研究フロンティア

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化過程におけるForkhead転写因子の役割
梶原健１），末永昭彦２），Jan Brosens３），石原理１）

１）埼玉医科大学産婦人科学教室
２）埼玉医科大学総合医療センター産婦人科
３）Institute of Reproductive and Developmental Biology，Imperial College London

はじめに脱落膜（deciduas）とは妊娠の成立に伴い変化し，妊およびその標的遺伝子（Bim）の役割について示す［11］．

Forkhead転写因子

娠の終結に伴い胎盤とともに剥脱する子宮内膜組織の一部と定義される．また子宮内膜間質細胞が妊卵の着床にFOXOとはForkhead（もしくはwinged-helix）と呼伴い形態学的および機能的に分化をする過程を脱落膜化ばれる特徴的なDNA結合領域を有する転写因子群の１（decidualization）といい［１，２］，この分化過程は絨

つ で あ り， 哺 乳 類 で は FOXO1（FKHR），FOXO3a毛細胞の浸潤，胎盤形成に重要な役割を果たしていると（FKHR-L1），FOXO4（AFX），FOXO6の ４ 種 類 が 存考えられている［３］．脱落膜化の形態学的特徴として在し，FOXO6を除く３つのForkhead転写因子は機能的は大型で敷石状の配列を示す上皮細胞様形態が挙げらにも高い相同性を有し，共通の認識配列であるinsulin

れ，機能的特徴としてはステロイドホルモン受容体の発response sequenceに結合し，標的遺伝子の発現を制御

現，ステロイド代謝，細胞骨格の再構成，成長因子，サしている．Forkhead転写因子は糖・脂質代謝，細胞周イトカイン，その受容体の発現の変化等が挙げられる［４期の制御，アポトーシス，寿命・老化等に関連して重要-６］．ヒトなどの月経のある種において脱落膜化変化はな役割を果たしている［12］．またFOXO転写因子は胚の存在の有無に関係なく，分泌期中期以降には子宮内PI3K/AKt経路におけるリン酸化標的の遺伝子であり，膜の機能層において観察され，プロゲステロンの長期投

通常は核内に局在し標的遺伝子のプロモター領域に結合与によっても脱落膜様変化（偽脱落膜：pseudodecidua）し，標的遺伝子の発現を亢進させる．しかしインスリンと呼ばれる変化が観察される．またアポトーシスやプロなどのホルモンのシグナルが受容体を介して細胞内に伝ゲステロンの低下（withdrawal）による脱落膜化変化

達されると，下流のPI3K/AKt経路が活性化され，核内の喪失により子宮内膜機能層の剥離（月経）は誘導されにあるFOXOの３ヵ所のセリン/スレオニン残基がリンると考えられており，脱落膜化は月経発来にとっても必酸化を受け［13］，その結果14-３-３タンパクに結合し要な過程であると考えられている．

その局在が核から細胞質に変化することによりその転写脱落膜化の維持にはプロゲステロンが無論必要不可欠活性を失うと考えられている（図１）．核内に存在し活であるが，この過程の誘導にはcAMPの上昇とPKA経性化されたフォークヘッド転写因子は細胞周期を制御す路の活性化・維持が必要であることが明らかとなっている［７-９］．最近，われわれはヒト子宮内膜間質細胞においてcAMPによる脱落膜化誘導に伴いForkhead転写因子の１つであるFOXO1の発現が誘導されることを明らかにした［10］．本稿では，その後の検討により筆者
らのグループが明らかにしたヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化・月経発来制御に対するフォークヘッド転写因子

連絡先：梶原 健，埼玉医科大学産婦人科学教室〒350-0495 埼玉県入間郡毛呂山町毛呂本郷38
TEL: 049-276-1347
FAX: 049-294-8305
E-mail: kajihara@saitama-med.ac.jp

図１

フォークヘッド転写因子の制御機構(Tran H, et al. Sci STKE. 2003 Mar 4 ; 2003(172): RE5.より引用)

日本生殖内分泌学会雑誌（2006）11：43-47

43

梶原 健他

るp27kip1［14, 15］，アポトーシス関連遺伝子である誘導された．MPAと8-br-cAMPを同時添加することでBim，TRAILやFas Ligand［16-19］，酸化ストレス消FOXO1の発現はさらに増強された．一方MPA単独の刺去酵素であるMn-SODやcatalase［20-22］，DNA損傷修激でFOXO1の発現は誘導されなかったが，FOXO3aの復に関与する遺伝子である Gadd45［23, 24］などの遺発現はmRNA，タンパク共に誘導された．しかし8-br-伝子群の発現を制抑することにより多彩な機能を発揮す

cAMPとMPAを同時添加すると FOXO3aの発現は逆にる．

抑制された．FOXO1 および FOXO3aで並行するmRNAとタンパクの誘導と対照的にFOXO４の発現はｍRNA

ヒト子宮内膜組織におけるForkhead転写因子の発現レベルでは認められたが，ウェスタンブロットによる検討では認められなかった．
続いて月経周期各時期の子宮内膜組織（in vivo）にこれまでに，われわれのグループは分離培養したヒトおける各種フォークヘッド転写因子の検討を行った．そ子宮内膜間質細胞（HESCs）においてcAMP刺激によりの結果，分泌中期にはFOXO1 mRNAの発現は増殖期のフォークヘッド転写因子の１つであるFOXO1の発現が約４倍に増加しており，その増加したFOXO1 mRNAは誘導されることを報告している［10］．今回われわれは分泌後期（前月経期）まで維持されていた（図2C）．そ

脱落膜化刺激として0.5mM 8-br-cAMPと10-6M MPAをれに対しFOXO3a mRNAは増殖期〜分泌期〜前月経期１日または３日間用いてHESCsの脱落膜化を誘導し，に向かい減少していき，FOXO４ mRNAは月経周期に非脱落膜化HESCsと脱落膜化HESCsにおける各種フォおいて有意な変化はみられなかった（図2C）．免疫組織ークヘッド転写因子の発現について検討した（図２A,化学的検討では分泌期中期・後期の子宮内膜間質細胞にB）． そ の 結 果，8-br-cAMPの 刺 激 に よ りFOXO1のFOXO1の強い発現を認め，FOXO3aとFOXO４の発現mRNAとタンパクは，共に以前の報告［10］と同様には免疫組織化学的には子宮内膜組織には観察されなかった（図2D）．すなわち以上をまとめると，in vivo，invitroのいずれにおいても，子宮内膜間質細胞において，脱落膜化に伴いFOXO1の発現が誘導されることが明らかとなった．

子宮内膜組織におけるBimの発現とその制御機構
次に子宮内膜組織におけるフォークヘッド転写因子の役割を明らかにするために，フォークヘッド転写因子の標的遺伝子でありpro-apoptotic因子として知られているBim［16, 17］の発現とその発現の制御機構について検討を試みた．
子宮内膜組織において，BimのmRNAは分泌期後期のみに発現の増加を認め（図3A），免疫組織化学的にも同時期の子宮内膜に被覆腺上皮細胞とそれに隣接した間質細胞にBimの強い発現を認めた（図3B）．一方HESCsの培 養 系 で は， 前 述 し たFOXO1の 発 現 と 同 様 に8-brcAMP刺激によりBimのmRNA，タンパク共にその発現は誘導されたが，MPAと8-br-cAMPによって同時に刺激 を 行 う と，FOXO1の 場 合 と は 逆 に，Bimの 発 現 は
図２

44

ヒト子宮内膜におけるフォークヘッド転写因子の発現（A)Real-Time PCR 法 に よ る 培 養 HESCs に お け る FOXO1,
FOXO3a，FOXO4の発現（B)培養HESCｓにおけるウェスタンブロット法による検討（C)子宮内膜組織（in vivo）におけるRealTime PCR 法による検討（D)子宮内膜組織における免疫組織化学的検討（文献11より引用）

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.11

2006

mRNA，タンパク共に抑制された（図3C, D）．しかしこの条件でsiRNA法により選択的にFOXO1の発現を抑制したところ，Bimの発現も抑制され（図3E），HESCs
においてFOXO1がBimの発現を制御していることが明らかとなった．

ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化過程におけるForkhead転写因子の役割

図３

ヒト子宮内膜におけるBimの発現とその制御（A)Real-Time PCR法によるヒト子宮内膜組織の各性周期におけるBimの発現 （B)免疫組
織化学的に検討したヒト子宮内膜組織におけるBimの発現 （C)Real-Time PCR法により検討した各種刺激を行った培養系HESCsにおけるBim mRNAの発現 （D)培養系HESCsにおけるウェスタンブロット法による検討 （E)siRNA法によりFOXO1の発現を選択的に抑制
し，FOXO1，Bimの発現をウェスタンブロットにより検討（文献11より引用）

前述したように，PI３K/Akt経路やその他の経路によりリン酸化されたフォークヘッド転写因子はその局在を核から細胞質に変化させその転写活性を失うことが知られている（図１）．そこでわれわれは，HESCsにおいて8-br-cAMPによって誘導されたFOXO1はMPAによってその局在を変化させるのではないかと考えた．図4AのようにHESCsにおいて8-br-cAMPによって誘導されたFOXO1の局在は主に核に認められたが，MPAを同時に添加するとFOXO1の局在は細胞質に移動した．次に抽出したタンパクを核と細胞質の分画に分けウェスタンブロットを行ったところ，8-br-cAMP単独の刺激では核にFOXO1を認めたが，8-br-cAMP とMPAを同時添加した場合，細胞質にリン酸化されたFOXO1が観察され，同時にリン酸化されたAktも誘導されていた（図4B）．一方，8-br-cAMPとMPAによって脱落膜化されたHESCsにPI３KのinhibitorであるLY294002を添加すると，AktとFOXO1のリン酸化は抑制された（図4C）．
以上の結果より，MPAによって変化するFOXO1の局在の変化はPI３K/Akt経路を介していることが判明した．

図４

プロゲステロン添加による脱落膜化したHESCsにおけるFOXO1のリン酸化と局在の変化（A)共焦点顕微鏡によって観察したFOXO1の局在の変化 （B)細胞質と核の分画に分けBim，p-FOXO1，FOXO1，p-Akt，Aktの発現 を ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ り 検 討 （C)PI3K inhibitor（LY294002）の影響をウェスタンブロットにより検討した（文献11より引用）

月経発来におけるアポトーシスとFOXO1との関係
月経発来におけるアポトーシスとFOXO1との関連につ次いで月経発来モデルとしてHESCs培養系におけるいて検討を行った．8-br-cAMPとMPAを用いて３日間プロゲステロンwithdrawalモデルを用い，脱落膜化・脱落膜化誘導後，その刺激を8-br-cAMP，MPAもしく研究フロンティア

45

梶原 健

他の発現が抑制された（図5E, F）．以上のことより脱落膜化 し たHESCsよ りMPAをwithdrawalす る とFOXO1が核内に誘導され，そのFOXO1によりproapototic因子であるBimの発現が亢進し，その結果アポトーシスが誘導されることが明らかとなった．

まとめ
今回の検討によりHESCsでは脱落膜化に伴いフォークヘッド転写因子の１つであるFOXO1が誘導され，プロゲステロンはそのFOXO1の局在を変化させることによりsurvival因子として働き，ヒト子宮内膜の脱落膜化・月経発来に関与していることが明らかとなった．最近，われわれは脱落膜化したHESCsは酸化ストレスに対して強い抵抗性を有し，その耐性獲得メカニズムにFOXO1が関与していることも明らかにした［25］．このようにフォークヘッド転写因子は子宮内膜の脱落膜化機構において多彩な機能を発揮し重要な役割を果たしていると考えられる．今後のさらなる研究により正常の脱落膜化機構へのフォークヘッド転写因の役割を明らかにす
図５

脱落膜化したHESCsからプロゲステロンをwithdrawalｌすると核内にFOXO1が誘導されその結果アポトーシスが誘導された（A)ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 に よ り 検 討 し た8-br-cAMP，MPAをwithdrawalしたときのBimの発現 （B，C)FACScanによる8-brcAMP，MPAをwithdrawalし た 場 合 の ア ポ ト ー シ ス の 発 現（D)MPAをwithdrawalした時の核，細胞質内のFOXO1の発現をウェスタンブロットにより検討 （E,F)siRNA法によりFOXO1の発現を選択的に抑制した後にMPAをwithdrawalしたときのアポトーシスの発現（文献11より引用）

は そ の 両 者 を24時 間 中 止（withdrawal） し た も の をWithdrawalモデルとして用いて実験を行った．MPAを単 独 にwithdrawalし た 場 合 にpro-apototic因 子 で あ るBimの発現が強く誘導されたが，8-br-cAMPとMPAの両者をwithdrawalした場合はBimの発現はわずかに増強
し た の み で あ っ た（ 図5A）
．FACScanを 用 い たflow
cytometryの検討では，MPAを単独でwithdrawalした場合にのみアポトーシス細胞が多く観察されていた（図5B, C）．それに対して8-br-cAMPのみwithdrawalした場合にはアポトーシス細胞の増加は観察されず，8-brcAMPとMPAの両者をwithdrawalした場合にはアポトーシス細胞はわずかに増加したのみであった．またMPAをwithdrawalすると１〜12時間の間に時間依存性にFOXO1は核内に誘導され，それに伴い細胞質内のFOXO1は 減 少 し て い る の が 観 察 さ れ た（ 図4D）．
siRNA法によりFOXO1の発現を選択的に抑制するとMPAのwithdrawalにより誘導されたアポトーシス細胞

46

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.11

2006

ることは，流産，PIH，IUGRなどの脱落膜化のdefectとの関与が指摘されている病態の解明の一助になることが期待される．

文

献１．Brosens JJ, Pijnenborg R, Brosens IA（2002）The myometrial junctional zone spiral arteries in normal and abnormal
pregnancies：a view of the literature. Am J Obstet Gynecol
187, 1416-1423.
２．Finn CA（1998）Menstruation：a nonadaptive consequenceof uterine evolution. Q Rev Biol 73, 163-173.
３．Dey SK, Lim H, Das SK, Reese J, Paria BC, Daikoku T,
Wang H（2004）Molecular cues to implantation. Endocr Rev
25, 341-373.
４．Oliver C, Cowdrey N, Abadia-Molina AC, Olivares EG（1999）
Antigen phenotype of cultured deciduas stromal cells of human term deciduas. J Reprod Immunol 45, 19-30.
５．Popovici RM, Kao LC, Giudice LC（2000）Discovery of new
inducible genes in in vitro decidualized human endometrial
stromal cells using microarray technology. Endocrinology
141, 3510-3513.
６．Brar AK, Handwerger S, Kessler CA, Aronow BJ（2001）
Gene induction and categorical reprogramming during in vitro human endometrial fibroblast decidualization. Physiol Genomics 7, 135-148.
７．Telgmann R, Maronde E, Tasken K, Gellersen B（1997）Activated protein kinase A is required for differentiation-dependent transcription of the decidual prolactin gene in human endometrial stromal cells. Endocrinology 138, 929-937.
８．Brosens JJ, Hayashi N, White JO（1999）Progesterone re-ヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化過程におけるForkhead転写因子の役割

ceptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology 140,4809-4820.
９．Gellersen B, Brosens JJ（2003）Cyclic AMP and progesterone receptor cross-talk in human endometrium：a decidualizing affair. Endocrinology 178, 357-372.
10．Christian M, Zhang X, Schneider-Merck T, Unterman TG,
Gellersen B, White JO, Brosens JJ（2002）Cyclic AMP-induced forkhead transcription factor, FKHR, cooperates withCCAAT/enhancer-binding protein in differentiating humanendometrial stromal cells. J Biol Chem 277, 20825-20832.
11．Labied S, Kajihara T, Madureira PA, Fusi L, Jones MC,
Higham JM, Varshochi R, Francis JM, Zoumpoulidou G, Essafi A, Fernandez de Mattos S, Lam EW, Brosens JJ（2006）
Progestins regulate the expression and activity of the forkhead transcription factor FOXO1 in differentiating humanendometrium. Mol Endocrinol 20, 35-44.
12．Accili D, Arden KC（2004）FoxOs at the crossroads of cellular metabolism, differentiation, and transformation. Cell117, 421-426.
13．Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, Anderson MJ, Arden KC, Blenis J, Greenberg ME（1999）Aktpromotes cell survival by phosphorylating and inhibiting aForkhead transcription factor. Cell 96, 857-868.
14．Dijkers PF, Medema RH, Pals C, Banerji L, Thomas NS, Lam
EW, Burgering BM, Raaijmakers JA, Lammers JW, Koenderman L, Coffer PJ（200）Forkhead transcription factor
FKHR-１ modulates cytokine-dependent transcriptional regulation of p27（KIP１）．Mol Cell Biol 20, 9138-9148.
15．Medema RH, Kops GJ, Bos JL, Burgering BM（2000）AFXlike Forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Ras and PKB through p27kip1. Nature 404, 782-787.
16．Dijkers PF, Medema RH, LammersJW, Koenderman L, Coffer PJ（2000）Expression of the pro-apoptotic Bcl-2 family
member Bim is regulated by the forkhead transcription factor FKHR-L1. Curr Biol 10, 1201-1204.
17．Sunters A, Fernandez de Mattos S, Stahl M, Brosens JJ,Zoumpoulidou G, Saunders CA, Coffer PJ, Medema RH,Coombes RC, Lam EW（2003）FoxO3a transcriptional regulation of Bim controls apoptosis in paclitaxel-treated breast
cancer cell lines. J Biol Chem 278, 49795-49805.
18．Modur V, Nagarajan R, Evers BM, Milbrandt J（2002）
FOXO proteins regulate tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand expression. Implications for PTEN mutation in prostate cancer. J Biol Chem 277, 47928-47937.
19．Suhara T, Kim HS, Kirshenbaum LA, Walsh K（2002）Suppression of Akt singaling induces Fas ligand expression：involvement of caspase and Jun kinase activation in Akt-mediated Fas ligand regulation. Mol Cell Biol 22, 680-691.
20．Kops GJ, de Ruiter ND, De Vries-Smits AM, Powell DR, BosJL, Burgering BM（1999）Direct control of the Forkheadtranscription factor AFX by protein kinase B. Nature 398,630-634.
21．Nemoto S, Finkel T（2002）Rodex regulation of Forkhead
proteins through a p66shc-dependent signaling pathway. Science 295, 2450-2452.
22．Essers MA, Weijzen S, de Vries-Smits AM, Saarloos I, deRuiter ND, Bos JL, Burgering BM（2004）FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by thesmall GTPase Ral and JNK. Embo J 23, 4802-4812.
23．Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, Jr.,
DiStefano PS, Chiang LW, Greenberg ME（2002）DNA repair pathway stimulated by the forkhead transcription factor FOXO3a through the Gadd45 proteins. Science 296,530-534.
24．Brunet A, Sweeney LB, Sturgill JF, Chua KF, Greer PL, LinY, Tran H, Ross SE, Mostoslavsky R, Cohen HY, Hu LS,
Cheng HL, Jedrychowski MP, Gygi SP, Sinclair DA, Alt FW,Greenberg ME（2004）Stress-dependent regulation ofFOXO transcription factors by the SIRT１ deacetylase. Science 303, 2011-2015.
25．Kajihara T, Jones M, Fusi L, Takano M, Feroze-Zaidi F,Pirianov G, Mehmet H, Ishihara O, Higham JM, Lam EW,
Brosens JJ（2006）Differential expression of FOXO1 andFOXO3a confers resistance to oxidative cell death upon endometrial decidualization. Mol Endocrinol（in press）

研究フロンティア47