多様多種な微生物への生体分子の導入は膜透過性ペプチドが有効！
大学院工学研究院
生命機能科学部門准教授 モリ テツシ

新技術の紹介（背景）
重要性

自然界
環境微生物
生物

• 環境と相互作用しその環境のバランス（健康、疾患）に深い関わりを持つ• 進化過程を得て特殊な性質や機能を持つ → 重要な遺伝子資源（高活性酵素、天然化合物など）
高活性酵素の発見

新規天然化合物（リード化合物）の発見

バイオマス・天然資源

Formosa sp.

Shewanella sp.

Vibrio sp.

Rheinheimera sp.

Cobetia sp.

Falsirhodobacter sp.

応用••
•
•
Image borrowed from the SCSIO website

生理活性物質新バイオマテリアル
食品、品質の向上
リード化合物

高分子分解酵素

Tokyo University of Agriculture and Technology2

新技術の紹介（背景）
環境中に生息している多くの微生物種はまだ単離、分離されておらず→ 有用性は解明されていないHug et al., Nature microbiology, 2016

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3新技術の紹介（背景）エレクトロポレーション・形質転換• 特定の細菌種にしか応用できない• 煩雑、最適が必要• 導入効率が低い• 核酸に限定される

直接分離培養・共培養

コンジュゲーション

トランスダクション

https://www.istockphoto.com

長所：• 標的形質を持つ微生物の単離• 生きて保存可能

汎用性が高い多様多種の微生物に生体分子を導入できる手法が必要

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4新技術の紹介（膜透過性ペピチド(CPP）
CPPの性質• 自然界に存在し、生体分子のキャリアとして利用されている• 細胞表面のリセプターあるいは膜タンパク質を介さずに細胞膜を透過できる• 主に両親媒性、カチオン性、疎水性に分類され、プラスチャージを持つのが特徴• ペプチドの長さは短く、多くが40アミノ酸以下である• 導入する細胞の性質に依存せず、また細胞へ毒性はない
http://crdd.osdd.net/raghava/cppsite/Mickan et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 2014

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5新技術の紹介（膜透過性ペピチド(CPP）
BPP Sequence

Peptide Length

Native function

Reference(KFF)₃9-①-③(RFF)₃9-④,⑤

RTRTRFLRRT

10-④(RXX*)₃

9-④(RX)₆12-⑤(RXR)₄12-⑤(RXRRBR)₂12-⑤(RFR)₄12-⑥11

Streptococcus pneumoniae phage⑦

MINWKLRLKNKYGRKKRRQRRR

11

HIV-1 Tat (47-57)⑦

RQIKIWFQNRRMKWKK

16

Antennapedia (43-58)⑥

GRKKKRRQRRRYK

13HIV-1 Tat (48-61)⑥VLTNENPPFSD

11Receptor recycling signal⑧YKKSNNPFSD

10EH domain affinity⑧RSNNPFRAR

9EH domain affinity⑧CMVSCAMPNPF

11Vesicle recycling signal⑧LMDLAD

6Receptor recycling signal⑧7Endoplasmic reticulum⑧

CFFKDELIKFLKFLKFL

10-⑨KRLKWKYKGKF11-⑨KTKCKFLKKC

10-⑨IRTRCRFLRRC

11-⑨holing protein

localization

様々な種類が存在し、微生物を初め、真核細胞に対しても応用可能

特定の細菌種にしか応用できない① Liam Good et al, Nature, 2001, ② Magdalena Eriksson et al, The
Journal of Biological Chemistry, 2002, ③ Ravi R. Patel et al, Frontiers inMicrobiology, 2017, ④ Lucas D. Tilley et al, Antimicrobial Agents andChemotherapy, 2006, ⑤ Brett L. Mellbye et al, Antimicrobial Agents andChemotherapy, 2009, ⑥ Mostafa F. N. Abushahba et al, Scientific
Report, 2016, ⑦ Shan Goh et al, BMS Microbiology, 2015, ⑧ Gunaratna
Kuttuva Rajarao et al, FEMS Microbiology Letters, 2002, ⑨ Martti Vaaraet al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1996.

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6新技術の紹介（論文・プレスリリス）

多様多種な微生物に生体分子を導入できるCPPを開発した

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7新技術の紹介（研究成果）a) Lysine (K)Name

Cationiccharge

Sequence
Weakest(KFF)3H-KFFKFFKFF-K*-NH2K3

H-KKK-K*-NH2K6

H-KKKKKK-K*-NH2K9H-KKKKKKKKK-K*-NH2K12

H-KKKKKKKKKKKK-K*-NH2R3H-RRR-K*-NH2R6H-RRRRRR-K*-NH2R9H-RRRRRRRRR-K*-NH2R12H-RRRRRRRRRRRR-K*-NH2εK9

H-εKεKεKεKεKεKεKεKεK-K*-NH2dOrn9

H-Orn9-K*-NH2Dab9

H-Dab9-K*-NH2Dap9

H-Dap9-K*-NH2b) Ornithine (Orn)c) Diaminobutyric acid (Dab)d) Diaminopropionic acid (Dap)
Strongest

1. Inoue, Mori, Muraoka et al., Applied Bio Materials, 2021

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8新技術の紹介（研究成果）
NameSequence

Permeability (%)(KFF)3

H-KFFKFFKFF-K*-NH248

K3

H-KKK-K*-NH20.1

K6

H-KKKKKK-K*-NH20.7

K9

H-KKKKKKKKK-K*-NH240

K12

H-KKKKKKKKKKKK-K*-NH284

R3

H-RRR-K*-NH20.2

R6

H-RRRRRR-K*-NH258

R9H-RRRRRRRRR-K*-NH268

R12H-RRRRRRRRRRRR-K*-NH278

εK9H-εKεKεKεKεKεKεKεKεK-K*-NH2d75

Orn9H-Orn9-K*-NH2>99

Dab9H-Dab9-K*-NH2>99

Dap9H-Dap9-K*-NH2>99

1. Inoue, Mori, Muraoka et al., Applied
Bio Materials, 2021

リジンのアナログで合成されたCPPが最も高い導入効率を示す
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9新技術の紹介（研究成果）

1. Inoue, Mori, Muraoka et al.,Applied Bio Materials, 2021

細胞内への導入が認められている
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10新技術の紹介（用途・応用例① ）Bacterial Strains

Permeability (%)(KFF)348

Dab9>99

Dap9>99

E. hormaechei<5>9981P. hauseri<57455

S. grimesii<5>9976

T. guamensis<5>9993

Y. bercovieri

XX>99>99

E. coli

従来報告されたCPPに比べ、本研究で開発したCPPの方が圧倒的に導入率が高い→汎用性あり真核細胞（微細藻類）に対しても高い導入効率を示す
1. Inoue, Mori, Muraoka et al., Applied Bio Materials, 2021

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11新技術の紹介（用途・応用例②）
CPPを利用した新規遺伝子制御系の構築
Target Gene
-5+55’-…ATTACTAACTAGATCTATGAGTAAAGGAGAAGAAC… -3’
CTAGATACTCCPP-PNA
10 mer(Protein Nucleic Acid) PNA

1.8
1.6
1.41.2

OD₆₆₀

遺伝子発現制御への効果あり↓• 化合物生産向上に向けて代謝経路の解明• 未知タンパク質の解明

10 µM4 µM
2 µM
1 µM
0 µM

10.80.60.40.2002468Time (hour)

101224

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12新技術の紹介（用途・応用例③）
BF

微生物の芽胞芽胞のみを特異的に検出可能

Filter5
U-FBWA (Green)

BF

Bacillus megaterium
BF

Filter5
U-FBWA (Green)

Lactobacillus plantarum

Filter5
U-FBWA (Green)

Bacillus subtilis
BF

Filter5
U-FBWA (Green)

Staphylococcus saprophyticus

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13• 様々な微生物種に対して導入評価および実績が必要（実証開始）• 核酸以外の生体分子の導入の実証例が必要（実証開始）

研究②

遺伝子発現制御系の構築• 遺伝子発現制御した代謝経路の実証例（実証開始）• より多くの未知タンパク質の機能解明実績が必要（実証開始）

芽胞の特異的検出系の開発

研究①

多様多種な微生物（原核および真核細胞）へ生体分子の応用

研究③

実用化に向けた課題• モデル細菌に対して実証済み。
環境サンプルへの応用が必要

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14企業への期待• CPPを利用した遺伝子制御の系は研究室レベル（小スケール）での実証は成功しているが、産業の現場で実際にその利用性を実証したい → ラー
ジスケールでの応用は可能かどうか、有効性と実現性。
• 芽胞の検出系はモデル微生物レベルでは可能と証明されているが、食品や医療現場での応用性を探りたい → 可能であることが実証できた場合、商品開発へのつながること期待したい。
• CPPにおける他の応用法についても相談化
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：微生物膜透過剤、複合体、これを用いた微生物細胞に化合物を送達する
方法、殺菌剤、抗菌剤及びラベル化剤• 出願番号：特願2020-25607• 出願人：国立大学法人東京農工大学• 発明者：モリ テツシ、村岡 貴博、井上 豪、豊原 大智、三浦 恵理香

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お問い合わせ先

東京農工大学先端産学連携研究推進センター
ＴＥＬ
ＦＡＸ
e-mail042－388－7550
042－388－7553
suishin@ml.tuat.ac.jp

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