JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

学術論文
低温マイクロ波利用が切り開いた糖ペプチド合成の汎用化
Study of Glycopeptide Synthesis under Microwave Irradiation at Low
Temperatures towards Automated Synthesiser

横江 貴之 1、大木 裕太 2 、長島 生 1、高橋 直行 2、清水 弘樹 1＊
Takayuki Yokoe1, Yuuta Ohki2, Izuru Nagashima1, Naoyuki Takahashi2, Hiroki Shimizu1＊
１．国立研究開発法人 産業技術総合研究所 生物プロセス研究部門、
２．東京理化器械株式会社
1. 〒305-8566 茨城県つくば市東 1-1-1 中央第 6、2. 〒112-0002 東京都文京区小石川 1-15-17
1. Life Science and Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1-1, Higashi,
Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan
2. Tokyo Rikakikai Co., Ltd, 1-15-17, Koishikawa Bunkyo-ku, Tokyo, 112-0002, Japancorresponding author*, e-mail address : hiroki.shimizu@aist.go.jp
キーワード: マイクロ波、進行波、低温照射、半導体発振器、ペプチド固相合成、糖ペプチド
Keywords: microwave, traveling wave, low temperature irradiation, semiconductor oscillator, solid-phase peptide synthesis(SPPS), glycopeptides
Abstract
We have developed a new waveguide for 2.45GHz microwave which is equipped an aluminum block jacket thermostat, and built
up a novel microwave synthesizer which can perform chemical reactions even at low temperatures with continuous microwave
irradiation. Applying this for solid-phase peptide synthesis (SPPS), we successfully obtained some advantages. Reactions wereaccelerated even at lower temperatures. Microwave unique effect could be clearly observed. Only small excess reagents (ex. 1.2
equivalent of Fmoc-amino acids and condensation reagents) were enough in microwave supported SPPS even at low temperatures,
though large excess (more than five equivalent) of reagents are commonly used. As glycosylated amino acid synthons are
expensive and relatively unstable, also as glycopeptides are potentially suffered epimerization and are easily to be decomposed byelimination of sugars, microwave supported SPPS at low temperatures gave big advantages for glycopeptide synthesis.
1. 緒言
一般に、化学反応を高温で進めると反応はより迅速れ、反応時間の短縮ならびに目的物の収率向上といっに進行するが、副生成物の増加や原料、目的物の分解なた効能が多数報告されている[1, 2]。一方、我々は、マ

どの問題も協奏的に生じる。加熱手段としてマイクロイクロ波加熱と通常加熱で反応経路の選択性が変化す

波を利用すると、その特性から反応系が迅速に加熱さる反応事例[3, 4]、マイクロ波を低温中で照射してはじ32

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

めて可能となる反応事例[5]、酵素反応で照射周波数にック恒温槽で覆った「アルミブロック恒温槽一体型導よって効果が変わる事例[6]などを報告しており、マイ波管（Fig. 1）」の開発をおこなった[9]。この導波管に、クロ波には化学反応に寄与する「効果」が存在すること

伝送線路型のマイクロ波の通り道である方形テーパーを示唆してきた[7]。

導波管（入口側と出口側の 2 箇所）と、2.45 GHz 帯固

一方、化学反応においてマイクロ波特有の効果があ

定半導体デバイスによるマイクロ波発振器を組み合わるかないかは、依然、議論の的ともなっている[8]。こせ、1～3mL 程度の少量バッチ式マイクロ波反応装置のマイクロ波効果の検証は様々なアプローチで進めらを作製した。これにより、マイクロ波照射しつつ同時にれているが、我々は、実験化学的にマイクロ波効果を明

アルミニウムブロック恒温槽によって緩衝冷却が可能

らかにする研究を指向した。そのために、となり前項２）の性能を担保することができた。さらに、

１）同温度、同スケール、同条件、さらに同装置で化

前項１）で述べた、同じ装置で全く同じ条件下、マイク

学反応におけるマイクロ波照射有無の差異を実証

ロ波照射の有無のみの差異を精密に検証することも可

可能とする、

能となった。
Fig. 2 に作製した反応装置の詳細について示した。

２）マイクロ波照射しつつ、加熱される以上に早い速度レベルの緩衝力をもって冷却が可能な反応系で、低温反応場を実現するアルミブロック恒温槽内の中心

熱的効果を除いた検証を可能とする、部に高電界密度のマイクロ波を再現良く形成するため、という化学反応システムの開発をおこなった。そしてTE10 のシングルモードを用いた。TE10 モードの進行波

これを固相合成仕様へと改良をおこない、近年、創薬分を形成する導波管の寸法は電磁界シミュレータを用い野で着目されているペプチドや、さらに合成困難な糖て決定し、反応部で電界強度が最大となることで反応

ペプチド合成へ展開させた。

溶液の誘電特性にしたがったマイクロ波の吸収加熱による効率的な加熱を可能とし、過熱の影響を排除した。

2．方法

そして、反射波を抑制しマイクロ波発振器を保護する

2-1．低温マイクロ波反応装置の開発 －マイクロ波反ためのチューナーおよびアイソレーターや、マイクロ応場創生やマイクロ波効果が検証可能な装置の開発

波発振器内に方向性結合器を、さらに導波管前後に出マイクロ波が創り出す新しい反応場の検証や、マイ

力波と反射波と透過波のパワーメータ(モニター)を内

クロ波の熱に依らない効果を研究するため、つまり前蔵させた。これらのデバイスを使用することにより、マ

項１）２）を可能とするマイクロ波合成装置を創り上げ

イクロ波挿入損失の自動キャリブレーションが行え、るため、まず反応部とマイクロ波通路部をアルミブロ

さらに「（出力波）－｛（反射波）＋（透過波）＋（挿入

Termination

Fiber-optic
thermometer

Semiconductor
Oscillator
2.45 GHz
Power monitor
Reflection monitor
Reaction Vessel and
AdapterTraveling wave
（0~100 W）

Antenna

Low-pass
filterAntenna

Tuner
CouplerThroughmonitor

Waveguide

Waveguide

Aluminum block Jacket(solid-state thermostat)-13~200 ℃

Magnetic stirrer

Fig. 2 Flow diagram of a microwave synthesizer
which available to perform reactions at low
temperatures with continuous microwave
irradiation.

Fig. 1 Developed waveguide equipped with analuminum block jacket thermostat.

33

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

損失）｝」のリアルタイム演算により、反応溶液の温度や温度が 30℃を超えたとき、マイクロ波出力を絞りアル状態が変化した際でも、反応部で吸収したマイクロ波

ミブロック恒温槽の冷却機能を働かせたところ、最大吸収量[W]を測定し続けることができる様になった。こ1℃/2 秒の速さで冷却された。最終的には、マイクロ波

れにより、反応熱量（エンタルピー変化）の測定や、反出力を 8-10 W で随時調整することで、連続的に照射し応進行状況のモニタリングが可能となった。

つつも溶媒温度を 30℃に維持することができた。最終さらに、マイクロ波発振器によって出力を 1 W から的に、これらの機能を保有した低温マイクロ波反応装

100 W まで増幅する機能を付与し、反応遂行中に任意

置（GPS 型）を作製した[10]。

に出力を変更できる様にした。また、溶媒内にある in

2-2．ペプチド固相合成と糖ペプチド固相合成

situ の光ファイバー温度計からの温度情報を基に、マペプチド合成として現在広く用いられているのは、

イクロ波出力を自動的に調整することで、反応溶液の固相合成法である[11, 12]。一般に、各反応の後には合温度維持機能を付加させた。このとき、緩衝力のあるア

成品の分離精製作業が伴うが、固相合成法では、反応後ルミブロック恒温槽の温度を反応温度よりも低い温度の望む化合物のみが固相上に残る様に設計され、反応で冷却維持させることにより、急な反応温度の変化に後に余剰の試薬を洗い流すだけで次工程へ進むことがも対応ができ、精密な温度制御が可能となった。また、できる。そして、固相合成法では副反応を抑えて本反応

マイクロ波照射を受けた物質は一般に迅速かつ高温にを収率良くおこなうことがカギとなることから[13]、ペ加熱されるため、化学反応のマイクロ波利用は「加熱反プチド固相合成では、一般に大過剰の試薬が用いられ応への熱源としての利用」が一般的であったが、本装置る。また、反応の高収率化の一環としてマイクロ波利用

では、アルミブロック恒温槽を氷点下とすることによも効果的であると知られており[14, 15]、既に国内外メ

り、反応温度を低温に維持したまま連続的にマイクローカーからマイクロ波を利用したペプチド固相合成装

波を照射することが可能となり、前項２）のマイクロ波

置がいくつか製造、販売されている。これらの装置では、の熱的効果以外の効果、いわゆる非熱効果の利用の汎ペプチド合成は高温ですすめられる。ペプチドやその用化を実現させた。一例として、Fig. 3 に 2.5 mL の合成原料になるアミノ酸誘導体などは多官能基性化合

DMF（ジメチルホルムアミド）に対し、アルミブロッ

物のため、概して言うと不安定化合物のひとつである

ク恒温槽を 0℃としたときの実験を示す。まず、マイク

が、装置メーカーでは、高温（75℃以上）かつ短時間

ロ波出力を最大 90 W として溶媒を昇温させた。溶媒（数分から 1 分）で処理することで、副反応を抑えつ

Temperature [℃] / Power [W]

つアミノ酸縮合反応を進める方法を示している[16]。
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10

一般に、動物生体内のタンパク質のほとんどは糖化された「糖タンパク」として存在する。しかし生体内でJaket Temp.
Solvent Temp.

の糖修飾は翻訳後修飾と呼ばれ、糖化を制御する仕組Powerみが無い。その結果、生体内糖タンパクの糖部分は多様な混合物となり、これまで研究対象になりにくくなっていた。また、糖タンパクのエピトープ部となる糖ペプ
チドは、基本的にはペプチド固相合成法と同様の手法
で合成可能であるが、実際には糖アミノ酸シントンが

0

60

120

非常に高価であることから、その合成は汎用化されて180いない。例えば、天然型の O-グリカン糖アミノ酸の代

Irradiation time（sec）

表である、GalNAc-Ser や GalNAc-Thr は、糖のヒド

Fig. 3 Diagram of power of irradiated microwave[W] (orange), temperature of aluminum block jacket[oC] (sky blue) and solvent temperature [oC] (pink) for
2.5 mL of DMF.

ロキシ基とアミノ基がアセチル保護され、アミノ酸 N
末端のアミノ基には Fmoc が導入された合成シントンの形で 13～25 万円/100mg で国内外の試薬メーカーか

34

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

ら販売されている。100 mg はモル数換算すると約 0.15

ペプチド合成においてマイクロ波加熱により反応のmmol になる。
一般に、糖アミノ酸シントンの反応性は、迅速化を行う流れの中、我々は、小出力のマイクロ波の側鎖糖部分のかさ高さにも起因して、アミノ酸シント

On/Off を繰り返すことで反応温度を 50℃以下に保ち

ンより反応性が劣る。また先に述べた様に、ペプチド固つつ反応を進めた場合でも、ペプチドや糖ペプチド合

相合成では大過剰の試薬（3 当量以上）を使用するのが成において高収率化などのメリットが得られることを定法である。そこで本来であれば糖アミノ酸の反応で認知していた[17, 18, 19]。しかし、論文報告を積み上はより過剰量の試薬を投じたいところであるが、ペプ

げても、小出力のパルス照射で本当にマイクロ波効果

チド固相合成と同様に、糖アミノ酸シントンを 3 当量が現れているのか、一時的な昇温による高収率化では利用して合成する場合でも、「0.05 mmol スケールでのないのかなどの議論が常に生じた。そこで、低温でも連糖ペプチド体合成で、糖アミノ酸１残基伸長の試薬代続的なマイクロ波照射が可能で、さらに反応温度を精だけで 13～25 万円かかる」ことになる。合成総収率が密に制御できる固相合成装置の製作を目指した。

20%の場合、得られる糖ペプチド体は 10 µmol 程度と2-1 項で述べた低温マイクロ波反応装置（GPS 型）

なるが、糖が１か所ならともかく、ムチンの様に、糖が[10]を固相合成仕様にすると、「低温制御したままマイ

7 か所 8 か所に存在し糖の重量割合が 50%を超える様

クロ波照射によって反応加速効果が得られるペプチド

な糖ペプチド体の合成では、試薬代だけで 100 万円を合成装置が作製でき、さらにこれは糖ペプチド合成装

優に超えることになり、その化学合成は現実離れして置への展開も可能になる」と考えた。そこで、GPS 型

いる。

の固相反応仕様への展開を検討した。まず解決すべき

この糖ペプチド合成において、反応性の劣る糖アミ課題であったのは、攪拌に代わる代替え法の確立であノ酸反応を加速させるために、加熱条件下でのマイクった。固―液反応系である固相反応においては反応のロ波照射を利用する研究も進められてはいるが[16]、一振とう攪拌が必須とされているが、GPS 型装置では反般に糖ペプチド体はエピメリ化しやすく、また糖の脱応部をアルミニウム恒温槽に密着させて緩衝冷却させ離などの副反応が起こりやすいことから、反応温度はることから、振とう攪拌法の導入は不可能である。そこ

極力低温で進めるのが定石である。

で、攪拌に代わる代替え法を種々検討した結果、反応液

2-3．低温マイクロ波反応装置をペプチド固相合成シスをバブリングすることで攪拌と同等の効果を得ること

テムへ対応展開するに成功した。
この結果を踏まえて、まず、固相反応を市販のフィル
圧力計

ター付ポリプロピレン製固相反応容器（内径 9 mm）で

リリーフ弁
シリンジ
気体圧力

20kPa

チェック弁

圧力調整器

進めることができる様、アルミ製のアプリケーターをリザーバー作製した。次に、固相合成ユニットの作製をすすめた。

チェック弁

流量調整弁

ベント
光ファイバー
温度計
回収容器

反応容器

樹脂製 ガラス瓶
遠沈管

Fig. 4 Flow diagram for solid-supported peptide
synthesis. Bottom line is used either to drain
solvents/regents off or to bubble for mixing
reaction by pressured gas.

Fig. 5 Overview of GPS synthesizer (right) [10]and a unit of solid-supported peptide synthesis(left).

35

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

一連のペプチド合成を通じて、固相レジンを入れた固3.結果

相反応容器を取り外しすることなく全合成が進められ実際に Fig. 6 で示した 5 残基ペプチド (Ser-Gly-

る様、液体や気体の流路を設計した（Fig. 4）。反応容

Thr-Gly-Phe, 分子量 = 467) をモデルに、合成の必須器の上部に 3 ライン、
下部に 1 ラインの流路を導入し、条件の検討をおこなった。Fmoc-Phe-HMPB-BHA

流路切替え弁を介して液体や気体の供給、反応液の排Resin (0.49 mmol/g) 50 mg を用い、アルミブロック恒出を可能とした。反応のバブリングの他、試薬や溶媒な温槽を 10℃、マイクロ波照射によって反応温度を 50℃

どの液体の供給、反応液の排出はガス圧によっておこに設定し、Fmoc 基の脱保護は 5 分、アミノ酸の縮合反ない、アミノ酸シントン、糖アミノ酸シントンは溶媒に

応は 10 分おこなった。アセチルキャッピング反応はマ溶解させ、シリンジにて適時、反応容器の上部ラインを

イクロ波を利用せずにアルミブロック恒温槽による加通じて反応槽に注入する様にした。
4 ラインの流路切替

熱で反応温度を 25℃として 5 分間おこなった。合成終えパターンは、「添加、撹拌、反応」操作モードと「洗了後、レジンから切り出し HPLC にて精製、得られた浄、濾過、回収」操作モードに集約させ、一つの切替え

5 残基ペプチドの重量から総収率を計算した。

レバーで連動させることにより、誤操作を防ぐ様にし

まず、各反応に使用した Fmoc アミノ酸シントンをた。これらを集約させた固相合成ユニットを作製し連各々3.0～1.1 当量として比較検討したところ、使用す結することで、GPS 型を基にしたペプチド固相合成装る試薬量が少なくなるほど、得られた収量が低下した置を製作し、新たに特許出願をおこなった（Fig. 5）。

（Table1, entry1～4）。しかし、アミノ酸の縮合反応時

2-4．低温マイクロ波反応装置を使ったペプチド、糖ペ
プチド合成
2-3 項で述べた GPS 型ペプチド固相合成装置の性能H 2Nを評価した。最大の興味は、マイクロ波照射によって、

OH
H
N

O
N
H

O

OH
H
N

Ph

O

O

N
H

OH
O

反応の昇温なく反応性や収率の向上が得られるかとい

Ser-Gly-Thr-Gly-Phe

うことであった。また、糖ペプチド合成の汎用化を指向

Fig. 6 Structure of synthesised model peptide.

して、必要試薬量の低減化についても検討した。

Table 1 Study of essential equivalent of aminoacid reagents (by microwave heating at 50oC).

Fmoc 法ペプチド固相合成では、一般に「1. Fmoc 基の脱保護」「2.アミノ酸の縮合反応」「3. アセチルキャ
ッピング」の 3 ステップを 1 サイクルとして反応を行

entry reagentsう。各反応の条件は、レジン 50 mg に対し以下のよう

1
2
3
4
5
6

に設定した。
1. 20 %ピぺリジン/DMF 溶液 (1 mL)
2. Fmoc-アミノ酸 (X mmol)、HBTU (X mmol)、HOBt

3.0 eq.
1.5 eq.
1.2 eq.
1.1 eq.
1.2 eq.
1.1 eq.

time

microwave
absorption

10 min.
8.2 - 9.4 W
10 min.
9.3 - 10.3 W
10 min.
9.3 - 11.2 W
10 min. 11.5 - 13.5 W
20 min. 10.5 - 12.1 W
20 min. 11.4 - 13.7 W

yields
92 % (10.5 mg)
84 % (9.7 mg)
71 % (8.1 mg)
58 % (6.6 mg)
92 % (10.5 mg)
70 % (8.0 mg)(X mmol)、DIEA (2X mmol)、DMF (1 mL)
Table 2 Study of essential temperature conditions. (1.2 eq. reagents were used and reaction
time was 20 min.) Entry 1 was same as Table 1
entry 5. Entry 3 and 5 were performed underconventional heating.

3. Acetyl Capping Solution (1 mL)；Ac2O (1.2 mL)、
DIEA (0.6 mL)、HOBt (50.0 mg) を DMF (23.2mL) に溶解させたもの
なお、「1. Fmoc 基の脱保護」及び「2. アミノ酸の縮合

temperatures
entry reaction outside

反応」については、アルミブロック恒温槽を低温で一定とし、マイクロ波出力を変化させることで反応温度を

1
2
3
4
5

一定に保った。
「3. アセチルキャッピング」はマイクロ波照射を行わず、アルミブロック恒温槽にて反応温度を制御した。

36

microwave
absorption

10 oC 10.5 - 12.1 W
50 oCo-10 oC30 C
8.9 - 11.5 W
o
30 C
N/A
-10 oC
25 oC
8.3 - 9.7 W
25 oC
N/A

yields
92 % (10.5 mg)
93 % (10.6 mg)
80 % (9.2 mg)
93 % (10.7 mg)
84 % (9.6 mg)

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

間を 20 分とすると、試薬量がわずか 1.2 当量であってチド合成では、Fmoc-アミノ酸もしくは Fmoc-保護糖

も、収率として 92%、
計算上の１サイクルの収率が 98%

アミノ酸を 1.5 当量使用し、反応温度は 30℃（アルミでアミノ酸伸長反応が進行することがわかった(Table

ブロック恒温槽は-10℃）、アミノ酸の縮合反応時間は1, entry5)。また、entry 1～4 の反応時間 10 分のとき、20 分として合成をすすめたところ、目的とする糖ペプ

試薬量を少なくするとマイクロ波の反応部吸収電力がチド体(Ser-Gly-Thr(Ac3GalNAc)-Gly-Phe, 分子量 =増える傾向がみられたが、entry 5,6 の反応時間 20 分797)を 14.6 mg (収率 75 %)で 得た。同配列ペプチドのときの結果も考慮すると、マイクロ波吸収電力が収を同温度条件、試薬量は1.2 当量で合成した場合は93%率に影響しているとは考えにくい。一方、マイクロ波に収率で目的物を得ていたが（Table 2, entry 2）、これとよる反応系の加熱に試薬や一役かっているとすれば、比べると収率が低下したことになる。しかし、5 残基合

試薬量が少なくなったときに必要なマイクロ波電力が成、つまり 4 残基アミノ酸伸長を逐次おこなうとき、大きくなったことは理解できる。

総収率 93%で得られた場合の１反応換算収率は 98%で次に、必要温度条件の検討をおこなった（Table 2）。

あり、総収率 75%では１反応換算収率は 94%となる。

Table 1 で示した検討において必要最小量と分かった

つまり、計算上は、１反応わずか 5%の差だけだったと

1.2 当量の試薬を用い、反応時間を 20 分として反応温いうことになるが[13]、今回の結果は、反応収率が低下

度条件を様々に変えて試験をすすめた。まず、先の実験したためではなく、精製ロスによるものと考察していと同様にマイクロ波によって 40℃昇温される様に、アる。つまり、糖ペプチド合成では粗精製後に 15.5 mg

ルミブロック恒温槽を-10℃にしてマイクロ波照射にしか得られていが、これを HPLC 精製して目的糖ペプ

よって反応温度を 30℃としたとき、Table 1, entry 5 でチド体が 14.6 mg 得られている。短い配列の中でアセ得られた反応温度 50℃の場合と同等の収率を与えた

チル保護された糖が加わることで化合物の脂溶性が高(Table 2, entry 2)。一方、同じ 30℃でもマイクロ波をまり、エーテル沈殿による粗精製の段階でロスが生じ

使わずアルミブロック恒温槽にて反応温度を 30℃とした可能性が高いと考えている。

たときは、合成収率は 80%と大幅に低下した(Table 2,
Fmoc-Phe HMPB-BHA Resin(50.0 mg, 0.490 mmol/g)

entry 3)。さらに、アルミブロック恒温槽を-10℃のままでマイクロ波照射によって反応温度を 25℃に抑えた
時、昇温度が 35℃と小さくなったからか反応部のマイ

AcO

クロ波吸収電力が少なくなったものの、得られた収率

AcO

は 30℃の時と同等で（Table 2, entry 4）、さらに反応HO

温度 25℃でも 30℃のときと同様にマイクロ波有無に

H
N

H 2N

よる収率の差異が観察された(Table 2, entry 4 と 5)。

O

OAc

SPPS in GPS

O
AcNH
O
O
N
H

H
N
O

Ph

O
N
H

OH
O

つまり、マイクロ波を利用すると低温条件下でも高収

Ser-Gly-Thr(Ac3GalNAc)-Gly-Phe

率でペプチド固相合成反応が進行する結果が得られた。

Fig. 7 Synthesis of a model glycopeptide.

これらの実験を通じ、本装置では緒言の１）として述
4. 考察と結論

べた、「同温度、同スケール、同条件、さらに同装置で化学反応におけるマイクロ波照射有り無しの差異が実本研究では、低温下でマイクロ波が利用できる合成証可能」で、このペプチド固相合成ではマイクロ波を利装置の開発、及びマイクロ波照射下での固相ペプチド用することによって収率向上することも示された。

合成の検討を行った。これまでペプチド固相合成ではさらに、先の 5 残基ペプチド合成において、使用さアミノ酸伸長サイクルの収率を少しでも高めるため、れた Fmoc-Thr(tBu)-OH の代わりに糖アミノ酸シント

大過剰の試薬の利用や、マイクロ波照射による高温反ンである Fmoc-Thr(Ac3GalNAc)-OH を用いることで応などが遂行されてきた。アミノ酸シントンや合成ペ糖ペプチド合成試験をおこなった（Fig. 7）。本糖ペプ

プチドなどが高温でも安定な場合、マイクロ波加熱に

37

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

H Pro

1) coupling:
Fmoc-AA(5 eq), COMU, DIEA, DMF
microwave 50oC, 5minFmoc-Thr(Ac3GalNAc)-OH (1.3 eq), COMU, DIEA, DMF
microwave 50oC, 15min2) deprotection:
20% piperidine in DMF
microwave 50℃, 2 min

repeatcleavage: TFA, TIS, H2O, rt, 2 hdeacetylation: NaOH, MeOH (pH 10～), rt, 3 h
HO OH
O

N
O

N
H

H
N

AcHNO
O

O
O
AcHN

N
H

HO OH
O

HO

HO

AcHNO
O
N
H

HO OH
O

HO OH
O

HO

OH

O
N
O

N
H

O

N
O

HO

N

N
O

N
H
HO

O
HO OH

HO OH
O

HO

AcHNO
O

H
N

O
O
AcHN

O
HO OH

HO

AcHNO
O
N
H

H
N

AcHNO
O

O
O
AcHN

N
H

O
N

OH

O

HO

O
HO OH

yield: 15%

HPLC (crude)

HPLC condition
Column : InertSustain C18,
4.6mmID×250mm
Eluent : (A) 0.1%TFA in H2O(B) 0.1%TFA in CH3CN
Gradient : A/B = 95:5 (0 min)
→ A/B = 85:15 (15 min)Flow rate : 1.0 ml/min
Detector : UV 220 nm
Column Temp : 30oC

Fig. 9 Synthesis of a sugar riched 16 amino acids
glycopeptide, a part of mucin 2, MUC2. Shown
HPLC is for a data of crude, material before
purification.

Fig. 8 Synthesis of 46 amino acids glycolpeptide, a part of a glycoprotein on hepatitis typeB virus (HBV).

を 1.3～1.5 当量利用した初回合成で、B 型肝炎ウイル

よって非常に迅速に合成ができ、これは大変有効な合ス表面糖タンパクの部分構造である 46 残基糖ペプチ

成手段であると言える。一方、今回我々は、合成反応

ドを総収率 14%で（換算 1 残基伸長平均収率 96%）

温度を 50℃以下に抑えつつも、マイクロ波照射によっ（Fig. 8）、8 個の O-グリカン糖（O-ガラクトサミン）て反応時間を 20 分とすると、必要試薬量を 1.2 当量まが最大 5 か所連続し重量比で糖が 50%以上を占める 16

で抑えることが可能であることを見出した。この試薬

残基ムチン(MUC2)を総収率 15%で合成することにも量の低減化は、高価な糖アミノ酸シントンの使用が必成功している（Fig. 9）。

要となる糖ペプチド合成には大変大きなメリットとな

今後は、GPS 型を利用したより長鎖のペプチド固相る。また、同温度、同スケール、同条件、さらに同装置

合成法への展開、これまで合成困難とされてきた糖ペにおいて、マイクロ波照射有無における収率に明確な

プチドの様々な合成法の開発、また低温マイクロ波照差が得られたことから、いわゆる「マイクロ波の加熱に射利用合成におけるエピメリ化や糖の脱離などの副反依らない特有効果」を明確に示すことができた。そして応制御効果などについて、さらなる研究を展開させ、糖当初の目論見通り、本反応システムを糖ペプチド合成

ペプチドの自動合成装置の開発へと展開させたいと考へ展開できることも示した。

えている。

本論文では詳細を論じなかったが、現在、本システムにおいて 40 残基程度のペプチド・糖ペプチドの合成は、

5. 謝辞

配列上困難な組み合わせでない限り、汎用的に達成で本研究の一部は、国立研究開発法人日本医療研究開発

きる様になった。また、条件検討をすることなく、反応機構(AMED) の「次世代治療・診断実現のための創薬

温度 50℃、N-グリカン Fmoc 糖アミノ酸合成シントン

基盤技術開発事業 (糖鎖利用による革新的創薬技術開38

JEMEA Journal Vol.3 (2019.9)

発) 」、JSPS 科研費 JP26620142 などの支援助成を受が、１残基伸長が 98%で進行すると総収率は 42%

けて遂行しました。

と、40 倍の差になる。また、実際には 4%の含有物
を HPLC により分離精製することは困難であることから、この「1 反応 5%の収率の差」が「44 残基ペ

引用文献・参考
1. P. Lidström, J. Tierney, B. Wathey, J. Westman,

プチド合成の可否」を左右している。１残基伸長がTetrahedron 57 (45), (2001) 9225-9283.

98％収率で進行すれば、100 残基ペプチドを固相法

2. S. L. Gaonkar, H. Shimizu, Tetrahedron 66 (18),で合成することも不可能ではないともいえる。

(2010) 3314-3317.

single reaction yields

3. H. Ohrui, R. Kato, T. Kodaira, H. Shimizu, K.

Total yield of

93%

98%

Akasaka, T. Kitahara, Biosci. Biotechnol. Biochem.

20 AA

25%

68%

69 (5), (2005) 1054-1057.

44 AA

4.4%

42%

4. Y. Yoshimura, H. Shimizu, H. Hinou, S. -I.

69 AA

0.7%

25%

Nishimura, Tetrahedron Lett. 46 (28), (2005) 4701-

100 AA

0.08%

14%

4705.

14. 長島生、清水弘樹、化学と生物 56 (12), (2018)

5. H. Shimizu, Y. Yoshimura, H. Hinou, S. -I.

811-818.

Nishimura, Tetrahedron 64 (43), (2008) 10091-

15. S. L. Pedersen, A. P. Tofteng, L. Malik, K. J.

10096.

Jensen, Chem. Soc. Rev. 41, (2012) 1826-1844.

6. I. Nagashima, J. -i. Sugiyama, T. Sakuta, M.

16. 2012 年に Biotage 社は、基本プロトコルとして

Sasaki, H. Shimizu, Biosci. Biotechnol. Biochem.

「アミノ酸縮合反応を 75℃で 5 分＋脱 Fmoc 反応を

78 (5), (2014) 758-760.

室温 3 分」を繰り返してペプチド合成可能と発表し7. 長島生、清水弘樹、有機合成化学協会誌 70 (1)、た。CEM 社は 2013 年に 1 サイクル「90℃で 4(2012) 250-264.

分」のプロトコルを発表し、さらに 2018 年には

8. S. K. Ritter, C&EN 92 (4), (2014) 26-28.

「105℃1 分（アミノ酸縮合反応）＋90℃40 秒（脱9. 特許第 6231295 号

Fmoc 反応）」を 1 残基伸長サイクルとする

10. Commercially available as GPS-1000 (EYELA).

CarboMAX 法を発表した。そして、CarboMAX 法

11. J. M. Palomo, RSC Adv. 4, (2014) 32658-32672.

では糖ペプチド合成も可能としている。

12. R. Behrendt, P. White, J. Offer, J. Pept. Sci. 22,

17. T. Matsushita, H. Hinou, M. Kurogochi, H.

(2016) 4-27.

Shimizu, S. -I. Nishimura, Org. Lett. 7 (5), (2005)

13. ペプチド固相合成ではアミノ酸を１残基ずつ伸

877-880.

長させるため、１反応の収率を数％向上させること

18. T. Matsushita, H. Hinou, M. Fumoto, M.

が高収率化や長鎖ペプチド合成のカギとなる。例えKurogochi, N. Fujitani, H. Shimizu, S. -I.

ば 20 残基ペプチドを合成するとき、C 末端 1 残基

Nishimura, J. Org. Chem. 71 (8), (2006) 3051-

があらかじめ提示されたプレロード固相レジンを用

3063.

いた場合 19 回のアミノ酸伸長反応を行うことにな

19. K. Yamada, I. Nagashima, M. Hachisu, I.

り、もし１残基伸長が 93%で進行すると 0.93 の 19

Matsuo, H. Shimizu, Tetrahedron Lett. 53(9),乗で総収率は 25%となるが、１残基伸長が 98%で進(2012) 1066-1070.

行すると総収率は 0.98 の 19 乗で 68%と、3 倍近くの収量が得られる。長鎖ペプチド合成ではこの差異

Manuscript received: June 12, 2019

が顕著に表れる。例えば 44 残基合成では１残基伸Revised: Aug. 19, 2019

長が 93%で進行すると総収率はわずか 4%となる

Accepted: Aug. 26, 201939