蛍光分光法を用いた
大豆イソフラボン量の簡易推定法

新潟大学 農学部 農学科
流域環境学プログラム
助教 斎藤 嘉人
2023年11月7日

2 2

背景(1)

肥料・飼料→タンパク質の変換
窒素変換効率(%)

 大豆の重要性☞大豆：世界的に生産量，需要ともに年々増加傾向☞食用大豆は基本的に加工され，流通 USDA，2020☞品種特性に応じて様々な加工用途
大豆の用途別需要量（日本）（平成27年度）
4000

食用需要量（千トン）

油糧用
3000

その他
豆乳

15%

豆腐・油揚げ納豆 13%

51%

2000

醤油
28 %

0

牛肉 豚肉 牛乳 鶏肉 大豆
豆類
J. Life Cycle Assessment, Japan, 14(2), 2018

その他

1000

2525004%4%505013%

味噌☞輸入割合：約80%→異なる産地の大豆を仕入れる「リスク分散」

農林水産省，2017

種子の品質や加工特性の簡便な計測の必要性

食料需給表，2020

3 3

背景(2)
 品種例：’里のほほえみ’■特徴・大粒・高タンパク質
・耐倒伏性：〇

 選抜過程

粒単位での選抜

里のほほえみエンレイ

里のほほえみエンレイ（豆腐用）

東北農研研報，113，
2011

一粒単位でのスクリーニング技術の必要性

背景(3)

4 4

 大豆の品質
大豆の栄養成分5%

タンパク質
脂質39%

34%

炭水化物
灰分22%

■主要成分
・タンパク質→豆腐用・脂質→味噌用 Liu, K., Springer, 2012

日本食品標準成分表2015年版（乾物ベース）■その他重要成分
・イソフラボン：抗酸化作用，発がんリスク低減
Yan and Spitznagel, Am. J. Clin. Nutr., 2009などの機能性 先行研究：イソフラボン量の推定
近赤外分光法・非破壊計測の代表手法
・イソフラボン量の推定精度→R2 = 0.80・測定波長：1000～2500 nm→測定波長帯は広いものの推定可能

Food Chemistry, 317, 126373, 2020.

■課題
・O-H, C-H, N-Hの倍音，結合音の重なり→長波長まで測定が必要
・タンパク質・脂質より推定精度は劣る
例：R2 = 0.89～0.99 (タンパク質，脂質)→微量成分に対する精度を上げたい
KOREAN JOURNAL OF CROP SCIENCE, 46(2), 106–111, 2001

Food Control, 35(1), 227–232, 2014

5 5

背景(4)
 蛍光分光法

大豆に含まれる蛍光物質☞短波長側で励起→長波長側の発光を計測☞利点
・蛍光を持つ物質のみが観測される →選択性：〇
・励起波長，蛍光波長の組み合わせ→特異性：〇
・波長選択によりイメージングへ応用→装置化：〇

・アミノ酸・脂質関連物質・ビタミンB2・イソフラボン
・メイラード化合物☞励起蛍光マトリクス（EEM）

・単離成分：報告あり
・大豆自体：報告なし

蛍光強度(A.U.)

励起波長(nm)

蛍光波長 (nm)等

Liang, J.-H., 1999. Food Chemistry 66, 103–108.
Liang, J.-H., Lin, C.-C., 2000. Journal of the American Oil Chemists’ Society77, 709–713.

1イメージング
応用・励起波長，蛍光波長，蛍光強度の3次元データ
・蛍光特性の把握 ＋ 適切な波長選択2334

目的・内容 開発内容蛍光分光法を利用した大豆のイソフラボン含有量の簡易推定■新技術の特徴・従来技術との比較• これまで難しかった，分光法による大豆イソフラボンの高精度な推定に成功した。

• 事前に複数品種の測定を行い検量線を作成すれば，蛍光スペクトルの測定のみでイソフラボン含有量を推定できる。
• 従来の科学的手法（HPLC等）に比べ，化学薬品の利用が不要で，測定時間も1/5以下で完了する。（一試料約15分）

6 6

検証内容

■具体的な検証内容
1. 大豆のイソフラボン含有量の定量（HPLCにて測定）
2. 励起蛍光マトリクス，近赤外拡散反射スペクトルの測定
3. 多変量解析によるイソフラボン含有量推定の精度比較

7 7

試料8 8

 供試試料・大豆：34品種（日本、アメリカ、カナダ、ロシア、中国産）
・百粒重：24.2±8.8g
・含水率：10.3±1.5%・大豆60 gを振動式ミルにて60秒間粉砕し、均一化・各種測定まで、-40℃にて保管

大豆試料60 g

粉砕（1分間）SAMPLE MILL TI-100 (CMT Co., Ltd, Japan)→-40℃にて冷凍保存

9 9

実験方法
1. イソフラボンの測定

菊地ら, 1999. 食品衛生学雑誌 40, 444–454_1.

・生大豆粉末を300 µmふるいで夾雑物除去
・生大豆粉末を1.0gとなるよう精秤
・80%メタノールを5mL添加，2分間均一に攪拌
・6000rpmで5分間遠心分離し，上清を得る
・再度同様の抽出工程を繰り返し，2回目の上清を得る
・1回目・2回目の上清を合わせてHPLCの測定に供試
LC-20ADほか（島津製作所）＜HPLC測定条件＞
・測定成分：ダイジン，ダイゼイン，ゲニスチン，ゲニステイン (標準液は100%メタで調製)・A相：100mMりん酸ナトリウム緩衝液，B相：90%メタノール
・グラジェント条件：0分(A: 66.7%, B: 33.3%)→ 30分(A: 44.4%, B: 55.6%) → 35分(A: 66.7%, B: 33.3%)
・流速：1.0mL/min
・測定時間：50分
・検出器：UV検出（254 nm）
・カラム：Shim-pack VP-ODS 150L-4.6 (島津製作所)
・オーブン：40℃

10 10

実験方法
2. EEM・NIR反射スペクトルの測定
・試料：300 µmふるいを通した生大豆粉約2.0 g

ーEEM計測パラメーター
・Excitation波長：200-500 nm
・Emission波長：220-600 nm
・バンド幅：5 nm（Ex, Em）
・走査速度：5000 nm/min
・Response：50 ms
・表面蛍光測定（Front-Face）により計測
・水のラマン散乱積算強度（Ex.350 nm,Em.371-428 nm）で強度を正規化

ーNIR計測パラメーター
・波長：800-1800 nm
・バンド幅：5.0 nm (UV-Vis)，8.0 nm (NIR)
・データ間隔：0.5 nm
・積分球ユニット（ISN-923）を使用
・リファレンス：各試料ごとにスペクトラロンで測定

蛍光FP8300, 日本分光

V-670, 日本分光

11 11

結果と考察(1) 大豆のNIR反射スペクトル
Savitzky Golayスムージング処理済
0.6

1st overtone of
O-H stretching (1450 nm)

0.5

水log(1/R)

0.4

2nd overtone of
C-H stretching(1200 nm)0.3

1st overtone ofN-H stretching(1520 nm)0.2

1st overtone of
C-O and C-Hstretching(1720 nm)タンパク質0.1

脂質0800

1000

1200
1400
Wavelength (nm)

■PLSR入力前のスペクトル前処理：3パターン・log(1/R)（Savitzky Golayスムージング処理済，窓サイズ25）・log(1/R)の2次微分スペクトル：d2log(1/R)
・反射率をKubelka-Munk変換したスペクトル：KM=(1-R2)/2R

1600

1800

12 12

結果と考察(1) 大豆のNIR反射スペクトル■log(1/R)の2次微分スペクトル
5 ×10
432
101000-1 800-2-3-4-5■Kubelka-Munk変換後スペクトル
10.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.10KM

d2log(1/R)

-4

1200

1400

Wavelength (nm)

1600

1800

800

■PLSRによる推定モデルの構築
・目的変数：イソフラボン総量・交差検証：5分割交差検証
・潜在変数：5分割交差検証でRMSEが最小値となった個数

10001200 1400 1600
Wavelength (nm)1800

13 13

結果と考察(2)500400PeakC300 Peak

B

200

Peak
A

300
400
500
600
Emission wavelength (nm)Fluorescence intensity(R.U.)

Excitation wavelength (nm)

 大豆のEEMNo.

Ex [nm]Em [nm]

想定される蛍光物質

A

230

335

アミノ酸[1]

B

285

335

C

365~
435

475~
495

アミノ酸[1]
脂質酸化物
メイラード化合物[2]イソフラボン類[3][1] Yamashita & Tanoue, Marine Chemistry, 82(3-4), 255–271, 2003
[2] Sun & Leopold, Physiologia Plantarum 94, 94–104,
1995[3] Chaudhuri et al., Current drug metabolism 14, 491–503,
2013■PLSR入力前のスペクトル前処理
・全ての(Ex, Em)波長組み合わせを1次元にunfold■PLSRで推定モデルを構築
・目的変数：イソフラボン総量・交差検証：5分割交差検証
・潜在変数：5分割交差検証でRMSEが最小値となった個数

14 14

結果と考察(3) PLS回帰の結果：総イソフラボン含量の推定■log(1/R)の2次微分スペクトル4d2log(1/R)
y=xPredicted value (mg/g)

Predicted value (mg/g)

4

■EEM

32R2 = 0.62
RPD = 1.62

1EEM
y=x

32

R2 = 0.87

1RPD = 2.73000

123Measured value (mg/g)

40123Measured value (mg/g)■考察・NIRでは二次微分処理により推定精度が改善（RPD = 1.62）
・log(1/R)とKMではRPDが1.1程度と推定不可能
・EEMでは高精度な推定が可能，スクリーニングにも適用可能（RPD = 2.73）

4(dry basis)

15 15

結果と考察(4) 推定に寄与した波長の考察：VIPの可視化■ d2log(1/R)■EEM ※VIP>1.0のみ表示

4C-O
C-H

ダイゼインの蛍光が寄与した可能性

VIP score

32正の寄与

1負の寄与
0800

1000

1200
1400
Wavelength (nm)

1600

1800

■考察
・C-OやC-H：イソフラボンにも含まれる官能基
ただし脂質由来が支配的（脂質20%，イソフラボン0.1%／大豆中）
ダイゼイン
・EEM：ダイゼインの蛍光（Ex:300–350, Em: 465 nm）が寄与した可能性
J. Photochemistry and Photobiology B: Biology, 96(3), 242–248., 2009
ただし他の蛍光物質も影響している可能性

検証内容の結論

16 16

 研究目的

大豆のイソフラボン含有量の推定における蛍光分光法と近赤外分光法の比較 結果■近赤外分光法
・二次微分により精度が改善（RPDで1.6）・脂質由来の情報(C-O, C-H)に埋もれ選択的な推定が難しい可能性■蛍光分光法・RPDで2.7を超える推定精度
・蛍光波長450 nm以上の領域が正に寄与

蛍光分光法を用いた大豆のイソフラボン量推定の可能性

17 17

想定される用途
育種

ほ場管理

栽培管理

収穫

選別貯蔵

加工

消費

種子の迅速スクリーニング
色彩選別機への組み込み

貯蔵中の種子品質のモニタリング
加工前の“オンサイト”品質検査■利用者
・大豆の育種者
・大豆商社
・大豆加工メーカー（豆腐・味噌・豆乳・醤油・納豆等）

18 18実用化に向けた課題■ハードウェアの課題
・EEM全体を入力とすることで，実用に足る精度は得られている（RPD = 2.73）。一方，EEMの取得のためには，励起波長・蛍光波長を両方とも走査できる分光蛍光光度計が必要。
⇒一農家が導入できる価格帯ではない（最低100万円～）

・EEMを用いない方法として，励起波長固定型・蛍光スペクトル走査型の簡易光学系が考えられる（つまり，重要波長のみに絞る）
・励起波長固定型の光学デザインについては今後検証する必要がある■ソフトウェアの課題
・励起波長固定型を想定したときの精度⇒今後検証する必要がある

重要波長

企業への期待19 19

・励起波長固定型・蛍光スペクトル走査型の簡易光学系について紫外LEDや小型分光器，ファイバなどの装置開発メーカー，あるいは農機メーカーとの協業で開発できる可能性がある。
・別の農作物や食品，医薬品など，別の対象物への応用可能性についても連携を期待する。
（特に社会的インパクトの大きい研究・開発）

知的財産権20

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：豆含有イソフラボン量の推定方法、及び豆含有イソフラボン量推定装置• 出願番号• 出願人• 発明者：特願2023-140758
：新潟大学
：斎藤嘉人

産学連携等の経歴
共同研究先企業・機関
2020年-2023年
地方公共団体及び民間企業等

外部資金等獲得状況
2020年-2023年[1] 科研費：代表３件，分担１件
特別研究員奨励費DC2（代表，2020-04-01～2022-03-31）
科研費研究活動スタート支援（代表，2022-08-01～2024-03-31）
科研費挑戦的研究(萌芽)（分担，2022-06-30～2025-03-31）
科研費若手研究（代表，2023-04-01～2025-03-31）[2] 公的競争的資金：代表１件NEDO官民による若手研究者発掘事業（代表，2022-10-01～2025-03-31）

21

お問い合わせ先

お問い合わせ先
新潟大学 社会連携推進機構
ＴＥＬ 025－262 － 7554
ＦＡＸ 025－262 － 7513
e-mail onestop＠adm.niigata-u.ac.jp22