福岡水海技セ研報第 26号

資料2016年 ３ 月

Bull.Fukuoka.Fisheries.Mar.Technol.Res.Cent.No26.March 2016

あかぐされ病菌遊走子の定量検出技術の開発
渕上哲（ 有明海研究所）

あかぐされ病はノリ生産に多大な被害を与える病害である。感染力の源である遊走子については，これまで，蛍光抗体法やPCR法で検出が試みられたが，実用化には至っていない。そこで，新しい手法である定量PCR法を用いて遊走子の定量検出を試みた。プライマー及びプローブは，あかぐされ菌の既知の塩基配列情報を用いて，18SrDNAのITS領域を標的領域として開発した。試料は，実験室内で培養して得た遊走子を海水に加え，フィルターに捕集してDNAを抽出した。これらを用いて定量PCRを行ったところ，目視計数値と概ねオーダーレベルで一致する結果が得られ，遊走子数10 0～10 1個の試料からも検出可能であった。また，所要時間は従来法に比べて大幅に短縮可能であると考えられた。
キーワード：ノリ，あかぐされ病，定量PCR

あかぐされ病は有明海のノリ養殖生産に大きな影響を方法

与 え る 要 因 で あ り ， 卵 菌 綱 フ ハ イ カ ビ 目 の Pythium
porphyrae（以下，あかぐされ菌）によって引き起こさ

定量PCR法は，検量線により対象物の数量を決定するれる。本病の発生は毎年みられ，漁期を通して感染の拡方法である。検量線は，既知濃度の試料を用いて作成し大･縮小を繰り返しながら継続する。特に，高水温や低た希釈系列が一般的に用いられる。試料としては，標的塩分条件下においては爆発的に感染を拡大し，大被害を配列を組み込んだプラスミドが用いられることが多い与える。近年では2003年や2011年に大きな被害がみられが，増幅効率やコピー数の問題により不適当であることた。

が知られている。6)また，DNA抽出時における抽出効率等

感染の拡大は菌糸上に形成された遊走子嚢から放出さの影響も考えられることから，検量線用の試料としては，れる遊走子によって引き起こされる。このため，病勢の目視計数した遊走子から試験サンプル同様の方法で抽出

予測や感染対策には遊走子の動態を把握することが重要したDNA溶液を用いることとした。

であるが，現状ではノリ葉状体の目視及び顕微鏡による病斑の観察によって感染状況を把握しているのが実情で試料の作成ある。したがって，感染成立前の遊走子の存在量，時系

先の漁場で採取したノリ葉状体から分離したあかぐされ列変化，環境要因との関連など，基本的な知見は非常に菌を用いた。菌糸をコーンミール平板培地に植え継いで，乏しい。

18℃のインキュベータ内で保存培養しておき，必要に応

あかぐされ菌遊走子については，これまで蛍光抗体法
1,2)

やPCR法

3-5)供試菌として，2012年４月２日に柳川市地じて切り出して試料とした。遊走子はAmano et al.1)のでの検出が試みられているが，検出感度が方法に従って放出させ，一定量をホルマリン海水で固定低い，処理に時間を要する，定量が困難などの理由で実してトーマ血球計算板を用いて目視計数したのち，濾過用化には至っていない。しかしながら，漁場の海水中に海水500ml に所定の数を加えて遊走子液とした。これをおける遊走子の動態を明らかにすることができれば，感３ μmメンブレンフィルター（ミリポアTSTP04700）を用染成立前にその兆候を把握でき，より早期の対処が可能

いて吸引濾過し，遊走子をフィルター上に捕集した。遊となる。あるいは，一斉撤去などの集団管理の効果を定走子を捕集したフィルターは-20℃で冷凍保存しておき，量的に評価することも可能となる。

後日DNA抽出キット（Qiagen DNeasy Plant Mini Kit）

そこで，本研究では新しい手法である定量PCR法を用を用いてDNAを抽出した。カラムからの最終溶出量は，いて，遊走子の定量検出技術を開発することを目的とし標準プロトコルでは100μl となっているが，濃度を上げた。て検出感度を高めるため50μl とした。

- 93 -渕上

DNAデータベース

良好な増幅がみられたセットAについては，通常のPCR（DDBJ）からダウンロードしたあかぐされ菌18SrDNAのとアガロースゲル電気泳動を行って，目的とするサイズITS領域の塩基配列情報（アクセッション番号:AB043506）の断片（62bp）が増幅されていることを確認した。以上を用い，プライマー設計支援ソフトPrimer ExpressのことからセットAは使用可能であると判断し，以降の（Applied Biosystems社）でプライマー及びプローブを分析に採用することとした。

プライマー及びプローブの設計設計した。合成はライフテクノロジーズジャパン社に依頼した。反応系はTaqManプローブアッセイとし，PCR反検量線の作成と清浄海水からの定量検出

得られた検量

応と検出は7500Fast Real-Time PCR System（ライフテ線を図４に示す。概ね良好な直線性を示し，R2は0.98でクノロジーズジャパン）を用いて行った。１サンプルああった。この検量線を用いて清浄海水中の遊走子を定量たりの反応液組成は，滅菌水4.4μl，２×TaqMan Fast

した結果は，目視計数結果に対して0.15～4.21倍の範囲

Universal PCR Master Mix（ライフテクノロジーズジャであり，遊走子数１個でも検出可能であった（表２）。

パン）10μl，フォワード及びリバースプライマー（10μM）
各 1.8μl，プローブ（５μM）１μl，テンプレートDNA溶

漁場海水からの遊走子の定量検出液１μl の計20μl とした。反応プログラムは，初期活性ルターは懸濁物質等でかなり汚れた。このためPCR阻害化ステップとして95℃，20秒を１サイクル行い，続いて物質の影響が懸念されたが，全ての濃度区で遊走子が検95℃，３秒と60℃，30秒の２ステップを40サイクル行っ出され，目視計数値に対する定量誤差は7.8～38.3倍でた。

あった（表３）。清浄海水を用いた場合に比べやや誤差
07

試料として遊走子数10 ～10 個のDNA抽出溶液を用い，増幅の有無を確認した。増幅がみられたプライマーセッ

遊走子捕集後のフィが大きくなり，全ての濃度区で目視計数値よりも多く検出された。

トについては，さらに通常のPCRを行って，目的のサイズの断片が増幅されていることを確認した。
検量線の作成と清浄海水からの定量検出

考

遊走子数10 1

7～10 個の７段階の試料を用い，検量線用のスタンダードとした。各濃度系列は３反復とし，平均値を用いて検量線を作成した。

察

作製したプライマー及びプローブのセットAは良好な増幅を示し，有効であると判断された。
検出感度については，清浄海水では１個，現場海水では10個と，いずれも最低濃度の試験区で検出できたこと得られた検量線を用いて定量検出を試みた。試料は，から検出感度は良好であるといえる。一方，定量誤差にPCR阻害物質の影響を排除するため，0.45μm 及び0.22μm

ついては，一例としてKamikawa et al.が有害赤潮プラのフィルターで２段階濾過した清浄海水に遊走子を加えンクトンを対象として目視及び定量PCRで比較した結果て作成した。によると２～３倍程度の誤差である。7)今回の試験においては，清浄海水では最大で4.21倍であり概ね良好であ漁場海水からの遊走子の定量検出より現場に近い状況るといえる。現場海水では最大38.3倍と１オーダーレベで定量検出可能であるか明らかにするため，４月のノリルの誤差で，全体として過大評価になり精度はやや低下

網撤去後にノリ漁場で採水して濁りやプランクトン等をした。これは，海水中に含まれるPCR阻害物質により感含んだままの未濾過海水に計数した遊走子を加えて作成度が低下するのではないかという，当初の予想に反するした試料を用い，定量PCRを行った。

結果であった。むしろ過大に検出される方向であることから，現時点では実用上大きな支障はないと考えられる

結果が，その原因は不明であり，今後さらに試験を重ねて検討する必要がある。

プライマー及びプローブの設計

３セットのプライマー

検量線に関しては，手法は今回と違うものの福岡県有及びプローブを作成した（表１）。各セットを用いた増

明海地先のノリ漁場内における遊走子数は，小谷ら2)に幅曲線を図１～３に示した。セットAは良好な増幅曲線

よると海水１l 当たり数個～約2,300個，福永ら3)によるが得られた。一方，セットB及びCについては，増幅はみと海水500ml 当たり数個～104個が確認されており，今回られたものの良好な曲線が得られず，Ct値を決定できな作成した検量線の範囲で十分にカバー可能である。

かった。

今回，DNA抽出における最終溶出は50μl のバッファー- 94 -

あかぐされ病菌遊走子の定量検出技術の開発で行ったため，得られたDNA溶液は約50μl である。PCR料の作成手法の検討も必要である。

反応にはこのうち１μl のみを用いたが，清浄海水中からは遊走子数１個，現場海水中からは遊走子数10個と，文

献いずれも最小濃度の試験区で検出可能であった。このことは，今回標的とした増幅領域が１細胞あたり複数コピ

１）Amano H，Sakaguchi K，Maegawa M，Noda H．The

ー存在することを示していると考えられる。実際，真菌

Use of a Monoclonal Antibody for the DetectionにおけるrDNAのITS領域は数十～数百コピー存在するとof Fungal Parasite，Pythium sp. the Causative

6)

されている。 このことは，検出感度を高めるという点

Organism of Red Rot Disease, in Seawater fromで有利であるといえる。

Porphyra Cultivation Farms．Fisheries Science

本法は，従来の手法に比べ極めて迅速に結果を得ることができることと，定量が可能であることが特徴である。

1996；62(４)：556-560.
２）小谷正幸，岩渕光伸，藤井直幹，渕上

哲．海水中

従来法の場合，蛍光抗体法では発芽に８時間のインキュのあかぐされ菌の遊走子数とノリ葉体への感染の関ベートが必要であるため，１日以上を要する。1,2)また，係．福岡県水産海洋技術センター研究報告 1999；

PCR法ではNested-PCR法のため２回のPCR反応が必要で，

９：43-46．

さらに判定にはアガロースゲル電気泳動を行うので半日3-5)以上を要すると考えられる。 これに対し本法の場合は，遊走子のフィルター捕集とDNA抽出に約90分，PCR反応と検出は40分程度で終了する。反応プレートの調製時間を

３）福永

剛．ノリ漁場におけるあかぐされ病菌遊走子の分布．福岡県水産海洋技術センター研究報告
2006；16：１-５．
４）服部克也，蒲原聡，原田靖子，柿沼誠．2004年

考慮しても，帰港後３時間程度で結果を得られるため，と2005年における愛知県内ノリ養殖漁場海水中のあ当日発行のノリ養殖情報に記載することも不可能ではな

かぐされ病菌遊走子のＰＣＲ法による検出結果．水い。

産増殖 2007；55(３)：483-487．

一方，養殖漁場においては赤潮の発生，降雨，時化等

５）清水泰子，草加耕司，杉野博之．児島湾口部ノリ養により海水の状態は大きく異なる。本技術を現場に応用

殖漁場におけるあかぐされ病の発生．岡山県水産試するためには，多様な状態の海水からでも安定して検出できることを検証する必要がある。

験場報告 2009；24：54-59．
６）三好孝典，清水伸一，篠崎毅，澤田宏之．リアルタ

また，検量線用の試料は，試験ロット毎の抽出効率のイム定量PCR法によるイチジク株枯病菌の絶対定量差や経時劣化の観点から試験毎に作製することが望ましおよび検出.日本植物病理学会報2011；77：96-104．

いと考えられるが，あかぐされ菌の遊走子は活発に遊泳

７）Kamikawa R，Asai J，Miyahara T，Murata K,

する上に，極めて生長が早く，遊走子嚢から放出されたO y a m a K , Y o s h i m a t s u S , Y o s h i da T , Sa k o Y .

遊走子は数時間後には着定して発芽してしまう。この性

Application of a Real-time PCR Assay to a Comp

質のため，検量線用の試料を作製するにあたっては，計

rehensive Method of Monitoring Harmful Algae.

数精度及び十分な細胞数の確保に大変苦労した。加えて，Microbes and Enviroments 2006；21（３）：163-

菌糸の前培養も含めて約10日と時間を要する。今後，本173．

技術を現場に応用していくためには，簡便な検量線用試- 95 -渕上

表１セット A

セット B

セット C

プライマー(F)5’-GATCGCTTTGCGCTTTCG-3’

プライマー(R)5’-CGCCAATAGAGGTTGCTTCCT-3’

TaqMan MGB probe

5’-CGACTTCGGTTAGGACAT-3’ MGB

プライマー(F)5’-GCTGCGAACTGCGATACGTA-3’

プライマー(R)5’-CGTTCAAGATTTCGATGACTCACT-3’

TaqMan MGB probe

5’-TGCGAATTGCAGAATT-3’ MGB

プライマー(F)5’-GGCTTCGGCCCGACTT-3’

プライマー(R)5’-GTACACCTCAAGGAAAGAACAGAAAA-3’

TaqMan MGB probe

5’-CAGCTGACGGAGTGTG-3’ MGB

増幅曲線（セット A）

図２

Ct値

図１

作成したプライマー及びプローブセット

3634
32
30
282624
2220
1816
14

y = -3.1996x + 38.084
R² = 0.9792

0

図３

表２

増幅曲線（セット C）

目視計数値(A)
110
100
1,000
10,000100,000
1,000,000
10,000,000

定量結果（B）
定量誤差(B/A)
0.35
0.35
38.24
3.82
122.971.23
152.270.15
4,943.27
0.49
99,503.99
1.00
803,180.21
0.80
42,100,000.00
4.21

1234
56
遊走子数の対数値（log10)

図４

清浄海水からの遊走子の定量検出結果

遊走子濃度
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
10 7

増幅曲線（セット B）

表３
遊走子濃度
10 1
10 2
10 3
10 451010 6- 96 -

78

検量線

現場海水からの遊走子の定量検出結果
目視計数値(A)
10100
1,000
10,000100,000
1,000,000

定量結果（B）
定量誤差(B/A)
382.8138.28
779.72
7.80
16,194.38
16.19
94,591.69
9.46
1,790,000.00
17.90
16,400,000.00
16.40