エクソソーム治療開発経験から生まれたバイオマーカー
新潟大学大学院医歯学総合研究科 消化器内科学分野
未来医療研究開発センター（F-EDC）
准教授 土屋淳紀

2023年11月7日
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細胞外小胞（エクソソーム）について
CD9, 63, 81等が共通マーカー

電子顕微鏡像• 脂質二重膜に覆われ、安定
Size：40~160nm (100nm)の細胞外小胞• タンパクや核酸を含む• 表面分子で特定の細胞を認識

有効物質を効率良く運搬する、細胞間伝達物質我々
は治療薬や、バイオマーカーの可能性を探索している
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肝硬変での治療の可能性とバイオマーカー
HBV, HCV, NASH, Alcohol等

線維化を改善させる
薬剤がないこと
線維化のマーカーも新たなものが望まれる

Terai S, Tsuchiya A et al. Inflamm Regen. 2021 Sep 16;41(1):27.
3細胞外小胞の治療薬としての可能性
間葉系幹細胞Takeuchi S, Tsuchiya A, Terai et al. Npj Regenerative Medicine 2021

組織修復マクロファージを誘導して線維化を改善させる
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細胞外小胞の治療薬としての可能性
私見

細胞外小胞を使用した治療法開発を目指している。
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腸内細菌の小胞に関しての研究

細菌の小胞Natsui K, Tsuchiya A et al. Liver International 2023

腸内細菌の小胞は肝硬変時に侵入し、肝障害を悪化させる
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線維化は予後を決める重要な指標

線維化の進展がNAFLDの予後を決める
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細胞外小胞のマーカーとしての可能性• 今回新たな線維化マーカーのFibulin-4の可能性• 測定計の開発が向上すれば新たなマーカーは更に増える
細胞外小胞をきっかけとしたバイオマーカーの開発
測定系の向上を通して新たなマーカの探索
臨床への方向性を探って行きたい8肝線維化の評価に関して
血小板・IV型コラーゲン・7S・ヒアルロン酸
P-III-P・M2BPGi・ATX

FIB-4（数式）
フィブロスキャン

超音波
線維化の評価7129 Pa5826 Pa

欠点
炎症を合わせて反映してしまう線維化の現時点での進行が？
大型の機器を要する
計測ごとの誤差が大きい
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今回新たな線維化マーカーのFibulin-4の開発

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エクソソーム解析の流れ
血清を使用（代表的な少数検体）

臨床データ
解析

MagCaptureで採取

プロテオミクス多検体血清を用いてELISAにて測定

候補タンパクの選定

目的タンパクの発現するcell lineを用いて抗体の検定
11プロテオミクス解析
Mag captureを用いて患者血清中のエクソソームを回収し，がん研究会の植田幸嗣先生の下でプロテオミクスをおこなって頂いた。
【Human】• 進行肝硬変患者（Child-Pugh Grade B-C）：5名 2,182個• 進行していない肝硬変患者（Child-Pugh Grade A）：5名 2,198個• コントロール：5名 2,068個

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EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2；
EFEMP2 （ Fibulin-4；FIBL-4)の発見
2500004人/5人
200000150000100000

50000

1人/5人

0C-P AC-P B-C
進行している 進行していない

Control
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Fibulin-4はLOX familyに属する

Fibulin-4

Fibulin-3

Hepatology, Volume: 72, Issue: 2, Pages: 729-741, First published: 16 March 2020, DOI: (10.1002/hep.31236)

線維性コラーゲンやエラスチンの架橋に関与し、線維化の進行や線維化回復に対する抵抗性に強く関与している。
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Fibulin-4はLOX familyに属する細胞外マトリックスのフィブリンファミリーの一つで，タンパク質間相互作用に関与するMatrix Biol. 2014 July ; 0: 142–149

弾性線維を形成に不可欠であり，正常な血管、肺、皮膚の発達に必要なためFibulin-4が欠損しているマウスは周産期に死亡し，発現が低下するマウスは動脈瘤を発症する
Journal of Biological Chemistry. 2009;284(36):24553-67.

Fibulin-4は，エラスチン分子の架橋を触媒するLysyloxidase(LOX)のpropeptideとの相互作用を介してLOXをtropoelastinにつなぎ，弾性線維の適切な成熟を促進する上で特定の役割を示す
PNAS November 10, 2009 106 (45) 19029-19034

線維化回復に対する抵抗性に強く関与する可能性など
従来にはない特徴を持つ

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Protein atlasでの肝臓内での発現（Single cell RNA解析）

肝臓内では胆管や間葉系、血管内皮などに発現していそう
16肝臓内での発現；免疫組織染色

肝臓内では胆管や間葉系、血管などに発現している
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Protein atlasでのFibulin-4の肺癌や膵癌での染色

肺癌

膵癌

線維が多い事で知られている、膵癌や肺癌の一部にも発現しており今後、癌の線維化が多い癌のマーカーになり得る可能性
18CD9とCD63の関係（測定系の信頼性）
CD9-Capture ヒトエクソソームELISAキットを使用。CD63は抗体を変えて測定

r = 0.8426

細胞外小胞（エクソソーム）に発現するCD9、63は相関性よく測定できる
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CD9と血小板（Platelet）及びAgeとの関係

r = 0.5607

r = -0.2577

細胞外小胞は血小板数と関連がある、年齢は高いほど低い傾向
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一次抗体の選定
0.9

TIG3を用いて検討

0.8

0.7

1/2

1/4

1/8

Blank

Abs.450nm

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.10

抗体A

抗体B

抗体C

抗体D

21測定した患者背景疾患なし
肝疾患なし（他疾患）
慢性肝疾患
肝硬変 Child-Pugh A

7人
16人
38人
肝細胞癌なし 36人
肝細胞癌あり29人
肝硬変 Child-Pugh B-C 肝細胞癌なし
39人
肝細胞癌あり26人

22Fibulin-4/CD9と肝病変での変化

CLD; chronic liver disease；慢性肝疾患
LC; Liver cirrhosis；肝硬変

細胞外小胞は一般的に体内から速やかに消失する細胞外小胞を測定している事でその時々の線維化の度合いを反映しやすい可能性
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ROC曲線
CLD vs LC

No disease vs CLD

AUC：0.8206

AUC：0.7857

No disease vs LC

AUC：0.9648

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Fibulin-4/CD9と更に細かい肝病変での変化

LC C-P; liver cirrhosis Child-Pugh grade X
肝硬変が悪化するほど上がってくる。特定の患者では高値になるが、進行がしやすい患者が含まれていた25

ROC曲線
No disease vs CLD

No disease vs CP-A

AUC：0.7381

AUC：0.9344

CLD vs CP-A
AUC：0.8000

CLD vs CP-B

AUC：0.9079

No disease vs CP-B
AUC：0.9774

CP-A vs CP-B
AUC：0.7283

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新技術の特徴・従来技術との比較• 細胞外小胞を測定する事で新たな線維化マーカーの発見に至った。

• 細胞外小胞を測定する事でその時々の、強固な線維化の形成を予測できる。肝硬変でも進行しやすい患者を見抜ける可能性• 従来の測定法の問題であった、炎症の影響を受けない可能性がある。
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想定される用途・実用化への課題・企業への期待• 本技術の特徴を生かすためには、企業の持つ測定系の活用ができればありがたい• Fibulin-4以外に、細胞外小胞マーカーの候補は多数あり、同時に開発できるとありがたい• 現在ELISA法で発現する表面蛋白を測定してみているが、細胞外小胞内の蛋白の測定系があればありがたい28

本技術に関する知的財産権• 発明の名称：臓器線維症の診断を補助する方法、被験者における臓器での強固な線維の構築しやすさを予測する方法、及び、臓器線維症の診断用試薬• 出願番号：特願2023-014537• 出願人 ：国立大学法人新潟大学、公益財団
法人がん研究会• 発明者 ：土屋 淳紀、寺井 崇二、植田幸嗣
29お問い合わせ先
新潟大学 社会連携推進機構
ＴＥＬ 025－262 － 7554
ＦＡＸ 025－262 － 7513
e-mail onestop＠adm.niigata-u.ac.jp30