抗 CKD(慢性腎臓病)効果のある薬物のスクリーニングに有効なアッセイ系の構築

横浜市立大学 医学部 医学科
循環器・腎臓・高血圧内科学准教授 石上 友章
2022年10月25日
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近位尿細管アンジオテンシノーゲン(AGT)を標的にした創薬～背景～
1, レニン･アンジオテンシン系は、体液･電解質の恒常性を維持する生理的なシステムである。
2, ヒトアンジオテンシノーゲン遺伝子は、高血圧症･食塩感受性の原因遺伝子 であり、realthrifty geneである。
3, レニン･アンジオテンシン系には、全身性レニン･アンジオテンシン系と尿細管レニン･アンジオテンシン系がある。
4, 既存のレニン･アンジオテンシン系阻害薬では、腎糸球体血行動態に対する作用と、尿細管に対する作用とを分離できないために、腎機能の恒常性の維持が破綻してしまうリスクがあり、 複数の臨床試験によってその限界が示唆されている。
5, CKDは、成人の8人に1人が罹患しており、末期腎不全に至るまでの病態を修正・解消する有効な薬物に乏しく、典型的なUnmet Medical Needsといえる。
6,代表的なCKDの一つ、多嚢胞性腎症（PKD）は、治療法がほとんどない。
患者数は国内で3万人、欧州では約20万人、米国には約12万人と推定されている。
PKDの原因遺伝子であるPC1/PC2は、尿細管上皮の繊毛（Cilia)の主要な構成成分であり、尿細管の拡張により、腎組織が嚢胞に置換されることで、腎機能が廃絶する。PKDの嚢胞には、尿細管由来の高濃度のレニン・アンジオテンシノーゲンが存在し、PKDモデル動物にAGT ASOによってAGT遺伝子を抑制すると、嚢胞が縮小することが判明した。

慢性腎臓病(CKD)は、Unmet Medical Needs有効な薬剤がない。
慢性腎臓病
CKD

・CKD(慢性腎臓病)は、健康長寿の脅威であり、典型的なUnmet Medical Needsである。
・CKD(慢性腎臓病)は、本邦成人の8人に1人であり、約580万人弱を数える。(日本腎臓学会)・代表的なCKDの一つである、PKD(多嚢胞性腎症)は、治療法がほとんどなく、患者数は、国内で約3万人・欧州には約20万人、米国には約12万人と推定されている。

本技術が提供する、新技術・解決策

 不死化ヒト近位尿細管細胞と、近接ホモジニアスアッセイをカスタム化した高感度・ハイスループットのアンジオテンシノーゲン(AGT)の測定系からなる、近位尿細管細胞からのAGT分泌抑制効果をもった物質・化合物を選択するアッセイ系を構築した。
 東京大学・創薬機構から提供された、低分子化合物3000種類を対象に、本法を使ったスクリーニングを行った結果、同一クラスの低分子化合物（Statin類)を特定することが出来た。
 StatinのAGT分泌抑制効果については、濃度依存性・細胞特異性を確認することができた。
〇 尿細管レニン・アンジオテンシン系の基質である、近位尿細管AGTの産生・分泌を抑制する、抗CKD薬の創薬に有効・有用な技術である。
〇 HMGCoA還元酵素阻害薬であり、脂質代謝異常症治療薬であるスタチン類は、近位尿細管アンジオテンシ
ノーゲン分泌阻害作用により、慢性腎臓病の治療剤となる。

“古典的”レニン・アンジオテンシン系

DRI（直接レニン阻害薬）

ACEI

ARBSABModern RAS 現代のレニン・アンジオテンシン系
受容体随伴プロレニン系(RAPS)

非ACE依存性AＩＩ産生経路

尿細管レニンアンジオテンシン系

アンジオテンシノーゲン
(P)RR
プロレニン

レニン

(Tonin）(Cathepsin）

カリクレインキニノーゲン

ブラジキニンACE

キニン・カリクレイン系
不活化

NEP・ACE2

アンジオテンシンI(Chymase）

Ang(1-7)

アンジオテンシンII
Ang III/IV

AT1受容体

AT2受容体

AT3受容体非AT1受容体情報伝達系

AT4受容体

Mas受容体Ang(1-7)-Mas受容体系

近位尿細管細胞(PT)には、アンジオテンシノーゲンが発現し、結合尿細管(CNT)/皮質集合管(CCD)には新規レニンが発現しており、尿細管レニン・アンジオテンシン系(Tubular RAS)として、生体のナトリウム代謝の恒常性の維持に働いています。Tubular RASの異常により、食塩感受性・高血圧症の病態がもたらされると考えられます。

Tubular RAS and ENaC-Nedd4L-Proteasome system
Colocalization of renin andkallikrein in CNT

Renin expressed inCNT(2003)((AGT and HT, 1992, 1997, 1999）

KLK

Glomerulus

Alternative renin 2014

Renin

Connecting Tubule
ENaC

Proximal Tubule＋cAMP

Distal Tubule

Nedd4L＋ MR((AGT and HT, 2002, 2004）

Collecting Duct

Angiotensinogen expressed in PT(1999, 2002, 2004)
Loop ofHenle

aldosterone
Angiotensin IIAGTADH(抗利尿ホルモン)

ENaC-Nedd4L-Proteasome
In ASDN(2002, 2006, 2007, 2008, 2009,2010
2012, 2014, 2016, 2020)既存のRA系阻害薬の臓器保護効果（心血管保護、腎保護）には、限界がある。
(BMJ, 2017)

PKD1/PKD2異常によるモデルPKD ・Progression

PC1

PC2

軽症PKD

遺伝性多発性嚢胞腎(ADPKD)は、繊毛(cilia)を構成する二つの重要なたんぱく質(PC1/PC2)
重症PKDの遺伝子変異(first hit)に、未知のsecond hit/third hit が加わることで、嚢胞形成・嚢胞の持続的な増大に至り、正常腎組織が嚢胞に置換されることで、腎機能の廃絶に至る。
初期嚢胞形成Torres et al. (1992)
培養嚢胞上皮レニン

嚢胞液中Na濃度とレニン活性の相関

嚢胞上皮レニン

PKD嚢胞上皮にレニンが存在する。PKDでは、嚢胞上皮レニンがAutocrine/Paracrineに嚢胞上皮の過形成を制御しており、嚢胞の増大をもたらしていると考えられた。

PKD and RAS
ADPKD嚢胞のレニンレニンに加えて、AGTが嚢胞及び、拡張した尿細管で発現していることを示した。ACE、ATR type I並びにANGIIも、嚢胞及び尿細管に認めることができた。嚢胞液中に、高濃度のANGIIが存在している。さらに、嚢胞由来の細胞を培養したところ、RA系の構成要素のタンパク・mRNAの発現を認めた。

嚢胞液中のANG IIADPKD嚢胞のAGT

Urinary RAS in ADPKD～1～(Salih, et al. AJP, 2017)
ADPKD 60名・CKD 57名を、患者背景を揃えて比較検討した。

Urinary RAS in ADPKD～2～(Salih, et al. AJP, 2017)
①

血漿AGT

血漿レニン

尿中AGT

尿中レニン

②

多変量回帰分析の結果、尿中AGT・尿中レニンは、
ADPKD/血漿レニン/尿中アルブミン量と有意に相関した。
尿中AGTは、RAS阻害薬使用群で有意にADPKD>CKD、尿中レニンはADPKD>CKDだった。

③④ADPKD患者
では、AGT・プロレニンともに嚢胞液中で高値を示す。
尿中AGTは、尿中レニンは、尿中アルブミン排泄量と有意に正相関している。

Park et al. BMC Nephrology (2015) 16:86
①eGFR

全腎容積

クレアチニン補正尿中AGT②
233名のADPKD患者を対象にした解析の結果、クレアチニン補正した尿中AGTは、推定GFRと負の、htTKV(身長補正全腎容積)とは正の、それぞれ有意な相関関係が認められました。（①）CKDステージ分類に従って、比較検討したところ、Stage 3Bで最大値をとることが判明しました。(②)
CKDステージ

AGT-ASO投与により、PKDが解消する(Pkd2, AJP 2015)

AGT-ASOは、血清AGT・腎内AGTを抑制する。
①AGTタンパク

血清AGT③は、腎重量・嚢胞
AGT-ASO
容量・ BUNを抑制する。

②尿中AGT

AGT-ASO投与により、PKDが解消する(Pkd1, FASEB J 2016)

血圧変化
嚢胞の変化

腎レニン

肝・腎AGTAGTを分泌する不死化近位尿細管細胞の樹立

ヒトAGTに対する高感度ハイスループットαLISA法の確立

AGT分泌抑制作用をもつ、低分子化合物のスクリーニング

hRPTEC アンジオテンシノーゲン抑制率 度数分布
800705700

600

675

550

500
376400323300192

311140150-502130-60

7120-708110-80

22100-902190-100

2080-110

3770-12040-13030

172017101604-101-202-30

16138-402236090100017650200AGT分泌抑制効果(%)
DP4057-T9

E722202125

T-026139 Fluvastatin sodium salt

100.2

DP4049-T9

C1022201507

T-208506 Atorvastatin

54.1

DP4057-T9

C1022202147

T-026145 Simvastatin

80

DP4059-T9

A422202257

T-139732 Fluvastatin , Na salt

132.1

DP4060-T9

H1122202400

T-193245 Ce rivastatin

113.7

DP4073-T9

D722203404

T-208130 Pitavastatin (Calc iu m)

71.8

DP4065-T9

F422202742

T-139769 Carazostatin

78.8

DP4066-T9

D1122202876

T-139883 Gliotoxin

50.7

DP4054-T9F522201870

T-025718 Digoxin

91.6

DP4054-T9

C822201891

T-025752 Stroph an tin e oc tah ydrate

106.7

DP4056-T9

H522202032

T-026028 Mon e n sin sodiu m salt

95.8

DP4042-T9

C422200899

T-140866 Ou abain

57.6

DP4055-T9

D422201940

T-025936 Lan atoside C

65.6

DP4060-T9

F522202350

T-139860 Ou abain , 8 H2 O;Stroph an th in G;3 - [(6 - D

111.8

DP4068-T9

D522202988

T-207123 A2 3 1 8 7 (fre e ac id)

72.7

DP4069-T9E722203085

T-207235 Valinomycin (ポタシウム・イオノフォア）

81.8

DP4071-T9C222203203

T-209229 Gitoxin

72.8

DP4063-T9G1022202631

T-025490 Kawain （ Ca c h an n e l bloc ke r)

140(Ca イオノフォア）

従来技術とその問題点
CKD(慢性腎臓病）は、心血管リスクであり、有効な薬剤がなく、進行すると透析が必要になる。
医療経済、患者負担から、対策が必要である。

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新技術の特徴・従来技術との比較(1)• レニン・アンジオテンシン系は、創薬に実績がある。しかし、尿細管レニン・アンジオテンシン系を選択的に制御する薬剤はなかった。
• 尿細管中のアンジオテンシンIIは、血漿より100倍から1000倍の高濃度と考えられており、従来薬であるアンジオテンシン受容体拮抗薬の効果は、尿細管腔側からは期待できない。

29

新技術の特徴・従来技術との比較(2)• 代表的なCKDの一つである、PKDの患者数は、国内で3万人、欧州では約20万人、米国には約12万人と推定されている。治療法としては降圧薬による進展抑制が推奨されるが効果は弱い。
• 唯一バソプレシンV2受容体拮抗薬サムスカ（トルバプタン）は腎機能が良好で両腎容積が750 mL 以上の遺伝性PKDの治療薬として認可されたが、安全性（肝障害）や腎機能の観点から新たな治療薬が求められている。

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想定される用途• 抗CKD薬の創薬にあたって、近位尿細管AGTの分泌抑制効果を持った化合物を特定するうえで、有用な技術である。
• 適切な動物モデル(ADPKDであれば、Pkd1
flox/flox・タモキシフェンCreマウス）への投与実験を行うことで、創薬の基盤を提供することが出来る。

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実用化に向けた課題• 近位尿細管AGTを抑制する、抗CKD薬の創薬にあたっては、これまでに特定することができたStatin類だけでなく、分子機序に基づいた創薬標的や、プロテイン・ノックダウン法による新規化合物の開発が必要である。
• 本技術は、低分子化合物ライブラリのスクリーニングに実績があり、こうした新規化合物の探索・効果確認のために、有用な技術である。
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企業への期待• 代表的なCKDのひとつである、ADPKDは稀少難病であり、ヒトおよび、実験動物を対象にした研究から、尿細管アンジオテンシノーゲンの分泌抑制効果を持った化合物が有効である。
• 典型的な、Unmet Medical NeedsであるCKDに対する創薬を可能にする、本技術を活用した、創薬研究での共同研究を希望する。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：抗 CKD(慢性腎臓病)効果のある薬物のスクリーニングに有効なアッセイ系の構築• 出願番号 ：特願2022-003795• 出願人：横浜市立大学• 発明者：石上友章、中島理恵
杉山美智子、桑江明子
34産学連携の経歴• 2012年- 医療・健康機器メーカーA社と共同研究を実施• 2012年 JST特許出願支援制度(指定国移行時）に採択• 2014年 製薬企業B社からの支援を受けて、医師主導型臨床研究を実施• 2018年 医療・健康機器メーカーC社と共同研究を実施• 2019年 製薬企業C社と共同研究• 2021年 公益財団法人Dと共同研究
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お問い合わせ先
横浜市立大学 研究推進部
研究・産学連携推進課
Tel 045-787-2061
Fax 045-787-2025
sangaku@yokohama-cu.ac.jp36