東洋鋼鈑Vol.３9

抗がん剤ゲムシタビンの副作用に関連する一塩基多型を判別するDNAチップキットの開発
中村憲章＊１・平山幸一＊２・山野博文＊３
Development of DNA Chip for Detection of SNPs Involving a Side Effect of Gemcitabine
Noriaki NAKAMURA, Koichi HIRAYAMA, Hirofumi YAMANO

Synopsis：The toxicities of Gemcitabine, which is one of anti-cancer drugs, have been reported to correlatewith the 4 polymorphisms (rs11141915, rs1901440, rs11719165, rs12046844). We have developed
a DNA chip to detect these polymorphisms using the GENE SILICON. In order to improve the DNAchip detection accuracy, we examined PCR conditions, hybridization conditions and washingconditions. In addition, the threshold to judge the allele type was established using 171 DNAsamples. Using this threshold, we evaluated the correlation with the invader assay. As a result, allalleles were consistent. We were able to develop the good precision DNA chip to analyze 4polymorphisms.
Keywords：GENE SILICON ; DNA chip ; gene polymorphism ; Gemcitabine

阻害するため副作用が懸念される．代表的な副作用として

１．緒言は，倦怠感，脱毛，悪心，血管障害などが挙げられ，時には重篤な骨髄抑制により死亡する例も報告されている．

近年，生活習慣の欧米化によりがんの罹患数は増加して

これら副作用は患者により程度の差が見られ，最近の研おり，1980年から現在に至るまで死亡率はあらゆる疾患の究からゲノム塩基配列に存在する4種類のSNP（Single中で最も高い．一方で，がんに対する治療法は日々進歩しNucleotide Polymorphism）が関連することが明らかにており，治療ガイダンスにより，発がん部位や進行度に応なりつつある１）．SNPとは塩基配列中の特定の1塩基が母じて治療法が細かく設定されている．

集団内でおよそ1%以上の頻度で変異することを指し，対がんの治療法は3種に大別することができ，「外科的療象となる塩基が変異していれば薬剤への反応性に影響を及法」，「放射線療法」，「化学療法」がある．中でも化学療法ぼす場合がある．そこで我々は，抗がん剤ゲムシタビンのは，抗がん剤の投与によりがん細胞を破壊する手法であり，副作用を投薬前に予測するため，4種類のSNPを同時に解外科的療法による摘出が困難な場合や，放射線治療では効析することが可能なDNAチップの開発を行った．

力が弱い場合に有効である．

２．方法

化学療法に用いられる抗がん剤は，性質の違いから発がん部位による使い分けが必要であり，膵臓がんであれば第DNAチップを用いた遺伝子型の検査フローを下記に示

1選択薬に代謝拮抗剤のゲムシタビンが用いられる．ゲム

す．

シタビンは，DNAの構成要素である核酸構造に近似しているため，DNA複製を過剰に行うがん細胞内に取り込ま検体DNA抽出 ⇒ PCR反応 ⇒ ハイブリダイズ反応

せることで，がん細胞の異常増殖を阻害する作用を有する．

⇒ 洗浄 ⇒ 蛍光検出

しかしながら，その作用機構により，健康な細胞の増殖も＊１ 技術研究所 研究部 ライフサイエンス技術グループ＊２ 技術研究所 研究部 ライフサイエンス技術グループ チームリーダー＊３ 技術研究所 研究部 ライフサイエンス技術グループ グループリーダー

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東洋鋼鈑

患者から抽出した検体DNAを用いて，検査に必要な遺Vol.３9

２．１

伝子部分を選択的に増幅する（PCR: Polymerase Chain

DNAチップの作製と試験方法

２．１．１

Reaction）．この増幅産物を一定の環境下でDNAチップとDNAチップの作製

3mm角 の シ リ コ ン 基 板 にDLC（Diamond Like

接触させて反応させる（ハイブリダイズ反応）．DNAチッCarbon） 膜 を イ オ ン 化 蒸 着 法 に よ り 成 膜（ 膜 厚プには，それぞれの遺伝子型に対応したプローブが予め固40nm）した．その後，反応溶液中での浸漬処理により，定化されており，増幅産物中に該当するDNAが存在すれ

DLC表面にアミノ基およびカルボキシル基を順次導入し，ばハイブリダイズ反応により2本鎖を形成する．反応後はカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS未反応DNAを洗浄し，蛍光検出機にて測定する．増幅産（N-Hydroxysuccinimide））でエステル化し，活性エステ物には蛍光を標識しているため，DNAチップに励起光をルが表面修飾された基板（製品名「ジーンシリコン」）を照射するとハイブリダイズ反応量に応じて蛍光を発する．

作製した２）．活性エステルは，DNAの末端に修飾された

以下に詳細な試験方法を示す．なお，対象である4種類のアミノ基とアミド結合を形成する．ジーンシリコンにプ

SNPの識別番号はTable 1に示す．

ロ ー ブ をDNAス ポ ッ ト 装 置（ 高 電 工 業 ㈱ 製，

約SPBIO2000）によりスポット（φ150μmの液滴）し，共Table 1

有結合によって4種類のSNPを検出するためのプローブをReference SNP ID numbers of Target SNP

基板に固定化した．プローブの詳細をTable 2に示す．また，DNAチップの外観をFig.1に示す．
２．１．２

検体DNAからのDNA増幅および蛍光標識検証試験には匿名化された検体DNAを用いた．プライマーは最近接塩基対法３）を用いて設計した．各プライマー
セ ッ ト をTable 3に 示 す．PCRは サ ー マ ル サ イ ク ラ ー（Applied Biosystems®製, GeneAmp® PCR System9700）を用いて行った．PCRの組成をTable 4に示す．
PCR条件をTable 5に示す．
Table 2 probe of initial examination

Fig.1

Gene silicon DNA chip34

抗がん剤ゲムシタビンの副作用に関連する一塩基多型を判別するDNAチップキットの開発
Table 3 Primer sequences

Table 4２．
１．
３

PCR components

Table 5 PCR cycles

ハイブリダイズおよび蛍光検出される．両親から野生遺伝子のみを引き継いだ状態を野生

得 ら れ た 増 幅 産 物 と ハ イ ブ リ ダ イ ズ 緩 衝 液（2.25×型（wild），変異遺伝子のみを引き継いだ状態を変異型

SSC/0.23%SDS） と を3：1で 混 合 し た． こ の 混 合 液 を（variant），また両方の遺伝子を引き継いだ状態をヘテロ

DNAチップに滴下し，ハイブリダイズカバーを被せて，型（hetero）と呼ぶ．

一定温度で1時間ハイブリダイズ反応を行った．ハイブリダイズ反応にはハイブリダイズインキュベーター（タイ２．２テック㈱製, HB-100）を用いた．ハイブリダイズ反応後に，

２．２．１

実験内容
ハイブリダイズ条件の検討

ハイブリダイズカバーを外し，DNAチップを洗浄液（0.1遺伝子型の判別には，ハイブリダイズ後の野生プローブ

×SSC/0.1 w/v% SDS溶液）に5分間浸漬した後，リンスと変異プローブから検出できる蛍光強度を用いる．判別の液（1×SSC）中で10回上下に振とうした．

精度を向上させるためには，プローブが相補的なターゲッ

DNAチップをリンス液から取り出し，余分なリンス液トDNAと特異的に反応する必要性があり，プローブの特を 拭 き 取 り， 専 用 蛍 光 検 出 器（ 東 洋 鋼 鈑 ㈱ 製,異性はハイブリダイズ温度の上昇に伴い増加する（Fig.2BIOSHOT）にて蛍光検出画像を撮影した．の実線）．しかしながら，プローブには2本鎖DNAを維持できる上限温度が存在しており，上限温度へ接近するにつ

２．
１．
４

蛍光強度値および判定値の算出

蛍光検出画像からそれぞれのスポットの輝度の中央値を算出し蛍光強度とした．さらに，遺伝子型を判別する指標として，（1）式を用いて判定値（index）を算出した．
２×変異プローブ蛍光強判定値＝――――――――――――――――――――――――…（1）
野生プローブ蛍光強度＋変異プローブ蛍光強度
高い特異性を有したプローブを用いた場合，判定値は検体DNAの遺伝子型ごとに収束する．そのため，判定値が分離するプローブの組み合わせを選択することで，検体DNAの遺伝子型の判別が可能となる．ヒトの遺伝子型は3Fig.2

種類あり，両親から受け継いだ2セットのゲノムから決定

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The relationship between Fluorescence intensity andSpecific reaction東洋鋼鈑
Table 6Vol.３9probes of secondary examination

れて反応量は減少するため蛍光強度が低下する（Fig.2のられた判定値をFig.3 ～ 6に示す．

破線）．このことから，遺伝子型の正確な判別には，プロー

SNP1（Fig.3）は，52，54，および56℃においてヘテブが高い特異性を以てターゲットDNAと反応し，かつ2本ロ型の判定値は0.8程度であったが，58℃では0.5程度に低鎖DNAを保持することが可能なハイブリダイズ温度を決下した．これはSNP1W-25よりSNP1V-25のTm値４）が低い定しなければならない．

ことから，ハイブリダイズが可能な上限温度にSNP1V-25

そこで，初期設計したプローブに最適なハイブリダイズの方が先に達すると想定されるため，58℃ではSNP1V-25の温度域を決定するため条件検討を行った．検討試験ではの蛍光強度の大幅な減少に伴い判定値が低下したと考えら増幅産物とDNAチップを，ハイブリダイズインキュベーれる．また，ヘテロ型の判定値は1.0付近が理想的である

ターを用いて50，52，54，56または58℃で1時間反応させ，ことから，ハイブリダイズ温度は50，52，54，および56℃判定値を算出することでハイブリダイズ温度を評価した．

において遺伝子型を判別することが可能であると考えられる．

２．
２．
２SNP2（Fig.4）は，ハイブリダイズ温度の上昇に伴いプローブの塩基数の最適化

２．
２．
１で決定した最適なハイブリダイズ条件においてヘテロ型の判定値が緩やかに増加した．これはSNP2V-29特異性の高い反応を実現するため，プローブの最適な塩基よりSNP2W-29のTm値４）が低いことから，ハイブリダイ数を評価した．検討したプローブをTable 6に示す．プローズが可能な上限温度にSNP2W-29の方が先に達すると想定ブをシリコン基板に固定化し，遺伝子型が既知の検体を用されるため，SNP2W-29の蛍光強度の減少に伴い判定値がいて反応させることで，算出した判定値の分離と3σ（3×上昇したと考えられる．このことから，ハイブリダイズ温標準偏差）からプローブの最適な塩基数を評価した．

度は50，52，および54℃において遺伝子型を判別することが可能であると考えられる．

２．
２．
３

SNP3（Fig.5）は，野生型とヘテロ型の判定値が56お遺伝子型判定の閾値設定

試作したDNAチップの精度を検証するため，遺伝子型よび58℃の条件で分離したが，一方でヘテロ型と変異型はが未知の検体171例に対して遺伝子型の判別試験を実施しいずれの温度においても近接していた．これは用いたプた．また，判別の結果が合致した試験データを用いて，判ローブのTm値が高かったため，50 ～ 58℃のハイブリダ定値の平均±3σにより閾値を設定した．

イズ温度では十分な特異性を得られなかったと推測される．そのため，SNP3においてはプローブの塩基数の短縮３．結果と考察が必要であると考えられる．
SNP4（Fig.6）は，ヘテロ型と変異型の判定値が56℃３．
１および58℃の条件で近接したが，54℃以下では判定値は分ハイブリダイズ条件の検討

ハイブリダイズ温度を50，52，54，56または58℃とし，離しており，特に50℃で良好な分離を確認した．

それぞれ1時間ハイブリダイズを行い，算出した判定値か以上の結果から，4種類のSNPにおいて同時に判定値をら評価を行った．Table 2に示したSNP1 ～ 4について得分離することが可能なハイブリダイズ温度を確認すること

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抗がん剤ゲムシタビンの副作用に関連する一塩基多型を判別するDNAチップキットの開発

Fig.3

The relationship between hybridization temperatureand SNP1 index

Fig.5

The relationship between hybridization temperatureand SNP3 index

Fig.4

The relationship between hybridization temperatureand SNP2 index

Fig.6

The relationship between hybridization temperatureand SNP4 index

はできなかったが，高いハイブリダイズ温度では一般的によびFig.8にそれぞれ示す．なお，図中の「W」と「V」は，蛍光強度のばらつきが大きくなるため，安定した結果を得それぞれ野生プローブと変異プローブを表し，ハイフン以るためには52および54℃での反応が適していると考えられ降の数字は塩基数を示す．

る．

SNP3（Fig.7） の 判 定 値 の 分 離 を 初 期 条 件（initial

また，ハイブリダイズ後にDNAチップ上の反応液を除condition）と比較したところ，W-26とV-26の組み合わせ去する洗浄作業までに，DNAチップ表面の温度が低下すから得られる判定値の分離が最も良好であり，3種類の遺ることでプローブの非特異的な反応が進行して判定値が変伝子型はヘテロ型を中心に均等に分離した．これは，プロー動する恐れがある．そこで，今回は遺伝子型の判別が期待ブの塩基数を短くすることで，特異性が向上したと考えらできるハイブリダイズ温度範囲52 ～ 54℃のうち，DNAれる．

チップ表面の温度低下による影響を軽減するために54℃をSNP4（Fig.8）では，W-27とV-26の組み合わせから得採用することにした．

られる判定値の分離が最も良好であり，判定値の平均はそれぞれヘテロ型を中心に均等に分離した．また，変異プロー
ブの塩基数の減少に伴いヘテロ型と変異型の判定値が低下

３．
２ プローブの最適化に向けた検討
前節の結果より，SNP3における各遺伝子型の判定値はした．

近接し，またSNP4は野生型とヘテロ型の分離と比較して，以上の結果から，SNP3とSNP4において判定値の分離ヘテロ型と変異型が近接しており，判定値の分離に改善のを改善できるプローブをそれぞれで確認することができ余地がある．そこで，SNP3とSNP4に対して最適なプローた．最適化したプローブの塩基数をTable 7に示す．

ブの塩基数の検討を行った．判定値の平均の導出には3試行の試験データを用いた．SNP3とSNP4の結果をFig.7お37

東洋鋼鈑Vol.３9

Fig.7

The relationship between number of bases and SNP3 index

Fig.8

The relationship between number of bases and SNP4 index

Table 7 Optimized probe

Table 8The number of genotyped sample38抗がん剤ゲムシタビンの副作用に関連する一塩基多型を判別するDNAチップキットの開発

Fig.9

３．
３

The determined thresholds of 4SNPs index

対象SNPの選定とDNAサンプルの提供においては，国遺伝子型判定の閾値設定

遺伝子型が未知の検体171例における遺伝子型の例数を

立がん研究センター研究所遺伝医学研究分野（現がん研究Table 8に示す．また，得られた各遺伝子型の判定値から

会がんプレシジョン医療研究センターリキッドバイオプ

算出した平均値および閾値をFig.9に示す．

シー診断開発プロジェクト部長）の前佛均先生にご協力頂

検体171例に対してDNAチップ法を用いた試験を実施しきました．感謝とともに御礼申し上げます．

たところ，得られた判定値は3群に分離した．また，異なる遺伝子解析方法であるインベーダー法により得られた遺引

用文

献伝子型と比較したところ，全ての検体において遺伝子型が１）K. Kiyotani, S. Uno, T. Mushiroda, A. Takahashi,一致した．このことから，試作したDNAチップキットは

M. Kubo, N. Mitsuhata, S. Ina, C. Kihara, Y.

既存の遺伝子型判定法と同等の性能を有することを確認で

Kimura, H. Yamaue, K. Hirata, Y. Nakamura andきた．

H. Zembutsu：Pharmacogenetics and Genomics.,
22-4（2012）：229．

４．結言２） 岡 村 浩, 山 野 博 文：New Diamond, 29-2（2013），17.

試作したDNAチップキットおいてDNAチップとのハイ

３）W. Rychlik, RyChlik, W. J. Spencer and R. E.

ブリダイズの反応条件とプローブの塩基数の検討を行い，Rhoads：Nucleic Acids Res., 18-21（1990），6409.

最適な条件を得ることができた．また未知の171例の検体

４）J. Meinkoth and G. wahl：Anal Biochem., 38-2を用いて試験したところ，判定値は3群に分離した．既存（1984），267.の遺伝子型判定キットと判定結果を比較したところ，遺伝子型が全て一致したため，この試験データを用いて遺伝子型の判定を決定するための閾値を設定した．

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