T-G601

最

終

報

告

書

ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウム：
チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる in vitro 染色体異常試験
試験番号 T-G601

試験期間2022 年 1 月 14 日-2022 年 3 月 23 日

試験施設
株式会社ボゾリサーチセンター〒156-0042

東京研究所

東京都世田谷区羽根木 1-3-11

試験委託者
厚生労働省
〒100-8916

東京都千代田区霞が関 1-2-2

試験受託者
株式会社ボゾリサーチセンター〒151-0065

東京都渋谷区大山町 36-7

1

T-G6011.

GLP 陳述書
試験番号：T-G601

試験表題：

ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウム：チャイニーズ・ハム
スター培養細胞を用いる in vitro 染色体異常試験

本試験は以下の GLP 基準を遵守して実施したものです。

•「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準」（平成 23 年 3 月 31 日、薬食発 0331 第 8 号、平成 23･03･29 製局第 6 号、環保企発第 110331010 号）

年

試験責任者
株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

2

月

日

T-G601

2.

目次

1.

GLP 陳述書 ................................................................................................... 2

2.

目次 .............................................................................................................. 33.

試験実施概要 ................................................................................................ 6
3.1

試験番号 ............................................................................................... 6

3.2

試験表題 ............................................................................................... 6

3.3

試験目的 ............................................................................................... 6

3.4

規制に関する情報 ................................................................................. 6

3.4.1

GLP ............................................................................................... 63.4.2

毒性試験ガイドライン .................................................................... 6

3.5

試験委託者 ........................................................................................... 6

3.6

試験受託者 ........................................................................................... 6

3.7

試験施設 ............................................................................................... 6

3.8

試験責任者 ........................................................................................... 7

3.9

試験担当者 ........................................................................................... 7

3.10

試験日程 ............................................................................................... 7

3.11

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと ............................................ 73.12

資料保存 ............................................................................................... 7

3.13

試験責任者の署名 ................................................................................. 8

4.

要約 .............................................................................................................. 95.

緒言 ............................................................................................................ 106.

試験材料 ..................................................................................................... 106.1

被験物質及び陰性対照物質（溶媒） .................................................... 10

6.1.1

被験物質 ...................................................................................... 106.1.2

陰性対照物質（溶媒） .................................................................. 11

6.2

被験液の調製 ...................................................................................... 116.2.1

細胞増殖抑制試験 ......................................................................... 11

6.2.1.1

調製方法 ............................................................................. 11

6.2.1.2

調製頻度 ............................................................................. 116.2.2

染色体異常試験 ............................................................................ 11

6.2.2.1

調製方法 ............................................................................. 11

6.2.2.2

調製頻度 ............................................................................. 12

6.3

陽性対照物質 ...................................................................................... 12

6.3.1

陽性対照物質 1 ............................................................................. 12

6.3.2

陽性対照物質 2 ............................................................................. 126.4

試験系及びその選択理由 ..................................................................... 13
3

T-G601
6.4.1
6.5

7.

細胞株 .......................................................................................... 13
試薬 ................................................................................................... 13

6.5.1

S9 mix ......................................................................................... 136.5.2

培養液 .......................................................................................... 14

試験方法 ..................................................................................................... 15
7.1

容器及びスライド標本の識別法 ........................................................... 15

7.2

用量の設定 ......................................................................................... 157.2.1

細胞増殖抑制試験 ......................................................................... 157.2.2

染色体異常試験 ............................................................................ 167.3

培養容器数及び培養条件 ..................................................................... 16

7.4

処理方法 ............................................................................................. 167.4.1

細胞増殖抑制試験 ......................................................................... 167.4.2

染色体異常試験 ............................................................................ 177.5

細胞毒性に関連するデータの表示 ........................................................ 187.6

染色体標本の観察 ............................................................................... 18

7.6.1

観察手順 ...................................................................................... 187.6.2

染色体異常の分類 ......................................................................... 19

7.7

統計解析 ............................................................................................. 197.8

試験成立基準 ...................................................................................... 20

7.9

結果の判定基準................................................................................... 20

7.10

確認試験 ............................................................................................. 208.

試験結果 ..................................................................................................... 20
8.1

細胞増殖抑制試験 ............................................................................... 208.2

染色体異常試験................................................................................... 218.3

試験の成立 ......................................................................................... 22

9.

考察 ............................................................................................................ 2210.

結論 ............................................................................................................ 22

添付資料
Attachment 1

試験成績書（安定性） ................................................... 23

Attachment 2

Historical Data of the Chromosomal Aberration Tests in
CHL/IU Cells ................................................................ 25

表
Table 1Results of the chromosomal aberration test [Short-term
treatment: −S9 mix] ....................................................... 26

Table 2

Results of the chromosomal aberration test [Short-term
treatment: +S9 mix] ....................................................... 27
4

T-G601
Table 3Results of the chromosomal aberration test [Continuous
treatment: 24h] .............................................................. 28

付表Appendix 1

Results of the cell-growth inhibition test [Short-term
treatment: −S9 mix] ....................................................... 29

Appendix 2

Results of the cell-growth inhibition test [Short-term
treatment: +S9 mix] ....................................................... 30

Appendix 3

Results of the cell-growth inhibition test [Continuous
treatment: 24h] .............................................................. 31

Appendix 4

Results of the chromosomal aberration test [Short-term
treatment: −S9 mix] ....................................................... 32

Appendix 5

Results of the chromosomal aberration test [Short-term
treatment: +S9 mix] ....................................................... 33

Appendix 6

Results of the chromosomal aberration test [Continuous
treatment: 24h] .............................................................. 34

Appendix 7

Population doubling in the cell-growth inhibition test ...... 35

Appendix 8

Population doubling in the chromosomal aberration test .. 36

信頼性保証書 .................................................................................. 37

5

T-G6013.
試験実施概要3.1
試験番号T-G601

3.2

試験表題

ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウム：チャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる in vitro 染色体異常試験

3.3

試験目的

チャイニーズ・ハムスター肺線維芽細胞の培養細胞（CHL/IU）を用いて、ヘキサフ
ルオリドケイ酸（２－）二カリウムの染色体異常誘発能を検討した。

3.4
3.4.1
•

規制に関する情報
GLP「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準」（平成 23 年 3 月 31 日、薬食発 0331 第 8 号、平成 23･03･29 製局第 6 号、環保
企発第 110331010 号）

3.4.2
•

毒性試験ガイドライン「新規化学物質等に係る試験の方法について」（平成 23 年 3 月 31 日付け薬食発 0331 第 7 号厚生労働省医薬食品局長、平成
23・03・29 製局第 5 号経済産業省製造産業局長、環保企発第 110331009 号環境省総合環境政策局長連名通知）（最終改正：平成 30 年 3 月 29 日）•「 OECD Guidelines for Testing of Chemicals 473: In Vitro Mammalian
Chromosomal Aberration Test」（2016 年 7 月 29 日）

3.5

試験委託者

厚生労働省
医薬・生活衛生局〒100-8916

3.6

医薬品審査管理課

化学物質安全対策室

東京都千代田区霞が関 1-2-2

試験受託者

株式会社ボゾリサーチセンター〒151-0065

3.7

東京都渋谷区大山町 36-7

試験施設

株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所
6

T-G601〒156-0042

3.8

東京都世田谷区羽根木 1-3-11

試験責任者
株式会社ボゾリサーチセンター

3.9

東京研究所

試験担当者
被験物質管理責任者 ：
試験担当者

3.10

：

試験日程
試験開始日

： 2022 年

1 月 14 日

被験物質受領日： 2021 年 12 月 7 日

細胞増殖抑制試験
実験開始日： 2022 年

1 月 17 日

実験終了日： 2022 年

1 月 21 日

実験開始日： 2022 年

1 月 31 日

実験終了日： 2022 年

2 月 18 日： 2022 年

3 月 23 日

染色体異常試験

試験終了日

3.11

予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったこと

本試験に関し、予見することができなかった試験の信頼性に影響を及ぼす疑いのある事態及び試験計画書に従わなかったことはなかった。

3.12

資料保存

試験計画書原本（試験計画書変更書含む）、記録文書、生データ、被験物質保存試
料、報告書類（最終報告書の原本を含む）及び染色体標本は株式会社ボゾリサーチセンター

御殿場研究所の資料保存施設に保存する。なお、その期間は試験終了後 5 年間とする。期間終了後の取り扱いについては、厚生労働省
品審査管理課

医薬・生活衛生局

医薬

化学物質安全対策室と株式会社ボゾリサーチセンター間で協議し、その処置を決定する。

7

T-G601

3.13

試験責任者の署名
年

試験責任者
株式会社ボゾリサーチセンター

東京研究所

8

月

日

T-G601

4.

要約
ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウムの染色体異常誘発能を検討するため、チャイニーズ・ハムスター肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験の用量を設定するため、2000 μg/mL を最高用量とし、以下公比 2 で除した計 8 用量を設定し、細胞増殖抑制試験を行った。その結果、細胞増殖抑制率は、
短時間処理法の非代謝活性化では 250 μg/mL 以上の用量で、短時間処理法の代謝活性化では 125 μg/mL 以上の用量で、連続処理法では 62.5 μg/mL 以上の用量で 50%以上を示した。50%細胞増殖抑制濃度（IC 5 0 ）は、短時間処理法の非代謝活性化で 151 μg/mL、
短時間処理法の代謝活性化で 114 μg/mL、連続処理法で 53.7 μg/mL であった。以上の結果より、染色体異常試験の用量は、短時間処理法の非代謝活性化では 200 μg/mL を最高用量とし、以下等差 25.0 μg/mL で減じた 6 用量を、短時間処理法の代謝活性化では 175 μg/mL を最高用量とし、以下等差 25.0 μg/mL で減じた 6 用量を、連続処理法
では 80.0 μg/mL を最高用量とし、以下等差 10.0 μg/mL で減じた 6 用量を設定した。
染色体異常試験では、細胞増殖抑制率が 55 ± 5%を示した用量を最高用量とし、短時間処理法の非代謝活性化では 200、175 及び 150 μg/mL、短時間処理法の代謝活性化では 150、125 及び 100 μg/mL、連続処理法では 70.0、60.0 及び 50.0 μg/mL を観察した。その結果、短時間処理法の非代謝活性化で染色体構造異常（TA）の出現頻度は
陰性対照群との比較で有意差はみられなかったが、数的異常（倍数性細胞及び核内倍加細胞）の出現頻度は陰性対照群と比較して統計学的に有意な増加を示し（Fisher の直接確率計算法、p < 0.05）、その出現率は陰性対照群の施設内背景データの 95%管理上限を超え、傾向検定においても有意な用量依存性が認められた（Cochran Armitageの傾向検定、p < 0.05）。短時間処理法の代謝活性化及び連続処理法では、染色体構造異常（TA）及び数的異常（倍数性細胞及び核内倍加細胞）の出現頻度はいずれの処理法においても陰性対照群との比較で有意差はみられなかった。
なお、すべての処理法で、試験成立の基準を満たしたため、試験は適切に実施されたと考えられた。
以上の結果から、ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウムは本試験条件下において、染色体構造異常は誘発しない（陰性）が、数的異常を誘発する（陽性）と結論した。

9

T-G601

5.

緒言
ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウムのほ乳類培養細胞を用いる染色体異常試験を実施したので、その成績を報告する。

6.
試験材料
6.1
被験物質及び陰性対照物質（溶媒）
6.1.1
被験物質
以下の情報は非 GLP で実施された分析結果に基づく。
製造者

：

名称

： ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウム

別名： けいふっ化カリウム、ヘキサフルオロけい酸カリウム

CAS 番号： 16871-90-2

官報公示整理番号： (1)-324（化審法）

構造式又は示性式：

分子式： K 2 SiF 6

分子量： 220.27

外観： 白色の粉末

融点/凝固点： 750°C

溶解性： 溶解性検討の結果、水、DMSO、アセトンに不溶であっ
た。

ロット番号

：

入手量

： 500 g（T-3600 と共用）

純度

： 99.5%

保存条件： 冷蔵、遮光、密閉

保存方法： 気密容器に入れ、冷蔵庫内（許容範囲：1°C~10°C、実測値は許容範囲内であった）に保存。

取扱い上の注意： 作業場の換気を十分に行い、マスク、保護眼鏡、保護手袋等の適切な保護具を着用し、直接の接触を防ぐ。取り扱い後は、手、顔等を良く洗い、うがいをする。

保存場所： 被験物質保存室

安定性確認： 当試験に使用した被験物質の安定性は、同ロット品について別途実施された安定性試験（赤外吸収スペクトル法）
結果から確認した（試験番号 A-3343、Attachment 1）。

保存試料： 被験物質約 1 g を保存試料として保存した。保存試料は
10

T-G601
T-3600 と共通とした。
残余品の処理6.1.2： 使用後の残余は全て廃棄した。

陰性対照物質（溶媒）： 0.5w/v% カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロ ー ス ナ ト リ ウ ム

名称（CMC-Na）水溶液
メーカー： 自家調製

ロット番号： C20220119

保存条件

： 冷蔵

保存場所

： 標本作製室

媒体の選択理由： 被験物質が注射用水、DMSO 及びアセトンで懸濁であり、被験物質の沈降が早かったため、懸濁溶媒として
CMC-Na 水溶液を選択した。また、発泡、発熱、吸熱は認められなかった。
： CMC-Na（化学用、富士フイルム和光純薬株式会社、ロ

調製方法

ット番号 SKJ2353）1.0000 g を秤取し、これに注射用水（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、ロット番号
1G70N）200 mL を加えて溶解後、121°C、20 分高圧蒸
気滅菌して 0.5 w/v%CMC-Na 水溶液とした。

6.2

被験液の調製

調製操作は、紫外線吸収膜付蛍光灯下で実施した。

6.2.1
6.2.1.1

細胞増殖抑制試験
調製方法

10 mL のメスフラスコに被験物質 0.2000 g を秤量し、適量の溶媒を加えて懸濁させたのち更に溶媒を加えて 10 mL とし、最高用量群液（調製濃度：20.0 mg/mL）を調製した。これを、溶媒で段階的に希釈（公比 2）して、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、
0.313 及び 0.156 mg/mL 液とし、計 8 濃度を調製した。この時の用量（細胞暴露濃度）については第 7.2.1 項参照。

6.2.1.2

調製頻度

用時に調製し、調製後 1 時間以内に使用した。

6.2.2
6.2.2.1

染色体異常試験
調製方法

50 mL のメスフラスコに被験物質 0.1000 g を秤量し、適量の溶媒を加えて懸濁させたのち更に溶媒を加えて 50 mL とし、最高用量群液（調製濃度：2.00 mg/mL）を調製
11

T-G601
した。これを、溶媒で直接希釈して、1.75、1.50、1.25、1.00、0.800、0.750、0.700、0.600、0.500、0.400 及び 0.300 mg/mL 液とし、計 12 濃度を調製した。このうち、短時間処理法の非代謝活性化では 2.00、1.75、1.50、1.25、1.00 及び 0.750 mg/mL の 6
濃度、短時間処理法の代謝活性化では 1.75、1.50、1.25、1.00、0.750 及び 0.500 mg/mLの 6 濃度、連続処理法では 0.800、0.700、0.600、0.500、0.400 及び 0.300 mg/mL の6 濃度を使用した。この時の用量（細胞暴露濃度）については第 7.2.2 項参照。

6.2.2.2

調製頻度

用時に調製し、調製後 2 時間以内に使用した。

6.3

陽性対照物質以下の 2 つの化合物を用いた。これらの陽性対照物質はガイドライン（OECD TG473）
で推奨され、in vitro 染色体異常試験に広く使用されており、また、背景データが豊富であることから選択した。

6.3.1
1)

2)

陽性対照物質 1

マイトマイシン（代謝活性化無し）
名称： Mitomycin C（略称：MMC）

CAS 番号： 50-07-7

メーカー： 富士フイルム和光純薬株式会社

ロット番号： LEQ1937

保存条件

： 冷所

保存場所

： 培養細胞試験室

MMC 溶液の調製用時に調製した。
MMC 1.0 mg を遠沈管に秤取し、これに生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、ロット番号 K1C94）2 mL を加えて溶解し、0.5 mg/mL 溶液とした。
この液を生理食塩液で更に 200 倍希釈して 2.5 μg/mL 溶液とした。

3)

MMC の用量
短時間処理法（代謝活性化無し）で 0.075 μg/mL、連続処理法で 0.050 μg/mL と
した。

6.3.2
1)

陽性対照物質 2

シクロフォスファミド（代謝活性化有り）
名称： Cyclophosphamide monohydrate（略称：CP）

CAS 番号： 6055-19-2

規格： 生化学用（97%以上）

メーカー： 富士フイルム和光純薬株式会社
12

T-G6012)

ロット番号： SKE6784

保存条件： 冷蔵、遮光保存場所： 培養細胞試験室

CP 溶液の調製
用時調製した。
CP 14.0 mg を秤取した。これに生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場、
ロット番号 K1C94）を 20 mL 加えて溶解し、0.70 mg/mL 溶液を調製した。

3)

CP の用量
短時間処理法（代謝活性化系）で 14 μg/mL とした。

6.4

試験系及びその選択理由

当試験で使用する細胞株はガイドライン（OECD TG473）で推奨されている細胞の一つであり、in vitro 染色体異常試験に広く使用されており、背景データが豊富である
ことから選択した。

6.4.1

細胞株

細胞名

： チャイニーズ・ハムスター肺由来の線維芽細胞（CHL/IU）

供給源

：

入手日

： 2014 年 4 月 2 日

特性検査： 細胞の形態が正常（シャーレ底面に接着し紡錘状の形態を有する）、細胞倍加時間 15~20 時間以内（実測値；17.3 時間）、染色体数が 25 本の細胞が 70%以上、染色体異常発生率が 5%未満であり、マイコプラズマの汚染がないことが確認されたものを用いた。

供試時の継代数： 使用時の細胞継代数は細胞増殖抑制試験で 10 継代、染色体異常試験で 14 継代であった（許容範囲：3~30 継
代）。

6.5
6.5.1
1)

試薬
S9 mix

S9
名称

： S-9

メーカー

： オリエンタル酵母工業株式会社

内容量： 2 mL/バイアル

ロット番号： 21090306、21111209

由来： SD 系雄ラット、肝臓

誘導物質： フェノバルビタール（PB）及び 5,6-ベンゾフラボン（BF）
13

T-G601
誘導物質の処理： PB：4 日間腹腔内投与（30、60、60 及び 60 mg/kg）
BF：PB 投与 3 日目に単回腹腔内投与（80 mg/kg）： 2021 年 9 月 3 日（ロット番号；21090306）

製造日

2021 年 11 月 12 日（ロット番号；21111209）
使用期限： 2022 年 3 月 2 日（ロット番号；21090306）
2022 年 5 月 11 日（ロット番号；21111209）

週齢・性： 7 週齢・雄

平均体重： 215.8 ± 7.2 g（ロット番号；21090306）
255.5 ± 9.0 g（ロット番号；21111209）

2)

保存条件

： 冷凍（−70°C 以下）

保存場所： 培養細胞試験室

コファクター
名称： Cofactor C

メーカー： オリエンタル酵母工業株式会社

内容量： 4.7 mL/バイアル

ロット番号： C21090106、C21111009

使用期限： 2022 年 2 月 28 日（ロット番号；C21090106）
2022 年 5 月 9 日（ロット番号；C21111009）

3)

保存条件

： 冷凍（−70°C 以下）

保存場所： 培養細胞試験室

S9 mix の調製方法
用時調製した。S9 とコファクターを 2：4.7 の割合（各 1 バイアル）で無菌的に混合して S9 mix を調製した。S9 mix の組成（1 mL 中）を以下に示す。
水： 0.7 mL

S9

： 0.3 mL

MgCl 2： 5 µmolKCl： 33 µmol

グルコース-6-リン酸： 5 µmol
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）： 4 µmol
HEPES 緩衝液（pH7.2）： 4 µmol

6.5.2

培養液

Minimum Essential Medium (MEM)に非働化した牛血清（bovine serum、BS）を最終濃度が 10v/v%となるように添加した培養液（10%BS-MEM）を調製した。調製後の培養液は冷蔵保存し、1 箇月以内に使用した。
1)

牛血清
14

T-G601

2)

メーカー： Thermo Fisher Scientific Inc.

ロット番号

： 2261346、2402160

保存条件： 冷凍（−20°C 以下）

保存場所： 培養細胞試験室

Minimum Essential Medium（MEM）
メーカー： ナカライテスク株式会社

ロット番号： L1K6990

保存条件

： 冷蔵

保存場所

： 標本作製室

7.

試験方法
各処理法の概略を以下に示す。
短時間処理法 （代謝活性化無し）： S9 mix 非存在下で被験物質/対照物質 6 時間処理、その後 10%BS-MEM 培養液で 18 時間培養（回復培養）
短時間処理法（代謝活性化有り）： S9 mix 存在下で被験物質/対照物質 6 時間処理、その後10%BS-MEM 培養液で 18 時間培養（回復培養）
連続処理法（代謝活性化無し）： S9 mix 非存在下で被験物質/対照物質 24 時間処理7.1

容器及びスライド標本の識別法

容器は試験番号、試験群･処理法及び用量を示す記号･数字で識別した。染色体観察用のスライドは盲検法による観察のため、試験番号及び各容器に対応したコード番号を記したラベルで識別した。

7.2
7.2.1

用量の設定
細胞増殖抑制試験

各処理法における用量を設定する目的で、細胞毒性/細胞増殖抑制及び被験液添加による培養液性状の変化（沈殿物の有無を含む）を検討した。細胞毒性/細胞増殖抑制の強さは細胞集団倍加数（Population Doubling：PD）及び相対細胞集団倍加数（Relative
Population Doubling：RPD）から算出する細胞増殖抑制率により推定した（詳細は第7.4.1 項参照）。
最高用量は、ガイドライン「新規化学物質等に係る試験の方法について」に基づいて 2000 μg/mL とした。以下、公比 2 で除して 1000、500、250、125、62.5、31.3 及び 15.6 µg/mL を設け、計 8 用量を各処理群に設定した。
被験物質処理群に加え、各処理法に陰性対照群を設けた。

15

T-G6017.2.2

染色体異常試験

細 胞 増殖 抑制 試験 の 結果 、 細胞 増殖 抑制 率 は、 短 時間 処理 法の 非 代謝 活 性化 では
250 μg/mL 以上の用量で、短時間処理法の代謝活性化では 125 μg/mL 以上の用量で、連続処理法では 62.5 μg/mL 以上の用量で 50%以上を示した。50%細胞増殖抑制濃度（IC 5 0 ）は、短時間処理法の非代謝活性化で 151 μg/mL、短時間処理法の代謝活性化で 114 μg/mL、連続処理法で 53.7 μg/mL であった。処理開始時に 62.5 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められたが、短時間処理法では培地交換によりある程度除去できると判断し、連続処理法では、沈殿の認められない用量を設定したため、標本観察への影
響は、無いものと判断した。
また、被験物質処理群に加えて各処理法に陰性対照群及び陽性対照群を設けた。

処理法
短時間処理法
非代謝活性化
短時間処理法
代謝活性化
連続処理法

7.3
1)

適用濃度（μg/mL）
200、175、150、125、100、75.0
175、150、125、100、75.0、50.0
80.0、70.0、60.0、50.0、40.0、30.0

培養容器数及び培養条件
培養容器数
培養にはプラスチック製のプレート（シャーレ）を用いた。
細胞増殖抑制試験では各群 1 系列（single culture：培養終了時の細胞濃度測定用）、
染色体異常試験では各群 3 系列（triplicate culture：2 系列を染色体標本作製用、1 系列を培養終了時の細胞濃度測定用）とした。
また、細胞増殖抑制試験及び染色体異常試験とも、別に 1 枚のプレートを処理開始時の細胞濃度測定用として使用した。

2)

培養条件
温度 37°C、加湿及び 5%CO 2 下で培養した。

7.4
7.4.1

処理方法
細胞増殖抑制試験

試験操作のうち 1) ~ 5)の操作については、無菌環境下で実施した。
1)

プレート（培養液 5.0 mL）当たり 2×10 4 個の細胞を播種し、3 日間培養した。

2)

培養 3 日後に、倒立位相差顕微鏡下で細胞の状態に異常がないことを確認した。

3)

下表に従って、培養液を除去し、陰性対照液又は被験液、あるいは S9 mix を添加した。
また、処理開始時細胞濃度測定用のプレート 1 枚について、0.25%trypsin 処理後に細胞を回収し、血球計算盤を用いて処理開始時の細胞濃度を測定した。

16

T-G601

処理内容
培養液除去量S9 mix 添加量（S9 蛋白最終濃度）
陰性対照液又は被験液
添加量4)

短時間処理法
代謝活性化無し
代謝活性化有り0.500 mL
1.333 mL
0.833 mL
（1.049 mg/mL）
0.500 mL

0.500 mL

連続処理法
0.500 mL

0.500 mL

上記操作直後に、処理培養液の色調を肉眼で観察し、また、倒立位相差顕微鏡下で沈殿の有無を観察した。その後、短時間処理法では 6 時間、連続処理法では 24時間培養（処理）した。

5)

短時間処理法では、6 時間の処理後、倒立位相差顕微鏡下で沈殿の有無と細胞の状態を観察した。次いで、処理培養液を捨て、2%牛血清添加生理食塩液で細胞を洗浄し、新しい 10%BS-MEM 培養液 5.0 mL を加えて 18 時間培養（回復培養）した。

6)

培養終了後に、倒立位相差顕微鏡下で沈殿の有無と細胞の状態を観察した。

7)

次いで、各プレートを 0.25% trypsin で処理して細胞を回収し、血球計算盤を用いて培養終了時の細胞濃度を測定した。

8)

処理開始時及び培養終了時の細胞濃度から、次の式 1 及び 2 に従い、各群の PD
及び RPD を算出した。
log（培養終了時の細胞濃度 ÷ 処理開始時の細胞濃度）
log 2

PD =

〔式 1〕

RPD (%) =（被験物質処理群における PD）（陰性対照群における PD）

×100
〔式 2〕

9)

RPD から細胞増殖抑制率（=100-RPD）を算出した。細胞増殖抑制率が 50%以上の用量がみられたため、50%を挟む 2 点の直線式から、IC 5 0 を算出した。

7.4.2

染色体異常試験1)

第 7.4.1 項の 1) ~ 3) と同じ操作を行った（処理開始時の細胞濃度測定を含む）。

2)

下表に従って、培養液を除去し、陰性対照液、被験液又は陽性対照液、あるいはS9 mix を添加し、各処理群における処理培養液とした。

17

T-G601
処理内容
培養液除去量

短時間処理法
代謝活性化無し
代謝活性化有り0.500 mL
1.333 mL
(0.150 mL) *(0.933 mL) *0.833 mL
（1.069 mg/mL）

S9 mix 添加量（S9 蛋白最終濃度）
陰性対照液又は被験0.500 mL
液添加量
陽性対照液
MMC: 0.150 mL
添加量*：陽性対照群での培養液除去量

3)

連続処理法
0.500 mL
(0.100 mL) *0.500 mL

0.500 mL

CP: 0.100 mL

MMC: 0.100 mL

第 7.4.1 項の 4) ~ 5) と同じ操作を行った（処理直後及び短時間処理法での 6 時間
培養後の培養液と細胞の観察を含む）。
ただし、各群 2 枚の染色体標本作製用プレートについては、培養終了の約 2 時間
前にコルセミド（デメコルシン溶液、10 μg/mL）を 0.1 mL 加えた。

4)

培養終了後、各濃度群 2 枚の染色体標本作製用プレートについて、以下の手順で染色体標本を作製した。染色体標本はプレート当たり 2 枚作製した。
0.25% trypsin 処理後に細胞を回収し、0.075 M 塩化カリウム溶液で約 15 分間低張処理した後、カルノア固定液（メチルアルコール/酢酸、3/1、v/v）で固定した。
固定した細胞をスライドガラス 1 枚につき 2 箇所に滴下し、風乾したのちギムザ液で染色して染色体標本とした。

5)

各群の残りの 1 枚のプレート（細胞濃度測定用プレート）を用いて沈殿物の有無
及び細胞の状態を確認した。次いで、第 7.4.1 項の 7) ~ 9) の手順で PD、RPD 及
び細胞増殖抑制率を算出した。

7.5

細胞毒性に関連するデータの表示

細胞濃度、RPD 及び細胞増殖抑制率は、四捨五入により整数表示、PD は四捨五入により小数点第 2 位まで表示した。また、IC 5 0 は有効数字 3 桁で表示した。

7.6
7.6.1

染色体標本の観察
観察手順

染色体が良く展開し、染色体モード数±2 のセントロメアを含んだ分裂中期像の細胞を顕微鏡下（倍率：×600）で各群 300 個（2 系列×150 個/系列）観察し、構造異常の種
類と異常を持つ細胞の出現数を計数し、出現率を算出した。同時に数的異常（倍数体及び核内倍加細胞を区別して計数する）の出現数を計数し、出現率を算出した。観察は盲検法により行った。
陰性対照群及び陽性対照群は全て観察した。被験物質処理群は、細胞増殖抑制率が55 ± 5%を示した用量を最高用量とした 3 用量、すなわち、短時間処理法の非代謝活性化では 200、175 及び 150 μg/mL、短時間処理法の代謝活性化では 150、125 及び100 μg/mL、連続処理法では 70.0、60.0 及び 50.0 μg/mL を観察した。
18

T-G6017.6.2

染色体異常の分類

染色体異常は構造異常と数的異常に大別し、構造異常は更に以下のように定義・分類した。なお、構造異常については、ギャップを含む場合（Total number of cells withaberration including gap：TAG）と含まない場合（Total number of cells with aberration
excluding gap：TA）に分けて集計した。
1)

構造異常
ギャップ（g）： 染色分体型(ctg)及び染色体型(csg)におけるギャップとは染色分体の同軸線上に、染色分体の幅以下で明瞭な非染色部位が認められるもの

染色分体型切断(ctb) ： 断片が染色分体の同軸線上からはずれているもの及び非染色部位が染色分体の同軸線上にあっても、非染色部位の長さが染色分体の幅以上に離れているもの
染色分体型交換(cte) ： 2 ヵ所以上で 生じた切 断が相互に再結 合する 異常であり、染色体内交換と染色体間交換に分類できる。四放射状交換、三放射状交換などがある
染色体型切断(csb)： 分類は ctb に準ずる。非染色部位が染色体の同軸線上からはずれており動原体が認められないもの及び非染色部位が染色体の同軸線上にあっても、非染色部位の長さが染色分体の幅以上に長いもの

染色体型交換(cse)： 染色体内交換と染色体間交換に分類できる。二動原体染
色体、環状染色体などがある

その他(other)2)： 断片化(frg)などがある

数的異常
染色体数が、その細胞が本来持っている固有の数（二倍体）と異なり、倍加したもの（3 倍体、4 倍体など）。
倍数性： 倍数性細胞（polyploid cell）
核内倍加の細胞（cells with endoreduplicatedchromosomes）

7.7

統計解析

それぞれの処理法ごとに、ギャップを含まない場合（TA）の染色体構造異常を有する細胞の総頻度、数的異常を有する細胞（倍数性細胞及び核内倍加細胞の合計）の総頻度について、以下の統計解析を行った。陰性対照群と被験物質処理群間で Fisher の直接確率計算法による対比較（有意水準：0.05、片側）を行った。
上記の比較において、短時間処理法において有意な増加が認められたため、CochranArmitage の傾向検定（有意水準：0.05、片側）を行った。
また、染色体構造異常については、陰性対照群と陽性対照群との間でも Fisher の直19

T-G601
接確率計算法による対比較（有意水準：0.05、片側）を行った。
いずれの検定も増加を示す場合についてのみ評価した。

7.8

試験成立基準以下に示す全ての基準を満たした場合、試験成立とする。
1)

観察可能な用量が 3 用量以上あること

2)

陰性対照群における染色体異常の出現率が、陰性対照群背景データの 95%管理範
囲内（Mean ± 1.96 SD）であること

3)

陽性対照群における染色体構造異常の出現頻度が、陰性対照群と比べて有意な増加を示すこと4)試験（培養）環境に問題が認められないこと

7.9

結果の判定基準

以下の全ての基準を満たす場合、被験物質は染色体構造異常又は数的異常（倍数性細胞及び核内倍加細胞）誘発性を有する（陽性）と判定する。
1)

少なくとも 1 つの被験物質濃度群における染色体異常出現頻度が、陰性対照群と比べて有意な増加を示す

2)

上記の増加には Cochran Armitage の傾向検定で有意な用量依存性がみられる

3)増加を示した被験物質濃度群の出現率が、陰性対照群背景データの 95%管理範囲
外である

7.10

確認試験

確認試験は実施しなかった。

8.
試験結果
8.1
細胞増殖抑制試験
結果を Appendix 1~3、Appendix 7 に示した。
1)

培養液の色調変化
すべての処理法の 250 μg/mL 以上の用量で淡黄色、125 及び 62.5 μg/mL の用量で淡橙色への色調変化が観察された。

2)

沈殿
短時間処理法の非代謝活性化では、被験液添加直後及び処理終了時には
62.5 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められた。なお、2000、1000 及び 62.5 μg/mL
では回復培養終了時には沈殿はみられなくなった。短時間処理法の代謝活性化では、被験液添加直後及び処理終了時には 62.5 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められた。なお、250、125 及び 62.5 μg/mL では回復培養終了時には沈殿はみられなくなった。連続処理法では、62.5 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められた。

20

T-G601
3)

細胞毒性
細胞増殖抑制率は、短時間処理法の非代謝活性化では 250 μg/mL 以上の用量で、
短 時 間 処 理 法 の 代 謝 活 性 化 で は 125 μg/mL 以 上 の 用 量 で 、 連 続 処 理 法 で は62.5 μg/mL 以上の用量で 50%以上を示した。50%細胞増殖抑制濃度（IC 5 0 ）は、
短 時 間 処 理 法 の 非 代 謝 活 性 化 で 151 μg/mL 、 短 時 間 処 理 法 の 代 謝 活 性 化 で
114 μg/mL、連続処理法で 53.7 μg/mL であった。

8.2

染色体異常試験

結果を Table 1~3、Appendix 4~6 及び Appendix 8 に示した。
1)

培養液の色調変化
被験液処理液の細胞への処理時における色調変化は、短時間処理法の非代謝活性化では 200 μg/mL の用量で淡黄色、175、150、125、100 及び 75.0 μg/mL の用量
で淡橙色、短時間処理法の代謝活性化ではすべての用量で淡橙色、連続処理法では 60.0 μg/mL 以上の用量で淡橙色への色調変化が観察された。

2)

沈殿
短時間処理法の非代謝活性化では、被験液添加直後及び処理終了時には
100 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められた。なお、回復培養終了時には沈殿はみられなくなった。短時間処理法の代謝活性化では、被験液添加直後には 100 μg/mL
以上の用量で沈殿が認められ、処理終了時には 75.0 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められた。なお、回復培養終了時には沈殿はみられなくなった。連続処理法では、被験液添加直後には 80.0 μg/mL の用量で沈殿が認められた。なお、処理終了
時には 70.0 μg/mL 以上の用量で沈殿が認められた。

3)

細胞毒性
細胞増殖抑制率は、短時間処理法の非代謝活性化では 200 μg/mL、短時間処理法の代謝活性化では 150 μg/mL 以上の用量で、連続処理法では 70.0 μg/mL 以上の用量で 50%以上を示した。

4)

観察結果
染色体構造異常（TA）の出現頻度は、短時間処理法の非代謝活性化では 200、175
及び 150 μg/mL の用量で 3、3 及び 1、短時間処理法の代謝活性化では 150、125
及び 100 μg/mL の用量で 4、3 及び 3、連続処理法では 70.0、60.0 及び 50.0 μg/mLの用量で 2、1 及び 1 であり、対応する陰性対照群との間に有意差はみられなかった。
数 的 異 常 の 出 現 頻 度 は 、 短 時 間 処 理 法 の 非 代 謝 活 性 化 で は 200 、 175 及 び
150 μg/mL の用量で 23、2 及び 2、短時間処理法の代謝活性化では 150、125 及び100 μg/mL の用量で 1、3 及び 3、連続処理法では 70.0、60.0 及び 50.0 μg/mL の用量で 1、1 及び 3 であり、短時間処理法の非代謝活性化で陰性対照群と比較して統計学的に有意な増加を示し（Fisher の直接確率計算法、p < 0.05）、その出現率は陰性対照群の施設内背景データの 95%管理上限を超え、傾向検定においても
21

T-G601
有意な用量依存性が認められた（Cochran Armitage の傾向検定、p < 0.05）。D 2 0
値は 0.603 mg/mL であった。短時間処理法の代謝活性化及び連続処理法では、対応する陰性対照群との間に有意差はみられなかった。

8.3

試験の成立

すべての処理法で、7.8 項の基準を満たしたため、試験は適切に実施されたと考えら
れた。

9.

考察
ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウムの染色体異常誘発能を検討するため、チャイニーズ・ハムスター肺由来線維芽細胞（CHL/IU）を用いた染色体異常試験を実施した。
染色体異常試験では、細胞増殖抑制率が 55 ± 5%を示した用量を最高用量とし、短時間処理法の非代謝活性化では 200、175 及び 150 μg/mL、短時間処理法の代謝活性化では 150、125 及び 100 μg/mL、連続処理法では 70.0、60.0 及び 50.0 μg/mL を観察した。その結果、短時間処理法の非代謝活性化で染色体構造異常（TA）の出現頻度は
陰性対照群との比較で有意差はみられなかったが、数的異常（倍数性細胞及び核内倍加細胞）の出現頻度は陰性対照群と比較して統計学的に有意な増加を示し（Fisher の直接確率計算法、p < 0.05）、その出現率は陰性対照群の施設内背景データの 95%管理上限を超え、傾向検定においても有意な用量依存性が認められた（Cochran Armitageの傾向検定、p < 0.05）。短時間処理法の代謝活性化及び連続処理法では、染色体構造異常（TA）及び数的異常（倍数性細胞及び核内倍加細胞）の出現頻度はいずれの処理法においても陰性対照群との比較で有意差はみられなかった。

10. 結論
ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウムは本試験条件下において、染色体構造異常は誘発しない（陰性）が、数的異常を誘発する（陽性）と結論した。

22

T-G601
Attachment 1 (1/2)
No.A3345‑1/2
試験成績書
試験番号

A‑3345

試験項目

安定性試験

被験物質

ヘキサフノレオリドケイ酸 (2‑)二カリウム

ロット番号
保存条件

冷 蔵 ( 許 容 範 囲 : lOC~10oC) 、遮光、密閉試験施設

株式会社ボゾリサーチセンター

測定日

2021年 12月 28 日(前値)

御殿場研究所2022年 2月 22 日(後値)
測定項目

赤外吸収スベクトル(臭化カリウム錠剤法)

判定基準
赤外吸収スベクトル:

前値で得られた赤外吸収スペクトノレと同等(主な吸収について、同一波数域に同様な強度の吸収を認める)であることを確認する。

結果
赤外吸収スペクトル:

前値で得られた赤外吸収スベクトルと同等(主な吸収について、同一波数域に同様な強度の吸収を認める)であった。
赤外吸収スベクトルを次ページに示す。

申ナ

定

安定性評価

適
赤外吸収スペクトルが前値と同等であったことから、2月 28 日から 2022年 2月 22 日
被 験 物 質 は 2021年 1までの問、保存条件下で安定であったと判定した。
本 試 験 は 以 下 の GLP基準を遵守して実施した。
「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準j(平成 23年 3月 31 日:薬食発 0331第 8号、平成 23・03・29製 局 第 6号、
環 保 企 発 第 110331010号)
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試験責任者
株式会社ボゾリサーチセンター

御殿場研究所23

T-G601
Attachment 1 (2/2)
No.A3345・2
/
2
試験成績書

赤外吸収スベクトル:
前値

1
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河
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3

目

24

T-G601
Attachment 2

Historical Data of the Chromosomal Aberration Tests in CHL/IU Cells
Negative control

Positive control

Short-term treatment (50 studies, 15900 cells)
PolyTA
S9 mix Time
(%)
(%)
Mean
0.7
0.7
S.D.
0.2
0.3
+
6
1.1
1.3
UCL
0.3
0.1
LCL

Short-term treatment (50 studies, 15000 cells)
Poly
Substance S9 mix Time
(%)
Mean
0.0
S.D.
0.0
CP
+
6
0.0
UCL
0.0
LCL

Short-term treatment (50 studies, 15900 cells)
PolyTA
S9 mix Time
(%)
(%)
Mean
0.6
0.8
S.D.
0.2
0.3
6
1.0
1.4
UCL
0.2
0.2
LCL

Short-term treatment (50 studies, 15300 cells)
Poly
Substance S9 mix Time
(%)
Mean
0.1
S.D.
0.2
MMC
6
0.5
UCL
0.0
LCL

Continuous treatment (50 studies, 15900 cells)
PolyTA
S9 mix Time
(%)
(%)
Mean
0.7
0.7
S.D.
0.3
0.3
24
1.3
1.3
UCL
0.1
0.1
LCL

Continuous treatment (50 studies, 15300 cells)
Poly
Substance S9 mix Time
(%)
Mean
0.2
S.D.
0.2
MMC
24
0.6
UCL
0.0
LCL

TA
(%)
60.7
11.5
83.2
38.2

TA
(%)
21.8
3.8
29.2
14.4

TA
(%)
24.1
4.1
32.1
16.1

Cumulative background data of chromosome aberration tests in cultured Chinese hamster cells line (CHL/IU), carried out
under the same study conditions at BoZo Research Center Inc. from April 2018 to October 2021.
Negative control: solvent or extraction vehicle of the test formulations (water for injection, isotonic sodium chloride
solution, dimethyl sulfoxide, acetone, 1,4-dioxane or culture medium)
Positive control: CP; Cyclophosphamide, 14 μg/mL
MMC; Mitomycin C, 0.075 μg/mL (for the short-term treatment)
MMC; Mitomycin C, 0.050 μg/mL (for the continuous treatment)
S9 mix : + ; with metabolic activation - ; without metabolic activation
Time : Duration of treatment. Short-term treatment (6-hour treatment) was followed by 18-hour non-treatment
culture.
Poly : polyploid cells and endoreduplication cells
TA : total number of cells with aberrations excluding gaps
UCL : 95% control limits(upper control limit)
LCL : 95% control limits(lower control limit When calculated value was less than 0, LCL value was regarded as 0%)25

T-G601
Table 1

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster cells
Results of the chromosomal aberration test [Short-term treatment: -S9 mix]

Number of cells with numericalchromosomal aberration b)
Treatment S9 Dose Level
RPD
Plate
Plate
Endore(h)mix (μg/mL)(%)
Cells d) Polyploid
Cells c)
ctb
cte
csb
cse
other
TA
g
TAG
duplicated
Total
cell
observed
observed
cell
1
150
0
1
0
0
0
1
0
1
1
152
2
0
2
100
NC
2
150
0
0
0
1
0
1
0
1
2
150
0
0
0
Total
300
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
Total
302
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)#
1
150
0
0
0
0
0
0
0
0
1
150
0
0
0
90
150
2
150
1
0
0
0
0
1
0
1
2
152
2
0
2
Total
300
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
Total
302
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
1
150
0
1
0
0
0
1
0
1
1
152
1
1
2
6
71
175
2
150
0
2
0
0
0
2
0
2
2
150
0
0
0
Total
300
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
Total
302
1(0.3)
1(0.3)
2(0.7)
1
150
0
2
0
0
0
2
0
2
1
159
6
3
9
43
200
2
150
0
1
0
0
0
1
0
1
2
164
7
7
14
Total
300
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
Total
323
13(4.0)10(3.1) 23*(7.1)
1
150
1
21
0
0
0
22
0
22
1
150
0
0
0
76
PC
2
150
5
28
0
0
0
33
0
33
2
150
0
0
0
Total
300
6(2.0) 49(16.3) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 55*(18.3) 0(0.0)
55(18.3)
Total
3000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)a): ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange, other: including fragmentation, g: chromatid or chromosome gapb): Value in the parentheses indicates percentage against the total number of cells observed. c): Diploid cells d): Diploid, polyploid, and endoreduplicated cells
TA: Total number of cells with aberration excluding gap, TAG: Total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC: Positive control (mitomycin C, 0.075 μg/mL)
RPD: Relative population doubling*: p < 0.05 (significantly different from the negative control by Fisher’s exact test)#: p < 0.05 (statistically significant trend by Cochran-Armitage trend test)
Number of cells with structural chromosomal aberration a), b)

26

T-G601
Table 2

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster cells
Results of the chromosomal aberration test [Short-term treatment: +S9 mix]

Number of cells with numericalchromosomal aberration b)
Treatment S9 Dose Level
RPD
Plate
Plate
Endore(h)mix (μg/mL)(%)
Cells d) Polyploid
Cells c)
ctb
cte
csb
cse
other
TA
g
TAG
duplicated
Total
cell
observed
observed
cell
1
150
0
1
0
0
0
1
0
1
1
151
1
0
1
100
NC
2
150
1
0
0
0
0
1
0
1
2
150
0
0
0
Total
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
Total
301
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
1
150
0
0
0
0
0
0
0
0
1
152
2
0
2
89
100
2
150
0
3
0
0
0
3
0
3
2
151
0
1
1
Total
300
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
Total
303
2(0.7)
1(0.3)
3(1.0)
1
150
0
3
0
0
0
3
0
3
1
151
1
0
1
6
+
51
125
2
150
0
0
0
0
0
0
0
0
2
152
1
1
2
Total
300
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
Total
303
2(0.7)
1(0.3)
3(1.0)
1
150
0
2
0
0
0
2
0
2
1
151
1
0
1
40
150
2
150
1
2
0
0
0
2
0
2
2
150
0
0
0
Total
300
1(0.3)
4(1.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
4(1.3)
0(0.0)
4(1.3)
Total
301
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
1
150
13
101
0
0
0
105
0
105
1
150
0
0
0
44
PC
2
150
13
92
0
0
0
99
0
99
2
150
0
0
0
Total
300
26(8.7) 193(64.3) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 204*(68.0) 0(0.0) 204(68.0)
Total
300
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)a): ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange, other: including fragmentation, g: chromatid or chromosome gapb): Value in the parentheses indicates percentage against the total number of cells observed. c): Diploid cells d): Diploid, polyploid, and endoreduplicated cells
TA: Total number of cells with aberration excluding gap, TAG: Total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC: Positive control (cyclophosphamide monohydrate, 14 μg/mL)
RPD: Relative population doubling*: p < 0.05 (significantly different from the negative control by Fisher’s exact test)
Number of cells with structural chromosomal aberration a), b)

27

T-G601
Table 3

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese hamster cells
Results of the chromosomal aberration test [Continuous treatment: 24h]

Number of cells with numericalchromosomal aberration b)
RPD
Treatment S9 Dose Level
Plate
Plate
Endore(h)mix (μg/mL)(%)
Cells d) Polyploid
Cells c)
ctb
cte
csb
cse
other
TA
g
TAG
duplicated
Total
cell
observed
observed
cell
1
150
0
1
0
0
0
1
0
1
1
152
2
0
2
100
NC
2
150
1
0
0
0
0
1
0
1
2
151
1
0
1
Total
300
1(0.3)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
Total
303
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
1
150
0
0
0
0
0
0
0
0
1
152
2
0
2
83
50.0
2
150
0
1
0
0
0
1
0
1
2
151
1
0
1
Total
300
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
Total
303
3(1.0)
0(0.0)
3(1.0)
1
150
0
0
0
0
0
0
0
0
1
151
1
0
1
24
67
60.0
2
150
0
1
0
0
0
1
0
1
2
150
0
0
0
Total
300
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
Total
301
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
1
150
0
1
0
0
0
1
0
1
1
151
1
0
1
43
70.0
2
150
0
1
0
0
0
1
0
1
2
150
0
0
0
Total
300
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
0(0.0)
0(0.0)
2(0.7)
0(0.0)
2(0.7)
Total
301
1(0.3)
0(0.0)
1(0.3)
1
150
4
39
0
0
0
43
0
43
1
150
0
0
0
76
PC
2
150
3
41
0
0
0
44
0
44
2
150
0
0
0
Total
300
7(2.3) 80(26.7) 0(0.0)
0(0.0)
0(0.0) 87*(29.0) 0(0.0)
87(29.0)
Total
3000(0.0)
0(0.0)
0(0.0)a): ctb: chromatid break, cte: chromatid exchange, csb: chromosome break, cse: chromosome exchange, other: including fragmentation, g: chromatid or chromosome gapb): Value in the parentheses indicates percentage against the total number of cells observed. c): Diploid cells d): Diploid, polyploid, and endoreduplicated cells
TA: Total number of cells with aberration excluding gap, TAG: Total number of cells with aberration including gap.
NC: Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC: Positive control (mitomycin C, 0.050 μg/mL)
RPD: Relative population doubling*: p < 0.05 (significantly different from the negative control by Fisher’s exact test)
Number of cells with structural chromosomal aberration a), b)

28

T-G601
Appendix 1

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese
hamster cells
Results of the cell-growth inhibition test
[Short-term treatment: -S9 mix]

Study type
S9mix

Treatment(h)Concentration(μg/mL)-

6

Test article

0 (NC)

RPD
(%)

a)

Condition of culture medium
Cell-growthc, e)Condition of cells
inhibition
Precipitates g)
f)
b)
Color
rate (%)
1)
2)
1)
2)

d)

3)

100

0

-

-

-

-

-

-

15.6

96

4

-

-

-

-

-

-

31.3

106

-6

-

-

-

-

-

-

62.5

83

17

-

-

Light orange

+

+

-

125

72

28

+

+

Light orange

+

+

+

250

-33

133

++

++

Light yellow

+

+

+

500

-168

268

++

+++

Light yellow

+

+

+

1000

-317

417

+

+++

Light yellow

+

+

-

2000

h)

h)

+

+++

Light yellow

+

+

-

Concentration of 50% cell-growth inhibition : 151 μg/mL
NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)a) RPD (relative population doubling) = PD (population doubling) of treated group/PD of negative control group × 100b) Cell-growth inhibition rate was shown as 100 - RPD.
c) Condition of cells was observed 1): at the end of the treatment and 2): at the end of incubation.
d) Color of culture medium was observed immediately after addition of the test solutions. Presence or absence of precipitates
was examined 1): immediately after addition of the test solution, 2): at the end of the treatment, 3): at the end ofe) -: Most of the cells were attached to the plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
+: A small number of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
++: Approximately half of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
+++: Most of the cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells was also
altered.
f) -: No color changesg) -: No precipitates+: Presence of precipitates.
h) RPD and cell-growth inhibition rate could not be calculated because the number of cells was zero.

29

T-G601
Appendix 2

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese
hamster cells
Results of the cell-growth inhibition test
[Short-term treatment: +S9 mix]

Study type
S9mix

Treatment(h)Concentration(μg/mL)+

6

Test article

0 (NC)

RPD
(%)

a)

Condition of culture medium
Cell-growthc, e)Condition of cells
inhibition
Precipitates g)
f)
b)
Color
rate (%)
1)
2)
1)
2)

d)

3)

100

0

-

-

-

-

-

-

15.6

93

7

-

-

-

-

-

-

31.3

90

10

-

-

-

-

-

-

62.5

84

16

-

-

Light orange

+

+

-

125

43

57

+

+

Light orange

+

+

-

250

0

100

+

++

Light yellow

+

+

-

500

-52

152

++

+++

Light yellow

+

+

+

1000

-278

378

i)

i)

Light yellow

+

+

+

2000

h)

h)

i)

i)

Light yellow

+

+

+

Concentration of 50% cell-growth inhibition : 114 μg/mL
NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)a) RPD (relative population doubling) = PD (population doubling) of treated group/PD of negative control group × 100b) Cell-growth inhibition rate was shown as 100 - RPD.
c) Condition of cells was observed 1): at the end of the treatment and 2): at the end of incubation.
d) Color of culture medium was observed immediately after addition of the test solutions. Presence or absence of precipitates
was examined 1): immediately after addition of the test solution, 2): at the end of the treatment, 3): at the end ofe) -: Most of the cells were attached to the plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
+: A small number of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
++: Approximately half of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
+++: Most of the cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells was also
altered.
f) -: No color changesg) -: No precipitates+: Presence of precipitates.
h) RPD and cell-growth inhibition rate could not be calculated because the number of cells was zero.
i) It was difficult to distinguish due to severe precipitation.

30

T-G601
Appendix 3

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese
hamster cells
Results of the cell-growth inhibition test
[Continuous treatment: 24h]d)Study type-

Treatment(h)24

Condition of culture medium
Cell-growthc,e)g)inhibition Condition of cells
Precipitates
f)
b)
Color
rate (%)
1)
2)

Concentration(μg/mL)

RPD(%)

0 (NC)

100

0

-

-

-

-

15.6

100

0

-

-

-

-

31.3

96

4

-

-

-

-

62.5

32

68

+

Light orange

+

+

125

-24

124

++

Light orange

+

+

250

h)

h)

+++

Light yellow

+

+

500

h)

h)

+++

Light yellow

+

+

1000

h)

h)

+++

Light yellow

+

+

2000

h)

h)

+++

Light yellow++

Test article

S9
mix

a)

Concentration of 50% cell-growth inhibition : 53.7 μg/mL
NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)a) RPD (relative population doubling) = PD (population doubling) of treated group/PD of negative control group × 100b) Cell-growth inhibition rate was shown as 100 - RPD.
c) Condition of cells was observed at the end of the treatment.
d) Color of culture medium was observed immediately after addition of the test solutions. Presence or absence of precipitates
was examined 1): immediately after addition of the test solution, and 2): at the end of the incubation.
e) -: Most of the cells were attached to the plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
+: A small number of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
++: Approximately half of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
+++: Most of the cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells was also
altered.
f) -: No color changesg) -: No precipitates+: Presence of precipitates.
h) RPD and cell-growth inhibition rate could not be calculated because the number of cells was zero.

31

T-G601
Appendix 4

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese
hamster cells
Results of the chromosomal aberration test
[Short-term treatment: -S9 mix]

Study type
S9mix

Treatment(h)Concentration(μg/mL)-

6

Test article

0 (NC)

RPD
(%)

a)

Condition of culture medium
Cell-growth
Condition of cells c, e)g)inhibition
Precipitates
f)
b)
Color
rate (%)
1)
2)
1)
2)

d)

3)

100

0

-

-

-

-

-

-

75.0

102

-2

-

-

Light orange

-

-

-

100

100

0

-

-

Light orange

+

+

-

125

90

10

-

-

Light orange

+

+

-

150

90

10

+

-

Light orange

+

+

-

175

71

29

+

-

Light orange

+

+

-

200

43

57

+

+

Light yellow

+

+

-

76

24

-

-

-

-

-

-

PC

NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC : Positive control (Mitomycin C: 0.075 μg/mL)a) RPD (relative population doubling) = PD (population doubling) of treated group/PD of negative control group × 100b) Cell-growth inhibition rate was shown as 100 - RPD.
c) Condition of cells was observed 1): at the end of the treatment and 2): at the end of incubation.
d) Color of culture medium was observed immediately after addition of the test solutions. Presence or absence of precipitates
was examined 1): immediately after addition of the test solution, 2): at the end of the treatment, 3): at the end ofe) -: Most of the cells were attached to the plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
+: A small number of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
f) -: No color changesg) -: No precipitates+: Presence of precipitates.

32

T-G601
Appendix 5

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese
hamster cells
Results of the chromosomal aberration test
[Short-term treatment: +S9 mix]

Study type
S9mix

Treatment(h)Concentration(μg/mL)+

6

Test article

0 (NC)

RPD
(%)

a)

Condition of culture medium
Cell-growth
Condition of cells c, e)g)inhibition
Precipitates
f)
b)
Color
rate (%)
1)
2)
1)
2)

d)

3)

100

0

-

-

-

-

-

-

50.0

89

11

-

-

Light orange

-

-

-

75.0

85

15

-

-

Light orange

-

+

-

100

89

11

-

-

Light orange

+

+

-

125

51

49

+

-

Light orange

+

+

-

150

40

60

+

+

Light orange

+

+

-

175

-12

112

+

+

Light orange

+

+

-

44

56

-

-

-

-

-

-

PC

NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC : Positive control (Cyclophosphamide monohydrate: 14 μg/mL)a) RPD (relative population doubling) = PD (population doubling) of treated group/PD of negative control group × 100b) Cell-growth inhibition rate was shown as 100 - RPD.
c) Condition of cells was observed 1): at the end of the treatment and 2): at the end of incubation.
d) Color of culture medium was observed immediately after addition of the test solutions. Presence or absence of precipitates
was examined 1): immediately after addition of the test solution, 2): at the end of the treatment, 3): at the end ofe) -: Most of the cells were attached to the plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
+: A small number of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
f) -: No color changesg) -: No precipitates+: Presence of precipitates.

33

T-G601
Appendix 6

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured Chinese
hamster cells
Results of the chromosomal aberration test
[Continuous treatment: 24h]d)Study type-

Treatment(h)24

Condition of culture medium
Cell-growthc,e)g)inhibition Condition of cells
Precipitates
f)
b)
Color
rate (%)
1)
2)

Concentration(μg/mL)

RPD(%)

0 (NC)

100

0

-

-

-

-

30.0

102

-2

-

-

-

-

40.0

90

10

-

-

-

-

50.0

83

17

-

-

-

-

60.0

67

33

+

Light orange

-

-

70.0

43

57

+

Light orange

-

+

80.0

25

75

++

Light orange

+

+

76

24

-

-

-

-

Test article

S9
mix

a)

PC

NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC : Positive control (Mitomycin C: 0.050 μg/mL)a) RPD (relative population doubling) = PD (population doubling) of treated group/PD of negative control group × 100b) Cell-growth inhibition rate was shown as 100 - RPD.
c) Condition of cells was observed at the end of the treatment.
d) Color of culture medium was observed immediately after addition of the test solutions. Presence or absence of precipitates
was examined 1): immediately after addition of the test solution, and 2): at the end of the incubation.
e) -: Most of the cells were attached to the plates and grew as a monolayer. Their shape was normal.
+: A small number of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
++: Approximately half of cells were detached from the plate and floated in the culture medium. The shape of attached cells
was also altered.
f) -: No color changesg) -: No precipitates+: Presence of precipitates.

34

T-G601
Appendix 7

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured
Chinese hamster cells
Population doubling in the cell-growth inhibition test

[Short-term treatment: -S9 mix]
Study type

-

(h)

6

Test article

S9
mix

Concentration
Treatment(μg/mL)

Cell counts (×104 cells/mL)
At the initiation of thetreatment

At the end of the
incubationPD

0 (NC)

48

1.34

15.6

46

1.28

31.3

51

1.42

62.5

41

1.11

19

37

0.96

250

14

-0.44

500

4

-2.25

1000

1

-4.25

2000

0

a)

125

[Short-term treatment: +S9 mix]
Study type+

6

Cell counts (×104 cells/mL)
At the end of the
incubationPD

0 (NC)

55

1.53

15.6

51

1.42

31.3

49

1.37

46

1.28

30

0.66

250

19

0.00

500

11

-0.79

1000

1

-4.25

2000

0

a)

(h)

Test article

S9
mix

Concentration
Treatment(μg/mL)At the initiation of thetreatment

62.5
125

19

[Continuous treatment: 24h]
Study type

-

(h)

24

Test article

S9
mix

Concentration
Treatment(μg/mL)

Cell counts (×104 cells/mL)
At the initiation of thetreatment

At the end of the
incubationPD

0 (NC)

51

1.42

15.6

51

1.42

31.3

49

1.37

26

0.45

15

-0.34

250

0

a)

62.5
125

19

500

0

a)

1000

0

a)

2000

0

a)

NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PD : Population doubling was determined as;[log (cell counts at the time of end / cell counts at the time of start treatment)] / log 2a) PD could not be calculated because the number of cells was zero.

35

T-G601
Appendix 8

Dipotassium hexafluoridosilicate(2-): In vitro chromosomal aberration test in cultured
Chinese hamster cells
Population doubling in the chromosomal aberration test

[Short-term treatment: -S9 mix]
Study type-

6

Cell counts (×104 cells/mL)
At the end of the
incubationPD

0 (NC)

48

1.26

75.0

49

1.29

100

48

1.26

125

44

1.14

44

1.14

175

37

0.89

200

29

0.54

PC (MMC)

39

0.96

(h)

Test article

S9
mix

Concentration
Treatment(μg/mL)150

At the initiation of thetreatment

20[Short-term treatment: +S9 mix]
4

Study type+

6

Cell counts (×10 cells/mL)
At the end of the
incubationPD

0 (NC)

47

1.23

50.0

43

1.10

75.0

41

1.04

100

43

1.10

31

0.63

(h)

Test article

S9
mix

Concentration
Treatment(μg/mL)125

At the initiation of thetreatment

20

150

28

0.49

175

18

-0.15

PC (CP)

29

0.54[Continuous treatment: 24h]4

Study type-

24

Cell counts (×10 cells/mL)
At the end of the
incubationPD

0 (NC)

48

1.26

30.0

49

1.29

40.0

44

1.14

50.0

41

1.04

(h)

Test article

S9
mix

Concentration
Treatment(μg/mL)At the initiation of thetreatment

20

36

0.85

70.0

29

0.54

80.0

25

0.32

PC (MMC)

39

0.96

60.0

NC : Negative control (0.5w/v% sodium carboxymethyl cellulose solution)
PC : Positive control (MMC; Mitomycin C, 0.075 or 0.050 μg/mL, CP; Cyclophosphamide monohydrate, 14 μg/mL)
PD : Population doubling was determined as;[log (cell counts at the time of end / cell counts at the time of start treatment)] / log 236

T-G601

信頼性保証書（1/2）

試験番号

：

T-G601

試験表題：

ヘキサフルオリドケイ酸（２－）二カリウム： チャイニーズ・ハム
スター培養細胞を用いる in vitro 染色体異常試験

本試験は以下に示す基準に従って実施されたことを保証致します。
•「新規化学物質等に係る試験を実施する試験施設に関する基準」（平成 23 年
3月 31 日：薬食発 0331 第 8 号、平成 23・03・29 製局第 6 号、環保企発第110331010号）

なお、調査は下記の通り実施し、報告致しました。
試験の調査
項

目

担当者

調

査

試験責任者及び運営管理者への
報告日

日

試験計画書

2022 年1 月 14 日

2022 年1 月 14 日

試験計画書変更書（１）2022 年1 月 28 日

2022 年1 月 28 日

細胞播種

2022 年

1 月 31 日

2022 年 2月2日

調製・保存（被験物質・

2022 年 2月3日

2022 年 2月7日

染色体標本作製（固定）2022 年 2月4日

2022 年 2月9日

染色体標本作製（染色）2022 年 2月7日

2022 年 2月9日

染色体標本観察2022 年2 月 15 日

2022 年2 月 17 日

生データ

2022 年3 月 15 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 15 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 15 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 16 日

2022 年3 月 16 日

陽性対照物質）、処理

改善確認
最終報告書草案

表・付表

改善確認
申請資料
改善確認

37

T-G601

信頼性保証書（2/2）

試験の調査
項

目

担当者

調

最終報告書

2022 年

査試験責任者及び運営管理者への報告日日

3 月 23 日

2022 年3 月 23 日

施設調査
項

目

担当者

調

査

部門責任者及び運営管理者への報告日日2021 年 12 月 24 日

培養細胞の性状検査

2021 年 12 月 27 日
2021 年 12 月 28 日
2021 年 12 月 29 日
2022 年 1

年

月

月4

日

株式会社ボゾリサーチセンター
信頼性保証部門38

日

2022 年 1月6日