研究用試薬

iPS 細胞作製用センダイウイルスベクターキット

本製品は、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘナ法）」の対象品です。

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目次
I． 本製品 CytoTune®-iPS 2.0 について
II． センダイウイルスベクターについて・ センダイウイルスベクターの特徴
・ センダイウイルスについて・ センダイウイルスのベクター化について......................................... 3......................................... 3......................................... 3......................................... 4......................................... 4

III． CytoTune®-iPS 2.0 を使用した iPS 細胞の作製について ............................ 5・ 本製品の構成......................................... 5・ 搭載遺伝子の情報......................................... 5・ 輸送温度、保存温度......................................... 5・ 本製品以外に必要な器具・試薬......................................... 51) 器具･装置......................................... 52) 試薬類および培地......................................... 5・ 本製品を使用した iPS 細胞誘導の実施例......................................... 6
１． ヒト新生児包皮由来線維芽細胞（BJ 細胞）からの iPS 細胞
誘導実施例......................................... 6［iPS 細胞誘導手順］......................................... 6
２． 末梢血単核球（PBMC）からの iPS 細胞誘導実施例 ....................... 7［血液用の試薬］......................................... 7［iPS 細胞誘導手順］......................................... 8
３． マウス胎児繊維芽細胞からの iPS 細胞誘導実施例 ...................... 8［MEF 用の試薬］......................................... 8［iPS 細胞誘導手順］......................................... 9
４． iPS 細胞誘導後（共通）....................................... 10［アルカリホスファターゼ（ALP）染色］ ....................................... 10［SeV ベクターフリーの iPS 細胞の取得］ ...................................... 10
参考：SeV ベクターの検出方法....................................... 11

IV． Q&A
V． 参考文献....................................... 12....................................... 12....................................... 12・ 参考文献VI． 本製品の使用上の注意点....................................... 13....................................... 13....................................... 13・ 必ずお守り下さい
・ 付記-2v.2.6.12

I．本製品 CytoTune®-iPS 2.0 について
CytoTune®-iPS は、効率的な核初期化に必要な、いわゆる山中 4 遺伝子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC）をセン
ダイウイルスベクター（SeV ベクター）に搭載した製品です。これらを適切に使用することにより、ヒトなどの体細胞から人工多能性幹細胞（iPS 細胞）を誘導できることが示されています。SeV ベクターの特性により、本製品で誘導された iPS 細胞は染色体に傷害がなく、細胞からベクターや導入した核初期化遺伝子を取り除くことが出来ます。
また、本製品で使用されている SeV ベクターは、遺伝子導入細胞から感染性ウイルス粒子を産生、放出しないなど、環境と安全性への影響について配慮した改良がなされています。
CytoTune®-iPS 2.0 では、OCT3/4、SOX2、KLF4 を一つの温度感受性の SeV ベクターに搭載し(KOS ベクター)、これと KLF4、c-MYC ベクターを組み合わせることにより 従来の製品より効率のよい誘導と、迅速なベクター消去を実現いたしました。
本製品は、センダイウイルスベクターに関する株式会社ＩＤファーマの特許上の独占的技術と、核初期化遺伝子に関する iPS アカデミアジャパン株式会社の独占的技術から構成されています。

II. センダイウイルスベクターについて・ センダイウイルスベクターの特徴
本製品で使用されている SeV ベクターは以下の特徴を持っています。
1） 細胞質で RNA として機能するため標的細胞の染色体に組み込まれることが原理的になく、遺伝毒性がな
い2） 分裂、非分裂細胞を問わず、ヒトを含むさまざまな動物細胞種（少なくとも哺乳動物と鳥類細胞を含む）に遺伝子導入が可能である（naïve T 細胞†、一部のがん細胞などで導入効率が低い例があり、その場合は工夫を必要とする）
3） 低い感染価（少ないベクター量）でも高い遺伝子導入効率が得られる
4） 標的細胞との短い時間の接触でも高い遺伝子導入効率が得られる
5） 搭載遺伝子の高い発現が得られる
6） 遺伝子導入 6～10 時間後から発現を確認することができる（最大の発現は 24 時間以降）
7） 標的細胞の処理後、ベクターおよび導入遺伝子を細胞から除去することができる
8） 遺伝子導入細胞から感染能を持つウイルス粒子は産生されない
9） ヒトでの病原性が報告されていないセンダイウイルスからデザインされたベクターである
このような特徴から、SeV ベクターは細胞質型 RNA ベクターという新しい概念の遺伝子デリバリーシステムとして、遺伝子治療、遺伝子ワクチンとして開発されている他、広くバイオ分野の研究ツール、バイオプロダクツの製造ツールとして使用されています。
†：Okano, S. et al. Gene Ther, 10, 1381-1391(2003).

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・センダイウイルスについて
センダイウイルス（Sendai virus, SeV）は、マウスやラットの呼吸器感染ウイルスであり、パラミクソウイルス科のマウスパラインフルエンザウイルス 1 型に分類されます。SeV は 1950 年代前半に日本で初めて分離され、SeV という通称以外に HVJ（Hemagglutinating Virus of Japan） とも呼ばれています。1 本のマイナス鎖 RNA（全長 15,384 塩基）をゲノムにもつ直径 150-250 nm のエンベロープ型ウイルスです。ゲノムには 3’末端から順に、ヌクレオカプシド
蛋白質（Nucleocapsid Protein, NP）、RNA ポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化蛋白質（Phosphoprotein, P）、
ウイルス粒子構造を内側から維持するマトリクス蛋白質（Matrix protein, M）、標的細胞への侵入にかかわる膜融合 蛋 白 質 (Fusion protein, F) 、 標 的 細 胞 と の 結 合 に か か わ る 赤 血 球 凝 集 素 / ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ（Hemagglutinin-Neuraminidase, HN）、RNA ポリメラーゼの大サブユニットである巨大蛋白質（Large protein, L）の主
要な 6 種の蛋白質をコードする遺伝子が配置されています。細胞表面のシアル酸を主要な受容体として感染する
ため、多くの動物種の多様な細胞に接着可能です。感染が成立するためには、膜融合蛋白質が、標的細胞のプ
ロテアーゼにより活性化される必要があります。感染後は、細胞質内で自己複製と自己蛋白質の産生を経て娘ウ
イルス粒子として放出されます。

・ センダイウイルスのベクター化について本製品に使用されている SeV ベクターは、NP、P、M、F（活性化済み）、HN、L の構成蛋白質と F 遺伝子を欠失させた SeV ゲノムより構成されています。広範な細胞への遺伝子導入能を維持している他、SeV ゲノム上より F 遺伝
子を欠失させて、遺伝子導入細胞から感染可能なウイルス粒子が産生されないよう工夫されています。また、温度感受性変異などアミノ酸レベルの変異を導入してベクターを除去しやすいようにしています（SeV/TS∆F および
SeV/TS15∆F）。
染色体に組み込まれて遺伝子を発現するレトロウイルスベクター、あるいは細胞核内で染色体から離れて DNA
として存在し、一定頻度で染色体に組み込まれる恐れがあるアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクタ
ー、プラスミドベクターなどに対し、SeV ベクターは細胞質で全生活環を通して RNA の状態で存在するため、染色体ゲノムへの組込みによる挿入変異や染色体の構造変化を惹起する恐れがありません。
パラミクソウイルスまたは SeV のベクター技術の商業的利用にかかわる特許上の権利は、日本を含む世界主要
各国で株式会社ＩＤファーマが独占的に所有しています（特許 3602058、特許 4999330、特許 5438149、特許5763340 、 特 許 5908838 、 US 8,741,650 、 US 9,127,256 、 US 9,695,445 、 US 9,090,909 、 CN ZL805673.0 、 CN
ZL200580009182.8、CN ZL200980136168.2、CN ZL201180052632.7 、EP 1186667、EP 2434020、EP 2322611、EP
2612911、CA 2,553,976、AU 2011297075）。

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III．CytoTune®-iPS 2.0 を使用した iPS 細胞の作製について

・ 本製品の構成
チューブ SeV KOS (Tube KOS)：橙キャップ SeV(PM)hKOS/TS12ΔF

100 µL（5 x 106 CIU 以上/ 100 µL）

チューブ SeV Klf4 (Tube Klf4)：赤キャップ SeV18+hKLF4/TSΔF

100 µL（5 x 106 CIU 以上/ 100µL）

チューブ SeV Myc (Tube c-Myc)：白キャップ SeV(HNL)hC-Myc/TS15ΔF

100 µL（5 x 106 CIU 以上/ 100µL）

ヒト線維芽細胞株 BJ 細胞を用いた場合、1x106 の細胞に対して１回の実験が可能です。
力価については添付の COA をご参照下さい。本製品は無菌試験、マイコプラズマ否定試験、エンドトキシン否定試験合格品です。

・ 搭載遺伝子の情報
本製品は下記に示す遺伝子情報（GenBank Accession No.）に基づきヒト遺伝子を用いて構築しています。
OCT3/4：NM_002701.4
SOX2: NM_003106.2
KLF4: BC029923.1
c-MYC: K02276.1

・ 輸送および保管温度
本製品の輸送はドライアイスで行なわれます。
受取後は-80ºC で保管して下さい。
COA の保証期限以内に使用して下さい。

本製品以外に必要な器具・試薬
1）器具･装置
・ CO2 インキュベーター
・ 恒温槽 （ウォーターバス）
・ 培養プレート(100 mm 培養ディッシュ、6-ウェルプレート、12-ウェルプレート)・ プラスチック（ポリプロピレン）遠心管(15 mL)・ プラスチックピペット (5 mL、10 mL)
・ 微量ピペット(200 µL、1000 µL)・ 倒立顕微鏡・ ステムセルカッティングツール （例 Cat. No. VTL-14601, 株ベリタス）
・ トランスファーピペット （例 Cat. No. VTL-14319, 株ベリタス）

2）試薬類および培地
・ ダルベッコ変法基本培地 (D-MEM )高グルコース・ Basic fibroblast growth factor（bFGF）: human recombinant
・ ES 細胞用培地 (4ng/mL bFGF を含む)
・ ROCK 阻害剤:Y27632
・ 0.1 % ゼラチン水溶液-5v.2.6.12

・ フィーダー細胞 (マイトマイシン C 処理済みマウス胎児線維芽細胞：MEF)
・ ES 細胞用剥離液
・ ES 細胞用凍結保存液
・ 0.25%トリプシン-EDTA 溶液
・ Fetal Bovine Serum （FBS）
・ ペニシリン-ストレプトマイシン溶液
・ PBS
・ anti-Sendai Virus 抗体（Cat. No. PD029, 医学生物学研究所：MBL）
・

iPS Transgene/SeV検出用プライマーセット（Cat. No. IDT-DV0304, 医学生物学研究所:MBL）・

10Nマイルドホルム（WAKO）

・ 本製品を使用した iPS 細胞誘導の実施例
本例示は、本製品使用者が標的とする細胞からの iPS 細胞誘導を保証するものではありません。

１．

ヒト新生児包皮由来線維芽細胞（BJ 細胞；ATCC No. CRL2522）からの iPS 細胞誘導実施例［iPS 細胞誘導手順］
1. BJ 細胞を、ステップ 2 操作後に 5x105cells/well になるように 6-ウェルプレートの 2 ウェルへ播種する（初期化効率に影響する可能性があるため、なるべく継代数の若い細胞を使用する）。
2. CO2 インキュベーター（37ºC、5% CO２）で 1〜2 晩培養する。細胞が十分接着伸展していることを確認する。
3. -80C̊ で保存されている CytoTune®-iPS 2.0 の各チューブ下端を順に 37C̊ 温浴に接触させ、それぞれ一部
解凍後スピンダウンし、速やかに氷中へ移す（半分くらい融解したところで素早く温浴から取り出し、余熱で最後まで溶かして氷中に移す）。
4. 15 mL ポリプロピレン遠心管に 10% FBS/D-MEM 2 mL を入れ、そこに 3 種類のチューブ（KOS、KLF4、
c-MYC）のベクター溶液を添付データシートに記載 された分量をそれぞれ加える（106 細胞に対し MOI=5となる）。5 mL のプラスチックピペットで数回ピペッティングし、5 分以内にステップ 5 に従って遺伝子導入を行う。
注）解凍後のベクターは、再凍結、再融解せず使い切るようにすること。

5. ステップ 2 で用意した BJ 細胞の培地を吸引除去し、直ちにステップ 4 で用意した CytoTune®-iPS 2.0 培地
混液半量を、細胞が剥がれないように静かに培養ウェルそれぞれに添加し、全体によくなじませる。
6. CO2 インキュベーター（37ºC、5% CO２）に 6-ウェルプレートを移す。
7. 24 時間培養後、10% FBS/D-MEM で培地交換する（2 mL/well）（遺伝子導入の翌日以降、細胞が丸くなり、接着が弱くなる場合もあるので培地交換は丁寧に行う。一部の細胞が剥がれた場合でもそのまま次のステップに進む）。
8. CO2 インキュベーター（37ºC、5% CO２）でさらに 5〜6 日間培養する（10% FBS/D-MEM を用いて毎日培地交換する）。
9. ステップ 10 の細胞継代の前日にフィーダー細胞を準備する（予めゼラチンコートした培養ディッシュ*に 1〜1.5×106 cells/100mm dish になるように MEF を播種する、翌日 10% FBS/D-MEM を用いて培地交換を行う）。
*0.1%ゼラチン水溶液を 4 mL/100mm dish または 1 mL/well （6〜12 well）添加し、培養容器によくなじませ、37ºC
で 30 分から一晩静置する。使用直前にゼラチン溶液を除く。

10. 遺伝子導入の 6〜7 日後、培地を取り除き、PBS で 1 度洗浄した後、PBS で 5 倍希釈した 0.25%トリプシン-EDTA 溶液 500 µL/well を加え室温で静置する。細胞が丸くなったことを確認したら、培地（ 10%
FBS/D-MEM）を加えた後、細胞を剥離回収する（iPS 細胞の誘導効率に影響する可能性があるため、トリプシン処理は必要最小限にとどめる。ステップ 11 の重層時に細胞塊が残ってもよい）。
11. 細胞数を計測し、ステップ 9 で用意したフィーダー細胞上に、誘導した細胞を約 1×104 ター検出の陽性コン-6v.2.6.12

トロールに使用することができるので、凍結してとっておくと良い）。
12. CO2 インキュベーター（37ºC、5% CO２）に培養ディッシュを戻す。
13. 24 時間培養後 ES 細胞用培地に交換し、37ºC、5% CO2 インキュベーターに移す。以降、同培地にて毎日培地交換する。
14. ステップ 15 のコロニー継代の前日にフィーダー細胞を準備する（予めゼラチンコートした 6-ウェルプレートに 1.7〜2.5×105 cells/well もしくは、12-ウェルプレートに 5〜9×104 cells/well になるように MEF を播種す
る）。
15. 遺伝子導入から約 20 日以降コロニーが大きくなった段階で、現れたコロニーをステップ 14 で用意した 6ウェルプレート上に顕微鏡下で IVF 用ガラスピペットを用いて移し替える（10µM ROCK 阻害剤、ES 細胞用培地を使用する）。
16. CO2 インキュベーター（37C̊、5% CO2）に 6-ウェルプレートを戻す。
17. 翌日 ES 細胞用培地に交換し、以降同培地にて毎日培地交換する。
18. ステップ 15 のコロニー継代の 5〜7 日後より継代を行う（通常の ES/ iPS 細胞の培養方法に従う）。
２．

末梢血単核球（PBMC）からの iPS 細胞誘導実施例［血液用の試薬］
・ Ficoll-Paque PREMIUM：Cytiva, Cat. No. 17-5442-02
・ StemPro-34 SFM (1X), Liquid：Life Technologies, Cat. No. 10639-011
・ SCF (c-Kit Ligand) Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC2116
0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用
Stock concentration：100 µg/ml
Working concentration：100 ng/mL
・ FLT-3 Ligand Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC9414
0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用
Stock concentration：100 µg/ml
Working concentration：100 ng/mL
・ TPO (Thrombopoietin), Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC9514
0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用
Stock concentration：20 µg/ml
Working concentration：20 ng/mL

・ IL6 Recombinant Human Protein：Life Technologies, Cat. No. PHC0065
0.1％ BSA/D-PBS 溶液に溶解して使用
Stock concentration：10 µg/ml
Working concentration：10 ng/mL
・ PBMC 用培地
StemPro-34 Nutrient を 4℃で終夜、融解
融解後、StemPro-34 SFM ボトルに添加、優しく完全に混合
L-Glutamine を添加 5 ml
・ PBMC 用完全培地（PBMC 用培地）：
PBMC medium

100 mlSCF stock solution

100 µl

FLT-3 stock solution

100 µlTPO stock solution

100 µlIL6 stock solution

100 µl2-8℃で 30 日間、使用可能-7v.2.6.12

［iPS 細胞誘導手順］
1. 採血（採血管 2 本分 9 ml x 2 本）を行なう。
2. Ficoll-Paque PREMIUM を 4 ml ずつ 15 ml チューブ 5 本に分注する。
3. 血液と D-PBS を 1：1.5 で混合し、ステップ 2.で準備したチューブに 8 ml ずつ、ステップ 3.で準備した希釈
血液を Ficoll-Paque PREMIUM の上に優しく上層する。
4. 400 x g,18℃で 30 分間遠心し（加速、減速ともにブレーキ解除）、 遠心後、白く濁った中間層をピペットマ
ンで回収し、新しい 15 ml チューブに移す。1 本より 1 ml 程度回収。5 本分をまとめて 1 本にする。
5. 回収した PBMC に対し D-PBS 9 ml を添加し、100 x g, 18℃, 10 分間遠心する。
6. 上清を除去し、D-PBS 12 ml を添加する。
7. 細胞懸濁後、100 x g, 18℃, 10 分間遠心する。
8. 上清を除去の後、PBMC CM 培地を添加（5 ml）し、懸濁する。
9. トリパンブルー染色液を用いて細胞数をカウントする。
10. PBMC CM 培地を用いて 5 x 105 cells/well/ml で 24 ウェルプレートに播種する。
11. 37℃、5％ CO2 のインキュベーターで培養する。
12. 翌日、0.5 ml の培養液を除き、0.5 ml の PBMC CM 培地を添加し、培養を続ける。
13. 翌々日、0.5 ml の培養液を除き、0.5 ml の PBMC CM 培地を添加し培養を続け、37℃、培養４日目にベクター感染する。
14. カウント用のウェルをピペッティングにより懸濁し、培養上清を 1.5 ml エッペンドルフチューブに移す。
15. ウェルに 0.025％ Trypsin-EDTA 溶液を 1 ml 添加し、37℃でインキュベートする（〜5 分）。
16. 1.5 ml エッペンドルフチューブを遠心する（5000 rpm 1 分）。
17. 上清を除去し、0.025％ Trypsin-EDTA 溶液を添加したウェルをピペッティングにより懸濁し、先ほどと同じ 1.5 ml エッペンドルフチューブに移し、遠心する（5000 rpm 1 分）。
18. 上清を除去し、細胞に D-PBS 0.5 ml を添加、懸濁し、トリパンブルーを用いて細胞数をカウントする。
19. ステップ 5 の細胞数を基に、PBMC CM 培地にそれぞれ MOI=5 になるようにベクター溶液を調製し、感染用ウェルの培地を除去し、細胞へ添加する*（目安：PBMC CM 培地 300 µｌ〜500 µl に各ベクターを添加、混合する。また MOI は、生細胞と死細胞の合計した細胞数を用いて計算する）。*多くの細胞が浮遊する
場合、除いた培地をエッペンドルフチューブに入れ遠心し細胞を落としたところに、ベクター溶液を入れる。
20. 翌日、細胞を吸わないように培養液 0.5 ml を除去し、PBMC CM 培地を 0.5 ml 添加し、37℃、5％ CO2 イ
ンキュベーターで培養する。
21. 重層用の MEF を準備する（p8 参照）
22. 感染 3 日目に感染細胞をピペッティング等で剥がして 6 ウェルプレートの MEF に重層し CO2 インキュベーターで培養する。培養目安として 2 x 104 〜1ｘ105cells/well とする。
23. 感染 4〜6 日目に細胞を吸わないように培養液を除去し、PBMC 培地を 2 ml 添加し、37℃、5％ CO2 イン
キュベーターで培養する。
24. 感染 7 日目に培養液 1 ml を除去し、ES 培地を添加(1 ml/well)、37℃、5％ CO2 インキュベーターで培養
25. 感染 8 日〜21 日、培地交換は、1 週間に 6 回行う（土日は 1 回、その他は毎日）
26. iPS 細胞の状態から判断して、適宜、ピックアップやアルカリホスファターゼ染色等、目的に応じた評価を行う。

３．

マウス胎児線維芽細胞（MEF）からの iPS 細胞の誘導［MEF 用の試薬］
・ D-MEM（Life Technologies, Cat. No. 11995-065）-8v.2.6.12

・ D-MEM/ F-12, GlutaMAX （Life Technologies, Cat. No. 10565-018）
・ Neurobasal medium （Life Technologies, Cat. No. 21103-049）
・ N2 （Life Technologies, Cat. No. 17502-048）
・ B27 （Life Technologies, Cat. No. 17504-044）
・ L-Glutamate （Life Technologies, Cat. No. 25030-081）
・ 2-メルカプトエタノール （シグマ, Cat. No. M3148-100ML）
・ LIF （ミリポア, Cat. No. ESG1106）
・ PD 0325901 （フナコシ, Cat. No. Axon1408）
・ CT 99021 （フナコシ, Cat. No. Axon1386）
・ 0.1 % ゼラチン水溶液
・ フィーダー細胞 (マイトマイシン C 処理済みマウス胎児線維芽細胞：MEF)
・ 0.25 % トリプシン-EDTA 溶液 （Life Technologies, Cat. No. 25200-056）
・ Fetal Bovine Serum (FBS) （BIO WHITTAKER, Cat. No. 14-501F）
・ ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（ナカライテスク, Cat. No. 26253-84）
・ PBS （Life Technologies, Cat. No.C14190500BT）・ 2i/ LIF 培地
Neurobasal medium
DMEM/ F-12, GlutaMAX
B27
N2
2-メルカプトエタノール
L-Glutamine
ペニシリンストレプトマイシン溶液
PD0325901 (5 mM)
CT 99021 (15 mM)
LIF (10& U/ ml)

250 ml
250 ml
10 ml
5 ml
3.5 µl
2.5 ml5 ml
100 µl100 µl500 µl[iPS 細胞誘導手順]
1. MEF 細胞(129+TER/SvJc1 由来)を、5x105 cells/ well になるように 6-ウェルプレートへ播種する。(―１日目)・ ベクター感染用のウェルと細胞数をカウントするためのウェルが必要である。
・ 初期化効率に影響する可能性があるため、なるべく継代数の若い細胞を使用する。
2. CO2 インキュベーター（37 ºC、5% CO２）で 1 晩培養する。
3. 細胞のカウントを行う。（０日目）
4. CytoTune-iPS 2.0 の各チューブ下端を 37 ˚C 温浴に接触させ、それぞれ一部解凍後スピンダウンし、速やかに氷中へ移す
5. 遠心管等に 10% FBS/ 1xPS D-MEM 1 mL を入れ、そこに 3 種類のチューブ（KOS、KLF4、c-MYC）のベクター溶液を添付データシートに記載された分量をそれぞれ加える（3.で算出した細胞に対し、5 倍量のベクター（MOI=5 となる）を添加する）。ピペット等で数回ピペッティングし、5 分以内にステップ 6に従って遺伝子導入を行う。
6.

ベクター感染用の細胞の培地を吸引除去し、直ちにステップ 5 で用意した CytoTune-iPS 2.0 培地混

7.

CO2 インキュベーター（37 ºC、5 % CO２）で 24 時間培養後に培養液を除去し、10% FBS/ 1xPS D-MEM

8.

CO2 インキュベーター（37 ºC、5 % CO２）で２日間培養する。培地交換は毎日行う。(２－３日目)

9.

CO2 インキュベーター（37ºC、5 % CO２）で約 24 時間培養後、培養液を除き、2i/ LIF 培地を添加（2

液全量を添加し、全体によくなじませる。
を添加する（2 mL/ well）。(１日目)mL/ well）する。(３日目)-9v.2.6.12

10. 毎日 2i/LIF 培地で培地交換を行いながら３～４日培養を行う。(４－６/７日目)
11. 細胞継代の前日にフィーダー細胞を準備する（ゼラチンコートした培養 10 cm dish に 1〜1.5×106
cells/ 100 mm dish になるようにフィーダー細胞を播種し 10% FBS/ 1xPS D-MEM 中で培養する。）。
*0.1 %ゼラチン水溶液を 4 mL/ 100 mm dish または 1 mL/ well （6〜12 well）添加し、培養容器によくなじませ、37 ºC で 30 分から一晩静置する。使用直前にゼラチン溶液を除く。
12. 遺伝子導入の 6〜7 日後、トリプシン処理により細胞を剥がす。遠心して上清を取り除いた細胞に2i/LIF 培地を 1〜2 ml 添加、懸濁し、細胞数を計測する。約 1×105〜1×106 cells/ 100 mm dish になるよう 2i/ LIF に培地交換したフィーダ細胞に重層する。 （７日目）
13.
14.

CO2 インキュベーター（37 ºC、5 % CO２）に培養ディッシュを戻す。
24 時間培養後に 2i/ LIF 培地で培地交換し、37 ºC、5 % CO2 インキュベーターに移す。以降、同培地にて毎日培地交換しながら誘導する。(１６―２１日目)

15.

４．

iPS 細胞誘導後（共通）［アルカリホスファターゼ（ALP）染色］
1. 培養液を除き、D-PBS で洗浄（1 ml x 2 回）
2. マイルドホルム 10N を添加し、細胞を固定（1 ml/well）
3. 室温で 10 分、振とう後、マイルドホルム 10N を除き、D-PBS で洗浄（1 ml x 2 回）
4. 1-Step NBT/BCIP を添加 （1 ml/well）
5. 室温で 20 分程度振とう後、D-PBS で洗浄（1 ml x 2 回）
6. ALP 陽性 iPS 様細胞コロニー数をカウントし、誘導効率を計算［SeV ベクターフリーの iPS 細胞の取得］
1. CytoTune®-iPS は通常感染後後 6 週間程度で SeV ベクターフリーの iPS 細胞が取得できますが、培養および継代条件によって、時期が変動する可能性があります。
2. iPS 細胞のコロニーを継代時に免疫染色用プレートと継代用プレートに同時に継代し anti-Sendai Virus 抗体による免疫染色を行う（下記を参照）。
3. すべてのコロニーが SeV 抗原陽性の場合はクローニングを行う。
4. SeV 抗原陰性コロニーがあれば、継代用プレート上の同コロニーを継代し、RT-PCR にて SeV ベクターや、導入遺伝子が残存していないことを RT-PCR にて確認する（下記を参照）。
5. クローニングを行ったものは再度 anti-Sendai Virus 抗体による免疫染色する。

- 10 v.2.6.12

注） 継代を繰り返すことによりベクターは、自然に脱落するようになっております。また、PCR によって、c-MYC のベクターの残存のみが確認されたコロニーは、38〜39ºC、3% CO2（HEPES 不含培地用いる場合は 5%）の条件で 5 日間培養すると残存する SeV ベクターの消去率が上昇する場合があります。

iPS 細胞の取り扱い技術に関しては V の参考文献や一般解説書およびウェブサイト等のご参照をお勧めします。

[参考：センダイウイルスベクターの検出方法]＜anti-Sendai Virus 抗体*による免疫染色＞12-ウェルプレートで培養中の iPS 細胞を PBS で洗浄する↓
1 mL のマイルドホルム 10N（Wako）を用いて 5 分間室温で細胞を固定する↓
PBS で 2 回洗浄↓
500 µL の anti-Sendai Virus 抗体（0.1% TritonX-100/ PBS で 1/500 希釈）を 37C̊ で
1 時間反応させる↓
PBS で 3 回洗浄↓
500 µL の蛍光標識 anti-rabbit IgG 抗体（0.1% TritonX-100/ PBS で 1/500 希釈）を37C̊ で 1 時間反応させる↓
PBS で 3 回洗浄↓
蛍光顕微鏡で検出を行う＊anti-Sendai Virus抗体は、株式会社医学生物学研究所（MBL）より販売中です。
Cat No. PD029： Anti-Sendai Virus pAb （MBL）＜Transgene および SeV ゲノムを検出するための RT-PCR＞
iPS 細胞コロニーから RNA を回収する（ポジティブコントロールとして、ステップ 10 で余った細胞を使用）↓
逆転写反応（RT 反応：SeV ベクターゲノムは RNA であり、検出するためには
RT-PCR が必要、プライマーはランダムプライマーを使用）を行う↓
PCR 反応変性温度：

95C̊ 30 sec

アニーリング温度： 55C̊ 30 sec
伸張温度：72C̊ 30 sec

サイクル数：

30-35 サイクル↓
2% アガロース電気泳動にて PCR 産物を確認
Transgene および SeV ゲノムを検出するための RT-PCR 用プライマー- 11 v.2.6.12

productsize

transgene

ForwardKOS

ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC ACCTTGACAATCCTGATGTGG*

528 bpKLF4ACAAGAGAAAAAACATGTATGG* CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC

529 bpc-MYC(HNL)

TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG* TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG

532 bpSeVGGATCACTAGGTGATATCGAGC* ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC*

181 bp

Reverse*SeV 配列上のプライマーであり、これらとの組合せにより SeV ベクター上の Transgene、あるいはSeV ゲノムを特異的に検出する。
上記のSeV検出用プライマーセットプライマーセット（Cat. No. IDT-DV0304）は、医学生物学研究所より発売中です。

IV．Q&A
Q1

遺伝子導入させた後、細胞が剥がれてしまいます。

A1細胞によっては、SeVベクターによる搭載遺伝子の高発現のために細胞が丸くなり、剥がれる場合があります。細胞密度を上げたり、コラーゲンでコートされたプレートを用いたりすることで、この現象は軽減される場
合があります。このような現象があっても、これらは主にSeVベクターの高い遺伝子発現効果によるものなので、そのまま作業を継続することもよいでしょう。

Q2

iPS細胞が分化しているようです。

A2

本製品を用いると、他の方法より早めにiPS細胞が誘導される場合があります。新しいフィーダー細胞上ヘ早めの継代をお奨めします。

Q3

iPS細胞から、SeVゲノムがなかなか抜けません。

A3細胞によっては、時間がかかるものもあります。SeV抗体で免疫染色を行い、SeV陽性細胞が残っている場合
は、クローニングを繰り返すことでSeV陰性のiPS細胞を得ることができます。クローニングの際はガラスピペ
ットでコロニーの一部を移す方がSeV陰性のコロニーを得やすいです。

V．参考文献・参考文献
1)

Medical Science Digest 35(12): 505-508（2009）「センダイウイルスベクターを用いた新しい iPS 細胞作製技術」 房木 ノエミ、長谷川 護

2)

Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA
virus that does not integrate into the host genome. Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Proc
Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85(8):348-362 (2009)3)

羊土社 ISBN 9784758101745（2008）「改訂培養細胞実験ハンドブック」 黒木 登志夫（監修）、許 南浩、中村 幸夫（編集）4)

組織培養研究 27(4): 139-147(2008)「日本におけるヒト ES、iPS 細胞研究標準化：その 1」 古江-楠田 美保

5)ウイルス 57(1): 29-36 (2007)- 12 v.2.6.12

「特集. 第 54 回日本ウイルス学会学術集会、2. センダイウイルスベクター：ベクター開発と医療・バイオ分野への応用」 飯田 章博
6)

蛋白質・核酸・酵素 51(1): 27-37 (2006)「「センダイウイルス工学の展開」 永井 美之、加藤 篤、井上 誠

7)

岩波書店 ISBN4-00-006274-3 C0345 (2006)「センダイウイルス物語 ---日本発の知と技---」 永井 美之

8)

A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer andexpression. Li HO, Zhu YF, Asakawa M, Kuma H, Hirata T, Ueda Y, Lee YS, Fukumura M, Iida A, Kato A, Nagai Y,
Hasegawa M. J Virol. 74(14):6564-6569 (2000)

VI．本製品の使用上の注意点
必ずお守り下さい・ 本製品は、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律(カルタヘナ
法)」の対象品です。使用の際には、カルタヘナ法を遵守してお取扱い下さい。

・ 本製品の使用には P2 レベル以上の施設で、必ず安全キャビネットを使用して下さい。
・ 本製品の使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。
・ 本製品はドライアイス中にて届けられます。開封の際には、凍傷・切創に十分ご注意ください。
・ 取り扱いには十分ご注意ください。万が一誤って飛散させ眼に入れたり、皮膚を汚染したりした場合は、すぐに洗浄し、医師にご相談ください。
・ 本製品の解凍後は、分注せずに速やかにご使用ください。凍結融解後の力価は保証いたしません。

・付記

・ 本製品の使用によって生じたいかなる事故、損害についても、株式会社ＩＤファーマでは責任を負いかねま
すので、ご了承の上ご使用下さい。

・ 本製品は、核初期化遺伝子については iPS アカデミアジャパン株式会社よりライセンスを受け、株式会社ＩＤ
ファーマが製造しています。
・ 本製品を使用して作製した細胞を商用利用される場合は事前に株式会社ＩＤファーマ及び iPS アカデミアジ
ャパン株式会社までお問い合わせ下さい。
製造元：株式会社ＩＤファーマ

本社：〒102-0071 東京都千代田区富士見 2-10-2 飯田橋グラン・ブルーム
研究開発センター：〒300-2611 茨城県つくば市大久保６番（テクノパーク大穂）
お問い合わせ先: https://www.iromgroup.co.jp/inq/- 13 v.2.6.12