タンパク質・化合物を大量に生産する微生物を高速・低コストにスクリーニングする
金沢工業大学 大学院工学研究科
バイオ・化学専攻
教授 町田雅之
2022年12月2日

町田雅之

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バイテク産業への貢献の戦略
概要• 生産コスト（競争力）に直結する、微生物・細胞の物質生産性を、迅速・低コストに向上する。
• 対象分野：バイオテクノロジー産業全般
現状• 育種による迅速な高生産化は業界の長年の悲願• 決定的な方法は無く、ケースバイケースで対応（職人芸的に行うか、膨大なコストをかけるか）
ソリューション
• 高生産株の大規模・迅速・低コストなスクリーニングを実現（定量的「高生産化株選別」、及び、定性的「生産株獲得」）• 大規模・迅速・低コストなGMD技術で統一・汎用化する
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GMDによる細胞・微生物のスクリーニング
GMDを微小な反応空間とすることで、これまでにない大規模なスクリーニングが可能となる。
プレート法 1万サンプル

GMD法 100万サンプル
GMD
微生物・細胞✖ 100万-1000万培地
60-90 μm
100倍96ウェル プレート
104枚
体積数十μL/well
培養
大量の培地

1本のチューブ

1/1,000,000以下

人手・時間
数名 数日

新たな発見は運次第（見逃す可能性が高い）

1/10以下に

体積pL/GMD
培養
少量の培地

培養可能

人手・時間
1名 1日

新たな発見はほぼ確実（大規模に探索できる）
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技術の概要とポイント
レポーター株を用いることで、GMD内で化合物の検出が可能になる
1. 高速・低コストな分泌生産向上微生物スクリーニングを実現
2. 従来のタンパク質だけでなく、GMD内での化合物の検出を可能に
3. 生産化合物検出で酵素活性の検出に対応
4. レポーター株の変更で化合物・酵素スクリーニングを含めて汎用化
分泌生産物の捕獲

GMD（アガロース等）

酵素基質
酵素60-90 µm

生産物
レポーター生産物
培地

栄養素、試薬等

科学技術振興機構（A-STEP）
株式会社オンチップバイオテクノロジーズ＊本研究は上記の支援を受けています。

酵素 生産細胞

GMD内での化合物・酵素活性の検出方法（タンパク質の直接蛍光標識による検出も可能）4

GMDの原理と特徴、およびマイクロ流路を用いた作製方法
作製方法

原理
分泌生産物の捕獲

GMD（アガロース等）

顕微鏡像

水滴

60-90 µm培地

栄養素、試薬等

GMD (ゲルマイクロドロップ)

概略図

エマルジョン

Droplet Generator

微生物

アガロースの固化（低温処理）
オイルの除去GMD ≦ 1 細胞/GMDに調製（エマルジョン作製時に限界希釈） 1本のチューブで106-107（384穴マイクロプレートで2,60026,000枚分に相当）

オイル培地
蛍光標識など蛍光像

試薬添加など培地
5従来技術とその問題点

スクリーニングの重要性• カーボンニュートラル実現が最重要課題となり• 「バイオものづくり」（バイオプロセス化）が更に必要不可欠に• 情報科学的解決は未だ困難で、スクリーニングが不可避• → 迅速・低価格な大規模（ミリオン）スクリーニングが必要不可欠

しかし、従来は以下のいずれかの二択しかなかった。
• 手作業によるプレートアッセイ等：時間と手間が必要• ハイスループットスクリーニング等：大がかりで高コスト→ 「短時間・低コストで大規模なスクリーニング」の方法の欠除（バイテクの基盤技術にも関わらず、大規模スクリーニングは製薬など大企業しか行えない）
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新技術の特徴・従来技術との比較①
従来技術（手作業・小型機器）

従来技術（大規模機器）新技術（GMD）

サンプル規模✕ ～104✕ 105～106○ 106～108

時間・コスト✕ 手間と時間が必要✕ 大がかり・高コスト○ 短時間・低コスト効果△ 優れた高生産株は限られたケースのみ○ 優れた高生産株を取得できる○ 優れた高生産性株を取得できる

適用範囲

○ 広い

○ 広い

○ 広い

対象生産物

化合物、酵素、抗体（タンパク質）等

化合物、酵素、抗体（タンパク質）等

化合物、酵素、抗体（タンパク質）等

対象業種

化成品企業、製薬企業、 大手製薬企業、大手化
食品会社、酵素メーカー、 学系企業のみ
農薬メーカー等

化成品企業、製薬企業、食品会社、酵素メーカー、農薬メーカー等
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新技術の特徴・従来技術との比較②

大規模機器
手作業・小型機器（寒天平板培養など） （ハイスループットスクリーニング）

GMD＋チップ型ソーター（本技術による方法）

特徴的性能の比較
スクリーニング規模＊1104

105～106

106～108

スクリーニング時間＊2

1～2日

1～10日＊3

1～数時間ランニングコスト＊4数万円

100～1000万円程度＊3数万円*1 現実的な母集団の大きさ。致死性スクリーニングなど特別なスクリーニング手段がある場合を除く。
*2 培養に要する時間を除いた一般的な時間。
*3 機器の性能・規模に依存。
*4 試薬代、人件費などを考慮した一般的な推定価格。

実施性能の比較（一般的と考えられる推定値）
スループット（1時間）
変異株取得のコスト（106から）
培地交換・誘導物添加結合・洗浄検出
長時間培養
簡便性

手作業・小型機器
104程度
限られたケース以外困難◎◎◎×

ハイスループットスクリーニング
103～104程度（ELISA）
数百万円程度（ELISA）◎◎◎
×

GMD＋チップ型ソーター
106程度
10万円程度*1◎◎◎○*1 変異処理とスクリーニング1回、人件費含む（準備の中でレポーターを作製しておく：1ヶ月程度）

従来の方法を代替する高速・安価な「変異株スクリーニング」技術を提供する
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新技術の特徴・従来技術との比較③• 本技術の適用により、数万円程度で106以上に達する大規模スクリーニングの実施が可能になる。
研究開発コストを1/10程度に削減する。
従来より優れた高生産株の獲得により、生産コストの更なる削減が期待できる。

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想定される用途
業種
これまでにない特徴
化学会社、農薬会社 「低コスト」、「迅速」に優れた高生産株を獲
酵素メーカー
得する
食品会社、化粧品会 「低コスト」、「迅速」に優れた突然変異（非社
遺伝子組み換え）高生産株を獲得する
製薬会社「迅速」、「低コスト」に大規模スクリーニングを達成する
その他の特徴• 組換え生産細胞の更なる高生産化にも有効• 定性的スクリーニングである「新規な物質生産微生物」の探索にももちろん利用可能。
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GMD技術の特徴
106以上の変異処理細胞から、高生産細胞を高速にスクリーニングする
GMDの使用例
変異処理した細胞（＞106）

GMDへの封入(~1細胞/1 GMD)
蛍光測定
ソート
高生産変異株

GMDの優位性• ～107 個の細胞を1本のチューブで扱える• 高い柔軟性– 細胞の培養可能– 簡単に培地交換できる– 化合物等で誘導可能– いつでも蛍光標識可能– GMD内の細胞は簡単に回収できる• 低ランニングコスト– 試薬を大幅に節約できる– プラスチック廃棄物が少ない

マイクロ流路型ソーターとの組合せの利点
柔軟・簡便な操作– 回収物を直接顕微鏡観察できる– 高濃度で回収できる– 迅速にソート情報を蓄積できる11

マイクロ流路型ソーターによる簡便・迅速化~3x105 個のGMD（細胞）は30分程度以内にソートが完了する
サンプル

マイクロ流路チップ

シース液

GMDs

ソート細胞

蛍光測定

廃液

ソート

オンチップ・バイオテクノロジーズ社製 “On-chip Sort”

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GMD内での酵素活性の検出方法
酵素生産細胞とレポーターを封入し、GMD内で酵素活性を検出する
酵素基質の添加酵素 生産細胞（酵母、細菌、etc.）
培養

GMD内封入

GMD内培養GMD
GMD内の反応

レポーター(生産細胞の約10倍）

生産物 レポーター（酵母等）
形質転換

誘導性Pr.

培養
蛍光タンパク質

酵素

酵素基質生産物
レポーター生産物

酵素 生産細胞13

GMDによるスクリーニングの工程
スクリーニングの概要

レポーター混合生産細胞

生産細胞・レポーターの培養

ソート前GMDの顕微鏡像

変異処理

GMD調製 (~30 分)（Droplet Generator）

明視野~1x106 GMDs

GMD内での培養

GMDのソート(~60 分)（On-chip Sort）

選択培地で培養(生産細胞のみ生育)

暗視野

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性能評価と取組中の課題
高生産株の高濃縮率達成、レポーター構築で様々な生産物に迅速に対応β-ガラクトシダーゼを分泌生産する組換え体酵母の高生産化• UV照射とスクリーニングを２回繰り返し取得した変異株15株で、半数以上の8株で2倍以上に高生産化（濃縮率は約1,000倍と推定される）
最大約3.5倍の高生産株取得に成功• UV照射とスクリーニングを3回繰り返し最大約7倍の高生産株取得に成功
約3週間、20万円程度（レポーター構築は別途1ヶ月程度）
Tryptophan分泌生産する大腸菌の高生産化• 多数の2～5倍の高生産株取得に成功（詳細な解析を実施中）
GABAに対するレポーター作製完了など実施例を拡充中。

貴社の微生物スクリーニングのニーズをお聞かせください！

15実用化に向けた課題• 現在、以下が可能なところまで開発済み。

– 化合物（主に代謝物）の分泌生産量の向上– 酵素・タンパク質の分泌生産量の向上– 対象として、バクテリア、酵母などの単細胞微生物• 以下の点が未解決の課題・改良点である。

– 酵素活性を持たないタンパク質は遺伝子組換えが必要→ 対応策は考案済、近く実証予定– 糸状菌（カビ）はGMDから突き出た菌糸がソートの障害になる→ 対策済、現在実証中• 今後、多数の課題を実施して機能向上を計る。

– 実際の産業課題に適用して実証し技術の周知を計る。
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企業への期待分野
酵素メーカー
化学系企業
食品メーカー
農薬メーカー
製薬企業

主な対応状況・実績
β-ガラクトシダーゼ活性検出による高生産化（2～7倍）
トリプトファンの高生産化（詳細解析中）GABAの高生産化
（実施中）

主な課題
様々な酵素・生産生物種への対応

二次代謝物質の高生産化（実施中）
二次代謝物質の高生産化（実施中）

様々な生産物・生産生物種への対応
様々な生産物・生産生物種への対応

様々な化合物への対応
様々な生産物・生産生物種への対応

利用範囲の拡大と汎用化に向けて、種々企業からの受託・共同研究を希望します。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：細胞のスクリーニング方法• 出願番号 ：特願2022- 33964• 出願人：金沢工業大学、東北大学• 発明者：町田雅之、佐野元昭
阿部敬悦
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産学連携の経歴• 2018年-2022年 オンチップバイオテクノロジーズ社と共同研究実施• 2020年-2022年 JST A-STEP（育成型）事業に採択

19お問い合わせ先
金沢工業大学
金沢工業大学 産学連携局 研究支援推進部
ＴＥＬ 076-294-6740
ＦＡＸ 076-248-9508
e-mail kitor@neptune.kanazawa-it.ac.jp20