hon p.1 [100%]YAKUGAKU ZASSHI 130(12) 1701―1706 (2010)  2010 The Pharmaceutical Society of Japan

1701―Review―

抗体プロテオミクス技術による乳がん関連バイオマーカーの探索とその評価
長野一也

Search for Breast Cancer-related Biomarker Proteins for Drug Discovery
Kazuya NAGANOLaboratory of Biopharmaceutical Research, National Institute of Biomedical Innovation,
768 Saito-Asagi, Ibaraki, Osaka 5670085, Japan(Received July 5, 2010)
The identiˆcation of biomarkers is a promising approach for the diagnosis and eŠective therapy of cancer. In particular, disease proteomics is a potentially useful method for identifying such biomarkers. However, very few biomarker
proteins for drug development have been discovered using this approach. The main di‹culty is to e‹ciently select potential biomarkers from the many candidate proteins identiˆed by the proteomics approach. To circumvent this problem,
we have developed ``antibody proteomics technology'' that can screen for biomarker proteins by isolating antibodies
against each candidate in a rapid and comprehensive manner. Here, we applied ``antibody proteomics technology'' tobreast cancer-related biomarker discovery and evaluated the utility of this novel technology. Cell extracts derived frombreast tumor cells (SKBR3) and normal cells (184A1) were analyzed by two-dimensional diŠerential gel electrophoresis(2D-DIGE) to identify proteins over-expressed in the tumor cells. Candidate proteins were extracted from the gel pieces,
immobilized onto a nitrocellulose membrane using a dot blot apparatus and then used as target antigens in scFv-phageenrichment and selection. Following this in vitro phage selection procedure, scFvs binding to 21 diŠerent over-expressedproteins in tumor cells were successfully isolated within several weeks. The expression proˆles of the identiˆed proteins
were then determined by tissue microarray analysis using the scFv-phages. Consequently, we identiˆed three breast
tumor-speciˆc proteins. Our data demonstrates the utility of an antibody proteomics system for discovering and validating tumor-related proteins in pharmaceutical proteomics. Currently, we are analyzing the functions of these proteins to
use them as diagnostic markers or therapeutic targets.
Key words―biomarker protein; antibody proteomics; phage antibody library; tissue microarray1.

はじめにパク質の同定は，対照試料と比較して疾患試料で発近年，医療の個別化・最適化の高まりも相まっ現変動しているタンパク質を質量分析法により網羅て，各種疾患治療薬の標的となり得る“創薬ターゲ的に同定し，その上で，見い出された候補タンパクット”や，的確な診断を可能とする“疾患マーカー”

質の機能を解析することで，その有用性をバリデーといった創薬バイオマーカーの探索研究が，臨床やションし，絞り込むことになる．このようなプロセ創薬研究現場において大きな注目を集めており，熾スの中で，候補タンパク質の同定に関しては，近年烈な国際競争が繰り広げられている．中でも，生命の質量分析装置の高性能化等に伴って，その数とス現象の直接の担い手である「タンパク質」に着目し，ピードは飛躍的に進歩し，一度の解析で数十，数百疾患状態におけるタンパク質の質的・量的・時空間といった発現変動タンパク質の同定が可能となって的変化を網羅的に解析しようとする疾患プロテオミ

いる．1) しかし，候補タンパク質のバリデーション

クスのアプローチに大きな期待が寄せられている．

に関しては，同定したタンパク質を 1 つ 1 つ評価す疾患プロテオミクスによる創薬バイオマーカータン

るか，各研究者の興味や経験からトライ・アンド・エラーで解析せざるを得ないのが現状であり，同定

独立行政法人医薬基盤研究所バイオ創薬プロジェクト（〒5670085 大阪府茨木市彩都あさぎ 768）
e-mail: knagano＠nibio.go.jp
本総説は，平成 21 年度日本薬学会近畿支部奨励賞（生物系薬学）の受賞を記念して記述したものである．

されるタンパク質の数が増えた一方で，この検証と絞り込みの過程が創薬研究における律速となっている．そのため，プロテオミクス研究から医薬品開発にまで展開できた例はほとんどないといっても過言hon p.2 [100%]

1702

Vol. 130 (2010)

ではない．これは，タンパク質の発現分布や機能解を実証した．2,3) そこで続いて，抗原としてリコンビ

析に必須のツールである抗体を，数多くの候補タン

ナントタンパク質を別途作製することなく，二次元パク質に対して手にすることが困難であることに起ディファレンシャル電気泳動（ 2D-DIGE ）ゲルか因している．近年，試薬メーカー等により多種類のら回収されるナノグラムオーダーのタンパク質を直抗体が提供されつつあるが，興味深いタンパク質で接用いて，抗体を取得し得る方法論の確立を試みあるほど，抗体は市販されておらず，とりわけ，詳た．筆者らは，抗原タンパク質の固相化担体とし細な解析に必須となるモノクローナル抗体は，多くて，タンパク質の吸着力に優れたニトロセルロースの場合，自ら作製する必要がある．しかし，モノク膜を利用し，ドットブロット装置上でファージ抗体ローナル抗体作製の常法であるハイブリドーマ法でライブラリの選別操作を行ったところ，わずか 0.5

 1 つの抗原に対して抗体を作製するのにさは，◯ng の微量抗原からでも目的抗体を単離することがえ，数ヵ月以上もの時間と多大な労力を費やさなけ可能であることを明らかとした（メンブランパンニ

 プロテオミクス研究の汎ればならない．さらに，◯

ング法）．以上のプロセスにより，二次元電気泳動用法である二次元電気泳動のゲルから直接回収でき法によるプロテオミクス解析で同定される候補分子るタンパク質は概して微量（数 100 ng 以下）であに対して， in vitro で迅速に抗体を取得し得る方法

るため，動物への免疫を必要とする本方法では，遺を確立することができた．本方法により抗体を取得

伝子のクローニングやリコンビナントタンパク質のできれば，タンパク質レベルでの様々な機能解析が発現・精製といった過程も経なければならず，数可能となる．そこで筆者らは，多数の臨床サンプル十，あるいは数百種類も同定されてくる候補タンパで候補分子の有用性を効率よくバリデーションし，ク質に対応することは極めて困難である．

真に有用な創薬バイオマーカーを絞り込むための本観点から筆者らは，上記課題を克服し，創薬バツールとして，組織マイクロアレイ（ TMA ）に着イオマーカータンパク質の探索から，バリデーショ目した．TMA は多症例の臨床組織切片が 1 枚のスン・絞り込みまでを迅速に効率よく行い得る創薬基

ライドガラスに搭載されたもので，目的抗原に対す盤技術，「抗体プロテオミクス技術」を確立した．

る抗体で免疫染色すれば，1 度の解析で，多数の症

本稿では，抗体プロテオミクス技術による乳がん関例における発現プロファイルを取得でき，さらに，連バイオマーカータンパク質の探索の試みについて各症例が有している様々な臨床情報との相関も解析紹介させて頂く．

することが可能となる．4) 種々の条件検討の結果，

2.

抗体プロテオミクス技術の開発

ファージ発現型抗体を用いて，TMA の免疫染色がまず，数多くの候補タンパク質に対してハイス可能であることを見い出しており，これらの技術をループットに抗体を作製するため，筆者らは， in組み合わせることによって，最短 1 ヵ月程度で，プvitro でモノクローナル抗体を作製可能なナイーブロテオーム解析から有用なバイオマーカータンパクファージ抗体ライブラリに着目した．ナイーブフ質の絞り込みまでを達成することが可能となった．

ァージ抗体ライブラリは，生体が有する多様なレ以上，疾患サンプルの 2D-DIGE 法による発現変パートリーの抗体 Fv 領域を，リンカーペプチドに動タンパク質の同定から，抗体の網羅的作製，さらより一本鎖化した scFv の形でファージ表面に発現に多数の臨床サンプルでのバリデーションまでを迅させたライブラリである．研究に取りかかった当速かつ効率よく完了できるシステムを，われわれは時，有用で自由に使うことのできるナイーブファー「抗体プロテオミクス技術」と名付けた．具体的な

ジ抗体ライブラリがなかったため，抗体 V 遺伝子

 疾患サプロセスとしては，Fig. 1 で示すように，◯を網羅的に増幅可能とする PCR プライマーセット

ンプルとしてがん細胞株等を用い，健常組織由来細を独自に設計することで，マウス由来ナイーブフ胞株を対照として， 2D-DIGE により発現変動タン

ァージ抗体ライブラリの作製を試みた．その結果，

 電気泳動後のゲルから回収さパク質を探索する．◯

20 億種類以上ものレパートリーを有する抗体ライれる数 100 ng 以下のタンパク質の一部を使用してブラリの構築に成功し，各種タンパク質に対する特 一方
質量分析法によりタンパク質を同定する．◯

異的抗体発現ファージを約 2 週間で単離できること

で，一部のタンパク質をニトロセルロース膜上に固hon p.3 [100%]

No. 12

Fig. 1.

1703

Schematic Illustration of Antibody Proteomics Technology

Monoclonal antibodies against many diŠerentially expressed proteins could be rapidly created by applying naäƒve phage scFv library to proteomics study, andthese candidates could be eŠectively validated by tissue microarray.

相化し， 24 億種類の抗体レパートリーからなるナ
イーブファージ抗体ライブラリにより，目的とするタンパク質に対して高親和性抗体クローンをスク

Table 1. Identiˆcation of DiŠerentially-expressed Proteins in
Breast Cancer Cells by MALDI-TOF/MSSpot#Protein name123456789101112131415161718192021

Splicing factor YT521-B
IkappaBR
SPATA5Skin aspartic protease
Beta actin variant
TRAIL-R2
Cytokeratin 18
TRAIL-R2
RREB1
Cytokeratin 7
Cytokeratin 18
Cytokeratin 7
FLJ31438
Cytokeratin 7
PAK65
Cytokeratin 8
Cytokeratin 8
XRN1
Jerky protein homolog-like
EPH receptor A10
Glutatione S transferase 得られたファージ抗体と TMAリーニングする．◯

による発現プロファイリングにより，候補タンパク質の創薬バイオマーカーとしての有用性を多数の臨床サンプルでバリデーションする．
本技術は，多数の発現変動タンパク質の中から真に価値のある『疾患バイオマーカーや創薬ターゲット』の候補を，効率よくバリデーションし，絞り込むことができる唯一の方法であり，創薬研究に極めて有用な基盤技術になるものと考えられる．そこで
以下では，本技術の有用性検証を目的として，乳がんの創薬ターゲットタンパク質，あるいは悪性度診断のための疾患マーカータンパク質の同定を試みた．
3.

プロテオーム解析による乳がん関連タンパク質の同定と網羅的な抗体作製
不死化乳腺細胞株 184A1 から調製したタンパク質を対照サンプルに，乳がん細胞株 SKBR3 から調製したタンパク質を疾患サンプルとして 2D-DIGE解析を行った．定量的解析により発現変動レベルのExpression ratio
MW(folds)(kDa) pI
[cancer/normal]
85637637424848485251
4851
53515554545451
32
23

5.9
5.5
5.6
5.3
5.3
5.4
5.3
5.4
5.3
5.4
5.3
5.4
5.5
5.4
5.7
5.5
5.5
5.8
6.0
5.7
5.4

667
0.1
151812161023132435368327282290.02

大きかった 21 個の spot について，ゲルを切り出し，ゲルを溶解することによりタンパク質を回収し（ Table 1 ）．また，回収したタンパク質の一部を用た．回収したタンパク質の一部を用いて質量分析にいて，メンブランパンニング法によりファージ抗体より解析（ PMF 及び MS / MS ）したところ，すべの単離を試みた．その結果，すべてのタンパク質にてのスポットのタンパク質を同定することができた

対して親和性を有するファージ抗体を単離することhon p.4 [100%]1704

Vol. 130 (2010)ができた．ファージ抗体の単離に要した期間は約 2週間であり， 2D-DIGE によるプロテオーム解析かTable 2. Validation of Biomarker Candidates by Tissue
Microarray with Breast Cancer and Normal Tissues

ら同定・回収される微量で多種類のタンパク質を直Protein name

接抗原として使用し，それらに対する抗体を迅速に取得可能な方法論であることが確認できた．
4.

Her-2

組織マイクロアレイ解析による乳がん関連
IkappaBR

マーカータンパク質の絞り込み候補タンパク質に対する抗体を手にすることがでSPATA5きれば，様々な機能解析が可能となる．そこで，得Beta actin variant

られたファージ発現型抗体を用いて，がん組織マイTRAIL-R2クロアレイを免疫染色し，同定されたタンパク質の発現プロファイリングを試みた．189 症例の乳がん

RREB1

組織と 15 症例の正常の乳腺組織が搭載された TMA

FLJ31438を用いて，ファージ発現型抗体にて染色した．そPAK65の結果，SPATA5, Beta actin variant, FLJ31438,
PAK65, XRN1 に関しては正常乳腺組織においてCytokeratin 8も，がん組織においてもほとんど発現は認められなXRN1かった．一方，カスパーゼカスケードの活性化を介したアポトーシス誘導性の受容体である TNF-related apoptosis-inducing receptor 2（TRAIL-R2）は約

Jerky protein homolog-like
EPH receptor A10

Positive rate of identiˆed proteins
Normal breast Breast cancer
tissuestissues
0/15 cases( 0％)
3/15 cases(20％)
0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)/
1 15 cases( 7％)
0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)0/15 cases( 0％)

53/189 cases(28％)
22/189 cases(12％)
0/189 cases( 0％)0/189 cases( 0％)
119/189 cases(63％)
83/189 cases(44％)
0/189 cases( 0％)0/189 cases( 0％)
137/189 cases(73％)
0/189 cases( 0％)0/189 cases( 0％)
93/189 cases(49％)

60％，細胞骨格を構成する中間径フィラメント構成タンパク質である Cytokeratin 8 は約 70％，機能がほとんど知られていないチロシンキナーゼ型受容体

Her-2 陽性症例においても，抗 Her-2 抗体による治である EPH receptor A10 （ EPHA10 ）は約 50 ％の療を続けるうちに耐性が生じることが問題になって症例で共通して発現していたが，正常乳房組織でのいることから，5,6) そのような患者に対しても有用な発現は認められなかった（Table 2）．現在，乳がん創薬ターゲットになり得るものと期待される．

で汎用されている抗体医薬トラスツズマブの標的分

続いて，上記候補分子の発現と臨床情報との相関

子 Her-2 が約 30 ％の陽性率であることを考慮する解析を試みた．その結果，Cytokeratin 8 と EPHA10と，これら 3 種類のタンパク質は，乳がんの優れたの発現は，乳がんの病期の進行と有意な相関が認め創薬ターゲットになり得るものと期待される．また，られた［Fig. 2(B）］．したがって，Cytokeratin 8 や

Her-2 陽性あるいは陰性症例において，これら候補

EPHA10 は乳がんの進行に関連するタンパク質でタンパク質の発現を調べたところ，Her-2 陽性患者あり，悪性度を客観的に予測・評価し得る診断マーのうち， TRAIL-R2 あるいは EPHA10 は，約 77％カーになり得るものと考えられる．近年， TRAIL-あるいは 62 ％の割合で発現しており，これら分子R2 は，がんの新たな分子標的として抗体医薬の開のうち，いずれかが発現している割合は約 87 ％の発が進んでおり，7,8) また Cytokeratin 8 はがんの悪症例であった．一方， Her-2 陰性の症例において性度に係わることが報告されている．9,10) 以上の結も，約 70％の症例が TRAIL-R2 あるいは EPHA10

果は，抗体プロテオミクス技術が，多種類の発現変いずれかに陽性であった［ Fig. 2 ( A ）］．現在臨床動タンパク質の中から，有用なマーカータンパク質で，抗 Her-2 抗体が乳がんに対する画期的な治療を迅速かつ効率的に絞り込むことが可能な極めて有薬として汎用されているが，TRAIL-R2 と EPHA10用な創薬基盤技術であることを示すものである．

も細胞膜タンパク質であることから，抗 Her-2 抗5.

おわりに体が適用されない Her-2 陰性症例に対する新規創本稿では，筆者らが確立した「抗体プロテオミク薬ターゲットになり得るものと期待される．また，ス技術」と，その応用例について紹介した．本技術

hon p.5 [100%]

No. 12

Fig. 2.

1705

Correlation Analysis between the Expression Proˆle of Biomarker Candidates and Clinical Information(A) The expression rate of drug target candidates, TRAIL-R2 and EPHA10, in Her-2 positive and negative cases. The expression of Her-2 in 28％ of breast
tumor cases describes gray. The expression of each candidate in Her-2 positive and negative cases describes black. (B) The expression rate of diagnosis marker candidates, Cytokeratin 8 and EPHA10, in each clinical stage (stage I; n ＝14, stage II; n＝87, stage III; n＝86).

により乳がんの創薬バイオマーカータンパク質の探

薬学研究科毒性学分野教授堤康央先生，独立行政索を試みた結果，有望な候補分子として， TRAIL-

法人医薬基盤研究所バイオ創薬プロジェクトリー

R2, Cytokeratin 8, EPHA10 を絞り込むことができダー角田慎一先生を始めとする，研究室のメンバーた．中でも TRAIL-R2, EPHA10 は，乳がんに対す諸氏の多大な協力を得て成されたものであり，このる新たな治療薬のターゲットになり得ることが期待場をお借りして御礼を申し上げます．また本研究のされる．現在，これら分子の詳細な機能解析を進め遂行にあたり，ご指導ご助言を賜りました富山大学

るとともに，抗体医薬の開発を目指した研究を進め

医学部附属病院外科病理学講座教授福岡順也先生，ている．今後，抗体プロテオミクス技術が，わが国大阪大学大学院薬学研究科薬剤学分野教授中川晋作の創薬研究に貢献することを願っている．

先生，同助教向洋平先生，に感謝の意を表します．なお本研究は，文部科学省科学研究費補助金，謝辞

本研究は，独立行政法人医薬基盤研究所

厚生労働科学研究費補助金創薬基盤推進研究事業，バイオ創薬プロジェクトチーフリーダー・大阪大学

厚生労働科学研究費補助金政策創薬総合研究事業のhon p.6 [100%]1706

Vol. 130 (2010)

支援を受けて実施したものです．
7)
REFERENCES1)
2)

3)

4)
5)

6)

Yates J. R., Ruse C. I., Nakorchevsky A.,
Annu. Rev. Biomed. Eng., 11, 4979 (2009).
Imai S., Mukai Y., Nagano K., Shibata H.,
Sugita T., Abe Y., Nomura T., Tsutsumi Y.,
Kamada H., Nakagawa S., Tsunoda S., Biol.
Pharm. Bull., 29, 13251330 (2006).
Nagano K., Imai S., Mukai Y., Nakagawa S.,
Abe Y., Kamada H., Tsunoda S., Tsutsumi
Y., Pharmazie, 64, 238241 (2009).
Camp R. L., Neumeister V., Rimm D. L., J.
Clin. Oncol., 26, 56305637 (2008).
Nahta R., Yu D., Hung M. C., Hortobagyi G.
N., Esteva F. J., Nat. Clin. Pract. Oncol., 3,269280 (2006).
Mehta K., Osipo C., TheScientiˆcWorldJour-8)9)10)nal, 9, 14381448 (2009).
Plummer R., Attard G., Pacey S., Li L., Razak A., Perrett R., Barrett M., Judson I.,
Kaye S., Fox N. L., Halpern W., Corey A.,
Calvert H., de Bono J., Clin. Cancer Res., 13,61876194 (2007).
Camidge D. R., Herbst R. S., Gordon M. S.,
Eckhardt S. G., Kurzrock R., Durbin B., IngJ., Tohnya T. M., Sager J., Ashkenazi A.,
Bray G., Mendelson D., Clin. Cancer Res., 16,12561263 (2010).
WolŠ J. M., Borchers H., Brehmer B. Jr.,
Brauers A., Jakse G., Urol. Int., 60, 152155(1998).
Fukunaga Y., Bandoh S., Fujita J., Yang Y.,
Ueda Y., Hojo S., Dohmoto K., Tojo Y.,
Takahara J., Ishida T., Lung Cancer, 38, 31
38 (2002).