福岡水海技セ研報 第14号 2004年3月
Bull.Fukuoka Fisheries Mar.Technol.Res.Cent,No14. March 2004

アユにおける耐病性マーカーの探索
中本 崇・岩渕 光伸・濱崎 稔洋・恵崎 摂(内水面研究所・研究部)

Search of Resistance Marker to Disease in Ayu

Takashi Nakamoto, Mitsunobu Iwabuchl Toshihiro Hamasaki*2 and Osamu Ezaki(Freshwater Laboratory ・ Research Department)

水産生物の養殖において疾病の発生は避けがたいもの

川産耐病系統F 4と,耐病選抜を行わなかった矢部川産であり,生産性に大きく影響を及ぼす。疾病には一般的F4,対照区としてビブリオ痛に弱い和歌山系クローンには薬剤療法が用いられているが,薬剤耐性菌の出現やを用いた。 3系統を鰭切除標識により区別し,屋外の薬剤残留といった食の安全性からも問題がある。そのた

25t水槽に収容し,地下水を用いて市販の配合飼料を給め,養殖業界では耐病性のある品種あるいは系統の作出が強く望まれている。

餌した。 2ケ月間混合飼育した後, 3系統にホルマリン

アユのビブリオ痛は,アユ養殖において短期間に大量注射し,元の水槽で引き続き飼育した。注射後20日目に死菌(FKC;lmg/m^PBS)を1尾当たりO.lm^腹腔内にへい死を起こす重大な疾病である。その対策として,オ3系統のそれぞれ30尾から採血し,血清を分離後‑80℃キソリン酸による薬剤療法やワクチンによる予防法が用で保存した。その後,これら保存血清についてマイクロいられている。しかし,これらの治療法や予防法にも限タイタ一法6)により血中抗体価を測定した。

界があり,ビブリオ痛やその他の重大疾病に対して耐病

2包 ビブリオ人為感染試験性のある品種の作出が望まれている。

(月番系統における耐病性の差異

こジマスのIPN(伝染性輝臓壊死症)ではIPN耐病性系

試験魚には耐痛系統として平成9年から5回の耐痛選

統とIPN感受性系統,その交雑F l及び交雑F lと感受抜を行った筑後川産耐病系統F 6及び矢部川産耐痛系統性系統との戻し交配家系からDNAを抽出し,耐病性F6,対照区として和歌山系クローン,更に矢部川天然(表現型;坐,死)とマイクロサテライトマーカーの遺遡上アユと合所ダム陸封アユを加えた。各30尾をそれぞ伝状況をとの関連の有無を解析し,感受性/耐病性に関れNaCl1%のビブリオ菌液(lO5CFU/m」)に5分間浸連する2つの連鎖群に属する4遺伝子座を兄いだしてい潰し, 60t水槽に収容した。以後の飼育は地下水を毎分る1)。

0.54注水し,無給餌で行った。 ‑い死が見られなく

本研究では,福永2‑5)がビブリオ菌を用いて耐痛選抜なった時点での生残率を耐病性の指標とした。

を繰り返し行うことで耐病性のある家系を作出した耐痛(2)交雑『用の表現型

家系とビブリオ痛に感受性のある和歌山系クローンを用

試験魚には矢部川産耐病系統F 4 (父親)と和歌山系

いAFLP解析による耐病性に関するDNAマーカーの検出

クローン(母親)との交雑Flから2家系(No.1,を試みたので報告する。

No.2),対照区として平成9年から4回ビブリオ耐病選抜を行った矢部川産耐痛系統F 5及び和歌山系クロー方法ンを使用した。鰭切除標識により試験魚を区別し, 5t水槽で56日間飼育した。各30尾をNaCllのビブリオ

1.血中抗体価菌液(3.5×105CFU/r

試験魚には,ビブリオ菌(Vibrio anguillarum P午479イト水槽に収容した。以後の飼育は地下水を毎分0.51

秩)を用い,平成9年から3回の耐痛選抜を行った矢部

注水し無給餌で行った。へい死が見られなくなった時点*1現有明海研究所 *2現福岡県水産林務部漁政課‑

63‑に1時間浸潰し, 1tパンラ

中本・岩渕・濱崎・恵崎

での生残率を耐病性の指標とした。
3.

耐病性DNAマ‑カーの同定

80

価(1) AFLP解析法の有効性

FJ 60

AFLP解析法によってアユ耐病性と連鎖するDNAマー合石40カーの検出が可能かどうかを確認するため,矢部川産耐5i病性系統F4と和歌山系クローンそれぞれ5個体から20DNAを抽出してAFLP解析を行った。 DNAは胸鰭等から常法によりプロテアーゼKとフェノールクロロフォルム処理によって抽出し, RNase処理でRNAを除いた後,濃図1各系統のビブリオ菌に対する血中抗体価

度0.05/ig/5.5μLのこ調整した。 AFLP解析はアプライ
ドバイオシステムズ社のAFLP Plant Mapping Kit

100

80

Regular Plant Genomes用を用い,添付プロトコールに坐残率

従って処理を行った。解析にはEco‑RI個‑MseI側の組

60

Eid

合せにagg‑ctt, aag‑cagの2組のプライマーペアを用

%

40iZq

い,アプライドバイオシステムズ社のGenetic Analyzer
310を用いて増幅断片を検出した。
(2)耐病憶に関するDNAマーカーの探索
矢部川産耐病系統F4 (父親)と和歌山系クローン(母親)の交雑F lのうち, No∴1家系30個体について64通りのプライマーペアの組合せを用いてAFLP解析を80坐行った。 F l個体間では耐病性に差が認められなかった

残60率ことから,父親に認められるが母親の和歌山系クローン

lらii3%40には認められない増幅断片のうち,交雑FlのNo言家

四一!

系の30個体すべてに検出される断片を探索した。さらに

20

その断片がNo. 2家系のF l個体すべてに認められるか1日目どうかを同様に調べ,耐病性に関するDNAマーカーの3日目

5日目

7日目

9日目11日目13日目

図3 各系統毎の生残率の推移絞り込みを行った。
結

アユで73%,合所ダム陸封アユで67%となり,耐病系統

果の生残率は他系統のそれより高かった。
1.

(2)交雑F1の表現型

血中抗体価

矢部川産耐病系統F 4,矢部川産F 4及び和歌山系ク各系統毎の生残率の推移を図3に示した。試験開始後

ローンの血中抗体価を図1に示した。 FKC接種後の抗体14日目の生残率は矢部川産耐病系統F 5で9796,交雑F

価が32以上を示した個体の割合は矢部川産耐病系統F 4lではそれぞれ100%, 97%,和歌山系クローンでで90.0%,矢部川産F 4で67.9%及び和歌山系クローン25%,となり和歌山系クローン以外では耐病性を持ち,で10.0%となり耐病系統が高い債を示した。また,和歌

生残率に有意な差は見られなかった。

山系クローンの値は全体の76.7%が抗体価16に集中し,3.耐病性DNAマーカーの同定

ビブリオ病に対する抵抗力がほぼ均一なことが確認され(1 ) AFLP解析法の有効性た。

和歌山系クローンのAFLPパターンは図4に示したよ2. ビブリオ人為感染試験

うに5個体全てが完全に一致し, AFLP法でもクローン(1)各系統における耐病性の差異怪の確認が可能であった。これは, DNA解析法として各系統毎の生残率の推移を図2に示した。試験開始後信頼性の高いRFLP法と同様, AFLP法の再現性,信頼性14日目の生残率は筑後川及び矢部川耐痛系統でそれぞれに問題が無いことを示している。
一方,父親に使用した耐病系統5個体間では多型断片

97%, 87%,和歌山系クローンで40%,矢部川天然遡上‑64‑

アユにおける耐病性マーカーの探索が確認され,多型断片数はプライマーペアagg‑cttがかつF l個体すべてに認められる増幅断片が耐病性関連

13, aag‑cagが17であった。またクローンには認められ遺伝子と連鎖するDNAマーカーの候補と推定された。

ないが,耐病系統5個体すべてに認められた断片数は,耐病性No. 1家系の父親に認められるが,和歌山系クagg‑cttが2ローンの母親に認められない増幅断片は63プライマーペaag‑cagが3であった。

(2)耐病性に関するDNAマーカーの検索

アで217断片認められた。そのうち図5の左端の矢印に感染試験の結果,すべてのF l個体に耐病性が認めら見られるように,すべてのFl個体に認められた断片はれたことから,父親に認められて母親には認められず,61断片であった。さらにこれらの断片のうち,交雑FI
No. 2家系のF l個体すべてに検出されたのは表1に示80120160200240280320

した23断片であった(図6)。
考 察
画密16:AISa叫eAYUCLONEl/AGG・CTT

読

アユのビブリオ病における耐病形質の確認には抗体価の変異を見ることが有効であると言われている7)。本試
験においての血中抗体価は耐病系統の方が和歌山系クローンや無選抜群よりも高い結果となり,耐痛系統の耐病性は引き継がれていた。また,血中抗体価の変異はビブリオ人為感染後の生残率の結果にも符合した。
耐病系統のF 5, F 6及び福永2 5)の行った耐病系統]山]

F 2, 3との選抜回数による耐病性の差は感染試験時の条件が一様でないため,人為感染試験の生残率の差からは選抜の効果を見ることが出来なかった。しかし,いず国画IG:A7SampleAYU CLONE4/AGG‑CTT

1 5..コ??03岬〕eo‑¥〔泊

母親

68等

28古

和歌山系クローンのAFLPパターン
10幻だ68巳
60CFri辿300

止No.2家系Fl起 些些 …
l止m監̲∴!A'JEl夢

002 10EqC

回国 5G・A9Samp!eAYU CLONE5/AGG‑CTT

図堵

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IOOC二"̲二⊥

E回3一

ヨ細小三・1.'AGC‑CAG

口匪 こB:A了S川㌣le2‑2 / ACA‑C,昌T

図68cc

40C

Fj

二二二=二圏===耐病系のみに認められた増幅断片↓

襲用 耐病性DNAマーカー候補と推定された23AFLP増幅断片

8qL14mO

aaer‑caa 116

aac‑cac 67

aec‑cag 249

act‑cta 122

aag‑cta 157

aac‑cae 210

agc‑ctだ79

act‑eta 31 3

aag‑etc 21 3

aac‑cas 226

aca‑cac 427

act‑ctc 219

aag‑ctt 317

agg‑cag 290

acc‑caa 324

aca‑cta 182

ags‑cta 52

acc‑cac 479

aca‑cac 139

ags‑ctg 363

ac卜cag 119

aca‑etc 441‑65‑

act‑cag 192

中本・岩渕・濱崎・恵崎

れの場合も耐病系統は和歌山系クローンや無選抜群等よ文りも高い生残率を示した。

献

また,耐病系統と和歌山クローンの交雑Flは2家系とも生残率が高く,耐病性を有していた。このことから

1)岡本信明,坂本崇,尾崎照連:魚類ウイルス病に対4世代にわたり選抜を行った矢部川耐病性系統の耐病性

する抵抗性遺伝子座の検出.水産育種, voL32,に関する遺伝子は優性であり,ホモ化していると推察さNo2, 75‑86 (2002)

れた。
AFLP解析では最大64通りの組み合わせが可能なプラ

2)福永剛:アユ耐病性系統作出技術の開発.水産生物育種の効率化基礎技術の開発,前期成果, 175‑178

イマーペアのうち, 2通りの組み合わせでも系統間の違いを示す断片が認められたことから,交雑家系のAFLP
解析により耐病性DNAマーカーの検出は可能であると(2001)

3)福永剛,潰崎稔洋:アユ耐病性系統作出技術の開発.福岡県水産海洋センター事業報告,平成9年度, 409‑411 (1997)

考えられた。
耐病性マーカーの検出では耐病性に関するDNAマーカーを23断片までに絞り込むことが出来たが,特定するまでには至らなかった。 DNAマーカーを特定するためには交雑F lと和歌山系クローンとの戻し交配家系を作

4)福永剛,潰崎稔洋,岩測光伸:アユ耐病性系統作出技術の開発.福岡県水産海洋センター事業報告,辛成10年度, 342‑344 (19985)福永剛,潰崎稔洋:アユ耐病性系統作出技術の開後の課題である。また,耐病性AFLPマーカーが特定さ

発.福岡県水産海洋センター事業報告,平成11年度, 339‑340 (1999)

れても本耐病系統以外での利用はできないため,汎用性

6)東京大学医学科学研究所学友会:微生物学実習提の高いマイクロサテライトDNAマーカー等の同定も必要,丸善株式会社,東京, 1988. pp. 305
7)稲田善和:アユにおける耐病系統群作出の実際.水出し,耐病性と連鎖する断片を同定する必要があり,今要であると考えられる。また,検出されたDNAマー産育種, voL32, No2, 59‑66 (2002)

カーがビブリオ痛だけでなく冷水病等他のアユの重大疾病に関与しているかも調べる必要がある。
要約1)耐病家系とビブリオ病に感受性のある和歌山系クローン及びその交雑F 1/盲用いAFLP解析による耐Liiiiii3

病性に関するDNAラーカーの検出を試みた
2)抗体価は耐病系統の方が和歌山系クローンよりも高い結果となり,これはビブリオ人為感染後の生残率の結果にも符合した。
3)和歌山系クローン個体は,全体の76.7%が抗体価16に集中し,ビブリオ病に対する抵抗力がほぼ均一で弱いことが確認された。
4)人為感染試験の結果,耐病系統は和歌山系クローンや無選抜群等よりも高い生残率を示した。
5)耐病怪に関するDNAマーカーを23断片までに放り込むことが出来たが,特定するまでには至らなかった。 DNAマーカーを特定するには交雑Flと和歌山系クローンとの戻し交配家系の個体を調べる必要がある。

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