αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

研究課題名

αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

フリガナ

イトウ コウメイ

代表者名

伊藤 浩明

所属機関 （機関名） あいち小児保健医療総合センター（役職名） 副センター長 兼 総合診療科部長
氏 名 （フリガナ）

共同研究者

所属機関 ・ 役職名

役割分担

和泉 秀彦 （イズミ ヒデヒコ）

名古屋学芸大学管理栄養
抗原の精製、 動物実験学科教授、 学科長

武藤 太一朗（ムトウ タイチロウ）

愛知医科大学小児科助教

近藤 康人 （コンドウ ヤスト）

藤田保健衛生大学坂文種 好塩基球活性化試験の報徳会病院小児科教授
実施 ・ 指導

血清中の抗体測定

本 助 成 金 に よ る 発 第 55 回日本小児アレルギー学会 （2018 年 10 月） 及び国際学会での発表、 及び
表論文， 学会発表 海外誌への論文投稿を予定している。

研究結果要約＜目的と意義＞牛乳アレルギーに対する経口免疫療法 (OIT) の機序として、 従来は牛乳粗抗原又は各種カゼイン混合物を用いた免疫学的検討が行われてきた。 本研究では、 牛乳の主要抗原である αs1 カ
ゼイン特異的な液性因子について解析することを目的とした。
＜方法＞ 5 歳以上で牛乳アレルギーの急速 OIT を行った患児 39 名の経時的な血清を用いて、 精製したαs1 カゼイン特異的 IgE、IgG4 抗体測定及び受動感作による好塩基球活性化 (BAT) の変化を検討した。
さらに、 OIT 後又は自然耐性獲得した患児の血清 （以下、 耐性化血清） による受動感作 BAT の抑制を検討した。
＜研究から得られた新しい知見＞牛乳 OIT により、 αs1 カゼイン特異的 IgE は低下したが、 IgG4 の有意な増加は確認されなかった。 OIT 前の血清では受動感作 BAT の活性化が認められたが、 OIT 後には活性化が低下した。 OIT 前の血清に耐性化血清を混和すると、受動感作 BAT は有意に抑制された。 一方、混和した血清による受動感作後に上清を洗浄すると、 有意な抑制が解除された。 Protein G カラムを用いて IgG を除去した血清を混和した場合や、 抗 FcγR 抗体で FcγRⅡb の機能を阻害した場合にも、 この抑制は解除されなかった。 以上より、 牛乳 OIT の機序として、 αs1 カゼイン特異的 IgG4 の寄与は少ないものの、 何らかの液性因子が関与している可能性が示唆された。

5

αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

研究目的

物としか解析されておらず、 真に抗原特異的な免疫学的制御に関する解析が十分ではない。

牛乳アレルギーにおける主要アレルゲンはカゼインである。 牛乳カゼインの中でも、 αs1、

本研究では、 5 歳以上になっても牛乳アナフ

αs2、 β、 κ - カゼインがそれぞれアレルゲン

ィラキシーが残存する患児、 自然耐性獲得したとして同定されているが、 αs1 カゼインには多く

患児、 経口免疫療法によって脱感作状態に至の IgE エピトープが存在し、 最も強いアレルゲった患児、 さらにそこに到達できなかった患児

ン活性を示す。

を対象として、 高度に精製したαs1 カゼインに

臨床的に牛乳は鶏卵に次いで頻度の高い食対する IgE、 IgG4 抗体測定と、 好塩基球活性物アレルゲンであり、 微量でもアナフィラキシー

化の抑制を検討する。 好塩基球活性化試験にを誘発する重症者も少なからず存在する。 自然

おいて、 患者の末梢血好塩基球のみでは抑制耐性獲得が進む患者が存在する一方で、 5 歳性因子に関する検討が十分行えないため、 健

過ぎても耐性獲得できない患者も多い。 さらに常者の好塩基球を用いた受動感作による活性

そうした患者を対象として経口免疫療法を行っ化試験を主な手段として、 抑制性因子の同定をても、 鶏卵 ・ 小麦と比較して脱感作状態まで到試みる。

達する成績が悪く、 治療に難渋することが多い。
食物アレルゲンに対する脱感作状態、 あるい

研究計画及び研究手法

は耐性獲得をもたらす要因として、 特異的 IgG,

＜αs1- カゼインの分離＞

IgG4 抗体をはじめとする液性の抑制性因子、

αs1- カゼインの分離は、 無脂肪乳を原材料

マスト細胞・好塩基球の活性化を抑制する因子、

1)として、 Igarashi の方法 を一部改変し行った。

さらに制御性 T 細胞による抗体産生やマスト細初めに、 無脂肪乳 120mL に 4M NaSCN 40ml、

胞 ・ 好塩基球の活性化抑制などが想定されて99.5% Ethanol (EtOH) 160mL お よ び 0.75Mいる。 経口免疫療法の効果は、 治療したアレ

CaCl2 (50% EtOH) 80mL を加え、 4℃で 30 分

ルゲン特異的に得られること、 治療後数週間で間 攪 拌 後、 遠 心 分 離 し 得 ら れ た 残 渣 を 4M

大幅な閾値上昇が認められる症例もあること、

urea, 0.04M NaCl, 0.03M EDTA (pH7.8)

特異的 IgE 抗体が残存したまま脱感作状態に200mL で 溶 解 し、 さ ら に 2-mercaptoethanol

至ることから、 特異的 IgG4 抗体など抗原特異2mL を加え、 室温で 1 時間攪拌した。 その後、的な因子が、 マスト細胞や好塩基球の活性化を0.2M Na2HPO4 40mL および 2M CaCl2 10mL を抑制することが最も中心的な機序であろうと推測

交互に半量ずつ加え、 遠心分離し得られた残される。 しかし、 経口免疫療法で得られる脱感

渣を 4M urea, 0.03M EDTA (pH7.8) 20mL およ

作状態と、 自然耐性獲得した状態との違いにつび 3.2M (NH4)2SO4 (pH4.7) 20mL で 溶 解 後、いて、 十分に検討されていない。 さらに、 牛乳

遠心分離し残渣を得た。 残渣に純水 50mL と、アレルギーの免疫学的検討は、 乳清タンパクも99.5% EtOH 50mL を加え、 遠心分離後の上清含む牛乳粗抗原、 あるいは各種カゼインの混合

を pH4.7 に調製し、 遠心分離し残渣を得た。

6

αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

その残渣を 4M urea, 0.1M NH4H2PO4 (pH7.8)＜αs1- カゼイン特異的 IgE および IgG4 の測定＞

1mL で 溶 解 し、 純 水 40mL を 加 え、 pH4.7 に患者血清中のαs1- カゼイン特異的 IgE およ

調整し、 遠心分離によって残渣を得た。 再びこび IgG4 抗体は ELISA 法により測定した。 αs1-の 操 作 を 繰 り 返 し 行 い、 得 ら れ た 残 渣 を 4M

カゼイン /PBS (10µg/mL) をマイクロタイタープ

urea, 0.1M NH4H2PO4 (pH7.8) で溶解し 3 日間

レートにコーティングし、 0.05% Tween 20 を含む透析した。 透析した溶液を凍結乾燥し、 PBS でProtein-Free Blocking Buffer (Thermo Fisher

溶解しゲル濾過 SephadexG-50、 及び Vivaspin

Scientific. PFBB-T) でブロッキングした。 次い

20 遠心濃縮チューブにより分画した。 分画分取

で、 PFBB-T で 1:10 (IgE) または 1:200 (IgG4)した溶液を 3 日間透析したものをαs1- カゼイに希釈した患者血清を 4℃で一晩反応させ、 二ンとした。

次抗体として alkaline phosphatase-conjugated＜ SDS-PAGE ＞

goat anti-human IgE (BETHYL, 1:1000) または2)

αs1 カゼインの精製は、 Laemmli の方法 に

horseradish peroxidase-conjugated mouse anti-

よる SDS-PAGE により確認した。 解析には、

human IgG4 (Thermo Fisher Scientific, 1:10000)

15% ポリアクリルアミドゲルを用い、 Coomassieを用い、 発色基質として TMB (SeraCare Life

Brilliant Blue R-250 にてタンパク質を染色した

Sciences, Inc) または PNPP (Thermo Fisher(Figure.1)。

Scientific) で反応させた。 測定された αs1- カ
ゼイン特異的 IgE の吸光度が高かった免疫療法患者 1 名を対照 (100%) とした吸光度 (%) を測定結果として示した。

SDS-PAGE＜対象血清＞
急速経口免疫療法対象患者 ： 2011 年 4 月(kDa)～ 2017 年 3 月 ま で に 急 速 経 口 免 疫 療 法

97.0(ROIT) を施行し、 ROIT 開始時と、 ROIT 後 6

66.0

ヵ月 ・ 1 年 ・ 2 年 ・ 3 年後のいずれかの保存血45.0

清が得られた 39 名を対象とした。
牛乳アレルギー寛解患者 ： 過去の明らかな

30.0

即時型アレルギーの病歴、 もしくは経口負荷試
験陽性により、 牛乳アレルギーの診断が確実で20.1あり、 その後寛解が確認された後の保存血清が得られた 7 名を対象とした。

14.4＜急速経口免疫療法＞
5 歳以上で、 ROIT 開始前 6 ヵ月以内に、 牛Figure 1 Purification of αS1-casein

乳 5ml 以下を閾値とする明らかな即時型症状を7

αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

認める児に対し、 12 日間の入院治療を行った。

13ml HA buffer で 2 回洗浄を行い中和した。

入院治療は、 閾値量と誘発症状の重症度に応

細胞表面上の IgE の剥離が行われていること

じて、 閾値量またはそれ以下の量から牛乳摂取

は、 細胞表面上の IgE が減少し、 FcεRⅠα のを開始し、 最大 1 日 4 回、 約 1.3 倍ずつ増量

IgE 結合部位と結合する CRA2 が増加しているした。 各摂取において無症状、 または軽度なことにより確認した (Figure 2)。

症状誘発であれば増量を継続、 中等度の症状であれば同量の摂取または増量、 重度の症状あれば一旦減量をし、 症状を確認しながら摂取の増量を継続した。 退院後は、 入院で摂取可能となった摂取量を毎日継続し、 最低 1 か月は同量を維持した後に、摂取量を次第に増量した。
摂取に伴う誘発症状がみられた場合は、 適宜
摂取量を減量し治療を継続した。 100ml まで摂取量を漸増した上で、 約 1 年後を目途として牛Figure2 Confirmation of stripping of IgEs
from basophils

乳 200ml 単 回 の 経 口 負 荷 試 験、 又 は 牛 乳
200ml まで摂取量の漸増を行った。 200ml を症

・ 好塩基球の受動感作

状なく 3 か月以上摂取できた時点で、 摂取後の運動誘発試験を行って安定性を確認し、 日

IgE を剥離した血球に対し、 その 1/2 量の対常生活における牛乳を含む加工食品や料理の象患者血清及び 1/2 量の PBS を加えて、 37℃

解除を進めた。

で 1 時間培養した後、 4℃ で一晩培養すること＜受身感作による好塩基球活性化試験＞

で、 受動感作を行った。 免疫療法後 (post) の・ 血球表面の IgE の剥離

血清、 もしくは寛解患者 (tolerance) 血清を加え

3)
IgE の剥離は、 Santos らの報告に準じて行た好塩基球活性化の抑制の検討時には、 1/2った。 牛乳アレルギーのない成人男性由来全量の PBS に替えて、 各対象血清を加えてその血を EDTA-2Na 採血管に採取した。 全血 2ml検討を行った。

に対し、 4℃ 13ml HA buffer （0.3% ヒト血清ア・ 好塩基球活性化試験

ルブミン、10mM HEPES、140mM 塩化ナトリウム、

好塩基球活性化試験 (BAT) は、 Allergenecity

塩化カリウム 5mM [pH7.4]） を加え懸濁し、 遠

kit (Beckman Coulter) と anti-CD63 抗体 （Anti-

心後にその上清を破棄した。 得られた血球成分

Hu CD63 APC (EXBIO)） を用いて、 その説明

を 4℃ 13ml 乳酸バッファー （27.75mM 乳酸、

書 に 準 じ て 行 っ た。 ま ず、 受 動 感 作 後 の140mM 塩 化 ナ ト リ ウ ム、 5mM 塩 化 カ リ ウ ム

sample 50µL に対し、 活性化バッファー 50µL、[pH3.9]） で再懸濁し、 氷中、 5 分間静置し、細 胞 表 面 抗 体 (CD3-PC7/CRTH2-FITC/

IgE の剥離を行った。 IgE 剥離後の血液は、4℃

CD203c-PE と CD63-APC を 2:1 で混和した抗8

αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

・ 細胞表面抗原の評価

体 )15µL、 抗 原 液 10µL を 混 和 し 遮 光 下、
37℃ で 15 分反応させた。 抗原刺激はαs1 カ

精製した αs1 カゼイン (10mg/ml) を、 Biotin

ゼイン (1mg/ml) で行い、 陽性対照として付属

L a b e l i n g k i t - N H2 ( D o j i n d o M o l e c u l a rの anti-IgE 抗体、 陰性対照として PBS(-) を用Technologies) を用いてビオチン標識した。 受

いた。 Stop solution 50µL を添加し反応を停止

動 感作した試料 50µL を事前に PBS(-) 1ml と後、 Fix and Lyse Solution1mL を加え、 赤血球

混和し、 上清 1ml を破棄し洗浄した。 得られたの溶血及び細胞の固定を行った。 PBS(-) で洗

試料 50µL に対し、 ビオチン標識したαs1 カゼ

浄した後、 0.1% ホルムアルデヒド加 PBS(-) 溶

インを 10µL 加え、 氷中で 30 分間反応させた。

液 で 再 懸 濁 し た。 細 胞 表 面 上 の、 CD3、

好 塩 基 球 の 細 胞 表 面 上 に 発 現 す る IgE、

CRTH2、 CD203c、 CD63 の検出は、 フローサ

CRA1、 CRA2、 CD3、 CRTH2、 αs1 カゼイン

イトメーター (Gallios, BECKMAN COULTER)を 検 出 す る た め、 PE anti-human IgE

で 行 い、 そ の 解 析 に は Kaluza (BECKMAN(Biolegend) 2.5µL、 PE/Cy7 anti-human FcεRⅠaCOULTER) を 使 用 し た。 好 塩 基 球 は Front(Biolegend) 2.5µL、 Anti-FcεR1α (human IgE

scatter, side scatter から単核球を gating し ,receptor) monoclonal antibody (CRA2) FITC-

CD3 (+), CRTH2 (+) cells で同定し、 好塩基球

labeled (BioAcademia) 1µL、 CD3-APC-Alexaの活性化の評価は、 好塩基球上に発現する

Flour 750 (Beckman Coulter)2.5µL、 PerCP/

CD203c もしくは CD63 の平均蛍光強度 (MFI),

Cy5.5 anti-human CD294 (Biolegend) 2.5µL、

もしくは、 陰性対照の CD203c 及び CD63 の蛍

Brilliant violet 421 Streptavidin (Biolegend) 2µL

光強度が上位 5% に含まれ高発現な領域の細を 加 え、 4 ℃ 遮 光 下 で 30 分 間 反 応 さ せ た。

胞数割合で行った (Figure 3)。

Stop solution 50µL を添加し反応を停止後、 Fix
and Lyse Solution1mL を加え、 赤血球の溶血
及び細胞の固定を行った。 PBS(-) で洗浄した
後、 0.1% ホルムアルデヒド加 PBS(-) 溶液で再懸 濁 し、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー (Gallios,
BECKMAN COULTER) で検出した。
・ 液性因子による好塩基球活性化の抑制の検討
Post 血清、 もしくは tolerance 血清による好塩基球活性化の抑制が、 それらの液性因子によ る も の か 評 価 を 行 う た め、 受 動 感 作 後 のSample 50µL に対して PBS(-)1mL を加えその血清成分を洗浄し、 遠心後にその上清 1mL を除去した後に、 好塩基球の活性化の評価を行

Figure3 Gating of basophilsった。

9αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究＜統計解析＞c, d） が、 牛乳 (Figure 5b) ・ カゼイン (Figure

各 Figure の結果は平均値 ± 標準偏差で示

6a) ・ 精製したαs1 カゼイン特異的 IgE は有意した。 連続変数の解析には、 one-way analysisに減少を認めた (Figure 6b)。 αs1 カゼイン特of variance (one-way ANOVA) test を用い、 有

異的 IgG4 は明らかな増加を認めなかったが意差が認められた場合は post hoc 検定として、(Figure 6c)、 αs1 カゼイン特異的 IgE との比は免疫療法開始時 (pre) を対照として Dunnett’s

増加していた (Figure 6d)。
a) total IgE(IU/ml)test を行った。 連続変数の相関係数の検定に

80

5000

60

4000

は、 Pearson の積率相関係数を用いた。 両側

3000

40

2000
0
pre

6m

1y

2y

50
40
30

治医科大学附属さいたま医療センター ) を用い

20
10

た。

0
pre

6m

1y

2y

3y

＜免疫療法に伴う各パラメーターの推移＞
１． 牛乳摂取可能量a) Casein speciﬁc-IgE(kUA/L)60

月、 1 年、 2 年、 3 年と経時的に牛乳摂取可能

20

pre

6m

1y

2y

3y

6m

1y

2y

3y

**

6m

1y

2y

3y

****
*

**

4
2

20
0
pre

****

pre

6

40

****

***

8

60

****

*

d) αS1 casein speciﬁc IgG4/IgE

80

****

b) αS1 casein speciﬁc-IgE0c) αS1 casein speciﬁc-IgG4

100

(ml)

6m

1y

2y

3y

0
pre

6m

1y

2y

3y

Figure 6 Change of casein specific
Immunoglobulins after immunotherapy
n=39 Dunnett’s tests compared to pre wereapplied. * p<0.05, **p<0.01,***p<0.005,**** p<0.001

100
50
0
2y

3y

20

(%)

1y

pre

40

0

6m

2y

35
30
25
20
15
10
5
0

60

**

量は増加を認めた (Figure 4)。

pre

1y

80

40

150

(kUA/L)6md) β-lactoglobulin speciﬁc-IgE

(%)

80

ROIT 開始時 (pre) と比較して、 ROIT 後 6 ヵ

200

pre

Figure 5 Change of IgEs after oral
immunotherapy
n=39 Dunnett’s tests compared to prewere applied. * p<0.05

結果と考察

250

0

3y

c) α-lactalbumin speciﬁc-IgE(kUA/L)判定した。 全ての統計学的解析は、 EZR ( 自

*

20

1000

分布、 危険率 (p 値 ) 5% をもって有意差ありとb) Cow's milk speciﬁc-IgE(kUA/L)

6000

3y

Figure 4Change of tolerated amount of
cow's milk after oralimmunotherapy
n=39 Dunnett’s tests compared to prewere applied. **** p<0.001

３． 好塩基球活性化
受動感作好塩基球におけるαs1 カゼイン刺激後の CD203c、 及び CD63 高発現な好塩基２． 免疫グロブリン

球 細 胞 割 合 及 び 平 均 蛍 光 強 度 (MFI) は、

総 IgE、 αラクトアルブミン ・ βラクトグロブリ

ROIT 開始時と比較し減少を認めた (Figure 7)。

ン特異的 IgE は免疫療法開始時と比較して、好塩基球細胞表面上の総 IgE (Figure 8a)、免疫療法開始後も変化しなかった （Figure 5a,FCεRⅠα の IgE の結合部位以外の部位と結合10

αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究する CRA1 (Figure 8b)、 FcεRⅠα の IgE 結合

IgG4 とは有意な相関を認めなかった (Table

部位と結合する CRA2 (Figure 8c)、 αs1 カゼイ

1)。
Table1 Correlations between
Immunoglobulins and tolerated amount of
cow's milkン (Figure 8d) は、 ROIT による有意な変化を認めなかった。
a) CD203c

(%)
70
60
50
40
30
20
10
0

**

60

**

***

r

b) CD63

(%)
80

***

40

****

****

20
pre

6m

1y

2y

0

3y

pre

c) CD203c

(MFI)
70
60
50
40
30
20
10
0

6m

1y

2y

3y

d) CD63

(MFI)
200

****

150

**

**

100

****

50
pre

6m

1y

2y

****

****

2y

3y

0

3y

pre

6m

1y

95% CIp

Total IgE

0.044

-0.13 - 0.21

0.62

Cow's milk s-IgE-0.42-0.55 - -0.27<0.001

Casein s-IgE-0.44-0.56 - -0.29<0.0010.0074α-lactalubmin s-IgE-0.25-0.042 - -0.071

β-lactoglobulin s-IgE-0.22-0.38 - -0.31

0.018

αs1 casein s-IgE-0.46-0.58 - -0.31<0.001αs1 casein s-IgG4

0.078-0.093 - 0.25

0.37

αs1 casein s-IgG4/IgE

0.42

0.27 - 0.55

<0.001

Pearson’s product-moment correlations compared to tolerated amount of cow’s milk were calculated.

Figure 7 Change of basophil activation
stimulated by αs1 casein after
immunotherapy
n=39 Dunnett’s tests compared to pre wereapplied. **p<0.01, ***p<0.005,**** p<0.001

2. 好塩基球活性化
牛乳摂取可能量と、 αs1 カゼイン刺激後のCD203c、 及び CD63 高発現な好塩基球細胞
割合及び平均蛍光強度 (MFI) はそれぞれ逆相a) Total IgE

(MFI)
250
200

関を認めた (Table 2)。

150

150

100

100

Table2 Correlations between basophil
activation and tolerated amount of cow's milk

50

50
0

b) CRA1

(MFI)
200

]

pre

6m

1y

2y

3y

c) CRA2

(MFI)

10
5
0
6m

1y

pre

6m

2y

3y

1y

2y

3y

αs1 casein

(MFI)

15

pre

0

7
6
5
4
3
2
1
0

r

95% CIp

CD63 (%)-0.51-0.63 - -0.37<0.001

CD63 (MFI)-0.58-0.68 - -0.46<0.001

CD203c (%)-0.45-0.57 - -0.30<0.001

CD203c (MFI)-0.49-0.61 - -0.35<0.001

Pearson’s product-moment correlations compared to tolerated amount of cow’s milk were calculated.
pre

6m

1y

2y

3y

Figure 8 Change of basophil surface
antigens stimulated by αS1 casein after
immunotherapy
n=39 one-way ANOVAtests compared to
pre were applied.

＜αs1 カゼイン特異的 IgE ・ IgG4 と好塩基球活性化の相関関係＞
αs1 カゼイン刺激後の CD203c 及び CD63
高発現な好塩基球細胞割合及び MFI は共に、＜牛乳摂取可能量と各パラメーターの関係＞

αs 1 カゼイン特異的 IgE と正の相関関係を認

1． 免疫グロブリン

めたが、 αs1 カゼイン特異的 IgG4 及び IgG4/

全対象者の ROIT 前、 ROIT 6 か月後、 1 年

IgE との相関関係は認められないか、 非常に弱後、 2 年後、 3 年後を全て対象とし、 牛乳摂取い相関関係しか認めなかった (Table 3)。

可能量と各パラメーターとの相関関係を検定し牛乳経口免疫療法により有意に牛乳摂取可

た。 牛乳 ・ カゼイン ・ αs1 カゼイン特異的 IgE

能量は増加し、 αs1 カゼイン特異的 IgE は減とは逆相関を、 αs1 カゼイン特異的 IgG4 / IgE

少することと、 αs1 カゼイン刺激による受動感作とは正の相関を認めたが、 αs1 カゼイン特異的

好塩基球活性化は抑制されることが示された。

11αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

Table3 Correlations between basophil activation and αS1-casein
specific ImmunoglobulinsrCD63 (%)

CD63 (MFI)

CD203c (%)

CD203c (MFI)

95% CI

p

IgE

0.54

0.41- 0.65

0.65

<0.001

IgG4

0.18

0.008 - 0.34

0.34

0.04

IgG4/IgE-0.23-0.39 - -0.062-0.0620.0078IgE

0.65

0.54 -0.74

0.74<0.001

IgG4

0.17-0.0042 -0.32

0.32

0.056

IgG4/IgE-0.27-0.42 - -0.1

-0.1

0.0019IgE

0.48

0.33 - 0.6

0.6<0.001

IgG4

0.18

0.0049 - 0.34

0.34

0.044

IgG4/IgE-0.21-0.37 - -0.045-0.045

0.014

IgE

0.58

0.45 - 0.68

0.68

<0.001

IgG4

0.083

-0.881 - -0.25

-0.25

0.34

IgG4/IgE-0.31-0.46 - -0.15-0.15

0.00023Pearson’s product-moment correlations compared to tolerated amount of cow’s milk were calculated.

また、 牛乳摂取可能量と αs1 カゼイン特異的もしくは、 tolerance 血清を混和して抑制がみら

IgE、 及び好塩基球活性化は、 いずれも負の相れるかどうか検討した。 その結果、 post 血清、関関係を認めた。

tolerance 血清を混和した場合、 ROIT 前と比較

一方、 αs1 カゼイン特異的 IgG4 は免疫療して好塩基球活性化が抑制されることが示され法による有意な増加が確認されず、 牛乳摂取

た (Figure 9a,9b)。
a) CD203c(%)

可能量とも有意な相関を示さなかった。 また、

40

25

30

20

αs1 カゼイン特異的 IgG4 は好塩基球活性化と

15

*

*

10
0

c) CD203c

50

50

40
30

30

20

20

10

10
0

いることが示唆された。

**d) CD63

(MFI)

60
40

取可能量の増加を可能にする機序に関与して

*
**

0

(MFI)

特異的 IgE の低下が免疫療法による牛乳摂

20
10

5

も関連を認めなかった。

b) CD63

(%)

30

0

pre

+

-

+

+

pre

+

-

+

+

post

-

+

+

-

post

-

+

+

-

tolerance

-

-

-

+

tolerance

-

-

-

+

Figure 9 Suppression of basophil activation
stimulated by αs1-casein
n=4 Dunnett’s tests compared to pre wereapplied. * p<0.05,**p<0.01＜ ROIT 後 (post) 血 清 あ る い は 寛 解 患 者(tolerance) 血清による好塩基球活性化の抑制＞
1. Post 血清あるいは tolerance 血清の混和によ

2. 液性因子による好塩基球活性化抑制の検討

る検討
αs1 カゼインによる抗原刺激による好塩基球

確認された好塩基球活性化の抑制機序が、活性化は ROIT 後に抑制されることが明らかに混和した血清に由来する液性因子によるものかなったため、 この機序を解明するために、 ROIT

確認するために、 受動感作後の上清を PBS (-)

前の患者血清に、 同一患者由来の post 血清、で洗浄した後に、 αs1 カゼインによる抗原刺激12αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究を行い、 同様の抑制が確認されるか確認を行っない場合と比較して好塩基球活性化の抑制がた。 その結果、 上清を洗浄した場合には、 post解除されるかどうか検討したが、 抑制は解除さ

血清、 tolerance 血清のいずれを混和しても、れなかった (data not shown)。

ROIT 前と比較して抑制傾向はみられたものの、統計学的には有意な好塩基球活性化の抑制は

3. 抗原非特異的な因子による好塩基球活性化

確認されなかった (Figure 10)。

抑制の検討a) CD203c(%)

40

好塩基球活性化の抑制機序が抗原特異的なb) CD63

(%)
80

50

IgG4 に起因しないことが示唆されたため、 確認

60

30

40

20

された好塩基球活性化の抑制機序が、 抗原非

10

20

0

0

c) CD203c(MFI)d) CD63

(MFI)

80

100

60

80

特異的であるかどうか確認を行うため、 pre 血清と、 post 血清又は tolerance 血清の混和を行い

60

40

40

20

20

受動感作することで、 抗 - IgE 抗体による、 抗

0

0
pre

+

-

+

+

pre

+

-

+

+

post

-

+

+

-

post

-

+

+

-

tolerance

-

-

-

+

tolerance

-

-

-

+

原非特異的な好塩基球の活性化が、 pre 血清

Figure 10 Suppression of basophil
activation stimulated by αs1-casein
afterwashing supernatantn=4 one-way ANOVA tests compared to
pre were applied.

で受動感作した場合と比較して、 抑制されるかどうか確認を行った。
その結果、 post 血清及び tolerance 血清の混和は、 受動感作後の上清の洗浄の有無に関これらの結果から、 上清中に存在する IgG4

わらず、 抗 -IgE 抗体による抗原非特異的な好等の何らかの液性因子が、 好塩基球活性化に

塩基球の活性化を抑制しないことが示された

寄与している可能性が示唆された。

(Figure 11, 12)。 以上の結果から、 post 血清及IgG4 が好塩基球活性化に関与しているか確

び tolerance 血清の混和による好塩基球活性化

かめるため、 post 血清 ・ tolerance 血清を事前の抑制機序には、 IgG4 以外の抗原特異的な液にプロテイン G カラムで処理することで IgG を性因子が関与することが示唆された。

除去した sample を、 pre 血清と混和し受動感作a) CD203c(%)

60を行った。 その結果、 IgG を除去しない場合とb) CD63

(%)
150

80

100

40
50

20

比較して、 好塩基球活性化の抑制は解除され00c) CD203c(MFI)

なかった (data not shown)。
また、 好塩基球細胞表面上の FcγRⅡb を介

80

80

60

60

40

40

20

20
0

0

4)
した好塩基球活性化抑制機序 の関与についd) CD63

(MFI)

pre

+

-

+

+

pre

+

-

+

+

post

-

+

+

-

post

-

+

+

-

tolerance

-

-

-

+

tolerance

-

-

-

+

3)

て確認するため、 Santos らの方法 に準じて、

Figure 11 Suppression of basophil
activation stimulated by anti-IgE antibody
n=4 one-way ANOVA tests compared to
pre were applied.

post 血清又は tolerance 血清を pre 血清と混和して受動感作する際に、 抗 CD32 抗体 （抗FcγR 抗体） を同時に加えた場合、 抗体を加え13αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究があり、 この検証を以下のように進める予定であa) CD203c(%)b) CD63

(%)
120

80

る。

100

60

80
60

40

①αs1 カゼイン以外の牛乳コンポーネントに

40

20

20
0

0

c) CD203c(MFI)

対する特異的 IgE、 IgG4 を測定し、 免疫療法d) CD63

(MFI)

80

60

60

により IgE の低下がみられるか、 また IgG4 の増

40

40

20

20

加が確認されないかどうか確認を行う。

0

0
pre

+

-

+

+

pre

+

-

+

+

post

-

+

+

-

post

-

+

+

-

tolerance

-

-

-

+

tolerance

-

-

-

+

②上記において、 IgE の低下及び、 IgG4 のFigure 12 Suppression of basophil
activation stimulated by anti-IgE antibody
after washing supernatantn=4 one-way ANOVA tests compared to
pre were applied.

増加を認めるコンポーネントが同定された場合、同コンポーネントによる好塩基球活性化と、 抑制試験を行う。
③抗原非特異的な液性因子による好塩基球＜残された課題及び発表予定＞

活性化抑制の可能性について検証するため、当初は、 鶏卵やピーナッツで既報があるよう

鶏卵や小麦等の牛乳以外の食物アレルギー児に、 牛乳 ROIT 後に好塩基球活性化を抑制すの患者血清で受動感作した好塩基球の抗原特る主な液性因子は IgG4 抗体で、 上清中の中

異的な活性化が、 牛乳免疫療法後の患者血清

和抗体活性と、 FcγRII を介した抑制性シグナル

もしくは牛乳寛解患者血清を混和することで抑が主な機序と想定していた。 しかしその予想に制されるかどうか検証を行う。

反して IgG4 抗体の役割は限定的で、 その他の

④受動感作における好塩基球上の Fc ε RI

液性因子による機序を解明する新たな課題が見が、 特異性の異なる IgE 抗体で占拠されることつかった。 ここまでの成果は、 第 55 回日本小で活性化が抑制される可能性を検証するため

児アレルギー学会及びアレルギー関連の国際に、 ヒト化した Der p 2 特異的モノクローナル

学会で発表した上で、 国際誌への論文投稿を

IgE キメラ抗体等を用いた抑制試験を行う。

するべく準備を始めている。

⑤可能であれば、 健常者末梢血から IgE をストリッピングした好塩基球でなく、 ヒトの肥満細今後の研究活動について

胞株、 又はヒト Fc ε RI を transfect した RBL 細経口免疫療法の効果の一つとして、 抗原特胞などを用いて同様の検討を行う。

異的な IgG4 の増加が報告されていたが、 今回の我々の研究からは、 牛乳アレルゲンの中で最

参考文献

も抗原性が高いとされている、 αs1 カゼイン特1） Igarashi Y. Separation of caseins by chemical

異的 IgG4 の関与は低いことが示唆された。 α

procedures. Int Dairy J. 1999 Mar;9(3):377-

s1 カゼイン以外のコンポーネントに対する IgG48.

の増加が寄与している可能性や、 IgG4 以外の

2） Laemmli UK. Cleavage of structural proteins

抗原特異的な液性因子が関与している可能性

during the assembly of the head of14αs1 カゼインのアレルゲン活性に対する免疫学的機序による制御に関する研究

May; 135(5): 1249-56.

b a c t e r i o p h a g e T4. N a t u r e . 1970

4） Burton OT, Longston SL, Zhou JS, et,al.

Aug;227(5259):680-5
3） Santos AF, James LK, Bahnson HT, et,al.

Oral immunotherapy induces IgG antibodies

IgG4 inhibits peanut-induced basophil andthat act through FcγRⅡb to suppress IgE-

mast cell activation in peanut-tolerant

mediated hypersensitivity. J Allergy Clinchildren sensitized to peanut major

Immunol. 2014 Dec; 134(6): 1310-1317.

allergens. J Allergy Clin Immunol. 201515