2020年 TRC CMC分析研究部

多様化する医薬品モダリティに対する不純物分析についてー低分⼦医薬品・核酸医薬品・タンパク質医薬品ー1O00126ＣＭＣ分析研究部20200320

内容
１．医薬品中の不純物について◆低分⼦医薬品，核酸医薬品，抗体医薬品
２．分析機能紹介◆GC-MS◆キャピラリー電気泳動◆イオンクロマトグラフィー（IC）◆HPLC-CAD
３．まとめ
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医薬品中の不純物について
低分⼦医薬品
不純物
有機低分⼦不純物

分析⼿法LC-MS/MS，

GC-MS，MS，

核酸医薬品
不純物

分析⼿法

オリゴヌクレオチド
類縁物質

UHPLC，

キャピラリー電気泳動

NMR，UHPLC

残留溶媒

元素不純物

GC-MS，GC,IC

ICP-OES，ICPMS

有機低分⼦不純物

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不純物

分析⼿法

電荷不均⼀性

イオン交換クロマト
グラフィー
等電点電気泳動（ゲル，キャピラリー）

凝集体

サイズ排除クロマトグ
ラフィー（UV，MALS）

切断体

電気泳動（ゲル，キャピラリー）

残留溶媒

GC-MS，GC

⾮結合型修飾物

UPLC

元素不純物

ICP-OES，ICPMS

宿主細胞由来タンパク質，宿主細胞由来DNAELISA，ウェスタンブロッティング
定量PCR

製造⼯程不純物

GC-MS，GC,さまざまな分析⼿法が必要．
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LC-MS/MS，GCMS，MS，NMR，UHPLC

タンパク質医薬品

3IC，HPLC-CAD

トラップ法を⽤いたヘッドスペースGC-MS
ヘッドスペースサンプラーで気化したサンプルを，活性炭の吸着管でトラップし濃縮する．
従来のループ法によるサンプル導⼊に⽐べ，さらなる微量分析が可能である．

ヘッドスペースサンプラー

ループ吸着管

GC-MSへGC-MSシステム

気化サンプル溶液
気化した成分のみを注⼊．
良好な再現性‼
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ガスクロマトグラフ︓GC-2010 Plus (島津製作所 )ヘッドスペースサンプラー︓HS-20 Trap (島津製作所)
質量分析計︓GCMS-QP2020 (島津製作所)
CSV，データインテグリティ対応．
4GC-MSによる核酸中の残留溶媒分析
トラップ法による検出能⼒の増⼤トラップ法では，SN⽐が約 30倍向上した．

ジクロロメタン溶液（5 ng/mL）を測定
ピーク強度100000

ループ法
（従来法）

50000

ターゲットイオン︓ m/z 49

100000ジクロロメタン（5 ng/mL）

50000

ジクロロメタン（5 ng/mL）

S/N⽐ = 4500120

トラップ法による核酸中の微量残留溶媒分析

サンプル中含量 4 ppm 相当の微量のジクロロメタンを検出した．

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50000

00521100000

ピーク強度

合成DNA（ C-Myc antisense DNA）
中の残留ジクロロメタンを測定．

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S/N⽐ = 146903（分）ターゲットイオン︓m/z 49

トラップ法

トラップ法

3（分）

ターゲットイオン︓ m/z49

ジクロロメタン
試料溶液中4 ng/mL（4 ppm相当）

123（分）

HS-GC/MSによる核酸中の残留ベンゼン分析
発がん性の⾼いベンゼンは，医薬品原薬中での残存が 2 ppm 以下であることが求められる．ヘッド
スペース-GC/MSを使⽤し，オリゴ核酸中の 2 ppm以下の微量のベンゼンを測定する⼿法を開発．
試料︓合成核酸（ C-Myc antisense DNA，S化）
配列︓CACGTTGAGGGGCAT
濃度︓1 mg/mL （⽔溶液）ターゲットイオン︓ m/z 78

ピーク⾯積

ベンゼン標準溶液の直線性（0.23 〜 22.71 ppm 相当）

添加回収率
88%

y = 1435.1x + 45.468
R² = 0.9983ベンゼン濃度 （ppm）

合成核酸⽔溶液中のベンゼンの添加濃度
2 ppm

1017min

GC/MSによる合成核酸⽔溶液のクロマトグラム

良好な感度、直線性、および添加回収率が得られ，本法によりオリゴ核酸中の 2 ppmのベンゼンが測定可能であることが⽰唆された．
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6核酸中のオリゴヌクレオチド類縁物質の測定
核酸医薬品中の不純物であるオリゴヌクレオチド類縁物質は，主成分の核酸と構造が類似する⾼分⼦であり，識別が難しく，定量が難しい．そこで，キャピラリー電気泳動法を⽤いた測定法を検討した．
キャピラリー電気泳動法
Ⅰ．分離の検討
リン酸基部分をS化した合成DNAを⽤い，⻑さの異なるオリゴヌクレオチドの分離を検討した．
・使⽤機器︓PA800plus（AB Sciex社）
・検出⽅法︓UV280 nm
Ⅱ．設定した分析⼿法の定量性を確認
合成DNAをTris緩衝液で段階希釈し、本法の定量性（直線性，LOD，LOQ）について確認．
分離したオリゴヌクレオチドの塩基配列
A︓CACGTTGAGGGGCAT S化（MW:4857)
B︓CACGTTGAGGGGCA S化（MW:4537)
C︓CACGTTGAGGGG
S化（MW:3902)
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核酸医薬品中に含まれる不純物
オリゴヌクレオチド
類縁物質
残留溶媒
S化︓リン酸基の酸素を硫⻩に置換する修飾．
DNAを安定化す
る修飾として⽤いられる．

⾦属不純物

有機低分⼦不純物

核酸中のオリゴヌクレオチド類縁物質の測定
結果

Ⅰ．分離の検討

Ⅱ．定量性の確認

吸光度
280nm

⾯積値

B

0.0130.010

B
ACA

C

0.007

0.004

相関係数︓1.000
LOQ︓ 4 μM 付近
LOD︓1 μM 付近

0.001-0.0011213141516171819202122

濃度（ μM )時間（分）3種類の試料が分離し，分⼦量順に溶出した。
1塩基違いのオリゴヌクレオチドの分離が可能であることを確認できた。

相関係数1.000で，直線性は良好だった。LOQ 及びLODはμMオーダーであり、定量性を確認できた。

結論
キャピラリー電気泳動は、核酸医薬品中の不純物（オリゴヌクレオチド類縁物質）の定量法として、有⽤であることを確認できた。
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8イオンクロマトグラフィーによる医薬品中の残留溶媒分析
医薬品の製造承認申請において、原薬や製剤中の不純物量を把握するために、残留溶媒の測定が求められている。多くの残留溶媒はGCで分析可能であるが、GCでは分析が困難なイオン性化合物や有機酸について、イオンクロマトグラフィーを⽤いた分析を開発した。
1. 医薬品の残留溶媒試験
ICH Q3C 医薬品の残留溶媒ガイドライン

2. 分析⼿法
残留溶媒の定量には、⼀般的にGCが⽤いられるが、GC では測定が容易でないものもある。

・クラス 1 （使⽤を避けるべき溶媒）
ベンゼン、四塩化炭素など全 5成分

・極性が⾼い・揮発性が低い・C-H 結合がない（FID 検出）

・クラス 2 （残留量を規制すべき溶媒）
アセトニトリル、クロロホルム、メタノールなど全 26成分
・クラス 3 （GMP ⼜はその他の品質基準により規制されるべき溶媒）
酢酸、エタノール、ギ酸など全 28成分

ギ酸（10 mg/mL）のクロマトグラム（GC）

イオンクロマトグラフィー（IC）による分析
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9イオンクロマトグラフィーによる医薬品中の残留溶媒分析
酢酸，ギ酸及び TFA について，IC による同時分析を検討．分析には陰イオン交換カラムを⽤いた．また，ペプチド原料を⽤いて添加回収実験を⾏い，回収率を算出した．
酢酸、ギ酸および TFA の回収率
試料溶液（10 mg/mL）

酢酸

ギ酸

TFA
標準溶液（各 5 µg/mL）

添加試料溶液（各 5 µg/mL）（500 ppm 相当）（%, n=3）

添加溶液

0.25 μg/mL

1 μg/mL

5 μg/mL

酢酸

100.7

93.798.7

ギ酸

96.798.794.7

TFA

108.794.7

100.0

オキシトシン酢酸塩中の残存TFA の定量
オキシトシン(µs)

Cys-Tyr-Ile-Gly-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2酢酸、ギ酸及び TFA のクロマトグラム
ギ酸

r=0.9999
DL︓0.04 µg/mL

酢酸塩
TFA

酢酸

r=0.9998
DL︓0.06 µg/mL
r=0.9999
DL︓0.06 µg/mL(µg/mL)

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TFA︓ 2.68 µg/mL （参考値）

オキシトシンオキシトシン酢酸塩
オキシトシン及びオキシトシン酢酸塩のクロマトグラム

荷電化粒⼦検出器を⽤いた医薬品中のPEG及び添加剤の分析
荷電化粒⼦検出器（CAD）は，紫外吸収を有さない化合物の検出が可能で，化合物に関係なく同等の感度が得られる特⻑がある．TRCでは、CADを⽤いることにより，修飾バイオ医薬品分析で必要となる遊離PEGと，添加剤として汎⽤されているポリソルベートの分析が可能となった．

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11荷電化粒⼦検出器を⽤いた医薬品中のPEG及び添加剤の分析

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まとめ
 医薬品中の不純物分析を確実に検出，同定，定量するためには，特異性や感度にすぐれた分析⼿法が必要となる．
 HS-GC/MSを⽤いた残留溶媒分析は，⾼感度かつ注⼊再現性の⾼い⼿法である．試料の確保が困難な場合，特に威⼒を発揮する．
 キャピラリー電気泳動は，オリゴヌクレオチド類縁物質の定量分析に有⽤な試験法である．
 東レリサーチセンターは，さまざまな分析⼿法を所有し，お客様の研究開発に貢献いたします．
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