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魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

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魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法
小森谷 敏一 *Simultaneous Determination of Malachite Green and Leucomalachite Greenin Fish Oil by LC-MS/MSToshiichi KOMORIYA *( * Food and Agricultural Materials Inspection Center, Fertilizer and Feed Inspection Department)
An analytical method for determination of malachite green and leucomalachite green in fish
oil using liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESIMS/MS) was developed.

Malachite green and leucomalachite green were extracted withacetonitrile-acetic acid (19+1) and hexane (saturated with acetonitrile).

The extracts were

purified by Bond Elut SCX (Varian) column, and subjected to LC-ESI-MS/MS for determinationof malachite green and leucomalachite green.

A recovery test was conducted using refined fish

oil and non-refined fish oil spiked with 2 and 100 µg/kg of malachite green and leucomalachitegreen.

The mean recoveries of malachite green were in the range of 89.9~101 % with therelative standard deviation of within 10 %.
for leucomalachite green.

These respective values were 94.6~112 % and 3.9 %A collaborative study was conducted in eight laboratories using

refined fish oil and non-refined fish oil spiked with 5 µg/kg of malachite green and leucomalachitegreen.

The mean recovery of malachite green in the refined fish oil was 87.4 %, andrepeatability and reproducibility in terms of the relative standard deviations (RSDr and RSDR)
were 6.8 % and 13 % respectively, and HorRat was 0.60.

The mean recovery of leucomalachitegreen was 108 % with RSDr of 3.8 %, RSDR of 8.2 % and HorRat of 0.37.

For the non-refined

fish oil, these respective values were 85.9 %, 2.5 %, 12 % and 0.56 for malachite green, and
101 %, 4.2 %, 6.2 % and 0.28 for leucomalachite green.
Key words: 合成抗菌剤 synthetic antibacterial ; マラカイトグリーン malachite green ; ロイ
コマラカイトグリーン leucomalachite green ; 液体クロマトグラフタンデム型質量分
析計 liquid chromatograph-tandem mass spectrometer ; エレクトロスプレーイオン化法
electrospray ionization (ESI) ; 魚油 fish oil ; 共同試験 collaborative study
1緒言

マラカイトグリーン（以下「MG」という）は，緑色の合成色素で工業的にトリフェニルメタン染料として繊維等の染色に使用されている．また，抗菌活性を示し，水産において水カビ病の治療薬として使用されていたが，近年，発がん性が示唆され，遺伝毒性が疑われている 1) ．また，ロイコマラカイトグリーン（以下「LMG」という）は，MG が生体内で還元されて生じる代謝物である．
*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部

44

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

国内では薬事法の一部改正及びそれに伴う動物用医薬品等取締規則の一部改正により現在，すべての食用水産動物に対しての使用が禁止されている．
魚粉及び配合飼料の MG 及び LMG の分析法については，平成 20 年 4 月 1 日付け 19 消安第14729 号農林水産省消費・安全局長通知にて飼料分析基準 2)に収載されているが，魚油については分析法が検討されていない．
今回，「平成 19 年度飼料に含まれるマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの畜産物への残留に関する調査委託事業」において財団法人日本食品分析センターが開発した「魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの分析法」 3) （以下「分析センター法」という．）を基に飼料分析基準への適用の可否についての検討を行ったので，その概要を報告する．
なお，マラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの構造式を Fig. 1 に示した．

NN

N+ Cl-

Malachite green (MG) chloride

N

Leucomalachite green (LMG)

N-[4-[[4-(dimethylamino)-phenyl]4,4′-benzylidenebis(N,N-dimethylaniline)

phenylmethylene]-2,5-cyclohexadien1-ylidene]-N-methylmethanaminium
chlorideC23H25ClN2

MW: 364.9

C23H26N2

CAS No.: 569-64-2
Fig. 1CAS No.: 129-73-7
Chemical structures of MG and LMG
22.1

試

MW: 330.5

実験方法

料

市販の精製魚油及び未精製魚油を用いた．
2.21)

試

薬MG 標準原液MG シュウ酸塩標準品（Sigma-Aldrich 製，純度 97.2 %）12.7 mg を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて MG の標準原液を調製した（この液 1 mL は，MG として 100 µg（f=0.972）を含有する．）．

2)

LMG 標準原液
LMG 標準品（林純薬工業製，純度 99.9 %）10.0 mg を正確に量って 100 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて LMG の標準原液を調製した（この液 1 mL は，LMG として 100 µg（f=0.999）を含有する．）．

魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

3)45MG-d5 （安定同位体元素標識 MG）内標準原液
MG シュウ酸塩-d5 標準品（林純薬工業製，純度 97.5%）6.4 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて MG-d5 の標準原液を調製した（この液 1 mL は，MG-d5 として 100 µg（f=0.975）を含有する．）．

4)

LMG-d6 （安定同位体元素標識 LMG）内標準原液
LMG-d6 標準品（林純薬工業製，純度 99.9 %）5.0 mg を正確に量って 50 mL の全量フラスコに入れ，メタノールを加えて溶かし，更に標線まで同溶媒を加えて LMG-d6 の標準原液を調製した（この液 1 mL は，LMG-d6 として 100 µg（f=0.999）を含有する．）．

5)

混合内標準液使用に際して，MG-d5 及び LMG-d6 内標準原液各 1 mL を 100 mL の全量フラスコに正確に入れ，更に標線までアセトニトリルを加えて，1 mL 中に MG-d5 及び LMG-d6 として各 1µg を含有する混合内標準液を調製した．

6)

検量線作成用標準液使用に際して，MG 及び LMG 各標準原液並びに混合内標準液の一定量をアセトニトリ
ル－水（1+1）で正確に希釈し，1 mL 中に MG 及び LMG としてそれぞれ 0.1，0.2，0.5，1，5 及び 20 ng を含有し，かつ MG-d5 及び LMG-d6 としてそれぞれ 5 ng を含有する各検量線作成用標準液を調製した．

7)

溶離液調製用アセトニトリルは LC-MS 用，標準液調製用メタノール及びアセトニトリルはHPLC 用を用いた．特記している以外の試薬については特級を用いた．

2.3
1)

装置及び器具液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（LC-MS/MS）：LC 部：Agilent Technologies 製

1200 Series

MS 部：Agilent Technologies 製

6410 Triple Quad LC/MS

2)

振とう機：タイテック製

3)遠心分離器：久保田製作所製4)

ロータリーエバポレーター：BÜCHI 製5)

ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）：
Varian 製

2.41)

レシプロシェーカーSR-2W
5200
R-200

Bond Elut SCX（リザーバー容量 3 mL）に 10 mL のリザーバーを連結したもの

定量方法
抽出

分析試料 1 g を正確に量って 100 mL の共栓遠心沈殿管に入れ，混合内標準液 50 µL を正確に加えた．更にアセトニトリル－酢酸（19+1）40 mL 及びアセトニトリル飽和ヘキサン 10 mLを加えた．10 分間振り混ぜた後，2,600 rpm（1,300×g）で 5 分間遠心分離し，ヘキサン層（上層）を駒込ピペットで除去し，アセトニトリル層（下層）を試料溶液とした．
2)

精製

ベンゼンスルホニルプロピルシリル化シリカゲルミニカラムをアセトニトリル－酢酸（19+1）5 mL で洗浄した．試料溶液 4 mL をミニカラムに正確に加え，自然流下で液面が充てん剤の上端に達するまで流出させた．更にアセトン 2.5 mL 及びアセトニトリル 5 mL を順次ミニカラムに加え，同様に流出させた．
50 mL のなす形フラスコをミニカラムの下に置き，アセトニトリル－アンモニア水（19+1）

46

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

10 mL をミニカラムに加えて MG 及び LMG を溶出させた．
溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．アセトニトリル－水（1+1）1 mL を正確に加えて残留物を溶かし，プラスチック製遠心沈殿管（容量 1.5 mL）に入れ，10,000 rpm（5,000×g）で 5 分間遠心分離し，上澄み液を液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による測定に供する試料溶液とした．
3)

液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による測定
試料溶液及び各混合標準液各 5 µL を液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（以下「LC-MS/MS」という．）に注入し，Table 1 及び Table 2 の測定条件に従って選択反応検出クロマトグラムを得た．
Table 1Column

Operating conditions for LC-MS/MS for analysing MG and LMG
Agilent Technologies, ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d.×150 mm, 5 µm)
A: 0.3 v/v % ammonia solution·2 v/v % formic acid solution-water-acetonitrile (10:81:9)
Mobile phase
B: 0.3 v/v % ammonia solution·2 v/v % formic acid solution-water-acetonitrile (10:9:81)
B(v/v%) 30 v/v% (1 min)→7 min→100 v/v% (10 min)Flow rate
0.25 mL/min
Column temp.
40 °CIonization
Electrospray ionization (ESI)
N2 (340 kPa)
Nebulizer
N2 (350 °C)
Drying gas temp.
Capillary voltage
4,000 V

Substance
MGMG-d5LMG
LMG-d64)

計

Mode++++

Table 2MS/MS Parameters

Precursor

Product

QualifierFragmentor

Collision(m/z )
329334331
337(m/z )313
318
239240(m/z )208－
316－(V)
100
100
100100(eV)
40402525算得られた選択反応検出クロマトグラムから MG，LMG，MG-d 5 及び LMG-d6 のピーク面積を求めて内標準法により検量線を作成し，試料中の MG 及び LMG 量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

47

Sample 1 g
add 50 µL of mixed internal standard solution
add 40 mL of acetonitrile-acetic acid (19:1)
add 10 mL of hexane (saturated with acetonitrile)shake for 10 min
centrifuge for 5 min at 1,300×g
remove hexane layer with pipet
Bond Elut SCX (prewash with 5 mL of acetonitrile-acetic acid (19:1))
apply 4 mL of sample solution
wash with 2.5 mL of acetone
wash with 5 mL of acetonitrile
elute with 10 mL of acetonitrile-ammonia solution (19:1)
evaporate to dryness under 40 °C
dissolve in 1 mL of acetonitrile-water (1:1)
centrifuge for 5 min at 5,000×g
LC-MS/MS

Scheme 1

Analytical procedure for MG and LMG in fish oil
33.1

検討内容

検量線
MG 及び LMG として 1 mL 中に 0.1，0.2，0.5，1，5 及び 20 ng を含有し，かつ，MG-d5 及びLMG-d6 としてそれぞれ 5 ng を含有する各混合標準液を調製し，これらの液各 5 µL を LCMS/MS に注入し，得られた選択反応検出クロマトグラムから MG 及び LMG と MG-d5 及びLMG-d6 のピーク面積比を求めて検量線を作成した．その結果，検量線は Fig. 2 及び Fig. 3 のとおり，MG 及び LMG として 0.5~100 pg の範囲で直線性を示した．

Fig. 2Calibration curve of MG

48

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

Fig. 3
3.2

Calibration curve of LMG

妨害物質の検討
精製魚油 4 点及び未精製魚油 6 点について本法に従って選択反応検出クロマトグラムを作成し，MG 及び LMG の定量を妨害するピークの有無を検討した．その結果，MG 及び LMG の定量を妨害するピークは認められなかった．
3.3

窒素ガスによる通気乾燥操作の必要性の有無
分析センター法ではミニカラムにおける精製においてアセトニトリル流出後に溶媒を揮散させるために窒素ガスによる通気乾燥を行うこととなっているが，妨害物質の検討時に内標準物質の回収率が低くなる（10 %以下）傾向が見られたので，以降，本操作は行わないこととした．
3.4

ミニカラム処理における溶出画分の確認
ミニカラム処理による MG，LMG，MG-d5 及び LMG-d6 の溶出状況を確認した．
精製魚油に MG 及び LMG としてそれぞれ 100 µg/kg 相当量ずつを添加し，本法により操作した後，ミニカラム処理を行い，MG，LMG，MG-d 5 及び LMG-d6 溶出状況を確認した．
その結果，Table 3 のとおりアセトニトリル－アンモニア水（19+1）10 mL でほぼ溶出され，内標準物質も同様の挙動を示すことから，溶出液量は 10 mL で十分であると思われた．
Table 3Fraction volume (mL)
MGMG-d5
LMG
LMG-d6

Elution pattern from Bond Elut SCX
0~10
10~12
12~14
14~16
area (arb. units)
443,558
2,249
1,083969
relative value (%)
1000.51
0.24
0.22
area (arb. units)
190,3141,045
448360relative value (%)
1000.55
0.24
0.19
area (arb. units)
162,683
1,271859371
relative value (%)
1000.780.53
0.23
area (arb. units)
74,077623
382
160
relative value (%)
1000.840.52
0.22

16~1818~20758

773

0.170.17316

320

0.170.17443

658

0.270.40

228

331

0.310.45

49

魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

3.5

添加回収試験及び検出下限
本法による回収率及び繰返し精度を確認するため，添加回収試験を実施した．
精製魚油 2 種類及び未精製魚油 2 種類に MG 及び LMG としてそれぞれ 2 及び 100 µg/kg 相当量ずつを添加した試料を用いて，本法に従って 3 点併行分析を行い，その回収率及び繰返し精度を求めた．
その結果，Table 4 及び Table 5 のとおり，MG の平均回収率は 89.9~101 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 10 %以下であった．また，LMG の平均回収率は 94.6~112 %，その繰返し精度は RSD として 3.9 %以下であった．
また，内標準として添加した MG-d5 について，ピーク面積から求めた見かけ上の回収率の総平均値は，67.8 %であった．同様に，LMG-d6 については，41.8 %であった．なお，添加回収試験で得られた精製魚油における選択反応検出クロマトグラムの一例を Fig. 4 に示した．
以上の結果から，本法は，魚粉及び配合飼料の MG 及び LMG の分析法の検出下限である試料
中 2 µg/kg 相当量を魚油において同様に検出可能であると考えられた．
Table 4

Results of recovery test for MG(%)
Spikedrefined fish oil 1level(µg/kg) Recovery a) RSD b)
10093.3( 1.8)
297.4( 5.9)

refined fish oil 2

non-refined fish oil 1

non-refined fish oil 2

Recovery a) RSD b)
89.9( 3.1)
98.0
( 3.3)

Recovery a) RSD b)
91.8( 2.1)
98.1(10.0)

Recovery a) RSD b)
94.2( 2.5)
101( 4.6)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)
Table 5Results of recovery test for LMG(%)
Spikedrefined fish oil 1
level(µg/kg) Recovery a) RSD b)100
99.5( 0.5)
2107( 3.0)

refined fish oil 2

non-refined fish oil 1

non-refined fish oil 2

Recovery a) RSD b)
103( 3.9)
112( 3.1)

Recovery a) RSD b)
94.6( 1.7)
97.7( 1.6)

Recovery a) RSD b)
99.4( 1.6)
105( 1.1)a) Mean recovery (n=3)b) Relative standard deviation (RSD)

50

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

(A)

(B)

3.6

Fig. 4Chromatograms of standard solution and sample solution(A)

Standard solution (The amount of MG and LMG are each 1 pg.)

(B)

Sample solution of refined fish oil spiked MG and LMG at each 2 µg/kg

共同試験
本法の再現精度を調査するため，共通試料による共同試験を実施した．
精製魚油及び未精製魚油に MG 及び LMG としてそれぞれ 5 µg/kg 相当量を添加した共通試料を用いて，アジレント・テクノロジー株式会社アプリケーションセンター，協同飼料株式会社研究所，財団法人食品環境検査協会東京事業所，社団法人日本科学飼料協会科学飼料研究センタ
ー，財団法人日本食品分析センター彩都研究所，財団法人日本冷凍食品検査協会横浜試験センター，独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部及び同仙台センター（8 試験室）において，本法に従って共同試験を実施した．
MG の共同試験の結果は Table 6 のとおりであり，精製魚油における平均回収率は 87.4 %，その室内繰返し精度及び室間再現精度は相対標準偏差（RSDr 及び RSDR）として 6.8 %及び 13 %，HorRat は 0.60 であった．未精製魚油における平均回収率は 85.9 %，それらの室内繰返し精度及び室間再現精度は RSDr 及び RSDR として 2.5 %及び 12 %であり，HorRat は 0.56 であった．
LMG の共同試験の結果は Table 7 のとおりであり，精製魚油における平均回収率は 108 %，その 室 内 繰 返 し 精 度 及 び 室 間 再 現 精 度 は 相 対 標 準 偏 差 （ RSDr 及 び RSDR ） と し て 3.8 %及 び8.2 %，HorRat は 0.37 であった．未精製魚油における平均回収率は 101 %，それらの室内繰返し
精度及び室間再現精度は RSDr 及び RSDR として 4.2 %及び 6.2 %であり，HorRat は 0.28 であった．

51

魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

なお，参考のため，各試験室で使用した LC-MS/MS の機種等を Table 8 に示した．
Table 6

Collaborative study results of MG(µg/kg)SampleLab. No.

Refined fish oil

Non-refined fish oil

1

4.95

4.04

4.21

4.35

24.39

4.18

4.02

4.13

3

4.57

4.54

4.50

4.57

45.10

4.81

4.86

5.03

53.86

3.62

3.82

3.88

63.58

3.36

3.47

3.31

7

4.70

5.27

5.05

4.74

8

4.55

4.43

4.38

4.40

Spiked level

5.00

5.00a)

4.37

4.30

Recovery (%)
RSDr b) (%)

87.4

85.9

6.8

2.5RSDRc) (%)
PRSDR d) (%)

131222220.600.56

Mean valueHorRata) Mean value (n=16)b) Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)

Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated from themodified Horwitz equation

52

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

Table 7

Collaborative study results of LMG(µg/kg)SampleLab. No.

Refined fish oil

Non-refined fish oil

1

5.80

5.47

5.07

4.73

2

4.78

5.38

4.48

4.80

3

5.33

5.53

5.18

5.20

4

6.19

6.02

5.21

5.20

5

5.05

5.05

5.61

5.17

6

5.02

4.95

4.85

4.74

7

5.34

4.96

5.28

4.75

8

5.85

5.90

5.35

5.44

Spiked level

5.00

5.00a)

5.41

5.07

Mean valueRecovery (%)
RSDr b) (%)
RSDRc) (%)
PRSDR d) (%)
HorRat108101

3.8

4.2

8.2

6.2

22220.370.28a) Mean value (n=16)b) Relative standard deviations of repeatability within laboratoryc)

Relative standard deviations of reproducibility between laboratoriesd)Predicted relative standard deviations of reproducibility between laboratories calculated from themodified Horwitz equation

魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンの液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

Table 8Lab. No.

LC53

Instruments used in the collaborative studyLC column（i.d.×length, particle size）MS/MS

1Waters
Alliance2695

Watersmicromass Quattro Premier XE

2Agilent Technologies
1200 Series

Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS

3Waters
Alliance2695

Watersmicromass Quattro Micro

4Shimadzu
LC20AD

Applied Biosystems
API 3200Q

5Agilent Technologies
1200 Series

Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS

6

Agilent Technologies
1200 Series

Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS

7Waters
Alliance2695

Watersmicromass Quattro Micro

8

Agilent Technologies
1200 Series

Agilent Technologies
6410 Triple Quad LC/MS

4Shiseido
CAPCELL-PAK C18 UG120(2.0 mm×150 mm, 5 µm)
Agilent Technologies
ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm, 5 µm)
Agilent Technologies
ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm, 5 µm)
GL Sciences
Inertsil ODS-3(2.1 mm×150 mm, 5 µm)
Chemicals Evaluation and ResearchInstitute
L-Column2 ODS(2.0 mm×150 mm, 3 µm)
GL Sciences
Inertsil ODS-3(2.1 mm×150 mm, 3 µm)
Agilent Technologies
ZORBAX Plus-C18(2.1 mm×150 mm, 3.5 µm)
Agilent Technologies
ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm, 5 µm)

まとめ魚油中のマラカイトグリーン及びロイコマラカイトグリーンについて，分析センター法を基に，液体クロマトグラフタンデム型質量分析計を用いた定量法の飼料分析基準への適用の可否について検討し，次の結果を得た．
1)

MG 及び LMG の検量線は 0.5~100 pg の範囲で直線性を示した．

2)

精製魚油 4 点及び未精製魚油 6 点を用い，本法に従って選択反応検出クロマトグラムを作成したところ，MG 及び LMG の定量を妨害するピークは認められなかった．

3)

ミニカラム処理による MG，LMG，MG-d5 及び LMG-d6 の溶出画分を確認したところ，溶出液量は 10 mL で十分であった．

4)

精製魚油 2 種類及び未精製魚油 2 種類に MG 及び LMG として，それぞれ 2 及び 100 µg/kg 相当量ずつを添加し，添加回収試験を実施したところ，MG の平均回収率は 89.9~101 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSD）として 10 %以下，LMG の平均回収率は 94.6~112 %，その繰返し精度は RSD として 3.9 %以下の成績が得られた．

5)

本法は試料中の MG 及び LMG を 2 µg/kg で検出可能であった．
なお，本法は，平成 21 年 5 月 1 日付けで飼料分析基準に収載された．
謝

辞

共同試験に参加して頂いたアジレント・テクノロジー株式会社アプリケーションセンター，協同54

飼料研究報告 Vol. 34 (2009)

飼料株式会社研究所，財団法人食品環境検査協会東京事業所，社団法人日本科学飼料協会科学飼料研究センター，財団法人日本食品分析センター彩都研究所，財団法人日本冷凍食品検査協会横浜試
験センターの試験室の各位に感謝の意を表します．
文1)

献

食品安全委員会：“食品健康影響評価の結果の通知について”，平成 17 年 11 月 24 日，府食第 1140 号 (2005).

2)

農林水産省消費・安全局長通知：“飼料分析基準の制定について”，平成 20 年 4 月 1 日，19
消安第 14729 号 (2008).

3)

財団法人日本食品分析センター：平成 19 年度飼料に含まれるマラカイトグリーン及びロイコ
マラカイトグリーンの畜産物への残留に関する調査委託事業（分析法の開発） (2008).