アプリケーションノート

臨床研究

血漿プロテオミクスの自動サンプル前処理
PreOmics iST 技術と Agilent Bravo Automated Liquid
Handling Platform

著者

Phillipp E. Geyer2,3,
Garwin Pichler1, Peter V.
22

Treit , Sophia Doll , and Nils A.
Kulak1
1

PreOmics GmbH,Matrinsried, Germany

2

Department of Proteomics
and Signal Transduction,
Max Plank Institute ofBiochemistry,Matinstried, Germany

3

NNF Center for Protein
Research Faculty of HealthSciences,
University of Copenhagen,Denmark

概要

臨床研究では、血漿や血清などの血液 ベースサンプル中のタンパク質を頻繁に分析します。血液試料に含まれる血漿プロテオームの研究は、さまざまな問題のために極めて困難なものでした 1。最大の問題は、サンプル前処理ワークフローにおけるマニュアル操作が複雑で時間がかかることです。このようなマニュアル操作を行うことで、サンプルの平行処理でミスが非常に起こりやすくなり、比較分析に必要な再現性を犠牲にせざるを得ません。サンプル数が増えるほどこれらのマニュアル操作による前処理はより困難になり、信頼性が低い結果を導きます。一方で、仮定のない 1 回の MS 分析で測定される何千もの変数 (この場合はタンパク質やペプチド) でバランスを取るには、統計学的に大量のサンプル数が不可欠です。

これらの問題を解消するために、Geyer 等は高速 (2 時間) かつ堅牢な「血漿プロテオームプロファイリング」パイプラインを開発しました 2。このプロトコルには、PreOmics の iST Kit と Agilent Bravo

Automated Liquid Handling Platform の高スループット自動化ソリューションとの組 み合 わせで実現するシンプルなサンプル前処理の相乗作用を活用しています。他のサンプル前処理メソッドとは異なり、このプロトコルはサンプル前処理のすべてのステージ (変性、還元、アルキル化、酵素消化、ペプチド精製、脱塩) が、単一の反応バイアルで完結します。Bravo ロボティクスプラットフォームの使用によって、汚染を最小に抑え、 ユーザーに起因するシステム誤差を低減することができます。この単一分析

LC/MS/MS プロテオミクスワークフローでは、以上のような利点を活用して、数百もの血漿プロテオームの再現性のある自動定量分析が 1 µL のサンプルから可能になります 2、3。

はじめに循環器系 のタンパク質 は 個々人 の 生理機能を映し出します。現在、タンパク質 の 測定 には、一般的に単一タンパク質の免疫測定法が使用されていますが、これは複数の欠点が生じやすい手法です 4。MS ベースのプロテオミクスを使用する、高スループットで仮定のない定量データは、きわめて望ましい代替手段ですが、それには 特有の課題 があります。最 も多く言及される問題は、プロテオーム内のタンパク質アバンダンスの広いダイナミックレンジで、これは質量分析システムとスキャンモードの 仕様 の 絶え間 ない向上 によってバランスがとられています

1、2。しかし、大規模コホート中の潜在的バイオマーカーの同定と確認に必要な、堅牢で高スループットのプロテオミクスワークフローが存在しなかったため、プロテオミクスワークフローの分析前段階 に大きな制約がありました。

こ の 制 限 を 克 服 す る た め に、Geyer 等(2016)2 は高速かつ堅牢な「血漿プロテオームプロファイリング」パイプラインを発表しました。先ごろ記述された in-StageTip (iST) メ

ソッド 3 をベースとし、血漿サンプルに特化して手法 をさらに合理化しました。指 を針で突いてわずか 1 µL の血漿を得ることから初め、すべての前処理段階 (変性、還元、アルキル化、酵素消化、ペプチド精製、脱塩) を 1 つの反応バイアル iST カートリッジで実行しました。iST Kit の手順に従って実行すると、サンプル 前処理全体 が 2 時間未満 で 完了し、Bravo 液体処理プラットフォームにおいて 96ウェルフォーマットで簡単 に実行できました。

他のサンプル前処理メソッドとは異なり、このワークフローではタンパク質除去 が 不要で、ワークフロー類の血漿プロテオームの定量分析が、20 分性、還元、アルキル化、消化: iST サンプル前

指を針で突いて得た 1 µL の血液中の数百種のグラジエントを用いた LC/MS/MS で可能になります。

iST サンプル 前処理: 溶解、タンパク質 の変処理プロトコルにより、96 ウェルプレートで 1～ 96 プレートを同時処理する選択肢 が提供

このアプリケーションノートでは、女性 1 名とされます。この実験では、2 人の血漿サンプル用した、血漿プロテオミクスプロファイリングの血漿サンプルを処理しました。プロトコルにテップ Agilent Bravo プロトコルを解説しまら試薬 を吸引し、試薬 をサンプルに添加したタンパク質の変性、還元、アルキル化、消化ンプルプレート内で溶液を混合します。

ルに対して混合相ペプチドクリーンアップを実1.

血漿サンプルを、水と 1:10 (v:v) の比にク質が定量され、全体で 3,486 のユニークな

2.

10 µL のサンプルを MTP → SAMPLEました。大部分は 96 ウェルのすべてのサンプ

3.

分析で一意的 に存在しました。繰り返し測定により、血漿プロテオーム特性解析のための4.

なりました。全体のワークフローの繰り返し分5.

した。

6.

男性 1 名の被験者から得た血漿サンプルに適のサンプル前処理ワークフローのための 2 ス

す。PreOmics 社の iST Kit を使用して、血漿を実行しました。サンプル前処理後に、サンプ施し、次いで LC/MS/MS 分析を行いました。

1 回 の 分析で平均 300 のユニークなタンパペプチド配列と 373 のタンパク質が同定されル中に存在し、わずか 2 % が複数の単一 LC

LC/MS ワークフローの 再現精度 が 明らかに
析間で、0.98 のピアソン相関係数が得られま

実験方法
材料

血漿サンプル: 静脈穿刺によって 10 mL の血液を採取しました。2,000 × g で 20 分間遠心分離した後、血漿を採取しました。血液は、マックスプランク研究所の生命倫理委員会の事前の承認を得て、書面でのインフォームドコンセントを提出した健康なドナーから採取しました。

をそれぞれ 48 × 1 µL 量、つまり合計で 96

従って、Bravo は順に適切なソースプレートか後、ソフトウェアに入力した条件に従って、サ試薬の準備溶解して～ 5 µg/µL の濃度にするの 1 ～ 12 列に加える

120 µL の溶解液を MTP → LYSE の列 1 ～ 6 に加える

210 µL の再懸濁液を消化用の各チューブに加えて振る (RT、500 rpm、10 分)

120 µL の消化液を MTP → DIGEST の列 1 ～ 6 に加える

120 µL の停止液を MTP → STOP の1 ～ 12 列に加える

図 1 は、Agilent Bravo Platform での試薬の適切な配置を示しています。

サンプル

新しいチップ

加熱、37 °C

廃液

iST カートリッジ

加熱、80 °C

溶解液

停止消化液

図 1. プロトコル 1 のプレート構成: 溶解、タンパク質の変性、還元、アルキル化、消化2

Agilent Bravo システムのワークフロー
•
••
•
•

ロボットとインキュベータを始動させる

80 ° C、ポジション 6
37 ° C、ポジション 3

図 1 に示すようにプレートを配置する

プロトコルを開始する

••
•

•
•
•
•
•

溶解液を iST カートリッジに

iST サンプル前処理: タンパク質の変性、還元、アルキル化、消化デッキの位置と試薬

ラボウェアタイプ

1: 血漿サンプル、5 µg/µL 水溶液

twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

3: 加熱シェーカー

Teleshake 加熱振とうステーション (G5498B#009)

2: 新しいチップ

4: 廃液

384ST 70 µL チップ、滅菌 (p/n 19133-112)

5: iST カートリッジ

アダプタプレート (PreOmics 社、P.O.00027)

サンプルを iST カートリッジに

7: 溶解液twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

iST カートリッジを閉める

9: 消化液twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

ピペットで移す
ピペットで移す•

iST カートリッジをポジション 6 に•サンプルを iST カートリッジ内で移動させる

10 分間 80 ° C で加熱する

6: 加熱

ペルチェ式サーマルステーション (G5498B#035)

8: 停止液twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

表 2. 分析機器
iST カートリッジ

iST Kit 96x (P.O.000027)、ボトムアップ式プロテオミクスサンプル前処理用
1 ～ 100 μg タンパク質原材料用カートリッジ

5 分間冷却する

アダプタプレート

カートリッジを 96 ウェル MTP プレートに配置

遠心分離する

MTP プレート

溶出後にペプチドを収集するための LoBind プレート

iST カートリッジを最大 400 g で
iST カートリッジをポジション 5 に配置する

ふたを取り外す

プロトコルを再開する•••

消化液を iST カートリッジにピペットで移す

iST カートリッジをポジション 3 に移動する

iST カートリッジを閉める• トリプシン消化 iST カートリッジを60 分間 37 ° C で加熱する•

iST カートリッジを最大 400 g で•

iST カートリッジをポジション 5 に•

表 1. デッキ上のサンプルと試薬遠心分離する配置する

プロトコルを再開する•

停止液を iST カートリッジにピペットで移す•

アダプタ内の iST カートリッジを廃液に•

iST カートリッジを3,800 rcf で 3 分間

廃液プレート

洗浄後に廃液を収集するためのディープウェルプレート自動化

コア自動化プラットフォーム

スタンドアロン仕様の Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform (G5523A)

アジレントの Bravo アクセサリ

Bravo、グリップ付き、スタンドアロン (G5523A#003)

アジレントのピペットヘッド
その他のアクセサリ
その他のアクセサリ
その他のアクセサリ
その他のアクセサリ

96ST ディスポーザブルチップピペットヘッド (G5498B#041)
分注機用アクセサリ (G5498B)

アライメントステーション (G5498B#028)

Inheco 社の MTC コントローラ (G5498B#015)

Teleshake 加熱振とうステーション (G5498B#009)

その他のアクセサリスロット/シェーカーカード (G5498B#019)

その他のアクセサリ

カスタムネスト、CPAC 用 (G5498B#017)

その他のアクセサリ

Bravo risers、146mm (G5498B#055)

その他のアクセサリ
その他のアクセサリ

CPAC、Ultraflat、コントローラなし (G5498B#021)
ペルチェ式サーマルステーション (G5498B#035)

その他のアクセサリ

アダプタプレート、INHECO CPAC NUNC 用 (G5498B#012)

LC システム

EASY- nLC 1000 超高圧システム (Thermo Fisher Scientific 社)

その他のアクセサリ

V_P PCR プレートインサート VP741I6A (G5498B#013)
LC/MS/MS

ナノエレクトロスプレーイオン源

ナノエレクトロスプレーイオン源 (Thermo Fisher Scientific 社)

LC カラム40 cm HPLC カラム

MS セットアップ

Q Exactive HF Orbitrap (Thermo Fisher Scientific 社)

配置する

遠心分離機にかけるペプチドを含むチューブまたはカートリッジを閉 めます (底の場合 はキャップを使用) 。ペプ

チドは –20 ° C で冷凍できます。ペプチドを–20 ° C で 2 週間を超えて保管しないでください。保管期間 を延長する場合 は、プロトコルを完了して –80 ° C で保管してください。

3

iST サンプル前処理: ペプチドのクリーンアップ

Bravo システムでのワークフロー

洗浄溶液で洗浄して、脂質や塩などの疎水性•

トリプシンペプチドを有機性 および水溶性 のおよび親水性汚染を除去しました。

試薬の準備
1.

2.

3.

4.

••120 µL の洗浄液 1 を 1 ～ 12 列に加える (twin.tec PCR Plate 96

ロボットを始動する

iST カートリッジをポジション 5 に配置する

プロトコルを開始する•

洗浄液 1 を iST カートリッジにピペットで移す

LC/MS/MS 分析

EASY-nLC 1000 超 高 圧 システム (ThermoFisher Scientific 社) とナノエレクトロスプ

レーイオン源 (Thermo Fisher Scientific 社)と Q Exactive HF Orbitrap (Thermo FisherScientific 社) で構成した LC/MS 機器を使用して、サンプルを測定しました。精製したペプ

チドを 40 cm HPLC カラム (内径 75 µm、イLoBind、Eppendorf 社)•

iST カートリッジを3,800 rcf で 3 分間

ンハウスで ReproSil-Pur C18-AQ 1.9 µm 樹

加える (twin.tec PCR Plate 96•iST カートリッジをポジション 5 にました。

120 µL の溶出液を 1 ～ 12 列に•プロトコルを再開する

120 µL の洗浄液 2 を 1 ～ 12 列に

LoBind、Eppendorf 社)

加える (twin.tec PCR Plate 96

遠心分離機にかける配置する•

LoBind、Eppendorf 社)

洗浄液 2 を iST カートリッジにピペットで移す

120 µL の LC ロードを 1 ～ 6 列に•iST カートリッジを3,800 rcf で 3 分間

LoBind、Eppendorf 社)•

iST カートリッジを MTP プレートに•

iST カートリッジをポジション 5 に加える (twin.tec PCR Plate 96

図 2 は、Bravo Platform での試薬の適切な配置を示しています。

洗浄液 1

新しいチップ

加熱、37 °C

廃液iST カートリッジ

加熱、80 °C

洗浄液 2

溶出液

LC ロード

図 2. ステップ 2 のペプチドクリーンアップ用

プレート構成 (表 1 にも掲載)•

遠心分離機にかける配置する
配置するプロトコルを再開する•

溶出液を iST カートリッジにピペットで移す•

iST カートリッジを3,800 rcf で 3 分間•

MTP プレート内の溶出液を Speed-Vac•

MTP プレートをポジション 5 に脂をチップに充填、Dr. Maisch 社) で分離し10 ～ 50 % の緩衝液 B (0.1 % ギ酸、60 % アセトニトリル v/v) の 15 分間の直線グラジエントでペプチドを溶出した後、98 % 洗浄液を5 分間、流量 450 nL/min で流しました。カラ

ム温度は 60 ° C に保持しました。

データ解析

MS の生データファイルを MaxQuant ソフト

ウェアバージョン 1.5.2.105 で解析し、システインカルバミドメチル化を固定修飾として、N-端子アセチル化とメチオニン酸化を可変修飾として、 ヒト Uniprot FASTA データベ ース(2014 年 6 月版) および Andromeda サーチ

エンジン 6 による共通汚染物質データベース

でペプチドリストを検索しました。

遠心分離機にかけるにかけて 45 ° C で完全に乾燥させる

配置する

••

LC Load を MTP プレートにピペットで移す

MTP プレートを超音波洗浄器または振とう器にかけてペプチドを完全に再懸濁する

表 3. デッキ上のサンプルと試薬

iST サンプル前処理: タンパク質の変性、還元、アルキル化、消化デッキの位置と試薬

ラボウェアタイプ

2: 新しいチップ

384ST 70 µL チップ、滅菌 (p/n 19133-112)

1: 洗浄液 1

3: 加熱シェーカー
4: 廃液

Teleshake 加熱振とうステーション (G5498B#009)

5: iST カートリッジ

アダプタプレート (PreOmics 社、P.O.00027)

7: 洗浄液 2

twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

9: LC ロード

twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

6: 加熱

8: 溶出液4

twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

ペルチェ式サーマルステーション (G5498B#035)

twin.tec PCR プレート 96 LoBind (Eppendorf 社、p/n 0030129504)

False discovery rate は、最小で 7 アミノ酸の 長さのタンパク質 およびペプチドの 両方 について 0.01 に設定し、リバースデータベースを検索 することによって 求 めました。データ

ベース検索では、酵素特異性をアルギニンとリジンの C-末端として設定し、トリプシンをプ結果と考察消化がすでに起こっていました。脂肪や塩 など

このアプリケーションノートで解説する容易に

サンプル前処理の手順全体が 2 時間未満で完ル前処理メソッドと、Bravo システムが可能にに実行して、MS 分析用にペプチドを精製できにより、PreOmics 社 が開発した iST サンプした 高スループット自動化 の 相乗効果 を得らは最大 7 ppm 許容し、フラグメント質量偏差テオミクスサンプルの 大規模コホートを高速た。ラベルフリー定量化 (LFQ) は 最小レシオができます。

は 20 ppm 許容して、 ペプチドを同定しましカウント 1 で実行しました 7。

性の洗浄ステップで、ペプチドを精製しました。

適応可能 な血漿プロテオミクスワークフローロテアーゼとして使用し、最大 2 個の切断ミスを許容しました。初期プリカーサ質量偏差の汚染物質を除去するための有機性および水了し、Bravo の 96 ウェルフォーマットで簡単ました。

れます。このメソッドを使用すると、血漿プロ自動化プロトコルを評価するために、96 個の血漿サンプル (女性と男性 1 人 ずつから得かつ堅牢で再現性の高い方法で分析することたそれぞれ 48 個 のサンプル) を処理して 分析しました。LC/MS/MS データの 定量ラベ先ごろ記述された in-StageTip (iST) メソッド 3

ルフリー 解析用 に MaxQuant を使用しましステムでの平行自動化プロトコルを確立するこ

全体でピアソン相関係数 を計算しました。定(PreOmics GmbH、ドイツ) を基に、Bravo シた 7。各個人のワークフローでの繰り返し分析とができました。1 µL の血漿から始め、すべて量化されたタンパク質信号の相関値の平均はの 前処理ステップを単一 の 反応 バイアルであ0.98 です (図 3)。

る iST カートリッジで実行しました。iST Kit の手順に従って、1 時間後には十分なタンパク質11

Individual 148 1

Individual 248

Individual 11211

Individual 2 sample 48[Log10intensity]1048
1R = 0.9898

Individual 276648

0.85

78910
Individual 1 sample 1[Log10intensity]

11121.00

図 3. 色分けされたピアソン相関係数、96 テクニカルワークフローレプリケートの一対比較用。
0.98 のピアソン相関係数は高い再現性を示しています。

5

テクニカルレプリケートの 優 れた 再現性 を強100
Relative abundance

調するために、1 個のサンプルからの 3 つの繰り返し分析で生成されたトータルイオンクロ

マトグラム (TIC) を重 ね表示しました (図 4)。

重要 なことは、溶液内消化とペプチド精製を含 む包括的 な血漿プロテオミクスサンプル前処理ワークフロー全体の実行後に、この優 れA

691.76395.24480.7950682.71
693.86349.68812.40
0

た再現性レベルが達成されたことです。

Relative abundance

100

血漿プロテオーム中のタンパク質の量の範囲はおよそ 6 桁にわたり (図 5)、1 回の平均的な分析につき 300 個の定量化されたタンパク質で構成されました。これらの約 300 種類のタンパク質の中で、さまざまな典型的血漿タ

B691.76395.24682.71

480.79349.6850693.860

ンパク質機能が示されました。例えば、アポリ

100Relative abundance

ポタンパク質 A1 および B などの脂質恒常性システムからのタンパク質、補体因子 C5 などの炎症を起こす反応に関与するタンパク質、レチノール結合タンパク質やインシュリン感受性

パラメータアディポネクチン (ADIPOQ) などの輸送タンパク質などです。

C

691.76395.24480.79500682.71

349.68693.86

0510Time (min)15

図 4. 個々人のサンプルの異なるテクニカルレプリケートから 3 つの TIC を直接比較。

ピークの上の数値は m/z を示しています。

A12B
12ALB
APOA111Individual 2 sample 48[Log10intensity]

Log10Intensity

11APOB

1010KNG1C59SHBG
RBP4ADIPOQ

8BCHE

IGHG4987
LDHA6PZP

S100A8050100150
200
Protein rank

250

IGHM

SHBG

HBD

73003506678910
Individual 1 sample 1[Log10intensity]

図 5. A) 20 分間のグラジエントで定量化された 96 ワークフロー繰り返し分析によるタンパク質の分布。

11B) 他の定量化された血漿タンパク質をバックグラウンドとして IGHG4、IGHM、SHBG、PZP の量を視覚化するための直接比較

6812.40

12812.40

20

このラベルフリーワークフローは、個人間 のタンパク質 の 自然 および 病理学的変化 の 捕捉に最適です 2。例えば、2 つのサンプル (女性 1 人と男性 1 人) 間のタンパク質の定量レ結論

PreOmics iST Kitは、プロトコルを変えずに、Bravo システムでシームレスに使用できます。

ベルの直接比較では、妊娠性血漿タンパク質

このメソッドの組み合わせを使用すると、血漿は 女性サンプル中の血漿タンパク質に絶対的高速なテクニックを用いて、 わずか 2 時間の(PZP) と性 ホルモン結合 グロブリン (SHBG)に多く存在します (図 5)。SHBG の主要 な機能的役割はエストロゲンとの結合です。一方、

PZP はプロテアーゼをトラップします。免疫グ

ロブリンは膜結合性があり、また、B リンパ球によって生成される分泌糖タンパク質です。免

疫グロブリン IGHG4 および IGHM は 2 つのタンパク質の同定のための堅牢かつ高感度で合計サンプル処理時間で LC/MS/MS グレードの ペプチドを 得 ることができます。Bravo

Liquid Handling Platform が 実現 する 自動化により、ワークフローでの繰り返し分析全体から得られる結果も再現性 が非常に高まります。ワークフローの再現性 は、2 つの血漿ササンプル間で存在量 が異 なり、タンパク質発ンプル間での有意差を明らかにするのに十分しています。

研究において、血漿プロテオーム中の新規の現レベルに個人間で大きな差異があること示なものでした。この再現性 は、特に長期的 な生物学的変化を発見する上で十分であると結論付けました。このことは、Geyer 等による別人から得た 1 µL の血漿の 48 回の繰り返し分析でサンプルを前処理する、つまり合計 96 サンプルを前処理することによって、このワークフローの特長を実証しました。

1 回の分析で、血漿プロテオーム中のタンパク質を平均 300 個定量しました。生物学的に関連したパラメータを基 にした患者の層別化に使用できる血漿プロテオームの典型的 な機能も含まれています。2 つのテクノロジーを 1つのワークフローに統合することで実現される高スループットと堅牢性のコンビネーションを活用することによって、数百種類さらには数千種類の血漿サンプルの前処理が実現可能なものとなります。この相乗効果 は 大規模 な臨床研究アプリケーションにおいて不可欠 になると考えられます。の研究で示されています(2017)1。このアプリ
ケーションノートでは、女性と男性それぞれ 17参考文献
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カストマコンタクトセンタ

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Printed in Japan, October 17, 20185994-0306JAJP

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