アプリケーションノート

バイオ医薬品・バイオシミラー

Agilent AssayMAP Bravo および 6545XT
AdvanceBio LC/Q-TOF による
宿主細胞タンパク質分析

著者

Linfeng Wu, Shuai Wu andTe-Wei Chu
Agilent Technologies, Inc.,
Santa Clara, CA, USA

はじめにモノクローナル抗体 (mAb) などのバイオ医薬品の使用は急速に拡大しています。バイオ医薬品は生物由来であるため、最終製品には複数手順による精製後でも、微量の宿主細胞タンパク質 (HCP) が含まれている場合があります。HCP は製品の安全性と効能に影響を及 ぼす可能性があるため、医薬品に含まれる HCP レベルを規制要件1に従ってモニタリングし、管理する必要があります。治療用タンパク質に含まれる HCP の定量には、以前から、酵素免疫測定法 (ELISA) が標準メソッドとして選 ばれています。

しかし、ELISA には個々の HCP を同定および定量するための特異性とカバレッジが不足しています。そのため、HCP 分析に LC/MS 手法が選 ばれるようになりました。HCP の LC/MS 分析における主な課

題点は、医薬品由来の大量のペプチドと低存在量の HCP ペプチドが共溶出することです。つまり、ペプチドに対する優れた分離能と LC/MS システムの広いダイナミックレンジが必要になります。

今 回 の 研 究 で は、 自 動 サンプル 前 処 理 に

サンプル前処理

Agilent AssayMAP Bravo プ ラットフォ ーム を、LC-MS/MS 分 析 に Agilent 6545XT

オンライン分離検出

データの処理およびレポート作成

AdvanceBio LC/Q-TOF を、 デ ー タ 解 析 にProtein Metrics 社 のベンダーニュートラルなソフトウェアを用 いた HCP 分析 ワークフ

ロー (図 1) について説明します。AssayMAP

Bravo プラットフォームは、タンパク質の消化、脱塩、 カートリッジでの 高 pH 逆相 (HPRP)

分画 などの 自動 サンプル 前処理 に 使用します。HPRP 分画をする場合としない場合の消AssayMAP Bravo
酵素分解およびHPRP 分画化サンプルを LC-MS/MS 分析に供し、プラットフォーム 性能 を調 べました。新しい 測定メソッドである反復 MS/MS により、タンパク質同定 の改善 が示されました。この標準フロー

LC/Q-TOF は、広いダイナミックレンジ、優れた再現性、定量機能を有します。実験結果から、2 ppm を超える HCP はすべて、カートリッジでのサンプル分画と反復 MS/MS によって高い信頼性で同定されることが示されました。

1290 Inﬁnity II LC
システム

AdvanceBio ペプチド
プラスカラム

反復 MS/MS

Protein Metrics

図 1. アジレント HCP ワークフローの概要

実験方法
材料

ヒト IgG1 mAb (パ ートナ ー から 入 手 した

R&D 製品) は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞から産生され、プロテイン A で精製しました。プロテオミクスダイナミックレンジ

スタンダードセット (UPS2) は Sigma-Aldrich社から購入しました。

装置構成
••

Agilent AssayMAP Bravo システム

Agilent 1290 Infinity II LC シ ス テ ム(下の機器で構成)••••

Agilent 1290 Infinity II

ハイスピードポンプ G7120A

Agilent 1290 Infinity II

マルチサンプラ G7167B

Agilent 1290 Infinity II

サーモスタット付カラム

コンパートメント G7116B

Agilent 6545XT AdvanceBio
LC/Q-TOF•

26545XT AdvanceBio
LC/Q-TOF

Agilent Dual Jet Stream ESI イオン源

サンプル前処理

UPS2 を 1:1,000 の比率で mAb に添加しました。2 つ目のサンプルは UPS2 を添加しない mAb であり、ネガティブコントロールとして同時に調製し、分析しました。このコントロールの分析により、UPS2 タンパク質の同定が、コントロールサンプルの 配列 ホモログによるものではないことを確認しました。いずれのサンプルも AssayMAP Bravo システムを用いて、還元、アルキル化、トリプシン消化、脱塩を行いました。次にサンプルを分注し、一方を Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
システムを用いて直接 LC-MS/MS 分析 に供し、 もう一方 を AssayMAP Bravo システムによる HPRP メソッドを用 いて 分画した 後、LC-MS/MS 分析に供しました。

HPRP 分画

消化サンプルをアジレントの逆相 (RP-S) カー

トリッジで 6 つのフラクションに 分画しました。AssayMAP Bravo の設定済みの Protein

Sample Prep WorkBench Fractionation

アプリケーション (図 2) を用いました。RP-S

カートリッジ は まず、70 % アセトニトリル(ACN)、0.1 % トリフルオロ 酢酸 (TFA) でプ

ライミングし、0.1 % TFA で平衡化しました。

次に、150 μg の消化サンプルを各カートリッジにロードした後、10 mM ギ酸アンモニウム

バッファ (pH 10) で ACN を段階的に増やして(10、15、20、25、30、90 %) 6 つのフラクションに溶出しました。

LC/MS 分析

表 1. 液体クロマトグラフィーのパラメータLC 分析パラメータ

分析カラム

AdvanceBio ペプチドプラス、2.1 × 150 mm、2.7 μm (部品番号 675950-902)

移動相 B

90 % ACN、0.1 % ギ酸

移動相 A

H2O、0.1 % ギ酸

流量

0.4 mL/min

グラジエント53.0 分 - 90 %B

ストップタイム
カラム温度

1.0 分 - 3 %B

50.0 分 - 21 %B

55.0 分 - 90 %B
55.1 分 - 3 %B
60 分

60 ° C

表 2. MS パラメータ
MS パラメータ

LC 分 離 は、Agilent AdvanceBio ペプチド

ドライガス温度

品番号 675950-902) を用いて、60 分の LCネブライザ

35 psi

シースガス流量12 L/minプラスカラム (2.1 × 150 mm、2.7 µm、部メソッドで流量 0.4 mL/min で実施しました(表 1)。各 サンプルは 6545XT AdvanceBio
LC/Q-TOF システムで、従来の自動 MS/MS

メソッドまたは反復 MS/MS メソッドを使用して測定しました (表 2)。

ドライガス流量
シースガス温度

290 ° C

13 L/min
275 ° C

Isolation Width (選択幅)狭い ( ～ 1.3 m/z)

MS 質量範囲

250 ～ 1,700 m/z

分析でのダイナミック排除

MS 取り込みレート
MS/MS 質量範囲

MS/MS 取り込みレート
取り込みモード

反復 MS/MS

0.2 分後に 1 スペクトル放出
10 スペクトル/秒

50 ～ 1,700 m/z
3 スペクトル/秒

反復 MS/MS または自動 MS/MS
質量誤差許容範囲: 15 ppm

RT 排除許容範囲: -0.2 ～ +0.4 分

図 2. 分画アプリケーションのユーザーインタフェースのデフォルト設定3

生 データファイル は Protein Metrics 社 のソフトウェアを用いて処理しました。1 つの生データファイルを Preview を用 いて 検索し、Byonic パラメータを 作成します。すべての生データファイルについて、Byonic を用いてmAb および UPS2 タンパク質配列を連動させた Uniprot CHO K1 タンパク質データベースで検索しました。検索パラメータには、半特×106
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.20カウント

データ処理

異的トリプシン消化、最大 2 つの切断ミス、プ22232425

リカーサ許容範囲 20 ppm、フラグメント許容26

取り込み時間 (分)27282930

範囲 30 ppm、固定のシステイン (C) のアルキル化、可逆のメチオニン (M) の酸化、アスパラギン (N) とグルタミン (Q) の脱アミド化、そして Preview 解析で示されたその他種々の可逆修飾などがあります。Byonic の結果ファLC/MS
注入 1

イルを Byologic にインポートし、タンパク質配列のより小さなセットで詳細を解析して、結m/z

果を作成しました。MS2 検索の最少スコアを150 としてペプチドを検索しました。

結果と考察

反復 MS/MS と自動 MS/MS の比較
Agilent 6545XT AdvanceBio Q-TOF

LC/MS
注入 2

システムは、新しいデータ測定メソッドである

反復 MS/MS により、存在量 の 少 ないプリカーサイオンの同定 を改善します (図 3)。このメソッドを使用して、タンパク質消化 サン

プルを複数回、LC-MS/MS で 分析します。

最初 の 分析 はデータ依存型測定 による従来の 自動 MS/MS で実施しました。次 に 反復追加注入…

m/z

MS/MS 用に選択したプリカーサ

ローリンング排除プリカーサ

図 3. 自動化された反復 MS/MS 測定メソッドのダイアグラム

まず、オフライン分画のない LC/Q-TOF シスに UPS2 を添加すると、タンパク質レベルはテムを用いて、反復 MS/MS と自動 MS/MS0.0004 から 313 ppm の範囲となり、19 種範囲およびリテンションタイム排除許容範囲た 精製 mAb を両方 のメソッドで 分析しましす。この添加サンプルは、治療用タンパク質にしたプロテオミクスダイナミックレンジスタンました。その結果、より多くのプリカーサイオ現したものです。今回の研究で調 べるように、つの 濃度範囲 の 48 種類 のヒトタンパク質 をLC-MS/MS 分析を実施し、MS/MS フラグメ

ンテーション用 に事前 に選択したプリカーサイオンを、カスタマイズ可能な質量誤差許容を用いてローリングベースで自動的に排除しンに対して LC-MS/MS を自動的に行うことができました。

4を比較しました。すなわち、UPS2 を添加した。UPS2 は、Sigma-Aldrich 社 か ら 購 入ダードで、500 amole から 50 pmole の 6

含 む 複雑 なタンパク質混合物 です。消化前に 1:1,000 の比率 (w/w) で、mAb サンプル類 のタンパク質 が 1 ppm を超えて存在しま存在する HCP の広いダイナミックレンジを再異 なるメソッドの感度およびダイナミックレンジを評価することもできます。

表 3 に、それぞれの測定メソッドで同定した

mAb および UPS2 タンパク質 のペプチド配列 の 総数 を示します。同じアミノ酸配列で修

表 3. 反復 MS/MS または自動 MS/MS 測定メソッドで同定したペプチド配列の数

飾 が異 なるペプチドは、1 つのペプチド配列

タンパク質アクセッション

1 回の測定で 3 回の注入

タンパク質添加レベル (ppm)

反復 MS/MS

自動 MS/MS

ド量 は 32 µg で、それぞれの測定メソッドで

mAb_HC

49.7

NA419382

3 回の注入を実施しました。全体的に、反復

mAb_LC

24.0NA201186

MS/MS は 広 いダイナミックレンジにわたっ

ALBU_HUMAN_spike

66.4

313.04643て、タンパク質あたりより多くのペプチド配列

CAH2_HUMAN_spike

29.1

137.3

1915を 同定しました。8 ppm 以上添加したタン

CAH1_HUMAN_spike

28.7

135.6

99

パク質 はすべて、高い信頼性で同定されまし

LEP_HUMAN_spike

16.2

76.2

41た。ここに示した 追加 の 結果 のすべては 反復

HBB_HUMAN_spike

15.9

74.8

1210MS/MS で分析しました。

HBA_HUMAN_spike

15.1

71.3

76

UBIQ_HUMAN_spike

10.6

50.066

CO5_HUMAN_spike

8.6

40.444

CATA_HUMAN_spike

59.6

28.1

22

SUMO1_HUMAN_spike

38.8

18.3

31とカウントしました。注入ごとのサンプルロー

クロマトグラフィーの再現性およびダイナミックレンジ

反復 MS/MS 分析 の 3 回 の 注入 で 得られた 上 記 データセットを 用 いてクロマトグラ

分子量 (kDa)

フィーの 再現性 およびダイナミックレンジに

NQO1_HUMAN_spike

30.7

14.520PRDX1_HUMAN_spike

22.0

10.4

30LC-MS/MS 測定 によるベースピーククロマ

PPIA_HUMAN_spike

20.2

9.544

MYG_HUMAN_spike

17.1

8.0

21

ついても評価しました。図 4 に、3 回の反復トグラム (BPC) と 4 つの共溶出したプリカー
サイオンの抽出イオンクロマトグラムの重 ね

表示 を示します。カラムへのサンプルロード

量 が 多 いため、mAb のペプチドからの 多くのシグナルにおいて検出器 が 飽和しました。

BPC はプラトーになっています。4 つの共溶出したペプチドプリカーサイオンについての

ビンペプチドのRSD 値 は、10.3 % でした。

詳細を表 4 にまとめます。共溶出したペプチ

これらのデータより、6545XT AdvanceBio性 が 得られ、定量 の 再現性 も極 めて広 いダミックレンジおよび再現性 は 良好であること

ドにおいてクロマトグラフィーの 優 れた 再現

LC/Q-TOF システムのスペクトル内のダイナイナミックレンジで良好 でした (ピーク強度が実証されました。

は 6.76 × 103 から 1.38 × 108)。存在量が 最 も少 ない、8 ppm を添加したミオグロ
×106
2.4

EPQVYTLPPSR

BPC

拡大

2.2

SAVTALWGK

2.0

TIAQDYGVLK

1.8
1.6
カウント

1.4
1.2
1.0

ALELFR

0.8
0.6
0.40.20

カウント VS 取り込み時間 (分)2468101214161820 222426283032

取り込み時間 (分)3436384042444648 5052545658

図 4. 3 回の LC-MS/MS 測定の BPC と 4 つの選択したペプチドプリカーサイオンの抽出イオンクロマトグラムの重ね表示

5

定量

反復 MS/MS 分析の 3 回の注入で得た上記のデータフファイルを用いて、ワークフローソリューションの 定量機能 についても調 べました。測定したペプチドすべてを用いて同定した

各 UPS2 タンパク質のすべての抽出イオンクロマトグラム (XIC) をサンプル 内で最 も存在量 が多いタンパク質 (ここでは mAb の重鎖)に対して正規化しました。値は Byologic ソフ

表 4. 4 つの選択したペプチドプリカーサイオンのデータ(m/z)

質量誤差 (ppm)

強度%RSD

強度

タンパク質添加ALELFR

374.7208-1.1

6.76E+03

10.3 %

8

TIAQDYGVLK

554.3049-1.81.51E+05

6.2 %

10.4

SAVTALWGK

466.7659

4.8

1.36E+05

6.0 %

74.8

ヘモグロビンβEPQVYTLPPSR

643.844

1.0

1.38E+08

1.2 %NAmAbペプチド

プリカーサイオンレベル (ppm)

タンパク質名
ミオグロビンペルオキシレドキシン 1
サブユニットトウェアから直接エクスポートしました。図 5にタンパク質あたりの正規化した XIC (Y 軸左側、mAb コントロールサンプル は青、UPS2

mAb コントロールの正規化した XIC

添加サンプルはオレンジ) とUPS2 添加サンプ

UPS2 添加サンプルの正規化した XIC

サンプルには UPS2 タンパク質からの XIC シグナルはありませんでした。よって、今回のワー

0.10

クフローソリューションは高い特異性があることが示されました。UPS2 添加サンプルでは、正規化した XIC は、実際のタンパク質添加レベル (ppm) と相関していました。これらの結果から、Byologic ソフトウェアからの正規化した XIC 値により、HCP 存在量の定量推定値が得られることが示されました。

UPS2 添加サンプルの実際のタンパク質レベル (ppm)

400
UPS2 に添加した実際のタンパク質レベル (ppm)を示します。予想どおり、mAb コントロール

0.12

タンパク質あたりの正規化した XIC

ルの実際のタンパク質レベル (Y 軸右側、緑)

350
300

0.08
0.06
0.04

250
200
150
1000.020500

図 5. タンパク質あたりの正規化した XIC と実際に添加した UPS2 レベルの比較。タンパク質あたりの XIC を、mAb 重鎖に対して正規化。mAb コントロールサンプル (青) および UPS2 添加サンプル (オレンジ) の値を
UPS2 添加サンプルの実際のタンパク質レベル (緑) とともにプロット

6

AssayMAP Bravo を用いた
HPRP 分画による同定の改善

プラットフォームで、RP-S カートリッジを用いクロマトグラフィー分離させた HPRP 溶出サンた HPRP 分画により、同定の感度が向上する

主要 なタンパク質サンプル前処理 (タンパク質ことが示されました。消化サンプル 150 µg をを Agilent AssayMAP Bravo サンプル前処理

高 pH 分画のプロトコルで 6 つのフラクションプルを比較した LC-MS/MS 分析の TIC シグナルを示します。

各 RP-S カートリッジにロードし、使いやすい消化、ペプチド精製、免疫アフィニティー精製)に溶出させました。各フラクションは 2 回の反プラットフォームと、マイクロクロマトグラフィー

復 MS/MS 測定で分析しました。図 6 に、分カートリッジおよびタスク中心の自動化プロト画していないサンプルと RP-S カートリッジでコル2～ 4 を用いて自動化しました。同じ自動化

カウント

×107
2

分画していないサンプル

カウント0×1065

HPRP フロースルー

カウント

0×1071

HPRP フラクション 1

カウント0×1072

HPRP フラクション 2

カウント0×1071

HPRP フラクション 30

カウント×1072HPRP フラクション 4

カウント

0×1072

HPRP フラクション 5

カウント

0×107201357911131517192123252729

取り込み時間 (分)3133353739414345474951

HPRP フラクション 6

図 6. 分画していないサンプルと HPRP 分画したサンプルの TIC シグナル7

添加した存在量の少 ないタンパク質由来 ペプ

チドの MS/MS スペクトルは 手作業で調 べ、高品質のスペクトルで、内因性の CHO HCPからのホモログの汚染 がないことを確認しま

表 5. AssayMAP HPRP 分画後、各フラクションにつき 2 回の反復 MS/MS 測定による

UPS2 添加タンパク質由来ペプチド配列の同定
タンパク質アクセッション

分子量

タンパク質添加レベル(ppm)

ペプチド配列の数

66.4313.079(kDa)

した。2 ppm 以上添加したタンパク質 はすべ

ALBU_HUMAN_spike

分画 により同定 の 感度 が 向上 することが 示

CAH2_HUMAN_spike

29.1

137.332

されました (表 5、表 3 と比較)。図 7 に、2

CAH1_HUMAN_spike

28.7

135.6

15

LEP_HUMAN_spike

16.276.26

ペプチド IEEIFK の MS/MS スペクトルの例

HBB_HUMAN_spike

15.9

74.8

22

HBA_HUMAN_spike

15.1

71.3

14

UBIQ_HUMAN_spike

10.6

50.0

9

CO5_HUMAN_spike

8.6

40.46

CATA_HUMAN_spike

59.6

28.1

14

SUMO1_HUMAN_spike

38.8

18.3

11

NQO1_HUMAN_spike

30.7

14.58

PRDX1_HUMAN_spike

22.0

10.4

9

PPIA_HUMAN_spike

20.2

9.5

11

MYG_HUMAN_spike17.1

8.02

CYB5_HUMAN_spike

16.0

7.62

EGR_HUMAN_spike

6.4

3.0

1

SYHC_HUMAN_spike

58.2

2.75

KCRM_HUMAN_spike

43.1

2.0

3て、高い信頼性で同定されたことから、HPRP

ppm 添加したヒト KCRM タンパク質からのを示します。

2,500

Intensity

2,000
1,500
1,000
500
0

100

200

300
400
Mass-to-charge (m/z)

500

図 7. 2 ppm 添加した KCRM タンパク質由来のペプチド IEEIFK の MS/MS スペクトル

8600700内因性 の CHO HCP の同定 における HPRP分画の影響についても調べました。図 8 に、1160% のタンパク質誤同定率において、分画して140します。分画していないサンプルは 3 回 の反同定された CHO タンパク質の数 について示120

復 MS/MS 測定、HPRP 分画したサンプルは各フラクションにつき 2 回の反復 MS/MS 測100定を実施しました。その結果 HPRP 分画したサンプルは、反復 MS/MS と組み合わせることによって、数 が 3 倍以上増加することが示されました (138 対 38)。

以上により、HCP の同定の改善がカートリッCHO タンパク質の数いないサンプルと HPRP 分画したサンプルでジによる HPRP 分画の利点であることが実証

自 動 サンプ ル 前 処 理 に AssayMAP Bravo

プ ラットフォ ー ム を、LC-MS/MS 分 析 に6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF を、データ解析に Protein Metrics のベンダーニュート

ラルなソフトウェアを用いた宿主細胞タンパク質分析ワークフローについて説明しました。

•た AssayMAP Bravo プラットフォーム
により、比類のない再現性、拡張性、柔軟性、使いやすさを備えたサンプル前処•理の自動化が実現します。

60400383 回反復測定した

分画していないサンプル

2 回反復測定した
HPRP 分画サンプル

図 8. 同定した内因性の CHO HCP の数について、分画していないサンプルとHPRP 分画後に反復 MS/MS 測定したサンプルとの比較•

AssayMAP Bravo を用いた HPRP 分画も実施すると、2 ppm 以上添加したタンパク質がすべて、高い信頼性で同定されマイクロクロマトグラフィーカートリッジとタスク中心の自動化プロトコルを用い80

20されました。

結論

138

•

ました。

データ依存型測定 により得たデータファイルにより、高速でシンプルなタンパク質の同定と定量が可能になりました。

反復 MS/MS により、タンパク質の同定能 も改善 されます。反復 MS/MS 測定を 組 み 合 わ せた LC-MS/MS を 用 いると、8 ppm 以上添加した標準タンパク質•すべてが高い信頼性で同定されました。

広 いダイナミックレンジおよび優 れた再現性 が 標準フロー LC/Q-TOF システムで実証されました。

9参考文献1.

ICH Q6B Specifications:TestProcedures and Acceptance Criteria
for Biotechnological/Biological
Products.

2.

Automation for LC/MS Sample
Preparation:High Throughput
In-Solution Digestion andPeptide Cleanup Enabled by the
Agilent AssayMAP Bravo Platform.
Agilent Technologies, publication

number 5991-2957EN.
3.

Automation of Sample Preparation
for Accurate and Scalable
Quantification and Characterizationof Biotherapeutic Proteins Using theAgilent AssayMAP Bravo Platform.
Agilent Technologies, publication

number 5991-4872EN.
4.

Agilent AssayMAP Bravo Technology
Enables Reproducible Automated
Phosphopeptide Enrichment fromComplex Mixtures Using HighCapacity Fe(III)-NTA Cartridges.
Agilent Technologies, publication

number 5991-6073EN.

ホームページ

www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

email_japan@agilent.com
本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2018
Printed in Japan, July 2, 20185991-9300JAJP