技術概要

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ
精度と正確性に優れた低圧ミキシンググラジエントポンプ

800700600mAU

500400300200
10000.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Time (min)著者

概要

Patric Hörthを用いた従来のアプリケーションや、内径 2.1 および 3.0 mm のカラムを用いた高速分析に非常に柔軟

Melanie Metzlaff andAgilent Technologies, Inc.

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプは、精度や正確性を損なうことなく、内径 4.6 mm のカラムに対応します。

この技術概要では、1260 Infinity II フレキシブルポンプの卓越した性能について説明します。厳しい条件下でのリテンションタイムの精度を評価し、Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプと比較しました。さらに、両ポンプの組成精度、ディレイボリューム、流量真度をステップグラジエントを用いて評価しました。

はじめに

Agilent 1260 Infinity II フレキ シブル ポンプ
は 低圧ミキシンググラジエントポンプで、動作圧力 は 最大 80 MPa です。一体型 の 多目的 バルブにより、自動 パージ、ミキサのイン/アウト切り替え、フィルタのバックフラッシュといった便利な機能を使用できます。

1260 Infinity II フレキシブルポンプの優 れた性能 を実証するために、複数 の 高度 なアプリケーションを 選択 しました。1260 Infinityツ) から購入しました。トリフルオロ酢酸 (TFA) およびギ酸 (FA) は、Sigma-Aldrich (シュタインハイム、ドイツ) から購入しました。

メソッド

表 1. ステップグラジエントのクロマトグラフィー条件
カラムパラメータ

れた結果と比較しました。

実験方法
装置構成

実験では、次のモジュールを用いました。

•Agilent 1260 Infinity II フレキシブル•

Agilent 1260 Infinity バイナリポンプ

ポンプ (G7104C)(G7112B)•••

Agilent 1260 Infinity II マルチサンプラ(G7167A)、サンプル冷却システム(オプション #100) 付

Agilent 1260 Infinity II マルチカラムB) 水

1 % ステップ 100 ～ 94 %A (20 ～ 45 分 )グラジエントストップタイム

流量1 % ステップ 51 ～ 49 %A (80 ～ 90 分 )10 % ステップ 40 ～ 10 %A (90.01 ～ 110 分 )2 % ステップ 6 ～ 0 %A (110.01 ～ 135 分 )140 分

1 mL/min

カラム温度

DAD

30 ° C

273/4 nm、参照波長 360/100 nm、10 Hz

表 2. 緩やかなグラジエントでのクロマトグラフィー条件
パラメータ

化合物

設定値

ポリフェノール混合物: カテキン、
カフェイン酸、
エピカテキン、
エピガロカテキン(すべて Sigma-Aldrich から購入)

Agilent ZORBAX StableBond C18、2.1 × 50 mm、1.8 µm (p/n 857700-902)

カラムA) 0.1 % FA 水溶液

溶媒B) 0.1 % FA アセトニトリル溶液

グラジエント

6% B (0 分)

12 % B (8 分)

ストップタイム

8分

アレイ検出器 WR (G7115A)、標準流量

0.6 mL/min

フローセル: 光路長 10 mm、容量 13 µL

ソフトウェアAgilent OpenLAB CDS 2.2 (M8413A)

試薬

すべての溶媒 は LC グレードを使用しました。

超純水は、0.22 μm メンブレンユースポイント

カートリッジ (Millipak) 付の Milli-Q Integralシステムで精製しました。アセトニトリルおよびアセトンは、Merck (ダルムシュタット、ドイポストタイム

注入量

サンプル温度

カラム温度

DAD

3分2 µL、ニードル洗浄 3 秒 (60 % アセトニトリル水溶液)
10 °C
30 °C

280/4 nm、参照波長 360/50 nm、40 Hz

表 3. 有機溶媒の割合が低い分析のクロマトグラフィー条件
パラメータ

化合物
カラム

溶媒
グラジエント

設定値

サルファ剤: スルファニルアミド、スルファチアゾール、スルファメラジン、スルファクロ
スルファメタジン (すべて Sigma-Aldrich から購入)
ロピリダジン、

Agilent ZORBAX StableBond C18、2.1 × 50 mm、1.8 µm (p/n 857700-902)
A) 0.1 % TFA 水溶液

B) 0.1 % TFA アセトニトリル溶液

1% B (0 分)

25 % B (6 分)

ストップタイム

8分

流量0.6 mL/min

ポストタイム

注入量

サンプル温度

カラム温度

DAD

22 % ステップ 94 ～ 90 %A (45 ～ 55 分 )10 % ステップ 90 ～ 51 %A (55 ～ 80 分 )サーモスタット (G7116A)

Agilent 1260 Infinity II ダイオード

設定値A) 0.3 % アセトン水溶液

溶媒II フレキ シブル ポンプ で 得 ら れ た 結 果 を、
Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプで得ら

リストリクションキャピラリー

3分2 µL、ニードル洗浄 3 秒 (60 % アセトニトリル水溶液)
10 °C
45 °C

254/4 nm、参照波長 360/80 nm、20 Hz

結果と考察実験 1: ステップグラジエント

溶媒 A にトレーサを含んだステップグラジエン

トを使用し、 システムディレイボリューム、組成精度、ミキシングノイズ、流量真度を求めました。流量真度の評価 には 高精度フローメー
タ (FAM) を用いました。

同 一 条 件 で の ス テップ グラ ジ エ ント を、

Jet Weaver ミキサ付きの 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、Jet Weaver ミキサなしの1260 Infinity II フレキシブル ポンプ、1260Infinity II バイナリポンプに適用しました。図1 は、1、2、10 % ステップで 100 %A (水 + トレーサー ) から 0 %A (水 + トレーサー ) までの 3 つのステップグラジエントを重ね表示したものです。両 ポンプともこのグラジエント範囲で優れた性能を示しました。3 つのグラジエン

トステップは、移動相 B の割合が少ない 1 %ステップにおいても同じ挙動を示しました。この結果 は、1260 Infinity II バイナリポンプと1260 Infinity II フレキシブルポンプのグラジ

表 4. 有機溶媒の割合が高い分析のクロマトグラフィー条件
化合物

スダンレッド混合物: スダン I、
スダン II、
スダン III、
スダン IV (すべて Sigma-Aldrich から購入)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、3.0 × 50 mm、1.8 µm (p/n 959941-302)

カラムA) 水B) 95 % アセトニトリル

溶媒90% B (0 分)
100 % B (4 分)

グラジエント4分

ストップタイム

2分

ポストタイム

流量1 mL/min

注入量

1 µL、ニードル洗浄 3 秒 (アセトニトリル)

サンプル温度

10 °C

カラム温度

40 °C

490/20 nm、参照なし、20 Hz

DAD

表 5.高速グラジエントでのクロマトグラフィー条件
化合物

設定値

パラメータ

Agilent RRLC チェックアウトサンプル (p/n 5188-6529)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、3.0 × 50 mm、1.8 µm (p/n 959941-302)

カラムA) 水B) アセトニトリル

溶媒30% B (0 分)
100 % B (1 分)

グラジエント

エント性能が、移動相 B が 1 ～ 5 % のようなストップタイム

示しています。

流量

厳しい条件下でさえ、同等であることを明確に設定値

パラメータ

2分1分

ポストタイム2 mL/min

注入量

1 µL、ニードル洗浄 3 秒 (60 % アセトニトリル水溶液)

サンプル温度

10 °C

カラム温度

60 °C

254/4 nm、参照波長 360/60 nm、80 HzDAD

標準Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、380 μL Jet Weaver ミキサ付
Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、ミキサなし
Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプ

600
500
400300標準

200580585575100
0570
565
202530354045 分-100204060

80100120分

図 1. Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプのミキサ付きとミキサなし、Agilent 1260 Infinity II バイナリ
ポンプ、100 % から 0 % トレーサーのステップグラジエント

3

ステップグラジエントに 基 づいて 両 ポンプの組 成 精 度 を 算 出 しました。図 2 は、1260に増加しますが、混合性能 が 向上するため、は、設定値 1 mL/min をわずかに下回りまし

UV シグナルが安定するようになります。以上

た。1260 Infinity II バイナリポンプの 実際 のJet Weaver ミキ サ ありとなしの 場 合) と、リュームを最小限 に抑えるように設計された上回っています。しかし、両ポンプとも優 れた成精度 を 示しています。組成精度 の 仕様範に示されました。

Infinity II フ レ キ シ ブ ル ポ ン プ (380 µL

1260 Infinity II バイナリポンプについての組囲 は、1260 Infinity II バイナリポンプが ±0.35 %、1260 Infinity II フレキシブルポンプ
が ± 0.4 % と定義しました。両ポンプの組成精度は、仕様範囲内でした。

表 7 にシステムディレイボリューム、ミキシンの 結果 から、混合 の 効率 が 高く、 ディレイボ

流量は 1.003 mL/min で、設定値をわずかにJet Weaver ミキサの卓越した性能 が、明確性能を示し、仕様範囲である ± 1 % に収まりました。

LC スタック構成に FAM を追加することにより、ステップグラジエントでの実際の流量をモニタリングしました。1260 Infinity II フレキ
シブルポンプの実際 の流量 (0.998 mL/min)

グノイズ、流量真度 をまとめています。予測したとおり、Jet Weaver ミキサなしの 1260

Infinity II フレキシブルポンプが最 も低いディ

1.0380 µL Jet Weaver ミキサを追加すると、ディ0.6

レイボリュームは 460 μL に 増加しました。

1260 Infinity II バイナリポンプでは、ディレイボリュームは 610 µL と算出 されました。いずれのポンプのディレイボリュームにも、キャピラリー、リストリクションキャピラリー、検出器 のセルの 容量 が 含 まれています。1260

Infinity II マルチサンプラは、測定時、流路内リポンプ は 同 様 の 結 果 を 示 しました。た だし、380 µL Jet Weaver ミキサ付きの 1260

Infinity II フレキシブルポンプが、ミキシングノ+0.35 %-0.2-0.35 %-0.4-1.0での 値 を比較しています。1260 Infinity II フ

-0.80204060

キシブルポンプのディレイボリュームがわずか

100 020406080

移動相 B の設定値 (%)

100 020406080100

用いた組成精度

表 7. ステップグラジエントの結果
Agilent 1260 Infinity II

ディレイボリューム

95 %A でのミキシングノイズ

49 %A でのミキシングノイズ
4 %A でのミキシングノイズ
平均流量 (mL/min)∆ 平均流量 (%)

480

図 2. Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプのミキサありとなし、Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプをイズに関して最良の結果となりました。ミキサを追加することにより、1260 Infinity II フレバイナリポンプ0のステップで算出しました。表 7 は 3 つの異レキシブル ポンプと 1260 Infinity II バイナ

Agilent 1260 Infinity II

0.2-0.6なるステップ( 95 %、49 %、4 % トレーサー )Agilent 1260 Infinity II

フレキシブルポンプ、ミキサなし

0.4に含まれていませんでした。

ミキシングノイズは、グラジエントのそれぞれフレキシブルポンプ、
380 μL Jet Weaver ミキサ付

0.8

組成精度 (%)

レイボリュームで、約 310 µL でした。流路にAgilent 1260 Infinity II

フレキシブルポンプ、Agilent 1260 Infinity II

Agilent 1260 Infinity II

約 460 µL

約 310 µL

約 610 µL

380 µL Jet Weaver ミキサ付

フレキシブルポンプ

バイナリポンプ

0.015 %

0.048 %

0.023 %

0.024 %

0.040 %

0.045 %

0.013 %

0.034 %

0.012 %

0.998

0.998

1.003

-0.164-0.1550.270

実験 2: 緩やかなグラジエントでのリテンションタイム精度緩やかなグラジエントでのリテンションタイムの精度を求めるために、4 つのポリフェノール化合物 の 混合物 について分析しました。グラジエントは 8 分間で 6 %B から 12 %B にしの変化に相当します。図 3 は、1260 Infinity

II フレキシブルポンプ (ミキサなし) と 1260

Agilent 1260 Infinity IIフレキシブルポンプ

mAUます。これは 1 分あたり 0.75 % の移動相 B

Infinity II バイナリポンプで分析した 2 つのクロマトグラムを比較したものです。4 つのポリフェノール化合物のリテンションタイムの精度(表 8) は、両ポンプで類似していました。このAgilent 1260 Infinity II
バイナリポンプ

実験により、緩やかなグラジエント条件下でも1260 Infinity II フレキシブルポンプのミキシン

グ精度が高く、バイナリポンプも適していることが示されています。

実験 3: 有機溶媒の割合が低い場合のリテンションタイム精度

有機溶媒 が 1 % から 25 % の 割合 のグラジエントで、5 つのサルファ剤 の 混合物 を分析しました (図 4)。有機溶媒 の 割合 が 低くても分析できるのは、バイナリポンプの利点です。

時間 (分)

図 3. 緩やかなグラジエント条件でのポリフェノール化合物の分析。溶出順序 : カテキン、カフェイン酸、

エピカテキン、エピガロカテキン

表 8. ポリフェノール化合物の分析におけるリテンションタイム (RT) の精度。
8 回の連続分析から算出しました。
Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ

平均 RT (分)標準偏差 RT

1260 Infinity II フレキシブルポンプは、組成RSD RT

割合が低い場合の両ポンプの性能を評価する

平均 RT (分)範囲 0 から 100 % の仕様です。有機溶媒のために、リテンションタイムの精度を 8 回の連続分析から算出しました (表 9)。

両ポンプは、リテンションタイムの精度に関し標準偏差 RT

RSD RT

カテキン

カフェイン酸エピカテキン

エピガロカテキン

0.00180.00150.00420.0036

0.087

0.061

0.106

0.081

2.019

2.348

2.372

Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプ

3.979

4.426

2.710

4.927

5.4910.0035

0.00230.00320.0033

0.151

0.085

0.066

0.060て、優 れた性能 を示しました。溶出 が 早 い 2つの化合物、スルファニルアミドとスルファチアゾールについては、1260 Infinity II フレキ

シブルポンプが 1260 Infinity II バイナリポン

プよりも優れた性能を示しました。

mAU

Agilent 1260 Infinity II
フレキシブルポンプ

Agilent 1260 Infinity II
バイナリポンプ
時間 (分)

図 4. 低い有機溶媒割合でのサルファ剤の分析。溶出順序: スルファニルアミド、スルファチアゾール、スルファメラジン、スルファクロロピリダジン、スルファメタジン

5

実験 4: 有機溶媒の割合が高い場合のリテンションタイム精度

この実験では、スダンレッド 1、2、3、4 を有機溶媒 90 ～ 100 % のグラジエントを用いて分析しました (図 5 および 表 10)。その結果、1260 Infinity II フレキシブルポンプはこの種のアプリケーションに最適で、1260 Infinity IIバイナリポンプよりも性能が優れていることが示されました。

表 9. サルファ剤の分析におけるリテンションタイムの精度
Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ

平均 RT (分)スルファニルアミド スルファチアゾール

スルファメラジン

スルファクロロピリダジン

スルファメタジン

0.00090.00120.00130.0005

0.032

0.033

0.033

0.010

標準0.5052.926

0.0005

RSD RT

0.092

平均 RT (分)

0.499

偏差 RT

標準RSD RT

3.935

Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプ

4.586

3.468

4.331

4.671

5.355

0.00090.00440.00220.00220.0024

0.174

0.127

0.050

0.047

0.045Agilent 1260 Infinity IIフレキシブルポンプ

mAU

偏差 RT

3.607

Agilent 1260 Infinity IIバイナリポンプ
時間 (分)

図 5. 高い有機溶媒割合でのスダンレッド化合物の混合物の分析。

溶出順序: スダンレッド 1、スダンレッド 2、スダンレッド 3、スダンレッド 4
表 10. スダンレッド化合物の分析におけるリテンションタイムの精度。
8 回の連続分析から算出しました。
Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ

平均 RT (分)標準偏差 RT

RSD RT

平均 RT (分)標準偏差 RT

RSD RT6スダン I

スダン II

スダン III

スダン IV

0.00040.00080.00070.0014

0.070

0.047

0.053

0.643

0.055

0.630

1.085

Agilent 1260 Infinity II バイナリポンプ

1.497

2.656

1.058

1.4682.640

0.00090.00180.00270.0044

0.147

0.173

0.1870.166

実験 5: 高速分析におけるリテンション
タイム精度

分析時間を短縮するために、2 mL/min といAgilent 1260 Infinity バイナリポンプ、低ディレイボリューム

う高流量 にしました。グラジエント時間 を 1分間に設定し、有機溶媒を 30 ～ 100 % にしました (図 6)。1260 Infinity II バイナリポ成 で検討しました。低 ディレイボリューム 構

成では、ダンパとミキサをバイパスしました。

Agilent 1260 Infinity バイナリポンプ、標準構成

mAU

ンプは、標準構成と低ディレイボリューム構

1260 Infinity II フレキシブルポンプは、ミキ

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、標準構成

サを取り付けた状態と取り付けていない状態で検討しました。すべての機器構成の圧力は約 54 MPa でした。

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、380 μL Jet Weaver ミキサ付

1260 Infinity II バイナリポンプの低ディレイボ

リューム構成が最も短い分析時間で、次に短かったのは 1260 Infinity II フレキシブルポン

時間 (分)

プの標準構成で分析した場合でした。

図 6. 流量を上げた RRLC チェックアウトサンプルの分析

タイムの精度 (表 11) を実証するために、3 つ

表 11. RRLC チェックアウトサンプルの分析におけるリテンションタイムの精度。
3 つの代表的なピークを選択しました。8 回の連続分析から算出しました。

高速のクロマトグラフィー 分析のリテンションの 代表的 なピークを選択しました。この 厳しい条件下でも、両 ポンプおよび対応する機器構成でのリテンションタイムの精度が優れてい

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、標準構成る（< 0.09 %RSD）ことが示されました。

平均値

ら 2.6 mL/min に 上 げました。システム 圧RSD

続 いての 実 験 で は、 流 量 を 2 mL/min か
力 は 約 75 MPa となりました。この 実験 では、1260 Infinity II フレキシブルポンプの標準構成 のみを使用しました。これは、1260Infinity II フレキシブルポンプの動作圧力上限が 80 MPa であるのに対し、1260 Infinity II

バイナリポンプの上限は 60 MPa であるためです。

標準偏差

平均値

標準偏差

RSD

平均値

標準偏差

RSD

平均値

標準偏差

RSD

ピーク 3

ピーク 6

ピーク 8

0.00040.00050.0005

0.051

0.047

0.040

0.697

0.977

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ、380 μL Jet Weaver ミキサ付

1.166

0.766

1.135

1.341

0.00050.00040.0000

0.060

0.031

0.003

Agilent 1260 Infinity バイナリポンプ、標準構成
0.813

1.112

1.290

0.00050.00050.0006

0.066

0.048

0.050

Agilent 1260 Infinity バイナリポンプ、低ディレイボリューム
0.614

0.850

1.023

0.00050.00060.0005

0.084

0.074

0.047

7

流量を 2.6 mL/min まで上げることにより、グ化合物

平均 RT (分)RSD RT (%)

0.171

0.103

2.アセトフェノン

0.351

0.071

3.プロピオフェノン

0.546

0.037

4.ブチロフェノン

0.668

0.021

5.バレロフェノン

0.710

0.019

6.ヘキサノフェノン

0.763

0.025

7.ヘプタノフェノン

0.842

0.025

8.オクタノフェノン

0.909

0.024

9.ベンゾフェノン

0.967

0.024

ラジエント時間 は 1 分から 0.77 分に短縮で1.アセトアニリドに溶出され、リテンションタイムの精度も優れきました (図 7)。すべてのピークが 1 分以内ており、仕様の 0.15 %RSD を下回りました。

最後に溶出された化合物は、流量 2 mL/minの 1260 Infinity II バイナリポンプの低ディレイボリュームシステム構成 (1.095 分) よりも、1260 Infinity II フレキシブルポンプにおいて早く溶出されました（0.967 分)。

Agilent 1260 Infinity II フレキシブルポンプ
は、複数の困難 な LC アプリケーションにおいて、リテンションタイムの精度に関して優れた 性能 を発揮しました。適用したステップグラジエントにより、1260 Infinity II フレキシブルポンプと Agilent 1260 Infinity II バイナ

リポンプの優 れた組成精度とミキシングノイズが示されました。両 ポンプの実際の流量を測定し、モニタリングしたところ、流量真度は常に 0.3 % 未満でした。

システムディレイボリュームは、1260 Infinity

II フレキシブルポンプで約 310 µL、380 µL

Jet Weaver ミキサを付けた場合で 460 μL でした。1260 Infinity II バイナリポンプでは、システムディレイボリュームは 610 µL まで増加します。

この技術概要では、両ポンプの優 れた性能を実証しました。さらに、1260 Infinity II フレキ

シブルポンプは、バイナリポンプの利点である困難 なアプリケーションにおいても優 れた 結果を示しました。

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www.agilent.com/chem/jp

カストマコンタクトセンタ

0120-477-111

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本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2018Printed in Japan, March 1, 20185991-9031JAJP×102
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.00.5051mAU

結論0.1

20.2

0.3

430.4

0.5

0.6

6780.70.8
0.9Time (min)91.0

図 7. 背圧 75 MPa、流量 2.6 mL/min での 8 回のクロマトグラムの重ね表示

1.1

1.2

1.3

1.41.5