技術紹介

株式会社パーキンエルマージャパン

赤外イメージングを用いた硬骨魚類ウロコの成分分布分析
新居田恭 弘イメージング法を用いた魚類の鱗の成分分布の可視化の1 は じ め に方法を紹介する．

1･1 硬骨魚類の鱗（ウロコ）硬骨魚類の鱗は破骨細胞と骨芽細胞によって骨中のカ

2 鱗の成分分布分析

ルシウム代謝が調節される．ヒトの骨の研究において鱗2･1 分析対象とサンプリングが優秀なモデル試料となりうるため，大きく注目されて硬骨魚類として条鰭網─ 骨 鰾 上 目 ─コイ目─コイ科にいる1）．硬骨魚類の鱗はコラーゲンを主成分とする繊維属するキンギョ，モツゴ，フナ，ゼブラフィッシュの 4層とコラーゲンにハイドロキシアパタイト（HAP）や種を対象とした．各個体から鱗を超精密ピンセット

炭酸アパタイトが沈着した骨質層の二層構造から成（Dumont 製 No.Du-5）で採取し，エス・ティ・ジャパる

2）3）．ヒトの骨は骨折しても修復され再生されるよう4）

じょうきこうこっぴょうじょうもく

ン製 Low-E グラススライド上にサンプリングした．鱗に，鱗も再生される ．種々の硬骨魚類の鱗の成分分布は乾燥すると反りやすいため，乾燥する前に Low-E グの可視化により，骨の再生に関する知見を得ることは重ラススライドに密着させた．Low-E グラススライドは要である．本稿では赤外イメージングを用いた硬骨魚類

可視光を透過し，かつ赤外光を良好に反射する光学基板の鱗のタンパク質，HAP，炭酸アパタイトの各成分分である．赤外反射測定における最も一般的な基板は金蒸布の可視化の手法について述べる．

着ミラーであるが，Low-E グラススライドは金蒸着ミラーと比べ可視画像の色情報を損なわず，かつ良好な反1･2 赤外分光法と赤外イメージング法
鱗表面の HAP や炭酸アパタイトの成分分布を可視化

射スペクトルが得られる．

する方法として，赤外分光法，ラマン分光法による方法

2･2 装 置が挙げられる．ラマン分光は 1 μm 以下の微小領域の測すべての測定は PerkinElmer 社製赤外イメージングシ定が可能であるが，コラーゲンを構成するタンパク質の吸収バンドが弱く，かつ大面積の測定には不向きであステム Spectrum3/Spotlight400 を使用した．装置の外観を図 1 に示す．FTIR 本体である Spectrum3 に Spotlight400

る．赤外分光法はタンパク質，HAP，炭酸アパタイトを接続した構成である．Spectrum3 が有する改良型マイの特徴的なバンドが良好に得られ，かつ 10 μm 程度のケルソン干渉計によって安定的に高いシグナルノイズ比大きさまで赤外光を絞った顕微測定が可能なため，本分のスペクトルが得られるため6），イメージング測定にお析の目的によく合致している．

ける高速スキャンが可能となる．鱗のような数 mm 角

赤外顕微測定は，赤外分光計を赤外顕微鏡に接続することで可能となる．赤外顕微鏡はカセグレン鏡と呼ばれる凹面鏡により光源からの赤外光を集光でき，かつ赤外光を高感度で検出可能なテルル化カドミウム水銀（MCT）検出器を備えている5）．赤外イメージングシス
テムは赤外顕微鏡の検出器としてアレイ型 MCT 検出器を備えたもので，視野内の複数の箇所のスペクトルを一度に取得できる．このシステムでは赤外顕微鏡の焦点位置に試料を配置し，精密な電動ステージにより試料を奥行き方向と左右方向に移動させることで，2 次元イメージングデータを高速で得ることができる．このような測定法を赤外イメージング法と呼ぶ5）6）．本講では，赤外22

図1

PerkinElmer 社製 Spectrum3/Spotlight 400
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の大きさのサンプルのイメージングデータに含まれるスピークの向きと合わせている．反射スペクトルの元デーペクトル数は 5 万本以上になるが，数分～数十分程度

タには正反射光に由来する屈折率の異常分散の寄与がわの測定時間で解析に足るデータが得られる．

ずかに認められたものの，全体的には拡散反射光が支配的なスペクトルが得られた．

2･3 測定方法
可視画像は Spotlight400 の赤外光学系を利用した装置内蔵の可視光学系を利用して取得した．視野サイズは各鱗の大きさに合わせた．測定方法は反射イメージング

生データは 1655 cm－1 にタンパク質のアミドⅠバンド（主に C ＝ O 伸縮振動），1551 cm－1 にアミドⅡバンド（主に C─N─H 変角振動），1242 cm－1 にアミドⅢバンド（主に C─N 伸縮振動）がそれぞれ観察された7）．

を選択した．Spotlight400 は透過イメージング , 反射イ

さ ら に 1065 cm－1 に HAP に 含 ま れ る リ ン 酸 イ オ ン，ジングの三つのイメージング手法を選択できる．これら因するバンドが観察された8）．元データのスペクトルはのうち透過イメージングは鱗の厚みが厚いため吸収ピー赤外光の散乱によるベースラインの傾きが大きい．ベー

クが飽和する問題がある．ATR イメージングは鱗の大スラインの傾きはケミカルイメージを描く際に特定の吸きさが Ge クリスタルの測定可能サイズより大きく，収バンドで予期せぬアーティファクトをもたらすため，メージング，ATR（Attenuated Total Reflection）イメー

868 cm－1 に炭酸アパタイトに含まれる炭酸イオンに起データ取得領域に問題がある．反射イメージングは，こ排除する必要がある．図 3 の微分後の鱗のスペクトルれらの問題が起こらず，鱗全体の赤外吸収スペクトルのは，各ピークの波数位置は生データとほぼ一致し，かつ収集が期待できる．

散乱によるベースラインの傾きが良好に補正された．

反射イメージングの取得領域は可視画像と一致させた．測定条件は分解能 4 cm－1，積算回数 4 回，波数範

囲 4000～700 cm－1，干渉計の移動速度 2.2 cm s－1，ピクセルサイズ 25 μm とした．バックグラウンドに使用するリファレンスは Low-E グラススライドの未使用箇所で取得した．

2･4 解 析測定によって得られた反射率スペクトル（R）を以下の式に基づき吸収スペクトル（A）に変換した．
A ＝ log（100/R）
更に PerkinElmer 製 HyperView ソフトウェアを使用し，吸収スペクトルに Savitzky-Golay 法による 2 次微分処理を加えた．2 次微分処理は吸収スペクトルのベースラインの変動を抑制することが目的である．

図23 結果及び考察

通常鱗の可視画像

3･1 硬骨魚の通常鱗
3･1･1 可視画像と赤外スペクトル
キンギョの鱗の可視画像を図 2 に示す．鱗の大きさは，もっとも小さいゼブラフィッシュで約 1 mm 角，最も大きいフナが約 6 mm 角の大きさであった．鱗の表面構造である骨質の線状隆起によって形成される隆起線4），鱗の中心から縁辺にのびる溝条4），露出部と被覆部の色差が明瞭に観察された．
キンギョ通常鱗の反射イメージングから抽出および解析したスペクトルを図 3 に示す．
図の上段は抽出した吸収スペクトルの元データ，下段は 2 次微分後のスペクトルである．2 次微分スペクトルは吸収ピークの向きが微分前と比べ上下逆転するため，2 次微分スペクトルに－1 を乗算し，元データの吸収
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図3

キンギョ通常鱗の IR スペクトル（上段）と 2 次微分 IR
スペクトル（下段）233･1･2 キンギョ通常鱗の赤外イメージング

めで，その下部に存在する骨質層まで赤外光が届いていキンギョ通常鱗の 2 次微分後赤外イメージングデーないためと考えられる．炭酸アパタイトも HAP と同様

タからアミドⅠ，アミドⅡ，HAP，炭酸アパタイトのに隆起線に沿って分布していた．

各ピークを抽出してケミカルイメージを作成した．ケミ
カルイメージとは特定の官能基の強度分布を示した画像

3･1･3 モツゴ・フナ・ゼブラフィッシュ

情報である．結果を図 4 に示す．左上はアミドⅠバン

同じ手法でモツゴ・フナ・ゼブラフィッシュのケミカ

ド，右上はアミドⅡバンド，左下は HAP，右下は炭酸ルイメージを作成した．図 5 以降はアミドⅡは省略す

アパタイト（CO3Ap）のケミカルイメージである．

る．各図のうち，左上が可視画像，右上がアミドⅠ，左アミドⅠは鱗の露出部側に多く分布しており，被覆部下が HAP，右下が炭酸アパタイトである．図 5 にモツ側は少なかった．加えて，アミドⅠは溝条に沿って分布ゴのケミカルイメージを示す．モツゴのアミドⅠはキンしていることが示唆された．アミドⅡはアミドⅠと同じギョと同様には露出部側に多く分布していた．HAP と傾向を示した．HAP はアミドⅠ, Ⅱと異なり被覆部側に炭酸アパタイトは特定の隆起線に沿って分布しており，多く存在していた．また隆起線に沿って分布している様

HAP と炭酸アパタイトの分布のパターンは互いに異子が観察された．被覆部側の HAP の吸収が弱い．これは被覆部側の表面を被覆しているコラーゲン層の存在たなっていた．図 6 にフナのケミカルイメージを示す．
フナのアミドⅠは被覆部に加えて鱗の縁を囲うように分

図 4 キンギョ通常鱗のケミカルイメージ

図 5 モツゴ通常鱗のケミカルイメージ

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図6

図7

フナ通常鱗のケミカルイメージ

ゼブラフィッシュ通常鱗のケミカルイメージ
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分布の可視化の方法を紹介した．反射イメージング法で測定したデータを 2 次微分することで，タンパク質，HAP，炭酸アパタイトの分布を明瞭に示すことが可能となり，特に HAP と炭酸アパタイトは鱗の内部で異なる分布を示すことが示唆された．
謝辞

本稿は東京医科歯科大学との共同研究の成果の一部をまとめたものです．奈良雅之教授，服部淳彦教授，丸山雄介先
生には，試料のご提供，研究の進め方や枠組みに関して大変有益な助言を賜りました．この場を借りて厚く御礼申し上げます．

文

図 8 キンギョ再生鱗のケミカルイメージ布していた．HAP と炭酸アパタイトが隆起線に沿って濃淡が観察されており，HAP と炭酸アパタイトの分布のパターンはやはりそれぞれ異なっていた．図 7 のゼ
ブラフィッシュの HAP と炭酸アパタイトも隆起線に沿った分布が見られ，かつ HAP と炭酸アパタイトが異なる分布を示していた．ゼブラフィッシュは鱗が小さいため，より高い解像度で測定する必要があると考えられる．

献1） 奈良雅之，丸山雄介，服部淳彦，新居田恭弘：日本化学会 第 101 回 春 季 年 会 講 演 要 旨 講 演 番 号 A04-3am-07（2021）.
2） 山田寿郎，麦谷泰雄：“海洋生物の石灰化と系統進化”,p.210（1988）,（東海大学出版会）.
3） 福若雅章：“魚鱗の構造，形成と鱗相分析”p.47,（1997）.
4） 吉富友恭 日本水産学会監修：“魚のウロコのはなし”p.35（2007），（ベルゾーブックス）.
5） 田 隅 三 生 編 著：“ 赤 外 分 光 測 定 法 基 礎 と 最 新 手 法 ”，p.114（2012）,（日本分光学会）.
6） P. R. Griffiths, J. A. De Haseth, J. D. Winefordner :“FourierTransform Infrared Spectrometry 2nd Edition”，p.312（2007）,（Willy）.

to Infrared7） N. B. Colthup, L. H. Daly, S. E. Wiberley “Introduction:and Raman Spectroscopy, Third Edition”，p.320（1990）（Academic,Press）.

8） C. Rey, C. Combes, C. Drouet, A. Lebugle, H. Sfihi, A. Barroug :Mat.-wiss.u. Werkstofftech., 38, No.12., p.2（2007）.

3･2 キンギョの再生鱗●

最後にキンギョの再生鱗を図 8 に示す．再生鱗は鱗が急激に発達するため，個体の発生から一生を通じて成長を続けてきた通常鱗とは構造が異なると考えられている4）．キンギョの再生鱗でも HAP と炭酸アパタイトの分布が異なることが明らかになった．

●新居田 恭弘（Yasuhiro Niida）
株式会社パーキンエルマージャパン アプリケーションリサーチラボ（〒240─0005
神奈川県横浜市保土ヶ谷区神戸町 134 横浜ビジネスパーク テクニカルセンター4F）．神戸大学大学院自然科学研究科応用化学専攻．修士．《現在の研究テーマ》国4 ま と め内における紫外可視，近赤外，赤外分光光度計の分析解析技術の向上に貢献する．

本講では，赤外イメージングを用いた魚類の鱗の成分

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