【別紙5】

薬剤耐性遺伝子による耐性確立を抑える新規薬剤探索法
広島大学

大学院統合生命科学研究科講師

守口 和基
令和２年１０月１日

従来技術とその問題点
1925 ペニシリンの発見（１９２８）
相次ぐ抗生物質の発見による黄金期
1950

1975

2000

化学合成による新規抗生剤の開発の時代

新規抗生剤の開発は緊急性が高いにも関わらず，行き詰まってきている。
開発が耐性菌の蔓延に追いつかない。

従来技術とその問題点
WHOが警告する緊急対応が必要な12の薬剤耐性病原菌リスト
緊急性
非常に高い

Nature 543, 15 (02 March 2017)
doi:10.1038/nature.2017.21550
表を引用
A. バウマニ（日和見感染菌の１種）
緑膿菌（日和見感染菌の１種）
腸内細菌科菌群（大腸菌や赤痢菌）
腸球菌（尿路感染症などの原因菌）
黄色ブドウ球菌（日和見感染菌の１種）

高い

ピロリ菌（胃潰瘍、胃がん原因菌）
カンピロバクター（食中毒）
サルモネラ属（食中毒）淋菌（淋病）肺炎連鎖球菌（肺炎）中程度

インフルエンザ菌（副鼻腔炎、気管支炎）
赤痢菌属（食中毒）

新薬開発に新たな選択肢が必要
行き詰まり感の強い新規抗生剤開発

原因である耐性菌の出現は，多くは耐性遺伝子の水平伝播による獲得に起因

現状：抗生剤の使用をコントロールして耐性菌の蔓延を予防する取り組み（難題も多）

形質転換

接合伝達

こちらを抑え込むアプローチが有効なのではないか。

除菌対象の細菌
薬剤耐性遺伝子の水平伝播を抑える

形質導入

スクリーニング法（基本）
大腸菌のノックアウト変異コレクション（Keio collection: 3884株）を用いたゲノム網羅的スクリーニング

LB+Ap+Cm

Keiomutants

LB+Km

Conjugation
28℃, 24h

HB101(pRH220,pRS316oriTP)
1/2000上昇変異体
スクリーニング

28℃,
24h
Selection medium(LB+Ap+Cm+Km agar)

1/100

Colonycounting

低下変異体
スクリーニング
37℃,
Turbidity
24hmeasurement
Selection
medium(LB+Ap+Cm+Km)

スクリーニング法
段階的選抜

選抜が期待される遺伝子

pRS316oriTP
ApR

1stCmRtra

KmR•••

接合伝達
プラスミド複製
Cm, Ap 耐性

•••

接合伝達
プラスミド複製
Cm 耐性

••

接合伝達
Cm 耐性

•

接合伝達

pRH220pRS316oriTP
ApR

2ndCmRtra

KmR

pRH220pJP5603ΔKmR(::GmR CmR leuB–D)

3rdCmR

KmR

tra

4thApRtra

RP4::GmRΔKmR

KmR

Log2(colonies / median colony no.)接合効率“上昇” 変異体選抜 (１段階目)

Distribution pattern of colony number ratio8≥3 (≥8-fold)
119 mutants

6420-20500

100015002000

2500

3000-4-6-8

変異体 (効率の低い順)●: Less than detection limit.
µ = 0.13, σ = 1.86 (excluding the data less than detection limit)

3500

4000

接合効率“上昇” 変異体選抜 (２段階目)

Log2(colonies / control colonies)

Distribution pattern of colony number ratio
4.0≥3 (≥8-fold) 2 mutants≥2 (≥4-fold) 6 mutants

3.0
2.0
1.0
0.0
0

20

40

60

80

100

120

-1.0
-2.0
-3.0
-4.0-5.0

Mutants (ascending order)n = 3 (applied integrated value), µ = 0.12,
σ = 1.56

３，４段階目の選抜で全て外れ (<1)であることがわかった。

明白な“上昇” 変異体は存在しない。
⇨接合伝達を抑制する因子はない。

接合効率“低下” 変異体選抜 (１段階目)

Log2(turbidity / median turbidity)

Distribution pattern of turbidity ratio
32
10-1 0-2-3-4-5-6-7-8500

1000

1500

2000

2500

≤−2 (≤1/4-fold)
156 mutants

変異体 (効率の低い順)●: Less than detection limit.
µ = −0.20, σ = 0.93 (excluding the data less than detection limit)µ = −0.03, σ = 0.40 (−2 < sample < 2)

3000

3500

4000

接合効率“低下” 変異体選抜 (２段階目)（接合体コロニー数に基づいた解析）
Log2(colonies / control colonies)

Distribution pattern of colony number ratio
2.00.0050

100150≤−2 (<1/4-fold) 29 mutants-2.0-4.0≤−3 (<1/8-fold)
21 mutants

-6.0
-8.0

-10.0

Mutants (ascending order)●: Less than detection limit.

n = 3 (integrated value)µ = −0.69, σ = 1.87 (excluding the data less than detection limit)µ = −0.09, σ = 0.78 (−2 < log2 value < 2)≤−2 (<1/4-fold) を第３，４段回目のスクリーニングへLog2(colonies / control colonies)

接合効率“低下” 変異体選抜 (３，４段階目)（接合体コロニー数に基づいた解析）
2Control level0-2-4-6-8-10* * * * ** * *2nd (Cm)*

3rd (Cm, Integration type)*

4th (Ap)n = 3 (applied integrated value)⚫ プラスミド複製欠陥依存的な「低下」変異株は含まれなかった。
⚫ ほとんどの候補変異株は接合変異体ではなかった。

残ったΔpriA and ΔdnaT (ラギング鎖合成関連遺伝子) は本物／偽物の接合伝達変異体か？
Living recipient cell ratio (生細胞比率)(Mutant colony number / Control colony number)-1.0

2.0-1.5

**

**

***

-2.0

*

生細胞率

Log10(接合効率)

接合効率(Transconjugant / Recipient cell)-2.5-3.0-3.5

1.5
1.0-4.0

0.5

-5.0

0.0

1.0の差で10-4.5倍の効率差

n≥3より成長条件の良い環境で長く培養すると接合体が検出できた。

***n≥3ΔpriA and ΔdnaT 変異体は死細胞の割合が多い。

明白な“低下” 変異体は存在しない ⇨接合伝達を促進する因子はない。

上昇／低下変異体両方無し ⟹ 接合伝達は止められない？

Log2(colonies / control colonies)

データを読み取る視点を変えてみる。
2Control level0-2-4-6-8-10* * * * ** * *2nd (Cm)*

3rd (Cm, Integration type)*

4th (Ap)

ここだけに引っ掛かるものは？

第２第３スクリーニングでポジティブで第４スクリーニ
ングでネガティブな変異体は何を意味するのか？

抗生物質（Chloramphenicol）特異的な接合変異体？
接合効率(Transconjugant / Recipient cell)

生細胞比率(Mutant colony number / Control colony number)-1.0

1.61.4**-2.0**

1.2*
**

生細胞率

Log10(接合効率)****-3.0-4.0

1.00.80.60.4-5.0

1.0の差で10倍の効率差 -6.00.20.0n≥3n≥3⚫ ΔihfA, ΔihfB, ΔpncA, ΔacrB, ΔubiH は接合効率が低下。
⚫ ΔdnaK レシピエント生細胞率が低い。 有意差は無いものの、接合効率も低い。

Chloramphenicol 特異的な接合変異体であることの確認

固相（ドナーとレシピエントが強制接触）での接合実験結果
***
**

*

Log10(接合効率)

0.0

1.0の差で10倍の効率差

***

**

*

-1.0-2.0-3.0-4.0

接合効率の低下はCell-Cellcontact低下によるものではない。

-5.0n≥3

ΔdnaK を含む６変異体全てで接合効率の低下を確認。

伝達そのものは抑えられない代わりに、伝達後の耐性確立を抑えることはできそう。

Chloramphenicol特異的な接合変異体の結果例
接合体 (28℃ 22 h + 37℃ 24 h)
ΔdnaK(10×)
ΔubiH
(10×)
ΔacrB
(10×)

ΔihfA
(10×)
ΔihfB
(10×)
ΔpncA
(10×)

ΔihfB
Control1(100×)
ΔihfA(100×)

Control2

Control2 Control1(1/10×) (1/10×)

レシピエント (28℃ 24 h)
ΔubiH

ΔacrB
ΔpncA

Control1

ΔihfA
ΔihfB

Blank

Blank
ΔdnaK(10×)ΔdnaK

Control2Blank

接合効率が低いだけでなく，接合体のコロニー形成が遅い（Cm感受性が保持されている）。

新薬開発に新たな選択肢を提供
IncPプラスミドによるゲノム網羅的接合受容因子探索結果① 接合伝達による受容過程

薬剤耐性遺伝子ブロック
不可ブロック
可② 機能的発現過程

本技術の適用により可能なこと②をブロックするための標的因子探索を、①の接合系で行うと効率的にスクリーニング可能。

新技術の特徴・従来技術との比較• ノックアウトライブラリーからのスクリーニングなので、非必須遺伝子が単離され、従来の抗生剤とは標的が異なる。
（従来の抗生剤は生命維持に必須なステップに作用）• 個々の薬剤耐性遺伝子に対応した標的遺伝子が見つかる可能性が高い。
（今回の場合ではクロラムフェニコール）

新技術の特徴・従来技術との比較• 薬剤耐性遺伝子に対応した標的遺伝子であれば、水平伝播の経路に関係なく効果が期待できる。

形質転換

接合伝達

形質導入

除菌対象の細菌遺伝子の伝達後に抑える• 最終的に出来上がる新薬は、耐性菌が問題となっている既存品のシェアを奪うものではない。併用することで既存品の売上を伸ばすことに貢献。

想定される用途
 行き詰まり感のある新規抗生剤開発において、新たに標的とすべき遺伝子産物を探索する方策の一つになる。
 上記を標的とした薬剤は、臨床現場において既存の抗生剤との併用薬として期待される。

（改変による）想定される用途
 また、スクリーニング系を改変することにより、薬剤耐性プラスミドの供与に関与するバクテリア側染色体因子の探索にも適用可能である。
 上記を標的とした薬剤は、院内で薬剤耐性プラスミドによる耐性病原菌が生じることを抑制する予防薬として期待される。

実用化に向けた課題
 標的とすべき遺伝子の探索法は確立したが、薬剤探索ステップ以降は専門外である。
 Fragment-Based Drug Discovery法による薬剤探索を産総研との共同研究で計画しているが、公的研究資金の獲得には至っていない。
 標的遺伝子スクリーニングの迅速化も必要あり（現状は全てマンパワー）。

企業への期待 標的遺伝子スクリーニングの迅速化については、バイオ・製薬企業が所持するような、多サンプル対応の自動培養・測定機器により克服できると考えている。
 標的化合物スクリーニングの技術を持つ、企業との共同研究を希望。
 また、新規抗生剤を開発中の企業、製薬分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

本技術に関する知的財産権
 発明の名称 ：細菌におけるクロラムフニ

コール耐性の確立を阻害するためのキットおよび方法
 出願番号 ：特願2019-117496
 出願人
：広島大学
 発明者
：守口和基、鈴木克周、
清川一矢産学連携の経歴
 2019年-

アイ・メジャー社と共同研究実施

お問い合わせ先
広島大学 産学連携推進部 産学連携部門
産学官連携コーディネーター栁 和裕
ＴＥＬ 082-424-4306
ＦＡＸ 082-424-6189
e-mail yanagi＠hiroshima-u.ac.jp