プロテアソーム機能代償機構を標的とした新規がん治療戦略の開発
岐阜薬科大学 薬学部
生命薬学大講座 生化学研究室
准教授 遠藤 智史
2023年10月24日

ユビキチン/プロテアソーム系
がん細胞◆ 過剰な細胞増殖◆ 細胞死の抑制◆ 栄養飢餓・低酸素

Ub
Ub

Ub

オートファジー/リソソーム系とならびタンパク質の恒常性維持に重要

Ub
Ub

Ub

Ub Ub

異常タンパク質の分解

異常タンパク質

ユビキチン化タンパク質

プロテアソーム

細胞周期、DNA修復、細胞死制御、シグナル伝達、遺伝子発現、抗原提示、恒常性維持など多くの現象に関与する。

プロテアソーム阻害剤【特徴】• プロテアソームのプロテアーゼ活性を阻害し、小胞体ストレス誘導や細胞周期停止によって抗腫瘍効果を発揮する。
• 固形がんでの臨床応用は進んでいない。
• 血液がんの治療において、耐性症例および不応例が顕在化しており、米国で行われた第II/III相試験 (SUM-MIT試験, VISTA試験など) において、無増悪生存期間は概ね半年から10ヶ月ほどであった。[Jagannath et al., Br J Haematol. 2004;127:165-72.]→このことは多くの症例が1年以内に耐性を獲得することを意味する。
一般名

商品名

適用

販売年

メーカー

売上

Bortezomib
(BTZ)

ベルケイド

多発性骨髄腫
マントル細胞リンパ腫
原発性マクログロブリン血症及びリンパ形質細胞リンパ腫

2006

ヤンセン/武田薬品

約500億円(2020年)

Carfilzomib

カイプロリス

再発又は難治性の多発性骨髄腫

2016

アムジェン/小野薬品

約300億円(2020年)

Ixazomib

ニンラーロ

再発又は難治性の多発性骨髄腫

2017

武田薬品

約900億円(2020年)

従来技術とその問題点【プロテアソーム阻害剤の課題】
1. 固形がんへの適用拡大
2. 耐性化の抑制

プロテアソーム構成因子の代償的合成促進（Bounce back）の関与[Induction of proteasome subunits by bortezomib (BTZ)][Sha and Goldberg, Curr Biol, 2014]

“Bounce back”の機序①正常時
Nrf1

ER lumen①

cytosolp97

Degradation

Nrf1
Proteasome

Nrf1はプロテアソームで分解される
DDI2: DNA Damage Inducible 1 Homolog 2[Mitsiades et al., PNAS, 2002, Meiners et al., J Biol Chem, 2003など]

プロテアソーム阻害剤②プロテアソーム
活性低下時

①正常時
Nrf1

ER lumen①

cytosol

②

DDI2

p97

Degradation

プロテアソーム阻害剤
Nrf1

Proteasome
genes (PSMs)

Proteasome

Nrf1はプロテアソームで分解される
DDI2: DNA Damage Inducible 1 Homolog 2

Nrf1“Bounce back”
nucleus

プロテアソーム機能が亢進！！

[Mitsiades et al., PNAS, 2002, Meiners et al., J Biol Chem, 2003など]

唯一のDDI2阻害剤nelfinavir【Nelfinavir (NFV)】• ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の治療薬。

• 日本では1998-2017年に製造販売されていたが、現在では、HIV治療ガイドラインにおいて、積極的に変更を考慮すべき旧来の薬剤に位置付けられたことから、販売は中止されている。
• NFVとプロテアソーム阻害剤の併用の有効性が、多発性骨髄腫や、腎細胞がんにおいて細胞レベルで評価されてきた。
[Kraus et al., Blood Cancer, 2013, Kawabata et al., Cell Death Dis, 2012, Besse et al., BJU Int, 2018]• DDI2阻害活性を有する。 [Gu et al., Cell Signal, 2020]

目的①

難治性固形がんの治療向上を目指し、プロテアソーム阻害剤とDDI2阻害剤併用の有効性を検証する膀胱がん◼ 米国で５番目に患者数の多いがん。
◼ 日本でも患者数が増加。

①白金製剤療法(Gemcitabine/Cisplatin (GC))②免疫チェックポイント阻害薬療法(ペンブロリズマブ)

20000

人口10万人対化学療法は未だ選択肢が少ない

25000

罹患者数
15000
10000

5000

死亡者数

01975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 2015 2020
国立がん研究センターがん情報サービス「がん統計」（厚生労働省人口動態統計）

耐性化した場合の予後は極めて不良

新規治療法の開発が求められている

GC耐性膀胱がん (T24GC) 細胞 の樹立【耐性株の樹立】【GC感受性】
100

継代 (1:3~1:4)

Viable cells (%)

GC処理濃度

120

T24GC

**

80

T24GC
T24**

**

**

60
40
20T240

処理010500

Bax / Bcl2 (%)

Bcl2β-Actin
GC (μM)

NS100

5000T24505T24GC

400300NS200
1000GC (μM) 0T24505T24GCGC (μM) 050** p < 0.01 vs T24**
Cleaved / total PARP (%)

150

Cleaved PARP

40****
Bax / Bcl-XL (%)

BaxPARP

30GC (μM)

【アポトーシスシグナルへの影響】

Bcl-XL20

5T2405T24GC

400
300
NS200
1000GC (μM) 0T24505T24GC** p < 0.01, NS p > 0.05

プロテアソーム阻害剤に対する交叉耐性

120

120

100100**80****

60

**

40
T24GC

20

Viable cells (%)

Viable cells (%)

【プロテアソーム阻害剤感受性】

80*60
40T24GC

20T240T2400500

BTZ (nM)

10000500

Ixazomib (nM)1000** p < 0.01, * p < 0.05 vs T24• T24GC細胞ではT24細胞と比べて、プロテアソーム阻害剤BTZとIxazomibに対する感受性が低下していた。

⇛GC耐性化に伴い、プロテアソーム阻害剤に対する交叉耐性を獲得していることが示唆された。

T24GC細胞におけるNFVのBTZ感受性亢進
【アポトーシスシグナルへの影響】
Cleaved PARP
Bcl-2
Baxβ-Actin-+-+++-+-

T24+++20**

15105*50-++--++-

0100 nM BTZ -++--++-

5 μM NFV--++--++

5 μM NFV --++--++

T24

T24GC

T24

T24GC

** p < 0.01, * p < 0.05 vs Control, # p < 0.05, NS p > 0.05 vs BTZ alone

T24
T24GC

100Viable cells (%)

1000100 nM BTZ

T24GC

120NS NS****60****【BTZ感受性】

80150#Bax / Bcl2 (%)

Cleaved / Total PARP(fold)

Total PARP

100 nM BTZ
5 μM NFVNS#• T24GC細胞で低下したBTZ感受性は、NFVの併用によって有意に回復した。

##⇛BTZ/NFV併用がGC耐性膀胱がんの治療に有効であることが示唆された。

40
200100 nM BTZ-++-

5 μM NFV--++** p < 0.01, NS p > 0.05 vs Control, ## p < 0.01, # p < 0.05 vs BTZ alone

T24GC細胞におけるプロテアソーム活性の亢進【プロテアソーム活性】【ユビキチン化タンパク質発現量26S proteasome
activity (%)

600

Ubiquitinatedproteins

T24
T24GC

500**

400300200****

1000Chymo Caspase Tryptic
tryptic-like** p < 0.01, NS p > 0.05 vs T24

Nrf1• Nrf1の切断型の量はNFVによって減少した。
• BTZによって増加したユビキチン化タンパク質量はNFV併用によって低下した。
• T24GC細胞ではT24細胞と比べて、プロテアソーム活性が上昇した。

切断型

DDI2
β-Actin
100 nM BTZ-++--++-

5 μM NFV--++--++

T24

T24GC

⇛BTZ/NFV併用によってプロテアソーム活性の増強 (Bounce back) が誘導された可能性が考えられた。

BTZ/NFV併用によるBounce backの亢進

【BTZ/NFV併用時のプロテアソーム関連因子の発現変化】

§400

##

**
**

300
200****100
§700

##

T24
T24GC

600
500

****

400300#§**200100

##

T24
T24GC

500400§#300******

200
10001000§
T24
T24GC ##

800
600

**
**400

§

**

200

PSMB2 / β-Actin (%)

500600§

PSMB5 / β-Actin (%)

6000

PSMB3 / β-Actin (%)

##

T24
T24GC

PSMB4 / β-Actin (%)

Nrf1 / β-Actin (%)

700§

PSMB1 / β-Actin (%)

§700

T24
T24GC

600

##500****400300§**

2001000§

600

T24T24GC500##400§

**
**300

**

2001000100 nM BTZ-++-0100 nM BTZ-++-0100 nM BTZ-++-

5 μM NFV--++

5 μM NFV--++

5 μM NFV--++** p < 0.01 vs Control # p < 0.05 , ## p < 0.01 vs 100 nM BTZ § p < 0.05 vs T24• T24 細 胞 、 T24GC 細胞ともにプロテアソーム構成因子 (PSMB1-5)とNrf1の発現はBTZ処理によって亢進した。
• NFV の併用に よ って 、T24GC細胞ではさらにPSMB1-5 と Nrf1 の 発現が誘導された。

⇛T24GC細胞においてNFV が BTZ に よ る
Bounce backを増強することが示唆された。

BTZ/NFV併用によるNrf1核内移行への影響【Nrf1核内移行】
T24 cells
DMSO

BTZ

BTZ/NFV

T24GC cells
DMSO

NFV

DAPI

DAPI

Nrf1

Nrf1

MergedMergedBTZ

BTZ/NFVNFVScale bar : 20 μm• T24細胞において、BTZによって見られたNrf1の核内移行はNFV併用によって増強された。
• T24GC細胞では、T24細胞と比べて明らかにBTZ単独、BTZ/NFV併用時のNrf1の蛍光強度が高かった。

⇛BTZ/NFV併用時にT24GC細胞で見られた高いBounce back誘導は核内Nrf1量の増大に伴って起きると考えられた。

小括①1

GC耐性膀胱がん細胞の治療におけるプロテアソーム阻害剤とDDI2阻害剤NFVの併用の有効性が示唆された。

2

DDI2阻害剤NFVはプロテアソーム阻害剤によるBounce backを亢進させた。

プロテアソーム阻害剤/DDI2阻害剤の併用療法の有効性が示唆された
ただし、Bounce backを誘導しない新規DDI2阻害剤の開発が必要

新規DDI2阻害剤のスクリーニング【Thermal shift assay】
trans-Stilbene
10.50⊿Tm (˚C)

Resveratrol

cis-Stilbene
Stilbestrol(4,4’-Dihydroxystilbene)-0.5-1-1.5-217β-Estradiol-2.5

Androsterone

Mifepristone

Dienestrol

Testosterone

Hexestrol(HEX)

Diethylstilbestrol

Piceatannol

Genistein

DaidzeinDDI2-hexestrol (HEX) ドッキングモデル
(A)

(B)

Pro285HEXHEX

Ile227
Met286

Gln224 2.8 Å

Gly222

Ala223

Asp220(C)

Nelfinavir(NFV)

Ala223

Ala223(D)

Phe218
Asp220

Met203Gln284

NFV
Ile227
Leu289Phe218
Met203

Phe218
Asp220

Leu289HEX

HEXと構造/機能類縁体によるDDI2阻害活性評価【候補化合物によるDDI2阻害活性評価】

120

Ubiquitinatedproteins

未切断型Nrf1
Nrf1
DDI2β-Actin

Cleavage rate of Nrf1 (%)

NSNS

100** **

80

10060****

15258060
40200
HEX (μM)**

05100 nM BTZ

40200Daidzein

Genistein

100 nM BTZ

Dienestrol

17β-Estradiol

Diethylstibestrol

Stilbestrol

Resveratrol

HEX

NFV

DMSODaidzein

Genistein

Dienestrol

17β-Estradiol

Diethylstibestrol

Stilbestrol

Resveratrol

HEX

NFV

DMSO

DMSO

100 nM BTZCleavage
rate of Nrf1 (%)

120• HEX と 構 造 類 縁 体dienestrolは、有意なDDI2阻害活性を示した。
• HEXは用量依 存的にDDI2を阻害した。

⇛ HEX が 新 規 DDI2 阻害剤になることが明らかとなった。

T24GC細胞におけるBounce backに及ぼすHEXの影響

##300

**

200

NSNS

100600
##500
400
300

**

200

##

100

NS

PSMB2 / β-Actin (%)

Nrf1 / β-Actin (%)

400

PSMB1 / β-Actin (%)

【Nrf1とプロテアソーム構成因子のmRNA発現変動】
400

##300

**
200

##NS100+--

0100 nM BTZ-++--

0100 nM BTZ-++--

5 μM NFV--+-+

5 μM NFV--+-+

5 μM NFV--+-+

25 μM HEX---++

25 μM HEX---++

25 μM HEX

---++

400

##

300

**
200

##

NS

100

400
##

300
200

**

##

100

NS

PSMB5 / β-Actin (%)+

PSMB4 / β-Actin (%)-PSMB3 / β-Actin (%)

0100 nM BTZ⇛HEXがNFVの欠点を改善した、新規DDI2阻害剤になることが明らかとなった。

500
##

400
300

**

200

• HEX は BTZ 誘 導 性bounce back を 有意に抑制した。

##NS

1000100 nM BTZ-++--

0
100 nM BTZ-++--

0100 nM BTZ-++--

5 μM NFV--+-+

5 μM NFV--+-+

5 μM NFV--+-+

25 μM HEX---++

25 μM HEX---++

25 μM HEX---++

T24GC細胞におけるHEXによる抗がん活性増強効果【アポトーシスシグナルへの影響】【CompSynプログラムによる相乗性判定】
Fa-CI plot

Bax

150

50100β-Actin
100 nM BTZ-++-

25 μM HEX--++Cleaved / Total PARP(fold)

Cleaved caspase-8

CI1201

相加効果 (CI=1)
相乗効果 (CI<1)

5 μM NFV

Caspase-8阻害効果 (CI>1)

1000100 nM BTZ

Total PARP
Cleaved PARP

2*-+-+++80

60400 μM HEX
25 μM HEX
50 μM HEX

**

1Fa

2.0

1.5

100 200 300 400 500

BTZ (nM)

200.5HEX(μM)
2550

60

04008020

##0CI

Bcl-2

CompuSynソフトウェアを用いた併用係数 (CI) の算出

NSViable cells (%)

Bax / Bcl-2 (%)

200

1000.460.51

Fa; fraction affected(≒ Viability)

BTZ (nM)
2005000.43
0.510.400.41
25 μM HEX
50 μM HEX

1.00.50.00.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00
100 nM BTZ-++-

5 μM NFV--++Fa• HEXはBTZとの併用で有意にアポトーシスを誘導した。
• HEXによるBTZとの併用効果が相乗的であることが明らかとなった。

⇛HEXがプロテアソーム阻害剤の有効性を高める新規アジュバント薬になることが期待される。

小括②1

スクリーニングから、Bounce backを抑制できるDDI2阻害剤
hexestrol (HEX) を見出した。

2

HEXはプロテアソーム阻害剤の抗がん活性を有意に増強した。

プロテアソーム阻害薬の抗がん活性を増強する
新規アジュバント薬の開発に成功

まとめ

ER lumen

DDI2p97
プロテアソーム阻害剤
cytosol

Nrf1

DDI2阻害剤
HEX
Proteasomegenes (PSMs)

nucleus“Bounce back”

難治性固型がんのモデルとして樹立したGC耐性膀胱がん(T24GC) 細胞を用いて、プロテアソーム阻害剤と新規DDI2阻害剤HEXの併用の有効性を実証した。
今後、さらに強力かつ特異的なDDI2阻害剤の開発研究を進め、臨床応用を目指したい。

新技術の特徴・従来技術との比較

DDI2 inhibitors

NFV (既存技術)

HEX (新技術)

その他の薬理作用HIVプロテアーゼ阻害薬

エストロゲン受容体作動薬

DDI2阻害○○BTZ抗がん活性の増強○○Bounce back

増強抑制

想定される用途• 研究試薬としてのDDI2阻害剤• 既存薬との併用によって、作用増強効果を示す
がんアジュバンド薬• 既存薬に対して抵抗性を獲得したがん細胞に対する抗がん剤耐性克服薬

今後の展望

HEX
計算

構造解析

• in silicoスクリーニング• ドッキング解析• X線結晶構造解析• クライオ電顕生物
活性評
価 • 酵素活性評価、in vitro試験• in vivo試験

有機合成• リードからの誘導体の合成• 天然化合物の合成

ドッキング解析で得られたファーマコフォアに基づく誘導体の設計・合成・評価
より高活性なDDI2阻害剤の創製

企業への期待• HEXは、Bounce backを阻害できる唯一のDDI2阻害剤であるが、その構造最適化が課題である。
• 活性の向上、物性や体内動態の改善、を加味した構造最適化に向けたノウハウの提供や有機合成の支援をいただける企業との共同研究を希望。

• NFVがDDI2阻害剤として同定されたのは2020年である。プロテアソーム阻害剤の有効性の拡大に向けた
DDI2阻害戦略の確立はまだ発展途上であり、一緒に研究を推進していただける企業との共同研究を希望。

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：アスパラギン酸プロテアーゼDDI2阻害剤
およびその利用• 出願番号：特願2023-027556• 出願人：岐阜市
• 発明者
：遠藤智史

お問い合わせ先岐阜薬科大学◎生命薬学大講座 生化学研究室
遠藤 智史
TEL
058-230-8100 (内線3669)
FAX
058-230-8105
e-mailsendo＠gifu-pu.ac.jp◎事務局 庶務会計課
中尾 真一郎TEL
058-230-8100
FAX
058-230-8200
e-mailsyomuk＠gifu-pu.ac.jp