魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

研究課題名

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

フリガナ

マツナガ

代表者名

松永

カヨコ

佳世子

所属機関（機関名）藤田医科大学（役職名）教授
氏
共同研究者

名（フリガナ）

所属機関・役職名

役割分担田中宏幸(タナカヒロユキ) 岐阜薬科大学・准教授 モデルマウスの作製
大野敏(オオノサトシ)

岐阜大学・准教授

蛋白質の調製

第 67 回日本アレルギー学会学術大会、日本薬学会第 139 年会、および第 1 回日
本 助 成金 によ る 発 本アレルギー学会東海地方会にて発表した（共同研究者：田中宏幸）。
表論文，学会発表 第 68 回日本アレルギー学会学術大会および第 135 回日本薬理学会近畿部会にて発表（共同研究者：田中宏幸）。および海外誌への論文投稿を予定している。
研究結果要約背景：魚アレルギーは免疫学的寛解が成立しにくいアレルギーの一つであり、新規治療法の創製が切望されている。
目的：アレルギー症状の誘発を極力抑えた免疫療法剤を創製するために、魚アレルギーマウスの作製、目的遺伝子改変技術を利用した低アレルゲン化コンポーネントの合成、ならびに低アレルゲン化
コンポーネントに対する IgE 反応性を評価する。
結果：ヒトが摂取しうる蛋白質成分を多く含有した生魚身、加熱魚身、コラーゲン画分の 3 種を調製し、従来の腹腔内感作に加えて経皮感作モデルを新たに構築した。総 IgE 値や脾細胞による IL-13 産
生量を測定した結果、コラーゲンを腹腔内感作させた場合に高値であったが、経皮感作では生魚身を塗布した場合に高値であった。粗抽出物による経口惹起試験を実施した結果、感作試験時に比べ総 IgE 値がさらに上昇した。原核生物により作製されたアレルゲンコンポーネントの ELISAの結果、エノラーゼやパルブアルブミンに対して IgE が顕著に反応した。これらパルブアルブミンに対して強い反応を示す群の血清を用いて、低アレルゲン化パルブアルブミンの ELISA を実施した結果、IgE 反応性が著しく減少した。
結論：実際の魚アレルギー症例の発症機序に近似した魚アレルギーモデルマウスを構築し、コンポーネントや低アレルゲン化コンポーネントの作製系を確立した。今後は、特定された他の蛋白質の変異型を順次作製し、その組み合わせによる最適な免疫療法剤を創製する。

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魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

研究目的

すでに特定された抗原や IgE エピトープ解析に【背景】魚アレルギーは、食物アレルギーにおけよって得られた抗原情報をもとに低アレルゲン

る新規発症例で上位を占め、小児より成人に多い

化コンポーネントの作製系を確立し、これらを複のが特徴である 1)。特に、寿司職人など鮮魚を扱合的に用いた免疫療法剤開発の着想に至った。

った特殊な環境下での職業性アレルギーが複数【意義】アレルギー症状の誘発を極力抑え、かつ例報告され、これらは経皮感作によって発症した

効率的な寛容状態へ誘導させる免疫療法を確立と考えられる 2)。魚アレルギーの最大の特徴は、させることにより、患者のリスク低減や患者 QOL

1 種類の魚で感作が成立した場合でも他魚種にも向上につながる。また、免疫療法を実施する医療

類似した蛋白質が含まれていることから、様々な従事者への医療現場での負担軽減にも寄与する魚種で交差反応が生じアレルギーを引き起こすと考える。

可能性がある。そのため、摂取により発症する魚【研究目的】魚アレルギーマウスを用いて、複合種の回避指導や、負荷試験により摂取可能な魚種

的低アレルゲン化コンポーネント免疫療法剤のを確認する必要があり、魚食文化が浸透した日本基盤研究を開始する。つまり、１）魚アレルギーにおいて魚アレルギー発症は患者の QOL を低下

モデルマウスを作製してコンポーネントを特定させる。

し、２）コンポーネント改変に伴う低アレルゲン

魚アレルギーの免疫療法研究は、主要アレルゲ化を構築し、３）低アレルゲン化コンポーネントンであるパルブアルブミンを用いた SCIT の臨床の IgE 反応性を評価することを目的とする。これ

研究が第二相まで完了している 3)。当該研究の興らを達成することで、最終的にはアレルギー症状

味深い点として、魚のパルブアルブミンそのままの誘発を極力抑えた免疫療法剤を創製する。

の状態ではアレルゲン性を有しているため、IgE
エピトープ領域をアレルゲン性のないアミノ酸

研究計画及び研究手法に置換した、つまり低アレルゲン化パルブアルブ

魚粗抽出物の作製

ミンを使用している点にあり、効能・安全性や今魚種について、魚アレルギーの中で発症の割合

後の動向に注目したい 4)。

が高く、かつ、NCBI における遺伝子登録数の多い

これまで、当講座ではプロテオミクス手法によ銀鮭（Oncorhynchus kisutch）を選択した。粗抽るアレルゲンコンポーネントを探索し、予想に反出物については銀鮭の生魚身、加熱魚身、コラーして多くの新規コンポーネントを特定した(特許

ゲン画分の 3 種を作製した。

出願済)5,6)。この成果から、魚アレルギー症例は

生魚身：生魚 100 g に対し氷冷した超純水1 種の蛋白質だけでなく、複数の蛋白質により感500mL を添加し、ホモジェナイザーにて 15 分間

作・発症している可能性が示唆された。そこで、氷上で破砕した。次に、破砕した溶液をガーゼで44

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

ろ過して水溶液を回収した。その後、1,000×g、

mL/匹）と共に PBS に懸濁させた。これらの粗抽

4℃、10 分間遠心し、得られた上清溶液を凍結乾出物溶液を 0 日目および 12 日目に BALB/c マウス燥した。

の腹腔内に投与した。次いで、22 日目にマウスを加熱魚身：生魚 100 g に対し 95 度 30 分加熱処

屠殺し脾臓を採取した後、96 穴プレートに脾細理した。その後、氷冷した超純水 500mL を添加し、胞を播種し、粗抽出物溶液および concanavalin A

ホモジェナイザーにて 15 分間氷上で破砕した。

(以下、Con A) で脾細胞を刺激した。粗抽出物溶

次に、破砕した溶液をガーゼでろ過して水溶液を液の添加濃度については終濃度が 100 μg/mL と回収した。その後、1,000×g、4℃、10 分間遠心なるように、また、Con A は終濃度が 5 μg/mL とし、得られた上清溶液を凍結乾燥した。

なるようにそれぞれ添加した。粗抽出物溶液添加

コラーゲン画分：Hamada らの文献を参照してコ

72 時間後に脾細胞培養上清を回収し、IL-13 産生

ラーゲンを抽出した 7）。加熱魚身と同手法により量を ELISA にて測定した。さらに、感作前および水溶性部分を回収した。その後、15,000×g、4℃、

感作後に血清を回収し、血清中総 IgE 値を ELISA

15 分間遠心し、得られた上清溶液を凍結乾燥しにて測定した。

た。

経皮感作モデル：抗原として、コラーゲン画分および生魚身粗抽出物溶液を用いて 100 μg/20 μ

魚アレルギーマウスモデルを用いた感作試験

L/匹となるように PBS に溶解させた。これらの粗「魚粗抽出物の作製」の項にて作製した 3 種の抽出物溶液をフィンチャンバーに滴下し、マウス

粗抽出物を用いて感作試験の前検討を実施した。

背部皮膚に貼付する操作を、週 1 回計 4 回繰り返

感作経路については、摂取食物からの感作およびし実施した。フィンチャンバーの最終貼付 1 週間

生魚との接触による感作を鑑み、腹腔内、ならび後に脾臓を回収し、腹腔内感作の際と同様に、細に経皮による感作を選択した。その結果、腹腔内

胞播種および抗原刺激を実施した。また、IL-13

感作においては加熱魚身とコラーゲン画分に対産生量ならびに血清中総 IgE 値の測定も同時にする効率的な感作が認められた。一方で、経皮感実施した。

作においては生魚身とコラーゲン画分に対して効率的な感作が認められた。以上の結果より、当魚アレルギーマウスモデルを用いた症状誘発試

試験では 3 種の粗抽出物の中から、効率的に感作

験（経口惹起試験）が成立した 2 種を用いて以下の試験を実施した。

感作については「魚アレルギーマウスモデルを腹腔内感作モデル：抗原として、加熱魚身、およ

用いた感作試験」の項と同法で実施した。経口惹

びコラーゲン画分を用いた。50 μg/0.5 mL/匹と起に用いる粗抽出物については、腹腔内感作ではなるように水酸化アルミニウムゲル（1 mg/0.5

コラーゲン画分、または加熱魚身を、また、経皮45魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

感作ではコラーゲン画分、または生魚身を用いた。

バイオより市販されている pNCMO2 を用いた。な

各粗抽出物溶液は 30 mg/0.2 mL/匹となるように

お、ブレビバチルス菌発現系でも、目的蛋白質のPBS に懸濁させた。また、aspirin については、4N 末端側に精製を容易にするためにヒスチジンタ

mg/0.2 mL/匹(200 mg/kg)となるように 0.5%

グが融合されるように設計した。

carboxymethyl cellulose-Na (CMC-Na) 溶液に大腸菌での発現と精製：作製したプラスミドベク

溶解させた。経口惹起の際には、各マウスを 1 時

ターを大腸菌に加え形質転換し、抗生物質を含む間馴化させた後に、直腸温を測定し、次いで、CMC-

LB 寒天培地にて培養した。翌日、抗生物質を含む

Na 溶液もしくは aspirin 溶液を経口ゾンデによLB 培地へ植菌し 37℃で培養し、濁度（OD600）がり胃内投与した。その 30 分後、PBS もしくは各粗0.6

抽出物溶液を胃内投与し、さらにその 1 時間後に

thiogalactopyranoside (IPTG)（FUJIFILM）を加

直腸温を測定した。

え発現誘導を行い、さらに室温で一晩培養した。

を 超 え た ら

isopropyl

β -D-

また、感作前、感作後および経口惹起後に血清培養した菌体は遠心操作により回収した。次に、を回収し、血清中総 IgE 値を ELISA にて測定し菌体を超音波破砕し、遠心した上清を菌体抽出液た。

とした。回収した菌体抽出液より、固定化金属ア
フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム 樹 脂 、 Ni-NTA

原核生物を用いた蛋白質作製

agarose（FUJIFILM）を用いて目的蛋白質を精製した。

各種抗原に対し原核生物を用いた蛋白質発現

回収した溶液の一部を SDS-PAGE により分離し、系を構築した。

CBB-R250 にて染色を行い、精製の確認を行った。

発現用プラスミドベクターの作製：各種アレルゲ

また目的蛋白質を含む溶液の一部は限外濾過フ

ンコンポーネント遺伝子は人工遺伝子作製サーィルターユニット Amicon Ultra（Merck Milipore）

ビス、GeneArtTM（Thermo Fisher Scientific）にで濃縮し、液体窒素で凍結後保存した。回収したより作製した。大腸菌発現系で用いるプラスミド

蛋白質の濃度は、紫外吸収もしくは BCA 法を利用

ベクターの作製においては、村上らにより報告さして定量した。

れたシームレスクローニング法により、これら各
種アレルゲンコンポーネント遺伝子を大腸菌発

ブレビバチルス菌での発現と精製

現 用 ベ ク タ ー （ pET-21a(+),Merck Millipore-

作製したプラスミドベクターを用い、キット添

Novagen）に挿入した 8)。なお、大腸菌発現系では付手順に従い形質転換し、抗生物質を含む MT 寒目的蛋白質の C 末端側に精製を容易にするため

天培地にて培養した。翌日、プレート上のコロニにヒスチジンタグが融合されるように設計した。

ーを突き、抗生物質を含む 2SY 培地に植菌し、24

一方、ブレビバチルス菌発現用ベクターはタカラ

時間 30℃で培養した。培養開始 24 時間後に培養

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魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

液を遠心操作により培養上清を得た。その後、マウス血清を用いた各種蛋白質の ELISASDS-PAGE もしくは WIDE RANGE Gel Preparation

2 μg/mL となるように蛋白質を PBS で希釈し、Buffer（4×）for PAGE（ナカライテスク）を用い

384 プレートへ一晩 4℃で静置し固相化した。翌

た電気泳動により分離し、培地への分泌発現状況

日、溶液を除去して PBS-T（0.05%）洗浄後、Pierceを確認した。回収した培養上清シリンジフィルタ

Protein Free (Thermo Fisher Scientific)で 1ー（33 mm マイレクス 0.22μm）に通し、Ni-

時間室温ブロッキングを行った。血清は各群６匹

NTA agarose（FUJIFILM）を用いて目的蛋白質をのマウス血清を混和させたプール血清を用いた。

精製した。また目的蛋白質を含む溶液の一部は洗浄後、Can Get Signal 1（TOYOBO）で希釈したSlide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices（Thermo

5％マウス血清を添加して 1 時間室温で振とうしFisher Scientific）を用いて透析した。

て反応した。洗浄後、Can Get Signal 2（TOYOBO）

回収した蛋白質の濃度は、紫外吸収もしくはで希釈したビオチン化ヤギ抗マウス IgE 抗体

BCA 法を利用して定量した。

（1:4,000、Bio-Rad）を添加して 1 時間室温で振とうして反応した。洗浄後、PBS-T（0.05%）で希変異型パルブアルブミン発現用プラスミドベク

釈した HRP 標識ストレプトアビジン（1:2,500、

ターの作製

Dako）を添加して 1 時間室温で振とうして反応しパルブアルブミン遺伝子を組込んだ各種発現た。洗浄後、TMB 試薬（Thermo Fisher Scientific）

用ベクターを鋳型に、クイックチェンジ法によりを添加して 15 分間室温で振とうして発色後、2N51 残基目と 90 残基目のアスパラギン酸をアラニの H2SO4 溶液で反応停止し、EnSpireTM（Bio-Rad）

ンへそれぞれ置換した D51A、D90A 変異型、ならにて 450nm で測定した。

びに 51、90 両残基を置換した D51/90A 変異型の低アレルゲン化パルブアルブミンの ELISA にパルブアルブミンを作製した 9,10)。アミノ酸置換

ついては、野生型パルブアルブミン、51 残基目のの確認は DNA シーケンサーを実施し、DNA の塩基

アスパラギン酸をアラニンに置換したもの、90 残配列をもって確認した。

基目のアスパラギン酸をアラニンに置換したもの、ならびに、51 と 90 残基目のアスパラギン酸

エンドトキシン量の測定
ToxinSensor

Chromogenic

をアラニンに置換したもの、の計 4 種を用いた。
LAL

Endotoxin

血清については、腹腔内にコラーゲンで感作・経Assay Kit（GenScript）を利用し、キット添付の口惹起させた群、生魚身で経皮感作・コラーゲン

手順に従った。

＋aspirin 経口惹起させた群を用いてマウスの血清による ELISA 同様の試験系を実施した。

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魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

電気泳動

質の含有数や量と比べて非常に近似した組成で粗抽出物の蛋白質、大腸菌により作製されたリあった。アレルギー症例の中には複数のコンポー

ンコンビナント蛋白質の確認には Laemmli の方

ネントに感作されて発症する症例がいるため 6)、法 11）による SDS-PAGE により確認した。

このように実際に含まれる蛋白質組成の粗抽出物を用いたモデル動物作製は極めて重要である。

質量分析装置を用いた蛋白質の特定

一方、コラーゲン感作による魚アレルギー発症

蛋白質の特定にはタンデム型高速液体クロマが近年報告されており、コラーゲン分子の重要性

トグラフ質量分析計システム（TripleTOF®6600、が再認識されている。そこで、Hamada らが確立し

ABSCIEX）を用いて、Shimojo らの論文を参考にした魚身からのコラーゲン単離方法 6）を参考とし、て実施した 5）。

加熱魚身から得られるコラーゲン画分を 3 つ目の粗抽出物として作製した。その結果、若干のパ

結果と考察

ルブアルブミンの混入は確認されたものの、精製

魚粗抽出物の作製

度の高いコラーゲンを抽出した。

電気泳動の結果と質量分析装置により特定した各蛋白質を図 1 に示す。

魚粗抽出物を用いた感作性試験・総 IgE・IL-13の結果
コラーゲン画分と加熱魚身の粗抽出物溶液を用いて腹腔内感作を実施した結果、両粗抽出物において血清中総 IgE 値が上昇した(図 2)。

銀鮭の生魚身、加熱魚身を電気泳動した結果、低分子量域から約 110kDa までは両抽出物に含まれる蛋白質は同一であった。一方で、110kDa 以上の領域では異なる蛋白質が特定され、生魚身の高感作においては、特にコラーゲン画分で感作し分子領域にはミオシン重鎖が、また、加熱魚身でた場合が最も高値であった。一方、コラーゲン画

はコラーゲンが特定された。これら調製した粗抽分と生魚身の粗抽出物を用いて経皮感作を実施

出物は実際の生魚身や加熱魚身に含まれる蛋白した結果、両粗抽出物において血清中総 IgE 値が48

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発上昇したが、特に生魚身の粗抽出物溶液で感作し魚粗抽出物を用いた経口惹起試験・総 IgE・体温た場合が最も高値であった。脾細胞による IL-13

低下の結果

産生量について測定した結果、感作に用いた粗抽

図 4A-C についてはコラーゲン画分（図 4B）、な出物溶液で脾細胞を再刺激した際に、顕著に上昇

らびに加熱魚身（図 4C）の粗抽出物で腹腔内感作した(図 3)。

したマウスにおいて、両粗抽出物をそれぞれ反復
的に経口投与し惹起試験を実施し、マウスの血清
中総 IgE 値を測定した。さらに、各抽出物に対し、aspirin の併用群を設け、aspirin によるアレル
ギー反応の増強の可能性を検討した。図 4B にお
いて、PBS 群と比較してコラーゲン画分で腹腔内感作させた場合、コラーゲン画分の経口惹起＋
aspirin 併用群が有意な高値を示した。さらに、
図 4C において、加熱魚身による腹腔内感作させた場合においても同様にコラーゲン画分の経口惹起＋aspirin 併用群が有意な高値を示した。

両感作の結果から、腹腔内感作モデルではコラーゲン画分により、また、経皮感作モデルでは生

図 4D-F についてはコラーゲン画分（図 4E）、な魚身により血清中総 IgE 値が高値を示した。すな

らびに生魚身（図 4F）の粗抽出物で経皮感作した

わち、感作経路の違いにより反応抗原が異なる可

マウスにおいて、両粗抽出物をそれぞれ反復的に能性が示唆された。IL-13 については、感作経路

経口投与し惹起試験を実施した。その結果、図 4Eによらず、感作に用いた粗抽出物で脾細胞の再刺においてコラーゲン画分で経皮感作させた場合、激により応答することが観察された。

生魚身の経口惹起＋aspirin 併用群、ならびにコ

寿司職人など鮮魚を扱う業務に従事している

ラーゲン画分の経口惹起＋aspirin 併用群は有意

中で、生魚身を素手で接触することで繰り返し抗な高値を示した。さらに、図 4F において、生魚原に暴露されて発症する職業性魚アレルギーが身で経皮感作させた場合、生魚身の経口惹起＋問題になっている。今回の実験結果の中で、生魚

aspirin 併用群、ならびにコラーゲン画分の経口

身で経皮感作させたマウスはこの感作機序に近惹起＋aspirin 併用群に加え、生魚身の経口惹起似したモデルであることが示唆され、抗原と感作群でも有意な高値を示した。
次に、経口投与最終回後における直腸温を測定に関する発症形態の機序の解明に役立つモデル

した（図 5）。

と期待している。

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魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

まず、コラーゲン画分、ならびに加熱魚身を用いて、コラーゲン画分、または生魚身を反復的にいて腹腔内感作、経口惹起させた群の直腸温を測経口投与したが、顕著な差はみられなかった。

定した。その結果、図 5A において、コラーゲン

経口惹起試験の結果から、腹腔内感作モデルで画分による腹腔内感作群の中で、コラーゲン画分

はコラーゲン画分の感作＋コラーゲン画分の経の経口惹起群、ならびにコラーゲン画分の経口惹

口惹起＋aspirin 併用投与により、また、経皮感起＋aspirin 併用群が PBS 群と比較して有意に直作モデルでは生魚身の感作・生魚身の経口惹起＋

腸温低下を示した。また、加熱魚身による腹腔内aspirin 併用投与により直腸温低下を示した。す感作の中で、コラーゲン画分の経口惹起＋

なわち、両粗抽出物に関しては、感作させた物質

aspirin 併用群も同様に直腸温低下が認められたを経口的に投与することで重篤な体温低下を引が、一方で、加熱魚身の経口惹起した全群では有き起こす可能性が示唆された。一方、加熱魚身に意な差がみられなかった。

よる腹腔内感作モデルの中で、コラーゲン画分の次に、コラーゲン画分、ならびに生魚身を用いて経皮感作、経口惹起させた群の直腸温を測定した。その結果、図 5B において、生魚身による経皮感作群の中でコラーゲン画分の経口惹起＋
aspirin 併用群と生魚身の経口惹起＋aspirin 併
用群において有意な直腸温低下が認められた。一方、コラーゲン画分で経皮感作させたマウスにお50

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

経口惹起＋aspirin 併用投与によって顕著な体温

コラーゲンに関しては、構成されるアミノ酸の低下が認められた。これについて図 1 より加熱魚中でプロリンがヒドロキシプロリンに修飾され身の粗抽出物にはコラーゲンが含まれており、おていることが知られているが、原核生物ではプロ

そらくこのコラーゲンに対する著しい免疫応答

リンのヒドロキシ化は不可能であるため、銀鮭かが発生したものと推察される。ただ、コラーゲンら抽出したコラーゲン（n コラーゲン）を採用し単体投与では有意な差が認められなかったことた（図 6C）。

を踏まえると、aspirin による生体内へのコラー

またパルブアルブミンに関しては、低アレルゲ

ゲン取り込みの増加により高い抗原性を獲得し、ン化コンポーネントのモデルとして、IgE エピト

結果的に直腸温低下を引き起こしたものと考えープ領域のアミノ酸残基を置換した変異型

る。

（D51/90A、D51A、D90A）3 種を作製し、マウスのIgE 反応性を検証した（図 7）。

原核生物を用いた蛋白質発現系の構築調製したアレルゲンコンポーネントを動物実

発現・精製・エンドトキシン測定

験などへ利用する際、発熱などの生体反応や各試

原核生物発現系により銀鮭由来リコンビナン

験の偽陽性を示すエンドトキシンの混入が危惧

トパルブアルブミン（以下、r パルブアルブミン）、

されるが、ブレビバチルス菌はグラム陽性菌であ

リコンビナントβ-エノラーゼ（以下、rβ-エノ

り、大腸菌とは異なりエンドトキシンを持たない。

ラーゼ）を作製した。例としてブレビバチルス菌

実際にエンドトキシン活性を測定したところ、蛋発現系により産生し、24 時間培養した 2SY 培地

白質 1 mg あたり大腸菌発現系では 368 エンドト

（図 6A）から Ni-NTA agarose で r パルブアルブ

キシンユニット（EU）、ブレビバチルス菌発現系

ミンを精製した結果、１回のカラム操作で培地上

では 3 EU と、ブレビバチルス菌発現系を用いた

清中由来の他蛋白質の含有もなく、非常に精製度方が低値となった。このことは動物実験での利用の高い蛋白質が単離された（図 6B）。当該行程をなどを考慮した際、ブレビバチルス菌発現系が有もとに rβ-エノラーゼも同様に調製した（図 6C）。

用であることを示唆している。

51

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

一方で、ブレビバチルス菌によってエンドトキ投与の有無に関係なく r パルブアルブミンと rβ

シンの対策を実施しているが、それだけでは不十-エノラーゼに対する IgE 反応性が最も高値を示分であることがわかってきた。エンドトキシンをした。さらに、rβ-エノラーゼに関しては、加熱産生するグラム陰性菌は至る所に常在しており、魚身で感作＋コラーゲン画分の経口惹起群にお実験室の中ではシンクなど水回りに多く存在しいても高値を示した。一方、経皮感作群の中で、ていることが知られている。そのため、器具や調

生魚身で感作させ生魚身の経口惹起群、ならびに製した試薬中にも微量のエンドトキシンが含ま

コラーゲン画分の経口惹起群において、aspirin

れている可能性も否定できない。その対策として、投与の有無に関係なく rβ-エノラーゼに対するエンドトキシンフリーの純水やディスポの器具

IgE 反応性が最も高値を示した。パルブアルブミを準備する必要がある。

ンに対する IgE については、同様の 2 群においてaspirin を併用投与した群の方が併用していない

経口惹起試験マウス血清を用いた蛋白質の群に比べ高値を示した。n コラーゲンに対する

ELISA

IgE 反応性については上述の 2 蛋白質と比較し、経口惹起試験を実施したマウスのプール血清

両感作群において顕著な差はみられなかった。

を用いて r パルブアルブミン、n コラーゲン、rβ

まず特筆すべき点として、感作試験のみ実施し-エノラーゼの ELISA を実施した（図 8）。

たマウスの血清を用いて各蛋白質の ELISA を実

腹腔内感作群の中で、コラーゲン画分で感作＋施したが（データ非公表）有意な差が認められなコラーゲン画分の経口惹起群において、aspirin

かったのに対し、経口惹起試験を実施した場合で52

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

は各抗原に対して IgE が反応した。その中で、腹ラーゲンの ELISA の低反応性については加熱魚

腔内・経皮による両感作において rβ-エノラー

身から抽出されたものを利用しており、抽出物かゼに対する IgE が顕著に反応していた。魚アレルらの単離による抗原性の担保について詳細に調ゲンの中でパルブアルブミンやコラーゲンはよ査する必要がある。

く知られているが、エノラーゼに関する報告は数

マウスを用いて感作・惹起させた実験系で血清例のみである 12,13)。各粗抽出物内のエノラーゼ含学的検討を実施する場合、IgE に加えて IgG1 の有量を図 1 の電気泳動の結果で確認すると、生魚存在も考慮に入れる必要がある。血清中 IgG1 の身や加熱魚身には多く含まれているが、コラーゲ

濃度は IgE の数百～数千倍といわれ、ELISA など

ン画分にはほとんど含まれていなかった。それでを実施する場合には IgG1 による競合阻害の可能もコラーゲン画分の投与によって rβ-エノラー性を視野に入れ ELISA の系を構築する必要があゼに対して IgE が反応した理由については、微量る。

のエノラーゼでも継続的な惹起によって高い抗原性を獲得した可能性が示唆された。他のコンポ

経口惹起試験マウス血清を用いた低アレルゲン

ーネント含め今後詳細な解析が必要である。

化パルブアルブミンの ELISA

一方、パルブアルブミンについてはコラーゲン

パルブアルブミンの抗原性に関わるアミノ酸

画分による腹腔内感作・経口惹起させた群で顕著残基をアラニンに置換した変異型 r パルブアルに反応している結果であった。これについても同ブミンを作製し、ELISA により各マウス IgE の反じく図 1 より、コラーゲン画分内にはコラーゲン

応性を測定し低アレルゲン性を検証した（図 9）。

以外にもパルブアルブミン分子が含まれている

パルブアルブミンに対して IgE が顕著に反応すことがわかるが、当モデル作製法ではパルブアル

る２群を抽出し、各マウスの IgE を測定した結果、ブミンの方がコラーゲンよりもアレルゲンとし

腹腔内・経皮感作ともに野生型 r パルブアルブミて成立しやすい可能性が示唆された。また、生魚ンに対する反応性に対し、変異型 r パルブアルブ

身で経皮感作させた aspirin 併用の 2 群では併ミンの方が低下していた。特に、51 残基目のアス用していない群に比べパルブアルブミンに対しパラギン酸をアラニンに置換した D51A の変異型て顕著に反応した結果が得られている。Aspirinにおいては著しく反応が低下した。D51/90A 変異

は消化管の抗原取り込みの吸収を促進させ抗原型についてもほぼ同様の結果が得られ、D51A に性の上昇や症状誘発に関与することが知られて依存していることが示唆された。一方、D90A に関いるが、aspirin によってパルブアルブミンの抗してはマウスによって IgE 反応性が下がるもの

原性が高くなったことは非常に興味深く、臨床でと下がらないものの両方が確認された。各群 6 匹も同様の事例があるか確認する必要がある。n コから構成されているが、感作惹起後に野生型パル53

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

ブアルブミンに反応しなかったマウスが各群 1ビジン結合固相化ビーズを混合する。この測定手匹存在していたため当マウスの結果は除外した。

法においては、スポンジやマイクロプレートウェ

パルブアルブミンは、様々な魚種間で交差反応

ルなどの固相反応と比較して立体障害が最小限

性が高く、特にカルシウムイオン結合領域においになり、また球形のビーズが液相中で回転するこてアミノ酸類似性が高いことから、同領域が主要とにより抗原を認識する確率が高くなると考えな IgE エピトープと考えられている。また、同領られている 14,15)。これらを踏まえ、本研究で取り域に変異を入れたコイ由来パルブアルブミンに上げたアレルゲンコンポーネントについて、ビオ

おいて、マウスモデルを用いた実験では IgE 反応

チン化蛋白質の作製を可能にする Avitag 技術を性が著しく低下したことが報告されている 10)。今検 討 し た 。 Avitag は ア ミ ノ 酸 配 列 と し て回、当報告を参考に変異型 r パルブアルブミンをGLNDIFEAQKIEWHE をもち、このリシン残基に大腸作製し同様の結果が得られたことから、今後、エ菌内に含まれる酵素反応によりビオチンが付加

ノラーゼ含め、すでにヒト症例の抗原解析によりされる。このため、発現操作を行うだけで、ビオ特定した様々なアレルゲンコンポーネントに対チン化されたアレルゲンコンポーネントが作製し、同様の手法で低アレルゲン化を実施し、免疫可能となる 16)。

療法剤の原薬候補を選定していきたい。
残された課題及び発表予定
動物モデルの課題：今回の検討では、腹腔内感計画に追加して行ったこと
アラスタット 3g Allergy®はビオチン化した粗作を用いて全身感作のマウスモデルの作製を試抽出物などを抗原とし、患者血清とストレプトア

みた。しかしながら、臨床において、腹腔内感作

54

魚アレルギー免疫療法を見据えた複合的低アレルゲン化コンポーネントの開発

モデルは応用しづらく、摂取食物からの感作を鑑

139 年会および第 1 回日本アレルギー学会東海地

みるには、経口投与による全身感作モデルを作製方会にて発表した。今後、第 68 回日本アレルギするのが好ましい。そのため、今後はコレラトキー学会学術大会および第 135 回日本薬理学会近シンを用いた経口感作マウスモデルの作製を試

畿部会では経口惹起の成績を加えて発表する予みる必要がある。また、今後、アレルギー抑制試定である。

験の実施を想定しているが、その際にはフローサ
イトメーターによる制御性 T 細胞の population

今後の研究活動についてを確認する必要があるが、そのためには、マウス

前述したように、今回作製した魚アレルギーモの免疫細胞系の活性化を確認する必要があり、細デルマウスにおいて、アレルギー症状の誘発を確胞増殖試験を現在検討している。

認できた。しかしながら、臨床における摂取食品

蛋白質発現系の課題：ブレビバチルス菌発現系からの感作を鑑みた経口感作のマウスモデルをで産生したパルブアルブミンの回収量は、培地作製する必要があると考え、コレラトキシンおよ

100mL あたりで計算した場合、大腸菌発現系と比び抗原を併用する経口感作モデルを確立したい。

べると非常に少ないことがわかった。これについ今後、これらモデル系を用いて低アレルゲン化しては今後、最大 10L までの培地で培養可能なジャたコンポーネントを複数作製して投与し、症状抑ーファーメンタを利用し、発現条件の最適化など

制に関する研究を遂行する予定である。

により解決したい。また、ブレビバチルス菌発現最後に、本研究を遂行するにあたり、臨床医と系では、rβ-エノラーゼの培地上清へ分泌されなして「患者にとって有益な免疫療法剤とは何か？」かった。今回は市販されている pNCMO2 を利用しを常に意識した上で、得られた研究結果に対し共たが、今後プロモーターや分泌シグナルの検討に同研究者とともに議論してきた。患者にとって本より高産生される条件を検討していきたい。

当の意味での有益な免疫療法剤を提供するため

抗原解析：今回、3 種のアレルゲンコンポーネに、臨床と基礎がより一層密に連携して本研究をントに対し研究を進めてきたが、魚アレルギー症

継続していく。

例で特定した全てのコンポーネントに対して実参考文献

施できていない。抗原性について課題の残る n コ

1) 食物アレルギーの診療の手引き, 2017

ラーゲンも含め抗原・エピトープ解析を実施予定

2) Leung NY, Wai CY, Shu S, et al. Currentである。また ELISA については特異的 IgE を検出

immunological and molecular biologicalできるような系を構築し、精度の高い結果を提供

perspectives

し、動物実験との対比が必要である。

comprehensive

今回得られた成果の一部は、既に日本薬学会第55

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