東洋鋼鈑Vol.４０

DNAメチル化異常を伴う疾患の鑑別診断チップの開発―プラダーウィリー /アンジェルマン症候群鑑別チップ―
鴻海俊太郎＊１・永田伊智郎＊２・山根衣寿美＊２・井上頼江＊２・大場光芳＊３・山野博文＊４
Development of Differential Diagnostic Chip for Diseases Accompanying DNA Methylation Abnormality- Prader-Willi / Angelman Syndrome Discrimination chip Shuntaro KOHNOMI, Ichiro NAGATA, Izumi YAMANE, Yorie INOUE, Mitsuyoshi OHBA, Hirofumi YAMANO

Synopsis：In-vitro diagnosis of genetic abnormalities using DNA chips is now becoming universal, and eventhe ones, which can evaluate some kinds of disease risks have been developed recently.
DNA primarily encodes a protein, and it is the substantial body of the gene. In addition, the roleof DNA is not only a simple information accumulator but also has the function of regulating thetranscription to RNA itself. The most prominent one is a promoter and numerous research studies
related to it have been promoted.
DNA methylation in the promoter region is one of a crucial regulatory mechanisms in gene
expression. It is said that various diseases such as cancer, depression and diabetes might be causedby methylation abnormality in the sequence.   
In this paper, we report a new development of DNA chip related to diagnoses with Prader-Willi
syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS), both of which are typically congenital genetic
disorders with methylation abnormalities.
Keywords：Prader-Willi syndrome ； Angelman syndrome ；SNRPN ； CpG island ； bisulfite treatmentており，特に，プロモーター領域で多く見られる，5’

１．緒言-CG-3’ の順となる配列中のシトシン残基メチル化が重要とされている（この5’ -CG-3’ 配列が多発する領域はCpG

DNAチップを用いた遺伝子異常の体外診断は，今や普アイランドと呼ばれている）．メチル化修飾を受けた配列遍的なものになりつつあり，疾病リスクを評価するようなは，発現・転写が抑制される．このような制御機構は，個々ものまで登場している．まさに黎明期と言って良いであろの細胞にとって必要な時期に必要なタンパク質を発現さう．そして，DNAチップは既に次の段階へと進み始めてせ，不要の時には発現を抑制させる役割を担っていると推いる．

定されている．つまり，このDNAメチル化程度が異常をDNAは，主としてタンパク質をコードしており，遺伝きたすと，コードするタンパク質の需要と供給のバランス子の実質的な本体である．しかし，DNAの役割は単純なが乱される結果となる．このことから容易に想像がつくよ

情報の蓄積体であるだけではなく，それ自身にRNAへのうに，メチル化程度の異常は，疾患の原因となり得る．近

転写を調節する機能も有している．
その最も著名なものが，年では，メチル化異常とがん，うつ病，糖尿病など，様々プロモーターであろう．プロモーターにおける発現調節機な疾患との関連が取り沙汰されている．

構の一つとして近年注目度が高まっているものに，DNA本 稿 に 記 す プ ラ ダ ー ウ ィ リ ー 症 候 群（Prader-Williのメチル化修飾が挙げられる．具体的には，DNA中のシsyndrome，PWS）とアンジェルマン症候群（Angelman

トシン（C）残基が受けるメチル化修飾が発現調節に関わっsyndrome，AS）は，メチル化異常を伴う代表的な先天性＊１ 技術研究所 研究部 ライフサイエンス技術グループ 医療検査チーム 主事＊２ 技術研究所 研究部 ライフサイエンス技術グループ 医療検査チーム＊３ 技術研究所 研究部 ライフサイエンス技術グループ 医療検査チーム チームリーダー＊4 技術研究所 研究部 研究部長 兼 ライフサイエンス技術グループ グループリーダー

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遺伝子疾患である．これらの疾患に関連するSNRPN（smallは，同キットの添付文書に従い，95℃ for 5 min，65℃

nuclear ribonucleoprotein polypeptide N） 遺 伝 子 は，for 85 min，95℃ for 5 min，65℃ for 175 min とした．

インプリンティング（刷り込み）遺伝子に分類される．

処 理 後 サ ン プ ル 中 のDNA濃 度 をNanodrop 2000 SNRPNのCpGアイランドには，以下のような特徴がある．

（Thermofisher社製）で測定し，次節のPCRの際の鋳型健常人では，この領域のDNAメチル化率が50%である．

量計算に用いた．

PWS患者の99%以上において，そのメチル化率は100%である１,２）．一方，AS患者の7割程度は，同上領域のメチル２．４

PCR（polymerase chain reaction）．このような特性を生かして，我々は，PCRには，BIOTaqTM HS DNA Polymerase（BIOLINECpGアイランドのメチル化率が0，50，100%のいずれであ社製）を用いた．プライマーは，SNRPNのバイサルファるかを検査することにより，PWS/AS罹患の鑑別診断がでイト処理後配列から設計した（詳細は３．１節に記す）．そきるキットの開発を企図した．本報では，① バイサルファのプライマー配列をTable 1に示す．Reverse側について

イト処理後の塩基配列から検査内容に適したプライマーをは， 蛍 光 色 素IC5に よ り 標 識 さ れ た プ ラ イ マ ー

設計し，② そのプライマーを材料に，まずは，検査対象（Thermofisher社製）を用いた（その配列は，Table 1 でとなる遺伝子配列だけを含むプラスミド検体を用いてプは逆相補鎖表記としている）．鋳型量は25 ngとした．サーローブの選定を行った．そして，③ 選定したプローブをマルサイクラーは，Applied Biosystems社製のveritiを用用いてゲノムDNAサンプルを試験して，設計したプライいた．PCR条件は，以下のとおりである．Initial step：

マーおよび選定したプローブの妥当性を評価した．

95℃ for 10  min，Reaction： 40  cycles of（95℃ for

２．実験方法

72℃ for 7 min．

化率が0%である

１,３）

30 sec，60℃ for 30 sec，72℃ for 30 sec）
，Final step：２．
１

DNAチップ

２．５

DNAチップの作製方法は前報に記されたとおりとした ．

ハイブリダイズ反応，蛍光強度測定チップ上には，目的とするSNRPN遺伝子のCpGアイラ４）ンドをバイサルファイト処理した際に生じる配列（CpG
２．
２メチル化体および非メチル化体それぞれに対応するもの）

DNAサンプル

検査対象となるSNRPNのCpGアイランドのバイサルに相補的な配列が固定化されている．したがって，増幅産ファイト処理後配列（メチル化体，非メチル化体とも）を物中のメチル化体あるいは非メチル化体の含有量・含有率

人工的に作製し，プラスミド内に挿入したものをファスに応じて，それぞれに対応するスポット上に固定化されたマック社より購入した．これらメチル化体配列プラスミド

相補鎖プローブと水素結合し，2本鎖を形成する（ハイブおよび非メチル化体プラスミドを混合して，人為的にメチリダイズ反応）．これ以降の手順は，当社においてこれまル化率が0，50および100% のサンプルを調製した．これで開発されてきたDNAチップと同様である．すなわち，らをプラスミド検体と呼び，以降の実験に用いた．

チップ上のスポットに結合したPCR産物に由来する蛍光強ゲノム DNA（gDNA）サンプルは，いずれもClontech

度を測定することにより，サンプルDNA当該領域のメチ社より販売されているものを購入した．その内訳を以下にル化率を計算することができる原理である（詳細後述）．

記す．健常人サンプル（メチル化率50%）は，ヒト白血球

上 記 で 得 ら れ たPCR産 物 に， 最 終 濃 度 で0.75×SSCgDNA を用いた．メチル化率 0% を模した遺伝子操作細（saline sodium citrate buffer，11.3  NaCl，1.13 胞 株 由 来DNAと し て，EpiScope® Unmethylated

sodium citrate，単位：mM）および0.075% SDS（sodium

HCT116 DKO gDNA（以下，DKO）を使用した．高メチ

dodecyl sulfate）となるようにそれぞれの試薬を添加しル化率（100%想定）のサンプルはEpiScope® Methylatedて，ハイブリダイズ反応液を作製した．この液中にDNA

HCT116 gDNA（以下，Me）を用いた．

チップニードルを浸漬して（55℃，1 hr），インキュベートした．インキュベート終了後，チップを0.1% SDS含２．
３

有0.5×SSC中で振盪して洗浄した．さらに1.0×SSCでgDNA検体のバイサルファイト処理

EpiTect Bisulfite Kit（QIAGEN社 製 ） を 用 い て，洗浄後，同液に浸漬した状態で蛍光強度を測定した．

gDNAサンプルをバイサルファイト処理した．処理条件

蛍光強度測定には，遺伝子解析装置（BIOSHOT HT-32 

Table 1 Primer sequences.

Prime rForward primer
Reverse primer

Se que nce (5' → 3')
GGAGGGAGTTGGGATTTTTGTATIC5-TTCAATACTCCAAATCCTAAAAACTTAAAATA
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東洋鋼鈑㈱製） ５） を用いた．測定結果から，露光時間4forward，reverseともCpGを含まない配列となるようにsecの励起光で惹起される蛍光強度を自動計算し（推定蛍検索した．その結果，Fig. 1（b）において灰色網掛け部

光強度法），メチル化率を示す判定値の算出に用いた．

分をプライマー配列として選択した（配列は前掲のTable．なお，reverseプライマーは，実際には Fig. 1（b）1を参照）

２．
６に記された配列の逆相補鎖を用いるので，Table 1 では逆データ解析および判定値算出

上述の方法により測定された蛍光強度から，下記の数式相補鎖表記としている．

によりメチル化率を示す判定値（index）を算出した．
判定値（index）＝メチル化体プローブの蛍光強度
メチル化体プローブの蛍光強度 ＋ 非メチル化体プローブの蛍光強度

このプライマーセットにより，Fig.1に示した24カ所のCpGのうち，最大で22カ所のCpGのメチル化程度を調べることができる．そこで，次にCpGメチル化体あるいは×100

非メチル化体を検出するプローブを考案した．図示されているように，CpGアイランド（CG配列が頻出する領域）

３．結果および考察

では，複数のCGが近接あるいは隣接している．したがって，検出用のプローブを単一CGのメチル化の有無を調べるよ３．
１

うに設計するのは難しい．そこで，本チップ用のプローブ

プライマーおよびプローブの設計

ゲノムDNA中のある領域のメチル化程度を知りたいとは複数 CpG が含まれるものを設計した．

きに，バイサルファイト処理後PCRは，これまでも有用な本チップでは，Genus らの同領域の CpG における研究を参照して，Fig.1（b）に示されるPCR産物配列（灰ツールであり続けてきた．しかし，この手法を用いて報告

DNAのシトシンメチル化率を調べたい時，CpGがプライ色網掛け部分間の配列）を7つの領域に分割した（Fig.2）．

マー配列中には全く含まれていないことが必要である．な

それぞれの領域についてメチル化体プローブおよび非メチ

ぜならば，バイサルファイト処理により，メチル化されてル化体プローブを3〜6種類ずつ設計した．

６）

いないシトシンは最終的にチミンに変換されるが，メチル化されているとこの変換が起きないからである．つまり，

３．２

この化学処理により，CpGの部分で2種類の配列が生成さゼーションによるプローブの選定

プラスミド検体PCR産物を用いたハイブリダイれることを意味する．そうすると，設計したプライマーはプラスミド検体を鋳型として，２．４節に記したものと理論上，処理により変換された配列か，変換されていない同一の方法でPCRを行った．PCR産物を２．５節と同じ方配列のいずれか一方しか増幅できないことになる．

法にてチップ上でハイブリダイズし，洗浄後，蛍光強度を測定した．

SNRPNのCpGアイランド元来の配列と，そのバイサルファイト処理後の配列をFig.1に示す．ただし，CpGsは任意のメチル化および非メチル化プローブの組み合わせすべてメチル化された状態で，バイサルファイトによる変からメチル化率を示す判定値を算出し，２．２節に記した換を受けないものと仮定して配列を示した（Fig.1（b））．

サンプル本来のメチル化率と相関性が最も高く，かつ，値Fig.1（b）の配列からメチル化体，非メチル化体の区別なのバラつき（3σより判断）が小さいものを選定した．

くPCR増幅が可能なプライマーを考案した．すなわち，Table 2に，サンプルの実際のメチル化率と特に近かった

Fig.1

DNA sequences of SNRPN CpG island (a) before bisulfite treatment and (b) after bisulfite treatment.
24 CpGs are highlighted in blue. The primer set, prepared for this study, shown in gray.

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Fig.2

Table 2Vol.４０

23 CpGs and 7 regions for candidate of hybridization probes.
23 CpGs (A-W)6) are highlighted in blue. The primer set, prepared for this study, shownin gray. 7 regions for probe design are indicated by the frames with numbers.

The list of methylation rate calculated from each combination of un-methylated and methylated probes.

UN-ME: un-methylated and methylated probe No., respectively. (a) The values obtained from the 5th region in Fig.
2. (b) The values calculated from the 7th region. In each tables, the combination of probes, which shows the mostequivalent values in calculation to nominal methylation rates of the prepared samples, is shown in bold style.

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DNAメチル化異常を伴う疾患の鑑別診断チップの開発

Fig.3―プラダーウィリー /アンジェルマン症候群鑑別チップ―

The examination of plasmid samples on DNA chips.
The data obtained from 5th (un-methylated andmethylated probes: 4-M1, a) and 7th (un-methylatedand methylated probes: 2-M2, b) region in Fig. 2. Bars
represent mean values ± 3σ.

Fig.4 The examination of gDNA samples on DNA chips.
The data obtained from 5th (un-methylated andmethylated probes: 4-M1, a) and 7th (un-methylatedand methylated probes: 2-M2, b) region in Fig. 2. Bars
represent mean values ± 3σ.

5 および 7 番目の領域（Fig. 2）のプローブ群から得られ４．結言た判定値の一覧を示す．Table 2 において，UN-MEは非メチル化-メチル化プローブ番号を表しており，5番目の領域では，4-M1の組み合わせ（Fig.3（a），Table 2），7番

本研究により，SNRPN遺伝子CpGアイランドのメチル目の領域では，2-M2の組み合わせが理論値に近く，かつ，化率が0，50，100%のいずれであるかを判別できるプロー判定値の分離の良いものであった（Fig.3（b），Table 2）．

ブ群が選定された．これらを用いたgDNAサンプルの評価

上記の5 番目および 7 番目の領域では，プローブに CpG

結果から，本チップは，現在PWSおよびAS患者の診断にがともに 3 カ所比較的密集して含まれており，そのこと用いられているメチル化解析と同等の鑑別能を有しているが他の領域（1 番目の領域を除けば，CpG が 2, 3 カ所し可能性が示唆された．以上の検討結果から，本チップは，かなく，かつ，それらの CpG 間隔が疎である）と比較し実際の患者サンプルの鑑別診断に適用可能な段階に達したて検査性能が高かった原因であると推察される．と判断できる．

３．
３引gDNA検体を用いたプローブおよび閾値の検証

用

文

献

次に，遺伝子DNA低メチル化細胞株DKO（メチル化率１）K. Kosaki，M.J. McGinniss，A.N. Veraksa，W.J.

0% と想定される），正常ヒト白血球遺伝子DNA（メチル

McGinnis and K.L. Jones：Am. J. Med. Genet.，73（1997），308．

化率50%），高メチル化処理DNAサンプルMe（想定メチル２）D.J. Driscoll，J.L. Miller，S. Schwartz and S.B.

化率100%）の3種類のサンプルを用いて，３．２節と同様の実験を行い，メチル化程度を評価した．これらサンプル

Cassidy：GeneReviews® [Internet]．のチップでの評価により得られた判定値（Fig. 4，前節でhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1330/

選定した5番目の領域の 4-M1 プローブ，および7番目の３）A. Dagli，J. Mueller and C.A. Williams：

領域の2-M2プローブの組み合わせより算出）は，前出のGeneReviews® [Internet]．

プラスミド検体を用いた際の判定と同等と見なせるもので

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1144/
４）中村憲章，平山幸一，山野博文：東洋鋼鈑，39（2017）
，あった．

33．

前節３．
２にて検討したプラスミド検体の結果と同様に，

５）森弘惇一，津田稔也，山野博文：東洋鋼鈑，40（2019），

5番目の領域の4-M1プローブでは，0% と 50% サンプル35．の間の判定値の差に比して，50% と 100% サンプル間の判定値差が小さく，より接近した値を取った．一方，7番６）E. Genus，M.D. Rycke，A.V. Steirteghem and I.

目の領域の2-M2プローブは，0, 50, 100% サンプルを検査

Liebaers：Hum. Mol. Genet.，12（2003），2873．

した際の判定値の間隔がより均等に近く，より理想的であると判断できる．

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