経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

研究課題名

経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

フリガナ

ツネヤマ

代表者名

常山コウイチ幸一

所属機関（機関名）徳島大学（役職名）教授
氏

共同研究者

大学院

医歯薬学研究部

名（フリガナ）

疾患病理学分野

所属機関・役職名

役割分担

市村真祐子

徳島大学・助教

動物モデル作成菊池健太郎

帝京大学・准教授

免疫動態解析

守時

由起

秋田大学・特任講師

生化学的検査福島大学・教授

イメージング平修

本助成金による発 英文論文準備中
表論文，学会発表 学会報告予定（2020 日本病理学会総会、2020 Digestive disease week, USA）

研究結果要約
生活環境の変化に伴い食物アレルギー患者は増加傾向にある。アナフィラキシーで死に至るような重篤例から口腔不快感にとどまるものまで症状は個人差が大きいが、総じて患者や家族の QOL を大きく損なっている。
近年、食物アレルギーがアレルゲンの皮膚への曝露によって誘導されるという経皮感作説が注目されている。
我々は、成人の食物アレルギーで過半数を占めるとされる甲殻類アレルギーに注目し、主要アレルゲンであるエビトロポミオシン（ｒMet e1）の経皮感作による新規モデルマウスの開発に取り組んだ。まず、従来の経口負荷と同量の rMet e1 を経皮的に継続的に塗布したところ、経口負荷よりも血中 IgE 値が上昇することがわかった。次に、rMet e1 塗布時に皮膚のバリア機能を障害する操作を追加することで、皮膚局所に好酸球浸潤を伴う炎症が惹起され、血中 IgE 値が無処置よりも上昇することを明らかにした。なかでも、市販の皮膚塗り薬とともに rMete1 塗布した際の IgE 値上昇が顕著であり、経口抗原曝露では軽度のアナフィラキシー症状を呈した。このことか
ら、皮膚を保護する目的で使用した外用薬がかえって抗原の皮膚からの取り込みを促進している可能性が推測された。次に、新規モデルマウスにフラクトオリゴ糖を投与し、アレルギー状態が軽減するかどうかを検討した。フ
ラクトオリゴ糖投与群では IgE 値の上昇が抑制されており、腸内細菌叢を改善することでアレルギー状態が軽減する可能性が示された。

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経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

研究目的れておらず、モデル動物の確立は研究の推進に非生活環境の変化に伴い食物アレルギー患者は増常に有用である。さらに、経皮感作の程度を皮膚の加傾向にある。小児の食物アレルギーは成長ととも状態から検討することで、皮膚が置かれた環境がアに軽快することも多いが、成人で発症する食物アレレルゲンへの感作にどのような役割を果たしている

ルギーは難治性であり、QOL を大きく損なう要因となかを知る手がかりとなり、成人の経皮感作の予防にっている。成人の場合は対象物を避けるなどの対応繋がる情報が得られると期待される。また、医療行為がしやすく、患者総数などの実態がなかなか表面化の対象になりにくい食物アレルギーを、プレバイオテしていないが、形を変えた食事を誤って摂取してアィクスという食によって軽快できれば、潜在的な食物ナフィラキシーに陥るなどの重篤例も報告されており、アレルギー患者にも取り入れやすい容易な方法となその対策が望まれている。成人の食物アレルギー患り、QOL の改善に寄与することができる。これらの取者の上位を占めているのはエビ、カニ、イカなどの甲り組みは、食の問題を食で解決する画期的なもので殻類アレルギーであり、そのアレルゲンとしてトロポミあり、その意義は大きいと考えられる。

オシンが同定された。我々はアメリカや香港の研究者と共同でエビトロポミオシンで経口感作したモデル

研究計画及び研究手法

動物を作成し、種々の解析を行ってきたが、コレラト

予備実験：キシンによるアジュバントを用いるなど実際のヒトの患エビアレルゲン（トロポミオシン）の作製者とは発症機序に相違があるモデルであった。

エビアレルゲンであるトロポミオシン（rMet

近年アレルゲンに対する感作が腸管ではなく皮膚e1）は MTA を締結し、Chinese University ofで起こっているとの仮説が提唱された。経口免疫寛Hong Kong の Wai 博士に供与頂いた。そのタン容が皮膚からの曝露では生じないため、経皮感作でパク質は遺伝子組換えによって E.coli に発現さはより強い免疫反応が惹起され、食物アレルギー発せ、固定化金属イオンアフィニティークロマトグ症のトリガーとなっている可能性が推測される。経皮ラフィーで精製したものである１）。それらの濃度感作食物アレルギーモデル動物は未だ数が少ない

お よ び 純 度 は BCA protein assay (Thermoことから、本研究では、トロポミオシンの経皮感作モFisher)を用いたタンパク質の定量および SDS-デル動物の確立を第一の目的とした。さらに、確立さPAGE によって確認した（図１）。

れたモデル動物を用いて、皮膚局所の免疫学的な変化や成体内輸送経路について検証するとともに、プレバイオティクスによる食物アレルギーの予防とそのメカニズムの解明に取り組んだ。
成人型食物アレルギーの半数以上を占める甲殻類アレルギーの経皮感作モデル動物は未だ確立さ28

経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

実験１：経皮感作による食物アレルギーモデルと同時に従来の経口感作によるモデル１）も作成して比較検証した（図２）。

実験２：
感作によって産生されるトロポミオシン特異的IgE の増加を目的とし、皮膚バリアの破壊方法（tape-stripping 法、SDS 塗布法、抗生物質塗布法）を比較検討した（図３）。マウスおよび感作に用いた rMet e1 は実験１と同様である。感作は実験開始後 0、7、14、21 日目に実施した。
4 週齢雌性 Balb/c マウスを経口感作（IS）群、経皮感作（ES）群、およびそれらのコントロール群の 4 群に分けた。IS 群には胃ゾンデで rMet e10.1mg を投与し、ES 群には背中の皮膚に rMete1 0.1mg を塗布した。皮膚バリアの破壊にはtape-stripping 法を用いた。各コントロール群には rMet e 1 の代わりに PBS を用いた。感作は実験開始後 0、12、19、26 日目に行い、感作の 24時間後に採血した。最後の感作から 1 週間後にrMet e1 を胃ゾンデで経口負荷をした。経口負荷実験３：後、1 時間の間、基準に従ってアナフィラキシー

プレバイオティクスによる食物アレルギーの予および糞便を観察した（表１、２）。経口負荷の翌防効果を評価した。マウスおよび感作、経口負荷日に解剖し、血液および臓器を採取した。のスケジュールは実験１と同様である。プレバイ
オティクスにはフラクトオリゴ糖（FOS）を用い、5％添加した飼料を自由摂取させた（図４）。

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経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析（UHPLC-MS / MS）を用いて、酢酸（AA）、プロピオン酸、酪酸（BA）、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、4-メチル吉草酸およびコハク酸（SA）などの短鎖脂肪酸（SCFA）の同時定量を行う方法を確立した 2,3,4）。実験１－３で組織学的に顕著な変化を示した個体を選択し各個体より 25μl の血清を採取し、凍結保存の上で同各実験における検索項目法による SCFA 網羅的同時測定を検討中である。

１）血中トロポミオシン特異的 IgE の測定
実験１－３の全ての検体について、血中トロポ結果と考察

ミオシン特異的 IgE 値を文献１に準じ、ELISA

実験１：感作 3 回目（19 日目）で血中トロポミオシン法により測定した。

特異的 IgE が増加し、IS 群より ES 群が高値を
２）組織学的評価示す傾向にあった（図５）。

実験１－３の全ての検体について、解剖時に採取した臓器はすべて 10％中性緩衝ホルマリン溶液で固定し、パラフィン包埋、薄切後、HE 染色、特殊染色および免疫染色を行った。また、アレルゲン曝露部位の皮膚については凍結標本を作成し、rMet e1 のイメージング質量分析や、樹状細胞等のマーカーの免疫染色を試みた。
経口負荷後、アナフィラキシー等のアレルギー反応は IS 群、ES 群ともにみられなかった。組織学

3) サイトカイン解析（解析中）
実験１－３で組織学的に顕著な変化を示した的には腸管および肝臓において各群で有意な差個体を選択し、腸に発現するサイトカイン等をはみられなかった（図６－８）。従来の経口感作Real time-PCR 法によって現在解析を行っていモデルでは、コレラトキシンを併用することで腸る。

内環境を破壊して抗原曝露を促進していたが、今回はコレラトキシンを使用せず、同量のアレルゲ

4) 短鎖脂肪酸（SCFA）解析

ンを経腸管経路と経皮経路で曝露している。実験（解析中）立命館大学の井之上、長友らは最近、2-ピコリ１の結果からは、正常に近い腸内環境の際には、ルアミンの簡単な誘導体化を伴う高感度超高速経皮的な感作のほうが生じやすい可能性を示し

液体クロマトグラフィータンデム質量分析ていると考えられた。

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経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

実験２：
感作 3 回目（14 日目）で血中トロポミオシ
ン特異的 IgE が増加し、そのレベルは tapestripping 法に比べて SDS および抗生物質塗布法の方が高い傾向を示した（図９）。

また、本実験による SDS、及び抗生物質塗布群
では、経口負荷後に、実験１ではみられなかったアナフィラキシー反応が軽度に観察された。
次に、抗生物質塗布法の皮膚を Day 21 に採取し、組織像をホルマリン固定標本、及び凍結標本で解析した。ホルマリン固定標本において、HE染色では浅層から皮下の筋肉内に至るまで炎症細胞浸潤が軽度に認められた。核が分葉した細胞が多く、ルナ染色では細胞質が好酸性を示し、好酸球浸潤と考えられた（図１０）。

筋層内に炎症細胞浸潤（HE染色）

肥満細胞（HE染色）
図１０31

皮下脂肪内に炎症細胞浸潤（HE染色）

好酸球（ルナ染色）

抗生物質塗布法によるアレルゲン塗布部

経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

その他、肥満細胞も散見され、アレルゲン曝露部

diet 群に比べて FOS diet 群で低値を示す傾向が位で炎症反応が生じていると考えられた。次に、みられた（図１１）。

同部の凍結標本を用いて CD207， CD103 の免疫染色で樹状細胞の同定を、及びイメージング質量分析（福島大・平教授に依頼）によるｒMet e1の局在解析を試みた。しかしながら、皮膚の凍結標本は膠原線維の変性が強く、挫滅によって細胞成分が離開し、十分な解析ができなかった。現在、ホルマリン固定標本を用いたイメージング質量分析により、rMet e1 の局在解析を検討中である。
Tape-stripping 法も SDS 塗布も、皮膚のバリア機能を機械的に破壊する方法としてすでに報告された手法である。一方、抗生剤塗布法は我々のオリジナルであり、機械的破壊なしに皮膚のバリア機構が破綻しうる可能性を示す結果となった。
その機序としては、皮膚の表在菌叢の減少や消失
現在、腸内細菌叢が産生する短鎖脂肪酸(SCFA)が関与している可能性が考えられる。現代人は日の解析を施行中である。今回の結果から、腸内細焼け止めや皮膚の保護を目的に様々な薬剤を皮菌叢への介入によって、食物アレルギーの病態が膚に使用しているが、それら皮膚を保護する目的軽快する可能性が示された。今後は、フラクトオで使用している薬剤が、アレルゲンの皮膚からのリゴ糖のみならず、他のオリゴ糖群を検証する予感作を促進している可能性は否定できない。今後定である。また、短鎖脂肪酸の変化が見られた群は抗生物質に加え、ハンドクリームや日焼け止めについては、腸内細菌叢の次世代シークエンスをなど様々な皮膚に関する薬剤による抗原曝露の用いた解析を追加する予定である。

増強の可能性を検証する予定である。

残された課題実験３：

現時点で結果が出ていない項目（サイトカイン

感作２回目（12 日目）で血中トロポミオシン特測定や短鎖脂肪酸解析など）については、可能な異的 IgE が増加し、そのレベルは Normal diet 群

限り早い段階で検討を行い、作用機序についてのと FOS diet 群では同等であった。しかし、感作考察を行う。また、より広範な介入実験を計画し、3 回目（19 日目）、および感作 4 回目（26 日目）

食による食物アレルギーの予防・治療の実現を目には血中トロポミオシン特異的 IgE は Normal

指す。

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経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

学会発表・論文作成の予定

破綻があり、その要因として皮膚に使用している

本研究内容は、サイトカイン解析や短鎖脂肪酸様々な薬剤が悪影響を与えている可能性が示唆

解析の結果が揃った時点で、国内外の学会での発される。皮膚を強くすることで、皮膚からの感作表や英文論文作成を計画している。具体的には、の成立が抑制される可能性もあり、食物アレルギ

2020 年の日本病理学会総会、及び 2020 年の米ーを皮膚を標的に予防する試みも必要であると

国消化器病週間（DDW）での発表を予定してい考えられる。

る。
参考文献
今後の研究活動について

1 ） Leung PS, Lee YS, Tang CY, Kung WY,

本研究で、成人型食物アレルギーモデルの過半

Chuang YH, Chiang BL, Fung MC, Chu KH.

数を占める甲殻類アレルギーモデルマウスを経Induction

皮的に作成することに成功した。また、腸内細菌

hypersensitivity in mice. Int Arch Allergy

叢への介入によって、食物アレルギーの症状が軽Immunol. 2008;147(4):305-14.

ofshrimp

tropomyosin-specific

快する可能性が示された。食物アレルギーは程度の差こそあれ、患者の QOL を大きく損なう疾患で

2） Nishitsuji K, Watanabe S, Xiao J, Nagatomo

あるが、その治療法は未だ確立されていない。成R, Ogawa H, Tsunematsu T, Umemoto H,

人の場合は病院にも行かず、個人で対応している

Morimoto Y, Akatsu H, Inoue K, Tsuneyama K.

ケースも多く、容易に取り入れられる食による病
Effect of coffee or coffee components on gut

態改善法の確立は多くの患者にとって福音となると考えられる。本検討ではプレバイオティクス

microbiome and short-chain fatty acids in a mouse

による介入を試みたが、プレバイオティクスにも、

model of metabolic syndrome. Sci Rep. 2018 Nov

様々な種類があり、ガラクトオリゴ糖や乳菓オリ1;8(1):16173.

ゴ糖、コーヒーオリゴ糖など他のオリゴ糖類の検討も必要と考えられる。さらに、乳酸菌などの有3) Nishitsuji K, Xiao J, Nagatomo R, Umemoto H,用な菌叢の摂取とオリゴ糖の摂取を組み合わせ

Morimoto Y, Akatsu H, Inoue K, Tsuneyama K.

た、シンバイオティクスの本モデル動物への応用

Analysis of the gut microbiome and plasma short-も重要なトライアルになると考えられる。さらに、
chain fatty acid profiles in a spontaneous mouse

漢方薬や天然薬物、サプリメントなど、食に近く安価に長期間摂取が可能な候補物質の有用性をmodel of metabolic syndrome. Sci Rep. 2017 Nov

検証することも重要な課題である。

20;7(1):15876.

また、経皮感作の成立には皮膚のバリア機構の4)33

Nagatomo R, Okada Y, Ichimura M,

経皮感作による甲殻類アレルギーモデル動物の作成とプレバイオティクス投与による予防効果の解析

Tsuneyama K, Inoue K. Application of
2-Picolylamine

Derivatized

Short-chain Fatty Acids in Feces Samples. Anal
Ultra-highSci. 2018 Sep 10;34(9):1031-1036.

Performance Liquid Chromatography Tandem
Mass Spectrometry for the Determination of34