稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬 6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発

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1 稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬
6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発
船木 紀夫 *，小堀 拓也 *，関口 好浩 *Development of Simultaneous Determination Method of Bensulfuron-Methyl andOther 6 Pesticide Ingredients in Rice Straw and Whole-Crop Rice Silage by LC-MS/MS
FUNAKI Norio *, KOBORI Takuya * and SEKIGUCHI Yoshihiro *( * Nagoya Regional Center, Food and Agricultural Materials Inspection Center)
We have developed a simultaneous quantitative determination method of the concentration ofazimsulfuron, bensulfuron-methyl, cyclosulfamuron, ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuronmethyl and imazosulfuron in rice straw and whole-crop rice silage (WCRS) using a liquidchromatograph electrospray-ionization tandem mass spectrometer (LC-ESI-MS/MS).
Having added water to a sample, azimsulfuron, bensulfuron-methyl, cyclosulfamuron,ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron were extracted withacetone, and the extracted solution was filtered. The filtrate was then diluted with acetone. The
diluted solution was purified with two types of solid phase extraction columns (InertSep K-solute,
GL Sciences Inc.; Tokyo, Japan and ENVI-Carb, Sigma-Aldrich Co. LLC.; St. Louis, MO, USA),and injected into an LC-MS/MS to determine the concentration of seven pesticides. LC separation
was then carried out on an ODS column (Mightysil RP-18, 2.1 mm i.d. × 150 mm, 5 µm, Kanto
Chemical Co.,Inc.; Tokyo, Japan) with a gradient of 2 mmol/L ammonium acetate solution andmethanol as a mobile phase. In the MS/MS analysis, the positive mode electrospray ionization(ESI+) was used.
Recovery tests were conducted on rice straw and WCRS. Seven pesticide ingredients were addedat the levels of 0.04 and 0.5 mg/kg for rice straw and 0.02 and 0.2 mg/kg for WCRS respectively.
The resulting mean recoveries ranged as following: 84.1 % to 96.0 % for azimsulfuron; 91.7 % to120 % for bensulfuron-methyl; 89.7 % to 118 % for cyclosulfamuron; 70.7 % to 90.0 % forethoxysulfuron; 72.6 % to 85.7 % for flucetosulfuron; 71.4 % to 82.8 % for halosulfuron-methyl;
and 75.2 % to 82.5 % for imazosulfuron. The repeatability in the form of the relative standard
deviation (RSDr) was as following: less than 8.4 % for azimsulfuron; less than 3.2 % forbensulfuron-methyl; less than 3.4 % for cyclosulfamuron; less than 4.7 % for ethoxysulfuron; lessthan 6.4 % for flucetosulfuron; less than 8.9 % for halosulfuron-methyl; and less than 15 % forimazosulfuron.
Key words: azimsulfuron; bensulfuron-methyl; cyclosulfarmuron; ethoxysulfuron; flucetosulfuron;
hlosulfuron-methyl; imazosulfuron; liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LCMS/MS); electrospray ionization (ESI); rice straw; whole-crop rice silage
キーワード：アジムスルフロン；ベンスルフロンメチル；シクロスルファムロン；エトキ
シスルフロン；フルセトスルフロン；ハロスルフロンメチル；イマゾスルフロン；液体クロマトグラフタンデム型質量分析計；エレクトロスプレーイオン化法；稲わら；
稲発酵粗飼料*

独立行政法人農林水産消費安全技術センター名古屋センター

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飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

1

緒

言

ベンスルフロンメチルは DuPont de Nemours（米国）により開発されたスルホニルウレア系除草剤であり，ノビエを除く主要な水田雑草に卓効を示す 1) ．我が国では 1987 年に農薬登録されており，飼料の有害物質の管理基準値 2) として，稲わらで 0.1 mg/kg，稲発酵粗飼料（以下「WCRS」という．）で 0.05 mg/kg と設定されているが，その分析法は飼料分析基準 3) に収載されていない．
令和 3 年度に武田ら 4)は，一般財団法人日本食品分析センターが平成 25 年度飼料中の有害物質
等分析法開発委託事業において開発した液体クロマトグラフタンデム型質量分析計（以下「LCMS/MS」という．）を用いたアジムスルフロン，ベンスルフロンメチル，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン及びイマゾスルフロンの同時定量法 5) （以下「JFRL 法」という．）を基に，飼料用稲（稲わら，WCRS 及び籾米）中のベンスルフロンメチルを対象として飼料分析基準への収載の可否を検討し，稲わら，WCRS 及び籾米のいずれにも適用可能な定量法（以下「LC-MS/MS 法」という．）であることを報告した．
その際，ベンスルフロンメチルと同じスルホニアウレア系除草剤であるアジムスルフロン，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン，フルセトスルフロン及びイマゾスルフロンについても，
JFRL 法を適用できる可能性を考慮し，同時定量法としての適用を併行して検討した．なお，フルセトスルフロンについては，平成 27 年に一般財団法人日本食品分析センターにより JFRL 法への適用の妥当性が確認されている 6)．さらに，管理基準値として稲わらで 0.2 mg/kg，WCRS で 0.8 mg/kgと設定されており，平成 21 年に JFRL 法とは異なる方法 7)が開発されているハロスルフロンメチル
についても，上述の農薬と同じスルホニルウレア系除草剤であることから，同時定量法としての適用を検討した．
その結果，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン及びフルセトスルフロンについては，ベンスルフロンメチルとの同時定量法として適用可能であることが確認された．アジムスルフロン，
ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンについては，稲わら及び WCRS においてマトリック
ス効果によるイオン化抑制のため，回収率が飼料分析基準別表 3 の試験法の妥当性確認法ガイド
ライン（以下「妥当性確認法ガイドライン」という．）に定められた真度の目標値を満たさなかった．
そこで今回，アジムスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンを追加するため，
稲わら及び WCRS を用いて，LC-MS/MS 法の改良を検討するとともに，7 成分同時定量法の飼料分
析基準への収載の可否を検討したので，その概要を報告する．
参考に各農薬の構造式等を Fig. 1 に示した．

稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬 6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発

Azimsulfuron

Bensulfuron-methyl

CH3
N

N
N

N
N

OCH3
N

SO2NHCONH

N

N

CH3

OCH3

1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-[1-methyl-4-(2-methyl-

Methyl α-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-

2H-tetrazol-5-yl)pyrazol-5-ylsulfonyl]urea

ylcarbamoylsulfamoyl)-o-toluate

C13H16N10O5S

MW: 424.40

CAS No.: 120162-55-2

C16H18N4O7S

CyclosulfamuronOC

CAS No.: 83055-99-6

Ethoxysulfuron

N
NH SO2NHCONH

MW: 410.40

OCH2CH3

OCH3

NO SO2NHCONH

N

OCH3

N
OCH3

OCH3
1-[2-(cyclopropylcarbonyl)phenylsulfamoyl]-3-(4,6-

1-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)-3-(2-dimethoxypyrimidin-2-yl)urea

ethoxyphenoxysulfonyl)urea

C17H19N5O6S

MW: 421.43

CAS No.: 136849-15-5

C15H18N4O7S

Flucetosulfuron

MW: 398.39

CAS No.: 126801-58-9

Halosulfuron-methyl

CO2CH3Cl
N

N

N

SO2NHCONH

OCH3

N
OCH3

CH3
1-{3-[(4,6-dimethoxypyrimidin-2-ylcarbamoyl)sulfamoyl]-

methyl 3-chloro-5-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-2-pyridyl}-2-fluoropropyl methoxyacetate

ylcarbamoylsulfamoyl)-1-methylpyrazole-4-carboxylate

C18H22FN5O8S

MW: 487.46

CAS No.: 412928-75-7

C13H15ClN6O7S

MW: 434.81

CAS No.: 100784-20-1

Imazosulfuron
Cl
N

N
N

SO2NHCONH

OCH3

N
OCH3

1-(2-chloroimidazo[1,2-a]pyridin-3-ylsulfonyl)-3-(4,6dimethoxypyrimidin-2-yl)urea
C14H13ClN6O5S

Fig. 1

MW: 412.81

CAS No.: 122548-33-8

Chemical structures of azimsulfuron, bensulfuron-methyl, cyclosulfamuron,ethoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron

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飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

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2.1

試

実験方法

料

稲わらはそれぞれ目開き 1 mm のスクリーンを装着した粉砕機で粉砕し，分析用試料とした．
稲発酵粗飼料は 60 °C で 10 時間乾燥後，更に室内に静置して風乾した後，同様に粉砕し，分析用試料とした．
2.2
1)

試

薬

アセトニトリル，アセトン，酢酸エチル，ヘキサン及びトルエンは残留農薬・PCB 試験用を用いた．メタノールは LC-MS 用（富士フイルム和光純薬製）を用いた．塩酸及びギ酸（質量分率 98 %）は試薬特級を用いた．酢酸アンモニウムは高速液体クロマトグラフ用（1 %溶液，
富士フイルム和光純薬製）を用いた．水は Milli-Q Advantage（Merck Millipore 製）により精製した超純水（JIS K0211 の 5218 に定義された超純水）を用いた．

2)

農薬標準品
アジムスルフロン，ベンスルフロンメチル，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン，
フルセトスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンの各標準品は，Table 1 に示した供給業者，純度のものを用いた．
Table 1

3)

Pesticide standards used in this study

Compound

Manufacturer

Purity(%)

Azimsulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

99.9

Bensulfuron-methyl

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

100

Cyclosulfamuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

99.3

Ethoxysulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

99.7

Flucetosulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

99.6

Halosulfuron-methyl

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

99.9

Imazosulfuron

FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

100

農薬標準原液農薬標準品各 25 mg を量ってそれぞれ 50 mL の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線までアセトンを加えて各農薬標準原液を調製した（これらの液各 1 mL は，各農薬として 0.5 mg を含有）．

4)

農薬混合標準液
7 成分の農薬標準原液各 1 mL を 25 mL の全量フラスコに正確に入れて混合し，更に標線までアセトンを加えて農薬混合標準原液を調製した（この液 1 mL は，各農薬として 20 µg を含有）．
使用に際して，農薬混合標準原液の一部を，アセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈し，1 mL 中に各農薬として 0.5，1，2，4，6，8，10，20，40，60，80 及び 100 ng を含有する農薬
混合標準液を調製した．

2.3

装置及び器具1)

粉砕機：SM 100

Retsch 製（目開き 1 mm スクリーン，回転数（仕様）1430 rpm）

2)

振り混ぜ機：レシプロシェーカーSR-2W タイテック製（使用時振動数 300 rpm）

稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬 6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発

53)

多孔性ケイソウ土カラム：InertSep K-solute（5 mL 保持用）

4)

グラファイトカーボンミニカラム（以下「ミニカラム」という．）：ENVI-Carb（500 mg）

ジーエルサイエンス製

Sigma-Aldrich 製
5)メンブランフィルター：DISMIC-25HP（孔径 0.20 µm，直径 25 mm，親水性 PTFE）

東洋濾

紙製
6)

LC-MS/MS：LC 部：ACQUITY UPLC System Waters 製
MS/MS 部：ACQUITY TQ Detector Waters 製

2.4
1)

定量方法
抽

出

分析試料 10 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ，水 30 mL を加え，30 分間静置
後，更にアセトン 120 mL を加え，30 分間振り混ぜて抽出した．200 mL の全量フラスコをブフ
ナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（5 種 B）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン 50 mL で洗浄し，同様に吸引ろ過した．更に全量フラスコの標線までアセトンを加えた．この液 10 mL を 50 mL のなす形フラスコに正確に入れ，40 °C 以下の水浴で約 2 mLまで減圧濃縮し，カラム処理 I に供する試料溶液とした．
2)

カラム処理 I
試料溶液に 0.1 mol/L 塩酸 2.5 mL を加え軽く振り混ぜた後，多孔性ケイソウ土カラム（5 mL保持用）に入れ，10 分間静置した．
100 mL のなす形フラスコをカラムの下に置き，試料溶液の入っていたなす形フラスコをヘキサン－酢酸エチル（3+1）5 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液を順次カラムに加え，液面が充てん剤の上端に達するまで流下した後，更にヘキサン－酢酸エチル（3+1）40 mL をカラムに加え，同様に溶出させた．
溶出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．アセトニトリル－水－ギ酸（50+50+1）10 mL を加えて残留物を溶かし，カラム処理 IIに供する試料溶液とした．

3)

カラム処理 II
ミニカラムをアセトニトリル 5 mL 及び 1 v/v%ギ酸溶液 5 mL で順次洗浄した．試料溶液をミニカラムに入れ，液面が充てん剤の上端に達するまで流下（必要に応じて流速が 1 mL/min
程度になるよう吸引した．以下同様．）した．試料溶液の入っていたなす形フラスコをアセト
ニトリル－ギ酸（99+1）5 mL ずつで 2 回洗浄し，洗液をミニカラムに加え，同様に流出させた．
100 mL の な す 形 フ ラ ス コ を ミ ニ カ ラ ム の 下 に 置 き ， ア セ ト ニ ト リ ル － ト ル エ ン － ギ 酸（75+25+1）30 mL をミニカラムに加えて各農薬を溶出させた．
流出液を 40 °C 以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後，窒素ガスを送って乾固した．アセトニトリル－水（1+1）5 mL を正確に加えて残留物を溶かし，メンブランフィルタ
ーでろ過し，LC-MS/MS による測定に供する試料溶液とした．また，必要に応じて試料溶液の一部をアセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈し，同様に LC-MS/MS による測定に供した．

6

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

4)

LC-MS/MS による測定
試料溶液及び各農薬混合標準液各 4 µL を LC-MS/MS に注入し，選択反応検出（以下「SRM」という．）クロマトグラムを得た．測定条件を Table 2 及び 3 に示した．

ColumnMobile phase
Flow rate
Column temperature
Detecter
Ionization
Ion source temperature
Desolvation gas
Capillary voltage
Cone gas
Collision gas

Target5)

計

Table 2
Operation conditions of LC-MS/MS
Mightysil RP-18 GP (2.0 mm i.d. × 150 mm, 5 μm), Kanto Chemical
2 mmol/L ammonium acetate- methanol (9:1) →5 min → (1:1) (hold for 15 min)→ (1:9) (hold for 15 min) →5 min → (9:1)
0.2 mL/min
40 °C
Quadrupole mass spectrometer
Electrospray ionization (ESI) (Positive ion mode)
120 °CN2 (600 L/h, 400 °C)
1.0 kVN2 (50 L/h)
Ar (0.25 mL/min)
Table 3

MS/MS parameters

Precursor

Product ion

Cone

Collisionion

Quantifier

Qualifiervoltageenergy(m /z )

(m /z )

(m /z )

(V)

(eV)

182

－

25

15

－

156

25

36

149

－

28

21

－

91

28

58

261

－

25

16

－

218

25

27

261

－

27

14

－

218

27

24

156

-

32

17

－

273

32

23

182

－

27

20

－

83

27

52

153

－

22

10

－

258

22

23

Azimsulfuron

425

Bensulfuron-methyl

411

Cyclosulfamuron

422

Ethoxysulfuron

399

Flucetosulfuron

488

Halosulfuron-methyl

435

Imazosulfuron

413

算得られた SRM クロマトグラムからピーク面積を求めて検量線を作成し，試料中のベンスル
フロンメチル等の量を算出した．
なお，定量法の概要を Scheme 1 に示した．

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Sample 10.0 g (300 mL Erlenmeyer flask)
added 30 mL of water and allowed to stand for 30 min
added 120 mL of acetone and shook for 30 min
filtered through filter paper (No. 5B of JIS P3801) under reduced pressure
washed with 50 mL of acetone
filled up to 200 mL with acetone
transferred 10 mL of sample solution to 50 mL evaporator flask
evaporated to the volume of 2 mL under 40 °C
added 2.5 mL of 0.1 mol/L hydrochloric acid
InertSep K-solute (applicable sample volume 5mL)

placed a receiver (100 mL evaporator flask)
applied sample solution and allowed to stand for 10 min
washed the 50 mL evaporator flask with 5 mL of hexane-ethyl acetate (3:1) and eluted (twice)eluted with 40 mL of hexane-ethyl acetate (3:1)
evaporated under 40 °C and dried with nitrogen gas
added 10 mL of acetonitrile-water-formic acid (50:50:1)
ENVI-carb（500 mg）

washed with 5 mL of acetonitrile and 5 mL of 1 v/v% formic acid solution
applied sample solution
washed the evaporator flask with 5 mL of acetonitrile-formic acid (99:1) and eluted(twice)placed a receiver (100 mL evaporator flask)
eluted with 30 mL of acetonitrile-toluene-formic acid (75:25:1)
evaporated under 40 °C and dried with nitrogen gas
added 5 mL of acetonitrile-water (1:1)
filtered through a membrane filter (0.2 µm)(five-fold dilution with acetonitrile-water (1:1) )LC-MS/MS

Scheme 1

Analytical procedure for azimsurufuron, bensulfuron-methyl, cyclosurufamuron,etoxysulfuron, flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and imazosulfuron
in rice straw and whole-crop rice silage (WCRS)

2.5

添加回収試験
2.2 の 4)の農薬混合標準原液をアセトンで正確に希釈し添加に用いた．
各農薬として，稲わらに 0.04 及び 0.5 mg/kg 相当量（最終試料溶液中で 4 及び 50 ng/mL），

WCRS に原物換算して 0.02 及び 0.2 mg/kg 相当量（同 4 及び 50 ng/mL）になるようにそれぞれ添加してよく混合し，一夜静置した後に 2.4 に従って定量し，平均回収率及び繰返し精度を求めた．
同時に，この試料溶液をアセトニトリル－水（1+1）で 4 倍又は 5 倍に希釈したものも定量した．
なお WCRS について，添加は風乾物試料に対して各農薬として 0.04 及び 0.5 mg/kg 相当量になるよう行い，原物中濃度への換算は，原物中及び風乾物中の水分含有量を 60 %及び 10 %と想定
して，原物（水分含有量 60 %）中濃度＝風乾物（水分含有量 10 %）中濃度／2.25 の式により行った．

8

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

3
3.1

結果及び考察マトリックス効果の確認
令和 3 年度の検討において，最終試料溶液を希釈することによりマトリックス効果を低減できる可能性が認められた．そこで，2.4 の 1)から 3)により調製した稲わら及び WCRS のブランク試料溶液に各農薬として 0.1 mg/kg 相当量（希釈しない最終試料溶液中で 10 ng/mL 相当量）を添加した各マトリックス標準液並びに同マトリックス標準液をアセトニトリル－水（1+1）で 4 倍及び 5 倍に希釈した液それぞれについて，2.2 の 4)に従って調製した同濃度の農薬混合標準液に対するピーク面積比を確認した．その結果は Table 4 のとおりであり，アジムスルフロン，ベンス
ルフロンメチル，シクロスルファムロン，エトキシスルフロン及びフルセトスルフロンについて，
マトリックスによる影響は認められなかった．ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンについては試料溶液を 4 倍 又は 5 倍希釈すること で，農薬混合標準液に 対するピーク面積比が80~120 %以内となり，試料マトリックスの測定値への顕著な影響は認められなかった．
Table 4

Matrix effect study by diluted sample solutiona)Matrix effect (%)
Pesticides

Rice straw
c)

WCRS

b)

d)

b)

Azimsulfuron

×1
93.5

×4
102

×5
96.5

×1
88.0

×4
99.1

c)

×5
96.2

d)

Bensulfuron-methyl

99.1

105

106

98.1

101

102

Cyclosulfamuron

101

103

104

98.5

99.7

104

Ethoxysulfuron

94.6

104

100

96.3

100

100

Flucetosulfuron

87.5

99.5

101

92.1

101

99.8

Halosulfuron-methyl

74.2

97.9

97.0

77.0

96.3

96.2

Imazosulfuron

72.1

91.0

97.5

72.3

92.1

90.0

n=3
a) Ratio of peak area of pesticides in the presence of matrix to that in the absence of
matrix. The concentration in matrix standard solution was 10 ng/mL (spiked at
0.1 mg/kg as air-dry basis).
b) No dilutionc) 4-times dilutiond) 5-times dilution
3.2

添加回収試験
2.5 により添加回収試験を実施した．その結果は Table 5 のとおり，ベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロンについては，試料溶液を希釈しない場合で平均回収率はそれぞれ
91.7~120 %及び 89.7~118 %，その繰返し精度は相対標準偏差（RSDr）としてそれぞれ 3.2 %以下
及び 3.4 %以下の成績が得られた．アジムスルフロン，エトキシスルフロン，フルセトスルフロ
ン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスルフロンについては，試料溶液を 5 倍希釈した場合で平均回収率はそれぞれ 84.1~96.0 %，70.7~90.0 %，72.6~85.7 %，71.4~82.8 %及び 75.2~82.5 %，RSDr
はそれぞれ 8.4 %以下，4.7 %以下，6.4 %以下，8.9 %以下及び 15 %以下の成績が得られた．これ
らは妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（真度：70 %以上 120 %以下，精度：0.04

稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬 6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発

mg/kg では 22 %以下，0.5 mg/kg では 18 %以下）を満たしていた．
なお，得られた SRM クロマトグラムの一例を Fig. 2 に示した．

910

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

Table 5
Pesticides

Feed types

Recoveries for pesticides (1)Spiked level(mg/kg as fed basis)a)Dilution
ratio
d)

0.04
Rice straw

0.5
Azimsulfuron

0.02
WCRS

0.2

0.04
Rice straw

0.5
Bensulfuron-methyl

0.02
WCRS

0.2

0.04
Rice straw

0.5
Cyclosulfamuron

0.02
WCRS

0.2

0.04
Rice straw

0.5
Ethoxysulfuron

0.02
WCRS

0.2

×1
e)
×4
f)
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5

Recovery

b)

RSDr

(%)

(%)

50.2
83.6
87.2
81.0
93.4
96.0
79.8
85.3
84.1
78.4
89.1
94.4
91.7
99.5
103
116
120
123
120
120
120
119
122
125
89.7
92.0
94.7
109
117
119
116
118
113
118
119
120
62.0
71.9
77.5
83.9
89.2
90.0
71.9
69.9
70.7
74.8
74.1
76.9

2.3
3.8
5.7
6.4
5.5
7.0
7.1
2.2
3.7
8.7
8.2
8.4
1.9
3.2
3.7
3.2
3.8
2.7
1.4
5.0
2.4
1.5
0.8
1.3
3.4
2.7
3.8
2.0
3.4
3.3
1.4
3.7
2.5
1.7
1.2
1.9
3.6
7.4
4.7
2.4
2.2
2.5
3.6
3.2
1.4
1.2
2.0
3.8

c)

稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬 6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発 11

Table 5
Pesticides

Feed types

Recoveries for pesticides (2)Spiked level(mg/kg as fed basis)

a)

0.04
Rice straw

0.5
Flucetosulfuron

0.02
WCRS

0.2

0.04
Rice straw

0.5
Halosulfuron-methyl

0.02
WCRS

0.2

0.04
Rice straw

0.5
Imazosulfuron

0.02
WCRS

0.2

b)

RSDr

Dilution
ratio

Recovery
(%)

(%)

×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5
×1
×4
×5

59.0
75.6
85.7
76.0
84.0
84.9
69.5
70.9
72.6
72.8
72.9
75.8
47.8
74.3
82.8
61.7
78.1
80.6
58.5
71.8
71.4
62.8
72.5
75.4
46.8
75.1
78.8
62.5
78.6
82.5
61.1
75.1
75.3
64.9
70.9
75.2

3.8
5.8
5.8
2.7
3.2
5.4
4.2
4.3
6.4
9.7
3.3
6.0
2.0
8.0
7.7
3.2
4.8
5.1
2.2
3.6
5.0
6.4
6.1
8.9
5.8
7.2
15
6.4
6.4
5.8
10
4.9
2.8
8.8
8.8
7.3

a) The pesticides were spiked to air-dried WCRS samples one night prior to extraction.
levels were 0.04 and 0.5 mg/kg as air-dry basis for each pesticide.

c)

The spiked

The levels of each pesticide

as fed basis were calculated with following equation on the assumption that the moisture content
of WCRS samples was 60 % as fed basis and 10 % as air-dry basis.
The levels of pesticides as fed basis (moisture 60 %)= the levels of pesticides as air-dry basis (moisture 10 %) / 2.25b) Mean (n = 5)c) Relative standard deviation of repeatabilityd) No dilutione) 4-times dilutionf) 5-times dilution

12

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

B
4500000

4500000

4000000

4000000

3500000

3500000

3000000
4

2500000

5

Intensity / arb. units

Intensity / arb. units

A

7

6

3

2000000

1

15000002

73000000
2500000
3

11500000
1000000

500000500000542000000

1000000

0

6

2

0
4

6

8

10
12
Retention time / min

14

16

18

16

18

4

6

8

10
12
Retention time / min

14

16

18

C
4500000
4000000

6
7

Intensity / arb. units

3500000
3000000
2500000

5

42000000

3

11500000

2

1000000
500000
0
4

Fig. 26

8

10
12
Retention time / min14

Typical selected reaction monitoring chromatograms of pesticides in standard and spiked
sample solutions(LC-MS/MS conditions are shown in Tables 2 and 3.

Arrows indicate the retention times of 1:

azimsulfuron, 2: imazosulfuron, 3: flucetosulfuron, 4: halosulfuron-methyl, 5: ethoxysulfuron, 6:
bensulfuron-methyl and 7: cyclosulfamuron. The baselines are shifted for display.)
A: Standard solution (10 ng/mL: 0.04 ng as each pesticide)
B: Sample solution of rice straw (spiked at 0.5 mg/kg of azimsulfuron, imazosulfuron,
flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and ethoxysulfuron (as 10 ng/mL: 0.04 ng in five-folddiluted sample solution) and at 0.5 mg/kg bensulfuron-methyl and cyclosulfamuron (as 50
ng/mL: 0.2 ng in sample solution))
C: Sample solution of WCRS (spiked at 0.5 mg/kg of azimsulfuron, imazosulfuron,
flucetosulfuron, halosulfuron-methyl and ethoxysulfuron (as 10 ng/mL: in five-fold diluted
sample solution) and at 0.5 mg/kg of bensulfuron-methyl and cyclosulfamuron (as 50 ng/mL:
0.2 ng in sample solution))
3.3

定量下限及び検出下限
令和 3 年度の検討において，ベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロンを除く 5 農薬の検量線が直線性を示した範囲，各 0.5~100 ng/mL の下端付近となる濃度（稲わら中で 0.04 mg/kg
相当量（5 倍希釈した試料溶液中で 0.8 ng/mL 相当量））の添加回収試験の結果は Table 5 のとおり良好であり，得られたピークの SN 比が 10 以上であったため，それら 5 農薬の定量下限の濃度

稲わら及び稲発酵粗飼料中のベンスルフロンメチル及びその他の農薬 6 成分の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時分析法の開発 13

は 0.04 mg/kg とした．この濃度は，5 農薬の中で唯一管理基準値が設定されている，ハロスルフ
ロンメチルの稲わら及び WCRS 中の管理基準値の風乾物中換算値（それぞれ 0.2 mg/kg 及び 0.225
mg/kg）に対してそれぞれ 1/5 及び 8/45 であり，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（基準値 0.1 mg/kg 未満：2/5 以下，基準値 0.1 mg/kg 以上：1/5 以下）を満たしていた．なお，最終試料溶液を希釈せずに測定するベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロンの定量下限の濃度は，令和 3 年度の検討に基づき 0.01 mg/kg とした．
本法の検出下限を確認するため，添加回収試験により得られたピークの SN 比が 3 となる濃度を求めた．その結果，検出下限は試料中でベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロンを除
く 5 農薬で 0.01 mg/kg であり，同様に妥当性確認法ガイドラインに定められた目標値（基準値
0.1 mg/kg 未満：1/5 以下，基準値 0.1 mg/kg 以上：1/10 以下）を満たしていた．なお，最終試料溶液を希釈せずに測定するベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロンの検出下限は，令和3 年度の検討に基づき 0.003 mg/kg とした．

4まとめ

飼料用稲（稲わら及び WCRS）に残留するアジムスルフロン，ベンスルフロンメチル，シクロス
ルファムロン，エトキシスルフロン，フルセトスルフロン，ハロスルフロンメチル及びイマゾスル
フロンについて，JFRL 法を基に，LC-MS/MS を用いた同時定量法の飼料分析基準への収載の可否について検討したところ，ベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロンについては最終試料溶液を希釈せずに，他の 5 農薬については稲わら及び WCRS 中のマトリックスによる影響を低減するため，最終試料溶液を 5 倍希釈することで以下の結果が得られた．
1)

本法に従い得られた試料溶液についてマトリックス効果を確認した結果，各試料マトリックスの測定値への顕著な影響は認められなかった．

2)

各農薬として稲わらに 0.04 及び 0.5 mg/kg 相当量，WCRS に原物換算して 0.02 及び 0.2 mg/kg
相当量を添加し，本法に従って 5 点併行分析を実施し，回収率及び繰返し精度を求めたところ，妥当性確認法ガイドラインに定められた真度及び併行精度の目標値を満たしていた．

3)

本法のベンスルフロンメチル及びシクロスルファムロン（試料溶液を希釈せずに測定）の定量
下限は 0.01 mg/kg，検出下限は 0.003 mg/kg であった．他の 5 農薬（試料溶液を 5 倍希釈して測定）の定量下限は 0.04 mg/kg，検出下限は 0.01 mg/kg であった．設定した定量下限及び検出下限
は，妥当性確認法ガイドラインに定められた目標を満たしていた．

文

献

1)

食品安全委員会農薬専門調査会：農薬評価書

ベンスルフロンメチル，平成 22 年 10 月 (2010).

2)

農林水産省畜産局長通知：飼料の有害物質の指導基準及び管理基準について，昭和 63 年 10 月
14 日，63 畜 B 第 2050 号 (1988).

3)農林水産省消費・安全局長通知：飼料分析基準の制定について，平成 20 年 4 月 1 日，19 消安
第 14729 号 (2008).

4)

武田 然也，船木 紀夫，関口 好浩：飼料用稲中のベンスルフロンメチルの液体クロマトグラ
フタンデム型質量分析計による分析法の開発，飼料研究報告，47，46-61 (2022).

14

飼料研究報告 Vol. 48 (2023)

5)

一般財団法人日本食品分析センター：平成 25 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業
飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2014).

6)

一般財団法人日本食品分析センター：平成 27 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業
飼料中の有害物質等の分析法の開発 (2016).

7)

財団法人日本食品分析センター：平成 21 年度飼料中の有害物質等分析法開発委託事業
中の有害物質等の分析法の開発 (2010).

飼料