株式会社クロマニックテクノロジーズ

アルキル基型逆相固定相の保持のメカニズムについて長 江

1は じ め に

徳 和， 塚 本友 康， 小 山隆 次

ル基はこの移動相との接触面積が最小になる様なコンフォメーションを取ると考えられる。またこれらのアル現在は，クロマトグラフィーを最初に提唱したロシア

カンは THF とは混ざり合えるため， THF /水系移動相

人植物科学者 Tswett の 1903 年の論文発表から 100 年を通液すると塊状態になっているアルキル基の内部に以上経過し，また 1969 年の Kirkland らによる HPLCTHF は浸透し，THF 濃度が高くなれば，アルキル基と（High Pressure Liquid Chromatography）の発表から 50

アルキル基の間に THF が十分浸透し，アルキル基はほ年以上経過しており，分離分析の手法としてクロマトグぼ立ち上がった状態になると考えられる。図 1 には移ラフィーは欠かすことのできないものとなった。クロマ

動相中の有機溶媒濃度と固定相（ C18， C30）への有機トグラフィーの分離モードの中でも逆相クロマトグラ

溶媒の溶媒和量の関係1)を示す。また図 2 にはメタノー

フィーは使用頻度が高く汎用性の高い分離分析技術であルと THF の固定相への溶媒和状態1)を示す。カラムサる。 1970 年代から 1980 年代は基礎的な固定相の保持

イス 150 mm×4.6 mm ID のカラム管には，炭素含有量機構など様々な角度からの研究が行われたが，その後はが 16 ％ の C30 充填剤および C18 充填剤は約 1.5 g 充

新規固定相や応用例など実用的な研究が盛んになった。

填されており，カラム内の固定相容量は C30 と C18 両

逆相クロマトグラフィーにおいて現在は「固定相とはど充填剤とも約 0.35 mL と計算される。図 1 の C18 充填のようなものでどのように作用するものなのか。」など

剤への溶媒和量はメタノールが約 0.06 mL に対し THFの基礎的な事柄は等閑になり，装置の操作方法や分離分は 6 倍の約 0.36 mL であり， C18 固定相の容量とほぼ析の応用などの実務的な事柄が重要視され，一つの基礎的な事柄として，「 C18 固定相（カラム）は C8 固定相（カラム）に比べ固定相の疎水性が高いので保持が大きい。」と多くのクロマトグラファーは認識している。しかしこれは真実を正しく表現しておらず，「メタノール/水系移動相を用いた場合 C18 カラムは C8 カラムに比べ充填剤の炭素含有量が高いので保持が大きい。」，さらに「テトラヒドロフラン（THF)/水系移動相を用いた場合
C18 カラムは C8 カラムに比べアルキル鎖が長いので保持が大きい。」がより正確な表現である。
本稿では逆相カラムの保持について従来とは異なる視点から述べる。逆相クロマトグラフィーにおける保持は疎水性相互作用以外に残存シラノール基の影響やフェニル基などの固定相の p p 相互作用などの 2 次的相互作用が働くが，疎水性相互作用のみについての議論をするために，固定相はアルキル基型とし，残存シラノール基の影響を受けない中性化合物の保持について記述する。

2

アルキル基固定相の状態

オクタデカン（ C18H38 ）やオクタン（ C8H18）のよう

図1

移動相中の有機溶媒濃度と固定相への有機溶媒の溶媒和量の関係
カラム， 150 mm × 4.6 mm i.d. ， 5 nm ， C18 （％ C ＝ 16なアルカンはメタノールに混ざり合わないことから，メ％）， C30 （％ C ＝ 16 ％）， 10 nm 細孔径；移動相，有機溶媒/水，有機溶媒濃度は図の横軸に表示；カラム温

タノール/水系移動相を通液した場合，固定相のアルキ度，40 °C。

726

ぶんせき  表1

メタン，オクタン，オクタデカン，トリアコンタンの疎水性と水への溶解度

Methane Octane Octadecane Triacontane
（C1)
（C8)
（C18)
（C30)
疎水性（Log P ）

1.09

5.18

9.18

14.09

水への溶解度（mg/L)

22.6

0.660.006

8.84×10－10

る 。 こ れ は n オ ク タ ノ ー ル と 水 へ の 分 配 濃 度 比 が10,000 倍以上異なることを示しており，非常に大きな
図2

メタノールとテトラヒドロフラン（ THF ）の固定相への溶媒和状態疎水性の差になる。しかし水への溶解度がオクタデカンおよびトリアコンタンは極端に低いことから，この水への溶解度の低さが疎水性に大きく反映していると考えら同じ量の THF が溶媒和していることになる。また C30れる。実際の逆相クロマトグラフィーの保持はブチルベ充填剤への THF の溶媒和量は 0.49 mL と C18 充填剤

ンゼンの様な溶質の移動相と固定相への分配量比によりの約 1.4 倍となり，アルキル鎖長の長い分溶媒和量も増決まるのであって，オクタデシル基固定相自体の水へのえたことになる。このような事から，図 2 に示された分配や溶解度は溶質の保持には無関係である。

ような固定相の状態が推察される。

3

メタノール/水系移動相を用いた時のアルキル基固定相の保持力

3･ 1

疎水性の比較的高い化合物の保持

逆相クロマトグラフィーで使用されるアルキル基固定相は C30，C18，C8，C1（TMS，トリメチルシリル化）等があり，それぞれのアルキル基の疎水性により保持力が決まると多くのクロマトグラファーが考えている。
「 C18 固定相は C8 固定相より疎水性が高いので， C18カラムの方が C8 カラムより保持が大きい。」ともしば

固定相と移動相への溶質の分配が主な分離機構とされる逆相クロマトグラフィーにおける保持係数 k と溶質の固定相と移動相への分配比 KD は以下の式で示される。
k＝S
S D × VS＝M
MD × V M

K D＝SDMD

K ＝K D×

VSVM

S は固定相中の溶質の存在量， M は移動相中の溶質のしば言われている。実際に同じ平均細孔径 12 nm，比表存在量， SD は固定相中の溶質の分配濃度， MD は移動面積 340 m2/g のシリカ基材から製造されエンドキャッ

相中の溶質の分配濃度， VS は固定相の体積（容積），ピングを施した C18 カラムと C8 カラムをメタノール/VM は移動相の容積である。保持係数 k は分配比 KD と水移動相を用いて比較すると，C18 カラムの方が C8 カは異なり，保持係数は固定相と移動相への溶質の分配量ラムよりも保持が大きくなる。しかし同様に C30 カラの比であるのに対し，分配比は固定相と移動相への溶質ムと C18 カラムを比較すると， C30 トリアコンチル基の分配濃度比である。したがって，上記の保持係数の式

かさは 嵩高く，結合密度が上がらず，結果として C30 充にある様に保持係数は分配比に固定相の体積（容積）を剤は C18 充剤とほぼ同じ炭素含有量となり， C30 カ乗じ，移動相の容積を除したものである。異なる炭素含ラムと C18 カラムの保持はほぼ同じであった。それぞ有量の C18 充剤を製造した場合，同じ C18 固定相でれの充剤の炭素含有量を比較すると， C30 充剤はあるので，分配比は同じであると仮定すると，固定相と18 ％， C18 充剤も 18 ％， C8 充剤は 11 ％ であっ移動相の体積（容積）比が保持係数にかかわってくる。

た。また， C18 オクタデシル基の結合密度を敢えて低つまり固定相と移動相の体積比（固定相体積/移動相体くし，炭素含有量を 11 ％ とした C18 充カラムは，積）が 1 / 2 になると保持係数も 1 / 2 になる。表 2 に炭炭素含有量 11 ％ の C8 カラムとほぼ同じ保持であっ素含有量 18 ％ と 11 ％ の C18 充剤と 11 ％ の C8 充た。以上のことから保持力はアルキル鎖長ではなく充

剤の結合密度，固定相体積および移動相体積を示す。

剤の炭素含有量でほぼ決まることが分かる。

これらの値から表 2 の 3 種の充剤の保持係数と分配

表 1 にメタン，オクタン，オクタデカンおよびトリアコンタンの疎水性（ LogP ）と水への溶解度を示す。
LogP は n オクタノールと水への分配濃度比の対数である。オクタンとオクタデカンの LogP の差は 4，オクタデ カ ンと トリ ア コ ンタ ン の LogP の 差は 4.91 であぶんせき  比の関係を以下に示す。
C18 と C8 固定相分配比（KD）はKDC18, KDC8, KD ＝SDMD727

表2
固定相C18 カラムと C8 カラム物性値

表3

炭素含有量

結合密度C18(A)C18(B)

18 ％11 ％2.3 nmol/m20.4 mL

1.6 mL0.23 mL

1.77 mL

C811 ％

1.2 nmol/m22.4 nmol/m20.23 mL

1.77 mL

C30, C18, C8, C1 固定相の炭素含有量と疎水性

固定相体積 移動相体積

C30
C18C8C1C18(A)の場合
KC18 ＝＝S
S D×V S
SD×0.4＝＝
M
M D × VM
MD×1.6SD
× 0.25 ＝ 0.25 KDC18MD

C18(B)の場合
S
S D×V S
SD×0.23＝
KC18 ＝ ＝M
M D × VM
MD×1.77＝SD
× 0.13 ＝ 0.13 KDC18MD

C8 の場合KC8 ＝

S
S D× V S
SD×0.23
SD＝＝＝× 0.13
M
MD×V M
MD×1.77MD＝ 0.13 KDC18

分離係数a(アミルベンゼン/ブチルベンゼン)

保持係数
アミルベンゼンの保持係数

18 ％
18 ％

1.72

18.91.68

19.7

11 ％
4.5 ％

1.559.41.432.3

炭素含有量

固定相

固定相：シリカ基材の細孔径，12 nm，一官能性試薬＋エンドキャッピング，移動相：メタノール/水＝ 70 / 30 ，温度：30 °Cれば，アミルベンゼンの様な溶質の保持はほぼ等しくなる。しかし選択性は固定相により当然異なり，ある固定相が分離できる成分が他の固定相では分離できない場合や，溶出順序が逆になる場合もある。
3･2

アルキル基固定相の炭素一個分の差の認識力

逆相固定相（カラム）の疎水性を比較するパラメーター
として，アミルベンゼンの保持係数（保持時間）や炭素一個分の差の有るアミルベンゼンとブチルベンゼンの分離係数を用いて分離特性等の議論がされている。表 3には同じシリカ基材に一官能性シリル化試薬を結合後，同じエンドキャッピングを施した C30 ， C18 ， C8 および C1 固定相の炭素含有量，疎水性としてアミルベンゼ

炭素含有量 18 ％ と 11 ％ の C18 ( A ）と C18 ( B ）の保ンとブチルベンゼンの分離係数，更にアミルベンゼンの持係数 k はそれぞれ 0.25KDC18 と 0.13KDC18 となり，同保持係数を示す。前項で記述している様に C30 固定相

じ C18 固定相であれば炭素含有量が異なっても KDC18と C18 固定相は炭素含有量が同じ 18 ％ であり，アミ値は同じであるとすると，保持係数については， C18ルベンゼンの保持係数もほぼ同じであった。 C8 固定相(A）は C18(B）のほぼ 2 倍になり，これは実験結果とは炭素含有量が 11 ％ でアミルベンゼンの保持係数は一致する。また，同じ炭素含有量 11 ％ の C18 ( B ）とC18 固定相に比べ約半分であった。疎水性のもう一方C8 を 比 較 す る と ， 保 持 係 数 は そ れ ぞ れ 0.13KDC18 との指標であるアミルベンゼンとブチルベンゼンの分離係0.13KDC8 となる。実験結果は両カラムでほぼ同じ保持数は，アルキル鎖長が短い程小さくなった。これはアル係数を示したことから， C18 と C8 の分配比 KDC18 とキル鎖長が長い程疎水性が高いことを示している様に見KDC8 はほぼ同じ値となる。これは例えば溶質としてのえる。これはアミルベンゼンの保持係数が固定相ごとにベンゼンにペンチル基が結合したアミルベンゼンから見異なっており，保持時間が大きく異なる条件でのアミルれば，メタノール/水移動相と C18 固定相への分配比率ベンゼンとブチルベンゼンの分離係数を比較している。

は，メタノール/水移動相と C8 固定相への分配比率と保持係数（k）と分離度（R）の関係を以下に示す。

同じであり，オクタデカンとオクタンの疎水性を比較すれば，当然ながらオクタデカンの方が高いが，アミルベンゼンの分配比率から比較した場合には， C18 固定相

RS ＝14N(a －a 1)(k ＋k 1)と C8 固定相には大きな差がないことになる。同じ炭素N は理論段数，a は分離係数である。この式は保持係数

含有量 18 ％ の C30 充剤と C18 充剤も保持がほぼk の値により分離度が変わることを示している。そこで同じことから，同様に， C30 固定相と C18 固定相もア

同じ移動相条件ではそれぞれの固定相で保持時間が大きミルベンゼンの分配比率から比較した場合には，大きなく異なるので，移動相の有機溶媒濃度を変え，同じ保持差がないことになる。極端な例として，同じシリカ基材

時間で比較を行った。C30，C18，C8 および C1 カラムを用い炭素含有量が 11 ％ になる様に結合量を調整したを用いエチルベンゼンの保持時間が約 8.2 分になる様に

C30 カラム， C18 カラム， C8 カラムは，すべてのカラ移動相中のメタノール濃度を調整した時の標準試料のクムでアミルベンゼンはほぼ同じ保持を示すことになる。

ロマトグラムを図 3 に示す。炭素一個分の差であるエアルキル鎖長の異なる固定相は，炭素含有量が同じであチルベンゼン（ピーク 6）とトルエン（ピーク 4）のピー728

ぶんせき  図3

エチルベンゼンの保持時間を合わせた場合の標準試料の分離
カラム，固定相は図中に表示， 150 × 4.6 mm i.d. ；移動相，メタノール/水，有機溶媒濃度は図中に表示；流速，1.0 mL/min；カラム温度，30 °C；ピーク，1＝メチルパ
ラベン， 2＝エチルパラベン， 3 ＝ベンゼン， 4＝トルエン，5＝ナフタレン，6＝エチルベンゼン。

クを比較すると，すべてのカラムでほぼ同じ溶出時間であった。このことは同じ保持時間になる様に調整した条件下では，どの固定相でも炭素一個分の差をもつ化合物の分離係数は同じになり，炭素一個分の差を認識する能力は同じであることを意味している。炭素一個分の差を

図4

アミルベンゼンとフェノールの保持の比較
カラム，カラム名は図中に表示， 150× 4.6 mm i.d. ；移動相，メタノール/水，有機溶媒濃度は図中に表示；流速，1.0 mL/min；カラム温度，40 °C；ピーク，1＝ウラもつ化合物の分離係数を疎水性のパラメーターとした場

シル， 2＝カフェイン， 3 ＝フェノール， 4＝ブチルベン

合，同じ移動相条件では炭素含有量が高く保持時間が長ゼン，5＝o ターフェニル， 6＝アミルベンゼン，7＝トリフェニレン，8＝ピリジン。

くなる程，疎水性が高い傾向があるが，保持時間が一定になる様に移動相条件を調節すると，炭素含有量やアルキル鎖長に関係なく，疎水性はすべての固定相で同じであった。前項でも述べたが，それぞれの固定相で分離選

移動相では保持時間が 2 分台で保持自体は非常に小さ択性は異なるため，図 3 に示されている極性の高いメいが，3 種のカラムともほぼ同じ保持の様に見える。メ

チルパラベンやエチルパラベンおよび二重結合の多いナタノール/水＝ 30/ 70 移動相を用いて，フェノールの保フタレンの保持時間や溶出パターンは固定相間で異なっ持時間を長くして比較すると，アミルベンゼンとは異なている。特に C1 固定相ではエチルバラベンはベンゼン

り， C30， C18 および C8 カラムでほぼ同じ 8 分前後のより長い保持時間であり，溶出順序が逆転した。

保持時間を示した。このことはアミルベンゼンとフェノールでは固定相との相互作用が異なることを意味して

3･ 3極性の比較的高い化合物の保持いる。図 5 には溶質が相互作用する固定相の部位の模図 4 には標準試料の分離をメタノール濃度の異なる式図を示す。アミルベンゼンはオクタデカンやオクタン移動相を用いて比較した。前項で述べたように炭素含有に可溶で，固まった固定相内部に入り込むことができる量が同じ C30 カラムと C18 カラムのアミルベンゼンのが，極性が高くなったフェノールの場合は，オクタデカ保持時間はほぼ同じであり，炭素含有量の低い C8 カランやオクタンに難溶になるため，溶媒和している固定相ムのアミルベンゼンの保持時間はほぼ半分であった。3の表面が主な相互作用場となる。したがって同じシリカ番のフェノールに着目すると，メタノール/水＝ 75 / 25基剤を用いた C18 カラムと C8 カラムでは，炭素含有量

ぶんせき 
 729

図5

溶質が相互作用する固定相の部位が異なり，固定相全体で相互作用するアミルベンゼンの保持時間は異なるが，固定相表面の面積は大差ないた
め，フェノールの保持時間はほぼ同じであったと推察される。巨大分子のタンパク質は固定相の表面と相互作用すると考えられ，高極性化合物の分離挙動がタンパク質と同様になった実験結果2)からもフェノールのような極性化合物は固定相表面が主な相互作用場であることが肯定された。

4

THF /水系移動相を用いた時のアルキル基固定相の保持力

図 6 にはメタノール/水系および THF/水系移動相を用いた場合の分離を示す。炭素含有量が同じ C30 カラムと C18 カラムのアミルベンゼンの保持の比較において，メタノール/水系移動相では今まで述べてきた様に保持の差はほとんどないが，THF/水系移動相では C30カラムは C18 カラムより大きな保持を示し，C8 カラムは最も小さな保持であった。これは図 2 に示されてい

図6

メノール/水系および THF/水系移動相を用いた分離移動相は図中に表示，他の条件は図 4 と同じ。

る様に THF は固定相内部に浸透し，THF 濃度が 50 ％になるとほぼアルキル基が立ち上がった状態になる。また保持しない溶質の溶出時間（ホールドアップタイム）定相の容量で保持がほぼ決まることを明らかにした。メが THF の溶媒和量の増加量に伴い減少することから，タノール/水系移動相では充填剤の炭素含有量が，THF溶媒和した THF は移動相としてではなく，固定相とし/水系移動相ではアルキル鎖長が保持の増減に大きくかて働いている事が示されている。溶媒和した溶媒とアルかわる事も明らかにした。炭素一個の差を認識する能力

キル基全体が固定相として働くため，アルキル鎖長の最は保持を同じにすればアルキル鎖長に関係なくどの固定も長い C30 固定相が最も固定相容量が大きくなり，固相も同じことや，溶質の極性の度合いにより相互作用が定相への溶質の分配量も多くなることから，保持がもっ働く固定相の部位が異なることを認識する事が，今後のとも大きくなったと考えられる。また THF/水系移動相

逆相モードの分離分析方法開発へのヒントにつながればはメタノール/水系移動相に比べ，溶出順序が大きく異幸いである。

なり，選択性の変化が大きいが，これは移動相が変わっただけでなく， THF の溶媒和量がメタノールに比べ多いことと，固定内部に浸透していることから，固定相自体が変化したと考えられ，その結果分離選択性が大きく変化したと推察される。

5

ま とめ文献1) 長江徳和：LC と LC/MS の知恵，1, 8（2020）．
2 ) 長江徳和： JASIS2020 ，クロマニックテクノロジーズ新技術説明会．
（http://chromanik.co.jp/info/wp-content/uploads/2020/12/jasis2020s_c.pdf）（2021 年 6 月 15 日，最終確認）．

アルキル基型逆相カラムは固定相の種類ではなく，固730

ぶんせき  

小山隆次（Ryuji KOYAMA)

長江徳和（Norikazu NAGAE)

株式会社クロマニックテクノロジーズ（〒552 0001 大 阪 府 大 阪 市 港 区 波 除 6 3 

株式会社クロマニックテクノロジーズ（〒552 0001 大 阪 府 大 阪 市 港 区 波 除 6 3 1 ）。立命館大学理工学部生物工学科卒。

1 ）。名古屋大学工学部応用化学卒。博士≪趣味≫クロマトグラフィー（工学）。≪主な著書≫“LC/MS, LC/MS/E mail : koyama＠chromanik.co.jp

MS のメンテナンスとトラブル解決”（分担執筆）（オーム社）。
E mail : nagae＠chromanik.co.jp

塚本友康（Tomoyasu TSUKAMOTO)
株式会社クロマニックテクノロジーズ（〒552 0001 大 阪 府 大 阪 市 港 区 波 除 6 3 1 ）。中部大学応用生物学研究科応用生物学専攻博士課程修了。博士（応用生物学）。
≪現在の研究テーマ≫液体クロマトグラ
フィー用充剤の開発。
E mail : tsukamoto＠chromanik.co.jp+//////////////////////////////////////////////,
1 会社のホームページURL :2

1
1 http://chromanik.co.jp/
11
1 関連製品ページURL :1 http://chromanik.co.jp/pdf/Sunniest_catalog.pdf
1
1 http://chromanik.co.jp/product/SunShell.html

22222222-0000000000000000000000000000000000000000000000 .

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に関する情報・解説，5）前処理や試料の取扱い等に関する情報・解説・注意事項， 6）その他，分析機器の性能を十分に引き出すために有用なぶんせき  は，データや知見の追加などにより繰り返し紹介

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