特定の物質を高効率に濃縮可能な機能材料の開発技術
有明工業高等専門学校 創造工学科教授 大河平 紀司

ウイルス検出技術
イムノクロマト法

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法

簡便な方法として普及しているが、検体に含まれる抗原・抗体の濃度が低く、検出感度が低いため誤診につながるケースが後を絶たず、新型コロナウイルスに関する利用は推奨されていない。

感度が高いと言われているが、これは遺伝子増幅を何度も繰り返し行うが故であり、精度を高めるためには十分なウイルス量が重要となる。

抗原標識抗体キャプチャー抗体

粘液や唾液から検体を採取

1/27

PCRにて増幅

分析機器によるチェック下水道サーベイランス
１：下水採取（雨水等で希釈される）
２：ウイルス濃縮
３：RNA抽出1234

下水サーベイランスは、下水中に微量存在するコロナウイルスのRNA濃度を測定し、地域の蔓延状況や感染者の推移予測が可能であるとして実施されている事業。
2/27

下水道サーベイランス
ウイルス濃縮方法
陰電荷膜濃縮法⊕⊕⊕⊕⊖ ⊖⊖ ⊖PEG沈殿法⊖

ウイルスの表面電荷がマイナスであることを利用し、逆電荷であるプラスの電荷を付与した膜にて静電吸着を行う方法。
濃縮対象以外のマイナス電荷を帯びた物質（タンパク質等）も吸着してしまう。
3/27

超遠心法

ポリエチレングリコール
NaCl

ポリエチレングリコール
ローターによりサンプルを大き（PEG）及び塩化ナトリウムと な遠心力で回転させることによ混合して振とうし、PEGが水分 り、拡散力による熱運動の影響子を吸着することによってウイ を打ち消して沈降させる方法。
ルス同士が凝集沈殿する現象
雨水等の希釈により効率が低下（塩析）を利用した方法。雨水 する。高額機器が必要。
等の希釈により効率が低下する。

高効率に物質（ウイルス）を濃縮可能な手法（材料）が必要！！

4/27

本技術の概要
ポリマーブラシ(A)

従来の固定化法（単位面積あたり低濃縮率）

5/27

抗原（ウイルス）

抗体（抗原認識部位）(B)

提案する革新的機能材料（単位面積あたり高濃縮率）

高効率濃縮が可能！！

本技術の詳細
電子線グラフト重合法

電子線照射(200 kGy)

ラジカル発生Glycidyl Methacrylate(GMA)

窒素雰囲気下汎用基材（ポリエチレン平膜）

反応性の高いエポキシ環に官能基を導入することで様々な機能性の付与が可能
6/27

電子線グラフト重合による機能化の例
分解したい物質（ビスフェノールA）
汎用基材（ポリエチレン膜）

酸化分解
拡大像
きのこ由来

基材：ポリエチレン製多孔性中空糸膜（Microza®)
モノマー：グリシジルメタクリレート（GMA）
官能基：アミノエタノール
ラッカーゼ：Trametes. sp
分解対象：ビスフェノールA
活性評価：UPLC/MS

7/27

1) 酸化反応2) 基質特異性低い
3) フェノール系化合物の分解

O2 +4e- + 4H+ →2H2O

PDB ID: 3KW7

活性中心

Ayasa Nagatani, Ashkan Mokhtar, Tadashi Okobira, Bioresource Technology Reports, 22, 101444-101444 (2023)

本技術の詳細
高密度抗体固定化ポリマーブラシ作製スキーム

電子線照射

反応性モノマー（グリシジルメタクリレート）
OOO

汎用基材

ラジカルが発生（抗体）

高濃度ポリマーブラシの生成

ポリマーブラシに抗体を高密度固定する

8/27

高密度抗体固定化
ポリマーブラシ本技術の詳細
高密度抗体固定化ポリマーブラシ作製スキーム
OOO

高濃度ポリマーブラシの生成

ジアミンの導入

一本鎖の拡大イメージ
クロスリンカー（抗体）

クロスリンカ－の導入

9/27

高密度抗体固定化
ポリマーブラシポリマーブラシにクロスリンカーを導入することで、抗体の高密度固定化を実現

本技術の詳細
クロスリンカーを用いたIgG抗体の固定化
結合形成
ポリマーブラシ

HS

結合形成
NH2

一次抗体（IgG）

クロスリンカー

① ポリマーブラシにアミノ基を導入し、クロスリンカーのN-ヒドロキシスクシンイミド活性エステルと反応② クロスリンカーのマレイミド基とIgG抗体のチオール基を反応させて固定化
10/27

本技術の詳細
IgG抗体固定化の確認（発光法）

ポリマーブラシ

一次抗体（IgG）

発光クロスリンカー

HRP＋ルミノール

二次抗体（HRP-抗IgG）

IgG固定化の可否の評価は「固定化したIgGを特異的に認識するHRP-抗IgG」とルミノール（基質）との発光により評価
11/27

本技術の詳細
発光法によるIgG導入評価結果(1) (2) (3) (4) (5)No.＆膜の種類(1) EDA膜

露光撮影(2) KMUS膜(3) IgG膜(0.05mL)(4) IgG膜(0.10mL)

発光撮影(5) IgG膜(0.20mL)

IgG溶液に浸漬させた試料のみ, HRP-抗IgG由来の発光⇒ Sulfo-KMUSを介したIgG導入に成功
12/27

本技術の詳細
IgG抗体固定化の確認（染色法）

ポリマーブラシ

一次抗体（IgG）

染色クロスリンカー

HRP＋DAB

二次抗体（HRP-抗IgG）

IgG固定化の可否の評価は「固定化したIgGを特異的に認識するHRP-抗IgG」とDABによる染色により評価
13/27

本技術の詳細
染色法によるIgG導入評価結果

No.＆膜の種類

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(1) 0.1 vol%(2) 0.01 vol%(3) 0.001 vol%(4) 0.0001 vol%(5) 0.00001 vol%(6) コントロール

14/27

サンプル間で異なる発色度⇒ 抗体導入量に依存した染色を確認

本技術の詳細
HRP標識Protein Aによる評価

1% BSA

0.1%
Protein A

PBS, 4℃

PBS, 4℃
物理吸着阻害IgG膜

発色基質
3,3′-ジアミノベンジジン

発光基質
ルミノール

(DAB)

発光法
15/27

Protein A導入

発色法

本技術の詳細
染色法によるHRP標識Protein Aによる評価結果
No.＆膜の種類
(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(1) 0.1 vol%(2) 0.01 vol%(3) 0.001 vol%(4) 0.0001 vol%(5) 0.00001 vol%grayscale240(6) コントロール

220200

抗体量依存の吸着量180➤膜上での抗原認識能

160

16/27

抗体溶液濃度 (%)

本技術の詳細
ポリマーブラシの効果の検証
単層固定化膜の作製

1) Pr2NEt
2) COMU
3) EDAhνDMF

被酸化PE膜

PE膜

hν

RH

単層EDA膜RHO2RROO

ROOH + R

紫外線の吸収により生成した炭素ラジカルがUV照射装置
17/27

連鎖反応を引き起こし, ROOH生成

本技術の詳細
ポリマーブラシの効果の検証
単層vs積層間の染色比較
発色
前発色
後

単層抗体膜はCOMU縮合操作由来の薄黄色の着色が発色前から見られた
単層

積層

発色操作前後の濃淡差で抗体量を評価した

Table 1 発色操作前後の各膜の濃淡差

18/27

単層

積層同量のIgGを仕込んだ膜の発色前193.58209.93

発色度に差が生じた

発色後

118.15102.42

濃淡差75.43107.51

積層膜では抗体量が増加

本技術の詳細
ポリマーブラシの効果の検証
単層、積層間の染色比較＋IgG仕込み量変化
No.＆膜の種類(1) 単層膜 0.1 vol%60(4) 積層膜 0.001 vol%濃淡差(2) 積層膜 0.1 vol%(3) 積層膜 0.01 vol%抗体固定量up！！

804020(5) 積層膜 0.0001 vol%0(6) 積層膜 0.00001 vol％-20123456sample No.

✓ 単層膜はIgG仕込み量 1/100 の積層膜と同等の濃淡差を示した⇒積層膜（ポリマーブラシ）の有用性
19/27

本技術の特徴、想定される用途

感度が大幅にアップ！！

濃縮の実現により解決！！

新しい濃縮技術として学術的・産業的価値が非常に高い！！

20/27

理論的にはどのウイルスにも応用可能！！

本技術の特徴、想定される用途
高感度ウイルスマルチプレックス解析

マルチプレックス解析

分離
同一基材上のポリマーブラシに種々の抗体を同時固定

21/27

デジタルPCR

本技術の特徴、想定される用途
高感度ウイルスマルチプレックス解析

インフルエンザウイルスのみ認識

ポリオウイルスのみ認識

コロナウイルスのみ認識

分離
汎用基材

さる痘ウイルスのみ認識

22/27

デジタルPCR

本技術の特徴、想定される用途
高感度ウイルスマルチプレックス解析
Q-body法
測定サンプル

発光洗浄

レーン毎に異なる抗原を認識する
クエンチ抗体を積層固定

Q-bodyは蛍光免疫センサーであるクエンチ抗体を利用した方法であり、特定の抗原と結合することで蛍光を発する
23/27

R. Abe, et. al., J. Am. Chem. Soc., 133, 17386-17394(2011)本技術の特徴、想定される用途✓プロテインＧ固定化→高効率抗体精製材料✓レクチン固定化→高感度レクチンアレイ（糖鎖認識材料）✓酵素固定化→生体内の反応を人工材料で実現
24/27

企業への期待✓イムノクロマト開発技術を持つ企業とのコラボ→本技術の有効性、有用性を検証したい✓サーベイランスの技術を有する企業とのコラボ→実証に向けた開発・改良を進めたい✓分析機器の高感度化に関心がある企業とのコラボ→Q-body法、水晶振動子マイクロバランス法（QCM）、表面プラズモン共鳴法（SPR）等、様々な分析法への応用が期待される
25/27

本技術に関する知的財産権✓発明の名称 ：機能性成形体およびその製造方法

26/27

✓出願番号

：特願2023-101839✓出願人：独立行政法人国立高等専門学校機構✓発明者：大河平紀司、冨永伸明

お問い合わせ先

有明工業高等専門学校
総務課 連携推進係
ＴＥＬ：0944-53-8627
ＦＡＸ：0944-53-1361
e-mail：souren-staff@ml.ariake-nct.ac.jp
27/27