食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発

研究課題名

食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発

フリガナ

カヅキ ヤスヒロ

代表者名

香月 康宏

所属機関 （機関名） 国立大学法人鳥取大学 染色体工学研究センター（役職名） 准教授
氏 名 （フリガナ）

所属機関 ・ 役職名

役割分担
ヒト型免疫獲得マウスの作出
山梨大学と抑制性エピトープの探索 ・神沼 修 （カミヌマ オサム） 総合分析実験センター ・T 細胞依存性免疫、 アレル
准教授
共同研究者
ギー研究を実施
抑制性エピトープの探索と
東京都医学総合研究所
作用検証 ・ アレルギー疾患
佐伯 真弓 （サエキ マユミ） 花粉症プロジェクト ・
モデルと米を用いたアレル
主席研究員
ギー治療研究を実施
1. 久郷裕之 , 宇野愛海 , 大平崇人 , 平塚正治 , 香月康宏 , 押村光雄 （2017 年
12 月 6 日 -9 日、 神戸ポートアイランド、 神戸）、 染色体医工学技術を用いた疾患の原因究明、 治療法の開発 （口頭、 ワークショップ / ポスター）、 第 40 回日本助成金による発本分子生物学会年会
表論文， 学会発表
2. 香月康宏、 （2017 年 10 月 24 日、 オークラアクトシティーホテル浜松、 浜松市）
最先端染色体工学技術の創薬研究への応用 （招待講演）、 薬物動態談話会第40 年回
研究結果要約
食物アレルギーは、 国民の食生活向上や食品産業の発展に大きな障害となっている。 食材中の各種タンパク／ペプチドと T 細胞受容体 （TCR） および主要組織適合複合体 （MHC ／ HLA） との結合が過度に強固または薄弱な場合は、 細胞死や不応答、 制御性 T 細胞 （Treg） への分化が誘導される。 そこで本研究は、 ヒト TCR ／ HLA を介して Treg 誘導能を示す食材中のエピトープ探索を目指した。 まず、ヒト TCR 遺伝子座導入マウスを作製するため、 ヒト TCRα 鎖および β 鎖両遺伝子座を導入した人工染色体の作製に取り組む一方、 マウス TCR-/- マウス MHCII-/- ヒト HLA ＋ヒト CD4 ＋マウスの交配を進めた。 また、 マウスをモデルケースとして卵白アルブミン蛋白 （OVA） 中の Treg 誘導性エピトープ探索を行ったところ、 幾つかのペプチド領域が比較的高い Treg 誘導能を示した。 さらに、 同定した Treg 誘導性エピトープの作用を検証するための、 新たな食物アレルギーモデルの樹立に取り組んだ。 OVA 反応性 Th2細胞を正常マウスに移入し、 卵白含有食を連日経口投与することにより、 IgE/IgG 産生を伴う消化管アレルギー症状が発症することを見いだした。 最終的に、 ヒト TCR 遺伝子座導入マウスを利用して抑制性エピトープを新たに見いだし、 食物アレルギー抑制薬または機能性食品として開発を進めることにより、 食物アレルギーの根絶を目指したい。

24

食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発

研究目的

独自に開発した米の難消化性タンパク顆粒を用いた効率的消化管デリバリー法を利用して

近年、 食文化の大きな発展と並行して、 乳2,3)、児期から青年期の幅広い若年層で食物アレル抑制性エピトープの抗アレルギー効果をヒト免疫ギーの罹患率が急激に上昇してきた。 食物アレシステムで実証すると共に、 その実用化に向けルギーは、 皮膚、 呼吸器、 粘膜や全身的な症た開発研究の端緒を得ることを目的とした。

状を引き起こすことから、 国民の食生活向上や食品産業の発展に対する大きな障害となってい研究計画及び研究手法る。 その危険性が指摘された多くの食材に対し

１． ヒト TCR 遺伝子座／ HLA-Tg マウスの樹立て、 アレルギー誘発エピトープに関する研究は（香月）

これまで盛んに行われてきた。 一方、 食材中にヒト TCR α鎖 （Chr.14） およびβ鎖 （Chr.7）

含まれる各種タンパク／ペプチドの抗原性は、両遺伝子座全体を新規人工染色体 (NAC) に導T 細胞受容体 （TCR） および主要組織適合複入した後、 ES 細胞に移入してキメラマウスを作合体 （MHC ／ HLA） との結合強度で規定さ製 す る。 そ れ を ヒ ト HLA-Tg マ ウ ス、 マ ウ スれることが知られており、 結合が過度に強固ま

MHCII-KO マウス、 マウス TCR-KO マウスおよたは薄弱な場合は、 逆に細胞死や不応答、 制び ヒ ト CD4-Tg マ ウ ス 等 と 交 配 し て、 マ ウ ス

御性 T 細胞 （Treg） への分化等が誘導され、TCR-/- マ ウ ス MHCII-/- ヒ ト HLA ＋ ヒ ト1)

アレルギー反応は抑制されると見込まれる 。 しCD4 ＋ヒト TCR 遺伝子座＋マウスを作出する。

かしながらこれまで、 そのような抑制性エピトー

本マウスの体内では、 マウス由来の免疫系は完プに関する詳細な解析は行われていない。

全に遮断され、 さまざまなアレルゲンに対するヒTCR/MHC に対する抗原結合性およびそれにト TCR ／ HLA を介した認識 ・ 反応系が稼動す起因する T 細胞反応の微妙な相違を解析するることが期待される。 ヒト TCR 遺伝子座の人工際、 遺伝的に均一なマウスを用いるのが一般的

染色体導入には時間を要しているため、 交配にであるが、 それではヒトの免疫応答を完全にはよるマウス TCR-/- マウス MHCII-/- ヒト HLA ＋反映できない。 そのため食物アレルギーに対す

ヒト CD4 ＋マウスの作製を先行した。

る実用化研究を行う上では、 ヒト TCR/HLA を介した実験系が不可欠といえる。 しかしながら、

２． 食材成分中の抑制性エピトープの探索 （香ヒト臨床検体を用いた解析では、 個体差や様々

月 ・ 神沼 ・ 佐伯）な環境要因に影響を受ける上、 成果物の臨床作出したマウスを卵、 乳、 落花生をはじめとす的有効性を検証することも難しい。 そこで本研るアレルギー誘発食材の抽出物で免疫後、 リン

究は、 申請者が開発中のヒト TCR 遺伝子座導パ節細胞を調整する。 各食材抽出物の各種ク入マウスを用いることにより、 ヒト TCR ／ HLA をロマトグラフィー分画成分で刺激培養後、 分化介して Treg 誘導能を示す各種食材中のエピトした FoxP3+CD25+Treg の比率を比較することープを詳細に探索することを目指した。 さらに、により、 Treg 誘導能を示す粗精製画分を得る。

25

食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発

さらに数種類のクロマトグラフィーによって絞り込

IgG 産生を伴う消化管アレルギーの発症を検討んだ後、 質量分析を行って食材成分中の Tregす る。 実 際 に は、 ヒ ト TCR 遺 伝 子 座 ／誘導性候補物質を同定する。 次に、 候補物質

HLA-Tg マウスの樹立に時間を要したため、 マのリコンビナント蛋白からその部分蛋白、 ペプチウス抗原特異的 Th2 細胞を移入したマウスを用ドを用いた絞り込み実験を行うことによって、 最いてモデルケース実験を行った。

終的に Treg 誘導性エピトープをペプチドレベルで 決 定 す る。 な お、 ヒ ト TCR 遺 伝 子 座 ／HLA-Tg マウスの樹立に時間を要したため、 本実験については、 アレルギー誘発食材である鶏卵中の卵白アルブミン （OVA） を対象とし、 マウスを用いたモデルケース実験を実施した。

４． Treg 誘導性エピトープのアレルギー抑制効果 （香月 ・ 神沼 ・ 佐伯）ペプチドは通常、 消化管内で消化分解を受けるため経口投与での有効性の確認は困難である。 そこで、 決定した Treg 誘導性エピトープを、独自に開発した効率的消化管デリバリーシステ
３． 新たな食物アレルギーモデルの開発（神沼・ムである米タンパク顆粒に封入して Tg マウスに佐伯）経口投与した後、 各種食材成分で免疫する。

作出したマウスを用いて、 抑制性エピトープのその後、 各食材を経口投与することによって誘効果を評価できる食物アレルギーモデルを開発導される消化管アレルギー症状を解析することする。 ２と同様にアレルギー誘発食材抽出物でにより、 Treg 誘導性エピトープのアレルギー抑免疫した後、 リンパ節細胞を調整し、 対応抗原制効果を検討する。 実際には、 Treg エピトーで刺激培養して抗原特異的ヒト TCR を発現するプを米タンパク顆粒に封入するまでは進めなかマウス T 細胞を得る。 それを移入した正常マウった。

スに抗原を連日経口投与することにより、 IgE/26

食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発

結果と考察

析を再現する計画である。

１． ヒト TCR 遺伝子座／ HLA-Tg マウスの樹立（香月）

２． 食材成分中の抑制性エピトープの探索 （香ヒト TCR 遺伝子座／ HLA-Tg マウスを樹立す

月 ・ 神沼 ・ 佐伯）

るたま、 ヒト TCR α鎖 （Chr.14） および β 鎖マウスを用いたモデルケース実験として、 OVA（Chr.7） 両遺伝子座全体を導入した新規人工で免疫した BALB/c マウスよりリンパ節細胞を調染色体 （NAC） の作製に着手し、 Chr.14 の改整し、 OVA の全長をカバーするリコンビナント

変および Chr.7 の改変に成功した。 今後、 ヒト部 分 ペ プ チ ド で 刺 激 培 養 後、 分 化 し た

TCR α鎖 （Chr.14） およびβ鎖 （Chr.7） のFoxP3+CD25+Treg の比率をフローサイトメトリー

全長が搭載されたヒト TCR αβ—NAC を構築すで比較した。 その結果、 OVA による刺激培養る予定である。

によって約 6％の Treg 誘導能がみられたが、また、 その NAC を導入したキメラマウスと交配各 OVA 部分ペプチドで刺激培養した場合、 平するため、 その他のマウスの導入、 交配を先行

均 6.9％の CD4 陽性 T 細胞が Treg に分化誘して実施した。 すなわち、 ヒト HLA-Tg マウス、導された。 また、 いくつかの部分ペプチドでは、

マウス MHCII-KO マウス、 マウス TCR αならびOVA 刺 激 よ り も 髙 い Treg 誘 導 能 が み ら れ、にβ -KO マウスおよびヒト CD4-Tg マウスを交P23 で誘導された Treg は 17.1％にのぼることが配し、 全遺伝子をヘテロに持つマウスを作出で明らかとなった （次頁上図）。 各種アレルギーきた。 最終的に、 ヒト TCR 遺伝子座の導入キメ

誘 発 食 品 成 分 に 対 し、 ヒ ト TCR 遺 伝 子 座 ／ラマウスと交配後にその F1 マウスを得、 全てのHLA-Tg マウスを用いて同様の解析を行うことに目的遺伝子がホモに導入されたマウスを作出

より、 ヒト TCR ／ HLA を介して Treg 誘導能をし、 今回モデルケースとして実施した以下の解示す各種食材中のエピトープを同定できる可能27

食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発+

Foxp3 C D 25+

T re g25% in C D 4+

201510509P38P2722PP56P2422PP23P21P20P29P28P17P16PP1154P13P12P11P10P19P18P7P6P5P4P3P2P1PPOVA0せたマウスでは、 通常食 （CE） を摂取させた性が示唆された。

マウスに比し、 血中総 IgE ならびに抗原特異的
３． 新たな食物アレルギーモデルの開発（神沼・IgE, IgG1 および IgG2 の有意な上昇がみられた佐伯）（下図）。

使用予定であった TCR 遺伝子座／ HLA-Tg

このマウスでは、 明らかな体重減少や下痢等マウスの作出に時間を要したため、 まずマウスをの臨床所見はみられなかったが、 病理所見上用い、 抑制性エピトープの効果を評価できる食では、 Crypt の伸長や杯細胞の粘膜上皮への物アレルギーモデルの開発を行った。 OVA 中浸潤等、 軽い炎症所見がみられた。の主要エピトープである OVA323-339 に反応す以上の結果から、 抗原特異的 T 細胞による抗る TCR を発現するトランスジェニックマウスであ原認識が起点となり、 IgE/IgG 産生を伴う消化る DO11.10 を、 抗原ペプチド、 IL-4 および抗管アレルギー症状が誘発されうることが明らかとIL-12 抗体、 および非動化した抗 原提示細胞の存在下で刺激培養することにより抗原特異的b350

Th2 細胞を得た。 正常マウスに Th2 細胞を移OVA-speciﬁc IgE

Total IgE

40060000

与することにより、 IgE/IgG 産生を伴う消化管ア40000

250200aa150(unit)(pg/ml)

入後、 卵白含有食 （EW） を２週間連日経口投a,b30000
20000

10010000

500

レルギーの発症を検討した （下図）。

b50000300a0

PBS/EW Th2/EW Th2/CE-2

PBS/EW Th2/EW Th2/CE-2

その結果、 Th2 細胞を移入して EW を摂取さ

OVA-speciﬁc IgG2a

OVA-speciﬁc IgG1
Th2細胞分化OVAstimulation

8250000

15 days

移入-10

卵白含有食自由摂取 14 days

20000020000

15000015000

実験プロトコール解析

02×107 cells/head

28a100000
50000

i.v. injectionof Th2 cells

25000

ba
PBS/EW Th2/EW Th2/CE-2(unit)

3(unit)0a

10000
50000aa

PBS/EW Th2/EW Th2/CE-2

食物由来抑制性ペプチドの探索に基づく食物アレルギー予防食品の開発なった。 今後、 ヒト TCR 遺伝子座／ HLA-Tgしてゆくと共に、 免疫寛容誘導機構の解析にもマウスが樹立出来次第、 それを用いた病態モ役立ててゆきたい。 それらの発展的な研究展開

デルを確立し、 Treg 誘導性エピトープにおけるにより、 通常給食を摂取できない就学児童が１アレルギー抑制効果の検討に利用してゆく計画割を超えるなど、 深刻な社会問題となった食物である。

アレルギーの根絶も可能にし、 国民の食生活向上や食品産業の発展にも大きく役立つと考えて今後の研究活動についている。

ヒト免疫システムを用い、 エピトープ探索から機能検証、 実用化に向けた研究を行うことから、

参考文献

その最終成果物は、 そのまま食物アレルギーを

1） Stone JD, Chervin AS, Kranz DM. T-cell

予防または治療する医薬品または機能性食品とreceptor binding affinities and kinetics:して開発できる可能性が高い。 それを実現する

impact on T-cell activity and specificity.

上で、 同定した抑制性エピトープを消化管免疫Immunology. 2009 Feb;126(2):165-76.

担当細胞にデリバリーする効率が鍵となるため、

2） Suzuki K, Kaminuma O, Yang L, Takai T,独自に開発した米の難消化性タンパク顆粒を用Mori A, Umezu-Goto M, Ohtomo T,

いたデリバリーシステムの効率を、 今後正確に

Ohmachi Y, Noda Y, Hirose S, Okumura K,検証してゆく必要がある。 さらに実用化に向け、

Ogawa H, Takada K, Hirasawa M, Hiroi T,

安全性および経済性の両面において、 他法にTakaiwa F. Prevention of allergic asthma by

対する優位性を実証することが必要である。

vaccination with transgenic rice seed

最終的に食物アレルギー抑制薬または機能expressing mite allergen: induction of性食品として開発した抑制性エピトープを、 乳

allergen-specific oral tolerance without

児期より投薬または離乳食等として摂取させるこbystander suppression. Plant Biotechnol J.とで、 アナフィラキシー反応等を起こさずに、 体2011 Dec;9(9):982-90.
3） W akasa Y, Takagi H, Hirose S, Yang L,

内における Treg 数の増加を促し、 アレルギー

Saeki M, Nishimura T, Kaminuma O, Hiroiの発症を抑止できると期待される。
食物アレルギーのみに止まらず、 安全かつT, Takaiwa F. Oral immunotherapy with

有効性の高い経口免疫療法の実用化が望まれ

transgenic rice seed containing destructed

る他のアレルギー ・ 免疫疾患に対しても同様のJapanese cedar pollen allergens, Cry j 1 and効果が期待できることから、 今後は、 ヒト TCR

Cry j 2, against Japanese cedar pollinosis.

遺伝子座／ HLA-Tg マウスを用いてそれらのモ

Plant Biotechnol J. 2013 Jan;11(1):66-76.

デルも樹立し、 抑制性ペプチドの有効性を検証

29