福岡水技セ研報第12号

2002年3月

Bull. Fukuoka. Fisheries. Mar. Technol. Res. Cent. No12. March2002

ノリ無基質糸状体の培養中に出現する細菌類の抑制法
福永 剛(有明海研究所)

Bactericidal Method of Cultured Pree‑Conchocelis of Porphyra spp.

Takeshi Fukunaga(Ariakekai Labolatory)

変培地を用いて100ml当たりの湿重量1‑3

現在ノリ養殖に用いられている無基質糸状体(以下,を19℃フリー糸状体という。)の多くは,養殖漁場で見つけらのインキュベーターで保存・培養していたフリー糸状体れた生長や色合いの良い葉体を母藻として採取されてい5株(表1)を用いた。

る。フリー糸状体の採取時には滅菌海水で母藻を十分洗

生菌数の測定:浄して爽雑物を極力除去するものの,細菌類,真菌類,①フリー糸状体

また他の藻類(珪藻,藍藻,緑藻)を完全に除去するのフリー糸状体の表面に付着している細菌数の計数は,は困難である。これらの爽雑物は,通常の培養やカキガ以下の方法により行った。まず,フリー糸状体を滅菌ガラへの移植(種入れ)ではほとんど問題がないが,漁業ーゼでよく吸水した後に約0.1を秤量し,次いでこれ者に種として配布するために高栄養の条件下で大量培養に10mlの滅菌海水と破砕を促すため少量のガラスビーする場合には,バクテリアが大量に繁殖し,培養が困難ズを加えて十分磨りつぶし,懸濁液とした。以後は10になる場合が多い。また,品種識別を目的としてDNA倍階段希釈法を用いてZoBell 2216E寒天平板培地に混を抽出する場合では,これらの爽雑生物のDNAがコン釈し, 25℃で培養した。生菌数は,培養開始72時間後タミすることでノリのDNAとの区別が困難になるなどに培地上に発育してきたコロニーを数を数え,これをフの問題が生じている。

リー糸状体湿重量1 g当たりに換算して求めた。
②培養海水

そこで,今回はフリー糸状体の純粋培養を目的とした培養海水の場合は,フリー糸状体と同様の方法で, 1試験の一環として,フリー糸状体に混在する細菌の数とml当たりの生菌数として求めた。

種類を調べるとともに薬剤(抗菌剤)による細菌の抑制効果を検討した。

2.分離された細菌の種類
方

生菌数測定時にAおよびB棟のフリー糸状体および培法

表2 感受性試験に用いた薬剤

1.フリー糸状体および培養海水中の生菌数種 類供試したフリー糸状体:研究所内においてSWMl改

ペニシリン系

薬剤名
ベンジルペニシリン
アンピシリン

表1 試験に使用したフリー糸状体
略号

株

名

1 992年採取

NT

1 989年採取
1 989年採取

T1 4
FA8 9

ストレプトマイシン
カナマイシン

株の由来;ca
B NO‑NG元株

アミノグリコシド系
マクロライド系

ジョサマイシンリンコマイシン系

リンコマイシンテトラサイクリン系

テトラサイクリンオキシテトラサイクリン

年採取
1 9i 年プロトプラスト培養中高生長個体を選抜

クロラムフェニコール系‑7‑クロラムフェニコール

ポリペプチド系

コリステン

キノロン系

ナリジクス酸福永

養海水から分離されたコロニーの中から無作為に30個理によるフリー糸状体の損傷程度は,蛍光顕微鏡下で,を単離培養し, S.T.Cowanlの第一次鑑別表に従っで性無処理の糸状体と比較してその影響を観察した。

状検査を行い,属レベルまでの同定を行った。

結果

3.主な細菌に対する薬剤感受性

1.フリー糸状体および培養海水中の生菌数B株から分離された細菌の中から優占種であった
Corynebacterium属, Flavobacterium属およびフリー糸状体および培養海水中の生菌数を表3に示しStaphylococcus属の3株について,表2に示した11薬た。生菌数はフリー糸状体中が105 ‑108 CFU/g・剤に対する薬剤感受性試験(ディスク法)を行った。

wetbasis,培養海水が102‑105CFU/mlであった。

この結果から,フリー糸状体自体にかなりの数の細菌

4.薬剤の殺菌効果の検討が付着しているのが分かった。

薬剤感受性試験の結果から,特に感受性の高かったオ

表3 フリー糸状体および培養海水中の生菌数

キシテトラサイクリンとクロラムフェニコールを用いて株名殺菌効果の検討を行った。薬剤の濃度は0, 25, 50,糸状体(CFU/g. ・ wetbasis)

100, 500, lOOOppmとし,作用時間は10, 30, 60,120, 720分とした。試験に供したフリー糸状体は,前述のB株を用い,これを約0.01秤量して所定の薬剤濃度と時間で作用させた後に,前述と同様の方法で生菌数培養海水(CFU/ml)

2.5×10〈75.4×10〈27 .1×105

上1×10

7.6×108

2.6×10〈531 .6×10〈84.8×10

31 .2×10

1.2×1048を測定し, 1g当たりの生菌数を求めた。また,薬剤処表4 フリー糸状体および培養海水の細菌相
糸状体から分離された細菌株

名

種類

培養海水から分離された細菌

コロニー数

出現率(%)

種類

Coryn eb actehum

27/ 3090

Corynebacterium

21/3070

Flavobac terium

2/ 30

6. 7

Flavobacterium

3/3010その他

1 /30

3. 3

Staphylococcu s

4/30

13. 3

その他

2/30

6. 7

コロニー数

出現率(%)

Co/γnebactenum

13/30

43. 3

Corynebactenum

24/ 30

Flavobac terium

4/ 30

12. 1

Flavobactenum

4/30

13. 3

Sta phyloco ccu s

6/30

202/306. 7

Micmcoecu s

2/30

6.7

その他

5/30

16.7

その他

表5 分離菌に対する薬剤感受性
薬剤名

Corynebacterium Flavobacterium Staphylococcusベンジルペニシリン

効果++十アンピシリン++

ストレプトマイシン
カナマイシン+++

ジョサマイシン+十リンコマイシン++++++

テトラサイクリン++十十十++++

オキシテトラサイクリン

+++

+++

+++

+十クロラムフェニコール

+++

+++

+++

十十コリステン

ナリジクス酸‑8‑

ノリ無基質糸状体の培養中に出現する細菌類の抑制法

表7

表6 オキシテトラサイクリンの濃度別一処理別

クロラムフェニコールの濃度別‑処理別
付着細菌数(× io3cfu/g)

付着細菌数(× io3CFU/g)
処理濃度(ppm)

02550

1005001000

処理濃度(ppm)
処理時間(分)

処理時間(分)
0

1442

1442

1442

1442

10

1 500

2823

4460

1442

860

10060

2600

840

361000101201600

180

420

210

15720

650

860

730

580

372550100500722722722722722722

240

6108501 200540360

1 500

1 30470640

7307602304503201 6430540

8. 51200

3 10

く1390390

210

1600

69079044980

290590540

430

1 6082̲*‑‑ 0‑x‑ 0‑‑O‑‑ 25‑‑O‑‑ 25I‑A‑ 50‑ムー50‑・ロ‑・ロー100‑1000‑‑⑧‑ 1 0006012072010

処理時間(分)

図1ー100‑‑0‑‑‑500‑‑Q‑‑50030

1000

1 442

5 1300

図2

オキシテトラサイクリンによる3060
処理時間(分)クロラムフェニコールによるフリー糸状体付着細菌抑制効果

フリー糸状体付着細菌抑制効果

クロラムフェこコ‑)i,の場合は,減少がみられず効果は2.分離された細菌の種類少ないと判断された。また,両剤の処理による損傷は,供試菌株の同定結果を表4に示した。最も多く出現し全く認められなかった。

たのはグラム陽性のCorynebacterium属で,ついでグラム陰性のFlavobacterium属が多かった。これはA,

考B株のフリー糸状体と培養海水に共通の傾向であった。

察

この他にはグラム陽性菌のStaphylococcus属や今回はフリー糸状体の無菌化を目的として,フリー糸Micrococcus属が確認された。

状体に付着する細菌の種類と数を調べるとともに薬剤(抗菌剤)の感受性と実用性を検討した。その結果,フ3.主な細菌に対する薬剤感受性
薬剤感受性試験の結果を表5に示した。 3株に共通しリー糸状体の株分けなどの操作は無菌的に行われているて感受性を示した薬剤は,今回試験に供した11種類のものの,糸状体自体に多数の細菌が付着していることが薬剤のうちテトラサイクリン,オキシテトラサイクリン分かった。しかも,今回調べた2株において細菌相がほおよびクロラムフェニコールの3種であった。

ぼ一致していたこと,また,通常海水の細菌相と異なりグラム陽性菌の占める割合が非常に高かったことから,フリー糸状体保存株特有の細菌相を形成しているものと4B 薬剤の殺菌効果の検討考えられた。また,薬剤感受性試験や殺菌効果の検討か各処理区における生菌数の変化を表6, 7に示した。
また,薬剤の抑制効果をみるために浸潰処理前の生菌数

らオキシテトラサイクリンを使用することで抑制効果がを1として,その後の生菌数の推移を割合で整理したも託められ,しかも薬剤処理によるフリー糸状体の損傷ものを図1, 2に示した。なお,グラフ化に際して,検出認められなかったことから,抗菌剤処理による細菌の抑限界以下は生菌数を便宜上1 × io3cfu/g ・ wetbasisと制は可能であると考えられた。今後はさらに効果的な手して計算した。

法を検討するとともに,他の藻類や真菌類などの除去を試みて,どの程度の爽雑物を排除すればDNA解析の材

オキシテトラサイクリンについては, lOOOppm,料として使用できるかを検討する必要がある。

120分の処理で明らかな細菌数の減少が認められたが,‑9‑

福永

要

薬剤は,オキシテトラサイクリンとクロラムフェニ

約コール,次いでテトラサイクリンの3種であった。

1)培養中におけるフリー糸状体の無菌化を目的として,

5)オキシテトラサイクリンIOOOppm, 120分の処理

フリー糸状体に付着する細菌の数とその種類を調べで細菌数の減少が認められた。しかし,クロラムフるとともに薬剤(抗菌剤)の感受性を検討した。

ェニコールの処理では減少がみられず効果はないと

2)フリー糸状体および培養海水中の生菌数はフリー糸判断された。また,薬浴によるフリー糸状体への影響は見られなかった。

状体で105‑108CFU/g ・ wetbasis,培養海水で102405CFU/mlであった。
3)フリー糸状体と培養海水に共通して最も多くみられ

文

献たのはグラム陽性のCorynebacterium属で,ついでグラム陰性のFlavobacterium属が多かった。

1 S.T.Cowan :医学細菌同定の手引き(坂崎利一訳主4)出現頻度の高い3株に共通して強い感受性を示した

近代出版,東京1984, pp.62‑164.

‑10‑