平成 30 年度研究助成報告書

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不活動が脳に与える影響の基礎的検討

方−脳由来神経栄養因子 BDNF に着目して−

1．不活動モデルマウスの作製と実験群

法
実験には 9 週齢の C57BL/6 系マウスを使用した。不活動のモデルマウス作成にはギプス固定法を用いた。実相原正博（PT）1），萩原宏毅（MD）1）2）3）

験群は，通常飼育した対照群（以下，Co 群），ギプス固定による不活動群（以下，CI 群），不活動後，通常飼1）

帝京科学大学医療科学部理学療法学科2）

帝京大学脳神経内科

3）

育にて再荷重を 1 日間行う群（以下，RL1 群）と 14 日間行う群（以下，RL14 群），運動介入を行う群（以下，帝京科学大学大学院理工学研究科バイオサイエンスEx 群）に分類した。ギプス固定法は，一側後肢を膝関専攻医療科学分野

節伸展，足関節底屈位にギプス包帯で固定し，2 週間不動化した。循環障害を防ぐため，ギプスは週 2 回取りか

キーワード：脳由来神経栄養因子 BDNF，廃用性筋萎縮，再荷重4）えた 。RL 群は，筋萎縮誘発後にギプス包帯を除去し，通常飼育を 2 週間行うことで再荷重を行った。Ex 群は，運動介入としてトレッドミル運動を 2 週間を行った。本

はじめに研究は，帝京科学大学の動物実験委員会の承認（承認番

本邦は高齢化率，高齢化速度とも世界一であり，不活号 18C039，18C052）を得たうえで，実験動物取扱ガイ動となる高齢者は増加する一途である。運動療法は，骨ドラインにしたがって飼育，解析，組織の採取を行った。

格筋の肥大，筋持久力の改善などを目的に実施するが，脳機能も改善させる効果があることは多くの報告があ

2．トレッドミル運動のプロトコルる。しかし，運動による脳機能への効果を忠実に反映

トレッドミル運動は，TREAT-NMD の標準作業手するバイオマーカーは未だ確立されておらず，客観的指5）
順書（SOPs）（DMD̲M.2.1.003） にしたがって実施し標に乏しい中で運動介入が行われているのが実情であた。具体的には，Ex 群のマウスに対して週 2 回，（1）る。脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic

トレッドミル上で安静factor：以下，BDNF）は神経栄養因子のひとつで，神ドミル走行経細胞の生存維持，神経突起の伸長促進，神経伝達物質

3 分間，（4）12 m/min でトレッドミル走行1）の合成促進などの作用が知られている 。この BDNF は，のスケジュールにて，トレッドミル装置（PanaLab，大脳，海馬のみならず骨格筋からも分泌される。疾患とLE8709）を用いてトレッドミル運動を実施した。

2 分間，（2）4 m/min でトレッ2 分間，（3）8 m/min でトレッドミル走行
30 分間6）の関連では，認知症やうつ病患者における血中 BDNF量が健常者と比較して低いことが報告されている。これ

3．マルチプレックスサスペンションアレイ解析

らの知見により，BDNF が脳機能に重要な役割を果たしCo 群，CI 群，RL 群 1 日，RL 群 14 日，Ex 群 14 日ていることが考えられる。最近になって，実験動物やヒ7）マウスから採血後に血清を調製し ，BDNF の血中濃度

トにおいて，運動により BDNF が増加することが報告

をマルチプレックスサスペンションアレイ解析（Merckされている2）
3）。たとえば，ラットにおいて車輪付きケージを用いた自発的運動負荷後，BDNF 量が自発的運動負Millipore，Milliplex MAP Mouse Panel）にて定量化し8）た 。

荷と正の相関を示し，運動負荷によって BDNF 量が増加することが報告されている。また，ヒトにおいて，有酸素運動後 BDNF レベルが改善したことや，神経筋疾4．マイクロアレイ解析
骨格筋中の BDNF に関連する遺伝子の発現量につ患患者に対して運動トレーニングを実施すると，BDNF

いて，マイクロアレイ法を用いて解析した。Co，CI，が活性化し身体的能力が改善した報告がある。一方で，

RL1，RL14，Ex14 の腓腹筋を単離し，筋から RNA を不活動の病態における BDNF の動態や，不活動に対す抽出し，cDNA の合成とラベリング，増幅を行った。

る運動介入による BDNF への影響はほとんど検討され次にハイブリダイゼーションを実施し，スキャニングをていない。今回，我々は，この BDNF が不活動によっ行うことにより mRNA の発現量を分析した。解析として低下し，運動介入によって増加するのではないかと推て，Co の発現量に対する CI，RL1，RL14，Ex14 の発測し，BDNF が運動を反映した脳機能のバイオマーカー現量の比を fold change として求めとなるのではないかと仮説を立てた。それを検証するた

Co vs RL1，Co vs RL14，Co vs Ex14 とした。

9）

，順に Co vs CI，め，不活動状態およびそれに対して運動介入を行った際の BDNF の変動を検討することを目的とした。

5．統計解析
統計解析は，各群間の各測定結果を Mann-Whitney U
検定を用いて，群間比較を行った。検定において有意水準 5% とした。

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平成 30 年度研究助成報告書

脳から分泌される神経栄養因子としてのみならず，骨格筋から分泌されるホルモン様因子とされるマイオカインのひとつとしても注目されている10）。今回の血中と骨格筋中の BDNF の動態が異なることが示唆された結果も，脳から分泌され血中より全身に作用する BDNF と骨格筋より分泌され全身に作用する BDNF があるとすると説明可能と考える。
近年，運動と BDNF を関連づけた検討が多く報告されている。しかし，不活動の状態における BDNF の動態や，それに対する運動介入が BDNF に与える影響の検討はほとんどされていなかった。今回の研究により，
BDNF は不活動によって減少し運動介入によって増加しており，活動量を反映している可能性が示唆された。ま図 各群における血中 BDNF 濃度
マルチプレックスサスペンションアレイ解析で測定した
BDNF 濃度（pg/mL）を示す．CI 群（不活動群）では，Co群と比較して BDNF 血中濃度が有意に減少した（p ＜ 0.05）．
再荷重により血中 BDNF 濃度は増加し，運動介入 14 日後にはさらに増加した．運動介入 14 日後（Ex14）は，不活動後通常飼育による再荷重 14 日後（RL14）と比較して有意に高い血中 BDNF 濃度を示した（p ＜ 0.05）（*：p ＜ 0.05）

た，血中と骨格筋で動態が異なることが明らかになった。
本研究の限界として，今回は野生型マウスの運動介入については検討していない。野生型マウスの運動後は従来報告されているようにさらに BDNF が高値を示すかを検討し，今回の結果が一貫するかの確認を行いたい。また今後の課題として，BDNF が運動の効果を反映した脳機能のバイオマーカーとなりうるか否か以下のような詳細な検討をさらに進めていきたい。不活動に結果よる筋萎縮から再荷重あるいは運動療法介入過程にお血中 BDNF 濃度は，ギプス固定による不活動モデル

ける BDNF 変化の詳細な時系列の動態を明らかにしたである CI 群では，Co 群と比較して有意に減少した（pい。また，今回は不活動，再荷重および運動介入の状態＜ 0.05）。再荷重により血中 BDNF 濃度は増加し，運での，骨格筋中，血液中の BDNF 量の動態を解析した

動介入 14 日後にはさらに増加した。運動介入 14 日後が，これに脳での検討を加えることで BDNF の多様な（Ex14 群）の血中 BDNF 濃度は，不活動後通常飼育に機能の解明を進めていきたい。さらに，今後の臨床応用よる再荷重 14 日後（RL14 群）と比較して有意に高値をへの展開を念頭に，運動の種類，負荷の程度での違いが示した（p ＜ 0.05）（図）。骨格筋中の BDNF の mRNA

BDNF の動態に及ぼす影響の検討を進めていきたい。の発現量は，Co 群と比較して，CI 群で 0.73 倍，RL1 群で 0.68 倍，RL14 群で 0.39 倍，Ex 群で 0.80 倍であり，筋利益相反萎縮誘発から再荷重期間中にかけて発現量は低下した。
考察
本研究課題では，ギプス固定法にて不活動のモデルマ

ウスを作成し，BDNF の不活動状態およびそれに対して運動介入を行った際の変動を検討した。その結果，血中 BDNF 濃度は CI 群で低下した。その後の再荷重により血中 BDNF 濃度は上昇し，さらに RL14 群と Ex 群を比較すると Ex 群で有意に BDNF 濃度が高値を示した。
以上の結果は，BDNF が不活動によって低下し，運動介入によって増加するのではないかという我々の仮説を支持するものといえる。また，Ex 群が RL14 群よりBDNF が高値であったことは，以前より報告されている運動により BDNF が増加するということに矛盾しないと考える。
骨格筋中 BDNF mRNA の発現は，CI 群，RL 群，Ex群で変動を示したが，血中とは動態が異なった。すな
わち，筋萎縮誘発により低下し，再荷重期間中も低下
し 14 日で約 0.4 倍ともっとも低下した。最近 BDNF は，本研究課題に関連して，開示すべき利益相反はない。
文献1）Binder DK, Scharfman HE: Brain-derived neurotrophicfactor. Growth Factors. 2004; 22: 123‒131.
2）Neeper SA, Gomez-Pinilla F, et al.: Physical activity
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726: 49‒56.
3）Rasmussen P, Brassard P, et al.: Evidence for a release ofbrain-derived neurotrophic factor from the brain during
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5）Grange RW: Use of treadmill and wheel exercise toassess dystrophic state. 2015.
6）Radley-Crabb H, Terrill J, et al.: A single 30 min treadmill
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2012; 22: 170‒182.
7）Katsuta W, Aihara M, et al.: Changes in oxidative stress平成 30 年度研究助成報告書

severity and antioxidant potential during muscle atrophy
and reloading in mice. J Phys Ther Sci. 2018; 30: 42‒46.
8）Djoba Siawaya JF, Roberts T, et al.: An evaluation ofcommercial fluorescent bead-based luminex cytokine
assays. PLoS One. 2008; 3: e2535.
9）Hagiwara H, Saito F, et al.: Histone deacetylase inhibitor
trichostatin A enhances myogenesis by coordinatingmuscle regulatory factors and myogenic repressors.
Biochem Biophys Res Commun. 2011; 414: 826‒831.
10）Pedersen BK, Pedersen M, et al.: Role of exerciseinduced brain-derived neurotrophic factor production in
the regulation of energy homeostasis in mammals. ExpPhysiol. 2009; 94: 1153‒1160.

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発表実績
学会発表（予定）
1）相原正博，廣瀬 昇，斉藤史明，丸山仁司，萩原宏毅：
不活動が脳由来神経栄養因子 BDNF に与える影響の検討．
日本筋学会第 5 回学術集会．令和元年 8 月 2 日（金）〜 3日（土）2）相原正博，廣瀬 昇，斉藤史明，丸山仁司，萩原宏毅：不活動および運動介入時の骨格筋と血中の脳由来神経栄養因
子 BDNF の動態．第 24 回日本基礎理学療法学会学術大会．
令和元年 11 月 30 日（土）〜 12 月 1 日（日）