LC/MS 法による標的タンパク質定量分析のための血漿前処理自動化

アプリケーションノート

著者
Lola Fagbami, Eric Kuhn, Susan E.
Abbatiello, and Steven A. Carr
Broad Institute of MIT and Harvard
Cambridge, MA USA

はじめに
タンパク質消化における再現性の低さは、安定同位体標識化合物を内部標準として用いるマルチプルリアクションモニタリング質量 分析 (SID-MRM-MS；Stable isotope

dilution-multiple reaction monitoring-mass spectrometry) および抗体アフィニティー精製を利用する MRM-MS (SISCAPA；Stable Isotope-labeled Standards with Capture on

Anti-Peptide Antibodies) アッセイにおいて測定誤差を生じる主たる原因となります１。
本アプリケーションノートでは、分析間の再現性を向上させ、大規模解析を実施する上での作業効率を改善するために、Agilent Bravo リキッドハンドリングプラットフォー
ムによる自動酵素消化法を紹介します。本実験は、Broad Institute において実施され、Bravo プラットフォームを用いて、患者と動物の血漿試料の還元アルキル化および酵素消化を実施し、本手法の妥当性を評価しました。Bravo プラットフォームを用いた 96
ウェルプレートでの血漿のトリプシン消化を自動および手作業で比較したところ、同等の結果が得られることがわかりました。Bravo を用いた自動化では、1 日あたり最大96 サンプル (手作業の場合は 24 サンプル) を処理することが可能であり、その上、試薬溶液の同時添加が可能なためラボの作業効率が向上します。

実験方法

トリプシンとリシルエンドペプチダーゼ

血漿試料に、15Ｎ 標識した 27 種のタンパク質 ( heavy proteins, Argonne National

は、自己 消 化を 防 止するために 50mMmg/mL としました。この酵素液を、あらかじめ 4 ºC に設 定したペルチェサーマ

量を 96 ディープウェルプレートに移し、酵 素 液を直 接試 料に添 加する場合、反Bravo プラットフォームによる酵素 消化を行い、残りの半量は手作業による処理を行いました (図 1)。
タンパク質の変性および還元のために、尿素およびトリス (2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP) とを、それぞ れ 終濃

度 6 M および 25 mM となるように添加し、試料液を加熱条件下混合 (37 ºC 、800rpm、30 分) しました。次いで、ヨードア
セトアミド (IAA) を終濃 度 80 mM となるように添加し、室温暗所にて 30 分間静 置しアルキル 化しました。Bravo デッキは図 2 に 示すように配 置し、全 工 程( 還元、アルキル化、酵素消化) において遮光しました。

Heating Shaking Station) 上で行われ、酵素溶液はポジション 6 (Agilent Peltier ThermalStation) の 384 ウェルプレートに用意されました。ポジション 4 および 6 のデバイスの温度調整は、MTC コントローラを用いて Agilent VWorks ソフトウェアでコント

酢 酸 で 溶 解し、そ れぞ れ の 濃 度 を 0.5Laboratories) を濃 度 が 0.33 pmol/µL となるように 添 加しました。試 料 液 の 半加熱および混合は、ポジション 4 (Agilent

ルユニット上のプレートに添加しました。

応溶液は pH 8.1 に維持する必要がありロールしました。一方、手作業では、サンプルチューブに分注した同じサンプルを、ます。図 2 に示すように Bravo プラット

フォームに配 置 され た 温 度 制 御シェーエッペンドルフサーモミキサー内で混合カーユニット上で、プレートを混合しなしました。

がらインキュベーションしました。Bravo

次に、質量分析グレードのリシルエンド

デッキポジションの構成は、以下に示す

ペプチダーゼ lys-C (Wako Pure Chemical通りです。

•

サンプルプレート : ポジション 5•

ピペットチップ : ポジション 1、2、3、8•

変 性 剤 液、還 元 剤 液、アル キル 化•

Industries, Ltd. p/n 125-05061) を 酵 素と基質の量 比が 1:50 となるように添 加した後、試料を加熱条件下混合 (37 ºC 、800 rpm、2 時間) しました。0.2 M トリ
ス 緩 衝 液 (pH 8.1) を 添 加し、尿 素 濃 度を 1 M 以 下としました。次 いで、シ ー剤液、反応停止液 : ポジション 7 の384 ウェルプレート

ケンシンググレ ード の 修 飾トリプシン(Promega p/n V5111) を酵素と基質の量トリス緩衝液 : ポジション 9

比が 1:100 となるように添加した後、加熱条件下混合 (37 ºC 、800 rpm、2 時間)

ピペットチップ

37 ºC ヒーター /ミキサー
27 でスパイク

血漿15N(U)-標識タンパク質

n=3、1 ウェルあたり
血漿 90 µL

遠心分離管変性6 M 尿素

還元

25 mM TCEP

アルキル化

80 mM IAA

分解

1Bravoプラットフォーム

4257

1.Lys-C (1:50) 2h
2.トリプシン (1:100) 2h
3.トリプシン (1:100) 15h

3105 でスパイク

813C/ 15N-標識ペプチド

脱塩

Oasis HLB 60 mg プレート
(陽圧マニフォールド)ナノ-rpLC-MRM-MS
データ解析

384 ウェルプレート( 尿素 /TCEP/IPP/ギ酸 )9ピペットチップ

6490 チップキューブ

サンプルプレート

スカイライントリズマ

回収率 (PAR)
精度 (CV)

図 1. 酵素消化ワークフロー

64 ºC (lys-C/トリプシン)

図 2. Agilent Bravo プラットフォームを用いた自動酵素消化のバッファおよびピペットチップのデッキ配置

2

しました。さらに、トリプシンを酵素と基質の量 比が 1:100 となるように添 加し、加熱 条 件下混合 (37 ºC 、800 rpm、15 時間) しました。酵 素 反 応を 停止させるために、ギ酸の終濃度が 1 % となるように 50 % ギ酸を加えました。

還元、アルキル化、酵素消化に続き、安定 同 位 体 標 識 合 成ペプ チド の 混 合 物を、血 漿に 添 加した 15N 標 識 タンパク質と同じモル濃 度で各ウェルに添 加し結果と考察

ムに注入し、ダイナミック LC-MRM-MS

質量分析結果から、ペプチドの回収率により分析しました。と酵 素 消 化 の 再 現 性 を 検 討 するため

回 収率と測 定 精 度を評 価するために、に、安定同位体 標識したタンパク質を分析した 105 の ペプチドのうちの 102

トリプシン消 化して得られたペプチド(15N- 標識) と対応する安定同位体標識合 成 ペ プ チド (13C-/15N- 標 識) の 量 比のペプチドについて、PAR 値と CV 値を算出し ( 表 1)、ヒストグラムを作成しました (図 3)。自動および手作業による酵を算出しました。例として、ピーク面積

素消化で得られたペプチドの平均回収比 (PAR : Peak Area Ratio) が 0.8 であれ率は、いずれも約 50 % であり、ペプチば、消化回収率は 80 % となります。再ドの回収率の幅を示すヒストグラムも、ました。安定同 位体 標 識 合成ペプチド

現性の検討のために血漿の消化プロセ

自 動 お よび 手 作 業 による 酵 素 消 化 で(13C/15N 標識) の添 加は、SID-MRM-MSスを 3 回繰り返し、HPLC-Chip を搭載しほぼ同等の結果であることを示しまし

測定における酵素消化効率および再現

た 6490 トリプル四重極 LC/MS システ性の評価のために行いました。

た(図 3A)。消化プロセスの 3 回繰り返

次 に、 陽 圧 マ ニ フ ォ ー ル ド で Oasis

表 1. 102 ペプチドの平均 PAR 値と CV 値 (3 トランジション/ペプチド )。
Agilent 6490 トリプル四重極 LC/MS システムを用いて MRM により測定の血 漿試料を脱 塩 処 理しました。脱 塩サンプル処理

平均回収率 (PAR)

平均精度 (CV)

手作業 (チューブ )

50 %

5.9 %

5 % 酢酸を含む希釈溶液 (3 % ACN、5%HOAc) で再溶解し、5,000 x gで 5 分間遠心しました。上澄みを希釈 溶液 (3 %ACN、5 % HOAc) で 10 倍希釈し、HPLCバイアルに移しました。試 料液 1µL を

Bravo プラットフォーム (プレート)

56 %

6.4 %

Agilent HPLC-Chip に 注 入 し、Agilent
6490 トリプル四重極 LC/MS システム

ペプチドの数HLB60 プレートを用いて、酵素消化後後の試料を 3 % アセトニトリルおよびトラップカラムと分析カラムを 備えたで分析しました。

181614MRM-MS のために、実験で得られた消12108

Bravo プラットフォーム

6手作業

4化ペプチド情 報、公 的データベース情2報および ESP 2 を参考にして、1 種類の0タンパク質あたり 1 から 5 本のトリプシン消化ペプチドを選択しました。ESP

アルゴリズムは、エレクトロスプレー有するペプチドを選 別するために有用一つは安定同位体標識された C 末端アルギニンまたはリジンを含み、他の一つは 15N (U) 標識されたタンパク質消化ペプチドを検出するためのものです。

2030405060
PAR708090100110

B40
カウント

つのトランジションイオンを選択し、ダた。3 つのトランジションイオンの内、1050です。各標識ペプチドについて固有の 3イナミック MRM 分析に最適化した LC060

質量分析において高いイオン化効率をグラジエント条 件で測定を実 施しましA

30

Bravo プラットフォーム

20

手作業1000510152025CV (%)

30354045

図 3. ヒストグラムプロット。(A) 安定同位体標識タンパク質 (15N- 標識 ) と安定同位体標識ペプチド(13C-/15N- 標識 ) のピーク面積比により算出した回収率 (PAR) および (B) 処理工程の再現性 (CV)3

しによる再現性の平均 CV 値は、自動お1ても約 6 % であり、ヒストグラムもほぼ0.9

よび手作 業による消 化のいずれについ同等の結果であることを示しました (図0.83B)。このことから、ペプチドの回収率に関して、手作業および自動分解がほぼ同0.7等であることを示しています (図 4)。

プチドの回収率のプロットでは、きわめて強い相関性が見られました。このことは、ペプチド回収率という点について、手作 業および自動 分解がほぼ同様であ0.6
手作業の PAR

手作 業および自動 分解で得られた各 ペ0.50.4ることを示しています (図 4)。

0.3結論

0.2

Agilent Bravo 自動リキッドハンドリング
プラットフォームは、血漿試料の酵素消化処理を自動化することが可能であり、

0.1
00

SID-MRM LC/MS 分 析 の 結 果 から 一定

程 度の熟 練技 術 者による手作業と同等の分析再現性が示され、大 規模 解 析に

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Bravo プラットフォームの PAR

図 4. 血漿の酵素消化における自動化法と手作業法の相関性おける作 業 効率を高めることが示されました。さらに、本実験では、最大 96 サンプルを同時に処理することができ、手作 業 の 24 サンプル 処 理に比 較して、4倍の作業効率を実現しました。

このことは、大 規模 解 析や一回の実 験での 多重 試 験を容 易とし、試 料 の同時処 理により試 料間誤 差の 低 減を可能とします。このアプリケーションノートで紹介した自動化ソリューションを利用する

参考文献
1. Kuhn, E., et al.Inter-laboratory
Evaluation of Automated, Multiplexed
Peptide Immunoaffinity Enrichment
Coupled to Multiple Reaction
Monitoring Mass Spectrometry for
Quantifying Proteins in Plasma.Mol
Cell Proteomics, 2011, doi:10.1074/
mcp.M111.013854.

2. Fusaro, V.A., et al.Computational
Prediction of High Responding
Peptides for Development of Targeted
Protein Assays by Mass Spectrometry
Nat Biotechnol., 2009, 27(2):190-8.

ことにより、研究者は手作業によるルーチン作 業 から解 放され、ラボ全 体 の 作業効率を高めることができ、さらに、信頼性の高い実 験 結果を得ることが 可能となります。

www.agilent.com/chem/jp
本資料に記載の情報は、予告なしに変更されることがあります。
アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc., 2013
Published in Japan, August 8, 2013
5991-0972JAJP