ライフサイエンス～医療系大学～ 新技術説明会

ΔNp63αノックダウンによる放射線抵抗細胞のアポトーシス亢進

福島県立医科大学 医学部 放射線生命科学講座
助教 工藤健一
2022年12月8日

発表の概要1. 出願者は思春期ラット雌の初代乳腺細胞をフローサイトメトリー解析などの手法で分析し、乳腺上皮の基底細胞は内腔細胞に比べて放射線に著しく抵抗性であることを明らかにした (Kudoら, Radiat. Res. 2020)
2. 出願者は、さらにΔNp63αを発現するヒト乳腺上皮細胞を用いてノックダウン実験を行い、その放射線抵抗性の原因をΔNp63αがDNA損傷応答時p53の働きを転写的に阻害するためと結論付けた (Kudoら,
Radiat. Oncol. 2022)
3. これにより、扁平上皮がんのようなΔNp63αを高発現するがん組織に対し、ΔNp63αノックダウンによって効果的な放射線治療および化学療法を行うことが期待できる

私の研究課題： 放射線誘発乳がん
 放射線影響研究所が実施した原爆被爆者コホート調査により、乳腺が放射線誘発がんに対して感受性であることがわかった (Prestonら, 2007) 発癌中心である乳腺上皮は基底細胞と内腔細胞から構成される。このうち幹細胞は基底細胞に含まれる (Stinglら, 2006)
 幹細胞は長い時間をかけて他の細胞へ分化していく。その過程で遺伝子変異が蓄積し、癌起源細胞へ変異すると言われている (Visvader 2011)
Kudo et al., 2020

乳腺

CK14
CK18

幹細胞

がん

がん起源細胞

内腔細胞
基底細胞

Visvader and Clevers, 2016

矢状面

Visvader, Nature, 2011

DNA損傷応答
放射線

DNA二本鎖切断
細胞周期停止幹細胞

悪性腫瘍（がん）DNA修復?

がん幹細胞

アポトーシス

核心をなす学術的問い： 放射線誘発がんの発生は照射後に起こる幹細胞のDNA損傷応答異常に起因するのではないか？

ラット乳腺を対象とした放射線誘発アポトーシスの解析
SDラット雌*: p<0.05, **: p<0.01

解剖、乳腺細胞の採取、標識抗体処理

Cells > No debris > Live cells > Lin-CD24104

内腔細胞 2

アポトーシス解析

アポトーシス細胞の割合・フローサイトメトリー解析

基底 内腔１ 内腔２ 繊維芽

内腔細胞 1・RT-qPCR

103102

基底細胞

101

基底線維芽細胞101102

CD49f

103

内腔１104
Kudo et al. Radiat. Res. 2020

ΔNp63αについて
 TP63はTP53のスーパーファミリー遺伝子の一つとして発見された(Yangら, 1998; Osadaら, 1998)
 TP63は複数のスプライシングバリアントを持つ。ΔNp63αはΔN型の全長であり、乳腺・皮膚・肺など上皮組織の基底細胞に常時発現している
p53, p63の遺伝子構造

TA: transactivation

・ΔN型は活性化部位(TA)が欠如している
・p53とDNA結合部位の相同性が高い

乳腺基底細胞のみΔNp63αを発現している
HE染色

基底細胞でp63が発現している

CK14
CK8DAPIp63 (4A4)CK5内腔細胞基底細胞

kD Marker

6640

内腔細胞0Gy

分子量とマーカーからΔNp63αと認められた

4Gy
4h 24hp63 (72kD)

112

4Gy
4h 24h

12β-ActinMarker

6000
4000

Expression (arbitary unit)

基底細胞
0Gy

40

112

2000014000

p63

10000
600001209060
300

ΔNp63

2

Simple westernによるタンパク質分析

66

1220

ΔNp63α200

Molecular weight [kD]Kudo et al. Radiat. Res. 2020

がん抑制遺伝子
ゲノム守護神DNA損傷応答に関係する遺伝子の発現

DNA

Woodstock, et al., 2021

DNA結合部位の相同性が高いことから、発見時よりΔN型はp53の働きを競合的に阻害すると言われてきた (Westfallら, 2003など)

ヒト乳腺上皮細胞(HMECs)を用いたp63ノックダウン実験

siRNAによるΔNp63の発現抑制

ΔNp63
CK14DAPIscramble

p63 siRNA

ΔNp63減少は48時間程度まで持続した
HMEC (ThermoFisher Scientificより購入)
・Adult Human (30代女性)
・Mammary epithelial cells・Single donor
・Passage 6 th (購入時)

scr: scramble siRNA処理群
sip63: p63 siRNA処理群
コントロール群とノックダウン群の両方で放射線照射後のp63発現変化は見られなかった（実験中のp63発現量の安定性を確認した）

Kudo et al. Radiat. Oncol. 2022

1. RT-qPCR**: P<0.01, *; P<0.05

2. Western blotting

ΔNp63αは放射線応答時、p53下流遺伝子を転写阻害し、発現を抑制している
Kudo et al. Radiat. Oncol. 2022

3. RNA-seq解析
K-means clustering heatmaps

Gene Ontology Analysis

ΔNp63αをノックダウンすることにより・・・

細胞周期や細胞増殖に関する遺伝子発現が減少

アポトーシスや細胞の分化に関する遺伝子発現が増加

ΔNp63αは幹細胞性を保持して細胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制する
Kudo et al. Radiat. Oncol. 2022

4. アポトーシス細胞の検出
ノックダウン群

アポトーシス細胞の割合 (%)

コントロール群

ΔNp63αノックダウンによって放射線誘発アポトーシスの割合が大幅に増加

Kudo et al. Radiat. Oncol. 2022

5. ヒトiPS細胞に対する異所性発現解析

ΔNp63α-expressing iPS cells

0.008mRNA relative expression

ΔNp63αSSEA4DAPIBAX発現解析**0.004

00Gy

4Gy

アポトーシス細胞の検出
Cleaved caspase3-positive cells (%)ΔNp63αの導入

40**

**

**

3020100ΔNp63α非発現細胞
ΔNp63α発現細胞

0Gy

4Gy**: P<0.01, *; P<0.05

ΔNp63α発現によってBAX発現が抑制され、放射線誘発アポトーシスが阻害された
Kudo et al. Radiat. Oncol. 2022

アポトーシスを含むDNA損傷応答を抑制

新技術の特徴・想定される用途
1.

肺扁平上皮がんのような90％以上がΔNp63αに陽性であるがんに対し、ノックダウン処理後に放射線および薬剤によってDNA損傷を引き起こすことでアポトーシスを亢進する効果的な治療法を開発することが期待できる。また、そのΔNp63αノックダ
ウンによって癌細胞の増殖活性を著しく下げることが期待できる。これにより、放射線治療に要する総線量を下げ、治療期間の短縮とともに正常組織への障害を防ぐことが期待できる
2.

ΔNp63αは四肢などの発生に関わるが臓器が完成すると役割はほとんどないためノックダウンのターゲットとしてより安全であると見なせる

企業への期待1.

ΔNp63αはCRL4CRBNによるユビキチン分解のターゲット分子であり、すでにサリドマイドによってノックダウン可能であることが確認されている（AsatsumaOkumuraら, 2019）。現在、多発性骨髄腫の治療薬としてサリドマイド誘導体が開発されているので、企業の既存技術を用いて創薬開発が可能と考えられる

2.

今年、DNA脱メチル化剤によってΔNp63αがp53と類似した働きをするTAp63αへスイッチ可能であることが発見された（Pokornaら, 2022）。したがって5-dAzaな
どDNA脱メチル化剤から癌組織のΔNp63αをノックダウンする戦略も考えられる
3.

ほかにヒストン脱アセチル化剤によるノックダウンも報告されており、多様な創薬開発が可能と考えられる

本技術に関する知的財産権
 発明の名称 ：がん治療のための放射線増感剤
 出願番号 ：特願2022-142009
 出願人：福島県立医科大学
 発明者：工藤 健一

お問い合わせ先
公立大学法人 福島県立医科大学
医療研究推進課 佐藤 浩樹
ＴＥＬ 024－547－1791
ＦＡＸ 024－581－5163
e-mail bluebird@fmu.ac.jp