombre de lectures que prévu ?

R7 :S’il y a très peu de lectures totales analysées, voire aucune, d’après le Read Summary (Résumé de lecture), vérifiez
que vous avez coché le bon type d’analyse (Leader, IGH FR1, IGH FR2, IGH FR3, IGK, TRB ou TRG) lors de l’exécution
du logiciel LymphoTrack Dx – MiSeq. Si le nombre de lectures totales semble être très réduit, comparez la taille desfichiers *.fastq à analyser avec la taille des fichiers *.fastq présents sur l’instrument MiSeq. Si la taille des fichiers
sur l’instrument MiSeq est plus importante, transférez de nouveau les données de séquence afin de bien analyser
l’intégralité des données.

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L’outil de séquençage MiSeq affiche différents messages lors de la production des données de séquençage. Un
message peut indiquer « Sequencing Complete » (Séquençage terminé), et un autre peut ensuite indiquer« Analysis Complete » (Analyse terminée). Le transfert des données *.fastq entre ces deux messages peut rendre
l’analyse LymphoTrack Dx incomplète.
Q8 :Pourquoi le Read Summary (Résumé de lecture) comprend-il une lecture, figurant parmi les dix premières, quin’apparaît pas dans le Merged Read Summary (Résumé de lecture) ?

R8 :La lecture introuvable a peut-être été fusionnée avec une lecture d’un rang supérieur, ou il est possible que sonalignement soit exceptionnellement médiocre. Lors du processus de fusionnement, les lectures contenues dans lerésumé de lecture sont alignées sur celles du fichier de lectures uniques. Cependant, les lectures du résumé delecture ont été orientées de façon à ce que l’alignement corresponde à la référence, et il est donc possible qu’elles
soient anti-sens par rapport au gène de référence. Cela se produit uniquement lorsque l’alignement est
particulièrement mauvais ou qu’un alignement sens ou anti-sens serait presque équivalent, mais que l’anti-sens est
légèrement meilleur. Dans ce cas, il est préférable d’ignorer complètement la lecture.

IMPORTANT :seules les lectures du Merged Read Summary (Résumé de lecture fusionné) peuvent être utilisées pourmettre en évidence la clonalité.

Q9 :Pourquoi l’analyse prend-elle plus de temps que prévu (plus d’une heure par échantillon) ?

R9 :Consultez le fichier journal pour connaître le temps nécessaire à chaque étape. Sous la ligne « INFO: Decompressing
files » (INFO : Décompression des fichiers), une autre ligne indique le nombre de fichiers et le temps utilisé pour ladécompression. Ce nombre est exprimé en millisecondes. Si la décompression prend plusieurs heures, vérifiez queles fichiers cibles se trouvent sur un serveur de fichiers. En général, l’exécution d’un processus E/S intensif, commec’est le cas de la décompression, sur un réseau est beaucoup plus longue. Si possible, copiez les fichiers sur un
ordinateur local ou décompressez les fichiers directement avant d’exécuter ce logiciel. Veillez à ce que les fichiers
compressés et décompressés ne se trouvent pas dans le même dossier. Le logiciel ne poursuivra pas l’opération si
les fichiers de type *.fastq et *.fastq.gz se trouvent ensemble dans le dossier cible.
Si les étapes de parsing et d’analyse subséquentes prennent beaucoup de temps, il est possible que vos fichiers*.fastq soient très volumineux. Des fichiers *.fastq volumineux peuvent par exemple être générés lorsque moins de
24 index sont contenus dans une seule analyse MiSeq et que la profondeur de couverture des échantillonsséquencés est donc plus importante. Un second exemple est celui d’une bibliothèque déséquilibrée qui
contiendrait une proportion plus élevée d’échantillons d’un même index par rapport à la proportion d’échantillons
d’autres index. Le temps d’exécution estimé dans ces instructions d’utilisation part du principe que l’analyse
comporte 24 index et que les bibliothèques sont équilibrées.

Q10 :L’analyse Q30 rapportée par l’instrument MiSeq ne répond pas à la spécification Illumina. Si l’analyse
LymphoTrack est effectuée et que les contrôles semblent avoir donné les résultats attendus, l’analyse a-t-ellevraiment échoué ?

R10 :L’analyse Q30 est calculée en temps réel au cours du processus de définition des bases. À ce stade, aucun autre
traitement de données n’a été effectué, tel que le démultiplexage et l’élimination des adaptateurs. Autrement dit,
toute séquence d’un index de qualité médiocre qui se produit en dehors de la séquence de l’adaptateur est priseen compte dans le score Q30. La séquence en dehors de celle de l’adaptateur est généralement de faible qualité, etce scénario se produit souvent avec les dimères d’amorces. Si une bibliothèque contient un niveau suffisant dedimères d’amorces, une chute de l’analyse Q30 peut survenir. À titre de confirmation, la sortie LymphoTrack
Reporter affiche le score Q30 de l’index tel qu’il est calculé à partir de toutes les lectures éliminées dans cet index.
Si le score Q30 d’un index échoue également à la spécification Illumina, l’utilisateur doit considérer que cet index
n’est pas conforme.

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Q11:

Comment résoudre un échec lors du lancement du LymphoTrack Dx Software – MiSeq en double-cliquant sur lefichier startLymphoTrackDxMiSeq.jar?

R11 :Ce problème peut se produire lorsqu'il y a un problème avec l'installation actuelle de Java. La version correcte deJava (Java 8 64 bits) doit être installée sur le système pour que le logiciel LymphoTrack Dx – MiSeq puisses'exécuter. De plus, le fichier startLymphoTrackDxMiSeq.jar doit être configuré pour être ouvert avec la version
correcte de Java.
Les étapes de dépannage suivantes peuvent être suivies pour s'assurer que la bonne version de Java est installée etque le JAR est ouvert avec la bonne version de Java :1.

Vérifiez que le logiciel Java est installé :
1.1.
1.2.
1.3.

2.

Désinstallez les anciennes versions de Java :
2.1.
2.2.

3.

Suivez les étapes 1.1 et 1.2.
Faites défiler la liste des programmes installés. Identifiez tout programme commençant par les lettres
Java et contenant également les lettres Java 8 et 64 bits, cliquez sur l'entrée dans la liste, puis cliquez
sur Désinstaller.

Désinstallez Java et réinstallez Java :Si la version correcte de Java est installée et que le logiciel ne s'ouvre toujours pas, désinstallez et réinstallez
Java.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.

4.

Ouvrez le Windows Menu (Menu Windows) et tapez Settings (Paramètres) dans la barre derecherche, puis sélectionnez la première icône qui s'affiche.
Dans la barre de recherche de la nouvelle fenêtre, tapez Add or remove programs (Ajouter ou
supprimer des programmes) et sélectionnez la première option qui apparaît.
Faites défiler la liste des programmes installés.
• Si un programme avec un nom commençant par les lettres Java 8 et se terminant par les caractères(64 bits) est dans la liste, la version correcte de Java est installée.
• Sinon, Java 8 64 bits doit être installé ; passez à la section 3.

Suivez les étapes 1.1 et 1.2.
Faites défiler la liste des programmes installés et cliquez sur l'entrée portant le nom Java 8 et se
terminant par les caractères 64 bits, puis cliquez sur Uninstall (Désinstaller).
Accédez au site Web Java pour télécharger le logiciel Java 8 64 bits directement à partir d'Oracle àl'adresse http://www.java.com/.
Suivez les instructions pour installer le logiciel.

Pointez le fichier JAR sur le bon exécutable Java :
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.

4.6.
4.7.

Faites un clic droit sur le fichier startLymphoTrackDxMiSeq.jar, puis sélectionnez Properties(Propriétés).
Dans la boîte de dialogue qui apparaît, sélectionnez le bouton Change (Modifier) à opens with (côtéde s'ouvre avec) du texte.
Dans la boîte de dialogue suivante qui apparaît, sélectionnez Choose another app (Choisir une autreapplication).
Dans la nouvelle fenêtre qui s'ouvre, cliquez sur More apps (Plus d'applications), puis sélectionnez
Look for another app on this PC (Rechercher une autre application sur ce PC).
Dans la fenêtre de navigation qui apparaît, accédez à l'emplacement du dossier de l'installation deJava 8 64 bits.
• Ce sera probablement : Local Disk (C:) > Program Files > Java > jre1.8.0_(version number) >bin (Disque local (C:) > Program Files > Java > jre1.8.0_(numéro de version) > bin).
Sélectionnez javaw.exe et cliquez sur Open (Ouvrir).
Une fois l'installation confirmée, répétez les sections 4.1 à 4.3 et cochez la case indiquant Always
open .jar files with this app (Toujours ouvrir les fichiers .jar avec cette application), puis accédez aumême fichier javaw.exe à partir de l'étape 4.6. Cela permettra au LymphoTrack Dx Software des'ouvrir correctement.

LymphoTrack Dx Software – MiSeq

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Contrat de Licence Utilisateur Final
CE CONTRAT DE LICENCE UTILISATEUR FINAL DOIT ÊTRE ACCEPTÉ PAR UN REPRÉSENTANT AUTORISÉ DE L’UTILISATEUR FINAL DE CE PRODUIT AVANT D’UTILISER LELOGICIEL LYMPHOTRACK® MISEQ SOFTWARE (le « Logiciel »). EN UTILISANT LE LOGICIEL LYMPHOTRACK® MISEQ SOFTWARE, VOUS RECONNAISSEZ ÊTRE UN
REPRÉSENTANT AUTORISÉ DE L’UTILISATEUR FINAL MANDATÉ AYANT REÇU PROCURATION POUR CONCLURE CE CONTRAT. VEUILLEZ LIRE CE CONTRAT ATTENTIVEMENT.
EN UTILISANT LE LOGICIEL, VOUS VOUS ENGAGEZ À RESPECTER LES TERMES DE CE CONTRAT. SI VOUS N’ACCEPTEZ PAS LES CONDITIONS DE CE CONTRAT, VEUILLEZ CESSERD’UTILISER CE PRODUIT. SI VOUS ACCEPTEZ LES CONDITIONS DE CE CONTRAT EN VOTRE NOM ET/OU AU NOM DE L’ENTITÉ QUE VOUS REPRÉSENTEZ, VOUS POUVEZCONTINUER DE L’UTILISER.
Ce Contrat de Licence Utilisateur Final (CLUF) est établi et conclu entre INVIVOSCRIBE, INC., société basée en Californie (le « Concédant ») et vous en tant qu’utilisateur du
Logiciel (individu ou entité légale) (le « Titulaire de la licence ») pour le contrat de licence et l’utilisation du Logiciel du Concédant. Le Titulaire de la licence reconnaît etaccepte que le droit d’utilisation du Logiciel, de quelque manière que ce soit, soit contrôlé par ce CLUF et que cette utilisation soit strictement conforme aux termes et aux
conditions de ce CLUF.

1. CONCESSION DE LICENCE. Le Concédant accorde au Titulaire une licence non exclusive, non transférable et limitée, sans droit de sous-licencier, afin d’utiliser le Logiciel ettoute documentation écrite afférente, ainsi que tout document ou autre contenu présentant des informations contenues dans le Logiciel (regroupés sous le terme« Produit ») uniquement à des fins d’utilisation interne propre. À l’exception de ce qui a été convenu dans un document signé par le Concédant, la licence du Logiciel
accordée dans la phrase précédente est limitée à l’utilisation avec les tests LymphoTrack® Assays du Concédant achetés au Concédant ou à un distributeur agréé duConcédant. Le Concédant se réserve tout droit qui ne serait pas expressément accordé au Titulaire de la licence. La licence limitée accordée par ce CLUF et le paiement dudroit de licence par le Titulaire de la licence donne au Titulaire de la licence le droit d’utiliser le Produit uniquement conformément aux termes de ce CLUF. Cette licence
ne constitue pas une vente du logiciel original ou de toute copie de celui-ci.
2. CONFIDENTIALITÉ. Le Titulaire de la licence a été informé que le Produit est détenu par le Concédant et qu’il inclut et relève de la propriété intellectuelle du Concédant, ycompris mais sans s’y limiter, un ou plusieurs secrets commerciaux, les droits d’auteur, les dépôts de brevet et/ou les brevets délivrés (« Propriété intellectuelle ») duConcédant. La possession et l’utilisation du Produit par le Titulaire de la licence doivent être restreintes aux termes de ce CLUF, et la réception ou la possession neconfèrent aucun droit de divulguer, reproduire ou permettre à d’autres d’utiliser le Produit en dehors des termes de ce CLUF sans l’autorisation écrite expresse duConcédant. Le Titulaire de la licence accepte de ne pas divulguer, publier, traduire, communiquer ou distribuer des copies du Produit ou de toute partie de celui-ci endehors des termes de ce CLUF. Le Titulaire de la licence n’est pas autorisé à modifier, adapter, traduire, rétroconcevoir, décompiler, désassembler ou créer des produits
dérivés basés sur le Produit ou une partie de celui-ci, y compris tout document ou autre contenu conçu grâce à l’utilisation du logiciel.
3. PROPRIÉTÉ DU PRODUIT. Le titre, la propriété et tous les droits et intérêts du Produit, y compris mais pas exclusivement le Logiciel, toutes les copies de celui-ci et toute« Propriété intellectuelle » afférente demeurent à tout moment la propriété du Concédant, et ce CLUF ne concède aucun droit de propriété au Titulaire de la licence.
4. RESTRICTIONS RELATIVES À LA REPRODUCTION. Le Produit est protégé par les droits d’auteur. La copie ou la modification non autorisées du Produit, notamment dulogiciel modifié, fusionné ou inclus dans un autre logiciel, est expressément interdite. Le Titulaire de la licence peut être tenu légalement responsable de toute violation
des droits d’auteur causée ou encourue à la suite du non-respect des termes de ce CLUF par le Titulaire de la licence.
5. RESTRICTIONS RELATIVES AU TRANSFERT. La licence de ce Produit est concédée au Titulaire de la licence et ne peut pas être transférée à qui que ce soit sans l’autorisationécrite préalable du Concédant. Le Titulaire de la licence ne peut en aucun cas transférer, céder, louer, donner à bail, vendre ou éliminer autrement le produit, ou toutepartie de celui-ci, de manière temporaire, sauf si expressément prévu par les présentes.
6. RÉSILIATION. Le présent CLUF sera résilié automatiquement sans préavis en cas de non-respect de toute condition par le Titulaire de la licence.
7. GARANTIE LIMITÉE. LE PRODUIT, Y COMPRIS LE LOGICIEL ET LA DOCUMENTATION ÉCRITE AFFÉRENTE, NOTAMMENT LES INSTRUCTIONS D’UTILISATION, SONT FOURNIS« EN L’ÉTAT », SANS AUCUNE GARANTIE, ET LE CONCÉDANT REJETTE TOUTE AUTRE GARANTIE, QU’ELLE SOIT EXPLICITE, IMPLICITE OU STATUTAIRE, Y COMPRIS LESGARANTIES IMPLICITES DE QUALITÉ MARCHANDE ET D’ADÉQUATION À UN USAGE PARTICULIER, DE TITRE, D’ABSENCE DE CONTREFAÇON ET TOUTE GARANTIERÉSULTANT DES PRATIQUES COMMERCIALES ÉTABLIES OU DES MODALITÉS D’EXÉCUTION, RELATIVES AU LOGICIEL, À LA DOCUMENTATION OU À TOUT AUTRE MATÉRIELQUI VOUS EST FOURNI EN VERTU DE CE CLUF. LE CONCÉDANT NE GARANTIT EN AUCUN CAS QUE LE LOGICIEL FONCTIONNERA DE FAÇON ININTERROMPUE, SERA EXEMPTDE DÉFAUT ET RÉPONDRA (OU EST CONÇU POUR RÉPONDRE) À VOS EXIGENCES COMMERCIALES.
8. RESPONSABILITÉ LIMITÉE. DANS LES LIMITES AUTORISÉES PAR LA LOI, LE CONCÉDANT NE POURRA EN AUCUN CAS ÊTRE TENU RESPONSABLE DE TOUT MANQUE ÀGAGNER OU TOUTE PERTE D’OPPORTUNITÉS COMMERCIALES, D’UTILISATION, DE REVENU OU DE CLIENTÈLE, OU DE TOUTE INTERRUPTION D’ACTIVITÉ OU PERTE DE
DONNÉES, OU DE TOUT AUTRE DOMMAGE INDIRECT, SPÉCIAL, ACCIDENTEL OU CONSÉCUTIF EN VERTU DE TOUTE THÉORIE DE RESPONSABILITÉ, QU’ELLE SOIT FONDÉE
SUR UN CONTRAT, UN DÉLIT, UNE NÉGLIGENCE, LA RESPONSABILITÉ VIS-À-VIS DU PRODUIT OU TOUTE AUTRE RESPONSABILITÉ. DANS LA MESURE OÙ CERTAINESJURIDICTIONS N’AUTORISENT PAS L’EXCLUSION OU LA LIMITATION DE LA RESPONSABILITÉ POUR DES DOMMAGES CONSÉCUTIFS OU ACCIDENTELS, LES LIMITATIONSSUSMENTIONNÉES PEUVENT NE PAS S’APPLIQUER AU TITULAIRE DE LA LICENCE. LA RESPONSABILITÉ DU CONCÉDANT EN VERTU DE CE CLUF NE POURRA EN AUCUN CAS,
QUE L’ARGUMENT SOIT BASÉ SUR UN CONTRAT, UN DÉLIT, UNE RESPONSABILITÉ STRICTE OU TOUTE AUTRE RESPONSABILITÉ, DÉPASSER LES FRAIS DE LA LICENCE PAYÉS
PAR LE TITULAIRE DE LICENCE POUR LE LOGICIEL, LE CAS ÉCHÉANT. LES LIMITATIONS SUSMENTIONNÉES S’APPLIQUENT, QUE LE CONCÉDANT AIT ÉTÉ AVISÉ OU NON DE LA
POSSIBILITÉ DE TELS DOMMAGES, ET QUE TOUT RECOURS ÉCHOUE OU NON À ATTEINDRE SON OBJECTIF PRINCIPAL.
9. RECOURS EXCLUSIF. Le recours exclusif du Titulaire de la licence et la seule responsabilité du Concédant en cas de violation de ce CLUF par le Concédant se limitera, à laseule et entière discrétion du Concédant, au : (i) remplacement de tout Logiciel défectueux ou Documentation connexe ; ou (ii) au remboursement de la contrepartie
payée au Concédant pour le Logiciel.
10. LÉGISLATION APPLICABLE. Ce CLUF est régi par la législation de l’État de Californie, sans égard aux principes de conflits de lois, et le Titulaire de la licence accepte lacompétence des tribunaux d’État et fédéraux siégeant dans l’État de Californie.
11. ACCORD COMPLET. Ce CLUF constitue l’intégralité de l’accord entre le Concédant et le Titulaire de la licence selon les conditions spécifiques énoncées dans les présentes
concernant la licence et les garanties du Produit et toute autre condition ou obligation incluses. Ce CLUF remplace tous les accords et contrats antérieurs, qu’ils soientécrits ou oraux. Ce CLUF ne peut être modifié à moins que ces modifications soient approuvées par écrit par le Concédant et le Titulaire de la licence.
12. DIVISIBILITÉ. Si, pour une raison quelconque, un tribunal compétent détermine que toute disposition ou partie de toute disposition de ce CLUF est inapplicable, cettepartie ou disposition sera exécutée dans les limites autorisées par la législation afin de respecter les intentions des parties, et le reste du CLUF demeurera en vigueur.
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280387 Rév. J | février 2024