創薬標的となるRNA/DNA立体構造の予測モデル
大学院工学研究院
生命機能科学部門

准教授 寺 正行
2023年 9月 7日
1創薬標的となるタンパク質が枯渇しつつある

潜在的標的

承認済

“Red ocean”

Undruggable
明確なポケットがない

1,265 (7%)

疾患非関連672 (3%)

3,131 (16%)

14,545 (74%)

Human Protein Atlas, Kelvin Stott (2018)

ヒトタンパク質: 19,613

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2

ウイルス感染症治療薬開発では開発迅速性が重要
最初の罹患者

WHO
緊急事態宣言

1/30

12月

死者数
100万人突破

9/29

2021
12/9

1/10

ウイルスゲノム報告

7/19

カシリピマブ（バイオ医薬）RNAワクチン
（バイオ医薬）RNAWHO
緊急事態宣言終了

11/2

1/26

2020

2019

死者数
500万人突破

感染者数
1億人突破

9/27

2022
12/24

2/10

モルヌピラビル（低分子医薬）ソトロビマブ（バイオ医薬）抗体

ワクチン格差は15倍(G20 vs アフリカ諸国)

5/5

2023
8/30 11/22

チキサゲピマブ（バイオ医薬）ニルマトレビル（低分子医薬）ゾコーバ（低分子医薬）低分子
バイオ医薬品

低分子医薬品

開発迅速性
生産/物流/貯蔵コスト

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3

ウイルスRNA/DNAを標的として開発を加速

既存薬はタンパク質の機能を阻害
薬剤探索にはタンパク質の大量調製が必須
組み換えタンパク質精製

核酸合成

入手容易な核酸を標的

RNAの翻訳を止める = タンパク質を消去する

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4従来技術とその問題点
創薬コンセプト比較

標的分子

潜在標的数

ウイルス酵素標的薬

タンパク質

少siRNA/アンチセンス

核酸配列

多ウイルスG4標的薬

核酸構造

多タンパク質NSP15 (151aa)

標的分子調製

開発迅速性

流通性

mRNA
NSP15 (453 base)

16 KDa150 kDa
5 nm

翻訳阻害数でとらえる細胞生物学,
R. Miloより一部改変

Xu, Zhou, JACS Au, 2021.
Mergny, Rahimi, Pharmacol. Rev.,.2021.

感染細胞内でウイルス増殖阻害

核酸高次構造

6OTD

G4リガンドTokyo University of Agriculture and Technology

5従来の核酸構造とグアニン四重鎖の比較

SARS-CoV-2
RNA 二次構造予測
二重鎖を形成する水素結合

Watson-Crick
水素結合• In genomic DNA, stem-loop RNA etc.

Melidis, Stamataki, Grzechnik, Hannon, ACIE, 2021.

四重鎖を形成する水素結合

G-Quadruplex: G4M+Hoogsteen
水素結合

SARS-CoV-2 G4: Zhao, Qin, Niu, Wang, Ren, Qu, ACIE, 2021.

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6RNA G4を作用点とする抗ウイルス薬の創薬研究
ウイルスRNA“高次構造”を標的 → RNAウイルスの転写、翻訳、複製を阻害
翻訳阻害

X
5’Gカルテット

G4: グアニン四重鎖Gカルテット x 3枚
G4形成ルール*: GGG N1-7 GGG N1-7 GGG N1-7 GGG → 逸脱するG4多数
SARS-CoV2 G4: GGG TCA GGG TTTAAAT GG TTACACTGTAGA GG

Hurley, PNAS, 2002.
Balasubramanian, Nat. Chem. Biol., 2007.

*Hupport, Nucleic Acids Res., 2007.

MethodName

Reference

Regular expression matching

Quadparser

Huppert and Balasubramanian (2005)

Quadruplexes

Todd et al. (2005)

AllQuads

Kudlicki (2016)

ImGQfinder

Varizhuk et al. (2017)

QGRS Mapper

Kikin et al. (2006)

pqsfinder

Hon et al. (2017)

G4P calculator

Eddy and Maizels (2006)

cG/cC

Beaudoin et al. (2014)

G4Hunter

Bedrat et al. (2016)

G4RNA screener

Garant et al. (2017)

Quadron (Experimental)

Sahakyan et al. (2017)

ViennaRNA folding suite (RNAfold)

Lorenz et al. (2013)

G4PromFinder

Di Salvo et al. (2018)

Scoring
Sliding window, scoring

Machine learning
Specialized tools

・Gの数が少ないG4は予測困難
・G4-リガンドの相互作用は考慮外

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7G4の配列と機械学習における塩基配列の特徴づけ

蛍光G4リガンドでG4探索

100配列のG4配列

100配列の非G4配列
10.50-3-2-1
実験値の Kd予測値の Kd

1.50

G4の安定性を予測できる
機械学習モデル

GG

G4配列:5’- Ny0 GGx1 Ny1 GGx2 Ny2 GGX3 Ny3 GGX4 Ny4GGGG

Tether1GG

Loop1

Loop2

Loop3

Tether2

テザー・ループ部分 Ny0–y4: 5塩基ずつ配列を断片化して相同性を計算＋
Gカルテット Gx1–x4の数: Gの枚数はG4への安定性に大きく影響

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8

SARS-CoV-2ウイルスゲノムでの機械学習によるG4配列の探索
sequences

position coding

1

TAAGGAAGGTGTAGAGTTTCTTAGAGACGGTTGG

2169

ORF1a2TAAGGGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGT4482

ORF1a4TACAGGCTGGTAATGTTCAACTCAGGGTTATTGG

10256

ORF1a8TAAGGGTTCATTCCTTAATGGTTCATGTGGTAGTGTTGGT10461

ORF1a9GGTATTAAAATACAAGAGGGTGTGGTTGATTATGGT

4486

ORF1a12TTGGTTGTACGCTGCTGTTATAAATGGAGACAGGTGGTTT

10671

ORF1a13

GGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGG

22893

S14

TCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGG

15439

ORF1b17TGGTAAAGTTGAGGGTTGTATGGTACAAGTAACTTGTGGT

10083

ORF1a20TAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGG

15199

ORF1b21TATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGG

24258

S22

TACCCGGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGAGG

4249

ORF1a23

GGGTTTATACAACAAAAGCTAGCTCTTGGAGGTTCCGTGG

21120

ORF1b28

TCATAGGATACAAGGCTATTGATGGTGGT8681

ORF1a34TAAGAACGGTAATAAAGGAGCTGGTGG

636

ORF1a37

GGTTCATTCCTTAATGGTTCATGTGGTAGTGTTGGTTTT10465

ORF1a38TAAAGGATTAAACAACCTAAATAGAGGTATGGTACTTGGT

12957

ORF1a40TGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGG28557

ORF9b

RNA22

D Absorbance

RNA No'KCl 1000 mM

DNA 220.1

RNA 22285

Wavelength305(nm)295315RNA-22はG4を形成-0.05

G-quartet形成されると295 nm付近に弱いUV吸収
TRS journal, 2021

Tokyo University of Agriculture and Technology9簡便なHTS構築–蛍光滴定実験
Buffer: 10 mM Li-cacodylate buffer (with 1000 mM KCl), RNA22: 0.5 mM, TO: 1.0 mM
RNA22 5’-GGGUCAGGGUUUAAAUGGUUACACUGUAGAGG-3’thiazole orange(TO)
Teulade-Fichou et al., Bioorg. Med. Che. Lett., 2006, 18, 4842–4845.

→ 460/520 nmの蛍光で結合判定

TO displacement (%)

G177
G76

Ligand concentration (mM)

Tokyo University of Agriculture and Technology 10簡便なHTS構築– in vitro translation
Name
RNA-22RNA-22 mut

Sequence(5’→3’)
GGGTCAGGGTTTAAATGGTTACACTGTAGAGGa
AAATCAAAATTTAAATGGTTACACTGTAGAAAa

GFP synthesis
Fluorescence intensity (A.U.)

2015

N=3, ±SD

N150

G076

6OTD

DMSO

ATG

T043

T7 promoter

RBS

G4GFP

10*

50
SC-2

SC-2 mut

SC-2'

SC-2' mut

Tokyo University of Agriculture and Technology 11

感染細胞を用いた抗SARS-CoV-2活性評価（case study）
wash out
the virus compound (10 µM)

SARS-CoV-2(MOI=0.003)
1h24 hviral RNA (n=3)
48 hCytopathic effect–log10 (10 mM 添加時RNA相対量)

VeroE6/TMPRSS2 cell

ウイルス
増殖阻害
活性

765N150系
R = 0.897

4T043

N150

T035

T054
T056

32T039

1T055

T040

6OTD系
R = 0.699

0020

40608010050 mM添加時のTO displacement (%)

低低ウイルスRNA G4結合活性Tokyo University of Agriculture and Technology 12

1010101
11

0.1
0.1
0.1

0.01
0.01
0.01

0.001
0.001
0.001

0.00010.00010.00010.00001
0.00001
0.00001

0.000001
0.000001
0.000001

No.149 10uM

No.142 10uM

No.106 10uMNo.90 10uM

No.87 10uM

No.83 10uM

No.69 10uM

No.2 10uM

RDV10uM(b) Entry (n=3)

DM 0.1%

No.149 10uM

No.142 10uM

No.106 10uM

No.90 10uM

No.87 10uM

No.83 10uM

No.69 10uM

No.2 10uM(a) Whole (n=3)

RDV10uM

DM 0.1%

No.149 10uM

No.142 10uM

No.106 10uM

No.90 10uM

No.87 10uM

No.83 10uM

No.69 10uM

No.2 10uM

RDV10uM

DM 0.1%viral RNA (fold)

G4に作用しているかの検証–感染成立後に薬効発現(c) Post-entry (n=3)

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新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の二次構造予測はWatson-Crick
塩基対に限られていた。
• 従来の二次構造よりG4は安定な場合が多く、翻訳阻害効果を得られやすい。
• タンパク質標的創薬と比べて、HTS実施までの負担が少ない。（発現タンパク質 vs合成オリゴ）

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想定される用途• 標的とするウイルス、細菌のDNA・RNAから標的G4を探索する。
• 探索したG4との結合試験でHTSが可能。
• がん遺伝子上流のUTR G4も標的となり得る。

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実用化に向けた課題• 実用化に向けて、動物レベルでの薬効試験結果が必要。
• 感染モデル動物の準備が困難。

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企業への期待• 標的探索部署との共同研究を希望。
• 化合物ライブラリを所有してHTSを実施したい部署との共同研究を希望。
• 注力しているウイルス、細菌のゲノムを提供してもらえれば、候補配列を提示。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：グアニン四重鎖形成配列予測装置及び機械学習方法、並びに化合物又はその塩、及びグアニン

四重鎖結合性リガンド• 出願番号：出願済み、未公開• 出願人：国立大学法人東京農工大学• 発明者：寺正行、野原玲奈、佐々木捷悟

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お問い合わせ先

東京農工大学先端産学連携研究推進センター
Tel042-388-7550
Fax
042-388-7553
e-mail suishin@ml.tuat.ac.jp

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