MOLECULARSCIENCENew ProductMol.Sci.5,NP0014(2011)

プリンストン・インスツルメンツ社製
高感度冷却 CCD分光器を使った，コヒーレントラマン
分光イメージング測定
Coher
entRamanSpectroscopicImagingMeasur
ement
sUsi
ngPr
incet
onI
nst
r
ument
sCool
edHi
ghSensitive
Camer
aandSpectrometer
佐野 隆三a，逢坂 雄良a
RyuzoSanoa
ndTakeyosh
iOsaka

1. はじめにラマン分光を顕微鏡法に応用した顕微ラマン分光法ではラマン散乱の散乱断面積が非常に小さい為，生細胞から良好なラマンスペクトルを得る為には数秒から数分の露光時間を必要としていた。その問題を解決した手法が，高性能，高感度 CCDカメラ分光器（米国プリンストンインスツルメンツ社

rentAntiStokesRaman以下 PI製）を使った CoheSc
attering（CARS）顕微分光法である。
今回は，CCDカメラ分光器の特徴とそれによって得られた結果を紹介する。

2. CARS顕微分光装置
Figur
e1に，超広帯域 CARS顕微分光装置の概略を示す 1–3。

iple
xCARSexper
iment
alsetup;SF,LF,NF,BS,andFi
gure1. Mul
PCFar
es
hort
pass,longpass,notc
hf
iters,beams
plitter,andphot
oniccrystalfiber,respectiv
ely.

使用する高感度 CCD は電子冷却型の PI社製モデル
PIXIS100BRを用いた。これは冷却温度が－70°
C～－90°
C5で暗電流ノイズを低くし，量子効率が近赤外域で 9％と高N比で微弱光を検出することがい検出器である為，高い S/できる。また，背面照射型のエタロニング 注 1効果（干渉縞）を抑えたディープディプリーション型 注 2である為，近赤外線レーザー励起で微弱ラマン信号の弊害となったエタロニングを防ぐことが可能になった。読み出し回路はA/D変換 2MHz
ec読み出し（1KHz同期）に加え，，1ms
カスタムチップ設定により，CARSイメージングの連続取得が可能である。分光器部は非点収差を補正した PI社製
SpectraProと f値 2.
0の最も明るいレンズ分光器，PI製モXISDeepCooledCCDCa
mera.
Figure2. PI

85を使用している。（Figure2 PIXIS）
デル LS7:
Sapphireレーザーまた光源にはフェムト秒モード同期 Ti:
YAGレーザーを用い，出はサブナノ秒マイクロチック Nda

株式会社 日本ローパーPI事業部
0033 東京都江東区深川 2819 サクライビル 3F
連絡先 〒 135os
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oper.
co.
jp
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nSocietyforMolecularScience

注1

エタロニング
近赤外領域の光が，薄膜 Si層の表面反射と裏面反射から戻ってくる光の多重反射によって，起こる干渉縞
注2
ディープディプリーション型
Si基板上に高抵抗のエピタキシャル Siを厚く成長させ，近赤外光の吸収を高めた構造

Pa
ge1of4(pagenumbe
rnotf
orcit
ati
onpurpose)

New Pr
oduct

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力の一部を PCFに導入してスーパーコンティニューム光（以降，白色レーザー光と呼ぶことにする）を発生させた。
白色レーザー光は可視から近赤外まで幅広いスペクトルを有するが，そのうち近赤外成分のみを選び，広帯域ストークス光（w2）として用いた。一方，発振器からの残りの基本波を狭帯域化してポンプ光（w1）とし，光学遅延を経由させた後，ノッチフィルターによりストークス光と同軸に重ねた。二つの光パルスは，同軸のまま顕微鏡へと導入され，対物レンズにより試料へと集光される。通常，CARS発生には位相整合条件が満たされる必要があるが，対物レ.
9ンズの高い NA値（本セットアップでは 0）のため，この条件は緩和され，幅広い波数領域で CARS光の発生が可能となっている。試料から発生した CARS光を対向させた対物レンズで集め，各種フィルターを経由させた後，分光器（PI社）及び CCDカメラ（PI社）で分光測定した。
Figure3に分光器及び CCDカメラの概観を示す。
pectrum andima
geofCherrypollen.(1scale=5Fi
gure4. CARSsmm)

させたり 7してラマンスペクトルを取得した例が報告されている。これに対して本実験では，蛍光の妨害を受けにくいという CARSの利点を活かすことで，花粉の CARSスペクトルを前処理無しで高速に取得することに成功した。さgure4て，Fi（a）に示したマルチプレックス CARSスペクト
ル 注 3（強度補正済み）は複数のピークから構成されている。
100,1500cm–1付近のピークはカロテノイドに特徴的
特に 1C，C=C伸縮振動に帰属される。
な信号であり，それぞれ C850c
m–1付近に観測される強い信号は，これに対して，2CH伸縮振動に帰属される。これまでの実験から，カロテXISa
ndSpectr
ometer.
Figure3. PI

H伸縮領域に見られなノイドではこのように強い信号が C試料は三軸ピエゾステージ上に載っており，三次元的ないこと，そして，脂質は長鎖アルキル鎖から構成されておH伸縮振動領域に与えること，がり，非常に強い信号を C-像を得ることが可能である。
CARS過程は非線形光学過程であるため，レーザー光がわかっている。これに加え，花粉にはカロテノイドや脂質強く集光された部分からのみ信号光が発生する。その結果，が構成成分として含まれることが，生化学的な手法を通し共焦点顕微鏡のようにピンホールを導入する必要がなく，C,C=C伸縮振動における信て明らかとなっているため，C-高い三次元空間分解能を実現することができる。本装置のH伸縮振動における信号は脂質に
号はカロテノイドに，C-.
5.
5mm,1空間分解能は，面内・面外方向でそれぞれ約 0gure4（b–d由来するバンドであると考えられる。Fi）には4mmであった 。

CC，C=C，CH伸縮振動それぞれによる CARSイメージを

3. CARS分光イメージングの一例

どちらも顆粒状の部分で特に強いコントラストを示していgure4示す。Fi（b）及び（c）は同じイメージを与えており，C及び C=C伸縮振動に由来するバンドが同る。これは，C-

3.
1 花粉
5Fi
gure4にサクラの花粉を試料とした実験結果を示す 。

一の化学種（カロテノイド）からのものであるという我々00msである。光源にはフェムト秒
露光時間は一点あたり 1H伸縮振動による CARSイの同定と矛盾しない。一方，C-Ti:
sapphireレーザーを用いた。花粉は非常に強い自家蛍光

gure4gure4メージ（Fi（d））は，Fi（b）及び（c）と異なり，を発するため，自発ラマンスペクトルの測定は困難である。

花粉全体の形状を与えている。また，発芽孔も複数の位置

このため，あらかじめレーザー光照射により光褪色をさせurfaceたり 6，銀ナノ粒子を用いた表面増強ラマン散乱（senhancedRamanscattering;SERS）によりラマン信号を増強

注3

マルチプレックス CARS
狭帯域レーザーと広帯域レーザーの組み合わせにより，CARSのスペクトル情報を取得する方法

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H伸縮振動によるイメージでも，顆粒状ので見られる。C部分で強い信号が観測されることから，この顆粒状の部分でカロテノイドと脂質が高濃度で共存していることが予想される。このように，マルチプレックス CARS顕微分光法を用いることにより，異なる化学種を異なるコントラストで可視化計測することが可能である。
3.
2 生細胞への応用
Fi
gure5に，フェムト秒 Ti:sapphireレーザーを用いて分chizosaccharomycespombe;S.pombe
裂酵母（S）生細胞のマ8

ルチプレックス CARSイメージングを行った結果を示す 。

pectrum andimageoflivi
ngfissionye
astcells.
Fi
gure5. CARSs.
(1scale=2mm)

Figure5（a）には酵母にレーザー光を照射したときのマルチプレックス CARSスペクトルが示されている。露光時間は100msである。2850cm–1付近に観測されるピークは，リH伸縮振動にン脂質，タンパク質，多糖類等に含まれる C由来する信号である。この CARS信号によりイメージを構gure5
成した結果を Fi（b）に示す。CARSにより，様々な分裂周期にある複数の酵母細胞が明瞭に可視化されている。
酵母の内部には，信号強度の強い部分が複数箇所存在するが，これらはリン脂質を豊富に含むミトコンドリア等の膜系オルガネラや，多糖類から構成されている隔壁に由来すると考えられる。
:
YAGレーザーを光源としサブナノ秒マイクロチップ Ndbelfreeandmultifrequenc
yima
geofalivi
ngb
uddi
ngFi
gur
e6. Layeas
tcell.

064nm以上の波長帯域での光源て用いることで，近赤外 1を用いた CARS分光イメージングも可能である。この装置

4．

おわりにeepdepletionタイプのカメラの利用は必須である。
でも，dCARS顕微分光装置は，生体試料を構成する様々な分子一例として，出芽酵母生細胞の CARS分光イメージングの種を，分子の指紋であるラマンスペクトルに基づいて多彩

gure6に示す 9。様々な振動モードにより，生細胞結果を Fiに”色分け”することが可能である。本方法は，既知の分を“色づけ”することが可能になった。

子を可視化することが得意な蛍光イメージングと比べ，スペクトルを通して，未知の分子をも分析・検出することを

XI
S100BReXcelonQECurve.
Fi
gure7. PIPa
ge3of4

New ProductMol.Sc
i.5,NP0014(
2011)

可能とするため，生細胞内でこれまで知られていなかった引用文献

分子や分子構造についても研究対象とすることができる。

（1） 加納英明，島田林太郎，濵口宏夫，応用物理 2006,75,682–XIS100BRは，特に近赤外領域で感度が今回使用した PI高い CCDカメラの為，良好なデータが得られたが，最近リXc
elon
リースした PI社の e（エクセロン）技術を搭載したカメラを用いると，より良いデータが得られると期待され

688.
no,H.
;Hi
roo,H.Molecul
arScience2007,1,A0005.
（2） Kano,H.
;Ha
maguchi,H.Appl.Phys.Le
tt.2005,86,121113/
1.
（3） Kano,H.
;Ha
maguchi,H.J.Phys.Che
m.B2006,110,3120–（4） Ka3126.

Xc
elon技術とは，PI社の独自開発した CCD素子ている。eno,H.
;Ha
maguchi,H.Chem.Lett.2006,35,1124–1125.
（5） Kaであり，エタロニング効果を低減させる為に背面薄化シリvleva,N.P.
;Niessner,R.
;Panne,U.Anal.Bioanal.Chem.
（6） I

コン処理を行うことで可能になり，かつ従来の量子効率もR領域で 150
従来に比べ，UV～NI～2％も増加した。低い
エタロニング，高い量子効率で，近赤外領域での微弱光計測に期待がよせられている。
Figure7に，PIXI
S100BRe
Xcelonの QEグラフを示す。

2005,381,261–267.
ngupt
a,A.
;Lauc
ks,M.L.
;Davis,E.J.Appl.Spectrosc.2005,（7） Se59,1016–1023.
no,H.
;Hamaguchi,H.Opt.Ex
press2006,14,2798–2804.
（8） Ka;Kano,H.
;Le
proux,P.
;Couderc,V.
;Day,J.
;Bonn,（9） Okuno,M.
;Ha
maguchi,H.An
gew.Chem.I
nt.Ed.
,2010,49,6773–6777.
M.
（受理日2011年 2月 21日）

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