ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

研究課題名

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

フリガナ

マツモト ケンジ

代表者名

松本 健治

所属機関 （機関名） 国立成育医療研究センター研究所 免疫アレルギー ・ 感染研究部（役職名） 部長氏 名 （フリガナ）

共同研究者

所属機関 ・ 役職名
役割分担
La Jolla Institute for Allergy and研究計画の川上敏明 ( カワカミトシアキ ) Immunology, University of California San
立案と解析
Diego, 教授

Ando T, Kashiwakura JI, Itoh-Nagato N, Yamashita H, Baba M, Kawakami Y, TsaiSH, Inagaki N, Takeda K, Iwata T, Shimojo N, Fujisawa T, Nagao M, Matsumoto K,
本助成金による発Kawakami Y, Kawakami T. Histamine-releasing factor enhances food allergy.
表論文， 学会発表
J Clin Invest. 2017 Dec 1;127(12):4541-4553
他、 学会発表３件 （後述）

研究結果要約
食物アレルギーは、 食物抗原を摂食後、 即時型アレルギー反応を起こすケースが多く、 時に生命の危険を来すアナフィラキシーが誘発される。 食物アレルギーにはアレルゲンの除去および減感作療法以外には確立された治療法はなく、 本研究はヒスタミン遊離因子 (HRF) の機能を抑制する治療法の開発を最終目標としている。 HRF は IgE を介した免疫応答に対して、 in vivo でマスト細胞表面で IgE や IgG に結合してマスト細胞の活性化を増幅し、 結果的にマスト細胞の増殖を誘導して腸管の炎症を増悪させることが明らかとなった。 また、 マウスの IgE を介した免疫応答に HRF の結合を阻害する活性を有するペプチドを前投与することによって症状をほぼ完全に抑制し、 また症状発現後に投与することでも約 70% の効果が得られることが明らかとなった。 この結果は生体内で HRF が in vivo での IgE を介した反応を増幅しており、その阻害が IgE を介するアレルギー応答の治療薬として有用である事を示唆するものである。 また、 HRFはマスト細胞や好塩基球の遊走を起こさせず、 抗体をタンパク質分解酵素から守る機能はなく、 腸管内細菌の成長に影響しなかった。 さらに、 経口免疫寛容の奏功機序の全貌は明らかとなっていないが、 HRF結合性 IgE の減少がその一部である可能性が示唆された。

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ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

研究目的

果を示すかをマウスモデルで検討する。 (II) 腸

食物アレルギーは、 近年患者数が増え、 社

管での HRF の定常状態における機能を解析す会問題になっている。 食物抗原を摂食後、 即る。 (III) マウスの食物アレルギー誘発モデルと時型アレルギー反応を起こすケースが多く、 時免疫寛容モデルを用いて、 HRF と HRF 反応性に生命の危険を来すアナフィラキシーがおこる。

抗体の変化を解析する。 HRF 阻害剤は Fc ε RI

経口免疫療法による免疫寛容の成功例が報告と複数の IgG 受容体 （Fc ε Rs） による活性化されつつあるが、 食物アレルギーには確立されを抑えることから、 Fc ε RI による活性化だけをた治療法はなく、 新規の治療法の開発は喫緊

抑える Omalizumab （抗 IgE 抗体で食物アレルの研究課題である。 IgE 依存性の食物アレルギ

ギーに効果あり） より高い治療効果が期待でき、ーには、 動物モデルの研究により、 IgE とそのかつ安価に製造できる。 ペプチド由来の HRF受容体 Fc ε RI を介したマスト細胞の活性化が阻害剤は、 アレルゲンを含む可能性のある食品重要であることが知られている。 ヒスタミン遊離を摂取する前に服用することで、 食物アレルギ因子 (HRF) は、 N 末端の 19 アミノ酸と H3 ドメーを未然に防ぐ、 あるいは症状を軽減すること

インの 2 箇所で約 30% の IgE 抗体（IgG 抗体とも）が出来ると思われる。 また、 少なくとも、 免疫療と直接結合でき、 ２量体として存在する HRF が法施行時の抗原投与によるアナフィラキシーをIgE と結合した複数の Fc ε RI を会合させて、マ防ぐことが期待できる。 また、 HRF 反応性 IgEスト細胞を活性化できることが、 これまでに本申抗体価が免疫療法の治療効果の客観的指標と請者らによって明らかになった１）。 標準的なマなる可能性がある。

ウスの食物アレルギーモデルを用いて、HRF は、アレルギー症状の誘発期 （感作期ではなく） に研究計画及び研究手法炎症増悪作用があることが明らかにした。さらに、

I. 食物アレルギー治療に最適な HRF 阻害剤

経口投与した HRF 阻害剤は特異的に小腸のマの選択スト細胞に結合すること、 HRF は腸管で細胞外計画 ： 抗原 ovalbumin (OVA) で ip 免疫したママトリクスと同じような分布を示すことを明らかにウスに、 同じ抗原を複数回経口投与して下痢をした。 また、 急速経口免疫療法を施行後１年後発 症 さ せ る。 HRF 阻 害 剤 (GST-N19 ま た はに鶏卵アレルギーを克服できなかった患児でHRF-2CA[HRF の単量体 ]) を抗原投与の直前

は、血中 HRF 反応性 IgE が増加すること （HRFに投与すると下痢の発症が抑えられることは、濃度や HRF 反応性 IgG は変わらない） も明ら10 回以上の実験で確かめられている。 下痢発かにした。以上の結果に基づいて、本研究では、症後に HRF 阻害剤を投与した場合も、 下痢の(I) HRF-IgE 間の結合を抑える HRF 阻害剤を、発症頻度と重症度を 70% 以上低下させられる。

ヒト患者に使用することを最終目標として開発す

ヒト患者に使用できる HRF 阻害剤として、 阻害る。 候補として、 阻害効果の強い 3 種のペプチ効果の強さから HRF の N 末端部分に由来するド由来阻害剤のうちどれが最大の予防 ･ 治療効N19, N25, N32 が考えられる。 これらのペプチド38

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発をそのまま、 または化学修飾 （N 末端のアセチincubate してから細菌の成長を調べる。

ル化や PEG 化、 C 末端のアミド化） して安定性と可溶性を高めて検討する。 下痢症状を呈し

III. 経 口 免 疫 寛 容 モ デ ル に お け る HRF とたマウスに２回の抗原投与前に HRF 阻害剤をHRF 反応性抗体の変化の解析
Yamashita らの経口免疫寛容モデルを用いる

種々の経路で投与し、 下記①～⑥を指標として阻害剤の治療効果とその機序を検討する。

(Allergy, 2012)。 ip 免疫前に OVA を 3 日連続実施内容 ：飲ませることで、 上記の食物アレルギーとほぼ①下痢の重症度 ・ 直腸温。 ②最終抗原暴露後同じ OVA 感作と OVA 摂食による下痢の発症に腸管組織を染色。 炎症度は、 H&E 染色で、が抑えられる。 経口免疫寛容モデルにおけるマスト細胞数は、 chloroacetate esterase 染色でHRF 反応性 IgE の変化が、 鶏卵アレルギー患測定。 ③血中 HRF 濃度および HRF 反応性抗児に対する急速免疫療法の効果と相似であるな

体価を ELISA 法で測定。 ④抗原暴露後、 リンらば、 HRF 反応性 IgE が低下するはずである。

パ節を回収し、 抗原で再刺激後、 各種のサイト

実施内容 ：カ イ ン 産 生 を ELISA 法 で 測 定。 ⑤ DNA

ip 免疫前に OVA を 3 日連続飲ませた場合と、microarray( または RNA-Seq) 法で腸管の網羅

この免疫寛容の操作をしない場合の２つのグル的な遺伝子発現解析。

ープに OVA 感作と OVA 摂食をさせ、 それによって下痢の発症程度や、 他の炎症症状の変II. 腸管での定常状態における HRF の機能解化、 とくに、 血中 HRF 濃度および HRF 反応性

析計画 ： 共焦点蛍光顕微鏡により、 HRF は小IgE 抗体価を測定する。 ついで、 より臨床に近腸でコラーゲンなどの細胞外マトリクスと同じようい条件で （はじめに食物アレルギーを発症させな分布を示すことが明らかになった。 可能性がてから、 比較的少量の OVA を摂食させることにある HRF の機能を以下のように調べる。

より、 脱感作させてから） HRF 反応性抗体の変実施内容 ：化を解析する。

①小腸の組織を抗 IgG、 抗 IgE、 抗 IgA 抗体で計画から外れて実施した内容：

染めて共焦点蛍光顕微鏡で観察し、 HRF 反応性抗体を保持する役割があるかを調べる。 ②抗原 ovalbumin (OVA) を i.p. 注射によって感HRF が HRF 反応性 IgE を細胞表面にもつマス作したマウスに、 同じ抗原を複数回経口投与しト細胞や好塩基球を遊走させるかを Transwellて下痢を発症させ、 HRF 阻害剤 (GST-N19 まを用いて調べる。 ③ IgG, IgE, IgA を小腸内のたは HRF-2CA[HRF の単量体 ]) を抗原投与のタンパク質分解酵素と HRF 存在下ないし非存直前に投与すると下痢の発症が抑えられること

在下で incubate してから SDS-PAGE で解析し、は、 理研でおこなった 10 回以上の実験で確か

HRF が抗体をタンパク質分解酵素から守る機能められている。 下痢発症後に HRF 阻害剤を投が あ る か 調 べ る。 ④ 腸 管 内 細 菌 と HRF を与した場合も、 下痢の発症頻度と重症度を 70%

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ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発以上低下させられる。 ところが、 LJI では同じ条析

件でも安定的かつ客観的に下痢重症度が判定

研究の結果：HRF はマスト細胞や好塩基球のできず、 より客観的な指標が必要だと結論され遊走を起こさせず、 抗体をタンパク質分解酵素た。 この問題は、 安価な温度計で多数のマウスから守る機能はなく、 腸管内細菌の成長に影響の体温を短時間で測ることで解決できた。 さらしなかった。に、 アナフィラキシーによる体温の低下が最も大きいのは 3、 4 回目の抗原投与時であること

III. 経 口 免 疫 寛 容 モ デ ル に お け る HRF とが判明した。

HRF 反応性抗体の変化の解析
研究の結果：

結果と考察

ip 免疫前に OVA を 3 日連続飲ませてから

I. 食物アレルギー治療に最適な HRF 阻害剤

OVA 感作と OVA 摂食をさせた場合 （経口免の選択疫療法） には、 この免疫寛容の操作をしない

当初、 LJI でのマウス実験が理研のときのよう場合に比して、 下痢の発症程度や、 他の炎症に下痢の重症度の判定ができず進捗が遅れた。

症状が有意に軽度であった。 また、 この変化にしかし、 上述のように問題は解決した。

つ れ て、 経 口 免 疫 療 法 を 行 っ た マ ウ ス で は研究の結果：HRF 結合性 IgE が減少した。

実験系が安定した後に行った結果では、 経以上の研究成果から、 HRF は IgE を介した口投与した HRF-2CA は特異的に小腸のマスト免疫応答に対して、 in vivo でマスト細胞表面で細胞表面に結合して、 ex vivo での抗原や HRF

IgE や IgG に結合してマスト細胞の活性化を増によるマスト細胞の活性化を抑制した。 また、幅し、 結果的にマスト細胞の増殖を誘導して腸胃内に OVA を反復投与することによって誘導さ管の炎症を増悪させることが明らかとなった。 まれ る 下 痢 や 消 化 管 の マ ス ト 細 胞 の 増 多 は、た、 この系に HRF の結合を阻害する活性を有Histamine-releasing factor (HRF) の IgE や IgGするペプチドを前投与することによって下痢をほへの結合を阻害するペプチド （GST-N19） やぼ完全に抑制し、 また症状発現後に投与するこHRF 阻害剤 （HRF-2CA ： HRF の単量体） のとでも約 70% の効果が得られることが明らかとな投与によって著明に阻害された。 また、 GST-った。 この結果は HRF が in vivo での IgE を介

N19 投与によって腸管上皮の IL-4 や IL-13 のした反応を増幅しており、 その阻害が IgE を介mRNA 発現も著明に低下した。これらのことから、するアレルギー応答の治療薬として有用である

HRF にはアレルギー症状の誘発期 （感作期で事を示唆するものである。

はなく） の炎症増悪作用があることが示唆されまた、 経口免疫寛容の奏功機序の全貌は明た。

らかとなっていないが、 HRF 結合性 IgE の減少がその一部である可能性が示唆された。

II. 腸管での定常状態における HRF の機能解40

ヒスタミン遊離因子の阻害による食物アレルギー治療薬の開発

論文発表などの第二世代の HRF 阻害剤の開発にも注力

Ando T, Kashiwakura JI, Itoh-Nagato N,したいと思います。 また、 HRF の産生機序や、

Yamashita H, Baba M, Kawakami Y, Tsai SH,

免疫療法が HRF の産生や IgE 抗体の HRF 結Inagaki N, Takeda K, Iwata T, Shimojo N,

合性に与える影響のヒトでのデータなど、 極めFujisawa T, Nagao M, Matsumoto K,て重要な課題がこのされております。

Kawakami Y, Kawakami T.

本研究を更に強力に推進してゆきたいと考え

Histamine-releasing factor enhances foodております。 今後もご指導ご鞭撻を宜しくお願allergy.

い申し上げます。

J Clin Invest. 2017 Dec 1;127(12):4541-4553
参考文献学会発表1） K ashiwakura J, Ando T, Matsumoto K,th1 The 8 EMBRN International Mast Cell andKimura M, Kitaura J, Matho MH, Zajonc

Basophil Meeting, May 25-27, 2017, Prague,DM, Ozeki T, Ra C, Macdonald SM,Czech Republic.

Siraganian RP, Broide DH, Kawakami Y,

2 J ohns Hopkins University Symposium,

Kawakami T. Histamine-releasing factor has

November 17, 2017, Baltimore, MD, USAa proinflammatory role in mouse models of3 G ordon Research Conference on Foodasthma and allergy. J. Clin. Invest. 2012

Allergy, January 7-12, 2018, Ventura, CA,

Jan;122(1):218-228.

USA2） Brandt EB, Strait RT, Hershko D, Wang Q,Muntel EE, Scribner TA, Zimmermann N,

今後の研究活動について

Finkelman FD, Rothenberg ME. Mast cells

HRF が食物アレルギーを始めとするアレルギ

are required for experimental oral allergen-ー疾患の増悪に寄与していることは、 疑う余地

induced diarrhea. J. Clin. Invest. 2003がないほどデータが蓄積してきております。また、

Dec;112 (11):1666-177.

HRF 阻害剤がヒトに応用できる可能性はまだ直3） Yamashita H, Takahashi K, Tanaka H, Nagai

接 の 証 拠 が な い も の の マ ウ ス で の Proof ofH, Inagaki N. Overcoming food allergy

concept (POC) はほぼ固まったと考えられます。

through acquired tolerance conferred by

今後、 現在の候補群から最適な HRF 阻害剤をtransfer of Tregs in a murine model. Allergy

決定して、 なるべく早く臨床試験に進むことを第2012 Feb; 67(2):201-209.

一に考えております。 しかし、 さらに薬物製剤

4) K a w a k a m i T , B l a n k U . F r o m I g E t o法の改良 （たとえばコートする） や抗体の開発

omalizumab. J.Immunol. 2016;197:4187-419

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