超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成
Organic synthesis by enzymes in supercritical CO2

東京工業大学 大学院生命理工学研究科 講師

松田 知子

TOMOKO MATSUDATokyo Institute of Technology, Department of Bioengineering, Associate Professor

1. はじめに

2. 加水分解酵素を用いるラセミ体アルコールの速度論的分割反応―立体選択性の制御3）二酸化炭素は、常温常圧では気体であるが、温度を31度（臨界温度）以上とし、圧力を73気圧（臨界圧力）以加水分解酵素であるリパーゼは、図2（a）に示すように、上とすると、 超臨界流体 となる。超臨界CO2は、図1に自然界では脂肪酸エステルを加水分解する酵素である。

示すように、液体と気体の両方の性質を併せ持つ溶媒

ところが、水が少ない環境、つまり、有機溶媒中で用いであり、高機能性溶媒として、様々な分野で利用されてると、その逆反応のエステル化反応を触媒する（図2（b））。

いる。例えば、拡散性が高いことや物質を溶かすことがアセチル化剤としては、vinyl acetateが頻繁に用いられできるため、コーヒー豆からのカフェインの抽出、ビールている。基 質のアセチル 化と同 時に 生 成するv i ny l

用のポップエキスの抽出、香料の抽出、クロマトグラフィ

alcoholがacetaldehydeに変換されるため、生成したエスー用の溶媒、染色、精密部品の洗浄等に用いられてきテルの分解反応を防げるためである（図2（c））。本研究た。また、有機合成反応や高分子合成の溶媒や反応剤

では、ラセミ体の二級アルコールを基質として用い、アセとしても用いられている1）。本研究では、超臨界CO 2中チル化反応を行った。R体とS体では反応速度が異なる

2）で酵素反応 を行い、光学活性体等の有用物質を合成ため、どちらかをエステルに変換して逆側をアルコールできたので、紹介したい。のままで残す速度論的分割反応が可能である（図2（d））。

図1（a）
CO2の相図（b）超臨界流体のイメージ（密閉された容器の中で液体を加熱すると、臨界温度で液相と気相の区別がなくなり、超臨界流体となる。
）8THE CHEMICAL TIMES 2005 No.3
（通巻197号）

超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成

図2（a）自然界でのリパーゼの反応 （b）
リパーゼの逆反応 （c）
アセチル化剤としてvinyl acetateを用いるアセチル化反応（d）ラセミ体アルコールの速度論的分割反応

反応の立体選択性を示す尺度としては、反応が速い異せると、分子の形がかわるため、その影響までが出てし性体と遅い異性体の反応速度の比であるE 値を用いまう。一方、超臨界CO2を用いると、分子の形は変化した。

ない。さらに、有機溶媒の性質は連続的に変化させることは不可能である。例えば、ヘキサンをヘプタンにするリパーゼの反応を、有機溶媒中ではなく、超臨界CO2と、炭素数は、6から7へと変化する。しかし、6.1や6.2

中で行った理由は、CO2は、1）安価であり、2）無害での炭素数の化合物は存在しないため、その間がどのよあり、3）地球上に多量に存在し、4）反応終了後は常圧うになっているのかは、調べることができない。ところが、に戻すだけで生成物と簡単に分離でき、5）拡散性が高超臨界CO2を用いる場合には、圧力や温度は連続的にいので反応速度が加速できるためである。さらに、超臨次第に変化させることができるので、立体選択性も連続

界CO 2は、その溶媒の性質を圧力や温度によって制御的に変化させることができる。

できる。超臨界流体は、図1（b）に示すように、気体のように密度が低い部分と液体のように密度が高い部分が図3に結果を示す。 図3（a）に示すリパーゼの反応の混ざっている状態であるので、例えば、少し圧力を上げ

立体選択性は、圧力や温度を変化させることにより連続ると、密度が高い部分が多くなり、その結果、溶解度や的に変化した（図3（b,c））。ここで、超臨界CO2を利用す

誘電率、拡散係数等の物理化学的な性質が大きく変化ると、圧力や温度により立体選択性を制御できることがする。本研究では、反応溶媒として用いるCO2の圧力やわかった。また、その変化は、密度の変化（図3（d））と温度が、リパーゼの立体選択性におよぼす影響を調べも関係深いことがわかった。ではなぜ、温度や圧力によた。有機溶媒の種類を変化させることにより、リパーゼ

り超臨界CO2の密度が変化すると、反応の立体選択性の反応の溶媒効果を検討した例は多数ある。しかし、が変化するのか考察した。CO2の酵素への吸着等によ有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒の種類を変化さる酵素の構造の微妙な変化が立体選択性に影響を与え

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ているのではないかと考えているが、詳しくは現在検討

そこでの説明に用いられている絶対反応速度式を、超中である。温度により立体選択性の制御に関しては、有臨界CO2中での反応を説明するためにも用いることがで

4）

機溶媒中のリパーゼの反応においても報告されており 、きた（図3（e））。

図3 超臨界CO2中でのリパーゼによるフルオロアルコールの速度論的分割反応の立体選択性におよぼす圧力および温度の影響 （a）反応スキーム （b）55 ℃での立体選択性におよぼす圧力の影響 （c）様々な温度での立体選択性におよぼす圧力の影響 （d）CO2の密度5）（e）CO2の密度一定条件下（0.75 g/mL）
での立体選択性におよぼす温度の影響

3. 加水分解酵素を用いるラセミ体アルコールの速度論的分割反応―大量合成6）わかった（図4（ a））。ラセミ体の1-phenylethanolとvinylacetate を用いて反応を行ったところ、R体のアルコールが 選 択 的にアセチル化され 、S 体は未 反 応であった

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超臨界CO 2を用いる反応では、高圧容器を必要とす（図4（ b））。まずラセミ体のアルコールとvinyl acetateのるため、なるべく単位スペースあたりの収率が高い方モル比を1:0.5とし、反応を行った。結果を表1に示す。

が有利である。そのため、フロー系の反応を行った。

反応はスムーズに進行し、ほぼ定量的にR体のアセテ反応には、Candida antarctica由来の固定化リパーゼートが高い光学純度で得られた。この時、立体選択性であるNovozym435を用いた。この酵素は固定化されを示すE値は非常に高く、1800以上であった。反応条ているので、反応管に簡単に充填できる。ラセミ体の件を検討したところ、vinyl acetateを少過剰量用いるこ

基質をCO 2と酵素を充填した反応管へ 送液することにとにより、収率を47%から50%へと向上させることが可より、生成物である光学活性化合物が連続的にしかも能であり、R体のアセテートのみではなく、未反応のS体バッチ式に比べて高い効率（400倍）で得られることがのアルコールも99%以上の不斉収率で得ることができ

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超臨界CO2中での酵素反応による有用物質の合成た。vinyl acetateを大過剰に用いても、S体のアルコー素（Novozym435）を用いて、221gの ラセミ体のアルコルの過剰反応は避けられた。また、圧力の検討により、ールを99%ee以上のS体のアルコールおよびR体のアセ9-20MPaの範囲で同様の結果が得られ、この反応は圧テートへと変換できた。本反応の、基質特異性の検討力に影響を受けないことがわかった。さらに、3日間のを行ったところ、 図4（d,e）に示すように、2-undecanolの連続運転反応を行ったところ、図4（c）に示すように収ような脂肪族や1-tetralolのような環状アルコールの速度率や立体選択性の低下は見られず、1.73gの固定化酵論的分割反応にも成功した。

図4（a）フロー系超臨界CO2反応装置の概要 （b）1-phenylethanolの速度論的分割反応（c）1-phenylethanolを基質とする3日間の連続運転反応（d）2-undecanolの フロー系速度論的分割反応（e）1-tetralolのフロー系速度論的分割反応

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表1. 超臨界CO2中でのリパーゼNovozym によるラセミ体1-phenylethanolのフロー系速度論的分割反応の条件検討

1-phenylethanol:vinyl acetate

圧力（S）-alcohol（R）-alcohol

変換率dEmol/mol

MPa%ee%ee%

1:0.50a13.089.6

99.7471850

1:0.60b

13.0

98.8

99.2501240

1:1.30c12.9>99.599.050>1000

1:1.30c

8.9>99.599.050>1000

1:1.30c

20.0>99.599.050>1000

反応条件：42-43 ℃, Novozym: 5.0 mL, 超臨界CO2流速：1.5 mL/min, 1-phenylethanolの流速：0.050 mL/min（1-phenylethanolとvinyl acetateの混合物の流速：a0.070 mL/min, b0.074 mL/min, c0.100 mL/min）d 1-phenylethanolを基準としたアセチル化体への変換率.

表2 チチカビによる超臨界CO2中でのケトンの不斉還元

4. アルコール脱水素酵素によるケトンの不斉還元反応7）
チチカビ（Geotrichum candidum IFO5767）由来のア
ルコール脱水素酵素はケトンの不斉還元反応を行うための触媒として有用であるが、超臨界CO2が反応媒体として有望であることも分かった。一般に水中での反応では、水からの生成物の抽出が困難であるが超臨界CO2中の反応では、分離の問題が解決できる。触媒としては、単離酵素ではなく、細胞を水と2-propanolの懸濁液とし、そこに吸水性ポリマーを加えることにより、ポリマー上に固定化、分散させたものを用いた。この反応により、初めてアルコール脱水素酵素が超臨界CO2中で活性を示すことを見い出した。また、様々な基質の還元反応は、非常に高い立体選択性で進行し、光学活性なアルコールが生成した。
（表2）。

5. 脱炭酸酵素によるCO2の固定化反応（カルボキシル化反応）8）であるため、超臨界CO 2中の反応においては細胞そのものを用いた。その結果、脱炭酸酵素によるピロールのカルボキシル化反応が、超臨界CO2中においても進行す12脱炭酸酵素を超臨界CO 2中で用いると、その逆反応ることを見い出した（図5（a））。系内を0.1 MPa（常圧）ににより、CO 2 の 固定化反応が 開発できる。ここでは、保つと反応はほとんど進行せず、10 MPaの方がはるか

Bacillus megaterium PYR2910由来の脱炭酸酵素を、超に速く進行した（図5（b））。圧力は臨界点付近以下の圧

臨界CO2層と水層の二層系の反応系で用いた。この酵力で収率は最高となり、臨界圧力以上で減少した（図5

素は、長澤らにより通常の条件において効率的にピロー（c））。水層のpHの低下や、基質と生成物の水層と超臨ルのカルボキシル化反応を触媒し、ピロール-2-カルボキ界CO2層への分配等が原因であると考えられる。このシシレートを36g/L蓄積できることが見い出されている。単ステムは他の脱炭酸酵素を用いたCO2の固定化反応に離された酵素よりは細胞中に存在する酵素の方が安定も応用可能であり、今後のさらなる発展が期待される。

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図5 （a）Bacillus megateriumによる超臨界CO2中でのピロールのカルボキシル化反応 （b）
経時変化 （c）
圧力の影響

6. まとめ超臨界CO2を利用したバイオプロセスの開発は、始まったばかりであり、超臨界流体の特徴を十二分に生かせる系を構築するには、多くの技術的改良および新しい反応の開発が必要である。今後、これらの研究開発が進めば、CO2を用いた新規合成反応群が生み出されるだろう。最終的には、微生物や植物がCO2をバランス良く循環させているように、人類も酵素を駆使することにより自然界に多量に存在するCO2を用い、持続的社会を築けるようになることが期待される。

7. 謝辞
本研究を行うにあたり、龍谷大学理工学部の原田忠夫教授に御指導頂き、感謝致します。また、本研究は龍谷大学理工学部原田研究室の卒業生の皆様との共同研究の結果であり感謝致します。また、3章のリパーゼによる光学活性体の大量合成は、碇屋隆雄教授、有田佳生氏、美澄幸弘博士、市川真一郎氏（東京工業大学）との共同研究であり、4章のアルコール脱水素酵素の反応は、中村薫助教授（京都大学）との共同研究であり、5章の脱炭酸酵素の反応は、長澤透教授（岐阜大学）との共同研究であり、ここに感謝致します。

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