新規アレルギー抑制分子

Ly6G によるマスト細胞の機能制御と創薬への応用（2022）

研究課題名

新規アレルギー抑制分子

フリガナ

スズキ

代表者名

鈴木リョウ亮所属機関（機関名）金沢大学（役職名）教授
氏

共同研究者

Ly6G によるマスト細胞の機能制御と創薬への応用

医薬保健研究域名（フリガナ）

薬学系

所属機関・役職名

役割分担平嶋 尚英
名古屋市立大学医薬学総合 Ly6G 改変細胞・DDS 治療（ヒラシマ ナオヒデ） 研究院（薬学） 教授の研究中村 亮介
国立医薬品食品衛生研究所 EXiLE 法を用いたアレル（ナカムラ リョウスケ）医薬安全科学部・第３室長 ギー疾患転写制御機構解析

本 助 成金 によ る 発
表論文、学会発表

研究結果要約
アレルギー疾患(食物アレルギー等)は、世界的患者数の増加や新型コロナワクチン摂取に伴う副反応(アナフィラキシー等)など、重大かつ身近な問題として注目されている。アレルギー疾患は、多様な疾患症状を示すため、予防や根治が難しく対症療法が中心となっているのが現状である。そのため、アレルギー(マスト細胞)応答を制御する新たなアレルギー制御因子の解明が期待されている。我々は、マスト細胞によるアレルギー応答の多様性の制御機構を追究する過程で、アレルゲンと IgE の親和性が浸潤細胞の種類に違いを生じさせ、アレルギー炎症を調節していることを明らかにした。本研究では、アレルギー応答制御における、マスト細胞と好中球の相互作用をはじめ、好中球に特異的に発現する蛋白質（Ly6G）の機能を明らかにすることを試みた。その結果、好中球に特異的に発現する Ly6G 蛋白質は、マスト細胞への結合能や分泌反応調節作用を有していることが明らかになった。更に、疾患モデルを用いた研究においても、Ly6G 蛋白質がアレルギー炎症を調節している可能性が示唆された。

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症状の調節が行われていると考えられている 1)。

研究目的
アレルギー疾患（食物アレルギー、アナフィラ

我々は、マスト細胞によるアレルギー応答の多キシーショック等）は、世界的患者数の増加や新様性の制御機構を追究する過程で、アレルギー疾型コロナワクチン摂取に伴う副反応（アナフィラ患モデルを用いた研究から、アレルゲンと IgE のキシー等）など、これまで以上に重大かつ身近な親和性が浸潤細胞の種類に大きな違いを生じさ問題として注目されている。また、最近の国会答せ、アレルギー炎症を調節していることを明らか弁でもアレルギー疾患が取り上げられるなど、にした 2)。特に、高親和性アレルゲンによるマス益々社会問題化しているのが現状である。アレルト細胞の活性化によって、アレルギー炎症を誘導

ギー疾患は、多様な疾患症状（発症部位、病態、した組織では、炎症組織に浸潤する好中球の数が重症度、加齢変化等）を示すため、予防や根治が有意に増加しており、更に、マスト細胞と好中球難しく、疾患の複雑化・慢性化、更には患者 QOLが相互作用している様子が観察された。これまで、（quality of life）の低下を招くなど、解決すべき自然免疫において重要な役割を有する好中球が、課題である。

アレルギー応答において、どの様な役割を担ってこの様なアレルギー疾患に対する予防や治療いるのかなど、好中球によるアレルギー応答の調については、疾患原因（アレルゲン）への曝露除節機構を追究してきた。その過程で、in vitro 共去をはじめ、抗アレルギー薬や抗炎症薬など、医存培養系を用いた研究からも、脱顆粒したマスト薬品による対症療法が中心である。また、根治療細胞と好中球が接着している様子が観察されて法として期待されているアレルゲン特異的免疫おり、これらの接着を介した相互作用によって、療法についても、長期に渡る治療期間の問題や治アレルギー炎症の病態を調節している可能性が療にアレルゲンを摂取するため、危険を伴うのが示唆された。更に、マスト細胞と好中球の接着部現状である。そのため、アレルギー（マスト細胞）位では、好中球に特異的に発現する蛋白質 Ly6G応答を調節する新たなアレルギー制御因子の解が 3)、マスト細胞と好中球の接着部位で移動して明が期待されている。

いることを見出した。本研究では、アレルギー応様々なアレルギー疾患の発症には、マスト細胞答制御における、マスト細胞と好中球の相互作用が重要な役割を担っており、アレルゲン（食物、をはじめ、好中球に特異的に発現する蛋白質花粉、医薬品等）が IgE 受容体を活性化すると、Ly6G の機能を明らかにすることを試みた。

ヒスタミンをはじめとする炎症性メディエータ
研究計画及び研究手法が分泌され、疾患が惹起される。その結果、アレ
ルギー炎症組織では、マスト細胞と様々な免疫細マスト細胞と好中球の相互作用及び両者の相胞が相互作用し、治癒や増悪などアレルギー疾患互作用を介した好中球蛋白質 Ly6G の機能解析

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Ly6G によるマスト細胞の機能制御と創薬への応用（2022）を行うため、マスト細胞には骨髄由来マスト細胞白質の機能を詳細に追究するため、Ly6G 以外のを用い、好中球には骨髄単離好中球を用いた。骨

Ly6 ファミリー蛋白質に関しても、各種組織から髄由来マスト細胞は、マウス骨髄細胞を採取し、遺伝子の取得と各種プラスミドの作製、及び各種

Interleukin-3 及び Stem cell factor 存在下で 1リコンビナント蛋白質の作製・精製を行った。リか月間培養し、マスト細胞に分化したものを用いコンビナント蛋白質の発現及び精製の確認には、た。骨髄単離好中球は、骨髄細胞を採取し、精製電気泳動による CBB（Coomassie Brilliant Blue）キットを用いたネガティブセレクション法によ染色法やウエスタンブロッティング法を用いて、り単離した。分化・精製率の確認には、各種マー各種特異的抗体により行った。また、マスト細胞

カー蛋白質（骨髄由来マスト細胞：FcεRI、上の結合分子を同定する前段階の実験として、作CD117）及び（骨髄単離好中球：Ly6G）を用い製した各種リコンビナント蛋白質を用いて、マスて行った。これらの骨髄由来マスト細胞や骨髄単ト細胞上に Ly6G に対する結合分子が存在する離好中球を用いて、マスト細胞と好中球の相互作のかなどについて、フローサイトメータを用いた用における好中球蛋白質 Ly6G によるアレルギ結合実験を行った。マスト細胞を各種リコンビナー応答調節機構を明らかにすることを試みた。そント蛋白質で処理後、マスト細胞上に結合していのため、マウス骨髄由来マスト細胞と骨髄単離好るリコンビナント Ly6G 蛋白質を抗 Ly6G 抗体や中球をマトリゲルコートしたガラスボトムディ

抗 His-tag 抗体を用い、フローサイトメータによッシュ上で培養する共存系を確立し、アレルゲンって検出した。更に、プルダウン法やファーウエによる特異的刺激応答に伴うマスト細胞と好中スタン法を用いて、マスト細胞に発現する Ly6G球の接着を伴う相互作用、好中球蛋白質 Ly6G の結合分子について追究した。

培養上清中への遊離、及び近傍のマスト細胞への先に作製・精製したリコンビナント蛋白質やLy6G ペプチドを用いて、マスト細胞の各種炎症移動について定量・定性的な解析を行った。
次に、Ly6G 及び Ly6 ファミリー蛋白質による性メディエータの分泌反応やシグナル伝達調節アレルギー応答制御機構を追究するため、各種リ機構に及ぼす影響について追究した。分泌反応のコンビナント蛋白質の作製を行なった。リコンビ解析には、マスト細胞を各種リコンビナント蛋白ナント蛋白質は、研究目的や用途に応じて、大腸質や Ly6G ペプチド処理後、アレルゲンの刺激応

菌発現系（BL21（DE3）、ClearColi BL21（DE3）答に伴う、分泌顆粒内酵素（β-hexosaminidase）

等）やヒト細胞発現系（HEK 293 細胞等）を用の定量や各種炎症性サイトカイン（TNFα等）やいた。リコンビナント蛋白質の培養・精製条件のケモカイン（CCL2 等）について ELISA 法を用最適化をはじめ、これらの発現系を用いてリコンいて定量した。また Ly6G 蛋白質によるマスト細ビナント Ly6G 蛋白質を作製した。また Ly6G 蛋胞シグナル伝達調節機構については、各種シグナ

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ル分子や転写調節因子の活性化状態について追そこで、両者の接着を介した相互作用を更に詳細究した。また、IgE 非依存的刺激によるアレルギに解析するため、マスト細胞のアレルゲン刺激応ー応答への Ly6G 蛋白質の機能を明らかにする答に伴う好中球との相互作用についてライブイ

た め 、 IgE 非 依 存 的 刺 激 と し て 、 ATP 、

メージング法を用いて追究した。その結果、マスMastoparan、Compound48/80 を用い、刺激応答ト細胞を活性化すると、マスト細胞の分泌反応にに伴う分泌顆粒内酵素（β-hexosaminidase）や伴い好中球の形態が球状から紡錘形に変化し、マ各種炎症性サイトカイン（TNFα等）やケモカイスト細胞方向に遊走し、両者が接着し相互作用しン（CCL2 等）について mRNA 発現量の定量的ている様子が観察された（図 2）。そこで、好中球

PCR 及び ELISA 法を用いた定量解析を行った。に特異的に発現する Ly6G 蛋白質を染色したと最後に、アレルギー疾患モデルを用いた解析を実施した。疾患モデルとして、マスト細胞依存的なモデルとして使用されるアレルギー疾患モデル（PCA: passive cutaneous anaphylaxis）を用いた。マウスの両耳にアレルゲン特異的 IgE を皮内投与により受動的に感作した。翌日、アレルゲンを投与し、アレルギーモデルを作製した。また、アレルギー炎症反応の測定には、Evans Blue 色素を用いた血管透過性を指標に定量した。
図１ アレルギー炎症組織でのマスト細胞と好中球結果と考察
我々は、これまでアレルギー応答の多様性の制御機構について追究してきた。そして、アレルゲンと IgE の親和性に着目した研究から、高親和性アレルゲンによって誘導されたアレルギー炎症組織では、マスト細胞と好中球が相互作用することによって、アレルギー応答を調節している可能性を見出した（図 1）。また、マスト細胞と好中球の共存培養系を用いた実験から、アレルゲンによってマスト細胞を特異的に活性化するとマスト

図 2 マスト細胞の活性化による好中球の遊走と相互作用細胞と好中球が接着している様子が観察された。

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ころ、Ly6G 蛋白質が好中球からマスト細胞の細腸菌発現系やヒト細胞発現系の最適化を行うと胞膜へ移動していることが明らかになった。そこ

伴にリコンビナント蛋白質（Ly6G 及び Ly6 ファで、好中球からマスト細胞へ移動した Ly6G 蛋白ミリー）を作製し、マスト細胞への結合量をフロ質について定量解析を行なったところ、アレルゲーサイトメータで解析した。その結果、未刺激状ン刺激に伴って、接着している部分で Ly6G 蛋白

態では Ly6G 蛋白質が約 20％程度のマスト細胞質の移動が顕著に起こっていることが分かった。

で結合していた。一方、アレルゲン刺激を行なっまた、マスト細胞と好中球の接着部位では、細胞たマスト細胞では、Ly6G 蛋白質の結合率が増加骨格蛋白質（F-actin）の集積も観察されており、している様子が観察された。このことから、マス両細胞は接着することによって情報交換や機能ト細胞の細胞膜上には Ly6G 蛋白質に対する結調節を行っている可能性が示唆された。

合因子が存在すると推察され、その結合因子が、次に、好中球からマスト細胞への Ly6G 蛋白質

Ly6G 蛋白質によるマスト細胞の機能調節を行っの移動メカニズムを明らかにするために、マストている可能性が示唆された。また、Ly6G 以外の細胞と好中球の共存培養系を用いて、好中球からLy6 ファミリー蛋白質についても、マスト細胞への Ly6G 蛋白質の遊離過程について追究した。マの結合能を有することも確認した。そのため、プスト細胞と好中球を共存培養した後、マスト細胞ルダウン法やファーウエスタン法を用いて、マスをアレルゲンで刺激し、培養上清中の Ly6G 蛋白ト細胞に発現する Ly6G 結合分子について確認

質をウエスタンブロッティング法で定量解析しを試みた。しかし現時点において、Ly6G 蛋白質

たところ、アレルゲン刺激１時間後の培養上清にに結合するマスト細胞上の分子の同定には至っ

おいて Ly6G 蛋白質量が増加し、刺激後 3〜6 時ていない。そのため現在は、各種条件の最適化を間では減少している様子が観察された。このこと行っている状況である。

から、アレルゲン刺激によるマスト細胞の活性化

また先の実験から、マスト細胞の活性化に伴っに伴って、マスト細胞の分泌顆粒内に含有していて好中球に発現する Ly6G 蛋白質が好中球からるプロテアーゼなどが 4)、相互作用（接着）部位切断されマスト細胞表面に移動・結合することがの局所で高濃度に分泌され、好中球の Ly6G 蛋白明らかになった。そこで、Ly6G 蛋白質によるマ質が切断されることによって、培養上清中に遊離スト細胞応答調節機構を明らかにするため、し、近傍のマスト細胞に移動したのではないかと

Ly6G 蛋白質による炎症性メディエータ分泌反応考えられた。

への影響について解析した。はじめに、ヒスタミ

次に、マスト細胞の活性化に伴って培養上清中ン分泌（脱顆粒反応）の指標として用いられる分に切断された Ly6G 蛋白質のマスト細胞への結泌顆粒内酵素（β-hexosaminidase）の定量を行合能について解析した。そのため本研究では、大なった。その結果、Ly6G 蛋白質処理によりアレ5353新規アレルギー抑制分子

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ルゲン刺激に伴う脱顆粒反応が有意に抑制され観察された。更に、IgE 非依存的刺激（ATP、ており、また、その抑制効果は Ly6G 蛋白質の濃Mastoparan、Compound48/80）の場合には、分度依存的であることも明らかになった（図 3）。次泌顆粒内酵素（β-hexosaminidase）の分泌につに、各種炎症性サイトカイン（TNFα等）やケモいて、アレルゲンとは異なる細胞応答を示す可能カイン（CCL2 等）について ELISA 法を用いて性が存在することが分かり、現在、分子メカニズ定量解析を行なったところ、予想に反して、Ly6Gムについて追究している。これらのことから、蛋白質を処理した細胞では、有意に分泌反応が増

Ly6G 蛋白質にはマスト細胞の分泌反応を調節す強していることが分かった（図 3）。そこで、Ly6Gる機能配列が存在する可能性が示唆された。

蛋白質の分泌機能配列を明らかにするため、次に、Ly6G 蛋白質によるシグナル調節機構のLy6G 蛋白質を断片化した Ly6G ペプチドを用解析を行った。マスト細胞に発現する重要シグナ

いて、マスト細胞の脱顆粒反応（β-ル分子（キナーゼ等）について、ウエスタンブロhexosaminidase）の定量解析を行なった。その結ット法を用いた蛋白質の活性化を指標に追究し果、未処理の細胞と比較して、Ly6G ペプチド#4

た 5)。特に、マスト細胞の脱顆粒反応に重要であ及び#9 処理によりマスト細胞のアレルゲン刺激

る Lyn、Syk、LAT、PLCγをはじめ、MAPK（Erk、に伴う脱顆粒量が有意に減少していた。さらに、

p38、JNK）などの転写調節因子などについて解Ly6G ペプチドによるマスト細胞のサイトカイン

析を行なったところ、Ly6G 処理した細胞ではア（TNFα）及びケモカイン（CCL2）分泌への影

レルゲン刺激に伴って幾つかのシグナル分子

響を解析したところ、未処理の細胞と比較して（Syk、LAT、PLCγ、Akt、Erk、p38 など）にLy6G ペプチド#4 処理により抗原刺激に伴うおいて活性化状態が持続している傾向が観られTNFαや CCL2 の分泌量が増加している様子がた。

図 3 Ly6G によるマスト細胞の分泌制御

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Ly6G によるマスト細胞の機能制御と創薬への応用（2022）

最後に、Ly6G 蛋白質による生体レベルでのア質をはじめ Ly6 ファミリー分子が、マスト細胞レルギー応答調節の可能性について検討した。そ上の Ly6 ファミリー結合分子を介して、マストのため、マスト細胞依存的なモデルとして多くの細胞の機能調節を行なっていることを示唆して研究で使用されているアレルギー疾患モデルおり、新たなアレルギー調節因子としての可能性（PCA: passive cutaneous anaphylaxis）を用いが期待される。また、Ly6G 蛋白質は、各種炎症て、アレルギー応答調節機構の解析を行なった 2)。

性メディエータ（脱顆粒反応やサイトカイン・ケ

その結果、Ly6G 蛋白質を投与したマウスでは、モカイン分泌）の分泌反応において、相反するママスト細胞の活性化に伴う炎症応答の指標としスト細胞（分泌）応答を誘導するなど、改めてマて用いた血管透過性（Evans Blue 色素の組織内スト細胞の分泌調節機構の複雑さが明らかにな浸潤）が、未処理の場合と比較して有意に抑制さった。そのため、アレルギー反応を誘導する各種れていることが分かった（図 4）。このことから、炎症性メディエータの分泌反応について、単一顆

Ly6G 蛋白質は生体レベルでもアレルギー応答を粒レベルでより詳細に解析する必要性があると調節している可能性が示唆された。

考えられる。生体レベルでの調節作用に関しても、他のアレルギー疾患モデルでの研究が実施されることによって、Ly6 ファミリー分子による機能今後の研究活動について本研究で実施した、in vitro 及び in vivo での調節作用の実体が明らかになるものと期待され研究成果から、Ly6G 蛋白質が、アレルゲン刺激る。この様に、Ly6G によるマスト細胞の機能調応答に伴うマスト細胞の機能調節作用を有して節メカニズムが明らかになれば、新たなアレルギいる可能性が示唆された。これらの研究成果は、ー制御メカニズムが解明され、アレルギー応答の機能ほとんど明らかになっていない Ly6G 蛋白

機能調節因子として、アレルギー疾患治療に向け

図 4 Ly6G によるアレルギーモデルでのマスト細胞活性調節5555

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Ly6G によるマスト細胞の機能制御と創薬への応用（2022）

28;343(6174):1021-5.

た新たな展開が期待される。

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