LC/MS 用サンプル前処理の自動化 :

溶液中酵素消化と脱塩処理の自動化を可能にするハイスループット型
試料前処理システム
Agilent AssayMAP Bravo プラットフォーム
アプリケーションノート

著者

Jason D. Russell,
Zachary Van Den Heuvel, Michael

概要
LC/MS 分析のためのタンパク質およびペプチドの試料前処理は、依然として手作業による個別の操作に頼ったワークフローで行われているため、作業効率が劣り、大規模 解析への対応を困難にしています。多くの場合、手作業によるワークフローでは、

Bovee, and Steve Murphy

妥当な再現性を得るためには、スキルの高い分析者に頼る必要があります。また、たAgilent Technologies, Inc.

いていのケースでは、ワークフローに内在するものとして、大きな測定誤 差も許 容Madison, WI USA

せざるを得ないのが現状です。このような問題に対処するために、一般的に LC/MS
プロテオミクスワークフローにおいて利用されているル ーチン 試 料前処 理 作 業を、AgilentAssayMAP Bravo プラットフォームを用いて自動化しました。
このプラットフォームとツールは、LC/MS 分析のための試料前処理において、再現性の向上、大規模解析への拡張性、プロトコル編集の柔軟性、および使いやすさを実現できるように設計されています。このプラットフォームは、クラス最高のリキッドハン
ドラ、一回使い切りのマイクロクロマトグラフィーカートリッジ、およびユーザーによる
カスタマイズが可能なシンプルなプロトコルで構成されており、タンパク質酵素消化および脱塩作業を迅速化することが可能です。本自動化法の有用性は、25 種類のウシ
血清アルブミン (BSA) 酵素消化ペプチドの日間再現性の変動係数 (CV) が 5 % 未満であることで証明されました。また、脱塩処理における AssayMAP RP‑S および C18 逆相カートリッジの特性についても紹介します。

はじめに

前処 理 ステップ で 調 整 する必 要があるました。試料前処理法は、仮説にもとづ

タンパク質およびペプチドの分析法は、

ワークフローで、個別に、あるいは少ス

く小規模スクリーニングから臨床応用のケールでのバッチ処理を行うと、各段階ためのバリデーションや 大 規 模 臨 床 研

近年大きく進歩してきました。その要因
は、タンデム質量分析、ソフトイオン化
法、バイオインフォマティクス、およびク
ロマトグラフィー分離などの技術革新にあります。こうした分析上の革新的技術と情報処理力の向上の相乗効果により、での 些 細なハンドリングの 違 いが 累 積

究にまで適 用可能なものでなければな

され、分析精度の低下をもたらすことにりません。タンパク質研究者の要求に対なります。そのような分析精度の低下は、応 できるタンパク質 試 料 の前処 理 専用

ディス カバリー 研 究の段 階 で 示 唆 されに設 計された自動 化システムが 利 用でた病 態や応 答 性の 指 標として生物学的

きれば、そうした大規模解析が可能となに有用なタンパク質の 発 現 変 化を再 現ります。

液体クロマトグラフィー /質量分析 (LC/

できない可能性があります。

ク質の動態解析が可能となり、定量におLC/MS による定 量プロテオミクス解 析MS) を用いたワークフローによるタンパ
いては高 感 度と高 精度 分析が できるよの試 料前処 理は、依 然として手作 業にうになっています。LC/MS による定量プ

よる多段 階の 操 作を必 要とするワーク

ロテオミクス解 析の応 用範囲の 拡 大にフローでおこなわれているため、スルー

このア プ リケ ー ションノートで は、 タ
ンパク 質の 大 規 模 解 析 の ため に、LC/MS の試 料前 処 理における高 い 実 験 再
現 性および 効 率 化を実 現した、Agilent
AssayMAP Bravo 自動化プラットフォー

伴い、求められる分析精度が高くなり、プットや大規模解析への対応性が劣り、ムとプ ロテオミクスツール を 紹 介しま

作業効率の向上が求められています。し技 術 者間での誤 差が生じる原因になっす。このプラットフォームは、精密な流量

かし、プロテオミクスにおける LC/MS

技術が飛躍的に進歩した一方で、試料前ループットスクリーニングおよびプロセています。LC/MS の 臨 床 応 用やハイス

コントロールを可能にする 96 プローブ

処 理の進歩は、他の重要な技 術に遅れス管 理 のためには、これらのワークフと、ベッドボリューム 5 µL の充填済カー

シリンジを 備えたクラス 最高の 分 注 機をとっています。定 量プロテオミクス解

ロ ー 特 性 は不 可欠 な 要 素 で す。多くのトリッジカラム、さらには高い操作性を

析における試 料前処 理の進歩の遅れが場合、このような手作業によるワークフ

有するユーザーインターフェースを備えもっとも顕著に表れている分野が、バイ

ローでは、妥当な再現性を得るために、たカスタマイズが可能なソフトウェアでオマーカーの発見およびバリデーション

一部の習熟 度の高い分析者に頼る必要構成されています。また、マイクロタイです。数百に及ぶ疾患特異的なタンパクがあります。このことは、要求される再タープレートフォーマットでのハイスルー

質バイオマーカー候補が LC/MS 解析に現性を維 持し、かつ多数の試 料を処 理

プット処理を可能とするタンパク質の自動消化および脱塩に対応できます。ここ

しかし、そうしたバイオマーカー研究のするための障壁となっています。LC/MS

によるタンパク質分析の成功の鍵は、再多くは、少数の患者試料を用いた初期分

現 性の高い試 料前処 理にかかっていまける AssayMAP Bravo の 利 用につ いてより明らかにされ、報 告されています。

では、BSA の酵素消化および脱 塩にお析の域を出ていません。臨床応用のためす。これまで、高い操作性と信頼性を備に利用されるアッセイ法のバリデーショ

えた、大 規 模 解 析に適 用できる自動 化について、さまざまな評価指標をもとに

ンでは、桁 違いの試 料 数を用いて検 証

法 が 存 在しなかったために、多検 体 の報告します。

する必要があります。大規模解析を実施

迅速試料処理が必要な研究への LC/MS

する場合、すべての患者試料を多段階のの導入は、さらに大きな制約を受けてい2

紹介し、統合したワークフローの有用性

実験方法

表 1. サンプル、試薬、分析機器

デッキ上のサンプルと試薬

溶液中酵素消化法
溶液中酵素消化法では 1 枚から 4 枚までの 96 ウェルプレートを処理でき、1 枚のプレート中でも 1〜12 列の試 料 数 (8〜 96 試料/プレート) を並行して処 理を行うことが で きま す。今 回 の 実 験 で はプレート 1 枚当たり 32 試料を処理しました。このプロトコルは、ユーザーイン

ターフェースで入 力されたパラメーターをもとに、順番にソースプレート中の試
薬溶液を試料液に加えて混合します (図2)。ユーザーインターフェースの各ステッ
プを ON または OFF することや、種々の試薬 液の組成を反応 条件に合わせて変更することで、システムにフレキシビリ
ティーを持たせています。

溶液内分解 v1.0
サンプル

ウシ血清アルブミン (BSA) 、15 µg/µL を水に溶解

変性混合液

25 mM TCEP と 150 mM トリスを含む 8 M グアニジン HCl (pH 8)
25 mM TCEP と 150 mM トリスを含む 9 M 尿素 (pH 8)

アルキラント300 mM ヨードアセトアミド

希釈混合液

50 mM トリス (pH 8)

プロテアーゼトリプシン (50 mM 酢酸中で 1 µg/µL)

洗浄ステーション

脱イオン水

ペプチド精製 v1.1
サンプル

TFA で酸性化した BSA のトリプシン消化物 (pH ~ 2.6) 、0.75 µg/µL

プライミングバッファ

50 % ACN/0.1 % TFA

ユーティリティ ( 平衡化)
バッファ

0.1 % TFA

溶出バッファ

70 % ACN/0.1 % ギ酸

洗浄ステーション

脱イオン水

分析機器
自動化

図 1 と表 1 に、それぞれプレートレイア

ウトと試 薬 液のリストを示します。BSA

コア自動化プラットフォーム

Agilent AssayMAP Bravo (G5542A)

Agilent AssayMAP 分解

分解および精製用の 96 RP‑S カートリッジおよびラボウェア(G6596‑60034)

を濃度が 15 µg/µL となるように水で溶

および精製スターターキット

クロタイタープレートの 1 列目から 4 列

Agilent AssayMAP Bravo

ライザー、146 mm (G5498B#055)
ペルチェ式サーマルステーション、STC コントローラ搭載 (G5498B#035)
カスタムプレートネスト (G5498B#017)
PCR プレートインサート (G5498B#013)

その他のアクセサリ

Agilent PlateLoc サーマルマイクロプレートシーラー (G5402A)

解し、その 15 µL (225 µg) を U 底のマイ
目ま で の 各 ウェル に 分 注しました。こ分解および精製用の 96 C18 カートリッジおよびラボウェア(G5496‑60013)

アクセサリの 分 注 操 作は、他の 3 枚のプレートについても同様に行い、4 枚のサンプルプ

レートを作成し、合計 128 サンプルを消化 に 用 い ま し た。Denaturation mixture

plate には、変性剤と還元剤の混合溶液を分注しました。変性剤は、グアニジンと尿 素について検 討し、グ アニジン溶

LC/MS
質量分析計

Agilent 6550 iFunnel QTOF LC/MS
デュアル Agilent Jet Stream ESI

LC システムおよびカラム

Agilent 1290 Infinity LC システム
Agilent AdvanceBio Pepide Mapping カラム (C18) :分析カラム : 2.1 × 250 mm、2.7 µm (651750‑902)
ガードカラム : 2.1 mm Fast Guard (851725‑911)

液を 1 列目と 2 列目に分注し、尿素溶液
サンプルプレート 1

サンプルプレート 2

変性混合液プレート

アルキラントプレート

サンプルプレート 3

サンプルプレート 4

希釈混合液プレート

プロテアーゼプレート

図 1. BSA のマルチプレート消化のためのマイクロタイタープレートレイアウト。Sample Plateには BSA (15 µg/µL) を分注。Denaturation Mixture Plate にはグアニジンベースの変性還元剤溶液 ( 橙色) および尿素ベースの変性還元剤溶液 (紫色) を分注。Alkylant Plate にはヨードアセトアミド溶液を分注。Diluent
mixture Plateには Tris バッファーを分注。Protease Plate にはトリプシンを分注

3

を 3 列目と 4 列目に分注しました。ヨーン 設 定は図 2 に示した値を In‑Solution

列目から 4 列目までに分注しました。ト

力しました。プロトコルが開始されると、ドアセトアミド溶液は Alkylant plate の 1
リス バッファー は Diluent mixture plate(ディープウエル) の 1 列目から 4 列目までに各 1 mL を 分 注しました。トリプシ
ンは Protease plate の 1 列目から 4 列目までに分注しました。

溶液中酵素消化プロトコルにある Plate

Stacking ユーティリティは、各試料やプ

ロテアーゼのプレートの リッド として使 用する 5 枚のプレートを AssayMAP

Bravo デッキの Location 2 に積み重ねるために使 用します。これらのプレートはアルキル化ステップでの遮光や、環境中の埃等によるコンタミネーションのリスクを低減します。これらのプレートはまた、各リキッドハンドリングステップ間のシリンジの洗浄液のリザーバーとして
用 いら れま す (今 回 の 実 験 で はこの 洗浄 液を用いたシリンジの 洗 浄は 行っていません)。各 試 薬 液と試 料プレートの配置を図 2 に示します。アプリケーショ

Digestion ユーザーインターフェースに入

まず 変 性 剤溶 液 が 試 料に添 加され 混合されます。サンプルプレートをデッキ

Digest プロトコルを同条件で翌日繰り返
し 行 いました。BSA 消 化 物を含 む 酸 性溶液は次の Peptide Cleanup プロトコルによる脱塩ステップに供しました。

上から取り出すために、プロトコルは自脱塩処理

動的に一時停止します。サンプルプレー

AssayMAP では逆 相精製のために 2 種

ト を 取り出し、PlateLoc (プレ ートシーラー ) を用いてシール後、インキュベー
ターに移し、変性還元処理 (60 ºC 、1 時間) を行いました。その 後、プレートを類のカートリッジが用意されています。

• C18 固相担体 (カーボン含有率 : 16 % 、
ポアサイズ : 150 Å) を充填したカート

遠心し、シールをはがし、Bravo デッキ

リッジ

アルキル化溶液の添加後、45 分間の反• ポリスチレン ジビニルベンゼン固相担
体 (RP‑S 、ポアサイズ : 100Å) を充填し上に 戻しました。プ ロトコルを再 開し、応、希釈液の添加 ( 酵素消化のための変性剤希釈 ) およびトリプシン消化までの工程を自動で実施しました。プロトコル
終了後、サンプルプレートをデッキから取り出し、PlateLoc を用いてシールした
後、37 ºC で一晩かけて消化を行いました。サンプルをインキュベーターから取り出し、遠心した後、30 µL の 10 % TFA

を Single Liquid Addition ユーティリティを用いて添加しました。この In‑Solution

たカートリッジ

これら 2 種 類 のカートリッジには 微 妙な選 択 性の 違いがあるため、サンプルと使 用する試 薬 の 性 質をもとに選 択します。C18 カートリッジは pH 2〜8 で安定したパフォーマンスを示し、R〜13) に対 応 し ま す。Peptide Cleanup プ ロトコ

ル は Workflow Navigator か ら 開 くこ とが で き ま す。表 1 に 示 すバッファー を

図 2. Agilent AssayMAP In‑Solution Digestion プロトコルのユーザーインターフェースと BSA のマルチプレート消化に使用するパラメーター

4Syringe Wash (priming) Buffer プレート、
Utility (equilibration/washing) プレート、Elution Bufferプレートの各プレートの 1列目から 4 列目に分 注しました。空の U
底プレートまたは PCR プレートを Flow
Through Collection プ レ ー ト と EluateCollection プレートとして使用しました。
Cartridge Transfer ユーティリティーを使用して AssayMAP C18 (1 日目) もしく は
RP‑S (2 日目) の各カートリッジラックにある 1 列目から 4 列目のカートリッジ
を Bravo デッキ のLocation 2 に 置 い た
Cartridge Seating Station に移しました。
Bravo デッキ は 図 3 に 示 すように 設 定
し、BSA 消化物を含む酸性の溶液が入ったプ レ ート を デッキ 4 に 置 き ました。
Peptide Cleanup ユーザーインターフェースにアプリケーションの設 定を入 力し、

図 3 に示すLabware Table からラボウェ
アの種類を選択しました。プロトコルがスタートすると、カートリッジの初期化

用い、In‑Solution Digest プロトコルで処理を行った他の 3 枚のプレートについても同 様 に処 理しました。脱 塩 処 理されオンライン LC 精製を行った各濃度の消た溶出液は乾固し、‑8 0 ºC で保存しまし化物 0.5 µg 相当量と比較しました (BSA

のち、1.25 µg 相当量を LC/MS 分析に供の範囲の注入量で評価 )。

た。脱 塩 処 理 後 の 各 試 料 を再 溶 解したしました。LC/MS で検出された 25 種の

濃 度の最大と最小で 0.67 µL から 16 µLペプチドについて評価しました。

脱塩処理 – ロード量の違い

脱塩処理 - 回収率

べるために、バルク処理の溶液内消化に

脱 塩 処 理におけるロード量の 影 響を調

脱 塩 処 理 の 回 収 率 を 評 価 するために、

In‑Solution Digest プロトコルで作成された BSA 消化物を含む酸性溶液 (0.75 µg/µL) を混合し、次に示す濃度系列を作成するために希釈しました。

濃度系列 : 0.75, 0.50, 0.25,0.125, 0.0625,
0.03125 µg/µL.
サンプルは図 3 に示した設 定を用いてPeptide Cleanup を実施しました。各濃度のサンプル100 µL を並行処理 (n = 3) にて AssayMAP C18 カートリッジへロードと平衡化を行った後、100 µL の BSA 消しました。溶 出したサンプルは 乾 固し、しました。Peptide Cleanup プロトコルを‑80 ºC で保存しました。脱塩処理後の試料は再溶解後、各濃 度の 0.5 µg 相当量

化物 (75 µg) を各カートリッジへロード

を LC/MS 分析に供しました。LC/MS で検 出された 25 種の ペプチドについて、より得られた酸を添加した BSA 消化物(4.75 µg/µL) を希釈し、次の濃度系列を作成しました。

濃 度 系 列 : 4.0, 3.0, 2.0, 1.0,0.75, 0.50,
0.25, 0.10 µg/µL.
サンプルは図 3 に示した設 定を用いて
脱 塩 処 理 を実 施しました。各 濃 度 の サ

ンプル (100 µL) を並行処理 (n = 2) にて、

AssayMAP RP‑S および C18 カートリッジへロードしました、なお、すべての実
験は並行して実施しました。溶出したサ
ンプルは乾固し、‑80 ºC で保存し、使用時に再溶解し各濃 度の 1.0 µg 相当量を

LC/MS 分析に供しました。

図 3. Agilent AssayMAP Peptide Cleanup プロトコルのユーザーインターフェースと BSA 消化物のクリーンナップに使用するパラメーター

5

結果と考察溶液中消化と脱塩処理
1 日目 (C18) と 2 日目 (RP‑S) の BSA 消
化 物を LC/MS で 分析しました。各 LC/
MS 分析について、25 種類の BSA トリ
プシン消化ペプチドの抽出イオンクロマ

トグラム (EIC) を作成し、各ペプチドのピーク面積をプロットしました。図 4 (上)は、両日にわたって実施した 128 試料の消化および脱塩操作によって得られた 5

種類の BSA トリプシン消化ペプチドのピーク面 積 (グ アニジン変 性) を示して強 度を示します。また、y イオンの m/z

たとえば、ペプチド FKDLGEEHFK では、

アス パラギン酸 残 基に隣 接するリジンも高くなるため、マルチプルリアクショ

残 基 の C 末 端 側 が 切 断 さ れて い ま せンモニタリング (MRM) 分析における特ん。この配列モチーフは、一部のタンパ

異性が 高くなります。尿 素 変 性の場合、ク質にお いてトリプシン 消 化 の 効 率を

ピーク面 積の日間 CV 値は 39.2 % でし低下させることがあります。このようなたが、日内 CV 値は 5.5 % および 8.8 % とペプチドは、LC/MS による特 定タンパ

なりました。一方、グアニジン変性の場
合、ピーク面積の日間 CV 値は 5.8 %で、ク質の定 量に適 するものではありませんが、ほかに定 量の選 択 肢が無い場合

日内 CV 値 は 2.5 % および 1.9 % でした。

に有用となります。この例では、ペプチ

以上の結果から、グアニジンは変性剤とド FKDLGEEHFK は、完 全 消 化ペプチド

して尿素より優れていることがあきらかになりました。AssayMAP Bravo プラッ

DLGEEHFK に比べて、4〜 5 倍のシグナル

います。これらのペプチドの CV 値は、すべての繰り返し実験を通して 1.3 〜2.5 %LVNELTEFAK 、%CV = 1.3の範囲内でした。図 4 の表に、25 種類のペプチドの CV 値分布を日別および変性

5

剤 別にまとめています。25 種 類の BSA

消化ペプチドの平均 CV 値はいずれの日

アニジンの場合は 2.6 % 未満でした。この 結 果 から、消 化 から脱 塩および LC/
MS 分析までのワークフロー全体において、きわめて再現性の高いペプチドのシ
グナル 強 度 が 得られていることが 明ら
かとなりました。複数のデータで示され

RHPEYAVSVLLR 、%CV = 2.5
ペプチドピーク面積 (×10 7)でも、尿素の場合は 3.7 % 未満、またグ

4
AEFVEVTK 、%CV = 1.8

LVVSTQTALA 、%CV = 2.5
3た再現性は、この溶液中消化プロトコルが、384 試料を同時処理できる能力を有しており、ハイスループットでの試料前AWSVAR 、%CV = 3.3

処 理が 可能であることを示しています。
同様に、脱塩処理も 96 サンプルで同時に迅速に実行できます。いずれのケース

2でも、1 週間あたり数千までの試料を処理でき、迅速分析に簡便に対応することができます。
評 価 対 象とした 大 部分 の ペプチドでは低い CV 値を示しましたが、これらの消化条件において、すべての BSA 消化ペ

プチドが良 好な 結 果 を 示したわけではありません。これは、タンパク質消化の複 雑さを反 映しているものと考えられます。タンパク質の酵素消化では、消化条 件が 特定のペプチドの遊 離に影 響を及ぼします。

0

16

32

48

64

80

96

112

128

サンプル番号 (グアニジン変性による BSA 消化 )
尿素
サンプル数

1 日目

2 日目

64

62

グアニジン HCl
サンプル数

1 日目

2 日目

64

64

モニタリングしたペプチド数2525

モニタリングしたペプチド数

25

25

平均ピーク面積 % CV

3.3

3.7

平均ピーク面積 % CV

2.3

2.6

%CV <5 のペプチドの数

23

21%CV <5 のペプチドの数

25

23

5 > % CV < 10 のペプチドの数

2

3

5 > % CV < 10 のペプチドの数

0

1% CV > 10 のペプチドの数

0

1% CV > 10 のペプチドの数

01

図 4. BSA の溶液内消化およびクリーンナップにおける日差およびプレート間の比較結果。BSA は In‑
Solution Digestion プロトコルを使用して 2 日にわたり尿素もしくはグアニジンの両変性剤を用いた消化を繰り返し行いました。Peptide Cleanup プロトコルは C18 (1 日目) または RP‑S (2 日目) カートリッジ
を使用して行いました。溶出液は乾固後、再溶解し、1.25 µg 相当量を LC/MS で測定した。25 種類のペ
プチドについてシグナルをモニターし、Extracted ion chromatograms のピーク強度を評価指標としました。グアニジン変性による 5 種類のペプチドのピークエリア CV 値を示します。全 128 サンプルにわた
り CV 値は 3.3 % 以下でした。表は日差および変性剤の違いによるペプチドピークエリアの CV 値です。

6

トフォームは、複数試料の同時処理が可能であることから、複数の変性条件を同時に評価することにより、ミスクリベー
ジペプ チド であっても定 量 性 のある変の回収率は、50 µg を超えるロード量で果は、中程 度 以下の相対疎 水性を有す

5 、中段 )。このグループのほかの 6 ペプ

安定した回収率が得られることを示して

いロード量では 21.8 % となりました (図性条件を見つけることができます。個々

チドについては、すべてのロード量で高のタンパク質から定量的にターゲットペ

い回収率が得られました。一般的にペププチドが遊 離する最 適な変性 条 件を迅

チドの回収率は、相対疎水性値と強い相速に突きとめるために、複数の変性剤を関性を有しますが、この例で示されてい異 な る 濃 度 で Denaturation Mixture プ

るように、すべてのペプチドにその傾向

レートに分注することが可能です。また、があてはまるわけではありません。極め

試 料前 処 理 が異 なるプレートで同 時にて疎 水性が 高い 2 種 類のペプチドであおこなわれるため、サンプルプレートごとに変性条件を評価し、メソッド開発をる TVMENFVAFVDK (RH = 45.1) お よ び

は、同等の疎水性を有するほかの 5 種類

脱塩処理 – 回収率とロード量の関係

ロード量では 70 % を超える回収率が得

消化物を含む酸性溶液の希釈系列を作るペプチドにおいて、幅広いロード量でいます。25 種 類 すべ ての ペプ チド の 平

均回収率および CV 値 (カッコ内に記載 )は、3.125 µg、6.25 µg、12.5 µg、25 µg、50µg、75 µg のロード量でそれぞれ 87.5
% (2.6 %)、92.7 % (1.1 %)、93.0 % (2.1 %)、96.8 % (1.3 %)、100.0 %(1.1 %)、99.7 % (1.4%) でした。

GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK (RH =52.4)

迅速化します。

溶 液中 消 化プロトコルで得られた BSA

も再現性は保たれています。これらの結は 94.5 % 以上であったが、もっとも少なの ペプチドと同様に、12.5 µg を超えるられました (図 5 、下 )。きわめて疎水性の高いペプチドは、ロード量が少ないと回収率が低くなりますが、低い回収率で成し、同一試料を用いて C18 カートリッ

ジとオンライン LC 精製でのペプチド回120収率を比 較し評 価しました。25 種 類のペプチドのピーク面積を解析し、相対疎LKECCDKPLLEK (RH = 14.5)

AEFVEVTK (RH = 22.2)

LVVSTQTALA (RH = 25.5)

LVNELTEFAK (RH = 32.0)

TVMENFVAFVDK (RH = 45.1)

GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK (RH = 52.4)

80

水 性 (Relative Hydrophobicity; RH) の 理

40

論値をもとに、次の 3 つのグループに分•

RH < 22.5 、低い疎水性、10 ペプチド•22.5 < RH < 35 、中程度の疎水性、
8 ペプチド•

RH > 35 、高い疎水性、7 ペプチドオンライン精製と比べた回収率

類しました。

120
80
40
120

図 5 (上段 ) に示すように、低疎水性のペ80

び AEFVEVTK (RH = 22.2) は、広いロー

40

プチド LKECCDKPLLEK (RH = 14.5) およ

ド量にわたって定 量 的な回 収率が 得られています。このグループのほかの 8 種
類の ペプチドでも、同 等 の回収率が 得られました。中程度の疎水性のペプチド

LVNELTEFAK (RH = 32.0) の回収率は、3〜75 µg のロード量において、オンライ
ン LC 精製と同等もしくはより高い結果がえられました。しかし、中程度の疎水性の ペプチド LVVSTQTALA (RH = 25.5)

3.125

6.25

12.5

25

50

75

C18 カートリッジにロードした BSA 分解物の量 (µg)

図 5. BSA ロード量に対するペプチド回収率。BSA 消化物を希釈し、0.03125 〜 0.75 µg/µL の濃度の溶液を作成しました。C18 カートリッジを用いたペプチド精製プロトコルにより、サンプル 100 µL を処理
し (n = 3) 、各溶出液の 0.5 µg を分析しました。ペプチド回収率を、各濃度の消化物 0.5 µg のオンライン
LC 精製に対して標準化しました。25 種類のペプチドをモニタリングし、相対疎水性をもとに、次の 3 つのグループに分類しました : 低い疎水性 ( 上段、10 ペプチド ) 、中程度の疎水性 (中段、8 ペプチド ) 、高い疎水性 ( 下段、7 ペプチド )。全体的に見て、低〜中程度の相対疎水性 (RH) のペプチドにおいて、高い回収率が得られました。しかし、2 つのペプチド LVVSTQTALA および LVNELTEFAK (中段 ) で示されているように、回収率が常に RH に相関するわけではありませんでした。25 種類すべてのペプチドの平均回収率および CV 値 (カッコ内に記載 ) は、3.125 µg、6.25 µg、12.5 µg、25 µg、50 µg、75 µg の各カートリッ
ジロード量でそれぞれ 87.5 % (2.6 %) 、92.7 % (1.1 %) 、93.0 % (2.1 %) 、96.8 % (1.3 %) 、100.0 % (1.1 %) 、
99.7 % (1.4 %) でした。全体では、すべてのロード量の平均回収率と CV 値は、94.9 % および 1.6 % でした。

7

脱塩処理 – 分析対象ペプチドのRH とロード量の関係

BSA 消化ペプチドの 10–400 µg 相当量

程 度の疎 水性ペプチド (RH = ~8‑48) のTIC シグナルはほぼ同一でした。RH 値が14.5 〜 48 のペプチドの TIC シグナルは、
300 µg まで安定しています。400 µg で、これらの ペプチドは負荷 許 容量を 超 過しました。親水性のきわめて高いペプチ
ド (RH < ~8) は、ロード量が 100 µg を超えると、カートリッジへの保持が弱くなりました。また、ロード量 10 µg では、疎水性のきわめて高いペプチド (RH > 48)の 非 特異的吸 着に起 因すると考えられ

LVNELTEFAKRH = 32.0

カートリッジ
ロード量

10 µg
25 µg

0
5
カウント ×107

化 物 の 負荷 許 容 量を 評 価しました。図量が 10 から 200µg の範囲では、低〜中MPCTEDYLSLILNR
RH = 48.0

0
5(BSA 1µg 相当量) を分析し、AssayMAP
C18 および RP‑S カートリッジの BSA 消

し、ロード量ごとに示しています。ロード

QEPER
RH = 0.85をロードしたカートリッジからの溶出液

6 では、RP‑S および C18 溶出液のトー
タルイオンクロマトグラム (TIC) のオー
バーレ イを 相 対 疎 水 性 の 理 論 値 (RH、
SSRCalc を用いて算出)1 にもとづき分割

TCVADESHAGCEKRH = 7.9
CCTESLVNR
RH = 14.5

C18
RP-S

50 µg

0
5

75 µg

0
5

100 µg05200 µg05300 µg030400 µg
1

3

5

7

9

11

取り込み時間 (分)

13

15

17

19

図 6. ペプチドクリーンナップの負荷許容量。Peptide Cleanup プロトコルを用いて RP‑S および C18 カート
リッジに 10 から 400 µg の範囲の BSA 消化物をロードしました。溶出物を乾固し再溶解後、1.0 µgを LC/
MS にて分析した。25 から 100 µg のロード量では相対疎水性に関係なく偏りのないペプチドの回収が確認されました。ロード量が 100 µg を超えると、親水性ペプチドの保持能は、より疎水性の強いペプチドとの競合関係により低下し、ロード量が 25 µg 未満では疎水性の高いペプチドの回収が減少しました。

るロスが生じました。C18 および RP‑S の保持許容量はほぼ同様でしたが、C18 では、ロード量が 100 µg を超える場合でも、親水性ペプチドの保持力が若干高くなりました。AssayMAP 逆相カートリッジへのサンプル 保 持能および負荷 許 容
量は、試料量、試料マトリクスの複雑さ、
試 料ロード時 の 流 速といった種々の試料条件の影響を受けます。注目すべき点
は、AssayMAP Bravo Peptide Cleanup プ

ロトコルでは、カートリッジへの負荷許
容量および保持能を迅速に評価し、サン
プル の脱 塩 条 件を 最 適 化できることで
す。

8

結論

本実験で用いた BSA の場合、グアニジ

Agilent AssayMAP Bravo と LC/MS サ

る高い 再 現 性を示した 5 種の ペプチド

ンプル前処理ツールを使えば、ほかのプ
ラットフォームでは不可能なレベルの再現性、拡張性、柔軟性、使いやすさを備
えた自動化が実現します。この技術により、手作業に要する時間が最小限に抑えられ、作 業 効率を 最 大 限に高めることができるため、定量プロテオミクスにおいて重要な試料前処 理作業の高い再現性および迅速化を実現できます。溶液中
消 化プロトコルを 使えば、8 〜384 試 料の同時処理が可能であり、ペプチド精製

プロトコルでは、8 〜 96 試料を同時に処ン変 性が 有 効であり、酵 素 消 化におけには、バイアスの原因となりうる Met や

Cys 残基を含んでいません。また、定量的な脱 塩 法開発には、相対疎 水性が重要な 指 標 の 一つとなることが示されました。LC/MS 法 によるタンパク質 バイ

オマーカー の臨 床 応 用を実 現するためには、高い多様性を有する標的タンパク
質 消 化ペプチドの中から定 量に最 適なペプチドを実 験 的に選 別する必 要があります。Agilent AssayMAP Bravo と LC/

MS サンプル前処理ツールは、これらの検討を驚異的な速さ、簡便さで実現する理できます。この 2 つのプロトコルを利唯一の方法であると言えます。

の対応ができ、一台の AssayMAPBravo

参考文献

することができます。AssayMAP の溶液

1. V. Spicer, et al., “Sequence‑specificretention calculator.A family of
peptide retention time prediction
algorithms in reversed-phase
HPLC:Applicability to various
chromatographic conditions andcolumns”, Anal.Chem., 79 (22),8762‑8768, 2007.

用することにより、容易に大規模解析へ
で 1 週間あたり数千 のサンプルに対応
中消化プロトコルとペプチド精製プロト
コルを組み合わせることにより、2 種類の変 性 剤を用いた複 数日、複 数プレー

トの分析において、25 種類の BSA 消化ペプチドで平均ピーク面積 CV 値は 2.3〜3.7 % でした。AssayMAP RP‑S および

C18 逆相カートリッジの特性を詳細に検討、BSA トリプシン消化 物の負荷 許 容
量、保持能、およびペプチド回収率といった重要な指標を評価しました。低〜中程
度の疎水性のペプチドでは、低負荷量 (3µg) においても高い回収率が得られました。また、親水性の高いペプチドの保持能が維持される 100 µg までの BSA 消化
物をロードすることが可能です。

9www.agilent.com/chem/jp
本資料記載の情報は予告なしに変更されることがあります。
アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc., 2013
Published in Japan, August 20, 2013
5991‑2957JAJP