プレスリリース

令和 4 年 3 月 9 日
各報道機関 御中国立大学法人山梨大学

下水から新型コロナウイルスのステルスオミクロン株を検出～亜種レベルでの変異株の流行監視への下水疫学調査の有効性を実証～
ポイント
・ 2022 年 2 月 9 日に山梨県内の下水処理場で採取した下水から新型コロナウイルスのステルスオミクロン株（BA.2 系統）を検出。
・ 1 月下旬～2 月の下水から検出された新型コロナウイルスはすべてオミクロン株と判明。
・ 山梨県内の感染者からの最初の検出報告よりも約 1 週間早く下水から BA.2 系統を検出。
・ COVID-19 下水疫学調査が亜種レベルでの変異株の感染流行監視に活用されることが期待。
山梨大学大学院総合研究部附属国際流域環境研究センターの原本英司教授と山梨大学総合分
析実験センターの瀬川高弘講師の研究グループは，2022 年 2 月に採取した下水から新型コロナウイルスのステルスオミクロン株（BA.2 系統）を検出することに成功しました（図 1）。
約半数以上の感染者の糞便中に新型コロナウイルスが排出されることから，下水中の新型コロナウイルスを測定することで地域や施設における新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の流行状況を捉える「下水疫学調査」1）が現在注目を集めています。原本教授は，国内外の研究者と共に下水疫学調査の有用性を世界に先駆けて提唱し 2），下水中の新型コロナウイルスの検出調査 3）や下水からの検出法の開発 4–6)等に取り組んでいます。2022 年 1 月には，逆転写定量PCR を用いてオミクロン株に特徴的な変異を下水から検出することに成功しています 7）。
今回，2022 年 1 月～2 月に山梨県内の下水処理場で採取した下水 12 試料に対して次世代シーケンス解析を実施した結果，5 試料から新型コロナウイルスの遺伝子配列を取得することに成功し，すべてオミクロン株と判定されました。2 月 9 日に採取した下水から得られた遺伝子配列（約 45 万本）は，BA.1 系統が 59.4%，BA.2 系統が 40.6%を占めていました。山梨県内でCOVID-19 感染者から BA.2 系統の感染が初めて報告されたのは 2 月 15 日であり，感染報告よりも少なくとも約 1 週間早く下水中に BA.2 系統が存在していたことが明らかとなりました。
本研究により，亜種レベルでの詳細な感染流行状況の把握に対しても下水疫学調査が有効となることが示され，今後，下水疫学調査の社会実装に向けた動きの加速が期待されます。

下水中の新型コロナウイルスの遺伝子配列数の割合（%）

BA.1系統（オミクロン株）

BA.2系統（ステルスオミクロン株）

10080

40.6

60
100

100

100

1002/212/24

4059.4
2001/272/72/9
採水日

図 1 次世代シーケンス解析により下水から検出された新型コロナウイルスの遺伝子配列の分類【COVID-19 の下水疫学調査に関するこれまでの研究の展開】
原本教授らが 2020 年 5 月に発表したプレスリリース 2）を契機に，国内でも新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に対する「下水疫学調査」1）が，地域や施設における COVID-19 の感染流行状況を迅速かつ効率的に把握し，感染拡大防止に貢献し得る科学技術として注目を集めています。2020 年 6月に原本教授らが山梨県内の下水処理場で採取した下水から新型コロナウイルス遺伝子を検出することに国内で初めて成功したのを皮切りに 3），国内各地から続々と調査事例が報告されてきています。
下水疫学調査を社会実装していく上で，諸外国と比較して感染者の割合が低いことに起因して下水中の新型コロナウイルス濃度も低いため，検出が難しいことが課題となっていました。そこで，原本教授は，タカラバイオ（株）との共同研究を通じ，下水中の新型コロナウイルス遺伝子を高感度で検出可能な逆転写定量 PCR キット「SARS-CoV-2 Detection RT-qPCR Kit for Wastewater」（型番 RC390A）
8)を開発し，（公社）日本水環境学会 COVID-19 タスクフォースが公表している手法 9)では検出できな

い下水の多くから新型コロナウイルス遺伝子を検出することに成功しています 5)。
さらに，変異株が特徴的に有する変異箇所を検出対象とする逆転写定量 PCR を用いることで，第 4波時に流行していたアルファ株（N501Y 変異）が第 5 波時にデルタ株（L452R，T478K 変異）に置き換わる様子 5)や，第 6 波に入りオミクロン株（G339D，E484A 変異）が出現する様子を捉えることに成功しており 7)，変異株の流行監視にも下水疫学調査が活用できる可能性を示してきています。

【次世代シーケンス解析による下水中の新型コロナウイルス遺伝子の検出】
逆転写定量 PCR を用いることで迅速かつ高感度で下水中の新型コロナウイルスの変異を検出することができますが，一般に下水中には複数の感染者から排出される多種類の変異株が含まれているため，個々の変異株の同定まではできないという欠点があります。患者検体からの変異株の同定には全ゲノム解析が用いられていますが，ウイルス濃度が低い下水には適用が困難であり，また，測定に時間を要するという問題もありました。そこで，本研究では，新型コロナウイルスの一部の遺伝子領域を対象とした次世代シーケンス解析を用いることで，下水中に存在する変異株を効率的かつ網羅的に検出することを試みました。
2022 年 1 月 11 日～2 月 24 日に山梨県甲府市内の下水処理場において採取した下水 12 試料に対し，ポリエチレングリコール沈殿法による濃縮と遺伝子抽出，逆転写反応に供した後，新型コロナウイル
スの S 遺伝子（スパイクタンパク質をコードする遺伝子）領域の一部（206 塩基対）を増幅する定性PCR を行いました。その結果，12 試料中 9 試料が PCR で陽性となりました（表 1）。これら 9 試料をさらに次世代シーケンス解析用の PCR に供したところ，5 試料が陽性と判定されたため，iSeq 100 シーケンサーシステム（イルミナ社）を用いた次世代シーケンス解析を実施しました。
PCR で使用したプライマー配列を除いた約 170 塩基対を対象とした解析の結果，5 試料から合計2,320,349 本の遺伝子配列（1 試料あたり 286,460～733,768 本）を取得することに成功しました（表1）。これらの遺伝子配列は，50 種類の遺伝子型に分けることができ，50 種類すべてがオミクロン株に分類され，デルタ株等の他の変異株は含まれていないことが分かりました。

表 1 次世代シーケンス解析による下水中の新型コロナウイルス遺伝子の検出結果
新型コロナウイルス
定性PCR

次世代シーケンス解析
用PCR

1/11
1/19
1/25
1/27
2/1
2/3
2/7＋＋－＋＋＋＋－－2/9

採水日

遺伝子配列数遺伝子型数計

BA.1系統BA.2系統計

BA.1系統BA.2系統＋－－＋286,460

286,4600330298,013

190＋

450,0450182,942（40.6%）

19＋

298,013
267,103（59.4%）

20

128

2/14
2/17
2/21
2/24

－－＋＋＋＋733,768
552,063

18
1900

9/12

5/900182,942（7.9%）

1819計

733,768
552,063
2,137,407
2,320,349（92.1%）

50428＋：検出，－：非検出

ステルスオミクロン株（BA.2系統）にのみ見られる変異

S477N T478K

下遺水伝由子来型

E484A

Q493R G496S Q498R N501Y Y505H

BA.1系統BA.2系統

図 2 下水から検出されたオミクロン株の遺伝子配列のアライメント結果（抜粋）オミクロン株は多数の変異箇所を有することが知られており，今回解析対象とした遺伝子領域にはそのうち 7 ヶ所（S477N，T478K，E484A，Q493R，Q498R，N501Y，Y505H 変異）が含まれています。また，最近になり，従来のオミクロン株（BA.1 系統）よりも感染力が高いとされるステルスオミクロン株（BA.2 系統）による感染拡大が懸念されていますが，BA.2 系統のみが有する G496S 変異もこの領域に含まれています。すなわち，本研究で解析対象とした遺伝子領域は，オミクロン株を同定するのみならず，BA.1 系統と BA.2 系統を区別することを可能とします（図 2）。
本研究で得られた遺伝子配列のうち，92.1%（2,137,407 本）が BA.1 系統，7.9%（182,942 本）がBA.2 系統に分類されました（表 1）。遺伝子型別では，42 種類が BA.1 系統，8 種類が BA.2 系統となり，下水中には非常に多様なオミクロン株が存在していることが分かりました。
採水日別では，BA.2 系統は 2 月 9 日に採取した下水からのみ検出され，遺伝子配列数の 40.6%を占めていました。山梨県内において，COVID-19 感染者から BA.2 系統の感染が初めて報告されたのは 2月 15 日であり，感染報告の 6 日前に採取した下水中にすでに BA.2 系統のオミクロン株が存在していたことが明らかとなりました。また，8 種類の遺伝子型が検出されたという結果は，下水処理場の処理区域内に BA.2 系統のオミクロン株への感染者が複数存在していたことを強く示唆するものであると言えます。

【今後の展望】
次世代シーケンス解析は，亜種レベル，さらには遺伝子型レベルでの変異株を検出可能とするため，変異株の流行状況を詳細に把握する上で有用な手法となり得ます。しかし，逆転写定量 PCR と比べると検出感度が低く，解析にも時間を要するため，下水疫学調査に本格的に組み入れていくためには検出法の改良等による検出感度や解析速度の向上が望まれます。
今回の研究では，BA.2 系統は 2 月 9 日に採取した下水からのみ検出されており，2 月 21 日と 24 日に採取した下水からは BA.1 系統しか検出されませんでした。この理由として，BA.2 系統による感染流行は短期間で収束し，BA.1.1 系統等の BA.1 系統による感染が山梨県内では主流となっていたことが考えられます。今回解析した遺伝子領域では BA.1.1 系統と他の BA.1 系統を区別することはできな
いため，別の遺伝子領域を対象とした次世代シーケンス解析を試みることで，さらに詳細な変異株の流行状況に関する知見が得られるものと期待されます。
今後，逆転写定量 PCR を用いたスクリーニングと次世代シーケンス解析を併用して活用することにより，下水疫学調査の社会実装に向けた動きがさらに加速することが期待されます。また，インフルエ
ンザウイルスやノロウイルス等の疫学上重要な病原ウイルスへの下水疫学調査の拡張も望まれます。

研究実施者
・

山梨大学大学院総合研究部附属国際流域環境研究センター

・山梨大学総合分析実験センター

・

山梨大学大学院総合研究部附属国際流域環境研究センター

・山梨大学大学院医工農学総合教育部工学専攻

講師

教授

原本 英司

瀬川 高弘
研究員

博士課程 3 年

Bikash Malla

Niva Sthapit

研究支援
・

国立研究開発法人科学技術振興機構（JST）

新型コロナウイルス感染症（COVID-19）関連国際緊急共同研究・調査支援プログラム（J-RAPID） 「下水疫学調査による新型コロナウイルスの感染流行状況のリアルタイム監視」（課題番号：JPMJJR2001）
・JST

e-ASIA 共同研究プログラム「COVID-19 および疾病 X の被害最小化に向けた下水情報に基づく早期警報システムの構築」（課題番号：JPMJSC20E2）
・

厚生労働行政推進調査事業費補助金（新興・再興感染症及び予防接種政策推進研究事業） 「新型コロナウイルス感染症等の感染症サーベイランス体制の抜本的拡充に向けた人材育成と感染症疫学的手法の開発研究」（課題番号：JPMH20HA2007）

1） 「下水疫学」は学問分野である「Wastewater-based epidemiology」の訳語であり，原本教授が北島正章准教授（北海道大学）と共に考案。
「調査」を付けることで，調査する行為そのものを意味する。
2） 北海道大学・山梨大学共同プレスリリース「下水中の新型コロナウイルスに関する世界初の総説論文を
発 表 ～ COVID-19 の 流 行 状 況 を 把 握 す る 上 で の 下 水 疫 学 調 査 の 有 用 性 を 提 唱 ～ 」
https://www.yamanashi.ac.jp/wp-content/uploads/2020/05/20200514pr.pdf（2020 年 5 月 14 日）
3） 山梨大学・北海道大学共同プレスリリース「国内初となる下水試料からの新型コロナウイルス RNA の検 出 に 成 功 ～ COVID-19 流 行 状 況 監 視 へ の 下 水 疫 学 調 査 の 活 用 に 期 待 ～ 」
https://www.yamanashi.ac.jp/wp-content/uploads/2020/06/20200626pr.pdf（2020 年 6 月 26 日）
4） 北海道大学・山梨大学共同プレスリリース「下水中のコロナウイルス濃縮回収率を手法ごとに評価～

COVID-19 の 下 水 疫 学 調 査 を 実 施 す る 上 で の 標 準 的 手 法 確 立 に 期 待 ～ 」
https://www.yamanashi.ac.jp/wp-content/uploads/2020/07/20200710pr.pdf（2020 年 7 月 10 日）
5） 山梨大学プレスリリース「下水中の新型コロナウイルス遺伝子の高感度検出法を開発～変異株の流行把
握 を は じ め COVID-19 下 水 疫 学 調 査 の 社 会 実 装 に 貢 献 ～ 」 https://www.yamanashi.ac.jp/wpcontent/uploads/2021/09/202109015pr.pdf（2021 年 9 月 15 日）
6） JNC（株）
・山梨大学共同プレスリリース「下水中の新型コロナウイルスの磁気分離技術を開発～下水疫学調査に大きく貢献～」https://www.yamanashi.ac.jp/wp-content/uploads/2021/12/20211216press.pdf（2021 年 12 月 16 日）
7） 山梨大学プレスリリース「下水からオミクロン変異を有する新型コロナウイルス遺伝子を検出～変異株の 流 行 監 視 へ の 下 水 疫 学 調 査 の 有 効 性 を 実 証 ～ 」 https://www.yamanashi.ac.jp/wpcontent/uploads/2022/01/20220114pr.pdf（2022 年 1 月 14 日）
8） タ カ ラ バ イ オ （ 株 ） ウ ェ ブ サ イ ト 「 SARS-CoV-2 Detection RT-qPCR Kit for Wastewater 」
https://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100009513
9） （公社）日本水環境学会 COVID-19 タスクフォース「下水中の新型コロナウイルス遺伝子検出マニュアル」https://www.jswe.or.jp/aboutus/pdf/SARS-CoV-2_RNA_Detection_Manual_for_Wastewater.pdf（2021 年 3 月 30 日）

研究についての問い合わせ先
山梨大学大学院総合研究部

教授 原本 英司（はらもと えいじ）

TEL：055-220-8725
E-mail：eharamoto@yamanashi.ac.jp
URL：http://www.ccn.yamanashi.ac.jp/~eharamoto/
広報についての問い合わせ先
山梨大学総務部総務課広報企画室
TEL：055-220-8005，8006
FAX：055-220-8799
E-mail：koho@yamanashi.ac.jp