技術概要

メタボロミクス/リピドミクス

哺乳類細胞サンプル用の代謝物 + 脂質のデュアル自動化サンプル前処理ワークフロー
包括的でエンドツーエンドの LC/MS メタボロミクス
およびリピドミクスワークフローで用いる
自動細胞サンプル前処理

著者

Genevieve Van de Bittner,
Mark Sartain, Dustin Chang,Alex Apffel, Kristin Bernick,and Manuel Gomez
Agilent Technologies, Inc.
Santa Clara, CA

概要

この技術概要では、哺乳類細胞サンプルから極性代謝物と脂質をデュアル抽出するための、包括的で自動化されたサンプル前処理法について説明します。このサンプル前処理ワークフローでは、哺乳類細胞の簡単な溶解および代謝クエンチングを室温で行う革新的なメソッドを用います。細胞溶解液の各サンプルからの極性代謝物と脂質の分画および順次抽出は、Agilent Captiva EMR-Lipid 固相抽出プレー

トで行うことができます。代謝物と脂質の分画手順は、Agilent Bravo Metabolomics Sample Prep

Platform 上で、追加の代謝物 + 脂質細胞のデュアルサンプル前処理 Vworks プロトコルを使用して自動化されます。代謝物と脂質の回収率とワークフローの再現性を、Agilent 6545 LC/Q-TOF、Agilent

6550 iFunnel Q-TOF LC/MS、および Agilent MassHunter ソフトウェアを使用して評価します。

はじめに

LC/MS オミクス分析によって測定される細胞グの改善、ろ過の再現性の向上が達成できま

超純水（H2O）は、LC-Pak Polisher と 0.22な性能は、13C 標識極性代謝物と 2H 標識脂

リッ ジ（MilliporeSigma）を 備 え た Milli-Q

した。サンプル 前処理ワークフローの 全体的生物学をより完全に理解するために、各サン質を使用したスパイクイン回収実験によって評ことには大きな利点があります。これは、細胞の代謝物 + 脂質のデュアル抽出のための堅牢

プルから複数のクラスの細胞成分を分離する

代謝の変化 が 1 次代謝と脂質代謝の両方 に影響を与える可能性があるため、極性代謝物と脂質 に 特 に 当てはまります。細胞 サンプルから代謝物と脂質を分画するメソッドは存在しますが、より習得しやすく、感度が高く精密で正確なワークフローが必要とされています。こ価しました。まとめると、哺乳類細胞サンプル

で部分的に自動化されたサンプル前処理ワー
クフローを実証します。

実験方法
材料

により、サンプル処理の一貫性が向上し、ユーCollection から入手しました。Roswell Park

時間が短縮されます。

自動化 を実現するための最初 のステップとして、懸濁液または接着哺乳類細胞で使用できる新しい室温細胞溶解およびクエンチングメ

ソッドを開発・評価しました。さらに、液液抽出法よりも自動化 が 容易 な固相抽出（SPE）

を使用して、極性代謝物と脂質のデュアル分

画 に取り組 みました。この目的 のために、極性代謝物またはプラズマサンプルからの脂質抽出 に 以前 から使用 されていた EMR-Lipid
吸着剤 1-3 を、細胞溶解液用の新しい代謝物 +脂質 のデュアル 抽出プロトコルに適合させました。Agilent Captiva EMR-Lipid SPE メソッ

ドは、個々のサンプルから極性代謝物と脂質の両方を抽出できるため、下流の LC/MS メ

タボロミクスおよびリピドミクスデータの堅牢なマルチオミクス相関分析 が容易になる点 が重要です。

Captiva EMR-Lipid SPE を極性代謝物 および脂質抽出に使用することで、Agilent Bravo

Automated Liquid Handling Platform を用いて、デュアル 分画ワークフローを簡単 に自動化することが 可能 になりました。自動化 は

比較的簡単でしたが、最適化により、分析成

分のより多くの定量的回収率、液体ハンドリン

病 由 来 細 胞 株 は American Type Culture

Memorial Institute （RPMI）の 完 全 培 地 で培養し、0.5 ～ 1 × 106 細胞/ミリリットルの密度で採取されました。

CellTiter Glo ATP アッセイキット（Promega）

を使用して、細胞溶解物で ATP 測定を行いました。

定 性 フラックス 解 析 では、13C5-L- グルタミン（MilliporeSigma）を使用しました。回収率の検討では、13C 標識極性代謝物と 2H 標
識脂質 を使用しました。 C 標識極性代謝物
13と は、MSK-QC1、CLM-1579-N-0.1MG、CLM-4442-0.1MG、 お よ び ISO1 U-13C 標

識 酵 母 抽 出 物（Cambridge Isotopes）、
13

サ ン プ ル 前 処 理 溶 媒 お よ び 化 学 薬 品：

LC/MS グレ ー ド の メ タノー ル（MeOH）、
LC/MS グレードのトリフルオロエタノール（TFE）、≧99.5 % GC グレードのジクロロメタン（DCM）、高純度（>99.5 %）のエタノー

すべ て の 検 討 で、K562 慢 性 骨 髄 性 白 血ザーエラーが減少し、新しいユーザーの習得

Integral システムで生成しました。

ル （EtOH）、LC グレードまたは純度 99.9 %れらの 特性 を改善するよく知られたアプロー

チの 1 つは、自動化によるものです。自動化µm ユースポイントメンブレンフィルタカート

C6-D- グルコ ースおよび 13C5-L- グルタミン（MilliporeSigma）です。2H 標識脂質 は、

UltimateSPLASH ONE ミ ッ ク ス（Avanti
Polar Lipids）か ら な ります。一 般 的 な 中

心炭素代謝物 の 非標識極性代謝物混合物（MilliporeSigma）を 使 用 して、 回 収 率 ののブタノール （BuOH）、LC/MS グレードのア

セトニトリル （ACN）、LC/MS グレードのイソ

プロパノール （IPA）、および LC/MS グレードのギ酸を使用しました。

LC/MS 移動相溶媒 および 試薬：LC/MS グ

レードの MeOH、LC/MS グレードの ACN、

LC/MS グレードの IPA、LC/MS グレードの酢

酸アンモニウム、純度 99.99 % のフッ化アンモ

ニウム、LC/MS グレードの酢酸、および GC
グレードのトリブチルアミンを使用しました 。

Agilent Bravo リキッドハンドラーと消耗品– Agilent Bravo Metabolomics Sample
Prep Platform（G5589AA）– 追加の代謝物 + 脂質細胞のデュアル
サンプル前処理 Vworks プロトコル（詳細は、Automation の営業担当者にお問い合わせください）– Agilent Captiva EMR-Lipid SPE プレート
（部品番号 5190-1001）– Agilent 250 µL ディスポーザブルチップ（部品番号 19477-002）

検討で分析された極性代謝物のサブセットの– Agilent PlateLoc Thermal Microplate

含水率の影響を判断しました。

– Agilent PlateLoc マイクロプレート

ピーク同定を行い、代謝物の回収率に対するSealer（G5585BA）

穴開け可能薄型クリアシール（部品番号 17318-001）– Agilent 接着シール、一時的プレート
シーリング用（部品番号 410186）– VWR プレートの冷蔵保管用粘着ホイル（PlateLoc を使用しない場合。部品番号60941-112）– Agilent Captiva コレクションプレート（部品番号 A696001000）2

– Agilent リザーバ、単一キャビティ（部品プレートリーダー– Thermo Fisher Scientific プレート

ウェアバージョン 3.02.1 を搭載した Agilent

番号 204484-100 または 201254-100）+ ガラスコーティング マイクロプレート（Thermo Fisher Scientific 部品番号

60180-P338、部品番号 60180-P309 の代替品）

LC/MS 機器および消耗品– Agilent 1290 Infinity II LC システム
（脂質 LC/MS 用）– Agilent 1290 Infinity II ハイスピード
ポンプ（G7120A）– Agilent 1290 Infinity II マルチサンプ
ラ、サーモスタット付き（G7167B）– Agilent 1290 Infinity II マルチ

カラムサーモスタット（G7116B）、

2- ポジション/10- ポートバルブ付き– Agilent 1290 Infinity II ハイスピード
ポンプ（G7120A）、リファレンス質量

導入用 100:1 スプリッタ（G1607-

60000）付き– Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS、デュアル Agilent Jet Stream 技術イオン

源（脂質 LC/MS 用）搭載

– Agilent 1290 Infinity/II LC システム
（代謝物 LC/MS 用）– Agilent 1290 Infinity バイナリポンプ（G4220A）– Agilent 1290 Infinity II マルチサンプ
ラ、サーモスタット付き（G7167B）– Agilent 1290 Infinity II マルチカラム
サーモスタット（G7116B）– Agilent 1290 Infinity II バイナリ

ポンプ（G4220A）、リファレンス質量

導入用 100:1 スプリッタ（G1607-

60000）付き– Agilent 6545 LC/Q-TOF、デュアル
Agilent Jet Stream 技術イオン源（代謝物 LC/MS 用）搭載

– どちらのシステムにも、インジェクタの後にインラインフィルタハウジング（5067-

6189）と 0.3 µm フィルタ（5023-0271）が設置されています

ATP 検出用の生物発光測定は、Gen 5 ソフト
BioTek Synergy H1 マルチモードリーダーで行いました。

メソッド

室温細胞溶解および代謝クエンチング

持に関連する問題を回避し、細胞溶解およびクエンチングの 自動化 を可能 にします。このメソッドでは、TFE:H2O 1:1 溶液を使用します（図 1）。図 1 に 示すように、RT における細胞溶解と、浮遊細胞株と接着哺乳類細胞株の両方のクエンチングのために手動のメソッドを開発しました。

室温（RT）細胞溶解 およびクエンチングのメソッドを開発しました。この RT メソッドは、

零度付近/氷点下 の 細胞溶解 およびクエンチ

ングソリューションの 手動操作 および温度維哺乳類浮遊細胞サンプル：
細胞溶解およびクエンチプロトコル

哺乳類接着細胞サンプル：
細胞溶解およびクエンチプロトコル

それぞれ約 100 万個の細胞を含む
細胞アリコートを、別々の 1.5 mL
微量遠心チューブに移す。

それぞれ約 100 万個の細胞を含むプレート/ウェルの場合、培養皿を傾け、細胞からメディアを慎重に吸引する。

微量遠心チューブを 4 ℃、250 ×g で 5 分間
遠心分離し、細胞を穏やかに沈殿させる。
メディアを慎重に吸引する。

オプション：1 ～ 3 mL の洗浄バッファー（PBS など）を追加する。
培養皿を傾けて、
プレート/ウェル全体を洗浄バッファでコーティングする。

オプション：1 mL の洗浄バッファ（PBS など）を追加し、チューブを攪拌して細胞を懸濁させる。

オプション：細胞を洗浄する場合は、培養皿を傾け、慎重に洗浄バッファを吸引する。

オプション：細胞を洗浄する場合は、微量遠心チューブを 4 ℃、250 ×g で 5 分間遠心分離して細胞を沈殿させる。
洗浄バッファを慎重に吸引する。

室温の 1:1 トリフルオロエタノール:
水 1 mL を追加する。
培養皿を傾けてすべての細胞を
コーティングする。
培養皿から細胞をこすり落として溶液に入れる。

室温の 1:1 トリフルオロエタノール:
水 100 µL を追加する。
手動で攪拌するか、
ボルテックスミキサーを使用して、細胞を溶液に混ぜる。

サンプルを 1.5 mL 微量遠心チューブに移す。
室温で 10 分間静置する。

室温で 10 分間サンプルを静置する。

サンプルを 250 ×g で 30 秒間穏やかに遠心分離し、すべての液体を微量遠心チューブの底に沈殿させる。

96 ウェルプレートの各ウェルにサンプルを移動する。
自動化されたワークフローにサンプルを載せる
準備が完了。

30 ℃の窒素下でサンプルを乾燥させるか、熱を加えずに真空濃縮器でサンプルを乾燥させる。
室温の 1:1 トリフルオロエタノール:水 100 µL でサンプルを再懸濁させる。
撹拌またはボルテックス
ミキサーで混合して、細胞溶解液を懸濁させる。
96 ウェルプレートの各ウェルにサンプルを移動する。
自動化されたワークフローにサンプルを載せる
準備が完了。

図 1. 手動による室温での細胞溶解と、懸濁液および接着哺乳類細胞の代謝クエンチングのワークフロー。

3

ここで 説 明 する 実 験 では、K562 細 胞 の 調

吸引ろ過ステーションと、サンプル混合用の振す。タンパク質 を効果的 に沈殿させるために

酸 緩 衝 生 理 食 塩 水（PBS、–Ca、–Mg、1

ワークフローと同様に、細胞ワークフローではです。代謝物抽出ステップの 変更 の 一部 は、行いました。オプションの洗浄により、細胞外代謝物を抽出しながら、タンパク質沈殿物をろ製 に 浮遊細胞メソッドを使用し、RT の リン

mL/100 万細胞）によるオプションの 洗浄 を
代謝物や培地に存在する脂質、または細胞かとうデッキが付属しています。前述のプラズマ

Captiva EMR-Lipid プレートを使用して極性

アジレントのアプリケーションノート 5994-

過により除去し、吸着によって脂質を除去しま

ンプルで行 われた 調整と同じものです。具体

質を溶出させ、代謝物 + 脂質のデュアル抽出

フローでは、代謝クエンチングおよびタンパクら排出される脂質に起因するサンプルの汚染す。さらに、細胞ワークフローでは吸着した脂チングまでの時間 が長くなり、細胞内の代謝を行います（図 2）。EMR-Lipid 充填剤からの洗浄では細胞からの代謝物の漏出が起こりまで実施できます。 3が減少します。ただし洗浄を行うと必ずクエン物と脂質のターンオーバーが増加し、一部のす。したがって、洗浄をするかどうか、また洗浄する場合 はどの洗浄を行うかを、ユーザーが決める必要があります。

重要 なのは、懸濁細胞 と接着細胞 の 両方 のワークフローで、100 µL の 1:1 TFE:H2O には、1:1 MeOH:EtOH を使用することが重要

脂質溶出 は、前述 のように 2:1 MeOH:DCM

ワークフローの 代謝物抽出部分 については、

元のメソッド 1 と変更されたこのプロトコルの間で、大部分のステップと基本原則 は 同じで2156EN 2 で説明されている低容量プラズマサ
的には、代謝物 + 脂質細胞のデュアルワーク
質沈殿後 の 10 分間 のインキュベーションを行いますが、これはサンプルの一貫性を向上させる溶液とタンパク質沈殿物との間の代謝物と脂質 を平衡化するのに役立ちます。さらに、極性代謝物抽出の前に、タンパク質が沈殿したサンプルに水を加えてH2O 含有量を 50% とします（結果と考察を参照）。

懸濁された約 100 万個の細胞からの溶解液

が 最終 サンプルとして 得られることです。この最終サンプルをディープウェル 96 ウェルプ

レート（部 品 番 号 A696001000）に 移 しま
す。接着細胞の場合、100 µL という溶解液の量を得るには、濃縮ステップが必要です。細胞

溶解液の 100 µL という最終的な量は、次に説明する代謝物 + 脂質の自動化デュアル抽出

ワークフローの 性能 の 鍵となります。細胞量は 細胞株によって異 なるため、代謝物と脂質の検出を最適化するには、1:1 TFE:H2O 100µL あたりの細胞数の調整 が必要になる場合があります。参考までに、100 万個の K562

細胞は、約 1 ～ 2 µL の充填細胞容積です。

自動化された代謝物 + 脂質のデュアル抽出

前述の 100 および 25 µL のプラズマサンプル

からの極性代謝物抽出の自動ワークフロー 1,2と同様に、哺乳類細胞サンプルの自動化された代謝物 + 脂質のデュアル抽出ワークフロー

では、Agilent Bravo Metabolomics Sample

Prep Platform （部 品 番 号 G5589AA）を 使用します。 1 さらに、哺乳類細胞サンプルの自動化された代謝物 + 脂質のデュアル抽出ワー

クフローを実行するには、追加の VWorks プ
ロトコルが 必要 です。Bravo Metabolomics

Sample Prep Platform には、固相抽出用の

図 2. 細胞溶解液サンプルからの自動化された代謝物 + 脂質のデュアル抽出のワークフロー。

緑色のステップは、追加の代謝物 + 脂質細胞のデュアルサンプル前処理 Vworks プロトコルと Agilent Bravo

Metabolomics Sample Prep Platform を使用して実行できます。*窒素乾燥に関する注意：高流量の窒素を使用し、マニホールドを定期的に下げる（窒素の流れがサンプルの上部に近い距離に維持されるようにする）と、乾燥時間が短縮されます。サンプルが 50 µL 未満に減少する場合に、乾燥したサンプルがプレートウェルから排出されるのを防ぐためには、窒素の流量を低く抑えることが推奨されます。

4

特 に、細胞 サンプルから 抽出 された 代謝物

その他の自動化の最適化としては、脂質溶出

め、自動化されたワークフローにいくつかの

堅牢 な処理 ができるように、チップを 2 回溶

体含有量 が低いことを考えると、これは 特にのすべてのろ過ステップを最適化すること、必と脂質 の 定量的 な 回収 をより厳密 にするたステップを追加しました。細胞 サンプルの 生

重要 であると考 えられます。これらのサンプ

ルには 約 1 ～ 2 µL の 充填細胞容積 が 含 まに使用する低沸点有機溶媒 をドリップのない

媒プライミングすること、細胞溶解液サンプル
要に応じて、ろ過時間を延長し、ろ過圧力を上 げる機能を用いてオプションのろ過後 SPEれていますが、これは元のメソッドで処理されプレート検査を有効にすること、が考えられま

100 倍少 ないサンプル量です。これらの定量

溶解液の代謝物 + 脂質のデュアル抽出を実行

た 100 µL のプラズマサンプルよりも約 50 ～的 な 回収ワークフローの 調整 には、1）細胞溶解液をタンパク質沈殿溶媒に添加するのではなく、1:1 MeOH:EtOH タンパク質沈殿溶

媒 を細胞溶解液 に 追加すること、2）細胞溶

解液 を Captiva EMR-Lipid プレートに 移した後、細胞溶解液プレートから細胞溶解液残留物を洗浄および収集すること、3） Captiva

EMR-Lipid プレートを洗浄して、プレートの滞留量（約 115 µL）をリリースし、EMR-Lipid

吸着剤と相互作用する極性代謝物を洗い流す

こと、4）収集した極性代謝物サンプル全体を乾燥させること、が含まれます。更新したワー

クフローは、追加の代謝物 + 脂質細胞のデュ

アルサンプル前処理 Vworks プロトコルを使用して、Bravo Metabolomics Sample Prep

Platform を用いて自動化されました。図 3Aと 3B は、それぞれ細胞代謝物と脂質抽出に使用する追加プロトコルのユーザーインター

フェースです。

す。これらの改良を組み合わせることで、細胞する非常に堅牢 な自動ワークフローが実現されます。

この 検討 では、乾燥した 極性代謝物分画 を

25 µL の MeOH に手動で溶解し、続いてプレートを 60 秒間超音波処理することによって、サンプルの再溶解を行いました。次に、75µL の H2O を加えてサンプルをさらに溶解し、プレートをさらに 60 秒間超音波洗浄器で超音波処理した後、穏やかに遠心分離して（15～ 30 秒、250 x g）サンプル全体をプレートの 各ウェルの 底部 に 移動させました。乾燥した脂質分画を 200 µL の MeOH:BuOH（1:1、細胞溶解およびクエンチング効率の評価

ATP 測定ATP 測定は、CellTiter Glo アッセイキットの記載に従い、若干の変更を加えて実施しました。具体的には、CellTiter Glo キットを使用

して細胞 から抽出した ATP の 安定性 を評価する前に、細胞サンプルをクエンチングの有無にかかわらず溶解させました。次の 2 つの メ

ソッドを使用しました：1）細胞溶解に室温のPBS とプローブ超音波処理を使用する非クエ

ンチメソッド（メソッド 1）、2）室温で溶解し、1:1 TFE:H2O でクエンチする方法（図 1、メ

ソッド 2）。細胞溶解 およびクエンチング溶液

中の溶媒によるアッセイキットからの光出力の変化を説明するために、各細胞溶解およびク

エンチング溶液 を用 いて個別 の ATP 標準曲

線を作成しました。

定性フラックス分析

定性フラックス分析では、サンプルあたり 100

万個 の K562 細胞 を使用し、ATP 測定 のセクションで説明した 細胞溶解 およびクエンチv:v）で再懸濁しました。プレートを 60 秒間超

ングメソッド（メソッド 1 および 2）を使用し心分離して（15 ～ 30 秒間、250 × g）、サン

メソッドも 2 つ使用しました（メソッド 3 およさせました。

し、0.1 % ギ酸を含む 2:2:1 MeOH:ACN:H2O

音波洗浄器で超音波処理した後、穏やかに遠プル 全体 をプレートの各ウェルの底部 に移動

代 替 法 と し て、Bravo Metabolomics

Sample Prep Platform で提供される再溶解

アプリケーションを使用して、代謝物および脂質サンプルの再溶解を行うことができます。ここで説明したものとは 異 なる種類 のクロマトグラフィー （HILIC、順相など）で代謝物および脂質分画を分析する場合、特に大量のサン

プル （>1 µL）を注入する際 は、他 の 再溶解

溶媒 を考慮することができます。多くの場合、これが必要になります。

ました。追加 の 細胞溶解 およびクエンチングび 4）。メソッド 3 では、–20 ℃で細胞を溶解

でクエンチしました。これに続いて、約 5 分後に 15 % NH4HCO3 （H2O 中 w/v）で酸中和を行いました。4 メソッド 4 はメソッド 3 と同様ですが、室温で実施しました。すべての細胞溶解およびクエンチングメソッドで、500 ppmの 13C5-L- グルタミンを細胞溶解およびクエン

チング溶液に溶解してから、細胞沈殿に溶液を加 えました。 5細胞溶解液 およびクエンチ

ング溶液を添加してから 5 分または 60 分後に、サンプルを 20,000 × g、4 ℃で 5 分間

遠心分離して、沈殿物や細片を除去しました。
上澄みの一部（75 µL）を新しいチューブに移し、真空濃縮器で濃縮し、イオンペア逆相ク
ロマトグラフィー分離による LC/MS 分析用に

再懸濁しました。

5

A

B

図 3. 細胞代謝物抽出（A）および脂質抽出（B）に使用した追加の代謝物 + 脂質細胞のデュアルサンプル前処理 Vworks プロトコルの Agilent Bravo ユーザーインター

フェースとカスタム設定。

6

極性代謝物の回収率に対するサンプル
含水率の影響

Captiva EMR-Lipid プレートからの代謝物回収率に対する含水率の影響を、さまざまな溶
媒組成の下で代謝物標準の混合物を Captiva

EMR-Lipid プレートに 通すことによって評価

処理 ワークフローを使用して 調製しました。

LC/MS メソッドのポストスパイクインを、収集した極性代謝物

成分、特 にリン酸化代謝物 の 最適 なピーク

2.5、5、10、または 20 µL のマスターミックス

および脂質分画 に 追加しました。各 サンプルに加えた 1:1 TFE:H2O の 総量 の 一貫性 を維持するために、さまざまな量の 1:1 TFE:H2O

し まし た。Captiva EMR-Lipid プ レ ート をを再度追加しました。前述のように、プレート

Captiva EMR-Lipid プレートを通さなかった

下で乾燥させました。

通過させた 代謝物 の LC/MS ピーク面積 を、代謝物標準の同じ混合物の LC/MS ピーク面積で割り、回収された代謝物標準の割合を測定しました。

細胞溶解液マトリックスにおける代謝物
および脂質の回収率の推定
サンプル前処理13

C 代謝物と 2H 脂質のマスターミックスをサンプルのスパイクインとして使用するために調製しました。このマスターミックスは、細胞溶
解液を Captiva EMR-Lipid プレートに通す前

または通した後に適用しました。マスターミッ

クスを作成するために、13C 標識酵母抽出物、その他の記載された
2

13C 標識代謝物、およびH 標識脂質 を、1:1 TFE:H2O に溶解した単一の溶液にまとめました。

を穏やかに遠心分離し、再溶解する前に窒素

極性代謝物および脂質データ解析

極性代謝物 の同定 は、1）前述 の偏りのない
選択アプローチ 2 および 2）極性代謝物標準の 混合物 を使用する方法 の 2 つの 方法で実2 種類の容量で注入しました。各成分の回収率を計算するために使用した注入量は、そのTFE:H2O を各サンプルに追加しました。サンAgilent VWorks automation control

ソ

加 の 代 謝 物 + 脂 質 細 胞 のデュアル サンプ

Agilent Bravo Metabolomics Sample
VistaFlux ソフトウェアバージョン 1.0 を 使用して、下流 の 代謝物 への 13C5-L- グルタミンからの 13C 標識 の 取 り込 みを 決定しまし

代謝物標準混合物、13C 標識酵母抽出物、おウェアを使用して、6545 LC/Q-TOF およびされた検量線を使用して決定しました。4 つのました。Agilent MassHunter パーソナル 化

パイクおよびポストスパイクインの 4 つのサン

ソフトウェア（バージョン B.08.00）を使用し胞溶解液で検出されたバックグラウンドシグナ

管理・編集しました。これらのライブラリは、注入量としました。各成分の直線検出範囲は、種類の脂質を含む各脂質クラスの値を平均し100 µL にするために、さまざまな容量の 1:1

注入バルブの直後に設置しました。

成分 の 線形検出範囲内 に 収 まる成分 の 最高

チしました。室温で 10 分間インキュベーショ

ンプルに 添加しました。各 サンプルの 容量 を

2 µL の注入量を使用しました。どちらのメソッ

ドでも、インラインフィルタを追加し、サンプル

Prep Platform を 制 御 し ま し た。Agilentのピークの S/N が 5 を超えていることを確認

ルを差し引いた後、回収率の値を計算しましたは 20 µL のマスターミックスを 各細胞 サは、前述の LC/MS メソッド 8,9 に従い、0.5 ～しました。極性代謝物 および脂質 サンプルを度を維持するために、100 万細胞/80 µL 1:1

イクインサンプルに対しては、2.5、5、10、ま4 µL を使用しました。細胞脂質分画 の 分析

ル 前 処 理 Vworks プ ロトコ ル を 使 用 して、プルをペアとしました。スパイクインなしの細ルプレートのウェルに分注しました。プレスパ

トグラフィー LC/MS メソッドに従い、注入量

目的の化合物のピーク面積を決定し、すべてAgilent MassHunter 定量分析 を使用して、ミックスのスパイクインの 余地 を残しながらンした後、溶解液を混合し、80 µL を 96 ウェ

7970EN 7 のイオンペア逆相（IP-RP）クロマ

フトウェア（バ ー ジョン 13.1.5）お よ び 追

スパイクイン容量のそれぞれについて、プレス

TFE:H2O の 濃度 で 細胞 をまず溶解・ クエン

析 は、Agilent アプリケーションノート 5991-

ア ル ゴ リズ ム を 使 用 して 同 定 し ま し た。

を溶解・ クエンチしました。体積 は、回収し100 万細胞/100 µL 1:1 TFE:H2O の最終濃態 化 しました。 6細 胞 極 性 代 謝 物 分 画 の 分

ソフトウェア

MassHunter 定性分析 の Find-by-Formula

よび Ultimate SPLASH One 混合物 で 作成

た 細胞数 に合 わせて調整しました。マスター

形状 を維持するために、通常 の 方法 で 不動施しました。2H 標識脂質 ピークは、Agilent

6,000 万個 の K562 細胞 を回収した 後、図1 で説明したメソッドを使用して、室温で細胞LC 機器と LC カラムは、金属 に敏感 な分析

た。脂質データについては、それぞれ 3 ～ 9て、回収率とパーセント RSD を求めました。

た。Agilent MassHunter Acquisition ソフト

6550 iFunnel Q-TOF LC/MS 機器 を操作し合物データベースおよびライブラリマネージャて、注釈付きの代謝物および脂質ライブラリを

Agilent MassHunter Quantitative Analysis

ソフトウェアでピーク抽出 およびピーク面積の 決 定 に 使 用 されて います。MassHunter

Qualitative Analysis ソフト ウェ ア を 使 用

し、Agilent アプリケー ションノート 5994-

2156EN. 2 に 記載 されている代謝物選択戦

略 を利用して、非標識酵母 サンプルに 存在する 非 標 識 代 謝 物 の 同 定 を 支 援 しました。

プルは、上記の哺乳類細胞サンプル用の自動化された代謝物 + 脂質のデュアルサンプル前

7

MassHunter Quantitative Analysis ソフト

物 に変換されます。これは、これら下流の代合物に加えて、13C および 2H で標識された代で監視できます。

ウェアを使用して、標準代謝物混合物中の化謝物と回収率検討で検出された脂質のピーク
面積を抽出し、定量化しました。

結果と考察

謝物 への 13C 標識の取り込みを検出すること
図 4A は、K562 細胞から抽出された ATP の安定性を、非クエンチ条件と室温でクエンチン

グした条件（それぞれメソッド 1 および 2）で比較したものです。非クエンチサンプルは、細胞の溶解の 5 分後にはるかに低い ATP レベ

室温細胞溶解およびクエンチング
メソッドの代謝クエンチング効率ルを示すだけでなく、室温で 4 時間にわたっンチングの検証は、2 つの分析で行いました。

室温細胞溶解およびクエンチングメソッドを使

室温での細胞溶解と 1:1 TFE:H2O によるクエ

1）溶解 およびクエンチング後 に 細胞 から放出される ATP の安定性のモニタリング、および 2）適用した 13C5-L- グルタミンからの 13C

標識の下流の TCA サイクル代謝物 への取り
込 みの測定です。これらの測定値 は、クエンチング溶液が、主要な代謝酵素を急速に不活性化し不活性化を維持する能力を評価するもので、細胞代謝の停止の指標として用いることができます。ATP アッセイでは、代謝クエン

チングが継続しない場合、ATP はすぐに ADP
および他の ATP 誘導体 に変 わり、時間の経

過とともにサンプルの ATP 含有量が減少します。さらに、代謝クエンチングが急速でない場

合、 C5-L- グルタミンが酵素的に下流の代謝13て ATP が下流の代謝物に継続的にターンオー

バーされていることも示しています。対照的に、用して抽出された ATP は、時間が経過しても安定性を保っており、代謝が室温でクエンチされたままであることを示しています。さらに、

PBS で 10 倍に希釈してTFE 含有量が 50 から 5 %（v/v）に 下 がった 室温クエンチサンプ

ルは、時間が経過しても ATP レベルが一定に保たれています（図 4B）。これは、代謝 が最初に抑制された後、TFE 含有量を減らしても酵素活性が回復しないことを示しています。

図 5 は、4 つの細胞溶解およびクエンチング

メソッド、メソッド 1 ～ 4 において、細胞 の

酵素 を急速 に不活性化することによって細胞代謝 を停止する能力 を比較しています。本検討では、13C5-L- グルタミンを、メソッド 1 ～

4 で使用した細胞溶解およびクエンチング溶液とともに細胞沈殿物 に添加しました。得られた 細 胞 溶 解 液 において VistaFlux ソフト

ウェア 10 で 検出 された 13C5-L- グルタミン酸

は、クエンチされていない活性のある細胞酵素によって 13C5-L- グルタミン酸に変換された
13

C5-L- グルタミンを表しています。メソッド 1

を使用して作成された非クエンチサンプルは、

このメソッドが 細胞酵素 をあまり不活性化しないため、最も高い濃度の 13C5-L- グルタミン酸を含んでいます。一方で、室温での細胞溶

解およびクエンチングメソッド（図 1 のメソッ

ド 2）および低温クエンチングメソッド（メソッド 3）を使用した場合に検出される 13C5-L- グ

ルタミン酸の量 は 低く、両方のメソッドにより細胞酵素 が急速に不活性化したことを示しています。重要なことは、購入した 13C5-L- グル

タミンに微量の 13C5-L- グルタミン酸が検出されたことです。メソッド 2 および 3 を使用した

ときに検出された 13C5-L- グルタミン酸の濃度がゼロではないのは、これが原因であると説明できます。

図 4.（A）室温（RT）の細胞溶解およびクエンチング溶液で抽出されたATP（メソッド 2）は、細胞溶解の 5 分後のクエンチされていないサンプル （メソッド 1）の ATP レベルよりも有意に高くなります。RT 細胞溶解およびクエンチング溶液で抽出された ATP（メソッド 2）は室温で最大 4 時間安定ですが、プローブ超音波処理によって PBS に抽出された ATP（メソッド 1）は代謝が継続されます。
（B）RT 細胞溶解およびクエンチング溶液で抽出された ATP（メソッド 2）は、PBS への 10 倍希釈後、室温で安定したままです。
10 倍に希釈したサンプルの場合、測定した ATP 濃度を 10 倍しました。メソッド 1：室温の PBS と細胞溶解のためのプローブ超音波処理を使用した非クエンチメソッド。
メソッド 2：室温で溶解し、1:1 TFE:H2O でクエンチするメソッド（図 1）。

8

メソッド 4 では、メソッド 3 を使用してクエンチしたサンプル中の 13C5-L- グルタミン酸のレベルを、溶媒溶液を -20 ℃ではなく室温で加えて評価しました。室温メソッド 2 と比較して、

室温メソッド 4 を使用すると、わずかに高いレ
ベルの 13C5-L- グルタミン酸が検出されました（アジレントメソッド、図 1）。これは、アジレントの室温メソッドが、別の室温溶媒溶液よりも室温クエンチングが速いことを示唆しています。13C5-L- グルタミン酸に加えて、13C4-L- コ

ハク酸、13C4-L- リンゴ酸、および 13C4-L- アス
パラギン酸のレベルをメソッド 1 ～ 4 について評価しました。これらの 13C 標識代謝物 が検出されたのは、メソッド 1 を使用して調製された 非 クエンチサンプルのみでした（データは示していません）。

極性代謝物の回収率を改善するためのサンプル含水率の調整

Captiva EMR-Lipid プレートを通過させる前のサンプル中の水の割合は、代謝物標準から収集されたデータに 基 づくと、元 のワークフ

ロー 1 で使用された 18 % から 50 % に増加しました（図 6）。糖、アミノ酸、一部の有機酸などのより極性の高い化合物のいくつかは、

18 % または 50 % の H2O の存在下で同様の回収率 を示します。ただし、リン酸化 および両親媒性代謝物は、含水率が 50 % に増加す

ると、回収率が大幅に増加する傾向があります。これらの検討は、細胞サンプルで見いだされた代謝物レベルを近似した代謝物標準で実施しました。各代謝物標準の量は、100 万個の K562 細胞から抽出された量の約 10 分の1 から 10 倍 の範囲としました。100 万個 のK562 細胞から抽出された量の 5 倍以内の量で、代謝物標準の約半分を使用しました。代謝物標準混合物は、元のワークフローで使用された 100 µL プラズマサンプルの近似としては優れたものではありません。 これらのサン
1

プルでは、抽出された代謝物の量がはるかに多く、18 % H2O 溶液で発生する代謝物の損

失は、総代謝物の量のうちわずかな割合しか表していない可能性が高くなります。

図 5. メソッド 1 ～ 4 を使用した細胞溶解およびクエンチング後の細胞溶解液から検出された 13C5-L- グルタミン酸の量。13C5-L- グルタミン酸は、13C5-L- グルタミンの非クエンチ酵素変換から生じます。これは、各細胞溶解およびクエンチング溶液とともに細胞に適用されました。メソッド 1 を使用して作成された非クエンチサンプルは、
13

C5-L- グルタミン酸のレベルが最も高く、一方、Agilent 室温メソッド（メソッド 2、図 1）を使用して溶解およびクエンチされたサンプルは、13C5-L- グルタミン酸のレベルが最も低くなっています。メソッド 1 ：室温のリン酸緩衝生理食塩水と細胞溶解のためのプローブ超音波処理を使用する非クエンチメソッド。メソッド 2 ：室温で溶解し、1:1 TFE:H2O でクエンチするメソッド（図 1）。メソッド 3 ： -20 ℃で細胞を溶解し、0.1 % ギ酸を含む 2:2:1

MeOH:ACN:H2O でクエンチし、約 5 分後に 15 % NH4HCO3（H2O 中 w/v）で酸を中和するメソッド。メソッド 4：

メソッド 3 を室温で実施するメソッド。注：購入した 13C5-L- グルタミン標準液から微量の 13C5-L- グルタミン酸が検出されました。

哺乳類細胞サンプルの自動化された代謝物 + 脂質のデュアルサンプル
前処理ワークフローの回収率と再現性

哺乳類細胞サンプルから極性代謝物および脂質抽出物を調製するための自動化された代謝物 + 脂質のデュアルサンプル前処理ワークフ

極性代謝物の回収率は、有機酸、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、コエンザイム A 誘導体など、主要な中心炭素代謝化合物グループについて評価しました（図 7A および 7B）。13C 標識代

謝物のスパイクインは、4 種類のプレスパイク

およびポストスパイクイン容量で実施し、各サ

ローの全体的な性能を評価するために、スパ

ンプルに存在する 13C 標識代謝物の量を、ネ率の検討では、K562 細胞溶解液マトリックス

モニターしました。回収率 を 4 つの別々のス

チングメソッドを使用して前処理された同位体

パイクイン容量すべてで一貫性 が 示されましイクイン回収率 の 検討 を実施しました。回収に添加され、室温での細胞溶解およびクエン

標識された極性代謝物および脂質標準を採用しました（図 1）。自動化された 代謝物 + 脂

質 のデュアルサンプル 前処理ワークフローを使用して、極性代謝物と脂質を順次分離しました（図 2）。

ガティブイオンモード IP-RP LC/MS によってパイクイン容量にわたって評価し、これらのスた。各代謝物のさまざまな絶対量の存在下での 抽出 の 安定性 が 示されました。52 種類 の極性代謝物のうち、92 % の化合物 が 90 ～110 % の平均回収率を示し、96 % の化合物

が 80 ～ 120 % の平均回収率を示しました。

サンプルの含水率 が 50 % に増加したことが要因のひとつで極性代謝物の回収率が極めて優 れた値になったことに加えて、回収率のばらつきも並外 れたものでした。すべての 化合

9図 6. 18 % および 50 % H2O 存在下での Agilent Captiva EMR-Lipid プレートからの代謝物標準の回収率の比較。

物およびスパイクインレベルの平均相対標準

ク面積 は、他 のポストスパイクイン容量と比す。脂質の回収率を最優先する検討では、2:1% の化合物で平均 %RSD < 10 % （すべてのタは 解析 から除外しました。極性代謝物と比トを使用して、3 回目の脂質溶出ステップを実化合物で平均 %RSD ≦ 17 % でした。

脂質は一般的に存在量が多く、イオン化効率

偏差（%RSD）は 5.31 % でした。さらに、96

スパイクイン容量 の平均）となり、100 % の

脂質 の 回収率 は、 セラミド、 ジアシルグリセ

ロール（DG）、
トリアシルグリセロール（TG）、

スフィンゴミエリン（SM）、ホスファチジルグリ

セロール （PG）、
ホスファチジルコリン（PC）、

ホスファチジルエタノールアミン（PE）、およびホスファチジルイノシトール （PI）などの幅

広い脂質クラスについて評価しました。図 8A

および 8B を参照ください。2H 標識脂質スパ

イクインは、4 つのプレスパイクおよびポスト

スパイクイン容量で再度実施し、各サンプルに存在する重水素化脂質の量をポジティブモー

ドおよびネガティブモード LC/MS でモニターしました。20 µL のポストスパイクインのピー

10較して非線形性 を示したため、これらのデー

較して、脂質の回収率はやや低下しましたが、

MeOH:DCM の 900 µL の 3 回目のアリコー施することができます（図 2）。この 3 回目の脂質溶出は、Lyso-PC、PC、および SM 脂質が高いため、これは許容範囲内です。さらに、クラスのプレスパイクイン 2H 標識脂質の 18に高く、脂質濃度が増加するにつれて脂質溶の合計回収率 が得られます（データは 示して

脂質回収率は 10 µL のスパイクインでわずか

出 が 改善されたことを示しています。重要 なことは、脂質回収率のばらつきが小さく抑えられており、平均 %RSD は、ポジティブモードとネガティブモード、すべての脂質、すべてのス

パイクイン容量 を合 わせたもので 6.74 % でした。ポジティブモードとネガティブモードの両方の分析で、%RSD をすべてのスパイクイ

ン容量に対して脂質クラスごとに平均すると、%RSD は 10 % 未満 であり、各脂質 クラスの %RSD 性能が良好であることを示していま～ 25 % をさらに溶出させ、約 70 ～ 100 %いません）。

図 7. 主要な化合物クラスにわたる 52 種類の極性代謝物と 4 種類の 13C 標識代謝物スパイクイン容量（A および B）の回収率。13C-NAD + と 13C-N- アセチル -L- グルタミン酸の 2 つの化合物は、20 µL のスパイクイン容量でのみ確実に検出されたため、回収率の計算が可能だったのは、このスパイクイン容量のみでした。

11

図 8. 正（A）および負（B）イオンモードの 3 つの 2H 標識脂質スパイクイン容量にわたり脂質クラスによって平均化された 53 種類の脂質の回収率。示されているデータは、特定の脂質クラスの検量線の直線範囲内に収まる最大サンプル注入量に対するものです。900 µL の 2:1

MeOH:DCM による 3 回目の脂質溶出は、Lyso-PC、PC、および SM 脂質クラスのプレスパイクイン 2H 標識脂質の追加の 18 ～ 25 % を溶出させ、約 70 ～ 100 % の合計回収率となりました。

結論

自動化された 代謝物 + 脂質 のデュアル 分画動化された代謝物 + 脂質のデュアル分画に基動化から期待される結果である、代謝物と脂室温での細胞溶解とクエンチング、および自づく、新しい細胞サンプル前処理メソッドを開発しました。LC/MS サンプル分析およびデー法により、主要 な代謝化合物クラスのほぼ定
量的な回収が可能になり、ワークフローの自質の回収についても優 れた再現性が得られます。以上をまとめると、このサンプル前処理メ

タ解析を対象とするアジレントのソリューショ

ソッドは、哺乳類細胞サンプルから相互相関

ローよりも優 れたエンドツーエンドの LC/MS

タを高い再現性で日常的に取得するための基ンと組み合わせることにより、従来のワークフ
メタボロミクスおよびリピドミクスワークフ
ローが生成されます。室温での細胞溶解およびクエンチングメソッドにより、温度管理が容易になり、細胞溶解およびクエンチ溶液の手動または自動処理が簡素化されます。さらに、

12のあるメタボロミクスおよびリピドミクスデー

礎となります。

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カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。
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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2022
Printed in Japan, August 2, 2022
5994-5065JAJP

定性フラックス分析 Agilent Technologies

5991-6756JAJP, 2016.