双性イオン構造をもつ高分子ゲルを用いた組織透明化と病理診断への展開

大阪府立大学

大学院工学研究科
応用化学分野准教授 児島 千恵
2019年11月9日
1

生体組織の観察
生体組織の観察
蛍光イメージング

生命現象の解明

生体内の特定のタンパク質を蛍光ラベルして観察

・神経回路の接続状態
・細胞間ネットワーク

・簡便・組織、細胞レベルでの解析可能

２D

病理診断
・精神疾患 ・免疫疾患

３D

生体組織イメージング
組織切片の作製

従来法
不透明蛍光顕微鏡で観察
二次元的な解析

透明化

組織透明化技術

蛍光顕微鏡で観察
三次元的な解析

Chung, K. et al. Nature,497, 332 (2013).

2

組織透明化技術
CLARITY法によるマウス脳組織透明化(和光純薬)

参考文献
Chung,K et al. : Nature., 497, 332(2013).

２D

３D

フジフィルム和光純薬HPより・ 生体組織中の細胞の所在やネットワークを3Dで解析することが可能
・ 病理診断に新たな知見をもたらす革新的技術

3

組織透明化後の免疫染色コスモバイオHPより

フナコシHPより透明化と免疫染色で、３D観察・診断が可能

4がん病理診断への応用
がんに対する化学療法、免疫療法の効果は個人差が大きい
免疫チェックポイント阻害剤のレスポンダー診断（例）
腫瘍血管の構造
PD1の発現
PD-L1の発現••••

がん細胞の不均一性
免疫細胞の種類と数
血管の構造間質の状態

がん生検サンプルから多くの情報を入手して総合的に診断する必要がある。

免疫抑制細胞の存在

Crit Rev Immunol. 2014;34(2):91-102.

5がん病理診断への応用
生検サンプルホルマリン固定パ
ラフィン包埋標本

FRET解析

癌微小環境においてPD-1とPD-L1が近傍に存在する患者は免疫チェックポイント阻害剤が有効であることが事前に診断できる可能性がある。
（英Bath大学チーム）
2020. 8.30

6

がん病理診断への応用
がんに対する化学療法、免疫療法の効果は個人差が大きい
免疫チェックポイント阻害剤のレスポンダー診断（例）
腫瘍血管の構造
PD1の発現
PD-L1の発現••••がん細胞の不均一性
免疫細胞の種類と数血管の構造間質の状態

がん生検サンプルから多くの情報を入手して総合的に診断する必要がある。

免疫抑制細胞の存在

現在は、数枚のスライドの組織染色(2次元情報)で診断

Crit Rev Immunol. 2014;34(2):91-102.

サンプルを透明化して、3次元病理診断が有効
7

既存の組織透明化技術との比較
3DISCOなど（有機溶媒を使用）

CUBIC

SeeDB

（水溶性試薬を使用）

CLARITY（高分子ゲルを使用）◎○○◎

蛍光蛋白質の ×
退色

○

○

△

使用試薬の×(有害、揮発)
安全性

○

○

△

透明性

適用可能
組織

様々な臓器

利点

様々な臓器に適用

問題点

蛋白質変性
有害な有機溶媒を使用

脳、胚など

脳、胚

蛋白質変性なし
水溶性試薬を使用
適用可能組織が限定される

脳など
蛋白質変性なし
水溶性試薬を使用
操作が煩雑

8

CLARITY法
生体組織（不透明）タンパク質固定
脂質除去
溶媒置換

水タンパク質脂質・屈折率： 水 1.33 < タンパク質 1.5
・脂質の会合体が光散乱

タンパク質

透明化

組織の屈折率を1.5にCLARITYの手順
1

組織内のタンパク質をポリアクリルアミドゲルに固定

2

脂質の除去

3 高屈折率の界面活性剤存在下で電気泳動または振とう

4 透明化

溶液に置換

ホルムアルデヒド

NH 2
タンパク質

アクリルアミド
N,N’-メチレンビス
アクリルアミド【問題点】
・電気泳動は組織へのダメージが懸念（条件による）・脂質の除去に長時間 (2,3週間)の振とうが必要
Tomer, R. et al. Nature Protocols, 9, 1689 (2014).
Chung, K. et al. Nature, 497, 332 (2013).

9

CLARITY法に関する先行研究
CLARITY法に関する先行研究
アニオン性高分子ゲルを用いた組織透明化
CLARITY法

アクリルアミド(AAm)

アニオン性モノマー

架橋剤

中性モノマー

N,N’-メチレンビス
アクリルアミド(bisAA)

スチレンスルホン
アクリル酸 酸ナトリウム(AcA)(SS)

がん組織透明化
振とう前

振とう
8日後

振とう
65日後（2か月）

AAm
のみ
SS75
(AAm/SS=25/75)

ゲルの合成

高分子
ゲルの作製

✓ 想定メカニズム
ゲル中の浸透圧が向上

ゲルが膨潤

SSを含む条件でより迅速に透明化が進行

迅速な脂質除去

Y. Ono, C. Kojima et al, J. Biomed. Mater. Res. B, 107, 2297-2304 (2019).
C. Kojima et al Mater. Today Commun, 21, 100611 (2019).

●アニオン性ゲルを用いることで透明化が促進

10本研究：双性イオンモノマーの利用
双性イオンモノマーの利用
透明化マテリアルの改良：双性イオンの構造の影響を検討
スルホベタイン（SB）

ホスホベタイン（リン脂質模倣、MPC）

カルボキシベタイン（CB）＋

N,N-ジメチル(アクリルアミドプロピル)
アンモニウムプロパンスルホネート(DAPS)

AAmとの共重合： 〇共重合体ゲルー

2-メタクリロイルオキシエチル
ホスホリルコリン(MPC)

×⁻
単独重合ゲル3-[(3-アクリルアミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]プロパノエート(ADAP)〇共重合体ゲル11

がん組織の透明化方法
がん組織の透明化方法
溶液の調製
PBS溶液2.5 mLの調製

モノマー
アクリル AcA75, ADAP75,
DAPS50,75,100
系

架橋剤
bisAA

メタクリル DMAPS, MPC
tetra-EGMA系
・モノマー/架橋剤= 0.56M / 6.5mM・VA-044：6.3mg
・がん組織片の厚さ 2 mm

組織内に試薬を浸透1晩放置

24 h4ºC

37 ºC

組織包埋ゲルの作製

脂質の除去
4%ラウリル硫酸ナトリウムを含む
0.8 Mホウ酸バッファー

4日間振とう透明性評価※乳がん組織(MDA-MB-231細胞)

2日間振とうエチレングリコール
置換

ImageJ同一面積の平均強度から透過率を定量的に測定

1時間
ラウリル硫酸ナトリウムの除去

0.1%TritonX-100
水溶液

透明性評価

透明化率 (%)
ゲルを除いた黒線の強度＝ゲルを置く前の黒線の強度

Y. Ono, C. Kojima et al, J. Biomed. Mater. Res. B, 107, 2297-2304 (2019).
C. Kojima et al Mater. Today Commun, 21, 100611 (2019).

×10012

がん組織の透明化-アニオン、双性イオンの比較がん組織の透明化：アニオン、双性イオンの比較
双性イオン

アニオン

PADAP75（CB）

PAcA75PDAPS75（SB）

振とう前
透明化率

0%

0%

0%

5%

0%

59%

73%

85%

95%

振とう
4日後

透明化率
エチレン
グリコール
置換後
透明化率

PADAP75, PDAPS75で短期間でがん組織の透明化が進行した➡アニオン性ゲルより双性イオンゲルで透明化能が向上

13がん組織の透明化-SB組成比の影響がん組織の透明化：組成比の影響
アクリル系SB

アクリル系SBPDAPS50PDAPS75

アクリル系SB
PDAPS

振とう前
透明化率

0%

0%

0%

58%

59%

28%

96%

95%

53%

振とう
4日後

透明化率
エチレン
グリコール
置換後

透明化率

PDAPSより PDAPS50, 75で短期間でがん組織の透明化が進行した

14

がん組織の透明性評価-MPCがん組織の透明化：リン脂質模倣ポリマー（MPC）
MPC-bisAA

MPC-tetraEGMA

振とう前

透明化率

0%

0%

MPC

振とう
4日後
透明化率

75%

89%

bisAA

エチレン
グリコール
置換後
透明化率

tetra-EGMA

99%

94%

MPCゲルでは架橋剤によらず短時間での透明化の進行が見られた

15

組織透明化プロセスにおける双性イオンの効果
組織透明化プロセスにおける双性イオンの効果(双性イオン高分子ゲル)(PAAmゲル)+++++++++++++

Micellesfor lipid
removal+++Protein network++++Target protein
for observation+++Polymer gel++Smallcounterion

双性イオンゲルではカウンターイオンが多数存在→浸透圧が向上→脂質除去が促進（透明化が促進）

AAm

DAPS
AAm/DAPSの共重合ゲル

MPC
PMPCゲル16

脳の血管網の３D蛍光イメージング
脳の血管網の蛍光イメージング★FITC標識抗αSMA(血管平骨筋マーカー)抗体による免疫染色・十分に透明化処理されたマウスの脳サンプルを用いて免疫染色を行った
・ CUBIC-Rで浸漬後、光シート顕微鏡にて撮影した※屈折率を調節するオイル

透明化度
PAAm

PDAPS75

PMPC

FITC-aSMA
・PAAmとPMPC組織包埋ゲル
で良好に血管網を観察できた

・PDAPS75ではCUBIC-R中で組織が白濁したため、良好に撮影できなかった

PMPCゲルは短時間で透明化可能で、かつ蛍光イメージングに適している
17

肺転移モデルでのがん診断
肺転移モデルでのがん診断★肺転移がんモデルでのがん組織の検出
結腸癌細胞（CT26.WT）を尾静脈投与したマウス（肺転移モデルマウス）の肺を採取→PMPCで組織透明化後、ヨウ化プロピジウム（PI）で核を染色→CUBIC-Rで浸漬後、光シート顕微鏡にて撮影した

3次元組織
3D核イメージング

組織切片（連続切片）
2D核イメージング HE染色*後の顕微鏡観察*既存の病理診断法

0.2mm

1mm

核（細胞）が密集している領域 →腫瘍

紫の部分→腫瘍

三次元組織で転移がんを検出できた

現在の病理診断では、3次元組織から一部を切り出して観察（見落とすリスク）18→三次元組織を丸ごと調べることで、正確な診断が可能になる

肺転移モデルでのがん診断
肺転移モデルの３Ｄ蛍光イメージング
同系腫瘍肺転移モデルにおいて、マウス肺を透明化後、ヨウ化プロピジウム（PI）で核を染色
Normal control

Tumor Model

無処置マウス転移巣が明瞭に検出できる19

本研究のまとめ⚫ 以下の双性イオンをもつ高分子ゲルは透明化プロセスを短時間化できた。
共重合体ゲルAAm

DAPS

単独重合ゲルMPC（リン脂質模倣）⚫ PMPCゲルを用いて透明化した組織では、免疫染色後に３次元蛍光イメージングができた。
→新たなPMPCゲルの用途⚫ PMPCゲルで透明化した組織で、大小の転移がんを検出できた。
→新たながん診断技術として有用（研究費）
AMED橋渡し研究戦略的推進プログラム/異分野融合型研究開発推進支援事業（大阪大学拠点）

病理医、獣医の先生との共同研究で、腫瘍内の各種免疫細胞の様子や様々な病理組織について３Dイメージングを実施中

20

論文発表とプレスリリース
論文発表

大学からプレスリリース（2021年8月3日）
日刊工業新聞科学新聞
MRJじほうに記事掲載

21

本研究のまとめ⚫ 以下の双性イオンをもつ高分子ゲルは透明化プロセスを短時間化できた。
共重合体ゲルAAm

DAPS

単独重合ゲルMPC（リン脂質模倣）⚫ PMPCゲルを用いて透明化した組織では、免疫染色後に３次元蛍光イメージングができた。
→新たなPMPCゲルの用途⚫ PMPCゲルで透明化した組織で、大小の転移がんを検出できた。
→新たながん診断技術として有用（研究費）
AMED橋渡し研究戦略的推進プログラム/異分野融合型研究開発推進支援事業（大阪大学拠点）22

肺転移モデルでの免疫細胞の３Ｄイメージング（例）
肺転移モデルでのがん診断
病理医、獣医の先生との共同研究で、様々な病理組織について３Dイメージングを検討中
CD4

FOXP3

Merge

同系腫瘍肺転移モデルにおいて、マウス肺を透明化後、蛍光抗体で目的分子を染色

CD4陽性T細胞の多くがFOXP3陽性の免疫抑制性細胞（制御性T細胞）であることがわかる

23

既存の組織透明化技術との比較
CUBIC

3DISCOなど（水溶性試薬を使用）（有機溶媒を使用）

透明性

SeeDB

CLARITY

本発明（高分子ゲルを使用）◎◎○◎◎

蛍光蛋白質の ×
退色△○△△

使用試薬の×(有害、揮発)安全性○○△○脳など
脳、胚など 脳、胚
適用可能 様々な臓器
組織 （〔備考〕 線維化が観察されるがん組織と異なり、脳は透明化が容易である。）

利点

様々な臓器に適用

蛋白質変性なし
水溶性試薬を使用

脳、がん組織蛋白質変性なし
水溶性試薬を使用

CLARITY法よりも透明化に要する時間が短い
本発明によって脳以外の組織にも現実的に適用可能となった

問題点

蛋白質変性
有害な有機溶媒を使用

適用可能組織が限定される（左記の問題なし）
24

想定される用途
・病変部を確実に検出するために利用→見落とし防止2017年8月30日 プレスリリース 理化学研究所、大阪大学
組織透明化技術「CUBIC」のリンパ節生検への応用

・腫瘍組織の全体像を把握に利用
血管ネットワークの観察→DDSの治療効果の予測に有用免疫細胞の数・種類・空間的配置の観察→個別化がん免疫療法に利用

将来的にはAIを利用した画像診断技術との融合も25実用化に向けた課題• 様々な病態や組織でのデータの蓄積により、診断プロトコルの設定が必要。
→現在、病理医、獣医の先生方と共同研究にて実施中• さらなるプロセス時間の短縮が必要。→現在検討中• 3次元イメージング技術と連動した技術開発が必要。

26

企業への期待• ３D蛍光イメージング技術を持つ企業、画像診断技術をもつ企業との共同研究を希望。
• 双性イオン型の特殊モノマーをお持ちの企業、病理診断・研究用の試薬を開発中の企業、病理診断・イメージングの受託研究をされる企業には、本技術の導入が有効と思われる。
27

特許
•

発明の名称：
発明者：
出願人：
基礎出願：
国際出願：
移行国（出願番号）：

生体組織透明化法およびその試薬
児島 千恵、他
公立大学法人大阪
特願2017-132787 (2017/7/6 出願)
PCT/JP2018/025239 [WO2019/009300] (2018/7/3 出願）
日本（JP2019-527726）、米国（US16/628595）•発明の名称：
発明者：
出願人：
基礎出願：
国際出願：
移行国（出願番号） ：生体組織透明化法およびその試薬
児島 千恵、他
公立大学法人大阪JP2019-203871（2019/11/11 出願）
PCT/JP2020/041890 [WO2021095718A1] (2020/11/10 出願）[国内移行期限前]28

お問い合わせ先
公立大学法人大阪 大阪府立大学
学術研究支援部 URAセンター
TEL：072-254-9128
FAX：072-254-7475
e-mail ：URA-center@ao.osakafu-u.ac.jp