研究フロンティア（平成２０年度学術奨励賞受賞論文）

顆粒膜細胞の分化と黄体細胞のアポトーシスにリンクするペースメーカーの発振吉田薫１），楢原佐由子１），賀橋本 誠一２），服部 眞彰１）培建１），平田 雅美１），山内 伸彦１），１）九州大学大学院農学研究院動物資源科学部門
２）アステラス製薬分子医学研究所

はじめににわたって生物の生命現象が調節されている［７，８］．
これまでの研究により，生殖においてもペースメー

哺乳類を含むほとんどの生物の多くの生理学的・行動カーの関与が示唆されている．時計遺伝子 Clock のノッ学的過程で昼夜のリズムがみられる．これは概日リズム

クアウトによりマウスは異常な発情周期を示し，LHといわれ，内分泌的には約２４時間に自己維持されているサージが起こらず，結果として不妊になる ［９］．しか［１］．概日リズムは入力，ペースメーカー，出力の３要しながら，ラット卵巣の黄体では時計遺伝子 Per1や Per素からなり，哺乳類におけるペースメーカーの中枢は視2の概日的な発現がみられるという報告［１０］に対し，床下部にある視交叉上核（SCN）である．光は中枢時計

卵胞では Bmal1や Per2が振動的に発現するが黄体ではの主な同調因子であり，視神経を介した光刺激が SCN

否定的な報告もある［１１］．このように卵巣のペースメーに入力し，主要な時計遺伝子の発現を伴ってペースメーカーでは相反する報告があり，卵巣でのペースメーカーカーが同期化される．ペースメーカーの分子メカニズムの存在を含めそれを制御する因子についてほとんど明らは，２つの転写・翻訳フィードバックループによって形かではない．本研究では，ラット顆粒膜細胞および黄体成されている．bHLH―PAS ドメインを含む CLOCK と細胞のペースメーカーを解析し，それらのペースメー

BMAL１の２つの転写因子はヘテロダイマーを形成し，カーの機能について検討することを目的とした．

Period （Per）遺伝子や Cryptochrome（Cry）遺伝子の転写を促進する．生成された PER 蛋白質と CRY 蛋白質は顆粒膜細胞および黄体細胞における PER１の細胞複合体を形成して，核内に移行し，CLOCK/BMAL１の内局在活性を抑制することで自身の転写を抑制している．このネガティブフィードバックループによって，約２４時間のペースメーカーが維持されている［２，３］．

１２時間明暗周期（点灯時間０８００〜２０００）のもとで飼育している未成熟雌ラット（４週齢）および黄体期の成熟SCN で同期化されたペースメーカーは，神経シグナ

雌ラットから，点灯後４時間（ZT４）および１２時間（ZT

ルやホルモン分泌を通して末梢組織におけるペースメー１２）に卵巣を採取して，免疫組織化学により PER１の．心臓や肝臓，腎臓，骨カーを同期化している［４―６］細胞内局在を観察した．図１に示すように，未成熟雌ラッ格筋などの多くの末梢組織では，同期化により時計遺伝

トの顆粒膜細胞では，ZT４および ZT１２のいずれも PER子が振動的に発現して，時計遺伝子の下流に存在する組１は細胞質で凝集して局在するのに対し，成熟雌ラット織特異的な時計支配遺伝子（Clock Controlled Genes）の黄体細胞では PER１の凝集の様子はみられず，ZT４が概日的な発現を示す．その一方で，末梢組織は中枢かでは核のみに，ZT１２では核と細胞質の両方に局在するら独立したペースメーカーをもっている．末梢組織の同ことが認められた．しかも，ZT１２で PER１の強い発現期化により，睡眠や行動，脂質代謝，腫瘍形成など多岐が認められた．免疫組織化学的所見では明確にはいえな
いが，少なくとも黄体細胞では時計遺伝子の振動的な発連絡先：吉田 薫，九州大学大学院農学研究院動物資源科学部門〒８１２―８５８１ 福岡県福岡市東区箱崎６―１
０―１TEL＆FAX：０
９２―６４２―２９３
８E-mail : kaoru.１
２０４＠hotmail.co.jp

現が発生していることが考えられる．

日本生殖内分泌学会雑誌（2009）14 : 29-3429吉田薫

他

GC（ZT4）

GC（ZT12）LC（ZT4）LC（ZT12）図１

顆粒膜細胞および黄体細胞における PER１の細胞内局在
抗 PER１抗体を用いて蛍光免疫組織化学的手法により，ZT４とZT１２に採取した未成熟ラットおよび成熟ラットの卵巣の凍結切片を作製して免疫染色を施した．
赤：抗 PER１抗体，青：核染色（Hoechst），上図：顆粒膜細胞，
下図：黄体細胞．点灯時を ZT０，消灯時を ZT１２とする．

Anti-PER2

Merge

ZT0

図２

ZT4

ZT8

ZT12

ZT16ZT20

黄体細胞における PER２の概日リズムと細胞内局在
抗 PER２抗体を用いて蛍光免疫組織化学的手法により，eCG/hCG 処理した未成熟ラットから４時間間隔で卵巣を採取し，凍結切片を作製して免疫染色を施した．
上図：抗 PER２抗体，下図：抗 PER２抗体（赤）と核染色（Hoechst，青）をマージ．Bars＝５０μmペースメーカーの分子機構から考えると，時計遺伝子が黄体細胞における PER２発現の概日リズム振動的に発現するためには時計タンパク質 PER２が核と細胞質の両方に局在することになる．したがって，黄未成熟ラットに eCG（５０単位）を投与，その４８時間

体細胞での免疫組織化学的所見はペースメーカーの駆動後に hCG（２５単位）を投与（eCG/hCG）して５日後かを示しているものと考えられる．一方，顆粒膜細胞ではら４時間おきに２４時間経時的に卵巣を採取し，免疫組織ペースメーカーが駆動していない．ショウジョウバエの化学により PER２の細胞内局在を観察した．図２に示卵巣卵胞では，period と timeless は振動的な発現を示さすように，ZT１２〜ZT１６に PER２の強い発現が見られ，ないことが報告されており［１２］，顆粒膜細胞での所見

ZT０〜ZT４ではその発現は低下し明らかな概日リズムと一致するものである．

が認められた．強い発現がみられた時間帯では，PER１と同様に PER２の局在が核と細胞質に認められたのに対し， 低下した時間帯では核のみに PER２が局在した．

30

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

CONT

Bioluminescence (counts/min)

6000

FSH

4000

2000
2448

7296

2448

72

CONT

6000

96
LH

CONT

6000

DXM

FSK

4000

2000
2448

72

2448

72

2448

72

Time (h)4000

図４2000
2448

7296

2448

72

96

Time (h)図３Bioluminescence (counts/min)

顆粒膜細胞および黄体細胞におけるペースメーカー

Per2―プロモーター連結 dLuc 遺伝子導入ラットから採取した顆粒
膜細胞におけるペースメーカーの振動
DES 処理（上図）あるいは eCG 処理（下図）のラットから採取した卵巣の顆粒 膜 細 胞 を 分 離 し て，３５―mm コ ラ ー ゲ ン コ ー トディッシュに播種して２日間培養，０．
１mM ルシフェリン存在下で生じる発光を連続的に４日間計測した．発光計測直前に，１００ng/ml の FSH あるいは LH を含む培地と交換した．

FSH/LH による顆粒膜細胞ペースメーカーの制御

Per2―プロモーター連結 dLuc 遺伝子導入ラットから採取した黄体細胞におけるペースメーカーの振動
eCG/hCG 処理のラットから採取した卵巣の黄体細胞を 分 離 して，３５―mm コ ラ ー ゲ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ に 播 種 し て３日 間 培
養，０．
１mM ルシフェリン存在下で生じる発光を連続的に３日間計測した．発光計測直前に，０．
１μM DXM あるいは１μM FSKを含む培地と交換した．コントロールには vehicle（０．
０１％エタノール）を添加した．

黄体細胞におけるペースメーカーの発振

多くの時計遺伝子はグルココルチコイド，フォルスコ

顆粒膜細胞が分化した黄体細胞での Per2の振動的発リン（FSK）あるいは血清などによって誘導される［１３現について解析するために，eCG/hCG で処理した TG―１５］．顆粒膜細胞の増殖・分化には FSH や LH が大きラットから黄体細胞を分離・培養した．前述した顆粒膜く関わっており，これまでに FSH と LH が in vitro で細胞とは対照的に，ホルモン等を添加しない場合でも黄Per1の発現を刺激することが報告されている［１９， ２０］．

体細胞は Per2の連続的な振動的発現を示した（図４）．

時計遺伝子 Per2の発現に対しても，FSH や LH が影響また，一般的にペースメーカーの同期化因子として知らを及ぼすことが考えられることから，Per2のプロモーれているデキサメサゾン（DXM）や FSK を添加すると，ター領域と dLuc 遺伝子を融合させて（Per2 promoter-

他の細胞でみられているように Per2の振動的発現が増dLuc）組み込んだトランスジェニックラット（TG ラッ幅した．このことから，黄体細胞ではペースメーカー機ト）を用いて，顆粒膜細胞における Per2の発現をリア構が存在し，しかも自己振動していることを示している．

ルタイムに計測した（図３）．合成エストロジェン（DES）

精巣の精子形成過程では時計遺伝子が振動的に発現して投与ラットから分離した LH 受容体が発現していない未いないこと［１７，１８］，脱落膜化を誘導させた子宮内膜

成熟顆粒膜細胞では，Per2の発現は低く，FSH の刺激間質細胞や精巣ライディッヒ細胞および胸腺細胞では，で１回の発現を示すものの連続的な振動を示さなかっPer2の振動的発現が消失していること［２０］など，こた．一方，eCG 投与ラットから分離した LH 受容体が発れまで報告がある．神経系の細胞（PC１２）で分化を誘現している成熟顆粒膜細胞では，未成熟顆粒細胞よりも導すると，停止していた Per1と Per2の振動的な発現が高いレベルの Per2の一定発現がみられたが，明確な振再開する［２１］．これらのことを考え合わせると，細胞動的な発現を示さなかった．しかし，成熟顆粒膜細胞を周期や分化過程によっては時計遺伝子の振動的発現にス

LH で刺激すると連続的な振動が発生した．これらの結イッチが入ることが考えられる．卵胞を構成する顆粒膜果から，成熟した顆粒膜細胞には内因性のペースメー細胞は LH サージの刺激により，卵子を放出した後機能カー機構が存在しているが，その機構は停止しており，的な黄体細胞へと分化する．顆粒膜細胞での時計遺伝子

LH 刺激によりペースメーカーが発振されることが考えの振動的発現の入力因子が LH サージであることが考えられる．

られ，LH の新たな機能が浮かび上がってきた．この顆
粒膜細胞の増殖と黄体細胞への分化という時間の流れ

研究フロンティア

31

薫

他

Bioluminescence (counts/min)

吉田

3000

CONT

P4+AMG

AMG

P4

2000

1000

244872244872

244872244872

Time (h)図５黄体細胞のペースメーカーの振動に及ぼす P４および P４合成阻害剤添加の影響
eCG/hCG 処理のラットから採取した卵巣の黄体細胞を分離して，３５―mm コラーゲンコー
トディッシュに播種して３日間培養後，０．
１mM ルシフェリン存在下で生じる発光を連続的に３日間計測した．発光計測直前に，０．
１μM P４，１μM AMG あるいは P４＋AMG を含む培地と交換した．コントロールには vehicle（０．
０１％エタノール）を添加した．

＊ACell death (%)

40B

＊24-h

CONT96-h

Bax

AMG
Bcl-220
Caspase-3β-actin

030-h
図６72-hCONT

CONT AMG

黄体細胞における細胞死の判定
AMG 添加から３０時間後（Per2過剰発現前）および７２時間後（Per2過剰発現時）に，死細胞率を PI 染色（A）および AO/EB 染色（B）により判定した．AO/EB 染色では AMG 添加から７２時間後の細胞について判定した．平均値±SE（n＝３）で示す．＊P＜０．
０５

図７AMG

CONTAMG

黄体細胞での Per2過剰発現に伴うアポトーシス関連遺伝子の発現
AMG 添加から２４時間後（Per2過剰発現前）および９６時間後（Per2過剰発現時）の黄体細胞から総 RNA を分離して，アポトーシス関連遺伝子（Bax,Bcl2，Caspase―3）の発現を以下に示すプライ
マーを用いて RT-PCR によって調べた．
Bax（センス：５ ―AGG ATC GAG CAG AGA GGA TG―３ ；アンチセンス：５ ―GAG GAC TCC AGC CAC AAA GA―３ ），Bcl2（センス：５ ―GGT GGT GGA GGA ACT CTT CA―３ ；アンチ
センス：５ ―TGA TTT GAC CAT TTG CCT GA―３ ），Caspase―3（センス：５ ―GCT ACG ATC CAC CAG CAT TT―３ ；アンチ．
センス：５ ―AGT CTG CAG CTC CTC CAC AT―３ ）に，ペースメーカーが深く関わっていることが示唆さ響を解析した．P４の添加によりペースメーカーの振幅れる．

や周期に大きな変化をもたらさなかったが，興味あることに AMG の添加によって４８時間以降に Per2の過剰な黄体細胞におけるペースメーカーとアポトーシス発現が認められた（図５）．この過剰発現は P４の添加により抑制された．

黄体細胞の生存にはプロジェステロン（P４）が重要培養している黄体細胞中の P４濃度が減少すると，黄であり，P４は LH の刺激によって産生・分泌が始まる．

体細胞のアポトーシスが誘導される［２２，２３］．そこで，前述したように顆粒膜細胞が黄体細胞に分化することにPI 染色および AO/EB 染色を用いて黄体細胞での死細胞よりペースメーカーが発振したことから，P４が黄体細率を判定した．Per2の過剰発現が発生する前では（AMG胞のペースメーカーの発振に重要な役割を担っているこ

添加後３０時間），AMG の添加および無添加に関わらず PIとが考えられる．そこで，培養黄体細胞に P４および P染色による死細胞率に有意な変化は認められなかった

４合成阻害剤であるアミノグルテタマイド（AMG）を

（P＞０．
０５）
（図６）
．これに対して，Per2の過剰発現が添加して，P４合成阻害が Per2の振動的発現に及ぼす影発生している時期（AMG 添加後７２時間）で は，AMG

32

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

顆粒膜細胞および黄体細胞におけるペースメーカー添加によって死細胞率が有意に増加した（P＜０．
０５）
．

引用文献

同様の結果は AO/EB 染色によっても確認された．また，アポトーシス関連遺伝子の発現を RT―PCR によって解析したところ，アポトーシス促進遺伝子 Bax および Caspase―3の発現は変化しないが，Per2の過剰発現の前にすでにアポトーシス抑制遺伝子である Bcl ―2の発現が低下することが認められた（図７）．すなわち，アポトーシスのシグナルが入力された後，細胞ではペースメーカーは本来の振動を示さなくなり，Per2の過剰発現にシフトすることを強く示唆している．しかも，P４が黄体細胞の連続的な Per2の振動的発現の制御に重要な役割を担っていることが考えられる．
肝臓における Wee１や TGFβなど多くの細胞増殖関連遺伝子がペースメーカーの制御下にあること［２４］，
ま た Wee１や VEGF は E―Box を 介 し て Per2や Cry のペースメーカーの制御を受けていること［２５］など，細胞周期や細胞分化とペースメーカーの関連性が報告されている．さらに，Per2の過剰発現と肺がん・乳がんのアポトーシスの誘導［２６］，Per2の発現抑制による乳がん成長の促進［２７］など，時計遺伝子とアポトーシスの関係についても報告がある．これらの報告を考え合わせると，卵巣の黄体細胞におけるアポトーシスもペースメーカーと深くリンクしていることが示唆される．

おわりに本研究では，卵胞を構成する顆粒膜細胞や排卵後の黄体細胞にみられる増殖・分化に伴って，ペースメーカーの振動が変化することを紹介した．排卵する前の増殖期にある顆粒膜細胞ではペースメーカーは停止しているが，排卵後黄体細胞へと分化することによりペースメーカーが発振し始めることが明らかとなった．ペースメーカーの停止から発振へと切り替えるスイッチとなるのがLH であるなら，P４が黄体細胞のペースメーカーを維持するのに重要な役割を担っている可能性がある．このように，生殖組織における細胞増殖・分化およびアポトーシスはペースメーカーと密接にリンクしていることは明らかとなったが，これらの関わりの詳細な分子メカニズムを解明していくことが今後必要である．
謝辞
本稿は２００８年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究をまとめたものである．執筆の機会を与えてくださいま
した日本生殖内分泌学会理事長 峯岸 敬教授，第１３回日本生殖内分泌学会学術集会会長 寺川直樹教授に御礼申し上げます．

１．Repper SM, Weaver DR（２００２）Coordination of circadiantiming in mammals. Nature ４１８，９３５９- ４１．
２．Shearman LP, Sriram S, Weaver DR, Maywood ES,Chaves I, Zheng B, Kume K, Lee CC, Horst GT, Hastings MH, Reppert SM（２０００）Interacting molecular loops
in the mammalian circadian clock. Science ２８８，１０１３１- ０１９．
３．Ueda HR, Hayashi S, Chen W, Sano M, Machida M,
Shigeyoshi Y, Iino M, Hashimoto S （２００５） System-level
identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nature ３７，１８７１-９２．
４．Tsuchiya Y, Minami I, Kadotani H, Nishida E（２００５）Resetting of peripheral circadian clock by prostaglandin E２.
EMBO Rep ６，２５６２- ６１．
５．Hinoi E, Ueshima T, Hojo H, Iemata M, Takarada T,Yoneda Y （２００６） Up-regulation of per mRNA expression
by parathyroid hormone through a protein kinase A-CREBdependent mechanism in chondrocytes. J Biol Chem ２８１，２３６
３２２- ３６４２．
６．Nakahata Y, Akashi M, Trcka D, Yasuda A, Takumi T（２００６）The in vitro real-time oscillation monitoring system
identifies potential entrainment factors for circadian clocks.
BMC Mol Biol ７，５．
７．Gery S, Gombart AF, Yi WS, Koeffler C, Hofmann WK,Koeffler HP （２００５） Transcription profiling of C/EBP targets identifies Per２ as a gene implicated in myeloid leukemia. Blood １０６，２８２７２- ８３６．
８．Chappell PE, White RS, Mellon PL（２００３）Circadian gene
expression regulates pulsatile gonadotropin-releasing hormone （GnRH） secretory patterns in the hypothalamic
GnRH-secreting GT１-７ cell line. J Neurosci ２３，１１２０２１１２１３．
９．Low-Zeddies SS, Takahashi JS（２００１）Chimera analysis ofthe Clock mutation in mice shows that complex cellular
integration determines circadian behavior. Cell １０５，２５４- ２．
１０．Fahrenkrug J, Georg B, Hannibal J, Hindersson P, Gras S（２００６）Diurnal rhythmicity of the clock genes Per１ andPer２ in the rat ovary. Endocrinology １４７，３７６９３- ７７６．
１１．Karman BN, Tischkau SA （２００６） Circadian clock gene
expression in the ovary : Effects of luteinizing hormone.
Biol Reprod ７５，６２４６-３
２．
１２．Beaver LM, Rush BL, Gvakharia BO, Giebultowicz JM（２００３） Noncircadian regulation and function of clock
genes period and timeless in oogenesis of Drosophilamelanogaster. J Biol Rhythms １８，４６３４-７
２．
１３．Balsalobre A, Brown SA, Marcacci L, Tronche F, Kellendonk C, Reichardt HM, Schutz G, Schibler U（２０００a）Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science ２８９，２３４４２-３４７．
１４．Balsalobre A, Damiola F, Schibler U （１９９８） A serum
shock induces circadian gene expression in mammaliantissue culture cell. Cell ９３，９２９９-３
７．
１５．Yagita K, Okamura H（２０００） Forskolin induces circadiangene expression of rper１, rper２ and dbp in mammalianrat-１ fibroblasts. FEBS Lett ４
６５，７９８- ２．
１
６．Richards JS （１９９４） Hormonal control of gene expression
in the ovary. Endocr Rev １５，７２５７-５
１．

研究フロンティア

33

吉田薫他

１７．Alvarez JD, Chen D, Storer E, Sehgal A （２００３） Noncyclic and developmental stage-specific expression of circadian clock proteins during murine spermatogenesis. BiolReprod ６９，８１９- １．
１８．Alvarez JD, Sehgal A（２００５）The thymus is similar to thetestis in its pattern of circadian clock gene expression. JBiol Rhythms ２０，１１１１-２
１．
１９．He P-J, Hirata M, Yamauchi N, Hashimoto S, Hattori M-A（２００７a）Gonadotropic regulation of circadian clockwork inrat granulosa cells. Mol Cell Biochem ３０２，１１１１-１
８．
２０．He PJ, Hirata M, Yamauchi N, Hashimoto S, Hattori MA（２００７b）The disruption of circadian clockwork in differentiating cells from rat reproductive tissues as identified byin vitro real-time monitoring system. J Endocrinol １９３，４１３４- ２０．
２１．Pretzmann CP, Fahrenkrug J, Georg B（２００８）Differentiation of PC１２ cells results in enhanced VIP expression andprolonged rhythmic expression of clock genes. J Mol
Neurosci ３６，１３２１- ４０．
２２．Rueda BR, Hendry IR, Hendry IW, Stormshak F, Slayden
OD, Davis JS （２０００） Decreased progesterone levels andprogesterone receptor antagonists promote apoptotic cell
death in bovine luteal cells. Biol Reprod ６２，２６９２-７６．

34日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.14 2009

２３．Liszewska E, Rekawiecki R, Kotwica J （２００５） Effect ofprogesterone on the expression of bax and bcl-２ and on
caspase activity in bovine luteal cells. Prostaglandins Other
Lipid Mediat ７８，６７８- １．
２
４．Miller BH, McDearmon EL, Panda S, Hayes KR, Zhang J,Andrews JL, Antoch MP, Walker JR, Esser KA, Hogenesch JB, Takahashi JS （２００７） Circadian and CLOCKcontrolled regulation of the mouse transcriptome and cellproliferation. Proc Natl Acad Sci USA １０４，３３４２３- ３４７．
２５．Koyanagi S, Kuramoto Y, Nakagawa H, Aramaki H, OhdoS, Soeda S, Shimeno H （２００３） A molecular mechanism
regulating circadian expression of vascular endothelial
growth factor in tumor cells. Cancer Res ６３，７２７７７-２８３．
２６．Hua H, Wang Y, Wan C, Liu Y, Zhu B, Yang C, Wang
X, Wang Z, Cornelissen-Guillaume G, Halberg, F （２００６）
Circadian gene mPer２ overexpression induces cancer cellapoptosis. Cancer Sci ９７，５８９５-９
６．
２７．Yang X, Wood PA, Oh EY, Du-Quiton J, Ansell CM,Hrushesky WJ（２００８）Down regulation of circadian clock
gene Period ２ accelerates breast cancer growth by altering its daily growth rhythm. Breast Cancer Res Treat（WEB 公開）