技術概要

ブリードが GC/MS データにおよぼす影響とその抑制方法
はじめにカラムブリードについて質量分析（MS）データによく見られるにも関 わらず、正しく理解されていない現象の 1 つに、カラムブリードがあります。ブリードはクロマトグラムのベースラインを押し上げてスペクトルに干渉し、データの品質と信頼性を損なわせます。ブリードについて理解するには、まず、ブリードがどこで発生するのかを考えなければなりません。カラムの固定相の種類は多岐にわたり、現在、最も広く使用されている 1、5、624 などのカラムは WCOT （内壁コーティングオープンチューブラ）カラムに分類されます。この種のカラムは、図 1 に示すように、固定相の薄膜（μm 単位の多様な厚さ）で内壁がコーティングされたフューズドシリカチューブ（mm 単位の多様な内径）で構成されます。このコーティングされた固定相が成分と相互作用して、クロマトグラフィーの選択性とリテンション特性を生み出しますが、まさにこれらの特性がカラムブリードの発生源にもなります。

ポリイミドコーティング

フューズドシリカチューブ固定相（膜）膜厚

内径

図 1. WCOT フューズドシリカ GC カラムの概略図と一般的なカラム属性

カラム相は、ポリシロキサンを主骨格とする幅広い極性の液体ポリマーでベースラインの上昇幅が大きくなると、特に S/N 比の低い成分ではピーできています。熱が加わると、固定相のポリマーの末端が後方に曲がり、ク積分がデータ品質に悪影響をおよぼし、問題になる可能性があります。

います。その結果、図 2 に示すように、熱力学的安定性の高い環状構造ラインです。MS などの高感度検出器を使用する場合、検出器の感度がその後も繰り返されます。また、温度が高いほど、この反応 は 促進されカラムブリードにつながり、微量化合物の感度に悪影響をおよぼします。

ポリマー 自体を攻撃し始 めます。この現象を「バックバイティング」と言が遊離し、ノイズが増加してベースラインが上昇します。このプロセスは、ます。300 ℃を超える温度でベースラインが上昇しているのは、そのためピーク積分の精度と再現性が最適化されるのは、安定した平坦なベース高いほど、バックグラウンドノイズとブリードの検出量 が高まって過度 なです。

固定相13.3 pA

標準

4.7 pA

Agilent DB1-ms
2.3 pA

0.8 pA
135 °C0325 °C
25時間（分）350 °C50

図 2. カラムブリードのメカニズムと、「標準」カラムおよび Agilent J&W DB-1ms カラムのブリードプロファイルの比較

2

バックバイティングによって遊離した環状構造が MS に進入すると、そのカラムを温度限度内で使用することして現れることがあります。図 3 に示すように、カラム相の極性にかかわグラミングを守ることが重要です。どの GC カラムにも最高許容使用温のスペクトルの完全性を損なわせる原因になります。このような理由から、ます。MAOT とはカラムを曝露できる最高温度で、早期の劣化を抑えるリードのカラムを使用することを強く推奨します。

325/350 ℃のように 2 つの数値で表され、最初の小さい方の数値は恒質量もイオンソースでフラグメント化され、質量スペクトルに干渉イオンとらず、m/z 207 および 281 のイオンはスペクトルによく見られ、目的成分GC/MS 分析、特に高感度の GC/TQ および GC/Q-TOF 機器には、低ブ

温度 はカラムブリード量 を大きく左右するため、GC カラムの 温度プロ度（MAOT）がありますが、この温度 はカラム相の種類 によって異 なりには、この 温度以下で使用する必要 があります。一般 に、最高温度 は温分析における MAOT を示します。また、2 番目の大きい方の数値は、サーマルグラジエントまたはオーブンプログラムを使用する場合の MAOTです。カラムの寿命を最適化し、ブリードの影響を抑えるため、オーブンプログラムはこの使用限度内で運用してください。

Agilent DB-1701

Agilent DB-5

図 3. 極性が異なる 2 種類の GC カラム相によるブリードスペクトルの例13

ガスクロマトグラフィー /質量分析用のカラムを選ぶこと

アジレントは、1991 年に、低ブリードの MS アプリケーション用に設計された初のカラムである Agilent J&W DB-5ms を発売しました。このカラムは瞬く間に GC/MS アプリケーションの業界標準となりました。いまや

GC/MS は感度が大幅に向上し、さらなる高感度化と精密質量機能により

表 1. メソッド A の Agilent 8890 GC パラメータ
Agilent 8890 GC
注入口

300 ℃、スプリットモード、スプリット 20:1

注入量

0.5 mL

進化を続けています。最新のタンデムおよび飛行時間型質量分析計の感度

注入口ライナGC カラムには超低ブリードポリマーが採用されています。J&W HP-5Q

セプタムパージ流量抑えることでベースラインの安定性を高 め、特に低い S/N 比の成分にオーブンおよびスペクトル要件を満たすため、Agilent J&W DB-5Q および HP-5Q
カラムは、従来の GC/MS カラムよりブリードプロファイルを格段に低く対して正確な積分を実現します。また、干渉するブリードイオンを大幅に低減し、成分のスペクトル信頼性を確保します。

実験方法

データの採取には、Agilent 8890 GC と水素炎イオン化検出器（FID）を組 み合 わせたシステムと Agilent 5977 シリーズ B GC/MSD を使用しました。データ取り込 みは、Agilent OpenLab ChemStation およびMassHunter Acquisition ソフトウェアで行 いました。さらに、Agilent

Intuvo 9000 GC と FID を組み合わせたシステムでもデータを採取しました。J&W DB-5Q および J&W HP-5Q GC カラムと、従来のさまざまな市販 5 ms GC カラムを比較しました。

表 1 ～ 8 に、各メソッドのパラメータを示します。

ガスセーバ

Agilent 注入口ライナ、ウルトライナート、スプリット、低圧力損失（p/n 5190-2295）

オン、3 分後に 20 mL/min

3 mL/min
90 ℃（0.5 分間）、20 ℃ /min で 330 ℃まで昇温（10 分間）、

10 ℃ /min で 340 ℃まで昇温（10 分間）、10 ℃ /min で 350 ℃まで昇温（30 分間）

キャリアガスカラム

ヘリウム、2.0 mL/min の定流量

– Agilent J&W DB-5Q、30 m × 0.25 mm、0.25 µm（p/n 122-5532Q）– Agilent J&W HP-5Q、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

カラム（p/n 19091S-433Q）– 従来の 5ms カラム X、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

注入口接続
出口接続

– 従来の 5ms カラム Y、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

スプリット/スプリットレス注入口

FID

表 2. メソッド A の FID パラメータ
温度設定

H2 流量

空気流量

メークアップガス

メークアップガス流量

条件

325 ℃
30 mL/min
400 mL/min
N225 mL/min、カラム + メークアップ = 一定

表 3. メソッド B の Agilent 8890 GC パラメータ
Agilent 8890 GC
注入口
注入量
注入口ライナ
注入圧力

スプリットベントへのパージ流量

セプタムパージ流量

オーブン

キャリアガス
カラム

注入口接続
出口接続

4300 ℃、スプリットレスモード
0.5 mL
Agilent 注入口ライナ、ウルトライナート、スプリット、低圧力損失（p/n 5190-2295）

12.37 psi
1.0 分で 100 mL/min
3 mL/min
70 ℃（1.0 分間）、20 ℃ /min で 200 ℃まで昇温、10 ℃ /min で330 ℃まで昇温（10 分間）、10 ℃ /min で 340 ℃まで昇温（10 分間）カラム

ヘリウム、1.3 mL/min の定流量

– Agilent J&W DB-5Q、30 m × 0.25 mm、0.25 µm（p/n 122-5532Q）– 従来の 5ms カラム X、30 m × 0.25 mm、0.25 µm– 従来の 5ms カラム Y、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

スプリット/スプリットレス注入口

MSD

表 7. メソッド D の Agilent Intuvo 9000 GC パラメータ

表 4. メソッド B の MSD パラメータ
設定値

パラメータ

モデル

Agilent 9000 GC
注入口

Agilent 5977B GC/MSD

イオン源モード

溶媒ディレイ

イオン源温度

四重極温度
ゲイン

XTR
スキャン（40 ～ 500 amu）

4.0 minAgilent 8890 GC
250 ℃、スプリットモード、スプリット 100:1
1.0 mL

注入口ライナガスセーバ

セプタムパージ流量
オーブン
キャリアガスAgilent 注入口ライナ、ウルトライナート、スプリット、低圧力損失（p/n 5190-2295）

オン、3 分後に 20 mL/min

3 mL/min
50 ℃、30 ℃ /min で 350 ℃まで昇温（150 分間）、30 ℃ /min で50 ℃まで昇温（10 分間）
カラム

ヘリウム、2.0 mL/min の定流量

– Agilent J&W HP-5Q、30 m × 0.25 mm、0.25 µm（p/n 122-5532Q）– 従来の 5ms カラム X、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

カラム– 従来の 5ms カラム Y、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

注入口接続
出口接続

0.5 mL

注入口ライナセプタムパージ流量

175 ℃

表 5. メソッド C の Agilent 8890 GC パラメータ

注入量

注入量

ガスセーバ

300 ℃
1.0

注入口

300 ℃、スプリットモード、スプリット 236:1– 従来の 5ms カラム Z、30 m × 0.25 mm、0.25 µm

スプリット/スプリットレス注入口

FID

Agilent 注入口ライナ、ウルトライナート、スプリット、低圧力損失（p/n 5190-2295）

オン、3 分後に 20 mL/min

3 mL/min

ガードチップ

300 ℃、定温

オーブン

65 ℃（11 分間）、20 ℃ /min で 350 ℃まで昇温（30 分間）

バス温度

キャリアガス

300 ℃

カラム

ヘリウム、3.27 mL/min の定流量

– Agilent J&W DB-5Q、30 m × 0.25 mm、0.25 µm（p/n 122-5532Q-INT）

カラム– Agilent J&W DB-5ms ウルトライナート Intuvo カラム、注入口接続
出口接続

30 m × 0.25 mm、0.25 µm（p/n 122-5532UI-INT）

スプリット/スプリットレス注入口

FID

表 8. メソッド D の FID パラメータ
温度

設定

H2 流量

空気流量

325 ℃
30 mL/min
400 mL/min

メークアップガスN2

検出器 1 Tail D1

320 oC

メークアップガス流量条件

25 mL/min、カラム + メークアップ = 一定

表 6. メソッド C の FID パラメータ
温度設定

H2 流量

空気流量

メークアップガス

メークアップガス流量

325 ℃

条件30 mL/min
400 mL/min
N225 mL/min、カラム + メークアップ = 一定

5

結果と考察図 4 に示すように、DB-5Q および HP-5Q のどちらのカラムも上限温度で非常に低い FID レスポンスを維持し、340 ℃でのカラムブリードレベルは1.0 pA 未満でした。また、カラムを 350 ℃（プログラムされた最高温度）上限温度でのブリードプロファイルの比較で 10 時間にわたって使用した場合も、DB-5Q および HP-5Q カラムのHP-5Q カラムと従来の 5ms カラムの熱安定性を比較するために、デュブリードレベルは 2.0 pA 未満にとどまりました。一方、従来の 5ms カラ

アルスプリット/スプリットレス注入口 とデュアル FID を搭載した 8890

ム X および Y のブリードレベルはそれぞれ 10 pA と 4 pA でした。以上のGC にカラムを取り付け、連続して実験を実施しました。カラムが正しく結果から、DB-5Q および HP-5Q GC カラムの優れた熱安定性が明らか接続され、リークがないことを確認し、カラムをコンディショニングした後になりました。に、オーブン温度を 330 ℃および 340 ℃まで上昇させ、それぞれの温度で 10 分間維持しました。その後、オーブン温度を最終温度 350 ℃（カラム相にプログラムされた MAOT）まで上昇させ、30 分間維持しました。
14pA
FID Response (pA)

28
26
24

Conventional 5ms column X

Bleed at 350 °C

12Conventional 5ms column Y
Agilent HP-5Q

10Agilent DB-5Q

8642220200123456
Time at 350 °C (hours)

78910350 °C

1816340 °C
14330 °C

12100102030405060Time (min)図 4. FID で GC メソッド A を使用して採取した 2 種類の従来の 5ms カラムと Agilent J&W HP-5Q および DB-5Q GC カラムによるブリードプロファイルの比較

6熱安定性の向上がスペクトル干渉の抑制につながるリングなしで質量スペクトルを比較しました。図 5 に示すように、従来の領域のスペクトルスナップショットを撮れば、カラムブリードによるスペクトスが DB-5Q の場合より大幅に高くなっています。スペクトル干渉の小ささカラムを 5977 シリーズ GC/MSD に取り付け、8890 GC でメソッド B

上限温度における DB-5Q カラム相の熱安定性の高さを裏付けています。

5ms カラム Y および X では、m/z 207 および 281 のイオンのアバンダン

シングル四重極質量分析計を使用する場合、ピークのないクロマトグラム

は、高感度の GC/MS 微量分析アプリケーションで一般的に使用されるル干渉がわかります。実験では、2 種類の従来の 5ms カラムと DB-5Qを使用して比較しました。その際、330 ℃における、ベースラインの上昇のみでピークが存在しないスペクトルのスナップショットを撮り、スケー%
9080

207.05
Conventional
5ms column X

Conventional
5ms column Y7060
50
40
207.0630
20 44.02
100

96.00
73.05
133.02 191.02

50

100

150

200

281.06267.04250

300341.04

191.02176.9996.02
133.02
73.06

350

400

281.0644.03

429.12401.06
450

500

50

100

150200267.02250

300

355.10415.08

350

400

450

500

%
9080

Agilent J&W DB-5Q

7060
50
4030
20100

44.03

73.06 95.9950100132.98
150207.04
191.00200281.04
250355.04
300

350

415.03
400

450

500

Mass-to-charge (m/z)

図 5. Agilent 5977 シリーズ B GC/MSD および 8890 GC でメソッド B を使用して 330 ℃で採取した、従来の 5ms カラム X および Y と Agilent J&W DB-5Q GC°カラムによるブリードスペクトル7

GC カラムを適切にコンディショニングすること水平になった時点で、カラムはコンディショニングが完了したと見なされます。完了までの時間はカラム相によって異なりますが、一般には、カラ

最初にカラムを GC の注入口と検出器に取り付けたら、カラムをコンディ

ム相の熱安定性が高いほど、カラムのコンディショニングにかかる時間はショニングすることが重要です。コンディショニングにより、過度なベース短くなります。

ラインノイズが排除され、カラムの寿命が延び、分析間で正確な結果が保たれます。コンディショニングするには、カラムをトリミングして取り付け

5 % フェニル相などの非極性カラムでは、コンディショニングに 2 時間かた後に、キャリアガス流をオンにし、オーブンを低温の 40 ℃に設定します。

かることも珍しくありません。図 6 からわかるように、350 ℃でコンディ小限に抑えることができます。リークのない接続とパージが完了したら、ています。これに対し、従来の 5ms カラムは、コンディショニングが完了

昇温前にカラムから水分と酸素をパージすることで、カラム相の劣化を最ショニングした場合、HP-5Q は 1 時間足らずでベースラインが水平になっカラム流量をオンにしてカラムを最高使用温度にします。その際、ご使用したと見なせるまでに 2 時間を要しました。短時間で適切にコンディショベースラインが 上昇しますが、分析 に 必要 な 最高温度でカラムを維持時間を短縮し、機器の生産性向上に貢献できます。のカラム相および構成の MAOT を超えないようにしてください。最初はニングできる HP-5Q GC カラムなら、稼働可能な状態に復帰するまでのすると、ベースラインは下降し、安定して水平になります。ベースラインがpA
45403530

Conventional 5ms column Z

2520

Agilent J&W HP-5Q

15105020406080100120Time (min)図 6. FID でメソッド C を使用して 350 ℃で採取した、従来の 5ms カラム Z と Agilent J&W HP-5Q°のコンディショニングプロファイル

8140160

カラムブリードによるベースライン安定化への影響

クル間の時間が短縮されるため、カラムのベースラインが期待される設定

カラムブリードがどのような影響をおよぼすのかが容易にわかりますが、を図 7 に示します。

可能性があります。オーブン温度が設定値に達して平衡化されたか、注入ルーチンテスト混合物の 1 回目の注入結果を示しています。すべての化合るために GC 取り込 みプログラムが 使用するインジケータは 多数 あり

この分析の完了後、シーケンスは次の行に進み、分析可能と判断された値に戻る前に、GC が「分析可能」と見なされる可能性があります。これ

通常、クロマトグラムを見 れば、 GC オーブンプログラムの上限温度 に熱安定性も、ベースラインの安定化という形で分析開始時に影響を与える

図 7A は、Agilent J&W DB-5ms UI で分析した、UBER 混合物という口温度が設定値に達したかなど、機器で次の注入準備が整ったと判断す物が溶出した後に、オーブンを 350 ℃まで昇温し、30 分間維持しました。

ます。これらの設定が設定値に達すると、注入サイクルが開始されます。

時点で GC が開始され、次の注入が行 われてデータが採取されました。

ただし、これには、ベースラインが期待される状態に戻ったかどうかの判断

図 7B に示すように、ベースラインは分析開始時点でまだ下降過程にありは含まれません。8890 GC に搭載されているものなど、従来の空気浴式ます。これは、高温での維持後にカラムのベースラインがまだ 通常の状でに長い時間がかかるため、サイクル間の時間が長くなる可能性があり化合物の積分に誤差が生じ、早期に溶出する化合物について定量が不正

オーブンは、高温に達した後に低いオーブン設定値に戻って平衡化するま態に戻っていないことを示しています。この変化するベースラインにより、ます。空気浴式オーブンを使用するシステムで、 ベースラインが戻る前に確になり、不良なピーク形状が観察される結果となります。

分析が開始される状況がそれほど頻繁に見られないのは、そのためです。
一方、Intuvo 9000 GC の高速加熱/冷却サイクルでは、潜在的 なサイpA
45B

1402

1. プロピオン酸
2. 1-オクテン
3. n-オクタン
4. 4-メチルピリジン
5. n-ノナン
6. リン酸トリメチル
7. 1,2-ペンタンジオール
8. n-プロピルベンゼン
9. 1-ヘプタノール
10. 3-オクタノン
11. n-デカン

4335530761189251020151050pA
45A40135234730525611892010151050012345Time (min)678910

図 7.（A）Agilent J&W DB-5ms Intuvo GC カラムで分析した、1 回目の UBER テスト混合物の注入結果、（B）350 ℃へのオーブン昇温サイクル後に分析した、2 回目のUBER テスト混合物の注入結果

9結論

図 8 は、同じテストを DB-5Q Intuvo GC カラムで実施した結果です。
優れた熱安定性と超低カラムブリードにより、後続のテスト混合物の注入カラムブリードはごく一般的な現象ですが、それによる分析および使用検出開始時にも、 ベースラインの上昇はありません。これは、DB-5Q Intuvo器の感度への影響を抑える方法があります。Agilent J&W DB-5Q およびカラムの優れた熱安定性により、全体的にカラムブリードが低く保たれる

HP-5Q GC カラムが備える高度なカラム技術により、熱安定性が向上し、だけでなく、Intuvo 9000 GC の高速冷却オプション機能の使用時にもカラムブリードが大幅に低減します。高温でのカラムブリードを低減する最適な低ブリードが実現されることを示しています。

ことで、カラム相のバックバイティングに起因するイオンによるスペクトル干渉が抑えられ、質量分析計の感度が高まります。これは、DB-5Q および HP-5Q GC カラムが、GC/MS、トリプル四重極 GC/MS、GC/Q-TOFなどの高感度検出器を使用する場合に最適であることを示しています。

参考文献
1.

Reese, A.; Vickers, A.; George, C. GC Column Bleed: A MassPerSPECtive, Agilent Technologies, publication number
B-0442, 2001.
1. プロピオン酸
2. 1-オクテン
3. n-オクタン
4. 4-メチルピリジン
5. n-ノナン
6. リン酸トリメチル
7. 1,2-ペンタンジオール
8. n-プロピルベンゼン
9. 1-ヘプタノール
10. 3-オクタノン
11. n-デカン

pA
4540
135746301185252209310
1 回目の UBER 注入
2 回目の UBER 注入

15105012345678Time (min)図 8. Agilent J&W DB-5Q Intuvo GC カラムで分析した、1 回目の UBER テスト混合物の結果と最高温度 350 ℃で 30 分間維持した後の結果

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Printed in Japan, June 25, 2024
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