アプリケーションノート

インタクトおよび脱グリコシル化抗体薬物
複合体の薬物抗体比の効率的な測定ワークフローAgilent AssayMAP Bravo および Agilent 6545XT
AdvanceBio 精密質量四重極飛行時間型 LC/MS システム

著者

Jerry Han, Zach Van Den
Heuvel, and Steve Murphy
Agilent Technologies, Inc.
Santa Clara, CA 95052

はじめに

抗体薬物複合体 (ADC) は、急成長している生体分子医薬品であり、合成リンカーによって低分子医薬品に結合されたモノクローナル抗体 (mAb) で構成されています。結合された薬物と mAb の比 (薬物抗体比: DAR) は、効果と安全性に影響を与えるため、ADC 開発の重要な品質特性の 1 つです 1、2。生体内の DAR 分布の変化をモニタリングすることにより、ADC の生体内分解 (例えば薬物の脱結合) に対する重要な理解を得ることができます 3、4。しかし、LC/MS で繰り返し実行される平均 DAR や DAR

分布の測定では、複雑なマトリックス (例えば血清/血漿) からの ADC の親和性捕捉や精製済み抗体の脱グリコシル化など、煩雑でミスが起きやすいサンプル前処理手順が必要です。この複雑なサンプル前処理ワークフローの課題に対応するために (図 1)、本アプリケーションノートでは Agilent AssayMAP

Bravo Platform におけるアフィニティ精製と脱グリコシル化の自動化について説明します 5、6。血清中にすべての DAR 種 (0 ～ N) のある ADC の単離を可能にするために、標的抗原を用いてアフィニティ

精製を実行しました。脱グリコシル化によってさまざまなグリコフォームを除去することで、精製された抗体の質量スペクトルをシンプルなものにし、検出下限を向上させました。手作業の時間を最小に抑え、抗原の固定、アフィニティ精製、オンカートリッジ脱グリコシル化を含む自動処理全体を約 5 時間で完了することができました。

本 アプリケー ションノートでは、AssayMAP Bravo を Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF、Agilent BioConfirm DAR Calculator ソフトウェアと組み合わせて使用する効率的な ADC DAR ワーク

フローを紹介します。このワークフローは導入が容易で再現性が高く、拡張性に優れ、手作業の時間を最小に短縮します。

実験方法
材料

遺 伝 子 組 み 換 え ヒト HER2 細 胞 外 領 域(ECD) は ACRO Biosystems 社 (デラウェア州ニューアーク、HE2-H5225) から購入しました。トラスツズマブエムタンシン (T-DM1)

固定

溶出

濃縮

脱グリコシル化は Genentech 社 が 製造したものです。EZLink Sulfo-NHS-LC-ビ オ チ ン、Pierce ビ

オチン 定量 キット、Zeba スピン 脱塩 カラム(7K MWCO、0.5 mL)

は Thermo Fisher

Scientific 社 (ニューヨーク州グランドアイラ

ンド、327、28005、89882) から入手しました。

ラット血清は Sigma-Aldrich 社 (ミズーリ州セントルイス、R9759) から入手しました。Rapid

PNGase F は New England Biolabs 社 (マサンプル前処理

DAR の計算

図 1. ADC DAR の特性解析のワークフロー

ら 入 手 し ま し た。AssayMAP Streptavidin

抗原固定、親和性捕捉、オンカートリッジ
脱グリコシル化の自動化

リフォルニア州サンタクララ、SA-W、G5496-

固 定、ADC の 精 製、ADC の 脱 グリコ シ

サチューセッツ州イプスウィッチ、P0711) かLC/MS

合されているすべてのストレプトアビジンを除去します。図 2A はこのステップでの設定を示

自 動 化 セット アッ プ: ビ オ チ ン 化 抗 原 のしています。SA-W カートリッジのコンディショ

60010) から入手しました。10X HEPES バッ

ル 化 は、AssayMAP Bravo Platform でこともできますが (Wu 氏 ほか 7)、本 アプリ

は GE Healthcare Life Sciences 社 (マ サ

(アフィニティ精製)、On-Cartridge Reactionて実行しました。

入 手 し まし た。5 M NaCl は Promega 社

いて実行しました。図 2 ～ 4 は、各手順で使ティ精製用のアフィニティ (ベイト) カートリッ

HCl、pH 8.0 は Quality Biological 社 (351-ています。表 1 に、サンプルと試薬の要約を

v1.0 アプリケーションを使用して 3 µg のビオ

学物質 は Sigma-Aldrich 社 (ミズーリ州セン

な溶液量 は、対応する試薬容量カリキュレー

アビジンカートリッジ (SA-W) のそれぞれに固カートリッジは Agilent Technologies 社 (カファ、100 mM、1.5 M NaCl、pH 7.4 (HBS-N)

チューセッツ 州 マルボロ、BR100670) から(PAV4221) か ら 入 手 し ま し た。1 M Tris-

007-101) から入手しました。他のすべての化

Immobilization (固定)、Affinity Purification(カートリッジでの反応) アプリケーションを用用されるデッキレイアウトとラボウェアを示し示します。それぞれのアプリケーションに必要

ニングとビオチン化抗原 の固定 を同時 に行う
ケーションノートではわかりやすいように分 け

ビオチン化済み HER2 ECD の固定: アフィニ
ジを生成するために、Immobilization (固定)チン化済み HER2 ECD を 48 個のストレプトトルイス) から入手しました。

タを使用して 算出しました。Immobilization(固定) アプリケーションのプラットフォームを最終濃度 を 2 mg/mL にするために、1 mg

設定 を示しています。10 ベッドボリュームのトリッジ 移 動) v1.0 ユ ーティリティ (表 2B)

を 500 μL の Milli-Q 水 で 再溶解 しました。

mM NaCl、pH 7.4) を 10 µL/min で使用しン (SA-W) カートリッジをカートリッジラック

LC-ビオチンを使用して、再溶解済みの HER2

リッジステーション (デッキ 2 上) に移動させ

HER2 ECD のビオチン化の凍結乾燥済 み遺伝子組 み換え HER2 ECD
メーカーの指示に従い、EZ-Link Sulfo-NHS-ECD の半分 (250 µL 中 0.5 mg) をビオチン化しました。ビオチンの 過剰モル 倍率 は 250で、室温で 1 時間インキュベーションしました。ラベリング後、Zeba スピン 脱塩 カラムを使用しゲルろ過することによって、余分 な

Sulfo-NHS-LC-ビオチンと Sulfo-NHS (副産物) を除去しました。メーカーの指示 に従い、Pierce ビオチン定量キットを使用して、ラベリ

ング済 み HER2 ECD 中 のビオチン化濃度 を推定しました。

2

準備 するた めに、Cartridge Transfer (カー

定しました。図 2B はこのアプリケーションの結合バッファ (50 µL、10 mM HEPES、150を使用し、48 (6 カラム) のストレプトアビジて、SA-W コンディションステップでプライミン(AssayMAP Bravo のデッキ 6) からカート

100 µL の結合バッファ中の 3 μg のビオチンました。

グされたカートリッジを平衡化しました。次に、化済み HER2 ECD を、平衡化済みカートリッジそれぞれに流量 5 µL/min でロードしましSA-W カートリッジ のコンディショニング:た。ビオチン化済み HER2 ECD をロードした

100 µL の 1 % ギ酸 (FA) でプライミングし、バッファを 10 µL/min で使用してカートリッの後、流量 5 μL/min、100 µL の 1 % FA にステップのためのカートリッジの準備が整いま

SA-W カートリッジ は、 流 量 300 µL/min、
樹脂 に取り込まれた 空気 を除去しました。こよる平衡化ステップへと続きます。平衡化ス
テップでは、溶出ステップで共溶出すると後の分析へ干渉しうる、カートリッジ樹脂に弱く結後、ベッドボリュームの 10 倍 (50 µL) の結合ジを洗浄しました。これで、アフィニティ精製

した。

A

B

図 2. Immobilization (固定) アプリケーションの設定。A) SA-W カートリッジのコンディショニング、(B) ビオチン化済み HER2 ECD の SA-W カートリッジへの固定

3図 3. Affinity purification (アフィニティ精製) アプリケーションの設定

図 4. On-cartridge reaction (オンカートリッジ反応) アプリケーションの設定

4

ADC アフィニティ精製: 20 ～ 0.3125 μg/mLの 異 なる T-DM1 濃度 の 血清 と、T-DM1 な

表 1. サンプルと試薬しのコントロールを作成するために (表 2A)、

サンプルと試薬

Milli-Q 水、すべてのプロトコル用

さまざまな 量 の T-DM1 (トラスツズマブエム

洗浄ステーションを 精製済 みラット血清 にスパイクしました。

SA-W カートリッジのコンディショニング

タンシン、HER2 ECD を 標 的 とする ADC)

LC/MS への直接注入のために水で希釈した

Immobilization v1.0
カートリッジ

SA-W (G5496-60010)

平衡化

1 % ギ酸セットも準備しました。アフィニティによる捕プライム

HER2 ECD-SA-W カートリッジにロードする
直前に、結合バッファ (10 mM HEPES, 150
mM NaCl, pH 7.4) を用いてさらに 1:1 で希釈しました。アフィニティ精製 には、Affinity
Purification (アフィニティ精製) v1.0 アプリ
ケーションを使用しました。図 3 はこのアプリ

ビオチン化済み HER2 ECD の固定:捉のために、血清サンプルをビオチン化済 み

10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4

ビオチン化 HER2 ECD-SA-W

さまざまな濃度の ADC がスパイクされたラット血清

カートリッジ洗浄 1

10 mM HEPES、1 M NaCl、pH 7.4

カートリッジ洗浄 2

10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4
On-Cartridge Reaction v1.0

(n = 6) ごとに異なる濃度の T-DM1 をロードしました (プレートのレイアウトは 表 2B を参

カートリッジ

ADC-結合されたビオチン化済み HER2 ECD-SA-W

脱グリコシル化酵素

PNGase F

平衡化および chase バッファ照)。サンプルのロード後、流量 10 µL/min

で、ベッドボリュームの 10 倍 (50 µL) の 高

塩 HEPES バッファ (50 µL、10 mM HEPES、

20 mM トリス、pH 8.0

カートリッジ洗浄 1

10 mM HEPES、1 M NaCl、pH 7.4

溶出バッファ

1 % ギ酸カートリッジ洗浄 2

1 M NaCl、pH 7.4)、次いで ベッドボリュー
ムの 10 倍 (50 µL) の結合バッファによって、存在しない場合の DAR 分析を比較するためビオチン化HER2 ECD

サンプル

トリッジに通過させました。カートリッジの列

脱 グリコシル 化: グリカンが 存在する場合 とサンプル

Affinity Purification v1.0

すると、
T-DM1 を含む 100 µL の希釈済みラッが整いました。

コンディショニングされた SA-W

カートリッジト血清を、流量 2 µL/min でアフィニティカー

脱 グリコシル 化 のためのカートリッジの 準備

カートリッジ

平衡化およびカートリッジ洗浄バッファ

ケーションの設定を示しています。簡単に説明

連続的にカートリッジを洗浄しました。これで、

1 % ギ酸0.003 % ギ酸

中和溶液

0.5 % 水酸化アンモニウム

表 2. 実験計画。(A) 段階希釈およびロード量と (B) アフィニティ精製および脱グリコシル化のためのプレートレイアウトA

段階希釈およびロード量

ラット血清中の ADC 濃度に、精製済み T-DM1 のカートリッジの半分はPNGase F (カラム 1 ～ 3) でインキュベーショ

(µg/mL)ンし、カートリッジの残りの半分 (カラム 4 ～血清の使用量カートリッジにロードした

LC カラムにロードした(µL)

質量 (ng)質量 (ng)

20

50

1000

200

6) は PNGase F を含まない脱グリコシル化

10

50

500

100

5

50

250

50

でインキュベーションしました (表 2B)。

2.5

50

125

25
12.5

用バッファ (脱グリコシル化コントロール無し)

B

1.25

50

62.5

0.625

50

31.25

6.25

0.312550

15.625

3.125

0

50

0

0

アフィニティ精製および脱グリコシル化のためのプレートレイアウト (ラット血清中の ADC 濃度 (µg/mL) )

1

2

3

4

5

6

A

20

20

20

20

20

20

B

10

10

10

10

10

10

C

5

5

5

5

5

5

D

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

E

1.25

1.25

1.25

1.25

1.25

1.25

F

0.625

0.625

0.625

0.625

0.625

0.625

G

0.31250.31250.31250.31250.31250.3125

H

0

0

0

0

0

0

脱グリコシル化

脱グリコシル化なし

5オンカートリッジ 脱 グリコシル 化 には、On-

リカン、酵素溶液の混合溶液) を空のフロース

v1.0 アプリケーションを使用しました。図 4

量 10 µL/min で、 ベッドボリュームの 10 倍

プルを空 のウェルに 移し、Agilent PlateLoc

mM HEPES、1 M NaCl、pH 7.4) を用いて、ました。これで、LC/MS 分析用のサンプルのCartridge Reaction (カートリッジでの 反応)
はこのアプリケーションの 設定 を示しています。簡 単 に 説明 すると、T-DM1-結 合 カート

ルーコレクションプレートに分注しました。流(50 µL) の高塩 HEPES バッファ (50 µL、10

リッジを、流量 10 µL/min で ベッドボリュー

カートリッジを洗浄しました。この後に、同じ

ファ (20 mM Tris、pH 8.0) により平衡化しを用いて低ストリンジェンシー洗浄を行い、高た PNGase F (カラム 1 ～ 3) または脱グリコ

くつかの 非特異的結合 エンティティを除去し位置 4 (ペルチェヒーター /クーラー ) から各

ル化 T-DM1 (カラム 1 ～ 3) またはインタクト

応ステップの後に、2 µL の低速吸引が 30 分

µL の 1 % FA を用いて、ウェルごとに 15 µL

ムの 10 倍 (50 µL) の 脱 グリコ シル 化 バッました。反応ステップでは、4 µL の加熱されシル 化用バッファ (カラム 4 ～ 6) を、 デッキ

T-DM1-結合カートリッジに吸引しました。反流量で、10 ベッドボリュームの 0.003 % FA

塩 HEPES バッファ (MS では使用不可) といました。カートリッジに固定された脱グリコシ

T-DM1 (カラム 4–6) を、流量 5 µL/min、15

は 30 µL でした。最後に、水中の希釈された

未処理 の T-DM1 サンプルと処理済 みのサン

プレートシーラーを用いてプレートをシールし準備が完了しました。

LC/MS 分析

準 備 し た サ ン プ ル を、Agilent 6545XT

AdvanceBio 精 密 質 量 四 重 極 飛 行 時 間

LC/MS シス テム と Agilent 1290 Infinity II

UHPLC システムを組 み 合 わせて 分析しました。LC/MS パラメータは、表 3A と 3B に示されているとおりに設定しました。サンプルごとに、30 µL のうち 6 µL (20 %) を分析用に注以上続きます。このソフトウェアでは必ず、反の 0.5 % 水酸化アンモニウム (存在する採取た後、残りの量 (今回の例では 2 µL) をフォー

ンプルを中和しました。各 サンプルの 最終量

応 の 間、 カートリッジチップをウェル 内 の 溶B) インタクト ADC の MS データを取り込むために使用した MS パラメータ

応量の最初の 4 µL を 10 µL/min でロードしムで設定した 継続時間 の 間 ロードします。反液と接触させ、コンダクタンスによってカート

リッジ 内部 の 上昇した 温度 を保持しました。
カートリッジ内を約 37 ° C にするために (反応温度)、 ペルチェ温度を 45 ° C に設定しま量) を含んだ溶出プレートに溶出し、即座にサ

表 3. LC および MS パラメータ。A) ADC 分離に使用した LC パラメータ。

Aした。6 µL の 溶液 のみがカートリッジを通っ

パラメータ
カラム

サンプルサーモスタットて 吸引 されますが、1:12 に 希釈した 12 µL

移動相 Aの PNGase F (カラム 1 ～ 3) と脱 グリコ シ

移動相 B

ル化用バッファのみ (カラム 4 ～ 6) が、反応

設定値

Agilent 1290 Infinity II UHPLC システム

Agilent PLRP-S 1000Å 8 µm 150 × 2.1 mm (PL1912-3802)
5°C

0.1 % FA 水溶液

0.1 % FA アセトニトリル溶液
時間 (分)%Bの開始時に位置 4 の PCR プレートに分取さ

0–1

25–25

1–2

25–37

ほか、ウェルの底部とカートリッジのチップの

2–4

37–37

4–4.5

37–50

れました。蒸発 によるボリューム 損失 がある

グラジエント (セグメント化)

間の接触を維持して熱 が伝 わるように、反応が 終 わるまでの 間 ウェルごとに 少 なくとも 3

4.5–5.5

50–50

5.5–6

50–25

6–8.5

25–25

µL が必要となるため、カートリッジを通過しストップタイム

8.5 分

す。必要となる超過量は温度設定や反応時間

流量0.4 mL/minて吸引されるよりも多くの 量 が 必要 となりまにより異 なります。反応後のカートリッジ内に残留する遊離グリカンを集 めるために、流量

5 μL/min で 25 µL の脱グリコシル化用バッ

ファ ( �reaction chase� バッファ ) を各 カー

トリッジに通過させて、シリンジプローブに吸引しました。シリンジに 集 められたフロース

ルー ( �reaction chase� バッファ、遊離 N-グ

カラム温度

B

イオンモード60 ° C
Agilent 6545XT AdvanceBio 精密質量四重極飛行時間型 MS システム
ポジティブイオンモード

イオン源

Agilent Dual Jet Stream

ドライガス流量12 L/min

ドライガス温度
シースガス温度
シースガス流量

ネブライザ

キャピラリ電圧ノズル

フラグメンタ電圧

350 ° C
400 ° C
11 L/min
60 psi
5,500 V
2,000 V
380 V

スキマ電圧

140 V

Oct RF Vpp

750 V

取り込みパラメータ

MS モード6

入しました。

高 (30,000 m/z) 質量範囲
拡張質量範囲 (2 GHz)

MS のみのモード

質量範囲 1,000–5,000 m/z

MS データ解析

生 デ ー タ は、Agilent MassHunter

BioConfirm ソフトウェアで 解 析 しました。

3.05 分 から 3.85 分 の 間 のリテンションタイ

ムの 平均スペクトルをトータルイオンクロマ

トグラム (TIC) から抽出し、デコンボリュートしました。表 4 に、デコンボリューションのパラメータを示します。DAR 解析では、デコン

ボリュートしたスペクトルをエクスポートし、Agilent MassHunter DAR カリキュレータを用いて解析しました。最大 DAR ピーク数を 7

表 4. デコンボリューション用の Agilent MassHunter BioConfirm のパラメータ
パラメータ

Agilent MassHunter BioConfirm Deconvolute (MS): タンパク質

デコンボリューションアルゴリズム

最大エントロピー

限られた m/z 範囲の使用

2,400–3,600 m/z

デコンボリューションの設定
ベースライン

付加体

同位体幅

質量範囲: 140–160 KDa
質量ステップ: 1.0 Da
ベースライン減算
ベースライン係数: 7.00

プロトン

自動

に設定した以外は、DAR カリキュレータのデ

Protein Sample Prep WorkBench

で

ECD 分子ごとに約 9 種類のビオチングループ

還元)、リジンの結合した ADC の DAR 値を求

Purification (アフィニティ精 製) v1.0、On-

た。今回の研究では、各カートリッジの固定に

v1.0 の 3 つのアプリケーションプロトコルをの約 6 倍の過剰モル) を使用しました。このア

フォルトパラメータを使用して、インタクト (非めました。定量分析の再現性と性能を評価するために、Agilent MassHunter Qualitative

Analysis を使用して m/z が 2,000 ～ 4,000は、Immobilization (固 定) v1.0、Affinity

Cartridge Reaction (カートリッジでの 反応)順に使用しました。今回の研究でのアプリケー

がラベリングされたものと結論 づけられまし3 µg のベイト抗原 (捕捉する ADC の最大量

フィニティ精製リガンドの質量は、SA-W カーの範囲の抽出イオンクロマトグラム (EIC) を抽

ションの設定 (図 2 ～ 4) を使用した場合、機トリッジの結合容量をはるかに下回っていまし

結果と考察

アフィニティ精製に 1.2 時間、オンカートリッ

えつつ高 いレベルのターゲット回収 を可能 に出し積分しました。

ADC DAR の特性解析器が要したおよその時間 は、固定に 1 時間、ジ脱グリコシル化 に 1.3 時間でした。自動化

サンプルプロセス全体は約 4.5 時間で完了しました。AssayMAP により、最大 96 のサンAgilent AssayMAP Bravo Platform を使用

プルの前処理を同時に完了でき、手作業の時

複雑なサンプル前処理の問題に対処するためできました。

して、血清中の ADC DAR 特性解析におけるに、包括的なワークフローを開発しました。自動化されたサンプル前処理のワークフローには次の作業ステップが含まれます。

•••

ビオチン化済み標的抗原の AssayMAP

ストレプトアビジンカートリッジ (SA-W)への固定

血清からの ADC のアフィニティ精製
ADC 開発中 に 何度 も 分析 される 生体内 のADC サンプルを再現するために、一連の希釈した T-DM1 をラット血清にスパイクして 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0 µg/mL(表 2A) の最終濃度とします。ロードステップでの効率的 な結合を実現する重要 なパラメー

遺 伝 子 組 み 換 えヒト HER2 ECD (アクセッ
酸 Thr23–Thr652) は、T-DM1 への 標的結

時間はロードの流量によってコントロールされション番号 AAA75493、細胞外領域: アミノ

剰モルと、結合のための滞留時間です。滞留

合部位を含み、アフィニティ精製のベイトとします。この両方のパラメータを最適化し、最小捕捉を回避するために、ビオチン化済み抗原

コストを最小に抑え、一方で実行時間が最短

脱グリコシル化のアフィニティ精製手法ではプロテイン A/G

精製済み ADC のオンカートリッジでのするために選択しました。

タは、標的に対するアフィニティリガンドの過て 使用しました。非特異的 な 内在性抗体 のカートリッジではなくストレプトアビジンカーのアフィニティリガンドの過剰モルを使用してとなる最大の流量を使用しました。さまざまな条件を考慮して、過剰モルを約 6 倍とし、ロートリッジを 使 用 しました。すべての DAR 種

ド流量を 2 µL/min としました。これらの変数

N-グリカンを含むフロースループレート

できました。抗原を AssayMAP ストレプトア

る必要があります。

せんでした)。

プとして、第一級アミンにより HER2 ECD を

可溶性の反応生成物、この場合は(今回は N-グリカンの分析は実施しま•

ビオチン化済み抗原と抗原結合
カートリッジの前処理

複雑なマトリックスからの ADC の精製

次の 2 つの結果プレートが生成されました。

•

間を最小に抑えて LC/MS 分析を 1 日で開始たが、アフィニティリガンドの消費を最小に抑精製および脱塩済みのインタクトおよび
脱グリコシル化された ADC を含む溶出プレート (ADC は LC/MS で分析しま

した)。

(0 ～ N) を抗原精製 によって単離することがビジンカートリッジに 結合する最初 のステッ

は、他の結合パートナーに合 わせて最適化す

Sulfo-NHS-LC-Biotin でラベリングしました。
HER2 ECD には、15 のリジン残基とプロテ

イン N-末端の 16 の第一級アミンのラベリン
グ部位 が可能性として存在します。250 倍の過剰モルにより、室温で 1 時間の間に HER2

7

オンカートリッジ脱グリコシル化

ADC DAR の 特性解析 では、 複数 のグリコフォームにより MS スペクトルが 複雑 なものになり、DAR 計算の精度が低下します。このため、一般的 に脱 グリコシル 化ステップを実施して LC/MS 分析前 にグリカンを除去します。今回の研究では、新たに開発されたオン
カートリッジ反応手法を用いてカートリッジでのアフィニティ精製後に ADC を脱グリコシル化しました。従来 の 溶液中での 脱 グリコシル化反応と比 べると、オンカートリッジ脱グリコシル化によってタンパク質精製、脱グリコシル

化、バッファ交換のプロセス全体を効率化できます。このプロセス中に ADC から PNGase Fを分離したため、LC/MS 分析でのイオン抑制を回避できました 8。脱グリコシル化を 37 ° C

で実行し、ADC の完全性を維持して蒸発を最小に抑え、同時に完全な脱グリコシル化を 30

分以内に完了しました。必要 な場合 は、N-グ

TIC は、血清にスパイクされたサンプルの最高

リカンをラベリングのために使用できます。

レベルの純度、およびコントロール T-DM1 との比較での良好な回収率を示しました (図 5A–

LC/MS によるサンプル前処理性能のC)。コントロール、アフィニティ精製、アフィニ

評価

ティ精製と脱 グリコシル 化 の T-DM1 サンプル

上 述 の 方 法 で Agilent AssayMAP Bravoの 抽出スペクトルとデコンボリュートしたスペ

Platform を用 いて 準備した T-DM1 サンプル

クトルは、ADC のアフィニティ精製 による偏りと未処理 の T-DM1 コントロールを、Agilentが生じなかったことを示しています。また、オン

1290 Infinity II UHPLC システム で PLRP-S

カートリッジ 脱 グリコシル 化 によって、大部分

カ ラ ム に よ り 分 離 し て、Agilent 6545XTのグリコフォームを除去することで、 デコンボ

AdvanceBio 精密質量四重極飛行時間 MS シ

リュートしたスペクトルの簡素化と信号強度のステムで分析しました。TIC、EIC、抽出スペク向上が予想どおりに実現したことが示されまし

トル、デコンボリュートしたスペクトル、DAR 値

た (図 5D–I)。

を、MassHunter ソフトウェアスイートを使用して生データから生成しました (詳細 については

MS データ解析を参照)。図 5 は、200 ng のコントロールおよび精製済 み T-DM1 の LC/MS

データを示しています (サンプル 前処理中 にオンカラムで 100 % 回収 があったものと仮定)。

処理済み T-DM1
アフィニティ精製済み T-DM1

未処理の T-DM1

アフィニティ精製および脱グリコシル化済み T-DM1

A

B

C

D

E

F

TIC

抽出
スペクトル

G

DAR = 3.5

H

DAR = 3.5

I

DAR = 3.5

デコンボリュートした
スペクトル

図 5. サンプル前処理の前後の 200 ng の T-DM1 から得られた代表的な TIC、抽出スペクトル、デコンボリュートしたスペクトル。未処理の T-DM1 (A)、

アフィニティ精製済みのインタクト T-DM1 (B)、アフィニティ精製および脱グリコシル化済みの T-DM1 (C) の TIC。未処理の T-DM1 (D)、アフィニティ精製済みのインタクト T-DM1 (E)、アフィニティ精製および脱グリコシル化済みの T-DM1 (F) の抽出スペクトル。未処理の T-DM1 (G)、アフィニティ精製済みのインタクト T-DM1 (H)、
アフィニティ精製および脱グリコシル化済みの T-DM1 (I) のデコンボリュートしたスペクトル8このワークフローの 再現性 を 評価 するために、前述 のさまざまな濃度 の T-DM1 をスパ

×108

精製/脱 グリコ シル 化した T-DM1 の 両方 に

2.8

A

イクしたラット血清 から精製した T-DM1 と、

3.0

ついて、EIC ベースの 定量 を実行しました。

2.6

50 ng; %CV = 2.63

2,000 ～ 4,000 m/z の範囲にわたって EIC を

2.4

25 ng; %CV = 1.60

対定量に使用しました。図 6 は繰り返しテスト

2.0

2.2

(n = 3) での EIC の重ね表示と %CV を示して

1.8

値が 10 未満でした (図 6)。全体的に CV 値が低く、EIC が密接して重なっていることから、

このワークフローの 再現性 が 優 れていることが分かります。

100 ng; %CV = 3.67

12.5 ng; %CV = 2.26
6.25 ng; %CV = 4.73
3.125 ng; %CV = 14.50
0 ng

1.6

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

×108
3.2
3.0
2.8
2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

3.3

3.4

取り込み時間 (分)

3.5

3.6

3.7

B

3.8

3.9

4.0

200 ng; %CV = 1.07

アフィニティ精製済み/脱グリコシル化
済み T-DM1

100 ng; %CV = 4.94
50 ng; %CV = 6.74
25 ng; %CV = 5.79

2.4

12.5 ng; %CV = 5.04

2.2

6.25 ng; %CV = 5.47

2.0

3.125 ng; %CV = 9.01

1.8

0 ng

1.6

カウント

います。3.125 ng のグリコシル化 T-DM1 サ

ンプル (CV % = 14.50) を除くすべての %CV

200 ng; %CV = 1.01

カウント

抽出、積分しました。曲線下面積 (AUC) を相

アフィニティ精製済み T-DM1

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

3.3

3.4

取り込み時間 (分)

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

4.0

図 6. アフィニティ精製済み T-DM1 の EIC によって評価されたワークフローの再現性。ADC T-DM1 をラット血清に 20 ～ 0.3125 µg/mL の濃度でスパイクして、脱グリコシル化を伴うアフィニティ精製と伴わない

アフィニティ精製によって回収し、その後にインタクト LC/MS 分析を実行しました。最初のサンプル入力に基づく、T-DM1 のカラムローディング質量を示しています (表 2A を参照)。この繰り返しトレースを同じ色で重ね表示して示しています。繰り返しテスト間の %CV は、積分された AUC に基づいて計算しました (n = 3)。

9インタクトタンパ ク 質 レ ベ ル で の アフィニ

×108
40

ティ精 製 T-DM1 の 定 量 につ いてのワー ク

フロ ーの 性能 を、 分析 の 直 線 ダイナミック

35

レンジを 基 にさらに 評 価 しました。精 製 済

回 帰 分 析 で は、0.3125 ～ 10 µg/mL の

T-DM1 (初 期 スパイク 量 に 基 づ いた 3.125

25
20
15

～ 100 ng のカラムロード量) の 血清 サンプ

10と精製済み/脱グリコシル化済み T-DM1 (R2 =0ルについて、精製済み T-DM1 (R = 0.9987)
250.9996) の両方で優 れた直線レスポンスが示されました。この分析で溶出物の 20 % のみ

果 によって、AssayMAP Bravo Platform を

35

定量分析することの実現可能性が実証されま

25

用いて複雑なマトリックスから ADC を単離し、DAR 値を算出するために、前述 (表 2A) のコ

ントロール、精製済み、精製済み/脱グリコシ

AUC0

値 は、 すべてのサンプルで 約 3.5 ±0.1 (図8) でした。これは、報告されている DAR 値

60

カラムへのロード量 (ng)

80

100

120

100

120

B

アフィニティ精製済み/脱グリコシル化済み T-DM1
R² = 0.9996

15

カリキュレータによって解析しました。DAR 0

回の繰り返しテストから計算された平均 DAR

40

20

10

～ 7 を使用して平均 DAR を求 めました。320

y = 3E+07x + 9E+0730

ル 化済 み T-DM1 サンプルから得られたデコンボリュートしたスペクトルを Agilent DAR

0

×108
40

を注入したことに注目してください。以上の結した。

y = 3E+07x + 2E+08
R² = 0.9987

30
AUC

み T-DM1 と精製済 み/脱 グリコシル 化済 み

T-DM1 の AUC をプロットしました (図 7)。

A

アフィニティ精製済み T-DM1

5
0

20

40

60

カラムへのロード量 (ng)80

図 7. 血清サンプルのアフィニティ精製済みおよびアフィニティ精製済み/脱グリコシル化
済み T-DM1 の直線ダイナミックレンジ解析。T-DM1 をラット血清にスパイクして、最終濃度を 0.3125 ～ 10 ng/µL としました。これらのサンプルの T-DM1 を、脱グリコシと一致しています 9。コントロール T-DM1 のル化ありまたはなしでアフィニティ精製し、インタクト LC/MS 分析を実施しました。

ム T-DM1 で 3.125 ng です。AssayMAP プを除去した後、これらのサンプルのオンカラム T-DM1 ロード量に対してプロットされ結果に基づく、DAR 測定の下限値はオンカラ

ラットフォームでのアフィニティ精製の後に高い信頼性で測定できる T-DM1 の最小の血清濃度は 0.3125 µg/mL でしたが、このレベルのスペクトルはノイズが多いものでした。精製

済 み T-DM1 サンプルの 脱 グリコシル 化 により、質量スペクトルがシンプルになり、0.3125µg/mL の血清濃度で信頼性のより高い DAR

測定が可能になりました (図 8)。

102,000 ～ 4,000 m/z の範囲の EIC が抽出され積分されました。AUC は、バックグランドました (表 2A)。直線性を評価するために、線形回帰分析を行いました。

未処理の T-DM1

アフィニティ精製済み/
脱グリコシル化済み T-DM1

アフィニティ精製済み T-DM1

3.5

3.5

3.5

3.5

3.4

3.5

3.5

3.4

3.4

3.5

3.4

3.4

3.5

3.4

3.4

3.5

3.6

3.5

3.5

3.6

3.6

200 ng

100 ng

50 ng

25 ng

12.5 ng

6.25 ng

3.125 ng

図 8. 未処理、アフィニティ精製済み、アフィニティ精製/脱グリコシル化済み T-DM1 のデコンボリュートした代表的なスペクトルと平均 DAR 値。

T-DM1 を 0.3125 ～ 20 µg/mL の異なる濃度でラット血清にスパイクし、脱グリコシル化を伴う場合と伴わない場合のアフィニティ精製により回収しました。

その後、インタクト LC/MS 分析を実施しました。DAR 値は Agilent DAR カリキュレータを使用してデコンボリュートしたスペクトルから求めました。

初期入力に基づくオンカラムローディング質量を左側に示します (表 2A を参照)。繰り返しテストから求めた平均 DAR 値を各スペクトルの右上に示しています (n = 3)。

11

結論

生体内 の ADC DAR 解析 の 課題 に 対応する

包括的 なソリューションが 提供 されました。

参考文献
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LC/MS 分析前 に 血清 から ADC を回収して脱グリコシル化する一般的なワークフローが、

Agilent AssayMAP Bravo Platform による自動化 された 手順 によって 実証 されました。
ンカートリッジ脱グリコシル化は、約 4.5 時間で完了し、再現性が高く、手作業時間は最小限で、必要 に応じて拡張 が可能です。このようにして前処理されたサンプルを、高性能 な

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conjugates as novel anti-cancer

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レスに分析することで、定性と定量の両方のby affinity capture capillary

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研究に対応する高品質データを得られます。

liquid chromatography-mass

8445EN.pdf.

謝辞

spectrometry.Anal.Biochem.2011

ここで紹介したワークフローの開発と最適化に大 いにご尽力 いただいたた Jing Chen 氏に、そして本アプリケーションノートへのアド

バイスおよびクリティカルリーディングにご協力くださった Bill Rust 氏、Maryann Shen氏、

Shuai Wu 氏に感謝の意をお伝えいたします。

3.

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カストマコンタクトセンタ

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