唾液の次世代プロテオーム解析による、非侵襲的な食物蛋白誘発胃腸炎の診断・症状誘発予測マーカーの開発（2022）

研究課題名

唾液の次世代プロテオーム解析による、非侵襲的な食物蛋白誘発胃腸炎の診断・症状誘発予測マーカーの開発

フリガナ

イノウエ

代表者名

井上ユウザブロウ

祐三朗

所属機関（機関名）千葉大学大学院医学研究院（役職名）特任准教授
氏

共同研究者

名（フリガナ）

総合医科学

所属機関・役職名

役割分担

東海大学医学部
総合診療学系 小児科学 臨床検体収集
教授
かずさＤＮＡ研究所
ゲノム事業推進部
プロテオーム解析ユウスケ）
ユニットリーダー

山田 佳之(ヤマダ ヨシユキ)
川島 祐介
（カワシマ

本 助 成金 によ る 発なし
表論文，学会発表

研究結果要約
食物蛋白誘発胃腸炎( FPIES: Food protein‐induced enterocolitis syndrome)は、食物アレルゲン摂取後に嘔吐・下痢・下血などの消化器症状を来たす非 IgE 依存性食物アレルギーの一つである。FPIESの診断や耐性獲得の確認には、食物経口負荷試験(OFC)が有用であるが、IgE 依存性食物アレルギーと異なり、症状誘発を予測可能なバイオマーカーがないため、時に誘発症状が重篤となることが問題である。非侵襲的に評価可能であり、診断や症状誘発予測に有用なバイオマーカーが確立されれば、より安全かつ簡便な診断・評価が可能となることが期待される。
そこで本研究では、唾液の次世代プロテオーム解析により、非侵襲的な FPIES の診断・症状誘発予測マーカーを確立することを目的とし、卵黄 FPIES 患者を対象とした OFC において採取された唾液および血液の次世代プロテオーム解析により、FPIES の診断・症状誘発予測マーカーとなりうるタンパク質の同定を目指している。
2023 年 8 月末までに、OFC 陽性例採取症例

6 例（血液採取症例3 例を含む）と OFC 陰性例

9 例（血液5 例を含む）より臨床検体が採取され、プロテオーム解析に十分な検体数に達したため、2023

年 9 月より解析を開始する予定である。
(2024 年 3 月末まで計画延長課題のため途中状況として記載 )2222唾液の次世代プロテオーム解析による、非侵襲的な食物蛋白誘発胃腸炎の診断・症状誘発予測マーカーの開発（2022）

研究目的

ため、EY-FPIES の病態を解明し、その予防や早食物蛋白誘発胃腸炎( FPIES: Food protein‐期の寛解誘導へのアプローチを検討することはinduced enterocolitis syndrome)は、食物アレル重要である。

ゲン摂取後に嘔吐・下痢・下血などの消化器症状

そこで本研究では、唾液の次世代プロテオームを来たす非 IgE 依存性食物アレルギーの一つで解析により、非侵襲的な FPIES の診断・症状誘ある。FPIES の多くは、原因食物に対する特異的発予測マーカーを確立することを目的とし、卵黄IgE 抗体が陰性であるため、抗原特異的リンパ球FPIES 患者を対象とした OFC において採取さ刺激試験や便粘液好酸球検査などが、診断補助目れた唾液および血液の次世代プロテオーム解析的に施行されるが、その特異性は高くない。また、により、FPIES の診断・症状誘発予測マーカーと内視鏡検査・病理検査は侵襲的であり、専門施設なりうるタンパク質の同定を目指す。

以外で施行することは困難である。FPIES の診断や耐性獲得の確認には、食物経口負荷試験

研究計画及び研究手法(OFC)が有用であるが、IgE 依存性食物アレルギ＜研究対象者＞

ーと異なり、症状誘発を予測可能なバイオマーカ

千葉大学医学部附属病院または共同研究機関

ーがないため、時に誘発症状が重篤となることがにおいて、下記選択基準を満たし、除外基準に該問題である。非侵襲的に評価可能であり、診断や当しない、診療上必要な卵黄 OFC を施行する予症状誘発予測に有用なバイオマーカーが確立さ定の患者に対して、承認の得られた同意説明文書れれば、より安全かつ簡便な診断・評価が可能とを保護者に渡し、文書および口頭による十分な説なることが期待される。

明を行い、十分理解を得たうえで自由意志に基づ

近年、乳幼児における卵黄による FPIES(EY-

く文書による同意を得た。

FPIES)の報告が増加している。食物アレルギー

選択基準の発症予防の観点から、授乳・離乳の支援ガイド

以下の基準にすべて該当する患者(2019 年改訂版)では、生後 5-6 か月から固ゆで卵

1. 同意取得時に 6 か月以上 6 歳未満の患者

黄の摂取が勧められている一方で、少数であって2. 病歴あるいは過去の加熱卵黄を用いた OFCも加熱卵黄摂取で重篤な誘発症状を認める EY-から卵黄 FPIES と診断され、卵黄の完全除FPIES 患者の増加は、乳児期における「安全な卵去を継続している患者
3. 卵黄 FPIES 診断時の卵黄に対する特異的黄摂取の開始」に課題を投げかけている。
EY-FPIES が増加している原因は不明であり、IgE 抗体が、全て Class 2 以下である患者

病態解析はあまりされていない。しかし、卵黄

4. 保護者から本研究参加に対するインフォー

FPIES は、牛乳 FPIES と比較して罹病期間が高ムドコンセントを得た患者
5. 保護者が医師・看護師などとの意思疎通がいため、除去による QOL 低下がより問題となる

2323唾液の次世代プロテオーム解析による、非侵襲的な食物蛋白誘発胃腸炎の診断・症状誘発予測マーカーの開発（2022）

点で、全血 0.5ml を採取（逆流採血）し、血清を可能である患者-30℃で凍結保存する。

除外基準
以下の基準のいずれかに該当する患者● 卵黄摂取 1 時間後

1. アトピー性皮膚炎・乳幼児喘息の合併を認● 卵黄摂取 2.5 時間後● 可能であれば、症状誘発時める患者
2. 心疾患、肝疾患、腎疾患などの、アレルギー● 末梢静脈ルートを留置せず卵黄 OFC を施疾患以外の基礎疾患の既往歴があり、現在行したが、症状誘発への対応のために末梢治療中の患者静脈ルートを確保する場合には、可能であれば、同時に全血 0.5ｍｌを採取する。

3. 卵黄 FPIES 診断時に、卵黄に対する特異的IgE 抗体のいずれかが Class 3 以上(3.5UA/mL 以上)、または測定されていない患＜プロテオーム解析＞
凍結保存された唾液および血清のプロテオー者

ム解析は、共同研究機関のかずさ DNA 研究所に4. その他，医師が不適当と判断した患者測定を依頼し解析を行う。最新鋭のデータ非依存＜卵黄 OFC・臨床検体採取＞
卵黄 OFC（5ｇの加熱卵黄性解析（DIA）ベースの質量分析計(Q-Exactive
HF-X, Thermo Fisher Scientific 社あるいは Or-

単回摂取）前後にbitrap Exploris 480 MS, Thermo Fisher Scien-

おいて、下記の臨床検体を採取した。
唾液採取tific 社)を使用し、高深度プロテオーム解析をお以下の時点で、自然分泌唾液 1mL をシリンジこなう。得られたタンパク定量値は、Perseus ソに採取し、ろ紙に滴下後乾燥（あるいは滅菌チュ

フトウェア（MaxQuant 社）を用いてデータ処理、ーブに保管）させ、-30℃で凍結保存する。

統計解析を行い、発現変動タンパクの同定や機能● 卵黄 OFC 開始 30 分前解析を行う。また、バイオマーカー候補タンパク● 卵黄摂取 1〜1.5 時間後測定の検証実験は ELISA 法を用いる。測定され● 卵黄摂取 2.5〜3 時間後（すでに症状誘発をたタンパク濃度については、JMP15 ソフトウェアを用いて多重比較検定を行う（p<0.05 を有意認める場合は省略）
食事摂取から 30 分以上空けてから唾液採取をとする）。また、ロジスティック回帰分析によるおこなう。また、唾液採取 5 分前に、水あるいはROC 曲線から、診断の有用性についても検討を白湯を適量摂取あるいは「うがい」をおこない、行う。

口腔内をできるだけ洗浄する。
結果と考察及び今後の研究活動について

血液採取

研究代表者である井上が、2022 年 4 月に千葉末梢静脈ルートを留置した場合には、以下の時大に異動したため、異動後に研究計画倫理審査を
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9. 東千葉メディカルセンター開始した。コロナ禍のため倫理審査が遅れ、7 月

小児科の倫理審査委員会の承認が得られた。その後に共新型コロナ第 7 波、第 8 波では、小児のコロナ同研究施設の実施承諾が得られ、研究開始は2022 年 9 月からとなった。

感染者が多かったため、診療制限のため卵黄FPIES の負荷試験の施行が困難であったが、なお、以下の共同研究施設において、臨床検体

2022 年 12 月頃より、臨床検体収集が可能となっを採取している。
1. 千葉大学医学部附属病院

2. 東海大学医学部総合診療学系
3. 千葉県こども病院
4. 亀田総合病院

た。

小児科

2023 年 8 月末までに、下記の臨床検体が採取

小児科学され、プロテオーム解析に十分な検体数に達した

アレルギー・膠原病科ため、2023 年 9 月より、プロテオーム解析を開小児科

5. 慶應義塾大学病院始する予定である。

小児科

6. 神奈川県警友会けいゆう病院
7. 群馬県立小児医療センター

1. OFC 陽性例 6 例（血液採取症例 3 例をむ）

小児科

2. OFC 陰性例 9 例（血液採取症例 5 例を含アレルギー・

む）。

リウマチ科
8. 佐久医療センター

小児科

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