特集 感染症 ―薬剤耐性菌―

感染症検査の最前線－迅速な薬剤感受性検査の最新動向を含めて－Emerging Technologies for the Clinical Microbiology Laboratory:
Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing Update

東京医科大学 微生物学分野 教授

大楠 清文

Kiyofumi Ohkusu, PhD. (Professor)
Department of Microbiology, Tokyo Medical University

キ ーワード01

薬剤感受性検査，遺伝子検査，質量分析法

はじめに伝子検査システムとして（アルファベット順に）、ARIS（Luminex（日本ベクトン・社）、BD マックスTM全自走核酸抽出検査ステム
ディッキンソン社）
eSensor（GenMark

Diagnostics社）、

近年の飛躍的な技術の進歩によって感染症検査が大きな

Verigene（Nanosphere社）などがある。これらのシステムは変貌を遂げようとしている。すなわち、感染症検査における「三病態別に想定される病原体を網羅的に検索できるのが特長で大技術革新」ともいえる、自動同定・感受性機器、遺伝子解析技ある。以下に、病原体の検出のみならず、薬剤耐性遺伝子の検術、そして質量分析法が日常検査に導入されつつある１）。さらに索も同時に実施できる3社のシステムを紹介する。

は、光散乱法や蛍光分光法を用いた集落や検体から直接の菌種同定や薬剤感受性試験も実用化の兆しが見える。
適切な感染症診療を行うための第一歩は、感染症の原因微生物を迅速に特定することであろう。そのために遺伝子解析技術や質量分析法などの活用が今後、重要なカギを握ると考えている。つまり、感染症診療におけるこれら迅速診断技術の適応には、①臨床検体から直接、病原体に特徴的な遺伝子領域を増幅・検出して迅速に感染症の診断を行う、②分離・培養された菌株を迅速かつ正確に同定あるいは毒素や薬剤耐性遺伝子の検出、③感染源の特定や感染拡大を防ぐための分子疫学的な解析、の3つに大別される。
本稿では、迅速な薬剤感受性検査の新たな知見を含めて、全自動遺伝子検査による臨床検体から直接の病原体検出、遺伝子解析技術や質量分析法による菌株同定、シークエンス解析による分子疫学的なタイピングに関する最新の動向を概説したい。

02

図1.次世代型の遺伝子検査システム

GenXpert TMシステム（米国Cepheid社）

全自動遺伝子検査システム

遺伝子検査の基本的なステップは、① 検体採取と搬送（保存）、② 核酸（DNA/RNA）の抽出、③ 増幅反応、④ 増幅産物

本システム
（図１-A）は1つのカートリッジで測定できる項

目数は少ないが、結核菌の検出とリファンピシン耐性か否かを同時に判定できる。また、医療関連感染の対策上も重要な
MRSA、ESBLなどの薬剤耐性菌の同定と耐性遺伝子の検出がClostridium difficile とその毒素同時に実施できる。そして、の検出、⑤ 結果の判定と報告、の5つからなる。これまでの検査の同時検出も可能である。現在、カルバペネマーゼ産生遺伝子は、核酸の抽出と増幅・検出が別々の実施であったため、時間と（KPC, NDM, VIM, OXA-48, IMP-1）の検出キット（Xpert

労力の面から病院検査室での遺伝子検査の導入のボトルネッCarba-R）は既に研究用試薬として販売されている。

クになっていた。近年、核酸抽出から増幅反応、検出までをすべて自動で行うシステムが開発されており、遺伝子検査の利用が現実味を帯びてきた。すなわち、核酸の抽出から増幅と検出を全自動で2～3時間以内に完了する、いわゆる「次世代型」の遺Verigeneシステム-自動多項目同時遺伝子関連検査シス

テム（Nanosphere社）

標識に金ナノ微粒子を用いてシグナル増幅した後、各プロー
15

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特集

ブのシグナルを光分散によって検出する。光分散による検出は、これまでの螢光法より1,000倍以上感度が高い。金ナノ微感染症 ―薬剤耐性菌―

粒子の表面に、DNAのかわりに抗体を結合させて、生体の微量なタンパクを直接検出するといった多様な測定系が構築できるのも特長の１つである。米国では心筋梗塞の早期診断に、超高感度なトロポニンIの定量検査（検出限界；0.2 pg/ml）の開発が進められている。2015年12月現在、わが国では血液培養が陽性となった後の培養液から、グラム陽性菌と薬剤耐性遺伝子の15項目を同時に検出・同定できる試薬（約3時間）とグラム陰

図２ POCT型の遺伝子検査システム

性菌と薬剤耐性遺伝子の15項目を検出する試薬(約2.5時間)

A: GeneXpert Omni (Cepheid社)
B: Cobas Liat (Roche社)
C: Alere I (Alere社)の薬事申請が進められている。
（表１＆図１-B；国内の販売元は日立ハイテクノロジーズ社）。

表１ Verigene®BC-GP/GNテストカートリッジで検出可能な病原体と耐性遺伝子グラム陽性菌(GP) 12項目

Staphylococcus spp.,
S. aureus,

S. epidermidis,

S. lugdunensis,

Streptococcus spp.,

S. pneumoniae,

グラム陽性菌(GN) 9項目

E. coli,

K. pneumoniae,
K. oxytoca,

医などでも感染症の診断に遺伝子検査が活用されるようになEnterobacter spp.

Citrobacter spp.,

Enterococcus faecium,Listeria spp.

薬剤耐性遺伝子 6項目

mecA, vanA, vanB役は免疫クロマトグラフィー法であるが、今後、POCT型遺伝子

Acinetobacter spp.,

S. marcescens,

S. anginosus group

薬剤耐性遺伝子 3項目査を行うことを意味している。現在、感染症検査のPOCTの主検査の機器・試薬の低価格化と検査項目のラインナップの充実

Proteus spp.,

Enterococcus faecalis,

Central Lab.）のではなく、患者がいる各々の診療の現場で検P. aeruginosa,S. pyogenes,

S. agalactiae

着しつつある。すなわち、検体を病院の中央検査室や検査センターに搬送して集中的に検査する（Centralized Testing in

KPC, NDM, CTX-M,VIM, IMP, OXAが共に実現すれば、病院検査室はもちろんのこと診療所、開業
るであろう。

04

質量分析法による微生物の同定と費用対効果

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計（MALDITOF MS）による微生物の新しい同定法１）が注目されている。
病原体に由来したタンパク質成分の分子量情報（マススペクト

FilmArray システム（米国Bio Fire社）®

フィルム製のパウチに凍結乾燥した試薬が装填されており、検体の破砕、核酸の精製、multiplex PCRによるDNAの増幅、そして各病原体のDNAがアレイ上で自動的に検出される（図ル）のパターンから、わずか10分足らずで分離菌株の同定ができるようになったのである。まさしく、臨床微生物検査のワークフローを一変させる技術革新そのものと言える。わが国でも2011年から臨床微生物検査の現場での使用が開始され、現在１-C）。欧米では呼吸器病原体パネル（20項目）や血液培養陽（2015年12月）
約100施設で導入されており、今後急速に普vanA/B , KPC）などの網羅的検出試薬 が既に販売されてい理と活用法について紹介したい。

性用パネル（24病原体の同定と薬剤耐性遺伝子検出；mecA ,２）及していくであろう。ここでは質量分析法による菌種同定の原る。検体と試薬溶解用のシリンジを挿入するだけのわずか1、2分の操作（hands-on time）のみで、かつ1時間で測定が完了することから、point-of-care testing (POCT)として外来診療やベッドサイドでの実施が期待される。なお、現在（2015年12月）、わが国でのFilmArray®システムの販売は未定である。

03

POCT型の全自動遺伝子検査

遺伝子検査の最新トレンドは、POCT (Point of CareTesting)として導入可能な機器・試薬の登場である（図２）。
単項目（インフルエンザウイルス、GASなど）であるものの、Hands-on-Timeが短く、検体を投入後は全自動で測定結果が得られること（Sample to Result）、そのTurn Around Time(TAT)が8～15分と極めて短いことなどが特長である。POCTは開業医院、病院内の集中治療室など診療の現場で行う検査の総称であったが、近年ではその概念がやや変化しており、欧米ではDecentralized Testing（分散化された検査）として定16

図３ MALDI-TOF MSを用いた微生物同定システム
A: MALDI Biotyper(ブルカー・ダルトニクス社)
B: VITEK MS(シスメックス・ビオメリュー社)

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さ ま ざ ま な 菌 種 の さ ま ざ ま な 菌 株 の マ ス ス ペ クトである。すなわち、1つのシステムで臨床的に重要なあらゆる菌種を取り扱うことができる。
MALDI-TOF MSの活用として最も臨床的に有用性が高いのが、血液培養陽性時の培養液から直接の菌種同定である。既パターンと一致しているかをDBの中から瞬時に探す。つまり、に多くの施設で検討されており、約70～80%の同定精度とのMALDI-TOF MSを用いた菌種の同定は、「データベースに登録されている菌種のマススペクトルとのパターンマッチング」

報告３）が多い。

次にはおそらく臨床検体から直接に菌種の同定ができないかとの期待が大きく膨らむであろう。
しかし、現在のシステムでである。

は105個くらいの菌量を必要とするため、敗血症の診断に血液MALDI-TOF MSシステムによる微生物同定の実際から直接に菌種の同定は行うことは困難である。一方、感染時が販売されている。
１つはブルカー・ダルトニクス社（ドイツ）がある。

質量分析法による細菌同定の装置・システムとして2種類

感染症 ―薬剤耐性菌―

ル を デ ー タ ベ ー ス（ D B ）に 登 録し て お き 、コ ン ピ ュ ー
ターの力を借りて未知の菌株のマススペクトルがどの菌種の特集

MALDI-TOF MSによる微生物同定の基本原理の菌量が多い尿や髄液では検体直接の同定が可能との報告３）の「MALDI Biotyper」
である（図３-A）。シスメックス・ビオメ

薬剤耐性菌の鑑別については、
β－ラクタム薬４）やカルバペネ

リュー社から「VITEK MS」が販売されている（図３-B）。質量分ム系薬５）での検討結果が報告されている。分離菌株とβ－ラクタ

析法による菌株の同定は3つのステップからなる。①菌体とマト

ム薬あるいはカルバペネム系薬を含む培養液で2～4時間培養

リックス試薬を混ぜて乾燥させる、②MALDI-TOF MSでマス後にこれらの薬剤が加水分解されるとマススペクトルの波形がスペクトルを取得する、③そのマススペクトルをデータベース変化することを利用して（図４）、β－ラクタマーゼ産生あるいはに照合してパターンマッチングを行う。

（図５）。
カルバペネマーゼ産生６）の菌株であるかを判定できる

MALDI-TOF MSシステムの適用

マーゼの検出をMALDI-TOF MSのスペクトルパターンで検討

同じく、NDM-1、VIM-1、OXA-48、OXA-162型カルバペネ
MALDI-TOF MSは一般細菌だけでなく、嫌気性菌、抗酸菌、酵母様真菌、糸状菌の同定も実施できることが大きな利点

図4 imipenemの分解によるマススペクトルの変化6)

図５ imipenem感受性もしくは耐性のA.baumanii のマススペクトル6)（上段は感受性株，下段は耐性株）

した論文７）も発表されている。今後も同様な検討結果が次々と報告されるであろう。

図６ BARDOT の原理10)

図７ 光散乱法による各種食材の培養集落から直接の菌種同定10)
EC; E. coli , LS ; L. monocytogenes, SE; Salmonella Enteritidis

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感染症 ―薬剤耐性菌―

05

費用対効果「マルディノミクス」

MALDI-TOF MSによる菌種同定は、単なる菌株同定コストの低減だけでなく、その迅速性に優れるが故に、適切な抗菌薬

光散乱法による集落から直接の菌種/血清型の同定

寒天培地に発育した集落をスキャンしながらレーザー光治療、入院期間の短縮、院内感染防止など医療経済的にも大きな影響（”エコノミカル”なインパクト）を与えるものと考えてい線（635nm）を照射して、各集落の透過・散乱光をCCDカメる。つまり、質量分析技術を今後、医療現場でうまく活用しながラで撮影した画像パターン（ライブラリーのイメージデータら、患者の感染症診療に貢献（”クリニカル”なインパクト）
できと照合）
から菌種の同定を行うBARDOT (Bacterial Rapid

るような実践的な学問分野となり”ダブル”
インパクトを与える

Detection using Optical Scatter Technology)が開発10）ことを願い、私は「マルディノミクス」と命名した。実際、欧米でされている（図６）。これまでに各種食材を培養した培地・集落

はMALDI-TOF MSによる菌種の迅速同定とその結果に基づから直接に腸管出血性大腸菌 (EHEC)、サルモネラ、リステリ

いた抗菌薬適正使用への介入（Antimicrobial Stewardship）

ア菌などを同定できることが報告されている
（図７）
。特筆すべ

によって入院期間短縮８）や医療費低減の効果９）があったとしてきは、EHECの各種O抗原型 (O157, O145, O121, O111,いる。すなわち、介入前後において、効果的な抗菌薬治療まで

O103, O45, O26)の判定や、サルモネラでは各種血清型にかかった時間(h)が、30.1hから20.4hに、入院期間が14.2日(Enteritidis, Typhimurium, Newportなど)も画像パターンから11.4日に、死亡率が20.3%から14.5%に低下したとの報で鑑別できることである。

（表２）や入院費用が45,709ドル（約457万円）から26,162
告８）（値はすべて平ドル（約262万円）に低減したとの報告９）がある
均値）。今後は国内からの「マルディノミクス」を裏付けるデータ報告に期待したい。
表2 MLADI-TOF MSによる迅速同定とAntimicrobial Stewardship介入前後における臨床的および治療的な評価8)
Outcome介入前( n = 256)

介入後
( n = 245)

P Value

30日時の全死因死亡者

52(20.3%)

31(12.7%).021

培養陰性までの日数

3.3±4.8

3.3±5.7.928

臨床的な評価入院期間

14.2±20.6

11.4±12.9.066

ICU入室期間14.9±24.2

8.3±9.0.014

BSIの再発者15(5.9%)5(2.0%).038

30日時の同一BSIによる再入院者

9(3.5%)

4(1.6%).262

治療に関連した評価
効果的な治療導入に要した時間(h)30.1±67.7

20.4±20.7.021

適切な治療導入に要した時間(h)90.3±75.4

47.3±121.5<.001

数値はNo.(%)もしくは平均値±標準偏差
入院期間とICU入室期間は血液培養が陽性になった時点から退院（退室）までに要した日数

トリプトファン

図８ 蛍光分光法による血液培養液から直接の菌種同定11)

18

NADH

フラビン

ポルフィリン

図９ Excitation-Emission Matrices (EEMs) 励起・蛍光マトリックス11)

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迅速な薬剤感受性検査の最新動向

細菌が内在性に保有する発光分子（Intrinsic fluorescence;

現在、日常検査で実施されている薬剤感受性試験は、純培養

NADH、トリプトファン、ポルフィリン、フラビンなど）に励起光をされた集落を用いて薬剤を含む培地に一定の菌量を接種して照射して、その発光を測定するExcitation-Emission Matrices

18～24時間培養後に判定を行う。実際には、自動感受性シス（励起・蛍光マトリックス）で菌種を同定する技術が注目されてテムが頻用されているが、迅速パネルを利用しても報告までにいる（図８）。血液培養で陽性になった培養液を前処理（赤血球8～12時間を要する。近年、菌種の同定だけでなく、薬剤感受を溶解）後に集菌し、レーザー光を照射して、縦軸に励起光の性試験においても様々な技術革新の恩恵を受けながら、数時波長 (260～800 nm)、横軸に蛍発光の波長 (260～1,100間で感受性菌か耐性菌を判定する画期的な技術12）が登場してnm)をスキャンしたその画像パターン（図９）から約20分で菌種いる（表３）。質量分析法の活用、デジタル顕微鏡や光散乱法にを同定する。血液培養の陽性液1,121件を解析した結果、菌種よる菌数や菌体の形態変化をモニタリングしてMIC値に換算、レベルで96.5%の一致率であったとの報告11）がある。また、薬あるいは菌が内部に保有する蛍光物質を励起光と蛍光の画像

剤感受性試験においても本技術を適用して、薬剤作用後の内変化で捉えて、2～5時間で薬剤感受性を判定する技術である。

部発光のマトリックスパターン変化から感受性か耐性かを数時

これらの最新技術の適用は、現段階では血液培養液が主体で間で判定する（図10）。

あるが、今後は検体から直接の同定・薬剤感受性検査、
いわゆる感染症 ―薬剤耐性菌―

07

特集

06

蛍光分光法(Fluorescence Spectroscopy)を用いた菌種同定と薬剤感受性試験「Culture-Free Microbiology」の時代へ突入する可能性を

表３ 迅速な薬剤感受性検査の最新技術秘めている。

１．MALDI-TOF（質量分析装置）
１）耐性に関与する蛋白ピークの検出
２）
酵素活性のモニタリング
３）
薬剤と一定時間作用後のスペクトラム変化

08

２．デジタル顕微鏡（Accelerate Diagnostics社）
血液培養液（将来的にはBAL，便，尿検体）から直接の菌種同定と薬剤感受性試験を5時間で実施。薬剤作用による菌体の形態変化をデジタル顕微鏡で経時的にモニタリングする12)とは、院内環境のアウトブレイクの検知、感染源の特定や伝３．病原体に特異的な人工粒子＆蛍光法（GeneWeave社/Roche社）
菌種/属/科に特異的な人工粒子をファージのように菌体に取り込ませた後，薬剤と一定時間作用させた後その人工粒子の蛍光変化から判定
４．レーザー光散乱法（BacterioScan社）
血液培養液（将来的には臨床検体から直接）を薬剤と一緒に培養しながら細菌にレーザー光を照射して菌数，菌体の大きさや形態の変化をモニタリングしてMIC値に換算する。所要時間は2～5時間５．蛍光分光法
（図10）
血液培養液
（将来的には臨床検体から直接）レーザー光を照射して，縦軸に励起光の波長 (260～800 nm)，横軸に蛍光の波長 (260～1,100 nm)をスキャンした
その画像パターン（NADHの蛍光度合いほか）
から約4時間で判定11)

分子疫学的な解析法の新たな潮流分離菌株が同じ由来（クローン）であるか否かを判定するこ
播様式の探索のために重要である。いわゆる、株レベルの型別（タイピング）ではパルスフィールドゲル電気泳動法（PFGE法）に代表される制限酵素断片多型（RFLP）解析が主流である。PFGE法は現在でもタイピングのゴールドスタンダードであるが、操作が煩雑で解析に長時間を要するという欠点がある。近年、DNA塩基配列の決定が容易となったので、細菌の5～7領域のハウスキーピング遺伝子をそれぞれ400～600塩基を解読して、これらの配列を比較することでタイピングを行うmultilocus sequence typing (MLST)法が普及している。
MLST法の最大の特長は、主要な病原細菌や食中毒菌の解析
プロトコールがWebサイト（http://www.mlst.net/）
で公開されており、世界中の研究室や検査室で配列データを比較できることである。

Change in Total Cellular NADH in MRSA and MSSAQC Strains Cultured with Cefoxitin
250%MRSA% Change in Cellular
NADH Over Time

225%
200%
175%

MSSA-実験1
MSSA-実験3
MRSA-実験1
MRSA-実験2
MRSA-実験3

150%
125%
100%
75%
50%
25%

0%

1234MSSAMRSA after 1hr (L) and 2hr (R) with cefoxitin

MSSA after 1hr (L) and 2hr (R) with cefoxitin

Culture Timewith Cefoxitin (hrs)図10

蛍光分光法による薬剤感受性試験

Dr. Humphries, Rapid Phenotypic Susceptibility Testing of Bacteria
Antimicrobial Susceptibility Testing Update: Clinical and Laboratory Impact, 2015 ICAAC

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特集

その他の遺伝子型別法としては、細菌の反復配列（tandemrepeats）の多型を解析する反復配列多型分析法（VNTR法）感染症 ―薬剤耐性菌―がある。細菌ゲノム上の繰り返し配列領域をPCR法によって増幅して、その産物の大きさから繰り返し配列のコピー数を調べる方法で、おもに結核菌のタイピングに利用されている。repPCR（repetitive sequence-based PCR）法を用いた自動細菌タイピング装置としてDiversiLabシステムがシスメック・ビオ
メリュー社から販売されている。DNA抽出から自動結果解析までの所要時間は4時間と迅速かつ簡便で、日常検査の現場での活用が期待される．
関東化学から販売されているPOT (PCRアシネトバ
based ORF Typing)法13）はおもにMRSA、緑膿菌、クターのタイピングで実用化されている。ファージを構成するORF (open reading flame)の中からいくつか選んでマルチプレックスPCRで検出して、その保有パターンによって遺伝子型を決定する。
シークエンス解析で注目すべきは、生物発光を応用したパイロシークエンス法 の実用化である。この方法はPCR反応産物14）を加工することなく、そのままシークエンスできるので、大幅な省力化と自動化が特徴である。既にこの原理は第二世代シークエンサーにも応用されており、半日で数百メガ塩基を解読できる状況となっている。アウトブレイク時に次世代シークエンサーを用いて全ゲノム解析（Whole-genome sequencing）によ
ノロウイルス
る型別を実施した事例が、結核菌 、MRSA 、
15）

16）

17）などの病原体で報告されている。
さらには、塩基配列決定の能力が日進月歩の勢いで飛躍的に伸びている現在、“次の”第三世代シークエンサーや“次の次”第四世代シークエンサーの話題 18）も出ている。第三世代シークエンサーは1分子リアルタイム・シークエンスを原理としており、1分子のDNAを鋳型としてDNAポリメラーゼの合成速度（1秒間に数塩基）で塩基配列を解読できるので、短時間当たりの配列決定数が多く、コストダウンにも繋がっている。分離菌株の全ゲノムを1時間足らずで解読できるようになる日もそう遠くはないようである。

09

おわりに感染症検査のワークフローを一変させる遺伝子解析技術と質量分析法の概略そして迅速な薬剤感受性検査の最新動向を紹介した。これからの感染症診療においても、鏡検・培養・感受性試験の「三種の基本技術」が大切であることはいささかもかわらないが、全自動遺伝子検査システム、質量分析法による菌種の迅速同定などを適宜活用することにより、抗菌薬・抗ウイルス薬の適正使用、入院期間の短縮、医療関連感染の予防などから、費用対効果のさらなる向上を期待したい。

20

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