hon p.1 [100%]YAKUGAKU ZASSHI 130(12) 1665―1670 (2010)  2010 The Pharmaceutical Society of Japan

1665―Review―

超音波感受性リポソームを利用した超音波がん治療システムの開発
鈴木亮，小田雄介，宇都口直樹，丸山一雄

Development of Ultrasonic Cancer Therapy Using Ultrasound Sensitive Liposome
Ryo SUZUKI,Yusuke ODA, Naoki UTOGUCHI, and Kazuo MARUYAMA
Department of Biopharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University,10911 Suwarashi, Midori-ku, Sagamihara, Kanagawa 2525195, Japan(Received September 1, 2010)
Ultrasound (US) has been utilized as a useful tool for diagnosis and therapy. US mediated drug and gene delivery ispaid to attention as a non-invasive system. The combination of US and microbubbles generated microjet stream by inducing disruption of bubbles and resulted in enhancing permeability of cell membrane. This phenomenon has been utilized as driving force for drug and gene delivery. Recently, we developed ultrasound sensitive liposome [Bubble liposome (BL)] containing per‰uoropropane gas. US combined with BL could eŠectively transfer gene in vivo compared toconventional cationic liposomes. Using this method, we succeeded to obtain a therapeutic eŠect in cancer gene therapy
with Interleukin-12 corded plasmid DNA. Therefore, it is expected that US combined with BL might be a useful nonviral vector system. From this result, the fusion of liposomal and ultrasound technologies would be important for establishment of advanced cancer therapy.
Key words―liposome; ultrasound; non-viral vector; drug delivery system (DDS); gene therapy

1.

はじめに行っている．411) そこで本稿では，筆者らが開発を

リポソームは脂質二重膜からなる閉鎖小胞であ続けているリポソーム型微小気泡（バブルリポソーり，その内部に薬物を封入したり，表面にポリマーム）と超音波照射の併用によるがん遺伝子治療につや抗体などを修飾できる性質を有していることかいて紹介する．
バブルリポソームについてら，薬物キャリアーとして期待されている．実際に2.

11 品目のリポソーム製剤が世界中で上市されてお近年の超音波技術の進展は目覚ましく，超音波造り，リポソーム技術は薬物治療の最適化を目指すド影装置の高解像度化や 3D 撮像などが可能となってラッグデリバリーシステム（ DDS ）のための製剤いる．そして最近では，超音波を数 mm 単位で患技術として注目されている．その中で筆者らは，リ部に対し正確に照射することのできる強力集束超音

ポソームに関する研究を長年続けており，がん細胞波（High intensity focused ultrasound: HIFU）が開にアクティブターゲティング可能な抗がん剤封入リ発され，超音波熱エネルギーによる前立腺がんや子ポソームや中性子捕捉療法におけるがん組織へのボ宮筋腫の低侵襲的治療として医療の現場で利用されロン化合物送達システムとしてのリポソームの利用始めている．このように超音波技術は医療分野におなど様々なリポソーム開発に携わってきた．13) そ

いて診断及び治療に応用され，これからさらなる飛して最近では，新たな取り組みとしてリポソームの躍が期待されている．これに加え，超音波造影剤の内水相部分に超音波造影ガスであるパーフルオロプ開発も進められており，わが国においては世界に先ロパンを封入した新たなタイプのリポソーム開発を駆け肝腫瘤性病変のための超音波造影剤である
Sonazoid が上市された．この Sonazoid は静脈内投

帝京大学薬学部生物薬剤学教室（〒2525195 神奈川県相模原市緑区寸沢嵐 10911）
e-mail: r-suzuki＠pharm.teikyo-u.ac.jp
本総説は，日本薬学会第 130 年会シンポジウム S10 で発表されたものを中心に記述したものである．

与後，速やかに肝臓のクッパー細胞に取り込まれることで肝腫瘤病変を陰影像としてとらえることができる優れた超音波造影剤である．このように肝臓のクッパー細胞を利用した超音波造影が可能になるのhon p.2 [100%]1666

Vol. 130 (2010)

Fig. 1.

Comparison of Sonazoid and Bubble Liposome

Scheme (upper) and microscope (×400)(lower)

は， Sonazoid がホスファチジルセリンからなる気ち勝ったときに空洞を生じる現象である．このキャ泡であること，さらに粒子サイズが 23 mm でありビテーション気泡は最終的に圧壊するが，この圧壊クッパー細胞に積極的に貪食され易い性質を有して時に気泡近傍にジェット流が生じ，このエネルギーいるためである．一方，われわれが開発したバブルにより細胞膜に一過性の小孔が開くことで，細胞外リポソームは，粒子サイズが約 500 nm と Sonazoidの物質が細胞内に送達されると考えられている．しより小さい上，ポリエチレングリコール（ PEG ）かし，超音波を利用した初期の遺伝子導入ではキャ修飾リポソーム内に気泡が封入された構造であるた

ビテーションの誘導効率を高めるために 2050 kHz

め表面に存在する PEG の影響でクッパー細胞によの低い周波数の超音波が用いられており，細胞に対る貪食から逃れ易くなっている（ Fig. 1 ）．したがする傷害性が問題となっていた．これは低い周波数って，粒子サイズ及びクッパー細胞などによる貪食ほど低い強度でキャビテーションを誘導可能であるの回避などの観点から，バブルリポソームが組織深が，キャビテーション気泡の直径が大きくなり細胞部にまで到達可能になるものと期待される．

に対する傷害性が高くなってしまったと考えられ

3.

ソノポレーションを利用した遺伝子デリバた．一方，高い周波数の超音波ではキャビテーショリー
超音波を利用した遺伝子導入研究は 1987 年にFechheimer らによる報告から始まった．12) この超音波による遺伝子導入メカニズムとしてキャビテーション（空洞現象）が関与していると考えられている．
キャビテーションとは，液体に超音波を照射したときの負の圧力が液体を維持するのに必要な圧力に打鈴木亮

帝京大学薬学部生物薬剤学教室講師．
博士（薬学）． 1973 年神奈川生まれ．
東京薬科大学卒業，大阪大学大学院薬学研究科博士課程修了．2001 年東レ株式会社入社，2004 年帝京大学薬学部助手，2007 年同助教，2010 年現職．リポ
ソーム技術を駆使した革新的がん治療システムの構築に関する研究に従事．

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No. 121667

ン誘導作用が低いものの，発生したキャビテーショ

4.

ン気泡の直径は小さく，細胞傷害性は低いと考えらリー

微小気泡と超音波の併用による遺伝子デリバれている．そのため， 1 2 MHz の超音波周波数がマイクロバブルを用いた遺伝子導入増強に関する遺伝子導入に使用されるようになった．しかし，こ報告が進む中，マイクロバブルの種類による導入効の周波数ではキャビテーション誘導の閾値が高くな率の比較検討も行われた．アルブミン外殻中に空気るため，強い照射強度（ 20 100 W / cm2 ）あるいはを封入した Albunex，アルブミン外殻中にパーフル長い時間（ 3 30 分）の照射が必要となり細胞傷害オロプロパンを封入した Optison，アルブミン外殻の問題を完全に払拭できるような条件と言い難かっ中に空気とパーフルオロプロパンを封入した PES-た．この問題を解決するために考えられたのが，超DA，パルミチン酸を含むガラクトース結晶複合体

音波によるキャビテーションを誘導し易くするためからなる Levovist，脂質膜中にパーフルオロプロパにあらかじめキャビテーション核となる微小気泡をンを封入した Deˆnity など多くの超音波造影剤が開存在させておくことである．すなわち，上述の超音発されており，各々のマイクロバブルと超音波の併

波遺伝子導入において超音波造影剤であるマイクロ用による遺伝子導入の増強効果が認められていバブルを添加することで，低い超音波照射強度及びる．14) このようなキャビテーションを利用したデリ短時間で遺伝子導入可能であることが報告されるよ

バリーシステムは，体外からの超音波照射により目うになった．13) これは，マイクロバブルがキャビ的組織にのみ低侵襲的な遺伝子デリバリーを可能とテーション核として存在することで，遺伝子導入にする新たな遺伝子デリバリーシステムとして期待さ必要なキャビテーションを誘導するための超音波照れている．そこで，このキャビテーションを利用し射強度の閾値を下げることができたと考えられたた遺伝子導入がバブルリポソームでも可能であるこ（Fig. 2）．このような背景の下，1990 年代後半からとを評価するため，バブルリポソームと超音波照射

マイクロバブルと超音波の併用による遺伝子導入にの併用による遺伝子導入について検討した．様々な関する研究がスタートしている．

種類の細胞にルシフェラーゼ発現プラスミド DNAを超音波単独又はバブルリポソームと超音波照射の併用により遺伝子導入したところ，いずれの細胞種においてもバブルリポソームと超音波照射の併用により高いルシフェラーゼ発現が認められた（ Fig.
3)．11) このようにバブルリポソームと超音波の併用が細胞種を問わず遺伝子導入可能であったのは，キャビテーションによる物理的エネルギーを利用して細胞質内に遺伝子を直接導入できるためであると考えられた．
本方法は超音波を照射したときのみ遺伝子導入が誘導されるため，超音波照射部位をコントロールすることで超音波照射部位特異的な遺伝子導入が可能になると考えられる．そこで，バブルリポソームと超音波の併用による低侵襲的かつ組織特異的な invivo 遺伝子導入システムの確立を試みた．バブル

リポソームとルシフェラーゼ発現プラスミド DNA
をマウスの尾静脈から全身投与後，直ちに肝臓に向けて体外から経皮的に超音波照射した．その 2 日後にマウスから各臓器を回収し，ルシフェラーゼ活性Fig. 2. Mechanism of Gene Delivery into Cell by Microbubble and Ultrasound Exposureを測定した（ Fig. 4 ）．その結果，超音波照射部位である肝臓において高いルシフェラーゼ発現が認めhon p.4 [100%]

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Fig. 3.

Vol. 130 (2010)

Gene Delivery by Bubble Liposome and Ultrasound Exposure in vitroCells (1×105 cells/500 ml) mixed with pCMV-Luc (5 mg) and Bubble liposomes (60 mg) were exposed or not to ultrasound (frequency, 2 MHz; duty, 50％;
burst rate, 2 Hz; intensity, 2.5 W /cm2; time, 10 s). The cells were washed and cultured for 2 days. Thereafter, luciferase activity was determined. Data are shown asmeans±S.D. (n＝3). S-180, mouse sarcoma; Colon26, mouse colon adenocarcinoma; B16BL6, mouse melanoma; Jurkat, human T cell line; HUVEC, human umbilical vein endothelial cell.

Fig. 4.

Liver Speciˆc Gene Delivery by Bubble Liposomes and Ultrasound Exposure(a) Gene delivery method: Luciferase corded plasmid DNA (100 mg) and Bubble liposomes (500 mg) were intravenously injected and ultrasound (1 MHz, 1W /cm2, 1 min) was transdermally exposed toward liver. After 1 day of ultrasound exposure, luciferase expression in each tissue was measured. (b) Luciferase expression in each tissue.

られた．このようにバブルリポソームとプラスミド的に遺伝子導入できる可能性を有しており，他の遺DNA が血流を介して流れていたにもかかわらず肝伝子導入ベクターにはない非常に簡便でユニークな臓に遺伝子導入できたのは，超音波照射部位である特性を持つ方法であると言える．

肝臓でバブルリポソームがキャビテーションを誘導し，そのときに遺伝子を肝臓に導入したためである

5.

バブルリポソームと超音波照射を利用したがん遺伝子療法と考えられた．今回は示していないが，筆者らは同近年，抗腫瘍免疫の活性化を目的とした新しいが様の方法を用い超音波照射部位を変更することで脾ん治療法としてサイトカイン療法が注目されてい臓や脳へも遺伝子導入できることを確認している．

る．その中でも IL-12 は， NK 細胞や細胞傷害性 T

このように今回示した方法は，超音波照射部位を変細胞などを活性化することで強力な抗腫瘍効果を誘

更するだけで様々な組織や部位に低侵襲的かつ特異導するサイトカインとして，臨床の場においても期hon p.5 [100%]

No. 12Fig. 5.

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Cancer Gene Therapy in Gene Delivery by Bubble Liposomes and Ultrasound Exposure

B6C3F1 mice were intradermally inoculated with 1 ×106 OV-HM cells into the ‰ank. After 7 days of tumor inoculation, the tumors were injected with pCMVIL12 (10 mg) using Bubble liposomes (2.5 mg) and /or ultrasound (1 MHz, 0.7 W /cm2, 1 min ), or Lipofectamine 2000 as a conventional lipofection method. The
volume of the growing tumors was calculated by: (tumor volume; mm3)＝(major axis; mm)×(minor axis; mm)2×0.5. The data are represented as tumor volume
relative to the tumor volume on the ˆrst day of treatment (day 7 after tumor inoculation). Each point represents the mean±S.D. (n＝5). BL, Bubble liposomes;
US, Ultrasound; LF2000, Lipofectamine 2000.

待されている．しかし，IL-12 の全身投与は，全身の超音波照射により超音波照射部位のみに遺伝子を作用による副作用のリスクが懸念されており，副作送達可能であった．本方法は既存の非ウイルスベク用の影響なく治療効果を得るためには，がん組織特ターシステムとは異なり，低侵襲的かつ部位特異的異的に IL-12 を作用させる必要がある．前項で示し遺伝子導入を可能とする有望な遺伝子導入法としてたように，バブルリポソームと超音波照射の併用期待される．それゆえ，本稿で紹介した方法は，遺は，がん細胞に効率よく遺伝子導入できることが明伝子治療分野で課題となっている部位特異的な遺伝らかとなっている．そこで筆者らは，バブルリポ子発現用ベクター開発において有望な技術ではないソームと超音波の併用による IL-12 発現プラスミドかと考えられる．

DNA（ pCMV-IL12 ）の遺伝子導入によるがん遺伝

冒頭でも述べたようにバブルリポソームはリポ子治療を試みた（ Fig. 5 ）．その結果，バブルリポソーム技術を基盤としたバブル製剤であり，リポソームと超音波の併用により pCMV-IL12 を導入しソーム表面に容易に標的指向性分子を修飾することた群で顕著な腫瘍増殖抑制効果が認められた．7) 一ができる．今回紹介しなかったが，これまでに筆者

方，LipofectamineTM 2000 による遺伝子導入では，らの共同研究者はバブルリポソーム表面に血栓を認

ほとんど腫瘍増殖抑制効果は認められなかった．こ識するペプチドを修飾し，血栓モデル動物に静脈内のような結果が得られたのは，バブルリポソームと投与することで，バブルリポソームの血栓部位への超音波の併用により効率よく IL-12 遺伝子が発現集積を超音波造影により確認している．4) さらに，し，強力な抗腫瘍免疫が誘導されたためであると考この集積したバブルリポソームにキャビテーションえられた．このことから，バブルリポソームと超音を誘導するような周波数・強度の超音波を体外から波照射の併用法は IL-12 がん遺伝子治療において有照射することで血栓を破壊し血流を再開することが用な非ウイルスベクターになることが示唆された．

可能であることも確認している．このように，バブ

6.

おわりに

ルリポソームと超音波の併用は，単に細胞に遺伝子

本稿では，バブルリポソームと超音波を利用したを導入するだけでなく，これまで超音波造影では診遺伝子導入について紹介した．バブルリポソームと断できなかった血栓の診断を可能にし，さらに治療超音波の併用による遺伝子導入は，短時間の超音波用超音波照射により血栓治療も行えるような次世代照射で細胞内に遺伝子導入可能である上，体外から型医療システムの構築を予感させる．

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今後，バブルリポソームへのパッシブターゲティングやアクティブターゲティング能の付与による体内動態制御及び集束超音波による超音波照射部位の空間的制御の両者を組み合わせたダブルターゲティ
ングを利用することで，厳密な空間的・時間的制御を可能とする理想的な超音波がん治療システムが構築可能になるものと期待される．
謝辞

本稿で紹介したバブルリポソームに関する研究は，帝京大学薬学部生物薬剤学教室で行われた研究であり，研究遂行にご協力頂いた学生諸子に深謝する．また，本研究遂行においてご協力頂いた
東京薬科大学薬学部・根岸洋一先生，国立がんセン
ター東病院・松村保広先生，陸上自衛隊研究本部・萩沢康介博士，福岡大学医学部・立花克郎先生，北海道大学大学院情報科学研究科・工藤信樹先生に深謝する．さらに，本研究の一部は厚労省科研費：第3 次対がん総合戦略研究事業，文科省科研費：基盤研究（ A ），若手研究（ B ），医薬基盤研究所：保健医療分野における基礎研究推進事業の研究助成により遂行された研究である．
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