2ーエチ｝1‑2‑ヒドロキシメチ）1‑1:,3‑
ブ ロ パ ン ジ オ ー }Lの細呻杢用tヽる
復 帰 変 異 試 験厚生省生活鉗生局

委託

財団法人食品薬品安全そンク：一

秦野研究三所目 次要緒頁

1
言‑‑‑・‑‑‑‑‑・‑‑・・・・‑・‑‑・‑‑・‑・‑‑・・‑・・・・‑・・・‑‑‑・・・・・・‑‑・・・‑・・・・・・・・・・・・‑
‑・・‑
・・、 2
約‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑・‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
・材料および試験方法 ……•-----·-------·……………-•--……••----·---•--------------·—• 3
試験結果および考察 --------------……-·--------------------………•••ー・・----·--………• 7
参考文献·…………------------------………………ヽ—---·-------------·--·-•

表

1 38

要 約

2 —エチルー 2 ーヒドロキシメチル＿ 1,3- プロバンジオールの変異原性の有無について、細菌を用いる復帰変異試験を実施することにより検討した。
検定菌として、 Sa
L111iJneUat沖hi
皿riumTAlOO,TA
1535,TA
98,TA
1
537およびE
scherichiacoliW
P2uvr
A を用い、直接試験および代謝活性化試験のいずれも、用量設定試験は 50500011g/ivートの用量で、本試験は 312.
55000μg/ivートの用量で試験を行った。
その結果、2回の本試験とも、用いた 5種 類 の 検 定 菌 に お い て 、 い ず れ の 用 量でも復帰変異コロニー数の増加が認められなかったことから、 2 —エチルー 2 ーヒドロ

キシメチル＿ 1,
3‑プロバンジオールは、用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された。

‑1‑

言緒

高生産量既存化学物質で、現在十分な安全性費料のない、 2ーエチルー 2ーヒドロキ
シメチル＿ 1,
3‑プロパンジオールについて、OECDを中心として行われている国際協力による、安全性点検評価事業の一環として、細菌を用いる復帰変異試験をプレート法により実施した。
この試験は、サルモネラ（ネズミチフス菌）におけるヒスチジン要求性から非要(1)求性への復帰変異、ならびに大腸菌におけるトリプトファン要求性から非要求性へ(Z)の復帰変異を指標とした変異原の検出系である。
試験は、被験物質をそのまま検定菌に作用させる直接試験と、哺乳動物のもつ薬物代謝酵素 (S9混液）によって産生される被験物質の代謝物の変異原性を試験する代謝活性化試験とからなっている。
本試験は、「新規化学物質に係る試験の方法について」（昭和62年 3月31日、環保業第 237号、薬発第 306号、 62
基局第 303号）および O
ECD
化学品試験法ガイドラ
イン： 471,472に準拠し、化学物質 GL
P （昭和59年 3月31日，環保業第39号，薬発第 229号
，59基局第85号，改訂昭和63年11月18日，環企研第 233号，衛生第38号，63基局第 823号）に基づいて実施した。

‑2‑

材料および試験方法（検定菌）Salmonellat
yphimurれunT
AlOO
Salmonell
atyphi皿riumT
A
1535EscherichiacoliWP2uv
rA
Salmonellatyphi皿riu況 TA
98SalmoneilatyPhim.
u.
ァiwnTA
1537S.typhim:u.
rium.の 4菌株は 1975年10月31日にアメリカ合衆国、から分与を受けた。

E.coliWP2uvr
A株は 1979年 5月 9日に分与を受けた。

から•検定菌は、ー 80℃以下で凍結保存した。
試験に際して、 0.
5％塩化ナトリウム添加ニュートリエントブロス（Difeo) を入れた L字型試験管に種菌を接種し、 37℃、 10時間往復振とう培委したものを検定菌液とした。

〔被験物妥〕
2 —エチルー 2 ーヒドロキシメチル＿ 1,3- プロバンジオール (CASNo.
77‑
99‑6、 以下 EHPDと略）は分子量 134.
20、比重 1.
176、融点 61℃、水溶性の白色結晶である。純度99.
9％のもの（ロット番号：）をから供与された。被験物度は、使用時まで室温で遮光して保存した。

EHPDは、蒸留水を用いて 50mg／叫になるように詞製したあと、同溶媒でさらに公比 2ないし 3で希釈したものを、速やかに試験に用いた。
試験の開始に先立って、秦野研究所において EHPDの水溶液中での安定性試験を行った。安定性試験における溶媒は当研究所で実施される、培茶細胞を用いる染色体異常試験と共通なことから、両試験における最高瀑度

‑3‑(50mg／戒）および最低濃度（ 3.
125mg/mR,)の 2濃度について室温遮光条件下で実施した。その結果、調製後 3時間における各 3サンプルの平均含量は、それぞれ初罪値の平均 (O時間）に対して 99.
0％および 104％であった。これらの値は、当研究所の歴準揉作手！頓害の基準（初回の測定平均値の 90％以上）を満たしていた (Appendix1)。
また、本試験に用いた調製検体について、含量測定試験を行った結果、 50mg／叫溶液の含量は既定濃度に対し、 97.297.9%、 3.
125mg／叫溶液は、 92.9 96.2%であった。これらの値も当研究所の標準揉作手順書の基準（平均含量は添加量の 85％以上）を満たしていた (Appendix2) 。
以上の結果から、 EHPDは水溶液中では安定であり、また調製液中の被験物妥の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された。

（隔性対照物妥〕
用いた陽性対照物妥およびその溶媒は以下のとおりである。

AF‑2:フリルフラマイド（上野製薬閥
SA :アジ化ナトリウム（和光純薬工業閥
9‑A
A:9‑7 ミノアクリジン （東京化成工業閥
2‑A
A:2ーアミノアントラセン（和光純薬工業（梼ロット番号 46,
ロット番号 T
しN
5556,
ロット番号訊 01,
ロット番号 EDE7881,

純度99.9%)
純度＞90%)
純度＞ 98%)
純度＞ 90%)

AF‑
219‑
AA,2‑
A
Aは DMSO （和光純薬工業閥 ロット番号 DSL
5887および E
CJ7001) に、SA は蒸留水に溶解して試験に用いた。

〔培地および S9混液の組成〕

1) トップアガー (TA菌株用）
下記の水溶液 (A) および (B) を容量比 10:l の割合で混合した。
＊(A) ,,クト •7炉 (Difco) 0.6%
塩化ナトリウム(B) L —ヒヌチジン

0.5mlv
Iビ抒.
/0.
5mM0.5%*:WP2用には、 0.5mML —トリプトファン水溶液を用いた。
‑4‑2) 合成培地
培地は、日清製粉株式会社製の最少寒天培地（ロット番号： DJ050GG(
1991年 7月 9日製造）および D
J060IG(
1991年 9月 3日製造））を用いた。
なお、培地 1tあたりの組成は下記のとおりである。

硫酸マグネシウム・ 7水和物

0.
2g

リン酸水素ァ、ベニウムナトリウム •4水和物 3.5 g

クエン酸・1水和物2g

グル
コース

20g

リン酸水素ニカリウム

10g

1,クト •7ガー (Difeo)

15g

径 90Dのシャーレ 1枚あたり 30戒を流して固めてある。

3) S9混液（ l叫中下記の成分を含む）＊＊

S90.
1誠NADH4 μmole

塩化マグネシ松

8μmole

NADPH4μmole

塩化訓松

33p.mole

グルコース •6 リン酸

5μmole0.
2M リン酸緩衝液(pH7.4) 0.
5戒** :7週齢の Sprague‑Dawley系雄ラットをフェノパルビタール (PB)、および 5 、 6 —ベンゾフラポン (BF) の併用投与で酵素誘導して作製した S9（キッコーマン閥、ロット番号 RA
A‑
254(1991年 5月23日製造）および RAA‑
258(
1991年 8月23日製造））を用いた。 PBおよび BFの投与量は 1日目 PB30mg/kg、 2 日目 ~B 60mg/k、
g 3日目 P
B60mg/kg
および B
F80mg/k、
g 4日目 P
B60mg/kgであり、いずれも腹腔内投与したものである。

〔試験方法〕
プレート法により直接試験および代謝活性化試験を行った。
小試験管中にトップアカ:'‑2叫、被験物蛍調製液 0.
1戒、リン酸緩衝液 0.
5戒（代謝活性化試験においては S9混液 0.
5mi)、検定菌液 0.
1戒を混合したのち合成培地平板上に流して固めた。また、対照群として被験物委調製液の代わりにみ•V,.,'`[‑5‑

蒸留水、または数種の隅性対照物質溶液を用いた。各検定菌ごとの隔性対照物質の名称および用量は表中に示した。培養は37℃で 48時間行い、生じた復帰変異コロニー数を算定した。用いた平板は用量設定試験においては、陰性および隔性対照群では3枚ずつ、各用量については 1枚ずつとした。また、本試験においては両対照群および各用量につき、3枚ずつを用い、それぞれその平均値と標準偏差を求めヤ

用量設定試験は 1回、本試験は同ー用量について 2回実施し、再現性の確認を行った。

〔判定基準〕
被験物質を含有する平坂上における復帰変異コロニー数が、陰性対照のそれに比べて 2倍以上に増加し、かつ、その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に、当該被験物質は本試験系において変異原性を有する（陽性）と判定することとした。

‑6‑

試験結果および考察

試験の全過程を通して、信頼性に悪影響を及ぼすおそれのある予朋し得なかった事態および試験計画害からの逸脱はなかった。

〔用量設定試験〕
結果を表 1に示した。 505000μg／プVートの範囲で試験を実施したところ、すべての菌種において抗菌性が認められなかったことから、本試験における最高用量を、sooo!l'l!ivートとし、公比 2で 5用量を設定した。
（本試験〕
結果を表 2、 3に示した。被験物質について 312.
55000μg/ivートの範囲で試験を実施した。

2回の試験を通して、用いた 5種類の検定菌の直接試験、代謝活性化試験のいずれにおいても、用量依存性のある変異コロニー数の増加は認められなかった。また、すべての菌種において抗菌性は認められなかった。

EHPDについて実施した試験において、陽性対照群では、いずれの検定菌においても変異コロニー数の増加が認められ、陰性対照群とも計測された変異コロニー数はヒストリカルコントロール値の範囲内であったことから、本試験に用いた各検定菌の感受性および各陽性対照物質の変異原活性についての安定性が確認された。

以上の結果に基づき、 EHPDは、用いた試験系において変異原性を有しないもの（陰性）と判定した。

‑7‑

参考文献

(1)Maron, D. M. andAmes, B. N. :Mutation Research. 113:173‑
215(1983)(2) Green,M.H. :in "Handbookof加tag
enicityTestProcedures."
Kilby,8.J.
, Leg
ator,M.
, Nichols,W. and R
amel,C.(eds.
) Elsevier
Sci
encePublisher, NewYork.(
1984)pp.
161‑
187.

‑8‑

表

用量設定試験結果表l褐験暉：2-エチル—たヒト＇ロキシメチル•L 3-プロパンジール

体 躙 K

検質 濃物

度の塩佃hレト） 有無

溶媒対照〉団ぼ）

検体溶媒

対照虫 xを性 の対 躍ixを換

TA
1535r

18(121土1異変

コロニー数／プレート型

フレームシフト型

紀 珈A

T約8屈 12(121土6TA
l蕊78( 6土5113(10610土8一14512208，

一

図

152
11762

18510

1588

156一

1500一119一108＋2)

14，

109(
10711
土0

忠

i4(161士
8＋％，

150＋1~咽＋103

1500＋1，

団＋％

15名5.
76)

，

団晶

14(.15土14］

11(10e2)29(30磁土3.
95)

忍）

，

( 8土6163341117お1514l532，

82114307，

L51)

1~5)

称

陽 必要と 濃（m／九—卜）

しないも基

置

M‑91‑161

一￨¥体

検対TAlO
O

500印

帰復7

コ

プレート

名

称

必要と 濃（111 ／九—卜）照 するもの
コ ：
プレぅ
ート

既0.
0
1600
(616鯰土2訥A1SA0.
5閃。）

血（斑お土4叫

291 1m(71568
土1 67(15515土350.5) 5

既0.
01292お土9詈4) 瑯 (叫10（鉛6伍土3誓1) 位5A
F20.
1（庶ぷ26土6侶7) 泌5訥9AA80笥2) 睾 呻241土0 詈1)

0.5

5届
畑 149(15415
土叫児。
）

2

148 108(136土毘7)復帰変異試験結果表 I

表 2

M‑91‑16l

躙：2‑エチル‑2‑ヒト ロキシメチルーL3‑プロパン・ンかール

度

質 濃物の媒

対照¥

媒

対照

検

147(1:rr~±i『5)A

紀T
泊814(131土212t4(1612土ゼ，）

2)

1.
331塁ii1.
4)

16(141土4訟 18(141土44.
95)

625

149(13412土0i5)

6(101土0t。)

14(17幻土晶

12.
8(129土B閉。
）

16(212土2（以）一r

TA1537z(~2土1 霜

16(13土11晶

16（おお土翌5)

8(91土11~7)

16(181
土9i!
7)

11( 9土81~7)

13
16(161土9 し71)
(18幻
土そ6)

晶

ふ舟。
）

7(91土01.
95)

11(12塁，3.
1)

14.
5(l泣12
土13(14土9 晶 1且ll) 11(14庄・晶5000

一132(13l13土21f2)

16(141土2晶

15(151土2晶 25(212土5 贔＼＋

138(1位13土'

恥

18(151士
5晶

16(17幻土ゼ3)

3
12.5 ＋

169(
1601'
土12滋を

鯰5＋

12
50＋

2
500＋

50
00＋

コ：
プ っI名，t5)( 8土，L67J

33(323土1 門晶 17(191±6 む 16(141土4 E。
）5)19（刃 2163(15213土3 阻2(151士
6 閉侶(384士
0 晶土1 門3)8) 1。
）
2219(131158士
0 5.
95)(1401~土（刃 2土晶 ）＄(413土9 晶
紺1)17153(
14114土.
5 詈，｝(141土1晶 23(191土9 tS) 35(353土1 も）1591322(141土5(171土9 晶 2(14116土2 恥 1(35'土l1晶悲1)12(121土48(10土9晶晶晶

10(121土2よ55)

10(121土2訟SA0.5

既 0.
0
1

しないも対 血を34（％ 2土613(151土4称

名11,‑ト）
陽 必 要 と 濃度 (n/性 の17(19l土9，( 7土4一体初 (542出土

更。
）

375(
37839
土1

郎0.
01A
F
20.
1

叫

80

土6 碑56.2)
翌8) 275（切628土1 忠 3.13（磁33土6 詈 5) 2361(2425246

称必 要 と 濃度（ けレト）
置̀'

フレームシフト型型

2500体溶換

312.5 一四検置

↑Al寧↑AlOO佃心） 有 無溶

対基塩

コロニ→也／プレ—卜異変

帰復体 血検狐 1糾A2するもの
コ：フレーっト

706(70170土3警7)134 l~(161土糾閉。
）

10708（町6臨土

狐 0.
5糾A2177 1塁 璧8)
島 253(254'l1土1 ぉ(
17317.0)

復帰変異試験結果表 I

表 3襴拠帽l:2‑エチル令ヒト、ロキ・ンメチルーし3‑プロバンわすールの塩佃心） 有 無↑AlO
O

質 濃物

溶媒

対照検

¥

体溶媒

対照検度

置対換

TAl蕊

コロニー数／プレート型

フレームシフト型

配 珈ATA98↑Al臼B4(13113土91}.
15)

17(16~土21（以'l土l晶 14(16l土2 を3)

312.5 一以{r。
)

14(171土9晶

10(131土7625一

13.
1(14114土316g l45) 19(181土6茫8)(161250

一161{14012土>毘，）12(131土1r2)

勾('l
1'l土l忽6)2500

一立1(12512土6也

17(171土60(232土3訟 ぉ(211士5 r,) 2『5)一(138四土(171土6ぎ。
）

8(91土01~2)

10
土5晶 35（勾 2晶 13(121土2 L5)
和 17(192土5 l69) 12(10土7 晶tl)

刃

13{10土8，(111±22.
89)

灼贔t7)

20(171土3土5晶 26（お 2晶

17(21土235(404土.
9
和 12(141土4 晶を6)血一129（出E土3¥＋ll;(113±3閃5)

17{182
土1晶

312.5 ＋

152(13812土S詈2)

19(19土180晶
和 18(16土15 杓 36(414土14(13土13il625＋l
伯(139B
土6恥

15(141土6四(181土7よ16)

t6)

t6)

13(121土1晶

四＋123(13715土520(1911li43)

ゼ5)

息7)

13(162土1む

お＋146(13613
土6

13(1110i75)
土ぶ）碑＋l侶{1位l灯土12(12土11贔

体

名郎

0.
0
1

しないも性 の対 ＄珈をコフ？
しート

名

土奈1)

7(12土12閏5)

17(141士211(1S1土7lf7)19(181土7晶
晶

18(21土15灯(414士0胡(35訂土土7晶 41(454和 (393土5t7)，(121土5S)

称

陽 必 要 と 濃 （m月レト）

殴（恋躙土~0.
5郎

0.
01塁6) 匹（位3伯土1 誓，） 112(202lg土)

AF
20.
1望，）

匿

519(51~80479(2428嘔土お002.
9)
蟄，） 2

称

必要と 濃度（fJ,｀/1l,‑‑ト）蓬ヽ基異変

201f5)(181土1田似を99

帰復体 区検M‑91‑I6I

叫 1するもの
コ：ブレっート&
12（お884
土1狐2狐10

訥A0.
5

糾A2t
訊 156(18919:9翌n 濶（頌）蕊土 登6) お0(29828土2 昂 226(22321土8 忠