ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

研究課題名

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

フリガナ

マツモト

代表者名

松本

ケンジ

健治

所属機関（機関名）国立成育医療研究センター研究所（役職名）部長
氏
共同研究者

名（フリガナ）

川上敏明(カワカミトシアキ)

免疫アレルギー・感染研究部

所属機関・役職名

役割分担

La Jolla Institute forAllergy and Immunology,
研究計画の立案と解析
University of California
San Diego, 教授

Kashiwakura JI, Ando T, Karasuyama H, Kubo M, Matsumoto K, Matsuda T,
Kawakami T.
本 助 成金 によ る 発
The basophil-IL-4-mast cell axis is required for food allergy.
表論文，学会発表
Allergy. 2019 Apr 21. doi: 10.1111/all.13834. [Epub ahead of print] PMID:31006132

研究結果要約IgE 依存性の食物アレルギーは即時型アレルギー反応を起こし、時に生命の危険を来すアナフィラキシーが誘発される。経口免疫療法や経皮免疫療法の試みがなされているが、現時点で食物アレルギーにはアレルゲンの除去以外には確立された治療法はない。本研究はヒスタミン遊離因子(HRF)の機能を抑制することによる食物アレルギーの治療法の開発を最終目標としている。これまでの研究から、HRF はマスト細胞表面の IgE や IgG に結合して IgE を介したマスト細胞の活性化を増幅し、結果的にマスト細胞の増殖をも誘導して腸管の炎症を増悪させることが明らかとなった。また、マウスの IgE を介した免疫応答に HRF の結合の阻害活性を有するペプチドを前投与することによって症状をほぼ完全に抑制し、また症状発現後に投与することでも約 70%の効果が得られることを明らかにした。この結果は生体内でHRF が in vivo での IgE を介した反応を増幅しており、その阻害が IgE を介するアレルギー応答の治療薬として有用である事を示唆する。HRF の阻害活性は HRF の N 末を用いたペプチドが最も強かった。
また、HRF の二量体形成に関わる酵素は消化管に強く発現していることから、HRF 阻害剤の投与は経口的に行う事が有益と考えられた。

58

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発する HRF 阻害剤を、ヒト患者に使用することを研究目的
食物アレルギーは近年患者数が増え、社会問題最終目標として開発する。阻害効果の強い 3 種のとなっている。IgE 依存性の食物アレルギーは即ペプチド由来阻害剤候補から最大の予防･治療効時型アレルギー反応を起こし、時に生命の危険を果を示すペプチドをマウスモデルで同定を試み来すアナフィラキシーが誘発される。経口免疫療る。また、これらのペプチドに化学的な修飾を施法による免疫寛容の成功例が報告されつつあるしたものも検討する。

が、食物アレルギーには確立された治療法はなく、(II) HRF 二量体形成酵素系の解析。HRF が IgE と新規の治療法の開発は喫緊の研究課題である。

結合して FcRI を会合させるためには、ジスルフIgE 依存性の食物アレルギーの解析に用いられるィド結合による二量体でなければならない。HRF

マウスモデルでは、IgE とその受容体 FcRI を介二量体の 3 次構造は英国の Brian Sutton 博士らとしたマスト細胞の活性化が重要であることが知の共同研究ですでに明らかにした（Mol Immunol.

られている。

2018;93:216-222）6)。また、各種サイトカインで刺ヒスタミン遊離因子(HRF)は、N 末端の 19 アミ激されたマクロファージなどの細胞が HRF 二量ノ酸と H3 ドメインの 2 箇所で約 30%の IgE 抗体体を産生分泌することも明らかにした。そこで、（および IgG 抗体）と直接結合する。ジスルフィ培養細胞を用いて、HRF をジスルフィド結合させド結合による二量体の HRF は IgE と結合してる酵素系を同定したい。さらに、(III) HRF のジスFcRI を会合させてマスト細胞を活性化できるこ

ルフィド結合ができない、HRF 単量体マウスを用と 1)、さらに一昨年度までの本財団研究費によっいて、食物アレルギー実験を施行する。HRF 阻害て、マウスの食物アレルギーモデルで、HRF には剤は FcRI と複数の IgG 受容体（FcRs）によるアレルギー症状の誘発期に炎症増悪作用があり、活性化を抑えることから、FcRI による活性化の②経口投与した HRF 阻害剤（HRF 単量体）は特みを抑制する Omalizumab（抗 IgE 抗体）より高異的に小腸のマスト細胞に結合して活性化を抑い治療効果が期待でき、かつ安価に製造できる。

制する、③食物アレルギー誘発モデルでは、HRF

その効果推定と、阻害剤使用時の副反応の予見のと HRF 反応性抗体が増加し、Th2 サイトカインために動物実験を行う。ペプチド由来の HRF 阻が上皮細胞、線維芽細胞、マクロファージに HRF

害剤は、アレルゲンを含む可能性のある食品を摂産生を誘導する、④急速経口免疫療法を施行１年取する前に服用することで、食物アレルギーを未後の有効例やマウスでは、血中 HRF 反応性 IgE然に防ぐ、あるいは症状を軽減することが出来るが低いのに対して、経口免疫療法が無効例や経口と思われる。また、少なくとも、免疫療法施行時免疫療法を施行しなかったマウスでは血中 HRFの抗原投与によるアナフィラキシーを防ぐこと反応性 IgE が増加に転じた、ことなどを明らかにが期待できる。また、HRF 反応性 IgE 抗体価が免してきた 4)。本年度は(I) HRF-IgE 間の結合を抑制

疫療法の治療効果の客観的指標となる可能性が59ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発ある。

遺伝子発現解析を行う。

研究計画及び研究手法

II.

I.

食物アレルギー治療に最適な HRF 阻害剤のHRF 二量体形成酵素系の解析

ジスルフィド結合を推進する酵素には、15 種類の protein disulfide isomerases (PDIs)とそれらの選択抗原 ovalbumin (OVA)を i.p.注射によって感作酸化酵素(Ero1l, Ero1lb, Prdx4, Gpx7/8, VKOR)が連したマウスに、同じ抗原を複数回経口投与して下結して行われる場合と, PDIs なしでジスルフィド痢を発症させる。HRF 阻害剤(GST-N19 または結合を直接触媒する QSOX などが知られている。

HRF-2CA [HRF の単量体])を抗原投与の直前に投食物アレルギーの誘発前後の腸管の網羅的な遺与すると下痢の発症が抑えられることは、理研で伝子発現解析から、Ero1l と Ero1lb の mRNA が食おこなった 10 回以上の実験で確かめられている。

物アレルギーの誘発によって増加することが判

下痢発症後に HRF 阻害剤を投与した場合も、下明した。15 種類の PDIs とほかの酸化酵素にはそ

痢の発症頻度と重症度を 70%以上低下させられのような変化がみられないことから、Ero1l とる。アナフィラキシーによる体温の低下が最も大

Ero1lb および、これらの酵素と連関することが知きいのは 3、4 回目の抗原投与時であることが判られている PDI が、HRF 二量体形成酵素系の候明した。ヒト患者に使用できる HRF 阻害剤とし補として浮上した。さらに、各種サイトカインでて、HRF の N 末端部分に由来する N19、N25、刺激されたマクロファージなどの培養細胞がN32、および単量体の HRF (HRF-2CA)が考えられHRF 二量体を産生分泌することを証明した。以上る。これらのペプチドをそのまま、または化学修より、二量体形成酵素系候補に対する siRNA (ま飾（N 末端のアセチル化や PEG 化、C 末端のア

たは CRISPR/Cas9 使ってノックアウト)をこれらミド化）して安定性と可溶性を高めて検討する。の 細 胞 に 導 入 し て か ら 、 HRF 二 量 体 の 量 を

3、4 回目の抗原投与前に HRF 阻害剤を種々の経western blot 法を用いて測定する。また、培養細胞路で投与し、下記①～⑤を指標として阻害剤の治で得られた結果は、PDI、Ero1l、Ero1lb の欠損マ療効果とその機序を検討する。①下痢の重症度・ウスの脾臓細胞を用いて再現することが可能で体温。②最終抗原暴露後に腸管組織を染色。炎症ある。

度は、H&E 染色で、マスト細胞数は、chloroacetate
esterase 染色で測定。③血中 HRF 濃度および HRF

III. HRF 単量体マウスを用いた食物アレルギー反応性抗体価を ELISA 法で測定。④抗原暴露後、実験

リンパ節を回収し、抗原で再刺激後、各種のサイHRF のジスルフィド結合ができない、C172A

ト カ イ ン 産 生 を ELISA 法 で 測 定 。 ⑤ DNAmutant マウスを樹立した。現在食物アレルギーにmicroarray (または RNA-Seq)法で腸管の網羅的な最適な Balb/c マウスに backcross しており、H3060

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

年度には食物アレルギー実験が可能となる。このーモデル（2 回の OVA と Alum の腹腔内投与によマウスは食物アレルギー抵抗性を示すことが期る感作、連続 9 日間の OVA 経口負荷による下痢待される。の発症を検討）を用いて、効果相の直前に好塩基球を除去する抗体を投与してから抗原チャレン計画から外れて実施した内容：ジを行い、その影響を検討した。
その結果、好塩基球を除去したマウスでは下痢

高親和性 IgE 受容体を発現して即時型の免疫応の発症頻度が有意に低下した。また、好塩基球の答を行う細胞はマスト細胞と好塩基球である。ヒ

コンディショナルノックアウトマウスであるトマスト細胞は組織中にしか存在しない。一方、

Bas-TRECK マウスを用いて、効果相の直前にジヒト好塩基球は定常状態では末梢血内にしか存フテリアトキシンを投与して好塩基球を除去し在しない。IgE 依存性の食物アレルギーの症状発ても全く同様の結果であった。

現にはマスト細胞と好塩基球のどちらが重要で次に、好塩基球が下痢の発症に与える影響を検あるかは、長らく議論の的であるが結論は出てい討するため、好塩基球が IgE 抗体の架橋後に特異なかった。

的に産生する IL-4 が重要であると仮説を立て、本研究に用いているマウスモデルは IgE 依存性好塩基球を除去したマウスに OVA を負荷する際に下痢を発症するモデルであり、ヒトの食物アレに IL-4 を同時に投与して影響を検討した。そのルギーに見られるような皮膚所見や体温低下な結果、好塩基球除去マウスでも IL-4 を投与するどは惹起されない。しかし、IgE や IgE 受容体、ことで下痢の発症頻度は増加した。そのため、IL-マスト細胞のいずれかを欠損するマウスでは下4 の役割の少なくとも一部は IL-4 を介している痢がほとんど誘発されないことから、IgE 依存性可能性が示唆された。さらに、マウス食物アレルにマスト細胞が活性化されているとされて来た。

ギーモデルの抗原チャレンジに際して抗 IL-4 抗この系における、好塩基球の関与は不明であった。

体を投与してその影響を検討した。その結果、抗このマウス実験系では、抗原感作時に好塩基球

IL-4 抗体投与マウスでは著明な下痢の発症抑制を除去すると、IgE 抗体産生が著しく低下するこが認められた。とから、抗体産生に好塩基球由来の IL-4 が重要以上の結果から、IgE 依存性のマウス食物アレルであることが知られている。そのため、好塩基球ギーモデルの発症には好塩基球由来の IL-4 が重欠損マウスでは感作自体が誘導できないので食要な役割を演じていることが示唆された。

物アレルギーモデルが樹立できず、好塩基球の関上記の検討は研究計画書には記載されていなか与の検討が行えなかった。

ったが、本研究の標的分子である HRF の作用機序を検討する上で極めて重要な意義を持つこと

今回、私達は IgE 依存性のマウス食物アレルギ

61

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

種類の中では、N19 が最も阻害の potency が高いから、一部本研究の一環として行った。

事が明らかとなった。GST-N19 はマウスだけで無以上の成果は欧州免疫アレルギー学会の機関

く、ヒトの好塩基球を用いた実験でも同等に HRF誌である Allergy（Impact Factor: 6.048）に 2019 年による IgE 抗体の架橋を阻害する事が明らかとな

4 月 21 日に掲載された。本論文の謝辞にはニッっていることから、今後は GST-N19 を臨床応用

ポンハム食の未来財団のサポートを受けた事がの第一候補として前臨床試験を目指す。

記載されている。
II.
結果と考察
I.

HRF 二量体形成酵素系の解析

ジスルフィド結合を推進する酵素には、15 種

食物アレルギー治療に最適な HRF 阻害剤の類の protein disulfide isomerases (PDIs)とそれらの選択酸化酵素(Ero1l, Ero1lb, Prdx4, Gpx7/8, VKOR)が連実験系が安定した後に行った結果では、経口投結して行われる場合と, PDIs なしでジスルフィド与した HRF-2CA は特異的に小腸のマスト細胞表結合を直接触媒する QSOX などが知られている。

面に結合して、ex vivo での抗原や HRF によるマ食物アレルギーの誘発前後の腸管の網羅的な遺スト細胞の活性化を抑制した。また、胃内に OVA

伝子発現解析から、Ero1l と Ero1lb の mRNA が食を反復投与することによって誘導される下痢や物アレルギーの誘発によって増加することが判

消化管のマスト細胞の増多は、HRF の IgE や IgG明した。15 種類の PDIs とほかの酸化酵素にはそへの結合を阻害するペプチド（GST-N19）や HRFのような変化がみられないことから、Ero1l と阻害剤（HRF-2CA：HRF の単量体）の投与によっEro1lb および、これらの酵素と連関することが知て著明に阻害された。また、GST-N19 投与によっられている PDI が、HRF 二量体形成酵素系の候て腸管上皮の IL-4 や IL-13 の mRNA 発現も著明補として浮上した。さらに、各種サイトカインでに低下した。これらのことから、HRF にはアレル刺激されたマクロファージなどの培養細胞がギー症状の誘発期（感作期ではなく）の炎症増悪HRF 二量体を産生分泌することを証明した。

作用があることが示唆された。もっとも強く HRF

Ero1l と Ero1lb の mRNA は全身の臓器の中で、を阻害するペプチドの選別のために、HRF と免疫消化管に最も強く発現しており、消化管におけるグロブリンの結合部位に相当する N 末の 19、25、HRF 二量体の形成は HRF が産生される局所で誘32 残基をもちいたペプチドを合成した。また、導される可能性が強く示唆された。また、このこ

HRF の単量体 HRF-2CA にも HRF の阻害活性がとは食物アレルギーにおける HRF の阻害のため認められた。には HRF 阻害剤の経口投与が有用である事を示今回用いた HRF の N 末端部分に由来する N19、唆する事実と考えられた。

N25、N32、および単量体の HRF (HRF-2CA)の 462

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

III.

ます。また、HRF の二量体形成の機序は明らかと

HRF 単量体マウスを用いた食物アレルギ

ー実験

なってきましたが、その酵素の誘導機構や、HRF

HRF のジスルフィド結合ができない、C172Aの産生機序、免疫療法が HRF の産生や IgE 抗体mutant マウスを 2017 年末に樹立した。食物アレの HRF 結合性に与える影響のヒトでのデータなルギーに最適な Balb/c マウスに backcross して実ど、重要な課題がまだまだ多く残されております。

験に供することを目指していたが、2018 年度中

本研究を更に強力に推進してゆきたいと考えてに実験に十分な匹数を確保することが出来ず、おります。今後もご指導ご鞭撻を宜しくお願い申HRF 単量体マウスのアレルギー免疫応答の全貌し上げます。

を明らかにするに至っていない。このマウスのフェノタイプと食物アレルギーモデルの解析は現

参考文献

在も継続しており、成果が出次第、論文化する方

1）Kashiwakura J, Ando T, Matsumoto K, Kimura M,Kitaura J, Matho MH, Zajonc DM, Ozeki T, Ra C,針である。

Macdonald SM, Siraganian RP, Broide DH,
Kawakami Y, Kawakami T. Histamine-releasing

論文発表

factor has a proinflammatory role in mouse models

Kashiwakura JI, Ando T, Karasuyama H, Kubo M,of asthma and allergy. J. Clin. Invest. 2012

Matsumoto K, Matsuda T, Kawakami T. The

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今後の研究活動について

Invest. 2003;112 (11):1666-177.

HRF が食物アレルギーを始めとするアレルギ3）Yamashita H, Takahashi K, Tanaka H, Nagai H,ー疾患の増悪に寄与していることは、疑う余地がInagaki N. Overcoming food allergy throughないほどデータが蓄積してきております。また、

acquired tolerance conferred by transfer of Tregs in

HRF 阻害剤がヒトに応用できる可能性はまだ直a murine model. Allergy 2012 Feb; 67(2):201-209.

接の証拠がないもののマウスでの Proof of concept

4) Kawakami T, Blank U. From IgE to omalizumab.
J. Immunol. 2016;197:4187-4192.5）(POC)はほぼ固まったと考えております。今後、現在の候補群から最適な HRF 阻害剤を決定しま

5) Ando T, Kashiwakura JI, Itoh-Nagato N, Yamashita

したので、なるべく早く臨床試験に進むことを考H, Baba M, Kawakami Y, Tsai SH, Inagaki N,

えております。しかし、さらに薬物製剤法の改良

Takeda K, Iwata T, Shimojo N, Fujisawa T, Nagao
M, Matsumoto K, Kawakami Y, Kawakami T.

（たとえばコートする）や抗体の開発などの第二Histamine-releasing factor enhances food allergy. J

世代の HRF 阻害剤の開発にも注力したいと思い

Clin Invest. 2017;127(12):4541-4553

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ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

6) Doré KA, Kashiwakura JI, McDonnell JM, Gould

7) Kashiwakura JI, Ando T, Karasuyama H, Kubo M,HJ, Kawakami T, Sutton BJ, Davies AM. Crystal

Matsumoto K, Matsuda T, Kawakami T. The

structures of murine and human Histamine-basophil-IL-4-mast cell axis is required for foodReleasing Factor (HRF/TCTP) and a model forallergy.

HRF dimerisation in mast cell activation. Mol

10.1111/all.13834. [Epub ahead of print] PMID:

Immunol. 2018;93:216-222.

31006132

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Allergy.

2019

Apr21.

doi: