学術奨励賞受賞論文

ヒト子宮内膜間質細胞脱落膜化におけるヒストンアセチル化の役割に関する研究
丸山哲夫

慶應義塾大学医学部産婦人科学教室

このたび私は，平成14年度12月５日に大阪・千里ライフサ

れる繰り返し構造が螺旋状につながったクロマチンと呼イエンスセンターで開催された第７回日本生殖内分泌学会にばれる高次構造をとっており，ヌクレオソームコアは，おきまして，日本生殖内分泌学会奨励賞をいただきました（受

H2A, H2B, H3, H4それぞれ２分子ずつなるヒストンオ

賞 演 題「 子 宮 内 膜 間 質 細 胞 の insulin-like growth factor

クタマーに，146塩基対の DNA が約1.7回転巻き付いた

binding protein-1プロモーター領域におけるアセチル化ヒス構造をとっている．コアヒストンのＮ末端のヒストンテトンの検討」）．対象となった研究は私ひとりの力で成し得たールがアセチル化・メチル化・リン酸化などの修飾を受ことではなく，諸先生方ならびに良き同僚からのご指導ご協けることにより転写活性が制御される．転写反応を開始力の賜物であり，この場をお借りして皆様に厚く御礼申し上するためには，クロマチン構造の局所的な変化が必要とげます．

なるが，その分子メカニズムのひとつとして，HAT 複

本稿では，受賞研究を含めた当該テーマに関する一連の私合体が DNA 結合性転写活性化因子によって目的遺伝子たちの研究を，抜粋して紹介させていただきます．なお詳細のプロモーター領域上にリクルートされ，ヌクレオソーにつきましては，受賞後に発表した以下の論文を参考にしてムヒストンをアセチル化するといわれている．アセチルいただければ幸いです．

化は，HAT の基質特異性に依存し，アセチル化される

Sakai N, Maruyama T, Sakurai R, Masuda H, YamamotoY, Shimizu A, Kishi I, Asada H, Yamagoe S, Yoshimura Y.

残基の違いによりさまざまな生体の機能発現を規定していると考えられている．

Involvement of histone acetylation in ovarian steroid-

一方，ヒト子宮内膜間質細胞においてエストロゲンのinduced decidualization of human endometrial stromal cells.

プライミング後プロゲステロンの作用によって引き起こ

J Biol Chem 2003; 278: 16675-16682.

される脱落膜化現象は，妊娠の成立（着床）・維持にとってきわめて重要である．また子宮内膜の卵巣ステロイ緒

言

ド依存的な増殖・分化（脱落膜化）・剥脱というサイクルの反復は，内膜特異的・周期的転写活性・遺伝子発現

近年，転写活性・遺伝子発現調節において，DNA のを反映していると考えられ，こうした子宮内膜の機能発高次構造に加えてその基本構造単位であるヌクレオソー

現に，クロマチン修飾を介したエピジェネテックなメカムおよびクロマチンの修飾が重要であることが明らかにニズムの関与が強く示唆されるが，現在までに子宮内膜なってきた．1990年代になってヒストンアセチル化酵素の増殖や分化におけるクロマチン修飾に関する研究は，(histone acetyltransferase: HAT) ならびにヒストン脱ほとんどなされていない．われわれは，子宮内膜分化にアセチル化酵素（histone deacetylase: HDAC）が種々おけるクロマチン修飾，特にヒストンアセチル化の分子単離され，蛋白翻訳後修飾として核構造蛋白コアヒストメカニズムの解明が，今後の生殖医療や癌治療への応用ン（H2A, H2B, H3, H4）のアセチル化・脱アセチル化の基礎的研究として重要であると考え，本研究に着手しによる転写調節の分子メカニズムが急速に解明されつつた．

ある．
真核生物の染色体 DNA 構造はヌクレオソームと呼ば連絡先：丸山哲夫，慶應義塾大学医学部産婦人科学教室，〒160-8582 東京都新宿区信濃町35
TEL: 03-3353-1211
FAX: 03-3226-1667
E-mail: tetsuo@sc.itc.keio.ac.jp

目的以下の３点に着目して，卵巣ステロイド依存性の子宮内膜脱落膜化の制御機構をヒストンアセチル化の側面から明らかにすることを目的とした．
１．ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の脱落膜化に対す

日本生殖内分泌学会雑誌（2003）８：45-4845

丸山 哲夫図１

TSA は子宮内膜間質細胞の卵巣ステロイド依存性脱落膜化を促進する．

る効果
２．脱落膜化に伴ってアセチル化されるヒストンとアセチル化リジン残基部位の同定
３．脱落膜化特異的マーカーのプロモーター領域におけるヒストンアセチル化状態の検討

方法

婦人科領域の良性疾患により摘出された子宮あるいは内膜生検から子宮内膜を採取し，細切・酵素処理・濾過操作により腺細胞，間質細胞に分離・純化した．生体試料の採取は，慶応義塾大学医学部倫理委員会の承認のもと，患者より informed consent を得て行った．
１）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤 trichostatin Ａ(TSA) のヒト子宮内膜間質細胞の脱落膜化への効果の検討
卵巣ステロイドホルモン（17β-estradiol ＋ progesterone：E2＋ P4），TSA（10〜500ng/ml）あるいは両者で48時間処理した内膜間質細胞より RNA を抽出し，脱落膜化マーカーである insulin-like growth factor binding
protein-1（IGFBP-1） と prolactin（PRL）
，その他に

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日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 82003

図２

TSA は 相 乗 的 か つ 用 量 依 存 性 に 卵 巣 ス テ ロ イ ド 依 存 性
IGFBP-1発現を増強する．

ヒト子宮内膜間質細胞脱落膜化におけるヒストンアセチル化の役割に関する研究

図３

間質細胞のコアヒストンは性ステロイドおよび TSA 処理によりアセチル化を受ける．

matrix metalloproteinase-2（MMP-2），内部 標 準と してβ-actin の mRNA の発現を RT-PCR にて解析した．
さらに IGFBP-1mRNA に関しては，Northern Blotting
解析をすると同時に，IGFBP-1の DNA 断片を用いた
competitive RT-PCR により定量化した．腺細胞についても同様に，E2＋ P4, TSA，あるいは両者で処理したの
ち RNA を抽出し，IGFBP-1遺伝子発現について RTPCR を施行した．
２）脱落膜化に伴ってアセチル化されるヒストンとアセチル化リジン残基部位の同定
E2＋ P4，TSA あるいは両者で８時間処理した間質細胞 お よ び HeLa 細 胞 よ り ヒ ス ト ン を 抽 出 し，Acid/Urea/Triton（AUT）ゲルを用いて各コアヒストンを泳

図４

TSA はプロゲステロン作用を通じて卵巣ステロイド依存性ヒストン H4アセチル化を促進する．

動・分離した後，クマシーブリリアントブルー染色を行い，それぞれのアセチル化ヒストンの検出を試みた．加えて，特異的ヒストンアセチル化抗体を用いた Western
blotting を行い，アセチル化部位の同定を行った．

３）脱落膜化特異的マーカー（IGFBP-1）のプロモー
ター領域におけるヒストンアセチル化状態の検討
アセチル化ヒストン H4に対する抗体を用いたクロマ
チン免疫沈降法 (ChIP assay; Chromatin Immunopre-学術奨励賞受賞論文

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cipitation Assay) により，IGFBP-1プロモーター領域抽出したヒストンでは，ヒストンアセチル化は認めなのどの部分のヒストンがアセチル化されているかについかった（レーン１）．TSA100ng/ml にて８時間処理て検討を行った．具体的には，間質細胞を分離・純化しした HeLa 細胞より抽出したヒストンではアセチル化た後，E2＋ P4, TSA あるいは両者の存在下で１時間培レベルの上昇を認めた（レーン２）．内膜間質細胞に養し，ChIP assay に供した．すなわち，ホルマリンにおいては，TSA500ng/ml 単独および卵巣ステロイドより培養細胞を固定し，DNA とクロマチンをクロスリとの同時添加により，H4のアセチル化レベルの上昇ンキングし，sonication 後にその複合体を抗アセチル化が認められた．さらに，Western blot により，どのヒストン H4により免疫沈降した．続いて，免疫沈降物リジン残基がアセチル化されているかについての検討を65℃４時間で処理することにより遊離した DNA に対を行った ( 図３Ｂ・Ｃ )．その結果，ヒストン H3おし，IGFBP-1プロモーター上のプロゲステロン応答類

よび H4の８番目のリジン残基が卵巣ステロイドによ似配列（PRE）が存在する領域（領域Ⅱ）と，それよりりアセチル化され，TSA の同時添加によりそのアセも遠位の領域（領域Ⅰ）をターゲットにして PCR によチル化は増強された．

る増幅を試みた．
３．図４Ａは，PRE を含むヒト IGFBP-1遺伝子のプロ結果・考察

モーター領域をシェーマ化したものである．ChIP アッセイの結果を図４Ｂに示す．領域Ⅱを標的にした場

１．RT-PCR 解析では，IGFBP-1 mRNA は卵巣ステロ合， 卵 巣 ス テ ロ イ ド 無 処 理 群（ レ ー ン13） お よ び

イド添加により発現が誘導され，TSA との同時添加

TSA 単独添加群（レーン14）では増幅産物は得られに よ り そ の 増 強 を 認 め た（ 図 １ Ａ ）． ま た，

なかったが，E2＋ P4 処理群では増幅産物を認め（レTSA500ng/ml の比較的高濃度では単独においてもーン15），その量は TSA 同時添加により相乗的に増IGFBP-1 mRNA の発現を認めた（図１Ａ）．これに加した（レーン16）．一方，領域Ⅰを標的にした場合は，対して，β-actin mRNA の発現量に変化はなかった

いずれの処置においても明らかな PCR 産物は得られ（図１Ａ）．Northern blotting においても同様な結果なかった（レーン５〜８）．
卵巣ステロイド処置により，が得られた（図１Ｂ）．他の脱落膜化マーカーである

間質細胞 IGFBP-1プロモーターのプロゲステロン応

PRL mRNA でも，TSA との同時添加により卵巣ス

答領域 PRE のヒストン H4がアセチル化され，これはテロイドによる発現の増加を認めたが（図１Ｃ），TSA により増強されることが示された．

MMP-2で は 発 現 量 に 変 化 は 認 め な か っ た（ 図 １以上より，TSA は，ヒストンアセチル化によるプロＤ）．一方，TSA 単独，E2＋ P4，および同時投与のゲステロン作用の増強を通じて，内膜間質細胞の分化をいずれにおいても形態学的変化を認めた（図１Ｅ）．

促進することが示され，内膜分化にヒストンアセチル化

Competitive RT-PCR によりその定量性を検討したとが深く関与していることが明らかとなった．

こ ろ， 卵 巣 ス テ ロ イ ド 依 存 性 の IGFBP-1な ら び に本研究が，子宮内膜由来疾患（子宮内膜症，子宮内膜PRL の発現誘導は，TSA 添加により濃度依存性かつ癌，子宮内膜機能不全による着床障害など）に対するヒ相乗的に増強された（図２Ａ - Ｄ）
．腺細胞ではいずストンアセチル化を標的にした治療薬の開発の手がかり

れの処理によっても形態変化および IGFBP-1の発現となることを願って止まない．

は認めなかった．
謝辞
２．子宮内膜間質細胞において TSA 添加によりどのヒストンがアセチル化されるかについて AUT gel 解析を行い検討した（図３Ａ）．未処理の HeLa 細胞より48

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 82003

本研究への多大な貢献に対し，酒井のぞみ氏に深甚なる謝意を表します．