抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発

研究課題名

抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発

フリガナ

キタウラ

代表者名

北浦ジロウ

次郎

所属機関（機関名）順天堂大学大学院医学研究科アトピー疾患研究センター（役職名）先任准教授
氏
共同研究者

名（フリガナ）

瀬藤光利（セトウミツトシ）

所属機関・役職名
浜松医科大学・教授

役割分担
組織における脂質分析

本 助 成金 によ る 発
現在、国際雑誌への論文投稿準備中である。
表論文，学会発表

研究結果要約
近年増加の一途をたどる食物アレルギーは国民の健康を脅かす大きな社会問題である。本助成研究の目的は、ミエロイド系細胞に発現する受容体 CD300f が食物アレルギーを抑制するメカニズムの全容を明らかにすること、さらに CD300f のリガンドであるセラミド vesicle の投与が食物アレルギーの予防と治療に有効であることを証明することである。本助成研究の意義は、食物アレルギーの画期的な予防・治療法を開発するための分子基盤を形成することにある。本助成研究により、CD300f は IgE とマスト細胞に依存する食物アレルギーの病態形成を抑制することが明確になった。また、CD300f には IgE と抗原による小腸マスト細胞の活性化を抑制する作用と直接・間接的に Treg 誘導を促進する作用及び Th2 誘導を抑制する作用があることが示され、それらの複合作用が食物アレルギーの病態形成を抑えると考えられた。さらに、CD300f とそのリガンドであるセラミドの結合を阻害すると野生型マウスの食物アレルギー症状は悪化し、CD300f リガンドを組織で増加させるセラミド vesicle の投与は食物アレルギー症状を軽減させることが明らかになった。従って、CD300f は食物アレルギーの予防・治療における有望な分子標的であることが示唆された。今後、CD300f リガンドを利用した食物アレルギーの予防・治療法開発が期待される。

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抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発

研究目的の画期的な予防・治療法開発につながり、本助成

安全で豊かな食生活は健康長寿社会の実現に研究は大きな意義をもつことになる。

不可欠であるが、近年増加の一途をたどる食物アレルギーは国民の健康を脅かす大きな社会問題研究計画及び研究手法である。マウスモデルの解析により、食物アレル①定常状態のマウスの小腸から粘膜固有層の細ギー（特に、IgE 依存性の食物アレルギー）のメ胞 を 分 離 し て 、 各 種 抗 体 で 染 色 し て flow

カニズムの解明は大きく進んだが、その成果は必cytometry で 解 析 す る 。 小 腸 粘 膜 固 有 層 のずしも予防・治療法の開発に直結していない。基（ FcRI+c-Kit+ ） マ ス ト 細 胞 、（ Lin-c-礎研究により食物アレルギーのメカニズムを理Kit+ST2+integrin 7+）mast cell progenitor

解した上で画期的な予防・治療法を開発すること（MCP）、（Lin-c-Kit+ST2+ integrin 7-）IL-9

が本研究において取り組むべき課題である。研究producing mucosal mast cell（MMC9）におけ

代表者は食物アレルギーのエフェクター細胞でる CD300f の発現レベルを解析する。また、小あるマスト細胞が IgE と抗原により活性化され腸 粘 膜 固 有 層 の 細 胞 を 抗 CD11b 抗 体 と 抗る機序とそのアレギー反応を抑制する生体内のCDD11c 抗 体 で 二 重 染 色 し た う え で仕組みに関して研究を続けてきた。その過程で、、（CD103+CD11b+）（CD103+CD11b-）樹状細胞（DC）

マスト細胞に発現する受容体 CD300f（別名 LMIR3）

DC、マクロファージ、好酸球における CD300f のが脂質セラミドに結合してアレルギー反応を抑発現レベルを解析する。

制することを明らかにした（Immunity, 2012）。
１）②野生型及び CD300f 欠損マウス（BALB/c）に対そこで、本助成研究の目的は、CD300f が食物アしてオボアルブミン（OVA）(100 g)と（アジレルギーを抑制するメカニズムの全容を明らかュバントである）Alum（1 mg）を腹腔投与（Dayにすること、さらに CD300f のリガンドであるセ0, 14: 2 週間間隔で計 2 回）する。その 2 週ラミド vesicle の投与が食物アレルギーの予防間後から、OVA（25 mg）を経胃管投与（Day 28-と治療に有効であることを証明することである。

38: 2 日間間隔で計 6 回）して重症の食物アレ

本研究助成の意義は、本研究助成の目的を達成

ルギーを誘導する。経時的に、食物アレルギーすることによって受容体 CD300f が食物アレルギ症状（下痢・血便など）の有無を確認する。OVAーの予防・治療における有望な分子標的となる可の最終投与 24 時間後の血液、小腸を採取する。

能性を見出せることである。特に、CD300f のリガ

血清中の総 IgE 値、OVA 特異的 IgE 値、MCPT-1ンドである脂質セラミドの vesicle の前投与が値を ELISA で測定する。小腸の組織切片を作製

食物アレルギーの症状を抑えることが示されれ

して chloroacetate esterase 染色をしてマスば、CD300f リガンドを利用した食物アレルギー

ト細胞数を計測する。重症の食物アレルギーモ21

抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発

デルでは、マウスの小腸から粘膜固有層の細胞が誘導される。

を分離すると腸管粘膜の死細胞が多く flow⑤マスト細胞欠損（KitW-sh/W-sh）マウスに OVA(100cytometry による解析は困難である。

g)と Alum（1 mg）を腹腔投与（Day 0, 14）し③野生型及び CD300f 欠損マウス（BALB/c）に対た後、野生型あるいは CD300f 欠損 BMMC（1 xしてオボアルブミン（OVA）(100 g)と（アジ106）を静脈注射（Day 20, 27: １週間間隔でュバントである）Alum（1 mg）を腹腔投与（Day計２回）する。その後、OVA（25 mg）を経胃管

0, 14: 2 週間間隔で計 2 回）する。その 2 週投与（Day 28-38: 2 日間間隔で計 6 回）して間後から、OVA（5 mg）を経胃管投与（Day 28-食物アレルギーを誘導して、経時的に食物アレ46: 2 日間間隔で計 10 回）して軽症の食物アルギー症状（下痢・血便など）の有無を調べる。

レルギーを誘導する。経時的に、食物アレルギー症状（下痢・血便など）の有無を確認する。

⑥野生型及び CD300f 欠損マウス（BALB/c）に対OVA の最終投与 24 時間後の血液、小腸、腸間膜して OVA（100 g）と Alum（1 mg）を腹腔投与リンパ節を採取する。血清中の総 IgE 値、OVA（Day 0, 14: 2 週間間隔で計 2 回）した後、特異的 IgE 値、MCPT-1 値を ELISA で測定する。

OVA（25 mg）を経胃管投与（Day 28-38: 2 日間

小 腸 の 組 織 切 片 を 作 製 し て chloroacetate

間隔で計 6 回）して食物アレルギーを誘導する。

esterase 染色をしてマスト細胞数を計測する。

その際、抗セラミド抗体あるいはコントロール軽症の食物アレルギーモデルでは、マウスの小抗体（5 g）を腹腔注射（Day 27-37: 2 日間隔

腸から分離した粘膜固有層の細胞を各種抗体で計 6 回）する。経時的に食物アレルギー症状で染色して flow cytometry で解析することが（下痢・血便など）の有無を調べる。

可能である。OVA の最終投与後の小腸粘膜固有層における D45+血球系細胞中のマスト細胞や⑦野生型及び CD300f 欠損マウス（BALB/c）に対MMC9 細胞の比率を測定する。また、粘膜固有層して OVA（100 g）と Alum（1 mg）を腹腔投与における CD4+T 細胞中の Foxp3+ Treg 細胞の比（Day 0, 14: 2 週間間隔で計 2 回）した後、率を測定する。

OVA（50 mg）を経胃管投与（Day 28-36: 2 日間間隔で計 5 回）して食物アレルギーを誘導する。

④野生型マウスあるいは CD300f 欠損マウスからその際、Extruder で作製したセラミド vesicle

骨髄細胞を採取して、IL-3（10 ng/ml）の存在あるいはコントロール vesicle（100 g）を静下 で 5 週 間 培 養 す る と そ の 95 ％ 以 上 が脈注射（Day 28-36: OVA 投与の 2 時間前に 2 日FcRI+c-Kit+マスト細胞となり、骨髄由来マス間隔で計 5 回）する。１）経時的に、食物アレルト細胞（bone marrow-derived mast cell: BMMC）ギー症状（下痢・血便など）の有無を調べる。

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また、セラミド vesicle の投与前あるいは 1 回現したが、CD300f 欠損マウスでは野生型マウス

投与後のマウスの小腸や血清を採取してセラの場合と比較して下痢の発症が早く頻度も多ミドや類似脂質の量を質量分析装置で測定すかった。また、どちらのマウスでも OVA 摂取にる。

より血清中総 IgE 値、OVA 特異的 IgE 値、（粘膜型マスト細胞の活性化マーカーである）⑧野生型及び CD300f 欠損マウス（BALB/c）に対MCPT-1 値の上昇や小腸組織中のマスト細胞増して OVA（100 g）と Alum（1 mg）を腹腔投与加が認められた。しかし、CD300f 欠損マウスで（Day 0, 14: 2 週間間隔で計 2 回）した後、は野生型マウスの場合と比較して血清中総 IgEOVA（25 mg）を経胃管投与(Day 28: 計 1 回)し値、OVA 特異的 IgE 値、MCPT-1 値の上昇や小腸て翌日（Day 29）に腸間膜リンパ節を採取する。

マスト細胞数の増加が顕著に高かった。

腸 間 膜 リ ン パ 節 の CD11c+B220- 細 胞 中 のCD103+CD11b+DC あるいは CD103＋CD11b- DC の比③食物アレルギーの軽症モデルでは、野生型マウ率を測定する(flow cytometry)。他方、腸間膜スでは明らかな食物アレルギー症状（下痢）はリンパ節細胞を OVA 存在下で 4 日間培養して出現せず、CD300f 欠損マウスの約 40％にのみ産生される IL-4 や IL-5 量を測定する（ELISA）。

下痢が認められた。野生型マウスと比較してまた、CD4+ T 細胞中の Foxp3+ Treg 細胞の比率

CD300f 欠損マウスでは血清中 OVA 特異的 IgEを測定する（flow cytometry）。の上昇や小腸組織におけるマスト細胞の増加が顕著に認められた。また、このモデルでは小結果と考察腸組織の障害による死細胞の混入が少ないのマスト細胞、①小腸粘膜固有層の（FcRI+c-Kit+）で、分離した小腸粘膜固有層の細胞を flow

（Lin-c-Kit+ST2+integrin 7+ ）MCP、（Lin-c-cytometry で解析することができた。
その結果、Kit+ST2+ integrin 7- ）、 IL-9 producing

野生型マウスと比較して CD300f 欠損マウスのmucosal mast cell（MMC9）に CD300f の発現が小腸粘膜固有層ではマスト細胞や MMC9 の比率認められた。
小腸粘膜固有層の CD103+CD11b+ DCが著しく高いかとが確認された。他方、どちらと好酸球には CD300f の発現が認められるが、のマウスでも OVA の経口摂取により小腸粘膜

CD103+CD11b- DC とマクロファージには CD300f

固有層 CD4+細胞中の Foxp3+Treg 細胞の比率はの発現が認められなかった。

低下するが、野生型マウスと比較して CD300f欠損マウスでは Foxp3+Treg 細胞の比率の低下が有意に認められた。

②食物アレルギーの重症モデルにおいて、野生型及び CD300f 欠損マウスは OVA 摂取回数が増えこれらの結果から、IgE とマスト細胞に依存するとともに食物アレルギーの症状（下痢）が出

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抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発ると考えられる食物アレルギーモデルにおいて、が得られた。小腸組織におけるセラミド及び類

２）似脂質の解析については共同研究者が行い、現が増悪することが示された。また、CD300f 欠損マ在、詳細な定量分析が行われている。

CD300f を欠損するマウスでは食物アレルギーウスでは小腸マスト細胞の増加と活性化亢進及び Th2 誘導の促進と Treg 誘導の抑制を示唆する

これらの結果から、食物アレルギーモデルにお結果が得られた。マスト細胞の CD300f は細胞外いて、CD300f とセラミドの結合は小腸のマストセラミドと結合して IgE と抗原によるマスト細細胞の活性化を抑制して食物アレルギー症状を胞の活性化を抑えるので、１）食物アレルギーモデ抑えると考えられた。

ルにおける小腸マスト細胞の CD300f とセラミドの役割を明確にする実験を行った。

⑦CD300f の Th2 誘導や Treg 誘導における役割を明らかにするために、OVA あるいは PBS（コン④作製した野生型及び CD300f 欠損 BMMC（④）をトロール）の経胃管摂取 1 回後の腸間膜リンパマスト細胞欠損（KitW-sh/W-sh）マウスに静脈注射節を解析した。その結果、OVA 摂取により野生してから同様の食物アレルギーを誘導した。そ型マウスの腸間膜リンパ節では（CD300f を発現の結果、野生型 BMMC と比較して CD300f 欠損マする）CD103+CD11b+ DC の比率が有意に増加す

ウスを投与されたマウスにおいて下痢の頻度るが、CD300f 欠損マウスではその上昇が認めらが著しく多かった。

れなかった。他方、両マウスにおいて OVA 摂取により（CD300f を発現しない）CD103+CD11b- DC⑤野生型マウスに（組織で CD300f と脂質セラミの比率は有意に変化しなかった。また、OVA にドの結合を阻害する）セラミド抗体を投与した

よる再刺激実験では野生型マウスと比較して場合、食物アレルギー（下痢）の頻度は著しく

CD300f 欠損マウスの腸間膜リンパ節細胞にお増加した。

いて、Th2 サイトカイン（IL-4 や IL-5）産生の亢進や Treg 細胞比率の低下が認められた。小

⑥野生型マウスに（組織で CD300f リガンドを増腸粘膜固有層の CD103+ DC は抗原を取り込み、加させる）セラミド vesicle を投与した場合、腸間膜リンパ節へ遊走して抗原特異的な Treg

食物アレルギー（下痢）の頻度は著しく減少し細胞を誘導すると考えられているので、 ３ ）た。他方、セラミド vesicle の投与は CD300f

CD300f は CD103+CD11b+ DC の腸管膜リンパ節へ欠損マウスの食物アレルギー（下痢）の頻度にの遊走を促して Treg 誘導を促進する可能性がは影響しなかった。セラミド投与後の小腸組織示唆された。他方、IgE と抗原によるマスト細をセラミド抗体で染色するとコントロール群胞の活性化や Th2 が Treg 誘導を抑制すること、と比較してセラミド量の増加を示唆する結果

逆に、Treg がマスト細胞の活性化や Th2 誘導24

抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発を抑制することも知られている。3)４）現時点に今後の研究活動についておいて、CD300f が食物アレルギーを抑える機序

食物アレルギーに対するセラミド vesicle のにおいて、マスト細胞に発現する CD300f とそ静脈投与が有効であることは明らかになった。セ

れ以外のミエロイド系細胞、特に CD103+CD11b+ラミド vesicle の静脈投与による小腸組織におDC、における CD300f の相対的な役割を明確にけるセラミドあるいは類似脂質の量を質量分析することは難しかった。また、CD300f がどのよ装置で解析することにより、セラミド vesicle のうに CD103+CD11b+ DC の腸管膜リンパ節への遊投与量や方法を改良できると思われる。また、そ走を制御するのかは今後の研究課題である。の解析結果をもとに質量顕微鏡も利用して、セラ
ミド vesicle の静脈投与が小腸組織におけるセいずれにせよ、CD300f には食物アレルギーの病ラミドあるいは類似脂質の動態に及ぼす影響を態形成を抑える作用があること、また、CD300f リ明らかにして、治療法の開発につなげたいと考えガンドであるセラミドの vesicle の静脈投与がている。他方、安定した大量のセラミド vesicle

食物アレルギーの予防・治療に有効であることをの作製法が確立されると、さまざまな実験により明らかにした。本研究により本研究目的の大半を予防・治療効果を検討できるようになる。従って、達成することができた。今後、詳細な脂質分析のセラミド vesicle 自体の作製方法の改良も大き結果に基づき、セラミド vesicle の投与量や投与な課題の一つである。

方法の改良が期待される。それにより、経皮感作

CD300f が食物アレルギーの病態形成を抑制すによる食物アレルギーのモデルでも治療効果のる機序においてマスト細胞や CD103+CD11b+ DC に検討を行うことが可能になると思われる。セラミ発現する CD300f の相対的な役割を明確にするた

ド vesicle の作製方法を改良して大量の安定しめには、マスト細胞や DC 特異的に CD300f を欠損たセラミド vesicle を作製できれば、経口摂取のするマウスの解析が必要であり、現在、準備中で予防効果を検討することも可能になると考えらある。また、Treg などの抑制性 T 細胞による免疫れる。

寛容に CD300f がどのように関与するかは基礎研究における大きな課題である。今後、各種遺伝子本研究の途中結果は第 67 回日本アレルギー学改変マウスを使用してそのメカニズムの解明に会（平成 30 年 6 月 22 日）や第 47 回日本免疫学挑みたいと考えている。
会（平成 30 年 12 月 11 日）で発表され、当該研いずれにせよ、CD300f を標的とした食物アレ究分野の研究者から注目を集めた。現在、本研究

ルギーの予防・治療法開発を目指した研究を継続

内容をまとめて国際雑誌への論文投稿を準備ししていく予定である。ている。

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抑制型受容体に着目した食物アレルギーの予防・治療法開発

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